(57)【要約】  ゲル化可能な高分子鎖により形成されたゲルを含むマイクロファイバ形状のゲルであって、ゲル化可能な高分子鎖がファイバ長軸方向に配向したゲル。一定方向に配向した状態の細胞、例えば筋細胞などを該ゲル内に含む培養物を簡便に製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル化可能な高分子鎖により形成されたゲルを含むマイクロファイバ形状のゲルであって、ゲル化可能な高分子鎖がファイバ長軸方向に配向したゲル。
【請求項２】
ゲル化可能な高分子鎖がフィブリンモノマー、アルギン酸、又はコラーゲンである請求項１に記載のゲル。
【請求項３】
シート又はブロック形状である請求項１又は２に記載のゲル。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のゲルの製造方法であって、下記の工程：
(a)ゲル化可能な高分子鎖を毛細管中に導入してゲル化可能な高分子鎖を該毛細管の長軸方向に配向させる工程、及び
(b)該ゲル化可能な高分子鎖をゲル化させる工程
を含む方法。
【請求項５】
細胞培養に用いるための請求項１ないし３のいずれか１項に記載のゲル。
【請求項６】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のゲル内にファイバ長軸方向に配向した細胞を含む培養物。
【請求項７】
細胞が筋細胞である請求項６に記載の培養物。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の培養物を含む細胞シート又は細胞ブロック。
【請求項９】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のゲルの保存方法であって、シリコンチューブ内に上記のゲルを吸引してチューブの縦軸方向にゲルを伸張して保存する方法。
【請求項１０】
シリコンチューブ内に充填された請求項１ないし３のいずれか１項に記載のゲルであって、該チューブの縦軸方向に伸張した状態で充填されたゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は配向された筋細胞などの細胞をゲル内に含む培養物、及び該培養物の調製に用いるためのマイクロゲルファイバに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体材料は近年センサやアクチュエータとして注目を集めている(Synthetic Metals, 138, pp.391-398, 2003; Science, 288, pp.2335-2338, 2000; Synthetic Metals, 105, pp.61-64, 1999; Micro Electro Mechanical Systems, pp.454-457, 2004などを参照のこと)。特に、微小物体を動かすための筋肉細胞を駆動源とする微小アクチュエータの進展が著しい。例えば、ポリマー性のシート上にラットの心筋を培養させた収縮型の心筋シート(Science, 317, pp.1366-1370, 2007)、ラットの心筋を駆動源にしたポンプ(Lab on a Chip, 6, pp.362-368, 2006)、マウスの骨格筋とカンチレバーを用いた力計測デバイス(Proc. of MEMS2009, pp.403-406, 2009)などの報告がある。【０００３】
このような筋肉細胞を駆動源とするアクチュエータを製作する際に、力強く効率的な収縮力を発生させるためには筋肉細胞を一定方向に配向させることが重要となる。この配向性を実現するためにリソグラフィーによるパターニングにより筋肉細胞を配向させる方法が知られている(Science, 317, pp.1366-1370, 2007; Advanced Materials, 20, pp.1-5, 2008)。しかしながら、リソグラフィーにより細胞を配向させる方法では複雑なプロセスが必要となるという問題がある。【０００４】
