(57)【要約】  ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を含む必須成分を含有し、任意にタンパク質、マグネシウム塩及びカルシウム塩からなる群より選択される成分をさらに含有する溶液を用いることを特徴とする細胞の凍結保存方法。本発明により、融解後に高い生存率を維持することが可能な細胞の凍結保存方法、並びに当該凍結保存に用いる凍結用保存液が提供される。また、当該凍結保存方法に用いることにより、融解後も高い生存率を維持し、その生理機能も維持している状態で細胞を長時間保存可能であり、更に凍結融解後の細胞洗浄工程も不要であることから、細胞の基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を必須成分として含有し、タンパク質、マグネシウム塩及びカルシウム塩からなる群より選択される成分をさらに任意に含有してもよい溶液を用いることを特徴とする細胞の凍結保存方法。
【請求項２】
糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノースからなる群より選択される少なくとも１種類の糖類である請求項１記載の方法。
【請求項３】
凍害保護剤が、ジメチルスルホキシド、ハイドロキシエチルスターチ、エチレングリコール、及びグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種類の保護剤である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
タンパク質が血液由来タンパク質である請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載の方法で凍結保存された細胞溶液を融解し、液体懸濁状態で更に保存することを特徴とする細胞の保存方法。
【請求項６】
ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を必須成分として含有し、タンパク質、マグネシウム塩及びカルシウム塩からなる群より選択される成分をさらに任意に含有してもよいことを特徴とする細胞の凍結用保存液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の凍結保存方法、及び当該方法に用いるための凍結用保存液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学の進歩に伴い、生細胞を用いた基礎研究や治療が盛んに行われるようになってきた。このため、細胞を安全にかつ細胞の活性を維持したまま保存する技術が必要となり、種々研究がなされてきている。細胞を保存する方法としては、短時間保存の場合は凍結を行わずに懸濁状態で保存する方法が知られており（例えば、特許文献１）、また長時間保存の場合は凍結を行う保存方法が知られている（例えば、特許文献２）。例えば、癌に対する免疫療法である養子免疫療法やドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）療法では、細胞を調製後すぐに使用（投与）することは作業上困難な場合があるため、当該細胞を使用するまでの期間、凍結保存することが求められる。凍結保存方法としては、約４０種類の成分からなる細胞培養用培地に凍害保護剤を添加したものを細胞保存液として使用する方法が知られている。【０００３】
しかしながら、従来の方法は上記のように約４０種類もの成分が含まれている培地を用いており、これら成分の中には細胞や生体に好ましくないものが含まれる可能性がある。更に凍結保存した細胞を融解後、生体内に投与する場合は投与されるまでの間、液体状態で細胞を保存する必要があるが、従来の凍結用保存液では、その保存時間の経過とともに、細胞の生存率、すなわち生存細胞数が著しく低下するという問題がある。また、融解後に細胞を洗浄する工程が必要な場合は、更に細胞の生存率が低下するという問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２３０３９６号公報
【特許文献２】特開２００２−２３３３５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、高い生存率を維持することが可能な細胞の凍結保存方法、並びに当該凍結保存に用いるための必須な組成を有する凍結用保存液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、細胞の凍結保存において従来使用されている培地中の約４０種類もの成分から、生体に無害であり、かつ細胞を凍結保存する際に必須な成分を見出すため、膨大な組合せを１つ１つ検証した結果、ナトリウム塩、カリウム塩、糖、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を含有する溶液を用いることにより、融解後においても高い生存率を維持した細胞が得られることを見出した。更に当該溶液を用いることで、前記凍結保存した細胞を融解後、液体懸濁状態で長期保存した場合においても、驚くべきことに、一度凍結しているにも関わらず、高い生存率を維持したまま細胞を保存することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。【０００７】
すなわち本発明を概説すれば、
［１］ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を必須成分として含有し、タンパク質、マグネシウム塩及びカルシウム塩からなる群より選択される成分をさらに任意に含有してもよい溶液を用いることを特徴とする細胞の凍結保存方法、
