(57)【要約】  本発明は、ポリリン酸又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する腸管保護剤を提供する。
2011125619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリリン酸又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する腸管保護剤。
【請求項２】
熱ショックタンパク質２７の発現を誘導することに基づくものである、請求項１に記載の腸管保護剤。
【請求項３】
腸管バリア機能の低下を抑制するため、又は腸管バリア機能を回復するために使用される、請求項１又は２に記載の腸管保護剤。
【請求項４】
炎症性腸疾患を予防又は改善するために使用される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の腸管保護剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の腸管保護剤を含む医薬品。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の腸管保護剤を含む飲食品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の腸管保護剤における有効成分であるポリリン酸を産生し、かつ、腸管バリア機能の低下を抑制するため、又は腸管バリア機能を回復するために使用される微生物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の腸管保護剤における有効成分であるポリリン酸を産生し、かつ、炎症性腸疾患を予防又は改善するために使用される微生物。
【請求項９】
乳酸菌である、請求項７又は８に記載の微生物。
【請求項１０】
ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株である、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の微生物を含む医薬品。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の微生物を含む飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腸管保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の腸管は、有害微生物や毒素等から生体を守るバリア機能（腸管バリア機能）を有している。一方、何らかの原因によってその腸管バリア機能が破綻すると、有害微生物や毒素等の無秩序な生体内への侵入が生じ、様々な疾患の原因となり得る。例えば、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）やアルコール性肝障害等の腸管における疾患の発症には、腸管バリア機能の低下が寄与していると言われている。【０００３】
これまでに、腸管バリア機能の低下を抑制する物質として、ラクトバチルス・ラムノーサスＯＬＬ２８３８菌株が産生するリポテイコ酸（特許文献１）や、枯草菌のペンタペプチド（非特許文献１）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２１２００６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ．、２００７年、１巻、２９９−３０８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
腸管バリア機能の低下を抑制する、又は低下した腸管バリア機能を回復することにより腸管を保護することのできる腸管保護剤は、腸管バリア機能の低下を伴う種々の腸疾患の予防又は改善（治療、軽減）に有効であると考えられる。このような腸管保護剤はいくつか知られているものの、未だ、消費者の多様な需要を満たすのに十分な選択肢が存在するとは言えないのが実情である。【０００７】
そこで、本発明は、新規の腸管保護剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ポリリン酸又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する腸管保護剤を提供する。【０００９】
本発明の腸管保護剤は、ポリリン酸又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分としていることにより、腸管バリア機能の低下を抑制することができ、また腸管バリア機能の機能を回復することができる。本発明の腸管保護剤は、これらの作用を通じて、腸管を保護することができる。【００１０】
本発明の腸管保護剤は、このような作用メカニズムに基づいているため、腸管バリア機能の低下を抑制すること、又は腸管バリア機能を回復することを介して炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）を予防又は改善（治癒、軽減）することができる。【００１１】
本発明の腸管保護剤は、上述のような効果を奏することから、例えば、腸管バリア機能の低下を抑制するために使用すること、又は腸管バリア機能を回復するために使用することができる。また、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）の予防又は改善剤として使用することができる。【００１２】
本発明の腸管保護剤はまた、ポリリン酸又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分としていることにより、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）２７の発現を誘導することができる。本発明の腸管保護剤による上記作用メカニズムの少なくとも一部は、このＨＳＰ２７の発現誘導に基づくものである。【００１３】
本発明の腸管保護剤は、医薬品成分、飲食品成分、飲食品添加物、飼料成分、飼料添加物等として使用することができる。【００１４】
本発明はまた、腸管バリア機能の低下を抑制するため、又は腸管バリア機能を回復するために使用される、上記ポリリン酸を産生する微生物を提供する。本発明の微生物は、上記ポリリン酸を産生することから、腸管バリア機能の低下を抑制するため、又は腸管バリア機能を回復するために使用することができる。同様に、上記ポリリン酸を産生することから、炎症性腸疾患を予防又は改善するために使用することができる。【００１５】
上記微生物は、乳酸菌とすることが好ましい。乳酸菌は腸内で生存及び増殖し、上記ポリリン酸を継続的に腸内で供給することができるため、より高い効果を奏する。【００１６】
上記乳酸菌として、ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株とすることができる。ラクトバチルス・ブレビスは、古くから発酵食品に利用されている乳酸菌の一種であるため、生体への安全性が確立されている。したがって、長期間継続的に摂取することもできる。なお、ラクトバチラス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株は、２００６年６月２８日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託された、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３２の菌株である。【００１７】
また、本発明の微生物は、医薬品成分、飲食品成分、飲食品添加物、飼料成分、飼料添加物等として使用することもできる。【００１８】
上述のように、ポリリン酸若しくはその薬学的に許容可能な塩又は上記微生物は、腸管保護のため或いは腸管バリア機能の低下抑制又は腸管バリア機能の回復のために使用することができる。更にまた、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）の予防又は改善のために使用することができる。【００１９】
