(57)【要約】  Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列とＩｇＧ型抗体を重鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列とを結合させたＤＮＡ配列、およびＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列と任意の軽鎖鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列とを結合させたＤＮＡ配列を含む、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡをカイコに導入して遺伝子組換えカイコを作成し、該遺伝子組換えカイコの生産するＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を回収することにより、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を安定的かつ効率的に製造することができる。
2011046097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法であって；
Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＨ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＨ鎖可変領域と、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＬ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＬ鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）ＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域
とを有し；
該製造方法は、該抗体をコードするＤＮＡが導入された遺伝子組換えカイコから生産される該抗体を回収して製造することを含む、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞非依存性抗原が腫瘍マーカー糖鎖抗原である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞非依存性抗原がシアリルルイスＸ（シアリルＬｅｘ）である請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体の製造方法であって；
シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体は、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２６、２７および２８に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２９、３０および３１に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域
とを有し；
該製造方法は、該抗体をコードするＤＮＡが導入された遺伝子組換えカイコから生産される該抗体を回収して製造することを含む、シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体の製造方法である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体が、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれるフレームワーク領域として、ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４としてそれぞれ配列番号３２、３３、３４および３５に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれるＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４として、それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域
とを有する抗体である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記遺伝子組換えカイコが、
（ｉ）カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡ、および、
（ｉｉ）該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡ
が導入されたカイコである、請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記遺伝子組換えカイコが、
（ｉ）カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡが導入されたカイコと、
（ｉｉ）該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡが導入されたカイコ
とを交配させることで得られたカイコである、請求項１から７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
シアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡであって；
シアリルＬｅｘに対する抗体は、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域としてＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２６、２７および２８に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域としてＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２９、３０および３１に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域
とを有し；
かつ、該ＤＮＡが該抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
前記シアリルＬｅｘに対する抗体が、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれるフレームワーク領域としてＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４としてそれぞれ配列番号３２、３３、３４および３５に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれるＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４がそれぞれ配列番号３６、３７、３８および３９で表されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域
とを有する抗体である、請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域とを有する抗体をコードするＤＮＡである、請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
Ｈ鎖可変領域をコードする配列番号２０に示される塩基配列と、Ｌ鎖可変領域をコードする配列番号２４に示される塩基配列とを含む、請求項１０に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項８から１１のいずれかに記載のＤＮＡのＤＮＡ配列を含む遺伝子組換えベクター。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ配列が、カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合されている、請求項１２に記載の遺伝子組換えベクター。
【請求項１４】
遺伝子組換えカイコであって、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＨ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡと、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＬ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡと、
（ｉｉｉ）ＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡ
とを含むＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡが導入され、かつ、前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を生産する遺伝子組換えカイコ。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞非依存性抗原が腫瘍マーカー糖鎖抗原である請求項１４に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞非依存性抗原がシアリルＬｅｘである請求項１４に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１７】
請求項８から１１のいずれかに記載のシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡが導入され、かつ、シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体を生産する遺伝子組換えカイコである、請求項１６に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１８】
（ｉ）カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、
（ｉｉ）該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡ
とが導入された、請求項１４から１７のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項１９】
遺伝子組換えカイコの製造方法であって、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＨ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡと、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＬ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡと、
（ｉｉｉ）ＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡと
を含むＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡをカイコに導入することを含む、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を生産する遺伝子組換えカイコの製造方法。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞非依存性抗原が腫瘍マーカー糖鎖抗原である請求項１９に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞非依存性抗原がシアリルＬｅｘである請求項１９に記載の遺伝子組換えカイコ。
【請求項２２】
請求項８から１１のいずれかに記載のシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡをカイコに導入することを含む、シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体を生産する遺伝子組換えカイコの製造方法である、請求項２１に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
【請求項２３】
（ｉ）カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、
（ｉｉ）該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡ
とをカイコに導入することを含む、請求項１９から２２のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
【請求項２４】
（ｉ）カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡが導入されたカイコと、
（ｉｉ）該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡが導入されたカイコとを交配させてＤＮＡを導入することを含む、請求項２３に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換えカイコを用いた、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体と同様の反応性を有するＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法に関する。本発明はさらに、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を生産するカイコおよびその製造方法に関する。本発明は、また、Ｔ細胞非依存性抗原であるシアリルルイスＸ（シアリルＬｅｘ）に対する抗体をコードするＤＮＡおよびこのＤＮＡ配列を含む遺伝子組換えベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原は、Ｔ細胞依存性抗原とＴ細胞非依存性抗原の２つに分類することができる。このうちＴ細胞依存性抗原は、免疫応答にＴ細胞の助けを必要とする抗原であり、タンパク質等が含まれる。一方、Ｔ細胞非依存性抗原とは、Ｔ細胞の必要なしに免疫応答を誘導する抗原であり、炭水化物や脂質等が含まれる。
抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ，ＩｇＤおよびＩｇＥクラスが存在する。Ｔ細胞依存性抗原とＴ細胞依存性抗原では、それぞれの抗原に対して免疫応答により産生される抗体のクラスが異なる。Ｔ細胞依存性抗原に対する免疫応答では、免疫応答初期にはＩｇＭクラスに属する抗体（以下、ＩｇＭ型抗体ということもある）が産生される。その後、Ｔ細胞の助けを受けて、抗体のクラスがＩｇＭからＩｇＧ等に変換されるクラススイッチが起こり、Ｔ細胞依存性抗原に対する免疫応答では、多くの場合、最終的にＴ細胞依存性抗原に対するＩｇＧクラスに属する抗体（以下、ＩｇＧ型抗体ということもある）が産生されるようになる。一方、Ｔ細胞非依存性抗原への免疫応答では、Ｔ細胞が免疫応答に関与しないため、ＩｇＧ型抗体へのクラススイッチが起こらない。そのため、Ｔ細胞非依存性抗原に対する抗体を作成する場合、ＩｇＭクラスに属する抗体しか得られない。つまり、Ｔ細胞依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を得る場合と比較して、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を作成することは困難である。【０００３】
Ｔ細胞非依存性抗原である糖鎖抗原の中には、腫瘍マーカーが多数確認されている。ここで腫瘍マーカーとは、癌細胞に特異的に、または、多量に発現する特徴を持つ。実際、糖鎖抗原である腫瘍マーカーに対する抗体を用いた癌の診断は広く行われている。例えば、癌の診断に用いられている、糖鎖抗原の腫瘍マーカーとしては、ＣＳＬＥＸ、ＫＭ９３，ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＫＭ０１、Ｓｐａｎ−１、ＫＭ２３１、ＣＡ１９５、ＳＬＡ２−６、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＳＬＸ、ＣＡ７２−４、ＳＴＮ等が使用されている。このうち、ＣＳＬＥＸ、ＫＭ９３及びＮＣＣ−ＳＴ−４３９は、腫瘍マーカーの免疫測定に用いられる抗体により区別されているが、いずれもシアリルＬｅｘ抗原である。同様に、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＫＭ０１、Ｓｐａｎ−１、ＫＭ２３１、ＣＡ１９５及びＳＬＡ２−６はいずれもシアリルルイスＡ（シアリルＬｅａ）抗原である。また、ＣＡ７２−４及びＳＴＮはいずれもシアリルＴｎ抗原である。【０００４】
例えば、シアリルＬｅｘは、癌細胞表面に存在し、血管内皮細胞の細胞接着分子Ｅ−セレクチンと結合して、癌細胞の血管内皮細胞への接着及び転移巣の形成に寄与するものであり、生体内シアリルＬｅｘのレベル上昇は細胞の癌化の指標となる。
このシアリルＬｅｘを認識するモノクローナル抗体としてＣＳＬＥＸ１（以下、ＣＳＬＥＸ１抗体ということもある）が知られている（特許文献１参照）。このＣＳＬＥＸ１抗体は、ハイブリドーマＣＳＬＥＸ１（寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８５８０）により産生されるＩｇＭ型抗体である。このハイブリドーマから得られたＣＳＬＥＸ１抗体は、胃癌、結腸癌、肺癌、食道癌、卵巣癌、胸癌、膀胱癌、膵臓癌などの腫瘍組織に対して明瞭な陽性染色像を示すことが開示されている（特許文献１参照）。このＣＳＬＥＸ１抗体を用いると、癌患者血清中に含まれるシアリルＬｅｘ量を、ＥＬＩＳＡ法で定量することが可能となる。特に、マイクロタイタープレートを用いた汎用性のあるシアリルＬｅｘのＥＬＩＳＡ測定系を用いることで、再発乳癌の発症や再発乳癌の術後経過観察を高い陽性率でスクリーニングをすることが可能とされている（非特許文献１参照）。そのため、このＥＬＩＳＡ測定キットは、現在、診断薬の分野で実用化され販売されている。【０００５】
また、癌診断においては、１つの糖鎖抗原である腫瘍マーカーを用いた場合には偽陰性等が生じるため、複数の腫瘍マーカーを組み合わせて診断することが行われている。例えば、糖鎖抗原である腫瘍マーカーであるＣＡ１９−９とＣＡ７２−４を組み合わせて使用することによる診断精度の向上（非特許文献２）が確認されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４７５２５６９号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】癌の臨床、第４５巻、第３号、１９５−２０１頁
【非特許文献２】REV. HOSP. CLIN. FAC. MEED. S. PAULO，Vol. 46，No. 3，p.89-92，2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
腫瘍マーカーとして用いられるＴ細胞非依存性抗原である糖鎖抗原を免疫原として作成される抗体はＩｇＭ抗体となる。このＩｇＭ型抗体は、ＰｒｏｔｅｉｎＡ等のアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製可能なＩｇＧ型抗体と比較して、精製が困難である。癌等の診断においては、特に抗原抗体反応の高い特異性およびそれに起因する信頼性が求められる。そのため、ＩｇＭ型抗体の精製が困難であり不純物が混入する可能性が高いことは、診断におけるＩｇＭ型抗体の使用を制限してしまう。また、診断用途での使用が可能となる程度のＩｇＭ型抗体の純度を確保するためには、煩雑な精製作業が必要であり、抗体の商業的利用の妨げとなる。したがって、特に癌等の診断に用いるためには、精製が容易で純度を高めやすいという特徴をもつ、Ｔ細胞非依存性抗原、特に腫瘍マーカーである糖鎖抗原に対するＩｇＧ型抗体が不可欠である。また、癌診断においては複数の腫瘍マーカーが組み合わされて用いられ、新たな高い信頼度を示すマーカーの組合せが求められていることから、診断に利用可能なＩｇＧ型抗体の種類を増加させ、その生産量を増大させることも必要である。【０００９】
Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を得る方法として、例えば、Ｔ細胞非依存性抗原およびＴ細胞依存性タンパク質キャリアを含む組成物でＴ細胞依存性免疫応答を誘導する方法（ＷＯ２００７／０３９５８３号パンフレット）等が提案されている。しかしながら、この方法では、新規なＩｇＧ型抗体を産生するハイブリドーマを得るのに長期間を要する場合があり、かつ確実にＩｇＧ型抗体のみを得られるわけではない。また、この方法では、既存のＩｇＭ型抗体をＩｇＧ型として活用することはできなかった。さらには、この方法によりＩｇＧ型抗体を産生するハイブリドーマは得られるものの、抗体産生能の高いハイブリドーマを継代させることは比較的困難であり、ＩｇＧ型抗体を長期間にわたって大量にかつ安定的に生産することは困難であった。一方、特に糖鎖抗原である腫瘍マーカーを複数組み合わせて用いる癌診断の場合には複数種類の抗体が高純度でかつ多量に必要になる。したがって、この方法では既存抗体や新規抗体を効率的に利用できないので、特に癌診断分野における腫瘍マーカーに対する抗体の需要に十分応えること困難であった。【００１０】
一方、タンパク質を大量に生産する宿主としては、大腸菌が用いられる場合が多く、大腸菌を用いた抗体製造も検討されている。しかしながら、抗体の重鎖定常領域は一般的に大腸菌の細胞質内で難溶性であり、不溶性粒子を構成してしまう。つまり、ＩｇＧ型抗体の重鎖定常領域も細胞質内で難溶性であり、大腸菌に製造されたＩｇＧ型抗体も不溶性粒子を構成してしまう。ここで、ＩｇＧ型抗体の重鎖定常領域は抗体の簡便な精製に重要な役割を果たす。そのため、重鎖定常領域を持たない抗体断片の大腸菌を用いた製造は可能であるが、簡便に精製可能であるＩｇＧ型抗体の効率的な生産は大腸菌では困難であった。【００１１】
