(57)【要約】  本発明は、結合活性に加えてエフェクター活性も高く、且つヒトやマウスにおいて抗原性の低い抗ポドプラニン抗体等を提供することを課題とする。  本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをエピトープとする抗ポドプラニン抗体（但し、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むラットＮＺ−１抗体を除く）、及び当該抗ポドプラニン抗体の重鎖相補性決定領域及び軽鎖相補性決定領域を含むキメラ抗体等を提供するものである。
2011040565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをエピトープとする抗ポドプラニン抗体（但し、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むラットＮＺ−１抗体を除く）。
【請求項２】
以下のａ）〜ｆ）に示すポリペプチドの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の抗体：
ａ）配列番号：６に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：７に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：８に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：１０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；及び、
ｆ）配列番号：１１に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３。
【請求項３】
以下のａ’）〜ｆ’）に示すポリペプチドの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の抗体：
ａ’）配列番号：６に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、又は、配列番号：６に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
ｂ’）配列番号：７に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、又は、配列番号：７に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
ｃ’）配列番号：８に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、又は、配列番号：８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
ｄ’）配列番号：９に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、又は、配列番号：９に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
ｅ’）配列番号：１０に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、又は、配列番号：１０に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；及び、
ｆ’）配列番号：１１に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３、又は、配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３。
【請求項４】
以下のポリペプチドを含む、請求項１に記載の抗体：
ｉ）配列番号：１８に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）、配列番号：１８に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）、又は、配列番号：１８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）；及び
ｉｉ）配列番号：１９に示す軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号：１９に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は、配列番号：１９に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）。
【請求項５】
以下のポリペプチドをさらに含む、請求項４に記載の抗体：
ｉｉｉ）配列番号：２０に示すアミノ酸配列からなる重鎖定常領域１（ＣＨ１）、配列番号：２０に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖定常領域１（ＣＨ１）、又は、配列番号：２０に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖定常領域１（ＣＨ１）；及び
ｉｖ）配列番号：２１に示すアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域（ＣＬ）、配列番号：２１に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域（ＣＬ）、又は、配列番号：２１に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域（ＣＬ）。
【請求項６】
ヒトＦｃ領域又はマウスＦｃ領域を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号：２３に示すアミノ酸配列からなる重鎖、配列番号：２３に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖、又は、配列番号：２３に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する重鎖と、
配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号：３に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、配列番号：３に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する軽鎖と、を含む請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号：３７に示すアミノ酸配列からなる重鎖、配列番号：３７に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖、又は、配列番号：３７に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する重鎖と、
配列番号：３９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号：３９に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、配列番号：３９に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する軽鎖と、を含む請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
Ｆｃ領域に１以上のＮ−結合型糖鎖が結合し、該Ｎ−結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、請求項１から８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
抗がん活性を有する物質を結合させた、請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含み、ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性、又はα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの活性が低下又は欠失した細胞からなる形質転換体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換体を培養する工程と、
得られた培養物から抗ポドプラニン抗体を精製する工程と、を含む請求項９に記載の抗体を含む抗体組成物の製造方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載のベクターを含むトランスジェニック昆虫。
【請求項１７】
請求項１６に記載のトランスジェニック昆虫又はその分泌物から抗ポドプラニン抗体を抽出する工程を含む、請求項９に記載の抗体を含む抗体組成物の製造方法。
【請求項１８】
以下のいずれかの抗体を有効成分として含む医薬組成物：
（Ａ）請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体；及び
（Ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含むラットＮＺ−１抗体。
【請求項１９】
抗体依存性細胞障害活性及び／又は補体依存性細胞障害活性を有する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
抗腫瘍活性及び／又は腫瘍増殖抑制活性を有する、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ポドプラニンを発現する腫瘍、血栓症及び動脈硬化症からなる群の少なくとも一の疾患の治療剤である、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ポドプラニンを発現する腫瘍が、脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍（セミノーマ）及び扁平上皮がんからなる少なくとも一の腫瘍である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
以下のいずれかの抗体を投与することを含む、ポドプラニンを発現する腫瘍、血栓症及び動脈硬化症からなる群の少なくとも一の疾患の治療方法：
（Ａ）請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体；及び
（Ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む抗体。
【請求項２４】
以下のいずれかのポリペプチド：
１）配列番号：６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
２）配列番号：７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
３）配列番号：８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
４）配列番号：９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
５）配列番号：１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
６）配列番号：１１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
７）配列番号：６〜１１に示すアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号：６〜１１に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識するペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ポドプラニン抗体、及び抗ポドプラニン抗体を含む抗がん剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞の血行性転移において、がん細胞による血小板凝集が認められることが報告されている。ほとんどのがん細胞は血管に侵入すると、宿主の免疫系による攻撃や物理的衝撃によって破壊される。しかしながら、血小板凝集を引き起こすことにより、これらの過程から保護され、転移が可能になると考えられている（図１３）。一方、血小板凝集はがん細胞の血管内皮細胞への接着を促し、また増殖因子を放出することにより、がん細胞の局所的な増殖も引き起こすと考えられている。さらに、がん細胞による血小板の凝集塊が毛細血管に詰まることも、血行性転移の促進に寄与している。【０００３】
