(57)【要約】  本発明は、尿中ポドカリキシンを検出することを特徴とする、急性腎障害の検査方法により解決される。本発明の検査方法では、尿中ポドカリキシン値が基準値より高い場合に、急性腎障害であると判定することができる。また本発明の検査方法は、従来の方法よりも正確に、かつ非侵襲的に急性腎障害を判定することができ、患者の身体的負担を軽減することができるため、有用である。
2011105474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿中ポドカリキシンを検出することを特徴とする、急性腎障害の検査方法。
【請求項２】
尿中ポドカリキシン値が基準値よりも高い場合に、急性腎障害であると判定される、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
基準値が、健常人の尿中ポドカリキシン値の９５％信頼区間の上限値である、請求項３に記載の検査方法。
【請求項４】
尿中ポドカリキシン値が、尿中成分値で補正されたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項５】
尿中成分が尿中クレアチニンである、請求項４に記載の検査方法。
【請求項６】
急性腎障害が、急性尿細管障害によるものである、請求項１〜５のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項７】
尿中ポドカリキシンの検出を、免疫学的手法により行う、請求項１〜６のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項８】
尿中ポドカリキシンを検出するための抗ポドカリキシン抗体を含む、請求項７に記載の検査方法に用いる、急性腎障害検査用試薬。
【請求項９】
抗ポドカリキシン抗体を用いた尿中ポドカリキシンを検出するための試薬を含む、請求項７に記載の検査方法に用いる、急性腎障害検査用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿中のポドカリキシンを検出することを含む、急性腎障害の検査方法、および抗ポドカリキシン抗体を含む、当該検査方法に用いる急性腎障害の検査用試薬に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2010-041748号の優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
近年、急性腎不全（ＡＲＦ）は、急性尿細管壊死という構造的異常だけではなく、腎血行動態の機能的異常が重要視されてきている。診断や治療に関してもＡＲＦから急性腎障害（ＡＫＩ）という概念に変わってきており、早期に診断・治療を行なうことの重要性が提唱されてきている。【０００４】
急性腎障害とは急速に腎機能が低下した状態のことを示し、急性腎障害の多くは尿細管壊死による腎機能の低下を特徴とする。急性腎障害の原因として、腎前性腎不全、腎実質性腎不全、腎後性腎不全がある。腎前性腎不全は、外傷による出血、脱水、嘔吐、下痢などの細胞外液量の低下、心源性ショックなどの有効循環血液量の減少、および解離性大動脈瘤、腎動脈血栓症などによる腎血流の低下により、腎臓が虚血にさらされることにより生じるものである。腎実質性腎不全は、糸球体性のもの（急性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、結節性多発動脈炎など）、急性尿細管壊死（アミノグリコシド系など抗生物質、消炎鎮痛薬、抗腫瘍薬、造影剤などによるもの）、急性間質性腎炎（βラクタム系など抗生物質、消炎鎮痛薬、抗けいれん薬などによるもの）など、直接腎組織に障害が引き起こされるものである。腎後性腎不全は、尿管の閉塞（尿管結石）、膀胱、尿道の閉塞（前立腺肥大、前立腺ガン）、骨盤部腫瘍など尿の通過する途中に閉塞が起こり、尿の排泄障害が引き起こされるものである。【０００５】
急性腎障害は開心術・大動脈置換術後などＩＣＵ管理の必要な疾患が多く、発症後、時間単位での病態の把握が必要となる。急性腎障害の生命予後改善は、早期診断・早期治療介入なくしては望めないのが現状である。【０００６】
現在、急性腎障害の診断は通常、血清クレアチニン・尿量により行なわれていたが、これらの２項目による診断には問題があった。これら２項目には診断基準が定まっておらず、３５通りの急性腎障害の定義が存在することとなっていた。この問題を解決するために、世界的な取り組みとして、急性腎障害ネットワークがつくられ、急性腎障害の診断基準が提言された。当該診断基準では、（１）血清クレアチニンが１．５倍以上上昇、または０．３ｍｇ／ｄＬ以上上昇、（２）１時間当たり０．５ｍＬ／ｋｇの乏尿が６時間以上継続、を満たす段階で、急性腎障害と診断すると示されている。さらに、慢性腎臓病のステージ分類と同様に、特に急性腎障害のステージ分類（RIFLE分類・AKIN分類など）が提唱されている。【０００７】
