(57)【要約】タンパク質等の生体高分子が安定に単分散状態で存在する条件で生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させて、生体高分子が結晶化する条件を探査する方法であって、前記生体高分子含有溶液の均一性を極力維持しながら物理化学的性質の変化を実施できる方法および装置を提供する。循環流路内に溶液を流し、該溶液中の生体高分子および溶液の物理化学的性質を変化させる少なくとも1種の物質(以下、試薬と呼ぶ)の少なくとも一つの濃度を連続的または断続的に、循環流路内の容量を一定に維持しつつ変化させ、かつ溶液中の結晶生成を連続的または断続的にモニタリングして、前記生体高分子の結晶が生成する条件を探査することを含み、前記循環流路内の容量は、循環流路内への溶液注入に伴って、流路内の溶液の一部を、半透膜を介して流路外に排出することで一定に維持される、生体高分子の結晶生成条件探査方法。この探査方法に用いられる装置。
2011115223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
循環流路内に溶液を流し、
該溶液中の生体高分子および溶液の物理化学的性質を変化させる少なくとも1種の物質(以下、試薬と呼ぶ)の少なくとも一つの濃度を連続的または断続的に、循環流路内の容量を一定に維持しつつ変化させ、かつ溶液中の結晶生成を連続的または断続的にモニタリングして、前記生体高分子の結晶が生成する条件を探査することを含み、
前記循環流路内の容量は、循環流路内への溶液注入に伴って、流路内の溶液の一部を、半透膜を介して流路外に排出することで一定に維持される、生体高分子の結晶生成条件探査方法。
【請求項２】
循環流路は、生体高分子含有溶液の添加部位、半透膜を介しての排出部位、試薬含有溶液の添加部位、分散状態モニター部位及び結晶生成モニター部位をこの順に有し、前記結晶生成モニター部位の次に前記生体高分子含有溶液の添加部位を有する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
結晶生成のモニタリングと並行して溶液に含有される生体高分子の分散状態が連続的または断続的にモニタリングされる、請求項1〜2のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
分散状態のモニタリングは、動的光散乱法による散乱光強度分布測定により行う、請求項5に記載の方法。
【請求項５】
溶液は流路中をペリスタルティックポンプで循環する、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ペリスタルティックポンプによる送液は、半透膜を介しての排出部位と試薬含有溶液の添加部位の間で行われる、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
溶液中の生体高分子の濃度変化は、流路内の溶液に生体高分子含有溶液を注入することで行い、溶液中の試薬の濃度変化は、流路内の溶液に試薬含有溶液または試薬を含有しない溶液を注入することで行う、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
溶液中の生体高分子の濃度変化及び試薬の濃度変化は、独立に行われる請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
溶液中の生体高分子の濃度を一定に維持しつつ、溶液中の試薬の濃度を変化させて結晶生成のモニタリングを行う請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
循環溶液中の試薬濃度の変化は、濃度の上昇または減少である、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
生体高分子が、水溶性タンパク質、膜タンパク質、及び核酸−タンパク質複合体から成る群から選ばれる少なくとも1種である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれかに記載の生体高分子の結晶化条件探査方法に用いられる装置であって、
(1)生体高分子含有溶液貯蔵及び投入部、
(2)半透膜を用いた連続透析膜、
(3)物理化学的性質を変化させる物質(以下、試薬と呼ぶ)含有溶液貯蔵及び投入部、
(4)生体高分子の分散状態観察用のモニター、及び
(5)結晶化セル、
上記(1)〜(5)の間を連絡する容量一定の流路、並びに
流路内に溶液を流通させるためのポンプを有し、
前記(4)による生体高分子の分散状態のモニタリング及び(5)結晶化セル内を流れる溶液中の前記生体高分子濃度及び前記試薬の少なくとも一つの濃度を連続的または断続的に変化させて、生体高分子が結晶化する条件を探査するために用いられる前記装置。
【請求項１３】
(4)生体高分子の分散状態のモニタリングは、動的光散乱法による散乱光強度分布測定装置に結合された動的光散乱法による散乱光強度分布セルである請求項12に記載の装置。
【請求項１４】
