(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２groupIIＡおよびｓＰＬＡ２活性からなる群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして用いるＮＡＳＨの検出又は重篤度の評価方法で、新規なＮＡＳＨマーカーの提供、該マーカーを用いる被験者におけるＮＡＳＨの検出または重篤度の評価のための方法を提供する。
2011046204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の生体試料における、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２groupIIＡおよびｓＰＬＡ２活性からなる群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして測定する工程を含む、非アルコール性脂肪肝炎の検出又は重篤度の評価のための方法。
【請求項２】
Ａ）被験者の生体試料における請求項１に記載の因子の量および／または活性値を測定する工程、および
Ｂ）前記Ａ）で測定した値を、カットオフ値と比較する工程
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験者の生体試料における、ＩＬ−２、アポリポタンパクＡ-IV、アポリポタンパクＣ-II、ＣＣＬ２、トロンボスポンジン１、トレハラーゼ、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、補体Ｄ因子、リポタンパクリパーゼ、ＩＬ−３レセプター、 alpha chain、lymphocyte antigen 6 complex、 locus Ｄ、ＣＯＬ１ａ１、ＴＮＦＲスーパーファミリー，メンバー１９（ＴＡＪ）、ＴＮＦＡＩＰ６、ＶＬＤＬＲ、ＥａｒＡファミリー, メンバー１，２，３，１２、ＩＮＳＬ５、ＴＧＦβ２、ＨＡＭＰ、リパーゼＨおよびＣＹＰ７Ｂ１からなる第２の因子群より選ばれる１以上をさらにマーカーとして測定する工程を含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
被験者の生体試料における、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２groupIIA、ｓＰＬＡ２活性、および請求項３に記載の第２因子群からなる群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして、一定期間以上の間を空けて少なくとも２回測定し、測定値を比較する工程を含む、非アルコール性脂肪肝炎治療効果の評価のための方法。
【請求項５】
前記非アルコール性脂肪肝炎治療のためにイコサペント酸、その製薬学上許容しうる塩およびエステルからなる群から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物が投薬され、少なくとも第２因子群より選ばれる1以上がマーカーとして用いられる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２groupIIＡ、ＩＬ−２、アポリポタンパクＡ-IV、アポリポタンパクＣ-II、ＣＣＬ２、トロンボスポンジン１、トレハラーゼ、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、補体Ｄ因子、リポタンパクリパーゼ、ＩＬ−３レセプター、 alpha chain、lymphocyte antigen 6 complex、 locus Ｄ、ＣＯＬ１ａ１、ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１９（ＴＡＪ）、ＴＮＦＡＩＰ６、ＶＬＤＬＲ、ＥａｒＡファミリー、 メンバー１，２，３，１２、ＩＮＳＬ５、ＴＧＦβ２、ＨＡＭＰ、リパーゼＨおよびＣＹＰ７Ｂ１からなる群より選ばれる１以上に対する抗体又は抗体フラグメント、および／または、ｓＰＬＡ２活性測定用基質を含む、非アルコール性脂肪肝炎の検出又は重篤度・治療効果の評価のための測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪性肝疾患、特に、非アルコール性脂肪性肝疾患、あるいは非アルコール性脂肪肝炎の検出、重篤度の指標となるマーカーを用いた疾患の検出、重篤度・治療効果の評価のための方法に関する。さらに、これらのマーカーを用いた評価を含む非アルコール性脂肪肝炎の治療方法、さらにまた、これらのマーカーにより評価を行うためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルス性肝疾患、自己免疫疾患性肝疾患、ヘマクロトーシスやWilson病等の代謝性肝疾患などを除外して、飲酒歴のない人に発生する単純脂肪肝から脂肪性肝炎、線維症、肝硬変までの肝障害を含む疾患群は、一括して非アルコール性脂肪性肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease：以下、ＮＡＦＬＤと記す）と定義される。ＮＡＦＬＤは、さらに、肝生検（病理所見）により、一般に予後良好と考えられている単純性脂肪肝と、予後不良な非アルコール性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis：以下、ＮＡＳＨと記す）とに分類され、ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤの重症型と考えられている。肝生検によりＮＡＳＨと判定される炎症、脂肪化、線維化ないし肝硬変、肝癌の病態は、他因と同じであり、アルコール性肝障害、ウィルス性肝炎や薬剤性肝障害の否定できる肝炎の多くがＮＡＳＨの病態であろうと推定される。米国では、人口の２０％がＮＡＦＬＤ、３％がＮＡＳＨであるとされる。日本でも一般診療においても比較的頻繁に遭遇する疾患であり、検診受診者におけるＮＡＦＬＤの頻度は８％であり、ＮＡＳＨの頻度は少なくとも成人の０．５〜１％と推定される。日本では、ＢＭＩ≧２５の成人肥満者が、男性で１３００万人、女性で１０００万人いることから、国内のＮＡＦＬＤは５００〜６００万人、ＮＡＳＨは約３０〜５０万人と推定される。また、ＮＡＦＬＤでのメタボリックシンドローム診断基準に基づく、脂質代謝異常の合併頻度は約５０％、高血圧の合併頻度は約３０％、高血糖の合併頻度は約３０％、メタボリックシンドロームの合併頻度は約４０％であり、生活習慣病の増加に伴い、今後、ＮＡＳＨの症例数の増加ならびに低年層への拡大が予想される。さらに肝炎を経て一部は星状細胞活性化による肝硬変、あるいは肝癌への進行が臨床的な問題である。現在のところ、ＮＡＳＨの確定診断には肝生検組織診断が必要とされ、疾患治癒の判定においても同様に肝生検が必要と考えられている。肝生検には、患者の身体的負担、医療従事者の負担が大きいという問題があり、侵襲を伴う肝生検に代わって、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨの診断、病態の評価に有用な特徴的な血液マーカーの確定が求められている。また、種々の病態改善を目指したＮＡＳＨの治療方法が試みられ、その有効性が報告されているが、確立した治療法がないのが現状である（非特許文献１参照）。【０００３】
従来、ＮＡＳＨの検出に用いられる血液検査指標としては、例えば、アスパルテートアミノトランスフェレース（以下、ＡＳＴとも記す）、アラニンアミノトランスフェレース（以下、ＡＬＴとも記す）、ＡＳＴ／ＡＬＴ比、血清フェリチン、血清チオレドキシン、ＨＯＭＡ−ＩＲ、血小板数、ＴＮＦα、アディポネクチン、レプチン、高感度ＣＲＰ、ヒアルロン酸、IV型コラーゲン７Ｓ、プロコラーゲンIIIポリペプチド、ＣＫ１８フラグメントなどが挙げられる。【０００４】
その他にも、ＮＡＳＨ患者では、単純脂肪肝の患者と比較して、ＴＮＦα、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１が上昇したことが報告されている（非特許文献２参照）。
また、ＮＡＳＨモデル動物に対して、テルミサルタン（非特許文献３参照）、あるいは、オルメサルタン（非特許文献４参照）が投薬されたところ、肝臓線維化が抑制されるとともに、それぞれ、肝組織のＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２のｍＲＮＡ発現が低下した（非特許文献３参照）、肝臓のalpha 1［Ｉ］procollagenの遺伝子発現が低下した（非特許文献４参照）ことが報告されている。
脂肪性肝炎、肝臓の癌形成のモデルとしての肝細胞特異的Pten欠損マウスの肝臓細胞における遺伝子解析により、adipsin、adiponectinなどの発現が誘導されたことが報告されている（非特許文献５参照）。【０００５】
また、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤をＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤに用いる提案がある（特許文献１参照）。【０００６】
Tanakaらは、高純度イコサペント酸エチル（以下、ＥＰＡ−Ｅとも記す）の１２ヶ月間投与によるＮＡＳＨ改善の検討において、ＥＰＡ−Ｅ投与観察期間後の肝生検とともに、ＡＳＴ、ＡＬＴ酵素観察、ＴＮＦα、ｓＴＮＦ−Ｒ１およびｓＴＮＦ−Ｒ２などの炎症性サイトカイン、チオレドキシンなどの酸化ストレスマーカーによる評価を示す（非特許文献６参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開２００７／０１６３９０号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本肝臓学会編、「ＮＡＳＨ・ＮＡＦＬＤの診察ガイド」、文光堂出版、２００６年８月２２日
【非特許文献２】J. Hepatol. ２００６ Jun；４４（６）：１１６７−７４
【非特許文献３】Biochem Biophys Res Commun. 2007 Dec 28;364(4):801-7.
【非特許文献４】Eur J Pharmacol. 2008 Jul 7;588(2-3):316-24.
