(57)【要約】  イノシトール?１，４，５?トリスリン酸受容体(IP3R)結合タンパク質およびそれを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。この発明は、KRAP タンパク質（配列番号１〜４）などのタンパク質と、IP3R（配列番号５〜８）とが結合しているIP3R 結合タンパク質、およびこのIP3R 結合タンパク質を主成分とするIP3R 活性阻害剤に関する。また、この発明は、IP3R結合タンパク質を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。IP3R が結合するKRAP タンパク質の結合部位は、マウスKRAP タンパク質においては、その２００番目から２１８番目の１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列領域に存在する。その他の動物種由来のマウスKRAPタンパク質におけるIP3R 結合部位は、マウスKRAP タンパク質の２００番目から２１８番目の１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列領域に対応する領域に存在する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
KRAPタンパク質（配列番号１〜４）などのタンパク質と、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体（IP3R: 配列番号５〜８）が結合していることを特徴とするイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質であって、IP3Rが結合するタンパク質を構成するアミノ酸配列が、全長であっても、またはIP3Rが結合するアミノ酸部位を含むIP3R結合部位含有領域、つまりアミノ酸部分配列領域であることを特徴とするイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質であって、該IP3R結合部位含有領域が、マウスKRAPタンパク質の場合、その２００番目から２１８番目の１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列領域であること、またはマウスKRAPタンパク質以外の動物種由来のKRAPタンパク質の場合、上記マウスKRAPタンパク質のアミノ酸配列領域に対応するアミノ酸配列領域であることを特徴とするイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質。
【請求項４】
請求項１、２ないし３に記載のイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質であって、前記IP3R結合タンパク質または前記IP3R結合部位含有領域のアミノ酸一次構造もしくは高次構造情報に基づいて合成される構造模倣物または化合物であることを特徴とするイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質またはその結合部位含有領域を主成分とすることを特徴とする細胞内カルシウムイオン濃度調節剤。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞内カルシウムイオン濃度調節剤であって、該細胞内カルシウムイオン濃度調節剤が、IP3R機能調節剤、IP3R活性阻害剤またはIP3R活性化剤であることを特徴とする細胞内カルシウムイオン濃度調節剤。
【請求項７】
KRAPタンパク質とIP3RとのKRAP−IP3Rタンパク複合体もしくはIP3R結合部位含有領域を調製することまたはその結合能を検出することによってそのKRAP−IP3Rタンパク間の相互作用を阻害する物質をスクリーニングすることを特徴とするアッセイ方法。
【請求項８】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質またはその結合部位含有領域を含むことを特徴とするベクター。
【請求項９】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質またはその結合部位含有領域を含むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体（IP3R）結合タンパク質およびそれを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  KRAPタンパク質 (Ki-ras-induced actin-interacting protein)をコードするKRAP遺伝子は、本発明者によって、その発現レベルが活性化Ki-rasによってアップレギュレートされる遺伝子の1つとしてヒト結腸がん細胞株HCT116のcDNAライブラリから同定された（非特許文献１）。KRAP遺伝子は、その構造が動物の種を超えて魚種から哺乳動物種に亘って保存されているが、その発現パターンや分子機能は未だ解明されていなかった。【０００３】  本発明者らは、KRAPに対する特定のポリクローナル抗体を作製し、マウス組織中での組織学的発現を調べたところ、KRAPタンパク質はマウスの生理学的組織ではユビキタスな発現を示していること、またその発現レベルは、膵臓、肝臓ならびに褐色脂肪組織中で高く、また膵臓ならびに肝臓組織中のメンブレン頂端部に沿った糸状アクチンと共在していることを報告した（非特許文献２）。KRAPタンパク質の亜分画研究では、KRAPタンパク質は細胞質タンパク質であって、その大部分は細胞骨格に関連していることが明らかにされた。また、結腸がん細胞株HCT116中でのKRAP発現を抑制してのマイクロアレイでの遺伝子発現プロファイルによって、がん細胞においてしばしばデレギュレートされる数種類の受容体ならびにシグナル分子が、KRAPノックダウン細胞では非ノックダウン細胞に比べて発現変動をしていることが明らかにされた。その上、本発明者が作製したKRAP欠損マウスが顕著な全身性エネルギー代謝異常を呈し、KRAPタンパク質が、エネルギー消費の亢進、インスリン感受性の亢進、肥満の予防ならびに解消、および／または血中ホルモン濃度異常を誘起する作用効果を有していることが明らかにされた（特許文献１、非特許文献３）。したがって、KRAPまたはKRAP関連経路を標的とする薬剤は、肥満または糖尿病などの代謝疾患の予防ならびに治療薬となりうる可能性がある。しかし、KRAPタンパク質の分子機能の詳細が不明であった。【０００４】  そこで、本発明者は、KRAPタンパク質の分子機能を解明する目的で、KRAP過剰発現マウスを作製し、そのマウス肝臓組織から、KRAPタンパク質に分子間相互作用するタンパク質を共精製することにより同定し、この結合タンパク質がイノシトール−１，４，５−トリスリン酸（IP3）受容体結合タンパク質であり、IP3受容体（IP3R）と分子間相互作用をしているKRAPタンパク質がIP3Rの機能を調節する重要な作用を有していることを見出して、この発明を完成させた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開WO2007/010999
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Inokuchi J, Komiya M, Baba I, Naito S, Sasazuki T, Shirasawa S., Deregulated  exression of KRAP, a novel gene encoding actin-interacting protein, in human colon cancer cells.J Hum Genet. 2004;49(1):46-52.
【非特許文献２】Fujimoto T, Koyanagi M, Baba I, Nakabayashi K, Kato N, Sasazuki T, Shirasawa S. , Analysis of KRAP expression and localization, and genes regulated by KRAP in a human colon cancer cell line.J Hum Genet. 2007;52(12):978-84.
