(57)【要約】抗腫瘍／抗癌作用を有する新規化合物を提供する。下記式（Ｉ）【化１】2011013612.tif 000013（式中、Ｒ１はアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基またはアルコキシ基を示す。  Ｒ２は、置換基を有していてもよいアミノ基または置換基を有していてもよい含窒素複素環基を示す。  Ｒ３は水素、ハロゲン、アルキル、メトキシ、シアノ、トリフルオロメチル、アセチルアミノまたはアミノを示す。  但し、式（Ｉ）のN-Me-Alaは、N-Me-Gly、N-Me-Ser、N-Me-Thr、Ala、Gly、SerもしくはThrで置換されていてもよい。  Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅは、Ｐｈｅ，Ｔｙｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒで置換されていてもよい。Ｄ−ＬｅｕはＬ−Ｌｅｕで置換されていてもよい。）で表される化合物又はその誘導体もしくはその塩。
2011013612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
2011013612.tif 000010
（式中、Ｒ１はアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基またはアルコキシ基を示す。
Ｒ２は、置換基を有していてもよいアミノ基または置換基を有していてもよい含窒素複素環基を示す。
Ｒ３は水素、ハロゲン、アルキル、メトキシ、シアノ、トリフルオロメチル、アセチルアミノまたはアミノを示す。
但し、式（Ｉ）のＡｌａは、Ｎ−Ｍｅ−Ｇｌｙ、Ｎ−Ｍｅ−Ｓｅｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｈｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＴｈｒで置換されていてもよい。
Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅは、Ｐｈｅ，Ｔｙｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒで置換されていてもよい。
Ｄ−ＬｅｕはＬ−Ｌｅｕで置換されていてもよい。）
で表される化合物又はその誘導体もしくはその塩。
【請求項２】
Ｒ２は、ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４，Ｒ５は、同一又は異なって水素原子、アルキル基またはシクロアルキル基を示す。）、
【化２】
2011013612.tif 000011
（式中、Ｒ６は、Ｒ７−ＣＯ−もしくはそのヒドラジド、Ｒ７−ＣＨ（ＯＲ８）−（Ｒ７はアルキル、アリールもしくはアラルキル基を示す。Ｒ８は水素、アルキル基、アリール基、アラルキル基またはアシル基を示す。）を示す。）
で表される、請求項１に記載の化合物又はその誘導体もしくはその塩。
【請求項３】
下記式１
【化３】
2011013612.tif 000012
で表される請求項１に記載の化合物又はその誘導体もしくはその塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその誘導体もしくはその塩を有効成分とする抗癌剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその誘導体を有効成分とするＥＲＫ選択的なリン酸化阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド性化合物もしくはその誘導体、並びにその用途に関し、詳しくは、前記ペプチド性化合物の抗癌剤、ＭＡＰＫのリン酸化阻害剤、特にＥＲＫ選択的なリン酸化阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在臨床使用されている薬物の約半数は天然物起源であり(非特許文献１)、これは天然物が薬物の発見及び開発プロセスにおいて非常に重要な役割を果たすことを意味している（非特許文献２）。陸生植物及び微生物由来の天然物は長い間薬物分子の供給源となってきた。実際、植物及び微生物由来の薬理学的に活性な化合物は新たに開発される医薬で重要な役割を果たしている。さらに、近年、海洋生物由来の生理活性物質が注目されている（非特許文献３）。特に、シアノバクテリアは、生理活性二次代謝物を大量生産し、潜在的な医薬品の供給源であると認識されている。例えば、TZT-1027はドラスタチン10の合成アナログであり、現在日本、欧州、米国で第１相臨床試験が行われている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Newman, D. J.; Cragg, G. M. J. Nat. Prod. 2007, 70, 461-477.
【非特許文献２】Koehn, F. E.; Carter, G. T. Nat. Rev. Drug Discovery 2005, 4, 206-220
【非特許文献３】Molinski, T. F.; Dalisay, D. S.; Lievens, S. L.; Saludes, J.P.; Nat. Rev. Drug Discovery 2009, 8, 69-85.
