(57)【要約】  新規なシグナルペプチドを提供するとともに、当該シグナルペプチドを用いて所望のタンパク質を効率的に蓄積することができる技術を提供する。  配列番号２に示すアミノ酸配列からなる、又は配列番号２に示すアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなる、又は配列番号２に示すアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸。
【請求項２】
上記ペプチドは、シグナルペプチドであることを特徴とする請求項１記載の核酸。
【請求項３】
上記シグナルペプチドは、小胞体移行シグナルペプチドであることを特徴とする請求項２記載の核酸。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれか一項記載の核酸と、当該核酸の下流に位置するタンパク質の成熟領域をコードする核酸とからなる遺伝子。
【請求項５】
上記タンパク質の成熟領域は、ナガイモ（Dioscorea batatas）のマンノース特異的レクチンの成熟領域であることを特徴とする請求項４記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項４又は５記載の遺伝子を、植物体内で発現可能なプロモーターの下流に配する発現ベクター。
【請求項７】
請求項４又は５記載の遺伝子を外来遺伝子として含有する形質転換植物。
【請求項８】
耐虫活性が付与されるか、増強されたことを特徴とする請求項７記載の形質転換植物。
【請求項９】
イネ科植物であることを特徴とする請求項７記載の形質転換植物。
【請求項１０】
イネであることを特徴とする請求項７記載の形質転換植物。
【請求項１１】
請求項４又は５記載の遺伝子を外来遺伝子として対象の植物に導入する工程を含む、耐虫活性の付与又は増強方法。
【請求項１２】
上記対象の植物がイネ科植物であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
上記対象の植物がイネであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺虫作用をもちマンノースを特異的に認識するレクチンをコードする遺伝子、詳細にはナガイモ（Dioscorea batatas）のマンノース特異的レクチンの遺伝子が有するシグナルペプチド、当該シグナルペプチドをコードするＤＮＡ及びこれを利用した害虫の防除方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
レクチンは、動物、植物、真菌および細菌等幅広い生物種に見出され、糖を特異的に認識して可逆的に結合するタンパク質である。レクチンについては、生理活性についても研究が展開されており、例えば、血液型の研究、がん細胞の研究、リンパ球分裂促進の研究、ウィルスの研究および細胞毒性の研究が展開されている（非特許文献１）。【０００３】
また、有害昆虫に対する殺虫活性を有するバチルス菌株のレクチンを利用して、該レクチンをコードする遺伝子を導入した耐虫性の向上した組換え植物を作出する技術も報告されている（特許文献１）。【０００４】
植物由来のレクチンは、害虫に対して効果を持つことが知られており、マンノース結合性レクチンであるＧＮＡは観賞植物のスノードロップ（Galanthus nivalis；マツユキソウ）の球根からクローニングされ、ジャガイモ、トマトおよびイネなどに遺伝子導入された組換え植物が作出されている。これらの植物は、耐虫性が付与されていることが知られている（非特許文献２、３）。【０００５】
植物由来のレクチンについては、例えば、ナガイモ由来マンノース特異的レクチンＤＢ１タンパク質の全アミノ酸をコードするＤＮＡ配列は既に報告されている（特許文献２）。このＤＮＡ配列は成熟したタンパク質の全アミノ酸をコードしており、ＤＢ１遺伝子をコードする既報のＤＮＡ配列をタバコに遺伝子導入したことは既に報告されている（非特許文献４）。また、ＤＢ１遺伝子をコードする既報のＤＮＡ配列をイネに遺伝子導入したことは既に報告されている（非特許文献５，非特許文献６）。ＤＢ１タンパク質は貯蔵タンパク質であるため、ｍＲＮＡから翻訳された前駆体には移行シグナルが含まれていると予想されるが、この移行シグナルのＤＮＡ配列は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１０−５０６５３２号公報
【特許文献２】ＷＯ２００６／０３０６３８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】レクチン、大沢利昭・森良一編、講談社サイエンティフィク
【非特許文献２】Fitches et al., Effect of Snowdrop Lectin(GNA) Delivered Via Artificial Diet and Transgenic Plants on the Development Tomato Moth(Lacanobia oleracea) Larvae in Laboratory and Glasshouse Trials, Journal of Insect Physiology, 43(8), 727-739(1997).
【非特許文献３】Rao et al., Expression of snowdrop lectin(GNA) in transgenic rice plants confers resistance to rice brown planthopper, The Plant Journal, 15(4), 469-477(1998).