ポンプは、ペリスタルティックポンプである請求項12または13に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１０年３月１８日出願の日本特願２０１０−６２８６２号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、生体高分子の結晶化条件探査方法及びそれに用いる装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質を始めとした生体高分子の立体構造は、生体高分子を結晶化し、Ｘ線回折試験に付すことにより解析される。しかし、生体高分子は多種多様であり、その結晶化へのプロセスは一定ではなく、生体高分子によっては結晶化しない場合もある。現在採用されている生体高分子の結晶化方法は、非常に多数の結晶化条件をランダムな順列組合せで試みることにより行われ、多分に偶然性に依存する非合理的手法に依存している。【０００４】
ポストゲノム時代を迎えた現在、結晶構造解析はタンパク質の立体構造を基にした薬剤設計、開発等でも用いられる有用な手段でもあり、多くのタンパク質の構造解析が待たれている。複雑な結晶構造の解析のために、高性能のＸ線回折装置の開発も進んでいるものの、肝心な生体高分子の結晶化方法が、試行錯誤と偶然性に依存しており、タンパク質の結晶構造解析全体の律速要因となっている。【０００５】
そこで本発明者らは、先に、比較的少量の生体高分子であっても、より確実に、かつより簡便に生体高分子の結晶化条件を探査できる方法及び装置を提供することに成功し、さらに、前記探査方法により見いだされた結晶化条件において生体高分子の結晶を製造する方法も提供した(特許文献１)。【０００６】
特許文献1に記載の生体高分子含有溶液からの生体高分子の結晶化条件を探査する方法は、生体高分子含有溶液と半透膜で隔てられた溶液に、溶液の物理化学的性質を変化させる物質を連続的または断続的に添加して、前記生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させ、その間の、生体高分子含有溶液中の生体高分子の分散状態を、連続的または断続的にモニタリングすることで、生体高分子が安定に単分散状態で存在する条件を検索し、生体高分子が安定に単分散状態する条件で、生体高分子の結晶化条件を探査する方法である。【０００７】
特許文献１に記載の発明と同様に、特許文献2にも、半透膜で仕切られた2つの室に生体高分子含有溶液と結晶化剤含有溶液をそれぞれ格納し、半透膜を介して、結晶化剤の生体高分子含有溶液への浸透による結晶成長を検出することで結晶成長の条件を求め、この条件により結晶育成を行う生体高分子結晶の製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2004-45169号公報
【特許文献２】特開2004-26528号公報
【０００９】
特許文献１および２の全記載は、ここに特に開示として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１及び２に記載の方法では、具体的には、半透膜を介して溶液混合室と隣接している結晶化セルを用い、前記半透膜により、結晶化セル内のタンパク質を濃縮し、あるいは結晶化セル内の溶液の物理化学的性質を変化させる物質(例えば、沈殿剤)の濃度を変化させている。そのため、結晶化セル内の溶液中のタンパク質や沈殿剤等の濃度に、半透膜近傍と半透膜から離れた位置で、不均一な濃度分布ができ、結果として、タンパク質の結晶化を妨げ、あるいは安定的な結晶の形成や成長を妨げることがあり、大きな問題となっていた。また、タンパク質の濃縮に伴い、半透膜上での沈殿も生じやすいことも懸念され、この沈殿の影響によって条件探査の精度が下がるという問題点があった。【００１１】
そこで、本発明の目的は、タンパク質等の生体高分子が安定な分散状態で存在する条件で生体高分子含有溶液の物理化学的性質を連続的または断続的に変化させて、生体高分子が結晶化する条件を探査する方法であって、前記生体高分子含有溶液の濃度、温度などの均一性を極力維持しながら物理化学的性質の変化を実施できる方法および装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明では、新たにタンパク質等の生体高分子含有溶液を内部循環させる方式を採用し、かつ、循環経路に設置された半透膜ユニットを用いて溶液中の沈殿剤等の低分子成分を含有する溶液を系外に排出することで、溶液中の生体高分子及び沈殿剤等の濃度の均一性を維持しながら、半透膜上での沈殿発生を抑制しつつ、生体高分子の濃縮を可能にした。かつ生体高分子の濃度を一定に保ちつつ沈殿剤等の濃度を自在に変化させることができることを見出し、または溶液中のタンパク質粒子の分散状態をモニタリングする為の工程も更に含めることにより、前記先行技術が有する課題を解決できることを見出して本発明を完成させた。【００１３】
前記課題を解決するための本発明は以下のとおりである。
［1］
循環流路内に溶液を流し、
該溶液中の生体高分子および溶液の物理化学的性質を変化させる少なくとも1種の物質(以下、試薬と呼ぶ)の少なくとも一つの濃度を連続的または断続的に、循環流路内の容量を一定に維持しつつ変化させ、かつ溶液中の結晶生成を連続的または断続的にモニタリングして、前記生体高分子の結晶が生成する条件を探査することを含み、
