(57)【要約】  正常眼圧緑内障疾患感受性遺伝子及びその利用方法を提供する。  多数の正常眼圧緑内障患者と正常人を対象に全ゲノム上の一塩基多型を網羅的に解析・比較して相違を見出した多型部位の中から、一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249及びrs2763979の多型部位が診断に有効であることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一塩基多型国際番号rs3213787の多型部位の塩基（ヒト第２染色体のSRBD1を含む領域中に存在する配列番号１のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs735860の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のELOVL5を含む領域中に存在する配列番号２のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs4412249の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のGMDSを含む領域中に存在する配列番号３のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs2763979の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のHSPA1Bを含む領域中に存在する配列番号４のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、及びそれらの多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型部位の塩基からなる群より選択される少なくとも１個の多型部位の塩基を同定することを含む、正常眼圧緑内障の検査方法。
【請求項２】
一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249及びrs2763979の多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型が、一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249又はrs2763979の多型と連鎖不平衡にある多型である請求項１記載の方法。
【請求項３】
一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249又はrs2763979の多型と連鎖不平衡にある多型が、一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249又はrs2763979のＬＤブロック内にある多型である請求項２記載の方法。
【請求項４】
下記の(a)及び(b)の成分からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、正常眼圧緑内障の検査をするための試薬。
(a) 一塩基多型国際番号rs3213787の多型部位の塩基（ヒト第２染色体のSRBD1を含む領域中に存在する配列番号１のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs735860の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のELOVL5を含む領域中に存在する配列番号２のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs4412249の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のGMDSを含む領域中に存在する配列番号３のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs2763979の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のHSPA1Bを含む領域中に存在する配列番号４のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、及びそれらの多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型部位の塩基からなる群より選択される少なくとも１個の多型部位の塩基を含む領域を増幅することができるプライマー
(b) 一塩基多型国際番号rs3213787の多型部位の塩基（ヒト第２染色体のSRBD1を含む領域中に存在する配列番号１のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs735860の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のELOVL5を含む領域中に存在する配列番号２のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs4412249の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のGMDSを含む領域中に存在する配列番号３のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs2763979の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のHSPA1Bを含む領域中に存在する配列番号４のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、及びそれらの多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型部位の塩基からなる群より選択される少なくとも１個の多型部位の塩基を含む領域にハイブリダイズすることができるプローブ
【請求項５】
プローブが固相に固定されている請求項４記載の試薬。
【請求項６】
請求項４又は５記載の試薬を含む、正常眼圧緑内障の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常眼圧緑内障疾患感受性遺伝子及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は正常視機能を維持できる健常眼圧以上の眼圧上昇のために、視神経に障害を来す進行性の難治性疾患である。放置すると視野狭窄が進行し、失明することのある疾患で、現在本邦の失明原因の第一位を占めているのにも関わらず、その原因は不明であり正確な診断法、有効な治療法および予防法は存在しない。日本人ではそのなかでも眼圧が正常範囲にあるにも関わらず緑内障を発症する正常眼圧緑内障（NTG）が最も多く、その頻度は40歳以上の約4％である。NTGは眼圧が正常範囲にあるため、眼圧検査では発見することが困難であり、健康診断や通常の眼科検査では見落とされがちである。視神経の障害は回復しないため、NTGにおいては早期発見・早期治療が最も重要であり大切である。しかしながら、その進行は遅く、かつ中心視野は後期に障害を受けるため自覚症状に乏しく、本人も気づかないうちに視神経障害が進行する。【０００３】
正常眼圧緑内障疾患感受性遺伝子の探索はおこなわれているが、未だに疾患と連鎖する遺伝子は発見されていない。いくつかの候補遺伝子解析が進められてきた。緑内障との関連が強く疑われているmyocilin（非特許文献1-15）そしてoptineurin（非特許文献16-30）、optic atrophy 1（非特許文献31-41） 遺伝子の解析がそれぞれ精力的におこなわれてきたがNTGとの関連は明らかではない。また、候補と考えられる遺伝子の解析も進められているが、関連の示唆までにしかいたっていない。【０００４】
