(57)【要約】  本発明は、操作性に優れ、外科手術をせずに、従来より短期間に再生が可能な、再生材を提供する。また、本発明は、組織の再生を有効に評価可能な評価方法を提供する。  本発明の上皮層含有組織の再生材は、高密度コラーゲン基材と、コラーゲン結合性生理活性物質とを含み、前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする。また、本発明の評価方法は、候補物質による組織の再生を評価する方法であって、下記（Ｘ）および（Ｙ）工程を含み、下記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする。（Ｘ）高密度コラーゲン基材を、前記候補物質と共に、実験動物の鼓膜欠損部に配置する工程（Ｙ）前記（Ｘ）工程後の前記鼓膜欠損部における組織の再生を評価する工程
2011142425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮層含有組織の再生材であって、
高密度コラーゲン基材と、コラーゲン結合性生理活性物質とを含み、
前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする上皮層含有組織の再生材。
【請求項２】
前記高密度コラーゲン基材に前記コラーゲン結合性生理活性物質を添加して使用する、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項３】
前記高密度コラーゲン基材を、前記コラーゲン結合性生理活性物質を含有する液に浸漬して、前記高密度コラーゲン基材に前記コラーゲン結合性生理活性物質を添加する、請求項２記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項４】
さらに、支持体を含み、
前記高密度コラーゲン基材が、前記支持体上に積層されている、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項５】
前記コラーゲン結合性生理活性物質が、コラーゲン結合性サイトカインである、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項６】
前記コラーゲン結合性サイトカインが、コラーゲン結合性成長因子およびコラーゲン結合性ケモカインの少なくとも一方である、請求項５記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項７】
前記コラーゲン結合性成長因子が、コラーゲン結合性上皮成長因子、コラーゲン結合性線維芽細胞増殖因子およびコラーゲン結合性血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項６記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項８】
前記コラーゲン結合性ケモカインが、コラーゲン結合性ストローマ細胞由来因子である、請求項６記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項９】
さらに、把持部を含み、
前記高密度コラーゲン基材に、前記把持部が配置されている、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項１０】
前記高密度コラーゲン基材が、下記（Ａ）工程を含む製造方法により製造された、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
（Ａ）支持体を配置した循環流路において、コラーゲン含有液を循環して、前記支持体上に前記高密度コラーゲン基材を形成する工程
【請求項１１】
前記コラーゲン含有液が、前記コラーゲン結合性生理活性物質を含む、請求項１０記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項１２】
前記コラーゲン含有液が、細胞を含まない、請求項１０記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項１３】
前記上皮層含有組織が、粘膜、上皮および鼓膜の少なくとも一つである、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項１４】
前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、１００ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項１５】
候補物質による組織の再生を評価する方法であって、
下記（Ｘ）および（Ｙ）工程を含み、
下記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする評価方法。
（Ｘ）高密度コラーゲン基材を、前記候補物質と共に、実験動物の鼓膜欠損部に配置する工程
（Ｙ）前記（Ｘ）工程後の前記鼓膜欠損部における組織の再生を評価する工程
【請求項１６】
前記（Ｘ）工程において、
前記高密度コラーゲン基材を、前記鼓膜欠損部の中耳側に配置する、請求項１５記載の評価方法。
【請求項１７】
前記高密度コラーゲン基材が、下記（Ａ）工程を含む製造方法により製造された、請求項１５記載の評価方法。
（Ａ）支持体を配置した循環流路において、コラーゲン含有液を循環して、前記支持体上に前記高密度コラーゲン基材を形成する工程
【請求項１８】
候補物質による組織再生を評価する評価用キットであって、
高密度コラーゲン基材を含み、
前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬであり、
請求項１５記載の評価方法に使用することを特徴とする、評価用キット。
【請求項１９】
前記高密度コラーゲン基材が、下記（Ａ）工程を含む製造方法により製造された、請求項１８記載の評価用キット。
（Ａ）支持体を配置した循環流路において、コラーゲン含有液を循環して、前記支持体上に前記高密度コラーゲン基材を形成する工程
【請求項２０】
上皮層含有組織を再生する再生方法であって、
請求項１記載の再生材を、生体に配置することを特徴とする再生方法。
【請求項２１】
前記上皮層含有組織が、粘膜、上皮および鼓膜の少なくとも一つである、請求項２０記載の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮層含有組織の再生材および再生評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な細胞が、生体外で培養可能になってきている。細胞を有機的に立体配置する培養技術として、例えば、三次元培養法が開発されている。前記三次元培養法は、従来、予め接着基質（いわゆる、足場材料）を作製し、これに細胞を播種して、培養液中で培養する方法（例えば、特許文献１〜６等）、ディッシュ（例えば、ペトリ皿）上で、前記接着基質と細胞とを混合して培養する方法等が開発されている。【０００３】
しかし、前者は、細胞を、前記接着基質内に遊走させる必要があり、後者は、播種した細胞により、前記接着基質を収縮させて高密度化する必要がある。このため、いずれの方法も、２週間程度の培養を要する。しかし、このような長期間の培養は、細胞から分泌される前記接着基質に対する分解酵素によって、三次元的に形成された接着基質が分解されるリスクが高まる。このように、三次元的に形成された接着基質は、移植医療、生命科学、新薬開発等における有用性が期待されているが、作製期間が長く、かつ利用期間が短いため、未だ充分に普及していない。【０００４】
他方、慢性中耳炎、外傷等の原因により、鼓膜に裂傷または穿孔等の欠損を生じる鼓膜穿孔という症状が知られている。前記鼓膜穿孔は、軽度の場合には、抗生物質の投与が有効である。しかしながら、重度の場合には、例えば、鼓膜形成術、鼓膜閉鎖術等が行われる。前記鼓膜形成術は、皮下組織等の移植により前記穿孔を塞ぎ、鼓膜再生を促す方法である。前記鼓膜形成術は、外科手術を伴うため、１〜２週間の入院と高額な医療費とを要し、かつ、再穿孔を起こす場合もある。これに対して、前記鼓膜閉鎖術は、障子紙、ステリストリップ（登録商標、３Ｍ社製）、キチンシート等を用いて、前記穿孔を塞ぎ、鼓膜再生を促す方法である。前記鼓膜閉鎖術は、近年、市販のゼラチンスポンジを用いて前記穿孔を塞ぎ、このシートに、ｂＦＧＦ（Basic  fibroblast  growth  factor）を毎日投与する治療法が報告されている（特許文献７）。しかし、前記ゼラチンスポンジは、スポンジ状のため脆く、吸水によりゲル状に膨潤するため、取り扱い難い。また、前記ｂＦＧＦは、保存安定性が低く、生体内における安定性も低い。このように失活の早いｂＦＧＦ投与のため、約２週間、毎日通院しなければならず、患者への負担が大きい。他方、鼓膜等の組織を再生する活性物質の探索が行われているが、有効なアッセイ系が無いのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０６−２７７０５０号公報
【特許文献２】特開平１０−５２２６１号公報
【特許文献３】特開２００１−１２０２５５号公報
【特許文献４】特開２００３−２６５１６９号公報
【特許文献５】国際公開第２００４／０７８９５４号パンフレット
【特許文献６】特開２００４−６５０８７号公報
【特許文献７】国際公開第２００９／１５７５５８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、操作性、有効性、確実性および安全性に優れ、従来より短期間に再生が可能な、粘膜、上皮および鼓膜等の上皮層含有組織の再生材の提供を目的とする。また、本発明は、種々の候補物質について、組織再生能を有効に評価可能な評価方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の粘膜、上皮層含有組織の再生材は、上皮層含有組織の再生材であって、
高密度コラーゲン基材と、コラーゲン結合性生理活性物質とを含み、
前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする。以下、「本発明の再生材」という。【０００８】
本発明の評価方法は、候補物質による組織の再生を評価する方法であって、
下記（Ｘ）および（Ｙ）工程を含み、
下記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする。
（Ｘ）高密度コラーゲン基材を、前記候補物質と共に、実験動物の鼓膜欠損部に配置する工程
（Ｙ）前記（Ｘ）工程後の前記鼓膜欠損部における組織の再生を評価する工程【０００９】
本発明の評価用キットは、候補物質による組織再生を評価する評価用キットであって、
高密度コラーゲン基材を含み、
前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であり、前記本発明の評価方法に使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の再生材は、前記高密度コラーゲン基材と前記コラーゲン結合性生理活性物質とを用いることにより、操作性に優れ、かつ、局所的に再生が促進されるため、副作用が起こりにくく、安全性にも優れる。また、本発明の再生材は、通常のコラーゲン基材に比べて分解されにくいことから、比較的長期間、形態が維持されるため、有効性、確実性が高い。さらに、本発明の再生材は、従来よりも短期間に、粘膜、上皮または鼓膜等の上皮層含有組織の再生が可能であるため、通院および高額な費用等の患者への負担を低減できる。また、本発明の評価方法により、候補物質による組織の再生を、有効に評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１およびコントロールにおける鼓膜の再生状況を示す写真である。
【図２】図２は、実施例２およびコントロールにおける残存穿孔サイズを示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３およびコントロールにおける外耳側の鼓膜の再生状況を示す写真である。
【図４】図４は、実施例３およびコントロールにおける中耳側の再生状況を示す写真である。
【図５】図５は、実施例４（ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質添加）およびコントロールにおける鼓膜の再生状況を示す写真である。
【図６】図６は、実施例４（ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質添加）およびコントロールにおける鼓膜の再生状況を示す写真である。
【図７】図７は、実施例５およびコントロールにおける外耳皮膚欠損部の写真である。
【図８】図８は、実施例６およびコントロールにおける鼓室表面粘膜の写真である。
【図９】図９は、本発明の再生材の製造に用いる製造装置の一例の概略図である。
【図１０】図１０は、本発明の再生材の製造に用いる形成用容器（リアクター）の一例の概略図である。
【図１１】図１１は、本発明の再生材の製造に用いる形成用容器（リアクター）における、コラーゲン含有液の液流方向を示す模式図である。
【図１２】図１２は、実施例７における鼓膜の再生状況を示す写真である。
【図１３】図１３は、実施例８における鼓膜の再生状況を示す写真である。
【図１４】図１４は、実施例８のコントロールにおける鼓膜の再生状況を示す写真である。
【図１５】図１５は、実施例３における鼓膜の再生状況を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の再生材は、前記高密度コラーゲン基材に前記コラーゲン結合性生理活性物質を添加して使用するのが好ましい。
【００１３】
本発明の再生材は、前記高密度コラーゲン基材を、前記コラーゲン結合性生理活性物質を含有する液に浸漬して、前記高密度コラーゲン基材に前記コラーゲン結合性生理活性物質を添加するのが好ましい。
【００１４】
本発明の再生材は、例えば、さらに、支持体を含み、前記高密度コラーゲン基材が、前記支持体上に積層されていてもよい。
【００１５】
本発明の再生材は、前記コラーゲン結合性生理活性物質が、コラーゲン結合性サイトカインであるのが好ましい。
【００１６】
本発明の再生材は、前記コラーゲン結合性サイトカインが、コラーゲン結合性成長因子およびコラーゲン結合性ケモカインの少なくとも一方であるのが好ましい。
【００１７】
本発明の再生材は、前記コラーゲン結合性成長因子が、コラーゲン結合性上皮成長因子、コラーゲン結合性線維芽細胞増殖因子およびコラーゲン結合性血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも一つであるのが好ましい。
【００１８】
本発明の再生材は、前記コラーゲン結合性ケモカインが、コラーゲン結合性ストローマ細胞由来因子であるのが好ましい。
【００１９】
本発明の再生材は、さらに、把持部を含み、前記高密度コラーゲン基材に、前記把持部が配置されているのが好ましい。
【００２０】
本発明の再生材は、例えば、前記コラーゲン含有液が、前記コラーゲン結合性生理活性物質を含んでもよい。
【００２１】
本発明の再生材は、前記コラーゲン含有液が、細胞を含まないのが好ましい。
【００２２】
本発明の評価方法は、前記（Ｘ）工程において、前記高密度コラーゲン基材を、前記鼓膜欠損部の中耳側に配置するのが好ましい。
【００２３】
本発明の再生材、評価方法および評価用キットにおいて、前記高密度コラーゲン基材は、下記（Ａ）工程を含む製造方法により製造されたものであることが好ましい。
（Ａ）支持体を配置した循環流路において、コラーゲン含有液を循環して、前記支持体上に前記高密度コラーゲン基材を形成する工程
【００２４】
つぎに、本発明について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の記載により制限されない。
【００２５】
本発明の再生材は、前述のように、高密度コラーゲン基材と、コラーゲン結合性生理活性物質とを含み、前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする。前記再生材は、前述の密度範囲でコラーゲンを含む前記高密度コラーゲン基材と、前記コラーゲン結合性生理活性物質とを含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の再生材は、例えば、再生用の足場材ということもできる。
