(57)【要約】  転写抑制因子ＧｎｔＲの活性が不活化されていると共に、イソプロピルアルコール生産系と、好ましくは更に、該ＧｎｔＲの活性の不活性化に伴うイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性発現パターンの補助酵素群と、を備えたイソプロピルアルコール生産大腸菌と、このイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法と、該生産方法で得られたイソプロピルアルコールに、酸化亜鉛及び周期律表の第４族の少なくとも１種の酸化物を含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を接触させることを含むアセトン生産方法と、該生産方法で得られたイソプロピルアルコール及びアセトンに、触媒として固体酸物質及びＣｕを含む水添触媒を接触させることを含む、プロピレン製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写抑制因子ＧｎｔＲの活性が不活化されていると共に、イソプロピルアルコール生産系と、該ＧｎｔＲの活性の不活化に伴うイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性発現パターンの補助酵素群とを備えたイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項２】
前記補助酵素群の酵素活性発現パターンが、
（１）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性の野生型の維持、
（２）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性の不活化と、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性の強化、
（３）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性の不活化と、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性の強化と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性の不活化、
から選択されたものである請求項１記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項３】
前記グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性が、エシェリヒア属細菌由来のグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）をコードする遺伝子に由来するものである請求項２記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項４】
前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものである請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項５】
前記イソプロピルアルコール生産系が、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものであり、かつ各酵素遺伝子が、それぞれ独立に、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種の原核生物に由来するものである請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項６】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子に由来するものである請求項４又は請求項５記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項７】
前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ及び前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの少なくとも１つの活性が、遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する請求項４に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項８】
前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子改変体が配列番号４０で表される塩基配列であり、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子改変体が配列番号４３で表される塩基配列である請求項７に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項９】
さらに、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有する請求項４〜請求項８のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
【請求項１１】
請求項１〜請求項９のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを得ること、及び
得られたイソプロピルアルコールに、触媒として、酸化亜鉛と、第４族の元素を含む少なくとも１種の酸化物とを含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を接触させることを含む、アセトン生産方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項９のいずれかの１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料から得られ且つアセトンを含有するイソプロピルアルコールに、反応温度５０〜３００℃の範囲で、触媒として固体酸物質およびＣｕを含む水添触媒を接触させることを含む、プロピレンの製造方法。
【請求項１３】
前記Ｃｕを含む水添触媒が、さらに第６族、第１２族、および第１３族のうち少なくとも一つの元素を含む触媒である請求項１２に記載のプロピレンの製造方法。
【請求項１４】
前記固体酸物質がゼオライトである請求項１２又は請求項１３に記載のプロピレンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプロピルアルコール生産細菌及びこれを用いたイソプロピルアルコール生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロピレンは、ポリプロピレンなどの合成樹脂や石油化学製品の重要な基礎原料であり、自動車用バンパーや食品容器、フィルム、医療機器などに幅広く使われている。
植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。またアセトンも溶剤、プラスチックの原料として幅広く使われている。京都議定書によって２００８年から２０１２年の間に先進国全体で二酸化炭素排出量を１９９０年比で５％削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。【０００３】
植物由来原料を資化してイソプロピルアルコールを生産する細菌は既に知られている。例えば国際公開２００９／００８３７７号には、グルコースを原料としてイソプロピルアルコールを生産するように改変された細菌が開示されており、イソプロピルアルコールの選択性が高いことから工業生産用生体触媒として優れた性質を持つと記載されている。【０００４】
イソプロピルアルコール製造大腸菌においては、イソプロピルアルコールの原料がグルコースであるため、解糖および異化によって得られる夥しい数の化合物全てが副生成物となり得る。一方これらの化合物は大腸菌が生育するために必須な物質となっている場合があるため、これらの副反応で消費されるグルコースの量を完全に抑制することはできない。このため、副生成物を最小化し且つイソプロピルアルコールの生産量を上げるために、種々の検討が為されている。【０００５】
例えば、国際公開２００９／００８３７７号パンフレットには、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各遺伝子が導入され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成細菌が開示されている。このイソプロピルアルコール生産細菌の能力は、生産速度０．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、蓄積量２８．４ｇ／Ｌであると記載されている。【０００６】
国際公開２００９／０４９２７４号及びＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７３（２４），ｐｐ．７８１４−７８１８，（２００７）には、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及び、セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造する大腸菌が開示されている。これらの細菌の能力は生産速度０．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、収率４３．５％、蓄積量４．９ｇ／Ｌであると記載されている。【０００７】
国際公開２００９／０２８５８２号には、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡ：アセテートＣｏＡ−トランスフェラーゼ及びアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造する大腸菌が開示されている。この細菌の能力は、蓄積量９．７ｇ／Ｌであると記載されている。【０００８】
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７７（６），ｐｐ．１２１９−１２２４，（２００８）には、チオラーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、プライマリー−セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造する大腸菌が開示されている。この細菌の能力は生産速度０．６ｇ／Ｌ／ｈｒ、収率５１％、蓄積量１３．６ｇ／Ｌであると記載されている。【０００９】
国際公開２００９／１０３０２６号には、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、アセチルＣｏＡ：アセテートＣｏＡ−トランスフェラーゼ及びアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造し得る大腸菌が開示されている。この細菌の能力は、収率５０％、生産速度０．４ｇ／Ｌ／ｈｒ、最終生産量１４ｇ／Ｌと期待されると記載されている。【００１０】
国際公開２００９／２４７２１７号には、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、チオラーゼ及び２−プロピルアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造し得る大腸菌が開示されている。この細菌の能力は、最終生産量２ｇ／Ｌと記載されている。【００１１】
ここで、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼ、プライマリー−セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼ及び２−プロピルアルコールデヒドロゲナーゼは、名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、アセチルＣｏＡ：アセテートＣｏＡ−トランスフェラーゼ及びＣｏＡ−トランスフェラーゼは、名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素である。また、アセト酢酸デカルボキシラーゼとアセトアセテートデカルボキシラーゼは名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素であり、チオラーゼとアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼも名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素である。従って、これらの文献によるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、生産性に種々違いはあるもののイソプロピルアルコールを製造するために利用している酵素は、国際公開第２００９／００８３７７号に記載されている、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの４種と同様のものであり、生産性や収率を向上させるなどを目的とする場合、従来は、これら４種の酵素を検討していた。【００１２】
特開平５−２６０９７９号には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓにおいて、該大腸菌が保有するＧｎｔＲ遺伝子を破壊するとＤ−リボースの生産性が上がると記載されている。【００１３】
またイソプロピルアルコールをアセトンに変換する方法としては、特開平７−５３４３３号及び特開平１１−３３５３１５号に、イソプロピルアルコールを脱水素によりアセトンを製造する固体触媒として銅系の触媒が使用されている。また英国特許第６６５３７６号には酸化亜鉛微粒子と酸化ジルコニウム微粒子を物理的に混ぜ合わせた触媒が使用されている。一般に微生物を用いて物質を生産すると不純物が含まれることが知られている。この点で、これらの技術はいずれも、微生物を用いた製造方法ではないので、不純物を含むイソプロパノールを原料として用いたとの記載はない。【００１４】
アセトンは、水添することにより容易にイソプロパノールへ変換でき、このイソプロパノールをさらに脱水反応によりプロピレンとした後にベンゼンと反応させクメンを得るプロセス。すなわち、アセトンを二段階の反応により、プロピレンへと変換することにより、クメン法の原料として再使用するプロセスが提案されている（例えば、特開平２−１７４７３７号公報参照）。
上記のような再使用においては、アセトンから高選択的にプロピレンを製造する方法を工業上、実用的に確立することが必要とされている。また、Ｃｕ（２５％）−酸化亜鉛（３５％）−酸化アルミニウム（４０％）触媒の存在下、４００℃でアセトンの水素化反応を行い、プロピレンを得る方法も知られている（例えば、東ドイツ特許  ＤＤ８４３７８号公報参照）。しかし、この方法では、反応温度が４００℃と高温であるにも関わらず、アセトン転化率が８９％と低い。また該方法ではプロピレンが水添されることによりプロパンが生成する副反応のため、プロピレン選択性も８９％と不充分である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、イソプロピルアルコールを生産可能な上記大腸菌のいずれも、充分な生産能力を有しているとは言い難く、イソプロピルアルコール生産大腸菌においてイソプロピルアルコールの生産性を向上させることは、解決すべき大きな課題であった。また、得られたイソプロピルアルコールを効果的に利用する方法を提供することも求められていた。
本発明は、イソプロピルアルコールの生産性を大幅に向上させた大腸菌、該大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産方法及びアセトン生産方法、更には該大腸菌を用いて得られたアセトンを含有するイソプロピルアルコールから、プロピレンを生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は上記状況を鑑みてなされたものであり、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌、イソプロピルアルコール生産方法及びアセトン生産方法は、以下のとおりである。
〔１〕  転写抑制因子ＧｎｔＲの活性が不活化されていると共に、イソプロピルアルコール生産系と、該ＧｎｔＲの活性の不活化に伴うイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性パターンの補助酵素群とを備えたイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔２〕  前記補助酵素群の酵素活性パターンが、
（１）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性の野生型の維持、
（２）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性の不活化と、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性の強化、
（３）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性の不活化と、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性の強化と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性の不活化、
から選択されたものである［１］記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔３〕  前記グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性が、エシェリヒア属細菌由来のグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）をコードする遺伝子に由来するものである［２］に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔４〕  前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものである［１］〜［３］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔５〕  前記イソプロピルアルコール生産系が、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものであり、かつ各酵素遺伝子が、それぞれ独立に、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種の原核生物に由来するものである［１］〜［４］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔６〕  前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子に由来するものである［４］又は［５］記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔７〕  前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ及び前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの少なくとも１つの活性が遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する［４］に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔８〕  前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子改変体が配列番号４０で表される塩基配列であり、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子改変体が配列番号４３で表される塩基配列である［７］に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔９〕  さらに、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有する［４］〜［８］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔１０〕  ［１］〜［９］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
