(57)【要約】  ｃ−Ｍｅｔが関係して引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断、および治療等に利用可能な物質として、ｃ−Ｍｅｔに結合可能な核酸分子、ならびにその用途を提供する。  本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ｂ１）および（Ｂ２）のいずれかの核酸分子である。（Ａ１）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子（Ａ２）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、ｃ−Ｍｅｔに結合可能である核酸分子（Ｂ１）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子（Ｂ２）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、ｃ−Ｍｅｔに結合可能である核酸分子
2012014890.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ１）〜（Ａ４）および（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ｃ−Ｍｅｔに結合可能なｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子。
（Ａ１）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ａ２）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ａ３）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列に対して、６０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ａ４）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ｂ１）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ｂ３）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列に対して、６０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ｂ４）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
【請求項２】
前記（Ｂ２）のポリヌクレオチドが、配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列において、３’末端の３塩基を欠失した塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子。
【請求項３】
前記（Ｂ２）のポリヌクレオチドが、配列番号８１〜８９のいずれかで表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１または２記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子。
【請求項４】
前記（Ｂ２）のポリヌクレオチドが、配列番号８１〜８９のいずれかで表わされる塩基配列において、３’末端の３塩基を欠失した塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１から３のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が、修飾化ヌクレオチド残基を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子。
【請求項６】
前記修飾化ヌクレオチド残基が、メチル化ヌクレオチド残基、フルオロ化ヌクレオチド残基、アミノ化ヌクレオチド残基およびチオ化ヌクレオチド残基からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項５記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子。
【請求項７】
前記修飾化ヌクレオチド残基が、シトシンを有するヌクレオチド残基およびウラシルを有するヌクレオチド残基の少なくとも一方である、請求項５または６記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子。
【請求項８】
前記修飾化ヌクレオチド残基が、リボース残基が修飾されたヌクレオチド残基である、請求項５から７のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子。
【請求項９】
前記核酸分子の全塩基数が、４０〜１００塩基である、請求項１から８のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子が、ステムループ構造を形成可能である、請求項１から９のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含み、ｃ−Ｍｅｔタンパク質と前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子との結合により、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の機能を中和することを特徴とする中和剤。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含み、ｃ−Ｍｅｔタンパク質と前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子との結合により、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の機能を阻害することを特徴とする阻害剤。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含むことを特徴とする医薬品。
【請求項１４】
前記医薬品が、抗癌剤、抗炎症剤、抗肝障害剤および抗筋委縮性側索硬化症剤からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１３記載の医薬品。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１６】
さらに、キャリアーを含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含むことを特徴とする、前記ｃ−Ｍｅｔタンパク質を検出するためのｃ−Ｍｅｔ検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質に結合する核酸分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｍｅｔタンパク質（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＨＧＦＲ、以下、「ｃ−Ｍｅｔ」という）は、受容体型チロシンキナーゼであり、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）のレセプターとして知られている。ｃ−Ｍｅｔは、α鎖とβ鎖とからなるヘテロ二量体の膜タンパク質であり、前記β鎖は、チロシンキナーゼドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインから構成されている。ｃ−Ｍｅｔは、その細胞外ドメインにＨＧＦが結合すると、前記チロシンキナーゼドメインがリン酸化され、シグナル伝達系が活性化される。このシグナル伝達系の活性化により、例えば、細胞の増殖、浸潤、移動等が制御されている。【０００３】
ｃ−Ｍｅｔは、例えば、肝臓、腎臓、膵臓、肺、膀胱、前立腺、精嚢、卵巣、乳房、乳腺、胃および結腸等の消化管等、多くの組織における癌細胞で、過剰発現していることが報告されている（非特許文献１）。このため、ｃ−Ｍｅｔは、各種癌をはじめとする疾患のターゲットおよび診断マーカーとして、注目されている。このような背景から、ｃ−Ｍｅｔに結合可能な物質を作製し、その作用を中和することで、前記疾患を予防および治療することが望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．３６、Ｎｏ．２、ｓｕｐｐｌ  １、２００９年、ｐｐ．ｓ５２−ｓ５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、例えば、ｃ−Ｍｅｔが関係して引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断、および治療、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達系の作用機構の解析等に利用可能な物質として、ｃ−Ｍｅｔに結合可能な核酸分子、ならびにその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、下記（Ａ１）〜（Ａ４）および（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ｃ−Ｍｅｔに結合可能なｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子である。
（Ａ１）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ａ２）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ａ３）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列に対して、６０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ａ４）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ｂ１）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ｂ３）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列に対して、６０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ｂ４）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド【０００７】
本発明の中和剤は、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含み、ｃ−Ｍｅｔと前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子との結合により、ｃ−Ｍｅｔの機能を中和することを特徴とする。【０００８】
本発明の阻害剤は、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含み、ｃ−Ｍｅｔと前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子との結合により、ｃ−Ｍｅｔの機能を阻害することを特徴とする。【０００９】
本発明の医薬品は、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含むことを特徴とする。【００１０】
本発明の組成物は、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含むことを特徴とする。【００１１】
本発明の検出試薬は、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含むことを特徴とする、前記ｃ−Ｍｅｔを検出するためのｃ−Ｍｅｔ検出試薬である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、ｃ−Ｍｅｔに結合可能である。このため、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子によれば、例えば、ｃ−Ｍｅｔと結合してその機能を阻害することより、ｃ−Ｍｅｔが原因となる前述のような疾患の予防および治療が可能となる。また、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子によれば、例えば、ｃ−Ｍｅｔとの結合の有無を確認することで、ｃ−Ｍｅｔを検出でき、疾患の早期診断が可能となる。また、例えば、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を培養細胞内で発現させることで、遺伝子転写の阻害実験が可能となる、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を使用して、細胞外のｃ−Ｍｅｔとその受容体との結合阻害実験が可能となる等、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、ｃ−Ｍｅｔの機能解明にも使用できる。このため、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、新たな研究用ツールとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明におけるＲＮＡアプタマーｇ１の推定二次構造を示す模式図である。
【図２】図２は、組換えｃ−Ｍｅｔの概略を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の実施例１において、組換えｃ−Ｍｅｔに対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例２において、組換えＮＧＦＲに対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例２において、組換えｃ−Ｍｅｔに対するＲＮＡアプタマープールの結合能を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例３において、組換えｃ−Ｍｅｔに対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例４において、組換えｃ−Ｍｅｔに対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明におけるＲＮＡアプタマーｇ１−ｔｒＡの推定二次構造を示す模式図である。
【図９】図９は、本発明の実施例５において、組換えｃ−Ｍｅｔに対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明におけるＲＮＡアプタマーｇ７の推定二次構造を示す模式図である。
【図１１】図１１は、本発明の実施例６において、組換えｃ−Ｍｅｔに対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例７において、組換えｃ−Ｍｅｔに対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例８において、ＲＮＡアプタマーの存在下における、移動細胞の割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子＞