中村らは、正常眼圧緑内障の疾患感受性遺伝子の同定を目的とし、SNP（一塩基多型）解析を行い、p＜0.000001の関連を有する遺伝子が17個見つかったことを報告している（非特許文献42）。しかし、生物学上の有意差はｐ＜0.05でありｐ値は関連の有無を判定する指標である。特にSNPを用いて診断を行う際に値の高低が感度、精度だけを示すものではない。例えばGWASで有意差が見られたSNPを単独あるいは組み合わせて同定することで、リスクの高低を示唆できる場合に加えてより多くの患者の確定診断が可能になる場合、また、その疾患に含まれる多様な型を分類できる場合がある。診断により有効なSNPとは患者群と健常者群からなる一集団単位ではなく異なる集団でさらに同様な解析を行った際にも有意な差を認めるＳＮＰである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、正常眼圧緑内障の診断に有効な正常眼圧緑内障疾患感受性遺伝子を見出し、その利用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、正常眼圧緑内障患者集団と正常人集団を対象に全ゲノム上のSNPを網羅的に解析・比較した結果、複数のSNPに相違があり、そのうちの53個のSNPがクラスター解析の結果が良好であることを見出した。さらに、その53個のSNPの中から、正常眼圧緑内障の診断に特に有効な4個のSNPを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成された。【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）一塩基多型国際番号rs3213787の多型部位の塩基（ヒト第２染色体のSRBD1を含む領域中に存在する配列番号１のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs735860の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のELOVL5を含む領域中に存在する配列番号２のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs4412249の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のGMDSを含む領域中に存在する配列番号３のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs2763979の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のHSPA1Bを含む領域中に存在する配列番号４のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、及びそれらの多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型部位の塩基からなる群より選択される少なくとも１個の多型部位の塩基を同定することを含む、正常眼圧緑内障の検査方法。
（２）一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249及びrs2763979の多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型が、一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249又はrs2763979の多型と連鎖不平衡にある多型である（１）記載の方法。
（３）一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249又はrs2763979の多型と連鎖不平衡にある多型が、一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249又はrs2763979と同一のＬＤブロック内にある多型である（２）記載の方法。
（４）
下記の(a)及び(b)の成分からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、正常眼圧緑内障の検査をするための試薬。
(a) 一塩基多型国際番号rs3213787の多型部位の塩基（ヒト第２染色体のSRBD1を含む領域中に存在する配列番号１のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs735860の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のELOVL5を含む領域中に存在する配列番号２のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs4412249の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のGMDSを含む領域中に存在する配列番号３のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs2763979の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のHSPA1Bを含む領域中に存在する配列番号４のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、及びそれらの多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型部位の塩基からなる群より選択される少なくとも１個の多型部位の塩基を含む領域を増幅することができるプライマー
(b) 一塩基多型国際番号rs3213787の多型部位の塩基（ヒト第２染色体のSRBD1を含む領域中に存在する配列番号１のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs735860の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のELOVL5を含む領域中に存在する配列番号２のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs4412249の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のGMDSを含む領域中に存在する配列番号３のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs2763979の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のHSPA1Bを含む領域中に存在する配列番号４のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、及びそれらの多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型部位の塩基からなる群より選択される少なくとも１個の多型部位の塩基を含む領域にハイブリダイズすることができるプローブ
（５）プローブが固相に固定されている（４）記載の試薬。
