(57)【要約】  本発明は、癌に対する抗癌剤の治療効果の簡便な判定を実現することを可能にする。具体的には、本発明は、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む、癌に対する抗癌剤の効果の診断用マーカー；ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質、およびｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントを含む、癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬；（ａ）被験体由来の生体サンプル中のｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程、および（ｂ）測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程を含む、癌に対する抗癌剤の効果の試験方法を提供する。
2011125458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む、癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬。
【請求項２】
ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに対する抗体である、請求項１記載の診断試薬。
【請求項３】
抗癌剤が肺癌に対する抗癌剤である、請求項１または２記載の診断試薬。
【請求項４】
抗癌剤の効果がｃ−ＭＥＴ阻害剤に対する感受性である、請求項１〜３のいずれか一項記載の診断試薬。
【請求項５】
抗癌剤の効果が抗癌剤に対する耐性である、請求項１〜３のいずれか一項記載の診断試薬。
【請求項６】
抗癌剤がＥＧＦＲ阻害剤である、請求項５記載の診断試薬。
【請求項７】
ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質、およびｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントを含む、癌に対する抗癌剤の効果の診断キット。
【請求項８】
以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、癌に対する抗癌剤の効果の試験方法：
（ａ）被験体由来の生体サンプル中のｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程；および
（ｂ）測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤の効果の診断試薬およびキット、ならびに抗癌剤の効果の試験方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の抗癌剤に対する感受性および耐性の診断は、特定の癌患者に対してより有効な特定の抗癌剤を選択するために、重要である。したがって、特定の抗癌剤に対する感受性および耐性を診断し得るバイオマーカーが、活発に探索されている。このような抗癌剤としては、例えば、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤が挙げられる。【０００３】
（１）ｃ−ＭＥＴ阻害剤
癌遺伝子の一つであるｃ−ＭＥＴ（受容体型チロシンキナーゼ）を阻害することにより所定の癌の増殖を阻害することが可能であることが示されており（非特許文献１）、抗癌剤としてのｃ−ＭＥＴ阻害剤の開発が進められている。ｃ−ＭＥＴ阻害剤による治療が有効であるｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性である癌については、今のところ不明な点も多いが、ｃ−ＭＥＴ遺伝子の過剰な活性化に起因する癌（例、ｃ−ＭＥＴ遺伝子の増幅または変異等に起因する癌）が、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性である癌の有力な候補である。【０００４】
（２）ＥＧＦＲ阻害剤
ＥＧＦＲ阻害剤（例、ゲフィチニブ）等の分子標的薬による癌の治療において、治療当初に治療効果が認められた癌が、長期治療により分子標的薬に耐性を示し治療効果を失う事象が問題となっている。この事象の原因の一つとして、ｃ−ＭＥＴ遺伝子の増幅が考えられること（ゲフィチニブ獲得耐性肺癌の約２０％においてｃ−ＭＥＴ遺伝子の増幅が確認されたこと）が報告されている（非特許文献２）。また、ｃ−ＭＥＴ遺伝子の増幅が認められる癌が、ＥＧＦＲ阻害剤およびｃ−ＭＥＴ阻害剤の同時併用により治療可能であることが報告されている（非特許文献２）。【０００５】
ところで、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性である癌、ＥＧＦＲ阻害剤に耐性である癌を選択し得る方法としては、ｃ−ＭＥＴ遺伝子の増幅を測定する方法がある。ｃ−ＭＥＴ遺伝子の増幅を測定する方法としては、遺伝子増幅を直接的に検出可能なＦＩＳＨ法が知られているが、ＦＩＳＨ法は、癌細胞の処理および遺伝子増幅の検出という煩雑な工程を要し、また、自動化が難しいという問題があり、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に対する感受性、ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性を簡便に診断し得る方法の開発が期待される。【０００６】
なお、ｃ−ＭＥＴ遺伝子については、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメント（分泌型ｃ−ＭＥＴ）を放出する現象である外部ドメイン排出（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  Ｓｈｅｄｄｉｎｇ）が、報告されている（特許文献１）。また、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントが癌に対するバイオマーカーとして使用し得ること（特許文献２）、および外部ドメイン排出が癌の悪性度と関連し得ること（非特許文献３）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ  ２００７０３７２０９（Ａ１）
【特許文献２】ＷＯ２００７／０５６５２３
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：２０８１−２０８８．