〔１１〕  ［１］〜［９］のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを得ること、及び
得られたイソプロピルアルコールに、触媒として、酸化亜鉛と、第４族の元素を含む少なくとも１種の酸化物とを含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を接触させることを含む、アセトン生産方法。
〔１２〕  ［１］〜［９］のいずれかに記載の記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料から得られ且つアセトンを含有するイソプロピルアルコールに、反応温度５０〜３００℃の範囲で、触媒として固体酸物質およびＣｕを含む水添触媒を接触させることを含む、プロピレンの製造方法。
〔１３〕  前記Ｃｕを含む水添触媒が、さらに第６族、第１２族、および第１３族のうち少なくとも一つの元素を含む触媒である［１２］に記載のプロピレンの製造方法。
〔１４〕  前記固体酸物質がゼオライトである［１２］又は［１３］に記載のプロピレンの製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、イソプロピルアルコールを高生産できる大腸菌、該大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産方法及びアセトン生産方法、更には該大腸菌を用いて得られたアセトンを含有するイソプロピルアルコールから、プロピレンを生産する方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、転写抑制因子ＧｎｔＲの活性が不活化されていると共に、イソプロピルアルコール生産系と、該ＧｎｔＲの活性の不活化に伴うイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性パターンの補助酵素群とを備えたイソプロピルアルコール生産大腸菌である。
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌では、ＧｎｔＲ活性が不活化されていると共に、上記所定の酵素活性パターンの補助酵素群を備えているため、イソプロピルアルコールを高生産することができる。
【００１９】
即ち本発明は、イソプロピルアルコールの生産性を高めるために種々検討した結果、グルコン酸代謝の負の制御因子であるＧｎｔＲの活性を不活化することによって、該大腸菌による生成物であるイソプロピルアルコールの生産性が上がることを見出したものである。
また、この際、ＧｎｔＲの活性の不活化により向上したイソプロピルアルコール生産能に影響する酵素が存在することが見出された。これらの酵素の活性のパターンによって、ＧｎｔＲの活性の不活化により向上したイソプロピルアルコール生産能が維持又は強化される。
【００２０】
本発明における「補助酵素群」とは、このようなイソプロピルアルコール生産能に影響する１つ又は２つ以上の酵素を指す。また、補助酵素群のそれぞれの酵素活性は、不活化、活性化又は強化されており、本発明における「補助酵素群の酵素活性パターン」とは、ＧｎｔＲの活性を不活化したことのみによって得られる向上したイソプロピルアルコール生産量が、維持又は増加し得る各酵素の酵素活性パターンを指し、１つ又は２つ以上の酵素の組み合わせを包含する。
【００２１】
前記補助酵素群は、イソプロピルアルコール生産系を備え且つＧｎｔＲ活性を不活化した以外は生来の酵素（本発明では、除外することを特に断らない限り「酵素」には単独では酵素活性を示さない「因子」も含まれる）のみで構成された酵素群であってもよい。
例えば、所定のイソプロピルアルコール生産能を発揮するイソプロピルアルコール生産系を備え、且つ遺伝子組み換え技術によりＧｎｔＲを不活化した以外は、何ら人為的に変更していないイソプロピルアルコール生産大腸菌、及び、イソプロピルアルコールの生産能を高めるための改変が付与されたイソプロピルアルコール生産系を備え、且つ、遺伝子組み換え技術によりＧｎｔＲを不活化した以外は、何ら人為的に変更していないイソプロピルアルコール生産大腸菌は、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌に包含される。
【００２２】
補助酵素群の酵素活性パターンとしては、好ましくは、以下のパターンを挙げることができる：
（１）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性の野生型の維持、
（２）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性の不活化と、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性の強化、
（３）グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性の不活化と、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性の強化と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性の不活化。
なかでも、上記（３）の補助酵素群の酵素活性パターンがイソプロピルアルコール生産能の観点からより好ましい。
【００２３】
なお、本発明にかかる補助酵素群及びその酵素活性パターンは、これらに限定されず、ＧｎｔＲの活性の不活化を含み、イソプロピルアルコール生産大腸菌におけるイソプロピルアルコール生産量が増加し得る補助酵素群及びその酵素活性パターンであれば、いずれも本発明に包含される。また、補助酵素群は、必ずしも複数の酵素で構成されている必要はなく、１の酵素で構成していてもよい。
【００２４】
なお、本発明における「不活化」とは、既存のあらゆる測定系によっても測定された当該因子又は酵素の活性が、不活化前の大腸菌での活性を１００としたとき、その１／１０以下の状態を指す。
本発明における「遺伝子組換え技術により」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のＤＮＡの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
【００２５】
本発明において因子又は酵素の活性が不活化された大腸菌とは、菌体外から菌体内への何らかの方法によって、生来の活性が損なわれた細菌を指す。これらの細菌は、例えば該蛋白質又は酵素をコードする遺伝子を破壊すること（遺伝子破壊）により作出することができる。
【００２６】
本発明における遺伝子破壊としては、ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変異を入れる、別のＤＮＡを挿入する、及び、遺伝子のある部分を欠失させることを挙げることができる。遺伝子破壊の結果、例えばその遺伝子がｍＲＮＡへ転写できなくなり、構造遺伝子が翻訳されなくなる。あるいは、転写されたｍＲＮＡが不完全なために翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じて本来の機能の発揮が不可能になる。
【００２７】
遺伝子破壊株の作製は、当該酵素又は蛋白質が発現しない破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能である。遺伝子破壊の方法は種々の方法（自然育種、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射、ランダム突然変異、トランスポゾン、部位特異的遺伝子破壊）が報告されているが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同組換えによる遺伝子破壊が好ましい。相同組換えによる手法はJ.Bacteriol.,161,1219-1221(1985)やJ.Bacteriol.,177,1511-1519(1995)やProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,97,6640-6645(2000)に記載されており、これらの方法及びその応用によって同業技術者であれば容易に実施可能である。
【００２８】
本発明における「活性」の「強化」とは、強化前のイソプロピルアルコール生産大腸菌での各種酵素活性が強化後に高まることを広く意味する。
強化の方法としては、イソプロピルアルコール生産大腸菌が有している各種酵素の活性が高まれば、特に制限はなく、菌体外から導入された酵素遺伝子による強化、菌体内の酵素遺伝子の発現増強による強化、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
【００２９】
菌体外から導入された酵素遺伝子による強化としては、具体的には、宿主由来の酵素よりも高活性の酵素をコードする遺伝子を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入して、導入された酵素遺伝子による酵素活性を追加するあるいはこの酵素活性に宿主が本来有する酵素活性と置換すること、更には宿主由来の酵素遺伝子又は菌体外からの酵素遺伝子の数を２以上に増加させること、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。
【００３０】
菌体内の酵素遺伝子の発現増強による強化としては、具体的には、酵素遺伝子の発現を増強する塩基配列を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入すること、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーターを他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子の発現を強化させること、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子を菌体外から導入された結果、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
以下に、本発明について説明する。
【００３１】
本発明におけるＧｎｔＲとは、エントナードウドロフ経路を経由したグルコン酸代謝に関与するオペロンを負に制御する転写因子を指す。グルコン酸の取り込みと代謝を担う二つの遺伝子群（ＧｎｔＩとＧｎｔII）の働きを抑制するＧｎｔＲ転写抑制因子の総称を指す。
本発明におけるグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号５．３．１．９に分類され、Ｄ−グルコース−６−リン酸からＤ−フルクトース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
【００３２】
本発明におけるグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．４９に分類され、Ｄ−グルコース−６−リン酸からＤ−グルコノ−１，５−ラクトン−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ等のＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌  、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉ等のＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ等のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等のＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ等のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ等のＢａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌由来のものが挙げられる。
【００３３】
本発明において用いられるグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ等のＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌  、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉ等のＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ等のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等のＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ等のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ等のＢａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌  、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属などの原核生物に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００３４】
本発明におけるホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．４４に分類され、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸からＤ−リブロース−５−リン酸とＣＯ２を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
【００３５】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコール生産系を備えた大腸菌であり、遺伝子組換え技術により導入又は改変されたイソプロピルアルコール生産能力を保有する大腸菌をいう。このようなイソプロピルアルコール生産系は、対象となる大腸菌にイソプロピルアルコールを生産させるものであればいずれのものであってもよい。
好ましくは、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性の強化を挙げることができる。本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及び前述したチオラーゼ活性の４種類の酵素活性が、菌体外から付与され若しくは菌体内において発現増強され、又はこれら双方がなされていることが更に好ましい。
【００３６】
本発明におけるチオラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．９に分類され、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）細菌、ズーグロア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ）等のズーグロア属細菌、リゾビウム種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。
【００３７】
本発明において用いられるチオラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種の細菌、ズーグロア・ラミゲラ等のズーグロア属細菌、リゾビウム種の細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス等のエンテロコッカス属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌などの原核生物に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００３８】
本発明におけるアセト酢酸デカルボキシラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．１．１．４に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）等のバチルス属細菌由来のものが挙げられる。
【００３９】
本発明の宿主細菌に導入されるアセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はバチルス属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、バチルス・ポリミクサ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００４０】
本発明におけるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．８０に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。
【００４１】
本発明の宿主細菌に導入されるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００４２】
本発明におけるＣｏＡトランスフェラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．８．３．８に分類され、アセトアセチルＣｏＡからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：大腸菌）等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
【００４３】
本発明において用いられるＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ等のファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００４４】
上記４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、なかでも、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム属細菌由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア属細菌由来である場合が更に好ましい。
【００４５】
なかでも本発明にかかる４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジュリンキ又はエシェリヒア・コリのいずれか由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、アセト酢酸デカルボキシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼが、それぞれクロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の酵素であり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼが、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素であることがより好ましく、上記４種類の酵素は、酵素活性の観点から、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来であり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来であることが特に好ましい。
【００４６】
本発明におけるこれらの酵素の活性は、菌体外から菌体内へ導入されたもの又は、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものとすることができる。
酵素活性の導入は、例えば酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することにより行うことができる。このとき、導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれであってもよい。菌体外から菌体内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook, J., et al., ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)などに記載されている。
【００４７】
本発明において酵素の活性を強化した大腸菌とは、何らかの方法によって該酵素活性が強化された大腸菌を指す。これらの大腸菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を、前述したものと同様の遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内にプラスミドを用いて導入する又は、宿主大腸菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させる、等の方法を用いて作出することができる。
