(57)【要約】  本発明は、副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地中で、哺乳動物の内細胞塊を培養すること、及び培養物から哺乳動物ＥＳ細胞を単離することを含む、哺乳動物ＥＳ細胞の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地中で、哺乳動物の内細胞塊を培養すること、及び培養物から哺乳動物ＥＳ細胞を単離することを含む、哺乳動物ＥＳ細胞の製造方法。
【請求項２】
哺乳動物がマウスである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
マウスがＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスである、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
培地が更にＬＩＦを含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
ＦＧＦ受容体阻害剤がＳＵ５４０２である、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
ＭＥＫ活性化阻害剤がＰＤ１８４３５２である、請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
多能性を維持したまま増殖可能な、単離されたＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスＥＳ細胞。
【請求項９】
副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地。
【請求項１０】
更にＬＩＦを含む、請求項９記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞の樹立に有用な、哺乳動物ＥＳ細胞の製造方法、該方法に有用な培地、ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスＥＳ細胞等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＳ細胞（embryonic stem cells）は、１９８１年にＥｖａｎｓらによってマウス胚盤胞から初めて樹立された。ＥＳ細胞を胚盤胞に注入する等の方法でキメラマウスを作成すると、高い効率でＥＳ細胞が機能する生殖細胞に分化し、キメラマウスを交配することによりＥＳ細胞由来の子孫を得ることが出来る。この性質を最も有効に活用したのがノックアウトマウスの作成であり、この技術の開発により遺伝子機能の解析が飛躍的に進歩したのは周知の通りである。【０００３】
現在ではマウスのＥＳ細胞は市販されており、容易に購入可能である。しかしながら、現在市販されているＥＳ細胞の大部分は１２９バックグラウンドのものである。これは、マウスの系統間でＥＳ細胞の樹立効率に大きな差があるためであり、一般的に１２９バックグラウンドのマウスと比較すると、その他のマウスからのＥＳ細胞の樹立効率は極めて低い。そのため、ＥＳ細胞の樹立効率を高めるべく、様々な培養条件の改良が検討されている。【０００４】
非特許文献１には、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）がマウスＥＳ細胞のクローン増殖を促進し、ＥＳ細胞の多能性を維持することが開示されている。【０００５】
非特許文献２には、ＦＧＦ受容体、ＭＥＫ及びＧＳＫ３を阻害すると、ＥＳ細胞の多能性が維持されることが記載されている。そして、この条件を用いてＮＯＤマウスからＥＳ細胞を樹立できたことが報告されている（非特許文献３）。【０００６】
一方、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、Ｓｃｉｄ変異をＮＯＤバックグラウンドに対して戻し交配して得られた周知のマウスである（特許文献１）。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、Ｔ細胞受容体及び免疫グロブリン遺伝子を再構成することができないため、末梢血中の機能的なＴ細胞及びＢ細胞が欠失しており、ＮＫ細胞活性も低いため、重度の複合免疫不全症を呈する。【０００７】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、重篤な免疫不全を呈し、ヒトの様々な組織や細胞を移植しても拒絶されないため、いわゆる「ヒト化マウス」を作成するための基盤として使用されている。特に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤから、更にコモンγ鎖を欠損させることにより得られるＮＯＤ／ＳＣＩＤ／コモンガンマ欠損マウス（ＮＯＧマウス）は、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞の欠失、補体活性の消失、マクロファージや樹状細胞の機能不全という多態な免疫不全を呈する（特許文献２）。そのため、ＮＯＧマウスは、従来のマウスと比較して格段にヒトの細胞や組織の生着性が高く、かつ移植したヒト幹細胞が成熟細胞へも分化することが可能であり、多様なヒト化マウスモデルの作成に有用である（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平９−９４０４０号公報
【特許文献２】特許第３７５３３２１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Genes to Cells, vol.9, pp.471-477, 2004
【非特許文献２】Nature, vol.453, pp.519-523, 2008
【非特許文献３】Biology of Reproduction, vol.81, no.6, pp.1147-1153, 2009
【非特許文献４】Blood, vol.100, no.9, pp.3175-3182, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来、ヒト化マウス内でヒトの環境を再構築するためには、ヒトの遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作成し、これを何代も掛け合わせて最終的にヒト遺伝子を発現するＮＯＧマウスを得ていた。これを達成するためには通常２年以上もの長い時間と多大な労力を要する。【００１１】
本発明者らは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスからＥＳ細胞を樹立し、これにヒトの遺伝子を導入することによりヒト遺伝子導入ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスを作成すれば、この問題を解決することができると考えた。そこでまず、ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞を樹立するべく、１２９バックグラウンドマウスからＥＳ細胞を樹立する方法に従ってＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの内細胞塊（ＩＣＭ）をＬＩＦを含む培地中で培養したが、ＥＳ細胞を樹立することが出来なかった。そこで、非特許文献１でＥＳ細胞の樹立効率を上げると報告されているＡＣＴＨを培地に添加してみたが、やはりＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＥＳ細胞を樹立することは出来なかった。更に、ＮＯＤマウスからＥＳ細胞を樹立した方法（非特許文献４）に従い、培地にＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を添加したところ、ＥＳ細胞は樹立されたものの、得られた細胞は分化傾向が強く、多能性を維持したまま増殖しなかった。【００１２】
