(57)【要約】配列番号２もしくは配列番号５のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号２の１２０２位（配列番号５の１７７位）のグルタミン酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換、１０５６位（配列番号５の３１位）のグルタミン酸に相当するアミノ酸のバリンへの置換、および２１９９位（配列番号５の１１７４位）のアラニンに相当するアミノ酸のスレオニンへの置換を含む、ポリヌクレオチド。
2011024875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の非構造タンパク質及び構造タンパク質を発現することのできるポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２の１２０２位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２の１２０２位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換、１０５６位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のバリンへの置換、および２１９９位のアラニンに相当するアミノ酸のスレオニンへの置換を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、さらに、配列番号２の２３２１位のセリンに相当するアミノ酸のプロリンへの置換および／または２８８９位のロイシンに相当するアミノ酸のフェニルアラニンへの置換を含む、請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１の塩基配列または該塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（但し、ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、配列番号１の塩基「ｔ」は「ｕ」に読み替える。）
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えＣ型肝炎ウイルス粒子。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが導入され、組換えＨＣＶを産生する非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
ヒト肝細胞キメラマウスである、請求項７に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが導入され、組換えＨＣＶを産生する細胞。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の非ヒト哺乳動物または請求項９に記載の細胞に医薬候補物質を投与または添加し、ＨＣＶの複製能またはＨＣＶタンパク質の翻訳能を評価する工程を含む、ＨＣＶの複製またはタンパク質の翻訳を阻害する医薬候補物質をスクリーニング又は評価する方法。
【請求項１１】
配列番号５のアミノ酸配列またはそれと９８％以上同一性を有するアミノ酸配列をコードし、ＨＣＶの非構造タンパク質を発現することのできるポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記配列番号５のアミノ酸配列またはそれと９８％以上同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号５の１７７位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のバリンへの置換を含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記配列番号５のアミノ酸配列またはそれと９８％以上同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号５の１７７位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のバリンへの置換、３１位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換、および１１７４位のアラニンに相当するアミノ酸のスレオニンへの置換を含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記配列番号５のアミノ酸配列またはそれと９８％以上同一性を有するアミノ酸配列が、さらに、配列番号５の１２９６位のセリンに相当するアミノ酸のプロリンへの置換および／または１８６４位のロイシンに相当するアミノ酸のフェニルアラニンへの置換を含む、請求項１２または１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
さらにＩＲＥＳ配列を含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
さらに選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号３の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（但し、ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、配列番号３の塩基「ｔ」は「ｕ」に読み替える。）
【請求項１８】
レプリコンＲＮＡである、請求項１１〜１７のいずれか記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のレプリコンＲＮＡを細胞に導入することにより作製された、レプリコン複製細胞。
【請求項２０】
細胞が、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞である、請求項１９に記載のレプリコン複製細胞。
【請求項２１】
細胞が、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞である、請求項１９又は２０に記載のレプリコン複製細胞。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のレプリコン複製細胞に医薬候補物質を添加し、レプリコンＲＮＡの複製能またはタンパク質の翻訳を評価することを含む、ＨＣＶの複製またはタンパク質の翻訳を阻害する医薬候補物質をスクリーニングまたは評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの新規株由来のポリヌクレオチド、並びに該ポリヌクレオチドが導入された細胞および非ヒト哺乳動物、該ポリヌクレオチドを利用したレプリコンＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ、以下、ＨＣＶ）は、フラビウイルス科に属する一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスで、Ｃ型肝炎の原因となることが知られている。近年の研究により、ＨＣＶは遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されることがわかってきた。ＳｉｍｍｏｎｄｓらによるＨＣＶ株の塩基配列を用いた系統解析法によると、ＨＣＶは遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型３ａ、及び遺伝子型３ｂの６タイプに分類され、さらにそれらの各タイプがいくつかのサブタイプに分類される（非特許文献１）。【０００３】
Ｃ型肝炎に対する現在の主な治療は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、及びインターフェロン−αとプリン−ヌクレオシド誘導体であるリバビリンとの併用療法により行われている。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけであり、効果が出た患者も治療を中止すると半分以上が再発する。インターフェロンの治療効果は、ＨＣＶの遺伝子型と関連することが知られており、遺伝子型１ｂに対しては効果が低く、遺伝子型２ａに対してはより効果が高いと言われている（非特許文献２）。
したがって、薬剤の効果を評価するためには、各タイプのウイルスを感染および増殖させることができる系を確立し、ウイルスのタイプごとに薬剤の効果を調べることが重要である。【０００４】
