(57)【要約】  本発明は、効率的に生体分子を修飾するとともに幅広く適用可能な反応を用いた、生体分子の修飾方法等を確立することを課題とする。本発明によれば、環状ジイン化合物における８員環の環状骨格の２つの炭素−炭素三重結合部位のそれぞれに、アジド基を有するアジド化合物をダブルクリック反応により付加させて連結することにより形成される２つのトリアゾール環を含む環状化合物、およびダブルクリック反応を用いた環状化合物の製造方法、生体分子の修飾方法により、本課題が解決された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状骨格と、前記環状骨格と炭素−炭素二重結合部位を共有する２つのトリアゾール環とを含む環状化合物。
【請求項２】
環状ジイン化合物における前記環状骨格の２つの炭素−炭素三重結合部位のそれぞれに、アジド基を有するアジド化合物をダブルクリック反応により付加させて連結することにより形成される前記トリアゾール環を含む請求項１に記載の環状化合物。
【請求項３】
８員環の前記環状骨格を含む請求項１または請求項２のいずれかに記載の環状化合物。
【請求項４】
前記環状骨格と炭素−炭素二重結合部位を共有するベンゼン環および／またはヘテロ芳香環をさらに有する請求項１から請求項３のいずれかに記載の環状化合物。
【請求項５】
前記環状化合物が、下記式（１）または（２）で表される請求項１から請求項４のいずれかに記載の環状化合物。
【化１】
2011118394.tif 000037
（式（１）中、Ｒはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、ｎはそれぞれ独立して０から４の整数）
【化２】
2011118394.tif 000038
（式（２）中、Ｒはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、ｎはそれぞれ独立して０から４の整数）
【請求項６】
環状ジイン化合物における２つの炭素−炭素三重結合部位のそれぞれに、アジド基を有するアジド化合物をダブルクリック反応により付加させて連結し、２つのトリアゾール環を含む環状化合物を製造する環状化合物の製造方法。
【請求項７】
プローブとしてのアジド化合物のアジド基と、生体分子に導入したアジド基とを、ダブルクリック反応により、環状ジイン化合物における２つの炭素−炭素三重結合部位のそれぞれに付加させて連結することにより環状化合物を形成する生体分子の修飾方法。
【請求項８】
前記環状ジイン化合物が、２つの炭素−炭素三重結合部位を含む８員環の環状骨格を有する請求項７に記載の修飾方法。
【請求項９】
前記環状ジイン化合物が、前記環状骨格と炭素−炭素二重結合部位を共有するベンゼン環および／またはヘテロ芳香環をさらに有する請求項８に記載の修飾方法。
【請求項１０】
前記環状ジイン化合物が、下記式（３）で表される請求項７から請求項９のいずれかに記載の修飾方法。
【化３】
2011118394.tif 000039
（式（３）中、Ｒはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、ｎはそれぞれ独立して０から４の整数）
【請求項１１】
触媒を用いることなしに、前記アジド化合物および前記生体分子の付加反応が進行する請求項７から請求項１０のいずれかに記載の修飾方法。
【請求項１２】
前記アジド化合物および前記生体分子が共存した状態で、前記ダブルクリック反応を行う請求項７から請求項１１のいずれかに記載の修飾方法。
【請求項１３】
前記環状ジイン化合物に前記生体分子を付加させ、未反応の前記環状ジイン化合物を除いて前記生体分子が付加された前記環状ジイン化合物のみに対して前記アジド化合物を付加させる請求項７から請求項１２のいずれかに記載の修飾方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状化合物、歪み誘起性ダブルクリック反応による環状化合物の製造方法、および生体分子の修飾方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物活性物質の活性発現のメカニズムや生体分子の機能を解明することなどを目的として、生体分子の化学修飾が行われている。例えば、細胞膜表面の複合糖質等の生体分子にアジド基を導入し、そのアジド基と、プローブとして蛍光性官能基等を有するトリアリールホスフィン誘導体とを反応させることで両者を共有結合で連結し、複合糖質を選択的に蛍光色素等で修飾する方法が知られている（例えば非特許文献１〜３参照）。【０００３】
また、アルキンに対して単一のアジド化合物を付加、連結させるシングルクリック反応を利用する方法も知られている。この場合、標的である生体分子に導入したアジド基と、プローブとしてのアルキン化合物とを反応させることにより、プローブを含む生体分子が識別可能となる。このようなクリック反応の例として、Ｃｕ（Ｉ）触媒を利用するものと、触媒を利用しないものとがいずれも知られている（例えば非特許文献４〜１３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】E. Saxon, C. R. Bertozzi, Science, 2000, 287, 2007-2010
【非特許文献２】K. L. Kiick, E. Saxon, D. A. Tirrell, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 19-24
【非特許文献３】J. A. Prescher, D. H. Dube, C. R. Bertozzi, Nature, 2004, 430, 873-877Nicholas J. Agard, Jennifer A. Prescher, and Carolyn R Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 126, 15046-15047, 2004
【非特許文献４】N. J. Agard, J. A. Prescher, C. R. Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047
【非特許文献５】N. J. Agard, J. M. Baskin, J. A. Prescher, A. Lo, C. R. Bertozzi, ACS Chem. Biol. 2006, 1, 644-648
【非特許文献６】J. M. Baskin, J. A. Prescher, S. T. Laughlin, N. J. Agard, P. V. Chang, I. A. Miller, A. Lo, J. A. Codelli, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007, 104, 16793-16797
【非特許文献７】J. A. Codelli, J. M. Baskin, N. J. Agard, C. R. Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 11486-11493
【非特許文献８】S. T. Laughlin, J. M. Baskin, S. L. Amacher, C. R. Bertozzi, Science 2008, 320, 664-667
【非特許文献９】X. Ning, J. Guo, M. A.Wolfert, G. J. Boons, Angew. Chem. 2008, 120, 2285-2287; Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2253-2255
【非特許文献１０】A. A. Poloukhtine, N. E. Mbua, M. A. Wolfert, G.-J. Boons, V. V. Popik, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 15769-15776
【非特許文献１１】S. T. Laughlin, C. R. Bertozzi, ACS Chem. Biol. 2009, 4, 1068-1072
【非特許文献１２】M. F. Debets, S. S. van Berkel, S. Schoffelen, F. P. J. T. Rutjes, J. C. M. van Hest, F. L. van Delft, Chem. Commun. 2010, 46, 97-99
【非特許文献１３】P. V. Chang, J. A. Prescher, E. M. Sletten, J. M. Baskin, I. A. Miller, N. J. Agard, A. Lo, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010, 107, 1821-1826
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のアジド基とホスフィン誘導体とによる生体分子の修飾反応においては、少なくとも、ホスフィン誘導体をプローブ化させる反応と、アジド基に対するホスフィン誘導体の連結反応を含む複数の工程が必要となる。このため、生体分子を効率的に修飾することは難しい。特に、アジド基とホスフィン誘導体との反応速度は一般に遅いため、修飾反応の迅速化はより困難である。さらにホスフィン誘導体が酸化され易いため、必ずしも高い効率で修飾を行うことができない。【０００６】
また、アルキンに対して単一のアジド化合物を付加させるシングルクリック反応においても、実験目的に応じてその都度、予めアルキン分子をプローブ化させる反応が必要であり、少ない工程数で生体分子を修飾することは困難である。さらに、触媒を用いないシングルクリック反応の場合には基質合成が煩雑であること、また、触媒を用いる場合においては細胞に対して触媒が毒性を示すことなどにより、シングルクリック反応は、生体分子の修飾に幅広く適用できないという欠点を有する。【０００７】
上記の状況下、基質が入手容易で、かつ少ない工程数で効率的に生体分子を修飾する反応であって、幅広く適用可能な反応により得られる環状化合物、およびそのような反応を用いた環状化合物の製造方法、生体分子の修飾方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、合成が容易な高歪性ジインを用いたダブルクリック反応を活用することにより、少ない工程数で効率的に生体分子を修飾することができ、かつこの方法が幅広く適用可能であることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。本発明は、以下のように、環状化合物、ダブルクリック反応による環状化合物の製造方法、および生体分子の修飾方法を提供する。【０００９】
＜１＞環状骨格と、環状骨格と炭素−炭素二重結合部位を共有する２つのトリアゾール環とを含む環状化合物。
＜２＞環状ジイン化合物における環状骨格の２つの炭素−炭素三重結合部位のそれぞれに、アジド基を有するアジド化合物をダブルクリック反応により付加させて連結することにより形成されるトリアゾール環を含む上述の＜１＞に記載の環状化合物。
＜３＞８員環の環状骨格を含む上述の＜１＞または＜２＞のいずれかに記載の環状化合物。
＜４＞環状骨格と炭素−炭素二重結合部位を共有するベンゼン環および／またはヘテロ芳香環をさらに有する、上述の＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の環状化合物。
＜５＞下記式（１）または（２）で表される、上述の＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の環状化合物。
【化１】
2011118394.tif 000002
（式（１）中、Ｒはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、ｎはそれぞれ独立して０から４の整数、好ましくは０又は１の整数）
【化２】
2011118394.tif 000003
（式（２）中、Ｒはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、ｎはそれぞれ独立して０から４の整数、好ましくは０又は１の整数）
＜６＞環状ジイン化合物における２つの炭素−炭素三重結合部位のそれぞれに、アジド基を有するアジド化合物をダブルクリック反応により付加させて連結し、２つのトリアゾール環を含む環状化合物を製造する環状化合物の製造方法。
＜７＞プローブとしてのアジド化合物のアジド基と、生体分子に導入したアジド基とを、ダブルクリック反応により、環状ジイン化合物における２つの炭素−炭素三重結合部位のそれぞれに付加させて連結することにより環状化合物を形成する生体分子の修飾方法。
＜８＞環状ジイン化合物が、２つの炭素−炭素三重結合部位を含む８員環の環状骨格を有する、上述の＜７＞に記載の修飾方法。
＜９＞環状ジイン化合物が、環状骨格と炭素−炭素二重結合部位を共有するベンゼン環および／またはヘテロ芳香環をさらに有する、上述の＜８＞に記載の修飾方法。
＜１０＞環状ジイン化合物が、下記式（３）で表される、上述の＜７＞から＜９＞のいずれかに記載の修飾方法。
【化３】
2011118394.tif 000004
（式（３）中、Ｒはそれぞれ独立して水素または炭化水素基、ｎはそれぞれ独立して０から４の整数、好ましくは０又は１の整数）
＜１１＞触媒を用いることなしにアジド化合物および生体分子の付加反応が進行する、上述の＜７＞から＜１０＞のいずれかに記載の修飾方法。
＜１２＞アジド化合物および生体分子が共存した状態で、ダブルクリック反応を行う、上述の＜７＞から＜１１＞のいずれかに記載の修飾方法。
＜１３＞環状ジイン化合物に生体分子を付加させ、未反応の環状ジイン化合物を除いて生体分子が付加された環状ジイン化合物のみに対してアジド化合物を付加させる、上述の＜７＞から＜１２＞のいずれかに記載の修飾方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明においては、合成容易な高歪性ジインを用いたダブルクリック反応により、少ない工程数で効率的な生体分子の修飾が可能となる。さらに、ダブルクリック反応は様々な化合物に対して適用可能であるため、このような効率的な修飾方法を幅広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】高歪性ジインとメチルアジドとのＳＰＤＣ反応における活性化エネルギーおよび遷移状態の計算結果を示す。
【図２】式（１４）に示したＳＰＤＣ反応におけるアジド化合物（ベンジルアジド）の減衰曲線を示す。
【図３】図２のＳＰＤＣ反応における濃度の異なるアジド化合物に対する擬一次反応速度定数をプロットして得られた直線（ＳＰＤＣ反応の擬一次反応速度定数）を示す。
【図４】高歪性ジインおよびＴＥＳＲＡ−ＰＥＯ３−アジドを用いたＳＰＤＣ反応により蛍光修飾されたＨａｌｏＴａｇタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図５】ＴＥＳＲＡ−ＨａｌｏＴａｇリガンドにより蛍光修飾されたＨａｌｏＴａｇタンパク質の質量分析の結果を示す。
【図６】ＳＰＤＣ反応によりＴＥＳＲＡ標識されたＨａｌｏＴａｇタンパク質の質量分析の結果を示す。
【図７】高歪性ジインおよびＴＥＳＲＡ−ＰＥＯ３−アジドを用いたＳＰＤＣ反応による生細胞表面の複合糖質の蛍光修飾実験（ジインおよびアジドによる細胞表面修飾）の結果を示す。
【図８】高歪性ジインおよびAlexaFluor 488アジドを用いたＳＰＤＣ反応による生細胞表面の複合糖質の蛍光修飾実験の結果を示す。
【図９】ＳＰＤＣ反応とシングルクリック反応それぞれによる生細胞表面の複合糖質の蛍光修飾実験の結果を示す。
【図１０】ＳＰＤＣ反応に用いられた高歪性ジインの細胞に対する毒性試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．環状化合物およびダブルクリック反応による環状化合物の製造方法
本発明の環状化合物は、環状骨格と、環状骨格と炭素−炭素二重結合部位を共有する２つの１，２，３−トリアゾール環とを含む。このような環状化合物は、ダブルクリック反応により、環状ジイン化合物における２つの炭素−炭素三重結合部位のそれぞれに、アジド基を有するアジド化合物を付加させ、縮合環である２つの１，２，３−トリアゾール環を形成されることにより製造される。
【００１３】
１Ａ．ダブルクリック反応
環状ジイン化合物における２つの炭素−炭素三重結合部位に対してアジド化合物をそれぞれ付加させるように、１つのジイン化合物に対して、２つのアジド化合物を付加させる反応をダブルクリック反応とよぶ。下記の一般式（Ｉ）により示されるダブルクリック反応では、２つの炭素−炭素三重結合部位に異なるアジド化合物をそれぞれ付加させ、３つの分子を自発的に連結させることが可能である。
【００１４】
【化Ｉ】
2011118394.tif 000005
（式（Ｉ）中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’はそれぞれ独立して水素または炭化水素基）
【００１５】
ダブルクリック反応の基質には、８員環状のジイン化合物を用いる。これは８員環状のジイン化合物が高度に歪んでおり、ダブルクリック反応を促進するためである。このように、環状ジイン化合物の歪みが促進するダブルクリック反応を、ＳＰＤＣ反応（Strain-Promoted Double-Click Reaction：歪み誘起性ダブルクリック反応）とよぶ。
【００１６】
ＳＰＤＣ反応を含むダブルクリック反応においては、ジイン化合物に対し、過剰量のアジド化合物を用いる。例えば、ジイン化合物１当量に対して、アジド化合物を２〜１０当量、好ましくは２〜５当量、より好ましくは２〜３当量程度用いる。
【００１７】
なおダブルクリック反応においては、様々な種類の溶媒が使用可能である。すなわち、アジド化合物および環状ジイン化合物が適度に溶解し得る限り、メタノール、エタノール等の主として低級のアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ピリジン、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトン、酢酸エチル、ヘキサンなどの有機溶媒、水、又は適度なｐＨの緩衝水溶液、あるいはそれらの混合溶媒が使用できる。
【００１８】
ダブルクリック反応は、環状ジイン化合物の歪みにより促進されるため、比較的穏やかな条件下で進行する。すなわちダブルクリック反応は、例えばシングルクリック反応を速やかに進めるために使用される銅触媒等の触媒が存在しない、室温付近で行うことが可能である。ただし必要に応じて、例えば１５０℃程度まで加熱することもでき、また、適切な溶媒を用いれば、例えば、−１００℃程度の低温条件下でも反応を行うこともできる。また、ダブルクリック反応の反応時間は、基質およびその濃度、あるいは反応溶媒などによっても異なるが、概ね１分間〜一日程度、通常は１０分間〜２時間程である。
【００１９】
１Ｂ．環状ジイン化合物（上述の一般式（Ｉ）における（Ａ））
環状ジイン化合物は歪みを有することが好ましく、さらに適度な安定性が必要とされる。従って、７員環以下の不安定な環状ジイン化合物よりも、８員環以上の環状ジイン化合物が好ましく、特に、８員環の環状骨格を有する環状ジイン化合物が望ましい。また、環状ジイン化合物として、酸素、窒素、硫黄等を含む複素環化合物を用いることも可能である。
【００２０】
なお環状トリイン化合物、環状テトライン化合物、あるいはそれ以上の数の炭素−炭素三重結合を有する環状化合物も、安定に存在し得る場合においては、ダブルクリック反応、トリプルクリック反応、クアドラプルクリック反応などの対象となり得る。例えば、９員環以上の環状骨格においては、トリイン、テトライン化合物も安定に存在する可能性がある。
【００２１】
環状ジイン化合物においては、炭素−炭素三重結合を２つ含む、好ましくは８員環である上述の環状骨格と、炭素―炭素二重結合部位を共有するベンゼン環等を有することが好ましい。このようなベンゼン環により、環状ジイン化合物が平面性を有し、１，３−双極子化合物であるアジドとの反応性が良好になり得るからである。環状ジイン化合物は、より好ましくは２つのベンゼン環を有する。なお環状ジイン化合物として、ベンゼン環の他にも、炭化水素基等の置換基を有するベンゼン環、または置換基を有するピリジン環、ピリミジン環、ピラジン環、フラン環、チオフェン環、ピロール環、イミダゾール環、トリアゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、などのヘテロ芳香環、さらにそれらが複数縮環したナフタレン環、アントラセン環、キノリン環、イソキノリン環、キノキサリン環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、インドール環、ベンゾイミダゾール環等を含む多環系の環状ジイン化合物をダブルクリック反応（ＳＰＤＣ反応）に用いることも可能である。また、上述の芳香環を組み合わせて、例えば１つずつ有する環状ジイン化合物を用いることもできる。
【００２２】
