(57)【要約】  本発明は、癌細胞の存否を判定可能な新規分子マーカーを用いて、生体試料から抽出したDNAのメチル化状態を解析し、その解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法に関する。
2011105570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した生体試料からDNAを抽出する工程と、
抽出工程で得られたDNAについて、配列番号１〜１４の塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態を解析する工程と、
解析工程で得られた解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する工程と
を含む、生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法。
【請求項２】
CpG部位が、
配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3〜7、9〜26および28〜54番目のCpG部位、
配列番号２の塩基配列の5'末端側から1〜11、13〜23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40〜44、46〜49、51〜57、59〜66、68、70〜73、75、76、78および79番目のCpG部位、
配列番号３の塩基配列の5'末端側から1〜10および12番目のCpG部位、
配列番号４の塩基配列の5'末端側から1〜3番目のCpG部位、
配列番号５の塩基配列の5'末端側から1〜4番目のCpG部位、
配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
配列番号７の塩基配列の5'末端側から1〜7および9〜52番目のCpG部位、
配列番号８の塩基配列の5'末端側から1〜16、18〜25および27〜39番目のCpG部位、
配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7〜11および13〜23番目のCpG部位、
配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1〜6、8および10番目のCpG部位、
配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1〜3、5〜11、13、15〜19および21〜23番目のCpG部位、
配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1〜6、8、10〜22、25〜28および32番目のCpG部位、
配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1〜3、7〜13、15および19番目のCpG部位、ならびに
配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1〜4、14〜16、18、19、21および22番目のCpG部位
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
解析工程が、複数のCpG部位のメチル化状態を解析する工程である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
解析工程が、CpG部位のメチル化の有無を解析する工程である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
判定工程が、解析工程においてメチル化されたCpG部位が有るという結果が得られた場合に、生体試料中に癌細胞が存在すると判定する工程である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
解析工程が、CpG部位のメチル化の頻度を解析する工程である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
判定工程が、解析工程においてメチル化の頻度が所定の閾値より高いという結果が得られた場合に、生体試料中に癌細胞が存在すると判定する工程である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
解析工程が、抽出工程で得られたDNAに含まれるメチル化されたDNAを免疫沈降により濃縮し、該濃縮されたメチル化DNAのメチル化状態を解析する工程である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１〜１４の塩基配列に存在するCpG部位から少なくとも１つ選択される、メチル化状態の解析を用いた癌細胞の存否の判定用分子マーカー。
【請求項１０】
CpG部位が、
配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3〜7、9〜26および28〜54番目のCpG部位、
配列番号２の塩基配列の5'末端側から1〜11、13〜23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40〜44、46〜49、51〜57、59〜66、68、70〜73、75、76、78および79番目のCpG部位、
配列番号３の塩基配列の5'末端側から1〜10および12番目のCpG部位、
配列番号４の塩基配列の5'末端側から1〜3番目のCpG部位、
配列番号５の塩基配列の5'末端側から1〜4番目のCpG部位、
配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
配列番号７の塩基配列の5'末端側から1〜7および9〜52番目のCpG部位、
配列番号８の塩基配列の5'末端側から1〜16、18〜25および27〜39番目のCpG部位、
配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7〜11および13〜23番目のCpG部位、
配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1〜6、8および10番目のCpG部位、
配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1〜3、5〜11、13、15〜19および21〜23番目のCpG部位、
配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1〜6、8、10〜22、25〜28および32番目のCpG部位、
配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1〜3、7〜13、15および19番目のCpG部位、ならびに
配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1〜4、14〜16、18、19、21および22番目のCpG部位
から選択される、請求項９に記載の判定用分子マーカー。
【請求項１１】
被験者から採取した生体試料から抽出したDNAに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と、
配列番号１〜１４の塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態をメチル化特異的PCR法により確認するためのプライマーセットと
を含む、生体試料中の癌細胞の存否の判定用キット。
【請求項１２】
CpG部位が、
配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3〜7、9〜26および28〜54番目のCpG部位、
配列番号２の塩基配列の5'末端側から1〜11、13〜23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40〜44、46〜49、51〜57、59〜66、68、70〜73、75、76、78および79番目のCpG部位、
配列番号３の塩基配列の5'末端側から1〜10および12番目のCpG部位、
配列番号４の塩基配列の5'末端側から1〜3番目のCpG部位、
配列番号５の塩基配列の5'末端側から1〜4番目のCpG部位、
配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
配列番号７の塩基配列の5'末端側から1〜7および9〜52番目のCpG部位、
配列番号８の塩基配列の5'末端側から1〜16、18〜25および27〜39番目のCpG部位、
配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7〜11および13〜23番目のCpG部位、
配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1〜6、8および10番目のCpG部位、
配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1〜3、5〜11、13、15〜19および21〜23番目のCpG部位、
配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1〜6、8、10〜22、25〜28および32番目のCpG部位、
配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1〜3、7〜13、15および19番目のCpG部位、ならびに
配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1〜4、14〜16、18、19、21および22番目のCpG部位
から選択される、請求項１１に記載の判定用キット。
【請求項１３】
プライマーセットが、
配列番号２８および配列番号２９の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号３０および配列番号３１の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号３２および配列番号３３の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号３４および配列番号３５の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号３６および配列番号３７の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号３８および配列番号３９の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号４０および配列番号４１の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号４２および配列番号４３の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号４４および配列番号４５の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号４６および配列番号４７の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号４８および配列番号４９の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号５０および配列番号５１の塩基配列であるプライマーセット、ならびに
配列番号５２および配列番号５３の塩基配列であるプライマーセット
から少なくとも１つ選択される、請求項１１または１２に記載の判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法に関する。より詳細には、生体試料から抽出したDNAについて、所定の塩基配列のCpG部位のメチル化状態を解析し、その解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法に関する。
また、本発明は、その方法に用いられる判定用分子マーカーおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
高等真核生物の染色体DNAでは、DNAを構成する塩基のうちC（シトシン）の５位がメチル化されることが知られている。このようなDNAのメチル化は、遺伝子発現の制御機構として機能している。例えば、ある遺伝子のプロモーター領域に存在する、CpG配列に富む領域（「CpGアイランド」または「CG島」とも呼ばれる）がメチル化されている場合、その遺伝子の転写は抑制される。この現象は、「遺伝子のサイレンシング」とも呼ばれる。これに対して、CpGアイランドがメチル化されていない場合、転写因子がプロモーターに結合できるので、遺伝子の転写が可能となる。【０００３】
このように、DNAのメチル化は、遺伝子発現の制御機構の１つである。そのため、DNAのメチル化は、初期胚発生、組織特異的な遺伝子の発現、哺乳動物に特徴的な現象である遺伝子刷り込みやX染色体の不活性化、染色体の安定化、DNA複製のタイミングなど、様々な生理的および病理的な現象に重要な役割を果たしている。【０００４】
さらに近年、DNAのメチル化の異常、すなわち、DNAのメチル化による遺伝子のサイレンシングが、癌などの疾患の発生や進行に関与することが明らかになってきている。それゆえ、種々の遺伝子についてDNAのメチル化状態を解析することにより、癌などの疾患を診断する試みがなされている。例えば、特許文献１には、NPTX2、SARP2、CLDN5などの遺伝子が、正常膵臓細胞ではメチル化されていないが、膵臓癌細胞ではメチル化されていることが記載されており、これらの遺伝子のメチル化状態を解析することにより、膵臓癌を検出する方法が記載されている。また、特許文献２には、BRCA2、PCDH7などの遺伝子のメチル化状態を解析することにより、乳癌の一種である乳房増殖性疾患を検出する方法が記載されている。【０００５】
このように、種々の癌について異常メチル化される遺伝子が多数報告されている。しかしながら、それらの中で癌を検出するための分子マーカーとして用い得るものは少数に過ぎない。