【００２６】
本発明の再生材は、前述のように上皮層含有組織の再生に利用できる。前記上皮層含有組織は、特に制限されず、例えば、粘膜、上皮および鼓膜等があげられる。本発明の再生材は、例えば、粘膜、上皮および鼓膜の少なくとも一つの再生材ともいえる。なお、本発明の再生材の用途は、これらには限定されず、例えば、生体内における様々な器官、組織等の再生材としても使用できる。
【００２７】
前記コラーゲンは、特に制限されず、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型等のコラーゲンがあげられる。前記コラーゲンの種類は、例えば、本発明の再生材を適用する箇所に応じて選択でき、非軟骨性組織の場合、例えば、Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型であり、軟骨性組織の場合、例えば、ＩＩ型、Ｖ型である。また、簡便性の点から、例えば、Ｉ型が好ましい。前記コラーゲンは、例えば、コラーゲンを含む生体組織を、酸、アルカリ、酵素等を用いて可溶化して調製できる。前記生体組織は、特に制限されず、例えば、動物の皮、アキレス腱等の腱、鼻軟骨等があげられる。前記動物は、特に制限されず、例えば、豚、牛等の家畜、魚介類等があげられる。前記コラーゲンは、例えば、遺伝子組換え型コラーゲンでもよい。前記コラーゲンは、例えば、酵素処理等により、テロペプチドの全部または一部を除去したアテロコラーゲンが好ましい。前記テロペプチドの除去により、例えば、前記コラーゲンによるアレルギー反応、拒否反応等の生体不適合反応を、解消または抑制できる。前記コラーゲンは、例えば、１種類でもよいし、２種類以上の混合物でもよい。後者の場合、前記コラーゲンは、例えば、前述のコラーゲン型、生体組織、処理方法等が異なるコラーゲンの混合物でもよい。前記コラーゲンは、例えば、可溶性コラーゲンおよび不溶性コラーゲンがあげられるが、不溶性コラーゲンが好ましい。
【００２８】
前記高密度コラーゲン基材における前記コラーゲン密度（例えば、コラーゲン濃度ということもできる）は、前述のように、２０ｍｇ／ｍＬ以上である。本発明において、「前記高密度コラーゲン基材における前記コラーゲン密度（ｍｇ／ｍＬ）」は、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材１ｍＬあたりのコラーゲン重量（ｍｇ）を意味する。また、「前記高密度コラーゲン基材における前記コラーゲン密度（ｍｇ／ｍＬ）」は、例えば、「湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材の湿重量１ｇあたりのコラーゲン重量（ｍｇ）」ともいえる。前者の値は、例えば、ｍＬ＝ｃｍ３、比重を１と仮定することで、後者の値から算出できる。以下、コラーゲン密度に関する「ｍｇ／ｍＬ」の単位は、全て、「湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材の湿重量１gあたりのコラーゲン重量（ｍｇ）」と読み替えることができる。前記高密度コラーゲン基材は、例えば、湿潤液に浸漬することで、湿潤状態とすることができる。湿潤の程度は、例えば、湿潤液への浸漬により飽和していることが好ましい。前記湿潤液は、特に制限されず、例えば、後述するような、水、生理食塩水、緩衝液、生理緩衝液等があげられる。
【００２９】
本発明において、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材における前記コラーゲン密度は、例えば、市販試薬Ｓｉｒｃｏｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（商品名、バイオカラー社、http://www.biocolor.co.uk/index.php/assay-kits/sircol-1/）を用いて、マニュアル（http://www.biocolor.co.uk/manuals/sircol.pdf）に沿って行うことができる。一例を以下に示す。まず、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材の一部を採取して、体積または重量を測定し、全量を、０．５ｍｏｌ／Ｌ  酢酸１ｍＬに溶解して、この溶解液をコラーゲン試料とする。遠心管に、前記コラーゲン試料１００μＬ、および、シリウスレッドを含むピクリン酸試薬としてＳｉｒｃｏｌ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  １ｍＬを入れ、３０分間振とうする。振とうした前記遠心管を、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、上清を除去し、染色されたコラーゲンペレットを得る。このコラーゲンペレットを、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液であるＡｌｋａｌｉ  ｒｅａｇｅｎｔ溶液  １ｍＬ中で、１０分間振とうし、色素を抽出する。この抽出液の波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定する。他方、検量線作成のため、所定濃度（５、１０、２５および５０μｇ/１００μＬ）のコラーゲンを含む標準試料を調製する。前記標準試料は、前記コラーゲン試料と同様にして、吸光度を測定し、コラーゲン濃度と吸光度との検量線を作成する。そして、前記コラーゲン試料の吸光度と前記検量線とから、前記コラーゲン試料中のコラーゲン濃度を求め、前記高密度コラーゲン基材における前記コラーゲン密度を算出する。さらに、この結果から、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材１ｇ（湿重量）あたりのコラーゲン量を算出する。なお、前記高密度コラーゲン基材の体積を求めた場合は、例えば、比重１として重量を換算できる。
【００３０】
前記コラーゲン密度の下限は、前述のように、２０ｍｇ／ｍＬであり、例えば、好ましくは２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３４ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは、１００ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１５０ｍｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは、２００ｍｇ／ｍＬ以上、より特に好ましくは、２５０ｍｇ／ｍＬ以上であり、最も好ましくは、３００ｍｇ／ｍＬ以上である。前記コラーゲン密度は、例えば、使用目的の組織等の種類に応じて適宜決定できるが、その上限は、特に制限されず、例えば、５００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは４００ｍｇ／ｍＬであり、このような上限であれば十分な密度である。
【００３１】
前記高密度コラーゲン基材における前記コラーゲン密度の測定方法は、特に制限されない。前記測定方法は、例えば、シリウスレッドを用いた定量法、ハイドロキシプロリン定量法等の公知の方法があげられ、好ましくは、シリウスレッドを用いた定量法である。前記シリウスレッドを用いた定量法は、例えば、Ｓｉｒｃｏｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ（バイオカラー社製）等の市販キットを用いて実施できる。
【００３２】
前記高密度コラーゲン基材は、例えば、前記コラーゲンのみから構成されてもよいし、前記コラーゲンの他に、さらに前記コラーゲン以外の成分を含んでもよい。前記成分は、例えば、細胞外マトリックス成分等があげられる。前記細胞外マトリックス成分は、例えば、エラスチン、プロテオグリカン、フィブリン、フィブロネクチン、ラミニン、キチン、キトサン、これらの構成成分等があげられる。前記構成成分は、特に制限されず、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸等のグリコサミノグリカン等があげられる。前記細胞外マトリックス成分は、例えば、化学的に修飾されていてもよい。前記修飾は、例えば、生体内で通常見られる修飾でもよいし、各種活性または特性を付与するための人工的な修飾でもよい。前記細胞外マトリックス成分は、例えば、１種類でもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
前記高密度コラーゲン基材は、例えば、さらに、細胞を含んでもよいし、含まなくてもよい。前者の場合、前記高密度コラーゲン基材は、例えば、前記細胞による収縮作用のため、より高密度なコラーゲン基材を作製できる。また、後者の場合、例えば、前記細胞による拒絶反応、ウイルスへの感染等を回避できるため、より安全性の高いコラーゲン基材を作製できる。生体への配置を考慮すると、前記高密度コラーゲン基材は、例えば、前記細胞を含まないのが好ましい。
【００３４】
前記細胞は、特に制限されず、例えば、線維芽細胞、上皮細胞、角化上皮細胞、粘膜上皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、中皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、骨芽細胞等があげられる。前記細胞は、１種類でもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。前記高密度コラーゲン基材が前記細胞を含む場合、例えば、前記高密度コラーゲン基材は、収縮により、さらにコラーゲンが高密度化する。前記細胞の由来は、例えば、配置する生体と同じ動物種でもよいし、異なる動物種でもよく、好ましくは、配置する生体と同じ動物種である。前記動物種は、特に制限されず、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物があげられる。前記細胞は、例えば、配置する生体由来の細胞でもよいし、配置する生体以外の生体由来の細胞でもよく、例えば、前記拒絶反応等を考慮すると、配置する生体由来の細胞が好ましい。
【００３５】
前記高密度コラーゲン基材は、さらに、前記コラーゲン以外の成分として、例えば、塩類、基本培地の構成成分、添加剤等を含んでもよい。前記塩類は、特に制限されず、例えば、塩化ナトリウム等があげられる。前記基本培地は、例えば、α−ＭＥＭ、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＣＭＲＣ、ＨＡＭ、ＤＭＥ／Ｆ１２、ＴＣＭ１９９、ＭＣＤＢ等があげられる。前記高密度コラーゲン基材が前記細胞を含む場合、前記基本培地は、例えば、前記細胞の種類に応じて、前記細胞の培養に適した培地が好ましい。前記添加剤は、例えば、成長因子、ホルモン等の生理活性物質、血清、細胞付着促進物質等があげられる。
【００３６】
前記成長因子は、特に制限されず、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、神経栄養因子（ＮＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）等があげられる。前記ＶＥＧＦのファミリーは、特に制限されず、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ等があげられ、例えば、ＶＥＧＦ−Ａが好ましい。また、増殖因子は、例えば、ＰｌＧＦ−１、ＰｌＧＦ−２等の胎盤増殖因子があげられる。前記ホルモンは、特に制限されず、例えば、インシュリン、トランスフェリン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、チロキシン、３，３’，５−トリヨードチロシン、１−メチル−３−ブチルキサンチン、プロゲステロン等があげられる。前記生理活性物質は、これらの他に、例えば、アスコルビン酸、ビオチン、パントテン酸カルシウム、アスコルビン酸二リン酸、ビタミンＤ等のビタミン類、血清アルブミン、トランスフェリン等のタンパク質、脂質、脂質酸源、リノール酸、コレステロール、ピルビン酸、ＤＮＡ合成用ヌクレオシド、ＲＮＡ合成用ヌクレオシド、グルココルチコイド、レチノイン酸、β−グリセロホスフェート、モノチオグリセロール、抗生物質等があげられる。これらの添加剤は、例えば、いずれか１種類を単独で添加してもよいし、２種類以上を併用してもよい。前記血清は、特に制限されず、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清等があげられる。
【００３７】
前記細胞付着促進物質は、特に制限されず、例えば、ペプチド、タンパク質、多糖およびその誘導体、その他のポリマー等があげられる。前記ペプチドは、例えば、細胞接着性オリゴペプチド、ポリリジン、ヒストン、グルテン、ゼラチン、フィブリン、フィブロイン等があげられる。前記細胞接着性オリゴペプチドは、特に制限されず、ＲＧＤ、ＲＧＤＳ、ＧＲＧＤＳ、ＹＩＧＳＲ、ＩＫＶＡＶ等のアミノ酸配列があげられ、これらのアミノ酸配列からなるオリゴペプチドまたは前記アミノ酸配列を含むオリゴペプチドがあげられる。前記タンパク質は、例えば、前述のペプチドを含むタンパク質、前述のペプチドのアミノ酸配列を組み込んだ組換えタンパク質等があげられる。前記多糖は、例えば、アルギン酸、デンプン、デキストラン等があげられる。前記その他のポリマーは、特に制限されず、前記ポリマーの構成成分は、例えば、乳酸、グリコール酸、カプロラクトン、ヒドロキシブチレート等があげられる。前記その他のポリマーは、例えば、生分解性ポリマーがあげられる。前記その他のポリマーは、例えば、前記構成成分のポリマーまたはコポリマーでもよい。前記その他のポリマーは、例えば、前記ポリマーまたは前記コポリマーと、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールとのブロックコポリマー等の生分解性ポリマーでもよい。
【００３８】
前記高密度コラーゲン基材の形状および大きさは、特に制限されず、例えば、用途に応じて適宜設定可能である。前記形状の具体例は、例えば、シート状、フィルム状等があげられる。前記高密度コラーゲン基材は、例えば、乾燥タイプ（ドライタイプ）でもよいし、湿潤タイプ（ウェットタイプ）でもよい。前記高密度コラーゲン基材は、例えば、冷凍されていてもよいし、冷蔵されていてもよい。
【００３９】
前記高密度コラーゲン基材の製造方法は、特に制限されず、例えば、循環法、遠心法等があげられる。
【００４０】
前記循環法は、例えば、下記（Ａ）工程を含む製造方法があげられる。
（Ａ）支持体を配置した循環流路において、コラーゲン含有液を循環して、前記支持体上に前記高密度コラーゲン基材を形成する工程
【００４１】
前記（Ａ）工程において、前記支持体は、例えば、液流制御部材、メッシュ部材等を含んでもよい。
【００４２】
前記液流制御部材は、例えば、前記コラーゲン含有液を通過させ、かつ、その液流を減速させる部材が好ましい。前記液流制御部材は、例えば、多孔質膜、織布、不織布等があげられ、前記多孔質膜が好ましい。前記多孔質膜の材質は、特に制限されず、例えば、多孔質ポリマー、紙、絹フィブロイン等があげられ、好ましくは、前記多孔質ポリマーである。前記多孔質ポリマーを使用した前記液流制御部材は、例えば、局所還流を制御できる。これにより、例えば、製造装置の構成をより簡素化でき、前記支持体の目詰まりによる還流障害をさらに回避できる。前記多孔質ポリマーは、特に制限されず、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）等の生分解性ポリマーが好ましい。前記生分解性ポリマーを使用した前記液流制御部材は、例えば、生体に配置後、経時的に分解される。このため、より安全性に優れた再生材を製造できる。前記液流制御部材の網目または孔径は、特に制限されず、例えば、１０〜５００μｍであり、好ましくは、５０〜２５０μｍである。
【００４３】
前記メッシュ部材は、特に制限されず、例えば、前記高密度コラーゲン基材を支持できるものが好ましい。前記メッシュ部材は、例えば、前記コラーゲン含有液の液流を大きく妨げない孔または網目を有することが好ましい。前記孔または網目の大きさは、特に制限されず、例えば、１０μｍ〜１ｍｍ、好ましくは、０．２５〜０．５ｍｍである。前記メッシュ部材の材質は、特に制限されず、例えば、ステンレス等の金属、ポリエステル等の合成樹脂、セラミック、人工材料等があげられ、好ましくは、前記金属である。前記金属製のメッシュ部材は、例えば、滅菌および洗浄操作性に優れる。前記メッシュ部材の材質は、例えば、生体適合性材料でもよい。前記生体適合性材料製のメッシュ部材は、例えば、安全性および患部処置時の操作性に優れる。