本発明者らは、タンパク質に対する抗体をコードするＤＮＡをカイコに導入し、得られた遺伝子組換えカイコに抗体を製造させることに成功していた（ＷＯ２００７／０４６４３９号パンフレット）。しかしながら、遺伝子組換え手法でＩｇＭ型抗体をＩｇＧ型抗体に変換して製造した場合に、製造されたＩｇＧ型抗体がＩｇＭ型抗体と同様の反応性を有する保証はなかった。ＩｇＭ型抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖からなる抗体ユニットが５つ結合して構成される。一方、ＩｇＧ型抗体は１つの抗体ユニットから構成される。遺伝子組換え手法でＩｇＭ型抗体から変換されたＩｇＧ型抗体は、元来抗原に対して強い親和性を有しないＩｇＭ型抗体に５つある抗体ユニットのうちの１つに実質的に相当するに過ぎない。そのため、元々弱い抗原への親和性がさらに低下し、その元となったＩｇＭ型抗体が有していた抗原反応性をＩｇＧ型抗体が喪失するおそれがあった。【００１２】
この実状に鑑み、本発明の課題は、Ｔ細胞非依存性抗原を免疫原としてモノクローナル抗体を作成した場合に得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体と同様の反応性を有し、かつ精製が容易なＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を、ハイブリドーマによらずに、安定的かつ効率的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記した課題を解決することを目的として鋭意研究した結果、先ず、ハイブリドーマにより産生されるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ抗体の重鎖および軽鎖が有する相補性決定領域（以下、ＣＤＲということもある）のアミノ酸配列を明らかにした。次いで、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡを設計した。設計されたＤＮＡ配列は、重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列とＩｇＧ型抗体の重鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列とを結合させたＤＮＡ配列、および軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列と任意の軽鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列とを結合させたＤＮＡ配列を含む。次いで、このＤＮＡをカイコに導入して遺伝子組換えカイコを作成した。次いで、この作成した遺伝子組換えカイコによって、設計したＤＮＡ配列がコードする抗体が分泌されること、および、分泌物から安定的に回収可能な該抗体が精製が容易なＩｇＧ型抗体であることを確認した。さらに、驚くべきことに、ＩｇＭ型抗体を変換して設計され、カイコにより産生されたＩｇＧ型抗体のＴ細胞非依存性抗原への反応性がハイブリドーマにより産生される元のＩｇＭ型抗体と同様であり、かつＥＬＩＳＡ法等の免疫測定法により該抗原の定量が可能な程度に反応性が十分に高いことを見出し、本発明を完成させるに至ったものである。【００１４】
従って、本発明は、以下の［１］から［２４］に挙げる、遺伝子組換えカイコを用いたＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法等に関する。
［１］．Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法であって；
Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＨ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＨ鎖可変領域と、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＬ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＬ鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）ＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域
とを有し；
該製造方法は、該抗体をコードするＤＮＡが導入された遺伝子組換えカイコから生産される該抗体を回収して製造することを含む、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法。
［２］．前記Ｔ細胞非依存性抗原が腫瘍マーカー糖鎖抗原である［１］に記載の製造方法。
［３］．前記Ｔ細胞非依存性抗原がシアリルルイスＸ（シアリルＬｅｘ）である［１］に記載の製造方法。
［４］．シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体の製造方法であって；
シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体は、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２６、２７および２８に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２９、３０および３１に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域
とを有し；
該製造方法は、該抗体をコードするＤＮＡが導入された遺伝子組換えカイコから生産される該抗体を回収して製造することを含む、シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体の製造方法である、［３］に記載の製造方法。
［５］．前記シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体が、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれるフレームワーク領域として、ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４としてそれぞれ配列番号３２、３３、３４および３５に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれるＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４として、それぞれ配列番号３６、３７、３８および３９に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域
とを有する抗体である、［４］に記載の製造方法。
［６］．前記遺伝子組換えカイコが、
（ｉ）カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡ、および、
（ｉｉ）該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡ
が導入されたカイコである、［１］から［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］．前記遺伝子組換えカイコが、
（ｉ）カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡが導入されたカイコと、
（ｉｉ）該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡが導入されたカイコ
とを交配させることで得られたカイコである、［１］から［７］のいずれかに記載の製造方法。
［８］．シアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡであって；
シアリルＬｅｘに対する抗体は、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域としてＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２６、２７および２８に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域としてＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２９、３０および３１に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域
とを有し；
かつ、該ＤＮＡが該抗体をコードするＤＮＡ。
［９］．前記シアリルＬｅｘに対する抗体が、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれるフレームワーク領域としてＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４としてそれぞれ配列番号３２、３３、３４および３５に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれるＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４がそれぞれ配列番号３６、３７、３８および３９で表されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域
とを有する抗体である、［８］に記載のＤＮＡ。
［１０］．配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域とを有する抗体をコードするＤＮＡである、［９］に記載のＤＮＡ。
［１１］．Ｈ鎖可変領域をコードする配列番号２０に示される塩基配列と、Ｌ鎖可変領域をコードする配列番号２４に示される塩基配列とを含む、［１０］に記載のＤＮＡ。
［１２］．［８］から［１１］のいずれかに記載のＤＮＡのＤＮＡ配列を含む遺伝子組換えベクター。
［１３］．前記ＤＮＡ配列が、カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合されている、［１２］に記載の遺伝子組換えベクター。
［１４］．遺伝子組換えカイコであって、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＨ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡと、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＬ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡと、
（ｉｉｉ）ＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡ
とを含むＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡが導入され、かつ、前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を生産する遺伝子組換えカイコ。
［１５］．前記Ｔ細胞非依存性抗原が腫瘍マーカー糖鎖抗原である［１４］に記載の遺伝子組換えカイコ。
［１６］．前記Ｔ細胞非依存性抗原がシアリルＬｅｘである［１４］に記載の遺伝子組換えカイコ。
［１７］．［８］から［１１］のいずれかに記載のシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡが導入され、かつ、シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体を生産する遺伝子組換えカイコである、［１６］に記載の遺伝子組換えカイコ。
［１８］．（ｉ）カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、
（ｉｉ）該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡ
とが導入された、［１４］から［１７］のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
［１９］．遺伝子組換えカイコの製造方法であって、
（ｉ）Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＨ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡと、
（ｉｉ）Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＬ鎖可変領域が有する相補性決定領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡと、
（ｉｉｉ）ＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡと
を含むＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡをカイコに導入することを含む、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を生産する遺伝子組換えカイコの製造方法。
［２０］．前記Ｔ細胞非依存性抗原が腫瘍マーカー糖鎖抗原である［１９］に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
［２１］．前記Ｔ細胞非依存性抗原がシアリルＬｅｘである［１９］に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
［２２］．［８］から［１１］のいずれかに記載のシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡをカイコに導入することを含む、シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体を生産する遺伝子組換えカイコの製造方法である、［２１］に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
［２３］．（ｉ）カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、
（ｉｉ）該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡ
とをカイコに導入することを含む、［１９］から［２２］のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
［２４］．（ｉ）カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡが導入されたカイコと、
（ｉｉ）該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前記Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡが導入されたカイコ
とを交配させてＤＮＡを導入することを含む、［２３］に記載の遺伝子組換えカイコの製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法により、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を安定的かつ効率的に生産可能である。この本発明の製造方法により大量に製造可能なＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、Ｔ細胞非依存性抗原を免疫して得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体と同様の反応性を有し、かつ精製が容易である。この方法により得られたＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、精製が容易であるため純度を高めやすく、ＥＬＩＳＡ法等の免疫学的測定方法に利用可能である。
本発明のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法により、既存のまたは新たに作成されもしくは見出されるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体を、精製が容易で純度を高めやすいＩｇＧ型抗体に変換して効率的に生産することができる。そのため、複数の疾病マーカーを組み合わせて行われる癌等の診断では複数種類の抗体が高純度でかつ多量に必要になる場合があるが、本発明の効率的な抗体の製造方法は、Ｔ細胞非依存性抗原に対する抗体の癌等の診断での利用を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＳＶ４０ＵＴＲベクターの構築工程を示した図である。
【図２】ｐＤＮＲ／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ−ＳＶ４０ＵＴＲベクターの構築工程を示した図である。
【図３】カイコ形質転換用ベクターｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨの構築工程を示した図である。
【図４】本発明の抗体の製造方法により得られたＩｇＧクラスに属するＣＳＬＥＸ１抗体（以下、ＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体ということもある）の陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製結果を示した図である。横軸は、フラクション番号を、縦軸はフラクション中のＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体のシアリルＬｅｘに対する反応性に比例する波長４５０ｎｍにおける吸光度、または、フラクション中のタンパク質濃度に比例する波長２８０ｎｍにおける吸光度（ｍＡＢＵ）を表している。白丸および実線により、波長４５０ｎｍにおける吸光度により表されるフラクション中の本発明の抗体の製造方法により得られたＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体のシアリルＬｅｘに対する反応性が示される。一方、黒丸および破線により、波長２８０ｎｍにおける吸光度により表されるフラクション中のタンパク質濃度が示されている。
【図５】本発明の抗体の製造方法により得られたＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体と比較例であるＩｇＭクラスに属するＣＳＬＥＸ１抗体（以下、ＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体ということもある）をそれぞれ用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系により検体中のシアリルＬｅｘを測定したときの検量線を示した図である。横軸は、抗原シアリルＬｅｘ試料濃度（Ｕ／ｍｌ）、縦軸は波長４５０ｎｍにおける吸光度を表している。実線が本発明の抗体の製造方法で得られたＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体を用いたときの検量線を示し、破線が比較例であるＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体を用いたときの検量線を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本明細書において、「本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコ」に関する記載は、「本発明で提供される遺伝子組換えカイコ」および「本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法により得られる遺伝子組換えカイコ」にも同様にあてはまるものである。
【００１８】
本発明においては、Ｔ細胞非依存性抗原とは、Ｔ細胞の必要なしに宿主で免疫応答を誘導できる抗原である。本発明におけるＴ細胞非依存性抗原に対するモノクローナル抗体をハイブリドーマにより作成する場合、ＩｇＭ型抗体が産生される。また、本発明におけるＴ細胞非依存性抗原は、好ましくは、腫瘍マーカーとして機能し、すなわち、細胞の癌化により量的または質的な変化が生じる。
本発明におけるＴ細胞非依存性抗原としては、例えば、糖鎖（多糖類、オリゴ糖類または単糖類）、脂質、糖脂質、リン脂質、リポ多糖類、キャリヤーコンジュゲートおよびファージを挙げることができる。腫瘍マーカーとしての機能を有する抗原が多いことから、本発明におけるＴ細胞非依存性抗原は、糖鎖抗原であることが好ましく、腫瘍マーカー糖鎖抗原であることがさらに好ましい。なお、本発明における糖鎖抗原は、通常、生体内でタンパク質または脂質等に結合して存在する。また、本発明における糖鎖抗原には、シアル酸またはフコース等で修飾された糖鎖が含まれる。
【００１９】
本発明においては、腫瘍マーカー糖鎖抗原とは、腫瘍マーカーとして機能し、細胞の癌化により量的または質的な変化が生じる糖鎖抗原である。本発明における腫瘍マーカー糖鎖抗原としては、シアリルＬｅｘ、シアリルＬｅｘ−ｉ、シアリルＬｅａ、シアリルルイスＣ（シアリルＬｅｃ）、シアリルＴｎ、ルイスＹ（Ｌｅｙ）が挙げられる。ここで、シアリルＬｅｘには、ＫＭ９３、ＣＳＬＥＸ、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９が含まれる。また、シアリルＬｅｘ−ｉにはＳＬＸが含まれる。また、シアリルＬｅａには、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＫＭ０１、ＳＰａｎ−１、ＫＭ２３１、ＣＡ１９５、ＳＬＡ２−６が含まれる。また、シアリルＬｅｃには、ＤＵ−ＰＡＮ−２が含まれる。また、シアリルＴｎには、ＣＡ７２−４、ＳＴＮが含まれる。本発明における腫瘍マーカー糖鎖抗原としては、腫瘍マーカーとしての有用性が特に高いため、シアリルＬｅｘが好ましい。また、シアリルＬｅｘの中では、ＣＳＬＥＸが特に好ましい。
【００２０】
