(57)【要約】  iPS細胞を効率的且つ簡便に作製する方法を提供することを課題とする。骨髄を顆粒球単球コロニー刺激因子の存在下で培養した後、増殖した細胞を形質転換させて多能性幹細胞を得る。
2011135969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）及び（２）を含む、誘導多能性幹細胞の作製法：
（１）骨髄を顆粒球単球コロニー刺激因子の存在下で培養するステップ；
（２）増殖した細胞を多能性幹細胞へ形質転換させるステップ。
【請求項２】
骨髄がヒトの骨髄である、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の作製法。
【請求項３】
骨髄が、壮年期以降のヒトの骨髄である、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の作製法。
【請求項４】
骨髄がマウスの骨髄である、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の作製法。
【請求項５】
ステップ（２）の形質転換が、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を細胞に導入することにより行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の誘導多能性幹細胞の作製法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の作製法で作製される誘導多能性幹細胞。
【請求項７】
多能性幹細胞マーカーであるNanog遺伝子、Oct4遺伝子、FgF4遺伝子、Esg-1遺伝子及びCript遺伝子を発現している、請求項６に記載の誘導多能性幹細胞。
【請求項８】
遺伝子の再構成が行われていない、請求項６又は７に記載の誘導多能性幹細胞。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の誘導多能性幹細胞に対して分化誘導処理を施すことを特徴とする、特定の細胞系譜に分化した細胞の作製法。
【請求項１０】
骨髄を顆粒球単球コロニー刺激因子の存在下で培養することを特徴とする、誘導多能性幹細胞作製用細胞の調製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は誘導多能性幹細胞の作製法及びその用途に関する。本出願は、２０１０年４月２８日に出願された日本国特許出願第２０１０−１０３２１１号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
マウスあるいはヒトから誘導多能性幹細胞(iPS細胞)が樹立されるようになったことは再生医療における大きなブレークスルーとなる（非特許文献１〜５）。この技術は患者自身の細胞を用いた治療（再生医療）を可能にすると期待されており、高齢者が自己の細胞からiPS細胞を作製し、必要に応じて修飾をした上で利用することによって、機能が衰えた臓器・組織を修復したり、老化に伴う疾病を治療したりする時代が到来しようとしている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Jaenisch R, Young R,. Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming. Cell 2008: 132:567-82.
【非特許文献２】Takahashi K, Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663-676.
【非特許文献３】Wernig M, Meissner A, Foreman R, et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES cell-like state. Nature 2007 ;448: 318-24.
【非特許文献４】Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007;131: 861-72.
【非特許文献５】Hanna J, Wernig M, Markoulaki S. et al., Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science 2007; 318:920-23.
【非特許文献６】Hong H, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Kanagawa O, Nakagawa M, Okita K, Yamanaka S. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature 460, 1132-1135(2009).
【非特許文献７】Okabe M, Otsu M, Ahn DH, et al. Definitive proof for direct reprogramming of hematopoietic cells to pluripotency. Blood.2009;114:1764-1767.
【非特許文献８】Kunisato A, Wakatsuki M, Kodama Y, Shinba H, Ishida I, Nagao K. Generation of induced pluripotent stem (iPS) cells by efficient reprogramming of adult bone marrow cells. Stem Cells Dev. 2010;19(2):229-238.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
