(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、翻訳開始因子または転写伸長因子を増加するような化合物またはその薬学的に許容し得る塩を有効成分とする、様々な疾患の予防および／または治療のための医薬製剤を提供することに関する。【解決手段】  本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行う中で、ミノサイクリンまたはシロスタゾールのＮＧＦ誘発神経突起伸長増強作用にそれぞれ翻訳開始因子（ｅＩＦ４Ａ１など）または翻訳伸長因子（ｅＥＦ１Ａ１など）の増加が関与していることを初めて見出し、本発明を完成させた。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールを含有する神経突起伸長増強剤。
【請求項２】
翻訳開始因子および／または翻訳伸長因子を増加させることを特徴とする神経突起伸長増強剤。
【請求項３】
翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ａアイソフォームおよび／または翻訳伸長因子であるｅＥＦ１Ａアイソフォームを増加させることを特徴とする神経突起伸長増強剤。
【請求項４】
翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ａ１および／または翻訳伸長因子であるｅＥＦ１Ａ１を増加させることを特徴とする神経突起伸長増強剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の神経突起伸長増強剤の精神疾患治療への使用。
【請求項６】
ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールを含有する、翻訳開始因子増加剤および／または翻訳伸長因子増加剤。
【請求項７】
ミノサイクリンを含有する翻訳開始因子ｅＩＦ４Ａ１の増加剤。
【請求項８】
シロスタゾールを含有する翻訳伸長因子ｅＥＦ１Ａ１の増加剤。
【請求項９】
ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールを含有する、翻訳開始因子および／または翻訳伸長因子の異常に起因する疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項１０】
ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールを含有する、翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ａ１アイソフォームおよび／または翻訳伸長因子であるｅＥＦ１Ａ１アイソフォームの減少に由来する精神疾患、神経疾患、脳血管疾患、循環器疾患、呼吸器疾患、内分泌疾患、代謝疾患、血液疾患、免疫疾患、感染症、および悪性腫瘍からなる群から選択される１種または２種以上の症状を呈する疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項１１】
ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールを含有する、翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ａ１および／または翻訳伸長因子であるｅＥＦ１Ａ１の減少に由来する精神疾患、神経疾患、脳血管疾患、循環器疾患、呼吸器疾患、内分泌疾患、代謝疾患、血液疾患、免疫疾患、感染症、および悪性腫瘍からなる群から選択される１種または２種以上の症状を呈する疾患の予防剤および／または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精神疾患、神経疾患、脳血管疾患、循環器疾患、呼吸器疾患、内分泌疾患、代謝疾患、血液疾患、免疫疾患、感染症、および悪性腫瘍などの様々な疾患の予防および／または治療のための医薬に関する。さらに詳しくは、翻訳開始因子もしくは翻訳伸長因子を増加させるような化合物、またはその薬学的に許容し得る塩を含有する、医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
社会生活様式の変化や社会の高齢化に伴い、精神疾患、神経疾患、脳血管疾患、循環器疾患、呼吸器疾患、内分泌疾患、代謝疾患、血液疾患、免疫疾患、感染症、悪性腫瘍などの様々な疾患は、全体として増加する傾向にある。例えば、代表的な精神疾患であるうつ病や統合失調症は発症率が高く、医療経済という点からも大きな問題となっている。うつ病や統合失調症などの精神疾患の治療には、薬物治療が不可欠であり、抗うつ薬（三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、およびセロトニン・ノルエピネフリン再取り込み阻害薬など）や抗精神病薬（フェノチアジン系化合物、ブチロフェノン系化合物、ベンズアミド系化合物、イミノジベンジル系化合物、チエピン系化合物、インドール系化合物およびセロトニン・ドーパミン受容体遮断薬など）などが投与されている。しかしながら、臨床の場で実際に使用されているこれらの薬剤は、一部の患者や一部の症状には有効であるが、これらの薬剤では効果が無い、いわゆる治療抵抗性の患者が存在する事も知られており、新しい治療薬の開発が切望されている。既存の薬物では、これらの精神疾患に対する十分な治療効果が出ているとは言い難く、現実的には有効な予防法や治療法はほとんど無いのが現状である。
さらに、精神疾患以外の疾患、例えば、神経疾患、脳血管疾患、循環器疾患、呼吸器疾患、内分泌疾患、代謝疾患、血液疾患、免疫疾患、感染症、および悪性腫瘍などの様々な他の疾患においても、既存の薬物では、十分な治療効果が出ているとは言い難く、新しい治療薬の開発が切望されている。【０００３】
