(57)【要約】【課題】  様々な疾病においてそのメカニズムの解明や診断・治療を可能とするために、生体内因性分子をリアルタイムで視覚化する方法を提供する。【解決手段】  本発明は磁気共鳴法（オーバーハウザーＭＲＩや電子スピン共鳴法を含む）を用いて生体内因性分子を視覚化する新規方法を提供する。すなわち、本発明の画像化方法は、生体内因性分子をリアルタイムで画像化するための方法であって、測定対象となる生体に磁気共鳴法を適用して生体内因性分子の情報を得る工程と；前記得られた生体内因性分子の情報を処理して画像化情報を得る工程と；前記得られた画像化情報を表示する工程と、を含む。【選択図】  なし
2011052760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内因性分子の酸化及び／又は還元反応をリアルタイムで検出するための方法であって、
測定対象となる生体に磁気共鳴法を適用して生体内因性分子の情報を得る工程と、
前記得られた生体内因性分子の情報を処理して画像化情報を得る工程と、
前記得られた画像化情報を表示する工程と、
を含む検出方法。
【請求項２】
前記磁気共鳴法がオーバーハウザーＭＲＩ法または電子スピン共鳴法のいずれかである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記生体内因性分子がフリーラジカルを有するものである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
前記生体内因性分子がユビキノン、フラビンアデニンジヌクレオチド、ビタミンＫ又はアスコルビン酸である、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
生体内因性分子は生体外から生体内に取り込まれるものである、請求項１に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内因性分子の酸化及び／又は還元反応をリアルタイムで検出する方法に関し、より詳細には、オーバーハウザーＭＲＩ法又は電子スピン共鳴（ＥＰＲ）法を用いた生体内因性分子の酸化及び／又は還元反応の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキノン（ＣｏＱ）、ビタミンＫ、アスコルビン酸又はフラビンアデニンジヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＦＡＤ）等のラジカル中間体を形成する、すなわちフリーラジカルを有する生体内因性分子（物質）は、生体内で恒常性の維持（ホメオスタシス）のため重要な役割を担っている。特にユビキノンはすべての細胞が持つミトコンドリアの内膜や原核生物の細胞膜に存在する電子伝達体の１つであり、ミトコンドリア機能の保持に深く関与する。このため、ユビキノンは細胞内のミトコンドリア機能の改善、抗酸化効果、抗アルドステロン効果が期待され心機能補助役等としても用いられている。【０００３】
ユビキノンはミトコンドリア呼吸鎖Ｉ〜ＩＩＩにおいてＱサイクルと呼ばれる電子の授受に関わる分子であり、電子伝達系において呼吸鎖複合体ＩとＩＩＩの電子を仲介し、その代謝過程でセミキノンフリーラジカルを生成する。このようなフリーラジカルは生体レドックス反応に関係する。生体レドックス反応とは、酸化還元反応を介した生理機能発現及びそれに伴う活性種産生、産生された活性種と生体分子との代謝・反応の全体を表す概念であり、多くの生理現象やがん・糖尿病をはじめとする生体レドックス疾患に密接に関与することが示唆されている。【０００４】
従って、ユビキノン等の生体内因性分子の酸化及び／又は還元反応の挙動、状態を直接視覚化する方法があれば、様々な疾病において、生体内因性分子の情報から病気のメカニズム解明や診断・治療が可能となると考えられる。【０００５】
このような生体内の画像化をおこなう方法としては、従来よりＸ線ＣＴやＰＥＴ  ＣＴ、磁気共鳴（ＭＲＩ）等があり、空間情報の画像化を行う形態画像化が主として行われてきたが、近年は形態画像化に加え、生体内の機能・現象を可視化する、機能画像化が行われるようになってきた。【０００６】
例えば、摘出臓器から調製した溶液中に生成するフリーラジカルを電子スピン共鳴法等で計測し、そのスペクトル波形・強度変化から機能解析をした例がある。この方法は、試験管レベルでの解析はできるものの、疾病に生体内物質がいつ、どこで、どのように関与するかを知ることはできなかった。【０００７】
また、生体内の酸化還元反応を検出・解析する方法としては、合成ニトロキシルラジカル化合物をプローブとして体内に投与し、当該化合物の酸化還元反応を指標に検出・解析する方法が知られている。しかし、この方法では、生体内の酸化還元反応を合成ニトロキシルラジカル化合物の反応を指標に検出・解析することができるが、生体内分子の酸化・還元反応を直接的に検出・解析しているわけではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【特許文献１】Non-invasive monitoring of redox status in mice with dextran sodiumsulphate-induced colitis.  Yasukawa K, Miyakawa R, Yao T, Tsuneyoshi M, Utsumi H.  Free Radic Res. 2009 May;43(5):505-13.
