(57)【要約】  植物の深根性を制御する遺伝子、該遺伝子が導入された形質転換植物体、並びに該遺伝子を利用した植物の深根性を制御する方法等を提供するため、大規模分離集団により、浅根型を示すイネ品種IR64と深根型を示すKinandang Patongの間で検出された植物の深根性を制御する遺伝子座（Dro1遺伝子座）の高精度連鎖解析を試みた。その結果、Dro1の遺伝子領域はInDelマーカーであるDro1-INDEL09からCAPSマーカーであるDro1-CAPS05で挟まれた6.0kbpの領域であることが判明した。またKinandang Patong 型のDro1の遺伝子の形質転換植物体は、優位に深根率が高いことを確認した。またKinandang Patong 型のDro1遺伝子を有する個体は耐乾性であることを確認した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のDNA；
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１、２、１２、１４、１６又は１７のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
（ｃ）配列番号：３、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（ｄ）配列番号：１、２、１２、１４、１６又は１７のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するDNA、及び
（ｅ）配列番号：３、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
植物が単子葉植物である、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
単子葉植物がイネ科植物である、請求項２に記載のDNA。
【請求項４】
イネ科植物がイネ、麦類（コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ）、トウモロコシ、キビ、アワ、ヒエ、ソルガム、シコクビエ、トウジンビ、テフ、サトウキビ、チモシー、ケンタッキーブルーグラス、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、バヒアグラスからなる群より選択される、請求項３に記載のDNA。
【請求項５】
イネ科植物がイネ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項３に記載のDNA。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載のDNAを発現可能に保持する形質転換細胞。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかに記載のDNAで形質転換された植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体。
【請求項９】
請求項１から５のいずれかに記載のDNA又は請求項６に記載のベクターを植物細胞に導入することによって製造される形質転換植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体。
【請求項１０】
以下（ａ）から（ｄ）の工程によって得られる形質転換植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体；
（ａ）請求項１から５のいずれかに記載のDNA又は請求項６に記載のベクターを植物細胞に導入する工程、
（ｂ）工程（ａ）の植物細胞における請求項１から５のいずれかに記載のDNAのコピー数を測定する工程、
（ｃ）導入されたDNA又はベクターのコピー数が１である形質転換植物細胞を選択する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）で選択された形質転換植物細胞から植物体を再生させる工程。
【請求項１１】
植物が単子葉植物である、請求項８から１０のいずれかに記載の植物体。
【請求項１２】
単子葉植物がイネ科植物である、請求項１１に記載の植物体。
【請求項１３】
イネ科植物がイネ、麦類（コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ）、トウモロコシ、キビ、アワ、ヒエ、ソルガム、シコクビエ、トウジンビ、テフ、サトウキビ、チモシー、ケンタッキーブルーグラス、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、バヒアグラスからなる群より選択される、請求項１２に記載の植物体。
【請求項１４】
イネ科植物がイネ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、請求項１２に記載の植物体。
【請求項１５】
請求項８から１４のいずれかに記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１６】
請求項８から１５のいずれかに記載の形質転換植物体から単離された細胞。
【請求項１７】
請求項８から１５のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１８】
請求項８から１５のいずれかに記載の形質転換植物体から単離された器官。
【請求項１９】
請求項１６に記載の細胞、請求項１７に記載の繁殖材料、および請求項１８に記載の器官の少なくとも１つから得られる加工食品。
【請求項２０】
請求項８、１１から１３のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１から５のいずれかに記載のDNA又は請求項６に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項２１】
請求項１から５のいずれかに記載のDNAのコピー数が１である形質転換植物細胞または形質転換植物体を選択する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、被検植物が深根性の形質を有すると判定する方法；
（ａ）被検植物からDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から請求項１から５のいずれかに記載のDNAを含む領域を増幅する工程、及び
（ｃ）増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、請求項１から５のいずれかに記載のDNAのそれと比較する工程。
【請求項２３】
被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：８に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が深根性の形質を有すると判定される方法。
【請求項２４】
被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：１０に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：１１に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が深根性の形質を有さないと判定される方法。
【請求項２５】
以下の（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む深根性の形質を有する植物を選抜する方法；
（ａ）深根性の形質を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
（ｂ）請求項２２から２４のいずれかに記載の方法により、工程（ａ）で得られた植物が深根性の形質を有するか否かを判定する工程。
【請求項２６】
請求項１から５のいずれかに記載のDNAによりコードされるタンパク質。
【請求項２７】
請求項２６に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項２８】
請求項１から５のいずれかに記載のDNAまたはその相補配列に相補的な少なくとも１５の連続する塩基を含むDNA。
【請求項２９】
配列番号：４から１１のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の根の形態を制御する新規遺伝子および該遺伝子を利用した植物の根の形態の制御方法に関する。具体的には本発明は、植物において深根性に関与する新規遺伝子および該遺伝子を利用した植物の深根性を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界の人口は発展途上国を中心に増加の一途をたどり、これらの人口を養うための食糧増産は必須である。しかしながら、近年の地球温暖化や沙漠化などの気候変動により、農耕地において安定的な降雨を得ることは難しくなってきている。その結果、世界中で、降雨の減少に伴う干ばつが農作物生産に対して大きな被害をもたらしている。特に、雨水のみで栽培されることの多いイネやコムギ、トウモロコシなどの穀類では干ばつによる被害がより大きくなる。そこで、作物への耐乾性の付与は穀類の育種上重要な目標となっている。【０００３】
作物にとっての根は、水分や栄養素の吸収などによる収量性や地上部植物体の耐倒伏性、乾燥回避性に関わる重要な形質である。単子葉植物であるイネは種子根の発生後に節間から伸長する多数の冠根により根系を形成する。イネの根系分布は、冠根の長さと伸長方向によって決定される(森田茂紀 根のデザイン 107p、2003(非特許文献１))。このうち、冠根の伸長方向は、根系分布を形成するうえで特に重要である。つまり、冠根が横方向に伸長すれば浅根性となり、縦方向に伸長すれば深根性となる。深根性の植物は、浅根性の植物に比べ、土壌深層に根がより多く分布することから、植物が乾燥条件下にさらされた場合に土壌深層から水を吸収し、乾燥から回避することができる有効な形質である（Yoshida and Hasegawa Drought resistance in crops with emphasis on rice p. 97-114. 1982(非特許文献２); 森田茂紀 根の発育学 132p、2000(非特許文献３)）。つまり、浅根型の作物を深根化することで、乾燥回避性の向上による耐乾性付与が期待できる。【０００４】
作物における耐乾性のタイプは、乾燥逃避型、乾燥耐性型、乾燥回避型の3種類ある。一般に、作物が最も乾燥に弱い時期は幼穂形成期から出穂期の間である。乾燥逃避型は、作物を早晩生化することで降雨の少ない時期が幼穂形成期から出穂期と重ならないようにすることができる。もっとも一般的な耐乾性の品種改良の方法であり、出穂期を操作できる遺伝子は多数単離されている(WO 01/032881(特許文献１); 特開2002-153283(特許文献２); 特開2003-339382(特許文献３); 特開2004-089036(特許文献４); 特開2004-290190(特許文献５); 特開2005-110579(特許文献６))。ただし、出穂期は品種によって決まっているため、栽培期間の降雨の変化が毎年同じであるなら有効であるが、気候の変化で幼穂形成期から出穂期に干ばつが起これば、干ばつの影響を受けることになることが問題である。乾燥耐性型は、植物が乾燥にさらされたときに、細胞の浸透圧調整などを通して乾燥に耐える性質である。乾燥耐性型の評価は、植物個体に水をやらないことで簡便に評価できることから、乾燥耐性型に関与する遺伝子は、分子生物学的実験により多数単離されてきた(特開2007-222129(特許文献７); 総説, Tran et al. Methods in Enzymology 428:109-28. 2007(非特許文献４))。しかし、圃場条件下における乾燥耐性型のスクリーニングは、土壌の水分含量のむらなど環境条件をコントロールすることが難しいことから、簡単ではない。そのため、乾燥耐性型の品種育成はあまり進んでいない。さらに、乾燥耐性型は乾燥に耐える能力であるが、乾燥期間が長ければ、土壌からの養水分の吸収ができないため、個体としての生長が抑制され、最終的には枯死することになる。子実を最終生産物とする穀物生産においては、植物体としての個体の維持ではなく、どれだけ収穫量を確保できるかが重要であることから、この点は問題となる。乾燥回避型は、乾燥条件下において、乾燥ストレスを受けないようにすることで耐乾性を獲得する性質である。前述の深根性はそのうちの1つである。通常、圃場における干ばつは、土壌表面から下層に向かって進むが、一般的な農地では土壌深層には水が存在するため、深根性の植物は土壌深層からの水を利用することで、乾燥条件下での個体の乾燥を回避することができる。日本では陸稲栽培における梅雨明け後の少雨・多照による干害を避けるために深根性の育種が行われ、深根性品種である「ゆめのはたもち」が高度耐乾性・極良食味陸稲品種として育成された(平澤秀雄ら Breeding Science 48: 415-419. 1998(非特許文献５))。しかしながら、深根性の改変を目的にした遺伝子の単離はこれまで報告されていない。【０００５】
根の伸長方向を制御している要因の1つである屈性に関与する遺伝子は突然変異体などを用いた分子生物学的手法で多数単離されてきた。屈性は、外因性の環境刺激に反応して根が反応することで起こる屈曲成長である。屈性には、重力屈性、光屈性、水分屈性、接触屈性、電気屈性、磁気屈性、化学屈性などがある。シロイズナズナでは、多くの重力屈性遺伝子(総説, Morita and Tasaka Current Opinion in Plant Biology 7(6): 712-718. 2004(非特許文献６))や水分屈性遺伝子MIZ1 (Kobayashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11): 4724-4729. 2007(非特許文献８))、MIZ2(Miyazawa et al. Plant Physiology 149(2): 835-840. 2009(非特許文献９))が見つかっている。イネでは根の屈性に関与する遺伝子の報告は少ない。光屈性遺伝子CPT1(Haga et al. Plant Cell 17(1):103-115. 2005(非特許文献７))や冠根形成遺伝子Crl1(Inukai et al. Plant Cell 17(5): 1387-1396. 2005(非特許文献１０))が重力屈性に関与していることが報告されている。これらの遺伝子は機能欠損を伴う突然変異体などから単離されたものが多く、これらの遺伝子を改変することで作物に深根性を付与することができたとの報告はない。【０００６】
乾燥回避を目標とした深根性の遺伝学的研究はトウモロコシやイネで報告されている。トウモロコシでは、TuberosaらやTrachselらが根長に関与する量的形質遺伝子座(QTL)を見出している (Tuberosa et al. Plant Molecular Biology 48: 697-712. 2002(非特許文献１１); Trachsel et al. Theoretical and Applied Genetics DOI 10.1007/s00122-009-1144-9. 2009(非特許文献１２))。イネでは、深根性や根長、根の太さなどの形質について品種間で幅広い自然変異が存在する(Uga et al. Breeding Science 59: 87-93. 2009(非特許文献１３))。分子マーカーを用いた遺伝解析によって、このような品種間でみられる根の形態変異に関与する量的形質遺伝子座(QTL)が多数見出されてきた(総説, Price et al. Journal of Experimental Botany 53: 989-1004. 2002(非特許文献１４))。深根性は、根長と根の伸長方向(角度)の2つの形質から成り立つが、深根性に関するQTL のほとんどは根長に関与するQTLの報告である(総説, Price et al. Journal of Experimental Botany 53: 989-1004. 2002(非特許文献１４); Courtois et al. Euphytica 134: 335-345. 2003(非特許文献１５); Zheng et al. Theoretical and Applied Genetics 107: 1505-1515. 2003(非特許文献１６); Li et al. Theoretical and Applied Genetics 110: 1244-1252. 2005(非特許文献１７))。根の伸長角度に関するQTLはトウモロコシで1例のみあるが、あくまで統計的に推定されたものであり、遺伝子の単離・同定には至っていない(Omori F. and Mano Y. Plant Root 1: 57-65. 2007(非特許文献１８))。よって、自然変異から見出された根に関与するQTLの遺伝子単離・同定に成功したという報告はない。この原因として考えられるのは、根系形態は地上部の形質と違い表現型を正確に評価することが難しく、再現性が得にくいという点である。さらに、圃場条件で調査するには労力がかかるという問題もある(Yadav et al. Theoretical and Applied Genetics 95: 619-632. 1997(非特許文献１９))。【０００７】
植物の深根性を調査する公知の方法には、塹壕法やモノリス法、コアサンプリング法などが存在し、圃場における深根性を評価するには適している(Nemoto et al. Breeding Science 48: 321-324. 1998(非特許文献２０); 平山正賢ら 日本作物学会紀事 76:245-252. 2007(非特許文献２１))。塹壕法は圃場で植物を栽培した後、土を掘りあげて、深さ別に根の太さや数を調査する方法である。ただし、塹壕法は、土の掘りあげに非常に労力がかかり、大量の個体を評価するには不適である。モノリス法は、栽培した植物の株元に2枚の鉄枠を打ち込み、方形のモノリス(例えば、幅30cm x 奥行き5cm x 深さ30cm)を掘り出し、深さごとに、土を切り出すなどして、根の長さや数を調査する方法である。コアサンプリング法は、直径5〜8cm、長さ30〜50cmの金属製の円柱管を植物体の株元や株間に打ち込み、得られた土壌サンプルから根を洗い出し、根の長さや数を調査する方法ある。どちらの方法も、塹壕法よりは、サンプリングが簡単であるが、打ち込む場所により、サンプルに誤差が生じるため、土中の根の正確な状態を確認することはできない。温室などの人口環境下で、大量の個体を評価する方法として、直径5〜10cmの円柱状の栽培容器に培地を詰め、植物を播種・栽培し、乾燥ストレス条件下での深根性を評価する方法が開発されている(WO2006/123392(特許文献８))。この方法では、栽培期間中に段階的に水の水位を下げて植物に乾燥ストレスをかけ、深根性の品種は浅根性の品種よりも葉の枯れ上がり程度が小さいという関係を得ている。この結果から、深根性は直接評価せずに、地上部の枯れ上がりによって深根性を評価する方法である。利点としては、土から根を洗い出す手間がなく、深根性を簡便に評価できる。ただし、根長は長いが、根が横に伸長する品種の場合、円柱に根が当たった時点で円柱に沿って根は下に伸長するため、深根性として誤って評価されることがある。この方法では深根性を構成する形質のうち根長は評価できるが、根の伸長方向を評価することが難しい。
根の伸長方向のみを簡便に定量化する方法として、バスケット法がコムギにおいて開発された(Oyanagi et al. 日本作物学会紀事 62: 565-570. 1993(非特許文献２２))。さらに、イネにおいてもバスケット法によって深根性を調査した報告がある(Kato et al. Plant Soil 287: 117-129. 2006(非特許文献２３))。この方法は、網目状のザルに土を詰め、圃場もしくはポットに設置し、一定期間栽培した後、地表面に対してザルから伸長してくる根の伸長角度を測定することで深根性を評価する。簡便に伸長角度を評価できるが、遺伝子単離のために一度に大量の検体を評価するにはスペースと水管理が大変である。【０００８】
このような背景のもと、自然変異を用いた深根性遺伝子の単離と深根性遺伝子の乾燥回避に対する効果を明らかにすることは、乾燥回避能力の改良にむけた品種育成を効率化するためにも不可欠となっている。【０００９】
Dro1(Deeper Rooting 1)はindicaの水稲品種IR64を反復親とした熱帯japonicaの陸稲品種であるKinandang Patongの戻し交雑後代系統(BC2F2)を用いたQTL解析により、第9染色体長腕に統計的に存在が推定された深根性に関与するQTLである（Uga et al. The 2nd International Conference on Plant Molecular Breeding. 2007(非特許文献２４); 宇賀ら 日本育種学会第112回講演会要旨集188p. 2007(非特許文献２５); 宇賀ら 第27回根研究集会. 2007(非特許文献２６); Uga et al. The 5th International Crop Science Congress Abstracts 243p. 2008(非特許文献２７)）。IR64は、アグロバクテリウム形質転換法で遺伝子導入を行うことが困難な品種である。現在、イネでは脱分化した培養組織（例えば、カルス）を植物試料として行うアグロバクテリウム形質転換法が一般的である(特許2649287号(特許文献９))。しかし、IR64ではカルスを用いた方法では形質転換効率が極めて低く、カルスを用いたアグロバクテリウム形質転換法は確立していない(Hiei and Komari Nature Protocols 3: 824-834. 2008(非特許文献２８))。Hiei and Komariは、IR64の形質転換の植物試料としてカルスの代わりに未熟胚を用いた方法を報告している。しかし、未熟胚法は、開花後の未成熟な胚を使うことから、必要な時に未熟胚がすぐ手に入るようにするために年中水田や温室などで植物を準備する必要がある。たとえば、常に未熟胚を利用できるようにするためには、2週間おきに種子を播き、植物を管理するための多大な栽培スペースと労働力が必要である。IR64でもカルスを用いたアグロバクテリウム形質転換法で遺伝子の導入ができることは、分子育種の実用化においても非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO 01/032881  植物の感光性遺伝子Ｈｄ１およびその利用
【特許文献２】特開2002-153283  植物の開花を誘導する遺伝子Ｈｄ３ａおよびその利用
【特許文献３】特開2003-339382  植物の開花時期を促進するＥｈｄ１遺伝子およびその利用
【特許文献４】特開2004-089036  植物の開花促進遺伝子ＲＦＴ１および植物の開花時期を予測する方法
【特許文献５】特開2004-290190  植物の開花を制御する遺伝子Ｌｈｄ４とその利用
【特許文献６】特開2005-110579  植物の感光性遺伝子Ｈｄ５およびその利用
【特許文献７】特開2007-222129  環境ストレス耐性植物の作出方法
【特許文献８】WO2006/123392  植物の深根性評価方法
【特許文献９】特許2649287号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】森田茂紀 (2003) 根のデザイン 107p 養賢堂.