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、前述のように、下記（Ａ１）〜（Ａ４）および（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、ｃ−Ｍｅｔに結合可能なｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子である。
（Ａ１）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ａ２）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ａ３）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列に対して、６０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ａ４）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ｂ１）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ｂ３）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列に対して、６０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
（Ｂ４）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
【００１５】
本発明において、「ｃ−Ｍｅｔに結合可能」とは、例えば、ｃ−Ｍｅｔに対する結合能を有している、または、ｃ−Ｍｅｔに対する結合活性（ｃ−Ｍｅｔ結合活性）を有しているともいう。本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する。前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子とｃ−Ｍｅｔとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ビアコアＸ(商品名、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｔｄ．)が使用できる。
【００１６】
本発明において、ｃ−Ｍｅｔは、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号４２７４１６５５にアイソフォームｂのアミノ酸配列（配列番号８０）が開示されている。
【００１７】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、ｃ−Ｍｅｔアプタマーともいう。本発明の核酸分子は、例えば、前記（Ａ１）〜（Ａ４）および（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記（Ａ１）〜（Ａ４）および（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかのポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
【００１８】
前記（Ａ１）のポリヌクレオチドを含む核酸分子について、説明する。以下、前記（Ａ１）のポリヌクレオチドを含む核酸分子を、ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）という。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）において、配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列を、塩基配列（Ａ１）ともいう。
（Ａ１）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド
【００１９】
前記塩基配列（Ａ１）からなるポリヌクレオチド、および前記塩基配列（Ａ１）のポリヌクレオチドを含むｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）は、それぞれ、以下に示すように、配列番号の前に示す名称で表わすこともある。
ｇ１（配列番号１）
acacacugagaguuugaccagcuauuaaaugggucgugac
ｇ２（配列番号２）
acccuggcgaucuccggccggauacgggagaacgagguac
ｇ３（配列番号３）
gggcgaaacugucgugacacgguuugacaugccggccuua
ｇ４（配列番号４）
uaccgugauucggggugguauccgguggacauccaggucg
ｇ５（配列番号５）
gcccaacgaacauuuugaguuuccaggcagcucauagaca
ｇ６（配列番号６）
uccagguguggcgagccacuguaagagucgccgugaggau
ｇ７（配列番号７）
cuugaagucaaggguagagugaccaugcagcucguagaca
ｇ８（配列番号８）
gggcacuuaaaaccagaccgugauuugcgguuggucucgc
ｇ９（配列番号９）
gaugucucaauuggucgugauugugcugaccacacgaacc
ｇ１０（配列番号１０）
acacagcucugauggucgugauuagguugaccaccuaccu
ｇ１１（配列番号１１）
guuuagguggcaucgaccuucaugaaacgggugcacaggc
ｇ１２（配列番号１２）
cgcggccauccggcguuuggaacgggauguacaccugaca
ｇ１３（配列番号１３）
ucacucggacagccggagcgaaacgggcuguguaagacug
ｇ１４（配列番号１４）
ucaucgggacaucggauggaacgggugucaagaagcgugu
ｇ１５（配列番号１５）
gacgcgggccaccggcuagcgacgggugguaaagggcuug
ｇ１６（配列番号１６）
ccgcuaccgggugcaacggguagacuguaaccaggugaua
ｇ１７（配列番号１７）
agugauggccggcuggagaaacgggccacucgauccagg
ｇ１８（配列番号１８）
ggcacccuauaggauucagccccuaacccgguguugugaa
ｇ１９（配列番号１９）
guagccgugauuggguuggcugcccacaauuauccaggac
ｇ２０（配列番号２０）
acguuguggcgaacuucggcccgaacgggaguaacugca
ｇ２１（配列番号２１）
ccuuggugucauccgaccaaauuagaacgggaugaggaag
ｇ２２（配列番号２２）
gcguguuucuucauuucgacgcuggccaacggaaaugcaa
ｇ２３（配列番号２３）
augggagugcgccucggcucuaacggagguaugcacguca
ｇ２４（配列番号２４）
gaguugucgcacagcgacucgaaaauaaucuguccgacac
ｇ２５（配列番号２５）
uagcaacaguucccagaggugaucaggcagccuuaagaca
ｇ２６（配列番号２６）
gcuccaccagguguagcuagccuguagacaucaguagca
ｇ２７（配列番号２７）
ccuaugcagaccgacauccggguauacgggaugaugcgac
ｇ２８（配列番号２８）
ccuggggguuccgcaggaaucgggaacuagauuggugguc
ｇ２９（配列番号２９）
acgagccgugauuggguuggcaacccugcuuaugugagga
ｇ３０（配列番号３０）
aaauugccgggaucugguguggcgaccaugcggcgugcau
ｇ３１（配列番号３１）
agagucuaugccgugagugaggguggcgccucgacugcca
ｇ３２（配列番号３２）
acaagaccgggauggggguuggucacacacaaagacugaa
ｇ３３（配列番号３３）
acuuuuggcgaucuccggccggauacgggagaacgaggua
ｇ３４（配列番号３４）
uuuggugaauuccgaccauuuugcaaacgggauacgggac
ｇ３５（配列番号３５）
gauuugugugauacccgacacucuaacgggguagcagggc
ｇ３６（配列番号３６）
cuugauuggucgcaaccggacaaggacggguugaugcagu
ｇ３７（配列番号３７）
gguuugcuccgaccgacuaaagggagccucugucacgagu
ｇ３８（配列番号３８）
ccaggagcauuagaccggggaaagaaggaguaccgucugg
【００２０】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、前記塩基配列（Ａ１）からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子でもよい。
【００２１】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）が、前記塩基配列（Ａ１）からなるポリヌクレオチドを含む場合、例えば、前記塩基配列（Ａ１）をＸ領域として、さらに、Ｙ領域および／またはＹ’領域を有してもよい。前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）において、前記Ｘ領域、前記Ｙ領域、前記Ｙ’領域は、例えば、５’側から、前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域の順で連結していることが好ましい。前記Ｙ領域は、特に制限されず、例えば、配列番号７７または７８の塩基配列からなる配列および前記塩基配列を含む配列があげられる。また、前記Ｙ’領域は、特に制限されず、例えば、配列番号７９の塩基配列からなる配列および前記塩基配列を含む配列があげられる。これらの配列は、一例であって、本発明を制限するものではない。
gggacgcucacguacgcuaa（配列番号７７）
acgcucacguacgcuaa（配列番号７８）
ucagugccuggacgugcagu（配列番号７９）
【００２２】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）において、前記Ｙ領域は、例えば、前記塩基配列（Ａ１）の５’側に結合していることが好ましい。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）において、前記Ｙ’領域は、例えば、前記塩基配列（Ａ１）の３’側に結合していることが好ましい。前記塩基配列（Ａ１）と前記Ｙ領域、および前記塩基配列（Ａ１）と前記Ｙ’領域とは、例えば、直接結合してもよいし、介在配列を介して結合してもよい。
【００２３】
前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、それぞれ、特に制限されない。前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、それぞれ、例えば、プライマーがアニーリング可能なプライマー結合配列、および、ポリメラーゼが認識可能なポリメラーゼ認識配列等を有することが好ましい。核酸分子を大量に製造する場合、例えば、前述のような化学合成よりも、核酸増幅法により増幅させる方が、効率よい製造が可能である。そこで、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を核酸増幅法により増幅させる場合、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、プライマーがハイブリダイズ可能なプライマー結合配列およびポリメラーゼが認識可能なポリメラーゼ認識配列を有することが好ましい。前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、前記Ｘ領域の５’側上流、すなわち前記Ｙ領域と、前記Ｘ領域の３’側下流、すなわち前記Ｙ’領域との少なくとも一方に、前記プライマー結合配列およびポリメラーゼ認識配列を有することが好ましい。前記ポリメラーゼ認識領域は、例えば、核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子がＲＮＡの場合、前記ポリメラーゼの認識配列は、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識配列（以下、「ＲＮＡポリメラーゼ認識配列」ともいう）が好ましく、具体例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識配列であるＴ７プロモーター等があげられる。前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、５’側の前記Ｙ領域は、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識配列と前記プライマー結合配列（以下、「５’側プライマー領域」ともいう）とを、この順序で有することが好ましい。そして、前記Ｙ領域の３’側に、前記Ｘ領域が連結されていることが好ましい。さらに、前記Ｘ領域の３’側に、前記Ｙ’領域が連結され、前記Ｙ’領域が、プライマー結合配列（以下、「３’側プライマー領域」ともいう）を有することが好ましい。前記ＲＮＡにおける前記５’側プライマー領域は、例えば、前記ＲＮＡを鋳型として合成したＤＮＡアンチセンス鎖の３’側に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の３’側に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、さらに、ｃ−Ｍｅｔへの結合を補助する領域を有してもよい。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域、および、前記Ｘ領域と前記Ｙ’領域が、それぞれ、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。
【００２４】
前記Ｙ領域およびＹ’領域の塩基数は、特に制限されず、それぞれ、例えば、１０〜５０塩基であり、好ましくは１５〜４０塩基であり、より好ましくは２０〜３７塩基長、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。
【００２５】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）が、前記塩基配列（Ａ１）を含む場合、例えば、配列番号３９〜７６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子、または前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子が例示できる。以下に示す配列番号３９〜７６の塩基配列は、それぞれ、前記配列番号１〜３８の塩基配列（Ａ１）を含み、下線部で表わされる領域が、それぞれ、前記配列番号１〜３８の塩基配列に相当する。前記配列番号３９〜７６の塩基配列からなるポリヌクレオチド、および前記塩基配列のポリヌクレオチドを含む前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）は、それぞれ、以下に示すように、配列番号の前に示す名称で表わすこともある。