ゲルを用いて細胞を配向させる技術としては、高度配向ハイドロゲルを利用して筋芽細胞の配向を制御する方法(第47回日本歯科理工学会学術講演会・総会 A-11: 歯科材料・機器, 25, pp.89）や3次元配向性のコラーゲンゲルを用いて細胞を培養する手段(3次元コラーゲンジェル、株式会社アトリー)が知られているが、配向性を有するゲルの調製には煩雑な操作が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Synthetic Metals, 138, pp.391-398, 2003
【非特許文献２】Science, 288, pp.2335-2338, 2000
【非特許文献３】Synthetic Metals, 105, pp.61-64, 1999
【非特許文献４】Micro Electro Mechanical Systems, pp.454-457, 2004
【非特許文献５】Science, 317, pp.1366-1370, 2007
【非特許文献６】Lab on a Chip, 6, pp.362-368, 2006
【非特許文献７】Proc. of MEMS2009, pp.403-406, 2009
【非特許文献８】Advanced Materials, 20, pp.1-5, 2008
【非特許文献９】歯科材料・機器, 25, pp.89
【非特許文献１０】http://www.a-tree.co.jp/life_sci/index.html(3次元コラーゲンジェル、株式会社アトリー)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は配向された細胞をゲル内に含む培養物を提供することにある。より具体的には、一定方向に配向した状態の細胞、例えば筋細胞などをゲル内に含み、簡便な方法で調製可能な培養物を提供することが本発明の課題である。
また、本発明の別の課題は、上記の培養物の調製に用いるためのゲルを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、フィブリンモノマーをガラス製毛細管中に導入してフィブリンモノマーを毛細管の長軸方向に配向させた後にゲル化させることにより、長軸方向に配向したフィブリン繊維を含むゲルファイバを簡便に調製できることを見出した。また、このゲルファイバに骨格筋細胞を接触させると細胞がファイバ内に侵入すること、及び該細胞が配向しているフィブリン繊維に沿って縦方向に整列することを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。【０００８】
すなわち、本発明により、ゲル化可能な高分子鎖により形成されたゲルを含むマイクロファイバ形状のゲルであって、該ゲル化可能な高分子鎖がファイバ長軸方向に配向したゲルが提供される。
この発明の好ましい態様によれば、ゲル化可能な高分子鎖がフィブリンモノマー、アルギン酸、又はコラーゲンである上記のゲル；ゲル化可能な高分子鎖がフィブリンモノマーであり、ゲル化可能な高分子鎖により形成されたゲルがフィブリンである上記のゲル；及びシート又はブロック形状である上記のゲルが提供される。【０００９】
また、本発明により、上記のゲルの製造方法であって、下記の工程：
(a)ゲル化可能な高分子鎖を毛細管中に導入して該ゲル化可能な高分子鎖を該毛細管の長軸方向に配向させる工程、及び
(b)該ゲル化可能な高分子鎖をゲル化させる工程
を含む方法が提供される。【００１０】
さらに、細胞培養に用いるための上記のゲルも本発明により提供される。
好ましい態様として、横方向に束ねられた複数の上記ゲルを含むシート状細胞培養用ゲル、該シート状細胞培養ゲルを積層したブロック状細胞培養用ゲル、及び3次元形状に成形された上記のゲルを含む細胞培養用のゲルが本発明により提供される。ゲルの好ましい3次元形状として、例えば、二重鎖又は三重鎖などの撚糸構造、織布構造、シリンダ構造、らせん構造、又は中空構造などを挙げることができる。【００１１】
別の観点からは、上記のゲル内にファイバ長軸方向に配向した細胞を含む培養物が本発明により提供される。
この発明の好ましい態様として、細胞が骨格筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、神経細胞、血管内皮細胞などの上皮細胞、又は線維芽細胞である上記の培養物を挙げることができる。
