(57)【要約】  本発明は、インフルエンザウイルス感染阻害剤を提供することを目的とする。具体的には、アミノ酸配列RERRRKKR（配列番号１）を有するペプチドを認識する抗体などのRR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質を医薬組成物とし、その医薬組成物を含むインフルエンザウイルス感染阻害剤を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
RR配列を有するペプチドを認識する抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
エピトープとしてRR配列のアミノ酸配列を認識することを特徴とする、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
RR配列が、RERRRKKR（配列番号１）である、請求項１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
前記抗体がポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントをコードするDNA。
【請求項６】
請求項５に記載のDNAを含み、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを発現することができる発現ベクター。
【請求項７】
RR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質を含有する医薬組成物。
【請求項８】
前記阻害物質が、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項６に記載の発現ベクターであることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の医薬組成物を含有するインフルエンザ予防または治療のための医薬。
【請求項１０】
ノイラミニダーゼ阻害剤と併用されることを特徴とする、請求項９に記載のインフルエンザ予防または治療のための医薬。
【請求項１１】
RR配列を有するペプチドの細胞内への侵入を阻害する侵入阻害剤であって、
当該RR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質を含有する侵入阻害剤。
【請求項１２】
前記阻害物質が、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項６に記載の発現ベクターであることを特徴とする、請求項１１に記載の侵入阻害剤。
【請求項１３】
RR配列を有する高病原性インフルエンザウイルスの細胞内への感染を阻害する高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤であって、
当該RR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質を含有する高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項１４】
前記細胞が、機能的なインフルエンザウイルス受容体を有さないことを特徴とする、請求項１３に記載の高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項１５】
前記細胞が、呼吸器や腸管以外の細胞であるか、または、呼吸器や腸管の細胞である場合、インフルエンザウイルス受容体の機能が阻害されていることを特徴とする、請求項１４に記載の高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項１６】
前記阻害物質が、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項６に記載の発現ベクターを含有することを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載の高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤。
【請求項１７】
前記高病原性インフルエンザウイルスが、A型H5N1亜型であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載のインフルエンザウイルス感染阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスには、A,B,C型の3種類が存在し、A型は人畜共通感染症である。A型インフルエンザウイルスは、その膜表面にある16種類のヘマグルチニン(HA）と9種類のノイラミニダーゼ(NA)の組み合わせにより多数の亜型が存在する。そして、HAの抗原性により、低病原性ウイルスと高病原性ウイルスに分類されるが、低病原性ウイルスが局部的（呼吸器や腸管）にしか感染しないのに対し、HAの抗原性がH5型及びH7型の高病原性ウイルスは、全身の臓器に感染して増殖し、宿主を死亡させる。【０００３】