本発明においては、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体とは、Ｔ細胞非依存性抗原を含む免疫原に応答するＢ細胞またはこのＢ細胞に由来するハイブリドーマが産生する抗体であって、ＩｇＭクラスに属し、Ｔ細胞非依存性抗原に特異的に結合し、かつ、その抗原抗体反応が抗原依存性を示す抗体である。なお、Ｔ細胞非依存性抗原に対する免疫応答では生体内で抗体クラススイッチが起こらないので、Ｔ細胞非依存性抗原を含む免疫原に応答するＢ細胞またはこのＢ細胞に由来するハイブリドーマはＩｇＭ型抗体を一般的に産生する。
【００２１】
本発明においては、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体とは、前述した本発明におけるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体と同様の抗原反応性を有し、ＩｇＧクラスに属する抗体である。
【００２２】
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、重鎖（以下、Ｈ鎖ということもある）可変領域、軽鎖（以下、Ｌ鎖ということもある）可変領域およびＨ鎖定常領域に特徴を有する。すなわち、本発明の、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、重鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＨ鎖可変領域中の３つのＨ鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）を含むＨ鎖可変領域と、軽鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＬ鎖可変領域中の３つのＬ鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含むＬ鎖可変領域とを有するので、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体と同様の抗原反応性を有する。また、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、ＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域を有するので、ＩｇＧクラスに属する。なお、ＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域は、任意の生物のＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域から選択可能であるが、Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域の由来生物種と同一の生物種のＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域であることが好ましい。
ここで、Ｔ細胞非依存性抗原ＩｇＭ型抗体の相補性決定領域は、例えば、そのアミノ酸配列を解析し、複数の抗体のアミノ酸配列との間で配列比較を行うことで決定することができる。
【００２３】
Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体が有する相補性決定領域としては、例えば、表１に示すアミノ酸配列が挙げられる。
【表１】
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【００２４】
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコなどに由来する抗体を挙げられるが、好ましくは、マウス由来の抗体である。
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体としては、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４といったサブクラスに属する抗体が挙げられるが、好ましくは、ＩｇＧ１サブクラスに属する抗体（以下、ＩｇＧ１型抗体ということもある）である。なぜなら、ＩｇＧ１型抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇのいずれかをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーを利用することで、抗体の精製を容易に行うことができるからである。
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、Ｌ鎖に関しては、κ鎖、λ鎖のいずれでもよい。
【００２５】
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の「抗体のサブクラス」は、該抗体の定常領域を構成するアミノ酸配列に応じて決定される。したがって、本発明の抗体の製造方法により得ようとするＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の「抗体のサブクラス」に応じて、該抗体のＨ鎖定常領域を構成するアミノ酸配列を選択する。
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の「抗体のサブクラス」としては、ＩｇＧ１が好ましい。なぜなら、前述の通り、ＩｇＧ１型抗体であれば、その精製が容易だからである。
したがって、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域としては、好ましくは、ＩｇＧ１型抗体のＨ鎖定常領域、例えば、マウスＩｇＧ１型抗体のＨ鎖定常領域が挙げられ、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが具体的な一態様として挙げられる。
一方、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体のＬ鎖定常領域は、任意の生物のＩｇＧ型抗体のＬ鎖定常領域から選択可能であるが、Ｈ鎖定常領域の由来生物種と同一の生物種のＩｇＧ型抗体のＬ鎖定常領域であることが好ましい。また、κ鎖定常領域、λ鎖定常領域のいずれでもよいが、例えば、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域またはＬ鎖定常領域は、配列番号４１または５５に挙げられるアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
ここで「機能的に同等」とは、変異を有しないアミノ酸配列からなるタンパク質／ポリペプチドと、変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質／ポリペプチドとが、同様の生物学的あるいは生化学的性質を有することを意味する。より具体的には、そのような変異を有するアミノ酸配列からなるタンパク質／ポリペプチドを用いて本発明の製造方法により得られる、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体が、Ｔ細胞非依存性抗原に対して意図する反応性や特異性において同様の性質を有することを意味する。
【００２６】
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体において、Ｈ鎖およびＬ鎖は前記可変領域と定常領域とが連結されて構成される。ここで、可変領域と定常領域を連結する連結領域を有してもよい。本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体において、例えばＨ鎖に関しては、連結領域を有さない。一方、Ｌ鎖に関しては、例えば、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む連結領域を有する。
この本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体のＬ鎖に用いられる連結領域は、配列番号５３に挙げられるアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００２７】
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、可変領域をコードするＤＮＡ配列全てを用いるのに代えて、可変領域中のＣＤＲをコードするＤＮＡ配列と、前記した可変領域のフレームワーク領域とは異なるフレームワーク領域をコードするＤＮＡ配列とを連結させたＤＮＡ配列を用いた、ＣＤＲ移植抗体でもよい。ＣＤＲ移植抗体の作成法としては、ＷＯ９８／１３３８８号パンフレット開示の方法を利用できる。また、ＣＤＲを介して連結される他の抗体のフレームワーク領域のアミノ酸は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するように、置換、欠失等によって変異してもよい。
【００２８】
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体において、遺伝子組換えカイコでそれぞれ独立に翻訳された該抗体のＨ鎖とＬ鎖は、本来抗体分子を有さないカイコの成体内であっても、それぞれに含まれるシステイン残基間にジスルフィド結合を形成し、適切な構造をとる。
【００２９】
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡは、シグナル配列をコードするＤＮＡを有すことが好ましく、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡ、および、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡの５´末端にシグナル配列をコードするＤＮＡを有することがより好ましい。
シグナル配列とは、分泌タンパク質や膜内在性タンパク質が、小胞体膜結合性のリボソーム上で合成された後に、脂質２重層を通り抜けるのに必要な、タンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸残基であり、本発明においては、この機能を有する配列であれば特に限定されるものではない。本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡが含みうるシグナル配列をコードするＤＮＡとしては、例えば、動物由来のシグナル配列や動物抗体由来のシグナル配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母、昆虫が挙げられる。シグナル配列としては、例えば、ＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体のシグナル配列、ヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列、マウスイムノグロブリンκ鎖のシグナル配列、および、マウスＩｇＧ１型抗体のシグナル配列が挙げられる。シグナル配列の具体的な一態様としては、Ｈ鎖に関するシグナル配列としては配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、一方、Ｌ鎖に関するシグナル配列としては配列番号２３に表されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。ここで、これらのシグナル配列を有することで、遺伝子組換えカイコにおいて、抗体の分泌組織、例えば、絹糸腺や脂肪体、への移行が促進される。
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、Ｌ鎖に関するシグナル配列は配列番号２３に表されるアミノ酸配列を含むペプチドとしては、さらに、これらの配列において、機能的に同等であれば、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有してもよい。なお、その他のシグナル配列のアミノ酸配列は各種文献に記載され公知である。
【００３０】
本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは、抗体分子を元来有しないのにもかかわらず、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体が翻訳された時点ではシグナル配列を有していたとしても、該抗体がカイコの分泌物から回収される際には、シグナル配列は除去される。
【００３１】
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を原材料として、抗体断片の製造が可能である。ここで抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２が挙げられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧ型抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合で結合した分子量約５万Ｄａの抗原に対する特異的結合能力を有する抗体断片である。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧ型抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万Ｄａの抗原に対する特異的結合能力を有する抗体断片である。
Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）２に還元剤ジチオスレイトール処理等を行い、前記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万Ｄａの抗原に対する特異的結合能力を有する抗体断片である。
【００３２】
以下、Ｔ細胞非依存性抗原がシアリルＬｅｘの場合を代表例として、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体について説明するが、それ以外のＴ細胞非依存性抗原の場合も、アミノ酸配列を変更して同様の説明を適用することができる。ここで、シアリルＬｅｘ以外のＴ細胞非依存性抗原に対する抗体のアミノ酸配列は、例えば、表１に記載したアミノ酸配列などが挙げられ、また、後述の実施例で示される方法を同様に用いて、シアリルＬｅｘ以外のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のアミノ酸配列を明らかにすることによっても得ることができる。
【００３３】
本発明の抗体の製造方法により得られるシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体は、Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域（以下、ＨＣＤＲということもある）としてＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２６、２７および２８に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と、Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域としてＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２９、３０および３１に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域とを有する抗体である。
なお、配列番号２６〜３１に示される相補性決定領域は、シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ型抗体であるＣＳＬＥＸ１抗体が有する相補性決定領域である。
【００３４】
本発明の抗体の製造方法により得られるシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体のＨ鎖可変領域は、それぞれのアミノ酸配列が配列番号２６、２７および２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むポリペプチドである。また、本発明の抗体の製造方法により得られるシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体のＨ鎖可変領域は、それぞれのアミノ酸配列が配列番号２６、２７および２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および、それぞれのアミノ酸配列が配列番号３２、３３、３４および３５に示されるＨ鎖フレームワーク領域（以下、ＨＦＲ）１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４を含むポリペプチドでもよく、例えば、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドがその具体的な一態様として挙げられる。ここで、通常、ＨＣＤＲを含むことで抗体は抗原認識能を有するが、ＨＦＲをさらに含むことで、抗原認識能が担保されやすく、さらに、従来技術のＣＳＬＥＸ１抗体の可変領域と同一のポリペプチドを含む可変領域を有することで、抗原認識能がより担保される。しかしながら、本発明においては、前記したＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、またはそれらの変異体を有するＩｇＧ型抗体であれば、いずれの抗体でもよく、それらの抗体は、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を有する。
前記Ｈ鎖可変領域中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、配列番号２６、２７および２８に示されるアミノ酸配列において、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と高い相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
ここで、「シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない」とは、前記変異を有するアミノ酸配列に由来するＣＤＲを有するシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体が、変異を有さないアミノ酸配列に由来するＣＤＲを有するシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体と同様にシアリルＬｅｘに特異的に結合することを意味する。なお、変異を有するアミノ酸配列に由来するＣＤＲを有するシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体が、変異を有さないアミノ酸配列に由来するＣＤＲを有するシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体よりも高いシアリルＬｅｘへの反応性を有することを妨げない。実際に、ＣＤＲおよびＦＲへの変異により結合親和性が大幅に向上する場合があることは当業者には容易に理解し得る技術的事項である。
また、前記高い相同性としては、例えば、９０％以上の相同性が挙げられ、より好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。なぜなら、ＣＤＲは抗体の抗原認識能を決定する残基であるから、許容される変異が通常は限定されるからである。
前記Ｈ鎖可変領域中のＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４は、配列番号３２、３３、３４および３５に示されるアミノ酸配列において、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
前記Ｈ鎖可変領域は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列において、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００３５】
一方、本発明の抗体の製造方法により得られるシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体のＬ鎖可変領域は、それぞれのアミノ酸配列が配列番号２９、３０および３１に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むポリペプチドである。また、本発明の抗体の製造方法により得られるシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体のＬ鎖可変領域は、それぞれのアミノ酸配列が配列番号２９、３０および３１に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、および、それぞれのアミノ酸配列が配列番号３６、３７、３８および３９に示されるＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４を含むポリペプチドでもよく、例えば、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドがその具体的な一態様として挙げられる。ここで、通常、ＣＤＲを含むことで抗体は抗原認識能を有するが、ＦＲをさらに含むことで、抗原認識能が担保されやすく、さらに、従来技術のＣＳＬＥＸ１抗体の可変領域と同一のポリペプチドを含む可変領域を有することで、抗原認識能がより担保される。勿論、前記したとおり、本発明においては、前記したＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、またはそれらの変異体を有するＩｇＧ型抗体あれば、いずれの抗体でもよく、それらの抗体は、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を有する。
前記Ｌ鎖可変領域中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、配列番号２９、３０および３１に示されるアミノ酸配列において、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくも１種の変異を有し、かつ、該配列と高い相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、高い相同性としては、例えば、９０％以上の相同性が挙げられ、より好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。
