(57)【要約】本発明は、任意の標的遺伝子について、標的遺伝子配列を含むＤＮＡ断片の精製の有る無しに拘わらずに、標的遺伝子断片のみを目的とする他のＤＮＡ断片と結合させた「連結ＤＮＡ断片」を選択的に得る方法を提供することを目的とする。本発明は、配列Ａおよび配列Ｂ、あるいは配列Ａまたは配列Ｂを含む連結用二本鎖ＤＮＡ断片を、標的遺伝子断片の各末端側に選択的に連結させる方法に関する。所定の関係にある３’端突出二本鎖遺伝子断片と連結用二本鎖ＤＮＡ断片とを用い、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片および前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の混合物を、少なくとも２サイクルの熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応に供して、前記配列Ａ、前記標的遺伝子の配列および前記配列Ｂが連結された一単位の配列を１個以上含む二本鎖ＤＮＡ断片である「連結ＤＮＡ断片」を得る。類似の方法で、「片側連結ＤＮＡ断片」も得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法であって、
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、中央部に標的遺伝子配列を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片を準備し、
(2)中央部に連結用ＤＮＡ領域を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片を準備し、
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(4)上記３’端突出二本鎖遺伝子断片及び連結用二本鎖ＤＮＡ断片を用いて、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応を少なくとも2回行うことで、上記連結ＤＮＡ断片を得ることを含む、
連結ＤＮＡ断片の製造方法。
【請求項２】
前記一方の会合可能な領域を「領域1」とし、他方の会合可能な領域を「領域2」とすると、前記連結ＤＮＡ断片は、模式的に領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1-標的遺伝子-領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1で示される配列を少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
連結用ＤＮＡ領域が2つの連結用ＤＮＡ領域として配列Ａおよび配列Ｂを含み、
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の会合可能な領域は、一方が末端側から配列Ｐ１およびＴ１を有し、他方が末端側から配列Ｐ２およびＴ２を有し、配列Ｔ１および配列Ｔ２の少なくとも一方は標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列を有し、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域は、一方が末端側から配列ＶＰ１およびＶＴ１を有し、他方が末端側から配列ＶＰ２およびＶＴ２を有し、配列ＶＰ１およびＶＴ１は、配列Ｐ１およびＴ１とそれぞれ相同的な塩基配列を有し、配列ＶＰ２およびＶＴ２は、配列Ｐ２およびＴ２とそれぞれ相同的な塩基配列を有する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片は、Ｐ１−Ｔ１−標的遺伝子−Ｔ２−Ｐ２で表され、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片は、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１で表され、
前記連結ＤＮＡ断片は、ＶＴ２−ＶＰ２（Ｔ２−Ｐ２）−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）−標的遺伝子−ＶＴ２−ＶＰ２（Ｔ２−Ｐ２）−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）を少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である、但し、ＶＴ２−ＶＰ２（Ｔ２−Ｐ２）は、Ｔ２−Ｐ２と相同的なＶＴ２−ＶＰ２であることを意味し、ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）は、Ｔ１−Ｐ１と相同的なＶＴ１−ＶＰ１であることを意味する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
配列Ｐ２の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＢのＶＰ２と隣接する配列と非相同的な配列であり、配列Ｐ１の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＡのＶＰ１と隣接すると非相同的な配列である請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記突出末端は、３’端にダイデオキシヌクレオチドを含む配列である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法で製造した連結ＤＮＡ断片を鋳型として、
連結ＤＮＡ断片に含まれる少なくとも１つの少なくとも一部の連結用ＤＮＡ領域と標的遺伝子の配列の全てを増幅するように、
連結ＤＮＡ断片に含まれる異なる連結用ＤＮＡ領域で機能するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、
少なくとも１つの少なくとも一部の連結用ＤＮＡ領域と標的遺伝子の配列の全てを含むＤＮＡ断片を製造する方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法で製造した連結ＤＮＡ断片を鋳型として、
配列Ａの塩基配列の一部を標的遺伝子に向かうように３’端に含むフォワードプライマー、および
配列Ｂの塩基配列の一部を標的遺伝子に向かうように３’端に含むリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列Ａ、標的遺伝子の配列および配列Ｂが連結されたＤＮＡ断片を得ることを含むＤＮＡ断片を製造する方法。
【請求項９】
標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域１、他方の側に連結用ＤＮＡ領域２を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法であって、
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、中央部に標的遺伝子配列を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片を準備し、
(2)連結用ＤＮＡ領域１を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片１および連結用ＤＮＡ領域２を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片２を準備し、
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(4)上記３’端突出二本鎖遺伝子断片並びに連結用二本鎖ＤＮＡ断片１および２を用いて、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応を少なくとも2回行うことで、上記連結ＤＮＡ断片を得ることを含む、
連結ＤＮＡ断片の製造方法。
【請求項１０】
連結用ＤＮＡ領域１が配列Ａを含み、連結用ＤＮＡ領域２が配列Ｂを含み、
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の会合可能な領域は、一方が末端側から配列Ｐ１およびＴ１を有し、他方が末端側から配列Ｐ２およびＴ２を有し、配列Ｔ１および配列Ｔ２の少なくとも一方は標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列を有し、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域は、末端側から配列ＶＴ１およびＶＰ１を有し、連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の会合可能な領域は、末端側から配列ＶＴ２およびＶＰ２を有し、配列ＶＰ１およびＶＴ１は、配列Ｐ１およびＴ１とそれぞれ相同的な塩基配列を有し、配列ＶＰ２およびＶＴ２は、配列Ｐ２およびＴ２とそれぞれ相同的な塩基配列を有する、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片は、Ｐ１−Ｔ１−標的遺伝子−Ｔ２−Ｐ２で表され、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片１は、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１で表され、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片２は、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂで表され、
前記連結ＤＮＡ断片は、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）−標的遺伝子−ＶＴ２−ＶＰ２（Ｔ２−Ｐ２）−配列Ｂを少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である、但し、ＶＴ２−ＶＰ２（Ｔ２−Ｐ２）は、Ｔ２−Ｐ２と相同的なＶＴ２−ＶＰ２であることを意味し、ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）は、Ｔ１−Ｐ１と相同的なＶＴ１−ＶＰ１であることを意味する、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
配列Ｐ２の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＢのＶＰ２と隣接する配列と非相同的な配列であり、配列Ｐ１の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＡのＶＰ１と隣接する配列と非相同的な配列である請求項１０または１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記突出末端は、３’端にダイデオキシヌクレオチドを含む配列である請求項９〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれかに記載の方法で製造した連結ＤＮＡ断片を鋳型として、
連結ＤＮＡ断片に含まれる少なくとも１つの少なくとも一部の連結用ＤＮＡ領域と標的遺伝子の配列の全てを増幅するように、
連結ＤＮＡ断片に含まれる異なる連結用ＤＮＡ領域で機能するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、
少なくとも１つの少なくとも一部の連結用ＤＮＡ領域と標的遺伝子の配列の全てを含むＤＮＡ断片を製造する方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法で製造した連結ＤＮＡ断片を鋳型として、
配列Ａの塩基配列の一部を標的遺伝子に向かうように３’端に含むフォワードプライマー、および
配列Ｂの塩基配列の一部を標的遺伝子に向かうように３’端に含むリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列Ａ、標的遺伝子の配列および配列Ｂが連結されたＤＮＡ断片を得ることを含むＤＮＡ断片を製造する方法。
【請求項１６】
標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた片側連結ＤＮＡ断片を製造する方法であって、
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、前記標的遺伝子配列の一方の末端側に会合可能な領域を有し、かつ前記領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、前記会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片を準備し、
(2)連結用ＤＮＡ領域を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片を準備し、
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(4)上記３’端突出二本鎖遺伝子断片並びに連結用二本鎖ＤＮＡ断片を用いて、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応を１回行ってヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物を得、次いで、
このヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行うことで、上記片側連結ＤＮＡ断片を得ることを含む、
片側連結ＤＮＡ断片の製造方法。
【請求項１７】
連結用ＤＮＡ領域が配列Ａを含み、
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の会合可能な領域は、末端側から配列Ｐ１およびＴ１を有し、配列Ｔ１および配列Ｔ２の少なくとも一方は標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列を有し、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域は、末端側から配列ＶＴ１およびＶＰ１を有し、配列ＶＰ１およびＶＴ１は、配列Ｐ１およびＴ１とそれぞれ相同的な塩基配列を有し、
前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物を鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応は、前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物の標的遺伝子の一部を前記標的遺伝子の突出末端側に向かうよう３’端に含むプライマーおよび前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物の配列Ａの一部を前記標的遺伝子側に向かうよう３’端に含むプライマーを用いる、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片は、Ｐ１−Ｔ１−標的遺伝子で表され、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片は、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１で表され、
前記片側連結ＤＮＡ断片は、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）−標的遺伝子を少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である、但し、ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）は、Ｔ１−Ｐ１と相同的なＶＴ１−ＶＰ１であることを意味する、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
配列Ｐ１の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＡのＶＰ１と隣接すると非相同的な配列である請求項１７または１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記突出末端は、３’端にダイデオキシヌクレオチドを含む配列である請求項１６〜１８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２１】
標的遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片およびポリデオキシヌクレオチドに、デオキシヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼを作用させて、標的遺伝子の配列を含む３’端突出二本鎖遺伝子断片を得ることをさらに含む
（但し、前記標的遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片は、配列Ｐ１および配列Ｐ２を各末端に有し、前記配列Ｐ１の内側の一部に配列Ｔ１を有し、前記配列Ｐ２の内側の一部に配列Ｔ２を有し、かつ前記配列Ｔ１およびＴ２の一方又は両方は、標的遺伝子に固有の塩基配列を有する）、請求項３、４、１０、または１１に記載の製造方法。
【請求項２２】
標的遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片およびポリデオキシヌクレオチドに、デオキシヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼを作用させて、標的遺伝子の配列を含む３’端突出二本鎖遺伝子断片を得ることをさらに含む
（但し、前記標的遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片は、配列Ｐ１を一方の末端に有し、前記配列Ｐ１の内側の一部に配列Ｔ１を有し、かつ前記配列Ｔ１は、標的遺伝子に固有の塩基配列を有する）、請求項１７または１８に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記配列Ｔ１および配列Ｔ２の一方または両方が、標的遺伝子に固有の塩基配列を有する、請求項３、４、１０、または１１に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記配列Ｐ１および配列Ｐ２の一方または両方が、標的遺伝子に固有の塩基配列を有する、請求項３、４、１０、または１１に記載の製造方法。
【請求項２５】
前記配列Ｐ１およびＰ２は、独立に１０塩基以上である、請求項３、４、１０、１１、１７または１８に記載の製造方法。
【請求項２６】
前記標的遺伝子が抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子であり、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片が前記抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来する配列を含み、ならびに、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片または前記配列Ａを有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片における前記領域ＶＰ１および領域ＶＴ１は、抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来するまたは由来しない配列を有する、請求項１〜２５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２７】
前記標的遺伝子が抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子であり、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片が前記抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来する配列を含み、ならびに、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片または前記配列Ｂを有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片における前記領域ＶＰ２および領域ＶＴ２は、抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来するまたは由来しない配列である、請求項２６に記載の製造方法。
【請求項２８】
請求項２６または２７に記載の方法で製造された連結ＤＮＡ断片を用いて抗体またはＴ細胞受容体を製造する方法。
【請求項２９】
標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、中央部に標的遺伝子配列を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片。
【請求項３０】
中央部に連結用ＤＮＡ領域を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片。
【請求項３１】
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、中央部に標的遺伝子配列を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片と
(2)中央部に連結用ＤＮＡ領域を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片
との組合体であって、標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられる組合体。
【請求項３２】
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない、
請求項３１に記載の組合体。
【請求項３３】