【非特許文献３】Fujimoto T, Miyasaka K, Koyanagi M, Tsunoda T, Baba I, Doi K, Ohta M, Kato N, Sasazuki T, Shirasawa S.Altered energy homeostasis and resistance to diet-induced obesity in KRAP-deficient mice.PLoS One. 2009;4(1):e4240.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  この発明は、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体（IP3R）結合タンパク質、好ましくはイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体（IP3R）結合KRAPタンパク質を提供することを目的としている。【０００８】  この発明は、その好ましい態様として、IP3Rが結合するタンパク質を構成するアミノ酸配列が、全長であるか、またはIP3Rが結合するアミノ酸部位を含むIP3R結合部位含有領域、つまりアミノ酸部分配列領域であることからなるIP3R結合タンパク質を提供することを目的としている。【０００９】  この発明は、その更に好ましい態様として、該IP3R結合部位含有領域が、マウスKRAPタンパク質の２００番目から２１８番目の１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列領域であること、またはマウスKRAPタンパク質以外の動物種由来のKRAPタンパク質の場合、上記マウスKRAPタンパク質のアミノ酸配列領域に対応するアミノ酸配列領域であることからなるIP3R結合タンパク質を提供することを目的としている。【００１０】  この発明は、その更に好ましい態様として、該イノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質または前記IP3R結合部位含有領域のアミノ酸一次構造もしくは高次構造情報に基づいて合成される構造模倣化合物であることを特徴とするイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質を提供することを目的としている。【００１１】この発明は、その別の形態として、該IP3R結合タンパク質またはその結合部位含有領域を主成分とすることを特徴とする細胞内カルシウムイオン調節剤、たとえばIP3R機能調節剤、IP3R活性阻害剤またはIP3R活性化剤を提供することを目的としている。【００１２】この発明は、更に別の形態として、KRAPタンパク質とIP3RとのKRAP−IP3Rタンパク複合体もしくはIP3R結合部位含有領域を調製することまたはその結合能を検出することによってそのKRAP−IP3Rタンパク間の相互作用を阻害する物質をスクリーニングするアッセイ方法を提供することを目的としている。【００１３】  また、この発明は、KRAPタンパク質を過剰発現するIP3R結合タンパク質を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供することを目的としている。また、この発明は、IP3R結合タンパク質を含むベクターを提供することを目的としている。【００１４】なお、本明細書において使用する「イノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体（IP3R）結合タンパク質」またはこれに関連する用語は、IP3Rタンパク質と、KRAPタンパク質などのタンパク質とのタンパク質同士の結合したKRAP−IP3Rタンパク質複合体に加えて、IP3Rタンパク質とKRAPタンパク質などのタンパク質とを構成する塩基配列ならびにアミノ酸配列同士の結合したKRAP−IP3Rタンパク質複合体をも包含するものと解釈すべきである。【００１５】  また、本明細書において使用する「結合タンパク質」ならびにこれに関連する用語に使用する「結合」という用語は、タンパク質の他に、塩基配列またはアミノ酸配列同士が分子間作用によって会合などの形式で結合をしていることを意味している。
【課題を解決するための手段】
【００１６】  上記目的を達成するために、この発明は、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体（IP3R）結合タンパク質、好ましくはイノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体（IP3R）結合タンパク質を提供する。【００１７】  この発明は、その好ましい態様として、IP3Rが結合するタンパク質を構成するアミノ酸配列が、全長であっても、またはIP3Rが結合するアミノ酸部位を含むIP3R結合部位含有領域、つまりアミノ酸部分配列領域であることからなるIP3R結合タンパク質を提供する。【００１８】  この発明は、その更に好ましい態様として、該IP3R結合部位含有領域が、マウスKRAPタンパク質の２００番目から２１８番目の１９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列領域であること、またはマウスKRAPタンパク質以外の動物種由来のKRAPタンパク質の場合、上記マウスKRAPタンパク質のアミノ酸配列領域に対応するアミノ酸配列領域であることからなるIP3R結合タンパク質を提供する。【００１９】  この発明は、その更に好ましい態様として、該イノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体結合タンパク質または前記IP3R結合部位含有領域のアミノ酸一次構造もしくは高次構造情報に基づいて合成される構造模倣化合物であることからなるIP3R結合タンパク質を提供する。【００２０】この発明は、その別の形態として、該IP3R結合タンパク質またはその結合部位含有領域を主成分とすることを特徴とする細胞内カルシウムイオン調節剤、たとえばIP3R機能調節剤、IP3R活性阻害剤またはIP3R活性化剤を提供する。【００２１】この発明は、更に別の形態として、KRAPタンパク質とIP3RとのKRAP−IP3Rタンパク複合体もしくはIP3R結合部位含有領域を調製することまたはその結合能を検出することによってそのKRAP−IP3Rタンパク間の相互作用を阻害する物質をスクリーニングすることができるアッセイ方法を提供する。【００２２】  また、この発明は、別の態様として、KRAPタンパク質を過剰発現するIP3R結合タンパク質を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。さらに、この発明は、さらに別の態様として、IP3R結合タンパク質を含むベクターを提供する。
【発明の効果】
【００２３】現在、IP3Rの活性を阻害するものとしては、ヘパリン、ゼストスポンジン(Xestospongin) ならびに２−アミノエトキシジフェニルボレート (2-Aminoethoxydiphenyl borate: 2-APB)が知られている。ヘパリンは、Gタンパクシグナルの脱共役やリアノジン受容体の活性化なども引き起こし、特異性の点で問題がある。また、膜透過性が無いため細胞内への注入が必要である。ゼストスポンジンは、海綿由来のアルカロイドであるため高価である。また、Ca2+シグナリングの阻害効果の報告があるが、その作用機序は明確でない。2-APBは、小胞体貯蔵からのCa2+放出抑制能の他に、形質膜上の容量依存性チャネルにも作用し、特異性の面で問題がある。それに対して、この発明のIP3R結合タンパク質は、KRAPタンパク質などのタンパク質がIP3Rに分子間作用することにより、IP3Rの機能を調節するという作用効果を有しているところから、従来知られているような上記IP3R活性阻害剤とは作用効果が異なる新たなIP3R活性阻害剤になりうると期待できる。【００２４】さらに、この発明は、KRAPタンパク質などのタンパク質のアミノ酸配列ならびにそのIP3R結合部位含有領域のアミノ酸一次構造もしくは高次立体構造を模した物質によってIP3R機能調節剤、更には細胞内カルシウムイオン濃度調節剤の開発に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、樹立したトランスジェニックマウスの尾から調製したゲノムDNAをテンプレートとしてex Taq酵素によるPCRを行った結果を示す図である。