【００２６】
ｇ１（配列番号３９）
gggacgcucacguacgcuaaacacacugagaguuugaccagcuauuaaaugggucgugacucagugccuggacgugcagu
ｇ２（配列番号４０）
gggacgcucacguacgcuaaacccuggcgaucuccggccggauacgggagaacgagguacucagugccuggacgugcagu
ｇ３（配列番号４１）
gggacgcucacguacgcuaagggcgaaacugucgugacacgguuugacaugccggccuuaucagugccuggacgugcagu
ｇ４（配列番号４２）
gggacgcucacguacgcuaauaccgugauucggggugguauccgguggacauccaggucgucagugccuggacgugcagu
ｇ５（配列番号４３）
gggacgcucacguacgcuaagcccaacgaacauuuugaguuuccaggcagcucauagacaucagugccuggacgugcagu
ｇ６（配列番号４４）
gggacgcucacguacgcuaauccagguguggcgagccacuguaagagucgccgugaggauucagugccuggacgugcagu
ｇ７（配列番号４５）
gggacgcucacguacgcuaacuugaagucaaggguagagugaccaugcagcucguagacaucagugccuggacgugcagu
ｇ８（配列番号４６）
gggacgcucacguacgcuaagggcacuuaaaaccagaccgugauuugcgguuggucucgcucagugccuggacgugcagu
ｇ９（配列番号４７）
gggacgcucacguacgcuaagaugucucaauuggucgugauugugcugaccacacgaaccucagugccuggacgugcagu
ｇ１０（配列番号４８）
gggacgcucacguacgcuaaacacagcucugauggucgugauuagguugaccaccuaccuucagugccuggacgugcagu
ｇ１１（配列番号４９）
gggacgcucacguacgcuaaguuuagguggcaucgaccuucaugaaacgggugcacaggcucagugccuggacgugcagu
ｇ１２（配列番号５０）
gggacgcucacguacgcuaacgcggccauccggcguuuggaacgggauguacaccugacaucagugccuggacgugcagu
ｇ１３（配列番号５１）
gggacgcucacguacgcuaaucacucggacagccggagcgaaacgggcuguguaagacugucagugccuggacgugcagu
ｇ１４（配列番号５２）
gggacgcucacguacgcuaaucaucgggacaucggauggaacgggugucaagaagcguguucagugccuggacgugcagu
ｇ１５（配列番号５３）
gggacgcucacguacgcuaagacgcgggccaccggcuagcgacgggugguaaagggcuugucagugccuggacgugcagu
ｇ１６（配列番号５４）
gggacgcucacguacgcuaaccgcuaccgggugcaacggguagacuguaaccaggugauaucagugccuggacgugcagu
ｇ１７（配列番号５５）
gggacgcucacguacgcuaaagugauggccggcuggagaaacgggccacucgauccaggucagugccuggacgugcagu
ｇ１８（配列番号５６）
gggacgcucacguacgcuaaggcacccuauaggauucagccccuaacccgguguugugaaucagugccuggacgugcagu
ｇ１９（配列番号５７）
gggacgcucacguacgcuaaguagccgugauuggguuggcugcccacaauuauccaggacucagugccuggacgugcagu
ｇ２０（配列番号５８）
gggacgcucacguacgcuaaacguuguggcgaacuucggcccgaacgggaguaacugcaucagugccuggacgugcagu
ｇ２１（配列番号５９）
gggacgcucacguacgcuaaccuuggugucauccgaccaaauuagaacgggaugaggaagucagugccuggacgugcagu
ｇ２２（配列番号６０）
gggacgcucacguacgcuaagcguguuucuucauuucgacgcuggccaacggaaaugcaaucagugccuggacgugcagu
ｇ２３（配列番号６１）
gggacgcucacguacgcuaaaugggagugcgccucggcucuaacggagguaugcacgucaucagugccuggacgugcagu
ｇ２４（配列番号６２）
gggacgcucacguacgcuaagaguugucgcacagcgacucgaaaauaaucuguccgacacucagugccuggacgugcagu
ｇ２５（配列番号６３）
gggacgcucacguacgcuaauagcaacaguucccagaggugaucaggcagccuuaagacaucagugccuggacgugcagu
ｇ２６（配列番号６４）
gggacgcucacguacgcuaagcuccaccagguguagcuagccuguagacaucaguagcaucagugccuggacgugcagu
ｇ２７（配列番号６５）
gggacgcucacguacgcuaaccuaugcagaccgacauccggguauacgggaugaugcgacucagugccuggacgugcagu
ｇ２８（配列番号６６）
gggacgcucacguacgcuaaccuggggguuccgcaggaaucgggaacuagauugguggucucagugccuggacgugcagu
ｇ２９（配列番号６７）
gggacgcucacguacgcuaaacgagccgugauuggguuggcaacccugcuuaugugaggaucagugccuggacgugcagu
ｇ３０（配列番号６８）
gggacgcucacguacgcuaaaaauugccgggaucugguguggcgaccaugcggcgugcauucagugccuggacgugcagu
ｇ３１（配列番号６９）
gggacgcucacguacgcuaaagagucuaugccgugagugaggguggcgccucgacugccaucagugccuggacgugcagu
ｇ３２（配列番号７０）
gggacgcucacguacgcuaaacaagaccgggauggggguuggucacacacaaagacugaaucagugccuggacgugcagu
ｇ３３（配列番号７１）
gggacgcucacguacgcuaaacuuuuggcgaucuccggccggauacgggagaacgagguaucagugccuggacgugcagu
ｇ３４（配列番号７２）
gggacgcucacguacgcuaauuuggugaauuccgaccauuuugcaaacgggauacgggacucagugccuggacgugcagu
ｇ３５（配列番号７３）
gggacgcucacguacgcuaagauuugugugauacccgacacucuaacgggguagcagggcucagugccuggacgugcagu
ｇ３６（配列番号７４）
gggacgcucacguacgcuaacuugauuggucgcaaccggacaaggacggguugaugcaguucagugccuggacgugcagu
ｇ３７（配列番号７５）
gggacgcucacguacgcuaagguuugcuccgaccgacuaaagggagccucugucacgaguucagugccuggacgugcagu
ｇ３８（配列番号７６）
gggacgcucacguacgcuaaccaggagcauuagaccggggaaagaaggaguaccgucuggucagugccuggacgugcagu
【００２７】
前記ｇ１（配列番号３９）の推定二次構造を図１に示し、前記ｇ７（配列番号４５）の推定二次構造を図１０に示す。図１および図１０において、囲んでいる領域が、前述したｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子間における保存領域の一例である。
【００２８】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）の全塩基数は、特に制限されず、例えば、２０〜１６０塩基であり、好ましくは３０〜１２０塩基であり、より好ましくは４０〜１００塩基である。
【００２９】
つぎに、前記（Ａ２）のポリヌクレオチドを含む核酸分子について、説明する。以下、前記（Ａ２）のポリヌクレオチドを含む核酸分子を、ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ２）という。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ２）において、置換、欠失、付加または挿入を、以下「改変」といい、前記改変された下記塩基配列を、塩基配列（Ａ２）ともいう。
（Ａ２）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
【００３０】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ２）は、例えば、前記改変された塩基配列（Ａ２）を含む核酸分子でもよいし、前記改変された塩基配列（Ａ２）からなる核酸分子でもよい。
【００３１】
前記（Ａ２）において、「１または複数」は、特に制限されず、前記（Ａ２）のポリヌクレオチドが、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であればよい。前記「１または複数」は、前記塩基配列（Ａ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、「１または複数」は、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）の全長配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。
【００３２】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ２）の全塩基数は、特に制限されず、例えば、２０〜１６０塩基であり、好ましくは３０〜１２０塩基であり、より好ましくは４０〜１００塩基である。
【００３３】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ２）は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）と同様に、さらに、前記Ｙ領域および／または前記Ｙ’領域を有してもよい。この場合、例えば、前記塩基配列（Ａ２）を前記Ｘ領域とし、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、前述の通りである。
【００３４】
前記（Ａ２）のポリヌクレオチドは、特に制限されず、具体例として、前記塩基配列（Ａ１）において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基までの塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。すなわち、前記（Ａ２）のポリヌクレオチドは、例えば、前記塩基配列（Ａ１）において、５’末端のｇｇｇを欠失したポリヌクレオチドがあげられる。
【００３５】
つぎに、前記（Ａ３）のポリヌクレオチドを含む核酸分子について、説明する。以下、前記（Ａ３）のポリヌクレオチドを含む核酸分子を、ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ３）という。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ３）において、下記同一性を有する塩基配列を、塩基配列（Ａ３）ともいう。
（Ａ３）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列に対して、６０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
【００３６】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ３）は、例えば、前記同一性を有する塩基配列（Ａ３）からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子でもよい。
【００３７】
前記（Ａ３）において、前記同一性は、例えば、前記塩基配列（Ａ１）に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。また、前記同一性は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ３）の全長配列が、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）の全長配列に対して、７０％以上でもよく、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
【００３８】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ３）の全塩基数は、特に制限されず、例えば、２０〜１６０塩基であり、好ましくは３０〜１２０塩基であり、より好ましくは４０〜１００塩基である。
【００３９】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ３）は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）と同様に、さらに、前記Ｙ領域および／または前記Ｙ’領域を有してもよい。この場合、例えば、前記塩基配列（Ａ３）を前記Ｘ領域とし、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、前述の通りである。
【００４０】
つぎに、前記（Ａ４）のポリヌクレオチドを含む核酸分子について、説明する。以下、前記（Ａ４）のポリヌクレオチドを含む核酸分子を、ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ４）という。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ４）において、下記相補的な塩基配列を、塩基配列（Ａ４）ともいう。
（Ａ４）配列番号１〜３８のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
【００４１】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ４）は、例えば、前記塩基配列（Ａ４）からなるポリヌクレオチドを含む前記核酸分子（Ａ４）でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子でもよい。前記（Ａ４）のポリヌクレオチドは、例えば、前記塩基配列（Ａ１）からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ｃ−Ｍｅｔに結合可能なポリヌクレオチドでもよい。