［２］糖類が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノースからなる群より選択される少なくとも１種類の糖類である［１］の方法、
［３］凍害保護剤が、ジメチルスルホキシド、ハイドロキシエチルスターチ、エチレングリコール、及びグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種類の保護剤である［１］の方法、
［４］タンパク質が血液由来タンパク質である［１］の方法、
［５］［１］の方法で凍結保存された細胞溶液を融解し、液体懸濁状態で更に保存することを特徴とする細胞の保存方法、
［６］ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を必須成分として含有し、タンパク質、マグネシウム塩及びカルシウム塩からなる群より選択される成分をさらに任意に含有してもよいことを特徴とする細胞の凍結用保存液、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、融解後に高い生存率を維持した細胞が得られる凍結保存が可能であり、更に融解後の液体懸濁状態で保存する場合においても、当該細胞は高い生存率を維持し、その生理機能も維持していることから、細胞の基礎研究、医療への応用研究及び適用において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の保存方法に用いる溶液の必須成分を検討した際の細胞生存活性の一例を示す図である。
【図２】凍結保存した細胞の繰り返し凍結融解後の細胞生存活性を比較した図である。
【図３】凍結保存した細胞を融解後、長時間液体懸濁状態で保存した場合の細胞生存活性を比較した図である。
【図４】凍結保存した異なる細胞を融解後、長時間液体懸濁状態で保存した場合の細胞生存活性を比較した図である。
【図５】凍結保存した細胞の繰り返し凍結融解後の細胞生存活性を比較した図である。
【図６】凍結保存した細胞を融解後、長時間液体懸濁状態で保存した場合の細胞生存活性を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に本発明について詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を含有する溶液中に細胞を懸濁し、得られた細胞懸濁液を凍結保存することを特徴とする細胞の凍結保存方法を提供する。すなわち、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩及び／又は炭酸塩は、本発明における細胞の凍結保存に必要かつ十分な成分〔本発明の凍結保存方法に用いる溶液（本発明の凍結用保存液）の必須成分ともいう〕である。
【００１２】
本願明細書において「ナトリウム塩」は、溶媒に溶解した際にナトリウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩又は有機酸塩等を用いることができる。例えば、オキソ酸塩としては過炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ４）、亜二チオン酸ナトリウム（亜ジチオン酸ナトリウム、ナトリウムハイドロサルファイト）（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）、硫酸ナトリウム（芒硝：Ｎａ２ＳＯ４）、チオ硫酸ナトリウム（ハイポ）（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）、ハロゲン化物としてはフッ化ナトリウム（ＮａＦ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、酸化物としては酸化ナトリウム（Ｎａ２Ｏ）、過酸化ナトリウム（Ｎａ２Ｏ２）、水酸化物としては水酸化ナトリウム（苛性ソーダ：ＮａＯＨ）、無機塩としては水素化ナトリウム（ＮａＨ）、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、硫化水素ナトリウム（水硫化ナトリウム）（ＮａＨＳ）、珪酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｉＯ３）、リン酸三ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、ホウ酸ナトリウム（Ｎａ３ＢＯ３）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、テトラクロロ金酸ナトリウム（Ｎａ［ＡｕＣｌ４］）、有機酸塩としては酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。これらのナトリウム塩は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、１種類としては塩化ナトリウムが、複数種類としては塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウムが好適に使用される。ナトリウム塩含有量は特に限定されないが、本発明の凍結用保存液に含まれる全ナトリウムイオンの終濃度として、好ましくは０．０１〜５０００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１〜３００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１３】