【図２】図２は、トランスジェニックマウスの各組織から調製したタンパク溶液をウェスタンブロットし抗HA抗体で検出した結果を示す図である。
【図３】図３は、肝臓においてKRAPの過剰発現量を野性型のものと比較した図を示す。
【図４】図４は、過剰発現KRAPタンパクの肝臓での局在を抗HA抗体を用いた免疫組織染色で調べた結果を示す図である。
【図５】図５は、野生型（WT）マウスおよびトランスジェニック (TG) マウスの肝臓から調製されたHA-matrix結合画分をSDS-PAGEで展開し銀染色した像を示す図である。
【図６】図６は、共精製したタンパクバンドの質量分析機での解析結果を示す図である。
【図７】図７は共精製産物のウェスタンブロットを示す図である。
【図８】組織（肝臓・腎臓・褐色脂肪組織（BAT）・膵臓）のタンパク抽出物からの抗KRAP抗体による免疫沈降産物についてのウェスタン法による結果を示す図である。
【図９】培養細胞（HCT116・Hela）のタンパク抽出物からの抗KRAP抗体による免疫沈降産物についてのウェスタン法による結果を示す図である。
【図１０】図１０は、タンパクの共局在を観察するために、培養細胞（HEK293細胞）を免疫細胞染色した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、KRAP遺伝子発現抑制細胞および非抑制細胞における ATP終濃度1μM、3μMおよび10μM刺激でのカルシウムインジケーター蛍光シグナル経時変化の代表例を示す図である。なお、図中、上側がscramble siRNA処理細胞を示し、下側がKRAP抑制細胞を示す。
【図１２】図１２は、ATP終濃度1μM、3μMおよび10μMでのATP刺激後の最大蛍光値の比較を示す図である。なお、図中、左側がscramble siRNA処理細胞を示し、右側がKRAP抑制細胞を示す。
【図１３】図１３は、ATP刺激前を１として最大蛍光値をその比で示した最大蛍光上昇度（Mean peak amplitude）を示す図である。なお、図中、左側がscramble siRNA処理細胞を示し、右側がKRAP抑制細胞を示す。
【図１４】ATP刺激後（ATP刺激3秒後から25.5秒まで）の蛍光値の積算を示した刺激後全蛍光値（total fluorescence value after stimulation）を示す図である。なお、図中、左側がscramble siRNA処理細胞を示し、右側がKRAP抑制細胞を示す。
【図１５】図１５は、HEK293細胞でのKRAP発現抑制を表すウェスタンブロット図である。
【図１６】図１６は、マウスＫＲＡＰタンパク質の模式図である。図中、上から順に、全長、コイルドコイル領域（９８８−１２５２）のみの欠損変異体コンストラクト、コイルドコイル領域を欠損した欠損変異体コンストラクトＫＲＡＰ（１−９４２）、Ｎ末端領域を少しずつ短縮した欠損変異体コンストラクトＫＲＡＰ（１−３１８、１−２３６、１−２１８、１−１９８）であり、それぞれＮ末端またはＣ末端にはＨＡタグが付加されている。
【図１７】図１７は、HEK293細胞におけるKRAPの全長および各欠損変異体とIP3R1との結合能を示す電気泳動図である。
【図１８】図１８は、HCT116細胞におけるKRAPの全長および各欠損変異体とIP3R1との結合能を示す電気泳動図である。
【図１９ａ】図１９ａは、実施例５で同定したIP3Rとの結合に重要なKRAPタンパク領域である１９アミノ酸長の領域についてのマウスKRAPならびにヒトKRAP のアミノ酸配列を示す。
【図１９ｂ】図１９ｂは、点変異体のIP3R1との結合能を示す電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】この発明は、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸受容体（IP3R）結合タンパク質、IP3R結合タンパク質を含むたとえばIP3R機能調節剤、IP3R活性阻害剤、IP3R活性化剤などの細胞内カルシウムイオン濃度調節剤、およびIP3R結合タンパク質を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関するものである。
【００２７】この発明に係るIP3R結合タンパク質は、IP3Rタンパク質と、KRAPタンパク質などのタンパク質とが分子間作用によって結合した形態で非ヒト哺乳動物の様々な組織や細胞に幅広く存在している。
【００２８】まず、イノシトール−１，４，５−トリスリン酸（IP3）ならびIP3がリガンドとして結合するIP3受容体（IP3R）について説明する。IP3は、ホルモンや成長因子、神経伝達物質などの多くの細胞外刺激に反応し産生されるシグナル伝達分子であり、細胞内のカルシウムイオン貯蔵庫であるオルガネラ（主に小胞体）からのカルシウムイオン放出を誘導することで様々なカルシウムイオンに依存する細胞機能を調節するセカンドメッセンジャーである。また、IP3は、例えば、分泌、受精、筋収縮、神経シグナル伝達および細胞成長などの種々の細胞機能の制御に重要な役割を演じている（Berridge, M., et al., Nature, 361, 315, 1993; Claphem, D. E., Cell, 80, 259, 1995）。
【００２９】  このIP3は、カルシウムイオン貯蔵庫である小胞体などの膜上に存在するIP3Rにリガンドとして結合して、IP3Rを活性化し、カルシウムイオン放出を生起して細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる作用を有している。カルシウムイオンは、細胞内の情報伝達物質として重要な機能を果たしていて、細胞内のカルシウムイオンの濃度は、通常、細胞外の約１万分の１と極めて低く保たれていて、このカルシウムイオンの濃度変化は、細胞分裂、細胞死、受精、発生などのさまざまな細胞応答に関与している。
【００３０】一方、IP3受容体（IP3R）は、ヒト、マウスなどの哺乳動物の脳、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、胸腺などの種々の組織や細胞に広く分布していると共に、神経や筋肉などの興奮性細胞だけでなく、非興奮性細胞にも幅広く存在していて、多岐に亘る生命現象に関与している。IP3Rは、４量体の細胞内IP3誘導性Ｃａ２＋放出チャンネル（IP3-gated Ca++ Release Channel）であり、３つの機能的に異なる領域、つまり、Ｎ末端近傍にIP3結合ドメイン、Ｃ末端近傍に６回膜貫通領域を有するチャネル形成ドメイン、およびこれら２つの領域の間に制御領域からなっている。IP3Rは、これまでにIP3Rの脳内局在について詳しく調べられていて、タイプ１、２、３がいずれも脳に存在していることが分かっている。そのうちでも、特にタイプ１のIP3R（IP3R１）は小脳のプルキンエ細胞に非常に多く存在し、強い染色を示すことが知られている。
【００３１】この発明に係るIP3R結合タンパク質は、IP3RにKRAPタンパク質などのタンパク質が分子間作用により結合した結合タンパク質の１種である。たとえば、IP3R結合KRAPタンパク質は、本発明者によって新たに作出されたKRAPタンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト哺乳動物の各種組織（例えば肝臓組織など）や細胞から共精製などにより得ることができる。なお、ヒトKRAPの塩基配列は配列番号１、ヒトKRAPのアミノ酸配列は配列番号２、マウスKRAPの塩基配列は配列番号３、マウスKRAPのアミノ酸配列は配列番号４、ヒトIP3Rの塩基配列は配列番号５、ヒトIP3Rのアミノ酸配列は配列番号６、マウスIP3Rの塩基配列は配列番号７、マウスIP3Rのアミノ酸配列は配列番号８で表している。
