(57)【要約】  抗体よりも簡便に調製可能で、且つ抗体と比べて同等以上の結合性を有する、げっ歯類由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子、この核酸分子を用いた結合剤、検出試薬および検出キットを提供する。本発明の核酸分子は、げっ歯類由来のＩｇＧ抗体に結合性を有し、解離定数が１μＭ以下であることを特徴とする。また、本発明のげっ歯類由来ＩｇＧ抗体に対する結合剤は、本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。また、本発明のげっ歯類由来ＩｇＧ抗体の検出試薬は、本発明のげっ歯類由来ＩｇＧ抗体に対する結合剤を含むことを特徴とする。また、本発明のげっ歯類由来ＩｇＧ抗体の検出キットは、本発明のげっ歯類由来ＩｇＧ抗体の検出試薬を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
げっ歯類由来ＩｇＧ抗体に対し特異的結合性を有し、解離定数が１μＭ以下であることを特徴とする核酸分子。
【請求項２】
一本鎖の核酸分子であり、かつ下記一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
【化１】
2011021308.tif 000006
前記式（Ｉ）において、前記Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７およびＮ８は、ヌクレオチド残基を示し、各ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７およびｎ８は、それぞれ前記ヌクレオチド残基Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７およびＮ８の数を示し、
前記Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５およびＮ７は、それぞれループ構造形成可能であり、前記Ｎ２およびＮ８は、相互に水素結合してステム構造形成可能であり、前記Ｎ４およびＮ６は、相互に水素結合してステム構造形成可能である。
【請求項３】
前記式（Ｉ）において、
前記一本鎖核酸全体のヌクレオチド残基の数は、７〜１５０残基の範囲であり、
前記Ｎ１のヌクレオチド残基数ｎ１は、０〜４０残基の範囲であり、
前記Ｎ２のヌクレオチド残基数ｎ２は、１〜４０残基の範囲であり、
前記Ｎ３のヌクレオチド残基数ｎ３は、１〜５０残基の範囲であり、
前記Ｎ４のヌクレオチド残基数ｎ４は、１〜４０残基の範囲であり、
前記Ｎ５のヌクレオチド残基数ｎ５は、１〜５０残基の範囲であり、
前記Ｎ６のヌクレオチド残基数ｎ６は、１〜４０残基の範囲であり、
前記Ｎ７のヌクレオチド残基数ｎ７は、１〜５０残基の範囲であり、
前記Ｎ８のヌクレオチド残基数ｎ８は、１〜４０残基の範囲である、
ことを特徴とする請求項２記載の核酸分子。
【請求項４】
前記式（Ｉ）において、前記ヌクレオチド残基の一部がメチル化ヌクレオチド残基であることを特徴とする請求項２または３記載の核酸分子。
【請求項５】
ＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記式（Ｉ）において、前記ヌクレオチド残基の一部がＬＮＡおよびＤＮＡの少なくとも一方であることを特徴とする請求項５記載の核酸分子。
【請求項７】
前記式（Ｉ）において、５’末端にラベル化合物が結合していることを特徴とする請求項２から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記ラベル化合物が、ビオチンであることを特徴とする請求項７記載の核酸分子。
【請求項９】
下記に示す配列からなる群から選択された少なくとも一つの配列からなることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子。
配列番号１
dAdAdAdAdA-CGCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCG-dT
配列番号２
dAdAdAdAdA-GCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGC-dT
配列番号３
dAdAdAdAdA-dGdCGCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCdGdC
配列番号４
dAdAdAdAdA-dGdCdGdCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAdGdCdGdC
配列番号５
dAdAdAdAdA-GCGCmUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCGC
配列番号６
dAdAdAdAdA-dGdCdGdCmUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAdGdCdGdC
配列番号７
dAdAdAdAdA-CGCmUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCG-dT
【請求項１０】
前記げっ歯類由来ＩｇＧが、マウス由来ＩｇＧであることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記マウス由来ＩｇＧ抗体が、サブタイプ１のＩｇＧ抗体、サブタイプ２ａのＩｇＧ抗体およびサブタイプ３のＩｇＧ抗体のうち少なくとも一つであることを特徴とする請求項１０記載の核酸分子。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とするげっ歯類由来ＩｇＧ抗体に対する結合剤。
【請求項１３】
請求項１２記載の結合剤を含むことを特徴とするげっ歯類ＩｇＧ由来抗体の検出試薬。
【請求項１４】
請求項１３記載の検出試薬を含むことを特徴とするげっ歯類由来ＩｇＧ抗体の検出キット。
【請求項１５】
試料中の検出対象物を抗原とし、前記検出対象物と抗体とを反応させて免疫沈降させる免疫沈降工程と、
前記免疫沈降物を変性させて前記試料の他の成分から分離する分離工程と、
前記分離工程で分離した免疫沈降物の前記抗原に抗体を反応させる第１反応工程と、
前記抗体反応工程の抗体に対し特異的に結合する結合剤を反応させる第２反応工程とを有し、
前記第２反応工程の前記結合剤として、請求項１２記載の結合剤を用いることを特徴とする検出方法。
【請求項１６】
前記分離工程が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、前記第１反応工程および前記第２反応工程がウエスタンブロット法であることを特徴とする請求項１５記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、げっ歯類由来ＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子、結合剤、検出試薬および検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応は、特異性の高い反応であるため、特定のタンパク質等の検出等に応用されている。例えば、ＥＬＩＳＡ法は、酵素で標識化した抗体を、試料中の特定の抗原（タンパク質等）と反応させて複合体を形成し、さらにビーズ等に固定化した抗体で前記複合体を捕捉し、前記酵素に発色性基質を作用させることで、抗原（タンパク質等）を検出する方法である。さらに、抗体は、その特異性を利用して医薬としても使用されている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
検出試薬用として、マウスおよびラット等のげっ歯類由来抗体が使用されている。げっ歯類由来抗体を用いた検出キットでは、げっ歯類由来抗体に特異的に結合する抗体が使用されている。しかし、抗体の製造は困難であり、かつ抗体の取り扱いが煩雑であるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−４６４９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、製造および取り扱いが容易であり、かつ抗体と同等以上の結合性を有するげっ歯類由来ＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の核酸分子は、げっ歯類由来ＩｇＧ抗体に対し特異的結合性を有し、解離定数が、１μＭ以下であることを特徴とする。なお、濃度の単位Ｍとは、１ｍｏｌ／ｄｍ３または１ｍｏｌ／Ｌに等しい。【０００７】
本発明のげっ歯類由来ＩｇＧ抗体に対する結合剤は、本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。【０００８】
本発明のげっ歯類由来ＩｇＧ抗体の検出試薬は、本発明のげっ歯類由来ＩｇＧ抗体に対する結合剤を含むことを特徴とする。【０００９】
