(57)【要約】  本発明の目的は安全で力価が高く、大量生産や保存が可能であって、細胞または臓器への指向性を有することを特徴とする抗原送達複合体、もしくは薬物送達複合体を提供することである。  本発明は、抗原もしくは薬物とカチオン性分子との複合体、ならびにそれを内包するアニオン性分子を含有し、細胞または臓器への指向性を有することを特徴とする、抗原もしくは薬物送達複合体を提供する。本発明の抗原もしくは薬物送達複合体は、種々の抗原や薬物を特定の細胞や臓器へ送達させるドラッグデリバリーシステムの主成分として用いられ得る。
2011105520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原もしくは薬物とカチオン性分子との複合体、ならびにそれを内包するアニオン性分子を含有し、細胞または臓器への指向性を有することを特徴とする、抗原もしくは薬物送達複合体。
【請求項２】
抗原もしくは薬物が、核酸、ペプチド、タンパク質または不活化ウイルスである、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
アニオン性分子が、ホスファチジルセリン、ラウロイルザルコシンおよびグリチルリチンから選択され、脾臓、肺または肝臓への指向性を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
アニオン性分子が、ホスファチジルセリンであり；
抗原もしくは薬物、カチオン性分子、ホスファチジルセリンの配合比が１：２：４〜１：８：８であり；かつ
脾臓への指向性を有することを特徴とする、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
アニオン性分子が、ラウロイルザルコシンであり；
カチオン性分子が、カチオン性高分子およびカチオン性脂質からなり；
抗原もしくは薬物、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ラウロイルザルコシンの配合比が１：２：２：１〜１：２：２：４であり；かつ
肺への指向性を有することを特徴とする、請求項３に記載の複合体。
【請求項６】
アニオン性分子が、グリチルリチンであり；
抗原もしくは薬物、カチオン性分子、グリチルリチンの配合比が１：２：８〜１：８：１６であり；かつ
肝臓への指向性を有することを特徴とする、請求項３に記載の複合体。
【請求項７】
アニオン性分子が、γ−ポリグルタミン酸であり、樹状細胞または脾臓への指向性を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項８】
抗原もしくは薬物、カチオン性分子、γ−ポリグルタミン酸の配合比が１：２：８〜１：８：１６であり；かつ
樹状細胞または脾臓への指向性を有することを特徴とする、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
アニオン性分子が、アプタマー、ｍｉＲＮＡおよび抗体から選択される、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項１０】
抗原もしくは薬物、カチオン性分子、アニオン性分子の配合比が１：２：８〜１：８：１６である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
複合体が、
抗原もしくは薬物；
ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリエチレンイミンおよびカチオン性デンドリマーから選択されるカチオン性高分子、あるいはＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌおよび塩化ベンザルコニウムから選択されるカチオン性脂質；
から構成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
複合体が、
抗原もしくは薬物；そして
ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰおよびＤＣ−Ｃｈｏｌから選択されるカチオン性脂質ならびにＤＯＰＥおよびコレステロールから選択される脂質からなるリポソームあるいはミセル；
から構成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１３】
イメージングに使用するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の複合体を含む、イメージング用核種の輸送体。
【請求項１４】
抗原もしくは薬物が、イメージング用核種、カチオン性デンドリマーおよびキレート剤からなる複合体であり；
カチオン性分子が、ポリエチレンイミンであり；
アニオン性分子が、γ−ポリグルタミン酸であり；そして
リンパ節への指向性を有することを特徴とする、請求項１４に記載の輸送体。
【請求項１５】
イメージング用核種、カチオン性デンドリマーおよびキレート剤からなる薬物複合体；ポリエチレンイミン；ならびにγ−ポリグルタミン酸から構成される複合体を用いることを特徴とする、センチネルリンパ節のイメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規抗原送達複合体、ワクチン、薬物送達複合体などに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、新興・再興感染症に対し、不活化ワクチンや弱毒性ワクチンが開発され、高い予防効果が得られている。しかし、日本における感染症ワクチンの開発は大きく立ち遅れている。開発途上国での特定感染症の撲滅や、パンデミックに対する対応には、大量生産と長期保存が可能で、更に安全性が高く力価が強いワクチンの開発が望まれている。なかでも、ＤＮＡワクチンは安価な大量生産が可能で、その有効性が期待されているが、安全性や力価の観点から、未だ成功には至っていない。また、体免疫を活性化する静脈注射や皮下・皮内注射に適した製剤、粘膜免疫を活性化する経口・吸入や点鼻投与に適した製剤の開発が必要である。【０００３】
また、ヒトパピローマウイルスに対するワクチンが子宮頸癌のワクチンとして認可され、高い効果を示すことが報告されている。しかし、癌抗原に対するワクチン療法は世界でも未だ確立されていない。様々な抗原やＤＮＡを用いたワクチンの報告はあるものの、十分な免疫誘導効果は得られておらず、臨床応用には至っていない。特に、ＤＮＡワクチンは癌に関わる細胞性免疫を選択的に活性化し、抗癌免疫を増強することが期待されている。更に、安価な大量生産が可能なことから、注目されているものの、安全性や力価の観点から成功した例はない。【０００４】
ＤＮＡ医薬品は塩基の組み合わせの変化で、異なる薬理作用を示し、安価に大量生産ができることから、医薬品としての有効性が期待されている。これまでに遺伝子送達のためのベクターとして様々なナノ構造体が開発され、臓器特異性や細胞特異性が報告されている。しかし、安全性と効率性が低く、臨床使用には至っていない。多くは合成材料を用いるため、安全性が確立されておらず、医療経済的負担も大きい。安全性が高く、汎用性のある臓器特異的ベクターの開発が望まれている。【０００５】
ベクターに臓器指向性をもたせるにはいくつか方法があり、ひとつはターゲットの臓器に集積しやすい特定の分子を使う方法で、他には抗体やアプタマーなど特異的な結合能をもった分子を使う方法である。【０００６】
本発明者らは前者の方法として、薬物送達複合体（特許文献１）の技術を応用し、更に生体分解性の脂質を簡便に添加することで、脾臓と肺臓に対する選択性をもつ新規標的化システムの構築に成功している。すなわち、ＤＮＡを内包したカチオン性の核に、ホスファチジルセリン（負電荷）を添加するだけで、ナノ微粒子の安全性を高め、マウスに静脈内注射後、脾臓のみに選択的に遺伝子発現を実現できた。脾臓は免疫細胞が豊富で、脾臓への選択的遺伝子発現によりＤＮＡワクチンの開発ができる。更に、ホスファチジルセリンの代わりに、Ｎ−ラウロイルザルコシン（負電荷）を添加することにより、同じくナノ微粒子の安全性を高め、マウスに静脈内注射後、肺のみに遺伝子発現を実現できた（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−０５９０６４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Journal of Controlled Release, 136, 213-219 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、安全で力価が高く、大量生産や保存が可能な抗原送達複合体、ワクチン、薬物送達複合体などを提供することを課題とする。特に、細胞または臓器への指向性を有することを特徴とする、抗原もしくは薬物送達複合体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、マラリア抗原のＤＮＡとカチオン性分子との複合体を、γ−ポリグルタミン酸、コンドロイチン硫酸、アルギン酸のいずれかのアニオン性分子で被覆して、実質的に非荷電であるか、あるいは負の表面電荷を有する複合体とすることにより、細胞毒性が低く、赤血球凝集を引き起こすことなく、種々の細胞において高いトランスフェクション効率を示すこと、更にインビボでの全身投与により脾臓に効率よく抗原ＤＮＡを送達し得ることを見出した。
また、複数回の投与によってマラリアに特異的な抗体の産生を得ること、それによりマラリアの感染を抑制し得ることを見出した。更に、癌抗原として悪性黒色腫の表面抗原をコードしたｐＤＮＡを用いた場合に悪性黒色腫に特異的な細胞性免疫を誘導し、悪性黒色腫の増殖と転移を抑制し得ることを見出した。【００１１】
また、本発明者らは不活化ウイルスや癌抗原とカチオン性分子との複合体をγ−ポリグルタミン酸、コンドロイチン硫酸、アルギン酸のいずれかのアニオン性分子で被覆して、実質的に非荷電であるか、あるいは負の表面電荷を有する複合体を作製することに成功した。更に、得られたワクチンが首尾よく樹状細胞内に送達され得ること、実験動物に投与した際に高い免疫誘導効果を示すことを見出した。【００１２】
更に、本発明者らは、特許文献１に記載の技術を応用し、細胞または臓器特異的な送達を可能にする、新規標的化システムの構築に成功した。すなわち、抗原もしくは薬物とカチオン性分子との複合体、ならびにそれを内包するアニオン性分子を含有し、細胞または臓器への指向性を有することを特徴とする、抗原もしくは薬物送達複合体を開発することに成功した。
また、抗原もしくは薬物とカチオン性分子との複合体にホスファチジルセリン、Ｎ−ラウロイルザルコシンおよびグリチルリチンから選択されるアニオン性分子を添加することにより、それぞれ、脾臓、肺または肝臓への選択性（臓器選択性）を付与した、抗原もしくは薬物送達複合体の作製にも成功した。
さらに、アニオン性分子としてγ−ポリグルタミン酸を使用することで、樹状細胞へ指向性を有する複合体を作製できることを発見した。
これらの複合体は、抗原もしくは薬物とカチオン性分子との複合体、そしてアニオン性分子が静電的に結合しているので安全性が極めて高く、細胞障害性がないことも明らかになった。
さらに、抗原もしくは薬物とカチオン性分子との複合体に、さらにアプタマー、ｍｉＲＮＡおよび抗体から選択されるアニオン性分子を添加することで、より特異的な細胞もしくは臓器選択性を付与した複合体の作製にも成功した。【００１３】
加えて、抗原もしくは薬物として公知のイメージング用核種（イメージングプローブ）や診断薬を用いることで、上記複合体をイメージング用核種（イメージングプローブ）や診断薬を特定の細胞または臓器へ送達する輸送体として用いることにも成功した。【００１４】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
［１］抗原もしくは薬物とカチオン性分子との複合体、ならびにそれを内包するアニオン性分子を含有し、細胞または臓器への指向性を有することを特徴とする、抗原もしくは薬物送達複合体。
［２］抗原もしくは薬物が、核酸、ペプチド、タンパク質または不活化ウイルスである、［１］に記載の複合体。
［３］アニオン性分子が、ホスファチジルセリン、ラウロイルザルコシンおよびグリチルリチンから選択され、脾臓、肺または肝臓への指向性を有することを特徴とする、［１］または［２］に記載の複合体。
［４］アニオン性分子が、ホスファチジルセリンであり；
抗原もしくは薬物、カチオン性分子、ホスファチジルセリンの配合比が１：２：４〜１：８：８であり；かつ
脾臓への指向性を有することを特徴とする、［３］に記載の複合体。
［５］アニオン性分子が、ラウロイルザルコシンであり；
カチオン性分子が、カチオン性高分子およびカチオン性脂質からなり；
抗原もしくは薬物、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ラウロイルザルコシンの配合比が１：２：２：１〜１：２：２：４であり；かつ
肺への指向性を有することを特徴とする、［３］に記載の複合体。
［６］アニオン性分子が、グリチルリチンであり；
抗原もしくは薬物、カチオン性分子、グリチルリチンの配合比が１：２：８〜１：８：１６であり；かつ
肝臓への指向性を有することを特徴とする、［３］に記載の複合体。
［７］アニオン性分子が、γ−ポリグルタミン酸であり、樹状細胞または脾臓への指向性を有することを特徴とする、［１］または［２］に記載の複合体。
［８］抗原もしくは薬物、カチオン性分子、γ−ポリグルタミン酸の配合比が１：２：８〜１：８：１６であり；かつ
樹状細胞または脾臓への指向性を有することを特徴とする、［７］に記載の複合体。
［９］アニオン性分子が、アプタマー、ｍｉＲＮＡおよび抗体から選択される、［１］または［２］に記載の複合体。
［１０］抗原もしくは薬物、カチオン性分子、アニオン性分子の配合比が１：２：８〜１：８：１６である、［９］に記載の複合体。
［１１］複合体が、
抗原もしくは薬物；
ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリエチレンイミンおよびカチオン性デンドリマーから選択されるカチオン性高分子、あるいはＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌおよび塩化ベンザルコニウムから選択されるカチオン性脂質；
から構成される、［１］〜［１０］のいずれか一に記載の複合体。
［１２］複合体が、
抗原もしくは薬物；そして
ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰおよびＤＣ−Ｃｈｏｌから選択されるカチオン性脂質ならびにＤＯＰＥおよびコレステロールから選択される脂質からなるリポソームあるいはミセル；