【００４８】
本発明における遺伝子のプロモーターとは、上記いずれかの遺伝子の発現を制御可能なものであればよいが、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターがよい。具体的にはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターを例示することができる。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のＧＡＰＤＨプロモーターはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、塩基番号３９７−４４０に記されている。
【００４９】
大腸菌由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ａｔｏＤ及びａｔｏＡ）とチオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）は、ａｔｏＤ、ａｔｏＡ、ａｔｏＢの順番で大腸菌ゲノム上でオペロンを形成しているため（Journal of Baceteriology Vol.169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkinsら）、ａｔｏＤのプロモーターを改変することによって、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とチオラーゼ遺伝子の発現を同時に制御することが可能である。
このことから、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が宿主大腸菌のゲノム遺伝子より得られたものである場合、充分なイソプロピルアルコール生産能力を獲得する観点から、両酵素遺伝子の発現を担うプロモーターを他のプロモーターと置換する等によって両酵素遺伝子の発現を増強することが好ましい。ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の発現を増強するために用いられるプロモーターとしては、前述のエシェリヒア・コリ由来ＧＡＰＤＨプロモーター等を挙げることができる。
【００５０】
本発明において、イソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌の例として、ＷＯ２００９／００８３７７号に記載のｐＩＰＡ/Ｂ株又はｐＩａａａ/Ｂ株を例示できる。また、該大腸菌には、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素のうち、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性とチオラーゼ活性の増強は該大腸菌のゲノム上の各遺伝子の発現を強化することで行い、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性とアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性の増強は各遺伝子の発現をプラスミドで強化した株（ｐＩａ/Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株と呼ぶことがある）を含む。
【００５１】
本発明では、イソプロピルアルコール生産性をより効果的に向上させる観点から、不活化されたＧｎｔＲ活性が含まれることが好ましい。不活化されたＧｎｔＲと共に不活化されたグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性と強化されたグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性が含まれることが更に好ましく、不活化されたＧｎｔＲ活性、不活化されたグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性、不活化されたホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性と強化されたグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性が含まれることが最も好ましい。これらの組み合わせにより、これ以外の各因子又は酵素の組み合わせと比してイソプロピルアルコールの生産性を驚異的に向上させることできる。
【００５２】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌の好ましい態様としては、上記ｐＩＰＡ/Ｂ株、ｐＩａａａ/Ｂ株又はｐＩａ/Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性を不活化した株である。
更に好ましい態様としては、上記ｐＩＰＡ/Ｂ株、ｐＩａａａ/Ｂ株又はｐＩａ/Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性とグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性を不活化し、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性を強化した株である。
【００５３】
特に好ましい態様としては、上記ｐＩＰＡ/Ｂ株、ｐＩａａａ/Ｂ株又はｐＩａ/Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株のＧｎｔＲ活性とグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性とホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性を不活化し、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性を強化した株である。
【００５４】
更に本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、にスクロース資化酵素をコードする遺伝子群を導入することができる。これにより、スクロースからイソプロピルアルコールを生産することが可能となる。
スクロース資化酵素をコードする遺伝子としては、微生物のスクロース資化経路のうち、ＰＴＳ系と非ＰＴＳ系に関与する酵素群をコードする遺伝子が含まれる。
具体的にスクロースＰＴＳに関与する酵素群をコードする遺伝子としては、ＳｃｒＡ（スクロースの取り込みを行う）、ＳｃｒＹ（スクロースのリン酸化を行う）、ＳｃｒＢ（微生物内部でスクロースの分解を行う）、ＳｃｒＲ（ＳｃｒＡ，Ｙ，Ｂをコードする遺伝子の発現を制御する）、ＳｃｒＫ（フルクトースのリン酸化を行う）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００５５】
また、具体的にスクロース非ＰＴＳに関与する酵素群をコードするスクロース非ＰＴＳ遺伝子群は、ＣｓｃＢ（スクロース透過酵素：スクロースの取り込みを行う）、ＣｓｃＡ（スクロース加水分解酵素：微生物内部でスクロースの分解を行う）、ＣｓｃＫ（フルクトキナーゼ：フルクトースのリン酸化を行う）、ＣｓｃＲ（リプレッサー蛋白質：ＣｓｃＢ、Ａ、及びＫをコードする遺伝子の発現を制御する）をコードする遺伝子で構成される遺伝子群である。
【００５６】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌に導入するスクロース資化酵素遺伝子としては、このうち非ＰＴＳ系に関与する酵素群をコードする遺伝子を挙げることができ、中でもＣｓｃＡを少なくとも含む一種以上の酵素の組み合わせの遺伝子を挙げることができる。例えば、ｃｓｃＡのみ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＫの組み合わせ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＢの組み合わせ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲの組み合わせ、ｃｓｃＡ、ｃｓｃＲ及びｃｓｃＫの組み合わせ、ｃｓｃＡ、ｃｓｃＲ及びｃｓｃＢの組み合わせ等が挙げられる。中でも、イソプロピルアルコールを効率よく生産する観点から、ＣｓｃＡをコードする遺伝子のみを導入することも選択できる。
【００５７】
前記スクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。またｃｓｃＡには、ｃｓｃＡを菌体のペリプラズムへ移行させるためのシグナル配列が付加されていることが好ましい。
【００５８】
前記リプレッサー蛋白質（ＣｓｃＲ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるリプレッサータンパク質（ＣｓｃＲ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００５９】
前記フルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００６０】
前記スクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られる、スクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００６１】
本発明にかかるイソプロピルアルコール生産大腸菌では、前記イソプロピルアルコール生産系にかかる各酵素、好ましくは上記イソプロピルアルコール生産系の酵素のうち、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ及びアセト酢酸デヒドロゲナーゼの少なくとも一方の酵素の活性が、遺伝子改変体として導入された導入遺伝子に由来してもよい。
本発明において「遺伝子改変体」とは、当該酵素遺伝子の塩基配列に、欠失、置換、付加等の改変を加えたものすべてが含まれる。具体的には、当該酵素遺伝子の塩基配列のうち、コドンのみに変更を加え、当該コドンのみに変更を加えた塩基配列を基に合成されるアミノ酸配列には変更がないものや、当該酵素遺伝子のプロモーター領域のみに変更を加え、当該プロモーター領域のみに変更を加えた塩基配列を基に合成されるアミノ酸配列には変更がないものなどが挙げられる。
改変される酵素遺伝子は、宿主本来の遺伝子であってもよく、他種の微生物由来の酵素遺伝子であってもよい。
またイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする酵素遺伝子のみ又はアセト酢酸デヒドロゲナーゼ酵素遺伝子のみが、遺伝子改変されていてもよく、これらが同時に遺伝子改変されていてもよい。
【００６２】
遺伝子改変体としては、遺伝子改変の上記いずれかの酵素遺伝子に対する変更の結果、宿主に対して対応する酵素の酵素活性が付与され又は強化されて、目的の物質生産能が増強するものであれば、どのような改変を加えてもよい。
好ましくは、遺伝子改変体は、大腸菌のコドン使用頻度に基づいて使用コドンを改変した改変体遺伝子である。このような遺伝子改変体とすることにより、イソプロピルアルコールの生産性を上げることができる。
【００６３】
本発明において「使用コドンを改変する」とは、アミノ酸配列をコード規定する塩基配列上において、各アミノ酸に対応する３塩基の並びであるコドンを改変することを意味する。本発明において「コドン改変」とは、アミノ酸配列を変えずに塩基配列のみを改変することを意味している。
【００６４】
前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子改変体としては、好ましくは、配列番号４０で示される塩基配列を有する。また、前記アセト酢酸デヒドロゲナーゼの遺伝子改変体としては、好ましくは、配列番号４３で示される塩基配列を有する。これらの遺伝子改変体を用いることにより、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ及びアセト酢酸デヒドロゲナーゼの各酵素活性をそれぞれ好ましく増強することができる。
【００６５】
本発明において大腸菌とは、本来、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有し得る大腸菌を意味する。
【００６６】
ここで上記の遺伝子組換えの対象となる大腸菌としては、イソプロピルアルコール生産能を有しないものであってもよく、上記の各遺伝子の導入及び変更が可能であればいずれの大腸菌であってもよい。
より好ましくは、イソプロピルアルコール生産能が予め付与された大腸菌であることができ、これにより、より効率よくイソプロピルアルコールを生産させることができる。
【００６７】
このようなイソプロピルアルコール生産大腸菌としては、例えばＷＯ２００９／００８３７７号パンフレットに記載されているアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成大腸菌などを挙げることができる。
【００６８】
本発明のイソプロピルアルコール生産方法は、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産させることを含むものであり、即ち、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、培養すること（以下、培養工程）と、接触により得られたイソプロピルアルコールを回収すること（以下、回収工程）とを含むものである。
【００６９】
上記イソプロピルアルコール生産方法に用いられる植物由来原料は、植物から得られる炭素源であり、植物由来原料であれば特に制限されない。本発明においては、植物由来原料とは、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、及びそれら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、及びそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。
【００７０】
このような植物由来原料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、及びこれら成分を多く含む草木質分解産物、セルロース加水分解物など、並びにこれらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。
【００７１】
本発明における植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、及びこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。
【００７２】
培養工程におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料との接触は、一般に、植物由来原料を含む培地でイソプロピルアルコール生産大腸菌を培養することにより行われる。
【００７３】
植物由来原料とイソプロピルアルコール生産大腸菌との接触密度は、イソプロピルアルコール生産大腸菌の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来原料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して２０質量％以下とすることができ、大腸菌の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を１５質量％以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。
【００７４】
また培地中のイソプロピルアルコール生産大腸菌の含有量としては、大腸菌の種類及び活性によって異なるが一般に、培養開始時に投入する前培養の菌液（ＯＤ６６０ｎｍ＝４〜８）の量を培養液に対して０．１質量％〜３０質量％、培養条件制御の観点から好ましくは１質量％〜１０質量％とすることができる。
【００７５】
イソプロピルアルコール生産大腸菌の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及び乳酸を生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた通常用いられる培地であれば特に制限はない。
【００７６】
本発明の培養に際して、培養条件は特別の制限はなく、例えば好気条件下でｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４２℃の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養することができる。
【００７７】
前記混合物中への気体の通気量は、特に制限はないが、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）であり、大腸菌への物理的ダメージを抑制する観点から０．１ｖｖｍ〜１．５ｖｖｍで行うことが好ましい。
【００７８】
培養工程は、培養開始から混合物中の植物由来原料が消費されるまで、又はイソプロピルアルコール生産大腸菌の活性がなくなるまで継続させることができる。培養工程の期間は、混合物中のイソプロピルアルコール生産大腸菌の数及び活性並びに、植物由来原料の量により異なるが、一般に、１時間以上、好ましくは４時間以上であればよい。一方、植物由来原料又はイソプロピルアルコール生産大腸菌の再投入を行うことによって、培養期間は無制限に連続することができるが、処理効率の観点から、一般に５日間以下、好ましくは７２時間以下とすることができる。その他の条件は、通常の培養に用いられる条件をそのまま適用すればよい。
【００７９】
培養液中に蓄積したイソプロピルアルコールを回収する方法としては、特に制限はないが、例えば培養液から菌体を遠心分離などで除去した後、蒸留や膜分離等通常の分離方法でイソプロピルアルコールを分離する方法が採用できる。
【００８０】
なお、本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、イソプロピルアルコール生産のための培養工程の前に、使用するイソプロピルアルコール生産大腸菌を適切な菌数又は適度な活性状態とするための前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程は、イソプロピルアルコール生産細菌の種類に応じた通常用いられる培養条件による培養であればよい。
【００８１】
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、好ましくは、前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、該イソプロピルアルコール生産大腸菌を培養する培養工程と、前記培養により生成したイソプロピルアルコールを混合物から分離し回収する回収工程とを含む。
【００８２】
この方法によれば、混合物に気体を供給しながら生産大腸菌を培養する（通気培養）。この通気培養により、生産されたイソプロピルアルコールは混合物中に放出されると共に、混合物から蒸散し、この結果、生成したイソプロピルアルコールを混合物から容易に分離することができる。また、生成したイソプロピルアルコールが混合物から連続的に分離するため、混合物中のイソプロピルアルコールの濃度の上昇を抑制することができる。これにより、イソプロピルアルコール生産大腸菌のイソプロピルアルコールに対する耐性を特に考慮する必要がない。
なお、本方法における混合物とは、大腸菌の培養に一般的に用いられる基本培地を主体とすればよい。培養条件については、前述した事項がそのまま適用される。
【００８３】
回収工程では、培養工程で生成され、混合物から分離したイソプロピルアルコールを回収する。この回収方法としては、通常培養により混合物から蒸散したガス状又は飛沫状のイソプロピルアルコールを収集することができるものであればよい。このような方法としては、一般に用いられる密閉容器等の収集部材へ収容すること等を挙げることができるが、なかでも、イソプロピルアルコールのみを純度高く回収できる観点から、イソプロピルアルコールを捕捉するための捕捉液と、混合物から分離したイソプロピルアルコールとを接触することを含むものであることが好ましい。
【００８４】
本方法では、イソプロピルアルコールは、捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収することができる。そのような回収方法としては、例えば国際公開２００９／００８３７７号パンフレットに記載された方法などが挙げられる。回収されたイソプロピルアルコールは、ＨＰＬＣ等の通常の検出手段を用いて確認することができる。回収されたイソプロピルアルコールは、必要に応じて更に精製することができる。このような精製方法としては、蒸留等をあげることができる。