【非特許文献５】Hepatology October 2004 428A 609
【非特許文献６】Journal of Clinical Gastroenterology、２００８年、第４２巻、第４号、４１３−４１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＮＡＳＨの検出、重篤度の評価に有用なマーカーを提供することを目的とする。本発明は、ＮＡＳＨ治療薬、特にＥＰＡ−Ｅを有効成分として含有する医薬組成物による治療効果の評価に有用なマーカーを提供することを目的とする。本発明は、該マーカーを用いる、被験者におけるＮＡＳＨの検出、重篤度の評価のための方法、さらには治療効果の評価のための方法を提供することを目的とする。本発明は、本発明のマーカーを用いてＮＡＳＨの検出又は評価された被験者を対象とするＮＡＳＨ治療方法を提供することを目的とする。本発明は、ＮＡＳＨの検出、重篤度の評価に有用なマーカーの測定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行ったところ、特定の生体内因子の量又は活性が健常者とＮＡＳＨ患者とで異なることを見出した。これら因子は、タンパク質の量または活性として公知の測定方法で測定可能であるが、これまで、ＮＡＳＨマーカーとして使用された報告はない。そして、ＮＡＳＨ患者における該特定の因子の量または活性値は、公知の肝機能障害の指標であるＡＳＴ値と相関する傾向があることを確認でき、これら因子は、ＮＡＳＨの新規な検出、重篤度・治療効果の評価に有用なマーカーになり得ることを見出し、本発明を完成した。
またさらに、実施例として後述するマウスにおける遺伝子解析により、ＥＰＡ−ＥのＮＡＳＨ・ＮＡＦＬＤ抑制効果を示すものとして選抜される第２因子をマーカーとして提供する。第２因子は、高脂肪・高ショ糖食により重篤な脂肪肝を呈するマウスの肝臓で発現が変動し、かつ、ＥＰＡ−Ｅ投与によりその発現が抑制された遺伝子群から選抜された因子である。これら第２因子群中には、従来ＮＡＳＨマーカーと考えられている因子も含まれており、第２因子群はＮＡＳＨマーカーとしても有用と考えられる。第２因子群は上記ＮＡＳＨマーカーの因子に付加的に使用することもできる。特に、これら第２因子は、ＥＰＡ−Ｅの効果との関連が確認されたことから、イコサペント酸、その製薬学上許容しうる塩およびエステルからなる群（以下、ＥＰＡ類と総称することもある）によるＮＡＳＨ治療効果を評価できるマーカーとしての有用性が考えられる。
したがって、本発明は、本発明のマーカーを用いたＮＡＳＨ検出方法、重篤度・治療効果の評価のための方法を提供する。また、本発明のマーカーを用いてＮＡＳＨの検出又は評価された被験者にＮＡＳＨ治療薬を投薬する治療方法、あるいは本発明のマーカーによる治療効果の評価のための方法を含むＮＡＳＨ治療方法を新規な治療方法として提供することができる。ここでのＮＡＳＨ治療薬は、好ましくはＥＰＡ類である。特に第２因子は、ＥＰＡ−Ｅの効果との関連が確認されたことから、ＮＡＳＨ及び／又はＮＡＦＬＤの被験者の中から、ＥＰＡ類の投薬による治療が適する被験者を選択するための指標、あるいは、個々の被験者において、ＮＡＳＨ治療方法の中からＥＰＡ類の投薬による治療を選択するための指標とすることができる。
このような本発明の態様例を以下に示す。【００１１】
（１）ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２group IIＡおよびｓＰＬＡ２活性からなる群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして用いるＮＡＳＨの検出又は重篤度の評価のための方法。
上記ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１またはｓＰＬＡ２groupIIＡは、好ましくは抗原の形態である。（１）の方法は、好ましくはＮＡＳＨの検出方法である。
（２）Ａ）被験者の生体試料における、上記（１）の因子を測定する工程を含む、（１）の方法。【００１２】
（３）Ａ）被験者の生体試料における、前記因子の量および／または活性値を測定する工程、およびＢ）上記Ａ）で測定した値を、カットオフ値と比較する工程、を含む上記（１）または（２）に記載の方法。【００１３】
（４）上記Ｂ）において、被験者における測定値がカットオフ値と比較して陽性のときに被験者におけるＮＡＳＨの存在が示唆されるとする、ＮＡＳＨの検出方法である上記（３）に記載の方法。【００１４】
（５）被験者の生体試料における、ＩＬ−２、アポリポタンパクＡ-IV、アポリポタンパクＣ-II、ＣＣＬ２、トロンボスポンジン１、トレハラーゼ、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、補体Ｄ因子、リポタンパクリパーゼ、ＩＬ−３レセプター、 alpha chain、lymphocyte antigen 6 complex、 locus D、ＣＯＬ１ａ１、ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１９（ＴＡＪ）、ＴＮＦＡＩＰ６、ＶＬＤＬＲ、ＥａｒＡファミリー、 メンバー１，２，３，１２、ＩＮＳＬ５、ＴＧＦβ２、ＨＡＭＰ、リパーゼＨおよびＣＹＰ７Ｂ１からなる第２因子群より選ばれる１以上をマーカーとして測定する工程を含む、ＮＡＳＨの検出又は重篤度の評価のための方法。
上記因子は、好ましくは抗原の形態である。
（６）被験者の生体試料における、上記（５）の第２の因子群より選ばれる１以上をさらにマーカーとして用いる上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の方法。【００１５】
（７）上記第２の因子群が、ＩＬ−２、アポリポタンパクＡ-IV、アポリポタンパクＣ-II、ＣＣＬ２、トロンボスポンジン１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、トレハラーゼ、ＴＩＭＰ１、補体Ｄ因子、リポタンパクリパーゼ、ＨＡＭＰおよびリパーゼＨからなる上記（５）または（６）に記載の方法。【００１６】
（８）被験者の生体試料における、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２group IIＡ、ｓＰＬＡ２活性、及び第２因子群からなる群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして、一定期間以上の間を空けて少なくとも２回測定し、測定値を比較する工程を含む、ＮＡＳＨ治療効果の評価のための方法。
（９）次の工程を含む、ＮＡＳＨ治療効果の評価のための方法。
Ａ）被験者の生体試料における、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２group IIＡ、ｓＰＬＡ２活性、及び第２因子群からなる群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして測定する工程
Ｂ）非アルコール性脂肪肝炎の治療を行う工程
Ｃ）前記Ａ）の測定時から一定期間以上経過した後、被験者の生体試料における前記Ａ）で用いた同一因子を測定する工程
Ｄ）前記Ａ）とＣ）で得られた測定値を比較する工程【００１７】
（１０）さらに、ＮＡＳＨ治療のためにＮＡＳＨ治療薬が投薬される、該ＮＡＳＨ治療薬の治療効果の評価のための（８）または（９）に記載の方法。
（１１）前記ＮＡＳＨ治療薬がＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物であり、少なくとも第２因子群より選ばれる１以上がマーカーとして用いられる（１０）に記載の方法。【００１８】
（１２）次の工程を含むＮＡＳＨの治療方法。
１）（１）〜（７）のいずれかの方法によりＮＡＳＨの検出又は重篤度の評価のための方法が行われる工程
２）前記１）で検出又は評価された被験者に対して、ＮＡＳＨの治療を行う工程
（１３）さらに次の工程を含む（１２）に記載の治療方法。
３）前記（８）又は（９）のＮＡＳＨ治療効果の評価のための方法が行われる工程
（１４）さらに次の工程を含む（１３）に記載の治療方法。
４）治療効果の評価に基づいて被験者の治療方法が決定される工程
（１５）上記ＮＡＳＨの治療がＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物の投薬である（１２）〜（１４）のいずれかに記載の治療方法。
（１６）前記ＮＡＳＨ治療効果の評価のための方法が、少なくとも第２因子群より選ばれる１以上をマーカーとして用いて行われる（１５）に記載の治療方法。
（１７）被験者の生体試料における、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２group IIＡ、ｓＰＬＡ２活性からなる群より選ばれる１以上の因子により非アルコール性脂肪肝炎の存在が示唆された被験者に対して、有効量のＮＡＳＨ治療薬を投与することを含む、非アルコール性脂肪肝炎の治療方法。
（１８）前記ＮＡＳＨ治療薬がＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物である（１７）に記載の方法。
（１９）さらに、その他の検査指標からなる群から１以上が検出又は評価に用いられる、（１）〜（１８）に記載の方法。
（２０）被験者の生体試料における、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２group IIＡ、ｓＰＬＡ２活性、及び第２因子群からなる群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして、ＥＰＡ類によるＮＡＳＨ治療を選択する方法。
（２１）（２０）によりＥＰＡ類によるＮＡＳＨ治療が選択された被験者に対して、ＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物が投薬されるＮＡＳＨ治療方法。
（２２）被験者の生体試料における、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２group IIＡ、ｓＰＬＡ２活性、及び第２因子群からなる群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして、ＮＡＳＨ及び／又はＮＡＦＬＤの被験者の中からＥＰＡ類によるＮＡＳＨ治療が適する被験者を選択する方法。
（２３）（２２）により選択された被験者に対して、ＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物が投薬されるＮＡＳＨ治療方法。【００１９】
（２４）ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２groupIIＡ、ＩＬ−２、アポリポタンパクＡ-IV、アポリポタンパクＣ-II、ＣＣＬ２、トロンボスポンジン１、トレハラーゼ、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、補体Ｄ因子、リポタンパクリパーゼ、ＩＬ−３レセプター、 alpha chain、lymphocyte antigen 6 complex、 locus D、ＣＯＬ１ａ１、ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１９（ＴＡＪ）、ＴＮＦＡＩＰ６、ＶＬＤＬＲ、ＥａｒＡファミリー, メンバー１，２，３，１２、ＩＮＳＬ５、ＴＧＦβ２、ＨＡＭＰ、リパーゼＨおよびＣＹＰ７Ｂ１からなる群より選ばれる１以上に対する抗体又は抗体フラグメント、及び／又は、ｓＰＬＡ２活性測定用基質を含む、ＮＡＳＨの検出又は重篤度・治療効果の評価のための測定キット。
（２５）ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２group IIＡおよびｓＰＬＡ２活性からなる群より選ばれる１以上の因子よりなるＮＡＳＨの検出又は重篤度の評価のためのマーカー。
