(57)【要約】  下記一般式（１）2011059073.tif 000018（式中、各記号は、明細書に記載のとおりである）で示されるリン脂質誘導体；当該リン脂質誘導体を含んでなるリポソームなど。
2011059073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
2011059073.tif 000017
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、炭素数８〜２４のアシル基または炭素数８〜２４の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ３は、炭素数２〜１２で分岐鎖状または環状の、二価の炭化水素基を示し、
ａは、０〜５の整数を示し、
Ｍは、水素原子、アルカリ金属またはアンモニウム基を示し、
ＰＧは、ポリグリセリン由来の残基を示し、ｋ１は、２〜５０の整数を示し、ｋ２≧ｋ３、ｋ２＋ｋ３＝ｋ１＋１を満たす）
で示されるリン脂質誘導体。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、炭素数１２〜２０のアシル基もしくは炭素数１２〜２０の脂肪族炭化水素基である、請求項１に記載のリン脂質誘導体。
【請求項３】
Ｒ３が、炭素数３〜８で分岐鎖状または環状の、二価の炭化水素基である、請求項１または２に記載のリン脂質誘導体。
【請求項４】
Ｒ３が、２−メチルプロピレン基、または１，２−シクロヘキセン基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリン脂質誘導体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のリン脂質誘導体を含んでなる、リポソーム。
【請求項６】
ｐＨ応答性である、請求項５に記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なリン脂質誘導体に関する。またドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として特定ｐＨで内部に封入された物質を放出できるｐＨ応答性を有するリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物をベクター（担体）に担持させた薬物担体は、薬物を目的病巣部位の細胞内に確実、安全にかつ効率よく送達するためのドラッグデリバリーシステム（以下、「ＤＤＳ」と記載する）として注目されており盛んに研究されている。特に、薬物がタンパク質、ＤＮＡ（遺伝子）、アンチセンス分子などの細胞内で活性を発現する生理活性物質であるとき、これらを有効に働かせるためには細胞質中に導入する必要があるが、細胞膜は多くの水溶性物質、高分子を透過させないため、薬物を細胞質まで送達するためのベクター（担体）を必要とする。ベクターにはウイルスベクターと合成ベクターがあるがウイルスベクターは安全性に問題があるため、安全で高機能の合成ベクターの開発が切望され、リポソーム、エマルジョン、リピッドマイクロスフェアなどの脂質膜小胞の利用が検討されている。【０００３】
上記合成ベクターとして、特にリポソームなどの小胞を薬物担体としてＤＤＳに応用しようとする研究が行われている。これら小胞は一般的にリン脂質あるいはその誘導体、またはステロールやリン脂質以外の脂質などを基本膜構成成分として調製される。しかしながら、これらの基本構成成分のみでは、小胞同士の凝集、体内における滞留性の低下などの問題を解決することが難しく、ＤＤＳ製剤として目的の部位、例えば標的臓器や細胞にリポソーム内の薬物を送達させることは困難である。そこでこれらの問題を解決するために、ポリグリセリンリン脂質誘導体を用いてリポソームを形成することによって血液成分や血球細胞、血管内皮細胞との相互作用を回避することが報告されている（例えば特許文献１）。しかし、この技術によっては、血液中の滞留性は維持されるものの、水溶性高分子の存在が障壁となり、かえって薬物が作用する臓器、細胞への接近、接触などが抑制され、薬物の細胞内への導入率が低くなる問題がある。【０００４】
そこで、生体膜と相互作用を示す物質をリポソーム膜に修飾することで細胞への導入を促進する研究も行われている。例えば、弱酸性下で膜融合性を示すポリグリセリンのスクシニル化誘導体（以下、ＳｕｃＰＧと示す）が報告されている（例えば特許文献２）。また、ＳｕｃＰＧとは炭化水素鎖長が異なり、かつ分岐した構造を持つ３−メチルグルタル酸をポリグリセリンに誘導化したものとカチオン化修飾剤であるアミジン誘導体とで修飾された脂質膜の担体粒子に、薬物を担持した薬物担体が、遺伝子導入活性を有することについても報告されている（例えば特許文献３）。しかしながらこれらの誘導体では、ポリグリセリンへの炭化水素基の導入がランダムであって任意の位置に導入できないことから、リポソームをはじめとした脂質膜からなる担体粒子の構成物質としてこれらの誘導体を用いた場合、アンカー部分である炭化水素基が複数の位置でランダムに脂質膜に組み込まれる。したがって親水性であるポリグリセリン鎖が拘束されてリポソーム表面からあまり離れることができず、水和層を広げることができないので、安定なリポソームが形成しにくいという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２００４／０６０８９９号パンフレット
【特許文献２】特開２００４−３５２６１９号公報
【特許文献３】特開２００８−１２０７２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、病巣部位を確実にターゲッティングし、薬物を効率良く目的部位に送達しうるＤＤＳのための薬物担体が望まれている。特に薬物が細胞内で薬理作用を示す生理活性物質の場合には、薬物を効率良く細胞内で発現するために、細胞導入率がより一層向上された薬物担体の開発が強く望まれている。【０００７】
このため本発明は、タンパク質、アンチセンス分子、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体などの細胞内で活性を発現する生理活性物質の細胞へのトランスフェクションを、安全にかつ効率良く行うことができる導入システムを達成できるベクターとして有効な薬物担体としてのｐＨ応答性を有するリポソーム、またたとえば腎ガン、肺ガン、肝ガン、膵ガンなどの癌、リンパ腫、肺炎、肝炎、腎炎、血管内皮損傷部位などの病巣部位を確実にターゲッティングし、該部位に、治療および／または診察するための薬物を安全にかつ効率良く送達するＤＤＳ療法の運搬体として有効なｐＨ応答性を有するリポソーム、さらにはそのような薬物担体を形成するために有用なリン脂質誘導体を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような課題に直面した本発明者らは、下記一般式（１）【０００９】
【化１】
2011059073.tif 000003
【００１０】
（式中の各記号は、明細書に記載のとおりである）で表されるリン脂質誘導体を含んでなるリポソームが、ｐＨが低くなると膜が不安定化して細胞膜との融合能を持つことを初めて解明した。
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち本発明は、
［１］下記一般式（１）【００１２】
【化２】
2011059073.tif 000004
【００１３】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、炭素数８〜２４のアシル基または炭素数８〜２４の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ３は、炭素数２〜１２で分岐鎖状または環状の、二価の炭化水素基を示し、
ａは、０〜５の整数を示し、
Ｍは、水素原子、アルカリ金属またはアンモニウム基を示し、
ＰＧは、ポリグリセリン由来の残基を示し、ｋ１は、２〜５０の整数を示し、ｋ２≧ｋ３、ｋ２＋ｋ３＝ｋ１＋１を満たす）
で示されるリン脂質誘導体（以下、「リン脂質誘導体（１）」と記載する場合がある）；
［２］Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、炭素数１２〜２０のアシル基もしくは炭素数１２〜２０の脂肪族炭化水素基である、［１］に記載のリン脂質誘導体；
［３］Ｒ３が、炭素数３〜８で分岐鎖状または環状の、二価の炭化水素基である、［１］または［２］に記載のリン脂質誘導体；
［４］Ｒ３が、２−メチルプロピレン基、または１，２−シクロヘキセン基である、［１］〜［３］のいずれか一に記載のリン脂質誘導体；
［５］［１］〜［４］のいずれか一に記載のリン脂質誘導体を含んでなる、リポソーム；
［６］ｐＨ応答性である、［５］に記載のリポソーム；
などに関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のリン脂質誘導体は、ポリグリセリン鎖中に導入された二塩基酸によって、ｐＨが低くなるとプロトン化されて疎水性が強くなる性質を持つ。
このため、本発明のリン脂質誘導体を含んでなる薬物担体としての本発明のリポソームは、ｐＨ応答性であり、従来用いられてきたリポソームと異なり、エンドソーム中のｐＨ低下により膜が不安定化され膜融合能を持つことができる。よって、本発明のリポソームは、エンドソーム膜と効率よく融合し、リポソーム内の内包物を細胞質中に効率良く移行させることができることから、公知の薬物担体よりも向上された細胞導入率を示す。【００１５】
このような本発明のｐＨ応答性リポソームは、病巣部位で膜融合性を発現することができ、病患部もしくは細胞内への薬物導入を効率よくかつ安全に行うことができる。したがって、薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質を封入した本発明のｐＨ応答性リポソームは、治療および診断目的のＤＤＳとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明のリポソームがｐＨに応答してリポソーム内の物質を放出することを示す図である。