また、環状ジイン化合物に含まれる置換基（上述の一般式（Ｉ）におけるＲ）としては、Ｃ1-10アルキル基（メチル、エチル、プロピル等）、Ｃ2-10アルケニル基（エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル等）、Ｃ2-10アルキニル基（エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル等）、Ｃ3-10シクロアルキル基（シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル等）、Ｃ3-10シクロアルケニル基（２−シクロペンテン−１−イル、３−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル等）、Ｃ4-10シクロアルカジエニル基（２，４−シクロペンタジエン−１−イル、２，４−シクロヘキサジエン−１−イル、２，５−シクロヘキサジエン−１−イル等）、Ｃ6-14アリール基（フェニル、ナフチル、アントリル等）、Ｃ7-13アラルキル基（ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等）、Ｃ8-13アリールアルケニル基（スチリル等）、Ｃ3-10シクロアルキル−Ｃ1-6アルキル基（シクロヘキシルメチル等）等の炭化水素基、水酸基、Ｃ1-10アルコキシル基、Ｃ1-10アルコキシカルボニル基、チオール基、Ｃ1-10アルキルチオ基、アミノ基、ジ又はモノＣ1-10アルキルアミノ基、カルボキシル基、アミド基、チオアミド基、チオール基、エーテル基、エステル基、スルホン酸基、スルホン酸アミド基、ハロゲン、あるいは置換基を有する、または有していないピリジン環、ピリミジン環、ピラジン環、フラン環、チオフェン環、ピロール環、イミダゾール環、トリアゾール環、オキサゾール環、チアゾール環等のヘテロ芳香環、あるいは上述のヘテロ芳香環、Ｃ6-14アリール基等が複数縮環した多環系、さらに、上述のいずれかの置換基にハロゲン、窒素、酸素、硫黄等のうち少なくともいずれかが含まれる置換基、あるいは上述の置換基に、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、チオアミド基、チオール基、エーテル基、エステル基、スルホン酸基、スルホン酸アミド基等のうち少なくともいずれかがさらに含まれる置換基等が挙げられる。これらのうち、好ましい置換基Ｒは、Ｃ1-10アルキル基（メチル、エチル、プロピル等）、Ｃ2-10アルケニル基（エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル等）、Ｃ2-10アルキニル基（エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル等）、Ｃ3-10シクロアルキル基（シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル等）、Ｃ3-10シクロアルケニル基（２−シクロペンテン−１−イル、３−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル等）、Ｃ4-10シクロアルカジエニル基（２，４−シクロペンタジエン−１−イル、２，４−シクロヘキサジエン−１−イル、２，５−シクロヘキサジエン−１−イル等）、Ｃ6-14アリール基（フェニル、ナフチル、アントリル等）、Ｃ7-13アラルキル基（ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等）、Ｃ8-13アリールアルケニル基（スチリル等）、Ｃ3-10シクロアルキル−Ｃ1-6アルキル基（シクロヘキシルメチル等）等の炭化水素基等である。より好ましい置換基Ｒは、Ｃ1-10アルキル基（メチル、エチル、プロピル等）、Ｃ2-10アルケニル基（エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル等）、Ｃ2-10アルキニル基（エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル等）、Ｃ3-10シクロアルキル基（シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル等）、Ｃ3-10シクロアルケニル基（２−シクロペンテン−１−イル、３−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル等）、Ｃ4-10シクロアルカジエニル基（２，４−シクロペンタジエン−１−イル、２，４−シクロヘキサジエン−１−イル、２，５−シクロヘキサジエン−１−イル等）である。これらの置換基は、アジド分子の付加反応を妨げる立体障害とならないよう、炭素数が概ね上述の範囲内にあることが好ましい。また、上述の置換基は、環状ジイン化合物に、例えば単一あるいは複数の酸素原子、アミド結合、エステス結合を含むＣ1-10アルキルリンカー等を介して結合されており、あるいは直接結合されている。
【００２３】
以上のことから、歪み誘起性ダブルクリック反応（ＳＰＤＣ反応）の基質として好ましい環状ジイン化合物は、ｓｙｍ−ジベンゾ−１，５−シクロオクタジエン−３，７−ジイン（５、６、１１、１２−テトラヒドロジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテン），５、６、１１、１２−テトラヒドロ−１，４，７，１０−テトラメチルジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテン，５、６、１１、１２−テトラヒドロ−２，３，８，９−テトラメトキシジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテン，１，７−ジブチル−５、６、１１、１２−テトラヒドロジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテン、および６、７、１４、１５−テトラヒドロシクロオクタ［１，２−ｂ：５、６−ｂ’］ジナフタレン等であり、より好ましい環状ジイン化合物は、例えば、ｓｙｍ−ジベンゾ−１，５−シクロオクタジエン−３，７−ジイン（５、６、１１、１２−テトラヒドロジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテン）である。
【００２４】
１Ｃ．アジド化合物（上述の一般式（Ｉ）における（Ｂ））
ダブルクリック反応のアジド化合物としては、有機アジド化合物であればほとんど全てのものが使用可能である。有機アジド化合物は、一般的にジインとの反応性を有するからである。例えば、後述する実施例におけるアジド化合物である、芳香族アジド、脂肪族アジド、アジド糖、アジドタンパク質に加え、アジドアミノ酸、アジドペプチド、アジド核酸、アジド脂質等を用いることもできる。
【００２５】
例えば、アジド化合物は、置換基（上述の一般式（Ｉ）におけるＲ’、Ｒ’’）として、Ｃ1-10アルキル基（メチル、エチル、プロピル等）、Ｃ2-10アルケニル基（エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル等）、Ｃ2-10アルキニル基（エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル等）、Ｃ3-10シクロアルキル基（シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル等）、Ｃ3-10シクロアルケニル基（２−シクロペンテン−１−イル、３−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル等）、Ｃ4-10シクロアルカジエニル基（２，４−シクロペンタジエン−１−イル、２，４−シクロヘキサジエン−１−イル、２，５−シクロヘキサジエン−１−イル等）、Ｃ6-14アリール基（フェニル、ナフチル、アントリル等）、Ｃ7-13アラルキル基（ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等）、Ｃ8-13アリールアルケニル基（スチリル等）、Ｃ3-10シクロアルキル−Ｃ1-6アルキル基（シクロヘキシルメチル等）、等の炭化水素基、置換基を有するピリジン環、ピリミジン環、ピラジン環、フラン環、チオフェン環、ピロール環、イミダゾール環、トリアゾール環、オキサゾール環、チアゾール環、などのヘテロ芳香環とＣ6-14アリール基を含むそれらが複数縮環した多環系、さらにこれらの置換基にハロゲン、窒素、酸素、硫黄等が含まれる水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、チオアミド基、チオール基、エーテル基、エステル基、スルホン酸基、スルホン酸アミド基等を有する。さらにこれらの他、保護または無保護の糖誘導体、核酸誘導体、脂質誘導体、アミノ酸またはペプチド誘導体等である。これらの置換基は、環状ジイン化合物への付加反応を妨げる立体障害とならないよう、炭素数が概ね上述の範囲内にあることが好ましい。
アジド化合物は、より好ましくは、置換基Ｒ’、Ｒ’’として、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、Ｃ6-10シクロアルキル基、Ｃ6-10シクロアルケニル基、Ｃ6-10シクロアルカジエニル基、Ｃ6-12アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ8-10アリールアルケニル基、Ｃ6-10シクロアルキル−Ｃ3-6アルキル基等の炭化水素基、等を有する。
これらの好ましいアジド化合物の例としては、メチルアジド、エチルアジド、プロピルアジド、アジド酢酸エステル、アジドアダマンタン、フェニルアジドおよびその誘導体、ベンジルアジドおよびその誘導体、シクロヘキシルアジド等が挙げられる。
好ましいアジド化合物のより具体的な例としては、メチルアジド、アジド酢酸エチル、1-アジドアダマンタン、フェニルアジド、2-メチルフェニルアジド、2-イソプロピルフェニルアジド、2,6-ジメチルフェニルアジド、2,6-ジエチルフェニルアジド、2,6-ジイソプロピルフェニルアジド、2‐ｔ-ブチル‐6‐メチルフェニルアジド、2,6-ジブロモフェニルアジド、4-メトキシフェニルアジド、4-トリフルオロメチルフェニルアジド、3,5‐ビス（トリフルオロメチル）フェニルアジド、4-(アジドメチル)安息香酸メチル、ベンジルアジド、4-(アジドメチル)ベンジルアルコール等が挙げられる。
【００２６】
１Ｄ．環状化合物およびトリアゾール環
ダブルクリック反応の結果、環状化合物（上述の式（１）、（２）および一般式（Ｉ）における（Ｃ）、（Ｄ））が製造される。この環状化合物においては、アジド化合物（上述の一般式（Ｉ）における（Ｂ））の付加による２つのトリアゾール環が形成されている。このように、アジド化合物のアジド基由来のトリアゾール環は、いずれも上述の環状骨格と縮合しており、炭素−炭素二重結合部位を共有する。
環状化合物は、ダブルクリック反応に使用された環状ジイン化合物とアジド化合物に対応した構造を有する。すなわち、環状化合物のトリアゾール環においては、下記式（１-１）〜（２-３）に示されたようにアジド化合物の置換基Ｒ１、Ｒ２が導入される。また、反応に用いられた環状ジイン化合物において、環状骨格に縮合された２つのベンゼン環が置換基を有していない場合、環状化合物のベンゼン環も置換基を含まず（下記式（１-１）および（２-１）参照）、２つのベンゼン環が置換基Ｒ３、Ｒ４を有していた場合、環状化合物も対応する置換基Ｒ３、Ｒ４を有する（下記式（１-２）および（２-２）参照）。なお、下記式（１-２）および（２-２）におけるｎは、それぞれ独立して０から４の整数である。さらに、環状ジイン化合物の環状骨格にベンゼン環以外の環Ａ、Ｂが縮合されていた場合、生じた環状化合物においても、対応する環Ａ、Ｂが含まれる（下記式（１-３）および（２-３）参照）。
【化３−１】
2011118394.tif 000006
【化３−２】
2011118394.tif 000007
【化３−３】
2011118394.tif 000008
以上のことから明らかであるように、置換基Ｒ１〜Ｒ４をいずれも有していない環状化合物、置換基Ｒ１〜Ｒ４の一部または全てを有する環状化合物のいずれもが、ダブルクリック反応に使用可能である。なお、上述の式（１-１）、（２-１）、（１-２）、（２-２）、（１-３）、および（２-３）における置換基Ｒ１およびＲ２は上述の一般式（Ｉ）におけるＲ’、Ｒ’’と同じであり、置換基Ｒ３およびＲ4は一般式（Ｉ）におけるＲと同じである。
好ましい環状化合物の具体例としては、上述の好ましい環状ジイン化合物およびアジド化合物のダブルクリック反応により生成されたもの、すなわち、
1,8-ジヒドロ-1,8-ジメチルジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ジヒドロ-1,10-ジメチルジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ビス（エトキシカルボニルメチル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ビス（エトキシカルボニルメチル）-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ジアダマンチル-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ジアダマンチル-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ジヒドロ-1,8-ジフェニルジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ジヒドロ-1,10-ジフェニルジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ジヒドロ-1,8-ビス（2-メチルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ジヒドロ-1,10-ビス（2-メチルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
-1,8-ジヒドロ-1,8-ビス（2-イソプロピルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ジヒドロ-1,10-ビス（2-イソプロピルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ビス（2,6-ジメチルフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ビス（2,6-ジメチルフェニル）-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ビス（2,6-ジエチルフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ビス（2,6-ジエチルフェニル）-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ビス（2,6-ジイソプロピルフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ビス（2,6-ジイソプロピルフェニル）-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ビス（2-ｔ-ブチル-6-メチルフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ビス（2-ｔ-ブチル-6-メチルフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ビス（2,6‐ジブロモフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ビス（2,6‐ジブロモフェニル）-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ジヒドロ-1,8-ビス（4-メトキシフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ジヒドロ-1,10-ビス（4-メトキシフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ジヒドロ-1,8-ビス（4-トリフルオロメチルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ジヒドロ-1,10-ビス（4-トリフルオロメチルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ビス［3,5‐ビス（トリフルオロメチル）フェニル］-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ビス［3,5‐ビス（トリフルオロメチル）フェニル］-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ジヒドロ-1,8-ビス[4-（メトキシカルボニル）ベンジル]ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ジヒドロ-1,10-ビス[4-（メトキシカルボニル）ベンジル]ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ジベンジル-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ジベンジル-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、
1,8-ジヒドロ-1,8-ビス[4-（ヒドロキシメチル）ベンジル]ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)、1,10-ジヒドロ-1,10-ビス[4-（ヒドロキシメチル）ベンジル]ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)等が挙げられる。
なおダブルクリック反応により生成された環状化合物においては、置換基Ｒ１およびＲ２の大きさ等にも左右されるものの、通常、熱力学的により安定なトランス体（一般式（Ｉ）における（Ｃ）および式（１-１）〜（１-３））が、シス体（一般式（Ｉ）における（Ｄ）および式（２-１）〜（２-３））よりも多く含まれる。
【００２７】
２．ダブルクリック反応による生体分子の修飾方法
本発明の生体分子の修飾方法においては、ダブルクリック反応（ＳＰＤＣ反応）が用いられる。すなわち、環状ジイン化合物における２つの炭素−炭素三重結合部位のそれぞれに、プローブとしてのアジド化合物のアジド基と、予め生体分子中に導入したアジド基とを、ダブルクリック反応（ＳＰＤＣ反応）により付加、連結させて環状化合物を形成する。こうして生成される、生体分子を含む環状化合物においては、プローブとしてのアジド化合物由来の置換基が導入される。
【００２８】
例えば、蛍光プローブ、陽電子放射断層画像撮影法(PET)プローブ等の分子イメージングプローブとしての機能を有するアジド化合物等を、環状ジイン化合物を介して、予め調製したアジド基含有タンパク質、アジド基含有複合糖質等に連結させるダブルクリック反応を行うことにより、タンパク質、あるいは生細胞の膜表面の複合糖質などの生体分子を、機能を維持したまま修飾し、標識化することができる。より具体的には、後述の実施例２１、２２を参照されたい。
また、ダブルクリック反応においては、環状ジイン化合物に生体分子を付加させた後にプローブとしてのアジド化合物を逐次的に付加させることもできる。このような逐次的なダブルクリック反応の場合、生体分子の付加反応において未反応のまま残った環状ジイン化合物を除去し、生体分子が付加された環状ジイン化合物のみに対してアジド化合物を付加させることが好ましい。一方、生体分子とアジド化合物とが共存した状態で、これらを環状ジイン化合物に付加させることもできる。この場合、環状ジイン化合物を介して生体分子とアジド化合物とを一工程にて連結させることができ、生体分子の効率的な化学修飾が可能である。
【００２９】
２Ａ．生体分子
本発明を用いて修飾できる生体分子としては、以下のように、予めアジド基が導入されたタンパク質（酵素、抗体、受容体、ホルモン、結合因子、リガンド、細胞構造蛋白質等を含む）、糖、核酸、脂質、およびこれらの複合分子等が挙げられる。さらに、試験管内にて調製されるものに限らず、生きた状態の細胞の内側、外側、および表面に存在する生体分子も含まれる。
例えば、生体分子として、アクチン・チューブリン・ビメンチン・ラミン等の細胞骨格タンパク質およびこれらに結合するアクチニン・コフィリン・プロフィリン・Arp2/3・ジキシン・MRTF(MAL)等の機能タンパク質、ミオシン・ダイニン・キネシン・ATP合成酵素等のモータータンパク質、カドヘリン・インテグリン等の接着タンパク質、コラーゲン・フィブロネクチン・テネイシン・バイグリカン・シンデカン・フィブリノーゲン・トロンビン・フィブリン・ラミニン・エンタクチン・エラスチン・ファシクリン・ペリオスチン・beta ig-h3・バーシカン、デコリン等の細胞外マトリックスタンパク質および細胞外マトリックスに結合するタンパク質（トランスグルタミナーゼ・リシルオキシダーゼ・コラーゲンC末端切断酵素・マトリックスメタロプロテアーゼ・コラーゲン受容体等）・ペプチド（コラゲリン等）・糖（ヒアルロン酸等）、FAK・p130CAS・タリン・ビンキュリン・Rap等の細胞間接着複合体構成タンパク質、熱ショックタンパク質・カルレティキュリン・カルネキシン等の小胞体シャペロンタンパク質、GM130等のゴルジ体構成タンパク質、チトクロム複合体等のミトコンドリア構成タンパク質、プロテアソーム構成タンパク質、増殖因子受容体タンパク質、Toll様受容体、STAT・MAPK・Ras・Rho・Rac等のシグナル伝達タンパク質群、上皮成長因子EGF・線維芽細胞増殖因子FGF・血小板由来増殖因子PDGF・神経栄養因子・インスリン・インリン用増殖因子・血管内皮細胞増殖因子VEGF・幹細胞因子・TGFb等の細胞増殖・細胞移動を惹起する分泌性タンパク質、TNFa等の炎症性サイトカイン、セロトニン・アドレナリン等の神経伝達物質、副甲状腺ホルモン・インヒビン・カルシトニン・性腺刺激ホルモン・メラトニン・インスリン・プロラクチン・甲状腺刺激ホルモン・抗利尿ホルモン・エピネフリン・ノルエピネフリン・アンドロゲン・エストロゲン・コルチコイド等のホルモン、NFkappaB・c-fos・c-jun・SRF・熱ショック因子HSF・低酸素誘導因子HIF・ステロール調節エレメント結合タンパク質SREBP・Hoxファミリー・Soxファミリー・c-myc・c-myb等の転写活性化因子、RNAポリメラーゼ等の転写因子複合体構成タンパク質、SAP130等のスプライソソーム複合体構成タンパク質、S6等のリボソーム複合体構成タンパク質、核膜孔複合体構成タンパク質、テロメラーゼ・ヒストン等のDNA結合タンパク質、、死細胞に特異的に結合するアネキシンV等の標識タンパク質、抗体タンパク質、イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン等の発光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（GFP）、青色蛍光タンパク質（BFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）等の蛍光タンパク質、ホタルルシフェラーゼ、ウミホタルシフェラーゼ、Renillaシフェラーゼ、Gaussiaシフェラーゼ、Oplophorusシフェラーゼ、BFP等のシフェラーゼ、アジド基を有するリガンドを予め特異的に共有結合させたＨａｌｏＴａｇタンパク質、ＳＮＡＰタグタンパク質、ＣＬＩＰタグタンパク質等のリガンド共有結合性タンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、デヒドロ葉酸還元酵素、テトラシステインモチーフ（-CCXXCC-：Xは任意のアミノ酸）ペプチド配列含有タンパク質、テトラセリンモチーフ（-SSXXSS-：Xは任意のアミノ酸）ペプチド配列含有タンパク質等の低分子リガンド非共有結合性タンパク質等が挙げられる。さらなる生体分子として、プロテインキナーゼC・プロテインキナーゼA・カルモジュリン・DYRK・p70S6K・Clk・受容体型リン酸化酵素（上皮成長因子受容体・血小板由来増殖因子受容体・神経栄養因子受容体・線維芽細胞増殖因子受容体・インスリン受容体・インスリン様増殖因子受容体・血管内皮細胞増殖因子受容体・幹細胞因子受容体等）・mTOR複合体・GSK3・MAPキナーゼ・Mos/Rafキナーゼ・cdc2等のリン酸化酵素、カルシニューリン・脂質脱リン酸化酵素PTEN・ヒスチジン脱リン酸化酵素・セリン／トレオニン特異的脱リン酸化酵素・チロシン特異的脱リン酸化酵素・酸性脱リン酸化酵素・アルカリ性脱リン酸化酵素等の脱リン酸化酵素、および上記全ての変異体、予めアジド基を導入したならびに上記の複数のタンパク質それぞれを適当なリンカーを介して融合したタンパク質、アジドチロシン、アジドフェニルアラニン、アジドアラニン、アジドホモアラニン等のアジド基含有非天然アミノ酸を用いて作成されたペプチドおよびタンパク質、予めアジド基を導入したシアル酸、グルコース、グルコサミン、マンノース、マンノサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、リボース、デオキシリボース等の誘導体を含む細胞膜表面等の複合糖質、予めアジド基を導入したオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、モルフォリノヌクレオチド等のヌクレオチド類、アジドアデノシン、アジドグアノシン、アジドチミジン、アジドシトシン、アジドウラシル、などの核酸から合成されるヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチド類、予めアジド基を導入したジアシルグリセロール・セラミド・スフィンゴリン脂質・グリセロリン脂質・スフィンゴ糖脂質・グリセロ糖脂質・スルホ脂質・脂肪酸・テルペノイド・ステロイド・カロテノイド等の脂質類、および生体由来の培養された細胞等、さらに光クロスリンク法やFITC等の高反応性機能性低分子リガンドで無差別あるいは部位特異的に化学修飾した予めアジド基を導入した上記のあらゆる天然生体分子等、様々なものが挙げられる。