【非特許文献２】Yoshida S., Hasegawa S. (1982) The rice root system: its development and function. In "Drought resistance in crops with emphasis on rice" International Rice Research Institute, Los Banos, Laguna, Philippines. p. 97-114.
【非特許文献３】森田茂紀 (2000) 根の発育学 132p 東京大学出版会
【非特許文献４】Tran L. S., Nakashima K., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2007) Plant gene networks in osmotic stress response: from genes to regulatory networks. Methods in Enzymology 428:109-28.
【非特許文献５】平澤秀雄、根本博、須賀立夫、石原正敏、平山正賢、岡本和之、宮本勝 (1998) 高度耐干性・極良食味陸稲品種「ゆめのはたもち」の育成. Breeding Science 48: 415-419.
【非特許文献６】Morita M. T., Tasaka M. (2004) Gravity sensing and signaling. Current Opinion in Plant Biology 7(6): 712-718.
【非特許文献７】Haga K., Takano M., Neumann R., Iino M. (2005) The Rice COLEOPTILE PHOTOTROPISM1 gene encoding an ortholog of Arabidopsis NPH3 is required for phototropism of coleoptiles and lateral translocation of auxin. Plant Cell 17(1):103-115.
【非特許文献８】Kobayashi A., Takahashi A., Kakimoto Y., Miyazawa Y., Fujii N., Higashitani A., Takahashi H. (2007) A gene essential for hydrotropism in roots. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11): 4724-4729.
【非特許文献９】Miyazawa Y., Takahashi A., Kobayashi A., Kaneyasu T., Fujii N., Takahashi H. (2009) GNOM-mediated vesicular trafficking plays an essential role in hydrotropism of Arabidopsis roots. Plant Physiology 149(2): 835-840.
【非特許文献１０】Inukai Y., Sakamoto T., Ueguchi-Tanaka M., Shibata Y., Gomi K., Umemura I., Hasegawa Y., Ashikari M., Kitano H., Matsuoka M. (2005) Crown rootless1, which is essential for crown root formation in rice, is a target of an AUXIN RESPONSE FACTOR in auxin signaling. Plant Cell 17(5): 1387-1396.
【非特許文献１１】Tuberosa R., Sanguineti M. C., Landi P., Giuliani M. M., Salvi S., Conti S. (2002) Identification of QTLs for root characteristics in maize grown in hydroponics and analysis of their overlap with QTLs for grain yield in the field at two water regimes. Plant Molecular Biology 48: 697-712.
【非特許文献１２】Trachsel S., Messmer R., Stamp P., Hund A. (2009) Mapping of QTLs for lateral and axile root growth of tropical maize. Theoretical and Applied Genetics DOI 10.1007/s00122-009-1144-9.
【非特許文献１３】Uga Y., Ebana K., Abe J., Morita S., Okuno K., Yano M. (2009) Variation in root morphology and anatomy among accessions of cultivated rice (Oryza sativa L.) with different genetic backgrounds. Breeding Science 59: 87-93.
【非特許文献１４】Price A. H., Cairns J. E., Horton P., Jones H. G., Griffiths H. (2002) Linking drought-resistance mechanisms to drought avoidance in upland rice using a QTL approach: progress and new opportunities to integrate stomatal and mesophyll responses. Journal of Experimental Botany 53: 989-1004.
【非特許文献１５】Courtois B., Shen L., Petalcorin W., Carandang S., Mauleon R. Li Z. (2003) Locating QTLs controlling constitutive root traits in the rice population IAC 165 x Co39. Euphytica 134: 335-345.
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【非特許文献１７】Li Z., MuP. , Li C., Zhang H., Li Z., Gao Y., Wang X. (2005) QTL mapping of root traits in a doubled haploid population from a cross between upland and lowland japonica rice in three environments. Theoretical and Applied Genetics 110: 1244-1252.
【非特許文献１８】Omori F., Mano Y. (2007) QTL mapping of root angle in F2 populations from maize ‘B73’ × teosinte ‘Zea luxurians’ Plant Root 1: 57-65.
【非特許文献１９】Yadav R., Courtois B., Huang N., McLaren G. (1997) Mapping genes controlling root morphology and root distribution in a doubled-haploid population of rice. Theoretical and Applied Genetics 95: 619-632.
【非特許文献２０】Nemoto, H., Suga, R., Ishihara M., Okutsu Y. (1998) Deep rooted rice varieties detected through the observation of root characteristics using the trench method. Breeding Science 48: 321-324.
【非特許文献２１】平山正賢、根本博、平澤秀雄 (2007) 圃場栽培した中生・晩生熟期日本陸稲品種の根系発達程度と耐干性との関係. 日本作物学会紀事 76: 245-252.
【非特許文献２２】Oyanagi A., Nakamoto T., Wada M. (1993) Relationship between root growth angle of seedlings and vertical distribution of roots in the field in wheat cultivars. 日本作物学会紀事 62: 565-570.
【非特許文献２３】Kato Y., Abe J., Kamoshita A., Yamagishi J. (2006) Genotypic variation in root growth angle in rice (Oryza sativa L.) and its association with deep root development in upland fields with different water regimes. Plant Soil 287: 117-129.
【非特許文献２４】Uga Y., K. Okuno and M. Yano (2007) Relationship between QTLs for vascular system and vertical distribution of roots on chromosome 9 of rice. The 2nd International Conference on Plant Molecular Breeding.
【非特許文献２５】宇賀優作, 奥野員敏, 矢野昌裕 (2007) イネ第9染色体上に見出された深根性に関与するQTL. 日本育種学会第112回講演会要旨集188p.
【非特許文献２６】宇賀優作, 奥野員敏, 矢野昌裕 (2007) イネ深根性関連遺伝子座Dro1のファインマッピング. 第27回根研究集会.
【非特許文献２７】Uga Y., K. Okuno and M. Yano (2008) Fine mapping of a deeper-rooting QTL, Dro1, on chromosome 9 in rice. The 5th International Crop Science Congress Abstracts 243p.
【非特許文献２８】Hiei Y., Komari T (2008) Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols 3: 824-834.