【非特許文献２】In vivo detection of free radicals induced by diethylnitrosamine in rat liver tissue.  Yamada K, Yamamiya I, Utsumi H.  Free Radic Biol Med. 2006 Jun 1;40(11):2040-6.
【非特許文献３】Application of in vivo ESR spectroscopy to measurement of cerebrovascular ROS generation in stroke.  Yamato M, Egashira T, Utsumi H.  Free Radic Biol Med. 2003 Dec 15;35(12):1619-31.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前述の問題を解決し、様々な疾病においてそのメカニズムの解明や診断・治療を可能とするために、生体内因性分子の酸化及び／又は還元反応をリアルタイムで視覚化する方法を提供することをその課題とする。  
【課題を解決するための手段】
【００１０】
具体的には、本発明は磁気共鳴法（オーバーハウザーＭＲＩ（ＯＭＲＩ）や電子スピン共鳴法を含む）を用いて生体内因性分子の酸化及び／又は還元反応を視覚化する新規検出方法を提供する。すなわち、本発明の検出方法は、生体内因性分子の酸化及び／又は還元反応をリアルタイムで検出するための方法であって、測定対象となる生体に磁気共鳴法を適用して生体内因性分子の情報を得る工程と；前記得られた生体内因性分子の情報を処理して画像化情報を得る工程と；前記得られた画像化情報を表示する工程と、を含むものである。【００１１】
また、本発明の検出方法において用いる前記磁気共鳴法としては、ＯＭＲＩ法または電子スピン共鳴法等を挙げることができる。これらの磁気共鳴法を用いることで、より正確な計測画像を得ることができる。【００１２】
また、本発明の検出方法の画像化対象となる前記生体内因性分子としては、例えばユビキノン、ビタミンＫ、アスコルビン酸又はＦＡＤを挙げることができる。さらに、本発明において、フリーラジカルを有する生体内因性物質であれば画像化の対象となりうる。これらの生体内因性分子を画像化できるということは、様々な疾病においてそれらの分子が関与する生体機能を直接描写しそのメカニズムの解明や診断・治療を可能とするという観点から重要である。【００１３】
さらに、本発明の検出方法の対象となる生体内因性分子は、生体外から生体内に取り込まれるものであってもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の検出方法によって生体内因性分子の酸化及び／又は還元反応をリアルタイムで画像化することができるようになり、生体内因性分子であるユビキノン由来のセミキノンラジカルのオーバーハウザーＭＲＩを用いた画像化を世界で初めて実現した。特にユビキノンに関しては、ユビセミキノンラジカルを内因性のプローブ（造影剤）としてマウス直腸内より投与した場合、時間と共にユビセミキノンラジカルが減少することを示した。一方、溶液の状態ではユビセミキノンラジカルは安定であったことから、投与したユビセミキノンラジカルは生体内反応を経て消失したことが明らかとなった。【００１５】
また、塞性動脈硬化症の動物モデルであるマウス下肢虚血モデルにユビセミキノンをプローブとして応用した場合、対称肢（正常側）に比べユビセミキノンの消失が有意に抑制されたことから本プローブが病態をモニターできることを示した。【００１６】
これらの結果より、本法は生体内因性分子の酸化及び／又は還元反応を直接視覚化するだけでなく、生体内因性分子そのものも視覚化できる可能性が示唆された。また内因性物質であるユビキノンを造影剤として活用するので、造影剤の毒性という観点からも劇的な改善が期待される。【００１７】
さらに、本発明の検出方法を用いてＦＡＤセミキノンラジカルのＯＭＲＩ画像を得ることにも成功した。ＦＡＤは生体内の様々な臓器において電子伝達体として活用されていることから、ＦＡＤを生体プローブとして活用することで生体内因性分子を用いたレドックス可視化への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１ａは、ユビキノンの酸化還元反応スキームを、図１ｂはユビセミキノンラジカルのＥＰＲスペクトルを、図１ｃはユビセミキノンラジカルのＤＮＰスペクトルを、それぞれ示す図である。