すなわち、本発明はまた、ポリリン酸若しくはその薬学的に許容可能な塩又は上記微生物を有効量投与して腸管を保護する方法を提供する。また、ポリリン酸若しくはその薬学的に許容可能な塩又は上記微生物を有効量投与して、腸管バリア機能の低下を抑制し又は腸管バリア機能を回復する方法を提供する。更にまた、ポリリン酸若しくはその薬学的に許容可能な塩又は上記微生物を有効量投与して、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）を予防又は改善する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ポリリン酸又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する新規な腸管保護剤が提供される。本発明の腸管保護剤は、腸管バリア機能の低下を抑制すること、及び腸管バリア機能を回復することにより腸管を保護することができる。また、この作用により炎症性腸疾患を効果的に予防又は改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１における、ＨＳＰ２７の発現誘導を示すウエスタンブロットの写真である。
【図２】実施例２における、ＨＳＰ２７発現誘導物質の分離を示すウエスタンブロットの写真である。
【図３】実施例３のＨＳＰ２７発現誘導物質の単離における各プロセスでの単離状況を示すウエスタンブロットの写真である。
【図４】実施例３のＨＳＰ２７発現誘導物質の単離における各プロセスでの単離状況を示すＨＰＬＣチャート及びウエスタンブロットの写真である。
【図５】実施例５における、分解ポリリン酸によるＨＳＰ２７の発現誘導を解析した結果を示すウエスタンブロットの写真である。
【図６】実施例６における急性腸炎誘発マウスの生存曲線である。
【図７】実施例６における急性腸炎誘発マウスの結腸長を示すグラフである。
【図８】実施例６における急性腸炎誘発マウスの腸組織染色写真である。
【図９】実施例７の合成ポリリン酸のＨＰＬＣチャートである。
【図１０】実施例７における、合成ポリリン酸によるＨＳＰ２７の発現誘導を示すウエスタンブロットの写真である。
【図１１】実施例８における急性腸炎誘発マウスの生存曲線である。
【図１２】実施例８における急性腸炎誘発マウスの結腸長を示すグラフである。
【図１３】実施例９におけるマンニトール漏出量を示すグラフである。
【図１４】実施例１０のウエスタンブロットを示す写真である。
【図１５】実施例１１におけるマンニトール漏出量を示すグラフである。
【図１６】実施例１２におけるマンニトール漏出量を示すグラフである。
【図１７】実施例１２におけるマンニトール漏出量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の腸管保護剤は、ポリリン酸又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分とするものである。
【００２３】
本発明者らは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）により急性腸炎を誘発した炎症性腸疾患モデルマウスにおいて、ポリリン酸によって、腸管バリア機能の低下が抑制されること、及び腸管バリア機能の機能が回復されることを介して、有意に死亡率を低下させ得ることを見出した。本発明者らはまた、腸管上皮細胞において、ポリリン酸により、ＨＳＰ２７の発現が誘導されることを見出した。本発明はこれらの新規な知見に基づくものである。
【００２４】
したがって、本実施形態における腸管保護剤は、腸管バリア機能の低下を抑制するため、又は腸管バリア機能の機能を回復するために使用することができる。すなわち、腸管バリア機能の低下を原因とする腸疾患の予防又は改善のために使用することができる。
【００２５】
本明細書においてポリリン酸とは、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）が脱水縮合した縮合リン酸化合物を意味する。このような縮合リン酸化合物としては、例えば、リン酸が鎖状に連なった鎖状ポリリン酸、両末端同士が結合した環状ポリリン酸等が挙げられる。また、鎖状ポリリン酸としては、例えば、分岐を有しない直鎖状ポリリン酸、分岐を有する分岐鎖状ポリリン酸等が挙げられる。
【００２６】
ここで、直鎖状ポリリン酸は、下記一般式（１）で表すことができる。なお、一般式（１）中、ｎは０又は自然数を示す。分岐鎖状ポリリン酸は、例えば、下記一般式（１）で表わされる直鎖状ポリリン酸の側鎖に、分岐を有しない直鎖状ポリリン酸、又は分岐を有する分岐鎖状ポリリン酸が更に結合したものが挙げられる。
【化１】
2011125619.tif 000003
【００２７】
一般式（１）中、ｎは、１０以上であることが好ましく、５０以上であることがより好ましく、１００以上であることがさらに好ましい。このような高分子ポリリン酸を用いることで、より効果的に腸管バリア機能の低下抑制作用及び腸管バリア機能の機能回復作用を及ぼすことができ、これらを介してより効果的に腸管を保護することができる。また、より効果的に炎症性腸疾患を予防又は改善（治癒、軽減）することができる。一方、ｎの上限には特に制限はないが、取扱いの容易さという観点から、例えば、ｎは１０，０００以下とすることができる。
【００２８】
本実施形態におけるポリリン酸は、限外濾過を行った場合に、分画分子量１０ｋＤａの限外濾過膜を透過しない高分子ポリリン酸であることが好ましい。なお、本明細書において限外濾過とは、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）からなる限外濾過膜を備えたスピンカラムを用い、このスピンカラムに被濾過サンプルを添加した後、遠心分離することによって、被濾過サンプル中の分子を濾別することを意味する。
【００２９】
本実施形態における腸管保護剤には、上記ポリリン酸は、薬学的に許容可能な塩として含まれていてもよい。このような薬学的に許容可能な塩は、ポリリン酸と無毒な塩を形成する塩基とにより形成されるものである。具体的には、特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００３０】
また、本実施形態における腸管保護剤には、上記ポリリン酸及びその薬学的に許容可能な塩が複数種類含まれていてもよい。
【００３１】
ポリリン酸の製造方法は、特に限定されるものではないが、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を原料としてポリリン酸を合成する合成工程を少なくとも備えたものとすることができる。また、合成したポリリン酸を精製する精製工程を更に備えていてもよい。
【００３２】
上記合成工程では、ポリリン酸を、化学合成してもよく、酵素等の生体分子を用いてインビトロで合成してもよく、又はポリリン酸を産生する微生物等を利用して合成してもよい。直鎖状ポリリン酸を合成する場合には、高い効率で直鎖状ポリリン酸を得ることができるため、酵素等の生体分子を用いてインビトロで合成すること、又は微生物等を利用して合成することが好ましい。
【００３３】
ポリリン酸を化学合成する方法としては、例えば、ＡＴＰを原料として含む反応溶液を加熱して、脱水縮合する方法が挙げられる。加熱温度としては、例えば、１５０〜３５０℃とすることができる。
【００３４】
酵素等の生体分子を用いてインビトロでポリリン酸を合成する方法としては、例えば、ポリリン酸を合成する酵素であるポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）を「酵素等の生体分子」として用い、ＡＴＰを原料としてＰＰＫの酵素作用によりポリリン酸を合成する方法が挙げられる。ＰＰＫはラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ菌株やラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株などの多くのプロバイオティクスが具備していることが報告されており、その酵素の遺伝子配列もＤＢに公開されている。
【００３５】
ＰＰＫは、ＡＴＰを基質としてポリリン酸を合成できるものであればよく、ＰＰＫを発現している任意の菌株から得ることもできるし、市販されているものを購入してもよい。ＰＰＫとしては、例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ由来のＰＰＫとすることができる。
【００３６】
