(57)【要約】  本発明は、所定の面２３上に金属薄膜２５が形成されたプリズム２１に対し、全反射された状態で金属薄膜２５への入射角θを変えながら光線αを射出し、金属薄膜２５で光線αが反射されることにより金属薄膜２５の表面２５ａ側で生じる光を測定し、測定された光の強度変化に基づいて光線αが金属薄膜２５に入射する角度θ５を決定し、この決定された入射角θ５で金属薄膜２５に光線αが入射するように当該光線αの射出方向を調整し、射出方向を調整された光線αを射出した状態で、金属薄膜２５の表面２５ａ側で生じた蛍光を測定する。
2011152064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含まれる蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
所定の面の面上に金属膜が形成されたプリズムを有するプリズム部と、
前記金属膜により反射されるように前記プリズムの内部に光線を前記所定の面と異なる面から入射させる光源と、
前記金属薄膜により前記光線が反射されることによって当該金属膜における前記プリズムと反対の面側で生じる光の強度を測定可能な光測定部と、
前記光測定部により測定された光の強度に基づいて前記光源における光線の射出方向を調整する制御部と、を備えることを特徴とする表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項２】
前記光測定部は、前記金属膜において生じたプラズモン散乱光の強度を測定することを特徴とする請求項１に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項３】
前記光測定部は、前記金属膜において生じた光を受光する受光部と、
入射した光を減衰させて出射する第１の光フィルタと、
前記金属膜と前記受光部との間である中間位置とこの中間位置よりも前記金属膜及び前記受光部から離れた待避位置との間で前記第１の光フィルタの位置を切り換える位置切換部と、を有することを特徴とする請求項２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項４】
前記光測定部は、所定の波長の光を遮る第２の光フィルタを有し、
前記位置切換部は、前記第１の光フィルタが前記中間位置のときに前記第２の光フィルタが前記待避位置となり、前記第１の光フィルタが前記待避位置のときに前記第２の光フィルタが前記中間位置となるように、前記第１の光フィルタ及び前記第２の光フィルタの位置をそれぞれ切り換え可能であることを特徴とする請求項３に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項５】
前記金属膜における前記プリズムと反対側の面には、前記検体に含まれる特定の抗原を捕捉可能な捕捉体が固定され、
前記光測定部は、前記捕捉体に捕捉された特定の抗原に基づく前記蛍光物質の蛍光の強度を測定することを特徴とする請求項１又は２に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項６】
前記光測定部は、前記金属膜で生じた光を受光する受光部と、
所定の波長の光を遮る光フィルタと、を有し、
前記光フィルタは、前記金属膜と前記受光部との間である中間位置に配置されることを特徴とする請求項５に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項７】
検体に含まれる蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、
所定の面の面上に金属膜が形成されたプリズムを有するプリズム部を着脱可能に保持する保持部と、
前記保持部に前記プリズム部が保持されたときに前記プリズムに向けて光線を射出可能な光源と、
前記保持部に前記プリズム部が保持されたときにこのプリズム部の前記金属膜により光線が反射されることによって当該金属膜における前記プリズムと反対の面側で生じる光の強度を測定可能な光測定部と、
前記光測定部により測定された光の強度に基づいて前記光源における光線の射出方向を調整する制御部と、を備え、
前記保持部は、前記光源から射出された光線が前記プリズムの内部に入射してこの入射した光線が前記金属膜により反射される姿勢となるように前記プリズム部を保持することを特徴とする表面プラズモン共鳴蛍光分析装置。
【請求項８】
検体に含まれる蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析方法であって、
所定の面の面上に金属膜が形成されたプリズムに対し、前記金属膜によって反射されるように前記所定の面と異なる面から当該プリズムの内部に光線を入射させ、この光線が前記金属膜により反射された状態で当該金属膜への入射角を変えながら光線を射出する光射出工程と、
前記金属膜により光線が反射されることによって当該金属膜における前記プリズムと反対の面側において生じる光を測定する光測定工程と、
前記光測定工程において測定された光の強度変化に基づいて前記光線が前記金属薄膜に入射する角度を決定する射出方向決定工程と、
前記射出方向決定工程において決定された入射角で光線が前記金属膜に入射するように当該光線を射出する射出工程と、
前記金属膜の前記プリズムと反対側の面に接するように前記検体を流し、前記射出工程における光線の射出に基づく前記金属膜のプリズムと反対の面側において生じた蛍光を測定する検査工程と、を備えることを特徴とする表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【請求項９】
前記光測定工程は、前記金属膜において生じたプラズモン散乱光の強度を測定することを特徴とする請求項８に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【請求項１０】
前記金属膜は、前記検体に含まれる特定の抗原を捕捉可能な捕捉体を前記プリズムと反対側の面に固定され、