（６）（４）又は（５）記載の試薬を含む、正常眼圧緑内障の検査キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、正常眼圧緑内障をより正確に診断することが可能となった。既に発症した患者では確定診断が可能となり、積極的な治療をおこなうことが可能となった。また、未発症者では発症の予測が可能となり、検査を頻回に行うことを勧め、早期発見につなげることができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2010‐120758の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００１０】
本発明は、一塩基多型国際番号rs3213787の多型部位の塩基（ヒト第２染色体のSRBD1を含む領域中に存在する配列番号１のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs735860の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のELOVL5を含む領域中に存在する配列番号２のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs4412249の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のGMDSを含む領域中に存在する配列番号３のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs2763979の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のHSPA1Bを含む領域中に存在する配列番号４のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、及びそれらの多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型部位の塩基からなる群より選択される少なくとも１個の多型部位の塩基を同定することを含む、正常眼圧緑内障の検査方法を提供する。
【００１１】
一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249及びrs2763979の多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型は、一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249又はrs2763979の多型と連鎖不平衡にある多型であるとよい。
【００１２】
一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249又はrs2763979の多型と連鎖不平衡にある多型は、一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249又はrs2763979のＬＤブロック内にある多型であるとよい。
【００１３】
本明細書において、一塩基多型(SNP)は、NCBIのSNPデータベースであるdbSNPにおけるreference SNP ID番号であるrs番号で示す。また、塩基の位置はNCBIのゲノムデータベース、build36に基づく。
【００１４】
本明細書において、「正常眼圧緑内障の検査」とは、被検者が正常眼圧緑内障に罹患する可能性が高いか低いかを判定するための検査、すでに被検者が正常眼圧緑内障に罹患している場合にはその確定診断を行うための検査が含まれる。
【００１５】
rs3213787は、ヒト第２染色体上の45500328番目の塩基におけるアデニン(A)/グアニン(G)の多型であり、この部位の塩基がAである場合は、正常眼圧緑内障に罹患する可能性が高い、あるいは正常眼圧緑内障に罹患していると判定される。
rs735860は、ヒト第６染色体上の53231077番目の塩基におけるチミン(T)/シトシン(C)の多型であり、この部位の塩基がCである場合は、正常眼圧緑内障に罹患する可能性が高い、あるいは正常眼圧緑内障に罹患していると判定される。
rs4412249は、ヒト第６染色体上の1947050番目の塩基におけるグアニン(G)/アデニン(A)の多型であり、この部位の塩基がAである場合は、正常眼圧緑内障に罹患する可能性が高い、あるいは正常眼圧緑内障に罹患していると判定される。
rs2763979は、ヒト第６染色体上の31902571番目の塩基におけるシトシン(C)/チミン(T)の多型であり、この部位の塩基がCである場合は、正常眼圧緑内障に罹患する可能性が高い、あるいは正常眼圧緑内障に罹患していると判定される。
同定するSNPは、一種類でもよいし、複数を組み合わせてもよいが、rs3213787又はrs735860のいずれか、あるいはrs3213787とrs735860の両方が含まれることが好ましく、これに加えて、rs4412249及び/又はrs2763979を含んでもよい。また、遺伝子のセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
また、本発明において、同定する塩基は上記のSNPに限定されず、上記のSNPと連鎖不平衡にある多型の部位の塩基であってもよい。
【００１６】
一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249及びrs2763979の多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型としては、後述の表Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満である多型を例示することが出来る。
表Ａは、一塩基多型国際番号rs3213787の存在する遺伝子領域(SRBD1)内にある多型の部位とp値を示す。
（表Ａ）
【００１７】
【表１】
2011148715.tif 000002
（表Ａ）（続き）
【００１８】
【表２】
2011148715.tif 000003
表Ｂは、一塩基多型国際番号rs735860の存在する遺伝子領域(ELOVL5)内にある多型の部位とp値を示す。
（表Ｂ）
【００１９】
【表３】
2011148715.tif 000004
（表Ｂ）（続き）
【００２０】
【表４】
2011148715.tif 000005
表Ｃは、一塩基多型国際番号rs4412249の存在する遺伝子領域(GMDS)内にある多型の部位とp値を示す。
（表Ｃ）
【００２１】
【表５】
2011148715.tif 000006
（表Ｃ）（続き）
【００２２】
【表６】
2011148715.tif 000007
（表Ｃ）（続き）
【００２３】
【表７】
2011148715.tif 000008
（表Ｃ）（続き）
【００２４】
【表８】
2011148715.tif 000009
（表Ｃ）（続き）
【００２５】
【表９】
2011148715.tif 000010
表Ｄは、一塩基多型国際番号rs2763979の存在する遺伝子領域(HSPA1B)内にある多型の部位とp値を示す。
（表Ｄ）
【００２６】
【表１０】
2011148715.tif 000011
（表Ｄ）（続き）
【００２７】
【表１１】
2011148715.tif 000012
SNP間のD'が大きければ連鎖不平衡にあると考えられている(Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2005;21(2):263-265.; Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science. 2002;296(5576):2225-2229.)。従って、一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249又はrs2763979の多型と連鎖不平衡にある多型は、例えば、これらのSNPとの間のD'がより大きい多型である。
