(57)【要約】  環境微生物の捕集効率の優れた微生物培養シートと捕集効率に優れる環境微生物の測定方法を提供する。  基材シートと前記基材シートの上に形成された乾燥培養層と、前記乾燥培養層を被覆するカバーシートとからなる微生物培養シートであり、前記カバーシートは、内面に粘着層と剥離フィルムとが積層されたことを特徴とする微生物培養シートである。粘着層により環境微生物を捕集するため、捕集効率に優れる。
2011093342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材シートと前記基材シートの上に形成された乾燥培養層と、前記乾燥培養層を被覆するカバーシートとからなる微生物培養シートであり、前記カバーシートは、内面に粘着層と剥離フィルムとが積層されたものである、微生物培養シート。
【請求項２】
前記粘着層の厚みは１〜１００μｍであることを特徴とする請求項１記載の微生物培養シート。
【請求項３】
前記乾燥培養層は、前記基材シートに、ゲル化剤を含有する培地液をパターン形成したものである、請求項１記載の微生物培養シート。
【請求項４】
前記基材シートは、前記乾燥培養層の外周に疎水性樹脂からなる枠層を有することを特徴とする、請求項１または２記載の微生物培養シート。
【請求項５】
前記枠層は、前記乾燥培養層の高さより、１００〜１２００μｍ高いことを特徴とする、請求項４記載の微生物培養シート。
【請求項６】
前記基材シートおよび／またはカバーシートは、透明プラスチックシートからなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の微生物培養シート。
【請求項７】
請求項１の微生物培養シートと、前記乾燥培養層中に含まれていない菌の培養を可能にする成分や発色指示薬、選択剤などを含有するゲル化溶液とからなる、微生物培養キット。
【請求項８】
請求項７記載の微生物培養キットの粘着層に捕集した菌の培養方法であって、
前記粘着層に菌を捕集する工程と、
前記ゲル化溶液を添加してカバーシートの粘着層を乾燥培養層に被せ乾燥培養層をゲル化する工程と、
ゲル化完了後培養することを特徴とする、菌の培養方法。
【請求項９】
前記菌の捕集方法が、前記粘着層を被験面に接触させて菌を捕集する方法である、請求項８記載の菌の培養方法。
【請求項１０】
前記菌の捕集方法が、前記粘着層を所定時間解放状態とし落下菌を捕集する方法である、請求項８記載の菌の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カバーシートの粘着層によって固形状の被験面や空中に浮遊する微生物を優れた捕集率で捕集することができる微生物培養シート、ならびに、前記微生物培養シートと乾燥培養層のゲル化溶液とからなる、微生物培養キットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の存在を確認し、または微生物数を測定する方法として、寒天平板混釈法があり、予め滅菌したシャーレに形成した寒天培地が使用される。また、食品や医薬品の製造設備の衛生管理などの目的で、調理器具、容器などの表面に付着した細菌の検出方法としてスタンプ法が知られている。このスタンプ法は、寒天培地等を試験対象物に直接付着させてその表面に存在する細菌を検出する方法であり、細菌を採取した後でそのまま培養できるように、細菌が増殖可能な栄養素を含む水溶液をスタンプ状に固形化したスタンプ培地が用いられている。スタンプ培地は、被検査対象物に押し当てることを考慮して、寒天培地等を満たしたシャーレ本体に蓋体を取外し可能に取り付けたものが使用されている。これらのシャーレ本体と蓋体はいずれもポリプロピレン等のプラスチック成形品からなり、シャーレ本体は角形や丸形をした基板に円形状の凹部を突出形成した形状をしており、蓋体はシャーレ本体の凹部の外周に取外し可能に嵌着する形状になっている。そして、シャーレ本体の円形凹部に寒天培地等を充填し、それに蓋体を被せられかつ内部が滅菌状態にされている（特許文献１）。【０００３】
また、食品や医薬品の製造設備の衛生管理などの目的で、濃度２．５％以上の含水寒天培地の上面を被覆するカバーシートの面に粘着層を形成した微生物検出用デバイスがある(特許文献２)。微生物を捕集した粘着シート等を固形培地に積層して微生物を培養すると、検出される微生物数が固形培地の滲出液量に応じて変動するという問題に鑑みてなされたものである。濃度２．５％以上の含水寒天培地を使用することで固形培地に含まれる滲出液による微生物の移動を抑制し、検出される微生物数の変動を抑制できる、という。【０００４】
一方、希釈液を収容する容器本体と、この容器本体の開口部を密栓する着脱可能に装着されるキャップと、このキャップに固定または一体化された綿棒軸と、この綿棒軸の先端に取り付けられてキャップ密栓状態において希釈液中に浸漬される綿球とを有してなる拭き取り検査キットであって、上記キャップに延長棒を取り付け可能であることを特徴とする、拭き取り検査キットがある（特許文献３）。拭き取り検査法は、滅菌済みのリン酸緩衝生理食塩水などで湿らせて滅菌した綿棒などを用いて検査対象の器具などの表面を拭いた後に、これを収納ビンにいれ、試料検液とするものであるが、キャップに延長棒を取り付けることで拭き取りを容易にすることができる、という。【０００５】
また、被験面の微生物を繊維層で拭き取り捕集した後に、水溶性高分子化合物層で培養する検査方法も存在する（特許文献４）。被検査対象物表面を拭き取った繊維層を、水溶性高分子化合物層を上層に有する培地に載せるか、または張り付けて培養を行い、微生物の存在を確認することを特徴とする、微生物の拭き取り検査方法である。含水マトリックスと水溶性高分子化合物層とからなる微生物培地の前記含水マトリックス層を検査対象に直接接触させて菌を採取する方法では、培地成分などが検査対象に付着するなどの問題点に鑑みてなされたものであり、繊維層と水溶性高分子化合物層とを分離し、前記繊維層で検査対象物を拭き取り、その後に、この繊維層を水溶性高分子化合物層で培養する、というものである。
また、空中浮遊菌用のエアーサンプラーが各社より販売されているが、清浄な環境の場合サンプリング時間を長くとらねばならず、長時間シャーレを解放しておくと培地の水分が減ってヒビが入ったり乾燥し、菌の発育に影響を与える場合がある（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２７８７７２号公報
【特許文献２】特開２００６−２３０３１５号公報
【特許文献３】特開２００８−１０１９７１号公報
【特許文献４】特開２００１−３３３７９６号公報
【特許文献５】特開２０００−３０４６６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載する、寒天培地をスタンプ用培地として使用する方法は、被検査部位に直接寒天培地を接触する必要があるため、被検査部位を培地成分や水分で汚染し、接触部位が菌の温床となる場合がある。このような培地の残存を回避するには菌捕集後の洗浄が必要となり、操作が煩雑となる。また、寒天培地を被検査部位に接触して菌を捕集する方法では、微生物の捕集率が低く、被検査部位に付着している菌の５０％も捕集することができない。特に、白衣などの布を被検査部位とする場合には、布に培地成分と水分が吸収され、白衣を汚染するとともに布に付着している菌の捕集効率がさらに低減する場合がある。
更に、特許文献１、特許文献２では、培地成分として寒天培地を使用しているが、寒天は、１００℃前後の加熱でゾル化し、４５〜５０℃付近でゲル化するものであり、ゲル化物から凝固水が滲出しやすい。このため、鞭毛を有する菌の培養などに寒天培地を使用する場合には、凝固水によって菌が遊走し、コロニーが見にくくなる場合がある。また、寒天には、不飽和脂肪酸が含まれ、不飽和脂肪酸の作用に鋭敏な菌の培養には適しない。
また、寒天にカバーシートの粘着層を被せた場合、付着異物によって気泡の混入もし易く視認性が悪くなる場合がある。
更に、特許文献３による拭き取り法は、容器の中に希釈液とともに綿棒がセットされ、前記希釈液に浸漬された綿球で検査対象物を拭き取った後に、綿球を容器に回収するものであるが、捕集した菌を含む希釈液の一部のみがシャーレなどの検査容器内に分注されて培養に供されるため、一般に微生物の培養固体数が低減する。また、希釈液に浸漬した綿球を検査対象物に直接接触させるため、検査対象物を汚染する場合がある。
更に、特許文献４の測定方法も、拭き取りの際に湿潤した繊維層を使用する点で特許文献３と共通するものであり、含水繊維層が直接接触させるため、検査対象物を汚染する場合があり、特許文献１記載のスタンプ培地同様に検査対象物が吸水物の場合には、検体対象に水分が吸収され、検査対象に付着している菌の捕集効率がさらに低減する場合がある。【０００８】
一方、微生物培養シートは、検体を簡便に採取して処理でき、かつコンパクトであることが好ましい。特許文献１記載のスタンプ用培地は、含水寒天培地を使用するため所定の厚みが必要となる。なお、寒天は冷水可溶粉末や水溶性高分子化合物でなく、乾燥培地を調製することは困難である。したがって、乾燥培養層を使用したコンパクトなシート状物の開発が望まれる。