また、例えば、大腸菌、昆虫細胞、酵母等を用いて人工的に作製されるタンパク質や、試験管内でアミノ酸から人工合成されたタンパク質などの人工生体分子を含む。これらの生体分子は、いずれも、プローブによって標識することが可能である。
【００３０】
次に、実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
環状ジイン化合物の合成方法
後述の実施例で、環状ジイン化合物として用いられるジイン３（sym-ジベンゾ−１，５−シクロオクタジエン−３，７−ジイン（sym-dibenzo-1,5-cyclooctadiene-3,7-diyne））は、例えば非特許文献（a）H. N. C. Wong, P. J. Garratt, F. Sondheimer, J. Am. Chem. Soc. 1974, 96, 5604-5605；ｂ） A. Orita, D. Hasegawa, T. Nakano, J. Otera, Chem. Eur. J. 2002, 8, 2000-2004; ｃ) S. Chaffins, M. Brettreich, F. Wudl, Synthesis 2002, 1191-1194）に記載の方法により容易に合成することができる。
各化合物の合成の際に、フラッシュカラムクロマトグラフィーには、シリカゲル（関東化学社製37563−85、シリカゲル 60 N（球状、中性）、粒径40−50μm）又は関東化学社製37565−85、シリカゲル 60 N（球状、中性）、粒径63−210μmを用いて行った。
薄層クロマトグラフィー（TLC）は、あらかじめシリカゲルが塗布されたガラスプレート（Merck社製1.05715、シリカゲル 60 F254）を用いて行った。
化合物の物性値の測定
後述の実施例で生成された化合物の構造解析、物性値の測定は、以下のように行った。
融点（Mp）は、ヤナコ（YANACO）機器開発研究所社製、MP−J3微量融点測定装置を用いて測定した（未補正値）。
1Hおよび13C NMR（核磁気共鳴）スペクトルは、バリアン（Varian）社製、Mercury 300核磁気共鳴装置を用い、それぞれ300 MHzおよび75.5 MHzにて測定するか、または、ブルカー（Bruker）社製、AVANCE 500核磁気共鳴装置を用い、それぞれ500 MHzおよび126 MHzにて測定した。NMRスペクトル測定用溶媒には、CDCl3、DMSO-d6、又はCD3OD（いずれもCIL社製）を使用した。
化学シフト（δ）は、テトラメチルシラン（(CH3)4Si）（CDCl3中での1H NMR測定；δ 0 ppm）、又は測定溶媒由来のピーク（DMSO-d6中での1H NMR測定；δ2.49 ppm、CD3OD中での1H NMR測定；δ3.30 ppm、CDCl3中での13C NMR測定；δ77.0 ppm）を内部標準として相対的な値として表し、結合定数（J）はHzで示した。後述の略号s、d、t、q、m、及びbrはそれぞれ単重線、二重線、三重線、四重線、多重線、及び幅広線を表す。
赤外分光（IR）スペクトルは、DRS−8000A拡散反射測定装置を装着した島津製作所（SHIMADZU）社製、IRPrestige−21フーリエ変換赤外分光光度計を用いて拡散反射法により測定した。
紫外吸収（UV）スペクトルは、島津製作所（SHIMADZU）社製、UV−3100紫外可視近赤外分光光度計を用い、石英セル（光路長10 mm）中、２５℃においてスキャン速度：高速の条件で測定した。
蛍光（FL）スペクトルは、島津製作所（SHIMADZU）社製、RF−5300PC分光蛍光光度計を用い、石英セル（光路長10 mm）中、２５ ℃において励起側バンド幅3 nm、蛍光側バンド幅3 nm、スキャン速度：中速の条件で測定した。
高分解能質量分析スペクトル（HRMS）は、日本電子（JEOL）社製、JMS−700を用いた高速原子衝突（FAB+）法又は電子衝撃イオン化（EI）法、又はブルカー（Bruker）社製、micrOTOF質量分析装置を用いたエレクトロスプレーイオン化（ESI+）法により測定した。FAB+法の際のマトリックスには、m−ニトロベンジルアルコール（NBA）を用いた。
結晶のX線は、リガク（Rigaku）社製、イメージングプレート単結晶自動Ｘ線構造解析装置R-AXIS RAPID IIを用いて測定し、SHELXL-97プログラムを用いて構造解析を行った。結晶構造のデータは、CSD (ケンブリッジ結晶構造データベース)に登録されており、ケンブリッジ結晶学データセンター (Cambridge Crystallographic Data Centre : CCDC、www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif)にリクエストすることで入手可能である。
【００３１】
実施例１（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製１）
【化４】
2011118394.tif 000009
上記反応式（４）で示されるように、ジイン３（40.0 mg, 200 μmol）のメタノール（23.5 mL）溶液に、室温にて、ベンジルアジド（４ａ、市販品）（63.9 mg, 480 μmol）のメタノール（1.5 mL）溶液を加え、そのまま室温にて７０分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ジクロロメタンのみからジクロロメタン/メタノール = 6/1）により精製し、二重環化付加生成物の２つの位置異性体であるトランス体６ａ（55.8 mg, 120 μmol, 59.9%）、およびシス体７ａ（35.2 mg, 75.4 μmol, 37.8%）を得た。それぞれの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 759900（６ａ）および CCDC 759902（７ａ））。
1,8-ジベンジル-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
（1,8-Dibenzyl-1,8-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)） (６ａ)
ｎ-ヘキサン／酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。 
Mp 230-232 ℃; 
Rf= 0.26 (ヘキサン/酢酸エチル = 1/1); 
Rf= 0.69 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.31 (d, 2H, J = 15.3 Hz), 5.50 (d, 2H, J = 15.3 Hz), 6.94-7.01 (m, 4H), 7.09 (dd, 2H, J = 0.8, 7.6 Hz), 7.22-7.30 (m, 6H), 7. 40 (ddd, 2H, J = 1.3, 7.6, 7.6 Hz), 7.52 (ddd, 2H, J = 1.3, 7.6, 7.6 Hz), 7. 71 (dd, 2H, J = 0.8, 7.6 Hz); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ 52.1 (2C), 126.4 (2C), 127.0 (4C), 128.2 (2C), 128.7 (2C), 128.8 (4C), 129.9 (2C), 130.2 (2C), 131.2 (2C), 132.6 (2C), 134.9 (2C), 135.1 (2C), 145.0 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 706, 731,764, 910, 984, 1028, 1215, 1250, 1350, 1454, 1497, 1514, 3063; 
HRMS (ESI+) m/z 467.1984 ([M+H]+, C30H23N6+計算値 467.1979).
1,10-ジベンジル-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
（1,10-Dibenzyl-1,10-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)）(７ａ)
ｎ-ヘキサン／酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。 
Mp 274-277 ℃; 
Rf= 0.26 (ヘキサン/酢酸エチル = 1/1); 
Rf= 0.44 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4.89 (d, 2H, J = 15.5 Hz), 5.31 (d, 2H, J = 15.5 Hz), 6.94-7.04 (m, 4H), 7.04-7.14 (m, 2H), 7.24-7.36 (m, 6H), 7.36-7.45 (m, 2H), 7.45-7.54 (m, 2H), 7.62-7.72 (m, 2H); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ 52.0 (2C), 127.2 (4C), 127.9 (2C), 128.3 (2C), 128.8 (4C), 129.1 (2C), 129.8 (2C), 130.3 (2C), 130.7 (2C), 130.9 (2C), 133.6 (2C), 135.3 (2C), 146.2 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 698, 729, 766, 910, 984, 1028, 1211, 1246, 1344, 1427, 1454, 1497, 1516, 3061; 
HRMS (ESI+) m/z 467.1982 ([M+H]+, C30H23N6+計算値 467.1979).
【００３２】
実施例２（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製２）
【化５】
2011118394.tif 000010
上記反応式（５）で示されるように、ジイン３（40.0 mg, 200 μmol）のメタノール（23.5 mL）溶液に、室温にて、ベンジルアジド（４ａ）（26.6 mg, 200 μmol）のメタノール（1.5 mL）溶液を加え、そのまま室温にて２４時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ジクロロメタンのみからジクロロメタン/メタノール = 6/1）により精製し、二重環化付加生成物の２つの位置異性体であるトランス体６ａ（22.0 mg, 47.2 μmol, 23.6%）、およびシス体７ａ（19.0 mg, 40.7 μmol, 20.4%）を得るとともに、出発原料のジイン３（22.7 mg, 113 μmol, 56.8%）を回収した。
【００３３】
上記実施例１のＳＰＤＣ反応において、中間体として推定されるモノ環化付加物５ａ（上記反応式（４）参照）は検出されず、単離することもできなかった。また、実施例２のＳＰＤＣ反応のように、ジイン３とベンジルアジド（４ａ）を当量ずつ反応させてもモノ環化付加物５ａは得られず、二重環化付加体６ａおよび７ａとジイン３が回収されるだけであった。出発原料のジイン３を基準にすると、６ａ、７ａ、および回収されたジイン３の合計収率が１００％であった。これらのことは、中間体５ａのベンジルアジド４ａに対する反応性が、出発物質であるジイン３よりも高いことを示している。このように、ＳＰＤＣ反応の中間体の反応性が出発物質であるジインよりも高いことは、後述する反応の活性化エネルギー等の計算結果によっても支持された。
【００３４】
このように、２つのアジド化合物が環状ジイン化合物に付加し、連結されることにより、８員環の環状骨格と炭素―炭素二重結合部位をそれぞれ共有する２つの１，２，３−トリアゾール環が形成される。なおジイン３は、歪みを有するとともに安定で取り扱い易いため、ＳＰＤＣ反応の基質として適している。ジイン３の代わりに、上述の式（３）で示されたように、ジイン３の２つのベンゼン環のいずれか、あるいは両方に炭化水素基などの置換基を有する環状ジイン化合物を用いることもできる。
【００３５】
実施例３（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製３）
【化６】
2011118394.tif 000011
上記反応式（６）で示されるように、ジイン３（40.0 mg, 200 μmol）のメタノール（23.5 mL）溶液に、室温にて、アジド酢酸エチル（４ｂ、市販品）（55.0 μL, 480 μmol）のメタノール（1.5 mL）溶液を加え、そのまま室温にて６０分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ヘキサン/酢酸エチル = 1/1）により精製し、二重環化付加生成物の２つの位置異性体であるトランス体６ｂ（41.9 mg, 91.5 μmol, 45.8%）、およびシス体７ｂ（38.8 mg, 84.7 μmol, 42.4%）を得た。それぞれの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 759901（６ｂ）および CCDC 759903（７ｂ））。
1,8-ビス（エトキシカルボニルメチル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール）
（1,8-Bis(ethoxycarbonylmethyl)-1,8-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)） (６ｂ)
ｎ-ヘキサン／酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 204-205 ℃; 
Rf= 0.55 (ヘキサン/酢酸エチル = 1/3); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.23 (t, 6H, J = 7.1 Hz), 4.10-4.34 (m, 4H), 4.87 (d, 2H, J = 17.4 Hz), 5.09 (d, 2H, J = 17.4 Hz), 7.31 (d, 2H, J = 7.1 Hz), 7.48 (dd, 2H, J = 7.1, 7.1 Hz), 7.57 (dd, 2H, J = 7.1, 7.1 Hz), 7.78 (d, 2H, J = 7.1 Hz); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ 13.8 (2C), 49.4 (2C), 62.3 (2C), 125.7 (2C), 129.0 (2C), 129.1 (2C), 130.3 (2C), 131.5 (2C), 132.4 (2C), 135.3 (2C), 144.4 (2C), 166.3 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 737, 766, 779, 876, 910, 986, 1022, 1134, 1161, 1211, 1256, 1348, 1364, 1418, 1474, 1516, 1748, 2982; 
HRMS (ESI+) m/z 459.1788 ([M+H]+, C24H23N6O4+計算値 459.1775).
1,10-ビス（エトキシカルボニルメチル）-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Bis(ethoxycarbonylmethyl)-1,10-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) (７ｂ)
ｎ-ヘキサン／酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。 
Mp 214-217 ℃; 
Rf= 0.38 (ヘキサン/酢酸エチル = 1/3); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, 6H, J = 7.1 Hz), 4.21 (q, 4H, J = 7.1 Hz), 5.03 (d, 2H, J = 17.4 Hz), 5.13 (d, 2H, J = 17.4 Hz), 7.35-7.44 (m, 2H), 7.47-7.59 (m, 4H), 7.66-7.76 (m, 2H); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ 13.9 (2C), 49.3 (2C), 62.2 (2C), 128.3 (2C), 129.0 (2C), 129.8 (2C), 130.19 (2C), 130.22 (2C), 130.8 (2C), 134.5 (2C), 145.6 (2C), 166.5 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 733, 768, 799, 876, 912, 986, 1020, 1132, 1161, 1211, 1250, 1346, 1362, 1414, 1474, 1518, 1748, 2984; 
HRMS (ESI+) m/z 459.1783 ([M+H]+, C24H23N6O4+計算値 459.1775).
【００３６】
実施例４（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製４）
【化７】
2011118394.tif 000012
上記反応式（７）で示されるように、ジイン３（40.0 mg, 200 μmol）のメタノール（23.5 mL）溶液に、室温にて、フェニルアジド（４ｃ、非特許文献N. D. Obushak, N. T. Pokhodylo, N. I. Pidlypnyi, V. S. Matiichuk, Russ. J. Org. Chem. 2008, 44, 1522-1527に記載の方法により合成）（57.2 mg, 480 μmol）のメタノール（1.5 mL）溶液を加え、そのまま室温にて９０分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ヘキサン/酢酸エチル = 4/1）により精製し、二重環化付加生成物の２つの位置異性体であるトランス体６ｃ（36.5 mg, 83.2 μmol, 41.7%）、およびシス体７ｃ（46.1 mg, 105 μmol, 52.6%）を得た。それぞれの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 759898（６ｃ）および CCDC 759905（７ｃ））。
1,8-ジヒドロ-1,8-ジフェニルジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
（1,8-Dihydro-1,8-diphenyldibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)） (６ｃ)
ｎ-ヘキサン／ジクロロメタンで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。 
Mp >300 ℃; 
Rf= 0.23 (ヘキサン/酢酸エチル = 3/1); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6.84 (dd, 2H, J = 1.2, 7.8 Hz), 7.21 (ddd, 2H, J = 1.2, 7.8, 7.8 Hz), 7.29-7.43 (m, 10H), 7.48 (ddd, 2H, J = 1.2, 7.8, 7.8 Hz), 7.83 (dd, 2H, J = 1.2, 7.8 Hz); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ 125.0 (4C), 126.7 (2C), 128.8 (2C), 129.1 (2C), 129.3 (4C), 130.0 (2C), 130.8 (2C), 131.3 (2C), 131.9 (2C), 134.2 (2C), 135.9 (2C), 145.8 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 692, 734, 768, 997, 1265, 1361, 1497, 1512, 1595; 
HRMS (ESI+) m/z 439.1667 ([M+H]+, C28H19N6+計算値 439.1666).