【００４４】
前記支持体は、例えば、前記液流制御部材または前記メッシュ部材を単独で含んでもよいし、前記液流制御部材および前記メッシュ部材を含んでもよい。前者の場合、例えば、前記液流制御部材を単独で含んでもよく、前記高密度コラーゲン基材は、例えば、前記液流制御部材上に形成される。後者の場合、例えば、前記液流制御部材および前記メッシュ部材は、接触または近接して、層状に配置される。この場合、前記液流制御部材は、例えば、前記メッシュ部材よりも、前記コラーゲン含有液の液流の上流側に配置されるのが好ましい。前記液流制御部材と前記メッシュ部材との距離は、特に制限されず、例えば、２ｍｍ以下であり、好ましくは、１ｍｍ以下である。前記液流制御部材は、例えば、前記メッシュ部材よりも、前記コラーゲン含有液の液流の上流側に配置されてもよいし、反対の下流側に配置されてもよく、好ましくは、前者である。前者のように配置すれば、前記メッシュ部材により、例えば、前記液流制御部材上に形成された前記高密度コラーゲン基材を、より安定的に保持できる。
【００４５】
前記（Ａ）工程において、前記コラーゲン含有液は、前述のコラーゲンを含む以外は、特に制限されない。前記コラーゲン含有液中の前記コラーゲン濃度は、特に制限されず、下限は、例えば、０．１ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．２５ｍｇ／ｍＬであり、上限は、例えば、１ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．７５ｍｇ／ｍＬであり、その範囲は、例えば、０．１〜１ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．２５〜０．７５ｍｇ／ｍＬである。前記コラーゲン含有液は、例えば、さらに、前記コラーゲン以外の成分を含んでもよい。前記成分は、前述した塩類、基本培地の構成成分、添加剤等があげられる。前記コラーゲン含有液の溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液、生理食塩水、緩衝生理食塩水、前記基本培地等があげられ、前記コラーゲン含有液は、具体的には、例えば、水、緩衝液、生理食塩水、前記緩衝生理食塩水または前記基本培地等に、コラーゲンを添加した溶液等があげられる。前記コラーゲン含有液は、例えば、さらに、前記細胞を含んでもよい。前記コラーゲン含有液中の前記細胞の密度は、特に制限されず、例えば、１×１０７〜５×１０７細胞／ｍＬであり、好ましくは、２×１０７〜３×１０７細胞／ｍＬである。前記（Ａ）工程では、前述のように、前記コラーゲン含有液を循環して前記高密度コラーゲン基材を形成する。このため、例えば、前記成分および／または前記細胞等を添加した前記コラーゲン含有液を使用すれば、前記成分および／または前記細胞等を含有する高密度コラーゲン基材を、より容易に形成できる。
【００４６】
前記（Ａ）工程の処理時間は、特に制限されず、例えば、前記高密度コラーゲン基材が所望の厚さに形成されるまで行うことが好ましい。前記高密度コラーゲン基材の形成は、例えば、従来公知の方法により行える。前記循環流路における前記コラーゲン含有液の流速は、特に制限されず、例えば、０．５〜７ｍＬ／分であり、好ましくは、１〜２ｍＬ／分である。循環時間は、特に制限されず、例えば、３〜７２時間であり、好ましくは、１２〜２４時間である。前記高密度コラーゲン基材の厚さは、特に制限されず、例えば、０．５〜３ｍｍであり、好ましくは、１〜２ｍｍである。前記高密度コラーゲン基材の形状および大きさは、特に制限されず、例えば、欠損部の形状および大きさ等に応じて適宜設定でる。前記高密度コラーゲン基材は、例えば、製造後に、メス等の切除用具を用いて、所望の形状および大きさに加工できる。
【００４７】
前記（Ａ）工程は、例えば、図９に示す製造装置を用いて実施できる。図９は、製造装置の一例を示す模式図であり、具体的には、閉鎖循環式製造装置の一例である。図９に示すように、製造装置１は、リアクター１０、液体用容器３０、循環ポンプ４０、フローセル５０、管路１００ａ〜１００ｄおよびインキュベーター６０を含む。リアクター１０、液体用容器３０、循環ポンプ４０およびフローセル５０は、管路１００ａ〜１００ｄで連通されており、これらは、インキュベーター６０内に配置されている。製造装置１は、さらに、例えば、溶存酸素センサー７０等のセンサー、前記センサーによる計測値の表示装置８０、スターラー９０を備えてもよい。スターラー９０は、例えば、液体用容器３０内の磁気撹拌子を回転させて前記コラーゲン含有液を撹拌するための磁気回転装置である。前記磁気回転装置の回転速度は、特に制限されず、例えば、１００ｒｐｍ以下が好ましく、より好ましくは、５０〜６０ｒｐｍである。
【００４８】
リアクター１０内には、前記高密度コラーゲン基材を作製する形成用容器２（リアクター）が配置される。図１０に、形成用容器２の一例について、分解構成図を、図１１に、形成用容器２の概略図を示す。図１０において、形成用容器２は、外筒２１、シリコーンリング２２、メッシュ部材２３、生分解性シート２４およびシリコーンリング２５を有し、外筒２１は、筒状体である。外筒２１は、例えば、底を有してもよいし、有していなくてもよい。後者の場合、リアクター１０の底部が、外筒２１の底部を兼ねる。形成用容器２は、シリコーンリング２２、メッシュ部材２３、生分解性シート２４、シリコーンリング２５が、外筒２１内に、前記筒状体の軸方向に略垂直になるように積層されている。この積層体２６は、外筒２１の内周面に形成されたリブ２７上に、シリコーンリング２５が上面になるように配置され、さらに、外筒２１の内周に当接するスペーサー２８が、前記シリコーンリング２５側に配置されて、外筒２１内に装着されている。図１１において、スペーサー２８は、外筒２１内部に配置された際、その上部端が、外筒２１の上部端と同じ高さであることが好ましい。また、図１０において、外筒２１は、リブ２７の下方に、積層体２６を通過したコラーゲン含有液を排出するスリット２９が形成されている。スリット２９は、例えば、数、大きさ、形状等は、何ら制限されない。
【００４９】
製造装置１において、液体用容器３０内の前記コラーゲン含有液は、循環ポンプ４０によりリアクター１０内に導入され、形成用容器２内を通過し、さらに、フローセル５０を通過後、液体用容器３０に還流する。図１１に示すように、本例では、前記コラーゲン含有液を、形成用容器２のシリコーンリング２５側から流入させ、シリコーンリング２２側に通過させる。この循環を、例えば、数時間〜数日間行うことにより、生分解性シート２４上に、前記高密度コラーゲン基材が形成される。
【００５０】
前記遠心法は、例えば、下記（Ｂ１）および（Ｂ２）工程を含む製造方法があげられる。
（Ｂ１）コラーゲン溶液を加温して、コラーゲンゲルを形成する工程
（Ｂ２）前記コラーゲンゲルを遠心管に入れて、超遠心処理する工程
【００５１】
前記（Ｂ１）工程において、前記コラーゲンの種類は、特に制限されず、例えば、前述のコラーゲン等があげられる。前記加温温度は、特に制限されず、例えば、３０〜４０℃であり、好ましくは、３５〜４０℃であり、より好ましくは、３７℃である。前記加温時間は、特に制限されず、例えば、１０〜６０分であり、好ましくは、２０〜４０分であり、より好ましくは、３０分である。
【００５２】
前記（Ｂ２）工程において、前記遠心処理の回転数は、特に制限されず、例えば、５０００〜２００００ｒｐｍであり、好ましくは、７５００〜１５０００ｒｐｍであり、より好ましくは、１００００ｒｐｍである。
【００５３】
前記コラーゲン結合性生理活性物質は、一般に、コラーゲンに対する結合性を有する生理活性物質をいう。前記コラーゲン結合性生理活性物質は、例えば、天然の物質でもよいし、前記コラーゲン結合性を有するペプチドと生理活性物質との融合タンパク質（融合ペプチドの意味を含む。以下、同様）、前記コラーゲン結合性を有するペプチドと生理活性物質との結合物等でもよい。前記コラーゲン結合性を有するペプチドは、特に制限されず、例えば、コラゲナーゼに由来するコラーゲン認識ペプチド、コラーゲン結合性アドへジンに由来するコラーゲン結合ドメイン、細胞接着分子のコラーゲン結合部位、フォンヴィルブランド因子のコラーゲン結合部位等があげられる。
【００５４】
前記コラーゲン認識ペプチドは、例えば、コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）等があげられる。前記コラーゲン結合性生理活性物質は、具体的には、例えば、前記コラーゲン結合性を有するペプチドである前記コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）と、前記生理活性物質との融合タンパク質等があげられる。
【００５５】
前記コラーゲン結合性生理活性物質に含まれる前記生理活性物質は、例えば、直接または間接的に、生理作用、薬理作用等を示す物質等があげられる。前記生理活性物質は、特に制限されず、具体的には、例えば、サイトカイン、ホルモン、酵素、ビタミン等があげられる。前記コラーゲン結合性生理活性物質は、例えば、前記生理活性物質の全部を含んでもよいし、その一部を含んでもよい。前記生理活性物質の一部は、特に制限されず、例えば、生理活性物質として機能する最小限のアミノ酸領域、生理活性作用が高いアミノ酸領域等があげられる。前記生理活性物質の一部を含んだ前記コラーゲン結合性生理活性物質は、例えば、合成が容易であり、使用時の副作用を低減できる。
【００５６】
前記サイトカインは、特に制限されず、例えば、成長因子、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、造血因子、細胞傷害因子、神経栄養因子等があげられる。
【００５７】
前記成長因子は、特に制限されず、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）等があげられ、好ましくは、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である。
【００５８】
前記ケモカインは、特に制限されず、例えば、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１、ストローマ細胞由来因子−１）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８等のＣＸＣケモカイン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２等のＣＣケモカイン、ＸＣＬ１等のＣケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン等があげられ、好ましくは、ＣＸＣＬ１２である。
【００５９】
前記インターフェロンは、特に制限されず、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−λ等があげられる。
【００６０】
前記インターロイキンは、特に制限されず、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８等があげられる。
【００６１】
前記造血因子は、特に制限されず、例えば、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ)等があげられる。
【００６２】
前記細胞傷害因子は、特に制限されず、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β等があげられる。
【００６３】
前記神経栄養因子は、特に制限されず、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）等があげられる。
【００６４】
前記コラーゲン結合性生理活性物質に含まれる前記ホルモンは、特に制限されず、例えば、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン等があげられる。
【００６５】
前記コラーゲン結合性生理活性物質に含まれる前記酵素は、特に制限されず、例えば、第Ｘ因子、トロンビン、ウロキナーゼ、プラスミン等のプロテアーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ等の炎症性メディエーター不活性化酵素等があげられる。
【００６６】
前記コラーゲン結合性生理活性物質が前記融合タンパク質の場合、前記融合タンパク質は、例えば、市販品でもよいし、調製品でもよい。前記融合タンパク質の調製方法は、特に制限されず、従来公知の方法があげられる。前記融合タンパク質は、例えば、下記（Ｐ１）〜（Ｐ３）工程により製造できる。以下の例では、前記融合タンパク質において、コラーゲン結合性を示すドメインとして前記ＣＢＤを使用するが、本発明は、以下の例により制限されない。
（Ｐ１）細菌性コラゲナーゼのコラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）をコードする遺伝子断片を、ベクターに挿入する工程
（Ｐ２）前記（Ｐ１）工程後の前記ベクターに、さらに、前記ＣＢＤに融合させる生理活性物質をコードする遺伝子断片を挿入し、前記生理活性物質と前記ＣＢＤとの融合タンパク質を発現する発現ベクターを構築する工程
（Ｐ３）前記（Ｐ２）工程の発現ベクターを宿主に導入して形質転換し、この形質転換体を培養して、前記融合タンパク質を生産および精製する工程
【００６７】
前記各種断片を挿入する前記ベクターは、特に制限されず、従来公知のベクターが使用できる。前記ベクターは、例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターが使用でき、後者は、例えば、各種プラスミドがあげられる。
【００６８】
前記（Ｐ１）工程は、例えば、常法により、以下のように行ってもよい。まず、公知の細菌性コラゲナーゼの構造遺伝子を鋳型とし、ＰＣＲ法等の核酸増幅法により前記ＣＢＤをコードする遺伝子断片を得る。そして、前記遺伝子断片を、任意のベクターに挿入する。
【００６９】
前記細菌性コラゲナーゼの構造遺伝子は、特に制限されず、例えば、配列番号１の塩基配列に示すＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ  ｃｏ１Ｈ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２９９８１．１）等があげられる。配列番号２に、前記Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ  ｃｏ１Ｈ遺伝子がコードするコラゲナーゼのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ０６２５１．１）を示す。前記配列番号１において、５’末端から３０１０番目〜３３６６番目の塩基配列（配列番号３）が、前記ＣＢＤをコードする。前記ＣＢＤをコードする遺伝子断片の塩基配列は、例えば、下記（Ｑ１）〜（Ｑ４）に表される塩基配列でもよい。
（Ｑ１）配列番号３に表される塩基配列
（Ｑ２）配列番号３に表される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなり、かつ、コラーゲン結合活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（Ｑ３）配列番号３に表される塩基配列と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、コラーゲン結合活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（Ｑ４）配列番号３に表される塩基配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズする塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなり、かつ、コラーゲン結合活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
【００７０】
