(57)【要約】［課題］本発明は、ＳＰＦＳ測定において、アッセイシグナルの低下およびアッセイブランクの上昇を抑制することができるセンサエリアを提供することを目的とする。［解決手段］本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光〔ＳＰＦＳ〕測定用流路において、フロー方向に対して上流に精製エリアを配置し、その下流にセンサエリアを配置することを特徴とするＳＰＦＳ用センサチップ。
2012023391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン励起増強蛍光分光〔ＳＰＦＳ〕測定用流路において、
フロー方向に対して上流に精製エリアを配置し、
その下流にセンサエリアを配置することを特徴とするＳＰＦＳ用センサチップ。
【請求項２】
上記センサエリアが、
透明支持体と；
該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；
該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と；
該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と；
該親水性高分子層の、該ＳＡＭとは接していないもう一方の表面に固定化された生理活性物質と；
を含んでなるプラズモン励起センサの表面上に形成されている請求項１に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
【請求項３】
上記精製エリアが、検体用精製エリアを含む請求項１または２に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
【請求項４】
上記精製エリアが、検体用精製エリアおよび標識抗体用精製エリアを含む請求項１または２に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
【請求項５】
上記検体用精製エリアが、
透明支持体と；
該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；
該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と；
該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と；
を含んでなるセンサ基板の表面上に形成されている請求項３または４に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
【請求項６】
上記標識抗体用精製エリアが、
透明支持体と；
該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；
該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成されたＳＡＭと；
該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と；
該親水性高分子層の、該ＳＡＭとは接していないもう一方の表面に固定化された生理活性物質と；
を含んでなるプラズモン励起センサの表面上に形成されている請求項４に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
【請求項７】
上記精製エリアが、検体用精製エリアおよび標識抗体用精製エリアを含み、
上記標識抗体用精製エリアが、上記プラズモン励起センサの表面上に形成されている請求項２に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
【請求項８】
透明支持体と；
該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；
該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成されたＳＡＭと；
該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と；
を含んでなるセンサ基板、および
透明支持体と；
該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；
該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成されたＳＡＭと；
該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と；
該親水性高分子層の、該ＳＡＭとは接していないもう一方の表面に固定化された生理活性物質と；
を含んでなるプラズモン励起センサを備え、
該センサ基板に含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子と、
該プラズモン励起センサに含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子とが
異なっている請求項１〜７のいずれか一項に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
【請求項９】
上記精製エリアが、上記センサエリアから上流の流路すべてに配置されている請求項１〜８のいずれか一項に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
【請求項１０】
少なくとも、下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特徴とするアッセイ法；
工程（ａ）：検体を、請求項３〜６のいずれか一項に記載の検体用精製エリアに接触させる工程，
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られた検体を、請求項１〜８のいずれか一項に記載のセンサエリアに接触させる工程，
工程（ｃ）：請求項２および６〜８のいずれか一項に記載のプラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを、該工程（ｂ）を経たセンサエリアと反応させる工程，
工程（ｄ）：該工程（ｃ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程，ならびに
工程（ｅ）：該工程（ｄ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
【請求項１１】
さらに、下記工程（ｘ）を含む請求項１０に記載のアッセイ法；