連結用ＤＮＡ領域１を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片１または連結用ＤＮＡ領域２を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片２。
【請求項３４】
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、中央部に標的遺伝子配列を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片と
(2)連結用ＤＮＡ領域１を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片１または連結用ＤＮＡ領域２を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片２
との組合体であって、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域１、他方の側に連結用ＤＮＡ領域２を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられる組合体。
【請求項３５】
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない、
請求項３４に記載の組合体。
【請求項３６】
標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、前記標的遺伝子配列の一方の末端側に会合可能な領域を有し、かつ前記領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、前記会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片。
【請求項３７】
連結用ＤＮＡ領域を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片。
【請求項３８】
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、前記標的遺伝子配列の一方の末端側に会合可能な領域を有し、かつ前記領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、前記会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片と
(2)連結用ＤＮＡ領域を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片
との組合体であって、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた片側連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられる組合体。
【請求項３９】
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない、
請求項３８に記載の組合体。
【請求項４０】
前記連結用ＤＮＡ領域は、イントロン、エクソン、蛍光タンパク質遺伝子、Hisタグ等の各種タグ配列や、菌や動物細胞内で種々の遺伝子の発現を制御することができるプロモーター、エンハンサー配列、ポリＡ付加配列等から成る群から選ばれる少なくとも1種の配列である請求項３０〜３５、３７〜３９のいずれかに記載の連結用二本鎖ＤＮＡ断片または組合体。
【請求項４１】
請求項２９に記載の３’端突出二本鎖遺伝子断片、請求項３０に記載の連結用二本鎖ＤＮＡ断片、または請求項３１若しくは３２に記載の組合体を含む、標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられるキット。
【請求項４２】
請求項２９に記載の３’端突出二本鎖遺伝子断片、請求項３３に記載の連結用二本鎖ＤＮＡ断片、または請求項３４若しくは３５に記載の組合体を含む、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域１、他方の側に連結用ＤＮＡ領域２を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられるキット。
【請求項４３】
請求項３６に記載の３’端突出二本鎖遺伝子断片、請求項３７に記載の連結用二本鎖ＤＮＡ断片、または請求項３８若しくは３９に記載の組合体を含む、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた片側連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられるキット。
【請求項４４】
前記連結用ＤＮＡ領域は、イントロン、エクソン、蛍光タンパク質遺伝子、Hisタグ等の各種タグ配列や、菌や動物細胞内で種々の遺伝子の発現を制御することができるプロモーター、エンハンサー配列、ポリＡ付加配列等から成る群から選ばれる少なくとも1種の配列である請求項４１〜４３のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００９年９月４日出願の日本特願２００９−２０５３０８号の優先権を主張し、それらの全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、標的遺伝子由来配列を含む連結ＤＮＡ断片の特異的作製方法に関するものであり、より詳しくは、非特異的増幅生成ＤＮＡ断片共存下において、標的遺伝子断片を特異的に、他の目的ＤＮＡ断片と特異的に連結させるための製造方法に関する。詳しくは、本発明は、（１）標的遺伝子の配列を含む３’端突出二本鎖遺伝子断片と、標的遺伝子の各末端側に固有の塩基配列をその両末端側に含む連結用二本鎖ＤＮＡ断片とから成る計２種類のDNA断片を用いて、標的遺伝子断片の各末端側に連結用二本鎖ＤＮＡ断片を特異的に連結させて「連結ＤＮＡ断片」を製造する方法；（２）標的遺伝子の配列を含む３’端突出二本鎖遺伝子断片と、標的遺伝子の各末端側に固有の塩基配列をそれぞれ一方の末端側に含む２種の二本鎖ＤＮＡ断片とからなる計３種類のDNA断片を用いて、標的遺伝子断片の各末端側にそれぞれの連結用二本鎖ＤＮＡ断片を特異的に連結させて「連結ＤＮＡ断片」を製造する方法；ならびに、（３）標的遺伝子の配列を含む３’端突出二本鎖遺伝子断片と、標的遺伝子の一方の末端側に固有の塩基配列を一方の末端側に含む連結用二本鎖ＤＮＡ断片とから成る計２種類のDNA断片を用いて、標的遺伝子断片の一方の末端側に連結用二本鎖ＤＮＡ断片を特異的に連結させて「片側連結ＤＮＡ断片」を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡクローニングとは、一般的に、標的遺伝子断片をプラスミド、ファージ、コスミドなどの自己複製能を持つベクターに結合し、大腸菌などの宿主に導入して増殖させることにより、同じ遺伝子集団を作り出す技術を言う。大腸菌におけるクローニング及びサブクローニングは、重合酵素（ポリメラーゼ）連鎖反応（ＰＣＲ）の方法などにより増幅された標的遺伝子断片を、ＤＮＡリガーゼを用いて複製開始点と抗生剤の選択標識を持ったベクターに結合して大腸菌細胞の中に導入した後、抗生剤耐性を調べることでクローニングされた菌体を選り分ける方法で行われる。【０００４】
既存のＤＮＡクローニング法においては、挿入ＤＮＡとベクターを同じ認識部位の制限酵素で切断することや、制限酵素を選択するときにも挿入ＤＮＡやベクターの内部を切断しないものを選択すること、などが求められるといった制限がある。【０００５】
近年、特定の塩基配列を認識してＤＮＡ断片間の組換えを促すという配列特異的な遺伝子組換え酵素を用いた部位特異的組換え技術や相同組換え技術が標的遺伝子断片のクローニングに利用され、制限酵素等の処理を行うことなく、大量の遺伝子の素早いクローニング及び蛋白質の発現のために汎用され始めている。【０００６】
しかし、相同組換え技術を用いた場合であっても、大腸菌などの微生物を用いたプラスミドの増幅及び精製工程は必要であり、作業は依然として煩雑であり、経済性も悪い。【０００７】
大腸菌などの微生物を用いたプラスミドの増幅及び精製工程を行うことなく、標的遺伝子断片を標的遺伝子以外の特定の機能を有する１つまたは複数のＤＮＡ断片と、前記機能が発現し得る状態で連結させ、同じ塩基配列を有する遺伝子集団を製造する方法として、連結ＰＣＲ法が知られている（特許文献１、並びに非特許文献１及び２を参照）。ここでは、「標的遺伝子以外の特定の機能を有するＤＮＡ断片」とは、プロモーター配列及びポリＡ付加配列である。【０００８】
特許文献１に記載の方法では、プロモーター配列、標的遺伝子配列及びポリＡ付加配列を独立に含む３種のＤＮＡ断片をＲＮＡ-ＤＮＡキメラプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。次いで増幅されたＤＮＡ断片をＲＮａｓｅにより処理することでＲＮＡプライマー部位を除去し、各ＤＮＡ断片末端に生じた３’突出領域の互いの相補性を利用し、ＤＮＡリガーゼを用いて３種のＤＮＡ断片を結合させている。これを鋳型としたＰＣＲを行うことで、プロモーター配列、標的遺伝子配列およびポリＡ付加配列をこの順に機能的に連結させた連結ＤＮＡ断片を大量に製造できる（特許文献１の図１を参照）。【０００９】
非特許文献１及び２では、遺伝子増幅に用いるプライマーの５’端側に連結される相手方のＤＮＡ断片の末端領域と相同的な配列を付加したプライマーを用い、プロモーター配列、標的遺伝子配列、及びポリＡ付加配列をそれぞれ独立に増幅している。これら３種のＤＮＡ断片を用いて、連結ＰＣＲを行うことにより、プロモーター配列、標的遺伝子配列及びポリＡ付加配列が機能的に連結された連結ＤＮＡ断片を製造する方法が記載されている（非特許文献１のFigure 2及び非特許文献２のFig.1を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ０３／０９１４４０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Nikolai A. Shevchuk et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 2 e19
【非特許文献２】H.-X. Liao et al., Journal of Virological Methods, 158, (2009), pp.171-179
【００１２】
特許文献１並びに非特許文献１〜２の全記載は、ここに特に開示として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
標的遺伝子断片は一般にＰＣＲ産物として調製されるが、ＰＣＲの際のプライマーの鋳型への結合の特異性が低い場合や鋳型にプライマー配列と類似した配列が複数存在する場合などでは、非特異的増幅反応が生じる結果、両端のプライマー配列に挟まれた領域が、クローニングの対象である標的遺伝子でない非特異的増幅生成ＤＮＡ断片が生じ得る。【００１４】
従来の連結ＰＣＲ法では、各ＤＮＡ断片を増幅するために使用されるプライマー中に、連結に利用するための配列が付加されている。本プライマーを用いて増幅された個々のＤＮＡ断片には、異なるＤＮＡ断片とハイブリダイズするための配列がＤＮＡ断片末端側に導入される。次に増幅されたＤＮＡ断片を混合して連結ＰＣＲを行うことで、２種類以上のＤＮＡ断片が結合した「連結ＤＮＡ断片」が形成される。【００１５】
しかし上記の方法では、遺伝子増幅反応により得られたＰＣＲ産物のプライマー配列に挟まれた領域が標的遺伝子に由来する配列でない断片についても、標的遺伝子断片と同様に「連結ＤＮＡ断片」が形成される。【００１６】
また仮に遺伝子増幅反応により標的遺伝子断片のみが増幅された場合であっても、反応液中には遺伝子増幅に用いられたプライマーが残存しており、これを除去することなく連結ＰＣＲ反応を行うと、「連結ＤＮＡ断片」の構成要素である各ＤＮＡ断片の増幅が「連結ＤＮＡ断片」の増幅に優先して生じるため、目的とする標的遺伝子に由来する配列を含む「連結ＤＮＡ断片」の形成は困難である。【００１７】
従って上記特許文献及び非特許文献に記載の方法では、標的遺伝子断片のＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ増幅産物は、プライマー及び非標的遺伝子配列を含むＤＮＡ断片の混入の影響が無視できる程度に精製されなければならない。【００１８】
以上の通り、２本以上の二本鎖ＤＮＡ断片を結合させた「連結ＤＮＡ断片」を従前の方法で製造するには、標的遺伝子以外の特定の機能を有する１つまたは複数のＤＮＡ断片と連結する前の工程の一つとして、非標的遺伝子配列を含むＤＮＡ断片、及び標的遺伝子増幅に用いたプライマーの混在が連結反応に与える影響を無視できる程度に、ＰＣＲ増幅産物に含まれる標的遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を精製することが求められる。しかし、標的遺伝子断片の長さが非標的遺伝子断片の長さと類似している場合には標的遺伝子断片の分離が困難である。そのため、このような場合には、目的とする標的遺伝子に由来する配列を含む「連結ＤＮＡ断片」のみを得ることが不可能となる。【００１９】
そこで、本発明の目的は、標的遺伝子配列を含むＰＣＲ増幅産物に一つ以上の二本鎖ＤＮＡ断片を結合させて、目的とする標的遺伝子に由来する配列を含む「連結ＤＮＡ断片」を作製する方法であって、前記ＰＣＲ増幅産物を精製することなく、前記「連結ＤＮＡ断片」を特異的に作製できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、鋭意研究を積み重ねた結果、
標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片と
この二本鎖遺伝子断片と連結するための連結用ＤＮＡ領域を含む連結用二本鎖ＤＮＡ断片とを連結するに当たり、
(1)前記二本鎖遺伝子断片として、中央部に標的遺伝子を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子に含まれる固有の配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片を準備し、
(2)前記二本鎖ＤＮＡ断片として、中央部に連結用ＤＮＡ領域を少なくとも1つ含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片を準備し、
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の前記一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の前記他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(4)上記３’端突出二本鎖遺伝子断片及び連結用二本鎖ＤＮＡ断片を用いて、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応を少なくとも2回行うことで、
前記二本鎖遺伝子断片に、非標的遺伝子を含む遺伝子断片や、前記二本鎖遺伝子断片をPCRで増幅するために用いたプライマーが共存している場合であっても、
非標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域が連結した連結ＤＮＡ断片の非特異的な生成は抑制し、標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた、目的とする連結ＤＮＡ断片を特異的に得ることに成功し、本発明の第1の態様(請求項1に記載の発明)を完成した。【００２１】
ここで一方の会合可能な領域を「領域1」、他方の会合可能な領域を「領域2」とすると、３’端突出二本鎖遺伝子断片は、模式的に領域1-標的遺伝子-領域2で示される配列を有し、連結用二本鎖ＤＮＡ断片は、模式的に領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1で示される配列を有し、連結ＤＮＡ断片は、模式的に領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1-標的遺伝子-領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1で示される配列を少なくとも１つ有するものである。【００２２】
さらに、連結用ＤＮＡ領域が2つの連結用ＤＮＡ領域1及び2を含む、模式的に領域2-連結用ＤＮＡ領域2-連結用ＤＮＡ領域1-領域1で示される配列を有する場合には、模式的に領域2-連結用ＤＮＡ領域2-連結用ＤＮＡ領域1-領域1-標的遺伝子-領域2-連結用ＤＮＡ領域2-連結用ＤＮＡ領域1-領域1で示される配列を少なくとも１つ有するものとなる。【００２３】
さらに本発明者らは、上記本発明の第1の態様における連結用二本鎖ＤＮＡ断片を、模式的に領域1-連結用ＤＮＡ領域1及び連結用ＤＮＡ領域2-領域2でそれぞれ示される配列を有する2つの連結用二本鎖ＤＮＡ断片１および２に分けることでも、非標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域1、他方の側に連結用ＤＮＡ領域2が連結した連結ＤＮＡ断片の非特異的な生成を抑制して、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域1、他方の側に連結用ＤＮＡ領域2を連結させた、目的とする連結ＤＮＡ断片を特異的に得ることに成功し、本発明の第2の態様(請求項9に記載の発明)を完成した。【００２４】
ここで得られる連結ＤＮＡ断片は、模式的に連結用ＤＮＡ領域1-領域1-標的遺伝子-領域2-連結用ＤＮＡ領域2で示される配列を有するものである。【００２５】
加えて本発明者らは、上記本発明の第2の態様における、2つに分けたいずれか一方の連結用二本鎖ＤＮＡ断片、模式的に領域1-連結用ＤＮＡ領域1または連結用ＤＮＡ領域2-領域2で示される配列を用いることで、非標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域1または2を連結させた連結ＤＮＡ断片の非特異的な生成を抑制して、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域1または2を連結させた、目的とする片側連結ＤＮＡ断片を特異的に得ることに成功し、本発明の第3の態様(請求項16に記載の発明)を完成した。【００２６】
さらに本発明は、上記本発明の第1の態様〜第3の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片、連結用二本鎖ＤＮＡ断片及びこれらの組合体、さらにはこれらを含むキットを包含する。【００２７】
本発明は以下のとおりである。
[１]
標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法であって、
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、中央部に標的遺伝子配列を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片を準備し、
(2)中央部に連結用ＤＮＡ領域を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片を準備し、
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(4)上記３’端突出二本鎖遺伝子断片及び連結用二本鎖ＤＮＡ断片を用いて、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応を少なくとも2回行うことで、上記連結ＤＮＡ断片を得ることを含む、
連結ＤＮＡ断片の製造方法。
[２]
前記一方の会合可能な領域を「領域1」とし、他方の会合可能な領域を「領域2」とすると、前記連結ＤＮＡ断片は、模式的に領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1-標的遺伝子-領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1で示される配列を少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である、[１]に記載の製造方法。
[３]
連結用ＤＮＡ領域が2つの連結用ＤＮＡ領域として配列Ａおよび配列Ｂを含み、
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の会合可能な領域は、一方が末端側から配列Ｐ１およびＴ１を有し、他方が末端側から配列Ｐ２およびＴ２を有し、配列Ｔ１および配列Ｔ２の少なくとも一方は標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列を有し、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域は、一方が末端側から配列ＶＰ１およびＶＴ１を有し、他方が末端側から配列ＶＰ２およびＶＴ２を有し、配列ＶＰ１およびＶＴ１は、配列Ｐ１およびＴ１とそれぞれ相同的な塩基配列を有し、配列ＶＰ２およびＶＴ２は、配列Ｐ２およびＴ２とそれぞれ相同的な塩基配列を有する、[１]に記載の製造方法。
[４]
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片は、Ｐ１−Ｔ１−標的遺伝子−Ｔ２−Ｐ２で表され、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片は、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１で表され、
前記連結ＤＮＡ断片は、ＶＴ２−ＶＰ２（Ｔ２−Ｐ２）−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）−標的遺伝子−ＶＴ２−ＶＰ２（Ｔ２−Ｐ２）−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）を少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である、但し、ＶＴ２−ＶＰ２（Ｔ２−Ｐ２）は、Ｔ２−Ｐ２と相同的なＶＴ２−ＶＰ２であることを意味し、ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）は、Ｔ１−Ｐ１と相同的なＶＴ１−ＶＰ１であることを意味する、[３]に記載の製造方法。