このように、うつ病や統合失調症などの精神疾患、さらには神経疾患、脳血管疾患、循環器疾患、呼吸器疾患、内分泌疾患、代謝疾患、血液疾患、免疫疾患、感染症、および悪性腫瘍などの様々な他の疾患の予防や治療に使用されている薬剤では十分な治療効果が出ているとは言い難い状況がある。
ところで、テトラサイクリン系抗生物質は一群の広域スペクトラム抗生物質の総称であり、クラミジア感染症、リケッチア感染症、マイコプラズマ感染症、ブルセラ症、およびスピロヘータ感染症（梅毒・ライム病）などで処方される安価な薬剤である。近年、テトラサイクリン系抗生物質の一つであるミノサイクリンが、抗生物質としての作用以外に神経保護作用および抗炎症作用などの様々な作用を有する事が知られるようになり、また精神疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染などの様々な疾患に対する治療効果が報告されている（非特許文献１から７）。
最近、発明者らは、第二世代抗生物質ミノサイクリンまたは抗血小板薬シロスタゾールが統合失調症のモデル動物や細胞培養試験を用いた神経可塑性等の試験において改善作用があることを報告した。例えば、ミノサイクリンが、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬フェンサイクリジン投与による認知機能障害やＮＭＤＡ受容体拮抗薬ＭＫ−８０１投与によるプレパルス抑性障害に対して改善作用を有する事を報告した（非特許文献８および９）。
さらに、プラセボ対照二重盲検試験より、ミノサイクリンが統合失調症患者の陰性症状および認知機能障害を有意に改善する事が報告されている（非特許文献１０）。また、ミノサイクリンは双極性障害患者のうつ症状を改善する作用があることが報告されている（非特許文献１１）。
さらに、発明者らは、シロスタゾールがフェンサイクリジン投与による認知機能障害やＮＭＤＡ受容体拮抗薬ＭＫ−８０１投与によるプレパルス抑性障害に対して改善作用を有する事を報告し、統合失調症などの精神疾患の治療薬としての可能性を報告した（非特許文献１２および１３）。
しかしながら、現時点ではミノサイクリンおよびシロスタゾールの作用メカニズムは不明である。【０００４】
一方、ラット副腎髄質由来の褐色細胞腫であるＰＣ１２細胞は、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）を作用させることにより、神経のように樹状突起を伸ばすことから、神経細胞分化のモデルとして幅広く使用されている。またＮＧＦ誘発の神経突起伸長作用は、様々な疾患の治療メカニズムとして、幅広く使用されている実験系である（非特許文献１４および１５）。【０００５】
細胞成長や細胞周期の進展には、タンパク質発現の調節が密接に関わっている。したがって、翻訳過程の異常が、ヒトの病気の病因・病態だけでなく治療薬の作用にも関わっている事が予想される。ｍＲＮＡの翻訳は、ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ（開始）・ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ（伸長）・ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（終結）といった段階からなり、多くの真核生物の翻訳開始因子（ｅＩＦｓ；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）は、開始段階で特異的に作用する。翻訳開始因子は、ポリペプチド鎖開始因子とも称され、リポゾームがｍＲＮＡの塩基配列に従ってアミノ酸を結合させる過程、すなわちタンパク質合成の翻訳過程を開始させるタンパク質群（ｅＩＦ１、ｅＩＦ２、ｅＩＦ３、ｅＩＦ４、ｅＩＦ５など）をいう。ｅＩＦｓや 翻訳開始の最終目的は、８０Ｓリボソームの形成とリボソームのＰ部位（ぺプチジルｔＲＮＡ結合部位）上にｍＲＮＡの開始コドン、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡの配置をすることである。翻訳伸長因子は、ポリペプチド鎖伸長因子とも称され、ｍＲＮＡからタンパク質を生合成させるポリペプチド鎖伸長の翻訳過程に必要なタンパク質群（ｅＥＦ１、ｅＥＦ２、ｅＥＦ３、ｅＥＦ４、ｅＥＦ５など）である。翻訳伸長因子は、機能的に大別して２種類に分けられ、ｍＲＮＡの暗号に対応したアミノアシルｔＲＮＡをリボソームのＡ部位（アミノアシルｔＲＮＡ結合部位）へ結合させる因子と、ぺプチジル結合形成直後Ａ部位に存在するペプチジルｔＲＮＡをＰ部位へトランスロケーションさせる因子である。翻訳開始因子および翻訳伸長因子の調節は、最終産物であるタンパク質の発現量を調節するという意味で重要な過程であり、ｍＲＮＡ翻訳開始および翻訳伸長の制御の変化はヒトを含む哺乳類の病気を発症させる原因の一つと考えられているので（非特許文献１６から２０）、翻訳過程の制御を理解する事は、様々な病気の原因解明だけなく、新しい予防薬、診断薬、治療薬の開発に応用できると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】DomercqM, Matute C. (2004). Neuroprotection by tetracyclines. Trends Pharmacol Sci 25l:609-612.
【非特許文献２】Yong VW,Wells J, Giuliani F, Casha S, Power C, Metz LM. (2004). The promise ofminocycline in neurology. Lancet Neurol 3: 744-751.
【非特許文献３】Blum D,Chtarto A, Tenenbaum L, Brotchi J, Levivier M. (2004). Clinical potential ofminocycline for neurodegenerative disorders. Neurobiol Dis 217: 359-366.