インフルエンザウイルスが細胞に感染する際、HAが細胞表面の受容体に結合することが必要となる。インフルエンザウイルスは、受容体に結合して細胞内に侵入し、細胞内で増殖する。その際、低病原性ウイルスは、局部的に細胞外に分泌されているプロテアーゼによってHAが開裂する必要があり、それによって細胞感染能力を獲得するため、HA開裂と感染はカップルしている。一方、高病原性ウイルスは、細胞内で増殖後、細胞外へ放出される際にHAが開裂して、細胞感染能力を獲得する。従って、細胞外に存在する高病原性ウイルスは、すでに感染力を有しているため、HAの開裂と感染はカップルしていない。そこで、高病原性ウイルスのHAは自己開裂タイプと呼ばれている（Kawaoka, Y. and Webster, R. G., Proc. Natl Acad. Sci. USA vol.85, p.324−328, 1988）。【０００４】
ところで、インフルエンザウイルスが感染する受容体は動物種特異的であるため、通常、トリインフルエンザウイルスがヒトに感染することは無い。しかしながら、トリインフルエンザウイルスに変異が生じ、受容体認識が変化し、ヒトに感染する危険性が指摘されている。【０００５】
これまで、トリからヒトへの感染は何度か確認されているが、ヒト間での感染は確認されていない。しかしながら、一旦高病原性のトリインフルエンザウイルスがヒトへの感染能力を獲得すると、ヒトは、トリインフルエンザウイルスに対する免疫を持たないので、流行が急速に広まることが予想されている。従って、高病原性のインフルエンザウイルスに対する予防薬や治療薬の開発が期待されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、インフルエンザウイルス感染阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これまで、高病原性インフルエンザウイルスが、どのようにして全身の細胞に侵入できるか明らかではなかった。というのは、上述した様に、高病原性インフルエンザウイルスは、細胞外ではHAの開裂が既に起きているため、全身の細胞に対する感染は、開裂するためのプロテアーゼの発現パターンでは説明がつかないからである。【０００８】
ところで、高病原性インフルエンザウイルスは、ＨＡの開裂部位に塩基性アミノ酸が連続した特異的な配列RERRRKKR（配列番号１）を有することが知られているが、この配列の機能は明らかにはされていなかった。本発明者らは、このアミノ酸配列の機能を調べる中で、このアミノ酸配列を有するペプチドが膜透過性ペプチド(CPP; Cell penetrating peptide)として機能することを発見した。そして、この機能によって、高病原性インフルエンザウイルスが、全身性に感染すると考えられたので、このアミノ酸配列に関するポリクローナル抗体を作製したところ、このアミノ酸配列を有するペプチドが細胞内へ侵入することを阻害することができた。従って、このアミノ酸配列に関する抗体は、高病原性インフルエンザウイルスの感染を抑制できることが明らかになり、本発明は完成に至った。【０００９】
本発明の一実施形態は、RR配列、特にアミノ酸配列RERRRKKR（配列番号１）を有するペプチドを認識する抗体またはそのフラグメント、または少なくともそれらのいずれかを発現する発現ベクターである。前記抗体またはそのフラグメントは、エピトープとしてRR配列、特にRERRRKKR（配列番号１）のアミノ酸配列を認識することが好ましい。また、前記抗体またはそのフラグメントは、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。【００１０】
本発明のさらなる実施形態は、RR配列特にRERRRKKR（配列番号１）の細胞導入作用を阻害する阻害物質を含有する医薬組成物、RR配列特にRERRRKKR（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドの細胞内への侵入を阻害する侵入阻害剤である。前記阻害物質は、前記抗体またはそのフラグメント、またはそれらのいずれかを発現する発現ベクターであってもよい。前記高病原性インフルエンザウイルスが、A型H5N1亜型であってもよい。【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、高病原性インフルエンザウイルスの細胞への感染を阻害する高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤、または高病原性インフルエンザウイルスによるインフルエンザの予防または治療のための医薬であって、RR配列特にRERRRKKR（配列番号１）の細胞導入作用を阻害する阻害物質を含有する。