[５]
配列Ｐ２の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＢのＶＰ２と隣接する配列と非相同的な配列であり、配列Ｐ１の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＡのＶＰ１と隣接すると非相同的な配列である[３]または[４]に記載の製造方法。
[６]
前記突出末端は、３’端にダイデオキシヌクレオチドを含む配列である[１]〜[４]のいずれかに記載の製造方法。
[７]
[１]〜[６]のいずれかに記載の方法で製造した連結ＤＮＡ断片を鋳型として、
連結ＤＮＡ断片に含まれる少なくとも１つの少なくとも一部の連結用ＤＮＡ領域と標的遺伝子の配列の全てを増幅するように、
連結ＤＮＡ断片に含まれる異なる連結用ＤＮＡ領域で機能するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、
少なくとも１つの少なくとも一部の連結用ＤＮＡ領域と標的遺伝子の配列の全てを含むＤＮＡ断片を製造する方法。
[８]
[３]に記載の方法で製造した連結ＤＮＡ断片を鋳型として、
配列Ａの塩基配列の一部を標的遺伝子に向かうように３’端に含むフォワードプライマー、および
配列Ｂの塩基配列の一部を標的遺伝子に向かうように３’端に含むリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列Ａ、標的遺伝子の配列および配列Ｂが連結されたＤＮＡ断片を得ることを含むＤＮＡ断片を製造する方法。
[９]
標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域１、他方の側に連結用ＤＮＡ領域２を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法であって、
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、中央部に標的遺伝子配列を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片を準備し、
(2)連結用ＤＮＡ領域１を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片１および連結用ＤＮＡ領域２を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片２を準備し、
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(4)上記３’端突出二本鎖遺伝子断片並びに連結用二本鎖ＤＮＡ断片１および２を用いて、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応を少なくとも2回行うことで、上記連結ＤＮＡ断片を得ることを含む、
連結ＤＮＡ断片の製造方法。
[１０]
連結用ＤＮＡ領域１が配列Ａを含み、連結用ＤＮＡ領域２が配列Ｂを含み、
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の会合可能な領域は、一方が末端側から配列Ｐ１およびＴ１を有し、他方が末端側から配列Ｐ２およびＴ２を有し、配列Ｔ１および配列Ｔ２の少なくとも一方は標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列を有し、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域は、末端側から配列ＶＴ１およびＶＰ１を有し、連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の会合可能な領域は、末端側から配列ＶＴ２およびＶＰ２を有し、配列ＶＰ１およびＶＴ１は、配列Ｐ１およびＴ１とそれぞれ相同的な塩基配列を有し、配列ＶＰ２およびＶＴ２は、配列Ｐ２およびＴ２とそれぞれ相同的な塩基配列を有する、[９]に記載の製造方法。
[１１]
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片は、Ｐ１−Ｔ１−標的遺伝子−Ｔ２−Ｐ２で表され、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片１は、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１で表され、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片２は、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂで表され、
前記連結ＤＮＡ断片は、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）−標的遺伝子−ＶＴ２−ＶＰ２（Ｔ２−Ｐ２）−配列Ｂを少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である、但し、ＶＴ２−ＶＰ２（Ｔ２−Ｐ２）は、Ｔ２−Ｐ２と相同的なＶＴ２−ＶＰ２であることを意味し、ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）は、Ｔ１−Ｐ１と相同的なＶＴ１−ＶＰ１であることを意味する、[１０]に記載の製造方法。
[１２]
配列Ｐ２の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＢのＶＰ２と隣接する配列と非相同的な配列であり、配列Ｐ１の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＡのＶＰ１と隣接する配列と非相同的な配列である[１０]または[１１]に記載の製造方法。
[１３]
前記突出末端は、３’端にダイデオキシヌクレオチドを含む配列である[９]〜[１１]のいずれかに記載の製造方法。
[１４]
[９]〜[１３]のいずれかに記載の方法で製造した連結ＤＮＡ断片を鋳型として、
連結ＤＮＡ断片に含まれる少なくとも１つの少なくとも一部の連結用ＤＮＡ領域と標的遺伝子の配列の全てを増幅するように、
連結ＤＮＡ断片に含まれる異なる連結用ＤＮＡ領域で機能するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、
少なくとも１つの少なくとも一部の連結用ＤＮＡ領域と標的遺伝子の配列の全てを含むＤＮＡ断片を製造する方法。
[１５]
[１０]に記載の方法で製造した連結ＤＮＡ断片を鋳型として、
配列Ａの塩基配列の一部を標的遺伝子に向かうように３’端に含むフォワードプライマー、および
配列Ｂの塩基配列の一部を標的遺伝子に向かうように３’端に含むリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列Ａ、標的遺伝子の配列および配列Ｂが連結されたＤＮＡ断片を得ることを含むＤＮＡ断片を製造する方法。
[１６]
標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた片側連結ＤＮＡ断片を製造する方法であって、
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、前記標的遺伝子配列の一方の末端側に会合可能な領域を有し、かつ前記領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、前記会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片を準備し、
(2)連結用ＤＮＡ領域を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片を準備し、
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(4)上記３’端突出二本鎖遺伝子断片並びに連結用二本鎖ＤＮＡ断片を用いて、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応を１回行ってヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物を得、次いで、
このヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行うことで、上記片側連結ＤＮＡ断片を得ることを含む、
片側連結ＤＮＡ断片の製造方法。
[１７]
連結用ＤＮＡ領域が配列Ａを含み、
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の会合可能な領域は、末端側から配列Ｐ１およびＴ１を有し、配列Ｔ１および配列Ｔ２の少なくとも一方は標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列を有し、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域は、末端側から配列ＶＴ１およびＶＰ１を有し、配列ＶＰ１およびＶＴ１は、配列Ｐ１およびＴ１とそれぞれ相同的な塩基配列を有し、
前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物を鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応は、前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物の標的遺伝子の一部を前記標的遺伝子の突出末端側に向かうよう３’端に含むプライマーおよび前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物の配列Ａの一部を前記標的遺伝子側に向かうよう３’端に含むプライマーを用いる、[１６]に記載の製造方法。
[１８]
前記３’端突出二本鎖遺伝子断片は、Ｐ１−Ｔ１−標的遺伝子で表され、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片は、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１で表され、
前記片側連結ＤＮＡ断片は、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）−標的遺伝子を少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である、但し、ＶＰ１−ＶＴ１（Ｐ１−Ｔ１）は、Ｔ１−Ｐ１と相同的なＶＴ１−ＶＰ１であることを意味する、[１７]に記載の製造方法。
[１９]
配列Ｐ１の３’端にある突出末端のＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない配列は前記配列ＡのＶＰ１と隣接すると非相同的な配列である[１７]または[１８]に記載の製造方法。
[２０]
前記突出末端は、３’端にダイデオキシヌクレオチドを含む配列である[１６]〜[１８]のいずれかに記載の製造方法。
[２１]
標的遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片およびポリデオキシヌクレオチドに、デオキシヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼを作用させて、標的遺伝子の配列を含む３’端突出二本鎖遺伝子断片を得ることをさらに含む
（但し、前記標的遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片は、配列Ｐ１および配列Ｐ２を各末端に有し、前記配列Ｐ１の内側の一部に配列Ｔ１を有し、前記配列Ｐ２の内側の一部に配列Ｔ２を有し、かつ前記配列Ｔ１およびＴ２の一方又は両方は、標的遺伝子に固有の塩基配列を有する）、[３]、[４]、[１０]、または[１１]に記載の製造方法。
[２２]
標的遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片およびポリデオキシヌクレオチドに、デオキシヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼを作用させて、標的遺伝子の配列を含む３’端突出二本鎖遺伝子断片を得ることをさらに含む
（但し、前記標的遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片は、配列Ｐ１を一方の末端に有し、前記配列Ｐ１の内側の一部に配列Ｔ１を有し、かつ前記配列Ｔ１は、標的遺伝子に固有の塩基配列を有する）、[１７]または[１８]に記載の製造方法。
[２３]
前記配列Ｔ１および配列Ｔ２の一方または両方が、標的遺伝子に固有の塩基配列を有する、[３]、[４]、[１０]、または[１１]に記載の製造方法。
[２４]
前記配列Ｐ１および配列Ｐ２の一方または両方が、標的遺伝子に固有の塩基配列を有する、[３]、[４]、[１０]、または[１１]に記載の製造方法。
[２５]
前記配列Ｐ１およびＰ２は、独立に１０塩基以上である、[３]、[４]、[１０]、[１１]、[１７]または[１８]に記載の製造方法。
[２６]
前記標的遺伝子が抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子であり、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片が前記抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来する配列を含み、ならびに、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片または前記配列Ａを有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片における前記領域ＶＰ１および領域ＶＴ１は、抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来するまたは由来しない配列を有する、[１]〜[２５]のいずれかに記載の製造方法。
[２７]
前記標的遺伝子が抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子であり、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片が前記抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来する配列を含み、ならびに、
前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片または前記配列Ｂを有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片における前記領域ＶＰ２および領域ＶＴ２は、抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来するまたは由来しない配列である、[２６]に記載の製造方法。
［２８］
［２６］または［２７］に記載の方法で製造された連結ＤＮＡ断片を用いて抗体またはＴ細胞受容体を製造する方法。
［２９］
標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、中央部に標的遺伝子配列を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片。
［３０］
中央部に連結用ＤＮＡ領域を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片。
［３１］
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、中央部に標的遺伝子配列を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片と
(2) 中央部に連結用ＤＮＡ領域を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片
との組合体であって、標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられる組合体。
［３２］
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない、
［３１］に記載の組合体。
［３３］
連結用ＤＮＡ領域１を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片１または連結用ＤＮＡ領域２を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片２。
［３４］
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、中央部に標的遺伝子配列を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有し、前記会合可能な2つの領域は互いに会合しない塩基配列を有し、かつ一方または両方の領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片と
(2)連結用ＤＮＡ領域１を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片１または連結用ＤＮＡ領域２を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片２
との組合体であって、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域１、他方の側に連結用ＤＮＡ領域２を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられる組合体。
［３５］
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない、
［３４］に記載の組合体。
［３６］
標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、前記標的遺伝子配列の一方の末端側に会合可能な領域を有し、かつ前記領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、前記会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片。
［３７］
連結用ＤＮＡ領域を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片。
［３８］
(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、前記標的遺伝子配列の一方の末端側に会合可能な領域を有し、かつ前記領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、前記会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片と
(2)連結用ＤＮＡ領域を含み、末端側に会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片
との組合体であって、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた片側連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられる組合体。
［３９］
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない、
［３８］に記載の組合体。
［４０］
前記連結用ＤＮＡ領域は、イントロン、エクソン、蛍光タンパク質遺伝子、Hisタグ等の各種タグ配列や、菌や動物細胞内で種々の遺伝子の発現を制御することができるプロモーター、エンハンサー配列、ポリＡ付加配列等から成る群から選ばれる少なくとも1種の配列である［３０］〜［３５］、［３７］〜［３９］のいずれかに記載の連結用二本鎖ＤＮＡ断片または組合体。
［４１］
［２９］に記載の３’端突出二本鎖遺伝子断片、［３０］に記載の連結用二本鎖ＤＮＡ断片、または［３１］若しくは３２に記載の組合体を含む、標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられるキット。
［４２］
［２９］に記載の３’端突出二本鎖遺伝子断片、［３３］に記載の連結用二本鎖ＤＮＡ断片、または［３４］若しくは［３５］に記載の組合体を含む、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域１、他方の側に連結用ＤＮＡ領域２を連結させた連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられるキット。
［４３］
［３６］に記載の３’端突出二本鎖遺伝子断片、［３７］に記載の連結用二本鎖ＤＮＡ断片、または［３８］若しくは［３９］に記載の組合体を含む、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた片側連結ＤＮＡ断片を製造する方法に用いられるキット。
［４４］
前記連結用ＤＮＡ領域は、イントロン、エクソン、蛍光タンパク質遺伝子、Hisタグ等の各種タグ配列や、菌や動物細胞内で種々の遺伝子の発現を制御することができるプロモーター、エンハンサー配列、ポリＡ付加配列等から成る群から選ばれる少なくとも1種の配列である［４１］〜［４３］のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の方法によれば、非特異的な増幅で得られた遺伝子増幅産物共存下において、標的遺伝子増幅産物を特異的に連結用ＤＮＡ断片に連結させることができる。本発明の方法によれば、標的遺伝子について、標的遺伝子配列を含むＤＮＡ断片の精製の有る無しに係わらずに、例えば、連結用ＤＮＡ断片に含まれていた配列Ａ及び配列Ｂを、配列Ａ−標的遺伝子配列−配列Ｂがこの順に機能的に連結した連結ＤＮＡ断片を特異的に製造できる。【００２９】