から構成される、［１］〜［１０］のいずれか一に記載の複合体。
［１３］イメージングに使用するための請求項１〜１２のいずれか一に記載の複合体を含む、イメージング用核種の輸送体。
［１４］抗原もしくは薬物が、イメージング用核種、カチオン性デンドリマーおよびキレート剤からなる複合体であり；
カチオン性分子が、ポリエチレンイミンであり；
アニオン性分子が、γ−ポリグルタミン酸であり；そして
リンパ節への指向性を有することを特徴とする、［１３］に記載の輸送体。
［１５］イメージング用核種、カチオン性デンドリマーおよびキレート剤からなる複合体；ポリエチレンイミン；ならびにγ−ポリグルタミン酸から構成される複合体を用いることを特徴とする、センチネルリンパ節のイメージング方法。【００１５】
［１’］抗原とカチオン性分子との複合体及びそれを内包するアニオン性分子を含有し、実質的に非荷電であるか負の表面電荷を有する抗原送達複合体であって、該アニオン性分子がγ−ポリグルタミン酸、コンドロイチン硫酸、アルギン酸及びそれらの塩からなる群より選択される、抗原送達複合体。
［２’］該抗原が病原体抗原又はそれをコードするＤＮＡである、［１’］に記載の複合体。
［３’］病原体がマラリア原虫である、［２’］に記載の複合体。
［４’］該抗原が不活化ウイルスである、［１’］に記載の複合体。
［５’］ウイルスがインフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、パピローマウイルス、又はＨＩＶウイルスである、［４’］に記載の複合体。
［６’］カチオン性分子の正電荷を有する官能基と、アニオン性分子の負電荷を有する官能基とのモル比が３：１〜１：４である、［１’］に記載の複合体。
［７’］アニオン性分子の分子量が１０万以下である、［１’］に記載の複合体。
［８’］アニオン性分子がγ−ポリグルタミン酸又はその塩である、［１’］に記載の複合体。
［９’］カチオン性分子がポリエチレンイミン、塩化ベンザルコニウム、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム又はそれらの塩である、［１’］に記載の複合体。
［１０’］抗原を脾臓に送達させるためのものである、［８’］に記載の複合体。
［１１’］［１’］〜［１０’］のいずれか一に記載の複合体を含有する、感染症ワクチン。
［１２’］感染症がマラリア感染症又はウイルス感染症である、［１１’］に記載のワクチン。
［１３’］［１’］〜［１０’］のいずれか一に記載の複合体又は［１１’］もしくは［１２’］に記載のワクチンを樹状細胞に接触させることを特徴とする、該細胞内への抗原送達方法。
［１４’］［１’］〜［１０’］のいずれか一に記載の複合体又は［１１’］もしくは［１２’］に記載のワクチンを哺乳動物に投与することを特徴とする、該動物の細胞内への抗原送達方法。
［１５’］薬物とカチオン性分子との複合体を含むリポソーム及びそれを内包するアニオン性分子を含有し、実質的に非荷電であるか負の表面電荷を有する薬物送達複合体であって、該アニオン性分子がラウロイルザルコシン及びホスファチジルセリンからなる群より選択される、薬物送達複合体。
［１６’］薬物を脾臓に送達させるためのものである、［１５’］に記載の複合体。
［１７’］薬物を肺に送達させるためのものである、［１５’］に記載の複合体。
［１８’］該リポソームが、薬物、カチオン性分子、及びカチオン性脂質からなるものである、［１５’］に記載の複合体。
［１９’］カチオン性分子がポリエチレンイミンであり、カチオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムである、［１８’］に記載の複合体。
［２０’］抗原が、癌抗原又はそれをコードするＤＮＡである、［１’］及び［６’］〜［１０’］のいずれか一に記載の複合体。
［２１’］［２０’］記載の複合体を含有する、癌ワクチン。
［２２’］癌が悪性黒色腫である、［２１’］に記載のワクチン。
［２３’］［２０’］に記載の複合体又は［２１’］もしくは［２２’］に記載のワクチンを樹状細胞に接触させることを特徴とする、該細胞内への抗原送達方法。
［２４’］［２０’］に記載の複合体又は［２１’］もしくは［２２’］に記載のワクチンを哺乳動物に投与することを特徴とする、該動物の細胞内への抗原送達方法。
［２５’］薬物とカチオン性分子との複合体及びそれを内包する抗体、アプタマー又はその塩を含有する、臓器特異的な薬物送達複合体であって、該抗体、アプタマー又はその塩が薬物とカチオン性分子との複合体に静電的に結合していることを特徴とする薬物送達複合体。
［２６’］［２５’］に記載の薬物送達複合体を特異細胞に送達させることを特徴とする、該細胞内への薬物送達方法。
［２７’］［２５’］に記載の薬物送達複合体を哺乳動物に投与することを特徴とする、該動物の特異細胞内への薬物送達方法。
［２８’］薬物がＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなど負電荷の核酸である、［１５’］又は［２５’］に記載の薬物送達複合体。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の複合体は、赤血球凝集を引き起こさず、また細胞毒性も低く、しかも細胞内取り込み効率に優れるので、安全かつ有効に抗原や薬物を送達することができる。
特に本発明の複合体は、標的となる細胞や臓器への高い指向性を有することを特徴とするので、新たなドラッグデリバリーシステムの有効成分となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１におけるワクチン抗体価を示す。
【図２】実施例１におけるマラリア感染後のマウスの生存率を示す。
【図３】実施例２におけるワクチン抗体価を示す。
【図４】実施例３における複合体を細胞に添加後の蛍光顕微鏡観察像を示す。
【図５】実施例４における腫瘍重量の変化を示す。
【図６】実施例４における悪性黒色腫の肺転移の様子を示す。
【図７】実施例４における肺転移した細胞数を示す。
【図８】実施例５における粒子サイズ及び表面電荷を示す。
【図９】実施例５における遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）を示す。
【図１０】実施例５におけるマウスのルシフェラーゼイメージング像を示す。
【図１１】実施例５における多変数のスプライン補間法及び寄与指数を示す。
【図１２】実施例６における遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）を示す。
【図１３】実施例７における粒子サイズ及び表面電荷を示す。
【図１４】実施例７における遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）を示す。
【図１５】実施例７における粒子サイズ及び表面電荷を示す。
【図１６】実施例８における遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）を示す。
【図１７】実施例９における不活化ウイルスの樹状細胞株への取り込みを示す。
【図１８】実施例１０における遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）を示す。
【図１９】実施例１１における遺伝子抑制効率を示す。
【図２０】実施例１２におけるマラリア感染後のマウスの生存率を示す。
【図２１】Ａ：実施例１３におけるマウス血清を希釈することによる抗体価の変動を示す。Ｂ：希釈率１０−４におけるマウスの抗体価を示す。
【図２２】実施例１４における腫瘍の増殖変化を示す。
【図２３】実施例１５における細胞障害性を示す。
【図２４】実施例１５におけるラットＦｏｏｔ  Ｐａｄへの投与２４時間後の複合体の生体内分布を示す。
【図２５】実施例１５におけるラットＦｏｏｔ  Ｐａｄへの投与２４時間後のＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を示す。矢印（実線）は、膝窩リンパ節を示し、矢印（点線）は、腰部リンパ節を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、抗原を所望の細胞または臓器内へ送達させるための、抗原もしくは薬物複合体（以下、「本発明の抗原送達複合体」、「本発明の薬物送達複合体」、これらを併せて、「本発明の複合体」ともいう）を提供する。
以下、本発明の抗原送達複合体と、本発明の薬物送達複合体のそれぞれについて説明する。
【００１９】
本発明の「抗原送達複合体」は、抗原とカチオン性分子との複合体、ならびにそれを内包するアニオン性分子を含有し、細胞または臓器への指向性を有することを特徴とする。
【００２０】
本発明の抗原送達複合体における「抗原」としては、例えば病原体抗原（特に病原体の表面抗原）又はそれをコードするＤＮＡ、あるいは不活化ウイルスが挙げられる。
【００２１】
病原体抗原において対象となる「病原体」としては、後述するように、本発明の抗原送達複合体がワクチンとして使用されることに鑑みれば、ワクチン療法が所望される各種病原体が挙げられる。具体的には、マラリア原虫、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、ＨＩＶウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）、パピローマウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）ウイルス等が挙げられる。
そのような病原体抗原としては、病原体の表面抗原（例えば、タンパク質（抗原）、ペプチド（抗原）など）及びそれらをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）抗原等から選択される。
【００２２】
前記核酸抗原における核酸の種類は、使用の目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されないが、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＰＡＣ、ＢＡＣ等が挙げられ、好ましくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡである。プラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡは適宜制限酵素等により消化され、線形ＤＮＡとして用いることもできる。
【００２３】
核酸の大きさは特に限定されないが、プラスミドＤＮＡの場合は、２〜１５ｋｂｐ、好ましくは２〜１０ｋｂｐ、より好ましくは４〜１０ｋｂｐである。また、１〜５ｋｂｐのＤＮＡも好ましい。
【００２４】
核酸は天然に存在するもの又は合成されたもののいずれでも良いが、１００ｂｐ程度以下の大きさのものであれば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられる核酸自動合成装置を利用して合成することが可能である。
より大きなサイズの核酸については、通常用いられる方法で適宜調製することができる。
本発明において用いられる核酸は、特に限定されないが、当業者が通常用いる方法により精製されていることが好ましい。
【００２５】
本明細書における抗原としては、上記のように病原体の表面抗原又はそれをコードする核酸以外に、病原体（ウイルス）そのものを使用することができる。この場合、感染防御の点から不活化ウイルスを用いる。
不活化ウイルスとしては、通常行われている手法により得られたものであればいかなるものでも使用することができるが、例えば、ホルマリン処理、紫外線照射、β−プロピオラクトン等により得たものを使用することができる。
【００２６】
このような抗原として、好ましくは核酸、ペプチド、タンパク質または不活化ウイルスが挙げられ、その一例として、マラリア抗原遺伝子、不活化インフルエンザウイルス等が挙げられる。
【００２７】
本発明の別の実施態様として、抗原として癌抗原又はそれをコードするＤＮＡを用いて得られる抗原送達複合体が挙げられる。抗原として癌抗原を用いる点から、該抗原は細胞特異的に送達されることが好ましい。すなわち、抗原を樹状細胞などの抗原提示細胞へ特異的に送達することにより高い免疫誘導効果が期待される。
【００２８】
上記抗原は、後述する本発明の薬物と共に本発明の複合体を形成してもよい。したがって本発明の抗原送達複合体は、薬物を取り込んだ抗原送達複合体であってもよい。
【００２９】
一方、本発明の「薬物送達複合体」は、薬物とカチオン性分子との複合体、ならびにそれを内包するアニオン性分子を含有し、細胞または臓器への指向性を有することを特徴とする。
【００３０】
本発明の薬物送達複合体における「薬物」とはいかなるものであってもよく、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、ペプチド脂質、糖、低分子化合物、その他の合成もしくは天然化合物等が挙げられる。これらの化合物は、種々の核種（例えば、天然放射性核種、人工放射性核種、陽電子放出核種など）を含むものであってもよいし、核種によって放射ラベルされたものであってもよい。あるいは、種々の化合物（例えば、公知の蛍光色素、酵素など）で標識されたものであってもよい。また当該薬物は、一種だけであってもよいし、二種以上であってもよい。
【００３１】
本発明の薬物送達複合体による細胞または臓器内への薬物送達が、疾患の治療及び／又は予防を目的とする場合、該薬物は該疾患の治療及び／又は予防活性を有するものであり、例えば、抗高血圧剤、抗低血圧剤、抗精神病剤、鎮痛剤、抗鬱剤、抗躁剤、抗不安剤、鎮静剤、催眠剤、抗癲癇剤、オピオイドアゴニスト、喘息治療剤、麻酔剤、抗不整脈剤、関節炎治療剤、鎮痙剤、ＡＣＥインヒビター、鬱血除去剤、抗生物質、抗狭心症剤、利尿剤、抗パーキンソン病剤、気管支拡張剤、分娩促進剤、抗利尿剤、抗高脂血症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、制吐剤、抗感染症剤、抗新生物剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗糖尿病剤、抗アレルギー剤、解熱剤、抗腫瘍剤、抗痛風剤、抗ヒスタミン剤、止痒剤、骨調節剤、心血管剤、コレステロール低下剤、抗マラリア剤、喫煙を中止するための薬剤、鎮咳剤、去痰剤、粘液溶解剤、鼻詰り用薬剤、ドパミン作動剤、消化管用薬剤、筋弛緩剤、神経筋遮断剤、副交感神経作動剤、プロスタグランジン、興奮薬、食欲抑制剤、甲状腺剤又は抗甲状腺剤、ホルモン、抗偏頭痛剤、抗肥満剤、抗炎症剤などとして作用し得るものが挙げられる。