（２６）ＩＬ−２、アポリポタンパクＡ-IV、アポリポタンパクＣ-II、ＣＣＬ２、トロンボスポンジン１、トレハラーゼ、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、補体Ｄ因子、リポタンパクリパーゼ、ＩＬ−３レセプター、 alpha chain、lymphocyte antigen 6 complex、 locus D、ＣＯＬ１ａ１、ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１９（ＴＡＪ）、ＴＮＦＡＩＰ６、ＶＬＤＬＲ、ＥａｒＡファミリー、 メンバー１，２，３，１２、ＩＮＳＬ５、ＴＧＦβ２、ＨＡＭＰ、リパーゼＨおよびＣＹＰ７Ｂ１からなる第２因子群より選ばれる１以上よりなるＮＡＳＨの検出又は重篤度の評価のためのマーカー。
（２７）ＮＡＳＨの検出又は重篤度の評価のためのマーカーに使用するための、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２group IIＡおよびｓＰＬＡ２活性からなる群より選ばれる１以上の因子。
（２８）ＮＡＳＨの検出又は重篤度の評価のためのマーカーに使用するための、ＩＬ−２、アポリポタンパクＡ-IV、アポリポタンパクＣ-II、ＣＣＬ２、トロンボスポンジン１、トレハラーゼ、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、補体Ｄ因子、リポタンパクリパーゼ、ＩＬ−３レセプター、 alpha chain、lymphocyte antigen 6 complex、 locus D、ＣＯＬ１ａ１、ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１９（ＴＡＪ）、ＴＮＦＡＩＰ６、ＶＬＤＬＲ、ＥａｒＡファミリー、 メンバー１，２，３，１２、ＩＮＳＬ５、ＴＧＦβ２、ＨＡＭＰ、リパーゼＨおよびＣＹＰ７Ｂ１からなる第２因子群より選ばれる１以上の物質。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、ＮＡＳＨの検出・診断、重篤度・治療効果の評価に有用な指標が提供されるため、簡便に、ＮＡＳＨに罹患している可能性のある被験者を検出することができ、また、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤの重篤度や、治療効果を評価することが可能になる。
特に、ＥＰＡ類によるＮＡＳＨ治療を行う場合に、簡便に、その治療効果を評価することが可能になる。生検を行う必要がないため、患者の負担、及び、医療従事者の負担も軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＮＡＳＨ患者の血漿におけるＩＬ−１ｒａ値とＡＳＴ値との相関図である。
【図２】ＮＡＳＨ患者の血漿におけるｓＣＤ４０値とＡＳＴ値との相関図である。
【図３】ＮＡＳＨ患者の血漿におけるＨＭＧＢ１値とＡＳＴ値との相関図である。
【図４】ＮＡＳＨ患者の血漿におけるｓＰＬＡ２groupIIＡ値とＡＳＴ値との相関図である。
【図５】ＮＡＳＨ患者の血漿におけるｓＰＬＡ２活性値とＡＳＴ値との相関図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明をより具体的に説明する。
１．マーカー
本発明に係るマーカーは、生体試料中の因子として測定することができれば、遺伝子、タンパク質、活性のいずれであってもよいが、好ましくは、血中で簡便に測定できる因子であり、タンパク質であることが望ましく、抗体で測定可能な抗原であることがより望ましい。
＜第１因子群＞
本発明では、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２groupIIＡおよびｓＰＬＡ２活性をＮＡＳＨマーカーとして提供する。説明の便宜上、これら因子群より選ばれる１つ以上の因子を第１因子または第１マーカーと称することもある。第１因子は、生体試料を検体として公知の測定キットを用いて検出しうる因子である。ＮＡＳＨマーカーとしてはこれらの生物活性のあるタンパク質として検出してもよいが、好ましくは抗原として測定できればよい。そして、それらはＮＡＳＨマーカーとして使用された報告はない。ＮＡＳＨの診断・検出、重篤度・治療効果の評価のための新規なマーカーである。以下に、具体的に説明する。なお、本明細書において、診断・検出、重篤度・治療効果の評価を単に評価と記載することがある。
【００２３】
ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）：Interleukin-1 receptor antagonist
ＩＬ−１は、ＴＮＦαと並び、代表的な炎症性サイトカインである。ＩＬ−１ｒａは、内因性の抗炎症サイトカインであり、ＩＬ−１受容体に対し、ＩＬ−１と競合拮抗することにより、ＩＬ−１のアゴニスト活性を阻害する。
これまで、ＩＬ−１ｒａ欠損マウスは、ＩＬ−１シグナル伝達が過剰となり、動脈硬化食を投与すると、ＮＡＳＨ類似の肝組織像と高コレステロール血症を呈するとの報告がなされている（日本臨床６４巻６号（２００６−６）１０６３−１０７０頁）。この報告から、ＮＡＳＨ患者では、体内のＩＬ−１ｒａが低下していることが予測された。
今回、我々は、ＮＡＳＨ患者と健常者において、血漿中のＩＬ−１ｒａ濃度を比較したところ、予想に反して、ＮＡＳＨ患者の血漿中のＩＬ−１ｒａ濃度は、健常者と比較して有意に上昇していた。このように、本発明において、ＩＬ−１ｒａのＮＡＳＨマーカーとしての有用性が示された。
【００２４】
solubleＣＤ４０（ｓＣＤ４０）
ＣＤ４０は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの５０ｋＤａの膜結合糖タンパクである。多くの細胞に発現していて、免疫反応とアポトーシスの制御に重要な役割を果たす。
これまでに、肝臓疾患をもつ被験者の血清中の平均ｓＣＤ４０レベルは１１２．９であり、健常者の２４．２と比較して高かったことが報告されている。この報告における肝臓疾患とは、ウイルス性肝炎５９例、胆汁鬱滞性肝炎２０例、ＡＩＨ（自己免疫性肝炎）７例、アルコール性肝炎７例、特発性肝疾患７例、劇症肝炎４例、肝細胞癌７例、サルコイドーシス２例、ウィルソン病１例であった。疾患別にｓＣＤ４０濃度を比較すると、一般的に、ＮＡＳＨに病態が近いといわれているアルコール性肝疾患のｓＣＤ４０レベルは１２．６であり、健常者以下の値を示した（apoptosis２００４；９：２０５−２１０）。この報告から、ＮＡＳＨ患者のｓＣＤ４０レベルは、健常者と比較しても同等かそれ以下であることが予想された。
また、ＦａＯ細胞（肝臓癌細胞）を２４時間脂質エマルジョンに暴露した細胞死は、アポトーシスではなく、ネクローシスであったとの文献も存在していた（Nutrition２５（２００９）２００−２０８）。
今回、我々は、ＮＡＳＨ患者と健常者において、血漿中のｓＣＤ４０濃度を比較したところ、予想に反して、ＮＡＳＨ患者の血漿中のｓＣＤ４０濃度は、健常者と比較して有意に上昇していた。ｓＣＤ４０のＮＡＳＨマーカーとしての有用性が示された。
【００２５】
ＨＭＧＢ１（High mobility group box１）
ＨＭＧＢ１は、分子量３０ｋＤａのタンパク質であり、様々な細胞で発現している。ＨＭＧＢ１は、ＤＮＡと結合し安定化させる作用、サイトカインとしての作用をもち、細胞ネクローシスのマーカーともいわれている。
これまでに、一定時間脂質エマルジョンに暴露したＦａＯ細胞（肝臓癌細胞）をビトロの脂肪肝モデルとして使用して、ＨＭＧＢ１を評価した報告がある。
ＦａＯ細胞（肝臓癌細胞）を脂質エマルジョンに６時間暴露したところ、細胞内のＲＯＳ産生が顕著に増加した。ＨＭＧＢ１はネクローシス細胞死のマーカーとして使用された。ＦａＯ細胞を脂質エマルジョンに２４時間暴露したところ、ＨＭＧＢ１の低下が観察された。カスパーゼ３活性は、アポトーシス細胞死のマーカーとして使用された。２４時間の暴露によってカスパーゼ３活性は変化せず、肝臓細胞死はネクローシスであったとされている（Nutrition２５（２００９）２００−２０８）。
今回、我々は、ＮＡＳＨ患者と健常者において、血漿中のＨＭＧＢ１濃度を測定したところ、ＮＡＳＨ患者の血漿中のＨＭＧＢ１濃度は、健常者と比較して有意に上昇していた。今回初めて、被験者の血漿中のＨＭＧＢ１が、ＮＡＳＨマーカーとして使用できることが示された。
【００２６】
ｓＰＬＡ２（secretory phospholipase Ａ２）groupIIＡ：type２Ａ、typeIIＡ
ホスフォリパーゼＡ２（ＰＬＡ２ｓ）は、ホスフォグリセリドの２位の位置でエステル結合を加水分解し、遊離脂肪酸とリゾリン脂質を遊離させる、スーパーファミリーを形成する酵素である。ｓＰＬＡ２は分泌型の酵素であり、分子量やＣａ2+依存性などにより、GroupＩＡ、ＩＢ、IIＡ、IIＢ、IIＣ-III、Ｖ、VII、ＩＸなどのサブタイプに分類される。ｓＰＬＡ２groupIIＡは、ヒト滑液、血小板に存在が確認され、炎症への関与が示唆されている（Dennis E.A.ら、Trends  Biochem．Sci．２２，１−２（１９９７））。
ヒトｓＰＬＡ２groupII遺伝子を発現させたトランスジェニックマウスに関し、ｓＰＬＡ２groupIIＡと高コレステロール血症との関連を示唆する報告がある。ヒトｓＰＬＡ２groupIIトランスジェニックマウスと非トランスジェニックマウス（ｎ＝１０）に、１％コレステロールリッチな食餌を１３週間摂食させた。ｓＰＬＡ２groupIIトランスジェニックマウスは、非トランスジェニックのコントロールと比較して、血漿コレステロールレベルが低下し、肝臓組織では遊離およびエステル化コレステロール濃度が上昇したが、トリグリセライド濃度は変化しなかったことが示された。この結果から、この文献の著者らは、「ｓＰＬＡ２groupIIＡの過剰発現は、コレステロールの肝臓への輸送を増加させることが示唆される。このメカニズムは、炎症性疾患をもつ患者においてみられる高コレステロール血症の進展に寄与しているかもしれない」と考察し、上記ｓＰＬＡ２groupIIＡと高コレステロール血症との関連を示唆している（Inflammation Vol.２８  No.２（２００４））。
しかし、これまで、ｓＰＬＡ２groupIIＡ  について、ＮＡＳＨとの関連は知られておらず、ヒトＮＡＳＨ患者の血漿でｓＰＬＡ２groupIIＡ濃度がどのような動きをするのか予測もされていなかった。
今回、我々は、ＮＡＳＨ患者と健常者において、血漿中のｓＰＬＡ２groupIIＡ濃度を測定したところ、ＮＡＳＨ患者の血漿中のｓＰＬＡ２groupIIＡ濃度は、健常者と比較して有意に上昇していた。今回初めて、被験者の血漿中のｓＰＬＡ２groupIIＡが、ＮＡＳＨマーカーとして使用できることが示された。
【００２７】
ｓＰＬＡ２活性
分泌型ホスフォリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２ｓ）には、いくつかのサブタイプが存在することは前記のとおりであるが、我々は、血漿中のｓＰＬＡ２全体の活性を測定した。
ｓＰＬＡ２は、アテローム性プラークにおいて発現が上昇していて、ＬＤＬを加水分解することによるリゾリン脂質のような炎症性の脂質の産生を促進することが示唆されている。このように、ｓＰＬＡ２は、アテローム性動脈硬化、炎症などとの関連が示唆されている（Biochim Biophys Acta.２００６ Nov；１７６１（１１）：１３０９−１６．Oestvang Jら）。
また、前記文献（Inflammation，Vol.２８No．２（２００４））では、ｓＰＬＡ２groupIIを高発現させたトランスジェニックマウスでは、血漿中のｓＰＬＡ２活性が上昇したことが示されている。
これまで、ｓＰＬＡ２活性とＮＡＳＨとの関連をみた報告はない。しかし、ｓＰＬＡ２活性に関するこれまでの報告から予測するとすれば、ＮＡＳＨ患者において、ＴＮＦαなど炎症性の指標の上昇が報告されているから、ｓＰＬＡ２活性も上昇することが予測された。