回収されたイソプロピルアルコールが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコールの生産方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコールの脱水は、常法により行なうことができる。
【００８５】
捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収可能なイソプロピルアルコールの生産方法に適用可能な装置としては、例えば、国際公開２００９／００８３７７号パンフレットの図１に示される生産装置を挙げることができる。
この生産装置では、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。
また、培養槽には、連結管を介して、捕捉液としてのトラップ液が収容されたトラップ槽が連結されている。このとき、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じる。
これにより、培養槽で通気培養により生成したイソプロピルアルコールは、エアレーションによって蒸散して培地から容易に分離される共に、トラップ槽においてトラップ液に補足される。この結果、イソプロピルアルコールを、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。
【００８６】
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法では、イソプロピルアルコールを高生産することができ、同様の方法で通常得られる生産量は本発明を適用しない場合と比較して多い。生産方法の条件や用いられるイソプロピルアルコール生産大腸菌の状態によって異なるが、生産性が５０〜１００ｇ／Ｌ／７２ｈｒ、好ましくは５５〜８０ｇ／Ｌ／７２ｈｒとすることができる。
【００８７】
このように本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコールを高生産することができるため、例えば、本発明の大腸菌触媒を用いてイソプロピルアルコールの製造を行った場合、培養７２時間で７５ｇ／Ｌ以上のイソプロピルアルコールを蓄積することができ、従来触媒と比較してはるかに高い生産性を獲得することができる。
【００８８】
また、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌では、イソプロピルアルコールの前駆体であるアセトンも同時に生産される。得られたアセトンは、公知の方法で精製後に、公知の方法（例えば特許第２７８６２７２号公報記載の方法）を用いることによって、イソプロピルアルコールに変換することが好ましい。これにより、糖原料からイソプロピルアルコールへの変換効率を更に高めることができる。
【００８９】
本発明に係るアセトン生産方法は、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを得ること（以下、イソプロピルアルコール生産工程という）、及び、得られたイソプロピルアルコールに、触媒として、酸化亜鉛と、第４族の元素を含む少なくとも１種の酸化物とを含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を接触させること（以下、アセトン生産工程という）を含むアセトン生産方法である。
前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて得られたイソプロピルアルコールに、共沈法で調製された前記複合酸化物を接触させることにより、脱水素反応が生じて、イソプロピルアルコールからアセトンが生産できる。これにより、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて生産されたイソプロピルアルコールを効果的に利用して、効率よく物質生産を行うことができる。
【００９０】
イソプロピルアルコール生産工程で用いられるイソプロピルアルコール生産大腸菌及び植物由来原料並びに、イソプロピルアルコール生産の条件等については、イソプロピルアルコールの生産に関して前述した事項がそのまま適用できる。
【００９１】
アセトン生産工程では、酸化亜鉛と、第４族の元素を含む少なくとも１種の酸化物とを含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を触媒として使用する。
第４族の元素とは、周期律表の第４族の元素を意味し、チタン、ジルコニウム及びハフハニウム等を挙げることができる。アセトンを高選択的に生産するとの点で、ジルコニウムであることが好ましい。
【００９２】
触媒として用いられ得る複合酸化物としては、ＺｎＯ：ＺｒＯ２、ＺｎＯ：ＴｉＯ２、ＣｕＯ：ＺｎＯ：Ａｌ２Ｏ３等を挙げることができ、触媒活性、及びアセトンの選択性の点で、ＺｎＯ：ＺｒＯ２が好ましい。
酸化亜鉛と、第４族元素を含む少なくとも１種の酸化物との比率については、特に制限はないが、５０：５０〜９９：１とすることが、触媒活性及びアセトン選択性の点で好ましく、６５：３５〜９５：５とすることがより好ましい。酸化亜鉛の比率が５０以上であればより高い触媒活性を示すことができ、９９以下であればより高いアセトン選択性を示すことができるため好ましい。
【００９３】
複合酸化物は、共沈法で調製されたものである。触媒として用いうる複合酸化物は、共沈法で調製されたものであるため、触媒組成の均一性、触媒調製のコントロールのし易さ等の利点を有する。
共沈共沈法とは、多成分系の複合酸化物を製造する方法として一般的に用いられる調製法であり、２種類以上の金属塩の混合水溶液にアルカリ水溶液のような沈殿剤を加えることで、固体として均一に沈殿させることができる。
【００９４】
具体的な触媒の調製方法としては、硝酸亜鉛等の水溶性の亜鉛塩水溶液と、硝酸ジルコニウム等の水溶性のジルコニウム塩水溶液とを、所望の金属酸化物の組成となるように混合し、この水溶液を炭酸ナトリウム等のアルカリ水溶液中に滴下しアルカリ性にすることで水酸化物として固体が沈殿する。この生成した沈殿物をろ別し、水洗、乾燥した後、焼成することで製造できる。
【００９５】
また本発明を実施するに際し、使用する触媒量は特に限定されないが、例えば、固定床流通装置を用いて反応を行う場合、原料（イソプロピルアルコール）の時間あたりの供給量（質量）を触媒の質量で割った値、即ちＷＨＳＶで示すと、０．０１〜２００／ｈの範囲であることが望ましく、より好ましくは０．０２〜１００／ｈの範囲が好適である。
【００９６】
本発明における脱水素の反応は、回分式や連続式等の反応形式で行うことができる。連続式の場合、例えば触媒を充填した管状の反応器に原料を流通させ反応器から出てきた反応生成物を回収する。
脱水素反応を行う際の反応温度は通常１００℃〜５００℃、好ましくは１５０℃〜４５０℃、さらに好ましくは２００℃〜４００℃とすることができる。アセトンとイソプロピルアルコール、水素には平衡関係があり、反応温度が高いほうがアセトンの平衡組成が高くなる。このため、反応温度が１００℃以上であればイソプロピルアルコールが大量に残存することなく、好ましい。また５００℃以下であれば、望ましくない副反応の増大を招くことがなく好ましい。反応圧力には特に限定はなく、反応温度にも依存するが、好ましくは０．１ＭＰａ〜１．０ＭＰａとすることができる。
反応生成物の回収後には、必要に応じて、適宜、精製等を追加的に行ってもよい。アセトンの精製方法等については、当業界で周知又は公知の精製方法を適用することができる。
【００９７】
本発明にかかるプロピレン生産方法は、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からアセトンを含むイソプロピルアルコールを得ること（以下、イソプロピルアルコール生産工程という）、及び、得られたアセトンを含むイソプロピルアルコールに、触媒として、Ｃｕを含む水添触媒および固体酸物質の存在下で、反応温度５０〜３００℃の範囲でアセトンと水素とを反応させること（以下、触媒反応工程という）を含む。なお、Ｃｕを含む水添触媒を、明細書において以下、単に「水添触媒」とも記す。
前記プロピレン生産方法では、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌により得られたイソプロピルアルコールが、前記固体酸物質により、イソプロピルアルコールが脱水されてプロピレンおよび水が生成する。
【００９８】
イソプロピルアルコール生産工程で用いられるイソプロピルアルコール生産大腸菌及び植物由来原料並びに、イソプロピルアルコール生産の条件等については、イソプロピルアルコールの生産に関して前述した事項がそのまま適用できる。
前記触媒反応工程では、イソプロピルアルコール生産工程で得られたアセトンを含むイソプロピルアルコールを原料として、Ｃｕを含む水添触媒および固体酸物質を用いて所定の条件下で、アセトンと水素を反応させる。
【００９９】
前記触媒反応工程で使用される水素としては、分子状の水素ガスを用いてもよく、反応条件により水素を発生するシクロヘキサン等の炭化水素に由来する水素であってもよい。水素は原理的にはアセトンに対して等モル以上あればよく、分離回収の点からはアセトンに対して好ましくは１〜１０倍モル、より好ましくは１〜５倍モルあればよい。例えば、アセトンの時間あたりの供給量に対する水素の時間当たりの供給量を前記範囲に設定すればよい。アセトンの転化率を１００％以下に抑えたい場合は、水素の量をアセトンの量に対して１倍モルから低減させることで対応できる。
【０１００】
前記触媒反応工程において、供給された水素は、アセトンの酸素原子と結合して水となり、反応器出口から取り出すことが可能である。またアセトンの当量以上の水素は、予想外の副反応が進行しない限り、本質的には消費されないことになる。
反応器へ水素ガスを供給する場合には、通常は連続的に供給するが、この方法に特に限定されるものではない。水素の供給の形態としては、反応開始時に水素ガスを供給した後、反応中供給を停止し、ある一定時間経過後に再度供給する間欠的な供給でもよいし、液相反応の場合には溶媒に水素ガスを溶解させて供給してもかまわない。
【０１０１】
また、水素は、水素を反応器から取り出して再利用することができる。このような水素のリサイクルプロセスとしては、例えば、反応器後部で気液分離器により反応液と反応ガスに分離し、反応ガスから分離膜等で水素ガスを分離し、反応器の入り口に再度供給してもよい。このリサイクルプロセスの場合では、軽沸留分とともに塔頂から回収される水素ガスを、反応器に供給することができる。供給される水素の圧力は、反応器の圧力と同等であることが一般的であるが、水素の供給方法に応じて適宜変更すればよい。
【０１０２】
本発明を実施する際には、反応系内に触媒および出発物質（アセトン、イソプロピルアルコール、および水素）に対して不活性な溶媒または気体を供給して、前記反応を希釈した状態で行うことも可能である。
前記触媒反応工程に適用される反応温度は、５０℃〜３００℃である。５０℃未満では、充分なアセトン、又はイソプロピルアルコールの転化率が得られず、また３００℃を超えると予想外の副反応やプロピレンの重合等が生じて充分なプロピレンの選択率が維持できない。経済性の点で、反応温度は、好ましくは１５０℃〜２５０℃、より好ましくは１５０〜２００℃の範囲である。
【０１０３】
前記反応を行う場合、その他の方法および条件としては特に制限はなく、例えば、以下に示すような条件および方法が採用できる。出発物質であるアセトン、イソプロピルアルコールと水素との接触や、水素の供給方法は、気液向流および気液併流の何れでもよく、また液およびガスの方向として、液下降−ガス上昇、液上昇−ガス下降、液ガス上昇、液ガス下降の何れでもよい。また実施圧力は、好ましくは０．１気圧〜５００気圧、更に好ましくは０．５気圧〜１００気圧である。
【０１０４】
前記固体酸物質としては、通常の固体酸である、ゼオライト、シリカ、アルミナ、シリカアルミナ、γアルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化ジルコニウムなどの金属酸化物などが挙げられる。これらの中では、高い触媒活性、及び高いプロピレン選択性の点でゼオライトが好ましい。
【０１０５】
ゼオライトとしては、前記反応において原料および中間体として存在すると考えられるイソプロピルアルコールおよび目的とするプロピレンの分子径により、好適なゼオライトを選択すればよい。
特にゼオライトとしては、イソプロピルアルコールやプロピレンの分子径に近いことから、酸素１０〜１２員環の細孔を有するゼオライトが好ましい。酸素１０〜１２員環を有するゼオライトとしては、フェリエライト、ヒューランダイト、ＺＳＭ−５、ＺＳＭ−１１、ＺＳＭ−１２、ＮＵ−８７、シーター１、ウェイネベアイト、Ｘ型ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、ＵＳＹ型ゼオライト、モルデナイト、脱アルミニウムモルデナイト、β−ゼオライト、ＭＣＭ−２２、ＭＣＭ−５６などが挙げられる。これらの中でもβ−ゼオライトが好ましい。
【０１０６】
ゼオライトにおけるケイ素とアルミニウムとの組成比（ケイ素／アルミニウム）は、高い活性を得るため、２／１〜２００／１の範囲にあることが好ましく、活性および熱安定性の面から５／１〜１００／１の範囲にあることが特に好ましい。さらにゼオライト骨格に含まれるアルミニウムを、Ｇａ、Ｔｉ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｂなどのアルミニウム以外の金属で置換した、いわゆる同型置換したゼオライトを用いることもできる。また、ゼオライトとしては、自身を金属イオンで修飾したものも用いることができる。
【０１０７】
固体酸物質の形状は特に制限は無く、球状、円柱状、押し出し状、破砕状の何れでもよい。また、その粒子の大きさも特に制限は無く、通常は０．０１ｍｍ〜１００ｍｍの範囲のものを反応器の大きさに応じて選択すればよい。固体酸物質は、一種単独で用いてもよく、二種以上を用いてもよい。
【０１０８】
前記Ｃｕを含む水添触媒としては、Ｃｕを金属そのものとして含むもの、金属化合物の形で含むものなどが挙げられる。前記金属化合物としては、例えば、ＣｕＯ、Ｃｕ２Ｏなどの金属酸化物；及び、ＣｕＣｌ２などの金属塩化物などが挙げられる。また、これらの触媒を担体に担持させてもよい。
【０１０９】
前記Ｃｕを含む水添触媒は、さらに周期律表の第６族、第１２族および第１３族のうち少なくとも一つの元素を含むことが、より高い選択性、又はより長い触媒ライフを得る点で、好ましい。第６族としてはＣｒ、Ｍｏなど；第１２族としてはＺｎなど；第１３族としてはＡｌ、Ｉｎなどが好ましい元素として挙げられる。このような水添触媒としては、銅−クロム、ラネー銅、銅−亜鉛などの銅系の触媒が挙げられる。
また、前記Ｃｕを含む水添触媒には、ＰｂＳＯ４、ＦｅＣｌ２、ＳｎＣｌ２などの金属塩；Ｋ、Ｎａなどのアルカリ金属やアルカリ金属塩；ＢａＳＯ４；などを添加してもよく、これにより、前記Ｃｕを含む水添触媒の活性やプロピレンの選択率が向上する場合がある。前記金属塩、アルカリ金属又はアルカリ金属塩の前記水添触媒への添加量としては、特に制限はないが、主に選択性の点で、０．０１質量％〜１０．００質量％であることが好ましい。
市場で入手できるＣｕを含む水添触媒としては、例えば、ＣｕＯ−ＺｎＯ−Ａｌ２Ｏ３、ＣｕＯ−Ｃｒ２Ｏ３−ＢａＯなどが挙げられる。
【０１１０】
水添触媒の形状は特に制限は無く、球状、円柱状、押し出し状、破砕状の何れでもよい。また、その粒子の大きさも特に制限は無く、通常は０．０１ｍｍ〜１００ｍｍの範囲のものを反応器の大きさに応じて選択すればよい。
【０１１１】
本発明にかかるプロピレンの製造方法では、前記水添触媒および固体酸物質が充填された反応器に、前記アセトンおよび水素を供給し、アセトンと水素とを反応させることができる。反応器に充填された水添触媒および固体酸物質の合計量（以下「触媒量」とも記す）は特に限定されないが、例えば、固定床反応器を備えた固定床流通装置を用いて反応を行う場合、出発物質であるアセトンの時間あたりの供給量（質量）を触媒量（重量）で割った値、すなわちＷＨＳＶで示すと、好ましくは０．１〜２００／ｈ、更に好ましくは０．２〜１００／ｈの範囲である。
固体酸物質と水添触媒との量比は特に限定されないが、固体酸物質：水添触媒（質量比）が、通常は１：０．０１〜１：１００、好ましくは１：０．０５〜１：５０であることが好ましい。固体酸物質：水添触媒の量比が１：０．０１以上であれば、十分なアセトンの転化率となる傾向があり、また固体酸物質：水添触媒の量比が１：１００以内であれば、脱水反応が十分に行われてプロピレンの収率が十分となる傾向がある。
【０１１２】
前記反応がある時間経過した後において触媒の活性が低下する場合には、公知の方法で再生を行い、水添触媒および固体酸物質の活性を回復することができる。
本発明においては、触媒として固体酸物質と、水添触媒との２成分を用いればよい。また、その触媒の使用方法としては、特に限定はなく、例えば、酸触媒成分である、固体酸物質と、水添触媒とをセンチメートルサイズの触媒粒子レベルで物理混合したものを用いてもよいし、両者を微細化し混合した後に、改めてセンチメートルサイズの触媒粒子へ成形してもよいし、固体酸物質を担体として、その上に水添触媒を担持してもよいし、水添触媒を担体として、その上に固体酸物質を担持してよい。また、水添触媒と、固体酸物質とを混合等することなく、各々を用いてもよい。
【０１１３】
特に、高活性、及び高選択的で工業的に入手可能なの点で、水添触媒を用い、かつ固体酸物質を構成するゼオライトとしてβ−ゼオライトを用いることが好ましい。例えば、水添触媒は、ゼオライトに担持されていてもよい。その調製方法としては、Ｃｕの硝酸塩などの水溶液にゼオライトを含浸させ、焼成する方法；Ｃｕを有機溶媒に可溶にするため、配位子とよばれる有機分子をＣｕと結合させた錯体として、有機溶媒中に添加し、溶液を調製し、該溶液にゼオライトを含浸させ、焼成する方法；さらに錯体のうちあるものは真空下で気化するため、蒸着などでゼオライトに担持させる方法などが挙げられる。
【０１１４】
また、水添触媒は、ゼオライト以外の担体に担持されていてもよい。水添触媒を担持しうる担体としては、シリカ、アルミナ、シリカアルミナ、チタニア、マグネシア、シリカマグネシア、ジルコニア、酸化亜鉛、カーボン（活性炭）、酸性白土、けいそう土などが挙げられる。これらの中でも、シリカ、アルミナ、シリカアルミナ、チタニア、マグネシア、シリカマグネシア、ジルコニア、酸化亜鉛、カーボン（活性炭）のうち少なくとも１つを選択することが、より高活性、及びより高選択性の点で好ましい。
【０１１５】
本発明において使用される反応器としては、固定床反応器、流動床反応器などが挙げられるが、触媒の磨耗や粉化を防止するという観点から、固定床反応器が好ましい。
本発明において、反応器に水添触媒および固体酸物質を充填する方法は特に限定されない。反応器として固定床反応器を用いる場合、水添触媒および固体酸物質の充填方法は反応成績に大きな影響を与えることがある。前述のように、本発明では水素化と脱水反応とが段階的に起こっていると考えられる。従って、反応の各段階に応じた適当な触媒種を順番に反応器に充填することは、触媒を効率よく使用するという意味で、また目的としない副反応を抑制するという意味で好ましい充填方法である。
【０１１６】
特に反応速度を上げるために水素圧や反応温度を上昇させる場合、低い水素圧や低い反応温度では見られなかった予想外の副反応が起こることは、一般的な化学反応においてよく見られる挙動である。このような場合においては、特に触媒の充填方法が反応成績に大きな影響を与える可能性がある。
【０１１７】
従って、反応の各段階に応じた適当な触媒種を順番に反応器に充填してもよく、水添触媒と固体酸物質との混合比に傾斜をつけて反応器に充填してもよい。水添触媒と固体酸物質とを反応器に充填する方法としては、例えば、反応器に、（１）水添触媒および固体酸物質を混合して充填する方法、（２）水添触媒からなる層（上流側即ち、入口側）と、固体酸物質からなる層（下流側即ち、出口側）とを形成するように充填する方法、（３）水添触媒を担持した固体酸物質を充填する方法、（４）水添触媒からなる層（上流側即ち、入口側）と、固体酸物質および水添触媒からなる層（下流側即ち、出口側）とを形成するように充填する方法、（５）水添触媒からなる層（上流側即ち、入口側）と、水添触媒を担持した固体酸物質からなる層（下流側即ち、出口側）とを形成するように充填する方法、（６）水添触媒および固体酸物質からなる層（上流側即ち、入口側）と、固体酸物質からなる層（下流側即ち、出口側）とを形成するように充填する方法、（７）水添触媒を担持した固体酸物質からなる層（上流側即ち、入口側）と、固体酸物質からなる層（下流側即ち、出口側）とを形成するように充填する方法が挙げられる。なお、上流側とは、反応器の入口側、すなわち出発物質が反応の前半に通過する層を示し、下流側とは、反応器の出口側、すなわち出発物質、中間体および反応生成物などが反応の後半に通過する層を示す。なお、出発物質とは、アセトンおよび水素を意味するが、気液向流でアセトンおよび水素を反応器に供給する場合には、前記上流側（入口側）とは、アセトンが反応の前半に通過する層を意味する。
