(57)【要約】  細胞を生きたまま解析し、分別し、培養するに当たって、より簡便に、リアルタイムに作業ができ、培養細胞から不要細胞を除去・純化させながら培養できるようにする。また、培養細胞から所望の細胞を解析分別し、その細胞の純度，回収率，バイアビリティーを高める。  細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を透明基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材を用いる。細胞像を検出，解析し、所望の細胞の位置情報を得る。本情報に基づき、第２の光照射により細胞／細胞間及び細胞接着性光制御材料を切断する。一方、第１の光照射により該基材の表面を細胞接着性から細胞非接着性に変化させ、細胞／該基材間の剥離を生じさせる。これにより細胞を生きたまま解析し、分別することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材。
【請求項２】
光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材。
【請求項３】
光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化することを特徴とする細胞接着性光制御基材。
【請求項４】
前記細胞非接着性材料がホスホリルコリン基を有する材料であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項５】
前記細胞非接着性材料が、下記一般式（１）で表される（メタ）アクリル酸エステル重合体、または、下記一般式（２）で表される（メタ）アクリル酸エステル重合体、または、（１）（２）で表される（メタ）アクリル酸エステル重合体の共重合体のいずれかを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化１】
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（式中Ｒ1は水素又はメチル基を表し、ｎは１〜２０の数を表す。）
【化２】
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（式中Ｒ2は１〜２０のアルキレン基又は１〜２０のポリオキシエチレン基を表す。）
【請求項６】
前記細胞非接着性材料が、下記一般式（３）で表されるアルコキシシランであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化３】
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（式中Ｒ3は水素又はアルキル基を表す。）
【請求項７】
前記細胞接着性材料が、末端に細胞接着性基を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項８】
前記細胞接着性材料が、末端に下記一般式（４）で表される細胞接着性基Ｘを有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化４】
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（式中Ｘはカルボン酸、モノあるいはポリカルボン酸アルキル基，アミノ基、モノあるいはポリアミノアルキル基，アミド基、モノあるいはポリアミドアルキル基，ヒドラジド基、モノあるいはポリヒドラジドアルキル基，アミノ酸基，ポリペプチド基，核酸基を表す。）
【請求項９】
前記細胞接着性材料が、前記細胞接着性基に、細胞との接着を促す細胞外マトリックスあるいは細胞の表面抗原と結合する抗体及び該抗体を結合させるためのタンパク質などを結合あるいは接着させた材料であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項１０】
前記細胞外マトリックスがコラーゲン群，非コラーゲン性糖タンパク質群（フィブロネクチン，ビトロネクチン，ラミニン，ニドジェン，テネイノシン，トロンボスポンジ，フォンビルブランド，オステオポンチン，フィブリノーゲンなど），エラスチン群，プロテオグリカン群から選ばれた材料であることを特徴とする請求項９に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項１１】
前記抗体を結合させるタンパク質が、アビジン／ビオチン，プロテインＡあるいはプロテインＧから選ばれた材料であることを特徴とする請求項９に記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項１２】
前記光解離性基が３６０ｎｍ以上、かつ、観察用入射光又は蛍光観察用励起光波長よりも短波長で光反応性を持つことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項１３】
前記光解離性基が３６０ｎｍから４５０ｎｍで光反応性を持つことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項１４】
前記光解離性基が２価でクマリニルメチル骨格を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項１５】
前記光解離性基が下記一般式（５）で表される２価でクマリニルメチル骨格を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化５】
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（式中Ｒ4は水素又はハロゲン基又はアルコキシ基、Ｒ5は２価で、Ｏ，ＣＯ，ＣＯ2，ＯＣＯ2，ＮＨＣＯ2，ＮＨ，ＳＯ3，(ＯＰＯ(ＯＨ))1~3Ｏを表す。）
【請求項１６】
前記細胞接着性光制御材料が一般式（６）で表される細胞接着性基と一般式（７）で表される光解離性基をクマリン骨格の７位あるいはＲ5の位置で直接あるいは間接に結合した構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化６】
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【化７】
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【請求項１７】
前記細胞接着性光制御材料が下記一般式（８）で表される光解離性基と細胞接着性基がクマリン骨格の７位で二価の連結基Ｒ6を介して結合した構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化８】
2011058721.tif 000022
【請求項１８】
前記細胞接着性光制御材料が下記一般式（９）で表される光解離性基と細胞接着性基をＲ5の位置で結合した構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化９】
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【請求項１９】
前記２価の連結基Ｒ6が、Ｏ(ＣＨ2)m，Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m，ＯＣＯ(ＣＨ2)m，ＯＣＯＣＨ2Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)mのいずれかで表されることを特徴とする請求項１７記載の細胞接着性光制御基材。（ここで、ｍは０〜２０の整数を表す。）
【請求項２０】
前記細胞接着性光制御材料が、一般式（１０）で表される細胞接着性基と一般式（１１）で表される光解離性基をクマリン骨格の７位あるいはＲ5の位置で直接あるいは間接に結合した前記構造を、前記細胞非接着性材料に直接あるいは間接に結合した構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化１０】
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【化１１】
2011058721.tif 000025
【請求項２１】
前記細胞接着性光制御材料が、下記一般式（１２）で表される構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化１２】
2011058721.tif 000026
【請求項２２】
前記細胞接着性光制御材料が、下記一般式（１３）で表される構造を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化１３】
2011058721.tif 000027
【請求項２３】
前記細胞接着性光制御材料が下記一般式（１４）で表される（メタ）アクリル酸エステルを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化１４】
2011058721.tif 000028
【請求項２４】
前記細胞接着性光制御材料が、下記一般式（１５）（１６），下記一般式（１５）（１７），下記一般式（１５）（１８），下記一般式（１５）（１６）（１９），下記一般式（１５）（１７）（１９），下記一般式（１５）（１８）（１９）で表される（メタ）アクリル酸エステルの共重合体のいずれかを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
2011058721.tif 000033
【請求項２５】
前記細胞接着性光制御材料が、側鎖にアルコキシシランを含む（メタ）アクリル酸エステルを共重合してなることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項２６】
前記細胞接着性光制御材料が下記一般式（２０）で表されるアルコキシシランであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化２０】
2011058721.tif 000034
【請求項２７】
前記細胞接着性光制御材料が下記一般式（２１）で表されるアルコキシシランであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【化２１】
2011058721.tif 000035
【請求項２８】
前記基材がガラス製培養容器であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性光制御基材。