最近まで、ＨＣＶを細胞培養系で増やすこと、ＨＣＶを培養細胞に感染させることは困難であり、また、ＨＣＶに感染可能かつ実験可能な動物はチンパンジーしかいなかったため、ＨＣＶの複製機構や感染機構の研究は困難であった。しかし、最近ＨＣＶ由来の自律複製能を有するＲＮＡとして、ＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンが作製されたこと（特許文献１；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）により、培養細胞を用いてＨＣＶの複製機構を解析することが可能となった。これらのＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンは、遺伝子型１ｂに属するＣｏｎ１というクローンのＨＣＶゲノムＲＮＡの５'非翻訳領域中のＨＣＶ ＩＲＥＳの下流に存在する構造タンパク質を、ネオマイシン耐性遺伝子、及びその下流に連結したＥＭＣＶ−ＩＲＥＳによって置換したものである。このＲＮＡレプリコンは、ヒト肝癌細胞Ｈｕｈ７に導入してネオマイシン存在下で培養することにより、Ｈｕｈ７細胞内で自律複製することが証明されている。このＲＮＡレプリコンシステムを用いたＨＣＶの複製評価系は抗ＨＣＶ薬の開発の強力なツールになると考えられる。【０００５】
しかし、遺伝子型が異なるＨＣＶではコードされるウイルスタンパク質にも違いがあるため、遺伝子型１ｂのＨＣＶ由来のサブゲノムＲＮＡレプリコンの解析だけでは、ＨＣＶの複製機構を十分に解明することは難しいと考えられる。したがって、数多くの遺伝子型のＨＣＶ ＲＮＡレプリコンを作製して、ＨＣＶ複製機構、及び抗ＨＣＶ薬の研究を行う必要があると考えられる。【０００６】
特許文献２には２ａ型であるＪＦＨ−１株について、ウイルスの同定及びゲノム配列が開示されている。また、特許文献３には、同じく２ａ型であるＪＦＨ２．１株及び２．２株とそれを用いたレプリコンＲＮＡの作製が開示されている。一方、１ａ型に関しては、Ｈ７７株についての報告がある（非特許文献６）が、この株から得られる組み換えウイルスは複製効率が十分ではなく、また、１ｂ型から予想される５種類の変異を導入することによりレプリコンの作製にも成功しているが、このレプリコンは特殊な細胞でしか複製しないという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１７１８７号公報
【特許文献２】特開２００２−１７１９７８号公報
【特許文献３】国際公開２００５／０２８６５２号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hepatorigy（1994）10，p1321-1324
【非特許文献２】Biochem. Biophis. Res. Commun.,（1992）183,334-342
【非特許文献３】Science，（1999）285,110-113
【非特許文献４】Science，（2000）290,1972-1974
【非特許文献５】J．Virol., （2002）76 2997-3006
【非特許文献６】J．  Virol. （2003）77 3181-3190
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、ＨＣＶの新規株由来のポリヌクレオチドを提供し、これを用いて複製効率の高いＨＣＶレプリコンＲＮＡ、及びＨＣＶタンパク質を持続的に大量生産可能なＨＣＶレプリコン細胞を提供することを課題とする。
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、Ｃ型肝炎患者の血清からＨＣＶの１ａ型に分類される新規ＲＭＴ株を単離し、その塩基配列を同定し、このウイルスの感染効率が良いことを発見した。そして、このウイルスを用いて複製効率の良いレプリコンＲＮＡを作製することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下を提供する。
【００１１】
（１）配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードし、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の非構造タンパク質及び構造タンパク質を発現することのできるポリヌクレオチド。
（２）前記配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２の１２０２位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換を含む、（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）前記配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２の１２０２位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換、１０５６位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のバリンへの置換、および２１９９位のアラニンに相当するアミノ酸のスレオニンへの置換を含む、（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）前記配列番号２のアミノ酸配列または該アミノ酸配列と９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、さらに、配列番号２の２３２１位のセリンに相当するアミノ酸のプロリンへの置換および／または２８８９位のロイシンに相当するアミノ酸のフェニルアラニンへの置換を含む、（２）または（３）に記載のポリヌクレオチド。
（５）配列番号１の塩基配列または該塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（但し、ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、配列番号１の塩基「ｔ」は「ｕ」に読み替える。）
（６）（１）〜（５）のいずれか記載のＲＮＡポリヌクレオチドを含有するＣ型肝炎ウイルス粒子。
（７）（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入され、組換えＨＣＶを産生する非ヒト哺乳動物。
（８）ヒト肝細胞キメラマウスである、（７）に記載の非ヒト哺乳動物。
（９）（１）〜（５）のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入され、組換えＨＣＶを産生する細胞。
（１０）（７）または（８）に記載の非ヒト哺乳動物または（９）に記載の細胞に医薬候補物質を投与または添加し、ＨＣＶの複製能またはＨＣＶタンパク質の翻訳能を評価する工程を含む、ＨＣＶの複製またはタンパク質の翻訳を阻害する医薬候補物質をスクリーニング又は評価する方法。
（１１）配列番号５のアミノ酸配列またはそれと９８％以上同一性を有するアミノ酸配列をコードし、ＨＣＶの非構造タンパク質を発現することのできるポリヌクレオチド。
（１２）前記配列番号５のアミノ酸配列またはそれと９８％以上同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号５の１７７位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のバリンへの置換を含む、（１１）に記載のポリヌクレオチド。
（１３）前記配列番号５のアミノ酸配列またはそれと９８％以上同一性を有するアミノ酸配列が、配列番号５の１７７位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のバリンへの置換、３１位のグルタミン酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換、および１１７４位のアラニンに相当するアミノ酸のスレオニンへの置換を含む、（１１）に記載のポリヌクレオチド。
（１４）前記配列番号５のアミノ酸配列またはそれと９８％以上同一性を有するアミノ酸配列が、さらに、配列番号５の１２９６位のセリンに相当するアミノ酸のプロリンへの置換および／または１８６４位のロイシンに相当するアミノ酸のフェニルアラニンへの置換を含む、（１２）または（１３）に記載のポリヌクレオチド。