さらに、本発明によれば、配列Ａをプロモーター配列、配列ＢをポリＡ付加配列とすることで、配列Ａ−標的遺伝子配列−配列Ｂがこの順に機能的に連結した連結ＤＮＡ断片を宿主細胞に導入すれば、標的遺伝子配列を発現させることができる。後に詳述するが、上記配列をこの順に機能的に連結させた配列を有する二本鎖ＤＮＡの単位が、上記のようにプロモーター配列およびポリＡ付加配列を機能的に連結させた配列のように、この標的遺伝子配列の発現に必要な最小構成の二本鎖ＤＮＡ断片からなる場合、これを本発明では発現ユニットと呼ぶことがある。【００３０】
上記発現ユニットは、大腸菌を用いて調製された環状型ベクターと異なり、試験管内で合成された線状二本鎖ＤＮＡ断片であることから、エンドトキシン等の菌体に由来する有害物質の混入が無い。その結果、標的遺伝子がコードする蛋白質を有害物質の影響が無い状態で宿主細胞を用いて特異的かつ大量に生産させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明の第1の態様を説明するための反応スキームである。
【図２】図２は、本発明の第1の態様の１つの実施態様を説明するための反応スキームである。
【図３】図３は、本発明の第1の態様の１つの実施態様において、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応において核酸伸長産物が生じず、連結ＤＮＡ断片が得られない場合を説明するための反応スキームである。
【図４】図４は、本発明の第1の態様の１つの実施態様によって得られた連結ＤＮＡ断片から、所望の二本鎖ＤＮＡ断片を得るための方法を説明するための反応スキームである。
【図５】図５は、本発明の第1の態様の１つの実施態様によって得られた連結ＤＮＡ断片から、所望の二本鎖ＤＮＡ断片を得るための方法において、所望の二本鎖ＤＮＡ断片が得られない場合を説明するための反応スキームである。
【図６】図６は、本発明の第2の態様の１つの実施態様を説明するための反応スキームである。
【図７】図７は、本発明の第3の態様の１つの実施態様を説明するための反応スキームである。
【図８】図８は、ヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片と、標的及び非標的遺伝子断片の混合物を該選択的連結方法に供して得た増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認した図である。レーン１：３’端ポリヌクレオチド付加標的遺伝子断片１をヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片に連結させることで得られた、プロモーター−ヒトγ鎖遺伝子−ポリＡ付加配列から成る連結単位（ヒトγ鎖遺伝子発現ユニット）、レーン２：３’端ポリヌクレオチド付加非標的遺伝子断片２をヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片に連結することで得られた連結単位：レーン３：標的遺伝子断片１をヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片に連結することで得られたヒトγ鎖遺伝子発現ユニット、レーン４：非標的遺伝子断片２をヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片に連結することで得られた連結単位
【図９】図９は、3’端ポリヌクレオチド付加標的遺伝子断片１とヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片の結合により生じたヒトγ鎖遺伝子発現ユニットの重合体をミスマッチプライマーまたは通常のプライマーを用いてＰＣＲに供し、増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で確認した図である。レーン１及び２：プライマーＥ及びＦを用いたヒトγ鎖遺伝子発現ユニットの増幅、レーン３及び４：プライマーG及びHを用いたヒトγ鎖遺伝子発現ユニットの増幅
【図１０】図１０は、標的遺伝子断片１の塩基配列の説明図である。
【図１１】図１１は、非標的遺伝子断片２の塩基配列の説明図である。
【図１２】図１２は、ヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列の説明図である。
【図１３】図１３は、磁気ビーズを用いたｃＤＮＡ合成法（免疫グロブリン可変領域増幅法）の説明図である。
【図１４】図１４は、ヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片の製造方法の模式図である。
【図１５】図１５は、例３において、ヒトプラズマ細胞１及び２よりγ鎖及びκ鎖可変領域を増幅した結果を示した図である。
【図１６】図１６は、ヒトκ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列の説明図である。
【図１７】図１７は、例３において、増幅されたγ鎖及びκ鎖可変領域を発現ユニットに変換した結果を示した図である。
【図１８】図１８は、例３において、ELAISA法を用いて細胞培養液中に分泌された組み換えヒト免疫グロブリンを測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
［用語の定義］
本明細書において、以下の用語は以下に示す意味を有するものとする。
「標的遺伝子配列」とは、本発明の方法において、連結用二本鎖ＤＮＡ断片を連結させた連結ＤＮＡ断片を特異的に得たい遺伝子の配列である。標的遺伝子配列の例は後述する。
「二本鎖遺伝子断片」とは、標的遺伝子配列を含む二本鎖の遺伝子断片である。
「３’端突出二本鎖遺伝子断片」とは、二本鎖遺伝子断片の両方の３’端に突出末端を有する遺伝子断片である。
「連結用二本鎖ＤＮＡ断片」とは、本発明の方法において、連結ＤＮＡ断片を得るために標的遺伝子配列に連結させるＤＮＡ断片である。
「会合可能な領域」とは、後述する「熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応」における再会合(アニーリング)において、連結用二本鎖ＤＮＡ断片が有する2つの「会合可能な領域」の一方と会合し得る領域である。
「標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列」とは、標的遺伝子配列に含まれる、標的遺伝子が本来有する塩基配列である。
「連結ＤＮＡ断片」とは、標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた二本鎖連結ＤＮＡ断片である。
「片側連結ＤＮＡ断片」とは、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた二本鎖連結ＤＮＡ断片である。
「連結単位」とは、配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂを意味する。
「連結単位重合体」とは、複数の連結単位が連なったＤＮＡ断片を意味する。
「センス鎖」とは、二本鎖ＤＮＡの任意の一方の一本鎖ＤＮＡ鎖を意味し、「アンチセンス鎖」とは、任意の一方の一本鎖ＤＮＡ鎖が「センス鎖」である場合の二本鎖ＤＮＡの他方の一本鎖ＤＮＡ鎖を意味する。
「領域」は、該当する箇所のセンス鎖の配列とアンチセンス鎖の配列からなる部分を意味する。
上記以外の用語についても、以下の明細書中で定義している用語は、その定義の意味で用いられる。
【００３３】
［本発明の第1の態様］
本発明の第1の態様について、以下に詳細に説明する。
本発明の第1の態様は、「３’端突出二本鎖遺伝子断片」及び「連結用二本鎖ＤＮＡ断片」から、標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた「連結ＤＮＡ断片」を製造する方法である。(図1参照)
【００３４】
「３’端突出二本鎖遺伝子断片」
本発明の第1の態様では、(1)標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から、「３’端突出二本鎖遺伝子断片」を準備する。「３’端突出二本鎖遺伝子断片」は、図1の最上段に示すように、中央部に標的遺伝子配列を含み、両方の末端側に会合可能な領域(会合可能な領域1および会合可能な領域2)をそれぞれ有する。
【００３５】
本発明における「標的遺伝子配列」は、特に制限されない。「標的遺伝子配列」は、例えば、抗体遺伝子の配列であることができ、抗体遺伝子の配列の一方の末端に位置する配列は、抗体遺伝子の定常領域由来の配列であることができる。「標的遺伝子配列」は、抗体遺伝子の配列以外に、T細胞受容体遺伝子、スプライシングバリアント等の、プライマー領域及びそれに隣接する内側の配列が一定であるが、内部に可変部位を持つＤＮＡ配列であることもできる。
【００３６】
「会合可能な領域」とは、後述する「熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応」における再会合(アニーリング)において、連結用二本鎖ＤＮＡ断片が有する2つの「会合可能な領域」の一方と会合し得る領域である。３’端突出二本鎖遺伝子断片の「会合可能な領域」と連結用二本鎖ＤＮＡ断片の「会合可能な領域」の会合関係は後述する。
【００３７】
「３’端突出二本鎖遺伝子断片」の両末端の会合可能な2つの領域は、互いに会合しない塩基配列を有する。「互いに会合しない塩基配列」とは、一方の「会合可能な領域」のセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれもが、他方の「会合可能な領域」のセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれもと会合しない塩基配列を意味する。
【００３８】
さらに、３’端突出二本鎖遺伝子断片の「会合可能な領域」の一方または両方は、少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列である。「標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列」とは、標的遺伝子配列に含まれる、標的遺伝子が本来有する塩基配列である。「会合可能な領域」が含む標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列は、標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片から「３’端突出二本鎖遺伝子断片」が準備される際に、標的遺伝子配列を含む二本鎖遺伝子断片に含まれていた塩基配列をそのまま保存して残された配列である。「３’端突出二本鎖遺伝子断片」には、「会合可能な領域」の上記塩基配列以外に、標的遺伝子配列も保存されて残っていることは言うまでもない。換言すると、「会合可能な領域」の上記塩基配列は、標的遺伝子配列の一部であるとも言える。本発明の第１の態様の方法で製造した「連結ＤＮＡ断片」から、さらなる追加の工程(さらなる追加の工程については後述する)を経て、最終的に目的とする標的遺伝子配列からこの標的遺伝子配列がコードするタンパク質を発現させる場合、上記「会合可能な領域」に含まれる「標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列」がコードする部分も、発現するタンパク質の一部となる場合がある。
【００３９】
３’端突出二本鎖遺伝子断片は、両方の会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する。この突出末端は、ヌクレオチドの一本鎖からなり、それぞれ、一方の末端は、「会合可能な領域」の３’端に結合し、他方の末端、即ち、３’端は未結合の開放状態である。
【００４０】
上記突出末端は、連結用二本鎖ＤＮＡ断片が有する会合可能な領域との間で、以下の(3-2)および(3-4)の関係を有する。
(3-2)３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない。
(3-4)３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない。
【００４１】
本発明において、「ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない」配列とは、相手側の一本鎖とハイブリダイズせず、その結果、相手側の一本鎖を鋳型としてＤＮＡ合成反応において鎖伸長が生じないことを意味する。例えば、互いにＤＮＡ同士である場合に、相手側の一本鎖と少なくとも一つのヌクレオチドが相補的でない配列は、「ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない」配列である。但し、ハイブリダイズの条件は、１サイクル目の熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応における再会合の条件である。１サイクル目の再会合の条件は、後述する。あるいは、３’端がＤＮＡ合成反応において次のヌクレオチドを付加できない構造を有するヌクレオチド、例えば、ダイデオキシヌクレオチドである配列は、「ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない」配列である。
【００４２】
突出末端と連結用二本鎖ＤＮＡ断片が有する会合可能な領域とが、上記(3-2)および(3-4)の関係を有することで、PCRで調製された３’端突出二本鎖遺伝子断片に、標的遺伝子に相当する領域に非標的遺伝子を含む非標的３’端突出二本鎖遺伝子断片や、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の元となる二本鎖遺伝子断片をPCRで増幅するために用いたプライマーが共存している場合であっても、2サイクル行われる、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応において、非標的３’端突出二本鎖遺伝子断片を鋳型とした、非標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域が連結した非標的連結ＤＮＡ断片の生成を抑制できる。その結果、非標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域が連結した非標的連結ＤＮＡ断片の非特異的な生成を抑制できる。より具体的な説明は後述する。
【００４３】
「連結用二本鎖ＤＮＡ断片」
(2)本発明では、中央部に連結用ＤＮＡ領域を含み、両末端側にそれぞれ会合可能な領域を有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片を準備する。連結用二本鎖ＤＮＡ断片は、図1の上から2番目に示すように、連結用ＤＮＡ領域の両方の末端側に会合可能な領域(会合可能な領域1および会合可能な領域2)をそれぞれ有する。
【００４４】
連結用ＤＮＡ領域は、標的遺伝子の両方の側に連結して、連結ＤＮＡ断片に追加の機能を付与できるＤＮＡ領域であれば特に制限はない。連結用ＤＮＡ領域は、例えば、イントロン、エクソン、蛍光タンパク質遺伝子、Hisタグ等の各種タグ配列や、菌や動物細胞内で種々の遺伝子の発現を制御することができるプロモーター、エンハンサー配列、ポリＡ付加配列等を挙げることができる。
【００４５】
前述のように、一方の会合可能な領域を「領域1」、他方の会合可能な領域を「領域2」とすると、３’端突出二本鎖遺伝子断片は、模式的に領域1-標的遺伝子-領域2で示される配列を有し、連結用二本鎖ＤＮＡ断片は、模式的に領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1で示される配列を有し、連結ＤＮＡ断片は、模式的に領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1-標的遺伝子-領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1で示される配列を少なくとも１つ有するものである。したがって、例えば、連結用ＤＮＡ領域が蛍光タンパク質遺伝子である場合には、連結ＤＮＡ断片は、領域2-蛍光タンパク質遺伝子-領域1-標的遺伝子-領域2-蛍光タンパク質遺伝子-領域1で示される配列を少なくとも１つ有するものになる。
【００４６】
また、標的遺伝子を宿主細胞で発現させ、標的遺伝子がコードするタンパク質を調製したい場合には、連結用ＤＮＡ領域としてポリＡ付加配列とプロモーターの2つの連結用ＤＮＡ領域1及び2を含む連結用二本鎖ＤＮＡ断片を用いる。この場合、連結用二本鎖ＤＮＡ断片は模式的に領域2-ポリＡ付加配列-プロモーター-領域1で示される配列を有する。この連結用二本鎖ＤＮＡ断片を用いると、連結ＤＮＡ断片は、模式的に領域2-ポリＡ付加配列-プロモーター-領域1-標的遺伝子-領域2-ポリＡ付加配列-プロモーター-領域1で示される配列を少なくとも１つ有するものとなる。
【００４７】
次に、３’端突出二本鎖遺伝子断片の会合可能な領域と、連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域との関係について説明する。
【００４８】
まず、本明細書において、二本鎖遺伝子断片および連結用二本鎖ＤＮＡ断片における「会合可能な領域」とは、後述する「熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応」における再会合において、再会合に先立つ熱変性において、一本鎖に解離させたＤＮＡ(遺伝子)断片が、相補的な塩基配列を有する一本鎖の遺伝子(ＤＮＡ)断片と、ハイブリダイズして二本鎖を形成できる領域を意味する。但し、会合可能であるか否かは、互いに相補的な塩基配列を有する二本の一本鎖ＤＮＡ(遺伝子)断片の長さや塩基配列にもよるが、再会合の条件は、一本鎖となった会合可能な領域の長さが１１ヌクレオチド以上で、再会合時のアニーリング温度が計算されたTm値より0℃から20℃低い温度である場合に、会合し得ることを意味するものとする。
【００４９】
本発明の第１態様においては、３’端突出二本鎖遺伝子断片の会合可能な領域と、連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域とは、以下の(3-1)および(3-3)の関係を有する。
(3-1)３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域(図1中の会合可能領域1)は、連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端の会合可能な領域(図1中の会合可能領域1v)と相同的な塩基配列からなるが、３’突出末端と結合する末端側が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側である。即ち、３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域(会合可能領域1)と連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端の会合可能な領域(会合可能領域1v)とは、相同的な塩基配列からなる。しかし、３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域の末端側が、連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端の会合可能な領域では、連結用ＤＮＡ領域と結合する側(内側)に位置する。
【００５０】
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域(図1中の会合可能領域2)は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の末端の会合可能な領域(図1中の会合可能領域2v)と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側である。上記(3-1)と同様に、３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域(会合可能領域2)と連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の末端の会合可能な領域(会合可能領域2v)とは、相同的な塩基配列からなる。しかし、３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域の末端側が、連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の末端の会合可能な領域では、連結用ＤＮＡ領域と結合する側(内側)に位置する。
【００５１】
本発明の第１態様においては、３’端突出二本鎖遺伝子断片の会合可能な領域と、連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域とが、上記(3-1)および(3-3)の関係を有することで、2サイクル行われる、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応によって、標的遺伝子が、両側を領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1で挟まれた、模式的に領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1-標的遺伝子-領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1で示される配列を少なくとも１つ有する連結ＤＮＡ断片が得られる。より具体的な説明は後述の具体例において行う。
【００５２】
「熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応」
本発明の第１の態様においては、(4)上記３’端突出二本鎖遺伝子断片及び連結用二本鎖ＤＮＡ断片を用いて、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応を少なくとも2回行うことで、上記連結ＤＮＡ断片を得ることを含む。図1には、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応を2回行う例を示す。熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応の詳細な条件については、後述する。この方法で製造される連結ＤＮＡ断片は、図1の最下段に示すように、前記一方の会合可能な領域(会合可能領域1)を「領域1」とし、他方の会合可能な領域(会合可能領域2)を「領域2」とすると、模式的に領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1-標的遺伝子-領域2-連結用ＤＮＡ領域-領域1で示される配列を少なくとも１つ有するＤＮＡ断片になる。