また、特許文献３は希釈液で含水した綿球で、特許文献４は滅菌水などで含水した繊維層で菌を捕集した後に他の培地で菌を培養するものであるが、食品や医薬品の製造装置の衛生管理などの目的で菌を捕集する際にカバーシートの粘着層で菌を捕集できれば、含水物によって菌を捕集する場合に生ずる被験面の汚染を回避することができる。また、乾燥培養層を使用し、培養時にゲル化溶液を投与することで含水培養層に調製できれば、使用前の保存が容易で、かつ軽量化できる。更に、空気中の微生物検査には従来、寒天培地による落下菌法や衝突法が実施されているが、長時間捕集しようとすると寒天から水分が蒸発し菌の生育に影響がでるため清浄度のある室内の検査には高価なメンブランフィルター等を使用せざるを得ない状況であった。【０００９】
本発明は、上記問題点に鑑みて、被験面からの微生物の捕集が容易で、捕集した菌を培養しうる乾燥培養層を有し、高精度に微生物を検出することができ、空気中の微生物検査においては捕集時間が長時間でも培養可能でコンパクトな微生物培養シートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、微生物培養シートについて詳細に検討した結果、カバーシートの内面に粘着層と剥離フィルムとを積層すれば、剥離フィルムを剥離して粘着層を被験面と接触させることで捕集率高く微生物を捕集できること、検査対象微生物用組成の乾燥培養層に、例えば生理食塩水や滅菌精製水などのゲル化溶液を滴下した後にカバーシートを被覆することで当該培養層で検査対象微生物を培養しうること、更に、検査部位を培地成分で汚染することも水分を与えることも無いため、接触部位の清浄性を保つことができ、かつカバーシートの粘着層と培養層とをゲル化溶液を介して接触させることで気泡の混入を防ぎ、寒天培地よりも格段と高い視認性を確保しうることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は、基材シートと前記基材シートの上に形成された乾燥培養層と、前記乾燥培養層を被覆するカバーシートとからなる微生物培養シートであり、前記カバーシートは、内面に粘着層と剥離フィルムとが積層されたものである、微生物培養シートを提供するものである。
また、基材シートと前記基材シートの上に形成された乾燥培養層と、前記乾燥培養層を被覆するカバーシートとからなり、前記カバーシートは、内面に粘着層と剥離フィルムとが積層された微生物培養シートと、前記乾燥培養層のゲル化溶液とからなる、微生物培養キットを提供するものである。
また、前記微生物培養キットの粘着層に捕集した菌の培養方法であって、前記粘着層に菌を捕集する工程と、前記ゲル化溶液を添加してカバーシートの粘着層を乾燥培養層に被せ乾燥培養層をゲル化する工程と、ゲル化完了後培養することを特徴とする、菌の培養方法を提供するものである。
また、空気中の微生物検査には剥離フィルムを剥がしてカバーシートの粘着層を上にしてシャーレの底面に貼り付けエアーサンプラーにセットし、所定の時間サンプリン後、前記ゲル化溶液を添加してカバーシートの粘着層を乾燥培養層に被せ乾燥培養層をゲル化する工程と、ゲル化完了後培養することを特徴とする、菌の培養方法を提供するものである。エアーサンプラーを使用しない落下菌測定を行う場合はカバーシートの粘着層を上にして所定時間放置後上記操作を行えばよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、カバーシートの内面に形成した粘着層を被験面に接触するだけで容易に定量的に微生物を捕集することができ、使用が簡便である。しかも、水分のほとんど無い粘着層を使用するため、被験面を汚染することがない。
本発明によれば、特許文献３のようにふき取り１０ｍＬの希釈液を１ｍＬ取って計測する検査法よりもより的確にその部位の菌を計測できる。
本発明によれば、乾燥培養層にゲル化溶液を滴下したのち、菌を捕集したカバーシートの粘着層を被覆するとゲル化溶液が粘着層へぬれ広がることから気泡の混入が少なく、気泡による視認性低下がなく、菌と菌以外のゴミや気泡などとの区別が明確で、視認性が向上するため高精度に微生物を検出することができる。
本発明によれば、粘着層によって空気中の微生物も捕集できるため、従来の寒天培地による落下菌法や衝突法にて問題となる培地が乾燥するという欠点を解消でき好適に使用することができる。
本発明によれば、基材シートに枠層が形成される場合には、生理食塩水などのゲル化溶液を投与しても枠層が崩れず安定しており、作業の操作性および安定性に優れる。
本発明の微生物培養シートは、基材シートとカバーシートとを透明素材で調製することができ、背面、側面からの入射光によって微生物コロニーを計測することができ、使用方法の選択幅を広げることができる。
また、本発明の微生物培養シートは、乾燥培養層を被覆するカバーシートを有するため、培養操作中の落下菌などによる汚染を防止することができ、同時にゲル化溶液投与後の乾燥培養層の水分の蒸発を防止することができる。
更に、本発明によればコンパクト性は明らかであり使用後の廃棄物の低減にも寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に係る、基材シート、乾燥培養層およびカバーシートとからなる微生物培養シートの一例を示す平面図（ａ）、Ａ−Ａ’線断面図（ｂ）およびＢ−Ｂ’線断面図（ｃ）であり、カバーシート（４０）は、前記乾燥培養層（３０）と対向する内面に粘着層（４３）が積層され、更に前記粘着層（４３）は、剥離フィルム（４５）で被覆され、基材シートの略中央に円形の培養層が形成される態様を示す図である。
【図２】本発明に係る、基材シート、乾燥培養層およびカバーシートとからなる微生物培養シートの一例を示す断面図であり、図２（ａ）は、基材シートが多層構造である態様を示し、図２（ｂ）は、乾燥培養層が多層構造である態様を示す図である。
【図３】本発明に係る、基材シート、乾燥培養層、枠層およびカバーシートとからなる微生物培養シートの一例を示す平面図（ａ）、Ａ−Ａ’線断面図（ｂ）およびＢ−Ｂ’線断面図（ｃ）であり、方形の基材シート（１０）の略中央に乾燥培養層（３０）が形成され、カバーシート（４０）は、前記乾燥培養層（３０）と対向する内面に粘着層（４３）が積層され、更に前記粘着層（４３）は、剥離フィルム（４５）で被覆され、かつ前記乾燥培養層（３０）の外周に枠層（２０）とが形成され、これらを被覆するように、方形のカバーシート（４０）が設けられている態様を示す図である。
【図４】本発明に係る、基材シート、乾燥培養層、枠層および、粘着層と剥離フィルムとがカバーシートとからなる微生物培養シートの一例を示す断面図であり、図４（ａ）は、基材シートが多層構造である態様を示し、図４（ｂ）は、乾燥培養層が多層構造である態様を示す図である。
【図５】本発明に係る、基材シート、乾燥培養層および、粘着層と剥離フィルムとが積層されたカバーシートとからなる微生物培養シートの製造方法を説明する図であって、基材シートとカバーシートとを連設させ、基材シートの上に乾燥培養層とを形成し、カバーシートに粘着層と剥離フィルムとを積層し、ついでカバーシートを折り曲げて微生物培養シートを形成する態様を示す平面図（ａ）および断面図（ｂ）、（ｃ）である。
【図６】本発明に係る、基材シート、乾燥培養層および、粘着層と剥離フィルムとが積層されたカバーシートとからなる微生物培養シートであって、乾燥培養層を形成した基材シートが、両面テープ（５０）によってカバーシートに固設された態様の断面図である。
【図７】本発明に係る、基材シート、乾燥培養層および、粘着層と剥離フィルムとが積層されたカバーシートとからなる微生物培養シートであって、基材シートの全面に乾燥培養層が形成され、かつ両面テープ（５０）によって基材シートにカバーシートが固設された態様の断面図である。
【図８】本発明に係る、基材シート、乾燥培養層およびカバーシートとからなる微生物培養シートの外観斜視図である。
【図９】実施例１で検出したコロニーを示す図である。
【図１０】比較例２で検出したコロニーを示す図である。
【図１１】実施例４で検出したコロニーを示す図である。
【図１２】比較例３で検出したコロニーを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第一は、基材シートと前記基材シートの上に形成された乾燥培養層と、前記乾燥培養層を被覆するカバーシートとからなる微生物培養シートであって、前記カバーシートは、内面に粘着層と剥離フィルムとが積層された、微生物培養シートである。