マウス結腸がん細胞株ｃｏｌｏｎ２６を繰り返し実験的に肺転移させることで、高転移性株ＮＬ−１７細胞と低転移性株ＮＬ−１４細胞が樹立された（非特許文献１）。さらに、ＮＬ−１７細胞に高反応性を示し、ＮＬ−１４細胞には低反応性を示すモノクローナル抗体８Ｆ１１抗体を作製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で、ＮＬ−１７細胞はマウスの血小板凝集を引き起こしたが、８Ｆ１１抗体によりその活性は阻害された。また、ｉｎ  ｖｉｖｏの実験で、ＮＬ−１７細胞の実験的肺転移が８Ｆ１１抗体の投与によって阻害された。これらのことから、ＮＬ−１７細胞は、８Ｆ１１抗体に認識される血小板凝集因子を発現することによってマウス血小板を凝集させ、その結果、肺転移を起こすことが示唆された。この血小板凝集因子が後にポドプラニン（別名：Aggrus、アグラス）と名付けられた。【０００４】
その後、８Ｆ１１抗体カラムとＷＧＡカラムを使ってＮＬ−１７細胞からマウスのポドプラニンタンパク質が精製された（非特許文献２）。精製されたポドプラニンは、血漿成分非存在下で、濃度依存的にマウスの血小板凝集を引き起こし、さらにこの凝集反応は、８Ｆ１１抗体によって完全に阻害された。【０００５】
本発明者らは、これまでにポドプラニンの遺伝子クローニングに成功した（非特許文献３）。ポドプラニンは、Ｃ末端に膜貫通部位を有するＩ型膜貫通型タンパク質である。ヒトポドプラニンは、マウスポドプラニンとホモロジーが低いにも関わらず、マウスの血小板凝集を引き起こし、逆にマウスポドプラニンはヒトの血小板凝集を引き起こす。マウスポドプラニンの中和抗体８Ｆ１１抗体のエピトープ解析や、詳細な変異実験により、ＥＤｘｘＶＴＰＧという配列の３回繰り返し（ＰＬＡＧドメイン）のスレオニン（Ｔｈｒ）がポドプラニンによる血小板凝集の活性中心であり、種を越えて保存されていることが明らかとなった（非特許文献４）。ポドプラニンはその分子量の約半分が糖鎖であるが、糖鎖合成不全の変異ＣＨＯ細胞（Ｌｅｃ１，Ｌｅｃ２，Ｌｅｃ８）を用いることにより、ＰＬＡＧドメインのＴｈｒに付加されているＯ−結合型糖鎖のシアル酸が血小板凝集の活性中心であることがわかった（非特許文献５）。【０００６】
また、本発明者らは、ヒトポドプラニンを精製するために、特異性が高いラットモノクローナル抗体ＮＺ−１抗体を作製した（非特許文献６）。ＮＺ−１抗体は、ウェスタンブロットやフローサイトメトリー、免疫組織染色に有用なだけでなく、免疫沈降においても感度及び特異度が高い抗体として利用できることがわかった。質量分析計（ＭＳ）を使った詳細な糖鎖構造解析（特にＯ−結合型糖鎖）には数十μｇの精製タンパク質が必要となるため、ヒトポドプラニンを高発現しているがん細胞株のスクリーニングも同時に行った。その結果、ＮＺ−１抗体を用いて、ヒトポドプラニンを高発現しているヒト膠芽腫細胞ＬＮ３１９からヒトポドプラニンを大量に精製することができた（非特許文献７）。【０００７】
さらに、ヒトポドプラニンの詳細な糖鎖構造解析を行った結果、ヒトポドプラニンの血小板凝集の活性中心は、ＰＬＡＧドメインのＴｈｒ５２に付加されたｄｉｓｉａｌｙｌ−ｃｏｒｅ１構造であることが明らかとなった（非特許文献７）。【０００８】
本発明者らはまた、ポドプラニンの血小板上受容体が、Ｃ型レクチン様受容体のＣＬＥＣ−２（Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２）であることを見出した（非特許文献８）。ＣＬＥＣ−２のＦｃキメラや膜型発現株を作製したところ、ポドプラニンとＣＬＥＣ−２が特異的に結合した。また、ＣＬＥＣ−２のＦｃキメラによってポドプラニンによる血小板凝集が阻害された。【０００９】
さらに、ポドプラニンとＣＬＥＣ−２の反応がＰＬＡＧドメインを介して起こっていることを確かめるため、ＰＬＡＧドメインのＴｈｒ５２のみにＯ−結合型糖鎖を付加した様々な糖ペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。その結果、ＰＬＡＧドメインにｄｉｓｉａｌｙｌ−ｃｏｒｅ１構造を付加した糖ペプチドのみがＣＬＥＣ−２と高い反応性を示した（非特許文献９）。【００１０】
ＮＺ−１抗体はポドプラニンとＣＬＥＣ−２との結合を阻害し、ポドプラニンによる血小板凝集も濃度依存的に阻害した。また、ＮＺ−１抗体をポドプラニン発現細胞と共に尾静注すると、肺転移も有意に抑制した（非特許文献９）。
本発明者らはまた、６種類のポドプラニン−Ｆｃキメラと２１種類のペプチドを合成し、ＮＺ−１の最小エピトープがＡＭＰＧＡＥであること、また、ＮＺ−１との強固な結合のためには、ＧＶＡＭＰＧＡＥＤＤの１０アミノ酸が必要であることを確認した。
なお、他のエピトープを認識する抗ポドプラニン抗体（Ｄ２−４０、ＡＢ３、１８Ｈ５及びラビットポリクローナル抗体）は、ポドプラニンとＣＬＥＣ−２の相互作用を阻害しなかった（非特許文献１０）。【００１１】
以上の結果から、ヒトポドプラニンは、ＣＬＥＣ−２に結合することにより血小板凝集を起こし、さらにがんの血行性転移に重要な役割を果たすことが示され、がん治療のターゲットとなりうることが示唆された。【００１２】
ところで、近年、疾患に関連するターゲットに対する抗体を用いる抗体医薬品が開発されている。抗体は一対のジスルフィド結合で安定化された２本の重鎖（Ｈ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ鎖）が会合した構造をとる。重鎖は、重鎖可変領域ＶＨ、重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ１とＣＨ２の間に位置するヒンジ領域からなり、軽鎖は、軽鎖可変領域ＶＬと軽鎖定常領域ＣＬとからなる。この中で、ＶＨとＶＬからなる可変領域断片（Ｆｖ）が、抗原結合に直接関与し、抗体に多様性を与える領域である。また、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、ＣＨ１からなる抗原結合領域をＦａｂ領域と呼び、ヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３からなる領域をＦｃ領域と呼ぶ。【００１３】
抗体医薬の薬効メカニズムは、抗体が有する２つの生物活性に基づいている。一つは標的抗原特異的な結合活性であり、結合することによって標的抗原分子の機能を中和する活性である。標的抗原分子の機能の中和はＦａｂ領域を介して発揮される。抗原分子に対する中和活性を利用した抗体医薬としては、インフリキシマブやベバシズマブが知られている。【００１４】
もう一つは、エフェクター活性と呼ばれる抗体の生物活性である。エフェクター活性は、抗体のＦｃ領域を介して、抗体依存性細胞障害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害活性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＣＤＣ）、アポトーシスの直接誘導等の態様で発揮される。エフェクター活性を利用して薬効を発現する抗体医薬としてはリツキシマブやトラスツズマブが挙げられる（非特許文献１１）。
中和活性とエフェクター活性は、それぞれ独立しており、いずれかの活性を有する抗体が他方の活性を有するとは限らない。また、ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性は抗体のサブクラスに依存しており、ＡＤＣＣ活性を持っていてもＣＤＣ活性があるとは限らず、またＣＤＣ活性を持っていてもＡＤＣＣ活性があるとは限らない。【００１５】
抗体医薬の活性として、特にエフェクター活性が重要視されている。例えば、ヒトのＦｃγ受容体ＩＩＩａには、リツキシマブに対して親和性の高い多型と低い多型が存在するが、親和性の高い多型を有する非ホジキンリンパ腫患者において、より優れた臨床効果が得られている。また、トラスツズマブによる乳がん治療においても、末梢血をエフェクター細胞として用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＤＣＣ活性測定において、有意に高い活性が得られた患者において、より高い治療効果が観察されている。これらの結果は、臨床的に効果のある抗体医薬を開発するためにＡＤＣＣ活性が重要であることを示唆している。従って、特に抗がん剤について、臨床応用可能で、かつエフェクター活性の強い抗体医薬が求められている（非特許文献１１）。【００１６】
抗体のＡＤＣＣ活性を増強する手段として、抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列を改変する方法とＦｃ領域に結合している糖鎖の構造を制御する方法がある。しかしながら、これらの方法によってＡＤＣＣ活性が必ず増強されるものではない。また、増強される場合も、アミノ酸配列の改変や、糖鎖構造の制御には種々の態様があり、所定の抗体についてＡＤＣＣ活性を増強する方法を見出すのは容易ではない。【００１７】
これまでに、ポドプラニンは、脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び各種扁平上皮がん（口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺癌、皮膚がん、子宮頸がん）などに高発現していることが報告されている（非特許文献１２−１５）。特に、脳腫瘍の中でも星細胞系腫瘍においては、悪性度と相関してポドプラニンが発現している。従って、結合活性のみでなく、ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性等のエフェクター活性も有する抗ポドプラニン抗体があれば、これらのがんにおいても抗がん作用が得られることが期待される。
しかしながら、上述のとおり、これまでＮＺ−１抗体については、ポドプラニンとＣＬＥＣ−２との結合を阻害することによる血小板凝集中和活性しか確認されておらず、従って、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもがんの血行性転移との関連しか確認されていなかった。【００１８】
一方、抗体医薬の研究開発においては、ヒト体内における免疫原性も問題となる。マウスやラットなどのげっ歯類で作製されるモノクローナル抗体は、ヒト体内では免疫原性を示し、中和抗体の出現による効果の減弱やアレルギー反応の原因となり得る。これを回避するため、当初げっ歯類で作製されたモノクローナル抗体を、ヒトに対する抗原性の低いキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体にする技術が開発されている。【００１９】
しかしながら、キメラ抗体やヒト化抗体の製造方法には、任意の抗体に普遍的に適用し得る画一的な方法は存在しない。他種から得られた抗体を基にキメラ抗体を作製しても、結合活性、エフェクター活性のいずれも失われる場合がある。また、マウスやラットなどのげっ歯類で作製されるモノクローナル抗体をキメラ抗体やヒト化抗体にした場合、同等の活性を得られ、且つ抗原性の低いものが得られるとは限らない。【００２０】
上述のとおり、ＮＺ−１抗体については、これまでラットで作製したモノクローナル抗体のみが報告され、当該抗体がポドプラニンとＣＬＥＣ−２の結合を阻害して中和する活性のみが知られていた。また、ＮＺ−１抗体のアミノ酸配列、ＣＤＲのアミノ酸配列やこれをコードする遺伝子配列は明らかとなっておらず、具体的にキメラ抗体等が設計された例もなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Tsuruo T., Yamori T. et al., Cancer Res. 43, 5437-5442, 1983.
【非特許文献２】Toyoshima M., Nakajima M. et al., Cancer Res. 55, 767-773, 1995.
【非特許文献３】Kato Y., Fujita N. et al., J. Biol. Chem. 278, 51599-51605, 2003.
【非特許文献４】Kaneko MK., Kato Y. et al., Gene 378C:52-57, 2006.
【非特許文献５】Kaneko M., Kato Y. et al., J. Biol. Chem. 279, 38838-38843, 2004.
【非特許文献６】Kato Y., Kaneko MK. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 349:1301-1307, 2006
【非特許文献７】Kaneko MK., Kato Y. et al., FEBS Lett. 581, 331-336, 2007.
【非特許文献８】Suzuki-Inoue K., Kato Y. et al., J. Biol. Chem. 282, 25993-26001, 2007.
【非特許文献９】Kato Y., Kaneko MK. et al., Cancer Sci. 99, 54-61, 2008.
【非特許文献１０】Ogasawara S., et al., Hybridoma, 27(4):259-267, 2008.
【非特許文献１１】Satoh M.et al., Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 18, 129-136, 2006.
【非特許文献１２】Kato Y., Sasagawa I. et al., Oncogene 23, 8552-8556, 2004.
【非特許文献１３】Kato Y., Kaneko M. et al., Tumor Biol. 26,195-200, 2005.