本願明細書において「カリウム塩」は、溶媒に溶解した際にカリウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩又は有機酸塩等を用いることができる。例えば、オキソ酸塩としては、硝酸カリウム（ＫＮＯ３）、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）、過炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ４）、ハロゲン化物としてはフッ化カリウム（ＫＦ）、フッ化水素カリウム（ＫＨＦ２）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、酸化物としては過酸化カリウム（Ｋ２Ｏ２）、酸化カリウム（Ｋ２Ｏ）、水酸化物としては水酸化カリウム（ＫＯＨ）、無機塩として水素化カリウム（ＫＨ）、硫化カリウム（Ｋ２Ｓ）、硫化水素カリウム（水硫化カリウム：ＫＳＨ）、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）、クロム酸カリウム（Ｋ２ＣｒＯ４）、塩素酸カリウム（ＫＣｌＯ３）等が挙げられる。これらのカリウム塩は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、塩化カリウムが好適に使用される。カリウム塩含有量は特に限定されないが、本発明の凍結用保存液に含まれる全カリウムイオンの終濃度として、好ましくは０．０１〜５０００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１４】
本明細書において「炭酸水素塩」は、溶媒に溶解した際に炭酸水素イオンを生じるものであれば特に限定はなく、種々の陽イオンとの塩を用いることができる。例えば、炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）、炭酸水素カリウム（ＫＨＣＯ３）、炭酸水素カルシウム（Ｃａ（ＨＣＯ３）２）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、炭酸水素マグネシウム（Ｍｇ（ＨＣＯ３）２）等が挙げられる。
【００１５】
本明細書において「炭酸塩」は、溶媒に溶解した際に炭酸イオンを生じるものであれば特に限定はなく、種々の陽イオンとの塩を用いることができる。例えば、炭酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＣＯ３）、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、炭酸バリウム（ＢａＣＯ３） 、炭酸マグネシウム（ＭｇＣＯ３）、炭酸リチウム（Ｌｉ２ＣＯ３）、炭酸銅（ＩＩ）（ＣｕＣＯ３）、炭酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＣＯ２）、炭酸銀（Ｉ）（Ａｇ２ＣＯ３）等が挙げられる。
【００１６】
これら炭酸水素塩及び／又は炭酸塩は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、炭酸水素ナトリウムが好適に使用される。炭酸水素塩及び／又は炭酸塩の含有量は特に限定されないが、本発明の凍結用保存液に含まれる炭酸水素イオンと炭酸イオンの合計の終濃度として、好ましくは０．０１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１７】
本願明細書において「糖類」は、単糖、オリゴ糖又は糖アルコールを用いることができる。例えば、単糖としてはグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、オリゴ糖としてはトレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、糖アルコールとしてはキシリトール、ソルビトール等が挙げられる。これらの糖類は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよいが、本発明においては好ましくは、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノースからなる群より選択される少なくとも１種類の糖類であり、より好ましくはグルコースである。糖類の含有量は、凍結用保存液中、好ましくは０．０１〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜１００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０.２５〜５０ｇ／Ｌである。
【００１８】
本願明細書において「凍害保護剤」とは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ハイドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、エチレングリコール、グリセロール等が挙げられる。また、市販品としてはＣＰ−１〔ＨＥＳ１７．６５％（Ｗ／Ｖ）、ＤＭＳＯ１４．７１％（Ｖ／Ｖ）を含む生理食塩水、極東製薬工業社製〕が挙げられる。これら凍害保護剤は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、ＤＭＳＯ及びハイドロキシエチルスターチが好適に使用される。凍害保護剤の含有量は、凍結用保存液中、好ましくは０．０１〜５０％、より好ましくは１〜４０％、さらに好ましくは３〜３０％である。また、凍害保護剤としてＤＭＳＯ及びハイドロキシエチルスターチを併用する場合、総含有量は前記範囲内に含まれることが好ましく、かつ、それぞれの濃度が、ＤＭＳＯ濃度は、好ましくは０．０１〜５０％、より好ましくは１〜３０％、さらに好ましくは２〜１５％であり、ハイドロキシエチルスターチ濃度は、好ましくは０．０１〜５０％、より好ましくは１〜３０％、さらに好ましくは２〜１５％である。