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１６：１０３９−１０４３．
【非特許文献３】Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；１２：４１５４−４１６２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、癌に対する抗癌剤の治療効果の簡便な判定を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントが、抗癌剤に感受性または耐性の癌に対する特異的なバイオマーカーとして利用できることを見出した。したがって、本発明者らは、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定することにより、癌に対する抗癌剤の治療効果を簡便に判定し得ることを着想し、本願発明を完成するに至った。上述した先行技術は、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントが癌に対する抗癌剤の治療効果（例、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に対する感受性、ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性）を判定するバイオマーカーとして使用できることを記載も示唆もしていない。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む、癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬。
〔２〕ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに対する抗体である、上記〔１〕の診断試薬。
〔３〕抗癌剤が肺癌に対する抗癌剤である、上記〔１〕または〔２〕の診断試薬。
〔４〕抗癌剤の効果がｃ−ＭＥＴ阻害剤に対する感受性である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかの診断試薬。
〔５〕抗癌剤の効果が抗癌剤に対する耐性である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかの診断試薬。
〔６〕抗癌剤がＥＧＦＲ阻害剤である、上記〔５〕の診断試薬。
〔７〕ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質、およびｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントを含む、癌に対する抗癌剤の効果の診断キット。
〔８〕以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、癌に対する抗癌剤の効果の試験方法：
（ａ）被験体由来の生体サンプル中のｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程；および
（ｂ）測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、癌に対する抗癌剤（例、ｃ−ＭＥＴ阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤等の分子標的薬）の治療効果を簡便に判定でき、また、癌に対する抗癌剤の治療効果を簡便にモニタリングできる。
また、本発明によれば、抗癌剤に感受性の癌と抗癌剤に耐性の癌との間で測定されるｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度に顕著な差が認められること、ならびにこのような顕著な差に起因して抗癌剤に感受性の癌および抗癌剤に耐性の癌を明確に区別し得ることから、癌に対する抗癌剤の治療効果を判定する上で、信頼性が高い。
さらに、本発明によれば、抗癌剤に感受性または耐性の癌で多量のｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントが認められること、ならびにこのような多量のｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの測定は容易であることから、癌に対する抗癌剤の治療効果を容易に判定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性である癌細胞株Ｈ１９９３の培養上清における、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの特異的な検出を示す図である。略号：ＰｒｏＭＥＴ（未成熟ｃ−ＭＥＴ）；ＭＥＴ（成熟ｃ−ＭＥＴ）；Ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ＭＥＴ／分泌型ＭＥＴ（ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメント）
【図２】図２は、ゲフィチニブ耐性細胞株（Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）の培養上清における、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの特異的な検出を示す図である。略号は、図１と同様である。
【図３】図３は、Ｈ１９９３移植マウスの血清（ＮＣＩ−Ｈ１９９３）中、およびＨ２１７０移植マウスの血清（ＮＣＩ−Ｈ２１７０）中における、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの量を示す図である。
【図４】図４は、Ｈ１９９３移植マウスにおける、血清中のｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの量と、腫瘍の大きさ（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）との相関性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、癌に対する抗癌剤の効果の試験方法を提供する。本発明の試験方法は、診断方法または予測方法であってもよい。
【００１４】
本発明の試験方法は、以下（ａ）および（ｂ）の工程を含み得る：
（ａ）被験体由来の生体サンプル中のｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度を測定する工程；および