前記Ｌ鎖可変領域中のＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４は、配列番号３６、３７、３８および３９に示されるアミノ酸配列において、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
前記Ｌ鎖可変領域は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列において、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００３６】
本発明の製造方法により得られるシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体の具体的な一態様として、そのシグナル配列を含めたＨ鎖が配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、シグナル配列を含めたＬ鎖が配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである抗体が挙げられる。また、シグナル配列を含まない場合、Ｈ鎖が配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、Ｌ鎖が配列番号６１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである抗体が挙げられる。
本発明の製造方法により得られるシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体のＨ鎖またはＬ鎖としては、配列番号４３、５７、５９もしくは６１に挙げられるアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性が挙げられる。
【００３７】
本発明の抗体の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡは、Ｈ鎖可変領域、Ｌ鎖可変領域およびＨ鎖定常領域に特徴を有する抗体をコードするＤＮＡである。すなわち、本発明の抗体の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡは、Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＨ鎖可変領域中が有する相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＨ鎖可変領域と、Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域として、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のＬ鎖可変領域中が有する相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＬ鎖可変領域と、ＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域とを含む抗体をコードするＤＮＡである。したがって、本発明の抗体の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡは、前記Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡと、前記Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡと、前記ＩｇＧ型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡとを含む。このうち、前記Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡおよびＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡを含むＨ鎖をコードするＤＮＡと、前記Ｌ鎖可変領域を含むＬ鎖をコードするＤＮＡとは、連結されていても、連結されていなくてもよい。なお、これらのＤＮＡが連結される場合には、２つのＤＮＡ間にこれら以外のＤＮＡ配列を含んでもよい。
【００３８】
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体のＩｇＧ型抗体の「抗体のサブクラス」は、本発明の抗体の製造方法により得られるをＴ細胞非依存性抗原に対する抗体のＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡ中の定常領域をコードするＤＮＡにより決定される。したがって、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体のＩｇＧ型抗体の「抗体のサブクラス」に応じて、該抗体の定常領域をコードするＤＮＡ配列を設計する。本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体のＩｇＧ型抗体の「抗体のサブクラス」としては、前述のように、ＩｇＧ１が好ましい。
したがって、本発明の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡ中のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡとしては、好ましくは、ＩｇＧ１型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡ、例えば、マウスＩｇＧ１型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡが挙げられ、その具体的な一態様としては、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号４０に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。
一方、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体のＩｇＧ型抗体のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡは、任意の生物のＩｇＧ型抗体のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡから選択可能であるが、Ｈ鎖定常領域の由来生物種と同一の生物種のＩｇＧ型抗体のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡであることが好ましい。また、κ鎖定常領域をコードするＤＮＡ、λ鎖定常領域をコードするＤＮＡのいずれでもよい。本発明の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡ中のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡとして、例えば、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号５４に示すＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。
本発明の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡ中のＨ鎖定常領域、もしくは、Ｌ鎖定常領域をコードするＤＮＡとして、さらには、それぞれ配列番号４０もしくは５４に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００３９】
本発明の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡにおいて、Ｈ鎖をコードするＤＮＡおよびＬ鎖をコードするＤＮＡは前記可変領域をコードするＤＮＡと定常領域をコードするＤＮＡとが連結されて構成される。ここで、前記可変領域と定常領域は、連結領域を介さず、または、連結領域を介して連結される。
可変領域をコードするＤＮＡ配列と定常領域をコードするＤＮＡ配列との連結方法としては、例えば、連結領域を介して、または、連結領域を介さずに２つのＤＮＡ配列が連結された配列を設計し、設計された配列を全合成する方法、一のＤＮＡ配列を遺伝子組換えベクターに挿入した後に、該ＤＮＡ配列と連続的な位置にまたは適切な間隔を空けて、もう一方のＤＮＡ配列を挿入する方法が挙げられる。
本発明の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡにおいて、例えば、Ｈ鎖をコードするＤＮＡに関しては、前記Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡと前記Ｈ鎖定常領域をコードするＤＮＡとが連結される。一方、Ｌ鎖に関しては、例えば、可変領域をコードするＤＮＡと定常領域をコードするＤＮＡ配列とが、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む連結領域をコードするＤＮＡ配列を介して連結される。配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む連結領域をコードするＤＮＡ配列としては、配列番号５２に示されるＤＮＡ配列が挙げられる。
本発明の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡ中のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡにおいて、Ｌ鎖可変領域とＬ鎖定常領域とを連結する領域をコードするＤＮＡとして、さらには、配列番号５２に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００４０】
本発明の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡは、例えば、動物由来のシグナル配列や動物抗体由来のシグナル配列をコードするＤＮＡを有することが好ましく、Ｈ鎖可変領域、および、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡの５´末端にシグナル配列をコードするＤＮＡを有することがより好ましい。
ここで動物としては、前記したように、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母、昆虫が挙げられる。シグナル配列としては、例えば、ＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体のシグナル配列をコードするＤＮＡ、ヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列をコードするＤＮＡ、マウスイムノグロブリンκ鎖のシグナル配列をコードするＤＮＡ、およびマウスＩｇＧ１型抗体のシグナル配列をコードするＤＮＡが挙げられる。具体的な一態様として、Ｈ鎖に関するシグナル配列としては配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡ、一方、Ｌ鎖に関するシグナル配列としては配列番号２３に表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号１８で表されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられ、一方、配列番号２３に表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号２２に表されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。ここで、これらのシグナル配列を有することで、遺伝子組換えカイコにおいて、抗体の分泌組織、例えば絹糸腺や脂肪体、への移行が促進される。
本発明の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡ中のシグナル配列をコードするＤＮＡとして、さらには、それぞれ配列番号１８もしくは２２に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００４１】
本発明において例示するＤＮＡ配列は、コドンを昆虫型に変換することが好ましい。なぜなら、コドンを昆虫型に変換することにより、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の発現量を増加させることが可能となるからである。
【００４２】
以下、Ｔ細胞非依存性抗原がシアリルＬｅｘの場合を代表例として、本発明の抗体の製造方法に用いられるＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡについて説明するが、それ以外のＴ細胞非依存性抗原の場合も、塩基配列を変更して同様の説明を適用することができる。ここで、シアリルＬｅｘ以外のＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば、表１に記載したアミノ酸配列に基づいて決定することができ、また、後述の実施例で示される方法を同様に用いて、シアリルＬｅｘ以外のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のアミノ酸配列を明らかにし、そのアミノ酸配列に基づいて決定することもできる。
【００４３】
本発明の抗体の製造方法に用いられるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡのうち、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡとしては、アミノ酸配列が配列番号２６、２７および２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡが挙げられる。また、本発明の抗体の製造方法に用いられるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡのうち、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡは、アミノ酸配列が配列番号２６、２７および２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および、それぞれのアミノ酸配列が配列番号３２、３３、３４および３５に示されるＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４を含むＨ鎖可変領域コードするＤＮＡでもよく、その具体的な一態様として、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡが挙げられる。配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号２０に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。ここで、通常、ＣＤＲをコードするＤＮＡを含むことでこのＤＮＡにコードされる抗体は、抗原認識能を有するが、ＦＲをコードするＤＮＡをさらに含むことで、抗原認識能が担保されやすく、さらに、従来技術であるＣＳＬＥＸ１抗体のＨ鎖可変領域と同一のポリペプチドを含むＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡを有することで、抗原認識能がより担保される。
本発明の抗体の製造方法に用いられるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡ中のＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡとして、さらには、配列番号２０に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００４４】
一方、本発明の抗体の製造方法に用いられるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡのうち、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡとしては、アミノ酸配列が配列番号２９、３０および３１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡが挙げられる。また、本発明の抗体の製造方法に用いられるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡのうち、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡは、アミノ酸配列が配列番号２９、３０および３１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および、それぞれのアミノ酸配列が配列番号３６、３７、３８および３９に示されるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含むＬ鎖可変領域コードするＤＮＡでもよく、その具体的な一態様として、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡが挙げられる。配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号２４に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。ここで、通常、ＣＤＲをコードするＤＮＡを含むことでこのＤＮＡにコードされる抗体は抗原認識能を有するが、ＦＲをコードするＤＮＡをさらに含むことで、抗原認識能が担保されやすく、さらに、従来技術であるＣＳＬＥＸ１抗体のＬ鎖可変領域と同一のポリペプチドを含むＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡを有することで、抗原認識能がより担保される。
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡ中のＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとして、さらには、配列番号１４に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００４５】
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡは、Ｈ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域としてＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２６、２７および２８に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域と、Ｌ鎖可変領域中に含まれる相補性決定領域としてＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２９、３０および３１に示されるアミノ酸配列、または、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、該配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域とを有する抗体をコードするＤＮＡである。
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡにおいて、シアリルＬｅｘに対する抗体のＨ鎖可変領域を含むＨ鎖をコードするＤＮＡと、Ｌ鎖可変領域を含むＬ鎖をコードするＤＮＡとは、連結されていても、連結されていなくてもよい。なお、これらのＤＮＡが連結される場合には、２つのＤＮＡ間にこれら以外のＤＮＡ配列を含んでもよい。
【００４６】
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡのうち、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡとしては、アミノ酸配列が配列番号２６、２７および２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡが挙げられる。また、本発明の抗体の製造方法に用いられる、もしくは、本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体コードするＤＮＡのうち、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡは、アミノ酸配列が配列番号２６、２７および２８に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および、それぞれのアミノ酸配列が配列番号３２、３３、３４および３５に示されるＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４を含むＨ鎖可変領域コードするＤＮＡでもよく、その具体的な一態様として、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡが挙げられる。配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号２０に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。ここで、通常、ＣＤＲをコードするＤＮＡを含むことでこのＤＮＡにコードされる抗体は、抗原認識能を有するが、ＦＲをコードするＤＮＡをさらに含むことで、抗原認識能が担保されやすく、さらに、従来技術であるＣＳＬＥＸ１抗体のＨ鎖可変領域と同一のポリペプチドを含むＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡを有することで、抗原認識能がより担保される。