工程（ｘ）：予め、上記コンジュゲートを、請求項４〜７のいずれかに記載の標識抗体用精製エリアに接触させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光〔ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ〕測定用流路に直列に配置した精製エリアとセンサエリアとの組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＰＦＳとは、照射したレーザ光が金属薄膜表面で全反射減衰〔ＡＴＲ〕する条件において、誘電体に接触した金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金属薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。【０００３】
ＳＰＦＳに限らず、検体中のバイオマーカを捕捉し検出する技術において、従来、血液や血漿などの検体をセンサエリアに接触させた場合、検体中の夾雑物により、所望の捕捉反応が阻害されアッセイシグナルが低下してしまうこと、さらにはアッセイブランクが上昇してしまうことが問題となっている。これは、主に、夾雑物がセンサ基板に非特異的に結合してしまうことが原因であることがわかっている。【０００４】
一方で、標識抗体の純度が充分高くない場合にも、標識夾雑物がセンサエリアに捕捉されることでアッセイブランク上昇の原因になっている。【０００５】
上述のようにＳＰＦＳは極微量の濃度領域を検出するシステムであるゆえに、アッセイシグナルの低下、さらなる多少のアッセイブランクの上昇が検出感度の低下に繋がるという本質的な問題を抱えている。さらにＳＰＦＳにおいて、共鳴角シフトが起こるレベルの非特異吸着が発生すると、電場増強度が変化してしまうという深刻な問題がある。【０００６】
特許文献１には、少なくとも生理活性物質を結合させた表面と生理活性物質を保持しない表面（参照部）とを有する基板からなるＳＰＲ〔ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ〕測定用のバイオセンサーが開示されており、その参照部が２種類以上の親水性基で保護されている。これにより参照部に対する非特異的な吸着を抑制しようとしている。【０００７】
特許文献２には、その表面に、リガンドが固定される測定領域と、リガンドが固定されてない参照領域との２つの領域が、アナライトの流れ方向に沿って並列に配置されているＳＰＲ測定用センサが開示されている。測定領域から検出された測定信号を、参照領域から検出された参照信号で差分することにより、異なるセンサ間の個体差などがキャンセルされた測定データが得られる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−２６６７４２号公報
【特許文献２】特開２００６−１０５６７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような背景から、ＳＰＦＳにおいても、センサエリア上の非特異吸着を防止する対策が極めて重要であると考えられる。【００１０】
そこで本発明は、ＳＰＦＳ測定において、アッセイシグナルの低下およびアッセイブランクの上昇を抑制することができるセンサエリアを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、検体に含まれる非特異吸着成分を、センサエリアと接触させる前に、検体用精製エリアと接触させて予め取り除くことができることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明のＳＰＦＳ用センサチップは、表面プラズモン励起増強蛍光分光〔ＳＰＦＳ〕測定用流路において、フロー方向に対して上流に精製エリアを配置し、その下流にセンサエリアを配置することを特徴とする。【００１３】
上記センサエリアは、透明支持体と；該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と；該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と；該親水性高分子層の、該ＳＡＭとは接していないもう一方の表面に固定化された生理活性物質と；を含んでなるプラズモン励起センサの表面上に形成されていることが好ましい。【００１４】
上記精製エリアは、検体用精製エリアを含むことが好ましく、該検体用精製エリアは、透明支持体と；該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と；該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と；を含んでなるセンサ基板の表面上に形成されていることが好ましい。【００１５】
上記精製エリアは、上記検体用精製エリアおよび標識抗体用精製エリアを含むことがより好ましく、該標識抗体用精製エリアは、上記プラズモン励起センサの表面上に形成されていることが好ましい。【００１６】
上記センサ基板に含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子と、上記プラズモン励起センサに含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子とが異なっていることがこのましい。【００１７】
上記精製エリアは、上記センサエリアから上流の流路すべてに配置されていてもよい。【００１８】
また、本発明のアッセイ法は、少なくとも、下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特徴とする。【００１９】
工程（ａ）：検体を、上記検体用精製エリアに接触させる工程，
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られた検体を、上記センサエリアに接触させる工程，
工程（ｃ）：上記プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを、該工程（ｂ）を経たセンサエリアと反応させる工程，
工程（ｄ）：該工程（ｃ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程，および
工程（ｅ）：該工程（ｄ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。【００２０】
さらに、下記工程（ｘ）を含むことが好ましい。【００２１】
工程（ｘ）：予め、上記コンジュゲートを、上記標識抗体用精製エリアに接触させる工程。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、ＳＰＦＳ測定において、アッセイシグナルの低下およびアッセイブランクの上昇を抑制することができる精製エリアとセンサエリアとの組み合わせを提供することができる。【００２３】