そのため、遺伝子のメチル化解析を利用した癌細胞の検出方法に有用な新規分子マーカーのさらなる開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５２４３６９号公報
【特許文献２】特表２００８−５０６４０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、癌細胞の存否を判定可能な新規分子マーカーを用いて、生体試料から抽出したDNAのメチル化状態を解析し、その解析結果に基づいて、癌細胞の存否を判定する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、その方法に用い得る判定用分子マーカーおよびキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、癌組織および癌細胞株のゲノムDNAのメチル化状態を解析して、DNAのメチル化が、癌組織および癌細胞株に特異的に認められる遺伝子領域を同定した。そして、本発明者らは、これらの遺伝子領域中の所定の塩基配列についてメチル化状態を解析し、得られた解析結果を利用することにより、癌細胞を含む試料と癌細胞を含まない試料とを、高精度に区別できることを見出して、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明によれば、
被験者から採取した生体試料からDNAを抽出する工程と、
抽出工程で得られたDNAについて、配列番号１〜１４の塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態を解析する工程と、
解析工程で得られた解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する工程と
を含む、生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法が提供される。【００１０】
また、本発明によれば、配列番号１〜１４の塩基配列に存在するCpG部位から少なくとも１つ選択される、メチル化状態の解析を用いた癌細胞の存否の判定用分子マーカーが提供される。【００１１】
さらに、本発明によれば、
被験者から採取した生体試料から抽出したDNAに含まれる非メチル化シトシンを他の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤と、
配列番号１〜１４の塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態を、メチル化特異的PCR法により確認するためのプライマーセットと
を含む、生体試料中の癌細胞の存否の判定用キットが提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法（以下、本発明の方法ともいう）によれば、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAについて、本発明の判定用分子マーカーのメチル化状態を解析することにより、該試料中の癌細胞の存否を判定できる。
また、本発明は、その方法に用い得る判定用分子マーカーおよびキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】膵臓癌組織の４サンプルおよび正常膵臓組織の５サンプルから得たDNAにおける、配列番号１の塩基配列の5'末端から数えて1〜54番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。
【図２】膵臓癌組織の５サンプルおよび正常膵臓組織の５サンプルから得たDNAにおける、配列番号２の塩基配列の5'末端から数えて1〜79番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。
【図３】膵臓癌組織の５サンプルおよび正常膵臓組織の４サンプルから得たDNAにおける、配列番号３の塩基配列の5'末端から数えて1〜12番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。
【図４】配列番号１〜３の各塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の頻度を示す棒グラフである。
【図５】膵臓癌組織および正常組織から得たDNAについて、配列番号１５の塩基配列をメチル化特異的PCR（MSP）法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図６】膵臓癌組織および正常組織から得たDNAについて、配列番号１６の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図７】膵臓癌組織および正常膵臓組織から得たDNAについて、配列番号１７の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図８】膵臓癌組織および正常組織から得たDNAについて、配列番号１８の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図９】膵臓癌組織および正常組織から得たDNAについて、配列番号１９の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図１０】大腸組織および乳腺組織から得たDNAについて、配列番号１５の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図１１】乳腺組織から得たDNAについて、配列番号１８の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図１２】乳癌細胞株MCF7の６サンプルおよび正常乳腺上皮細胞株HMECの５サンプルにおける、配列番号７の塩基配列の5'末端から数えて1〜52番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。
【図１３】MCF7細胞の４サンプルおよびHMEC細胞の４サンプルにおける、配列番号８の塩基配列の5'末端から数えて1〜39番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。
【図１４】MCF7細胞の６サンプルおよびHMEC細胞の６サンプルにおける、配列番号９の塩基配列の5'末端から数えて1〜23番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。
【図１５】MCF7細胞の５サンプルおよびHMEC細胞の５サンプルにおける、配列番号１０の塩基配列の5'末端から数えて1〜10番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。
【図１６】MCF7細胞の４サンプルおよびHMEC細胞の４サンプルにおける、配列番号１１の塩基配列の5'末端から数えて1〜23番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。
【図１７】MCF7細胞の６サンプルおよびHMEC細胞の６サンプルにおける、配列番号１２の塩基配列の5'末端から数えて1〜32番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。
【図１８】MCF7細胞の５サンプルおよびHMEC細胞の４サンプルにおける、配列番号１３の塩基配列の5'末端から数えて1〜19番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。
【図１９】MCF7細胞の４サンプルおよびHMEC細胞の４サンプルにおける、配列番号１４の塩基配列の5'末端から数えて1〜24番目のCpG部位のメチル化状態を示す表である。
【図２０】配列番号７〜１４の各塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の頻度を示す棒グラフである。
【図２１】MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２０の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図２２】MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２１の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図２３】MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２２の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図２４】MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２３の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図２５】MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２４の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図２６】MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２５の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図２７】MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２６の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図２８】MCF7細胞およびHMEC細胞から得たDNAについて、配列番号２７の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図２９】乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２０の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図３０】乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２１の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図３１】乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２２の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図３２】乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２３の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図３３】乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２４の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図３４】乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２５の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図３５】乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２６の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図３６】乳癌組織および正常乳腺組織から得たDNAについて、配列番号２７の塩基配列をMSP法により増幅して得られたPCR産物のバンドの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図３７】大腸癌組織および正常大腸組織から得たDNAについて、配列番号１７〜１９、２１、２２および２５〜２７の塩基配列をMSP法により増幅し、得られた反応液をアガロース電気泳動したときの写真である。
【図３８】MCF7細胞、正常心臓組織、正常腎臓組織、正常肝臓組織、正常肺組織および正常抹消血中白血球から得たDNAについて、配列番号２０〜２７の塩基配列をMSP法により増幅し、得られた反応液をアガロース電気泳動したときの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、「CpG部位」とは、塩基配列中のシトシン（C）とグアニン（G）とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った配列の部位を意味する。なお、CpGの「p」の文字は、シトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表わす。
【００１５】
本明細書において、「メチル化状態を解析する」とは、解析対象の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の有無、または該塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の頻度を解析することを意味する。なお、ここでいう解析対象の塩基配列は、配列番号１〜１４の塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列のうち、少なくとも１つのCpG部位を含む領域であれば特に限定されない。
上記の「メチル化の有無」は、解析対象の塩基配列に存在するCpG部位のシトシン残基がメチル化されているか否かを意味する。
また、「メチル化の頻度」は、解析対象の塩基配列に存在する全てのCpG部位の数に対する、メチル化されたCpG部位の数の割合を意味する。なお、本発明においては、配列番号１〜１４の各塩基配列に存在するCpG部位の位置および数は既知であるので、配列番号１〜１４の各塩基配列の中から解析対象の塩基配列を特定すれば、そこに存在するCpG部位の数も予め把握することが可能である。したがって、解析対象の塩基配列におけるメチル化されたCpG部位の数自体もメチル化の頻度として利用できる。