前記光測定工程は、前記補足体に捕捉された特定の抗原に基づく前記蛍光物質の蛍光の強度を測定することを特徴とする請求項８に記載の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴によって生じたエバネッセント波の電場を利用して検体に含まれる蛍光物質を発光させ、この蛍光を検出することにより検体を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（以下、単に「蛍光分析装置」とも称する。）としては、特許文献１に記載のものが知られている。この分析装置では、プリズムに成膜した金属膜において表面プラズモン共鳴を生じさることにより前記金属膜の表面近傍に増強された電場（増強電場）が形成され、この増強電場を利用して高感度且つ高精度の検体の検査が行われる。【０００３】
具体的に、この蛍光分析装置は、図６及び図７に示されるように、金属膜１１２が形成されたプリズム部１１０と、このプリズム部１１０に向けて光線αを射出する光源１２０と、プリズム部１１０において反射された光線αを測定する受光部１３０と、金属膜１１２の近傍において増強電場に基づく光（蛍光）を検出するための蛍光検出手段１４０と、を備える。【０００４】
プリズム部１１０は、三角プリズム（以下、単に「プリズム」と称する。）１１４と、このプリズム１１４の頂角に対向する所定の面１１４ｂ上に成膜された金属膜１１２と、この金属膜１１２の表面（プリズム１１４と反対側の面）１１２ａ上に成膜され、検体（試料溶液）中の特定の抗原を捕捉する抗体が表面に固定された抗体固層膜１１３と、検体が抗体固層膜１１３の表面と接しつつ流れることができる流路１１６を有する流路部材１１７とを備える。【０００５】
このプリズム部１１０において、プリズム１１４は、光源１２０から射出された光線αを一方の斜面（入射面）１１４ａからプリズム１１４の内部に入射させ、所定の面１１４ｂ上に設けられた金属膜１１２により反射された光線αを他方の斜面（射出面）１１４ｃから外部に射出する。詳しくは、プリズム１１４内に入射した光線αは、金属膜１１２の裏面（プリズム１１４側の面）１１２ｂ側から金属膜１１２の表面１１２ａで全反射され、射出面１１４ｃからプリズム１１４の外部に射出される。【０００６】
光源１２０は、プリズム１１４の入射面１１４ａに向けて光線αを射出するものである。この光源１２０は、金属膜１１２への光線αの入射角θを変更可能に構成されている。受光部１３０は、金属膜１１２により反射されてプリズム１１４の射出面１１４ｃからプリズム１１４の外部に射出された光線αを受光し、その強度を測定する。蛍光検出手段１４０は、金属膜１１２に対して流路１１６を挟んで対向する位置に配置され、金属膜１１２の表面近傍に形成される増強電場により励起された蛍光物質の蛍光を検出する。【０００７】
この蛍光分析装置１００においては、以下のようにして検体の検査が行われる。【０００８】
蛍光分析装置１００は、流路１１６に検体を流す前に、金属膜１１２の表面近傍に増強電場を形成するための金属膜１１２への光線αの入射角θ（詳しくは、金属膜１１２の表面１１２ａに対して裏面１１２ｂ側から入射する光線αの入射角θ）を決定する。具体的には、金属膜１１２への光線αの入射角θを変えながら光源１２０から光線αが射出される。このとき、金属膜１１２により反射された光線αが受光部１３０によって受光され、その強度が測定される。これにより、金属膜１１２において表面プラズモン共鳴が生じる金属膜１１２への入射角である共鳴角（ＳＰＲ角）θ１が求まる（図８参照）。具体的には、反射光の強度が最も小さくなった金属膜１１２への入射角（即ち、反射率が最も小さくなった入射角）が共鳴角θ１となる。ここで、金属膜１１２において表面プラズモン共鳴が生じる共鳴角θ１と、増強電場が最も大きくなる金属膜１１２への光線αの入射角（増強電場最大角）θ２との間には、図８に示すようなズレがある。即ち、共鳴角θ１と増強電場最大角θ２とは一致しない。そのため、蛍光分析装置１００は、求めた共鳴角θ１から所定の角度を加減（通常、±０．５°を加減）して、検体を検査する際の入射角（測定角）θ３を決定する。【０００９】
光線αの金属膜１１２への入射角が測定角θ３となるように光源１２０の射出方向が調整される。これにより、金属膜１１２の表面１１２ａ近傍（金属膜１１２の流路１１６側近傍）に形成される増強電場が略最大となる。この状態のときに流路１１６に検体が流される。【００１０】
流路１１６に検体が流されると、抗原抗体反応により検体中の標的物質（特定の抗原）が抗体固層膜１１２ａに固定された抗体に捕捉される。そして、流路１１６に蛍光標識された抗体を流すことにより、抗原が捕捉された部分にのみ蛍光物質が標識される。この標識された蛍光物質は、金属膜１１２の表面近傍に形成されている増強電場により励起されて発光する。受光部１３０がこの蛍光を測定することにより蛍光分析装置１００において抗原の反応量を高感度且つ高精度に測定することができる。【００１１】
金属膜１１２において表面プラズモン共鳴が生じる共鳴角θ１と、金属膜１１２の表面近傍の増強電場が最大となる増強電場最大角θ２との間の角度のズレ量は、種々のパラメータにより決定される。従って、一部のパラメータが異なれば、共鳴角θ１と増強電場最大角θ２との間の角度のズレ量が変化するため、検査毎に共鳴角θ１が精度よく求められて測定角θ３が決定されても、金属膜１１２の表面近傍に形成される増強電場が最大とならない場合がある。即ち、蛍光分析装置１００において検査毎に増強電場の大きさにバラつきが生じる。そのため、蛍光分析装置１００によって同一検体の検査が行われても測定結果にバラつきが生じる場合があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】日本国特許第４３７０３８３号公報
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的は、検体に含まれる蛍光物質を励起させるための電場が最も大きくなるようなプリズム部の金属膜への光線の入射角を精度よく求めることが可能な表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法を提供することである。
【００１４】