また、本発明により、上記の培養物の製造方法であって、上記のゲルと細胞とを培養する工程を含む方法が提供される。【００１２】
また、上記培養物を含む細胞シート又は細胞ブロックが本発明により提供される。
この細胞シートは、マイクロファイバ状のゲルを用い、細胞と接触するように培養することにより調製されたマイクロファイバ状の培養物を横方向に束ねることにより調製することができ、細胞ブロックは上記のようにして得られた細胞シートを適宜積層することにより調製することができる。また、横方向に束ねられた複数の上記ゲルを含むシート状細胞培養用ゲル又は該シート状細胞培養ゲルを積層したブロック状細胞培養用ゲルを用い、細胞と接触するように培養することによっても細胞シート又は細胞ブロックを調製することができる。【００１３】
さらに別の観点からは、上記のゲルの保存方法であって、シリコンチューブ内に上記のゲルを吸引してチューブの縦軸方向にゲルを伸張して保存する方法が本発明により提供される。
また、シリコンチューブ内に充填された上記のゲルであって、該チューブの縦軸方向に伸張した状態で充填されたゲルも本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のゲルを用いることにより、リソグラフィーなどの煩雑な工程を経ることなく、極めて簡便に配向させた細胞を含む培養物を調製することができる。例えば、フィブリンモノマーをファイバ長軸方向に配向させた後にゲル化して得られるフィブリンゲルのマイクロファイバを骨格筋細胞と接触するように培養することにより、フィブリン繊維に沿って配向した骨格筋細胞を含むゲルを調製することができるが、この培養物に電気パルスを与えると、配向した骨格筋細胞の収縮と同期してゲルも伸縮することができる。従って、この培養物から調製されたシートやブロックなどを人工筋肉の材料として好適に用いることができる。また、このゲルを複数束ねることにより骨格筋の収縮力を駆動力として利用することも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】配向された骨格筋細胞を含むマイクロファイバ状のゲルの模式図である。フィブリンモノマー溶液を吸引により微小流路で配向させ、ゲル化した後に骨格筋細胞とともに培養してファイバ内に細胞が取り込まれて配向した培養物が得られることを示す。
【図２】ディッシュとフィブリンハイドロゲル層を用いて培養した骨格筋細胞により筋管細胞が形成されることを示した図である。(a)はディッシュ上、(b)はフィブリンハイドロゲル上での培養結果を示す。
【図３】ディッシュとフィブリンゲル層を用いて培養した骨格筋細胞が電気刺激により収縮する結果を示した図である。(a)はディッシュ上、(b)はフィブリンハイドロゲル上での培養結果を示す。
【図４】配向した骨格筋細胞を含むフィブリンゲルファイバの作製方法を示した図である。(a)ガラス製毛細管の内壁にプルロニック127をコーティングし、(b)フィブリンモノマー溶液をガラス製毛細管内に吸引し、(c)マイクロファイバ状のフィブリンゲルをPDMSコートディッシュ上に吐出して細胞浮遊液を添加し、(d)フィブリンゲルをPDMS層に固定し、(e)骨格筋細胞をマイクロファイバ内で増殖させる様子を示す。
【図５】フィブリンゲルファイバ(直径約100μm)に骨格筋細胞(C2C12細胞)が付着した様子を示した図である。
【図６】ディッシュ上に培養された細胞及びフィブリンゲルファイバ内に培養された細胞を蛍光免疫染色法により観察した結果を示した図である。(a)はディッシュ上でランダムに増殖した細胞、(b)はフィブリンゲルファイバ内で配向して増殖した細胞を示す。
【図７】ディッシュ上における骨格筋の形成及びフィブリンゲルファイバ内における骨格筋の形成を蛍光免疫染色法により観察した結果を示した図である。(a)はディッシュ上での骨格筋形成、(b)はフィブリンゲルファイバ内での骨格筋形成を示し、(c)はフィブリンゲルファイバ内でファイバ長軸方向に骨格筋細胞が配向している様子を示す。