このように、従来公知の方法では、ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスから、多能性を維持したまま増殖可能なＥＳ細胞を樹立することが困難であるという新たな課題を本発明者らは見出した。【００１３】
本発明は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスからも多能性を維持したまま増殖可能なＥＳ細胞を樹立することが可能な、哺乳動物ＥＳ細胞の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ＡＣＴＨ、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤の存在下で、ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスの内細胞塊を培養することにより、多能性を維持したまま増殖可能なＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞を樹立できることを見出し、本発明を完成した。【００１５】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地中で、哺乳動物の内細胞塊を培養すること、及び培養物から哺乳動物ＥＳ細胞を単離することを含む、哺乳動物ＥＳ細胞の製造方法。
［２］哺乳動物がマウスである、［１］記載の製造方法。
［３］マウスがＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスである、［２］記載の製造方法。
［４］培地が更にＬＩＦを含む、［１］記載の製造方法。
［５］ＦＧＦ受容体阻害剤がＳＵ５４０２である、［１］記載の製造方法。
［６］ＭＥＫ活性化阻害剤がＰＤ１８４３５２である、［１］記載の製造方法。
［７］ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、［１］記載の製造方法。
［８］多能性を維持したまま増殖可能な、単離されたＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスＥＳ細胞。
［９］副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地。
［１０］更にＬＩＦを含む、［９］記載の培地。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法を用いれば、多能性を維持したまま増殖可能な哺乳動物のＥＳ細胞を効率的に樹立することが可能であり、特に、多能性を維持したまま増殖可能なＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞を樹立することが出来る。
ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞を用いれば、インビトロでこのＥＳ細胞に様々な遺伝子操作を行い、容易に遺伝子改変ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスを製造することが可能となる。従って、ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞は、ヒト化マウス製造の基盤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６由来胚盤胞胚へ微小注入することにより得られたキメラマウスを示す。
【図２】ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６由来胚盤胞胚へ微小注入することにより得られたキメラマウスを示す。
【図３】ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６由来胚盤胞胚へ微小注入することにより得られた生殖系列キメラマウスと野生型マウスを交配して得られた、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＥＳ細胞由来の子孫マウスを示す。
【図４】ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６由来胚盤胞胚へ微小注入することにより得られた生殖系列キメラマウスと野生型マウスを交配して得られた、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＥＳ細胞由来の子孫マウスを示す。
【図５】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／コモンガンマＫＯマウスのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６由来胚盤胞胚へ微小注入することにより得られたキメラマウスを示す。
【図６】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／コモンガンマＫＯマウスのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６由来胚盤胞胚へ微小注入することにより得られたキメラマウスを示す。
【図７】ＢＡＬＢ／ｃＡマウス由来ＥＳ細胞（クローンＮｏ．７）を比較培地２（ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含み、ＡＣＴＨを含まない）にて維持培養し、リプレート２日後のコロニー形態を示す。
【図８】ＢＡＬＢ／ｃＡマウス由来ＥＳ細胞（クローンＮｏ．６）を比較培地２（ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含み、ＡＣＴＨを含まない）にて維持培養し、リプレート２日後のコロニー形態を示す。
【図９】ＢＡＬＢ／ｃＡマウス由来ＥＳ細胞（クローンＮｏ．２）をＣＣＭ＋３ｉ培地（ＡＣＴＨ、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む）にて維持培養し、リプレート２日後のコロニー形態を示す。
【図１０】ＢＡＬＢ／ｃＡマウス由来ＥＳ細胞（クローンＮｏ．１）をＣＣＭ＋３ｉ培地（ＡＣＴＨ、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む）にて維持培養し、リプレート２日後のコロニー形態を示す。
【図１１】ヒト・エリスロポイエチン遺伝子ノックインベクターの模式図を示す。
