(57)【要約】  抗ＲＧＭ中和抗体等のＲＧＭ阻害物質を有効成分とするＴ細胞活性化阻害剤を提供する。当該Ｔ細胞活性化阻害剤は、多発性硬化症等の自己免疫疾患や、その他のＴ細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物として有用である。また、被験物質をＲＧＭに接触させ、ＲＧＭの活性レベルを低減させる被験物質を選択することにより、Ｔ細胞活性化阻害物質のスクリーニングすることができる。
2011071059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＧＭ阻害物質を有効成分とするＴ細胞活性化阻害剤。
【請求項２】
ＲＧＭ阻害物質が抗ＲＧＭ中和抗体である請求項１に記載のＴ細胞活性化阻害剤。
【請求項３】
ＲＧＭ阻害物質がＲＧＭ ｓｉＲＮＡである請求項１に記載のＴ細胞活性化阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＴ細胞活性化阻害剤を含有することを特徴とするＴ細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物。
【請求項５】
Ｔ細胞活性化に起因する疾患が自己免疫疾患である請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
自己免疫疾患が多発性硬化症である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
被験物質をＲＧＭに接触させる工程と、
前記ＲＧＭの活性レベルを測定する工程と、
前記活性レベルを、被験物質に接触していないＲＧＭの活性レベルと比較する工程と、
ＲＧＭの活性レベルを低減させる被験物質を選択する工程とを包含することを特徴とするＴ細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞活性化阻害剤、これを含有する医薬組成物およびＴ細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法に関するものであり、詳細には、ＲＧＭ阻害物質を有効成分とするＴ細胞活性化阻害剤、当該Ｔ細胞活性化阻害剤を含有するＴ細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物および被験物質をＲＧＭに接触させる工程を含むＴ細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＲＧＭ（repulsive guidance molecule）は、当初、視覚系の軸索誘導分子として同定された膜タンパク質である（非特許文献１参照）。ＲＧＭファミリーには、ＲＧＭａ、ＲＧＭｂおよびＲＧＭｃと呼ばれる３種類のメンバーが含まれ、少なくともＲＧＭａとＲＧＭｂは同じシグナル伝達機構で働くことが知られている（非特許文献２参照）。その後の研究により、ＲＧＭは、ゼノパスおよびニワトリ胚における軸索誘導およびラミナ形成、並びに、マウス胚における頭部神経管の閉鎖の制御等の機能を有することが明らかとなっている（非特許文献３参照）。発生段階の機能に加えて、成人ヒトおよびラットの中枢神経系損傷後に再発現すること、ラットにおいてＲＧＭ阻害が脊髄損傷後の軸索成長を亢進し、機能回復を促進することから（非特許文献４参照）、ＲＧＭは中枢神経系損傷後の軸索再生阻害物質であると考えられている。また、特許文献１には抗ＲＧＭ中和抗体を有効成分として含有する軸索再生促進剤が開示されている。【０００３】
多発性硬化症（Multiple Sclerosis）は、脳と脊髄の神経線維を覆うミエリン（髄鞘）が炎症を起こして脱髄が生じ、神経の情報がうまく伝わらなくなるために視覚障害、運動障害、感覚低下、平衡障害等のさまざまな症状が出る疾患であり、未だ原因がはっきりせず、現代の医学では完全に治すことができない慢性病である。自己免疫疾患の１つと認識されているが、その発症メカニズムの詳細は解明されていない。例えば、非特許文献５には、ＣＤ４＋Ｔ細胞が脳および脊髄の白質におけるミエリンおよびオリゴデンドロサイトを免疫的に攻撃することが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３９８１１４８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Stahl, B., Muller, B., von Boxberg, Y., Cox, E.C. & Bonhoeffer, F. Biochemical characterization of a putative axonal guidance molecule of the chick visual system. Neuron 5, 735-743 (1990)
【非特許文献２】Liu, X., Hashimoto, M., Horii, H., Yamaguchi, A., Naito, K. and Yamashita, T. Repulsive guidance molecule b inhibits neurite growth and is increased after spinal cord injury. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 795-800 (2009)
【非特許文献３】Yamashita, T., Mueller, B.K. & Hata, K. Neogenin and repulsive guidance molecule signaling in the central nervous system. Curr. Opin. Neurobiol. 17, 29-34 (2007)
【非特許文献４】Hata, K. et al. RGMa inhibition promotes axonal growth and recovery after spinal cord injury. J. Cell Biol. 173, 47-58 (2006)
【非特許文献５】Trapp, B.D., Ransohoff, R.M., Fisher, E. & Rudick, R. Neurodegeneration in multiple sclerosis: relationship to neurological disability. Neuroscientist 5, 48-57 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＲＧＭの新規な機能を見出し、新規なＴ細胞活性化阻害剤、Ｔ細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物、Ｔ細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］ＲＧＭ阻害物質を有効成分とするＴ細胞活性化阻害剤。
［２］ＲＧＭ阻害物質が抗ＲＧＭ中和抗体である前記［１］に記載のＴ細胞活性化阻害剤。
［３］ＲＧＭ阻害物質がＲＧＭ ｓｉＲＮＡである前記［１］に記載のＴ細胞活性化阻害剤。
［４］前記［１］〜［３］のいずれかに記載のＴ細胞活性化阻害剤を含有することを特徴とするＴ細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物。
［５］Ｔ細胞活性化に起因する疾患が自己免疫疾患である前記［４］に記載の医薬組成物。
［６］自己免疫疾患が多発性硬化症である前記［５］に記載の医薬組成物。
［７］被験物質をＲＧＭに接触させる工程と、前記ＲＧＭの活性レベルを測定する工程と、前記活性レベルを、被験物質に接触していないＲＧＭの活性レベルと比較する工程と、ＲＧＭの活性レベルを低減させる被験物質を選択する工程とを包含することを特徴とするＴ細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法。
［８］ＲＧＭ阻害物質をＲＧＭ発現細胞と接触させる工程を包含することを特徴とするＴ細胞活性化阻害方法。
［９］ＲＧＭ阻害物質が抗ＲＧＭ中和抗体である前記［８］に記載のＴ細胞活性化阻害方法。
［１０］ＲＧＭ阻害物質がＲＧＭ ｓｉＲＮＡである前記［８］に記載のＴ細胞活性化阻害方法。
［１１］哺乳動物に対して、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のＴ細胞活性化阻害剤の有効量を投与する工程を包含することを特徴とする自己免疫疾患の予防または治療方法。
