(57)【要約】  キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）のゲノムに由来する、真核細胞宿主内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、分泌シグナル遺伝子が開示される。この分泌シグナル遺伝子により、タンパク質を効率よく製造することが可能となる。
2011078351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）のゲノムに由来する、真核細胞宿主内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、分泌シグナル遺伝子。
【請求項２】
キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の分泌シグナル遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）：
（ａ）配列番号１１１、２〜５、１５、２４、２９、３１、３２、３５、３６、４１、４６、４９〜５１、５５〜５７、６０、６３、６４、７８、８７、９１、９８、１０７、１１８、１２０、１２１、１２６、１３０、１３１、１３３、１３６、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７〜１４９、１５２、１５４、１５６、１６８、１７２、１７３、１７８、１７９、１８５、１８９、１９０、１９７、１９８、２０２、２１５、２１８、２２４、２２５および２３２〜２３４からなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号５４０〜５４４、５４６、５４７、５５０、５５４、５５６〜５５８、５６１、５６２、５６６〜５６９、５７１、５７６、５７９、５８２、５８５〜５９２、５９５、５９７、５９８、６０２、６０６、６１０、６１１、６１４、６１８、６１９、６２１、６２２、６２５、６２６、６２８、６２９、６３２、６３４、６３６〜６３９、６４２〜６４８、６５１、６５２、６５７〜６５９、６６１、６６３、６６４、６６９、６７０、６７２、６７７、６７８、６８１、６８４、６８６、６９０、６９１、６９４、６９６、６９７、７００〜７０４、７１０、７１１、７１３〜７１５、７１７、７１８、７２１〜７２４、７２９、７３１〜７３４、７３７、７３８、７４２、７４５、７４７、７５０、７５２および７５９からなる群から選択されるアミノ酸配列；
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列であり、かつ、分泌シグナル活性を有するアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列からなる、請求項１または２に記載の分泌シグナル遺伝子。
【請求項４】
真核細胞宿主内でタンパク質を発現させるための発現用ベクターであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に前記タンパク質の遺伝子を連結させるための遺伝子導入部位を含んでなる、発現用ベクター。
【請求項５】
真核細胞宿主内でタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に連結された前記タンパク質の遺伝子を含んでなる、発現ベクター。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の分泌シグナル遺伝子と、該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に連結されたタンパク質の遺伝子とからなるコード配列、または請求項５に記載の発現ベクターを含んでなる真核細胞宿主からなる、形質転換体。
【請求項７】
タンパク質を製造する方法であって、
（ａ）請求項６に記載の形質転換体を培養し、これにより培地中にタンパク質を蓄積させる工程、および
（ｂ）培地からタンパク質を回収する工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２００９−２９５９２７号（出願日：２００９年１２月２５日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【発明の背景】
【０００２】
技術分野
本発明は、新規な分泌シグナル配列およびこれを利用したタンパク質発現系に関する。
【０００３】
背景技術
これまでに、遺伝子組み換え技術を用いたタンパク質生産には、大腸菌、酵母、枯草菌などの微生物をはじめとして、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞など、様々な宿主が用いられてきた。これらタンパク質生産系において、大腸菌が最も広く用いられている宿主の一つである。しかしながら、大腸菌で発現させた異種タンパク質は不溶化する場合が多く、また、翻訳後の修飾が行われないことから、真核生物由来のタンパク質を天然型と同じ立体構造で再現することは必ずしも容易ではない。また、大腸菌には特有のエンドトキシンが存在し、これが最終製品に夾雑物として混入する可能性がある。一方、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞を用いる方法は、真核生物由来のタンパク質の正確な翻訳後修飾が期待できるが、扱いが微生物より難しい、培養コストがかかる、生育が遅い、生産効率が悪い、培養のスケールアップが困難など、多くの問題点を有する。このため、安価にタンパク質を生産するためには、大腸菌のように取り扱いが容易で、真核生物由来のタンパク質を発現させた場合においても翻訳後修飾が起こる宿主が有望である。
【０００４】
単細胞真核微生物である酵母でタンパク質を分泌発現させた場合、細胞質から小胞体／ゴルジ体を経由する過程で様々な修飾が起こる。そのため、ヒトや動物由来のタンパク質を比較的高い確率で正常タンパク質として発現することができる。また、大腸菌などの微生物と同様に、培養設備、培養時間および培養コストの面で培養細胞よりも安価に培養することができるという利点を有する。特に出芽酵母は、ビールやワインなどの酒類やパンの製造に用いられており、安全性が確認されている。
【０００５】
酵母のうち、今日まで最も良く研究されて遺伝学的知見が蓄積している酵母にはサッカロマイセス属酵母があり、これは種々の物質生産の宿主として検討されている。近年、サッカロマイセス属以外の酵母として、ピキア属酵母、ハンセヌラ属酵母、クルイベロマイセス属酵母、カンジダ属酵母などの多くの種について、それらを形質転換する手法が開発され、有用物質生産の宿主として検討されている。特にカンジダ属酵母は、炭素資化領域が広く、Crabtree効果陰性酵母であるなど、サッカロマイセス属にはない特徴を有していることから、有用物質生産とってその役割が期待されている。
【０００６】
カンジダ属酵母の中でも、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）は、キシロースなどのペントースに対する優れた資化性を示す。サッカロマイセス属とは異なり、好気的条件下でエタノールを生成せず、それによる増殖阻害も受けないことから、高密度で連続培養による効率的な菌体生成が可能である。また、無機窒素の同化能に優れることから、かつてタンパク質源として注目され、ペントースを多く含む、広葉樹の糖化液や亜硫酸パルプを糖源とした菌体の工業生産が実施されたことがある。また、キャンディダ・ユティリスは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やサッカロマイセス・フラジリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）と同様に、ＦＤＡ（米国連邦食品医薬品局）によって食用酵母として認定されており、食品添加物として安全に使用できることが認められている。実際に、キャンディダ・ユティリスは、現在でも日本、ドイツ、アメリカなど、世界各国で生産され、食飼料として利用されている。さらに、以上のような微生物タンパク質源としての利用だけでなく、キャンディダ・ユティリスは、ペントースの資化性株、エチルアセテート、L-グルタミン酸、グルタチオン、インベルターゼなどの生産株として広く産業界で利用されてきた。近年、キャンディダ・ユティリスについてもその形質転換法が開発され（非特許文献１：K Kondo, T Saito, S Kajiwara, M Takagi and N Misawa., A transformation system for the yeast Candida utilis: use of a modified endogenous ribosomal protein gene as a drug-resistant marker and ribosomal DNA as an integration target for vector DNA., J. Bacteriol., 12, 1995, 7171-7177, Vol 177, No.）