【００１６】
本発明の方法では、まず被験者から採取した生体試料からＤＮＡを抽出する。
この抽出工程において、上記の生体試料は、被験者のDNAを含む試料であれば特に限定されないが、好ましくはゲノムDNAを含む試料、例えば臨床検体を用い得る。臨床検体として具体的には、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、乳頭分泌液、手術や生検により採取した組織および細胞などが挙げられる。
【００１７】
生体試料からのDNAの抽出は、公知の抽出方法により行うことができる。例えば、生体試料と、細胞や組織を可溶化する界面活性剤（例えばコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなど）を含む処理液とを混合し、得られた混合液に物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など）を施して、生体試料に含まれるDNAを該混合液中に遊離させることによって行うことができる。この場合、該溶液を遠心分離して細胞破片を沈殿させた後、DNAを含む上清を回収し、この上清を次の解析工程に用いることが好ましい。さらに、得られた上清を、公知の方法により精製してもよい。なお、生体試料からのDNAの抽出および精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。
【００１８】
上記の抽出工程は、抽出したDNAを断片化する工程をさらに含むことが好ましい。そのような工程により、DNAを適当な長さに断片化しておけば、後述するメチル化DNA免疫沈降（MeDIP）法および非メチル化シトシン変換処理を効率よく行うことができる。
DNAの断片化は、超音波処理、アルカリ処理、制限酵素処理などにより行うことができる。例えば、水酸化ナトリウムを用いてアルカリ処理を行なう場合は、DNA溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度0.1〜1.0 Ｎとなるよう添加し、10〜40℃で5〜15分間インキュベーションすることによりDNAを断片化できる。また、制限酵素処理を行う場合、制限酵素はDNAの塩基配列に基づいて適宜選択でき、例えばMseIやBamHIなどを用い得る。
【００１９】
次いで、本発明の方法では、生体試料から抽出したDNAについて、配列番号１〜１４の塩基配列から選択される少なくとも１つの塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態を解析する。
【００２０】
上記の配列番号１〜１４の塩基配列は、いずれもヒトゲノムDNAの一領域である。より具体的には、これらの塩基配列はそれぞれ、以下の表１に示される遺伝子領域またはその付近の塩基配列領域の一部である。なお、これらの塩基配列自体は公知であり、例えば米国国立医学図書館の国立生物情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）により提供されるデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）などの公知のデータベースから知ることができる。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
この解析工程では、解析対象のCpG部位は、以下に示すものから選択されることが好ましい：
配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3〜7、9〜26および28〜54番目のCpG部位、
配列番号２の塩基配列の5'末端側から1〜11、13〜23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40〜44、46〜49、51〜57、59〜66、68、70〜73、75、76、78および79番目のCpG部位、
配列番号３の塩基配列の5'末端側から1〜10および12番目のCpG部位、
配列番号４の塩基配列の5'末端側から1〜3番目のCpG部位、
配列番号５の塩基配列の5'末端側から1〜4番目のCpG部位、
配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
配列番号７の塩基配列の5'末端側から1〜7および9〜52番目のCpG部位、
配列番号８の塩基配列の5'末端側から1〜16、18〜25および27〜39番目のCpG部位、
配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7〜11および13〜23番目のCpG部位、
配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1〜6、8および10番目のCpG部位、
配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1〜3、5〜11、13、15〜19および21〜23番目のCpG部位、
配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1〜6、8、10〜22、25〜28および32番目のCpG部位、
配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1〜3、7〜13、15および19番目のCpG部位、ならびに
配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1〜4、14〜16、18、19、21および22番目のCpG
部位。
【００２３】
上記の解析工程は、配列番号１〜１４の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の有無を解析する工程であってもよい。
この場合、解析対象のCpG部位は１つであってもよいが、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のCpG部位のメチル化の有無を解析することが好ましい。なお、複数のCpG部位は、１つの塩基配列中から選択してもよく、複数の塩基配列のそれぞれの中から選択してもよい。
【００２４】
また、上記の解析工程は、配列番号１〜１４の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の頻度を解析する工程であってもよい。
この場合、解析対象の塩基配列はCpG部位を１つしか含んでいなくてもよいが、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のCpG部位を含む塩基配列を解析対象とすることが好ましい。また、解析対象の塩基配列は、上記の配列番号１〜１４の塩基配列のうちのいずれか１つであってもよいが、好ましくは複数の塩基配列である。
【００２５】
メチル化状態を解析する方法としては、種々の方法が公知である。本発明の方法では、いずれの解析方法を用いるかは特に限定されないが、メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程と、DNAを増幅する工程と、メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程とを含むことが好ましい。
【００２６】
メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程としては、メチル化感受性制限酵素処理、MeDIP法、非メチル化シトシン変換処理などを行う工程が挙げられる。
DNAを増幅する工程としては、PCR増幅法、定量的PCR増幅法、IVT（in vitro transcription）増幅法、SPIA（商標）増幅法などを行う工程が挙げられる。
メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程としては、電気泳動法、シークエンス解析法、マイクロアレイ解析法、質量分析法、サザンハイブリダイゼーションなどを行う工程が挙げられる。
【００２７】
MeDIP法とは、抗メチル化シトシン抗体もしくは抗メチル化シチジン抗体、またはメチル化DNA結合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫沈降により、生体試料に含まれるメチル化DNAを濃縮する方法である。本発明の方法の解析工程では、上記の抽出工程で得られたDNAに含まれるメチル化DNAをMeDIP法により濃縮し、この濃縮されたメチル化DNAのメチル化状態を解析する工程であってもよい。
また、MeDIP法により濃縮したメチル化DNAを、IVT増幅法などにより増幅し、得られた増幅産物について、マイクロアレイを用いてメチル化状態を解析できる。このような解析方法は、MeDIP on chip法と呼ばれる。
【００２８】
非メチル化シトシン変換処理とは、生体試料から抽出したDNAと非メチル化シトシン変換剤とを反応させることにより、該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基（ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン）に変換する処理のことである。
ここで、非メチル化シトシン変換剤とは、DNAと反応して該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基（ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン）に変換できる物質である。このような非メチル化シトシン変換剤としては、例えば亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの亜硫酸水素塩（バイサルファイト）が好適に用いられる。
バイサルファイトを用いる処理では、DNA中の非メチル化シトシンは、脱アミノ化反応によりウラシルに変換されるが、メチル化シトシンには、このような塩基の変換が起こらない。
したがって、DNAのメチル化状態の違いは、バイサルファイトを用いる非メチル化シトシン変換処理によって、塩基配列の違い（CおよびU）に変換される。なお、バイサルファイトによる非メチル化シトシン変換処理は、バイサルファイト処理と呼ばれる。
【００２９】
バイサルファイト処理を行なう場合、バイサルファイトの添加量（濃度）は、DNA中の非メチル化シトシンを十分に変換できる程度であれば特に限定されないが、例えば、試料中の終濃度として1 M以上、好ましくは1〜15 M、より好ましくは3〜10 Mである。また、生体試料にバイサルファイトを添加した後のインキュベーションの条件（温度および時間）は、バイサルファイトの添加量に応じて適宜設定できるが、例えば、バイサルファイトを終濃度6 Mで添加した場合、50〜80℃で10〜90分間インキュベーションする。
【００３０】
DNAのメチル化状態は、バイサルファイト処理後のDNAをシークエンス解析して、本来の塩基配列との違いを検出することにより解析できる。この方法は、バイサルファイトシークエンス法と呼ばれる。
【００３１】
また、DNAのメチル化状態は、バイサルファイト処理後のDNAを、後述するプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、PCR産物の有無を確認することによっても解析することができる。このような解析方法は、メチル化特異的PCR（MSP）法と呼ばれる。
【００３２】
上記のMSP法には、解析対象のCpG部位のシトシンがメチル化されている（すなわち、シトシンがウラシルに変換されていない）塩基配列は増幅できるが、CpG部位のシトシンがメチル化されていない（すなわち、該シトシンがウラシルに変換されている）塩基配列は増幅できないプライマーセットを用いる。このようなプライマーセットを用いるMSP法では、PCR産物が存在することにより、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
また、MSP法は、解析対象のCpG部位のシトシンがウラシルに変換されていない塩基配列は増幅できないが、CpG部位のシトシンがウラシルに変換されている塩基配列は増幅できるプライマーセットを用いて行なうこともできる。この場合、PCR産物が存在しないことにより、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
【００３３】
上記のプライマーセットに含まれる各プライマーは、解析対象のCpG部位を含む塩基配列に応じて当業者が適宜設計できるが、プライマーの3'末端またはその付近に、解析対象のCpG部位のシトシンを含むように設計することが好ましい。
【００３４】
本発明の方法の解析工程においては、マイクロアレイを用いてメチル化状態を解析することもできる。この場合、解析用マイクロアレイは、配列番号１〜１４の塩基配列に相補的な核酸プローブ１種以上を、基板上に固定して作製できる。なお、このようなマイクロアレイは、当該技術において公知の方法により作製できる。
【００３５】
マイクロアレイによる解析では、生体試料から抽出したDNAは、当該技術において公知の標識物質により標識されていることが好ましい。よって、本発明の方法は、抽出したDNAを標識する工程をさらに含むことが好ましい。この標識工程は、生体試料中の全てのDNAを標識できるので、上記のDNA増幅工程の後に行われるのが有利である。なお、標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。また、蛍光物質としては、Cy3、Cy5、Alexa Fluor（商標）、FITCなどが挙げられる。
このようにDNAを標識することにより、マイクロアレイ上のプローブからのシグナルの測定が容易になる。なお、DNAをこれらの標識物質で標識する方法は、当該技術において公知である。
【００３６】
上記のシグナルは、マイクロアレイの種類に応じて適切なシグナルであり得る。例えば、シグナルは、マイクロアレイの各プローブとハイブリダイズしたDNA断片が存在する場合に発生する電気的シグナルであってもよいし、上記のように解析対象のDNAが標識されている場合は、標識物質から生じる蛍光、発光などのシグナルであってもよい。
シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。スキャナーとしては、例えば、GeneChip（登録商標）Scanner3000 7G（Affymetrix社）などが挙げられる。
【００３７】
本発明の方法では、上記の解析工程で得られた解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する。
この判定工程では、解析工程においてメチル化されたCpG部位が有るという結果が得られた場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得る。反対に、メチル化されたCpG部位が無いという結果が得られた場合に、該生体試料中に癌細胞が存在しないと判定し得る。
なお、上記の判定は、１つのCpG部位の解析結果から行ってもよいが、判定精度を向上させるために、複数のCpG部位の解析結果から判定することが好ましい。
【００３８】
また、上記の判定工程では、解析工程においてメチル化の頻度が所定の閾値より高いという結果が得られた場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得る。反対に、メチル化の頻度が所定の閾値より低いという結果が得られた場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在しないと判定し得る。
なお、上記の閾値は、次のようにして設定できる。まず、癌細胞を含まないことが予め確認されている生体試料（正常組織または正常細胞）、および癌細胞を含む生体試料から抽出したDNAについて、メチル化の頻度を解析する。次いで、得られた解析結果に基づいて、癌細胞を含まない生体試料のメチル化の頻度よりも高く、癌細胞を含む生体試料のそれよりも低い範囲から、閾値を設定する。好ましくは、癌細胞を含まない生体試料と癌細胞を含む生体試料とを高精度に区別し得る値を、閾値として設定する。
【００３９】
上記の本発明の方法に用いる癌細胞の存否の判定用分子マーカー（以下、「本発明の分子マーカー」ともいう）も、本発明の１つである。
本発明の分子マーカーは、配列番号１〜１４の塩基配列に存在するCpG部位から少なくとも１つ選択される。
【００４０】
また、本発明の分子マーカーは、以下に示すCpG部位から選択されることが好ましい：
配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3〜7、9〜26および28〜54番目のCpG部位、
配列番号２の塩基配列の5'末端側から1〜11、13〜23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40〜44、46〜49、51〜57、59〜66、68、70〜73、75、76、78および79番目のCpG部位、
配列番号３の塩基配列の5'末端側から1〜10および12番目のCpG部位、
配列番号４の塩基配列の5'末端側から1〜3番目のCpG部位、
配列番号５の塩基配列の5'末端側から1〜4番目のCpG部位、
配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
配列番号７の塩基配列の5'末端側から1〜7および9〜52番目のCpG部位、
配列番号８の塩基配列の5'末端側から1〜16、18〜25および27〜39番目のCpG部位、
配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7〜11および13〜23番目のCpG部位、
配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1〜6、8および10番目のCpG部位、
配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1〜3、5〜11、13、15〜19および21〜23番目のCpG部位、
配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1〜6、8、10〜22、25〜28および32番目のCpG部位、
配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1〜3、7〜13、15および19番目のCpG部位、ならびに
配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1〜4、14〜16、18、19、21および22番目のCpG
部位。
【００４１】
また、上記の本発明の方法を実行するための生体試料中の癌細胞の存否の判定用キット（以下、「本発明のキット」ともいう）も本発明の１つである。
本発明のキットは、非メチル化シトシン変換剤と、配列番号１〜１４の塩基配列に存在する少なくとも１つのCpG部位のメチル化状態をメチル化特異的PCRにより確認するためのプライマーセットとを含む。
【００４２】
本発明のキットに含まれる非メチル化シトシン変換剤は、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAと反応して、該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基（ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン）に変換できる物質であれば特に限定されないが、好ましくはバイサルファイトである。なお、非メチル化シトシン変換剤は、溶液の形態にあってもよく、用時に適切な溶媒に溶解して液体にし得る固体の形態にあってもよい。
【００４３】
本発明のキットを用いる場合、MSP法により確認されるCpG部位は、以下に示すものから選択されることが好ましい：
配列番号１の塩基配列の5'末端側から1、3〜7、9〜26および28〜54番目のCpG部位、
配列番号２の塩基配列の5'末端側から1〜11、13〜23、25、26、28、29、31、32、34、35、38、40〜44、46〜49、51〜57、59〜66、68、70〜73、75、76、78および79番目のCpG部位、
配列番号３の塩基配列の5'末端側から1〜10および12番目のCpG部位、
配列番号４の塩基配列の5'末端側から1〜3番目のCpG部位、
配列番号５の塩基配列の5'末端側から1〜4番目のCpG部位、
配列番号６の塩基配列の5'末端側から1および2番目のCpG部位、
配列番号７の塩基配列の5'末端側から1〜7および9〜52番目のCpG部位、
配列番号８の塩基配列の5'末端側から1〜16、18〜25および27〜39番目のCpG部位、
配列番号９の塩基配列の5'末端側から1、2、4、7〜11および13〜23番目のCpG部位、
配列番号１０の塩基配列の5'末端側から1〜6、8および10番目のCpG部位、
配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1〜3、5〜11、13、15〜19および21〜23番目のCpG部位、
配列番号１２の塩基配列の5'末端側から1〜6、8、10〜22、25〜28および32番目のCpG部位、
配列番号１３の塩基配列の5'末端側から1〜3、7〜13、15および19番目のCpG部位、ならびに
配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1〜4、14〜16、18、19、21および22番目のCpG
部位。
【００４４】
より好ましくは、MSP法により確認されるCpG部位は、以下に示すものから選択される：
配列番号１の塩基配列の5'末端側から9、10および28〜30番目のCpG部位、
配列番号２の塩基配列の5'末端側から4〜7番目のCpG部位、
配列番号３の塩基配列の5'末端側から6および9番目のCpG部位、
配列番号７の塩基配列の5'末端側から3、4、11および12番目のCpG部位。
配列番号８の塩基配列の5'末端側から8、9および14〜16番目のCpG部位、
配列番号９の塩基配列の5'末端側から15、16および22番目のCpG部位、
配列番号１０の塩基配列の5'末端側から2および6番目のCpG部位、
配列番号１１の塩基配列の5'末端側から1〜3および10番目のCpG部位、
配列番号１２の塩基配列の5'末端側から10、11および16〜19番目のCpG部位、
配列番号１３の塩基配列の5'末端側から7、8および15番目のCpG部位、ならびに
配列番号１４の塩基配列の5'末端側から1、2および4番目のCpG部位。
【００４５】
本発明のキットに含まれるプライマーセットは、以下から選択されることが好ましい：
配列番号２８および配列番号２９の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号３０および配列番号３１の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号３２および配列番号３３の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号３４および配列番号３５の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号３６および配列番号３７の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号３８および配列番号３９の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号４０および配列番号４１の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号４２および配列番号４３の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号４４および配列番号４５の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号４６および配列番号４７の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号４８および配列番号４９の塩基配列であるプライマーセット、
配列番号５０および配列番号５１の塩基配列であるプライマーセット、ならびに
配列番号５２および配列番号５３の塩基配列であるプライマーセット。
【００４６】
上記のプライマーセットは、配列番号１〜１４の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の有無をMSP法で解析することにより、本発明の方法を行なう場合に好適に用いられる。
【００４７】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例１    膵臓癌組織のゲノムDNAからの新規マーカーの同定
ヒト膵臓癌組織およびヒト正常膵臓組織のゲノムDNAを、マイクロアレイを用いて解析することにより、膵臓癌組織のゲノムDNAに特異的にメチル化が認められる遺伝子領域の探索を行った。
なお、実施例１での具体的な操作手順は、使用したキットおよび試薬類に添付のマニュアルの記載に従って行った。【００４９】
１．MeDIP法によるメチル化DNAの調製
ヒト膵臓癌組織およびヒト正常膵臓組織を生体試料として用いて、これらからゲノムDNAを抽出した。抽出した各ゲノムDNA（４μg）を、制限酵素MseI（NEB社）と37℃で一晩反応させて、300〜1000 bpに断片化した。次いで、これらを95℃で10分間加熱して変性させた後、４℃まで急冷して、一本鎖DNA断片を得た。
得られた一本鎖DNA断片をChromatin Immunoprecipitationアッセイキット（Upstate biotechnology社）の希釈用緩衝液（302μl）で希釈した。次いで、得られた各希釈液にProteinG Sepharoseビーズ（68μl：GE Healthcare社）を添加し、４℃で１時間ローテーションした後、遠心分離することにより、該ビーズに非特異的に結合するタンパク質などを除いた（以下、プレクリアー処理ともいう）。そして、各上清を回収した後、これらをそれぞれ二等分して別々のチューブに移して、一方に抗メチル化シトシン抗体BI-MECY-0500（10μg：Eurogentec社）を添加し、他方には該抗体を添加せず、それぞれ検体試料および対照試料（Input）とした。そして、各検体試料を４℃で一晩ローテーションした後、ProteinG Sepharose ビーズ（68μl：GE Healthcare社）を添加し、さらに４℃で１時間ローテーションした。その後、これらを遠心分離して、上清を除いてビーズを回収した。得られたビーズを上記のキットの洗浄用緩衝液で洗浄した後、該ビーズに溶出用緩衝液（250μl）を加えて、一本鎖DNA断片を溶出した。
得られたDNA溶液をプロテイナーゼK（Sigma社）と反応させた後、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて精製した。
なお、各検体試料においてメチル化DNAが特異的に濃縮されていることを、定量的PCR法により確認した。【００５０】
２．試料中の核酸の増幅および標識
上記のヒト膵臓癌組織およびヒト正常膵臓組織のそれぞれから得た検体試料および対照試料について、CIP（Calf intestine phosphatase）（New England Biolab社）を用いて、DNAの脱リン酸化処理を行った。次いで、Terminal transferase（ROCHE社）を用いてDNAの3'末端にdATPを付加し、MinElute purificationキット（QIAGEN社）を用いてDNAを精製した。そして、GeneChip（登録商標）One-Cycle Traget Labelingキット（Affymetrix社）を用いて、各試料中の一本鎖DNA断片から二本鎖DNAを得た。さらに、得られた二本鎖DNAを鋳型としてIVT増幅によるビオチン標識をして、各試料からビオチン化cRNAを得た。得られたcRNAの濃度を、吸光度（260 nmおよび280 nm）を測定することにより確認した。