【非特許文献１４】Mishima K., Kato Y. et al., Acta Neuropathol.111(5):483-488, 2006a
【非特許文献１５】Mishima K., Kato Y. et al., Acta Neuropathol.111(6):563-568. 2006b
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、結合活性や中和活性に加えてエフェクター活性も高く、且つヒトやマウスにおいて抗原性の低い抗ポドプラニン抗体等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記課題を解決するために、本発明者らが研究を重ねた結果、結合活性や中和活性しか確認されていなかったラットＮＺ−１抗体が、ポドプラニン陽性腫瘍細胞においてＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性も示すこと；ラットＮＺ−１抗体は、マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖抑制効果を示すこと；ラットＮＺ−１抗体の相補性決定領域（以下、「ＣＤＲ」と表記する場合もある。）を用いたマウスキメラ抗体もヒトポドプラニンに結合すること；マウスキメラ抗体は、ポドプラニン陽性腫瘍細胞においてＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を示すこと；ラットＮＺ−１抗体のＣＤＲを用いたヒトキメラ抗体もヒトポドプラニンに結合すること；ヒトキメラ抗体は、ラットＮＺ−１抗体及びマウスキメラ抗体に比較して著しく高い細胞障害活性を有すること等を確認し、本発明を完成するに至った。【００２４】
即ち、本発明は、
〔１〕配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをエピトープとする抗ポドプラニン抗体（但し、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むラットＮＺ−１抗体を除く）；
〔２〕以下のａ）〜ｆ）に示すポリペプチドの少なくとも１つを含む、上記〔１〕に記載の抗体：
ａ）配列番号：６に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：７に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：８に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：１０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；及び、
ｆ）配列番号：１１に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３；
〔３〕以下のａ’）〜ｆ’）に示すポリペプチドの少なくとも１つを含む、上記〔１〕に記載の抗体：
ａ’）配列番号：６に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、又は、配列番号：６に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１；
ｂ’）配列番号：７に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、又は、配列番号：７に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２；
ｃ’）配列番号：８に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、又は、配列番号：８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３；
ｄ’）配列番号：９に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、又は、配列番号：９に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１；
ｅ’）配列番号：１０に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、又は、配列番号：１０に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２；及び、
ｆ’）配列番号：１１に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３、又は、配列番号１１に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３；
〔４〕以下のポリペプチドを含む、上記〔１〕に記載の抗体：
ｉ）配列番号：１８に示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）、配列番号：１８に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）、又は、配列番号：１８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域（ＶＨ）；及び
ｉｉ）配列番号：１９に示す軽鎖可変領域（ＶＬ）、配列番号：１９に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は、配列番号：１９に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）；
〔５〕以下のポリペプチドをさらに含む、上記〔４〕に記載の抗体：
ｉｉｉ）配列番号：２０に示すアミノ酸配列からなる重鎖定常領域１（ＣＨ１）、配列番号：２０に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖定常領域１（ＣＨ１）、又は、配列番号：２０に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖定常領域１（ＣＨ１）；及び
ｉｖ）配列番号：２１に示すアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域（ＣＬ）、配列番号：２１に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域（ＣＬ）、又は、配列番号：２１に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖定常領域（ＣＬ）；
〔６〕ヒトＦｃ領域又はマウスＦｃ領域を含む、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の抗体；
〔７〕配列番号：２３に示すアミノ酸配列からなる重鎖、配列番号：２３に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖、又は、配列番号：２３に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する重鎖と、
配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号：３に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、配列番号：３に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する軽鎖と、を含む上記〔６〕に記載の抗体；
〔８〕配列番号：３７に示すアミノ酸配列からなる重鎖、配列番号：３７に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖、又は、配列番号：３７に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する重鎖と、
配列番号：３９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号：３９に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、配列番号：３９に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する軽鎖と、を含む上記〔６〕に記載の抗体；
〔９〕Ｆｃ領域に１以上のＮ−結合型糖鎖が結合し、該Ｎ−結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の抗体；
〔１０〕抗がん活性を有する物質を結合させた、上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の抗体；
〔１１〕上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の抗体をコードするＤＮＡ；
〔１２〕上記〔１１〕に記載のＤＮＡを含むベクター；
〔１３〕上記〔１２〕に記載のベクターを含む形質転換体；
〔１４〕上記〔１２〕に記載のベクターを含み、ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性、又はα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの活性が低下又は欠失した細胞からなる形質転換体；
〔１５〕上記〔１４〕に記載の形質転換体を培養する工程と、
得られた培養物から抗ポドプラニン抗体を精製する工程と、を含む上記〔９に記載の抗体を含む抗体組成物の製造方法；
〔１６〕上記〔１２〕に記載のベクターを含むトランスジェニック昆虫；
〔１７〕上記〔１６〕に記載のトランスジェニック昆虫又はその分泌物から抗ポドプラニン抗体を抽出する工程を含む、上記〔９〕に記載の抗体を含む抗体組成物の製造方法；
〔１８〕以下のいずれかの抗体を有効成分として含む医薬組成物：
（Ａ）上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の抗体；及び
（Ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含むラットＮＺ−１抗体；
〔１９〕抗体依存性細胞障害活性及び／又は補体依存性細胞障害活性を有する、上記〔１８〕に記載の医薬組成物；
〔２０〕抗腫瘍活性及び／又は腫瘍増殖抑制活性を有する、上記〔１８〕又は〔１９〕に記載の医薬組成物；
〔２１〕ポドプラニンを発現する腫瘍、血栓症及び動脈硬化症からなる群の少なくとも一の疾患の治療剤である、上記〔１８〕から〔２０〕のいずれか１項に記載の医薬組成物；
〔２２〕前記ポドプラニンを発現する腫瘍が、脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍（セミノーマ）及び扁平上皮がんからなる少なくとも一の腫瘍である、上記〔２１〕に記載の医薬組成物；
〔２３〕以下のいずれかの抗体を投与することを含む、ポドプラニンを発現する腫瘍、血栓症及び動脈硬化症からなる群の少なくとも一の疾患の治療方法：
（Ａ）上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の抗体；及び
（Ｂ）配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む抗体；
〔２４〕以下のいずれかのポリペプチド：
１）配列番号：６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
２）配列番号：７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
３）配列番号：８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
４）配列番号：９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
５）配列番号：１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
６）配列番号：１１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
７）配列番号：６〜１１に示すアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号：６〜１１に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識するペプチド、
に関する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性等のエフェクター活性を有する抗ポドプラニン抗体を得ることができる。エフェクター活性を有する抗ポドプラニン抗体は、がんの血行性転移の抑制のみでなく、ポドプラニンを高発現する腫瘍細胞の増殖を特異的に抑制することができる。従って、ポドプラニンの発現が見られる脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び各種扁平上皮がん（口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺癌、皮膚がん、子宮頸がん）等の治療に効果的に用いられる。
また、本発明に係るヒトキメラ抗体は、著しく高いエフェクター活性を有し、且つ、ヒトに対する抗原性も低いと考えられるため、安全で高い効果を示す医薬品として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、中皮腫細胞（Ｈ２０５２細胞）におけるＮＺ−１抗体によるＡＤＣＣ活性の測定結果を示す。ラットＮＺ−１抗体によるＡＤＣＣ活性が確認された。
【図１Ｂ】図１Ｂは、中皮腫細胞（Ｈ２２６細胞）におけるＮＺ−１抗体によるＡＤＣＣ活性の測定結果を示す。ラットＮＺ−１抗体によるＡＤＣＣ活性が確認された。
【図１Ｃ】図１Ｃは、中皮腫細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞）におけるＮＺ−１抗体によるＡＤＣＣ活性の測定結果を示す。ラットＮＺ−１抗体によるＡＤＣＣ活性は確認されなかった。
【図２Ａ】図２Ａは、中皮腫細胞（Ｈ２０５２細胞）におけるポドプラニンの発現をフローサイトメトリーにより確認した結果を示す。ポドプラニンとラットＮＺ−１抗体の結合が見られ、ポドプラニンが発現していることが確認された。
【図２Ｂ】図２Ｂは、中皮腫細胞（Ｈ２２６細胞）におけるポドプラニンの発現をフローサイトメトリーにより確認した結果を示す。ポドプラニンとラットＮＺ−１抗体の結合が見られ、ポドプラニンが発現していることが確認された。
【図２Ｃ】図２Ｃは、中皮腫細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞）におけるポドプラニンの発現をフローサイトメトリーにより確認した結果を示す。ポドプラニンの発現は見られなかった。
【図３】図３は、ラットＮＺ−１抗体による腫瘍増殖抑制効果を調べた結果を示す。ＣＨＯ／ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎを皮下に移植したマウスにラットＮＺ−１抗体を投与したところ、コントロール群に比較して、腫瘍の成長が有意に抑制された。
【図４】図４は、ラットＮＺ−１抗体を用いて動脈硬化病変におけるポドプラニンを検出した結果を示す。進行病変及びマクロファージ浸出性早期病変にポドプラニンが高発現していることが確認された。
【図５】図５は、ラットＮＺ−１抗体及びマウスキメラ型ＮＺ−１抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動した結果を示す。