前記細胞は、機能的なインフルエンザウイルス受容体を有さないことが好ましく、特に呼吸器や腸管以外の細胞であることが好ましいが、呼吸器や腸管の細胞である場合、インフルエンザウイルス受容体の機能が阻害されていることが好ましい。前記阻害物質は、前記抗体またはそのフラグメント、またはそれらのいずれかを発現する発現ベクターであってもよい。前記高病原性インフルエンザウイルスが、A型H5N1亜型であってもよい。【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、高病原性インフルエンザウイルスの予防方法または治療方法であって、健常人または高病原性インフルエンザウイルスに感染したインフルエンザ患者に、RR配列特にRERRRKKR（配列番号１）の細胞導入作用を阻害する阻害物質を投与する工程を含む。前記阻害物質は、前記抗体またはそのフラグメント、またはそれらのいずれかを発現する発現ベクターであってもよい。前記高病原性インフルエンザウイルスが、A型H5N1亜型であってもよい。さらに、前記患者に、低病原性インフルエンザウイルスによる感染経路を阻害しながら投与してもよく、例えばノイラミニダーゼ阻害剤を併用してもよい。前記ノイラミニダーゼ阻害剤は、オセルタミビル、ザナミビル、それらの塩、それらの水和物、及びそれらの混合物からなるグループから選択されることが好ましい。【００１３】
[関連出願へのクロスリファレンス]
本出願は、２００９年１１月２０日付で出願した日本国特許出願２００９−２６５３９に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施例において、RR配列を有するペプチドが、細胞内へ侵入することを示す図である。なお、Ａ、Ｂ共に、左上がGFPによる蛍光シグナル、右上が抗GFP抗体を用いた抗体染色によるシグナル、左下がDAPIによる核染色シグナル、右下が、GFPによる蛍光シグナル・抗GFP抗体を用いた抗体染色によるシグナル・DAPIによる核染色シグナルの三重撮影である。
【図２】本発明の一実施例において、RR配列を有するペプチドを認識するポリクローナル抗体が、そのペプチドの細胞内への侵入を阻害することを示す図である。なお、左カラムの４枚の写真がDAPIによる核染色シグナル、右カラムの４枚の写真が抗GFP抗体を用いた抗体染色によるシグナルを示し、上４枚の写真がRR配列を有するペプチドを認識するポリクローナル抗体で処理したGFP-RR融合タンパク質を用いた実験、下４枚の写真が免疫前のウサギ血清で処理したGFP-RR融合タンパク質を用いた対照実験の結果を示す。
【図３】本発明の一実施例において、RR配列を有するペプチドを認識するポリクローナル抗体のFabフラグメントが、そのペプチドの細胞内への侵入を阻害することを示す図である。Ａが免疫前のウサギ血清で処理したGFP-RR融合タンパク質を用いた対照実験の結果を示し、ＢがRR配列を有するペプチドを認識するポリクローナル抗体で処理したGFP-RR融合タンパク質を用いた実験の結果、を示す。
【図４】本発明の一実施例において、シアリダーゼによって細胞表面のシアル酸を除去した細胞に対し、高病原性インフルエンザウイルスを感染させたとき、RR配列特異的抗体が感染阻害効果を有することを示す図である。ＡがＰＢＳで処理した高病原性インフルエンザウイルスを感染させた実験結果を示し、ＢがRR配列特異的抗体を含む血清で処理した実験結果を示す。なお、Ｂ右図は、DAPIで細胞の核を染色した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１６】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１７】
本発明の一実施態様は、RR配列特にRERRRKKR（配列番号１）の細胞導入作用を阻害する阻害物質である。この阻害物質は、好ましくは、RR配列を有するペプチドを認識する抗体（以下、RRペプチド認識抗体と称する）であるが、RR配列の細胞導入作用を阻害すれば特に限定されず、アプタマー、環状ペプチド、低分子化合物等でも構わない。抗体の場合、構造的にRR配列の機能を阻害するものであれば特に限定されないが、エピトープとしてRR配列を認識することが好ましい。また、この抗体は、モノクローナルでもよく、ポリクローナルでもよく、ヒト型抗体等の人工抗体であっても構わない。これらの抗体は、当業者には明らかな製造方法に従って製造することができる。その際に用いる抗原は、RR配列そのものでも良く、あるいは、ハプテンなどを結合させても良い。
【００１８】
なお、RR配列とは、高病原性インフルエンザウイルスがHA開裂部位に有する塩基性アミノ酸配列であり、５〜８塩基のアミノ酸からなる。具体的には、A型H5N1亜型インフルエンザウイルスの有するRERRRKKR（配列番号１）とその変異型配列（配列番号２〜４）、及びＡ型H7亜型インフルエンザウイルスの有する塩基性アミノ酸配列（配列番号５〜９）を含む（表１参照）。
【表１】