本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、プリズムの所定の面の面上に形成された金属膜によって反射されるようにプリズム内に光線を照射し、この光線が金属膜に反射されることにより生じた光を測定し、この測定された光の強度に基づいて検体の測定の際の光線の射出方向を調整する。このため、本発明によれば、検体に含まれる蛍光物質を励起させるための電場が最も大きくなるようなプリズム部の金属膜への光線の入射角を精度よく求めることが可能な表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法を提供することができる。
【００１５】
上記並びにその他の本発明の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な記載と添付図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、第１実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置の概略構成図である。
【図２】図２は、前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において第１の光フィルタと第２の光フィルタとの位置を切り換えた状態の概略構成図である。
【図３】図３は、前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において、プリズム上に成膜された金属膜の表面近傍に生じるプラズモン散乱光の強度と電場増強度との関係を示す図である。
【図４】図４は、試薬チップを説明するための拡大斜視図である。
【図５】図５は、第２実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置の概略構成図である。
【図６】図６は、従来の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置の概略構成図である。
【図７】図７は、前記表面プラズモン共鳴蛍光分析装置のプリズム部の構造を示す拡大縦断面図である。
【図８】図８は、プリズム部の金属膜における光線の反射率と金属膜の表面近傍に生じるプラズモン散乱光の強度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の第１実施形態について、添付図面を参照しつつ説明する。
【００１８】
本実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（以下、単に「蛍光分析装置」とも称する。）は、図１及び図２に示すように、分析素子チップ（プリズム部）２０と、分析素子チップ２０に向けて光線を射出する光源４０と、分析素子チップ２０において生じた光を測定する光測定部５０と、分析素子チップ２０を着脱可能に保持する保持部１２とを備える。また、蛍光分析装置１０は、患者からの血液等の検体の前処理を行う前処理部（図示省略）と、光測定部５０により測定した光を分析するための演算部１４と、演算部１４における演算結果等の各種情報を表示するための表示部１６とを備える。
【００１９】
分析素子チップ２０は、プリズム２１と、プリズム２１の表面に成膜される金属膜２５と、金属膜２５上を当該金属膜２５に接しつつ検体や試薬、洗浄液等の試料溶液（以下、単に「検体」とも称する。）が流れる流路３１を形成する流路部材３０とを備える。
【００２０】
プリズム２１は、光源４０からの光線αをプリズム２１の内部に入射させる入射面２２と、このプリズム２１の内部に入射した光線αを反射する金属膜２５が成膜される成膜面（所定の面）２３と、金属膜２５で反射された光線αがプリズム２１の外部に射出される射出面２４とをその表面に含み、透明なガラス又は樹脂により形成されている。本実施形態のプリズム２１は、屈折率が１．４０〜１．７５程度の透明なガラス又は樹脂により形成されている。尚、プリズムは、側面視が本実施形態のように三角プリズムの頂角部分を切り取ったような形状でもよく、また、側面視が三角形状であってもよい（図１の点線部参照）。即ち、プリズムは、入射面と成膜面と射出面とをその表面に含み、入射面からプリズムの内部に入射した光線αが成膜面上の金属膜により全反射され、この光線αを内部で乱反射させずに射出面から外部に射出するような形状であればよい。
【００２１】
金属膜２５は、プリズム２１の成膜面２３上に成膜（形成）された金属製の薄膜である。本実施形態の金属膜２５は、金により形成されている。この金属膜２５は、光線αを全反射することにより生じるエバネッセント波を増幅するための部材である。即ち、成膜面２３上に金属膜２５を設けて表面プラズモン共鳴を生じさせることにより、金属膜２５のない面（成膜面２３）により光線αを全反射させてエバネッセント波を生じさせた場合に比べ、形成される電場を増強させることができる。本実施形態における電場の増強度（電場増強度）は、金属膜２５がない場合に比べて１０倍程度となる（図３参照）。金属膜２５は、膜厚が３０〜７０ｎｍとなるようにスパッタ法や蒸着法、メッキ法等の各種成膜方法により形成されている。尚、金属膜２５の素材は、金に限定されず、表面プラズモンを発生させる金属であればよく、例えば、銀、銅、アルミ等（合金を含む）であってもよい。
【００２２】
また、金属膜２５の表面（プリズムと反対側の面）２５ａには、特定の抗原を捕捉するための捕捉体２６が固定されている。この捕捉体２６は、表面処理によって金属膜２５の表面２５ａに固定される。
【００２３】
流路部材３０は、プリズム２１の成膜面２３上に設けられ、検体が流れる流路３１を有する。この流路部材３０は、透明な樹脂により形成される。本実施形態の流路部材３０は、水平方向に拡がる板状の部材である。流路３１は、抗原抗体反応が行われる検出部３２と、分析素子チップ２０の外部から検出部３２へ検体を案内し、又は検出部３２から分析素子チップ２０の外部へ検体を案内する案内部３３とから成る。検出部３２は、流路部材３０の裏面（図１において下側の面）３０ｂに設けられた溝とプリズム２１上の金属膜２５とにより囲まれている。即ち、この検出部３２では、検体が金属膜２５の表面（捕捉体２６が固定されている面）２５ａと接しつつ流れる。各案内部３３は、一方の端部が流路部材３０の表面（図１において上側の面）３０ａにおいて開口し、他方の端部（前記一方の端部と反対側の端部）が検出部３２に接続されている。このように案内部３３と検出部３２と案内部３３とが順に繋がることによって一本の流路３１が形成される。