【図６】図６は、ラットＮＺ−１抗体及びヒトキメラ型ＮＺ−１抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動した結果を示す。
【図７】図７は、ポドプラニンに対するラットＮＺ−１抗体、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体、及びヒトキメラ型ＮＺ−１抗体の反応性をフローサイトメトリーで確認した結果を示す。いずれの抗体もヒトポドプラニンを発現するヒト膠芽腫細胞ＬＮ３１９または中皮腫細胞Ｈ２２６とよく反応することが確認された。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｈ２２６細胞におけるラットＮＺ−１抗体によるＣＤＣ活性の測定結果を示す。ラットＮＺ−１抗体がＣＤＣ活性を有することが確認された。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｈ２２６細胞におけるマウスキメラ型ＮＺ−１抗体によるＣＤＣ活性の測定結果を示す。マウスキメラ型ＮＺ−１抗体もＣＤＣ活性を有することが確認された。
【図９】図９は、Ｈ２２６細胞におけるラットＮＺ−１抗体、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体、及びヒトキメラ型ＮＺ−１抗体によるＡＤＣＣ活性の測定結果を示す。ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体は、ラットＮＺ−１抗体及びマウスキメラ型ＮＺ−１抗体に比較して、著しく高いＡＤＣＣ活性を示した。
【図１０】図１０は、ＬＮ３１９細胞におけるラットＮＺ−１抗体、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体、及びヒトキメラ型ＮＺ−１抗体によるＡＤＣＣ活性の測定結果を示す。ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体は、ラットＮＺ−１抗体及びマウスキメラ型ＮＺ−１抗体に比較して、著しく高いＡＤＣＣ活性を示した。
【図１１】図１１は、Ｈ２２６細胞におけるラットＮＺ−１抗体、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体、及びヒトキメラ型ＮＺ−１抗体によるＣＤＣ活性の測定結果を示す。ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体は、ラットＮＺ−１抗体及びマウスキメラ型ＮＺ−１抗体に比較して、著しく高いＣＤＣ活性を示した。
【図１２】図１２は、ＬＮ３１９細胞におけるラットＮＺ−１抗体、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体、及びヒトキメラ型ＮＺ−１抗体によるＣＤＣ活性の測定結果を示す。ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体は、ラットＮＺ−１抗体及びマウスキメラ型ＮＺ−１抗体に比較して、著しく高いＣＤＣ活性を示した。
【図１３】図１３は、血小板凝集とがんの転移の関係を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（抗ポドプラニン抗体）
本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをエピトープとする抗ポドプラニン抗体（但し、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むラットＮＺ−１抗体を除く。以下、「本発明の抗ポドプラニン抗体」ということがある）を提供する。
本発明の抗ポドプラニン抗体は新規な抗体であり、ポドプラニンとＣＬＥＣ−２との結合を阻害するのみでなく、ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性等の高いエフェクター活性を有し、腫瘍増殖抑制能を有するものである（後述）。
【００２８】
これまでにも、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むラットＮＺ−１抗体がポドプラニンとＣＬＥＣ−２の結合を阻害し、その結果、血行性転移を抑制しうることは知られていた。しかしながら、結合阻害活性を有する抗体が同時に高いエフェクター活性を有することはむしろ稀であり、本発明の抗ポドプラニン抗体が、ポドプラニンとＣＬＥＣ−２の結合阻害活性のみならず、エフェクター活性を示すことは、当業者が予測し得ないことであった。
【００２９】
本明細書において、「配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド」とは、ラットＮＺ−１抗体が認識する、ポドプラニン上の最小エピトープである（非特許文献１０）。
【００３０】
本発明の抗ポドプラニン抗体は、以下の（１）〜（３）に示す重鎖相補性決定領域（重鎖ＣＤＲ１〜重鎖ＣＤＲ３）、及び（４）〜（６）に示す軽鎖相補性決定領域（軽鎖ＣＤＲ１〜軽鎖ＣＤＲ３）の少なくとも一つを含むことが好ましい。これらの重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲは、本発明者らが、今般、ラットＮＺ−１抗体に基づいて初めて決定したものである。
（１）配列番号：６に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号：６に示すアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、又は、配列番号：６に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１
（２）配列番号：７に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号：７に示すアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、又は、配列番号：７に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２
（３）配列番号：８に示すアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号：８に示すアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、又は、配列番号：８に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
（４）配列番号：９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号：９に示すアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、又は、配列番号：９に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１
（５）配列番号：１０に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、配列番号：１０に示すアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、又は、配列番号：１０に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２
（６）配列番号：１１に示すアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３、配列番号：１１に示すアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３、又は、配列番号：１１に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
【００３１】
本発明の抗ポドプラニン抗体は、本発明の効果を奏する限り、上記重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲをいくつ含むものであってもよいが、好ましくは３つ以上、より好ましくは５つ以上、最も好ましくは６つ含む。
【００３２】
本発明の抗ポドプラニン抗体は、上記重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲのうち、以下の組み合わせを有するものが好ましく用いられる。
ａ）配列番号：６に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：７に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：８に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：９に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：１０に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ２；及び、
ｆ）配列番号：１１に示すアミノ酸配列からなるＣＤＲ３。
【００３３】
本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。
【００３４】
本明細書において「ポリペプチド」とは、アミノ酸がペプチド結合によって連なった分子を意味し、天然又は人工のタンパク質、タンパク質断片を含む。
【００３５】
本明細書において、「１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する」という場合、欠失、置換等されるアミノ酸の個数は、結果として得られるポリペプチドがＣＤＲとしての機能を保持する限り特に限定されないが、１〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個程度であるか、あるいは全体の長さの２０％以内、好ましくは１０％以内である。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸又はアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。欠失、置換又は付加の位置は、ＣＤＲとしての機能が保持される限り、もとのポリペプチドのどこであってもよい。
【００３６】
本明細書において、「配列番号：Ｘに示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する」とは、二つのポリペプチドのアミノ酸配列の一致が最大になるように整列させたときに、共通するアミノ酸残基数の、配列番号：Ｘに示す全アミノ酸数に対する割合が６０％以上であることを意味する。本発明のＣＤＲは、配列番号：６〜１１に示すアミノ酸配列に対して６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。かかるポリペプチドも、ＣＤＲとしての機能を保持するものである。
【００３７】
配列番号：６〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲや、配列番号：６〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＣＤＲは、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、チェーンシャフリング法、ＣＤＲウォーキング法などの公知の方法を用いて作製され得る。これらの方法によれば、ファージディスプレイ法によってＣＤＲに種々の変異を有する抗体又は抗体断片をファージ表面に提示させ、抗原を使用してスクリーニングすることにより、より親和性が成熟したＣＤＲを得られることが当業者によく知られている（例えば、Wu et al., PNAS, 95:6037-6042(1998); Schier, R. et al., J. Mol. Bio. 263:551-567(1996); Schier, R. et al., J. Mol. Biol. 255:28-43(1996); Yang, W.P. et al., J. Mol. Biol., 254:392-403(1995)。）。
【００３８】
本発明の抗体は、組み換え抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等であってもよい。
また、本発明の抗ポドプラニン抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよいが、好ましくはＩｇＧである。
【００３９】
本発明の抗ポドプラニン抗体は、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるエピトープを認識する限り、マウスキメラ抗体、ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体のほか、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片等の低分子抗体も含むが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書において「キメラ抗体」あるいは「キメラ型抗体」とは、異なる種に由来する抗体の断片が連結されてなる抗体を意味する。
本発明の抗ポドプラニン抗体として好ましいキメラ抗体は、マウスキメラ抗体又はヒトキメラ抗体であり、前者は、配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるエピトープを認識する可変領域とマウスに由来するＦｃ領域を含み、後者は、同エピトープとヒトに由来するＦｃ領域を含む。配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるエピトープを認識する可変領域には、上記重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３が含まれることが好ましく、その他の領域、すなわち重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１〜４及び、軽鎖ＦＲ１〜４は、いずれの種に由来するものであってもよい。
【００４１】
本発明のマウスキメラ抗体としては、例えば、
（１）ラットＮＺ−１抗体のＦａｂ領域とマウス抗体のＦｃ領域を含むもの；
（２）ラットＮＺ−１抗体のＶＨ及びＶＬ領域と、マウス抗体のＣＨ１、ＣＬ、ヒンジ領域及びＣＨ２、ＣＨ３を含むもの；
（３）上記重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含むその他のすべての領域がマウス抗体に由来するもの、等が挙げられる。
また、本発明のマウスキメラ抗体は、一般にＡＤＣＣ活性が強いといわれるマウスＩｇＧ２ａサブクラスとのキメラ抗体であることが好ましい。
【００４２】
本発明のマウスキメラ抗体としては、ラットＮＺ−１抗体のＦａｂ領域と、マウス抗体のＦｃ領域を含むものが好ましい。特に配列番号：２３に示すアミノ酸配列からなる重鎖、配列番号：２３に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖、又は、配列番号：２３に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号：３に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、配列番号：３に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する軽鎖と、を含むマウスキメラ抗体が好ましい。
中でも、配列番号：２３に示すアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むマウスキメラ抗体が好ましい。