【００３２】
特に好ましい一実施態様において、細胞内に導入され得る薬物は核酸である。核酸としては、特に制限はなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド等いかなるものであってもよい。また、核酸は１〜３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖又は２本鎖である。核酸は、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）又は特殊な結合を含有するその他のオリゴマー（但し、該オリゴマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などであってもよい。更には公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）をもつもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）をもつもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチドなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）をもつもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合をもつもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。
【００３３】
例えば、ＤＮＡの種類は、使用の目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されないが、例えばプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＰＡＣ、ＢＡＣ等が挙げられ、好ましくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡである。プラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡは適宜制限酵素等により消化され、線形ＤＮＡとして用いることもできる。
また、ＲＮＡの種類は、使用の目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されないが、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡゲノム、二本鎖ＲＮＡゲノム、ＲＮＡレプリコン、トランスファーＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡ等が挙げられ、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡレプリコンである。
【００３４】
核酸の大きさは、特に限定されず、染色体（人工染色体等）等の巨大な核酸分子（例えば約１０７ｋｂｐの大きさ）から、低分子核酸（例えば約５ｂｐの大きさ）を導入することが可能であるが、細胞内への核酸導入効率を考慮すると、１５ｋｂｐ以下であることが好ましい。例えばプラスミドＤＮＡのような高分子核酸の大きさとしては、２〜１５ｋｂｐ、好ましくは２〜１０ｋｂｐ、より好ましくは４〜１０ｋｂｐが例示される。また、ｓｉＲＮＡのような比較的低分子の核酸の大きさとしては５〜１０００ｂｐ、好ましくは１０〜５００ｂｐ、更に好ましくは１５〜２００ｂｐが例示される。
【００３５】
核酸は天然に存在するもの又は合成されたもののいずれでもよいが、１００ｂｐ程度以下の大きさのものであれば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられる核酸自動合成装置を利用して合成することが可能である。
【００３６】
本発明において用いられる核酸は、特に限定されないが、当業者が通常用いる方法により精製されていることが好ましい。
【００３７】
上記薬物は、本発明の抗原と共に本発明の複合体を形成してもよい。したがって本発明の薬物送達複合体は、抗原を取り込んだ薬物送達複合体であってもよい。
【００３８】
本発明の薬物送達複合体による細胞または臓器内への薬物送達が、細胞または臓器の診断やイメージングを目的とする場合、該薬物は診断装置やイメージング装置に適した修飾をうけた化合物（例えば、核種、核種によって標識（放射ラベル）された化合物、蛍光色素、蛍光色素で標識された化合物など）でありうる（以下、これらを総称して「イメージング用核種」と略記する場合がある）。
【００３９】
このような薬物としては、例えば、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）用放射性核種（１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆなど）または当該核種で標識された化合物、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）用放射性核種（６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉなど）または当該核種で標識された化合物、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像診断）用造影剤（Ｇｄ３＋など）または当該造影剤で標識された化合物、色素（イソファルサンブルー、サルファンブルー、メチレンブルー、インドシアニングリーン、インジコカルミンなど）または当該色素で標識された化合物、蛍光色素または当該蛍光色素で標識された化合物（蛍光錯体を形成するランタノイドなど）、その他分子プローブやトレーサーとして用いられる化合物が挙げられる。これらの化合物は、当業者であれば自体公知の方法で製造することができる。
【００４０】
あるいはこれらのイメージング用核種は、後述する種々のカチオン性分子やアニオン性分子（好ましくは、カチオン性分子）に共有結合や配位結合によって結合させることも可能である。そのような結合方法は、当業者に公知である。
【００４１】
上記薬物として本発明の薬物送達複合体に封入される化合物としては特に限定されず、自体公知の核種、色素、蛍光色素、分子プローブや診断薬などが用いられる。
【００４２】
すなわち本発明の薬物送達複合体は、これらのイメージング用核種を送達するための輸送体として用いることが可能である。当該複合体は、本発明の薬物送達複合体が有する指向性に基づいて特定の細胞または臓器に向かうので、本発明の薬物送達複合体をイメージング用核種を送達するための輸送体として用いることで、イメージング用核種のみを用いる従来の診断方法・イメージング方法に比べて、目的部位をより正確に診断・イメージングすることが可能である。
【００４３】
あるいは、本発明の薬物送達複合体そのものを、診断もしくはイメージング薬として用いられる薬物の分子プローブとして用いることが可能である。
本発明の薬物送達複合体は、赤血球凝集を引き起こさず、また細胞毒性も低く、しかも細胞内取り込み効率に優れ、また細胞や臓器への指向性を有するので、安全かつ有効に用いられる分子プローブであるといえる。
【００４４】
本発明の薬物送達複合体を、イメージング用核種を送達するための輸送体として用いる場合、本発明の薬物は、カチオン性デンドリマーとキレート剤との複合体（以下、薬物複合体と略記する場合がある）として製造することが好ましい。
カチオン性デンドリマーが有するカチオン性の基（例、アミノ基）には、共有結合を介して色素や蛍光色素分子などの薬物を導入することができ、またキレート剤にも、放射性核種やＭＲＩ造影剤、ランタノイドなどの薬物を導入することが可能である。
カチオン性デンドリマーにキレート剤を結合させる方法や、本発明の薬物とカチオン性デンドリマーおよびキレート剤との複合体の製造方法は、当業者に公知である。例えば、薬物複合体の製造方法としては、カチオン性デンドリマーとキレート剤を混合させてカチオン性デンドリマーとキレート剤との複合体を形成し、これをイメージング用核種で標識する方法が挙げられる。
【００４５】
このようなカチオン性デンドリマーとキレート剤との複合体として製造された薬物を適用することによって、本発明の輸送体は、マルチモダリティイメージングプローブとしての適用も可能となり得る。
【００４６】
当該用途として用いる場合の、薬物複合体に含まれるカチオン性デンドリマーとしては、ポリアミドアミンデンドリマーなどが挙げられる。またキレート剤としては、ｐ−ＳＣＮベンジルジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
【００４７】
本発明の複合体に用いられるアニオン性分子とは、前記抗原や後述する薬物、カチオン性分子とともに細胞や組織への指向性を有する複合体を形成し、アニオンとしてふるまう分子である。アニオン性分子は、後述するカチオン性分子と静電的相互作用により会合し、実質的に非荷電であるか負の表面電荷を有する本発明の複合体を形成する。
好ましいアニオン性分子としては、アニオン性高分子、アニオン性脂質（例、ラウロイルサルコシン（以下、ＬＳと略記する場合がある）、ホスファチジルセリン（以下、ＤＯＰＳと略記する場合がある）など）、全体として負電荷を帯びた遺伝子（例、アプタマーなど）、全体として負電荷を帯びた抗体などが挙げられる。なかでも、例えばラウロイルサルコシン、γ−ポリグルタミン酸（以下、γ−ＰＧＡと略記する場合がある）、グリチルリチン（以下、ＧＬＹと略記する場合がある）、ホスファチジルセリン、コンドロイチン硫酸、アルギン酸などが特に好ましい。
これらのアニオン性分子は、種々の核種（例えば、天然放射性核種、人工放射性核種、陽電子放出核種など）を含むものであってもよいし、核種によって放射ラベルされたものであってもよい。あるいは、種々の化合物（例えば、公知の蛍光色素、酵素など）で標識されたものであってもよい。
【００４８】
各アニオン性分子は、塩の形態を採っていてもよく、塩の形態としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、塩酸塩等が挙げられる。
【００４９】
本発明の複合体において、アニオン性分子は、複合体に対し細胞または臓器指向性を付与するために最も重要な分子である。
たとえば、脾臓、肺または肝臓への指向性を与える場合、アニオン性分子としては、ホスファチジルセリン、ラウロイルサルコシンおよびグリチルリチンから選択することが望ましい。特に脾臓への指向性を与える場合はホスファチジルセリンを選択し、肺への指向性を与える場合はラウロイルサルコシンを選択し、そして肝臓への指向性を与える場合はグリチルリチンをそれぞれ選択することが望ましい。
各臓器において本発明の複合体が取り込まれる細胞としては特に限定されず、各臓器を形成する何れの細胞であってもよい。例えば、肝臓への指向性を有する本発明の複合体は、肝実質細胞に取り込まれる。
【００５０】
アニオン性脂質は、本発明の複合体におけるリポソームの構成成分としても用いることが可能である。このようなアニオン性脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ＬＳなどが挙げられる。
【００５１】
本発明の一つの実施態様において、アニオン性分子は、アプタマー、ｍｉＲＮＡおよび抗体から選択され得る。
【００５２】
本明細書において、アプタマーとは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法（ＳＥＬＥＸ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によって産生される、高親和性、高特異性ＲＮＡ又はＤＮＡベースリガンドである。アプタマーは、２０〜３０ヌクレオチドのランダム配列から生成され、分子抗原又は細胞に対する吸着により選択的にスクリーニングされ、高親和性結合リガンドを特異的に精製するため濃縮される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性と実用性を高めるため、アプタマーは、通常、ヌクレアーゼ分解を阻害し、薬剤、標識、又は、粒子との結合を容易にするように化学的に修飾される。その他、より単純な化学架橋法により、リガンドとの相互作用に具体的に関与しない核酸を置換する。溶液中において、アプタマーは構造をとらないが、折り畳み、標的エピトープを取り囲むことが可能であり、それにより特異的に認識する。エピトープ周囲における核酸の特異的な折り畳みは、水素結合、静電作用、スタッキング、形状相補性を介する識別力のある分子間接触をもたらす。タンパク質ベースのリガンドと比較して、一般に、アプタマーは安定であり、加熱滅菌の伝導性が高く、免疫原性が低い。アプタマーは、現在、血管形成、活性化血小板、固形腫瘍を含む多くの臨床的に意義のある病変を標的として使用されており、その使用は増加している。イメージング及び／又は治療用エマルション粒子におけるターゲティングリガンドとしてアプタマーを使用する場合、その臨床的な有用性は、クリアランス率に対する、核酸のリン酸基により付与される表面の負電荷強度に依存することもある。脂質ベースの粒子を用いた以前の研究は、負のゼータ電位がリポソームの血中半減期を著しく低下させる一方、中性又はカチオン性粒子は、共通して、より長い間全身で持続することを示している。
【００５３】
本発明のアプタマーは、塩の形態を採っていてもよく、そのようなアプタマーの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等が挙げられる。当該アプタマーまたはその塩は市販のもの（例、北海道システム・サイエンス社製）を使用しても良いが、慣用のプロトコールを用いて適宜作製することもできる。
【００５４】
本発明の複合体において、アニオン性分子として用いられる場合の抗体としては、アニオン性分子としてふるまう（例えば、抗体表面全体として負電荷を帯びている）抗体であれば特に限定されない。アニオン性分子として抗体を用いることで、抗原抗体反応を利用して細胞や臓器への指向性をより高めることが可能である。このような抗体としては市販のものを使用しても良いが、慣用のプロトコールを用いて選択された抗原に対して適宜作製することもできる。
【００５５】
本発明の一つの実施態様において、本発明の複合体に用いられるアニオン性分子は、γ−ポリグルタミン酸、コンドロイチン硫酸（以下、ＣＳと略記する場合がある）、アルギン酸（以下、ＡＧＡと略記する場合がある）及びそれらの塩から選択される。当該実施態様におけるアニオン性分子として好ましくは、γ−ＰＧＡである。
【００５６】