【非特許文献４】加藤哲也ら，1Ba-01 ナガイモレクチンＤＢ１を蓄積させた形質転換タバコの作出とアブラムシ抵抗性評価，第２６回日本植物細胞分子生物学会大阪・シンポジウム講演要旨集，第６４頁．
【非特許文献５】加藤哲也ら，701 ナガイモレクチンＤＢ１を用いた形質転換作物の作出とその害虫抵抗性評価，育種学研究日本育種学会第１１４回講演会要旨集，２００８年１０月第１０巻別冊２号，第１９３頁．
【非特許文献６】Tetsuya Katoら,P144 Production of transgenic rice expressing yam tuber lectin(DB1) to confer sap-sucking insect-resistance,The 6th International Symposium of Rice Functional Genomics Programs and Abstracts,第285頁.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
食用として古くから利用されているナガイモ（Dioscorea batatas）の塊茎由来のＤＢ１遺伝子が本来有する移行シグナルをコードする領域をクローニングし、そのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を明らかにすることで新規なシグナルペプチドを提供するとともに、当該シグナルペプチドを用いて所望のタンパク質を効率的に蓄積することができる技術を提供することを目的とする。また、上記シグナルペプチドを利用して、遺伝子組換え植物においてＤＢ１タンパク質を効率的に蓄積することで害虫抵抗性に優れた遺伝子組換え植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意研究した結果、これまでに報告されていたナガイモレクチン（ＤＢ１）遺伝子の配列を再検討し、新たな遺伝子配列を決定して、さらに、ＤＢ１タンパク質前駆体に含まれるシグナルペプチドをコードする核酸が存在することを発見、その配列を決定した。新たに決定したシグナルペプチドをコードする領域を付加した遺伝子を異種植物に導入し、ＤＢ１タンパク質を効率よく蓄積させることにより、耐虫活性を付与又は増強させた遺伝子組換え植物を作出することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は、以下を包含する。【００１１】
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる、又は配列番号２に示すアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸。【００１２】
（２）上記ペプチドは、シグナルペプチドであることを特徴とする（１）記載の核酸。【００１３】
（３）上記シグナルペプチドは、小胞体移行シグナルペプチドであることを特徴とする（２）記載の核酸。【００１４】
（４）上記（１）〜（３）いずれか記載の核酸と、当該核酸の下流に位置するタンパク質の成熟領域をコードする核酸とからなる遺伝子。【００１５】
（５）上記タンパク質の成熟領域は、ナガイモ（Dioscorea batatas）のマンノース特異的レクチンの成熟領域であることを特徴とする（４）記載の遺伝子。【００１６】
（６）上記（４）又は（５）記載の遺伝子を、植物体内で発現可能なプロモーターの下流に配する発現ベクター。【００１７】
（７）上記（４）又は（５）記載の遺伝子を外来遺伝子として含有する形質転換植物。【００１８】
（８）耐虫活性が付与されるか、増強されたことを特徴とする（７）記載の形質転換植物。【００１９】
（９）イネ科植物であることを特徴とする（７）記載の形質転換植物。【００２０】
（１０）イネであることを特徴とする（７）記載の形質転換植物。【００２１】
（１１）上記（４）又は（５）記載の遺伝子を外来遺伝子として対象の植物に導入する工程を含む、耐虫活性の付与又は増強方法。【００２２】
（１２）上記対象の植物がイネ科植物であることを特徴とする（１１）記載の方法。【００２３】
（１３）上記対象の植物がイネであることを特徴とする（１１）記載の方法。【００２４】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-237432号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、新規なシグナルペプチド及び当該シグナルペプチドをコードする核酸を提供することができる。本発明に係るシグナルペプチドや当該シグナルペプチドをコードする核酸を使用することにより、所望のタンパク質を植物体内に効率良く蓄積することができる。また、本発明に係るシグナルペプチドや当該シグナルペプチドをコードする核酸を使用することにより、ＤＢ１タンパク質を効率よく蓄積させることにより植物に耐虫活性を付加又は植物の耐虫活性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例で使用したプラスミドの作製過程を示すフロー図である。
【図２】実施例で使用したプラスミドの作製過程を示すフロー図である。
【図３】実施例で使用したプラスミドの作製過程を示すフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
新規シグナルペプチド
本発明に係るシグナルペプチドは、ナガイモ（Dioscorea batatas）由来のＤＢ１タンパク質前駆体に含まれる２３個のアミノ酸残基からなるペプチドである。本発明に係るシグナルペプチドをコードする核酸の塩基配列及びシグナルペプチドのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。
【００２９】
なお、本発明に係るシグナルペプチドは、配列番号２に示したアミノ酸配列からなるものに限定されず、例えば、配列番号２に示したアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、シグナルペプチドとして機能するものも含まれる。ここで、複数個のアミノ酸残基としては、例えば２〜５個のアミノ酸残基を挙げることができ、好ましくは２〜３個のアミノ酸残基を挙げることができ、最も好ましくは２個のアミノ酸残基である。
【００３０】
配列番号２に示したアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列がシグナルペプチドとして機能するか否かは、従来公知の如何なる手法を適用しても良い。例えば、対象のアミノ酸配列を上流に有しているタンパク質を発現させ、小胞体画分における当該タンパク質を検出する。対象のアミノ酸配列がシグナルペプチドとして機能する場合、当該タンパク質が小胞体画分において顕著に検出される。
【００３１】
なお、本発明に係るシグナルペプチドは、いわゆる小胞体シグナルペプチドとして機能する。小胞体シグナルペプチドとは、シグナル認識粒子（Signal recognition particle：SRP）により認識されるペプチドである。SRPは、リボソームにて翻訳された小胞体シグナルペプチドと結合した状態で小胞体表面のSPR受容体と結合する。小胞体では、SRPと小胞体シグナルペプチドが解離し、その後、ペプチターゼにより小胞体シグナルペプチドを切断し、その後の翻訳が進行して成熟型のタンパク質が合成される。
【００３２】
また、本発明に係るシグナルペプチドは、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して例えば７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の類似度を有するアミノ酸配列からなり、シグナルペプチドとして機能するものであってもよい。ここで、類似度の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータプログラムを用いてデフォルトの設定で算出することができる。