【図２】図２は、本発明のＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇからなるリポソームが細胞内に取り込まれ、リポソーム内の物質を放出することを示す図である。
【図３】図３は、本発明のＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇからなるリポソームが細胞内に取り込まれ、リポソーム内の物質を放出することを示す図である。
【図４】図４は、本発明のリポソームが細胞内に取り込まれ、リポソーム内の物質を放出することを示す図である。
【図５】図５は、ＯＶＡを封入したリポソーム分散液による腫瘍拒絶試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１．リン脂質誘導体
リン脂質誘導体（１）において、〔ＰＧ〕ｋ１で表される基は、平均重合度ｋ１の「ポリグリセリン由来の残基」を示す。
【００１８】
本明細書中、ＰＧで示される「ポリグリセリン由来の残基」とは、ポリグリセリンのグリセリン繰返し単位における全ての水酸基を除いた残部からなる基を意味する。ｋ１は、具体的にはポリグリセリンの繰返し単位を表し、特に限定されないが、ｋ１が２未満の場合には、後述する本発明のリポソームを作成した場合の水和層の形成が不十分であり、５０を超えるとリン脂質骨格に対して親水性のポリグリセリン骨格が大きいことから、本発明のリポソームの形成が困難であるか、または形成できた場合の本発明のリポソームの安定性に劣る。したがって、ｋ１として好ましくは２〜５０であり、より好ましくは２〜２０であり、特に好ましくは３〜１２である。
【００１９】
リン脂質誘導体（１）において、ｋ２は、〔ＰＧ〕ｋ１で表される平均重合度ｋ１の「ポリグリセリン由来の残基」に結合した、式（２）
【００２０】
【化３】
2011059073.tif 000005
【００２１】
（式中、Ｒ３は、明細書（後述）記載のとおりである）で表される二塩基酸由来の置換基の平均個数を表す。ｋ２は、通常２〜５１である。
【００２２】
またリン脂質誘導体（１）において、ｋ３は、〔ＰＧ〕ｋ１で表される平均重合度ｋ１の「ポリグリセリン由来の残基」に結合した、水酸基の平均個数を表す。ｋ３は、通常０〜２５である。
【００２３】
ｋ１、ｋ２とｋ３の関係はｋ２＋ｋ３＝ｋ１＋１を満たすものである。
またｋ２とｋ３の関係は、ｋ２≧ｋ３を満たす。ｋ３がｋ２よりも大きい場合にはｐＨ応答性が不十分となる。本発明のリポソームが充分なｐＨ応答性を発現させる点からは、ｋ２≧１．２５×ｋ３であることが好ましく、ｋ２≧１．５×ｋ３であることがさらに好ましく、ｋ２≧２×ｋ３であることが特に好ましい。
【００２４】
本発明のリン脂質誘導体は、ポリグリセリン鎖中に導入された二塩基酸によってｐＨが低くなるとプロトン化されて疎水性が強くなる性質を持つ。すなわちエンドソームとリポソームが膜融合して内包物を放出するｐＨは二塩基酸の導入率によって変化する。
本発明者らは、リポソーム組成が同じ場合、リン脂質誘導体（１）に導入された二塩基酸の導入率が低くなるほど、ｐＨ応答性領域が酸性側に移行することを見出した。また二塩基酸導入率が同じ場合、リポソーム組成においてリン脂質誘導体（１）の配合量が少なくなるほど、ｐＨ応答性領域が酸性側に移行することも見出した。
【００２５】
後述するように、本発明のリポソームは、物質が血中から細胞内に移行する際にエンドソームによって取り込まれる機構を利用している。血中のｐＨは７．４付近であり、この付近のｐＨではリポソームが安定に存在し、かつ薬物保持能を有する必要がある。さらにエンドソーム内では、プロトンポンプの作用などによりｐＨが５〜６付近まで低下していることが知られている（例えば、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｉｎｃ、Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、第３版、６１０−６１１頁参照）。よってリポソームからの内包物の放出を考えた場合、少なくともｐＨ５〜７の範囲で膜融合能を有するリポソームを製造することが好ましいのである。
上記リン脂質誘導体（１）を含む本発明のリポソームは、ｐＨ５〜７の範囲で膜融合能を有するリポソーム有している。さらに本発明のリポソームは、二塩基酸導入率を低くすること、またはリポソームに含まれるリン脂質誘導体（１）の配合量を少なくすることでｐＨ応答性領域を酸性側に移行することができるように、ｐＨ応答性領域の調整が可能なリポソームである。
【００２６】
リン脂質誘導体（１）における、二塩基酸導入率は以下の数式で表される。
【００２７】
【数１】
2011059073.tif 000006
【００２８】
数式の導入率が５０％以下の場合にはｐＨ応答性が不十分となるので、リン脂質誘導体（１）において、ｋ２／（ｋ２＋ｋ３）×１００＞５０であることが望ましい。特に本発明のリポソームが充分なｐＨ応答性を発現させる点からは、二塩基導入率が５６％以上であることが好ましく、６０％以上であることがさらに好ましく、６７％以上であることが特に好ましい。
【００２９】
リン脂質誘導体（１）において、ａは０〜５の整数を示す。ａが５を超えると疎水性が強まって、本発明のリポソームが形成しがたくなる。本発明のリポソームの製造の容易さの点から、ａは２〜４であることが好ましく、２または３であることがさらに好ましく、３であることが特に好ましい。
【００３０】
リン脂質誘導体（１）において、Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子またはアンモニウム基を示す。
本明細書中、「アルカリ金属」としては、リチウム、ナトリウム、カリウムなどが挙げられる。
リン脂質誘導体（１）の保存安定性に優れる点からは、Ｍはアルカリ金属またはアンモニウムであることが好ましく、ナトリウムまたはアンモニウムであることがより好ましい。
【００３１】
リン脂質誘導体（１）において、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、炭素数８〜２４のアシル基または炭素数８〜２４の脂肪族炭化水素基を示す。なかでも、より本発明のリポソームを形成しやすくする点から、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、炭素数１２〜２０のアシル基または炭素数１２〜２０の脂肪族炭化水素基であることが好ましく、炭素数１４〜１８のアシル基または炭素数１４〜１８の脂肪族炭化水素基がさらに好ましい。
Ｒ１およびＲ２をアシル基とした場合には、エステル結合部分が加水分解されやすいため、本発明のリポソームを治療または診断に用いた場合人体から代謝されやすくなり、一方でＲ１およびＲ２を炭化水素基とした場合には、耐加水分解性に優れる本発明のリポソームが得られ、したがってリポソーム液の保存安定性に優れることから、Ｒ１およびＲ２は、本発明のリポソームとして所望の特性に応じて任意に選択することができる。
【００３２】
本明細書中、「炭素数８〜２４のアシル基」としては、飽和または不飽和である炭素数８〜２４のアシル基が挙げられ、このような基としては、例えば、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ヘネイコサン酸、ベヘン酸、トリコサン酸、リグノセリン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ヘキサデカジエン酸、リノール酸、エイコサジエン酸、ドコサジエン酸、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エイコサトリエン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサヘキサエン酸等から水酸基を除いてなる残基が挙げられる。
なかでも、取扱いのしやすさ、および脂質膜の形成性の強さなどの点から炭素数１２〜２０のアシル基が好ましく、炭素数１４〜１８のアシル基がより好ましい。なかでも、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリストレイン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ヘキサデカジエン酸、またはリノール酸から水酸基を除いてなる残基がより好ましい。
【００３３】
本明細書中、「炭素数８〜２４の脂肪族炭化水素基」としては、直鎖状、分岐鎖状または環状であって、１つ以上の不飽和結合を有していてもよい脂肪族炭化水素基が挙げられ、このような基としては、例えば、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、エイコシル基、ヘキサジエニル基、リノレイル基、エイコセニル基、エルシル基、γ−リノレニル基、エイコサトリエニル基、などが挙げられる。なかでも、取扱いのしやすさ、および脂質膜の形成性の強さなどの点から、炭素数１２〜２０の脂肪族炭化水素基が好ましく、炭素数１４〜１８の脂肪族炭化水素基がより好ましい。なかでも、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノレイル基がより好ましい。
【００３４】
リン脂質誘導体（１）において、Ｒ３は、炭素数２〜１２で、分岐鎖状または環状の、二価の脂肪族炭化水素基を示す。当該基において炭素数が２より小さいと、本発明のリポソームのｐＨ応答性が得難くなり、一方で炭素数が１２を超えると、疎水性が強いために本発明のリポソームの形成性に劣る。
【００３５】