【請求項２９】
以下の工程を含むことを特徴とする細胞の解析分別方法。
細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化することを特徴とする細胞接着性光制御基材に細胞を播種，培養する工程
所望の細胞領域への第１の光照射により所望の細胞を基材から剥離回収する工程
【請求項３０】
さらに、以下の工程を含む、請求項２９に記載の細胞の解析分別方法。
細胞像を検出し、細胞特徴量を抽出する工程
所望の細胞の位置情報を得る工程
【請求項３１】
さらに、以下の工程を含む、請求項２９に記載の細胞の解析分別方法。
第１の光照射とは異なる第２の光照射により所望の細胞とそれ以外の細胞の間および細胞接着性光制御材料を切断または破壊する工程
【請求項３２】
以下の工程を含むことを特徴とする細胞の解析分別方法。
細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化することを特徴とする細胞接着性光制御基材に第１の光照射をし、細胞接着領域と細胞非接着領域を設ける工程
【請求項３３】
以下の工程を含む請求項３２に記載の細胞の解析分別方法。
第１の光照射後の細胞接着性光制御基材に細胞を播種する工程
細胞像を検出し、細胞の特徴量を抽出する工程
所望の細胞の位置情報を得る工程
細胞の接着していない細胞接着領域に第１の光照射をし、細胞非接着性とする工程
所望の細胞領域への第１の光照射により所望の細胞を基材から剥離回収する工程
【請求項３４】
以下の工程を含む請求項３３に記載の細胞の解析分別方法。
第１の光照射とは異なる第２の光照射により細胞接着性光制御材料を切断または破壊し、細胞接着領域と細胞非接着領域を設ける工程
【請求項３５】
第２の光照射はレーザ光であることを特徴とする請求項３１または３４に記載の細胞の解析分別方法。
【請求項３６】
細胞接着領域が細胞１個分の面積を格子状に並べてなり、細胞を播種する工程における細胞は個々に分離していることを特徴とする請求項３３または３４に記載の細胞の解析分別方法。
【請求項３７】
細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化することを特徴とする細胞接着性光制御基材と、
基材上の細胞接着性光制御材料を光反応させるための第１の光照射手段と、
を備えることを特徴とする、細胞の解析分別装置。
【請求項３８】
該基材を載せるステージと、細胞像を取得する光学検出手段と、細胞像から位置情報を得る位置情報取得手段と、各手段の動作を制御する手段を備える請求項３７に記載の細胞の解析分別装置。
【請求項３９】
さらに、細胞間及び細胞接着性光制御材料を切断または破壊するための第２の光照射手段を備える請求項３８に記載の細胞の解析分別装置。
【請求項４０】
前記光学検出手段の光源が、広域の発光スペクトルが得られるランプあるいはＬＥＤを用い、波長フィルターで細胞接着性光制御材料の光反応波長以下または蛍光励起波長より短波長（光反応波長＜蛍光励起波長）をカットしたことを特徴とする請求項３８に記載の細胞の解析分別装置。
【請求項４１】
前記光学検出手段の光源が、光反応波長より長波長のレーザを用いることを特徴とする請求項３８に記載の細胞の解析分別装置。
【請求項４２】
前記光学検出手段が、２次元ＣＣＤカメラまたは光電子増倍管を検出器に用いることを特徴とする請求項３８に記載の細胞の解析分析装置。
【請求項４３】
前記光学検出手段が、分散素子を通してラインセンサで検出することを特徴とする請求項３８に記載の細胞の解析分析装置。
【請求項４４】
前記第２の光照射手段が、赤外レーザまたは紫外レーザを光源として、前記位置情報取得手段の位置情報をもとに、ＸＹ偏向器によりレーザ走査する光学系であることを特徴とする請求項３９に記載の細胞の解析分別装置。
【請求項４５】
前記第２の光照射手段が、近赤外レーザを光源として、前記位置情報取得手段の位置情報を反映した空間光変調デバイスを通して基材上にレーザ集光する光学系であることを特徴とする請求項３９に記載の細胞の解析分別装置。
【請求項４６】
前記第２の光照射手段が、可視から近赤外領域のレーザを光源として、前記位置情報取得手段の位置情報を反映した空間光変調デバイスと波長変換デバイスを通して基材上にレーザ集光する光学系であることを特徴とする請求項３９に記載の細胞の解析分析装置。
【請求項４７】
前記第１の光照射手段の光源が、細胞接着性光制御材料の光反応波長であり、広域の発光スペクトルが得られるランプあるいはＬＥＤを用い、波長フィルターで３６０ｎｍ以下及び場合によっては蛍光励起波長以上をカットしたことを特徴とする請求項３７に記載の細胞の解析分別装置。
【請求項４８】
前記第１の光照射手段の光源が、光反応波長域のレーザ光源であることを特徴とする請求項３７に記載の細胞の解析分別装置。
【請求項４９】
前記第１の光照射手段が、前記位置情報取得手段の位置情報をもとに、ＸＹ偏向器またはＸＹスキャナーによるレーザもしくは光走査する光学系であることを特徴とする請求項３７に記載の細胞の解析分別装置。
【請求項５０】
前記第１の光照射手段が、前記位置情報取得手段の位置情報を反映した空間光変調デバイスを通して基材上に集光する光学系であることを特徴とする請求項３７に記載の細胞の解析分別装置。
【請求項５１】
請求項４５，４６、または５０記載の空間光変調デバイスが反射型又は透過型空間光変調デバイスであることを特徴とする細胞の解析分別装置。
【請求項５２】
請求項５１記載の反射型又は透過型空間光変調デバイスがそれぞれデジタルミラーデバイス又は液晶空間光変調デバイスであることを特徴とする細胞の解析分別装置。
【請求項５３】
請求項４６記載の波長変換デバイスが非線形結晶または強誘電体結晶であることを特徴とする細胞の解析分別装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は再生医療や幹細胞研究分野に係わり、特に細胞の解析分別・培養技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
再生医療の分野においては、体細胞中に含まれる極僅かな体性幹細胞や前駆細胞を同定，単離し、ここから培養して体細胞を作製する作業が行われている。また、体性幹細胞のソースとしてｉＰＳ細胞やＥＳ細胞からの分化誘導により体性幹細胞や体細胞へと培養する試みがなされている。しかしながら、これらｉＰＳ細胞やＥＳ細胞は均一なものではなく、また、そこから分化誘導される細胞も均一なものではない。様々な細胞が生じてくる。再生医療に供する細胞または組織には、体細胞としての均一性や体性幹細胞を含むこと、また、がん細胞やがん幹細胞，ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞を含まないことが要求される。【０００３】
このように再生医療の分野では、細胞を解析し、分別し、培養する技術はますます重要性を増している。複数種類からなる細胞群を分別するためにはそれを識別する解析技術が必要である。更には識別した複数種類からなる細胞群から単一種類の細胞に分別しなければ、単一種類の細胞の分子生物学的性質や細胞生物学的性質を解析することはできない。これらのことができるようになって初めて分化誘導を厳密にコントロールすることができるようになってくる。更には、１００％の分化誘導効率にならなくとも不要な細胞を除去する技術が必要になる。【０００４】
細胞を生きたまま解析する装置としては、周知の光学顕微鏡や蛍光標識された細胞を観察する蛍光顕微鏡，蛍光イメージング装置などがあるが、これらの装置は細胞を分別することはできない。一方、細胞を生きたまま分別する装置としては、細胞表面の抗原と磁気ビーズに付与した抗体との抗原抗体反応により目的の細胞を分別収集する装置があるが、この装置は細胞を解析することはできず、また、純度や回収率などに課題がある。細胞を分別する装置としてレーザマイクロダイセクション装置もあるが、これは主にパラフィン包埋された死細胞切片からの単離に使われている。【０００５】
細胞を生きたまま解析し、分別する装置としては、周知のフローサイトメーターとソーティング装置がある。この装置はシース流に乗せたサンプル流中の細胞１つ１つにレーザ光を当て、散乱光や蛍光を観察することで細胞を解析・識別し、その情報をもとに細胞一つ一つを含む液滴に電荷を与え、電場を掛けて分別する装置である。多色のレーザ光を照射することで多くの蛍光マーカーを解析することができるが、蛍光補正や光軸調整が煩雑である。また、予め細胞塊を個々の細胞に分離するためにトリプシン処理などを行うと細胞に少なからずダメージを与える。更にはソーティングされた細胞は純度や回収率は高いが、ソーティングの際の衝撃によりバイアビリティーが低下するなどの課題がある。また、この装置で処理するためには一旦培養基材から細胞を取り出さなければならない。【０００６】
細胞を生きたまま解析し、分別し、培養する技術としては、特許第３９７５２６６号公報に記載の方法がある。この技術は、光照射によってその物性が変化する光応答性材料を成膜した細胞培養基材を用い、モニターにより培養された細胞を識別し、所望の細胞の位置を特定し、所望の細胞位置へ光パターン照射し、所望の細胞を培養基材から剥離するための装置に係わるものである。ここで記載されている「光照射によってその物性が変化する光応答性材料」は、光照射により構造が異性化し、その分極率，親水−疎水性が変化して、細胞を培養基材から剥離する機能を有するものを挙げており、特にこれらの物性変化は可逆的であることが好ましいとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３９７５２６６号公報
【特許文献２】特許第３４７２７２３号公報
【特許文献３】特開２００４−１７０９３０号公報
【特許文献４】特開２００８−１６７６９５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】石原一彦、生体材料、18(1), 33(2000).
【非特許文献２】Y. Arima et al., J. Meter. Chem., 17, 4079(2007).
【非特許文献３】Y. Arima et al., Biomaterials 28, 3074(2007).
【非特許文献４】M. N. Yousaf et al., PNAS 98(11), 5992(2001).
【非特許文献５】古田寿昭、光学、34(4), 213(2005).
【非特許文献６】J. Edahiro et al., Biomacromolecules, 6(2), 970(2005).