【００５３】
「第1の態様の実施態様」
本発明の第1の態様の１つの実施態様を、図2を参照して、さらに詳細に説明する。
図2に示す実施態様では、
(i)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能領域1は、末端側から配列Ｐ１およびＴ１を有し、他方の会合可能領域2が末端側から配列Ｐ２およびＴ２を有する。そして、配列Ｔ１および配列Ｔ２の少なくとも一方は標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列を有し、好ましくは配列Ｔ１および配列Ｔ２の両方ともが標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列を有する。さらに、３’端突出二本鎖遺伝子断片は、一方の鎖の配列Ｐ２の３’端に突出末端として１ヌクレオチド以上の配列ＮＮＮＮＮを有し、かつ、他方の鎖の前記配列Ｐ１の３’端に突出末端として１ヌクレオチド以上の配列ＮＮＮＮＮを有する。尚、ＮＮＮＮＮは、１ヌクレオチド以上の配列を意味するものであり、ヌクレオチドが5であることを意味するものではない。
【００５４】
(ii)前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の連結用ＤＮＡ領域が連結用ＤＮＡ領域として配列Ａおよび配列Ｂを含み、
(iii)前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の会合可能領域1vは、末端側から配列ＶＴ１およびＶＰ１を有し、他方の会合可能領域2vは末端側から配列ＶＴ２およびＶＰ２をを有し、配列ＶＰ１およびＶＴ１は、配列Ｐ１およびＴ１とそれぞれ相同的な塩基配列を有し、配列ＶＰ２およびＶＴ２は、配列Ｐ２およびＴ２とそれぞれ相同的な塩基配列を有する。
【００５５】
さらに、上記具体的態様では、
３’端突出二本鎖遺伝子断片は、Ｐ１−Ｔ１−標的遺伝子−Ｔ２−Ｐ２で表される(但し、ここでは、３’端突出末端は表示されていない。３’端突出末端をＮＮＮＮＮと表記すると、ＮＮＮＮＮ−Ｐ１−Ｔ１−標的遺伝子−Ｔ２−Ｐ２−ＮＮＮＮＮと示すことができる)。また、連結用二本鎖ＤＮＡ断片は、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１で表される。そして、連結ＤＮＡ断片は、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１−標的遺伝子−ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１で表される配列を少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である。但し、ＶＴ２−ＶＰ２とＴ２−Ｐ２とは、相同的な配列であり、ＶＰ１−ＶＴ１とＰ１−Ｔ１は、相同的な配列であることから、連結ＤＮＡ断片は、Ｔ２−Ｐ２−配列Ｂ−配列Ａ−Ｐ１−Ｔ１−標的遺伝子−Ｔ２−Ｐ２−配列Ｂ−配列Ａ−Ｐ１−Ｔ１で表される配列を少なくとも１つ有するＤＮＡ断片である、とも言える。
【００５６】
＜実施態様における３’端突出二本鎖遺伝子断片＞
３’端突出二本鎖遺伝子断片についてさらに詳細に説明する。
配列Ｐ１およびＰ２は、プライミングされるべきプライマーに特異的にハイブリダイズされる配列および長さであれば特に制限はなく、長さについては、たとえば、１０塩基以上であり、好ましくは１０〜１００塩基であり、より好ましくは１５〜５０塩基であり、さらに好ましくは１５〜３０塩基である。領域Ｐ１およびＰ２の一方または両方は、標的遺伝子に固有の塩基配列を有してもよい。また、領域Ｐ１およびＰ２の一方または両方のすべての配列が、標的遺伝子の配列の一部の配列であってもよい。なお、後述するように、領域Ｐ１およびＰ２は、それぞれ、連結用二本鎖ＤＮＡ断片の領域ＶＰ１およびＶＰ２と相同的な塩基配列からなる。
【００５７】
３’端突出二本鎖遺伝子断片は、配列Ｐ１の内側に配列Ｔ１を有し、配列Ｐ２の内側に配列Ｔ２を有する。これら配列Ｔ１およびＴ２の一方又は両方は、標的遺伝子に固有の塩基配列を有する。配列Ｐ１と配列Ｔ１との間、配列Ｐ２と配列Ｔ２との間、配列Ｔ２が標的遺伝子に固有の配列を有する場合における配列Ｔ１と標的遺伝子の配列との間、配列Ｔ１が標的遺伝子に固有の配列を有する場合における配列Ｔ２と標的遺伝子の配列との間には、熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応において、３’端突出二本鎖遺伝子断片の各鎖とＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１の各鎖との二本鎖形成を妨げない範囲において、スペーサー配列などの配列を有してもよい。配列Ｔ１およびＴ２の詳細は、後述する。
【００５８】
３’端突出二本鎖遺伝子断片の３’突出末端は、例えば、配列Ｐ１及び配列Ｐ２のそれぞれの３’末端に設けられた連結用二本鎖ＤＮＡ断片の配列とは異なる少なくとも１個以上のヌクレオチドからなる配列である。この３’突出末端は、上述した通り、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１との熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応において、３’端突出二本鎖遺伝子断片の各鎖の両３’末端を基点とした核酸伸長を防止するために設けられている。
したがって、３’端突出二本鎖遺伝子断片のアンチセンス鎖と表示した鎖の３’末端に設けられたヌクレオチドまたはヌクレオチド鎖ＮＮＮＮＮは、連結用二本鎖ＤＮＡ断片ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１のセンス鎖と表示した鎖の配列ＶＰ１の５’側(配列Ａ側)の配列と、非相補的なヌクレオチドまたは少なくとも１部が非相補的な配列のヌクレオチド鎖であれば特に制限はなく、長さについては、たとえば、１塩基以上であり、好ましくは２〜１００塩基であり、より好ましくは５〜５０塩基である。
同様に、３’端突出二本鎖遺伝子断片のセンス鎖と表示した鎖の３’末端に設けられたヌクレオチドまたはヌクレオチド鎖ＮＮＮＮＮは、連結用二本鎖ＤＮＡ断片ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１のアンチセンス鎖の領域ＶＰ２の５’側(配列Ｂ側)に連結された配列と、非相補的なヌクレオチドまたは少なくとも１部が非相補的な配列のヌクレオチド鎖であれば特に制限はなく、長さについては、たとえば、１塩基以上であり、好ましくは２〜１００塩基であり、より好ましくは５〜５０塩基である。
【００５９】
また配列Ｐ１（Ｐ２）の３’突出末端に設けられたヌクレオチドまたはヌクレオチド鎖の３’端のヌクレオチドが、ダイデオキシヌクレオチドのように、配列Ｐ１（Ｐ２）の３’端からのDNA伸長反応を阻止できる化合物であることもできる。この場合、配列Ｐ１の３’末端に設けられたヌクレオチドまたはヌクレオチド鎖ＮＮＮＮＮは、連結用二本鎖ＤＮＡ断片ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１のセンス鎖と表示した鎖の配列ＶＰ１の５’側(配列Ａ側)の配列と相補的なヌクレオチドであることもできる。同様に、配列Ｐ２の３’末端に設けられたヌクレオチドまたはヌクレオチド鎖ＮＮＮＮＮは、連結用二本鎖ＤＮＡ断片ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１のアンチセンス鎖と表示した鎖の配列ＶＰ２の５’側(配列Ａ側)の配列と相補的なヌクレオチドであることもできる。
【００６０】
３’端突出二本鎖遺伝子断片の製造方法は特に制限されないが、例えば、標的遺伝子を鋳型として用いるＰＣＲによって製造することができる。以下に、免疫グロブリン遺伝子の可変領域と定常領域の一部を有する二本鎖ＤＮＡ断片を標的遺伝子断片とする場合を例に、図１３に基づいて説明する。図１３に示すプライマー２の配列（の一部）が、３’突出末端を有する標的二本鎖ＤＮＡ断片の配列Ｔ１に相当し、プライマー４と３が３’突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片の配列Ｐ１とＰ２に相当する。また、プライマー３の上流側に連結する定常領域に由来する配列が、３’端突出二本鎖遺伝子断片の配列Ｔ２に相当する。
【００６１】
まず、磁気ビーズを用いて標的遺伝子をコードするｍＲＮＡを回収し、次いでリバーストランスクリプターゼを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次いで合成したｃＤＮＡの３’末端に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてポリｄＧを付加させる。次いで３’末端にポリｄＧを付加させた免疫グロブリンｃＤＮＡ（磁気ビーズ上に合成されたもの）を鋳型として、プライマー１（免疫グロブリン遺伝子定常領域）と２（ポリｄＧと会合してＤＮＡ合成を行うためのもの）を用いて、１回目のＰＣＲを行う。
【００６２】
１回目のＰＣＲ終了後、これを例えば、１００倍程度に希釈したものを、２回目のＰＣＲの鋳型として用いる。使用するプライマーは、４と３である。プライマー４は、３’末端側の配列が１回目のＰＣＲで使用したプライマー２の５’末端側とオーバーラップするように設計してあり、この領域にプライマー４を結合させる。プライマー３は定常領域に位置し、１回目のＰＣＲで使用したプライマー１の内側に位置するように設計したプライマーである。ただし、プライマー３は、プライマー１と一部がオーバーラップする配列を有していてもよいが、プライマー１とオーバーラップしない配列を有することもできる。１回目のＰＣＲで免疫グロブリンの定常領域を含むＤＮＡ断片が増幅されていれば、プライマー3と４を用いることで、さらに免疫グロブリンの定常領域を含むＤＮＡ断片、すなわち、免疫グロブリンの定常領域を標的遺伝子配列として含む二本鎖ＤＮＡ断片を増幅することができる。ＲＡＣＥ（ＲＡＰＩＤ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ｃＤＮＡ  ＥＮＤ）法と呼ばれるＰＣＲ法の一つである。なお、プライマー４＋２配列は、２回のＰＣＲで、プライマー２と４により合成された人工的な配列であって、鋳型の配列に特有（固有）の配列は有さない。
【００６３】
２回目のＰＣＲでは、プライマー４が特異的に、１回目のＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片の３'端領域に結合し（プライマー２の配列を有するため）、プライマー３がプライマー１のさらに内側の免疫グロブリン定常領域に結合する。その結果、特異的な増幅が行われる。この場合は必ず、ＰＣＲ産物の片側には４＋２の配列が存在することになる。しかし実際には、使用したプライマーがこれと類似した塩基配列を有する非標的遺伝子に結合した結果、非特異的なＰＣＲ産物が合成されてしまうこともある。例えば、プライマー４が非特異的に他のＤＮＡ断片に結合した場合には、合成されたＤＮＡ断片にはプライマー４の配列がその末端に存在するが、その内側にはプライマー２の配列、すなわち、配列Ｔ１は存在しない。
【００６４】
また、もしプライマー３がこれと類似した塩基配列を有する非標的遺伝子に結合し、ＤＮＡ増幅が行われた場合、このＤＮＡ断片には定常領域の配列、すなわち配列Ｔ２が存在しない。プライマー３によって形成される配列は、鋳型の配列に特有（固有）の配列である。
【００６５】
上記２回目のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物、すなわち、標的遺伝子（抗体遺伝子）の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片の３’突出末端に少なくとも１個のヌクレオチドを設ける方法は特に制限されないが、例えば、該標的遺伝子の配列を含む二本鎖ＤＮＡ断片およびポリデオキシヌクレオチドに、デオキシヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼを作用させて、３’突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片を得ることを含む方法を挙げることができる。この方法によって、両３’末端に少なくとも１個のヌクレオチドを設けて３’端突出二本鎖遺伝子断片を得ることができる。
【００６６】
＜実施態様における連結用二本鎖ＤＮＡ断片＞
「連結用二本鎖ＤＮＡ断片」（ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１）は、任意の配列Ａおよび配列Ｂを有し、前記配列Ａの末端側に前記配列Ｐ１に相同的な塩基配列からなる領域ＶＰ１を有し、前記配列Ｂの末端側に前記配列Ｐ２に相同的な塩基配列からなる領域ＶＰ２を有し、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片における配列Ｐ１の内側の一部の配列Ｔ１に相同的な塩基配列からなる領域ＶＴ１を前記領域ＶＰ１の末端側に有し、かつ、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片における配列Ｐ２の内側の一部の配列Ｔ２に相同的な塩基配列からなる領域ＶＴ２を前記領域ＶＰ２の末端側に有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片である。但し、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片における配列Ｔ１および配列Ｔ２の少なくとも一方は標的遺伝子に固有の塩基配列を有し、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片における配列Ｐ２の３’端にある突出末端の配列がダイデオキシヌクレオチドを含む配列または前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の鎖の配列Ｂと非相同的な配列であり、かつ、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片における配列Ｐ１の３’端にある突出末端の配列がダイデオキシヌクレオチドを含む配列または前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の鎖の配列Ａと非相同的な配列である。なお、本明細書でいう「領域」は、該当する箇所のセンス鎖の配列とアンチセンス鎖の配列からなる。
【００６７】
図２〜３に示すスキームからわかるとおり、３’端突出二本鎖遺伝子断片の配列Ｔ１およびＴ２は、「連結用二本鎖ＤＮＡ断片」であるＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１のＶＴ１およびＶＴ２に対して内部配列の役目を果たし、標的遺伝子の配列を含む３’端突出二本鎖遺伝子断片とＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１との選択的な再会合とそれに引き続くＤＮＡ合成反応の進行を促進する。ここで、「内部配列」とは、標的遺伝子配列に特有の配列であり、標的遺伝子配列の末端に位置する増幅用プライマー配列と相同的な配列を有するＰ１およびＰ２の内側の配列(Ｔ１およびＴ２)を指し、連結用二本鎖ＤＮＡ断片のＶＴ１およびＶＴ２と相同的な配列を有する。よって非標的遺伝子断片は模式的に、Ｐ１−非標的遺伝子断片−Ｐ２またはＰ１−Ｔ１−非標的遺伝子断片−Ｐ２又はＰ１−非標的遺伝子断片−Ｔ２−Ｐ２で表される。「内部配列の役目」とは、連結用二本鎖ＤＮＡ断片と標的二本鎖遺伝子断片との特異的な再会合とそれに引き続くＤＮＡ合成反応の進行を促進し、且つ非標的二本鎖遺伝子断片との再会合とそれに引き続くＤＮＡ合成反応の進行を阻害する役割を有する配列である。
【００６８】
３’端突出二本鎖遺伝子断片の配列Ｔ１とＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１の領域ＶＴ１、ならびに、３’端突出二本鎖遺伝子断片の配列Ｔ２とＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１の領域ＶＴ２は、それぞれ、互いに相同的な塩基配列からなるものであれば特に制限はない。ＶＴ１およびＶＴ２の長さは、それぞれ、例えば、１塩基以上であり、好ましくは２〜１００塩基であり、より好ましくは５〜５０塩基である。配列Ｐ１＋Ｔ１、配列Ｐ２＋Ｔ２、領域ＶＰ１＋ＶＴ１および領域ＶＰ２＋ＶＴ２は、Ｔｍ値が６０℃以上であることが好ましく、約６８℃から７０℃であることがさらに好ましい。
【００６９】
ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１の配列Ａは特に制限されず、例えば標的遺伝子断片の上流配列や、イントロン、エクソン、蛍光タンパク質遺伝子、Hisタグ等の各種タグ配列や菌や動物細胞内で種々の遺伝子の発現を制御することができるプロモーター、エンハンサー配列等を挙げることができる。ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１の配列Ｂは特に制限されず、例えば標的遺伝子断片の下流配列や、イントロン、エクソン、蛍光タンパク質遺伝子、Hisタグ等の各種タグ配列やポリＡ付加配列等を挙げることができる。
【００７０】
配列Ａ及び配列Ｂにプロモーター配列、ポリＡ付加配列をそれぞれ用いる場合は、宿主細胞内での標的遺伝子の発現を妨げない範囲において、各配列の間、配列Ａの上流、配列Ｂの下流に、スペーサー配列などの配列があってもよい。
【００７１】
遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片における配列Aと配列Bとの間の長さは特に制限されない。また、配列Aと領域ＶＰ１との間、配列Bと領域ＶＰ２との間の長さは特に制限されない。領域ＶＰ１とＶＴ１との間、領域ＶＰ２とＶＴ２との間には、３’突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片とのアニーリングを妨げない範囲において適当な長さのスペーサー配列などの配列があってもよい。
【００７２】
「連結用二本鎖ＤＮＡ断片」であるＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１の製造方法は、特に制限されず、公知の方法を組み合わせて製造することができる。以下に、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１の製造方法の一例を、図１４に基づいて具体的に説明する。
【００７３】
制限酵素１（ＢａｍＨＩ）および制限酵素２（ＮｏｔＩ）によって認識される部位を有するベクター（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）を、制限酵素１で処理して、制限酵素１認識部位に既知配列（ポリｄＧ／ｄＣ）および制限酵素３（ＥｃｏＲＶ）によって認識される部位をこの順に含むリンカー（ポリｄＧ／ｄＣ−ＥｃｏＲＶリンカー）を挿入する。次いで得られたリンカー挿入ベクターを、制限酵素２および３で処理し、制限酵素３認識部位から制限酵素２認識部位までの配列を、上流に制限酵素３切断面を有し、かつ下流に制限酵素２切断面を有する標的遺伝子の一部の配列（ヒト末梢血リンパ球ｃＤＮＡからＰＣＲにより得られたヒト免疫グロブリン定常領域）で置換する。得られたベクターの制限酵素３部位にアンピシリン耐性遺伝子並びに複製開始点を挿入する。次にカナマイシン耐性遺伝子−複製開始点を本ベクターから除くことによりヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片が挿入されたベクター(pMiniCMV-hIgG)が獲られる。本ベクターを鋳型として、ポリｄＧ／ｄＣ領域並びに標的遺伝子の一部の配列（免疫グロブリン定常領域）を含むプライマーを用いるPCRを行うことにより、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片であるＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１が得られる。
【００７４】
この場合、ポリｄＧ／ｄＣが領域ＶＴ１に相当し、かつヒト免疫グロブリン定常領域の一部が領域ＶＴ２に相当し、配列ＡがＣＭＶプロモーターに相当し、配列Ｂが免疫グロブリン定常領域の残りの部分とポリＡ付加配列に相当する。また、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）とポリｄＧ／ｄＣとの間の配列の少なくとも一部が領域ＶＰ１に相当し、かつヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部の配列が領域ＶＰ２に相当することになる。
【００７５】
（１）熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応(１)
１サイクル目の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応について説明する。図2では、熱変性・再会合・ＤＮＡ合成(１)と表示する。
【００７６】
Ｐ１−Ｔ１−標的遺伝子−Ｔ２−Ｐ２で示される「３’端突出二本鎖遺伝子断片」およびＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１で示される「連結用二本鎖ＤＮＡ断片」を含む試料を、熱変性、再会合およびＤＮＡ合成反応に供すると、まず、熱変性後の再会合(アニーリング)により「３’端突出二本鎖遺伝子断片」の一方の鎖（アンチセンス鎖）の領域Ｐ１＋Ｔ１と「連結用二本鎖ＤＮＡ断片」の一方の鎖（センス鎖）の領域ＶＰ１＋ＶＴ１との間で安定した二本鎖形成が起こる。同様に、「３’端突出二本鎖遺伝子断片」のセンス鎖の領域Ｐ２＋Ｔ２と、「連結用二本鎖ＤＮＡ断片」のアンチセンス鎖の領域ＶＰ２＋ＶＴ２との間で安定した二本鎖形成が起こる。このようにして得られた2種類の二本鎖は、次いでＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応に供される。このＤＮＡ合成反応(核酸伸長反応)によって、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１のセンス鎖の領域ＶＴ１を起点として核酸が伸長して核酸伸長物（２）が合成され、また、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１のアンチセンス鎖の領域ＶＴ２を起点として核酸が伸長して核酸伸長物（１）が合成される。