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【００１９】
本発明の他の実施態様は、RRペプチド認識抗体のフラグメントでも良い。この抗体フラグメントは、抗体の一部からなり、可変領域を含む抗原結合部位であれば特に制限されるものではないが、例えば、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント等を用いることができる。これらのフラグメントは、例えば、モノクローナル抗体をタンパク質分解酵素によって部分消化することにより得ることができる。なお、タンパク質分解酵素としては、FabフラグメントやF(ab’)2フラグメントを得ることができるものであればどのようなものであってもよいが、例えば、ペプシン、フィシン等の分解酵素を用いることができる。
【００２０】
さらに他の実施態様として、RRペプチド認識抗体またはそのフラグメントをコードするDNA、またはそのDNAを有し、RRペプチド認識抗体またはそのフラグメントを発現する発現ベクターが挙げられる。これらのDNAや発現ベクターは、当業者には明らかな製造方法に従って製造することができる。
RRペプチド認識抗体またはそのフラグメントは、大腸菌や哺乳類の培養細胞などで機能するプロモーターを用いて発現ベクターを作製し、宿主細胞内に導入して抗体やそのフラグメントを発現させ、精製することによって作製しても良い。その際、シグナルペプチドを付加し、細胞外に分泌させるのが好ましい。
【００２１】
RR配列特にRERRRKKR(配列番号１)の細胞導入作用を阻害するRR配列阻害物質、好ましくは、RRペプチド認識抗体またはそのフラグメントは、RR配列を有するペプチドに結合することにより、このRR配列を有する部分が、細胞膜と相互作用することを阻害し、このペプチドが細胞内に侵入することを阻害することができる。従って、RR配列阻害物質は、RR配列を有するペプチドの細胞内への侵入を阻害する侵入阻害剤として、in vivo及びin vitroで用いることができる。また、RRペプチド認識抗体やそのフラグメントを細胞外に分泌できるようにした発現ベクターも、同様に侵入阻害剤として用いることができる。ここで、対象となる細胞は、特に限定されないが、低病原性インフルエンザウイルスが感染しないが、高病原性インフルエンザウイルスが感染する細胞、例えば、機能的なインフルエンザウイルス受容体を有さないことが好ましく、特に呼吸器や腸管以外の細胞であることが好ましいが、呼吸器や腸管の細胞である場合、インフルエンザウイルス受容体の機能が阻害されていることが好ましい。ここで、機能的なインフルエンザウイルス受容体とは、低病原性インフルエンザウイルスが感染するために用いられる受容体、すなわち細胞表面のシアル酸を含む糖鎖構造であって、インフルエンザウイルスが感染することができる受容体のことを意味する。その機能を阻害する方法は特に限定されず、例えば、シアリダーゼによって細胞表面のシアル酸を除去してもよく、インフルエンザウイルスと競合的にシアル酸に結合する化合物を投与してもよい。
【００２２】
また、高病原性インフルエンザウイルスは、外殻ペプチドの末端にRR配列を有し、その配列を用いて細胞内に侵入する。従って、RR配列阻害物質は、この外殻ペプチドに結合し、高病原性インフルエンザウイルスが細胞内に侵入することを阻害する。このように、RR配列阻害物質は、高病原性インフルエンザウイルス感染阻害剤として用いることができる。
【００２３】
ここで、高病原性インフルエンザウイルスは、全身感染性であれば特に限定されないが、HAの開裂部位にRR配列を有することが好ましく、細胞中で増殖し、細胞外に放出された時、既に開裂され、外殻ペプチドが末端にRR配列を有することが好ましい。具体的には、HAの抗原性がH5型及びH7型のインフルエンザウイルスが例示できる。
【００２４】
このように、RR配列阻害物質は、高病原性インフルエンザウイルスが細胞内に侵入することを阻害することができるので、高病原性インフルエンザウイルスによって生じる疾患に対し、医薬組成物として用いることができる。医薬組成物の投与対象は、脊椎動物であれば特に限定されないが、ヒト、トリ、ブタであることが好ましい。
【００２５】