（ｂ）測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度を、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較する工程。
【００１５】
ｃ−ＭＥＴは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の受容体であり、ＨＧＦが結合することにより細胞内シグナル伝達を活性化する。ｃ−ＭＥＴは、ｃ−ＭＥＴの前駆体（プロｃ−ＭＥＴ）が切断されることにより生じるα鎖およびβ鎖からなり、ジスルフィド結合により二量体を形成する。ｃ−ＭＥＴは、細胞膜を貫通する受容体であり、α鎖の全体およびβ鎖の一部が細胞外に存在している（例えば、Ｍａｒｋら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，Ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．３６，ｐｐ．２６１６６−２６１７１；医学のあゆみ，２００８，Ｖｏｌ．２２４，Ｎｏ．１，ｐｐ．５１−５５を参照）。また、ヒトｃ−ＭＥＴならびにそのα鎖およびβ鎖については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００２３６．２を参照のこと。
【００１６】
本明細書中で用いられる場合、用語「ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメント」とは、外部ドメイン排出（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  Ｓｈｅｄｄｉｎｇ）により排出されるｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインのポリペプチドまたはそのポリペプチドの分解産物をいう。本明細書では、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントを、分泌型ｃ−ＭＥＴということがある。
【００１７】
上記（ａ）において、被験体としては、癌に罹患している哺乳動物、または癌に罹患している可能性がある哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類、愛玩動物、使役動物が挙げられる。具体的には、哺乳動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、マウス、ラットが挙げられるが、好ましくは、ヒトである。
【００１８】
本明細書中で用いられる場合、用語「癌」とは、ｃ−ＭＥＴ遺伝子の増幅を伴い得る癌をいう。このような癌としては、例えば、肺癌（例、扁平上皮がん、腺がんおよび大細胞がん等の非小細胞癌、ならびに小細胞癌）、消化器系癌（例、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、脳腫瘍、肉腫、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、固形癌、上皮性癌、中皮腫が挙げられる。
【００１９】
好ましい被験体の例は、特定の抗癌剤による治療が検討されている癌患者である。特定の抗癌剤としては、例えば、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤が挙げられる。ｃ−ＭＥＴ阻害剤としては、例えば、ＰＨＡ−６６５７５２、ＳＵ１１２７４、ＸＬ−８８０、ＸＬ−１８４、ＡＲＱ  １９７、ＡＭＧ２０８、ＡＭＧ４５８、ＣＥ−３５５６２１、ＭＰ４７０が挙げられる。ＥＧＦＲ阻害剤としては、例えば、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ラパチニブ（ｌａｐａｔｉｎｉｂ）、ＺＤ６４７４、ＣＬ−３８７７８５、ＨＫＩ−２７２、ＸＬ６４７、ＰＤ１５３０３５、ＣＩ−１０３３、ＡＥＥ７８８、ＢＩＢＷ−２９９２、ＥＫＢ−５６９、ＰＦ−２９９８０４が挙げられる。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＴＡＥ６８４、ＰＦ−２３４１０６６が挙げられる。ＰＤＧＦＲ阻害剤としては、例えば、グリーベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、デサチニブ（Ｄｅｓａｔｉｎｉｂ）、ヴァラチニブ（Ｖａｌａｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）が挙げられる。ｃ−ＫＩＴ阻害剤としては、例えば、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ヴァラチニブ（Ｖａｌａｔｉｎｉｂ）、デサチニブ（Ｄｅｓａｔｉｎｉｂ）、マシチニブ（Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ）、モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）が挙げられる。
【００２０】
好ましい被験体の別の例は、特定の抗癌剤による治療効果がモニタリングされている癌患者である。癌患者はまた、特定の抗癌剤による治療効果の低下が認められた場合に、別の抗癌剤による治療に切り替えるかどうかの判断が求められている患者であってもよい。抗癌剤は、上述した抗癌剤と同様であり得る。
【００２１】
本発明において用いられ得る生体サンプルは、上述の被験体から採取された生体サンプルであり得る。生体サンプルは、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントが存在するサンプルである限り特に限定されず、例えば、血液、尿、唾液、腹水、組織試料、細胞試料、組織抽出液、細胞抽出液が挙げられる。なお、侵襲性の低さの観点からは、上記のうち、血液、尿、唾液が好ましい。必要に応じて、生体サンプルは、測定前に、事前に処理されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、濃縮、分画、細胞固定、組織固定、組織凍結、組織薄片化が挙げられる。
【００２２】
ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度の測定は、例えば、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに対して親和性を有する物質（後述）を用いて行うことができる。測定はまた、免疫学的手法により行なわれてもよい。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法が挙げられる。ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度の測定を可能とする上記以外の方法としては、例えば、ＬＣ−ＭＳが挙げられる。