【００１９】
本発明の好適な態様においては、上記の本発明の細胞の凍結保存方法に使用される溶液の必須の成分に加えて、任意にタンパク質、マグネシウム塩及びカルシウム塩からなる群より選択される成分をさらに含有させてもよい。
【００２０】
本願明細書において「タンパク質」は特に限定はなく、単離されたタンパク質、又は入手可能な組換えタンパク質が挙げられる。例えば、血液由来タンパク質が挙げられる。血液由来タンパク質としては、血漿由来タンパク質、血清由来タンパク質が挙げられ、具体的には、血清アルブミン、血清グロブリン等が挙げられる。また血清アルブミンとしては、ヒト血清アルブミン又はウシ血清アルブミンが挙げられる。市販品としてはブミネート静注液２５％（２５％ヒト血清アルブミン、バクスター社製）等が挙げられる。これらのタンパク質は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、ヒト血清アルブミンが好適である。タンパク質の含有量は、凍結用保存液中、好ましくは０．０１〜５０％、より好ましくは１〜３０％、さらに好ましくは２〜１５％である。
【００２１】
本願明細書において「マグネシウム塩」とは、溶媒に溶解した際にマグネシウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩又は有機酸塩等を用いることができる。例えば、オキソ酸塩としては、硝酸マグネシウム（Ｍｇ（ＮＯ３）２）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、過炭酸マグネシウム（ＭｇＣＯ４）、ハロゲン化物としてはフッ化マグネシウム（ＭｇＦ２）、フッ化水素マグネシウム（Ｍｇ（ＨＦ２）２）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、臭化マグネシウム（ＭｇＢｒ２）、ヨウ化マグネシウム（ＭｇＩ２）、酸化物としては過酸化マグネシウム（ＭｇＯ２）、酸化マグネシウム（ＭｇＯ）、水酸化物としては水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）２）、無機塩として水素化マグネシウム（ＭｇＨ２）、硫化マグネシウム（ＭｇＳ）、硫化水素マグネシウム（水硫化マグネシウム：Ｍｇ（ＳＨ）２）、過マンガン酸マグネシウム（Ｍｇ（ＭｎＯ４）２）、クロム酸マグネシウム（ＭｇＣｒＯ４）、塩素酸マグネシウム（Ｍｇ（ＣｌＯ３）２）等が挙げられる。これらのマグネシウム塩は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、塩化マグネシウムが好適に使用される。マグネシウム塩含有量は特に限定されないが、本発明の凍結用保存液に含まれる全マグネシウムイオンの終濃度として、好ましくは０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２２】
本願明細書において「カルシウム塩」とは、溶媒に溶解した際にカルシウムイオンを生じるものであれば特に限定はなく、オキソ酸塩、ハロゲン化物、酸化物、水酸化物、無機塩又は有機酸塩等を用いることができる。例えば、オキソ酸塩としては、硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２）、硫酸カルシウム（ＣａＳＯ４）、過炭酸カルシウム（ＣａＣＯ４）、ハロゲン化物としてはフッ化カルシウム（ＣａＦ２）、フッ化水素カルシウム（Ｃａ（ＨＦ２）２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、臭化カルシウム（ＣａＢｒ２）、ヨウ化カルシウム（ＣａＩ２）、酸化物としては過酸化カルシウム（ＣａＯ２）、酸化カルシウム（ＣａＯ）、水酸化物としては水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、無機塩として水素化カルシウム（ＣａＨ２）、硫化カルシウム（ＣａＳ）、硫化水素カルシウム（水硫化カルシウム：Ｃａ（ＳＨ）２）、過マンガン酸カルシウム（Ｃａ（ＭｎＯ４）２）、クロム酸カルシウム（ＣａＣｒＯ４）、塩素酸カルシウム（Ｃａ（ＣｌＯ３）２）等が挙げられる。これらのカルシウム塩は、１種類又は複数種類を組み合わせてもよい。本発明において、塩化カルシウムが好適に使用される。カルシウム塩含有量は特に限定されないが、本発明の凍結用保存液に含まれる全カルシウムイオンの終濃度として、好ましくは０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２３】
本発明の方法に用いる凍結用保存液の成分のうちナトリウム塩とカリウム塩の濃度比として、ナトリウムイオンとカリウムイオンの濃度比（ナトリウムイオン／カリウムイオン）は、好ましくは１／１０００〜１０００／１、より好ましくは１／１００〜１００／１、さらに好ましくは１／１０〜１００／１、さらに好ましくは１／１〜１００／１、さらに好ましくは１０／１〜５０／１である。
【００２４】
また、本発明の凍結用保存液は、上記の成分以外に、細胞への傷害性のない物質、例えば、ビタミン類、アミノ酸類等をさらに含有させてもよい。
【００２５】
