(57)【要約】  本発明は、抗ＨＳＰ９０抗体及びその用途に関し、より具体的には、細胞表面ＨＳＰ９０を認識可能な抗ＨＳＰ９０抗体、該抗体を使用するワクチン、該抗体を使用する薬剤、該抗体を含むアジュバント、及び該抗体を使用する細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞の検出方法等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＶＸ1Ｘ2ＥＸ3ＰＰＬＥＧＤＸ4（Ｘ1〜Ｘ4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す）（配列番号：１）、又はアミノ酸配列ＨＸ5ＩＸ6ＥＴＬＲＱＫＡＥ（Ｘ5〜Ｘ6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す）（配列番号：２）のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むエピトープと結合し、且つ細胞表面ＨＳＰ９０を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列中、Ｘ2がＥ又はＤである請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列中、Ｘ4がＥ又はＤである請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列中、Ｘ6がＩ又はＶである請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
該エピトープが、
(1)Ｘ1がＴであり、Ｘ2がＥであり、Ｘ3がＭであり、及びＸ4がＤである配列番号１のアミノ酸配列、
(2)Ｘ1がＰであり、Ｘ2がＤであり、Ｘ3がＩであり、及びＸ4がＥである配列番号１のアミノ酸配列、
(3)Ｘ5がＳであり、及びＸ6がＩである配列番号２のアミノ酸配列、又は
(4)Ｘ5がＰであり、及びＸ6がＶである配列番号２のアミノ酸配列
を含むエピトープである、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
細胞が、抗原提示細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
抗原提示細胞が、活性化樹状細胞、マクロファージ又はモノサイト（単核球）である、請求項６記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
細胞が、腫瘍細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
腫瘍細胞が、ヒト由来である、請求項８記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２２２又はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４３であるハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項１０記載のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同一のエピトープと結合し、且つ細胞表面Ｈｓｐ９０を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項１０記載のハイブリドーマによって産生される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
重鎖ＣＤＲ１（配列番号１０の６６〜７０位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ２（配列番号１０の８５〜１０１位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ３（配列番号１０の１３４〜１４１位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ1（配列番号１２の４３〜５８位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ２（配列番号１２の７４〜８０位で表わされるアミノ酸配列）、及びＣＤＲ３（配列番号１２の１１３〜１２１位で表わされるアミノ酸配列）のいずれか１つを少なくとも含む、細胞表面ＨＳＰ９０を認識する抗体。
【請求項１４】
配列番号１０の３６〜１８５位で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１２の２０〜１７７位で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、細胞表面ＨＳＰ９０を認識する抗体。
【請求項１５】
アミノ酸配列ＶＸ1Ｘ2ＥＸ3ＰＰＬＥＧＤＸ4（Ｘ1〜Ｘ4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す）（配列番号：１）、又はアミノ酸配列ＨＸ5ＩＸ6ＥＴＬＲＱＫＡＥ（Ｘ5〜Ｘ6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す）（配列番号：２）のいずれかから選択されるアミノ酸配列をエピトープとして含む免疫原ポリペプチドを動物に投与する工程を含む、細胞表面ＨＳＰ９０を認識するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１６】
重鎖ＣＤＲ１（配列番号１０の６６〜７０位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ２（配列番号１０の８５〜１０１位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ３（配列番号１０の１３４〜１４１位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ1（配列番号１２の４３〜５８位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ２（配列番号１２の７４〜８０位で表わされるアミノ酸配列）、及びＣＤＲ３（配列番号１２の１１３〜１２１位で表わされるアミノ酸配列）のいずれか１つを少なくとも含むようにポリペプチドを調製する工程を含む、細胞表面ＨＳＰ９０を認識する抗体の製造方法。
【請求項１７】
細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体と標的抗原との複合体を含むワクチン。
【請求項１８】
細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体が、請求項１〜９、及び１１〜１４のいずれか１項に記載の抗体である、請求項１７記載のワクチン。
【請求項１９】
標的抗原が病原体抗原又は腫瘍抗原である、請求項１７又は１８記載のワクチン。
【請求項２０】
細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体と標的抗原との複合体を形成させる工程を含む、ワクチンの製造方法。
【請求項２１】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のワクチンの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
【請求項２２】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のワクチンの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療または予防方法。
【請求項２３】
細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体と生物学的活性を有する物質との複合体を含む薬剤。
【請求項２４】
細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体が、請求項１〜９、及び１１〜１４のいずれか１項に記載の抗体である、請求項２３記載の薬剤。
【請求項２５】
生物学的活性を有する物質が核酸分子である、請求項２３又は２４記載の薬剤。
【請求項２６】
該核酸分子がｓｉＲＮＡである、請求項２５記載の薬剤。
【請求項２７】
生物学的活性を有する物質が抗癌剤である、請求項２３又は２４記載の薬剤。
【請求項２８】
請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の薬剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
【請求項２９】
細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを含むアジュバント。
【請求項３０】
細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体が請求項１〜９、及び１１〜１４のいずれか１項に記載の抗体である、請求項２９記載のアジュバント。
【請求項３１】
細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体が、配列番号３のアミノ酸配列（ＶＴＥＥＭＰＰＬＥＧＤＤ）をエピトープとして認識するものである、請求項２９に記載のアジュバント。
【請求項３２】
細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体の抗原結合部位が、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２２２であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の抗原結合部位中の軽鎖可変領域を含んでなる、請求項２９に記載のアジュバント。
【請求項３３】
細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを医薬上許容可能な賦形剤又は添加剤と混合する工程を含む、アジュバントの製造方法。
【請求項３４】
Ｆｃレセプターへの結合を介して抗原提示細胞に取り込まれるワクチンと請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
【請求項３５】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項３４記載の免疫誘導方法。
【請求項３６】
ワクチンが請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のワクチンである、請求項３４に記載の免疫誘導方法。
【請求項３７】
ワクチンが、標的抗原と抗体との複合体を含む、請求項３４記載の免疫誘導方法。
【請求項３８】
標的抗原が病原体抗原又は腫瘍抗原である、請求項３７記載の免疫誘導方法。
【請求項３９】
Ｆｃレセプターへの結合を介して抗原提示細胞に取り込まれるワクチンの有効量と請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のアジュバントの有効量とをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
【請求項４０】
抗腫瘍抗原抗体と請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
【請求項４１】
抗腫瘍細胞抗体と請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
【請求項４２】
抗癌剤と請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
【請求項４３】
抗腫瘍抗原抗体の有効量と請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のアジュバントの有効量とをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体及びその用途に関し、より具体的には、細胞表面ＨＳＰ９０を認識可能な抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体、該抗体を使用する細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞の検出方法、該抗体を使用するワクチン、該抗体を使用する薬剤、及び該抗体を含むアジュバント等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）は、その発現レベルが熱等の多種のストレスによって上昇する主要なシャペロン分子であり、新たに合成されるタンパク質のフォールディング、損傷タンパク質の凝集防止、不可逆的に損傷を受けたタンパク質のプロテアソーム依存性分解の促進、クライアントタンパク質及びペプチドのオルガネラ間及び／又はタンパク質間輸送、において中心的な役割を果たす。ＨＳＰ９０は、最も存在量の多いシャペロンタンパク質のひとつであり、細胞内の全タンパク質量の１％近くを占め、主に細胞質中に存在する（非特許文献１及び２）。【０００３】
しかし近年、癌細胞において、細胞表面にＨＳＰ９０が存在し、癌細胞の浸潤又は転移においてメディエーターとして関与することが見出されている（非特許文献３及び４）。また、ＨＳＰ９０は神経細胞の表面にも発現しており、発生過程における細胞移動に関与する（非特許文献５）。ＨＳＰ９０αは、ＴＧＦα刺激を受けたヒト角化細胞から分泌され、ＬＲＰ１と相互作用することにより、これらの細胞の運動性に関与する（非特許文献６及び７）。これらの結果は、ＨＳＰ９０が細胞表面に存在するときには、細胞移動及び浸潤につながる新規の経路に関与するという、ＨＳＰ９０の追加的役割を示唆する。【０００４】
一方、これまで樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージ、すなわち抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の細胞表面ＨＳＰ９０を検出することのできる適切なモノクローナル抗体が存在しなかったため、細胞表面のＨＳＰ９０を同定することは困難であった。既存の抗ＨＳＰ９０抗体はいずれも、細胞内のＨＳＰ９０は良好に認識するものの、細胞膜上のＨＳＰ９０との反応性が低い。そのため、細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞をフローサイトメトリー等の種々の分析方法で検出することは、これまで不可能であった。【０００５】
ＤＣにおいては、細胞外からの抗原がプロテアソームによって分解され、ＭＨＣクラスＩ分子と結合して細胞表面に提示されること、すなわちクロスプレゼンテーションが起こることが知られている。クロスプレゼンテーションに関しては、ＨＳＰ９０−ペプチド複合体の効果が実証されており、アジュバントを使用せずにＣＤ８+Ｔ細胞を刺激することができる（非特許文献８及び９）。しかしＣＤ８+Ｔ細胞の刺激には、大量のＨＳＰ９０−ペプチド複合体が必要であるため、効率良くＣＤ８+Ｔ細胞を刺激することのできる手段が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lindquist S. Annu Rev Biochem. 1986;55:1151-1191.
【非特許文献２】Morimoto RI, Santoro MG. Nat Biotechnol. 1998;16:833-838.
【非特許文献３】Sidera K, Gaitanou M, Stellas D, Matsas R, Patsavoudi E. J Biol Chem. 2008;283:2031-2041.
【非特許文献４】Tsutsumi S, Scroggins B, Koga F, et al. Oncogene. 2008;27:2478-2487.
【非特許文献５】Sidera K, Samiotaki M, Yfanti E, Panayotou G, Patsavoudi E. J Biol Chem. 2004;279:45379-45388.
【非特許文献６】Cheng CF, Fan J, Fedesco M, et al. Mol Cell Biol. 2008;28:3344-3358.
【非特許文献７】Woodley DT, Fan J, Cheng CF, et al. J Cell Sci. 2009;122:1495-1498.
【非特許文献８】Binder RJ, Srivastava PK. Nat Immunol. 2005;6:593-599.
【非特許文献９】Kurotaki T, Tamura Y, Ueda G, et al. J Immunol. 2007;179:1803-1813.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、新規な抗ＨＳＰ９０抗体及びその用途を提供することであり、より具体的には、細胞表面に発現しているＨＳＰ９０を認識することができるモノクローナル抗体の提供、該抗体を用いた細胞の同定方法、該抗体と抗原からなるワクチン、該抗体を使用する薬剤、さらにはアジュバントとしての用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、細胞表面上に発現したＨＳＰ９０を高感度で認識可能な新規抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体を得て、さらにＨＳＰ９０上の重複するアミノ酸配列を有するペプチドからなるライブラリーを使用してエピトープマッピングを行い、該抗体のエピトープを同定することに成功した。【０００９】
また本発明者らは、該抗体が、細胞表面ＨＳＰ９０発現細胞上（例えば抗原提示細胞等）の細胞表面ＨＳＰ９０に結合することによって、細胞表面ＨＳＰ９０の急速な内部移行が誘導され、同時に該抗体も細胞内に移行することを見出した。さらに、本発明者らは、該抗体に連結させた抗原が、抗原提示細胞内に移行した後、ＭＨＣクラスＩ抗原提示経路へと送達され、その結果ＣＤ８+Ｔ細胞が活性化されることを見出した。さらに、該抗体が、Ｆｃレセプターを介した抗原提示機構を増強するアジュバント効果を有することを見出した。以上の知見を得て、本発明者らは本発明を完成させるに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
［１］アミノ酸配列ＶＸ1Ｘ2ＥＸ3ＰＰＬＥＧＤＸ4（Ｘ1〜Ｘ4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す）（配列番号：１）、又はアミノ酸配列ＨＸ5ＩＸ6ＥＴＬＲＱＫＡＥ（Ｘ5〜Ｘ6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す）（配列番号：２）のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むエピトープと結合し、且つ細胞表面ＨＳＰ９０を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
［２］配列番号１のアミノ酸配列中、Ｘ2がＥ又はＤである［１］に記載のモノクローナル抗体。
［３］配列番号１のアミノ酸配列中、Ｘ4がＥ又はＤである［１］に記載のモノクローナル抗体。
［４］配列番号２のアミノ酸配列中、Ｘ6がＩ又はＶである［１］に記載のモノクローナル抗体。
［５］該エピトープが、
(1)Ｘ1がＴであり、Ｘ2がＥであり、Ｘ3がＭであり、及びＸ4がＤである配列番号１のアミノ酸配列、
(2)Ｘ1がＰであり、Ｘ2がＤであり、Ｘ3がＩであり、及びＸ4がＥである配列番号１のアミノ酸配列、
(3)Ｘ5がＳであり、及びＸ6がＩである配列番号２のアミノ酸配列、又は
(4)Ｘ5がＰであり、及びＸ6がＶである配列番号２のアミノ酸配列
を含むエピトープである、［１］に記載のモノクローナル抗体。
［６］細胞が、抗原提示細胞である、［１］〜［５］のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
［７］抗原提示細胞が、活性化樹状細胞、マクロファージ又はモノサイト（単核球）である、［６］に記載のモノクローナル抗体。
［８］細胞が、腫瘍細胞である、［１］〜［５］のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
［９］腫瘍細胞が、ヒト由来である、［８］に記載のモノクローナル抗体。
［１０］受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２２２又はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２４３であるハイブリドーマ。