［１２］自己免疫疾患の予防または治療用医薬組成物を製造するための、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のＴ細胞活性化阻害剤の使用。
［１３］自己免疫疾患の予防または治療に使用するための、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のＴ細胞活性化阻害剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、新規なＴ細胞活性化阻害剤を提供することができる。当該Ｔ細胞活性化阻害剤は、Ｔ細胞活性化に起因する疾患、例えば自己免疫疾患の予防または治療に有用である。また、本発明のスクリーニング方法により得られるＴ細胞活性化阻害物質は、Ｔ細胞活性化に起因する疾患の予防薬または治療薬の有効成分の候補となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＬＰＳで刺激された骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣｓ）におけるＲＧＭａのｍＲＮＡの発現をリアルタイム定量ＰＣＲで測定した結果を示す図である。
【図２】ＬＰＳで刺激されたＢＭＤＣｓにおけるＲＧＭａの発現をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す図である。
【図３】ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージと、各種濃度のヒトＲＧＭａ−Ｆｃとの結合をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図４（Ａ）】ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージにおける全Ｒａｐ１および活性型Ｒａｐ１をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。
【図４（Ｂ）】図４（Ａ）のウエスタンブロッティングのバンドをＳｃｉｏｎ ｉｍａｇｅを用いて定量し相対的なＲａｐ１活性化レベルを算出した結果を示す図である。
【図５（Ａ）】ＲＧＭａ刺激の有無における脾細胞のフィブロネクチンへの接着率を測定した結果を示す図である。
【図５（Ｂ）】ＲＧＭａ刺激の有無におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＣＡＭ１への接着率を測定した結果を示す図である。
【図６】抗ＲＧＭａ中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスとコントロール抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床症状をスコアにより数値化し、経時的変化を観察した結果を示す図である。
【図７】（Ａ）は各群におけるＥＡＥの臨床症状発現率を示す図であり、（Ｂ）は各群におけるＥＡＥ発病日の平均値を示す図であり、（Ｃ）は各群の各マウスのＥＡＥスコア最大値の平均値を示す図であり、（Ｄ）は各群の各マウスのＥＡＥスコア累積値の平均値を示す図である。
【図８】（ａ）および（ｂ）はコントロール抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスの頸髄のＨＥ染色組織像であり、（ｃ）および（ｄ）は抗ＲＧＭａ中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスの頸髄のＨＥ染色組織像である。
【図９】コントロール抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスの骨髄組織標本および抗ＲＧＭａ中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスの骨髄組織標本において、炎症インデックスに基づいて炎症の程度を数値化した結果を示す図である。
【図１０】コントロール抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスおよび抗ＲＧＭａ中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスから調製した脾細胞の抗原特異的Ｔ細胞活性化および非特異的Ｔ細胞活性化を検討した結果を示す図であり、（ａ）は細胞増殖、（ｂ）はＩＬ−２の分泌量、（ｃ）はＩＦＮ−γの分泌量、（ｄ）はＩＬ−１７の分泌量の結果を示す図である。
【図１１】抗ＲＧＭａ中和抗体を投与した再発性多発性硬化症モデルマウスとコントロール抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスにおけるＥＡＥの臨床症状をスコアにより数値化し、経時的変化を観察した結果を示す図である。
【図１２】ＲＧＭａ遺伝子ノックダウンしたＢＭＤＣｓまたはＲＧＭａ遺伝子ノックダウンしていないＢＭＤＣｓに対してＭＯＧ刺激を行った後、これらのＢＭＤＣｓをレシピエントマウスに移植し、レシピエントマウスにおけるＥＡＥの臨床症状をスコアにより数値化し、経時的変化を観察した結果を示す図である。
【図１３】抗ＲＧＭａ中和抗体またはコントロール抗体、およびＭＯＧを投与されたドナーマウスから調製したＣＤ４＋Ｔ細胞に対してＭＯＧ刺激を行った後、これらのＣＤ４＋Ｔ細胞をレシピエントマウスに移植し、レシピエントマウスにおけるＥＡＥの臨床症状をスコアにより数値化し、経時的変化を観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者らは、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣｓ）にＲＧＭが発現していること、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージにＲＧＭ受容体が発現していることを初めて見出し、ＲＧＭがＣＤ４＋Ｔ細胞やＣＤ１１ｂ＋マクロファージのＲＧＭａ受容体に結合することによってＲａｐ１が活性化され、その結果ＣＤ４＋Ｔ細胞やＣＤ１１ｂ＋マクロファージの細胞接着活性が増強することを見出した。また、本発明者らは、多発性硬化症モデルマウスを用いた実験において、抗ＲＧＭ中和抗体の投与は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）で誘導した多発性硬化症モデルマウス（実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウス）の臨床症状および組織病変の両方を軽減すること、抗ＲＧＭ中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスから採取した脾細胞では、抗原特異的および非特異的なＴ細胞活性化が顕著に減弱していることを明らかにした。さらに、抗ＲＧＭ中和抗体の投与は、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）で誘導した再発性多発性硬化症モデルマウスにおけるＥＡＥ臨床症状の発現を抑制すること、ＲＧＭａをノックダウンしたＢＭＤＣｓにＭＯＧ刺激を与えてマウスに移植した場合、移植を受けたマウスにおけるＥＡＥ臨床症状の発現が抑制されること、抗ＲＧＭ中和抗体およびＭＯＧを投与されたマウスから調製したＣＤ４＋Ｔ細胞にＭＯＧ刺激を与えてマウスに移植した場合、移植を受けたマウスにおけるＥＡＥ臨床症状の発現が抑制されることを見出した（実施例参照）。
【００１１】
〔Ｔ細胞活性化阻害剤〕
本発明は、ＲＧＭ阻害物質を有効成分とするＴ細胞活性化阻害剤を提供する。本発明のＴ細胞活性化阻害剤の有効成分であるＲＧＭ阻害物質は、ＲＧＭの活性（ＲＧＭ活性）を阻害する物質およびＲＧＭの発現を阻害する物質のいずれでもよい。
【００１２】
ＲＧＭ活性を阻害する物質としては、例えば、ＲＧＭ活性を阻害する低分子化合物、抗ＲＧＭ中和抗体などが挙げられる。ＲＧＭ活性の指標としては、例えば、ＲＧＭのＲＧＭ受容体への結合活性（実施例１の（１−２）参照）、Ｒａｐ１活性化の誘導活性（実施例１の（１−３）参照）、Ｔ細胞のＩＣＡＭへの接着増強活性（実施例１の（１−４）参照）等が挙げられ、これらの指標を用いて評価したときに、ＲＧＭ活性を阻害（減弱）する物質をＲＧＭ阻害物質と称する。ＲＧＭ活性を阻害する低分子化合物としては、例えばＲｈｏキナーゼ阻害剤として知られているＹ２７６３２（M. Uehata, et al. Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension. Nature 389, 990 (1997)）が挙げられる。