またさらに、本発明の凍結用保存液は、上記の成分以外に、ｐＨ調整や緩衝作用を発揮する観点から、リン酸イオンを含有してもよいが、融解後の細胞をそのまま生体に使用するという観点から構成成分を少なくする事が好ましく、含まないとしてもよい。
【００２６】
本発明の凍結用保存液のうち、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩及び／又は炭酸塩は、それぞれ必要量秤量し、全ての成分を純水又は生理食塩水に溶解させて調製することができる。また、それぞれの成分を別々に純水又は生理食塩水に溶解させて調製し、それぞれの成分溶液を必要量混合することにより調製してもよい。上記、凍結用保存液を調製する際には、各成分を純水又は生理食塩水に溶解後に除菌工程（例えば除菌ろ過工程）を組入れてもよい。更に、任意に、タンパク質、マグネシウム塩、カルシウム塩を同様に調製し加えてもよい。あるいは、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を含む市販されている溶液を数種類組み合わせて用いてもよい。市販品としては、例えば、ビカーボン輸液（味の素社製）、日本薬局方  ブドウ糖液（例えば、日新製薬社製）、日本薬局方  塩化ナトリウム液（例えば、大塚製薬社製）、日本薬局方  塩化カリウム液（例えば、大塚製薬社製）、日本薬局方  炭酸水素ナトリウム液（例えば、大塚製薬社製）、ＣＰ−１（極東製薬社製）、ブミネート静注液２５％（２５％ヒト血清アルブミン、バクスター社製）を、本発明の必要濃度を含むように無菌条件下で混合してもよい。
【００２７】
本発明の凍結用保存液を用いる際の浸透圧について特に限定されることはないが、細胞に対して損傷を与えない浸透圧比であることが望ましく、例えば、ヒトリンパ球細胞の保存に使用する場合、１２０〜１５００ｍＯｓｍ／Ｌが好ましく、２５０〜３００ｍＯｓｍ／Ｌがより好ましい。浸透圧の調整には、本発明の細胞の凍結保存方法に使用される溶液の必須の成分のいずれかを用いることが可能である。
【００２８】
本発明の凍結用保存液のｐＨについて特に限定されることはないが、細胞に対して損傷を与えないｐＨであることが望ましく、例えば、ヒトリンパ球細胞の保存に使用する場合、３．０〜１０．０が好ましく、４．５〜９．０がより好ましい。ｐＨ調整には、本発明の細胞の凍結保存方法に使用される溶液の必須の成分のいずれかを用いることが可能である。
【００２９】
上記の、本発明の細胞の凍結保存方法に使用される、ナトリウム塩、カリウム塩、糖類、凍害保護剤、ならびに炭酸水素塩及び／又は炭酸塩を含む必須成分を含有し、任意にタンパク質、マグネシウム塩及びカルシウム塩からなる群より選択される成分をさらに含有する凍結保存用溶液も本発明に包含される。
【００３０】
本発明の凍結保存方法に用いることができる細胞としては、ヒトを含む哺乳動物から単離した種々の細胞や細胞集団、これらから誘導された細胞等が挙げられる。単離された種々の細胞としては、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、臍帯血単核球、血球系細胞、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞等が挙げられ、誘導された細胞としては、細胞傷害活性を有する、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞等が挙げられるが、これらの細胞に限定されるものではない。これら細胞は公知の方法で調製すればよい。
【００３１】
目的とする細胞を凍結用保存液に均一に懸濁する際の細胞濃度は特に限定はなく、細胞の種類、細胞の使用用途、細胞の大きさ、保存容器のサイズ、保存期間等により適宜決定すればよいが、例えば、好ましくは１×１０４〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは１×１０５〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好ましくは２×１０５〜５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。保存容器としては、細胞の凍結保存が可能であれば特に限定はなく、凍結保存バック、アルミプロテクター、ミラクルバッグ、クライオバイアル等を用いることができる。
【００３２】
本発明において、細胞の凍結保存方法とは、目的とする細胞を本発明の凍結用保存液に懸濁して細胞懸濁液を調製後、超低温に保たれたフリーザー内に入れて放置し、細胞懸濁液を凍結させた状態で保存する方法をいう。ここでいう超低温とは、細胞懸濁液が完全に凍結する温度であれば特に限定はなく、通常マイナス６０℃以下であればよい。また、液体窒素を用いた細胞の凍結保存方法も、本発明に包含される。好適には液体窒素を充填したフリーザー中、マイナス７０℃以下の温度で細胞懸濁液が保存される。本発明の方法による細胞の凍結保存期間は特に限定はなく、例えば５分〜４８か月間、好ましくは１日〜１２か月間である。
【００３３】
本発明の方法により凍結保存された細胞懸濁液は、その後融解させ、非凍結状態で更に保存することができる。すなわち、本発明は、上記凍結保存された細胞懸濁液を融解させ、非凍結状態、すなわち液体懸濁状態で更に保存することを特徴とする細胞の保存方法も提供する。凍結保存された細胞懸濁液を融解する方法は特に限定はなく、凍結状態の細胞懸濁液を好ましくは０〜４０℃、より好ましくは２０〜３７℃で融解させればよい。融解後の保存温度は、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは４〜３７℃である。当該非凍結状態の細胞懸濁液の保存期間は特に限定はなく、例えば０〜１８日間、好ましくは０〜１０日間、より好ましくは０〜３日間である。