iPS細胞を臨床応用する上で克服すべき課題の一つはその作製効率の低さである。iPS細胞を疾病の治療や老化で衰えた臓器・組織の修復に利用するためには、iPS細胞を効率的に作製する技術の開発が必要である。特に、高齢化が進む現代においては高齢者（老化個体）の体細胞から効率的にiPS細胞を作製する技術の提供が要請される。そこで本発明は、iPS細胞を効率的且つ簡便に作製する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討し、比較的容易に採取可能な骨髄を細胞のソースとして採用するとともに、転写因子などの導入による形質転換操作（iPS細胞への形質転換）の前に細胞を顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF; Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor）の存在下で培養するという戦略を考案した。この戦略の有効性を検証するため、老齢マウスの骨髄を用いた実験を行った。具体的には老齢マウスの骨髄をGM-CSF添加培地で短期間培養した後、４つの転写因子（Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc）を導入した。その結果、約１月後にはiPS細胞様のコロニーの出現を認めた。形成されたコロニーからクローンを確立し、その特性を調べたところ、繊維芽細胞から作製したiPS細胞と同様に３胚葉への分化能を示すとともに多能性幹細胞マーカーを高発現していた。このように、老化個体の骨髄からiPS細胞を樹立することに成功し、上記戦略が有効であることを確認できた。ここで、本発明者らが実験に使用した老齢マウスの月齢（21月齢）はヒト年齢でいうと６０代〜８０代に相当する。このような老齢個体由来の細胞からiPS細胞の樹立に成功したことは、iPS細胞の実用化に向けた大きなブレークスルーとなる。【０００６】
一方、老齢個体の骨髄を用いた場合に比べ、若齢個体の骨髄を用いるとiPS細胞のコロニーが早期に出現することが示された（後述の実施例を参照）。この結果は、若齢個体の骨髄の活性が高いことを裏付ける一方で、上記戦略が若齢個体の骨髄を細胞のソースとした場合にも有効であることを示す。【０００７】
ところで、過去の報告における多くのiPS細胞は、マウスでは胎児繊維芽細胞、ヒトでは若齢個体の繊維芽細胞から作製されている。繊維芽細胞から作製する場合でもiPS細胞の作製効率はよくない。まして、他の細胞からiPS細胞を作製する場合にはより困難が伴う。例えばT細胞からiPS細胞を樹立しようとすればp53遺伝子を欠損させる必要がある（非特許文献６）。一方、骨髄からiPS細胞を樹立することに成功したとの報告はあるものの（非特許文献７、８）、老齢個体の骨髄を用いたものではない。本発明者らが採用した方法は比較的簡便であるにも拘わらずiPS細胞の作製効率を高め、老齢個体の骨髄からのiPS細胞の樹立をも可能にするものである。言い換えれば、過去の報告とは一線を画し、再生医療分野などにおけるiPS細胞の実用化、応用を進める上で極めて重要且つ有益な技術を提供するものであり、その意義は大きい。一方、本発明の方法によればGM-CSFの刺激により誘導されたミエロ系細胞からiPS細胞が作製される。従って、再生医療への適用に適した、遺伝子の再構成が生じていないiPS細胞が得られる。このことも本発明の作製法に特有の利点であり、特筆に値する。
以下に列挙する本発明は上記知見及び成果に基づく。
[１]以下のステップ（１）及び（２）を含む、誘導多能性幹細胞の作製法：
（１）骨髄を顆粒球単球コロニー刺激因子の存在下で培養するステップ；
（２）増殖した細胞を多能性幹細胞へ形質転換させるステップ。
[２]骨髄がヒトの骨髄である、[１]に記載の誘導多能性幹細胞の作製法。
[３]骨髄が、壮年期以降のヒトの骨髄である、[１]に記載の誘導多能性幹細胞の作製法。
[４]骨髄がマウスの骨髄である、[１]に記載の誘導多能性幹細胞の作製法。
[５]ステップ（２）の形質転換が、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を細胞に導入することにより行われる、[１]〜[４]のいずれか一項に記載の誘導多能性幹細胞の作製法。
[６][１]〜[５]のいずれか一項に記載の作製法で作製される誘導多能性幹細胞。
[７]多能性幹細胞マーカーであるNanog遺伝子、Oct4遺伝子、FgF4遺伝子、Esg-1遺伝子及びCript遺伝子を発現している、[６]に記載の誘導多能性幹細胞。
[８]遺伝子の再構成が行われていない、[６]又は[７]に記載の誘導多能性幹細胞。
[９][６]〜[８]のいずれか一項に記載の誘導多能性幹細胞に対して分化誘導処理を施すことを特徴とする、特定の細胞系譜に分化した細胞の作製法。
[１０]骨髄を顆粒球単球コロニー刺激因子の存在下で培養することを特徴とする、誘導多能性幹細胞作製用細胞の調製法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】iPS細胞の作製手順を模式的に示す図。21ヶ月齢のEGFP（enhanced green fluorescent protein）陽性C57BL/6マウスから骨髄細胞を取り出し、GM-CSF存在下で4日間培養後、iPS作製に必要な4因子を導入した。IPS様コロニーが数個現れた。トリプシンを用いてこれらをピックアップし、24ウェルプレートで培養した。その中で二つのクローンがiPS様形態を保ちながら増殖した。液体窒素下に保存するとともに、1クローンを後の解析に使用した。
【図２】細胞の形態変化を示す図。３つの形態変化を示す。左：21ヶ月齢C57BL/6マウスの骨髄細胞をGM-CSF存在下で培養した後の形態（培養４日目）。中央：出現したiPS細胞コロニー。右：確立した骨髄細胞由来iPS細胞（BM-M-iPS）。
【図３】iPS細胞作製効率の比較。C57BL/6マウス繊維芽細胞（MEF）、2ヶ月齢マウスの骨髄細胞をGM-CSF存在下で培養（4日間）したもの、又は23ヶ月齢マウスの骨髄細胞をGM-CSFで培養（4日間）したものを10cm培養皿内でフィーダー細胞上に培養し、iPS作製用の4因子を導入し、現れるコロニー数を経時的にカウントした。