、様々な化合物を代謝工学的に生産する技術が開発されている（非特許文献２：Hiroshi Shimada, Keiji Kondo, Paul D. Fraser, Yutaka Miura, Toshiko Saito, and Norihiko Misawa., Increased Carotenoid Production by the Food Yeast Candida utilis through Metabolic Engineering of the Isoprenoid Pathway., Appl Environ Microbiol, July 1998, p. 2676-2680, Vol. 64, No. 7；非特許文献３：Yutaka Miura, Keiji Kondo, Toshiko Saito, Hiroshi Shimada, Paul D. Fraser, and Norihiko Misawa, Production of the Carotenoids Lycopene, β-Carotene, and Astaxanthin in the Food Yeast Candida utilis., Appl Environ Microbiol, April 1998, p. 1226-1229, Vol. 64, No. 4；非特許文献４：Keiji Kondo, Yutaka Miura, Hidetaka Sone, Kazuo Kobayashi & Hiroshi lijima., High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis., Nature Biotechnology 15, 453 - 457 (1997)；非特許文献５：Yutaka Miura, Keiji Kondo, Hiroshi Shimada, Toshiko Saito, Katsumi Nakamura, Norihiko Misawa., Production of lycopene by the food yeast, Candida utilis that does not naturally synthesize carotenoid., Biotechnology and Bioengineering Volume 58 Issue 2-3, Pages 306 - 308；非特許文献６：Shigehito IKUSHIMA, Toshio FUJII1), Osamu KOBAYASHI, Satoshi YOSHIDA and Aruto YOSHIDA., Genetic Engineering of Candida utilis Yeast for Efficient Production of L-Lactic Acid., Bioscience Biotechnology and Biochemistry, Vol. 73 (2009), No. 8, pp.1818-1824；非特許文献７：Yi-Ren Hong, Ya-Lei Chen, Lynn Farh, Wen-Jen Yang, Chen-Hua Liao and David Shiuan., Recombinant Candida utilis for the production of biotin., Applied Microbiology and Biotechnology., Volume 71 (2006), Number 2, 211-221）。また、キャンディダ・ユティリスについて、多くの細胞質タンパク質が容易に生産できるようになり、発現システムとしての有用性が明らかにされている。
【０００７】
酵母におけるタンパク質生産においてタンパク質を分泌生産させることは、翻訳後に糖鎖などの修飾が付加される点、精製が容易である点、物質の細胞外変換の観点から望ましい方法である。酵母によるタンパク質の分泌発現は種々の利点があることから、これまで、より効率的な分泌生産を目指して数多くの取り組みがなされてきた（非特許文献８：MICHAEL A. ROMANOS, CAROL A. SCORER AND JEFFREY J. CLARE., Foreign gene expression in yeast: a review., YEAST VOL. 8: 423-488 (1992)）。キャンディダ・ユティリスにおいても、異種タンパク質の分泌発現量の向上を目的として、その主要分泌タンパク質であるインベルターゼの遺伝子を不活性化することにより、異種タンパク質の分泌発現量を増大させることに成功した報告がなされている（特許文献１：特開２００３−４７４７１６号公報）。しかしながら、細胞質タンパク質の発現量と比較した場合、異種タンパク質の分泌発現量は低く、改良の余地は大きい。
【０００８】
タンパク質が細胞外に分泌されるためには、まず、小胞体膜上の膜透過装置（トランスロコン）によって小胞体膜を通過する必要がある。分泌タンパク質の認識にはタンパク質のＮ末端に存在するシグナルペプチドが重要な役割を示す。酵母における一般的な分泌シグナルの構造は、２０アミノ酸前後の長さを持ち、Ｎ末端近傍に塩基性アミノ酸が存在し、その後に疎水性のアミノ酸が連続する構造を有する。最終的にこのシグナルペプチドは小胞体膜上のシグナルペプチダーゼで切断され、切断される部位となるＣ末端には分子量の小さなアミノ酸が存在する。膜通過には、トランスロコンに結合したリボソーム上でのタンパク質の合成と共役して行われるものと、細胞質で前駆体タンパク質合成完了後にSec62/63複合体が加わったトランスロコンを介して小胞体内腔へと通過されていく例が知られている。このように、１つのタンパク質の分泌には数多くのタンパク質が関わっており、それら分泌経路が選択される上でも、シグナルペプチドの構造が分泌効率に与える影響は大きい。しかしながら、キャンディダ・ユティリスにおいて、分泌効率の優れたシグナルペプチドが詳細に検討された例はない。
【０００９】
分泌されたタンパク質はすでにシグナルペプチドを有していないため、そのアミノ酸配列を決定するためには分泌タンパク質の塩基配列を決定する必要がある。分泌タンパク質は培養上清や膜画分をSDS-PAGEに供することで検出することができる。検出されたタンパク質についてアミノ酸解析や質量分析等を行うことにより部分アミノ酸配列を決定することができ、アミノ酸配列から予測された塩基配列情報を基にしてPCRやサザン解析を行うことによって分泌タンパク質の塩基配列を決定することができる。しかしながら、この方法では多検体の同定は困難であり、タンパク質自体の同定が困難な場合も多い。また、この方法では実際に発現している分泌タンパク質しか同定することができないため、潜在的な分泌タンパク質のシグナル配列を取得することはできない。
【００１０】
また、全ゲノム配列が明らかとなっている生物であれば、分泌シグナルとして機能しうる候補を効率良く選抜することが可能である。しかし、キャンディダ・ユティリスの全ゲノム配列は、今のところ公開されていない。
【００１１】
【非特許文献１】K Kondo, T Saito, S Kajiwara, M Takagi and N Misawa., A transformation system for the yeast Candida utilis: use of a modified endogenous ribosomal protein gene as a drug-resistant marker and ribosomal DNA as an integration target for vector DNA., J. Bacteriol., 12, 1995, 7171-7177, Vol 177, No.
【非特許文献２】Hiroshi Shimada, Keiji Kondo, Paul D. Fraser, Yutaka Miura, Toshiko Saito, and Norihiko Misawa., Increased Carotenoid Production by the Food Yeast Candida utilis through Metabolic Engineering of the Isoprenoid Pathway., Appl Environ Microbiol, July 1998, p. 2676-2680, Vol. 64, No. 7
【非特許文献３】Yutaka Miura, Keiji Kondo, Toshiko Saito, Hiroshi Shimada, Paul D. Fraser, and Norihiko Misawa, Production of the Carotenoids Lycopene, β-Carotene, and Astaxanthin in the Food Yeast Candida utilis., Appl Environ Microbiol, April 1998, p. 1226-1229, Vol. 64, No. 4
【非特許文献４】Keiji Kondo, Yutaka Miura, Hidetaka Sone, Kazuo Kobayashi & Hiroshi lijima., High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis., Nature Biotechnology 15, 453 - 457 (1997)