【００３４】
本発明の方法により凍結保存した細胞は、融解後も高い生存率を維持しており、更に融解後、継続しての保存も可能である。また、融解後の細胞の洗浄工程を経ずにそのまま生体に投与することが可能である。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例をもって本発明を更に具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。なお、本実施例にて、「室温」とは２０〜３０℃のことである。【００３６】
実施例１  保存液の検討
（１）検討溶液の調製
スクリーニング用の保存液として、表１に示す溶液を調製した。【００３７】
【表１】
2011021618.tif 000002
【００３８】
（２）細胞の調製
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより、６０ｍＬ分のへパリン加採血を実施した。得られた血液を約１５ｍＬずつコニカルチューブ（ベクトン・ディッキンソン社製又はグライナー社製）に分注後、７００×ｇ、室温で２０分間遠心し、遠心後の上清である血漿画分とヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含む細胞画分とに分離した。ＰＢＭＣを含む細胞画分は、ダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製又は日水製薬社製）を用いて２０ｍＬにフィルアップし希釈した。得られた希釈細胞液を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）２０ｍＬの上に重層して、７００×ｇ、室温で２０分間遠心した。遠心後、分離した層のうち、ＰＢＭＣ層をピペットで回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて３０ｍＬにフィルアップした後、６５０×ｇ、４℃にて１０分間遠心し、上清を除去した。同様に、６００×ｇ、５００×ｇと段階的に遠心Ｇを落としながら順次遠心操作を行い、計３回洗浄を繰り返した。得られたＰＢＭＣの生細胞数及び生存率（％）を自動血球計測装置（ヌクレオカウンター  Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製）を用いて算出した。【００３９】
こうして得られたＰＢＭＣを用いて、国際公開第２００９／０１９４５０号パンフレットに記載の方法によりヒトＴリンパ球細胞を調製した。得られたヒトＴリンパ球細胞から培地を除き、細胞濃度を３×１０８細胞／ｍＬの濃度となるように生理食塩水に懸濁し、細胞液を調製した。【００４０】
（３）細胞液の微温（３７℃）処理によるスクリーニング
実施例１−（１）で調製した各検討溶液４０μＬと実施例１−（２）で調製した細胞液１０μＬを、検討溶液ごとに１．５ｍＬプラスチックチューブ（トレフ社製）に入れ混和し細胞懸濁液を調製した。その後、３７℃に設定した恒温器内で３時間静置した。【００４１】
（４）ＭＴＴアッセイによる細胞生存活性の測定
実施例１−（３）記載の処理後の各細胞懸濁液は、以下に記載のＭＴＴアッセイを用いて、細胞の代謝（呼吸）を細胞生存活性として測定を行った。【００４２】
まず、各細胞懸濁液５０μＬに対して、ダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬社製）で５ｍｇ／ｍＬに調製したＭＴＴ〔臭化３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム、ナカライテスク社製〕５０μＬ、及び１０％牛胎児血清（ギブコ社製）と１％ペニシリン・ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク社製）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬社製）４００μＬを添加し、混和した。次に、混和した溶液を１００μＬずつ、９６穴マルチプレート（コースター社製又はベクトン・ディッキンソン社製）の４ウェルに播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５％の条件下で９０分間培養した。培養終了後、塩酸・２−プロパノール試液〔第十五改正日本薬局方に準じて調製：２−プロパノール（特級、ナカライテスク社製）と塩酸（ナカライテスク社製）を１００：０．３３の割合で混合したもの〕１００μＬを添加し、色素を完全に溶解した。溶解後の溶液を、測定波長５７０ｎｍ、対照波長６５５ｎｍとして、マイクロプレート吸光度計（６８０ＸＲ、バイオラッド社製）にて、吸光度を測定した。得られた吸光度の値を細胞の代謝（呼吸）の細胞生存活性（ＭＴＴ活性値）とした。その結果を図１に示す。すなわち図１は、測定値（４ウェル測定）の吸光度の平均値を溶液の種類ごとに示した図である。図中、横軸はＭＴＴ活性値を示す。また、図中、「Ｅｒｒｏｒ  Ｂａｒ＝Ｓ．Ｅ．」は４ウェルの測定値の標準誤差を示す。【００４３】
図１から明らかなように７種類の成分を含む溶液２に比べて、炭酸水素ナトリウムを含有しない溶液５及び塩化カリウムを含有しない溶液７ではＭＴＴ活性値が下がっており、これらの成分が細胞の安定化に必須であることが明らかとなった。一方、硝酸カルシウム、硫酸マグネシウム、又はリン酸水素二ナトリウムを含有しない溶液（それぞれ、溶液３、溶液４、溶液６）では、ＭＴＴ活性値が下がっておらず、細胞の安定化に必須ではないことが明らかとなった。【００４４】