また、本発明は、リガンド・夾雑物と蛍光色素とのコンジュゲートの混合物を精製しリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートの純度を高くすることができることから、さらにアッセイシグナルの低下およびアッセイブランクの上昇を抑制することができる精製エリアとセンサエリアとの組み合わせを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明のアッセイ法に含まれる工程（ａ），（ｂ）、すなわちＳＰＦＳ測定用流路（10）において、フロー方向に対して上流に配置した検体用精製エリア（30）によって、検体（20）に含まれる非特異吸着物質（22,23）が取り除かれ、精製された検体（40）（すなわち、アナライト（21）が濃縮された検体）がセンサエリア（50）と反応することを模式的に示した図である。
【図２】図２は、本発明のアッセイ法に含まれることが好ましい工程（ｘ）、すなわちＳＰＦＳ測定用流路（10）において、標識抗体用精製エリア（70）に標識抗体液（60）を接触させることによって、標識抗体液（60）に含まれる標識夾雑物（図示せず）を取り除き、その後に精製された検体（40）と標識抗体（61）とをセンサエリア（50）で反応することを模式的に示した図である。
【図３】図３は、透明支持体と、該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕とを含んでなる基板（グラフ中の「ＳＡＭ」に相当）および該基板に含まれるＳＡＭの、金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成されたＣＭＤ〔カルボキシメチルデキストラン〕層とを含んでなるセンサ基板（グラフ中の「ＣＭＤ」に相当）それぞれを用いて、バッファーおよび血漿を流路にフローした後にアッセイブランクを測定し（グラフ右）、その結果に基づきシグナル比を対バッファーに対して換算したもの（グラフ左）である。血漿を用いるとバッファー（水系）よりシグナルが低下し、アッセイブランクが上昇する。
【図４】図４は、血漿をセンサ基板上にフローすると、何らかの血漿成分がセンサ基板上に吸着するため、バッファーをセンサ基板上にフローした場合と比較して、共鳴角が約１°シフトすることを示し（グラフ左）、電場増強効果がピーク同士を比較しても約２％シグナルが低下し、同一測定角で比較した場合は約３０％もシグナルが低下することを示す（グラフ右）。
【図５】図５は、実施例１および比較例１の結果からそれぞれ得られたアッセイシグナルを棒グラフにして示した図である。
【図６】図６は、実施例２および比較例２の結果からそれぞれ得られたブランクシグナルを棒グラフにして示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
次に、本発明のＳＰＦＳ用センサチップおよびこれらを用いたアッセイ法について具体的に説明する。
【００２６】
＜ＳＰＦＳ用センサチップ＞
本発明のＳＰＦＳ用センサチップは、表面プラズモン励起増強蛍光分光〔ＳＰＦＳ〕測定用流路において、フロー方向に対して上流に精製エリアを配置し、その下流にセンサエリアを配置することを特徴とする。すなわち、ＳＰＦＳ用センサチップは、フロー方向に対して順に精製エリアとセンサエリアとを直列に配置したものである。
【００２７】
［センサエリア］
本発明に用いられるセンサエリアは、透明支持体と；該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と；該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と；該親水性高分子層の、該ＳＡＭとは接していないもう一方の表面に固定化された生理活性物質と；を含んでなるプラズモン励起センサの表面上に形成されていることが好ましく、図１に示すように、精製された検体（40）、すなわち、濃縮されたアナライトを捕捉し、ＳＰＦＳ測定に供されるエリアである。
【００２８】
（透明支持体）
本発明で用いられる「透明支持体」としては、石英製やガラス製であっても、ポリカーボネート〔ＰＣ〕，シクロオレフィンポリマー〔ＣＯＰ〕などのプラスチック製であってもよく、屈折率〔ｎｄ〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００２９】
なお、ガラス製の透明支持体は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎｄ〕１.５２）および「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎｄ〕1.８５），（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎｄ〕１．８４），「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎｄ〕１．８８）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎｄ〕１．９０），（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎｄ〕１．７２）などが光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
【００３０】
透明支持体は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
【００３１】
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
【００３２】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
【００３３】
（金属薄膜）
上記透明支持体の一方の表面に形成された「金属薄膜」としては、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなることが望ましく、これら金属の合金であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
【００３４】
なお、透明支持体としてガラス製平面基板を用いる場合に限り、ガラスと金属薄膜とをより強固に接着することができることから、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。
【００３５】
透明支持体上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜を形成することが好ましい。
【００３６】
金属薄膜の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。
【００３７】