【００２３】
上記（ｂ）において、測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度が、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度と癌に対する抗癌剤の効果との間の関係を示す基準と比較され得る。基準は、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度の高低と、抗癌剤の効果の強弱（抗癌剤への感受性または耐性）との間の相対的な関係を示すものであり得る。例えば、測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い場合には、ｃ−ＭＥＴ阻害剤の治療効果が高い可能性があり、または他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）の治療効果が低い可能性がある。また、測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い場合には、ｃ−ＭＥＴ阻害剤の治療効果が低い可能性があり、または他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）の治療効果が高い可能性がある。本発明の場合、基準として、特定の基準値を設けてもよい。このような基準値として、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性である患者、または他の抗癌剤に耐性である患者で高い陽性率（基準値以上）を示し、かつ、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に耐性である患者、または他の抗癌剤に感受性である患者で高い陰性率（基準値未満）を示し得る、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度を設定してもよい。このような基準値の例は、カットオフ値である。基準値の算出方法は、本分野において周知である。
【００２４】
本発明によれば、癌患者が、特定の抗癌剤に対して感受性であるのか、または耐性であるのかを判定することができる。このような判定は、例えば、被験体に投与する抗癌剤の決定に有用である。例えば、測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い場合には、癌患者は、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に対して感受性である可能性があり、ｃ−ＭＥＴ阻害剤による治療効果が高い可能性がある。また、この場合には、他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して耐性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が低い可能性がある。一方、測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い場合には、癌患者は、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に対して耐性である可能性があり、ｃ−ＭＥＴ阻害剤による治療効果が低い可能性がある。また、この場合には、他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して感受性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が高い可能性がある。
【００２５】
また、本発明によれば、特定の抗癌剤による治療効果を経時的にモニタリングすることができる。このようなモニタリングは、例えば、特定の抗癌剤による治療効果の低下が認められた場合に、別の抗癌剤による治療に切り替えるかどうかの判断に有用である。例えば、測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に高い状態が維持されている場合には、癌患者は依然として、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に対して感受性である可能性があり、ｃ−ＭＥＴ阻害剤による治療効果が引き続き高い可能性がある。また、この場合には、依然として、他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して耐性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が低い可能性がある。一方、測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度が相対的に低い状態が維持されている場合には、癌患者は依然として、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に対して耐性である可能性があり、ｃ−ＭＥＴ阻害剤による治療効果が引き続き低い可能性がある。また、この場合には、依然として、他の抗癌剤（例、上述したようなＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に対して感受性である可能性があり、当該抗癌剤による治療効果が引き続き高い可能性がある。
【００２６】
本発明の試験方法は、上記（ｂ）の代わりに、（ｂ’）測定されたｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの濃度を指標として、癌に対する抗癌剤の効果を判断する工程を含んでいてもよい。本工程は、上記（ｂ）と同様に行うことができる。本発明の試験方法はまた、このような判断に基づき、投与する抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）を決定する工程、および／または投与する抗癌剤を別の抗癌剤（例、上述したようなｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ｃ−ＫＩＴ阻害剤）に切り替えるか否かを決定する工程を含んでいてもよい。本発明の試験方法はさらに、このような決定に基づき、抗癌剤を投与する工程を含んでいてもよい。
【００２７】