【００２４】
この流路部材３０は、プリズム２１と接着剤により接着（接合）されている。本実施形態では、検出部３２を水平方向から囲み且つ流路部材３０とプリズム２１との間となる位置に、弾性体からなるシール部材３５が設けられている。これにより、流路部材３０とプリズム２１との接合部位からの検体の漏れが防止される。尚、流路部材３０とプリズム２１との接合は、接着に限定されず、レーザ溶着や超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着等であってもよい。また、流路部材３０とプリズム２１とが液密に接合されていれば、前記検出部３２を囲むシール部材３５はなくてもよい。
【００２５】
光源４０は、分析素子チップ２０、詳しくは、プリズム２１の入射面２２に向けて光線αを射出する光源装置である。この光源４０は、半導体レーザやＬＥＤ等の発光素子４１と、発光素子４１による光線αの射出方向を変更する角度変更部４２と、発光素子４１からの光線αを偏光する偏光板（図示省略）とを有する。
【００２６】
角度変更部４２は、発光素子４１から射出された光線αが入射面２２からプリズム２１の内部に入射して金属膜２５で全反射している状態（詳細には、金属膜２５の裏面（表面２５ａと反対の側の面）側から当該金属膜２５を通過してその表面２５ａで全反射している状態）で、この光線αの金属膜２５（詳細には、金属膜２５の表面２５ａ）に対する入射角θを変更するように発光素子４１による光線αの射出方向を変更させる。詳しくは、角度変更部４２は、金属膜２５における光線αの反射される位置を変えることなく金属膜２５への光線αの入射角θを変更するように、発光素子４１の射出方向を変更可能に構成される。本実施形態の角度変更部４２は、光測定手段５０の制御部５８と接続され、この制御部５８からの指示信号に従って発光素子４１による光線αの射出方向を変更する。
【００２７】
偏光板は、プリズム２１の成膜面２３上に設けられた金属膜２５に対してＰ偏光となるように発光素子４１から射出される光線αを偏光する。尚、発光素子４１として半導体レーザが用いられる場合、半導体レーザ自身の偏光面が金属膜２５に対するＰ偏光の偏光面と一致するように半導体レーザが配置されれば、偏光板は設けなくてもよい。
【００２８】
光測定部５０は、金属膜２５の表面２５ａ側に生じた光を受光する受光部５１と、第１の光フィルタ５４と、第２の光フィルタ５５と、これら第１の光フィルタ５４と第２の光フィルタ５５との位置をそれぞれ切り換える位置切換装置（位置切換部）５６と、当該光測定部５０の各構成要素や光源４０の角度変更部４２等の制御を行う制御部５８とを備える。
【００２９】
受光部５１は、光を検出する受光素子５２と、レンズ等により構成され、金属膜２５の表面２５ａ側で生じた光を受光素子５２まで導光する光学系５３とを有する。本実施形態では、微弱な光（検体中の抗原に標識した蛍光物質を励起させることにより生じた蛍光）を検出するため、受光素子５２として光電子倍増管（いわゆるフォトマル：Photomultiplier Tube）が用いられている。
【００３０】
第１の光フィルタ５４は、入射した光を減衰させて出射する光フィルタである。本実施形態の第１の光フィルタ５４は、減光フィルタ（ＮＤフィルタ）である。この第１の光フィルタ５４が分析素子チップ２０の金属膜２５において生じたプラズモン散乱光を減光することにより、微弱な光を検出するための受光素子（本実施形態ではフォトマル）５２によるプラズモン散乱光の測定が可能となる。
【００３１】
第２の光フィルタ５５は、所定の波長の光を遮るための光フィルタである。本実施形態の第２の光フィルタ５５は、ロングパスフィルタである。尚、第２の光フィルタ５５は、ロングパスフィルタに限定されず、バンドパスフィルタ等でもよい。
【００３２】
この第２の光フィルタ５５は、受光部５１に蛍光（検体中の抗原に標識した蛍光物質を励起させることにより生じた光）以外の波長の光（例えば、光源４０からの光（漏れ光）やプラズモン散乱光等）が入射することを防ぐ。即ち、第２の光フィルタ５５は、受光部５１に入射する光からノイズ成分を除去し、これにより受光部５１における微弱な蛍光の検出精度及び検出感度の向上を図っている。
【００３３】
位置切換装置５６は、第１の光フィルタ５４及び第２の光フィルタ５５の位置を中間位置と待避位置との間で切り換える装置である。尚、中間位置は、金属膜２５と受光部５１との間の位置である。詳しくは、中間位置は、分析素子チップ２０と受光部５１との間の位置である（図１における第１の光フィルタ５４の位置）。また、待避位置は、中間位置よりも金属膜２５及び受光部５１から離れた位置（図１における第２の光フィルタ５５の位置）である。詳しくは、待避位置は、金属膜２５の表面２５ａ側で生じた光が受光部５１に直接入射できるような位置である。
【００３４】
具体的に、位置切換装置５６は、第１の光フィルタ５４が中間位置のときに第２の光フィルタ５５が待避位置となり（図１参照）、第１の光フィルタ５４が待避位置のときに第２の光フィルタ５５が中間位置となる（図２参照）ように、第１の光フィルタ５４及び第２の光フィルタ５５の位置をそれぞれ切り換える。この位置切換装置５６は、制御部５８と接続され、この制御部５８からの指示信号に基づいて第１の光フィルタ５４及び第２の光フィルタ５５の位置の切り換えを行う。
【００３５】
制御部５８は、光源４０や光測定部５０の各構成要素等の制御を行う。具体的に、制御部５８は、受光部５１により測定された光の強度に基づいて光源４０による光線αの射出方向を調整する。本実施形態の制御部５８は、分析素子チップ２０の金属膜２５の表面２５ａ側で生じたプラズモン散乱光の強度に基づいて光源４０の光線αの射出方向を調整する。詳しくは、制御部５８は、保持部１２に分析素子チップ２０が保持されたときに、光源４０の発光素子４１及び角度変更部４２を制御して、光線αが金属膜２５の裏面側（プリズム２１側）から金属膜２５への入射角θを変えつつ金属膜２５に入射するように光源４０から光線αを射出させる。このとき、受光部５１が金属膜２５の表面２５ａ側において生じたプラズモン散乱光の強度を検出し、この強度変化に基づいて制御部５８が角度変更部４２を制御して光源４０による光線αの射出方向を調整する。詳しくは、入射角θを変えながら光線αが金属膜２５に入射すると、受光部５１が検出するプラズモン散乱光の強度は、図３に示すように変化する。制御部５８は、この強度変化がピーク（最大値）となったときの入射角θ５で光線αが金属膜２５に入射したときの光源４０による光線αの射出方向を求める。そして、制御部５８は、発光素子４１の向きを調整して光源４０がこの射出方向に光線αを射出できるように角度変更部４２に指示信号を出力する。