【図２】図２ａは、ユビセミキノンラジカル産生におけるユビキノン濃度依存性を示すグラフ及び各濃度におけるユビセミキノンのＥＰＲスペクトルを、図２ｂはユビセミキノンラジカル産生におけるｐＨ依存性及びそれぞれのｐＨにおけるユビセミキノンのＥＰＲスペクトルを示す図である。
【図３】図３ａ〜ｄは、ＯＭＲＩによるユビセミキノンラジカルのインビトロ分子イメージングを、図３ｅはＥＰＲ照射の有無による信号強度の違いを示す図である。
【図４】図４ａはコエンザイムＱ−０（ＣｏＱ０）、ＮＡＤＨ及びＣｏＱ０とＮＡＤＨの混合物のＥＰＲスペクトルを、図４ｂ〜ｅはユビセミキノンラジカルの分子イメージングを示す図である。
【図５】図５ａ〜ｄは、ユビセミキノンラジカルのインビボ分子イメージングを示す図を、図５ｅは盲腸におけるＯＭＲＩシグナルの経時変化を示すグラフである。
【図６】図６ａはＦＡＤのセミキノン体のＯＭＲＩ画像を示す図であり、図６ｂはＦＡＤ濃度とＦＡＤセミキノンラジカル濃度の関係を示すグラフである。
【図７】図７は、閉塞性動脈硬化症の動物モデルであるマウス下肢虚血モデルのユビセミキノンプローブを用いた解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に、本発明を詳細に説明する。まず、本発明における生体内因性分子とは、生体内で恒常性の維持（ホメオスタシス）のため重要な役割を担い、ラジカル中間体を形成する分子（物質）であって、元々生体内に存在するものをいう。具体的には、ユビキノン、ビタミンＫ、アスコルビン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ビタミンＢ２等を挙げることができる。
【００２０】
これら生成されるラジカルは不対電子を有し常磁性であり、生体レドックス反応に関係する。この生体レドックス反応とは、酸化還元反応を介した生理機能発現及びそれに伴う活性種産生、産生された活性種と生体分子との代謝・反応の全体を表す概念であり、多くの生理現象やがん・糖尿病をはじめとする生体レドックス疾患に密接に関与することが示唆されている。したがって、生体レドックス状態の可視化は低侵襲的な疾患機序解析あるいは新規治療薬の開発に新しい方法論を提供しうる。
【００２１】
本発明の検出方法により、前記生体内因性分子の機能画像としてのレドックス動態画像、代謝画像などの生体機能画像や、形態画像としての組織画像(１３Ｃ、１Ｈ、３１Ｐ核等)などのずれのない正確な計測画像を得ることができる。
【００２２】
本発明にいて用いる磁気共鳴法は一般的な磁気共鳴法であり、測定対象物に外部から電磁波又は振動磁場を加えると、特定の周波数に対して一種の共鳴を起こして電磁波が強く吸収される現象（磁気共鳴）を利用して、共鳴吸収の起こる周波数や吸収の波形から物質内部の電子や原子核の状態を測定する方法である。このような磁気共鳴法の具体例としては、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）法、オーバーハウザーＭＲＩ（ＯＭＲＩ）法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、電子スピン共鳴（ＥＰＲ）法、等を挙げることができる。前記各種磁気共鳴法の測定条件は、それぞれの測定法に一般的に用いられる条件の範囲で適宜選択することができる。
【００２３】
係る磁気共鳴法による画像化のための装置としては、例えば国際公開公報ＷＯ  ２０１０／１１０３８４号に開示されている装置、すなわち、「計測対象物の磁気共鳴を励起させるための磁場を発生させる磁場発生手段と、計測対象物または磁場発生手段を移動させることにより計測対象物を磁場発生手段の磁場中を移動させる移動手段と、移動手段による移動中に停止することなく、計測対象物の磁場発生手段に対する移動方向ｙおよびこの移動方向ｙに対して直交する方向ｘのいずれか一方または両方に傾斜磁場を掛けて位相エンコードおよび周波数エンコードのいずれか一方または両方により、計測対象物中の計測画像信号を得る計測手段と、計測画像信号に対し、ｙ方向の移動の影響を補正した補正画像信号を得る補正手段と、を有する装置」を用いることができる。
【００２４】