【図８】マイクロファイバ状のゲルを用いて織布構造を調製する方法の概念図及び調製された織布構造を示した図である。(A)は織機(左)及び織布調製方法(右)の概念図を示し、（B)は水中でマイクロファイバ状のゲルを用いて織布の調製する方法の具体例を示す。（C）は調製された織布構造のゲルを示し、(D)は織布の蛍光イメージを示し、(E)は(D)のイメージの拡大図を示し、(F)はシートの断面図を示す。図中、Wrap gel wireは縦糸であるマイクロファイバ状ゲル、Weft gel wireは横糸であるマイクロファイバゲルを示す。
【図９】(A)はシリコンチューブ内に吸引されたマイクロファイバ状ゲルを示し、(B)は拡大図を示す。
【図１０】配向された骨格筋細胞C2C12又は心筋細胞P19LC6を内包するフィブリンゲル(コア部)及びアルギン酸ゲル(シェル部)を有するコア・シェル型のファイバを培養した後に蛍光免疫染色した結果を示した図である。染色後にα-アクチニンの産生が認められ、骨格筋細胞と心筋細胞がそれぞれ分化していることが確認された。
【図１１】コア部に内包されたプライマリー心筋細胞P19LC6が培養後に自発的に収縮を繰り返しており、これらの細胞の動きと同期してファイバ全体が収縮する結果を示した図である。(a)はプライマリー心筋細胞の収縮運動を示し、(b)はファイバの収縮を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のゲルは、ゲル化可能な高分子鎖により形成されたゲルを含むマイクロファイバ形状のゲルであって、ゲル化可能な高分子鎖がファイバ長軸方向に配向していることを特徴としている。
マイクロファイバ形状とは、例えば外径が10μm〜1 mm 程度の繊維状の形状を意味しているが、外径は上記の範囲に特に限定されるわけではない。断面形状としては、円形、楕円系、又は四角形や五角形などの多角形など多様な形状であってもよい。長さは特に限定されないが、数mm〜数十cm程度であり、好ましくは数cm程度である。
【００１７】
ゲルはゲル化可能な高分子鎖により形成されたゲルを含む。本明細書において「ゲル化可能な高分子鎖」とはゲルを形成することができるゲル化可能な高分子鎖、好ましくは親水性の高分子鎖、換言すればゲル化前の状態にあるゲル化可能な高分子鎖、好ましくは親水性の高分子鎖を意味する。例えば、ゲル化可能な高分子鎖により形成されたゲルがフィブリンである場合には、ゲル化により集合体を形成する前のフィブリンモノマーがゲル化可能な高分子鎖に相当する。ゲル化可能な高分子鎖としては、ポリペプチド鎖、糖修飾ポリペプチド、又は多糖類などの天然高分子鎖のほか、ポリエチレングリコール鎖やポリアクリル酸鎖などの非天然高分子鎖を挙げることができるが、これらに限定されることはない。本発明において好ましいゲル化可能な高分子鎖はフィブリンモノマーやアルギン酸など金属イオンの存在下でゲル化する性質を有する高分子鎖、あるいは加熱によりゲル化するコラーゲンなどである。ゲル化可能な高分子鎖の分子量は特に限定されないが、例えば10〜600キロダルトン程度である。
【００１８】
本発明において特に好ましく用いられるゲル化可能な高分子鎖はフィブリンモノマーであり、フィブリンモノマーをトロンビンの存在下でゲル化することにより、ゲル化可能な高分子鎖により形成されたゲルであるフィブリンからなるゲルを調製することができる。また、アルギン酸やコラーゲンをゲル化可能な高分子鎖として用いることも好ましい。非天然のゲル化可能な高分子鎖を用いる場合などには、ゲル化に際して適宜のゲル化剤を用いることもできるが、このようなゲル化剤は当業者に適宜選択可能であることは言うまでもない。
【００１９】
本発明においては、ゲルの調製にあたり、ゲル化可能な高分子鎖を毛細管中に導入してゲル化可能な高分子鎖を該毛細管の長軸方向に配向させる必要がある。毛細管の材質は特に限定されないが、例えばガラス製毛細管、シリコン製毛細管、又はプラスティック製毛細管などを用いることができる。毛細管の内径は所望のゲル外径に応じて適宜選択すればよいが、例えば、内径10μm〜1 mm程度の毛細管を用いることが好ましい。ゲル形成後にゲルの排出を容易にするために毛細管の内壁を適宜コーティングしておくことも好ましい。例えば、ガラス製毛細管を用いる場合には、ポリプロピレングリコールエチレンオキシド付加物 (プルロニック型非イオン界面活性剤)などの共重合体界面活性剤などを毛細管内壁にコーティングすることが好ましい。ゲル化可能な高分子鎖を毛細管中に導入する方法は特に限定されないが、例えば、吸引や注入などの方法を採用することができる。