前記循環流路内の容量は、循環流路内への溶液注入に伴って、流路内の溶液の一部を、半透膜を介して流路外に排出することで一定に維持される、生体高分子の結晶生成条件探査方法。
［2］
循環流路は、生体高分子含有溶液の添加部位、半透膜を介しての排出部位、試薬含有溶液の添加部位、分散状態モニター部位及び結晶生成モニター部位をこの順に有し、前記結晶生成モニター部位の次に前記生体高分子含有溶液の添加部位を有する［1］に記載の方法。
［3］
結晶生成のモニタリングと並行して溶液に含有される生体高分子の分散状態が連続的または断続的にモニタリングされる、［1］〜[2]のいずれかに記載の方法。
［4］
分散状態のモニタリングは、動的光散乱法による散乱光強度分布測定により行う、［3］に記載の方法。
［5］
溶液は流路中をペリスタルティックポンプで循環する、［1］〜[4]のいずれかに記載の方法。
［6］
ペリスタルティックポンプによる送液は、半透膜を介しての排出部位と試薬含有溶液の添加部位の間で行われる、［5］に記載の方法。
［7］
溶液中の生体高分子の濃度変化は、流路内の溶液に生体高分子含有溶液を注入することで行い、溶液中の試薬の濃度変化は、流路内の溶液に試薬含有溶液または試薬を含有しない溶液を注入することで行う、［1］〜[6]のいずれかに記載の方法。
［8］
溶液中の生体高分子の濃度変化及び試薬の濃度変化は、独立に行われる［1］〜[7]のいずれかに記載の方法。
［9］
溶液中の生体高分子の濃度を一定に維持しつつ、溶液中の試薬の濃度を変化させて結晶生成のモニタリングを行う［1］〜[8]のいずれかに記載の方法。
［10］
循環溶液中の試薬濃度の変化は、濃度の上昇または減少である、［1］〜[9]のいずれかに記載の方法。
［11］
生体高分子が、水溶性タンパク質、膜タンパク質、及び核酸−タンパク質複合体から成る群から選ばれる少なくとも1種である、［1］〜[10]のいずれかに記載の方法。
［12］
［1］〜[11]のいずれかに記載の生体高分子の結晶化条件探査方法に用いられる装置であって、
(1)生体高分子含有溶液貯蔵及び投入部、
(2)半透膜を用いた連続透析膜、
(3)物理化学的性質を変化させる物質(以下、試薬と呼ぶ)含有溶液貯蔵及び投入部、
(4)生体高分子の分散状態観察用のモニター、及び
(5)結晶化セル、
上記(1)〜(5)の間を連絡する容量一定の流路、並びに
流路内に溶液を流通させるためのポンプを有し、
前記(4)による生体高分子の分散状態のモニタリング及び(5)結晶化セル内を流れる溶液中の前記生体高分子濃度及び前記試薬の少なくとも一つの濃度を連続的または断続的に変化させて、生体高分子が結晶化する条件を探査するために用いられる前記装置。
［13］
(4)生体高分子の分散状態観察用のモニターは、動的光散乱法による散乱光強度分布測定装置に結合された動的光散乱法による散乱光強度分布測定セルである［12］に記載の装置。
［14］
ポンプは、ペリスタルティックポンプである［12］または[13]に記載の装置。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、上記構成を採用することで、溶液中の生体高分子及び沈殿剤等の濃度の均一性を維持しながら、半透膜上での沈殿発生を抑制しつつ生体高分子の濃縮が可能になる。例えば、生体高分子の濃度を一定に保ちつつ沈殿剤等の濃度を、循環する溶液全体でほぼ均一に変化させることもでき、その結果、先行技術では提供できなかった、より厳密に生体高分子および沈殿剤濃度が制御された条件に生体高分子を置くことが可能になる。さらに、本発明では、循環する溶液について動的光散乱法による散乱光強度分布測定を行うことができるため、循環溶液中の生体高分子の分散状態を適宜測定できる。これらの構成の結果、先行技術では探索することが難しかった非常に狭い組成領域でのみ結晶化し得る生体高分子であっても、結晶化条件を探索することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、動的光散乱法による散乱光強度測定分布装置を利用した、溶液循環型タンパク質自動結晶化装置の概念図である。
【図２ａ】図２ａは、経路内にＢ液を注入した際及びＡ液を注入した際の経路内の電導率の変化を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、経路内にリゾチウム溶液を注入した際の経路内の電導率の変化を示す。
【図３ａ】図３ａは、リゾチウムによる結晶化実験の結果を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、結晶化中のリゾチウム分子の分散度の変化を示す。
【図４ａ】図４ａは、グルコースイソメラーゼの結晶化実験における測定回数に対する導電率変化を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、グルコースイソメラーゼの結晶化実験における測定回数に対する紫外吸収値変化を示す。