前記（Ｐ２）工程は、例えば、常法を用いて、以下のように行ってもよい。まず、前記生理活性物質を発現している細胞から全ＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡライブラリーを調製する。そして、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法により前記生理活性物質をコードするＤＮＡ断片を得る。前記生理活性物質をコードするＤＮＡ断片は、例えば、前記生理活性物質のｃＤＮＡの全塩基配列でもよいし、その部分配列でもよい。前記ＤＮＡ断片を、前記工程（Ｐ１）後の前記ベクターに挿入する。これによって、前記ベクターにおいて、前記生理活性物質と前記ＣＢＤとの融合タンパク質をコードする融合遺伝子が挿入される。
【００７１】
前記生理活性物質を発現している細胞は、特に制限されず、例えば、マクロファージ等の免疫担当細胞、血管内皮細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、滑膜細胞等が好ましい。
【００７２】
前記生理活性物質が上皮成長因子（ＥＧＦ）の場合、前記ＤＮＡ断片の塩基配列は、例えば、配列番号４に示すＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＭ＿１２８４２．１）の塩基配列等があげられる。配列番号５に、前記Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ遺伝子がコードするタンパク質（ＥＧＦ）のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＰ＿０３６９７４．１）を示す。前記生理活性物質が前記線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の場合、前記塩基配列は、例えば、配列番号６に示すＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２（ｂａｓｉｃ）遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＭ＿００２００６．４）の塩基配列等があげられる。配列番号７に、前記Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２（ｂａｓｉｃ）遺伝子がコードするタンパク質（ｂＦＧＦ）のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＰ＿００１９９７．５）を示す。前記生理活性物質が前記血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の場合、前記塩基配列は、例えば、配列番号８に示すＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＭ＿００９５０５．３）の塩基配列等があげられる。配列番号９に、前記Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ遺伝子がコードするタンパク質（ＶＥＧＦ）のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＰ＿０３３５３１．２）を示す。前記生理活性物質が前記ストローマ細胞由来因子（ＣＸＣＬ１２）の場合、前記塩基配列は、例えば、配列番号１０に示すＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ  １２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ００６６４０．１）の塩基配列等があげられる。配列番号１１に、前記Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ  １２遺伝子がコードするタンパク質（ＣＸＣＬ１２）のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ０６６４０．１）を示す。
【００７３】
前記（Ｐ３）工程において、前記宿主は、特に制限されず、例えば、使用したベクターに対応する宿主を選択できる。前記ベクターが原核細胞用ベクターの場合、前記宿主は、例えば、原核細胞があげられ、昆虫用ベクターの場合、昆虫細胞があげられる。前記導入の方法は、特に制限されず、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウム法等の常法が採用できる。前記形質転換体の培養は、特に制限されず、例えば、前記宿主および前記ベクターの種類に応じて実施できる。前記融合タンパク質の精製は、特に制限されず、例えば、前記形質転換体の培養物を用いて、常法を用いて実施できる。
【００７４】
前記融合タンパク質の精製は、例えば、以下のように行える。前記ベクターが、例えば、タグペプチドが付加された融合タンパク質を発現する場合、まず、生産された前記タグペプチドが付加された前記融合タンパク質を、アフィニティ精製法等の公知の方法により分離する。前記融合タンパク質は、例えば、コラーゲン結合性生理活性物質であり、具体例として、前記ＣＢＤと前記生理活性物質との融合タンパク質があげられる。前記タグペプチドが付加された前記融合タンパク質の分離方法は、特に制限されず、例えば、タグペプチドの種類に応じて、適宜設定できる。前記分離後、常法を用いて、タグペプチドが付加された前記融合タンパク質から、前記融合タンパク質の切り出しを行うことで、前記融合タンパク質を得ることができる。前記タグペプチドは、特に制限されず、例えば、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）等があげられる。
【００７５】
前記コラーゲン結合性生理活性物質は、特に制限されず、例えば、コラーゲン結合性上皮成長因子、コラーゲン結合性線維芽細胞増殖因子、コラーゲン結合性血小板由来成長因子、コラーゲン結合性肝細胞増殖因子、コラーゲン結合性トランスフォーミング増殖因子、コラーゲン結合性神経栄養因子、コラーゲン結合性血管内皮細胞増殖因子、コラーゲン結合性インシュリン様成長因子等があげられ、好ましくは、コラーゲン結合性上皮成長因子、コラーゲン結合性線維芽細胞増殖因子、コラーゲン結合性血管内皮細胞増殖因子である。前記コラーゲン結合性上皮成長因子は、例えば、ＥＧＦとＣＢＤとの融合タンパク質（以下「ＥＧＦ−ＣＢＤ」という。）があげられる。前記コラーゲン結合性線維芽細胞増殖因子は、例えば、ｂＦＧＦとＣＢＤとの融合タンパク質（以下「ｂＦＧＦ−ＣＢＤ」という。）があげられる。前記コラーゲン結合性血小板由来成長因子は、例えば、ＰＤＧＦとＣＢＤとの融合タンパク質（以下「ＰＤＧＦ−ＣＢＤ」という。）があげられる。前記コラーゲン結合性肝細胞増殖因子は、例えば、ＨＧＦとＣＢＤとの融合タンパク質（以下「ＨＧＦ−ＣＢＤ」という。）があげられる。前記コラーゲン結合性トランスフォーミング増殖因子は、例えば、ＴＧＦとＣＢＤとの融合タンパク質（以下「ＴＧＦ−ＣＢＤ」という。）があげられる。前記コラーゲン結合性神経栄養因子は、例えば、ＮＧＦとＣＢＤとの融合タンパク質（以下「ＮＧＦ−ＣＢＤ」という。）があげられる。前記コラーゲン結合性血管内皮細胞増殖因子は、例えば、ＶＥＧＦ−ＡとＣＢＤとの融合タンパク質（以下「ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ」という。）があげられる。前記コラーゲン結合性インシュリン様成長因子は、例えば、ＩＧＦとＣＢＤとの融合タンパク質（以下「ＩＧＦ−ＣＢＤ」という。）があげられる。前記コラーゲン結合性生理活性物質は、例えば、タグ等の付加配列を含んでもよい。
【００７６】
前記ＥＧＦ−ＣＢＤは、例えば、西らの文献（Ｎｉｓｈｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、１９９８年、９５巻、ｐ．７０１８−７０２３）に記載された公知物質である。前記文献において、前記ＥＧＦ−ＣＢＤは、動物実験で皮下注射により投与した場合、期待された効果を示さなかったことが報告されている。これに対して、本発明の再生材は、粘膜、上皮および鼓膜等の上皮層含有組織が、短期間に再生できる。すなわち、前記ＥＧＦ−ＣＢＤと前記高密度コラーゲン基材とを組み合わせることにより、前述の効果を発揮できる。
【００７７】
本発明の再生材は、前述のように、前記コラーゲン結合性生理活性物質と前記高密度コラーゲン基材とを含む。前記コラーゲン結合性生理活性物質は、例えば、前記高密度コラーゲン基材の使用時において、前記高密度コラーゲン基材と共存していればよく、また、前記高密度コラーゲン基材の表面および／または内部に存在していることが好ましい。具体例として、前記コラーゲン結合性生理活性物質は、例えば、前記コラーゲン含有液に含まれることにより、前記高密度コラーゲン基材中に内包されてもよいし、前記高密度コラーゲン基材を浸漬しておく保存液に添加されてもよいし、生体に配置する前または配置した後に、前記高密度コラーゲン基材に添加されてもよい。
【００７８】
前記コラーゲン結合性生理活性物質が前記コラーゲン含有液に含まれる場合、前記コラーゲン含有液中の前記コラーゲン結合性生理活性物質の濃度は、特に制限されない。前記濃度の下限は、例えば、０．１μｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．５μｇ／ｍＬであり、その上限は、例えば、１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは、３μｇ／ｍＬであり、その範囲は、例えば、０．１〜１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．５〜３μｇ／ｍＬである。前記コラーゲン含有液は、特に制限されず、例えば、前述のとおりである。
【００７９】
前記コラーゲン結合性生理活性物質が前記保存液に含まれる場合、前記保存液中の前記コラーゲン結合性生理活性物質の濃度は、特に制限されない。前記濃度の下限は、例えば、０．１μｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．５μｇ／ｍＬであり、その上限は、例えば、１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは、３μｇ／ｍＬであり、その範囲は、例えば、０．１〜１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．５〜３μｇ／ｍＬである。前記保存液は、例えば、さらに、塩化ナトリウム等の塩類、抗生物質、抗菌剤等を含んでもよい。
【００８０】
前記コラーゲン結合性生理活性物質が、前記高密度コラーゲン基材の生体への配置前または配置後に、前記高密度コラーゲン基材に添加される場合、前記コラーゲン結合性生理活性物質は、例えば、前記添加用の液に含まれるのが好ましい。前記添加用の液中の前記コラーゲン結合性生理活性物質の濃度は、特に制限されない。前記濃度の下限は、例えば、０．１μｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．５μｇ／ｍＬであり、その上限は、例えば、１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは、３μｇ／ｍＬであり、その範囲は、例えば、０．１〜１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは、０．５〜３μｇ／ｍＬである。
【００８１】
本発明の再生材は、前記高密度コラーゲン基材と前記コラーゲン結合性生理活性物質とを含むことにより、例えば、組織の再生を持続的に促進できる。また、本発明の再生材は、例えば、前記高密度コラーゲン基材に対する前記コラーゲン結合性生理活性物質の結合性が高いため、前記コラーゲン結合性生理活性物質が局所的に作用し、他の部位への作用による副作用を防止できる。
【００８２】
本発明の再生材は、例えば、さらに、前記支持体を含んでもよい。前記支持体により、前記再生材は、例えば、物理的強度がさらに向上し、取り扱いがさらに容易になる。前記支持体の材質は、特に制限されず、例えば、プラスチック材料、生分解性材料等があげられる。前記プラスチック材料は、特に制限されず、例えば、シリコーン、ポリエチレン、ビニール、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルアルコール等があげられる。前記生分解性材料は、特に制限されず、例えば、前述の生分解性ポリマー等があげられる。前記支持体が前記生分解性材料の場合、前記再生材は、例えば、前記支持体を備えた状態で前記生体に留置できるため、操作性および安全性に優れる。また、本発明の再生材を、例えば、鼓膜の中耳側等に配置する場合、通常、手術が必要である。しかし、本発明の再生材が、生分解性材料製の前記支持体を含む場合、例えば、配置してから所定の期間が経過した後、生体内で前記支持体は分解される。このため、前記支持体を除去のための再手術は不要である。したがって、手術を要する配置部位に使用する場合、本発明の再生材の中でも、例えば、前記生分解性材料から形成された支持体を有する前記再生材は、特に有用である。前記支持体は、例えば、前述の液流制御部材が好ましい。
【００８３】
本発明の再生材は、例えば、さらに、把持部を備えてもよい。この場合、本発明の再生材は、例えば、前記把持部を持って前記生体に配置できるため、操作性に優れる。前記把持部は、例えば、前記高密度コラーゲン基材に配置されてもよいし、前記支持体に配置されてもよい。前記把持部は、例えば、生分解性材料により形成されていることが好ましい。前記生分解性材料は、特に制限されず、例えば、前述の生分解性ポリマー等があげられる。
【００８４】
前記把持部の形状および大きさは、特に制限されず、例えば、持ちやすく、配置の妨げにならない形状および大きさが好ましい。前記形状は、例えば、糸状、凸状等があげられる。前記糸状の場合、前記把持部の長さは、例えば、０．５〜１０ｍｍであり、好ましくは、１〜５ｍｍである。前記糸状の場合、前記把持部の径は、例えば、１〜１００μｍであり、好ましくは、２０〜５０μｍである。前記把持部は、例えば、生体への配置後、前記高密度コラーゲン基材表面に接着または埋没してもよい。この場合、前記把持部は、例えば、前記接着時に、前記高密度コラーゲン基材表面が平滑となる形状が好ましい。前記把持部は、具体的には、例えば、径０．１ｍｍ、長さ５ｍｍの吸収糸があげられる。
【００８５】
本発明の再生材において、前記把持部の形成位置は、特に制限されず、例えば、持ちやすい位置が好ましい。前記把持部は、例えば、前記高密度コラーゲン基材の中央に形成されてもよいし、端部に形成されてもよい。前記把持部は、例えば、前記高密度コラーゲン基材の略中央部に形成されるのが好ましい。
【００８６】
本発明の再生材は、例えば、乾燥タイプ（ドライタイプ）でもよいし、湿潤タイプ（ウェットタイプ）でもよい。本発明の再生材は、例えば、前記高密度コラーゲン基材が予め前記コラーゲン結合性生理活性物質を含む剤型（以下、「一剤型」という。）でもよいし、前記コラーゲン結合性生理活性物質と前記高密度コラーゲン基材とを、それぞれ別個に有する剤型（以下「キット型」という。）でもよい。後者の場合、例えば、前記コラーゲン結合性生理活性物質と前記高密度コラーゲン基材とが、別々の容器に収容されてもよいし、同じ容器に収容されてもよい。前記コラーゲン結合性生理活性物質は、例えば、これを含む試薬でもよい。前記キット型の場合、さらに、使用説明書を含むことが好ましい。
【００８７】
前記一剤型の場合、本発明の再生材は、例えば、乾燥タイプでもよいし、湿潤タイプでもよい。前記一剤型の再生材は、例えば、前記コラーゲン結合性生理活性物質を含んだ前記高密度コラーゲン基材を凍結乾燥した再生材、前記コラーゲン結合性生理活性物質を含んだ前記高密度コラーゲン基材を冷蔵保存した再生材、前記コラーゲン結合性生理活性物質を含んだ前記高密度コラーゲン基材を凍結保存した再生材等があげられる。前記一剤型の場合、本発明の再生材は、例えば、前述のように、前記コラーゲン結合性生理活性物質を含む前記コラーゲン含有液を用いて製造した前記高密度コラーゲン基材を含む再生材があげられる。前記凍結乾燥方法、冷蔵保存方法、凍結方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。
【００８８】