ここで、前記磁場発生手段は、所定の大きさを発生させる第１の磁場発生手段と、この第１の磁場発生手段の磁場とは異なる大きさの磁場を発生させる第２の磁場発生手段とを有するものであり、前記移動手段は、計測対象物または前記第１および第２の磁場発生手段を移動させることにより、計測対象物を第１および第２の磁場発生手段の磁場中を順に移動させるものであってもよい。
【００２５】
また、前記移動手段は、計測対象物または第１および第２の磁場発生手段を回転移動させることにより、計測対象物を第１および第２の磁場発生手段の磁場中を順に通過させる回転移動手段であってもよい。
【００２６】
このように磁場発生手段を移動する計測対象物に適用することで生体内因性分子の情報を得ることができる。ここで、例えば、レドックス動態画像を得るためには、第１または第２の磁場発生手段の一方は核磁気共鳴を励起して計測するためのものであり、他方は電子スピン共鳴を励起して計測するためのものであってもよい。これにより、ずれのない正確な生体レドックス動態画像を得ることができる。
【００２７】
なお、第１および第２の磁場発生手段は、どちらが大きい磁場を発生させるものであっても良いが、第２の磁場発生手段が第１の磁場発生手段の磁場よりも大きい磁場を発生させるものである場合、例えば低磁場である第１の磁場発生手段をＯＭＲＩの電子スピン励起装置として用い、高磁場である第２の磁場発生手段をＭＲＩおよびＯＭＲＩの外部磁場発生装置として用いることもできる。これにより、第２の磁場発生手段ではＭＲＩ画像およびＯＭＲＩ画像が得られる。
【００２８】
一方、第１の磁場発生手段が第２の磁場発生手段の磁場よりも大きい磁場を発生させるものである場合は、例えば高磁場である第１の磁場発生手段をＭＲＩの外部磁場発生装置として用い、低磁場である第２の磁場発生手段をＯＭＲＩの外部磁場発生装置として用いることもできる。これにより、第１の磁場発生手段ではＭＲＩ画像が得られ、第２の磁場発生手段ではＯＭＲＩ画像が得られる。
【００２９】
前記得られた生体内因性分子の情報を処理して画像化情報を得る工程では、前記得られた生体内因性分子の情報（計測結果）に対し、計測対象物の移動の影響が補正されて補正画像信号が得られる。係る補正信号（画像化情報）は、計測画像信号をＳ（ｋｘ，ｋｙ）、補正画像信号（画像化情報）をＳ’（ｋｘ，ｋｙ）としたとき、式
2011052760.tif 000003
（但し、ｋｘ、ｋｙはｘ方向およびｙ方向の空間周波数、γは磁気回転比、Ｇｙ（ｎ）はｎ回目の計測における位相エンコードまたは周波数エンコードの傾斜磁場強度、ｖｙはｙ方向の移動速度、Δｔｙyは位相エンコードまたは周波数エンコードの印加時間、ｔｙ０は位相エンコードまたは周波数エンコードの印加までの時間である。）によって得られるものであってもよい。
【００３０】
また、計測画像信号をＳ（ｋｘ，ｋｙ，ｋｚ）、補正画像信号（画像化情報）をＳ’（ｋｘ，ｋｙ，ｋｚ）としたとき、式
2011052760.tif 000004
（但し、ｋｘ、ｋｙ、ｋｚはｘ方向、ｙ方向およびｚ方向の空間周波数、γは磁気回転比、Ｇｙ（ｎ）はｎ回目の計測における位相エンコードまたは周波数エンコードの傾斜磁場強度、ｖｙはｙ方向の移動速度、Δｔｙは位相エンコードまたは周波数エンコードの印加時間、ｔｙ０は位相エンコードまたは周波数エンコードの印加までの時間である。）によって得られるものであってもよい。
【００３１】
前記得られた画像化情報はモニター等の表示部に表示され、これにより生体内因性分子そのものや生体内因性分子が関与する反応をリアルタイムで観測することが可能となる。
【００３２】
次に、本発明の効果に関して実施例を示して説明する。しかし、本発明は以下に記載された実施例に限定されるものではなく、発明の要旨を変更しない範囲で様々な変更及び修飾等されたものも本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。
【００３３】
［実施例１］
ファントム実験
各チューブ（内径４．７ｍｍ）に、０、０．５、１、２、４、６、８ｍＭユビキノン水溶液（ｐＨ１１．８）（図３ａ参照）を含む、７本のチューブからなるファントムを使用した。ユビキノン／ＮＡＤＨファントム実験では、両試薬はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中に溶解している。ユビキノン溶液（終濃度１０ｍＭ）中にＮＡＤＨ溶液（終濃度５０ｍＭ）を加え、ＯＭＲＩイメージングを行った。結果を図４に示す。
【００３４】