本発明のげっ歯類由来ＩｇＧ抗体の検出キットは、本発明のげっ歯類由来ＩｇＧ抗体の検出試薬を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の核酸分子は、げっ歯類由来のＩｇＧ抗体と高い特異性で結合可能である。また、本発明の核酸分子は、抗体に比べ、製造および取り扱いが容易である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、各種アプタマーの予測２次構造を示す模式図である。
【図２】図２は、各種アプタマーの予測２次構造を示す模式図である。
【図３】図３は、各種アプタマーの予測２次構造を示す模式図である。
【図４】図４は、ノースウエスタンブロット法の結果を示す写真である。
【図５】図５は、ＢＩＡＣＯＲＥによる解析結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＢＩＡＣＯＲＥによる解析結果を示すグラフである。
【図７】図７は、ＢＩＡＣＯＲＥによる解析結果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＢＩＡＣＯＲＥによる解析結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＢＩＡＣＯＲＥによる解析結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＢＩＡＣＯＲＥによる解析結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、アプタマーの安定性の解析結果を示す電気泳動写真である。
【図１２】図１２は、アプタマーの安定性の解析結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、アプタマーとマウス由来ＩｇＧ抗体との結合の特異性の解析結果を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（本発明の核酸分子）
前記本発明の核酸分子は、前述の通り、げっ歯類由来ＩｇＧ抗体に対し特異的結合性を有し、解離定数が、１μＭ以下であることを特徴とする。前記解離定数は、好ましくは２００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、さらに好ましくは、１０ｎＭ以下である。本発明において、げっ歯類とは、哺乳網ネズミ目（げっ歯目）のことをいう。げっ歯類としては、例えば、マウス、ラット等があげられる。本発明の核酸分子は、マウス由来ＩｇＧに前記解離定数で特異的に結合する核酸分子が好ましい。同様に、本発明の核酸分子は、ラット由来ＩｇＧに前記解離定数で特異的に結合する核酸分子が好ましい。
【００１３】
前記本発明の核酸分子は、例えば、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。前記一本鎖としては、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡがあげられ、前記二本鎖核酸としては、例えば、二本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡがあげられる。本発明の核酸分子が、前記二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖にしてもよい。
【００１４】
前記本発明の核酸分子は、例えば、ＲＮＡ分子でもよいし、ＤＮＡ分子でもよいが、ＲＮＡ分子であることが好ましい。また、前記本発明の核酸分子は、例えば、前述のように、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、前記核酸分子を構成するヌクレオチド残基としては、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドと、ＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドとの両方を含んでもよい。また、前記本発明の核酸分子には、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ等、鎖の本数や、核酸が修飾されているか否か等に制約はない。
【００１５】