1,10-ジヒドロ-1,10-ジフェニルジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
（1,10-Dihydro-1,10-diphenyldibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)） (７ｃ)
ｎ-ヘキサン／ジクロロメタンで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。 
Mp >300 ℃; 
Rf= 0.13 (ヘキサン/酢酸エチル = 3/1); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6.87-6.95 (m, 2H), 7.12-7.21 (m, 2H), 7.39-7.51 (m, 10H), 7.52-7.62 (m, 2H), 7.77-7.85 (m, 2H); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ 126.1 (4C), 127.4 (2C), 129.4 (4C), 129.6 (2C), 129.8 (2C), 130.3 (2C), 130.6 (2C), 131.4 (2C), 131.6 (2C), 134.1 (2C), 135.8 (2C), 145.1 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 527, 608, 687, 734, 762, 997, 1069, 1132, 1175, 1263, 1358, 1427, 1476, 1497, 1514, 1595; 
HRMS (ESI+) m/z 439.1670 ([M+H]+, C28H19N6+計算値 439.1666).
【００３７】
実施例５（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製５）
【化８】
2011118394.tif 000013
上記反応式（８）で示されるように、ジイン３（40.0 mg, 200 μmol）のメタノール（25.0 mL）溶液を、室温にて、1-アジドアダマンタン（４ｇ）（85.1 mg, 480 μmol）に加えた。室温にて２４時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール = 49/1)で精製し、トランス体６ｇ（27.5 mg, 49.6 μmol, 24.8%）、およびシス体７ｇ（77.9 mg, 140 μmol, 70.3%）を得た。それぞれの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 810930（６ｇ）および CCDC 810837（７ｇ））。
1,8-ジアダマンチル-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Diadamantyl-1,8-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) (６ｇ) 
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 240-242 ℃; 
Rf= 0.79 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1); 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.56-1.65 (m, 12H), 2.02-2.11 (m, 12H), 2.21-2.25 (m, 6H), 7.32-7.38 (m, 4H), 7.47 (ddd, 2H, J = 1.5, 7.5, 7.5 Hz), 7.64 (d, 2H, J = 7.5 Hz); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) 29.7 (6C), 35.7 (6C), 42.7 (6C), 63.9 (2C), 127.6 (2C), 129.6 (2C), 129.8 (2C), 130.5 (2C), 130.9 (2C), 132.5 (2C), 134.3 (2C), 146.5 (2C); IR (KBr, cm-1) 731, 764, 777, 839, 912, 1011, 1101, 1125, 1260, 1306, 1323, 1358, 1452, 2853, 2909; 
HRMS (ESI+) m/z 555.3237 ([M+H]+, C36H39N6+ requires 555.3231).
1,10-ジアダマンチル-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Diadamantyl-1,10-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) (７ｇ) 
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp ＞300 ℃; 
Rf= 0.57 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1); 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ1.68 (br d, 6H, J = 12.0 Hz), 1.74 (br d, 6H, J = 12.0 Hz), 2.18 (br s, 6H), 2.34 (br s, 12H), 7.31-7.35 (m, 2H), 7.36-7.43 (m, 4H), 7.58-7.63 (m, 2H); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 29.8 (6C), 35.8 (6C), 44.0 (6C), 63.9 (2C), 128.4 (2C), 128.7 (2C), 130.2 (2C), 130.8 (2C), 131.1 (2C), 132.3 (2C), 132.9 (2C), 147.2 (2C); IR (KBr, cm-1) 737, 766, 908, 1011, 1101, 1308, 1321, 1452, 2855, 2914; 
HRMS (ESI+) m/z 555.3257 ([M+H]+, C36H39N6+ requires 555.3231). 
【００３８】
実施例６（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製６）
【化９】
2011118394.tif 000014
上記反応式（９）で示されるように、ジイン３（10.0 mg, 50.0 μmol）のメタノール（5.00 mL）溶液を、室温にて、2,6-ジイソプロピルフェニルアジド（４ｈ）（24.4 mg, 120 μmol）のメタノール（1.25 mL）溶液に加えた。室温にて３０分間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g,ジクロロメタン/メタノール= 100/1）により精製し、トランス体６ｈ、およびシス体７ｈの混合物（28.9 mg, 47.6 μmol, 95.4%）を得た。トランス体６ｈとシス体７ｈの比は、1H NMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 810931（６ｈ）および CCDC 810838（７ｈ））。
1,8-ビス（2,6-ジイソプロピルフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Bis(2,6-diisopropylphenyl)-1,8-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) (６ｈ)
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 273-275 ℃; 
Rf= 0.65 (ジクロロメタン/メタノール = 49/1); 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.73 (d, 6H, J = 7.0 Hz), 0.78 (d, 6H, J = 7.0 Hz), 1.410 (d, 6H, J = 6.5 Hz), 1.413 (d, 6H, J = 6.5 Hz), 1.96 (qq, 2H, J = 7.0, 7.0 Hz), 2.63 (qq, 2H, J = 6.5, 6.5 Hz), 6.87 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.06 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.17 (ddd, 2H, J = 1.0, 7.8, 7.8 Hz), 7.35 (dd, 2H, J = 1.0, 7.8 Hz), 7.38-7.45 (m, 4H), 7.81 (d, 2H, J = 7.5 Hz); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 22.3 (2C), 22.8 (2C), 24.4 (2C), 26.2 (2C), 28.3 (2C), 29.2 (2C), 123.85 (2C), 123.92 (2C), 126.3 (2C), 128.4 (2C), 129.6 (2C), 129.7 (2C), 130.7 (2C), 131.5 (4C), 132.5 (2C), 135.9 (2C), 144.1 (2C), 145.6 (2C), 146.9 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 733, 756, 768, 995, 1362, 1470, 2868, 2930, 2965; 
HRMS (ESI+) m/z 607.3525 ([M+H]+, C40H43N6+ requires 607.3544); 
C40H42N6: 計算値： C, 79.17; H, 6.98; N, 13.85%; 測定値: C, 79.09; H, 6.99; N, 13.59%.
1,10-ビス（2,6-ジイソプロピルフェニル）-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Bis(2,6-diisopropylphenyl)-1,10-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) (７ｈ)
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Rf= 0.40 (ジクロロメタン/メタノール = 49/1); 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.42 (d, 6H, J = 6.8 Hz), 0.98 (d, 6H, J = 6.8 Hz), 1.29 (d, 6H, J = 6.8 Hz), 1.32 (d, 6H, J = 6.8 Hz), 2.07 (dq, 2H, J = 6.8, 6.8 Hz), 2.21 (dq, 2H, J = 6.8, 6.8 Hz), 6.93 (dd, 2H, J = 3.5, 5.5 Hz), 7.03 (dd, 2H, J = 3.5, 5.5 Hz), 7.12 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.33 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.45 (dd, 2H, J = 7.5, 7.5 Hz), 7.55 (dd, 2H, J = 3.5, 5.5 Hz), 7.76 (dd, 2H, J = 3.5, 5.5 Hz); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 21.8 (2C), 22.5 (2C), 25.5 (2C), 26.2 (2C), 29.0 (2C), 29.3 (2C), 124.26 (2C), 124.34 (2C), 127.7 (2C), 128.8 (2C), 129.2 (2C), 130.9 (2C), 131.00 (2C), 131.02 (2C), 131.1 (2C), 132.3 (2C), 135.7 (2C), 145.7 (2C), 146.2 (2C), 147.9 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 733, 764, 991, 1277, 1354, 1456, 1724, 2868, 2928, 2964; 
HRMS (ESI+) m/z 629.3348 ([M+Na]+, C40H42N6Na+requires 629.3363).
【００３９】
実施例７（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製７）
【化１０】
2011118394.tif 000015
上記反応式（１０）で示されるように、ジイン３（40.0 mg, 200 μmol）のメタノール（22.0 mL）溶液を、室温にて、4-メトキシフェニルアジド（４ｉ）（71.6 mg, 480 μmol）のメタノール（3.00 mL）溶液に加えた。室温にて２０分間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ジクロロメタンのみからジクロロメタン/メタノール = 49/1）により精製し、トランス体６ｉ、およびシス体７ｉの混合物（88.8 mg, 178 μmol, 89.2%）を得た。トランス体６ｉとシス体７ｉの比は、1H NMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 810932（６ｉ）および CCDC 810839（７ｉ））。
1,8-ジヒドロ-1,8-ビス（4-メトキシフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Dihydro-1,8-bis(4-methoxyphenyl)dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （６ｉ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 250-251 ℃; 
Rf= 0.47 (ｎ-ヘキサン／酢酸エチル/ジクロロメタン/トルエン=1/1/1/1); 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 3.82 (s, 6H), 6.83-6.88 (m, 6H), 7.19-7.24 (m, 6H), 7.47 (ddd, 2H, J = 1.0, 7.5, 7.5 Hz), 7.81 (d, 2H, J = 7.5 Hz); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 55.5 (2C), 114.4 (4C), 126.4 (4C), 126.8 (2C), 128.8 (2C), 129.1 (2C), 129.9 (2C), 130.8 (2C), 131.2 (2C), 132.1 (2C), 134.2 (2C), 145.7 (2C), 159.9 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 538, 592, 733, 764, 833, 910, 993, 1028, 1053, 1103, 1115, 1169, 1182, 1252, 1302, 1443, 1464, 1514, 1589, 1609; 
HRMS (ESI+) m/z 499.1886 ([M+H]+, C30H23N6O2+requires 499.1877 ); 
C30H22N6O2: 計算値： C, 72.28; H, 4.45; N, 16.86%; 測定値: C, 72.09; H, 4.32; N, 16.60%.
1,10-ジヒドロ-1,10-ビス（4-メトキシフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Dihydro-1,10-bis(4-methoxyphenyl)dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （７ｉ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp ＞300 ℃;
Rf= 0.38 (ｎ-ヘキサン／酢酸エチル/ジクロロメタン/トルエン=1/1/1/1); 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 3.87 (s, 6H), 6.89-6.95 (m, 2H), 6.94 (AA’BB’, 4H), 7.13-7.19 (m, 2H), 7.31 (AA’BB’, 4H), 7.52-7.57 (m, 2H), 7.76-7.82 (m, 2H); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 55.6 (2C), 114.5 (4C), 126.5 (4C), 128.4 (2C), 129.2 (2C), 129.3 (2C), 129.4 (2C), 130.5 (2C), 130.7 (2C), 131.6 (2C), 133.5 (2C), 146.4 (2C), 160.1 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 532, 594, 733, 762, 775, 831, 995, 1020, 1036, 1256, 1306, 1516, 1611; 
HRMS (ESI+) m/z 499.1876 ([M+H]+, C30H22N602+requires 499.1877); 
C30H22N6O2: 計算値： C, 72.28; H,4.45; N, 16.86%; 測定値: C, 72.14; H, 4.38; N, 16.81%.
【００４０】
実施例８（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製８）
【化１１】
2011118394.tif 000016
上記反応式（１１）で示されるように、ジイン３（40.0 mg, 200 μmol）のメタノール（22.0 mL）溶液を、室温にて、4-トリフルオロメチルフェニルアジド（４ｊ）（89.8 mg, 480 μmol）のメタノール（3.00 mL）溶液に加えた。室温にて２４時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィー(ｎ-ヘキサン／酢酸エチル = 9/1)で精製し、トランス体６ｊおよびシス体７ｊの混合物（111 mg, 193 μmol, 96.7%）を得た。トランス体６ｊとシス体７ｊの比は、1H NMRスペクトルに基づいて決定した。
1,8-ジヒドロ-1,8-ビス（4-トリフルオロメチルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Dihydro-1,8-bis(4-trifluoromethylphenyl)dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （６ｊ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 270-272 ℃; 
Rf= 0.19 (ｎ-ヘキサン／酢酸エチル = = 9/1); 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.85 (dd, 2H, J = 1.0, 7.5 Hz), 7.28 (ddd, 2H, J = 1.0, 7.5, 7.5 Hz), 7.45 (d, 4H, J = 8.5 Hz), 7. 55 (ddd, 2H, J = 1.0, 7.5, 7.5 Hz), 7.66 (d, 4H, J = 8.5 Hz), 7.86 (dd, 2H, J = 1.0, 7.5 Hz); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 123.4 (q, 2C, J1cf = 273 Hz), 125.0 (4C), 126.2 (2C), 126.6 (q, 4C, J3cf= 3.5 Hz), 129.4 (2C), 130.5 (2C), 130.8 (2C), 131.1 (q, 2C, J2cf = 32.9 Hz), 131.5 (2C), 131.6 (2C), 134.2 (2C), 138.6 (2C), 146.1 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 733, 764, 845, 995, 1043, 1070, 1130, 1171, 1323, 1366, 1406, 1520, 1614, 3065; 
HRMS (ESI+) m/z 575.1399 ([M+H]+, C30H17F6N6+ requires 575.1413).
1,10-ジヒドロ-1,10-ビス（4-トリフルオロメチルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Dihydro-1,10-bis(4-trifluoromethylphenyl)dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （７ｊ）
Mp ＞300 ℃;
Rf= 0.13 (ｎ-ヘキサン／酢酸エチル = = 9/1); 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.91-6.96 (m, 2H), 7.24-7.30 (m, 2H), 7.56 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.56-7.61 (m, 4H), 7.78 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.77-7.82 (m, 4H); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 123.3 (q, 2C, J1cf = 273 Hz), 124.9 (4C), 126.8 (q, 4C, J3cf= 3.5 Hz), 127.8 (2C), 129.7 (2C), 129.9 (2C), 130.2 (2C), 130.9 (2C), 131.4 (q, 2C, J2cf = 33.3 Hz), 131.9 (2C), 133.2 (2C), 138.9 (2C), 147.1 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 733, 764, 775, 843, 997, 1047, 1063, 1076, 1119, 1169, 1329, 1360, 1412, 1522, 1618, 3071; 
HRMS (ESI+) m/z 575.1412 ([M+H]+, C30H17F6N6+ requires 575.1413); 
C30H16F6N6: 計算値： C, 62.72; H, 2.81; N, 14.63%; 測定値: C, 63.01; H, 3.06; N, 14.48%.
【００４１】
実施例９（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製９）
【化１２】
2011118394.tif 000017
上記反応式（１２）で示されるように、ジイン３（10.0 mg, 50 μmol）のメタノール（5.00 mL）溶液を、室温にて、2-メチルフェニルアジド（４ｋ）（16.0 mg, 120 μmol）のメタノール（1.25 mL）溶液に加えた。室温にて２４時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ジクロロメタンのみからジクロロメタン/メタノール = 9/1）により精製し、トランス体６ｋ、およびシス体７ｋの混合物（22.9mg, 49.1 μmol, 98.3%）を得た。トランス体６ｋとシス体７ｋの比は、1H NMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 810933（６ｋ）および CCDC 810840（７ｋ））。
1,8-ジヒドロ-1,8-ビス（2-メチルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Dihydro-1,8-bis(2-methylphenyl)dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （６ｋ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp ＞300 ℃;
Rf= 0.36 (ジクロロメタン/メタノール=49/1); 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.88 (br s, 6H), 6.86 (br d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.17 (ddd, 2H, J = 1.0, 1.0, 7.5 Hz), 7.19-7.37 (m, 8H), 7.43 (ddd, 2H, J = 1.0, 7.5, 7.5 Hz), 7.77 (dd, 2H, J = 1.0, 7.5 Hz); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 17.5 (2C), 126.4 (2C), 126.7 (2C), 127.9 (2C), 128.6 (2C), 129.9 (2C), 130.0 (2C), 130.4 (2C), 131.2 (2C), 131.3 (2C), 132.1 (2C), 135.09 (2C), 135.10 (2C), 135.8 (2C), 144.8 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 613, 719, 739, 770, 908, 997, 1267, 1362, 1425, 1466, 1497, 1514; 
HRMS (ESI+) m/z 467.1958 ([M+H]+, C30H23N6+ requires 467.1979); 
C30H22N6: 計算値： C, 77.23; H, 4.75; N, 18.01%; 測定値: C, 77.19; H, 4.65; N, 17.80%.
1,10-ジヒドロ-1,10-ビス（2-メチルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Dihydro-1,10-bis(2-methylphenyl)dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （７ｋ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp ＞300 ℃;
Rf= 0.22 (ジクロロメタン/メタノール=49/1); 
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.33 (s, 6H), 6.75-6.80 (m, 2H), 7.01 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.03-7.08 (m, 2H), 7.17 (dd, 2H, J = 7.5, 7.5 Hz), 7.37 (dd, 2H, J = 7.5, 7.5 Hz), 7.40 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.54-7.59 (m, 2H), 7.79-7.84 (m, 2H); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 18.3 (2C), 126.4 (2C), 127.2 (2C), 127.8 (2C), 129.2 (2C), 129.3 (2C), 130.1 (2C), 130.6 (2C), 130.9 (2C), 131.0 (2C), 131.6 (2C), 134.3 (2C), 135.2 (2C), 135.7 (2C), 145.9 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 611, 718, 737, 762, 781, 999, 1117, 1138, 1263, 1287, 1356, 1429, 1462, 1473, 1497, 1512; 
HRMS (ESI+) m/z 467.1979 ([M+H]+, C30H23N6+ requires 467.1979); 
C30H22N6: 計算値： C, 77.23; H, 4.75; N, 18.01%; 測定値: C, 77.22; H, 4.68; N, 17.77%.