【非特許文献４】Horti, J.; Juhasz, E.; Monostori, Z.; Maeda, K.; Eckhardt, S.; Bodrogi, I. Cancer Chemother. Pharmacol. 2008, 62, 173-180.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、抗腫瘍／抗癌作用を有する新規化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、沖縄県で採集したシアノバクテリアLyngbya sp.を用い、HeLa S3細胞に対する細胞増殖阻害作用を指標にして新規生理活性物質の探索を行ったところ、各種の癌細胞に対する細胞増殖阻害作用を有するBisebromoamide (1)を単離した。また、この化合物の誘導体について検討し、本発明を完成した。【０００６】
本発明は、以下の化合物及び抗癌剤を提供するものである。
項１．  下記式（Ｉ）【０００７】
【化１】
2011013612.tif 000003
【０００８】
（式中、Ｒ１はアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基またはアルコキシ基を示す。【０００９】
Ｒ２は、置換基を有していてもよいアミノ基または置換基を有していてもよい含窒素複素環基を示す。【００１０】
Ｒ３は水素、ハロゲン、アルキル、メトキシ、シアノ、トリフルオロメチル、アセチルアミノまたはアミノを示す。【００１１】
但し、式（Ｉ）のＡｌａは、Ｎ−Ｍｅ−Ｇｌｙ、Ｎ−Ｍｅ−Ｓｅｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｈｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒもしくはＴｈｒで置換されていてもよい。【００１２】
Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅは、Ｐｈｅ，Ｔｙｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒで置換されていてもよい。【００１３】
Ｄ−ＬｅｕはＬ−Ｌｅｕで置換されていてもよい。）
で表される化合物又はその誘導体もしくはその塩。
項２．  Ｒ２は、ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４，Ｒ５は、同一又は異なって水素原子、アルキル基またはシクロアルキル基を示す。）、【００１４】
【化２】
2011013612.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｒ６は、Ｒ７−ＣＯ−もしくはそのヒドラジド、Ｒ７−ＣＨ（ＯＲ８）−（Ｒ７はアルキル、アリールもしくはアラルキル基を示す。Ｒ８は水素、アルキル基、アリール基、アラルキル基またはアシル基を示す。）を示す。）
で表される、項１に記載の化合物又はその誘導体もしくはその塩。
項３．  下記式１【００１６】
【化３】
2011013612.tif 000005
【００１７】
で表される項１に記載の化合物又はその誘導体もしくはその塩。
項４．  項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその誘導体もしくはその塩を有効成分とする抗癌剤。
項５．  項１〜３のいずれかに記載の化合物又はその誘導体を有効成分とするＥＲＫ選択的なリン酸化阻害剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、抗腫瘍／抗癌作用を有する新規化合物が提供される。【００１９】
MAPKの活性化もしくはERKのリン酸化の異常な活性化が癌の増殖に関係していることは、Roberts P.J. and Der C.J.; Oncogene 2007, 26, 3291-3310に記載されている。【００２０】
本発明の化合物は、強力なプロテインキナーゼ阻害活性を示し、ＥＲＫのリン酸化を選択的に阻害し、その選択性が非常に高いため、MAPK情報伝達系が異常に活性化されている癌に対し副作用が低い強力な抗腫瘍剤ないし抗癌剤になり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】沖縄産シアノバクテリア（Lyngbya sp.）からBisebromoamide (1)を単離するまでのスキームを示す。
【図２】本発明で得られたBisebromoamide (1)によるタンパク質リン酸化の阻害の程度を示す。Bisebromoamide (1)の0.1〜10μMの濃度でERK以外のシグナル伝達分子のリン酸化を抑制することなく選択的にERKリン酸化を抑制することができることが示された。
【図３】Bisebromoamide (1)の構造決定。
【図４】各種癌細胞に対する増殖阻害活性の測定結果。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、下記式（Ｉ）
【００２３】
【化４】
2011013612.tif 000006
【００２４】
（式中、Ｒ１はアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基またはアルコキシ基を示す。
【００２５】
Ｒ２は、置換基を有していてもよいアミノ基または置換基を有していてもよい含窒素複素環基を示す。
【００２６】
Ｒ３は水素、ハロゲン、アルキル、メトキシ、シアノ、トリフルオロメチル、アセチルアミノまたはアミノを示す。
【００２７】
但し、式（Ｉ）のAlaは、N-Me-Gly、N-Me-Ser、N-Me-Thr、N-Me-Ala、Gly、SerもしくはThrで置換されていてもよい。