各試料からのcRNAを、GeneChip（登録商標）Sample Cleanup Module（Affymetrix社）により断片化して、マイクロアレイ解析用の検体試料および対照試料を得た。【００５１】
３．マイクロアレイ解析
（１）試料とマイクロアレイとの接触
上記のマイクロアレイ解析用の各試料を、マイクロアレイとしてのGeneChip（登録商標）Human Promoter 1.0R Array（Affymetrix社）に接触させて、プローブとのハイブリダイゼーションを行った。各検体試料および対照試料について、同種のマイクロアレイを１つずつ用いた。なお、マイクロアレイとの接触後の染色、洗浄およびスキャン（シグナルの測定）は、Affymetrix社から提供されるマニュアルに従って行った。【００５２】
（２）マイクロアレイデータの解析
得られたマイクロアレイのデータを、以下の手順に従って解析した。なお、この解析では、中央処理装置、記憶部、キーボードなどの入力部およびディスプレイなどの出力部を備える一般的なコンピュータを用いた。
（手順１）コンピュータに、上記のマイクロアレイに配置されている全プローブの塩基配列、ゲノムDNAの塩基配列および上記で得られたシグナル測定値を入力した。
（手順２）ゲノムDNAの塩基配列を、制限酵素MseIの認識配列“TACC”で区切ったDNA断片の塩基配列を取得した。次いで、取得した塩基配列から、その長さが300 bp以上で、且つその配列中に“CG”配列を含まないDNA断片の塩基配列を抽出した。このようにして、“CG”配列を含まない300 bp以上のDNA断片の塩基配列（以下、「断片配列」ともいう）を取得した。
（手順３）マイクロアレイに配置されている全プローブから、“CG”配列を含まないプローブを抽出した。そして、抽出されたプローブのうち、上記の断片配列と相補的なプローブを補正用プローブとした。
（手順４）入力したシグナル測定値から、上記の補正用プローブから得られたシグナル測定値を抽出し、それらの統計的代表値（最頻値）を算出した。この値をバックグラウンド値とした。なお、この手順は、検体試料および対照試料のそれぞれについて行った。
（手順５）入力した各シグナル測定値から上記のバックグラウンド値を差し引き、得られた値を各プローブの補正値とした。なお、補正値が負の場合、その値はゼロとした。なお、この手順も、検体試料および対照試料のそれぞれについて行った。
（手順６）検体試料の補正値と対照試料の補正値とについて、ウィルコクソンの符号順位検定を行って、有意確率を算出した。【００５３】
得られた有意確率を、標準ブラウザーであるIGB（Integrated Genome Browser；IGB社）を用いて可視化した。なお、IGBで表示される有意確率は、（変換値）= -10 log10（有意確率）の式で変換されており、その変換値が20以上の場合に、膵臓癌組織のゲノムDNAに特異的にメチル化されたCpG部位を含む遺伝子領域を有意に検出できたと考えられる。
その結果、膵臓癌組織のゲノムDNAに特異的にメチル化が認められる遺伝子領域として、配列番号１５〜１９の塩基配列で示される領域を同定した。なお、配列番号１５〜１９の塩基配列は、それぞれHOXA9、KCNQ1DN、RAPSN、FZD9およびCDH22の遺伝子領域またはその付近の塩基配列領域の一部であり、またそれぞれ配列番号１、２、３、４および５、ならびに６の塩基配列を包含する領域である。
上記の配列番号１５〜１９と、配列番号１〜６の各塩基配列および各遺伝子との対応を、以下の表２にまとめた。【００５４】
【表２】
2011105570.tif 000004
【００５５】
実施例２    バイサルファイトシークエンス法によるメチル化状態の解析
膵臓癌組織およびヒト正常膵臓組織のゲノムDNAにおいて、実施例１で同定した配列番号１５〜１７の塩基配列で示される遺伝子領域中のCpG部位がメチル化されているか否かを、バイサルファイトシークエンス法により調べた。
１．バイサルファイト処理
実施例１で用いたヒト膵臓癌組織およびヒト正常膵臓組織から抽出したゲノムDNA（2μg）に、0.3 N水酸化ナトリウム水溶液を300μl添加し、37℃で10分間インキュベーションして、ゲノムDNAを変性させた。次いで、各DNA溶液に10 M亜硫酸水素ナトリウム溶液を300μl添加し、80℃で40分間インキュベーションすることにより、バイサルファイト処理を行った。そして、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて、バイサルファイト処理後の各溶液からDNAを精製して、解析用試料を得た。【００５６】
２．シークエンス解析
得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、下記のプライマーセットを用いてPCR法を行った。
（i）PCR反応液の調製
下記の試薬を混合して、15μlの反応液を調製した。
10×Ex Taq（登録商標）buffer（タカラバイオ株式会社）  1.5μl
dNTP mix（2.5 mM）                                    1.2μl
Fプライマー（10μM）                                  0.6μl
Rプライマー（10μM）                                  0.6μl
解析用試料（テンプレート）                            1.0μl
Ex Taq（登録商標）polymerase（タカラバイオ株式会社） 0.12μl
蒸留水                                               9.98μl
合計                                                 15.0μl【００５７】
（ii）プライマーの配列および反応条件
（配列番号１５の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TAGTTAGGGATAAAGTGTGAGTGTTA -3'（配列番号５４）
R：5'- CAACTTATTAAATAACTATACTTCCCC -3'（配列番号５５）
（反応条件）
95℃で4分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、55℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
72℃で7分を1サイクル、
4℃で維持。【００５８】
（配列番号１６の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GGGATATTTGTTTTTTATATTTAATAAAGT -3'（配列番号５６）
R：5'- ACCTCACAATAAAACTACTACAACC -3'（配列番号５７）
（反応条件）
95℃で4分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、56℃で15秒および72℃で40秒を40サイクル、
72℃で7分を1サイクル、
4℃で維持。【００５９】
（配列番号１７の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- AGGTATTTATGGGGTAGGAATTATA -3'（配列番号５８）
R：5'- AAATCACTTAACTAAAATCCCACTA -3'（配列番号５９）
（反応条件）
95℃で4分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、56℃で15秒および72℃で40秒を40サイクル、
72℃で7分を1サイクル、
4℃で維持。【００６０】
得られた各PCR産物を、TA cloningキット（Invitrogen社）のpCR（登録商標）2.1ベクターに組み込んだ。得られた各プラスミド構築物をコンピテントセル（TOP10；Invitrogen社）に形質転換し、これらの形質転換体からプラスミドをGenElute Plasmid Miniprepキット（SIGMA社）を用いて抽出および精製した。得られた各プラスミドに含まれる上記のPCR産物の塩基配列を、Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いてシークエンス解析を行った。
シークエンス解析後、上記の配列番号の塩基配列におけるCpG部位のメチル化状態を解析した。【００６１】
配列番号１５〜１７の塩基配列のそれぞれに包含される配列番号１〜３の塩基配列中に存在するCpG部位のメチル化状態を、上記のシークエンス結果に基づいて、図１〜３に表として示した。これらの図に示される表において、「●」はメチル化CpG部位、「○」は非メチル化CpG部位、「−」は解析不能のCpG部位を表わす。また、「PT」および「PN」は、それぞれ膵臓癌組織および正常膵臓組織を意味する。
各図の表において、CpG部位の行に示される数字は、配列番号１〜３の各塩基配列の5'末端から数えたCpG部位の位置を示す番号である。また、該番号に「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位は、正常膵臓組織サンプルと比較して膵臓癌組織サンプルにおいてメチル化傾向にあるCpG部位である。【００６２】
図１〜３より、配列番号１〜３のいずれの塩基配列においても、CpG部位は、膵臓癌組織ではメチル化されている傾向にあり、正常膵臓細胞組織ではメチル化されていない傾向にあることがわかる。
これらの結果に基づいて、配列番号１〜３の各塩基配列におけるメチル化の頻度を解析した。例えば、配列番号１の塩基配列の場合では、膵臓癌組織（PT）のメチル化の頻度は、全クローン（clone１〜４）中のメチル化されたCpG部位「●」の数を、全クローン中のメチル化されたCpG部位「●」の数とメチル化されていないCpG部位「○」の数との和で除して、パーセンテージとして算出した値である。また、正常膵臓組織（PN）のメチル化の頻度も上記と同様に、全クローン（clone１〜５）中のメチル化されたCpG部位「●」の数を、全クローン中のメチル化されたCpG部位「●」の数とメチル化されていないCpG部位「○」の数との和で除して、パーセンテージとして算出した値である。
このようにして得られた各塩基配列におけるメチル化の頻度を、図４に棒グラフとして示した。なお、該グラフは、膵臓癌組織のサンプル群および正常膵臓組織のサンプル群の平均値を表す。【００６３】
図４より、配列番号１〜３の各塩基配列に存在する全CpG部位を解析対象とした場合、癌細胞を含む試料と含まない試料とを区別する閾値は、例えば20〜60％の範囲から選択できることがわかる。
このことから、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAにおいて、配列番号１、２および／または３の塩基配列中のCpG部位のメチル化の頻度が上記の閾値より高い場合、該生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得ることが示唆された。【００６４】
本発明の判定用分子マーカーとしては、癌組織ではメチル化されている傾向にあり、且つ正常組織ではメチル化されていない傾向にあるCpG部位が好適である。
したがって、配列番号１〜３の塩基配列中のCpG部位のメチル化の頻度に基づいて試料中の癌細胞の存否を判定する場合、判定用分子マーカーとしてのCpG部位は、図１〜３において、好ましくは「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位、より好ましくは「＊＊」が付されたCpG部位から選択することによって、より精度の高い判定を行い得る。
また、メチル化特異的PCRにより、配列番号１〜３の塩基配列中のCpG部位のメチル化の有無を解析した結果に基づいて試料中の癌細胞の存否を判定する場合、図１〜３において、好ましくは「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位、より好ましくは「＊＊」が付されたCpG部位から選択されるCpG部位を増幅できるプライマーを用いることによって、より精度の高い判定を行い得る。【００６５】
実施例３    メチル化特異的PCR（MSP）法によるメチル化状態の解析
実施例１で同定した配列番号１５〜１９の遺伝子領域に存在するCpG部位のメチル化状態をMSP法によって調べた。
１．バイサルファイト処理
ヒト膵臓癌組織、ヒト正常膵臓組織、ヒト正常心臓組織、ヒト正常腎臓組織、ヒト正常肝臓組織、ヒト正常肺組織およびヒト正常末梢血中の白血球からのゲノムDNA（各２μg）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purification キット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。【００６６】
２．MSP法
得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、下記のプライマーセットを用いてMSP法を行った。このMSP法においては、テンプレートのDNA中にメチル化されたCpG部位が存在する場合にPCR産物が得られる。なお、本実施例のMSPでの解析対象であるCpG部位は、図１〜３の「＊＊」が付されたCpG部位である。
（i）PCR反応液の調製
下記の試薬を混合して、25μlの反応液を調製した。
2×FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(ROCHE社)12.5μl
Fプライマー（10μM）                                   1.0μl
Rプライマー（10μM）                                   1.0μl
解析用試料（テンプレート）                             1.0μl
蒸留水                                                 9.5μl
合計                                                  25.0μl