本明細書中、「炭素数２〜１２で、分岐鎖状または環状の、二価の炭化水素基」としては、分岐鎖状または環状の二価の基であって、１つ以上の不飽和結合を有していてもよい炭素数２〜１２の炭化水素基が挙げられ、このような基としては、例えば、メチルメチレン基、エチルメチレン基、１−メチルエチレン基、２−メチルエチレン基、１−メチレンエチレン基、２−メチレンエチレン基、１，２−ジメチルエチレン基、１，１−ジメチルエチレン基、２，２−ジメチルエチレン基、１−ヘキセン−１−イルエチレン基、２−ヘキセン−１−イルエチレン基、１−オクテニルエチレン基、２−オクテニルエチレン基、１−アリルエチレン基、２−アリルエチレン基、１−ブチルエチレン基、２−ブチルエチレン基、１−デシルエチレン基、２−デシルエチレン基、１−フェニルエチレン基、２−フェニルエチレン基、１−ｎ−オクチルエチレン基、２−ｎ−オクチルエチレン基、１−ノネニルエチレン基、２−ノネニルエチレン基、１−メチルプロピレン基、２−メチルプロピレン基、３−メチルプロピレン基、１，１−ジメチルプロピレン基、２，２−ジメチルプロピレン基、３，３−ジメチルプロピレン基、１−エチルプロピレン基、２−エチルプロピレン基、３−エチルプロピレン基、１−エチル−１−メチルプロピレン基、１，３−ジエチルプロピレン基、２−エチルプロピレン基、２−エチルブチレン基、２−エチルブチレン基、２−プロピルブチレン基、２−（ｔ−ブチル）ブチレン基、２，２，６，６−テトラメチルペンテン基などの分岐鎖状の脂肪族炭化水素基；１，２−シクロヘキセン基、１，３−シクロヘキセン基、１，４−シクロヘキセン基、１−メチレン−２，３−シクロプロペン基、１，２−シクロブテン基、１，１−シクロブテン基、１，１−シクロプロペン基、３，４−ビシクロ（２．２．１）ヘプテン基、２，２−ビシクロ（２．２．１）ヘプテン基、２，３−ビシクロ（２．２．１）ヘプテン基、９，１０−トリシクロ［４．２．１．１（２，５）］デセン基、２，４−（１−メチル−３−フェニル）ビシクロ（１．１．０）ブテン基、９，１０−（４−メチル）ペンタシクロ［４．４．０．０（２，５）．０（３，８）．０（４，７）］デセン基、９，１０−ペンタシクロ［４．４．０．０（２，５）．０（３，８）．０（４，７）］デセン基、２，４−ペンタシクロ［４．４．０．０（２，５）．０（３，８）．０（４，７）］デセン基、４，４’−ビフェニレン基、２，３−（シス−５−ノルボルネン）イル基、１，３−アダマンタンイル基などの脂環式炭化水素基；１，２−フェニレン基、１，３−フェニレン基、１，４−フェニレン基、１，２−（３−メチル）フェニレン基、１，２−（４−メチル）フェニレン基、１，２−（４−エチル）フェニレン基、１，２−（４−プロピル）フェニレン基、１，２−（４−ｎ−ブチル）フェニレン基、ジブチル−１，２−フェニレン基、１，２−（４−イソブチル）フェニレン基、１，３−（５−メチル）フェニレン基、１，３−（５−エチル）フェニレン基、１，３−（５−ｎ−ブチル）フェニレン基、１，３−（５−イソブチル）フェニレン基、１，３−（５−ｔ−ブチル）フェニレン基、１，２−（４−ｔ−ブチル）フェニレン基、１，２−ナフタレニル基、１，４−ナフタレニル基、２，３−ナフタレニル基、２，６−ナフタレニル基、１，８−ナフタレニル基などの芳香族炭化水素基；が挙げられる。Ｒ３として好ましくは炭素数３〜８で分岐鎖状または環状の、二価の炭化水素基であり、さらに好ましくは２−メチルプロピレン基または１，２−シクロヘキセン基である。
【００３６】
リン脂質誘導体（１）において、Ｒ３は、炭素数２〜１２で、分岐鎖状または環状の、二価の脂肪族炭化水素基を示す。当該基において炭素数が２より小さいと、本発明のリポソームのｐＨ応答性が得難くなり、一方で炭素数が１２を超えると、疎水性が強いために本発明のリポソームの形成性に劣る。
【００３７】
なおリン脂質誘導体（１）におけるＲ３は、式（２）
【００３８】
【化４】
2011059073.tif 000007
【００３９】
で表される二塩基酸由来の置換基における二つのカルボキシル基を除いた部分である。
上記Ｒ３の起源となり得る二塩基酸としては、例えば、メチルマロン酸、エチルマロン酸、メチルコハク酸、エチルコハク酸、メチレンコハク酸、２，２−ジメチルコハク酸、２，３−ジメチルコハク酸、２−ヘキセン−１−イルコハク酸、２−オクテニルコハク酸、アリルコハク酸、ブチルコハク酸、デシルコハク酸、フェニルコハク酸、ｎ−オクチルコハク酸、ノネニルコハク酸、２−メチルグルタル酸、３−メチルグルタル酸、２，２−ジメチルグルタル酸、３，３−ジメチルグルタル酸、２−エチルグルタル酸、３−エチルグルタル酸、２−エチル−２−メチルグルタル酸、２，４−ジエチルグルタル酸、３−エチルグルタル酸、３−メチルアジピン酸、３−エチルアジピン酸、３−プロピルアジピン酸、３−（ｔ−ブチル）アジピン酸、２，２，６，６−テトラメチルピメリン酸などの分岐鎖状の炭化水素基を有する二塩基酸；１，２−シクロヘキサンジカルボン酸、１，３−シクロヘキサンジカルボン酸、１，４−シクロヘキサンジカルボン酸、１−メチレンシクロプロパン−２，３−ジカルボン酸、３−メチレンシクロプロパン−１，２−ジカルボン酸、シクロブタン−１，２−ジカルボン酸、シクロブタン−１，１−ジカルボン酸、シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸、ビシクロ（２．２．１）ヘプタン−３，４−ジカルボン酸、ビシクロ（２．２．１）ヘプタン−２，２−ジカルボン酸、ビシクロ（２．２．１）ヘプタン−２，３−ジカルボン酸、トリシクロ［４．２．１．１（２，５）］デカン−９，１０−ジカルボン酸、１−メチル−３−フェニル−ビシクロ（１．１．０）ブタン−２，４−ジカルボン酸、４−メチルペンタシクロ［４．４．０．０（２，５）．０（３，８）．０（４，７）］デカン−９，１０−ジカルボン酸、ペンタシクロ［４．４．０．０（２，５）．０（３，８）．０（４，７）］デカン−９，１０−ジカルボン酸、ペンタシクロ［４．４．０．０（２，５）．０（３，８）．０（４，７）］デカン−２，４−ジカルボン酸、ビフェニル−４，４’−ジカルボン酸、シス−５−ノルボルネン−ｅｎｄｏ−２，３−ジカルボン酸、１，３−アダマンタンジカルボン酸などの脂環式炭化水素基を有する二塩基酸；フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、３−メチルフタル酸、４−メチルフタル酸、４−エチルフタル酸、４−プロピルフタル酸、４−ｎ−ブチルフタル酸、ジブチルフタル酸、４−イソブチルフタル酸、５−メチルイソフタル酸、５−エチルイソフタル酸、５−ｎ−ブチルイソフタル酸、５−イソブチルイソフタル酸、５−ｔ−ブチルイソフタル酸、４−ｔ−ブチルフタル酸、１，２−ナフタレンジカルボン酸、１，４−ナフタレンジカルボン酸、２，３−ナフタレンジカルボン酸、２，６−ナフタレンジカルボン酸、１，８−ナフタレンジカルボン酸などの芳香族炭化水素基を有する二塩基酸；が挙げられる。なかでも、炭素数５〜１０（Ｒ３においては、炭素数３〜８となり得る）の二塩基酸が好ましく、３−メチルグルタル酸または１，２−シクロヘキサンジカルボン酸がより好ましい。
【００４０】
２．リン脂質誘導体（１）の製造方法
リン脂質誘導体（１）の製造方法は特に限定されるものではないが、下記一般式（３）
【００４１】
【化５】
2011059073.tif 000008
【００４２】
（式中、各記号は、前記したとおりである）で表される、１，２−ジアシルまたは１，２−ジアルキルホスファチジルエタノールアミンポリグリセリン誘導体（以下、「化合物（３）」と記載する場合がある）と、二塩基酸またはその無水物とを、有機溶媒中、反応させることで製造することができる。
【００４３】
なお化合物（３）は、当業者であれば自体公知の化合物から適宜合成することが可能である。
【００４４】
化合物（３）に反応させる二塩基酸としては、前記「Ｒ３の起源となり得る二塩基酸」で挙げた二塩基酸を好ましく用いることができる。反応には二塩基酸またはその無水物のいずれを用いても良いが、反応条件を穏和にでき望ましくない副反応などを抑制することができる点から二塩基酸無水物を用いることが好ましい。
【００４５】
化合物（３）と上記二塩基酸またはその無水物との反応において使用する有機溶媒としては、水酸基等の官能基を有しないものであれば特に制限することなく使用することができる。このような有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ベンゼンまたはトルエンなどが挙げられる。これらの中ではジメチルスルホキシド、クロロホルムまたはトルエンが好ましい。
本反応における反応温度は特に限定されないが、通常２０〜９０℃であり、好ましくは３０〜８０℃である。
【００４６】
化合物（３）に対する、二塩基酸またはその無水物の仕込みモル比率は、目的とするリン脂質誘導体（１）のｋ２に対して１倍以上であることが好ましく、２倍から１０倍の範囲にあることがさらに好ましく、２倍から５倍の範囲にあることが特に好ましい。
【００４７】
本反応に際しては、さらにエステル化反応に通常用いられる触媒を用いても良い。触媒の種類としては特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、ジメチル−４−アミノ−２−メチルピリジン、４−ピロリジノピロリジン酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ほう酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウム等の比較的穏和な塩基性触媒が好適に用いられる。
【００４８】
このようにして、本発明のリン脂質誘導体（１）を製造することができる。得られたリン脂質誘導体（１）は、クロマトグラフィー、透析、再結晶など自体公知の方法で精製することが可能である。
【００４９】
３．リン脂質誘導体（１）を含むリポソーム
本発明のリン脂質誘導体（１）は、膜形成能を有する公知の脂質と同様にリポソームの構成成分として用いることが可能である。本発明のリン脂質誘導体（１）を含むリポソーム（以下、「本発明のリポソーム」と記載する）は、従来用いられてきたリポソームと異なり、細胞内におけるエンドソーム内の低ｐＨ（ｐＨ５〜７付近）環境に接触したとき、リポソーム膜が不安定化されてエンドソーム膜と効率よく融合し、リポソーム内の内包物を細胞質中に効率良く移行させることができる。したがって本発明のリポソームはｐＨ応答性を有し、それゆえに公知の薬物担体よりも向上された細胞導入率を示すリポソームでありうる（このことから、本発明のリポソームを「本発明のｐＨ応答性リポソーム」と記載する場合もある）。
【００５０】