【非特許文献４】Zemke D,Majid A. (2004). The potential of minocycline for neuroprotection in humanneurologic diseases. Neurobiol Dis 217: 359-366.
【非特許文献５】MiyaokaT. (2008). Clinical potential of minocycline for schizophrenia. CNS NeurolDisord Drug Targets 7: 376-381.
【非特許文献６】Noble W,Garwood CJ, Hanger DP. (2009). Minocycline as a potential therapeutic agent inneurodegenerative disorders characterised by protein misfolding. Prion 3: 78-83.
【非特許文献７】OrsucciD, Calsolaro V, Mancuso M, Siciliano G. (2009). Neuroprotective effects oftetracyclines: molecular targets, animal models and human disease. CNS NeurolDisord Drug Targets 8: 222-231.
【非特許文献８】FujitaY, Ishima T, Kunitachi S, Hagiwara H, Zhang L, Iyo M, Hashimoto K. (2008).Phencyclidine-induced cognitive deficits in mice are improved by subsequentsubchronic administration of minocycline. Prog Neuropsychopharmacol BiolPsychiatry 32: 336-339.
【非特許文献９】Zhang L,Shirayama Y, Iyo M, Hashimoto K. (2007). Minocycline attenuates hyperlocomotionand prepulse inhibition deficits in mice after administration of the NMDAreceptor antagonist dizocilpine. Neuropsychopharmacology 32: 2001-2010.
【非特許文献１０】LevkovitzY, Mendlovich S, Riwkes S, Braw Y, Levkovitch-Verbin H, Gal G, Fennig S, TrevesI, Kron S. (2010). A double-blind, randomized study of minocycline for thetreatment of negative and cognitive symptoms in early-phase schizophrenia. JClin Psychiatry 71: 138-149.
【非特許文献１１】LevineJ, Cholestoy A, Zimmerman J. (1996). Possible antidepressant effect ofminocycline. Am J Psychiatry 153: 582.
【非特許文献１２】HashimotoK, Fujita Y, Ishima T, Horio M, Hagiwara H, Tanibuchi Y, Iyo M. (2010a) Effectsof cilostazol on cognitive deficits in mice after repeated administration ofphencyclidine. Clin Psychopharmacol Neurosci 8: 26-29.
【非特許文献１３】HashimotoK, Fujita Y, Horio M, Hagiwara H, Tanibuchi Y, Iyo M. (2010b) Effects ofcilostazol on dizocilpine-induced hyperlocomotion and prepulse inhibitiondeficits in mice. Clin Psychopharmacol Neurosci in press.
【非特許文献１４】NishimuraT, Ishima T, Iyo M, Hashimoto K. (2008). Potentiation of nerve growthfactor-induced neurite outgrowth by fluvoxamine: role of sigma-1 receptors, IP3receptors and cellular signaling pathways. PLoS ONE 3: e2558.
【非特許文献１５】IshimaT, Nishimura T, Iyo M, Hashimoto K. (2008). Potentiation of nerve growthfactor-induced neurite outgrowth in PC12 cells by donepezil: role of sigma-1receptors and IP3 receptors. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 32;1656-1659.
【非特許文献１６】ConawayJW, Conaway RC. (1999). Translation elongation and human diseas. Annu RevBiochem 68; 301-319.
【非特許文献１７】AbbottCM, Proud CG. (2004). Translation factors: in sickness and in health. TrendsBiochem Sci 29; 25-31.
【非特許文献１８】ScheperGC, van der Knaap MS, Proud CG. (2007). Translation matters: protein synthesisdefects in inherited disease. Nature Rev Genet 8; 711-723.
【非特許文献１９】KasinathBS, Feliers D, Sataranatarajan K, Ghosh Choudhury G, Lee MJ, Mariappan MM.(2009). Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease. Am JPhysiol Renal Physiol 297; F1153-F1165.