【０１１８】
プロピレンの生産量を維持するために、反応器を２つまたは３つ並列に並べ、１つの反応器内の触媒が再生している間に、残った１つまたは２つの反応器で反応を実施するメリーゴーランド方式をとることができる。さらに反応器が３つある場合には、他の反応器２つを直列につなぎ、生産量の変動を少なくする方法をとることができる。また、流動床流通反応方式や移動床反応方式で実施する場合には、反応器から連続的または断続的に、一部または全部の触媒を抜き出して相当する分を補充することにより、一定の活性を維持することが可能である。
【実施例】
【０１１９】
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、記載中の「％」は特に断らない限り、質量基準である。
（イソプロピルアルコール生産株の作製）
本実施例で使用した大腸菌株とプラスミドの一覧表を表１及び表２に示した。
【表１】
2012020833.tif 000002
【０１２０】
【表２】
2012020833.tif 000003
【０１２１】
［実施例１］
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株の作製＞
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＣｏＡトランスフェラーゼ  αサブユニットをコードする遺伝子（以下、ａｔｏＤと略することがある）の塩基配列も報告されている。すなわちａｔｏＤはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２１３１に記載されている。【０１２２】
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇｃｔｃａａｔｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号１）、及びａｃａｇａａｔｔｃｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２５１４）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー１０個をそれぞれアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した際、ＧＡＰＤＨプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、ＤＮＡ配列を確認しＧＡＰＤＨプロモーターが正しく挿入されたものをｐＵＣｇａｐＰとした。得られたｐＵＣｇａｐＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した。【０１２３】
さらにａｔｏＤを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａａｔｔｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａｃａａａａｔｔｇａｔｇａｃａｔｔａｃａａｇａｃ（配列番号３）、及びｇｃｇｇｔａｃｃｔｔａｔｔｔｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｃｇ（配列番号４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することで約６９０ｂｐのａｔｏＤフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを先に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＵＣｇａｐＰと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｔｏＤが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰａｔｏＤと命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１２４】
上述した通り、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡにおけるａｔｏＤの塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ｇｃｔｃｔａｇａｔｇｃｔｇａａａｔｃｃａｃｔａｇｔｃｔｔｇｔｃ（配列番号５）とｔａｃｔｇｃａｇｃｇｔｔｃｃａｇｃａｃｃｔｔａｔｃａａｃｃ（配列番号６）を用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。【０１２５】
また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＧＡＰＤＨプロモーターの配列情報に基づいて作製されたｇｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号７）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの配列情報に基づいて作製された配列番号４のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターｐＧＡＰａｔｏＤを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤからなる約７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。【０１２６】
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないＬＢ液体培地で３０℃で２時間培養し、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１２７】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤを含む約７９０ｂｐ断片を増幅させ、ａｔｏＤプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢと命名した。
なお、エシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１２８】
［実施例２］
＜プラスミドｐＩａｚの作製＞
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ５５３９２に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１５７３０７に記載されている。
上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。【０１２９】
ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａｇｃｔａｃａｔａｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号１８）、及びｃｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号１９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。【０１３０】
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ａａｔａｔｇｃａｔｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａｇｇｔｔｔｔｇｃａａｔｇｃｔａｇｇ（配列番号８）、及びｇｃｇｇａｔｃｃｔｔａｔａａｔａｔａａｃｔａｃｔｇｃｔｔｔａａｔｔａａｇｔｃ（配列番号９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しＩＰＡｄｈが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈと命名した。【０１３１】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ｃａｇｇａｔｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｔｔａａａｇｇａｔｇａａｇｔａａｔｔａａａｃａａａｔｔａｇｃ（配列番号１０）、及びｇｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃｔｔａｃｔｔａａｇａｔａａｔｃａｔａｔａｔａａｃｔｔｃａｇｃ（配列番号１１）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｄｃが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＩａと命名した。【０１３２】
グルコース６リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）を取得するためにエシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）をテンプレートに用いてｃａｇｇａｔｃｃｃｇｇａｇａａａｇｔｃｔｔａｔｇｇｃｇｇｔａａｃｇｃａａａｃａｇｃｃｃａｇｇ（配列番号１２）、及びｃｇｔｃｔａｇａｔｔａｃｔｃａａａｃｔｃａｔｔｃｃａｇｇａａｃｇａｃ（配列番号１３）を用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで消化することで約１５００ｂｐのグルコース６リン酸１−デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＩａを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られたプラスミドをｐＩａｚとした。【０１３３】
このプラスミドｐＩａｚを実施例１で作製したエシェリヒア・コリＢ：：ａｔｏＤＡＢコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢを得た。【０１３４】
［実施例３］
＜エシェリヒア・コリＢ株Δｐｇｉ株の作製＞
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ（以下ｐｇｉと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ１５１９６）。ｐｇｉをコードする遺伝子（１，６５０ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ｃａｇｇａａｔｔｃｇｃｔａｔａｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃａｃｇ（配列番号１４）、ｃａｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔａｃｔｃｔｔｃｔｇａｔｔｔｔｇａｇ（配列番号１５）、ｃａｇｔｃｔａｇａｔｃａｔｃｇｔｃｇａｔａｔｇｔａｇｇｃｃ（配列番号１６）及びｇａｃｃｔｇｃａｇａｔｃａｔｃｃｇｔｃａｇｃｔｇｔａｃｇｃ（配列番号１７）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号１４のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号１５および１６のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号１７のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。【０１３５】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１４と配列番号１５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号１６と配列番号１７のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｇｉ−Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、ｐｇｉ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをＸｂａＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本ＤＮＡ断片と、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０６４０４）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＥｃｏＲＩで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の間にカナマイシン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、ｐＴＨ１８ｃｓ１−ｐｇｉとした。【０１３６】
こうして得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｐｇｉをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１３７】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｐｇｉ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約３．３ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ株ｐｇｉ遺伝子欠失株（以下Ｂ△ｐｇｉ株と略することがある）と命名した。【０１３８】
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株およびエシェリヒア・コリＢ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１３９】
［実施例４］  
＜ｐＩａａａ／ＢΔｐｇｉ株の作製＞
エシェリヒア・コリのチオラーゼおよびエシェリヒア・コリのＣｏＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼをコードする遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２４１３１〜２３２５３１５に記載されている。またＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は上記エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２７８１に記載されている。これらと共に、後述するクロストリジウム属細菌由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させることでイソプロピルアルコールの生産が可能である。【０１４０】
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ａａｔａｔｇｃａｔｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａｇｇｔｔｔｔｇｃａａｔｇｃｔａｇｇ（配列番号２０）、及びｇｃｇｇａｔｃｃｇｇｔａｃｃｔｔａｔａａｔａｔａａｃｔａｃｔｇｃｔｔｔａａｔｔａａｇｔｃ（配列番号２１）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと実施例２で作製したプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを回収した。【０１４１】
エシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてａｔｇｇａｔｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａａｔｔｇｔｇｔｃａｔｃｇｔｃａｇ（配列番号２２）、及びｇｃａｇａａｇｃｔｔｇｔｃｔａｇａｔｔａａｔｔｃａａｃｃｇｔｔｃａａｔｃａｃｃａｔｃ（配列番号２３）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１.２ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢを回収した。【０１４２】
エシェリヒア・コリ由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｇｃｔｃｔａｇａｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａｃａａａａｔｔｇａｔｇａｃａｔｔａｃａａｇａｃ（配列番号２４）、及びｔａｇｃａａｇｃｔｔｃｔａｃｔｃｇａｇｔｔａｔｔｔｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｃｇ（配列番号２５）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼαサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢを制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤを回収した。【０１４３】
さらにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてａａｇｔｃｔｃｇａｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｇａｔｇｃｇａａａｃａａｃｇｔａｔｔｇ（配列番号２６）、及びｇｇｃｃａａｇｃｔｔｃａｔａａａｔｃａｃｃｃｃｇｔｔｇｃ（配列番号２７）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼβサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤを制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ＩＰＡｄｈ−ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡを回収した。【０１４４】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ｃａｇｇｔａｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｔｔａａａｇｇａｔｇａａｇｔａａｔｔａａａｃａａａｔｔａｇｃ（配列番号２８）、及びｇｃｇｇａｔｃｃｔｔａｃｔｔａａｇａｔａａｔｃａｔａｔａｔａａｃｔｔｃａｇｃ（配列番号２９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡを制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ＩＰＡｄｈ-Ａｄｃ−ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡを回収し、ｐＩａａａとした。【０１４５】
このプラスミドｐＩａａａを実施例３で作製したエシェリヒア・コリＢΔｐｇｉコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａａａ／Ｂ△ｐｇｉ株を得た。【０１４６】
［実施例５］
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉ株の作製＞
実施例１で作製したＢ：：ａｔｏＤＡＢに実施例３で作製したｐＴＨ１８ｃｓ１−ｐｇｉを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１４７】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｐｇｉ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約３．３ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ株aｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株と略することがある）と命名した。【０１４８】
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株およびエシェリヒア・コリＢ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１４９】
［実施例６］
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｔＲ株の作製＞