［１１］［１０］記載のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同一のエピトープと結合し、且つ細胞表面ＨＳＰ９０を認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
［１２］［１０］に記載のハイブリドーマによって産生される、［１］〜［９］のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
［１３］重鎖ＣＤＲ１（配列番号１０の６６〜７０位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ２（配列番号１０の８５〜１０１位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ３（配列番号１０の１３４〜１４１位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ1（配列番号１２の４３〜５８位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ２（配列番号１２の７４〜８０位で表わされるアミノ酸配列）、及びＣＤＲ３（配列番号１２の１１３〜１２１位で表わされるアミノ酸配列）のいずれか１つを少なくとも含む、細胞表面ＨＳＰ９０を認識する抗体。
［１４］配列番号１０の３６〜１８５位で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１２の２０〜１７７位で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、細胞表面ＨＳＰ９０を認識する抗体。
［１５］アミノ酸配列ＶＸ1Ｘ2ＥＸ3ＰＰＬＥＧＤＸ4（Ｘ1〜Ｘ4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す）（配列番号：１）、又はアミノ酸配列ＨＸ5ＩＸ6ＥＴＬＲＱＫＡＥ（Ｘ5〜Ｘ6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す）（配列番号：２）のいずれかから選択されるアミノ酸配列をエピトープとして含む免疫原ポリペプチドを動物に投与する工程を含む、細胞表面ＨＳＰ９０を認識するモノクローナル抗体の製造方法。
［１６］重鎖ＣＤＲ１（配列番号１０の６６〜７０位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ２（配列番号１０の８５〜１０１位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ３（配列番号１０の１３４〜１４１位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ1（配列番号１２の４３〜５８位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ２（配列番号１２の７４〜８０位で表わされるアミノ酸配列）、及びＣＤＲ３（配列番号１２の１１３〜１２１位で表わされるアミノ酸配列）のいずれか１つを少なくとも含むようにポリペプチドを調製する工程を含む、細胞表面ＨＳＰ９０を認識する抗体の製造方法。
［１７］細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体と標的抗原との複合体を含むワクチン。
［１８］細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体が、［１］〜［９］、及び［１１］〜［１４］のいずれかに記載の抗体である、［１７］に記載のワクチン。
［１９］標的抗原が病原体抗原又は腫瘍抗原である、［１７］又は［１８］に記載のワクチン。
［２０］細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体と標的抗原との複合体を形成させる工程を含む、ワクチンの製造方法。
［２１］［１７］〜［１９］のいずれかに記載のワクチンの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
［２２］［１７］〜［１９］のいずれかに記載のワクチンの有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
［２３］細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体と生物学的活性を有する物質との複合体を含む薬剤。
［２４］細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体が、［１］〜［９］、及び［１１］〜［１４］のいずれかに記載の抗体である、［２３］に記載の薬剤。
［２５］生物学的活性を有する物質が核酸分子である、［２３］又は［２４］に記載の薬剤。
［２６］該核酸分子がｓｉＲＮＡである、［２５］に記載の薬剤。
［２７］生物学的活性を有する物質が抗癌剤である、［２３］又は［２４］に記載の薬剤。
［２８］［２３］〜［２７］のいずれかに記載の薬剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
［２９］細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを含むアジュバント。
［３０］細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体が［１］〜［９］、及び［１１］〜［１４］のいずれかに記載の抗体である、［２９］に記載のアジュバント。
［３１］細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体が、配列番号３のアミノ酸配列（ＶＴＥＥＭＰＰＬＥＧＤＤ）をエピトープとして認識するものである、［２９］に記載のアジュバント。
［３２］細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体の抗原結合部位が、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２２２であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の抗原結合部位中の軽鎖可変領域を含んでなる、［２９］に記載のアジュバント。
［３３］細胞表面上のＨＳＰ９０を認識する抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを医薬上許容可能な賦形剤又は添加剤と混合する工程を含む、アジュバントの製造方法。
［３４］Ｆｃレセプターへの結合を介して抗原提示細胞に取り込まれるワクチンと［２９］〜［３２］のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
［３５］抗原提示細胞が樹状細胞である、［３４］記載の免疫誘導方法。
［３６］ワクチンが、［１７］〜［１９］のいずれかに記載のワクチンである、［３４］に記載の免疫誘導方法。
［３７］ワクチンが、標的抗原と抗体との複合体を含む、［３４］に記載の免疫誘導方法。
［３８］標的抗原が病原体抗原又は腫瘍抗原である、［３７］に記載の免疫誘導方法。
［３９］Ｆｃレセプターへの結合を介して抗原提示細胞に取り込まれるワクチンの有効量と［２９］〜［３２］のいずれかに記載のアジュバントの有効量とをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
［４０］抗腫瘍抗原抗体と［２９］〜［３２］のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
［４１］抗腫瘍細胞抗体と［２９］〜［３２］のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
［４２］抗癌剤と［２９］〜［３２］のいずれかに記載のアジュバントとをそれを必要とする対象に投与する工程を含む、免疫誘導方法。
［４３］抗腫瘍抗原抗体の有効量と［２９］〜［３２］のいずれかに記載のアジュバントの有効量とを対象に投与する工程を含む、疾患の治療又は予防方法。
［４４］(i)［１］〜［９］、及び［１１］〜［１４］のいずれかに記載の抗体を、透過処理していない細胞に反応させる工程、及び、
(ii)該抗体と細胞膜上に発現しているＨＳＰ９０との複合体形成の有無を評価する工程、
を含む、細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞の検出方法。
［４５］複合体形成の有無を評価する工程において、フローサイトメーターを使用することを特徴とする、［４４］に記載の方法。
［４６］細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞が抗原提示細胞である［４４］に記載の方法。
［４７］抗原提示細胞が、活性化樹状細胞、マクロファージ又はモノサイト（単核球）である、［４６］に記載の方法。
［４８］細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞が、腫瘍細胞である、［４４］に記載の方法。
［４９］腫瘍細胞が、ヒト由来である、［４８］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の抗ＨＳＰ９０抗体は、細胞表面ＨＳＰ９０を高感度に認識可能であり、したがって、該抗体はＦＡＣＳ解析において、生細胞の細胞表面ＨＳＰ９０を検出し得る。本発明の抗体は、細胞表面ＨＳＰ９０を高感度かつ特異的に認識することができるため、例えば、本発明のワクチンの調製、生物学的活性を有する物質の送達、及びワクチン、腫瘍抗原抗体、抗腫瘍細胞抗体の機能を増強するアジュバント、細胞表面ＨＳＰ９０発現細胞の特異的な検出方法等において使用することができる。【００１２】
本発明によって提供される抗ＨＳＰ９０抗体と抗原からなるワクチンは、抗原提示細胞、特に活性化された樹状細胞にのみ抗原を送達することができる。また、少ない抗原量で効率よくＴ細胞を活性化することができるため、抗原を適切に選択することによって、種々の疾患の治療に用いることが可能である。【００１３】
本発明によって提供される抗ＨＳＰ９０抗体は細胞表面のＨＳＰ９０を特異的に認識し、結合後速やかに細胞内に移行するため、生物学的活性を有する物質を細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞に効率的に送達することが可能である。【００１４】
本発明によって提供されるアジュバントは、細胞表面のＨＳＰ９０およびＦｃＲγからなる複合体への結合を介して、Ｆｃレセプターとの結合により起こる樹状細胞等の抗原提示機構を増強することができる。例えば、ワクチンと併用することにより、当該ワクチンの使用量を減らし、潜在的な副作用のリスクを低減させることができる。【００１５】
さらに、本発明によれば、従来検出され得なかった細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞を生細胞の状態で検出できるため、例えば抗原提示細胞の検出、単離、分析等に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａはモノクローナル抗体によるウエスタンブロット解析の結果を示す。ＤＣ２．４樹状細胞株抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開の後、示された抗体でブロットした。いずれのモノクローナル抗体も単一なバンドとしてＨＳＰ９０を検出する。図１Ｂは、モノクローナル抗体を使用した細胞表面ＨＳＰ９０のＦＡＣＳ解析の結果を示す。図１Ｂは、ＰＥ−ｃｙ５ストレプトアビジン及び各ビオチン化抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体を使用して染色したＤＣ２．４細胞のＦＡＣＳデータを示す。図１Ｃ及びＤは、６Ｈ８抗体を使用した抗原提示細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示す。
【図２】図２は、抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体のエピトープマッピングの結果を示す。図２Ａ及びＢは、ＨＳＰ９０α上の配列に対応するペプチドからなる合成ペプチドライブラリー中の各ペプチドを用いたＥＬＩＳＡアッセイの結果を相対値で示したもの（左パネル）、及び各抗体で染色したＤＣ２．４細胞についてのＦＡＣＳデータ（ヒストグラム、右パネル）を示す。図２Ｃには、エピトープマッピングの結果をまとめて図示する。
【図３】図３は、６Ｈ８抗体による細胞表面ＨＳＰ９０の免疫沈降の結果を示す。図３Ａは、細胞表面をビオチン化したＤＣ２．４細胞から調製した膜画分中の、ビオチン化ＨＳＰ９０の検出を示す。細胞膜画分から２Ａ６Ｅ９抗体により免疫沈降されるＨＳＰ９０（レーン６Ｂ）が、ビオチン化されている事を示す（レーンＡｖｉ．）。図３Ｂは、６Ｈ８抗体により免疫沈降される細胞表面のＨＳＰ９０α及びβの検出を示す。
【図４】図４は、６Ｈ８抗体によるＤＣ２．４細胞における細胞表面ＨＳＰ９０の内部移行を実証する。図４Ａは、ＯＶＡ（ｉ）並びにＨＳＰ９０阻害剤であるラディシコール(ｉｉ)及びノボビオシン（ｉｉｉ）が、細胞表面ＨＳＰ９０の存在状態に影響しないことを示す。図４Ｂは、ＤＣ２．４細胞上の細胞表面ＨＳＰ９０にビオチン化６Ｈ８抗体を４℃で結合させ、非結合抗体を洗浄除去後、温度を３７℃に上げて経時的（０、１０、２０、３０、６０分）に４℃に戻しＰＥ−Ｃｙ５−ストレプトアビジンで標識を行い、細胞表面上に存在する６Ｈ８抗体を経時的に検出、定量した結果を示す。図４Ｃは、図４Ｂにおける２０分時点でのＤＣ２．４細胞におけるＨＳＰ９０及びＨ−２Ｋbの局在を示す。図４Ｄは、ＤＣ２．４細胞におけるＨＳＰ９０及びＩ−Ａbの局在を示す。元々細胞膜表面に存在していたＨＳＰ９０のほとんどが細胞内に入り込んでいる一方、Ｈ−２Ｋb又はＩ−Ａbは細胞表面に存在したままである。
【図５】図５は、細胞表面ＨＳＰ９０の発現レベルに対するサイトカインの影響を示す。図５Ａ及びＢは、ＤＣ２．４細胞及びマウスＢＭＤＣにおける、ＩＦＮα、β又はγ処理後の細胞表面ＨＳＰ９０の発現変化についてのＦＡＣＳ解析の結果を示す。図５Ｃは、ＢＭＤＣにおける、種々のサイトカイン処理後の細胞表面ＨＳＰ９０の発現変化についてのＦＡＣＳ解析の結果を示す。黒色棒：１００ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮα、β：５００Ｕ／ｍｌ、ＩＦＮγ：５０Ｕ／ｍｌ）；灰色棒：１０ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮα、β：１００Ｕ／ｍｌ、ＩＦＮγ：１０Ｕ／ｍｌ）
【図６】図６は、６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートを使用したクロスプレゼンテーションアッセイの結果を示す。図６Ａは、６Ｈ８抗体及びマレイミド化ＯＶＡの反応液のサイズ排除クロマトグラムを示す。図６Ｂは、各画分中の６Ｈ８抗体及びＯＶＡについてその存在の有無と分子量プロファイルを示す。図６Ｃは、各画分で処理したＤＣ２．４細胞による、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞のＩＦＮγ産生の誘導を示す。図６Ｄは、ＤＣ２．４及びＤＣ２．４Ｌ（細胞表面ＨＳＰ９０欠失変異株）細胞表面上のＨＳＰ９０の認識を示すＦＡＣＳ解析の結果を示す（左側パネル）。同時に６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートを反応させた後、抗ＯＶＡ抗体で染色した（右側パネル）。結果は予想通り、細胞表面ＨＳＰ９０欠失変異株ＤＣ２．４Lでは抗ＯＶＡ抗体では染色されない。図６Ｅは、６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートの濃度を希釈したもので、或はフリーＯＶＡ（フラクション３３）でＤＣ２．４を処理した場合の、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞及びＯＴ−II  ＣＤ4+Ｔ細胞のＩＦＮγ産生の誘導を示す。
【図７】図７は、インビトロのクロスプレゼンテーションアッセイにおける、６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートの有する免疫効果の、６Ｈ８抗体による阻害を示す。
【図８】図８Ａは、６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートによるインビボでのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖の誘導を示す。図８Ｂは、ＴＡＰ１欠損マウスを用いた場合の６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートによるインビボでのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖の欠落を示す。図８Ｃは、段階的用量の６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートによる、インビボでのＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞及びＯＴ−II  ＣＤ４+Ｔ細胞の増殖の誘導を示す。図８Ｄ及びＥは、６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートでマウスを免疫し、その脾臓細胞から細胞障害性Ｔ細胞の誘導を試みた結果を示す。
【図９】図９は、インビボにおける６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートによるＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖の誘導を、６Ｈ８抗体が増強することを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、マウスに投与したＡｌｅｘａ４８８標識６Ｈ８抗体が、脾臓においてＣＤ１１ｂ+モノサイトに集積することを示す。Ａｌｅｘａ４８８標識６Ｈ８抗体をＢ６マウスに投与し、３時間後に該マウスから脾臓を回収し、Collagenase処理した試料についてＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、Ｂ２２０の発現をＦＡＣＳにより解析した。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、マウスに投与したＡｌｅｘａ６４７標識６Ｈ８抗体が、脾臓において樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性）に集積することを示す。Ａｌｅｘａ６４７標識６Ｈ８抗体をＢ６マウスに投与し、３時間後に該マウスから脾臓を回収し、Collagenase処理した試料についてＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、Ｂ２２０の発現をＦＡＣＳにより解析し、標識６Ｈ８抗体の各種細胞への蓄積を比較した。図１０ＡのＲ２領域に相当する領域についての結果を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、マウスに投与したＡｌｅｘａ６４７標識６Ｈ８抗体が、脾臓においてＣＤ８α陽性樹状細胞に集積することを示す。図１０Ｂと同様に調製した試料（但し、Ａｌｅｘａ６４７標識６Ｈ８抗体の投与後、０時間、１．５時間、又は３時間で、脾臓を回収した）について、ＣＤ８の発現をＦＡＣＳにより解析し、標識６Ｈ８抗体の樹状細胞への蓄積を調べた。
【図１１】図１１は、６Ｈ８−ＯＶＡが、インビボにおいてＦｃレセプター依存性のクロスプレゼンテーションを促進することを示す。ＣＦＳＥラベルしたＯＴ−Ｉ／ＣＤ４５．１マウスのＣＤ８+Ｔ細胞を、被移植マウスに尾静脈より移入し、同時に６Ｈ８−ＯＶＡ（若しくは６Ｈ８（Ｆ（ａｂ’）2）−ＯＶＡ、又はＯＶＡ、又はＩｇＧ２ａ−ＯＶＡ）及びフリーの６Ｈ８抗体（若しくは６Ｈ８（Ｆ（ａｂ’）2）、又はＩｇＧ２ａ）（３０μｇ）を投与した。７２時間後にマウス脾臓を回収し、脾臓細胞をＰＥ−ＣＤ４５．１抗体で染色した後、ＣＤ４５．１陽性細胞（ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞）のＣＦＳＥ強度を測定した。