【非特許文献２０】PavittGD, Proud CG. (2009). Protein synthesis and its control in neuronal cells witha focus on vanishing white matter disease. Biochem Soc Trans 37; 1298-1310.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ミノサイクリンやシロスタゾールの詳細な作用メカニズムを解明する事が、様々な疾患に対する新規な予防薬、診断薬、および治療薬等の開発に資することになる。本発明の課題は、様々な疾患、特に神経疾患に有効な医薬製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行う中で、ミノサイクリンまたはシロスタゾールが、ＰＣ１２細胞におけるＮＧＦ誘発神経突起伸長作用を有意に増強させる作用を有する事（神経突起伸長増強作用という）を発見した。他の第二世代抗生物質であるテトラサイクリンには、その効果が認められなかった。また、シロスタゾールの主作用は、フォスフォジエステラーゼ（ＰＤＥ）３阻害作用であるが、他のＰＤＥ３阻害薬シロスタミドはＮＧＦ誘発神経突起伸長効果を示さなかったことから、ＮＧＦ誘発神経突起伸長増強作用には、シロスタゾールのＰＤＥ３阻害作用は関係していない可能性があった。本発明者らは、ミノサイクリンまたはシロスタゾールのＮＧＦ誘発神経突起伸長増強作用の作用メカニズムの解明を進め、当該作用にそれぞれ翻訳開始因子（ｅＩＦ４Ａ１など）または翻訳伸長因子（ｅＥＦ１Ａ１など）の増加が関与していることを初めて見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、翻訳開始因子もしくは翻訳伸長因子を増加させる作用を有する化合物、またはその薬学的に許容し得る塩を含有する、医薬製剤に関する。
また、本発明は、翻訳開始因子または翻訳伸長因子の異常が関わっているような様々な疾患の治療薬に関し、さらに、神経疾患に有効な医薬製剤に関する。【００１０】
本発明は、１）ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールを含有する神経突起伸長増強剤に関する。
また、２）翻訳開始因子および／または翻訳伸長因子を増加させることを特徴とする神経突起伸長増強剤に関する。
また、３）翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ａアイソフォームおよび／または翻訳伸長因子であるｅＥＦ１Ａアイソフォームを増加させることを特徴とする神経突起伸長増強剤に関する。
さらに、４）翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ａおよび／または翻訳伸長因子であるｅＥＦ１Ａを増加させることを特徴とする神経突起伸長増強剤に関する。
並びに、５）上述の１）から４）のいずれかに記載の神経突起伸長増強剤の精神疾患治療への使用に関する。
また、本発明は、６）ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールを含有する、翻訳開始因子増加剤および／または翻訳伸長因子増加剤に関する。
さらに、７）ミノサイクリンを含有する翻訳開始因子ｅＩＦ４Ａ１の増加剤に関する。
さらに、８）シロスタゾールを含有する翻訳伸長因子ｅＥＦ１Ａ１の増加剤に関する。
また、９）ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールを含有する、翻訳開始因子および／または翻訳伸長因子の異常に起因する疾患の予防剤および／または治療剤に関する。
また、１０）ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールを含有する、翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ａアイソフォームおよび／または翻訳伸長因子であるｅＥＦ１Ａアイソフォームの減少に由来する精神疾患、神経疾患、脳血管疾患、循環器疾患、呼吸器疾患、内分泌疾患、代謝疾患、血液疾患、免疫疾患、感染症、および悪性腫瘍からなる群から選択される１種または２種以上の症状を呈する疾患の予防剤および／または治療剤に関する。
さらに、１１）ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールを含有する、翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ａ１および／または翻訳伸長因子であるｅＥＦ１Ａ１の減少に由来する精神疾患、神経疾患、脳血管疾患、循環器疾患、呼吸器疾患、内分泌疾患、代謝疾患、血液疾患、免疫疾患、感染症、および悪性腫瘍からなる群から選択される１種または２種以上の症状を呈する疾患の予防剤および／または治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
ミノサイクリンもしくはシロスタゾール、またはその薬学的に許容し得る塩は、それぞれ翻訳開始因子（ｅＩＦ４Ａ１）または翻訳伸長因子（ｅＥＦ１Ａ１）を有意に増加させたことから、翻訳開始因子または翻訳伸長因子を増加させる化合物は、様々な疾患、翻訳開始因子または翻訳伸長因子の異常が関係するような疾患に対して効果を奏し、その予防および／または治療に有効である。