【非特許文献７】J. Nakanishi et al., Analytical Sciences, 24, 67 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記の特許第３９７５２６６号公報に記載のある光照射によってその物性が変化する光応答性材料として、光により可逆的に構造変化する材料は、２つの異性体の片方に１００％持っていくことは困難であり、それは細胞接着性の選択性低下を招く。また、実施例にあるような長波長の光で反応する材料は、例えば、蛍光観察用の励起光に反応し、接着性が変化することになる。更には、当該技術では細胞を培養基材から剥離できても、細胞間の接着を剥離することは考慮されていない。従って、培養基材中に存在する孤立した細胞あるいは細胞塊を丸ごと剥離することになり、接着している複数種類の細胞からなる細胞塊を単一細胞に分別することはできないという課題が残る。【００１０】
本発明は以上の従来技術に鑑み、細胞を生きたまま解析し、分別し、培養するための細胞接着性光制御基材及び細胞の解析分別方法及びその装置を提供するものである。【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、細胞を生きたまま解析し、分別し、培養するに当たって、より簡便に、リアルタイムに作業ができ、培養細胞から不要細胞を除去・純化させながら培養できるようにすることであり、また、培養細胞から所望の細胞を解析分別し、その細胞の純度，回収率，バイアビリティーを従来以上に高めることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明では上記従来技術の課題を解決するために以下の手段を取った。【００１３】
つまり、本発明の細胞接着性光制御基材は、細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる。【００１４】
また、本発明の細胞接着性光制御基材は、光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残るものである。【００１５】
また、本発明の細胞接着性光制御基材としては、光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化するものである。【００１６】
また、本発明の細胞の解析分別方法は、以下の工程を含む。【００１７】
細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化することを特徴とする細胞接着性光制御基材に細胞を播種，培養する工程。【００１８】
所望の細胞領域への第１の光照射により所望の細胞を基材から剥離回収する工程。【００１９】
また、本発明の細胞の解析分別方法は、以下の工程を含む。【００２０】
細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化することを特徴とする細胞接着性光制御基材に第１の光照射をし、細胞接着領域と細胞非接着領域を設ける工程。【００２１】
また、本発明の細胞の解析分別装置は、細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、細胞接着性材料が離脱し、細胞非接着性材料が残ることを特徴とする細胞接着性光制御基材、あるいは光照射により光解離性基が結合解離して、照射された部分の表面が細胞接着性材料から細胞非接着性材料に非可逆的に変化することを特徴とする細胞接着性光制御基材と、
基材上の細胞接着性光制御材料を光反応させるための第１の光照射手段と、
を備えている。
【発明の効果】
【００２２】
細胞を生きたまま解析し、分別し、培養するに当たって、より簡便に、リアルタイムに作業ができ、培養細胞から不要細胞を除去・純化させながら培養できるようになる。また、培養細胞から所望の細胞を解析分別し、その細胞の純度，回収率，バイアビリティーを高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】培養中の細胞を解析し、所望の細胞を分別する方法（実施例１，２，５，６）。
【図２】個々に分離された細胞を解析し、所望の細胞を分別する方法（実施例３，７，９）。
【図３】個々に分離された細胞を解析し、所望の細胞を分別する方法（実施例４，８）。
【図４】本発明の細胞接着性光制御基材を用いた細胞の解析分別方法を実施するための装置（実施例１０）。
【図５】本発明の細胞接着性光制御基材を用いた細胞の解析分別方法を実施するための装置（実施例１１）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を実施するための形態を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明の一実施の形態では、細胞非接着性材料に光解離性基を介して細胞接着性材料を結合した細胞接着性光制御材料を基材に成膜してなる細胞接着性光制御基材とした。この細胞接着性光制御材料は、光照射により光解離性基が結合解離し、細胞接着性材料を基材から離脱させることができる。光結合解離は細胞非接着性材料と光解離性基の間または光解離性基と細胞接着性材料の間のどちらでも良い。光照射により、細胞非接着性材料を基材に残す。この非可逆的光解離反応により細胞接着性から細胞非接着性へと効率よく変化させることができ、接着選択性を良くすることができる。
【００２６】
細胞非接着性材料としては、細胞膜と類似の構造を持ち、生体適合性のあるホスホリルコリン基を有する材料が挙げられる。細胞非接着性材料は、例えば、下記一般式（１）で表されるホスホリルコリン基を有する（メタ）アクリル酸エステル重合体である。
【００２７】
【化１】
2011058721.tif 000003
【００２８】
（式中Ｒ1は水素又はメチル基を表し、ｎは１〜２０の数を表す。）
また、下記一般式（２）で表される（メタ）アクリル酸エステル重合体も細胞非接着性材料として使用できる。
【００２９】
【化２】
2011058721.tif 000004
【００３０】
（式中Ｒ2は１〜２０のアルキレン基又は１〜２０のポリオキシエチレン基を表す。）
細胞非接着性材料として、上記一般式（１）と（２）で表される（メタ）アクリル酸エステル重合体の共重合体であっても良い。更には、細胞非接着性材料として、下記一般式（３）で表されるアルコキシシランも使用することができる。
【００３１】
【化３】
2011058721.tif 000005
【００３２】
（式中Ｒ3は水素又はアルキル基を表す。）
細胞接着性材料としては、末端に細胞接着性基を有する材料が挙げられる。細胞接着性基としては、下記一般式（４）を含む材料が好適に用いられる。
【００３３】
【化４】
2011058721.tif 000006
【００３４】
（式中Ｘはカルボン酸、モノあるいはポリカルボン酸アルキル基，アミノ基、モノあるいはポリアミノアルキル基，アミド基、モノあるいはポリアミドアルキル基，ヒドラジド基、モノあるいはポリヒドラジドアルキル基，アミノ酸基，ポリペプチド基，核酸基を表す。）
一般式（４）の細胞接着性基Ｘを変えることにより様々な細胞に対する接着性のバリエーションを得ることができる。更に、該細胞接着性材料は、上記一般式（４）に、細胞との接着を促す細胞外マトリックスや細胞の表面抗原と結合する抗体及び該抗体を結合させるためのタンパク質などを結合あるいは接着させた材料も含む。細胞外マトリックスとしてはコラーゲン群，非コラーゲン性糖タンパク質群（フィブロネクチン，ビトロネクチン，ラミニン，ニドジェン，テネイノシン，トロンボスポンジ，フォンビルブランド，オステオポンチン，フィブリノーゲンなど），エラスチン群，プロテオグリカン群などである。抗体を結合させるタンパク質としては、アビジン／ビオチン，プロテインＡやプロテインＧなどがある。
【００３５】
光解離性基の光反応波長は、細胞毒性を示さない３６０ｎｍ以上で、かつ、光学顕微鏡観察用入射光や蛍光観察用励起光波長よりも短波長とする必要がある。これにより、細胞観察時に接着性の変化を起こさなくする。このような光解離性基としては、Ｏ−ニトロベンジル基やヒドロキシフェナシル基，クマリニルメチル基などが挙げられるが、細胞毒性を示さない点、光反応波長域や光反応効率が高いことから、クマリニルメチル骨格を含む材料が良い。特に、下記一般式（５）のクマリニルメチル骨格を含むものが好適に使用できる。
【００３６】
【化５】
2011058721.tif 000007
【００３７】
（式中Ｒ4は水素又はハロゲン基又はアルコキシ基、Ｒ5は２価で、Ｏ，ＣＯ，ＣＯ2，ＯＣＯ2，ＮＨＣＯ2，ＮＨ，ＳＯ3，(ＯＰＯ(ＯＨ))1~3ＯＰＯ2を表す。）
光解離性基と細胞接着性材料の結合は、一般式（４）で表される細胞接着性基と一般式（５）で表される光解離性基をクマリン骨格の７位あるいはＲ5の位置で直接あるいは間接に結合した構造とする。光解離はＲ5の位置で起こる。例えば、クマリン骨格の７位で結合させる場合には、下記一般式（６）で表されるような、二価の連結基Ｒ6を介して結合する構造がある。
【００３８】
【化６】
2011058721.tif 000008
【００３９】
２価の連結基Ｒ6としては、Ｏ(ＣＨ2)m，Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m，ＯＣＯ(ＣＨ2)m，ＯＣＯＣＨ2Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)m（ｍは０〜２０の整数）などが利用できるが、Ｒ6は光解離性基と細胞接着性基とを結合させるだけの意味を持つ。また、光解離性基の向きを逆にすれば、光解離性基と細胞接着性基の間で光解離させることができる。例えば、Ｒ5の位置で結合した構造である下記一般式（７）を挙げることができる。
【００４０】
【化７】
2011058721.tif 000009
【００４１】