【非特許文献２９】矢野昌裕、2nd International Symposium on Genomics of Plant Genetic Resources（イタリア）、2010年4月24日
【非特許文献３０】矢野昌裕、Gatersleben Lecture (Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research（ドイツ）、2010年4月29日
【非特許文献３１】矢野昌裕、Third International Conference of Plant Molecular Breeding、2010年9月7日
【非特許文献３２】宇賀優作、日本育種学会  第118回講演会、2010年9月24日、育種学研究第12号別冊2号21p
【非特許文献３３】宇賀優作、CIAT(International Center of Tropical Agriculture、colombia)における定期セミナー、2010年10月29日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、植物に乾燥回避能の向上による耐乾性を付与するための、植物の根の形態の改変方法の提供にある。より具体的には本発明は、植物において深根性に関与する新規遺伝子、深根性の形質を有する形質転換植物体、該植物体の製造方法、並びに植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法などを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
Dro1の候補となる領域は、insertion-delition(InDel)マーカーID07_14とID07_17で挟まれた1,443kbp(日本晴の塩基配列に基づく)の染色体領域である。この領域には、RAP-DBにより166個の遺伝子が予測されていた。これらの遺伝子のうち、イネを含め植物で深根性に関与すると報告されている遺伝子もしくはそのホモログは確認されていなかった。従って、予測遺伝子の機能から候補となる遺伝子を推定することは不可能であった。また、IR64とKinandang Patongの両品種は塩基配列が解読されていないため、遺伝子内に存在する塩基配列の違いから遺伝子を推測することも困難であった。このような事情のもと本発明者は、Dro1遺伝子の単離、同定を試みた。
本発明者はまず、約4,500個体からなる大規模分離集団により、浅根型を示すイネ品種IR64と深根型を示すKinandang Patongの間で検出された植物の深根性を制御する遺伝子座（Dro1遺伝子座）の高精度連鎖解析を試みた。一度に数百個体の深根率(各バスケットから出てくる全根数に対してバスケットの底から出てくる根の割合)を調査するために従来のバスケット法を改良し、500個体を1回で調査することができるようにした。ただし、それ以上は一度に大量の植物体を扱うことはできないため、大規模集団から選抜した組換え系統群から数系統を選び、各系統40個体の表現型と遺伝子型データから少しずつ候補領域を絞り込んだ。候補領域を1,443kbpから約100kbpまで絞り込んだ段階で、IR64とKinadang Patongのbacterial artificial chromosome(BAC)ライブラリーを作製し、100kbpの候補領域を含んだBACをスクリーニングした。つぎに、両品種のBACの塩基配列を解析した。塩基配列の比較から候補遺伝子が絞れないか検討するため、両品種についてRAP-DBで予測された遺伝子の塩基配列を比較したところ、エキソン領域内で塩基配列の変異が存在する遺伝子が多数で、候補遺伝子を絞り込むことは不可能であった。そこで、候補領域内の塩基配列の変異を用いてDNAマーカーを作製しながら合計5回の連鎖解析を行った。その結果、Dro1の遺伝子領域をinsertion-delition(InDel)マーカーであるDro1-INDEL09（プライマー5'- GCAGACGCTCGTAACACGTA -3'（配列番号：４）およびプライマー5'- GTGGCAGCTCCATCAACTCT -3'（配列番号：５））からCleaved Amplified Polymorphic Sequences(CAPS)マーカーであるDro1-CAPS05（プライマー5'- GCACAAGATGGGAGGAGAGT -3'（配列番号：６）およびプライマー5'- CATGGGTGAGAATCGTGTTG -3'（配列番号：７）、増幅したDNAはHinfIで制限酵素処理を行う）で挟まれた6.0kbpの領域に絞り込んだ。この領域には、RAP-DBにより予測された遺伝子が１つだけ存在し、この予測遺伝子は全くの機能未知のタンパクをコードしていることが推定されていた。IR64の形質転換は非常に困難なため、形質転換法を用いた相補性試験を行う前に、この予測遺伝子が本当に深根性と関係するのかを検討した。はじめに、以下に示す数種類の機能検索サイトで予測遺伝子のアミノ酸配列から機能予測を行い、深根性に関連する機能を持っているか調べた。
・「SALAD database」植物のタンパク質配列をゲノムワイドに比較するデータベース(salad.dna.affrc.go.jp/salad/)
・「Pfam」タンパク質ドメインのデータベース (pfam.janelia.org/)
・「PSORT」タンパクの疎水性や局在性を予測するサイト (www.psort.org/)
・「InterPro」蛋白質ファミリー、ドメイン、機能部位のデータベース(www.ebi.ac.uk/interpro/)
しかしながら、どの検索サイトでも、1つも保存されたドメインは見出すことができなかった。つぎに、この遺伝子のエキソン内にIR64とKinandang Patongの間で塩基配列の変異がないか調べた。その結果、第4エキソン内にKinandang Patongではアデニンである部分がIR64では1b欠失していた。この1b欠失によりフレームシフトが起こり途中でストップコドンが生じていた。そこで、この欠失によりIR64では候補遺伝子の発現量が低下しているのではないかと考え、発現量を調査した。調査には発芽6日目と12日目IR64およびKinandag Patongの葉身および葉鞘上部、葉鞘基部、冠根を用いた。これらの3つの組織よりトータルRNAを抽出し、リアルタイムPCRにより遺伝子の発現量を調査した。その結果、両品種とも葉身および葉鞘上部と冠根の2か所ではほとんど発現が見られなかったが、葉鞘基部では両品種とも発現が見られた。しかしながら、IR64とKinandang Patongで発現量を比較したところ、6日目および12日目のサンプルともに、両品種間に2倍以上の発現量の差は見られず、発現量の結果からはこの予測遺伝子がDro1遺伝子の本体であるとは判断できなかった。ただし、葉鞘基部には冠根の原基である冠根始原体が存在することや両品種間においてアミノ酸レベルでの機能の相違も考えられたので、候補遺伝子の可能性はあった。
つぎに、第4エキソンの1b欠失と深根率との関連性からこの遺伝子が深根性に関与していないかを検討した。IR64とKinandang Patongを含む栽培品種64系統、IR64と同じ国際稲研究所（International Rice Research Institute、Los Banos、Philippines）で育成されたIR品種22系統、野生種20系統（Oryza nivara7系統、O. rufipogon12系統、O. meridionalis1系統）について1b欠失のあった周辺塩基配列を解析し、塩基配列を比較したところ、第4エキソンの1b欠失はIR64にのみ存在することが分かった。そのため、1b欠失と深根率の関係からこの予測遺伝子がDro1遺伝子の本体であると判断することはできなかった。
Kinandang Patongを含むjaponica14品種のDro1のcomplementary DNA (cDNA)領域内の塩基配列をすべて解析したところ、全品種の塩基配列は同じであった。しかしながら、バスケット法で深根率を調査したところ、深根率が最も高いKinandang Patongの83.1％から最も低いTupa729の15.9％まで深根率に幅広い変異が見られた。この原因として、ほかに深根性関連QTLが存在することが考えられる一方で、プロモーター領域の塩基配列の違いが遺伝子の発現調節に影響を与えているのではないかと考えた。そこで、Kinandang Patong と日本晴の上流約2.2kb(5'側上流の候補領域の端まで)について塩基配列を比較したところ、2か所で変異が見られた。一箇所は、5’側非翻訳領域から1,250bp上流で日本晴の塩基配列チミンがKinandang Patongではグアニンに置換していた。この周辺配列をプロモーター領域のシス配列の検索サイトPLACE(A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements、 www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)で解析すると、「GATA box」と呼ばれるモチーフのチミンがグアニンになっていることが分かった。もう一箇所は、5’側非翻訳領域上流の1,189から1,218bpの30bpがKinandang Patongで欠失があった。このような塩基配列の変異が品種内の深根性の変異の原因の1つである可能性はある。【００１４】
6.0kbpの領域に予測された遺伝子について日本晴の完全長cDNAがAK068870として登録されていたので、日本晴のFOX hunting system (Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system) に含まれていないか検索した。その結果、T1世代が2系統、T2世代が2系統存在した。そこでこれら4系統各5個体の深根率を測定したところ、コントロールである日本晴（野生型）よりも有意に深根率が高い個体が数個体あることが分かった。この結果から、この予測遺伝子がDro1遺伝子本体である可能性が高くなった。そこで、この予測遺伝子が確実にDro1遺伝子の本体であるか実証するために、本発明者は、この予測遺伝子（Kinandang Patong型のDro1遺伝子）を含むベクターをIR64のカルスに導入し、形質転換体を作製することにした。日本晴のような形質転換の安易な品種に比べると形質転換効率が1/10以下であるため、形質転換には10倍以上のカルスを準備し、遺伝子導入を行った。得られた形質転換植物の深根率を調査したところ、予測遺伝子で形質転換された植物体は高い深根率を有することが確認された。
これら２つの試験から、候補領域6.0kbpに予測された遺伝子がDro1本体であることを見出した。その結果、深根性遺伝子であるDro1遺伝子の単離、同定に初めて成功した。【００１５】
さらに本発明者は、Dro1による深根化が耐乾性向上に関与しているかをIR64とIR64を遺伝的背景としDro1周辺領域のみをKinandang Patong 型に置き換えた準同質遺伝子系統（Dro1-NIL）を用いて調べた。その結果、Dro1-NILは根を深根化することで耐乾性を示し、IR64に対して有意に収量が増加することを証明した。【００１６】
本発明はこのような知見に基づくものであり、以下の〔１〕〜〔２８〕を提供する。
〔１〕以下（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のDNA；
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１、２、１２、１４又、１６又は１７のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
（ｃ）配列番号：３、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（ｄ）配列番号：１、２、１２、１４、１６又は１７のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するDNA、及び
（ｅ）配列番号：３、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
〔２〕植物が単子葉植物である、〔１〕に記載のDNA。
〔３〕単子葉植物がイネ科植物である〔２〕に記載のDNA。
〔４〕イネ科植物がイネ、麦類（コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ）、トウモロコシ、キビ、アワ、ヒエ、ソルガム、シコクビエ、トウジンビ、テフ、サトウキビ、チモシー、ケンタッキーブルーグラス、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、バヒアグラスからなる群より選択される、〔３〕に記載のDNA。
〔５〕イネ科植物がイネ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、〔３〕に記載のDNA。
〔６〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
〔７〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAを発現可能に保持する形質転換細胞。
〔８〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAで形質転換された植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体。
〔９〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNA又は〔６〕に記載のベクターを植物細胞に導入することによって製造される形質転換植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体。
〔１０〕以下（ａ）から（ｄ）の工程によって得られる形質転換植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体；
（ａ）〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNA又は〔６〕に記載のベクターを植物細胞に導入する工程、
（ｂ）工程（ａ）の植物細胞における〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAのコピー数を測定する工程、
（ｃ）導入されたDNA又はベクターのコピー数が１である形質転換植物細胞を選択する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）で選択された形質転換植物細胞から植物体を再生させる工程。
〔１１〕植物が単子葉植物である、〔８〕から〔１０〕のいずれかに記載の植物体。
〔１２〕単子葉植物がイネ科植物である、〔１１〕に記載の植物体。
〔１３〕イネ科植物がイネ、麦類（コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ）、トウモロコシ、キビ、アワ、ヒエ、ソルガム、シコクビエ、トウジンビ、テフ、サトウキビ、チモシー、ケンタッキーブルーグラス、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、バヒアグラスからなる群より選択される、〔１２〕に記載の植物体。
〔１４〕イネ科植物がイネ、ソルガム、及びトウモロコシからなる群より選択される、〔１２〕に記載の植物体。
〔１５〕〔８〕から〔１４〕のいずれかに記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１６〕〔８〕から〔１５〕のいずれかに記載の形質転換植物体から単離された細胞。
〔１７〕〔８〕から〔１５〕のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔１８〕〔８〕から〔１５〕のいずれかに記載の形質転換植物体から単離された器官。
〔１９〕〔１６〕に記載の細胞、〔１７〕に記載の繁殖材料、および〔１８〕に記載の器官の少なくとも１つから得られる加工食品。
〔２０〕〔８〕、〔１１〕から〔１３〕のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNA又は〔６〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
〔２１〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAのコピー数が１である形質転換植物細胞または形質転換植物体を選択する工程をさらに含む、〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、被検植物が深根性の形質を有すると判定する方法；
（ａ）被検植物からDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAを含む領域を増幅する工程、及び
（ｃ）増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAのそれと比較する工程。
〔２３〕被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：８に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列を含むプライマーでPCR(polymerase chain reaction)を行う工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が深根性の形質を有すると判定される方法。
〔２４〕被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：１０に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：１１に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が深根性の形質を有さないと判定される方法。
〔２５〕以下の（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む深根性の形質を有する植物を選抜する方法；
（ａ）深根性の形質を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
（ｂ）〔２２〕から〔２４〕のいずれかに記載の方法により、工程（ａ）で得られた植物が深根性の形質を有するか否かを判定する工程。
〔２６〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAによりコードされるタンパク質。
〔２７〕〔２６〕に記載のタンパク質に結合する抗体。
〔２８〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のDNAまたはその相補配列に相補的な少なくとも１５の連続する塩基を含むDNA。
〔２９〕配列番号：４から１１のいずれかに記載の塩基配列を含むDNA。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によりイネなどの植物の深根性を制御するDro1遺伝子及び該遺伝子で形質転換された植物体が提供された。本発明の遺伝子は、浅根性から深根性へ、深根性から浅根性へと植物の根系形態を操作することに利用可能である。具体的には、例えばDro1遺伝子の操作により浅根型の植物を深根化することで、乾燥回避能の向上による耐乾性付与が期待できる。世界的には干ばつによる農作物の減収が深刻であり、海外の大手企業では干ばつに強い作物の開発に力を入れている。また、Dro1遺伝子の操作により深根型の植物を浅根化することで、耐湿性の付与が期待できる。日本では農業政策の転換から休耕田での畑作物の栽培が推奨されているが、水田は排水性が悪いため、耐湿性のない大豆やトウモロコシは湿害が問題となっている。そのため、耐湿性の向上のため、作物の浅根化が研究されている。このような国際および国内的情勢を鑑みると、植物の根の形態を制御する遺伝子を利用し、干ばつや湿害に強い作物の品種開発の意義は非常に大きい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】改良型バスケット法における各系統の深根性の評価を示す写真である。ステンレスザルには輪が取り付けてある。この輪の位置は地表面に対して50度より深く伸長する根を深根と見なすように設置されている。凡例中の括弧内は、前半の記号は系統名を、後半は世代を表す。