【００２８】
Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅは、Ｐｈｅ，Ｔｙｒ、Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒで置換されていてもよい。Ｄ−ＬｅｕはＬ−Ｌｅｕで置換されていてもよい。）
で表される化合物又はその誘導体もしくはその塩を提供するものである。
【００２９】
本明細書において、「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を意味するが、フッ素、塩素、臭素が好ましい。
【００３０】
「置換基を有してもよいアミノ基」としては、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基が挙げられる。
【００３１】
「置換基を有してもよい含窒素複素環基」の複素環基としては、ピロリジニル基、ピペリジノ基、ピペラジニル基などの５員又は６員の含窒素複素環基が挙げられる。置換基としては、Ｒ７−ＣＯ−もしくはそのヒドラジド、Ｒ７−ＣＨ（ＯＲ８）−（Ｒ７はアルキル、アリールもしくはアラルキル基を示す。Ｒ８は水素、アルキル基、アリール基、アラルキル基またはアシル基を示す。）が挙げられる。以下において、アルキルカルボニルのアルキルのように、１つの基の一部としての「アルキル」は、「アルキル部分」として表す。同様に、アリールカルボニルのアリールのように、１つの基の一部としての「アリール」は、「アリール部分」として表し、アラルキルカルボニルのアラルキルのように、１つの基の一部としての「アラルキル」は、「アラルキル部分」として表す。
【００３２】
「アルキル基」もしくは「アルキル部分」は、直鎖状、分枝鎖状又は環状のいずれでもよく、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル及びデシルなどのＣ１−１０、好ましくはＣ１−６のアルキル基が挙げられる。
【００３３】
「アルコキシ基」は、直鎖状、分枝鎖状又は環状のいずれでもよく、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、tert−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、イソペントキシ、ヘキシルオキシなどのＣ１−６のアルコキシ基が挙げられる。
【００３４】
「シクロアルキル基」の具体例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルが挙げられる。
【００３５】
「アルケニル基」とは、直鎖状、分枝鎖状又は環状のいずれでもよく、二重結合を少なくとも１個有するものを意味し、例えばビニル、アリル、１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、イソプロペニル、１−、２−若しくは３−ブテニル、２−、３−若しくは４−ペンテニル、２−メチル−２−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、５−ヘキセニル、１−シクロペンテニル、１−シクロヘキセニル、３−メチル−３−ブテニルなどのＣ２−１０、好ましくはＣ２−６のアルケニル基が挙げられる。
【００３６】
モノアルキル置換アミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、イソブチルアミノ、tert−ブチルアミノ、ｎ−ペンチルアミノ、イソペンチルアミノ、ヘキシルアミノなどのＣ１−６のアルキル置換アミノ基が挙げられる。
【００３７】
ジアルキル置換アミノ基としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジｎ−ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジtert−ブチルアミノ、ジｎ−ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、ジヘキシルアミノなどのＣ１−６のアルキル基でジ置換されたアミノ基が挙げられる。
【００３８】
「アリール基」または「アリール部分」は、５又は６員の芳香族炭化水素環からなる単環又は多環系の基を意味し、具体例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アントリル、ビフェニリル、テトラヒドロナフチル、クロマニル、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニル、インダニル及びフェナントリルが挙げられる。
【００３９】
「アラルキル基」または「アラルキル部分」としては、例えばベンジル、フェネチルが挙げられる。
【００４０】
「ヘテロアリール基」とは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１〜３個のヘテロ原子を含む、５又は６員の芳香環からなる単環又は多環系の基を意味し、多環系の場合には少なくとも１つの環が芳香環であればよい。具体例としては、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾ［ｂ］チエニル及びベンズイミダゾリルが挙げられる。
【００４１】
「アシル化されたヒドロキシ（ＯＲ８で、Ｒ８＝アシル基）」とは、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ又はアリール置換Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシを意味する。
【００４２】