【非特許文献５】Yutaka Miura, Keiji Kondo, Hiroshi Shimada, Toshiko Saito, Katsumi Nakamura, Norihiko Misawa., Production of lycopene by the food yeast, Candida utilis that does not naturally synthesize carotenoid., Biotechnology and Bioengineering Volume 58 Issue 2-3, Pages 306 - 308
【非特許文献６】Shigehito IKUSHIMA, Toshio FUJII1), Osamu KOBAYASHI, Satoshi YOSHIDA and Aruto YOSHIDA., Genetic Engineering of Candida utilis Yeast for Efficient Production of L-Lactic Acid., Bioscience Biotechnology and Biochemistry, Vol. 73 (2009), No. 8, pp.1818-1824
【非特許文献７】Yi-Ren Hong, Ya-Lei Chen, Lynn Farh, Wen-Jen Yang, Chen-Hua Liao and David Shiuan., Recombinant Candida utilis for the production of biotin., Applied Microbiology and Biotechnology., Volume 71 (2006), Number 2, 211-221
【非特許文献８】MICHAEL A. ROMANOS, CAROL A. SCORER AND JEFFREY J. CLARE., Foreign gene expression in yeast: a review., YEAST VOL. 8: 423-488 (1992)
【特許文献１】特開２００３−４７４７１６号公報
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、キャンディダ・ユティリスのゲノムを解読し、そのデータを基にin silicoで遺伝子探索および機能予測を行い、続いて分泌シグナルを同定した。さらに、本発明者らは、そのシグナル配列をレポーターの遺伝子と融合させることにより、その配列の分泌シグナルとしての能力を評価した。その結果、キャンディダ・ユティリスのゲノム上に存在する多くの分泌シグナルが見出された。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１３】
従って、本発明の目的は、新規な分泌シグナル遺伝子、該分泌シグナル遺伝子を含む発現用ベクターおよび発現ベクター、該分泌シグナル遺伝子を含む形質転換体、ならびに該分泌シグナル遺伝子を利用したタンパク質の製造法を提供することにある。
【００１４】
そして、本発明による分泌シグナル遺伝子は、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）のゲノムに由来する、真核細胞宿主内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるものである。
【００１５】
本発明による発現用ベクターは、真核細胞宿主内でタンパク質を発現させるための発現用ベクターであって、本発明による分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に前記タンパク質の遺伝子を連結させるための遺伝子導入部位を含んでなるものである。
【００１６】
本発明による発現ベクターは、真核細胞宿主内でタンパク質を発現する発現ベクターであって、本発明による分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に連結された前記タンパク質の遺伝子を含んでなるものである。
【００１７】
本発明による形質転換体は、本発明による分泌シグナル遺伝子と、該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に連結されたタンパク質の遺伝子とからなるコード配列、または本発明による発現ベクターを含んでなる真核細胞宿主からなるものである。
【００１８】
本発明によるタンパク質の製造法は、（ａ）本発明による形質転換体を培養し、これにより培地中にタンパク質を蓄積させる工程、および（ｂ）培地からタンパク質を回収する工程を含んでなる。
【００１９】
本発明による分泌シグナル遺伝子を用いることにより、形質転換体の培養によって目的とするタンパク質が本発明による分泌シグナルとの融合物として生産され、その後のプロセッシングにより、分泌シグナルを有さない成熟型のタンパク質が細胞から分泌される。よって、本発明によれば、目的とするタンパク質を培地中に蓄積させることができるため、タンパク質の回収が容易であり、従って、タンパク質を効率よく製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ｐＶＴ９２の構築の手順を示す。
【図２】図２は、シグナルペプチドのアミノ酸残基数と相対活性のプロットを示す。
【図３】図３は、分泌シグナル配列のモチーフ解析の結果を示す。
【発明の具体的説明】
【００２１】
本発明による分泌シグナル遺伝子は、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）のゲノムに由来する、真核細胞宿主内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるものである。このような分泌シグナル遺伝子は、好ましくはキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）内で分泌シグナルとして機能しうるペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるものとされる。
【００２２】
本発明における分泌シグナルペプチドの具体的な配列は特に制限されるものではないが、例えば、配列番号２〜１７、１９〜３２、３４〜３９、４１、４３〜４６、４９〜５１、５４〜７２、７４〜８５、８７〜９４、９６〜１２１、１２３〜１２８、１３０〜１３３、１３５〜１５４、１５６〜１８１、１８３〜２１３および２１５〜２５６で表されるアミノ酸配列が挙げられる。他の具体的な配列としては、例えば、配列番号５３９〜５４７、５４９〜５５８、５６１〜５７３、５７５〜５８３、５８５〜５９２、５９４〜５９８、６００〜６０３、６０６〜６１４、６１６〜６２２、６２４〜６３０、６３２〜６３４、６３６〜６４８、６５０〜６５２、６５４〜６５９、６６１、６６３〜６６７、６６９、６７０、６７２〜６８２、６８４、６８６、６８８〜６９４、６９６〜７２６、７２９〜７５４、７５６および７５８〜７６１で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様によれば、分泌シグナルペプチドの配列は、配列番号２〜５、１５、２４、２９、３１、３２、３５、３６、４１、４６、４９〜５１、５５〜５７、６０、６３、６４、７８、８７、９１、９８、１０７、１１１、１１８、１２０、１２１、１２６、１３０、１３１、１３３、１３６、１４０、１４２、１４４、１４５、１４７〜１４９、１５２、１５４、１５６、１６８、１７２、１７３、１７８、１７９、１８５、１８９、１９０、１９７、１９８、２０２、２１５、２１８、２２４、２２５および２３２〜２３４からなる群から選択されるアミノ酸配列とされる。他の好ましい分泌シグナルペプチドの配列は、配列番号５４０〜５４４、５４６、５４７、５５０、５５４、５５６〜５５８、５６１、５６２、５６６〜５６９、５７１、５７６、５７９、５８２、５８５〜５９２、５９５、５９７、５９８、６０２、６０６、６１０、６１１、６１４、６１８、６１９、６２１、６２２、６２５、６２６、６２８、６２９、６３２、６３４、６３６〜６３９、６４２〜６４８、６５１、６５２、６５７〜６５９、６６１、６６３、６６４、６６９、６７０、６７２、６７７、６７８、６８１、６８４、６８６、６９０、６９１、６９４、６９６、６９７、７００〜７０４、７１０、７１１、７１３〜７１５、７１７、７１８、７２１〜７２４、７２９、７３１〜７３４、７３７、７３８、７４２、７４５、７４７、７５０、７５２および７５９からなる群から選択されるアミノ酸配列である。
【００２４】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、分泌シグナルペプチドの配列は、配列番号２９、３５、３６、１０７、１１１、１４４、１５４および２１８からなる群から選択されるアミノ酸配列とされる。また、これらと同様に好ましい他の分泌シグナルペプチドの配列として、配列番号５９５、６４７、７０４および６３９で表されるアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明の特に好ましい実施態様によれば、分泌シグナルペプチドの配列は、配列番号１１１、５９５、１４４、３６、３５、１０７、６４７、７０４、６３９、２９、１５４および２１８からなる群から選択されるアミノ酸配列とされる。