【００４２】
前記（Ａ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ４）は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）の全長配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、ｃ−Ｍｅｔに結合可能である核酸分子でもよい。
【００４３】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ４）の全塩基数は、特に制限されず、例えば、２０〜１６０塩基であり、好ましくは３０〜１２０塩基であり、より好ましくは４０〜１００塩基である。
【００４４】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ４）は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）と同様に、さらに、前記Ｙ領域および／または前記Ｙ’領域を有してもよい。この場合、例えば、前記塩基配列（Ａ４）を前記Ｘ領域とし、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、前述の通りである。
【００４５】
つぎに、前記（Ｂ１）のポリヌクレオチドを含む核酸分子について、説明する。以下、前記（Ｂ１）のポリヌクレオチドを含む核酸分子を、ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）という。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）において、配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列を、塩基配列（Ｂ１）ともいう。
（Ｂ１）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００４６】
配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列は、前述の通りである。配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列（Ｂ１）からなるポリヌクレオチド、および前記塩基配列（Ｂ１）を含むｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）は、それぞれ、前述した配列番号の前に示す名称で表わすこともある。
【００４７】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、前記塩基配列（Ｂ１）からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子でもよい。
【００４８】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）の全塩基数は、特に制限されない。その全長の上限は、例えば、１６０塩基であり、好ましくは１２０塩基であり、より好ましくは１００塩基である。
【００４９】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ａ１）と同様に、さらに、前記Ｙ領域および／または前記Ｙ’領域を有してもよい。この場合、例えば、前記塩基配列（Ｂ１）を前記Ｘ領域とし、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、前述の通りである。
【００５０】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、中でも、下記（ｂ１）のポリヌクレオチドを含む核酸分子であることが好ましい。以下、前記（ｂ１）のポリヌクレオチドを含む核酸分子を、ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（ｂ１）ともいう。前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（ｂ１）は、例えば、配列番号３９の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子でもよい。
（ｂ１）配列番号３９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００５１】
つぎに、前記（Ｂ２）のポリヌクレオチドを含む核酸分子について、説明する。以下、前記（Ｂ２）のポリヌクレオチドを含む核酸分子を、ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ２）という。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ２）において、置換、欠失、付加または挿入を、以下「改変」といい、前記改変された下記塩基配列を、塩基配列（Ｂ２）ともいう。
（Ｂ２）配列番号３９〜７６のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
【００５２】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ２）は、例えば、前記改変された塩基配列（Ｂ２）を含む核酸分子でもよいし、前記改変された塩基配列（Ｂ２）からなる核酸分子でもよい。
【００５３】
前記（Ｂ２）において、「１または複数」は、特に制限されず、前記（Ｂ２）のポリヌクレオチドが、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であればよい。前記置換された塩基の数は、前記塩基配列（Ｂ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。前記付加または挿入された塩基の数は、前記塩基配列（Ｂ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。前記欠失された塩基の数は、前記塩基配列（Ｂ１）において、例えば、１〜４０個、１〜２０個、１〜４個、１〜３個、２個または１個である。
【００５４】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ２）の長さは、特に制限されず、その全長は、例えば、２０〜１６０塩基長であり、好ましくは３０〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜１００塩基長である。
【００５５】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ２）のうち、例えば、前記塩基配列（Ｂ１）において、１または複数の塩基が、欠失された塩基配列からなるポリヌクレオチドを含み、ｃ−Ｍｅｔに結合可能である核酸分子は、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）を小型化した核酸分子ともいえる。前記小型化した核酸分子を、小型化ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ２）ともいう。
【００５６】
前記小型化ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ２）において、前記欠失された塩基配列を、小型化塩基配列（Ｂ２）ともいう。前記小型化塩基配列（Ｂ２）は、例えば、前記塩基配列（Ｂ１）において、１または複数の塩基が欠失するだけでなく、例えば、さらに、１または複数の塩基が、置換、付加または挿入された塩基配列でもよい。前記小型化ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、前記小型化塩基配列（Ｂ２）からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子でもよい。
【００５７】
前記小型化ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ２）は、前述のように、前記欠失された前記小型化塩基配列（Ｂ２）からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子でもよい。
【００５８】
前記小型化塩基配列（Ｂ２）のポリヌクレオチドは、特に制限されず、具体例として、前記塩基配列（Ｂ１）において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基までの塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。すなわち、前記塩基配列（Ｂ２）のポリヌクレオチドは、例えば、前記塩基配列（Ｂ１）において、５’末端のｇｇｇを欠失したポリヌクレオチドがあげられる。
【００５９】
前記小型化ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ２）の長さは、特に制限されず、その全長は、例えば、２０〜１６０塩基長であり、好ましくは３０〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜１００塩基長である。
【００６０】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ２）は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）と同様に、さらに、前記Ｙ領域および／または前記Ｙ’領域を有してもよい。この場合、例えば、前記塩基配列（Ｂ２）を前記Ｘ領域とし、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、前述の通りである。
【００６１】
前記小型化ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ２）は、例えば、中でも、下記（ｂ２）のポリヌクレオチドを含む核酸分子が好ましい。以下、前記（ｂ２）のポリヌクレオチドを含む核酸分子を、小型化ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（ｂ２）ともいう。前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、配列番号３９の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子でもよい。
（ｂ２）配列番号３９で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、欠失された塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
【００６２】
配列番号３９で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が欠失された塩基配列を、以下、欠失塩基配列ともいう。前記欠失塩基配列は、例えば、配列番号８１〜８９のいずれかで表わされる塩基配列があげられる。これらの塩基配列を下記表１に示す。下記表１において、各塩基配列は、配列番号３９の塩基配列と対応するように示す。各塩基配列について、配列番号３９の塩基配列と対比して、欠失する部分は空欄で示す。配列番号８１〜８９の塩基配列からなるポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む前記小型化ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（ｂ２）は、それぞれ、下記表１に示す名称で表わすこともある。
【００６３】
【表１】
2012014890.tif 000003
【００６４】
前記小型化ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、配列番号８１〜８９のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子でもよい。
【００６５】
前記小型化塩基配列（Ｂ２）は、特に制限されず、具体例として、前記配列番号３９の塩基配列および配列番号８１〜８９のいずれかの塩基配列（ｂ２）において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基までの塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。すなわち、前記小型化塩基配列（Ｂ２）は、例えば、配列番号３９の塩基配列および配列番号８１〜８９のいずれかの塩基配列（ｂ２）において、５’末端のｇｇｇを欠失したポリヌクレオチドがあげられる。
【００６６】
前記小型化ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（ｂ２）の長さは、特に制限されず、その全長は、例えば、２０〜１６０塩基長であり、好ましくは３０〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜１００塩基長である。
【００６７】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）と同様に、さらに、前記Ｙ領域および／または前記Ｙ’領域を有してもよい。この場合、例えば、前記塩基配列（ｂ２）を前記Ｘ領域とし、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、前述の通りである。
【００６８】
つぎに、前記（Ｂ３）のポリヌクレオチドを含む核酸分子について、説明する。以下、前記（Ｂ３）のポリヌクレオチドを含む核酸分子を、ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ３）という。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ３）において、下記同一性を有する塩基配列を、塩基配列（Ｂ３）ともいう。
（Ｂ３）前記配列番号３８〜７６のいずれかで表わされる塩基配列に対して、６０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
【００６９】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ３）は、前記同一性を有する塩基配列（Ｂ３）からなるポリヌクレオチドを含む核酸分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子でもよい。
【００７０】
前記（Ｂ３）において、前記同一性は、例えば、前記塩基配列（Ｂ１）に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。また、前記同一性は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ３）の全長配列が、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）の全長配列に対して、７０％以上でもよく、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