本明細書中、γ−ＰＧＡ又はその塩としては、下式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００５７】
【化１】
2011105520.tif 000003
【００５８】
（式中、Ｒは水素原子、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属原子、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエタノールアミン、トリメタノールアミン、ジエタノールアミン、ジメタノールアミン、エタノールアミン等の第三級アミン、又はテトラメチルアミン、テトラエチルアミン等の第四級アミンであり、分子中に存在するＲは同一でも異なってもよく、ｎは４０以上の整数である。）
【００５９】
本明細書中、ＣＳ又はその塩としては、下式（２）で表される化合物が挙げられる。
【００６０】
【化２】
2011105520.tif 000004
【００６１】
（式中、Ｒ１〜Ｒ３は独立してそれぞれ水素原子又はスルホン酸基であり（但し、Ｒ１又はＲ２の少なくとも一方はスルホン酸基である）、Ｒ４〜Ｒ６は独立してそれぞれ水素原子、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属原子、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエタノールアミン、トリメタノールアミン、ジエタノールアミン、ジメタノールアミン、エタノールアミン等の第三級アミン、又はテトラメチルアミン、テトラエチルアミン等の第四級アミンであり、分子中に存在するスルホン酸基はそれぞれナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属原子、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエタノールアミン、トリメタノールアミン、ジエタノールアミン、ジメタノールアミン、エタノールアミン等の第三級アミン、又はテトラメチルアミン、テトラエチルアミン等の第四級アミンで置換されていてもよく、ｎは１０以上の整数である。）
【００６２】
本明細書中、ＡＧＡ又はその塩としては、下式（３）で表される化合物が挙げられる。
【００６３】
【化３】
2011105520.tif 000005
【００６４】
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は独立してそれぞれ水素原子、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属原子、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエタノールアミン、トリメタノールアミン、ジエタノールアミン、ジメタノールアミン、エタノールアミン等の第三級アミン、又はテトラメチルアミン、テトラエチルアミン等の第四級アミンであり、ｍ及びｎはブロック共重合体の各ブロックの総数を表し、ｍとｎとの和は２０以上である。）
【００６５】
本明細書中、ＬＳは下式（４）で表される化合物である。
【００６６】
【化４】
2011105520.tif 000006
【００６７】
ＬＳの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等が挙げられる。
【００６８】
本明細書中、ホスファチジルセリンは下式（５）で表される化合物である。
【００６９】
【化５】
2011105520.tif 000007
【００７０】
ホスファチジルセリンの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、塩酸塩等が挙げられる。
【００７１】
本明細書中、グリチルリチンは下式（６）で表される化合物である。
【００７２】
【化６】
2011105520.tif 000008
【００７３】
グリチルリチンの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、塩酸塩等が挙げられる。
【００７４】
これらのアニオン性分子は、それぞれ自体公知の方法により調製することができる。
【００７５】
該アニオン性分子がポリマー、即ちγ−ＰＧＡ、ＣＳ、ＡＧＡ又はそれらの塩である場合、その重合度に特に制限はないが、例えば分子量５，０００以上、より好ましくは１０，０００以上のものが挙げられる。また、アニオン性分子の配合量の影響を受けずに安定に抗原を内包し得る点で、該アニオン性ポリマーは、例えば分子量２０万以下、好ましくは１５万以下、より好ましくは１０万以下である。
【００７６】
本発明の薬物送達複合体による細胞または臓器内への抗原もしくは薬物の送達が、細胞または臓器の診断や分子イメージングを目的とする場合、アニオン性分子は診断装置（方法）やイメージング装置（方法）に適したイメージング用核種で修飾をうけたアニオン性分子であってもよい。
【００７７】
このようなアニオン性分子としては、例えば、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）用放射性核種（１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆなど）または当該核種で標識されたアニオン性分子、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）用放射性核種（６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉなど）または当該核種で標識されたアニオン性分子、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像診断）用造影剤（Ｇｄ３＋など）または当該造影剤で標識されたアニオン性分子、色素（イソファルサンブルー、サルファンブルー、メチレンブルー、インドシアニングリーン、インジコカルミンなど）または当該色素で標識されたアニオン性分子、蛍光色素または当該蛍光色素で標識されたアニオン性分子が挙げられる。これらのアニオン性分子は、当業者であれば自体公知の方法で製造することができる。
【００７８】
例えば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩなどで使用される種々のシグナル金属（放射性核種、磁性金属、蛍光錯体を形成するランタノイドなど）はキレート剤を利用して配位結合によってアニオン性分子に導入することができるし、種々の色素については、アニオン性分子と共有結合させることによって導入することができる。これらの導入方法は、当業者に公知である。
【００７９】
本発明の複合体に用いられるカチオン性分子は、上記アニオン性分子と静電的相互作用により複合体を形成し得るものであればよく、例えば、カチオン性高分子［例えば、ポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩと略記する場合がある）、キチンやキトサンなどのポリカチオン性多糖、ポリリジン、ポリアルギニン、プロタミン等のポリカチオン性ポリペプチドなど］、あるいはカチオン性脂質［例えばホスファチジルコリン（大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加リン脂質等のリン脂質、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質に、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基、モノアシルオキシアルキル−ジアルキルアンモニウム基、ジアシルオキシアルキル−モノアルキルアンモニウム基、ジアシルオキシアルキル−トリアルキルアンモニウム基等の第４級アンモニウム基が導入された脂質、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｌｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下、ＤＯＴＭＡと略記する場合がある）、Ｎ−［１−（２，３−Ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｌｆａｔｅ（以下、ＤＯＴＡＰと略記する場合がある）、３ｂｅｔａ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（以下、ＤＣ−Ｃｈｏｌと略記する場合がある）、塩化ベンザルコニウムなど］やカチオン性の界面活性剤［例えば塩化ベンザルコニウムや塩化ベンゼトニウムなど］、カチオン性デンドリマー［例えばポリアミドアミンデンドリマーなど］などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００８０】
これらのカチオン性分子もまた、それぞれ自体公知の方法により調製することができる。
【００８１】
本発明のカチオン性分子としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリエチレンイミンおよびカチオン性デンドリマーから選択されるカチオン性高分子、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌおよび塩化ベンザルコニウムから選択されるカチオン性脂質、あるいは塩化ベンザルコニウムを好ましい例として挙げることができる。
【００８２】
これらのカチオン性分子は、種々の核種（例えば、天然放射性核種、人工放射性核種、陽電子放出核種など）を含むものであってもよいし、核種によって放射ラベルされたものであってもよい。あるいは、種々の化合物（例えば、公知の蛍光色素、酵素など）で標識されたものであってもよい。
【００８３】
本発明の薬物送達複合体による細胞または臓器内への抗原もしくは薬物の送達が、細胞または臓器の診断や分子イメージングを目的とする場合、カチオン性分子は診断装置（方法）やイメージング装置（方法）に適したイメージング核種で修飾をうけたカチオン性分子であってもよい。
【００８４】
このようなカチオン性分子としては、例えば、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）用放射性核種（１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆなど）または当該核種で標識されたカチオン性分子、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）用放射性核種（６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉなど）または当該核種で標識されたカチオン性分子、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像診断）用造影剤（Ｇｄ３＋など）または当該造影剤で標識されたカチオン性分子、色素（イソファルサンブルー、サルファンブルー、メチレンブルー、インドシアニングリーン、インジコカルミンなど）または当該色素で標識されたカチオン性分子、蛍光色素または当該蛍光色素で標識されたカチオン性分子が挙げられる。これらのカチオン性分子は、当業者であれば自体公知の方法で製造することができる。
【００８５】
例えば、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩなどで使用される種々のシグナル金属（放射性核種、磁性金属、蛍光錯体を形成するランタノイドなど）はキレート剤を利用して配位結合によってカチオン性分子に導入することができるし、種々の色素については、カチオン性分子と共有結合させることによって導入することができる。これらの導入方法は、当業者に公知である。
【００８６】
本発明の複合体を構成する、抗原もしくは薬物とカチオン性分子との複合体（以下、カチオン性複合体という場合がある）は、カチオン性複合体がアニオン性分子との静電的相互作用により、実質的に非荷電であるか、あるいは負の表面電荷を有する抗原送達複合体を形成し得る限り、いかなる形態であってもよく、例えば、
（ａ）抗原もしくは薬物とカチオン性分子（カチオン性高分子又はカチオン性脂質により構成されるリポソームやミセルを含む）との混合により自己組織化して得られる正の表面電荷を有する複合体（以下、自己組織化複合体という場合がある）；
（ｂ）抗原もしくは薬物を内包したカチオン性ミセル（マイクロスフェア）；
（ｃ）抗原もしくは薬物を内包したカチオン性リポソーム；
（ｄ）カチオン性デンドリマーおよびキレート剤との複合体を形成する薬物と、カチオン性分子との混合により自己組織化して得られる正の表面電荷を有する複合体
などが挙げられるが、それらに限定されない。リポソームの場合、単層型、多重層型のいずれであってもよい。
特に本発明の薬物送達複合体において、薬物がｓｉＲＮＡである場合、本発明の複合体はジオレイルホスファチジルエタノールアミンを含有したリポソームと自己組織化されることが好ましい。
【００８７】
当業者は、含有させる抗原もしくは薬物の物理化学的性質に応じて、適宜カチオン性複合体の形態を選択することができる。ＤＮＡや不活化ウイルスなどの負電荷を有する水溶性抗原もしくは薬物の場合、上記（ａ）又は（ｃ）の複合体を用いることができる。また、正電荷を有する水溶性抗原もしくは薬物の場合は、上記（ｃ）の複合体を用いることができる。あるいは、薬物をカチオン性デンドリマーおよびキレート剤との薬物複合体として取り扱う場合、上記（ｄ）の複合体を用いることができる。
【００８８】
本発明の別の実施態様である、抗原もしくは薬物として癌抗原を用いた場合には、上記カチオン性複合体はミセルの形態をとることが好ましい。
【００８９】
また、カチオン性複合体は正の表面電荷を有する限り、例えば上記した形態の２つ以上を組み合わせた形態であってよく、例えば、上記（ａ）もしくは（ｂ）複合体を封入したカチオン性リポソームのような形態が挙げられるが、これに限定されず、任意の他の組み合わせが利用可能である。
【００９０】
このような形態として具体的には、抗原もしくは薬物と、カチオン性高分子および／またはカチオン性脂質とから構成されるカチオン性複合体が挙げられる。この実施形態において、カチオン性高分子は、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリエチレンイミンおよびカチオン性デンドリマーから選択され、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌおよび塩化ベンザルコニウムから選択されることが好ましい。
【００９１】