本発明は、癌に対する抗癌剤の効果の診断試薬を提供する。本発明の試薬は、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質を含む。本発明の診断試薬は、キットの形態であってもよい。本発明の診断試薬は、本発明の試験方法を行なうために好適に用いることができる。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、用語「ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質」とは、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに結合する能力を有する物質をいう。ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質は、ｃ−Ｍｅｔのα鎖全体からなるポリペプチドまたはその部分ペプチドに親和性を有する物質、あるいはｃ−Ｍｅｔのβ鎖の細胞外領域からなるポリペプチドまたはその部分ペプチドに親和性を有する物質であり得る。ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質としては、例えば、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに対する抗体、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに対するアプタマー、ならびに肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびｃ−ＭＥＴに結合する能力を保持するＨＧＦ変異体が挙げられる。
【００２９】
ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに対する抗体は、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに特異的に結合し得る抗体である限り特に限定されない。例えば、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。抗体は、プレート等の基板上に固定された形態、またはストリップ等の支持体中に含侵された形態で提供されてもよい。抗体は、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチド（例、α鎖の部分ペプチド、β鎖の細胞外領域の部分ペプチド）を抗原として用いて、自体公知の方法により作製できる。抗原は、ｃ−ＭＥＴのアミノ酸配列情報を参考にして適宜作製できる。また、培養癌細胞の上清から得られるｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントを、抗原として用いてもよい。
【００３０】
ポリクローナル抗体は、例えば、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを抗原として、市販のアジュバント（例、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原は、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを、キャリアタンパク質（例、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ）に架橋した複合体であってもよい。抗原を投与する動物としては、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
【００３１】
モノクローナル抗体は、例えば、細胞融合法により作製できる。例えば、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントまたはその部分ペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに２〜４回皮下または腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、ＮＳ−１）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合としては、ＰＥＧ法、電圧パルス法が挙げられる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。
【００３２】
ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに対するアプタマーは、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに特異的に結合し得るアプタマーである限り特に限定されない。アプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸと呼ばれる手法により作製できる。また、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに対するアプタマーとしては、例えば、ＷＯ０１／００９１５９に開示されるＵＵＵＧＡＣＵＡＵＧＵＣＵＧＡＣＧＧＧＵＣＵＧＵＧＧＵＣＡＡＵＵＣＣＧＣＣＣＣ（配列番号１）が知られている。したがって、アプタマーとしては、配列番号１のヌクレオチド配列を有するアプタマー、およびｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに結合する能力を保持する、それらの変異体を用いてもよい。このような変異体としては、配列番号１のヌクレオチド配列において１または数個（例えば２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２または３個）のヌクレオチド残基が修飾（例、置換、欠失、付加または挿入）されたヌクレオチド配列を有し、かつｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに結合する能力を保持する変異体が挙げられる。