【００７１】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ３）の全塩基数は、特に制限されず、例えば、２０〜１６０塩基であり、好ましくは３０〜１２０塩基であり、より好ましくは４０〜１００塩基である。
【００７２】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ３）は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）と同様に、さらに、前記Ｙ領域および／または前記Ｙ’領域を有してもよい。この場合、例えば、前記塩基配列（Ｂ３）を前記Ｘ領域とし、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、前述の通りである。
【００７３】
つぎに、前記（Ｂ４）のポリヌクレオチドを含む核酸分子について、説明する。以下、前記（Ｂ４）のポリヌクレオチドを含む核酸分子を、ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ４）という。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ４）において、下記相補的な塩基配列を、塩基配列（Ｂ４）ともいう。
（Ｂ４）前記配列番号３８〜７６のいずれかで表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、ｃ−Ｍｅｔに結合可能であるポリヌクレオチド
【００７４】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ４）は、例えば、前記塩基配列（Ｂ４）からなるポリヌクレオチドを含む前記核酸分子（Ｂ４）でもよいし、前記ポリヌクレオチドからなる核酸分子でもよい。前記（Ｂ４）のポリヌクレオチドは、例えば、前記塩基配列（Ｂ１）からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ｃ−Ｍｅｔに結合可能なポリヌクレオチドでもよい。
【００７５】
前記（Ｂ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。前記「ストリンジェントな条件」とは、前述と同様である。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ４）は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）の全長配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、ｃ−Ｍｅｔに結合可能である核酸分子でもよい。
【００７６】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ４）の全塩基数は、特に制限されず、例えば、２０〜１６０塩基であり、好ましくは３０〜１２０塩基であり、より好ましくは４０〜１００塩基である。
【００７７】
前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ４）は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子（Ｂ１）と同様に、さらに、前記Ｙ領域および／または前記Ｙ’領域を有してもよい。この場合、例えば、前記塩基配列（Ｂ４）を前記Ｘ領域とし、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、前述の通りである。
【００７８】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（Ａ１）〜（Ａ４）および（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかのポリヌクレオチドを１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドを複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドが連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよいが、好ましくは同じである。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上であり、好ましくは２である。
【００７９】
前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜８０塩基長であり、好ましくは５〜６０塩基長であり、より好ましくは５〜４０塩基長であり、さらに好ましくは５〜３０塩基長である。
【００８０】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、一本鎖核酸が好ましい。前記一本鎖核酸は、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステム構造、ループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００８１】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、前記二本鎖核酸の場合、例えば、一方の一本鎖が、前記（Ａ１）〜（Ａ４）および前記（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかの核酸分子であり、他方の一本鎖が、前記（Ａ１）〜（Ａ４）および前記（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかの核酸分子に相補的な塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子であることが好ましい。前記二本鎖核酸の場合、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖に解離させてもよい。また、解離した前記一本鎖核酸は、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造等を形成していることが好ましい。
【００８２】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、その構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、リボヌクレオチド残基のみから構成されるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基を含むＲＮＡ等があげられる。後者の場合、ＲＮＡにおけるデオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１または２個である。
【００８３】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、修飾化ヌクレオチド残基を含んでもよい。前記核酸分子における前記修飾化ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【００８４】
前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、修飾化リボヌクレオチド残基および修飾化デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基における糖残基が修飾されているものがあげられる。前記糖残基は、例えば、リボース残基またはデオキシリボース残基があげられる。前記ヌクレオチド残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、塩基としてピリミジン塩基（ピリミジン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたもの、または、塩基としてプリン塩基（プリン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたものがあげられ、好ましくは前者である。以下、ピリミジン塩基を有するヌクレオチド残基をピリミジンヌクレオチド残基といい、修飾されたピリミジンヌクレオチド残基を修飾化ピリミジンヌクレオチド残基といい、プリン塩基を有するヌクレオチド残基をプリンヌクレオチド残基といい、修飾されたプリンヌクレオチド残基を修飾化プリンヌクレオチド残基という。前記ピリミジンヌクレオチド残基は、例えば、ウラシルを有するウラシルヌクレオチド残基、シトシンを有するシトシンヌクレオチド残基、チミンを有するチミンヌクレオチド残基等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位の炭素および／または４’位の炭素が修飾されていることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、リボース残基の２’位が修飾された、２’−メチルウラシル（２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基）、２’−メチルシトシン（２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基）、２’−フルオロウラシル（２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基）、２’−フルオロシトシン（２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基）、２’−アミノウラシル（２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基）、２’−アミノシトシン（２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基）、２’−チオウラシル（２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基）、２’−チオシトシン（２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基）等があげられる。
【００８５】
前記ヌクレオチド残基における塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）の天然塩基（非人工核酸）でもよいし、人工塩基（非天然塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基および改変塩基等があげられ、前記天然塩基（ａ、ｃ、ｇ、ｔまたはｕ）と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）またはウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’−メチルウラシル、２’−メチルシトシン、２’−フルオロウラシル、２’−フルオロシトシン、２’−アミノウラシル、２’−アミノシトシン、２’−チオウラシル、２’−チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
【００８６】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、前記構成単位として人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記核酸分子における前記人工核酸モノマー残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１または２個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における塩基は、例えば、前述と同様である。本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびＥＮＡの少なくともいずれかのモノマー残基を含むＲＮＡまたはＤＮＡがあげられ、好ましくはＲＮＡである。
【００８７】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。前記ヌクレアーゼは、特に制限されず、例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ等があげられ、具体例として、例えば、ＲＮＡ分解酵素であるリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮＡ分解酵素であるデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に作用するヌクレアーゼ等があげられる。前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、特に制限されない。
【００８８】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、構成単位として、前記修飾化ヌクレオチド残基を有することが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前述の通りであり、前記メチル化ヌクレオチド残基、前記フルオロ化ヌクレオチド残基、前記アミノ化ヌクレオチド残基、前記チオ化ヌクレオチド残基等があげられ、中でも前記フルオロ化ヌクレオチド残基が好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記ピリミジンヌクレオチド残基であり、前記糖残基（リボース残基またはデオキシリボース残基）が修飾されていることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
【００８９】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、前記ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、構成単位として、前記人工核酸モノマー残基を有してもよい。前記人工核酸モノマー残基は、特に制限されず、前述のとおりであって、中でも、ＬＮＡ残基が好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
【００９０】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、前述のように、ＲＮＡが好ましく、例えば、ＲＮＡ分解酵素耐性、すなわち、ＲＮａｓｅ耐性であることが好ましい。この場合、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、ＲＮＡ分解酵素耐性のため、例えば、前記デオキシリボヌクレオチド残基を有することが好ましい。具体的には、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基のうち、ウラシルを有するヌクレオチド残基の全てまたは一部が、チミンを有するヌクレオチド残基に置換されてもよく、具体的には、前記チミンを有するデオキシリボヌクレオチド残基に置換されてもよい。また、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド残基でもよい。
【００９１】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、ＲＮＡ分解酵素耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。前記ＰＥＧは、例えば、数十ｋＤａであることが好ましい。