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡ中のＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡとして、さらには、配列番号２０に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００４７】
一方、本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡのうち、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡとしては、アミノ酸配列が配列番号２９、３０および３１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡが挙げられる。また、本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡのうち、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡは、アミノ酸配列が配列番号２９、３０および３１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および、それぞれのアミノ酸配列が配列番号３６、３７、３８および３９に示されるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含むＬ鎖可変領域コードするＤＮＡでもよく、その具体的な一態様として、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡが挙げられる。配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号２４に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。ここで、通常、ＣＤＲをコードするＤＮＡを含むことでこのＤＮＡにコードされる抗体は抗原認識能を有するが、ＦＲをコードするＤＮＡをさらに含むことで、抗原認識能が担保されやすく、さらに、従来技術であるＣＳＬＥＸ１抗体のＬ鎖可変領域と同一のポリペプチドを含むＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡを有することで、抗原認識能がより担保される。
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡ中のＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとして、さらには、配列番号１４に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、シアリルＬｅｘに対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００４８】
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡ中のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡとしては、好ましくは、ＩｇＧ１型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡ、例えば、マウスＩｇＧ１型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡが挙げられ、その具体的な一態様としては、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号４０に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。
一方、本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡ中のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡは、任意の生物のＩｇＧ型抗体のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡから選択可能であるが、Ｈ鎖定常領域の由来生物種と同一の生物種のＩｇＧ型抗体のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡであることが好ましい。また、κ鎖定常領域をコードするＤＮＡ、λ鎖定常領域をコードするＤＮＡのいずれでもよい。本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡ中のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号５４に示すＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡ中のＨ鎖定常領域、もしくは、Ｌ鎖定常領域をコードするＤＮＡとして、さらには、それぞれ配列番号４０もしくは５４に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００４９】
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡにおいて、Ｈ鎖をコードするＤＮＡおよびＬ鎖をコードするＤＮＡは前記可変領域をコードするＤＮＡと定常領域をコードするＤＮＡとが連結されて構成される。ここで、前記可変領域と定常領域は、連結領域を介さず、または、連結領域を介して連結される。
可変領域をコードするＤＮＡ配列と定常領域をコードするＤＮＡ配列との連結方法としては、例えば、連結領域を介して、または、連結領域を介さずに２つのＤＮＡ配列が連結された配列を設計し、設計された配列を全合成する方法、一のＤＮＡ配列を遺伝子組換えベクターに挿入した後に、該ＤＮＡ配列と連続的な位置にまたは適切な間隔を空けて、もう一方のＤＮＡ配列を挿入する方法が挙げられる。
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡにおいて、例えば、Ｈ鎖をコードするＤＮＡに関しては、前記Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡと前記Ｈ鎖定常領域をコードするＤＮＡとが連結される。一方、Ｌ鎖に関しては、例えば、可変領域をコードするＤＮＡと定常領域をコードするＤＮＡ配列とが、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む連結領域をコードするＤＮＡ配列を介して連結される。配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む連結領域をコードするＤＮＡ配列としては、配列番号５２に示されるＤＮＡ配列が挙げられる。
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡ中のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡにおいて、Ｌ鎖可変領域とＬ鎖定常領域とを連結する領域をコードするＤＮＡとして、さらには、配列番号５２に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００５０】
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡは、例えば、動物由来のシグナル配列や動物抗体由来のシグナル配列をコードするＤＮＡを有することが好ましく、Ｈ鎖可変領域、および、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡの５´末端にシグナル配列をコードするＤＮＡを有することがより好ましい。
ここで動物としては、前記したように、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母、昆虫が挙げられる。シグナル配列としては、例えば、ＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体のシグナル配列をコードするＤＮＡ、ヒト酸性フォスファターゼのシグナル配列をコードするＤＮＡ、マウスイムノグロブリンκ鎖のシグナル配列をコードするＤＮＡ、およびマウスＩｇＧ１型抗体のシグナル配列をコードするＤＮＡが挙げられる。具体的な一態様として、Ｈ鎖に関するシグナル配列としては配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡ、一方、Ｌ鎖に関するシグナル配列としては配列番号２３に表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号１８で表されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられ、一方、配列番号２３に表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号２２に表されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。ここで、これらのシグナル配列を有することで、遺伝子組換えカイコにおいて、抗体の分泌組織、例えば絹糸腺や脂肪体、への移行が促進される。
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡ中のシグナル配列をコードするＤＮＡとして、さらには、それぞれ配列番号１８もしくは２２に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００５１】
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡの具体的な一態様としては、そのシグナル配列を含めたＨ鎖をコードするＤＮＡとして配列番号４２に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられ、一方、シグナル配列を含めたＬ鎖をコードするＤＮＡとして配列番号５６に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、シグナル配列を含まない場合、Ｈ鎖をコードするＤＮＡとして配列番号５８に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ、Ｌ鎖をコードするＤＮＡとして配列番号６０に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡが挙げられる。
本発明で提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡとして、さらには、それぞれ配列番号４２、５６、５８もしくは６０に示されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、シアリルＬｅｘ結合抗原に対する特異的結合能力を失わない限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
【００５２】
本発明おいてカイコに導入されるＤＮＡとしては、前述の本発明の抗体の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡを含めばよいが、好ましくは、カイコ由来の分泌組織、例えば、絹糸腺や脂肪体、に特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前述の本発明の抗体の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡとを含むものである。より好ましくは、カイコ由来の絹糸腺に特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前述の本発明の抗体の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡとを含むものである。なぜなら、カイコ由来の絹糸腺に特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターを利用することによって、カイコにおいてタンパク質を大量に発現させる器官である絹糸腺を利用して、本発明の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を多量に発現させることが可能となるからである。
好ましい態様として、例えば、カイコ由来の絹糸腺に特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前述の本発明の抗体の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体のＨ鎖またはシグナル配列を有するＨ鎖をコードするＤＮＡ、および、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前述の本発明の抗体の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対する抗体のＬ鎖またはシグナル配列を有するＬ鎖をコードするＤＮＡが挙げられる。これらのＴ細胞非依存性抗原に対する抗体のＨ鎖またはシグナル配列を有するＨ鎖をコードするＤＮＡと、Ｌ鎖またはシグナル配列を有するＬ鎖をコードするＤＮＡとは、直接連結していてもよく、また、他の遺伝子を介して連結していてもよい。
カイコに導入されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡの具体的な一態様としては、カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡ、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した配列番号５８または４２に記載された配列を含むＤＮＡ、および、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した配列番号６０または５６に記載された配列を含むＤＮＡが挙げられる。
さらに、配列番号で例示されるＤＮＡに代えて、これらの配列番号の配列を含むＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、機能的に同等な限りにおいて、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも１種の変異を有し、かつ、該配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いてもよい。ここで、一定の相同性としては、例えば、７０％以上の相同性が挙げられ、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。
ここで、「機能的に結合した」とは、プロモーターに転写制御因子が結合することにより、プロモーターの下流に存在するＤＮＡの発現が誘導されるように、該プロモーターと該ＤＮＡが結合していることをいう。従って、該ＤＮＡが他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、該プロモーターに転写制御因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、前記「機能的に結合した」の意味に含まれる。
この方法により、単独のプロモーターを使った場合より、導入遺伝子からの発現生産物の量が増えるという利点がある。
【００５３】
本発明において用いられるカイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターとは、カイコ細胞内で有効に働くプロモーターであればいずれでもよいが、カイコの絹糸腺において特異的にタンパク質の発現を誘導するように工夫されたプロモーターが好ましい。例えば、フィブロインＬ鎖タンパク質、フィブロインＨ鎖タンパク質、ｐ２５タンパク質、セリシンＩ遺伝子から合成されるタンパク質、もしくは、セリシンＩＩ遺伝子から合成されるタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターが挙げられる。ここで、絹糸腺は、カイコにおいて多量にタンパク質を発現させる器官であり、目的タンパク質を絹糸腺において発現させることで目的タンパク質を多量に得ることが可能となる。
一方、本発明において用いられるプロモーターとしては、カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターに代えて、カイコ由来の脂肪体特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターを用いてもよく、脂肪体特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターとしては、例えば、細胞質アクチンタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターが挙げられる。ここで、脂肪体は、カイコにおいて多量にタンパク質を発現させる器官であり、目的タンパク質を脂肪体において発現させることで目的タンパク質を多量に得ることが可能となる。
【００５４】
本発明において用いられるカイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子とその標的プロモーターの組み合わせとしては、例えば、転写因子ＧＡＬ４とＵＡＳ配列、転写因子ＴｅｔＲとＴＲＥ配列が挙げられるが、ＧＡＬ４とＵＡＳが好ましい。なぜなら、ＧＡＬ４とＵＡＳを用いたＧＡＬ４／ＵＡＳシステム（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，８５３−８５６，１９８８，Ｂｒａｎｄ，Ａ．Ｈ  ＆  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１８，４０１−４１５，１９９３）を利用することにより、目的とする遺伝子の発現部位や時期、量を正確に制御でき、多くの組織で容易に発現させることができるからである。また、発現させる遺伝子が致死性の遺伝子でも系統の作出が可能である。
【００５５】
以下、Ｔ細胞非依存性抗原がシアリルＬｅｘの場合を代表例として、本発明においてカイコに導入される抗体をコードするＤＮＡの具体的な一態様について説明するが、それ以外のＴ細胞非依存性抗原の場合も、塩基配列を変更して同様の説明を適用することができる。ここで、シアリルＬｅｘ以外のＴ細胞非依存性抗原に対する抗体をコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば、表１に記載したアミノ酸配列に基づいて決定することができ、また、後述の実施例で示される方法を同様に用いて、シアリルＬｅｘ以外のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体のアミノ酸配列を明らかにし、そのアミノ酸配列に基づいて決定することもできる。
【００５６】
本発明においてカイコに導入されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡの具体的な一態様としては、セリシンＩ遺伝子から合成されるタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に連結されたＧＡＬ４をコードするＤＮＡ、ＵＡＳ配列の下流に連結された配列番号４２で例示されるシグナル配列を有するシアリルＬｅｘに対する抗体のＨ鎖をコードするＤＮＡおよびＵＡＳ配列の下流に連結された配列番号５６で例示されるシグナル配列を有するシアリルＬｅｘに対する抗体のＬ鎖をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００５７】
本発明においてＤＮＡが導入されるカイコについては、特に制限はないが、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の大量生産のためには、フィブロインタンパク質などの絹糸を構成するタンパク質をコードするＤＮＡ領域（コード領域、プロモーター領域、非翻訳領域を含む）の変異によって、絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されているカイコを用いることが好ましい。このようなカイコとしては、絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されている突然変異系統のカイコ、好ましくは該変異によって絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されている裸蛹系統のカイコ、より好ましくはＮｄ−ｓＤが挙げられるが、絹糸を構成するタンパク質の生産抑制の原因が、人為的か否か、また、自然界において生じた変異に依存するか否かに関わらず、絹糸を構成するタンパク質の生産が抑制されているカイコであればよい。
本発明においてＤＮＡが導入されるカイコとしては、非休眠卵を産下する性質を有するカイコ、休眠卵を産下する性質を有するカイコ（例えば実用品種であるぐんま、２００、春嶺、鐘月、錦秋、鐘和等）を使用することができる。ここで、休眠卵とは産卵後胚発生が一時的に停止する卵を言い、非休眠卵とは産卵後胚発生が停止せず、幼虫が孵化する卵を言う。
【００５８】
本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは、前述の本発明においてＤＮＡが導入されるカイコに、安定に染色体に組み込まれる態様で前述の本発明においてカイコに導入されるＤＮＡを導入することで得られる。
【００５９】
本発明において遺伝子組換えカイコを得るために行われるカイコへのＤＮＡ導入は、前述の本発明においてカイコに導入されるＤＮＡが安定に前述の本発明においてＤＮＡが導入されるカイコの染色体に組み込まれる方法であれば特に限定しない。例えば、前述の本発明においてカイコに導入されるＤＮＡを含む遺伝子組換えベクターを構築し、この遺伝子組換えベクターをカイコ卵に遺伝子をマイクロインジェクションする方法（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，８１−８４，２０００）、遺伝子銃を用いる方法、バキュロウイルスベクターを使用する方法。などを用いることができる。中でも、トランスポゾンの逆位末端反復配列の間に前記本発明においてカイコに導入されるＤＮＡを含有する遺伝子組換えベクターとともに、トランスポゾン転移酵素をコードするＤＮＡを含むヘルパーベクターを同時にカイコ卵にマイクロインジェクションする方法（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，８１−８４，２０００）が好ましい。