リン脂質誘導体（１）と共に本発明のリポソームを構成する脂質は、膜形成能を有するものであれば、リン脂質であってもリン脂質以外の脂質であってもよく、このような脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ジセチルリン酸、ステアリルアミン、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）、カルジオリピン等の天然あるいは合成のリン脂質、またはこれらの部分もしくは完全水素添加物；これらの混合物である大豆レシチン、コーンレシチン、綿実油レシチン、卵黄レシチンなどの天然レシチン；および水素添加大豆レシチン、水素添加卵黄レシチン、これらのリン脂質にポリエチレングリコールやアミノグリカン類や蛍光性基を導入したリン脂質誘導体などが挙げられる。これらの脂質を構成する炭化水素基としては１−位、２−位が同種もしくは異種どちらでも良く、上記の炭素数８〜２４のアシル基や、炭素数８〜２４の脂肪族炭化水素基等で構成されている。以上の脂質のうち、１種又は２種以上が混合して用いられる。
【００５１】
本発明のリポソームは、さらに安定化剤として、ステロール、またはグリセロール、シュクロースなどの糖類を配合することにより、膜の流動性を抑制し、さらにリポソーム自体の経時安定性を高めることができる。上記ステロールとしては、例えば、コレステロール、フィトステロール、ジヒドロコレステロール、ステアリン酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、オレイン酸ジヒドロコレステリル等が挙げられる。ステロールとして好ましくは、コレステロール、フィトステロール、ステアリン酸コレステリルである。
また酸化防止剤として、トコフェロール同族体すなわちビタミンＥなどをリポソームに配合してもよい。トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが、本発明においてはいずれのトコフェロールも使用できる。
【００５２】
本発明のリポソームには、薬理活性を高める目的で、更にデンドロン脂質を配合することもできる。デンドロン脂質はプロトンスポンジ効果を持つため、これによりエンドソームからの脱出が促進され遺伝子導入活性が高められる。
【００５３】
本発明のリポソームにおいては、リン脂質誘導体（１）が、リポソーム製造時の原料全体の１〜５０モル％配合されていることが好ましく、２〜３０モル％配合されていることがさらに好ましい。
特に、式（１）中のＲ３が２−メチルプロピレン基である場合は、８〜３０モル％配合されていることが好ましく、１０〜３０モル％配合されていることが特に好ましい。また、Ｒ３が２−シクロヘキセン基である場合は、２〜２０モル％配合されていることが好ましく、２〜１２モル％配合されていることが特に好ましい。リン脂質誘導体（１）の配合割合がリポソーム全体の１〜５０モル％にあると、リポソーム形成性に優れ、かつ得られたリポソームのｐＨ応答性が良好となる。
【００５４】
本発明のリポソームは、例えば、リン脂質誘導体（１）と、脂質（例えば、リン脂質）と、そして任意の上記配合成分とを、リポソームを作製するための公知の技術により混合し、超音波処理法、フレンチプレス法、逆相蒸発法、界面活性剤法、エクストルージョン法、カルシウム−ＥＤＴＡキレート法、凍結融解法などの方法や、真空乳化機、高圧ホモミキサー、マイクロフルイダイザー、マントンゴーリンなどの乳化機で処理することにより、製造することができる。
また、これらのリポソームをフィルターやゲルろ過などのサイジング操作を行うことにより、粒径のそろったリポソームを選択的に得ることができ、それによりリポソームの安定性をさらに高めることもできる。
【００５５】
上記したようにリポソームの粒径はリポソームの安定性にも影響を与えるため、本発明のリポソームは、上記操作により粒径をそろえることが望ましい。リポソームの粒子径の表示方法には、重量平均粒子径と個数平均粒子径が一般に用いられるが、リポソームの保持容量の観点からは重量平均粒子径で表わすことが望ましい。本発明のリポソームの重量平均粒子径は、通常２０ｎｍ〜８００ｎｍ、好ましくは４０〜５００ｎｍ、より好ましくは８０ｎｍ〜４００ｎｍである。
上記の所望の粒径を得るためには、予め決められたポアサイズを有するフィルターを通して大きい粒径のリポソームを濾過する押出濾過法などを使用すればよい。
【００５６】
このようにして得られるリポソームに任意の薬理的活性物質や診断用薬剤を封入することで、細胞内へ薬理的活性物質や診断用薬剤を容易に輸送することができる。薬理的活性物質や診断用薬剤の封入方法は特に限定されず、自体公知の封入方法を適宜設定することができるが、通常、リポソーム形成時に薬理的活性物質や診断用薬剤を大過剰混合し、リポソームを形成させることで薬理的活性物質や診断用薬剤が封入されたリポソームが得られる。
【００５７】
本発明のリポソームに内包し得る薬理的活性物質としては、リポソームの形成を損ねない限り特に限定されないが、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖、多糖およびそれらの誘導体、タンパク質およびペプチドなどの生理活性的物質；抗炎症剤、ステロイド剤、抗癌剤、酵素剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り組み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウィルス剤、抗凝固剤、血管拡張剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤およびラジカルスカベンジャーなどが挙げられる。
【００５８】
本発明のリポソームに内包し得る診断用薬剤としては、リポソームの形成を損ねないかぎり特に限定されないが、たとえばＸ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬などの体内診断薬や、水溶性蛍光色素などの標識剤が挙げられる。
【００５９】
生体のｐＨは通常は７以上（例えば、血液中のｐＨは約７．４）であるが、細胞内のエンドソーム内では酸性条件（通常ｐＨ５〜７、好適にはｐＨ５〜６）になるため、本発明のリポソームは膜融合性を示す。特に本発明のリポソームはｐＨ５〜７で疎水性を増して不安定となり、膜融合しやすくなるというｐＨ応答性を示す。したがって本発明のリポソームがエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれた場合、プロトンポンプの作用でリポソーム周囲のｐＨがｐＨ５〜７付近まで低下し、そのとき本発明のリポソームは膜融合性を発現してエンドソーム膜と融合する。その結果、リポソームが内包する物質が細胞室内へ放出される。
すなわち、本発明のリポソームはｐＨ応答性を示すリポソームであるばかりか、生体細胞へのＤＤＳ担体としての役割を担うリポソームでもあり得る。
【実施例】
【００６０】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【００６１】
《リン脂質誘導体（１）の製造》
本発明のリポソームの重要な構成成分である、本発明のリン脂質誘導体（１）は以下のように製造した。【００６２】
実施例１：オクタグリセロールグルタリル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン３−メチルグルタル酸誘導体（以下ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇと記載する）の合成（二塩基酸導入率５８．９％）【００６３】
【化６】
2011059073.tif 000009
【００６４】
オクタグリセロールグルタリル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（日油株式会社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−ＰＧ８Ｇ）２．０ｇ（１．３８ｍｍｏｌ）に、溶媒としてジメチルホルムアミド２０ｍＬを加えて、８０℃にて溶解させた。次いで、３−メチルグルタル酸無水物４．７８ｇ（３７．３ｍｍｏｌ）を加えて、攪拌しながら８０℃で反応を６時間行った。反応溶液を濃縮乾固し、得られた結晶をイオン交換水１７５ｍＬ、メタノール３０ｍＬで分散させた。
分散溶液を透析膜Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ６（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）に仕込んで、イオン交換水８Ｌによる透析を三日間行った。イオン交換水は一日毎に交換した。透析後の溶液を凍結乾燥して、目的のＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ  １．４ｇを得た。【００６５】
１Ｈ−ＮＭＲ（重クロロホルム／重メタノール＝４／１重量比溶媒）より、δ  ０．８８にステアロイル基末端メチル基プロトン（積分値６．０）、δ  １．０４に３−メチルグルタル酸の分岐したメチル基のプロトン（積分値１６．０）、δ  １．２６にステアロイル基のメチレン基プロトン（積分値６０．０）、δ  ２．２〜２．５に３−メチルグルタル酸由来の−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−のメチレン基、メチン基プロトン、ステアロイル基メチレン基プロトン−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−、グルタル酸残基メチレン基プロトン−ＮＨＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−（積分値３３．６）、δ  ３．２〜４．５にオクタグリセロール由来のメチレン基、メチン基プロトン、エタノールアミン部分のメチレン基プロトン−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−、ＤＳＰＥ骨格に含まれるメチレン基プロトン−ＣＨ−ＣＨ２−ＯＰＯ３−（積分値５３．１）を確認した。