前記本発明の核酸分子は、前記ヌクレオチドにおける塩基が、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）という天然塩基（非人工塩基）でもよいし、前記天然塩基（ａ、ｃ、ｇ、ｔまたはｕ）と同様の機能を有する、修飾塩基および改変塩基等の人工塩基であってもよい。前記同様の機能を有する人工塩基とは、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）またはウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基としては、例えば、メチル化塩基、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２−チオウラシル等があげられる。また、前記本発明の核酸分子は、例えば、ＰＮＡ等のペプチド核酸、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等を含んでもよい。
【００１６】
前記本発明の核酸分子は、例えば、一本鎖の核酸分子であり、かつ下記一般式（Ｉ）で表されていてもよい。
【化１】
2011021308.tif 000002
前記式（Ｉ）において、前記Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７およびＮ８は、ヌクレオチド残基を示し、前記ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７およびｎ８は、それぞれ前記ヌクレオチド残基Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７およびＮ８の数を示し、前記Ｎ１、Ｎ３、Ｎ５およびＮ７は、それぞれループ構造形成可能であり、前記Ｎ２およびＮ８は、相互に水素結合してステム構造形成可能であり、前記Ｎ４およびＮ６は、相互に水素結合してステム構造形成可能である。
【００１７】
本発明において、「ループ構造形成可能」とは、例えば、実際にループ構造を形成すること、およびループ構造が形成されていなくても、条件によってはループ構造形成可能なことも含む。また、「ループ構造形成可能」であることは、例えば、実験的に確認した場合、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。同様に、本発明において、「ステム構造形成可能」とは、例えば、実際にステム構造を形成すること、およびステム構造が形成されていなくても、条件によってはステム構造形成可能なことも含む。また、「ステム構造形成可能」であることは、例えば、実験的に確認した場合、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００１８】
前記式（Ｉ）において、前記一本鎖核酸全体のヌクレオチド残基の数は、特に制限されないが、例えば、７〜１５０残基の範囲であり、好ましくは、１０〜１００残基の範囲であり、より好ましくは、１５〜６０残基の範囲である。
前記Ｎ１のヌクレオチド残基数ｎ１は、特に制限されないが、例えば、０〜４０残基の範囲であり、好ましくは、１〜２５残基の範囲であり、より好ましくは、４〜１０残基の範囲である。
前記Ｎ２のヌクレオチド残基数ｎ２は、特に制限されないが、例えば、１〜４０残基の範囲であり、好ましくは、２〜２０残基の範囲であり、より好ましくは、２〜８残基の範囲である。
前記Ｎ３のヌクレオチド残基数ｎ３は、特に制限されないが、例えば、１〜５０残基の範囲であり、好ましくは、１〜３０残基の範囲であり、より好ましくは、１〜１５残基の範囲である。
前記Ｎ４のヌクレオチド残基数ｎ４は、特に制限されないが、例えば、１〜４０残基の範囲であり、好ましくは、１〜２０残基の範囲であり、より好ましくは、１〜１０残基の範囲である。
前記Ｎ５のヌクレオチド残基数ｎ５は、特に制限されないが、例えば、１〜５０残基の範囲であり、好ましくは、１〜３０残基の範囲であり、より好ましくは、１〜１５残基の範囲である。
前記Ｎ６のヌクレオチド残基数ｎ６は、特に制限されないが、例えば、１〜４０残基の範囲であり、好ましくは、１〜２０残基の範囲であり、より好ましくは、１〜１０残基の範囲である。
前記Ｎ７のヌクレオチド残基数ｎ７は、特に制限されないが、例えば、１〜５０残基の範囲であり、好ましくは、１〜３０残基の範囲であり、より好ましくは、１〜１０残基の範囲である。
前記Ｎ８のヌクレオチド残基数ｎ８は、特に制限されないが、例えば、１〜４０残基の範囲であり、好ましくは、２〜２０残基の範囲であり、より好ましくは、２〜８残基の範囲である。
以上のヌクレオチド残基数ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７およびｎ８は、特に制限されないが、以下の等式および不等式を満たすことが好ましい。
ｎ２＝ｎ８、ｎ４＝ｎ６、（ｎ３＋ｎ７）＞ｎ５
【００１９】
