(57)【要約】  植物油を基本原料として、３−ヒドロキシヘキサン酸分率の高いポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］を生産することを目的とする。本発明によれば、脂肪酸β−酸化系中間体をモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ［Ｒ−３ＨＡ−ＣｏＡ］に変換するＲ−ヒドラターゼをコードする遺伝子を、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株に導入することによって、植物油を基本原料として、３−ヒドロキシヘキサン酸分率の高いポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を生産する微生物を製造する方法が提供される。
2011105379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）株の染色体にＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として植物油を含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、３−ヒドロキシヘキサン酸の分率が５〜２０モル％であり、及び形質転換体内蓄積率が５０〜９０重量％であるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を製造する方法。
【請求項２】
前記組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、又はＭＦ０１株であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）株由来であり、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が、クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が、クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が、
−  アエロモナス・キャビエ株由来であり、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
−  クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子が、
−  アエロモナス・キャビエ株由来であり、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
−  クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物油を基本原料として、微生物により分解可能であり、生体適合性にも優れた共重合ポリエステルの１つであるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を微生物により製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会における必須材料である石油合成プラスチックは安価で加工しやすい反面、難分解性のため廃棄された際の処理が問題になっている。そこで、多くの微生物がエネルギー源として細胞内に蓄積するポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、石油ではなくバイオマスを原料とし、かつ生分解性を有する環境低負荷型のプラスチック素材として期待されている。ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）（本明細書中「Ｐ（３ＨＢ）」と略記する。）は多くの微生物が生合成する代表的なＰＨＡである。しかしながら、Ｐ（３ＨＢ）は固くて脆いという物性のため実用化が困難である。【０００３】
一方、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）などによって植物油から合成されるポリ（（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸）共重合体［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］は柔軟性に富む優れた物性を示す。さらに、本共重合体は、３ＨＨｘ組成に応じて硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を示すため、多様の用途に向けた応用が期待できる（非特許文献１）。【０００４】
これまで、アエロモナス・キャビエは、植物油を原料とし、３ＨＨｘ（ヒドロキシヘキサン酸）の分率が９〜１３ｍｏｌ％であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を合成することで知られている。しかしながら、その菌体内蓄積率は約６〜１２重量％と低く、実生産に適用することは困難であった（特許文献１、特許文献２、非特許文献１）。そこで、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡシンターゼ（重合酵素）遺伝子であるｐｈａＣAcを効率的Ｐ（３ＨＢ）生産菌である水素細菌クプリアヴィダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）のＰＨＡ蓄積能欠損株であるＰＨＢ-４株に導入することによって、植物油からＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を高い蓄積率（７０〜８０重量％）で蓄積する組換え株が本発明者らによって作製された。しかしながら、この場合では３ＨＨｘ分率が４〜５ｍｏｌ％と低く、またＰＨＢ-４株は野生株であるＨ１６株と比較して増殖能が低下していることが問題点であった（特許文献３、非特許文献２）。実用可能な柔軟性を有するポリマーとするためには３ＨＨｘ分率が７〜１５ｍｏｌ％であることが好ましいことから、高い３ＨＨｘ分率のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を効率良く蓄積し、かつ増殖能の高い組換え株の作製方法が探索されてきた。本発明者らはｐｈａＣAcをクプリアヴィダス・ネカトールＨ１６株の染色体へ導入することによって高い増殖能及び高いＰＨＡ生産能を示す菌株を作製したが、３ＨＨｘ分率の低下が観察された（非特許文献３）。またアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡシンターゼの変異酵素の遺伝子ｐｈａＣNSDGを染色体に導入し、３ＨＢモノマーの供給酵素であるβ−ケトチオラーゼ遺伝子及びアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素を不活性化した方法が開示されている（特許文献４）。【０００５】
一方、本発明者らによって、アエロモナス・キャビエにおけるＰＨＡ生合成の解析から、ＰＨＡシンターゼのすぐ下流に位置する遺伝子ｐｈａＪAcが、脂肪酸β−酸化系の中間体であるエノイル−ＣｏＡをＲ−３ＨＡ−ＣｏＡに変換するＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ（以下、単に「Ｒ−ヒドラターゼ」と略記する場合がある。）をコードすることが明らかにされた（図１）（特許文献３、非特許文献４）。このｐｈａＪAcとｐｈａＣAcの両方を大腸菌に導入することにより、本来ＰＨＡ合成能を有しない大腸菌に脂肪酸を炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を生合成する能力を付与できることが本発明者らによって示された（非特許文献５）。また、アエロモナス・キャビエにおけるＲ−ヒドラターゼの発見以降、さまざまな微生物で類似のＲ−ヒドラターゼ及びその遺伝子が見出され、ＰＨＡ合成能を有しない大腸菌に適切なＰＨＡ重合酵素遺伝子とともに導入することで炭素数４−６のヒドロキシアルカン酸からなる共重合ＰＨＡや、炭素数６−１２の中長鎖３−ヒドロキシアルカン酸からなる共重合ＰＨＡの微生物合成に利用できることが示されている（非特許文献６、７及び８、特許文献５）。しかし大腸菌は脂肪酸を炭素源とした際の増殖能が低いために、これらの例におけるＰＨＡ生産性は低く、また大腸菌では炭素源として安価な植物油を使用できないことが問題点であった。【０００６】
一方、上述のクプリアヴィダス・ネカトールＰＨＢ-４株由来の組換え株の作製において、ｐｈａＣAcと共にｐｈａＪAcを導入した各種組換え株が作製され、オクタン酸を炭素源としたＰＨＡ生合成について検討されているが、これらの株におけるＰＨＡ蓄積率や３ＨＨｘ分率とｐｈａＪAc導入との明確な相関は確認されなかった（特許文献３、非特許文献９、１０）。したがって、クプリアヴィダス・ネカトール株を用いたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生合成におけるＲ−ヒドラターゼ遺伝子導入の効果については明らかになっていない。また、クプリアヴィダス・ネカトールがＲ−ヒドラターゼを有しているという報告例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平５−９３０４９号
【特許文献２】特開平７−２６５０６５号
【特許文献３】特許３０６２４５９号
【特許文献４】特開２００８−２９２１８号
【特許文献５】特開２００４−３２１１６７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｏｉ等、Ｍａｃｒｏｍｏｃｌｅｃｕｌｅｓ，２８：４８２２−４８２８（１９９５）
【非特許文献２】Ｆｕｋｕｉ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４９：３３３−３３６（１９９８）
【非特許文献３】Ｍｉｆｕｎｅ等、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，８６：６２１−６２７（２００８）
【非特許文献４】Ｆｕｋｕｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：６６７−６７３（１９９８）
【非特許文献５】Ｆｕｋｕｉ等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７０：６９−７５（１９９９）
【非特許文献６】Ｒｅｉｓｅｒ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３：２０９−２１８（２０００）
【非特許文献７】Ｔｓｕｇｅ等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１８４：１９３−１９８（１９９９）
【非特許文献８】Ｐａｒｋ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：５３９１−５３９７（２００３）
【非特許文献９】Ｆｕｋｕｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４８２１−４８３０（１９９７）
【非特許文献１０】Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２５：６９−７７（１９９９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、脂肪酸β−酸化系中間体をモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ［Ｒ−３ＨＡ−ＣｏＡ］に変換するＲ−ヒドラターゼをコードする遺伝子を、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株に導入することによって、植物油を基本原料として、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を生産する微生物を製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