「エーテル化されたヒドロキシ（ＯＲで、Ｒ＝アルキル基、アラルキルもしくはアリール基）」とは、Ｃ１−６アルキルオキシ、アリールオキシ又はアリール置換Ｃ１−４アルキルオキシを意味する。
【００４３】
Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシの具体例としては、メチルカルボニルオキシ、エチルカルボニルオキシ、ｎ−プロピルカルボニルオキシ、イソプロピルカルボニルオキシ、ｎ−ブチルカルボニルオキシ、イソブチルカルボニルオキシ、tert−ブチルカルボニルオキシ、ｎ−ペンチルカルボニルオキシ、イソペンチルカルボニルオキシ、ヘキシルカルボニルオキシが挙げられる。
【００４４】
アリールカルボニルオキシの具体例としては、フェニルカルボニルオキシ、ナフチルカルボニルオキシ、フルオレニルカルボニルオキシ、アントリルカルボニルオキシ、ビフェニリルカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルカルボニルオキシ、クロマニルカルボニルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルカルボニルオキシ、インダニルカルボニルオキシ及びフェナントリルカルボニルオキシが挙げられる。
【００４５】
アリール置換Ｃ１−４アルキルカルボニルオキシの具体例としては、ベンジルカルボニルオキシ、ナフチルメチルカルボニルオキシ、フルオレニルメチルカルボニルオキシ、アントリルメチルカルボニルオキシ、ビフェニリルメチルカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルメチルカルボニルオキシ、クロマニルメチルカルボニルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルメチルカルボニルオキシ、インダニルメチルカルボニルオキシ及びフェナントリルメチルカルボニルオキシ、フェネチルカルボニルオキシ、ナフチルエチルカルボニルオキシ、フルオレニルエチルカルボニルオキシ、アントリルエチルカルボニルオキシ、ビフェニリルエチルカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルエチルカルボニルオキシ、クロマニルエチルカルボニルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルエチルカルボニルオキシ、インダニルエチルカルボニルオキシ及びフェナントリルエチルカルボニルオキシが挙げられる。
【００４６】
Ｃ１−６アルキルオキシの具体例としては、メチルオキシ、エチルオキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソブチルオキシ、tert−ブチルオキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ヘキシルオキシが挙げられる。
【００４７】
アリールオキシの具体例としては、フェニルオキシ、ナフチルオキシ、フルオレニルオキシ、アントリルオキシ、ビフェニリルオキシ、テトラヒドロナフチルオキシ、クロマニルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルオキシ、インダニルオキシ及びフェナントリルオキシが挙げられる。
【００４８】
アリール置換Ｃ１−４アルキルオキシの具体例としては、ベンジルオキシ、ナフチルメチルオキシ、フルオレニルメチルオキシ、アントリルメチルオキシ、ビフェニリルメチルオキシ、テトラヒドロナフチルメチルオキシ、クロマニルメチルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルメチルオキシ、インダニルメチルオキシ及びフェナントリルメチルオキシ、フェネチルオキシ、ナフチルエチルオキシ、フルオレニルエチルオキシ、アントリルエチルオキシ、ビフェニリルエチルオキシ、テトラヒドロナフチルエチルオキシ、クロマニルエチルオキシ、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニルエチルオキシ、インダニルエチルオキシ及びフェナントリルエチルオキシが挙げられる。
【００４９】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、Ｎ末端側から（カルボン酸）−（Ala）−（N-Me-Br-Tyr）−（Me-Pro）−（4-Me-Tzn）−（D-Leu）−（N-Me-Phe）−（2-Opp）の順にアミノ酸、カルボン酸もしくはアミンを連結した構造を有し、各構成要素は以下のもので置換されて誘導体とされてもよい。
【００５０】
本発明の式（Ｉ）の化合物の誘導体の例を以下の(i)〜(viii)に示す。
(i)カルボン酸
Bisebromoamide (1)ではピバル酸であるが、脂肪族、芳香族のカルボン酸であってもよく、これらカルボン酸は、水酸基、カルボニル基、エーテル基、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、アミノ、カルバモイルなどの置換基を有していてもよい。
(ii)Ala
Ala残基は、Gly、Ser、Thr、β-Ala、あるいはこれらのN-アルキル化(メチル化、エチル化、プロピル化、ブチル化)アミノ酸残基で置換されてもよい。
(iii) N-Me-Br-Tyr
Brが他の置換基で置換されるか、N-Meが、NH、N-Et、N-Pr、N-Buなどのアルキル基で置換されていてもよい。
(iv) Me-Pro
これについては、Ｄ，Ｌの立体配置の変更は、誘導体の範囲に包含される。
(v) L-4-Me-Cys
これについては、Ｄ，Ｌの立体配置の変更は、誘導体の範囲に包含される。
(vi)D-Leu
D体、Ｌ体もしくはDL体のLeu、Ile、Val、ノルロイシン、ノルバリンが誘導体に使用できる。