【００３６】
また、制御部５８は、位置切換装置５６に対して、第１の光フィルタ５４及び第２の光フィルタ５５の位置の切り換え指示を行う。具体的に、制御部５８は、前記のプラズモン散乱光を用いた光源４０による光線αの射出方向の調整を行うときには、第１の光フィルタ５４が中間位置となり、第２の光フィルタ５５が退避位置となるように位置切換装置５６に指示信号を出力する。一方、制御部５８は、蛍光分析装置１０において検体の検査を行うときには、第１の光フィルタ５４が退避位置となり、第２の光フィルタ５５が中間位置となるように位置切換装置５６に指示信号を出力する。
【００３７】
保持部１２は、検体の検査のときに分析素子チップ２０を保持する部位である。具体的に、この保持部１２は、分析素子チップ２０が光源４０に対して所定の姿勢となるように分析素子チップ２０を着脱可能に保持する。前記所定の姿勢とは、光源４０から射出された光線αが入射面２２からプリズム２１の内部に入射してこのプリズム２１の内部に入射した光線αが金属膜２５により全反射される姿勢である。
【００３８】
前処理部は、試薬チップ６０（図４参照）を受け入れ、この試薬チップ６０に注入されている検査対象となる血液等の前処理（血球分離や希釈、混合等）を行い、処理後の検体を分析素子チップ２０に注入する部位である。試薬チップ６０には複数の収納部６１が設けられ、各収納部６１には血液等の他に、試薬、希釈液、洗浄液等が個別に封入されている。
【００３９】
演算部１４は、検体の検査時において、光測定部５０（受光部５１）から送られてきた出力信号を演算してこの光測定部５０により測定された蛍光に関する分析を行うための部位である。具体的に、例えば、演算部１４は、光測定部５０により検出した単位面積あたりの蛍光の数のカウントや時間の経過に伴う蛍光の増加量の算出等を行う。演算部１４での演算結果は、この演算部１４に接続される表示部１６に出力される。
【００４０】
表示部１６は、演算部１４からの出力信号に基づき、演算結果を表示するものである。表示部１６は、モニター等のように結果を画面に表示するものでもよく、プリンター等のように結果をプリントアウトするものでもよい。また、表示部１６は、これらを組み合わせたものでもよい。
【００４１】
このように構成される蛍光分析装置１０では、以下のようにして検体の検査が行われる。
【００４２】
患者から血液等の検体が採取され、この採取された検体が試薬チップ６０に注入される。この検体が注入された試薬チップ６０が蛍光分析装置１０の前処理部にセットされる。前処理部は、このセットされた試薬チップ６０の検体の前処理（血球分離や希釈、混合等）を行う。
【００４３】
次に、蛍光分析装置１０は、検体を検査するときの金属膜２５への光線αの入射角である測定角を決定する。
【００４４】
具体的に、制御部５８は、指示信号を位置切換装置５６に出力することによって第１の光フィルタ５４が中間位置となり第２の光フィルタ５５が退避位置となるように第１の光フィルタ５４及び第２の光フィルタ５５の位置をそれぞれ切り換える（図１参照）。
【００４５】
そして、蛍光分析装置１０において前記の処理後の検体が分析素子チップ２０に注入された後、制御部５８は、光源４０に光線αを射出させつつ角度変更部４２によってプリズム２１の金属膜２５に入射する光線αの入射角θを変更する。このとき、光線αがプリズム２１内に入射し、この光線αが金属膜２５の裏面側から金属膜２５を通過してその表面２５ａにおいて全反射することにより、エバネッセント波が金属膜２５の表面２５ａ側に染み出し、これにより、プラズモン散乱光が発生する。光測定部５０（詳しくは、受光素子（フォトマル）５２）は、このプラズモン散乱光の強度を測定する。このとき、第１の光フィルタ５４が中間位置に配置されているため、金属膜２５の表面２５ａ側で生じたプラズモン散乱光は、第１の光フィルタ５４を通過することにより減光された状態で受光素子５２に到達する。そのため、強い光（詳しくは、検体を検査する際に測定する蛍光に比べて強い光）が入ることによる受光素子５２の故障が防がれる。
【００４６】
制御部５８は、光測定部５０により測定されたプラズモン散乱光における角度依存データ（金属膜２５への光線αの入射角θと光強度との関係を表すデータ：図３参照）に基づき、プラズモン散乱光の強度が最大となる入射角θ５を求める。このプラズモン散乱光の強度が最大のときの金属膜２５への光線αの入射角θ５が分れば、制御部５８は、電場増強度が最大となる金属膜２５への光線αの入射角θを精度よく導出することができる。これは、金属膜２５において、表面プラズモン共鳴に起因する金属膜２５の表面２５ａ近傍に形成される電場の大きさ（電場増強度）が最大となるときにプラズモン散乱光の強度が最大となることに基づく。
【００４７】
制御部５８は、角度変更部４２を制御して、光線αが金属膜２５に入射する入射角が、プラズモン散乱光の強度が最大のときの入射角θ５（即ち、電場増強度が最大となる入射角θ５）となるように、光源４０から射出される光線αの方向を調整する。
【００４８】
次に、制御部５８は、各光フィルタ５４，５５の位置の切り換えを行う。即ち、制御部５８の指示信号により、位置切換装置５６が、第１の光フィルタ５４が退避位置となり第２の光フィルタ５５が中間位置となるように第１の光フィルタ５４及び第２の光フィルタ５５の位置をそれぞれ切り換える（図２参照）。
【００４９】
このように検体の検査を行うときの光線αの射出方向が定まり、第１の光フィルタ５４及び第２の光フィルタ５５の位置が切り換えられると、蛍光分析装置１０は、流路３１の検出部３２において抗原抗体反応等を行わせる。このとき、蛍光分析装置１０は、方向が調整された光源４０に光線αを射出させる。この光線αが金属膜２５において表面プラズモン共鳴を発生させ、この表面プラズモン共鳴により発生したエバネッセント波による増強電場が流路３１の検出部３２内に生じる。