ＥＰＲサイクル中における過度な出力の集中を避けるため、フィールドサイクルモードで運転する特注のヒト全身用マグネット（直径７９ｃｍ、長さ１２５ｃｍ）（フィリップス研究所、ハンブルク）を用いてＯＭＲＩの実験を行った。ＥＰＲ  Ｂ０は８．１ｍＴ、ＮＭＲ  Ｂ０は１５ｍＴとした。マウス実験用の共鳴装置は６２５ｋＨｚに調整されており、帯域幅は８０ｋＨｚでＮＭＲ送信サドルコイル（直径２５ｃｍ、長さ２３ｃｍ）、受信ソレノイドコイル（直径２．５ｃｍ、長さ６０ｍｍ）からなる。また、最大送信出力は２５０Ｗ（ピーク）である。ＥＰＲでは、２２０．６ＭＨｚに調整されたサドルコイル（直径１３．５ｃｍ、長さ２３．５ｃｍ）とＮＭＲコイルが使用されている。最大送信出力は１００Ｗである。
【００３５】
ＭＲＩ用の標準的なグラディエントエコー型シーケンスを用いて、ＯＭＲＩの実験を行った。フェーズエンコーディングステップには、オーバーハウザー効果（過分極化）を引き起こすＦＰＲ飽和パルスが先行した。ある出力における６００ｍｓのＥＰＲパルスが、この実験に使用された。パルスシーケンスはＢ０フィールドから開始し８．１ｍＴとし、それはＥＰＲ照射に相当した。約２００ｍｓの間、ＥＰＲ照射（２２０．６ＭＨｚ）が続き、ラジオ周波数（ＲＦ）パルスと関連するフィールドグラディエントがオンになる前に、Ｂ０フィールドは１５ｍＴとなった。イメージは、そのシステムにより実行された標準ソフトウエアを使用してエコーから再構成され、ＤＩＣＯＭ形式（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）で保存された。ＯＭＲＩの一般的なスキャン条件は、ＴＥＰＲ×ＴＲ×ＴＥ＝６００ｍｓ×１２００ｍｓ×２５ｍｓ、Ｎｏ．  ｏｆ  ａｖｅｒａｇｅｓ＝１、６４ｐｈａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｓｔｅｐｓである。イメージングフィールド（ファントム２８ｍｍ、生体内４８ｍｍ）は、６４×６４サイズである。
【００３６】
［実施例２］
生体内ＯＭＲＩイメージング
Ｃ５７ＢＬ６マウス（雌、５週齢）は、日本エスエルシー株式会社（浜松、日本）から購入し、実験前に１週間順応させた。マウスはケージ当たりに５匹で、温度および概日リズムを調整した室内で、不断給水・給餌で飼育し、実験時に６〜８週齢、体重は２０〜３０ｇだった。全ての手順および動物の取扱いは、九州大学薬学部動物実験倫理委員会により承認されており、九州大学薬学部動物実験ガイドラインに沿って実験を行った。
【００３７】
マウスは、ウレタン（２ｇ／ｋｇ）で麻酔し、胃側を下にして粘着性の皮膚用テープでホルダーに固定した。実験中のマウスの体温は３７±１℃だった。マウスを共鳴装置に移し、ＯＭＥＩ測定を開始した。下腹部領域のＯＭＲＩイメージングは、ｐＨ１１．８に調整した８ｍＭユビキノン水溶液（８００μＬ）を直腸投与し、その直後に行った。ＯＭＲＩの条件は以下の通りである。ＴＲ、１２００ｍｓ；ＴＥ、２５ｍｓ；ＴＥＰＲ、６００ｍｓ；ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｓｔｅｐｓ、６４；ＮＥＸ、４；ＦＯＶ、４８ｍｍ´４８ｍｍ；Ｍａｔｒｉｘ  ｓｉｚｅ、６４´６４(ｉｍｐｌａｎｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ０．７５ｍｍ)；ｓｌｉｃｅ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ、３０ｍｍ；ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ａｖｅｒａｇｅ、１、ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｔｉｍｅ、７９ｓ。ＯＭＲＩデータは、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（http://rsb.info.nih.gov/ij/）を使用し、解析を行った。
【００３８】
［実施例３］
フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のＯＭＲＩによる分子イメージング
体内電子伝達体であるフラビンアデニンジヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＦＡＤ）は、いくつかの代謝反応に必要な酸化還元反応の補因子である。ＦＡＤＨ２はエネルギーキャリアであり、還元された補酵素はミトコンドリアでの酸化的リン酸化の基質として使われる。係るＦＡＤをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し各濃度のＦＡＤ水溶液を調整した。そして、ＦＡＤの濃度に対して等濃度のＮＡＤＨ水溶液を添加した後、ＯＭＲＩにより画像化を行った。結果を図６に示す。