(vii)N-Me-Phe
Phe、Tyr、フェニルグリシンあるいは、アミノ基がメチル、エチル、プロピルもしくはブチルで置換されているアミノ酸（Phe、Tyr）が使用でき、Ｄ体、Ｌ体のいずれも使用できる。
(viii)2-Opp
３級アミノ基であれば使用でき、ジアルキルアミノ基、アルキルアリールアミノ基などのジ置換アミノ基であるか、ピペリジノ、ピロリジニル、ピペラジニルなどの含窒素複素環基が使用でき、これらは、Ｒ７−ＣＯ−もしくはそのヒドラジド、Ｒ７−ＣＨ（ＯＲ８）−（Ｒ７はアルキル、アリールもしくはアラルキル基を示す。Ｒ８は水素、アルキル基、アリール基、アラルキル基またはアシル基を示す。）などの置換基で置換されていてもよい。
【００５１】
本発明の化合物は不斉炭素を有するが、各不斉炭素の立体配置（Ｒ配置／Ｓ配置、あるいはＬ配置／Ｄ配置）は、一方の立体配置あるいはその混合物（ラセミ体を含む）のいずれであってもよい。例えば本発明の一般式（Ｉ）の化合物がＤ−Ｌｅｕを含む場合、Ｄ−ＬｅｕをＬ−Ｌｅｕに置換したものも本発明の一般式（Ｉ）の化合物に包含される。
【００５２】
式(Ｉ)で表される化合物の塩とは、構造中に酸付加塩または塩基塩を意味する。酸付加塩の具体例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩、及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸塩が挙げられる。塩基塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のようなアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩のような有機塩基との塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。
【００５３】
本発明の化合物は、沖縄産シアノバクテリアから単離してもよく、合成により製造してもよい。
【００５４】
式(１)のbisebromoamideの合成スキーム１を以下に示す。
スキーム１
【００５５】
【化５】
2011013612.tif 000007
【００５６】
２−（１−オキソプロピル）ピロリジン（２）１モルに対しN-Boc-Me-Phe(約１モルから約２モル)をカップリング試薬（ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミドなど、１モル〜過剰量）の存在下で反応させて化合物（３）に導く。次いで化合物（３）(１モル)のBoc基をTFA（１モルから過剰量）で脱保護し、N-Boc-D-Leu(約１モルから約２モル)とカップリング試薬（ＤＣＣ、水溶性カルボジイミドなど、１モル〜過剰量）の存在下で反応させて化合物（４）に導く。以下、Boc保護アミノ酸１モルをTFA（１モル〜過剰量）で脱保護し、脱保護アミノ酸（１モル）をカップリング試薬（ＤＣＣ、水溶性カルボジイミドなど、１モル〜過剰量）の存在下に縮合する反応を繰り返し、N-Boc-Alaの後にピバル酸を反応させ、さらにチアゾリン環を閉環させることで、目的とする式(１)のbisebromoamideを得ることができる。反応温度、反応時間、各試薬のモル比は、ペプチド合成で一般的に使用される条件であり、例えば温度は１０〜４０℃程度、時間は、３０分〜２４時間程度、試薬は原料１モルに対しＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）は１当量〜過剰量、カップリング試薬は１モルから過剰量を使用し、酢酸エチル、ＴＨＦ、ジオキサン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの適当な溶媒中で反応させることにより有利に進行する。
【００５７】
また、(viii)化合物（２）、(vii)N-Boc-Me-Phe、(vi)N-Boc-D-Leu、(v)N-Boc-4-Me-L-Cys、(iv)N-Boc-MePro、(iii)N-Boc-Me-BrTyr、(ii)N-Boc-Ala、(i)ピバル酸に代えて、誘導体もしくは式（I）の化合物を製造するための上記の各種の化合物を使用することで、bisebromoamide以外の式（I）の化合物もしくは誘導体を製造することができる。
【００５８】
本発明の化合物は通常、医薬用担体と混合して調製した医薬組成物の形で抗癌剤として適用される。医薬組成物の具体例としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、貼付剤、坐剤等が挙げられる。これらの医薬組成物は常法に従って調製される。
【００５９】
医薬用担体としては、医薬分野において常用され、かつ本発明の化合物と反応しない物質が用いられる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤製造に用いられる医薬用担体の具体例としては、乳糖、トウモロコシデンプン、白糖、マンニトール、硫酸カルシウム、結晶セルロースのような賦形剤、カルメロースナトリウム、変性デンプン、カルメロースカルシウムのような崩壊剤、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンのような結合剤、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油のような滑沢剤が挙げられる。錠剤は、カルナウバロウ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール、ヒドロキシプロピルメチルフタレート、セルロースアセテートフタレート、白糖、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、リン酸カルシウムのようなコーティング剤を用い、周知の方法でコーティングしてもよい。