【図１２】ヒト・エリスロポイエチン遺伝子をノックインした、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６由来胚盤胞胚へ微小注入することにより得られたキメラマウスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地中で、哺乳動物の内細胞塊を培養すること、及び培養物から哺乳動物ＥＳ細胞を単離することを含む、哺乳動物ＥＳ細胞の製造方法を提供するものである。
【００１９】
本発明の方法の特徴は、哺乳動物の内細胞塊を培養する際に、副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地を用いる点にあり、その他の培養条件については、哺乳動物の内細胞塊からＥＳ細胞を樹立する従来公知の方法に従って本発明を実施することができる。従来公知の哺乳動物のＥＳ細胞の製造方法については、例えばMethod in Molecular Biology, volume 329, “Embryonic Stem Cell Protocol”, second edition, Humana Press等を参照のこと。
【００２０】
ＥＳ細胞（胚性幹細胞）とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内細胞塊より作られる幹細胞細胞株のことをいう。本発明の方法により製造されるＥＳ細胞は、多能性を維持したままインビトロにて増殖することが可能である。多能性とは、生殖系列を含む生体を構成する全ての細胞やその前駆細胞に分化しうる能力を意味する。
【００２１】
哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されない。哺乳動物は、好ましくはマウスである。
【００２２】
マウスの系統は、特に限定されず、例えばＣ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ２、Ｂ６Ｃ３Ｆ１、ＢＤＦ１、Ｂ６Ｄ２Ｆ１、ＢＡＬＢ／ｃ、ＩＣＲ、１２９等が含まれる。また、ＮＯＤマウス、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス等の変異マウスのＥＳ細胞の製造にも本発明は使用することができる。ＮＯＤマウスは、はｏｕｔｂｒｅｄ（非近交系）のＪｃｌ−ＩＣＲマウスから純系化された、公知の糖尿病モデルマウスである。ＳＣＩＤマウスは、重症複合免疫不全症を呈する公知の免疫不全マウスである。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、ＮＯＤマウスへＳＣＩＤマウスを戻し交配することにより得られるマウスである。例えば、当業者に公知の手法、例えば、Ｃｒｏｓｓ  Ｉｎｔｅｒｃｒｏｓｓ法による戻し交配（Inbred Strains in Biomedical Research,M.F.W.Festing,1979,ISBN 0-333-23809-5,The Macmillan Press,London and Basingstoke）に従い、ＳＣＩＤマウスとＮＯＤマウスとを交配し、そのＦ１マウス同士を更に交配して得たＦ２マウスの血清中の免疫グロブリン量を測定し、検出できないマウスを選別する。このマウスを再びＮＯＤマウスと交配する。この操作を９回以上繰り返し（Ｃｒｏｓｓ  Ｉｎｔｅｒｃｒｏｓｓ法）行うことによって得ることが出来る。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの製造方法については、特開平９−９４０４０号公報に開示されている。ＮＯＤマウス、ＳＣＩＤマウス及びＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは共に日本クレア株式会社から販売されている。
【００２３】
本明細書において、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス及びＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに１又は複数の変異を更に導入することにより得られるマウスを「ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウス」という。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに１又は複数の変異を更に導入することにより得られるマウスとしては、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／コモンガンマ欠損マウス（ＮＯＧマウス）等を挙げることが出来る。ＮＯＧマウスの製造方法については、例えば特許３７５３３２１号に開示されている。またＮＯＧマウスは、実験動物中央研究所から販売されている。
【００２４】
内細胞塊は自体公知の方法で得ることができる。例えば、哺乳動物の雌雄を自然交配し、２〜３日後に子宮及び卵管を培地で洗浄することにより胚を採取する。採卵の効率を上げるため、雌にはホルモン処理による過排卵をあらかじめ誘発しておくことが好ましい。採取された胚を、適切な培地（例えば、Ｍ１６）中で培養することにより、胚盤胞期まで発生させる。このときの培養温度は通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃が例示される。ＣＯ２濃度は通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約７％が例示される。湿度は通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％が例示される。胚盤胞期になるまでの培養期間は通常１〜３日程度である。胚盤胞内に内細胞塊が含まれる。
【００２５】
得られた内細胞塊を副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地中へ移し、培養する。培養する細胞の中に内細胞塊が含まれている限り、内細胞塊は単離されていてもいなくてもよい。即ち、単離された内細胞塊を培養してもよいし、内細胞塊を含む胚盤胞をそのまま培養してもよい。胚盤胞からの内細胞塊の単離の方法は当業者に周知である。例えば、胚盤胞を酸性タイロードで処理することにより透明帯を溶解し、抗血清及び補体を用いた免疫手術に付し、栄養外胚葉細胞を除去することにより、胚盤胞から内細胞塊を単離することができる。
【００２６】
本発明の方法において用いられる培地の基礎培地は、哺乳動物のＥＳ細胞の培養に一般的に使用されているものを用いることができ、本発明の方法により哺乳動物のＥＳ細胞を製造し得る限り特に限定されない。例えばＧＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＨＡＭ、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ３０、ＤＭ−１６０、ＤＭ−２０１、ＢＭＥ、ＳＦＭ−１０１、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ等が挙げられる。また、ＥＳ細胞培養用等に改変された培地を用いてもよく、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。
【００２７】