【図４ｃ】図４ｃは、グルコースイソメラーゼの結晶化実験における紫外吸光度が0.38 (19mg/ml) になるまで濃縮した（866回）時点での散乱光強度分布を示す。
【図４ｄ】図４ｄは、グルコースイソメラーゼの結晶化実験において2.3mlのB溶液を急速注入した（867回）際の散乱光強度分布を示す。
【図４ｅ】図４ｅは、グルコースイソメラーゼの結晶化実験において測定回数1080回（0.1mm程度の大きさのグルコースイソメラーゼ結晶が得られた）における散乱光強度分布を示す。
【図４ｆ】グルコースイソメラーゼの結晶化実験において測定回数1080回で得られた0.1mm程度の大きさのグルコースイソメラーゼ結晶の写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[生体高分子の結晶生成条件探査方法]
本発明の生体高分子の結晶生成条件探査方法
循環流路内に溶液を流し、
該溶液中の生体高分子および溶液の物理化学的性質を変化させる少なくとも1種の物質(試薬)の少なくとも一つの濃度を連続的または断続的に、循環流路内の容量を一定に維持しつつ変化させ、かつ溶液中の結晶生成を連続的または断続的にモニタリングして、前記生体高分子の結晶が生成する条件を探査することを含み、
前記循環流路内の容液量は、循環流路内への溶液注入に伴って、流路内の溶液の一部を、半透膜を介して流路外に排出することで一定に維持される。
【００１７】
本発明の結晶生成条件探査方法において、結晶生成条件を探査する生体高分子は、結晶化を要する生体高分子であれば特に制限はない。生体高分子としては、例えば、水溶性タンパク質、膜タンパク質、核酸−タンパク質複合体などを挙げることができる。
【００１８】
本発明の方法で結晶生成条件を探査できる生体高分子は、使用する半透膜を透過しない分子量を有するものであれば、特に制限はない。一方、使用する半透膜にも特に制限はないが、入手可能な半透膜であればいずれも使用でき、本発明の方法で結晶化条件を探査する生体高分子の分子量等を考慮して、適宜選択することができる。例えば、半透膜としては、ＶＩＶＡ ＳＣＩＥＮＣＥ社製の再生セルロース膜（５ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ、１０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ、３０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ、５０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ、１００ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ）等を使用できるが、これらに限定されるものではない。例えば、カットオフ分子量が5000の半透膜を用いる場合、重量平均分子量が10,000以上の高分子であれば、濃縮または濃度の維持が可能である。
【００１９】
前記本発明の結晶生成条件探査方法における循環流路は、生体高分子含有溶液の添加部位、半透膜を介しての排出部位、試薬含有溶液の添加部位、分散状態モニター部位及び結晶生成モニター部位をこの順に有する。循環流路中の生体高分子濃度が循環系内で均一になるように、前記結晶生成モニター部位の次に前記生体高分子含有溶液の添加部位を有することが好ましい。以下、本発明の結晶生成条件探査装置を例にさらに説明する。
【００２０】
[生体高分子の結晶化条件探査装置]
本発明の生体高分子の結晶化条件探査装置は、本発明の結晶化条件探査方法に用いることができる装置であって、以下の構成を有する。
(1)生体高分子含有溶液貯蔵及び投入部、
(2)半透膜を用いた連続透析膜、
(3)物理化学的性質を変化させる物質(試薬と呼ぶ)含有溶液貯蔵及び投入部、
(4)生体高分子の分散状態観察用のモニター、及び
(5)結晶化セル、
前記(1)〜(5)の間を連絡する容量一定の流路、並びに
流路内に溶液を流通させるためのポンプを有する。
この装置は、前記(4)による生体高分子の分散状態のモニタリング及び(5)結晶化セル内を流れる溶液中の前記生体高分子濃度及び前記試薬の少なくとも一つの濃度を連続的または断続的に変化させて、生体高分子が結晶化する条件を探査するために用いられる。
【００２１】
さらに、本発明の装置においては、(4)動的光散乱法による散乱光強度測定セル（以下、散乱強度測定セルと記す）で測定された散乱光を動的光散乱法による散乱光強度分布測定装置に導き、散乱光の強度分布から散乱光強度測定セルの中のタンパク質粒子の分散状態をモニタリングする。動的光散乱法による散乱光強度分布測定装置としては、光ファイバーを直接散乱光強度測定セルに挿入し、粒子群に直接レーザ光を照射し、さらに散乱光を直接受光できる光ファイバープローブを利用する方式（例えば、日機装（株）社製  NanotracUPA ）が好ましい。
【００２２】