【００２０】
この程度の内径の毛細管を用いてゲル化可能な高分子鎖の水溶液を管内に導入することにより、毛細管の管内を通過する水溶液の流速には内壁付近及び中心部付近で大きな差が生じ、中心部付近で非常に速い流速となる。この現象を利用することにより、ゲル化可能な高分子鎖を毛細管の長軸方向に、すなわち溶液の流れの方向に効率的に配向させることが可能になる。ゲル化可能な高分子鎖を含む溶液を毛細管内に導入する速度は特に限定されないが、上記の現象が効率的に生じるように、例えば毛細管内に吸引された溶液の先端部の移動速度が1〜5cm/sec程度になることが好ましい。
【００２１】
ゲル化可能な高分子鎖を含む水溶液の濃度も特に限定されず、溶液の粘度及びゲル化後のゲル硬度などの観点から適宜選択することができるが、例えばフィブリンモノマーを用いる場合には1〜10 mg/ml程度の濃度とすることができる。ゲル化可能な高分子鎖を含む水溶液には適宜の緩衝剤のほか、細胞培養のための培地成分、任意のペプチド、タンパク質、糖類、脂質類、核酸類などの生体物質などを添加することができるが、添加可能な成分は上記のものに限定されることはない。また、配向性を高めるなどの観点から、適宜のマイクロファイバ、例えば多糖鎖、ポリペプチド鎖、ポリヌクレオチド鎖などの天然マイクロファイバや、カーボンナノファイバなどの非天然マイクロファイバを添加しておくことも可能である。もっとも、添加可能な成分はこれらに限定されることはない。
【００２２】
毛細管内に導入され配向したゲル化可能な高分子鎖をゲル化する方法は特に限定されず、ゲル化可能な高分子鎖の種類に応じて適宜のゲル化方法を選択すればよい。例えば、ゲル化可能な高分子鎖としてフィブリンモノマーを用いる場合にはトロンビンでゲル化するこができ、アルギン酸を用いる場合にはカルシウムイオンを用いてゲル化することができる。またコラーゲンを用いる場合には加熱によりゲル化することが可能である。ゲル化を行うに際して、適宜加温することも好ましい。例えば30〜40℃程度の温度、好ましくは37℃程度の温度で加温することによりゲル化を促進することができる場合がある。
【００２３】
ゲル化後、得られたゲルを毛細管から吐出させ、マイクロファイバ状のゲルを調製することができる。このゲルは毛細管内で毛細管の長軸方向に配向したゲル化可能な高分子鎖同士がゲル化して3次元構造体を形成したマイクロファイバ状のゲルであり、ゲル内部には配向したゲル化可能な高分子鎖が保存されている。ゲルの硬度は特に限定されないが、例えば通常のコラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、アガロースゲルなどの生物材料と同程度の硬度を有していることが好ましい。ゲルの硬度は培養に用いる細胞の種類に応じて適宜選択してもよい。細胞培養時にゲル内への細胞の侵入が容易になるように、かつ培養後に得られる培養物が十分な機械的強度を有するように適宜のゲル強度を選択することができる。
【００２４】
吐出させたマイクロファイバ状のゲルは適宜切断することができるが、好ましくは長軸に対して直角方向に切断して用いることができる。例えば、薄い切片となるように長軸に対して直角方向に切断することにより得られる薄片は断面に対して直角方向（すなわち毛細管の長軸方向）に整列した短い高分子鎖を含むが、このような切片の態様も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。
【００２５】
このようにして得られたマイクロファイバ状のゲルをシリコンチューブ内に吸引し、チューブの縦軸方向にゲルを伸張して保存することができる。ゲル化後に毛細管からゲルを水中又は緩衝液中などに吐出させるとゲルを直線状に保つことが一般には困難になるが、マイクロファイバ状のゲルを水中又は緩衝液中などに吐出した後、この水性媒体に内径100μm〜数mm程度のシリコンチューブの先端を浸漬してシリコンチューブを吸引することにより、マイクロファイバ状のゲルが先端からシリコンチューブ内に吸引され、チューブの縦軸方向に伸張された直線状態でシリコンチューブ内に吸引される。この状態を図9に示す。この状態でゲルを保存することができ、さらに使用にあたってはマイクロファイバ状のゲルを内包したシリコンチューブを適宜の長さに切断して所望の長さのゲルを調製することが可能になる。保存にあたっては、必要に応じてチューブ内に防腐剤、pH調節剤、緩衝剤など適宜の薬剤を添加することができる。