前記一剤型の再生材の使用方法は、特に制限されない。前記凍結乾燥した一剤型の再生材は、例えば、湿潤液に浸漬し、湿潤状態に戻した後に、生体に配置できる。前記湿潤液は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液、生理緩衝液等があげられる。前記冷蔵保存した一剤型の再生材は、例えば、そのまま生体に配置できる。前記凍結保存した一剤型の再生材は、例えば、解凍後、生体に配置するのが好ましい。前記解凍方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。
【００８９】
前記キット型の場合、前記コラーゲン結合性生理活性物質を含む試薬および前記高密度コラーゲン基材は、例えば、一方が乾燥タイプであり、他方が湿潤タイプでもよいし、両者が乾燥タイプでもよいし、両者が湿潤タイプでもよい。前記キット型の再生材は、例えば、凍結乾燥した前記高密度コラーゲン基材と液体タイプの前記試薬との組み合わせ、凍結乾燥した前記高密度コラーゲン基材と凍結乾燥した前記試薬との組み合わせ、湿潤タイプの前記高密度コラーゲン基材と液体タイプの前記試薬との組み合わせ、湿潤タイプの前記高密度コラーゲン基材と凍結乾燥した前記試薬との組み合わせ等があげられる。湿潤タイプの前記高密度コラーゲン基材は、例えば、冷蔵保存されていてもよいし、冷凍保存されていてもよい。後者の場合、前記高密度コラーゲン基材は、例えば、解凍後、生体に配置するのが好ましい。前記凍結乾燥方法、冷蔵保存方法、凍結方法および解凍方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。
【００９０】
前記キット型の再生材の使用方法は、特に制限されない。凍結乾燥した前記高密度コラーゲン基材と液体タイプの前記試薬とを含む再生材の場合、例えば、前記試薬を前記高密度コラーゲン基材に添加し、湿潤状態に戻った前記基材を生体に配置してもよい。前記凍結乾燥した高密度コラーゲン基材と凍結乾燥した前記試薬とを含む再生材の場合、例えば、生理食塩水を用いて前記試薬を溶解し、この液を前記高密度コラーゲン基材に添加し、湿潤状態に戻った前記基材を生体に配置してもよい。湿潤タイプの前記高密度コラーゲン基材と液体タイプの前記試薬とを含む再生材の場合、例えば、前記試薬を前記高密度コラーゲン基材に添加し、前記基材を生体に配置してもよい。湿潤タイプの前記高密度コラーゲン基材と凍結乾燥した前記試薬とを含む再生材の場合、例えば、生理食塩水を用いて前記試薬を溶解し、この液を前記高密度コラーゲン基材に添加し、前記基材を生体に配置してもよい。
【００９１】
前記添加方法は、特に制限されず、例えば、浸漬、塗布、噴霧等の方法があげられる。前記浸漬の場合、例えば、前記コラーゲン結合性生理活性物質を含有する添加用の液に、前記高密度コラーゲン基材を浸漬すればよい。前記塗布または噴霧の場合、例えば、前記添加用の液を、前記高密度コラーゲン基材に塗布または噴霧すればよい。前記高密度コラーゲン基材が乾燥タイプの場合、前記添加方法は、特に制限されず、例えば、浸漬が好ましい。前記高密度コラーゲン基材が湿潤タイプの場合、前記添加方法は、特に制限されず、例えば、塗布または噴霧が好ましい。前記添加用の液は、例えば、前記高密度コラーゲン基材に代えて、生体の配置部位に添加してもよい。前記浸漬の場合、例えば、前記添加用の液に、前記配置部位を浸漬してもよい。前記塗布または噴霧の場合、例えば、前記添加用の液を、前記配置部位に塗布または噴霧してもよい。
【００９２】
前記添加用の液は、前記コラーゲン結合性生理活性物質以外に、例えば、塩化ナトリウム等の塩類、抗生物質等の抗菌薬、抗ウイルス薬、タンパク質、糖、アミノ酸、ビタミン等を含んでもよい。前記添加用の液中の前記コラーゲン結合性生理活性物質濃度は、例えば、前述の通りである。
【００９３】
前記再生材は、前述のように、生体に配置する前に、前記高密度コラーゲン基材に前記コラーゲン結合性生理活性物質を添加して使用してもよいし、生体に配置した後に、前記高密度コラーゲン基材に前記コラーゲン結合性生理活性物質を添加して使用してもよい。前記再生材は、例えば、生体に配置する前に、前記再生材を配置する生体部位に、前記コラーゲン結合性生理活性物質を添加して使用してもよい。
【００９４】
前記コラーゲン結合性生理活性物質を含有する添加用の液に、前記高密度コラーゲン基材を浸漬する場合、浸漬時間は、特に制限されない。前記浸漬時間は、例えば、１分〜１６時間であり、好ましくは、３分〜３時間であり、より好ましくは、１０〜３０分である。前記コラーゲン結合性生理活性物質は、前記高密度コラーゲン基材に、例えば、１０分間の前記浸漬により、ほぼ十分量結合し、２０分間の前記浸漬により、十分量結合し、３０分間の前記浸漬により最大量結合する。このように、本発明の再生材は、例えば、前記浸漬の場合に、短時間で処理できるため、事前準備が不要であり、緊急時にも使用できる。このため、本発明の再生材は、利便性が高い。また、本発明の再生材において、前記浸漬時間は、例えば、３０分間以上でもよい。この場合、例えば、前記コラーゲン結合性生理活性物質を最大量含んだ状態で、本発明の再生材を生体に配置できる。
【００９５】
前記一剤型の場合、本発明の再生材は、例えば、前記添加処理をせずに使用してもよいし、前記添加処理後に使用してもよい。前記一剤型の再生材は、例えば、操作の簡便性から、前記添加処理をせずに使用するのが好ましい。また、前記再生材が前記支持体を含む場合、前記再生材は、例えば、前記生体に配置する時に、前記支持体を除去して貼付してもよい。
【００９６】
本発明の再生材は、例えば、その他の処理後、生体に配置してもよい。前記その他の処理は、特に制限されず、例えば、洗浄、接着剤塗布等の処理があげられる。前記洗浄に用いる洗浄剤は、例えば、生理食塩水等があげられる。前記接着剤は、特に制限されず、例えば、フィブリン系、シアノアクリレート系等があげられる。前記接着剤は、例えば、ヒアルロン酸等の粘性物質でもよい。
【００９７】
本発明の再生材は、例えば、生体に配置して使用する。前記生体は、特に制限されず、例えば、哺乳類動物があげられ、具体的には、ヒト、または、サル、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス等の非ヒト哺乳動物があげられる。前記再生材を配置する器官は、特に制限されず、例えば、耳、口、鼻、目、皮膚、内臓、血管、リンパ管、神経、骨、筋、髄膜、肺、胸腔等があげられる。前記再生材を配置する組織は、特に制限されず、例えば、上皮、粘膜、鼓膜、内皮、中皮、皮下組織、結合組織、平滑筋、血管平滑筋、骨格筋、心筋、漿膜等があげられ、好ましくは、粘膜、上皮、鼓膜である。前記再生材は、例えば、前記器官または組織等の欠損部、その周辺部等に配置するのが好ましい。
【００９８】
本発明の再生材を鼓膜の再生に用いる場合、前記再生材の配置方法は、特に制限されず、例えば、Ｏｖｅｒｌａｙ法、Ｕｎｄｅｒｌａｙ法、Ｉｎｌａｙ法等があげられる。前記Ｏｖｅｒｌａｙ法は、例えば、前記鼓膜欠損部の外耳側に、前記再生材を配置する。前記Ｏｖｅｒｌａｙ法は、例えば、外耳道側から操作し、鼓膜の前記外耳道側に前記再生材を配置するため、操作が簡便である。前記Ｏｖｅｒｌａｙ法は、異常が生じた場合に、直ちに前記再生材を除去できるため、安全性に優れる。前記Ｕｎｄｅｒｌａｙ法は、例えば、前記鼓膜欠損部の中耳側に、前記再生材を配置する。前記Ｕｎｄｅｒｌａｙ法は、鼓膜のマイグレーション等の影響を受け難いため、前記再生材をより安定して配置できる。前記マイグレーションは、前記鼓膜の上皮層が、新陳代謝によって外耳道側に移動することを意味する。前記Ｕｎｄｅｒｌａｙ法は、鼓膜欠損部を外耳道側から観察できるため、再生程度の確認が容易である。前記Ｉｎｌａｙ法は、例えば、前記鼓膜欠損部の固有層に、前記再生材を挿入する。前記Ｉｎｌａｙ法は、前記再生材を鼓膜の上皮層と粘膜層との間に配置するため、前記再生材をより固定しやすい。
【００９９】
前記再生材の貼付期間は、特に制限されず、例えば、欠損領域の大きさ等に応じて適宜設定可能である。
【０１００】
＜再生方法・治療方法＞
本発明の再生方法は、上皮層含有組織を再生する再生方法であって、前記本発明の再生材を、生体に配置することを特徴とする。また、本発明の治療方法は、前記本発明の再生材を生体に配置することを特徴とする。より詳細に、本発明の治療方法は、上皮層含有組織を再生するための治療方法である。前記上皮層含有組織は、特に制限されず、前述の通りであり、例えば、粘膜、上皮および鼓膜の少なくとも一つがあげられる。
【０１０１】
本発明の再生方法および治療方法は、前記本発明の再生材を生体に配置することが特徴であり、それ以外の工程および条件等は、何ら制限されない。前記再生材は、例えば、前述のとおりである。前記再生材を前記生体に配置する方法は、例えば、前述のとおりである。本発明の再生方法および治療方法は、例えば、鼓膜、皮膚、中耳粘膜、鼻粘膜、口腔粘膜、血管、リンパ管、神経、皮下組織、結合組織等の欠損部または新生もしくは増生を要する部位、口内炎等の治療に使用できる。
【０１０２】
＜再生キット＞
本発明の再生キットは、前述のように、上皮層含有組織を再生するキットであって、前記本発明の再生材を含むことを特徴とする。前記再生キットは、前記本発明の再生材を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、何ら制限されない。前記再生材は、例えば、前述のとおりであり、その使用方法も前述の通りである。
【０１０３】
＜評価方法＞
本発明の評価方法は、前述のように、候補物質による組織の再生を評価する方法であって、下記（Ｘ）および（Ｙ）工程を含み、下記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする。
（Ｘ）高密度コラーゲン基材を、前記候補物質と共に、実験動物の鼓膜欠損部に配置する工程
（Ｙ）前記（Ｘ）工程後の前記鼓膜欠損部における組織の再生を評価する工程
【０１０４】
前記（Ｘ）工程では、前述のように、前記高密度コラーゲン基材を、前記候補物質と共に、実験動物の鼓膜欠損部に配置する。
【０１０５】
前記評価方法において、前記高密度コラーゲン基材は、例えば、前述のとおりである。
【０１０６】
前記候補物質は、特に制限されず、例えば、天然由来物質でもよいし、化学合成物質でもよい。具体例としては、例えば、成長因子、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、造血因子、細胞傷害因子、神経栄養因子等のサイトカイン、ホルモン、酵素、ビタミン等の生理活性物質、化学的に合成された化学物質等があげられる。前記候補物質は、例えば、前記高密度コラーゲン基材に添加してもよいし、前記高密度コラーゲン基材に内包させてもよい。前記添加方法は、特に制限されず、例えば、前述のコラーゲン結合性生理活性物質を前記高密度コラーゲン基材に添加する方法と同様である。前記内包方法は、例えば、前述のコラーゲン結合性生理活性物質を前記高密度コラーゲン基材に内包させる方法と同様である。
【０１０７】
前記鼓膜の欠損は、特に制限されず、例えば、裂傷、穿孔等があげられる。前記鼓膜に対する前記鼓膜欠損部の形成方法は、特に制限されず、例えば、メス、パンチ等を用いてもよい。前記高密度コラーゲン基材は、例えば、前記鼓膜欠損部およびその周囲を覆うように配置するのが好ましい。前記配置方法は、特に制限されず、例えば、前述のＯｖｅｒｌａｙ法、Ｕｎｄｅｒｌａｙ法、Ｉｎｌａｙ法等があげられ、好ましくは、Ｕｎｄｅｒｌａｙ法である。前記Ｏｖｅｒｌａｙ法、Ｕｎｄｅｒｌａｙ法およびＩｎｌａｙ法による配置方法は、例えば、前述のとおりである。
【０１０８】
前記実験動物は、特に制限されず、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ等の非ヒト哺乳類動物等があげられる。前記実験動物は、例えば、種々の疾患モデル動物、老化モデル動物等でもよい。
【０１０９】
前記（Ｙ）工程では、前述のように、前記（Ｘ）工程後の前記鼓膜欠損部における組織の再生を評価する。
【０１１０】
前記組織の再生は、例えば、以下のように観察できる。前記Ｏｖｅｒｌａｙ法を用いた場合は、例えば、中耳側から再生を観察でき、前記Ｕｎｄｅｒｌａｙ法を用いた場合、外耳側から再生を観察でき、前記Ｉｎｌａｙ法を用いた場合、両側から再生を観察できる。前記Ｕｎｄｅｒｌａｙ法またはＩｎｌａｙ法は、例えば、外科手術をせずに、経時的に前記組織の再生を外耳側から観察できる。このため、前記評価方法における配置方法は、例えば、前記Ｕｎｄｅｒｌａｙ法またはＩｎｌａｙ法が好ましい。
【０１１１】
前記評価の指標は、特に制限されず、例えば、評価対象の組織等に応じた指標を適宜設定できる。前記組織が、例えば、粘膜、上皮、鼓膜全体等の場合、例えば、前記鼓膜欠損部における欠損面積または再生面積等を指標にして、再生を評価できる。具体的には、例えば、評価終了後における前記欠損面積を、前記候補物質（Ａ）とコントロール（Ｂ）とで比較し、その差、または、その差の割合（（Ｂ−Ａ）／Ｂ）等を指標にしてもよい。また、前記組織が血管の場合、例えば、前記再生した血管の面積を指標にして、再生を評価できる。
【０１１２】
＜評価用キット＞
本発明の評価用キットは、前述のように、候補物質による組織再生を評価する評価用キットであって、
高密度コラーゲン基材を含み、前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であり、本発明の評価方法に使用することを特徴とする。
【０１１３】
本発明の評価用キットは、前記高密度コラーゲン基材を含み、前記本発明の評価方法に使用することが特徴であって、その他の構成および条件は、何ら制限されない。前記評価用キットにおいて、前記高密度コラーゲン基材は、例えば、前述の通りであり、また、それを用いた前記評価方法は、例えば、前述のとおりである。
【実施例】
【０１１４】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。【０１１５】
（実施例１）
本例では、コラーゲン結合性生理活性物質としてＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性上皮成長因子）を使用し、これを含む機能性コラーゲンシート（再生材）を、外耳側から鼓膜穿孔部に貼付して、鼓膜再生を評価した。【０１１６】
以下、本発明の実施例において、「鼓膜穿孔部」は、鼓膜の欠損部をいう。本発明の実施例において、「穿孔の縮小」は、例えば、再生した組織により穿孔の一部が閉鎖し、その結果、穿孔の大きさが小さくなることをいい、「穿孔の閉鎖」は、例えば、再生した組織により穿孔の全部が閉鎖されることをいう。したがって、例えば、機能性コラーゲンシート等による前記鼓膜穿孔部の閉塞は、再生評価における「穿孔の閉鎖」にはあたらない。【０１１７】
［ラットＥＧＦ−ＣＢＤの調製］
配列番号１に示すＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ  ｃｏ１Ｈ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２９９８１．１）の３０１０番目〜３３６６番目の塩基配列（配列番号３）を含むＤＮＡ断片（ＣＢＤ遺伝子）を、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２プラスミド（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）のＳｍａＩ部位に、常法により挿入した。他方、配列番号４に示すＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＭ＿０１２８４２．１）の３３０８番目〜３４４８番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片（ラットＥＧＦ遺伝子）を、ＰＣＲ法により増幅した。前記ＣＢＤ遺伝子との融合遺伝子を形成するため、前記ＰＣＲは、前記ＤＮＡ断片が、その５’末端側にＢａｍＨＩ部位を有し、その３’末端側に１ヌクレオチド（塩基Ｇ）およびＥｃｏＲＩ部位を有するように、行った。増幅したＤＮＡ断片（ＥＧＦ遺伝子）を、前記ＤＮＡ断片（ＣＢＤ遺伝子）を挿入した前記プラスミドのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、常法により挿入し、発現プラスミドを調製した。前記発現プラスミドは、ＧＳＴ−ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号１２）をコードするリーディングフレーム（配列番号１３）を有している。つぎに、エレクトロポレーション法を用いて、前記発現プラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に導入し、形質転換体を作製した。【０１１８】