カバーシートに粘着層と剥離フィルムとが積層されるため、剥離フィルムを剥離して粘着層を被験面と接触させて容易に微生物を定量的に捕集でき、しかも培養層が乾燥培養層で形成されるため、コンパクトで保存安定性に優れる。基材シートの上に枠層を形成し、その内側に乾燥培養層を形成するものであってもよい。枠層を基材シートの上に形成すると、枠層が疎水性樹脂で製造されることとあいまって、生理食塩水などのゲル化溶液の投与によっても枠層が崩れず、安定して作業を行うことができる。乾燥培養層は、前記基材シートにパターン形成されていても良く、カバーシートの粘着層そしてゲル化溶液と乾燥培養層を組み合わせることにより気泡の混入を防いで培養可能とし、培養後の視認性が向上する。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
（１）微生物培養シートの構成
本発明の微生物培養シートの好適な態様の一例を図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示す。図１（ａ）は平面図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ’線断面図であり、図１（ｃ）は、図１（ａ）のＢ−Ｂ’線断面図である。
図１は、長方形の基材シート（１０）の略中央に乾燥培養層（３０）が形成され、かつ前記乾燥培養層（３０）を被覆するように、長方形のカバーシート（４０）が設けられている態様を示す。前記カバーシート（４０）は、前記乾燥培養層（３０）と対向する内面に粘着層（４３）が積層され、更に前記粘着層（４３）は、剥離フィルム（４５）で被覆されている。なお、図１（ｃ）に示すように、前記カバーシート（４０）は、粘着層（４３）を介して基材シート(１０)に固定されている。
本発明では、基材シート（１０）に乾燥培養層（３０）がパターン形成されていてもよい。図２（ａ）の断面図に示すように、基材シート（１０）が基材シート（１１）と基材シート（１３）の２層からなる多層シートであってもよく、更に、プラスチック以外の他の層を積層する多層シートであってもよい。また、図２（ｂ）に示すように、乾燥培養層（３０）が２層以上の多層で構成されるものであってもよい。なお、パターン形成で調製された乾燥培養層（３０）の形状は、図１に示す円形に限定されるものではなく、正方形、長方形、その他の多角形、不定形であってもよい。この点は、基材シート（１０）の形状も同様である。
また、本発明の微生物培養シートは、図３に示すように、基材シート（１０）の上に枠層（２０）を形成し、その内側に乾燥培養層(３０)が形成されるものであってもよい。乾燥培養層（３０）の外周に枠層（２０）を形成することで、生理食塩水などのゲル化溶液を所定の範囲に限定でき、かつゲル化溶液の遺漏を防止することができる。従って、枠層（２０）の外側には、乾燥培養層が存在する必要がない。このような枠層(２０)を有する微生物培養シートの好適な態様の一例を図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示す。図３（ａ）は平面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）のＡ−Ａ’線断面図であり、図３（ｃ）は、図３（ａ）のＢ−Ｂ’線断面図である。
図３に、長方形の基材シート（１０）の略中央に乾燥培養層（３０）が形成され、かつ前記乾燥培養層（３０）の外周に枠層（２０）が形成され、これらを被覆するように、長方形のカバーシート（４０）が設けられている態様を示す。前記カバーシート（４０）は、前記乾燥培養層（３０）と対向する内面に粘着層（４３）が積層され、更に前記粘着層（４３）は、剥離フィルム（４５）で被覆されている。基材シート(１０)の上に直接乾燥培養層（３０）を形成し、かつ枠層（２０）を疎水性樹脂で調製することで、乾燥培養層（３０）にゲル化溶液を投与した場合でも枠層（２０）がゲル化溶液によって崩れることがない。
また、枠層（２０）の形成により枠層（２０）で囲まれた乾燥培養層（３０）の上にゲル化溶液を滴下し、カバーシート（４０）を降ろしてカバーシート（４０）の粘着層（４３）を被覆するだけでゲル化溶液を枠層（２０）内の乾燥培養層（３０）の領域全体に均一に広げることができ、特別な器具を使用することなく操作性に優れる。
本発明では、基材シート（１０）に枠層が疎水性樹脂で形成されることが好ましい。このため、図４（ａ）の断面図に示すように、基材シート（１０）が基材シート（１１）と基材シート（１３）の多層シートで構成されるものであってもよく、更に、プラスチック以外の他の層を積層するものであってもよい。また、前記図４（ｂ）に示すように、乾燥培養層（３０）が２層以上の多層で構成されるものであってもよい。なお、本発明では、好ましくは疎水性樹脂からなる枠層は、基材シート（１０）の表面に形成され、基材シート（１０）と枠層との間には、乾燥培養層（３０）は存在しない。これにより、疎水性樹脂からなる枠層を安定して基材シート（１０）の上に形成することができ、かつ培地材料の無駄を回避することができる。本発明では前記乾燥培養層（３０）の等価円の直径は、２０〜８０ｍｍ、より好ましくは３０〜７０ｍｍである。微生物培養シートに滴下するゲル化溶液は一般に１ｍｌであり、上記範囲で十分にゲル化溶液を吸水することができる。
また、一般には枠層（２０）の高さは、乾燥培養層の高さより１００〜１２００μｍ高く、好ましくは２００〜１０００μｍ、より好ましくは３００〜８００μｍに調製される。上記範囲であれば、ゲル化溶液を乾燥培養層（３０）に投与するとゲル化溶液が遺漏したり空隙を作ることなく枠層（２０）まで速やかに拡散され、ゲル化溶液の乾燥培養層による吸水を待たずに直ちにカバーシート（４０）を被覆することができ、作業効率を向上することできる。
また、枠層の幅は、均一幅に限定されるものではないが、最細部が幅０．５〜５．０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは１．０〜３．０ｍｍである。上記範囲でカバーシートとの密着性に優れるからである。
なお、本発明では、基材シートに、乾燥培養層の外周に疎水性樹脂からなる枠層を有すればよく、単一の枠層に限定されるものでなく、上記枠層の外側に、更に枠層が形成される多重枠からなる枠層であってもよい。
更に、図５（ｃ）に示すように、カバーシート（４０）が基材シート（１０）に固設されるものであってもよく、その際、図６に示すように、カバーシート（４０）と基材シート（１０）とが両面接着テープ（５０）などを介して固設されるものであってもよい。なお、本発明の微生物培養シートは、基材シート（１０）の全面に乾燥培養層（３０）が形成されるものであってもよく、乾燥培養層に不織布を含んだものでもよい。
【００１６】
（２）基材シート
本発明で使用する基材シートは、耐溶媒性、印刷適性を有する必要がある。また、微生物培養シートとして、耐水性も要求され、乾燥培養層を形成する際の乾燥処理に耐える耐熱性を有することも要求される。基材シートは、単層でもよく、２層以上の積層シートであってもよい。
基材シートが単層の場合には、例えば、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックシートを好適に使用できる。これらのプラスチックシートは、透明性に優れるため、基材シートからの透過光によっても微生物コロニーを観察することができ、視認性を高めることができ、また、計測方法の選択幅を広げることができる。具体的には、本発明の微生物培養シートは、乾燥培養層で生育させたコロニーを観察、計数するものであるが、基材シートやカバーシートが透明であれば、微生物培養シートの背面からの投射光で観察することもでき、側面からの入射光で観察することもできる。したがって、カバーシート側からも基材シート側からも観察および計数することができる。ただし、発泡により白色を呈するもの、いずれかに着色されたものも使用することもできる。培養する菌種によっては、透明に限定されず、着色により生育させたコロニーを計数し易い場合があり、適宜選択することができる。
また、積層シートとしては、上記プラスチックシートの２種以上を積層したものを例示することができる。また、上記プラスチックシートに紙基材を積層した積層シートや紙基材に合成樹脂をコーティングした積層シートなども好適に使用することができる。このような積層シートとしては、例えば、ポリエチレンフィルムと紙基材との積層シートを例示することができる。
更に、合成樹脂を主原料として紙のように成型された合成紙も基材シートとして使用することができる。このような合成紙として、ユポ・コーポレーション製、商品名「ユポ」や東洋紡製、「クリスパー」などを例示することができる。
本発明で使用する基材シートは、上記乾燥培養層と密着性を向上させるため、予め乾燥培養層を形成する側に、表面処理をおこなったものであってもよい。このような表面処理としては、コロナ放電処理、オゾン処理、酸素ガス若しくは窒素ガス等を用いた低温プラズマ処理、グロー放電処理、化学薬品等を用いて処理する酸化処理、その他の前処理などがある。