【図４】BM-M-iPS細胞の皮下注射により形成された腫瘤を示す図。左：マウスの背中に形成された腫瘤。右：摘出した腫瘤。
【図５】老化骨髄ミエロ系細胞から樹立したiPS細胞の生体における分化能を示す図。BM-M-iPS細胞1x107個をC57BL/6マウスの背中に皮下注射した。A. 注射21日後、腫瘤を確認し（図３）、組織切片作製用にOCTで固定した。B. H&E染色像を示す。外胚葉；皮膚の角質層、中胚葉；平滑筋細胞、内胚葉；消化管上皮細胞。
【図６】老化骨髄ミエロ系細胞から樹立したiPS細胞の遺伝子発現を示す図。骨髄細胞をGM-CS存在下で4日間培養したもの（BMD4）は同7日間培養したもの（BMD7；骨髄樹状細胞を誘導する通常の条件で得られる細胞）同様にミエロ系サイトカイン（TNF-α、IL-1b）、ケモカイン（ccl7）、転写因子（C/EBPa、Pu-1）を発現するが、老化骨髄ミエロ系細胞から樹立したiPS細胞（BM-M-iPS）は、MEFから作製したiPS細胞と同様、これらサイトカインの発現が低下している。その代わり多能性幹細胞マーカーであるNanog、Oct4、FgF4、Esg-1及びCriptの発現が上昇した。分化誘導後のBM-M-iPS（BM-i-DC）及びMEF-iPS（MEF-i-DC）についても遺伝子発現を調べた。
【図７】老化（21ヶ月齢）骨髄ミエロ細胞由来のiPS細胞（BM-M-iPS）のin vitro分化。(A)胚様体（EB）形成及びin vitro分化誘導のスキーム（×40）。BM-M-iPS細胞をハンギングドロップ法で8日間培養した後、24ウェルプレートに移した。ハンギングドロップ法による培養（左）及び形成されたEB（右）を示す（Olympus社の位相差顕微鏡を使用）。(B)分化したBM-M-iPSの免疫染色（×100）。上段はα−アクチンを発現する中胚葉組織を示す。中段はα−フェトプロテインを発現する内胚葉組織を示す。下段はニューロフィラメントHを発現する外胚葉組織を示す。(C) 0.1%ゼラチンコート6ウェルプレートに播種したOP9上でiPS細胞を培養した。5日間の培養の後、位相差顕微鏡像を撮影した（×100）。上段；OP9との共培養5日目のMEF-iPS。下段；OP9との共培養5日目のBM-M-iPS。分化誘導後の位相差顕微鏡像及びギムザ染色像。上段；MEF-iPSの分化。下段；BM-M-iPSの分化。
【図８】分化誘導前後の細胞表面マーカーの解析結果。BM-M-iPS細胞とMEF-iPS細胞をGM-CSFによってミエロ系に分化誘導した後、ミエロ系細胞表面マーカーを検出した。
【図９】BM-M-iPS細胞を用いて得られたキメラマウス。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は誘導多能性幹細胞の新規作製法（以下、本発明の作製法とも呼ぶ）を提供する。「誘導多能性幹細胞」とは、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。誘導多能性幹細胞は胚性幹細胞（ES細胞）に近い性質を示す。説明の便宜上、本明細書では誘導多能性幹細胞のことをiPS細胞と略称することがある。
【００１０】
本発明の作製法では以下の二つのステップ、即ち、ステップ（１）「骨髄を顆粒球単球コロニー刺激因子の存在下で培養するステップ」とステップ（２）「増殖した細胞を多能性幹細胞へ形質転換させるステップ」を行う。以下、各ステップの詳細を説明する。
【００１１】
（１）顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF；Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor）存在下での培養
本発明ではiPS細胞へ形質転換させるステップに先だって、骨髄細胞をGM-CSF存在下で培養する。この培養を行うことが本発明の最大の特徴である。この培養工程を組み込むことによってiPS細胞の作製効率が向上する。理論に拘泥する訳ではないが、GM-CSFによる刺激を加えることによりミエロ系細胞系譜への誘導が生じ、増殖性の高い細胞が得られる。また、遺伝子の再構成を防止することができる。この特徴は、遺伝子の再構成が行われたB細胞やT細胞由来のiPS細胞を作製する技術（参考文献６、１３）と明確に異なり、再生医療での利用に適したiPS細胞を提供できる点において重要且つ有益である。
【００１２】
本発明ではまず骨髄を用意する。骨髄は常法で採取すればよい（例えば、財団法人骨髄移植推進財団ドナー安全委員会編集の骨髄採取マニュアル第三版が参考になる）。例えば、骨髄穿刺針を用いて腸骨から採取することができる。採取した骨髄を前処理に供してもよい。ここでの前処理として、フィルター処理等による不純物の除去、遠心処理等による細胞成分の分離、PBSによる洗浄等を挙げることができる。
【００１３】
骨髄の動物種は特に限定されない。好ましくはヒトから採取された骨髄が用いられるが、ヒト以外の動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ等である）から採取された骨髄を用いることもできる。
【００１４】
一般に、細胞の活性はその由来である個体の齢に依存する。即ち、老齢個体の細胞は、通常、若齢個体の細胞よりも活性が低い。このため老齢個体の細胞からiPS細胞を作製する場合その成功率（作製効率）は低くなる。本発明によればiPS細胞の作製効率を向上でき、老齢個体の細胞からも比較的安定してiPS細胞を得ることが可能となる。本発明の一態様ではこの特徴を活かし、壮年期以降のヒトの骨髄を用いてiPS細胞を作製する。また、他の一態様では中年期以降、更に他の一態様では高年期以降のヒトの骨髄を用いる。ヒトの一生は幼年期（0〜4歳）、少年期（5〜14歳）、青年期（15〜24歳）、壮年期（25〜44歳）、中年期（45〜64歳）、高年期（65歳以上）に分けることができる。一般に、壮年期以降は生活習慣病に罹り易くなるといわれ、また老化に起因する各種疾病（例えば筋萎縮、骨粗鬆症、関節炎）への罹患率も高まる。iPS細胞の作製効率を向上させる本発明は、このように疾病リスクの高まる壮年期以降の患者を対象とした医療の発展に大きく貢献する。尚、以上の説明から分かるように、本発明は老齢個体の細胞、換言すれば活性の低い細胞をソースとした場合に特に有効であるが、その適用範囲は特に限定されるものではなく、若齢個体の細胞をソースにしてもよい。