【図２】IR64にDro1を含むベクターを導入した形質転換体とベクターのみを導入した形質転換体のT0世代における深根率の分布を表すグラフである。
【図３】IR64にDro1を含むベクターを導入した形質転換体とベクターのみを導入した形質転換体のT1世代における深根率と形質転換ベクターのコピー数に対応したシグナル強度(リアルタイムPCR)の関係を示すグラフである。シングルコピーとは、To世代においてDro1が1コピーのみ導入された系統、マルチコピーとはDro1が複数個導入された系統を表す。シングルコピーの系統では、T1世代においてnull型(0コピー)、ヘテロ型(1コピー)、ホモ型(2コピー)に分離し、そのコピー数に対応してシグナル強度は3群に分離する。ただし、サザン解析と異なり、リアルタイムPCRでは、その原理からコピー数が同じでもシグナル強度は必ずしも個体間で同じになるとは限らない。グラフ中の記号は独立したクローンの系統番号を表す。
【図４】Fox系統と日本晴の深根率の分布を表すグラフである。
【図５】ソルガムとトウモロコシの類縁体の解析結果を示す図である。Dro1：イネ(Kinandang Patong)、SbDro1L1：ソルガムのDro1類縁体、ZmDro1L1：トウモロコシのDro1類縁体。
【図６】畑圃場におけるDro1-NILの深根性をIR64とKinandang Patongと比較した写真である。白字の数字は地表面からの土壌深度を表す。白の点線は、各系統のおおよその根系の分布域を表す。
【図７】耐乾性検定床における土壌の水ポテンシャルの経時的変化を示すグラフである。Irregatedは灌水区を、Droughtは乾燥ストレス区を表す。括弧内は水ポテンシャルを測定した土壌深度を表す。乾燥ストレス区の土壌深度25cmでは播種後70日目あたりから急速に土壌の乾燥が進行していることが分かる。
【図８】IR64とDro1-NIL間における乾燥ストレス条件下の葉巻抵抗性の違いを経時的に示した写真である。写真は、植物体を真上から撮影したものである。図上部の日数は、乾燥ストレス区において灌水を停止してからのストレス処理日数である。
【図９】IR64とDro1-NIL間における乾燥ストレス条件下の葉面温度、気孔コンダクタンス、光合成速度の違いを示す写真及びグラフである。A:灌水停止後35日目のイネの可視画像。右から1列目と2列目はIR64、3列目と4列目はDro1-NIL。B:灌水停止後35日目のイネの温度分布画像(Aと同じ個体について赤外線サーモグラフィを用いて撮影した画像)。右から1列目と2列目はIR64、3列目と4列目はDro1-NIL。色の違いは、暖色系に近い色ほど温度が高く、寒色系に近い色ほど温度が低いことを表す。この写真から、IR64とDro1-NILは葉面温度が異なる（Dro1-NILの方がIR64よりも葉面温度が平均0.7℃低い）ことが分かる。Dro1-NILのほうが寒色系の色の分布が広く、葉面温度IR64より低いことが分かる。C:乾燥ストレス区において灌水停止後のDro1-NILの葉面温度の変化を表す。値は、IR64の葉面温度を基準とし、Dro1-NILの平均葉面温度からIR64の平均葉面温度を引いた数字である。すべての調査日でIR64に対してDro1-NILの葉面温度の値が低いことが分かる。D: 乾燥ストレス区において灌水停止後のIR64とDro1-NILの気孔コンダクタンスの違いを表す。*はDro1-NILがIR64に対して5%水準で有意に大きいことを表す。E: 乾燥ストレス区において灌水停止後のIR64とDro1-NILの光合成速度の違いを表す。*はDro1-NILがIR64に対して5%水準で有意に大きいことを表す。
【図１０】乾燥ストレス条件下で栽培したIR64とDro1-NILの収量調査の結果を示す図と写真である。A:乾燥ストレス区から収穫したIR64とDro1-NILの諸形質の差を表す。縦棒は標準偏差を表す。*、**、***は、Dro1-NILがIR64に対してそれぞれ5%、1％、0.1％水準で有意に大きいことを表す。B:乾燥ストレス区において収穫したIR64とDro1-NILの平均的な穂の写真である。
【図１１】乾燥ストレス区の耐乾性検定床を解体した後、側面からIR64とDro1-NIL間における根系分布の違いを示した写真である。各系統の上図は、検定床の断面全体を、下図は上層の客土を洗い、砂利層に根が貫通しているか拡大して観察した結果である。Dro1-NILにおける矢頭は砂利層を貫通している根を示している。IR64では砂利層を貫通し下層に伸長した根が全く見られないが、Dro1-NILでは多くの根が砂利層を貫通し下層に届いていることが分かる。
【図１２】畑における土壌の水ポテンシャルの経時的変化を表すグラフである。
【図１３】畑における無施肥および施肥区の播種後120日目の植物体の様子を示した写真である。上図は、各区の全体図。下図は各区を上から拡大撮影した図。無施肥および施肥区ともにIR64では葉巻が確認できるが、Dro1-NILでは葉巻は起こっていない。
【図１４】Dro1遺伝子の欠失の有無を判別するPCRマーカーの結果を示す写真である。各アニーリング温度とも、左のレーンがIR64、右のレーンがKinandang Patongを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、以下（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のDNAを提供する。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号：１、２、１２、１４、１６又は１７のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
（ｃ）配列番号：３、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
（ｄ）配列番号：１、２、１２、１４、１６又は１７のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物に導入された場合に当該植物に深根性の形質を付与する活性を有するDNA、及び
（ｅ）配列番号：３、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
以下本明細書において、これらのDNAを「本発明のDNA」又は「Dro1遺伝子」と称する場合がある。また本発明のDNAによりコードされるタンパク質を「本発明のタンパク質」又は「Dro1タンパク質」と称する場合がある。
本発明において「含む」は「含む」及び「からなる」の両方を意味する。
また上の（ｅ）のDNAは次のように表現することも出来る。
（ｅ）配列番号：３、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸に置換、欠失、付加、挿入の少なくとも１つから選択される変異を有するタンパク質をコードするDNAであって、植物に深根性の形質を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
また本発明のDNAは「単離されたDNA」と表現することも出来る。
【００２０】
イネ品種Kinandang PatongのDro1遺伝子のゲノムDNAの塩基配列を配列番号：１に、cDNAの塩基配列を配列番号：２に、これらの塩基配列のコード領域によりコードされるタンパク質（Dro1タンパク質）のアミノ酸配列を配列番号：３に示す。
配列番号：１に記載の塩基配列におけるタンパク質のコード領域は、264番目の塩基から2685番目の塩基である。
また配列番号：２に記載の塩基配列におけるタンパク質のコード領域は、264番目の塩基から1019番目の塩基である。
またKinandang PatongのDro1遺伝子およびプロモーター領域を含むその上流の塩基配列を配列番号：１７に示す。日本晴における対応する領域の配列（配列番号：１８）と比較し、Kinandang Patong（配列番号：１７）では、Dro1遺伝子の上流約1.2kbに１塩基の塩基置換と30塩基の欠失が存在する。具体的には、日本晴における「GATA」モチーフの「T」（配列番号：１８に記載の塩基配列において6番目の塩基）が、Kinandang Patongでは「G」となっている（配列番号：１７に記載の塩基配列において６番目の塩基）。また配列番号：１８の７から３６番目における３０塩基が、Kinandang Patongの対応する領域では欠損している。
【００２１】
ソルガム由来のDro1遺伝子のCDS(coding sequence)の塩基配列を配列番号：１２に、これらの塩基配列のコード領域によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１３に示す。
配列番号：１２（CDS配列）に記載の塩基配列におけるタンパク質のコード領域は、1番目の塩基から789番目の塩基である。
【００２２】
トウモロコシ由来のDro1遺伝子のCDSの塩基配列を配列番号：１４に、これらの塩基配列のコード領域によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１５に示す。
配列番号：１４（CDS配列）に記載の塩基配列におけるタンパク質のコード領域は、1番目の塩基から768番目の塩基である。
【００２３】
本発明のDro1遺伝子は、植物に深根性の形質を付与する活性を有する。本発明において「深根性の形質」とは、植物体の地下部器官である根が地表面に対して深い角度で地中に伸長する性質を意味する。本発明において「深い角度」とは、根の地表面に対する角度が少なくとも50度、好ましくは60度、より好ましくは70度、さらに好ましくは80度以上であることを意味する。
【００２４】
DNAが植物に深根性の形質を付与する活性を有するか否かは、Dro1遺伝子で形質転換された植物体を調製し、該植物体の地表面に対する角度を測定することによって確認することが出来る。植物体の地表面に対する角度の測定は、例えば実施例に記載のバスケット法、改良型バスケット法の他、塹壕法やモノリス法、コアサンプリング法によって判定することが出来るがこれらに限定されない。
【００２５】
本発明のDro1タンパク質をコードするDNAには、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、深根性の形質を有するイネ品種（例えば、Kinandang Patong）、ソルガムあるいはトウモロコシからゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、 P1 artificial chromosome(PAC)などが利用できるがこれらに限定されない）を作製し、これを展開して、Dro1タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：１、２、１２、１４、１６又は１７に記載の塩基配列を有するDNA）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、Dro1タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：１、２、１２、１４、１６又は１７に記載の塩基配列を有するDNA）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、深根性の形質を有するイネ品種（例えば、Kinandang Patong）から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。
また化学合成DNAは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。
【００２６】
また本発明のDro1タンパク質をコードするDNAは、深根性の形質を有するソルガム（例えば、葉身、葉鞘）、トウモロコシ（例えば葉身、葉鞘）からゲノムDNA、mRNAを抽出することによって調製することも出来る。
【００２７】
本発明は、配列番号：３、１３又は１５のいずれかに記載のDro1タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを包含する。ここで「Dro1タンパク質と同等の機能を有する」とは、対象となるタンパク質が植物に深根性の形質を付与させる機能を有することを指す。このようなDNAは、好ましくは単子葉植物由来であり、より好ましくはイネ科、ユリ科、パイナップル科、ヤシ科、サトイモ科、ショウガ科、ラン科植物由来であり、さらに好ましくはイネ、麦類（コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ）、トウモロコシ、キビ、アワ、ヒエ、ソルガム、シコクビエ、トウジンビ、テフ、サトウキビ、チモシー、ケンタッキーブルーグラス、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、バヒアグラス由来であり、特に好ましくはイネ、ソルガム、及びトウモロコシである。
【００２８】
このようなDNAには、例えば、配列番号：３、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数（例えば２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、又は１００個）のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物に深根性の形質を付与させる機能を有するタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００２９】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer, W. and Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のDro1タンパク質をコードするアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであっても、天然型のDro1タンパク質（配列番号：３、１３又は１５のいずれかに記載のアミノ酸配列）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。このようなDNAの例として、例えば配列番号：１６に記載の塩基配列を有するDNAが挙げられる。配列番号：１６に記載の塩基配列を有するDNAは、配列番号：２に記載の塩基配列を有するDNAにおいて、5'末端と3'末端配列がそれぞれ1bp付加された塩基配列を有する。また5'末端側から373bp目（配列番号：２における5'末端側から372bp目）のAがGに置換されている。この塩基置換により、配列番号：１６に記載の塩基配列を有するDNAによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において37番目のリジンがグルタミン酸に非同義置換されている。本発明はこのような、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において37番目のリジンがグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質も提供する。また該タンパク質をコードするDNA（例えば配列番号：１６に記載の塩基配列を有するDNA）も提供する。
また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
【００３０】
配列番号：３、１３又は１５のいずれかに記載のDro1タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503）やPCR技術（Saiki, R. K. et al. (1985) Science, 230, 1350-1354、Saiki, R. K. et al. (1988) Science, 239, 487-491）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、Dro1遺伝子の塩基配列（配列番号：１、２、１２、１４、１６又は１７のいずれかに記載の塩基配列）もしくはその一部をプローブとして、またDro1遺伝子（配列番号：１、２、１２、１４、１６又は１７のいずれかに記載の塩基配列）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からDro1遺伝子と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうるDro1タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。
【００３１】
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、Dro1タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：３、１３又は１５）と高い相同性を有すると考えられる。また塩基配列レベルにおいて、Dro1タンパク質をコードするDNAの塩基配列（配列番号：１、２、１２、１４、１６又は１７）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体あるいは塩基配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００３２】
本発明のDNAは、例えば、組み換えタンパク質の調製や深根性の形質を有する形質転換植物体の作出などに利用することが可能である。
【００３３】
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Novagen社のpETシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M. &amp; Higa, A. (1970) Journal of Molecular Biology, 53, 158-162、Hanahan, D. (1983) Journal of Molecular Biology, 166, 557-580）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を上記のマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。また、後述する手法で、本発明のDNAが導入された形質転換植物体を作製し、該植物体から本発明のタンパク質を調製することも可能である。従って本発明の形質転換植物体には、後述する、植物に深根性の形質を付与するため本発明のDNAが導入された植物体のみならず、本発明のタンパク質の調製のために本発明のDNAが導入された植物体も含まれる。
【００３４】
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。これらの抗体を用いることにより、植物体におけるDro1タンパク質の発現部位の判別、もしくは植物種がDro1タンパク質を発現するか否かの判別を行うことが出来る。例えば、Kinandang Patong型Dro1タンパク質の227番目から251番目のアミノ酸配列は、深根性の形質を有する品種に特徴的な配列である。よってこのアミノ酸配列の全部又は一部を特異的に認識する抗体は、植物種がKinandang Patong型Dro1タンパク質を発現するか否か（深根性の形質を有するか否か）を判別する際に用いることができる。
【００３５】
また本発明は、Dro1遺伝子を含むベクターならびに形質転換細胞を提供する。
本発明のベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）等で大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有するベクターが挙げられるがこれに限定されない。このようなベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script等が挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7等が挙げられる。Dro1タンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等の大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET等が挙げられる。