本発明では、生体高分子の分散状態をモニタリングしながら生体高分子が結晶化する条件を探査することで、生体高分子の分散状態と生体高分子の結晶化を関連づけて把握することができるとの利点がある。さらに、生体高分子の分散状態のモニタリングについては、溶液中での生体高分子の粒子の会合状態を解析する方法として、例えば動的光散乱法による散乱光強度分布測定で行うことができ、好ましくは周波数解析法を使用した動的光散乱法による散乱光強度分布測定で行うことで、生体高分子の分散状態をより正確に評価できる。尚、動的光散乱法による散乱光強度分布測定による分散状態のモニタリングは、例えば、溶液の循環を一時的に停止して散乱光強度測定セル内の溶液の動きを一時的に停止して行う。あるいは、溶液の循環は停止せずに、動的光散乱法による散乱光強度測定に支障のない範囲に循環速度を制御して、動的光散乱強度分布測定を行うこともできる。さらにまた、溶液の循環は維持するが、散乱光強度測定セルと並行してバイパスを設けて、このバイパスを介して溶液は流通させ、散乱光強度測定セル内の溶液の動きを一時的に停止、又は分散状態をモニタリングができる程度に流速を下げて行う。従って、生体高分子の分散状態のモニタリングを動的光散乱法による散乱光強度分布測定で行う場合には、このような溶液循環に関する操作を行いながら、生体高分子の分散状態を変化させる。
【００２３】
さらに、ポンプは、ペリスタルティックポンプであることが、沈殿等の固形物によって影響を受けにくく、安定して送液を行えるというという観点から好ましい。
【００２４】
図１に動的光散乱法による散乱光強度分布装置を利用した、本発明の結晶化条件探査装置の概念図を示す。生体高分子としてタンパク質を用いた場合を例に、以下説明する。
(1)の生体高分子含有溶液貯蔵及び投入部は、生体高分子含有溶液を満たしたシリンジを有するシリンジポンプ10であることができる。(2)の半透膜を用いた連続透析膜20は、半透膜を介して溶液をろ液として流路60内から排出できる。(3)の試薬含有溶液貯蔵及び投入部30は、1つまたは複数の試薬含有溶液の貯蔵部を有し、この貯蔵部の1つまたは複数から、流路60内には、シリンジポンプから、電動または手動切り替えバルブ(図中は電磁バルブ61)を経由することによって試薬含有溶液が注入される。(4)の生体高分子の分散状態のモニター40は、例えば、動的光散乱法による散乱光強度分布測定装置41に結合された散乱光強度測定セル42であることができる。(5)の結晶化セル50は、流路60内に設置する。セル内容量は、例えば、数十マイクロリットル〜数百マイクロリットルである。また、セル内を観察するために、セル上部と下部は透明な観察窓を持つか、セル全体をアクリル樹脂で製作することにより、内部観察を可能とすることができる。また、セル内の結晶化セル外周辺にはウオータージャケット(図示せず)を設置することもでき、このジャケットに温度制御された流体を循環させることにより、セル全体の温度を制御することができる。上記(1)〜(5)の間を連絡する流路60は、容量一定であり、例えば、少なくとも循環する溶液と接する内面が溶液及びその含有物に対して不活性である材料製のチューブであることができる。流路60の全てを同一の材質のチューブで形成することもできるが、場所に応じて異なる材質のチューブを適宜用いることができる。流路60は、例えば、フレキシブルなシリコーンチューブ、PCV、ポリプロピレンなどであることができる。
【００２５】
ポンプ70は、流路内に溶液を流通させるためのポンプであり、ペリスタルティックポンプであることが、上記で説明した理由から好ましい。ポンプ70としてペリスタルティックポンプを用いる場合には、ペリスタルティックポンプ付近の流路60はフレキシブルな樹脂製のチューブであることが適当である。尚、生体高分子含有溶液を満たしたシリンジを有するシリンジポンプは、シリンジへの逆流を防止するという観点からペリスタルティックポンプの上流に位置することが好ましい。
【００２６】
上記装置において、タンパク質溶液は、シリンジポンプ10内から経路内に注入される。経路内のタンパク質濃度は、連続透析膜20により濃縮され、ペリスタルティックポンプ70によって経路内を循環させられる。試薬投入部30から塩、バッファーなどの試薬が経路内に制御されつつ注入される。タンパク質溶液の分散状態は、動的光散乱法による散乱光強度分布測定装置40に結合された散乱光強度測定セル42により、ほとんど時間遅れなくモニタリングすることができる。結晶化セル50内の観察部51おいて結晶化が観察される。一連の動作は、例えば、PC90により制御される。尚、経路内での試薬の濃度は、例えば、導電率計80を用いることでモニタリングすることができる。導電率計80の設置位置は、特に制限はないが、図1に示すシリンジポンプ10の直ぐ下流以外の位置に設置することもできる。
【００２７】