【００１５】
以上のようにして用意した骨髄をGM-CSF存在下での培養に供する。具体的にはGM-CSFが添加された培地中で骨髄を培養する。当該条件下での培養の前に、GM-CSFを含有しない培地で培養することにしてもよい。例えば、初代培養（又は初代培養とその後の数継代）にGM-CSF非含有培地を使用し、以降の継代培養にGM-CSF含有培地を使用することにする。使用するGM-CSFの動物種は骨髄の動物種と同一でなくてもよいが、GM-CSFの作用が良好に発揮されるように、好ましくは動物種を合わせるとよい。例えば、ヒト骨髄を使用する場合にあってはヒトGM-CSFを使用することが好ましい。このように動物種を合わせることは、異種動物由来の成分の混入を防止でき、安全性が向上するという点においても好ましい。
【００１６】
GM-CSFは造血幹細胞に分化を促すサイトカイン（造血系成長因子）であり、顆粒球及び単球／マクロファージの前駆細胞の増殖や分化を促す。GM-CSFは主に活性化T細胞より分泌される。GM-CSFには赤芽球、好酸球、巨核球のコロニー形成活性も認められ、生体の造血機構に幅広く関与している可能性が報告されている。生体から分離・精製したGM-CSFを用いても、或いは組換え生産したGM-CSF（リコンビナントGM-CSF）を用いても良い。いくつかのGM-CSFが市販されており（例えばコスモ・バイオ株式会社、生化学バイオビジネス株式会社、ミルテニーバイオテク株式会社などが提供する）、このような市販品を用いることもできる。
【００１７】
培地中のGM-CSF濃度は特に限定されず、予備実験等によって適宜設定することができる。GM-CSF濃度の例を示せば1ng/ml〜100ng/mlであり、好ましい濃度は5 ng/ml〜20 ng/mlである。全培養期間を通してGM-CSF濃度が一定である必要はない。例えば、培養後期に添加濃度が高くなる培養条件を採用することができる。GM-CSF含有培地を用いた培養の期間は例えば１日〜２０日、好ましくは２日〜１４日、更に好ましくは３日〜７日、より一層好ましくは３日〜５日とする。
【００１８】
GM-CSFを添加すること以外は、基本的には哺乳動物細胞の通常の培養条件に従えばよい。基本培地に必要な成分を添加することによって本発明に使用する培地を構成することができる。基本培地としてイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）（GIBCO社等）、ハムF12培地（HamF12）（SIGMA社、Gibco社等）、ダルベッコ変法イーグル培地（D-MEM）（ナカライテスク株式会社、シグマ社、ギブコ社等）、グラスゴー基本培地（Gibco社社等）、RPMI1640培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。混合培地の一例として、IMDMとHamF12を等量混合した培地（例えば商品名：IMDM/HamF12（Gibco社）として市販される）を挙げることができる。培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）、ウシ血清アルブミン（BSA）、抗生物質、2-メルカプトエタノール、白血病抑制因子（LIF）、PVA、L-グルタミン、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを挙げることができる。培養温度等、その他の培養条件についても、哺乳動物細胞の通常の培養条件に準ずればよい。即ち、例えば37℃、5%CO2の環境下で培養すればよい。
【００１９】
（２）iPS細胞への形質転換（初期化、リプログラミング）
上記の通り、理論に拘泥する訳ではないが、骨髄をGM-CSF存在下で培養するとミエロ系細胞（Bone marrow derived myeloid cells）が増殖する。本発明では当該ミエロ系細胞をiPS細胞へと形質転換させる。iPS細胞への形質転換にはこれまでに報告された各種iPS細胞作製法を利用できる。また、今後開発されるiPS細胞作製法を適用することも当然に想定される。
【００２０】
iPS細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトiPS細胞についてはOct4、Sox2、Lin28及びNonogの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。c-Mycを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Oct3/4及びKlf4の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはOct3/4のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるiPS細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素G9aに対する阻害剤BIX-01294やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（VPA）或いはBayK8644等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
【００２１】