【図１２Ａ】図１２Ａは、６Ｈ８抗体がアジュバントとして機能するメカニズムを説明する図である。ワクチンとして抗原タンパク質をコンジュゲートしたＩｇＧ２ａを用いた場合を示す。当該ワクチンはＩｇＧ２ａのＦｃ部位によりＦｃγレセプター（ＦｃγＲ）と結合する。これにより、細胞膜内側に存在するＦｃＲγによるＳＹＫのリン酸化が起こり、数々の免疫応答を引き起こす。一方、６Ｈ８の抗原結合部位は細胞表面のＨＳＰ９０と結合することにより、細胞表面のＨＳＰ９０を含むタンパク複合体中のＦｃＲγを介し、ＳＹＫのリン酸化を引き起こすと考えられる。これにより当該ワクチンのシグナルを増強し、免疫反応を増強するアジュバントとして機能する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、６Ｈ８抗体がアジュバントとして機能するメカニズムを説明する図である。ワクチンとして抗腫瘍細胞抗体（がん細胞特異的抗体）を用いた場合を示す。このような抗体に結合した腫瘍細胞（又はその断片）がＦｃγレセプターを介して樹状細胞に取り込まれ、数々の免疫応答を引き起こす。これらの免疫応答は、６Ｈ８の抗原結合部位が細胞表面のＨＳＰ９０と結合することにより増幅される。
【図１３】図１３は、樹状細胞における細胞表面ＨＳＰ９０（図中、ＨＳＰ９０）の発現が、ＦｃＲγ依存性であることを示す。正常マウス及びＦｃＲγＫＯマウスの骨髄から樹状細胞（ＢＭＤＣ）を樹立し、細胞表面ＨＳＰ９０の発現を解析した。
【図１４】図１４は、６Ｈ８−ＯＶＡについてのＦｃＲγＫＯマウス由来樹状細胞（ＦｃＲγＫＯ）のクロスプレゼンテーション能が、正常マウス由来樹状細胞（ＷＴ  Ｂ６）と比較して、有意に低下していることを示す。図１３と同様に調製したＢＭＤＣに抗原（６Ｈ８−ＯＶＡ、ＯＶＡ、又はＯＶＡ257-264）を加え、３時間インキュベーションした後、固定した。この細胞とＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞とを共培養し、培養上清中のＩＦＮγの産生量をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【図１５】図１５は、インビボにおいて、６Ｈ８−ＯＶＡの投与により、養子移入されたＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞が活性化され、メモリーＴ細胞へと分化することを示す。ＯＴ−Ｉ／ＣＤ４５．１マウスのＣＤ８+細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移入し、同時に６Ｈ８−ＯＶＡ又はＰＢＳを投与した。９６時間後にマウス脾臓を回収し、脾臓細胞についてＣＤ４４及びＣＤ４５．１の発現を解析した（左パネル）。またアポトーシスに陥った細胞をAnnexin Vにより染色した。右パネルはAnnexin Vの試薬としての機能を確認したコントロール実験の結果である。
【図１６】図１６は、固層化６Ｈ８抗体刺激による骨髄由来樹状細胞からのサイトカイン産生の誘導を示す。６Ｈ８抗体を固層化した９６ウェルフラットプレート中で、ＧＭＣＳＦ依存性骨髄由来樹状細胞を１２時間培養し、培養上清中のサイトカイン・ケモカイン量を測定した。ＰＢＳは、６Ｈ８抗体を固層化しないプレートで行なった対照実験の結果を示す。
【図１７】図１７は、抗原を既存のアジュバントと共に用いた場合よりも、６Ｈ８抗体にコンジュゲートした方が効率よく特異的ＣＴＬを誘導することを示す。６Ｈ８−ＯＶＡ又はＩＦＡ＋ＯＶＡ257-264により免疫したマウスの脾臓細胞における、特異的ＣＴＬの誘導を調べた。パネルは、ＣＤ８陽性細胞のうち、テトラマー染色陽性の細胞の割合を示す。
【図１８】図１８は、P. Acnes投与が脾臓樹状細胞膜表面上でのＨＳＰ９０及びＣＤ６４（Ｆｃγレセプター）の発現を誘導することを示す。実験１は、種々の量のP. Acnesを投与してから６日後の、マウス脾臓細胞におけるＨＳＰ９０及びＣＤ６４の発現を解析した結果を示す。実験２は、５００μｇのP. Acnesを投与してから０〜１０日後の、マウス脾臓細胞におけるＨＳＰ９０及びＣＤ６４の発現を解析した結果を示す。
【図１９】図１９は、P. Acnes投与による脾臓樹状細胞膜表面上でのＨＳＰ９０及びＣＤ６４の発現がＦｃＲγ依存性であることを示す。野生型マウス及び種々のノックアウトマウスに５００μｇのP. Acnesを投与し、６日後にマウス脾臓細胞におけるＨＳＰ９０及びＣＤ６４の発現を解析した結果を示す。
【図２０】図２０は、P. Acnes投与により細胞膜表面にＨＳＰ９０が発現するのは抗原提示細胞に限られることを示す。野生型マウスに５００μｇのP. Acnesを投与し、６日後にマウス脾臓細胞におけるＨＳＰ９０及びＣＤ６４の発現を解析した結果を示す。
【図２１】図２１は、６Ｈ８モノクローナル抗体重鎖遺伝子配列及びアミノ酸配列を示す。
【図２２】図２２は、６Ｈ８モノクローナル抗体軽鎖遺伝子配列及びアミノ酸配列を示す。
【図２３】図２３は、細胞膜表面ＨＳＰ９０を認識する抗体にコンジュゲートした抗原のクロスプレゼンテーションを説明する。該抗体は、抗原提示細胞上のＨＳＰ９０に結合すると、抗体−ＨＳＰ９０の複合体を形成した後、エンドサイトーシスにより細胞内へと取り込まれる。抗体にコンジュゲートした抗原は、細胞内のプロセシング機構によりＭＨＣクラスＩ抗原提示経路へと送達され、ＣＤ８+Ｔ細胞に提示される。
【図２４】図２４は、ＩｇＧ２ａ−抗原タンパク質及び６Ｈ８−抗原タンパク質がＦｃＲγ依存的にワクチン効果を発現することを説明する。ＩｇＧ２ａは、そのＦｃ部位によりＦｃγレセプターと結合する。これにより、細胞膜内側に存在するＦｃＲγによるＳＹＫのリン酸化が起こり、数々の免疫応答を引き起こす。一方、６Ｈ８の抗原結合部位は細胞表面のＨＳＰ９０と結合することにより、細胞表面のＨＳＰ９０を含むタンパク複合体中のＦｃＲγを介し、ＳＹＫのリン酸化を引き起こすと考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物、特許出願及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１８】
また、本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略語を用いて表される。また、特に断りがない限り、ペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端に向かってＮ末端からＣ末端となるように記載される。
Ａｌａ又はＡ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ：イソロイシン
Ｐｒｏ又はＰ：プロリン
Ｐｈｅ又はＦ：フェニルアラニン
Ｔｒｐ又はＷ：トリプトファン
Ｍｅｔ又はＭ：メチオニン
Ｇｌｙ又はＧ：グリシン
Ｓｅｒ又はＳ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ：トレオニン
Ｃｙｓ又はＣ：システイン
Ｇｌｎ又はＱ：グルタミン
Ａｓｎ又はＮ：アスパラギン
Ｔｙｒ又はＹ：チロシン
Ｌｙｓ又はＫ：リシン
Ａｒｇ又はＲ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ：ヒスチジン
Ａｓｐ又はＤ：アスパラギン酸
Ｇｌｕ又はＥ：グルタミン酸
【００１９】
本発明は、細胞表面ＨＳＰ９０を認識可能な抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体であって、ＨＳＰ９０上の特定の配列を認識するモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体と抗原とを結合させた複合体を含むワクチン及びその用途、該抗体に生物学的活性を有する化合物を結合させた複合体を含む薬剤、該抗体を含むアジュバント及びその用途、該抗体を使用する細胞表面ＨＳＰ９０発現細胞の検出方法等を提供する。
【００２０】
本発明において、ＨＳＰ９０とは、熱等の多種のストレスにさらされることによりその発現が上昇し、細胞を保護する分子量９０ｋＤａのタンパク質の一群を意味し、分子シャペロンとして機能する。ＨＳＰ９０には、ＨＳＰ９０α及びβのアイソフォームが知られている。したがって、本発明において、ＨＳＰ９０とは、ＨＳＰ９０α及びβのいずれのアイソフォームをも意味する。
【００２１】
哺乳動物において、ＨＳＰ９０α及びβのアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列はともに、その多くが公知となっている。例えば、ヒトＨＳＰ９０α（ＮＭ＿００５３４８，ＮＰ＿００５３３９）、マウスＨＳＰ９０α（ＮＭ＿０１０４８０，ＮＰ＿０３４６１０）、ヒトＨＳＰ９０β（ＮＭ＿００７３５５，ＮＰ＿０３１３８１）、マウスＨＳＰ９０β（ＮＭ＿００８３０２，ＮＰ＿０３２３２８）の塩基配列及びアミノ酸配列がそれぞれ公開されている。ＨＳＰ９０α及びβのアミノ酸配列は、異なる哺乳動物種間でもそれぞれ良く保存されており、例えばヒトとマウスにおける配列を比較すると、ＨＳＰ９０αは９９．０％、ＨＳＰ９０βは９９．６％の配列同一性を示すことが知られている。またＨＳＰ９０αとβの間の配列相同性は、ヒトにおいては８６．１％、マウスにおいては８６．２％であることが報告されている。したがって、これらの配列は、異なる種間又はアイソフォーム間の配列であっても、短い領域（例えば数十アミノ酸）においては１００％の配列同一性を示し得る。例えば、後述するが、本発明のモノクローナル抗体のエピトープは、マウスとヒトで１００％の配列同一性を示す。
【００２２】
本発明において、細胞表面ＨＳＰ９０とは、細胞の細胞膜近傍において発現しているＨＳＰ９０を意味する。抗原提示細胞（例えば、活性化樹状細胞、マクロファージ、モノサイト（単核球）等）、多分化能間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）（Gronthos S, McCarty R, Mrozik K, et al. Stem Cells Dev. 2009;18:1253-1262）、及びオリゴデンドロサイト前駆細胞（Cid C, Alvarez-Cermeno JC, Camafeita E, Salinas M, Alcazar A. FASEB J. 2004;18:409-411.）等で細胞表面ＨＳＰ９０が報告されている。「抗原提示細胞」とは、異物である抗原を細胞内に取り込み、ペプチドへと分解した後、これをＨＬＡ分子に結合して細胞表面に発現することによりＴ細胞に抗原を提示する働きを有する細胞であり、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞又はモノサイト（単核球）等が知られている。本発明で対象とする抗原提示細胞としては、好ましくは樹状細胞、マクロファージ及びモノサイト等であり、特に好ましくは活性化樹状細胞（抗原が取り込まれた状態にある細胞）、マクロファージ及びモノサイトである。
【００２３】
また、メラノーマ（Becker B, Multhoff G, Farkas B, et al. Exp Dermatol. 2004;13:27-32.；Stellas D, Karameris A, Patsavoudi E. Clin Cancer Res. 2007;13:1831-1838.）、線維肉腫（Eustace BK, Sakurai T, Stewart JK, et al. Nat Cell Biol. 2004;6:507-514.）、及び神経芽細胞腫（Cid C, Regidor I, Poveda PD, Alcazar A. Cell Stress Chaperones. 2009;14:321-327.）等のヒトの腫瘍細胞において細胞表面ＨＳＰ９０が報告されている。
【００２４】
したがって、本発明において、細胞表面ＨＳＰ９０発現細胞とは、これらの細胞を含む。好ましくは細胞表面ＨＳＰ９０発現細胞は、抗原提示細胞又は腫瘍細胞であり、特に好ましくは活性化樹状細胞及びマクロファージ、並びにヒトの腫瘍細胞である。
【００２５】
細胞表面ＨＳＰ９０は、少なくとも細胞外の抗ＨＳＰ９０抗体と反応し得る様式で細胞膜近傍に存在する。
【００２６】
抗ＨＳＰ９０抗体
本発明のモノクローナル抗体は、下記配列番号１又は２のアミノ酸配列を含むエピトープと結合し、且つ細胞表面上のＨＳＰ９０を特異的に認識する。本発明のモノクローナル抗体はＨＳＰ９０αおよびＨＳＰ９０βのいずれか一方を特異的に認識する。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体はＨＳＰ９０αおよびＨＳＰ９０βの両方を特異的に認識する。
ＶＸ1Ｘ2ＥＸ3ＰＰＬＥＧＤＸ4（Ｘ1〜Ｘ4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す）（配列番号：１）
ＨＸ5ＩＸ6ＥＴＬＲＱＫＡＥ（Ｘ5〜Ｘ6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示す）（配列番号：２）
【００２７】
配列番号１において、Ｘ1〜Ｘ4は同一又は異なって任意のアミノ酸を示すが、Ｘ2は好ましくはＥ又はＤであり、Ｘ4はＥ又はＤであることが好ましい。配列番号２において、Ｘ5〜Ｘ6は同一又は異なって任意のアミノ酸を示すが、Ｘ6はＩ又はＶであることが好ましい。
【００２８】
該エピトープは、より好ましくは、
(1)Ｘ1がＴであり、Ｘ2がＥであり、Ｘ3がＭであり、及びＸ4がＤである配列番号１のアミノ酸配列（即ち、ＶＴＥＥＭＰＰＬＥＧＤＤ（配列番号：３））、
(2)Ｘ1がＰであり、Ｘ2がＤであり、Ｘ3がＩであり、及びＸ4がＥである配列番号１のアミノ酸配列（即ち、ＶＰＤＥＩＰＰＬＥＧＤＥ（配列番号：４））、
(3)Ｘ5がＳであり、及びＸ6がＩである配列番号２のアミノ酸配列（即ち、ＨＳＩＩＥＴＬＲＱＫＡＥ（配列番号：５））、又は
(4)Ｘ5がＰであり、及びＸ6がＶである配列番号２のアミノ酸配列（即ち、ＨＰＩＶＥＴＬＲＱＫＡＥ（配列番号：６））
を含む。
【００２９】
該エピトープは、特に好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
配列番号３のアミノ酸配列は、ヒトＨＳＰ９０α（ＮＰ＿００５３３９）の７１２〜７２３領域、あるいはマウスＨＳＰ９０α（ＮＰ＿０３４６１０）の７１３〜７２４領域に相当し、配列番号４のアミノ酸配列は、ヒトＨＳＰ９０β（ＮＰ＿０３１３８１）の７０４〜７１５領域、あるいはマウスＨＳＰ９０β（ＮＰ＿０３２３２８）の７０４〜７１５領域に相当し、配列番号５のアミノ酸配列は、ヒトＨＳＰ９０αの６４０〜６５１領域、あるいはマウスＨＳＰ９０αの６４１〜６５２領域に相当し、配列番号６のアミノ酸配列は、ヒトＨＳＰ９０βの６３２〜６４３領域、あるいはマウスＨＳＰ９０βの６３２〜６４３領域に相当する。
【００３１】
本発明の抗体は、上記エピトープと結合し、細胞表面上のＨＳＰ９０を認識できるものであれば特に制限はなく、天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製された抗体断片、及びこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、例えば、重鎖ＣＤＲ１（配列番号１０の６６〜７０位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ２（配列番号１０の８５〜１０１位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ３（配列番号１０の１３４〜１４１位で表わされるアミノ酸配列）、軽鎖ＣＤＲ１（配列番号１２の４３〜５８位で表わされるアミノ酸配列）、ＣＤＲ２（配列番号１２の７４〜８０位で表わされるアミノ酸配列）、及びＣＤＲ３（配列番号１２の１１３〜１２１位で表わされるアミノ酸配列）のいずれか１つを少なくとも含む、細胞表面ＨＳＰ９０を認識する抗体であってもよく、または、配列番号１０の３６〜１８５位で表わされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１２の２０〜１７７位で表わされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、細胞表面ＨＳＰ９０を認識する抗体であってもよい。例えば、非ヒト哺乳動物由来のＣＤＲ配列をヒトフレームワーク（ＦＲ）配列に移植したヒト化抗体、非ヒト哺乳動物由来の可変領域配列をヒト定常領域配列と組み合わせたヒト型抗体を使用することができる。このような抗体の作製方法は公知であり、例えば、ヒト化抗体は米国特許第５２２５５３９号、５５８５０８９号、５６９３７６１号、５６９３７６２号、６１８０３７０号などに記載されている。結合性断片とは、前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ(variable fragment of antibody)、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ(disulphide stabilised Fv)、ｄＡｂ(single domain antibody)等が挙げられる(Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996)。これらのいずれもが本発明のモノクローナル抗体と同様に使用可能である。以下、主にモノクローナル抗体について記載するが、本明細書においてモノクローナル抗体に言及する場合、それには上記のような抗体およびその断片が含まれる。また、上記抗体およびその断片は例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などで化学的に修飾されていてもよい。
【００３２】
また、本発明のモノクローナル抗体は、上記エピトープと結合し、且つ細胞表面上のＨＳＰ９０を認識できる限り、そのアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有するものであってもよい。
【００３３】
抗体のクラスは特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。精製の容易性等を考慮すると好ましくはＩｇＧであり、より好ましくはＩｇＧ２ａである。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体の製造に用いられる免疫原としては、ＨＳＰ９０タンパク質の全長又はエピトープを含むその一部からなるポリペプチドを用いることができる。具体的には、該免疫原は、配列番号１又は２、より好ましくは配列番号３〜６からなる群より選択される１つのアミノ酸配列からなる領域を含むポリペプチドである。
【００３５】
また、上記ポリペプチドを担体に架橋する、精製に利用する等の目的で、１個又は複数個のアミノ酸を付加してもよい。付加されるアミノ酸の数は、特に限られないものの、製造される抗体の特異性を考慮すると、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個である。
【００３６】
付加されるアミノ酸の位置はポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれでもよいが、好ましくはＮ末端である。
【００３７】
さらに、免疫原性が維持されている限り、上記免疫原としてのポリペプチドは、そのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有するものであってもよい。置換、欠失及び／又は挿入をするアミノ酸の数は、特に限られないものの、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２個である。
【００３８】
免疫原ポリペプチドは、例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の抗原産生組織又は細胞から自体公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて単離・精製する方法；ペプチド・シンセサイザー等を使用する自体公知のペプチド合成方法で化学的に合成する方法；免疫原ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養する方法；あるいは、免疫原ポリペプチドをコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成する方法等によって取得することができる。
【００３９】
哺乳動物の組織又は細胞から免疫原を調製する場合、該組織又は細胞をホモジナイズした後、酸、又はアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を自体公知の蛋白質分離技術（例：塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等）に付すことにより単離・精製することができる。得られた抗原ペプチドをそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。