前記形質転換体を、５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有２×ＹＴ−Ｇ培地  ５０ｍＬ中で、一晩、前培養した。得られた前培養液１０ｍＬを前記培地５００ｍＬに加え、この培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が約０．７になるまで、３７℃で振とう培養した。得られた培養液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液５ｍＬを添加し、３７℃で２時間培養した。さらに、０．１ｍｏｌ／Ｌフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有イソプロパノール液５ｍＬを添加後、前記培養液を、６０００×ｇ（５８，８００ｍ／ｓ２）、４℃で１０分間遠心し、前記形質転換体を回収した。１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ含有リン酸緩衝生理食塩水  ７．５ｍＬに、前記形質転換体を懸濁し、フレンチ・プレスにより細胞を破壊した。この懸濁液１９容量に対して、２０％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００  １容量を加え、４℃で３０分間撹拌した。得られた懸濁液を、１５，０００×ｇ（１４７，０００ｍ／ｓ２）、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。前記上清を、さらに１５，０００×ｇ（１４７，０００ｍ／ｓ２）、４℃で３０分間遠心し、さらに上清を回収した。この上清を、清澄溶菌液とした。【０１１９】
前記清澄溶菌液をグルタチオン−セファロースビーズ  ２ｍＬに添加し、４℃で１時間撹拌した。前記ビーズを、リン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という。）１２ｍＬを用いて５回洗浄した後、前記ビーズを少量のＰＢＳに懸濁してカラムに充填し、溶出液を用いて、前記ＧＳＴ−ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質を溶出した。前記溶出液の組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  グルタチオンとした。前記融合タンパク質１ｍｇあたり、５ｕｎｉｔのトロンビンを添加して、２５℃で１０時間反応させた。この反応液を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）３００ｍＬに対して、４℃で１２時間の透析処理を、４回繰り返した。この透析物を、グルタチオン−セファロースビーズ  ２ｍＬを充填したカラムに添加し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用い、ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号１４）を含む非吸着画分を得た。配列番号１４に示すアミノ酸配列において、Ｎ末端の２つのアミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒは、制限酵素（トロンビンプロテアーゼ）の認識部位の一部に由来する。前記ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質をコードする塩基配列を配列番号１５に示す。【０１２０】
［機能性コラーゲンシートの作製］
本例では、図９に示す製造装置１および図１０に示す形成用容器２を用いて、高密度コラーゲン基材を作製した。図１０において、形成用容器２の外筒２１は、内径２２ｍｍ、高さ１７ｍｍの円筒であり、外筒２１内周面に形成されたリブ２７上に、シリコーンゴムリング２２、ステンレスメッシュ２３、ＰＬＡシート２４、シリコーンゴムリング２５、金属スペーサー２８が、下からこの順に積層されている。本例の形成用容器において、循環する混合液の液流方向は、図１１に示す矢印の方向である。【０１２１】
５ｍｇ／ｍＬ  Ｉ型アテロコラーゲン（豚皮由来）含有５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液（株式会社ニッピ製）を、０．５ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＥＭに添加して、５０ｍＬのコラーゲン含有液を調製した。前記コラーゲン含有液を、製造装置１を用いて、３７℃で１２時間循環させ、ＰＬＡシート２４上に高密度コラーゲン基材を形成した。【０１２２】
他方、前記ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質を、２．４μｇ／ｍＬになるように生理食塩水に添加して、浸漬液を調製した。プラスチックカニューレ型穿刺針２０Ｇ（プロテクティブＩ.Ｖ.カテーテル）を用いて、ラット（ｎ＝３）の両耳の鼓膜に孔を開け、穿孔を形成した。【０１２３】
前記鼓膜部位への処置直前に、前記ＰＬＡシートと前記高密度コラーゲン基材との積層体を、前記浸漬液に２５℃で３０分間浸漬した後、生理食塩水に２５℃で５分間浸漬し、前記機能性コラーゲンシート（再生材）を作製した。【０１２４】
［評価方法］
（１）鼓膜の再生
各ラットの一方の鼓膜穿孔部に、外耳側から前記再生材を７日間貼付し、外耳道側から前記鼓膜穿孔部を写真撮影した。また、コントロールとして、他方の鼓膜穿孔部は、前記機能性コラーゲンシートを貼付せず、自然経過を写真撮影した。【０１２５】
（２）コラーゲン密度の測定
また、本例で形成した湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材中のコラーゲン密度を、コラーゲン測定キット（商品名Ｓｉｒｃｏｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、バイオカラー社製）を用いて、以下のようにして測定した。まず、平均厚みが０．１５ｃｍである前記高密度コラーゲン基材を、直径１．７ｃｍの大きさに切り出し、０．５ｍｏｌ／Ｌ  酢酸１ｍＬに溶解した。なお、切り出した前記高密度コラーゲン基材の切片は、全体の体積０．３４０ｍＬ（０．３４ｍｇ）と算出した。この溶解液を、コラーゲン試料とした。遠心管に、前記コラーゲン試料１００μＬと、Ｓｉｒｃｏｌ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ１ｍＬとを入れ、３０分間振とうした。振とうした前記遠心管を、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、上清を除去し、染色されたコラーゲンペレットを得た。このコラーゲンペレットを、Ａｌｋａｌｉ  ｒｅａｇｅｎｔ溶液１ｍＬ中で、１０分間振とうし、色素を抽出した。この抽出液の波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、検量線作成のため、所定濃度（５、１０、２５および５０μｇ/１００μＬ）のコラーゲンを含む標準試料を調製した。前記標準試料は、前記コラーゲン試料と同様にして、吸光度を測定し、コラーゲン濃度と吸光度との検量線を作成し、前記コラーゲン試料のコラーゲン濃度を算出した。そして、この結果から、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材１ｇ（湿重量）あたりのコラーゲン量を算出した。【０１２６】
［評価結果］
（１）鼓膜の再生
穿孔４日後、コントロールは、組織再生による前記穿孔の縮小傾向が認められなかったが、前記機能性コラーゲンシートは、組織再生により前記穿孔が顕著に縮小した。【０１２７】
図１に、穿孔７日後の鼓膜部位の写真を示す。図１において、（Ａ）は、前記コントロールの結果であり、（Ｂ）は、前記ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性上皮成長因子）を含む機能性コラーゲンシート（再生材）を貼付した結果である。図１（Ａ）に示すように、前記コントロールにおける穿孔は、一部が組織再生したが、未だ組織再生していない部分（矢印部）が認められ、完全には閉鎖していなかった。これに対し、図１（Ｂ）に示すように、前記機能性コラーゲンシートを貼付した穿孔は、組織再生により、完全に閉鎖していた（矢印部）。そして、組織再生した部分には血管新生が認められ、前記機能性コラーゲンシートが生着していることが確認された。なお、評価に用いた３匹全てが同様の結果であった。【０１２８】
また、前記積層体からＰＬＡシート２４を除去した以外は、前述と同様にして作製した機能性コラーゲンシートも、ＰＬＡシート２４を含んだ前記機能性コラーゲンシートと同様の結果が得られた。【０１２９】
さらに、前記浸漬液に浸漬していない前記積層体について、ＰＬＡシート２４を除去し、前記高密度コラーゲン基材を得た。そして、前記高密度コラーゲン基材を、前記ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質が１μｇ／ｍＬになるように生理食塩水に添加した浸漬液に、２５℃で３０分浸漬させた後、生理食塩水に２５℃で５分間浸漬し、機能性コラーゲンシートを作製した。この機能性コラーゲンシートを使用した以外は、前述と同様にして、評価を行った。その結果、ＰＬＡシート２４を含む前記機能性コラーゲンシートと同様の結果が得られた。【０１３０】
（２）コラーゲン密度
本例で用いた、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度は、３４ｍｇ／ｇ、つまり、前記高密度コラーゲン基材１ｇ（湿重量）あたりのコラーゲン量は３４ｍｇであった。なお、前記コラーゲン密度を、３４８ｍｇ／ｍＬ±１１９ｍｇ（２２９〜４６７ｍｇ／ｇ）に変更した場合も、同様に優れた再生能が確認された。【０１３１】
（実施例２）
本例では、コラーゲン結合性生理活性物質としてヒトｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性塩基性線維芽細胞増殖因子）を使用し、これを含む機能性コラーゲンシート（再生材）を、外耳側から鼓膜穿孔部に貼付し、鼓膜再生を評価した。【０１３２】
本例では、以下に示す条件以外は、前記実施例１と同様にして、前記機能性コラーゲンシートの作製を行い、鼓膜穿孔部への貼付を行った。【０１３３】
前記浸漬液として、前記ラットＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質に代えて、以下に示すヒトｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質を１μｇ／ｍＬとなるように添加した浸漬液を使用した以外は、実施例１と同様にして、機能性コラーゲンシートを作製し、鼓膜穿孔部に貼付して、写真撮影した。そして、前記写真を、ＩｍａｇｅＪ（米国国立衛生研究所開発）を用いて解析し、前記写真における残存穿孔の大きさを算出した。【０１３４】
［ヒトｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質の調製］
前記ｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質は、前記ＤＮＡ断片（ＥＧＦ遺伝子）に代えて、配列番号６に示すＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２（ｂａｓｉｃ）遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＭ＿００２００６．４）の４６８番目〜９３２番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片（ｂＦＧＦ遺伝子）を挿入した発現プラスミドを使用した以外は、実施例１と同様にして調製した。前記発現プラスミドは、ＧＳＴ−ｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号１６）をコードするリーディングフレーム（配列番号１７）を有している。前記ｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１８に示し、前記ｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質をコードする塩基配列を配列番号１９に示す。配列番号１８に示すアミノ酸配列において、Ｎ末端の２つのアミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒは、制限酵素（トロンビンプロテアーゼ）の認識部位の一部に由来する。【０１３５】
［評価結果］
本例において、自然経過をたどった前記コントロールに比べて、前記機能性コラーゲンシートを使用した場合は、組織再生により穿孔が顕著に縮小した。図２に、穿孔７日後における残存穿孔サイズのグラフを示す。図２において、縦軸は、残存穿孔の面積（ｍｍ２）であり、各バーは、左から順に、前記コントロール、前記機能性コラーゲンシートの結果である。図２に示すように、前記機能性コラーゲンシートを使用した場合、前記面積は、０．１ｍｍ２未満であった。これに対して、前記コントロールでは、前記面積は、０．３ｍｍ２を超えていた。このように、本発明の再生材により、鼓膜の再生が促進された。【０１３６】
また、前記実施例１と同様にして、コラーゲン密度を測定したところ、本例で用いた、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度は、３４ｍｇ／ｇ、つまり、前記高密度コラーゲン基材１ｇ（湿重量）あたりのコラーゲン量は３４ｍｇであった。なお、前記コラーゲン密度を、３４８ｍｇ／ｍＬ±１１９ｍｇ（２２９〜４６７ｍｇ／ｇ）に変更した場合も、同様に優れた再生能が確認された。【０１３７】
（実施例３）
本例では、候補物質を添加した機能性コラーゲンシート（ＰＬＡシートなし）を、中耳側から鼓膜穿孔部に貼付し、前記候補物質による組織再生を評価した。前記候補物質は、前記ラットＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性上皮細胞成長因子）、前記ヒトｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性塩基性線維芽細胞増殖因子）、マウスＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性血管上皮細胞増殖因子）またはマウスＣＸＣＬ１２−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性ストローマ細胞由来因子）を用いた。【０１３８】
本例では、以下に示す条件以外は、前記実施例１と同様にして、前記機能性コラーゲンシートを作製した。【０１３９】
前記浸漬液として、前記ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質に代えて、前記候補物質を１．６μｇ／ｍＬとなるように添加した浸漬液を使用し、前記積層体からＰＬＡシートを除去した以外は、実施例１と同様にして、機能性コラーゲンシートを作製した。前記候補物質のうち、前記ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質は、実施例１と同様にして調製し、前記ｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質は、実施例２と同様にして調製した。また、前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質および前記ＣＸＣＬ１２−ＣＢＤ融合タンパク質は、以下のように調製した。【０１４０】
［マウスＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質の調製］