【００９２】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、使用時において、ｃ−Ｍｅｔへの結合性に影響を与えない範囲で、さらに付加配列（リンカーともいう）を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、例えば、ポリ（Ａ）配列、ポリ（Ｔ）配列等があげられる。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられ、リボヌクレオチド残基が好ましい。本発明の核酸分子を、例えば、担体に固定化する際、前記付加配列を介して、前記担体に前記核酸分子を固定化することが好ましい。
【００９３】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子のｃ−Ｍｅｔに対する結合活性は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子とｃ−Ｍｅｔとの解離定数で表わすことができる。本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子の解離定数は、特に制限されず、例えば、５×１０−８ｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは、８×１０−９ｍｏｌ／Ｌ以下である。前記ｃ−Ｍｅｔは、例えば、ヒト由来ｃ−Ｍｅｔである。
【００９４】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、単独のｃ−Ｍｅｔに結合する他、ｃ−Ｍｅｔを含む融合ペプチドに、ｃ−Ｍｅｔを介して結合可能である。前記融合ペプチドは、例えば、Ｎ末端側にｃ−Ｍｅｔを含む融合ペプチド、Ｃ末端側にｃ−Ｍｅｔを含む融合ペプチド、内部にｃ−Ｍｅｔを含む融合ペプチド等があげられる。前記融合ポリペプチドは、例えば、ｃ−Ｍｅｔと他のペプチドとを含んでもよい。前記他のペプチドは、例えば、タンパク質でもよい。前記融合ペプチドは、例えば、融合タンパク質の意味も含む。
【００９５】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子の製造方法は、何ら制限されず、化学合成を利用した核酸合成方法等、公知の方法により合成できる。
【００９６】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、核酸増幅により調製することもできる。前記核酸増幅による調製方法は、特に制限されない。本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、ＤＮＡを鋳型として調製できる。以下、前記ＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ鎖をアンチセンス鎖、前記ＲＮＡのウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を含むＤＮＡ鎖をセンス鎖ともいう。前記鋳型ＤＮＡは、例えば、前記ＲＮＡにおける前記Ｘ領域の相補鎖のウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換したＤＮＡ（アンチセンス鎖）、および、前記Ｘ領域のウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を含むＤＮＡ（センス鎖）のいずれか一方を含むことが好ましい。これらのＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅を行った後、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを転写する。これによって、前記ＲＮＡを増幅できる。また、前記ＲＮＡを鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によりＤＮＡの核酸増幅を行い、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを転写する。これによって、前記ＲＮＡを増幅してもよい。
【００９７】
また、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子がＤＮＡの場合、例えば、ＤＮＡをポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法等によって、増幅できる。
【００９８】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、ｃ−Ｍｅｔと結合可能であることから、例えば、ｃ−Ｍｅｔとの結合によりｃ−Ｍｅｔの機能を中和する中和剤として使用できる。
【００９９】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、前述のように、ｃ−Ｍｅｔと結合可能であることから、例えば、ｃ−Ｍｅｔとの結合によりｃ−Ｍｅｔの機能を阻害する阻害剤として使用できる。
【０１００】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、ｃ−Ｍｅｔと結合可能であることから、例えば、ｃ−Ｍｅｔの発現が原因となる疾患を、予防または治療するための医薬品として使用できる。前記疾患は、例えば、癌、肝障害、筋委縮性側索硬化症、感染性炎症等があげられ、前記肝障害は、例えば、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変等、前記感染性炎症は、例えば、細菌感染症、マラリア感染等があげられる。前記本発明の医薬品は、例えば、抗癌剤、抗肝障害剤、抗筋委縮性側索硬化症剤、抗炎症剤等として使用できる。
【０１０１】
本発明の中和剤、本発明の阻害剤および本発明の医薬品は、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の中和剤、本発明の阻害剤および本発明の医薬品は、それぞれ、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子の他に、例えば、キャリアー等を含んでもよく、例えば、以下に示す組成物と同様の構成があげられ、同様にして使用できる。
【０１０２】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、細胞の移動（遊走）および／または浸潤を抑制でき、例えば、ＨＧＦで促進される細胞の移動および／または浸潤を抑制できる。本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、細胞の移動抑制、細胞の遊走抑制剤または細胞の浸潤抑制剤として使用することもできる。また、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、細胞の移動等を抑制できることから、癌の転移抑制剤としても使用できる。
【０１０３】
＜組成物＞
本発明の組成物は、前述のように、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。
【０１０４】
本発明の組成物は、前述のように、ｃ−Ｍｅｔと結合可能であることから、例えば、ｃ−Ｍｅｔとの結合によりｃ−Ｍｅｔの機能を中和する中和剤として使用できる。
【０１０５】
本発明の組成物は、前述のように、ｃ−Ｍｅｔと結合可能であることから、例えば、ｃ−Ｍｅｔとの結合によりｃ−Ｍｅｔの機能を阻害する阻害剤として使用できる。
【０１０６】
本発明の組成物は、前述のように、ｃ−Ｍｅｔと結合可能であることから、例えば、ｃ−Ｍｅｔが原因となる疾患を予防または治療するための医薬品として使用できる。前記本発明の医薬品は、例えば、抗癌剤等として使用できる。
【０１０７】
本発明の組成物の適用対象は、特に制限されず、その用途に応じて適宜決定できる。前記適用対象は、例えば、細胞、組織および生体等があげられる。前記細胞および組織の由来、ならびに生体の種類は、特に制限されない。前記生体は、例えば、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子および／またはｃ−Ｍｅｔオーソログ遺伝子を有する生物があげられ、具体例としては、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等の動物があげられる。生体に投与する場合、投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与があげられる。前記非経口投与は、例えば、静脈投与、動脈投与、リンパ管への投与、筋肉投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。
【０１０８】
本発明の組成物は、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子の他に、例えば、各種添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、特に制限されず、例えば、本発明の組成物の用途に応じて、適宜決定できる。前記添加剤は、例えば、薬学上許容される添加剤が好ましい。
【０１０９】
本発明の組成物は、例えば、前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を、細胞、組織または生体内等にデリバリーする場合、さらに、前記添加剤として、キャリアーを含むことが好ましい。前記キャリアーは、特に制限されず、例えば、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、逆ミセル、ポリカチオン、細胞膜透過性ペプチド、磁気粒子、リン酸カルシウム等があげられる。前記ナノ粒子は、特に制限されず、例えば、カーボンナノホーンおよびカーボンナノチューブ等のナノカーボンがあげられる。これらのキャリアーは、いずれか一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。また、前記添加剤は、例えば、緩衝剤、金属塩、界面活性剤等があげられる。
【０１１０】
＜検出試薬・キット＞
本発明の検出試薬は、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含むことを特徴とする、前記ｃ−Ｍｅｔを検出するためのｃ−Ｍｅｔ検出試薬である。本発明は、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。
【０１１１】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、前述のように、ｃ−Ｍｅｔに結合可能である。このため、例えば、本発明の検出試薬を用いて、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子とｃ−Ｍｅｔとの結合の有無を確認することにより、試料中におけるｃ−Ｍｅｔを、検出可能となる。前記検出は、例えば、定性または定量のいずれも可能である。前記ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子とｃ−Ｍｅｔとの結合の有無の確認方法は、特に制限されず、核酸とタンパク質との結合を検出する公知の方法を利用できる。このように本発明の検出試薬を用いれば、ｃ−Ｍｅｔを容易に検出できることから、例えば、生化学や臨床の分野に有用である。
【０１１２】
本発明のキットは、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明のキットによれば、例えば、前述のように、ｃ−Ｍｅｔを検出できる。
【０１１３】
本発明のキットは、例えば、必要に応じて、各種添加剤、使用説明書等を含んでもよい。
【０１１４】
＜治療方法＞
本発明の治療方法は、前記ｃ−Ｍｅｔが関与する疾患の対象に、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を投与する工程を含むことを特徴とする。前記ｃ−Ｍｅｔが関与する疾患は、特に制限されず、例えば、癌、肝障害、筋委縮性側索硬化症、感染性炎症からなる群から選択された少なくとも一つの疾患があげられる。前記癌は、例えば、肝臓、腎臓、膵臓、肺、膀胱、前立腺、精嚢、卵巣、乳房、乳腺、胃および結腸等の消化管等の癌があげられる。前記肝障害は、例えば、慢性肝炎、脂肪肝、肝硬変等があげられ、前記感染性炎症は、例えば、細菌感染症、マラリア感染等があげられる。本発明の治療方法によれば、例えば、前記疾患の予防、前記疾患の進行の抑制または前記疾患の治療等が可能である。本発明の治療方法は、例えば、予防方法の意味も含み、前記疾患の危険性がある対象に、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を投与する工程を含んでもよい。本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子の投与方法、投与条件等は、特に制限されず、前述の通りである。また、前記投与対象（例えば、患者）も、特に制限されない。前記生体は、例えば、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子および／またはｃ−Ｍｅｔオーソログ遺伝子を有する生物があげられ、具体例としては、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、ヒトを除く非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等があげられる。前記投与工程において、例えば、本発明の組成物を投与してもよい。
【０１１５】
本発明は、前記ｃ−Ｍｅｔが関与する疾患の治療に使用するための核酸分子であることを特徴とする。前記核酸分子は、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子である。前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、前述の通りである。また、本発明は、前記ｃ−Ｍｅｔが関与する疾患の治療に使用するための組成物であることを特徴とする。前記組成物は、前記本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を含む前記本発明の組成物である。前記本発明の組成物は、前述の通りである。
【０１１６】
本発明の細胞移動の抑制方法は、細胞に、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を投与する工程を含む。特に示さない限り、例えば、前述の記載を援用できる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれで行ってもよい。前記細胞の種類は、何ら制限されず、例えば、前述した癌の細胞、その培養細胞、患者からの単離細胞等があげられる。また、本発明の細胞移動の抑制方法は、例えば、細胞遊走の抑制方法、細胞浸潤の抑制方法ということもできる。また、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、例えば、細胞の移動等を抑制できることから、本発明の細胞移動の抑制方法は、例えば、癌の転移抑制方法ともいえる。
【実施例】
【０１１７】