培地に含まれる副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）は、公知のペプチドホルモンである。本発明において使用されるＡＣＴＨは、哺乳動物のＡＣＴＨである。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、本発明の方法により哺乳動物のＥＳ細胞を製造し得る限り特に限定されない。また、それらＡＣＴＨと実質的に同様の生理活性を有するペプチド、すなわち上記哺乳動物のＡＣＴＨを構成するアミノ酸配列について一つ又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しており、対応する完全長ペプチドと同様の生理活性を有するものも使用することができ、これらのペプチドもＡＣＴＨに包含される。例えば、ＡＣＴＨは、３９個のアミノ酸からなるペプチド（ＡＣＴＨ（１−３９））であって、Ｎ末端１〜２４のアミノ酸は各動物に共通し、２５〜３３のアミノ酸は種によって相違し、Ｎ末端１〜１８に副腎皮質刺激作用があることが知られているが、本発明においては、ＡＣＴＨ（１−３９）に加え、その断片であるＡＣＴＨ（１−２４）、ＡＣＴＨ（１１−２４）なども使用することができる。上記したＡＣＴＨやその断片は、いずれも文献に記載されているか（例えば、米国特許公報第４，４１５，５４６号；今堀和友ら：生化学辞典（第３版）１１７８〜１１７９頁（１９９８）（株）東京化学同人）、又は試薬として市販されているか、若しくは文献記載の方法に準じて製造することが可能なものである。例えば、それらペプチドは、所望のアミノ酸配列を構築するための当業者にとって周知のペプチド合成法で作成することができる。
【００２８】
本発明の方法において、培地中に含まれるＡＣＴＨの濃度は、本発明の方法により哺乳動物のＥＳ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、通常１ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１〜３０μＭである。
【００２９】
培地に含まれるＦＧＦ受容体阻害剤とは、代表的には哺乳動物（例、マウス、ヒト）のＦＧＦＲ１および／またはＦＧＦＲ２を阻害する、小分子化合物またはポリペプチドをいう。したがって、ＦＧＦ受容体阻害剤は、哺乳動物（例、マウス、ヒト）のＦＧＦレセプターファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバー、またはすべてのメンバーの阻害剤であり得、ＦＧＦ受容体としては、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４が挙げられるがこれらに限定されない。多くのＦＧＦ受容体阻害剤が公知であり、ＳＵ５４０２（３−［３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル］−２−インドリノン）（例えばBernard-Pierrot (2004) Oncogene 23:9201-9211を参照）、ＰＤ１７３０７４（１−ｔ−ブチル−３−（６−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−（４−ジエチルアミノブチルアミノ）−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）ウレア）（例えばMoffa等(2004) Mol. Cancer Res. 2:643-652を参照)等が挙げられるが、これらに限定されない。また、可溶型の哺乳動物（例、マウス、ヒト）ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２等）や、哺乳動物（例、マウス、ヒト）ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２等）に対する特異的中和抗体も、ＦＧＦ受容体阻害剤として有用である。ＦＧＦ受容体阻害剤は、好ましくはＳＵ５４０２である。
【００３０】
本発明の方法において、培地中に含まれるＦＧＦ受容体阻害剤の濃度は、本発明の方法により哺乳動物のＥＳ細胞を製造し得る限り特に限定されず、ＦＧＦ受容体阻害剤の種類に応じて当業者は適宜設定することができる。例えば、ＦＧＦ受容体阻害剤としてＳＵ５４０２を使用する場合には、その濃度は通常０．１〜２０μＭ、好ましくは０．５〜１０μＭ、特に１〜５μＭの範囲内である。ＦＧＦ受容体阻害剤としてＰＤ１７３０７４を使用する場合には、その濃度は通常１〜２００ｎＭ、好ましくは５〜１００ｎＭ、特に１０〜５０ｎＭの範囲内である。
【００３１】
培地に含まれるＭＥＫ活性化阻害剤とは、一般的なＭＥＫ活性化阻害剤をいう。したがって、ＭＥＫ活性化阻害剤とは、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２およびＭＥＫ３を含むタンパク質キナーゼの哺乳動物（例、マウス、ヒト）ＭＥＫファミリーメンバーの活性化の任意の阻害剤、例えば、ＭＥＫ１活性化阻害剤、ＭＥＫ２活性化阻害剤およびＭＥＫ３活性化阻害剤をいう。ＭＥＫ活性化阻害剤は、ＭＥＫキナーゼファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバーまたはすべてのメンバーの活性化を阻害し得る。適切なＭＥＫ活性化阻害剤の例としては、当該技術分野で既に公知であり、ＭＥＫ１活性化阻害剤であるＰＤ１８４３５２（２−（２−クロロ−４−インド−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド）およびＰＤ９８０５９（２’−アミノ−３’−メトキシフラボン）、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２の活性化阻害剤であるＵ０１２６（1.4-ジアミノ-2,3-ジシアノ-1,4-ビス[2-アミノ-フェニルチオ]ブタジエン）およびＳＬ３２７（α-[アミノ[(4-アミノフェニル)チオ]メチレン]-2-(トリフルオロメチル)ベンゼンアセトニトリル）、ならびに、Ｄａｖｉｅｓら（2000）（Davies SP, Reddy H, Caivano M, Cohen P. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J. 351, 95-105）に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。特に、ＰＤ１８４３５２は、他の公知のＭＥＫ活性化阻害剤と比較した場合に、高い特異性および効力を有することが見出されている。他のＭＥＫ活性化阻害剤およびＭＥＫ活性化阻害剤のクラスは、Ｚｈａｎｇら（2000）Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters; 10:2825-2828に記載されている。ＭＥＫ活性化阻害剤は好ましくはＰＤ１８４３５２である。
【００３２】
本発明の方法において、培地中に含まれるＭＥＫ活性化阻害剤の濃度は、本発明の方法により哺乳動物のＥＳ細胞を製造し得る限り特に限定されず、ＭＥＫ活性化阻害剤の種類に応じて当業者は適宜設定することができる。例えば、ＭＥＫ活性化阻害剤としてＰＤ１８４３５２を使用する場合には、その濃度は通常０．０５〜１０μＭ、好ましくは０．２５〜５μＭ、特に０．５〜２．５μＭの範囲内である。