【００６０】
シロップ剤製造に用いられる担体の具体例としては、白糖、ブドウ糖、果糖のような甘味剤、アラビアゴム、トラガント、カルメロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、結晶セルロース、ビーガムのような懸濁化剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート80のような分散剤が挙げられる。シロップ剤製造にあたっては、必要に応じて矯味剤、芳香剤、保存剤等を添加することができる。また、用時溶解または懸濁するドライシロップの形であってもよい。
【００６１】
坐剤の基剤の具体例としては、カカオ脂、飽和脂肪酸グリセリンエステル、グリセロゼラチン、マクロゴールが挙げられる。坐剤製造にあたっては、必要に応じて界面活性剤、保存剤等を添加することができる。
【００６２】
これらの医薬組成物は、通常、活性成分として式(Ｉ)の化合物、その誘導体もしくはその塩を０.５％以上、好ましくは１０〜７０％の割合で含有することができる。これらの医薬組成物はまた、以下に述べる治療上有効な他の物質を含有していてもよい。
【００６３】
本発明の化合物を投与することにより治療できる癌または悪性腫瘍の種類としては、本発明の化合物が感受性を示すものであれば特に制限はなく、例えば頭頸部癌、胃癌、結腸・直腸癌（大腸癌）、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体ガン、咽頭癌、食道癌、腎癌、卵巣癌等が挙げられる。本発明の化合物は、MAPK情報伝達系、特にERKのリン酸化を選択的に阻害するため、ERK経路の活性化が亢進している癌について効果的な抗癌剤となり得る。
【００６４】
本発明の化合物を含有する医薬組成物は、患者の症状等に応じて、ガン治療に使用される各種の医薬とともに適用することもできる。医薬の具体例としては、イリノテカン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ダカルバジン、プロカルバジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タキソール、ドセタキセル、ゲムシタビン、グリベック、イレッサ、タルセバおよびネクサバール、ハーセプチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、ソラフェニブ、スニチニブなどが挙げられる。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。【００６６】
本発明の化合物の構造決定と生物活性について説明する。
実施例１
1. Bisebromoamideの単離及び絶対立体構造
沖縄県で採集したシアノバクテリアLyngbya sp.をMeOH抽出した後、H2O/AcOEtで分配し、さらにAcOEt層を90％MeOH/n-Hexaneで分配した。得られた90％MeOH層を腫瘍細胞に対する増殖阻害活性を指標として各種クロマトグラフィーで分離、精製したところ、新規ペプチドであるBisebromoamide (1)を単離した。単離までのスキームを図１に示す。【００６７】
この化合物はHeLa S3細胞に対して強力な増殖阻害活性(IC5040 ng/ml)を示した。平面構造は、主に各種二次元NMRスペクトルの解析をもとに行った。その結果、Bisebromoamide (1)は多くの異常アミノ酸構造を持ち、構成成分はAla, N-Me-3-bromo-Tyr, 4-Me-Pro, 2-Me-Cys, Leu, N-Me-Phe 及び、ピバル酸、2-(1-oxo-propyl)pyrrolidine (Opp)であることが明らかとなった。続いて8つの不斉中心を含むBisebromoamide (1)の絶対立体配置を決定するため、9 M HClにて酸加水分解処理を行った。酸加水分解物をHPLCにて分取したところ、Leu, N-Me-Tyr, 4-Me-Pro, N-Me-Phe, Opp及びAlaと2-methylcystineの混合物フラクションをそれぞれ得た。これらのフラグメントをChiral HPLCにて分析した結果、Leu, N-Me-Tyr, N-Me-Pheの立体配置はそれぞれD, D, Lであることが明らかとなった。また、4-Me-Pro, Opp, Ala, 2-methylcystineに関してはMarfey試薬にて誘導体へと導き、逆相HPLCにて分析した。その結果、Ala, 2-methylcystineの立体配置はそれぞれL, Lであると判明した。一方、Opp及び4-Me-Proは酸加水分解中にa位が完全にエピマー化してしまうことも判明した。そこでまず我々は、OppのケトンをNaBH4にて還元してから酸加水分解を行った。その結果、2位のラセミ化を抑えることができ、2(S)-(1-hydroxypropyl)-piperidine [6S : 6R= 1:1]が得られ、2位の絶対立体配置はSであることが明らかとなった。さらに、4-Me-Proに関してはオゾン分解にてチアゾリン環を開環した後に酸加水分解を行った。酸加水分解物と標品の1H NMRの比較、及びHPLC分析により (4S)-4-Me-Proが得られ[2S : 2R= 7:3]、4-Me-Proの絶対立体配置は(2S, 4S)であるということが明らかとなった。【００６８】