前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質として、以下のようにして、ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ−６×Ｈｉｓ融合タンパク質を調製した。【０１４１】
配列番号１に示すＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＣｏｌＨ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２９９８１.１）の３０１０番目〜３３６６番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片（ＣＢＤ遺伝子）を、ＰＣＲ法により増幅した。前記ＰＣＲは、前記ＤＮＡ断片が、その５’末端側にＥｃｏＲＩ部位を有し、その３’末端側にＸｈｏＩ部位を有するように、行った。他方、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００９５０５．３）の３９５番目〜９６４番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法により増幅した。前記ＰＣＲは、前記ＤＮＡ断片が、その５’末端側にＢａｍＨＩ部位を有し、その３’末端側にＥｃｏＲＩ部位を有するように行った。増幅した前記両ＤＮＡ断片を、ｐＭＣｓ−ＩＧベクタープラスミド（コスモバイオ社製）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位に、常法により挿入した。そして、さらに、３’末端側にＸｈｏＩ部位を有する６×Ｈｉｓ  ｔａｇオリゴマーを、前記両ＤＮＡ断片を挿入した前記プラスミドのＸｈｏＩ部位に挿入し、発現プラスミドを調製した。前記発現プラスミドは、ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ−６×Ｈｉｓ融合タンパク質（配列番号２０）をコードするリーディングフレーム（配列番号２１）を有している。つぎに、ＤＥＡＥデキストラン法を用いて、前記発現プラスミドを、Ｃｏｓ−１細胞に導入し、形質転換体を作製した。【０１４２】
前記形質転換体を、５％ウシ胎児血清、５０μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ（＋）培地）中で、４日間培養した。得られた培養液を、２０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、上清を回収した。他方、前記遠心により得られた沈殿物（形質転換体）に、新たに前記ＲＰＭＩ（＋）培地を加えて、さらに４日間培養した。得られた培養液から、前述と同様にして、上清を回収した。この上清２００ｍＬに、Ｌｙｓｉｓバッファー２０ｍＬを添加して、上清希釈液を調製した。前記Ｌｙｓｉｓバッファーの組成は、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、１．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌおよび１００ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾールとした。【０１４３】
前記上清希釈液を、１ｍＬ  Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＨＰカラムに添加し、４℃で４時間循環させた。循環後、洗浄バッファーを用いて、前記カラムを洗浄した。前記洗浄バッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌおよび２０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾールとした。洗浄後、さらに、溶出液を用いて、前記カラムから、前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ−６×Ｈｉｓ融合タンパク質（配列番号２０）を溶出した。前記溶出液の組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌおよび２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾールとした。前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ−６×Ｈｉｓ融合タンパク質をコードする塩基配列を配列番号２１に示す。【０１４４】
［マウスＣＸＣＬ１２−ＣＢＤ融合タンパク質の調製］
前記ＣＸＣＬ１２−ＣＢＤ融合タンパク質は、前記ＤＮＡ断片（ＥＧＦ遺伝子）に代えて、配列番号１０に示すＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ  １２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ００６６４０．１）の１３３番目〜３３６番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片（ＣＸＣＬ１２遺伝子）を挿入した発現プラスミドを使用した以外は、実施例１と同様にして調製した。前記発現プラスミドは、ＧＳＴ−ＣＸＣＬ１２−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号２２）をコードするリーディングフレーム（配列番号２３）を有している。前記ＣＸＣＬ１２−ＣＢＤ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４に示し、前記ＣＸＣＬ１２−ＣＢＤ融合タンパク質をコードする塩基配列を配列番号２５に示す。配列番号２４に示すアミノ酸配列において、Ｎ末端の２つのアミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒは、制限酵素（トロンビンプロテアーゼ）の認識部位の一部である。【０１４５】
［評価方法］
前記各候補物質を用いて調製した前記各機能性コラーゲンシート（再生材）を、各ラット（ｎ＝３）の一方の鼓膜穿孔部に、中耳側から７日間貼付した以外は、前記実施例１と同様にして、外耳道側および内耳側から前記鼓膜穿孔部を写真撮影した。また、コントロールとして、前記浸漬液に代えて生理食塩水に浸漬した前記高密度コラーゲン基材を、他方の鼓膜穿孔部に、中耳側から７日間貼付し、外耳道側および内耳側から写真撮影した。【０１４６】
［評価結果］
前記各種候補物質を添加した機能性コラーゲンシートを用いた場合は、前記コントロールに比べて、組織再生によって穿孔が縮小し、完全に閉鎖される期間が短かった。【０１４７】
図３および図４に、前記マウスＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を含む機能性コラーゲンシートを貼付した鼓膜穿孔部の写真を示す。図３は、前記鼓膜穿孔部の外耳道側からの写真であり、図４は、前記鼓膜穿孔部の中耳側からの写真である。図３（Ａ）は、穿孔直後の鼓膜穿孔部の写真であり、矢印で指し示す部分は、形成した穿孔である。図３（Ｂ）は、前記機能性コラーゲンシート貼付直後の鼓膜部分の写真であり、矢印で指し示す白い部分は、貼付した前記機能性コラーゲンシートである。図３（Ｃ）は、穿孔４日後の前記コントロールの写真であり、矢印で指し示す部分は、貼付した前記機能性コラーゲンシートである。図３（Ｄ）は、穿孔４日後の前記機能性コラーゲンシートを貼付した鼓膜部分の写真であり、矢印で指し示す部分は、前記機能性コラーゲンシートの表層に新生した血管である。図３（Ｅ）は、穿孔７日後の前記コントロールの写真であり、矢印で指し示す部分は、貼付した前記機能性コラーゲンシートである。図３（Ｆ）は、穿孔７日後の前記機能性コラーゲンシートを貼付した鼓膜部分の写真であり、矢印で指し示す部分は、前記機能性コラーゲンシートに新生した血管である。また、図４（Ａ）は、穿孔７日後の前記コントロールの写真であり、矢印で指し示す部分は、耳小骨周辺にわずかに新生した血管である。貼付した前記機能性コラーゲンシートの表層には新生した血管はほとんど認めなかった。図４（Ｂ）は、穿孔７日後の前記機能性コラーゲンシートを貼付した鼓膜部分の写真であり、矢印で指し示す部分は、前記機能性コラーゲンシートの表層部に新生した血管である。【０１４８】
前記高密度コラーゲン基材の貼付から７日後に、鼓膜部分の組織を採取し、ヘマトキシリン−エオジン染色して観察を行った。組織の採取および染色は、公知の方法に基づいて行った。組織像を、図１５に示す。図１５（Ａ）は、前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を含む機能性コラーゲンシートにより補修した鼓膜断片の光学顕微鏡写真であり、図１５（Ｂ）は、前記（Ａ）の四角枠内の拡大写真である。図１５（Ａ）において、グレーで示された領域が、染色領域である（＊：実際には赤桃色）。この染色された領域には、前記マウスＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を含む機能性コラーゲンシートを配置した領域が含まれることから、生体内において、前記機能性コラーゲンシートが組織化（器質化ともいう）したことが明らかとなった。また、図１５（Ａ）において、鼓膜の両面、すなわち外耳道側と中耳腔側の表面が、表皮で覆われていることが確認できた。具体的には、図１５（Ａ）の四角枠内の拡大写真である図１５（Ｂ）において、外耳道側の表面に層（図においてＥの領域）が形成されており、これが表皮であることは明らかである。また、図１５（Ａ）において、毛細血管および線維芽細胞も確認された。具体的には、図１５（Ｂ）において、移植した前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を含む機能性コラーゲンシート（＊）内に、毛細血管（矢印）があり、その内部に赤血球が充満していることが確認された。図１５（Ｂ）によれば、矢印部分に、複数の血管が形成されていることが明らかである。なお、前記マウスＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を含む機能性コラーゲンシートを移植していないコントロールにおいては、新生血管はほとんど確認できなかった。これらの結果から、前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を含む機能性コラーゲンシートの移植領域において、血流を伴う新生血管が再生されたことがわかった。【０１４９】
図３、図４および図１５に示すように、前記コントロールに比べて、前記マウスＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を添加した機能性コラーゲンシートを使用した場合、前記鼓膜穿孔部の両面共に、組織再生による穿孔の縮小が顕著に認められた。また、血管新生は、前記コントロールでは、前記高密度コラーゲン基材の周辺部のみにわずかに認められただけであったが、前記機能性コラーゲンシートを使用した場合は、前記シート上に顕著に認められた。このように、前記機能性コラーゲンシートを用いた本発明の評価方法により、候補物質による組織再生を経時的に評価可能であった。【０１５０】
また、前記マウスＣＸＣＬ１２−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性ストローマ細胞由来因子）を添加した機能性コラーゲンシートを用いた場合も、ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を添加した機能性コラーゲンシートを使用した場合と同様に、鼓膜再生の促進に加え血管新生が顕著であった。【０１５１】
また、前記候補物質は、いずれもコラーゲン結合性サイトカインであるため、前記候補物質を含む機能性コラーゲンシートは、本発明の再生材に該当する。したがって、本発明の再生材により、鼓膜の上皮層、粘膜層および血管が再生し、前記高密度コラーゲン基材のみを配置した場合に比べて、鼓膜の再生期間が短縮化されることが示された。【０１５２】
また、前記実施例１と同様にして、コラーゲン密度を測定したところ、本例で用いた、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度は、３４ｍｇ／ｇ、つまり、前記高密度コラーゲン基材１ｇ（湿重量）あたりのコラーゲン量は３４ｍｇであった。なお、前記コラーゲン密度を、３４８ｍｇ／ｍｌ±１１９ｍｇ（２２９〜４６７ｍｇ／ｇ）に変更した場合も、同様に優れた再生能が確認された。【０１５３】
（実施例４）
本例では、コラーゲン結合性生理活性物質として、前記ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性上皮成長因子）または前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性血管上皮細胞増殖因子）を使用し、いずれかを含む機能性コラーゲンシート（再生材）を、鼓膜穿孔部に中耳側から貼付し、鼓膜再生を評価した。また、前記機能性コラーゲンシートについて、既存材料であるコラーゲンスポンジ（ペルナック（登録商標）、シリコーンシートなし、グンゼ社製）との鼓膜再生の比較を行った。【０１５４】
前記コラーゲン結合性生理活性物質として、前記ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質または前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を用い、ラット（ｎ＝５）の一方の前記鼓膜穿孔部に、前記再生材を７日間貼付した以外は、実施例１と同様にして、機能性コラーゲンシートの作製し、前記鼓膜穿孔部の再生の評価を行った。また、コントロールとして、他方の鼓膜穿孔部に、生理食塩水に浸漬した市販のコラーゲンスポンジ（ペルナック（登録商標）、シリコーンシートなし、グンゼ社製）を、中耳側から前記鼓膜穿孔部に７日間貼付し、外耳道側から写真撮影した。【０１５５】
［評価結果］
図５および図６に、貼付７日後に外耳道側から撮影した各鼓膜の写真を示す。図５において、（Ａ）は、前記コラーゲンスポンジの結果であり、（Ｂ）は、前記ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質を含む機能性コラーゲンシートの結果である。また、図６において、（Ａ）は、前記コラーゲンスポンジの結果であり、（Ｂ）は、前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を含む機能性コラーゲンシートの結果である。前記コラーゲンスポンジは、図５（Ａ）の矢印で指し示すように、表面が平滑でなく、しわが形成され、図６（Ａ）の矢印で指し示すように、偏って、穿孔周囲に収縮して付着した。これに対して、前記機能性コラーゲンシートの場合は、図５（Ｂ）および図６（Ｂ）に示すように、前記鼓膜穿孔部を覆った状態が維持され、組織再生による穿孔の縮小が確認された。特に、前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を含む機能性コラーゲンシートでは、図６（Ｂ）の矢印で指し示すように、血管新生が顕著に認められた。このように、本発明の再生材は、前記既存のコラーゲンスポンジより、鼓膜および血管の再生の促進効果が優れていることが示された。また、本例では、前記実施例３と同様に、前記機能性コラーゲンシートの使用により、鼓膜および血管の再生を外耳道側から観察可能であった。このように、前記機能性コラーゲンシートを用いた本発明の評価方法により、組織再生についての有効性を評価可能であった。【０１５６】
また、前記実施例１と同様にして、コラーゲン密度を測定したところ、本例で用いた、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度は、３４ｍｇ／ｇ、つまり、前記高密度コラーゲン基材１ｇ（湿重量）あたりのコラーゲン量は３４ｍｇであった。なお、前記コラーゲン密度を、３４８ｍｇ／ｍｌ±１１９ｍｇ（２２９〜４６７ｍｇ／ｇ）に変更した場合も、同様に優れた再生能が確認された。【０１５７】
（実施例５）
本例では、コラーゲン結合性生理活性物質として、前記ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性上皮成長因子）を使用し、これを含む機能性コラーゲンシート（再生材）を、外耳の皮膚欠損部に貼付し、皮膚再生を評価した。【０１５８】