【００３２】この発明において使用するIP3Rに結合する例えばマウスKRAPタンパク質（配列番号３）は、１，２５２個のアミノ酸長からなっていて、Ｃ末端領域はコイルドコイル構造をとっていると推定されている。そこで、この発明においては、IP3R結合KRAPタンパク質は、その全長ばかりではなく、その全長よりも短いIP3R結合部位を含むIP3R結合部位含有部分領域もIP3R結合KRAPタンパク質のアミノ酸配列全長のような活性を有する場合、そのIP3R結合部位含有部分領域もまたこの発明の範囲に当然包含されるものと理解できる。そのため、KRAPの欠損変異体とIP3Rとの結合能を調べることによって、IP3Rとの結合に重要なKRAPタンパク領域を決定することができる。つまり、たとえば、HEK293細胞にKRAP全長または欠損変異体をIP3Rと共に発現させ、タンパク抽出物を抗ＨＡ抗体で免疫沈降し、IP3Rが共沈降するかどうかを調べることによってKRAPの欠損変異体とIP3Rとの結合能を調べることができる。このようにして特定されたIP3R結合部位含有部分領域としては、マウスKRAPタンパク質のアミノ酸番号２００〜２１８番目の１９個のアミノ酸長の領域がIP3Rとの結合に重要な領域と考えられることから、この領域を含むアミノ酸長を有する領域もこの発明の範囲に包含されるものと理解できる。
【００３３】上述したように、マウスKRAPタンパク質においては、そのアミノ酸番号が２００〜２１８番目の１９個のアミノ酸長の領域がIP3Rとの結合に重要な領域と考えられる。その他のヒトなどの由来によるKRAPタンパク質においても、マウスKRAPタンパク質のIP3R結合領域に対応する領域がIP3R結合に重要な領域と考えられる。
【００３４】また、この発明に係るIP3R結合KRAPタンパク質であるIP3R−KRAPタンパク質複合体またはそのIP3R結合部位含有領域のアミノ酸一次構造や高次構造情報に基づいて合成される構造模倣物や化合物などは、IP3R結合KRAPタンパク質またはそのIP3R結合部位含有領域と実質的に同等の機能ならびに作用効果を有していることから、これらの構造模倣物も化合物も当然のことながらこの発明の範囲に包含されるものと理解すべきである。
【００３５】この発明によって得られるIP3R結合KRAPタンパク質ならびにそのIP3R結合KRAPタンパク質のアミノ酸部分配列領域を有する物質は、細胞内カルシウムイオン濃度調節剤、たとえばIP3R機能調節剤、IP3R阻害剤またはIP3R活性化剤などの開発に利用することができる。
【００３６】さらに、この発明によって、KRAPタンパク質とIP3RとのKRAP−IP3Rタンパク複合体を調製することまたはその結合能を検出することによってそのKRAP−IP3Rタンパク間の相互作用を阻害する物質をスクリーニングするためのアッセイ方法としても利用することができる。
【００３７】この発明で作製可能な非ヒト哺乳動物としては、技術的には全ての哺乳動物種を対象とすることが可能であるが、例えば、サル、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスター、マウスなどが挙げられるが、作製、育成および使用の簡便さなどの観点から、モルモット、ラット、ハムスター、マウスなどのげっ歯類が好ましく、特に近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが最適である。
【００３８】ここで、この発明に係るトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法について説明するが、以下の説明において、説明を簡潔にするために、非ヒト哺乳動物としてマウスを例として説明する。しかし、当然のことながら、この発明は、マウスに何ら限定されるものではなく、特段の説明がない場合には、その他の非ヒト哺乳動物にも同様に適用できることは言うまでもない。
【００３９】この発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、当該技術分野で慣用されている既知の方法に従って、目的とする遺伝子を非ヒト哺乳動物に導入して作出することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77; 7380-7384, 1980参照）。
【００４０】トランスジェニックマウスを作出するためには、まず、導入遺伝子を調製する必要がある。導入遺伝子であるKRAP遺伝子としては、cDNAを用いるのがよい。このKRAP cDNAは、公知のマウスcDNA配列やヒトcDNA配列の任意の塩基配列部分に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて cDNAライブラリーをスクリーニングする方法や、正常細胞や培養細胞などから単離したmRNAを採取し、登録されているKRAP cDNA の塩基配列を元に、目的とするcDNA断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして合成し、これらのブライマーを用いてRT-PCR法により調製することもできる。なお、これらのプライマーの5"、3’ 部位には、下記で説明する発現ベクターの挿入部位にあわせて適切な制限酵素配列などを付加しておくのがよい。また、この導入遺伝子には、その発現を制御するためのプロモーター配列やエンハンサー配列を連結することもできる。このプロモーター配列やエンハンサー配列には、特に制限はなく、遺伝子導入動物の各種臓器において高度に発現する遺伝子のプロモーター領域やエンハンサー領域などを適宜に選択して用いることができる。
【００４１】なお、一般に、生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において、１個もしくは数個の少数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または追加された場合でも、その生理活性は維持されることは当業者において広く知られている。したがって、既知のKRAPのアミノ酸配列の少数のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは追加されたアミノ酸配列を有し、かつ、本来のKRAP活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も同様に利用することができる。
【００４２】上記導入遺伝子クローニングで取得された遺伝子は、発現効率を高めるために、適当なプロモーターを含む発現ベクターに導入することによって発現コンストラクトを作成することができる。この場合、導入遺伝子は、適切な哺乳動物用プロモーターの下流に連結した組換え遺伝子を使用するのがよく、さらに該遺伝子の下流にポリAシグナルを連結するのがよい。また、上記組換え遺伝子には、上記ペプチドをコードする遺伝子の発現に必要なターミネーターを連結していてもよく、目的とするmRNA の転写を終結する配列（いわゆるポリA）として使用することもできる。
【００４３】上記プロモーターおよびポリＡシグナルの種類は、特に制限されないが、例えば、サイトメガロウィルス、JCウィルス、乳癌ウィルス等のウイルス由来のプロモーター、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等の各種哺乳動物由来のプロモーターなどが使用できる。なお、プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス・エンハンサーとニワトリ―β―アクチン・プロモーターとを繋いだ構造と、ウサギβ―グロビン遺伝子のポリAシグナルサイトを含む pCAGGS ベクター、いわゆるCAGプロモーターが、目的遺伝子をほぼ全身性に過剰発現させることができるので好ましい。また、上記ターミネーターとしては、例えば、シミアンウィルスの SV40 ターミネーターなどが使用できる。