【００２８】
LDブロックはHaploviewソフト(Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics. 2005;21(2):263-265.)を用いてGabrielらの方法(Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science. 2002;296(5576):2225-2229.)で決定することができる。
【００２９】
一塩基多型国際番号rs3213787、rs735860、rs4412249及びrs2763979のＬＤブロック内にある多型としては、前述の表Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤで、ボールド太字で表示してあるリードSNP周辺のグレーの帯で示した以下のものを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００３０】
一塩基多型国際番号rs3213787のＬＤブロック内にある多型：rs11888802、rs11678872、rs2343468、rs13003019、rs6760244、rs12471726、rs2081297、rs10460504、rs7562458、rs4953230、rs4952763、rs6719211、rs1014454、rs3755070、rs3213787、rs10210691、rs3770251、rs4455206、rs3755076、rs3770254、rs11125017、rs3770264、rs10205197、rs10427308、rs17033745、rs3770278、rs17322370、rs6736954、rs10427402、rs4476395、rs13023749、rs17033801、rs755652、rs748573、rs6708810、rs6710581、rs12712945、rs17033871、rs3755082、rs6544840、rs7599740、rs11884064、rs7596942及びrs7565326
一塩基多型国際番号rs735860のＬＤブロック内にある多型：rs2562898、rs735860、rs715441、rs2057024、rs1429146、rs9463895、rs2235723、rs1346603、rs9474476、rs2294867、rs9349660、rs974323、rs6909592、rs9367520、rs9395854、rs209485、rs9395856、rs7747926、rs7738788、rs209500、rs9357760、rs9370196、rs209512、rs209517及びrs9370201
一塩基多型国際番号rs4412249のＬＤブロック内にある多型：rs7772545、rs6596866、rs4959621、rs4412249、rs4367413、rs11242729、rs6925298、rs12212324、rs9392353、rs11242730、rs4580917、rs6910252、rs11242733、rs9503080、rs11242735、rs476594、rs9378676、rs676015、rs2026446及びrs4959631
一塩基多型国際番号rs2763979のＬＤブロック内にある多型：rs707918、rs805292、rs2299851、rs707939、rs707937、rs480092、rs2075800、rs2763979及びrs11965547
【００３１】
本発明の検査方法における「多型部位」は、遺伝子のＯＲＦ中、遺伝子の発現を制御する領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域等）中、遺伝子のイントロン中、あるいはこれら遺伝子と連鎖不平衡にあるその前後の領域に存在しうる。多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基（時には数千塩基）が置換、欠失、挿入、転移あるいは逆位している多型などが挙げられるが、これらに特に限定されない。
【００３２】
本発明の検査方法において、多型部位の塩基の同定（すなわち、塩基種の決定）は、公知の一塩基多型解析方法によって行うことができる。一塩基多型解析方法としては、シークエンス解析、PCR、PCR-SSCP、ハイブリダイゼーション、HRM法、RFLP法などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００３３】
多型部位の塩基を同定するために、被検者の生体試料からゲノムＤＮＡを抽出するとよい。生体試料は、例えば、被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、手術により採取あるいは切除した組織または細胞、検査等の目的で採取された体液（唾液、リンパ液、気道粘膜、精液、汗、尿など）等である。生体試料としては、末梢血から分離した白血球又は単核球が好ましい。市販のDNA抽出キットを用いて、生体試料からゲノムＤＮＡを抽出することができる。次いで、必要に応じて、多型部位を含むDNAを単離する。該DNAの単離は、多型部位を含むDNAにハイブリダイズすることができるプライマーを用いて、ゲノムDNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって行うことができる。
【００３４】
また、本発明は、下記の(a)及び(b)の成分からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、正常眼圧緑内障の検査をするための試薬を提供する。
(a) 一塩基多型国際番号rs3213787の多型部位の塩基（ヒト第２染色体のSRBD1を含む領域中に存在する配列番号１のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs735860の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のELOVL5を含む領域中に存在する配列番号２のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs4412249の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のGMDSを含む領域中に存在する配列番号３のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs2763979の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のHSPA1Bを含む領域中に存在する配列番号４のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、及びそれらの多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型部位の塩基からなる群より選択される少なくとも１個の多型部位の塩基を含む領域を増幅することができるプライマー