ＰＰＫによる酵素反応は可逆的であるが、反応液中にＡＴＰと比べて大量のＡＤＰが存在する場合、ＡＤＰ／ＡＴＰ比が平衡に達するように、ポリリン酸の分解反応が優勢となる。したがって、ポリリン酸を効率よく合成するためには、反応液中にＡＤＰを添加しないことが好ましい。その他の反応液組成、反応温度、反応時間等の条件は、ＰＰＫ活性に対して最適となるように、また合成スケール等に応じて適宜設定することができる。一例として、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ由来のＰＰＫを用いてポリリン酸を合成する場合の反応条件を以下に示す。まず反応液組成を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、４０ｍＭ  硫酸アンモニウム、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ  クレアチンリン酸、２０ｎｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ、１ｍＭ  ＡＴＰ（ｐＨ７．２）及び１Ｕ／ｍｌ  ＰＫＫとし、反応温度を３７℃とし、反応時間を０．５〜１０時間とすることができる。反応時間は、目的とするポリリン酸の分子量及び収率に応じて適宜設定してよく、例えば、高分子量のポリリン酸を収率よく得るためには、反応時間を１〜５時間とすることが好ましい。
【００３７】
微生物等を利用して合成する方法としては、例えば、ポリリン酸を産出する微生物を適切な培養条件下で培養して、微生物にポリリン酸を製造させる方法が挙げられる。ポリリン酸を産出する微生物の例としては、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ菌株、ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株、ラクトバチルスに属する菌株、ビフィドバクテリウムに属する菌株、エンテロコッカスに属する菌株、ラクトコッカスに属する菌株、ペディオコッカスに属する菌株、リューコノストックに属する菌株、ストレプトコッカスに属する菌株、バクテロイデスに属する菌株、ユーバクテリウムに属する菌株、クロストリジウムに属する菌株等が挙げられる。
【００３８】
利用する微生物の増殖を維持できる適切な培地、適切な培養温度条件で、その微生物を培養することでポリリン酸を合成することができる。合成されたポリリン酸は、培養後の培地から回収するか、又は培養後の微生物を破砕して回収することができる。
【００３９】
合成したポリリン酸の精製工程においては、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、透析、塩析、硫安沈殿、沈殿、結晶化等、本技術分野で汎用されている精製方法を適宜組み合わせて使用することができる。使用する精製方法は、ポリリン酸の合成工程で用いた方法、目的とする精製度、目的とする収率等に応じて適宜決定することができる。
【００４０】
精製工程の一例を挙げる。合成工程後、ＣａＣｌ２を反応液に添加し、合成したポリリン酸を凝集させ、遠心分離して、ポリリン酸カルシウム塩の沈殿を回収する。沈殿をＥＤＴＡ溶液に溶解させ、透析膜を用いて透析する。透析により低分子を取り除いた合成ポリリン酸精製溶液が得られる。合成ポリリン酸精製溶液は、更にＨＰＬＣ等のクロマトグラフィーを用いて分子量、電荷等に基づいて分画することができる。これにより、例えば、所望の分子量範囲にある合成ポリリン酸を得ることができる。
【００４１】
本発明の腸管保護剤は、固体（例えば、凍結乾燥させて得られる粉末）、液体（水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液）、ペースト等のいずれの形状でもよく、また、散剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤等のいずれの剤形を取ってもよい。
【００４２】
上述の各種製剤は、ポリリン酸又はその薬学的に許容可能な塩のほか、上述のような各種製剤に一般的に用いられる添加剤を加えることもできる。このような添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等が挙げられる。
【００４３】
例えば、賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ８０等が挙げられる。懸濁化剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００４４】
本発明の腸管保護剤は、医薬品成分、飲食品成分、飲食品添加物、飼料成分、飼料添加物等として使用することができる。
【００４５】
例えば、本発明の腸管保護剤は、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醤油、味噌、菓子類等の飲食品への添加物として使用することができる。これらの飲食品は、当分野で通常使用される他の添加物を更に含有してもよく、そのような添加物としては、例えば、苦味料、香料、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂；グルコース、フルクトース等の単糖類；スクロース等の二糖類；デキストロース、デンプン等の多糖類；エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール等の糖アルコール類；ビタミンＣ等のビタミン類、が挙げられる。
【００４６】
本発明の腸管保護剤はまた、特定保健用食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、病者用食品等の成分として使用することもできる。
【００４７】
本発明の腸管保護剤は、ヒトに投与しても、非ヒト哺乳動物に投与してもよい。投与量及び投与方法は、投与される個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。好適な投与方法としては、例えば、経口投与、座薬投与、直腸投与が挙げられる。
【００４８】
本発明の他の実施形態として、腸管バリア機能の低下を抑制するため、又は腸管バリア機能を回復するために使用される、また、炎症性腸疾患の予防又は改善剤として使用される、上記ポリリン酸を産生する微生物が提供される。
【００４９】
上記ポリリン酸を産生する微生物は、ポリリン酸の産生を指標としてスクリーニングすることにより得ることができる。ポリリン酸の産生を指標としたスクリーニング方法としては、例えば、被検微生物を各菌株に適した培養条件（培地組成、培養温度等）で培養し、培養後の培養上清中に産出されたポリリン酸を定量し、ポリリン酸の産出量が多い菌株を取得することにより、行うことができる。培養上清中のポリリン酸の定量は、例えば、トルイジンブルー−Ｏ（ＴＢＯ）法により直接ポリリン酸を定量してもよいし、モリブデンブルー法によるリン酸の定量と組み合わせてもよい。また、培養上清をＨＰＬＣ等により分析し、ポリリン酸の存在量及び分子量の解析を行い、目的とする分子量を有するポリリン酸を産生する菌株を選択してもよい。
【００５０】
本実施形態に係る微生物は、上記ポリリン酸を産生することから、腸管バリア機能の低下を抑制するため、又は腸管バリア機能を回復するため、また、炎症性腸疾患を予防又は改善するために、使用することができる。上記微生物は、生菌のまま使用してもよく、また、菌の粉砕物として使用してもよい。
【００５１】
また、本実施形態に係る微生物は、上述の腸管保護剤と同様に、医薬品成分、飲食品成分、飲食品添加物、飼料成分、飼料添加物等として、また、特定保健用食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、病者用食品等の成分として使用することもできる。
【００５２】
本実施形態に係る微生物の例として、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ菌株、ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株、ラクトバチルスに属する菌株、ビフィドバクテリウムに属する菌株、エンテロコッカスに属する菌株、ラクトコッカスに属する菌株、ペディオコッカスに属する菌株、リューコノストックに属する菌株、ストレプトコッカスに属する菌株、バクテロイデスに属する菌株、ユーバクテリウムに属する菌株、クロストリジウムに属する菌株等が挙げられる。
【００５３】