【００３３】
培地に含まれるＧＳＫ３阻害剤とは、１以上のＧＳＫ３酵素に対する阻害剤をいう。したがって、ＧＳＫ３阻害剤は哺乳動物（例、マウス、ヒト）のＧＳＫ３酵素ファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバー、またはすべてのメンバーを阻害し得る。ＧＳＫ３酵素ファミリーは周知であり、ＧＳＫ３−αおよびＧＳＫ３−βが挙げられるが、これらに限定されない。多くの変異型が記載されている（例えば、Schafferら; Gene 2003; 302（1-2）: 73-81参照）。特定の実施態様ではＧＳＫ３−βが阻害される。ＧＳＫ３−α阻害剤もまた適切であり、そして一般に本発明において使用されるＧＳＫ３阻害剤は両方ともを阻害する。広い範囲のＧＳＫ３阻害剤が公知である。ＧＳＫ３阻害剤としては、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（６−｛２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチルアミノ｝−ニコチノニトリル）、ＣＨＩＲ９８０１４（２−［［２−［（５−ニトロ−６−アミノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］−４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ピリミジン）、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＴＤＺＤ−８（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）およびＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）等が挙げられるが、これらに限定されない。他の阻害剤が公知であり、そして本発明において有用である。ＧＳＫ３阻害剤の例は、Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｃら、J. Biol. Chem., 277巻, 34号, 2002年8月23日, 30998-31004頁およびＲｉｎｇ ＤＢら、Diabetes, 52巻, 2003年3月, 588-595頁に記載されている。さらに、ＧＳＫ３−βの活性部位の構造は特徴づけられており、特異的な阻害剤および非特異的な阻害剤と相互作用する重要残基が同定されている（Bertrandら；J Mol Biol．2003；333 （2）：393-407）。この構造特性によって、さらなるＧＳＫ阻害剤が容易に同定され得る。ＧＳＫ３阻害剤は、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１である。
【００３４】
本発明の方法において、培地中に含まれるＧＳＫ３阻害剤の濃度は、本発明の方法により哺乳動物のＥＳ細胞を製造し得る限り特に限定されず、ＧＳＫ３阻害剤の種類に応じて当業者は適宜設定することができる。例えば、ＧＳＫ３阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合には、その濃度は通常０．０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜２０μＭ、より好ましくは０．３〜１０μＭの範囲内である。
【００３５】
本発明の方法において用いる培地は、更にＬＩＦを含んでいてもよい。ＬＩＦは、例えばマウスのＥＳ細胞の分化を抑制する活性があるため、マウスＥＳ細胞の製造や培養におけるＬＩＦの使用は周知である。しかしながら、哺乳動物の種類（例えば、ヒト）によっては、ＥＳ細胞を製造する際にＬＩＦが不要であることが知られており、ＬＩＦは必須ではない。このように、培地にＬＩＦを含めるか否かは、公知のＥＳ細胞の樹立条件を参考に、動物種の違い等に基づき、当業者であれば適宜選択することができる。本発明において使用できるＬＩＦは哺乳動物のＬＩＦである。ＬＩＦとしては、例えば、ヒト（特開平１−５０２９８５号公報）、マウス（特開平１−５０２９８５号公報）、ヒツジ（特開平４−５０２５５４号公報）、ブタ（特開平４−５０２５５４号公報）、ウシ（特開平８−１５４６８１号公報）等のＬＩＦが例示される。
【００３６】
本発明の方法において、ＬＩＦを用いる場合には、その培地中の濃度は、本発明の方法によりＥＳ細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、通常１０〜１０６ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、例えば１０２〜１０５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、好ましくは５×１０２〜５×１０４ｕｎｉｔｓ／ｍｌである。
【００３７】
また、本発明の方法において用いる培地は、血清を更に含んでいてもよい。血清の種類は、本発明の方法により哺乳動物のＥＳ細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、好ましくは上記哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎仔血清等）である。血清は、非動化されていることが好ましい。また血清の代替添加物（例えばＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  （ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等）を用いてもよい。血清の濃度は、本発明の方法により哺乳動物のＥＳ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、通常０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の範囲である。なお、本発明の方法においては、血清は必須の因子ではない。無血清培地を用いてＥＳ細胞を樹立したことが報告されており（Method in Molecular Biology, volume 329, “Embryonic Stem Cell Protocol”, second edition, page 91-98, 2006, Humana Press; Genesis. 2004 Jun;39(2):100-4）、当業者は、これらに開示された培養条件を参照し、本発明の方法により、無血清培地を用いて哺乳動物のＥＳ細胞を製造することができる。
【００３８】
本発明の方法において用いる培地は、哺乳動物細胞の培養に使用する自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、本発明の方法により哺乳動物のＥＳ細胞を製造し得る範囲において特に限定されないが、例えば成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ−グルタミン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ−ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