さらに別の具体例としては、抗原もしくは薬物、カチオン性高分子ならびにカチオン性脂質から構成されるカチオン性複合体が挙げられる。この実施形態において、カチオン性高分子は、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリエチレンイミンおよびカチオン性デンドリマーから選択され、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌおよび塩化ベンザルコニウムから選択されることが特に好ましい。
【００９２】
また、ミセルやリポソームはカチオン性脂質分子以外に自体公知の中性脂質（リン脂質、ペプチド脂質、糖脂質等；例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（以下、ＤＯＰＥと略記する場合がある）やコレステロールなど）、ポリオキシアルキレングリコール（ＰＥＧ、ＰＰＧ等）などを構成分子として含んでいてもよい。
このような形態のカチオン性複合体としては、抗原もしくは薬物と、カチオン性脂質ならびにＤＯＰＥおよびコレステロールから選択される脂質からなるリポソームあるいはミセルとから構成されるカチオン性複合体が挙げられる。この実施形態において、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰおよびＤＣ−Ｃｈｏｌから選択されることが特に好ましい。
【００９３】
本発明のカチオン性複合体の調製に用いられる抗原もしくは薬物とカチオン性分子との配合比は特に制限されないが、例えば、カチオン性複合体が負電荷を有する抗原もしくは薬物とカチオン性分子との混合により得られる自己組織化複合体である場合、該抗原の負電荷を有する官能基（例えば、ＤＮＡにおけるリン酸基、タンパク質やペプチドにおけるカルボキシル基等）と、該カチオン性分子の正電荷を有する官能基（例えば、ＰＥＩにおけるイミノ基、ポリリジンやポリアルギニンにおけるアミノ基等）とのモル比が１：１〜１：２０、好ましくは１：２〜１：１５、より好ましくは１：２〜１：１０の割合で用いることができる。
【００９４】
なお、本明細書における「配合比」とは、本発明の複合体を形成する物質における以下の値の比を意味する。
・抗原もしくは薬物：負電荷を有する官能基のモル数
・カチオン性分子（カチオン性高分子およびカチオン性脂質）：正電荷を有する官能基のモル数
・中性脂質：モル数
・アニオン性分子：負電荷を有する官能基のモル数
すなわち「配合比」は、本発明の複合体を形成する各物質における、カチオン性の官能基（例えばアミノ基）またはアニオン性の官能基（例えばカルボキシル基やスルホニル基）の「電荷比」によっても定義することができる。
【００９５】
カチオン性脂質を配合することで本発明のカチオン性複合体がリポソームの形態をとる場合には、抗原もしくは薬物の負電荷を有する官能基（例えば、ＤＮＡにおけるリン酸基、タンパク質やペプチドにおけるカルボキシル基等）と、該カチオン性分子の正電荷を有する官能基とカチオン性脂質（例えば、ジアシルオキシアルキル−トリアルキルアンモニウム基等における第４級アンモニウム基）とのモル比が１：１：１〜１：２０：２０、好ましくは１：２：２〜１：１５：１５、より好ましくは１：２：２〜１：１０：１０の割合で用いることができ、リポソームの形態が維持される範囲で適宜設定される。
【００９６】
また、自体公知の中性脂質を配合することで本発明のカチオン性複合体がリポソームの形態をとる場合には、単に中性脂質を抗原もしくは薬物およびカチオン性分子と混合すればよく、配合比は当業者であれば適宜決定することが可能である。
【００９７】
このような本発明のカチオン性複合体は、抗原とカチオン性分子を適宜混合して調製することが可能である。調製に必要な手技や実験器具、反応時間や反応温度などの諸条件は当業者であれば適宜設定が可能である。
【００９８】
本発明の複合体において、上記カチオン性複合体は上記アニオン性分子に内包されている。ここで「内包する」とは内部に含んでいることを意味し、例えばカチオン性複合体表面をアニオン性分子が静電的相互作用により結合して覆うような非封入性の形態であってもよいし、あるいはリポソームのようにカチオン性複合体を封入した形態をとることもできる。前者の場合、複合体が実質的に非荷電であるか、あるいは負の表面電荷を有している限り、カチオン性複合体が完全にアニオン性分子で被覆されている必要はない。複合体が「実質的に非荷電である」とは、該複合体を血液と接触させた場合に赤血球凝集を引き起こさず、また、該複合体を細胞と接触させた場合の該細胞の生存率が少なくとも５０％である程度に、正電荷が低下していることを意味する。具体的には、複合体の表面電荷（ζ電位）は＋２０ｍＶ以下、好ましくは＋１０ｍＶ以下、より好ましくは＋５ｍＶ以下、更に好ましくは０ｍＶ以下、いっそう好ましくは−１０ｍＶ以下、特に好ましくは−１５ｍＶ以下である。表面電荷（ζ電位）の下限は特に制限はないが、例えば−５０ｍＶ以上、好ましくは−４０ｍＶ以上、より好ましくは−３０ｍＶ以上である。
【００９９】
本発明の複合体の調製に用いられるカチオン性分子とアニオン性分子との配合比は、該複合体が実質的に非荷電であるか、あるいは負の表面電荷を有するようになる限り特に制限はないが、例えば該カチオン性分子の正電荷を有する官能基（例えば、ＰＥＩにおけるイミノ基、ポリリジンやポリアルギニンにおけるアミノ基等）と、該アニオン性分子の負電荷を有する官能基（例えば、γ−ＰＧＡ、ＡＧＡ、ＣＳのスルホン酸基及びカルボキシル基）とのモル比が５：１〜１：５、好ましくは４：１〜１：４、より好ましくは３：１〜１：４である。しかしながら、カチオン性分子の性質に合わせて最適化が可能でこの比率に限定されない。
【０１００】
カチオン性脂質を配合することで本発明のカチオン性複合体がリポソームの形態をとる場合には、カチオン性分子とアニオン性分子との配合比は、該カチオン性分子の正電荷を有する官能基（例えば、ＰＥＩにおけるイミノ基、ポリリジンやポリアルギニンにおけるアミノ基等）と、カチオン性脂質の正電荷を有する官能基（例えばジアシルオキシアルキル−トリアルキルアンモニウム基等における第４級アンモニウム基）と、アニオン性分子の負電荷を有する官能基（例えば、ＬＳ、ホスファチジルセリン、アプタマーのリン酸基及びカルボキシル基）とのモル比が１：１：１〜１：１：５、好ましくは１：１：１〜１：１：４、より好ましくは１：１：１〜１：１：２の割合で用いることができ、リポソームの形態が維持される範囲で適宜設定される。
【０１０１】
上記配合比は、本発明の複合体が細胞や臓器への望ましい指向性を有するために重要である。
【０１０２】
本発明の一つの実施態様において、アニオン性分子がホスファチジルセリンであれば、得られる本発明の複合体が脾臓への指向性を有することは前述のとおりである。しかしながらこの際、抗原もしくは薬物、カチオン性分子、そしてアニオン性分子たるホスファチジルセリンの配合比を１：２：４〜１：８：８に調整することで、脾臓への指向性をより高めることが可能である。
すなわち本発明の好ましい実施態様によれば、アニオン性分子が、ホスファチジルセリンであり；抗原もしくは薬物、カチオン性分子、ホスファチジルセリンの配合比が１：２：４〜１：８：８であり；かつ脾臓への指向性を有することを特徴とする、複合体を提供する。配合比をこの範囲内にすることで、脾臓指向性に最適な表面荷電を有する本発明の複合体が得られる。
この場合のカチオン性高分子およびカチオン性脂質としては特に限定されないが、ポリエチレンイミンやポリリジン、ポリアルギニンであることが好ましい。
【０１０３】
本発明の一つの実施態様において、アニオン性分子がラウロイルサルコシンであれば、得られる本発明の複合体が肺への指向性を有することは前述のとおりである。しかしながらこの際、カチオン性分子がカチオン性高分子およびカチオン性脂質からなり、そして抗原もしくは薬物、カチオン性高分子、カチオン性脂質そしてアニオン性分子たるラウロイルサルコシンの配合比を１：２：２：１〜１：２：２：４に調整することで、肺への指向性をより高めることが可能である。すなわち本発明の好ましい実施態様によれば、アニオン性分子が、ラウロイルサルコシンであり；カチオン性分子が、カチオン性高分子およびカチオン性脂質からなり；抗原もしくは薬物、カチオン性分子、ホスファチジルセリンの配合比が１：２：２：１〜１：２：２：４であり；かつ肺への指向性を有することを特徴とする、複合体を提供する。配合比をこの範囲内にすることで、肺指向性に最適な表面荷電を有する本発明の複合体が得られる。
この場合のカチオン性高分子およびカチオン性脂質としては特に限定されないが、カチオン性高分子がポリエチレンイミンやポリリジン、ポリアルギニン、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡまたはＤＯＴＡＰであることが好ましい。
【０１０４】
本発明の一つの実施態様において、アニオン性分子がグリチルリチンであれば、得られる本発明の複合体が肝臓への指向性を有することは前述のとおりである。しかしながらこの際、抗原もしくは薬物、カチオン性分子そしてアニオン性分子たるグリチルリチンの配合比を１：２：８〜１：８：１６に調整することで、肝臓への指向性をより高めることが可能である。すなわち本発明の好ましい実施態様によれば、アニオン性分子が、グリチルリチンであり；抗原もしくは薬物、カチオン性分子、グリチルリチンの配合比が１：２：８〜１：８：１６であり；かつ肝臓への指向性を有することを特徴とする、複合体を提供する。配合比をこの範囲内にすることで、肝臓指向性に最適な表面荷電を有する本発明の複合体が得られる。
この場合の抗原もしくは薬物として好ましくは、核酸である。カチオン性分子として好ましくは、ポリエチレンイミンやポリリジン、ポリアルギニンである。
【０１０５】
あるいは、本発明の別の実施態様において、アニオン性分子がγ−ポリグルタミン酸であれば、得られる本発明の複合体が樹状細胞または脾臓への指向性を有することも前述のとおりである。
特に抗原もしくは薬物として蛋白抗原を用いる場合、カチオン性分子として塩化ベンザルコニウムを用い、かつアニオン性分子としてγ−ポリグルタミン酸を用いると、樹状細胞への指向性が一層強力となる。
【０１０６】
本発明の複合体は、抗原もしくは薬物とカチオン性分子とを適当な配合比で接触させてカチオン性複合体を形成させ、更に、該カチオン性複合体とアニオン性分子とを適当な配合比で接触させることにより調製することができる。
【０１０７】
例えば、ＤＮＡ等の負電荷を有する水溶性抗原もしくは薬物とＰＥＩ等の水溶性カチオン性ポリマーとの間の静電的相互作用を利用したカチオン性複合体は、抗原もしくは薬物とカチオン性ポリマーとを水又は適当な緩衝液中で混合し、室温で０．５〜３００分間、好ましくは１〜１８０分間インキュベートすることにより調製することができる。混合物中の抗原もしくは薬物の濃度は、用いる抗原もしくは薬物の種類、サイズ（分子量）等を考慮し適宜設定できるが、該抗原もしくは薬物がＤＮＡである場合は、通常０．０１〜１０００ｎｇ／μＬの範囲である。該抗原もしくは薬物が通常のプラスミドＤＮＡ（サイズが４〜７ｋｂｐ程度）である場合は、当該混合液中のＤＮＡ濃度は好ましくは５０〜５００ｎｇ／μＬの範囲である。濃度が低すぎると細胞へ導入されたＤＮＡが期待された機能を発現することができず、濃度が高すぎるとかえって核酸導入効率が低下する。なお、抗原もしくは薬物とカチオン性ポリマーとの配合比は、上記した範囲から適宜選択することができる。混合液のインキュベーション時間は、用いる抗原もしくは薬物とカチオン性ポリマーの種類に応じて上記の範囲内で適宜選択することができるが、インキュベーション時間が短すぎると、抗原もしくは薬物とカチオン性ポリマーとの複合体形成が不十分となり、インキュベーション時間が長すぎると、形成された複合体が不安定化する場合があり、いずれも細胞への抗原もしくは薬物の送達効率が低下する。
【０１０８】
抗原もしくは薬物を内包したカチオン性ミセルの場合、例えば、カチオン性脂質塩と脂溶性抗原もしくは薬物をクロロホルムに溶解し、十分に混和した後にエバポレーター、デシケーターを用いてクロロホルムを完全に除去し、任意の等張溶液を加えて一晩水和する。水和後にソニケーションによって抗原もしくは薬物を内包したカチオン性ミセルを作成する。作成に用いる抗原もしくは薬物の量とカチオン性脂質との配合比率は、抗原もしくは薬物の脂溶性等の物理化学的性質によって適宜調整することができる。また、この方法に限らず、公知の方法により調製することができる。使用する抗原もしくは薬物の量、抗原もしくは薬物とカチオン性脂質との配合比は、それぞれ上記した範囲から適宜選択することができる。
【０１０９】
また、抗原もしくは薬物を内包したカチオン性リポソームの場合、例えば、超音波処理、加熱、ボルテックス、エーテル注入法、フレンチ・プレス法、コール酸法、Ｃａ２＋融合法、凍結−融解法、逆相蒸発法等などの自体公知の方法により調製することができる。使用する抗原もしくは薬物の量、抗原もしくは薬物とカチオン性脂質との配合比は、それぞれ上記した範囲から適宜選択することができる。
【０１１０】
得られたカチオン性複合体溶液にアニオン性分子を添加し、室温で０．５〜３００分間、好ましくは１５〜６０分間インキュベートして自己組織化させることにより、カチオン性複合体がアニオン性分子により被覆されてなる抗原送達複合体を得ることができる。インキュベーション時間が短すぎると、カチオン性複合体とアニオン性分子との複合体形成が不十分となり、インキュベーション時間が長すぎると、形成された複合体が不安定化する場合があり、いずれも細胞への抗原送達効率が低下する。カチオン性複合体を構成するカチオン性分子とアニオン性分子との配合比は、上記した範囲から適宜選択することができる。
【０１１１】
このようにして得られた本発明の複合体は、その表面が実質的に非荷電であるか、あるいは負の表面電荷を有する。ここで「実質的に非荷電」とは上記の通りである。具体的には、実質的に非荷電とは、表面電荷（ζ電位）が＋２０ｍＶ以下かつ−２０ｍＶ以上、好ましくは＋１０ｍＶ以下かつ−１０ｍＶ以上、より好ましくは＋５ｍＶ以下かつ−５ｍＶ以上である。また、「負の表面電荷」とは０ｍＶ以下、好ましくは−５ｍＶ以下、より好ましくは−１０ｍＶ以下、更に好ましくは−１５ｍＶ以下である。表面電荷（ζ電位）の下限は特に制限はないが、例えば−５０ｍＶ以上、好ましくは−４０ｍＶ以上、より好ましくは−３０ｍＶ以上である。抗原もしくは薬物送達複合体のζ電位は、市販のζ電位測定装置を用いて測定することができる。
【０１１２】
本発明の複合体は実質的に非荷電もしくは負荷電であることから、静脈内投与等の全身投与によっても、ＰＥＩ等のカチオン性ポリマーやカチオン性リポソームを用いた従来のキャリア分子のように赤血球の凝集を引き起こすことがない。また、標的以外の細胞への非特異的な抗原の送達も低減される。
【０１１３】