【００２５】
本発明における分泌シグナルペプチドの配列は、上記の具体的なアミノ酸配列に代えて、各アミノ酸配列の変異体、例えば、各アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列であり、かつ、分泌シグナル活性を有するアミノ酸配列としてもよい。欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜９個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個とされる。また、上記の各アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であることが好ましい。特に好ましい変異は、一アミノ酸置換である。さらに、このアミノ酸残基の置換は、相互に類似の性質を有するアミノ酸間での置換、すなわち、保存的置換であることが好ましい。ここで、「保存的置換」としては、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＭｅｔの間での置換；ＡｓｐおよびＧｌｕの間での置換；ＡｓｎおよびＧｌｎの間での置換；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＡｌａの間での置換；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの間での置換；ならびにＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｉｐの間での置換が挙げられ、好ましくはＧｌｙおよびＡｌａの間での置換；Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕの間での置換；ＡｓｐおよびＧｌｕの間での置換；ＡｓｎおよびＧｌｎの間での置換；ＳｅｒおよびＴｈｒの間での置換；ＬｙｓおよびＡｒｇの間での置換；ならびにＰｈｅおよびＴｙｒの間での置換が挙げられる。さらに、本明細書においては、高い分泌効率を示すシグナルペプチドの構造的な特徴として、(i)Ｎ末のＭｅｔの次に塩基性アミノ酸（例えばＬｙｓまたはＡｒｇ）が存在すること、および(ii)「(ＡｌａまたはＶａｌ)−Ｘ（任意のアミノ酸）−Ａｌａ−切断部位(Ｃ末側)が存在すること、という２つの傾向が示されている。従って、本発明の一つの好ましい実施態様によれば、上記の変異体は、このような構造的特徴を有するものとされる。
【００２６】
本発明における分泌シグナルペプチドは、通常は３０個以下、好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１６〜１８個、最も好ましくは１７個または１８個のアミノ酸残基からなるものとされる。
【００２７】
本発明による分泌シグナル遺伝子は、上述の分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる遺伝子である。本発明による分泌シグナル遺伝子は、好ましくはキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）のゲノムに由来するものとされる。このような遺伝子はキャンディダ・ユティリスの染色体から採取することができ、また、合成することもできる。分泌シグナル遺伝子の具体的なヌクレオチド配列は特に制限されるものではないが、例えば、上述のアミノ酸配列に対応するコード配列として、後述する表１に記載のヌクレオチド配列が挙げられる。
【００２８】
一般に、目的とするタンパク質は、その構造遺伝子を組み込んだ発現系で発現される。発現系としては、タンパク質構造遺伝子を有する発現ベクターで形質転換した真核細胞が好ましい。真核細胞としては、特にキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）が好ましい。発現系においてタンパク質構造遺伝子の５’側（上流側）先端に上記した分泌シグナル遺伝子を結合することにより、タンパク質のＮ末端側に分泌シグナルが結合した融合タンパク質が生産され、その後、細胞内でプロセッシングされて、タンパク質が細胞外へ分泌される。
【００２９】
本発明による発現用ベクターは、真核細胞宿主内でタンパク質を発現させるための発現用ベクターである。この発現用ベクターは、本発明による分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に前記タンパク質の遺伝子を連結させるための遺伝子導入部位を含んでなる。この遺伝子導入部位にタンパク質構造遺伝子を導入して発現ベクターとすると、分泌シグナル遺伝子とタンパク質構造遺伝子が連結され、その発現により分泌シグナルとタンパク質が連結したタンパク質が生産される。
【００３０】
本明細書において、分泌シグナルと融合した形で発現される目的のタンパク質はいかなるタンパク質であってもよく、特に制限されない。このタンパク質は、発現に用いられる宿主細胞が本来発現するものであってもよいが、好ましくは宿主細胞が本来発現しないもの、すなわち異種タンパク質とされる。
【００３１】
本発明による発現ベクターは、真核細胞宿主内でタンパク質を発現する発現ベクターであり、本発明による分泌シグナル遺伝子、および該分泌シグナル遺伝子の下流側に直接的に連結された前記タンパク質の遺伝子を含んでなる。
【００３２】
本発明による発現用ベクターおよび発現ベクターは、染色体組み込み型のものであってもよく、あるいは、核外でコピー数を増やし、安定に存在するものであってもよい。
【００３３】
本発明による発現用ベクターおよび発現ベクターは、分泌シグナル遺伝子−タンパク質遺伝子の発現を制御するプロモーター領域を含むことが好ましい。このプロモーターは、その下流に導入された分泌シグナル遺伝子−タンパク質遺伝子の発現を支配する。このプロモーターは、形質転換に用いられる真核細胞宿主において機能しうるものであればよい。例えば、真核細胞宿主としてキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）を用いる場合には、キャンディダ・ユティリスにおいて機能しうるものであればよい。
【００３４】
また、本発明による発現用ベクターおよび発現ベクターは、形質転換に用いられる真核細胞宿主において機能しうる選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。この選択マーカー遺伝子は、例えば薬剤耐性マーカー遺伝子とされ、好ましくはシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子、ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子などがある。ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子は、野生の酵母には存在しない配列であるため、真核細胞宿主として酵母を用いる場合には標的の遺伝子座に組込まれる確率が高いと考えられている。
【００３５】
真核細胞宿主の形質転換は、当技術分野において公知の方法に従って行うことができる。特に、キャンディダ・ユティリスの形質転換法としては、特開２００３−１４４１８５号公報に記載の技術が挙げられる。この文献では、利用可能なベクターとして、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるもの、あるいは、キャンディダ・ユティリスで自律複製機能を有するＤＮＡ配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、高い頻度でキャンディダ・ユティリスを形質転換できるものが開発されている。
【００３６】
形質転換体を培養するための培地としては、形質転換体の製造に用いた真核細胞宿主に応じて当技術分野で公知の培地から選択することができ、例えば、ＹＰＤ培地等の栄養培地またはＭＭ培地等の最少培地などを用いることができる。
【００３７】
培養温度は、用いる真核細胞宿主の生育可能な範囲で選択することができる。培養温度は、例えば、約１５℃〜４５℃とすることができ、より好ましくは２５〜４０℃、さらに好ましくは２７〜４０℃とする。また、発酵過程における培地のｐＨは３〜８に保持することが好ましく、より好ましくはｐＨ４〜７とされる。培養時間は特に限定されず、適宜決定された反応時間で実施される。これらの条件の最適化は、当業者であれば容易に行うことができる。
【００３８】
培地中に生成したタンパク質の単離・精製法としては、例えば、塩析または溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過またはゲル電気泳動法等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００３９】
単離・精製されたタンパク質の確認方法としては、例えば、ウエスタンブロッティング法、活性測定法などが挙げられる。また、精製されたタンパク質は、アミノ酸分析、アミノ末端分析、一次構造解析などによりその構造を明らかにすることもできる。
【００４０】