上記のような細胞接着性材料と光解離性基を結合した構造は細胞非接着性材料に直接あるいは間接に結合させる。
【００４２】
例えば、下記一般式（８），（９），（１０）のような（メタ）アクリル酸エステル重合体の形にして、細胞非接着性材料の中に組み込むことができる。
【００４３】
【化８】
2011058721.tif 000010
【００４４】
【化９】
2011058721.tif 000011
【００４５】
【化１０】
2011058721.tif 000012
【００４６】
上記のような細胞接着性基と光解離性基を結合した構造を細胞非接着性材料に結合させた材料としては、例えば、上記一般式（１）（８），上記一般式（１）（９），上記一般式（１）（１０），上記一般式（１）（２）（８），上記一般式（１）（２）（９），上記一般式（１）（２）（１０）で表される（メタ）アクリル酸エステルの共重合体を挙げることができる。共重合体とすることで、細胞接着性材料と細胞非接着性材料の比率を変えることができ、これが様々な細胞に対する接着性のバリエーションを与えることになる。また、これらの重合体は側鎖にアルコキシシランを含む（メタ）アクリル酸エステルを共重合すると、基材との接着性を高めることができる。
【００４７】
一方、これらの系は共重合体の形を取っているが、単独の重合体としての形であっても良い。例えば、上記一般式（１０）を単独で用いても良いし、また、下記一般式（１１）あるいは（１２）で表されるアルコキシシランの形を取ることもできる。
【００４８】
【化１１】
2011058721.tif 000013
【００４９】
【化１２】
2011058721.tif 000014
【００５０】
これらの場合も細胞接着性材料には細胞との接着を促す細胞外マトリックスや細胞の表面抗原と結合する抗体及び該抗体を結合させるためのタンパク質などを結合あるいは接着させた材料も含む。
【００５１】
これらの細胞接着性光制御材料を成膜する基材としては透明なプラスチック製培養容器などを使うこともできるが、光学的な性能や耐久性から、好適にはガラス製培養容器を使うことができる。
【００５２】
次に本細胞接着性光制御基材を用いて細胞を解析分別する方法を図にて詳細を説明する。
【００５３】
図１は本発明の細胞の解析分別方法の一態様を示したものである。左側は右側の１点鎖線の断面図である。（１）ガラス製培養容器（透明基材）１に成膜した細胞接着性の細胞接着性光制御材料２上に細胞３を播種，培養する。（２）顕微鏡観察（透過像，位相差像，微分干渉像などを含む），蛍光観察，散乱光観察，ラマン光観察などにより細胞像を検出し、細胞の特徴量を抽出した後、（３）所望（要／不要を問わず）の細胞の位置情報を得る。蛍光マーカー標識などは培養の前でも後でも良い。（４ａ）では、例えば細胞４は不要な細胞であり、細胞３と細胞４の境界の細胞４側周辺及び細胞接着性光制御材料６を第２の光照射５により切断する。第２の光照射５としてはレーザ光を好適に用いることができる。（５ａ）細胞４の面積が広い場合は細胞４の領域８を第１の光照射７をし、細胞接着性光制御材料を細胞非接着性に変化させ、残りの細胞４をガラス製培養容器１から剥離，培養液と共に回収する。細胞４の面積が狭い場合はすべての細胞４及び細胞接着性光制御材料８を第２の光照射５することにより切断・破壊しても構わない。その後培養を続け、逐次不要細胞４を除去することで純化しながら細胞３の培養を続けることができる。
【００５４】
一方、（４ｂ）は、解析のために細胞４を分別・単離したい場合（細胞４が必要な場合）である。細胞３と細胞４の境界の細胞３側周辺及び細胞接着性光制御材料６を第２の光照射５により切断する。
【００５５】
第２の光照射５としてはレーザ光を好適に用いることができる。その後、（５ｂ）細胞４の領域８を第１の光照射７をし、細胞接着性光制御材料を細胞非接着性に変化させ、細胞４をガラス製培養容器１から剥離，培養液と共に回収する。
【００５６】
図２は本発明の細胞の解析分別方法の別の一態様を示したものである。左側は右側の１点鎖線の断面図である。（１）ガラス製培養容器１に成膜した細胞接着性の細胞接着性光制御材料２を図に示すように第１の光照射７をし、細胞接着領域６９と細胞非接着領域８を設ける。細胞接着領域６９と細胞非接着領域８は任意のパターンに設定できるが、ここでは細胞接着領域６９を細胞１個分の面積として格子状に並べた。つまり、細胞接着領域６９が格子状に並ぶように第１の光照射７を行った。
【００５７】
（２）次いで、既に培養された細胞塊をトリプシンなどの処理により個々の細胞に分離し、播種する。（３）顕微鏡観察（透過像，位相差像，微分干渉像などを含む），蛍光観察，散乱光観察，ラマン光観察などにより細胞像を検出し、細胞の特徴量を抽出した後、（４）所望（要／不要を問わず）の細胞の位置情報を得る。蛍光マーカー標識などは播種の前でも後でも良い。ここでは細胞３の他に別の細胞（例えば細胞４，細胞９）が存在したとする。（５）すべてのアドレス（細胞接着領域６９）に細胞が接着していない場合にはそのアドレスを第１の光照射７をして細胞非接着性にする（図に示す参照符号１０）。（６）次いで、所望の細胞、ここでは細胞４の領域１１に第１の光照射７をし、細胞４をガラス製培養容器１から剥離，培養液と共に回収する。この（６）の工程を逐次繰り返すことでそれぞれの細胞３，９を分別単離することができる。
【００５８】
図３は本発明の細胞の解析分別方法の更に別の一態様を示したものである。左側は右側の１点鎖線の断面図である。（１）ガラス製培養容器１に成膜した細胞接着性の細胞接着性光制御材料２に対して、所定の間隔を空けて、行方向及び列方向に第２の光照射（例えばレーザ光）５をし、隣接する細胞接着性光制御材料２を切断する（切断線：６）。また、所定の位置に第１の光照射７を行い、細胞接着領域６９と細胞非接着領域８を設ける。
【００５９】
細胞接着領域６９と細胞非接着領域８は任意のパターンに設定できるが、ここでは細胞接着領域６９を細胞１個分の面積として格子状に並べた。（２）次いで、既に培養された細胞塊をトリプシンなどの処理により個々の細胞に分離し、播種する。（３）顕微鏡観察（透過像，位相差像，微分干渉像などを含む），蛍光観察，散乱光観察，ラマン光観察などにより細胞像を検出し、細胞の特徴量を抽出した後、（４）所望（要／不要を問わず）の細胞の位置情報を得る。蛍光マーカー標識などは播種の前でも後でも良い。ここでは細胞３の他に細胞４，細胞９が存在したとする。
【００６０】
（５）すべての細胞接着領域（アドレス）６９に細胞が接着していない場合にはそのアドレス１０に第１の光照射７をして細胞非接着性にする。（６）次いで、所望の細胞、ここでは細胞４の領域１１に第１の光照射７をし、細胞４をガラス製培養容器１から剥離，培養液と共に回収する。この（６）の工程を逐次繰り返すことでそれぞれの細胞３，９を分別単離することができる。図２との違いは、細胞接着性材料の上層に細胞外マトリックスやフィーダー細胞のような繊維状あるいは膜状物質がある場合、第１の光照射７だけでは細胞接着性材料が領域毎に切断されないので、これを第２の光照射５で領域間を切断することにある。
【００６１】
本発明の細胞接着性光制御基材（例えば、細胞接着性光制御材料を透明基材上に成膜したもの）を用いた細胞の解析分別方法を実施する装置は少なくとも以下の（１）（２）（３）（４）（６）（７）を備えている。
（１）該細胞接着性光制御基材
（２）該基材を載せるステージ
（３）細胞像を取得する光学検出手段
（４）細胞像から位置情報を得る手段
（５）細胞間及び細胞接着性光制御材料を切断または破壊するための第２の光照射手段
（６）該基材上の細胞接着性光制御材料を光反応させるための第１の光照射手段
（７）各手段の動作を制御する手段
上記（３）記載の細胞像を取得する光学検出手段は周知の光学系を用いることができる。細胞像を得る際は、細胞接着性光制御材料の光解離性基に影響を与えない波長の光を照射して行う。例えば、光源として、広域の発光スペクトルが得られるランプあるいはＬＥＤを用い、少なくとも光反応波長以下の光を除去するための短波長カットフィルターを通して光照射し、透過光，反射光などをＣＣＤなどの２次元センサで検出する。細胞からの蛍光像の場合、励起光として、光反応波長より長波長帯で、目的の蛍光色素の吸収波長帯の光をバンドパス干渉フィルターなどで分光して照射する。前記波長帯のレーザ光を使うこともできる。蛍光は励起光カットフィルター，蛍光波長透過フィルター（バンドパス干渉フィルターなど）などの波長フィルターを通して、ＣＣＤなどの２次元センサで検出する。励起光を細く絞り、２次元に走査する方式にすれば、光電子増倍管で蛍光像を計測することも可能である。複数の波長フィルターを切り替えて測定すれば、複数の蛍光波長の蛍光像を得ることができ、複数の蛍光体に対応することができる。プリズム，回折格子などの分散素子を通し、ラインセンサなどで検出すれば、より細かな波長スペクトル像を得ることもできる。
【００６２】
上記（５）記載の第２の照射手段は、光源に赤外レーザまたは紫外レーザを用い、上記（４）記載の位置情報をもとにレーザ走査によって実施することができる。レーザ走査にはＸＹ偏向器を用い、目的の位置に光照射する。また、上記（４）記載の位置情報を反映したフォトマスクを通して一括光パターン照射することもできる。その場合、実験の度に固定したフォトマスクを作成することがないよう、パターンジェネレーターとして空間光変調デバイスを通して基材上にレーザを集光する光学系が好適である。空間光変調デバイスとしては反射型又は透過型空間光変調デバイスを用いることができる。反射型空間光変調デバイスとしてはデジタルミラーデバイス、また、透過型空間光変調デバイスとしては液晶空間光変調デバイスを使うことができる。ここで、デジタルミラーデバイスや液晶空間光変調デバイスは使えるレーザ波長が主として可視光から近赤外光領域である。従って、レーザ光源として水の吸収の強い近赤外レーザを使うことができる。また、紫外領域に波長を設定したい場合には可視から近赤外レーザ光を空間光変調デバイスを通した後、非線形結晶や強誘電体結晶などの波長変換デバイスを通して、波長が１／２，１／３になる第二高調波，第三高調波を使う。