【００３９】
［実施例４］
マウスをイソフルラン麻酔下（２％）、大動脈結紮による右下肢虚血モデルを作成した。ＯＭＲＩ測定は虚血２４時間後に行った。対称肢には虚血肢と同様に手術を行ったが、結紮のみ行わなかった。５０ｍＭのユビキノン水溶液に１００ｍＭのＮＡＤＨを添加し、１０分後の混合液をマウス両肢に２００μＬ筋肉内投与しすぐにＯＭＲＩ測定を開始した。結果を図７に示す。
［結果］
図１ａに、ミトコンドリア呼吸鎖（複合体Ｉ）におけるユビキノンの酸化・還元スキームを示す。ユビキノンは、ＮＡＤＨから２つの電子を受け取り、そして電子スピン共鳴スペクトルが検出できるユビセミキノンラジカル形態を介し、ユビキノールに変換される。ユビキノンの酸化還元に関わるベンゾキノン誘導体部位はパラ型に酸素原子が付属しており、Ｃ２にはメチル基、Ｃ４、Ｃ５には酸素原子よりメチル基が付属している。Ｃ３にはイソプレン側鎖が付属しており、生体膜中に保持されるべく長い炭素鎖を形成している。構造は以下図の通りである。
2011052760.tif 000005
【００４０】
イソプレン側鎖の数（ｎ＝）は高等動物では１０、下等動物では６〜９であり、イソプレン側鎖が長くなればなるほど黄橙色を呈するようになる。なおｎ＝１０のユビキノンは「ＵＱ１０」と、イソプレン側鎖の数字を示し、化粧品材料として使用されているコエンザイムＱ１０とはイソプレン側鎖の数が１０ということになる。
【００４１】
図１ｂに示すユビセミキノンラジカルの電子スピン共鳴スペクトルは、１規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１１．８に調整した８ｍＭユビセミキノンにより産生された。前後に検出される電子スピン共鳴スペクトルは、内部標準である１ｍＭ  １５Ｎ−ＣＡＴ１より産生された。１５Ｎ−ＣＡＴ１は、１４Ｎ−ＣＡＴ１をベースに合成した。
【００４２】
図１ｃは、ユビセミキノンラジカルの動的核分極（ＤＮＰ）スペクトルを示す。これは、オーバーハウザー効果ＭＲＩ（ＯＭＲＩ）装置を用いて得られた。掃引幅（Ｓｗｅｅｐ  ｗｉｄｔｈ）は、１．６ｍＴで１００ステップのスキャニングを行った（０．０１６ｍＴ／スキャン）。使用したＯＭＲＩ装置の電子スピン共鳴照射磁場は７．８８７ｍＴとした。電子スピン共鳴並びにオーバーハウザー効果ＭＲＩの条件は以下の通りである。ＥＰＲ：マイクロ波強度１ｍＷ、変調磁場周波数１００ｋＨｚ、変調磁場振幅０．００２ｍＴ、照射時間０．０３秒、掃引幅５ｍＴ、ＯＭＲＩ：ＴＲ（繰り返し時間）１２００ｍｓ、ＴＥ（エコー時間）２５ｍｓ、ＴＥＰＲ  ６００ｍｓ。
【００４３】
ユビセミキノンラジカル産生における濃度及びｐＨ依存性を、図２に示す。図２ａは、濃度依存性（左）と電子スピン共鳴スペクトル（右）を示しており、これは１規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１１．８に調整した８ｍＭユビキノンを用いて測定した。ユビキノン濃度は、１、２、４、８、１２及び２０ｍＭMに設定した。全ての測定は、要事調整した水溶液を用いて３回繰り返しにて行った。ユビキノン濃度の増加と比例しユビセミキノンが産生され、濃度依存的な反応であることが示されている。
【００４４】
図２ｂは、ｐＨ依存性の分散プロット図である。１規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを９．８４、１０．８、１１．０、１１．２、１１．５、１２．２に調整した８ｍＭユビキノンから産生されるユビセミキノンの濃度が示されている（左図）。また、各ｐＨに調整した後、Ｘバンド電子スピン共鳴測定を１０分間実施した結果（右図）、最大シグナル強度は、ｐＨ１１．８に調整されたユビキノン水溶液で得られた。しかしながら、ｐＨ１０．８以下の条件下では、電子スピン共鳴シグナルは得られなかった。ＥＰＲ測定の条件は、マイクロ波強度１ｍＷ、変調磁場周波数１００ｋＨｚ、変調磁場振幅０．００２ｍＴ、照射時間０．０３秒、掃引幅５ｍＴである。
【００４５】