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）、ＧｎｔＲをコードする塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９に記載のエシェリヒア・コリＢ株ゲノム配列の３５０９１８４〜３５１０１７９に記載されている。ＧｎｔＲをコードする塩基配列（ｇｎｔＲ）の近傍領域をクローニングするため、ｇｇａａｔｔｃｇｇｇｔｃａａｔｔｔｔｃａｃｃｃｔｃｔａｔｃ（配列番号３０）、ｇｔｇｇｇｃｃｇｔｃｃｔｇａａｇｇｔａｃａａａａｇａｇａｔａｇａｔｔｃｔｃ（配列番号３１）、ｃｔｃｔｔｔｔｇｔａｃｃｔｔｃａｇｇａｃｇｇｃｃｃａｃａａａｔｔｔｇａａｇ（配列番号３２）、ｇｇａａｔｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｇｃａａｇｇｃｃｇａｔｇｇｃ（配列番号３３）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号３０および３３のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位をそれぞれ有している。【０１５０】
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３０と配列番号３１のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号３２と配列番号３３のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｇｎｔＲ−ＬとｇｎｔＲ−Ｒ断片を鋳型に配列番号３０と配列番号３３のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｔＲ−ＬＲ断片と呼ぶことがある）。このｇｎｔＲ−ＬＲ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｇｎｔＬＲ断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｔＲとした。【０１５１】
こうして得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｔＲを実施例１で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１５２】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｔＲ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ株aｔｏＤゲノム強化、ｇｎｔＲ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｔＲ株と略することがある）と命名した。【０１５３】
［実施例７］
＜ｐＧＡＰ−Ｉａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｔＲ株の作成＞
実施例６で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｔＲ株を得た。【０１５４】
［実施例８］
＜ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｔＲ株の作成＞
実施例６で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａｚを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｔＲ株を得た。【０１５５】
［実施例９］
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ株の作製＞
実施例５で作製したエシェリヒア・コリＢ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株に実施例６で作製したプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｔＲを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１５６】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｔＲ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ株aｔｏＤゲノム強化、ｐｇｉ遺伝子欠失、ｇｎｔＲ遺伝子欠失株（以下Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ株と略することがある）と命名した。【０１５７】
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株およびエシェリヒア・コリＢ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１５８】
［実施例１０］
＜ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ株の作成＞
実施例９で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲを得た。【０１５９】
［実施例１１］
＜ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ株の作成＞
実施例９で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａｚを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ株を得た。【０１６０】
［実施例１２］
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ株の作製＞
ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｇｎｄ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ｃｇｃｃａｔａｔｇａａｔｇｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇｇｃｃｇｇｔｇｇ（配列番号３４）、ｔｇｇａｇｃｔｃｔｇｔｔｔａｃｔｃｃｔｇｔｃａｇｇｇｇｇ（配列番号３５）、ｔｇｇａｇｃｔｃｔｃｔｇａｔｔｔａａｔｃａａｃａａｔａａａａｔｔｇ（配列番号３６）、ｃｇｇｇａｔｃｃａｃｃａｃｃａｔａａｃｃａａａｃｇａｃｇｇ（配列番号３７）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号３４のプライマーは５’末端側にＮｄｅＩ認識部位を有し、配列番号３５および配列番号３６のプライマーは５’末端側にＳａｃＩ認識部位を有している。また、配列番号３７のプライマーは５’末端側にＢａｍＨＩ認識部位を有している。【０１６１】
エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）を調製し、配列番号３４と配列番号３５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｄ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号３６と配列番号３７のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｇｎｄ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｇｎｄ−Ｌ断片をＮｄｅＩ及びＳａｃＩで、ｇｎｄ−Ｒ断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｇｎｄをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、ｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｄとした。【０１６２】
こうして得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｄを実施例１で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１６３】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｄ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ株と命名した。【０１６４】
なおエシェリヒア・コリＢ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１６５】
［実施例１３］
＜ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ株の作製＞
実施例１２で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｇｎｄ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ株を得た。【０１６６】
［実施例１４］
＜ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ株の作製＞
実施例１２で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａｚを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄを得た。【０１６７】
［実施例１５］
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株の作製＞
実施例５で作製したエシェリヒア・コリＢ株、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株に実施例１２で作製したプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｄを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１６８】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｄ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株と命名した。【０１６９】
［実施例１６］
＜ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株の作製＞
実施例１５で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄを得た。【０１７０】
［実施例１７］
＜ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ，△ｇｎｄ株の作製＞
実施例１５で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａｚを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株を得た。【０１７１】
［実施例１８］
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作製＞
実施例１２で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ株コンピテントセルに実施例６で作製したプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｔＲを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１７２】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｔＲ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株と命名した。【０１７３】
［実施例１９］
＜ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作製＞
実施例１８で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株を得た。【０１７４】
［実施例２０］
＜ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作成＞
実施例１８で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａｚを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株を得た。【０１７５】
［実施例２１］
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作製＞  
実施例１５で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ株コンピテントセルに実施例６で作製したプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１−ｇｎｔＲを形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１７６】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｇｎｔＲ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株と命名した。【０１７７】
［実施例２２］
＜ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作製＞
実施例２１で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株を得た。【０１７８】
［実施例２３］
＜ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作製＞
実施例２１で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａｚを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株を得た。【０１７９】
［実施例２４］
＜ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株の作製＞
実施例１で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株コンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株を得た。【０１８０】
［実施例２５］
＜ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株の作製＞
実施例５で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株△ｐｇｉコンピテントセルに実施例２で作製したプラスミドｐＩａｚを形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株を得た。【０１８１】
［試験例１］
（イソプロピルアルコールの生産）
本実施例では、ＷＯ２００９／００８３７７号パンフレット図１に示される生産装置を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽は３リットル容のガラス製のものを使用し、トラップ槽は１０Ｌ容のポリプロピレン製のものを使用した。トラップ槽には、トラップ液としての水（トラップ水）を１槽あたり９Ｌの量で注入し、２台連結して使用した。なお、培養槽には廃液管を設置して、糖や中和剤の流加により増量した培養液を適宜培養槽外に排出した。
イソプロピルアルコール生産評価に用いた株の一覧を表３として示した。【０１８２】
【表３】
2012020833.tif 000004
【０１８３】
前培養としてアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）５０ｍＬを入れた５００ｍＬ容三角フラスコに各評価株を植菌し、一晩、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養４５ｍＬを、以下に示す組成の培地８５５ｇの入った３Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＳ−ＰＩ）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．９Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度５５０ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ７．０（ＮＨ３水溶液で調整）で行った。培養開始から８時間後までの間、５０ｗｔ／ｗｔ％のグルコース水溶液を１０ｇ／Ｌ／時間の流速で添加した。その後は５０ｗｔ／ｗｔ％のグルコース水溶液を２０ｇ／Ｌ／時間の流速で、培養槽内にグルコースがなるべく残存しないように適宜添加した。培養開始から７２時間までに数回、菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中及びトラップ水中のイソプロピルアルコールおよびアセトンの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ槽２台中の合算値である。結果を表４に示した。
＜培地組成＞
コーンスティープリカー（日本食品化工製）：２０ｇ／Ｌ
Ｆｅ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．１ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４：２ｇ／Ｌ  
アデカノールＬＧ１２６（株式会社ＡＤＥＫＡ）０．１ｇ／Ｌ
（残部：水）【０１８４】
【表４】
2012020833.tif 000005
【０１８５】
評価の結果、陰性対照（ｐｌａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ）のイソプロピルアルコール生産量は４８．７ｇ／Ｌ／７２ｈであり、ｇｎｔＲを破壊した株（ｐｌａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｇｎｔＲ）の生産量は５７．３ｇ／Ｌ／７２ｈであった。これにより、ｇｎｔＲを破壊すると陰性対照と比較して生産性が約１．２倍に向上することが分かった。
また、ｇｎｔＲとｐｇｉを破壊し且つｚｗｆの発現を強化した株（ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲ）の生産量は７０．２ｇ／Ｌ／７２ｈであり陰性対照と比較して生産性が約１．４倍となった。このことから、ｇｎｔＲのみを破壊したときよりもｇｎｔＲとｐｇｉを両方破壊し且つｚｗｆの発現を強化した方が生産性が更に向上することが分かった。【０１８６】
一方、ｐｇｉのみを破壊した場合（ｐＩａａａ／ＢΔｐｇｉ）ではイソプロピルアルコールは全く生産されず、ｚｗｆを強化しただけの場合（ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ）は生産量が３９．４ｇ／Ｌ／７２ｈであって、生産性は増加せずにむしろ低下した。
ｇｎｔＲを破壊し且つｚｗｆを強発現した場合（ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｇｎｔＲ）、ｐｇｉを破壊し且つｚｗｆを強発現した場合（ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉ）及びｐｇｉとｇｎｔＲを両方破壊した場合（ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲ）でも生産量が各々３３．３ｇ／Ｌ／７２ｈ、４１．１ｇ／Ｌ／７２ｈ、９．６ｇ／Ｌ／７２ｈとなり、イソプロピルアルコールの生産性は増加せずにむしろ低下した。【０１８７】
従って、ｇｎｔＲの破壊に加えて他の因子の破壊又は強発現を行う場合、ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲ株においてみられる生産性向上の効果は、ｇｎｔＲとｐｇｉを両方破壊し且つｚｗｆを強発現させたときに得られるといえる。