つぎに、本発明の実施例について説明する。本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。【０１１８】
［実施例１］
ｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子として、ｃ−Ｍｅｔに結合可能なＲＮＡアプタマーを作製し、各ＲＮＡアプタマーについて、ｃ−Ｍｅｔに対する結合能を確認した。【０１１９】
（１）ＲＮＡアプタマー
下記表２における、配列番号３９〜４８のいずれかで表わされる塩基配列からなるＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例１のＲＮＡアプタマーとして使用した。比較例１のＲＮＡとして、４０塩基長のランダム配列を有する下記配列番号９０で表わされるオリゴヌクレオチドからなるＲＮＡを複数含むＲＮＡライブラリー（４０Ｎ）を使用した（以下、同様）。配列番号９０において、「ｎ」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルである。
４０Ｎ（配列番号９０）
gggacgcucacguacgcucannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnucagugccuggacgugcagu【０１２０】
【表２】
2012014890.tif 000004
【０１２１】
（２）ターゲットタンパク質
ターゲットタンパク質として、Ｈｉｓ−タグ、ＩｇＧおよびｃ−Ｍｅｔを含む組換えタンパク質を使用した。前記組換えタンパク質は、市販品である製品名Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＨＧＦ  Ｒ／ｃ−ＭＥＴ/Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ，ＣＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した（以下、「ｒｅｃ−ｃＭｅｔ」という）。図２に、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔの構造の概略を示す。図２において、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔは、左側がＮ末端、右側がＣ末端である。「ｃＭｅｔ  α」は、ｃ−Ｍｅｔ（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０８５８１）のα鎖における２５番目Ｇｌｕから３０７番目Ａｒｇのペプチド配列（配列番号９１）であり、「ｃＭｅｔ  β」は、ｃ−Ｍｅｔ（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０８５８１）のβ鎖における３０８番目Ｓｅｒから９３２番目Ｔｈｒのペプチド配列（配列番号９２）である。「ＨＩＥＧＲＭＤ」は、Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｐの７アミノ酸残基からなるペプチド配列（配列番号９３）であり、「ＩｇＧ」は、ヒトＩｇＧにおける１００番目Ｐｒｏから３３０番目Ｌｙｓのペプチド配列（配列番号９４）であり、「６Ｈｉｓ」は、６個のＨｉｓが連結したＨｉｓ−タグ（配列番号９５）である。前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔは、前記ｃＭｅｔ  αと前記ｃＭｅｔ  βとが、ジスルフィド結合で結合しており、前記ｃＭｅｔ  βのＣ末端に、前記ＨＩＥＧＲＭＤ、前記ＩｇＧおよび前記Ｈｉｓ−タグが、この順序で連結している。【０１２２】
（３）改良ＥＬＩＳＡ法
抗ＩｇＧ抗体（製品名Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−Ｆｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を９６穴プレート（Ｉｗａｋｉ、ＡＧＣテクノガラス社、日本）に吸着させ、１％のウシ血清アルブミンでブロッキングを行った。次いで、前記プレートに、１μｇ／ｍＬの前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔを５０μＬ添加し、さらに、かっこ内に示す終濃度となるように、Ｔｒｉｓ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）、塩化ナトリウム（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、酢酸マグネシウム（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）およびＴｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００（０．２％）を加えた。前記プレートを、室温で３時間インキュベートし、前記プレートに前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔを結合させた。インキュベート後、前記プレートを洗浄液で３回洗浄した。前記洗浄液の組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムおよび０．２％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００とした。コントロールは、５０μＬの前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに代えて、５０μＬの前記洗浄液を添加し、同様に、インキュベートならびに洗浄を行った。【０１２３】
次いで、前記ＲＮＡアプタマーの３’末端に２０塩基のポリアデニン（ポリＡ）を付加して、ポリＡ付加ＲＮＡアプタマーを調製した。前記ポリＡ付加ＲＮＡアプタマーを変性した後、５’末端をビオチン化した２０塩基のビオチン化ポリチミン(７４０ｎｍｏｌ／Ｌ)、ｔＲＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）およびＲＮａｓｅインヒビター(０．１６ｕｎｉｔｓ／ｍＬ)と混合した。これにより、前記ポリＡ付加ＲＮＡアプタマーのポリＡと、前記ビオチン化ポリチミンのポリチミン（ポリＴ）との相補的な結合により、ビオチン標識ＲＮＡアプタマーを作製した。前記ビオチン標識ＲＮＡアプタマーを、前記プレートに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。続いて、前記プレートを洗浄し、０．１μｇ／ｍＬのＨＲＰ−ストレプトアビジン(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ）を添加した。さらに、前記プレートを洗浄した後、１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ基質(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ)を加えて発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１２４】
これらの結果を、図３に示す。図３は、ＲＮＡアプタマーｇ１〜ｇ９について、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する結合能を示すグラフである。図３において、縦軸は、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔへの結合能を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。図３において、各バーは、左から順に、Ｎ４０、ＲＮＡアプタマーｇ１〜ｇ９の結果である。【０１２５】
図３に示すように、前記ＲＮＡアプタマーｇ１〜ｇ９は、いずれも、前記Ｎ４０よりも高い吸光度を示した。この結果から、前記ＲＮＡアプタマーｇ１〜ｇ９は、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに結合することがわかる。中でも、前記ＲＮＡアプタマーｇ１、ｇ５、ｇ６、ｇ７およびｇ８は、高い結合能を示し、特に前記ＲＮＡアプタマーｇ７は、極めて優れた結合能を示した。【０１２６】
［実施例２］
前記実施例１の各ＲＮＡアプタマーについて、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔへの結合が、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔにおけるｃ−Ｍｅｔの領域に対する特異的な結合であることを確認した。【０１２７】
ターゲットタンパク質として、Ｎ末端側から、ＮＧＦＲタンパク質のペプチド配列（配列番号９６）、７アミノ酸残基からなるペプチド配列（ＤＩＥＧＲＭＤ：配列番号９７）、ヒトＩｇＧのペプチド配列（配列番号９４）およびＨｉｓ−タグ（配列番号９５）が連結した組換えタンパク質（６Ｈｉｓ）を使用した。前記組換えタンパク質は、市販品である、製品名Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＮＧＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６/Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（ＣＦ：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した（以下、ｒｅｃ−ＮＧＦＲという）。前記ｒｅｃ−ＮＧＦＲにおいて、ＮＧＦＲタンパク質のペプチド配列は、ＮＧＦＲタンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０８１３８）の２９番目Ｌｙｓから２５０番目Ａｓｎのペプチド配列（配列番号９６）であり、７アミノ酸残基からなるペプチド配列は、Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｐの７アミノ酸残基からなるペプチド配列（配列番号９７）であり、ヒトＩｇＧのペプチド配列は、ヒトＩｇＧにおける１００番目Ｐｒｏから３３０番目Ｌｙｓのペプチド配列（配列番号９４）であり、Ｈｉｓ−タグは、Ｈｉｓ−タグは、６個のＨｉｓが連結したペプチド配列である。【０１２８】
前記ｒｅｃ−ＮＧＦＲを前記プレートに結合させた以外は、前記実施例１と同様にして、前記ｒｅｃ−ＮＧＦＲに対する前記ＲＮＡアプタマーの結合能を確認した。また、比較例として、前記Ｎ４０を使用し、同様にして結合能を確認した。【０１２９】
これらの結果を、図４に示す。図４は、ＲＮＡアプタマーｇ１〜ｇ９の前記ｒｅｃ−ＮＧＦＲに対する結合能を示すグラフである。図４において、縦軸は、前記ｒｅｃ−ＮＧＦＲへの結合能を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。図４において、各バーは、左から順に、Ｎ４０、ＲＮＡアプタマーｇ１〜ｇ９の結果である。【０１３０】
図４に示すように、前記ＲＮＡアプタマーｇ１〜ｇ９は、いずれも、前記Ｎ４０よりも低い吸光度であり、前記ｒｅｃ−ＮＧＦＲに結合していないことがわかった。この結果から、前記実施例１において、前記各ＲＮＡアプタマーは、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔにおけるｃ−Ｍｅｔ領域に特異的に結合していることが確認された。【０１３１】
また、前記ＲＮＡアプタマーｇ１〜ｇ９を含むアプタマープールについて、図５に、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する結合能および前記ｒｅｃ−ＮＧＦＲに対する結合能を合わせて示す。図５は、前記アプタマープールの前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する結合能および前記ｒｅｃ−ＮＧＦＲに対する結合能を示すグラフである。図５において、縦軸は、前記各組換えタンパク質への結合能を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。図５において、各バーは、左から順に、Ｎ４０の前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する結合能、前記アプタマープールの前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する結合能、前記アプタマープールの前記ｒｅｃ−ＮＧＦＲに対する結合能の結果である。【０１３２】
図５に示すように、前記ＲＮＡアプタマープールは、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対して、前記Ｎ４０よりも高い吸光度を示し、前記ｒｅｃ−ＮＧＦＲに対して、極めて低い吸光度を示した。この結果から、前記ＲＮＡアプタマープールは、ＮＧＦＲではなく、ｃ−Ｍｅｔに対して特異的に結合することが確認された。【０１３３】
［実施例３］
前記ＲＮＡアプタマーｇ１（配列番号３９）を小型化したアプタマーを作製し、ｃ−Ｍｅｔに対する結合能を確認した。【０１３４】
（１）ＲＮＡアプタマー
図１に、前記ＲＮＡアプタマーｇ１の推定二次構造の概略図を示す。前記小型化ＲＮＡアプタマーは、前記ＲＮＡアプタマーｇ１の配列において、５’側の４塩基目〜８塩基目（５塩基長）を欠失するｇ１−ｕ５ｄｅｌ、前記４塩基目から１３塩基目（１０塩基長）を欠失するｇ１−ｕ１０ｄｅｌ、３’末端の１塩基目から５塩基目（５塩基長）を欠失するｇ１−ｄ５ｄｅｌ、３’末端の１塩基目から１０塩基目（１０塩基長）を欠失するｇ１−ｄ１０ｄｅｌを作製した。これらの小型化アプタマーの配列を下記表３に示す。【０１３５】
【表３】
2012014890.tif 000005
【０１３６】
前記小型化ＲＮＡアプタマーを使用した以外は、前記実施例１と同様にして、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する前記ＲＮＡアプタマーの結合能を確認した。また、前記ＲＮＡアプタマーｇ１についても、同様に結合能を確認した。比較例として、前記Ｎ４０を使用し、同様にして結合能を確認した。【０１３７】
これらの結果を、図６に示す。図６は、前記小型化アプタマーｇ１−ｕ１０ｄｅｌ、ｇ１−ｕ５ｄｅｌ、ｇ１−ｄ５ｄｅｌ、ｇ１−ｄ１０ｄｅｌの前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する結合能を示すグラフである。図６において、縦軸は、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔへの結合能を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。図６において、各バーは、左から順に、Ｎ４０、ＲＮＡアプタマーｇ１、小型化ＲＮＡアプタマーｇ１−ｕ１０ｄｅｌ、ｇ１−ｕ５ｄｅｌ、ｇ１−ｄ１０ｄｅｌ、ｇ１−ｄ５ｄｅｌの結果である。【０１３８】
図６に示すように、前記小型化ＲＮＡアプタマーｇ１−ｕ１０ｄｅｌ、ｇ１−ｕ５ｄｅｌ、ｇ１−ｄ１０ｄｅｌ、ｇ１−ｄ５ｄｅｌは、それぞれ、ＲＮＡアプタマーｇ１よりも高い吸光度を示した。この結果から、前記ＲＮＡアプタマーｇ１を小型化することにより、よりｃ−Ｍｅｔに対する結合能が向上することがわかった。【０１３９】