【００４０】
化学的に免疫原ポリペプチドを合成する場合、該合成ペプチドとしては、例えば、上述した天然より精製される免疫原ポリペプチドと同一の構造を有するもの、具体的には、該天然免疫原ポリペプチドのアミノ酸配列において、本発明のモノクローナル抗体のエピトープである配列番号１又は２のアミノ酸配列、もしくは配列番号３〜６からなる群より選択される１つのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドが用いられる。
【００４１】
ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて免疫原ポリペプチドを製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法[例えば、Molecular Cloning, 2nd ed.; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989) に記載の方法など]に従って作成することができる。
【００４２】
無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記と同様、公知のクローニング方法により調製した免疫原ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した発現ベクター（例えば、該ＤＮＡがＴ７、ＳＰ６プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼ及び基質（ＮＴＰｓ）を含む転写反応液を用いてｍＲＮＡを合成した後、該ｍＲＮＡを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。
【００４３】
免疫原ポリペプチドは、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、必要に応じて適当な担体（キャリア）に結合又は吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物又は共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。
【００４４】
本発明のモノクローナル抗体は、上記した免疫原を用いて当分野で通常用いられる方法により調製され得る。
【００４５】
（モノクローナル抗体の作製）
具体的には下記のようにして製造することができる。免疫原ポリペプチド（上述）を、マウス、ラットあるいはハムスターなどの動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。
【００４６】
モノクローナル抗体は、上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマ（融合細胞）を調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた免疫原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
【００４７】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法(Nature, Vol.256, p.495-497, 1975)及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合をさせることにより調製される。
【００４８】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653(653;ATCC No.CRL1580)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2/0-Ag14(Sp2/0、Sp2)、PAI、F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用することができる。
【００４９】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
【００５０】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、又はマウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等、好ましくはマウス又はラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、又は哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
【００５１】
インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
【００５２】
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、免疫原との親和性に加え、エピトープとの結合性及び細胞表面ＨＳＰ９０を認識する能力を有する必要があることから、得られたハイブリドーマが産生する抗体について、それらの特徴の有無を確認する。具体的には各ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体のエピトープマッピングによって評価することができる。エピトープマッピングは、ペプチドアレイ法、質量分析法、ＮＭＲによる構造決定などによって行うことができる。ペプチドアレイ法は免疫原のアミノ酸配列をウィンドウをずらしながら切断したものを配置したペプチドアレイに抗体を結合させ、どの配列断片を認識したかによってエピトープを決める方法であり、質量分析法は抗原抗体複合体の表面水酸基を重水置換した後にマススペクトロメトリーによりマスクされていたエピトープ領域を決める方法である。このどちらの手法も使えない抗原の場合にはＮＭＲによる構造解析により結合部分を決定する。
【００５３】
細胞表面ＨＳＰ９０を認識する能力を評価する方法は、後述の、細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞を検出する方法に準じて実施することができる。
【００５４】
かくして、エピトープが、配列番号１又は２、好ましくは配列番号３〜６からなる群より選択される１つであり、且つ細胞表面ＨＳＰ９０を認識するモノクローナル抗体を得、さらに該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得て、本発明のモノクローナル抗体及び本発明のハイブリドーマとすることができる。
【００５５】
モノクローナル抗体は、単離及び／又は精製されることが好ましい。モノクローナル抗体の単離／精製は、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又はプロテインＡあるいはプロテインＧ（モノクローナル抗体のクラスによって異なる）などの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００５６】
本発明のモノクローナル抗体は、検出可能な標識で標識されていてもよい。標識には蛍光標識、低分子化合物による標識、ペプチドによる標識等が挙げられる。
【００５７】
（ハイブリドーマ）
本発明は、細胞表面ＨＳＰ９０を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。該ハイブリドーマは、具体的には上記（モノクローナル抗体の作製）の項で述べたようにして調製されるが、具体的には本発明者らによって新たに分離され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託され、受託番号としてFERM BP-11222、FERM BP-11243が付されているハイブリドーマ等である（受託日：それぞれ2010年1月13日および2010年3月11日）。
【００５８】
従って本発明の抗体は、受託番号がFERM BP-11222又はFERM BP-11243である上記ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体であり得る。受託番号がFERM BP-11222である上記ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体は、配列番号１０の３６〜１８５位で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は配列番号１２の２０〜１７７位で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。これらの配列のいずれかを利用して可変領域以外がヒト由来であるキメラ（ヒト型）抗体を作製することができる。さらに、上記モノクローナル抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３として配列番号１０の６６〜７０位、８５〜１０１位、１３４〜１４１位、配列番号１２の４３〜５８位、７４〜８０位、１１３〜１２１位で表わされるアミノ酸配列をそれぞれ含む。これらの配列のいずれかを利用してＣＤＲ以外がヒト由来であるヒト化抗体を作製することができる。また該抗体が結合するエピトープと同一のエピトープと結合し、且つ細胞表面ＨＳＰ９０を認識するモノクローナル抗体も本発明の抗体として好適に用いることができる。
【００５９】
さらに本発明の抗体は、その重鎖及び軽鎖の塩基配列情報に基づいて遺伝子工学的に製造することもできる。例えば、配列番号９及び／又は１１の２配列を含む発現ベクターを宿主に導入して該宿主を培養し、培養物から該抗体を取得することができる。ここで配列番号９及び／又は１１は同一の発現ベクター中に導入されていてもよいし、別個の発現ベクター中に導入されていてもよい。
【００６０】
本発明の抗体を発現すべく構築された発現ベクターを用いて、本発明の抗体又はその機能的断片を発現する細胞を調製することができる。具体的には、目的とする抗体をコードするＤＮＡを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
【００６１】
ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などを用いることができる。
【００６２】
抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546;FASEB J. (1992) 6, 2422-2427、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ａｒａＢプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（QIAGEN社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
【００６３】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００６４】
また、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（GIBCO BRL社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）等を用いることができる。
【００６５】
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＣＡＧプロモーター（Gene. (1991) 108, 193、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、形質転換細胞を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
【００６６】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【００６７】
細胞表面ＨＳＰ９０の検出方法
本発明は、細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞を検出する方法を提供する。該方法は、（ｉ）配列番号１又は２、好ましくは配列番号３〜６からなる群より選択される１つのアミノ酸配列からなるエピトープと結合し、且つ細胞表面ＨＳＰ９０を認識することを特徴とする本発明の抗体（特にモノクローナル抗体）、又は、受託番号FERM BP-11222又はFERM BP-11243の本発明のハイブリドーマにより産生された本発明のモノクローナル抗体を透過処理していない細胞に反応させる工程、及び、（ｉｉ）該抗体と細胞表面ＨＳＰ９０との複合体形成の有無を評価する工程、を含む。
【００６８】
「透過処理」とは、抗体等の大きな分子が細胞内に入り込めるように細胞膜に孔をあける処理であり、当分野において周知の方法（例えば界面活性剤を使用する方法、有機溶媒を使用する方法等）を使用して実施される。
【００６９】
本発明においてＨＳＰ９０の発現を検出する対象となる細胞は、かかる膜透過処理を施していない為、抗体が細胞内に入らず、従って細胞内のＨＳＰ９０と反応しない。すなわち、本発明の方法は、本発明のモノクローナル抗体が細胞表面のＨＳＰ９０を認識できるという知見に基づいてなされたものであり、細胞表面ＨＳＰ９０を発現している細胞を検出することを可能にする。細胞質中に発現しているＨＳＰ９０が哺乳動物の細胞において普遍的に存在するのに対し、細胞表面に発現しているＨＳＰ９０は上記のように抗原提示細胞や腫瘍細胞等の限られた種類の細胞においてのみ存在する。したがって、本発明の検出方法は、これらの細胞を特異的に検出することを可能にする。また本発明の検出方法は、細胞の膜透過処理を必要としないため、生細胞を対象とすることも可能である。
【００７０】
以下、各工程について説明する。
(ｉ)本発明のモノクローナル抗体を透過処理していない細胞に反応させる工程。
【００７１】
本工程で用いるモノクローナル抗体は、上記した本発明のモノクローナル抗体であって、具体的には、配列番号１又は２、好ましくは配列番号３〜６からなる群より選択される１つのアミノ酸配列からなるエピトープと結合し、且つ細胞表面ＨＳＰ９０を認識できるモノクローナル抗体である。
【００７２】
本発明のモノクローナル抗体を反応させる対象となる細胞は、細胞表面にＨＳＰ９０を発現しているか否かを調べることが所望される任意の動物細胞であり得る。
【００７３】
モノクローナル抗体を細胞に反応させる際の反応条件（例、抗体及び細胞の濃度、反応温度、反応時間、使用する緩衝液の組成等）は当業者に公知の条件が使用され、例えば細胞あたり過剰量の抗体を用い、０℃〜２０℃、好ましくは約４℃で０．５時間〜１時間、等張リン酸緩衝液等の緩衝液中で反応させる。
【００７４】
（ｉｉ）該抗体と細胞膜上に発現しているＨＳＰ９０との複合体形成の有無を評価する工程。
【００７５】
該工程は、通常の抗原抗体反応において形成される複合体を検出する方法と同様な方法で実施することができる。例えば、ＲＩＡ法、表面プラズモン共鳴法、プロテインチップ、フローサイトメトリー等の自体公知の方法を用いることができる。これらの方法においては、検出のために本発明のモノクローナル抗体をあらかじめ標識しておいてもよいし、本発明の抗体を認識可能な、標識された二次抗体も使用することができる。標識には蛍光標識、低分子化合物による標識、ペプチドによる標識等が挙げられる。いずれの方法も当分野で常套的に行われている手法であり、当業者はその目的を考慮して適宜選択し実施することができる。例えば、本発明では膜透過処理を施さない細胞、好ましくは生細胞を用いることから、フローサイトメーターを用いた方法、すなわちフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）に好適である。
【００７６】
上述のように、本発明のモノクローナル抗体は細胞表面のＨＳＰ９０を認識することができる。従って、膜透過処理を施さなかった場合に該抗体とＨＳＰ９０との複合体形成が観察されるということは、ＨＳＰ９０が細胞表面上に存在していることを意味する。
【００７７】
細胞表面ＨＳＰ９０が検出される細胞としては抗原提示細胞（上述）又は腫瘍細胞が挙げられ、具体的には活性化樹状細胞及びマクロファージ等の抗原提示細胞、又はヒト由来の腫瘍細胞である。従って、本発明の細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞を検出・同定する方法は、活性化樹状細胞及びマクロファージ等の抗原提示細胞を検出する方法、あるいはヒト由来の腫瘍細胞を検出・同定する方法に相当する。
【００７８】
モノクローナル抗体以外の本発明の抗ＨＳＰ９０抗体についても、本発明のモノクローナル抗体と同様に上記検出方法に用いることができる。
【００７９】
ワクチン
本発明は、細胞表面上のＨＳＰ９０を認識するモノクローナル抗体と標的抗原との複合体（以下、便宜上、単に本発明の「抗原−抗体複合体」と称する場合もある）を含むワクチンを提供する。好ましくは、該モノクローナル抗体は本発明のモノクローナル抗体（上述）である。より好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（ＶＴＥＥＭＰＰＬＥＧＤＤ）をエピトープとして認識するものである。具体的には、例えば、受託番号がFERM BP-11222であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体（６Ｈ８Ｄ２；便宜上６Ｈ８と称する場合もある）の軽鎖及び／又は重鎖可変領域又はそのＣＤＲのいずれかを含む抗原結合部位、またはそれを含む抗体である。ここで、抗原結合部位は、抗体中の、抗原に結合する部位を言い、例えば軽鎖定常領域と軽鎖可変領域を含むＦａｂ領域（Ｆｒａｇｍｅｎｔ, ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）を抗原結合部位を含むポリペプチドとして使用することができる。ここで軽鎖可変領域とは抗原を認識するのに必要な配列を含む軽鎖Ｆａｂ領域のＮ末端側の領域を言う。
【００８０】
実施例にて後述するが、該モノクローナル抗体は、抗原提示細胞上のＨＳＰ９０に結合すると、抗体−ＨＳＰ９０の複合体を形成し、該複合体は効率よく細胞内へと内部移行する（取り込まれる）。したがって、細胞表面上のＨＳＰ９０を認識するモノクローナル抗体（好ましくは本発明のモノクローナル抗体）と標的抗原との複合体は、細胞表面上のＨＳＰ９０に結合し、次いで細胞内部へと取り込まれる。
【００８１】
上記複合体中の標的抗原は、複合体が細胞に取り込まれるのに伴い、内部移行する。その後、該抗原はＭＨＣクラスＩ抗原提示経路へと送達され、クロスプレゼンテーションが起こり、ＣＤ８+Ｔ細胞を活性化する。かかる作用機序により、上記複合体は、ワクチンとして機能する。従って、本発明のワクチンを標的抗原に対する免疫誘導方法において使用することができる。
【００８２】
また、本発明によれば、本発明のワクチンの有効量を対象に投与する工程を含む、疾患の治療または予防方法が提供される。標的抗原は、予防又は治療されるべき疾患に基づき、任意の公知の抗原から選択することができる。
【００８３】
例えば、標的抗原は、異常細胞又は病原体（pathogen）に発現している抗原であって、それを標的とする免疫作用により、体内における当該異常細胞又は病原体の消失、あるいは当該異常細胞又は病原体量の減少が期待できるものである限り特に限定されない。例えば、標的抗原としては、腫瘍抗原、病原体抗原が挙げられる。
【００８４】
腫瘍抗原は、上皮性及び非上皮性腫瘍を含む固形腫瘍、造血組織における腫瘍の抗原であり得る。固形腫瘍抗原としては特に限定されないが、例えば、MART-1/Melan-A、Mage-1、Mage-3、gp100、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質2（trp2）、CEA、PSA、CA-125、erb-2、Muc-1、Muc-２、TAG-72、AES、FBP、C-レクチン、NY-ESO-1、galectin-4/NY-CO-27、Pec60、HER-2/erbB-2/neu、テロメラーゼ、G250、Hsp105、点変異ras癌遺伝子、点変異p53癌遺伝子、癌胎児性抗原が挙げられる（例えば、特開2005-139118号公報、特開2004-147649号公報、特開2002-112780号公報、特開2004-222726号公報を参照）。造血組織における腫瘍（例、白血病）の抗原としては特に限定されないが、例えば、proteinase 3、WT-1、hTERT、PRAME、PML/RAR-a、DEK/CAN、シクロフィリンB、TEL-MAL1、BCR-ABL、OFA-iLRP、Survivin、idiotype、Sperm protein 17、SPAN-Xb、CT-27、MUC1が挙げられる。