【００１３】
抗ＲＧＭ中和抗体は、ＲＧＭに結合してその活性を阻害する抗体であればよく、例えば、ＲＧＭに結合してＲＧＭがＲＧＭ受容体に結合できなくする抗ＲＧＭ抗体等が挙げられる。抗ＲＧＭ中和抗体は、ＲＧＭまたはそのフラグメントを免疫原として用い、公知の方法で作製することができる。得られた抗体が中和抗体であることは、上記ＲＧＭ活性の指標を用いて確認することができる。ＲＧＭとしては、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるヒトＲＧＭａ、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるラットＲＧＭａ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。種々の生物由来のＲＧＭを免疫原として好適に用いることができる。これらのアミノ酸配列は公知のデータベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等）から容易に取得することができる。
【００１４】
抗ＲＧＭ中和抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。ポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして作製し、取得することができる。すなわち、抗原（ＲＧＭまたはこれらのフラグメント）をＰＢＳに溶解し、所望により通常のアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）を適量混合したものを免疫原として哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を免疫する。免疫方法は特に限定されないが、例えば、１回または適当な間隔で複数回、皮下注射または腹腔内注射する方法が好ましい。次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより取得することができる。モノクローナル抗体は、上記免疫された哺乳動物から得た免疫細胞（例えば脾細胞）とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによって得ることができる。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え型のモノクローナル抗体を産生させることもできる。さらに、ファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。
【００１５】
抗ＲＧＭ中和抗体は、ヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体が好ましい。ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、ヒト抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域からなる抗体をいう。ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来の抗体のＣＤＲ（相補性決定領域：complementarity determining region）をヒト抗体のＣＤＲへ移植したものをいい、ＣＤＲ移植抗体、再構成抗体などとも称される。ヒト化抗体のＦＲ（フレームワーク領域：framework region）は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、ヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるＦＲのアミノ酸配列を置換してもよい。ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列は、公知のデータベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等）から取得することができる。
【００１６】
ＲＧＭの発現を阻害する物質としては、例えば、ＲＧＭ遺伝子のｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。ＲＧＭ遺伝子としては、例えば配列番号１に示される塩基配列からなるヒトＲＧＭａ遺伝子、配列番号３に示される塩基配列からなるラットＲＧＭａ遺伝子等が挙げられるが、これに限定されるものではない。種々の生物由来のＲＧＭ遺伝子の塩基配列は公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から容易に取得することができる。ｓｉＲＮＡは、標的となる遺伝子（本発明においてはＲＧＭ遺伝子）の発現を抑制することができる短い二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡとして機能する限りにおいて、塩基配列や長さ（塩基長）は特に限定されないが、好ましくは約３０塩基未満、より好ましくは約１９〜２７塩基、さらに好ましくは約２１〜２５塩基である。ｓｈＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造からからなる約２０塩基対以上の分子のことをいう。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様に標的となる遺伝子（本発明においてはＲＧＭ遺伝子）の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、ＲＧＭ遺伝子の発現を抑制できるものであればどのような形態であってもよい。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成することができる。また、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡをインビトロで合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＧＭ遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであればよく、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。また、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置によって容易に合成することができる。
【００１７】
このように、ＲＧＭ阻害物質は、ＲＧＭ発現細胞（ＲＧＭを発現している細胞またはＲＧＭ発現能を有する細胞）と接触することにより、Ｔ細胞活性化を阻害することができる。したがって、ＲＧＭ阻害物質をＲＧＭ発現細胞と接触させる工程を包含することを特徴とするＴ細胞活性化阻害方法も本発明に含まれる。
【００１８】
〔医薬組成物〕
本発明は、上記本発明のＴ細胞活性化阻害剤を含有するＴ細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、換言すれば、ＲＧＭ阻害物質を有効成分とするＴ細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物である。
【００１９】
Ｔ細胞活性化に起因する疾患としては、自己免疫疾患、脳血管障害などが挙げられる。自己免疫疾患としては、例えば、細胞性自己免疫疾患、リウマチ、多発性硬化症、神経自己免疫疾患（ギランバレー症候群、神経ベーチェット病等）、悪性貧血、Ｉ型（インスリン依存型）糖尿病、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、グッドバスチャー症候群、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、糸球体腎炎、重症筋無力症、橋本病などが挙げられる。脳血管障害としては、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血などが挙げられる。中でも、本発明の医薬組成物は、自己免疫疾患の予防または治療に使用することが好ましく、多発性硬化症の予防または治療に使用することが特に好ましい。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、ＲＧＭ阻害物質を有効成分とし、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００２１】