Bisebromoamide (1)の構造については主としてNMRスペクトルの解析をもとに行った。重クロロホルムを用いてCOSYスペクトルを詳細に解析したところ、２つのアミドプロトンはAlanine (Ala)およびLeucine (Leu)残基に結合していることが明らかとなった。さらに重メタノールを用いてCOSY、HMQC、HMBCデータを詳細に解析したところ、N-methyl-3-bromotyrosine (N-Me-BrTyr)、4-methylproline (4-MePro)、N-methylphenylalanine (N-MePhe)、2-(1-oxo-propyl)-pyrrolidine (Opp)の存在が明らかとなった。この結果に加え、HMBCにおいて一重線のメチル基(H-4; MeCys) から炭素C-1 (MeCys)、C-2 (MeCys)、C-3 (MeCys)への相関が観測され、またH-3 (MeCys)からC-1 (MePro)への相関が観測されたことから、2-methylthiazoline-2-carboxylic acid ユニットの存在が示唆された。さらに詳細にHMBCスペクトルを解析した結果、６つのアミノ酸残基のつながりが明らかとなった(図３)。また、H3 (pivalic acid)/C1 (pivalic acid) および H2 (Ala)/C1(pivalic acid)の相関によりC1 (pivalic acid)-C2 (Ala)の結合が明らかとなり、Bisebromoamide (1)はN-ピバルアミド構造を有することが明らかとなった。これ以上のつながりはNMRスペクトルの解析では明らかとすることはできなかったが、分子式と不飽和度を考慮し、OppとN-MePheのつながりが明らかとなった。したがって、Bisebromoamide (1)を図３に示すように決定した。BisebromoamideのNMRデータを以下の表１に示す。【００６９】
【表１】
2011013612.tif 000008
【００７０】
Bisebromoamide(1)の高分解能質量分析
HRMS (ESI) m/z 1044.4212, calcd for C51H7279BrN7O8SNa (M + Na)+ 1044.4244
以上の結果から、Bisebromoamide (1)の絶対立体構造を決定した(スキーム２参照)。
スキーム２【００７１】
【化６】
2011013612.tif 000009
【００７２】
Bisebromoamide (1)は、多くのＤ−アミノ酸及び異常アミノ酸を含む、強力な細胞毒性物質である。特に、4-メチルチアゾリンに結合した4-Me-ProやN-Me-3-bromo-Tyr、N-ピバルアミド部位などを含む化合物は稀であり、さらに2-Opp部位は天然物に前例のないユニットである。Bisebromoamide (1)を39種類のヒト癌細胞に対してスクリーニングした結果、各種癌細胞に対して強い増殖阻害活性を示し、そのGI50の平均値は40 nMであった。【００７３】
Bisebromoamide (1)の各種癌細胞に対する増殖阻害活性は、以下のようにして試験した。
＜各種癌細胞に対する増殖阻害活性の測定方法＞
がん細胞を96ウェルプレートにまき込み，翌日サンプル溶液を添加，2日間培養後，細胞増殖をスルホローダミンBによる比色定量で測定した。がん細胞は、肺癌７系（Lu）、胃癌６系（St）、大腸癌５系（Co）、脳腫瘍６系（CNS）、乳癌５系（Br）、腎癌２系（Re）、前立腺癌２系（xPg）、メラノーマ１系（Me）の合計３９種で試験した。測定したがん細胞株39系の平均薬剤有効濃度に対する個々のがん細胞株の有効濃度偏差を計算し，フィンガープリントとして表示した。結果を図４に示す。
また、Bisebromoamide (1)は非常に強いプロテインキナーゼ阻害活性を示した。特にERKのリン酸化を10、1、0.1 μMにおいて選択的に阻害し、AKT、PKD/PKC、PLCγ1 やS6リボソームタンパク質(S6R)などのリン酸化には全く影響しないことがわかった(図２)。プロテインキナーゼ阻害活性の測定方法を、以下に記載する。【００７４】
＜プロテインキナーゼ阻害活性の測定方法＞
方法
NRK細胞を96ウェルプレートにまき込み，3日間培養後，サンプル溶液を添加，3時間処理した後にPDGFで刺激した。電気泳動用サンプルを調製し，リン酸化されたシグナル伝達分子（AKT，ERK，PKD，PLCγ1，S6 ribosomal protein）及びphosphotyrosineに対する抗体によるウェスタンブロットを行い，PDGFレセプターからの細胞内シグナル伝達に対する影響を評価した。PDGFRの阻害剤（PDGFR IV）とwortmannin (WTM)についても実験を行った（PDGFR IVはPDGF receptorの自己リン酸化を阻害するため、すべてのリン酸化が低下する。）。このとき泳動にかけた蛋白量が一定であることを、eIF4E、4E-BP-1およびヒストンＨ３のバンドで確認した。結果を図２に示す。【００７５】
活性の評価
Bisebromoamide (1)は最終濃度0.01、0.1、1，10μMになるように加え，阻害の有無と阻害パターンを判定した。各シグナル伝達分子活性化に対する有効阻害濃度を求めた。【００７６】
実施例２：Bisebromoamide(1)のOppのヒドラゾン、Bisebromoamide(1)のOppのケトンを還元したヒドロキシ体の製造例
Bisebromoamideの還元（ヒドロキシ体）
Bisebromoamide (2.5 mg, 2.44 μmol)の0.5 mLメタノール溶液に水素化ホウ素ナトリウム(30 mg, 0.79 mmol)を加えた。反応系を室温にて２時間撹拌し、水5 mL、酢酸エチル5 mLにて希釈後、酢酸エチル10 mLにて３回抽出を行った。有機層を飽和食塩水 15 mLにて洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(5 g, ヘキサン:酢酸エチル1:15)で精製後、アルコール体が無色油状物として得られた(2.1 mg, 84%)。