同様の試験をＲＰＭＩ１６４０培地において明らかにされている全４０種類の成分について、様々な組合わせ及び種々の濃度で行い、更に凍害保護剤としてＤＭＳＯ、ヒドロキシエチルスターチ、タンパク質としてアルブミン、のこれらの成分のうちの１種類又は数種類と組合わせた試験を行った。合計１００種類以上の溶液についてスクリーニングを行い、細胞の安定化に必須な成分であるかを比較検討した結果、上記４０種類の成分のうち、ナトリウム塩、カリウム塩、炭酸水素塩及び／又は炭酸塩、ならびに糖類の４成分が必要かつ十分であることを明らかにした。【００４５】
実施例２  凍結融解に対する影響
（１）検討溶液の調製
凍結融解操作に対する安定性検討用の保存液として、表２に示す３種類の溶液を調製した。【００４６】
【表２】
2011021618.tif 000003
【００４７】
（２）試験細胞の調製
実施例１−（２）と同様の方法で細胞液を調製した。但し、細胞は６×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度となるように生理食塩水に懸濁し調製した。【００４８】
（３）細胞の保存（細胞溶液の凍結融解処理）
実施例２−（１）で調製した各検討溶液４０μＬ、実施例２−（２）で調製した細胞液１０μＬ、ＣＰ−１（極東製薬社製）３４μＬ（細胞懸濁液中の凍害保護剤含有量３４％）、及びブミネート静注液２５％（２５％ヒト血清アルブミン、バクスター社製）１６μＬ〔細胞懸濁液中のタンパク質含有量４％（Ｗ／Ｖ）〕を、検討溶液ごとにクライオバイアル（ナルゲン社製）に入れ混和し、細胞懸濁液を調製した。尚、細胞懸濁液はそれぞれ３本ずつ調製した。その後、マイナス８５℃に設定した超低温槽内で１８時間以上静置し細胞懸濁液を完全に凍結した。完全凍結確認後、３７℃恒温槽に移し５分間で融解させた。この操作を１、３、７回繰り返したものを次の測定に用いた。【００４９】
（４）ＭＴＴアッセイによる細胞生存活性の測定
実施例２−（３）に記載の処理後の各細胞懸濁液は、実施例１−（４）と同様のＭＴＴアッセイを用いて細胞生存活性を測定した。その結果を図２に示す。すなわち図２は、測定値（４ウェル測定）の吸光度の平均値を溶液の種類及び凍結融解回数ごとに示した図である。図中、横軸は凍結融解回数を示し、縦軸はＭＴＴ活性値を示す。また、溶液８の結果は白四角を点線で結んだもので示す。溶液９の結果は黒四角を点線で結んだもので示す。溶液１０の結果は黒丸を実線で結んだもので示す。【００５０】
図２から明らかなように、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、及びブドウ糖の４成分のみを含む溶液１０は、１回、３回及び７回の凍結融解のいずれの場合においても、４０種類もの多数成分を含む溶液８（ＲＰＭＩ１６４０培地）と同等の細胞生存活性を有していることが明らかになった。一方、生理食塩水については、凍結融解操作を繰り返す事によって活性が著しく下がっており、この成分だけでは不十分であることが明らかとなった。【００５１】
実施例３  細胞融解時及び融解前後の加工時における微温状態（３７℃）に対する安定性
（１）検討溶液の調製
実施例２−（１）に記載の溶液と同様の溶液を調製した。【００５２】
（２）試験細胞の調製
実施例２−（２）と同様の方法で細胞液を調製した。【００５３】
（３）細胞液の微温（３７℃）処理
実施例３−（１）で調製した各検討溶液４０μＬ、実施例３−（２）で調製した細胞液１０μＬ、ＣＰ−１（極東製薬社製）３４μＬ、及びブミネート静注液２５％（２５％ヒト血清アルブミン、バクスター社製）１６μＬを、検討溶液ごとにクライオバイアル（ナルゲン社製）に入れ混和し、細胞懸濁液を調製した。その後、実施例２−（３）と同様の方法で細胞懸濁液の凍結融解を行った。但し、凍結融解は１回行い、融解後の各細胞溶液は３７℃に設定した恒温器内で３時間静置した。尚、細胞懸濁液中の凍害保護剤含有量及びタンパク質含有量は、実施例２−（３）と同じである。【００５４】
（４）ＭＴＴアッセイによる細胞生存活性の測定
実施例３−（３）に記載の処理後の各細胞懸濁液は、実施例１−（４）と同様のＭＴＴアッセイを用いて、細胞生存活性を測定した。その結果を図３に示す。すなわち図３は、測定値（４ウェル測定）の吸光度の平均値を溶液の種類ごとに示した図である。図中、横軸はＭＴＴ活性値を示す。【００５５】
また、インフォームド・コンセントの得られた実施例１−（２）と異なるヒト健常人ドナーの血液より実施例１−（２）と同様に調製した細胞を用いて、実施例２−（１）に記載の溶液と以下の溶液１１を調製し、同様の検討を行った。但し、実施例３−（３）で用いたブミネート静注液の代わりに、生理食塩液（大塚製薬社製）１６μＬをそれぞれ混和した。生理食塩水は、浸透圧調節のため必要であり、又、陰性対照でも用いられるため添加が必要である。添加によりイオン濃度は増加するが、そのことによる特別な安定化効果はないと考えられる。
・溶液１１：６．６ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、０．４０ｇ／Ｌ塩化カリウム、２．０ｇ／Ｌブドウ糖を含む水溶液（終濃度：ナトリウムイオン１１２．９４ｍｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン５．３７ｍｍｏｌ／Ｌ；ナトリウムイオン／カリウムイオン＝２１．０３／１）【００５６】
その結果を図４に示す。すなわち図４は、測定値（４ウェル測定）の吸光度の平均値を溶液の種類ごとに示した図である。図中、横軸はＭＴＴ活性値を示す。【００５７】