（１５）さらにＩＲＥＳ配列を含む、（１１）〜（１４）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（１６）さらに選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含む、（１１）〜（１５）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（１７）配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号３の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである、（１１）〜（１６）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（但し、ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、配列番号３の塩基「ｔ」は「ｕ」に読み替える。）
（１８）レプリコンＲＮＡである、（１７）に記載のポリヌクレオチド。
（１９）（１８）に記載のレプリコンＲＮＡを細胞に導入することにより作製された、レプリコン複製細胞。
（２０）細胞が、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞である、（１９）に記載のレプリコン複製細胞。
（２１）細胞が、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞である、（１９）又は（２０）のレプリコン複製細胞。
（２２）（１９）〜（２１）のいずれかに記載のレプリコン複製細胞に医薬候補物質を添加し、レプリコンＲＮＡの複製能またはタンパク質の翻訳を評価することを含む、ＨＣＶの複製またはタンパク質の翻訳を阻害する医薬候補物質をスクリーニングまたは評価する方法。
【００１２】
本発明の新規ＨＣＶ株のポリヌクレオチドを利用すれば、ＨＣＶ１ａ型の感染モデル動物や感染細胞を効率よく得ることができる。
また、本発明の新規ＨＣＶ株のポリヌクレオチドを利用すれば、高確率で複製効率の良いレプリコンＲＮＡとレプリコン複製細胞を得ることができる。このレプリコン複製細胞は、ＨＣＶ由来のＲＮＡ及びＨＣＶタンパク質を持続的に産生させるための培養系として利用することができる。さらに該レプリコン複製細胞は、ＨＣＶの複製又はＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒト肝細胞キメラマウスを用いて１ａ型Ｃ型肝炎患者由来血清の感染実験を行った結果を示す図。
【図２】Ｈ７７株の配列をもとに設計されたＲＭＴ株シークエンス解析用プライマーの位置を示す図。
【図３】ＲＭＴ組み換えウイルス発現ベクターの構造を示す図。
【図４】ＲＭＴ株およびＪＦＨ１株のヒト肝細胞キメラマウス感染効率を比較した結果を示す図。
【図５】ＲＭＴ株由来レプリコンＲＮＡ発現ベクターの構造を示す図。
【図６】各変異を有するレプリコンＲＮＡの薬剤存在下でのコロニー形成能を示す図（写真）。
【図７】ＲＭＴ組換えウイルスのHuh7細胞での複製効率を示す図。
【図８】ＲＭＴ組換えウイルス（３重変異導入）を用いてHuh7細胞において抗ウイルス薬の効果を調べた結果を示す図。
【図９】#11細胞の培養上清（A）または濃縮後の培養上清（B）を用いて感染させたHuh7細胞におけるHCV-core蛋白質の蛍光抗体染色結果を示す図（顕微鏡写真）。矢印は染色された箇所を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
なお、本明細書中において、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡとＤＮＡの両方を含むものとする。すなわち、「ウイルスタンパク質を発現することのできるポリヌクレオチド」とは、タンパク質を翻訳できるＲＮＡであってもよいし、ＲＮＡに転写してからタンパク質を翻訳できるＤＮＡであってもよい。
また、ポリヌクレオチドは１本鎖であっても２本鎖であってもよく、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。さらに部分的に修飾されていても、誘導体であってもよい。なお、便宜上、配列表の塩基配列はＤＮＡで示すが、当該ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする。
【００１５】
本発明の第１の態様にかかるポリヌクレオチドは、ＨＣＶの構造タンパク質および非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
このようなポリヌクレオチドとして、配列番号２のアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。
配列番号２のアミノ酸配列は、構造タンパク質（Ｃｏｒｅ、Ｅ１、及びＥ２）を含む領域と非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）を含む領域からなる。
【００１６】
このようなＨＣＶの構造タンパク質（Ｃｏｒｅ、Ｅ１、及びＥ２）と非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（すなわち、ＨＣＶのウイルスタンパク質）のうち、Ｃｏｒｅはコアタンパク質であり、Ｅ１及びＥ２はエンベロープタンパク質であり、非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質である。また、ＮＳ２はメタロプロテアーゼ活性、ＮＳ３はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。さらに、ＮＳ４ＡはＮＳ３のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有することも報告されている。
【００１７】
配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸番号１〜１９１がＣｏｒｅタンパク質に該当し、アミノ酸番号１９２〜３８３がＥ１タンパク質に該当し、アミノ酸番号３８４〜８０９がＥ２タンパク質に該当し、アミノ酸番号８１０〜１０２６がＮＳ２タンパク質に該当し、アミノ酸番号１０２７〜１６５７がＮＳ３タンパク質に該当し、アミノ酸番号１６５８〜１７１１がＮＳ４Ａタンパク質に該当し、アミノ酸番号１７１２〜１９７２がＮＳ４Ｂタンパク質に該当し、アミノ酸番号１９７３〜２４２０がＮＳ５Ａタンパク質に該当し、アミノ酸番号２４２１〜３０１１がＮＳ５Ｂタンパク質に該当する。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドはＲＭＴ株に由来するものであるが、ＲＭＴ株そのものに限定されず、ＲＭＴ株の誘導体に由来するものであってもよい。
すなわち、本発明の第１の態様にかかるポリヌクレオチドは、機能的な前記各ウイルスタンパク質をコードする限り、その配列内に置換、欠失、付加、挿入等が存在していてもよい。具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列全体に対して、９８％以上、好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００１９】
また、本発明の第１の態様にかかるポリヌクレオチドは、機能的な前記各ウイルスタンパク質をコードする限り、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００２０】
培養細胞における複製能を高く維持するためには、配列番号２の１２０２位のグルタミン酸に相当するアミノ酸がグリシンへ置換されていることが好ましく、１２０２位のグルタミン酸に相当するアミノ酸がグリシンへ置換され、１０５６位のグルタミン酸に相当するアミノ酸がバリンへ置換され、かつ２１９９位のアラニンに相当するアミノ酸がスレオニンへ置換されていることがより好ましい。また、上記置換に加えて、配列番号２の２３２１位のセリンに相当するアミノ酸のプロリンへの置換および／または２８８９位のロイシンに相当するアミノ酸のフェニルアラニンへの置換を含んでもよい。
ここで、「配列番号２の１２０２位のグルタミン酸に相当するアミノ酸」とは、配列比較した時に配列番号２の１２０２位のグルタミン酸の位置に存在するアミノ酸を意味し、仮に１２０２位より前に１アミノ酸欠失して１２０２位が１２０１位になった場合は、１２０１位のアミノ酸を「配列番号２の１２０２位のグルタミン酸に相当するアミノ酸」と呼ぶ。
【００２１】
本発明の第１の態様にかかるポリヌクレオチドは、ＨＣＶの前記構造タンパク質および非構造タンパク質をコードするものであるが、その前後にそれぞれ５'非翻訳領域および３'非翻訳領域を含み、感染能及び自律複製能を持ったＨＣＶを産生できるものであることが好ましい。このようなポリヌクレオチドとしては、ウイルスゲノムＲＮＡやそれを発現するＤＮＡなどが例示される。
【００２２】
このようなポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号１〜３４１が「５'非翻訳領域（５'ＵＴＲ）」、３４２〜９１４がＣｏｒｅタンパク質コード領域、９１５〜１４９０がＥ１タンパク質コード領域、１４９１〜２７６８がＥ２タンパク質コード領域、２７６９〜３４１９がＮＳ２タンパク質コード領域、３４２０〜５３１２がＮＳ３タンパク質コード領域、５３１３〜５４７４がＮＳ４Ａタンパク質コード領域、５４７５〜６２５７がＮＳ４Ｂタンパク質コード領域、６２５８〜７６０１がＮＳ５Ａタンパク質コード領域、及び７６０２〜９３７４がＮＳ５Ｂタンパク質コード領域」であり、９３７５〜９５９８が「３'非翻訳領域（３'ＵＴＲ）」である。
【００２３】
本発明の第一の態様にかかるポリヌクレオチドには、配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドに限定されず、配列番号１の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレチドも、それが前記した所望の各タンパク質をコードする限り、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいうが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば95％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼ−ションの洗いの条件である６０℃、０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００２４】
本発明の第一の態様に係るポリヌクレオチドを非ヒト哺乳動物に導入することにより、１ａ型ＨＣＶ感染モデル動物を作製することができる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、チンパンジー等が挙げられるが、ヒト肝細胞キメラマウスが好ましい。
アルブミンのエンハンサーとプロモーターに連結したウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（uPA）遺伝子をトランスジェニックしたマウス（uPA-Tgマウス）とSCIDマウスを掛け合わせたuPA/SCIDマウスを作製し、このマウスにヒト肝細胞を移植し、マウス肝臓の70％以上がヒト肝細胞で置換されたヒト肝細胞キメラマウスを作製した。このようにして作製されたヒト肝細胞キメラマウスに、HCVを接種すると、HCV持続感染キメラマウスを作製することができる。
このような１ａ型ＨＣＶ感染モデル動物は１ａ型ＨＣＶの感染や複製の制御機構の研究や医薬候補物質の評価やスクリーニングなどに利用できる。
【００２５】
また、本発明の第一の態様に係るポリヌクレオチドを培養細胞に導入することにより、１ａ型ＨＣＶ産生細胞を得ることができる。細胞の種類は特に制限されないが、哺乳動物由来の細胞が好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがより好ましく、具体的には、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような１ａ型ＨＣＶ産生細胞は１ａ型ＨＣＶの感染や複製の制御機構の研究や医薬候補物質の評価やスクリーニングなどに利用できる。
【００２６】
本発明の第２の態様にかかるポリヌクレオチドは、ＨＣＶの非構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
このようなポリヌクレオチドとして、配列番号５のアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。
配列番号５のアミノ酸配列は、非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）を含む。
【００２７】
配列番号５のアミノ酸配列において、アミノ酸番号２〜６３２がＮＳ３タンパク質に該当し、アミノ酸番号６３３〜６８６がＮＳ４Ａタンパク質に該当し、アミノ酸番号６８７〜９４７がＮＳ４Ｂタンパク質に該当し、アミノ酸番号９４８〜１３９５がＮＳ５Ａタンパク質に該当し、アミノ酸番号１３９６〜１９８６がＮＳ５Ｂタンパク質に該当する。
【００２８】
本発明の第２の態様にかかるポリヌクレオチドは、機能的な前記各タンパク質をコードする限り、その配列内に置換、欠失、付加、挿入等が存在していてもよい。具体的には、配列番号５で示されるアミノ酸配列全体に対して、９８％以上、好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００２９】
本発明の第２の態様にかかるポリヌクレオチドは、機能的な前記各タンパク質をコードする限り、その配列内に置換、欠失、付加、挿入等が存在していてもよい。具体的には、配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸、具体的には、１〜３０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００３０】
本発明の第２の態様にかかるポリヌクレオチドは、非構造タンパク質をコードする領域の前後にそれぞれ５'非翻訳領域と３'非翻訳領域を有し、宿主細胞において自律複製能を有するＲＮＡまたはそれを産生することのできるＤＮＡであることが好ましい。本明細書では、宿主細胞において自律複製能を有するＲＮＡを、「レプリコンＲＮＡ」又は「ＲＮＡレプリコン」と呼ぶ。
【００３１】
本発明に係るＨＣＶレプリコンＲＮＡの一つの実施形態は、ＲＭＴ株のゲノムＲＮＡ上の、５'非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、３'非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡである。
本発明に係るＨＣＶレプリコンＲＮＡまたはそれを発現するＤＮＡは宿主細胞において効率よく複製できるような変異を含むことが好ましい。
このような変異としては、配列番号５の１７７位（配列番号２の１２０２位）のグルタミン酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換が挙げられ、配列番号５の１７７位（配列番号２の１２０２位）のグルタミン酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換、配列番号５の３１位（配列番号２の１０５６位）のグルタミン酸に相当するアミノ酸のバリンへの置換、かつ配列番号５の１１７４位（配列番号２の２１９９位）のアラニンに相当するアミノ酸のスレオニンへの置換の３重変異がより好ましい。また、上記置換に加えて、配列番号５の１２９６位のセリンに相当するアミノ酸のプロリンへの置換および／または１８６４位のロイシンに相当するアミノ酸のフェニルアラニンへの置換を含んでもよい。
【００３２】
本発明に係るＨＣＶレプリコンＲＮＡは、さらに１つのＩＲＥＳ配列を含んでもよく、これにさらに１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含んでよい。
選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子は、ＩＲＥＳ配列の上流に連結されてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の上流又は下流に連結されてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の中に挿入されてもよい。
【００３３】
本発明に係るＨＣＶレプリコンＲＮＡの好適な実施形態は、５'非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列と、ＨＣＶのゲノムＲＮＡ上のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、３'非翻訳領域とを含むポリヌクレオチドからなる、レプリコンＲＮＡである。
【００３４】
本発明に係るレプリコンＲＮＡは、より好ましくは、ＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の５'非翻訳領域を有し、それよりも下流に選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」とをこの順番で有し、さらに最も３'側にＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の３'非翻訳領域を有する。
【００３５】