【００７７】
ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１は、３’端突出二本鎖遺伝子断片に固有の配列である内部配列Ｔ１及び／又はＴ２と相同的な塩基配列からなる領域ＶＴ１及び／又はＶＴ２を有することにより、３’突出末端を有するＤＮＡ断片との選択的な再会合とそれに引き続くＤＮＡ合成反応を進行させることができる。但し、３’端突出二本鎖遺伝子断片を用意する場合に、図１３に示すプライマー４が非特異的に非標的遺伝子の配列を含むＤＮＡ断片に結合した結果として配列Ｐ１の内側に配列Ｔ１が存在しない二本鎖ＤＮＡ断片が生じ、また、プライマー３がこれと類似した塩基配列を有する非標的遺伝子に結合した結果として配列Ｐ２の内側に配列Ｔ２が存在しない二本鎖ＤＮＡ断片が生じる。ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１と配列Ｐ１の内側に配列Ｔ１が存在せず配列Ｐ２の内側に配列Ｔ２が存在しない二本鎖ＤＮＡ断片とを熱変性−再会合した後のＤＮＡ合成反応に供した場合、図３に示すとおりに反応が進行せず連結産物を得ることができない。
【００７８】
さらに、「３’端突出二本鎖遺伝子断片」には領域Ｐ１およびＰ２の両３’端に、ＮＮＮＮＮで表記される３’端突出末端があり、かつこの突出末端(一本鎖ヌクレオチド)は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない。即ち、図2の左側の核酸伸長物（１）を与えるスキームでは、３’端突出二本鎖遺伝子断片のセンス鎖のＴ２−Ｐ２に続くＮＮＮＮＮは、会合した相手側の鎖（連結用二本鎖ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖）のＶＴ２−ＶＰ２に続く配列ＢのＶＰ２に隣接する配列またはＶＰ２と配列Ｂの間のＶＰ２に隣接する配列とは、ハイブリダイズしない。このように、Ｔ２−Ｐ２に続くＮＮＮＮＮは、ＶＴ２−ＶＰ２に続く配列ＢのＶＰ２に隣接する配列とハイブリダイズしないので、領域Ｐ１およびＰ２を起点とした核酸伸長はみられない。図2の右側の核酸伸長物（２）を与えるスキームにおいても同様に、３’端突出二本鎖遺伝子断片のアンチセンス鎖のＴ１−Ｐ１に続くＮＮＮＮＮは、連結用二本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖のＶＴ１−ＶＰ１に続く配列ＡのＶＰ１に隣接する配列またはＶＰ１と配列Ａの間のＶＰ１に隣接する配列とハイブリダイズしないので、領域Ｐ１およびＰ２を起点とした核酸伸長はみられない。
【００７９】
１サイクル目の熱変性の条件は、通常のＰＣＲで採用されている条件と同一で良く、例えば、熱変性を９０〜９８℃で２０〜６０秒であることができる。１サイクル目の再会合の条件は、通常のＰＣＲで採用されている条件と同一で良く、例えば、６０〜７２℃で30秒〜６分であることができる。１サイクル目のＤＮＡ合成反応は、通常のＰＣＲで採用されている条件と同一で良く、例えば、６８〜７２℃で30秒〜６分であることができる。使用するＤＮＡポリメラーゼの酵素活性の至適温度によっては、アニーリングと核酸伸長を同一温度で行い、一つの工程として実施してもよい。
【００８０】
１サイクル目の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応によって、核酸伸長物（１）および（２）を含有する反応生成物が得られる。この反応生成物には、図２には示していないが、図３で示した、非標的遺伝子を含む断片が含まれる可能性がある。
【００８１】
（２）熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応（２）
２サイクル目の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応について説明する。図2では、熱変性・再会合・ＤＮＡ合成(２)と表示する。
【００８２】
１サイクル目の反応生成物を熱変性し、次いで再会合（アニーリング）することによって、上記核酸伸長物（１）および（２）の一方の鎖は、「３’端突出二本鎖遺伝子断片」の３’端突出配列であるＮＮＮＮＮは有さず、かつ「３’端突出二本鎖遺伝子断片」のＮＮＮＮＮ以外の配列が相同的であることから、この部分で二本鎖が形成される。次いでこの二本鎖においてＤＮＡ合成反応によって、互いの鎖を鋳型にして、両鎖の３’末端から核酸が伸長し、標的遺伝子の両端のそれぞれに連結用二本鎖ＤＮＡ断片が連結した連結ＤＮＡ断片（ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂ−配列Ａ−Ｖ+Ｐ１−ＶＴ１）が得られる。一方、３’端突出配列であるＮＮＮＮＮを有する核酸伸長物（１）および（２）からの一本鎖ＤＮＡ断片は、３’端にＮＮＮＮＮを有するために、再会合（アニーリング）において二本鎖を形成できず、結果として、この一本鎖ＤＮＡ断片を鋳型とする核酸伸長物は、生じない。
【００８３】
２サイクル目の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応によって、上記連結ＤＮＡ断片（ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂ−配列Ａ−Ｖ+Ｐ１−ＶＴ１）が得られるが、この反応生成物には、図示していないが、１サイクル目の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応で生じた非特異的なＤＮＡ断片に加えて、核酸伸長物（１）および（２）の鋳型として使用されなかった３’端突出配列であるＮＮＮＮＮを有する一本鎖ＤＮＡ断片が含まれる（残存する）ことになる。
【００８４】
尚、後述するが、上記連結ＤＮＡ断片（ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂ−配列Ａ−Ｖ+Ｐ１−ＶＴ１）における、配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂが連結単位である。
【００８５】
（３）熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応（３）
図２には示されていないが、本発明の第１の態様においては、２サイクル目の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応につづいて、３サイクル目以降の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応を実施することもできる。
【００８６】
３サイクル目の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応では、２サイクル目の核酸合成産物であるＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１の熱変性により生じた一本鎖のいずれか2本が、相同的な領域でハイブリダイズし、このハイブリダイズした二本鎖を鋳型として、ＤＮＡ合成反応による核酸伸長が生じれば、２サイクル目の核酸合成産物中の「配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂ」からなる連結単位を二個含む二本鎖ＤＮＡ断片が得られる。
【００８７】
４サイクル目以降ではこの操作が繰り返されることにより、上記連結単位を3個以上含む連結単位の重合体(以下、連結単位重合体と呼ぶことがある)が得られる。従って３サイクル目以降の連結反応において連結用二本鎖ＤＮＡ断片または標的遺伝子断片或いは両者が枯渇した場合であっても、ＤＮＡ合成用の基質が反応液中に存在し、ＤＮＡポリメラーゼの活性が維持される限り、連結単位の増幅が行われる。即ち、3サイクル目以降では、標的遺伝子と連結用ＤＮＡ断片が残存する場合には1サイクル目と２サイクル目に相当する反応が起こると共に、重合反応も同時に進行する。しかし標的遺伝子と連結用ＤＮＡ断片が残存しない場合は、重合産物同士の繰り返しユニットがずれながら再会合することで連結単位の増幅が行われる。その結果、後述する、標的遺伝子断片、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１ならびにＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂを用いた、配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂがこの順に結合した連結単位の製造方法に比べ、より効率よい連結単位の製造が可能となる。
【００８８】
尚、熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応の系に、「３’端突出二本鎖遺伝子断片」および連結用二本鎖ＤＮＡ断片（ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１）の他に、後述するような連結単位重合体から連結単位を特異的に増幅するためのミスマッチプライマーを含めておくこともできる。その場合には、これらのミスマッチプライマーが、熱変性によって一本鎖になった連結用二本鎖ＤＮＡ断片の各一本鎖にプライミングしないように、再会合（アニーリング）は高温下（例えば、６５〜７２℃）で実施することが好ましい。さらに、反応系にミスマッチプライマーを含み、アニーリングと核酸伸長を同一温度で実施することもでき、その場合の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応は、例えば、熱変性を９０〜９８℃で２０〜６０秒、再会合およびＤＮＡ合成反応を６５〜７２℃で30秒〜６分で実施することができ、このサイクルを２〜１０サイクルとすることができる。好ましくは熱変性を９３〜９５℃で３０〜５０秒、再会合およびＤＮＡ合成反応を６８〜７０℃で１〜５分で実施することができ、このサイクルを４〜８サイクルである。ここでのサイクルは、１サイクル目の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応のサイクル数を意味する。
【００８９】
このような反応により得られた連結ＤＮＡ断片は、配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂから成る連結単位が、熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応のサイクル数に応じて、該連結単位の複数個を直鎖状に連結して含む重合体である。該重合体は、上記連結単位の他に、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１やＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂを末端に含む。
【００９０】
「連結単位の調製工程」
本発明の第１の態様において核酸合成産物として得られた連結ＤＮＡ断片は、熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応のサイクル数により、上記連結単位を１つ含むものである。熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応のサイクル数が３回以上であれば、複数の連結単位が連なる連結単位重合体が得られる。本発明の最終的な目的は、配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂで表される連結単位を得ることである。そこで、本発明の第１の態様は、連結単位重合体から、配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂから成る連結単位を調製する工程をさらに有することが好ましい。
【００９１】
連結単位を調製する工程には、特に制限はないが、たとえば、連結単位重合体に対して、連結単位の上流および下流を特異的に切断する制限酵素を使う方法や、連結単位重合体を鋳型として、連結単位を選択的に増幅する方法などを用いることができる。制限酵素を使う方法では、連結単位重合体中の配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂの配列Ａの外側と配列Ｂの外側の配列に制限酵素切断配列を導入することで実施できる。
【００９２】
連結単位重合体を鋳型として連結単位を選択的に増幅する方法は、たとえば、連結用二本鎖ＤＮＡ断片（ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１）のセンス鎖の配列Ａ又はその上流の配列と同一の配列を３’側に含むミスマッチフォワードプライマーおよび配列Ｂ又はその下流の配列と相補的な配列を３’側に含むミスマッチリバースプライマーを用いたＰＣＲにより実施できる。このミスマッチプライマーを用いて連結単位を選択的に増幅するためのＰＣＲのスキームを図４に示す。図４に示すとおり、ミスマッチプライマーを用いれば、連結単位重合体から分離された連結単位を選択的に効率よく増幅することができる。連結単位重合体を鋳型としミスマッチフォワードプライマーおよびミスマッチリバースプライマーを用いた最低２サイクルのPCR反応により合成される連結単位には、その両末端側に鋳型である連結用二本鎖ＤＮＡ断片と非相同的な配列が付加される。
【００９３】
ミスマッチプライマーを用いたＰＣＲの条件は特に制限されず、通常知られるＰＣＲ条件を適用できるが、たとえば、９０〜９８℃を２０〜６０秒、５５〜６５℃を２０〜６０秒、７０〜７４℃を３〜５分の反応を２５〜５０サイクル程度で実施することができる。
【００９４】
尚、ミスマッチ領域をその５’側に有さないプライマーを用いたＰＣＲのスキームを図５に示す。図５に示すように、用いるプライマーがミスマッチプライマーではない場合、連結単位と共に連結単位重合体も増幅されることとなり、連結単位のみを選択的に増幅することが難しい。すなわち、連結単位重合体を鋳型としフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いた最低２サイクルのＰＣＲ反応により合成される連結単位は、鋳型である連結単位重合体と相同的である。３回目以降のＰＣＲでは2つの様式の反応が並行して進む。一つは合成された連結単位にフォワードプライマーおよびリバースプライマーがアニーリングし、連結単位が増幅される反応である。他方は、連結単位が連結単位重合体にアニーリングした結果ヘテロ二本鎖ＤＮＡが形成され、連結単位重合体が増幅される反応である。後者の反応が前者の反応に比べ優位に進行した場合、連結単位を効率的に増幅することが困難となる。それに対して、図４に示した、ミスマッチプライマーを用いて連結単位重合体から合成された連結単位は、その両末端側に鋳型と非相同的配列を有するため、これが連結単位重合体にアニーリングしヘテロ二本鎖ＤＮＡが形成されてもＤＮＡ伸長反応が起こらず、その結果連結単位重合体が増幅されることはない。
【００９５】
［本発明の第２の態様］
本発明の第２の態様は、上記本発明の第1の態様における連結用二本鎖ＤＮＡ断片を、模式的に-連結用ＤＮＡ領域1-領域1及び領域2-連結用ＤＮＡ領域2でそれぞれ示される配列を有する2つの連結用二本鎖ＤＮＡ断片１および２に分けて用いる方法である。この方法によれば、非標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域1、他方の側に連結用ＤＮＡ領域2が連結した連結ＤＮＡ断片の非特異的な生成を抑制して、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域1、他方の側に連結用ＤＮＡ領域2を連結させた、目的とする連結ＤＮＡ断片を特異的に得ることができる。ここで得られる連結ＤＮＡ断片は、模式的に連結用ＤＮＡ領域1-領域1-標的遺伝子-領域2-連結用ＤＮＡ領域2で示される配列を有するものである。本発明の第２の態様において用いる「３’端突出二本鎖遺伝子断片」は、本発明の第1の態様におけるものと同様である。
【００９６】
本発明の第２の態様において用いる連結用二本鎖ＤＮＡ断片は、上記のように模式的に連結用ＤＮＡ領域1-領域1で示される連結用二本鎖ＤＮＡ断片１と領域2-連結用ＤＮＡ領域2で示される配列を有する2つの連結用二本鎖ＤＮＡ断片２である。以下、模式的に連結用ＤＮＡ領域1-領域1で示される配列が配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１であり、領域2-連結用ＤＮＡ領域2で示される配列がＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂである実施態様について、説明する。
【００９７】
この実施態様では、３’端突出二本鎖遺伝子断片、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１（連結用二本鎖ＤＮＡ断片１）、及びＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ（連結用二本鎖ＤＮＡ断片２）を、少なくとも２サイクルの熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応に供し、核酸合成産物として、配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂからなる連結単位を一つ有する連結ＤＮＡ断片を得る。
【００９８】
上記方法を図６のスキームにより説明する。なお、３’端突出二本鎖遺伝子断片および少なくとも2回の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応については、上記本発明の第１の態様の実施態様において説明したことと同様である。
【００９９】
配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１は、任意の配列A、領域ＶＰ１および領域ＶＴ１をこの順に有し、領域ＶＴ１が一方の末端にあり、領域ＶＰ１及び領域ＶＴ１は、それぞれ、３’端突出二本鎖遺伝子断片の配列Ｐ１に相同的な塩基配列及び配列Ｔ１に相同的な塩基配列からなる。ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂは、領域ＶＴ２、領域ＶＰ２および任意の配列Bをこの順に有し、領域ＶＴ２が一方の末端にあり、領域ＶＰ２及び領域ＶＴ２は、それぞれ、３’端突出二本鎖遺伝子断片の配列Ｐ２に相同的な塩基配列及び配列Ｔ２に相同的な塩基配列からなる。
【０１００】
＜配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１＞
配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１は、任意の配列A、領域ＶＰ１および領域ＶＴ１をこの順に有する。ただし、領域ＶＴ１は連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端に配置されている。配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１における、配列Ａ、領域ＶＰ１およびＶＴ１については、上記第１の態様の実施態様の記載を参照できる。配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１には、配列Aの上流、配列Aと領域ＶＰ１との間、領域ＶＰ１とＶＴ１との間に、熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応に供した場合に３’突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片とのアニーリングを妨げない範囲においてスペーサー配列などの配列があってもよい。配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１は、特に制限されないが、たとえば、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１をインサートとして含有するプラスミドから制限酵素処理により、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１を分離することにより得られる。また、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１は、遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片Ａをインサートとして含有するプラスミドを鋳型にして、配列Ａの上流の配列と同じ配列の一部を含むフォワードプライマーと領域ＶＴ１の一方の末端側の配列と相補的な配列の一部を含むリバースプライマーを用いたＰＣＲに供することにより得ることもできる。
【０１０１】
＜ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ＞