ＲＧＭ阻害物質が抗ＲＧＭ中和抗体である場合、薬学的に許容される担体とともに製剤化された注射剤または輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下または局所に投与することが好ましい。抗ＲＧＭ中和抗体を含む注射剤または輸液は、溶液、懸濁液または乳濁液として用いることができる。その溶剤として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖溶液および等張液（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、プロピレングリコール等の溶液）等を用いることができる。さらに、この注射剤または輸液は、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤、防腐剤、ｐＨ調整剤等を含んでいてもよい。安定剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール、プロピレングリコール、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡナトリウム、クエン酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン等を用いることができる。溶解補助剤としては、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０（登録商標）、ＨＣＯ−５０等）等を用いることができる。懸濁化剤としては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、等を用いることができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等を用いることができる。防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等を用いることができる。
【００２２】
ＲＧＭ阻害物質が核酸（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）である場合、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
【００２３】
このようにして得られる製剤は、例えばヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、その有効量を投与することにより、Ｔ細胞活性化に起因する疾患を予防または治療することができる。投与量は、目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。例えば、有効成分が抗ＲＧＭ中和抗体である場合、約６５〜７０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり０．０２ｍｇ〜４０００ｍｇ程度が好ましく、０．１ｍｇ〜２００ｍｇ程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００２４】
〔スクリーニング方法〕
本発明のスクリーニング方法は、被験物質をＲＧＭに接触させる工程、被験物質に接触したＲＧＭの活性レベルを測定する工程、測定した活性レベルを被験物質に接触していないＲＧＭの活性レベルと比較する工程、ＲＧＭの活性レベルを低減させる被験物質を選択する工程を包含するものであればよい。本発明のスクリーニング方法により、Ｔ細胞活性化阻害物質を簡便かつ効率的にスクリーニングすることができる。
【００２５】
被験物質とＲＧＭとの接触は、例えば、ＲＧＭ溶液に被験物質を添加し、溶解または懸濁することにより行うことができる。ＲＧＭは、市販のリコンビナントＲＧＭや定法により自製したリコンビナントＲＧＭを使用することができる。接触時間、接触温度は特に限定されず、適宜選択すればよい。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。ＲＧＭの活性レベルは、ＲＧＭのＲＧＭ受容体への結合活性（実施例１の（１−２）参照）、Ｒａｐ１活性化の誘導活性（実施例１の（１−３）参照）、Ｔ細胞のＩＣＡＭへの接着増強活性（実施例１の（１−４）参照）等を指標にして測定することができる。
【００２６】
測定した活性レベルを、被験物質に接触していないＲＧＭの活性レベルと比較することで、被験物質がＴ細胞活性化阻害物質であるか否かを判定することができる。被験物質を接触させていないＲＧＭの活性レベルと比較して、被験物質を接触させたＲＧＭの活性レベルが低ければ、被験物質がＴ細胞活性化阻害物質であると判定して、これを選択すればよい。好ましくは被験物質を接触させたＲＧＭの活性レベルが５０％以下、より好ましくは２５％以下であるときにＴ細胞活性化阻害物質であると判定する。本発明のスクリーニング方法により得られるＴ細胞活性化阻害物質は、自己免疫疾患等のＴ細胞活性化に起因する疾患の予防薬または治療薬の有効成分候補物質として有用である。特に、多発性硬化症の予防薬または治療薬の有効成分候補物質として極めて有用である。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００２８】
〔実施例１：免疫細胞におけるＲＧＭａおよびＲＧＭａ受容体の発現〕
（１−１）骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣｓ）におけるＲＧＭａの発現
Ｌｕｔｚらの方法（Lutz, M.B., et al. J. Immunol. Methods 223, 77-92 (1999).）に従って、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）から骨髄細胞を採取し、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ、シグマ・アルドリッチ）を含む培地で培養することによりＢＭＤＣｓを取得した。実験には、培養開始後６日のＢＭＤＣｓを使用した。【００２９】
ＢＭＤＣｓにおけるＲＧＭａ ｍＲＮＡの発現をリアルタイム定量ＰＣＲで測定した。すなわち、培養開始後６日のＢＭＤＣｓにＬＰＳ（シグマ・アルドリッチ）を０、０．０１、０．１または１μｇ／ｍＬ添加して２４時間培養し、活性化させたＢＭＤＣｓを集めた。ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてＢＭＤＣｓからトータルＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ＧＥヘルスケア）を用いてｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを鋳型としてＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ（ABI Prism 7500 Sequence Detection System）を製造業者のプロトコールに従って行い、ＲＧＭａのｍＲＮＡ発現を定量分析した。特異的プライマーとプローブはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入した。【００３０】
また、ＢＭＤＣｓにおけるＲＧＭａの発現をウエスタンブロッティングで検出した。すなわち、ＬＰＳ添加２４時間後のＢＭＤＣｓ（２×１０６個）を２×サンプルバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー、および１０％β−メルカプトエタノール）で溶解し、５分間の煮沸後、各サンプルの等量を、還元条件下で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Immobilon-P、ミリポア）に転写した。５％スキムミルクおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでブロッキングした後、抗ＲＧＭａ抗体（本発明者らが作製した抗体、非特許文献３参照）と反応させ、ＨＲＰ標識二次抗体（Cell Signaling Technology）およびＥＣＬ化学発光システム（ＧＥヘルスケア）を用いて検出した。タンパク質バンドの定量はＳｃｉｏｎ ｉｍａｇｅを用いて行った。【００３１】