【００４４】このようにして作製した発現コンストラクトは、大腸菌に注入され、その大腸菌を培養することにより増幅し、精製した後、シークエンサーで塩基配列が正しいことを確認するのがよい。
【００４５】  上記のようにして作製した発現コンストラクトは、通常、マウスなどの非ヒト哺乳動物の受精卵の雄、雌由来の核が融合する前の前核の１つに、マイクロインジェクション装置を用いて注入することによって、目的とする遺伝子の導入を行うことができる。目的遺伝子の導入に当たっては、調製したプラスミド（コンストラクト）を、環状の状態で、または直線状にしたものを用いることができるが、通常は、構造遺伝子領域およびプロモーター等の発現調節領域を破壊しない形で直線化して導入するのがよい。このように目的遺伝子を導入した受精卵を偽妊娠雌性マウスに移植し、仔マウスを分娩させることによりトランスジェニックマウスを作製することができる。
【００４６】上記のようにマウス受精卵に目的遺伝子を導入する方法の他に、動物細胞への目的遺伝子の導入方法としては、ES細胞に導入する方法、培養細胞に導入した細胞核を移植することにより受精卵に導入する方法なども用いることができる。この方法では、目的遺伝子DNAを組み込んだベクターを、エレクトロポレーション、リポフェクションなどの当該技術分野で常用されている手法によってES細胞や培養細胞などに導入し、ネオマイシン、プロマイシンなどでポジティブ選択した後、目的の導入細胞を得ることができる。ES細胞は、マウスの胚胎盤胞または８細胞期胚にマイクロインジェクションなどにより注入する。また、核移植は、目的遺伝子DNAが導入された細胞を、核を除去した受精卵に注入し、電気刺激で細胞融合することによって行うことができる。
【００４７】上記のようにしてES細胞が注入された胚胎盤胞または８細胞期胚は、直接仮親の卵管に移植するか、１日培養して胚盤胞まで発生したものを仮親の子宮に移植する。仮親を飼育し、仔マウスを出産させて、目的遺伝子が導入されたトランスジェニック動物（キメラ動物）を得ることができる。このように出産させた仔マウスが導入遺伝子を保持しているか否かの確認は、マウスの組織の一部（例えば尾部先端）から、体細胞中のジェノミックDNAを抽出し、PCR法やサザンブロット法で行うことができる。例えば、マウスの尾から調製したジェノミックDNAをテンプレートとして適切なプライマーを用いてex Taq酵素によるPCR反応を行って、仔マウスが導入遺伝子を保持しているか否かを確認することができる。
【００４８】出産仔マウスが保持している導入遺伝子は、全ての細胞に等量存在するが、この遺伝子が目的の組織に発現しているか否かは、RT-PCRによって、RNAとして発現していることを調べることによって確認することができる。さらに、導入遺伝子が、タンパク質として産生されているか否かは、該タンパク質や、その部分ペプチドに対する抗体を用いて、イムノブロッティングによって確認することができる。
【００４９】上記のようにして導入遺伝子が過剰発現していることが確認された個体を初代（Founder）とすれば、この初代のトランスジェニック動物と正常動物とを交配させると、ヘテロ接合体動物（F1）が得られ、このヘテロ接合体同士を交配させることによりホモ接合体動物（F2）が得られる。さらに、同種の動物とを交配させて通常の飼育環境で継代繁殖させることにより、この目的遺伝子を安定に生殖系列に保持させることができる。
【００５０】この発明に係るIP3R結合タンパク質は、上記の方法によって作製された目的遺伝子が過剰に発現しているマウスの臓器組織、例えば肝臓組織を共精製することによって同定することができる。かかる共精製方法としては、例えば、目的タンパク質に対する抗体を用いた免疫沈降法などを使用するのがよい。これにより、マウス生体組織由来または細胞株由来のタンパク質抽出物より内在性タンパク質と内在性IP3Rとが結合していることを確認することができる。
【００５１】以下に、この発明に係るIP3R結合タンパク質およびIP3R結合タンパク質を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物について、実施例により更に詳細に説明するが、この発明は、下記実施例で一切限定されるものではなく、また下記実施例はこの発明を限定する意図で記載されるものでは一切ないことも理解されるべきである。また、この発明には、本明細書ならびに下記実施例から容易に類推できるあらゆる変形や修飾などもまたこの発明の範囲に含まれるものと理解されるべきである。
【実施例１】
【００５２】マウスKRAPコーディング領域全長をpCAGGSベクター（Gene 1991, Niwa H et al.）のXhoI-Bgl II部分に挿入し発現コンストラクトを作成した。なお、コーディング領域の5"部分には制限酵素XhoI 認識配列とマウスKRAPの５"配列10bを付加し、3"部分にはHAタグとストップコドンおよび制限酵素BamHI認識配列を付加した形でインサートの作成を行った。使用したフォワードプライマーおよびリバースプライマーは以下の通りであり、アクセッション番号AB120565に登録されているマウスKRAP cDNAを鋳型にしてLA-taq酵素 (Takara)によるPCR反応でインサートを作成した。【００５３】フォワードプライマー（配列番号９）5"-gggctcgagcggcgcggccatgaaccgacccctgtcg-3"リバースプライマー（配列番号１０）5"-gggggatcctcaagcgtaatctggaacatcgtatgggtagtggctgtcctgcttaggacc-3"
【実施例２】
【００５４】マウスKRAPコーディング領域全長をＣ末端にＨＡタグを付加させた形でpcDNA/V5/GW/D-TOPO ベクター (Invitrogen) にクローニングし発現コンストラクトを作製した。下記のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、アクセッション番号 AB120565 に登録されているマウスKRAP cDNA を鋳型としてLA-taq 酵素 (Takara) によるPCR反応でインサートを作成した。【００５５】フォワードプライマー（配列番号１１）5"-caccatgaaccgacccctgtcg-3"リバースプライマー（配列番号１２）5"-ctactaagatctctaagcgtagtctgggacgtcgtatgggtagtggctgtcctgcttagg-3"
【実施例３】
【００５６】欠損変異体は、マウスKRAPのアミノ酸残基988-1252（コイルドコイル領域のみ）、アミノ酸残基1-942、アミノ酸残基1-318、アミノ酸残基1-236、アミノ酸残基1-218およびアミノ酸残基1-199の領域をコードするDNAフラグメントをPCRで調製し、それぞれpCMV-HAベクター（クロンテック社）のクローニングサイトSalI-NotIにクローニングすることで作成した。ベクターに含まれるN末端HAタグと読み枠を合わせて繋げ、KRAPフラグメントのC末端に停止コドンを入れた形で構築した。
【実施例４】