ＶＴ２−ＶＰ２−Ｂは、配列Ｂ、領域ＶＰ２および領域ＶＴ２をこの順に有する。ただし、領域ＶＴ２はＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂの一方の末端に配置されている。ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂにおける、配列Ｂ、領域ＶＰ２およびＶＴ２については、上記第１の態様の実施態様の記載を参照できる。ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂには、配列Ｂの上流、配列Ｂと領域ＶＰ２との間、領域ＶＰ２とＶＴ２との間に、熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応に供した場合に３’突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片とのアニーリングを妨げない範囲においてスペーサー配列などの配列があってもよい。ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂは、特に制限されないが、たとえば、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂをインサートとして含有するプラスミドから制限酵素処理により、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂを分離することにより得られる。また、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂは、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂをインサートとして含有するプラスミドを鋳型にして、配列Ａの上流の配列と同じ配列の一部を含むフォワードプライマーと領域ＶＴ２の一方の末端側の配列と相補的な配列の一部を含むリバースプライマーを用いたＰＣＲに供することにより得ることもできる。
【０１０２】
（１）熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応（１）
１サイクル目の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応では、３’端突出二本鎖遺伝子断片、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１、及びＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂを用いて熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応を行う。熱変性後のアニーリングにより３’端突出二本鎖遺伝子断片のアンチセンス鎖の配列Ｐ１＋Ｔ１と、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１の一方の鎖（センス鎖）の領域ＶＰ１＋ＶＴ１との間で安定した二本鎖形成が起こる。同様に、３’端突出二本鎖遺伝子断片のセンス鎖の配列Ｐ２＋Ｔ２と、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂの一方の鎖（アンチセンス鎖）の領域ＶＰ２＋ＶＴ２との間で安定した二本鎖形成が起こる。その後のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応によって、配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１の領域ＶＴ１を起点として核酸が伸長した核酸伸長物（４）が合成される。また、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂの領域ＶＴ２を起点として核酸が伸長した核酸伸長物（３）が合成される。一方、３’端突出二本鎖遺伝子断片には配列Ｐ１およびＰ２の３’端に少なくとも１個のヌクレオチドが付加されているため、配列Ｐ１およびＰ２を起点として核酸は伸長しないのは上記した通りである。
【０１０３】
（２）熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応（２）
２サイクル目の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応では、熱変性後のアニーリングによって、上記核酸伸長物（３）および（４）の間で二本鎖が形成されると、続くＤＮＡ合成反応によって、互いを鋳型にして、両方の３’末端から核酸が伸長し、配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂがこの順に結合された連結単位を1個含む連結ＤＮＡ断片が核酸合成産物として得られる。
【０１０４】
（３）熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応（３サイクル目以降）
図６のスキームには示されていないが、熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応を３サイクル目以降も実施することができ、３サイクル目以降の熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応を実施することで、配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂがこの順に結合された連結単位を1個含む連結ＤＮＡ断片が核酸合成産物として得られる。本発明の第２の態様では、本発明の第１の態様におけるように、連結用二本鎖ＤＮＡ断片として、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂ−配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１のような配列Ｂと配列Ａが連結した配列の断片を用いないので、配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂがこの順に結合された連結単位を複数含む連結単位重合体が合成されることはない。
【０１０５】
＜配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂからなる連結単位＞
本発明の第２の態様においても、本発明の第１の態様と同様に、核酸合成産物として得た連結ＤＮＡ断片から、配列Ａ−標的遺伝子−配列Ｂから成る連結単位を調製する工程を設けることが好ましい。このような連結単位を調製する工程は、特に制限されないが、たとえば、配列Ａ及びＢの上流および下流を特異的に認識する制限酵素を使う方法や、連結単位を選択的に増幅する方法などにより実施できる。
【０１０６】
連結ＤＮＡ断片から上記方法により分離された連結単位を、発現ユニットとして宿主細胞に導入し標的遺伝子がコードする蛋白質を宿主細胞内で選択的に発現させる場合、配列Ａにプロモーター配列、配列ＢにポリＡ付加配列を用いることができる。発現ユニットを作成する場合は、宿主細胞内での標的遺伝子の発現を妨げない範囲において、各配列の間、配列Ａの上流、配列Ｂの下流に、スペーサー配列などの配列があってもよい。
【０１０７】
［本発明の第３の態様］
本発明の第３の態様は、上記本発明の第2の態様における、2つに分けたいずれか一方の連結用二本鎖ＤＮＡ断片、模式的に領域1-連結用ＤＮＡ領域1または連結用ＤＮＡ領域2-領域2で示される配列を用いる方法である。この方法では、非標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域1または2を連結させた片側連結ＤＮＡ断片の非特異的な生成を抑制して、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域1または2を連結させた、目的とする片側連結ＤＮＡ断片を特異的に得ることができる。本発明の第３の態様において用いる「３’端突出二本鎖遺伝子断片」は、本発明の第1の態様におけるものと同様の標的遺伝子配列の両方の末端側に会合可能な領域と突出末端を有するものであることもできるが、標的遺伝子配列の一方の末端側のみに会合可能な領域を有し、かつ前記領域は少なくとも一部の塩基配列が標的遺伝子配列に含まれる固有の塩基配列であり、前記会合可能な領域の３’端に１ヌクレオチド以上の突出末端を有する３’端突出二本鎖遺伝子断片であることもできる。本発明の第３の態様では、３’端突出二本鎖遺伝子断片が有する一方の末端側の会合可能領域と突出末端とのみを利用するので，後者の３’端突出二本鎖遺伝子断片を用いる事か好ましい。
【０１０８】
本発明の第３の態様において用いる連結用二本鎖ＤＮＡ断片は、上記のように模式的に領域1-連結用ＤＮＡ領域1で示される配列または連結用ＤＮＡ領域2-領域2で示される配列を有する2つの断片である。以下、模式的に領域1-連結用ＤＮＡ領域1で示される配列が配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１である実施態様について説明する。連結用ＤＮＡ領域2-領域2で示される配列がＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂである実施態様は、模式的に領域1-連結用ＤＮＡ領域1で示される配列が配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１である実施態様と同様に、実施できる。
【０１０９】
本発明の第３の態様の上記実施態様では、配列Ａを有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片（配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１）を標的遺伝子断片の一方の末端側に選択的に連結させる方法が提供される。この方法は、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片（ただし、３’突出末端は一方の鎖の前記配列Ｐ１の３’末端側にあればよい）と、前記配列Ａを有するＤＮＡ断片とを用い、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片および前記配列Ａを有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片の混合物を、熱変性と再会合の後、核酸合成反応に供する。この操作により、一方の鎖の前記配列Ｐ１の３’端に突出末端として１ヌクレオチド以上の配列を有し、その鎖の５’端に配列Ｐ２に由来する配列を有する一本鎖ＤＮＡと（二本鎖ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖）、他方の鎖の５’端側に前記配列Ａに由来する配列ならびにその３’端に配列ＶＴ１に由来する配列を有する一本鎖ＤＮＡ（連結用二本鎖ＤＮＡのセンス鎖）とが会合したヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物を得る。次いで、このヘテロ二本鎖ＤＮＡ産物を鋳型として、二本鎖遺伝子断片のアンチセンス鎖の５’末端側の配列を有するリバースプライマーと連結用二本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖の５’末端側の配列を有するフォワードプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を行う。これにより、配列Ａおよび標的遺伝子の配列が連結された二本鎖ＤＮＡ断片（片側連結ＤＮＡ断片）を得る（図７のスキームを参照）。
【０１１０】
熱変性・再会合・ＤＮＡ合成反応については、上記本発明の第１の態様の実施態様において説明したことと同様である。配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１は、上記本発明の第２の態様の実施態様において説明したことと同様である。
【０１１１】
連結用ＤＮＡ領域2-領域2で示される配列がＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂである実施態様は、模式的に領域1-連結用ＤＮＡ領域1で示される配列が配列Ａ−ＶＰ１−ＶＴ１である実施態様と同様に、実施できる。また、ＶＴ２−ＶＰ２−配列Ｂは、上記本発明の第２の態様の実施態様において説明したことと同様である。
【０１１２】
本発明の連結ＤＮＡ断片の製造方法においては、前述のように、前記標的遺伝子が抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子であり、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片が前記抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来する配列を含み、ならびに、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片または前記配列Ａを有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片における前記領域ＶＰ１および領域ＶＴ１は、抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来するまたは由来しない配列を有することかできる。さらに、記標的遺伝子が抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子であり、前記３’端突出二本鎖遺伝子断片が前記抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来する配列を含み、ならびに、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片または前記配列Ｂを有する連結用二本鎖ＤＮＡ断片における前記領域ＶＰ２および領域ＶＴ２は、抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子に由来するまたは由来しない配列であることができる。本発明では、このような標的遺伝子を用いて製造された連結ＤＮＡ断片を用いて抗体またはＴ細胞受容体を製造する方法も包含する。
【０１１３】
標的遺伝子が抗体遺伝子またはＴ細胞受容体遺伝子である連結ＤＮＡ断片を用いて抗体またはＴ細胞受容体を製造する方法は、常法、例えば、標的遺伝子を含む連結ＤＮＡ断片を宿主細胞へ導入し、この宿主細胞を培養して抗体等を産生させることにより実施できる。
【０１１４】
前述のように本発明は、上記本発明の第1の態様〜第3の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片、連結用二本鎖ＤＮＡ断片及びこれらの組合体、さらにはこれらを含むキットを包含する。本発明の第1の態様〜第3の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片及び連結用二本鎖ＤＮＡ断片は前述の通りである。さらに、組合体は、第1の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片と連結用二本鎖ＤＮＡ断片との組合体、第2の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片と連結用二本鎖ＤＮＡ断片との組合体、及び第3の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片と連結用二本鎖ＤＮＡ断片との組合体からなる。
【０１１５】
第1の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片と連結用二本鎖ＤＮＡ断片との組合体においては、標的遺伝子の両方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた連結ＤＮＡ断片を良好に製造するという観点からは、
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の一方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の他方の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない、ことが好ましい。
【０１１６】
第2の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片と連結用二本鎖ＤＮＡ断片との組合体においては、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域１、他方の側に連結用ＤＮＡ領域２を連結させた連結ＤＮＡ断片を良好に製造するとの観点からは、
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片１の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さず、
(3-3)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の末端の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片２の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-4)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の他方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない、
ことが好ましい。
【０１１７】
第3の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片と連結用二本鎖ＤＮＡ断片との組合体においては、標的遺伝子の一方の側に連結用ＤＮＡ領域を連結させた片側連結ＤＮＡ断片を良好に製造するという観点からは、
(3-1)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域は、前記連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域と相同的な塩基配列からなるが、３’突出端が付加された末端側の配列が連結用二本鎖ＤＮＡ断片の会合可能な領域では連結用ＤＮＡ領域と結合する側であり、
(3-2)前記３’端突出二本鎖遺伝子断片の一方の会合可能な領域からの突出末端は、ＤＮＡ合成反応において鎖伸長機能を有さない、
ことが好ましい。
【０１１８】
本発明のキットは、上記本発明の第1の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片、連結用二本鎖ＤＮＡ断片またはこれらの組合体を含むものであるか、上記本発明の第2の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片、連結用二本鎖ＤＮＡ断片またはこれらの組合体を含むものであるか、または上記本発明の第3の態様で用いられる３’端突出二本鎖遺伝子断片、連結用二本鎖ＤＮＡ断片またはこれらの組合体を含むものである。本発明のキットに上記以外に、３’端突出二本鎖遺伝子断片並びに連結用二本鎖ＤＮＡ断片を用いて、熱変性、再会合及びＤＮＡ合成反応を行って、連結ＤＮＡ断片を得るために用いる緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡ合成用酵素または酵素含有緩衝液、及びキットの使用説明書を含むことができる。
【０１１９】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【０１２０】
［例１］
１．未精製標的遺伝子断片の発現ユニットへの特異的変換
標的遺伝子断片１（図１０を参照）は、ヒト免疫グロブリンγ鎖の可変領域と一部の定常領域を有する６８３ｂｐのＤＮＡ断片であり、その両端にＰＣＲ増幅のためのプライマーＡ：５’−ＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡ−３’並びにプライマーＢ：５’−ＡＧＣＣＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＴＧ−３’の配列を有する。また内部配列として、プライマーＡの内側にポリｄＣ配列、プライマーＢ配列の内側に免疫グロブリンγ鎖定常領域由来配列をそれぞれ有する。図１０において、増幅に用いたプライマーＡ、Ｂの位置を矢印で示した。【０１２１】
非標的遺伝子断片２（図１１を参照）は６２８ｂｐのＧＰＦ遺伝子に由来するＤＮＡ断片で、その両端にＰＣＲ増幅のために用いるプライマーＡ配列とプライマーＢ配列を有する。両プライマー配列の内側には内部配列は存在せず、ＧＦＰ遺伝子由来配列が存在する。【０１２２】
標的遺伝子断片１および非標的遺伝子断片２のそれぞれが挿入されたプラスミドｐＵＣ１１９を鋳型とし、プライマーＡ及びＢを用いてＰＣＲ反応を行い、標的遺伝子断片１および非標的遺伝子断片２をそれぞれ増幅した。ＰＣＲ反応は、５０μｌの反応系に、鋳型プラスミドＤＮＡ  ２ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  １０ｎｍｏｌを加え、タカラバイオのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い９４℃３０秒−６８℃４０秒の反応を３０サイクル行った。【０１２３】
２．ＰＣＲ産物の３’端ポリヌクレオチド付加反応
ＰＣＲ後の反応液をそれぞれ１μｌチューブに分注し、これにターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminaldeoxynucleotidyltransferase）を１０ｕｎｉｔ加え、３７℃にて３０分反応させ、その後９４℃にて５分間加熱することで酵素反応を停止させた。この反応により、ＤＮＡ断片の両３’端にポリヌクレオチドが付加された。陰性コントロールとして、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを加えない反応を標的遺伝子断片１および非標的遺伝子断片２のそれぞれについて同様に実施した。【０１２４】
３．ヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片の作成
ｐＭｉｎｉＣＭＶ−ｈＩｇＧは、ＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ポリｄＣ／ｄＧ配列、ｐＵＣ１１９複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子、ヒト免疫グロブリンγ鎖定常領域、ＳＶ４０ポリＡ付加シグナルを有する全長３５３３ｂｐのプラスミドである。【０１２５】