本発明に係るＨＣＶレプリコンＲＮＡのさらに好ましい１つの実施形態は、配列番号３の塩基配列からなるＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡである。さらに、配列番号３の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸をも含む。なお、ストリンジェントな条件とは上述したとおりである。
なお、配列番号３の塩基配列においては、塩基番号１〜３４１が「５'ＵＴＲ」、３４２〜１１８１がネオマイシン耐性遺伝子、１１８５〜１７６４がＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、１７６５〜７７２２が非構造タンパク質（ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂタンパク質）コード領域」であり、７７２３〜７９４６が「３'ＵＴＲ」である。
以上、レプリコンＲＮＡについて説明したが、これらのレプリコンＲＮＡを発現できるＤＮＡも当然に本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
【００３６】
本発明において「自律複製能を有する」とは、レプリコンＲＮＡを細胞中に導入したときに、そのレプリコンＲＮＡが細胞内でそのレプリコンＲＮＡ自身を複製することができることを意味する。この自律複製能は、例えば、レプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞中にトランスフェクションし、Ｈｕｈ７細胞を培養し、得られる培養物中の細胞から抽出したＲＮＡについて、導入したレプリコンＲＮＡを特異的に検出可能なプローブやプライマーを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲを行ってレプリコンＲＮＡの存在を検出することにより、確認することができる。自律複製能を確認するための具体的な操作は、本明細書の実施例に記載されたコロニー形成能の測定、ＨＣＶタンパク質の発現確認、レプリコンＲＮＡの検出等の記載に従って行うことができる。
【００３７】
本発明に係るレプリコンＲＮＡには、上記したような配列の他に、レプリコンＲＮＡを導入する細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子を含むＲＮＡを含んでもよい。外来遺伝子は、５'非翻訳領域の下流に連結してもよいし、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の上流又は下流に連結させてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の上流又は下流に連結してもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の中に挿入してもよい。外来遺伝子を含むレプリコンＲＮＡは、導入された細胞内で翻訳される際に、該外来遺伝子にコードされたタンパク質を発現することができる。従って外来遺伝子を含むレプリコンＲＮＡは、遺伝子治療などの、特定の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする場合にも、好適に使用することができる。
【００３８】
本発明において「選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現された細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。
【００３９】
また本発明において「リポーター遺伝子」とは、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。リポーター遺伝子の一般的な例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のイクリオン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。
上記の選択マーカー遺伝子及びリポーター遺伝子は、レプリコンＲＮＡ中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。
【００４０】
本発明における「ＩＲＥＳ配列」とは、ＲＮＡの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。本発明におけるＩＲＥＳ配列の好適な例としては、以下に限定するものではないが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ ＩＲＥＳ、ＨＣＶ ＩＲＥＳ、等が挙げられるが、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、及びＨＣＶ ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが最も好ましい。
【００４１】
また本発明に係るレプリコンＲＮＡには、さらにリボザイムを含んでいてもよい。リボザイムは、５'側のレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、又は外来遺伝子と、それより３'側のＩＲＥＳ配列、及び「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」とを連結するように挿入し、リボザイムの自己切断活性により両者が切断されて分離するようにすることができる。
【００４２】
本発明に係るレプリコンＲＮＡにおいては、上述したような選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、劇症肝炎患者由来のＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上のウイルスタンパク質をコードする配列、及び外来遺伝子等が、レプリコンＲＮＡから正しい読み枠で翻訳されるように連結される。それらの配列のうち、タンパク質をコードする配列は、Ｃ型肝炎ウイルスの「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」から翻訳されるポリタンパク質とともに融合タンパク質として発現させた後で、プロテアーゼによって各タンパク質へと分離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させてもよい。
【００４３】
本発明に係るＨＣＶレプリコンＲＮＡは、当業者に公知である任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。例えば、ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、以下のような方法で作製することができる。
まず、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質と３'非翻訳領域のＲＮＡに対応するＤＮＡとを、常法によりクローニングベクターに挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。一方、５'非翻訳領域はＲＮＡプロモーターの下流に挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。ここで、「ＲＮＡに対応するＤＮＡ」とは、当該ＲＮＡの塩基配列のｕ（ウラシル）をｔ（チミン）に置き換えた塩基配列からなるＤＮＡを意味する。前記ＲＮＡプロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。好適なＲＮＡプロモーターとしては、限定するものではないが、Ｔ７ ＲＮＡプロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡプロモーター、ＳＰ３ ＲＮＡプロモーターが挙げられ、Ｔ７ ＲＮＡプロモーターが特に好ましい。
【００４４】
次に、作製した５'非翻訳領域ＤＮＡクローンについて、例えば、５'非翻訳領域の下流に、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を挿入し、その下流にＩＲＥＳ配列を挿入する。そして、両クレーンを連結することにより本発明に係るＨＣＶレプリコンＲＮＡを発現するＤＮＡを得ることができる。
【００４５】
次いで、上記で作製したＤＮＡクローンを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。ＲＮＡ合成は、５'非翻訳領域及びＩＲＥＳ配列から、常法により開始させることができる。鋳型ＤＮＡがプラスミドクローンの場合には、そのプラスミドクローンから、ＲＮＡプロモーターの下流に連結された上記ＤＮＡ領域を制限酵素によって切り出し、そのＤＮＡ断片を鋳型として用いてＲＮＡを合成することもできる。このようにして、本発明に係るレプリコンＲＮＡが得られる。