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。
【００３８】
金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００３９】
（ＳＡＭ）
ＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕は、金属薄膜の透明支持体とは反対側の面に形成され、生理活性物質、好ましくは親水性高分子を金属薄膜に固定する際の土台としての役割を有する。
【００４０】
本発明において、このＳＡＭが含む単分子としては、通常、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
【００４１】
ＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜がその表面に形成されたガラス製の透明支持体を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金属薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。
【００４２】
（親水性高分子層）
親水性高分子層は、ＳＡＭと生理活性物質との結合を介在するように設けることが好ましい。親水性高分子層を構成する親水性高分子は、多糖類としてカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕等のデキストランが、合成樹脂としてポリアクリル酸が好ましい。
【００４３】
親水性高分子層をＳＡＭ表面に形成する方法としては、例えば、水溶性カルボジイミドである１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３エチルカルボジイミド〔ＥＤＣ〕単独またはＥＤＣとＮ−ヒドロキシこはく酸イミド〔ＮＨＳ〕との併用によって、親水性高分子が有するカルボキシル基を活性化し、ＳＡＭが有するアミノ基と反応させる方法などが挙げられるが、本発明はこの方法に限定されず、公知の方法を適宜用いることができる。
【００４４】
（生理活性物質）
生理活性物質は、捕捉対象物質と特異的に結合するタンパク質であってもよく、例えば、抗原と特異的に結合する抗体のように、基質・補酵素に対する酵素，ホルモンに対するレセプタ，抗体に対するプロテインＡ・プロテインＧ，ビオチンに対するアビジン類，カルシウムに対するカルモジュリンなどが挙げられ、これらのうち、「捕捉対象物質と特異的に結合するタンパク質」としては抗体が好ましい。
【００４５】
生理活性物質を固定化する方法は、公知の方法、例えば、ＥＤＣ単独またはＥＤＣとＮＨＳとの併用によって、ＳＡＭまたは親水性高分子が有するカルボキシル基を活性化し、アミノ基を有する生理活性物質を固定化する方法などが挙げられる。好ましい生理活性物質としてタンパク質を用いる場合、該タンパク質が失活しない方法であれば、本発明はこれらに限定されない。
【００４６】
［精製エリア］
精製エリアは、検体用精製エリアを含むことが好ましく、検体用精製エリアおよび標識抗体用精製エリアの両方を含むことがより好ましい。
【００４７】
また、精製エリアは、上記センサエリアから上流の流路すべてに配置することが好ましい。
【００４８】
［検体用精製エリア］
検体用精製エリアは、検体に含まれるアナライト以外の非特異吸着物質、所謂夾雑物を非特異的に吸着・付着させるエリアであって、この精製エリアを通過した検体は夾雑物の一部（好ましくは全部）が除去されている。
【００４９】
この非特異的吸着物質とは、例えば、アルブミンなどが挙げられ、アルブミンは検体用精製エリアに優先的に捕捉される。
【００５０】
検体用精製エリアは、透明支持体と；該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；該金属薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と；該ＳＡＭの、該金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された親水性高分子層と；を含んでなるセンサ基板の表面上に形成されていることが好ましい。
【００５１】
すなわち、「センサ基板」（検体用精製エリア）は、親水性高分子層に生理活性物質を固定化しない上記「プラズモン励起センサ」（センサエリア）と同じ構成を有し、生理活性物質を固定化しない以外はプラズモン励起センサと同様の方法で作製することができる。
【００５２】
また、「プラズモン励起センサ」（センサエリアおよび標識抗体用精製エリア）に含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子と、「センサ基板」（検体用精製エリア）に含まれる親水性高分子層を構成する親水性高分子とは異なっていても、同じであってもよい。異なっている場合、検体に含まれる種々の夾雑物のうちより多くの種類の夾雑物を非特異的に吸着・付着でき、その結果アッセイシグナルの低下およびアッセイブランクの上昇をより抑制することができるため好ましい。
【００５３】
［標識抗体用精製エリア］
標識抗体用精製エリアは、例えば抗体などのリガンドや微量に含まれると考えられる種々の夾雑物（非特異吸着物質・抗体であってもアナライトを認識しない抗体など）に蛍光色素を標識したコンジュゲートの混合物、すなわちリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートと夾雑物と蛍光色素とのコンジュゲートとの混合物のうち、夾雑物と蛍光色素とのコンジュゲートを非特異的に吸着・付着させるエリアであって、この精製エリアを通過した該混合物は、主に標識抗体用精製エリアに吸着・付着した夾雑物と蛍光色素とのコンジュゲートの一部（好ましくは全部）が取り除かれている。
【００５４】
このような標識抗体用精製エリアは、上記「プラズモン励起センサ」の表面上に形成されている、すなわち、標識抗体用精製エリアとセンサエリアとは同じ構成を有することが好ましい。標識抗体用精製エリアとセンサエリアとは同じ構成を有すると、図２に示すように、センサエリア（50）と同じ構成を有する標識抗体用精製エリア（70）を通過した標識抗体液（60）のうち、主に標識抗体用精製エリアに吸着・付着した、夾雑物、すなわちアナライトに結合しない標識抗体や非特異吸着物質の一部（好ましくは全部）が取り除かれるから、センサエリア（50）を構成する各部分に夾雑物がほとんど結合せず、アッセイシグナルの低下およびアッセイブランクの上昇をより抑制することができるため好ましい。
【００５５】
この場合、標識抗体用精製エリアはセンサエリアと同様にして作製することができる。
【００５６】