【００２６】
上記のマイクロファイバ状のゲルは細胞培養に用いることができる。本発明のゲルを用いて細胞を培養することにより、細胞がゲル内部に侵入してゲル化可能な高分子鎖に沿って配向した培養物を調製することができる。細胞としては配向性を有する細胞であれば任意の細胞を用いることが可能である。例えば、骨格筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、神経細胞、血管内皮細胞などの上皮細胞、又は線維芽細胞などを用いることができるが、これらに限定されることはない。本発明のマイクロファイバ状ゲルを用いて細胞を培養する方法は特に限定されず、使用する細胞の種類に応じて適宜の培養条件、例えば培地、培養温度、炭酸ガス濃度などを当業者が適宜選択できる。ゲル内に細胞が侵入して配向する様子は通常の光学顕微鏡下で容易に観察することができる。
【００２７】
本明細書において細胞の「配向」とは同一種類の非円形の細胞がおおむね同じ方向に整列することを意味しており、典型的には、略楕円形又は縦長の細胞が長径方向に沿って整列した状態を意味するが、いかなる意味においても「配向」の用語を限定的に解釈してはならず、この用語を最も広義に解釈しなければならない。例えば、骨格筋細胞は縦長の外形を有しているが、この細胞の長径方向がマイクロファイバのファイバ長軸方向におおむね一致するように整列した状態となった培養物を調製することができる。このような配向を有する培養物の概念図を図１に示す。ゲル内には必要に応じて細胞以外にもタンパク質類、核酸類、多糖類、抗体類、脂質類などの生体物質や無機材料や有機物質などの非生体物質を適宜含めることができる。
【００２８】
培養に用いるためのマイクロファイバ状のゲルは独立に用いてもよいが、複数のゲルを束ねて用いることもできる。マイクロファイバ状のゲルを独立に用いる場合の例として、図4に概念図を示した。シリンダに結合された毛細管内でゲル化させたマイクロファイバ状のゲルをディッシュ上に概ね直線状になるようにファイバを吐出し、注射針などで適宜引き伸ばして直線状に整形した後、細胞(図4においては骨格筋細胞)を添加して培養を行うことができる。
【００２９】
マイクロファイバ状のゲルを複数束ねて用いる場合の例としては、例えば横方向に複数のゲルを束ねて一列のゲルからなるシート状ゲルを形成して細胞培養を行うことによりシート状の細胞培養物（本明細書において「細胞シート」と呼ぶ）を調製する方法を例示することができる。また、シート状のゲルを複数積み重ねてブロック状のゲルを形成して細胞培養を行うことにより、ブロック状の細胞培養物（本明細書において「細胞ブロック」と呼ぶ）を調製することができる。シート状のゲルを複数枚積み重ねる際には、各シートを構成するマイクロファイバのファイバ長軸方向が一致するように積み重ねることもできるが、各シートのファイバ長軸方向が適宜の角度差を有するようにシートを積み上げてもよい。
【００３０】
また、細胞シートは、マイクロファイバ状のゲルを独立した状態で用い、細胞と接触するように培養することによりマイクロファイバ状の培養物を調製し、得られた培養物を横方向に束ねることにより調製することもできる。細胞ブロックは上記のようにして得られた細胞シートを適宜積層することにより調製してもよい。
【００３１】
また、培養に用いるためのマイクロファイバ状のゲルは任意の3次元形状を有するように成形されていてもよい。3次元形状は単独のゲル又は複数のゲルにより形成することができる。単独のゲルにより形成可能な3次元形状としては、例えばらせん形状やシリンダ構造などを挙げることができる。複数のゲルにより形成可能な3次元形状としては、例えば、二重鎖又は三重鎖などの撚糸構造や織布構造などを挙げることができる。3次元形状は中空構造であってもよい。もっとも、3次元形状は上記の形状に限定されることはない。