δ  １．０４のメチル基プロトンの積分値が１６であることから、オクタグリセリン骨格に含まれる水酸基９つのうち平均５．３個が３−メチルグルタル酸により置換されていることを確認した。すなわち上記式（４）におけるｋ２およびｋ３はそれぞれ５．３および３．７であった。したがって、二塩基酸導入率は５．３/９×１００=５８．９％である。【００６６】
実施例２：オクタグリセロールグルタリル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン３−メチルグルタル酸誘導体（以下ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇと記載する）の合成（二塩基酸導入率１００％）【００６７】
オクタグリセロールグルタリル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（日油株式会社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−ＰＧ８Ｇ）２．０ｇ（１．３８ｍｍｏｌ）に、溶媒としてトルエン（４７ｍＬ）を加えて４０℃にて溶解させた。ここに３−メチルグルタル酸無水物２．３９ｇ（１８．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン２．０８ｍＬ（１８．９ｍｍｏｌ）を加え、攪拌しながら４０℃で５時間反応を行った。反応溶液にアセトニトリル２００ｍＬを添加して氷冷化にて結晶を析出させた。その後上澄み液を除去し、得られた結晶をアセトニトリル２００ｍＬで二回洗浄し、乾燥することで、目的のＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ  １．９ｇを得た。【００６８】
実施例１と同様に二塩基酸導入率を算出したところ、ｋ２およびｋ３はそれぞれ９．０および０であった。したがって、導入率は９/９×１００＝１００％である。【００６９】
実施例３：オクタグリセロールグルタリル  ジステアリルホスファチジルエタノールアミン  １，２−シクロヘキサンジカルボン酸誘導体（以下ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇと記載する）の合成(導入率５６．７％)【００７０】
【化７】
2011059073.tif 000010
【００７１】
オクタグリセロールグルタリル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（日油株式会社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−ＰＧ８Ｇ）２．０ｇ（１．３８ｍｍｏｌ）に、溶媒としてトルエン（４７ｍＬ）を加えて５０℃にて溶解させた。ここにシクロヘキサンジカルボン無水物２．０１ｇ（１３．０ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム１．１ｇ（１３．０ｍｍｏｌ）を加え、攪拌しながら３０℃で１時間反応を行った。反応溶液をクロロホルム２００ｍＬにて希釈し、濾過により酢酸ナトリウムを除いた。さらに濾液を濃縮乾固して得られた結晶を、クロロホルム５０ｍＬで溶解し、ここにアセトニトリル２００ｍＬを添加して結晶を析出させた。その後上澄み液を除去し、得られた結晶をアセトニトリル２００ｍＬで二回洗浄し、乾燥することで、目的のＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ  ２．１ｇを得た。【００７２】
１Ｈ−ＮＭＲ（重クロロホルム溶媒）より、δ  ０．８８にステアロイル基末端メチル基プロトン（積分値６．０）、δ  １．２６にステアロイル基のメチレン基プロトン（積分値５９．０）、δ  １．３〜２．２にシクロヘキサンジカルボン酸由来のメチレン基プロトンステアロイル基メチレン基プロトン−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−、グルタル酸残基メチレン基プロトン−ＮＨＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ−（積分値５１．８）、δ  ２．６〜３．０にシクロヘキサンジカルボン酸由来のメチン基プロトン（積分値１０．１）を確認した。
δ  ２．６〜３．０のメチン基プロトンの積分値が１０．１であることから、オクタグリセロール骨格に含まれる水酸基９つのうち平均５．１個が、シクロヘキサンジカルボン酸により置換されていることを確認した。すなわち、上記式（５）で示されるｋ２およびｋ３はそれぞれ５．１および３．９であった。したがって、二塩基酸導入率は５．１／９×１００＝５６．７％である。【００７３】
実施例４：オクタグリセロールグルタリル  ジステアリルホスファチジルエタノールアミン  １，２−シクロヘキサンジカルボン酸誘導体（以下ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇと記載する）の合成（導入率９５．６％）【００７４】
オクタグリセロールグルタリル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（日油株式会社製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＳＰＥ−ＰＧ８Ｇ）３．０ｇ（２．０６ｍｍｏｌ）に、溶媒としてトルエン（７０ｍＬ）を加えて５０℃にて溶解させた。ここにシクロヘキサンジカルボン無水物８．６２ｇ（５５．９ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム４．７ｇ（５５．９ｍｍｏｌ）を加え、攪拌しながら５０℃で６時間反応を行った。ＴＬＣにて新たに反応生成物のスポットが得られた事を確認し、原料であるオクタグリセロールグルタリル  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの消失を確かめ反応を終了した。反応溶液をクロロホルム３００ｍＬにて希釈し、濾過により酢酸ナトリウムを除いた。さらに濾液を濃縮乾固して得られた結晶を、クロロホルム１００ｍＬで溶解し、ここにアセトニトリル３００ｍＬを添加して結晶を析出させた。その後上澄み液を除去し、得られた結晶をアセトニトリル３００ｍＬで二回洗浄し、乾燥することで、目的のＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ  ３．４５ｇを得た。【００７５】
実施例３と同様に、導入率を算出したところ、ｋ２およびｋ３はそれぞれ８．６および０．４であった。したがって二塩基酸導入率は８．６／９×１００＝９５．６％である。【００７６】
《リポソームの調製》
実施例１〜４で得られたリン脂質誘導体を利用して、リポソームを調製した。【００７７】
実施例５：ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）＝５０／５０（ｗｔ）［７３／２７（ｍｏｌ）］リポソームの調製
卵黄フォスファチジルコリン（日油株式会社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＣ−５０、以下、「ＥＹＰＣ」と記載する）１００ｍｇをクロロホルム１０ｍｌに溶解させて、濃度１０ｍｇ／ｍｌのＥＹＰＣ溶液を得た。これとは別に実施例１で得られたＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）１００ｍｇをクロロホルム１０ｍｌに溶解させて、濃度１０ｍｇ／ｍｌのＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）溶液を得た。
上記で得られたＥＹＰＣ溶液５００μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ溶液５００μｌを１０ｍｌナス型フラスコに仕込み、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去してＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（７３：２７（モル比））薄膜を形成させた。
次に、水溶性蛍光色素である８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム塩（以下、パイラニン）１８．９ｍｇ、その消光剤分子であるｐ−キシレン−ビス−ピリジウムブロミド（ＤＰＸ）２３．８ｍｇ、およびリン酸水素二ナトリウム９．９ｍｇを蒸留水０．９８ｍｌに溶解させ、さらに１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．０２ｍｌを加えｐＨ７．４にして蛍光消光水溶液を得た。この蛍光消光水溶液０．８５ｍｌを前記ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ薄膜を形成させたナス型フラスコ内に投入し、バス型超音波照射装置により３０秒間超音波照射して脂質膜を分散させ分散液を得た。この分散液に対して凍結−融解処理を三回行うことで、リポソームを形成させた後に、孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を装着したエクストルーダー処理を行ってリポソームの粒子径を１００ｎｍに揃えた。これをアガロースゲル（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社製、グルタチオンセファロース４Ｂ）を充填させたカラムにより精製し、パイラニンおよびＤＰＸ内包ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（７３：２７（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ１．８７ｍｍｏｌ／ｌであった。【００７８】
実施例６：ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）＝７５／２５（ｗｔ）［８９／１１（ｍｏｌ）］リポソームの調製