【００３６】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。また植物体内で発現するベクターとしてpMH1、pMH2、pCAMBIAなどのベクターが挙げられる。
【００３７】
大腸菌以外にも、例えば、Dro1タンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）等が挙げられる。
【００３８】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等が挙げられる。
【００３９】
本発明の形質転換細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質の製造のための産生系は、in vitroおよびin vivo の産生系がある。
【００４０】
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞（例えば、上述のCHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞に加え、3T3、ミエローマ細胞、BHK （baby hamster kidney）、HeLa、Vero等の細胞）、両生類細胞（例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340））、あるいは昆虫細胞（例えば、sf9 、sf21、Tn5等の細胞）が知られている。CHO 細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO 細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220）やCHO K-1 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。
【００４１】
植物細胞としては、後述の植物由来の細胞の他、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。
また真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られているがこれらに限定されない。
本発明は、本発明のDNAやベクターが導入されたこれらの細胞を提供する。
【００４２】
また本発明は、Dro1遺伝子で形質転換された植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体に関する。
【００４３】
植物体が深根性の形質を有するか否かは、対照と比較することによって判断することも出来る。本発明においては、対照と比較して、形質転換植物体の根がわずかでも地表面に対してより深い角度で地中に伸長する限り、「深根性の形質を有する」の意に含まれる。形質転換植物体の根が地表面に対してより深い角度で地中に伸長しているか否かの判定は上述の方法によって行うことが出来る。
【００４４】
本発明において対照とは、本発明の形質転換植物体と同じ種の植物体であって、本発明のDNAを有さない、もしくは本発明のDNAが人為的に導入されていない植物体を意味する。本発明における対照は、形質転換植物体と同じ種の植物体であって本発明のDNAを有さない、もしくは本発明のDNAが人為的に導入されたものでない限り何ら限定されない。従って本発明の対照には、本発明のDNA以外のDNAが人為的に導入された植物体も含まれる。このような植物体の例としては、例えば、本発明の形質転換植物体と同じ種の植物体であって、本発明のDNA以外のDNAで形質転換された植物体、本発明のDNAの機能欠失変異導入のDNAで形質転換された植物体、本発明のDNAの機能抑制型に変換されたDNAで形質転換された植物体、本発明のDNAの機能発現に不十分な領域のDNA断片で形質転換された植物体などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４５】
本発明のDNAで形質転換された植物体は、深根性の形質を有する限り何ら制限されず、植物の他の部位が改変されていてもよい。他の部位の改変としては、例えば、穂の形態変化などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明のDNAを利用して形質転換植物体を作製するには、該DNA又は該DNAが挿入されたベクターを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞から植物体を再生させればよい。
本発明におけるベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものが好ましく、上述のベクター（例えばpMH1、pMH2、pCAMBIAベクターなどのベクター）が挙げられるが、特に制限はない。本発明のベクターは、例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター等）を有していてもよい。このようなプロモーターを使用する場合、プロモーターの下流に、本発明のDNAが機能的に結合したDNAを設計する。そして設計されたDNAを含むベクターを植物細胞に導入する。これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることによって、本発明のDNAが発現された形質転換植物体を得ることが出来る。本発明はこのように、プロモーターの下流に、本発明のDNAが機能的に結合したDNAも提供する。ここで「機能的に結合」とは、プロモーター配列に転写因子が結合することにより、本発明のDNAの発現が誘導されるように、プロモーター配列と該DNAとが結合していることを言う。
なおこれら以外にも、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。
【００４７】
上記DNAやベクターを導入する植物細胞の種類としては、例えば単子葉植物が挙げられる。単子葉植物としては、イネ科、ユリ科、パイナップル科、ヤシ科、サトイモ科、ショウガ科、ラン科などの植物が挙げられるがこれらに限定されない。またイネ科の植物としては、イネや麦類（コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ）、トウモロコシ、キビ、アワ、 ヒエ、ソルガム、シコクビエ、トウジンビ、テフ、サトウキビ、チモシー、ケンタッキーブルーグラス、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、バヒアグラスなどが挙げられるがこれらに限定されない。
上記DNAやベクターが導入される植物細胞の形態は、植物体を再生しうるものであれば、特に制限はなく、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、発芽種子などが含まれる。
【００４８】
上記DNAやベクターの植物細胞への導入は、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法等の当業者に公知の方法によって実施することができる。アグロバクテリウムを介する方法においては、例えばNagelらの方法（Nagel, R. et al. FEMS Microbiol Lett. 67, 1990, 325-328.）にしたがって、上記DNAが挿入された発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、このアグロバクテリウムを直接感染法やリーフディスク法で植物細胞に感染させることにより、上記DNAを植物細胞に導入することができる。上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、本発明のDNAが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロモーターの下流には本発明のDNAが位置し、さらに該DNAの下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、又は植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。
上記プロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のCaMV35S、トウモロコシのユビキチンプロモーター（特開平2-79983号公報）等を挙げることができる。
また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。
【００４９】
植物細胞からの植物体の再生は、植物の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば以下の方法が挙げられるがこれらに限定されない。
イネであればFujimuraら（Fujimura. et al. Tissue Culture Lett. 2, 1995, 74.）の方法
小麦であればHarrisら（Harris, R. et al. Plant Cell Reports. 7, 1988, 337-340）の方法やOzgenら（Ozgen, M. et al. Plant Cell Reports. 18, 1998, 331-335）の方法
大麦であればKiharaとFunatsuki（Kihara, M. and Funatsuki, H. Breeding Sci. 44, 1994, 157-160.）の方法やLursとLorz（Lurs, R. and Lorz, H. Theor. Appl. Genet. 75, 1987, 16-25.）の方法
トウモロコシであればShillitoら（Shillito, R.D., et al. Bio/Technology, 7, 1989, 581-587.）の方法やGordon-Kammら（Gordon-Kamm, W.J. et al. Plant Cell. 2(7), 1990, 603-618.）の方法
ソルガムであればWenら(Wen, F.S., et al. Euphytica. 52, 1991, 177-181.)の方法やHagio（Hagio, T. Breeding Sci. 44, 1994, 121-126.）の方法
ライムギであればCastilloら（Castillo A. M., Vasil V., Vasil I. K. (1994) Nature Biotechnology 12: 1366-1371.）の方法
エンバクであればChoら（Cho M. J., WEN J., LEMAUX P. G., (1999) Plant science 148: 9-17.）の方法
トウジンビであればO’Kennedyら（O’Kennedy M. M., Burger J. T., Botha F. C. (2004) Plant Cell Reports 22: 684-690.）の方法
ケンタッキーブルーグラスであればHaら（Ha C. D., Lemaux P. G., Cho M. J. (2001) In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 37: 6-11.）らの方法
オーチャードグラスであればCHOら（CHO M.J., CHOI H. W., LEMAUX P. G. (2001) Plant cell reports 20: 318-324.）の方法
イタリアンライグラスであればYeら（Ye X., Wang Z. Y., Wu X., Potrykus I., Spangenberg G. (1997) Plant Cell Reports 16: 379-384.）の方法
ペレニアルライグラスであればSpangenbergら（Spangenberg G., Wang Z. Y., Wu X., Nagel J., Potrykus I. (1995) Plant science 108: 209-217.）らの方法
トールフェスクであればWangら（Wang Z. Y., Takamizo T., Iglesias V. A., Osusky M., Nagel J., Potrykus I., Spangenberg G. (1992) Nature Biotechnology 10: 691-696.）の方法
バヒアグラスであればSmithら（Smith R. L., Grando M. F., Li Y. Y., Seib J. C., Shatters R. G. (2002) Plant Cell Reports 20: 1017-1021.）の方法
【００５０】
また、本発明のDNAを導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「植物細胞」は、例えば葉、根、茎、花及び種子中の胚盤、未熟胚等の植物の細胞、カルス、懸濁培養細胞、発芽種子等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５１】
また、本発明のDNAの導入により形質転換した細胞を効率的に選択するために、組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシン又はゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、及び除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００５２】
組み換えベクターを導入した細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
【００５３】
形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、深根性の形質を有する植物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることができる。即ち本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、形質転換植物体の製造方法を提供する。また本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、植物体に深根性の形質を付与する方法を提供する。
（ａ）本発明のDNA（Dro1遺伝子）又は該DNA（Dro1遺伝子）を含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程。
上記形質転換体の製造方法は、
（ｃ）深根性の形質を付与する植物体を選択する工程、
をさらに含んでもよい。
【００５４】
このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来DNAの存在は、公知のPCR法やサザンハイブリダイゼーション法によって、又は植物体中のDNAの塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのDNAの抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法（Molecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に準じて実施することができる。再生させた植物体中に存在する本発明のDNAよりなる外来遺伝子を、PCR法を用いて解析する場合には、再生した植物体から抽出したDNAを鋳型として増幅反応を行う。また、本発明のDNAの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のDNA配列を含むDNA断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のDNA断片が分画されて、そのDNA断片が本発明のDNAに対応することを確認することが可能である。
【００５５】
また本発明は、Dro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入することによって製造される形質転換植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体に関する。また本発明は、Dro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入する工程を含む形質転換植物体の製造方法に関する。
また本発明の形質転換植物体の好ましい態様として、以下（ａ）から（ｄ）の工程によって得られる形質転換植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体が挙げられる。また本発明の形質転換植物体の製造方法の好ましい態様として、、以下（ａ）から（ｄ）の工程を含む形質転換植物体の製造方法が挙げられる。
（ａ）Dro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入する工程、
（ｂ）工程（ａ）の植物細胞における人為的に導入されたDro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターのコピー数を測定する工程、
（ｃ）人為的に導入されたDro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターのコピー数が１（シングルコピー）である形質転換植物細胞を選択する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）で選択された形質転換植物細胞から植物体を再生させる工程。
上記方法においては、Dro1遺伝子を含む形質転換植物細胞から植物体を再生した後、該植物体における人為的に導入されたDro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターのコピー数を測定し、コピー数が１である植物体を選択してもよい。従って本発明は、以下（ａ）から（ｃ）の工程によって得られる形質転換植物体であって、深根性の形質を有する形質転換植物体に関する。また本発明は、以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む形質転換植物体の製造方法に関する。
（ａ）Dro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生する工程、
（ｂ）工程（ａ）の植物体における人為的に導入されたDro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターのコピー数を測定する工程、
（ｃ）人為的に導入されたDro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターのコピー数が１である形質転換植物体を選択する工程。
【００５６】
Dro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターの植物細胞への導入、該植物細胞から植物体への再生は上述の方法によって行うことが出来る。また、形質転換植物細胞あるいは形質転換植物体におけるDro1遺伝子又はDro1遺伝子を含むベクターのコピー数の測定は、例えばサザンブロッド解析、リアルタイムPCR法、塩基配列の解析などによって行うことが出来るがこれらに限定されない。
なお本発明において「コピー数」とは、形質転換によって植物体に導入されたDro1遺伝子あるいは当該遺伝子を含むベクターの数を意味する。すなわち本発明の「コピー数」には、植物に内在するDro1遺伝子（内在性遺伝子）の数は含まれない。
【００５７】
なお本発明者は、実施例に記載のように、人為的に導入されたDro1遺伝子のコピー数が１である形質転換植物体（T0世代）からT1世代を作成し、T1世代におけるDro1遺伝子の推定コピー数と深根率の関係を調べた。その結果、T1世代において、ホモ型（人為的に導入されたDro1遺伝子の数が2コピー）の植物体が、null型（人為的に導入されたDro1遺伝子の数が0コピー）やヘテロ型（人為的に導入されたDro1遺伝子の数が1コピー）の植物体と比較し、深根率が大きいことを見出した。従って本発明においては、人為的に導入されたDro1遺伝子のコピー数が1であるT0世代の形質転換植物体より作製されるT1世代の形質転換植物体であって、T1世代の形質転換植物体における人為的に導入されたDro1遺伝子のコピー数が2（ホモ型）である形質転換植物体を、特に好ましい植物体として挙げることができる。