当該マウスキメラ抗体は、マウスＦｃとして、ＩｇＧ２ａのサブクラスを使用しており、実施例に示すとおりポドプラニン陽性ヒト腫瘍細胞においてＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を示すことが観察された。
【００４３】
本発明のヒトキメラ抗体としては、例えば、
（１）ラットＮＺ−１抗体のＦａｂ領域とヒト抗体のＦｃ領域を含むもの；
（２）ラットＮＺ−１抗体のＶＨ及びＶＬ領域と、ヒト抗体のＣＨ１、ＣＬ、ヒンジ領域及びＣＨ２、ＣＨ３を含むもの、が挙げられる。
また、本発明のヒトキメラ抗体は、一般にＡＤＣＣ活性が強いといわれるヒトＩｇＧ１サブクラスとのキメラ抗体であることが好ましい。
【００４４】
本発明のヒトキメラ抗体としては、ラットＮＺ−１抗体のＶＨ及びＶＬ領域と、ヒト抗体のＣＨ１、ＣＬ、ヒンジ領域及びＣＨ２、ＣＨ３を含むものが好ましい。
特に配列番号：３７に示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３７に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖、又は、配列番号：３７に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する重鎖と、配列番号：３９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖、配列番号：３９に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、配列番号：３９に示すアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性を有する軽鎖と、を含むマウスキメラ抗体が好ましい。
中でも、配列番号：３７に示すアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号：３９に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むヒトキメラ抗体が好ましい。
当該ヒトキメラ抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスとのキメラ抗体であり、実施例に示すとおりポドプラニン陽性ヒト腫瘍細胞において、ラットＮＺ−１抗体やマウスキメラ抗体に比較して、著しく高いＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を示すことが確認された。
【００４５】
本明細書において「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、ヒト抗体の対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、上記重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含むその他のすべての領域がヒト抗体に由来するもの等が挙げられる。かかる抗体は、ＣＤＲ移植抗体と呼ばれる場合もある。用語「ヒト化抗体」は、ヒトキメラ抗体を含む場合もある。
【００４６】
本明細書において「低分子抗体」とは、抗体の断片又は抗体の断片に任意の分子を結合させたものであって、もとの抗体と同じエピトープを認識するものを意味する。具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ’）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖ；ｄｉａｂｏｄｙ型、ｓｃＤｂ型、ｔａｎｄｅｍ  ｓｃＦｖ型、ロイシンジッパー型などの二重特異性抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の抗ポドプラニン抗体として好ましい低分子抗体は、上記重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を含む低分子抗体である。
【００４７】
本明細書における「抗体」には、糖鎖付加等の修飾が加えられたものも含まれる。かかる抗体としては、例えば、Ｆｃ領域に１以上のＮ−結合型糖鎖が結合し、該Ｎ−結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体が挙げられる。
例えばＩｇＧ抗体のＦｃ領域には、Ｎ−結合型糖鎖の結合部位が２ヶ所存在し、この部位に複合型糖鎖が結合している。Ｎ−結合型糖鎖とは、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列のＡｓｎに結合する糖鎖をいい、共通した構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２―Ａｓｎを有する。非還元末端の２つのマンノース（Ｍａｎ）に結合する糖鎖の種類により、高マンノース型、混成型、及び複合型等に分類される。
Ｎ−結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にはフコースが結合しうるが、このフコースが結合していない場合、結合している場合に比較してＡＤＣＣ活性が著しく上昇することが知られている。このことは例えば、国際公開第２００２／０３１１４０号パンフレットに記載されており、その開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＤＣＣ活性が著しく向上することにより、抗体を医薬として用いる場合に投与量を少なくすることができるので、副作用を軽減させることが可能であると共に、治療費も低減させることができる。
【００４８】
本発明はまた、上述した本発明の抗ポドプラニン抗体に抗がん活性を有する物質を結合させたものも含む。
本明細書において、「抗がん活性を有する物質」とは、腫瘍サイズの低下（遅延又は停止）、腫瘍の転移の阻害、腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを生じさせる物質を意味する。具体的には、毒素、抗がん剤、ラジオアイソトープを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００４９】
抗がん活性を有する毒素としては、例えば、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ又はその細胞障害性フラグメント（例えばＰＥ３８）、ジフテリア毒素、リシンＡ等が挙げられる。抗がん活性を有する毒素は、抗ポドプラニン抗体と共に毒素が取り込まれる細胞、即ちポドプラニンを発現している癌細胞のみに毒性を発揮するので、周囲の細胞に悪影響を与えず、特異的に効果を得られるという利点がある。
【００５０】
抗がん剤としては、例えば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、ビンクリスチン、エピルビシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、アクラシノマイシン、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミド、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、タモキシフェン、デキサメタゾン等の低分子化合物や、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン（例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２）等のタンパク質が挙げられる。
【００５１】
抗がん活性を有するラジオアイソトープとしては、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、９０Ｙ等が挙げられる。ラジオアイソトープは、抗ポドプラニン抗体が結合する細胞、即ちポドプラニンを発現している細胞の周囲の細胞にも毒性を発揮する。一般に、腫瘍細胞は均一ではなく、すべての腫瘍細胞がポドプラニンを発現しているわけではないので、周囲のポドプラニン陰性の腫瘍細胞を殺すためにラジオアイソトープは有用である。なお、ラジオアイソトープを結合させる場合、抗ポドプラニン抗体はＦａｂやｓｃＦｖなどの低分子抗体であることが好ましい。
【００５２】
上記抗がん活性を有する物質は、公知の方法によって抗ポドプラニン抗体に直接結合させることができる。また、例えばリポソーム等の担体に封入して抗ポドプラニン抗体に結合させてもよい。
上記抗がん活性を有する物質が蛋白質やポリペプチドの場合は、本発明の抗ポドプラニン抗体をコードするＤＮＡと抗がん活性を有する物質をコードするＤＮＡを連結し、適当な発現ベクターに挿入することにより、抗がん活性を有する物質と抗ポドプラニン抗体との融合タンパク質として発現させてもよい。
【００５３】
（抗ポドプラニン抗体をコードするＤＮＡ）
また、本発明は、上述した本発明の抗ポドプラニン抗体をコードするＤＮＡを含む。かかるＤＮＡは、当業者が公知の方法に従って塩基配列を決定することができ、また公知の方法で調製することができる。
本発明の抗ポドプラニン抗体が、上述の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３を含むものである場合、本発明の抗ポドプラニン抗体をコードするＤＮＡは、配列番号：１２〜１４にそれぞれ示す塩基配列からなる重鎖ＣＤＲ１〜３をコードするＤＮＡ及び、配列番号：１５〜１７にそれぞれ示す塩基配列からなる軽鎖ＣＤＲ１〜３をコードするＤＮＡを含む。
【００５４】
例えば、本発明の抗ポドプラニン抗体が、配列番号：２３に示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とからなるマウスキメラ抗体である場合について説明する。
当該マウスキメラ抗体のＶＨとＣＨ１、ＶＬとＣＬは、ラットＮＺ−１抗体に由来するものである。これらをコードするＤＮＡは、例えば、ラットＮＺ−１抗体を産生するハイブリドーマから標準的な手法により全ＲＮＡを調製し、市販のキットを用いてＮＺ−１抗体をコードするｍＲＮＡを調製した後、当該ｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬ領域のｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法により増幅して得ることができる。一方、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３はマウスに由来し、これらをコードするＤＮＡも同様の方法で得ることができる。
【００５５】
次に、ＶＬをコードするＤＮＡとＣＬをコードするＤＮＡとを作動的に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子を得ることができる。また、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３をコードするＤＮＡを作動的に連結することにより、完全長重鎖遺伝子を得ることができるので、これらを併せて、マウスキメラ抗体をコードするＤＮＡを得られることになる。
配列番号：２３に示すアミノ酸配列からなる重鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：２４に、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：５に示す。
【００５６】
また、本発明の抗ポドプラニン抗体が、ｓｃＦｖである場合、これをコードするＤＮＡは、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを、リンカーをコードするペプチドをコードするＤＮＡと作動的に連結することによって得ることができる。
【００５７】
また、本発明の抗ポドプラニン抗体が、ヒト化抗体である場合、これをコードするＤＮＡは、上述の重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３と、ヒト抗体のフレームワーク領域を連結するように設計したＤＮＡを、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成した後、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって得ることができる。
【００５８】
（ベクター）
本発明は、本発明の抗ポドプラニン抗体をコードするＤＮＡを含むベクターを包含する。発現ベクターは、使用する宿主細胞にあわせて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。これらの発現ベクターには、公知の方法（制限酵素を利用する方法等）で、本発明の抗ポドプラニン抗体をコードするＤＮＡを挿入することができる。
【００５９】
また、本発明のベクターは、さらに抗体遺伝子の発現を調節するプロモーター、複製起点、選択マーカー遺伝子等を含むことができる。プロモーター及び複製起点は、宿主細胞とベクターの種類によって適宜選択することができる。
【００６０】
（形質転換体）
本発明は、本発明のベクターを含む形質転換体を包含する。形質転換体は、本発明のベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすることによって得ることができる。宿主細胞としては、例えば、哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等）、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞（サッカロミセス属、アスペルギルス属等）といった真核細胞や、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、枯草菌などの原核細胞を用いることができる。
【００６１】
（本発明の抗ポドプラニン抗体の作製方法）
本発明の抗ポドプラニン抗体の作製方法は限定されないが、例えば、上述の本発明の形質転換体を、適当な条件で培養して抗体を発現させ、公知の方法に従って単離精製することができる。具体的には、プロテインＡ等を用いたアフィニティカラム、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜組み合わせることによって抗体の単離、精製を行うことができる。
また、本発明の抗ポドプラニン抗体が低分子化抗体である場合、当該低分子抗体をコードするＤＮＡを用いて上記方法で発現させることもでき、また、抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理して作製することもできる。
【００６２】
本発明の抗体は、作製方法や精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の抗体を、大腸菌等の原核細胞で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明は、かかる抗体も包含する。
【００６３】
還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−結合型糖鎖を有する抗体は、公知の方法又はそれに準ずる方法に従って製造することができる。かかる抗体の製造方法は、例えば、国際公開第２００２／０３１１４０号パンフレット、特開２００９−２２５７８１号公報に記載されており、その開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