例えば、翻訳開始因子または翻訳伸長因子の異常が指摘されている様々な疾患やタンパクの異常形成が関連する疾患、具体的には、精神疾患、神経疾患、脳血管疾患、循環器疾患、呼吸器疾患、内分泌疾患、代謝疾患、血液疾患、免疫疾患、感染症、および悪性腫瘍などの様々な疾患の予防および／または治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、神経成長因子誘発神経突起作用に対するミノサイクリンの効果を示す図である。ミノサイクリンは、濃度依存的にＰＣ１２細胞におけるＮＧＦ誘発神経突起伸長作用を有意に増強させたが、他の抗生物質テトラサイクリンは該作用に影響を与えなかった。
【図２】図２は、ミノサイクリンおよびテトラサイクリン処置による細胞内のｅＩＦ４Ａ１タンパク発現量を示す図である。ミノサイクリンは、ｅＩＦ４Ａ１タンパク発現量を有意に増加させた。
【図３】図３は、ミノサイクリンの細胞内の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ａ１タンパク発現量増加に対するｓｉＲＮＡ処置等の影響を示す図である。ｅＩＦ４Ａ１のｓｉＲＮＡ処置によりｅＩＦ４Ａ１のタンパク発現量は有意に減少した。ネガティブＲＮＡでは、影響はなかった。
【図４】図４は、ミノサイクリンのＮＧＦ誘発神経突起伸長作用におけるｅＩＦ４Ａ１の効果を示す図である。図２に示した条件下で、ｓｉＲＮＡ処置により翻訳開始因子ｅＩＦ４Ａ１のタンパク発現量の低下させると、ミノサイクリンのＮＧＦ誘発神経突起伸長作用を抑制した。
【図５】図５は、ＮＧＦ誘発神経突起伸長作用に対するシロスタゾールの効果を示す図である。シロスタゾールは濃度依存的にＰＣ１２細胞におけるＮＧＦ誘発神経突起伸長作用を有意に増強させたが、他のＰＤＥ３阻害薬シロスタミドは該作用に影響を与えなかった。
【図６】図６は、シロスタゾールおよびシロスタミド処置による細胞内のｅＥＦ１Ａ１タンパク発現量を示す図である。シロスタゾールは、ｅＥＦ１Ａ１タンパク発現量を有意に増加させた。
【図７】図７は、シロスタゾールの細胞内の翻訳開始因子ｅＥＦ１Ａ１タンパク発現量増加に対するｓｉＲＮＡ処置等の影響を示す図である。ｅＥＦ１Ａ１のｓｉＲＮＡ処置によりｅＥＦ１Ａ１のタンパク発現量は有意に減少した。ネガティブＲＮＡでは、影響はなかった。
【図８】図８は、シロスタゾールのＮＧＦ誘発神経突起伸長作用におけるｅＩＦ１Ａ１の効果を示す図である。図７に示した条件下で、ｓｉＲＮＡ処置により翻訳開始因子ｅＥＦ１Ａ１のタンパク発現量の低下させると、シロスタゾールのＮＧＦ誘発神経突起伸長作用を抑制した。
【図９】図９は、ｅＥＦ１Ａ１タンパク発現に及ぼすテトラサイクリンおよびミノサイクリンの効果、並びにｅＩＦ４Ａ１タンパク発現に及ぼすシロスタミドおよびシロスタゾールの効果を示した図である。テトラサイクリンおよびミノサイクリンは、ｅＥＦ１Ａ１タンパク発現には影響を与えず、並びにシロスタミドおよびシロスタゾールは、ｅＩＦ４Ａ１タンパク発現には影響を与えなかった。
【図１０】図１０は、ｅＩＦ４Ａ１のｓｉＲＮＡの塩基配列を、アンチセンスとして示した図である。
【図１１】図１１は、ｅＥＦ１Ａ１のｓｉＲＮＡの塩基配列を、アンチセンスとして示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
まず、本明細書における用語の意味あるいは定義について述べる。翻訳開始因子とは、リボソームがｍＲＮＡの塩基配列に従ってアミノ酸を結合させる過程、すなわちタンパク質合成の翻訳過程を開始させるタンパク質群である。翻訳伸長因子とは、ｍＲＮＡからタンパク質合成の翻訳過程を進行させる、ペプチド鎖伸長に関わる過程を制御するタンパク質群である。
翻訳開始因子のうちｅＩＦ４Ａというタンパク質は、ｅＩＦ４Ａ１、ｅＩＦ４Ａ２、ｅＩＦ４Ａ３など幾つかのアイソフォーム（またはサブクラス）が知られており、それらの機能は同じものと考えられ、本発明の効果を奏するものであれば、１種または２種以上のアイソフォームを対象として発明を実施することができる。これらのタンパク質を示す場合、ｅＩＦ４Ａアイソフォームという。本発明において好ましいｅＩＦ４ＡアイソフォームとしてｅＩＦ４Ａ１を挙げることができる。
また、同様に、翻訳伸長因子についても、翻訳伸長因子のうちｅＥＦ１Ａというタンパク質は、ｅＥＦ１Ａ１、ｅＥＦ１Ａ２、ｅＥＦ１Ａ３など幾つかのアイソフォーム（またはサブクラス）が知られており、それらの機能は同じものと考えられ、本発明の効果を奏するものであれば、１種または２種以上のアイソフォームを対象として発明を実施することができる。これらのタンパク質を示す場合、ｅＥＦ１Ａアイソフォームという。本発明において好ましいｅＥＦ１ＡアイソフォームとしてｅＥＦ１Ａ１を挙げることができる。
神経突起伸長作用とは、神経細胞の神経突起形成を起こさせる作用をいい、その増強作用（神経突起伸長増強作用）は、例えば、実施例中で述べたような定量化試験を行えばその効果が判定できる。さらに、神経突起伸長増強作用を有し、医薬として充分な該効果を有する化合物を神経突起伸長増強剤という。
【００１４】
本発明は、翻訳開始因子および／または翻訳伸長因子を増加させることを特徴とする神経突起伸長増強剤に関する。より好ましくは本発明は、翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ａアイソフォームおよび／または翻訳伸長因子であるｅＥＦ１Ａアイソフォームを増加させることを特徴とする神経突起伸長増強剤に関する。さらに好ましくは本発明は、翻訳開始因子であるｅＩＦ４Ａおよび／または翻訳伸長因子であるｅＥＦ１Ａを増加させることを特徴とする神経突起伸長増強剤に関する。
【００１５】