【００５７】点変異体は、上述のpcDNA/V5/GW/D-TOPOベクターに作成したKRAPコーディング領域全長コンストラクトをもとに、第一アミノ酸から数えて202番目のフェニルアラニンおよび203番目のフェニルアラニンをそれぞれ１つずつアラニンに置換したF202A変異体およびF203A変異体と、この2残基をアラニンに置換したF202A/F203A変異体を、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO社)で作成した。使用したプライマーは以下の通りである。【００５８】フォワードプライマー(F202A用)  （配列番号１３）5"-gcatttaattcatcatcctttgccagaggc-3"リバースプライマー(F202A用)（配列番号１４）5"-tctggaaggaattttagaagcaatatctg-3"フォワードプライマー(F203A用)（配列番号１５）5"-gcaaattcatcatcctttgccagaggc-3"リバースプライマー(F203A用)（配列番号１６）5"-aaatctggaaggaattttagaagcaat-3"フォワードプライマー(F202A/F203A用)（配列番号１７）5"-gcagcaaattcatcatcctttgccagaggc-3"リバースプライマー(F202A/F203A用)（配列番号１８）5"-tctggaaggaattttagaagcaatatctg-3"【００５９】  図１６には、マウスＫＲＡＰタンパク質の模式図が示されていて、図中、上から順に、全長、コイルドコイル領域（９８８−１２５２）のみの欠損変異体コンストラクト、コイルドコイル領域を欠損した欠損変異体コンストラクトKRAP（１−９４２）、Ｎ末端領域を少しずつ短縮した欠損変異体コンストラクトＫＲＡＰ（１−３１８、１−２３６、１−２１８、１−１９９）が示されていて、それぞれのＮ末端またはＣ末端にはＨＡタグが付加されている。
【実施例５】
【００６０】本実施例は、IP3R1との結合に重要なKRAPタンパク領域を決定するためのタンパク・タンパク間相互作用を調べる実験である。この実験では、KRAPの各欠損変異体とIP3R1との結合能を検討した。HEK293細胞に全長または各欠損変異体をIP3R1と共に発現させ、蛋白抽出物を抗HA抗体で免疫沈降し、IP3R1が共沈降するかどうかを検討した。【００６１】つまり、HEK293細胞に、IP3R1全長-GFP発現プラスミドと、上記で作成したKRAP全長、欠損変異体、または点変異体発現プラスミドをそれぞれリポフェクトアミンLTX(Invitrogen社)にて共導入し、24時間培養後に、抽出バッファー(50mM Tris-HCl,pH7.5, 140mM NaCl, 0.5% NP40, 0.25M NDSB-201(Calbiochem社), protease inhibitors(Complete EDTA-free, ロシュ社)）中でホモジナイズし、15,000rpm, 30min遠心後の上清を得た。この蛋白抽出物をHAマトリックス（ロシュ社）で免疫沈降することで各KRAP蛋白と結合しているIP3R１−GFPタンパクを共沈降させ、沈降物中のIP3R１−GFPタンパクの有無をウェスタンブロット法で検出した。抗ＧＦＰ抗体はウサギポリクローナル抗体（クロンテック社）を使用した。HCT116細胞での実験では、IP3R１−GFPタンパクをトランスフェクトせず、内在性のIP3R3タンパクの共沈降の有無を検討した。抗IP3R3抗体はマウスモノクローナル抗体（BD transduction laboratory社）を使用した。【００６２】本実施例によるHEK293細胞におけるKRAPの全長および各欠損変異体とIP3R1との結合能の結果を図１７に示す。図に示すように、各欠損変異体タンパクは、HAマトリックスによる免疫沈降（IP）画分において、ほぼ同等量回収されている。また、IP3R1がそれらと共沈降しているかどうかを調べたところ、全長KRAPおよび１〜９４２番目のアミノ酸領域でIP3R1が共に沈降したが、コイルドコイル部分に対応する９８８〜１２５２番目のアミノ酸領域は沈降しなかったことが分かった。このことから、KRAPのN末部分に結合領域が存在することが分かる。そこで、さらにN末部分を徐々に短くした変異体について検討したところ、１〜２１８番目のアミノ酸領域は結合能を保持しているのに対して１〜１９９番目のアミノ酸領域は結合能を無くしていることが判明した。このことから、２００〜２１８番目のアミノ酸領域の１９アミノ酸長の領域がIP3R1との結合に重要な領域であることが示唆された。
【実施例６】
【００６３】本実施例では、IP3Rは、タイプ１、２ならびに３と異なる遺伝子から成るファミリーの存在が知られており、細胞・組織によって発現しているタイプが異なることから、KRAPタンパクがタイプ１以外のIP3Rとの結合能を有しているかどうか、並びに、結合様式がタイプ１とのそれと共通かどうかを検討した。つまり、HCT116細胞に、各欠損変異体のみを発現させて、内在性のIP3Rタイプ３の共沈降実験を、実施例５と同様の方法で行った。その結果、KRAPのN末部分のアミノ酸番号１〜２１８番目のアミノ酸領域はタイプ３タンパクとの結合能を有しているのに対し、アミノ酸番号１〜１９９番目のアミノ酸領域は結合能が無かったことから、タイプ１タンパクとの相互作用様式で他のタイプのIP3Rとも相互作用することが明らかになった。図１８に、HCT116細胞におけるKRAPの全長および各欠損変異体とIP3R1との結合能の結果を示す。
【実施例７】
【００６４】本実施例では、実施例５で同定したIP3Rとの結合に重要なKRAPタンパク領域である１９アミノ酸長の領域について結合実験を行った。図１９ａは、上記１９アミノ酸長の領域についてのヒトKRAP のアミノ酸配列202−220（配列番号１９）ならびに対応するマウスKRAPのアミノ酸配列200−218（配列番号２０）を示す。これらのマウスKRAPならびにヒトKRAP のアミノ酸配列から、２種間においてそのアミノ酸配列がよく保存されていることが分かる。また、マウスKRAPならびにヒトKRAP のアミノ酸配列の下には、本実施例で用いた点変異体の変異部位を示した。N末端から数えて２０２番目のフェニルアラニン（F）および２０３番目のフェニルアラニンを共にアラニン（A）に置換した変異体(Mouse KRAP F202A/F203A mutant；配列番号２１)、またはどちらか一方を置換した変異体(Mouse KRAP F202A mutant：配列番号２２またはMouse KRAP F203A mutant：配列番号２３)である。図中、下線を引いたA（Ala）が野生型(wild)ではF（Phe）であった部分である。【００６５】IP3Rとの結合に重要なKRAPのアミノ酸を決定するために、上記点変異体を用いた結合実験を実施例５と同様に行った。つまり、HEK293細胞に野生型または各点変異体をIP3R1と共に発現させ、タンパク抽出物をHAマトリックスで免疫沈降し、IP3R1が共沈降するかどうかを調べた。その結果、２０２番目のフェニルアラニン（Phe）がアラニン（Ala）に置換された変異体においてIP3Rとの結合能が顕著に消失していた。
【実施例８】
【００６６】本実施例では、プラスミドをBamHI で消化して得られた6.2 kbpのDNAフラグメントを、マイクロインジェクションで受精卵に注入した。この受精卵を偽妊娠雌マウスの子宮に移植し、仔マウスを出産させた。出産仔マウスに導入遺伝子が保持されているか否かは、マウスの尾から調製したジェノミックDNAを取り、そのDNAをテンプレートとして以下のプライマーを使用してex Taq酵素（Takara）によるPCRで確認した。【００６７】フォワードプライマー（配列番号２４）5"-gtcacagagctaatgcggga-3"リバースプライマー（配列番号２５）5"-cttcacactgcagttgagtc-3"およびリバースプライマー（配列番号２６）5"-ggcttcatgatgtccccat-3"【００６８】出産した仔マウスが目的遺伝子を保持していることを確認後、その仔マウスを、上記方法に従って交配させて、C57BL/6J Jclとしてマウスの系統を樹立した。【００６９】図1は、樹立したトランスジェニックマウス尾から調製したゲノムDNAをテンプレートとして上記プライマーでex Taq酵素によるPCRを行った結果を示す。