iPS細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はFbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCript等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をiPS細胞として回収する。
【００２２】
本発明の作製法で得られたiPS細胞は創薬研究用ツール（例えば薬効や安全性試験のためのスクリーニング系等、細胞ベースのアッセイ系の開発）、病態解明用の研究ツール（例えばヒト疾患モデル細胞又はモデル動物の作製）、或いは細胞医療・再生医療用の原料ないし材料として有用である。iPS細胞から疾患モデル細胞を作製するため或いはiPS細胞を細胞医療・再生医療に利用するためには、原則、iPS細胞を所望の細胞系譜に分化誘導することになる。そこで本発明は、本発明の作製法で作製されたiPS細胞に対して分化誘導処理を施すことを特徴とする、特定の細胞系譜に分化した細胞の作製法も提供する。本発明の作製法で得られたiPS細胞を特定の細胞系譜に分化誘導させる手段としては、iPS細胞について過去に報告された各種分化誘導法を利用できることは勿論のこと、胚性幹細胞（ES細胞）について報告された分化誘導法も必要に応じて修正を加えた上で適用可能である。例えば、胚様体（EB)形成法（Chinzei R, Tanaka Y, et al: Hepatology 36, 22-29, 2002; Yamada T, Yoshikawa M, et al: Stem Cells 20, 146-154, 2002; Asahina K, Fujimori H, et al: Genes Cells 9, 1297-1308, 2004; Choi D, Lee HJ, et al: Stem Cells 23, 817-827, 2005）は、ES細胞をin vitroで分化させる方法として最も一般的である。本発明の作製法で得られたiPS細胞を分化誘導させる際にEB形成法を適用することにしてもよい。EB形成法としてハンギング・ドロップ（Hanging drop）法（Rundnick MA, Mcburney MW, Cell culture methods and induction of differentiation of embryonal carcinoma cell lines, p. 19-49. In Robertson, E. J. (ed.), Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, IRL press, Washington DC, 1987等）、細菌用培養皿（Bacterial dish）を用いた方法（Doetschman TC, Eistetter H, Katz M, et al: Embryol. Exp Morph 87, 27-45, 1985等）、U底のマルチウェルプレートを利用した方法(Yasuda E, Seki Y, Higuchi T, et al: J Biosci Bioeng 107, 442-446, 2009; Karp JM, Yeh J, Eng G, et al: Lab Chip 7, 786-794, 2007; Moeller HC, Mian MK, Shrivastava S, et al: Biomaterials 29, 752-763, 2008等）、SFEBq法（Eiraku M, Watanabe K, Matsuo-Takasaki M, et al: Cell Stem Cell 3, 519-532, 2008等）等が開発されている。EBからは様々な組織細胞を分化誘導することが可能である（Doetschman T.C, et al: J. Embryol. Exp. Morphol. 87, 27-45, 1985）。ES細胞の分化誘導法として、EB形成法の他、特定の遺伝子の強制発現による分化誘導法（Levinson-Dushnik M, Benvenisty N, et al: Mol Cell BioI 17, 3817-3822, 1997; Ishizaka S, Shiroi A, et al: FASEB J 16, 1444-1446, 2002; Fujikura J, Yamato E, et al: : Genes Dev 16, 784-789, 2002; Blyszczuk P, Czyz J, et al : Proc Natl Acad Sci USA 100, 998-1003, 2003; Miyazaki S, Yamato E, et al: Diabetes 53, 1030-1037, 2004）、ストローマ細胞との共培養による方法（Shiraki N, Lai CJ, et al: Genes Cells 10, 503-516, 2005; Ishii T, Yasuchika K, et al : Exp Cell Res 309, 68-77, 2005; Teratani T, Yamamoto H, et al: Hepatology 41, 836-846, 2005; Soto-Gutierrez A, Kobayashi N, et al: Nat Biotechnol 24, 1412-1419, 2006）、液性因子を利用した方法（SchuldinerM, Yanuka 0, et al: Proc Natl Acad Sci USA 97, 11307-11312, 2000; Lumelsky N, Blondel 0, et al: Science 292, 1389-1394, 2001; Hamazaki T, Iiboshi Y, et al: FEBS Lett 497, 15-19, 2001; Hori Y, Rulifson IC, et al: Proc Natl Acad Sci USA 99, 16105-16110, 2002; Kim D, Gu Y, et al: Pancreas 27, e34-41, 2003）等がある。これらの方法に準じ、本発明の作製法で得られたiPS細胞を分化誘導することにしてもよい。以下、分化誘導法に関する報告のいくつかを例示する。