図３及び４から明らかなように、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、及びブドウ糖を含む４成分と凍害保護剤、タンパク質を含む溶液１０は、凍結融解後、微温状態で長時間静置した場合においても、従来法で用いられる４０種類もの多数成分と凍害保護剤、タンパク質を含む溶液８（ＲＰＭＩ１６４０培地）と同等の活性を有していることが明らかになった。一方、溶液９（生理食塩水）、溶液１１（炭酸水素ナトリウムを含有しない溶液１０）については、凍結融解後に微温状態で長時間静置すると活性は著しく低くなり、この成分だけでは不十分であることが明らかとなった。また、保存する細胞については、図３及び４の溶液８〜１０で同じ傾向を示していることから、ドナーの違いによる影響は受けない事が明らかとなった。【００５８】
実施例４  静注実績のある医薬品による構成の可否１
（１）検討溶液の調製
実施例２及び３で凍結融解による細胞生存活性が高い溶液が、日本国内において医薬品登録され、静注実績のある溶液で構成した場合でも同様の結果が得られるかどうかを検討するため、表３に示す溶液を調製した。【００５９】
【表３】
2011021618.tif 000004
【００６０】
（２）試験細胞の調製
実施例２−（２）と同様の方法で細胞液を調製した。【００６１】
（３）細胞液の凍結融解処理
実施例４−（１）で調製した各検討溶液４０μＬ、実施例４−（２）で調製した細胞液１０μＬ、ＣＰ−１（極東製薬社製）３４μＬ、及びブミネート静注液２５％（２５％ヒト血清アルブミン、バクスター社製）１６μＬを、検討溶液ごとにクライオバイアル（ナルゲン社製）に入れ混和し、細胞懸濁液を調製した。尚、細胞懸濁液はそれぞれ３本ずつ調製した。その後、実施例２−（３）と同様の凍結融解操作を行い、凍結融解を１、３、７回繰り返したものを次の測定に用いた。細胞懸濁液中の凍害保護剤含有量及びタンパク質含有量は、実施例２−（３）と同じである。【００６２】
（４）ＭＴＴアッセイによる細胞生存活性の測定
実施例４−（３）に記載の処理後の各細胞懸濁液は、実施例１−（４）と同様のＭＴＴアッセイを用いて、細胞生存活性を測定した。その結果を図５に示す。すなわち図５は、測定値（４ウェル測定）の吸光度の平均値を溶液の種類及び凍結融解回数ごとに示した図である。図中、横軸は凍結融解回数を示し、縦軸はＭＴＴ活性値を示す。また、溶液１２の結果は白四角を点線で結んだもので示す。溶液１３の結果は黒四角を点線で結んだもので示す。溶液１４の結果は黒丸を実線で結んだもので示す。【００６３】
図５から明らかなように、溶液１４は溶液１２（ＲＰＭＩ１６４０培地）と同等の活性を有していた。この結果より、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、及びブドウ糖の４成分を含む静注実績のある医薬品を用いて保存液を構成することで、従来法で用いられる多数の非医薬品成分を含む溶液を用いて得られる保存液と同等の性能が得られることが明らかになった。【００６４】
実施例５  静注実績のある医薬品による構成の可否２
（１）検討溶液の調製  実施例４−（１）に記載の溶液と表４の溶液を調製した。【００６５】
【表４】
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【００６６】
（２）試験細胞の調製
実施例２−（２）と同様の方法で細胞液を調製した。【００６７】
（３）細胞液の微温（３７℃）処理
実施例５−（１）で調製した各検討溶液４０μＬ、実施例５−（２）で調製した細胞液１０μＬ、ＣＰ−１（極東製薬社）３４μＬ、及びブミネート静注液２５％（２５％ヒト血清アルブミン、バクスター社製）１６μＬをクライオバイアル（ナルゲン社製）に入れ混和し、細胞懸濁液を調製した。その後、実施例２−（３）と同様の方法で細胞懸濁液の凍結融解を行った。但し、凍結融解は１回行い、融解後の各細胞溶液は３７℃に設定した恒温器内で３時間静置した。尚、細胞懸濁液中の凍害保護剤含有量及びタンパク質含有量は、実施例２−（３）と同じである。【００６８】
（４）ＭＴＴアッセイによる細胞生存活性の測定
実施例５−（３）に記載の温度処理後の各細胞溶液は、実施例１−（４）と同様のＭＴＴアッセイを用いて、細胞生存活性を測定した。その結果を図６に示す。すなわち図６は、測定値（４ウェル測定）の吸光度の平均値を溶液の種類ごとに示した図である。図中、横軸はＭＴＴ活性値を示す。【００６９】
図６から明らかなように、溶液１４と１５は溶液１２（ＲＰＭＩ１６４０培地）と同等の活性を有していた。この結果より、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、及びブドウ糖の４成分を含む静注実績のある医薬品を用いて保存液を構成することで、従来法で用いられる多数の非医薬品成分を含む溶液を用いて得られる保存液と同等の性能が得られることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明により、融解後に高い生存率を維持することが可能な細胞の凍結保存方法、並びに当該凍結保存に用いる凍結用保存液が提供される。また、当該凍結保存方法に用いることにより、融解後も高い生存率を維持し、その生理機能も維持している状態で細胞を長時間保存可能であり、更に凍結融解後の細胞洗浄工程も不要であることから、細胞の基礎研究、医療への応用研究において極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2011021618.tif 000011
【国際調査報告】
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