【００３２】
例えば、織布構造のゲルを調製するためには、縦糸の間隔が1〜5 mm程度となるようなミクロ織機を用いて、縦糸として上記のマイクロファイバ状のゲルを用い、横糸として任意の高分子ゲルからなるマイクロファイバを用いて織布構造のゲルを調製すればよい。この概念図及び織布構造のゲルの例を図8に示す。図8(C)に示された織布構造において、縦糸として本発明のマイクロファイバ状ゲルを用い、横糸として例えばアルギン酸マイクロファイバゲルなどを用いることにより、機械的強度に優れた織布構造のゲルを調製することができる。
【００３３】
横糸及び縦糸として用いるマイクロファイバ状ゲルは、先に説明したようにシリコンチューブ内に保存された状態で織機に配置し、シリコンチューブ内からマイクロファイバ状ゲルが供給されるようにすることが好ましい。図8(A)は縦糸がシリコンチューブ内から供給されることを示す概念図である。このようにして得られた織布構造のゲルを用いて骨格筋細胞の培養を行うと、縦糸の軸方向に沿って骨格筋細胞が配向した培養物を調製することができるが、この培養物は人工筋肉を構成する細胞ブロックとして用いることができる。骨格筋を駆動源として利用する方法については、例えばProc. of MEMS2009, pp.403-406, 2009及びProc. of Transducers, pp.124-127, 2009などに報告されており、骨格筋細胞を含む培養物をこれらの刊行物に記載された方法に準じて駆動源として利用することもできる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例1
骨格筋細胞として株化細胞の一つとして確立されているマウス筋芽細胞株C2C12細胞を用いた。培地としては、筋芽細胞を増殖させるための増殖培地、及び筋芽細胞の分化と融合を促して筋管細胞を形成させるための分化培地がある。増殖培地はDMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) + FBS (Fetal Bovine Serum) 10% + AB (antibiotic-antimycotic) 1%から構成され、分化培地はDMEM + HS (Horse Serum) 5% + AB 1%から構成される。継代の際の播種濃度は約3000 cells/cm2で行った。継代は一週間に2度行った。また、分化培地は継代して3日後にコンフルになったときから加え始め、分化培地の交換は2日に1度行った。【００３５】
フィブリンゲルをフィブリノーゲン溶液400 μl、PBS (phosphate buffered saline) 100 μl、及びトロンビン溶液100 μlを混合することにより作製した。フィブリノーゲン溶液はフィブリノーゲン1.5 mlにHBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) を7.5 ml加えることにより調製し、トロンビン溶液はPBS 2 mlにCaCl2と100 μlのトロンビンを加えることにより調製した。【００３６】
フィブリンゲル上においてディッシュ上と同様に筋管細胞が形成されることを確認した(図2)。この結果は、フィブリンゲルファイバ内においても筋管細胞が形成される可能性があることを示している。また、フィブリンゲル層の上の筋管細胞がディッシュ上の筋管細胞と同様に外部からの電気パルスによって収縮することを確認した(図3)。この結果は、骨格筋細胞をフィブリンゲルファイバ内に培養し、骨格筋細胞が筋管細胞を形成した場合には、フィブリンゲルファイバ内においても筋管細胞が収縮しうることを示す。その際に、筋管細胞の下にあるフィブリンゲルの層が筋管細胞の収縮に同期して収縮することも確認した(図3)。この結果は、フィブリンゲルファイバ内において筋管細胞が収縮した際にゲルファイバ全体も収縮する可能性があることを示す。本実験においては5 Vの電圧、50 Hzの周波数の電気パルスを与え、電極間の距離は約45 mmとした。図3における収縮率のグラフは電気パルスを与える前の筋管上の2点とフィブリンゲル上の2点の距離を基準にした収縮率を示す。【００３７】