【００４２】
実施例１０（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製１０）
【化１３】
2011118394.tif 000018
上記反応式（１３）で示されるように、ジイン３（40.0 mg, 200 μmol）のメタノール（22.0 mL）溶液を、室温にて、2-イソプロピルフェニルアジド（４ｌ）（77.4 mg, 480 μmol）のメタノール（3.0 mL）溶液に加えた。室温にて２４時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィー(ｎ-ヘキサン／酢酸エチル = 9/1)で精製し、トランス体６lおよびシス体７lの混合物（99.5 mg, 190 μmol, 95.3%）を得た。トランス体６lとシス体７lの比は、1H NMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 810934（６l）およびCCDC 810841（７l））。
1,8-ジヒドロ-1,8-ビス（2-イソプロピルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール
(1,8-Dihydro-1,8-bis(2-isopropylphenyl)dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （６l）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 298-300 ℃;
Rf= 0.70 (ジクロロメタン/メタノール=24/1);
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.76 (br s, 12H), 2.07 (br s, 2H), 6.95 (br, 2H), 7.17 (dd, 2H, J = 7.5, 7.5 Hz), 7.35-7.48 (m, 8H), 7.67 (br, 2H), 7.77 (d, 2H, J = 7.5 Hz); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 21.9 (br, 2C), 24.2 (br, 2C), 27.8 (br, 2C), 126.4 (4C), 126.8 (br, 2C), 128.4 (br, 2C), 128.5 (2C), 129.8 (4C), 130.5 (br, 2C), 131.3 (2C), 132.3 (br, 2C), 133.7 (br, 2C), 135.8 (br, 2C), 144.6 (2C), 145.4 (br, 2C); 
IR (KBr, cm-1) 611, 735, 766, 783, 908, 995, 1045, 1111, 1211, 1269, 1360, 1454, 1493, 1512, 2967; HRMS (ESI+) m/z 523.2587 ([M+H]+, C34H31N6+requires 523.2605); 
C34H30N6: 計算値： C, 78.13; H, 5.79; N, 16.08%; 測定値: C, 77.90; H, 5.60; N, 15.85%.
1,10-ジヒドロ-1,10-ビス（2-イソプロピルフェニル）ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール
(1,10-Dihydro-1,10-bis(2-isopropylphenyl)dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （７l）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp ＞300 ℃;
Rf= 0.48 (ジクロロメタン/メタノール=24/1);
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.35 (br s, 6H), 1.45 (br s, 6H), 3.04 (br s, 2H), 6.72-6.78 (m, 2H), 6.82-6.91 (m, 2H), 6.98-7.06 (m, 2H), 7.07-7.16 (m, 2H), 7.40-7.49 (m, 2H), 7.52-7.61 (m, 4H), 7.79-7.87 (m, 2H); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 23.1 (2C), 25.2 (2C), 28.6 (2C), 126.0 (2C), 127.1 (2C), 127.5 (2C), 128.0 (2C), 129.1 (2C), 129.2 (2C), 130.4 (2C), 130.7 (2C), 130.9 (2C), 131.0 (2C), 133.9 (2C), 134.5 (2C), 145.8 (2C), 146.6 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 523, 611, 733, 758, 910, 997, 1028, 1092, 1134, 1213, 1261, 1360, 1452, 1495, 1512, 2965; 
HRMS (ESI+) m/z 523.2585 ([M+H]+, C34H31N6+ requires 523.2605).
【００４３】
実施例１１（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製１１）
【化１４】
2011118394.tif 000019
上記反応式（１４）で示されるように、ジイン３（10.0 mg, 50 μmol）のメタノール（5.00 mL）溶液を、室温にて、2,6-ジメチルフェニルアジド（４ｍ）（17.7 mg, 120 μmol）のメタノール（1.25 mL）溶液に加えた。室温にて３０分間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g,ジクロロメタン/メタノール= 9/1）により精製し、トランス体６ｍ、およびシス体７ｍの混合物（22.7 mg, 45.9 μmol, 91.9%）を得た。トランス体６ｍとシス体７ｍの比は、1H NMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 810935（６ｍ）および CCDC 810842（７ｍ））。
1,8-ビス（2,6-ジメチルフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Bis(2,6-dimethylphenyl)-1,8-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （６ｍ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp ＞300 ℃;
Rf= 0.49 (ジクロロメタン/メタノール=49/1);
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.53 (s, 6H), 2.41 (s, 6H), 6.87 (dd, 2H, J = 1.0, 7.5 Hz), 6.94 (dd, 2H, J = 5.0, 5.0 Hz), 7.19 (ddd, 2H, J = 1.0, 7.5, 7.5 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 5.0 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 5.0 Hz), 7.43 (ddd, 2H, J = 1.0, 7.5, 7.5 Hz), 7.77 (dd, 2H, J = 1.0, 7.5 Hz); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 17.3 (2C), 18.4 (2C), 126.4 (2C), 128.4 (2C), 128.5 (2C), 128.6 (2C), 129.4 (2C), 129.9 (2C), 130.0 (2C), 131.4 (2C), 132.0 (2C), 134.3 (2C), 135.7 (2C), 135.8 (2C), 136.1 (2C), 144.7 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 735, 764, 781, 912, 995, 1113, 1354, 1427, 1474, 1512; 
HRMS (ESI+) m/z 495.2276 ([M+H]+, C32H27N6+ requires 495.2292); 
C32H26N6: 計算値： C, 77.71; H, 5.30; N, 16.99%; 測定値: C, 77.95; H, 5.41; N, 16.88%.
1,10-ビス（2,6-ジメチルフェニル）-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Bis(2,6-dimethylphenyl)-1,10-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （７ｍ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp ＞300 ℃;
Rf= 0.24 (ジクロロメタン/メタノール=49/1);
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.76 (s, 6H), 2.23 (s, 6H), 6.87-6.93 (m, 2H), 7.00 (d, 2H, J= 7.5 Hz), 7.03-7.08 (m, 2H), 7.22-7.29 (m, 4H), 7.53-7.58 (m, 2H), 7.74-7.79 (m, 2H); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 18.4 (2C), 18.8 (2C), 127.0 (2C), 128.2 (2C), 128.8 (2C), 129.1 (2C), 129.3 (2C), 130.2 (2C), 130.6 (2C), 130.7 (2C), 131.1 (2C), 134.2 (2C), 134.8 (2C), 135.3 (2C), 137.3 (2C), 146.1 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 704, 733, 764, 918, 995, 1134, 1267, 1290, 1346, 1474, 1508; 
HRMS (ESI+) m/z 495.2315 ([M+H]+, C32H27N6+ requires 495.2292); 
C32H26N6: 計算値： C, 77.71; H, 5.30; N, 16.99%; 測定値: C, 77.59; H, 5.33; N, 16.73%.
【００４４】
実施例１２（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製１２）
【化１５】
2011118394.tif 000020
上記反応式（１５）で示されるように、ジイン３（10.0 mg, 50 μmol）のメタノール（5.00 mL）溶液を、室温にて、2,6-ジエチルフェニルアジド（４ｎ）（21.0 mg, 120 μmol）のメタノール（1.25 mL）溶液に加えた。室温にて３０分間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ジクロロメタンのみからジクロロメタン/メタノール = 24/1）により精製し、トランス体６ｎ、およびシス体７ｎの混合物（25.7 mg, 46.7 μmol, 93.4%）を得た。トランス体６ｎとシス体７ｎの比は、1H NMRスペクトルに基づいて決定した。これらの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 810936（６ｎ）および CCDC 810843（７ｎ））。
1,8-ビス（2,6-ジエチルフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Bis(2,6-diethylphenyl)-1,8-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （６ｎ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 255-257 ℃;
Rf= 0.57 (ジクロロメタン/メタノール=49/1);
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.73 (dd, 6H, J = 7.5, 7.5 Hz), 1.41 (dd, 6H, J = 7.5, 7.5 Hz), 1.74 (dq, 2H, J = 7.5, 15.0 Hz), 1.92 (dq, 2H, J = 7.5, 15.0 Hz), 2.59 (dq, 2H, J = 7.0, 14.0 Hz), 2.64 (dq, 2H, J = 7.0, 14.0 Hz), 6.85 (dd, 2H, J = 1.0, 7.5 Hz), 7.00 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.17 (ddd, 2H, J = 1.0, 7.5, 7.5 Hz), 7.30 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.35 (dd, 2H, J = 7.5, 7.5 Hz), 7. 41 (ddd, 2H, J = 1.0, 7.5, 7.5 Hz) 7.76 (dd, 2H, J = 1.0, 7.5 Hz); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 13.5 (2C), 15.2 (2C), 24.0 (2C), 24.7 (2C), 126.45 (2C), 126.49 (2C), 126.57 (2C), 128.5 (2C), 129.4 (2C), 129.9 (2C), 130.3 (2C), 131.4 (2C), 132.2 (2C), 133.15 (2C), 135.9 (2C), 141.0 (2C), 142.1 (2C), 144.6 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 733, 758, 910, 995, 1358, 1466, 1510, 2876, 2936, 2970; 
HRMS (ESI+) m/z 551.2912 ([M+H]+, C36H35N6+ requires 551.2918); 
C36H34N6: 計算値： C, 78.52; H, 6.22; N, 15.26%; 測定値: C, 78.26; H, 6.47; N, 14.97%.
1,10-ビス（2,6-ジエチルフェニル）-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Bis(2,6-diethylphenyl)-1,10-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （７ｎ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp ＞300 ℃;
Rf= 0.30 (ジクロロメタン/メタノール=49/1);
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.91 (dd, 6H, J = 7.5, 7.5 Hz), 1.32 (dd, 6H, J = 7.5, 7.5 Hz), 2.04 (dq, 2H, J = 7.5, 15.0 Hz), 2.09 (dq, 2H, J = 7.5, 15.0 Hz), 2.26 (dq, 2H, J = 7.5, 15.0 Hz), 2.41 (dq, 2H, J = 7.5, 15.0 Hz), 6.83-6.87 (m, 2H), 6.96-7.01 (m, 2H), 7.08 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.31 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.40 (dd, 2H, J = 7.5, 7.5 Hz), 7.53-7.57 (m, 2H), 7.74-7.79 (m, 2H); 
13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 14.9 (2C), 15.2 (2C), 24.7 (2C), 25.3 (2C), 126.7 (2C), 126.8 (2C), 126.9 (2C), 129.0 (2C), 129.1 (2C), 130.6 (2C), 130.7 (2C), 130.8 (2C), 131.2 (2C), 133.6 (2C), 134.2 (2C), 140.9 (2C), 143.3 (2C), 145.9 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 733, 758, 783, 908, 993, 1061, 1113, 1128, 1261, 1352, 1470, 1508, 2872, 2932, 2965; 
HRMS (ESI+) m/z 551.2940 ([M+H]+, C36H35N6+ requires 551.2918); 
C36H34N6: 計算値： C, 78.52; H, 6.22; N, 15.26%; 測定値: C, 78.49; H, 6.20; N, 15.03%.
【００４５】
実施例１３（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製１３）
【化１６】
2011118394.tif 000021
上記反応式（１６）で示されるように、ジイン３（20.3 mg, 102 μmol）のメタノール（9.0 mL）溶液を、室温にて、2‐ｔ-ブチル‐6‐メチルフェニルアジド（４ｏ）（45.4 mg, 240 μmol）のメタノール（3.5 mL）溶液に加えた。室温にて２４時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g,ヘキサンのみから酢酸エチル）により精製し、トランス体６ｏとシス体７ｏの混合物（58.4 mg, 101 μmol, 99.7%）を、それぞれのジアステレオマーの混合物として得た。
1,8-ビス（2-ｔ-ブチル-6-メチルフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Bis(2-tert-butyl-6-methylphenyl)-1,8-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) (６ｏ，ジアステレオマー混合物）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Rf= 0.47 (ジクロロメタン/ヘキサン = 3/1); 
1H NMR (400 MHz, CDCl3) （主要異性体） δ0.87 (s, 18H), 2.07 (s, 6H), 6.77 (dd, 2H, J= 1.2, 8.0 Hz), 7.13 (ddd, 2H, J = 1.2, 7.6, 7.6 Hz), 7.23-7.26 (m, 2H), 7.34-7.36 (m, 4H), 7.39 (dd, 2H, J = 1.2, 8.0 Hz), 7.69 (dd, 2H, J = 1.2, 7.6 Hz).
1,10-ビス（2-ｔ-ブチル-6-メチルフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Bis(2-tert-butyl-6-methylphenyl)-1,10-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) (７ｏ，ジアステレオマー混合物）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Rf= 0.30 (ジクロロメタン/ヘキサン = 3/1); 
1H NMR (400 MHz, CDCl3) （主要異性体） δ 0.93 (s, 18H), 1.80 (s, 6H), 6.98-7.02 (m, 2H), 7.30-7.42 (m, 6H), 7.51-7.57 (m, 4H), 7.63-7.67 (m, 2H).
【００４６】
実施例１４（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製１４）
【化１７】
2011118394.tif 000022
上記反応式（１７）で示されるように、ジイン３（20.0 mg, 100 μmol）のメタノール（12.5 mL）溶液を、室温にて、2,6‐ジブロモフェニルアジド（４ｐ）（66.5 mg, 240 μmol）に加えた。室温にて９時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン)で精製し、トランス体６ｐおよびシス体７ｐの混合物（74.3 mg, 98.7 μmol, 98.7%）を得た。トランス体６ｐとシス体７ｐの比は、1H NMRスペクトルに基づいて決定した。
1,8-ビス（2,6‐ジブロモフェニル）-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Bis(2,6-dibromophenyl)-1,8-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （６ｐ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Rf= 0.07 (ジクロロメタン); 
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.16-7.27 (m, 6H), 7.46-7.48 (m, 4H), 7.75 (dd, 2H, J = 1.2, 8.4 Hz), 782 (dd, 2H, J= 0.8, 7.6 Hz).
1,10-ビス（2,6‐ジブロモフェニル）-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Bis(2,6-dibromolphenyl)-1,10-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （７ｐ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Rf= 0.01 (ジクロロメタン); 
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.16 (dd, 2H, J = 3.6, 6.0 Hz), 7.22-7.30 (m, 4H), 7.53-7.57 (m, 4H), 7.75-7.79 (m, 4H).
【００４７】
実施例１５（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製１５）
【化１８】
2011118394.tif 000023
上記反応式（１８）で示されるように、ジイン３（20.4 mg, 102 μmol）のメタノール（9.0 mL）溶液を、室温にて、3,5‐ビス（トリフルオロメチル）フェニルアジド（４ｑ）（61.2 mg, 240 μmol）のメタノール（3.5 mL）溶液に加えた。室温にて２０時間撹拌した後、反応溶液を減圧濃縮した。残渣を薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/ヘキサン=3/1)で精製し、トランス体６ｑおよびシス体７ｑの混合物（71.6 mg, 101 μmol, 99.0%）を得た。トランス体６ｑとシス体７ｑの比は、1H NMRスペクトルに基づいて決定した。
1,8-ビス［3,5‐ビス（トリフルオロメチル）フェニル］-1,8-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Bis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]-1,8-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) （６ｑ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.84 (dd, 2H, J = 0.8, 8.0 Hz), 7.32 (ddd, 2H, J = 1.2, 7.6, 7.6 Hz), 7.60 (ddd, 2H, J = 1.2, 7.6, 7.6 Hz), 7.75 (s, 4H), 7.90-7.93 (m, 4H).
1,10-ビス［3,5‐ビス（トリフルオロメチル）フェニル］-1,10-ジヒドロジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Bis(4-methoxyphenyl)-1,10-dihydrodibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole))（７ｑ）
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.00-7.03 (m, 2H), 7.34-7.38 (m, 2H), 7.58-7.61 (m, 2H), 7.75-7.78 (m, 2H), 7.88 (d, 4H, J = 1.6 Hz), 7.99 (s, 2H).
【００４８】
実施例１６（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製１６）
【化１９】
2011118394.tif 000024
上記反応式（１９）で示されるように、ジイン３（40.0 mg, 200 μmol）のメタノール（23.5 mL）溶液に、室温にて、4-(アジドメチル)ベンジルアルコール（４ｄ、非特許文献M. Smet, K. Metten, W. Dehaen, Collect. Czech. Chem. Commun. 2004, 69, 1097-1108に記載の方法により合成）（78.3 mg, 480 μmol）のメタノール（1.5 mL）溶液を加え、そのまま室温にて６０分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ジクロロメタン/メタノール= 29/1）により精製し、二重環化付加生成物の２つの位置異性体であるトランス体６ｄ（63.5 mg, 121 μmol, 60.3%）、およびシス体７ｄ（40.9 mg, 77.7 μmol, 38.9%）を得た。それぞれの化合物の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 759899（６ｄ）および CCDC 759904（７ｄ））。
1,8-ジヒドロ-1,8-ビス[4-（ヒドロキシメチル）ベンジル]ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Dihydro-1,8-bis[4-(hydroxylmethyl)benzyl]dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)） (６ｄ)  
ジクロロメタン／メタノールで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。 
Mp >300 ℃ (dec.); 
Rf= 0.45 (ヘキサン/酢酸エチル = 1/9); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.38 (br s, 2H), 4.52-4.70 (m, 4H), 5.27 (d, 2H, J = 14.7 Hz), 5.29 (d, 2H, J = 14.7 Hz), 6.52-6.62 (AA’BB’×2, 4H), 7.06-7.13 (AA’BB’×2, 4H), 7.13-7.20 (m, 2H), 7.38-7.57 (m, 6H); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ 51.0 (2C), 62.4 (2C), 126.2 (4C), 126.5 (4C), 129.3 (2C), 130.1 (2C), 130.3 (2C), 130.9 (2C), 132.1 (2C), 134.0 (2C), 134.5 (2C), 142.1 (2C), 144.5 (2C), 147.7 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 519, 594, 775, 986, 1028, 1105, 1132, 1215, 1252, 1314, 1352, 1422, 1474, 1514, 1616, 2097, 2868, 3366; 
HRMS (ESI+) m/z 527.2191 ([M+H]+, C32H27N6O2+計算値 527.2190).