標識抗体用精製エリアを用いる場合、流路として例えばＹ字形（検体用精製エリアと標識抗体用精製エリアとが二股に分かれ、センサエリアに合流する形態）のものを用いる態様であってもよく、一直線状の流路において、センサ基板（検体用精製エリア）を用いた後、流路からセンサ基板を外し、同じ個所にプラズモン励起センサ（標識抗体用精製エリア）を設置するような態様であってもよい。
【００５７】
また、検体用精製エリアを通過させた検体と、標識抗体用精製エリアを通過させた標識抗体とを反応させる順序として、精製された検体をセンサエリアに通過した後に、精製された標識抗体をセンサエリアに通過させる態様が好ましい。
【００５８】
＜アッセイ法＞
本発明のアッセイ法は、少なくとも、下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特徴とし、洗浄工程、さらに下記工程（ｘ）を含むことが好ましい。
【００５９】
工程（ａ）：検体を、検体用精製エリアに接触させる工程，
工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られた検体を、センサエリアに接触させる工程，
工程（ｃ）：プラズモン励起センサに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを、該工程（ｂ）を経たセンサエリアと反応させる工程，
工程（ｄ）：該工程（ｃ）を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程，および
工程（ｅ）：該工程（ｄ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
【００６０】
洗浄工程：上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面および／または上記工程（ｃ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程，ならびに
工程（ｘ）：予め、上記コンジュゲートを、標識抗体用精製エリアに接触させる工程。
【００６１】
［工程（ａ）］
工程（ａ）とは、検体を、検体用精製エリアに接触させる工程である。
【００６２】
（検体）
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿），尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液および唾液が好ましい。
【００６３】
（接触）
「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、センサ基板の親水性高分子層が形成されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、検体用精製エリアと検体とを接触させる態様が好ましい。
【００６４】
「流路」とは、上述のとおり角筒状または丸筒（管）状のものであって、センサ基板およびプラズモン励起センサ（以下、これらをまとめて「チップ」とする。）を設置する個所近傍は角筒状構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は丸筒（管）状を有することが好ましい。
【００６５】
その材料としては、チップ部または流路天板ではメチルメタクリレート，スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、薬液送達部ではシリコーンゴム，テフロン（登録商標），ポリエチレン，ポリプロピレン等のポリマーを用いる。
【００６６】
チップ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、チップ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【００６７】
流路にチップを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、チップの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを該チップの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートとチップとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。
【００６８】
工業的に製造される大規模ロット（工場レベル）では、流路にチップを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に基板を形成、または別途作製した基板を固定し、その金属薄膜表面にＳＡＭおよび親水性高分子層等を形成した後、流路天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【００６９】
「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕，トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕，ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００７０】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。
【００７１】
送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
【００７２】
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．１〜１ｍＬである。
【００７３】
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。
【００７４】
［工程（ｂ）］
工程（ｂ）とは、上記工程（ａ）を経て得られた検体を、センサエリアに接触させる工程である。上記工程（ａ）を経て得られた検体は、種々の夾雑物が検体用精製エリア（すなわち、センサ基板の親水性高分子層やＳＡＭ，金属薄膜表面）に非特異的に吸着・付着したため、そのアナライト濃度が高くなっている。
【００７５】
（接触）
「接触」は、流路中に循環する送液にこのような検体が含まれ、プラズモン励起センサの第１のリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、センサエリアと該検体とを接触させる態様が好ましい。
【００７６】
［洗浄工程］
洗浄工程とは、上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面および／または下記工程（ｃ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面を洗浄する工程である。
【００７７】