図4に配向された骨格筋細胞を内包するフィブリンゲルファイバの作製方法を示す。ゲルファイバを毛細管から剥離しやすくするためににガラス製毛細管の内壁にプルロニック127をコーティングした(図4(a))。フィブリンモノマーをガラス製毛細管に吸引してフィブリンモノマーをミクロに配向させた(図4(b))。フィブリンモノマーをゲル化させた後、得られたフィブリンゲルマイクロファイバをPDMS (polydimethylsiloxane)でコーティングしたディッシュ上に押し出し、細胞懸濁液を加えた(図4(c))。フィブリンゲルマイクロファイバをPDMSの層に針で固定し(図4(d))、CO2濃度5%の条件下において37℃で骨格筋細胞とフィブリンゲルマイクロファイバとが接触するように培養を行った(図4(e))。この結果、図5に示すように、直径100 μm程度のフィブリンゲルマイクロファイバに骨格筋細胞C2C12が侵入して増殖した培養物が得られた。【００３８】
ディッシュ上で培養した細胞、及びフィブリンゲルマイクロファイバ内に侵入して増殖した細胞の様子を蛍光免疫染色法により観察した結果を図6に示す。蛍光免疫染色は以下の手順で行った。(1)パラホルムアルデヒドで試料を固定し；(2)TritonX-100 in PBSにより細胞膜透過処理を行い；(3)goat serum in PBSでブロッキングを行い；(4)Alexa 488-phalloidin 2 μlをgoat serum in PBS 1 ml に加えて2時間室温で静置し；(5) Hoechst 33342 1 μlを加えて5分間室温で静置し；(6)4 ℃でパラフィルムを巻いて試料が乾燥しないように遮光保存した。図6において細胞核は青色、F-アクチン(細胞骨格)は緑色に染色されている。ディッシュ上では細胞は不特定の方向に培養されるのに対してフィブリンゲルマイクロファイバ内では細胞はファイバの長軸方向に配向していた。【００３９】
骨格筋細胞における骨格筋の形成の有無を同様に蛍光免疫染色法により確認した。上記の蛍光免疫染色の手順(3)と(4)の間に以下のプロセスを行った。(3-1)マウス抗α-アクチニン(Sarcomeric)モノクローナル抗体 20 μlをPBS中ヤギ血清 1 ml に加えて2時間室温で静置し；(3-2)Alexa 568-抗マウス抗体 5 μlをPBS中ヤギ血清 1 ml に加えて2時間室温で静置した。図7においてα-アクチニンは赤色に染色されており、黄色に染色された箇所は緑色(F-アクチン)と赤色(α-アクチニン)の混ざった骨格筋の領域を示している。図7(a)においてディッシュ上で骨格筋が形成されるのと同様に、図7(b)においてもフィブリンゲルマイクロファイバ内で骨格筋が形成されることが確認された。また、ディッシュ上では骨格筋が不特定の方向に形成されるのに対して、フィブリンゲルマイクロファイバ内では骨格筋はファイバの長軸方向に配向しており(図7(c))、ファイバ内の配向された骨格筋が電気パルスに応じて収縮した際には、不特定の方向に形成された骨格筋よりも全体としてより大きな収縮力が得られることが示された。【００４０】
例2
コア部として配向された骨格筋細胞C2C12又は心筋細胞P19LC6を内包するフィブリンゲルを有し、シェル部としてアルギン酸ゲルを有するコア・シェル型のファイバを二重の同軸の層流装置(Lab. Chip, 4, pp.576, 2004, Fig.1)を用いて尾上らの方法により作製した(MEMS, pp.248-251, 2010)。ファイバー直径は約150μmであり、培養後のコア部の細胞密度は1.0×108 細胞/mlであった。培養後に蛍光免疫染色をするとα-アクチニンの産生が認められ、骨格筋細胞と心筋細胞がそれぞれ分化していることが確認された(図10)。コア部に内包されたプライマリー心筋細胞P19LC6は培養後に自発的に収縮を繰り返しており、これらの細胞の動きと同期してファイバ全体の収縮も認められた(図11)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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