なお、上記の組成において、テンプレートに代えて蒸留水を添加したサンプルおよびテンプレートを含まないサンプルを、陰性対照として用いた。【００６７】
（ii）プライマーの配列および反応条件
（配列番号１５の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- CGTGGGTTTTAGTTAGGAGC -3'（配列番号２８）
R：5'- ATCCAAAACGACGATATTTAACG -3'（配列番号２９）
このプライマーセットは、配列番号１５の塩基配列の5'末端から数えて9、10および28〜30番目（配列番号１の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、54℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
4℃で維持。【００６８】
（配列番号１６の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- CGTTTCGTTCGTATTTATAATAGACG -3'（配列番号３０）
R：5'- AAAACCCATTCTTCCTAACTCCG -3'（配列番号３１）
このプライマーセットは、配列番号１６の塩基配列の5'末端から数えて7〜10および20番目（配列番号２の塩基配列の5'末端から数えて4〜7および17番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【００６９】
（配列番号１７の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TGAGGAATGTTAGTAGTAAGGTTACGT -3'（配列番号３２）
R：5'- CCTATATACTCAAAAAAACCACGTC -3'（配列番号３３）
このプライマーセットは、配列番号１７の塩基配列の5'末端から数えて9および12番目（配列番号３の塩基配列の5'末端から数えて6および9番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【００７０】
（配列番号１８の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GTTGGGTTATACGTCGTAGGGC -3'（配列番号３４）
R：5'- GACAAACGAAAATAAACGTCGAA -3'（配列番号３５）
このプライマーセットは、配列番号１８の塩基配列の5'末端から数えて21〜23および36〜39番目（配列番号４の塩基配列の5'末端から数えて1〜3番目および配列番号５の塩基配列の5'末端から数えて1〜4番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、57℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【００７１】
（配列番号１９の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GATAGTTTTAGAGTCGGGGAAGC -3'（配列番号３６）
R：5'- CCTAATCCTAACAAAATCTACCGAC -3'（配列番号３７）
このプライマーセットは、配列番号１９の塩基配列の5'末端から数えて74および75番目（配列番号６の塩基配列の5'末端から数えて1および2番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【００７２】
PCR終了後、各反応液を２％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルに現れたバンドからPCR産物の存在を確認した。そして、ゲルの写真を撮影し、得られた写真をQuantity One（Bio-Rad社）のソフトウェアを用いて解析して、バンドの蛍光強度を定量化した。これらの結果を図５〜９に示す。これらの図において、「−」はテンプレートを含まない陰性対照、「PN」は正常膵臓組織、「PT」は膵臓癌組織を意味する。【００７３】
配列番号１５および１６の塩基配列についてのMSP法では、各正常組織（膵臓、心臓、腎臓、肝臓、肺および末梢血の白血球）ではほとんどバンドは検出されなかったが、膵臓癌組織では顕著に高い強度のバンドが検出された（図５および６）。
配列番号１７の塩基配列についてのMSP法では、正常膵臓組織よりも膵臓癌組織において、顕著に高い強度のバンドが検出された（図７）。
配列番号１８および１９の塩基配列についてのMSP法では、各正常組織（膵臓、心臓、腎臓、肝臓および末梢血の白血球）ではほとんどバンドは検出されなかったが、膵臓癌組織では顕著に高い強度のバンドが検出された（図８および９）。【００７４】
上記のとおり、配列番号１５〜１９の塩基配列についてのMSP法において、膵臓癌組織に特異的に多くのPCR産物が得られた。これは、各組織のゲノムDNAについて、配列番号１５〜１９の塩基配列、すなわち配列番号１、２、３、４および５、ならびに６の塩基配列中のメチル化CpGの有無をMSP法で解析することにより、膵臓癌組織と正常膵臓組織とを区別できたことを示す。
したがって、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAについて、本発明の判定用分子マーカーである配列番号１、２、３、４、５および／または６の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の有無をMSP法で解析することにより、該生体試料中の癌細胞の存否を判定し得ることが示唆された。【００７５】
実施例４    他の組織におけるMSP法によるメチル化状態の解析
MSP法により、膵臓癌組織以外の癌組織からのDNAについても、メチル化CpG部位を検出できるか否かを検討した。
１．バイサルファイト処理
ヒト乳癌組織、ヒト正常乳腺組織、ヒト大腸癌組織およびヒト正常大腸組織からのゲノムDNA（各2μg）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。【００７６】
２．MSP法
得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、上記の配列番号２８および２９、ならびに３４および３５の塩基配列のプライマーセットを用いてMSP法を行った。なお、MSP法は、実施例３と同様にして行った。
PCR終了後、実施例３と同様に、各反応液を2％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルに現れたバンドの蛍光強度を定量化した。この結果を図１０および１１に示す。これらの図において、「−」はテンプレートを含まない陰性対照、「PN1」および「PN2」は正常乳腺組織、「BT1」および「BT2」は乳癌組織、「CN」は正常大腸組織、「CT1」および「CT2」は大腸癌組織を意味する。【００７７】
配列番号２８および２９の塩基配列のプライマーセットを用いた、配列番号１５の塩基配列についてのMSP法では、正常乳腺組織および正常大腸組織において、ほとんどバンドは検出されなかったが、乳癌組織および大腸癌組織で顕著に高い強度のバンドが検出された（図１０）。
配列番号３４および３５の塩基配列のプライマーセットを用いた、配列番号１８の塩基配列についてのMSP法では、正常乳腺組織よりも乳癌組織において、顕著に高い強度のバンドが検出された（図１１）。【００７８】
上記のとおり、配列番号１５および１８の塩基配列についてのMSP法において、乳癌組織および大腸癌組織に特異的に多くのPCR産物が得られた。これは、各組織のゲノムDNAについて、配列番号１５および１８の塩基配列、すなわち配列番号１、ならびに４および５の塩基配列中のメチル化CpGの有無をMSP法で解析することにより、癌組織と正常組織とを区別できたことを示す。
したがって、膵臓癌組織から同定された本発明の判定用分子マーカーに存在するCpG部位のメチル化の有無をMSP法で解析することによって、膵臓組織とは異なる組織についても癌細胞の存否を判定し得ることが示唆された。【００７９】
実施例５    乳癌細胞株からの判定用分子マーカーの探索
乳癌細胞株および正常乳腺上皮細胞のゲノムDNAを、マイクロアレイを用いて解析することにより、乳癌由来細胞株のゲノムDNAに特異的にメチル化が認められる遺伝子領域の探索を行った。
なお、実施例５での具体的な操作手順は、使用したキットおよび試薬類に添付のマニュアルの記載に従って行った。【００８０】
１．MeDIP on chip法によるメチル化遺伝子の探索
（１）MeDIP法によるメチル化ＤＮＡの調製
乳癌細胞株であるMCF7、MB-MDA231およびSK-BR-3、ならびに正常乳腺上皮細胞株であるHMECを生体試料として用いたこと以外は実施例１と同様にして、ゲノムDNAを抽出し、そして一本鎖DNA断片を得た。
得られた一本鎖DNA断片を、実施例１と同様にして希釈した後、ProteinG Sepharoseビーズ（68μl：GE Healthcare社）を添加した。そして、実施例１と同様にしてプレクリアー処理を行った。各上清を回収した後、これらをそれぞれ二等分して別々のチューブに移して、一方に抗メチル化シトシン抗体BI-MECY-0500（10μg：Eurogentec社）を添加し、他方に正常マウスIgG抗体（４μg：Santa Cruz社）を添加して、それぞれ検体試料および対照試料とした。そして、これらの検体試料および対照試料を、実施例１と同様に免疫沈降して、一本鎖DNA断片を溶出した。
得られたDNA溶液をプロテイナーゼK（Sigma社）と反応させた後、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて精製した。
なお、上記の検体試料においてメチル化DNAが特異的に濃縮されていることを、定量的PCR法により確認した。【００８１】
２．試料中の核酸の増幅および標識
上記のMCF-7細胞、MB-MDA231細胞およびSK-BR-3細胞、ならびにHMEC細胞のそれぞれから得た検体試料および対照試料中のDNAを、WT-Ovation（商標）Pico RNA Amplification System Version 1.0（NuGEN社）を用いて増幅した。次いで、各試料の吸光度（260 nmおよび280 nm）を測定して増幅した核酸の濃度を確認した。
そして、上記で増幅した検体試料および対照試料に含まれる核酸を、FL-Ovation（商標）cDNA Biotin Module V2（NuGEN社）を用いて断片化およびビオチン標識を行った。各試料から得られた核酸を、マイクロアレイ解析用の検体試料および対照試料とした。【００８２】
３．マイクロアレイ解析
（１）試料とマイクロアレイとの接触
上記のマイクロアレイ解析用の各試料を、実施例１と同様にして、GeneChip（登録商標）Human Promoter 1.0R Array（Affymetrix社）に接触させて、プローブとのハイブリダイゼーションを行った。各検体試料および対照試料について、同種のマイクロアレイを１つずつ用いた。【００８３】
（２）マイクロアレイデータの解析
得られたマイクロアレイのデータを、実施例１と同様の手順により解析した。その結果、乳癌細胞株のゲノムDNAに特異的にメチル化が認められる遺伝子領域として、配列番号２０〜２７の塩基配列で示される領域を同定した。なお、配列番号２０〜２７の塩基配列は、それぞれLBX2、PAX9、ADD3、CCDC61、ZIC4、CGB7、TOX、およびTNNI3の遺伝子領域またはその付近の塩基配列領域の一部であり、またそれぞれ配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４の塩基配列を包含する領域である。
上記の配列番号２０〜２７と、配列番号７〜１４の各塩基配列および各遺伝子との対応を、以下の表３にまとめた。【００８４】
【表３】
2011105570.tif 000005
【００８５】
実施例６    バイサルファイトシークエンス法によるメチル化状態の解析
乳癌細胞株および正常乳腺細胞上皮株のゲノムDNAについて、実施例５で同定した配列番号２０〜２７の塩基配列で示される遺伝子領域のCpG部位がメチル化されているか否かをバイサルファイトシークエンス法により調べた。
１．バイサルファイト処理
実施例５で用いた乳癌細胞株MCF7および正常乳腺細胞上皮株HMECから抽出したゲノムDNA（２μg）に、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。そして、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて、バイサルファイト処理後の各溶液からDNAを精製して、解析用試料を得た。【００８６】
２．シークエンス解析
得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、下記のプライマーセットを用いてPCR法を行った。
（i）PCR反応液の調製
実施例２と同じ試薬類を用いて、上記の15μlの反応液を調製した。
（ii）プライマーの配列および反応条件
（配列番号２０の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GGAAGAGGTTTAAGTGGATTTTTTT -3'（配列番号６０）
R：5'- TTTTCTTTCCAAACCCAACCTA -3'（配列番号６１）
（反応条件）
95℃で4分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
72℃で7分を1サイクル、
4℃で維持。【００８７】
（配列番号２１の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- AGTTAGGATTGTGTAATATTAGTTTT -3'（配列番号６２）
R：5'- CACTATACAACCATCAACTACAAC -3'（配列番号６３）
（反応条件）
95℃で4分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、55.5℃で15秒および72℃で40秒を40サイクル、
72℃で7分を1サイクル、
4℃で維持。【００８８】