【００３３】
さらに、本発明に係るシグナルペプチドは、配列番号１に示した塩基配列からなる核酸によりコードされるものに限定されず、配列番号１に示した塩基配列からなる核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ、シグナルペプチドとして機能するものであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、45℃、6×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、その後の50〜65℃、0.2〜1×SSC、0.1％SDSでの洗浄が挙げられ、或いはそのような条件として、65〜70℃、1×SSCでのハイブリダイゼーション、その後の65〜70℃、0.3×SSCでの洗浄を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
【００３４】
本発明に係るシグナルペプチドは、所望のタンパク質のN末端側に連結することで、当該タンパク質を植物体内において高蓄積させることができる。なお、植物体内において発現するタンパク質は、上記シグナルペプチドとの融合したタンパク質前駆体として発現し、その後、シグナルペプチダーゼによりシグナルペプチド領域が切断され成熟型タンパク質として存在することとなる。
【００３５】
上記シグナルペプチドを含むタンパク質前駆体は、従来公知の手法によって、当該前駆体をコードする核酸を発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターを植物体に導入することで当該植物体に蓄積することができる。
【００３６】
発現ベクターは、植物内で発現を可能とするプロモーターと、上述した前駆体をコードする核酸とを含むように構築する。発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、pBluescript、pBluescriptSK、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１等を挙げることができる。
【００３７】
プロモーターは、植物体内で上記前駆体をコードする核酸を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。特に、プロモーターとしては、植物体内において下流の遺伝子を恒常的に発現させる恒常発現プロモーターを使用することが好ましい。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、アクチン遺伝子プロモーター又はユビキチン遺伝子プロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【００３８】
また、プロモーターとしては、植物における部位特異的に発現させる機能を有するものを使用することもできる。このようなプロモーターとしては、従来公知の如何なるプロモーターを使用することができる。このようなプロモーターを使用して、上記前駆体を部位特異的に発現させることができる。
【００３９】
なお、発現ベクターは、プロモーター及び上記前駆体をコードする核酸に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００４０】
転写ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。上記発現ベクターにおいては、転写ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成させるといった現象の発生を防止することができる。
【００４１】
形質転換体選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。また、形質転換体選別マーカーとしては、所定の薬剤に対して抵抗性を付与する変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子を使用することもできる。
【００４２】
発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター及び上記前駆体をコードする核酸並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、上記前駆体をコードする核酸とプロモーターと（必要に応じて転写ターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記前駆体をコードする核酸、ターミネーターの順となっていればよい。また、発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【００４３】
また、上記発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【００４４】
上述した発現ベクターは、一般的な形質転換方法によって対象の植物内に導入される。発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【００４５】
また、DNAを直接植物細胞に導入する方法を採るなら、対象とする遺伝子の発現に必要な転写ユニット、例えばプロモーターや転写ターミネーターと、対象とする遺伝子を含んだDNAであれば十分であり、ベクター機能が必須ではない。さらに、転写ユニットを有さない対象とする遺伝子のタンパク質コード領域のみを含むDNAであっても、宿主の転写ユニット内にインテグレートし、対象となる遺伝子を発現することができればよい。
【００４６】
上記発現ベクターや、発現ベクターを含まず対象となる遺伝子を含んだ発現カセットが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。ここで、発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。
【００４７】
耐虫活性の付与又は増強
本発明では、上述した本発明に係るシグナルペプチドを利用して、ナガイモ（Dioscorea batatas）のマンノース特異的レクチン成熟領域をコードする遺伝子を発現することで、植物に対して耐虫活性を付与するか、耐虫活性を向上させることができる。ナガイモ（Dioscorea batatas）のマンノース特異的レクチン成熟領域をコードする核酸の塩基配列及び当該成熟領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３及び４に示す。
【００４８】
なお、本発明においてマンノース特異的レクチン成熟領域は、配列番号４に示したアミノ酸配列からなるものに限定されず、例えば、配列番号４に示したアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、マンノースを特異的に結合する活性を有するものも含まれる。ここで、複数個のアミノ酸残基としては、例えば２〜３０個のアミノ酸残基を挙げることができ、好ましくは２〜１５個のアミノ酸残基を挙げることができ、最も好ましくは２〜１０個のアミノ酸残基である。
【００４９】
配列番号４に示したアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列がマンノース特異的レクチンとして機能するか否かは、従来公知の如何なる手法を適用しても良い。例えば、対象のアミノ酸配列からなるタンパク質のマンノース結合活性を測定することで、マンノースに特異的に結合する活性を評価することができる。
【００５０】