(b) 一塩基多型国際番号rs3213787の多型部位の塩基（ヒト第２染色体のSRBD1を含む領域中に存在する配列番号１のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs735860の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のELOVL5を含む領域中に存在する配列番号２のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs4412249の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のGMDSを含む領域中に存在する配列番号３のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、一塩基多型国際番号rs2763979の多型部位の塩基（ヒト第６染色体のHSPA1Bを含む領域中に存在する配列番号４のヌクレオチド配列における501番目の塩基）、及びそれらの多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型部位の塩基からなる群より選択される少なくとも１個の多型部位の塩基を含む領域にハイブリダイズすることができるプローブ
一塩基多型国際番号rs3213787の多型部位、一塩基多型国際番号rs735860の多型部位、一塩基多型国際番号rs4412249の多型部位、一塩基多型国際番号rs2763979の多型部位、及びそれらの多型部位が存在する遺伝子領域内にあるp値（正常眼圧緑内障患者と健常者間での有意差の指標）が0.05未満の他の多型部位は、上記の通りである。
さらにまた、本発明は、上記の試薬を含む、正常眼圧緑内障の検査キットを提供する。
【００３５】
本発明の試薬の成分であるプライマー及びプローブは、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドであるとよい。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、上記多型部位を含むDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。プライマーが増幅することができるDNAの長さは、通常、１５〜１０００ｂｐ、好ましくは、２０〜５００ｂｐ、より好ましくは２０〜２００ｂｐである。また、該オリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合、その長さは、通常7bp〜500bpであり、好ましくは8bp〜500bpである。プローブは、上記多型部位を含むDNAとハイブリダイズしうるものであれば、特に制限されない。プローブがハイブリダイズできるＤＮＡの長さは、通常、１６〜５００ｂｐ、好ましくは、２０〜２００ｂｐ、より好ましくは２０〜５０ｂｐである。
【００３６】
本発明において、多型部位を含む領域を増幅することができるプライマーは、多型部位を含むDNAを鋳型として、多型部位に向かって相補鎖合成を開始することができるものであるとよい。
【００３７】
プライマーには、多型部位を含む領域の塩基配列に相補的な塩基配列に加え、任意の塩基配列を付加することができる。例えば、IIs型の制限酵素を利用した多型の解析方法のためのプライマーにおいては、IIs型制限酵素の認識配列を付加したプライマーが利用される。更に、プライマーは修飾してもよい。例えば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーを利用してもよい。
【００３８】
本発明において、多型部位を含む領域にハイブリダイズすることができるプローブは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるものであればよく、多型部位を含む領域の塩基配列を有するDNAに特異的にハイブリダイズするものが好ましい。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、多型部位を含む領域の塩基配列を有するDNA以外のDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブが好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。従って、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。
【００３９】
プローブには、プライマーと同様に、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。例えば、Invader法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、ゲノムにおける本発明の多型部位の周辺DNA領域の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。
【００４０】
当業者であれば、多型部位を含む周辺DNA領域についての塩基配列情報を基に、解析手法に応じたプライマー及びプローブをデザインすることができる。プライマー及びプローブを構成する塩基配列は、ゲノムの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列のみならず、適宜改変することができる。
【００４１】
プライマー及びプローブは、それを構成する塩基配列をもとに、任意の方法によって合成することができる。与えられた塩基配列に基づいて、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する手法は公知である。更に、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、オリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することもできる。あるいは、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。
【００４２】
プローブは、固相に固定されていてもよい（ＤＮＡアレイ）。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNA（あるいはRNA）をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、例えば、多数の多型部位について同時に解析するには、DNAアレイは有用である。ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常in situで合成される。例えば、リソグラフィー方式（Affymetrix社）、インクジェット方式(Agilent社)、ビーズアレイ方式(Illumina社)等によるオリゴヌクレオチドのin situ合成法が知られている。
【００４３】
オリゴヌクレオチドは、検出すべき多型部位を含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ｂｐであり、好ましくは10〜50ｂｐであり、さらに好ましくは15〜25ｂｐである。
【００４４】
DNAアレイ法によるSNP検出のための試料は、被検者から採取された生体試料をもとに当業者に周知の方法で調製することができる。生体試料は特に限定されない。例えば被検者の末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪から抽出したゲノムDNAから、DNA試料を調製することができる。判定すべき多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーを用いて、ゲノムDNAの特定の領域が増幅される。このとき、マルチプレックスPCR法によって複数の領域を同時に増幅することができる。マルチプレックスPCR法とは、複数組のプライマーセットを、同じ反応液中で用いるPCR法である。複数の多型部位を解析するときには、マルチプレックスPCR法が有用である。
【００４５】