図３に、ＯＭＲＩを用いたユビセミキノンラジカルのインビトロ分子イメージングの結果を示す。図３ａは、疑似試料の構成図を示す。数値は、１規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１１．８に調整したユビキノンラジカルの濃度を示している（０．５、１、２、４、６、８ｍＭ）。各ユビキノンラジカル水溶液はガラスチューブ（直径４ｍｍ、高さ３０ｍｍ）に注入され測定を行った。
【００４６】
図３ｂは、ＥＰＲ照射を行った場合（Ｈｙｐｅｒｐｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ＯＮ）、図３ｃはＥＰＲ照射を行っていない場合（Ｈｙｐｅｒｐｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ＯＦＦ）における疑似試料のＯＭＲＩ画像を示している。ＥＰＲ照射がＯＦＦの条件では、ＯＭＲＩ画像の取得感度が低くかったが、ＥＰＲ照射を行い、核スピンを増強したＯＭＲＩイメージング法（ＥＰＲ照射ＯＮ）において、８ｍＭのユビキノンから産生されたユビセミキノンラジカル画像データを取得した。
【００４７】
図３ｄは、ＥＰＲ照射ＯＮの画像データとＯＦＦの画像データの差分画像データを示し、図３ＥはＥＰＲ照射の有無によるＳＮＲ信号強度の差を示している。以上の結果から、水溶液をアルカリ性に調整することで、ユビセミキノンラジカルの電子スピン共鳴スペクトル及びＯＭＲＩを用いた画像データを取得可能であることを証明した。さらに生体内のレドックス状態を解析するため、電子供与体を用いた測定系を構築した。
【００４８】
図４に、ＥＰＲ及びＯＭＲＩを用いたＣｏＱ／ＮＡＤＨシステムにおけるユビセミキノンラジカルのスペクトル分析及び分子イメージングの結果を示す。生体内のｐＨ条件の下、電子供与体であるＮＡＤＨを添加し産生させたユビセミキノンラジカルの電子スピン共鳴スペクトルとＯＭＲＩを用いてイメージングを行った。
【００４９】
図４ａは、ｐＨ７．４に調整したＰＢＳ中に溶解した１０ｍＭのコエンザイムＱ−０（Ｃｏ−Ｑ０；イソプレン側鎖の数がゼロ））、５０ｍＭのＮＡＤＨ、及び１０ｍＭのＣｏＱ−０と５０ｍＭのＮＡＤＨを混合物の電子スピン共鳴スペクトルを示している。また、図４ｂはユビセミキノンラジカルを擬似的に配置した図を示し、係るユビセミキノンラジカルに対して、電子スピン共鳴をさせたとき（Ｈｙｐｅｒｐｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ＯＮ）と共鳴させないとき（Ｈｙｐｅｒｐｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ＯＦＦ）のＯＭＲＩ画像がそれぞれ図４ｃ及び図４ｄである。さらに、図４ｅはＨｙｐｅｒｐｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ＯＮとＯＦＦの差分データにより得られたユビセミキノンフリーラジカルの画像データであり、これらの結果から、電子供与体であるＮＡＤＨを添加した条件において産生されたユビセミキノンラジカルの電子スピン共鳴スペクトルとＯＭＲＩを用いたイメージングが可能であることを証明した。
【００５０】
ユビセミキノンラジカルを野生型マウスの直腸に投与し、ＯＭＲＩを用いたインビボイメージングの性能を評価した結果を図５に示す。図５ａは、マウスの大腸と盲腸におけるユビセミキノンラジカルの代謝動態を示している。また、図５ｂはマウスのプロトンＭＲイメージ（生体画像データ）（Ｈｙｐｅｒｐｏｌｉｚａｔｉｏｎ−ＯＦＦ）を、図５ｃはプロトンＭＲイメージとユビセミキノンフリーラジカルイメージの融合画像データを、図５ｄはレドックスマップとＭＲＩイメージを、それぞれ示す。レドックスマップは、ユビセミキノンフリーラジカル画像データの１ピクセル当たりにおけるユビセミキノンフリーラジカル消失速度定数を計算した結果の片対数プロット図である。さらに、図５ｅは、盲腸におけるＯＭＲＩシグナルの経時変化とユビキノン水溶液の安定性に関する片対数プロット図である。
【００５１】
大腸と盲腸のＯＭＲＩイメージの強度は、ユビセミキノンフリーラジカルの消失によって徐々に減少することが示されている（ａ）。大腸と盲腸におけるＯＭＲＩイメージの強度は、ユビセミキノンフリーラジカルの消失に応じて徐々に減少したが、ユビキノン水溶液の強度は、２０分以上も安定であった。これらのデータは、生体内に投与されたユビキノン水溶液から体内でのレドックス反応によりユビセミキノンフリーラジカルが産生されその体内動態をイメージングしていることを示している。