さらに、本明細書においては、高い分泌効率を示すシグナルペプチドの構造的な特徴として、(i)Ｎ末のＭｅｔの次に塩基性アミノ酸（例えばＬｙｓまたはＡｒｇ）が存在すること、および(ii)「(ＡｌａまたはＶａｌ)−Ｘ（任意のアミノ酸）−Ａｌａ−切断部位(Ｃ末側)が存在すること、という２つの傾向が示されている。従って、本発明の他の態様によれば、これらの構造を有することを指標とする、分泌シグナルペプチドを探索する（スクリーニングする）ための方法が提供される。この方法では、候補となるペプチドが上記の構造(i)および(ii)を有するか否かを調べ、そのペプチドがこれらの構造を有する場合には、そのペプチドを分泌シグナルペプチドとして同定することができる。この方法が適用されるペプチドは、キャンディダ属生物に由来するペプチドであることが好ましく、より好ましくはキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）に由来するペプチドとされる。このようにして同定された分泌シグナルペプチドは、分泌効率を試験するためのさらなる生物学的試験に供することができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４２】
以下の実施例において、ＰＣＲによる遺伝子増幅には、特に述べない限りＴＯＹＯＢＯ社製ＫＯＤ  ｐｌｕｓを使用し、方法は添付のプロトコールに従った。ＰＣＲ増幅反応は９４℃で２分間の熱処理を行った後、変性工程：９４℃で３０秒、アニーリング工程：５５℃で３０秒、伸長工程：６８℃でＸ秒（ただし、Ｘ分は予想される増幅遺伝子の大きさから１  ｋｂｐにつき1分として計算）の３工程を２５サイクル繰り返し、最後に４℃とした。ＰＣＲ増幅装置はＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００ (ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)を使用した。アガロースゲルからのＤＮＡの回収およびＰＣＲ産物の精製にはＧＥヘルスケア社製のＩｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた。各種制限酵素はＴａＫａＲａ社のものを使用し、方法は添付のプロトコールに従った。ＤＮＡの脱リン酸化反応にはＴａＫａＲａ社製Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｓｈｒｉｍｐ）を使用し、方法は添付のプロトコールに従った。ライゲーション反応にはＴａＫａＲａ社製ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞を使用し、方法は添付のプロトコールに従った。大腸菌の形質転換にはTOYOBO社製のＤＨ５αコンピテントセルを使用し、方法は添付のプロトコールに従った。大腸菌の形質転換体の選抜にはアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むLBプレートを用いた。大腸菌からプラスミドＤＮＡの回収にはＫＵＲＡＢＯ社製ＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＤＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＰＩ−２００を使用した。酵母の形質転換は電気パルスによる方法（エレクトロポレーション法）で行った。【００４３】
具体的には、電気パルスによる酵母の形質転換は、特開２００３−１４４１８５号公報に記載された方法を一部改変して行った。ＹＰＤプレート上のコロニーを、５ｍｌのＹＰＤ液体培地において、３０℃で約８時間振盪培養した後、２００ｍｌのＹＰＤ液体培地にＯＤ６００が０．００２４になるよう植菌して３０℃で振盪培養する。約１６時間後、対数増殖期（ＯＤ６００＝２．５）にまで菌体が増殖した後、１，４００×ｇで５分間の遠心分離により集菌する。菌体は１００ｍｌの氷冷した滅菌水で１回、続いて４０ｍｌの氷冷した滅菌水で１回洗浄した後、氷冷した１Ｍソルビトール４０ｍｌで１回洗浄する。菌体を１０ｍｌの１Ｍソルビトールに懸濁した後、滅菌ポリプロピレンチューブに移し、再度１，１００×ｇで５分間の遠心分離により集菌する。上清を除いた後、最終菌体液量が２．５ｍｌになるよう、氷冷した１Ｍソルビトールに懸濁する。【００４４】
電気パルスによる形質転換実験はバイオラッド社のジーンパルサーを用いて行なう。５０μｌの菌液と、１００ｎｇ〜１０μｇのＤＮＡを含む５μｌのＤＮＡ試料、および２．０ｍｇ／ｍｌのサケ精巣由来のキャリアーＤＮＡを５μｌ混合した後、０．２ｃｍのディスポーザブルキュベットに入れ、適当な条件の電気パルスを加える。例えば、電気容量が２５μＦ、抵抗値が６００〜１０００オーム、電圧が０．７５〜１．２５ＫＶの条件とする。パルス後、１ｍｌの氷冷した１Ｍソルビトールを含むＹＰＤ培地を加え、滅菌ポリプロピレンチューブに移した後、３０℃で約６〜１５時間振盪培養する。培養後、選択マーカー遺伝子に応じて、菌液を適切な薬剤を含むＹＰＤ選択培地に塗布した後、プレートを２８〜３０℃で３〜４日保温して、形質転換体コロニーを得た。ＨＰＴ遺伝子を選択マーカー遺伝子とする場合にはハイグロマイシンＢを６００〜８００μｇ／ｍｌの濃度で、ＡＰＴ遺伝子を選択マーカー遺伝子とする場合にはＧ４１８を２００μｇ／ｍｌの濃度でＹＰＤ培地に加えた。以下、それぞれの培地をＨｙｇＢ培地およびＧ４１８培地と表記する。また、ハイグロマイシンＢに耐性であることをＨｙｇＢｒ、ハイグロマイシンＢに感受性であることをＨｙｇＢｓ、Ｇ４１８に耐性であることをＧ４１８ｒ、Ｇ４１８に感受性であることをＧ４１８ｓと表記する。【００４５】
例１：キャンディダ・ユティリス NBRC0988株のゲノムDNAの調製
キャンディダ・ユティリスのNBRC0988株を200mlのYPD液体培地（2%グルコース、1%酵母エキス、2％ポリペプトン）に接種し、30℃で24時間振とう培養した後、遠心分離によって菌体を回収した。当業者に公知の方法で酵母ゲノムDNAを穏やかに抽出し、さらに塩化セシウム・エチジウムブロミド密度勾配遠心分離法（Molecular Cloning, 3rd Edition）によってDNA以外の不純物を少なくする作業を行った。最終的に300 micro-gram以上のキャンディダ・ユティリスのゲノムDNAを調製した。パルスフィールドゲル電気泳動でDNAのサイズを調べ、97 kbを超えるサイズのDNAも多量に存在することを確認した。【００４６】
例２：サンガー法によるシークエンスのためのキャンディダ・ユティリスゲノムDNAライブラリーの作製
上記で調製したゲノムDNAをHydroshear Device（Genemachines, San Carlos, CA）で断片化し、ベクターに連結した。特に3〜4 kbのDNA断片をクローン化されたプラスミドライブラリーと、約40 kbのDNA断片が連結されたフォスミドライブラリーを構築した。【００４７】
このライブラリーを用いて、BigDye Terminator v3.1（Applied Biosystems）を試薬とし、ABI PRISM 3730xl（Applied Biosystems）を用いて、挿入されたDNA断片のシークエンスを行った。配列はペアーエンドで解読した。なお反応液はApplied Biosystems社製のサーマルサイクラーを利用し、精製はCleanSeq dye-terminator removal kit（Agencourt）を利用した。得られたデータのうち、特にPHREDスコアーが平均20、あるいは100 bp以上より大きく解読できたもの（典型的なものは500〜600 bp）を有効なデータとして取り扱った（プラスミドより57.9 Mbp、フォスミドより18.5 Mbp）。そしてArachne Whole Genome Assembler（Broad Institute of MIT and Harvard）とAgencourt’s Galaxy LIMS systemとConsed（University of Washington）を利用してアッセンブルとその結果のモニタリングを行った。【００４８】
キャンディダ・ユティリスのゲノムDNAを用いて、Roche社製の454FLXにてシークエンスを解読した。その結果、211.7 Mbpの塩基配列情報を取得した。これをNewblerでアッセンブルして得られたコンティグ配列と、サンガー法で得たデータについて、Arachne Assemlerを利用することによるハイブリッドアセンブリを行った。その結果、1,307個のコンティグ （うち、2 kb以上が457個）、スーパーコンティグが975個 (うち、1 Mb以上のもの6個、40 kb以上1Mb未満のものが7個) 得られた。スーパーコンティグの長さの合計は14.6 Mbであった。【００４９】
40 kbより大きい13個のスーパーコンティグを染色体として扱い、それ以外のものはUMとして1本の染色体にまとめた。【００５０】
例３：遺伝子予測