1,10-ジヒドロ-1,10-ビス[4-（ヒドロキシメチル）ベンジル]-ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,10-Dihydro-1,10-bis[4-(hydroxylmethyl)benzyl]dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)) (７ｄ)
ジクロロメタン／メタノールで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp >300 ℃ (dec.); 
Rf= 0.39 (ヘキサン/酢酸エチル = 1/9); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2.03 (t, 2H, J = 5.2 Hz), 4.66 (d, 4H, J = 5.2 Hz), 4.96 (d, 2H, J = 15.7 Hz), 5.33 (d, 2H, J = 15.7 Hz), 6.90-7.00 (AA’BB’×2, 4H), 7.08-7.16 (m, 2H) 7.20-7.32 (AA’BB’×2, 4H), 7.40-7.52 (m, 4H), 7.62-7.70 (m, 2H); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ 51.3 (2C), 62.5 (2C), 126.8 (4C), 127.0 (2C), 127.1 (4C), 129.2 (2C), 130.2 (2C), 130.3 (2C), 130.7 (2C), 130.8 (2C), 133.5 (2C), 133.8 (2C), 142.5 (2C), 145.0 (2C); 
IR (KBr, cm-1), 704, 737, 764, 986, 1028, 1134, 1209, 1248, 1265, 1287, 1315, 1346, 1422, 1514, 1634, 2089, 3360; 
HRMS (ESI+) m/z 527.2205 ([M+H]+, C32H27N6O2+計算値 527.2190).
【００４９】
実施例１７（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製１７）
【化２０】
2011118394.tif 000025
上記反応式（２０）で示されるように、ジイン３（40.0 mg, 200 μmol）のメタノール（23.5 mL）溶液に、室温にて、4-(アジドメチル)安息香酸メチル（４ｅ、非特許文献E. A. Wydysh, S. M. Medghalchi, A. Vadlamudi, and C. A. Townsend, J. Med. Chem. 2009, 52, 3317-3327に記載の方法により合成）（91.8 mg, 480 μmol）のメタノール（1.5 mL）溶液を加え、そのまま室温にて１２０分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣の固体を桐山ロート上にて酢酸エチルを用いて洗浄し、二重環化付加生成物の２つの位置異性体のうちの一つであるシス体７ｅ（36.1 mg, 61.9 μmol, 30.9%）を純品として得た。ろ液を、エバポレーターを用いて減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ヘキサン/酢酸エチル = 1/2 から 酢酸エチル のみ）により精製し、二重環化付加生成物のトランス体６ｅ（71.8 mg, 123 μmol, 61.5%）を得た。これらの化合物の構造は、それぞれをTHF 中LiAlH4（0 ℃ から加熱還流, 7.5 時間)を作用させることによりエステルを還元し、対応するジオール６ｄおよび７ｄに導くことで決定した。
1,8-ジヒドロ-1,8-ビス[4-（メトキシカルボニル）ベンジル]ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
(1,8-Dihydro-1,8-bis[4-(methoxycarbonyl)benzyl]dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)） (６ｅ)
得られた無色の固体につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 102-104 ℃; 
Rf= 0.31 (ヘキサン/酢酸エチル = 2/1); 
Rf= 0.27 (ジクロロメタン/メタノール = 15/1); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.90 (s, 6H), 5.34 (d, 2H, J = 15.9 Hz), 5.57 (d, 2H, J = 15.9 Hz), 7.03 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.05-7.12 (AA’BB’×2, 4H), 7.39 (dd, 2H, J = 7.6, 7.6 Hz), 7.54 (dd, 2H, J = 7.6, 7.6 Hz), 7.73 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.91-8.00 (AA’BB’×2, 4H); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ51.0 (2C), 52.1 (2C), 126.0 (2C), 126.5 (4C), 128.9 (2C), 129.3 (4C), 129.4 (2C), 130.1 (2C), 130.4 (2C), 130.7 (2C), 131.8 (2C), 134.6 (2C), 140.9 (2C), 144.8 (2C), 165.6 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 581, 735, 746, 764, 806, 910, 1020, 1111, 1180, 1283, 1352, 1435, 1516, 1614, 1719, 2951;
HRMS (ESI+) m/z 583.2104 ([M+H]+, C34H27N6O4+計算値 583.2088).
1,10-ジヒドロ-1,10-ビス[4-（メトキシカルボニル）ベンジル]ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール)
（1,10-Dihydro-1,10-bis[4-(methoxycarbonyl)benzyl]dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)） (７ｅ)
得られた無色の固体につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 287-290 ℃; 
Rf= 0.31 (ヘキサン/酢酸エチル = 2/1); 
Rf= 0.27 (ジクロロメタン/メタノール = 15/1); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.91 (s, 6H), 4.98 (d, 2H, J = 15.9 Hz), 5.36 (d, 2H, J = 15.9 Hz), 6.98-7.11 (m, 6H), 7.38-7.45 (m, 2H), 7.46-7.56 (m, 2H), 7.64-7.72 (m, 2H), 7.94-8.00 (AA’BB’×2, 4H); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ51.7 (2C), 52.4 (2C), 127.1 (4C), 127.8 (2C), 129.3 (2C), 130.06 (2C), 130.14 (2C), 130.2 (4C), 130.3 (2C), 130.4 (2C), 130.6 (2C), 133.5 (2C), 140.1 (2C), 146.3 (2C), 166.3 (2C); 
IR (KBr, cm-1) 582, 735, 750, 764, 804, 910, 1020, 1111, 1180, 1283, 1435, 1516, 1614, 1719, 2951; 
HRMS (ESI+) m/z 583.2092 ([M+H]+, C34H27N6O4+計算値 583.2088).
【００５０】
実施例１８（ＳＰＤＣ反応による二重環化付加化合物の調製１８）
【化２１】
2011118394.tif 000026
【００５１】
上記反応式（２１）で示されるように、ジイン３（40.0 mg, 200 μmol）のメタノール（22 mL）溶液に、室温にて、4-(アジドメチル)ベンジルアルコール（４ｄ）（39.2 mg, 240 μmol）、および4-(アジドメチル)安息香酸メチル（４ｅ）（45.9 mg, 240 μmol）の混合物のメタノール（3 mL）溶液を加え、そのまま室温にて１２０分間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル  10 g, ヘキサン/酢酸エチル = 1/1 to 1/4, そして酢酸エチルのみ）により精製し、ヘテロ二重環化付加生成物の２つの位置異性体であるトランス体６ｄｅ（21.8 mg, 39.3 μmol, 19.7%）、およびシス体７ｄｅ（25.3 mg, 45.6 μmol, 22.8%）を得た。それに加え、二組のホモ二重環化付加生成物トランス体６ｄ／シス体７ｄ（29.2 mg, 55.5 μmol, 27.8%, ６ｄ／７ｄ= 1.8/1）、およびトランス体６ｅ／シス体７ｅ（31.4 mg, 53.9 μmol, 27.0%, ６ｅ／７ｅ= 1.2/1）をそれぞれ位置異性体の混合物として得た。異性体混合物における異性体比は、混合物の1H NMRスペクトルにおけるベンジル位のプロトンピークの積分比を求めることにより決定した。また、６ｄｅ、および７ｄｅの構造は、それぞれをテトラヒドロフラン（THF）中、水素化リチウムアルミニウム（LiAlH4）（0 ℃ から加熱還流, 7.5 時間)を作用させることによりエステルを還元し、対応するジオール６ｄおよび７ｄに導くことで決定した。
1,8-ジヒドロ-1-[4-（ヒドロキシメチル）ベンジル]-8-[4-（メトキシカルボニル）ベンジル]ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール
（1,8-Dihydro-1-[4-(hydroxylmethyl)benzyl]-8-[4-(methoxycarbonyl)benzyl]dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)） (６ｄｅ) 
得られた無色の固体につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 116-118 ℃; 
Rf= 0.30 (ヘキサン/酢酸エチル = 1/4); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.16 (br s, 1H), 3.91 (s, 3H), 4.60 (s, 2H), 5.28-5.40 (m, 2H), 5.51 (d, 1H, J = 15.5 Hz), 5.61 (d, 1H, J = 15.5 Hz), 6.64-6.72 (AA’BB’, 2H), 6.92-7.03 (m, 3H), 7.05-7.12 (AA’BB’, 2H), 7.23 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 7.38 (dd, 1H, J = 7.3, 7.3 Hz), 7.42-7.62 (m, 4H), 7.71 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 7.90-7.98 (AA’BB’, 2H); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ51.6, 52.1, 52.6, 64.8, 126.0, 126.5, 126.6 (2C), 127.2 (2C), 127.8 (2C), 128.8, 128.9, 129.67, 129.71, 130.0, 130.1 (3C), 130.4, 131.0, 131.2, 131.9, 132.5, 133.7, 134.7, 134.9, 139.9, 141.3, 144.6, 145.2, 166.4; 
IR (KBr, cm-1) 583, 748, 961, 986, 1018, 1049, 1109, 1182, 1215, 1281, 1352, 1435, 1514, 1614, 1719, 2068, 2359, 3389; 
HRMS (ESI+) m/z 555.2150 ([M+H]+, C33H27N6O3+計算値 555.2139).
1,10-ジヒドロ-1-[4-（ヒドロキシメチル）ベンジル]-10-[4-（メトキシカルボニル）ベンジル]ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d:5,6-d']ビス([1,2,3]トリアゾール
（1,10-Dihydro-1-[4-(hydroxylmethyl)benzyl]-10-[4-(methoxycarbonyl)benzyl]dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d:5,6-d']bis([1,2,3]triazole)） (７ｄｅ)
得られた無色の結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 134-136 ℃; 
Rf= 0.38 (ヘキサン/酢酸エチル = 1/4); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.90 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 3.90 (s, 3H), 4.68 (d, 2H, J = 5.4 Hz), 4.89 (d, 1H, J = 16.0 Hz), 5.04 (d, 1H, J = 16.0 Hz), 5.33 (d, 1H, J = 16.0 Hz), 5.39 (d, 1H, J = 16.0 Hz), 6.88-6.96 (AA’BB’, 2H), 7.00 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.04-7.10 (AA’BB’, 2H), 7.15 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.24-7.32 (AA’BB’, 2H), 7.34-7.54 (m, 4H), 7.62-7.70 (m, 2H), 7.92-7.99 (AA’BB’, 2H); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ51.6, 51.9, 52.3, 64.3, 127.0 (2C), 127.1 (2C), 127.4 (2C), 127.6, 128.0, 129.18, 129.22, 129.9, 130.06, 130.09 (3C), 130.3, 130.5, 130.61, 130.64, 130.7, 133.4, 133.7, 134.1, 140.4, 141.3, 146.1, 146.2, 150.8, 166.4; 
IR (KBr, cm-1) 471, 579, 750, 984, 1018, 1111, 1209, 1281, 1346, 1416, 1514, 1614, 1715, 2949, 3061, 3416; 
HRMS (ESI+) m/z 555.2127 ([M+H]+, C33H27N6O3+計算値 555.2139).
【００５２】
上記実施例１８のＳＰＤＣ反応のように、２つの異なるアジド化合物を用いることにより、ヘテロ二重環化付加生成物を主生成物として得ることができる。
【００５３】
以上の実施例の結果に示されるように、様々なアジド化合物がＳＰＤＣ反応に適用可能であることが明らかになった。そして、アジド化合物のアジド基に隣接する置換基Ｒを様々な種類に変更することにより、生成される二重環化付加化合物におけるトリアゾール環上の置換基を、上述の式（１）または（２）で表されたように、適宜変更することができる。
【００５４】
また、上述の実施例のように、触媒が存在せず、さほど高温でもない穏やかな条件下においても、ＳＰＤＣ反応は速やかに進行する。これは、８員環の環状骨格を含む環状ジイン化合物の歪みによって、アジド化合物との反応が促進され、自発的に進行したためと考えられる。さらに、単一の工程で２つのアジド化合物を環状ジインに付加、連結させることができる点で、ＳＰＤＣ反応は効率的であるといえる。
【００５５】
これに対し、生体分子を修飾するために、例えばアジド基とトリアリールホスフィン誘導体とを用いた場合、あるいはアルキンに対して単一のアジド化合物を付加させるシングルクリック反応を用いた場合においては、複数の工程が必要となる。実験目的に合わせてその都度、プローブとしての蛍光標識等の機能性アジド化合物の調製と、機能性アジド化合物を生体分子に付加させる反応とが必要となるためである。
【００５６】
【化２２】
2011118394.tif 000027
上記反応式（２２）に示されるジイン３とメチルアジド４ｆとのＳＰＤＣ反応における、活性化エネルギーおよび遷移状態を、汎密度関数法（Density Functional Theory：ＤＦＴ）[B3LYP/6-31G(d)]を用いて計算した。この結果、図１に示すように、ジイン３に対するメチルアジド４ｆの環化付加についてのエネルギー障壁は低く、室温下で、ジイン３および中間体であるモノイン５ｆのいずれに対しても、メチルアジド４ｆが自発的に反応可能であることが示された。特に、中間体であるモノイン５ｆに対する第二の環化付加反応の活性化エネルギー（トランスおよびシス付加それぞれについて、＋８．８および＋９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の方が、ジイン３に対する第一の環化付加反応の活性化エネルギー（＋１２．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）よりも小さかった。このことは、モノイン中間体５ｆが、メチルアジド４ｆに対してジイン３よりも高い反応性を有することを示している。このため、ＳＰＤＣ反応においては、２つのアジド化合物の付加反応が段階的に進行する際に、二つ目のアジド基も速やかに導入可能である。
【００５７】
実施例１９（ＳＰＤＣ反応と従来のシングルクリック反応の反応性の比較）
【化２３】
2011118394.tif 000028
ＳＰＤＣ反応と従来の歪み誘起性シングルクリック反応の反応性を比較するために、競争実験を行った。すなわち、上記反応式（２３）で示されるように、ジイン３（20.0 mg, 100 μmol）およびモノイン２а（11,12-didehydro-5,6-dihydrodibenzo[a,e]cycloocten-5-ol、非特許文献X. Ning, J. Guo. M. A. Wolfert, G.-J. Boons, Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2253-2255に記載の方法により合成） (22.0 mg, 100 μmol)の混合物のメタノール（22.5 mL）溶液に、室温にて、ベンジルアジド（４a）（13.3 mg, 100 μmol）のメタノール（2.5 mL）溶液を加えた。そのまま室温にて２４時間撹拌し、エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮した。残渣は、ジイン３由来の二重環化付加生成物トランス体６а／シス体７а、およびモノイン２а由来のモノ環化付加生成物２３−２６の混合物であり、このままではカラムクロマトグラフィーによる分離精製、あるいは1H NMRスペクトルによる両者の生成比を求めることが困難であった。そこで、混合物に酸化剤を加えることでモノイン２а由来のモノ環化付加生成物であるアルコール２３−２６を、対応する下記反応式（２４）のケトン体２７（トランス体）、２８（シス体）に導くことで解析を容易にすることにした。すなわち、上記残渣のジクロロメタン (10 mL)溶液に、室温にて、デス−マーチン ペルヨージナン（Dess-Martin periodinane）（37.2 mg, 87.7 μmol)を加え、そのまま室温にて４時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮し、残渣を短いカラムクロマトグラフィー（5 g, 酢酸エチルのみ）に通すことにより、二重環化付加生成物であるトランス体６а／シス体７а、およびモノ環化付加ケトン体であるトランス体２７／シス体２８の混合物を得た。混合物の1H NMRスペクトルにおけるプロトンピークの積分比を求めたところ、６а／７аと２７／２８の比がほぼ１：１であった。このことは、ジイン３およびモノイン２аのベンジルアジド４аに対する反応性が同程度であることを示している。
【００５８】
【化２４】
2011118394.tif 000029