本発明の方法及び装置においては、系内を溶液が一定の速度で流通しており、かつ連続透析膜20においては溶液がろ過される。タンパク質溶液が系内に注入されるときには、タンパク質濃度は徐々に上昇し、タンパク質溶液は注入されず、試薬溶液が注入される場合には、タンパク質濃度は一定に維持されつつ試薬濃度が徐々に上昇する。また、試薬を含まない溶液を試薬投入部30から系内に注入することもでき、この場合には、タンパク質濃度は一定に維持されつつ試薬濃度は徐々に低下する。連続透析膜20における溶液のろ過は、溶液が一定の速度で流通しながら行われる。また、溶液の循環流速が試薬注入速度やタンパク質溶液の注入速度に比べて十分に確保されており、かつ各種溶液の注入量が循環経路内の溶液量に比べて極微量な条件下では、連続透析膜20付近における溶液中の試薬濃度やタンパク質濃度の変化は穏やかであり、かつ溶液が、測定時以外は、常時循環し、攪拌状態を維持していることから、系内がほぼ均一な濃度状態を維持でき、その結果、タンパク質の分散状態が局所的に変化する恐れが極めて低く、タンパク質等の生体高分子が結晶化する条件を探査するに適している。本発明において、溶液組成が均一であるとは、分オーダーの時間内に、循環経路内部全体の溶液組成が同一になることを意味する。
【００２８】
溶液の循環速度は、系内がほぼ均一な濃度状態を維持できる速度であれば特に制限はなく、系の容量や流路の断面積、使用されるポンプの種類や能力等に応じて、さらには、生体高分子含有溶液に結晶化のため与えたい条件変化等を考慮して適宜決定できる。溶液の循環速度は、例えば、0.0001〜2 ml/minの範囲であることができる。
【００２９】
例えば、ペリスタルティックルティックポンプにおける使用チューブの種類と吐出量とヘッド回転速度（rpm）との関係は、ペリスタルティックルティックポンプのメーカーが技術情報として公開している。
例えば、http://www.technosaurus.co.jp/product/mp-flow_1.htm参照。その全記載は、ここに特に開示として援用される。
このような公開されている技術情報によれば、チューブとしてPVC0.5 mmを使用する場合、ポンプの回転速度を最大の50 rpmに設定すると、沈殿剤を急速に注入（1 ml/min程度）しても約1 ml/minの循環速度で経路内の溶液が循環できる。このような循環速度であれば、数分後には経路内の組成は均一な平衡状態に達することができる。一方、タンパク質や沈殿剤をゆっくり注入する（例えば、0.0002〜0.07 ml/min）過程では、ヘッド速度を1〜5 rpm程度で運転することで0.1 ml/min程度で溶液は循環する。そのため、十分経路内の均一性を保ちつつ溶液組成を変化させることが可能になる。
【００３０】
溶液の物理化学的性質を変化させる物質(試薬)は、例えば、ｐＨ緩衝剤、沈殿化剤、塩類、添加剤、及び水から成る群から選ばれる少なくとも１ 種の物質であることができる。ｐＨ緩衝剤、沈殿化剤、塩類、添加剤は、生体高分子の結晶化にこれまで使用されている物質から適宜選択することができる。
【００３１】
ｐＨ緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム／ カリウム、ＭＥＳ、カコジル酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。
沈殿化剤としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、ポリエチレングリコール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。
【００３２】
塩類としては、例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、塩化コバルト、硫酸リチウム、酢酸アンモニウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、塩化セシウム等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。添加剤としては、例えば、エチレングリコール、グリセロール、尿素、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ＥＤＴＡ、ＤＤＴ、ヘキサンジオール、オクチルグルコシド等を挙げることができる。但し、これらの限定されるものではない。
【００３３】
循環経路内の溶液の温度は、結晶化セル内のウオータージャケット(図示せず)に温調された液体を循環させることにより、一定になるように制御しておくこともできるし、生体高分子の濃度変化や溶液の添加と並行して温度を変化させることもできる。生体高分子の濃度変化時や溶液添加時の温度を一定にする場合、同一条件の検索操作を、温度を変えて行うこともできる。循環経路の温度調整は、例えば、循環経路の一部または全部を恒温槽(室)100に設置することで行うこともできる。本発明の方法を実施する溶液温度は、特に制限はなく、低くする場合、凍結が生じない範囲であればよく、また、高くする場合、生体高分子に変性等が生じない範囲であれば良い。例えば、０〜４０℃の範囲とすることができる。
【００３４】
以上の方法により、良質な結晶が得られる条件が探査できたら、その結晶化条件を用いて、構造解析に適した品質とサイズを有する生体高分子結晶を製造することができる。この生体高分子結晶の製造は、常法により行うことができる。例えば、蒸気拡散法、透析法、バッチ法などが知られている。
【００３５】