実施例５に記載のＥＹＰＣ溶液５００μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）溶液５００μｌの溶液量を、ＥＹＰＣ溶液７５０μｌ、ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）溶液２５０μｌにそれぞれ変更し、ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（８９：１１（モル比））薄膜を形成させた以外は実施例５に記載の手順に従い、パイラニン内包ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（８９：１１（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ４．３２ｍｍｏｌ／ｌであった。【００７９】
実施例７：ＥＹＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）＝２５／２５／５０（ｗｔ）［３６／３８／２６（ｍｏｌ）］リポソーム液の調製
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（日油株式会社製ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＥ−８１８１、以下ＤＯＰＣ）１００ｍｇをクロロホルム１０ｍｌに溶解させて濃度１０ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＥ溶液を得た。
実施例５に記載のＥＹＰＣ溶液５００μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）溶液５００μｌの代わりに、ＥＹＰＣ溶液２５０μｌ、ＤＯＰＥ溶液２５０μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）溶液５００μｌを用いて、ＥＹＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（３６：３８：２６（モル比））薄膜を形成させた以外は実施例３に記載の手順に従い、パイラニン内包ＥＹＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（３６：３８：２６（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ  １．６９ｍｍｏｌ／ｌであった。【００８０】
実施例８：ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率１００％）＝４５／５５（ｗｔ）［７３／２７（ｍｏｌ）］リポソームの調製
実施例２で得られたＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率１００％）１００ｍｇをクロロホルム１０ｍｌに溶解させて、濃度１０ｍｇ／ｍｌのＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率１００％）溶液を得た。
実施例５に記載のＥＹＰＣ溶液５００μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）溶液５００μｌの代わりに、ＥＹＰＣ溶液４５０μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率１００％）溶液５５０μｌを用いて、ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（７３：２７（モル比））薄膜を形成させた以外は実施例５に記載の手順に従い、パイラニン内包ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（７３：２７（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ１．１６ｍｍｏｌ／ｌであった。【００８１】
実施例９：ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率１００％）＝７１／２９（ｗｔ）［８９／１１（ｍｏｌ）］リポソームの調製
実施例５に記載のＥＹＰＣ溶液５００μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）溶液５００μｌの代わりに、ＥＹＰＣ溶液７１０μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率１００％）溶液２９０μｌを用いて、ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（８９：１１（モル比））薄膜を形成させた以外は実施例５に記載の手順に従い、パイラニン内包ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（８９：１１（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ２．４８ｍｍｏｌ／ｌであった。【００８２】
実施例１０：ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率５６．７％）＝７４／２６（ｗｔ）［８９／１１（ｍｏｌ）］リポソーム液の調製
実施例３で得られたＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率５６．７％）１００ｍｇをクロロホルム１０ｍｌに溶解させて濃度１０ｍｇ／ｍｌのＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率５６．７％）溶液を得た。
実施例５に記載の濃度１０ｍｇ／ｍｌのＥＹＰＣ溶液７４０μｌおよび上記のＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率５６．７％）溶液２６０μｌを１０ｍｌナス型フラスコに仕込み、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去してＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（８９：１１（モル比））薄膜を形成させた。次にパイラニン１８．９ｍｇ、ＤＰＸ  ２３．８ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム９．９ｍｇを蒸留水に溶解させ、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８．０にし全量を１ｍｌとして蛍光消光水溶液を得た。次いで前記内容以外は実施例５に記載の手順に従いパイラニン内包ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（８９：１１（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ３．３２ｍｍｏｌ／ｌであった。【００８３】
実施例１１：ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率５６．７％）＝８２／１８（ｗｔ）［９３／７（ｍｏｌ）］リポソーム液の調製
実施例１０に記載のＥＹＰＣ溶液７４０μｌおよびＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率５６．７％）溶液２６０μｌの溶液量を、ＥＹＰＣ溶液８２０μｌ、ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率５６．７％）溶液１８０μｌに変更し、ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（９３：７（モル比））薄膜を形成させた以外は実施例１０に記載の手順に従い、パイラニン内包ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（９３：７（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ３．３２ｍｍｏｌ／ｌであった。【００８４】
実施例１２：ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率９５．６％）＝７９／２１（ｗｔ）［９３／７（ｍｏｌ）］リポソーム液の調製
実施例４で得られたＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率９５．６％）１００ｍｇをクロロホルム１０ｍｌに溶解させて濃度１０ｍｇ／ｍｌのＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率９５．６％）溶液を得た。
実施例１０に記載のＥＹＰＣ溶液７４０μｌおよびＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率５８．９％）溶液２６０μｌの代わりに、ＥＹＰＣ溶液７９０μｌ、ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率９５．６％）溶液２１０μｌを用いて、ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（９３：７（モル比））薄膜を形成させた以外は実施例１０に記載の手順に従い、パイラニン内包ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（９３：７（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ１．９１ｍｍｏｌ／ｌであった。【００８５】
実施例１３：ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率９５．６％）＝９０／１０（ｗｔ）［９７／３（ｍｏｌ）］リポソーム液の調製