【００５０】
流路３１の検出部３２では、当該流路３１を流れる検体中の特定の抗原を金属膜２５の表面２５ａに固定された捕捉体２６が捕捉する。そして、流路３１に蛍光物質を標識された抗体が流されることにより、捕捉体２６に捕捉された抗原に蛍光物質が標識される。このとき、検出部３２の金属膜２５の表面２５ａ近傍には増強電場が形成されているため、この電場によって抗原に標識された蛍光物質が励起されて光る。
【００５１】
この蛍光が第２の光フィルタ５５を透過することによりノイズ成分が除去されて受光部５１に到達し、受光部５１の受光素子５２が前記ノイズ成分の除去された蛍光を検出する。受光部５１は、この検出結果を出力信号として制御部５８を介して演算部１４に出力する。演算部１４は、この出力信号を受信し、この出力信号を演算処理することにより、抗原の定量分析を行う。尚、光測定部５０が前記蛍光を測定する際に、制御部５８が検体を流路３１に流しつつ光源４０から光線αを射出させ続け、光測定部５０が時間の経過に伴う蛍光点の数の変化や、検体を流す前後での蛍光点の数の変化を測定してもよい。また、制御部５８が、流路３１に検体を流し終えた後、洗浄剤により流路３１内を洗浄し、その後に光源４０に光を照射させ、光測定部５０が捕捉体２６に捉えられた抗原に標識された蛍光物質からの蛍光を検出してもよい。
【００５２】
そして、演算部１４が演算結果を表示部１６に送り、当該表示手段１６が演算結果を表示する。
【００５３】
このように、プラズモン散乱光に基づいて検体の検査のときの金属膜２５への光線αの入射角である測定角θ５を決定する蛍光分析装置１０は、金属膜２５の表面２５ａ近傍に形成される増強電場の強度が最大となる増強電場最大角θ５を精度よく得ることができる。そのため、蛍光分析装置１０は、検体の検査の際に、金属膜２５の表面２５ａ近傍の増強電場の強度を最大にすることができる。これにより、蛍光分析装置１０は、検体中に含まれる蛍光物質を効果的に発光させることができ、その結果、検体を高感度且つ高精度に検出することができる。しかも、蛍光分析装置１０における種々のパラメータが変更されても、蛍光分析装置１０は、金属膜２５の表面２５ａ近傍の電場強度を最大とする金属膜２５への光線αの入射角θ５を精度よく得ることができ、これにより、検査毎の結果のバラつきを抑制することができる。
【００５４】
また、蛍光分析装置１０において、従来の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置のように、分析素子チップの金属膜２５により反射された後の光線αを測定する必要がない（即ち、プラズモン共鳴角を求める必要がない）。このため、蛍光分析装置１０には、金属膜２５に反射された光線αを測定する光学系を設ける必要がなく、装置の小型化及び省コスト化を図ることができる。
【００５５】
次に、本発明の第２実施形態について図５を参照しつつ説明するが、上記第１実施形態と同様の構成には同一符号を用いると共に詳細な説明を省略し、異なる構成についてのみ詳細に説明する。
【００５６】
本実施形態に係る蛍光分析装置１０Ａは、分析素子チップ（プリズム部）２０と、光源４０と、光測定部５０Ａと、保持部１２と、前処理部（図示省略）と、演算部１４と、表示部１６とを備える。
【００５７】
光測定部５０Ａは、受光部５１と、光フィルタ５５と、制御部５８Ａとを備える。光フィルタ５５は、所定の波長の光を遮るための光フィルタであり、中間位置に配置されている。本実施形態の光フィルタ５５は、ロングパスフィルタである。
【００５８】
制御部５８Ａは、光源４０や光測定部５０Ａの各構成要素等の制御を行う。本実施形態の制御部５８Ａは、保持部１２に分析素子チップ２０が保持されこの分析素子チップ２０に検体が注入されている状態のときに、光源４０の発光素子４１及び角度変更部４２を制御して、光線αが金属膜２５に対する入射角θを変えながら金属膜２５に入射するように光線αを射出させる。このとき、受光部５１が金属膜２５の表面２５ａ側において生じた蛍光を検出し、この強度変化に基づいて制御部５８Ａが角度変更部４２を制御して光源４０による光線αの射出方向を調整する。尚、蛍光は、分析素子チップ２０に検体が流されることにより検体中の抗原が金属膜表面２５ａの抗体に捕捉され、この捕捉された抗原に標識された蛍光物質が金属膜２５に生じた表面プラズモン共鳴により形成された増強電場によって励起されて生じる。
【００５９】
詳しくは、検体が流路３１に流され、光線αが金属膜２５に対する入射角θを変えながら金属膜２５に入射すると、受光部５１において検出される蛍光の強度は、図３におけるプラズモン散乱光の強度変化と同様に、入射角θの変化に伴って増減する。制御部５８Ａは、金属膜２５への光線αの入射角が、前記強度変化がピーク（最大値）となったときの入射角θ５となるように光源４０による光線αの射出方向を求める。そして、制御部５８Ａは、発光素子４１の向きを調整して光源４０が前記求めた射出方向に光線αを射出できるように角度変更部４２に指示信号を出力する。
【００６０】
このように構成される蛍光分析装置１０Ａでは、以下のようにして検体の検査が行われる。
【００６１】
検体が注入された試薬チップ６０が蛍光分析装置１０Ａの前処理部にセットされ、検体の前処理（血球分離や希釈、混合等）が行われる。
【００６２】
蛍光分析装置１０Ａは、処理後の検体を分析素子チップ２０に注入し、流路３１の検出部３２において抗原抗体反応等を行わせる。このとき、蛍光分析装置１０は、分析素子チップ２０への検体の注入と共に、測定角、即ち、検体の検査のときの光源４０による光線αの射出方向を決定する。
【００６３】
具体的に、制御部５８Ａは、光源４０に光線αを射出させつつ角度変更部４２によってプリズム２１の成膜面２３上に設けられた金属膜２５に入射する光線αの入射角θを変更する。このとき、光線αが金属膜２５（詳しくは、金属膜２５の表面２５ａ）により全反射されているため、金属膜２５の表面２５ａ近傍にはエバネッセント波による電場が形成されている。一方、流路３１の検出部３２では、金属膜２５に固定された捕捉体２６が、抗原抗体反応等により抗原を捕捉する。そして、蛍光物質がこの捕捉された抗原に標識されると、金属膜２５の表面２５ａ近傍に形成されている電場によって蛍光物質が励起されて光る。