【００３９】
本発明の方法において、内細胞塊をフィーダー細胞上で培養してもよい。フィーダー細胞の種類としては、本発明の方法により哺乳動物のＥＳ細胞を製造し得る限り特に限定されないが、ＥＳ細胞を多能性を維持しながら培養する際に用いられる自体公知のフィーダー細胞を用いることができ、例えば、線維芽細胞（マウス胎仔線維芽細胞、マウス線維芽細胞株ＳＴＯ等）が挙げられる。フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線等）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣ等）処理等で不活化されていることが好ましい。なお、本発明の方法においては、フィーダー細胞は必須の因子ではない。フィーダーフリーの条件でＥＳ細胞を樹立したことが報告されており（Method in Molecular Biology, volume 329, “Embryonic Stem Cell Protocol”, second edition, page 91-98, 2006, Humana Press）、当業者は、これに開示された培養条件を参照すれば、本発明の方法により、フィーダーフリーの条件で哺乳動物のＥＳ細胞を製造することができる。
【００４０】
本発明の方法における細胞培養条件は、哺乳動物のＥＳ細胞を培養する際に通常用いられている培養条件を用いることができる。例えば、培養温度は通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃が例示される。ＣＯ２濃度は通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約７％が例示される。湿度は通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％が例示される。内細胞塊の培養期間は、内細胞塊からＥＳ細胞が生じるのに十分な期間（通常１週間以上）であり、適宜継代を繰り返しながら、培養を継続することが可能である。
【００４１】
培養開始後の操作を更に詳細に説明すると、例えば以下の通りである。
【００４２】
副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地中での、哺乳動物の内細胞塊の培養を開始した後は、内細胞塊の成長が始まるまで、培地交換は行わないことが好ましい。内細胞塊の成長が始まるまでの期間は、通常培養開始から４〜７日間程度である。
【００４３】
内細胞塊が直径１００μｍ程度にまで成長した段階で、注射針等を用いて、細胞塊を３〜４個程度の塊に切断し、培養を継続する。毎日、新鮮な培地に交換しながら、再度細胞塊の成長が起こり始めるまで培養を更に続ける。再度細胞塊の成長が起こり始めるまでの期間は、通常４〜５日程度である。
【００４４】
細胞塊の成長が確認できたウェルを、トリプシン−ＥＤＴＡによって処理することにより、細胞塊をほぐし、剥がれた細胞を新たなプレートに撒き直す。このように、副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地中で細胞を培養することを除き、当該技術分野において周知の方法に従い、継代を繰り返す。
【００４５】
このように継代を繰り返していくと、細胞のコロニーが出現してくる。未分化のＥＳ細胞のコロニーは硬く詰め込まれた特徴的な形態を呈しており、分化した細胞とは明らかにコロニーの形態が異なる。当業者であれば、コロニーの形態に基づいて未分化のＥＳ細胞のコロニーを明確に視覚的に識別することが可能である。従って、このようなコロニーの形態を手掛かりに、例えば、顕微鏡下で未分化のＥＳ細胞のコロニーをパスツールピペット、マイクロマニピュレーター等を用いて選択的にピックアップすることにより、培養物から未分化のＥＳ細胞を単離することができる。「培養物」とは、細胞を培養することにより得られる結果物をいい、細胞、培地、場合によっては細胞分泌性成分等が含まれる。
【００４６】
本発明の方法により得られたＥＳ細胞が多能性を保持しているか否かは、自体公知の方法により確認することができる。例えば、得られた細胞の一部を宿主胚に導入し、キメラ動物の誕生の有無を解析することによっても、当該細胞が多能性を保持しているか否かを確認することができる。本発明の方法により得ることのできるＥＳ細胞は、宿主胚に導入されると、キメラ動物の正常な発生に寄与することができる。更に、得られたキメラ動物を野生型動物と交配し、その子孫動物にＥＳ細胞の遺伝型が伝達された個体が含まれるか否かを確認することにより、得られた細胞が生殖系列への分化能をも保持しているか否かを確認することができる。本発明の方法により得ることのできるＥＳ細胞は、生殖系列への分化能をも保持している。
【００４７】
あるいは、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２等の未分化なＥＳ細胞に特徴的なマーカー遺伝子の発現を解析することによっても、得られた細胞が多能性を保持しているか否かを確認することができる。また、３つの胚葉系（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべてを含む奇形腫を生じる能力の有無を解析することによっても、得られた細胞が多能性を保持しているか否かを確認することができる。
【００４８】
このような確認試験をすることにより、多能性を維持したまま増殖可能な哺乳動物のＥＳ細胞を確実に得ることが出来る。
【００４９】
本発明の方法により製造することのできるＥＳ細胞は、３日間で、１０倍以上にも増殖することが可能である。
【００５０】
本発明の方法を用いれば、多能性を維持したまま増殖可能な哺乳動物のＥＳ細胞を効率的に樹立することが可能であり、特に、多能性を維持したまま増殖可能なＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞を樹立することが出来る。本発明はまた、この多能性を維持したまま増殖可能な、単離されたＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞をも提供する。従来のＥＳ細胞の製造方法を用いても、ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞を樹立することは不可能であったが、本発明の方法を用いて初めてＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞を樹立することに成功したものである。
【００５１】
本明細書において「単離された」とは、目的とする細胞以外の細胞を除去する操作がなされていることを意味する。「単離された細胞Ｘ」における、細胞Ｘの純度は、全細胞数の通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％、最も好ましくは１００％である。
【００５２】
多能性を維持したまま増殖可能なＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞は、例えば、上述の本発明の方法において用いる培地中の培養物として提供される。
【００５３】