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、工程（ｂ）および（ｃ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に、Ｔｗｅｅｎ２０，ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を１０〜５００ｍＭ含有するものが望ましい。あるいは、低ｐＨの緩衝液、例えば、１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＨＣｌでｐＨが１．５〜４．０のものであってもよい。
【００７８】
洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程（ｂ）の送液を循環させる温度および流速と同じであることが好ましい。
【００７９】
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【００８０】
［工程（ｃ）］
工程（ｃ）：プラズモン励起センサに含まれるリガンド（第１のリガンド）とは同じであっても異なっていてもよいリガンド（第２のリガンド）と蛍光色素とのコンジュゲートを、上記工程（ｂ）、好ましくは上記洗浄工程を経たセンサエリアと反応させる工程である。
【００８１】
（蛍光色素）
「蛍光色素」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【００８２】
本発明で用いられる蛍光色素は、金属薄膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ〕よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【００８３】
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製），ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製），シアニン・ファミリーの蛍光色素，インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素，オキサジン・ファミリーの蛍光色素，チアジン・ファミリーの蛍光色素，スクアライン・ファミリーの蛍光色素，キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素，ピレン・ファミリーの蛍光色素，トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【００８４】
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【００８５】
【表１】
2012023391.tif 000003
【００８６】
また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、例えばＥｕ，Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光色素となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【００８７】
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属薄膜に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜として金を用いる場合には、金薄膜による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属薄膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
【００８８】
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
【００８９】
（第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート）
「本発明で用いられるセンサエリアに含まれるリガンド（第１のリガンド）とは同じであっても異なっていてもよいリガンド（第２のリガンド）と蛍光色素とのコンジュゲート」は、リガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。
【００９０】
本発明のアッセイ法において、第２のリガンドは、アナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、上記第１のリガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンドとして用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２のリガンドとして用いる２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【００９１】
さらに、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）と競合する第２のアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）と２次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。
【００９２】
第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートの作製方法としては、第２のリガンドとして２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
【００９３】
このように作製された第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートの送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
【００９４】
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程（ｂ）の場合と同様である。
【００９５】
［工程（ｘ）］
工程（ｘ）とは、予め、上記コンジュゲートを、標識抗体用精製エリアに接触させる工程である。すなわち、工程（ｘ）とは、図２に示すように、標識抗体用精製エリア（70）に標識抗体液（60）を接触させることで標識抗体（60）に含まれる標識夾雑物を取り除く工程である。
【００９６】
［工程（ｄ）］
工程（ｄ）とは、上記工程（ｃ）、好ましくは上記洗浄工程を経て得られたプラズモン励起センサに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量をＳＰＦＳ検出部により測定する工程である。
【００９７】