一般にDNAアレイ法においては、PCR法によってDNA試料を増幅するとともに、増幅産物が標識される。増幅産物の標識には、標識を付したプライマーが利用される。例えば、まず多型部位を含む領域に特異的なプライマーセットによるPCR法でゲノムDNAを増幅する。次に、ビオチンラベルしたプライマーを使ったラベリングPCR法によって、ビオチンラベルされたDNAを合成する。こうして合成されたビオチンラベルDNAを、チップ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、固相に固定するヌクレオチドプローブの長さや反応温度等の条件に応じて、適宜調整することができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーションの条件をデザインすることができる。ハイブリダイズしたDNAを検出するために、蛍光色素で標識したアビジンが添加される。アレイをスキャナで解析し、蛍光を指標としてハイブリダイズの有無を確認する。
【００４６】
ＤＮＡアレイ法を用いて本発明の検査方法を実施する手順の一例を示せば、被検者から調製した多型部位を含むDNA及びヌクレオチドプローブが固定された固相を用意した後、該DNAと該固相を接触させる。次いで、固相に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたDNAを検出することにより、多型部位の塩基種を決定する。
【００４７】
本明細書において「固相」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な材料を意味する。固相は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、具体的には、マイクロプレートウェル、プラスチックビーズ、磁性粒子、基板などを含む固相等を例示することができる。固相としては、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。本明細書において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。また、本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。
【００４８】
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。アレル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)は、検出すべき多型部位が存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ASOを試料DNAにハイブリダイズさせるとき、多型によって多型部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。
【００４９】
本発明の試薬およびキットには、塩基の同定方法に応じて、各種の酵素、酵素基質、および緩衝液などを含めることができる。酵素としては、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、あるいはIIs制限酵素などの、上記の塩基同定方法として例示した各種の解析方法に必要な酵素を示すことができる。緩衝液は、これらの解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液が、適宜選択される。更に、酵素基質としては、例えば、相補鎖合成用の基質等が用いられる。
【００５０】
さらに、本発明の試薬およびキットには、多型部位における塩基が明らかな対照を添付することができる。対照としては、予め多型部位の塩基種が明らかなゲノムDNA、あるいはゲノムDNAの断片を用いることができる。ゲノムDNAは、細胞から抽出されたものを対照として添付してもよいし、あるいは、細胞又は細胞の分画を対照として添付しておき、そこから使用者がゲノムDNAを抽出してもよい。細胞を対照として用いれば、対照の結果によってゲノムDNAの抽出操作が正しく行われたことを証明することができる。あるいは、多型部位を含む塩基配列からなるDNAを対照として用いることもできる。具体的には、多型部位における塩基種が明らかにされたゲノム由来のDNAを含むYACベクターやBACベクターを対照として用いてもよい。あるいは多型部位に相当する数十から数百ｂｐのみを切り出して挿入したベクターを対照として用いることもできる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５２】
〔実施例１〕
NTG患者および健常者の検体は横浜市立大学医学部、倫理委員会の許可のもと当該施設を中心として、年齢、眼圧、屈折異常など厳密なクライテリアを満たしたNTG患者血液白血球を収集した。【００５３】
NTGの診断基準は日本緑内障学会の基準にしたがった。【００５４】
primaryとして患者305名、健常者355名を対象とし53遺伝子領域に絞り込んだ。続くreplicationとして異なる患者214名、健常者257名を対象とし高い有効性が期待される４SNPを同定した。表にはこれら４遺伝子を示し、primaryとreplicationそれぞれの結果に加え全検体を（overall）対象に計算した値を示した。【００５５】
ジェノタイピングは、GeneChip Human Mapping 500K Array Set (Affymetrix)を使用し、Affymetrix社が推奨する標準的プロトコールに従って実施した。
統計解析を含むGWASの解析はHelixtree SVS 7 (Golden Herix. Inc. 米国モンタナ州ボーズマン)、およびHaploview v4.1を用いた。
標的位置のLD構造の推測にもHaploview v4.1を用いた。
結果を下記の表に示す。rs3213787、rs735860、rs4412249及びrs2763979は、GWAS及びReplication共に、NTGと顕著な相関を示しており、NTGの診断に有効なSNPであることが実証された。【００５６】
【表１２】
2011148715.tif 000013
患者および健常者の数を増やした新たな結果（上記のデータに患者46名および健常者46名のデータを追加）を下記の表に示す。追加の患者および健常者でも同様のアリル頻度の傾向を示した。
【表１３】
2011148715.tif 000014
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、生命科学、医学、眼科学及び診断に利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
＜配列番号１＞
配列番号１は、rs3213787の多型部位を501番目(r=A/G)に含む1000塩基長の塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、rs735860の多型部位を501番目(y=C/T)に含む1000塩基長の塩基配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、rs4412249の多型部位を501番目(r=A/G)に含む1000塩基長の塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、rs2763979の多型部位を501番目(y=C/T)に含む1000塩基長の塩基配列を示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００５９】
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