前記ヘルパーベクターとしては、ｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，８１−８４，２０００）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
前記トランスポゾンとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃが好ましいが、これに限定されるものではなく、ｍａｒｉｎｅｒ、ｍｉｎｏｓ等を用いることもできる。
【００６０】
本発明において遺伝子組換えカイコを得るために行われるカイコへのＤＮＡ導入は、前述の本発明においてカイコに導入されるＤＮＡを分割して前記方法でカイコに導入し、それぞれ異なるＤＮＡ配列を有する成体遺伝子組換えカイコを交配させることでも実行することができる。異なるＤＮＡ配列を有する遺伝子組換えカイコの交配により、導入対象ＤＮＡ配列が全て導入された遺伝子組換えカイコを製造し、遺伝子組換えカイコを得ることができる。
例えば、一のカイコに、前述の本発明においてカイコに導入されるＤＮＡのうち、カイコ由来の絹糸腺または脂肪体特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするＤＮＡを前述の方法で導入し、もう一つのカイコに、前述の本発明においてカイコに導入されるＤＮＡのうち、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した本発明の抗体の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡ中のＨ鎖またはシグナル配列を有するＨ鎖をコードするＤＮＡ、および、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した本発明の抗体の製造方法に用いられるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体をコードするＤＮＡ中のＬ鎖またはシグナル配列を有するＬ鎖をコードするＤＮＡを導入し、これらのカイコ卵から得られる２種類の成体カイコ同士を交配させることで、前述の本発明においてカイコに導入されるＤＮＡが全て導入された遺伝子組換えカイコを得ることができる。
本発明において遺伝子組換えカイコを得るために行われるカイコの交配を伴うＤＮＡ導入の具体的一態様としては、一のカイコは、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合したＧＡＬ４をコードするＤＮＡが導入されたカイコであり、もう一つのカイコは、ＵＡＳ配列の下流に機能的に結合した配列番号５８または４２に記載された配列を含むＤＮＡ、および、ＵＡＳ配列の下流に機能的に結合した配列番号６０または５６に記載された配列を含むＤＮＡが導入されたカイコである。
この方法では、一のカイコに転写制御因子を導入し、この転写制御因子により発現する組織、時期、量などを決めることができるため、発現させたい遺伝子を導入した系統と交配させることにより、多くの系統を作ることなく、各組織や時期、量などを変えることができる利点がある。また、目的遺伝子を発現させることで遺伝子組換えカイコが不妊になる場合でも系統作出が可能である。さらに、単独のプロモーターを使った場合より、導入遺伝子からの生産物の量が増えるという利点もある。
なお、前述の本発明においてカイコに導入されるＤＮＡを分割して導入する方法としては、前記のカイコを交配させる方法以外に、例えば、片方のＤＮＡが導入されたカイコが産卵した卵に、もう片方のＤＮＡを前述の方法で人為的に導入する方法、および、分割されたＤＮＡのうち両方を、前述の方法で同じ卵に導入する方法が挙げられる。
【００６１】
本発明においてカイコへのＤＮＡ導入後に行われる遺伝子組換えカイコの選択は、ＤＮＡ導入がなされたと考えられるカイコからＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法を用いて、抽出されたＤＮＡ中に前述の本発明においてカイコに導入されるＤＮＡが含まれることを確認することにより行うことができる。
もしくは、前記遺伝子組換えカイコの選択は、前述の本発明においてカイコに導入されるＤＮＡとともに、適切なプロモーター、例えば、胚の単眼や蛾の複眼、神経由来の組織での発現を促すプロモーターである３ｘＰ３タンパク質、または、アクチンプロモーター、をその遺伝子領域の上流に有する公知のマーカー遺伝子を導入し、このマーカーの存在を確認することにより行うこともできる。前述のカイコを交配させることでＤＮＡ導入を行う場合においては、交配させる２種類のカイコに、それぞれ異なる公知のマーカー遺伝子を、それぞれに導入するＤＮＡとともに導入してもよい。
【００６２】
本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは、元来カイコが有さない抗体を発現させ、しかも、毒性があると考えられるＧＡＬ４／ＵＡＳ系システムを持つにもかかわらず、通常のカイコと同様の方法で、継代維持可能であり、さらには、子孫のカイコは、導入された抗体を製造することができる。
例えば、卵を通常の条件で催青し、孵化した蟻蚕を人工飼料等へ掃立てし、通常のカイコと同様な条件で飼育することで５令カイコまで飼育できる。
本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは、通常のカイコと同様に蛹化する。蛹の段階で雌雄を区別し、発蛾したのち雌雄を交尾させ、翌日採卵する。カイコ卵は通常のカイコ卵と同様に保存することが可能である。本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは、こうした飼育を繰り返すことで継代することが可能であり、また、大量に増やすことが可能である。
本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは人工飼料による清浄飼育が可能であり、大掛かりな設備がなくとも数万匹規模での大量飼育を容易に行うことができる。さらに自然界に豊富にある桑の葉を用いて遺伝子組換えカイコの安価な飼育も可能である。一方、例えば、哺乳動物細胞はその培養に大規模な培養設備や大量の培地を必要とし、安価な培養は困難である。したがって、製造コストの面から遺伝子組換えカイコを用いた抗体製造は哺乳動物細胞を用いた抗体製造よりも優れている。Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体、特に腫瘍マーカー糖鎖抗原に対するＩｇＧ型抗体といった診断用途での大量の需要が見込まれる抗体の商業的製造には、遺伝子組換えカイコを用いた抗体製造が適している。
【００６３】
本発明のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法において、該抗体が遺伝子組換えカイコから生産されるとは、遺伝子組換えカイコの体内組織において、導入された該抗体をコードするＤＮＡが転写、翻訳され、場合によっては、翻訳後処理を受け、その後、翻訳産物が、その体内組織から分泌されること、もしくは、その体内組織にとどまることをいう。ここで、本発明におけるカイコの体内組織としては、好ましくは、絹糸腺および脂肪体が挙げられ、翻訳産物はこれらから分泌されることが好ましい。なぜなら、翻訳産物が分泌された方が、その回収が容易となるからである。また、本発明におけるカイコの体内組織としては、タンパク質をより多量に生産可能なことから、絹糸腺がより好ましい。
ここで、絹糸腺は、前部絹糸腺、中部絹糸腺、後部絹糸腺に分けられるが、本発明における絹糸腺としては、中部絹糸腺および後部絹糸腺がより好ましい。なぜなら、絹タンパク質の合成は、中部絹糸腺および後部絹糸腺にて行われ、これらの器官から目的タンパク質を多量に得ることができるからである。
さらに、本発明で用いられるカイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターとして、セリシンＩ遺伝子から合成されるタンパク質、もしくは、セリシンＩＩ遺伝子から合成されるタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターを用いる場合には、本明細書における絹糸腺としては、中部絹糸腺が好ましく、フィブロインＬ鎖タンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターを用いる場合には、後部絹糸腺が好ましい。なぜなら、これらのプロモーターを用いて発現されるタンパク質は、それぞれの絹糸腺特異的に発現するからである。
一方、本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコとは、前述のように本発明の製造方法により製造する抗体がその体内組織において生産される遺伝子組換えカイコのことをいう。
【００６４】
本発明のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法は、遺伝子組換えカイコから生産される該抗体を回収することを工程として含む。本発明における回収方法としては、カイコの分泌物から該抗体を回収する方法が挙げられる。ここで、本発明における分泌物としては、例えば、絹糸腺、特に中部絹糸腺および後部絹糸腺、において分泌される液状絹または絹糸、および、脂肪体の分泌物が挙げられる。
本発明のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法において、該抗体を回収する方法としては、絹糸腺からの回収に関しては、例えば、吐糸期になったカイコを解剖し、絹糸腺を摘出した後、緩衝液中で、絹糸腺にピンセットやメスで傷を入れ、あるいは、絹糸腺をホモジナイズして、緩衝液中に放出される液状絹に含まれる該抗体を得る方法が挙げられる。また、遺伝子組換えカイコが吐糸した繭から回収する手法、界面活性剤を用いる手法、水溶液で溶かす等の当業者であれば公知の手法が挙げられる。一方、Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の脂肪体からの回収に関しては、幼虫体内から脂肪体を摘出し、タンパク質抽出のための緩衝液でホモジナイズすることや、脂肪体から体液に分泌させ、体液を分取する等の当業者であれば公知の手法が挙げられる。本発明におけるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の回収方法の具体的一態様としては、例えば、吐糸期になったカイコを解剖し、絹糸腺を摘出した後、緩衝液中で、絹糸腺をホモジナイズする手法が挙げられる。
【００６５】
本発明のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法は、カイコの分泌物から回収された該抗体を精製する工程を含んでもよい。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、または、これらの組み合わせを利用することにより行うことができる。本発明において、好ましくは、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、または、これらを組み合わせて利用する。より好ましくは、アフィニティークロマトグラフィーとして、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇのいずれかをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーを利用する。なぜなら、これらを用いることで簡便な精製が可能となるからである。
Ｔ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体には、抗体に対するアフィニティークロマトグラフィーとして最も一般的に用いられているＰｒｏｔｅｉｎ  ＡやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーへの親和性がなく、これらを用いた簡便な精製を行うことができなかった。これに対し、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、ＩｇＧ型抗体の定常領域を有することによって、特にＩｇＧ１型抗体の定常領域を有することによって、前記のアフィニティークロマトグラフィーへの親和性が高くなり、簡便な精製が可能となる。一方、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体から前述した方法で抗体断片を作成した場合、該抗体断片は通常の抗体から分子量が変化するため、ゲルろ過クロマトグラフィー等の適用が可能となる。
【００６６】
本発明の抗体の製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは、元来、免疫分子を有さないため、本発明の抗体の製造方法により製造される抗体以外の抗体が含まれない。この点について、前記ＷＯ２００７／０４６４３９号パンフレットにおいては、交差反応が起きる可能性が低く、抗原抗体反応の正確な測定に寄与することが指摘されているが、精製の容易化という観点からも非常に有用である。
【００６７】
本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体についての、精製後の抗体の抗原に対する反応性評価方法としては、例えば、当業者においては公知のＥＬＩＳＡ法が挙げられる。この際、Ｔ細胞非依存性抗原を含む生物由来試料を反応性評価に用いることができる。
【００６８】
以下、Ｔ細胞非依存性抗原がシアリルＬｅｘの場合を代表例として、本発明のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法についてより具体的に説明するが、以下の記載は本発明のＴ細胞非依存性抗原がシアリルＬｅｘ以外の抗原の場合についても、用いる抗原の種類や性質等に応じて適宜変更を加えて、同様に適用できるものである。
【００６９】
本発明の製造方法により得られるシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体の場合、抗原であるシアリルＬｅｘは低分子量化合物であるが、多価抗原であるため、例えば、捕獲抗体と一次抗体にＣＳＬＥＸ１抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定を行うことが可能である。また、シアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体の抗原に対する反応性評価に用いる試料としては、シアリルＬｅｘを含む癌細胞由来の試料が挙げられる。
【００７０】
詳細については実施例において記載されるが、本発明の抗体の製造方法により得られるシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体の抗原抗体反応は、明確な抗原濃度依存性を示す。さらには、本発明の抗体の製造方法により得られるシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体は、前記の簡便な手法で精製可能なのにもかかわらず、ハイブリドーマにより産生され煩雑な手法で精製された公知のＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体と同様に、抗原濃度依存性を示す。この事実は、本発明の抗体の製造方法により得られるシアリルＬｅｘに対するＩｇＧ型抗体を用いて、従来のＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体を容易に代替可能であり、前述した診断キットの迅速な供給に寄与することを示している。
この結果は、本発明の抗体の製造方法により得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、簡便な精製が可能でありかつＩｇＭ型抗体と同様の反応性を有することを示す。そのため、該抗体を用いたＩｇＭ型抗体の代替が可能なことを示唆している。
【００７１】
本発明で提供される遺伝子組換えベクターとしては、前記した本発明て提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡを含む遺伝子組換えベクター、更には、カイコ由来の絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするＤＮＡのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子の標的プロモーターの下流に、前記した本発明て提供されるシアリルＬｅｘに対する抗体をコードするＤＮＡが機能的に結合されている遺伝子組換えベクターが挙げられる。これらの遺伝子組換えベクターについては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＰ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等が挙げられる。
【００７２】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００７３】
（１）ＣＳＬＥＸ１抗体のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域の配列決定
（１−１）ＣＳＬＥＸ１抗体遺伝子５´末端領域のｃＤＮＡクローニングおよび配列決定
ＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体遺伝子の５´末端から定常領域開始点までのｃＤＮＡをクローニングした。次いで、クローニングされたｃＤＮＡの塩基配列を決定した。この領域は、５´末端から順に、シグナル配列をコードする塩基配列と、Ｈ鎖可変領域をコードする塩基配列またはＬ鎖可変領域をコードする塩基配列との２つの連結された塩基配列領域により構成される。【００７４】
具体的には、先ず、ＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体を産生するハイブリドーマ（寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８５８０）を培養し、細胞を遠心によって集めた。回収されたハイブリドーマにＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を添加して、添付の使用説明書に従って全ｍＲＮＡを抽出した。【００７５】
一方で、５´−ＦＵＬＬ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用い、添付の使用説明書に基づき、クローニングのためのプライマーを設計した。ここで、Ｈ鎖についてはマウスＩｇＭ型抗体のＨ鎖定常領域１（ＣＨ１）から配列番号１に示す５´リン酸化アンチセンスプライマー（ＩｇＭｈ−ＲＴ−ｐｒｉｍｅｒ）とそれぞれ配列番号２および３に示すセンスプライマー１、２（ＩｇＭｈ−Ａ１−ｐｒｉｍｅｒ、ＩｇＭｈ−Ａ２−ｐｒｉｍｅｒ）、および、それぞれ配列番号４および５に示すアンチセンスプライマー  １、２（ＩｇＭｈ−Ｓ１−ｐｒｉｍｅｒ、ＩｇＭｈ−Ｓ２−ｐｒｉｍｅｒ）を設計した。また、Ｌ鎖についてはマウスＩｇκの定常領域から配列番号６に示す５´リン酸化アンチセンスプライマー（ＩｇＫ−ＲＴ−Ｐｒｉｍｅｒ）とそれぞれ配列番号７および８に示すセンスプライマー１、２（ＩｇＫ−Ａ１−ｐｒｉｍｅｒ、ＩｇＫ−Ａ２−ｐｒｉｍｅｒ）、および、それぞれ配列番号９および１０に示すアンチセンスプライマー  １、２（ＩｇＫ−Ｓ１−ｐｒｉｍｅｒ、ＩｇＫ−Ｓ２−ｐｒｉｍｅｒ）を設計した。【００７６】
前記抽出された全ｍＲＮＡ４．１７μｇを鋳型として、５´−Ｆｕｌｌ  Ｒａｃｅ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔに添付の使用説明書に従い、５´末端をリン酸化したＩｇＭｈ−ＲＴ−ｐｒｉｍｅｒおよびＩｇＫ−ＲＴ−ｐｒｉｍｅｒを用いてｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成し、それに続き、得られた一本鎖ｃＤＮＡを環化した次いで、環化した一本鎖ｃＤＮＡ  を鋳型とし、ＩｇＭｈ−Ａ１−ｐｒｉｍｅｒ、ＩｇＭｈ−Ｓ１−ｐｒｉｍｅｒおよびＩｇＫ−Ａ１−ｐｒｉｍｅｒ、ＩｇＫ−Ｓ１−ｐｒｉｍｅｒを用いて、９４℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、９０秒の条件で２５サイクルのＰＣＲ反応を行った。さらに、その１００倍希釈した反応液１μｌを鋳型とし、ＩｇＭｈ−Ａ２−ｐｒｉｍｅｒ、ＩｇＭｈ−Ｓ２−ｐｒｉｍｅｒおよびＩｇＫ−Ａ２−ｐｒｉｍｅｒ、ＩｇＫ−Ｓ２−ｐｒｉｍｅｒを用いて、９４℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、９０秒のサイクルを３５回繰り返してＰＣＲを行なった。増幅された断片をアガロース電気泳動にて確認後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡを精製した。その後、精製したＤＮＡ断片をＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングした。【００７７】
得られたクローンのプラスミドＤＮＡを精製し、Ｈ鎖については７クローン、Ｌ鎖については５クローンを対象として、配列番号１１に示すＭ１３−Ｆ−Ｐｒｉｍｅｒを用いて、それぞれのシグナル配列および可変領域が連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を決定した。ここで得られたシグナル配列とＨ鎖可変領域とが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列は配列番号１２（対応するアミノ酸配列は配列番号１３）、シグナル配列とＬ鎖可変領域とが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列は配列番号１４（対応するアミノ酸配列は配列番号１５）で表される。【００７８】