今回、血漿中のｓＰＬＡ２活性を、ＮＡＳＨ患者と健常者とで比較したところ、予想外にも、ＮＡＳＨ患者の血漿中のｓＰＬＡ２活性は、健常者と比較して有意に低下していた。
本発明において、初めて、ｓＰＬＡ２活性が、ＮＡＳＨマーカーとして使用できることが示された。
【００２８】
＜第２因子群＞
本発明に係る第２因子群のマーカーは以下の方法により選抜された因子群である。すなわち、（１）マウスに高脂肪・高ショ糖食＋５％パルミチン酸エチルを２０週間摂食させたところ、重篤な脂肪肝を呈した（ＨＦ−ＨＳ群）。一方、別のマウスに高脂肪・高ショ糖食＋５％ＥＰＡ−Ｅを同様に摂食させたところ、脂肪肝は誘発されなかった（ＥＰＡ群）。
（２）次に、通常食を与えたコントロール群、ＨＦ−ＨＳ群、及びＥＰＡ群の３群で、肝臓の遺伝子発現を比較した。コントロール群と比較して、ＨＦ−ＨＳ群で変動の見られた遺伝子で、かつ、ＨＦ−ＨＳ群と比較してＥＰＡ群で変動の見られた遺伝子を抽出した。（３）さらに、この遺伝子の中から、対応するタンパク質が血中に分泌する可能性のある因子、かつ、ＮＡＳＨと関連する可能性のある因子を抽出した。
具体的には実施例２として後述するが、上記（２）における、各群間の遺伝子の比較の条件に基づいて以下の２つのグループ（Ａ）および（Ｂ）として選択される。
（Ａ）：ＨＦ−ＨＳ群／コントロール群≧２かつＥＰＡ群／ＨＦ−ＨＳ群≦０.５。
（Ｂ）：ＨＦ−ＨＳ群／コントロール群≦０.５かつＥＰＡ群／ＨＦ−ＨＳ群≧２。
また、上記（３）におけるＮＡＳＨと関連する可能性のあるとは、脂質代謝に関連する、炎症に関連する、ＳＲＥＢＰトランスジェニックマウスの肝臓で発現が上昇する、のいずれかであればよい。
【００２９】
（Ａ）グループは、脂肪肝を呈するマウスの肝臓で発現が上昇し、ＥＰＡ−Ｅ投与により発現が抑制された遺伝子をもとに抽出されたマーカーであるから、ＮＡＦＬＤにおいて生体試料中含量好ましくは血漿中含量が上昇し、ＥＰＡ類の投薬治療によりその含量は低下する。
（Ｂ）グループは、脂肪肝を呈するマウスの肝臓で発現が低下し、ＥＰＡ−Ｅ投与により発現が上昇する遺伝子をもとに抽出されたマーカーであるから、ＮＡＦＬＤにおいて生体試料中含量好ましくは血漿中含量が低下し、ＥＰＡ類の投薬治療によりその含量は上昇する。
これらの因子は、ＮＡＳＨの前段階、すなわち、脂肪肝の状態（ＮＡＦＬＤ）で発現が変動する因子であり、ＮＡＳＨの予備群の検出、診断、重篤度の評価に有用である。
本発明においてＮＡＦＬＤとは、ＮＡＳＨも含む非アルコール性脂肪性肝疾患の意味で用いられるが、特にＮＡＳＨには至っていないＮＡＳＨの前段階としての脂肪肝を呈する病態との意味に用いられることがある。
また、これらの因子は、マウスモデルにおいてＥＰＡ−Ｅ投与により脂肪肝の抑制とともに発現が変動した因子でもあることから、ＥＰＡ類の投薬治療によるＮＡＳＨ治療効果を評価する指標としても有用である。また、これらの因子は、ＮＡＳＨ及び／又はＮＡＦＬＤの被験者の中から、ＥＰＡ類の投薬による治療が適する被験者を選択するための指標、ＥＰＡ類の投薬対象となる被験者を選択するための指標、あるいは、個々の被験者において、ＮＡＳＨ治療方法の中からＥＰＡ類の投薬による治療を選択するための指標とすることができる。
【００３０】
（Ａ）グループとして選抜される因子としては、ＩＬ−２、アポリポタンパクＡ-IV、アポリポタンパクＣ-II、ＣＣＬ２、トロンボスポンジン１、トレハラーゼ、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、補体Ｄ因子、リポタンパクリパーゼ、ＩＬ−３レセプター, alpha chain、lymphocyte antigen 6 complex、 locus Ｄ、ＣＯＬ１ａ１、ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１９（ＴＡＪ）、ＴＮＦＡＩＰ６、ＶＬＤＬＲおよびＥａｒＡファミリー、 メンバー１，２，３，１２が挙げられる。
（Ｂ）グループとして選抜される因子としては、ＩＮＳＬ５、ＴＧＦβ２、ＨＡＭＰ、リパーゼＨおよびＣＹＰ７Ｂ１が挙げられる。
これら因子を以下に説明する。
【００３１】
ＩＬ−２：interleukin（インターロイキン）2
ＩＬ−２はサイトカインのひとつであり、細胞性免疫に関与する。
ＩＬ−２は、Ｔ細胞の増殖及び活性化、Ｂ細胞の増殖と抗体産生能の亢進、単球・マクロファージの活性化、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖・活性化、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）の誘導などの活性をもつ。
また、ＩＬ−２は制御性Ｔ細胞（Regulatory T Cell、Treg）の維持に必要であると考えられている。
１０日間高フルクトース食を負荷して脂肪肝を誘発させたラットで、血中のＩＬ−２レベルが上昇したことが報告されている（Clin Biochem. 2005 Jun;38(6):540-7）。
【００３２】
アポリポタンパクＡ-IV：ApolipoproteinＡ-IV
アポリポタンパクＡ-IVは、カイロミクロンと高密度リポタンパクの構成要素である。ストレプトゾトシン誘発のＩ型糖尿病モデルのマウス、及び、II型糖尿病モデルのｏｂ／ｏｂマウスにおいて、コントロールと比較して、肝臓のアポリポタンパクＡ-IVのｍＲＮＡレベルと、血清タンパクレベルの上昇が報告されている（J Lipid Res. 2006 Nov;47(11):2503-14）。
【００３３】
アポリポタンパクＣ-II：ApolipoproteinＣ-II
アポリポタンパクＣ-IIは、カイロミクロン、ＶＬＤＬ中のトリグリセリドを加水分解する酵素であるリポタンパクリパーゼの活性発現に不可欠のアポタンパクである。
アポリポタンパクＣ-IIは、高脂血症のIIｂ、III、ＩＶ、Ｖ型において上昇が認められる（日本臨床  Vol.62, Suppl.12 2004）。
【００３４】
ＣＣＬ２：chemokine (C-C motif) ligand 2
ＣＣＬ２は、サイトカイン遺伝子の１つであり、免疫調節と炎症に関わる。
ＮＡＦＬＤにおける全身性炎症の役割を明らかにするために、２２例の単純脂肪肝と２５例のＮＡＳＨの血清サンプルのＣＲＰ、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１などを測定したところ、健常者と比較して、ＮＡＦＬＤ患者では、ＩＬ−６、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ１９が増加していた。そして、ＮＡＳＨ患者では、単純脂肪肝の患者と比較して、ＴＮＦα、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１が上昇したことが報告されている（Haukeland et al. J Hepatol. 2006 Jun;44(6):1167-74）。
【００３５】
トロンボスポンジン１（Thrombospondin 1）：ＴＳＰ１
この遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞どうし、ならびに細胞−基質間の相互作用を仲介する接着糖タンパク質であり、血小板凝集、血管新生、腫瘍形成などにおいて働くことが知られている。
８６例の非糖尿病の被験者の皮下脂肪と、１４例の手術を受けた患者及び、メトホルミン又はピオグリタゾンを１０週間服用している３８例の耐糖能異常の被験者の内臓脂肪と皮下脂肪のＴＳＰｍＲＮＡが測定され、ＴＳＰ１ｍＲＮＡは肥満（ＢＭＩ）、脂肪細胞の炎症、インスリン抵抗性に関連するとの報告がある（Varma et al. Diabetes. 2008 Feb；57(2):432-9、Epub 2007 Dec 5.）。
これまで、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ患者の血中トロンボスポンジン１が測定された例はなかったが、今回、ＮＡＦＬＤ患者の血漿でトロンボスポンジン１（タンパク）が上昇することが確認され、血中で測定可能なマーカーであることが示された。
【００３６】
ＩＬ−３レセプター（Interleukin-3 receptor）alpha chain
ＩＬ−３レセプターは、ＩＬ−３に高親和性のレセプターであり、造血前駆細胞、骨髄前駆細胞、好酸球、好塩基球に見られる。
ＩＬ−３レセプターは、ＩＬ−３レセプターアルファサブユニットとサイトカインレセプター共通ベータサブユニットの２量体により形成される。
【００３７】
lymphocyte antigen 6 comlex、 locus Ｄ
ケラチノサイトに発現することが知られている。
【００３８】
ＭＭＰ１２，１３：atrix metallopeptidase 12，atrix metallopeptidase 13
ＭＭＰは細胞外基質を分解する酵素である。ＭＭＰ１２は主にマクロファージから分泌され、各種炎症性疾患と関連があると考えられている。ＭＭＰ１３は骨格組織における細胞外基質の分解に関与する。マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤をＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤに用いる提案がなされている（特許文献１参照）。
【００３９】
トレハラーゼ（trehalase）（brush-border membrane glycoprotein）
この遺伝子は、ジサッカライドのトレハロースを加水分解する酵素トレハラーゼをコードする。
トレハラーゼは、ジサッカライドのトレハロースを加水分解してグルコースを産生する酵素である。自然界に広く存在し、ヒト血漿中と同様に様々なヒト組織にも見られる。基質であるトレハロースの合成と分解は、炭水化物輸送メカニズムに関連すると考えられている。
【００４０】
ＴＩＭＰ１：tissue inhibitor of metalloproteinase 1
コリン欠乏、Ｌ−アミノ酸欠乏（ＣＤＡＡ）食８週間投与により誘導されたラットＮＡＳＨモデルでは、肝線維化が見られたが、その後、アンギオテンシンIIタイプ１レセプターアンタゴニストのテルミサルタンを１０週間投与することにより、ＴＩＭＰ１、２のｍＲＮＡ発現が低下し、肝線維化が抑制されたことが報告されている（Biochem Biophys Res Commun. 2007 Dec 28;364(4):801-7）。
【００４１】
ＣＯＬ１ａ１：procollagen type I、alpha 1
糖尿病モデルラットにメチオニン・コリン欠乏食を与えた脂肪性肝炎モデルにおいて、アンギオテンシンIIタイプ１レセプターブロッカーのオルメサルタンは、肝線維化、星細胞の活性、線維化遺伝子（ＴＧＦ−β、alpha１［Ｉ］procollagenなど）の発現を抑制したことが報告されている（Eur J Pharmacol. 2008 Jul 7;588(2-3):316-24）。
【００４２】
補体Ｄ因子：complement factor Ｄ（adipsin）
補体Ｄ因子は、脂肪細胞から血中に分泌される、補体活性化の開始に必須のセリンプロテアーゼである。血清補体Ｄ因子濃度は、腎臓における異化を介して制御されていて、腎臓疾患をもつ患者では、補体Ｄ因子レベルの上昇がみられる。
肝細胞特異的Ｐｔｅｎ欠損マウスは、脂肪性肝炎、肝臓の癌形成が起こり、肝臓細胞におけるＲＴ−ＰＣＴ解析から、脂肪細胞特異的遺伝子（adipsin，adiponectinなど）の発現が誘導されたことが報告されている（Watanabe et al.，Hepatology October 2004 428A 609）。
今回、我々は、初めて、ＮＡＦＬＤ患者の血漿において補体Ｄ因子が上昇することを確認した。補体Ｄ因子は、血中で測定可能なマーカーとなりうることが示された。
【００４３】