しかしながら、上記２項目による診断にはなお、問題が存在する。血清クレアチニンは、腎障害に伴って糸球体濾過量が低下しても、すぐに上昇せず、一方、糸球体濾過量が回復傾向にあっても、しばらく上昇し続けることがあり、血清クレアチニンは急性の変化をとらえる早期マーカーならびに治療効果のモニタリング、予後予測マーカーとしての有用性は高いとはいえない。さらに、血清クレアチニンは体重、人種、性別、薬物、筋代謝、栄養状態などの腎外性因子の影響を受けやすい。また尿量は診断に時間がかかるため、発症後は時間単位での病態把握が必要である急性腎障害のマーカーとしては適していない。したがって、測定が簡単で、他の生物学的因子の影響を受けにくく、さらに疾患の早期発見とリスク分類、予後予測を可能とするバイオマーカーの開発が急務である。【０００８】
腎疾患に関連して見られる物質として尿中のポドカリキシンがあり、尿中ポドカリキシンを測定することによる、簡便な腎障害の検査手段が開示されている（特許文献１）。ポドカリキシンは、腎糸球体を構成するタコ足細胞（ポドサイト）の表面に存在し、濾過機能を担っている糖タンパク質である。ポドサイトは、糸球体基底膜のボウマン腔側に位置し、糸球体濾過機構に重要な役割をもつため、ポドサイトの障害の程度を把握することは、腎疾患において極めて重要な意味をもつことが知られている（非特許文献１）。尿中ポドサイトは、正常、非糸球体性腎疾患および非炎症性糸球体性腎疾患では出現しないが、炎症性糸球体性腎疾患では出現が認められることが知られている。特に、糸球体の急性炎症所見の強い症例では、多数のポドサイトが出現する（非特許文献２，３）。しかしながら、多様な原因を持つ急性腎障害において、ポドサイトおよびポドカリキシンがどのような挙動を示すかについては、未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００２／０３７０９９号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hara et al., Nephron 69: 397-403 (1995)
【非特許文献２】原正則，腎疾患の診療に役立つ新しい検査  尿中podocyte検査，尿中ポドカリキシン定量，腎と透析，2008.10.25，Vol.65  No.4
【非特許文献３】関根盛，原正則，腎障害の新しいマーカーについて-尿中ポドサイト，ポドカリキシンと臨床病理学的意義-，Ther.Res.,  2008,  Vol.29  No.11,  p.1900-1904
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、急性腎障害の検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するために、急性腎障害患者の尿中ポドカリキシン濃度が健常人よりも高いことに着目し、尿中ポドカリキシンを検出することにより急性腎障害の検査を行い得ることを見出し、本発明を完成した。【００１３】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．尿中ポドカリキシンを検出することを特徴とする、急性腎障害の検査方法。
２．尿中ポドカリキシン値が基準値よりも高い場合に、急性腎障害であると判定される、前項１に記載の検査方法。
３．基準値が、健常人の尿中ポドカリキシン値の９５％信頼区間の上限値である、前項３に記載の検査方法。
４．尿中ポドカリキシン値が、尿中成分値で補正されたものである、前項１〜３のいずれか１項に記載の検査方法。
５．尿中成分が尿中クレアチニンである、前項４に記載の検査方法。
６．急性腎障害が、急性尿細管障害によるものである、前項１〜５のいずれか１に記載の検査方法。
７．尿中ポドカリキシンの検出を、免疫学的手法により行う、前項１〜６のいずれか１に記載の検査方法。
８．尿中ポドカリキシンを検出するための抗ポドカリキシン抗体を含む、前項７に記載の検査方法に用いる、急性腎障害検査用試薬。
９．抗ポドカリキシン抗体を用いた尿中ポドカリキシンを検出するための試薬を含む、前項７に記載の検査方法に用いる、急性腎障害検査用試薬キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の検査方法により、従来の検査方法より正確に急性腎障害を判定することが可能になり、尿中ポドカリキシンを時間経過毎に測定することにより被験者の治療経過、重症度、予後評価を把握することができる。さらに、非侵襲的に急性腎障害の検査を行なうことが可能になり、被験者の身体的負担を軽減することができるとともに、治療方針等の決定を速やかに行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】健常人と急性腎障害患者の尿中ポドカリキシン濃度を比較した図を示す。（実施例２）