［実施例４］
前記ＲＮＡアプタマーｇ１（配列番号３９）を、小型化したアプタマーを作製し、ｃ−Ｍｅｔに対する結合能を確認した。【０１４０】
（１）ＲＮＡアプタマー
図１に、前記ＲＮＡアプタマーｇ１の推定二次構造の概略図を示す。前記小型化ＲＮＡアプタマーは、前記ＲＮＡアプタマーｇ１の配列において、５’側の４塩基目から２３塩基目（２０塩基長）を欠失するｇ１−ｕ２０ｄｅｌおよび５’側の４塩基目から２３塩基目（２０塩基長）および３’側の１塩基目から１４塩基目（１４塩基長）を欠失するｇ１−ｔｒＡを作製した。これらの小型化アプタマーの配列を下記表４に示す。【０１４１】
【表４】
2012014890.tif 000006
【０１４２】
前記小型化ＲＮＡアプタマーを使用した以外は、前記実施例１と同様にして、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する前記ＲＮＡアプタマーの結合能を確認した。また、前記ＲＮＡアプタマーｇ１についても、同様に結合能を確認した。比較例として、前記Ｎ４０を使用し、同様にして結合能を確認した。【０１４３】
これらの結果を、図７に示す。図７は、前記小型化アプタマーｇ１−ｔｒＡおよびｇ１−ｕ２０ｄｅｌの前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する結合能を示すグラフである。図７において、縦軸は、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔへの結合能を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。図７において、各バーは、左から順に、Ｎ４０、ＲＮＡアプタマーｇ１、小型化ＲＮＡアプタマーｇ１−ｔｒＡ、ｇ１−ｕ２０ｄｅｌの結果である。【０１４４】
図７に示すように、前記小型化ＲＮＡｇ１−ｔｒＡおよびｇ１−ｕ２０ｄｅｌは、それぞれ、ＲＮＡアプタマーｇ１よりも高い吸光度を示した。この結果から、前記ＲＮＡアプタマーｇ１を小型化することにより、よりｃ−Ｍｅｔに対する結合能が向上することがわかった。【０１４５】
［実施例５］
ＲＮＡアプタマーｇ１−ｔｒＡ（配列番号８６）をさらに小型化したＲＮＡアプタマーを作製し、各ＲＮＡアプタマーについて、ｃ−Ｍｅｔに対する結合能を確認した。【０１４６】
（１）ＲＮＡアプタマー
図８に、前記ＲＮＡアプタマーｇ１−ｔｒＡの推定二次構造の概略図を示す。前記小型化ＲＮＡアプタマーは、前記ＲＮＡアプタマーｇ１−ｔｒＡの配列において、５’側の４塩基目および３’末端の１塩基目を欠失するｇ１−ｍｉｎｉＡ、５’側の４塩基目から５塩基目（２塩基長）および３’側の１塩基目から２塩基目（２塩基長）を欠失するｇ１−ｍｉｎｉＢ、５’側の４塩基目から６塩基目（３塩基長）および３’側の１塩基目から３塩基目（３塩基長）を欠失するｇ１−ｍｉｎｉＣを作製した。図８に示すように、前記ＲＮＡアプタマーｇ１−ｔｒＡから、前記ＲＮＡアプタマーｇ１−ｍｉｎｉＡは、ステム領域の１塩基対を欠失させ、前記ＲＮＡアプタマーｇ１−ｍｉｎｉＢは、ステム領域の２塩基対を欠失させ、前記ＲＮＡアプタマーｇ１−ｍｉｎｉＣは、ステム領域の３塩基対を欠失させた。これらの塩基配列を下記表５に示す。【０１４７】
【表５】
2012014890.tif 000007
【０１４８】
これらの小型化ＲＮＡアプタマーを使用し、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する前記ＲＮＡアプタマーの結合能を確認した。前記結合能の解析には、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘ（ＧＥヘルスケア社製）を、その使用説明書にしたがって使用し、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔ濃度は、１７５ｎｍｏｌ／Ｌとした。また、前記ＲＮＡアプタマーｇ１およびｇ１−ｔｒＡについても、同様に結合能を確認した。比較例として、前記Ｎ４０を使用し、同様にして結合能を確認した。【０１４９】
これらの結果を、図９に示す。図９は、前記小型化アプタマーの前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する結合能を示すグラフである。図９において、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。【０１５０】
図９に示すように、前記小型化ＲＮＡは、それぞれ、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する結合能を示した。中でも、ｇ１−ｍｉｎｉＡは、優れた結合能を示した。前記ｇ１−ｔｒＡ、ｇ１-ｍｉｎｉＡおよびｇ１−ｍｉｎｉＢの解離定数（ＫＤ）は、それぞれ、８．１８×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、７．９８×１０−９ｍｏｌ／Ｌ、２．６４×１０−８ｍｏｌ／Ｌであり、結合能に優れることがわかった。【０１５１】
［実施例６］
以下に示すＲＮＡアプタマーを作製し、各ＲＮＡアプタマーについて、ｃ−Ｍｅｔに対する結合能を確認した。【０１５２】
（１）ＲＮＡアプタマー
ｇ１（＃６：配列番号３９）、ｇ２８（＃５６：配列番号６６）、ｇ６（＃１８：配列番号４４）、ｇ２１（＃２５：配列番号５９）、ｇ３４（＃７３：配列番号７２）、ｇ３７（＃７１：配列番号７５）、ｇ５（＃２０：配列番号４３）、ｇ７（＃３２：配列番号４５）、ｇ２５（＃５１：配列番号６３）
ｇ２（＃２８：配列番号４０）、ｇ３３（＃６４：配列番号７１）、ｇ２７（＃４３：配列番号６５）、ｇ２０（＃３５：配列番号５８）、ｇ１１（＃２１：配列番号４９）、ｇ３５（＃６３：配列番号７３）、ｇ２３（＃４４：配列番号６１）、ｇ１５（＃３９：配列番号５３）、ｇ１４（＃２３：配列番号５２）、ｇ１７（＃２６：配列番号５５）、ｇ１３（＃１４：配列番号５１）
ｇ４（＃１６：配列番号４２）、ｇ３１（＃９５：配列番号６９）、ｇ２９（＃４９：配列番号６７）、ｇ１９（＃２７：配列番号５７）、ｇ９（＃８：配列番号４７）、ｇ１０（＃１：配列番号４８）、ｇ８（＃３３：配列番号４６）、ｇ３２（＃８８：配列番号７０）、ｇ３０（＃７０：配列番号６８）
ｇ３（＃４７：配列番号４１）、ｇ１６（＃２４：配列番号５４）、ｇ２６（＃６５：配列番号６４）、ｇ３６（＃８７：配列番号７４）、ｇ３８（＃５０：配列番号７６）、ｇ１８（＃１７：配列番号５６）、ｇ２２（＃３０：配列番号６０）、ｇ１２（＃３６：配列番号５０）、ｇ２４（＃８９：配列番号６２）【０１５３】
前記ＲＮＡアプタマーを使用した以外は、前記実施例５と同様にして、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する前記ＲＮＡアプタマーの結合能を確認した。前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔ濃度は、１００ｎｍｏｌ／Ｌとし、チップへの前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔの導入開始を０秒とし、６０秒後からバッファーを導入した。前記比較例は、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに特異的な結合を示さないＲＮＡをネガティブコントロールとして使用し、同様にして結合能を確認した。【０１５４】
これらの結果を、図１１に示す。図１１は、前記ＲＮＡアプタマーの前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する結合能を示すグラフである。図１１において、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示す。前記シグナル値は、前記バッファーを導入した６０秒の値である。図１１に示すように、いずれのＲＮＡアプタマーも結合力を示した。なお、いずれのＲＮＡアプタマーも、６０秒以後においても、同等のシグナル値を維持しており、結合能の減少が見られないことは確認済みである。【０１５５】
［実施例７］
以下に示す修飾化ＲＮＡアプタマーを作製し、各ＲＮＡアプタマーについて、ｃ−Ｍｅｔに対する結合能を確認した。【０１５６】
（１）修飾化ＲＮＡアプタマー
前記２’−フルオロ−ＣＴＰおよび前記２’−フルオロ−ＵＴＰを用いて、前記実施例６に示すＲＮＡアプタマーと同じ塩基配列からなるフルオロ化ＲＮＡアプタマーを合成した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、前記塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。【０１５７】
前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーを使用した以外は、前記実施例５と同様にして、前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する前記ＲＮＡアプタマーの結合能を確認した。前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔ濃度は、６０ｎｍｏｌ／Ｌとし、チップへの前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔの導入開始を０秒とし、６０秒後からバッファーを導入した。前記比較例は、前記実施例６と同じネガティブコントロールを使用した。【０１５８】
これらの結果を、図１２に示す。図１２は、前記ＲＮＡアプタマーの前記ｒｅｃ−ｃＭｅｔに対する結合能を示すグラフである。図１２において、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示す。前記シグナル値は、前記バッファーを導入した６０秒の値である。図１２に示すように、いずれのＲＮＡアプタマーも結合力を示した。中でも、フルオロ化したｇ２９（＃４９）、ｇ３８（＃５０）およびｇ２５（＃５１）、特にｇ３８（＃５０）が優れた結合能を示した。フルオロ化によって、ＲＮａｓｅ耐性が付与され、且つ、ｃ−Ｍｅｔへの結合力も維持していることから、これらのフルオロ化ＲＮＡアプタマーは、特に、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用に適していることがわかる。なお、いずれのＲＮＡアプタマーも、６０秒以後においても、同等のシグナル値を維持しており、結合能の減少が見られないことは確認済みである。【０１５９】
［実施例８］
修飾化ＲＮＡアプタマーが細胞移動に与える影響を確認した。【０１６０】
（１）修飾化ＲＮＡアプタマー
前記２’−フルオロ−ＣＴＰおよび前記２’−フルオロ−ＵＴＰを用いて、前記実施例７と同様にして、ｇ３８（＃５０）の塩基配列からなるフルオロ化ＲＮＡアプタマーを合成した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、前記塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。【０１６１】
（２）細胞移動の確認
市販のセルカルチャーインサート（商品名セルカルチャーインサート、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）を使用して、その使用説明書にしたがって、ヒトのグリオーマ細胞由来Ｔ９８Ｇ株の細胞移動を確認した。具体的には、まず、Ｔ９８Ｇ株を、貧栄養条件である０．１％ＢＳＡ含有無血清培地を用いて、３７℃で４８時間培養した。そして、インサートの下部に、培地を入れ、培養後のＴ９８Ｇ株を、前記インサートのメンブラン（ポアサイズ８μｍ）上に捲き、３７℃で１６時間培養した。培養後、前記メンブレンを通過して前記メンブレンの裏側に移動した細胞数をカウントした。前記培地は、５０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦおよび１μｇ／ｍＬ  修飾化ＲＮＡアプタマーを含む０．１％ＢＳＡ含有無血清培地（ＨＧＦ＋修飾化ｇ３８）を使用した。また、比較例として、前記ＨＧＦのみを含む培地（ＨＧＦ）、前記ＨＧＦおよび１μｇ／ｍＬ  コントロールＲＮＡを含む培地（ＨＧＦ＋ｃｏｎｔｒｏｌ）を使用し、コントロールとして、前記ＨＧＦおよび修飾化ＲＮＡアプタマー未添加の培地（−）を使用した。前記コントロールＲＮＡは、前記実施例６と同じネガティブコントロールＲＮＡを使用した。【０１６２】
これらの結果を、図１３に示す。図１３は、前記修飾化ＲＮＡ存在下における、Ｔ９８Ｇ株の移動を示すグラフであり、縦軸は、前記メンブレンを通過して裏側に移動した細胞数の割合を示す。前記割合は、ＨＧＦおよび修飾化ＲＮＡアプタマー未添加の培地（−）において移動した細胞数を１として算出した。【０１６３】
図１３に示すように、ＨＧＦ未添加の培地（−）では、細胞移動はほとんどみられなかったが、ＨＧＦ添加培地（ＨＧＦ）では、細胞移動が促進された。これに対して、前記修飾化ＲＮＡアプタマー添加した培地（ＨＧＦ＋修飾化ｇ３８）では、細胞の移動が抑制された。なお、ネガティブコントロールＲＮＡを添加した場合（ＨＧＦ＋ｃｏｎｔｒｏｌ）では、細胞移動の抑制は起こらなかった。このように、ｉｎ ｖｉｖｏと同様の状態である前記セルカルチャーインサートにおいて、前記修飾化ＲＮＡアプタマーの添加により、細胞の移動が抑制されたことから、本発明のＲＮＡアプタマーによれば、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても同様に、細胞の移動および浸潤を抑制できるといえる。【０１６４】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【０１６５】
この出願は、２０１０年７月２６日に出願された日本出願特願２０１０−１６７３４２を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、ｃ−Ｍｅｔに結合可能である。このため、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子によれば、例えば、ｃ−Ｍｅｔと結合してその機能を阻害することより、ｃ−Ｍｅｔが原因となる前述のような疾患の予防および治療が可能となる。また、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子によれば、例えば、ｃ−Ｍｅｔとの結合の有無を確認することで、ｃ−Ｍｅｔを検出でき、疾患の早期診断が可能となる。また、例えば、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を培養細胞内で発現させることで、遺伝子転写の阻害実験が可能となる、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子を使用して、細胞外のｃ−Ｍｅｔとその受容体との結合阻害実験が可能となる等、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、ｃ−Ｍｅｔの機能解明にも使用できる。このため、本発明のｃ−Ｍｅｔ結合核酸分子は、新たな研究用ツールとしても有用である。
【図１】
2012014890.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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