【００６４】
光測定部５０（詳しくは、受光素子５２）は、この蛍光の強度を測定する。このとき、光フィルタ５５によりノイズ成分が除去された蛍光が光測定部５０の受光部５１に入射するため、この微弱な蛍光が高感度且つ高精度に測定される。
【００６５】
制御部５８Ａは、光測定部５０により測定された蛍光における角度依存データ（金属膜２５への光線αの入射角θと光強度との関係を表すデータ）に基づき、蛍光の強度が最大となる金属膜２５への光線αの入射角θ５を求める。制御部５８Ａは、この蛍光の強度が最大のときの金属膜２５への光線αの入射角θ５が分れば、電場増強度が最大となる金属膜２５への光線αの入射角θを精度よく導出することができる。これは、電場の強さに基づいてこの電場に励起された蛍光物質が発する蛍光の強度が変化するからである。
【００６６】
制御部５８Ａは、角度変更部４２を制御して、光線αが金属膜２５に入射する入射角が、蛍光の強度が最大となる入射角、即ち、電場増強度が最大となる入射角θ５となるように、光源４０から射出される光線αの方向を調整する。
【００６７】
このように光源４０による光線αの射出方向が調整された後も、検体の分析素子チップ２０への注入は続けられ、分析素子チップ２０の検出部３２で生じる蛍光の測定も続けられる。
【００６８】
具体的に、受光部５１は、検出部３２において生じた蛍光の検出を行い、この検出結果を出力信号として制御部５８Ａを介して演算部１４に出力する。演算部１４は、この出力信号を受信し、これを演算処理することにより、抗原の定量分析を行う。そして、演算部１４は、演算結果を表示部１６に送り、当該表示部１６はこの演算結果を表示する。
【００６９】
このように、蛍光に基づいて測定角θ５を決定する蛍光分析装置１０Ａも、金属膜２５の表面２５ａ近傍に形成される増強電場の強度が最大となる増強電場最大角θ５を精度よく得られる。そのため、蛍光分析装置１０Ａは、検体の検査の際に、金属膜２５の表面２５ａ近傍の増強電場の強度を最大にすることができ、これにより検体中に含まれる蛍光物質を効果的に発光させることができる結果、検体を高感度且つ高精度に検査することができる。しかも、当該蛍光分析装置１０Ａにおける種々のパラメータが変更されても、蛍光分析装置１０Ａは、金属膜２５の表面２５ａ近傍の電場強度を最大とする金属膜２５への光線αの入射角θ５を精度よく得ることができ。その結果、蛍光分析装置１０Ａは、検査毎の結果のバラつきを抑制することができる。
【００７０】
さらに、蛍光分析装置１０Ａは、第１実施形態の蛍光分析装置１０のように、測定角θ５を決定するためにプラズモン散乱光を測定する必要がないため、第１の光フィルタ５４や第１の光フィルタ５４及び第２の光フィルタ５５の位置切換装置５６（図１参照）等を設けなくてもよい。これにより、蛍光分析装置１０Ａは、装置のより小型化及び省コスト化を図ることができる。
【００７１】
尚、本発明の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、上記第１及び第２実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
【００７２】
例えば、上記第１及び第２実施形態において蛍光分析装置１０，１０Ａの構成に分析素子チップ２０が含まれるが、蛍光分析装置の構成に分析素子チップが含まれなくてもよい。即ち、蛍光分析装置は、他の分析装置に用いられる分析素子チップを使用して検査を行うように構成されてもよい。
【００７３】
第１実施形態の蛍光分析装置１０は、プラズモン散乱光と蛍光とを共通の受光素子（フォトマル）５２を用いて測定するために、第１の光フィルタ５４と、この光フィルタの位置の切り換えを行う位置切換装置５６とを備えているが、これに限定されない。即ち、蛍光分析装置は、第１の光フィルタ５４を用いず、強い光（プラズモン散乱光）を受光するための受光素子（例えば、ＣＣＤ）と微弱な光（蛍光）を受光するための受光素子（例えば、フォトマル）とを備え、測定する光によってこれらの受光素子の位置を切り換えるように構成されてもよい。
【００７４】
［実施の形態の概要］
以上の実施形態をまとめると、以下の通りである。
【００７５】
本実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、検体に含まれる蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、所定の面の面上に金属膜が形成されたプリズムを有するプリズム部と、前記金属膜により反射されるように前記プリズムの内部に光線を前記所定の面と異なる面から入射させる光源と、前記金属薄膜により前記光線が反射されることによって当該金属膜における前記プリズムと反対の面側で生じる光の強度を測定可能な光測定部と、前記光測定部により測定された光の強度に基づいて前記光源における光線の射出方向を調整する制御部と、を備える。
【００７６】
かかる構成によれば、表面プラズモン共鳴によって金属膜の表面（プリズムと反対側の面）近傍に形成される電場の強度が最大となる金属膜への光線の入射角（即ち、光源における光線の射出方向）が精度よく得られる。そのため、検体の検査のときに、金属膜の表面近傍の電場強度を最大にすることができ、これにより検体中に含まれる蛍光物質を効果的に発光させることができる結果、高感度且つ高精度の検体の検査が可能となる。しかも、当該蛍光分析装置における種々のパラメータが変更されても、蛍光分析装置は、金属膜の表面近傍の電場強度を最大とする金属膜への光線の入射角を精度よく得ることができ、その結果、検査毎の結果のバラつきを抑制することができる。
【００７７】
さらに、蛍光分析装置は、従来の蛍光分析装置のように、プリズム部の所定の面で反射された後の光線を測定する必要がない。このため、蛍光分析装置に前記反射された光線を測定する光学系を設ける必要がなく、蛍光分析装置の小型化及び省コスト化を図ることができる。
【００７８】
上記の表面プラズモン共鳴蛍光分析装置において、前記光測定部は、前記金属膜において生じたプラズモン散乱光の強度を測定してもよく、また、前記金属膜における前記プリズムと反対側の面には、前記検体に含まれる特定の抗原を捕捉可能な捕捉体が固定され、前記光測定部は、前記捕捉体に捕捉された特定の抗原に基づく前記蛍光物質の蛍光の強度を測定してもよい。