【００６３】
上記（６）記載の第１の光照射手段は、光源に細胞接着性光制御材料の光反応波長を用いる。広域の発光スペクトルが得られるランプあるいはＬＥＤなどを用い、波長フィルターで３６０ｎｍ以下及び場合によっては蛍光励起波長以上をカットする、あるいは、光反応波長のレーザを使うことができる。上記（４）記載の位置情報をもとに、ＸＹ偏向器を用いて光走査し、目的の位置に光照射するか、あるいは、上記（４）記載の位置情報を反映したフォトマスクを通して一括光パターン照射することもできる。その場合、実験の度に固定したフォトマスクを作成することがないよう、パターンジェネレーターとして空間光変調デバイスを通して基材上に集光する光学系が好適である。空間光変調デバイスとしては反射型又は透過型空間光変調デバイスを用いることができる。反射型空間光変調デバイスとしてはデジタルミラーデバイス、また、透過型空間光変調デバイスとしては液晶空間光変調デバイスを使うことができる。
【００６４】
上記（３）（５）（６）記載の光学系はできる限り共通の部品を用いることが望ましい。
【実施例１】
【００６５】
一般式（１）で表されるメタクリル酸重合体（Ｒ1：メチル，ｎ：１）２０モル％と一般式（２）で表されるメタクリル酸重合体（Ｒ1：メチル，Ｒ2：ブチレン）５０モル％及び一般式（１０）で表されるメタクリル酸重合体（Ｒ1：メチル，Ｒ6：ＯＣＯＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ，Ｒ4：Ｂｒ，Ｘ：ＣＨ2ＣＯ2Ｈ，ｎ：１）３０モル％の３元共重合体（分子量：５,０００〜５０,０００）を成膜したガラス製培養容器を用意する。ここに、ヒト骨髄ストローマ細胞とヒト脂肪細胞分化培地（Cell Applications社）の細胞懸濁液を加え、３７℃，ＣＯ2インキュベータにて培養する。４０％コンフルエントの状態になった段階で、ガラス製培養容器を本発明の装置に設置し、４５０ｎｍ以下の光をカットして顕微鏡観察を行う。異常と思われる細胞位置をモニターにて確認し、その異常細胞群内周辺をレーザアブレーション領域に設定する（図１（１）（２）（３）（４ａ）（５ａ）参照）。１０６４ｎｍあるいは３５５ｎｍのレーザ光をレーザ走査またはパターン照射して正常脂肪細胞と異常細胞の間及び細胞接着性光制御材料を切断する。その後、レーザアブレーション照射で囲まれた内側の領域内の異常細胞群領域に、３６０ｎｍ以下の光をカットして、光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行う。ガラス製培養容器を装置から取り出し、異常細胞群を培地と共に回収し、新たな培地を加えて、インキュベータに戻して培養を続けた。【００６６】
本例は一例であるが、細胞接着性光制御材料の細胞接着性基を適切に選択することや細胞接着性材料と細胞非接着性材料の比を適切にコントロールすることにより、様々な種類の細胞を接着させることが可能になる。また、細胞接着性から非接着性へ光解離反応で効率良く非可逆的に変化するので、細胞と該基材との接着選択性に優れ、更に、細胞間の接着及び細胞接着性光制御材料をレーザ光で切断するので、任意の領域に存在する所望の細胞を回収するにあたり、該細胞の純度，回収率を高めることができる。更にまた、細胞を培養するに当たって、フローサイトメーターあるいはソーティング装置のように、培養基材から細胞を一旦取り出して純化する必要がなく、同じ培養基材上で、不要な細胞をリアルタイムに除去しながら培養することができ、培養・純化の操作が簡単になる。正常細胞と異常細胞が密着していたり、入り込んでいたりしても、正常細胞と異常細胞とが空間的に分離され、異常細胞領域が区画化される。これにより、光解離反応を異常細胞領域に限定して行うことができ、異常細胞を選択的に剥がすことができる。一旦剥がれた細胞は、元の場所が細胞非接着性に非可逆的に変化するため、再接着することがなく、異常細胞を効果的に除くことができる。更にまた、フローサイトメーターあるいはソーティング装置のような、電気的刺激，衝撃がなく、また、光反応波長，顕微鏡観察用光波長，蛍光観察用励起光波長をコントロールすることにより細胞への光毒性も低減できるので、細胞のバイアビリティーを上げることができる。更に、細胞を２次元平面上に並べ、ほぼ同時に各細胞に光を当てて、顕微鏡あるいは蛍光観察をするので、フローサイトメーターのように１次元に細胞を並べて個々の細胞にレーザを当てるための光軸調整が不要になる。
【実施例２】
【００６７】
実施例１の試料を培養し続けた後、ガラス製培養容器をインキュベータから取り出す。細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞表面マーカー用ブロッキング液（ＪＲＨ社）で１時間処理する。間葉系幹細胞マーカー：ＣＤ１０５を検出するために、マウス抗ヒトＣＤ１０５抗体（abcam社）の細胞表面マーカー用ブロッキング液希釈液を加え、室温で１時間反応させる。ＰＢＳで洗浄後、Alexa Fluor ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（Invitrogen社）の細胞表面マーカー用ブロッキング液希釈液を加えて、１時間遮光反応させる。反応後、溶液をＰＢＳで置換する。次いで、脂肪細胞を検出するために、Oil Red O染色液（Sigma社）を加えて１時間室温放置，染色し、溶液をＰＢＳに置換した。細胞の観察及び分別は以下の様に行った。ガラス製培養容器を本発明の装置に設置する。顕微鏡観察及び蛍光観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットする。顕微鏡観察及び蛍光観察にて、間葉系幹細胞と脂肪細胞の位置をモニターにて確認し、それぞれの細胞群内のレーザアブレーション領域を設定する（図１（１）（２）（３）（４ｂ）（５ｂ）参照）。１０６４ｎｍあるいは３５５ｎｍのレーザ光をレーザ走査またはパターン照射して、間葉系幹細胞，脂肪細胞，他の細胞との間及び細胞接着性光制御材料を切断し、それぞれの細胞群の領域を分離する。その後、まず、間葉系幹細胞領域に、光反応のための３６０ｎｍ以下の光を除去した４００ｎｍ付近の波長の光を使用し、光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行う。そして、剥離され、培地中に浮遊する間葉系幹細胞を培地と共に回収する。次に、洗浄し、培地を添加した後、異なる領域、すなわち、脂肪細胞領域に、光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行う。そして、剥離され、培地中に浮遊する脂肪細胞を培地と共に回収する。【００６８】
本例は、実施例１とは違い、光解離反応を起こさせる領域を逆にすることで、所望の正常細胞を高純度，高回収率，高バイアビリティーで分取するものである。本例でも実施例１と同様の効果がある。
【実施例３】
【００６９】
実施例２と同様にして培養した別のガラス製培養容器にＨＢＳＳを加えて洗浄後、Trypsin／ＥＤＴＡ溶液を加えて、室温で数分放置し、ガラス製培養容器から細胞を剥離させる。その後、Tripsin中和液を加えて反応を停止させ、ピペッティングにて細胞を遠心管に回収し、数分遠心分離を行い、上清を除いて培地を加え、細胞の懸濁液とした。また、間葉系幹細胞マーカーの付与と脂肪細胞染色も実施例２と同様にして行った。次に、一般式（１１）で表されるアルコキシシラン（Ｒ2：(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)2ＣＨ2ＣＨ2，Ｒ3：メチル，Ｒ4：Ｂｒ，Ｒ5：Ｏ，Ｒ6：ＯＣＯＣＨ2Ｏ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)3，Ｘ：ＣＨ2ＮＨ2）を成膜したガラス製培養容器を用意し、ＰＢＳを添加して、本発明の装置内に設置した。そして、７０μｍ角の細胞接着領域が１４０μｍピッチで格子状に並ぶ様に、それ以外の領域をレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射し、反応生成物をＰＢＳと共に除去し、再度、ＰＢＳで洗浄した。このガラス製培養容器に上記細胞懸濁液を播種・揺動した後、３０分間静置した。接着していない細胞を除くために、培地を交換した後、本容器を本発明の装置内に設置した。細胞の観察及び分別は以下の様に行った。顕微鏡観察及び蛍光観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットする。顕微鏡観察及び蛍光観察による各アドレスの色情報により、間葉系幹細胞，脂肪細胞，他の細胞，細胞無接着の位置を検出する。細胞接着領域の細胞無接着のアドレス領域に光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、回収細胞が再度接着しないようにした後、間葉系幹細胞のアドレス領域に、３６０ｎｍ以下の光をカットして光反応用のレーザもしく光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、剥離した間葉系幹細胞を培地と共に回収する。次に、培地を添加し、脂肪細胞のアドレス領域に、光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、剥離した脂肪細胞を培地と共に回収した。【００７０】
本例では、実施例１，２と同様の効果の他に、細胞を解析・分析するに当たり、個々の細胞を格子状のアドレスに接着させることで、光学的検出，解析分別のスピードを速めることができる。また、このような方法により、化合物による細胞の反応などを観察・解析しながら、即、分別できるようになり、リアルタイムな対応が可能になる。
【実施例４】
【００７１】