【図２】健常人と急性腎障害患者の尿中ポドカリキシン排泄量を比較した図を示す。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は被験者の尿中ポドカリキシンを検出することにより急性腎障害の検査を行うことを特徴とする。
【００１７】
本明細書において、検体である尿は、いかなる被験者から得られたものであってもよい。尿の採取方法は問わないが、早朝尿もしくは随時尿を用いることが好ましい。また、本発明の検査方法に必要な尿の量は１０〜２００μＬ程度である。本発明の検査方法は、従来の一般的な尿検査と同時に行われてもよい。
【００１８】
検体である尿の処理は、採取された尿に処理液を添加して混合することにより行うことができる。処理液は、尿のｐＨ調整、尿沈渣のマスキングおよび、ポドカリキシンの可溶化が可能なものであればいかなるものであってもよいが、好ましくは、緩衝液にキレート剤および界面活性剤などを添加した溶液が例示される。緩衝液、キレート剤は、公知のものであればいずれであってもよく、界面活性剤は、非イオン界面活性剤を用いることが好ましい。処理液としては、例えば２ＭＴＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）に、０．２Ｍ ＥＤＴＡと２％（Vol./Vol.）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液が例示される。かかる処理液１０μＬを、尿検体９０μＬに添加して混合することにより、尿試料溶液を得ることが可能である。
【００１９】
尿試料溶液から尿中ポドカリキシンを検出する方法は様々な方法が考えられる。尿中ポドカリキシンの検出方法の一例として、免疫学的手法が挙げられる。免疫学的手法は、例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素などによる検出方法との組み合わせ（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロッティング法、ラテックス凝集法（ＬＡ：Latex Agglutination-Turbidimetric Immunoassay）、イムノクロマト法などにより行うことができるが、ＥＬＩＳＡ法もしくはＬＡ法を用いることが好ましい。定量性の観点からＥＬＩＳＡ法のうちサンドイッチ法を用いることが好ましい。サンドイッチ法では、抗ポドカリキシン抗体を固相化したマイクロタイタープレートに尿試料溶液を添加し、抗原・抗体反応をさせ、さらに酵素標識した抗ポドカリキシン抗体を添加し、抗原・抗体反応をさせ、洗浄後、酵素基質と反応・発色させ、吸光度を測定して尿中のポドカリキシンを検出すると共に、その測定値から尿中ポドカリキシン濃度を算出することができる。
【００２０】
免疫学的手法において用いられる抗ポドカリキシン抗体は、ポドカリキシンを検出しうる抗体であればよい。本発明において用いられる抗ポドカリキシン抗体は、公知のものであってもよく、また今後開発される抗体であってもよく、特に限定されないが、例えばモノクローナル・ポリクローナル抗体や標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにこれらの結合活性断片などが挙げられる。また、２種類以上の抗ポドカリキシン抗体を用いてもよく、その場合は互いに異なるエピトープを認識する抗体であることが好ましい。
【００２１】
本発明において、尿中ポドカリキシン値とは、尿中ポドカリキシン濃度自体であってもよいが、尿中ポドカリキシン濃度を、尿中に安定に排泄される尿中成分に関する値（尿中成分値）で補正したパラメータであってもよい。尿中成分としては、特に尿中クレアチニンが好ましく、尿中クレアチニン濃度により尿中ポドカリキシン濃度を補正することが好ましい。尿中クレアチニン濃度はクレアチニンの産生が筋肉の量に依存することから、一個体に対して疾患にかかわらずほぼ一定であると考えられている。尿中成分の検査においては、尿量誤差を回避するため、クレアチニン１ｇ当りの量により目的とする尿中成分の量を補正する手法が一般的に用いられており、これによりクレアチニン単位グラム当たりの尿中成分を比較することが可能になる。尿中ポドカリキシン濃度を、尿中クレアチニン濃度により補正して得られるパラメータは、尿中ポドカリキシン排泄量（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）と称し、以下の式により算出することができる。