なお、上記実施例１９において生成したケトン体２７（トランス体）、および２８（シス体）の標品は、上記反応式（２４）で示されるように合成した。すなわち、モノイン２а(108 mg, 490 μmol)のメタノール（11 mL）溶液に、室温にて、ベンジルアジド（４a）（163 mg, 1.22 μmol）のメタノール（4 mL）溶液を加え、そのまま室温にて２時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ジクロロメタン/メタノール= 150/1 to 9/1）により精製し、モノ環化付加生成物の４つの位置異性体のうちトランスアルコールの混合物２３／２４（Rf = 0.14 (ジクロロメタン/メタノール = 49/1)(72.8 mg, 206 μmol, アジド（４ａ）に対して42.0%）、およびシス体アルコールの混合物２５／２６(Rf = 0.22 (ジクロロメタン/メタノール = 49/1)) (83.0 mg, 235 μmol, アジド（４ａ）に対して47.9%)を得た。
上記で得られたトランスアルコールの混合物体２３／２４（25.8 mg, 73.0 μmol）のジクロロメタン (10 mL)溶液に、室温にて、デス−マーチン ペルヨージナン（37.2 mg, 87.7 μmol）を加え、そのまま室温にて２１時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣を二度のフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, 酢酸エチル のみ,さらに シリカゲル 10 g, ジクロロメタンのみ）により精製し、トランスケトン体２７（23.3 mg, 66.3 μmol, 90.8%）を得た。
一方、同様にシスアルコールの混合物体２５／２６（22.3 mg, 63.1 μmol）のジクロロメタン (10 mL)溶液に、室温にて、デス−マーチン ペルヨージナン (32.1 mg, 75.7 μmol)を加え、そのまま室温にて２１時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣を二度のフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, 酢酸エチル のみ,さらに シリカゲル 10 g, ジクロロメタン のみ）により精製し、シスケトン体２８（20.5 mg, 58.3 μmol, 92.5%）を得た。
それぞれのケトン体の構造は、X線結晶構造解析により決定した（CCDC 761157（２７）および CCDC 761156（２８））。
1-ベンジル-1H-ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d][1,2,3]トリアゾール-8(9H)-オン（1-Benzyl-1H-dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d][1,2,3]triazol-8(9H)-one (２７)）
ｎ-ヘキサン／酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。 
Mp 220-222 ℃; 
Rf= 0.55 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.66 (d, 1H, J = 12.1 Hz), 3.76 (d, 1H, J = 12.1 Hz), 5.57 (d, 1H, J = 15.1 Hz), 5.69 (d, 1H, J = 15.1 Hz), 7.03-7.10 (m, 2H), 7.23-7.37 (m, 5H), 7.38-7.52 (m, 3H), 7.64 (ddd, 1H, J = 1.4, 8.0, 8.0 Hz), 8.01 (dd, 1H, J = 1.4, 8.0 Hz), 8.29 (dd, 1H, J = 1.4, 8.0 Hz); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ 48.0, 52.5, 125.4, 127.2 (2C), 127.5, 128.2, 128.29, 128.34 (3C), 128.8, 129.8, 130.8, 130.9, 131.3, 133.0, 133.2, 133.8, 134.0, 135.0, 146.6, 195.4; 
IR (KBr, cm-1) 542, 603, 704, 735, 764, 908, 1013, 1150, 1207, 1256, 1279, 1346, 1431, 1454, 1497, 1597, 1668, 3063
1-ベンジル-1H-ジベンゾ[3,4:7,8]シクロオクタ[1,2-d][1,2,3]トリアゾール-9(8H)-オン
(1-Benzyl-1H-dibenzo[3,4:7,8]cycloocta[1,2-d][1,2,3]triazol-9(8H)-one (２８)）
ｎ-ヘキサン／酢酸エチルで再結晶し、無色の結晶を得た。この結晶につき、以下の物性値を測定し、構造解析を行った。
Mp 178-180 ℃; 
Rf= 0.67 (ジクロロメタン/メタノール = 9/1); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3.60 (br, 1H), 3.81 (br, 1H), 5.67 (d, 2H, J = 5.5 Hz), 7.01-7.09 (m, 2H), 7.18 (dd, 1H, J = 1.7, 7.7 Hz), 7.24-7.30 (m, 3H), 7.32-7.41 (m, 3H), 7.43-7.56 (m, 2H), 7.66-7.74 (m, 1H), 8.15 (dd, 1H, J = 1.7, 7.7 Hz); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ 49.4, 53.1, 126.3, 127.3 (2C), 127.8, 128.5, 128.7, 128.9 (2C), 129.4, 129.5, 129.6, 130.5, 131.2, 131.4, 132.4, 133.2, 134.5, 134.8, 136.1, 145.8, 196.9; 
IR (KBr, cm-1) 538, 604, 706, 730, 766, 908, 1028, 1157, 1211, 1250, 1281, 1352, 1429, 1454, 1497, 1597, 1672, 3063
【００５９】
実施例２０（ＳＰＤＣ反応の反応速度解析）
【化２５】
2011118394.tif 000030
ＳＰＤＣ反応とシングルクリック反応との反応速度の差をより定量的に比較するために、上記反応式（２５）で示されるＳＰＤＣ反応の反応速度解析を行った。すなわち、ジイン３に対して過剰量のベンジルアジド(４ａ)を反応させ、ジイン３の時間依存的な減少を測定することで、ＳＰＤＣ反応の第一の環化付加反応の２次反応速度定数を求めた。
具体的には、光路長10 mmの石英セル中に2.0 mM (最終濃度1.0 mM) ジイン３のメタノール溶液1.5 mL を入れ、２５℃に保ちながらこれに３種類の異なる濃度（20,100, 200 mM；それぞれ最終濃度10,50,100 mM）のベンジルアジド（４ａ）のメタノール溶液1.5 mL を加えた。反応開始直後から、ジイン３に特徴的な吸収波長である351.5 nm（logε = 3.22）における吸光度を分光光度計により測定した。ちなみにベンジルアジド（４ａ）や二重環化付加生成物６ａ／７ａは、351.5 nmではほとんど吸収を示さない。上記の測定を、３００−３０００秒間、上述のベンジルアジド（４ａ）の各濃度において３回ずつ行い、吸光度を時間(秒)に対してプロットしたところ、図２に示すように指数関数的な減衰曲線が得られた。KaleidaGraph （ver. 4.1.1.）を用い、最小二乗法による近似曲線を求めることで反応の擬一次反応速度定数（k”）を算出した。このように、ベンジルアジド（４ａ）の各濃度において得られた擬一次反応速度定数（k”）をプロットしたところ、図３に示す直線が得られた。Microsoft Office Excel 2007を用いて線形回帰分析を行った結果、この直線の傾き、すなわち、ＳＰＤＣ反応の律速段階である第一の環化付加反応の２次反応速度定数は、(6.29 ± 0.05標準誤差) × 10-2 M-1s-1、であると求まった。
同条件下(メタノール中、２５℃)でのモノイン２ａと、ベンジルアジド（４ａ）とのシングルクリック反応における２次反応速度定数が、(5.67 ± 0.27標準誤差) ×10-2 M-1s-1 (メタノール, ２５℃)と報告されている（非特許文献：A. A. Poloukhtine, N. E. Mbua, M. A. Wolfert, G.-J. Boons, V. V. Popik, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 15769-15776）ことから、反応速度論の観点からも両反応はほとんど同じ速度で進行することが示された。
【００６０】
実施例２１（アジド含有生体分子の化学修飾）
次に、ＳＰＤＣ反応によるアジド含有生体分子の化学修飾についての実施例２１を説明する。実施例２１では、まず、ＧＳＴタンパク質とＨａｌｏＴａｇタンパク質の融合タンパク質ＧＳＴ-ＨａｌｏＴａｇタンパク質を発現する発現ベクターｐＧＥＸ６Ｐ-１-ＨａｌｏＴａｇを作製し、これを大腸菌株に導入した。ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）によるＧＳＴ-ＨａｌｏＴａｇタンパク質の発現誘導後、ＧＳＴが特異的に結合するＧＳＨ -セファロース樹脂を用いて、大腸菌破砕液よりＧＳＴ-ＨａｌｏＴａｇタンパク質を精製した。この精製したＧＳＴ-ＨａｌｏＴａｇタンパク質は、ＧＳＨ-セファロース樹脂に固定化した状態で、以下の化学修飾反応に用いた（以下、ＨａｌｏＴａｇ-セファロース樹脂と記載する）。このＨａｌｏＴａｇ-セファロース樹脂と、長鎖クロロアルカンであってアジド基を含むＨａｌｏＴａｇリガンド（アジド-ＨａｌｏＴａｇリガンド）８（下記の式（２６）参照）との反応により、所望のアジド含有ＨａｌｏＴａｇ-セファロース樹脂を得た。こうして得られたアジド含有ＨａｌｏＴａｇ-セファロース樹脂、およびＴＥＳＲＡ−ＰＥＯ３−アジド（９）（アジド結合テトラエチルスルホローダミン（ＴＥＳＲＡ））誘導体・式（２６）参照）を含有する溶液にジイン３を添加することによって、ＳＰＤＣ反応によるアジド含有ＨａｌｏＴａｇ-セファロース樹脂の蛍光修飾を試みた。まず、上述の反応後のアジド含有ＨａｌｏＴａｇ-セファロース樹脂に、還元剤を含むＳＤＳサンプルバッファーを加え、加熱することでＧＳＴとＧＳＨの結合を切断し、修飾されたＧＳＴ-ＨａｌｏＴａｇタンパク質を樹脂から切り離した。これらタンパク質を、アクリルアミドゲルを用いて分離し（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）、その後、蛍光標識されたかどうかを蛍光イメージ解析装置（Typhoon 7600, GE Healthcare）を用いて解析した。標識されたＧＳＴ-ＨａｌｏＴａｇタンパク質を、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色することにより可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、およそ４０％の総標識効率でＴＥＳＲＡ標識ＨａｌｏＴａｇタンパク質に対応する蛍光バンド（５１ｋＤａ）を示した（図４のレーン３参照）。この効率は、アジド基を含まないＨａｌｏＴａｇ-セファロース樹脂をＴＥＳＲＡ−ＨａｌｏＴａｇリガンド（１０）（式（２６）参照）で蛍光修飾した場合をほぼ１００％として算出している。このＴＥＳＲＡ−ＨａｌｏＴａｇリガンド（１０）によるアジド基を含まないＨａｌｏＴａｇ-セファロース樹脂の蛍光修飾効率がほぼ１００％であることは、MALDI-TOF-MSを用いた解析により、以下のように確認済みである。
ＴＥＳＲＡ−ＨａｌｏＴａｇリガンド（１０）によるＨａｌｏＴａｇタンパク質の修飾
まず、アジド基を含まないＨａｌｏＴａｇ-セファロース樹脂をＴＥＳＲＡ−ＨａｌｏＴａｇリガンド（１０）にて修飾し、修飾されたＨａｌｏＴａｇタンパク質をプロテアーゼにより切断してセファロース樹脂より切り離した。こうして切り離されたＨａｌｏＴａｇタンパク質の質量をMALDI-TOF-MSにより解析した（図５参照）。この質量分析の結果を示す図５のライン（１）（相対強度のピークが３５０８２［ａ.ｕ.］）はＴＥＳＲＡ−ＨａｌｏＴａｇリガンド（１０）にて修飾したＨａｌｏＴａｇタンパク質の分子量を、ライン（２）（相対強度のピークが３４３５５［ａ.ｕ.］）は未修飾のＨａｌｏＴａｇタンパク質の分子量を示している。このように、ＴＥＳＲＡ−ＨａｌｏＴａｇリガンド（１０）による修飾によって、ほぼ１００％のピークのシフトが認められた。この結果は、ＴＥＳＲＡ−ＨａｌｏＴａｇリガンド（１０）による修飾効率が、ほぼ１００％であることを示した。
【００６１】
なお、アジド含有ＨａｌｏＴａｇリガンド８、ジイン３、ＴＥＳＲＡ-ＰＥＯ３-アジド（９）のどれか一つが欠けても、ＧＳＴ-ＨａｌｏＴａｇタンパク質が蛍光修飾されなかった。つまり、この蛍光修飾反応は、タンパク質に対して非特異的な反応のほとんどない非常に特異性の高い反応であると言える。
また、ＳＰＤＣ反応が予想通り進行しているかを確認するため、上述（実施例２１）のＳＰＤＣ反応によりＴＥＳＲＡ標識されたアジド基含有ＨａｌｏＴａｇタンパク質の分子量をMALDI-TOF-MSを用いて解析した。プロテアーゼによる限定分解によりＧＳＴとＨａｌｏＴａｇタンパク質の接合部分を切り離すことにより、各ＨａｌｏＴａｇタンパク質をＧＳＨ -セファロース樹脂から溶出し、その溶出液をそのままMALDI-TOF-MS解析に用いた。この質量分析の結果を図６に示す。図６において、ライン（１）(相対強度のピークが３４３５５[a.u.])は未標識のＨａｌｏＴａｇタンパク質の分子量を、ライン（２）(相対強度のピークが３４３５７[a.u.])はＴＥＳＲＡ−ＰＥＯ３−アジド（９）とジイン３とを反応させたアジド基不含ＨａｌｏＴａｇタンパク質の分子量を示す。また、ライン（３）(相対強度のピークが３４７００[a.u.])はアジド-ＨａｌｏＴａｇリガンド８標識したＨａｌｏＴａｇタンパク質（アジド基含有ＨａｌｏＴａｇタンパク質）を、ライン（４）(相対強度のピークが３４６９９と３５６６５[a.u.])はそれぞれアジド含有ＨａｌｏＴａｇタンパク質とＴＥＳＲＡ−ＰＥＯ３−アジド（９）とジイン３が反応したアジド含有ＨａｌｏＴａｇタンパク質の分子量を示している。これらのＳＰＤＣ反応によるアジド含有ＨａｌｏＴａｇタンパク質の分子量の変化は、ＴＥＳＲＡ−ＰＥＯ３−アジド（９）とジイン３との共有結合による、予想される分子量の変化（３５６４３[a.u.]）とほぼ一致した。よって、アジド含有ＨａｌｏＴａｇタンパク質に対するＳＰＤＣ反応は、予想通りに順調に進行していることが示された。
【００６２】
【化２６】
2011118394.tif 000031
上述の反応では、アジド含有ＨａｌｏＴａｇタンパク質（アジド含有ＨａｌｏＴａｇ-セファロース樹脂）とジイン３、蛍光アジド分子（ＴＥＳＲＡ-ＰＥＯ３-アジド（９））が同一試験管内で共存する状態で反応を進行させた（同時ＳＰＤＣ反応）ため、ＳＰＤＣ反応の二つのクリック反応の進行を人為的に制御することは困難である。しかし、我々はＳＰＤＣ反応の二つのクリック反応が制御可能であることを見出した。以下に具体的な実験方法を示す。アジド含有ＨａｌｏＴａｇ-セファロース樹脂をジイン３で処理し、その後、バッファーにより未反応のジイン３を素早く洗浄した。この状態では、アジド含有ＨａｌｏＴａｇ-セファロースに対してジイン３の片側の三重結合が結合したモノイン中間体が存在していると予想される。上述の同時ＳＰＤＣ反応とは異なり、この状態においてすばやくＴＥＳＲＡ−ＰＥＯ３−アジド（９）を添加する逐次的手順（逐次的ＳＰＤＣ反応）によっても、およそ４５％の効率でアジド含有ＨａｌｏＴａｇタンパク質の蛍光標識が達成された（図４のレーン７参照）。つまり、ジイン３の片側のみが反応したモノイン中間体が確かに存在しうることが実証された。
さらに、上述の同時および逐次的ＳＰＤＣ反応において、アジド含有ＨａｌｏＴａｇタンパク質のホモダイマーのシグナルは、殆ど検出されなかった。これらの結果は、アジド含有タンパク質間でのＳＰＤＣ反応は、少なくとも試みられた条件下では進行しないことを示している。このことは、上述のタンパク質に対するＳＰＤＣ反応の条件下では、比較的大きい分子であるアジド含有タンパク質のホモダイマーの形成がほぼ確実に防止され、効率的な化学修飾が可能であることを示している。特に、アジド含有ＨａｌｏＴａｇタンパク質、ジイン化合物、および蛍光アジド分子を共存させる同時ＳＰＤＣ反応においては、アジド含有ＨａｌｏＴａｇタンパク質と蛍光アジド分子とをジイン化合物に対して一工程にて、実質的に同時に付加させることができるため、化学修飾をより効率化することができる。
【００６３】
アジド‐ＨａｌｏＴａｇリガンド８の合成法
【化２７】
2011118394.tif 000032
アルゴン雰囲気下、N-[2-{2-(6-クロロヘキシルオキシ)エトキシ}エチル]カルバメート（N-[2-{2-(6-chlorohexyloxy)ethoxy}ethyl]carbamate） (１１)（非特許文献Y. Zhang, M.-k. So, A. M. Loening, H. Yao, S. S. Gambhir, J. Rao, Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 118, 4936-4940に記載の方法により合成）(142 mg, 438 μmol)のジクロロメタン (3.5 mL)溶液に、０ ℃にて、トリフルオロ酢酸(0.5 mL)を加え、そのまま０ ℃にて２時間撹拌した。TLCにより出発原料である１１(Rf= 0.41, ジクロロメタン/メタノール = 9/1)の消失を確認した後、反応溶液を、エバポレーターを用いて減圧濃縮し、未精製のトリフルオロ酢酸2-[2-(6-クロロヘキシルオキシ)エトキシ]エチルアンモニウム（2-[2-(6-chlorohexyloxy)ethoxy]ethylammonium trifluoroacetate） (１２)を無色油状物質として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、スクシンイミド 4-(アジドメチル)ベンゾエート （succinimido 4-(azidomethyl)benzoate (１３) （非特許文献A. Gopin, S. Ebner, B. Attali, D. Shabat, Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1432-1440に記載の方法により合成） (100 mg, 365 μmol)のジクロロメタン (2 mL)溶液に、室温にて、トリエチルアミン(153 μL, 1.09 mmol)、および上記で得られた１２を順次加え、そのまま室温にて１８時間撹拌した。これに水(15 mL)を加え、生成物をジクロロメタン (×3回)を用いて抽出した。有機層を水(×1回)で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。これをろ過した後、ろ液をエバポレーターを用いて減圧濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ヘキサン/酢酸エチル = 1/1）により精製し、
4-(アジドメチル)-N-[2-{2-(6-クロロヘキシルオキシ) エトキシ}エチル]ベンズアミド （4-(azidomethyl)-N-[2-{2-(6-chlorohexyloxy)ethoxy}ethyl]benzamide） ８ (136 mg, 355 μmol, １３に対して97.3%) を黄色油状物質として得た。 
Rf= 0.29 (ヘキサン/酢酸エチル = 1/1); 
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1.28-1.50 (m, 4H), 1.51-1.66 (m, 2H), 1.67-1.82 (m, 2H), 3.46 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 3.52 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 3.57-3.62 (m, 2H), 3.64-3.71 (m, 6H), 4.40 (s, 2H), 6.75 (br s, 1H), 7.36-7.42 (AA’BB’, 2H), 7.79-7.85 (AA’BB’, 2H); 
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ25.3, 26.6, 29.3, 32.4, 39.6, 45.0, 54.1, 69.6, 69.9, 70.1, 71.2, 127.5 (2C), 128.0 (2C), 134.4, 138.7, 166.8; 
IR (KBr, cm-1) 557, 650, 733, 754, 853, 908, 1018, 1115, 1200, 1252, 1300, 1350, 1456, 1504, 1541, 1614, 1643, 2099, 2862, 2936, 3065, 3331; 
HRMS (EI) m/z 382.1775 (M, C18H2735ClN4O3計算値 382.1772).