翻訳開始因子もしくは翻訳伸長因子を増加させる化合物として、ミノサイクリンおよびシロスタゾールを好ましく例示できる。ミノサイクリンは、翻訳開始因子、好ましくはｅＩＦ４Ａアイソフォーム、より好ましくはｅＩＦ４Ａ１の増加剤として使用できる。シロスタゾール、翻訳伸長因子、好ましくはｅＥＦ１Ａアイソフォーム、より好ましくはｅＥＦ１Ａ１の増加剤として使用できる。
【００１６】
翻訳開始因子もしくは翻訳伸長因子を増加させる化合物、またはその薬学的に許容しうる塩を含有する本発明の医薬製剤、例えば予防剤および／または治療剤は、経口的または非経口的に投与することができる。経口投与には、錠剤、カプセル、コーティング錠、トローチ、溶液または懸濁液などの液剤といった既知の投与用剤形を用いることができる。また、非経口投与は、坐剤などを用いた直腸投与、パッチやリニメント、ゲルなどを用いた経皮投与、スプレーやエアロゾルなどを用いた経粘膜投与などによって行われてもよく、注射により静脈内、筋肉内、皮下または脳室内等に投与されてもよい。
【００１７】
本発明の予防剤および／または治療剤は、翻訳開始因子もしくは翻訳伸長因子を増加させる化合物は遊離塩基、またはその薬学的に許容し得る塩の両方の形態で用いることができる。薬学的に許容し得る塩としては、薬学的に許容し得る酸の付加塩が好ましく、より好ましくは塩酸塩である。
本発明の予防剤および／または治療剤は、翻訳開始因子もしくは翻訳伸長因子を増加させる化合物、またはその薬学的に許容しうる塩の他に、他の薬効成分を含有していてもよい。また、これら薬効成分の他に、適宜、投与形態などに応じて、抗酸化剤、安定剤、防腐剤、矯味剤、着色料、溶解剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、消泡剤、粘度調整剤、ゲル化剤、吸収促進剤、分散剤、賦形剤、およびｐＨ調整剤等の当業者によく知られた適切な生理学的に許容される物質を含有していてもよい。
【００１８】
したがって、本発明の予防剤および／または治療剤は、翻訳開始因子もしくは翻訳伸長因子を増加させる化合物、またはその薬学的に許容しうる塩と、これらの物質とを適宜配合することにより製造することができる。本発明の予防剤および／または治療剤を注射（皮下注射、筋肉注射、または静脈注射）用製剤として調製する場合、溶液剤または懸濁剤の製剤の形態が好ましく、膣または直腸投与用の場合、クリ−ムまたは坐薬のような半固形剤の製剤の形態が好ましく、経鼻腔投与用の場合、粉末、鼻用滴剤、またはエアロゾル剤の製剤の形態が好ましい。これらの製剤はいずれも、例えばレミントンの製薬科学（マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ＰＡ、１９７０年）に記載されているような製薬技術上当業者に知られているいずれかの方法によって調製することができる。注射用製剤は担体として、例えば、アルブミン等の血漿由来タンパク、グリシン等のアミノ酸、およびマンニトール等の糖を加えることができ、さらに緩衝剤、溶解補助剤、および等張剤等を添加することもできる。また、水溶製剤または凍結乾燥製剤として使用する場合、凝集を防ぐためにＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０などの界面活性剤を添加するのが好ましい。さらに、注射用製剤以外の非経口投与剤形は、蒸留水または生理食塩液、ポリエチレングリコ−ルのようなポリアルキレングリコ−ル、植物起源の油、および水素化したナフタレン等を含有してもよい。例えば、坐薬のような膣または直腸投与用の製剤は、一般的な賦形剤として、例えば、ポリアキレングリコ−ル、ワセリン、およびカカオ油脂等を含有する。膣用製剤では、胆汁塩、エチレンジアミン塩、およびクエン酸塩等の吸収促進剤を含有してもよい。吸入用製剤は固体でもよく、賦形剤として、例えば、ラクト−スを含有してもよく、さらに、経鼻腔滴剤は水または油溶液であってもよい。
【００１９】
本発明の予防剤および／または治療剤の正確な投与量および投与計画は、個々の治療対象毎の所要量、治療方法、疾病または必要性の程度などに依存して調整できる。投与量は、具体的には年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組合せ、および患者の病状などに応じて決めることができ、さらに、その他の要因を考慮して決定してもよい。翻訳開始因子あるいは翻訳伸長因子を増加させる化合物、またはその薬学的に許容しうる塩は、ヒトにおける薬物動態に問題がなく、安全に使用することができ、その１日の投与量は、患者の状態や体重、化合物の種類、投与経路などによって異なるが、例えば、非経口的には皮下、静脈内、筋肉内または直腸内に、翻訳開始因子または翻訳伸長因子を増加させる化合物（遊離塩基）として約０．０１〜１０００ｍｇ／人／日、好ましくは０．１〜５００ｍｇ／人／日で投与され、また、経口的には約０．０１〜５００ｍｇ／人／日、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／人／日で投与されることが望ましい。
【００２０】
さらに本発明は、翻訳開始因子の増加剤および／または翻訳伸長因子の増加剤を対象に投与することを特徴とする神経突起伸長増強方法に関する。また本発明は、神経突起伸長増強方法や神経突起伸長増強剤の製造における、翻訳開始因子の増加剤および／または翻訳伸長因子の増加剤の使用に関する。さらにまた本発明は、翻訳開始因子の増加剤および／または翻訳伸長因子の増加剤を対象に投与して神経突起伸長を増強することを特徴とする精神疾患の予防および／または治療方法に関する。また本発明は、精神疾患の予防および／または治療方法や精神疾患の予防および／または治療剤の製造における、翻訳開始因子の増加剤および／または翻訳伸長因子の増加剤の使用に関する。