本実施形態に係る上記微生物としては、乳酸菌であることが好ましい。乳酸菌は腸内で生存することができるため、生菌のまま用いた場合、上記ポリリン酸を継続的に腸管に供給することができ、より高い効果を奏することができる。また、上記乳酸菌として、ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株とすることが好ましい。ラクトバチルス・ブレビスは、古くから発酵食品に利用されている乳酸菌の一種であるため、生体への安全性が確立されている。したがって、長期間継続的に摂取することもでき、より効果的に腸管バリア機能の低下を抑制すること、腸管バリア機能を回復すること、又は炎症性腸疾患の予防又は改善が可能である。
【実施例】
【００５４】
〔実施例１〕
ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養上清によるＨＳＰ２７の発現誘導
ヒト大腸癌由来腸管上皮細胞（Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞）を用いて、乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養上清によりＨＳＰ２７の発現が誘導されるかどうかを解析した。【００５５】
（培養上清の調製）
ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株をＤｅＭａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）中、３７℃のインキュベーターにて２４時間培養し、培養上清を得た。また、未使用のＭＲＳ培地をコントロールとして用意した。次に、培養時間を１２時間、３６時間、６０時間に変更して、同様にして培養上清を得た。なお、１２時間、３６時間、６０時間培養したときの、培養液のＯＤ６００値は、それぞれ、０．０６９、０．４４３、０．３９８であった。これを乳酸菌数に換算すると、それぞれ、０．１１×１０９、１．０７×１０９、０．９５×１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。【００５６】
（Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞の培養）
Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞は、ＡＴＣＣより入手した（カタログ番号ＣＲＬ−２１０２）。Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１０μｇ／ｍｌトランスフェリンを補った高グルコース−ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（試薬は全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社製）中で、ＣＯ２インキュベーターにて、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。上記条件下で維持継代培養を行っていたＣａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞を、６ウェル又は１２ウェル培養プレートに１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種し、１０〜１４日間培養して分化させた。各種試験には、このようにして分化させたＣａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞を用いた。【００５７】
（培養上清によるＨＳＰ２７タンパク質の誘導）
ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養上清を１０％（ｖ／ｖ）含む培地中でＣａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞を２４時間培養した後、ＨＳＰ２７タンパク質の発現量をウエスタンブロット法により解析した。【００５８】
（ウエスタンブロット法による解析）
ウエスタンブロット法によるタンパク質の解析を次のようにして行った。
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄したＣａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞から、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）を用い、タンパク質を抽出した。抽出したタンパク質１０〜３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ただちに、転写バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．８、１９２ｍＭグリシン、２０％  ｖ／ｖメタノール）中で、ニトロセルロース膜に転写した。
転写後のニトロセルロース膜（ブロット）を、５％（ｖ／ｖ）スキムミルク又は１％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含有するＴ−ＰＢＳ（０．０５％  ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）中、室温で１時間インキュベートし、ブロットをブロッキングした。次に、１次抗体として抗ＨＳＰ２７抗体及び抗ＨＳＣ７０抗体（いずれも、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社製）を用い、ブロットを４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、Ｔ−ＰＢＳを用いて、室温で１０分間ブロットを洗浄した。この洗浄を３回繰返した後、ブロットを２次抗体とともに６０分間インキュベートした。２次抗体には、１次抗体が由来する生物に応じた適切なＨＲＰ標識抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ブロットをＴ−ＰＢＳで３回洗浄した後、Ｓｕｐｅｒ−Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅシステム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用い、化学発光法によりシグナルを検出した。【００５９】
ウエスタンブロットの結果を図１に示した。ＨＳＣ７０は構成的に発現しているタンパク質であり、ここではローディング・コントロールとして用いている。未使用のＭＲＳ培地を１０％（ｖ／ｖ）含有する培地（コントロール）中、又はラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３を２４時間培養した培養上清を１０％（ｖ／ｖ）含有する培地（培養上清含有培地）中で、Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞を２４時間培養し、ウエスタンブロット解析を行った。ＨＳＣ７０の発現量には、両条件で大きな差異がみられなかったのに対して、ＨＳＰ２７の発現量は、培養上清含有培地で培養した場合に、有意に高かった（図１（Ａ））。また、ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株を１２時間培養した培養上清は、３６時間及び６０時間培養した培養上清と比べて、より強くＨＳＰ２７の発現を誘導した（図１（Ｂ））。【００６０】
以上の結果から、ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養上清により、ヒト大腸癌由来腸管上皮細胞Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞において、ＨＳＰ２７の発現が誘導されることがわかった。また、この培養上清により誘導されるＨＳＰ２７の発現量は、培養上清を調製する際に、ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株を培養していた時間に依存することがわかった。【００６１】
〔実施例２〕
ＨＳＰ２７発現誘導物質の分離
ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養上清により、ＨＳＰ２７の発現を誘導できることが明らかとなったので、次に、ＨＳＰ２７発現誘導物質の分離を試みた。【００６２】
（ＨＳＰ２７発現誘導物質のＭＷＣＯ膜による分離）
ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養液を遠心加速度５００×ｇにて１０分間遠心分離して、培養上清を回収し、この培養上清を孔径０．２μｍのフィルターで濾過して、その濾液を得た。得られた濾液中に含まれる成分を、分画分子量（ＭＷＣＯ）が５ｋＤａ、１０ｋＤａ、３０ｋＤａ又は５０ｋＤａであるＭＷＣＯ膜を備えたＶｉｖａｓｐｉｎウルトラフィルトレーションスピンカラム（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて分画した。次に、ＭＷＣＯ膜を通過した透過液によるＨＳＰ２７の発現誘導を、実施例１と同様に、解析した。【００６３】
（ＨＳＰ２７発現誘導物質の硫安沈殿による分離）
ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養液を遠心加速度５００×ｇにて１０分間遠心分離して、培養上清を回収し、この培養上清を孔径０．２μｍのフィルターで濾過して、その濾液を得た。得られた濾液に、６５％飽和に達するまで、撹拌しながら、硫酸アンモニウムを添加した。６５％飽和に達したところで濾液を遠心加速度５０００×ｇにて１０分間遠心分離して、沈殿（６５％硫安ペレット）と上澄みを分取した。分取した上澄みに対して、９０％飽和になるまで、撹拌しながら、更に硫酸アンモニウムを添加した。９０％飽和に達したところで上澄みを遠心加速度５０００×ｇにて１０分間遠心分離して、沈殿（９０％硫安ペレット）と上清（硫安上清）を分取した。沈殿（６５％硫安ペレット及び９０％硫安ペレット）は、蒸留水に溶解させた後、分画分子量７０００の透析チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて脱塩した。このようにして得られた６５％硫安ペレットの水溶液、９０％硫安ペレットの水溶液、硫安上清によるＨＳＰ２７の発現誘導を、実施例１と同様に、解析した。【００６４】
ウエスタンブロットの結果を図２に示した。実施例１と同様に、ＨＳＣ７０をローディング・コントロールとして用いた。【００６５】
未使用のＭＲＳ培地を１０％（ｖ／ｖ）含有する培地（コントロール）、ＭＷＣＯ膜による分画を行っていない培養上清を１０％（ｖ／ｖ）含有する培地（培養上清）、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を通過した透過液（それぞれ、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜透過液、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜透過液、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜透過液、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜透過液）を１０％（ｖ／ｖ）含有する培地中で、Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞を２４時間培養し、ウエスタンブロット解析を行った。その結果、５ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜透過液及び１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜透過液では、コントロールと同程度のＨＳＰ２７発現量であった（図２（Ａ））。一方、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜透過液及び５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜透過液では、培養上清と同程度のＨＳＰ２７発現量であった（図２（Ａ））。【００６６】
６５％硫安ペレットの水溶液、９０％硫安ペレットの水溶液、硫安上清を、それぞれ、１００倍希釈液（１／１００）、１０倍希釈液（１／１０）、１倍希釈液（１）として、１０％（ｖ／ｖ）含有する培地中で、Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞を２４時間培養し、ウエスタンブロット解析を行った。その結果、６５％硫安ペレットの水溶液により、ＨＳＰ２７の発現が強く誘導された（図２（Ｂ））。【００６７】
実施例２の結果から、ＨＳＰ２７発現誘導物質は、１０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を通過しない成分中に主に含まれていること、及び６５％硫安ペレット中に主に含まれていることがわかった。【００６８】
〔実施例３〕
ＨＳＰ２７発現誘導物質の単離
ＨＳＰ２７発現誘導物質を、実施例２における６５％硫安ペレットから単離した。【００６９】
（陰イオン交換クロマトグラフィー分離）
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０（ＧＥヘルスケア社製）を満たしたカラムに６５％硫安ペレット水溶液を添加した。次に、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で調製した０Ｍ、０．１Ｍ、０．５Ｍ及び１Ｍ  ＮａＣｌ溶液を、この順に、カラムに添加し、カラムから吸着成分を溶出した。それぞれの溶出液によるＨＳＰ２７の発現誘導を、実施例１と同様に、解析した。【００７０】
（サイズ排除クロマトグラフィー分離）
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００を満たしたカラムに、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、１．０Ｍ  ＮａＣｌにより溶出された画分をロードし、２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で溶出した。溶出液を１フラクションあたり５ｍｌづつ、２０フラクションに分けて回収した。得られた２０フラクションの溶出液それぞれによる、ＨＳＰ２７の発現誘導を、実施例１と同様に、解析した。【００７１】
（ＨＰＬＣ分離）
Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ８００カラム（３００ｍｍ×８ｍｍ、昭和電工社製）を用い、ＡＫＴＡｄｅｓｉｇｎ  ＨＰＬＣシステム（ＧＥヘルスケア社製）により、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、フラクション番号１７及び１８として回収した溶出液を更に分画した。２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を溶出液として、流速０．１ｍｌ／分でサンプルを溶出した。溶出された液は波長２２０ｎｍの紫外光の吸収によってモニタリングし、吸収ピーク（Ａ１〜Ａ３）がみられる溶出画分を分取した。分取した溶出画分によるＨＳＰ２７の発現誘導を、実施例１と同様に、解析した。【００７２】
図３にＨＳＰ２７発現誘導物質の単離における各プロセスでの、単離状況の解析結果を示した。陰イオン交換クロマトグラフィーによる分離によって得た、０Ｍ  ＮａＣｌ溶出液、０．１Ｍ  ＮａＣｌ溶出液、０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶出液、１．０Ｍ  ＮａＣｌ溶出液による、ＨＳＰ２７の発現誘導を、ウエスタンブロットにより解析した。その結果、１．０Ｍ  ＮａＣｌ溶出液により、ＨＳＰ２７の発現が強く誘導された（図３（Ａ））。【００７３】
サイズ排除クロマトグラフィーにより分離した溶出液によるＨＳＰ２７の発現誘導を、ウエスタンブロットにより解析した。溶出液には、溶出された順に１〜２０のフラクション番号を付した。ウエスタンブロットの結果、フラクション番号１４〜１９の溶出液によりＨＳＰ２７の発現誘導が観察され、特にフラクション番号１７及び１８の溶出液において強く発現が誘導された（図３（Ｂ））。【００７４】