コラーゲンコートしたガラス製培養容器に、１.０×１０5個の未分化マウスＥＳ細胞を播種し、ＥＳ細胞用培地及び細胞増殖因子などの分化誘導因子を添加して７日間培養した。その後、０.２５％トリプシン・１ｍＭＰＢＳ液で剥がし、ＥＳ細胞用培地に懸濁した。【００７２】
別途、コラーゲンをコートした実施例１と同じガラス製培養容器を用意し、ＰＢＳを添加して、本発明の装置内に設置した。そして、２０μｍ角の細胞接着領域が４０μｍピッチで格子状に並ぶ様に、まず、碁盤目状に１０６４ｎｍあるいは３５５ｎｍのレーザ光をレーザ走査して細胞接着性光制御材料を切断した。次いで、細胞接着領域以外の領域をレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射し、反応生成物をＰＢＳと共に除去し、再度、ＰＢＳで洗浄した。【００７３】
ここに上記細胞懸濁液を播種・揺動した後、３０分間静置した。接着していない細胞を除くために、培地を交換し、細胞の観察及び分別は以下の様に行った。顕微鏡観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットした。顕微鏡観察による各アドレスの細胞画像情報により、肝細胞の位置を検出した。細胞接着領域の細胞無接着のアドレス領域に光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、回収細胞が再度接着しないようにした後、肝細胞のアドレス領域に、３６０ｎｍ以下の光をカットして光反応用のレーザもしく光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、剥離した肝細胞を培地と共に回収した。【００７４】
本例は、実施例１，２と同様の効果の他に、細胞外マトリックスやフィーダー細胞などの繊維状や膜状の物質を細胞との接着に用いる場合の該材料のパターニングに有効に作用する。上層に繊維状あるいは膜状物質がある場合、第１の光照射だけでは細胞接着性材料が領域毎に切断されない可能性がある。これを第２の光照射で領域間を切断する。
【実施例５】
【００７５】
一般式（１）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3，ｎ：１）と一般式（２）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3，Ｒ2：ブチレン）と一般式（８）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3，Ｒ4：Ｂｒ，Ｒ5：ＣＯ2，Ｒ6：ＯＣＯＣＨ2ＣＨ2，Ｘ：ＣＯ2Ｈ）の３元共重合体を成膜したガラス製培養容器（底面積９.６cm2）を用意する。不要な細胞のモデルとしてＮＩＨ／３Ｔ３細胞（マウス繊維芽細胞由来のセルライン）を１２.３万個用意し、同細胞専用培地（１０％子牛血清、９０％ＤＭＥＭ）１.６ｍＬに懸濁する。このＮＩＨ／３Ｔ３細胞懸濁液をガラス製培養容器に加え、３７℃，５％ＣＯ2インキュベータにて１日間培養する。必要な細胞のモデルとしてＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸がん由来のセルライン）を２４万個用意し、同細胞専用培地（１０％ＦＢＳ，９０％McCoy‘s  ５ａ）１.６ｍＬに懸濁する。前記ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を培養したガラス製培養容器から培地を除去し、ＨＣＴ１１６細胞の細胞懸濁液をガラス製培養容器に加え、３７℃，５％ＣＯ2インキュベータにて１日間培養する。また別途両細胞をそれぞれ単独で同様に培養し、それらの位相差顕微鏡像を取得しておく。ちなみにＨＣＴ１１６細胞は敷石状、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は紡錘状の細胞形態を示す。前記ガラス製培養容器を本発明の装置に設置し、４５０ｎｍ以下の光をカットして位相差顕微鏡観察を行う。不要細胞（すなわち紡錘状のＮＩＨ／３Ｔ３細胞）の位置をモニターにて確認し、その不要細胞群内周辺をレーザアブレーション領域に設定する（図１（１）（２）（３）（４ａ）（５ａ）参照）。１０６４ｎｍあるいは３５５ｎｍのレーザ光をレーザ走査またはパターン照射して必要細胞（すなわち敷石状のＨＣＴ１１６細胞）と不要細胞の間及び細胞接着性光制御材料を切断する。その後、レーザアブレーション照射で囲まれた内側の領域内の目的外細胞群領域に、３６０ｎｍ以下の光をカットして、光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行う。ガラス製培養容器を装置から取り出し、不要細胞群を培地と共に回収し、新たな培地を加えて、インキュベータに戻して培養を続けた。これにより、ほとんど全ての不要細胞を除去し、必要細胞を残して培養を継続できる。【００７６】
本例はモデル細胞を用いて動作原理を示したが、必要細胞を正常細胞、不要細胞を異常細胞と置き換えて同様の操作を行うことも可能である。具体的には例えば幹細胞の分化誘導研究において異常細胞（目的外の細胞へ分化した細胞や、幹細胞性を維持したままの未分化細胞など）を除去し、正常細胞（目的通りに分化した細胞など）を残して選別分取する目的などに同様に適用可能である。逆に必要細胞を異常細胞、不要細胞を正常細胞と置き換えて同様の操作を行うことも可能である。具体的には例えばがん細胞の研究において、正常細胞（目的外の、がん化していない細胞）を除去し、異常細胞（目的とするがん細胞など）を残して選別分取し濃縮する目的などにも同様に適用可能である。【００７７】
上記の例では細胞の観察手法として位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を判断基準として細胞を判別する場合について例示したが、他の手法により細胞を判別することもできる。例えば細胞に特異的な蛍光染色試薬を用い、蛍光顕微鏡像を用いて目的細胞と目的外細胞とを判別することも可能である。【００７８】
本例では細胞接着性光制御材料の細胞接着性基を適切に選択することや細胞接着性材料と細胞非接着性材料の比を適切にコントロールすることにより、様々な種類の細胞を接着させることが可能になる。また、細胞接着性から非接着性へ光解離反応で効率良く非可逆的に変化するので、細胞と該基材との接着選択性に優れ、更に、細胞間の接着及び細胞接着性光制御材料をレーザ光で切断するので、任意の領域に存在する所望の細胞を回収するにあたり、該細胞の純度，回収率を高めることができる。更にまた、細胞を培養するに当たって、フローサイトメーターあるいはソーティング装置のように、培養基材から細胞を一旦取り出して純化する必要がなく、同じ培養基材上で、不要な目的外細胞をリアルタイムに除去しながら培養することができ、培養・純化の操作が簡単になる。目的細胞と目的外細胞が密着していたり、入り込んでいたりしても、目的細胞と目的外細胞とが空間的に分離され、細胞領域が区画化される。これにより、光解離反応を目的外細胞領域に限定して行うことができ、目的外細胞を選択的に剥がすことができる。一旦剥がれた細胞は、元の場所が細胞非接着性に非可逆的に変化するため、再接着することがなく、目的外細胞を効果的に除くことができる。更にまた、フローサイトメーターあるいはソーティング装置のような、電気的刺激，衝撃がなく、また、光反応波長，位相差顕微鏡観察用光波長，蛍光観察用励起光波長をコントロールすることにより細胞への光毒性も低減できるので、細胞のバイアビリティーを上げることができる。更に、細胞を２次元平面上に並べ、ほぼ同時に各細胞に光を当てて、位相差顕微鏡あるいは蛍光観察をするので、フローサイトメーターのように１次元に細胞を並べて個々の細胞にレーザを当てるための光軸調整が不要になる。
【実施例６】
【００７９】
実施例５の試料を４日間培養し続けた後、ガラス製培養容器をインキュベータから取り出す。細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞表面マーカー用ブロッキング液（ＪＲＨ社）で１時間処理する。ヒト細胞のマーカーであるＨＬＡ抗原を検出するために、マウス抗ヒトＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体のＦＩＴＣ標識品（BioLegend社）と、マウス細胞のマーカーであるＨ−２抗原を検出するために、ラット抗マウスＨ−２抗体のＰＥ（フィコエリスリン）標識品（BioLegend社）とを細胞表面マーカー用ブロッキング液で希釈した染色液を加え、室温で１時間反応し、ＰＢＳで洗浄する。細胞の観察及び分別は以下の様に行った。ガラス製培養容器を本発明の装置に設置する。顕微鏡観察及び蛍光観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットする。蛍光観察および位相差顕微鏡観察にて、ヒト細胞（ＦＩＴＣで標識される、蛍光波長５２０ｎｍ，緑橙色）とマウス細胞（ＰＥで標識される、蛍光波長５７５ｎｍ，橙色）の位置をモニターにて確認し、それぞれの細胞群内のレーザアブレーション領域を設定する（図１（１）（２）（３）（４ｂ）（５ｂ）参照）。１０６４ｎｍあるいは３５５ｎｍのレーザ光をレーザ走査またはパターン照射して、ヒト細胞と、マウス細胞との間及び細胞接着性光制御材料を切断し、それぞれの細胞群の領域を分離する。その後、まず、ヒト細胞領域に、光反応のための３６０ｎｍ以下の光を除去した４００ｎｍ付近の波長の光を使用し、光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行う。そして、剥離され、培地中に浮遊するヒト細胞を培地と共に回収する。必要に応じて、次に、洗浄し、培地を添加した後、異なる領域、すなわち、マウス細胞領域に、光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行う。そして、剥離され、培地中に浮遊するマウス細胞を培地と共に回収する。【００８０】