【００８５】
病原体抗原は、病原性ウイルス抗原、病原性微生物抗原、又は病原性原生動物抗原であり得る。病原性ウイルス抗原としては特に限定されないが、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、肝炎ウイルス（例、A型、B型、C型、D型及びE型肝炎ウイルス）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、西ナイル熱ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ウマ脳炎ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス（例、HTLV-I）等のウイルスの抗原が挙げられる。具体的には、例えば、GP-120、p17、GP-160（以上、HIV）、NP、HA（以上、インフルエンザウイルス）、HBs Ag、HBVエンベロープタンパク質、コアタンパク質、ポリメラーゼタンパク質、NS3、NS5（以上、肝炎ウイルス）、HSVdD（単純ヘルペスウイルス）、EBNA1、2、3A、3B及び3C、LMP1及び2、BZLF1、BMLF1、BMRF1、BHRF1（以上、EBウイルス）、Tax（HTLV-I）、SARS-CoVスパイクタンパク質（SARSウイルス）、CMV pp5、IE-1（以上、CMV）、E6、E7タンパク質（以上、HPV）が挙げられる（例えば、特開2004-222726号公報参照）。病原性微生物抗原としては、例えば、病原性細菌（例、クラミジア、ミコバクテリア、レジオネラ）、病原性酵母（例、アスペルギルス、カンジダ）に発現している抗原が挙げられる。病原性原生動物抗原としては、例えば、マラリア、住血吸虫に発現している抗原が挙げられる。
【００８６】
本発明の抗原−抗体複合体において、細胞表面ＨＳＰ９０を認識するモノクローナル抗体と標的抗原との結合は、共有結合又は非共有結合であってもよく、また直接的であっても間接的であってもよい。両者の結合には、当分野で公知の種々の方法を使用することができる。
【００８７】
共有結合としては、例えば、マレイミド化した抗原を、抗体と反応させることにより複合体を形成させる場合等が挙げられるが、これに限定されない。
【００８８】
非共有結合の場合としては、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用し、抗体又は抗原の一方にビオチンを結合し、他方にストレプトアビジンを結合することによって、抗体と抗原とを間接的に連結させる場合等が挙げられるが、これに限定されない。また抗体と抗原との間接的な結合には、リポソームなどのナノキャリアを利用することもできる。この場合、抗原をナノキャリアの表面に結合させるか又は内部に封入し、抗体をナノキャリアの表面に抗原結合部位を外側に向けて結合させることで、抗原−抗体複合体を調製することができる。ナノキャリアの組成は特に限定されず、当該分野で公知のものから選択することができる。また抗体又は抗原とナノキャリアの結合も当該分野で公知の方法を用いて行なうことができる。
【００８９】
本発明の抗原−抗体複合体は、ワクチンとして機能する有効量で患者に投与され得る。有効量は、当業者であれば、例えば、細胞株を使用するエキソビボ試験又は実験動物を使用する試験等に基づき、過度の実験を必要とすることなく決定することができる。
【００９０】
本発明のワクチンは腫瘍性疾患又は感染症に有用である。
【００９１】
腫瘍性疾患としては、例えば、固形腫瘍（例、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍）、造血組織における腫瘍が挙げられる。より詳細には、固形腫瘍としては、例えば、消化器癌（例、胃癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌）、肺癌（例、小細胞癌、非小細胞癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺、脾臓、甲状腺癌、副腎、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、肉腫（例、カポシ肉腫）、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、非扁平細胞癌、脳腫瘍、ならびにこれらの固形腫瘍の再発及び転移が挙げられる。造血組織における腫瘍としては、白血病（例、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性リンパ球性白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、成人T細胞白血病（ATL）、骨髄異形成症候群（MDS））、リンパ腫（例、Tリンパ腫、Bリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、骨髄腫（多発性骨髄腫）、ならびにこれらの腫瘍の再発が挙げられる。感染症としては、例えば、上述の病原体により引き起こされる感染症が挙げられる。
【００９２】
本発明のワクチンは、上記抗原−抗体複合体に加えて、随意に医薬上許容可能な賦形剤、又は添加剤を含んでよい。医薬上許容可能な賦形剤、添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。医薬上許容可能な担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
【００９３】
本発明のワクチンは、経口又は非経口的に投与される。経口的に投与する場合、通常当分野で用いられる投与形態で投与することができる。非経口的に投与する場合には、局所投与剤（経皮剤等）、直腸投与剤、注射剤、経鼻剤等の投与形態で投与することができる。
【００９４】
また本発明のワクチンは、その免疫効果を増強するために、アジュバントと共に投与することができる。一般にアジュバントとは、抗原と共に用いられると、抗原に対する免疫応答を非特異的に高め、抗原に対する細胞性免疫や抗体生産を増強するという役割を果たす物質を指す。アジュバントとしては、例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、細菌や寄生虫由来の物質（Propionibacterium Acnes死菌など）などが挙げられるがこれらに限定されない。またアジュバントとして本発明の抗体を本発明のワクチンと共に投与することができる。「共に投与する」とは、同時投与又は併用投与を意味し、例えば、本発明のワクチンとアジュバントとが１つの組成物中に存在する場合、別個の組成物中に存在しほぼ同じ時間にしかし異なる部位で投与される場合、又は別個の組成物中に存在し異なる時間において投与される場合である。異なる時間において投与される場合、本発明のワクチンとアジュバントのいずれを先に投与してもよいが、アジュバントを先に投与することが好ましい。投与の間隔は、数秒、数分、数時間、又は数日の範囲において、任意に設定することができる。
アジュバントは、本発明のワクチンの免疫効果を増強する有効量で投与される。有効量は、当業者であれば、例えば、実験動物を使用する試験等に基づき、過度の実験を必要とすることなく決定することができる。
【００９５】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈剤に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００９６】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入等）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容可能な担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００９７】
モノクローナル抗体以外の本発明の抗ＨＳＰ９０抗体についても、本発明のモノクローナル抗体と同様に上記ワクチンに用いることができる。
【００９８】
薬剤
本発明は、細胞表面ＨＳＰ９０を認識可能な抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体に、生物学的活性を有する物質を結合させた複合体を含む薬剤を提供する。
【００９９】
本発明のワクチンと同様、本発明の薬剤においては、抗体と生物学的活性を有する物質との複合体（以下、便宜上「物質−抗体複合体」とも称する）は、細胞内に内部移行し得る。内部移行した物質−抗体複合体から、分解又は他の機構により、物質が遊離し、該物質が有する生物学的活性を示す。したがって、本発明の薬剤においては、生物学的活性を有する物質は、効率良く細胞内へと送達され得る。
【０１００】
抗体、抗体と物質との結合、薬剤の製剤化、投与方法についての説明は、本発明の上記ワクチンについての対応する記載を適用することができる。
【０１０１】
生物学的活性を有する物質としては、生物学的活性を有している限り特に限定されず、公知の物質であっても今後開発される新規な物質であってもよい。また、化合物であっても組成物であってもかまわない。化合物としては低分子化合物及び高分子化合物等が挙げられ、低分子化合物とは分子量１０００未満程度の化合物であって、例えば医薬品として通常使用し得る有機化合物及びその誘導体や無機化合物が挙げられ、有機合成法等を駆使して製造される化合物やその誘導体、天然由来の化合物やその誘導体、プロモーター等の小さな核酸分子や各種の金属等であり、望ましくは医薬品として使用し得る有機化合物及びその誘導体、核酸分子をいう。また、高分子化合物としては分子量１０００以上程度の化合物であって、タンパク質、ポリ核酸類、多糖類、及びこれらを組み合わせたものなどが挙げられる。組成物としては上記化合物を２種以上を含むものや、必要に応じて生物学的活性に悪影響を及ぼさない不活性の担体等を含めることができる。これらの物質は、公知のものであれば商業的に入手可能であるか、各報告文献に従って採取、製造、精製等の工程を経て得ることができる。これらは、天然由来であっても、また遺伝子工学的に調製されるものであってもよく、また半合成等によっても得ることができる。
【０１０２】
抗体に結合させる物質は、好ましくは、細胞表面のＨＳＰ９０を認識して、抗体とともに細胞内へと移行することから、細胞表面にＨＳＰ９０を発現している細胞に対して、生物学的活性を示す物質である。例えばヒト腫瘍細胞にＨＳＰ９０が発現していることから該物質として抗癌剤を用いることができる。抗癌剤としては、シクロフォスファミドやトリエチレンメラミンなどのアルキル化剤、メルカプトプリンや５−フルオロウラシルやメトトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシンやアドリアマイシンなどの抗腫瘍性抗生物質、アルカロイド類、ホルモン類などが挙げられる。さらに細胞内に移行して機能することから該物質として核酸分子を用いることができる。核酸分子としては、核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよい。ＤＮＡは、遺伝子を発現可能に含むものが挙げられ、例えばプラスミド、或いはプロモーターに連結された遺伝子を含む遺伝子構築物などが挙げられる。ＤＮＡとしては、アンチセンスＤＮＡ、酵素阻害剤、細胞毒性ないしアポトーシス誘導作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子、転写因子の阻害物質をコードする遺伝子などが挙げられる。ＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどが挙げられる。特にｓｉＲＮＡは、遺伝子の発現を制御する周知の機能を有しており、本発明の薬剤における使用に適している。
【０１０３】
本発明の薬剤を用いれば、生物学的活性を示す物質により治療又は予防され得る疾患又は状態（例えば腫瘍など）を治療又は予防することができる。従って、本発明は、本発明の薬剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患の治療方法を提供する。
【０１０４】
モノクローナル抗体以外の本発明の抗ＨＳＰ９０抗体についても、本発明のモノクローナル抗体と同様に上記薬剤に用いることができる。
【０１０５】
アジュバント及びその用途
本発明は、細胞表面上のＨＳＰ９０を認識するモノクローナル抗体の抗原結合部位を含むポリペプチドを含むアジュバントを提供する。該モノクローナル抗体は、好ましくは、上述の本発明のモノクローナル抗体である。より好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（ＶＴＥＥＭＰＰＬＥＧＤＤ）をエピトープとして認識するものである。具体的には、例えば、受託番号がFERM BP-11222であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体（６Ｈ８Ｄ２；便宜上６Ｈ８と称する場合もある）の軽鎖及び／又は重鎖可変領域又はそのＣＤＲのいずれかを含む抗原結合部位、またはそれを含む抗体である。ここで、抗原結合部位は、抗体中の、抗原に結合する部位を言い、例えば軽鎖定常領域と軽鎖可変領域を含むＦａｂ領域（Ｆｒａｇｍｅｎｔ, ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）を抗原結合部位を含むポリペプチドとして使用することができる。ここで軽鎖可変領域とは抗原を認識するのに必要な配列を含む軽鎖Ｆａｂ領域のＮ末端側の領域を言う。
【０１０６】
本発明のアジュバントは、実施例にて後述するように、Ｆｃレセプターへの結合を介した抗原提示機構を増強することができる。その作用機構において、細胞表面のＨＳＰ９０と複合体を形成しているＦｃＲγが重要な役割を果たしている。このＦｃＲγは免疫の誘導において貪食能の亢進、サイトカイン／ケモカインの産生と分泌、酸化バーストの誘導、antibody dependent cell mediated cytotoxicity(ADCC)誘導といった作用を示す事が知られている。従って、本発明のアジュバントは、このような抗原提示機構の増強に基づいた免疫誘導方法において、使用され得る。
【０１０７】
本発明のアジュバントは、Ｆｃレセプターへの結合を介して抗原提示細胞（好ましくは樹状細胞）に取り込まれるワクチンとともに対象に投与され得る。ここで用いられるワクチンは、例えば、標的抗原と抗体（好ましくはモノクローナル抗体）との複合体を含む。抗体は、Ｆｃ部分を有し、抗原提示細胞（好ましくは樹状細胞）上のＦｃレセプターと結合できるものであれば特に制限されない。抗体は、好ましくは、Ｆｃγレセプターと結合できるＩｇＧである。また標的抗原としては、例えば、上記本発明のワクチンの説明において列挙した標的抗原が挙げられ、好ましくは、病原体抗原又は腫瘍抗原である。
ワクチンとして、本発明のワクチンを使用することも好ましい。
該複合体において、抗体と標的抗原との結合部位は、該抗体とＦｃレセプターとの結合を妨げない限り、任意の部位を選択することができる。また両者の結合は、共有結合又は非共有結合であってよく、結合させる反応は、当分野で公知の種々の方法を使用して行なうことができる。
【０１０８】
本発明のアジュバントは、抗腫瘍抗原抗体とともに投与され得る。ここで、抗腫瘍抗原抗体としては、上記本発明のワクチンの説明のために記載した腫瘍抗原を認識する抗体が挙げられる。
抗腫瘍抗原抗体は腫瘍抗原と複合体を形成し、その複合体がＦｃレセプターを介して樹状細胞に取り込まれる、腫瘍抗原に対する免疫反応が誘導される。本発明のアジュバントはこのような免疫誘導機構を増強することができる。
【０１０９】
また、本発明のアジュバントは、抗腫瘍細胞抗体とともに投与され得る。抗腫瘍細胞抗体とは、腫瘍細胞膜表面に結合し、腫瘍細胞を殺傷する効果を有する抗体を意味する。このような抗体は、腫瘍細胞に作用した場合、細胞死（アポトーシス）を引き起こす。アポトーシスでばらばらになった腫瘍細胞等の細胞断片（apoptotic body）がＦｃレセプターを介して取り込まれ、免疫反応が誘導される。腫瘍細胞（又はその一部）には多くの腫瘍抗原が含まれているので、抗腫瘍細胞抗体で処理した腫瘍細胞は、腫瘍細胞に対する免疫反応を誘導する、多価ワクチンとして機能する。抗腫瘍細胞抗体としては、抗NY-ESO-1抗体、抗MAGE-3抗体、抗サバイビン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のアジュバントは、このような樹状細胞内への取り込みを促進することができる。
【０１１０】
上記免疫誘導方法における、本発明のアジュバント及びワクチンの対象への投与方法についての説明は、上記本発明のワクチンについての対応する記載を適用することができる。
【０１１１】
本発明のアジュバントは、抗癌剤を対象に投与する工程を含む免疫誘導方法においても使用され得る。抗癌剤により攻撃を受け潰れた癌細胞から腫瘍抗原が放出される。かかる腫瘍抗原と、該抗原に対して対象が産生した抗腫瘍抗原抗体とが結合し、得られた抗原抗体複合体が樹状細胞にＦｃレセプターを介して取り込まれる。本発明のアジュバントはこの取り込みを効果的に促進する。
抗癌剤としては、例えば、上記本発明の薬剤の説明において列挙した抗癌剤が挙げられる。
【０１１２】
本発明のアジュバントは、そこに含まれる、細胞表面上のＨＳＰ９０を認識するモノクローナル抗体、特にその抗原結合部位、好ましくは本発明で提供されるモノクローナル抗体、特にその抗原結合部位が、Ｆｃレセプターを介した抗原提示機構を増強する、即ちアジュバント効果を発揮するのに有効な量で投与される。有効量は、当業者であれば、例えば動物を使用する試験等に基づき、過度の実験を行なうことなく適宜決定することができる。
【０１１３】
モノクローナル抗体以外の本発明の抗ＨＳＰ９０抗体についても、本発明のモノクローナル抗体と同様に上記アジュバントに用いることができる。
【実施例】
【０１１４】
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
実施例１
本実施例に、抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体及びそれらを産生するハイブリドーマの作製について説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを５０μｇヒトリコンビナントＨＳＰ９０α（長崎大学歯学部  根本孝幸  教授より提供された大腸菌発現ベクターを使用して調製、参考文献 J.Biol.Chem.272:26179-26187、1997）で２回免疫した。アジュバントにはTiterMax  Gold（TiterMax、Georgia、USA）５０μｌを用いた。最終免疫から３日後に免疫マウスより脾臓細胞を取り出し、ポリエチレングリコール４０００により、Ｐ３Ｕ１ミエローマ細胞と１：１の割合で融合した。融合した細胞は、９６穴プレートに５０００個／ウェルになるよう撒き、ＨＡＴ選択培養液（０．１ｍＭヒポキサンチン、０．０１６ｍＭチミジン、０．４ｎＭアミノプテリンを含む、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ）で１０日間培養した。増殖してきた細胞を含むウェルの上清中に存在するＨＳＰ９０αに対する抗体をＥＬＩＳＡ法により検出した。ＨＳＰ９０αに対する抗体を分泌しているハイブリドーマを０．２個／ウェルに撒き直し、さらに１０日間ＨＴ選択培養液（０．１ｍＭヒポキサンチン、０．０１６ｍＭチミジンを含む、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ）で培養した。増殖してきた細胞上清中の抗体はＥＬＩＳＡ法とウエスタンブロット法によりＨＳＰ９０に対する抗体を分泌している事を確かめた。ウェスタンブロット解析の結果を図１Ａに示す。ＤＣ２．４樹状細胞株抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開の後、得られた抗ＨＳＰ９０抗体（２Ａ６Ｅ９（２Ａ６）、６Ｈ８Ｄ２（６Ｈ８）、５Ｈ１２Ｂ７（５Ｈ１２）、４Ｂ６Ｇ１２（４Ｂ６））でブロットした。いずれのモノクローナル抗体も、商業的に入手可能なモノクローナル抗体（レーン５、ＳＰＡ−８４０、Stressgen）により検出されるＨＳＰ９０と対応するサイズの単一のバンドとしてＨＳＰ９０を検出した。
６Ｈ８抗体を産生するハイブリドーマ、及び５Ｈ１２抗体を産生するハイブリドーマを、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託した。それぞれ受託番号FERM BP-11222、FERM BP-11243が付されている（受託日：それぞれ2010年1月13日および2010年3月11日）。【０１１５】
実施例２
本実施例に、本発明の抗体が、細胞表面ＨＳＰ９０発現細胞上の細胞表面ＨＳＰ９０を認識することを説明する。