【００４６】
上記のようにして作製されたレプリコンＲＮＡを、レプリコンＲＮＡを複製させるべき細胞に導入することにより、レプリコンＲＮＡが持続的に複製される細胞を得ることができる。本明細書では、レプリコンＲＮＡが持続的に増幅される細胞を「レプリコン複製細胞」と称する。
【００４７】
レプリコンＲＮＡを導入する細胞としては、継代培養することが可能な細胞であれば任意の細胞を用いることができるが、真核細胞であることが好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがより好ましく、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞であることがさらに好ましい。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から入手して使用してもよいし、任意の細胞（例えば、癌細胞又は幹細胞）から株化した細胞を使用してもよい。
【００４８】
レプリコンＲＮＡの細胞内への導入は、当業者には公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥセファロース法等が挙げられるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
細胞内導入に用いるレプリコンＲＮＡの量は、使用する導入法に応じて決めればよいが、好ましくは１ピコグラム〜１００マイクログラム、より好ましくは１０ピコグラム〜１０マイクログラムの量を使用する。
【００４９】
細胞内導入のために選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含有するレプリコンＲＮＡを用いる場合には、そのレプリコンＲＮＡが導入され持続的に複製している細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現を利用して、選択することができる。具体的には、例えば、そのようなレプリコンＲＮＡの細胞内導入処理を施した細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現により選択可能となる培地において培養すればよい。
【００５０】
一例として、レプリコンＲＮＡにネオマイシン耐性遺伝子が選択マーカー遺伝子として含まれる場合には、そのレプリコンＲＮＡを用いて細胞内導入処理した細胞を培養ディッシュに播種し、１６〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を０．０５ミリグラム／ミリリットル〜３．０ミリグラム／ミリリットルの濃度で添加し、その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続し、播種時から好ましくは１０日間〜４０日間、より好ましくは１４日間〜２８日間培養した後にクリスタルバイオレットで生存細胞を染色することにより、レプリコンＲＮＡが導入され持続的に複製されている細胞を、コロニーとして選択することができる。
形成されたコロニーからは、常法により細胞をクローン化することができる。こうして得られる目的のレプリコンＲＮＡが持続的に複製される細胞クローンを、本明細書では「レプリコン複製細胞クローン」と称する。
【００５１】
樹立した細胞クローンについては、導入されたレプリコンＲＮＡから該細胞クローン中で複製されているレプリコンＲＮＡの検出、導入されたレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認、及びＨＣＶタンパク質の発現の確認を行って、実際に目的のレプリコンＲＮＡが持続的に複製されていることを確認することが好ましい。
導入されたレプリコンＲＮＡから該細胞クローン中で複製されたレプリコンＲＮＡ（本明細書中では、以下便宜的に、「複製レプリコンＲＮＡ」と称する）の検出は、当業者には公知の任意のＲＮＡ検出法に従って行えばよいが、例えば、細胞クローンから抽出したトータルＲＮＡについて、導入されたレプリコンＲＮＡに対して特異的なＤＮＡ断片をプローブやプライマーとして用いるノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲを実施することにより検出することができる。
【００５２】
また導入されたレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの確認は、例えば、細胞クローンから抽出した宿主ゲノムＤＮＡについて該選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の少なくとも一部を増幅するＰＣＲを行い、その増幅産物の有無を確認することによって行うことができる。
【００５３】
ＨＣＶタンパク質の発現の確認は、例えば、導入されたレプリコンＲＮＡから発現されるべきＨＣＶタンパク質に対する抗体を、細胞クローンから抽出したタンパク質と反応させることによって行うことができる。この方法は、当業者には公知の任意のタンパク質検出法によって行うことができるが、具体的には、例えば、細胞クローンから抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗ＨＣＶタンパク質抗体（例えば、抗ＮＳ３特異的抗体、又はＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗ＨＣＶタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。細胞クローンから抽出したタンパク質中からＨＣＶタンパク質が検出されれば、その細胞クローンは、ＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡが持続的に複製してＨＣＶタンパク質を発現しているものと判断することができる。
【００５４】
以上のようにして、目的のレプリコンＲＮＡを持続的に複製していることが確認された細胞クローン（レプリコン複製細胞クローン）を得ることができる。
【００５５】
本発明に係るレプリコン複製細胞は、ＨＣＶタンパク質を製造するためにも好適に使用することができる。レプリコン複製細胞からのＨＣＶタンパク質の製造は、当業者であれば常法に従って行うことができる。具体的には、例えば、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び培養培地を含む）から常法によりタンパク質を取得することができる。
【００５６】
本発明に係るレプリコンＲＮＡ複製細胞は、例えばＨＣＶの複製やＨＣＶタンパク質の翻訳を抑制する物質をスクリーニングまたは評価するための試験系として使用することもできる。具体的には、例えば、医薬候補物質の存在下でレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製を検出し、その物質がレプリコンＲＮＡの複製を抑制するかどうかを判定することにより、ＨＣＶの複製を抑制する物質をスクリーニングすることができる。この場合、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製の検出は、レプリコンＲＮＡ複製細胞から抽出したＲＮＡ中のレプリコンＲＮＡの量又は有無を検出することによるものであってもよいし、培養物中又は該培養物に含まれるレプリコンＲＮＡ複製細胞中のタンパク質に含まれるＨＣＶタンパク質の量又は有無を検出するものであってもよい。
また、医薬候補物質の存在下でレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡ由来のタンパク質を検出し、その物質がタンパク質の産生を抑制するかどうかを判定することにより、ＨＣＶのタンパク質の翻訳を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
なお、医薬候補物質としては特に制限はなく、例えば、低分子合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドや核酸であってもよい。スクリーニングには個々の被検物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもよい。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明は以下の態様に限定されない。
（実施例1）  Ｃ型肝炎ウイルスのクローニング