また、本発明で使用する基材シートの表面に、予めアンカーコート剤を塗布し、表面処理することもできる。このようなアンカーコート剤としては、イソシアネート系（ウレタン系）、ポリエチレンイミン系、ポリブタジエン系、有機チタン系、その他のアンカーコーティング剤が例示できる。より好ましくは、例えば、トリレンジイソシアナート、ジフェニルメタンジイソシアナート、ポリメチレンポリフェニレンポリイソシアナートなどの芳香族ポリイソシアナート、またはヘキサメチレンジイソシアナート、キシリレンジイソシアナートなどの脂肪族ポリイソシアナート等の多官能イソシアナートと、ポリエーテル系ポリオール、ポリエステル系ポリオール、ポリアクリレートポリオール、その他のヒドロキシル基含有化合物との反応によって得られるポリエーテルポリウレタン系樹脂、ポリエステル系ポリウレタン系樹脂、ポリアクリレートポリウレタン系樹脂を主成分とするものである。
基材シートは、カールなどがなく平坦であることが好ましく、その厚さは、特に限定はされないが、通常、２５〜１５００μｍ、より好ましくは５０〜５００μｍである。
なお、基材シートには、予め水に不溶性で微生物の生育に影響を与えないインキで枡目印刷柄が印刷されていてもよい。枡目印刷を行うことによってコロニーが多数形成された場合、数か所の枡目内の菌数を計測按分しておよその全体数を求めることが出来るからである。印刷の版式は、特に限定されず何でもよいが、着色剤、樹脂、溶剤などの選択範囲が広い点でグラビア印刷などが好ましい。枡目の大きさは１ｃｍ角程度が適当である。
【００１７】
（３）乾燥培養層
本発明の微生物培養シートは、基材シートに乾燥培養層が配設される。粘着層で捕集された微生物が乾燥培養層で培養される際には、前記乾燥培養層は、微生物の発育に適する水分を含有する必要があり、一般には、ゲル化、もしくは増粘しうる従来公知の水溶性高分子化合物などを広く使用することができる。このような材料の総称を本発明ではゲル化剤とする。また、乾燥培養層には、栄養成分その他を含有していてもよい。更に乾燥培養層は、不織布を含んだ構成であってもよい。
（ｉ）ゲル化剤
本発明の乾燥培養層を構成するゲル化剤としては、カラギーナン、グアーガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、アルギン、澱粉およびその誘導体、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースやヒドロキシアルキルセルロースなど）などの水溶性高分子多糖類やポリビニルアルコール（ＰＶＡ）や変性ＰＶＡ、不飽和ジカルボン酸を共重合したもの、アクリル酸およびその誘導体、ポリエーテル（例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなど）などの水溶性ポリマーなどを例示することができる。グアーガムは、低濃度で極めて高い粘度を呈するため少量で菌の発育に適した環境を作れ、特に好適である。また、粘度、強度、菌の発育性を考慮し２種以上のゲル化剤を混合して使用することもできる。
（ｉｉ）栄養成分
本発明の乾燥培養層には、上記ゲル化剤に加えて、栄養成分を配合することができる。
栄養成分としては、例えば、一般生菌検査用としては、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、ペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物等が、大腸菌・大腸菌群検査用としては、ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・乳糖等が、ブドウ球菌用としては、肉エキス・ペプトン・マンニット・卵黄混合物、ペプトン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・等が、ビブリオ用としては酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・等が、腸球菌用としては、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・等が、真菌用としては、ペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、ポテトエキス・ブドウ糖混合物等が用いられる。これらの中から発育させようとする微生物に応じて一種またはそれ以上を選択し、混合して使用することができる。
（ｉｉｉ）発色指示薬、選択剤、基質、緩衝剤（ｐＨ調整剤）など他の成分
本発明の乾燥培養層には、上記ゲル化剤に加えて、発色指示薬、選択剤、基質など他の成分を配合して、乾燥培養層を形成することができる。
発色指示薬は、培養過程で発育する微生物に代謝され、コロニーが着色されるため、コロニー数の計数を極めて容易にする効果がある。このような発色指示薬として具体的には、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（以下ＴＴＣと表示）、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ペテトリルテトラゾリウムブルーなどのテトラゾリム塩やニュートラルレッド混合物、フェノールレッド、ブロムチモールブルー、チモールブルー混合物などのｐＨ指示薬がある。微生物の生育に伴い、発色または変色して微生物の生育が見やすくなり、また、特定の微生物が有する酵素の発色または蛍光酵素基質を加えておくことで、特定の微生物が検出できる。
さらに検出目的以外の微生物の生育を抑える選択剤を加えてもよく、このような選択剤としては、抗生物質、合成抗菌剤等の抗生剤、色素、界面活性剤、無機塩等が用いられる。抗生物質としては、メチシリン、セフタメタゾール、セフィキシム、セフタジジム、セフスロジン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、リファンピシン、ノボビオシン、コリスチン、リンコマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が例示でき、合成抗菌剤としては、サルファ剤、ナリジクス酸、オラキンドックス等が例示できる。また、色素としては、制菌または殺菌作用のあるクリスタルバイオレット、ブリリアントグリーン、マラカイトグリーン、メチレンブルー等が例示できる。また、界面活性剤としては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ７、ドデシル硫酸塩、ラウリル硫酸塩、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ８０）, ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）等が例示できる。また、無機塩類としては、亜セレン酸塩、亜テルル酸塩、亜硫酸塩、窒化ナトリウム、塩化リチウム、シュウ酸塩、高濃度の塩化ナトリウム等が例示できる。これら以外にもタウロコール酸塩、グリシン、胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸塩、高濃度の糖類等を用いることができる。緩衝剤は、検液中のｐＨを７．０から大きく逸脱している場合７．０に戻す作用を有している。これは、菌の生存し易いｐＨが中性の７．０付近にあることによる。緩衝剤としては、りん酸水素２ナトリウム、りん酸２水素ナトリウム、りん酸水素２カリウム、りん酸２水素カリウム、塩化ナトリウム等の組み合わせが例示できる。
なお、発色指示薬の種類によっては滅菌処理時に着色が目立つものもあり、乾燥培養層に含有させず、後記するゲル化溶液に発色指示薬を含んだものを使用して発色させる培地にしてもよい。
本発明の乾燥培養層では、少なくともゲル化剤（ｉ）を含有すればよく、更に栄養成分（ｉｉ）や発色指示薬、選択剤、基質など他の成分（ｉｉｉ）を含有してもよい。なお、発色指示薬や選択剤の組合せによっては混合によって反応を起こす場合があり、これらを別の層に含有させることで混合反応を防ぐことができる。また、発色指示薬を最上層に形成することでコロニーの視認性を向上させることができる。
（ｉｖ）乾燥培養層の構成
本発明で使用する乾燥培養層は、少なくとも上記したゲル化剤（ｉ）を含んだものが基材シートに形成できればよく、その他に栄養成分（ｉｉ）、発色指示薬、選択剤、基質など他の成分（ｉｉｉ）を含有したものや乾燥培養層が２層以上の多層であってもよい。また、乾燥培養層は基材シートの全面に形成されていてもよく、パターン形成されていてもよい。更に、乾燥培養層に不織布などを含んだものでもよい。不織布としては、合成繊維（例えば、ナイロン、ポリエステル（特に、親水化処理したもの）、ポリアクリロニトリル、ポリオレフィン（特に、親水化処理したもの）、ポリウレタン等）、半合成繊維（例えば、レーヨン等）、天然繊維（例えば、セルロース、綿、絹、羊毛（獣毛）等）、無機繊維（例えば、ガラス繊維等）等の材料が好ましい。
本発明において、不織布を含まない構成の乾燥培養層の厚さは、乾燥時５０〜１０００μｍ、より好ましくは２００〜６００μｍである。また、塗布量は、乾燥時５〜４００ｇ／ｍ２、より好ましくは１００〜３００ｇ／ｍ２である。上記範囲で、菌の発育に最適な粘度の乾燥培養層とすることができる。