【００５２】
図６にフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のＯＭＲＩによる分子イメージングの結果を示す。ＦＡＤのＥＳＲスペクトルの中心磁場をＯＭＲＩの電子スピン励起磁場として照射し、ＦＡＤセミキノンラジカルのＯＭＲＩ画像を得た。１０ｍＭ〜１００ｍＭのＦＡＤ水溶液を調整し、同様に等モルのＮＡＤＨを添加しＥＳＲで定量を行った結果、図６Ｂに示すようにＦＡＤの濃度依存的にセミキノンラジカルが生成することが明らかとなった。ＦＡＤは生体内における様々な臓器において電子伝達体として機能していることから、ＦＡＤを生体プローブとして使用することで生体内因性分子を用いたレドックスの可視化が可能となる。
【００５３】
図７に閉塞性動脈硬化症の動物モデルであるマウス下肢虚血モデルのユビセミキノンプローブを用いた解析結果を示す。図７に示されるように、ユビキノンプローブ投与後にマウス両肢においてユビセミキノンラジカル分布画像を得た。虚血肢における画像強度は対称肢に比べ高かった。それぞれの画像強度の領域を関心領域として選定し、強度の変化をプロットすると虚血肢におけるプローブの消失は対称肢に比べ有意に遅かった。これは虚血による筋組織の障害によりユビキノンプローブのラジカル消失能が有意に低下したことを表している。これらの結果から、本プローブは生体組織のレドックス機能障害をモニターできることを示している。
【図１】
2011052760.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月20日(2012.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内因性分子の酸化及び／又は還元反応をリアルタイムで検出するための方法であって、
測定対象となる生体に磁気共鳴法を適用して生体内因性分子の情報を得る工程と、
前記得られた生体内因性分子の情報を処理して画像化情報を得る工程と、
前記得られた画像化情報を表示する工程と、
を含み、前記生体内因性分子の情報を得る工程は、前記測定対象又は前記測定対象となる生体から得られたサンプル中におけるユビキノン、フラビンアデニンジヌクレオチド、ビタミンＫ、又はアスコルビン酸の情報を得るものであり、前記測定対象又は前記サンプルは、電子供与体と前記生体内因性分子との混合物が予め投与されているものである、検出方法。
【請求項２】
前記電子供与体はＮＡＤＨである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記磁気共鳴法がオーバーハウザーＭＲＩ法または電子スピン共鳴法のいずれかである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
生体内因性分子は生体外から生体内に取り込まれるものである、請求項１に記載の検出方法。
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月2日(2012.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内因性分子の酸化及び／又は還元反応をリアルタイムで検出するための方法であって、
測定対象となる生体に磁気共鳴法を適用して生体内因性分子の情報を得る工程と、
前記得られた生体内因性分子の情報を処理して画像化情報を得る工程と、
前記得られた画像化情報を表示する工程と、
を含み、前記生体内因性分子の情報を得る工程は、前記測定対象又は前記測定対象となる生体から得られたサンプル中におけるユビキノン、フラビンアデニンジヌクレオチド、ビタミンＫ、又はアスコルビン酸の情報を得るものであり、前記測定対象又は前記サンプルは、電子供与体と前記生体内因性分子とが予め投与されているものである、検出方法。
【請求項２】
前記電子供与体はＮＡＤＨである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記磁気共鳴法がオーバーハウザーＭＲＩ法または電子スピン共鳴法のいずれかである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
生体内因性分子は生体外から生体内に取り込まれるものである、請求項１に記載の検出方法。
【国際調査報告】
2011052760.tif 000013
2011052760.tif 000014