ＨＰＬＣのチャートを図４（Ａ）に示した。チャートの横軸は保持時間、縦軸は波長２２０ｎｍの吸光度を表す。上述のＨＰＬＣ条件において、主要な３つのピーク（Ａ１〜Ａ３）が観察された（図４（Ａ））。Ａ１〜Ａ３のピークに対応する溶出画分をそれぞれ分取し、ＨＳＰ２７の発現誘導を、ウエスタンブロットにより解析した。結果を図４（Ｂ）に示す。図４（Ｂ）中のグラフは、ウエスタンブロットの結果からＨＳＣ７０及びＨＳＰ２７のタンパク質量を定量し、ＨＳＣ７０に対するＨＳＰ２７のタンパク質量の割合を計算した結果を示したものである（図４（Ｂ））。なお、図４（Ｂ）中に示した濃度（μｇ／ｍｌ）は、各溶出画分中に含まれる成分をタンパク質であると仮定して、２２０ｎｍの吸光度から求めたものである。ウエスタンブロットの結果、Ａ１画分及びＡ２画分により、用量依存的に、ＨＳＰ２７タンパク質の発現が誘導された（図４（Ｂ））。【００７５】
以上の結果から、ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養液を、硫安沈降、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣにより精製した結果、ＨＳＰ２７発現誘導物質は、ＨＰＬＣにより得られたＡ１画分及びＡ２画分に、主に存在していることがわかった。【００７６】
〔実施例４〕
ＨＳＰ２７発現誘導物質の同定
実施例３において得られたＡ１画分及びＡ２画分を用いて、ＨＳＰ２７発現誘導物質の同定を行った。まず、Ａ１画分及びＡ２画分を、タンパク質の酸加水分解反応が生じる条件に供し、Ａ１画分及びＡ２画分に含まれるアミノ酸組成を分析した。しかしながら、Ａ１画分及びＡ２画分のいずれからもアミノ酸成分は検出されなかった（データは示さず）。また、中性糖及びウロン酸の含有量は、１％以下であった（データ示さず）。すなわち、ＨＳＰ２７発現誘導物質は、タンパク質でもなく、また多糖類でもなかった。次に、Ａ１画分及びＡ２画分を電子顕微鏡スキャンによって元素分析した結果、これらの画分はリンと酸素を多量に含有していることがわかった（データは示さず）。そこで、トルイジンブルー−Ｏ（ＴＢＯ）法及びモリブデンブルー法により、ポリリン酸、リン酸含有量の定量を行った。【００７７】
（ＴＢＯ法によるポリリン酸の定量）
ＴＢＯ法により、Ａ１画分及びＡ２画分中のポリリン酸の定量を行った。Ａ１画分及びＡ２画分をサンプルとし、それぞれ１０μｌを５００μｌのＴＢＯアッセイ溶液と混合した。ＴＢＯアッセイ溶液は、０．１規定の酢酸に１５ｍｇ／ｍｌとなるようにＴＢＯを溶解したものである。室温で１５分間反応させた後、ただちに波長６２０ｎｍの吸光度を測定した。【００７８】
（モリブデンブルー法によるリン酸の定量）
Ａ１画分及びＡ２画分各５μｌに等量の２規定塩酸を添加した後、９５℃で３０分間インキュベートして、ポリリン酸を酸加水分解した。このそれぞれの酸加水分解液をサンプルとして用い、モリブデンブルー法により、リン酸を定量した。酸加水分解液に滅菌水を加えて３００μｌにした後、７００μｌのモリブデンブルーアッセイ溶液を加えて混合した。なお、モリブデンブルーアッセイ溶液は、１規定硫酸と１０％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸とを６：１で混合した溶媒に、０．４２（ｗ／ｖ）％となるよう（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏを溶解させたものである。混合液を４５℃で２０分間反応させた後、波長７５０ｎｍの吸光度を測定し、濃度既知のリン酸溶液で作成した標準曲線から、リン酸濃度を計算した。【００７９】
ＴＢＯ法によるポリリン酸の定量結果を表１に示した。ブランクと比べて、Ａ１画分及びＡ２画分のサンプルにおいて、波長６２０ｎｍの吸光度が減少した。これは、ＴＢＯのメタクロマジーによるものであり、Ａ１画分及びＡ２画分中に、ポリリン酸が存在することを示している。【００８０】
【表１】
2011125619.tif 000004
【００８１】
モリブデンブルー法によるリン酸の定量結果を表２に示した。いずれの画分にもリン酸が６０％以上含まれていた。【００８２】
【表２】
2011125619.tif 000005
【００８３】
以上の結果から、ラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３菌株の培養上清中に存在するＨＳＰ２７発現誘導物質は、ポリリン酸であることが強く示唆された。なお、上述のＡ２画分を、ＬＰＰ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と名付けた。【００８４】
〔実施例５〕
ポリリン酸によるＨＳＰ２７発現誘導の確認
ＬＰＰ中のポリリン酸を分解酵素によって分解し、ＬＰＰによるＨＳＰ２７の発現誘導能力が喪失するかどうかを解析した。【００８５】
（ＬＰＰ中のポリリン酸の分解）
ＬＰＰ２μｌを全容量３０μｌの反応溶液中、３７℃で３時間反応させ、ポリリン酸を分解した。反応溶液の組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  硫酸アンモニウム、４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、１０μｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＰ、４０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１Ｕ／μｌのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｈｅｒｍａｎｉｉ由来ポリリン酸キナーゼ（ＰＰＫ）であった。反応後、反応溶液は９５℃で２分間インキュベートしてＰＰＫを失活させ、ポリリン酸を分解したＬＰＰを得た。このポリリン酸を分解したＬＰＰによるＨＳＰ２７の発現誘導を、実施例１と同様に、解析した。なお、ＰＫＫによる酵素反応は可逆的であるが、反応液中にＡＴＰと比べて大量のＡＤＰが存在する場合、ＡＤＰ／ＡＴＰ比が平衡に達するように、ポリリン酸の分解反応が優勢となる。したがって、上記反応条件においては、ポリリン酸を分解する方向へと反応が進む。【００８６】
ポリリン酸を分解したＬＰＰによるＨＳＰ２７発現誘導をウエスタンブロットで解析した結果を図５に示した。図５中のグラフは、ウエスタンブロットの結果からＨＳＣ７０及びＨＳＰ２７のタンパク質量を定量し、ＨＳＣ７０に対するＨＳＰ２７のタンパク質量の割合を計算した結果を、コントロールを１００％として、示したものである（図５）。図５中、ＬＰＰとのラベルは、ポリリン酸の分解反応を行っていないＬＰＰ、ＬＰＰ＋ＰＰＫは、ポリリン酸を分解したＬＰＰを示す。図５から明らかなように、ＬＰＰ中のポリリン酸を分解することにより、ＨＳＰ２７の発現が誘導されなくなった。【００８７】
以上の結果より、ＡＤＰ過剰存在下でＬＰＰにポリリン酸分解酵素を作用させ、ポリリン酸を分解することにより、ＬＰＰによるＨＳＰ２７の発現が誘導されなくなることがわかった。したがって、ＨＳＰ２７発現誘導物質はポリリン酸であることが明らかとなった。【００８８】
〔実施例６〕
ＤＳＳ処理マウスにおけるＬＰＰによる腸管障害及び生存率の改善
半数致死量のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を投与して腸管（腸粘膜）障害を誘発したマウスを用いて、腸管障害及び生存率に対するポリリン酸（ＬＰＰ）の影響を解析した。【００８９】
（半数致死量のＤＳＳで処理したマウスにおける生存率の解析）
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、４％（ｗ／ｖ）となるようにＤＳＳ（分子量２，５００）を添加した飲料水を与えた。次いで、被検対象となるＬＰＰ群（ｎ＝５）には、試験期間中毎日、１００μｌのＰＢＳに溶解させた１０μｇのＬＰＰを直腸内に投与した。一方、対照となるコントロール群（ｎ＝５）には、試験期間中毎日、１００μｌのＰＢＳを直腸内に投与した。試験開始から２０日間、被検マウスの生存状況を確認し、生存曲線を求めた。【００９０】
（ＤＳＳで処理したマウスにおける腸管障害の解析）
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、３％（ｗ／ｖ）となるようにＤＳＳを添加した飲料水を与えた。次いで、被検対象となるＬＰＰ群（ｎ＝５）には、試験期間中毎日、１００μｌのＰＢＳに溶解させた１０μｇのＬＰＰを直腸内に投与した。一方、対照となるコントロール群（ｎ＝５）には、試験期間中毎日、１００μｌのＰＢＳを直腸内に投与した。試験開始から７日後に、盲腸から肛門までの全結腸をマウスから取り出し、結腸長を測定した。【００９１】
（組織学的解析）