電気メスを用いて、ラット（ｎ＝２）の両耳の外耳の皮膚を欠損させた。一方の外耳の皮膚欠損部に、前記再生材を５日間貼付した以外は、実施例１と同様にして、機能性コラーゲンシートを作製し、前記皮膚欠損部における再生の評価を行った。また、コントロールとして、他方の皮膚欠損部は、前記機能性コラーゲンシートを貼付せず、前記皮膚欠損部の自然経過における皮膚再生を評価した。【０１５９】
図７に、欠損５日後の皮膚欠損部の写真を示す。図７において、（Ａ）は、前記コントロールの結果であり、（Ｂ）は、前記機能性コラーゲンシートの結果である。図７（Ａ）に示すように、前記コントロールでは、前記皮膚欠損部の表面に、大きな痂皮が形成され、中心部には潰瘍が増悪して、穿孔（矢印で指し示す部分）が形成された。これに対し、図７（Ｂ）の矢印で指し示すように、前記機能性コラーゲンシートを貼付した場合は、前記高密度コラーゲン基材が痂皮状に小さく収縮し、欠損が顕著に縮小し、再生が促進された。このように、本発明の再生材により、皮膚の再生が示された。【０１６０】
また、前記実施例１と同様にして、コラーゲン密度を測定したところ、本例で用いた、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度は、３４ｍｇ／ｇ、つまり、前記高密度コラーゲン基材１ｇ（湿重量）あたりのコラーゲン量は３４ｍｇであった。なお、前記コラーゲン密度を、３４８ｍｇ／ｍｌ±１１９ｍｇ（２２９〜４６７ｍｇ／ｇ）に変更した場合も、同様に優れた再生能が確認された。【０１６１】
（実施例６）
本例では、コラーゲン結合性生理活性物質として、前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性血管上皮細胞増殖因子）または前記ＣＸＣＬ１２−ＣＢＤ融合タンパク質（コラーゲン結合性ストローマ細胞由来因子）を使用し、いずれかを含む機能性コラーゲンシート（再生材）を、粘膜で囲まれた鼓室（中耳）に貼付し、粘膜および血管の新生を評価した。【０１６２】
前記コラーゲン結合性生理活性物質として、前記ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質または前記ＣＸＣＬ１２−ＣＢＤ融合タンパク質を用い、ラットの前記鼓室に前記機能性コラーゲンシートを７日間貼付した以外は、実施例１と同様にして、機能性コラーゲンシートを作製し、前記鼓室に貼付して、写真撮影した。【０１６３】
図８に、７日後の前記鼓室の写真を示す。図８（Ａ）は、ＶＥＧＦ−Ａ−ＣＢＤ融合タンパク質を含む機能性コラーゲンシートの結果であり、図８（Ｂ）は、ＣＸＣＬ１２−ＣＢＤ融合タンパク質を含む機能性コラーゲンシートの結果である。両図に示すように、各機能性コラーゲンシートの表面に、粘膜および血管の新生が認められた（楕円で囲った部分）。このように、本発明の再生材により、粘膜および血管の新生が示された。【０１６４】
また、前記実施例１と同様にして、コラーゲン密度を測定したところ、本例で用いた、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度は、３４ｍｇ／ｇ、つまり、前記高密度コラーゲン基材１ｇ（湿重量）あたりのコラーゲン量は３４ｍｇであった。なお、前記コラーゲン密度を、３４８ｍｇ／ｍｌ±１１９ｍｇ（２２９〜４６７ｍｇ／ｇ）に変更した場合も、同様に優れた再生能が確認された。【０１６５】
（実施例７）
前記コラーゲン含有液の体積を１００ｍＬとし、循環時間を２４時間とし、図１０において前記ＰＬＡシート２４とステンレスメッシュ２３との間にさらに前記液流制御部材として、ＰＥＴシートを配置した以外は、前記実施例１と同様にして、前記ＰＬＡシート上に、高密度コラーゲン基材を形成した。そして、前記コラーゲン結合性生理活性物質として、前記ラットＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質およびヒトＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質を使用し、前記積層体からＰＬＡシートを除去したこと以外は、前記実施例１と同様に、前記機能性コラーゲンシートを作製し、ラットの鼓膜穿孔部に貼付した後、長期間にわたる観察を行なって、鼓膜の再生と腫瘍形成（腫瘍類似病変を含む）の有無を確認した。【０１６６】
ラットＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質は、前記実施例１と同様に調製した。前記ヒトＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質は、前記実施例１において、前記ラットＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ断片に代えて、ヒトＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ断片を使用した以外は、前記ラットＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質と同様に調製した。前記ＤＮＡ断片は、前記ヒトＥＧＦ遺伝子（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号Ｘ０４５７１．１）の３３４７番目〜３５０２番目の塩基配列であり、配列番号２６で表わされる。前記機能性コラーゲンシートを浸漬する浸漬液における前記ラットＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質または前記ヒトＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質の濃度は、１μｇ／ｍＬとした。
配列番号２６
aatagtgactctgaatgtcccctgtcccacgatgggtactgcctccatgatggtgtgtgcatgtatattgaagcattggacaagtatgcatgcaactgtgttgttggctacatcggggagcgatgtcagtaccgagacctgaagtggtgggaactg【０１６７】
前記機能性コラーゲンシートをラットの鼓膜穿孔部に貼付して、３ヶ月後および８ヶ月後に、手術用顕微鏡で鼓膜を観察した。図１２に、前記コラーゲン結合性生理活性物質として前記ラットＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質を使用した場合における、８ヶ月後の鼓膜部位の写真を示す。図１２に示すように、鼓膜（矢印部分）が完全に再生され、上皮化し、穿孔は、治癒した状態が継続していることが確認できた（ｎ＝３）。また、腫瘍形成等の副作用が生じていないことが確認できた。また、前記ラットＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質に代えて、前記ヒトＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質を使用した場合も、３ヶ月後で同様の結果が得られた。【０１６８】
なお、前記実施例１と同様にして、本例で用いた、機能性コラーゲンシートにおける前記高密度コラーゲン基材について、コラーゲン密度を測定した。その結果、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材１ｇ（湿重量）あたりのコラーゲン重量は、３４８ｍｇであった。また、同様の方法により、前記コラーゲン重量が３４８±１１９ｍｇ（２２９〜４６７ｍｇ）の範囲に該当する高密度コラーゲン基材を使用して、同様に実験を行った結果、同様の結果が得られた。【０１６９】
（実施例８）
前記コラーゲン含有液の体積を１００ｍＬとし、循環時間を２４時間とし、前記コラーゲン結合性生理活性物質として、ＥＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質を使用し、前記積層体からＰＬＡシート２４を除去した以外は、前記実施例１と同様に前記機能性コラーゲンシートを作製し、ラットにおける鼓膜の再生を確認した。また、コントロールとして、対側の鼓膜穿孔部は、前記機能性コラーゲンシートを貼付しなかった。【０１７０】
前記機能性コラーゲンシートをラットの鼓膜穿孔部に貼付して、７日目に、手術用顕微鏡で鼓膜を観察した。図１３および図１４に、７日目の鼓膜部位の写真を示す。図１３は、機能性コラーゲンシートを貼付した結果であり、粘膜側からの写真である。図１４は、コントロールの結果であり、粘膜側からの写真である。図１３において、矢印で示す部分に、鼓膜および鼓膜上皮の再生が確認された。これに対して、図１４に示すコントロールでは、矢印で示す部分に穿孔が残存しており、治癒していないことがわかった。【０１７１】
なお、前記実施例１と同様にして、本例で用いた、機能性コラーゲンシートにおける前記高密度コラーゲン基材について、コラーゲン密度を測定した。その結果、湿潤状態の前記高密度コラーゲン基材１ｇ（湿重量）あたりのコラーゲン重量は、３４８ｍｇであった。また、同様の方法により、前記コラーゲン重量が３４８±１１９ｍｇ（２２９〜４６７ｍｇ）の範囲に該当する高密度コラーゲン基材を使用して、同様に実験を行った結果、同様の結果が得られた。【０１７２】
前記実施例１〜８から、本発明の再生材による、上皮、粘膜、鼓膜および血管の再生促進または新生が示された。また、本発明の評価方法により、上皮、粘膜、鼓膜および血管の再生または新生を、経時的に評価できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１７３】
以上のように、本発明は、例えば、組織の再生およびその評価に利用できる。このため、本発明は、特に、医療分野において有用であり、その他の分野にも適用可能である。
【符号の説明】
【０１７４】
１            製造装置
２            形成用容器
１０          リアクター
２１          外筒
２２、２５    シリコーンリング
２３          メッシュ部材
２４          生分解性シート
２６          積層体
２７          リブ
２８          スペーサー
２９          スリット
３０          液体用容器
４０          循環ポンプ
５０          フローセル
６０          インキュベーター
７０          溶存酸素センサー
８０          表示装置
９０          スターラー
１００ａ、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ  管路
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年2月13日(2012.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮層含有組織の再生材であって、
高密度コラーゲン基材、および、生理活性物質とコラーゲン結合性ペプチドとの融合タンパク質を含み、
前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする上皮層含有組織の再生材。
【請求項２】
前記高密度コラーゲン基材に前記融合タンパク質を添加して使用する、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項３】
前記高密度コラーゲン基材を、前記融合タンパク質を含有する液に浸漬して、前記高密度コラーゲン基材に前記融合タンパク質を添加する、請求項２記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項４】
さらに、支持体を含み、
前記高密度コラーゲン基材が、前記支持体上に積層されている、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項５】
前記生理活性物質が、サイトカインである、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項６】
前記サイトカインが、成長因子およびケモカインの少なくとも一方である、請求項５記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項７】
前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子および血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項６記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項８】
前記ケモカインが、ストローマ細胞由来因子である、請求項６記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項９】
さらに、把持部を含み、
前記高密度コラーゲン基材に、前記把持部が配置されている、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項１０】
前記高密度コラーゲン基材が、下記（Ａ）工程を含む製造方法により製造された、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
（Ａ）支持体を配置した循環流路において、コラーゲン含有液を循環して、前記支持体上に前記高密度コラーゲン基材を形成する工程
【請求項１１】
前記コラーゲン含有液が前記融合タンパク質を含む、請求項１０記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項１２】
前記コラーゲン含有液が、細胞を含まない、請求項１０記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項１３】
前記上皮層含有組織が、粘膜、上皮および鼓膜の少なくとも一つである、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項１４】
前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、１００ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項１記載の上皮層含有組織の再生材。
【請求項１５】
候補物質による組織の再生を評価する方法であって、
下記（Ｘ）および（Ｙ）工程を含み、
下記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする評価方法。
（Ｘ）高密度コラーゲン基材を、前記候補物質と共に、実験動物の鼓膜欠損部に配置する工程
（Ｙ）前記（Ｘ）工程後の前記鼓膜欠損部における組織の再生を評価する工程
【請求項１６】
前記（Ｘ）工程において、
前記高密度コラーゲン基材を、前記鼓膜欠損部の中耳側に配置する、請求項１５記載の評価方法。
【請求項１７】
前記高密度コラーゲン基材が、下記（Ａ）工程を含む製造方法により製造された、請求項１５記載の評価方法。
（Ａ）支持体を配置した循環流路において、コラーゲン含有液を循環して、前記支持体上に前記高密度コラーゲン基材を形成する工程
【請求項１８】
候補物質による組織再生を評価する評価用キットであって、
高密度コラーゲン基材を含み、
前記高密度コラーゲン基材におけるコラーゲン密度が、２０ｍｇ／ｍＬであり、
請求項１５記載の評価方法に使用することを特徴とする、評価用キット。
【請求項１９】
前記高密度コラーゲン基材が、下記（Ａ）工程を含む製造方法により製造された、請求項１８記載の評価用キット。
（Ａ）支持体を配置した循環流路において、コラーゲン含有液を循環して、前記支持体上に前記高密度コラーゲン基材を形成する工程
【請求項２０】
上皮層含有組織を再生する再生方法であって、
請求項１記載の再生材を、生体に配置することを特徴とする再生方法。
【請求項２１】
前記上皮層含有組織が、粘膜、上皮および鼓膜の少なくとも一つである、請求項２０記載の再生方法。
【請求項２２】
前記成長因子が、上皮成長因子である、請求項７記載の上皮層含有組織の再生材。
【国際調査報告】
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