１．ウイルスの由来ジェノタイプ１ａの感染者血清（G-52998-035:国際試薬株式会社）を株式会社フェニックスバイオで作製したヒト肝細胞キメラマウス（Tateno et al. American Journal Pathology 2004, 165:901-912）に27Gのディスポーザブル注射針を用いて、100 μl眼窩静脈叢からの静脈内接種を行った。接種後翌週より週1回、ジエチルエーテル麻酔下で眼窩静脈叢よりIntramedicTM Polyethylene Tubing（0.58×0.965 mm、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、東京）を用いて10 μL採血した。採血後、直ちに血液を血清分離剤入りの500 μLセイフロックマイクロテストチューブ（エッペンドルフ株式会社、東京）に移した。5分以上室温にて静置し、13200×g、3分間の遠心分離を行い、得られた血清を−80℃で保存した。採取した血清１μLからSepaGene RV-R（三光純薬株式会社、東京）を用いてRNA抽出を行い、RNAを1 mM DTT（プロメガ株式会社、東京）と4 U/mL ribonuclease inhibitor（タカラバイオ株式会社、滋賀）を含む10 μLのNuclease-free water（アンビオン株式会社／アプライドバイオシステムズジャパン株式会社、東京）に溶解した。溶解したRNAは血清HCV RNA定量するまで−80±10℃で保存した。
血清中HCV RNA定量時に、in vitro合成したHCV RNAをコピースタンダードとして使用した。血清中HCV RNA濃度の定量限界は血清中4.0×104 copies/mLから1.0×109 copies/mLであった。
PCR反応液は、溶解したRNA原液もしくは希釈したRNAを2.5 μL用いて TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社、東京）で行った。PCR反応は、50℃2分→60℃ 30分→95℃ 5分→（95℃ 20秒→62℃ 1分）×50サイクルで行い、ABI Prism 7700（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）によって反応と解析を行った。また、血清中HCV RNA量は2ウエルの平均で算出した。
プライマーおよびプローブは、以下の配列を用いた。
フォワードプライマー：5'-CGGGAGAGCCATAGTGG-3'(配列番号６)
リバースプライマー：5'-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3' (配列番号７)
プローブ：5'-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (配列番号８)（5末端：FAM 、3末端：TAMRA）
その結果、ＨＣＶの感染が成立して血中ウイルス量は高値に維持された。その経過および血清採取タイミングを図1に示す。
その結果、このウイルスは高い感染複製効率を維持していることがわかった。【００５８】
２．ウイルスの全RNAの調製及びcDNAの合成
上記１で得られたキメラマウス血清10μlより、ISOGEN-LS（日本ジーン社製）を用いてAGPC法（acid-guanidinium-isothiocyanate-phenol-chloroform）で全RNAを抽出し、RNase-free水に溶解した。前記で得た全RNAを用いてHCV-H77株配列（アクセッション番号：AF011751）より作成したプライマー（9569番塩基から21塩基長のアンチセンス配列）及びLongRange Reverse Transcriptase（Qiagen社製）による逆転写反応を、25℃・10分、42℃・90分行い、逆転写酵素不活化処理を85℃・5分行った後、RNaseH（Invitrogen社製）を添加して37℃・20分処理してウイルスRNAを消化し、cDNAのみを残存させた。【００５９】
３．配列の決定
合成されたcDNAをPCR反応の鋳型としてnested PCRを行った。上記反応液を全量の1/10添加し、酵素はPhusion DNA polymerase（Fynnzymes社製）を用いた。PCRプライマーは、HCV-H77のシークエンスをもとにデザインした（図２）。増幅される断片は、1次PCR反応では塩基番号9-4054、2952-7057、5963-9569の3本である。2次PCR反応ではそれぞれの反応溶液を鋳型として、塩基番号23-4033、2967-7035、5981-9554の3本を増幅した。PCRの条件は、98℃・10秒間の変性、60℃・30秒間のアニーリング、及び72℃・2分30秒間の反応を、1次PCR反応は20サイクル、2次PCR反応は30サイクルで行った。これらのDNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、Wizard SV gel and PCR clean-up system（Promega社製）で精製後、TOPOクローニングキット（Invitrogen社製）を用いてクローニングし、出現したコロニーをピックアップして増殖させ、プラスミドDNAを精製してBig Dye Terminator Mix及び自動ＤＮＡシークエンサーmodel3100（Applied Biosystems社製）により各断片15クローン以上塩基配列を決定した。得られた配列情報より、各塩基位置で多数を占める塩基名を決定し、共通配列とした。全ての塩基位置で15クローン中11クローン以上の一致をみた。
続いて、5'-RACE法及び3'-RACE法を用いて5'末端側及び3'末端側のウイルスRNAの塩基配列を決定した。5'末端配列を決定するために、5'-RACEシステム（Invitrogen社製；Version 2.0）及びプライマー（261番塩基から21塩基長のアンチセンス配列）を用いて5'末端cDNAを合成し、合成したcDNAの5'末端にterminal deoxynucleotidyl transferaseによりポリC配列を付加した後、nested-PCRにより増幅した。
また、3'末端配列を決定するために、抽出したウイルスRNAをpoly(A) polymerase（宝酒造社製）を使用してポリA配列を付加し、オリゴd(T)プライマーを用いてcDNAを作成し、特異的プライマー（9385番塩基から24塩基長のセンス配列）及びオリゴd(T)プライマーによりPCR増幅した。これらのDNA断片も同様にTOPOクローニングを行い、10クローン以上の配列を決定し、共通配列を得た。クローニングに使用したプライマーのHCV-H77配列上の位置と長さを図2に示す。これらのうち、領域2952-2972および5981-6000に相当するプライマーについては、先に得られた配列情報よりRMT配列にあわせて作成した。
以上により、全ウイルスゲノム共通配列を得、これをHCV-RMT株と命名した。得られた9598塩基長の塩基配列を配列番号1に示した。決定された全ウイルスゲノムの塩基配列は、その342番から9374番の間に3011個のアミノ酸残基をコードする長い翻訳領域を有するものであった。そのアミノ酸配列を配列番号２に付記した。
なお、RMT株のゲノム塩基配列は同じく１ａ型であるＨ７７株との間で、塩基配列レベルで９２．８％、アミノ酸配列レベルで９５．１％のホモロジーを有していた。【００６０】
（実施例2）  キメラマウス感染性の確認
１．ウイルスRNA発現ベクターの構築
実施例1より得られたHCV-RMT株配列を用いて発現ベクターを作成した。5'末端にT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を、3'末端に制限酵素XbaI切断サイトをつないてpBR322に挿入した。また、塩基番号3941のTをCに変換してHCV-RMT配列内のXbaI切断サイトをアミノ酸配列を変えることなく滅失した。変異の導入には、QuikChangeII Site-Directed Mutagenesis kit（Stratagene社製）を用いた。この発現ベクターをXbaIで消化し、mung bean nucleaseで1本鎖部分を除いたDNA断片をT7ポリメラーゼの鋳型に用いることで、HCVゲノム長のRNAが合成されるようにした。作製した発現ベクターをpRMTxと称し、その構造を図3に示す。【００６１】
２．HCV-RMT株RNAの作製とヒト肝細胞キメラマウス肝臓への注入
pRMTxをXbaIで充分に消化し、Mung bean nucleaseでXbaI切断後の1本鎖部分を除去した。次に、このDNA断片を用いて、RiboMAX（Promega社製）でRNAを合成した。37℃・90分の反応後、37℃・30分のDNase処理を行い、microspin-G25カラム（GE HealthCare社製）で合成RNAを精製後、フェノール抽出・エタノール沈殿した。得られたRNAの一部をアガロース電気泳動して目的サイズのRNAができていることを確認した。