（１−２）ＣＳＬＥＸ１抗体のＮ末端アミノ酸配列解析による可変領域の同定
ＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列を決定することで、前記（１−１）で得られた塩基配列からシグナル配列をコードする塩基配列と可変領域をコードする塩基配列とを分離し、Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域を同定した。【００７９】
具体的には、先ず、前記（１−１）で用いたハイブリドーマ（寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８５８０）より精製したＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体を２．５％の２−ＭＥで還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＨ鎖とＬ鎖を分離した。次いで、泳動されたタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）に転写して０．１％  Ａｍｉｄｏ  Ｂｌａｃｋ  １０Ｂ（ＮＡＫＡＲＡＩ）で染色した。続いて、染色されたＨ鎖とＬ鎖のバンドを切り出し、エドマン分解法によるＮ末端アミノ酸解析によりＮ末端側から５残基のアミノ酸配列をそれぞれ決定した。ここで、Ｈ鎖可変領域のＮ末端アミノ酸配列は配列番号１６で、Ｌ鎖可変領域のＮ末端アミノ酸配列は配列番号１７で表される。【００８０】
決定されたＣＳＬＥＸ１抗体Ｈ鎖またはＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をもとに、前記（１−１）で得られた塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列中のシグナル配列とＨ鎖またはＬ鎖可変領域との境界を決定し、それぞれの可変領域を同定した。ここで、Ｈ鎖のシグナル配列をコードする塩基配列は配列番号１８（対応するアミノ酸配列は配列番号１９）、Ｈ鎖可変領域をコードする塩基配列は配列番号２０（対応するアミノ酸配列は配列番号２１）、Ｌ鎖のシグナル配列をコードする塩基配列は配列番号２２（対応するアミノ酸配列は配列番号２３）、Ｌ鎖可変領域をコードする塩基配列は配列番号２４（対応するアミノ酸配列は配列番号２５）で表される。【００８１】
（１−３）ＣＳＬＥＸ１抗体Ｈ鎖およびＬ鎖のＣＤＲの同定
ＣＤＲ領域が既知の抗体のアミノ酸配列との比較から、ＣＳＬＥＸ１抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定した。【００８２】
具体的には、先ず、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｐｒｏｔｅｉｎ）から、マウスの免疫グロブリンのＨ鎖またはＬ鎖の可変領域のアミノ配列であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３全ての注釈があり、その配列長が１００残基以上１５０残基以下のものを収集した。次いで、収集されたＨ鎖可変領域の配列４０本と配列番号１６に示されるＣＳＬＥＸ１抗体Ｈ鎖可変領域との間、または、Ｌ鎖可変領域の配列７本と配列番号１８に示されるＣＳＬＥＸ１抗体Ｌ鎖可変領域との間でＣＬＵＳＴＡＬＷ２を用いてマルチプルアラインメントを得た。前記のＣＤＲ領域が既知であるＨ鎖またはＬ鎖についてのアミノ酸配列群中の８０％以上の配列で共通している得られたアラインメント中のＣＤＲ開始カラムおよび終止カラムに基づいて、Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域のＣＤＲを同定した。ここで、Ｈ鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、ＨＣＤＲ１が配列番号２６、ＨＣＤＲ２が配列番号２７、ＨＣＤＲ３が配列番号２８でそれぞれ表され、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列は、ＬＣＤＲ１が配列番号２９、ＬＣＤＲ２が配列番号３０、ＬＣＤＲ３が配列番号３１でそれぞれ表される。
ＮＣＢＩ  ＩｇＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を用いて、ＣＳＬＥＸ１抗体Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域の類似配列を検索したところ、前記全てのＣＤＲが完全に一致する配列は認められず、ＣＳＬＥＸ１抗体Ｈ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域のＣＤＲは新規なアミノ酸配列を有することを確認した。【００８３】
一方、同定されたＣＤＲの情報に基づいて、Ｈ鎖およびＬ鎖のフレームワーク領域を同定した。ここで、Ｈ鎖のＦＲのアミノ酸配列は、ＨＦＲ１が配列番号３２、ＨＦＲ２が配列番号３３、ＨＦＲ３が配列番号３４、ＨＦＲ４が配列番号３５でそれぞれ表され、Ｌ鎖のＦＲのアミノ酸配列は、ＬＦＲ１が配列番号３６、ＬＦＲ２が配列番号３７、ＬＦＲ３が配列番号３８、ＬＦＲ４が配列番号３９でそれぞれ表される。【００８４】
（２）カイコ形質転換用ＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体発現プラスミドベクターの構築
（２−１）ＩｇＧ１κ型抗体発現ベクターｐＵＣ５７／ＣＳＬＥＸＨおよびｐＵＣ５７／ＣＳＬＥＸＬの構築
前記（１−１）で決定した
ＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ抗体のシグナル配列と可変領域からなる塩基配列と、マウスのＩｇＧ型抗体の定常領域を構成する塩基配列を連結してＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ抗体を構成した。【００８５】
具体的には、その塩基配列が配列番号１２で表されるシグナル配列とＨ鎖可変領域とからなるポリペプチドをコードする塩基配列と、その塩基配列が配列番号４０（対応するアミノ酸配列は配列番号４１）で表される公知のマウスイムノグロブリンγ１鎖（ＩｇＧ１）定常領域をコードする塩基配列とが連結されて構成された、その塩基配列が配列番号４２（対応するアミノ酸配列は配列番号４３）で表されるＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体のＨ鎖をコードする塩基配列ＣＳＬＥＸＨを全合成し、ｐＵＣ５７ベクターにクローニングしてｐＵＣ５７／ＣＳＬＥＸＨを得た。ここで、イムノグロブリンγ１鎖定常領域は、その塩基配列が配列番号４４（対応するアミノ酸配列は配列番号４５）で表される定常領域１（ＣＨ１）、その塩基配列が配列番号４６（対応するアミノ酸配列は配列番号４７）で表されるヒンジ領域、その塩基配列が配列番号４８（対応するアミノ酸配列は配列番号４９）で表されるＨ鎖定常領域２（ＣＨ２）、その塩基配列が配列番号５０（対応するアミノ酸配列は配列番号５１）で表されるＨ鎖定常領域３（ＣＨ３）からなる。【００８６】
一方、その塩基配列が配列番号１４で表されるシグナル配列とＬ鎖可変領域とからなるポリペプチドをコードする塩基配列と、その塩基配列が配列番号５２（対応するアミノ酸配列は配列番号５３）で表される公知のマウスＪκセグメントをコードする塩基配列と、その塩基配列が配列番号５４（対応するアミノ酸配列は配列番号５５）で表される公知のマウスイムノグロブリンκ鎖をコードする塩気配列とが連結されて構成された、その塩基配列が配列番号５６（対応するアミノ酸配列は配列番号５７）で表されるＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体のＬ鎖をコードする塩基配列ＣＳＬＥＸＬを全合成し、ｐＵＣ５７ベクターにクローニングしてｐＵＣ５７／ＣＳＬＥＸＬを得た。【００８７】
ここで、得られたＣＳＬＥＸがコードするＨ鎖およびＣＳＬＥＸＬがコードするＬ鎖からなるＩｇＧ型抗体のサブクラスはＩｇＧ１であり、かつ、κ鎖の抗原性を有する。また、ＣＳＬＥＸＨおよびＣＳＬＥＸＬの配列構成は表２に示す通りである。
【表２】
2011046097.tif 000004
【００８８】
（２−２）カイコ形質転換用プラスミドベクターの構築
ＷＯ２００７／０４６４３９号パンフレット記載のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ／ＵＡＳ−ＳＶ４０ＵＴＲベクター、ｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰベクターおよびｐＤＮＲ／ＵＡＳ−ＳＶ４０ベクターを用いて、前記（２−１）で作成したＣＳＬＥＸＨとＣＳＬＥＸＬとが導入された、遺伝子組換えカイコにおいて標的遺伝子を効率的に発現させるＧＡＬ４／ＵＡＳシステム（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，８５３−８５６，１９８８，Ｂｒａｎｄ，Ａ．Ｈ  ＆  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１８，４０１−４１５，１９９３）を構成するためのプラスミドベクターｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ（図３参照）を構築した。【００８９】
具体的には、先ず、前記（２−１）で得られたｐＵＣ５７／ＣＳＬＥＸＬをＳｐｅＩ（東洋紡）で処理し、ＳｐｅＩ−ＣＳＬＥＸＬ−ＳｐｅＩ断片を得た（図１参照）。得られたＳｐｅＩ−ＣＳＬＥＸＬ−ＳｐｅＩ断片と、ＢｌｎＩ（ＴＡＫＡＲＡ）で処理された直鎖状ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ／ＵＡＳ−ＳＶ４０ＵＴＲベクターとをライゲーションし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐＩＩ／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＳＶ４０ＵＴＲを得た（図１参照）。
なお、ＢｌｎＩとＳｐｅＩは相補的断片を生じる制限酵素である。
次いで、得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＳＶ４０ＵＴＲをＳｐｅＩで処理し、ＳｐｅＩ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＳＶ４０―ＳｐｅＩ断片を得た（図１参照）。得られたＳｐｅＩ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＳＶ４０―ＳｐｅＩ断片と、ＢｌｎＩで処理された直鎖状ｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰベクターとをライゲーションし、ｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＳＶ４０ＵＴＲを得た（図１参照）。
一方、前記（２−１）で得られたｐＵＣ５７／ＣＳＬＥＸＨをＳｐｅＩで処理してＳｐｅＩ−ＣＳＬＥＸＨ―ＳｐｅＩ断片を得た（図２参照）。得られたＳｐｅＩ−ＣＳＬＥＸＨ―ＳｐｅＩ断片と、ＢｌｎＩで処理された直鎖状ドナーベクターｐＤＮＲ／ＵＡＳ−ＳＶ４０ＵＴＲとをライゲーションし、ｐＤＮＲ／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ−ＳＶ４０ＵＴＲを得た（図２参照）。
続いて、Ｃｒｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、添付の使用説明書に基づいて、ＤＮＲ／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ−ＳＶ４０ＵＴＲ内のＵＡＳ−ＣＳＬＥＸ−ＳＶ４０ＵＴＲ断片をｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ―ＳＶ４０ＵＴＲに導入して、ｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨベクターを得た（図３参照）。【００９０】
ここで、得られたｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨベクターは酵母の転写制御因子ＧＡＬ４の存在下で遺伝子発現を促すプロモーターＵＡＳと融合した抗体タンパク質遺伝子のＬ鎖およびＨ鎖をトランスポゾンｐｉｇｇｙＢＡＣの逆位末端反復配列の間に挿入したものである。（図３参照）。【００９１】
（３）ＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体発現遺伝子組換えカイコの作出
（３−１）発現ベクターのカイコ卵へのインジェクション
特開２００３−８８２７３号公報記載のポリヌクレオチド導入方法に従って、前記（２−２）で作成したｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨベクターと、転移酵素遺伝子をコードするヘルパープラスミドｐＡ３ＰＩＧ（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，８１−８４，２０００）とを同時に５３３粒の発生初期のカイコ卵に導入した。【００９２】
具体的には、産卵後８時間以内のカイコ卵をスライドガラス上に固定し、タングステン針を用いて固定されたカイコ卵の卵殻に穴を空け、該穴からガラスキャピラリーをカイコ卵の腹側の側面に対して８０°から９０°の角度で卵内に挿入し、該キャピラリーを通じて将来的に生殖細胞になる位置に、ｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨベクターと、転移酵素遺伝子をコードするヘルパープラスミドｐＡ３ＰＩＧとを注入した。【００９３】
（３−２）遺伝子組換えカイコの同定
前記（３−１）で発現ベクターが挿入された５３３粒のカイコ卵を孵化させ、得られた第１世代の成体を交配させることで得られた第２世代のカイコから、ｐＢａｃＮ／ｌｏｘＰ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨベクターが導入された２蛾区の遺伝子組換えカイコを選択した。その過程を表３に示す。
【表３】
2011046097.tif 000005
【００９４】
（３−３）ＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体発現系統の樹立
前記（３−２）で作出した２蛾区のＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ系統の遺伝子組換えカイコと、既に系統化されている絹糸腺特異的に発現するセリシンＩ遺伝子から合成されるタンパク質のＤＮＡの下流に機能的に結合したＧＡＬ４遺伝子をもつＳｅｒ１−ＧＡＬ４系統の遺伝子組換えカイコとを交配させ、ＧＡＬ４／ＵＡＳシステム（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，８５３−８５６，１９８８，Ｂｒａｎｄ，Ａ．Ｈ  ＆  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１８，４０１−４１５，１９９３）によりＣＳＬＥＸ１抗体を絹糸腺に発現させるＳｅｒ１−ＧＡＬ４／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ系統を樹立した。【００９５】
具体的には、ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ系統固体とＳｅｒ１−ＧＡＬ４系統個体を交配して得られた次世代の産卵後６日目の卵から、Ｓｅｒ１−ＧＡＬ４／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ系統個体を選択し、得られた個体を飼育した。【００９６】
ここで、Ｓｅｒ１−ＧＡＬ４／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ系統遺伝子組換えカイコは、絹糸腺特異的に発現するセリシンＩ遺伝子から合成されるタンパク質と同じプロモーターをもつＧＡＬ４遺伝子を有する。絹糸腺特異的に発現された転写因子ＧＡＬ４が、その標的配列であるＵＡＳに結合し、ＵＡＳの下流に存在するＣＳＬＥＸＬおよびＣＳＬＥＸＨを絹糸腺特異的に、また、大量に発現させる。発現、翻訳されたＣＳＬＥＸＬタンパク質およびＣＳＬＥＸＨタンパク質がＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体を形成する。【００９７】
（３−４）ＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体の発現確認
前記（３−３）で得られたＳｅｒ１−ＧＡＬ４／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ系統の遺伝子組換えカイコの絹糸腺において、ＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体が発現されていることを確認した。【００９８】
具体的には、先ず、吐糸期のＳｅｒ１−ＧＡＬ４／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ系統個体の幼虫から絹糸腺を摘出した。次いで、摘出された絹糸腺３本を１５０μｌのＰＢＳ中でポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズし、４℃、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。続いて、Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  ｋｉｔ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）を用いて、添付の使用説明書に基づき、得られた遠心上清中にκ鎖を持つＩｇＧ１型抗体が存在することを確認した（表４参照）。
【表４】
2011046097.tif 000006
【００９９】
一方、前記（１−２）と同様に遠心上清中から精製したＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１に対するＮ末端アミノ酸配列解析を行った。その結果、導入された塩基配列にはシグナル配列をコードする部分が含有されるにもかかわらず、前記（１−２）と同様に配列番号１６で表されるＨ鎖可変領域のＮ末端アミノ酸配列、および配列番号１７で表されるＬ鎖可変領域のＮ末端アミノ酸配列が得られた。この結果、免疫系が元来存在しないカイコにおいて、ＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体のシグナル配列を除去するプロセッシングが起きることが明らかとなった。【０１００】
（４）ＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体のシアリルＬｅｘに対する反応性評価
（４−１）絹糸腺抽出液の前処理
前記（３−３）で得られたＳｅｒ１−ＧＡＬ４／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ系統の遺伝子組換えカイコから、ＣＳＬＥＸ１抗体が含まれる精製サンプルを調整した。【０１０１】
具体的には、先ず、Ｓｅｒ１−ＧＡＬ４／ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＬ−ＵＡＳ−ＣＳＬＥＸＨ系統の組換えカイコ１００匹分の絹糸腺に１００ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を加え、ポリトロンホモジナイザーで破砕した。次いで、得られた破砕溶液を４℃、２４０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を回収した。また、遠心後の沈殿物に再度１００ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を加え、ポリトロンホモジナイザーで破砕して４℃、２４０００ｒｐｍで２０分間遠心した後、上清を回収した。さらに前記の操作をもう一度繰り返し、得られた上清を全て混合して計３００ｍｌの絹糸腺抽出液を得た。続いて、混合した絹糸腺抽出液に飽和硫安を終濃度１０％になるように添加し、４℃で一晩攪拌した。また、得られた水溶液を４℃、２４０００ｒｐｍ、３０分間遠心し、上清を回収して０．４５μｍのフィルターでろ過して精製サンプルとした。【０１０２】
（４−２）抗体の精製
前記（４−１）で得られた精製サンプルからＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体を、第１段階目にアフィニティークロマトグラフィーを用い、第２段階目にイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。この際、シアリルＬｅｘに対する反応性を評価して、ＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体が含まれるフラクションを回収した。【０１０３】
具体的には、先ず、精製サンプルを流速１ｍｌ／ｍｉｎで、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化されたｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）５ｍｌカラムに通液した。次いで、１５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を同流速で通液してカラムより抗体を溶出させ、抗体を含む溶出液７ｍｌを得た。ここで、得られた溶出液には予め溶液に対して１／１０量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を加えておき、溶出液は直ちに中和される。次に、溶出液のバッファーを脱塩し、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。【０１０４】