リアルタイムＰＣＲの結果を図１に示し、ウエスタンブロッティングの結果を図２に示した。図１から明らかなように、ＢＭＤＣｓにおけるＲＧＭａ ｍＲＮＡの発現はＬＰＳの刺激によって増強されることが示された。また、図２から明らかなように、抗ＲＧＭａ抗体が結合する３５ｋＤａおよび５０ｋＤａのバンドが存在し、ＬＰＳ刺激によって細胞内の量が増えることが示された。５０ｋＤａのバンドはＲＧＭａの全長に相当し、３５ｋＤａはＲＧＭａのＣ末端フラグメントでありＲＧＭａの成熟体と推定される（Mueller, B.K., Yamashita, T., Schaffar, G. & Mueller, R. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361, 1513-1529 (2006)）。これらの結果から、活性化されたＢＭＤＣｓにおいてＲＧＭａの発現が誘導されることが明らかとなった。【００３２】
（１−２）ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージにおけるＲＧＭａ受容体の発現
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）から脾臓を摘出し、速やかにＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen）中に入れて緩やかに押し付け、ＡＣＫ溶解バッファー（Lonza Walkersville）で赤血球除去処理をして細胞懸濁液を得た。ＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄後、細胞懸濁液を７０μｍのセルストレーナーに通して脾細胞の単一細胞懸濁液を調製した。この懸濁液に各種濃度のヒトＲＧＭａのＣ末端フラグメント（以下「ＲＧＭａ−Ｆｃ」という。）を添加して３０分間インキュベートした。洗浄後、ＰＥ標識抗ＣＤ１１ｂ抗体またはＡＰＣ標識抗ＣＤ４抗体と、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＲＧＭａ−Ｆｃ抗体（BD Biosciences）とを組み合わせた免疫染色を施し、フローサイトメトリー解析により細胞とヒトＲＧＭａ−Ｆｃとの結合を測定した。フローサイトメトリー解析には、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（BD Biosciences）を用いた。【００３３】
結果を図３に示した。図３から明らかなように、脾臓由来のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージは、いずれも濃度依存的にヒトＲＧＭａ−Ｆｃと結合することが示された。この結果から、これらの細胞がＲＧＭａ受容体を発現していることが明らかとなった。【００３４】
（１−３）ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージにおけるＲａｐ１活性化の検討
次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージに結合するＲＧＭａによって仲介される可能性のあるシグナル伝達について検討した。Ｔリンパ球において、ＴＣＲライゲーションはＲａｐ１の一時的活性化、および、Ｔ細胞の抗原提示細胞接触面におけるＲａｐ１−ＧＴＰの蓄積を引き起こし、これはＬＦＡ−１（インテグリン）：ＩＣＡＭ−１（インテグリンリガンド）が仲介するシグナルを制御することが知られている（Katagiri, K. et al. Mol. Cell Biol. 20, 1956-1969 (2000)、Katagiri, K., Hattori, M., Minato, N. & Kinashi, T. Mol. Cell Biol 22, 1001-1015 (2002)）。そこで、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージのＲａｐ１活性化におけるＲＧＭａの関与について評価した。【００３５】
上記（１−２）で調製した脾細胞の単一細胞懸濁液から、抗ＣＤ４磁気ビーズおよび抗ＣＤ１１ｂ磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）をそれぞれ用いたポジティブソーティングによりＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージを単離し、活性型Ｒａｐ１を測定した。活性型Ｒａｐ１の測定には、Ｒａｐ１活性化アッセイキット（Upstate Biotech）を使用し、対照としてＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージを単離する前の脾細胞を使用した。すなわち、各細胞懸濁液に２μｇ／ｍＬのリコンビナントマウスＲＧＭａ（R&D Systems）を添加し５分間処理した後、Ｍｇ２＋溶解バッファー（25mM HEPES(pH 7.5), 150mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 10mM MgCl2, 1mM EDTA, 2% glycerol, 2mM sodium orthovanadate, 1mM ethylsulfonyl fluoride, およびprotease inhibitor cocktails (Roche Diagnostics)を含む）で溶解した。細胞溶解液は全Ｒａｐ１の測定に用いた。ＲａｌＧＤＳ結合アガロースと細胞溶解液とを４℃で３０分間反応させ、Ｒａｌ結合ドメインに結合した活性型Ｒａｐ１を沈殿させた。ビーズをＭｇ２＋溶解バッファーで洗浄し、２×サンプルバッファーに再懸濁してウエスタンブロッティングに供した。ウエスタンブロッティングにはキットに添付の抗Ｒａｐ１抗体を用い、上記（１−１）と同様の手順で行った。Ｓｃｉｏｎ ｉｍａｇｅを用いてバンドの定量を行い、相対的なＲａｐ１活性化レベルを算出した。【００３６】
ウエスタンブロッティングの結果を図４（Ａ）に示し、相対体的なＲａｐ１活性を示すグラフを図４（Ｂ）に示した。図４（Ｂ）において、相対活性値のグラフは３〜４回の独立した実験の平均値および標準誤差で表わし、「＊」はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定においてＰ＜０．０５であることを表す。図４（Ａ）から明らかなように、いずれの細胞もマウスＲＧＭａの処理により活性型Ｒａｐ１（図中、Pull down Rap1）が増加した。そして、図４（Ｂ）に示したように、ＲＧＭａの５分間の刺激により、脾細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージのＲａｐ１は、いずれも有意に活性化されることが明らかとなった。この結果から、樹状細胞に発現したＲＧＭａがＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｂ＋マクロファージ表面のＲＧＭａ受容体を通して細胞内のＲａｐ１を活性化する可能性が示唆された。【００３７】
（１−４）リンパ球結合アッセイ
インテグリンが媒介する接着は、Ｔ細胞のトラフィッキングおよび活性化において中心的役割を果たす。さらに、ＴＣＲが誘導する接着はＲａｐ１の活性化を必要とする（Katagiri, K. et al. Mol. Cell Biol. 20, 1956-1969 (2000)、Reedquist, K.A. et al. J. Cell Biol. 148, 1151-1158 (2000)、Suga, K. et al. FEBS Lett. 489, 249-253 (2001)）。そこで、ＲＧＭａによって誘導された活性型Ｒａｐ１が接着活性に関与するか否かを確認するために、リンパ球結合アッセイを行った。【００３８】