この医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加し、錠剤、粉剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤などに剤形化しても良く、これにより、インフルエンザ予防または治療のための医薬を製造することができる。ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される医薬の形態に応じて、慣用されている担体の中から適宜選択して用いることができる。例えば、医薬が溶液形態として調製される場合、担体として、精製水（滅菌水）または生理学的緩衝液、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような注射投与可能な有機エステルなどを使用することができる。また、この医薬には、慣用的に用いられる安定剤、賦形剤などを含ませることができる。医薬の投与方法には特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾病の重篤度等に応じて適宜決定すればよいが、製剤形態としては、特に注射剤、点滴剤、噴霧剤等の非経口投与形態が好ましい。特に注射剤や点滴剤として用いる場合は、必要に応じて塩溶液、ブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液などと混合して静脈内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内に投与する。この医薬は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗ウイルス剤、抗炎症剤や、症状を緩和する薬剤など）と組み合わせて使用してもよい。特に、低病原性インフルエンザウイルスによる感染経路を阻害しながら投与することが好ましく、例えば、その阻害薬であるオセルタミビルあるいはその塩や水和物（例えば、リン酸塩であるタミフル（ロシュ社））やザナミビルあるいはその塩や水和物（例えば、水和物であるリレンザ（グラクソ社））などのノイラミニダーゼ阻害剤と併用することが好ましい。
【００２６】
併用する場合、RR配列阻害物質とノイラミニダーゼ阻害剤を、同時に投与してもよいが、一方の効果がある時間内であれば、時間的に前後して投与しても問題はない。
【実施例】
【００２７】
（１）GFPタンパク質とRR配列の融合タンパク質（以下、GFP-RR融合タンパク質と称する）の合成
RR配列はH5N1高病原性トリインフルエンザVietnam1203株DNAを用い、下記プライマーを使ってPCRにより増幅した。  
forward: ACCATTggggAATgCCCCAAATATgTgAAATC  （配列番号１０）
reverse: CgACAAgCTTgAATTCTTATCTCTTTTTTCTTCTTCTCTC  （配列番号１１）
この配列とEGFP遺伝子もしくはEGFP遺伝子単体をタンパク発現ベクターpCold-II(Takara)に組み込んだ。EGFPは以下のプライマーで増幅した。  
EGFP primer-F:CgAgggATCCgAATTCAgTAAAggAgAAgAACTTTTCAC  （配列番号１２）
EGFP primer-R:gCATTCCCCAATggTTTTgTATAgTTCATCCATgCCATg  （配列番号１３）
pCold-IIはEcoRIにより切断した。TakaraのキットIn-fusionを用いて、相同性組み換えによってDNAを組み込んだ。GFP-RRに含まれるGFPはRR配列のＮ末端側に融合タンパクとして作成した。この発現ベクターを遺伝子導入用大腸菌Rosseta-Gami (Novagen)に導入し、15℃で48時間培養した。培養した菌液をBugBuster (Novagen)により溶菌後、Ni-Sepharose (GE healthcare)によって精製した。【００２８】
（２）GFP-RR 融合タンパク質の細胞内への侵入
10 μｇのGFP-RR 融合タンパク質またはRR配列を有さないGFPタンパク質を、BHK細胞(1×105cells/ml)の培地（D-MEMに10%FCSを添加した培地とOPTI-MEMを1：9で混合した培地）に添加し、37℃、5% CO2存在下で、3時間インキュベートした。細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、スキムミルクに抗GFP抗体(ポリクローナル、MBL、500倍希釈)を加えたもので30分間、37℃でブロッキングした。続けて0.1%TritonX-100で30分間、室温で処理した後、１次抗体として抗GFP抗体（モノクローナル、MBL、500倍希釈）と30分間、37℃で反応させ、2次抗体としてCy3結合抗マウスIgG抗体（ポリクローナル、Jackson、500倍希釈）と30分間、37℃で反応させることにより免疫染色し、Cy3の蛍光発光を検出することにより、GFP-RR 融合タンパク質が細胞内に侵入するかどうかを調べた。なお、同時に、GFPの蛍光発光を検出するとともに、核をDAPIで染色し、DAPIの蛍光発光を検出した。  
RR配列を有さないGFPタンパク質を用いた場合（図１Ａ）、Cy3およびGFPによる発光が検出されず、このタンパク質が細胞内に侵入しなかった。一方、GFP-RR融合タンパク質を用いた場合（図１Ｂ）、細胞内でCy3およびGFPによる発光が検出され、この融合タンパク質が細胞内に侵入していた。なお、図１Ａ下及び図１Ｂ下の４つの写真で、円形に弱く光っているシグナルがDAPIによる核染色のシグナルであり、図１Ｂ左上、右上、及び右下の３つの写真で、斑点状に明るく光っているシグナルが、GFP-RR融合タンパクのシグナルである。  