【００３３】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、ｃ−ＭＥＴに対するリガンドであり、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインは、ＨＧＦに結合する能力を有する。したがって、本発明では、天然ＨＧＦを、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質として用いてもよい。また、ｃ−ＭＥＴに結合する能力を保持するＨＧＦ変異体を、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質として用いてもよい。このような変異体としては、ＨＧＦをコードするアミノ酸配列において１または数個（例えば２〜１００個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜３０、２〜２０個、２〜１０個または２〜５個）のアミノ酸残基が修飾（例、置換、欠失、付加または挿入）されたアミノ酸配列を有し、かつｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに結合する能力を保持する変異体が挙げられる。
【００３４】
ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質は、必要に応じて、標識用物質で標識された形態で提供されてもよい。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。
【００３５】
本発明の試薬は、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質に加えて、さらなる構成要素を含むキットの形態で提供されてもよい。この場合、キットに含まれる各構成要素は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器（例、チューブ）に格納された形態で提供されてもよい。例えば、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が標識用物質で標識されていない場合、このようなキットは、標識用物質をさらに含んでいてもよい。このようなキットはまた、ポジティブコントロールとして、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントを含んでいてもよい。
【００３６】
本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、キットは、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質の種類に応じたさらなる構成要素を含んでいてもよい。例えば、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントに親和性を有する物質が抗体である場合、キットは、２次抗体（例、抗ＩｇＧ抗体）、２次抗体の検出試薬をさらに含んでいてもよい。
【００３７】
本発明の試薬がキットの形態で提供される場合、キットは、生体サンプルを採取し得る器具をさらに含んでいてもよい。生体サンプルを採取し得る器具は、被験体から生体サンプルを入手可能である限り特に限定されないが、例えば、注射器等の採血器具が挙げられる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。【００３９】
実施例１：ｃ−ＭＥＴ阻害剤感受性細胞に特異的なｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの検出
ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を示さず、かつｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性でない細胞株Ｈ２１７０（ヒト扁平上皮肺癌由来、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；７：１６９−１８１．）、およびＨＣＣ８２７（ヒト非小細胞肺癌由来、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；１２：７１１７−７１２５．）、ならびにｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を示し、かつｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性である細胞株Ｈ１９９３（ヒト非小細胞肺癌由来、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：２０８１−２０８８．）を、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて３７℃、５％のＣＯ２濃度の条件にて８０％程度の細胞密度になるまで培養した後、ウシ胎児血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地にて２４時間培養した。培養後、各細胞株の細胞抽出液および培養上清濃縮物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いで、ＰＶＤＦ膜に転写した。各細胞抽出液を、ｃ−ＭＥＴのβ鎖に対する抗体（１４Ｇ９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚより入手）及びα鎖に対する抗体（ＥＰ１４５４Ｙ、ａｂｃａｍより入手）を用いたウェスタンブロッティングに供した。また、各培養上清濃縮物を、α鎖に対する抗体（ＥＰ１４５４Ｙ）を用いたウェスタンブロッティングに供した。β鎖に対する抗体（１４Ｇ９）は、未成熟ｃ−ＭＥＴ（プロｃ−ＭＥＴ）および成熟ｃ−ＭＥＴ（未切断型ｃ−ＭＥＴ）のβ鎖を認識する。一方、α鎖に対する抗体（ＥＰ１４５４Ｙ）は、α鎖（β鎖中の細胞外ドメインとジスルフィド結合を介して結合しており、細胞外に存在する）の部分ペプチドを抗原として用いて調製されたモノクローナル抗体であり、したがって、未成熟ｃ−ＭＥＴ（プロｃ−ＭＥＴ）および成熟ｃ−ＭＥＴ（未切断型ｃ−ＭＥＴ）のα鎖を認識し、また、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインのフラグメント（即ち、分泌型ｃ−ＭＥＴ）のα鎖を認識し得る。
その結果、細胞溶解液中に検出される１５０ｋＤａ近傍のｃ−ＭＥＴフラグメントについては、ｃ−ＭＥＴ阻害剤非感受性細胞株（Ｈ２１７０、ＨＣＣ８２７）とｃ−ＭＥＴ阻害剤感受性細胞株（Ｈ１９９３）との間で明確な差異が認められなかった（図１、細胞溶解液についてのＢｌｏｔ：１４Ｇ９およびＢｌｏｔ：１４５４Ｙ）。この結果は、未成熟ｃ−ＭＥＴ（プロｃ−ＭＥＴ）および成熟ｃ−ＭＥＴ（未切断型ｃ−ＭＥＴ）のような細胞内に検出されるｃ−ＭＥＴの濃度がｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅の程度に相関し得ないことを示す。一方、４０〜５０ｋＤａ近傍のｃ−ＭＥＴ細胞外フラグメントが、感受性細胞株（Ｈ１９９３）の培養上清濃縮物中に特異的に検出された（図１、上清についてのＢｌｏｔ：１４５４Ｙ）。この結果は、ｃ−ＭＥＴ細胞外フラグメント（分泌型ｃ−ＭＥＴ）の濃度がｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅の程度に強く相関し得ることを示す。