細胞接着の評価は、先行文献（Sebzda, E., Bracke, M., Tugal, T., Hogg, N. & Cantrell, D.A. Nat. Immunol. 3, 251-258 (2002)、Duchniewicz, M. et al. Mol. Cell Biol. 26, 643-653 (2006)）に記載の方法に準じて行った。すなわち、９６ウェル平底プレート（NUNC, MaxiSorp）に、２μｇ／ｍＬのリコンビナントマウスＩＣＡＭ−１／Ｆｃ（R&D Systems）または４μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（シグマ・アルドリッチ）を添加し、４℃で一夜静置してプレコーティングを行った。ＰＢＳでプレートを洗浄し、非特異的な結合を防ぐために２％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）で３７℃、１時間ブロッキングを行った。ＩＣＡＭ−１／ＦｃをコートしたプレートはＣＤ４＋Ｔ細胞の評価に用い、フィブロネクチンをコートしたプレートは脾細胞の評価に用いた。【００３９】
新たに調製した脾細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞を２．５μＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ（2’7’-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester、Calbiochem）で、３７℃３０分間標識し、続いて０．５％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。５×１０５個の細胞をプレコートしたプレートに加え、２μｇ／ｍＬのリコンビナントＲＧＭａを含む、または含まない０．５％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０中で３７℃１時間インキュベートした。接着していない細胞を、温かい０．５％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄することにより除去した。接着は、Ｓｐｅｃｔｒａ ＭＡＸ（Molecular Devices）を用いて、励起波長４８５ｎｍ蛍光波長５３８ｎｍで定量した。接着率は１ウェルに播種した全細胞数に対するパーセンテージで表した。【００４０】
脾細胞の結果を図５（Ａ）に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の結果を図５（Ｂ）に示した。接着率のグラフは、３回の独立した実験の平均値および標準誤差で表し、「＊」および「＊＊」はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定においてそれぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１であることを表す。図５（Ａ）から明らかなように、ＲＧＭａ刺激を受けた脾細胞は、ＲＧＭａ刺激を受けていない脾細胞と比較して、フィブロネクチンに対する接着率が有意に高くなることが示された。同様に、図５（Ｂ）から明らかなように、ＲＧＭａ刺激を受けたＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＲＧＭａ刺激を受けていないＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＩＣＡＭ−１に対する接着率が有意に高くなることが示された。これらの結果から、ＲＧＭａがＲａｐ１を活性化することで、脾細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の接着活性が増強されることが明らかとなった。【００４１】
〔実施例２：多発性硬化症モデルマウスにおける抗ＲＧＭａ中和抗体の効果の検討〕
（２−１）多発性硬化症モデルマウスの作製
多発性硬化症の臨床および病理学的特徴の研究モデルとして広く受け入れられているモデル動物として、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（myelin oligodendrocyte glycoprotein、以下「ＭＯＧ」という。）で誘導した実験的自己免疫性脳脊髄炎（experimental autoimmune encephalomyelitis、以下「ＥＡＥ」という。）マウスを用いた。具体的には、ＥＡＥは、（ＭＯＧ）３５-５５ペプチド（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK（配列番号５）、Greiner Bio-one）１００μｇを含むＰＢＳ１００μＬと、結核死菌（H37Ra、Difco）５００μｇを含むフロイント完全アジュバント１００μＬとのエマルジョン２００μＬを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１０週齢）の脇腹皮下に投与することで誘導した。さらに、ＭＯＧ投与後およびその４８時間後に、２００ｎｇの百日咳毒素（List Biological Laboratories）を静脈内投与した。【００４２】
（２−２）多発性硬化症モデルマウスへの抗ＲＧＭａ中和抗体投与による臨床症状の観察
ＭＯＧ投与後７日目および１０日目に本発明者らが作製した抗ＲＧＭａ中和抗体（非特許文献３参照）またはコントロール抗体（ウサギＩｇＧ、シグマ・アルドリッチ）を各４００μｇ腹腔内投与した。抗ＲＧＭａ中和抗体投与群は９匹、コントロール抗体投与群は１１匹のＥＡＥマウスで構成した。ＭＯＧ投与（０日）から２１日まで観察し、ＥＡＥの臨床症状を以下の基準に基づいて評価した。
０    ：異状なし
０．５：尾の緊張喪失
１    ：尾の反射性喪失
２    ：尾の反射性喪失、正向反射の低下、一肢の知覚異常
３    ：一肢の知覚異常および麻痺
３．５：両後肢の麻痺
４    ：前肢および後肢の麻痺
５    ：瀕死、死亡【００４３】
観察終了後のマウスを安楽死させ、脊髄を摘出し、パラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋切片を作製して、組織学的評価に供した。切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色し、炎症を評価した。頸髄から胸髄まで、マウス当たり２０−３０切片を観察し、以下の基準に基づいて半定量的な炎症の組織学的評価（炎症インデックス）をブラインドで行った。抗ＲＧＭａ中和抗体投与群は５匹、コントロール抗体投与群は６匹について評価した。
０：炎症なし
１：血管周囲および髄膜のみの細胞浸潤
２：骨髄実質の軽度の細胞浸潤
３：骨髄実質の中等度の細胞浸潤
４：骨髄実質の重度の細胞浸潤【００４４】
観察期間中のＥＡＥスコアの変化を図６に示した。ＥＡＥスコアは平均値および標準誤差で示した。図６から明らかなように、１４日以後抗ＲＧＭａ中和抗体投与群のＥＡＥスコアはコントロール抗体投与群より顕著に低値であった。図には示していないが、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定の結果、１４日目はＰ＜０．０５、１５日目以後はＰ＜０．０１で両群間に統計的有意差が認められた。【００４５】
図７（Ａ）に各群におけるＥＡＥの臨床症状発現率を示し、図７（Ｂ）に各群におけるＥＡＥ発病日の平均値を示し、図７（Ｃ）に各群の各マウスのスコア最大値の平均値を示し、図７（Ｄ）に各群の各マウスのスコア累積値の平均値を示した。図中「ｎ．ｓ．」はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定において有意差がないこと、「＊」および「＊＊」はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定においてそれぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１であることを表す。図７（Ａ）から明らかなように、コントロール抗体投与群は全例（１００％）がＥＡＥの臨床症状を発現したが、抗ＲＧＭａ中和抗体投与群では、４４％のマウスがＥＡＥの臨床症状を発現しなかった。また、図７（Ｂ）から明らかなように、両群間の発病日に差異はなく、抗ＲＧＭａ中和抗体投与によってＥＡＥの発病が遅延するものではないことが示された。一方、図７（Ｃ）および（Ｄ）から明らかなように、スコア最大値の平均値およびスコア累積値の平均値は、いずれも抗ＲＧＭａ中和抗体投与群がコントロール抗体投与群より有意に低い値を示した。これらの結果は、抗ＲＧＭａ中和抗体の投与が、ＥＡＥの症状発現の抑制および進行の抑制に有効であることを示すものである。【００４６】