また、本発明においてマンノース特異的レクチン成熟領域は、配列番号４に示したアミノ酸配列に対して例えば７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の類似度を有するアミノ酸配列からなり、マンノースに特異的に結合する活性を有するものであってもよい。ここで、類似度の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータプログラムを用いてデフォルトの設定で算出することができる。
【００５１】
さらに、本発明においてマンノース特異的レクチン成熟領域は、配列番号３に示した塩基配列からなる核酸によりコードされるものに限定されず、配列番号３に示した塩基配列からなる核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ、マンノースに特異的に結合する活性を有するものであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、45℃、6×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、その後の50〜65℃、0.2〜1×SSC、0.1％SDSでの洗浄が挙げられ、或いはそのような条件として、65〜70℃、1×SSCでのハイブリダイゼーション、その後の65〜70℃、0.3×SSCでの洗浄を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
【００５２】
耐虫活性を付与又は向上させる対象となる植物、換言すると上記シグナルペプチドを利用してマンノース特異的レクチンを蓄積する植物としては、特に限定されない。すなわち、上記シグナルペプチドを利用してマンノース特異的レクチンを発現させることによって、あらゆる植物体について、耐虫活性を付与又は向上させることができる。対象となる植物としては、例えば、双子葉植物、単子葉植物、例えばイネ科やアブラナ科の植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
【００５３】
イネ科の植物としては、トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、タケ（Phyllostachys）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ネピアグラス（Pennisetum pupureum）、エリアンサス（Erianthus ravenae）、ミスキャンタス（ススキ）（Miscanthus virgatum）、ソルガム（Sorghum）スイッチグラス（Panicum）等を挙げることができる。アブラナ科の植物としては、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ（Brassica rapa、Brassica napus、Brassica campestris）、キャベツ(Brassica oleracea var. capitata)、ハクサイ（Brassica rapa var. pekinensis）、チンゲンサイ（Brassica rapa var. chinensis）、カブ（Brassica rapa var. rapa）、ノザワナ（Brassica rapa var. hakabura）、ミズナ（Brassica rapa var. lancinifolia）、コマツナ（Brassica rapa var. peruviridis）、パクチョイ（Brassica rapa var. chinensis）、ダイコン（Raphanus sativus）、ワサビ（Wasabia japonica）等を挙げることができる。
【００５４】
ここで、耐虫活性とは、特に吸汁性害虫に対する殺虫活性又は忌避活性を意味する。吸汁性害虫としては、特に限定されないが、カメムシ目害虫、例えばセミ科のイワサキクサゼミ(Mogannia minuta)等、アワフキムシ科のシロオビアワフキ(Aphrophora intermedia)等、ツノゼミ科のトビイロツノゼミ(Machaerotypus sibiricus)等、ヨコバイ科のフタテンヒメヨコバイ(Arboridia apicalis)、チャノミドリヒメヨコバイ(Empoasca onukii)、ツマグロヨコバイ(Nephotettix cincticeps)、イナズマヨコバイ(Recilia dorsalis)等、ヒシウンカ科のヒシウンカ(Pentastiridius apicalis)等、ウンカ科のヒメトビウンカ(Laodelphax striatellus)、トビイロウンカ(Nilaparvata lugens)、セジロウンカ(Sogatella furcifera)等、シマウンカ科のシマウンカ(Nisia nervosa)等、ハネナガウンカ科のサトウマダラウンカ(Kamendaka saccharivora)等、コガラシウンカ科のレッドファンガスバック(Achilus flammeus)等、ハゴロモ科のベッコウハゴロモ(Orosanga japonicus)等、アオバハゴロモ科のトビイロハゴロモ(Mimophantia maritima)等、キジラミ科のナシキジラミ(Cacopsylla pyrisuga)等、ヒメキジラミ科のマンゴーキジラミ(Calophya mangiferae)等、フィロキセラ科のブドウネアブラムシ(Daktulosphaira vitifoliae)等、カサアブラムシ科のカラマツカサアブラムシ(Adelges laricis)、ハリモミヒノカサアブラムシ(Adelges tsugae)等、アブラムシ科のエンドウヒゲナガアブラムシ(Acyrthosiphon pisum)、ワタアブラムシ(Aphis gossypii)、ユキヤナギアブラムシ(Aphis spiraecola)、ニセダイコンアブラムシ(Lipaphis erysimi)、モモアカアブラムシ(Myzus persicae)、ムギミドリアブラムシ(Schizaphis graminum)、ムギクビレアブラムシ(Rhopalosiphum padi)等、コナジラミ科のミカントゲコナジラミ(Aleurocanthus spiniferus)、タバココナジラミ(Bemisia tabaci)、シルバーリーフコナジラミ(Bemisia argentifolii)、オンシツコナジラミ(Trialeurodes vaporariorum)等、ワタフキカイガラムシ科のオオワラジカイガラムシ(Drosicha corpulenta)、イセリアカイガラムシ(Icerya purchasi)等、コナカイガラムシ科のパイナップルコナカイガラムシ(Dysmicoccus brevipes)、ミカンコナカイガラムシ(Planococcus citri)、クワコナカイガラムシ(Pseudococcus comstocki)等、カタカイガラムシ科のツノロウムシ(Ceroplastes ceriferus)等、カタカイガラモドキ科のカンシャカタカイガラモドキ(Aclerda takahashii)等、マルカイガラムシ科のアカマルカガラムシ(Aonidiella aurantii)、ナシマルカイガラムシ(Diaspidiotus perniciosus)、ヤノネカイガラムシ(Unaspis yanonensis)等、カスミカメムシ科のライガスバック(Lygus hesperus)、アカヒゲホソミドリカスミガメ(Trigonotylus caelestialium)等、グンバイムシ科のツツジグンバイ(Stephanitis pyrioides)、ナシグンバイ(Stephanitis nashi)等、カメムシ科のトゲシラホシカメムシ(Eysarcoris aeneus)、イネカメムシ(Lagynotomus elongatus)、ミナミアオカメムシ(Nezara viridula)、チャバネアオカメムシ(Plautia crossota)等、マルカメムシ科のタイワンマルカメムシ(Megacopta cribraria)等、ナガカメムシ科のカンシャコバネナガカメムシ(Cavelerius saccharivorus)等、メダカナガカメムシ科のオオメダカナガカメムシ(Malcus japonicus)等、ホシカメムシ科のアカホシカメムシ(Dysdercus cingulatus)等、ホソヘリカメムシ科のホソクモヘリカメムシ(Leptocorisa acuta)、クモヘリカメムシ(Leptocorisa chinensis)等、ヘリカメムシ科のオオクモヘリカメムシ(Anacanthocoris striicornis)等、ヒメヘリカメムシ科のアカヒメヘリカメムシ(Rhopalus maculatus)等、トコジラミ科のトコジラミ(Cimex lectularis)等を挙げることができる。