本発明によれば、（ｉ）既知のアエロモナス・キャビエ由来のＲ−ヒドラターゼ遺伝子をＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株の染色体に導入することにより、植物油のみを原料として高３ＨＨｘ分率のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を高い蓄積率で製造する方法、及び（ｉｉ）水素細菌クプリアヴィダス・ネカトールより新規に同定したＲ−ヒドラターゼ遺伝子をＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株に導入することにより植物油のみを原料として高３ＨＨｘ分率のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を高い蓄積率で製造する方法が提供される。【００１１】
より具体的には、本発明によれば、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）株の染色体にＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として植物油を含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、３−ヒドロキシヘキサン酸の分率が５〜２０モル％であり、及び形質転換体内蓄積率が５０〜９０重量％であるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）を製造する方法が提供される。【００１２】
本発明の製造方法に使用することができる組換えクプリアヴィダス・ネカトール株は、限定されないが、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、又はＭＦ０１株である。【００１３】
本発明の一態様では、本発明の製造方法に使用されるＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、アエロモナス・キャビエ株由来であり、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。【００１４】
本発明の一態様では、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。あるいは、
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。【００１５】
本発明の一態様では、
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、
−  アエロモナス・キャビエ株由来であり、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
−  クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。【００１６】
本発明の一態様では、
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、
−  アエロモナス・キャビエ株由来であり、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
−  クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【発明の効果】
【００１７】
Ｒ−ヒドラターゼをポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］生産微生物に導入することにより、高い増殖能と高いＰＨＡ生産能を維持しつつ、３ＨＨｘ分離の高いＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を生産する株を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】アエロモナス・キャビエにおけるポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）の生合成の経路を示す。
【図２】作製した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株の名称と染色体上の関連遺伝子の構成を示す。
【図３】クプリアヴィダス・ネカトール組換え株における遺伝子の配置を示す。
【図４】エノイル−ＣｏＡヒドラターゼによる水和反応とＰＨＡ顆粒による重合反応との共役によるＰｈａＪ１、ＰｈａＪ２、ＰｈａＪ３の立体選択性を検討した結果を示す（Ａ）ＰｈａＪ１、（Ｂ）ＰｈａＪ２、及び（Ｃ）ＰｈａＪ３；黒四角：精製酵素添加、白三角：精製酵素添加なし）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
前述の通り、本発明は、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサン酸）［Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）］生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株の染色体にＲ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ（Ｒ−ヒドラターゼ）遺伝子を相同性組換えによって形質転換し、又は前記株に該遺伝子が組み込まれた自律複製ベクターを導入することによって形質転換し、炭素源として植物油を含有する培地で形質転換体を増殖させることを含む、３−ヒドロキシヘキサン酸（３−ＨＨｘ）の分率が５〜２０ｍｏｌ％であり、及び形質転換体内蓄積率が５０〜９０重量％であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を製造する方法を提供する。
【００２０】
（１）組換えクプリアヴィダス・ネカトール株
本発明の製造方法に使用される微生物としては、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能が付与された組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が好ましい。ここで、「Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能が付与された組換えクプリアヴィダス・ネカトール株」とは、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を生合成させることを目的として、クプリアヴィダス・ネカトール株が本来有しているＰＨＡシンターゼを変異あるいは遺伝子破壊などにより欠損した株に、炭素数６の３ＨＨｘ−ＣｏＡを基質とすることができる広基質特異性ＰＨＡシンターゼ（例えばアエロモナス・キャビエ株由来ＰＨＡシンターゼやその変異酵素の遺伝子）を導入された菌株、あるいは、クプリアヴィダス・ネカトール株が本来有しているＰＨＡシンターゼ遺伝子が広基質特異性ＰＨＡシンターゼやその変異酵素の遺伝子に染色体上で置換された菌株を意味し、広基質特異性ＰＨＡシンターゼの作用によってクプリアヴィダス・ネカトール野生株が生合成できないＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）を合成する能力を有することを特徴とする。このような遺伝子の操作は、一般的な遺伝子工学的手法により容易に実行することができる。上記のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能が付与された組換えクプリアヴィダス・ネカトール株には、例えば、限定されないが、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、ＭＦ０１株が挙げられる。ここで、「ＮＳＤＧ株」とは、水素細菌クプリアヴィダス・ネカトールの一種であるＨ１６株の染色体にＰＨＡシンターゼ変異酵素の遺伝子であるｐｈａＣNSDGが導入された形質転換体をいう。「ｐｈａＣNSDG」とは、クプリアヴィダス・ネカトールにおいてＰＨＡ合成酵素をコードするｐｈａＣ遺伝子であって、ｐｈａＣのアミノ酸配列（配列番号４）において、１４９位のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に置換され、１７１位のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に置換された変異遺伝子をいう。また、「ＮＳＤＧΔＡ株」とは、前記のＮＳＤＧ株において、β−ケトチオラーゼ遺伝子であるｐｈａＡCnを欠失させた形質転換体をいう。一方、「ＭＦ０１株」とは、前記ＮＳＤＧ株のｐｈａＡCnを広基質特異性β−ケトチオラーゼ遺伝子ｂｋｔＢCnに置換した形質転換体である。上記３種のＨ１６変異株は、クプリアヴィダス・ネカトールのＰＨＡシンターゼ酵素をコードする遺伝子の配列情報を基にして、一般的な遺伝子工学的手法を用いて作製することができる（例えば、特許文献４を参照されたい）。
【００２１】
（２）Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ（「Ｒ−ヒドラターゼ」）遺伝子のクローニング
本発明の製造方法に使用される「Ｒ−ヒドラターゼ」とは、脂肪酸β−酸化系中間体（例えば、エノイル−ＣｏＡ）をポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）モノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ［Ｒ−３ＨＡ−ＣｏＡ］（例えば、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸［（Ｒ）−３ＨＢ］、（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサン酸［（Ｒ）−３ＨＨｘ］）に変換する酵素をいう。なお、本発明の製造方法に使用されるＲ−ヒドラターゼをコードする核酸は、一本鎖又は二本鎖型ＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、Ｒ−ヒドラターゼをコードする核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
本発明の製造方法において、Ｒ−ヒドラターゼ遺伝子として、アエロモナス・キャビエ株由来のＲ−ヒドラターゼをコードする遺伝子（ｐｈａＪAc）の塩基配列：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ８８８２５中のヌクレオチド４４７５−４８７９（“ＯＲＦ３”）を利用することができる。本明細書では、該遺伝子の塩基配列を配列番号１として配列表に記載する。
【００２３】
また、本発明の製造方法において、Ｒ−ヒドラターゼ遺伝子として、クプリアヴィダス・ネカトール由来のＲ−ヒドラターゼをコードする遺伝子の塩基配列：（ｉ）ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＭ２６０４７９中のヌクレオチド１１６７０７７−１１６７５５３（“Ｈ１６ Ａ１０７０”）、本明細書中では「ｐｈａＪ１」に相当、及び（ｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＭ２６０４８０中のヌクレオチド４５４１０７−４５４５６２（“Ｈ１６ Ｂ０３９７”）、本明細書中では「ｐｈａＪ２」に相当、を利用することができる。本明細書では、上記（ｉ）の遺伝子の塩基配列を配列番号２、（ｉｉ）の遺伝子の塩基配列を配列番号３として配列表に記載する。
【００２４】
本発明の一態様として、アエロモナス・キャビエ株由来のＲ−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００２５】
本発明の好ましい態様として、アエロモナス・キャビエ株由来のＲ−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００２６】
本発明の一態様として、クプリアヴィダス・ネカトール株由来のＲ−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなるか、あるいは
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００２７】
本発明の好ましい態様として、クプリアヴィダス・ネカトール株由来のＲ−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸；又は