実施例１０に記載のＥＹＰＣ溶液７９０μｌおよびＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率５６．７％）溶液２１０μｌの代わりに、ＥＹＰＣ溶液９００μｌ、ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率９５．６％）溶液１００μｌを用いて、ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（９７：３（モル比））薄膜を形成させた以外は実施例１０に記載の手順に従い、パイラニン内包ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（９７：３（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ２．６１ｍｍｏｌ／ｌであった。【００８６】
比較例１：ＥＹＰＣリポソーム液の調製
実施例５に記載のＥＹＰＣ溶液５００μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ溶液５００μｌの代わりに、ＥＹＰＣ溶液１０００μｌをナス型フラスコに仕込み、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去してＥＹＰＣ薄膜を形成させた。以降は実施例５に記載の手順に従いパイラニン内包ＥＹＰＣリポソーム液を得た。得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ１．５６ｍｍｏｌ／ｌであった。【００８７】
《リポソームのｐＨ応答性測定試験》
実施例５〜１３および比較例１で調製したリポソームを用いて、ｐＨ応答性の測定試験を行った。【００８８】
実施例１４：実施例５で得られたリポソームのｐＨ応答性測定
実施例５で得られたリポソーム液にリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」と記載）を加えてリポソームの脂質濃度が１．６ｍｍｏｌ／ｌになるように調整した。石英セルに、１Ｎ塩酸で所定のｐＨに調整したＰＢＳを２４６９μｌ入れ、３７℃においてリポソーム分散液を３１μｌ加え、脂質濃度を２０μｍｏｌ／ｌとして１５分間３７℃でインキュベートした後、蛍光強度（Ｆ１５ｍｉｎ）を読み取り、また、１０％トリトンＸ−１００（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）水溶液を２５μｌ加えて撹拌し蛍光強度（Ｆｍａｘ）を読み取った。
Ｒｅｌｅａｓｅ（％）は下記式により求めた。【００８９】
【数２】
2011059073.tif 000011
【００９０】
実施例１５：実施例６で得られたリポソームのｐＨ応答性測定
実施例５で得られたリポソーム液の代わりに実施例６で得られたリポソーム液を用いた以外は実施例１４と同様に行い、所定のｐＨにおけるＲｅｌｅａｓｅ％を測定した。【００９１】
実施例１６：実施例７で得られたリポソームのｐＨ応答性測定
実施例５で得られたリポソーム液の代わりに実施例７で得られたリポソーム液を用いた以外は実施例１４と同様に行い、所定のｐＨにおけるＲｅｌｅａｓｅ％を測定した。【００９２】
実施例１７：実施例８で得られたリポソームのｐＨ応答性測定
実施例５で得られたリポソーム液の代わりに実施例８で得られたリポソーム液を用いた以外は実施例１４と同様に行い、所定のｐＨにおけるＲｅｌｅａｓｅ％を測定した。【００９３】
実施例１８：実施例９で得られたリポソームのｐＨ応答性測定
実施例５で得られたリポソーム液の代わりに実施例９で得られたリポソーム液を用いた以外は実施例１４と同様に行い、所定のｐＨにおけるＲｅｌｅａｓｅ％を測定した。【００９４】
実施例１９：実施例１０で得られたリポソームのｐＨ応答性測定
実施例５で得られたリポソーム液の代わりに実施例１０で得られたリポソーム液を用いた以外は実施例１４と同様に行い、所定のｐＨにおけるＲｅｌｅａｓｅ％を測定した。【００９５】
実施例２０：実施例１１で得られたリポソームのｐＨ応答性測定
実施例５で得られたリポソーム液の代わりに実施例１１で得られたリポソーム液を用いた以外は実施例１４と同様に行い、所定のｐＨにおけるＲｅｌｅａｓｅ％を測定した。【００９６】
実施例２１：実施例１２で得られたリポソームのｐＨ応答性測定
実施例５で得られたリポソーム液の代わりに実施例１２で得られたリポソーム液を用いた以外は実施例１４と同様に行い、所定のｐＨにおけるＲｅｌｅａｓｅ％を測定した。【００９７】
実施例２２：実施例１３で得られたリポソームのｐＨ応答性測定
実施例５で得られたリポソーム液の代わりに実施例１３で得られたリポソーム液を用いた以外は実施例１４と同様に行い、所定のｐＨにおけるＲｅｌｅａｓｅ％を測定した。【００９８】
比較例２：比較例１で得られたリポソームのｐＨ応答性測定
実施例５で得られたリポソーム液の代わりに比較例１で得られたリポソーム液を用いた以外は実施例１４と同様に行い、所定のｐＨにおけるＲｅｌｅａｓｅ％を測定した。【００９９】
実施例１４〜２２および比較例２で用いたリポソーム液（それぞれ、実施例５〜１３および比較例１で得られたリポソーム液に由来する）の脂質組成は、以下の各表に示すとおりである。【０１００】
【表１】
2011059073.tif 000012
【０１０１】
実施例１４、実施例１６、実施例２２および比較例２におけるｐＨ応答性測定の結果は、図１に示すとおりである。
その結果、比較例１のリポソームはｐＨに応答することなくリポソーム内の蛍光物質を放出しなかったが、実施例５、実施例７および実施例１３のリポソームはいずれもｐＨに応答してリポソーム内の蛍光物質を放出した。特に本発明のリン脂質誘導体（１）を高い割合で含むリポソームは、低ｐＨにおけるｐＨ応答性を示した。【０１０２】
【表２】
2011059073.tif 000013
【０１０３】
実施例１４〜１５、実施例１７〜１８および比較例２のｐＨ応答性測定の結果は、図２に示すとおりである。
その結果、比較例１のリポソームはｐＨに応答することなくリポソーム内の蛍光物質を放出しなかったが、実施例５〜６および実施例８〜９のリポソームはいずれもｐＨに応答してリポソーム内の蛍光物質を放出した。
二塩基酸導入率５８．９％において実施例１４と１５とを、二塩基酸導入率１００％において実施例１７と１８とを比較した場合、同じ二塩基酸導入率ではリポソームの脂質組成が減少するほどｐＨ応答領域が酸性側に移行した。また、脂質組成２７モル％の実施例１５と１７とを、１１モル％の実施例１５と１８とを比較した場合、同じリポソームの脂質組成では、二塩基酸導入率が低いほどｐＨ応答性領域が酸性側に移行した。【０１０４】
【表３】
2011059073.tif 000014
【０１０５】
実施例１９〜２２のｐＨ応答性測定の結果は、図３に示すとおりである。
その結果、実施例１０〜１３のリポソームはいずれもｐＨに応答してリポソーム内の蛍光物質を放出した。
導入率５６．７％において実施例１９と２０とを、９５．６％において実施例２１と２２とを比較した場合、同じ導入率ではリポソームの脂質組成が減少するほどｐＨ応答領域が酸性側に移行した。また、脂質組成７モル％の実施例２０と２１とを比較した場合、同じリポソームの脂質組成では導入率が低いほどｐＨ応答領域が酸性側に移行した。
また、表２の実施例１５と表３の実施例１９とを比較すると、ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８ＧのほうがｐＨ応答性能が強かった。【０１０６】
《リポソーム液の細胞取り込み能測定》
本発明のリポソームが細胞への取り込み能を有することを、以下の実験により確認した。【０１０７】
実施例２３：ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ＝５０／５０（ｗｔ）＋Ｒｈ−ＰＥ  ０．１ｍｏｌ％リポソーム液の調製
卵黄フォスファチジルコリン（日油株式会社製ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＣ−５０、以下、ＥＹＰＣ）１００ｍｇをクロロホルム１０ｍｌに溶解させて濃度１０ｍｇ／ｍｌのＥＹＰＣ溶液を得た。Ｎ−リサミンローダミンＢスルホニル  ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．社製、以下Ｒｈ−ＰＥ）１０ｍｇをクロロホルム１０ｍｌに溶解させて濃度１ｍｇ／ｍｌのＲｈ−ＰＥ溶液を得た。これとは別に実施例１で得られたＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ  １００ｍｇをクロロホルム１０ｍｌに溶解させて濃度１０ｍｇ／ｍｌのＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ溶液を得た。【０１０８】
ＥＹＰＣ溶液５００μｌ、Ｒｈ−ＰＥ溶液１０μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ溶液５００μｌを５０ｍｌナス型フラスコに仕込み、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧留去してＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ／Ｒｈ−ＰＥ薄膜を形成させた。次に、パイラニン１８．９ｍｇ、ＤＰＸ  ２３．８ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム９．９ｍｇを蒸留水０．９８ｍｌに溶解させ、さらに１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．０２ｍｌを加えｐＨ７．４にして蛍光消光水溶液を得た。【０１０９】
この蛍光消光水溶液０．８５ｍｌを前記ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ薄膜を形成させたナス型フラスコ内に投入し、バス型超音波照射装置により３０秒間超音波照射して脂質膜を分散させ分散液を得た。この分散液に対して凍結−融解処理を三回行い、リポソームを形成させた後に、孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を装着したエクストルーダーで処理してリポソームの粒子径を１００ｎｍに揃えた。これをアガロースゲル（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社製、セファロース４Ｂ）を充填させたカラムにより精製し、蛍光消光水溶液内包ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ/Ｒｈ−ＰＥ（７３：２７：０．１（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ１．５０ｍｍｏｌ／ｌであった。【０１１０】