【００１８】
（４）カバーシート
本発明では、カバーシートの内面に粘着層と剥離フィルムとが積層されることを特徴とする。本発明で使用するカバーシートは、培養中の落下菌などによる汚染を防止すると共に、ゲル化溶液投与後の乾燥培養層の水分蒸発を防止する作用を有する。更に、積層される剥離フィルムを除去し、粘着層を被験面に接触して菌を捕獲した後にゲル化溶液を注入し、乾燥培養層と接触させることで、乾燥培養層で菌を培養することができる。
このため、カバーシートは、被験面や乾燥培養層との接触が容易な柔軟性を有することが好ましい。更に、防水性、水蒸気不透過性を有すると同時に、微生物の培養後、カバーシートを通してコロニーを観察および計数できるように、透明であることが好ましい。
例えば、前記基材シートで挙げたようなポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックシートを使用することができる。なお、カバーシートの開け閉め等の作業性を考慮すると、ポリエステルフィルム、ポリオレフィンフィルムが特に好ましい。また、カバーシートには、基材シートの項で記載したコロナ放電処理などの表面処理がなされていてもよい。なお、カバーシートは、培養する微生物の種類により、適した気体透過性、主に酸素透過性、または酸素非透過性を有することが好ましく、この点も考慮して選定することができる。
カバーシートは、被験面と接触できる適度の柔軟性が確保されることが好ましい。従って、カバーシートの厚さは、１０〜２００μｍ程度が好ましく、２０〜７０μｍ程度が更に好ましい。なお、カバーシートは、どのような形状であってもよいが、雑菌の進入を防ぐために、乾燥培養層を被覆できるよう、乾燥培養層よりも大きいサイズとする必要がある。
カバーシートの内面に積層される粘着層は、被験面上の微生物を捕獲するのに十分な粘着性を有し、捕獲部位を汚染、汚損しないものであればよい。このような粘着層を構成する粘着剤としては、例えば、アクリル系粘着剤、ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤が挙げられる。特に、微生物の粘着面における蛍光標識性の点からは、粘着剤は透明性が高く、かつ、無蛍光性であるのが好ましい。より好ましくは、アクリル系粘着剤やシリコーン系粘着剤である。
このようなアクリル系粘着剤の好適な具体例としては、アルキル基の炭素数が２〜１３の直鎖又は分岐のアルキル基である（メタ）アクリル酸アルキルエステル、例えば、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸ノニル及び（メタ）アクリル酸デシル等から選ばれる１種または２種以上を主モノマーとし、これに（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸メトキシエチル、（メタ）アクリル酸エトキシエチル、（メタ）アクリル酸ブトキシエチル、（メタ）アクリル酸エチレングリコールといった親水性のモノマーを１種または２種以上共重合させた共重合体が挙げられる。また、粘着特性（特に粘着力）の改善のために、かかる共重合体に、イソシアネート化合物、有機過酸化物、エポキシ基含有化合物といった熱架橋剤による処理や、紫外線、γ線、電子線等の照射処理等を行って、架橋を施したものも好ましく使用される。
また、ゴム系粘着剤としては、天然ゴム、ラテックス、スチレン系重合体ブロックと共役ジエン系重合体ブロックとのブロック共重合体、スチレン系重合体ブロックと、スチレン系モノマー及び共役ジエン系モノマーのランダム共重合体ブロックとのブロック共重合体これらの水添物などのスチレン系エラストマー、その他、天然ゴム、スチレン−イソプレン−スチレン共重合体、スチレン−ブチレン共重合体、スチレン−エチレン−ブチレン−スチレン共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリイソブチレン、ポリイソプレンなどのベースポリマーにテルペン樹脂、脂肪族炭化水素樹脂、脂環族炭化水素樹脂、クマロン−インデン系樹脂、ロジン系樹脂、フェノール系樹脂、キシレン系樹脂、スチレン系樹脂などの粘着性付与剤と、パラフィン系オイル、ナフテン系オイルなどの軟化剤を組み合わせて得られるものなどを例示することができる。
また、シリコーン系粘着剤としては、−ＳｉＯ（ＣＨ３）２−を繰り返し単位とするポリマーの末端にシラノール基（ＳｉＯＨ）を持つ高分子量のポリジメチルシロキサン、ポリジメチルジフェニルシロキサン等のポリマー成分と３次元シリケート構造を有していて末端にトリメチルシロキシ基を有する架橋成分とからなる部分架橋したポリシロキサンからなるシリコーン系樹脂、主成分がジメチルシロキサンおよび／またはフェニルメチルシロキサンからなるもの、ジメチルシロキサン単位を含むポリオルガノシロキサンを主成分とするものなどが挙げられる。
上記アクリル系共重合物等の水溶性粘着剤を使用する場合、必要に応じて粘着剤１００重量部当たり５〜４０重量部の範囲内で可塑剤を添加してもよく、可塑剤を添加することで、粘着剤の柔軟性および粘着性をより向上させることができる。なお、粘着層の厚みは１〜１００μｍであることを特徴とし、より好ましくは１０〜６０μｍである。
また、剥離フィルムとしては、使用時に粘着層を容易に剥離しうるものであれば特に限定はない。粘着層との接触面にシリコーン処理が施されたポリエステルフィルム、ポリ塩化ビニルフィルム、ポリ塩化ビニリデンフィルム、などを例示することができる。剥離フィルムの厚さは、１０〜２００μｍ、より好ましくは２０〜１００μｍである。
本発明の微生物培養シートは、前記粘着層で菌を捕集した後に、剥離フィルムで前記粘着層を被覆してもよい。多数の微生物培養シートを使用して菌を捕集し、これらに一時にゲル化溶液を投与する場合には、一旦粘着層を剥離フィルムで再被覆することが便宜だからである。このような再被覆のために、全部が剥離しないように、剥離フィルムの一部をカバーシートに固設させてもよい。
なお、基材シートに枡目印刷柄が印刷されていない場合、カバーシートに、予め水に不溶性で微生物の生育に影響を与えないインキで枡目印刷柄が印刷されていてもよい。印刷の版式は、基材シートと同様に、着色剤、樹脂、溶剤などの選択範囲が広い点でグラビア印刷などが好ましい。枡目の大きさは１ｃｍ角程度が適当である。
【００１９】
（５）枠層
本発明では、基材シートに枠層を形成することができる。この枠層は、基材シートに形成された乾燥培養層の外周に調製される。枠層が形成されることでゲル化溶液を乾燥培養層に投与し、カバーシートを被覆することでゲル化溶液は枠層まで速やかに拡散され、これによって短時間で作業することができる。また、ゲル化溶液は枠層の内側にある乾燥培養層に吸水されて膨潤し、乾燥培養層とカバーシートとの密着性により乾燥培養層の乾燥を防止することができる。更に、カバーシートとの密着性に優れるため、カバーシートにコロニー形成のための層などを形成する必要がなく、コロニーの優れた視認性を確保することができる。
本発明は、基材シートに形成される枠層の高さは、乾燥培養層の高さより１００〜１２００μｍ高く、より好ましくは２００〜１０００μｍ高く、特に好ましくは３００〜８００μｍ高く調製される。１００μｍより低いと、拡散した後にゲル化溶液の広がりを抑制することができず、漏れが生じる場合がある。一方、１２００μｍを超えると、吸水後の乾燥培養層の上部に過度の空間部が発生するためカバーシートとの密着性を確保することが困難で、培養中に乾燥培養層が乾燥しやすくなり、または、一旦、カバーシートと乾燥培養層とが密着した場合でも、過度の空間によりカバーシートが乾燥培養層から剥がれ、乾燥培養層の乾燥を招く場合がある。上記範囲であれば、ゲル化溶液を乾燥培養層に吸水させつつ全面に広げることができ、かつ遺漏することがなく、カバーシートとの密着性も確保できる。
また、上記枠層は、基材シートの上に形成される。乾燥培養層の上に枠層を形成すると、乾燥培養層がゲル化溶液を吸水した後に枠層が崩れる場合があるが、基材シートに直接形成されるため、ゲル化溶液による浸潤がなく、枠層の剥離などを回避することができる。
本発明で使用する疎水性樹脂は、培養に際して投与したゲル化溶液の広がりに対して水をはじいて遺漏を防げるものであり、ゲル化溶液が水系であることからこれを反発できる疎水性樹脂を用いるものである。従って、枠層に用いる疎水性樹脂としては、水溶性樹脂や親水性樹脂でない限り、殆どの疎水性樹脂が使用できこれらは着色されていてもよく、ＵＶ硬化樹脂、ホットメルト樹脂、熱発泡インクやＵＶ発泡剤などを好適に使用することができる。
ＵＶ硬化樹脂としては、ラジカル型では、アクリレート系、不飽和ポリエステル系、カチオン型では、エポキシアクリレート系、オキセタン系、ビニルエーテル系などを例示することができるが、これらに限定されるものではない。ＵＶ硬化樹脂の硬化のための照射条件は、積算光量５０〜２０００ｍＪ／ｃｍ２、より好ましくは１００〜１０００ｍＪ／ｃｍ２である。