ＴＮＦＲ（tumor necrosis factor receptor）スーパーファミリー、メンバー１９（ＴＡＪ）
腫瘍壊死因子レセプター（Tumor necrosis factor receptor）スーパーファミリーのメンバーは、タイプＩ型の膜タンパクであり、細胞外ドメインにおいて相同性が高い。
【００４４】
ＴＮＦＡＩＰ（Tumor necrosis factor alpha induced protein）６
ＴＮＦＡＩＰ６タンパクは、２７７アミノ酸からなる切断シグナルペプチドである。
その発現は、線維芽細胞、末梢血単核細胞、滑膜細胞、軟骨細胞において、ＴＮＦα、ＩＬ−１、リポポリサッカライドにより活性化される。
【００４５】
ＶＬＤＬＲ：Very low density lipoprotein receptor
ＶＬＤＬＲは、５つのドメインからなり、２７残基のシグナルペプチドをもつ、８４６アミノ酸のタンパク質である。ＶＬＤＬＲの遺伝子は、心臓、筋肉、脂肪組織で発現していて、脂肪酸代謝で活性化される。
【００４６】
リポタンパクリパーゼ（Lipoprotein lipase）
リポタンパクリパーゼは、主に、カイロミクロン、ＶＬＤＬに含まれるトリグリセリドをグリセリールと脂肪酸に加水分解する酵素である。
【００４７】
Ｅａｒ（Eosinophil associated ribonuclease）Ａファミリー、メンバー１，２，３，１２
リボヌクレアーゼ（RNAse）ファミリーのメンバーである。
【００４８】
ＩＮＳＬ５：Insulin like 5
ＩＮＳＬ５は、インスリン遺伝子のスーパーファミリーのホルモンであり、１３５アミノ酸のタンパク質と推定されていて、細胞の成長、代謝、組織特異的機能を調節する。このファミリーメンバーは、シグナルペプチドにより特徴づけられる。
【００４９】
ＴＧＦβ２：Transforming growth factor beta 2
Transforming growth factor beta（ＴＧＦ−β）は、多くの細胞において、増殖、細胞の分化、その他の機能をコントロールする。免疫、癌、心疾患、糖尿病などにおいて役割を果たす。ＴＧＦ−βは正常の上皮細胞や腫瘍形成の早期のステージにおいて、抗増殖因子として働く。いくつかの細胞は、ＴＧＦ−βを分泌し、ＴＧＦ−βに対するレセプターを持っている。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３という３つのアイソフォームが存在する分泌タンパクである。
【００５０】
ＨＡＭＰ：Hepcidin antimicrobial peptide 1
ＨＡＭＰは、肝臓に発現する、抗バクテリア、抗真菌性のタンパクであり、鉄代謝におけるシグナル分子でもある。ＨＡＭＰは血中を循環し、体内における鉄の供給が過剰になったときに、小腸での鉄吸収を阻害する。
【００５１】
リパーゼＨ：Lipase member Ｈ（ＬＩＰＨ）
リパーゼＨは、トリグリセリドのリパーゼファミリーのメンバーであり、４５１アミノ酸からなるタンパク質である。リパーゼＨタンパクは、約６３ｋＤａの分子量をもつ分泌タンパクである。他のメンバーと同様に、リパーゼＨは脂質とエネルギー代謝に関連することが示唆されている。
【００５２】
ＣＹＰ７Ｂ１：Cytochrome P450 family 7 subfamily b polypeptide 1
コレステロールからの胆汁酸の合成は、cholesterol 7-alpha-hydroxylase（ＣＹＰ７Ａ１）が関与する中性の経路と、ミクロソームオキシステロール7-alpha-hydroxylase （ＣＹＰ７Ｂ１）が関与する酸性の経路の、２つの経路を介して起こる。
ＣＹＰ７Ｂ１ノックアウトマウスでは、血清と組織において、２つのオキシステロール、25-hydroxycholesterol と27-hydroxycholesterolレベルが上昇したことが知られている。
【００５３】
第２因子群のうち、ＮＡＳＨの検出・診断、重篤度・治療効果の評価のために好ましく用いられるマーカーとしては、測定の簡便性の点から、ＩＬ−２、アポリポタンパクＡ-IV、ＣＣＬ２、トロンボスポンジン１、トレハラーゼ、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、補体Ｄ因子、アポリポタンパクＣ-II、リポタンパクリパーゼ、ＨＡＭＰ、リパーゼＨが挙げられる。これらのマーカーは、特にＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分とする医薬組成物によるＮＡＳＨ治療効果の評価に有用である。これらの中でも、アポリポタンパクＡ-IV、トロンボスポンジン１、トレハラーゼ、補体Ｄ因子、アポリポタンパクＣ-II、リパーゼＨが特に好ましく、とりわけ好ましくは、トロンボスポンジン１、補体Ｄ因子である。
【００５４】
生体試料
本発明における生体試料とは、被験者から採取された、血液、血漿、血清、尿、体液、組織などをいうが、特に限定されない。好ましくは、血液、血漿、血清である。被験者からの生体試料の採取は、公知の方法に従って行う。
【００５５】
マーカーの測定方法
本発明のマーカーとなる因子がタンパク質である場合の「量」の測定は、特に限定されないが、例えば、血液試料中におけるマーカーの絶対量や濃度を測定することができる。
本発明においては、対応する抗体が認識する抗原をマーカーとすることができる。本発明のマーカーは、対応する抗体が認識して測定できる抗原である限り、対象となるマーカーのアミノ酸配列の部分配列、つまりマーカータンパク質の一部であってもよく、その立体構造の変化、糖鎖もしくは脂質等の付加されたものであってもよい。
具体的な測定方法は、特に限定されないが、免疫学的測定法を用いることが好ましい。競合法、非競合法（サンドイッチ法）のいずれを用いてもよく、例えば、酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ法、放射免疫分析（ＲＩＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）、発光免疫分析（ＬＩＡ）などが用いられる。凝集法、ウエスタンブロッティング法、プロテインチップを用いた方法などを用いてもよい。その他、プロテオミクス手法等により測定されてもよいが、これらに限定されない。また、市販の測定キットを使用して測定してもよい。
本発明のマーカーとしてタンパク質を用いる場合は、「活性」を測定することにより評価されてもよい。本発明のマーカーの「活性」の測定方法は、特に限定されないが、例えば、マーカーとするタンパク質と、該タンパク質の基質とを一定時間反応させて、生成された物質又は二次的に生成された物質を定量することによりタンパク質の活性をみる方法が挙げられる。
【００５６】
マーカーの測定に用いられる抗体
タンパク質の検出に用いられる抗体は、該タンパク質に特異的結合性を有する限り、その種類や由来などは特に限定されない。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を使用できるが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００５７】
抗体の作製
抗体の作製方法は、特に限定されないが、目的とするタンパク質またはその部分配列ペプチドで動物を免疫して、モノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を作製することができる。モノクローナル抗体を作製する場合、例えば、抗体産生細胞を骨髄腫細胞と細胞融合させることで自律増殖能を持ったハイブリドーマを作成し、目的の特異性をもった抗体を産生しているクローンのみをスクリーニングする。この細胞を培養し、分泌する抗体を精製することによって得られる。ポリクローナル抗体を作製する場合は、動物の血清として回収し、精製して得ることができる。その他、ファージディスプレイ法などが用いられてもよい。
【００５８】
マーカー遺伝子の測定方法
本発明のマーカーが遺伝子である場合、遺伝子はｃＤＮＡ等のＤＮＡ、及びｍＲＮＡ等のＲＮＡであってもよい。遺伝子発現量の測定方法は、特に限定されないが、マイクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ、サザンブロット法、ノーザンブロット法、in situハイブリダイゼーション法、ドットプロット法などが挙げられる。この場合の生体試料は組織、特に肝組織が好ましい。
【００５９】
２．ＮＡＳＨの検出、重篤度・治療効果の評価のための方法
本発明において、ＮＡＳＨの検出・診断、重篤度・治療効果の評価を単に「評価」と称することがある。本発明のＮＡＳＨの評価のための方法は、医師がＮＡＳＨの診断を、あるいは重篤度・治療効果の評価を行う場合に、医師の判断のための指標を提供するための方法である。
本発明のＮＡＳＨの検出、重篤度・治療効果の評価のための方法は、少なくとも上記第１因子をマーカーとして用いる。
【００６０】
＜ＮＡＳＨ検出方法＞
本発明の被験者におけるＮＡＳＨの検出方法は、Ａ）被験者の生体試料における、１以上の第１因子の量及び／又は活性を測定する工程を含む方法である。この方法は、１以上の第２因子の量及び／又は活性を測定する工程をさらに含んでもよい。Ｂ）目的とするマーカーについて、事前に疾患の陽性と陰性の境界値であるカットオフ値を決定し、上記Ａ）の被験者の測定値とカットオフ値とを比較する工程をさらに含むことが望ましい。この場合、被験者の測定値がカットオフ値と比較して陽性のときに被験者におけるＮＡＳＨの存在が示唆される。
本発明において、カットオフ値の決定方法は、特に限定されないが、例えば、健常者の平均値±２ＳＤ（標準偏差）、あるいは健常者の平均値±１ＳＤ、健常者の平均値±３ＳＤ、健常者の平均値をカットオフ値として用いてもよい。好ましくは健常者の平均値±２ＳＤである。
本発明の実施例１に記載の第１因子を用いる一例を示すと、カットオフ値の決定方法として平均値＋２ＳＤを用いるとすると、ＩＬ−１ｒａの場合、カットオフ値は６５２（ｐｇ／ｍＬ）となり、このとき、感度は１００％、特異度は１００％となる。同様に、カットオフ値の決定方法として平均値＋２ＳＤを用いると、ｓＣＤ４０のカットオフ値は１７．２（ｐｇ／ｍＬ）、感度は１００％、特異度は９０％である。ＨＭＧＢ１のカットオフ値は３．４（ｎｇ／ｍＬ）、感度は８６％、特異度は１００％と計算できる。
【００６１】
また、例えば、Ｒｏｃ曲線を用いてカットオフ値を決定してもよい。Ｒｏｃ曲線を用いる方法の一例を示すと、健常者とＮＡＳＨ患者の生体試料における目的とするマーカーを測定して、各測定値における感度（陽性率）、特異度、偽陽性率（１−特異度）を求めて、Ｘ軸に偽陽性率（１−特異度）、Ｙ軸に感度（陽性率）をプロットしてＲｏｃ曲線を作成する。このとき、感度と特異度の優れた理想的なマーカーのＲｏｃ曲線は、左上隅に近づくため、左上隅との距離が最小となる点をカットオフ値とすることができる。また、Youden indexを用いた方法によりカットオフ値を決定してもよい。
カットオフ値を用いてＮＡＳＨを検出する場合、ＮＡＳＨの定義やマーカーの測定方法によって、カットオフ値が変わってくる。従って、目的とするマーカーについて、健常者、ＮＡＳＨ患者の測定値を事前に確認して、カットオフ値を決めて、それに従って検出することが好ましい。本発明の実施例に従って、被験者の血漿を用いてマーカーの測定を行う場合には、本発明の実施例で得られた数値を参考にＮＡＳＨを検出することができる。
【００６２】
＜ＮＡＳＨ重篤度の評価のための方法＞
本発明の被験者におけるＮＡＳＨ重篤度の評価のための方法は、被験者におけるＮＡＳＨの重篤度を評価するために用いられる方法であり、少なくとも、Ａ）被験者の生体試料における、１以上の第１因子の量及び／又は活性を測定する工程を含む方法である。この方法は、１以上の第２因子の量及び／又は活性を測定する工程をさらに含んでもよい。
前記のＮＡＳＨ検出方法と同様に、事前にカットオフ値を決定し、Ａ）の測定値と、カットオフ値とを比較する工程を含んでもよい。また、被験者の生体試料におけるマーカー（因子）の測定値の経時的変化を比較する工程を含んでもよい。