このように、RR配列を有するタンパク質は、それだけで細胞内に侵入することができる。【００２９】
（３）ポリクローナル抗体の作製
ウサギに対し合成ペプチド（配列：CTGLRNSPQRERRRRKKR  （配列番号１４））を二週間毎に４回にわたって免疫を行った。初回免疫に600μｇ、二次免疫以降に300μｇのペプチドを背部皮下注射した。アジュバンドとして初回免疫にTiterMax  Gold（フナコシ）、二回目以降に不完全フロイントアジュバンドを各300μｌ用いた。最終免疫から二週間後に全採血を行い、血清をポリクローナル抗体として用いた。【００３０】
（４）モノクローナル抗体の作製
マウスに対し合成ペプチド（配列：CTGLRNSPQRERRRRKKR  （配列番号１４））を二週間毎に４回にわたって免疫を行った。初回免疫に100μｇ、二次免疫以降にも100μｇのペプチドを腹腔内または皮下に注射した。アジュバンドとして初回免疫にTiterMax Gold（フナコシ）、二回目以降に不完全フロイントアジュバンドを各300 μｌ用いた。最終免疫から二週間後にマウスを殺して脾臓を採取し、通常通りモノクローナル抗体を作製した。そして、免疫に使用した上記ペプチドを用いてＥＬＩＳＡでスクリーニングすることにより、上記ペプチドに反応する抗体を得た。【００３１】
（５）ポリクローナル抗体による侵入の阻害
GFP-RR融合タンパク質10μｇに、10 μｌの免疫前あるいは免疫後のウサギ血清を添加し、常温で、3時間インキュベートした。その後、C1C12細胞(1×105個/ml)の培地(D-MEMに10%FCSを添加した培地とOPTI-MEMを1:9で混合した培地)に添加し、37℃、5%CO2存在下で、3時間インキュベートした。
細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、スキムミルクに抗GFP抗体(ポリクローナル、MBL、500倍希釈)を加えた溶液で、30分間、37℃でブロッキングした。続けて0.1%TritonX-100で、30分間、室温で処理した後、1次抗体として抗GFP抗体(モノクローナル、MBL、500倍希釈)と30分間、37℃で反応させ、2次抗体としてCy3結合抗マウスIgG抗体(ポリクローナル、Jackson、500倍希釈)と30分間、37℃で反応させることにより免疫染色し、Cy3の蛍光発光を検出することにより、GFP-RR融合タンパク質が細胞内に侵入するかどうかを、調べた。なお、同時に、核をDAPIで染色した。図２に、染色を観察した蛍光顕微鏡写真(各２視野)を示す。
免疫前のウサギ血清を用いたところ、細胞内でGFPの発現が観察され、融合タンパク質が細胞内に侵入していた(図２下図）。一方、免疫後の抗体を含むウサギ血清を用いたところ、細胞内でGFPの発現が観察されず、融合タンパク質の細胞内への侵入が阻害されていた(図２上図)。なお、図２左カラムの４つの写真で、円形に弱く光っているシグナルがDAPIによる核染色のシグナルであり、図２右下の２つの写真で、斑点状に明るく光っているシグナルが、GFP-RR融合タンパクのシグナルである。【００３２】
このように、RR配列に対する抗体は、RR配列を有するタンパク質が細胞内に入るのを阻害することができるので、RR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質である。
（６）Fabフラグメントによる侵入の阻害
１）Fabフラグメントの作製
まず、免疫後の抗体を含むウサギ血清から、プロテインＧを用いてIgG抗体の精製を行った。具体的には、2mlの血清に18mlのTris-HClバッファー(pH=8.0)を加え、15000rpmで10分間遠心分離を行い、Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare社)と混合した。混合物をオープンカラムに充填し、10mlのPBS/0.1Tween20、20mlのTris-HClバッファー(pH 8.0)、10mlのPBSで順に洗浄を行った後、1mlの100mM Glycin-HCl (pH=3.0)により溶出し、1mlの１M Tris-HCl (pH=9.0)を加えて中和した。【００３３】
そして、得られた精製抗体に対し、Pierce Fab Preparation Kit (Thermo Fisher Scientific社)を用いて、そのプロトコールに従ってFabフラグメントを精製した。具体的には、パパインを用いて精製抗体を切断し、Fcフラグメントと未消化のIgGをプロテインＡに吸着させ、Fabフラグメントを精製した。【００３４】
２）Fabフラグメントによる阻害実験