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなるか、あるいは
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸；又は
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。
【００２８】
本発明の一態様として、
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、
−  アエロモナス・キャビエ株由来であり、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
−  クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。なお、上記Ｒ−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸（ａ又はｂ）と核酸（ｃ又はｄ）を隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される２つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。
【００２９】
本発明の好ましい態様として、
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、
−  アエロモナス・キャビエ株由来であり、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
−  クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸；又は
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。なお、上記Ｒ−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸（ａ又はｂ）と核酸（ｃ又はｄ）を隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される２つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。
【００３０】
本発明の一態様として、
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、
−  アエロモナス・キャビエ株由来であり、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
−  クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸；又は
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。なお、上記Ｒ−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸（ａ又はｂ）と核酸（ｃ又はｄ）を隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される２つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。
【００３１】
本発明の好ましい態様として、
Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子は、
−  アエロモナス・キャビエ株由来であり、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸；又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸；及び
−  クプリアヴィダス・ネカトール株由来であり、
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸；又は
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸β−酸化系中間体を（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する活性を有するタンパク質をコードする核酸
からなる。なお、上記Ｒ−ヒドラターゼをコードする遺伝子は、核酸（ａ又はｂ）と核酸（ｃ又はｄ）を隣接して又は隣接しないで連結したものであるが、連結される２つの核酸の順序は限定されず、さらに、適切なプロモーターの制御下であれば、染色体への挿入位置は限定されない。
【００３２】
前記Ｒ−ヒドラターゼ遺伝子は、例えば、後述する実施例１０及び１６に記載するように、配列番号１〜３の塩基配列に基づいてプライマーとして合成ヌクレオチド（それぞれ、配列番号１７と１８、配列番号２３と２４、及び配列番号２５と２６）を設計し、それぞれ、クプリアヴィダス・ネカトール株の染色体ＤＮＡや、染色体ＤＮＡを含むプラスミドなどを鋳型として増幅することができる。核酸を増幅するための手法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９））、及び転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））、及びＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を利用することができるが、これらに限定されない。本発明の製造法においては、ＰＣＲ法を使用することが好ましい。
【００３３】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，７．４２−７．４５（２００１）に示されるが、ニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０〜５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及び約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度及び洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
【００３４】
上記のような核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に記載の塩基配列に対して、それぞれ、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する。
【００３５】
なお、同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３）を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。
【００３６】
本発明の最も好ましい態様として、アエロモナス・キャビエ由来のＲ−ヒドラターゼとしては、配列番号１で表される塩基配列からなる核酸、あるいはクプリアヴィダス・ネカトール由来のＲ−ヒドラターゼとしては、配列番号２又は３で表される塩基配列からなる核酸である。
【００３７】
（３）遺伝子置換ベクターの構築及び組換え微生物の作製
本発明によれば、Ｒ−ヒドラターゼをコードする遺伝子を相同性組換え用ベクターに組み込んだ遺伝子置換ベクター、又は該遺伝子を自律複製ベクターに組み込んだ発現ベクターが提供される。ここで、ベクターに遺伝子を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、トーヨーボー社製等）を用いることもできる。
【００３８】
ベクターは、簡単には当該技術分野において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本発明のポリヒドロキシアルカン酸共重合体の製造方法に用いられるベクターとしては、微生物内で、微生物の染色体に既に組み込まれている微生物由来のポリエステル重合酵素遺伝子を外来の広基質特異性ポリエステル重合酵素遺伝子によって置換することを目的として、限定されないが、相同性組換え用ベクターｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｒら，Ｇｅｎｅ  １４５，６９−７３（１９９４））、ｐＪＱ２００（Ｑｕａｎｄｔ，Ｊ．及びＨｙｎｅｓ，Ｍ．Ｐ．，“Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｈｉｃｈ  ａｌｌｏｗ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｇｅｎｅ（１９９３）１２７：１５−２１を使用することが好ましい。あるいは、グラム陰性菌で自律複製することが知られている広宿主域ベクターｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ２３７５１）、ｐＪＲＤ２１５（Ｍ１６１９８）（Ｄａｖｉｓｉｏｎ，Ｊ．ら、（１９８７）Ｇｅｎｅ，５１，２７５−８０を参照）、ｐＪＢ８６１（Ｕ８２０００）、ｐＨＲＰ３１１（Ｐａｒａｌｅｓ，Ｒ．Ｅ．及びＨａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｓ．（１９９３）Ｇｅｎｅ，１３３，２３−３０を参照）が例示されるが、これらに限定されない。また、大腸菌用のプラスミドとして、例えば、ｐＢＡＤ２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ８１８３７）、ｐＤＯＮＲ２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等を使用することができる。
【００３９】
また、当業者であれば、組換えベクターに適合するように制限末端を適宜選択することができ、さらに、所望のタンパク質を発現させるために、宿主細胞に適した組換えベクターを適宜選択することができる。このようなベクターは、本発明で使用する遺伝子が目的の宿主細胞の遺伝子と相同性組換えが起るように機能する領域（必要に応じて、自立複製起点、接合伝達領域、選択マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子）等）が適切に配列されており又は導入することにより、該核酸が適切に組換えられるように構築されている又は構築することが好ましい。ベクターの構築については、実施例１０、１１、１３、及び１６に記載した。
【００４０】
一般的に、形質転換体は、組換えベクターを宿主細胞に組み込むことによって作製することができる。この場合、宿主細胞として原核細胞（例えば、大腸菌（Ｓ１７−１株等）、枯草菌）であっても真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても使用することができる。組換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換）は公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９））やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１））、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ラルストニア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等に属する菌体への発現ベクターの導入では、接合伝達法を使用することができる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４７，１９８（１９８１））。
【００４１】
この接合伝達法は、簡単には、細胞同士の接触によって染色体ゲノム又はプラスミドを一方の細胞から他方の細胞に移行させる細胞の性質を利用したものであり、例えば、目的のＤＮＡを担持する自己伝達性プラスミドが導入された供与菌と該プラスミドを有しない受容菌との接合に始まり、両菌体における橋の形成、該プラスミドの複製と移行、並びにＤＮＡ合成の完了と共に菌体の分離といった一連の工程によって遺伝子導入を可能にする手段である。
【００４２】