＜式＞  ＰＣＸ／Ｃｒｅ：尿中ポドカリキシン排泄量（μｇ／ｇ）＝１００×尿中ポドカリキシン濃度（ｎｇ／ｍＬ）÷尿中クレアチニン濃度（ｍｇ／ｄＬ）
【００２２】
本発明の検査方法により得られた尿中ポドカリキシン濃度および／または尿中ポドカリキシン排泄量（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）が基準値より高い場合、急性腎障害であると判定することができる。さらに、尿中ポドカリキシン濃度および／または尿中ポドカリキシン排泄量を時間経過毎に測定し、モニタリングすることにより被験者の治療経過、重症度を把握し、予後評価することができる。本発明における基準値は適宜設定することができるが、健常人の尿中ポドカリキシン値を用いることができる。健常人とは、他の腎機能マーカーで陰性を示した被験者が望ましく、他の腎機能マーカーとしては、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ：estimatedglomerular filtration rate）や、尿蛋白が例示される。さらに好ましくは、複数の健常人について尿中ポドカリキシンを検出し、その尿中ポドカリキシン値の９５％信頼区間の上限値を基準値として用いる。９５％信頼区間は公知の手法により求めることができる。健常人の測定値が正規分布している場合は以下の式によって求めることができる。
９５％信頼区間＝健常人尿中ポドカリキシン値の平均±ｔ×健常人尿中ポドカリキシン値の標準偏差
なお、ｔは自由度であり、健常人の検体数によって変動するため、ｔ分布表に基づき選択すればよい。一般に９５％信頼区間の場合ｔは１．９６である。
一方、健常人の尿中ポドカリキシン値が正規分布していない場合は中央値を含んだ９５％を占める範囲を基準範囲とし、その上限値を尿中ポドカリキシン値の基準値とする。
【００２３】
本発明において急性腎障害（ＡＫＩ）とは、急性尿細管壊死という構造的異常だけではなく、腎血行動態の機能的異常をも重要視した概念である。急性腎障害とは急速に腎機能が低下した状態のことを示し、特に、尿細管壊死等の尿細管障害（特に急性尿細管障害）による腎機能の低下を特徴とするものである。尿細管は、糸球体と腎盂をつなぐ無数の管であり、糸球体に近い場所にある管を近位尿細管、ヘンレループの後に続く管を遠位尿細管という。血液は糸球体で濾過されて原尿となり、尿細管の中に流れ込む。尿細管は必要に応じて、生体に必要な物質を原尿から再吸収する器官である。
【００２４】
また急性腎障害（ＡＫＩ）は、慢性腎臓病（ＣＫＤ）とは区別される概念である。急性腎障害と慢性腎臓病は、（ａ）腎機能低下の速度、（ｂ）原因、（ｃ）可逆性、（ｄ）治療の目標において異なる。具体的には、急性腎障害は（ａ）数時間から数週間で腎機能が低下し、（ｂ）脱水、薬物、手術などが原因であり、（ｃ）腎機能の回復が期待できるものであり、従って、（ｄ）腎機能の回復を治療の目標とする。一方、慢性腎臓病は（ａ）数カ月から十数年にわたって緩徐に腎機能が低下する病態を呈し、（ｂ）糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症を含む慢性糸球体腎炎などが原因であり、（ｃ）非可逆性で進行性であり、従って（ｄ）腎機能のそれ以上の悪化を防ぐことを治療の目標とする。
【００２５】
本発明は、尿中ポドカリキシンを検出するための抗ポドカリキシン抗体を含む、急性腎障害の検査を行うための急性腎障害検査用試薬および、当該試薬を含む急性腎障害検査用試薬キットにも及ぶ。当該キットには、検体採取器具、検体処理液、発色基質等の試薬および、試験に必要な器具等をさらに含むことができる。
【実施例】
【００２６】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。【００２７】
（実施例１）尿中ポドカリキシン濃度の測定
ポドカリキシン濃度の測定には、２種類の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を用いた。これらの２種類の抗体は、ヒトポドカリキシンの異なる２つのエピトープを各々認識し、それぞれ抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体１（以下単に「抗体１」と称する）と、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体２（以下単に「抗体２」と称する）である。本実施例では、抗体１固相化マイクロタイタープレート（分割型マイクロプレートＧＦ８高：Ｎｕｎｃ社）と、西洋ワサビＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ（以下「ＨＲＰ」と略す）により標識化した抗体２を用いた。【００２８】