この方法において、被験者のマーカー測定値が健常者の平均値に近づくほど、ＮＡＳＨが重篤ではないことが示唆される。逆に、被験者のマーカー測定値が健常者の平均値から遠くなるに従い、ＮＡＳＨが重篤である、あるいは、病態の悪化が示唆される。
【００６３】
＜治療効果の評価のための方法＞
本発明の被験者におけるＮＡＳＨ治療効果の評価のための方法は、ＮＡＳＨである被験者に治療を行った場合の治療効果の評価に用いられる方法であり、少なくとも、被験者の生体試料における、第１因子群および第２因子群からなる群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして、一定期間以上の間を空けて少なくとも２回測定し、測定値を比較する工程を含む。
この方法は、少なくとも第１因子群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして用いることが望ましい。マーカーの測定が一定期間以上の間を空けて複数回行われ、マーカー測定値の経時的変化を比較する工程を含む態様も望ましい。前記と同様に、被験者のマーカー測定値をカットオフ値と比較する工程を含んでもよい。
本発明におけるＮＡＳＨ治療とは、ＮＡＳＨ治療薬の投薬、運動療法、食事療法、その他ＮＡＳＨ治療を目的として行われる瀉血、外科的治療等の治療方法を含む。本発明においてＮＡＳＨ治療が行われる期間をＮＡＳＨ治療期という。
この治療効果の評価のための方法において、被験者のマーカー測定値が健常者の平均値に近づくように変動すれば、ＮＡＳＨ治療効果が得られていることが示唆される。逆に、被験者のマーカー測定値が健常者の平均値から遠くなるように変動すれば、治療効果が得られていないことが示唆される。
【００６４】
本発明の治療効果の評価のための方法は、ＮＡＳＨ治療が一定期間以上行われ、前記マーカーの測定がＮＡＳＨ治療期に一定期間以上の間を空けて行われることが望ましい。本発明において一定期間とは特に限定されないが、好ましくは１週間、より好ましくは１ヶ月、３ヶ月、６カ月、１年であり、１年以上の期間であってもよい。例えば、３ヶ月毎に定期的に被験者の生体試料におけるマーカー（因子）が測定される態様も望ましい。
【００６５】
ＮＡＳＨ治療のためにＮＡＳＨ治療薬が投薬され、該ＮＡＳＨ治療薬の治療効果の評価を行う場合、ＮＡＳＨ治療薬は後述のＮＡＳＨ治療方法において述べるとおりであり、特に限定されないが、好ましくはＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物である。
【００６６】
ＮＡＳＨ治療薬としてＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物を用いる場合、ＮＡＳＨ治療効果の評価のための方法は、第２因子のマーカーが用いられることが望ましい。
すなわち、この発明の態様は、
ａ）被験者の生体試料における第２因子群から選択される１以上の測定値の第１の決定を得る工程
ｂ）ＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物を投薬する工程
ｃ）被験者の生体試料におけるa)で測定値を得た因子の測定値の第２の決定を得る工程
ｄ）被験者の第１の決定と第２の決定を比較して、被験者の状態を評価する工程
を含む、被験者における、ＥＰＡ類の少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物によるＮＡＳＨ治療効果の評価のための方法である。
【００６７】
＜マーカーを複数組み合わせた評価＞
本発明に係るマーカーは、単独で用いられてもよいが、複数のマーカーを組み合わせて用いて、ＮＡＳＨの検出、評価の精度を高めることも可能である。このマーカーは、通常、少なくとも第１の因子を含む。
例えば、ＮＡＳＨの検出において本発明の２種のマーカーを用いる場合、２種のマーカーがどちらも陽性であるときに被験者におけるＮＡＳＨの存在を示唆してもよい。いずれか一方のみが陽性の場合には、例えば、本発明の他のマーカーを測定したり、その他の診断方法と組み合わせてＮＡＳＨの存在を示唆してもよい。
本発明のマーカーの組み合わせの好ましい態様は、特に限定されないが、ＮＡＳＨの検出、重篤度・治療効果の評価のために用いられるマーカーとして、ＩＬ−１レセプターアンタゴニストが含まれていることが望ましく、また、アポトーシスに関連するといわれるｓＣＤ４０とネクローシスに関連するといわれるＨＭＧＢ１とを組み合わせることも好ましい。ｓＣＤ４０とＨＭＧＢ１はＡＳＴと相関する傾向が得られたことから、重篤度・治療効果の評価のために用いられる態様も好ましい。
【００６８】
本発明のマーカーは、従来、ＮＡＳＨ診断や評価に用いられている検査、血液検査マーカーや、画像による検査（超音波、ＣＴ、ＭＲＩなど）、治療効果の指標などと組み合わせて使用されてもよい。本発明においてこれらを併せて、その他の検査指標という。
診断手法と組み合わせて使用されてもよい。複数の診断方法を組み合わせることにより、検出、評価の精度を高めることも可能である。
従来、ＮＡＳＨの検出や評価に用いられる指標としては、例えば、血清脂質データ（ＴＧ、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＴＣ、ＶＬＤＬ、ＥＰＡ濃度、ＥＰＡ／アラキドン酸（ＡＡ）比など）、遊離脂肪酸、肥満、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＳＴ／ＡＬＴ比、血清フェリチン、血清チオレドキシン、malondialdehyde、4-hydroxynonenal、 nitric oxide、ＨＯＭＡ−ＩＲ、血小板数、ＴＮＦα、アディポネクチン、レプチン、高感度ＣＲＰ、ヒアルロン酸、ＩＶ型コラーゲン７Ｓ、プロコラーゲンIIIポリペプチド、ＣＫ１８フラグメント、病理所見（脂肪肝：steatosis、肝細胞風船様腫大：hepatocellular ballooning、実質炎症：lobular inflammation、小葉内の炎症：ballooning inflammation、肝細胞膨化：ballooning degeneration、肝線維化：fibrosis、マロリー体形成：Mallory body）、ＮＡＳスコア（Ｋｌｅｉｎｅｒらの文献：Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２００５；４１：１３１３−１３２１），Ｆａｓ（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００３；１２５（２）４３７−４３），ＨｂＡ1ｃ，空腹時血糖、体重、腹囲などが挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、本発明のマーカーであるｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１及び補体Ｄ因子とその他の検査指標であるＮＡＳスコア及びＡＬＴとを組み合わせて評価することも望ましい。また、例えば、本発明のマーカーであるＨＭＧＢ１とその他の検査指標であるＦａｓを組み合わせて評価されることも望ましい。
ＮＡＳＨの治療効果の指標として、血中や肝臓の脂肪酸含量や脂肪酸組成比も好ましく用いられる。脂肪酸は、例えば、脂肪酸２４分画の公知の手法により測定でき、全脂肪酸中のモル％で算出することができる。脂肪酸組成比とは、例えば、オレイン酸（ＯＡ）／ステアリン酸（ＳＡ）比、ステアリン酸（ＳＡ）／パルミチン酸（ＰＡ）比、オレイン酸（ＯＡ）／パルミチン酸（ＰＡ）比などが使用できるが、特にこれらに限定されない（ＷＯ２００９／１５１１２５参照）。
【００６９】
３．治療方法
本発明では、上記ＮＡＳＨの検出及び／又は重篤度の評価のための方法で評価された被験者に対して、ＮＡＳＨ治療を行う、ＮＡＳＨ治療方法を提供する。本発明においてＮＡＳＨ治療は、好ましくは、ＮＡＳＨ治療薬、さらに好ましくはＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物の投薬である。さらに、本発明のマーカーを用いてＮＡＳＨ治療薬の治療効果の評価を行いながら、ＮＡＳＨ治療を行う方法を含む。
【００７０】
＜ＮＡＳＨ治療薬＞
本発明の治療方法において用いられるＮＡＳＨ治療薬は、ＮＡＳＨの病態を治療、軽減、緩和するために使用される薬物であれば特に限定されないが、次に述べるＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物の他、例えば、チアゾリジン誘導体（ピオグリタゾン、ロシグリタゾンなど）、ビグアナイド薬（メトホルミンなど）、αグルコシダーゼ阻害剤、スルホニルウレア剤、ナテグリニド、ＤＰＰ−４阻害剤（シタグリプチン、アログリプチン、ビルダグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチンなど）、ＧＬＰ−１受容体作動薬（リラグルチド、エキセナチド、タスポグルタイドなど）、ＰＤＥ−４阻害剤、フィブラート系薬剤（ベザフィブラートなど）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（プラバスタチン、アトルバスタチンなど）、プロブコール、アンギオテンシンII-１型受容体拮抗薬（ＡＲＢ：ロサルタンなど）、ウルソデオキシコール酸、タウリン、ポリエンホスファチジルコリン、抗酸化剤（ビタミンＥ、ビタミンＣ、ニコチン酸トコフェロール、Ｎ−アセチルシステインなど）、抗ＴＮＦ治療（抗ＴＮＦα抗体など）、ペントキシフィリン、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｍｉｌｋ  Ｔｈｉｓｔｌｅ，プロバイオティクスなどが挙げられる。ＮＡＳＨ治療薬は、治療上有効量が投薬される。これらの薬物は、ＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物と併用して投薬されることも可能であり、併用により優れた治療効果が発揮される。糖尿病をもつＮＡＳＨ患者は、特に、ＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物と抗糖尿病薬（例えば、ピオグリタゾン、スルホニルウレア剤、ＤＰＰ−４阻害剤など）が併用されることが望ましい。被験者が服用している薬剤（例えば、血圧低下剤、高脂血症剤、抗血栓剤など）は継続されることが望ましい。例えば、抗血栓薬のワーファリンやクロピドグレルがＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物と併用投与されてもよい。
【００７１】
＜ＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物＞
本発明に用いられるＥＰＡ類は、市販品の他、魚油やＥＰＡ産生菌およびその培養液を公知の方法、例えば連続式蒸留法、尿素付加法、液体クロマトグラフィー法、超臨界流体クロマトグラフィー法等あるいはこれらの組み合わせで精製して得ることができ、必要によりエステル化処理してエチルエステル等のアルキルエステルやグリセリド等のエステルとすることができる。また、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩基またはベンジルアミン塩、ジエチルアミン塩等の有機塩基あるいはアルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸との塩とすることができる。
【００７２】
本発明においてＥＰＡ類は、特に断らない限りは、ＥＰＡの遊離体のほか上記のような塩およびエステルも含む。ヒトあるいは動物に投与する場合は、製薬学上許容しうるものが好ましい。これらのうちでも、ＥＰＡはＥＰＡ−Ｅのエステル形態での使用が好ましい。