【００２１】
以下、実施例にて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。また、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
【実施例１】
【００２２】
（１）細胞培養
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％熱不活化ウマ血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加し、ＰＣ１２細胞（理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室、日本、つくば）をポリ−Ｄ−リジン／ラミニンコーティングした１００ｍｍ細胞培養ディッシュ（ベクトン・ディッキンソン、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用い、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。週に２〜３回培地を交換した。以下に述べる神経突起伸長増強効果を検討する試験、ウェスタンブロット法に供する際は、血清は様々な成長因子を含有することが知られているため、最低限の濃度の血清（０．５％ＦＢＳ）を含む培地を用いた。ＰＣ１２細胞分化誘導の為、ＮＧＦ（２．５ｎｇ／ｍＬ）の条件で、播種から２４時間後、０．５％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地にさらに各種薬剤を添加したもの、しないものと培地を交換した。
（２）神経突起形成の定量化
神経突起伸長増強の効果を検討する試験においては、ポリ−Ｄ−リジン／ラミニンコーティングした２４ウェル組織培養プレートに、比較的低密度で（０．２５×１０４個／ｃｍ２）ＰＣ１２細胞を播種した。ＮＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）を加え、さらに、各種薬剤の添加または不添加で４日間培養した後、カメラ付き位相差倒立顕微鏡で撮影した生細胞のデジタル画像を用いて形態計測分析を実施した。１ウェルにつき３視野の画像を撮影した。１視野当たりの細胞数は平均１００個であった。視認により各視野の分化細胞数を計測した。細胞体直径と等しい長さの神経突起が１本以上ある細胞のみを数え、当該視野内の総細胞数に対する割合として示した。計測は盲検下にて行われた。
（３）タンパク質発現定量化
ウェスタンブロット分析では、ＮＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）を加え、さらに、各種薬剤の添加または不添加で４日間培養した後、細胞溶解物からのタンパク質（総３０μｇ）を７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）にかけて分離した。Ｔａｎｋ−ｔｒａｎｓｆｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質をポリビニリデンフルオライド膜（ＧＥヘルスケア）に移し、この膜を５％スキムミルク、２％ＢＳＡ、５％ＦＢＳを含むＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．１３Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）でブロックした。ウサギ抗ｅＩＦ４Ａ抗体（Ａｂｃａｍ）およびマウス抗β‐アクチン抗体（シグマアルドリッチ）を上記ブロッキング緩衝液中でそれぞれ１：２５０、１：１００００に希釈したものを一次抗体として使用した。さらに、５％スキムミルク含有ＴＢＳＴ中で２５０００倍希釈の抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体（ＧＥヘルスケア）、および５％スキムミルク含有ＴＢＳＴ中で２５０００倍希釈の抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体（ＧＥヘルスケア）を二次抗体として使用した。膜上の抗原タンパク質はＥＣＬＴＭ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア）で検出した。冷却ＣＣＤカメラによるバンドの可視化をＬＡＳ３０００ｍｉｎｉ（富士写真フイルム社）により行い、解析ソフトＭｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ（富士写真フイルム社）によりタンパク質発現の定量化をおこなった。
（４）ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウン
ｅＩＦ４Ａ１、あるいはｅＥＦ１Ａ１を標的とするｓｉＲＮＡを用いてｅＩＦ４Ａ１、あるいはｅＥＦ１Ａ１の発現を抑制した。化学合成されたｓｉＲＮＡは、試薬会社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した（図１０、図１１）。実験に供したｓｉＲＮＡのアンチセンス配列およびセンス配列はそれぞれ配列表の配列番号１から６および配列番号７から１２に示した。ＰＣ１２細胞を培養し、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて上記のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。６時間後にＮＧＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）、さらに、各種薬剤の添加または不添加の０．５％ＦＢＡ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地と交換し、神経突起伸長増強効果を検討する試験およびウェスタンブロット分析に供した。