本発明者らが作製した複数のハイブリドーマから得られた抗ＨＳＰ９０抗体（２Ａ６、６Ｈ８、５Ｈ１２、４Ｂ６）を使用して、ＧＭＣＳＦ依存性骨髄由来樹状細胞（ＧＭＣＳＦ−ＢＭＤＣ）様の樹状細胞株ＤＣ２．４（Dr. Ken Rock、マサチューセッツ工科大学より供与）の細胞膜表面の染色を以下の手順に従って行なった。
（１）ビオチン化試薬EZ-Link（登録商標）Sulfo-NHS-Biotin（21217、タカラバイオ株式会社）１．１ｍｇを純水２５０μｌに溶解した（濃度１０ｍＭ）。抗体タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌに対して、溶解したビオチン化試薬２μｌを加え、氷冷下で２時間反応させた。反応後、Centricon[5k]（ミリポア）を用いて、反応しなかったビオチン試薬を除いた。最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとし、４℃にて保存した。
（２）膜透過処理を施していないＤＣ２．４（１×１０6個／０．１ｍｌ）を、ビオチン化抗ＨＳＰ９０抗体（1μｇ／ｍｌ）と、４℃にて３０分間インキュベートした。陰性対照として、ＤＣ２．４を、抗体を含まないＰＢＳ中で同様にインキュベートした。
（３）未反応の抗体を除去した後、ＤＣ２．４（１×１０6個／０．１ｍｌ）をＰＥ−ｃｙ５ストレプトアビジン（eBioscience、15-4317-82、使用濃度０．５μｇ／ｍｌ）と、４℃にて３０分間インキュベートした。
（４）未反応のＰＥ−ｃｙ５ストレプトアビジンを除去した後、細胞をＦＡＣＳ（Becton Dickinson）により解析した。【０１１６】
図１Ｂ左パネルに示すように、実験に供した抗体のうち、６Ｈ８Ｄ２（６Ｈ８）及び５Ｈ１２Ｂ７（５Ｈ１２）モノクローナル抗体が、細胞表面ＨＳＰ９０を高感度で認識した。図１Ｂ右パネルには、左パネル中のデータの平均蛍光強度（ＭＦＩ）についての棒グラフを示す。【０１１７】
６Ｈ８モノクローナル抗体を使用して、上記方法に従って、以下の抗原提示細胞の染色を行なった；（ｉ）ＤＣ２．４、（ｉｉ）マウスＢＭＤＣ（ＧＭ−ＣＳＦにより誘導）、（ｉｉｉ）マウスＢＭＤＣ（Ｆｌｔ３Ｌにより誘導）、（ｉｖ）ヒトＰＢＭＣ由来未熟ＤＣ（ヒト末梢血ＣＤ１４陽性細胞よりＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４により誘導）、（ｖ）ヒトＢＭＤＣ由来成熟ＤＣ（ヒト末梢血ＣＤ１４陽性細胞よりＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４により誘導し、さらにＴＮＦαにて成熟化）、（ｖｉ）マウス腹腔マクロファージ（プリステン（和光純薬）０．５ｍｌをマウス腹腔内に投与し5日後に腹腔洗浄液として回収した）、（ｖｉｉ）ヒトマクロファージ細胞株Ｊ７７４（ＡＴＣＣ）。図１Ｃ中、灰色部分は、ＰＥ−Ｃｙ５ストレプトアビジンのみでの染色データを陰性対照として示す。図１Ｄには、図１ＣのデータのＭＦＩについての棒グラフを示す。図１Ｃ及びＤに示すように、６Ｈ８抗体は、ヒトＰＢＭＣ由来未熟ＤＣ以外の細胞上の細胞表面ＨＳＰ９０を認識した。【０１１８】
実施例３
本実施例に、抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体のエピトープマッピングについて説明する。
抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体として、実施例１で作製したモノクローナル抗体２Ａ６Ｅ９（２Ａ６）、６Ｈ８Ｄ２（６Ｈ８）、５Ｈ１２Ｂ７（５Ｈ１２）及び４Ｂ６Ｇ１２（４Ｂ６）、並びにＫ４１１０２、Ｋ４１１０７、Ｋ４１３３１及びＫ４１００９（Dr.根本孝幸  長崎大学より供与）を用いた。
エピトープマッピングは、ビオチン化オーバーラッピングペプチドを使用して行なった。ビオチン化オーバーラッピングペプチドは、公知文献（J. Immunological Methods 2002;267:27-35.）に記載の方法に従って作製した。全長１２アミノ酸の４アミノ酸の重なりを有する合成ペプチドライブラリーを用いて実施した。
アビジンでコートしたプレートをＢＳＡでブロッキングした後、上記ビオチン化オーバーラッピングペプチド（１．２５−３．７５ｍｇ／ｍｌ）を加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、未反応のビオチン化オーバーラッピングペプチドを除去した。各抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）を加え、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、未反応の抗体を除去した後、抗マウスＩｇＧ−ＡＬＰ（BD Pharmingen、２０００倍希釈にて使用）を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、未反応の抗マウスＩｇＧ−ＡＬＰを除去した後、ｐＮＰＰ溶液（ＫＰＬ、１ｍｇ／ｍｌ）を加えて室温にて３時間インキュベートし、発色させた。発色後のプレートのＯＤ４０５ｎｍを測定した。
図２Ａ及びＢ左パネルにおいて、横軸は、マウスのＨＳＰ９０αのアミノ酸番号を示し、縦軸はＥＬＩＳＡアッセイにより得られたＯＤ４０５の相対値を示す。各抗ＨＳＰ９０モノクローナル抗体によりマッピングされた領域を、ＨＳＰ９０α上のアミノ酸番号範囲として示す。６Ｈ８Ｄ２（６Ｈ８）によって認識されるエピトープは、ＨＳＰ９０α713-724（ＨＳＰ９０β704-715に対応）にマッピングされ、５Ｈ１２Ｂ７（５Ｈ１２）によって認識されるエピトープは、ＨＳＰ９０α641-652（ＨＳＰ９０β632-643に対応）にマッピングされた。【０１１９】
図２Ａ及びＢ右パネルには、実施例２と同様に各モノクローナル抗体で染色したＤＣ２．４細胞についてのＦＡＣＳデータ（ヒストグラム）を示す。【０１２０】
図２Ｃには、エピトープマッピングの結果をまとめて図示する。対応するモノクローナル抗体によってＤＣ２．４細胞の細胞表面上で検出された、及び検出されなかった認識部位を、それぞれ斜線ボックス及び灰色ボックスで表す。【０１２１】
本実施例から、６Ｈ８抗体によって認識されるエピトープは、マウスＨＳＰ９０α713-724（ＨＳＰ９０β704-715に対応）に位置することがわかった。かかる領域はヒトＨＳＰ９０α712-723（ＨＳＰ９０β704-715に対応）に相当する。ＨＳＰ９０α及びβ上のエピトープの相同性は６６．７％であり、１２アミノ酸のうち８アミノ酸が同一であるに過ぎないが、残り４アミノ酸は同じカテゴリーに分類されるアミノ酸である。ＨＳＰ９０α713-724は、Ｃ末端近傍に位置し、この領域は、柔軟性が高すぎるためＸ線結晶構造解析において結晶化しない。同様にＣ末端近傍に位置するエピトープを認識する２Ａ６Ｅ９抗体及びＫ４１００９抗体は、それぞれマウスＨＳＰ９０α722-733及びマウスＨＳＰ９０α702-716をエピトープとし、マウスＨＳＰ９０α713-724と重複する領域を認識するが、細胞表面ＨＳＰ９０を認識しなかった。これらの結果より、これらのエピトープが２Ａ６Ｅ９抗体やＫ４１００９抗体によって認識されるのを妨げるような、細胞表面においてＨＳＰ９０と複合体を形成する未知の分子が存在する可能性が示唆される。【０１２２】
実施例４
本実施例に、本発明の抗体が、細胞表面ＨＳＰ９０の２つのアイソフォーム、ＨＳＰ９０α及びβの両方に結合することについて説明する。
まずＤＣ２．４細胞の細胞表面をビオチン化した。ビオチン化は、Pierce EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC（Thermo scientific、21338）を使用し、同試薬添付のインストラクションに従って行なった。細胞膜を細胞分画抽出キット（sub-cellular extraction kit）（Calbiochem）により調製し、２Ａ６Ｅ９抗体を使用して免疫沈降を実施した。沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ＨＳＰ９０α及びβの両方を認識する抗体（実施例１で得られた別の抗体である６Ｂ１Ｃ４）又はアビジン−ＨＲＰを使用してブロッティングを行なった（図３Ａ）。【０１２３】
図３Ａに示すように、２Ａ６Ｅ９抗体により免疫沈降され（６Ｂのレーン）、かつビオチン化された（Ａｖｉ．のレーン）、ＨＳＰ９０が検出され、ＤＣ２．４細胞表面にＨＳＰ９０が発現していることが示された。【０１２４】
哺乳動物ＨＳＰ９０には、二つのアイソフォーム、ＨＳＰ９０α及びβが存在する。本発明の抗体によってＨＳＰ９０αのみならず、ＨＳＰ９０βも認識されているか否かを以下の実験により確認した。まず、６Ｈ８、２Ａ６、及び陰性対照として正常マウスＩｇＧを使用して、ＤＣ２．４生細胞を氷上にて各抗体とインキュベートした。未反応の抗体を除去するために十分に洗浄した後、細胞を溶解し、該溶解物を１０，０００×ｇで遠心分離し、得られた上清をプロテインＧ−セファロースとインキュベートした。結合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ＨＳＰ９０α抗体（SPS-771、Assay designs）、抗ＨＳＰ９０β抗体（PB-118-P1、Neomarkers）、並びにＨＳＰ９０α及びβの両方を認識する抗体（実施例１で得られた別の抗体である６Ｂ１Ｃ４）を使用してブロッティングを行った。【０１２５】
図３Ｂに示すように、ＨＳＰ９０α及びβの両方が細胞表面に存在し、６Ｈ８によって、認識されることが示された（図３Ｂ中、６Ｈのレーン）。一方、図３Ａにおいて細胞分画後の膜画分中のＨＳＰ９０を認識・免疫沈降した２Ａ６Ｅ９は、生細胞上では細胞表面ＨＳＰ９０α及びβのいずれも認識しなかった（図３Ｂ中、２Ａのレーン）。したがって、本発明の抗体は、生細胞の細胞表面ＨＳＰ９０の分析に使用可能である点で、既存の抗体に比べて優れている。【０１２６】
実施例５
本実施例に、本発明の抗体が、細胞表面ＨＳＰ９０の研究においても有用であることを説明する。
上記した実施例から、細胞質シャペロンであるＨＳＰ９０がＡＰＣの細胞表面に発現する機構が存在することが明らかになった。ＨＳＰ９０は、自身を細胞膜や分泌経路へと標的化するためのシグナル配列を有さないため、細胞表面に移行するためには、非従来型分泌経路を通じて細胞表面に出る未知の分子と結合する必要がある。
そこで、ＨＳＰ９０特異的阻害剤であるラディシコール及びノボビオシンの、細胞表面ＨＳＰ９０の発現への影響を調べた。ＤＣ２．４細胞を、ＯＶＡ（図４Ａ中、ｉ；１ｍｇ／ｍｌ）、ラディシコール（図４Ａ中、ｉｉ；２５μＭ）又はノボビオシン（図４Ａ中、ｉｉｉ；４００μＭ）の存在下、５％ＣＯ2中で３７℃にて３時間インキュベートした。次いで、細胞を氷上で冷却し、細胞表面ＨＳＰ９０を検出するために、６Ｈ８抗体で染色した後、ＦＡＣＳにより解析した。図４Ａに示すように、ＨＳＰ９０特異的阻害剤であるラディシコール及びノボビオシンは、表面ＨＳＰ９０の発現レベルにほとんど又は全く影響を与えなかった。ＨＳＰ９０阻害剤であるラディシコール及びノボビオシンによる処理が、表面ＨＳＰ９０の発現に影響を与えなかったことは、細胞表面におけるＨＳＰ９０と、ＨＳＰ９０を細胞表面へ移行させる分子との結合様式がこれらの阻害剤に抵抗性であることを示しており、したがって、ＨＳＰ９０は通常のクライアントタンパク質ではない分子と結合することによって、細胞表面への移行を指示されている可能性がある。【０１２７】
サイトカインが細胞表面ＨＳＰ９０発現の変動因子である可能性を考え、種々のサイトカインの細胞表面ＨＳＰ９０発現への影響を以下のように調べた。ＤＣ２．４細胞及びマウスＧＭＣＳＦ依存ＢＭＤＣを、ＩＦＮα（５００Ｕ／ｍｌ）、ＩＦＮβ（５００Ｕ／ｍｌ）、若しくはＩＦＮγ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下（図５Ａ中、太線）又は非存在下（図５Ａ中、細線）、５％ＣＯ2中で３７℃にて２４時間インキュベートし、６Ｈ８抗体を用いて染色した細胞表面ＨＳＰ９０をＦＡＣＳにより解析した。その結果、培養液へのＩＦＮα、β、γの添加により、細胞表面ＨＳＰ９０発現が増加することを確認した（図５Ａ）。なお、灰色部分は、ＰＥ−Ｃｙ５のみによる染色の結果を陰性対照として示す。
また図５Ｂには、異なる濃度のＩＦＮα、β、γにより処理した結果を示す。黒色棒は、図５Ａにおけるサイトカイン処理した細胞についてのＭＦＩを示し、灰色棒は、低濃度のＩＦＮα（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＦＮβ（１００Ｕ／ｍｌ）、又はＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下でインキュベートした細胞についてのＭＦＩを示す。白色棒は、サイトカイン非存在下でのＭＦＩを陰性対照として示す。
図５Ｃには、種々のサイトカインにより、上記の実験と同様にＢＭＤＣを処理した結果を示す。黒色棒は、高濃度のＩＦＮ（図５Ｂと同様）、又は他のサイトカイン（１００ｎｇ／ｍｌ）存在下でインキュベートしたＢＭＤＣについてのＭＦＩを示し、灰色棒は、低濃度のＩＦＮ（図５Ｂと同様）、又は他のサイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下でインキュベートしたＢＭＤＣについてのＭＦＩを示す。白色棒は、サイトカイン非存在下でのＢＭＤＣについてのＭＦＩを陰性対照として示す。ＩＬ−３、４、５、６、１０、１２、１５、１８、２３による処理では、陰性対照に対して有意な差は認められなかった。【０１２８】
実施例６
本実施例に、本発明の抗体による細胞表面ＨＳＰ９０の内部移行について説明する。
以下の方法により、６Ｈ８抗体により認識された後の６Ｈ８−ＨＳＰ９０複合体の挙動を調べた。まずＤＣ２．４細胞を、ビオチン化６Ｈ８（１μｇ／ｍｌ）の存在下、氷上で３０分間インキュベートし、洗浄した。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ2下で、０、１０、２０、３０、又は６０分間インキュベートした。氷上で冷却した後、細胞をＰＥ−Ｃｙ５−ストレプトアビジンで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。結果を図４Ｂ左パネルに示し、右パネルには、各群のＭＦＩについての棒グラフを示す。６Ｈ８−ＨＳＰ９０複合体は、非常に短い時間（すなわち１０分程度）で、細胞表面から消失すること（細胞内へ移行すること）が見出された。【０１２９】
さらに、免疫染色により、ＨＳＰ９０の挙動を、ＭＨＣクラスＩ分子であるＨ−２Ｋb及びＭＨＣクラスＩＩ分子であるＩ−Ａbの挙動と比較した。まずＤＣ２．４細胞を、ビオチン化６Ｈ８抗体、及びＦＩＴＣ標識抗Ｈ−２Ｋb抗体又は抗Ｉ−Ａb抗体（Pharmingen、１００倍希釈した抗体で使用）の存在下、上記方法と同様にインキュベートした。細胞をＰＥ−Ｃｙ５−ストレプトアビジンで染色し、室温に移して２０分間インキュベートした後、共焦点顕微鏡により観察した。図４ＣにＨＳＰ９０及びＨ−２Ｋbの結果を、図４ＤにＨＳＰ９０及びＩ−Ａbの結果をそれぞれ示す。６Ｈ８抗体によって細胞表面ＨＳＰ９０が内部移行することが確認された。【０１３０】
実施例７
本実施例に、本発明の抗体にコンジュゲートした外来性抗原をＣＤ８+Ｔ細胞へとクロスプレゼンテーションさせることが可能であることを説明する。
実施例６の結果は、６Ｈ８抗体が抗原を効率よく細胞内に導入するアジュバントとして使用できる可能性を示す。そこで、モデル抗原として卵白アルブミン（Ovalbumin：ＯＶＡ）を使用して、６Ｈ８抗体のアジュバント能の検討を行なった。
Imject maleimide-activated ＯＶＡは、Thermo scientific（Rockford、USA）から入手した。６Ｈ８  ｍＡｂ（５ｍｇ／ｍｌ）（５０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１ｍｌを、１０μｌのＳＡＴＡ溶液（６．５ｍｇのN-Succinimidyl S-acetylthioacetateを５００μｌのＤＭＳＯに溶解）と室温で３０分間反応させた。30,000MW cut-off centrifugal filter（ミリポア）で３回遠心洗浄後、１ｍｌになるよう調整し、１００μｌの０．５Ｍヒドロキシルアミンを加えて室温にて２時間反応させた。これをmaleimide-activated ＯＶＡと１：１．５の比率で９０分間反応させて、１０ｍＭ（最終濃度）２−ＭＥを加えて反応を止めた。
６Ｈ８抗体及びマレイミド化ＯＶＡの反応液を、Superose6カラム（GE Healthcare）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーに供し、コンジュゲートを未反応のタンパク質から分離した。サイズ排除クロマトグラフィーはSuperose6カラム、AKTA purifier（GE Healthcare）を用いて行い、移動相にはＰＢＳを使用し、流速は０．５ｍｌ／分とした。分取は０．５ｍｌ／フラクションで行なった。図６Ａに、クロマトグラムを示す。以上の操作により、フラクション１から５０を得た。【０１３１】
抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（６Ｈ８抗体を検出）及びビオチン化抗ＯＶＡモノクローナル抗体（ＯＶＡを検出）を使用してイムノブロッティングを行なうことにより、各フラクションの分子量プロファイルを確認した（図６Ｂ）。フラクション１５から１９には、高分子の６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートが含まれていること、フラクション３３には、コンジュゲート化されていないＯＶＡが含まれており、６Ｈ８抗体は含まれていないことを確認した。【０１３２】
各フラクションを抗原として使用し、クロスプレゼンテーションアッセイを行なった。ＤＣ２．４細胞を、５μｇ／ｍｌの各フラクション（フラクション３３のみ３０μｇ／ｍｌ）又は１ｍｇ／ｍｌの遊離ＯＶＡで３時間パルスした。パラホルムアルデヒドを使用して固定した後、ＤＣ２．４細胞（１×１０4個／ウェル）を、９６穴丸底プレートにて、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞（１×１０5個／ウェル：ＯＴ−Iマウスの脾臓細胞を回収し、標準的プロトコールに従ってBD IMag anti mouse CD11b magnetic particles DM（BD Biosciences Pharmingen、558013）を使用してCD11b陽性細胞を除去した。次いで標準的プロトコールに従ってBD IMag anti mouse CD8a particles DM（BD Biosciences Pharmingen、551516）を使用してＣＤ８ａ陽性細胞を精製した。得られた細胞をＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞として使用した）と共培養した。２４〜７２時間後、培養上清を集め、ＩＦＮγ量を測定した。図６Ｃに示すように、高分子の複合体（すなわち６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲート）を含むフラクション１５〜２１をパルスしたＤＣ２．４細胞は、効率良くＣＤ８+Ｔ細胞のＩＦＮγ産生を誘導した。これらのフラクションのパルスに使用したタンパク質量（６Ｈ８抗体とマレイミド化ＯＶＡとの合計量）は、いずれも５μｇ／ｍｌ以下であり、陽性対照（ＯＶＡ）に含まれるＯＶＡ量の１／２００以下であった。【０１３３】
さらに、細胞表面ＨＳＰ９０を欠くＤＣ２．４Ｌ細胞（６Ｈ８抗体にて検出され、且つ細胞表面ＨＳＰ９０及びＨ−２Ｋbの発現が低下した株；ＤＣ２．４の培養途中に得られ、継続培養により樹立された株）を使用して、６Ｈ８−ＯＶＡの細胞表面ＨＳＰ９０に対する特異性を調べた。ＤＣ２．４及びＤＣ２．４Ｌ細胞を、６Ｈ８−ＯＶＡを含むフラクション１５〜１９（混合物）（３０μｇ／ｍｌ）とインキュベートし、その後ビオチン化抗ＯＶＡモノクローナル抗体及びＰＥ−Ｃｙ５ストレプトアビジンにより染色し、ＦＡＣＳ解析を行なった。図６Ｄに示すように、細胞表面ＨＳＰ９０を発現するＤＣ２．４細胞（左上パネル）は、抗ＯＶＡモノクローナル抗体に認識された（右上パネル）。予想通り、細胞表面ＨＳＰ９０を欠くＤＣ２．４Ｌ細胞（左下パネル）は、ＯＶＡモノクローナル抗体に認識されなかった（右下パネル）。この結果は、６Ｈ８−ＯＶＡが、ＯＶＡを結合していてもＨＳＰ９０特異的抗体として働くことを示している。【０１３４】