得られた生体高分子結晶は、結晶構造解析に使用することができる。結晶構造解析は、例えば、ＭＡＤ法に従って行うことができ、例えば、放射光を使用して、結晶のＸ 線回折データを測定する。この目的に使用できる放射光は、例えば、大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８／理研（ＲＩＫＥＮ）ビームラインＩＢＬ４４Ｂ２（ＢＬ４５ＸＵ）により発生させることかできる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。【００３７】
実施例１
図１に記載した連続フロー型半透膜を利用する装置の特徴を用いて、経路内の沈殿剤濃度などを連続的に任意に変化させられることを実験により確認した。結果を図2aに示す。A液は生体高分子の一つであるリゾチウムを溶解させるための緩衝液であり、組成は0.1 M 酢酸ナトリウム, pH4.3であり、B液はリゾチウムの結晶化剤であり、A液に塩化ナトリウムを2.0 Mの濃度に溶解した溶液である。A液、B液をそれぞれ経路内に注入し、半透膜外に流出した濾液の電導度を測定した。【００３８】
沈殿剤注入ステップでは、B液（0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.3、2.0 M NaCl）を5.2 ml(5 ml/hの注入速度で)注入し、その後、10 ml(50 ml/hの注入速度で)注入した。導電率は、約14 S/mで飽和した。その後、A緩衝液を20 ml (10 ml/hの注入速度で)注入した。図2aに示すように、導電率がスムーズに変化していることから、本システムにより、経路内の組成の均一性を保ちながら、組成を自由に変化されることが可能であることが示された。【００３９】
次に経路内にタンパク質溶液を注入した際の経路内のタンパク質濃度変化を測定した。結果を図2bに示す。10回目から48回目（測定は5分間隔）までの間に、リゾチウム溶液（20 mg/ml, 0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液, pH4.3）を5.36 ml(2 ml/hの注入速度で)経路内に注入した。タンパク質濃度に比例する動的光散乱法による散乱光強度分布の測定強度のピーク値がスムーズに上昇変化した。ピーク値がスムーズに上昇変化したことから本装置により経路内の均一性を保ちつつ、タンパク質濃度を変化させることが可能であることが示された。【００４０】
経路内に沈殿剤をV量注入したときの経路内沈澱剤濃度C(V)（S/m)は、下記式で概算できる。
C(V) = A・exp[-V/Vo] + C’
A, C’: 定数
Vo: 経路容量【００４１】
上記実験では、沈殿剤投入前またはタンパク質溶液注入前の経路には、A液（0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液, pH 4.3）が充填されており、C’は0.6 mS/m程度である。沈殿剤及びタンパク質溶液はあらかじめA液に溶解してあるため、全実験過程に渡って経路内のA液組成は維持される。
Vo = 2.5 mlであり、Aは経路内容量Voによって決まる。【００４２】
図2aに示す結果から、経路内の沈澱剤濃度C(V)を、経路内に沈澱剤を注入することにより上昇させることが可能であり、また、経路内にAバッファーを注入させることにより下降させることが可能であることを確認することができた。これにより、経路内の沈澱剤濃度C(V)を、経路外部から沈澱剤あるいはAバッファーを注入することにより、任意に変化させることが可能であることを確認した。この際の経路内の沈澱剤濃度C(V)は、経路内に注入した沈澱剤量(V)との関数として、上記式に従って数式により把握することが可能である。こうした特徴は、従来の結晶化装置にはない、本発明の装置に特有の特徴である。【００４３】
実施例２
実施例１で使用した装置を実際に組み立てて、タンパク質試料としてリゾチウムを用いて、リゾチウムの結晶化実験を行った。結果を図3a及び図3bに示す。【００４４】
クロマトグラムは、横軸が測定回数(時間)、縦軸がリゾチウム分子の動的光散乱法による散乱光強度分布測定より求めた半径である。タンパク質濃縮過程では、リゾチウムを34mg/mlの濃度まで濃縮した。次に、沈殿剤（NaCl）濃度を5分間で0→1Mまで上昇させると、タンパク質分子の動的光散乱法による散乱光強度分布測定より求めた半径の増加が観察された。更に徐々に沈殿剤濃度を増加させると、写真のようにリゾチウム結晶の生成が確認された。この連続写真は、50〜65回の測定結果であり、各測定は10分間隔で行った。結晶が観察できる拡大写真は、測定55回目の写真である。0.2〜0.4mm程度の結晶が生成していることが分かる(目盛り参照)。図中のMVは体積平均径、MNは個数平均径、MAは面積平均径である。【００４５】