本発明の複合体は、５００ｎｍ以下、好ましくは３００ｎｍ以下、更に好ましくは２００ｎｍ以下の平均粒径を有する。複合体の粒径分布及び平均粒径は、例えば動的光散乱測定装置を用いて得られる散乱強度分布から算出することができる。
【０１１４】
従来、粒子サイズを大きくして標的部位の細網内皮系に塞栓させることによって肺などの臓器への移行性を向上させる試みがなされてきたが、この手法では粒子が全身の毛細血管に詰まって、塞栓症を引き起こす危険性があった。これに対し、本発明の複合体は、カチオン性複合体とほぼ同等の粒子サイズで十分な滞留性を実現し、かつ特定の臓器への抗原もしくは薬物の送達効率を向上させ得ることから、安全に全身投与が可能である。
【０１１５】
本発明の複合体は、アニオン性分子を含まない、ＰＥＩ等のカチオン性ポリマーを用いたカチオン性複合体と比較して顕著に細胞毒性が低減されるので、望ましくない副作用を最小限に抑えることができる。
【０１１６】
本発明の複合体は、単独で、あるいは薬理学上許容されうる担体とともに常套手段に従って製剤化し、医薬もしくは試薬組成物として使用することができる。複合体を試薬組成物として製剤化する場合は、該複合体は、そのままで、あるいは例えば水もしくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、通常の細胞培養で用いられる培地（例えばＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＨＡＭ  Ｆ−１２、イーグル培地等）等の水性溶媒、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯなどの有機溶媒もしくは水性溶媒と有機溶媒との混合液等）との無菌性溶液もしくは懸濁液として提供され得る。該組成物は適宜、自体公知の生理学的に許容し得る賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等を含むことができる。
【０１１７】
また、本発明の複合体を医薬組成物として製剤化する場合は、該複合体は、そのままで、あるいは医薬上許容される担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって経口剤（例えば錠剤、カプセル剤等）あるいは非経口剤（例えば注射剤、スプレー剤等）として製造することができる。
【０１１８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチンなどのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料に更に油脂のような液状担体を含有することができる。注射剤用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例：エタノール）、ポリアルコール（例：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例：ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【０１１９】
また、上記医薬組成物は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸など）などと配合してもよい。
【０１２０】
本発明はまた、上記本発明の複合体を細胞に接触させることを特徴とする、該細胞内への抗原もしくは薬物送達方法を提供する。
【０１２１】
細胞の種類は特に限定されず、原核生物及び真核生物の細胞を用いることができるが、好ましくは真核生物の細胞である。真核生物の種類も、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（カエル等）、魚類（ゼブラフィッシュ、メダカ等）などの脊椎動物、昆虫（蚕、蛾、ショウジョウバエ等）などの非脊椎動物、植物、酵母等の微生物等が挙げられる。より好ましくは、本発明で対象とされる細胞は、動物もしくは植物細胞、更に好ましくは哺乳動物細胞である。当該細胞は、癌細胞を含む培養細胞株であっても、個体や組織より単離された細胞、あるいは組織もしくは組織片の細胞であってもよい。また、細胞は接着細胞であっても、非接着細胞であってもよい。
【０１２２】
本発明の複合体と細胞とを接触させる工程をより具体的に説明すると、例えば次の通りである。
【０１２３】
即ち、細胞は本発明の複合体との接触の数日前に適当な培地に懸濁され、適切な条件で培養される。複合体との接触時において、細胞は増殖期にあってもよいし、そうでなくてもよい。接触時の培養液は、血清含有培地であっても血清不含培地であってもよいが、培地中の血清濃度は３０％以下、好ましくは２０％以下である。培地中に過剰な血清等の蛋白質が含まれていると、複合体と細胞との接触が阻害される可能性があるからである。
【０１２４】
接触時の細胞密度は、特に限定されず、細胞の種類等を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常０．１×１０５〜５×１０５細胞／ｍＬ、好ましくは０．１×１０５〜４×１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは０．１×１０５〜３×１０５細胞／ｍＬ、更に好ましくは０．２×１０５〜３×１０５細胞／ｍＬ、最も好ましくは０．２×１０５〜２×１０５細胞／ｍＬの範囲である。
【０１２５】
このように調製された細胞を含む培地に、複合体含有溶液を添加する。複合体含有溶液の添加量は、特に限定されず、細胞数等を考慮して適宜設定することが可能であるが、培地１ｍＬにつき、通常１〜１０００μＬ、好ましくは１〜５００μＬ、より好ましくは１〜３００μＬ、更に好ましくは１〜２００μＬ、最も好ましくは１〜１００μＬの範囲である。
【０１２６】
培地に複合体含有溶液を添加し、細胞を培養する際の温度、湿度、ＣＯ２濃度等は、細胞の種類を考慮して適宜設定することができる。哺乳動物の細胞の場合は、通常約３７℃、湿度約９５％、ＣＯ２濃度は約５％である。
【０１２７】
また、培養時間についても、用いる細胞の種類等の条件を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常１〜７２時間、好ましくは１〜６０時間、より好ましくは１〜４８時間、更に好ましくは１〜４０時間、最も好ましくは１〜３２時間の範囲である。
上記培養時間が短すぎると、抗原もしくは薬物が十分細胞内へ導入されず、培養時間が長すぎると、細胞が弱ることがある。
【０１２８】
上記培養により、抗原もしくは薬物が細胞内へ導入されるが、好ましくは培地を新鮮な培地と交換するか、培地に新鮮な培地を添加して更に培養を続ける。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、新鮮な培地は血清又は栄養因子を含むことが好ましい。
更なる培養の時間は、抗原もしくは薬物に期待される機能等を考慮して、適宜設定することが可能であるが、抗原もしくは薬物が発現ベクター等のプラスミドＤＮＡである場合は、通常８〜７２時間、好ましくは８〜６０時間、より好ましくは８〜４８時間、更に好ましくは８〜３６時間、最も好ましくは１２〜３２時間の範囲である。
【０１２９】
本発明はまた、上記本発明の複合体を対象に投与することを特徴とする、該動物の細胞または臓器への抗原もしくは薬物送達方法を提供する。
即ち、本発明の複合体を対象に投与することにより、該複合体が標的細胞または標的臓器へ到達・接触し、生体内で該複合体に含まれる抗原もしくは薬物が細胞または臓器へと導入される。
【０１３０】
本発明の複合体を投与可能な対象としては、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（カエル等）、魚類（ゼブラフィッシュ、メダカ等）などの脊椎動物、昆虫（蚕、蛾、ショウジョウバエ等）などの無脊椎動物、植物等を挙げることができる。好ましくは、該複合体の投与対象としては、ヒト又は他の哺乳動物が挙げられる。
【０１３１】
本発明の複合体の投与方法は、標的細胞または標的臓器へ該複合体が到達・接触し、該複合体に含まれる抗原もしくは薬物を細胞または臓器へと導入可能な範囲で特に限定されず、抗原もしくは薬物の種類や、標的細胞または標的臓器の種類や部位等を考慮して、自体公知の投与方法（経口投与、非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、スプレー等）等）を適宜選択することができる。
【０１３２】
本発明の複合体の投与量は、抗原もしくは薬物の細胞または臓器への導入を達成可能な範囲で特に限定されず、投与対象の種類、投与方法、抗原もしくは薬物の種類、標的細胞または標的臓器の種類や部位等を考慮して適宜選択することができるが、経口投与の場合、一般的に例えばヒト（体重６０ｋｇとして）においては、その１回投与量は複合体として約０.００１ｍｇ〜１００００ｍｇである。非経口的に投与する場合（例えば静脈内投与等）は、一般的に例えばヒト（体重６０ｋｇとして）においては、その１回投与量は複合体として約０.０００１ｍｇ〜３０００ｍｇである。
【０１３３】
本発明の複合体は、静脈投与等の全身投与後に、アニオン性分子としてγ−ＰＧＡ、ＣＳもしくはＡＧＡ又はそれらの塩、好ましくはγ−ＰＧＡもしくはＣＳ又はそれらの塩、より好ましくはγ−ＰＧＡ又はその塩を用いた場合には、脾臓に高い選択性をもって送達される。
【０１３４】
本発明はまた、本発明の複合体を含有するワクチンに関する。
具体的には、抗原もしくは薬物として病原体抗原又はそれをコードするＤＮＡを用いた場合に感染症ワクチンとして使用することができ、抗原もしくは薬物として癌抗原を用いた場合に癌ワクチンとして使用することができる（以下、本発明の感染症ワクチン及び癌ワクチンを総称して本発明のワクチンともいう）。
【０１３５】
本発明のワクチンに含められる本発明の複合体は、前述のものと同様のものを使用することができる。
【０１３６】
本発明のワクチンは、本発明の複合体そのものであっても良いが、上記医薬上許容される担体等とともに当分野で通常行われる方法で製剤化したものを使用しても良い。
【０１３７】
なお、本発明のワクチンも、本発明の複合体と同様、塞栓症等を生じる危険性の観点から、平均粒径は５００ｎｍ以下、好ましくは３００ｎｍ以下、更に好ましくは２００ｎｍ以下である。
【０１３８】
本発明のワクチンは、上記した生理学的に許容し得る液、医薬上許容される担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等を添加して使用することもできる。
【０１３９】
本発明のワクチンもまた、本発明の複合体と同様にして細胞に接触させることにより該細胞内へ抗原を送達し、免疫を高めることができる。
【０１４０】
更に、本発明のワクチンは、本発明の複合体と同様にして哺乳動物に投与することにより該動物の細胞内へ抗原を送達し、免疫を高めることができる。
【０１４１】
あるいは本発明は、イメージング用核種を送達するための輸送体として用いられる、薬物送達複合体に関する。
本発明の複合体は、自身が有する指向性に基づいて特定の細胞または臓器に送達されるので、上記輸送体（以下、本発明の輸送体と記載する場合がある）は、プローブのみを用いる従来の診断方法・イメージング方法に比べて、目的部位をより正確に診断することが可能である。
本発明の輸送体は、本発明の複合体そのものであってもよいし、本発明の複合体を含んでなるものであってもよい。
【０１４２】
前記のように、本発明の複合体をイメージング用核種の輸送体（以下、イメージングプローブと記載する場合がある）に適用する場合、本発明の薬物は、薬物複合体として製造することが好ましい。カチオン性デンドリマーが有するカチオン性の基（例、アミノ基）には、共有結合を介して色素や蛍光色素分子などの薬物を導入することができ、またキレート剤にも、放射性核種やＭＲＩ造影剤、ランタノイドなどの薬物を導入することが可能である。このようなカチオン性デンドリマーとキレート剤との複合体として製造された薬物を適用することによって、本発明の輸送体は、マルチモダリティイメージングプローブとしての適用も可能となり得る。
【０１４３】
上記薬物複合体に対し適用されるカチオン性分子およびアニオン性分子としては特に限定されず、本明細書の記載から適切な分子を選択することが可能である。
しかしながら、特にリンパ節のイメージングを行う場合、カチオン性分子としてポリエチレンイミンを選択し、アニオン性分子としてγ−ポリグルタミン酸を選択することが好ましい。
この薬物複合体／ポリエチレンイミン／γ−ポリグルタミン酸の組合せにより、本発明の複合体がリンパ節への指向性を有するようになるため、薬物複合体に含まれるイメージング用核種によって、様々な用途に適したリンパ節イメージングが可能となる。
【０１４４】
本発明におけるリンパ節としては、センチネルリンパ節が好ましい。
センチネルリンパ節は、腫瘍からリンパ流に入った癌細胞が最初に到達し、領域リンパ節の中で最初に転移が生ずるリンパ節のことをいう。そのため、悪性腫瘍から他組織への転移が起こっているか否かを判別する上でセンチネルリンパ節の生検を行う必要があるが、センチネルリンパ節は肉眼で区別することができないため、確実に採取する上でイメージングは重要である。
【０１４５】
これまでにセンチネルリンパ節を検出するためのトレーサーが幾つか開発されているが、検出法が限定されており、異なる方法でイメージングを行うと、トレーサーの挙動の違いにより異なる結果が得られる場合があった。またセンチネルリンパ節への移行性、滞留性という点でも、望ましいトレーサーは得られていなかった。
本発明によれば、様々なイメージング法に適用可能であり、かつリンパ節への指向性を有し、特にセンチネルリンパ節に滞留可能なイメージング用核種の輸送体が提供される。すなわち、抗原もしくは薬物が、イメージング用核種、カチオン性デンドリマーおよびキレート剤からなる複合体であり；カチオン性分子が、ポリエチレンイミンであり；アニオン性分子が、γ−ポリグルタミン酸であり；そしてリンパ節（特にセンチネルリンパ節）への指向性を有することを特徴とする複合体を含む、イメージング用核種の輸送体が提供される。
【０１４６】
本発明はまた、本発明の複合体を用いたイメージング方法に関する。
この場合、本発明の複合体における、抗原もしくは薬物、カチオン性分子、アニオン性分子のいずれかが診断装置（方法）やイメージング装置（方法）に適した修飾をうけていることが望ましく、そのような修飾としては、種々の核種（例えば、ＰＥＴ用放射性核種、ＳＰＥＣＴ用放射性核種など）による標識、ＭＲＩ造影剤（ＭＲＩ造影効果を有する元素）による標識、蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒなど）による標識、酵素（例えば、ペルオキシダーゼなど）による標識などが挙げられる。