【００２３】
EBから心筋細胞への分化誘導には胚様体を培養皿に付着させて培養し、自己拍動する筋細胞を分取する方法（Boheler K.R, et al: Circ. Res. 91, 189-201, 2002等）が一般的である。また、心筋細胞を高純度で得る方法も報告されている（Klug M. G, et al: J. Clin. Invest. 98, 216-224(1996); Muller M, et al: FASEB. J. 14, 2540-2548, 2000等）。EBから膵インスリン産生細胞へ分化誘導することも可能である（D'Amour KA, Bang AG, Eliazer S, et al: Nat Biotechnol 24, 1392-1401, 2006等）。一方、血管内皮細胞や血管平滑筋細胞への分化誘導法も報告されている（Vittet D, et al: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6273-6278, 1997; Bloch W, et al: J. Cell Biol. 139, 265-278, 1997; Yamashita J, et al: Nature 408, 92-96, 2000; Feraud O, et al: Lab. Invest. 81, 1669-1681, 2001等）。網膜細胞への分化誘導法もいくつかの報告がある（Ikeda H, Osakada F, Watanabe K, Mizuseki K, Haraguchi T, Miyoshi H, Kamiya D, Honda Y, Sasai N, Yoshimura N, Takahashi M, Sasai Y, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 11331-11336, 2005; Osakada F, Ikeda H, Mandai M, Wataya T, Watanabe K, Yoshimura, N, Akaike A, Sasai Y, Takahashi M, Nat. Biotechnol. 26, 215-224, 2008; Osakada F, Ikeda H, Sasai Y, Takahashi M, Nat. Protoc. 4, 811-824, 2009; Hirami Y, Osakada F, Takahashi K, Okita K, Yamanaka S, Ikeda H, Yoshimura N, Takahashi M, Neurosci. Lett. 458, 126-131, 2009; Osakada F, Jin ZB, Hirami Y, Ikeda H, Danjyo T, Watanabe K, Sasai Y, Takahashi M. J Cell Sci 122, 3169-3179, 2009等）。また、bFGF存在下で培養した後に浮遊凝集培養系で培養する方法（Studer L, et al: Nat. Neurosci. 1, 290-295, 1998等）、bFGF及びグリア細胞株の培養上清の存在下で培養する方法（Daadi M. M, and Weiss S. J.: Neuroscience 19, 4484-4497, 1999等）、FGF8、Shh、bFGF及びアスコルビン酸等を利用した方法（Lee S. H. et al: Nat. Biotechnol. 18, 675-679, 2000等）、骨髄間質細胞と共培養する方法（Kawasaki H, et al: Neuron 28, 31-40, 2000等）、樹状細胞への分化誘導法（Senju S, Haruta M, Matsunaga Y, et al: Stem Cells 27, 1021-1031, 2009等）等、ドーパミン産生神経細胞へ分化誘導法も数多く報告されている。尚、上掲の分化誘導法は単なる例示であって、本発明に適用可能な分化誘導法はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
老齢個体からのiPS細胞の樹立を目指し、以下の実験を行った。
１．方法
（１）マウス
C57BL/6（B6）マウスは日本エスエルシー株式会社から購入した。全身にGFP（Green Fluorescent Protein）を発現するEGFP-C57BL/6マウス(C14-Y01-FM131Osb)は独立行政法人理化学研究所から岡部氏の許可の下、分譲を受けた（参考文献７）。これらのマウスは国立大学法人名古屋大学の動物実験指針に基づき名古屋大学医学部実験動物センターで飼育した。【００２５】
（２）遺伝子
転写因子を保持するプラスミドpMXs-c-Myc、pMXs-Klf4、pMXs-Sox2及びpMXs-OCT3/4はAddgene社より購入した。【００２６】
（３）細胞
マウス胎仔繊維芽細胞(MEF)を調製するため、妊娠13.5日のB6マウスから子宮を取り出し、PBSで洗浄した。分離した胚の頭部及び腹部組織を除去し、残りをはさみで細かく切り、0.25%トリプシン/1 mM EDTAを用いて細胞を分散させた。このようにして得られた細胞を10% FCSを含有するDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）で培養した。【００２７】