1H NMR (270 MHz, CDCl3)d 7.42 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 7.3, 1.5 Hz, 2H), 7.13 (dd, J = 7.8, 7.3 Hz, 2H), 7.09 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.83 (dd, J = 11.2, 5.9 Hz, 1H), 5.59 (dd, J = 9.3, 7.8 Hz, 1H), 4.87 (dd, J = 10.7, 7.3 Hz, 1H), 4.70 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.12 (m, 1H), 3.60 (m, 2H), 3.52 (m, 1H), 3.39 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 3.10 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 3.08 (s, 3H), 3.06 (s, 3H), 3.06 (m, 2H), 3.05 (m, 2H), 2.89 (m, 1H), 2.35 (m, 1H), 2.19 (m, 1H), 2.11 (m, 1H), 1.88 (m, 2H), 1.80 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 1.55 (s, 3H), 1.50 (m, 2H), 1.43 (m, 1H), 1.41 (m, 1H), 1.17 (s, 9H), 1.03 (d, J = 5.9 Hz, 3H), 0.90 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 0.76 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.74 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.54 (m, 1H).【００７７】
Bisebromoamideのヒドラゾン体
2,4-ジニトロフェニルヒドラジン(125 mg, 0.63 mmol)の5 mLメタノール溶液に濃硫酸を0.3 mL加えた。この溶液3 mLを、bisebromoamide (3.3 mg, 3.22 mmol)の2 mLメタノール溶液に滴下し、室温にて３時間撹拌した。反応系を水5 mL、酢酸エチル5 mLにて希釈後、酢酸エチル15 mLにて３回抽出を行った。有機層を飽和食塩水 15 mLにて洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。濃縮物をPLC (ヘキサン:酢酸エチル1:15)で精製後、ヒドラゾン体が黄色油状物として得られた(3.6 mg, 92%)。TLC, Rf0.58 (ヘキサン:酢酸エチル 1:15)。
1H NMR (270 MHz, CDCl3) d 7.42 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 7.3, 1.5 Hz, 2H), 7.13 (dd, J = 7.8, 7.3 Hz, 2H), 7.09 (dd, J = 7.8, 1.5 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.83 (dd, J = 11.2, 5.9 Hz, 1H), 5.59 (dd, J = 9.3, 7.8 Hz, 1H), 4.87 (dd, J = 10.7, 7.3 Hz, 1H), 4.70 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.12 (m, 1H), 3.60 (m, 2H), 3.52 (m, 1H), 3.39 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 3.10 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 3.08 (s, 3H), 3.06 (s, 3H), 3.06 (m, 2H), 3.05 (m, 2H), 2.89 (m, 1H), 2.35 (m, 1H), 2.19 (m, 1H), 2.11 (m, 1H), 1.88 (m, 2H), 1.80 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 1.55 (s, 3H), 1.50 (m, 2H), 1.43 (m, 1H), 1.41 (m, 1H), 1.17 (s, 9H), 1.03 (d, J = 5.9 Hz, 3H), 0.90 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 0.76 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.74 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.54 (m, 1H).
上記で得られたヒドロキシ体、ヒドラゾン体について、癌細胞の増殖阻害作用／ERKリン酸化阻害作用を試験したところ、Bisebromoamide(1)と同様な結果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2011013612.tif 000019
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