また、アザミウマ目害虫、例えばアザミウマ科のヒラズハナアザミウマ(Frankliniella intonsa)、ミカンキイロアザミウマ(Frankliniella occidentalis)、チャノキイロアザミウマ(Scirtothrips dorsalis)、ミナミキイロアザミウマ(Thrips palmi)、ネギアザミウマ(Thrips tabaci)等、クダアザミウマ科のカキクダアザミウマ(Ponticulothrips diospyrosi)、イネクダアザミウマ(Haplothrips aculeatus)等を挙げることができる。さらには、植物寄生性ダニ類、例えばハシリダニ科のムギダニ(Penthaleus major)等、ホコリダニ科のシクラメンホコリダニ(Phytonemus pallidus)、チャノホコリダニ(Polyphagotarsonemus latus)等、シラミダニ科のシラミダニの一種(Siteroptes sp.)等、ヒメハダニ科のブドウヒメハダニ(Brevipalpus lewisi)等、ケナガハダニ科のナミケナガハダニ(Tuckerella pavoniformis)等、ハダニ科のアンズアケハダニ(Eotetranychus boreus)、ミカンハダニ(Panonychus citri)、リンゴハダニ(Panonychus ulmi)、ナミハダニ(Tetranychus urticae)、カンザワハダニ(Tetranychus kanzawai)等、ナガクダフシダニ科のマツフシダニ(Trisetacus pini)等、フシダニ科のミカンサビダニ(Aculops pelekassi)、ナシサビダニ(Epitrimerus pyri)、シトラスラストマイト(Phyllocoptruta oleivora)等、ハリナガフシダニ科のイヌツゲフシダニ(Diptacus crenatae)等、コナダニ科のムギコナダニ(Aleuroglyphus ovatus)、ケナガコナダニ(Tyrophagus putrescentiae)、ロビンネダニ(Rhizoglyphus robini)等を挙げることができる。また、耐虫活性は、例えば、植物に雌成虫を所定の期間接触させ、生育した次世代の幼虫の数を測定することで評価することができる。また、幼虫を植物に接触させ、成虫に到達する割合を測定することにより評価することもできる。耐虫活性の付与とは、野生型において耐虫活性を有しないが、上記シグナルペプチドを利用してマンノース特異的レクチンを蓄積することにより耐虫活性を有するようになることを意味する。耐虫活性の向上とは、上記シグナルペプチドを利用してマンノース特異的レクチンを蓄積した組換え植物の耐虫活性が、野生型における耐虫活性と比較して有意に大となっていることを意味する。
【００５５】
特に、本発明においては、実用作物であるイネに対して、上述した本発明に係るシグナルペプチドを利用して、ナガイモ（Dioscorea batatas）のマンノース特異的レクチン成熟領域をコードする遺伝子を発現、蓄積することで、イネに耐虫活性を付与することができる。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を、実施例を用いて更に詳細に説明する。ただし、本発明の技術範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００５７】
（１）ナガイモレクチンDB1遺伝子の塩基配列決定
ナガイモ塊茎からConcert Plant RNA Reagent(Invitrogen社)を用いてプロトコルに従い全RNAを抽出した。引き続きMicro-FAST Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen社)を用いてプロトコルに従ってポリ(A)+RNAを精製した。【００５８】
Marathon cDNA Amplification Kit(BD Biosciences Clontech)を用いて、5’末端にMarathon cDNA Adaptorを付加したcDNAを合成した。そのcDNAを鋳型にして、既報のDB1(DDBJアクセッションNo.AB178475)配列に相補的なプライマーXB/DB1F(5'-TCTAGAGGATCCATGGCCGATTTCATACTT-3'（配列番号５）、下線部分はXba IとBam HI認識サイト)とS/DB1R(5'- GAGCTCTCACTTGTTGACGACC-3'（配列番号６）、下線部分はSac I認識サイト)の組合わせでPCRを表１及び表２に示した条件で行い、PCR生成物の塩基配列を決定した。得られたDNA配列は、配列番号３に示したとおりである。さらに本PCR生成物を、pGEM-Tベクター(Invitrogen社)にTAクローニングした。既報のDB1(DDBJアクセッションNo.AB178475)遺伝子が組込まれたプラスミドを持った大腸菌コロニーからQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN社)によりプラスミド１を単離した。【００５９】
なお、操作の概略を図１に示した。
【表１】
2011046177.tif 000002
【表２】
2011046177.tif 000003
【００６０】
（２）DB1タンパク質前駆体に含まれるシグナル配列をコードするDNAのクローニングと塩基配列決定
ナガイモ塊茎からConcert Plant RNA Reagent(Invitrogen社)を用いてプロトコルに従い全RNAを抽出した。引き続きMicro-FAST Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen社)を用いてプロトコルに従ってポリ(A)+RNAを精製した。【００６１】
Marathon cDNA Amplification Kit(BD Biosciences Clontech)を用いてcDNAの5’末端にMarathon cDNA Adaptorを付加したcDNAをキットのプロトコルに従い合成した。Marathon cDNA AdaptorがついたDB1cDNAを鋳型にして、cDNA Adaptorに相補的なAdaptor Primer(AP1;5’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’（配列番号７）)と、既報のDB1(DDBJアクセッションNo.AB178475)配列に相補的なプライマー(DB1midR;5’-CATTTCCCACGTTGGTGT-3’（配列番号８）)を用いて、表３及び４に示す条件で5’-RACE PCRを行った。
【表３】
2011046177.tif 000004
【表４】
2011046177.tif 000005
【００６２】