続いて、得られた溶出液を流速１ｍｌ／ｍｉｎで、予め２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通液した。その後、カラムに吸着したタンパク質を、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中のＮａＣｌ濃度が０〜５００ｍＭになるように、リニアグラジエント法を用いて溶出した。【０１０５】
溶出された各フラクション溶液をマイクロプレートウェル中に固相化し、それぞれのウェルにシアリルＬｅｘを含む４０Ｕ／ｍｌ相当の膵臓癌細胞株ＣＥＵの培養上清由来試料を加えた後、さらに、ハイブリドーマ（寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８５８０）から抽出精製してＨＲＰ標識を行ったＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体溶液を加え、続いて波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、高い吸光度を示すＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体が含まれるフラクションを回収した（図４）。なお、図４において、フラクション中のＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体のシアリルＬｅｘに対する反応性は、波長４５０ｎｍにおける吸光度によって測定され、また、フラクション中のタンパク質濃度は、波長２８０ｎｍにおける吸光度によって測定された。
図４に示すように、２段階の簡便な精製によってＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体を含むピークが明確に分離可能なことを確認した。【０１０６】
（４−３）抗体感作プレートによる反応性評価
前記（４−２）で精製されたＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体の癌細胞中に含まれるシアリルＬｅｘに対する反応性を評価した。特に、抗体の定量的な用途を示唆する抗原抗体反応の抗原濃度依存性を評価した。また、公知のＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体の反応性との比較を行った。【０１０７】
具体的には、先ず、前記（４−２）において回収したＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体を含む抗体フラクションから得たＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体溶液１００μｌを９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り１００μｌずつ加え、４℃で２晩静置してタンパク質の固相化を行った。次いで、１％カゼインを含むＰＢＳを１ウェル当り２００μｌずつ加え、４℃で１晩ブロッキングし、洗浄液（ＰＢＳ−Ｔ）で１回洗浄した。【０１０８】
一方、抗原であるシアリルＬｅｘ陽性サンプルとして４０Ｕ／ｍｌ相当の膵臓癌細胞株ＣＥＵの培養上清由来試料と０Ｕ／ｍｌ濃度試料を調整した。また、４０Ｕ／ｍｌ濃度試料を０Ｕ／ｍｌ濃度試料を用いて段階的に希釈し、２０Ｕ／ｍｌ濃度試料、１０Ｕ／ｍｌ濃度試料、５Ｕ／ｍｌ濃度試料をそれぞれ調整した。
前記ＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体が固相化されたウェル毎に、前記濃度を調整した試料の一を１００μｌ加え、３７℃で２時間振とうして、ＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体と試料中のシアリルＬｅｘ間で抗原抗体反応をさせた。その後、洗浄液で３回洗浄し、固相化されたＣＳＬＥＸ１抗体に結合していないシアリルＬｅｘを除去した。【０１０９】
続いて、ハイブリドーマ（寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８５８０）から抽出精製し、ＨＲＰ標識を行ったＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体溶液を１ウェル当り１００μｌ加え、３７℃で２時間振とうして、ＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体と固相化されたＩｇＧ型抗体に結合したシアリルＬｅｘとを抗原抗体反応をさせた。これを洗浄液で３回洗浄した後、ＨＲＰの酵素反応基質としてＴＭＢ溶液を１ウェル当り１００μｌ加え、室温で反応させた。反応開始２０分後に１ウェル当り１００μｌの１Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。反応停止後、ＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社製）を利用して、マイクロプレートの各ウェルの波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定を測定した（図５）。【０１１０】
比較例として、ハイブリドーマ（寄託番号ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ８５８０）から抽出精製したＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体溶液１００μｌを、前記（４−２）において回収したＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体溶液に代えて同様の操作を行い、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（図５）。
なお、シアリルＬｅｘは多価抗原であるため、共通の抗体可変領域をもち、それゆえ同一のエピトープをもつＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体またはＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体とＨＲＰ標識されたＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体とを用いたサンドイッチアッセイが可能である。
図５に示すように、本発明により製造されたＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体による抗原抗体反応において、抗原濃度依存的に吸光度が変化することを確認した。同時に、前記（４−２）に示した簡便な精製法により得られたＩｇＧ型ＣＳＬＥＸ１抗体が、煩雑な工程により精製された公知のＩｇＭ型ＣＳＬＥＸ１抗体と同程度の反応性を示すことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法により、Ｔ細胞非依存性抗原を免疫原としてモノクローナル抗体を作成した場合に通常得られるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型抗体と同様の反応性を有し、かつ精製が容易なＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体を安定的かつ効率的に生産可能である。この方法により得られたＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体は、精製が容易であるため純度を高めやすく、ＥＬＩＳＡ法等の免疫学的測定方法に利用可能であるので、このＩｇＧ型抗体を診断薬の分野で利用可能である。また、複数の疾病マーカーを組み合わせて行われる癌等の診断では複数種類の抗体が高純度でかつ多量に必要になる場合があるところ、本発明のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法により、既存のまたは新たに作成されもしくは見出されるＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＭ型を精製が容易で純度を高めやすいＩｇＧ型抗体に変換して効率的に生産することで、Ｔ細胞非依存性抗原に対する抗体の診断等での利用を促進することができる。さらに、本発明のＴ細胞非依存性抗原に対するＩｇＧ型抗体の製造方法により診断に利用可能な抗体の種類を充実させることで、新たな抗体の組合せを用いた、より精度の高い診断方法の確立に寄与できる可能性がある。
【配列表フリーテキスト】
【０１１２】
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−シグナル配列が連結されたシアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号１３−シグナル配列が連結されたシアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨ鎖可変領域
配列番号１４−シグナル配列が連結されたシアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号１５−シグナル配列が連結されたシアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬ鎖可変領域
配列番号１６−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨ鎖可変領域のＮ末端５残基
配列番号１７−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬ鎖可変領域のＮ末端５残基
配列番号１８−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨ鎖可変領域に連結するシグナル配列をコードするＤＮＡ
配列番号１９−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨ鎖可変領域に連結するシグナル配列
配列番号２０−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号２１−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨ鎖可変領域
配列番号２２−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬ鎖可変領域に連結するシグナル配列をコードするＤＮＡ
配列番号２３−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬ鎖可変領域に連結するシグナル配列
配列番号２４−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ
配列番号２５−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬ鎖可変領域
配列番号２６−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨＣＤＲ１
配列番号２７−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨＣＤＲ２
配列番号２８−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨＣＤＲ３
配列番号２９−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬＣＤＲ１
配列番号３０−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬＣＤＲ２
配列番号３１−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬＣＤＲ３
配列番号３２−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨＦＲ１
配列番号３３−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨＦＲ２
配列番号３４−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨＦＲ３
配列番号３５−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨＦＲ４
配列番号３６−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬＦＲ１
配列番号３７−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬＦＲ２
配列番号３８−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬＦＲ３
配列番号３９−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬＦＲ４
配列番号４０−マウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡ
配列番号４１−マウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域
配列番号４２−シグナル配列が連結されたシアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡとマウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡとが連結されてなるＤＮＡ
配列番号４３−シグナル配列が連結されたシアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨ鎖可変領域とマウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域とが連結されてなるポリペプチド
配列番号４４−マウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域の定常領域ドメイン１をコードするＤＮＡ
配列番号４５−マウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域の定常領域ドメイン１
配列番号４６−マウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域のヒンジ領域をコードするＤＮＡ
配列番号４７−マウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域のヒンジ領域
配列番号４８−マウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域の定常領域ドメイン２をコードするＤＮＡ
配列番号４９−マウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域の定常領域ドメイン２
配列番号５０−マウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域の定常領域ドメイン３をコードするＤＮＡ
配列番号５１−マウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域の定常領域ドメイン３
配列番号５２−マウスのＪκセグメントをコードするＤＮＡ
配列番号５３−マウスのＪκセグメント
配列番号５４−マウスのκ鎖定常領域をコードするＤＮＡ
配列番号５５−マウスのκ鎖定常領域
配列番号５６−シグナル配列が連結されたシアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとマウスの抗体のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡとが連結されてなるＤＮＡ
配列番号５７−シグナル配列が連結されたシアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬ鎖可変領域とマウスの抗体のＬ鎖定常領域とが連結されてなるポリペプチド
配列番号５８−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡとマウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡとが連結されてなるＤＮＡ
配列番号５９−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＨ鎖可変領域とマウスのＩｇＧ1型抗体のＨ鎖定常領域とが連結されてなるポリペプチド
配列番号６０−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとマウスの抗体のＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡとが連結されてなるＤＮＡ
配列番号６１−シアリルＬｅｘに対するＩｇＭ抗体ＣＳＬＥＸ1のＬ鎖可変領域とマウスの抗体のＬ鎖定常領域とが連結されてなるポリペプチド
配列番号６２−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体Ｂ５のＨＣＤＲ１
配列番号６３−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体Ｂ５のＨＣＤＲ２
配列番号６４−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体Ｂ５のＨＣＤＲ３
配列番号６５−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体Ｂ５のＬＣＤＲ１
配列番号６６−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体Ｂ５のＬＣＤＲ２
配列番号６７−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体Ｂ５のＬＣＤＲ３
配列番号６８−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体Ｂ５のＨ鎖可変領域（ＷＯ１９９６／０１３５９４号パンフレット図１６参照）
配列番号６９−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体Ｂ５のＬ鎖可変領域（ＷＯ１９９６／０１３５９４号パンフレット図１６参照）
配列番号７０−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体ＭＳＬ５のＨＣＤＲ１
配列番号７１−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体ＭＳＬ５のＨＣＤＲ２
配列番号７２−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体ＭＳＬ５のＨＣＤＲ３
配列番号７３−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体ＭＳＬ５のＬＣＤＲ１
配列番号７４−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体ＭＳＬ５のＬＣＤＲ２
配列番号７５−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体ＭＳＬ５のＬＣＤＲ３
配列番号７６−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体ＭＳＬ５のＨ鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＡＡ９３０３４参照）
配列番号７７−Ｌｅｙに対するＩｇＭ型抗体ＭＳＬ５のＬ鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＡＡＡ９３０３３参照）
配列番号７８−デキストランに対するＩｇＭ型抗体ＭＯＰＣ１０４ＥのＨＣＤＲ１
配列番号７９−デキストランに対するＩｇＭ型抗体ＭＯＰＣ１０４ＥのＨＣＤＲ２
配列番号８０−デキストランに対するＩｇＭ型抗体ＭＯＰＣ１０４ＥのＨＣＤＲ３
配列番号８１−デキストランに対するＩｇＭ型抗体ＭＯＰＣ１０４ＥのＬＣＤＲ１
配列番号８２−デキストランに対するＩｇＭ型抗体ＭＯＰＣ１０４ＥのＬＣＤＲ２
配列番号８３−デキストランに対するＩｇＭ型抗体ＭＯＰＣ１０４ＥのＬＣＤＲ３
配列番号８４−デキストランに対するＩｇＭ型抗体ＭＯＰＣ１０４ＥのＨ鎖可変領域（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ０１７５６参照）
配列番号８５−デキストランに対するＩｇＭ型抗体ＭＯＰＣ１０４ＥのＬ鎖可変領域（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ０１７２４参照）
配列番号８６−ラクトテトラオシルセラミドに対するＩｇＭ型抗体１１−５０のＨＣＤＲ１
配列番号８７−ラクトテトラオシルセラミドに対するＩｇＭ型抗体１１−５０のＨＣＤＲ２
配列番号８８−ラクトテトラオシルセラミドに対するＩｇＭ型抗体１１−５０のＨＣＤＲ３
配列番号８９−ラクトテトラオシルセラミドに対するＩｇＭ型抗体１１−５０のＬＣＤＲ１
配列番号９０−ラクトテトラオシルセラミドに対するＩｇＭ型抗体１１−５０のＬＣＤＲ２
配列番号９１−ラクトテトラオシルセラミドに対するＩｇＭ型抗体１１−５０のＬＣＤＲ３
配列番号９２−ラクトテトラオシルセラミドに対するＩｇＭ型抗体１１−５０のＨ鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＣＡＡ５１２７４参照）
配列番号９３−ラクトテトラオシルセラミドに対するＩｇＭ型抗体１１−５０のＬ鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＣＡＡ５１２７６参照）
【図１】
2011046097.tif 000007
【図２】
2011046097.tif 000008
【図３】
2011046097.tif 000009
【図４】
2011046097.tif 000010
【図５】
2011046097.tif 000011
【配列表】
2011046097000001.app
【国際調査報告】
2011046097.tif 000012
2011046097.tif 000013
2011046097.tif 000014