また、ホットメルト樹脂としては、軟化点温度が１２０℃以下、より好ましくは１００℃以下のものを好適に使用することができる。理由は、１２０℃を超えると基材シートがカールする場合がある。本発明で好適に使用できるホットメルト樹脂としては、ウレタン系、ポリアミド系、ポリオレフィン系、ポリエステル系、エチレン酢酸ビニル系、スチレンブタジエンゴム系やウレタンゴム系などの合成ゴム系などが挙げられるが、これらに限られたものではない。
疎水性樹脂として、熱発泡インクやＵＶ発泡剤なども好適に使用することができる。例えば、バインダーとしてポリウレタン系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリアクリレート系樹脂、ポリエステル系樹脂、そして、塩素化ポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂、また、塩化ゴムや環化ゴム等のゴム類などを用いたインキが使用できる。これらのインキは単に疎水性であるというよりも撥水性であれば更に好ましく、この点から上記の樹脂にシリコーン類やワックス類を添加したインキは更に好ましい。特に、枠層に用いる疎水性樹脂は、疎水性、撥水性であると同時に、塗膜の厚さを厚くする必要があり、上記の樹脂に従来公知の発泡剤等を添加して、発泡インキとして使用することが効果的である。このようなＵＶ発泡インキとして、少なくともアクリレート反応性希釈剤又はメタクリレート反応性希釈などの反応性希釈剤と、ウレタンアクリレート光重合性オリゴマー、ポリエステルアクリレート光重合性オリゴマー、エポキシアクリレート光重合性オリゴマー、アクリル系光重合性オリゴマー、特殊光重合性オリゴマーなどの光重合性オリゴマーと、光重合開始剤からなる紫外線硬化型インキに、無機発泡剤、有機発泡剤、液体発泡剤等の発泡剤を含有してなる紫外線硬化型発泡インキを例示することができる。
なお、上記疎水性樹脂には、添加剤として、消泡剤、重合禁止剤、顔料分散剤などを添加してもよい。また、通常使用される着色顔料を、１５質量％未満の範囲で含有してもよい１５質量％を超えると、発泡を阻害する虞れがあるため好ましくない場合がある。
本発明では、疎水性樹脂として、上記いずれも好適に使用できるが、特にＵＶ硬化樹脂やホットメルト樹脂が好適である。その理由は、枠層の形成は一定の高さを有するパターン形成が必要であり、これら２種の樹脂は非溶媒系の状態でディスペンサーなどによる塗布によって形状加工が容易であり、その後光照射や冷却によって容易に硬化させるだけでパターン形成できるからである。
これらによって枠層を形成するには、上記疎水性樹脂を印刷や塗布、塗工などによりパターン形成すればよい。その後、メタルハライドランプ、水銀ランプなどで紫外線（ＵＶ）を照射したり、冷却する。
また、枠層として、疎水性材料のくりぬき品を乾燥培養層の外周に接着して枠層とすることもできる。さらに、基材シートとしてエンボス加工品を使用する方法もある。例えば枠層の形状に凸状が形成されたエンボス加工品であれば、前記凸状の内側に乾燥培養層を形成すればよく、一方、乾燥培養層を形成する箇所を凹部で形成し、これより凸状で形成される残部を枠層として使用することができる。
更に、基材シートとして厚い疎水性基材を使用し、乾燥培養層を形成する部分を凹状に削って、残部を枠層とする方法や、または枠層の形状に凸状を形成し、この凸状の内側に乾燥培養層を形成すれば、前記凸状を枠層として使用することができる。ただし、これらに限定されるものではない。
【００２０】
（６）格子印刷層
本発明の微生物培養シートには、格子印刷層が積層されていてもよい。このような格子印刷層は、前記したように、基材シートやカバーシートに形成してもよいが、本発明では、前記基材シートとしてプラスチックシートに紙基材を積層した積層シートを使用する場合には、このような紙基材に格子印刷層を形成してもよい。格子印刷は、着色剤、樹脂、溶剤などの選択範囲が広い点でグラビア印刷などが好ましい。枡目の大きさは１ｃｍ角程度が適当である。
【００２１】
（７）ゲル化溶液
本発明の微生物培養シートは、菌類の培養に先立ち、乾燥培養層にゲル化溶液を投与してゲル化する必要がある。
ゲル化溶液としては、微生物培養シートを構成する乾燥培養層の組成に対応して適宜選択することができる。例えば、前記乾燥培養層が、ゲル化剤のみの場合には、栄養成分が溶解されたゲル化溶液を使用する。栄養成分の濃度は、微生物培養シートにゲル化に適する所定量を投与した場合に、菌類の培養に好適な濃度とする。更に、発色指示薬、選択剤および基質などを含有させることもできる。
一方、乾燥培養層に、栄養成分、発色指示薬、選択剤、基質などが含有されている場合には、滅菌生理食塩水や滅菌精製水などをゲル化溶液として使用することができる。なお、ゲル化溶液として、乾燥培養層に含まれない栄養成分、発色指示薬、選択剤および基質などの特定成分からなる被検溶液を使用する場合、このような特定成分が、滅菌処理その他の工程で変質、変色、分解などを受けやすい場合には、特に有効である。なお、乾燥培養層に発色指示薬、選択剤、基質などを含有させ栄養成分のみゲル化溶液として使用することもできる。
また、ゲル化溶液を使用することで、粘着層と乾燥培養層間とをゲル化溶液を介して接触させることで気泡の混入を防ぐことができる。
【００２２】
（８）微生物培養シートの使用方法
本発明の微生物培養シートは、カバーシートに積層された剥離フィルムを剥離して粘着層を露出させ、当該粘着層を被験面に接触させて菌を捕集することができる。次いで、微生物培養シートを構成する乾燥培養層に前記ゲル化溶液を所定量投与して前記粘着層を培養層に被覆してゲル化完了後所定時間、所定温度で培養し、カバーシートまたは基材シートから微生物コロニーを観察する。
本発明の微生物培養シートは、食品や医薬品などの製造工程における衛生管理の目的で、装置や施設などの表面を被験面とし、前記被験面にある微生物を粘着層を介して捕集することができる。このような被験面としては、上記製造工程に限定されず、ファーストフード等食品販売の店舗、病院、診療所、学校の給食厨房などの公共施設における衛生管理に好適に使用することができる。
更に、本発明の微生物培養シートは、空気中に存在する微生物の測定方法である落下菌法にも使用することができる。落下菌法は、一定時間開放した一定面積の寒天平板培地上に空中浮遊微生物を自然に落下させて補足する方法であり、一定時間後に回収し培養しコロニー数として計測するが、空中浮遊微生物が少ない環境下では微生物数が少ないため検出するためには長時間の開放時間が必要となる。従来の平板寒天培地を使用する場合は、水分が蒸散し、培地が乾燥してしまうという欠点があり、エアコンなどの空気の噴出し口においても培地の乾燥という問題があった。しかしながら、本発明の微生物培養シートは、乾燥培養層を使用し、菌を捕集した後にゲル化溶液で乾燥培養層をゲル化または増粘させるため、上記問題がない。
【００２３】
（９）微生物培養キット
本発明では、上記した微生物培養シートと、前記ゲル化溶液とからなる微生物培養キットとすることができる。
このような微生物培養キットを使用し、前記微生物培養シートのカバーシートの剥離フィルムを剥がして粘着層を被験面に接触させて菌を捕集し、前記ゲル化溶液を添加してカバーシートの粘着層を乾燥培養層に被せ乾燥培養層をゲル化し、ゲル化完了後培養し、発生するコロニーを評価することができる。
また、菌の捕集方法としては、前記微生物培養シートのカバーシートの剥離フィルムを剥がして粘着層を所定時間解放状態とし落下菌を捕集してもよい。ついで、前記ゲル化溶液を添加してカバーシートの粘着層を乾燥培養層に被せ乾燥培養層をゲル化し、ゲル化完了後培養し、発生するコロニーを評価することができる。
本発明の微生物培養キットを使用する際に、上記微生物培養シートに菌類を捕集した粘着面を被覆して保存し、培養直前に乾燥培養層に上記ゲル化溶液を投与してゲル化させ、ついで菌を培養してもよい。菌類を捕集した微生物培養シートが多数存在する場合には、上記操作によって、作業を効率的に行うことができる。
なお、微生物培養シートに使用する乾燥培養層の含有成分とゲル化溶液とは、菌類の培養に密接な関係を有する。このため、ゲル化溶液に、特定の菌類の増殖に好適な栄養成分、発色指示薬、選択剤、基質などを含有させると、同一の微生物培養シートに異なるゲル化溶液を組み合わせることで、種々の菌類の培養を簡便に行うことができる。
【００２４】
（１０）製造方法
本発明の微生物培養シートは、前記基材シートの上方に少なくともゲル化剤を含有する乾燥培養層を形成することができれば、その製造方法は問わない。
例えば、基材シートの上に接着剤を塗工し、上記ゲル化剤や栄養成分、発色指示薬、選択剤、基質、緩衝剤（ｐＨ調整剤）など他の成分を粉末状で均一に接着させて調製することができる。接着剤としては、微生物の発育に阻害性を与えないものであれば使用することができる。好ましくは水に不溶性の接着剤、例えばアクリル系の感圧接着剤などが使用できる。