すなわち本発明の特に好ましい態様として、上に記載の工程（ａ）から（ｄ）あるいは工程（ａ）から（ｃ）に加え、さらに以下の工程を含む方法によって得られる形質転換植物体にが挙げられる。また本発明の特に好ましい態様として、上に記載の工程（ａ）から（ｄ）あるいは工程（ａ）から（ｃ）に加え、さらに以下の工程を含む形質転換植物体の製造方法が挙げられる。
・工程（ｄ）あるいは（ｃ）で得られた形質転換体同士を交配させ、植物体を取得する工程
・上の工程によって得られた植物体からDro1遺伝子をホモに有する植物体を選択する工程
交配によりT0世代の植物体からT1世代の植物体を作製する方法は当業者に周知である。また交配によって得られた植物体におけるDro1遺伝子のコピー数（null型、ヘテロ型、ホモ型）の測定も、サザンブロッド解析やリアルタイムPCR法など当業者に周知の方法によって行うことが出来る。
【００５８】
一旦、染色体内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから細胞や器官、繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を単離し、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが人為的に導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の器官（例えば花、葉、根、茎等）、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫及びクローンの繁殖材料が含まれる。これらの植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の器官、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫及びクローンの繁殖材料は、植物に深根性の形質を付与するために使用することが可能である。
【００５９】
なお本発明の形質転換植物体としては、例えば単子葉植物が挙げられる。単子葉植物としては、イネ科、ユリ科、パイナップル科、ヤシ科、サトイモ科、ショウガ科、ラン科の植物などが挙げられるがこれらに限定されない。イネ科の植物としては、イネや麦類（コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ）、トウモロコシ、キビ、アワ、ヒエ、ソルガム、シコクビエ、トウジンビ、テフ、サトウキビ、チモシー、ケンタッキーブルーグラス、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、バヒアグラスなどがあげられるがこれらに限定されない。
【００６０】
また本発明は、本発明の細胞、繁殖材料、器官の少なくとも１つから得られる加工食品に関する。本発明における加工食品とは、米、麦類（コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ）、トウモロコシ、キビ、アワ、ヒエ、ソルガム、シコクビエ、トウジンビ、テフ、サトウキビ、チモシー等の植物あるいはその一部（細胞、繁殖材料、器官など）を人為的に加工することによって人が食する形態に改変されたものを言う。本発明において加工とは、炊く、煮る、炒める、蒸す、揚げる、粉末にする等の処理が挙げられるがこれらに限定されない。また「粉末にする」には脱穀、精米なども含まれる。本発明の加工食品には、これらの処理のうち少なくとも１つの処理が施された加工食品が含まれる。例えば、イネの種子を脱穀、精米し、さらに加熱することによって得られる加工食品を、本発明の加工食品の好ましい例として例示することが出来る。本発明の加工食品として、具体的には、米に炊飯という加工を施した米飯類（冷凍米飯、無菌米飯を含む）、米粉、餅、ビーフン、あられ、せんべい、クッキー、味噌、醤油、豆腐、パン、そば、うどん、パスタ、中華麺等の麺類（生麺、乾麺、茹で麺など）、シリアル、コーンフレークなどが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の加工食品の商品形態は特に限定されない。一例として、常温または低温にて流通販売され、飲食時に電子レンジ等の加温調理器具にて常温もしくは高温に加熱される形態が挙げられる。具体的には、コンビニエンスストア、スーパーマーケットやテイクアウト惣菜店等で販売される弁当、おにぎり、調理麺等が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の加工食品は容器包装した形態であってもよい。例えばプラスチック成型容器などの容器に封入された形態、あるいはレトルトパウチなどの容器に封入され密封後に殺菌された形態とすることも出来る。
本発明の「細胞、繁殖材料、器官の少なくとも１つから得られる加工食品」は、「細胞、繁殖材料、器官の少なくとも１つを原料として製造される加工食品」、「細胞、繁殖材料、器官の少なくとも１つを含む加工食品」、「細胞、繁殖材料、器官の少なくとも１つを加工することによって得られる加工食品」などとも表現することが出来る。
【００６１】
さらに本発明は、以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、被検植物が深根性の形質を有する、あるいは被検植物が深根性の形質を有する可能性があると判定する方法を提供する。
（ａ）被検植物からDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から本発明のDNA（Dro1遺伝子）の全部又は一部を含む領域を増幅する工程、及び
（ｃ）増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、本発明のDNA（Dro1遺伝子）のそれと比較する工程。
Dro1遺伝子の一部としては、好ましくはDro1遺伝子の第4エキソン、より好ましくはDro1遺伝子の第4エキソンの5’端から116bpの配列（配列番号：２の塩基配列において943番目の塩基）を含む領域（例えば、配列番号：２の塩基配列において943番目の塩基を含む、少なくとも100、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1の塩基を含む領域）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明者は、Kinandang PatongではDro1遺伝子の第4エキソンの5’端から116bpの配列（配列番号：２の塩基配列において943番目の塩基）がアデニンにあるのに対し、IR64ではこの塩基が欠失していることを見出した。従って、この塩基の欠失の有無を調べることにより、被検植物が深根性の形質を有するか否かの判定が可能である。すなわち本発明は、配列番号：２の塩基配列における943番目の塩基の有無を検出する工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法であって、塩基の欠失が検出された場合に被検植物が深根性の形質を有しないと判定する方法を提供する。1塩基の欠失の有無は、Dro1遺伝子の全部又は一部を含む領域の塩基配列や分子量を比較することによって検出することが可能である。
【００６２】
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：８に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法に関する。本方法では、増幅産物が得られた場合、被検植物が深根性の形質を有すると判定される。
【００６３】
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：１０に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：１１に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法に関する。本方法では、増幅産物が得られた場合、被検植物が深根性の形質を有さないと判定される。
【００６４】
また本発明は、植物が深根性の形質を有するか否かを判定するために用いられるプライマーを提供する。このようなプライマーとして配列番号：８〜１１のいずれかに記載の塩基配列を含むDNAが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６５】
本発明において「植物が深根性の形質を有するか否かを判定する」とは、これまでに栽培されていた品種が深根性の形質を有するか否かを判定することのみならず、交配や遺伝子組換え技術によって得られる新しい品種が深根性の形質を有するか否かを判定することも含まれる。
【００６６】
本発明の植物が深根性の形質を有するか否かの判定方法は、植物が機能的なKinandang Patong型のDro1タンパク質をコードするDNAを保持しているか否かを検出することを特徴とする。植物が機能的なDro1タンパク質（Kinandang Patong型）をコードするDNAを保持しているか否かは、ゲノムDNAのDro1に相当する領域の分子量の違い、または塩基配列の違いを検出することにより判定することが可能である。
【００６７】
本発明の判定方法ではまず、DNA試料を調製（抽出）する。次いで、該DNA試料からDro1遺伝子に相当するDNA領域を増幅する。さらに、深根性の形質を有する品種におけるDro1遺伝子のDNA領域を増幅したDNA断片と、被検植物のDNA試料から増幅したDNA断片の分子量を比較し、分子量が一致する場合に、被検植物が深根性の形質を有すると判定される。あるいは、深根性の形質を有する品種におけるDro1遺伝子のDNA領域を増幅したDNA断片と、被検植物のDNA試料から増幅したDNA断片の塩基配列を比較し、塩基配列が一致する場合に、被検植物が深根性の形質を有すると判定される。
【００６８】
DNA試料の調製（抽出）は、当業者に公知の方法によって行うことができる。好ましい調製方法として、例えば、CTAB法を用いてDNAを抽出する方法を挙げることができる。
また、本発明の判定方法に供されるDNA試料は特に制限されるものではないが、通常、被検植物から抽出されるゲノムDNAを用いる。また、ゲノムDNAの採取源は特に限定されるものではなく、植物のいずれの組織からも抽出できる。例えば、穂、葉、根、茎、種子、胚乳部、フスマ、胚等から抽出することができるがこれらに限定されない。
【００６９】
本発明の判定方法では、次に、本発明のDro1遺伝子のDNA領域をPCR法等によって増幅する。本発明における「Dro1遺伝子のDNA領域」とは、Dro1遺伝子のゲノムDNA領域（例えば配列番号：１に記載のDNA領域）に相当する部分であり、増幅される範囲としてはゲノムDNA全長であってもよいし、ゲノムDNAの一部分（例えばタンパク質をコードするORF領域又はその領域の一部）であってもよい。PCRは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。PCRの際に、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅DNA産物を標識することができる。あるいはPCR反応液に32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてPCRを行うことにより、増幅DNA産物を標識することも可能である。さらに、PCR反応後にクレノウ酵素等を用いて、32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅DNA断片に付加することによっても標識を行うことができる。
【００７０】
こうして得られた標識されたDNA断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素やSDSなどの変性剤を含むポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。変性剤としてSDSを利用したSDS-PAGEは、本発明において有利な分離手法であり、SDS-PAGEはLaemmliの方法(Laemmli (1970) Nature 227, 680-685)に準じて行うことができる。電気泳動後、DNA断片の移動度を、X線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。標識したDNAを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、DNA断片を検出することができる。例えば、配列番号：８に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列を含むプライマーを用いて、深根性の形質を有する品種（例えばKinandang Patong）および被験植物からDNA断片を増幅し、分子量を比較することで被験植物が深根性の形質を有するか否かを判定することが出来る。分子量が一致する場合に、該被検植物は深根性の形質を有すると判定される。
【００７１】
また、本発明のDNAに相当する被検植物体のDNA領域の塩基配列を直接決定し、深根性の形質を有する品種の塩基配列と比較することにより、植物が深根性の形質を有するか否かを判定することもできる。塩基配列が一致する場合に、該被検植物は深根性の形質を有すると判定される。
【００７２】
本発明において「一致する」とは、対立遺伝子の両方の遺伝子の分子量または塩基配列が深根性の形質を有する植物のそれと一致すること、あるいはアミノ酸配列において一致することを意味する。したがって、対立遺伝子の一方の遺伝子の分子量、塩基配列またはアミノ酸配列が深根性の形質を有する植物のそれと異なるが、もう一方が深根性の形質を有する植物のそれと同じである場合には、「一致する」に含まれない。
【００７３】
上記電気泳動分析は、常法にしたがって行えばよい。例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドのゲル中で電圧をかけて電気泳動し、分離したDNAパターンを分析する。
また塩基配列の決定は、例えば市販の自動DNAシーケンサーを用いて行うことが出来る。
【００７４】
また、本発明の判定方法を利用すれば、深根性の形質を有すると識別される植物を早期に選抜することが可能となる。
すなわち本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む深根性の形質を有する植物を選抜する方法を提供する。
（ａ）深根性の形質を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
（ｂ）本明細書に記載された被検植物が深根性の形質を有するか否かを判定する方法により、工程（ａ）で得られた植物が深根性の形質を有するか否かを判定する工程。
本発明の選抜方法は、以下の工程をさらに含むことが出来る。
（ｃ）工程（ｂ）において深根性の形質を有すると判定された植物を選択する工程。
【００７５】
深根性の形質を有する植物と任意の植物との交配は当業者に周知の方法によって行うことが出来る。
本発明の選抜方法を利用すれば、深根性の形質を有すると識別される植物を早期に選抜することが可能となる。本発明はこのような深根性の形質を有すると識別される植物を早期に選抜する方法も提供する。ここでいう「早期」とは、例えばイネの出穂より前の状態を指し、好ましくは発芽直後の状態を指す。本発明の選抜方法を利用すれば、深根性の形質を有する品種の育成を従来よりも短期間で成し遂げることが可能となる。
【００７６】
本発明の判定方法及び選抜方法における植物としては、例えば単子葉植物が挙げられるがこれに限定されない。単子葉植物としては、イネ科、ユリ科、パイナップル科、ヤシ科、サトイモ科、ショウガ科、ラン科の植物などが挙げられるがこれらに限定されない。イネ科の植物としては、イネや麦類（コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ハトムギ）、トウモロコシ、キビ、アワ、 ヒエ、ソルガム、シコクビエ、トウジンビ、テフ、サトウキビ、チモシー、ケンタッキーブルーグラス、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、バヒアグラスなどがあげられるがこれらに限定されない。
【００７７】
また本発明は、本発明のDro1遺伝子の塩基配列またはその相補配列に相補的な少なくとも15（例えば16,17,18,19,20,21,22,23,24,25）の連続する塩基を含むDNA（オリゴヌクレオチド）を提供する。ここで「相補配列」とは、A:T、G:Cの塩基対からなる2本鎖DNAの一方の鎖の配列に対する他方の鎖の配列を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上（95%,96%,97%,98%,99%）の塩基配列の同一性を有すればよい。このようなDNAは、本発明のDNAの検出や単離を行うためのプローブとして、また、増幅を行うためのプライマーとして有用である。
プライマーとしては、以下のプライマーセットが挙げられるがこれらに限定されない。
IR64とKinandang Patong 間で多型を示すInDelマーカーであるDro1-INDEL09の増幅に用いられる、配列番号：４に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：５に記載の塩基配列を含むプライマーからなるプライマーセット
IR64とKinandang Patong 間で多型を示すCAPSマーカーであるDro1-CAPS05の増幅に用いられる、配列番号：６に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：７に記載の塩基配列を含むプライマーからなるプライマーセット
Kinandang PatongのゲノムDNA特異的マーカーであるSNP02-KPの増幅に用いられる、配列番号：８に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列を含むプライマーからなるプライマーセット
IR64由来のゲノムDNA特異的マーカーであるSNP02-IR64の増幅に用いられる、配列番号：１０に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：１１に記載の塩基配列を含むプライマーからなるプライマーセット
また本発明は、植物（例えばイネ）由来のゲノムDNAを鋳型とし上のプライマーセットによって増幅されるDNA断片の全部又は一部を含むヌクレオチドであって、Dro1遺伝子の20〜100の連続したヌクレオチドに関する。このようなDNAは被検植物が深根性であるか浅根性であるかの判定に有用である。
【００７８】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００７９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
【００８０】
また本発明は、Dro1遺伝子あるいは当該遺伝子を発現可能に保持するベクターを含む植物に深根性の形質を付与する薬剤に関する。本発明の薬剤に用いるDNAの形態に特に制限はなく、cDNAであってもゲノムDNAであってもよい。また、植物に導入された場合に当該植物に深根性の形質を付与することが可能な限り、イネ由来のDro1タンパク質をコードするDNAのみならず、該タンパク質に構造的に類似したタンパク質をコードするDNA（例えば、変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログ）を用いることもできる。
本発明の薬剤に含まれるDNAは、ベクターに挿入された形態であってもよい。ベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、ジャガイモ・キチナーゼ遺伝子SK2のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター等）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。
本発明の薬剤は、上記DNAや該DNAが挿入されたベクター自体であってもよく、また、これらが植物細胞への導入のための他の成分と混合されているものであってもよい。例えば、上記DNA、上記DNAを挿入したベクター、上記DNAが導入されたアグロバクテリウム、これらを含む生化学的試薬や溶液は、本発明における薬剤に含まれる。