本発明の方法により得ることのできるＥＳ細胞は、長期間にわたって、多能性を維持した状態で増殖することができるので、自体公知の方法で、当該ＥＳ細胞の遺伝子を改変し、例えば、特定の外来遺伝子が導入されたＥＳ細胞や、特定の遺伝子を欠損したＥＳ細胞等の遺伝子改変ＥＳ細胞を製造することができる。本発明の方法により得ることのできるＥＳ細胞への遺伝子導入の方法としては、例えば、特定の遺伝子が機能的に発現できるように構築されたベクターをＥＳ細胞に導入する方法を挙げることができる。特定の遺伝子を欠損した多能性幹細胞を得る方法としては、例えばターゲッティングベクターを用いた相同的組換え（ジーンターゲッティング法）が挙げられる。
【００５４】
本発明の方法により得ることのできるＥＳ細胞は、生殖系列を含む生体を構成する全ての体細胞へ分化する能力を有しており、従来公知のＥＳ細胞に適用される全ての試験技術、方法を当該ＥＳ細胞に適用することができ、当該ＥＳ細胞を用いて多様な機能細胞、組織、哺乳動物等を製造することができる。また上述の方法で遺伝子を改変したＥＳ細胞を用いれば、遺伝子が改変された多様な機能細胞、組織、哺乳動物等を製造することができる。
【００５５】
本発明の方法により得ることのできるＥＳ細胞を用いた哺乳動物の製造は、例えばキメラ胚を用いる方法等の自体公知の方法に準じて行うことができる。
【００５６】
例えば、まず本発明の方法により得ることのできるＥＳ細胞を宿主胚に導入し、キメラ胚を得る。「宿主」の動物種は、導入されるＥＳ細胞の動物種と同一であることが好ましい。「胚」としては、特に限定されないが、例えば胚盤胞、８細胞期胚等が挙げられる。
【００５７】
「胚」はホルモン剤（例えば、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）等により過排卵処理を施した雌動物を、雄動物と交配させることに等より得ることができる。ＥＳ細胞を宿主胚に導入する方法としては、マイクロインジュクション法や凝集法等が知られているが、いずれの方法を用いることも可能である。
【００５８】
次に、当該キメラ胚を宿主動物の子宮又は卵管に移入し、キメラ動物（ヒトを除く）を得る。宿主動物は好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮などにより去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。キメラ胚が移入された宿主動物は、妊娠し、キメラ動物（ヒトを除く）を出産する。
【００５９】
更に、当該キメラ動物（ヒトを除く）を正常動物又は当該キメラ動物同士と交配し、次世代（Ｆ１）個体の中から当該ＥＳ細胞由来遺伝子を保有する個体を選択することにより、当該ＥＳ細胞由来遺伝子を保有する動物（ヒトを除く）（当該多能性幹細胞に由来する動物）を得ることができる。ＥＳ細胞由来遺伝子を保有する動物（ヒトを除く）の選択は、様々な形質を指標として用いることができるが、例えば体色や被毛色が指標として用いられる。また、体の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行うことにより、選択を行うこともまた可能である。
【００６０】
上述の方法を用いることにより、例えば特定の外来遺伝子が導入されたＥＳ細胞から、当該導入された外来遺伝子を保有する動物（トランスジェニック動物）を得ることができる。また、特定の遺伝子を欠損したＥＳ細胞から、遺伝子欠損ヘテロ接合体動物を得ることができる。更に得られた遺伝子欠損ヘテロ接合体動物を繁殖させることで、遺伝子欠損ホモ接合体動物を得ることができる。
【００６１】
特に、本発明の方法により製造することのできるＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞を用いれば、インビトロでこのＥＳ細胞に様々な遺伝子操作を行い、容易にトランスジェニックＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスや、遺伝子欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスを製造することが可能となるので、ヒト化マウス製造の基盤として有用である。
【００６２】
また、本発明は、副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤を含む培地を提供するものである。本発明の培地に含まれる、副腎皮質刺激ホルモン、ＦＧＦ受容体阻害剤、ＭＥＫ活性化阻害剤及びＧＳＫ３阻害剤の定義や含有量、該培地の基礎培地の種類や、更に含まれていてもよい因子の種類や含有量は、上述の本発明の方法の説明において述べた通りである。本発明の培地は、上記本発明の方法の実施に有用である。
【００６３】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００６４】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００６５】
［実施例１］
（方法）
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを自然交配後、２日目に胚を卵管より採取した。８細胞胚を単離し、Ｍ１６培地においてＣＯ２インキュベーター（７％ＣＯ２、３７℃）を用いて２日間培養し、胚盤胞期まで発生させた。胚盤胞期胚をマイトマイシンＣ処理したマウス胎児性線維芽細胞［ＭＥＦ］を敷き詰めた４穴ディッシュに移し、以下の組成の培地（ＣＣＭ＋３ｉ培地）中で培養した。胚がＭＥＦ上に付着し、内細胞塊（ＩＣＭ）の成長が始まるまで培地の交換は行わなかった（約１週間程度）。【００６６】
＜ＣＣＭ＋３ｉ培地＞
Glasgow minimal essential medium（ＧＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）
１０％（ｖ／ｖ）  ＦＣＳ；
１００μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｕｑｕｅ）；
１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
２０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
１０μｍ  ＡＣＴＨ；及び
３ｉ（ＦＧＦ受容体阻害剤  ＳＵ５４０２、２μＭ；ＭＥＫ活性化の阻害剤  ＰＤ１８４３５２、０．８μＭ；及びＧＳＫ３阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）【００６７】
内細胞塊（ＩＣＭ）が直径１００μｍ程度まで成長した段階で、２７ゲージ注射針を用いて、細胞塊を３、４個の塊に切断し、培養を継続した。毎日、培地交換をしながら、再度細胞塊の成長が起こり始めるのを待った（約４〜５日）。細胞塊の成長が確認出来たウェル中の細胞をトリプシン（０．０５％）−ＥＤＴＡによって処理し、ＭＥＦを敷き詰めた２４穴プレートに移し、ＣＣＭ＋３ｉ培地を用いた培養を続けた。ＥＳ細胞様の増殖が見られたので、細胞量に応じて２４穴プレートあるいは３．５ｃｍディッシュに撒き直した上で、ＣＣＭ＋３ｉ培地による培養を続けた。【００６８】
（結果）