本発明の製造方法に使用される宿主細胞としては、上述した通り、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株が好ましい。より好ましくは、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、又はＭＦ０１株である。なお、後述する実施例４では、作製した遺伝子置換ベクターｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＡＢを上記の株に接合伝達法により導入し、ベクターが相同領域で単交差相同性組換えにより染色体に挿入された組換え株をカナマイシン耐性を指標に単離した。
【００４３】
なお、Ｒ−ヒドラターゼ遺伝子が染色体上に導入される位置は、該遺伝子が染色体上にある既存の調節配列下で発現するような位置であれば特に限定されない。一態様では、好ましくはＲ−ヒドラターゼ遺伝子はｐｈａＣNSDG遺伝子と同じ転写単位の領域内に挿入されたものである。より好ましくはｐｈａＣNSDG遺伝子の下流に挿入されたものである。
【００４４】
（４）共重合ポリエステルの合成
ポリエステル合成は、上述したＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）生産能を付与した組換えクプリアヴィダス・ネカトール株（例えば、Ｈ１６ＣAc株、ＮＳＤＧ株、ＮＳＤＧΔＡ株、又はＭＦ０１株）を植物油を含む所定の培地で培養し、培養細胞（例えば、菌体）内又は培養物（例えば、培地）中に共重合ポリエステルを生成及び蓄積させ、培養細胞又は培養物から目的とする共重合ポリエステルを採取することにより行われる。なお、本発明の製造方法に使用される形質転換体の培養法は、通常、宿主細胞の培養に使用される方法に従って行われる。
【００４５】
組換えクプリアヴィダス・ネカトール株を宿主とした場合の培地として、微生物が資化し得る植物油を添加し、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源のいずれかを制限した培地が挙げられる。典型的には、培地温度を２５℃〜３７℃の範囲にし、好気的に１〜１０日培養することにより、共重合ポリエステルを菌体内に生成し蓄積させ、その後、回収・精製することによって所望の共重合ポリエステルを調製することができる。
【００４６】
本発明の製造方法で使用される形質転換体の親株であるクプリアヴィダス・ネカトールは、植物油を炭素源として成長し得る細菌として知られている。ここで、使用可能な植物油としては、一般的には、市販されている植物油を使用することができ、その供給源は特に限定されない。好ましくは、大豆油、コーン油、大豆油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ヤシ油、パーム油、ナタネ油、魚油、鯨油、豚油又は牛油などの天然油脂である。また、本発明によれば、本発明の形質転換体は、親株のクプリアヴィダス・ネカトールと同様の培養条件で培養することができ、培地中の植物油の濃度は、０．１〜５％が好ましいが、当業者であれば適宜調整することができる。
【００４７】
また、必要であれば、培地中に窒素源や無機物を添加してもよい。窒素源としては、アンモニア、塩化 アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム 等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナ トリウム等が挙げられる。
【００４８】
培養は、通常、振とう培養が用いられ、好気的条件下で、２５℃〜３７℃で遺伝子発現誘導後少なくとも１日以上行うことが好ましい。抗生物質として、カナマイシン、アンピシリン等を培地に添加してもよい。また、必要であれば、遺伝子発現誘導剤として、アラビノース、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を使用することができる。当業者であれば、所望の遺伝子発現のために可能な培養条件、遺伝子発現の誘導条件等を適宜選択できる。
【００４９】
（５）共重合ポリエステルの精製と構造解析
本発明において、共重合ポリエステルは、下記の通り精製することができる：培地から遠心分離によって形質転換体を回収し、蒸留水で洗浄後、乾燥又は凍結乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した形質転換体を懸濁させ、室温で所定時間撹拌し、共重合ポリエステルを抽出する。抽出の段階で、必要であれば加熱してもよい。濾過によって残渣を除去し、上清にメタノールを加えて共重合ポリエステルを沈殿させ、沈殿物を濾過又は遠心分離によって、上清を除去し、乾燥させて精製した共重合ポリエステルを得ることができる。
【００５０】
得られた共重合ポリエステルが所望のものであることを確認するための手段は、限定されないが、ＮＭＲ（核磁気共鳴）、ガスクロマトグラフィーを用いる方法を含む。本発明によれば、共重合ポリエステルのモノマーユニットの比、即ち、３−ヒドロキシブタン酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）の比を遺伝子発現条件、培養条件等を変えることにより適宜調節することができる。本発明の製造方法によって得られる共重合ポリエステルの３ＨＨｘ分率は、好ましくは５〜２０モル％、より好ましくは５〜１５モル％、さらにより好ましくは５〜１０モル％である。用語「モル％」は、本明細書中で使用するとき、多成分系における各成分のモル数の和で、ある成分のモル数を割ったものをいう。例えば、本発明の製造方法により得られる共重合体の一般式を３ＨＢ及び３ＨＨｘのモノマーユニットの数として、それぞれ「ａ」及び「ｂ」を用いて表記した場合、３ＨＨｘ分率は、式：ａ×１００／（ａ＋ｂ）により求めることができる。
【００５１】
【化１】
2011105379.tif 000003
【００５２】
なお、後述する実施例１８で示すように、本発明の製造方法により、３ＨＨｘ分率が異なる共重合ポリエステルを得ることができた（表１及び２、後述）。本発明の製造方法によって製造された共重合ポリエステルは、乾燥菌体重量当り５０重量％以上、好ましくは５５重量％以上の割合で菌体に蓄積される。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００５４】
実施例１  使用したクプリアヴィダス・ネカトール株
以下の実施例では、遺伝子組換え用の宿主としてクプリアヴィダス・ネカトールＨ１６株（野生株、ＤＳＭ４２８）、Ｈ１６株の染色体上のＰＨＡシンターゼ遺伝子ｐｈａＣCnを削除したＨ１６ΔＣ株（Ｍｉｆｕｎｅ，Ｊ．ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．（２００８），８６：６２１）、及びＨ１６株の染色体上のＰＨＡシンターゼ遺伝子ｐｈａＣCnを土壌細菌アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡシンターゼ遺伝子ｐｈａＣAcに置換したＨ１６ＣAc株（Ｍｉｆｕｎｅ，Ｊ．ら、上述）を用いた。【００５５】
実施例２  二重アミノ酸変異型ＰＨＡシンターゼ遺伝子のクローニング
アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡシンターゼに二重アミノ酸変異を導入した変異型酵素が報告されている（Ｔｓｕｇｅ，Ｔ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ（２００７），２７７：２１７−２２２；Ｋｉｃｈｉｓｅら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００２），６８：２４１１−２４１９；特開２００８−２９２１８）。本明細書では、本変異型ＰＨＡシンターゼ遺伝子を「ｐｈａＣNSDG」と称する。ｐｈａＣNSDGがクローニングされたｐＢＢＲＥＥ３２−ＮＳＤＧ（Ｔｓｕｇｅ，Ｔ．ら，上述）を鋳型とし、下記の配列１及び配列２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＣNSDGを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤプラス（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、６１℃で１５秒、６８℃で２分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
配列１：ＧＧＴＴＣＧＡＡＴＡＧＴＧＡＣＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＣＡＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＣＡＴＣＴＴＡＴＧＧＣ（配列番号５）（下線部はＣｓｐ４５Ｉ制限酵素サイト）
配列２：ＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＧＴＣＡＴＧＣＧＧＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧ（配列番号６）（下線部はＳｂｆＩ制限酵素サイト）【００５６】
増幅したｐｈａＣNSDG断片はＴＡクローニングキット（トーヨーボー社製）を用いて３’−末端にアデニン塩基を付加し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（トーヨーボー社製）を用いてベクタープラスミドｐＴＡ２（トーヨーボー社製）のマルチクローニングサイトに連結したｐＴＡ２NSDGを作製した。【００５７】
実施例３  二重アミノ酸変異型ＰＨＡシンターゼ導入用ベクターの作製
ｐＴＡ２NSDGをＣｓｐ４５ＩとＳｂｆＩで切断し、ｐｈａＣNSDGを含む遺伝子断片を単離した。次いで、組換えｐｈａオペロン（プロモーター領域−ｐｈａＣAc−ｐｈａＡCn−ｐｈａＢ１Cn）を含むｐＴＡ２Ｃ’ＡＢ（Ｍｉｆｕｎｅ，Ｊ．ら、上述）をＣｓｐ４５Ｉ及びＳｂｆＩで切断し、アルカリホスファターゼ（トーヨーボー社製）で５’−末端を脱リン酸化し、次いで先に得られたｐｈａＣNSDG断片を挿入することによりｐＴＡ２NSDG−ＡＢを得た。ここで、ｐｈａＢ１Cnはクプリアヴィダス・ネカトール株の染色体上のアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子である。ｐＴＡ２NSDG−ＡＢをＢａｍＨＩで切断し、プロモーター領域−ｐｈａＣNSDG−ｐｈａＡCn−ｐｈａＢ１Cnを含む５．０ｋｂｐの遺伝子領域を単離した。また、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ｓｃｈａｆｅｒら，Ｇｅｎｅ（１９９４），１４７：１９８）をＢａｍＨＩで切断し、アルカリホスファターゼ処理により５’−を脱リン酸化した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈにより２つの断片を連結し、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＡＢを作製した。【００５８】
実施例４  ＮＳＤＧ株の作製