まず、被験者から得た尿９０μＬと２Ｍ ＴＥＳ−ＮａＯＨ、０．２Ｍ ＥＤＴＡ、２％（Vol./Vol.）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．０の溶液１０μＬを混合した。混合して得られた尿試料溶液１００μＬを、抗体１固相化マイクロタイタープレートのウェルへ加えた。３７℃で１時間静置後、ウェルから尿試料溶液をデカンテーションにより除去した。３．６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（Vol./Vol.）Ｔｗｅｅｎ２０（以下「ＰＢＳ−Ｔ」と略す）をマイクロタイタープレートのウェルに２００μＬ／ウェルで添加し、デカンテーションによりＰＢＳ−Ｔの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄の工程を計３回行った。その後、ＨＲＰ標識化抗体２溶液を、１００μＬ／ウェルで添加した。３７℃で１時間静置後、ＨＲＰ標識化抗体２溶液をデカンテーションにより除去した。ＰＢＳ−Ｔを２００μＬ／ウェルで添加し、デカンテーションによりＰＢＳ−Ｔの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄の工程を計３回行った。その後、TMB One-Step Substrate System（Ｄａｋｏ社）をＨＲＰ酵素反応の基質溶液として用いて、１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で３０分間、遮光で静置した。その後、３１３ｍＭ Ｈ２ＳＯ４溶液を反応停止溶液として１００μＬ／ウェルで添加し、マルチスキャンアセントとAscent Software for Multiskan（大日本製薬株式会社）を使用し、波長４５０ｎｍと６３０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定した。そして、波長４５０ｎｍの吸光度から波長６３０ｎｍの吸光度を引いた値を測定値とした。検量線の標準品として腎臓から抽出したＮａｔｉｖｅなヒトポドカリキシンを使用し、検体中のポドカリキシン濃度を導き出した。【００２９】
尿中ポドカリキシン濃度を尿中クレアチニン濃度により補正した尿中ポドカリキシン排泄量を、以下の式から算出した。
＜式＞  尿中ポドカリキシン排泄量（μｇ／ｇ）＝１００×尿中ポドカリキシン濃度（ｎｇ／ｍＬ）÷尿中クレアチニン濃度（ｍｇ／ｄＬ）【００３０】
（実施例２）急性腎障害における尿中ポドカリキシン濃度および尿中ポドカリキシン排泄量の臨床的意義
実施例１の方法により、急性腎障害患者１０症例の尿中ポドカリキシン濃度を求め、健常人６６例のものと比較した。急性腎障害患者１０症例について、急性腎障害に至った背景病状を以下の表１に示す。
【表１】
2011105474.tif 000003
また、同様にして、尿中ポドカリキシン排泄量についても、急性腎障害患者１０症例のものと、健常人６６例のものとを比較した。【００３１】
尿中ポドカリキシン濃度に関する結果を図１に示す。急性腎障害患者の尿中ポドカリキシン濃度は、健常人の値より高値であることがわかった（Ｐ＜０．０５）。健常人から得た尿より求めた尿中ポドカリキシン濃度の９５％信頼区間の上限値を基準値とした場合その基準値は３３４ｎｇ／ｍＬとなり、急性腎障害患者の４０％がこの基準値より高い値を示した。
尿中ポドカリキシン排泄量に関する結果を図２に示す。急性腎障害患者の尿中ポドカリキシン排泄量は、健常人の値より高値であることがわかった（Ｐ＜０．０１）。健常人から得た尿より求めた尿中ポドカリキシン排泄量「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」の９５％信頼区間の上限値を基準値とした場合その基準値は１６１μｇ／ｇとなり、急性腎障害患者の８０％がこの基準値より高い値を示した。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
上記説明したとおり、本発明の検査方法により急性腎障害を正確かつ迅速に判定することが可能である。本発明の検査方法の試料は尿であるため、従来法と違い非侵襲的に検査を行なうことができ、患者の身体的負担を軽減することができ、有用である。
【図１】
2011105474.tif 000004
【図２】
2011105474.tif 000005
【国際調査報告】
2011105474.tif 000006
2011105474.tif 000007