GFP-RR融合タンパク質10μl（10μg）に、10μlのFabフラグメントを添加し、常温で、3時間インキュベートした。一方、Ｃ１Ｃ１２細胞（1×105個/ml）を準備し、1mlを直径3.5cmの培養皿に播種し、その培地（D-MEMに10%FCSを添加した培地とOPTI-MEMを1：9で混合した培地）に、Fabフラグメントで処理したGFP-RR融合タンパク質を全量（10μg）添加して、37℃、5％CO2存在下で3時間インキュベートした。【００３５】
処理後のＣ１Ｃ１２細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、スキムミルクに抗GFP抗体(ウサギポリクローナル、MBL、500倍希釈)を加えた溶液で、30分間、37℃でブロッキングした。続けて、0.1%TritonX-100で、30分間、室温で処理した後、１次抗体として抗GFP抗体（マウスモノクローナル、MBL、500倍希釈）と30分間、37℃で反応させ、２次抗体としてCy3結合抗マウスIgG抗体（ポリクローナル、Jackson、500倍希釈）と30分間、37℃で反応させることにより免疫染色し、Ｃｙ３の蛍光発光を検出することにより、GFP-RR融合タンパク質が細胞内に侵入するかどうかを、調べた。同時に、核をDAPIで染色した。なお、対象実験として、免疫前のウサギ血清で処理したGFP-RR融合タンパク質を用いた。図３に、染色を観察した際の蛍光顕微鏡写真を示す。【００３６】
図３Ａに示すように、免疫前のウサギ血清で処理したGFP-RR融合タンパク質をＣ１Ｃ１２細胞に投与したところ（対照実験）、細胞内でGFPの発現が観察され、融合タンパク質が細胞内に侵入していた。一方、図３Ｂに示すように、Fabフラグメントで処理したGFP-RR融合タンパク質を用いたところ、細胞内でGFPの発現が観察されず、融合タンパク質の細胞内への侵入が阻害されていた。なお、図３Ａで斑点状に明るく光っているシグナルが、GFP-RR融合タンパクのシグナルであり、図３Ａ及びＢで円形に弱く光っているシグナルがDAPIによる核染色のシグナルである、
このように、RR配列に対する抗体のFabフラグメントでも、RR配列を有するタンパク質が細胞内に入るのを阻害することができるので、RR配列の細胞導入作用を阻害する阻害物質として用いることができる。【００３７】
（７）シアル酸除去細胞への感染実験
ここでは、ノイラミニダーゼ阻害剤投与のモデル系として、シアリダーゼによって細胞表面のシアル酸を除去した細胞に対し、高病原性インフルエンザウイルスを感染させ、RR配列特異的抗体によって、その感染阻害効果を検証した。【００３８】
シアリダーゼとして、ストレプトコッカス（Streptococcus）6646K株から単離されたノイラミニダーゼ（生化学工業）を用い、MDCK細胞（2×105個/ml）に対して0.17U/mlの酵素を培地に添加して、一時間37℃で処理し、細胞表面のシアル酸を除去した。その後、さらに培地にMOI=1のA/Whooper Swan /Hokkaido /2008 (H5N1)高病原性トリインフルエンザウイルスを添加し、細胞に感染させた。なお、インフルエンザウイルスはあらかじめPBSまたは（３）に記載の血清中で、1時間37℃でインキュベーションしたものを用いた。【００３９】
感染8時間後、細胞をPBSで洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド水溶液で固定し、0.1%TritonX-100で、30分間、室温で処理した。そして、1次抗体として抗インフルエンザウイルスNPタンパク抗体（モノクローナル、Millipore社、500倍希釈）と1分間、37℃で反応させ、2次抗体としてCy3結合抗マウスIgG抗体（ポリクローナル、Jackson社、500倍希釈）と30分間、37℃で反応させた後、Cy3の蛍光発光を検出することにより、ウイルスの感染効率を調べた。図４に、染色を観察した蛍光顕微鏡写真を示す。【００４０】
PBSで処理したインフルエンザウイルスは、細胞表面上のシアル酸を除去したにもかかわらず、細胞への侵入が確認された（図４Ａ）。一方、インフルエンザウイルスをRR配列特異的抗体を含む血清で処理した場合、インフルエンザウイルスの細胞への侵入がほとんど検出されなかった（図４Ｂ左図）。なお、細胞の存在を示すため、同時に、核をDAPIで染色した（図４Ｂ右図）。このように、RR配列特異的抗体は、インフルエンザウイルスの細胞への侵入を著しく阻害した。【００４１】
このように、RR配列に対する抗体は、高病原性インフルエンザウイルスがRR配列を利用して細胞に感染することを阻害できるので、インフルエンザウイルス感染阻害剤として有用である。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明によって、インフルエンザウイルス感染阻害剤を提供することができるようになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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