スーパーコンティグ975個に対して、GlimmerM［Salzberg SL, Pertea M, Delcher AL, Gardner MJ, Tettelin H. "Interpolated Markov models for eukaryotic gene finding." Genomics. 1999 Jul 1; 59(1):24-31. ］とGeneLook［Nishi T, Ikemura T, Kanaya S. "GeneLook: a novel ab initio gene identification system suitable for automated annotation of prokaryotic sequences." Gene. 2005 Feb 14: 346:115-125. Epub 2005 Jan 26.］を用いて遺伝子予測を行なった。【００５１】
SGD （www.yeastgenome.org） よりSaccharomyces cerevisiae S288Cの遺伝子構造データを取得し、GlimmerMのトレーニングに用いた。トレーニングの結果得られたHMMをスーパーコンティグ配列に適用した結果、10,560個の遺伝子が予測された。【００５２】
ab initio gene finderであるGeneLookによりORF（Open Reading Frame）スキャンを行ない、8,927個の遺伝子を得た。【００５３】
プライマリーアノテーションの実施
GlimmerMにより予測された10,560個の遺伝子とGeneLookにより予測された8,927個の遺伝子について、gene name、descriptionを定義する目的でプライマリーアノテーションを実施した。具体的には、既知タンパク配列群に対してblastpによる相同性検索を行ない、ヒットしてきたHSPを一定の基準で評価することによりアノテーションを行なった。【００５４】
検索対象としたデータベースは、SGDの全ORF配列（6,717件）、Candida albicansデータベースであるCGD（http://www.candidagenome.org/）の全ORF配列（6,107件）、SwissProt Release 55.6の全配列（788,247件）とした。【００５５】
アノテーション手順の手順は次の通りである。
（１）予測されたORF配列それぞれについて、evalue cutoff 1e-5でblast検索を実行。
（２）blast検索の結果、得られたヒットについて、下記a)−c）のいずれの基準を満たすかを判定する：
a) （HSP長 / クエリー配列長 ≧ 0.7） かつ （HSP長 / ヒットしてきた配列の全長 ≧ 0.7）  かつ （HSPのidentity ≧ 0.5）；
b) (HSP長 / クエリー配列長 ≧ 0.5) かつ （HSP長 / ヒットしてきた配列の全長 ≧ 0.5） かつ （HSPのidentity ≧ 0.3）；
c) いずれのヒットも上記a)、b）を満たさない。
なお、HSPはHigh-scoring Segment Pairの略であり、閾値を超える類似性が検出された部分配列のペアを示す。
（３）上記（２）の結果、条件a)を満たすヒットが存在する場合、最もスコアの高いヒットを用いて下記のようなdescriptionをアノテーションする：
“conserved protein similar to XXXX(=hit accession). ヒット配列のdescription …”、または
“conserved hypothetical protein similar to XXXX(=hit accession). ヒット配列のdescription …”（ヒット配列のdescriptionに、putative, hypothetical, probable, unknown, unnamed, predictedなどの記述がある場合）；
・条件b)を満たすヒットが存在する場合、最もスコアの高いヒットを用いて下記のようなdescriptionをアノテーションする：
“conserved protein weakly similar to XXXX(=hit accession). ヒット配列のdescription …”、または
“conserved hypothetical protein weakly similar to XXXX(=hit accession). ヒット配列のdescription …”（ヒット配列のdescriptionに、putative, hypothetical, probable, unknown, unnamed, predictedなどの記述がある場合）；
・条件c)を満たす場合、下記のdescriptionをアノテーションする：
“hypothetical protein”；
・条件a)−c)いずれも満たさない場合、すなわちヒットが０の場合、下記のdescriptionをアノテーションする：
“predicted protein”；
４) 条件a)またはb)によりアノテーションを行なう際に、ヒットの配列に遺伝子名が定義されている場合は、遺伝子名も同時にアノテーションする。なお、アノテーションに適用するヒットが複数のDBに存在した場合、SGD＞CGD＞SwissProtの順に、優先度の高いものを用いてアノテーションを行なった。【００５６】
GlimmerMとGeneLookにより遺伝子予測を行ない、それぞれ10,560個、8,927個のORFが得られた。そこでさらに、長さ60未満でアノテーションの付かない（= predicted）ORFを除外すると、GlimmerMで得られるORFの数は6,820個になり、GeneLookで得られるORFの数は、8,397個となった。さらに、アノテーションが付かず、塩基配列に連続10個以上のN（ギャップをフィル・インするために用いた）を含むpredicted proteinまたはhypothetical proteinを中心に除外したところ、GlimmerMで得られるORFの数は6,800個になり、GeneLookで得られるORFの数は、8,261個となった。このうち、4,536個の遺伝子が開始位置、終了位置、向きについて両手法で同一の結果が得られていた。この共通遺伝子とは別に、オーバーラップした領域を持つが異なる遺伝子構造が予測されたGlimmerMの1,666個とGeneLookの1,968個については、アノテーション確度（qcr * hcr * identity）を調べ（qcr = hit length / query protein length。hcr = hit length / hit protein length。IdentityではSGD、CGD、SwissProtを利用した）、この数値が高い、つまり、より遺伝子として確からしいGlimmerMの967個、GeneLookの788個を遺伝子として予測した。それらとは別に両手法で独立して予測されたものは、GlimmerMで598個、GeneLookで1,757個であり、これらを遺伝子として予測した。この結果、8,646 (= 598 + 967 + 4,536 + 788 + 1,757) 個の遺伝子が予測された。これとは別に、tRNAとして191、rRNAとして27も予測された。【００５７】
例４：分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子領域の抽出
Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ由来の分泌シグナルペプチドを含有するタンパク質をコードする遺伝子を同定することで、本発明に係る分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを同定できる。まず、前項までに予測されたＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓの遺伝子の塩基配列でコードされる各アミノ酸配列から、膜貫通部位予測プログラム及び分泌シグナルペプチド予測プログラムであるＰｒｅｄｉＳｉ（PREDiction of Signal peptides）（http://www.predisi.de/）を用いて分泌シグナルペプチドの予測を行った。なお、真核生物用にトレーニングされたデータセットを用いて、シグナルペプチドと切断部位を推定した。さらに、本解析によって得られた結果に基づき、複数のこれら予測プログラムによって分泌シグナルペプチドを予測できた遺伝子から、分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子領域の抽出を行った。その分泌シグナルのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびに例３のアノテーションの結果を、表１に示す。【００５８】
【表１】
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【００５９】
例５：ＣｕＵＲＡ３遺伝子座への1コピー組込み型プラスミドの構築