【０１４７】
特にセンチネルリンパ節のイメージングを行う場合、抗原もしくは薬物としては、イメージング用核種、カチオン性デンドリマーおよびキレート剤からなる複合体を選択し、カチオン性分子としてポリエチレンイミンを選択し、アニオン性分子としてγ−ポリグルタミン酸を選択することが好ましい。これにより、センチネルリンパ節を様々なイメージング法でイメージングすることが可能である。
【０１４８】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【０１４９】
（実施例１）
方法
マラリア抗原ＭＳＰ−１をコードしたｐＤＮＡであるｐＭＳＰ−１とポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、γ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）の電荷比が１：８：６になるようにｐＭＳＰ−1／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体を作製した。また、薬効を持たないホタルルシフェラーゼをコードしたｐＣＭＶ−Ｌｕｃを用いたｐＣＭＶ−Ｌｕｃ／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体をコントロールのために用いた。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体をＤＮＡ量として４０μｇ（Ａ）、ｐＭＳＰ−1／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体をＤＮＡ量として０．４（Ｂ）、４（Ｃ）、４０（Ｄ）、８０（Ｅ）μｇになるようにマウスに三週間おきに計三回静脈内投与した。最終免疫から１０日後にマウス血清を採取し、ＥＬＩＳＡを用いてマラリアに対する抗体価を測定した。また、最終免疫から三週間後にマウスにマラリア原虫を感染させ、感染後のマウスの生存を経日的に観察した。【０１５０】
結果
ワクチン抗体価を図１に示す。血清希釈が３２０倍以上である場合には抗体価に差異はないが、希釈倍率がそれより低い場合には複合体に含まれるｐＤＮＡ量の多いものの方がより高い抗体価であった。また、コントロール群では抗体価の上昇は認められなかった。
マラリア感染後の生存率を図２に示す。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体投与群、又はｐＭＳＰ−1／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体投与群のｐＤＮＡ量が〜４μｇの場合は感染後９日で生存率がほぼ０％になったのに対して、ｐＤＮＡが４０μｇと８０μｇの場合は９日経過後も生存率が高く保たれていた。【０１５１】
（実施例２）
方法
不活化インフルエンザウイルス（Ｖａｃｃｉｎｅ）を塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）とγ−ＰＧＡを用いて微粒子化したＶａｃｃｉｎｅ／ＢＡＣ／γ−ＰＧＡ複合体を作製した。Ｖａｃｃｉｎｅ単体、ＶａｃｃｉｎｅにＢＡＣ又はγ−ＰＧＡのいずれかを混合したもの、あるいはＶａｃｃｉｎｅ／ＢＡＣ／γ−ＰＧＡ複合体をマウスに投与し、４週間後に採血し、インフルエンザウイルスに対する抗体価をＥＬＩＳＡを用いて測定した。【０１５２】
結果
図３には各ワクチンの抗体産生効果（ワクチン抗体価）を示す。ＶａｃｃｉｎｅにＢＡＣ又はγ−ＰＧＡのいずれかを混合しても、抗体価はＶａｃｃｉｎｅ単体と有意な差異は得られなかったが、Ｖａｃｃｉｎｅ／ＢＡＣ／γ−ＰＧＡ複合体はＶａｃｃｉｎｅ単体と比較して有意に高い抗体価が得られた。【０１５３】
（実施例３）
方法
モデルタンパク質として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）をローダミンＢイソチオシアネートを用いて蛍光標識したものを用いた。ＢＳＡ又はＢＳＡに塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）とγ−ＰＧＡを用いて作製したＢＳＡ／ＢＡＣ／γ−ＰＧＡ複合体を樹状細胞株であるＤＣ２．４細胞に添加し、２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、２２時間後に細胞の蛍光像を蛍光顕微鏡を用いて測定した。【０１５４】
結果
細胞の蛍光顕微鏡観察像を図４に示す。ＢＳＡのみでは細胞内取り込みは認められなかったが、ＢＳＡ／ＢＡＣ／γ−ＰＧＡ複合体を添加した細胞においてはＢＳＡの蛍光が強く観察され、ＢＳＡ／ＢＡＣ／γ−ＰＧＡ複合体が樹状細胞に高い細胞内取り込みを示すことが明らかとなった。【０１５５】
（実施例４）
方法
メラノーマ抗原遺伝子としてｇｐ１００とＴＲＰ−２のユビキチン化エピトープをコードしたｐＤＮＡであるｐＵｂ−ＭとＰＥＩ、γ−ＰＧＡの配合比（電荷比）が１：８：６になるようにｐＵｂ−Ｍ／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体を作製した。Ｃ５７ＢＬマウスに５％糖液（ｃｏｎｔｒｏｌ）又はｐＵｂ−Ｍのみ、薬効をもたないｐＣＭＶ−ＬｕｃとＰＥＩ、γ−ＰＧＡを用いて作製したｐＣＭＶ−Ｌｕｃ／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体、ｐＵｂ−Ｍ／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体を二週間おきに計四回投与し、免疫を惹起した。最終免疫から二週間後にメラノーマ細胞株Ｂ１６−Ｆ１０細胞、又はルシフェラーゼを恒常発現したＢ１６−Ｆ１０−Ｌｕｃ細胞を皮内又は静脈内に投与し、それぞれ皮内移植モデルと肺転移モデルを作製した。皮内移植モデルの腫瘍径を経日的に測定した。また、肺転移モデル作製から２１日目に肺を摘出し、観察した後に、肺のルシフェラーゼ活性を測定し、肺転移細胞数を算出した。【０１５６】
結果
皮内移植された悪性黒色腫の腫瘍重量の変化を図５に示す。ｐＵｂ−Ｍのみ、又はｐＣＭＶ−Ｌｕｃ／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体を投与したマウスの腫瘍増殖はコントロール群と有意な差異は認められなかったが、ｐＵｂ−Ｍ／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体を投与したマウスの腫瘍増殖はコントロール群と比較して有意に低値を示した。
静脈注入された悪性黒色腫の肺転移の様子を図６に示す。また、肺転移した細胞数を図７に示す。５％糖液投与群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べ、ｐＵｂ−Ｍ／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体投与群では肺転移が顕著に抑制された。【０１５７】
（実施例５）
方法
ｐＤＮＡ（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）とＰＥＩを混合し、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を調製した。また、このｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体にＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）を添加し、さらにＮ−ラウロイルザルコシン（ＬＳ）を添加することで新規薬物送達複合体を調製した。ｐＤＮＡとＰＥＩとＤＯＴＭＡとＬＳの配合比（電荷比）が１：２：０：０、１：２：２：０、１：２：２：２、１：２：２：４になるように各複合体を作製し、粒子径と表面電荷を測定した。更に、配合比（電荷比）を１：２：２：０、１：２：２：２、１：２：２：４とした複合体をそれぞれマウスに尾静脈内投与し、６時間後に肝臓、脾臓、及び肺の遺伝子発現を調べた。また、１：８：０：０の複合体を対照として用いた。
配合比（電荷比）が１：８：０：０と１：２：２：２の複合体をマウスに投与し、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング装置を用いて遺伝子発現を観察した。
また、様々な配合比（電荷比）の複合体を作製し、多変量解析を用いて各成分の肺における遺伝子発現量に及ぼす寄与率を測定した。【０１５８】
結果
粒子サイズと表面電荷を図８に示す。粒子サイズはＬＳを添加してもほぼ一定であり、表面電荷はＬＳ添加により負電荷に近づくことが確認された。
ルシフェラーゼ活性を図９に示す。ＬＳの添加によって肺における遺伝子発現量が著しく上昇した。
ルシフェラーゼでイメージングされたマウスを図１０に示す。ＬＳを添加した複合体では、肺でルシフェラーゼが高発現していることが確認された。
多変数のスプライン補間法及び寄与指数を図１１に示す。これより肺への送達にはＬＳが最も寄与することが明らかになった。【０１５９】
（実施例６）
方法
ホスファチジルセリン(ＤＯＰＳ)のみからなるリポソームを作製した。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃを用いて作製したｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体にＤＯＰＳリポソームをｐＤＮＡとＰＥＩ、ＤＯＰＳの配合比（電荷比）が１：８：６になるように添加して、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ／ＤＯＰＳ複合体を作製した。ｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体とｐＤＮＡ／ＰＥＩ／ＤＯＰＳ複合体をマウスに静脈内投与し、６時間後に各臓器の遺伝子発現量を測定した。【０１６０】
結果
各臓器における遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）を図１２に示す。ｐＤＮＡ／ＰＥＩ／ＤＯＰＳ複合体はｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体に比べ、特に脾臓に高い遺伝子発現効果を示すことが明らかにされた。【０１６１】
（実施例７）
方法
癌表面抗原ＭＵＣ１を認識するアプタマーに加え、非特異配列のアプタマーを用いた。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃとポリエチレンイミンの電荷比が１：８になるようにｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を作製した。ｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体にｐＤＮＡとＰＥＩ、アプタマーの配合比（電荷比）が１：８：１．２５、１：８：２．５、１：８：５、１：８：１０になるようにアプタマーをそれぞれ添加することで、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ／アプタマー複合体を作製し、粒子径と表面電荷を測定した。また、電荷比が１：８：１０の複合体のＡ５４９細胞（ＭＵＣ１＋）における遺伝子発現量を測定した。
ｐＤＮＡとＰＥＩの電荷比が１：８になるようにｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を作製した。ＳＴＥＡＰ−４（ｓｉｘ−ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−４：脂肪細胞の膜タンパク質）に対する抗体を１０μｇのｐＤＮＡを含んだｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体に２００、３００、４００μｇそれぞれ添加することで、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ／抗体複合体を作製し、粒子径と表面電荷とを測定した。【０１６２】
結果
アプタマーで被覆した複合体の粒子サイズ及び表面電荷を図１３に示す。ｐＤＮＡ／ＰＥＩ／アプタマー複合体の配合比（電荷比）が１：８：１０であるとき粒子サイズが小さく表面電荷が負になり、最も好ましい複合体が得られた。
ＭＵＣ１発現細胞におけるルシフェラーゼ活性を図１４に示す。ＭＵＣ１を発現したＡ５４９細胞では、ＭＵＣ１に対するアプタマーで被覆した複合体が非特異的なアプタマーに比べて顕著にルシフェラーゼ活性が高かった。
抗体で被覆した複合体の粒子サイズと表面電荷を図１５に示す。粒子サイズは抗体が３００μｇであるときに最も小さくなり、表面電荷は抗体で被覆した複合体いずれでも差異は見られなかった。したがって、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ／抗体３００μｇの複合体が最も適していると考えられた。【０１６３】
（実施例８）
方法
ｐＣＭＶ−Ｌｕｃを用いて作製したｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体にグリチルリチンをｐＤＮＡとＰＥＩ、ＧＬＹの配合比（電荷比）が１：８：１２になるように添加して、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ／ＧＬＹ複合体を作製した。ｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体（市販の遺伝子ベクター）とｐＤＮＡ／ＰＥＩ／ＧＬＹ複合体（新規遺伝子ベクター）をマウスに静脈内投与し、６時間後に各臓器の遺伝子発現量を測定した。【０１６４】
結果
各臓器における遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）を図１６に示す。ｐＤＮＡ／ＰＥＩ／ＧＬＹ複合体はｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体に比べ、特に肝臓に高い遺伝子発現効果を示すことが明らかにされた。【０１６５】
（実施例９）
方法
蛍光色素を用いて蛍光標識した不活化インフルエンザウイルス（以下Ｖａｃｃｉｎｅ）に塩化ベンザルコニウム（ＢＫ）とγ―ＰＧＡを自己組織化したＶａｃｃｉｎｅ／ＢＡＣ／γ−ＰＧＡ複合体を作成し、樹状細胞株（ＤＣ２．４）に添加した。【０１６６】
結果
不活化ウイルスの取り込みおよびマウスの抗体価を図１７に示す。ウイルス単体では樹状細胞への取り込みが認められなかったが、Ｖａｃｃｉｎｅ／ＢＡＣ／γ−ＰＧＡ複合体にする事によって、取り込み量が大きく増加した。【０１６７】