ｐＭｉｎｉＣＭＶ−ｈＩｇＧをＥｃｏＲＶで切断後、これを鋳型としてプライマーＣ  ５’−ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧ−３’及びプライマーＤ  ５’−ＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧ−３’を用いたＰＣＲ法にてヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖DNA断片の調製を行った。ＰＣＲ反応はタカラバイオのプライムスターＤＮＡポリメラーゼを用い、９４℃４０秒、６０℃４０秒、７２℃５分のサイクルを３０回行うことで増幅反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片はスピンカラム法により精製し、１０ｎｇ／μｌの濃度に調製した。ヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖DNA断片は、その一端に、５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法により増幅されたヒト免疫グロブリンγ鎖とのみと、特異的な相補鎖を形成する領域として、ヒト免疫グロブリンγ鎖定常領域由来の内部配列、その下流に遺伝子増幅に用いられたプライマーＢ配列と相補鎖を形成する配列を有する（図１２を参照）。【０１２６】
もう一方端にはterminaldeoxynucleotidyltransferase反応によりポリｄＣ配列が付加されたｃＤＮＡに由来する５’−ＲＡＣＥ増幅産物とのみと、特異的に相補鎖を形成する領域として、ポリｄＣ／ｄＧ配列、その上流には５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法に用いられたプライマーＡ配列と相補鎖を形成する配列が存在する（図１３を参照）。標的遺伝子断片１とは図１２中の網掛け部全体と相補鎖を形成することが可能であるが、非標的遺伝子断片２は図１２中の網掛け部のうちプライマーＢ並びにプライマーＡ相補鎖形成配列とのみ相補鎖を形成することが可能である。【０１２７】
４．ヒトγ鎖遺伝子発現ユニットの増幅
上記で調製した３’端ポリヌクレオチド付加ＤＮＡ断片１及び２に、ヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖DNA断片を１０ｎｇ、プライマーを１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰを１０ｎｍｏｌ加え、タカラバイオのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む２５μｌの反応液にて、９４℃を４０秒、７０℃を４分の反応を５サイクル、引き続き９４℃を４０秒、６０℃を４０秒、７２℃を４分の反応を３０サイクル行った。用いたプライマーのうち、プライマーＥ：５’−ＡＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧ−３’はその５’端にミスマッチ配列を有し、ヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖DNA断片のＣＭＶプロモーター上流付近にアニーリングする。プライマーＦ：５’−ＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧ−３’はその５’端にミスマッチ配列を有し、ヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖DNA断片のＳＶ４０ポリＡ付加配列下流付近にアニーリングする。【０１２８】
同様に陰性コントロールとして調製した３’端ポリヌクレオチド付加を行っていない標的遺伝子断片１及び非標的遺伝子断片２に、ヒトγ鎖遺伝子連結用DNA断片１０ｎｇ、プライマーＥ及びＦを１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰを１０ｎｍｏｌを加え、タカラバイオのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い２５μｌの反応液にて、９４℃を４０秒、７０℃を４分の反応を５サイクル、引き続き９４℃を４０秒、６０℃を４０秒、７２℃を４分の反応を３０サイクル行った。ＰＣＲ反応液よりそれぞれ２μｌをとり、アガロースゲル電気泳動法にて発現ユニットの増幅を確認した（図１を参照）。【０１２９】
その結果、３’端ポリヌクレオチド付加標的遺伝子断片１は特異的に発現ユニットに変換され、約２．５ｋｂのＰＣＲ産物の増幅が確認された。これに対し３’端ポリヌクレオチド付加非標的遺伝子断片２は発現ユニットに変換されなかった。また３’端ポリヌクレオチド付加反応を行わなかった標的遺伝子断片１は発現ユニットに変換されたが、非標的遺伝子断片２もヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖DNA断片に連結された。以上の結果より、標的遺伝子断片に対する内部配列を有する遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片と、３’端ポリヌクレオチド付加反応を行った遺伝子断片を用いることで、標的とするヒト免疫グロブリン可変領域と定常領域の一部を有するＤＮＡ断片を精製することなく発現ユニットに変換することが可能であることが判明した。【０１３０】
［例２］
５’端ミスマッチプライマーを用いた効率的な連結単位（発現ユニット）の増幅
［例１］の２で調製した３’端ポリヌクレオチド付加標的遺伝子ＤＮＡ断片１に、３で調製したヒトγ鎖遺伝子連結用DNA断片を加え９４℃を４０秒、７０℃を４分の反応を５サイクル行い、連結二本鎖ＤＮＡ重合体を合成した。これにプライマーＥ及びＦ、又はＧ及びＨを加え９４℃を４０秒、６０℃を４０秒、７２℃を４分の反応を３０サイクル行い発現ユニットの増幅を試みた。プライマーＧ：５’−ＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧ−３’及びプライマーＨ：５’−ＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧ−３’は、鋳型であるヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片に対し１００％の相同性を有する。【０１３１】
ＰＣＲの結果プライマーＧ及びＨを用いた場合では、目的とする発現ユニットの増幅の他に連結単位重合体の増幅が認められた（図２を参照）。これに対し５’端にミスマッチ配列を有するプライマーＥ及びＦを用いた場合では、効率的な発現ユニットの増幅が認められた。【０１３２】
［例３］
ヒト末梢血プラズマ細胞から増幅された未精製のヒトγ、κ鎖免疫グロブリン遺伝子断片と、ヒトγ及びκ鎖遺伝子連結用DNA断片を用い、ヒト免疫グロブリン発現ユニットを作成し、これを培養細胞に導入してヒト抗体を作成した。【０１３３】
１．５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法を用いたヒト免疫グロブリンγ及びκ鎖可変領域遺伝子断片の増幅
ヒトの末梢血より調整したプラズマ細胞を１個ずつ２つのチューブに単離し、これにオリゴｄＴ２５が結合した磁気ビーズ（ダイナピーズ）３μｇの入った細胞溶解液３μｌ（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），５００ｍＭ  ＬｉＣｌ，１％ドデシル硫酸  Ｌｉ（ＬｉＤＳ），５ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）に加え、細胞内のｍＲＮＡを磁気ビーズに結合させた。  次に磁気ビーズを、３μｌのｍＲＮＡ洗浄用溶Ａ（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１５Ｍ  ＬｉＣｌ，０．１％  ＬｉＤＳ）、続いて３μｌのｍＲＮＡ洗浄用溶液Ｂ（７５ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ，０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ，５ｍＭ  ＤＴＴ，２ｕｎｉｔ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）にて１回洗浄した後、ｃＤＮＡ合成を行った。洗浄後の磁気ビーズに、ｃＤＮＡ合成用溶液３μｌ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．３），７５ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ，５ｍＭ  ＤＴＴ，２  ｕｎｉｔ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｌ０ｕｎｉｔ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔｌｌｌ  Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、５０℃にて１時間反応させた。次に磁気ビーズを３’テーリング洗浄溶液３μｌ（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，４ｍＭ塩化マグネシウム）にて洗浄し、新たに３’テーリング反応溶液３μｌ（５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０），０．５ｍＭ  ｄＧＴＰ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，  ４ｍＭ塩化マグネシウム，ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １０Ｕ）を加え、３７℃にて３０分間反応を行った。【０１３４】
磁気ビーズを３μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて洗浄後、５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法を用いてヒト免疫グロブリンγ鎖及びκ鎖遺伝子の増幅を行った。１回目のＰＣＲ反応は、磁気ビーズに２５μｌのＰＣＲ反応溶液（プライマーＩ，Ｊ及びＫを各ｌ０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  １０ｎｍｏｌ、タカラバイオＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ  ｌＵ含有）を加え９４℃３０秒−６８℃４０秒の反応を３５サイクル行った。プライマーＩの配列は５’−ＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＤＮ−３’であり、ＴｄＴによりｃＤＮＡの３’端に付加されたポリＧにアニーリングする。プライマーＪの配列は５’−ＡＣＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧ−３’であり、ヒト免疫グロブリンγ鎖遺伝子の定常領域に由来する。プライマーＫの配列は５’−ＣＴＴＴＧＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＡＧＡＡＧＴＴ−３’であり、ヒト免疫グロブリンκ鎖遺伝子の定常領域に由来する。【０１３５】
反応後ＰＣＲ溶液に水２２５μｌを加え１０倍希釈した溶液１μｌを鋳型とし、プライマーＡ：とプライマーＢを用いて１回目のＰＣＲと同様の条件でヒト免疫グロブリンγ鎖遺伝子の可変領域の増幅反応を行った。同様にプライマーＡとプライマーＬ：５’−ＡＣＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＣＴＧＣ−３’を用いヒト免疫グロブリンκ鎖遺伝子の可変領域の増幅反応を行った。【０１３６】
その結果実験に用いた２個の形質細胞（細胞１及び細胞２）のそれぞれから約８００ｂｐのγ鎖の可変領域と一部の定常領域、並びに約６００ｂｐのκ鎖の可変領域と一部の定常領域の増幅が認められた（図１５を参照）。【０１３７】
２．ＰＣＲ産物の３’端ポリヌクレオチド付加反応
１．で調製した各ＰＣＲ産物１μｌに、terminaldeoxynucleotidyltransferaseを１０ｕｎｉｔ加え、３７℃にて３０分反応させ、その後９４℃にて５分間加熱することで酵素反応を停止させた。【０１３８】
３．ヒトγ鎖遺伝子及びκ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片の調製
ヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片は例１で調製したものを用いた。【０１３９】
ｐＭｉｎｉＣＭＶ−hＩｇＫは、ＣＭＶプロモーター、マルチクローニングサイト、ポリｄＣ／ｄＧ配列、ｐＵＣ１１９複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子、ヒト免疫グロブリンκ鎖定常領域、ＳＶ４０ポリＡ付加シグナルを有する全長２９７６ｂｐのプラスミドである。【０１４０】
ｐＭｉｎｉＣＭＶ−ｈＩｇＫをＥｃｏＲＶで切断後、これを鋳型としてプライマーＣ及びプライマーＭ：５’−ＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧ−３’を用いたＰＣＲ法にてヒトκ鎖遺伝子連結用ＤＮＡ断片（図１６を参照）の調製を行った。ＰＣＲ反応はタカラバイオのプライムスターＤＮＡポリメラーゼを用い、９４℃４０秒、  ６０℃４０秒、７２℃５分のサイクルを３０回行うことで増幅反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片はスピンカラム法により精製し、１０ｎｇ／μｌの濃度に調製した。【０１４１】
４．ヒトγ及びκ鎖発現ユニットの増幅
上記で調製した３’端ポリヌクレオチド付加ヒトγ鎖遺伝子溶液に、３．で調製したヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片を１０ｎｇ、プライマーを１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰを１０ｎｍｏｌを加え、タカラバイオのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い２５μｌの反応液にて、９４℃を４０秒、７０℃を４分の反応を５サイクル、引き続き９４℃を４０秒、６０℃を４０秒、７２℃を４分の反応を３０サイクル行った。用いたプライマーは、プライマーＥ及びプライマーＦである。【０１４２】
同様に上記で調製した３’端ポリヌクレオチド付加ヒトκ鎖遺伝子溶液に、３．で調製したヒトκ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片を１０ｎｇ、プライマーを１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰを１０ｎｍｏｌを加え、タカラバイオのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い２５μｌの反応液にて、９４℃を４０秒、７０℃を４分の反応を５サイクル、引き続き９４℃を４０秒、６０℃を４０秒、７２℃を４分の反応を３０サイクル行った。用いたプライマーは、プライマーＥ及びプライマーＦである。【０１４３】
増幅されたＤＮＡ断片をエタノール沈殿により精製し、２５μｌのＰＢＳにて溶解した。これよりそれぞれ１μｌをとりアガロースゲル電気泳動法にて、細胞１及び細胞２から得られたκ及びγ鎖免疫グロブリン遺伝子断片の発現ユニットへの変換を確認した（図１７を参照）。【０１４４】
５．培養細胞へのヒト免疫グロブリン発現ユニットの導入による、抗ＧＦＰ抗体の発現
４．で調製したヒトκ及びγ鎖発現ユニット各５μｌ（約０．２５μｇ）に、ＤＭＥＭ培地９０μｌ並びにＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ  トランスフェクション試薬２μｌを加え２０分室温にて放置後、２４穴培養皿に培養された２９３ＦＴ細胞へ遺伝子導入を行った。３日間培養を行った後の培養上澄を回収し、ヒト抗体の産生をサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した（図１８を参照）。ＥＬＩＳＡはヒツジ抗ヒト抗体１μｇを９６穴プレート底面に固定化し、これに細胞上澄を１００μｌ加え室温にて３時間抗原抗体反応を行った。プレートに結合した組換えヒト抗体を、西洋ワサビパーオキシダーゼが結合したヒツジ抗ヒト抗体を用いて検出を行った。その結果、細胞１由来のヒトγ及びヒトκ鎖遺伝子発現ユニット（カラム１）、ならびに細胞２由来のヒトγ及びヒトκ鎖遺伝子発現ユニット（カラム２）を導入した２９３ＦＴ細胞の培養上澄中に組み換えヒト抗体が検出された。一方、陰性コントロールである遺伝子導入をしていない細胞上澄中（カラム３）には組み換えヒト抗体が検出されなかった。【０１４５】
実施例で用いた各ＤＮＡ断片と配列表の配列番号１との関係は、以下の通りである。【０１４６】
配列表の配列番号1：標的遺伝子断片１
CTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCCGACATAACAACCAGAATCCTCCTCTAAAGAAGCACCTGGGAGCACAGCTCATCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATACTTTCACCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCCAATGTCGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGCTTATCGCGGACAAATTCACGAATTCAACGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGATGACACGGCCGTTTATTTTTGTGCCGGAGACCCCTCGGGCCACTCACATGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT【０１４７】
配列表の配列番号2：プライマーＡ
配列表の配列番号3：プライマーＢ
配列表の配列番号4：非標的遺伝子断片２
CTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT【０１４８】
配列表の配列番号5：pMiniCMV-hIgG
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCCCGATATCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCGATATCACGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGGTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAAC【０１４９】
配列表の配列番号6：プライマーＣ
配列表の配列番号7：プライマーＤ
配列表の配列番号8：ヒトγ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片
CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGGTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCGGCCAAGTCGACTTGGCCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCC【０１５０】
配列表の配列番号9：プライマーＥ
配列表の配列番号10：プライマーＦ
配列表の配列番号11：プライマーＧ
配列表の配列番号12：プライマーＨ
配列表の配列番号13：プライマーI
配列表の配列番号14：プライマーＪ
配列表の配列番号15：プライマーK
配列表の配列番号16：プライマーL
配列表の配列番号17：プライマーＭ【０１５１】
配列表の配列番号18：pMiniCMV-hIgK
TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCCCGATATCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCGATATCACGTGCGCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGAGGGAGAAGTGCGGCCAAGTCGACTTGGCCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAAC【０１５２】
配列表の配列番号19：ヒトκ鎖遺伝子連結用二本鎖ＤＮＡ断片
CATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGAGGGAGAAGTGCGGCCAAGTCGACTTGGCCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCC
【図１】
2011027808.tif 000002
【図２】
2011027808.tif 000003
【図３】
2011027808.tif 000004
【図４】
2011027808.tif 000005
【図５】
2011027808.tif 000006
【図６】
2011027808.tif 000007
【図７】
2011027808.tif 000008
【図８】
2011027808.tif 000009
【図９】
2011027808.tif 000010
【図１０】
2011027808.tif 000011
【図１１】
2011027808.tif 000012
【図１２】
2011027808.tif 000013
【図１３】
2011027808.tif 000014
【図１４】
2011027808.tif 000015
【図１５】
2011027808.tif 000016
【図１６】
2011027808.tif 000017
【図１７】
2011027808.tif 000018
【図１８】
2011027808.tif 000019
【配列表】
2011027808000001.app
【国際調査報告】
2011027808.tif 000020
2011027808.tif 000021
2011027808.tif 000022