次に、得られたPCR生成物をpGEM-T Easy Vector(Promega)にTAクローニングし、大腸菌JM109株に導入し、アンピシリン50ppmを含有するLB培地上で選抜した。目的のプラスミドを持った大腸菌コロニーからプラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN社)により回収し、Adaptor primerとDB1midR primerを用いて塩基配列を決定した。Adaptor primerとDB1midR primer間の明らかになった遺伝子配列及び推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号９及び１０に示した。【００６３】
次に、配列番号９に示したDNA配列の最初のATGの上流にXba IとBamH Iを付加したプライマー(XB/NDB1F;5’-TCTAGAGGATCCATGGCTAACCCAGGAGCA-3’（配列番号１１）、下線部分はXba IとBam HI認識サイト）および、既報のDB1のcDNA配列(DDBJアクセッションNo.AB178475)のストップコドンを含む１７塩基に相補的な配列にSac I配列を付加したプライマー(S/DB1R;5’-GAGCTCTCACTTGTTGACGACC-3’ （配列番号１２）、下線部分はSac I認識サイト）を用い、はじめに合成したナガイモ塊茎のcDNAを鋳型にして表５及び６に示す条件でPCRを行い、全長DB1DNAを得た。全長DB1DNAの配列を配列番号１３に示した。全長cDNAから予想されるアミノ酸配列（配列番号１４）に基づいて細胞内局在予測データベースpredotarを用いて予測すると、配列番号１及び２に示す領域に小胞体移行シグナル配列が確認された。
【表５】
2011046177.tif 000006
【表６】
2011046177.tif 000007
【００６４】
次に、本PCR生成物をpGEM-Tベクター(Invitrogen社)にTAクローニングした。全長ナガイモDB1遺伝子が組込まれたプラスミドを持った大腸菌コロニーからQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN社)によりプラスミド２を単離した。なお、操作の概略を図１及び図２に示した。【００６５】
（３）遺伝子組換えイネの作出とDB1遺伝子導入の確認
配列番号１３に示す全長ナガイモDB1遺伝子をバイナリーベクターに挿入し、通常のアグロバクテリウム法を用いてイネ(Oryza sativa L.)台中６５号に遺伝子導入した。【００６６】
＜イネ種子の前培養＞
感染用イネカルスの培養として、脱穀済みのイネ種子を50ml遠心用チューブに取り、イネ種子滅菌溶液（次亜塩素酸ナトリウム水溶液、有効塩素濃度2%(wt%)、0.5%Tween20を40ml加え15分間転倒混和しながら洗浄した。溶液のみをデカントで除去し滅菌水で４〜５回洗浄し、次亜塩素酸を除いた。滅菌した濾紙上に種子をあけ、水分を除去しN6CI培地に置床し、30℃、16L/8Dの条件で培養した。２週間ごとに継代し、１ヶ月半継代後のカルスを形質転換に使用した。【００６７】
＜コンストラクトの作成＞
I）35S-DB1
配列番号１３に示す全長ナガイモDB1遺伝子をバイナリーベクターE12-35S-Ω(Mitsuharaら， Plant and Cell Physiology, 37, 49-59(1996))のBamH I/Sac Iサイトに挿入して、コンストラクトを作成した（図２／バイナリーベクター２）。【００６８】
II）RSs1-DB1
5’末端にSal Iの制限酵素切断部位をつけたプライマー(Sal/RSs1 F)と3’末端にBamH Iの制限酵素切断部位をつけたプライマー(Bam/RSs1 R)を用いて、台中６５号から抽出したイネゲノムをテンプレートにしてKOD PLUS(TOYOBO)を用いたPCRを表７及び８に示す条件で行い、Rice sucrose synthase 1プロモーター(RSs1Pro.)をクローニングした。
【表７】
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【表８】
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【００６９】
次に、PCR生成物に対し1.5％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、RSs1プロモーターの断片をゲルから抽出した。rTaq(Takara)を用いたPCRを、表９及び１０に示す条件で行い断片の両端にA(adenine)を付加した後、pGEM-T Vector（アンピシリン；Amp耐性）(Promega)に挿入(TA cloning;16℃ o/n)して、大腸菌へクローニングした。
【表９】
2011046177.tif 000010
【表１０】
2011046177.tif 000011
【００７０】
次に、Amp耐性、RSs1Pro.cDNAを持つコロニーをSal/RSs1 F、RSs1 600 Rのプライマーを用いたコロニーPCRによって選抜した。コロニーPCRの条件を表１１、１２及び１３に示した。得られたコロニーを、Ampを加えたLB培地に植菌し、QIAprep spin miniprep kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。得られたプラスミドに対してSal IとBamH Iで制限酵素処理を行い、RSs1 Pro.を切り出した。バイナリーベクター(pBI101H)をSal IとBamH Iで制限酵素処理し、RSs1 Pro.を連結(ligation)した(RSs1バイナリー)。配列番号１３に示す全長ナガイモDB1遺伝子を、RSs1バイナリーのBamH I/Sac Iサイトに挿入して、コンストラクトを作成した（図３／バイナリーベクター４）。
【表１１】
2011046177.tif 000012
【表１２】
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【表１３】
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【００７１】
使用したプライマーを下記にまとめて示す。なお、下線部は制限酵素部位である。【００７２】
XB/NDB1 F：  5’-TCTAGAGGATCCATGGCTAACCCAGGAGCA-3’（配列番号１５）
S/DB1 R：    5’-GAGCTCTCACTTGTTGACGACC-3’（配列番号１６）
Sal/RSs1 F：  5’-GTCGACCTTTCGTGACTTGTTTTCGC-3’（配列番号１７）
Bam/RSs1 R：  5’-GGATCCTAGCTTGGCAGCCAT-3’（配列番号１８）
RSs1 600 R：  5’-CCAAACAAGAACAAACCGGC-3’（配列番号１９）
＜バイナリーベクターコンストラクトの作成＞
プラスミド１及びプラスミド２をSac I(TAKARA BIO社)で処理後、DNA PCR & Gel Purification Kit(GE Healthcare社)でDNAを精製した。引き続きBam HI(TAKARA BIO社)で切断し、アガロースゲル（0.8%）で電気泳動し、プラスミド１からは456bpのバンドを、プラスミド２からは525bpのバンドをアガロースゲルから回収し、DNA PCR & Gel Purification Kit(GE Healthcare社)でDNAを精製した。【００７３】
一方、バイナリーベクター(El2-35S-Ω)をSac I(TAKARA BIO社)で処理後、DNA PCR & Gel Purification Kit(GE Healthcare社)でDNAを精製した。引き続きBam HI(TAKARA BIO社)で切断し、アガロースゲル（0.8%）で電気泳動し、GUS遺伝子を除去したDNA部分をDNA PCR & Gel Purification Kit(GE Healthcare社)を使用して精製した。本バイナリーベクター部分のDNAをプラスミド１及びプラスミド２から切断した456bp及び525bpのDNAをそれぞれDNA Ligation Kit(TAKARA BIO社)を用いてライゲーションし、シグナル配列欠失DB1遺伝子を組込んだバイナリーベクター１と全長DB1遺伝子を組込んだバイナリーベクター２を作製した。【００７４】