【００８１】
また本発明は、本発明のDNAで形質転換された植物体であって、耐乾性を有する植物体に関する。
また本発明は、上記植物体から単離された細胞、繁殖材料、器官に関する。
また本発明は、上記細胞、繁殖材料、器官の少なくとも１つから得られる加工食品に関する。
また本発明は、本発明のDNA又はベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、耐乾性を有する形質転換植物体の製造方法に関する。
また本発明は、以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む植物が耐乾性を有するか否かを判定する方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、被検植物が耐乾性を有すると判定する方法に関する。
（ａ）被検植物からDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から本発明のDNAを含む領域を増幅する工程、及び
（ｃ）増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、本発明のDNAのそれと比較する工程。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：８に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が耐乾性を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が耐乾性を有すると判定される方法に関する。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：１０に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：１１に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が耐乾性を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が耐乾性を有さないと判定される方法に関する。
また本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む耐乾性を有する植物を選抜する方法に関する。
（ａ）耐乾性を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
（ｂ）上記耐乾性を有するか否かを判定する方法により、工程（ａ）で得られた植物が耐乾性を有するか否かを判定する工程。
【００８２】
耐乾性を有する形質転換植物体の製造、植物が耐乾性を有するか否かの判定、耐乾性を有する植物の選抜は本明細書に記載に従って行うことが出来る。
植物が耐乾性を有するか否かは、葉面温度を測定することによって行うことが出来る。
本発明では、形質転換植物が対照と比較して、人工的に作製した乾燥ストレス下（乾燥環境下）において、わずかでも葉面温度が下降する限り、「耐乾性を有する」の意に含まれる。
【００８３】
本発明において葉面温度とは、植物体の葉の表面温度を意味する。植物は、気孔を通して二酸化炭素を吸収し、光合成を行う。同時に、気孔から細胞内の水が外気へ蒸発し、水分が失われる。この現象を蒸散という。これらの関係について、Takai et alは、葉面温度と光合成速度および気孔の開き具合(気孔コンダクタンス)には負の相関があることを報告している（Takai et al. Field Crops Research doi:10.1016/j.fcr.2009.10.019. 2009）。気孔は開けば開くほど蒸散が盛んになり、蒸散により葉の表面から気化熱が奪われるため葉面温度は低下する。植物が光合成を盛んに行っているときには気孔が開き蒸散も盛んとなり、葉の表面温度は低くなる。一方、植物が乾燥ストレスを受けると、細胞の水ポテンシャルを維持するため、気孔を閉じ、蒸散を抑える。その結果、光合成が低下するとともに、葉の表面温度は上昇する。乾燥条件下において、気孔を開き光合成ができる乾燥に強い植物は、そうでない植物に比べて葉面温度がより低い値を示す。Hirayama et al は、イネにおいて葉面温度を指標とした耐乾性の系統選抜は耐乾性イネ品種の開発に効果的であると報告している(Hirayama et al. Breeding Science 56: 47-54. 2006)。植物の葉面温度が低いかどうかは、実施例に記載のように、乾燥ストレス時に赤外線サーモグラフィなどの装置を用いることで簡単に判定することが出来る。また、光合成や気孔の開き具合は、実施例に記載のように、乾燥ストレス時に光合成蒸散測定システムなどの装置を用いることで簡単に測定することが出来る。
【００８４】
また、通常植物は、乾燥ストレスに曝されると、葉が萎縮することが知られている。特にイネにおいては葉が針状に巻くことが知られている。しかしながら本発明の形質転換植物体は、乾燥ストレス下においても、葉がほとんど巻かない。
すなわち本発明は、本発明のDNAで形質転換された植物体であって、乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有する植物体に関する。
また本発明は、上記植物体から単離された細胞、繁殖材料、器官に関する。
また本発明は、上記細胞、繁殖材料、器官の少なくとも１つから得られる加工食品に関する。
また本発明は、本発明のDNA又はベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有する形質転換植物体の製造方法に関する。
また本発明は、以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有するか否かを判定する方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、被検植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有すると判定する方法に関する。
（ａ）被検植物からDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から本発明のDNAを含む領域を増幅する工程、及び
（ｃ）増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、本発明のDNAのそれと比較する工程。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：８に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有すると判定される方法に関する。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：１０に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：１１に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、被検植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有さないと判定される方法に関する。
また本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有する植物を選抜する方法に関する。
（ａ）乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
（ｂ）上記乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有するか否かを判定する方法により、工程（ａ）で得られた植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有するか否かを判定する工程。
【００８５】
乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有する形質転換植物体の製造、植物が乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有するか否かの判定、乾燥ストレス下において葉巻抵抗性を有する植物の選抜は本明細書に記載に従って行うことが出来る。
【００８６】
本発明において葉巻抵抗性とは、乾燥ストレスを原因とする葉の巻き込みに対する抵抗性を意味する。イネにおいて葉が乾燥すると葉の内部では上表皮の機動細胞が膨圧を失い結果として葉が上表面側に巻く。植物が葉巻抵抗性を有するか否かは乾燥ストレス時に葉が巻きこむか巻き込まないかによって簡単に判定することが出来る。
本発明では、形質転換植物が対照と比較してわずかでも乾燥ストレス時の葉の巻き込みの程度が少ない限り、「葉巻抵抗性を有する」の意に含まれる。
【００８７】
また、通常、作物は乾燥ストレス条件下では不稔が多数発生し稔実数や稔実重が減少する。そのため最終的な収量は減少する。しかしながら本発明の形質転換植物体は、本発明のDNAを有さない植物体（対照）と比較し、乾燥ストレス下においても多くの稔実数もしくは稔実重を有する（稔実数もしくは稔実重の減少が抑制されている）。
すなわち本発明は、本発明のDNAで形質転換された植物体であって、対照と比較し、乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは稔実重を有する植物体に関する。このような植物体は、乾燥ストレス下における稔実数もしくは稔実重の減少が抑制された植物体と表現することも出来る。また、対照と比較し、乾燥ストレス下における稔実数もしくは稔実重が増加した植物体と表現することも出来る。
また本発明は、上記植物体から単離された細胞、繁殖材料、器官に関する。
また本発明は、上記細胞、繁殖材料、器官の少なくとも１つから得られる加工食品に関する。
また本発明は、本発明のDNA又はベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、対照と比較し乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有する形質転換植物体の製造方法に関する。
また本発明は、以下（ａ）から（ｃ）の工程を含む、対照と比較し、植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するか否かを判定する方法であって、分子量または塩基配列が一致するときに、対照と比較し、被検植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有すると判定する方法に関する。
（ａ）被検植物からDNA試料を調製する工程、
（ｂ）該DNA試料から本発明のDNAを含む領域を増幅する工程、及び
（ｃ）増幅したDNA断片の分子量または塩基配列を、本発明のDNAのそれと比較する工程。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：８に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、対照と比較し、植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、対照と比較し、被検植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有すると判定される方法に関する。
また本発明は、被検植物から調製したゲノムDNAを鋳型とし配列番号：１０に記載の塩基配列を含むプライマー及び配列番号：１１に記載の塩基配列を含むプライマーでPCRを行う工程を含む、対照と比較し、植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するか否かを判定する方法であって、増幅産物が得られた場合、対照と比較し、被検植物が乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有さないと判定される方法に関する。
また本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む、対照と比較し、乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有する植物を選抜する方法に関する。
（ａ）対照と比較し乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有する植物と任意の植物とが交配された品種を作製する工程、及び
（ｂ）上記対照と比較し乾燥ストレス下において植物が多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するか否かを判定する方法により、工程（ａ）で得られた植物が、対照と比較し、乾燥ストレス下において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するか否かを判定する工程。
【００８８】
上記植物体の製造、判定及び選抜は、本明細書の記載に従って行うことが出来る。
本発明において多くの稔実数もしくは重い稔実重を有するとは、本発明のDNAを有さない対照と比較し、乾燥ストレス下における稔実数が多いもしくは稔実重が重いことを意味する。本発明においては、対照と比較しわずかでも多くの稔実数もしくは重い稔実重を有する限り、「多くの稔実数もしくは重い稔実重を有する植物体」を意味する。
植物の稔実数は、例えば収穫した穂から不稔を除いた稔実を数えることによって簡単に測定することが出来るがこの方法に限定されない。また、植物の稔実重は、例えば収穫した穂から不稔を除いた稔実の重さを計ることによって簡単に測定することが出来るがこの方法に限定されない。
【００８９】
以下に、配列番号と配列の対応関係を示す。
配列番号１：Kinandang PatongのDro1遺伝子のゲノムDNAの塩基配列
配列番号２：Kinandang PatongのDro1遺伝子のcDNAの塩基配列
配列番号３：Kinandang PatongのDro1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４、５：IR64とKinandang Patong 間で多型を示すInDelマーカーであるDro1-INDEL09の増幅に用いられるプライマーセット
配列番号６、７：IR64とKinandang Patong 間で多型を示すCAPSマーカーであるDro1-CAPS05の増幅に用いられるプライマーセット
配列番号８、９：Kinandang PatongのゲノムDNA特異的マーカーであるSNP02-KPの増幅に用いられるプライマーセット
配列番号１０、１１：IR64のゲノムDNA特異的マーカーであるSNP02-IR64の増幅に用いられるプライマーセット
配列番号１２：ソルガムのDro1遺伝子のCDSの塩基配列
配列番号１３：ソルガムのDro1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４：トウモロコシのDro1遺伝子のCDSの塩基配列
配列番号１５：トウモロコシのDro1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６：日本晴のFOX hunting systemに用いられているcDNAの塩基配列。ゲノムDNAの塩基配列から決定されたcDNA配列（配列番号：２の塩基配列）に対し、5'末端と3'末端配列がそれぞれ1bp付加されている。また、本cDNA塩基配列ベースで5'末端側から373bp目（配列番号：２における5'末端側から372bp目）のAがGに塩基置換されている。
配列番号１７：Kinandang PatongのDro1遺伝子およびプロモーター領域を含むその上流の塩基配列
配列番号１８：日本晴において、配列番号：１７に対応する領域の塩基配列
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００９０】
本発明では、簡便で、再現性が高く、省スペースで深根性を調査できようにバスケット法を改良した。また、候補となる塩基配列をIR64に導入するため、カルスを用いたアグロバクテリウム形質転換法を改良し、IR64に遺伝子を導入した。これらの方法を用いたマップベースクローニング法により、深根性遺伝子であるDro1の塩基配列を単離、同定した。この遺伝子を用いてイネの深根性を容易に改変し、さらに、乾燥回避能を付与する手法を開発した。
以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕Dro1遺伝子座の同定
フィリピンの陸稲品種Kinandang Patongと国際稲研究所が育成した水稲品種IR64の2品種を国際稲研究所より分譲していただき、両品種を交配することで遺伝子単離の材料を育成した。両品種の交配に由来するBC2F2集団のうち、第9染色体は分離するが、それ以外の染色体領域はできるだけIR64ホモ型に固定した集団において、浅根型と深根型の個体が分離することを発見した。IR64は浅根型を、Kinandang Patongは深根型を示すことから、この分離はKinandang Patongが持つ深根性の遺伝子が関与していると考え、集団内の個体を達観により浅根型と深根型に分けて、遺伝子型を調査した。その結果、深根性に関与するQTLが、第9染色体に存在することが分かった（Uga et al. The 2nd International Conference on Plant Molecular Breeding. 2007）。詳細な遺伝解析を行うために、深根性を定量的に評価できるバスケット法を利用した。すなわち、土を充填した直径15cmのプラスチックザルをポットに埋設し、播種した後、イネが8葉齢前後になるまで栽培した。各バスケットから出てくる全根数に対してバスケットの底から出てくる根の割合を深根率として深根性を求めた。バスケットの底は平らになっており、地表面に対して53度より下に向かって伸長する根がバスケットの底より伸長することになる。IR64の深根率は平均1.6%であったのに対し、Kinandang Patongの深根率は平均72.6％であった。深根性に関与するQTLを単一遺伝子座としてマッピングするために、BC2F2集団からQTLの近傍領域で組換えが生じた8個体を選抜し、その自殖後代（BC2F3）からさらに組換え自殖固定系統（BC2F4）を選抜した。各固定系統について、20〜23個体をポット栽培し、バスケット法によって求めた深根率から遺伝子型を推定した。BC2F4系統のうち、QTLの周辺領域がIR64型に固定した系統の深根率は平均2.6％とIR64とほぼ同じ割合を示したのに対し、QTLの周辺領域がKinandang Patong型に固定した系統の深根率は平均40.4％であった。この結果から、各系統のQTLの遺伝子型は明確に決定され、QTLはInDelマーカーであるID07_14とID07_17の間に単一遺伝子座として位置づけられた。そこで、このQTLは深根性関連遺伝子座Dro1(Deeper Rooting 1)と命名された（宇賀ら 日本育種学会第112回講演会要旨集188p. 2007; 宇賀ら 第27回根研究集会. 2007; Uga et al. The 5th International Crop Science Congress Abstracts 243p. 2008）。さらに、公開されているsimple sequence repeat（SSR）マーカー情報（International Rice Genome Sequencing Project 2005）をもとに、両InDelマーカー間に存在するすべてのSSRマーカーの多型解析を行い、Dro1の候補領域をSSRマーカーであるRM24393とRM7424間の608kbpに絞り込んだ。【００９１】
〔実施例２〕高精度連鎖解析