本例は、実施例５とは違い、光解離反応を起こさせる領域を逆にすることで、所望の必要細胞を高純度，高回収率，高バイアビリティーで分取するものである。【００８１】
本実施例のごとく蛍光観察を行う場合の特有の効果として、極微量の不要細胞が混入していても、必要細胞と不要細胞をそれぞれ選択的に蛍光染色し、蛍光検出によりそれぞれを高感度に検出，識別し、必要細胞のみを高精度に選別分取できる、という効果が挙げられる。また、本実施例では３種以上の細胞の混合物から、必要細胞を２種以上設定して、それぞれ順次回収することも可能である。【００８２】
本例はモデル細胞を用いて動作原理を示したが、必要細胞をヒト細胞、不要細胞をマウスフィーダー細胞と置き換えて同様の操作を行うことも可能である。具体的には例えばヒト幹細胞の未分化維持や分化誘導の研究において、不要細胞（マウスフィーダー細胞）を除去し、複数の目的細胞（多能性を維持しているヒト幹細胞と、ヒト幹細胞から分化した各種の分化細胞）を順次選別分取する目的などに適用可能である。この場合、ヒト幹細胞の未分化性の識別には、位相差顕微鏡による細胞形態や、各種幹細胞マーカーを指標とする蛍光染色などを採用可能である。もちろん本実施例で用いたモデル細胞は、実施例５と同様、各種目的に応じてそれぞれ設定可能である。本例のその他の効果は実施例５と同様である。
【実施例７】
【００８３】
実施例５と同様にして培養した別のガラス製培養容器にＰＢＳを加えて洗浄後、Trypsin／ＥＤＴＡ溶液を加えて、室温で数分放置し、ガラス製培養容器から細胞を剥離させる。その後、Trypsin阻害液を加えて反応を停止させ、ピペッティングにて細胞を遠心管に回収し、数分遠心分離を行い、上清を除いて培地を加え、細胞の懸濁液とした。また、ヒト細胞マーカー，マウス細胞マーカーを指標とすると細胞染色は実施例６と同様にして行った。次に、実施例５と同じ材料を成膜したガラス製培養容器を用意し、ＰＢＳを添加して、本発明の装置内に設置した。そして、２０μｍ角の細胞接着領域が４０μｍピッチで格子状に並ぶ様に、それ以外の領域をレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射し、反応生成物をＰＢＳと共に除去し、再度、ＰＢＳで洗浄した。このガラス製培養容器に上記細胞懸濁液を播種・揺動した後、３時間静置した。あるいは、接着を加速するために、播種・揺動の後、プレート遠心機等を用いて細胞をガラス製培養容器の底部に沈降させた後、３０分間静置した。接着していない細胞を除くために、培地を交換した後、本容器を本発明の装置内に設置した。細胞の観察及び分別は以下の様に行った。顕微鏡観察及び蛍光観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットする。顕微鏡観察及び蛍光観察による各アドレスの色情報により、ヒト細胞，マウス細胞，細胞無接着の位置を検出する。細胞接着領域の細胞無接着のアドレス領域に光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、回収細胞が再度接着しないようにした後、ヒト細胞のアドレス領域に、３６０ｎｍ以下の光をカットして光反応用のレーザもしく光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、剥離したヒト細胞を培地と共に回収する。必要に応じて、次に、培地を添加し、マウス細胞のアドレス領域に、光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、剥離したマウス細胞を培地と共に回収した。【００８４】
本例では、実施例５，６と同様の効果の他に、細胞を解析・分析するに当たり、個々の細胞を格子状のアドレスに接着させることで、光学的検出，解析分別のスピードを速めることができる。また、このような方法により、化合物による細胞の反応などを観察・解析しながら、即、分別できるようになり、リアルタイムな対応が可能になる、という効果がある。
【実施例８】
【００８５】
Colo320ＨＳＲ細胞１５.４万個を同細胞用培地（１０％ＦＢＳ，９０％ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁し、コラーゲンコートしたガラス製培養容器に播種して７日間培養した。その後、０.２５％トリプシンＰＢＳ液で剥がし、反応停止後、新鮮な同培地に懸濁した。【００８６】
別途、コラーゲンをコートした実施例５と同じガラス製培養容器を用意し、ＰＢＳを添加して、本発明の装置内に設置した。そして、２０μｍ角の細胞接着領域が４０μｍピッチで格子状に並ぶ様に、まず、碁盤目状に１０６４ｎｍあるいは３５５ｎｍのレーザ光をレーザ走査して細胞接着性光制御材料を切断した。次いで、細胞接着領域以外の領域をレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射し、反応生成物をＰＢＳと共に除去し、再度、ＰＢＳで洗浄した。【００８７】
ここに上記細胞懸濁液を播種・揺動した後、３時間静置した。あるいは、接着を加速するために、播種・揺動の後、プレート遠心機等を用いて細胞をガラス製培養容器の底部に沈降させた後、３０分間静置した。接着していない細胞を除くために、培地を交換し、細胞の観察及び分別は以下の様に行った。顕微鏡観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットした。顕微鏡観察による各アドレスの細胞画像情報により、Colo320ＨＳＲ細胞の位置を検出した。細胞接着領域の細胞無接着のアドレス領域に光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、回収細胞が再度接着しないようにした後、Colo320 ＨＳＲ細胞のアドレス領域に、３６０ｎｍ以下の光をカットして光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、剥離したColo320ＨＳＲ細胞を培地と共に回収した。【００８８】
本例は、実施例５，６と同様の効果の他に、細胞外マトリックスやフィーダー細胞などの繊維状や膜状の物質を細胞との接着に用いる場合の該材料のパターニングに有効に作用する。上層に繊維状あるいは膜状物質がある場合、第１の光照射だけでは細胞接着性材料が領域毎に切断されない可能性がある。これを第２の光照射で領域間を切断する。【００８９】
本実施例では細胞外マトリックスとしてコラーゲン、接着性が低い細胞としてColo320ＨＳＲ細胞をモデルとして用いた。本実施例では他の細胞外マトリックスや接着性が低い細胞も同様に好適に使用可能である。細胞外マトリックスの例としては上記コラーゲン以外にフィブロネクチン，ラミニン，ゼラチンなどがあり、またフィーダー細胞としてはマウス胎児繊維芽（ＭＥＦ）細胞，ＳＴＯ細胞，３Ｔ３細胞，ＳＮＬ細胞、などに対しガンマ線照射や抗生物質により増殖停止処理をしたものが利用できる。細胞外マトリックスを必要とする細胞の例としては、ＥＳ細胞，ｉＰＳ細胞、などの多能性幹細胞や、角膜上皮幹細胞、なども挙げられる。
【実施例９】
【００９０】
実施例７と同様にして培養した別のガラス製培養容器にＰＢＳを加えて洗浄後、Trypsin／ＥＤＴＡ溶液を加えて、室温で数分放置し、ガラス製培養容器から細胞を剥離させる。その後、Trypsin中和液を加えて反応を停止させ、ピペッティングにて細胞を遠心管に回収し、数分遠心分離を行い、上清を除いて培地を加え、細胞の懸濁液とした。また、ヒト細胞マーカー，マウス細胞マーカーを指標とする蛍光染色も実施例７と同様にして行った。次に、一般式（１）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3，ｎ：１）と一般式（２）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3，Ｒ2：ブチレン）と一般式（９）で表されるメタアクリル酸エステル重合体（Ｒ1：ＣＨ3，Ｒ4：Ｂｒ，Ｒ5−Ｘ：ＯＣＯＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ2Ｈ）の３元共重合体を成膜したガラス製培養容器を用意し、ＰＢＳを添加して、本発明の装置内に設置した。そして、２０μｍ角の細胞接着領域が４０μｍピッチで格子状に並ぶ様に、それ以外の領域をレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射し、反応生成物をＰＢＳと共に除去し、再度、ＰＢＳで洗浄した。このガラス製培養容器に上記細胞懸濁液を播種・揺動した後、３時間静置した。あるいは、接着を加速するために、播種・揺動の後、プレート遠心機等を用いて細胞をガラス製培養容器の底部に沈降させた後、３０分間静置した。接着していない細胞を除くために、培地を交換した後、本容器を本発明の装置内に設置した。細胞の観察及び分別は以下の様に行った。顕微鏡観察及び蛍光観察には、光反応させないために、光源波長の内４５０ｎｍ以下の光をカットする。顕微鏡観察及び蛍光観察による各アドレスの色情報により、ヒト細胞，マウス細胞，細胞無接着の位置を検出する。細胞接着領域の細胞無接着のアドレス領域に光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、回収細胞が再度接着しないようにした後、ヒト細胞のアドレス領域に、３６０ｎｍ以下の光をカットして光反応用のレーザもしく光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、剥離したヒト細胞を培地と共に回収する。必要に応じて、次に、培地を添加し、マウス細胞のアドレス領域に、光反応用のレーザもしくは光走査、またはレーザもしくは光パターン照射を行い、剥離したマウス細胞を培地と共に回収した。【００９１】
本例では、実施例５，６と同様の効果の他に、細胞を解析・分析するに当たり、個々の細胞を格子状のアドレスに接着させることで、光学的検出，解析分別のスピードを速めることができる。また、このような方法により、化合物による細胞の反応などを観察・解析しながら、即、分別できるようになり、リアルタイムな対応が可能になる。