また、少なくともゲル化剤を含み、その他に栄養成分、発色指示薬、選択剤、基質、緩衝剤（ｐＨ調製剤）から１種以上を含有する培地液を印刷や塗布、塗工、噴霧などによって基材シートの上方に形成してもよい。培地液は直接基材の上に成分を固着可能とするために、少なくとも接着性のある成分が溶解しているもの、かつ乾燥培養層を構成する成分を溶解、もしくは分散させたものである。たとえば、溶媒としてアルコールを使用する場合にはポリビニルピロリドンやヒドロキシプロピルセルロースなどをメタノールやエタノールに溶解し、これに少なくともゲル化剤を溶解、懸濁または分散させたものや、溶媒として水を使用する場合はポリビニルアルコールやポリエチレングリコールなどを水に溶解し、さらにゲル化剤などを溶解、分散させたものなどが挙げられる。なお、乾燥培養層は、前記図１に示すように基材シートの一部に形成してもよく、図７に示すように、基材シートの上部全面に形成してもよい。
また、基材シートに直接乾燥培養層を形成する場合に限定されず、基材シートに不織布を配設し、前記不織布に培地液を含浸させて乾燥培養層を形成するものであってもよい。例えば、レーヨン不織布などの合成繊維不織布、コットン不織布などの天然繊維不織布などの網目の大きさが１５〜１００メッシュ程度のものを基材シートに設置し、その上に少なくともゲル化剤を含み、その他に栄養成分、発色指示薬、選択剤、基質、緩衝剤（ｐＨ調製剤）から１種以上を含有する培地液を塗布、噴霧などによって含浸させればよい。
加えて、前記したように乾燥培養層は、２以上の多層であってもよい。例えば、前記培地液を基材シートに積層し、次いで、発色指示薬などを含有する溶液を積層することによって、コロニーの視認性を更に向上した乾燥培養層を形成することができる。
本発明では、乾燥培養層を使用することで、寒天培地と同様に微生物コロニーを観察及び計数することができ、かつ極めて寒天培地を使用する場合よりも優れた視認性を確保しうることが判明した。なお、培養層の乾燥は、培地液に含まれる前記溶媒を除去できればよく、温度、圧力など、従来公知の方法に準じて乾燥することができる。
本発明の微生物培養シートが乾燥培養層の外周に枠層を有する場合には、予め枠層を形成した後に乾燥培養層を形成してもよく、乾燥培養層を形成した後に枠層を形成してもよい。また、予め枠層が形成された基材シートを使用することもできる。
枠層が形成された基材シートとしては、少なくとも疎水性樹脂を表面に有する基材シートであって、これに枠層がエンボス加工されたものを使用する方法もある。例えば、基材シートに枠層の形状に凸状が形成されるものは、前記凸状の内側に乾燥培養層を形成すれば本発明の微生物培養シートを製造することができる。なお、乾燥培養層を形成する箇所を凹部のエンボス加工で形成し、前記凹部の外周に形成される凸部を枠層とすることもできる。
一方、基材シートに乾燥培養層を形成する前に枠層をパターン形成する方法としては、例えば、疎水性樹脂板を所定形状にくりぬき、これを基材シートに接着して枠層とすることができる。更に、基材シートとして厚い疎水性樹脂板を使用し、乾燥培養層を形成する部分を凹状に削って残部を枠層とする方法や、または枠層の形状に凸状を形成し、この凸状の内側に乾燥培養層を形成すれば、前記凸状を枠層として使用することができる。
また、疎水性樹脂として、前記したＵＶ硬化インキ、ホットメルト、熱発泡インクやＵＶ発泡剤などを使用し、パターン形成して枠層を形成してもよい。これらは非溶媒系であり、パターン形成をディスペンサー塗布などで容易に加工することができ、硬化も容易であるため特に好ましい。
疎水性樹脂として上記ＵＶ硬化インキなどを使用して枠層を形成するには、上記疎水性樹脂を適当な溶媒に溶解し、印刷や塗布、塗工などによりパターン形成してもよい。
疎水性樹脂がＵＶ硬化インキやＵＶ発泡インキである場合には、パターン形成後に、ＵＶを照射する。紫外線（ＵＶ）照射条件としては、積算光量５０〜２０００ｍＪ／ｃｍ２、より好ましくは１００〜１０００ｍＪ／ｃｍ２であり、紫外線照射ランプの光と熱を併用することができる。発泡可能照射条件の幅は、発泡剤の種類により変化する。一度では所定の高さを確保できない場合には、複数回の印刷によって枠層を形成してもよい。紫外線照射ランプとしては、メタルハライドランプ、水銀ランプなどが使用できる。
本発明において、乾燥培養層を形成した後に枠層を形成するには、上記ＵＶ硬化インキ、ホットメルト、熱発泡インクやＵＶ発泡剤などを使用し、パターン形成によって枠層を形成することができる。この際、乾燥培養層に、ＵＶ照射によって変質する成分が含まれている場合には、ＵＶ照射の際に、乾燥培養層を金属などで被覆することが好ましい。
更に、疎水性樹脂板を所定形状にくりぬき、これを乾燥培養層が形成された基材シートの前記乾燥培養層の外周の基材シートに接着して枠層とすることもできる。
本発明の微生物培養シートは、カバーシート（４０）に粘着層（４３）と剥離フィルム（４５）とが積層される。カバーシート（４０）に粘着層を形成する粘着剤溶液を塗工および乾燥して粘着層を形成し、ついで剥離フィルムを積層し、乾燥培養層（３０）や必要に応じて枠層（２０）が形成された基材シート（１０）に積層する。前記粘着層（４３）が基材シート（１０）と接触することで、基材シートにカバーシート（４０）を固設することができる。
一方、カバーシートと基材シートとが同一部材で構成される場合には、予め、粘着層(４３)と剥離フィルム(４５)とをカバーシート(４０)に積層し、これを基材シートにヒートシールやラミネート接着、その他によって固設してもよい。図５（ａ）の平面図、図５（ｂ）の断面図に示すように、基材シート（１０）とカバーシート（４０）とを連設したまま基材シート（１０）に枠層（２０）と乾燥培養層（３０）とを形成し、一方、カバーシート（４０）に粘着層（４３）と剥離フィルム（４５）とを積層し、これを折り曲げて微生物培養シートを形成してもよい。図６（ｃ）にその断面図を示す。この方法によれば、基材シート（１０）とカバーシート（４０）が連設されているため、粘着層（４３）で捕集した微生物を乾燥培養層（３０）培養する際に、粘着層(４３)をずれることなく乾燥培養層（３０）の上に被覆することができる。
なお、図６の横断面図に示すように、粘着層（４３）と剥離フィルム（４５）とを積層したカバーシート（４０）と基材シート（１０）とを別個に調製し、カバーシート（４０）と、乾燥培養層（３０）を形成した基材シート（１０）とを、両面接着テープ（５０）などで張り合わせてもよい。
更に、図８に、カバーシート（４０）に格子印刷が形成され、カバーシート（４０）と乾燥培養層（３０）を形成した基材シート（１０）とが端部で接着された本発明の微生物培養シートの外観斜視図を示す。
本発明の微生物培養シートは、ガンマ線照射やエチレンオキサイドガス滅菌等の滅菌を施し、本発明の微生物培養シートの製品とする。
本発明の微生物培養シートは、含まれる微生物栄養成分の種類や、使用する基材シート、カバーシートの通気性その他に応じて各種の微生物の培養を行うことができる。
【実施例】
【００２５】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。【００２６】
（実施例１）
ＵＶ硬化インク（十条ケミカル社製、商品名「レイキュアーＧＡ  ４１００−２」）をポリエチレンテレフタレートフィルム（帝人デュポン製、商品名「テイジンテトロンフィルム」）の上にディスペンサーによって幅１．０ｍｍ、高さ７５０μｍ、直径５２ｍｍの円状の枠層を形成し、水銀ランプにより積算光量２５０ｍＪ／ｃｍ２で照射し枠層を硬化させた。得られた枠層の高さは７５０μｍ（乾燥培養層の高さとの差＋４００μｍ）、幅は１ｍｍであった。
ついで、メタノール２１０ｍｌにポリビニルピロリドン  Ｋ−９０  ２０ｇを溶解し、これにグアーガム粉末（三晶社製、商品名「ＮＥＯＶＩＳＣＯ  Ｇ」、４００メッシュタイプ）６０ｇを分散し、更に栄養成分としてトリプトン（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  社製、商品名「ＢＡＣＴ  ＴＲＹＰＴＯＮＥ」）３．２６ｇ、肉エキス（Ｏｘｏｉｄ社製  商品名「Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ」）０．８２ｇ、酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製、商品名「ＹＥＡＳＴ  ＥＸＴＲＡＣＴ」）０．０３ｇ、ブドウ糖（和光純薬工業社製、商品名「Ｄ−（＋）−ＧＬＵＣＯＳＥ」）０．１６ｇ、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）０．４１ｇ、りん酸水素２ナトリウム（和光純薬工業社製）０．３７ｇを混合して塗布液を調整した。
この栄養成分、ゲル化剤を含んだ塗布溶液を前記の枠層を形成した基材の枠内にディスペンサーによって塗布した。ついで、塗布した層を５０℃で１５分間乾燥して乾燥培養層を形成した。乾燥時の層の厚さは、３５０μｍであった。