本発明に用いられるＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物は、ＥＰＡ類の純品を使用できることはもちろん、ＥＰＡ類とともに他の脂肪酸を有効成分として含有してもよい。これらの脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサモノエン酸、アラキドン酸、イコサテトラエン酸、イコサトリエン酸、イコサモノエン酸オクタデカテトラエン酸、α−リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、パルミトオレイン酸、ヘキサデカトラエン酸、ヘキサデカトリエン酸およびヘキサデカジエン酸等の不飽和脂肪酸あるいはベヘン酸、アラキジン酸、ステアリン酸、パルミチン酸およびミリスチン酸等の飽和脂肪酸等が例示される。また、上述の例の脂肪酸は遊離体のほか、それらのナトリウム塩等の無機塩基との塩またはベンジルアミン塩等の有機塩基との塩、さらにはそれらのエチルエステル等のアルキルエステルまたはグリセリド等のエステル体であってもよい。
【００７３】
本発明のＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物において、有効成分としてＥＰＡ類以外の脂肪酸を含む場合には、ＥＰＡ類を全脂肪酸中、５０重量％以上、好ましくは７０重量％以上、さらに好ましくは８５重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、とりわけ好ましくは９６．５質量％以上の量で含有することが望ましい。アラキドン酸含量は少ないことが望まれる。
【００７４】
また、例えば、ＥＰＡ−Ｅ及びＤＨＡ−Ｅを用いる場合、ＥＰＡ−Ｅ／ＤＨＡ−Ｅの組成比及び全脂肪酸中のＥＰＡ−Ｅ＋ＤＨＡ−Ｅの含量比は特に問わないが、好ましい組成比として、ＥＰＡ−Ｅ／ＤＨＡ−Ｅは、０．８以上であることが好ましく、更に好ましくは、１．０以上、より好ましくは、１．２以上である。ＥＰＡ−Ｅ＋ＤＨＡ−Ｅは高純度のもの、例えば、全脂肪酸及びその誘導体中のＥＰＡ−Ｅ＋ＤＨＡ−Ｅ含量比が４０質量％以上のものが好ましく、５５質量％以上のものがさらに好ましく、８４質量％以上のものがさらに好ましく、９６．５質量％以上のものが更に好ましい。他の長鎖飽和脂肪酸含量は少ないことが好ましく、長鎖不飽和脂肪酸でもω６系、特にアラキドン酸含量は少ないことが望まれ、２質量％未満が好ましく、１質量％未満がさらに好ましい。
【００７５】
本発明のＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物は、例えば賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、香味剤、滅菌水、植物油、無害性有機溶媒、無害性溶解補助剤（例えばグリセリン、プロピレングリコール）、乳化剤、懸濁化剤（例えばツイーン８０、アラビアゴム溶液）、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、無痛化剤などを必要に応じて使用することができる。
【００７６】
特にＥＰＡ類は高度に不飽和であるため、上記の製剤は、抗酸化剤をＥＰＡ類の酸化を抑制する有効量で含有させることが望ましい。抗酸化剤としては、例えばブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、プロピルガレート、没食子酸、医薬として許容されうるキノンおよびα−トコフェロールを使用することができる。
【００７７】
製剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、経口用液体製剤、坐剤、シロップ剤、吸入剤、点眼剤、軟膏、注射剤（乳濁性、懸濁性、非水性）、あるいは用時乳濁または懸濁して用いる固形注射剤の形態などが挙げられる。
なおＥＰＡ−Ｅ含有軟カプセル剤であれば、副作用の発現が少なく、安全な閉塞性動脈硬化症および高脂血症治療薬としてエパデールおよびエパデールＳ（いずれも持田製薬社製）の商品名で国内で市販されている高純度ＥＰＡ−Ｅ含有軟カプセル剤の市販品を使用することができる。また、ＥＰＡ−ＥとＤＨＡ−Ｅの混合物は、たとえば、米国で高ＴＧ血症治療薬として市販されているロバザ（Ｌｏｖａｚａ：グラクソ・スミス・クライン：ＥＰＡ−Ｅ約４６．５質量％、ＤＨＡ−Ｅ約３７．５質量％含有する軟カプセル剤）を使用することもできる。
【００７８】
本発明のＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物の投与量は、対象となる作用を現すのに十分な量とされるが、その剤形、投与方法、１日当たりの投与回数、症状の程度、体重、年齢等によって適宜増減することができる。
経口投与する場合には、ＥＰＡとして０．１〜９ｇ／日、好ましくは０．５〜６ｇ／日、さらに好ましくは１〜３ｇ／日を３回に分けて投与するが、必要に応じて全量を１回あるいは数回に分けて投与してもよい。また、例えば、ＥＰＡ−Ｅ及び／又はＤＨＡ−Ｅとして０．１〜１０ｇ／日、好ましくは０．３〜６ｇ／日、より好ましくは０．６〜４ｇ／日、さらに好ましくは０．９〜２．７ｇ／日、あるいは０．９〜１．８ｇ／日で投与されてもよい。
【００７９】
＜本発明の治療効果の評価のための方法を含むＮＡＳＨ治療方法＞
本発明のＮＡＳＨ治療方法は、前記の治療効果を評価するための方法をＮＡＳＨ治療方法の中にとり入れることも望ましい。すなわち、本発明の別の態様として、被験者の生体試料における、第１因子群および第２因子群からなる群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして、一定期間以上の間を空けて少なくとも２回測定し、測定値を比較してＮＡＳＨ治療効果を評価することを含むＮＡＳＨ治療方法を提供する。この治療方法は、治療効果の評価に基づいて被験者の治療方法が決定される工程をさらに含んでもよい。例えば、ＮＡＳＨ治療薬による治療効果が得られていない、あるいは十分でないと評価された被験者に対して、同治療薬の用量を増加する、他の治療方法・治療薬を追加する、又は他の治療方法・治療薬に切り替える等を行ってもよい。また、ＮＡＳＨ治療薬による治療効果が得られていると評価された被験者に対しては、そのまま投薬を継続することが望ましい。
【００８０】
本発明のＮＡＳＨ治療方法において、特に好ましい治療薬はＥＰＡ類から選ばれる少なくとも１つを有効成分として含有する医薬組成物であり、この場合、治療効果の評価には第２因子のマーカーが用いられることが好ましい。
【００８１】
＜本発明のマーカーによる治療方法の選択を含むＮＡＳＨ治療方法＞
本発明のＮＡＳＨ治療方法は、被験者の生体試料の、本発明のマーカーである第１因子群および第２因子群からなる群より選ばれる１以上の因子をマーカーとして測定し、測定値の評価からＥＰＡ類によるＮＡＳＨ治療方法を選択し、該被験者にＥＰＡ類を含有する医薬組成物を投薬するＮＡＳＨを治療する方法である。特に第２因子群の因子は、ＥＰＡ−Ｅの効果との関連が確認できたことから、第２因子群の異常の度合いが大きい被験者はＥＰＡ類による治療効果を得やすいことが示唆される。
ＥＰＡ類による治療を選択するのに用いられるマーカーとして望ましいのは、第２因子群からなる群より選ばれるマーカーであり、さらに望ましくは、トロンボスポンジン１、補体Ｄ因子である。また、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１もＥＰＡ類による治療を選択するのに用いられるマーカーとして望ましい。その他の検査指標も併せて用いられてもよい。
例えば、被験者の、第２因子群の因子である補体Ｄ因子が測定され、事前に定めた基準値と比較して高い被験者はＥＰＡ類を含有する医薬組成物による治療が行われることが望ましい。また、例えば、被験者の、補体Ｄ因子、ｓＣＤ４０及びＨＭＧＢ１が測定され、事前に定めた基準値と比較して高い被験者はＥＰＡ類を含有する医薬組成物による治療が行われることが望ましい。ここでの基準値の決定方法は、特に限定されないが、医療従事者が、健常者、ＮＡＦＬＤ患者及びＮＡＳＨ患者における因子の平均値をもとに決定することができる。さらに、その他の検査指標（例えば、ＮＡＳスコア、ＡＬＴ値、ＥＰＡ/ＡＡ比など）と組み合わせて治療方法が決定されてもよい。
この方法は、いいかえると、本発明のマーカーによりＮＡＳＨ及び／又はＮＡＦＬＤの被験者の中からＥＰＡ類の投薬による治療が適する被験者を選択し、該被験者にＥＰＡ類を含有する医薬組成物を投薬するＮＡＳＨを治療する方法である。
【００８２】
４．キット
本発明において、ＮＡＳＨの検出、重篤度・治療効果の評価のための方法に用いられる、被験者の生体試料中の第１因子および第２因子からなる群から選択される１つ以上、好ましくは第１因子群から選択される１つ以上の量及び／又は活性を測定するキットを提供する。
本発明のマーカーとしてこれらのタンパク質を用いる場合の測定キットは、該マーカーを測定する手段を備えていればよく、特に限定されないが、好ましくは、該マーカーに対する抗体を含むことが望ましい。該タンパク質に対する抗体は、抗体フラグメントであってもよく、標識された抗体を含むことが望ましい。サンドイッチ法による測定キットが望ましい。
本発明のマーカーのタンパク質の活性を指標として測定する場合の測定キットは、該タンパク質に特異的な基質を含む。本発明のマーカーとして、ｓＰＬＡ２活性を測定する場合、ｓＰＬＡ２活性測定用基質は、特に限定されないが、ＰＬＡ２がリン脂質をｓｎ−２の位置で加水分解する酵素であるため、基質にはリン脂質を含むことが好ましい。例えば、Diheptanoyl Thio‐phosphatydylcholineなどが挙げられるが、これに限定されない。
本発明の測定キットは、該タンパク質の標準品や発色試薬を含むことも望ましい。
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８３】
（実施例１）ヒトＮＡＳＨ患者の確認試験
肝生検によりＮＡＳＨと診断されたヒトＮＡＳＨ患者の血漿（７検体）、健常者の血漿（１０検体）の、ＩＬ−１ｒａ、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２groupIIＡの抗原量としての各濃度、及び、ｓＰＬＡ２活性を測定し、比較した。
測定には市販の測定キット、ＩＬ−１ｒａ（カタログ番号：ＤＲＡ００Ｂ／Ｒ＆Ｄ Systems Inc.：US）、ｓＣＤ４０（ＫＴ−００３／KAMIYA BIOMEDICAL COMPANY:Seattle WA）、ＨＭＧＢ１（３２６０５４３２９／Shino-Test Corporation：Japan）、ｓＰＬＡ２groupIIＡ（５８５０００／Cayman Chemical Company：US）、ｓＰＬＡ２活性（７６５００１／Cayman Chemical Company：US）を用いて行った。
すなわち、ＩＬ−１ｒａは、（１）抗ＩＬ−１ｒａモノクローナル抗体が固定化されたマイクロプレートに検体を加えて反応させ、その後、（２）標識したポリクローナル抗体を加えて反応させて測定した。上記と同様に、ｓＣＤ４０は（１）抗ｓＣＤ４０モノクローナル抗体、（２）標識したポリクローナル抗体を、ＨＭＧＢ１は（１）抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体、（２）標識した抗ＨＭＧＢ１、２モノクローナル抗体を用いて測定した。ｓＰＬＡ２groupIIＡは（１）に抗ｓＰＬＡ２groupIIＡモノクローナル抗体を用い、sPLA2分子の異なるエピトープに選択的に結合するアセチルコリンエステラーゼ：Fab'複合体を加えて、検体を加えて反応させて測定した。ｓＰＬＡ２活性は、基質としてDiheptanoyl Thio‐phosphatydylcholineが用いられ、検体と反応させて遊離したthiolsをＤＴＮＢにより検出した。
測定結果を表１に示す。測定結果は、平均値（mean）±標準偏差（ＳＤ）で示す。有意差の検定には、Wilcoxon検定を用いた。Wilcoxon検定（健常者vs  ＮＡＳＨ患者）は、+（ｐ＜０．０５）、++（ｐ＜０．０１）で示す。【００８４】