骨髄由来ミエロ系細胞（BM-M； Bone marrow derived myeloid cells）は稲葉らの方法（参考文献８）に基づき骨髄を0.3% GM-CSF上清（東レ・ダウコーニング・シリコーン株式会社の須藤氏から分譲を受けた、GM-CSFを産生するハムスター細胞の培養上清)を添加したRPMI1640培地(10% FBS、300μg/mLグルタミン、100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び50μM 2-メルカプトエタノールを含有する）で培養することによって得た。Plat-Eパッケージング細胞は北村教授より分譲を受けた（非特許文献９）。STO細胞にLIF発現コンストラクトを遺伝子導入することによってLIFを産生するSNL/76/7細胞を得た（非特許文献１０）。遺伝子導入2日前にPlat-E細胞を6ウェルプレートで培養し（1ウェルあたり5×105の細胞密度）、pMXsベクターにクローニングされた4つの転写因子遺伝子(Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc)をFugene 6遺伝子導入試薬(ロッシュ社)を用いて導入した。具体的にはベクターとFugene 6を混合し、一滴ずつPlat-E細胞にふりかけた。37℃、5%CO2下で24時間インキュベートした後、培地（MEM）を交換した。24時間後、0.45μmメッシュの酢酸セルロースフィルター(Schleicher & Schuell社)に通し、ウイルス含有上清を得た。一方、MEF及びBM-M細胞をそれぞれ、マイトマイシンC処理したSNL/76/7細胞（1x106個／ウェル）上に5x105個の細胞密度で播種した。24時間後、ウイルス含有上清をふりかけた。当該処理の後、培地（MEM）を交換し（MEFは24時間後、BM-Bは48時間後）、コロニーが現れるまで培養を続けた。【００２８】
（４）胚様体（EB）の形成及びin vitro分化
既報のプロトコール（Ohnuki, M., Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2009) Curr. Protoc. Stem Cell Biol., 9, 4A.2.1-4A.2.25.）に若干の修正を加えた方法によって、EBの形成を介してin vitro分化誘導した。概要を説明すると、iPS細胞用の培養液に3×103個／20μLの密度で細胞を懸濁し、8日間ハンギングドロップ培養した。形成されたEBを0.1%ゼラチンコートディッシュに移し、更に10日間分化誘導した。内胚葉マーカーとしてα−フェトプロテイン（R&D MAB1368）、中胚葉マーカーとしてα−平滑筋アクチン（Sigma A2547）及び外胚葉マーカーとしてニューロフィラメントH（Cell signaling No.2836）を使用し、免疫組織染色を実施した。【００２９】
２．結果
（１）老化骨髄由来ミエロ系細胞からのiPS細胞の樹立
老化骨髄からiPS細胞を樹立することを目指して実験を行った。EGFPを全身に発現する老齢C57BL/6マウスから骨髄細胞を取り出し、4因子（OCT3/4、Sox2、Klf4、c-Myc）を導入することによってiPS細胞を作製することを数回試みたが、いずれも失敗に終わった。そこで、骨髄をGM-CSFで4日間培養し、ミエロ系細胞が分化、増殖している時期の細胞（BM-M； bone marrow derived myeloid cells）に4因子を導入する実験に切り換えた。具体的には21ヶ月齢のEGFPC57BL/6マウス骨髄をGM-CSFで4日間培養後、4因子を導入した（効率が上がることを期待して導入操作を2回行った）。1月後、数個のコロニーが観察された。これらのコロニーをピペットで取り出し、24ウェルプレートで培養しておいたマイトマイシンC処理済のSNL/76/6細胞上に移して培養すると、2クローンが増殖した（図１）。これらクローンの形態は胎仔繊維芽細胞(MEF)から作製したiPS細胞及びES細胞と同様であった（図２）。【００３０】
（２）胎仔繊維芽細胞(MEF)、若い骨髄ミエロ細胞(BM-M)、及び老化骨髄ミエロ細胞間でのiPS細胞作製効率の比較
胎仔繊維芽細胞(MEF)、若い（2ヶ月齢）骨髄ミエロ細胞(BM-M)及び老化（23ヶ月齢）骨髄ミエロ細胞からそれぞれiPS細胞を作製し、作製効率（iPS細胞の作製頻度）を比較した。MEFと若い（2ヶ月齢）BM-Mからは約15日でコロニーが現れた。一方、老化（23ヶ月齢）BM-Mからはコロニーが現れるまでに30日を要した（図３）。尚、GM-CSFを使用しないと、若い骨髄ミエロ細胞、老化骨髄ミエロ細胞のいずれについても、iPS細胞のコロニーは得られなかった。【００３１】
（３）老化骨髄ミエロ細胞から作製されたiPS細胞(BM-M-iPS)による、MEF-iPSと同様の３胚葉の形成
BM-M-iPSとMEF-iPSを2ヶ月齢のC57BL/6マウスの皮下に1x107個注射したところ、3週間程で腫瘤が現れた（図４）。固定後、H&E染色すると、外胚葉（皮膚の角質層（corneum）、図５左）、中胚葉（平滑筋、図５中央）、内胚葉（腸管上皮、図５右）の３胚葉組織が観察された（図５）。【００３２】
（４）老化骨髄ミエロ細胞から樹立したiPS細胞の遺伝子発現
C57BL/6マウス（21ヶ月齢）骨髄細胞をGM-CSF存在下で4日又は7日間培養した。細胞からRNAを調製し、TNF-α、IL-1β、CCL-7、C/EBPα及びPU.1の発現をRT-PCRで検索すると強い発現を認めた（図６）。一方、老化骨髄ミエロ細胞から樹立したiPS細胞（BM-M-iPS）ではこれらミエロ系遺伝子発現が強く低下しているか、或いは発現が認められなかった（図６）。即ち、BM-M-iPSは、MEFから作製したMEF-iPSと同様の遺伝子発現プロファイルを示した。一方、BM-M-iPSでは、多能性幹細胞で発現が上昇することが知られているNanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCriptの遺伝子発現がMEF-iPSと同様に上昇していた。【００３３】
（５）老化（21ヶ月齢）骨髄ミエロ細胞から作製したiPS細胞のin vitro分化