また、生産性の向上が見られたｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲ株に更にｇｎｄ破壊を施した場合、即ちｐｇｉとｇｎｔＲとｇｎｄを破壊し且つｚｗｆを強発現させた場合（ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｄΔｇｎｔＲ）のイソプロピルアルコール生産量は７５．６ｇ／Ｌ／７２ｈとなり、ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲ株を上回る高い生産性を示した。【０１８８】
一方で、ｇｎｄのみを破壊した場合ではイソプロピルアルコール生産量は陰性対照より低い４５．５ｇ／Ｌ／７２ｈであり、ｇｎｄ破壊のみではイソプロピルアルコール生産性向上の効果はみられなかった。また、ｇｎｔＲとｇｎｄを破壊した場合（ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｇｎｄΔｇｎｔＲ）、ｐｇｉとｇｎｄを破壊した場合（ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｄ）及びｐｇｉとｇｎｔＲとｇｎｄを破壊した場合（ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｄΔｇｎｔＲ）の生産量は各々２８．６ｇ／Ｌ／７２ｈ、２．６ｇ／Ｌ／７２ｈ、０．８ｇ／Ｌ／７２ｈであり、これらの株ではイソプロピルアルコールの生産性が増加せずにむしろ低下した。更にはｇｎｄを破壊し且つｚｗｆを強発現させた場合（ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｇｎｄ）、ｇｎｔＲとｇｎｄを破壊し且つｚｗｆを強発現させた場合（ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｇｎｄΔｇｎｔＲ）及びｐｇｉとｇｎｄを破壊し且つｚｗｆを強発現させた場合（ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｄ）においてもイソプロピルアルコールの生産性は増加せずにむしろ低下していた（生産性は各々、４０．７ｇ／Ｌ／７２ｈ、３３．９ｇ／Ｌ／７２ｈ、３４．９ｇ／Ｌ／７２ｈであった）。
従って、ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｄΔｇｎｔＲ株においてみられる生産性向上の効果は、ｇｎｔＲとｐｇｉとｇｎｄを同時に破壊しかつｚｗｆを強発現させたときのみに得られるといえる。
また、得られたアセトンは、精製した後に、イソプロピルアルコール生産の原料として用いることができる。【０１８９】
（アセトンの製造）
［実施例２６］
＜イソプロピルアルコール、アセトンの取り出し＞
上記ｐＩａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｄΔｇｎｔＲ株（実施例２３）の培養評価時のトラップ水をＧＣ分析した結果、アセトンが１．２ｇ／Ｌ、イソプロピルアルコールは４．３ｇ／Ｌ含有されていることがわかった。上記イソプロピルアルコールおよびアセトンを含む水溶液（培養開始７２時間後のトラップ水）から蒸留により、イソプロピルアルコール及びアセトンを高濃度化し取り出した。
具体的には最初に上記水溶液２Ｌを、陽イオン交換樹脂（オルガノ製、アンバーリスト３１ＷＥＴ）２５０ｍｌを充填したカラムに流速５００ｍｌ／ｈで通液し、残存するアンモニア等を除去した。この処理液を常圧下蒸留した。沸点５３〜８１．６℃の留分を取り出し、ＧＣ分析した結果、アセトン１８．７質量％、イソプロピルアルコール６２．６質量％、不明成分が０．２質量％、残りは水であった。これを以下の脱水素反応の原料として用いた。【０１９０】
＜脱水素触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（９４：６）の調製＞
５００ｍｌの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム１５．９４ｇ（０．１５ｍｏｌ）及び水１３０ｍｌを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物３４．３６ｇ（０．１１ｍｏｌ）及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物１．３０ｇ（０．０５ｍｏｌ）を１５０ｍｌの水に溶解させた水溶液を、１時間半かけて滴下した。そのまま５日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を１２０℃で２時間、４００℃で１時間乾燥し、最後に６００℃で２時間焼成した。複合酸化物触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（９４：６）を白色の粉末として９．５０ｇを得た。【０１９１】
＜アセトンの生産＞
直径１ｃｍ、長さ４０ｃｍのＳＵＳ製反応器に、前記の複合酸化物触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（９４：６）１．０ｇ（２０ＭＰａで圧縮成型後、２５０〜５００μｍへ分級したもの）を充填し、１０ｍｌ／ｍｉｎの窒素気流下、３５０℃で上記蒸留液（アセトン１８．７質量％、イソプロピルアルコール６２．６質量％、不明成分０．２質量％、残りは水）を１．５０ｇ／ｈｒの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始５時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表５に示したように高濃度でアセトンが生成していた。なお、表５中「ＩＰＡ」はイソプロピルアルコールを表す（以下、同様）。【０１９２】
［実施例２７]
反応温度を４００℃とした以外は実施例２６と同様に行った。結果は表５に示した。表５に示したように高濃度でアセトンが生成していた。【０１９３】
［実施例２８]
＜脱水素触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（８８：１２）の調製＞
５００ｍｌの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム１５．９４ｇ（０．１５ｍｏｌ）及び水１３０ｍｌを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物３２．８６ｇ（０．１１ｍｏｌ）及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物２．６６ｇ（０．１０ｍｏｌ）を１５０ｍｌの水に溶解させた水溶液を、１時間半かけて滴下した。そのまま５日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を１２０℃で２時間、４００℃で１時間乾燥し、最後に６００℃で２時間焼成した。複合酸化物触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（８８：１２）を白色の粉末として９．９４ｇを得た。【０１９４】
＜アセトンの生産＞
直径１ｃｍ、長さ４０ｃｍのＳＵＳ製反応器に、前記の複合酸化物触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（８８：１２）１．０ｇ（２０ＭＰａで圧縮成型後、２５０〜５００μｍへ分級したもの）を充填し、１０ｍｌ／ｍｉｎの窒素気流下、３５０℃で上記蒸留液（アセトン１８．７質量％、イソプロピルアルコール６２．６質量％、不明成分０．２質量％、残りは水）を１．５０ｇ／ｈｒの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始５時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表５に示したように高濃度でアセトンが生成していた。【０１９５】
［実施例２９]
反応温度を４００℃とした以外は実施例２８と同様に行った。結果は表５に示した。表５に示したように高濃度でアセトンが生成していた。【０１９６】
【表５】
2012020833.tif 000006
【０１９７】
（イソプロピルアルコール生産大腸菌に含まれる遺伝子のコドン改変）
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌に含まれるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子とアセト酢酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン配列を変更して、イソプロピルアルコール及びアセトンの生産性を以下に示すとおりに確認した。
［実施例３０]
＜プラスミドｐＩ＊ａ＊ｚの作製＞
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ａｄｃ）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ５５３９２に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＩＰＡｄｈ）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１５７３０７に記載されている。
上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。【０１９８】
ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａｇｃｔａｃａｔａｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号３８）、及びｃｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号３９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。
コドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＩＰＡｄｈ＊）を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３のイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列をもとにコドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を設計し、ＤＮＡ合成により以下のＤＮＡフラグメント（配列番号４０）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＡＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴＧＣＧＧＧＴＴＣＧＴＡＴＧＡＴＧＣＧＡＴＴＧＴＧＣＧＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＡＴＣＴＣＣＧＴＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＴＡＣＣＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＡＧＣＴＣＴＴＧＧＣＧＡＣＣＧＣＡＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＴＧＧＡＧＧＴＡＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＴＡＴＣＧＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴＴＧＧＣＧＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴＣＡＡＡＣＧＧＴＡＴＧＣＴＣＧＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＴＴＧＧＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＣＡＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＣＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＴＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＣＧＧＧＣＴＴＣＣＡＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＴＧＴＡＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＧＣＧＧＴＴＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＡＣＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＣＧＧＡＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＣＧＡＴＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡＡＴＴＴＴＡＣＧＧＧＧＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＴＡＴＣＧＴＴＧＡＴＣＡＡＧＴＣＡＴＧＡＡＡＣＴＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡＡＡＡＧＧＣＧＴＴＧＡＣＣＧＣＧＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＣＧＴＡＴＣＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＣＣＡＧＧＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＴＡＴＡＡＡＴＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＣＧＣＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＴＡＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＣＴＴＴＧＴＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＧＴＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＡＧＡＴＡＴＧＧＴＡＧＴＧＴＡＣＡＡＣＣＧＴＧＴＴＧＡＴＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＧＴＴＣＧＡＴＣＡＣＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＴＴＡＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡ【０１９９】
作成したＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ａｃａｔｇｃａｔｇｃａｔｇａａａｇｇｔｔｔｔｇｃａａｔｇｃｔｇ（配列番号４１）、及びａｃｇｃｇｔｃｇａｃｔｔａｔａａｔａｔａａｃｔａｃｔｇｃｔｔｔａａ（配列番号４２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＳａｌＩで消化することで約１．１ｋｂｐのコドン改変イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａｌＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収してコドン改変したＩＰＡｄｈ＊が正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＵＣ−Ｉ＊と命名した。【０２００】
プラスミドｐＵＣ−Ｉ＊を制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるＩＰＡｄｈ＊を含むフラグメント、とプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しコドン改変したＩＰＡｄｈ＊が正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-Ｉ＊と命名した。【０２０１】
コドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ａｄｃ＊）を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子のアミノ酸配列をもとにコドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を設計し、ＤＮＡ合成により以下のＤＮＡフラグメント（配列番号４３）を作成した。配列を以下に記す。
ＡＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＧＣＡＣＧＣＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＡＴＴＴＣＣＧＣＧＣＧＧＴＣＣＧＴＡＴＡＡＡＴＴＴＣＡＴＡＡＴＣＧＴＧＡＡＴＡＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＴＡＴＡＣＣＧＴＡＣＣＧＡＴＡＴＧＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＴＴＡＧＴＣＣＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＴＧＡＴＡＣＧＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＴＴＧＣＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＧＴＧＡＧＣＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＡＣＧＡＧＣＣＧＧＣＡＡＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴＣＧＧＧＡＡＴＴＡＡＧＴＧＣＡＴＡＣＣＣＴＡＡＡＡＡＧＣＴＣＧＧＧＴＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＣＧＴＴＡＧＡＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＣＧＡＣＣＧＣＧＡＣＡＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＡＴＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＴＴＴＧＴＣＧＣＣＣＧＡＡＣＴＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＡＴＴＡＴＧＡＣＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣＧＣＡＴＡＴＧＣＧＡＧＣＴＴＡＴＣＡＡＣＧＣＧＡＡＡＡＴＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＣＧＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡＧＧＡＣＣＧＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＧＡＴＣＡＣＧＣＴＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＣＣＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＧＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＣＴＴＧＣＣＧＡＴＡＴＡＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＡＡＧＴＣＡＴＡＴＡＣＧＡＴＴＡＴＣＴＣＡＡＧＴＡＡ【０２０２】
作成したＤＮＡフラグメントをテンプレートに用いて、ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｇｃｔｇｇｔｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｃｔｇａａａｇａｔｇａａｇｔｇａｔｔａ（配列番号４４）、及びｇｃｔｃｔａｇａｔｔａｃｔｔｇａｇａｔａａｔｃｇｔａｔａｔｇａ（配列番号４５）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩ、ＸｂａＩで消化することで約７００ｂｐのコドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ−Ｉ＊を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｄｃ＊が正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＩ＊ａ＊と命名した。【０２０３】