Dro1遺伝子をマップベースクローニング法で単離するため、4,560個体からなるBC3F2集団から候補領域内で組換えのあった359個体を選抜した。選抜した個体の後代を用いて候補領域を絞り込むためには、一度に多数の個体の深根率を調査する必要があった。そこで、バスケットをポットに埋設しないで水耕栽培で調査できる方法を考案した。考案した改良型バスケット法は、ポットにザルを埋設することなく、土を充填した直径7.5cmのステンレス製の特注ザルを水耕液中に設置することで、これまでの方法よりも1/4のスペースでイネの深根率を調査することが可能となった。改良型バスケット法での深根率は、地表面に対して50度より下に向かって伸長する根を深根として求めた（図1）。改良型バスケット法を用いて、各系統あたり約40個体の深根率を調査し、深根率の頻度分布から各系統のDro1遺伝子の遺伝子型を推定した。遺伝子領域を狭めるために、DNAマーカーのスクリーニングを行った。OryzaSNP Consortium（http://irfgc.irri.org/index.php?option=com_content&task=view&id=14&Itemid=106）のホームページからIR64とKinandang Patongに近い品種AzucenaのDro1周辺のSNP情報を抽出し、CAPSマーカーをデザインした。これらのCAPSマーカーの多型をIR64とKinandang Patongで調べ、多型のあった6マーカーをマッピングに用いた。また、IR64とKinandang PatongのBACライブラリーを作製し、候補領域を含むクローンの選抜を行い、選抜したクローンの塩基配列を解析した。これらの配列情報を用いてIR64とKinandang Patong 間で多型を示すInDelマーカーやCAPSマーカーを11個作製した。これらのマーカーを用いて359系統から組換え系統を選抜し、連鎖解析を行った結果、Dro1の遺伝子領域はInDelマーカーであるDro1-INDEL09（プライマー5'- GCAGACGCTCGTAACACGTA -3'（配列番号：４）およびプライマー5'- GTGGCAGCTCCATCAACTCT -3'（配列番号：５））からCAPSマーカーであるDro1-CAPS05（プライマー5'- GCACAAGATGGGAGGAGAGT -3'（配列番号：６）およびプライマー5'- CATGGGTGAGAATCGTGTTG -3'（配列番号：７）、増幅したDNAはHinfIで制限酵素処理を行う）で挟まれた6.0kbpの領域に絞り込まれた。この候補領域を含むゲノム塩基配列をRAP-DBにより解析した結果、1つの予測遺伝子が存在した。この予測遺伝子は、IR64の配列で第4エキソンに1bの欠失が存在し、フレームシフトによってストップコドンが生じていることが分かった。【００９２】
〔実施例３〕Dro1遺伝子の特定のための相補試験およびDro1遺伝子過剰発現体の深根率の検討
3.1 Dro1遺伝子特定のための相補試験
RAP-DB で予測された遺伝子をDro1本体であると仮定し、Dro1候補領域6.0kbpとその前後を含むKinandang Patong由来のKpnI-NotI断片8.7kbpをpPZP2H-lac(Fuse et al. Plant Biotechnology 18:219-222, 2001)に組込み、アグロバクテリウムEHA101菌を介してIR64のカルスに導入した。具体的なIR64の形質転換は以下のとおりである。
（アグロバクテリウムを感染させるカルスの誘導）
滅菌したIR64の種子を2,4-Dを含むカルス誘導培地に置床し、30から33℃の24時間照明下で1週間培養後、新しいカルス誘導培地にカルスを分割し移植した。この操作を3回繰り返し、カルスを形成させた。カルス誘導培地の組成は、Hiei and Komariらが未熟胚法を用いた形質転換法で形質転換カルスを選抜した後に形質転換植物を再分化させる前培養として用いたNBPRCH40(Hiei and Komari Nature Protocols 3: 824-834. 2008)を改変し、カルス誘導培地として用いた。カルス誘導培地の組成は、以下のとおりである。
：100mL 10x N6 major salts、10mL 100x FeEDTA、1mL 1000x B5 minor salts、1mL 1000x B5 vitamins、30g/Lマルトース、0.5g/Lカザミノ酸、0.5g/Lプロリン、2mg/L 2,4-D、5ｇ/Lゲルライト、pH5.8。
（アグロバクテリウムの感染）
カルスを感染前に新しい培地に移植し、3日間前培養したカルスをアグロバクテリウム菌液に浸せきした後、2N6-AS培地（Hiei and Komari Nature Protocols 3: 824-834. 2008）に移植し、暗黒下23℃で共存培養を行った。
（除菌及び形質転換カルスの選抜）
共存培養の完了後、アグロバクテリウムを除菌し、次いで形質転換した細胞を選抜するために形質転換処理カルスを薬剤として25mg/Lハイグロマイシン及び400mg/Lカルベニシリンを含有するカルス誘導培地（選抜培地）に置床した。30から33℃の24時間照明下で1週間培養後、新しい選抜培地にカルスを分割し移植した。この操作を3回繰り返し、形質転換細胞を選抜した。
（形質転換体の再分化）
選抜培地上で増殖の見られたカルスを再分化培地に移植した。28℃の24時間照明下で1週間から10日間培養後、新しい再分化培地に芽が形成され始めたカルスについて移植した。この操作を2回繰り返し、形質転換植物を選抜した。再分化培地の組成は、以下のとおりである：100mL 10x N6 major salts、10mL 100x FeEDTA、1mL 1000x B5 minor salts、1mL 1000x B5 vitamins、30g/Lマルトース、30g/L ソルビトール、2g/Lカザミノ酸、0.5g/Lプロリン、0.02mg/L NAA、5ｇ/L、2mg/L カイネチン、5g/L ゲルライト、pH5.8に調整した培地に25mg/Lハイグロマイシン及び300mg/Lカルベニシリンを添加した。
（鉢上げ）
再分化した形質転換体を、発根培地（25mg/Lハイグロマイシン及び200mg/Lカルベニシリンを添加したMS培地(4g/L ゲルライト、pH5.8)）に移して、28℃の24時間照明下で培養した。形質転換植物は根の発育を確認した後に、鉢上げした。
ハイグロマイシンで選抜し得られた異なるカルス由来の形質転換体17クローンの当代（T0)の深根率を改良バスケット法で調査した。ベクターコントロールでは深根率は、IR64と同じであったが、8.7kbpのKinandang Patong断片を導入した系統のうち、深根率の高い系統が多数観察された（図1、図2）。T0世代でサザン解析と形質転換ベクター中に含まれるハイグロマイシン抵抗性遺伝子の配列を検出できるリアルタイムPCRの系を併用し、各個体に導入された形質転換ベクターのコピー数を調べ、シングルコピーの個体を選び、T1種子を増殖した。T1個体では、リアルタイムPCRの系を用いて得られたシグナル強度から、T0でシングルコピーであった4系統のnull型(0コピー)、ヘテロ型(1コピー)、ホモ型(2コピー)を推定し、深根率との関係を調べた。4系統ともシグナル強度が0の個体の深根率はコントロールベクターと同じであった（図3）。一方、シグナル強度の強い系統は深根率も高かった。例えば、D27-cでは、2系統のシグナル強度は0で深根率も低いことからnull型と考えられる。また、シグナル強度が10から20程度の4系統については深根率も中程度であることからヘテロ型、シグナル強度が40から70程度の4系統は深根率がすべて高いことからホモ型であると判断した。このように、シングルコピーのT1系統では、導入されたDro1の遺伝子型の分離と深根率に正の相関がみられた。
3.2 Dro1遺伝子過剰発現体の深根率の検討
予測遺伝子はRAP-DBで完全長cDNA （AK068870）が登録されており、日本晴のFOX hunting system (Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system) でT1世代が2系統、T2世代が2系統存在した。FOX系統に用いられた完全長cDNAの配列（配列番号：16）は、ゲノムの塩基配列から決定されたcDNA配列（配列番号：２）に対して、5'末端と3'末端配列がそれぞれ1bp付加されていた。また、本cDNA塩基配列ベースで5'末端側から373bp目（配列番号：２における5'末端側から372bp目）のAがGに塩基置換されていた。この塩基置換により、配列番号：３における37番目のアミノ酸がリジンからグルタミン酸に非同義置換を起こしていた。これら4系統について、各系統5個体の深根率を改良型バスケット法で調査した。その結果、コントロールである日本晴（野生型）10個体の深根率のレンジが12.2%から23.5%であったのに対し、FOX系統は8.1%から50.0%と日本晴よりも有意に深根率の高い個体が存在した(図４)。
これらの試験の結果から、候補領域6.0kbpに予測された遺伝子がDro1本体であることが明らかとなった。また、相補試験の結果から、Kinandang Patong型のDro1が機能型で深根となり、IR64型のDro1は機能が失われているか、低下していることで浅根になると考えられた。
マルチコピーの2系統（T1）でシグナル強度と深根率との関係を調査したところ、D130-cでは、シグナル強度と深根率に正の相関がみられた(図3)。しかし、D91-eは、シグナル強度がシングルコピーのホモ型（10〜350）程度であった4個体ではシグナル強度と深根率に正の相関がみられたが、シグナル強度が強い6系統（500〜2000）ではベクターコントロールと同じ浅根性を示した。Dro1がマルチコピーで植物体に導入されたことにより遺伝子のサイレンシングが起こったことが推測された。このことから、Dro1の遺伝子導入時にはシングルコピーを選抜するなどして発現量の調整が必要と考えられる。【００９３】
〔実施例４〕イネ、ソルガム、トウモロコシのDro1のアミノ酸配列の相同性
NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)のホームページのblastnを用いて、Dro1のアミノ酸配列をクエリーとしたDro1の類似遺伝子の検索を行った。その結果、相同性の高い類似の遺伝子がソルガムとトウモロコシでそれぞれ１つずつ見出された。ソルガムとトウモロコシともに、Dro1にもっとも類似したORFには遺伝子名が無く、ソルガムはSbDro1L1、トウモロコシはZmDro1L1と命名した。ソルガムのアミノ酸配列はNCBIのホームページから取得した。トウモロコシのアミノ酸配列については、MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)からNCBIで取得したmRNA配列をもとに検索し、取得した。SbDro1L1のCDSの塩基配列を配列番号：１２に、アミノ酸配列を配列番号：１３に示した。またZmDro1L1のCDSの塩基配列を配列番号：１４に、アミノ酸配列を配列番号：１５に示した。Dro1に対するSbDro1L1の相同性は64％、ZmDro1L1の相同性は62％であった（図5）。【００９４】
〔実施例５〕圃場条件におけるDro1の深根性への効果
Dro1が圃場条件下において、深根化しているかを調べた。圃場試験の実験材料として用いた準同質遺伝子系統(Dro1-NIL)は以下の通り作製した。IR64／Kinandang PatongのF1にIR64を4回戻し交雑し、1回の自殖を行ったBC4F2系統の中から 第9染色体16.6〜19.5Mbpの領域のみがホモ型になっている個体を選抜した。この系統の自殖種子を準同質遺伝子系統として用いた。畑圃場にIR64とKinandang Patong、Dro1-NILを播種し、一般的な陸稲の肥培管理を行った。灌水は、特に行わず、天水のみで105日間栽培した。ショベルカーを用いて植物体の株元近くの土壌を深さ約1ｍ掘り起こした後、水スプレーを用いて株から5cm程度の断面を丁寧に洗い流し、根がどこまで伸びているかを観察した。その結果、IR64で約20cm、Kinandang Patongで約80cm、Dro1-NILで約40cmの土壌深度まで根が伸びていた（図6）。Dro1-NILの根の長さは、IR64の根の長さと同じであったが、Dro1-NILはIR64に比べ約2倍も深く根が伸長していた。これは、Dro1の効果によって根の伸長角度が大きくなったことで、IR64の根の長さとほぼ同じ40cm程度まで根が深く伸びたことによる。【００９５】
〔実施例６〕耐乾性検定床におけるDro1の耐乾性への効果
Dro1による深根化が耐乾性向上に関与しているか調べた。耐乾性試験の実験材料としてIR64とDro1-NILを用いた。耐乾性試験には茨城県農業総合センター生物工学研究所にて用いられている耐干性検定(平山、須賀 農業研究センター研究資料第30号イネ育種マニュアル. 152-155. 1995)の施設と同じものを、当研究所のビニールハウス内に設けた。施設は、灌水区と乾燥ストレス区からなる。灌水区の検定床は、木枠を用いて床土に30cmの客土を行っている。灌水区は、播種時から収穫までイネに乾燥ストレスがかからないように断続的な灌水を行った。灌水は、栽培期間中土壌深度25cmに設置したテンションメーターで土壌の水ポテンシャルを測定し、約-0.015MPa以下になったときに行った(図７)。この値は、一般的に植物が乾燥ストレスの影響を受けない状態である。乾燥ストレス区の検定床は、地中からの毛細管水を遮断するために、床土の上に三分砂利を厚さ5cmほど敷き、その上に25cmの客土をした。この処理により、灌水を停止すると客土層では徐々に土壌の水分含量が低下し、植物体は乾燥ストレスにさらされることになる。乾燥ストレス区は播種後約2ヶ月目に灌水を停止し、最初の個体が出穂するまで灌水しなかった。その結果、乾燥ストレス区では、灌水停止後10日目で土壌深度25cmの水ポテンシャルが-0.07MPaまで低下し、乾燥ストレス条件下になった(図7)。一方、土壌深度40cmの水ポテンシャルはストレス処理期間を通して-0.03MPa前後で安定し乾燥条件下とはならなかった。乾燥ストレス区では灌水停止後35日目にIR64は葉巻が観察され乾燥ストレスの影響を受けていることが分かったが、Kinandang Patong型のDro1を持ったIR64(Dro1-NIL)は葉巻が見られなかった(図8)。その後、ストレス区のIR64は葉巻の程度が大きくなり、49日目には植物体の生育がかなり抑制されていることが分かった。一方、IR64に比較して、Dro1-NILは49日目も葉巻の程度は小さく、個体の生育状態は良かった。葉面温度については、乾燥ストレス区で灌水停止後35日目のIR64に比べDro1-NILは葉面温度が平均0.7℃低かった(図9)。その後も、すべての調査日においてDro1-NILの葉面温度はIR64に比べ低いことが分かった。また、IR64とDro1-NILに対して気孔コンダクタンスと光合成速度を34日目と41日目の2回測定したところ、両形質ともDro1-NILがIR64と比較して有意に値が大きいことが分かった(図9)。乾燥ストレス区において最初の個体が出穂した後、再灌水を行い、イネを登熟させた。個体ごとに収穫し、各個体のかん長、穂長、地上部乾物重、穂数、穂重、稔実数を調査した。その結果、かん長と穂長についてはIR64とDro1-NIL間に有意な差は見られなかった。一方、地上部乾物重、穂数、穂重、稔実数はIR64とDro1-NIL間に有意な差がみられた(図10)。特に、稔実数はIR64に比較してDro1-NILは約3.8倍も増加していた。これらの結果が、Dro1-NILの深根性によるものかを確認するため、検定床を解体し、根が砂利層を貫通しているか調べた。その結果、IR64は砂利層を貫通することはできなかったが、Dro1-NILは砂利層を貫通し、下の土層に根が伸びていることが確認できた(図11)。これらのことから、Dro1がイネを深根化することで耐乾性を獲得し、光合成能力や収量を増加させることが明らかとなった。
なお葉面温度の測定は、対象物から出ている赤外線放射エネルギーを検出し、見かけの温度に変換して、温度分布を画像表示する装置（赤外線サーモグラフィ）を用いて行った。具体的には、乾燥ストレス条件下のイネ植物体に対して、一定の距離から赤外線サーモグラフィを用いて葉の表面温度を撮影した。つぎに、専用のソフトウェアで取り込んだ画像中の植物体の平均的な葉面温度を求めた。光合成速度は、葉をおいた容器に一定濃度の二酸化炭素を含んだ空気を通気し、容器から出てくる空気の二酸化炭素濃度の減少を測定し見積もった。気孔コンダクタンスは、葉をおいた容器から出てくる空気の水蒸気の増加量を測定し見積もった。具体的には、乾燥ストレス条件下のイネ植物体に対して、完全展開葉を光合成蒸散測定システムのチャンバーに一定の時間挟むことで計測値を得た。同じ展開葉を3回計測し、平均値を求めた。【００９６】
〔実施例７〕畑圃場の強干ばつ下におけるDro1の耐乾性への効果
実施例6においては、耐乾性検定床を用いてDro1の耐乾性を実証した。つぎに、畑の自然環境下での強干ばつストレスに対し、Dro1が耐乾性を示すか調査した。調査にはIR64とDro1-NILを用いて、畑圃場において施肥区(N:P:K=12:12:9 kg/10a)と無施肥区それぞれ3反復を設けた。1区画3mx3m内に、株間15cm、畝間30cmで、200個体植えた。このうち、IR64を100個体、Dro1-NILを100個体、それぞれ植えた。栽培期間中灌水は行わなかった。そのため、播種後90日目から1カ月以上雨が降らなかったことにより、土壌深度40cmにおいても土壌の水ポテンシャルが平均-0.08MPa以下という厳しい乾燥ストレス条件となった(図12)。乾燥ストレス条件下において、IR64は両処理区とも激しい葉巻現象が観察されたがDro1-NILはほとんど観察されなかった(図13)。とくに、無施肥区では、Dro1-NILは葉巻がほとんど観察されなかった一方で、IR64は葉巻が観察され、出穂日もDro1-NILに比べ大きく遅延した。収穫期に坪刈りによる収量調査を行った。調査した5項目のうち、穂数、地上部乾物重、全籾重、稔実籾重の4項目でIR64よりDro1-NILが大きな値と示した(表1)。【００９７】
【表１】
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特に、収量に最も関与する稔実籾重は無施肥区で4.9倍、施肥区で7.8倍と大幅な増加が見られた。このことから、Dro1が畑という実際の栽培環境下で、しかも、干ばつ条件下で、耐乾性を示すことが証明された。【００９８】
〔実施例８〕Dro1遺伝子内の1塩基欠失の有無を判別するマーカー
Dro1遺伝子は、IR64の配列で第4エキソンに1bの欠失が存在することから、この欠失を判別するＰＣＲマーカーを設計した。設計したマーカーは、Kinandang PatongのDNAでのみ増幅するマーカーのSNP02-KP(プライマー5'- GTCTAGATCACGCAGTGAAT -3'（配列番号：８）およびプライマー5'- TCGCATGATGATGACCAAGT -3'（配列番号：９））とIR64のDNAでのみ増幅するマーカーのSNP02-IR64(プライマー5'- ATCGTCTAGATCACGCAGTGAAC -3'（配列番号：１０）およびプライマー5'- AGGGTGGCTTTACCTCCGTA -3'（配列番号：１１））の2種類である。
PCRの反応液は、1反応15μlあたり、0.2μM プライマー、0.6U Tag、0.2mM dNTPs、2mM MgCl2、20ng DNAを含む。PCRの反応条件は、(1) 95℃ 2分、(2) 94℃ 30秒、(3) アニーリング温度は51.8℃から62.2℃の範囲で30秒、(4) 72℃ 1分、(5) 7分で、SNP02-KPは(2)から(4)の反応を25サイクル、SNP02-IR64は(2)から(4)の反応を30サイクルそれぞれおこなった。PCR産物を電気泳動した結果、SNP02-KPはKinandang Patongで、SNP02-IR64はIR64でのみそれぞれ増幅が確認された（図９）。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によりイネなどの植物の深根性を制御するDro1遺伝子及び該遺伝子で形質転換された植物体が提供された。Dro1遺伝子の操作により浅根型の植物を深根化することで、乾燥回避能が向上した植物の作出が期待できる。あるいは、Dro1遺伝子の操作により深根型の植物を浅根化することで、植物への耐湿性の付与が期待できる。
世界的には干ばつによる農作物の減収が深刻である。また日本では、水田の排水性が悪いため、耐湿性のない大豆やトウモロコシの湿害が問題となっている。本発明は、このような国内外の問題の解決に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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