得られた組換えプラスミドｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＡＢを用いて、クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６ΔＣ株を接合伝達により形質転換した。まず、塩化カルシウム法によって、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＡＢを大腸菌Ｓ１７−１株に導入した。次に、この組換え大腸菌をＬＢ培地（１％トリプトン、１％塩化ナトリウム、０．５％イーストエキス、ｐＨ７．２）３．０ｍｌ中で３７℃終夜培養した。これと並行して、クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６ΔＣ株をＮＲ培地（１％魚肉エキス、１％ポリペプトン、０．２％イーストエキス）３．０ｍｌ中で３０℃終夜培養した。その後、大腸菌の培養液０．２ｍｌに対して、クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６ΔＣ株の培養液０．１ｍｌを混合し、３０℃で６時間培養した。この菌体混合液を０．２ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＳｉｍｍｏｎｓ  Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地（ディフコ社製）に塗布し、３０℃で３日間培養した。組換え大腸菌のプラスミドが、クプリアヴィダス・ネカトールに伝達され相同性組換えにより染色体上に取り込まれた該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はＳｉｍｍｏｎｓ  Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーは組換え大腸菌からｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＡＢが染色体に取り込まれたクプリアヴィダス・ネカトール形質転換体（ポップイン株）である。さらに、ポップイン株をＮＲ培地で３０℃終夜培養した後、１０％スクロースを添加したＮＲ培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ上のｓａｃＢにコードされるレヴァンスクラーゼはスクロースを基質にして細胞内に毒性多糖を蓄積する。このため、１０％スクロース添加培地においてはプラスミド領域が脱離した株（ポップアウト株）のみが生育することができる。これらのコロニーの中から染色体上にｐｈａＣNSDGが挿入されたクローンをＰＣＲ法によって選抜し、これをクプリアヴィダス・ネカトールＮＳＤＧ株とした。ＮＳＤＧ株は、以下の遺伝子組換えにおいて適宜、宿主として使用した。【００５９】
実施例５  ｐｈａＡCn−ｐｈａＢ１Cn破壊用ベクター（Ｈ１６ＣAc株用）の作製
クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型に、下記の配列３及び配列４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＢ１Cn下流の転写制御因子遺伝子（ｐｈａＲ）を含む１０４１ｂｐの遺伝子領域を増幅した。
配列３：ＴＣＧＡＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＣＴＴＣＴＣ（配列番号７）
配列４：ＧＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＴＣＴＴＡＣＴＴＣＴ（配列番号８）（下線部はＳｐｈＩ制限酵素サイト）【００６０】
ＰＣＲはＫＯＤプラス（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で１分１５秒の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。増幅した断片はＤＮＡ精製キット（プロメガ社製）にて精製した。その後、Ｔ４キナーゼ（トーヨーボー社製）により５’−末端をリン酸化し、ＨｉｎｃＩＩ及びアルカリホスファターゼ処理を施したｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結した。さらに作製したプラスミドをＮｄｅＩとＳｐｈＩで切断し、ｐｈａＢ１Cn下流を含む遺伝子領域を含む遺伝子領域を単離した。また、組換えｐｈａオペロン（プロモーター領域−ｐｈａＣAc−ｐｈａＡCn−ｐｈａＢ１Cn）をｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入したｐＫ１８Ｃ’ＡＢ（Ｍｉｆｕｎｅ，Ｊ．ら、上述）をＮｄｅＩとＳｐｈＩで切断し、ｐｈａＡCn−ｐｈａＢ１Cn領域を除去した。上述のｐｈａＢ１Cn下流を含む遺伝子領域を連結することで、プロモーター領域−ｐｈａＣAc−ｐｈａＲを持つｐＫ１８ｍｓＣ’Ｒを得た。さらに、ｐＫ１８ｍｓＣ’ＲをＥｃｏＲＩ及びＣｓｐ４５Ｉで切断して、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ（トーヨーボー社製）により末端を平滑化した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈによるセルフライゲーションを行うことで、プロモーター領域とｐｈａＣAcの一部を除去することでｐｈａＡCn−ｐｈａＢ１Cnを挟む２つの相同領域の長さを調節したｐＫ１８ｍｓＣ’ＲΔＰを得た。【００６１】
実施例６  ｐｈａＡCn−ｐｈａＢ１Cn破壊用ベクター（ＮＳＤＧ株用）の作製
ｐＫ１８ＮＳＤＧ−ＡＢをＮｄｅＩとＳｐｈＩで切断し、上述のｐｈａＢ１Cn下流を含む遺伝子領域を連結することでプロモーター領域−ｐｈａＣNSDG−ｐｈａＲを含むｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−Ｒを得た。さらに、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＲをＥｃｏＲＩ及びＣｓｐ４５Ｉで切断し、次いで、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈにより末端を平滑化した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈによるセルフライゲーションを行うことで、プロモーター領域とｐｈａＣAcの一部を除去することでｐｈａＡCn−ｐｈａＢ１Cnを挟む２つの相同領域の長さを調節したｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧＲΔＰを得た。【００６２】
実施例７  ｐｈａＢ１破壊用ベクターの作製
ｐＴＡ２ＮＳＤＧ−ＡＢを鋳型とし、下記の配列５及び配列６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＡCnを含む遺伝子領域を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤプラスを用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で１分２０分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
配列５：ＣＧＣＣＧＣＡＴＧＡＣＧＣＴＴＧＣＡＴＡ（配列番号９）
配列６：ＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣ（配列番号１０）（下線はＮｄｅＩ制限酵素サイト）【００６３】
その後、Ｔ４キナーゼにより５’−末端をリン酸化し、ＨｉｎｃＩＩ及びアルカリホスファターゼ処理を施したｐＵＣ１１８とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結した。得られたプラスミドをＮｄｅＩで切断し、ｐｈａＡCnを含む遺伝子領域を単離した。また、ｐＫ１８ｍｓＣ’ＲをＮｄｅＩで切断し、アルカリホスファターゼ処理により５’−末端を脱リン酸化した。得られた断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈで連結することでプロモーター領域−ｐｈａＣNSDG−ｐｈａＡCn−ｐｈａＲを有するｐＫ１８ｍｓＣ’ＡＲを得た。さらに、ｐＫ１８ｍｓＣ’ＡＲをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断し、プロモーター領域及びｐｈａＣNSDG領域を除去した。次いで、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈにより末端を平滑化した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈによるセルフライゲーションを行い、ｐＫ１８ｍｓＡＲを得た。【００６４】
実施例８  ｐｈａＡCn破壊用ベクター（Ｈ１６ＣAc株用）の作製
ｐＴＡ２ＮＳＤＧ−ＡＢを鋳型とし、下記の配列７及び配列８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＢ１Cnを含む遺伝子領域を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤプラスを用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で１分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。
配列７：ＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＴＧＧＣＧＣＧＧＡ（配列番号１１）（下線はＮｄｅＩ制限酵素サイト）
配列８：ＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＣＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＡＣＴＡＡＧ（配列番号１２）（下線はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）【００６５】
その後、Ｔ４キナーゼにより５’−末端をリン酸化し、ＨｉｎｃＩＩ及びアルカリホスファターゼ処理を施したｐＵＣ１１８（トーヨーボー社製）とをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結した。さらに作製したプラスミドをＮｄｅＩで切断し、ｐｈａＢ１Cnを含む遺伝子領域を含む遺伝子領域を単離した。また、ｐＫ１８ｍｓＣ’ＲをＮｄｅＩで切断し、アルカリホスファターゼ処理により５’−末端を脱リン酸化した。得られた断片を連結することでプロモーター領域−ｐｈａＣNSDG−ｐｈａＢ１Cn−ｐｈａＲを有するｐＫ１８ｍｓＣ‘ＢＲを得た。【００６６】
実施例９  ｐｈａＡCn破壊用ベクター（ＮＳＤＧ株用）の作製
ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−Ｒ（実施例６）をＮｄｅＩにより切断し、上述（実施例８）で得たｐｈａＢ１断片を連結することでプロモーター領域−ｐｈａＣNSDG−ｐｈａＢ１Cn−ｐｈａＲを有するｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＢＲを得た。【００６７】
実施例１０  アエロモナス・キャビエ由来Ｒ−ヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪAc）導入用ベクターの作製
クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型にし、下記の配列９及び配列１０のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＡCnの上流（ｐｈａＣNSDGの一部を含む）１ｋｂｐの遺伝子領域を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤプラスを用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で１分１０秒の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。また、配列１１及び配列１２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐｈａＢ１Cnを含むｐｈａＡCnの下流約１ｋｂｐの遺伝子領域を上記と同様のＰＣＲ条件で増幅した。得られた２つ遺伝子断片をＤＮＡ精製キットで精製し、それぞれ１００ｎｇずつ混合した溶液を鋳型としたフュージョンＰＣＲを行った。２つの断片は末端が配列１０及び配列１１に設計した２６ｂｐの相補的配列によって相補的になっている。プライマーを添加しないＰＣＲ反応（９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で２分１０秒の反応を１サイクルとしてこれを１０サイクル）を行った後、配列９及び配列１２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして加え、さらにＫＯＤプラスを０．５μｌを追加した後、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で２分１０秒の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。【００６８】