（実施例１０）
方法
ｐＣＭＶ−Ｌｕｃを用いて作製したｐＤＮＡ／ＰＥＩ複合体にγ−ＰＧＡをｐＤＮＡとＰＥＩ、γ−ＰＧＡの配合比（電荷比）が１：８：６になるように添加して、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体を作製した。樹状細胞株ＤＣ２．４細胞にｐＤＮＡのみ、ｐＤＮＡ＋γ−ＰＧＡ、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体、市販の遺伝子ベクターとしてＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎとｐＤＮＡとの複合体を添加し、２２時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。【０１６８】
結果
樹状細胞株における遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）を図１８に示す。ｐＤＮＡのみ、またはｐＤＮＡとγ-ＰＧＡを添加しても遺伝子発現は得られなかったが、ｐＤＮＡ／ＰＥＩ／γ-ＰＧＡ複合体は市販の遺伝子ベクターと比較して顕著に高い遺伝子発現効果を示した。【０１６９】
（実施例１１）
方法
ｓｉＲＮＡに対し、どのような複合体が最も機能するのかを試験するために、ルシフェラーゼ活性を指標とした遺伝子抑制試験を行った。ルシフェラーゼを恒常発現した大腸癌細胞株ｃｏｌｏｎ２６細胞を用いた。ｓｉＲＮＡとしてルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡに、市販の遺伝子ベクターであるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉｍａｘまたはＰＥＩ、ポリアルギニン（ＰＬＡ）、ＤＯＴＭＡ−Ｃｈｏｌリポソーム、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥリポソーム、ＤＣ−Ｃｈｏｌ−ＥｇｇＰＣリポソーム、ＤＣ−Ｃｈｏｌ−ＤＯＰＥリポソームと混合し、カチオン性の複合体を作成した。さらに、γ−ＰＧＡを添加し、それぞれ、アニオン性の複合体を構築した。各複合体を細胞に添加し、２２時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。値は未処理の細胞のルシフェラーゼ活性を１００％として算出した。【０１７０】
結果
ルシフェラーゼ活性を指標とした遺伝子抑制効率を図１９に示す。様々なカチオン性の高分子やリポソームを検討した結果、ｓｉＲＮＡにはカチオン性分子として、高分子よりリポソームが適していた。さらに、膜融合脂質であるＤＯＰＥを含有したリポソームとｓｉＲＮＡとの複合体をγ−ＰＧＡを用いて被膜することで、市販のｓｉＲＮＡベクターと匹敵する効果を示しながら、標的化が可能なベクターを開発できた。【０１７１】
（実施例１２）
方法
複合体の投与量（ＤＮＡ量として）を１００μｇに増加した以外は実施例１と同様にして、マウスにマラリアＤＮＡワクチン（ｐＭＳＰ−１）のみまたはｐＭＳＰ−１／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体を３週間おきに計三回投与し、最終免疫から１０日後にマラリア原虫を感染させた。【０１７２】
結果
マラリア感染後のマウスの生存率を図１２に示す。ＤＮＡワクチンのみではマラリアの感染抑制効果はほとんど得られなかったが、ｐＭＳＰ−１／ＰＥＩ／γ−ＰＧＡ複合体を投与することで、マラリアの感染を１００％抑制することが可能であった。【０１７３】
（実施例１３）
方法
卵白アルブミン（ＯＶＡ）と塩化ベンザルコニウム（ＢＫ）、γ−ＰＧＡを用いてＯＶＡ/ＢＫ/γ−ＰＧＡ複合体を構築した。マウスにＯＶＡのみ、塩化ベンザルコニウムとγ−ＰＧＡ（ベクターのみ）、ＯＶＡ/ＢＫ/γ−ＰＧＡ複合体をそれぞれ一週間おきに計４回投与して免疫感作させ、最終免疫から２週間後に血清を採取し、ＥＬＩＳＡでＯＶＡに対する抗体価を測定した。抗体価の測定には二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。【０１７４】
結果
マウス血清における抗体価を図２１（Ａ：血清を希釈した場合の抗体価の変動、Ｂ：希釈率  １０−４  における血清の抗体価）に示す。ＯＶＡのみやＢＫとγ−ＰＧＡの混合物では免疫誘導効果が得られなかったが、塩化ベンザルコニウムとγ−ＰＧＡを用いて作成したＯＶＡ/ＢＫ/γ−ＰＧＡ複合体は高い液性免疫誘導効果を示した。【０１７５】
（実施例１４）
方法
卵白アルブミン（ＯＶＡ）と塩化ベンザルコニウム（ＢＫ）、γ−ＰＧＡを用いてＯＶＡ/ＢＫ/γ−ＰＧＡ複合体を構築した。マウスにＯＶＡのみ、塩化ベンザルコニウムとγ−ＰＧＡ（ベクターのみ）、ＯＶＡ/ＢＫ/γ−ＰＧＡ複合体を一週間おきに計４回投与し、最終免疫から２週間後にＯＶＡ発現癌細胞（ＥＧ７）を皮内に移植し、移植後の腫瘍増殖を観察した。【０１７６】
結果
ＥＧ７の腫瘍移植からの腫瘍増殖の観察結果を図２２に示す。ＯＶＡのみやＢＫとγ−ＰＧＡの混合物では腫瘍増殖抑制効果が得られなかったが、ＯＶＡ/ＢＫ/γ−ＰＧＡ複合体を投与したマウスでは、高い免疫誘導効果によって、ＯＶＡ発現癌細胞を完全に抑制することが可能であった。【０１７７】
（実施例１５）
方法
ポリアミドアミンデンドリマー（Ｇ４）とｐ−ＳＣＮ  ｂｅｎｚｙｌ  ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ  ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＴＰＡ）を反応させることでＧ４の１分子に対し約５３個のＤＴＰＡを導入したＧ４−ＤＴＰＡを合成した。これをＰＥＩと混合させることでＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡとした後、γ−ＰＧＡと混合し、γ−ＰＧＡ／ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡを作製した。一方、１１１Ｉｎ標識体はＧ４−ＤＴＰＡ−１１１Ｉｎを用いて同様の方法で作製した。粒子径とゼータ電位を測定したところ、膜電位４７．７±６．０ｍＶ、粒子径３０．２±３．２ｎｍのＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡと膜電位−４８．９±１．６ｍＶ、粒子径２４．８±３．７ｎｍのγ−ＰＧＡ／ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡの生成を確認した。比較対照として別のアニオン性高分子であるアルギン酸（ＡＬＧ）を含有するＡＬＧ／ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡ  およびその１１１Ｉｎ標識体も同様の操作で作製した。
ＲＡＷ２６４にＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡ、γ−ＰＧＡ／ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡ、ＡＬＧ／ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡを添加し、細胞障害性を評価した。さらに、各複合体を雄性ラットのｆｏｏｔ  ｐａｄから投与し、経時的に各臓器での放射能を測定することにより各粒子の生体内分布を評価した。【０１７８】
結果
ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡでは非常に強い細胞障害性を示したが、γ−ＰＧＡ／ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡ、ＡＬＧ／ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡでは細胞障害性が認められなかった（図２３）。また、マウス赤血球を用いて各複合体の赤血球凝集能、溶血性を評価した結果、ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡでは赤血球の著しい凝集とわずかな溶血が確認されたが、γ−ＰＧＡ／ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡ、ＡＬＧ／ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡでは赤血球の凝集、溶血は認められなかった。  γ−ＰＧＡ／ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡ−１１１Ｉｎの投与２４時間後におけるセンチネルリンパ節への集積は、他の複合体よりも有意に高いものであった。また、いずれの複合体でもセンチネルリンパ節、投与部位以外の臓器への取り込みは非常に低い値を示し、各複合体のリンパ管から血管への漏出は起こりにくいことが示された（図２４）。またＳＰＥＣＴ／ＣＴ撮像においても、γ−ＰＧＡ／ＰＥＩ／Ｇ４−ＤＴＰＡ−１１１Ｉｎは他の複合体に比べてセンチネルリンパ節へ高く集積し、明瞭なイメージングに成功した（図２５）。
【産業上の利用可能性】
【０１７９】
本発明の複合体は、赤血球凝集を引き起こさず、また細胞毒性も低く、しかも細胞内取り込み効率に優れるので、安全かつ有効に抗原や薬物を送達することができる。
特に本発明の複合体は、標的となる細胞や臓器への高い指向性を有することを特徴とするので、新たなドラッグデリバリーシステムの有効成分となり得る。
さらに本発明の複合体は、イメージングプローブの輸送体として用いることも可能である。  【０１８０】
本出願は、日本で出願された特願２０１０−０４３１８６（出願日：２０１０年２月２６日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図３】
2011105520.tif 000009
【図５】
2011105520.tif 000010
【図７】
2011105520.tif 000011
【図８】
2011105520.tif 000012
【図９】
2011105520.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
2011105520.tif 000015
【図１４】
2011105520.tif 000016
【図１５】
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【図１６】
2011105520.tif 000018
【図１８】
2011105520.tif 000019
【図１９】
2011105520.tif 000020
【図２０】
2011105520.tif 000021
【図２１】
2011105520.tif 000022
【図２２】
2011105520.tif 000023
【図２３】
2011105520.tif 000024
【図２４】
2011105520.tif 000025
【図１】
2011105520.tif 000026
【図２】
2011105520.tif 000027
【図４】
2011105520.tif 000028
【図６】
2011105520.tif 000029
【図１０】
2011105520.tif 000030
【図１１】
2011105520.tif 000031
【図１７】
2011105520.tif 000032
【図２５】
2011105520.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成24年1月20日(2012.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸とポリエチレンイミンとの複合体、ならびにそれを内包するホスファチジルセリンを含有し；
核酸、ポリエチレンイミン、ホスファチジルセリンの配合比が１：２：４〜１：８：８であり；かつ
核酸を脾臓に送達するための、核酸送達複合体。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
核酸とカチオン性分子との複合体、ならびにそれを内包するラウロイルザルコシンを含有し；
カチオン性分子が、カチオン性高分子およびカチオン性脂質からなり；
カチオン性高分子がポリエチレンイミンであり、カチオン性脂質がＤＯＴＭＡであり；
核酸、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ラウロイルザルコシンの配合比が１：２：２：１〜１：２：２：４であり；かつ
核酸を肺に送達するための、核酸送達複合体。
【請求項６】
核酸とポリエチレンイミンとの複合体、ならびにそれを内包するグリチルリチンを含有し；
核酸、ポリエチレンイミン、グリチルリチンの配合比が１：２：８〜１：８：１６であり；かつ
核酸を肝臓に送達するための、核酸送達複合体。
【請求項７】
核酸とポリエチレンイミンとの複合体、ならびにそれを内包するγ−ポリグルタミン酸を含有し；
核酸、ポリエチレンイミン、γ−ポリグルタミン酸の配合比が１：８：６であり；かつ
核酸を樹状細胞または脾臓に送達するための、核酸送達複合体。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
核酸を樹状細胞に送達するための、請求項７に記載の複合体。
【請求項１９】
請求項７または１８に記載の複合体を含有してなる、感染症ワクチンまたは癌ワクチン。
【請求項２０】
請求項１、５〜７および１８のいずれか一項に記載の複合体を含有してなる、イメージング用核種の輸送体。
【請求項２１】
イメージング用核種、カチオン性デンドリマーおよびキレート剤からなる薬物複合体；ポリエチレンイミン；ならびにγ−ポリグルタミン酸から構成される複合体を含有してなる、リンパ節のイメージングのためのイメージング用核種の輸送体。
【請求項２２】
イメージング用核種、カチオン性デンドリマーおよびキレート剤からなる薬物複合体；ポリエチレンイミン；ならびにγ−ポリグルタミン酸から構成される複合体を用いることを特徴とする、センチネルリンパ節のイメージング方法。
【国際調査報告】
2011105520.tif 000034
2011105520.tif 000035
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2011105520.tif 000039
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