具体的には、例えば、本発明に係る抗ポドプラニン抗体をコードするＤＮＡを含むベクターを用いて、ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素の活性、又はα−１，６−フコシルトランスフェラーゼの活性が低下又は欠失した細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養した後、目的とする抗ポドプラニン抗体を精製することによって得ることができる。
ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、例えば、ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＭＰ）、ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ  ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ，４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ｆｘ）、ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＧＦＰＰ）が挙げられる。
ここで、細胞は特に限定されないが、哺乳動物細胞が好ましく、例えば上記酵素活性を低下又は欠失されたＣＨＯ細胞を用いることができる。
上記方法によって得られる抗体組成物は、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している抗体を含む場合もあるが、フコースが結合している抗体の割合は、抗体全体の２０重量％以下、好ましくは１０重量％以下、さらに好ましくは５重量％以下、最も好ましくは３重量％以下である。
【００６４】
また、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＮ−結合型糖鎖を有する抗体は、本発明に係る抗ポドプラニン抗体をコードするＤＮＡを含むベクターを昆虫卵に導入し、孵化させて昆虫を成長させ、必要に応じて交配を行ってトランスジェニック昆虫を作製し、当該トランスジェニック昆虫又はその分泌物から抗ポドプラニン抗体を抽出することによっても得ることができる。昆虫としてはカイコを用いることができ、その場合、繭から抗体を抽出することができる。
この方法によって得られる抗体組成物も、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合している抗体を含む場合もあるが、フコースが結合している抗体の割合は、抗体全体の２０重量％以下、好ましくは１０重量％以下、さらに好ましくは５重量％以下、最も好ましくは３重量％以下である。
【００６５】
（本発明の抗体の活性）
本発明者らは、本発明の抗ポドプラニン抗体、及び、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むラットＮＺ−１抗体（以下、併せて「本発明の抗体」という。）が、ポドプラニンとＣＬＥＣ−２の結合阻害活性だけでなく、ＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性等のエフェクター活性を有すること、また腫瘍増殖抑制活性を有することを見出した。これらの活性は、以下の方法で測定することができる。
【００６６】
（１）結合活性
抗体の結合活性は公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、蛍光抗体法、ＦＡＣＳ法等で、測定することができる。
（２）ＡＤＣＣ活性
ＡＤＣＣ活性とは、標的細胞の細胞表面抗原に本発明の抗体が結合した際、そのＦｃ部分にＦｃγ受容体保有細胞（エフェクター細胞）がＦｃγ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を意味する。
ＡＤＣＣ活性は、ポドプラニンを発現している標的細胞とエフェクター細胞と本発明の抗体を混合し、ＡＤＣＣの程度を測定することによって知ることができる。エフェクター細胞としては、例えば、マウス脾細胞、ヒト末梢血や骨髄から分離した単球核を利用することができる。標的細胞としては、例えばポドプラニン陽性中皮腫細胞やポドプラニン陽性膠芽腫細胞を用いることができる。標的細胞をあらかじめ５１Ｃｒ等で標識し、これに本発明の抗体を加えてインキュベーションし、その後標的細胞に対して適切な比のエフェクター細胞を加えてインキュベーションを行う。インキュベーション後、上清を採取し、上清中の上記標識をカウントすることにより、測定することが可能である。
（３）ＣＤＣ活性
ＣＤＣ活性とは、補体系による細胞障害活性を意味する。
ＣＤＣ活性は、ＡＤＣＣ活性の試験において、エフェクター細胞に代えて補体を用いることにより測定することができる。
（４）腫瘍増殖抑制活性
腫瘍増殖抑制活性は、腫瘍モデル動物を利用して測定することができる。例えば、マウスの皮下に腫瘍を移植し、本発明の抗体を投与する。非投与群と投与群における腫瘍組織の体積を比較することにより、腫瘍増殖抑制効果を測定することができる。
なお、本発明の腫瘍増殖抑制活性は、個々の細胞の増殖を抑制する結果生じるものであっても、細胞死を誘導する結果生じるものであってもよい。
【００６７】
（医薬組成物）
本発明者らは、本発明の抗体が、従来ラットＮＺ−１抗体について知られていたポドプラニンとＣＬＥＣ−２との結合阻害活性に加え、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性等のエフェクター活性及び腫瘍増殖抑制活性を有することを見出した。従って、本発明の抗体は、ポドプラニン抗体を発現するがんの治療に有効である。本発明の医薬組成物は、本発明の抗体、および薬学的に許容できる担体や添加物を含む。
【００６８】
担体及び添加物の例として、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤などとすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、ポドプラニンが関連する疾患、例えば、腫瘍、血栓症、動脈硬化症等の治療に有効である。
上述のとおり、ポドプラニンはＣＬＥＣ−２に結合することにより血小板凝集を起こすことが示唆されている。また、ポドプラニンの血小板上受容体であるＣＬＥＣ−２が血栓症／動脈硬化症に関連すること、具体的には、ＣＬＥＣ−２欠損血小板はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても凝集能に劣ること、及び、ＣＬＥＣ−２欠損は出血時間を延長させ、閉塞性動脈血栓形成を防ぐことが報告されている（May, F. et al., Blood prepublished online July 29 2009; doi:10.1182/blood-2009-05-222273）。
さらに本明細書の実施例に示すとおり、動脈硬化病変においてポドプラニンが高発現していることも見出された。以上の事実から、本発明の医薬組成物が血栓症や動脈硬化症の治療に有効であることが強く示唆される。
一方、ポドプラニンが関連する腫瘍としては、脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び扁平上皮がん等が挙げられる。ここで、扁平上皮がんには、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺癌、皮膚がん、子宮頸がんが含まれるがこれらに限定されない。
【００７１】
本発明は、本発明の抗体を治療有効量投与することを含むポドプラニンが関連する疾患の治療方法も包含する。
本明細書において、治療有効量とは、治療する疾患の一つ又は複数の症状が、それによりある程度緩和される作用物質の量を意味する。抗がん剤の場合、腫瘍サイズの低下；腫瘍の転移の阻害（遅延又は停止）；腫瘍増殖の阻害（遅延又は停止）、及びがんと関連する一つ又は複数の症状の緩和、の少なくとも１つを示す量を意味する。
具体的には、本発明の抗体の投与量は、例えば、０．０２５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は０．１〜３ｍｇ／ｋｇとすることができるが、これに限定されない。
【００７２】
（マーカー、診断薬）
上述のとおり、ポドプラニンは特定の腫瘍細胞において高発現している。従って、本発明の抗体は、がん、特に脳腫瘍、中皮腫、精巣腫瘍、卵巣がん、及び各種扁平上皮がん（口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、食道がん、肺癌、皮膚がん、子宮頸がん）などポドプラニンが高発現するがんの診断に有用である。
また、実施例に示すとおり、ラットＮＺ−１抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、動脈硬化病変においてポドプラニンが高発現していることが確認された。従って、本発明の抗ポドプラニン抗体は、動脈硬化の診断にも有用である。
動脈硬化病変については、早期病変のうちマクロファージ浸出性の病変においてポドプラニンの高発現が観察された。マクロファージ浸出性病変は進行病変になりやすいことが知られていることから、ポドプラニンを検出することによる診断方法によって、進行病変になりやすい動脈硬化の早期発見が期待される。
以上より、本発明は、本発明の抗体を含むがん又は動脈硬化の診断薬、がん又は動脈硬化の診断のための抗体の使用、本発明の抗体を用いるがん又は動脈硬化の診断方法をも包含する。
【実施例】
【００７３】
１．ラットＮＺ−１抗体のアミノ酸配列及びラットＮＺ−１抗体遺伝子の塩基配列の決定
ＮＺ−１ハイブリドーマ細胞（非特許文献６を参照）１×１０６からＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを使用してトータルＲＮＡを抽出した。
トータルＲＮＡ  １μｇからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  ｋｉｔを使用してｃＤＮＡ合成を行った。以下の実験にｃＤＮＡを鋳型として使用した。
Ｈ鎖の増幅に以下のプライマーを使用した。
S1      tcctcacc atg gac ttc agg  （配列番号：２５）
AS1    tca ttt acc agg aga gtg gg  （配列番号：２６）
ＰＣＲ反応にはＱＩＡＧＥＮ  ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑを使用した。温度条件は、最初に９５℃１５分、次に９４℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、最後に７２℃１０分とした。
増幅したＰＣＲ産物はＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製し、ｐｃＤＮＡ３−ｔｏｐｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔにてサブクローニングし、ベクタープライマーから塩基配列の決定を行った。
Ｌ鎖の増幅に以下のプライマーを使用した。
BamHI-S1      cca ggatcc acc atg aca tgg act cta ct  （配列番号：２７）
EcoRI-AS1 ggt gaattc cta gac aca ttc tgc agg ag  （配列番号：２８）
ＰＣＲ反応にはＱＩＡＧＥＮ  ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑを使用した。温度条件は、最初に９５℃１５分、次に９４℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃１分を３５サイクル、最後に７２℃１０分とした。
増幅したＰＣＲ産物はＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ  とＥｃｏＲＩにて３７℃で１時間処理した。制限酵素処理したＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ＆ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍｓにて精製し、同じく酵素処理したベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＺｅｏｃｉｎもしくはｐｃＤＮＡ３（Ｇ４１８）にサブクローニングし、ベクタープライマーから塩基配列の確認を行った。Ｈ鎖をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号：４に、Ｌ鎖をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号：５に示すとおりであった。
塩基配列からアミノ酸配列を予測した。Ｈ鎖アミノ酸配列は配列番号：２に、Ｌ鎖アミノ酸配列は配列番号：３に示すとおりであった。【００７４】
２．ＣＤＲの決定
決定した塩基配列より以下のＵＲＬのホームページ（ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ  Ｓｅａｒｃｈ  ｐａｇｅ）に提供されているイムノグロブリンの配列予測ソフトにてＣＤＲの部位を特定した。
http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanIg
重鎖ＣＤＲ１〜３及び軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：６〜１１に示されるように特定された。【００７５】
３．ポドプラニン陽性細胞におけるラットＮＺ−１抗体によるＡＤＣＣ活性の測定
ラット脾細胞の１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０浮遊液（グルタミンを含む）を作成し、赤血球を溶血後、脾細胞が５ｘ１０５個／ｗｅｌｌ又は１ｘ１０６個／ｗｅｌｌになるように、丸底９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに加えた。
腫瘍細胞として中皮腫細胞のＨ２０５２細胞、Ｈ２２６細胞、及びＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を用いた。腫瘍細胞は０．１μＣｉのＮａ５１ＣｒＯ４にてラベルし、２回洗浄後、１ｘ１０４個／ｗｅｌｌでラット脾細胞と混合した。
さらに、コントロール群にはラットＩｇＧを、ＮＺ−１抗体投与群にはラットＮＺ−１抗体を、それぞれ最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように添加した。以上の実験で、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／Ｔａｒｇｅｔ比は、５０あるいは１００となり、最終溶液量は２００μｌ／ｗｅｌｌとなる。実験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで行った。３７℃のＣＯ２インキュベーターにて６時間培養後、上清を１００μｌ回収し、γカウンターにて放射活性をカウントした（下記Ｅ値）。
上記コントロール群及びＮＺ−１抗体投与群とは別に、腫瘍細胞をｍｅｄｉｕｍのみで培養したｗｅｌｌの活性をｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅとし、１％ＳＤＳで培養したｗｅｌｌの活性をｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅとした。細胞障害活性（％）は、以下の式にて計算した。
% Specific lysis (Cytotoxicity)=(E-S)/(M-S)х100
E: the release in the test sample(cpm in the supernatant from target cells incubated with effector cells and test antibody) 