次に、BM-M-iPSをin vitroで３胚葉に分化させることを試みた。ハンギングドロップ法でBM-M-iPSを8日間培養して胚様体（EB）を形成させた。続いて、EBを0.1%ゼラチンコート24ウェルプレートに移した（図７A）。10日間培養した後、組織特異的抗体で染色した。分化したBM-M-iPS細胞はGFPを発現するとともに（図７B左）、α−平滑筋アクチン、α−フェトプロテイン及びニューロフィラメントHを発現した（図７B中央）。同様の方法でMEF-iPSも分化誘導した（データ示さず）。分化マーカーを発現する細胞を計数した結果、α−平滑筋アクチンを発現する細胞の割合はBM-M-iPSでは50%であり、MEF-iPSでは61.2%であった。α−フェトプロテインについては、BM-M-iPS細胞の場合は84.1%、MEF-iPSの場合は51.7%の細胞に発現を認めた。同様に、ニューロフィラメントHについては、BM-M-iPSの場合は68%、MEF-iPSの場合は73.1%の細胞に発現を認めた。これらの結果は、３胚葉の分化能に関して、BM-M-iPSとMEF-iPS細胞との間に大きな差がないことを示す。【００３４】
更に、分化誘導後のBM-M-iPSをミエロイド細胞に戻すことが可能か否かを調べた。OP9用培養液を用い、BM-M-iPSとMEF-iPSをそれぞれOP9細胞と5日間共培養した。その後、OP9細胞を交換し、GM-CSF添加OP9用培養液で更に5日間培養した（図７C）。続いて、細胞を6ウェルプレート（細胞接着のための処理は施していない）に移した。この段階でBM-M-iPS及びMEF-iPSの両者についてミエロイド様細胞が認められた（図７D）。また、分化誘導後の細胞では、Nanog及びPou5f1の発現が消失していた（図６）。一方、ミエロ系サイトカイン（TNF-α、IL-1β）、ケモカイン（CCL-7）及び転写因子（C/EBPα、Pu-1）の発現上昇を認めた（図６）。分化誘導させた細胞について、PE標識抗体を用いてミエロ系細胞表面マーカーの発現を調べた。ミエロ系に分化誘導させたBM-M-iPS及びMEF-iPSの両者についてCD11b及びCD115の発現を認めた（図８）。以上の結果は、BM-M-iPSがミエロ系細胞に分化したことを示す。【００３５】
（６）アグリゲーション法によるキメラマウスの作製
更なる検討として、BM-M-iPSを用いてキメラマウスの作製を試みた。まず、１日目に5 IUの妊馬血清ゴナドトロピン（PMSG）を6週齢ICRマウスに投与し、3日目にヒト胎盤性性腺刺激ホルモン（hCG）を投与した後、オスマウスとともにケージに入れた。交尾後2.5日目の朝に8細胞期胚を採取し、同日、アグリゲーション法に使用した。アグリゲーションを実施する1日前に、サブコンフルエント（70〜80%）の状態のBM-M-iPS細胞の懸濁液を、ゼラチンコートしたディッシュに添加した。一方、8細胞期胚を、その透明帯を除去した後、アグリゲーション用プレートに移した。8細胞期胚とのアグリゲーションの直前に、トリプシン処理によってBM-M-iPS細胞の塊（8〜15細胞）を回収した。そして、透明体を除去した8細胞期胚とBM-M-iPS細胞の塊をアグリゲーションさせた。アグリゲーションの後、E2.5の偽妊娠メスマウスの子宮に移植した。【００３６】
以上のプロトコールでキメラマウスの作製を試みた結果、図９に示す通り、BM-M-iPS細胞由来の黒い毛色が混ざった仔マウスが得られた。この結果は、BM-M-iPSがES細胞同様に多能性を示し、その有用性が高いことを意味する。【００３７】
３．考察
老化マウス骨髄由来ミエロ系細胞よりiPS細胞を樹立することに成功した。この成果は以下の３点において特に重要である。１つ目は骨髄由来ミエロ系細胞よりiPS細胞を作製したこと、２つ目は老齢マウスからiPS細胞を作製したこと、３つ目は、樹立されたiPS細胞は最もよく使用されているC57BL/6マウス由来であり、しかも全身に発現するGFPマーカーを保有するため、移入実験に利用したときに免疫拒絶を受けないこと、移入後の細胞の位置（所在）を容易に確認できること、である。【００３８】
ヒトの自己細胞からiPS細胞を樹立し、自己の疾患の治療や、老化により障害された組織の再生に利用する（personalized cell therapies）には簡便で安全な方法が求められる。これまでに各種細胞（ソース）がiPS細胞の作製に利用されてきた。最も一般的に利用される細胞は胎児又は成人の繊維芽細胞である（参考文献２、３）。成人の神経幹細胞を用いた場合、僅か２つの因子の利用によってiPS細胞を樹立できる（参考文献１１）。成体マウスの肝臓細胞や消化管細胞からもiPS細胞が作製されている（参考文献１２）。また、免疫系細胞からiPS細胞を作製する試みも行われており、B細胞（参考文献１３）、T細胞（参考文献６）からiPS細胞を作製することに成功したとの報告がある。しかしながら、これらの方法で作製されたiPS細胞は再生医療には適さない。遺伝子が既に組み換えられている（遺伝子の再構成が生じている）からである。今回、GM-CSFで短期間培養するという方法を採用することによって、老化骨髄細胞からiPS細胞を作製することに成功した。骨髄細胞を培養してiPS細胞を作製したとの報告（参考文献１４、１５）はあるものの、老齢個体の骨髄を用いたものではない。老齢個体由来の細胞を用いてiPS細胞を樹立できたことは、iPS細胞の実用化に向けた大きなブレークスルーとなる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の方法によれば老齢個体からもiPS細胞を比較的簡便に作製することが可能となる。本発明の方法で得られるiPS細胞の用途として、加齢ないし老化に伴う各種疾患（筋萎縮、骨粗しょう症、関節炎など）、肺繊維症、肝硬変、腎不全等の治療、及び美容（角質細胞（ケラチノサイト）に分化された細胞を用いた皮膚の若返りなど）が想定される。【００４０】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。【００４１】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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