この結晶化過程におけるリゾチウム分子の分散度の変化を図3bに示す。動的光散乱法による散乱光強度分布測定装置で検出された信号は、周波数解析法によってパワースペクトル（周波数vs信号強度）に変換される。図3b縦軸は信号強度(粒子群からの散乱光強度に入射光強度をかけたもの)、横軸は周波数に相当する散乱強度測定装置固有の区分数を表している。図3bに描かれている曲線は、このパワースペクトルを対数変換し、適宜周波数区分に切り分けたものである（以下、このグラフをRaw-dataと呼ぶ）。このRaw-data中の曲線は粒子径に応じた固有のピークを持ち、ピーク位置（横軸；周波数に対応したチャンネル）は液中に存在する代表的な溶質(単体分子あるいは分子の結合体）サイズの特徴を示している。粒子サイズが大きいほど、ピーク位置のチャンネル数が小さくなる。逆に、高いチャンネル数ほど径が小さい粒子に対応している。【００４６】
図3b中の系列に示した測定回数は、リゾチウムを系内に初めて投入した時点を0回目とし、続けて定期的に動的光散乱法による散乱光強度分布を測定したときの回数を示しており、図3bでは各々の測定回数(時間)での測定結果（リゾチウムの分散状態）を一つのグラフにプロットしている。沈殿剤を加えていない状態でのリゾチウムの分散状態は、図中の14〜16回目の測定結果であり、このときの測定結果は68ch付近をピークに散乱光強度分布が一山のなめらかなカーブを描いている。沈殿剤を初めて投入した時点のリゾチウムの分散状態は図中の17回目の測定結果であり、リゾチウムのみを測定した場合と同様一山のカーブを描くが、そのピーク位置が低ch側へややシフトし、ピークchにおける信号強度が増加した。本結晶化試験では、17回目の測定以降、上記散乱光強度分布の形状を維持しつつ、最終的にリゾチウムの結晶が生成された(17〜50回目)。50回目の測定以降、結晶生成にリゾチウムが消費され溶液中のリゾチウム濃度が低下したため、散乱光強度が下がった(60回目)。【００４７】
他方、リゾチウムの沈殿を生じた際の分散状態を図3に示す。この場合、高チャンネル側に図3bと同様にリゾチウムのピークが存在しているが、0〜40ch領域にスパイク状のピークが出力された。これは過剰の沈殿剤投入によりリゾチウムの凝集物ができたためである。またこの時のセル状態を観察すると、図3aの写真のように沈殿が生じていることが確認された。【００４８】
したがって、リゾチウムが結晶化する場合は、測定全般にわたって0〜40chの領域にスパイク等の強度変化は見られず、結晶化過程全般にわたってリゾチウム分子の溶液状態は一定の分散状態を維持していたことが確認された。【００４９】
実施例３
実施例２と同様に、実施例１で使用した装置を実際に組み立てて、タンパク質試料としてグルコースイソメラーゼを用いて、グルコースイソメラーゼの結晶化実験を行った。実験条件は以下の通りである。
・  グルコースイソメラーゼ：Hampton Research社製  分子量:173,000
・  タンパク質溶液：30mg/ml グルコースイソメラーゼ、50mM HEPES, pH7.0, 1mM MgCl2
・  A溶液：50mM HEPES, pH7.0, 1mM MgCl2
・  B溶液（沈澱剤溶液）：3M NH4(SO4)2, 50mM HEPES, pH7.0, 1mM MgCl2
・  結晶化セル温度：20℃【００５０】
結果を図4に示す。4aは測定回数に対する導電率変化、図4bは測定回数に対する紫外吸収値変化を示す。
(1)タンパク質溶液を結晶化装置に注入し、紫外吸光度（λ280 0.2cmセル使用）が0.38 (19mg/ml) になるまで濃縮した（866回）。その際の散乱光強度分布は、図4cに示すように低チャンネル側の信号がほとんどない安定な分散状態を示し、ピーク位置は59チャンネルであった。
(2)2.3mlのB溶液を急速注入したところ（867回）、導電率は13.0 S/mになり、動的光散乱プロファイルは図4dに示すように、安定な分散状態を維持しつつ、ピークチャンネルが56チャンネルにシフトした。
(3)その後、タンパク質溶液を0.05ml/hourおよび沈澱剤溶液Bを0.1ml/hourの速度でそれぞれ注入した。
(4)測定回数1080回において、紫外吸光度は0.515,導電率は16.2 S/mになり、図のように0.1mm程度の大きさのグルコースイソメラーゼ結晶が得られた（図4fに写真を示す）。その際の散乱光強度分布も、図4eに示すように安定な分散を維持していた。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、生体高分子の結晶化製造に関する分野に有用である。
【符号の説明】
【００５２】
10 生体高分子含有溶液を満たしたシリンジを有するシリンジポンプ
20 半透膜を用いた連続透析膜
30 試薬含有溶液貯蔵及び投入部
40 生体高分子の分散状態のモニター
41 動的光散乱法による散乱光強度測定装置
42 動的光散乱強度測定セル
50 結晶化セル
51 結晶観察部
60 流路
61 電磁バルブ
70 ペリスタルティックポンプ
80 導電率計
90 制御PC
100 恒温槽
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
2011115223.tif 000011
【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【国際調査報告】
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