グルコース６リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）を取得するためにエシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）をテンプレートに用いてｇｃｔｃｔａｇａｃｇｇａｇａａａｇｔｃｔｔａｔｇｇｃｇｇｔａａｃｇｃａａａｃａｇｃｃｃａｇｇ（配列番号４６）、及びｃｇｇｇａｔｃｃｔｔａｃｔｃａａａｃｔｃａｔｔｃｃａｇｇａａｃｇａｃ（配列番号４７）を用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで消化することで約１５００ｂｐのグルコース６リン酸１−デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＩ＊ａ＊を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＩ＊ａ＊ｚを回収した。【０２０４】
［実施例３１］
＜ｐＩ＊ａ＊／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｔＲ株の作成＞
実施例６で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに実施例３０で作製したプラスミドｐＩ＊ａ＊を形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩ＊ａ＊／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｇｎｔＲ株を得た。【０２０５】
［実施例３２］
＜ｐＩ＊ａ＊ｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ株の作成＞
実施例９で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに実施例３０で作製したプラスミドｐＩａ＊を形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩ＊ａ＊ｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｔＲを得た。【０２０６】
［実施例３３］
＜ｐＩ＊ａ＊ｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作製＞
実施例２１で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに実施例３０で作製したプラスミドｐＩ＊ａ＊ｚを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩ＊ａ＊ｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株を得た。【０２０７】
［実施例３４］
＜ｐＩ＊ａ＊／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株の作製＞
実施例１で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株コンピテントセルに実施例３０で作製したプラスミドｐＩ＊ａ＊を形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩ＊ａ＊／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株を得た。【０２０８】
［試験例２］
（イソプロピルアルコールの生産）
上記［試験例１］と同様にイソプロピルアルコールの生産評価を行った。評価に用いた株の一覧を表６に示した。また、評価結果を表７に示した。【０２０９】
【表６】
2012020833.tif 000007
【０２１０】
【表７】
2012020833.tif 000008
【０２１１】
表７の結果を表４の結果と比較したところ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子とアセト酢酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドンを改変すると、イソプロピルアルコールの生産性が大きく向上することが分かった。【０２１２】
［実施例３５］
（スクロースからのイソプロピルアルコール生産）
ｐＩ＊ａ＊ｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株に更にスクロースを分解するための酵素インベルターゼ遺伝子（ｃｓｃＡ）を導入し、スクロースからのイソプロピルアルコール発酵生産を行った。更に得られた発酵液からアセトン又はプロピレンを製造した。
＜ｐＩ＊ａ＊ｚ−ｃｓｃＡ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株の作製＞
エシェリヒア・コリＯ１５７株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＥ００５１７４ ）、エシェリヒア・コリＯ１５７株のインベルターゼをコードする遺伝子（以下、ｃｓｃＡと略することがある）の塩基配列も報告されている。すなわちｃｓｃＡはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＥ００５１７４に記載のエシェリヒア・コリＯ１５７株ゲノム配列の３２７４３８３〜３２７５８１６に記載されている。【０２１３】
ｃｓｃＡを取得するために、エシェリヒア・コリＯ１５７株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａｃｇｃａａｔｃｔｃｇａｔｔｇｃａｔｇ（配列番号４８）、及びｔｔａａｃｃｃａｇｔｔｇｃｃａｇａｇｔｇｃ（配列番号４９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで末端リン酸化することで約１４７０ｂｐのｃｓｃＡフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントと実施例３０で作成したｐＩ＊ａ＊ｚを制限酵素BamHＩで消化の後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、さらにアルカリフォスファターゼで末端を脱リン酸化したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、グルコース６リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）の３’末端側とｃｓｃＡの５’末端側が連結されｃｓｃＡが正しく挿入されていることが確認されたプラスミドをｐＩ＊ａ＊ｚ−ｃｓｃＡと命名した。
なおエシェリヒア・コリＯ１５７のゲノムは標準物質及び計量技術研究所より入手することができる。【０２１４】
実施例２１で作製したエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株コンピテントセルに作製したプラスミドｐＩ＊ａ＊ｚ−ｃｓｃＡを形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＩ＊ａ＊ｚ−ｃｓｃＡ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株を得た。【０２１５】
［試験例３］
（イソプロピルアルコールおよびアセトンの製造）
エシェリヒア・コリｐＩ＊ａ＊ｚ−ｃｓｃＡ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ△ｇｎｄ△ｇｎｔＲ株を用いた以外は上記［試験例１］と同様にして、イソプロピルアルコールおよびアセトンの製造を行った。ただし培地は５０ｗｔ／ｗｔ％グルコース水溶液の代わりに４０ｗｔ／ｗｔ％スクロース水溶液を用いて行った。その結果、培養７２時間目で８２．０ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールと２３．７ｇ／Ｌのアセトンが生成した。1台目のトラップ水をＨＰＬＣ分析した結果、アセトンが０．１４質量％、イソプロピルアルコールは０．５５質量％含有されていることが分かった。【０２１６】
（イソプロピルアルコール、アセトンの取り出し）
上記イソプロピルアルコールおよびアセトンを含むトラップ水から蒸留により、イソプロピルアルコール及びアセトンを高濃度化し取り出した。
具体的には最初に上記水溶液９Ｌを、陽イオン交換樹脂（オルガノ製、アンバーリスト３１ＷＥＴ）２５０ｍｌを充填したカラムに流速５００ｍｌ／ｈで通液し、残存するアンモニア等を除去した。この処理液を常圧下蒸留した。沸点５３℃〜８１．６℃の留分を取り出し、ＧＣ分析した結果、アセトン１９．１質量％、イソプロピルアルコール６０．５質量％、不明成分が０．５質量％、残りは水であった。これを以下の実施例３６〜実施例３９の脱水素反応、及び実施例４０のプロピレン生産の原料として用いた。【０２１７】
［実施例３６］
（アセトンの製造）
＜脱水素触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（９４：６）の調製＞
５００ｍｌの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム１５．９４ｇ（０．１５ｍｏｌ）及び水１３０ｍｌを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物３４．３６ｇ（０．１１ｍｏｌ）及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物１．３０ｇ（０．０５ｍｏｌ）を１５０ｍｌの水に溶解させた水溶液を、１時間半かけて滴下した。そのまま５日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を１２０℃で２時間、４００℃で１時間乾燥し、最後に６００℃で２時間焼成した。複合酸化物触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（９４：６）を白色の粉末として９．５０ｇを得た。【０２１８】
＜アセトンの生産＞
直径１ｃｍ、長さ４０ｃｍのＳＵＳ製反応器に、前記の複合酸化物触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（９４：６）１．０ｇ（２０ＭＰａで圧縮成型後、２５０〜５００μｍへ分級したもの）を充填し、１０ｍｌ／ｍｉｎの窒素気流下、３５０℃で上記蒸留液（アセトン１９．１質量％、イソプロピルアルコール６０．５質量％、不明成分０．５質量％、残りは水）を１．５０ｇ／ｈｒの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始５時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表８に示したように大量の水、およびバイオ由来の不純物を含んだアセトンとイソプロピルアルコールを用いた場合でも高濃度でアセトンが生成していた。なお、表８中「ＩＰＡ」はイソプロピルアルコールを表す（以下、同様）。【０２１９】
［実施例３７]
反応温度を４００℃とした以外は実施例３６と同様に行った。結果は表８に示した。表８に示したように高濃度でアセトンが生成していた。【０２２０】
［実施例３８]
＜脱水素触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（８８：１２）の調製＞
５００ｍｌの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム１５．９４ｇ（０．１５ｍｏｌ）及び水１３０ｍｌを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物３２．８６ｇ（０．１１ｍｏｌ）及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物２．６６ｇ（０．１０ｍｏｌ）を１５０ｍｌの水に溶解させた水溶液を、１時間半かけて滴下した。そのまま５日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を１２０℃で２時間、４００℃で１時間乾燥し、最後に６００℃で２時間焼成した。複合酸化物触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（８８：１２）を白色の粉末として９．９４ｇを得た。【０２２１】
＜アセトンの生産＞
直径１ｃｍ、長さ４０ｃｍのＳＵＳ製反応器に、前記の複合酸化物触媒ＺｎＯ：ＺｒＯ２（８８：１２）１．０ｇ（２０ＭＰａで圧縮成型後、２５０〜５００μｍへ分級したもの）を充填し、１０ｍｌ／ｍｉｎの窒素気流下、３５０℃で上記蒸留液（アセトン１９．１質量％、イソプロピルアルコール６０．５質量％、不明成分０．５質量％、残りは水）を１．５０ｇ／ｈｒの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始５時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表８に示したように高濃度でアセトンが生成していた。【０２２２】
［実施例３９]
反応温度を４００℃とした以外は実施例３８と同様に行った。結果は表８に示した。表８に示したように高濃度でアセトンが生成していた。【０２２３】
【表８】
2012020833.tif 000009
【０２２４】
［実施例４０]
（プロピレンの製造）
実施例３５の試験例３に記載の培養液より得られた蒸留液を原料とし、高圧用フィードポンプ、高圧用水素マスフロー、高圧用窒素マスフロー、電気炉、触媒充填部分を有する反応器、背圧弁を設置した固定床反応装置を用い、ダウンフローによる加圧液相流通反応を行った。
内径１ｃｍのＳＵＳ３１６製反応器に、反応器の出口側からまず、銅−亜鉛触媒（ＳｕｄＣｈｅｍｉｅ社製、製品名ＳｈｉｆｔＭａｘ２１０、元素質量％Ｃｕ  ３２〜３５％、Ｚｎ  ３５〜４０％、Ａｌ  ６〜７％）粉末（２５０〜５００μへ分級したもの）を上流側の触媒層として１．０ｇ充填した。触媒層を分離するため石英ウールを詰めた後、β−ゼオライト（触媒化成社製、２０ＭＰａで圧縮成型後、２５０〜５００μへ分級したもの）１．０ｇを下流側の触媒層として充填した。【０２２５】
水素で２．５Ｍｐａまで加圧した後、反応器入口側より２０ｍｌ／分の水素気流下、１８０℃で、反応器入口側より上記蒸留液（アセトン１９．１質量％、イソプロピルアルコール６０．５質量％、不明成分０．５質量％、残りは水）を０．６０ｇ／Ｈｒで流通させた。  反応器出口と背圧弁の中間に高圧窒素マスフローにより２００ｍｌ／分の窒素を導入した。背圧弁直後のラインに気液分離管を設置し、採取したガス成分、液成分をそれぞれＧＣ分析して生成物を定量した。反応結果を表９に示したように大量の水、およびバイオ由来の不純物を含んだアセトンとイソプロピルアルコールを用いた場合でも、高転化率でプロピレンが生成することがわかった。なお、表９中「ＤＩＰＥ」はジイソプロピルエーテルを表す。【０２２６】
【表９】
2012020833.tif 000010
【０２２７】
２０１０年８月１２日に出願された日本国特許出願第２０１０−１８１１５０号の開示及び２０１１年３月７日に出願された日本国特許出願第２０１１−０４９５３１号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【配列表】
2012020833000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月18日(2013.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明において用いられるグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ等のＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌  、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉ等のＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ等のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等のＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ等のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ等のＢａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌  、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属などの原核生物に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
グルコース６リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）を取得するためにエシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＣＰ０００８１９）をテンプレートに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素で消化することで約１５００ｂｐのグルコース６リン酸１−デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＩａを制限酵素で消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られたプラスミドをｐＩａｚとした。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
エシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素で消化することで約１.２ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを制限酵素で消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢを回収した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
エシェリヒア・コリ由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素で消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼαサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢを制限酵素で消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤを回収した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
さらにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素で消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼβサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤを制限酵素で消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ＩＰＡｄｈ−ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡを回収した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素で消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡを制限酵素で消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ＩＰＡｄｈ-Ａｄｃ−ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡを回収し、ｐＩａａａとした。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012020833000001.app
【国際調査報告】
2012020833.tif 000011
2012020833.tif 000012
2012020833.tif 000013
2012020833.tif 000014