（配列番号２２の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GTATATTTTTAGGGAGGAGGGGGG -3'（配列番号６４）
R：5'- CAACCCCTACTTCACCTCCACATA -3'（配列番号６５）
（反応条件）
95℃で4分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、65.1℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
72℃で7分を1サイクル、
4℃で維持。【００８９】
（配列番号２３の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TTATTAGGATGAGTTATTGGTTATTT -3'（配列番号６６）
R：5'- ACCTCCCTAACCCCAACTAC -3'（配列番号６７）
（反応条件）
95℃で4分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、56.8℃で15秒および72℃で40秒を40サイクル、
72℃で7分を1サイクル、
4℃で維持。【００９０】
（配列番号２４の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GTTTGGGTAGTTTATTGGTT -3'（配列番号６８）
R：5'- CTAAAAATTTCTCAACTCCTAACTC -3'（配列番号６９）
（反応条件）
95℃で4分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、55.7℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
72℃で7分を1サイクル、
4℃で維持。【００９１】
（配列番号２５の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GAGGTGATATTAAGGATTTTTGGGT -3'（配列番号７０）
R：5'- TACAACTCAACTCCAATAACCACAC -3'（配列番号７１）
（反応条件）
95℃で4分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、61.5℃で15秒および72℃で40秒を40サイクル、
72℃で7分を1サイクル、
4℃で維持。【００９２】
（配列番号２６の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- AATAAGATTTGTTTAGTTTTATTGTTAAAA -3'（配列番号７２）
R：5'- TCTACCTAATACTCACAACCCCTACA -3'（配列番号７３）
（反応条件）
95℃で4分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
72℃で7分を1サイクル、
4℃で維持。【００９３】
（配列番号２７の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GTAGTAGTAGAGTTTGTAGAGGGGTG -3'（配列番号７４）
R：5'- ATAAAAAATACCTATCCAAAAAAAA -3'（配列番号７５）
（反応条件）
95℃で4分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、50.9℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
72℃で7分を1サイクル、
4℃で維持。【００９４】
PCR終了後、実施例２と同様にして、得られた各PCR産物を含むプラスミド構築物を作製し、これらについてシークエンス解析を行った。
シークエンス解析後、上記の配列番号の塩基配列におけるCpG部位のメチル化状態を解析した。【００９５】
配列番号２０〜２７の塩基配列のそれぞれに包含される配列番号７〜１４の塩基配列中に存在するCpG部位のメチル化状態を、上記のシークエンス結果に基づいて、図１２〜１９に表として示した。これらの図に示す表において、「●」はメチル化CpG部位、「○」は非メチル化CpG部位、「−」は解析不能のCpG部位を表わす。
各図の表において、CpG部位の行に示される数字は、配列番号７〜１４の各塩基配列の5'末端から数えたCpG部位の位置を示す番号である。また、該番号に「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位は、HMEC細胞のサンプルと比較してMCF7細胞のサンプルにおいてメチル化されている傾向にあるCpG部位である。【００９６】
図１２〜１９より、配列番号７〜１４のいずれの塩基配列においても、CpG部位は、MCF7細胞ではメチル化されている傾向にあり、HMEC細胞ではメチル化されていない傾向にあることがわかる。
これらの結果に基づいて、配列番号７〜１４の各塩基配列におけるメチル化の頻度を解析した。メチル化の頻度は、実施例２と同様にして算出した。
得られたメチル化の頻度を、図２０に棒グラフとして示した。なお、該グラフは、MCF7細胞のサンプル群およびHMEC細胞のサンプル群の平均値を表す。【００９７】
図２０より、配列番号７〜１４の各塩基配列に存在する全CpG部位を解析対象とした場合、癌細胞を含む試料と含まない試料とを区別する閾値は、例えば15〜35％の範囲から選択できることがわかる。
このことから、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAにおいて、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３および／または１４の塩基配列中のCpG部位のメチル化の頻度が上記の閾値より高い場合、該生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得ることが示唆された。【００９８】
本発明の判定用分子マーカーとしては、癌細胞株ではメチル化されている傾向にあり、且つ正常細胞株ではメチル化されていない傾向にあるCpG部位が好適である。
したがって、配列番号７〜１４の塩基配列中のCpG部位のメチル化の頻度に基づいて試料中の癌細胞の存否を判定する場合、判定用分子マーカーとしてのCpG部位は、図１２〜１９において、好ましくは「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位、より好ましくは「＊＊」が付されたCpG部位から選択することによって、より精度の高い判定を行い得る。
また、メチル化特異的PCRにより、配列番号７〜１４の塩基配列中のCpG部位のメチル化の有無を解析した結果に基づいて試料中の癌細胞の存否を判定する場合、図１２〜１９において、好ましくは「＊」または「＊＊」が付されたCpG部位、より好ましくは「＊＊」が付されたCpG部位から選択されるCpG部位を増幅できるプライマーを用いることによって、より精度の高い判定を行い得る。【００９９】
実施例７    MSP法によるメチル化状態の解析
乳癌細胞株および正常乳腺上皮細胞株のゲノムDNAについて、実施例５で同定した配列番号２０〜２７の遺伝子領域に存在するCpG部位のメチル化状態をMSP法によって調べた。
１．バイサルファイト処理
乳癌細胞株MCF7および正常乳腺上皮細胞株HMECからのゲノムDNA（各２μg）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purification キット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。【０１００】
２．MSP法
得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、下記のプライマーセットを用いてMSP法を行った。なお、本実施例のMSPでの解析対象であるCpG部位は、図１２〜１９の「＊＊」が付されたCpG部位である。また、PCR反応液の調製は、実施例３と同様にして行った。
プライマーの配列および反応条件を以下に示す。
（配列番号２０の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TTTTAGAGTTTAGGATTGGCGGC -3'（配列番号３８）
R：5'- TACAACTTAACACTACCCGAAAACG -3'（配列番号３９）
このプライマーセットは、配列番号２０の塩基配列の5'末端から数えて3、4、11および12番目（配列番号７の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１０１】
（配列番号２１の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- ATAGGTTGGAAACGTAGTTTTTCG -3'（配列番号４０）
R：5'- CTATAACGTCTAACGAATCCTCGC -3'（配列番号４１）
このプライマーセットは、配列番号２１の塩基配列の5'末端から数えて8、9および14〜16番目（配列番号８の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、62℃で30秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１０２】
（配列番号２２の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TGTTGTAAAGTTTGTTCGGTTTCGT -3'（配列番号４２）
R：5'- TTCTACTTCATTTAAACCCCTCGAA -3'（配列番号４３）
このプライマーセットは、配列番号２２の塩基配列の5'末端から数えて15、16および22番目（配列番号９の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１０３】
（配列番号２３の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TGTGTGGAGTAGAATTTTGAGTAAATATGC -3'（配列番号４４）
R：5'- AATTTAAAAACAAAAAAACAACCGCA -3'（配列番号４５）
このプライマーセットは、配列番号２３の塩基配列の5'末端から数えて7および11番目（配列番号１０の塩基配列の5'末端から数えて2および6番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
4℃で維持。【０１０４】
（配列番号２４の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GTAGTTTATTGGTTCGCGGTC -3'（配列番号４６）
R：5'- AAAAAAAATATATAAAAAAATAACGAT -3'（配列番号４７）
このプライマーセットは、配列番号２４の塩基配列の5'末端から数えて1〜3および10番目（配列番号１１の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、51℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１０５】
（配列番号２５の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- AGAGTTCGGTTTATTTGGGATAGAATC -3'（配列番号４８）
R：5'- GACCGAAACGTCCTAAACCG -3'（配列番号４９）
このプライマーセットは、配列番号２５の塩基配列の5'末端から数えて10、11および16〜19番目（配列番号１２の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、62℃で30秒および72℃で30秒を35サイクル、
4℃で維持。【０１０６】
（配列番号２６の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- TATTGTTTAAGATTCGGAGTTGCGA -3'（配列番号５０）
R：5'- CTCCCAACATTTACCTAATAACGAA -3'（配列番号５１）
このプライマーセットは、配列番号２６の塩基配列の5'末端から数えて9、10および17番目（配列番号１３の塩基配列の5'末端から数えて7、8および15番目）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を30サイクル、
4℃で維持。【０１０７】
（配列番号２７の塩基配列を増幅するプライマーの配列）
F：5'- GGGAGGGAAGCGTAGTTTATTC -3'（配列番号５２）
R：5'- CTAAAAAATTTAAAAAAACAAAAACGAT -3'（配列番号５３）
このプライマーセットは、配列番号２７の塩基配列の5'末端から数えて1、2および4番目（配列番号１４の塩基配列においても同じ位置）のCpG部位を解析対象とする。
（反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、54℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１０８】
PCR終了後、実施例３と同様に、各反応液を２％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルに現れたバンドの蛍光強度を定量化した。この結果を図２１〜２８に示す。これらの図において、「−」はテンプレートを含まない陰性対照を意味する。
配列番号２０〜２７の各塩基配列についてのMSP法では、HMEC細胞よりもMCF7細胞において、顕著に高い強度のバンドが検出された（図２１〜図２８参照）。【０１０９】
上記のとおり、配列番号２０〜２７の塩基配列についてのMSP法において、乳癌細胞に特異的に多くのPCR産物が得られた。これは、各細胞株のゲノムDNAについて、配列番号２０〜２７の塩基配列、すなわち配列番号７〜１４の塩基配列中のメチル化CpGの有無をMSP法で解析することにより、乳癌細胞と正常乳腺上皮細胞とを区別できたことを示す。