S: the spontaneous release (cpm in the supernatant from target cells incubated with medium alone) 
M: the maximum release (cpm released from target cells lysed with 1% sodium dodecyl sulfate)
結果を図１Ａ〜Ｃに示す。
一方、上記中皮腫細胞におけるポドプラニンの発現をフローサイトメトリーにより確認した。具体的には、ＮＺ−１抗体（１０μｇ／ｍｌ）を４℃で３０分反応させ、さらに抗ラットＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体を４℃で３０分反応させた。蛍光強度をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）で測定した。
結果を図２Ａ〜Ｃに示す。実線がＮＺ−１抗体、塗りつぶしが二次抗体のみのコントロールのピークを示す。
図１及び図２に示されるとおり、ポドプラニンの陽性細胞においては、ＮＺ−１抗体によるＡＤＣＣ活性が確認された。それに対し、ポドプラニンの陰性細胞においては、ＮＺ−１抗体によるＡＤＣＣ活性が見られなかった。【００７６】
４．ラットＮＺ−１抗体による腫瘍増殖抑制効果
ポドプラニンを発現しているＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ（非特許文献３を参照））をトリプシン処理して浮遊させ、ＰＢＳで洗浄後、ＨＢＳＳに浮遊させ、３．０ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整して、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に１００μｌずつ移植した。
１日後、ＮＺ−１抗体投与群には５ｍｇ／ｍｌのＮＺ−１抗体を、コントロール群には５ｍｇ／ｍｌのラットＩｇＧをそれぞれ２００μｌ、ａｌｚｅｔ  ｍｉｎｉ−ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｕｍｐ（ｍｏｄｅｌ  ２００２，ＤＵＲＥＣＴ）に封入し、マウスの腹腔内に埋め込み、０．５μｌ（２．５μｇ）／ｈｏｕｒで２週間持続的に投与した（コントロール群；ｎ＝１０，ＮＺ−１群；ｎ＝９）。細胞移植２０日後より腫瘍径を３日毎に計測した。
結果を図３に示す。皮下腫瘍形成率はコントロール群では９／１０（９０％）であったのに対しＮＺ−１抗体投与群では６／９（６６．６％）であり、ＮＺ−１抗体により腫瘍生着率が低下した。さらに、ＮＺ−１抗体投与群は細胞移植５０日以降コントロール群と比較して形成された皮下腫瘍が有意に小さかった。以上の結果から抗ＮＺ−１抗体は皮下腫瘍の生着および増殖を抑制することが示された。【００７７】
５．ラットＮＺ−１抗体による動脈硬化病変の検出
動脈硬化病変の組織１０ｍｇをＰＢＳで３回洗浄後、可溶化溶液（１％Ｔｒｉｔｏｎ  ｉｎ  ＰＢＳ；５０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）で可溶化し、常法に従いタンパク定量を行った（非特許文献３を参照。）。タンパク１０μｇ（１０μｌ）を１０μｌの２  ｘ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え、１００℃で５分煮沸した。２０μｌを１０％ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｇｅｌにａｐｐｌｙし、ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１９２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ，０．１％ＳＤＳ）を用いて、４０ｍＡで５５分電気泳動した。
その後、ＰＶＤＦ膜に転写（３０Ｖ、６０分）し、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（４％スキムミルク  ｉｎ  ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で４℃、１８時間ブロッキングした。その後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１μｇ／ｍｌに調整したＮＺ−１抗体および１／４０００希釈した抗β−ａｃｔｉｎ抗体を、室温で５０分反応させた。
ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｉｎ  ＰＢＳ）で洗った後、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１／１０００に希釈したＨＲＰ−ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉ−Ｒａｔ  ＩｇＧ（ＧＥ社）およびＨＲＰ−ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ＧＥ社）を４５分室温で反応させた。ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで洗った後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ社）で発色させ、ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｉｌｍに露光させた。
結果を図４に示す。マクロファージ浸出性の早期病変及び進行病変において、ポドプラニンが高発現していることが確認された。【００７８】
６．マウスキメラ型ＮＺ−１抗体の作製
マウスキメラ型ＮＺ−１抗体の作製のために、ＮＺ−１のＶＨ領域とＣＨ１領域をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅し、マウスＩｇＧ２ａのヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３領域をコードするＤＮＡを保持したｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ２Ａ−Ｆｃ１ベクターに組み込んだ（ｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ２Ａ／ＮＺ−１Ｈ）。
ＮＺ−１のＶＨ領域とＣＨ１領域をコードするＤＮＡはｐｃＤＮＡ３／ＮＺ−１Ｈプラスミドを鋳型として、以下のプライマーにより増幅した。
EcoRI-NZ-1-Fwd          cca gaattc tcc tca cca tgg act  （配列番号：２９）
NZ-1-CH1-Rev-BglII      tgg agatct ccttggcacaattttcttgt  （配列番号：３０）
ＮＺ−１のＬ鎖をコードするＤＮＡは、塩基配列決定の際に作成したｐｃＤＮＡ３（Ｇ４１８）／ＮＺ−１Ｌを使用した。
ｐＦＵＳＥ−ｍＩｇＧ２Ａ／ＮＺ−１ＨとｐｃＤＮＡ３（Ｇ４１８）／ＮＺ−１Ｌ（Ｚｅｏｃｉｎ）それぞれ２μｇを混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ｋｉｔの方法に従って、ＣＨＯ細胞１ｘ１０５（６ウェルプレートの１ウェルに相当）に形質導入した。２４時間後からＺｅｏｃｉｎ  ５００μｇ／ｍｌ、Ｇ４１８  １ｍｇ／ｍｌ入りの培地で形質導入細胞の選択をした。ＬＮ３１９細胞もしくはポドプラニン発現ＣＨＯ細胞に対して、選択細胞の培養上清の反応性をフローサイトメトリーにて確認した。
キメラ抗体の高発現株を、無血清培地（インビトロジェン社）を用いて培養し、培養上清を回収した。培養上清をプロテインＧカラム（ピアス社）に通し、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体を精製した。マウスキメラ型ＮＺ−１抗体は、配列番号：２３で示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３に示すアミノ酸配列からなる軽鎖で構成されている。重鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：２４に、軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：５に示す。
精製したＮＺ−１抗体およびマウスキメラ型ＮＺ−１抗体２μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動し、ＣＢＢ染色を行った。結果を図５に示す。【００７９】
７．ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体の作製
ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体を作製するために、ＮＺ−１のＶＨ領域をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３領域をコードするＤＮＡを保持したｐｃＤＮＡ３．３ベクターに組み込んだ（ｐｃＤＮＡ３．３−ｈＩｇＧ１／ＮＺ−１Ｈ）。ＮＺ−１のＶＨ領域はｐｃＤＮＡ３／ＮＺ−１Ｈプラスミドを鋳型として、以下のプライマーにより増幅した。
NZ-1VH-Fprimer：TCCTCACCATGGACTTCAGG（配列番号：３１）
NZ-1VH-Rprimer：TTCAGCTGAGGAGACTGTGA（配列番号：３２）
ＮＺ−１のＬ鎖は、ＮＺ−１のＶＬ領域をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ヒトＩｇＧのκ鎖のＣＬ領域をコードするＤＮＡを保持したｐｃＤＮＡ３．１ベクターに組み込んだ（ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＩｇＣＬ／ＮＺ−１Ｌ）。ＮＺ−１のＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３／ＮＺ−１Ｌプラスミドを鋳型として、以下のプライマーにより増幅した。
NZ-1VL-Fprimer：accATGACATGGACTCTACT（配列番号：３３）
NZ-1VL-Rprimer：CTTGGGCTGACCTAGGACA（配列番号：３４）
ｐｃＤＮＡ３．３−ｈＩｇＧ１／ＮＺ−１Ｈ（Ｇ４１８）／ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＩｇＣＬ／ＮＺ−１Ｌ（Ｚｅｏｃｉｎ）それぞれ２μｇを混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ｋｉｔの方法に従って、ＣＨＯ細胞１ｘ１０５（６ウェルプレートの１ウェルに相当）に形質導入した。２４時間後からＺｅｏｃｉｎ  ５００μｇ／ｍｌ、Ｇ４１８  １ｍｇ／ｍｌ入りの培地で形質導入細胞の選択をした。Ｈ２２６、ＬＮ３１９細胞もしくはポドプラニン発現ＣＨＯ細胞に対して、選択細胞の培養上清の反応性をフローサイトメトリーにて確認した。
ヒトキメラ型抗体の高発現株を、無血清培地（インビトロジェン社）を用いて培養し、培養上清を回収した。培養上清をプロテインＧカラム（ピアス社）に通し、ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体を精製した。ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体は、配列番号：３７で示すアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号：３９で示すアミノ酸配列からなる軽鎖で構成されている。重鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：３８に、軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：４０に示す。重鎖は、ラットＮＺ−１抗体のＶＨ領域と、ヒトＩｇＧ１に由来するＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３からなる。軽鎖は、ラットＮＺ−１抗体のＶＬ領域と、ヒトＩｇＧ１に由来するＣＬとからなる。
精製したＮＺ−１抗体およびヒトキメラ型ＮＺ−１抗体２μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動し、ＣＢＢ染色を行った。結果を図６に示す。【００８０】
８．ポドプラニンに対するＮＺ−１抗体、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体、及びヒトキメラ型ＮＺ−１抗体の反応性
ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体がポドプラニンに対して反応を示すことを確認した。まず、ヒトポドプラニンを発現したヒト悪性中皮腫細胞（Ｈ２２６）、ヒト膠芽腫細胞（ＬＮ３１９）に、ＮＺ−１抗体、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体、ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体（１０μｇ／ｍｌ）を４度で３０分反応させ、さらに抗ラットＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体、抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体、抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体を４度で３０分それぞれ反応させた。蛍光強度をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）で測定した。
結果を図７に示す。図に示す通り、ＮＺ−１抗体、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体、及びヒトキメラ型ＮＺ−１抗体は、ヒトポドプラニンを発現したヒト悪性中皮腫細胞（Ｈ２２６）、ヒト膠芽腫細胞（ＬＮ３１９）に対し、いずれも良く反応した。ネガティブコントロールとして、それぞれの二次抗体のみを用いた。【００８１】
９．ラットＮＺ−１抗体及びマウスキメラ型ＮＺ−１抗体のＣＤＣ活性の測定（６時間及び２４時間培養後）
腫瘍細胞（Ｈ２２６細胞）を０．１μＣｉのＮａ５１ＣｒＯ４にてラベルし、２回洗浄後、１ｘ１０４個／ｗｅｌｌで丸底９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに加えた。ラットＮＺ−１抗体又はマウスキメラ型ＮＺ−１（正常ラット抗体、正常マウス抗体がそれぞれのコントロール抗体）を最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように添加し、そこにウサギ補体を最終的に４倍希釈となるように添加した。
最終溶液量は２００μｌ／ｗｅｌｌとした。３７℃のＣＯ２インキュベーターにて６時間又は２４時間培養後、上清を１００μｌ回収し、ガンマカウンターにて放射活性をカウントした。上記コントロール群、ＮＺ−１抗体投与群、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体投与群とは別に、腫瘍細胞をｍｅｄｉｕｍのみで培養したｗｅｌｌの活性をｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅとし、１％ＳＤＳで培養したｗｅｌｌの活性をｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅとした。細胞障害活性（％）は、以下の式にて計算した。