（光学系）
本発明のアッセイ法で用いる光源は、金属薄膜にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【００９８】
レーザ光の照射により、全反射減衰条件〔ＡＴＲ〕において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明支持体の屈折率、金属薄膜の金属種およびその膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。
【００９９】
蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【０１００】
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ，０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤ；波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。），０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
【０１０１】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明支持体と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明支持体」の市販品と同様のものが挙げられる。
【０１０２】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光〔ＮＤ〕フィルタ，偏光フィルタ，カットフィルタ，集光レンズ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光〔ＮＤ〕フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１０３】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
【０１０４】
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズ，および蛍光色素の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。
【０１０５】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０１０６】
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管〔ＰＭＴ〕（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【０１０７】
［工程（ｅ）］
工程（ｅ）とは、上記工程（ｄ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程である。
【０１０８】
より具体的には、工程（ｅ）は、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のアナライト（標的抗原量もしくは標的抗体）量を測定シグナルから算出する工程である。
【０１０９】
（アナライト）
「アナライト」としては、第１のリガンドに特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等，またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ〔αフェトプロテイン〕などのがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【０１１０】
（アッセイシグナル変化量）
さらに、工程（ｅ）は、上記工程（ｂ）の前に測定したシグナルを"ブランクシグナル"、としたとき、下記式で表されるアッセイシグナル変化量を算出することができる。
【０１１１】
シグナル変化量＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランク蛍光シグナル）｜
【実施例】
【０１１２】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【０１１３】
[作製例１]センサエリア・標識抗体用精製エリアとして用いるプラズモン励起センサの作製：
まず、屈折率〔ｎｄ〕１．７２，厚さ１ｍｍのガラス製の透明支持体（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ  １０」）をプラズマ洗浄し、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ，金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。【０１１４】
得られた支持体を、１１−アミノ−１−ウンデカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。支持体を該溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンで乾燥させた。【０１１５】
この支持体表面に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＥＤＣ〕０．５ｍＭと、ＣＭＤ−５００−０６Ｉ４（名糖産業（株）製：平均分子量５０万，置換度０．５１）１ｍｇ/ｍｌとを含む２５ｍＭのＭＥＳ緩衝生理食塩水、および１０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）を０．８ｍＬ滴下し、９０分間反応させた後、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を３０分間反応させて、ＳＡＭ上にＣＭＤを固相化した。【０１１６】
さらに、支持体表面に、ＮＨＳ１００ｍＭと、ＥＤＣ１００ｍＭを含む２５ｍＭのＭＥＳ緩衝生理食塩水、および１０ｍＭのＮａＣｌ溶液を０．８ｍＬ滴下し、２０分間反応させた後、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（１Ｄ５，５０ｍｇ／ｍＬ；（株）日本医学臨床検査研究所製）を含むＭＥＳ溶液０．８ｍＬを３０分間反応させることで、ＣＭＤ上に１次抗体を固相化した。【０１１７】
次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）０．８ｍＬを１５分間反応させることで、未反応の活性化エステル基をブロッキングし、１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＴＢＳ緩衝生理食塩水にて３０分間反応させることで、非特異的吸着防止処理を行った。【０１１８】