＜アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)へのコンストラクトの導入＞
作成した上記のバイナリーベクター１μｇを、Agrobacterium tumefaciensのEHA105系統に導入し、カナマイシンにて選抜した。コロニーPCRによりDB1cDNAの導入を確認できたアグロバクテリウムを形質転換に用いた。【００７５】
＜アグロバクテリウムの前培養＞
形質転換を行う３日前に、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)をAB固形培地(50mg/lハイグロマイシン)に塗布し、24℃、暗黒条件下で３日間培養した。【００７６】
＜アグロバクテリウムの感染と共存培養＞
50mlファルコンチューブにAA培地を40ml入れ、アセトシリンゴンを40mg/lとなるように加えた。前培養したアグロバクテリウムを200μlチップの先で少量かき取り、前述のAA培地中に溶かし、暗黒条件下で30分間振とうした。1ヵ月半培養したイネカルスを、アグロバクテリウムを入れたAA培地に入れ、1.5分間振とうした。AA培地の上澄みをビーカーに空け、余分なAA培地を滅菌したキムタオル（商品名：株式会社クレシア製）で除去した。N6CO培地(40mg/lアセトシリンゴン添加)に滅菌濾紙を載せ、その上にカルスを置いて24℃、暗黒条件下で3日間培養した。【００７７】
＜アグロバクテリウムの除去と選抜＞
共存培養したカルスを50mlファルコンチューブに移し、滅菌水で4回洗浄した。その後、滅菌水(50mg/l メロペン)で4回洗浄し、余分な滅菌水を滅菌したキムタオル（商品名：株式会社クレシア製）で除去した。カルスをN6SE(30mg/l ハイグロマイシン、40mg/l メロペン)培地に移植し、30℃、16L/8Dで2〜3週間培養した。【００７８】
＜形質転換体の再分化＞
選抜培養後、カルスをイネ再分化培地(30mg/l ハイグロマイシン、40mg/l メロペン)へと移植し30℃、16L/8Dで培養し、再分化を誘導した。2週間ごとに継代を行いシュート、根が分化してきたらイネ発根培地(30mg/l ハイグロマイシン、40mg/l メロペン)へと移植した。各培地組成は下記にまとめて示した。【００７９】
選抜によって得られたカルスから以下に示す簡易法によりゲノムを抽出し、XB/NDB1F、S/DB1 Rプライマーを用いて表１４及び１５に示す条件でPCRを行い遺伝子の導入を確認した。
【表１４】
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【表１５】
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【００８０】
PCRによって遺伝子導入が確認された個体は発根培地で十分根が生えるまで培養し、その後、直径8cmのビニールポットに移植して閉鎖系温室(25℃±1℃、16L/8D)で育成した。なお、形質転換体と非形質転換体において、生育に差は見られなかった。【００８１】
＜T0個体における簡易法による遺伝子導入の確認＞
植物体から0.5×1cm程度の大きさの葉片を切り取り、2〜3粒のガラスビーズBZ-3(AS ONE)といっしょに1.5mlチューブに入れた。DDW（滅菌水）を100μl加え、組織粉砕機(QIAGEN Tissue Lyser)で30回/秒、5分間高速振とうすることにより破砕した。100μlのDNA抽出バッファ(200mM Tris-HCl(pH7.5)、250mM NaCl、25mM EDTA、0.5%SDS)を加え、転倒混和してから10分間放置した。その後15,000rpmで10 分間遠心分離した。上清100μlを新たな1.5mlチューブに移し、2-プロパノールを等量加え転倒混和した。十分に攪拌した後、15,000rpmで5分間遠心分離した。上清をピペットで完全に取り除き、10分間風乾したのち、DDW100μlを入れボルテックスにより溶解した。抽出したゲノムDNAは4℃で保管した。【００８２】
＜T0個体におけるDB1タンパク質蓄積の確認＞
2 mlチューブにイネ葉片0.1gを入れ液体窒素で凍結したのちペッスルで破砕した。50mMのTris-HCl(pH7.0)およびProtease Inhibitor(Roche社製) をそれぞれ0.2mlおよび20μlずつ入れ、氷上にて磨砕した。抽出液を1.5mlチューブに移し、2,000rpmで10分間遠心分離した。上清を新しい1.5mlチューブへ移し、15,000rpm1で10分間遠心分離した。上清をタンパク質抽出液とした。【００８３】
得られたタンパク質抽出液0.5〜10μlと3×サンプルバッファ5μl、50mMのTris-HCl(pH7.0)を計15μlになるように混合し、33分間煮沸した後、氷上で5分間急冷し、泳動用サンプルとした。ポジティブコントロールおよびDB1の濃度定量として、ナガイモ精製DB1(1.0ng/μl)を1、3、5、8、10μlと3×サンプルバッファ5μl、50mMのTris-HCl(pH7.0)を計15μlになるように加えたものを作成し、同様に煮沸、急冷したものを用いた。これらを15%のポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。【００８４】
電気泳動後、セミドライ式ブロッティングを行った。PVDFメンブレン(0.45μm、Millipore)をメタノールに数秒間浸した後、トランスファーバッファ（グリシン14.42g、Tris-HCl3.02g、SDS1.0g/1L)に浸した。ブロッティング装置にトランスファーバッファで浸した濾紙６枚、ゲル、メンブレン、濾紙６枚の順に空気が入らないように重ね、装置のふたを閉めた。電流をメンブレンの大きさ(cm2)×0.8mAに設定して1.0時間ブロッティングした。【００８５】
ブロッティング終了後のメンブレンをTBS(50mM Tris-HCl、0.9%NaCl、0.02%NaN3、pH8.0)に10分間浸した。メンブレンをメンブレンバックに入れ、ブロッキングバッファ(20ml TBS、5%スキムミルク、0.1% Tween20)を入れて、室温で1時間振とう、あるいは4℃で一晩ブロッキングした。【００８６】
メンブレンを40rpmで振とうしながらTBS-T(TBS、0.1% Tween20)で10分間×2回洗った。メンブレンバックに入れ、１次抗体液(10ml TBS-T、0.1g BSA、1μl anti-DB1 rabbit antisera)を加え、室温で1時間振とう、あるいは4℃で一晩、1次抗体反応を行った。【００８７】
１次抗体反応後のメンブレンを40rpmで振とうしながらTBS-Tで10分間×2回洗った。メンブレンバックに入れ、2次抗体液(10ml TBS-T、0.1g BSA、2μl anti-Rabbit IgG(Fc)、AP conjugate(Promega))を加え、室温で１時間振とうして2次抗体反応を行った。【００８８】
2次抗体反応後のメンブレンを40rpmで振とうしながらTBS-Tで10分間洗った。洗浄液を捨てて、AP9.5Buffer(100mM Tris-HCl(pH9.5)、100mM NaCl，50mM MgCl2)にメンブレンを3分間浸して緩衝化させた。メンブレンをメンブレンバックに入れて発色液(10ml AP9.5Buffer、173mM NBT 50μl、115.3mM BCIP 25μl)を加え、バンドが検出されるまで軽く振とうした。【００８９】
35S-DB1導入系統のT0個体およびRSs1-DB1導入系統のT0個体において、DB1cDNAプラスミドと同様の位置(519bp)にバンドが確認できた 。【００９０】