配列９：ＴＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＧＴＣＧＣＣＴ（配列番号１３）（下線部はＥｃｏＲＩ制限酵素サイト）
配列１０：ＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＣＧＡＡＧＣＧＴＣＡＴＧＣＧＧＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧ（配列番号１４）（下線部はＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ−Ｃｓｐ４５Ｉ、ヌクレオチド１−２６は配列１１との相補的配列）
配列１１：ＡＣＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＧＡＴＡＡＣＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＡＡＧＧ（配列番号１５）（下線部はＣｓｐ４５Ｉ−ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ、ヌクレオチド１−２６は配列１０との相補的配列）
配列１２：ＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＧＣＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＡＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧ（配列番号１６）（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）【００６９】
ｐｈａＡCnの上下流１ｋｂｐが連結した２ｋｂｐの遺伝子断片をアガロースゲルから切り出してＤＮＡ精製キットにより精製し、さらにＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した。また、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アルカリホスファターゼ処理により５’−脱リン酸化を行った。これらの断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結することでｐｈａＣNSDGの一部とｐｈａＢ１Cnが連結した遺伝子領域を持つｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−Ｂを得た。【００７０】
その後、ｐＥＥ３２（Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９７），，１７９：４８２１）を鋳型として、下記の配列１３及び配列１４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってアエロモナス・キャビエ由来のＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪAc）を増幅した。
配列１３：ＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＣＣＧＣＡＴＧＡＧＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＡＧＧＣＣＡＧＡ（配列番号１７）（下線部はＳｂｆＩ、ヌクレオチド１４−１９はＣｓｐ４５Ｉ制限酵素サイト）
配列１４：ＣＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＣＡＣＧＧＣＴＴ（配列番号１８）（下線部はＳｂｆＩ、ヌクレオチド１５−２０はＸｂａＩ制限酵素サイト）【００７１】
得られた遺伝子断片をＳｂｆＩで切断し、イソプロパノール沈殿により精製した。またｐＴＡ２ＮＳＤＧ−ＡＢ（実施例３に記述）をＳｂｆＩで切断し、アルカリホスファターゼ処理により５’−脱リン酸化を行った後に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ＨｉｇｈによりｐｈａＪ断片と連結し、ｐＴＡ２−ＮＳＤＧ−ＪＡＢを得た。ｐＴＡ２−ＮＳＤＧ−ＪＡＢをＢａｍＨＩで切断し、ｐｈａＣNSDGの一部−ｐｈａＪAc−ｐｈａＡCn−ｐｈａＢ１Cnを含む５．４ｋｂｐの断片をｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢのＢａｍＨＩサイトに連結することによりｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪＡＢとした。【００７２】
実施例１１  ｐｈａＡCn欠失及びｐｈａＪAc導入用ベクターの作製
実施例１０で得られたｐｈａＪAc断片をＣｓｐ４５ＩとＸｂａＩで切断し、イソプロパノール沈殿により精製した。この断片をＣｓｐ４５ＩとＸｂａＩで切断したｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＢとＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結することで、ｐｈａＣNSDGの一部とｐｈａＪAc及びｐｈａＢ１Cnが連結した遺伝子断片を持つｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪＢを得た。【００７３】
実施例１２  ｐｈａＡCn欠失及びｂｋｔＢCn導入用ベクターの作製
クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型に、下記の配列１５及び配列１６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｂｋｔＢCn遺伝子領域を増幅した。
配列１５：ＴＡＣＡＴＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＡＴＧＡＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＡ（配列番号１９）（下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）
配列１６：ＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＧＡＴＡＣＧＣＴＣＧＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧ（配列番号２０）（下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）【００７４】
ＰＣＲはＫＯＤプラス（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で１分１５秒の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。増幅した断片はＤＮＡ精製キットにて精製した。その後、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断し、イソプロパノール沈殿により精製した。またｐＫ１８ＮＳＤＧ−Ｂ（実施例１０）をＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断し、アルカリホスファターゼ処理を施した。２つの断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結し、ｐｈａＣNSDGの一部−ｂｋｔＢCn−ｐｈａＢ１Cnを持つｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ｂＢを得た。【００７５】
実施例１３  ｐｈａＡCn欠失及びｐｈａＪAc・ｂｋｔＢCn導入用ベクターの作製
ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪＢ（実施例１１）をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐｈａＪAc−ｐｈａＢ１Cnを含む遺伝子断片を単離した。また、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ｂＢ（実施例１２）をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ベクター領域を含む遺伝子断片をアガロースゲルから切り出し、精製した。２つの断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結し、ｐｈａＣNSDGの一部−ｐｈａＪAc−ｂｋｔＢCn−ｐｈａＢ１Cnを持つｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪｂＢを得た。【００７６】
実施例１４  相同性組換え株の作製
実施例１３で作製した相同性組換え用プラスミドを用いて、実施例４と同様の手法によりクプリアヴィダス・ネカトール株を接合伝達により形質転換し、その後、目的とする組換えが生じたクローンをＰＣＲ法によって選抜した。すなわち、Ｈ１６ＣAc株を宿主とし、ｐＫ１８ｍｓＣ’ＢＲ（実施例８）、ｐＫ１８ＡＲ（実施例７）、ｐＫ１８ｍｓＣ’ＲΔＰ（実施例５）を用いてｐｈａＡCn、ｐｈａＢ１Cn、ｐｈａＡCn−ｐｈａＢ１Cnを破壊したＨ１６ＣAcΔＡ株、Ｈ１６ＣAcΔＢ株、Ｈ１６ＣAcΔＡＢ株を作製した。また、ＮＳＤＧ株を宿主とし、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＢＲ（実施例９）、ｐＫ１８ｍｓＡＲ（実施例７）、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＲΔＰ（実施例６）を用いてｐｈａＡCn、ｐｈａＢ１Cn、ｐｈａＡCn−ｐｈａＢ１Cnを破壊したＮＳＤＧΔＡ株、ＮＳＤＧΔＢ株、ＮＳＤＧΔＡＢ株を作製した。またｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ｂＢ（実施例１２）を用いてｐｈａＡCnをｂｋｔＢCnに置換したＭＦ０１株、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪＡＢを用いてｐｈａＣNSDGとｐｈａＡCnの間にｐｈａＪAcを挿入したＭＦ０２株（実施例１０）、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪＢを用いてｐｈａＡCnをｐｈａＪAcに置換したＭＦ０３株（実施例１１）、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪｂＢ（実施例１３）を用いてｐｈａＡCnをｐｈａＪAc−ｂｋｔＢCnに置換したＭＦ０４株を作製した（図２参照）。【００７７】
実施例１５  遺伝子発現用プラスミドの作製
クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型にし、下記の配列１７及び配列１８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってＰＨＡ顆粒結合タンパク質遺伝子（ｐｈａＰCn）の上流領域０．５ｋｂｐの遺伝子領域（ＰｈａＰプロモーター領域）を増幅した。
配列１７：ＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＣＡＣＧＴＣＴＴＴＧＴＴＡＧＴＴＣＣ（配列番号２１）（下線部はＢｇｌＩＩ−ＳｓｐＩ制限酵素サイト）
配列１８：ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＧＴＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＣＡＡＧ（配列番号２２）（下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）【００７８】