次いで、段階的用量の６Ｈ８−ＯＶＡ（フラクション１５〜１９）及び遊離ＯＶＡ（フラクション３３）を、ＤＣ２．４細胞にパルスし、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞及びＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４+Ｔ細胞（ＯＴ−ＩＩマウスの脾臓細胞を回収し、標準的プロトコールに従ってBD IMag anti mouse CD11b magnetic particles DM（BD Biosciences Pharmingen、558013）を使用してＣＤ１１ｂ陽性細胞を除去した。次いで標準的プロトコールに従ってBD IMag anti mouse CD4 particles DM（BD Biosciences Pharmingen、551539）を使用してＣＤ４陽性細胞を精製した。得られた細胞をＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４+Ｔ細胞として使用した）とインキュベートし、Ｔ細胞から分泌されたＩＦＮγ量を測定することにより、６Ｈ８−ＯＶＡのクロスプレゼンテーション能力を評価した。その結果、６Ｈ８−ＯＶＡは、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞に対して遊離ＯＶＡよりも少なくとも１００倍高い効果を示した（図６Ｅ、上パネル）。ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞の活性化とは対照的に、ＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４+Ｔ細胞に対する抗原提示は、遊離ＯＶＡよりは良好だったものの、弱かった（図６Ｅ、下パネル）。【０１３５】
実施例８
本実施例に、本発明の抗体にコンジュゲートした外来性抗原のクロスプレゼンテーションが、細胞表面ＨＳＰ９０を介して行なわれていることを説明する。
ＤＣ２．４細胞(１．５×１０6個)の細胞ペレットを、２０μｇ／ｍｌの抗体（６Ｈ８Ｄ２（６Ｈ８）、２Ａ６Ｅ９（２Ａ６）又は４Ｂ６Ｇ１２（４Ｂ６））で３７℃、５％ＣＯ2中で１５分間インキュベートした。その後６Ｈ８−ＯＶＡを３又は１μｇ／ｍｌになるよう加え、３７℃、５％ＣＯ2中で３時間インキュベートした。未反応の抗体及び６Ｈ８−ＯＶＡを除去するために洗浄を行なった後、細胞を０．５％パラホルムアルデヒドで固定した。この細胞１×１０4個を、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞１×１０5個と、９６穴丸底プレート内で３７℃、５％ＣＯ2中で共培養し、適宜上清を回収し、ＩＦＮγを標準的ＥＬＩＳＡ法で測定した。
図７に示すように、６Ｈ８−ＯＶＡによるクロスプレゼンテーション効果は、あらかじめ６Ｈ８でＤＣ２．４細胞を処理しておくと減弱したが、２Ａ６Ｅ９、４Ｂ６Ｇ１２抗体では全く抑制されなかった。この結果は、６Ｈ８抗体が細胞表面ＨＳＰ９０に結合したことにより、クロスプレゼンテーションが阻害されたことを示す。すなわち、本発明の抗体にコンジュゲートした外来性抗原のクロスプレゼンテーションは、細胞表面ＨＳＰ９０を介して行なわれていることを示す。【０１３６】
実施例９
本実施例に、６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートがインビボにおいてＣＤ８+Ｔ細胞活性化能を有することを説明する。
まずＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞を以下のように作製した：ＤＭＳＯに溶解した１０ｍＭ  ＣＦＳＥストック溶液をＰＢＳで希釈して１０μＭ  ＣＦＳＥ溶液を調製した。１５ｍｌチューブ内に調製した脾臓細胞のペレットを、タッピングによりよくほぐした後、ここに１０μＭ  ＣＦＳＥ溶液を２ｍｌ加え、軽くボルテックスにかけた。室温で５分間静置した後、ＰＢＳ（５ｍｌ）で２回洗浄を行なった。
ＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞を、被移植マウスに尾静脈から移植した。被移植マウスとしては野生型Ｂ６マウス（ＷＴ  Ｂ６）とＴＡＰ１欠損マウス（ＴＡＰ１  ＫＯ（米国、Jackson Laboratoryより購入））を用いた。同時に、３μｇのフラクション１５〜１９（混合物）、３μｇのフラクション３３、又はフラクション３３（３μｇ）と遊離６Ｈ８抗体（３μｇ）との混合物を注射した。３日後、被移植マウスの脾細胞を集め、移植細胞の増殖を調べた。その結果、フラクション１５〜１９（混合物）を投与したマウスにおいて、ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖が確認された（図８Ａ）。一方、ＴＡＰ１欠損マウスにおいては、フラクション１５〜１９（混合物）はＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を全く誘導しなかった（図８Ｂ）。このことは６Ｈ８−ＯＶＡのクロスプレゼンテーションがＴＡＰ分子に依存性であることを示す。【０１３７】
また、６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートを含むフラクション１５〜１９の混合物を、被移植マウスに段階的用量で注射し、上記と同様にＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を調べた。その結果、より高用量の該混合物は、ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖をより強く促進したが、その効果は０．１μｇでも見られた（図８Ｃ上パネル）。一方、ＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４+Ｔ細胞の分裂の促進には、より高用量の６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートが必要であった（図８Ｃ下パネル）。以上の結果は、６Ｈ８抗体にコンジュゲートしたＯＶＡが、ＭＨＣクラスＩ抗原提示経路に送達され、ＣＤ８+Ｔ細胞へ提示され、その結果ＣＤ８+Ｔ細胞が活性化したことを示す。【０１３８】
さらに、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞の分裂は、インビボでのクロスプライミングを必ずしも意味しないことから、６Ｈ８−ＯＶＡ（マウス当たり３μｇ）でマウスを免疫することで、ＯＶＡ257-264主要エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を生じるか否かを調べた。マウスを１週間の間隔で２回免疫し、２回目の免疫の１週間後に、脾臓細胞をＯＶＡ257-264ペプチド存在下で５日間培養し、生じた細胞障害性Ｔ細胞を、四量体（テトラマー）染色（T-Select H-2Kb OVA Tetramer-SIINFEKL-PE（MBL、TS5001-1、使用量１test／tube）で室温にて３０分間、Ｔ細胞を染色した）及び標準51Ｃｒ放出アッセイ（マウス腫瘍細胞Ｅ．Ｇ７（米国ワシントン大学  Dr.Michael Bevanより供与、参考文献 Cell vol 54:777-785 1988）及びＥＬ４（ＡＴＣＣより購入）、各２×１０6個をsodium 51Ｃｒ ５０マイクロキュリーでラベルし、これを標的細胞とした。５×１０3個の標的細胞に対し図８Ｅに示したごとく細胞障害性Ｔ細胞を加え、４時間培養後の上清遊離51Ｃｒを測定することにより障害活性を算出した。ＥＬ４細胞はペプチドＯＶＡ257-264をパルスしたものとしないものを準備した）によりモニターした。６Ｈ８−ＯＶＡによる免疫は、ＦＡＣＳ解析の結果から示されるように、四量体陽性細胞を生じ（図８Ｄ）、ＯＶＡ257-264エピトープに対する細胞傷害性も見られた（図８Ｅ）。これらの結果から、６Ｈ８と抗原との複合体により免疫することで、抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞を生じ得ることが示された。【０１３９】
すなわち、本発明のワクチンは、本発明の抗体にコンジュゲートした抗原をＣＤ８+Ｔ細胞へとクロスプレゼンテーションさせることが可能である（図２３）。また該抗原として腫瘍抗原を選択すれば、本発明のワクチンは腫瘍の転移の抑制に有効であり得る。【０１４０】
実施例１０
本実施例に、インビボにおいてＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を誘導する６Ｈ８−ＯＶＡコンジュゲートの活性を、６Ｈ８抗体が増強することを説明する。
６Ｈ８抗体又はＩｇＧ２ａ（正常マウスＩｇＧ２ａ（ｎｍＩｇＧ２ａ）、２０μｇ）を２００μｌのＰＢＳで希釈し、尾静脈からＢ６マウスに投与した。コントロールとしてＰＢＳ投与群も作製した。
その後、ＣＦＳＥラベルしたＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞（１．５×１０6個）を２００μｌのＲＰＭＩに懸濁し、尾静脈から投与した。同時に２００μｌのＰＢＳで希釈した６Ｈ８−ＯＶＡ（０．３μｇ）を尾静脈から投与した。コントロールとしてＰＢＳ投与群も作製した。
７２時間後、被投与マウスから脾臓細胞を回収し、FACS Calibur（BD Biosciences）にてＣＦＳＥ強度の減衰を測定し、移入細胞の増殖を確認した。
図９に示すように、６Ｈ８抗体をあらかじめ投与した場合、６Ｈ８−ＯＶＡによるＣＤ８+Ｔ細胞の増殖促進効果が増強された。【０１４１】
実施例１１−１
本実施例に、マウスに投与したＡｌｅｘａ４８８標識６Ｈ８抗体が、脾臓においてＣＤ１１ｂ+モノサイトに集積することを説明する。
まずＡｌｅｘａ４８８標識６Ｈ８抗体を、Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit（Invitrogen、Molecular probes、A10235）を用いて標準的プロトコールに従って作製した。
Ａｌｅｘａ４８８標識６Ｈ８抗体（２０μｇ）を２００μｌのＰＢＳで希釈し、尾静脈からＢ６マウスに投与した。３時間後、被投与マウスから脾臓を回収し、以下のようにCollagenase処理を行なった：Collagenase（４００Ｕ／ｍｌ、Wako、032-10534）、DNase（１５μｇ／ｍｌ、Roche、10401600）を含むＲＰＭＩ（１０ｍｌ）を６ｃｍディッシュに加え、この中で脾臓を良くほぐした。その後３７℃、５％ＣＯ2中で１０分間インキュベートした。パスツールピペットで撹拌した後、最終濃度が５ｍＭになるようＥＤＴＡを加え、３７℃、５％ＣＯ2中でさらに５分間インキュベートした。その後、ＲＰＭＩ（５ｍｌ）で２回洗浄を行った。
Collagenase処理後、赤血球を破砕した。試料を、マウスＩｇＧ（SIGMA、I5381、１０μｇ／ｍｌ）を用いて氷冷下で３０分間ブロッキングした（１００μｌ／１０6個）。その後、各種抗体（PE-Cy5 conjugate Anti-Mouse CD11b：（eBiosciences、15-0112-81、０．２μｇ／ｍｌ）、PE conjugate Anti-mouse/human CD45（B220）：（eBiosciences、12-0452-81、１μｇ／ｍｌ）、PE anti-mouse CD11c（HL3）（Integrin αx chain）：（BD Pharmingen、553802、１μｇ／ｍｌ））を用いて氷冷下で３０分間染色し（１００μｌ／１０6個）、FACS Caliburにて解析を行なった。
６Ｈ８抗体は、インビボでは活性化樹状細胞、マクロファージなどに結合すると考えられるが、図１０Ａに示すように、投与したＡｌｅｘａ４８８標識６Ｈ８抗体は、とりわけＣＤ１１ｂ+モノサイトに結合した。したがって、６Ｈ８抗体結合性モノサイトが抗原提示細胞として直接Ｔ細胞を活性化している可能性、あるいはモノサイトから一旦抗原が樹状細胞に受け渡しされ、樹状細胞がＴ細胞を活性化している可能性などが考えられる。【０１４２】
実施例１１−２
本実施例に、マウスに投与したＡｌｅｘａ６４７標識６Ｈ８抗体が、脾臓において樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性）とりわけＣＤ８α陽性樹状細胞に集積することを説明する。
まずＡｌｅｘａ６４７標識６Ｈ８抗体を、Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit（Invitrogen、Molecular probes、A20173）を用いて標準的プロトコールに従って作製した。
Ａｌｅｘａ６４７標識６Ｈ８抗体（３０μｇ）を２００μｌのＰＢＳで希釈し、尾静脈からＢ６マウスに投与した。１．５時間後（又は３時間後）に、被投与マウスから脾臓を回収し、以下のようにCollagenase処理を行なった：Collagenase（４００Ｕ／ｍｌ、Wako、032-10534）、DNase（１５μｇ／ｍｌ、Roche、10401600））を含むＲＰＭＩ（１０ｍｌ）を６ｃｍディッシュに加え、この中で脾臓を良くほぐした。その後３７℃、５％ＣＯ2中で１０分間インキュベートした。パスツールピペットで撹拌した後、最終濃度が５ｍＭになるようＥＤＴＡを加え、３７℃、５％ＣＯ2中でさらに５分間インキュベートした。その後、ＲＰＭＩ（５ｍｌ）で２回洗浄を行った。
Collagenase処理後、赤血球を破砕した。試料を、マウスＩｇＧ（SIGMA、I5381、１０μｇ／ｍｌ）を用いて氷冷下で30分間ブロッキングした（１００μｌ／１０6個）。その後、各種抗体（PE-Cy5 conjugate Anti-Mouse CD11b：（eBiosciences、15-0112-81、０．２μｇ／ｍｌ）、PE conjugate Anti-mouse/human CD45（B220）：（eBiosciences、12-0452-81、１μｇ／ｍｌ）、PE anti-mouse CD11c（HL3）（Integrinαx chain）：（BD Pharmingen、553802、１μｇ／ｍｌ）、PE anti-mouse CD8α（Ly-2）（Integrinαx chain）：（BD Pharmingen、12-0081、１μｇ／ｍｌ）を用いて氷冷下で３０分間染色し（１００μｌ／１０6個）、FACS Cantoにて解析を行なった。
６Ｈ８抗体は、インビボでは活性化樹状細胞、マクロファージなどに結合すると考えられるが、図１０ＡのＲ２領域に相当する領域を詳細に検討した。その結果、図１０Ｂに示すように、投与したＡｌｅｘａ６４７標識６Ｈ８抗体は、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性）に取り込まれた。また、図１０Ｃに示すように、とりわけＣＤ８α陽性樹状細胞に結合した。したがって、ＣＤ８α陽性樹状細胞が抗原提示細胞としてＴ細胞を活性化している可能性が考えられる。【０１４３】
実施例１２
本実施例に、本発明のモノクローナル抗体が、Ｆｃレセプターを介したクロスプレゼンテーション機構を促進すること、即ち優れたアジュバントとしても有用であることを説明する。
実施例９で説明したインビボにおけるクロスプレゼンテーションアッセイと同様の以下の方法により、フリーの６Ｈ８抗体存在下での、ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を調べた。
（１）ＣＦＳＥラベルしたＯＴ−Ｉ／ＣＤ４５．１マウスのＣＤ８+Ｔ細胞を、被移植マウスに尾静脈より移入し、同時に６Ｈ８−ＯＶＡ（若しくは６Ｈ８（Ｆ（ａｂ’）2）−ＯＶＡ、又はＯＶＡ、又はＩｇＧ２ａ−ＯＶＡ）（０．３μｇ）及びフリーの６Ｈ８抗体（若しくは６Ｈ８（Ｆ（ａｂ’）2）、又はＩｇＧ２ａ）（３０μｇ）を尾静脈より投与した。
（２）７２時間後にマウス脾臓を回収し、９６穴丸底プレート内で、２×１０6個の脾臓細胞をＰＥ−ＣＤ４５．１抗体で３０分間染色した（氷冷）。
（３）FACS Canto（ＢＤ）を用いて、ＣＤ４５．１陽性細胞（ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞）のＣＦＳＥ強度を測定した。
結果を図１１に示す。０．３μｇの６Ｈ８−ＯＶＡを投与した場合、養子移入したＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞は軽微の増殖反応を示したが、同時に６Ｈ８抗体又は６Ｈ８（Ｆ（ａｂ’）2）抗体を投与すると、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖反応は著しく増強された。それに対して、６Ｈ８（Ｆ（ａｂ’）2）−ＯＶＡ又はＯＶＡを投与した場合、６Ｈ８抗体によるＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖反応増強効果は認められなかった。またＩｇＧ２ａ−ＯＶＡを投与した場合には、６Ｈ８抗体による増強効果が認められた。
以上の結果から、本発明のモノクローナル抗体の樹状細胞への結合は、Ｆｃレセプターを介したクロスプレゼンテーション機構を促進すると結論される。さらに、上記の結果は、本発明のモノクローナル抗体からの刺激がＦｃレセプターからの刺激と交錯することを示唆しており、例えばＦｃＲγサブユニットを介して、共通のシグナルカスケードが活性化されていることが考えられる（図１２Ａ及びＢ）。【０１４４】
実施例１３
本実施例に、細胞表面へのＨＳＰ９０の発現がＦｃＲγに依存性であることを説明する。
図１２に提示したモデルを検証するために、ＧＭ−ＣＳＦ依存性ＢＭＤＣを用いて、以下の実験を行なった。【０１４５】
１．細胞表面ＨＳＰ９０の発現：
（１）正常マウス及びＦｃＲγＫＯマウス（筑波大学大学院  人間総合科学研究科  生命システム医学専攻  免疫制御医学分野  渋谷彰教授より供与を受けた）から、以下の方法により骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）を樹立した：マウス大腿骨及び脛骨より骨髄を回収し、各１ｘ１０6個の細胞を２４ウェルプレートで培養した。培養には、リコンビナントマウスＧＭＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）２０ｎｇ／ｍｌを含むコンプリートＲＰＭＩを２ｍｌ／ウェルで使用した。培地の半量を、培養３日目に新鮮な培地と交換し、培養５日目にＢＭＤＣとして使用した。
（２）ＧＭ−ＣＳＦ依存性に誘導したＤａｙ５のＢＭＤＣを、ビオチン−６Ｈ８（２．５μｇ／ｍｌ）及びストレプトアビジン−ＡＰＣ（０．２μｇ／ｍｌ）で染色し、FACS Canto（BD）を用いて蛍光を測定した。
結果を図１３に示す。細胞表面ＨＳＰ９０（図１３中、ＨＳＰ９０）は、正常マウス由来樹状細胞（ＷＴ  Ｂ６）では発現が認められたが、ＫＯマウス由来樹状細胞（ＦｃＲγＫＯ）では完全に消失していた。【０１４６】
２．インビトロクロスプレゼンテーションアッセイ：
（１）ＧＭ−ＣＳＦ依存性に誘導したＤａｙ５のＢＭＤＣ  １×１０6個分の細胞ペレットを、１５ｍｌチューブ中に調製した。ここに抗原（６Ｈ８−ＯＶＡ、ＯＶＡ、又はＯＶＡ257-264）４００μｌを加え、５％ＣＯ2中で３７℃にて３時間インキュベートした。細胞を０．５％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．１Ｍグリシンで洗浄し、更にＲＰＭＩで洗浄した後、１×１０5個／ｍｌに調整した。
（２）並行して、ＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞を精製し、１×１０6個／ｍｌに調整した。
（３）上記処理を施したＢＭＤＣ１×１０4個及びＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞１×１０5個を９６穴丸底プレート内で共培養した。
（４）適宜上清を回収し、ＩＦＮγの産生量をＥＬＩＳＡ法で測定した。
結果を図１４に示す。６Ｈ８−ＯＶＡについてのＦｃＲγＫＯマウス由来樹状細胞（ＦｃＲγＫＯ）のクロスプレゼンテーション能は、正常マウス由来樹状細胞（ＷＴ  Ｂ６）と比較して、有意に低下していることが明らかになった。一方、ＯＶＡ又はＯＶＡ257-264については、ＫＯマウス由来樹状細胞は、正常マウス由来樹状細胞と同等のクロスプレゼンテーション能を示した。
さらにインビボにおいてＯＴ−Ｉ  ＣＤ８陽性細胞の増殖反応も、ＦｃＲγＫＯマウスでは有意に低下した（データ示さず）。
以上の結果から、細胞表面へのＨＳＰ９０の発現がＦｃＲγに依存性であること、及び本発明のワクチンが機能する上でＦｃＲγが重要な役割を果たすことが示された（図２４）。【０１４７】
実施例１４
本実施例に、本発明のワクチンの投与により、インビボにおいてメモリーＴ細胞への分化が誘導されることを説明する。