（５）統計分析
データは平均値±標準偏差で示した。統計分析は一元配置分散分析を用いて行ない、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ボンフェロニ検定で行なった。０．０５以下のｐ値は統計的に有意とした。【００２３】
［実験結果］
（１）ＮＧＦ誘発神経突起伸長に対するミノサイクリン、シロスタゾールの作用
ミノサイクリン、シロスタゾールは、ＮＧＦ（２．５ｎｇ／ｍＬ）による神経突起伸長を示したＰＣ１２細胞の数を濃度依存的に有意に増加させた（図１、図５）。一方、テトラサイクリン、シロスタミドでは、神経突起伸長を示した細胞数の増加は見られなかった（図１、図５）。
（２） ｅＩＦ４Ａ１およびｅＥＦ１Ａ１タンパク質発現定量化
ミノサイクリンは、ＰＣ１２細胞中のｅＩＦ４Ａ１を有意に増加させた（図２）。シロスタゾールは、ＰＣ１２細胞中のｅＥＦ１Ａ１を有意に増加させた（図６）。
（３）ｓｉＲＮＡによる遺伝子ノックダウン
ミノサイクリンまたはシロスタゾールは、それぞれＰＣ１２細胞中のｅＩＦ４Ａ１またはｅＥＦ１Ａ１を有意に増加させ、それぞれのｓｉＲＮＡにより遺伝子をノックダウンさせると、ＰＣ１２細胞中のｅＩＦ４Ａ１またはｅＥＦ１Ａ１の増加は見られなかった。さらに、ターゲットとは全く関係のないｓｉＲＮＡ（ネガティブＲＮＡ）を作用させてもＰＣ１２細胞中のｅＩＦ４Ａ１またはｅＥＦ１Ａ１の増加に影響はなかった （図３、図７）。
さらに、ミノサイクリンまたはシロスタゾールは、（２．５ｎｇ／ｍＬ）による神経突起伸長を示したＰＣ１２細胞の数を濃度依存的に有意に増加させたが、ｓｉＲＮＡ処理により遺伝子をノックダウンさせると、神経突起伸長を示した細胞数を増加させなかった。さらに、ターゲットとは全く関係のないｓｉＲＮＡ（ネガティブＲＮＡ）を作用させても神経突起伸長を示した細胞数の増加に影響はなかった （図４、図８）。
一方、テトラサイクリンまたはミノサイクリンは、ｅＥＦ１Ａ１タンパク量には影響を与えなかった（図９）。また、シロスタミドまたはシロスタゾールは、ｅＩＦ４Ａ１タンパク量には影響を与えなかった（図９）。【００２４】
上述した結果より、ＮＧＦ誘発神経突起伸長作用モデルにおいてミノサイクリンまたはシロスタゾールが有意に増強作用を示したこと、およびその増強作用に翻訳開始因子または翻訳伸長因子が関与していることから、翻訳開始因子または翻訳伸長因子を増加するような化合物が、将来新規治療薬として有用であることが理解される。したがって、翻訳開始因子もしくは翻訳伸長因子を増加するような化合物、またはその薬学的に許容し得る塩を含有する本発明の薬剤は、精神疾患、神経疾患、脳血管疾患、循環器疾患、呼吸器疾患、内分泌疾患、代謝疾患、血液疾患、免疫疾患、感染症、および悪性腫瘍などを含む様々な疾患の予防薬および／または治療薬として有効である。
さらに、ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールが神経突起伸長増強剤として使用できる。神経突起伸長増強剤としての使用は、ミノサイクリンにおいては、翻訳開始因子、その中でもｅＩＦ４Ａ１の特異的増加を伴うものであり、また、シロスタゾールにおいては、翻訳伸長因子、その中でもｅＥＦ１Ａ１の特異的増加を伴うものであった。さらに、これらより、ミノサイクリンの翻訳開始因子増加剤、その中でもｅＩＦ４Ａ１の増加剤としての使用が可能であり、また、シロスタゾールの翻訳伸長因子増加剤、その中でもｅＥＦ１Ａ１の増加剤としての使用が可能となった。神経突起伸長増強剤の伸長増強作用は、翻訳開始因子または翻訳伸長因子にそれぞれ独立に係わっていることから、ミノサイクリンおよびシロスタゾールの併用効果も図れる。並びに、翻訳開始因子および／または翻訳伸長因子の異常に起因する種々の疾患、とりわけ神経疾患の予防剤および／または治療剤として、ミノサイクリンおよび／またはシロスタゾールが使えることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
上述の記載にて説明したとおり、本発明の翻訳開始因子または翻訳伸長因子を増加するような化合物は、精神疾患、神経疾患、脳血管疾患、循環器疾患、呼吸器疾患、内分泌疾患、代謝疾患、血液疾患、免疫疾患、感染症、および悪性腫瘍などの種々の疾患に有効な新規医薬品として用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００２６】
配列番号１：設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２：設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号３：設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４：設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：設計されたオリゴヌクレオチド。
【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2012014993.tif 000014
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