ＰＣＲはＫＯＤプラスを用い、９８℃で２０秒、６５℃で１５秒、６８℃で３０秒の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。増幅した断片はＤＮＡ精製キットにて精製し、その後Ｔ４キナーゼにより５’−末端をリン酸化し、ＨｉｎｃＩＩ及びアルカリホスファターゼ処理を施したｐＵＣ１１８とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結した。さらに作製したプラスミドをＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで切断し、ＰｈａＰプロモーター領域のＤＮＡ断片を単離した。また、プラスミドｐＢＡＤ２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ８１８３７）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断してＢＡＤプロモーター領域を除去し、アルカリホスファターゼ処理を施した断片と上述のＰｈａＰプロモーター領域をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結した。得られたプラスミド制限酵素ＳｓｐＩで切断することｐｈａＰプロモーター領域、マルチクローニングサイト、ｒｒｎＢターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を単離した。また、多くのグラム陰性菌で自律複製することが知られている広宿主域ベクターｐＢＢＲ１−ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ２３７５１）を制限酵素ＳｓｐＩで切断し、複製起点等を含むＤＮＡ断片を単離して脱リン酸化処理を行った後に、上述のｐｈａＰプロモーター領域を含むＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結することで、発現用プラスミドｐＢＢＲＰＰを作製した。【００７９】
実施例１６  クプリアヴィダス・ネカトール由来Ｒ体特異的−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子（ｐｈａＪ１、ｐｈａＪ２、ｐｈａＪ３）のクローニング
既知のＲ体特異的−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼとの相同性検索から、クプリアヴィダス・ネカトールにおける推定Ｒ体特異的−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子としてｐｈａＪ１（配列番号２）、ｐｈａＪ２（配列番号３）、ｐｈａＪ３を同定した。次にクプリアヴィダス・ネカトールのゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記の配列１９及び配列２０のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＪ１を増幅した。また同様に配列２１、配列２２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＪ２を増幅した。さらに同様に配列２３、配列２４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＪ３を増幅した。ＰＣＲはＫＯＤプラス（トーヨーボー社製）を用い、９８℃で２０秒、６１℃で１５秒、６８℃で２分の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。【００８０】
配列１９：ＴＣＣＡＴＡＴＧＣＧＴＡＣＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＣＴＧ（配列番号２３）（下線部はＮｄｅＩ制限酵素サイト）
配列２０：ＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＣＧＴＡＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＡ（配列番号２４）（下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）
配列２１：ＣＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣ（配列番号２５）（下線部はＮｄｅＩ制限酵素サイト）
配列２２：ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＧＣＡＧＧＡ（配列番号２６）（下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）
配列２３：ＣＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＧＴＴＣＴ（配列番号２７）（下線部はＮｄｅＩ制限酵素サイト）
配列２４：ＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＧＣＧＧＣＴＧ（配列番号２８）（下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）【００８１】
増幅した断片はＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断し、ＮｄｅＩ及びＳａｌＩで切断した発現ベクターｐＢＢＲＰＰ（実施例１５）とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結することで、クプリアヴィダス・ネカトール由来ｐｈａＪ１、ｐｈａＪ２、ｐｈａＪ３の発現ベクター、ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ１、ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ２、ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ３を得た。【００８２】
実施例１７  クプリアヴィダス・ネカトール由来ｐｈａＪ発現株の作製
上述の（Ｒ）−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子を含む発現ベクターをクプリアヴィダス用いて、クプリアヴィダス・ネカトールＨ１６ＣAc株又はＮＳＤＧΔ株（実施例１４）を接合伝達により形質転換した。まず、塩化カルシウム法によって、ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ１、ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ２、あるいはｐＢＢＲ−ｐｈａＪ３を大腸菌Ｓ１７−１株に導入した。次に、この組換え大腸菌をＬＢ培地（１％トリプトン、１％塩化ナトリウム、０．５％イーストエキス、ｐＨ７．２）３．０ｍｌ中で３７℃終夜培養した。これと並行して、クプリアヴィダス・ネカトール株をＮＲ培地（１％魚肉エキス、１％ポリペプトン、０．２％イーストエキス）３．０ｍｌ中で３０℃終夜培養した。その後、大腸菌の培養液０．２ｍｌに対して、クプリアヴィダス・ネカトール株の培養液０．１ｍｌを混合し、３０℃で６時間培養した。この菌体混合液を０．２ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＳｉｍｍｏｎｓ  Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地（ディフコ社製）に塗布し、３０℃で３日間培養した。組換え大腸菌のプラスミドがクプリアヴィダス・ネカトールに伝達され、保持される該菌体はカナマイシン耐性を示し、一方、組換え大腸菌はＳｉｍｍｏｎｓ  Ｃｉｔｒａｔｅ寒天培地では増殖不能であるため、上記培地上で増殖したコロニーはクプリアヴィダス・ネカトール形質転換体である。ＰＣＲによるベクターの保持を確認することでＨ１６ＣAc／ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ１株、Ｈ１６ＣAc／ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ２株、Ｈ１６ＣAc／ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ３株、ＮＳＤＧΔＡ／ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ１株、ＮＳＤＧΔＡ／ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ２株、ＮＳＤＧΔＡ／ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ３株をそれぞれ単離した。【００８３】
実施例１８  クプリアヴィダス・ネカトール組換え株による共重合ポリエステル合成
ＮＲ培地（前述）で前培養したクプリアヴィダス・ネカトール組換え株を１００ｍｌのＭＢ培地（０．９％リン酸水素二ナトリウム１２水和物、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．０５％塩化アンモニウム、１％微量金属溶液）に植菌し、坂口フラスコ中、３０℃で７２時間振とう培養した。炭素源として１％大豆油を用いた。発現ベクターｐＢＢＲ−ｐｈａＪ１、ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ２、あるいはｐＢＢＲ−ｐｈａＪ３を保持する組換え株においては、培地中に０．１ｍｇ／ｍｌカナマイシンを添加した。培養終了後に遠心分離によって菌体を回収し、付着した油分を除くために７０％エタノールで洗浄したのち、蒸留水で洗浄した。得られた菌体は凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。【００８４】
乾燥菌体１０〜３０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することにより、菌体内ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。これに１ｍｌの蒸留水を添加して激しく攪拌した。静置して二層に分離させた後、下層の有機層を取り出した。有機層０．５ｍｌをキャピラリーガラスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所製ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＩｎｅｒｔＣａｐ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃から８℃／分の速度で昇温した。得られた結果を下記の表１及び２に示す。【００８５】
【表１】
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【００８６】
【表２】
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【００８７】
ｐｈａＪAc遺伝子を染色体に導入した株はいずれも高い乾燥菌体重量、高いＰＨＡ蓄積率を維持しつつ、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）中の３ＨＨｘ分率が有意に向上していた。特にＭＦ０３株で合成されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）中の３ＨＨｘ分率は９．２ｍｏｌ％に達しており、実用化に十分な柔軟性を備えていることが期待できる。また、クプリアヴィダス・ネカトール由来ｐｈａＪを自律複製ベクターを用いて導入した場合では乾燥菌体重量やＰＨＡ蓄積率がやや減少する傾向が見られたものの、すべての宿主株においてｐｈａＪ１遺伝子又はｐｈａＪ２遺伝子の導入によってＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ）中の３ＨＨｘ分率が増加した。特に、ＮＳＤＧΔＡ株を宿主としてｐｈａＪ１遺伝子又はｐｈａＪ２遺伝子を導入した株では３ＨＨｘ分率は７．７〜８．９ｍｏｌ％に達しており、実用化に十分な柔軟性を備えていることが期待できる。ｐｈａＪ３遺伝子導入株では明らかな効果は見られなかった。【００８８】
実施例１９  ｐｈａＪ１、ｐｈａＪ２導入用ベクターの作製
ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ１（実施例１６）を鋳型に、配列２５及び配列２６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＪ１断片を増幅した。また、ｐＢＢＲ−ｐｈａＪ２（実施例１６）を鋳型に、配列２７及び配列２８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法によってｐｈａＪ２断片を増幅した。【００８９】