【実施例１０】
【００９２】
図４は本発明の細胞の解析分別装置の一実施態様の概要を示したものである。【００９３】
図４において、細胞を接着させる細胞接着性光制御材料２を透明基材１上に成膜した細胞接着性光制御基材を電動及び／又は手動で駆動できるステージ１２に固定する。透明基材１または／およびステージ１２には位置を特定できる位置マーカーを刻印しておく。【００９４】
顕微鏡観察は、広域の発光スペクトルが得られるハロゲンなどのランプを光源１３とし、波長フィルター１４で４５０ｎｍ以下の波長をカットした後、コンデンサーレンズ１５で基材上へ集光する。透過光は対物レンズ１６で集め、２つのダイクロイックミラー１７，１８を通過させた後、結像レンズ１９で集光して、ＣＣＤなどの（２次元）検出器２０で検出する。蛍光像観察は、広域の発光スペクトルが得られるキセノンランプ，高圧水銀ランプなどを（励起）光源２１とし、励起波長選択用に単一または複数の波長フィルター２２と、コリメーターレンズ２３と、ダイクロイックミラー１８，１７を通した後、対物レンズ１６で基材上に集光する。発生した蛍光は、対物レンズ１６で集光し、ダイクロイックミラー１７，１８を通した後、励起光カット用の単一または複数の波長フィルター２４を通して、結像レンズ１９で集光し、ＣＣＤなどの（２次元）検出器２０で検出する。検出データはモニター及び操作部を含む制御及び解析装置２５に送られ、画像解析による細胞特徴量の抽出及び各細胞の位置情報を取得する。光源２１は上記ではランプを使用しているが、アルゴンレーザなどの周知のレーザ光源を使用することもできる。【００９５】
アブレーション用の第２の光照射手段は、３５５ｎｍなどの紫外レーザを光源２６とし、ダイクロイックミラー２７で光路変更した後、上記各細胞の位置情報をもとにして、ＸＹ偏向器２８でレーザ光を走査する。走査されたレーザ光はダイクロイックミラー１７で対物レンズ１６に導かれ、基材上に照射する。【００９６】
光反応用の第１の光照射手段は、４０５ｎｍなどの半導体レーザを光源２９とし、ダイクロイックミラー２７を通した後、上記各細胞の位置情報をもとにして、ＸＹ偏向器２８でレーザ光を走査する。走査されたレーザ光はダイクロイックミラー１７で光路変更した後、対物レンズ１６で基材上に集光する。【００９７】
本例では、細胞はステージに培養されながら保持されている。そのため、ステージを移動しない限り、視野からなくなることはない。そこで、ランプおよび、複数の波長フィルター（複数のバンドパス干渉フィルター）を使い、順次フィルターを切り替えることで、複数の励起が可能になる。そのため、標識として複数の蛍光体を使用しても、多種類の蛍光励起レーザを使う必要はなくなる。【００９８】
標識として複数の蛍光体を使用する場合、複数の波長フィルターを切り替えて有効に蛍光像を検出することができる。波長フィルターとして各々の蛍光強度を検出するのに最適な異なる波長帯のバンドパス干渉フィルターを使い、順番に切り替えて各波長帯の蛍光像を検出する。これにより複数の標識状態をより精度よく計測することができ、識別・分取がより効率よくできるようになる。【００９９】
また、本例では、第１の光照射手段と第２の光照射手段では、同時に照射することがないため、ＸＹ偏向器２８を共用で使用する方式としている。そのため、光源２６と２９のレーザ光軸をダイクロイックミラー２７により同軸にするようにしている。レーザのＯＮ／ＯＦＦは制御及び解析装置２５で制御される。【０１００】
上記例では、ダイクロイックミラー２７は、３５５ｎｍ反射・４０５ｎｍ透過、ダイクロイックミラー１７は、３５５ｎｍ〜４０５ｎｍ反射・４５０ｎｍ以上透過、ダイクロイックミラー１８は、３５５ｎｍ〜５００ｎｍ反射・５２０ｎｍ以上透過のような特性とする。これらの波長特性は、使用するレーザ波長，蛍光体などによって変更される。【０１０１】
本例では、実施例１〜９の効果の他に、従来の蛍光イメージアナライザーのような画像情報だけでなく、フローサイトメーターのような細胞毎の蛍光デジタル情報を得ることができるので、細胞を分別する際の情報として簡便に使うことができる。
【実施例１１】
【０１０２】
図５は本発明の細胞の解析分別装置の一実施態様の概要を示したものである。【０１０３】
図５（ａ）において、細胞を接着させる細胞接着性光制御材料２を透明基材１上に成膜した細胞接着性光制御基材を電動及び／又は手動で駆動できるステージ３０に固定する。該透明基材１または／及びステージ３０には位置を特定できる位置マーカーを刻印しておく。【０１０４】
顕微鏡観察及び／又は蛍光観察は、広域の発光スペクトルが得られるキセノンランプまたは高圧水銀ランプなどのランプを光源３１とし、ダイクロイックミラー３２で波長毎に分割し、反射光を透過像測定のための照明光または蛍光像測定のための励起光として使用する。ダイクロイックミラー３２の透過光は、光解離性基反応用の照射光とする。通常、同時に試料に照射されることはしないようにする。【０１０５】
ダイクロイックミラー３２による反射光は、透光用あるいは蛍光励起波長選択用の複数の（光）波長フィルター３３で波長が選択される。その後シャッター３４を通過させるが、その際、上述のようにシャッター３５は閉じておく。ミラー３６で光路変更した光はコレクターレンズ３７を通し、ダイクロイックミラー３８で反射させて、対物レンズ３９に導き、基材上に集光する。透過光または蛍光は対物レンズ４０により集められ、ミラー４１にて光路変更した後、実施例１０と同様に、単一または複数の波長フィルター４２にて透過光もしくは複数の蛍光を選択し、結像レンズ４３で集光して、ＣＣＤカメラなどの（２次元）検出器４４で検出する。検出データはモニター及び操作部を含む制御及び解析装置４５に送られ、画像解析による細胞特徴量の抽出及び各細胞の位置情報を取得する。【０１０６】
アブレーション用の第２の光照射手段は、光源４６としては１０６４ｎｍのＮｄ：ＹＡＧ近赤外レーザを用い、コリメーターレンズ４７にてパターン領域の大きさにし、ダイクロイックミラー４８を通して、空間光変調デバイス４９に導く。空間光変調デバイス４９としては図５（ｂ）に示すデジタルミラーデバイスのような反射型空間光変調デバイス５０や図５（ｃ）に示す液晶型の空間光変調デバイス５３を使うことができる。空間光変調デバイスにて細胞の位置情報を反映したマスクパターンを形成し、リレーレンズ５４，ダイクロイックミラー３８，対物レンズ３９を通して、マスクパターンを基材上に投影し、基材上の切断すべき位置に光照射する。細胞接着性光制御基材が対物レンズで測定・照射できる領域より大きい場合は、ステージ３０を自動または手動にて移動させ、または、領域毎にステップアンドリピート方式で測定及び処理を行う。また、アブレーション光波長として紫外領域を設定したい場合には、アブレーション用レーザ光源４６として、例えば、１０６４ｎｍのＮｄ：ＹＡＧ近赤外レーザを用い、上記空間光変調デバイス４９とリレーレンズ５４の間に非線形結晶や強誘電体結晶などの波長変換デバイス５５をおいて、１／３波長の第三高調波３５５ｎｍとして使用することができる。また、例えば、６９４ｎｍのルビー可視レーザを用いて、第二高調波を取り出せば、３４７ｎｍのレーザ光として使うことができる。【０１０７】
光反応用の第１の光照射手段は、上記各細胞の位置情報を反映した空間光変調デバイス４９を通して基材上に集光する光学系である。光反応用光源３１は細胞像検出用の光源と共通としている。ダイクロイックミラー３２を通過した光はコレクターレンズ５６，シャッター３５，波長フィルター５７，ダイクロイックミラー４８を通して、空間光変調デバイス４９に導く。その際、シャッター３４を閉じておく。本例で使用する波長は、波長フィルター５７により、例えば、３６０〜４５０ｎｍとする。空間光変調デバイス４９としては図５（ｂ）に示すデジタルミラーデバイスのような反射型空間光変調デバイス５０や図５（ｃ）に示す液晶型の空間光変調デバイス５３を使うことができる。空間光変調デバイスにて細胞の位置情報を反映したマスクパターンを形成し、リレーレンズ５４，ダイクロイックミラー３８，対物レンズ３９を通して、所望のマスクパターンを基材上に投影し、目的の領域の表面特性を細胞接着性から細胞非接着性に変える。これにより、所望の領域の細胞を選択的に剥離，回収することができる。ステージ３０で基材の位置を変えることができ、ステップアンドリピート方式でより広い部分の処理を行うことができる。【０１０８】
本例でも実施例１０と同様の効果がある。
【符号の説明】
【０１０９】
１  透明基材
２  細胞接着性光制御材料
３，４，９  細胞
５  第２の光照射
６  細胞間及び細胞接着性光制御材料の切断領域
７  第１の光照射
８  光反応により細胞接着性から非接着性へ変化させる領域（細胞非接着領域）
１０，１１  光反応により細胞接着性から非接着性へ変化させる領域
１２，３０  ステージ
１３，２１  光源
１４，２２，２４，３３，４２，５７  波長フィルター
１５  コンデンサーレンズ
１６，３９，４０  対物レンズ
１７，１８，２７，３２，３８，４８  ダイクロイックミラー
１９，４３  結像レンズ
２０，４４  検出器
２３，４７  コリメーターレンズ
２５，４５  モニター及び操作部を含む制御及び解析装置
２６，４６  第２の光照射光源
２８  ＸＹ偏向器
２９  第１の光照射光源
３１  光源及び第１の光照射光源
３４，３５  シャッター
３６，４１，５１，５２  ミラー
３７，５６  コレクターレンズ
４９  空間光変調デバイス
５０  反射型空間光変調デバイス
５３  透過型空間光変調デバイス
５４  リレーレンズ
５５  波長変換デバイス
６９  細胞接着領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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