結腸を１０％緩衝ホルマリン液で固定化した後、標準的な方法により、パラフィンに包埋した。これを５μｍの切片に切断した後、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）で染色し、光学顕微鏡下で観察した。【００９２】
図６に生存曲線を示した。コントロール群は試験開始から１３日以内に全てのマウスが死亡したのに対し、ＬＰＰ群は１３日めで６０％のマウスが生存していた（図６）。ＬＰＰ群の累積生存率は、コントロール群の累積生存率と比べて有意に高かった。【００９３】
結腸長の測定結果を図７に示した。ＬＰＰ群の結腸長は、ＤＳＳ処理を施していない正常マウスの結腸長と比べて有意な差はなかった。一方、コントロール群の結腸長は、正常マウスの結腸長と比べて有意に短くなっていた（図７）。この結果は、ＬＰＰの投与により、ＤＳＳ処理によって誘発された腸管障害が抑制又は改善されたことを示している。【００９４】
ＨＥ染色による結腸標本の典型的な写真を図８に示した。コントロール群と比べて、ＬＰＰ群では腸管障害の改善が観察された（図８）。【００９５】
実施例６の結果、ＬＰＰの投与により、半数致死量のＤＳＳで処理したマウスの生存率を向上させることができ、かつ、腸管障害を抑制又は改善できることが明らかとなった。【００９６】
〔実施例７〕
酵素合成ポリリン酸によるＨＳＰ２７の発現誘導
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素的に合成したポリリン酸（酵素合成ポリリン酸）によりＨＳＰ２７の発現が誘導されるかどうかを解析した。【００９７】
（ポリリン酸の合成）
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、４０ｍＭ  硫酸アンモニウム、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０ｍＭ  クレアチンリン酸、２０ｎｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ、１ｍＭ  ＡＴＰ（ｐＨ７．２）及び１Ｕ／ｍｌ  ＰＰＫを含む反応液１ｍｌを、３７℃で３時間反応させた。反応後、１００μｌの５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を反応液に添加し、合成されたポリリン酸を凝集させた。その後、遠心加速度５，０００×ｇにて１０分間遠心分離して、ポリリン酸の沈殿を回収した。この沈殿を５０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に溶解させた後、分画分子量３，０００の透析膜を用いて透析し、ＣａイオンやＥＤＴＡなどの低分子を取り除いたポリリン酸精製溶液を得た。次に、Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ８００カラムを用いたＨＰＬＣにより、実施例３と同様にして、ポリリン酸精製溶液を更に分画した。溶出された液は波長２２０ｎｍの紫外光の吸収によってモニタリングし、保持時間１０分付近に現れた主要なピークに対応する溶出画分を分取した。分取した溶出画分によるＨＳＰ２７の発現誘導を、実施例１と同様に、解析した。【００９８】
ポリリン酸精製溶液のＨＰＬＣチャートを図９に示した。チャートの横軸は保持時間（分）、縦軸は波長２２０ｎｍにおける吸光度である。図９に示したとおり、保持時間１０分付近に主要なピークが現れた。このピークに対応する溶出画分を分取し、酵素合成ポリリン酸とした。なお、酵素合成ポリリン酸は、サイズ排除クロマトグラフィーにおける溶出速度がＬＰＰと比べて速いことから、ＬＰＰよりも高い分子量を有していると考えられた。【００９９】
酵素合成ポリリン酸によるＨＳＰ２７発現誘導をウエスタンブロットで解析した結果を図１０に示した。図１０中のグラフは、図５中のグラフと同様にして作成したものである。図１０から明らかなように、酵素合成ポリリン酸により、用量依存的に、ＨＳＰ２７の発現が誘導された。【０１００】
以上の結果より、ＬＰＰに含まれるポリリン酸のみならず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素的に合成したポリリン酸（酵素合成ポリリン酸）によってもＨＳＰ２７の発現が誘導されることが明らかとなった。【０１０１】
〔実施例８〕
ＤＳＳ処理マウスにおけるポリリン酸による腸管傷害及び生存率の改善
半数致死量のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を投与して腸管（腸粘膜）障害を誘発したマウスを用いて、腸管障害及び生存率に対するポリリン酸の影響を解析した。なお、ポリリン酸として、実施例７に記載した方法により酵素的に合成した酵素合成ポリリン酸を用いた。【０１０２】
（半数致死量のＤＳＳで処理したマウスにおける生存率の解析）
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、５％（ｗ／ｖ）となるようにＤＳＳ（分子量２，５００）を添加した飲料水を与えた。次いで、被検対象となる１μｇポリリン酸群（ｎ＝５）には、試験期間中毎日、１００μｌのＰＢＳに溶解させた１μｇの酵素合成ポリリン酸を直腸内に投与した。１０μｇポリリン酸群（ｎ＝５）には、試験期間中毎日、１００μｌのＰＢＳに溶解させた１０μｇの酵素合成ポリリン酸を直腸内に投与した。一方、対照となるコントロール群（ｎ＝５）には、試験期間中毎日、１００μｌのＰＢＳを直腸内に投与した。試験開始から１５日間、被検マウスの生存状況を確認し、生存曲線を求めた。【０１０３】
（ＤＳＳで処理したマウスにおける腸管傷害の解析）
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、５％（ｗ／ｖ）となるようにＤＳＳを添加した飲料水を与えた。次いで、被検対象となる１μｇポリリン酸群（ｎ＝５）には、試験期間中毎日、１００μｌのＰＢＳに溶解させた１μｇの酵素合成ポリリン酸を直腸内に投与した。１０μｇポリリン酸群（ｎ＝５）には、試験期間中毎日、１００μｌのＰＢＳに溶解させた１０μｇの酵素合成ポリリン酸を直腸内に投与した。一方、対照となるコントロール群（ｎ＝５）には、試験期間中毎日、１００μｌのＰＢＳを直腸内に投与した。試験開始から７日後に、盲腸から肛門までの全結腸をマウスから取り出し、結腸長を測定した。【０１０４】
図１１に生存曲線を示した。コントロール群は試験開始から１２日以内に全てのマウスが死亡したのに対し、１０μｇポリリン酸群は１２日めで６０％のマウスが生存していた（図１１）。１μｇポリリン酸群及び１０μｇポリリン酸群の累積生存率は、コントロール群の累積生存率と比べて有意に高かった。【０１０５】
結腸長の測定結果を図１２に示した。１μｇ及び１０μｇポリリン酸群の結腸長は、コントロール群の結腸長と比較して有意に長かった（図１２）。この結果は、酵素合成ポリリン酸の投与により、ＤＳＳ処理によって誘発された腸管障害が抑制又は改善されたことを示している。【０１０６】
実施例８の結果、酵素合成ポリリン酸の投与によっても、半数致死量のＤＳＳで処理したマウスにおける生存率を向上させることができ、かつ、腸管障害を抑制又は改善できることが明らかとなった。【０１０７】
〔実施例９〕
酵素合成ポリリン酸による腸管バリア機能の向上
マンニトールは本来腸管非透過性の物質であるが、タイトジャンクション等の細胞接着構造が崩れるなど、腸管バリア機能が低下した場合に透過性を示す。マンニトールのこの性質を利用し、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｌｏｏｐ  ａｓｓａｙによるマンニトールの腸管透過実験を行い、腸管バリア機能の評価を行った。【０１０８】
６週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスから小腸を摘出し、腸管内をＰＢＳにて洗浄したのち、小腸を３等分した。小腸の一端を外科用糸で縛った後、腸管内に、ＰＢＳ、酵素合成ポリリン酸を１０μｇ／ｍｌ含有するＰＢＳ溶液、酵素合成ポリリン酸を１００μｇ／ｍｌで含有するＰＢＳ溶液をそれぞれ充填し、他端を同様に外科用糸で縛った。なお、酵素合成ポリリン酸は、実施例７に記載した方法により酵素的に合成したものを用いた。【０１０９】
これらをＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にて、２時間インキュベートした。２時間のインキュベートの後、腸管内容物を取り除き、さらに腸管を２等分した。次に、一方の腸管にＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した１μＣｉ／ｍｌのトリチウム標識マンニトールを、他方の腸管にＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した１μＣｉ／ｍｌのトリチウム標識マンニトール及び酸化剤である０．３ｍＭモノクロラミン（ＮＨ２Ｃｌ）を充填した。【０１１０】
充填後、ＲＰＭＩ１６４０培地中にてインキュベートし、５分、２０分、３５分後に腸管外に漏出したトリチウム量を液体シンチレーションカウンターにて定量した。２０分後の定量値から５分後の定量値を差し引いた値を１５分後のマンニトール漏出量とし、また、３５分後の定量値から５分後の定量値を差し引いた値を３０分後のマンニトール漏出量とした。【０１１１】
図１３に、マンニトール漏出量のグラフを示した。ＰＢＳのみで処理した腸管では、経時的にマンニトールの漏出量が増加しているのに対して、酵素合成ポリリン酸で処理した腸管では、経時的なマンニトールの漏出量の増加は認められなかった（図１３）。すなわち、酵素合成ポリリン酸によって腸管バリア機能の低下を抑制できることが示された。【０１１２】
また、モノクロラミンによって酸化ストレスを与えた場合、ＰＢＳのみで処理した腸管では、マンニトール漏出量が数倍に増加した（図１３）ものの、酵素合成ポリリン酸で処理した腸管では、マンニトール漏出量が酸化ストレスを与えない場合よりも低下した（図１３）。ＰＢＳのみで処理した腸管における結果は、酸化ストレスにより腸管バリア機能が低下することを示している。また、酵素合成ポリリン酸で処理した腸管における結果は、ポリリン酸が、その酸化ストレスによる腸管バリア機能の低下を顕著に抑制すること、及び腸管バリア機能を回復できることを示している。【０１１３】
実施例９の結果より、（酵素合成）ポリリン酸は腸管バリア機能を回復すること、また腸管バリア機能の低下を抑制することが明らかとなった。【０１１４】
〔実施例１０〕
ポリリン酸によるカスパーゼ活性化の抑制
カスパーゼ−３、カスパーゼ−９は、不活性型の全長カスパーゼ−３、全長カスパーゼ−９として存在し、他のプロテアーゼの働きによって分解され（翻訳後修飾）、活性型のカスパーゼ−３、カスパーゼ−９となる。この活性型のカスパーゼ−３、カスパーゼ−９が関与するシグナル伝達経路により、細胞にアポトーシスが誘導されることが知られている。そこで、ＬＰＰによるアポトーシス抑制効果を解析した。【０１１５】
（カスパーゼカスケードの誘導）
Ｃａｃｏ−２／ｂｂｅ細胞を、０μｇ／ｍｌ（コントロール）、１μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌのＬＰＰ存在下で２４時間培養した。その後、プロテインキナーゼ阻害薬であるスタウロスポリンを１μＭとなるように培地に添加した。スタウロスポリンの添加後、０時間、１時間、３時間、６時間、９時間後に細胞を回収し、ウエスタンブロット法により、不活性型の全長カスパーゼ−９のタンパク質量、不活性型の全長カスパーゼ−３のタンパク質量を解析した。【０１１６】
ＬＰＰを添加していないコントロールにおいて、スタウロスポリンの添加によって、不活性型の全長カスパーゼ−９及び不活性型の全長カスパーゼ−３のタンパク質量が減少した（図１４（Ａ）、（Ｂ））。これは、スタウロスポリンの刺激により、翻訳後修飾が生じ、活性型のカスパーゼ−３、カスパーゼ−９が生じていることを示している。一方、ＬＰＰを添加した細胞においては、コントロールと比較して、スタウロスポリンの添加による、不活性型の全長カスパーゼ−９及び不活性型の全長カスパーゼ−３のタンパク質量の減少が抑制された（図１４（Ａ）、（Ｂ））。【０１１７】
この結果から、ポリリン酸はカスパーゼが関与するシグナル伝達経路によるアポトーシスを抑制することが明らかとなった。【０１１８】
〔実施例１１〕
化学合成ポリリン酸による腸管バリア機能の向上
酵素合成ポリリン酸に代えて、化学合成したポリリン酸（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、リン酸ナトリウムガラス、カタログ番号「Ｓ４３７９」、平均重合度４５±５）（化学合成ポリリン酸）を用いたこと以外は実施例９と同様にして、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｌｏｏｐ  ａｓｓａｙによるマンニトールの腸管透過実験を行い、腸管バリア機能の評価を行った。【０１１９】
図１５に、マンニトール漏出量のグラフを示した。図１５のデータは、いずれもモノクロラミンによって酸化ストレスを与えた場合のものである。化学合成ポリリン酸で処理した腸管では、ＰＢＳのみで処理した腸管と比べて明らかにマンニトールの漏出が抑えられていた（図１５）。すなわち、化学合成ポリリン酸によっても、腸管バリア機能を回復すること、又は腸管バリア機能の低下を抑制できることが示された。【０１２０】
〔実施例１２〕
ポリリン酸とインテグリンとの相互作用
インテグリンのペプチドアンタゴニストを用いて、ポリリン酸とインテグリンとの相互作用を解析した。インテグリンのペプチドアンタゴニストとして、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（ＧＲＧＤＴＰ）とのアミノ酸配列を有するペプチド（以下「ＧＲＧＤＴＰ」ともいう。）を用いた。ＧＲＧＤＴＰは、インテグリンβによって認識されるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）の配列を有する。【０１２１】
腸管内に充填するＰＢＳ溶液中に、酵素合成ポリリン酸又は化学合成ポリリン酸に加え、ＧＲＧＤＴＰを１００μｇ／ｍｌの濃度で加えたこと以外は、実施例９及び実施例１１と同様にして、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｌｏｏｐ  ａｓｓａｙによるマンニトールの腸管透過実験を行い、腸管バリア機能の評価を行った。【０１２２】
図１６に、酵素合成ポリリン酸とＧＲＧＤＴＰとを併用したときのマンニトール漏出量のグラフを示した。図１７に、化学合成ポリリン酸とＧＲＧＤＴＰとを併用したときのマンニトール漏出量のグラフを示した。酵素合成ポリリン酸とＧＲＧＤＴＰを併用した場合、酵素合成ポリリン酸による腸管バリア機能の回復効果、又は腸管バリア機能の低下の抑制効果が著しく阻害された（図１６）。また、化学合成ポリリン酸とＧＲＧＤＴＰを併用した場合も同様であった（図１７）。すなわち、ＧＲＧＤＴＰがポリリン酸とインテグリンへの結合を競合することにより、ポリリン酸による腸管バリア機能の回復効果、又は腸管バリア機能の低下の抑制効果が阻害されることを示している。【０１２３】
インテグリンは、細胞表面タンパク質の一種であり、細胞と細胞外マトリックスとの接着、細胞外マトリックスからの情報伝達に関与する細胞接着分子である。実施例１２の結果は、ポリリン酸は腸管管腔内に存在するインテグリン（インテグリンβ）へと結合することにより、ｐ３８ＭＡＰＫ経路の活性化を介して、腸管バリア機能の回復効果、又は腸管バリア機能の低下の抑制効果を奏することを示している。
【図１５】
2011125619.tif 000006
【図１６】
2011125619.tif 000007
【図１７】
2011125619.tif 000008
【図１】
2011125619.tif 000009
【図２】
2011125619.tif 000010
【図３】
2011125619.tif 000011
【図４】
2011125619.tif 000012
【図５】
2011125619.tif 000013
【図６】
2011125619.tif 000014
【図７】
2011125619.tif 000015
【図８】
2011125619.tif 000016
【図９】
2011125619.tif 000017
【図１０】
2011125619.tif 000018
【図１１】
2011125619.tif 000019
【図１２】
2011125619.tif 000020
【図１３】
2011125619.tif 000021
【図１４】
2011125619.tif 000022
【配列表】
2011125619000001.app
【国際調査報告】
2011125619.tif 000023
2011125619.tif 000024
2011125619.tif 000025
2011125619.tif 000026