10-14週齢のマウス血中ヒトアルブミン濃度が6 mg/ml以上のヒト肝細胞キメラマウスを開腹し、このＲＮＡ 400 μL/75 μgを肝臓に直接注射器を用いて注入した。接種後翌週より週1回、ジエチルエーテル麻酔下で眼窩静脈叢よりIntramedicTM Polyethylene Tubingを用いて10 μL採血し、上記と同様に、血清中のHCV-RNAコピー数を測定した。また、pRMTx においてE1202G（配列番号２の1202番のグルタミン酸がグリシンに置換する変異）を導入したpRMTx-E1202Gについても同様の実験を行った。
これらの結果、図4に示すとおり、HCV-RMT株は比較対照のJFH1株と比較して、キメラマウス血清中に高いHCV RNAコピー数が検出され、キメラマウスにおける高い複製能を持つことがわかった。また、HCV-RMT-E1202G株についても3週間後にはJFH1株と比較して高いHCV RNAコピー数が検出された。【００６２】
（実施例3）  レプリコン複製能の確認と馴化変異の同定
１．レプリコンRNA発現ベクターの構築
定法（Lohman et al., Science, 1999）に従って、上記pRMTxベクター内のHCV-RMT配列塩基番号391から3419までを削除し、代わりにネオマイシン耐性蛋白質配列、続けてEMCV-IRES配列及び開始コドンを挿入した。作成した発現ベクターをpRMTx-neoと称し、その構造を図5に、該発現ベクターより作製されるレプリコンRNAの塩基配列を配列番号５に、翻訳され生成する蛋白のアミノ酸配列を配列番号６（ネオマイシン耐性蛋白質），７（非構造タンパク質）に示す。【００６３】
２．レプリコンRNAの作製
pRMTx-neoをXbaIで充分に消化し、Mung bean nucleaseでXbaI切断後の1本鎖部分を除去した。次に、このDNA断片を用いて、RiboMAX（Promega社製）でRNAを合成した。37℃・90分の反応後、37℃・30分のDNase処理を行い、microspin-G25カラム（GE HealthCare社製）で合成RNAを精製後、フェノール抽出・エタノール沈殿した。得られたRNAの一部をアガロース電気泳動して目的サイズのRNAができていることを確認した。【００６４】
３．レプリコン複製細胞クローンの樹立とレプリコン配列変異の同定
前記２で作製した合成レプリコンRNA30μgをエレクトロポレーション法によりHuh7細胞に導入した。RNAを導入したHuh7細胞を培養ディッシュに播種し、16時間培養後培養ディッシュにG418（ネオマイシン）を300μg/mlで添加した。その後、週に3回培地を交換しながら培養を継続したところ、播種21日後に2つのコロニーが形成された。これらのコロニーをクローン化し、培養を継続したところ、安定に複製を維持するレプリコン複製クローン1株の樹立に成功した。樹立クローンよりトータルRNAを調整し、PCR増幅して共通配列を決定したところ、アミノ酸番号1056番のグルタミン酸がバリン（E1056V）、1202番のグルタミン酸がグリシン（E1202G）、2199番のアラニンがスレオニン（A2199T）、に変化した3つの変異が確認された。【００６５】
４．レプリコン配列変異の有用性解明
レプリコン複製クローンで確認された3変異を、単独あるいは複合でpRMTx-neoに導入した。得られた変異導入ベクターからレプリコンRNAを作製し、5μgを前記３と同様にエレクトロポレーション法によりHuh7細胞に導入した。21日間のG418選択後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色したところ、図6に示すとおり、コロニー形成が確認された。
この結果より、これら3変異間の比較では、E1202G、E1056V、A2199Tの順でHuh7細胞内増殖性が向上していた。また、いずれの単独変異導入クローンよりも3変異全てを導入したクローンの方が増殖性（複製能）が高いこともわかった。【００６６】
（実施例4）  馴化変異導入HCV-RMT株の培養細胞増殖能の確認
pRMTxにE1202G または3馴化変異（E1202G、E1056V、A2199T）を導入し、得られたベクターをそれぞれpRMTx-E1202G、pRMTx-triとした。pRMTx、pRMTx-E1202GおよびpRMTx-triよりウイルスゲノムRNA（それぞれRMT、RMT-E1202GおよびRMT-tri）を作製し、30μgをHuh7細胞にエレクトロポレーション法で導入した。培養ディッシュに播種後、週3-4回継代するとともに細胞を分取した。分取した細胞から、AGPC法で全RNAを精製し、定法（Takeuchi et al., Gastroenterology, 1999）に従って逆転写リアルタイムPCR法で全RNA・1μgあたりのHCVゲノムコピー数を、QuantiTect Multiplex PCR kit（Qiagen社製）を用いて定量した。RMT-RNA、RMT-E1202G-RNAおよびRMT-tri-RNA導入細胞におけるHCVゲノムコピー数の経日変化を図7に示す。馴化変異のないRMT-RNAが速やかに消失するのに対して、RMT-tri-RNAは1ヶ月以上にわたって1x106コピー／μg程度のウイルスゲノム量が維持されることがわかった。また、RMT-E1202G-RNAも12日目でも1x105コピー／μg以上のウイルスゲノム量が維持されることがわかった。【００６７】
また、HCVゲノムが維持されている状態のゲノム導入10日後の細胞を96wellプレートに播種して16時間後に薬剤を添加し、48時間後に各wellよりABIprizm6100および精製kit（Applied Biosystems社製）を用いての全RNAを精製した。上記のリアルタイムPCR法を用いて得られたRNA中のHCV量を、吸光光度計を用いて全RNA量を定量した結果を図8に示す。抗HCV物質として、HCVポリメラーゼ阻害剤（MK0608）、HCVプロテアーゼ阻害剤（BILN2061）、IFN-α、シクロフィリン阻害剤（シクロスポリンA）を用いた。全ての抗HCV物質において文献情報程度のHCV増殖阻害能が観察され、HCV-RMT株持続増殖細胞が抗HCV物質の評価系として有用であることが確認された。【００６８】
（実施例5）  馴化変異導入HCV-RMT株増殖細胞からの感染性ウイルス産生の確認
実施例4で増殖を確認したRMT-tri導入細胞より、限界希釈法で単細胞培養を行った。細胞内ウイルス量を指標に各クローンから選別を行い、蛍光抗体法で全ての細胞にHCV-core蛋白発現が確認でき、細胞内HCVゲノム量が1x108コピー/μgである#11クローンを取得した。0.22μmフィルターろ過後の同クローンの培養上清を非感染のHuh7細胞に処理したところ、core蛋白の蛍光抗体法で感染細胞が確認された（図９）。同培養上清を、限外ろ過膜を用いて全量を約70分の1にすると、HCVコピー数約40倍濃縮された。濃縮培養上清は濃縮前の培養上清と比較して45倍の感染価を示した。
#11細胞中のHCV配列を決定したところ、RMT株と比較して、シーケンシングを行った10クローン全てでアミノ酸番号2321番目のセリンがプロリン（S2321P）に、2889番目のロイシンがフェニルアラニン（L2889F）に変わっていた。これらの変異がRMT株の感染性及び増殖性の向上に寄与している可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明にかかる遺伝子型１ａであるHCV-RMT株に由来するポリヌクレオチドおよび同定された馴化変異を利用することにより、高確率で複製効率の良い遺伝子型１ａのHCVレプリコンRNAおよびHCVゲノムRNAを作製することができる。該レプリコンRNAを導入したレプリコン複製細胞および該HCVゲノムRNAを導入したHCV増殖細胞は、HCV由来のRNA及びHCVタンパク質を持続的に産生させるための培養系として利用できる。さらに前記レプリコン複製細胞およびHCV増殖細胞は、HCVの複製及び／又はHCVタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各
種物質をスクリーニングするための試験系として利用できる。【００７０】
［配列表の説明］
１．HCV-RMT株ゲノム全長の塩基配列
２．HCV-RMT株にコードされるアミノ酸配列
３．HCV-RMT株由来レプリコンの塩基配列
４．ネオマイシン耐性タンパク質のアミノ酸配列
５．HCV-RMT株にコードされる非構造タンパク質のアミノ酸配列
６．フォワードプライマーの塩基配列
７．リバースプライマーの塩基配列
８．プローブの塩基配列
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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