この図１から、野生型（WT）では892bp、トランスジェニックマウス（TG）では636bpのPCR産物が増幅され、それぞれ予想されるサイズのフラグメントであることが明らかになった。【００７０】作出したトランスジェニックマウスの各組織または細胞を抽出バッファー（50mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、1％ NP40、0.5％デオキシコレート（deoxycholate）, 0.1％ SDS、プロテアーゼインヒビター (Complete EDTA-free, ロシュ社) 中でホモジナイズし、15,000 rpmで30分間遠心した後、その上清を回収し全抽出タンパク質（total lysate）を得た。このように調製したタンパク質溶液は、常法に従ってウェスタンブロット法によりタンパク質を検出した。つまり、上記タンパク質溶液を、SDS−PAGEにて展開し、ニトロセルロース膜またはPVDF膜に転写した後、その膜を抗HA抗体で免疫染色してタンパク質を検出した（図２）。ここで、1次抗体としては、Anti-HA (3F10クローン、ロシュ社)、Anti-KRAP (J.Hum.Genet.2007, Fujimoto T. et al.)、Anti-IP3R1 (Sigma社)、Anti-phospho-IP3R (Ser1756; Cell Signaling社)、Anti-phospholipase Cγ(サンタクルーズ社)、Anti-actin (Sigma社) 、また2次抗体としてはHRP標識抗体を用いた。検出法としてはECL試薬（GEヘルスサイエンス社）による化学発光法を用いた。【００７１】図２は、トランスジェニックマウスの各組織から調製したタンパク溶液をウェスタンブロットし抗HA抗体で検出した結果を示す。図２に示す結果から、肝臓、膵臓、骨格筋、褐色脂肪組織において比較的強いKRAP-HAタンパクの発現が、腎臓、脾臓、前脳において弱い発現が確認できた。また、肝臓においてKRAPの過剰発現量を野性型のものと比較したところ、TGマウスでは4倍弱の発現増強が認められた（図３）。【００７２】過剰発現させたKRAPタンパクの肝臓での局在を抗HA抗体による免疫組織染色で調べた。マウス肝臓は、OCTコンパウンド（サクラ社）中で凍結し、クリオスタットで凍結切片を作成した。この切片を、4％PFAで固定した後、ブロッキング溶液（5％ウシ血清、20mM Tris-HCl (pH7.5)、150 mM NaCl、0.1％Tx-100）でブロッキングし、Anti-HA（3F10クローン、ロシュ社）で染色した。2次抗体としては、Alexa Fluor 488標識抗ラット抗体（インビトロジェン社）、F-actin染色には、Phalloidin-Alexa Fluor 546（インビトロジェン社）を使用した。【００７３】この免疫組織染色で、過剰発現させたKRAPタンパクの肝臓での局在を抗HA抗体で調べた結果、肝臓でのKRAPタンパクの局在は、実質細胞の頂上面付近および基底・側方面付近に存在することが明らかになった。また、この局在は、本発明者が以前に報告した内在性KRAPの局在と一致しており（J.Hum.Genetics 2007, Fujimoto T. et al.）、過剰発現タンパクが本来機能する部分に存在しているものと考えられる。【００７４】次に、KRAPトランスジェニック（TG）マウスの肝臓抽出物を共精製して、KRAP結合タンパクを同定した。野生型（WT）マウスおよびKRAPトランスジェニック（TG）マウスから肝臓を採取し、抽出バッファー（50 mM Tris-HCl (pH7.5)、140mM NaCl、0.5％ NP40、0.25M NDSB-201(Calbiochem)、プロテアーゼインヒビター(Complete EDTA-free、ロシュ社)）中でホモジナイズし、18,500rpmで30分間遠心分離して上清を得た。その上清にAnti-HA Affinity Matrix（ロシュ社）を添加し、4℃で5時間転倒混和した。Affinity Matrixを抽出バッファーで洗浄後、PBSでさらに洗浄し、SDS-PAGEサンプルバッファーで煮沸して溶出画分を得た。溶出画分は、SDS-PAGEで展開後、SilverQuest （インビトロジェン社）を用いて銀染色し、KRAP-HAタンパクと共沈降したバンドを切り出して質量分析でタンパクを同定した。図５は、野生型（WT）マウスおよびトランスジェニック (TG) マウスの肝臓から調製されたHA-matrix結合画分をSDS-PAGEで展開し銀染色した像である。図５に示すように、TGマウスではHA-tagが付加されたKRAPタンパクのバンドと、KRAPと共精製されたバンドとが検出された。【００７５】  上記で共精製したタンパクバンドを質量分析機で解析したところ、イノシトール−１,４,５−トリスホスフェート１（IP3R１）のトリプシン消化物の質量と１３箇所で一致した（図６）。【００７６】  上記共精製産物をウェスタンブロットにかけたところ、抗IP3R抗体でバンドが検出されたことから、同バンドは確かにIP3R１であると確認された（図７）。【００７７】内在性のKRAPタンパク・IP3R１タンパク間の物理的な相互作用の有無を明らかにするために、組織（肝臓・腎臓・褐色脂肪組織（BAT）・膵臓）および培養細胞（HCT116・Hela）のタンパク抽出物から抗KRAP抗体による免疫沈降産物を得て、その沈降物にIP3R1タンパクが含まれるかどうかをウェスタンブロット法で検討した。組織および培養細胞の両方の系において有意なIP3R１タンパクのバンドが検出された（図８、９）。コントロールとして設けたコントロールIgGによる免疫沈降産物中にはIP3R１タンパクのバンドは検出されなかったことから、KRAPタンパクに結合するIP3R１タンパクが共沈降したものと考えられる。【００７８】マウス組織または培養細胞を抽出バッファー（50 mM Tris-HCl (pH7.5)、140 mM NaCl、0.5％ NP40、0.25M NDSB-201 (Calbiochem)、プロテアーゼインヒビター(Complete EDTA-free、ロシュ社)）中でホモジナイズし、18,500 rpmで30分間遠心分離して上清を得た。その上清にAnti-KRAP抗体（J.Hum.Genet.2007, Fujimoto T. et al.）またはコントロールウサギIgGを添加し4時間反応後、プロテインGセファロースを添加し、さらに1時間反応後、免疫沈降物を抽出バッファーで洗浄し、SDS-PAGEサンプルバッファーで煮沸して沈降タンパクを得た。【００７９】KRAPタンパクとIP3R１タンパクの細胞内共局在の有無を検討するために、HEK293細胞にHA-tagを付加したKRAPおよびGFP-tagを付加したIP3R１をトランスフェクトし、免疫細胞染���を行った。培養細胞（HEK293細胞）は、10％ウシ血清含有ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン（インビトロジェン社）を添加したDMEM（high glucose, インビトロジェン社）中で37℃、5％CO2条件下で培養した。コラーゲンコートしたカバーガラス上に細胞を播き、リポフェクトアミンLTX（インビトロジェン社）を用いてKRAP-HA発現プラスミドおよびIP3R1-GFP発現プラスミドを導入した。24時間培養後、細胞を4％PFAで固定し、5％ウシ血清、20mM Tris-HCl（pH7.5）、150mM NaCl、0.1％Tx-100でブロッキング後、Anti-HA(3F10クローン、ロシュ社)およびAnti-GFP（クロンテック社）と反応させ、2次抗体としてAlexa Fluor 488標識抗ウサギ抗体（インビトロジェン社）とAlexa Fluor 546標識抗ラット抗体（インビトロジェン社）を用いて蛍光染色した。この免疫細胞染色を行った細胞（HEK293細胞）を共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果、両タンパクの蛍光シグナルが良く一致しており共局在が観察された（図１０）。