キャンディダ・ユティリスのゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＩＭ−３７１（配列番号５１３）とＩＭ−３７２（配列番号５１４）のプライマーセットでＰＣＲ（伸長反応４５秒）を行うことにより、ＣｕＵＲＡ３遺伝子の上流側配列を増幅した。また、キャンディダ・ユティリスのゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＩＭ−３７３（配列番号５１５）とＩＭ−３７４（配列番号５１６）のプライマーセットでＰＣＲ（伸長反応４５秒）を行うことにより、ＣｕＵＲＡ３遺伝子の下流側配列を増幅した。得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、ＩＭ−３７１とＩＭ−３７４のプライマーセットでＰＣＲを行った（伸長反応１分３０秒）。得られたＤＮＡ断片をＢｓｓＨＩＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＢｓｓＨＩＩ部位に挿入し、得られたプラスミドをｐＣＵ６８５（別名：ｐＵＲＡｉｎ）と名づけた。ＣｕＵＲＡ３の上流側と下流側の配列の連結部位にはＮｏｔＩ認識配列、ＸｂａＩ認識配列、ＢａｍＨＩ認識配列、ＣｌａＩ認識配列が存在する。また、ＢｓｓＨＩＩの挿入ＤＮＡ断片側には、それぞれＢｇｌＩＩ認識配列が存在する。なお、ＰＣＲは全てＫＯＤ  ｐｌｕｓで行った。【００６０】
次いで、次の３種類のＰＣＲを行った。（１）ｐＣＵ６２１を鋳型、ＩＭ−３４９（配列番号５１７）とＩＭ−３５０（配列番号５１８）をプライマーとしてＰＣＲを行った（伸長反応２．５分）。なお、プラスミドｐＣＵ６２１（別名ｐＮＮＬＨＬ）は、順にｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰからなるＤＮＡ断片が、ｐＣＲ２．１ベクター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：ＴＡクローニングキット（ｐＣＲ２．１ｖｅｃｔｏｒ）］にクローン化されている。（２）ｐＰＧＫＰＴ２（特開２００３−１４４１８５号公報）を鋳型、ＩＭ−３４７（配列番号５１９）とＩＭ−３４８（配列番号５２０）をプライマーとしてＰＣＲを行い（伸長反応３０秒）、ＰＧＫ遺伝子のターミネーター領域を、ＢｇｌＩＩ認識配列がなくなるように一塩基変異を入れて増幅した。（３）鋳型として（１）および（２）で増幅したＤＮＡ断片、プライマーとしてＩＭ−３４７とＩＭ−３５０を用いてＰＣＲを行った（伸長反応３分）。こうして増幅したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＣｌａＩで消化した。この結果得られたＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰからなる約３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩとＣｌａＩで消化したｐＣＵ６８５（別名：ｐＵＲＡｉｎ）に連結させて、新たなプラスミドｐＣＵ６８７（別名：ｐＵＲＡＰＧｔＨ）を構築した。【００６１】
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ｐＣＵ６８７（別名：ｐＵＲＡＰＧｔＨ）が有するＰＧＫ遺伝子プロモーターとＨＰＴ遺伝子の連結部位にあるＸｂａＩ認識配列を破壊したプラスミドｐＣＵ６９９（別名：ｐＵＲＡＰＧｔｘＨ）を構築した。鋳型にはプラスミドｐＣＵ６８７（別名：ｐＵＲＡＰＧｔＨ）、プライマーにはＩＭ−４２５（配列番号５２１）とＩＭ−４２６（配列番号５２２）を用いた。その他の実験条件は添付のプロトコールに従った。【００６２】
キャンディダ・ユティリスのオロチジン５’リン酸デカルボキシラーゼをコードするＣｕＵＲＡ３遺伝子座に複数の遺伝子発現カセットを導入するための発現ベクターを構築した。ＣｕＵＲＡ３遺伝子上流配列断片は、ＴＭＰ−１（配列番号５２３）およびＴＭＰ−２（配列番号５２４）の組み合わせをプライマーとして用い、ｐＣＵ６９９を鋳型としたＰＣＲを行うことによって得た。また、キャンディダ・ユティリスのグリセルアルデヒド３リン酸デデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰ）プロモーターは、ＴＭＰ−３（配列番号５２５）およびＴＭＰ−４（配列番号５２６）の組み合わせをプライマーとして用い、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことによって得た。得られたそれぞれのＤＮＡ増幅産物は電気泳動を行った後、アガロースゲルから抽出を行った。回収したそれぞれＤＮＡ断片は３’末端および５’末端が互いに対合するように設計されているため、混合してＴＭＰ−１およびＴＭＰ−４の組合せをプライマーとしてＰＣＲを行なうことによってＣｕＵＲＡ３遺伝子上流配列とＧＡＰ遺伝子プロモーターが融合したＤＮＡ断片を得ることができる。得られたＣｕＵＲＡ３遺伝子上流配列／ＧＡＰ遺伝子プロモーター融合断片は５’末端にＮｏｔＩサイト、ＢｇｌＩＩサイトをこの順で持ち、さらに３’末端にはＸｂａＩサイトを持つ。またＣｕＵＲＡ３遺伝子上流配列とＧＡＰ遺伝子プロモーターの間にはＮｈｅＩサイトを有している。このＤＮＡ断片をＮｏｔＩ、ＸｂａＩ処理を行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（ストラタジーン社製）の同制限酵素サイトに導入してｐＶＴ８６を構築した（図１）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋は予めＮｏｔＩ、ＸｂａＩ処理を行い、フェノール・クロロホルム沈殿を行った後、脱リン酸化を行った。【００６３】
キャンディダ・ユティリスのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＣｕＰＧＫ）ターミネーターはＴＭＰ−５（配列番号５２７）およびＴＭＰ−６（配列番号５２８）の組み合わせをプライマーとして用いて、ＣｕＵＲＡ３遺伝子下流配列断片はＴＭＰ−７（配列番号５２９）およびＴＭＰ−８（配列番号５３０）の組み合わせをプライマーとして用いて、キャンディダ・ユティリスのｐＣＵ６９９を鋳型としてＰＣＲを行なうことによってそれぞれの遺伝子断片を得た。また、キャンディダ・ユティリスで作用するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＨＰＴ；ハイグロマイシン耐性遺伝子）発現カセットは、ＴＭＰ−９（配列番号５３１）およびＴＭＰ−１０（配列番号５３２）の組み合わせのプライマーを用いてｐＣＵ６９９を鋳型としてＰＣＲを行なうことによって得た。得られたそれぞれのＤＮＡ増幅産物は電気泳動を行った後、アガロースゲルから抽出を行った。回収した産物は混合し、ＴＭＰ−５およびＴＭＰ−８の組合せをプライマーとしてＰＣＲを行なうことによってＣｕＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＣｕＵＲＡ３遺伝子下流配列が融合したＤＮＡ断片を得た。得られたＣｕＰＧＫ遺伝子ターミネーター／ハイグロマイシン耐性遺伝子／ＣｕＵＲＡ３遺伝子下流配列融合断片は５’末端にＢａｍＨＩサイト、３’末端にはＸｈｏＩサイトを持ち、ＣｕＰＧＫ遺伝子ターミネーターとハイグロマイシン耐性遺伝子間にＳｐｅＩサイトを有している。このＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ処理を行い、ｐＶＴ８６の同制限酵素サイトに導入してｐＶＴ９２を構築した（図１）。ｐＶＴ８６は予めＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ処理を行い、フェノール・クロロホルム沈殿を行った後、脱リン酸化を行った。【００６４】
ｐＶＴ９２をＮｏｔＩあるいはＢｇｌＩＩ、およびＢｇｌＩＩ、ＡｐａＩ、ＸｈｏＩ、あるいはＫｐｎＩで切断すると、ＣｕＵＲＡ３遺伝子上流側配列、ＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰからなるＤＮＡ断片が生じる。ｐＶＴ９２を用いてキャンディダ・ユティリスの形質転換を行うと、ＣｕＵＲＡ３遺伝子座で二重鎖組換えが生じることにより、染色体内に当該ＤＮＡ断片が組込まれ、例えば野生株では生育できない６００〜８００μｇ／ｍｌの濃度でＨｙｇＢを含む培地で生育可能となる。【００６５】
次いで、ｐＶＴ９２をＮｈｅＩ、ＳｐｅＩで処理し、得られた３つのＤＮＡ断片の精製を行った。７ｋｂｐのベクター断片は精製後、脱リン酸化を行った。また、１ｋｂｐのＣｕＧＡＰ遺伝子プロモーター、０．５ｋｂｐのＰＧＫ遺伝子ターミネーターを上記ベクターに順々にライゲーションしていき、遺伝子の向きがＣｕＵＲＡ３遺伝子上流、ＣｕＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ＣｕＧＡＰ遺伝子プロモーター、ｌｏｘＰ、ＣｕＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＣｕＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰ、ＣｕＵＲＡ３遺伝子下流となったものを選抜した。これをｐＶＴ２２９と名づけた。【００６６】