前記式（Ｉ）で表わされる核酸分子は、ＤＮＡ分子でもよいし、ＲＮＡ分子でもよいが、ＲＮＡ分子であることが好ましい。本発明の核酸分子がＲＮＡ分子である場合、ＲＮＡ分解酵素耐性であることが好ましい。ＲＮＡ分解酵素耐性にする手法は、特に制限されず、例えば、本発明のＲＮＡ核酸分子のヌクレオチド残基の一部をメチル化等で修飾する方法、前記ヌクレオチド残基の一部または全部をＤＮＡ化もしくはＬＮＡ化する方法等があげられる。
【００２０】
前記式（Ｉ）において、前記ヌクレオチド残基の一部（一本鎖核酸全体のヌクレオチド残基のうち一部のヌクレオチド残基）が、修飾化ヌクレオチド残基であることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基としては、例えば、メチル化ヌクレオチド残基であることが好ましい。前記ヌクレオチド残基における修飾部位は、例えば、リボース部位が好ましい。前記塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、２’位、４’位が修飾されていることが好ましく、プリン塩基の場合、例えば、２’位、４’位が修飾されていることが好ましい。また、５’末端や３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジンを結合させる方法等もあげられる。
【００２１】
前記式（Ｉ）において、前記一本鎖核酸全体のヌクレオチド残基の数は、特に制限されないが、例えば、７〜１５０残基の範囲であり、好ましくは、１０〜１００残基の範囲であり、より好ましくは、１５〜６０残基の範囲である。
【００２２】
前記式（Ｉ）において、前記修飾化ヌクレオチド残基の部位は、特に制限されないが、ステム構造形成可能な領域の末端であり、且つ、ループ構造形成可能な領域の末端であることが好ましい。具体例としては、前記式（Ｉ）において、例えば、Ｎ２の５’末端（Ｎ１の３’末端）、Ｎ２の３’末端（Ｎ３の５’末端）、Ｎ３の３’末端（Ｎ４の５’末端）、Ｎ４の３’末端（Ｎ５の５’末端）、Ｎ５の３’末端（Ｎ６の５’末端）、Ｎ６の３’末端（Ｎ７の５’末端）、Ｎ７の３’末端（Ｎ８の５’末端）等があげられ、中でも、Ｎ３の３’末端（Ｎ４の５’末端）、Ｎ５の３’末端（Ｎ６の５’末端）、Ｎ２の３’末端（Ｎ３の５’末端）等が好ましい。
【００２３】
前記式（Ｉ）において、前記ヌクレオチド残基の一部が、例えば、ＬＮＡおよびＤＮＡの少なくとも一方であることが好ましい。中でも、前記式（Ｉ）で表わされる核酸分子が、前述のようにＲＮＡ分子の場合、前記ヌクレオチド残基の一部または全部が、例えば、ＬＮＡおよびＤＮＡの少なくとも一方であることが好ましく、また、前記ＲＮＡ分子は、ＬＮＡおよびＤＮＡの両方を含んでもよい。
前記式（Ｉ）において、ＬＮＡヌクレオチドモノマーの数は、特に制限されないが、例えば、１〜１５０残基の範囲であり、好ましくは、１〜１００残基の範囲であり、より好ましくは、１〜１０残基の範囲である。
また、前記式（Ｉ）に含まれるＬＮＡの長さは、特に制限されないが、例えば、１〜１０残基の範囲であり、好ましくは２残基である。前記式（Ｉ）において、ＤＮＡを構成するデオキシリボヌクレオチドモノマーの数は、特に制限されないが、例えば、１〜１５０残基の範囲であり、好ましくは、１〜１００残基の範囲であり、より好ましくは、１〜３０残基の範囲である。また、前記（Ｉ）に含まれるＤＮＡの長さは、特に制限されないが、例えば、１〜３０残基の範囲であり、好ましくは、３〜１０残基の範囲であり、より好ましくは、４残基の範囲である。
【００２４】
また、前記式（Ｉ）で表わされる核酸分子がＲＮＡ分子であって、ＤＮＡを含む場合、前記式（Ｉ）において、ステム構造形成可能な部位に、前記ＤＮＡを含むことが好ましい。具体的には、前記式（Ｉ）において、Ｎ２およびＮ７の全部または一部に、ＤＮＡを含むことが好ましい。また、前記式（Ｉ）で表わされる核酸分子がＲＮＡ分子であって、ＬＮＡを含む場合も、同様に、前記式（Ｉ）において、ステム構造形成可能な部位に、前記ＬＮＡを含むことが好ましい。具体的には、前記式（Ｉ）において、Ｎ２およびＮ７の全部または一部に、ＬＮＡを含むことが好ましい。
【００２５】
前記式（Ｉ）において、例えば、５’末端および３’末端の少なくとも一方にラベル化合物が結合していることが好ましく、５’末端に前記ラベル化合物が結合していることがより好ましい。
【００２６】