実施例２４：ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ＝７０／３０（ｗｔ）＋Ｒｈ−ＰＥ  ０．１ｍｏｌ％リポソーム液の調製
実施例２３に記載のＥＹＰＣ溶液５００μｌ、Ｒｈ−ＰＥ溶液１０μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ溶液５００μｌの代わりに、ＥＹＰＣ溶液７００μｌ、Ｒｈ−ＰＥ溶液１３μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ溶液３００μｌを用いてＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ／Ｒｈ−ＰＥ薄膜を形成させた以外は実施例２３と同様の手順により、蛍光消光水溶液内包ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ／Ｒｈ−ＰＥ（８７：１３：０．１（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ１．７６ｍｍｏｌ／ｌであった。【０１１１】
比較例３：ＥＹＰＣ＋Ｒｈ−ＰＥ（０．１ｍｏｌ％）リポソーム液の調製
実施例２３に記載のＥＹＰＣ溶液５００μｌ、Ｒｈ−ＰＥ溶液１３μｌおよびＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ溶液５００μｌの代わりに、ＥＹＰＣ溶液１０００μｌおよびＲｈ−ＰＥ溶液１６μｌを用いてＥＹＰＣ薄膜を形成させた以外は実施例２３と同様の手順により蛍光消光水溶液内包ＥＹＰＣ／Ｒｈ−ＰＥ（１００：０．１（モル比））リポソーム液を得た。
得られたリポソーム液の脂質濃度をテストワコー（和光純薬工業株式会社製）により測定したところ３．８５ｍｍｏｌ／ｌであった。【０１１２】
実施例２５：実施例２３で得られたリポソーム液の細胞取り込み能測定
実施例２３で得られたリポソーム液にリン酸緩衝生理食塩水を加えてリポソームの脂質濃度が１ｍｍｏｌ／ｌとなるよう調整した後に孔径２００ｎｍの酢酸セルロース膜を通じて希釈リポソーム液を得た。これとは別に、ハンクス生理食塩水（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２回洗浄したＤＣ２．４細胞１０万個にｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ１６４０，  １０％  ＦＢＳ）５００μｌを加えたものを２日間培養したものに前記希釈リポソーム液５００μｌを加えて温度３７℃で４時間インキュベートさせることで、リポソームを細胞に取り込ませた。この後に顕微鏡観察ならびに蛍光強度をフローサイトメータ（ＦＣＭ）により測定した。
リポソームを打ち込んでから１５分後の蛍光強度を読み取り、Ｒｅｌｅａｓｅ（％）は最後にトリトンを加えたときの蛍光強度を１００％として算出した。【０１１３】
実施例２６：実施例２４で得られたリポソーム液の細胞取り込み能測定
実施例２３で得られたリポソーム液の代わりに実施例２４で得られたリポソーム液を用いた以外は実施例２５と同様に行い、細胞取り込み能を測定した。【０１１４】
比較例４：比較例３で得られたリポソーム液の細胞取り込み能測定
実施例２３で得られたリポソーム液の代わりに比較例３で得られたリポソーム液を用いた以外は実施例２５と同様に行い、細胞取り込み能を測定した。【０１１５】
実施例２５および２６、ならびに比較例４で得られた細胞取り込み能の測定結果を図４および表４に示す。【０１１６】
【表４】
2011059073.tif 000015
【０１１７】
本発明のリン脂質誘導体（１）を含まない比較例３のリポソームを用いた場合は、リポソーム膜由来の蛍光物質（ローダミンＢ）だけでなく、リポソーム内の蛍光物質（パイラニン）も細胞内に取り込まれるものは僅かであったが、本発明のリン脂質誘導体（１）を含む実施例２３および２４のリポソームを用いた場合は、いずれの蛍光物質も細胞内に取り込まれた。【０１１８】
《リポソームを用いたドラッグデリバリーによる腫瘍拒絶試験》
本発明のリポソームがドラッグデリバリー能を有することを、以下の実験により確認した。【０１１９】
実施例２７：腫瘍拒絶試験に用いるリポソーム分散液の調製
卵黄ホスファチジルコリン（ＥＹＰＣ）、及び実施例２に記載のＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ（導入率１００％）のクロロホルム溶液もしくは実施例４に記載のＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ（導入率９５．６％）のメタノール溶液を所定のモル比（ＥＹＰＣのみ，ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ＝６９／３１，ＥＹＰＣ／ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ＝９７／３，ｍｏｌ／ｍｏｌ）になるようフラスコに取り、そこへモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ，Ｓｉｇｍａ）のクロロホルム溶液を４ｇ／ｍｏｌ  ｌｉｐｉｄｓとなるよう加えた。ロータリーエバポレーターにより溶媒を減圧留去した後、高真空下に２時間置き、残存有機溶媒を除去した。
得られた混合薄膜へ、オボアルブミン（ＯＶＡ，Ｓｉｇｍａ）を４ｍｇ／ｍｌで溶解させたダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ８．０）を４ｍｇ  ＯＶＡ／１０μｍｏｌ  ｌｉｐｉｄｓとなるよう加え、氷冷下でボルテックスミキサーを用いて激しく撹拌し、薄膜を剥がした。この際、適宜溶液のｐＨを測定し、常にｐＨ７．４以上となるよう、必要な場合はＮａＯＨ水溶液を加えた。凍結−融解を５回行い、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーネート膜を通し、リポソームの粒径を揃えた。
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ  ７．４）で平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムに通し、リポソームを精製した後、テストワコーＣにより脂質濃度を定量した。また脂質分散液中のＯＶＡ濃度は、脂質分散液４０μｌに対して、６０μｌの２−イソプロパノールを加え、リポソームを溶解させた分散液について、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて定量した。Ｏｐｔｉｍａ  ＴＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて５５０００ｒｐｍで氷冷下３時間遠心し、１００μｇ  ＯＶＡ／１００μｌとなるようにバッファーを加え、リポソーム分散液の濃度を調整した。【０１２０】
実施例２８：リポソーム分散液によって免疫感作されたマウスの腫瘍拒絶試験
７週齢のＣ５７ＢＬ/６雌マウスはオリエンタル酵母工業株式会社より購入した。マウス背部皮下に、マウス一匹当たり１００μｇでＯＶＡ/１００μｌの実施例２７で得られたリポソーム分散液、ＯＶＡ/ＰＢＳ溶液を一週間毎に２回加えた。１週間後、ＯＶＡ発現がん細胞Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を、背部皮下に１０６/ｍｏｕｃｅとなるよう投与し、腫瘍の成長の経時変化をモニターした。腫瘍体積は、以下の式より求めた。【０１２１】
【数３】
2011059073.tif 000016
【０１２２】
また、未処理のマウスに対しても、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を播種し、腫瘍成長のコントロールとして用いた。【０１２３】
腫瘍拒絶試験の結果は、図５に示すとおりである。
その結果、ＥＹＰＣ、ＥＹＰＣ/ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ＝６９/３１、ＥＹＰＣ/ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇ＝９７/３の３つのリポソーム分散液を比較して、本発明のリン脂質誘導体（１）を含むＥＹＰＣ/ＤＳＰＥ−ＭＧｌｕＰＧ８Ｇ、ＥＹＰＣ/ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇにおいて腫瘍が増大しない結果を与え、皮下免疫により腫瘍が拒絶されることが分かった。特にＥＹＰＣ/ＤＳＰＥ−ＣＨｅｘＰＧ８Ｇにおいては腫瘍が完全に拒絶された。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明のリポソームは、エンドソーム膜と効率よく融合し、リポソーム内の内包物を細胞質中に効率良く移行させることができることから、公知の薬物担体よりも向上された細胞導入率を示す。
本発明のｐＨ応答性リポソームは、病巣部位で膜融合性を発現することができ、病患部もしくは細胞内への薬物導入を効率よくかつ安全に行うことができる。したがって、薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質を封入した本発明のｐＨ応答性リポソームは、治療および診断目的のＤＤＳおよびワクチンとして有用である。【０１２５】
本出願は、日本で出願された特願２００９−２６０３９８（出願日：２００９年１１月１３日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【国際調査報告】
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