メモリーＴ細胞は、免疫記憶に関わるＴ細胞であり、一度ある抗原に感作された生体内で生じた後、長期間生体内に留まり、同一抗原による再度の刺激に対して速やかに免疫応答を引き起こす。従って、ワクチンの投与によってメモリーＴ細胞への分化が起こることは、当該ワクチンの効果がより長期間持続することを意味する。
本発明のワクチンの投与によってメモリーＴ細胞が誘導される可能性を調べるために、以下の方法により実験を行なった。
（１）ＯＴ−Ｉ／ＣＤ４５．１マウスのＣＤ８+細胞２×１０6個を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈より移入し、同時に３μｇの６Ｈ８−ＯＶＡ又はＰＢＳを尾静脈より投与した。
（２）９６時間後にマウス脾臓を回収し、９６穴丸底プレート内で２×１０6個の脾臓細胞を以下の抗体で３０分間染色した（氷冷）。
・ＰＥ−抗マウス／ヒトＣＤ４４（eBioscience: Cat No. 12-0041）  濃度１μｇ／ｍｌ、使用量１００μｌ。
・ビオチン−抗ＣＤ４５．１（eBioscience: 13-0453）  濃度２．５μｇ／ｍｌ、使用量１００μｌ。
（３）ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を以下の抗体で３０分間染色した（氷冷）。
・ストレプトアビジン−ＡＰＣ（BioLegend: 405207）  濃度０．２μｇ／ｍｌ、使用量１００μｌ。
（４）Annexin結合バッファーで２回洗浄した後、Annexin V FITC reagentを使用してFITC-Annexin Vで１０分間染色した（氷冷）。
・Annexin結合バッファー（ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ、ＣａＣｌ2  １．８ｍＭ）
・Annexin V FITC reagent（MBL: BV-1001-5）  濃度原液５倍希釈、使用量５００μｌ
（５）FACS Canto（BD）を用いて蛍光を測定した。
結果を図１５に示す。養子移入したＯＴ−Ｉ  ＣＤ８+Ｔ細胞は、６Ｈ８−ＯＶＡの投与によって活性化され、６Ｈ８−ＯＶＡ未投与群に比べてＣＤ４４の発現レベルが上昇していた。このことは、６Ｈ８−ＯＶＡの投与により、メモリーＴ細胞への移行が引き起こされたことを示す。なお、６Ｈ８−ＯＶＡ投与群及び未投与群のいずれにおいても、一部の細胞は、Annexin V陽性細胞になっていたことから、アポトーシスに陥ったことが示唆される。また図１５右パネルは、ＵＶ照射によりアポトーシスを誘導したＤＣ２．４細胞を用いて、使用したAnnexin Vの試薬としての機能を確認したコントロール実験の結果である。
以上の結果から、本発明のワクチンによりメモリーＴ細胞への分化が誘導されることが示された。【０１４８】
実施例１５
本実施例において、固層化６Ｈ８抗体刺激による骨髄由来樹状細胞からのサイトカイン産生の誘導について説明する。
６Ｈ８抗体が骨髄由来樹状細胞からのサイトカイン産生に与える影響を調べるために、以下の方法により実験を行なった。
（１）ＰＢＳに希釈した６Ｈ８抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）を９６ウェルフラットプレート（Corning Incoporated, 製品番号3596）に５０ｍｌずつ加え、４℃にて一晩処理した。
（２）ＰＢＳ  ２００mlで２回プレートを洗浄し、過剰な６Ｈ８抗体を除去した。
（３）誘導後５日目のＧＭＣＳＦ依存性骨髄由来樹状細胞を１ｘ１０5／ウェルずつ（２）のプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで培養した。
（４）培養開始１２時間後に上清を回収し、上清中のサイトカイン・ケモカイン量を、Bio-Plexサスペンションアレイシステムにて23-Plex Panel（Bio-rad、171-F11241）を用いて標準的プロトコールに従って測定した。
図１６の結果より、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなどの産生が６Ｈ８抗体刺激により誘導された。以上の結果から、本発明のワクチンは樹状細胞を刺激活性化する事ができ、アジュバントとして優れた特性を有することが示された。【０１４９】
実施例１６
本実施例では、６Ｈ８−抗原の特異的ＣＴＬ誘導能について、低濃度範囲で検討した結果、及び抗原を既存のアジュバントと共に用いた場合の特異的ＣＴＬ誘導能と比較した結果を示す。
６Ｈ８−ＯＶＡ又はＩＦＡ＋ＯＶＡを１週間間隔で合計２回免疫した。６Ｈ８−ＯＶＡは、記載した量の６Ｈ８−ＯＶＡをＰＢＳ  ２００μｌに希釈して尾静脈より投与した。ＩＦＡ＋ＯＶＡは、記載した量のＯＶＡ257-264ペプチドが投与量２００μｌに含まれるようにエマルジョンを作製して皮下に投与した。エマルジョンは、予めＰＢＳに必要量のＯＶＡ257-264ペプチドを混和し、そこに等量のＩＦＡ（SIGMA: F5506）を加え、作製した。
最終免疫から７日後に被投与マウスの脾臓を採取し、ピンセットを用いて細かくほぐし、脾臓細胞を回収した。１５ｍｌチューブに脾臓細胞ペレットを作製し、ここにＯＶＡ257-264ペプチド(最終濃度１０-5Ｍ)を含むコンプリートＲＰＭＩ（ＦＣＳを含有しない）２ｍｌを加え、チューブの蓋を緩めた状態で、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターに１時間静置した。その後、培養液ＲＰＭＩ（ＦＣＳ１０％を含む)を加え合計量が２０ｍｌになるように調整し、２４穴プレートに２ｍｌずつまいた。
５日間培養後細胞を回収し、Ｈ−２Ｋb＋ＯＶＡ257-264特異的テトラマー（MBL: TS-5001-1）及びFITC-anti-mouse CD8a（eBioscience: 11-0081）を用いて染色し、特異的ＣＴＬの誘導をFACS Cantoにて確認した。なお、染色方法はＨ−２Ｋb＋ＯＶＡ257-264特異的テトラマーのインストラクションに従った。
結果を図１７に示す。６Ｈ８−ＯＶＡはＣＴＬ誘導においてＩＦＡ＋ＯＶＡと同等又はそれ以上の効果をもつことが明らかになった。【０１５０】
実施例１７
本実施例において、Propionibacterium Acnes（P. Acnes）死菌投与による炎症が、樹状細胞膜表面のＨＳＰ９０及びＣＤ６４（Ｆｃγレセプター）の発現を誘導することを説明する。
図１８に記載した量のP. AcnesをＰＢＳ２００μｌに希釈して、各マウスに尾静脈より投与した。投与から６日後（実験１）又は０〜１０日後（実験２）に、被投与マウスの脾臓を採取し、下記のコラゲナーゼ処理及びゲイズ溶液処理を行ない脾臓細胞を回収した。
コラゲナーゼ処理の詳細は以下の通りである。
コラゲナーゼ溶液１０ｍｌの入った６ｃｍディッシュ内で脾臓１個をピンセットなどを用いて細かくほぐし、３７℃インキュベーターの中に１５分間静置した。ここに最終濃度が５ｍＭになるようＥＤＴＡを加えピペッティングし、更に３７℃インキュベーターの中に５分間静置した。メッシュを通し１５ｍｌチューブへと移した。
コラゲナーゼ溶液：コラゲナーゼ（Wako, 032-10534）４００Ｕ／ｍｌ、Dnase  １５μｇ／ｍｌをＲＰＭＩに溶解したもの。使用直前に作製した。
ゲイズ処理の詳細は以下の通りである。
細胞のペレットを１５ｍｌチューブ内に準備し、これをタッピングで良くほぐした。ここにゲイズ溶液を２ｍｌ加え氷上にて３−５分間静置した。その後１０ｍｌのＰＢＳを加えて手早く遠心を行ない、ゲイズ溶液を除去した。
ゲイズ溶液：以下のＡ−Ｄ液をＡ２０％、Ｂ５％、Ｃ５％、Ｄ７０％の比率で混和したもの。
Ａ液：NH4Cl（３．５ｇ）、KCl（０．１８５ｇ）、Na2HPO4（０．０６ｇ）、KH2PO4(０．０１２ｇ)、D-Glucose（０．５ｇ）、Bromo phenol red（５ｍｇ）
Ｂ液：MgCl2・6H2O（０．４２ｇ）、MgSO4・7H2O（０．１４ｇ）、CaCl2（０．３４ｇ）
Ｃ液：NaHCO3（２．２５ｇ）
Ｄ液：DW
それぞれをDW  １００ｍｌに溶解し、オートクレーブ処理したものを用いた。
その後２ｘ１０6個の脾臓細胞を９６穴ラウンドプレート内で染色し、FACS Cantoを用いて解析した。ブロッキング並びに抗体染色は、抗体量１００μｌ／ウェル、氷上３０分静置にて行なった。各染色間にはＰＢＳ２００μｌを用いて洗浄を２回ずつ行なった。用いた抗体は以下の通りである：Mouse IgG（SIGMA: I5381、１００μｇ／ｍｌ）（ブロッキング用）、FITC-anti mouse CD8a（eBioscience: 11-0081、５μｇ／ｍｌ）、PE-anti mouse B220（eBioscience: 12-0452、１μｇ／ｍｌ）、PE-anti mouse CD64（BioLegend: 139304、１μｇ／ｍｌ）、PE-anti mouse CD86（BioLegend: 105508、１μｇ／ｍｌ）、PE-Cy5-anti mouse CD11b（eBioscience: 15-0112、０．４μｇ／ｍｌ）、PE-Cy5-anti mouse CD4（eBioscience: 15-0042、０．４μｇ／ｍｌ）、APC-Streptavidin（BioLegend: 405207、０．２μｇ／ｍｌ）、APC-Cy7-anti mouse CD11c（BioLegend: 117324、２μｇ／ｍｌ）、Biotin-6H8（１０μｇ／ｍｌ）。また脾腫についても評価した（++++、強度脾腫あり；++、中等度脾腫あり；+、軽度脾腫あり；-、脾腫なし）。
図１８に示すように、P. Acnesの投与量及び投与後の時間経過に比例して、ＨＳＰ９０及びＣＤ６４（ＦＣγレセプター）の発現は増強した。【０１５１】
実施例１８
本実施例では、P. Acnes投与による脾臓の樹状細胞膜表面ＨＳＰ９０及びＣＤ６４の発現変化に必須な因子について説明する。
＜実験１＞Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＭｙＤ８８／ＴＲＩＦノックアウト（ＫＯ）マウス、ＩＦＮγＫＯマウス及びＩＦＮα／βレセプターＫＯマウスに、ＰＢＳ２００μｌに希釈したP. Acnes５００μｇを尾静脈より投与した。投与から６日後に被投与マウスの脾臓を採取し、以下実施例１７と同様に解析を行った。
＜実験２＞Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＩＬ−１８  ＫＯマウス、Ｆｃレセプターγ鎖（ＦｃＲγ）ＫＯマウスを用いて＜実験１＞と同様の解析を行った。
結果を図１９に示す。実験１の結果から、P. Acnes投与による樹状細胞の活性化（ＨＳＰ９０及びＣＤ６４発現）は、ＭｙＤ８８依存性であり、かつＩＦＮγにも依存性であることが分かった。一方、ＩＦＮα／βには依存しなかった。また実験２の結果から、該活性化は、ＩＬ−１８には依存しないが、やはりＦｃＲγサブユニットには依存する事が明らかになった。【０１５２】
実施例１９
本実施例では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの各種細胞集団における、P. Acnes投与による膜表面ＨＳＰ９０及びＣＤ６４の発現の違いについて説明する。
ＰＢＳ２００μｌに希釈したP. Acnes５００μｇを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈より投与した。投与から６日後に被投与マウスの脾臓を採取し、コラゲナーゼ処理（既出）及びゲイズ溶液処理（既出）を用いて脾臓細胞を回収した。その後９６穴ラウンドプレート内で２ｘ１０6個の脾臓細胞をMouse IgG抗体（１００μｇ／ｍｌ）を用いてブロッキング処理をした後、各種抗体で染色した。なおブロッキング及び抗体染色は、抗体量１００μｌ／ウェル、氷上３０分静置にて行なった。各染色間にはＰＢＳ２００μｌを用いて２回ずつ洗浄を行なった。染色に用いた抗体は以下の通りである（既出のものについては詳細省略）：＜樹状細胞／マクロファージ＞PE-Cy5-anti mouse CD11b（eBioscience: 15-0112、０．４μｇ／ｍｌ）、APC-Cy7-anti mouse CD11c、PE-anti mouse CD64、Biotin-6H8、APC-Streptavidin；＜Ｔ細胞＞APC-Cy7-anti mouse CD11c、FITC-anti mouse CD8a、PE-Cy5-anti mouse CD4（eBioscience: 15-0042、０．４μｇ／ｍｌ）、PE-anti mouse CD64、Biotin-6H8、 APC-Streptavidin；＜Ｂ細胞＞APC-Cy7-anti mouse CD11c、PE-anti mouse B220（eBioscience: 12-0452、１μｇ／ｍｌ）、Biotin-6H8、APC-Streptavidin。染色後の細胞は、FACS Cantoを用いて解析した。
図２０には、それぞれの細胞集団の生細胞におけるＨＳＰ９０（６Ｈ８）／ＣＤ６４の発現を二次元ドットプロットで示す。ＣＤ１１ｃhigh／ＣＤ１１ｂ（−）の集団（Ｄ）では、ＨＳＰ９０、ＣＤ６４ともに発現が見られなかった。一方、樹状細胞の中でもＣＤ１１ｃhigh／ＣＤ１１ｂmiddle（Ｃ）、ＣＤ１１ｃmiddle／ＣＤ１１ｂhigh（Ａ及びＢ）ではＨＳＰ９０、ＣＤ６４ともに発現が見られた。Ｔ細胞、Ｂ細胞ではＨＳＰ９０、ＣＤ６４ともに発現は見られなかった。以上より、P. Acnes投与により細胞膜表面にＨＳＰ９０が発現するのは抗原提示細胞に限られることが明らかとなった。【０１５３】
実施例２０
本実施例では、６Ｈ８抗体遺伝子解析について説明する。
１．マウス抗体（ＩｇＧ）配列特異的ＲＴ反応
６Ｈ８抗体を産生するハイブリドーマ（受託番号FERM BP-11222）から定法に従って調製した全ＲＮＡを鋳型として、マウス抗体（ＩｇＧ）重鎖（Ｈ鎖）特異的なプライマー（Ｈ−ＲＴ１：TCCAKAGTTCCA（配列番号７））を用いてｃＤＮＡ合成を行った。同様に軽鎖（Ｌ鎖）特異的なプライマー（Ｌ−ＲＴ１：GCTGTCCTGATC（配列番号８））を用いてｃＤＮＡを合成した。ＲＴ反応は、SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech Cat.No.634924）の説明書に従い、以下の条件で行なった。
（１）全ＲＮＡ  ０．５μｇ、Ｈ−ＲＴ１又はＬ−ＲＴ１（１２μＭ）  １μｌ、ｄＨ2Ｏ  ３．７５μｌまでを混合し、７０℃、３分間、４２℃、２分間の反応を行った。
（２）反応液に、SMARTer II A Oligonucleotide（１２μＭ）  １μｌ、ＤＴＴ（２０ｍＭ）
１μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（各１０ｍＭ）  １μｌ、5×First-Strand Buffer  ２μｌ、RNase Inhibitor（４０Ｕ／μｌ）  ０．２５μｌ、SMARTScribeTM Reverse Transcriptase（１００Ｕ／μｌ）  １μｌを添加し、４２℃、９０分間、７０℃、１０分間の反応を行った。
（３）５０μｌ Tricine-EDTAバッファーを添加して反応を停止させ、−２０℃にて保存した。
２．マウス抗体（ＩｇＧ）配列特異的ＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応
SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kitを用いて５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ解析を行った。
（１）上記１で合成したｃＤＮＡ（Ｈ鎖特異的なプライマーにより合成)を鋳型として、マウス抗体（ＩｇＧ）Ｈ鎖特異的なプライマーをリバースプライマー、キットに含まれるＵＰＭ（Universal primer mix）をフォワードプライマーとしてＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応を行った。同様にｃＤＮＡ（Ｌ鎖特異的なプライマーにより合成）を鋳型に、Ｌ鎖特異的なプライマーを用いてＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ酵素にはPrimeSTAR（タカラバイオ株式会社）を使用した。
ＰＣＲ反応は上記キットに添付されたプロトコルに従って行なった。
（２）想定の大きさのＰＣＲ産物が得られたことを、アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。ＰＣＲ産物をSYN3025H、SYN3025Lと命名し、ゲル抜き精製後、解析に用いた。
３．クローニング及び塩基配列解析
（１）ゲル抜き精製したＰＣＲ産物（SYN3025H、SYN3025L）をクローニングプラスミドpMD20-T（タカラバイオ株式会社）にライゲーションした。
（２）常法により形質転換を行い、ＰＣＲ産物ごとに４８クローンを取得した。
（３）取得したクローンに含まれるインサートの配列を定法に従い解析した。シークエンス反応は、BigDye Terminators v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI社）を使用し、同社プロトコルに従ってABI3730 Sequencer（ABI社）により行った。
（４）Ｈ鎖、Ｌ鎖、それぞれ４８クローンの塩基配列解析結果と、ここからベクター領域及び確度の低い領域を除いた塩基配列を取得した。
４．結果評価
次に、３−（４）で得られた塩基配列を用いて以下の解析を行った。
（１）取得配列の分類とコンセンサス配列の取得
Ｈ鎖、Ｌ鎖の塩基配列を相同性により分類した。相同性比較はＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアセンブルソフトウエア、SEQUENCHERTM（Gene Codes：Windows（登録商標）版）により行った。この結果、Ｈ鎖で１つ、Ｌ鎖で３つのコンティグが得られた（コンティグを構成しない配列も見られた。)。得られたコンティグからコンセンサス配列を取得した。
（２）目的遺伝子の候補配列について
コンセンサス配列及び、コンティグを形成しなかった配列から、目的遺伝子の候補と考えられる配列を選別した。ここでは抗体定常域遺伝子のアミノ酸配列上流に、ストップコドンを含まずにメチオニン残基を持つ配列を全て選択した。
（３）アミノ酸配列の推定
候補配列の内、コンティグを形成した配列数及び、取得配列で考えられた遺伝子長から、Ｈ鎖、Ｌ鎖それぞれのメジャーコンティグが目的配列の可能性が高いと考えられた。そこで、それぞれのメジャーコンティグのコンセンサス配列にコードされるアミノ酸配列をＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列とした。
以上の方法により取得した６Ｈ８抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図２１及び２２に示す。Ｈ鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９及び１０に示す。Ｌ鎖の可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１及び１２に示す。配列番号１０において２つ目のメチオニンをコードするコドンが開始コドンであると考えられ、Kabatらの番号付け（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, Bethesda: US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH.）によれば１７〜３５位がリーダー配列、６６〜７０位がＣＤＲ１、８５〜１０１位がＣＤＲ２、１３４〜１４１位がＣＤＲ３に相当する。同様に、配列番号１２において、１〜１９位がリーダー配列、４３〜５８位がＣＤＲ１、７４〜８０位がＣＤＲ２、１１３〜１２１位がＣＤＲ３に相当する。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明の抗体は、本発明のワクチンの調製、生物学的活性を有する化合物の送達、及び細胞表面ＨＳＰ９０発現細胞の特異的な検出等において使用することができる。したがって、ワクチンを使用して治療可能な疾患の治療、細胞内に薬剤を送達することによって治療可能な疾患の治療、及び抗原提示細胞等の細胞表面ＨＳＰ９０発現細胞の分析等において有用である。さらに本発明の抗体は、アジュバントとして使用することができ、ワクチン等による免疫誘導の効率を高めることができ、疾患の治療における患者負担の軽減に有用である。【０１５５】
本出願は、米国仮特許出願６１／３２３，５７８（出願日：２０１０年４月１３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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