＜T1個体におけるDB1遺伝子導入の確認＞
簡易法により目的遺伝子の導入が確認された35S-DB1導入系統およびRSs1-DB1導入系統のT0個体について自殖次世代T1個体を展開した。T0個体の場合と同様に、簡易法によりT1個体のゲノムを抽出し、XB/NDB1F、S/DB1 Rプライマーを用いてPCRを行い遺伝子の導入を確認した。【００９１】
＜T1個体におけるDB1タンパク質蓄積の確認＞
T1個体について、T0個体と同様の操作を行い、DB1タンパク質の蓄積を確認した。【００９２】
（４）比較対照用の遺伝子組換えイネの作出とDB1遺伝子導入の確認−１
上記（３）に準じて、配列番号３に示すDB1遺伝子をバイナリーベクターに挿入し、通常のアグロバクテリウム法を用いてイネ(Oryza sativa L.)台中65号に遺伝子導入した。簡易法によりT0個体のゲノムを抽出し、XB/NDB1F、S/DB1 Rプライマーを用いてPCRを行い遺伝子の導入を確認したが、目的遺伝子の導入は確認されなかった。【００９３】
（５）比較対照用の遺伝子組換えイネの作出とDB1遺伝子導入の確認−２
上記（３）の「RSs1-DB1コンストラクトの作成」におけるGUS遺伝子を導入したバイナリーベクター３（図３）を用いて、上記（３）と同様の遺伝子組換え操作を行い、目的とする比較対照用の遺伝子組換えイネＴ１個体を作出した。【００９４】
（６）遺伝子組換えイネT0個体のヒメトビウンカ(Laodelphax striatellus)に対する効果試験
PCRによって遺伝子導入が確認された個体を発根培地で十分根が生えるまで培養し、その後、直径8cmのビニールポットに移植して閉鎖系温室(25℃±1℃、16L/8D)で育成した。個体が3葉期に達した段階で、菊川水田土を入れた1/10,000aポットに深度2cmで移植し、ナイロン製の網でポットを被い、移植７日後及び１４日後に網の中にそれぞれヒメトビウンカの雌成虫10頭を放した。移植42日後に次世代幼虫数及び成虫数を調査した。その結果を表１６に示す。
【表１６】
2011046177.tif 000017
【００９５】
表１６に示すように、配列番号３に示すシグナル配列を含むDB1遺伝子を導入したT0個体は、非組換え体と比較して、ヒメトビウンカに対する非常に優れた防除効果を示した。なお、配列番号３に示すシグナル配列を付加しないDB1遺伝子のみを導入したイネT0個体は、非組換え体と比較して、ヒメトビウンカに対する防除効果が僅かであった。【００９６】
（７）遺伝子組換えイネT1個体のヒメトビウンカ(Laodelphax striatellus)に対する効果試験
イネT1種子を育苗培土の入ったペーパーポットに１粒ずつ播種し、隔離温室で栽培した。播種後19日後、葉の一部からDNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて、ゲノムDNAを抽出してPCR解析に供試した。ハイグロマイシン耐性遺伝子を確認するために、フォワードプライマーとしてHph-1S(5’-tgtcacgttgcaagacct-3’（配列番号２０）)、リバースプライマーとしてHph-1A(5’-caaccaagctctgatagagttg-3’（配列番号２１）)を使用した。PCR反応は95℃で2分間行った後、95℃/30秒、54℃/1分、72℃/1分、を35サイクル行い、最終伸張反応は72℃で10分間行った。反応終了後、PCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ハイグロマイシン耐性遺伝子の導入が確認された個体を、菊川水田土を入れた1/10,000aポットに深度2cmで移植した。移植7日後に、ナイロン製の網でポットを被い、網の中にヒメトビウンカの雌成虫5頭を放した。移植12日後に全ての雌成虫を取り除き、移植28日後に次世代幼虫に対する効果を調査した。その結果を表１７に示す。
【表１７】
2011046177.tif 000018
【００９７】
（８）遺伝子組換えイネのトビイロウンカ(Nilaparvata lugens)に対する効果試験
イネT1種子を育苗培土の入ったペーパーポットに1粒ずつ播種し、隔離温室で栽培した。播種後19日後、葉の一部からDNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて、ゲノムDNAを抽出してPCR解析に供試した。ハイグロマイシン耐性遺伝子を確認するために、フォワードプライマーとしてHph-1S(5’-tgtcacgttgcaagacct-3’ （配列番号２０）)、リバースプライマーとしてHph-1A(5’-caaccaagctctgatagagttg-3’（配列番号２１）)を使用した。PCR反応は95℃で2分間行った後、95℃/30秒、54℃/1分、72℃/1分、を35サイクル行い、最終伸張反応は72℃で10分間行った。反応終了後、PCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ハイグロマイシン耐性遺伝子の導入が確認された個体を、菊川水田土を入れた1/10,000aポットに深度2cmで移植した。移植9日後に、ナイロン製の網でポットを被い、網の中にトビイロウンカの雌成虫５頭を放した。移植14日後に全ての雌成虫を取り除き、さらに、移植29日後にトビイロウンカの雌成虫5頭を追加放虫し、移植43日後に次世代幼虫に対する効果を調査した。その結果を表１８に示す。
【表１８】
2011046177.tif 000019
【００９８】
（９）遺伝子組換えイネのセジロウンカ(Sogatella furcifera)に対する効果試験
イネT1種子を育苗培土の入ったペーパーポットに1粒ずつ播種し、隔離温室で栽培した。播種後19日後、葉の一部からDNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて、ゲノムDNAを抽出してPCR解析に供試した。ハイグロマイシン耐性遺伝子を確認するために、フォワードプライマーとしてHph-1S(5’-tgtcacgttgcaagacct-3’ （配列番号２０）)、リバースプライマーとしてHph-1A(5’-caaccaagctctgatagagttg-3’ （配列番号２１）)を使用した。PCR反応は95℃で2分間行った後、95℃/30秒、54℃/1分、72℃/1分、を35サイクル行い、最終伸張反応は72℃で10分間行った。反応終了後、PCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ハイグロマイシン耐性遺伝子の導入が確認された個体を、菊川水田土を入れた1/10,000aポットに深度2cmで移植した。移植9日後に、ナイロン製の網でポットを被い、網の中にトビイロウンカの雌成虫５頭を放した。移植14日後に全ての雌成虫を取り除き、移植43日後に次世代幼虫に対する効果を調査した。その結果を表１９に示す。
【表１９】
2011046177.tif 000020
【００９９】
以上のように、本発明に係るシグナルペプチドを利用して、ナガイモレクチンDB1遺伝子を発現、蓄積した組み換えイネは、種々の吸汁性害虫に対する耐虫活性を有していることが明らかとなった。【０１００】
なお、本実施例で使用した培地組成を下記の表２０にまとめて示した。
【表２０】
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【０１０１】
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【０１０２】
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【０１０３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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