【実施例９】
【００８０】マウス肝臓のtotal RNAを鋳型としてoligo-dTプライマーで逆転写反応することでcDNAライブラリーを作成した。そのcDNAを鋳型として、以下のプライマーでIP3R１コーディング領域全長をPCRで増幅し、pEGFP-N1ベクター（クロンテック社）のNheI-SalIサイトにC末GFPにフレームを合わせて挿入した。【００８１】フォワードプライマー（配列番号２７）：5"-ggggctagctcaggctttccaacacggacatgtct-3"リバースプライマー（配列番号２８）：5"-ggggtcgactgggccggctgctgtgggttgacat-3"
【実施例１０】
【００８２】KRAPタンパクとIP3R１タンパクの機能的相互作用が存在するかを検討するために、ATPリガンド依存的な小胞体からのカルシウムイオンの放出を観察した。具体的には、KRAP遺伝子発現をRNA干渉で抑制したHEK293細胞を用意し、カルシウムイオンインジケーターであるFluo4の蛍光シグナル強度をATP刺激前後で経時的に測定した。【００８３】  細胞内カルシウムイメージングは次のようにして行った。つまり、HEK293細胞をエレクトロポレーション法（MicroPorator MP-100 (Digital Bio)使用）で1nMステルスsiRNAオリゴヌクレオチドを導入し、96ウェルプレートに30,000個ずつの密度で10％ウシ血清含有ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン（インビトロジェン社）を添加したDMEM（high glucose, インビトロジェン社）に播き、37℃で5％CO2条件下で培養した。siRNA導入後40時間の時点で4μM Fluo4（インビトロジェン社）と5μM Hoechst 33342（インビトロジェン社）を同培養液中で37℃で50分間細胞に取り込ませ、その後Hank"s BSS（Ca2+, Mg2+-Free）に置換してIn Cell Analyzer 1000（GE社）で細胞内カルシウムイメージングを行った。なお、自動リガンド注入機を使用して終濃度1、3、10μM ATPを細胞に作用させ、経時的に蛍光撮影した。撮影した蛍光画像を解析ソフトIn Cell Analyzer 1000 Workstation 3.5で定量化したが、視野中の全細胞について核領域内のFluo4蛍光シグナルを数値化し、１細胞辺りの平均値を算出した。【００８４】なお、用いたsiRNAオリゴヌクレオチドは、本発明者が以前報告した論文で使用したものであり（J.Hum.Genet. 2007, Fujimoto T. et al.）、その配列は以下の通りである。KRAP #1, 5’-G GAG AAU GCU GAU AGU GAU AGA AUU-3’（配列番号２９）3’-C CUC UUA CGA CUA UCA CUA UCU UAA-5’（配列番号３０）Scramble RNA #1, 5’-G GAC GUA UAG UGU GAG AUA AAG AUU-3’（配列番号３１）3’-C CUG CAU AUC ACA CUC UAU UUC UAA-5’（配列番号３２）KRAP #2, 5’-C CAG CUA GGU CUU ACG AAG UCG AAA-3’（配列番号３３）3’-G GUC GAU CCA GAA UGC UUC AGC UUU-5’（配列番号３４）Scramble RNA #2, 5’-C CAU AGG UCU UAC GAA GUC GGC AAA-3’（配列番号３５）3’-G GUA UCC AGA AUG CUU CAG CCG UUU-5’（配列番号３６）【００８５】図１１は、KRAP遺伝子発現抑制細胞および非抑制細胞における ATP終濃度1μM、3μMおよび10μM刺激でのカルシウムインジケーター蛍光シグナル経時変化の代表例を示している。図１から明らかなように、いずれの濃度においてもKRAP抑制細胞の方が、コントロールであるscramble siRNA処理細胞より、蛍光強度が弱かった。なお、図中、上側がscramble siRNA処理細胞を示し、下側がKRAP抑制細胞を示す。【００８６】  図１２は、ATP終濃度1μM、3μMおよび10μMATPでの刺激後の最大蛍光値を比較したデータを示している。図１２から明らかなように、最大蛍光値は刺激後3秒または5.5秒時点で得られ、ATP終濃度1μMおよび3μMでの刺激時において有意な差が認められ、KRAP抑制細胞において減弱されていた。なお、図中、左側がscramble siRNA処理細胞を示し、右側がKRAP抑制細胞を示す。【００８７】  図１３は、ATP刺激前を１として最大蛍光値をその比で示した最大蛍光上昇度（Mean peak amplitude）を示す棒グラフにおいても、1μMおよび3μM ATP刺激時において有意な差が認められ、KRAP抑制細胞において減弱されていた。なお、図中、左側がscramble siRNA処理細胞を示し、右側がKRAP抑制細胞を示す。【００８８】  図１４は、ATP刺激後（ATP刺激3秒後から25.5秒まで）の蛍光値の積算を示した刺激後全蛍光値（total fluorescence value after stimulation）の棒グラフを示している。図１４では1μM、3μMおよび10μM ATP刺激の全ての条件において有意なKRAP抑制細胞での蛍光値減少が認められた。なお、図中、左側がscramble siRNA処理細胞を示し、右側がKRAP抑制細胞を示す。【００８９】上記の結果は、KRAPがIP3R１の機能を正に調節し、細胞内貯蔵からの細胞質へのカルシウムイオン放出に影響を及ぼすことを示している。【００９０】  図１５は、HEK293細胞でのKRAPの発現抑制をウェスタンブロットで確認した図である。図から明らかなように、IP3R１の発現量およびIP3R１のリン酸化度合に大きな変動を及ぼすものでは無かった。また、IP3R１へのシグナル伝達の上流に位置するホスホリパーゼC-γの発現量にも変化は無かった。【００９１】  上記のように、この発明により、マウス組織および培養細胞での免疫沈降実験によりKRAPタンパク質とIP3R１タンパク質の会合が示されるとともに、さらに細胞内局在も一致したことから、KRAPタンパク質とIP3R１タンパクとの物理的結合が証明された。また、IP3Rの機能的解析法として樹立されている細胞内カルシウム動態測定を行った結果、培養細胞でのKRAP発現抑制が細胞内貯蔵から細胞質へのカルシウムイオン放出を負に調節していることが確認された。これらの結果は、KRAPがIP3R１に結合することがIP3R１の正常な機能発揮に必要であることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００９２】この発明において、KRAPタンパクの一部配列や、それを応用したペプチド、あるいはKRAP発現・機能に作用する物質などはIP3RとKRAP間の相互作用に影響を及ぼし、結果としてIP3R機能調節剤として働く可能性が示された。IP3Rは、セカンドメッセンジャーの一つである細胞内カルシウムイオンを調節し、遺伝子発現や細胞の生死、神経機能、分泌小胞動態など多岐にわたる生命現象の調節に機能していると考えられている（J. Neurochem. 2007, Mikoshiba K.）。一方、KRAP欠損マウスは全身性のエネルギー恒常性異常、抗肥満・抗糖尿病の性質を示すことから(PLoS ONE 2009, Fujimoto et al.)、IP3Rの機能を正または負に調節する物質は、さまざまな生命現象を理解するための研究ツールとなるのみならず、疾患発症機序の理解や治療法の開発に繋がる可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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