頸髄のＨＥ染色組織像を図８に示した。（ａ）および（ｂ）はコントロール抗体投与群のＨＥ染色組織像、（ｃ）および（ｄ）は抗ＲＧＭａ中和抗体投与群のＨＥ染色組織像であり、スケールバーは２５０μｍを示す。図８（ａ）および（ｂ）から明らかなように、コントロール抗体投与群の骨髄には広く炎症性単核細胞が存在し、広範囲の炎症性病変が示された。一方、（ｃ）および（ｄ）から明らかなように、抗ＲＧＭａ中和抗体投与群の骨髄には炎症性単核細胞が顕著に少なく、炎症病変が軽減されていることが示された。【００４７】
炎症インデックスの評価結果を図９に示した。図中「＊」はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定においてＰ＜０．０５であることを表す。図９から明らかなように、抗ＲＧＭａ中和抗体投与群の炎症インデックスは、コントロール抗体投与群と比較して有意に低い数値を示した。以上のように、多発性硬化症モデルマウスを用いた実験結果から、抗ＲＧＭａ中和抗体の投与は、ＥＡＥにおける臨床症状および組織学的病変の両方を軽減することが明らかとなった。【００４８】
〔実施例３：抗ＲＧＭａ中和抗体を投与した多発性硬化症モデルマウスの脾細胞におけるＴ細胞活性化の検討〕
実施例２の臨床症状観察を終了した多発性硬化症モデルマウス（ＥＡＥマウス）からＭＯＧ投与後２１日目に脾臓を摘出して脾細胞を単離し、９６ウェルプレートに５×１０５個／ウェルで播種し、３日間培養して細胞増殖を解析した。培地には、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、２−ＭＥ、および１０％熱不活化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。ＣＤ４＋Ｔ細胞を再刺激するために、２０μｇ／ｍＬのＭＯＧペプチドまたは５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（2C11、BD Biosciences）を培養開始時に添加した。Ｋｕｂｏらの方法（Kubo, T., et al. J. Immunol. 173, 7249-7258 (2004).）に従って、培養終了前１８時間の［３Ｈ］チミジン取り込みを評価した。【００４９】
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１７の生成量測定のために、上記脾細胞を２４ウェルプレートに２×１０６個／ウェルで播種し、２０μｇ／ｍＬのＭＯＧペプチドまたは５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下または非存在下で培養した。培養開始後２４時間の培養上清をＩＬ−２の測定に使用し、培養開始後７２時間の培養上清を他のサイトカインの測定に使用した。サイトカインの測定にはＥＬＩＳＡキット（Invitrogen）を用い、説明書の記載に従って行った。【００５０】
結果を図１０に示した。（ａ）は細胞増殖の測定結果、（ｂ）はＩＬ−２の測定結果、（ｃ）はＩＦＮ−γの測定結果、（ｄ）はＩＬ−１７の測定結果である。各グラフは平均値および標準誤差（コントロール抗体投与群ｎ＝６、抗ＲＧＭａ中和抗体投与群ｎ＝５）で表し、「＊」および「＊＊」はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定においてそれぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１であることを表す。図１０（ａ）から明らかなように、抗ＲＧＭａ中和抗体投与群のマウスから得た脾細胞の細胞増殖は、ＭＯＧペプチドによる抗原特異的刺激および抗ＣＤ３モノクローナル抗体による非特異的刺激のいずれによる場合も、コントロール抗体投与群のマウスから得た脾細胞の細胞増殖より有意に低いことが示された。また、図１０（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）から明らかなように、抗ＲＧＭａ中和抗体投与群のマウスから得た脾細胞のＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１７の分泌量は、ＭＯＧペプチドによる抗原特異的刺激および抗ＣＤ３モノクローナル抗体による非特異的刺激のいずれによる場合も、コントロール抗体投与群のマウスから得た脾細胞の各サイトカイン分泌量より有意に低いことが示された。一方、データを示していないが、ＩＬ−４の分泌量に関しては、抗ＲＧＭａ中和抗体の投与が影響を及ぼさなかった。これら結果から、ＥＡＥマウスへの抗ＲＧＭａ中和抗体の投与は、ＥＡＥマウスにおける抗原特異的および非特異的なＴ細胞活性化を顕著に減弱させることが明らかとなった。【００５１】
〔実施例４：再発性多発性硬化症モデルマウスにおける抗ＲＧＭａ中和抗体の効果の検討〕
（４−１）再発性多発性硬化症モデルマウスの作製
ＭＯＧに代えてミエリンプロテオリピドタンパク質（myelin proteolipid protein、以下「ＰＬＰ」という。）をＳＪＬ／Ｊマウスに投与することで、再発性ＥＡＥモデルマウスを作製した。具体的には、再発性ＥＡＥは、（ＰＬＰ）１３９-１５１ペプチド（HSLGKWLGHPDKF（配列番号６）、Greiner Bio-one）１００μｇを含むＰＢＳ１００μＬと、結核死菌（H37Ra、Difco）５００μｇを含むフロイント完全アジュバント１００μＬとのエマルジョン２００μＬを、ＳＪＬ／Ｊマウス（８〜１０週齢）の脇腹皮下に投与することで誘導した。さらに、ＰＬＰ投与後およびその４８時間後に、２００ｎｇの百日咳毒素（List Biological Laboratories）を静脈内投与した。【００５２】
（４−２）再発性多発性硬化症モデルマウスへの抗ＲＧＭａ中和抗体投与による臨床症状の観察
ＰＬＰ投与後２５日目および２８日目に本発明者らが作製した抗ＲＧＭａ中和抗体（非特許文献３参照）またはコントロール抗体（ウサギＩｇＧ、シグマ・アルドリッチ）を各４００μｇ腹腔内投与した。抗ＲＧＭａ中和抗体投与群は９匹、コントロール抗体投与群は１１匹のＥＡＥマウスで構成した。ＰＬＰ投与（０日）から４５日まで観察し、ＥＡＥの臨床症状を上記実施例２に記載の基準に基づいて評価した。【００５３】
観察期間中のＥＡＥスコアの変化を図１１に示した。ＥＡＥスコアは平均値および標準誤差で示した。図中「＊」はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定においてＰ＜０．０５であることを表す。図１１から明らかなように、抗体投与後における抗ＲＧＭａ中和抗体投与群のＥＡＥスコアは、コントロール抗体投与群のＥＡＥスコアより顕著に低値であった。この結果から、最初の麻痺発現期の後期に抗ＲＧＭａ中和抗体を投与することにより、ＥＡＥの再発が予防できることが示された。【００５４】
〔実施例５：ＭＯＧで刺激したＢＭＤＣｓ移植マウスのＥＡＥ臨床症状におけるＲＧＭａ遺伝子ノックダウンの効果の検討〕
（５−１）ＲＧＭａ遺伝子ノックダウンＢＭＤＣｓの作製
以下に示す塩基配列のマウスＲＧＭａ ｓｉＲＮＡ（Stealth RNAi（商品名）、Invitrogen）を購入して使用した。また、ノンターゲティングｄｓＲＮＡ（Invitrogen）をコントロールｓｉＲＮＡとして使用した。
センス鎖：5’-AAAGAGGCCGCAGUGAGUGUAGUUG-3’（配列番号７）
アンチセンス鎖：5’-CAACUACACUCACUGCGGCCUCUUU-3’（配列番号８）【００５５】
培養開始後７日のＢＭＤＣｓを使用した（実施例１参照）。５００ｐｍｏｌのマウスＲＧＭａ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡを含む核酸導入用溶液１００μＬに１×１０６個のＢＭＤＣｓを懸濁した。サンプルをキュベットに移し、ヌクレオフェクター（登録商標）装置（Lonza社）を用いて、製造業者の取り扱い説明書に従ってｓｉＲＮＡを細胞に導入した。ｓｉＲＮＡ導入後、細胞は、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン、２−ＭＥ、１０％熱不活化ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養した。マウスＲＧＭａ ｓｉＲＮＡを導入したＢＭＤＣｓにおけるＲＧＭａの発現は、顕著に低下していた。【００５６】