配列２５：ＴＴＧＡＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＧＴＡＣＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＣ（配列番号２９）（下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）
配列２６：ＧＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＡＡＣＴＡＧＴＴＧＣＡＧＣＴＣＧＡＣＴＣＡＣＣＣＧＴＡＧ（配列番号３０）（下線部はＳｐｅＩ制限酵素サイト）
配列２７：ＧＡＣＣＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴ（配列番号３１）（下線部はＸｂａＩ制限酵素サイト）
配列２８：ＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＧＣＡＧＧＡＴ（配列番号３２）（下線部はＳｐｅＩ制限酵素サイト）【００９０】
ＰＣＲはＫＯＤプラス（東洋紡）を用い、９８℃で２０秒、６０℃で２０秒、６８℃で５０秒の反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。増幅した断片はＤＮＡ精製キットにて精製した。その後、Ｔ４キナーゼにより５’−末端をリン酸化し、ＨｉｎｃＩＩ及びアルカリホスファターゼ処理を施したｐＵＣ１１８とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈにより連結した。さらに作製したプラスミドをＸｂａＩとＳｐｅＩで切断し、ｐｈａＪ１及びｐｈａＪ２断片を含む遺伝子領域を単離した。また、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−Ｂ（実施例１０）をＸｂａＩで切断後、脱リン酸処理を施し、上述のｐｈａＪ１断片、ｐｈａＪ２断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈによるライゲーションを行った。ｐｈａＣNSDGとｐｈａＪ１、ｐｈａＪ２の方向が同じものを選抜し、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−Ｊ１Ｂ及びｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−Ｊ２Ｂとした。【００９１】
また同様に、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪＢ（実施例１１）をＸｂａＩで切断後、脱リン酸処理を施し、上述のｐｈａＪ１断片、ｐｈａＪ２断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈによるライゲーションを行った。ｐｈａＣNSDGとｐｈａＪ１、ｐｈａＪ２の方向が同じものを選抜し、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪＡｃＪ１Ｂ及びｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪＡｃＪ２Ｂとした。【００９２】
実施例２０  相同性組換え株の作製
上述の実施例で作製した相同性組換え用プラスミドを用いて、実施例４と同様の手法によりクプリアヴィダス・ネカトール株を接合伝達により形質転換し、その後、目的とする組換えが生じたクローンをＰＣＲ法によって選抜した。すなわち、ＮＳＤＧ株を宿主とし、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−Ｊ１Ｂ（実施例１９）を用いてｐｈａＡをｐｈａＪ１に置換したＮＳＤＧΔＡ−Ｊ１株、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪＡｃＪ１Ｂ（実施例１９）を用いてｐｈａＡをｐｈａＪＡｃ−ｐｈａＪ１に置換したＭＦ０３−Ｊ１株、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−Ｊ２Ｂ（実施例１９）を用いてｐｈａＡをｐｈａＪ２に置換したＮＳＤＧΔＡ−Ｊ２株を、ｐＫ１８ｍｓＮＳＤＧ−ＪＡｃＪ２Ｂ（実施例１９）を用いてｐｈａＡをｐｈａＪＡｃ−ｐｈａＪ２に置換したＭＦ０３−Ｊ２株を作製した。各株の遺伝子配置構造を図３に示す。【００９３】
実施例２１  クプリアヴィダス・ネカトール組換え株による共重合ポリエステル合成
実施例２０で作製したクプリアヴィダス・ネカトール組換え株による共重合ポリエステル合成を実施例１８と同様の方法により行った。結果を表３に示す。ＮＳＤＧΔＡ−Ｊ１株、ＮＳＤＧΔＡ−Ｊ２株では、コントロールであるＮＳＤＧΔＡ株と比較してＰＨＡ生産量を低下することなく３ＨＨｘ分率が３．２ｍｏｌ％から７．３〜８．０ｍｏｌ％に向上した。この３ＨＨｘ分率は、アエロモナス・キャビエ由来の（Ｒ）−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子ｐｈａＪＡｃを相同性組換えにより導入したＭＦ０３株（実施例１４）での分率と比較すると、やや低かった。一方、ｐｈａＪをｐｈａＪ１又はｐｈａＪ２とをタンデムに配置したＭＦ０３−Ｊ１株、ＭＦ０３−Ｊ２株（図３参照）では、高いＰＨＡ生産量を維持しつつ３ＨＨｘ分率が１０．２〜１０．５ｍｏｌ％に改善された。【００９４】
【表３】
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【００９５】
実施例２２  クプリアヴィダス・ネカトール由来Ｒ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの機能解析
実施例１６において増幅し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断したｐｈａＪ１、ｐｈａＪ２、ｐｈａＪ３の各断片を、それぞれＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで切断した発現プラスミドｐＣＯＬＤＩＩ（タカラバイオ社製）に挿入した。得られたプラスミドをｐＣＯＬＤ−Ｊ１、ｐＣＯＬＤ−Ｊ２、ｐＣＯＬＤ−Ｊ３とした。これらの発現プラスミドは、アミノ末端側にヒスチジン６残基からなるタグ配列（以下、Ｈｉｓタグとする）が付加された組換え型タンパク質が生産されるように構築されている。ｐＣＯＬＤ−Ｊ１、ｐＣＯＬＤ−Ｊ２、ｐＣＯＬＤ−Ｊ３を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した。得られたそれぞれの形質転換体を１００ｍｇのアンピシリンを含む１００ｍＬのＬＢ培地で３７℃、４時間培養し、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．５ｍＭとなるように添加して発現を誘導し、さらに１５℃で２４時間、培養した。菌体を遠心分離によって回収した後、３０ｍＭイミダゾールと５００ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で再懸濁し、超音波破砕、遠心分離によって可溶性タンパク画分を得た。【００９６】
この可溶性タンパク質画分を孔径０．２２μｍのフィルターでろ過した。次いで３０ｍＭイミダゾールと５００ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）であらかじめ平衡化したＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ  ｃｒｕｄｅカラム（１ｍｌ）（ＧＥヘスケア社製）に供してＨｉｓタグを有するタンパク質を吸着させた。その後、イミダゾール濃度を３０ｍＭから５００ｍＭに直線的に増加させることにより吸着タンパク質を溶出させ、回収して精製酵素とした。【００９７】
クプリアヴィダス・ネカトール由来の３つの遺伝子ｐｈａＪ１、ｐｈａＪ２、ｐｈａＪ３から発現したタンパク質を、以下では、それぞれＰｈａＪ１、ＰｈａＪ２、ＰｈａＪ３とする。大腸菌で生産させたそれぞれの組換え型タンパク質の精製標品について、クロトニル−ＣｏＡ（炭素数４）、２−ヘキセノイル−ＣｏＡ（炭素数６）、２−オクテノイル−ＣｏＡ（炭素数８）を基質としたエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性測定を非特許文献４に記載の方法に従って行った。すなわち、基質を含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に精製酵素を添加し（総体積４００μｌ）、２６３ｎｍにおける吸光度減少を分光光度計により測定した。その際、基質濃度を変化させて得た測定値をラインウェーバー・バークプロットによって解析することで、ミカエリス定数Ｋｍと最大速度Ｖｍａｘを算出した。結果を表４に示す。この結果から、ＰｈａＪ１、ＰｈａＪ２、ＰｈａＪ３ともに、基質鎖長が長いほど高い触媒効率を示すエノイル−ＣｏＡヒドラターゼであることを明らかにした。【００９８】
【表４】
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【００９９】
上記のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性測定では、二重結合への水付加における立体選択性については知見が得られない。そこで、ＰｈａＪ１、ＰｈａＪ２、ＰｈａＪ３による水和反応の立体特異性について以下のように検討した。ＰＨＡを蓄積したクプリアヴィダス・ネカトールの菌体からは、水不溶性のＰＨＡ顆粒画分を調製できるが、このＰＨＡ顆粒の表面にはＰＨＡ合成シンターゼが結合している。このＰＨＡシンターゼは（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを特異的に重合し、ＣｏＡ−ＳＨを遊離させる。すなわち、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性測定の反応溶液にＰＨＡ顆粒画分と５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を共存させると、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの特異性がＲ体特異的であれば、ＰＨＡシンターゼによる重合に伴って遊離したＣｏＡ−ＳＨがＤＴＮＢと反応して４１２ｎｍに特異的な吸収を有する黄色色素が生成する。逆にエノイル−ＣｏＡヒドラターゼがＳ体特異的であれば、黄色色素は生成しない。【０１００】
測定は非特許文献４に記載の方法に従って行った。すなわち、ＰＨＡ顆粒画分はクプリアヴィダス・ネカトール野生株（Ｈ１６株）を実施例１８に記載の方法でフルクトースを炭素源とした１００ｍｌの培地により３６時間培養した菌体から調製した。培養液から遠心分離によって集菌し、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍＬに懸濁して超音波破砕した。破砕液を１，５００ｘｇ、５分間の低速遠心分離で得られた上清について、さらに１５，０００ｘｇ、１５分間の高速遠心分離を行い、その沈殿画分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍＬに懸濁してＰＨＡ顆粒画分とした。次に、０．２ｍＭクロトニル−ＣｏＡ、１ｍＭ  ＤＴＮＢ、５μｌＰＨＡ顆粒画分を含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に精製酵素を添加し（総体積４００μｌ）、４１２ｎｍにおける吸光度増加を測定した。その結果、図４に示すように、ＰｈａＪ１、ＰｈａＪ２、ＰｈａＪ３を加えた場合では４１２ｎｍの吸光度増加が観察された。この結果から、ＰｈａＪ１、ＰｈａＪ２、ＰｈａＪ３は全てＲ体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼであることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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