［作製例２］検体用精製エリアとして用いるセンサ基板の作製：
抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（１Ｄ５）を含まないＭＥＳを用いた以外は作製例１と同様にして、支持体表面にＣＭＤが固相化されたセンサ基板を作製した。【０１１９】
［実施例１］工程（ａ）〜（ｅ）のアッセイ法の実施：
はじめに、センサ基板（作製例２）の表面上に形成された検体用精製エリアを、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳ溶液０．８ｍＬで３回洗浄した。【０１２０】
工程（ａ）として、０．１ｎｇ/ｍｌのＡＦＰを添加した市販ウシ血漿（コージンバイオ（株）製）０．８ｍＬを、検体用精製エリアに２５分間接触させ、このウシ血漿中のＣＭＤ吸着成分を取り除いた。【０１２１】
工程（ｂ）として、工程（ａ）を経て得られたウシ血漿（検体）０．８ｍＬを、プラズモン励起センサ（作製例１）の表面上に形成されたセンサエリアに２５分間接触させた。【０１２２】
次いで、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳ溶液０．８ｍＬで、センサエリアを３回洗浄した。【０１２３】
工程（ｃ）として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を標識した２次抗体（１μｇ／ｍＬとなるように調製した１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）０．８ｍＬを、センサエリアに添加し、２０分間反応させた。【０１２４】
その後、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳ溶液０．８ｍＬで３回洗浄した。【０１２５】
工程（ｄ）として、プラズモン励起センサに、ガラス製の透明支持体の金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６３３ｎｍ，１０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を光電子増倍管〔ＰＭＴ〕で測定したときのシグナル値を計測し「アッセイ測定シグナル」とした。【０１２６】
なお、ウシ血漿中のＣＭＤ吸着成分を取り除いた溶液、すなわちＡＦＰが０ｎｇ／ｍＬ時のＳＰＦＳ測定シグナルを「ブランクシグナル」とした。【０１２７】
工程（ｅ）として、アッセイシグナルを以下の式で評価した。【０１２８】
アッセイシグナル＝｜（アッセイ測定シグナル）−（ブランクシグナル）｜
得られた結果を図５に示す。【０１２９】
[実施例２]工程（ｘ），（ａ）〜（ｅ）のアッセイ法の実施：
はじめに、プラズモン励起センサ（作製例１）の表面上に形成された標識抗体用精製エリアを、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳ溶液０．８ｍＬで３回洗浄した。【０１３０】
工程（ｘ）として、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を標識した２次抗体（１,０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製した１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を、標識抗体用精製エリアに０．８ｍＬ添加し、２０分間接触させた。【０１３１】
反応液を回収し、精製標識抗体溶液とした。【０１３２】
検体として、０．１ｎｇ/ｍｌのＡＦＰを添加した１重量％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用い、２次抗体を含有した溶液として、精製標識抗体溶液を用いた以外は実施例１と同様にしてアッセイ法を実施した。【０１３３】
得られた結果を図６に示す。【０１３４】
[比較例１]検体を精製しないアッセイ法の実施：
未精製のウシ血漿を用いた以外は実施例１と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を図５に示す。【０１３５】
[比較例２]抗体を精製しないアッセイ法の実施：
検体として、０．１ｎｇ/ｍｌのＡＦＰを添加した１重量％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を用いた以外は実施例１と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を図６に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明の精製エリアとセンサエリアとの組み合わせを用いたアッセイ法は、高感度かつ高精度に検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【符号の説明】
【０１３７】
１０・・・・・・ＳＰＦＳ測定用流路
２０・・・・・・検体
２１・・・・・・アナライト
２２，２３・・・非特異吸着物質
３０・・・・・・検体用精製エリア
３１・・・・・・その一方の表面に金属薄膜が形成された透明支持体
３２・・・・・・ＳＡＭ
３３・・・・・・カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕
４０・・・・・・精製された検体
５０・・・・・・センサエリア
５１・・・・・・その一方の表面に金属薄膜が形成された透明支持体
５２・・・・・・ＳＡＭ
５３・・・・・・カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕
５４・・・・・・抗体（生理活性物質）
６０・・・・・・標識抗体液
６１・・・・・・標識抗体
７０・・・・・・標識抗体用精製エリア
７１・・・・・・その一方の表面に金属薄膜が形成された透明支持体
７２・・・・・・ＳＡＭ
７３・・・・・・カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕
７４・・・・・・抗体
Ａ・・・・・・バッファーより少し高め
【図１】
2012023391.tif 000004
【図２】
2012023391.tif 000005
【図３】
2012023391.tif 000006
【図４】
2012023391.tif 000007
【図５】
2012023391.tif 000008
【図６】
2012023391.tif 000009
【国際調査報告】
2012023391.tif 000010
2012023391.tif 000011
2012023391.tif 000012
2012023391.tif 000013
2012023391.tif 000014