【表１】
2011046204.tif 000003
【００８５】
ＮＡＳＨ患者の血漿中のＩＬ−１ｒａ、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、ｓＰＬＡ２groupIIＡの各濃度は、健常者と比較して有意に上昇していた。一方、ＮＡＳＨ患者の血漿におけるｓＰＬＡ２活性は、健常者と比較して有意に低下した。今回、ＮＡＳＨ患者の血漿において、ｓＰＬＡ２groupIIＡ濃度は上昇し、ｓＰＬＡ２活性は低下がみられた理由は明らかではないが、ｓＰＬＡ２活性は、ｓＰＬＡ２groupIIＡだけではなく、ｓＰＬＡ２全体の活性を測定したためにこのような結果が得られたのかもしれない。また、あるいは、ＮＡＳＨ患者では、ｓＰＬＡ２groupIIＡ抗体により測定されるが、活性をもたないｓＰＬＡ２groupIIＡが増加した可能性も考えられる。【００８６】
また、ＮＡＳＨ患者における各患者の上記各因子の値とＡＳＴ値との相関を、図１（ＩＬ−１ｒａ）、図２（ｓＣＤ４０）、図３（ＨＭＧＢ１）、図４（ｓＰＬＡ２groupIIＡ）、図５（ｓＰＬＡ２活性）に示す。いずれの因子においても、ＡＳＴ値と相関する傾向が見られたが、特に、ＨＭＧＢ１、ｓＣＤ４０でよりその傾向が高かった。
以上より、上記各因子は、ＮＡＳＨを検出、重篤度を評価するマーカー、及び／又は、薬剤によるＮＡＳＨ治療効果を判定するマーカーとして使用できることが示唆された。【００８７】
（実施例２）第２マーカー候補の抽出
Ｂ６マウス（１０週齢）を、コントロール群（Ｉ）、ＨＦ−ＨＳ群（II）、ＥＰＡ群（III）に分け（ｎ＝７−１０）、以下の飼料の自由摂食により２０週飼育した。
Ｉ群：通常食（魚粉抜きＦ１）（フナバシファーム社製）
II群：高脂肪／高ショ糖食（Harlan Laboratories）＋５％パルミチン酸エチル（和光純薬）
III群：高脂肪／高ショ糖食（Harlan Laboratories）＋５％ＥＰＡ−Ｅ（日本水産）
２０週間の飼育の後、II群では脂肪肝を認めたが、Ｉ群及びIII群では脂肪肝を認めなかった。【００８８】
各群のマウスの肝臓を摘出し、ホモジネートよりＲＮＡを抽出して、肝臓の遺伝子マイクロアレイ解析を行い、以下のとおり遺伝子選抜を行った。
（１）II群／Ｉ群の発現比が２倍以上、かつ、III群／II群の発現比が１／２以下の遺伝子をピックアップする。
（２）II群／Ｉ群の発現比が１／２以下、かつ、III群／II群の発現比が２倍以上の遺伝子をピックアップする。
（３）Ｉ、II、III群のいずれにおいても、意味のある発現をしていない遺伝子をピックアップする。
（４）（１）から（３）を除いた遺伝子をピックアップする。
（５）（２）から（３）を除いた遺伝子をピックアップする。【００８９】
（６）第２マーカー（Ａ）候補の抽出
上記（４）の遺伝子の中から、タンパクが血中に分泌される可能性のある因子をピックアップし、さらにこの中から、脂質代謝に関連する、炎症に関連する、ＳＲＥＢＰトランスジェニックマウスの肝臓で発現が上昇する、のうちのいずれかを満たす遺伝子をピックアップした。得られた遺伝子群（第２因子（Ａ）群）を表２に示す。【００９０】
【表２】
2011046204.tif 000004
【００９１】
（７）第２マーカー（Ｂ）候補の抽出
上記（５）の遺伝子について、（６）と同様の手順で遺伝子を選抜した。得られた遺伝子群（第２因子（Ｂ）群）を表３に示す。
【表３】
2011046204.tif 000005
【００９２】
（実施例３）第２因子を用いるヒトＮＡＦＬＤ患者の確認試験
表２、３に記載の因子について、ヒトＮＡＦＬＤ患者、健常者の血漿中の各濃度を測定する。測定には、市販の測定キットを用いるか、対応する抗体を用いることにより測定可能である。対応する抗体が入手できない場合には、前記のとおり作製することができる。
（Ａ）群（表２）中のThrombospondin （トロンボスポンジン）１とcomplement factor Ｄ（補体Ｄ因子）について、ヒトＮＡＦＬＤ患者（肝生検によりＮＡＳＨと診断されたヒトＮＡＳＨ患者は除外した）の血漿（３検体）、及び、健常者の血漿（１０検体）中の各濃度を測定した。
測定には市販の測定キット、Thrombospondin１（カタログ番号：ＤＴＳＰ１０／Ｒ＆ＤSystems Inc.：US）、complement factor Ｄ（ＤＦＤ００／Ｒ＆Ｄ Systems Inc.：US）を用いた。
トロンボスポンジン１は、（１）抗トロンボスポンジン１モノクローナル抗体を結合させたマイクロプレートに検体を加えて反応させ、その後、（２）標識した抗トロンボスポンジン１ポリクローナル抗体を加えて反応させて測定した。同様に、補体Ｄ因子は、（１）に抗補体Ｄ因子モノクローナル抗体、（２）に標識した抗補体Ｄ因子ポリクローナル抗体を用いて測定した。
測定結果を表４に示す。測定結果は、平均値（mean）±標準偏差（ＳＤ）で示す。有意差の検定には、Wilcoxon検定を用いた。Wilcoxon検定（健常者vs  ＮＡＦＬＤ患者）は、＋（ｐ＜０．０５）、＋＋（ｐ＜０．０１）で示す。【００９３】
【表４】
2011046204.tif 000006
ＮＡＦＬＤ患者の血漿中のトロンボスポンジン１濃度、及び補体Ｄ因子濃度は、健常者と比較して有意に上昇していた。
表２中の因子は、脂肪肝を示すマウスの肝臓で遺伝子発現が上昇する因子であるが、ヒトＮＡＦＬＤ患者の血漿においても健常者と比較して、これらに対応するタンパク濃度が上昇する可能性が高く、血中で測定可能なＮＡＦＬＤのマーカーとなる可能性が示された。【００９４】
（試験例１）  ＮＡＳＨ検出のための方法、治療効果の評価のための方法、及び治療方法
ＮＡＳＨである可能性のある被験者３０例の血漿を採取し、ＩＬ−１ｒａ、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１を測定し、それぞれの因子について予め定めたカットオフ値と比較する。カットオフ値は試験前に医療従事者により適宜設定されうる。今回のカットオフ値は、ＩＬ−１ｒａは６５２（ｐｇ／ｍL）、ｓＣＤ４０は１７．２（ｐｇ／ｍL）、ＨＭＧＢ１は３．４（ｎｇ／ｍL）と定める。
被験者の肝生検を行い、組織学的所見の重症度からＮＡＳスコア（ＮＡＦＬＤ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）を決定する。ＮＡＳスコアは、ｓｔｅａｔｏｓｉｓ：脂肪変性（０−３），ｌｏｂｕｌａｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：小葉の炎症（０−３），ｂａｌｏｏｎｉｎｇ：バルーニング（０−２）の、０〜８の幅でスコア化する。ＮＡＳスコアが５以上であればＮＡＳＨである可能性が高い。（Ｋｌｅｉｎｅｒらの文献：Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２００５；４１：１３１３−１３２１）。
肝臓の線維化の重症度もスコア化する。これらの組織学的所見からＮＡＳＨと診断する。
組織学的所見からＮＡＳＨと診断された被験者は、ＩＬ−１ｒａ、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１の値がカットオフ値を超えており、ＩＬ−１ｒａ、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１の測定により簡易にＮＡＳＨを検出できる。
ＩＬ−１ｒａ、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１は、次のその他の検査指標のいくつかと組み合わせて評価されたとき、さらに精度が高まる。その他の検査指標としては、腹部超音波検査、ＣＴ検査、血清脂質データ（ＴＧ，ＨＤＬ，ＬＤＬ，ＴＣ，ＶＬＤＬなど）、遊離脂肪酸、血清２４分画、血中脂肪酸比（ＯＡ／ＳＡ比、ＥＰＡ／ＡＡ比など），空腹時血糖、食後血糖、ＨｂＡ１ｃ、ＡＳＴ，ＡＬＴ，ＡＬＰ，ＧＧＴ，ビリルビン、アルブミン、フェリチン、チオレドキシン、ＨＯＭＡ−ＩＲ，血小板数、ＴＮＦα、ｓＴＮＦ−Ｒ１，ｓＴＮＦ−Ｒ２，ＣＴＧＦ，アディポネクチン、レプチン、高感度ＣＲＰ、ヒアルロン酸、IV型コラーゲン７Ｓ，プロコラーゲンIIIポリペプチド、ＣＫ１8フラグメント、Ｆａｓなどが用いられ得る。【００９５】
本発明のマーカーが測定され、ＮＡＳＨの検出のための方法を経た被験者に対して、ＥＰＡ類を有効成分として含有する医薬組成物として、高純度ＥＰＡ−Ｅ含有製剤であるエパデールＳ（持田製薬（株）製）を２７００ｍｇ／日、１２ヶ月投薬する。
糖尿病をもつ被験者には抗糖尿病薬（チアゾリジン誘導体、ビグアナイド薬、αグルコシダーゼ阻害剤、スルホニルウレア剤、ナテグリニド、ＤＰＰ−４阻害剤、ＧＬＰ−１アナログなど）が併用投薬される。
投薬開始前、投薬後１ヵ月、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月に、本発明のマーカーであるＩＬ−１ｒａ、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、トロンボスポンジン１、ＴＩＭＰ１，ＭＭＰ１２，１３，補体Ｄ因子を測定する。併せて、その他の検査指標も測定する。
投薬終了時に、再び被験者の肝生検を実施して、ＮＡＳスコア及び線維化レベルを評価する。
被験者のＩＬ−１ｒａ値は、投薬開始前はカットオフ値より高値を示すが、ＥＰＡ−Ｅ製剤の投薬後１ヵ月、３ヶ月、６ヶ月の経過に伴い、ＮＡＳスコアの低下に連動して低下する。ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、トロンボスポンジン１、ＴＩＭＰ１，ＭＭＰ１２，１３，補体Ｄ因子も同様に、ＥＰＡ−Ｅ製剤の投薬に伴い低下する。
本発明のマーカー値がＮＡＳＨ治療薬の投薬に伴い低下した（及び／又は健常者の値に近づく変動を示した）被験者はＮＡＳＨ治療効果が得られていると評価できる。トロンボスポンジン１、ＴＩＭＰ１，ＭＭＰ１２，１３，補体Ｄ因子の変動は、特にＥＰＡ−Ｅ製剤による治療効果と高い相関が得られる。
上記のその他の検査指標も、投薬開始前と投薬後経時的に併せて測定して、治療効果の評価に用いることができる。
投薬開始前のＮＡＳスコアが６以上の被験者は、投薬開始前のＮＡＳスコアが４以下の被験者と比較して、ＥＰＡ−Ｅ製剤の投薬により、ＮＡＳスコアの低下がより大きい傾向（例えば、３低下する）を示し、ＥＰＡ−Ｅ製剤により高い治療効果を得られる。
この傾向は、ＩＬ−１ｒａ、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、トロンボスポンジン１、ＴＩＭＰ１，ＭＭＰ１２，１３，補体Ｄ因子のマーカーでも同様であり、被験者のマーカー値と事前に定めた基準値（例えば、ＮＡＳＨ被験者の平均値）と比較して高い被験者は、マーカー値の低下が大きく、ＥＰＡ−Ｅ製剤により高い治療効果を得られる。このように、これらのマーカーによりＥＰＡ−Ｅ製剤による治療が適する被験者を選択することができる。
すなわち、ＥＰＡ−Ｅ製剤は、ＮＡＳスコアが６以上の被験者のためのＮＡＳＨ治療薬としてより好ましい。また、ＥＰＡ−Ｅ製剤は、ＩＬ−１ｒａ、ｓＣＤ４０、ＨＭＧＢ１、トロンボスポンジン１、ＴＩＭＰ１，ＭＭＰ１２，１３，補体Ｄ因子のマーカーの異常の程度の大きい被験者のためのＮＡＳＨ治療薬としてより好ましい。
【図１】
2011046204.tif 000007
【図２】
2011046204.tif 000008
【図３】
2011046204.tif 000009
【図４】
2011046204.tif 000010
【図５】
2011046204.tif 000011
【国際調査報告】
2011046204.tif 000012
2011046204.tif 000013
2011046204.tif 000014
2011046204.tif 000015
2011046204.tif 000016
2011046204.tif 000017
2011046204.tif 000018