【００６４】
ＴＥＳＲＡ‐ＰＥＯ3-アジド（９）の合成法
【化２８】
2011118394.tif 000033
アルゴン雰囲気下、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド（lissamine rhodamine B sulfonyl chloride） (１５) （非特許文献H. Yang, S. Vasudevan, C. O. Oriakhi, J. Shields, R. G. Carter, Synthesis 2008, 957-961に記載の方法により合成）(600 mg, 1.04 mmol) のジクロロメタン (30 mL)溶液に、０℃にて、トリエチルアミン(291 μL, 2.08 mmol)、および 11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミン（11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amine） (１４、市販品) (90%) (275 μL, 1.25 mmol)を順次加え、室温に昇温してから２２時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣の固体を桐山ロート上にて酢酸エチルを用いて洗浄した後、それをフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 50 g, ジクロロメタン/メタノール= 19/1）により精製し、ＴＥＳＲＡ‐ＰＥＯ3-アジド（９）(421 mg, 554 μmol, 53.4%)を紫色固体として得た。
Rf= 0.61 (ジクロロメタン/メタノール = 6/1); 
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 1.20 (t, 12H, J = 7.1 Hz), 3.01 (br s, 2H), 3.32-3.68 (m, 22H), 6.86-7.07 (m, 6H), 7.46 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 7.94 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 8.06 (br s, 1H), 8.40 (s, 1H); 
IR (KBr, cm-1) 613, 683, 1024, 1074, 1134, 1182, 1197, 1248, 1281, 1341, 1352, 1420, 1466, 1526, 1595, 1647; 
UV (メタノール) λmax (logε) 560.5 nm (5.16); 
FL (メタノール) λmax Em. 577 nm (Ex. 450 nm); 
HRMS (ESI+) m/z 781.2649 ([M+Na]+, C35H46N6NaO9S2+計算値 781.2660).
【００６５】
ＴＥＳＲＡ‐ＨａｌｏＴａｇリガンド（１０）の合成法
【化２９】
2011118394.tif 000034
アルゴン雰囲気下、N-[2-{2-(6-クロロヘキシルオキシ)エトキシ}エチル]カルバメート（N-[2-{2-(6-chlorohexyloxy)ethoxy}ethyl]carbamate） (１１)（非特許文献Y. Zhang, M.-k. So, A. M. Loening, H. Yao, S. S. Gambhir, J. Rao, Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 118, 4936-4940に記載の方法により合成）(84.2 mg, 260 μmol)のジクロロメタン (2.5 mL)溶液に、０ ℃にて、トリフルオロ酢酸(0.5 mL)を加え、そのまま０℃にて２時間撹拌した。TLCにより出発原料である１１(Rf = 0.41, ジクロロメタン/メタノール = 9/1)の消失を確認した後、反応溶液を、エバポレーターを用いて減圧濃縮し、未精製のトリフルオロ酢酸2-[2-(6-クロロヘキシルオキシ)エトキシ]エチルアンモニウム （2-[2-(6-chlorohexyloxy)ethoxy]ethylammonium trifluoroacetate） (１２)を無色油状物質として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド（lissamine rhodamine B sulfonyl chloride） (１５) (100 mg, 173 μmol) の ジクロロメタン (2 mL)溶液に、室温にて、トリエチルアミン(72.4 μL, 519 μmol)、および上記で得られた１２のジクロロメタン(1.5 mL)溶液を順次加え、そのまま室温にて１８時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g, ジクロロメタン/メタノール= 15/1）により精製し、ＴＥＳＲＡ‐ＨａｌｏＴａｇリガンド（１０）(30.1 mg, 39.8 μmol, １５に対して22.8%)を紫色固体として得た。
Rf= 0.54 (ジクロロメタン/メタノール = 6/1); 
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 1.20 (t, 12H, J = 7.0 Hz), 1.25-1.40 (m, 4H), 1.42-1.52 (m, 2H), 1.62-1.73 (m, 2H), 3.01 (br s, 2H), 3.42-3.51 (m, 8H), 3.55-3.70 (m, 10H), 6.90-7.10 (m, 6H), 7.45 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 7.94 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 8.06 (br s, 1H), 8.40 (s, 1H); 
IR (KBr, cm-1) 579, 683, 1026, 1076, 1136, 1165, 1182, 1202, 1258, 1277, 1350, 1396, 1420, 1466, 1483, 1524, 1597, 1645; 
UV (メタノール) λmax (logε) 561 nm (5.15); 
FL (メタノール) λmax Em. 577 nm (Ex. 450 nm); 
HRMS (FAB+/NBA) m/z 764.2834 (M+H, C37H5135ClN3O8S2計算値 764.2806).
【００６６】
実施例２２（生きた細胞の表面におけるアジド基含有複合糖質の蛍光標識）
さらに実施例２２において、生きた細胞でＳＰＤＣ反応による化学修飾を応用するために、細胞表面上に局在するアジド基含有複合糖質の蛍光標識を試みた。実施例２２では、細胞表面の複合糖質にアジド基を導入するために、ＨＥＫ２９３細胞を、テトラアセチル化されたＮ−アジドアセチル−Ｄ−マンノサミン（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ）と終濃度１０％の牛胎児血清を含有する培地を用いて、２日間培養した。その後、血清を含む培養液を新しいものに交換し、この培養液にジイン３を加え、３７℃で５％二酸化炭素存在下に、２０分間放置したのち、素早く新しい血清含有培養液にて洗浄し、未反応のジイン３を除去した。アジド化合物のみが環状ジイン化合物に付加するといった副反応を防止するためである。その後、即座にＴＥＳＲＡ−ＰＥＯ３−アジド（９）（上述の式（２６）参照）を添加し、３７℃で５％二酸化炭素存在下に、２０分間放置した。細胞の形態や核の位置を確認するために、上記細胞を固定後、細胞骨格染色試薬であるAlexa Fluor 488標識ファロイジンと核染色試薬であるTO-PRO-3でさらに染色した。これらの蛍光修飾された細胞を、オリンパス社製共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察し、アドビ社製Photoshop CS2ソフトウェアを用いて画像化した。その結果、アジド糖が細胞表面の複合糖質に組み込まれた細胞では、細胞間の境界に確かな蛍光シグナルが検出された（図７Ａ・上側の重ね合わせ像参照）。対照的に、アジド糖が細胞表面の複合糖質に組み込まれていない細胞（図７Ａ・下側のバッファー（−）参照）では、ほとんど無視できる程度のごくわずかな蛍光シグナルしか検出されなかった。つまり、アジド含有複合糖質の存在下でのみ細胞表面を蛍光修飾することが可能であり、また細胞に対する非特異的な修飾はほとんど認められないことが明らかとなった。
【００６７】
上記ＨＥＫ２９３細胞におけるアジド基含有複合糖質の蛍光修飾実験系において、ジイン３を４０〜１００μＭの濃度で使用することにより、最適な結果が得られ、ジイン３の修飾効率の濃度依存性が確認された（図７Ｂ参照）。蛍光修飾効率の測定には、得られた蛍光画像の強度をImage-Jソフトウェアを用いて数値化し、平均化した数値を用いてグラフ化した。なお各点における標準誤差も同様に記載してある。
【００６８】
一方、ジイン３の反応時間を最適化するため、４０μＭのジイン３を、アジド基含有複合糖質を持つＨＥＫ２９３細胞の血清含有培養液に加え、０〜４８分間放置した後、上記の通りＴＥＳＲＡ-ＰＥＯ３−アジド（９）を用いた蛍光修飾を行った。得られた蛍光画像を上記方法で定量化し、グラフ化した。その結果、２０分前後の反応時間で効率が最大となり、２０分以上の反応時間では効率が低下することが判明した（図７Ｃ参照）。この経時的な標識効率の低下は、ジイン３の片側のみがアジド基と反応したモノイン中間体の不安定性を示しており、時間の経過に伴ってモノイン中間体が分解したことに起因すると考えられる。
【００６９】
また、我々が独自に合成したＴＥＳＲＡ-ＰＥＯ３-アジド（９）のみならず、市販の低分子アジド化合物もＳＰＤＣ反応に使用できるか否かを検討するために、市販のAlexa Fluor 488アジドを用いて、アジド基含有複合糖質を持つＨＥＫ２９３細胞の蛍光修飾実験を行った。その結果、図８に示されたように、上述のような逐次的手順のみならず、ジイン３とAlexa Fluor 488アジドを同時に細胞培養液に加える同時手順においても、同様に効率よく蛍光修飾を行うことが出来た。なお図８では、Alexa Fluor 488アジドにより修飾されたＨＥＫ２９３細胞（アジド基含有）の表面と細胞核、および比較例として修飾されていない細胞の表面、細胞核（アジド基なし）がそれぞれ示されている。以上の結果は、化学修飾に用いる低分子アジド化合物に対する大きな制限はなく、多様な低分子アジド化合物が利用可能であることを示している。
【００７０】
さらに我々は、ＳＰＤＣ反応による修飾反応と、既存のモノイン蛍光誘導体を用いたシングルクリック反応による修飾反応との比較、検討を行った。その結果を図９に示す。ここでは、アジド糖を取り込ませたＨＥＫ２９３細胞（アジド基含有）と、アジド糖を取り込ませていないＨＥＫ２９３細胞（アジド基なし）のそれぞれに対し、ジイン３とフルオレセイン結合アジド１８を用いたＳＰＤＣ反応と、モノイン２ａの蛍光誘導体であるモノイン２２（反応式３１参照）を用いたシングルクリック反応によって蛍光修飾を行った。なおＳＰＤＣ反応においては、同時と逐次的手順による反応の二種類を行った。各反応時間は図に示す。この比較試験の結果、ＳＰＤＣ反応とシングルクリック反応では、同一反応時間における蛍光修飾効率にほとんど違いは認められなかった。この結果は、実施例１９に示した競争実験、および実施例２０に示した反応速度解析の結果と良い一致を示した（上述の段落［００４６］〜［００４８］、図２、３参照）。すなわち、ジイン３に対してフルオレセイン結合アジド１８を用いたＳＰＤＣ修飾反応と、モノイン２ａに対して上記フルオレセイン結合モノイン２２を用いたシングルクリック修飾反応とは、ほぼ同じ速度で進行することが示された。
【００７１】
【化３０】
2011118394.tif 000035
フルオレセイン結合アジド１８の合成法
アルゴン雰囲気下、2-アジドエチルアミン（2-azidoethylamine） (１６) (〜50%, 1H NMR)（非特許文献R. Srinivasan, L. P. Tan, H. Wu, P. Yang, K. A. Kalesh, S. Q. Yao, Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 1821-1828に記載の方法により合成）(200 mg, 〜1.16 mmol)の ジクロロメタン (5 mL)溶液に、室温にて、トリエチルアミン(70.0 μL, 502 μmol) 、およびフルオレセインイソチオシアナート異性体（fluorescein isothiocyanate isomer） I (FITC, １７、市販品) (90%, HPLC) (100 mg, 231 μmol)を順次加え、そのまま室温にて２１時間撹拌した。エバポレーターを用いて反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 30 g, ジクロロメタン/メタノール= 9/1）により精製し、
1-(2-アジドエチル)-3-(5-フルオレセイニル)チオウレア（1-(2-azidoethyl)-3-(5-fluoresceinyl)thiourea） (１８) (109 mg, 229 μmol, 99.2%)を橙色固体として得た。
TLC Rf = 0.61 (ジクロロメタン/メタノール = 6/1); 
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 2.73 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 3.56 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 3.65-3.80 (br, 2H), 6.54 (dd, 2H, J = 2.2, 8.6 Hz), 6.61 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 6.65 (d, 2H, J = 2.2 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7,72 (dd, 1H, J = 1.7, 8.4 Hz), 8.21 (d, 1H, J = 1.7 Hz), 8.25-8.40 (br, 1H), 9.80-10.60 (br, 1H); 
IR (KBr, cm-1) 459, 476, 577, 600, 667, 812, 851, 914, 1111, 1173, 1207, 1296, 1389, 1458, 1570, 2108, 2930; 
UV (メタノール) λmax (logε) 456 nm (4.07), 482 nm (4.09); 
FL (メタノール) λmax Em. 516.5 nm (Ex. 450 nm); 
HRMS (ESI+) m/z 476.1024 ([M+H]+, C23H18N5O5S+required 476.1023).
【００７２】
【化３１】
2011118394.tif 000036
フルオレセイン結合モノイン２２の合成法
アルゴン雰囲気下、エチレンジアミン(１９、市販品) (320 μL, 479 μmol)のジクロロメタン (5 mL)溶液に、室温にて、トリエチルアミン(330 μL, 237 μmol) 、および
11,12-ジデヒドロ-5,6-ジヒドロジベンゾ[a,e]シクロオクテン-5-イル 4-ニトロフェニルカルボナート
（11,12-didehydro-5,6-dihydrodibenzo[a,e]cycloocten-5-yl 4-nitrophenyl carbonate） (２０)（非特許文献X. Ning, J. Guo. M. A. Wolfert, G.-J. Boons, Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2253-2255に記載の方法により合成） (60.3 mg, 156 μmol)を順次加え、そのまま室温にて２時間撹拌した。TLCにより出発原料である２０の消失を確認した後、反応溶液にジクロロメタン (70 mL)を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した(20 mL ×7)。無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した後、これをろ過し、ろ液をエバポレーターを用いて減圧濃縮し、未精製の
（11,12-ジデヒドロ-5,6-ジヒドロジベンゾ[a,e] シクロオクテン-5-イルN-(2-アジドエチル) カルバメート）（11,12-didehydro-5,6-dihydrodibenzo[a,e]cycloocten-5-yl N-(2-azidoethyl)carbamate） (２１) (51.2 mg)を淡黄色油状物質として得た。これ以上の精製は行わず、そのまま次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、上記で得られた２１の DMF (3 mL)溶液に、室温にて、トリエチルアミン(29.0 μL, 208 μmol) 、およびアジフルオレセインイソチオシアナート異性体(fluorescein isothiocyanate isomer） I (FITC, １７、市販品) (90%, HPLC) (45.0 mg, 104 μmol)を順次加え、そのまま室温にて１７時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 8 g, ジクロロメタン/メタノール= 12/1）により精製し、
1-[2-{(11,12-ジデヒドロ-5,6-ジヒドロジベンゾ[a,e] シクロオクテン-5-イル) オキシカルボニルアミド}エチル]-3-(5-フルオレセイニル)チオウレア
1-[2-{(11,12-didehydro-5,6-dihydrodibenzo[a,e]cycloocten-5-yl)oxycarbonylamino}ethyl]-3-(5-fluoresceinyl)thiourea (２２) (59.0 mg, 84.8 μmol, １７に対して80.7%)を黄色固体として得た。
TLC Rf = 0.52 (ジクロロメタン/メタノール = 6/1); 
1H NMR (300 Mz, CD3OD) δ 2.73 (dd, 1H, J = 3.7, 14.9 Hz), 3.20 (dd, 1H, J = 2.4, 14.9 Hz), 3.70-3.80 (m, 2H), 5.28 (s, 1H), 6.41 (dd, 2H, J = 2.3, 9.2 Hz), 6.59 (dd, 2H, J = 2.3, 9.2 Hz), 6.70 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.71 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 6.97-7.56 (m, 12H), 7.83 (s, 1H); 
IR (KBr, cm-1) 488, 546, 565, 578, 760, 851, 914, 993, 1022, 1076, 1113, 1179, 1207, 1258, 1317, 1449, 1506, 1595, 1701, 2938, 3063, 3287; 
UV (メタノール) λmax (logε) 455 nm (3.95), 481 nm (3.95); 
FL (メタノール) λmax Em. 515 nm (Ex. 450 nm); 
HRMS (ESI+) m/z 696.1785 ([M+H]+, C40H30N3O7S+required 696.1799).
【００７３】
最後に、ジイン３の生きた細胞に対する毒性試験を行った。培養中のＨＥＫ２９３細胞にジイン３を０−８０μMの濃度で加え、そのまま一晩培養した。培養後の細胞の形態を位相差顕微鏡により撮影し、アドビ社のPhotoshop CS2を用いて画像化したものを図１０に示す。このように、細胞毒性を示さなかったジイン３は、生きた細胞の化学修飾にも適応可能であると考えられる。
【００７４】
以上のように、ＳＰＤＣ反応を活用した、プローブとしての蛍光性官能基等を有する機能性アジド化合物によるアジド基含有生体分子の修飾において、ジイン３が基質として有用であることが明らかになった。特に、ジイン３（または類似の構造の環状ジイン化合物）と、様々な種類の機能性アジド含有化合物とが容易に入手あるいは合成可能であるため、ＳＰＤＣ反応の適用により、様々な機能性生体分子の調製が可能になる。また、２つのアジド化合物が単一の工程により付加、連結可能である上に、触媒のない穏やかな条件下でも速やかに進行するＳＰＤＣ反応を利用することにより、生細胞中等において機能を維持したまま機能性生体分子を容易に、かつ効率的に調製することができる。
【図１】
2011118394.tif 000040
【図２】
2011118394.tif 000041
【図３】
2011118394.tif 000042
【図４】
2011118394.tif 000043
【図５】
2011118394.tif 000044
【図６】
2011118394.tif 000045
【図７】
2011118394.tif 000046
【図８】
2011118394.tif 000047
【図９】
2011118394.tif 000048
【図１０】
2011118394.tif 000049
【国際調査報告】
2011118394.tif 000050
2011118394.tif 000051
2011118394.tif 000052
2011118394.tif 000053
2011118394.tif 000054
2011118394.tif 000055