したがって、被験者から採取した生体試料から抽出したDNAについて、本発明の判定用分子マーカーである配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３および／または１４の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化の有無をMSP法で解析することにより、該生体試料中の癌細胞の存否を判定し得ることが示唆された。【０１１０】
実施例８    MSP法による乳癌組織および正常乳腺組織のゲノムDNAのメチル化状態の解析
MSP法により、乳癌細胞株のみならず乳癌組織のゲノムDNAについても、配列番号２０〜２７の塩基配列で示される遺伝子領域に存在するメチル化CpG部位を検出できるか否かを検討した。
１．バイサルファイト処理
ヒト乳癌組織およびヒト正常乳腺組織からのゲノムDNA（各２μg）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purification キット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。【０１１１】
２．MSP法
得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、上記の配列番号３８〜５３の塩基配列のプライマーセットを用いてMSP法を行った。なお、PCR反応液の調製は実施例３と同様にして行い、各プライマーセットを用いるMSPの反応条件は実施例７と同じである。
PCR終了後、実施例３と同様に、各反応液を２％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルに現れたバンドの蛍光強度を定量化した。この結果を図２９〜３６に示す。これらの図において、「−」はテンプレートを含まない陰性対照を意味する。【０１１２】
上記のプライマーセットセットを用いた、配列番号２０〜２７の塩基配列についてのMSP法ではいずれも正常乳腺組織において、ほとんどバンドは検出されなかったが、乳癌組織で顕著に高い強度のバンドが検出された（図２９〜３６参照）。
このように、配列番号２０〜２７の塩基配列についてのMSP法において、乳癌組織に特異的に多くのPCR産物が得られた。これは、各組織のゲノムDNAについて、配列番号２０〜２７の塩基配列、すなわち配列番号７〜１４の塩基配列中のメチル化CpGの有無をMSP法で解析することにより、乳癌組織と正常乳腺組織とを区別できたことを示す。
したがって、本発明の判定用分子マーカーに存在するCpG部位のメチル化有無を解析することによって、被験者から採取した組織中の癌細胞の存否を判定し得ることが示唆された。【０１１３】
実施例９    MSP法による大腸癌組織および正常大腸組織のゲノムDNAのメチル化状態の解析
大腸癌組織および正常大腸組織のゲノムDNAについて、配列番号１７〜１９、２１、２２および２５〜２７の塩基配列で示される遺伝子領域に存在するCpG部位のメチル化状態をMSP法によって調べた。
１．バイサルファイト処理
ヒト大腸癌組織およびヒト正常大腸組織のゲノムDNA（各２μg：BioChain社）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purification キット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。【０１１４】
２．MSP法
得られた解析用試料中のDNAをテンプレートとして、上記の配列番号３２〜３７、４０〜４３および４８〜５３で示されるプライマーセットを用いてMSPを行った。なお、PCR反応液の調製は下記のとおりである。
（i）PCR反応液の調製
下記の試薬を混合して、25μlの反応液を調製した。
2×FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(ROCHE社)12.5μl
Fプライマー（10μM）                                   1.0μl
Rプライマー（10μM）                                   1.0μl
解析用試料（テンプレート）                             1.0μl
蒸留水                                                 9.5μl
合計                                                  25.0μl【０１１５】
上記の各プライマーセットを用いるMSPの反応条件は下記のとおりである。
（配列番号１７の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号３２および３３）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１１６】
（配列番号１８の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号３４および３５）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、58℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１１７】
（配列番号１９の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号３６および３７）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
4℃で維持。【０１１８】
（配列番号２１の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４０および４１）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１１９】
（配列番号２２の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４２および４３）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１２０】
（配列番号２５の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４８および４９）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
4℃で維持。【０１２１】
（配列番号２６の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号５０および５１）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
4℃で維持。【０１２２】
（配列番号２７の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号５２および５３）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、53℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１２３】
PCR終了後、各反応液を２％アガロースゲルに電気泳動し、PCR産物のバンドの有無を確認した。この結果を図３７に示す。この図において、「CN」は正常大腸組織、「CT」は大腸癌組織を意味する。【０１２４】
図３７より、上記のプライマーセットセットを用いた、配列番号１７〜１９、２１、２２および２５〜２７の塩基配列についてのMSP法では、正常大腸組織ではバンドが検出されず、大腸癌組織にのみバンドが検出されたことがわかる。
このように、配列番号１７〜１９、２１、２２および２５〜２７の塩基配列についてのMSP法において、大腸癌組織に特異的にPCR産物が得られた。これは、各組織のゲノムDNAについて、配列番号１７〜１９、２１、２２および２５〜２７の塩基配列、すなわち配列番号３〜６、８、９および１２〜１４の塩基配列中のメチル化CpGの有無をMSP法で解析することにより、大腸癌組織と正常大腸組織とを区別できたことを示す。
したがって、膵臓癌組織および乳癌細胞株から同定された本発明の判定用分子マーカーに存在するCpG部位のメチル化の有無をMSP法で解析することによって、膵臓組織および乳腺組織とは異なる組織中の癌細胞の存否を判定し得ることが示唆された。【０１２５】
実施例１０    MSP法による各種正常組織のゲノムDNAのメチル化状態の解析
各種正常組織のゲノムDNAについて、配列番号２０〜２７の塩基配列で示される遺伝子領域に存在するCpG部位のメチル化状態をMSP法によって調べた。
１．バイサルファイト処理
ヒト正常心臓組織、ヒト正常腎臓組織、ヒト正常肝臓組織、ヒト正常肺組織およびヒト正常末梢血中の白血球からのゲノムDNA（各２μg：BioChain社）に対して、実施例２と同様にして、バイサルファイト処理を行った。バイサルファイト処理後の溶液に含まれるDNAを、Qiaquick PCR purification キット（QIAGEN社）を用いて精製し、解析用試料を得た。また、乳癌細胞株MCF7からのゲノムDNAを上記の正常組織からのゲノムDNAと同様に処理して、陽性対照用試料を得た。【０１２６】
２．MSP法
得られた解析用試料及び陽性対照用試料中のDNAをテンプレートとして、上記の配列番号３８〜５３で示されるプライマーセットを用いてMSPを行った。なお、PCR反応液の調製は実施例９と同様にして行った。
上記の各プライマーセットを用いるMSPの反応条件は下記のとおりである。
（配列番号２０の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号３８および３９）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１２７】
（配列番号２１の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４０および４１）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、62℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１２８】
（配列番号２２の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４２および４３）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１２９】
（配列番号２３の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４４および４５）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
4℃で維持。【０１３０】
（配列番号２４の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４６および４７）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、50℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１３１】
（配列番号２５の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号４８および４９）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、61℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
4℃で維持。【０１３２】
（配列番号２６の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号５０および５１）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、60℃で15秒および72℃で30秒を35サイクル、
4℃で維持。【０１３３】
（配列番号２７の塩基配列を増幅するプライマーセット（配列番号５２および５３）を用いるMSPの反応条件）
95℃で9分30秒を1サイクル、
95℃で30秒、53℃で15秒および72℃で30秒を40サイクル、
4℃で維持。【０１３４】
PCR終了後、各反応液を２％アガロースゲルに電気泳動し、PCR産物の有無を確認した。この結果を図３８に示す。この図において、「MCF7」は乳癌細胞株MCF7、「H」は正常心臓組織、「K」は正常腎臓組織、「Li」は正常肝臓組織、「Lu」は正常肺組織、「Phe」は正常抹消血中白血球を意味する。【０１３５】
図３８より、上記のプライマーセットセットを用いた、配列番号２０〜２７の塩基配列についてのMSP法ではいずれの正常組織でもバンドは検出されなかったことがわかる。なお、上記のMSPの反応条件はいずれも、MCF7細胞のゲノムDNAから調製された陽性対照用試料をテンプレートとした場合にバンドが十分に検出される条件である。
このように、配列番号２０〜２７の塩基配列についてのMSP法において、各種の正常組織ではPCR産物が得られなかった。これは、各正常組織のゲノムDNAのMSP法による解析では、配列番号２０〜２７の塩基配列、すなわち配列番号７〜１４の塩基配列に存在するCpG部位のメチル化が検出されないことを示す。
したがって、本発明の判定用分子マーカーに存在するCpG部位のメチル化の有無を解析することによって、種々の正常組織中には癌細胞が存在しないと判定し得ることが示唆された。【０１３６】
本出願は２０１０年２月２６日に出願された日本国特許出願特願２０１０−０４２８１４号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面および要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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