以上より、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメント（分泌型ｃ−ＭＥＴ）の濃度を測定することにより、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴い得る、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性の癌を、特異的に判定できることが示された。【００４０】
実施例２：ゲフィチニブ耐性細胞に特異的なｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの検出
ゲフィチニブに感受性の細胞株ＨＣＣ８２７、および同細胞株から樹立したゲフィチニブ耐性細胞株（Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）を用いた。具体的には、ゲフィチニブ耐性細胞株は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１６：１０３９−１０４３に開示された方法に従い、ＨＣＣ８２７をゲフィチニブ含有培地にて３ヶ月継代することにより樹立した。ゲフィチニブに感受性の細胞株ＨＣＣ８２７およびゲフィチニブ耐性細胞株を、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて３７℃、５％のＣＯ２濃度の条件にて８０％程度の細胞密度になるまで培養した後、ウシ胎児血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地にて２４時間培養した。培養後、各細胞株の細胞抽出液および培養上清濃縮物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、次いで、ＰＶＤＦ膜に転写した。各細胞抽出液を、ｃ−ＭＥＴのβ鎖に対する抗体（１４Ｇ９）及びα鎖に対する抗体（ＥＰ１４５４Ｙ）を用いたウェスタンブロッティングに供した。また、各培養上清濃縮物を、α鎖に対する抗体（ＥＰ１４５４Ｙ）を用いたウェスタンブロッティングに供した。
その結果、細胞溶解液中に検出される１５０ｋＤａ近傍のｃ−ＭＥＴフラグメントについては、ゲフィチニブ感受性細胞株（ＨＣＣ８２７）とゲフィチニブ耐性細胞株との間で明確な差異が認められなかった（図２、細胞溶解液についてのＢｌｏｔ：１４Ｇ９およびＢｌｏｔ：１４５４Ｙ）。この結果は、未成熟ｃ−ＭＥＴ（プロｃ−ＭＥＴ）および成熟ｃ−ＭＥＴ（未切断型ｃ−ＭＥＴ）のような細胞内に検出されるｃ−ＭＥＴの濃度がｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅の程度に相関し得ないことを示す。一方、４０〜５０ｋＤａ近傍のｃ−ＭＥＴ細胞外フラグメントが、耐性細胞株の培養上清濃縮物中に特異的に検出された（図２、上清についてのＢｌｏｔ：１４５４Ｙ）。この結果は、ｃ−ＭＥＴ細胞外フラグメント（分泌型ｃ−ＭＥＴ）の濃度が、ｃ−ＭＥＴにその生存を依存している、抗癌剤（例、ＥＧＦＲ阻害剤）に耐性の癌におけるｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅の程度に強く相関し得ることを示す。
以上より、ｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメント（分泌型ｃ−ＭＥＴ）の濃度を測定することにより、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴い得る、抗癌剤に耐性の癌を、特異的に判定できることが示された。【００４１】
実施例３：ｃ−ＭＥＴ阻害剤感受性細胞に特異的なｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの血中分泌
ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を示さず、かつｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性でない細胞株Ｈ２１７０ならびにｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を示し、かつｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性である細胞株Ｈ１９９３をヌードマウス皮下に移植した。数週間後において皮下に腫瘍形成を認めたマウスから血液を採取して、血清サンプルを調製した。これらの血清中のｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントの存在量をＥＬＩＳＡ測定系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により定量した。
その結果、Ｈ２１７０移植マウスの血清中にはｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントを全く検出できなかったのに対して、Ｈ１９９３移植マウスの血清中には同フラグメントが明確に検出された（図３）。また、異なる大きさの腫瘍を生じたＨ１９９３移植マウス３匹の血清中のｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメントを定量したところ、血清中における同フラグメントの量は腫瘍の大きさと強い正の相関を示した（図４）。
以上より、癌を発症した個体に対してｃ−ＭＥＴ細胞外ドメインフラグメント（分泌型ｃ−ＭＥＴ）の血中濃度を測定することにより、ｃ−ＭＥＴ遺伝子増幅を伴い得る、ｃ−ＭＥＴ阻害剤に感受性の癌を、特異的に判定できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、例えば、癌に対する抗癌剤の効果の試験に有用であり、また、診断試薬およびキットとして有用である。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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