（５−２）ＭＯＧ刺激およびマウスへの移植
マウスＲＧＭａ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡを導入したＢＭＤＣｓに、１００μｇ／ｍＬの（ＭＯＧ）３５-５５ペプチドを添加し、４〜６時間培養して抗原刺激を与えた。刺激後の生細胞６×１０５個をレシピエントマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の静脈内に投与した。続いて、結核死菌（H37Ra、Difco）５００μｇを含むフロイント完全アジュバント２００μＬを皮下投与した。さらに、その４８時間後に２００ｎｇの百日咳毒素（List Biological Laboratories）を静脈内投与した。【００５７】
（５−３）ＥＡＥ臨床症状の観察
ＲＧＭａ ｓｉＲＮＡ群（５匹）およびコントロールｓｉＲＮＡ群（５匹）について、細胞移植（０日）から２１日まで観察し、ＥＡＥの臨床症状を上記実施例２に記載の基準に基づいて評価した。
観察期間中のＥＡＥスコアの変化を図１２に示した。ＥＡＥスコアは平均値および標準誤差で示した。図中「＊」および「＊＊」はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定においてそれぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１であることを表す。図１２から明らかなように、ＲＧＭａ ｓｉＲＮＡ群のＥＡＥスコアは、コントロールｓｉＲＮＡ群のＥＡＥスコアより顕著に低値であった。この結果から、ＲＧＭａ ｓｉＲＮＡが多発性硬化症の予防または治療に有効であることが明らかとなった。【００５８】
〔実施例６：ＭＯＧ刺激を受けたＣＤ４＋Ｔ細胞移植マウスのＥＡＥ臨床症状における抗ＲＧＭａ中和抗体の効果の検討〕
（６−１）ドナーマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞の調製
ドナーマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に本発明者らが作製した抗ＲＧＭａ中和抗体（非特許文献３参照）またはコントロール抗体（ウサギＩｇＧ、シグマ・アルドリッチ）を各４００μｇ腹腔内投与した（−２日）。その２日後（０日）に、抗ＲＧＭａ中和抗体またはコントロール抗体の２度目の投与を行うと共に、（ＭＯＧ）３５-５５ペプチド１００μｇを含むＰＢＳ１００μＬと、結核死菌（H37Ra、Difco）５００μｇを含むフロイント完全アジュバント１００μＬとのエマルジョン２００μＬを皮下投与した。さらに、その５日後（５日）に、抗ＲＧＭａ中和抗体またはコントロール抗体の３度目の投与を行った。ＭＯＧ投与から１０日目にマウスを安楽死させ、脾臓および流入領域リンパ節を摘出し、細胞を単離して細胞懸濁液を調製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を再刺激するために、４０μｇ／ｍＬの（ＭＯＧ）３５-５５ペプチドを含む培地で細胞（１×１０６個／ｍＬ）を３日間培養した。培養終了後、細胞を集め、ＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット（Miltenyi Biotec）を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。【００５９】
（６−２）レシピエントマウスへの移植およびＥＡＥ臨床症状の観察
レシピエントマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）には、予め亜致死量（５００Ｇｙ）の放射線を照射した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（生細胞）６×１０５個をレシピエントマウスに静脈内投与した。抗ＲＧＭａ中和抗体を投与したドナーマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を移植したマウス（抗ＲＧＭａ中和抗体群、７匹）およびコントロール抗体を投与したドナーマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を移植したマウス（コントロール抗体群、７匹）について、細胞移植（０日）から２１日まで観察し、ＥＡＥの臨床症状を上記実施例２に記載の基準に基づいて評価した。【００６０】
観察期間中のＥＡＥスコアの変化を図１３に示した。ＥＡＥスコアは平均値および標準誤差で示した。図中「＊」および「＊＊」はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定においてそれぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１であることを表す。図１３から明らかなように、抗ＲＧＭａ中和抗体群のＥＡＥスコアは、コントロール抗体群のＥＡＥスコアより顕著に低値であった。この結果から、抗ＲＧＭａ中和抗体による多発性硬化症の予防または治療効果は、抗ＲＧＭａ中和抗体が抗原特異的なＴ細胞活性化や自己反応性Ｔ細胞の分化を抑制することに基づくことが明らかとなった。【００６１】
以上の結果は、単核細胞の脊髄への浸潤、およびＴ細胞の増殖やＥＡＥ関連サイトカインであるＩＬ−２、ＩＬ−１７およびＩＦＮ−γの産生といったＴ細胞の活性化などの免疫応答の増大によるＥＡＥの発病に、ＲＧＭａが関与することを明らかにしたものである。さらに、抗ＲＧＭａ中和抗体やＲＧＭａ ｓｉＲＮＡがＴ細胞の活性化を阻害し、多発性硬化症の予防または治療に有効であることを示したものである。【００６２】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、医薬品産業において極めて高い利用価値を有する。
【図１】
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【図３】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年8月8日(2011.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＧＭ阻害物質を有効成分とするＴ細胞活性化阻害剤。
【請求項２】
ＲＧＭ阻害物質が抗ＲＧＭ中和抗体である請求項１に記載のＴ細胞活性化阻害剤。
【請求項３】
ＲＧＭ阻害物質がＲＧＭ  ｓｉＲＮＡである請求項１に記載のＴ細胞活性化阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＴ細胞活性化阻害剤を含有することを特徴とするＴ細胞活性化に起因する疾患の予防または治療用医薬組成物。
【請求項５】
Ｔ細胞活性化に起因する疾患が自己免疫疾患である請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
自己免疫疾患が多発性硬化症である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
被験物質をＲＧＭに接触させる工程と、
前記ＲＧＭの活性レベルを測定する工程と、
前記活性レベルを、被験物質に接触していないＲＧＭの活性レベルと比較する工程と、
ＲＧＭの活性レベルを低減させる被験物質を選択する工程とを包含することを特徴とするＴ細胞活性化阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のＴ細胞活性化阻害剤を含有することを特徴とする多発性硬化症の予防用医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のＴ細胞活性化阻害剤を含有することを特徴とする多発性硬化症の再発予防用医薬組成物。
【請求項１０】
ＲＧＭ阻害物質をＲＧＭ発現細胞と接触させる工程を包含することを特徴とするＴ細胞活性化阻害方法。
【請求項１１】
ＲＧＭ阻害物質が抗ＲＧＭ中和抗体である請求項１０に記載のＴ細胞活性化阻害方法。
【請求項１２】
ＲＧＭ阻害物質がＲＧＭ  ｓｉＲＮＡである請求項１０に記載のＴ細胞活性化阻害方法。
【国際調査報告】
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