【００７９】
このように検体の検査前の金属膜において生じるプラズモン散乱光が用いられても、また、検体の検査中の金属膜の表面近傍において生じる光が用いられても、表面プラズモン共鳴によって金属膜の表面近傍に形成される電場の強度が最大となる金属膜への光線の入射角が精度よく得られる。尚、金属膜の表面近傍において生じる光は、金属膜の表面の捕捉体が捕捉した検体中の特定の抗原に標識された蛍光物質が励起することにより生じる蛍光である。
【００８０】
検体の検査のときの金属膜への光線の入射角（即ち、測定角）を決定するためにプラズモン散乱光が用いられる場合、前記光測定部は、前記金属膜において生じた光を受光する受光部と、入射した光を減衰させて出射する第１の光フィルタと、前記金属膜と前記受光部との間である中間位置とこの中間位置よりも前記金属膜及び前記受光部から離れた待避位置との間で前記第１の光フィルタの位置を切り換える位置切換部と、を有することが好ましい。
【００８１】
かかる構成によれば、金属膜の表面近傍の電場強度を最大にする金属膜への光線の入射角を求めるためのプラズモン散乱光の測定と、検体に含まれる蛍光物質の蛍光の測定とを共通の受光部により測定することが可能となる。具体的には、プラズモン散乱光は、抗原に標識された蛍光物質を発光させたときの光量に比べて光量の非常に大きな光である。そのため、プラズモン散乱光の測定の際にこの光が第１のフィルタを通って減光されることにより、蛍光を受光するための受光部がプラズモン散乱光を測定可能となる。
【００８２】
また、前記光測定部は、所定の波長の光を遮る第２の光フィルタを有し、前記位置切換部は、前記第１の光フィルタが前記中間位置のときに前記第２の光フィルタが前記待避位置となり、前記第１の光フィルタが前記待避位置のときに前記第２の光フィルタが前記中間位置となるように、前記第１の光フィルタ及び前記第２の光フィルタの位置をそれぞれ切り換え可能であることが好ましい。
【００８３】
かかる構成によれば、プラズモン散乱光の測定と検体に含まれる蛍光物質の蛍光の測定とが共通の受光部により測定できると共に、微弱な光である蛍光の測定がより高感度且つ高精度に行われる。即ち、プラズモン散乱光の測定の際には、中間位置に第１のフィルタが移動することによりプラズモン散乱光が減光されて受光部に到達し、蛍光の測定の際には、中間位置に第２のフィルタが移動することにより受光部への蛍光以外の波長の光（ノイズ成分）が遮られ、これにより蛍光の測定感度及び精度が向上する。
【００８４】
一方、測定角を決定するのに検体に含まれる蛍光物質を励起させた光（蛍光）が用いられる場合、前記光測定部は、前記金属膜で生じた光を受光する受光部と、所定の波長の光を遮る光フィルタと、を有し、前記光フィルタは、前記金属膜と前記受光部との間である中間位置に配置されることが好ましい。
【００８５】
かかる構成によれば、受光部への蛍光以外の波長の光（ノイズ成分）が遮られ、微弱な光である蛍光の測定がより高感度且つ高精度に行われる。
【００８６】
また、本実施形態に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置は、検体に含まれる蛍光物質が表面プラズモン共鳴に基づく電場により励起されて発した蛍光を測定する表面プラズモン共鳴蛍光分析装置であって、所定の面の面上に金属膜が形成されたプリズムを有するプリズム部を着脱可能に保持する保持部と、前記保持部に前記プリズム部が保持されたときに前記プリズムに向けて光線を射出可能な光源と、前記保持部に前記プリズム部が保持されたときにこのプリズム部の前記金属膜により光線が反射されることによって当該金属膜における前記プリズムと反対の面側で生じる光の強度を測定可能な光測定部と、前記光測定部により測定された光の強度に基づいて前記光源における光線の射出方向を調整する制御部と、を備える。そして、前記保持部は、前記光源から射出された光線が前記プリズムの内部に入射してこの入射した光線が前記金属膜により反射される姿勢となるように前記プリズム部を保持する。
【００８７】
かかる構成によれば、前記プリズム部を保持部に保持させることにより、表面プラズモン共鳴によって金属膜の表面（プリズムと反対側の面）近傍に形成される電場の強度が最大となる金属膜への光線の入射角（即ち、光源による光線の射出方向）が精度よく得られる。
【００８８】
上記の表面プラズモン共鳴蛍光分析方法において、前記光測定工程は、前記金属膜において生じたプラズモン散乱光の強度を測定してもよく、また、前記金属膜が、前記検体に含まれる特定の抗原を捕捉可能な捕捉体を前記プリズムと反対側の面に固定され、前記光測定工程は、前記補足体に捕捉された特定の抗原に基づく前記蛍光物質の蛍光の強度を測定してもよい。
【００８９】
このように検体の検査前の金属膜において生じるプラズモン散乱光が用いられても、また、検体の検査中の金属膜の表面近傍において生じる光が用いられても、表面プラズモン共鳴によって金属膜の表面近傍に形成される電場の強度が最大となる金属膜への光線の入射角が精度よく得られる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
以上のように、本発明に係る表面プラズモン共鳴蛍光分析装置及び表面プラズモン共鳴蛍光分析方法は、表面プラズモン共鳴によって生じたエバネッセント波の電場を利用して検体に含まれる蛍光物質を発光させ、この蛍光を検出することにより検体を測定するのに有用であり、前記エバネッセント波の電場が最も大きくなるようなプリズム部の金属膜への光線の入射角を精度よく求めるのに適している。
【図１】
2011152064.tif 000003
【図２】
2011152064.tif 000004
【図３】
2011152064.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011152064.tif 000009
【図８】
2011152064.tif 000010
【国際調査報告】
2011152064.tif 000011
2011152064.tif 000012
2011152064.tif 000013
2011152064.tif 000014