前記ラベル化合物は、特に制限されないが、例えば、ビオチン、アビジン、蛍光団、酵素、放射性同位元素、チオール基やアミノ基などの官能基、メチレンブルーなどの電子受容体やＮＡＤＰＨなどの電子供与体、有機化合物や無機化合物、ルテニウムなどの電気化学発光物質等があげられ、ビオチンであることが好ましい。前記蛍光団は、特に制限されないが、例えば、フルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシルクロリドとその誘導体、ウンベリフェロン等があげられる。前記酵素は、特に制限されないが、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼ等があげられる。放射性同位元素は、特に制限されないが、例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、リン（３２Ｐ）、イオウ（３５Ｓ）、金属類（例えば６８Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇｅ、５４Ｍｎ、９９Ｍｏ、９９Ｔｃ、１３３Ｘｅ等）、トリチウム等があげられる。その他のラベルは、特に制限されないが、例えば、ＮＡＤＨ−、ＦＭＮＨ２−、アクリジニウムエステル、ルミノール等の発光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光物質、ＧＦＰ等の生体蛍光蛋白質等があげられる。
【００２７】
前記本発明の核酸分子は、例えば、下記に示す配列からなる群から選択された少なくとも一つの配列からなることが好ましい。下記式において、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびｄＴ等の「ｄＮ」は、デオキシリボヌクレオチド残基を示し、ＧおよびＣ等の「Ｎ」は、ＬＮＡヌクレオチド残基を示し、ｍＣおよびｍＵ等の「ｍＮ」は、メチル化リボヌクレオチド残基を示す。
配列番号１
dAdAdAdAdA-CGCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCG-dT
配列番号２
dAdAdAdAdA-GCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGC-dT
配列番号３
dAdAdAdAdA-dGdCGCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCdGdC
配列番号４
dAdAdAdAdA-dGdCdGdCUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAdGdCdGdC
配列番号５
dAdAdAdAdA-GCGCmUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCGC
配列番号６
dAdAdAdAdA-dGdCdGdCmUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAdGdCdGdC
配列番号７
dAdAdAdAdA-CGCmUGAAGAGAAGACGGAAGGAGACGAAGCG-dT
【００２８】
前記本発明の核酸分子において、例えば、前記マウスＩｇＧ抗体が、サブタイプ１のＩｇＧ抗体、サブタイプ２ａのＩｇＧ抗体およびサブタイプ３のＩｇＧ抗体のうち少なくとも一つであることが好ましい。
【００２９】
本発明において、マウス由来のＩｇＧ抗体のサブタイプとしては、特に制約はなく、例えば、サブタイプ１、サブタイプ２ａおよびサブタイプ３並びにこれらを任意に有する異なるサブタイプを有するＩｇＧ抗体を混合したものが挙げられる。
【００３０】
本発明の核酸分子は、いわゆるＲＮＡプール等の核酸分子と、標的物質としてマウス等のげっ歯類由来のＩｇＧ抗体とを用いて、核酸分子と標的物質とが特異的に結合して形成される核酸分子／標的物質複合体から、この複合体の形成に関与した核酸分子のみを選択する方法で製造することが可能である。このような方法としては、例えば、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と称される方法や、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲル等の担体を用いて核酸分子／標的物質複合体を得た後にこの複合体の形成に関与した核酸分子のみを回収する方法等が挙げられる。
【００３１】
（ＳＥＬＥＸ法に準じた本発明の核酸分子の製造方法）
本発明の核酸分子は、ＳＥＬＥＸ法に従って、またこの方法に準じた方法で、ＲＮＡプールと標的物質とを反応させて得られるＲＮＡプール−標的物質複合体を回収した後、この複合体から、この複合体の形成に関与したＲＮＡプールのみを回収して、製造することが可能である。
【００３２】