ついで、アクリル系粘着剤１００重量部（ＳＫダイン１４９５／綜研化学）にイソシアネート系硬化剤１重量部（Ｌ−４５／綜研化学）を混合調整し、シリコーン処理された厚さ５０μｍのポリエステルフィルム上へ乾燥後の厚みが２０μｍになるように塗布し厚さ４０μｍのＯＰＰフィルム（ＯＰ−Ｕ−１／東セロ）のコロナ処理面と張り合わせて粘着層を作製し、前記枠層と乾燥培養層を形成したＰＥＴ基材の上に積層し、端部を接着し、γ線で滅菌して本発明の微生物培養シートとした。
菌株として黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３）を使用し、液体培地（ＴＲＹＰＴＩＣ  ＳＯＹ  ＢＲＯＴＨ）にて３６±１℃で１８時間培養を行った菌液を滅菌生理食塩水で菌数が１０３／ｍｌとなるように希釈した液１ｍＬをゴム板の表面に滴下し自然乾燥した面を被験物とした。得られたゴム板は、２００ｃｍ２に１×１０３個の黄色ブドウ球菌が付着していた。このゴム板に、上記微生物培養シートのポリエステルフィルムからなる剥離フィルムを剥がし、粘着層で被験物に対し１回圧着し、黄色ブドウ球菌を捕集した。
次いで、上記微生物培養シートの乾燥培養層の上に滅菌済みのピペットで０．０５ｇ／ＬのＴＴＣ添加滅菌精製水を１ｍｌ添加し、その上にカバーシートを被覆し、前記滅菌精製水を枠層内全体に広げ、約１分間静置してゲルを形成させた後、孵卵器に入れ、３６±１℃で４８時間培養した。
培養後に発生したコロニー数をそれぞれ計数した。結果を表１に示す。また、発生したコロニーを図９に示す。【００２７】
（比較例１）
市販の微生物検出用シート（チッソ株式会社製、商品名「サニ太くん」、一般生菌用）を使用した。この微生物検出用シートのカバーを開け、不織布部に滅菌生理食塩水１ｍｌを添加し、１５分放置した。
実施例１で調製したものと同様の被験物に、上記微生物検出用シートの剥離フィルムを剥がし、不織布部で被験物に対し１回圧着し、黄色ブドウ球菌を捕集した。
次いで、上記微生物検出用シートの湿潤した不織布の上にカバーシートを被覆し、孵卵器に入れ、３６±１℃で４８時間培養した。培養後に発生したコロニー数をそれぞれ計数した。結果を表１に示す。【００２８】
（実施例２）
比較例１の検出用シートのカバーシートを剥がし、実施例１のカバーシートを使用して実施例１で調製したものと同様の被験物に、上記微生物検出用シートの剥離フィルムを剥がし、粘着層で被験物に対し１回圧着し、黄色ブドウ球菌を捕集した。
次いで、比較例１で使用した微生物検出用シートの不織布部に滅菌生理食塩水１ｍｌを添加し、十分に湿潤した後にカバーシートの粘着層にて被覆し、孵卵器に入れ、３６±１℃で４８時間培養した。培養後に発生したコロニー数をそれぞれ計数した。結果を表１に示す。【００２９】
（比較例２）
培地として、精製水１０００ｍｌに酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）２．５ｇ、トリプトン（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  社製、商品名「ＢＡＣＴ  ＴＲＹＰＴＯＮＥ」）５．０ｇ（Ｄ−（＋）−ぶどう糖（ナカライテスク社製）１．０ｇ、寒天１５．０ｇを均等浮遊液とした後、１２１℃１５分高圧蒸気滅菌し５０℃まで冷却して容器に分注してなる標準寒天培地を使用して厚さ３．５ｍｍ、面積１０ｃｍ２のスタンプ培地を調製した。これを、γ線で滅菌して比較スタンプ培地とした。
実施例１で調製したものと同様の被験物に、上記比較スタンプ培地を１回圧着し、黄色ブドウ球菌を捕集した。
次いで、上記比較スタンプ培地に蓋をし、孵卵器に入れ、３６±１℃で４８時間培養した。培養後に発生したコロニー数をそれぞれ計数した。結果を表１に示す。また、発生したコロニーを図１０に示す。【００３０】
【表１】
2011093342.tif 000003
【００３１】
(結果)
比較例１と比較例２は、含水培養層を検査対象物に直接接触させて微生物を捕集するものであり、培養コロニー数は、おのおの４個、５個である。これに対し、実施例１と実施例２とは、剥離フィルムを剥がして露出させた粘着層を検査対象物に直接接触させて微生物を捕集するものであり、コロニー数は、５５個、３３個であった。これにより、剥離フィルムを剥がして露出させた粘着層を検査対象物に直接接触させて微生物を捕集する方法は、捕集効率に優れることが判明した。
また、図９に示す実施例１のコロニーと図１０に示す比較例２のコロニーを比較すると、比較例２の寒天培地よりも実施例１の乾燥培養層を使用する方が、コロニーの視認性に優れることが判明した。【００３２】
（実施例３）
前記乾燥培養層として、（ｉ）実施例１と同様組成にて制作した微生物培養シートと、（ｉｉ）乾燥培養層に栄養成分を含まない以外は実施例１と同様に操作して調製した微生物培養シートとを使用し、実施例１で調製したと同様の被験物に、上記微生物検出用シートの剥離フィルムを剥がし、粘着層で被験物に対し１回圧着し、黄色ブドウ球菌を捕集した。なお、上記（ｉ）、（ｉｉ）の乾燥時の乾燥培養層の厚さは、３２０〜３６０μｍであった。
次いで、(ｉ)の微生物培養シートを使用した場合は、前記微生物培養シートの乾燥培養層の上に所定の希釈液(ゲル化溶液)を１ｍｌ添加し、（ｉｉ）の微生物培養シートを使用した場合は、前記微生物培養シートの乾燥培養層にトリプトン（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  社製、商品名「ＢＡＣＴ  ＴＲＹＰＴＯＮＥ」）２０．０ｇ、肉エキス（Ｏｘｏｉｄ社製  商品名「Ｌａｂ-Ｌｅｍｃｏ」）５．０ｇ、酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製、商品名「ＹＥＡＳＴ  ＥＸＴＲＡＣＴ」）１．０ｇ、ブドウ糖（和光純薬工業社製、商品名「Ｄ−（＋）−ＧＬＵＣＯＳＥ」）１．０ｇ、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）１．０ｇ、りん酸水素２ナトリウム（和光純薬工業製）１．０ｇ、ＴＴＣ（和光純薬工業社製）０．０５ｇを滅菌精製水１０００ｍｌに溶解した栄養成分液(ゲル化溶液)を１ｍｌ添加し、その上におのおのカバーシートを被覆して、前記ゲル化溶液を枠層内全体に広げ、約１分間静置してゲルを形成させた後、孵卵器に入れ、３６±１℃で４８時間培養し、培養後に発生したコロニー数をそれぞれ計数した。結果を表２に示す。【００３３】
【表２】
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【００３４】
(結果)
乾燥培養層に栄養成分を含有させ、栄養成分を含まないゲル化溶液で乾燥培養層をゲル化する場合も、乾燥培養層に栄養成分を含有させず、栄養成分を含むゲル化溶液で乾燥培養層をゲル化する場合も、検出するコロニー数は略同等であった。これにより、乾燥培養層をゲル化する際に、栄養成分を含むゲル化溶液を使用することで、微生物培養シートを製造する際に、異なるゲル化溶液を添付することで、異なる菌の検出が可能となり、生産ラインを一元化しうることが判明した。【００３５】
（実施例４）
実施例１で製造した微生物培養シートの粘着層の剥離フィルム（ポリエステルフィルム）を剥がし粘着面を指に押し付けた後、前記微生物培養シートの乾燥培養層に０．０５ｇ／ＬのＴＴＣ添加滅菌精製水を分注し、次いで前記粘着層の粘着面を培養層に被せながら前記滅菌精製水を微生物培養シートの枠層内全体に広げ、約１分間静置してゲルを形成した後、孵卵器に入れ、３６±１℃で４８時間培養した。培養後に発生したコロニー数を図１１に示す。【００３６】
(比較例３)
市販のスタンプ培地ＤＤチェッカー（極東製薬工業製、一般細菌検出用ＤＤ寒天培地）を使用し、左側の寒天培地表面に指を押し付け、右側の寒天培地表面には、実施例４と同様にして微生物培養シートの粘着層に指を押し付けたものを貼り付け、これを孵卵器に入れ、３６±１℃で４８時間培養した。培養後に発生したコロニー数を図１２に示す。【００３７】
（結果）
図１１に示すように、乾燥培養層からなる微生物培養シートとカバーシートの粘着層の組み合わせは非常に視認性がよくコロニーが良く判別できた。
これに比し、図１２の右側に示すように、寒天培地に粘着層を組み合わせた場合は細かな気泡等が入りやすく、また、コロニーが粘着層と寒天との間で拡散しコントラストがなく見難かった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の微生物培養シートは、菌の捕集率に優れる微生物培養シートを提供することができる。乾燥培養層は、寒天培地よりもコロニーの視認性に優れ、有用である。
【符号の説明】
【００３９】
１０・・・基材シート、
２０・・・枠層、
３０・・・乾燥培養層、
４０・・・カバーシート、
４３・・・粘着層、
４５・・・剥離フィルム、
５０・・・両面接着テープ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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