% Specific lysis (Cytotoxicity)=(E-S)/(M-S) x 100
E: the release in the test sample (cpm in the supernatant from target cells incubated with effector cells and test antibody)
S: the spontaneous release (cpm in the supernatant from target cells incubated with medium alone)
M: the maximum release (cpm released from target cells lysed with 1% sodium dodecyl sulfate)
結果を図８Ａ及びＢに示す。
６時間培養後、ラットＮＺ−１抗体及びマウスキメラ型ＮＺ−１抗体のいずれも、ポドプラニン陽性ヒト腫瘍細胞に対してＣＤＣ活性を有することが示された。２４時間培養後、ＣＤＣ活性はさらに上昇した。コントロールに対する細胞障害活性の上昇率は、ラットＮＺ−１抗体に比較して、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体で若干低くなる傾向があった。【００８２】
１０．ラットＮＺ−１抗体、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体及びヒトキメラ型ＮＺ−１抗体のＡＤＣＣ活性の測定
比重遠心法にて分離した健常人末梢血単核球（ＭＮＣ）の浮遊液を作成し、１ｘ１０６個/ｗｅｌｌになるようにＭＮＣを、丸底９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに加えた。ヒト悪性中皮腫細胞（Ｈ２２６）、ヒト膠芽腫細胞（ＬＮ３１９）は０．１μＣｉのＮａ５１ＣｒＯ４にてラベルし、２回洗浄後、１ｘ１０４個/ｗｅｌｌでＭＮＣと混合した。さらに、コントロールのラットＩｇＧおよびヒトＩｇＧ、ＮＺ−１、マウスキメラ型抗体、ヒトキメラ型抗体を最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように添加した。以上の実験で、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／Ｔａｒｇｅｔ比は、１００となり、最終溶液量は２００μｌ／ｗｅｌｌとなる。実験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで行った。３７℃のＣＯ２インキュベーターにて６時間培養後、上清を１００μｌ回収し、γカウンターにて放射活性をカウントした。ラベル下腫瘍細胞をｍｅｄｉｕｍのみで培養したｗｅｌｌの活性をｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅとし、１％ＳＤＳで培養したｗｅｌｌの活性をｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅとした。細胞障害活性（％）は、以下の式にて計算した。
% Specific lysis = (E - S) / (M - S) x 100
E：the release in the test sample (cpm in the supernatant from target cells incubated with effector cells and test antibody) 
S：the spontaneous release (cpm in the supernatant from target cells incubated with medium alone)
M：the maximum release (cpm released from target cells lysed with 1% sodium dodecyl sulfate)
結果を図９及び１０に示す。
ヒトエフェクター細胞を用いた場合、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体及びヒトキメラ型ＮＺ−１抗体が、ポドプラニン陽性ヒト腫瘍細胞に対してＡＤＣＣ活性を有することが示された。特にヒトキメラ型ＮＺ−１抗体は、ラットＮＺ−１抗体及びマウスキメラ型ＮＺ−１抗体に比較して、著しく高いＡＤＣＣ活性を示すことが確認された。マウスキメラ型ＮＺ−１抗体は、ＮＺ−１抗体と同等のＡＤＣＣ活性しか確認できなかったので、ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体でこのように活性が顕著に高くなることは当業者が予測し得ないことであった。【００８３】
１１．ラットＮＺ−１抗体、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体及びヒトキメラ型ＮＺ−１抗体のＣＤＣ活性の測定
ヒト悪性中皮腫細胞（Ｈ２２６）、ヒト膠芽腫細胞(ＬＮ３１９)を０．１μＣｉのＮａ５１ＣｒＯ４にてラベルし、２回洗浄後、１ｘ１０４個／ｗｅｌｌで丸底９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに加えた。コントロールのラットＩｇＧおよびヒトＩｇＧ、ＮＺ−１、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体、ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体を最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように添加し、そこにウサギ補体を最終的に４倍希釈となるように添加した。最終溶液量は２００μｌ／ｗｅｌｌとした。３７℃のＣＯ２インキュベーターにて６時間培養後、上清を１００μｌ回収し、γカウンターにて放射活性をカウントした。腫瘍細胞をｍｅｄｉｕｍのみで培養したｗｅｌｌの活性をｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅとし、１％ＳＤＳで培養したｗｅｌｌの活性をｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅとした。細胞障害活性（％）は、以下の式にて計算した。
% Specific lysis = (E - S) / (M - S) x100
E：the release in the test sample (cpm in the supernatant from target cells incubated with effector cells and test antibody) 
S：the spontaneous release (cpm in the supernatant from target cells incubated with medium alone)
M：the maximum release (cpm released from target cells lysed with 1% sodium dodecyl sulfate)
結果を図１１及び図１２に示す。
ラットＮＺ−１抗体、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体、ヒトキメラ型抗体のいずれも、ポドプラニン陽性ヒト腫瘍細胞に対してＣＤＣ活性を有することが示された。特にヒトキメラ型ＮＺ−１抗体は、ラットＮＺ−１抗体及びマウスキメラ型ＮＺ−１抗体に比較して、著しく高いＣＤＣ活性を示すことが確認された。マウスキメラ型ＮＺ−１抗体は、ＮＺ−１抗体と同等の細胞障害活性しか確認できなかったので、ヒトキメラ型抗体で活性がこのように顕著に高くなることは当業者が予測し得ないことであった。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号：１は、ラットＮＺ−１抗体のエピトープである。
配列番号：２は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖のアミノ酸配列である。
配列番号：３は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖のアミノ酸配列である。
配列番号：４は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖をコードするＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：５は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖をコードするＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：６は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号：７は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号：８は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号：９は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
配列番号：１０は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
配列番号：１１は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号：１２は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖ＣＤＲ１をコードするＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：１３は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖ＣＤＲ２をコードするＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：１４は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖ＣＤＲ３をコードするＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：１５は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖ＣＤＲ１をコードするＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：１６は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖ＣＤＲ２をコードするＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：１７は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖ＣＤＲ３をコードするＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：１８は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列である。
配列番号：１９は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列である。
配列番号：２０は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖定常領域１（ＣＨ１）のアミノ酸配列である。
配列番号：２１は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖定常領域（ＣＬ）のアミノ酸配列である。
配列番号：２２は、マウス抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列である。
配列番号：２３は、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体Ｈ鎖のアミノ酸配列である。
配列番号：２４は、マウスキメラ型ＮＺ−１抗体Ｈ鎖をコードするＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：２５は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖増幅用プライマーである。
配列番号：２６は、ラットＮＺ−１抗体Ｈ鎖増幅用プライマーである。
配列番号：２７は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖増幅用プライマーである。
配列番号：２８は、ラットＮＺ−１抗体Ｌ鎖増幅用プライマーである。
配列番号：２９は、ラットＮＺ−１抗体ＶＨ／ＣＨ１増幅用プライマーである。
配列番号：３０は、ラットＮＺ−１抗体ＶＨ／ＣＨ１増幅用プライマーである。
配列番号：３１は、ラットＮＺ−１抗体のＶＨ領域増幅用プライマーである。
配列番号：３２は、ラットＮＺ−１抗体のＶＨ領域増幅用プライマーである。
配列番号：３３は、ラットＮＺ−１抗体のＶＬ領域増幅用プライマーである。
配列番号：３４は、ラットＮＺ−１抗体のＶＬ領域増幅用プライマーである。
配列番号：３５は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３のアミノ酸配列である。
配列番号：３６は、ヒトＩｇＧ１のＣＬのアミノ酸配列である。
配列番号：３７は、ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体のＨ鎖のアミノ酸配列である。
配列番号：３８は、ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体のＨ鎖をコードするＤＮＡの塩基配列である。
配列番号：３９は、ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体のＬ鎖のアミノ酸配列である。
配列番号：４０は、ヒトキメラ型ＮＺ−１抗体のＬ鎖をコードするＤＮＡの塩基配列である。
【図１Ａ】
2011040565.tif 000003
【図１Ｂ】
2011040565.tif 000004
【図１Ｃ】
2011040565.tif 000005
【図２Ａ】
2011040565.tif 000006
【図２Ｂ】
2011040565.tif 000007
【図２Ｃ】
2011040565.tif 000008
【図３】
2011040565.tif 000009
【図７】
2011040565.tif 000010
【図８Ａ】
2011040565.tif 000011
【図８Ｂ】
2011040565.tif 000012
【図９】
2011040565.tif 000013
【図１０】
2011040565.tif 000014
【図１１】
2011040565.tif 000015
【図１２】
2011040565.tif 000016
【図４】
2011040565.tif 000017
【図５】
2011040565.tif 000018
【図６】
2011040565.tif 000019
【図１３】
2011040565.tif 000020
【配列表】
2011040565000001.app
【国際調査報告】
2011040565.tif 000021
2011040565.tif 000022
2011040565.tif 000023
2011040565.tif 000024
2011040565.tif 000025
2011040565.tif 000026