ＲＮＡプールとは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＵからなる群から選択された塩基、並びに、この塩基の置換体を２０〜１２０個程度連結した領域（この領域を、以下、「ランダム領域」と称する。）を有する遺伝子配列を総称する遺伝子の混合物をいう。従って、ＲＮＡプールは、４２０〜４１２０（１０１２〜１０７２）種類の複数の遺伝子が含まれ、４３０〜４６０（１０１８〜１０３６）種類の遺伝子が含まれることが好ましい。塩基の置換体としては、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素等のハロゲンや、メチル、エチルおよびプロピル等のアルキル基等、適当に置換された塩基が挙げられる。
【００３３】
ＲＮＡプールは、ランダム領域を有する限り、その他の構造に制約はないが、本発明の核酸分子をＳＥＬＥＸ法に準じて製造する場合、ランダム領域の５’末端および／又は３’末端には、後述のＰＣＲ等で利用するプライマー領域や、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域を有することが好ましい。例えば、ランダム領域は、５’末端側からＴ７プロモーター等のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域（以下、この領域を「ＲＮＡポリメラーゼ認識領域」と称する。）と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域（以下、この領域を「５’末端側プライマー領域」と称する。）とを連結し、この５’末端側プライマー領域の３’末端にランダム領域を連結し、さらにこのランダム領域の３’末端側にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域（以下、この領域を、「３’末端側プライマー領域」と称する。）を連結した構造を有してもよい。また、ＲＮＡプールは、これらの領域の他に、標的物質への結合を補助する公知の領域を有してもよい。さらに、ＲＮＡプールは、ランダム領域の一部が各ＲＮＡプールにおいて同じ配列を有するものであってもよい。
【００３４】
ランダム領域は、ＲＮＡプールのランダム領域のＵをＴに置き換えた初期プールを鋳型として、ＰＣＲ法に基づいて、遺伝子増幅した後、得た遺伝子産物と、Ｔ７ポリメラーゼ等のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとを反応させて、調製されてもよい。また、初期プールに相補的な遺伝子を合成し、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と、５’末端側プライマー領域に相補的な配列とからなるプライマーを、初期プールにおいてこのプライマーと相補的な遺伝子にアニーリングさせて、ＰＣＲ法に基づいて、調製されてもよい。
【００３５】
次に、このようにして合成したＲＮＡプールと、標的物質であるげっ歯類由来のＩｇＧ抗体とを水素結合等の分子間力を介して結合させる。この結合方法としては、ＲＮＡプールと標的物質とを、標的物質の結合等の機能が保たれる緩衝液中で一定時間インキュベートする方法が挙げられる。このようにして、緩衝液中でＲＮＡプール−標的物質複合体が形成される。
【００３６】
次に、このように形成されたＲＮＡプール−標的物質複合体を回収する。緩衝液中には、この複合体の他、複合体の形成に関与しなかったＲＮＡプールや標的物質が含まれるが、この複合体の回収方法としては、標的物質に結合性を有する核酸分子を回収することを目的として、緩衝液中に存在する複合体の形成に関与しなかったＲＮＡプールを除去する方法により行えばよい。この方法としては、標的物質およびＲＮＡプールの特定の成分への吸着性の違いを利用する方法や、複合体とＲＮＡプールとの分子量の違いを利用する方法が挙げられる。
【００３７】
標的物質およびＲＮＡプールの特定の成分への吸着性の違いを利用した方法としては、例えば、ニトロセルロース等の標的物質に吸着性を有する膜を用いて、上述のＲＮＡプール−標的物質複合体を有する緩衝液を濾過し、この膜上にＲＮＡプール−標的物質複合体を吸着させ、その後、膜上に残存したＲＮＡプール−標的物質複合体から、複合体の形成に関与したＲＮＡプールを、例えばこの複合体におけるＲＮＡプールと標的物質との結合を解除した後にＲＮＡプールを回収する方法が挙げられる。
【００３８】
また、ＲＮＡプール−標的物質複合体とＲＮＡプールとの分子量の違いを利用した方法としては、アガロースゲル等、ＲＮＡプールを通過させ得るがＲＮＡプール−標的物質複合体を通過させ得ない程度のポアを有する担体を利用して、ＲＮＡプール−標的物質複合体とＲＮＡプールとを電気的に分離し、この複合体から、複合体の形成に関与したＲＮＡプールを回収する方法が挙げられる。
【００３９】