２８個の着床前胚の培養を行い、９個のＥＳ様細胞（雌５クローン、雄４クローン）を得た。このうち、雄由来２クローンについて、Ｃ５７ＢＬ／６由来胚盤胞胚への微小注入をそれぞれ４０回あるいは４２回行い、それぞれ６個体（雌３、雄３）および９個体（雌３、雄６）のキメラマウスを得た（図１、２）。このうち、雄個体について生殖系列への伝達をチェックし、２個体における伝達を確認した（図３、４）。【００６９】
［比較例１］
ＣＣＭ＋３ｉ培地の代わりに、以下の組成を有する培地（比較培地１）を用いて、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／コモンガンマＫＯマウス着床前胚２１個を、実施例１と同一のプロトコールを用いて培養し、２クローンのＥＳ様細胞の作成に成功した。【００７０】
＜比較培地１＞
Glasgow minimal essential medium（ＧＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）
１０％（ｖ／ｖ）  ＦＣＳ；
１００μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｕｑｕｅ）；
１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
１００００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；及び
１０μｍ  ＡＣＴＨ
（比較培地１は、３ｉを含まず、ＬＩＦの濃度が１００００ｕｎｉｔｓ／ｍＬである点で、ＣＣＭ＋３ｉ培地と異なる。）【００７１】
しかしながら、一方のクローンについては、分化傾向が強く、クローニングを続けなければＥＳ様形態を維持出来なかった。また、１００回以上の微小注入を繰り返し、ようやくキメラ２個体（図５、６）を得たものの、生殖系列への伝達はおこらなかった。他方のクローンについては、細胞増殖が途中で止まり、消滅した。【００７２】
［比較例２］
実施例１と同一のプロトコールに従い、ＢＡＬＢ／ｃＡマウスの着床前胚からＥＳ細胞を樹立した。比較として、ＣＣＭ＋３ｉ培地の代わりに、以下の組成を有する培地（比較培地２）を用いて、ＥＳ細胞の樹立を試みた。【００７３】
＜比較培地２＞
Glasgow minimal essential medium（ＧＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）
１０％（ｖ／ｖ）  ＦＣＳ；
１００μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｕｑｕｅ）；
１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
２０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；及び
３ｉ（ＦＧＦ受容体阻害剤  ＳＵ５４０２、２μＭ；ＭＥＫ活性化の阻害剤  ＰＤ１８４３５２、０．８μＭ；及びＧＳＫ３阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）
（比較培地２は、ＡＣＴＨを含まない点で、ＣＣＭ＋３ｉ培地と異なる。）【００７４】
比較培地２を用いたところ、８個の着床前胚より３個のＥＳ様細胞を得、一方、ＣＣＭ＋３ｉ培地を用いた場合１２個の着床前胚より５個のＥＳ様細胞を得た。しかしながら、比較培地２培地によって得られた細胞は、いずれも増殖能が極端に低く、実質的な使用には不向きであった（図７、８、９、１０）。従って、比較培地２も、１２９、Ｃ５７ＢＬ／６以外の系統では、ＥＳ細胞の樹立には適していないと考えられた。【００７５】
［実施例２］
（方法）
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ由来ＥＳ細胞を、下記の培地（ＣＣＭ＋３ｉ培地）中で２Ｘ１０７までフィーダー細胞であるＭＥＦ上で増幅した後、電気穿孔法を用いた通常のプロトコールにより、線状化したヒト・エリスロポイエチン遺伝子ノックインベクター（図１１）を細胞内に導入した。【００７６】
＜ＣＣＭ＋３ｉ培地＞
Ｇｌａｓｇｏｗ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）
１０％（ｖ／ｖ）  ＦＣＳ；
１００μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｕｑｕｅ）；
１×非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
２０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
１０μｍ  ＡＣＴＨ；及び
３ｉ（ＦＧＦ受容体阻害剤  ＳＵ５４０２、２μＭ；ＭＥＫ活性化の阻害剤  ＰＤ１８４３５２、０．８μＭ；及びＧＳＫ３阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）【００７７】
遺伝子導入を行った細胞を６ｃｍ培養皿６枚上で、ＣＣＭ＋３ｉ培地中、ＭＥＦ上で再培養し，４８時間後に選択培地（ＣＣＭ＋３ｉ培地に１５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を添加したもの）に変更し、そのまま４〜５日培養を継続した。その後、顕微鏡下でＧ４１８耐性コロニーをピックアップし、得られた細胞塊をトリプシン（０．０５％）−ＥＤＴＡによって処理した上で、ＭＥＦを敷き詰めた４８穴プレートに移し、上記選択培地中で引き続き培養した。【００７８】
各ウェル内で増殖した細胞の半数を用いて遺伝子型の決定を行い、残る半分は凍結保存した。図１１に示すプライマー（Ｎｅｏ７９１ｒ／３’ｓｉｄｅ−Ｒ）を用いて，相同組み換え体のスクリーニングを行った。その結果、２４クーロンのうち、１６クーロンが相同組み換え体である可能性が示された。それらについて、今度は５’ｓｉｄｅＦ／Ｎｅｏ１５０２ｒプライマーを用いて遺伝子型を検証し，全てが相同組み換え体であることが示された。【００７９】
これらの組み換え体のうち３クーロンについて、Ｂ５７ＢＬ６由来胚盤胞胚への微小注入をそれぞれ４０回づつ行い、それぞれ６個体（♂３♀３）、９個体（♂６♀３）、６個体（♂３♀３）のキメラマウスを得た（図１２）。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の方法を用いれば、多能性及び生殖系列への伝達能力を維持したまま増殖可能なＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞を樹立することが出来る。
ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞を用いれば、インビトロでこのＥＳ細胞に様々な遺伝子操作を行い、容易に遺伝子改変ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスを製造することが可能となる。従って、ＮＯＤ／ＳＣＩＤバックグラウンドマウスのＥＳ細胞は、ヒト化マウス製造の基盤として有用である。【００８１】
本出願は、日本で出願された特願２０１０−０８６５６８（出願日：２０１０年４月２日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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