ｐＶＴ２２９はＢｇｌＩＩで切断すると、ＣｕＵＲＡ３遺伝子上流側配列、ＰＧＫ遺伝子ターミネーター、ＣｕＧＡＰ遺伝子プロモーター、ｌｏｘＰ、ＣｕＰＧＫ遺伝子プロモーター、ＨＰＴ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子ターミネーター、ｌｏｘＰからなるＤＮＡ断片が生じる。これを用いてＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓの形質転換を行うと、ＣｕＵＲＡ３遺伝子座で二重鎖組換えが生じることにより、染色体内に当該ＤＮＡ断片が組込まれ、例えば野生株では生育できない６００〜８００μｇ／ｍｌの濃度でＨｙｇＢを含む培地で生育可能となる。また、ｐＶＴ２２９はＸｂａＩ、ＢａｍＨＩで処理することでＣｕＰＧＫ遺伝子ターミネーターとＣｕＧＡＰ遺伝子プロモーターの間に目的遺伝子を導入することができるため、外来遺伝子をＣｕＵＲＡ３遺伝子座で発現させることができる。pＶＴ９２はＣｕＵＲＡ３座だけでなく、ＣｕＧＡＰ座にも組み込まれる可能性があるが、ｐＶＴ２２９は遺伝子の発現カセットが逆向きになっているためＣｕＵＲＡ３でしか組み換えが起こらない。【００６７】
例６：シグナルペプチド評価用レポーター遺伝子（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株由来のｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、ＸＰ＿００１８２０１０１）のクローニング
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株由来ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、（ＸＰ＿００１８２０１０１）遺伝子断片は、プライマーとして、ＨＡ４０Ｆ（配列番号５３３）およびＣＡ４０Ｒ（配列番号５３４）の組み合わせ、ならびにＣＡ４０Ｆ（配列番号５３５）およびＢＡ４０Ｒ（配列番号５３６）の組み合わせをそれぞれ用い、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことで得た。得られたそれぞれのＤＮＡ増幅産物は電気泳動を行った後、アガロースゲルから抽出を行った。回収した産物は混合し、ＨＡ４０ＦおよびＢＡ４０Ｒの組合せをプライマーとしてＰＣＲを行なうことによって、イントロンを欠失したｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ遺伝子全長を得た。得られたＤＮＡ断片をインビトロジェン社製Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてクローニングしてｐＶＴ１９２を得た。【００６８】
例７：Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓゲノムに存在するシグナルペプチドを付与したレポーター遺伝子を発現する株の構築
Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓゲノムに存在するシグナルペプチドを評価するために、各シグナルペプチドとレポーター遺伝子を融合したＤＮＡ断片を調製した。融合ＤＮＡ断片はｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲを用いることで調製した。すなわち各シグナルペプチドＤＮＡ断片と推定シグナルペプチドを欠損したレポーター遺伝子ＤＮＡ断片を混合し、再度ＰＣＲを行った。この融合ＤＮＡ断片をｐＶＴ２２９に導入して発現ベクターを構築した。【００６９】
まず、例５で作製したＣｕＵＲＡ３組込み型発現ベクターｐＶＴ２２９に上述の分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子領域を導入するため、各遺伝子領域をＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓのゲノムＤＮＡからＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲに用いられた各Ｆｏｒｗａｒｄプライマーの５’末端にはＸｂａＩサイトを付与してある。また、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーの５’末端は推定成熟型レポーター遺伝子の５’末端の塩基配列を付与してある。推定シグナル配列を欠損したレポーター遺伝子ＤＮＡ断片は、プライマーとしてＮｏＳＰＡｏＢＧＦｗ（配列番号５３７）およびＢａｍＡＡｏＢＧ＿Ｒｖ２（配列番号５３８）の組み合わせを用い、ｐＶＴ１９２を鋳型としてＰＣＲを行なうことで得た。各１ｓｔ  ＰＣＲ産物を精製後、これら２種のＤＮＡ断片を混同して２ｎｄ  ＰＣＲを行い、シグナルペプチド評価用のＤＮＡ断片を得た。各２ｎｄ  ＰＣＲ産物を精製後、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで処理し、キットによる精製を行った後、同制限酵素で処理したｐＶＴ２２９にライゲーションして各シグナルペプチドを付与したレポーター遺伝子を発現するベクターを作製した。得られたベクターをＢｇｌＩＩで消化し、エタノール沈殿により濃縮した。このDNA断片によりＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓを形質転換し、６００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含むＹＰＤ培地に塗沫し３０℃で２日間培養した。【００７０】
例８：各シグナルペプチドを付与したレポーター遺伝子を導入したＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ形質転換株のレポーターアッセイ
以下に示すとおり、得られたＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ形質転換体の培養を行い、培養液のｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を測定した。【００７１】
９６穴深底プレートに入れた０．５ｍｌのＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％、酵母エキス、２％グルコース）に各菌株を接種し、３０℃で２４時間前培養を行った。前培養液１０μｌを前培と同じ培地に接種し、同じ条件で本培養を行った。【００７２】
得られた形質転換体培養液を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で適宜希釈し、ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ活性を測定した。１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、５ｍＭパラニトロフェニルグルコピラノシド、５％（ｖ／ｖ）粗酵素液の反応系で５０℃、１０分間反応を行った。反応液後、１Ｍ炭酸ナトリウムを反応液の２倍量添加して反応を停止させ、４１０ｎｍの波長で吸光度を測定した。なお、数値は４ロットの平均値として表示した。【００７３】
各種シグナルペプチド評価のレポーターアッセイの結果を表２に示す。表２の結果によれば、レポーター遺伝子本来のシグナルペプチド（シグナルペプチド番号０）よりも分泌効率が向上した配列（nativeシグナルペプチドに対する分泌効率の倍数が１以上のもの）は１７４個であり、そのうち分泌効率が３倍以上だったものは１２個、最大で5.6倍だった。【００７４】
【表２】
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【００７５】
シグナルペプチドの長さと相対活性をプロットした結果を図２に示す。図２によればシグナルペプチドの長さが長いほど相対活性が減少する傾向にあり、シグナルペプチドを構成するアミノ酸残基数が17個、もしくは18個のときに最も高い活性を示すことが明らかとなった。これより、人工的にシグナルペプチドを合成するときは17個および18個のアミノ酸残基数が最も好ましいシグナルペプチドの長さであることが示唆された。【００７６】
例９：モチーフ解析
シグナルペプチドの残基数が３０個以下の計３５３個のシグナルペプチドについて、分泌効率の倍数（nativeシグナルペプチドに対する分泌効率の倍数）が２倍以上、１倍以上、１倍未満、０．５倍未満の４つのグループに分けてモチーフ解析を行った。アライメントにはＭＡＦＦＴ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ ｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を用いた。アライメントされた部位のアミノ酸の出現頻度の可視化には、ＷｅｂＬｏｇｏを用いた。結果を図３に示した。図３において、（Ａ）は分泌効率２倍以上のグループ、（Ｂ）は分泌効率１倍以上のグループ、（Ｃ）は分泌効率１倍未満のグループ、（Ｄ）は分泌効率０．５倍未満のグループの解析結果を示している。図３によりモチーフを比較したところ、分泌効率の高いシグナルペプチドが「Ｎ末のＭの次に塩基性アミノ酸（Ｋ, Ｒ）」および「(Ａ or Ｖ)-Ｘ(任意のアミノ酸)-Ａ-切断部位(Ｃ末側)」の構造を有するという傾向が見られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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