次に、このようにして得たＲＮＡプール−標的物質複合体から回収した複合体の形成に関与したＲＮＡプールを用いて、遺伝子増幅を行う。この遺伝子増幅の方法としては、ＲＮＡプールに含まれる５’末端側プライマー領域、３’末端側プライマー領域、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用する方法が挙げられる。例えば、複合体の形成に関与したＲＮＡプールの３’末端側プライマー領域に相補的な遺伝子断片をプライマーとして用いて、トリ骨髄芽球症ウイルス由来リバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）等のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応に従ってｃＤＮＡを調製した後、このｃＤＮＡに含まれる５’末端側プライマー領域および３’末端側プライマー領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応を行い、得た遺伝子産物に含まれるＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行って、ＲＮＡプールの遺伝子増幅を行ってもよい。
【００４０】
このように遺伝子増幅された複合体の形成に関与したＲＮＡプールと、標的物質とを用いて、上述のＲＮＡプール−標的物質複合体を形成する方法以下の各方法を繰り返し行い、最終的に、標的物質としてのマウスおよびラット等由来のＩｇＧ抗体に特異的に結合する核酸分子、つまり、げっ歯類（rodent）由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子を得ることができる。
【００４１】
（本発明における二次構造予測）
本発明の核酸分子は、上記の通りに得ることが出来るが、その塩基配列に基づいた二次構造予測の手法を用いた結果を参照して、得た核酸分子の一部を改変されたものであってもよい。この二次構造予測としては、核酸分子の二次構造の候補を探索し、この探索された二次構造候補のうち、エネルギー的に安定な二次構造を予測する方法であれば、特に制約はない。例えば、核酸分子の塩基配列を、ワトソン・クリック型等の塩基対を構成するステム領域と、このステム領域以外の塩基で構成されるループ構造等の一本鎖領域とに分割して得た二次構造候補のエネルギー関数を最小化することに基づく二次構造予測であってもよい。
【００４２】
この二次構造候補のエネルギー関数を最小化することに基づく二次構造予測について、説明する。まず、対象となる核酸分子の塩基配列のうち、ワトソン・クリック型等の塩基対を構成する塩基の候補と、この塩基対候補以外の一本鎖領域の候補とを探索する。探索された塩基対候補および一本鎖領域候補の全組合せのうち、塩基対候補を構成する塩基と一本鎖領域候補を構成する塩基とが重複する等、理論的に取り得ない組合せを除いて、二次構造候補を同定する。同定された二次構造候補のうち、二次構造候補のエネルギー関数を算出し、算出されたエネルギー関数が最小となる二次構造を探索する。この際、この二次構造候補のエネルギー関数の算出方法としては、二次構造候補を構成する個々のステム領域および一本鎖領域の自由エネルギーに基づいて、この二次構造候補における自由エネルギーを、二次構造候補のエネルギー関数とする方法であってもよい。このようにして、同定された二次構造候補のうち、エネルギー関数の最も小さい二次構造を、対象となる核酸分子の塩基配列の二次構造とする。
【００４３】
本発明の核酸分子は、このようにして得た二次構造の結果を参照して、二次構造のうちの特徴ある部位を構成する塩基の置換若しくは欠失によって、又は二次構造のうちの特徴ある部分への塩基の挿入等によって、改変されてもよい。例えば、上記の通り調製した核酸分子を親分子として、二次構造のステム領域および／又は一本鎖領域を構成する塩基の一部を置換してもよい。また、二次構造のステム領域および／又は一本鎖領域を構成する塩基の一部を欠失させてもよい。また、二次構造のステム領域および／又は一本鎖領域に、単数又は複数の塩基を挿入して、ステム長さおよび／又は一本鎖領域の長さを短縮／延長してもよい。
【００４４】
本発明の核酸分子は、この二次構造予測を用いて得た核酸分子の二次構造において、ステム長さ３以上のステム領域を、この核酸分子の末端に有することが好ましい。また、本発明の核酸分子において、ステム長さ３以上のステム領域の一本鎖領域側の末端の塩基に隣接する塩基が、アデニン以外の塩基であることが好ましい。また、本発明の核酸分子において、ステム長さ３以上のステム領域は、グアニン残基およびシトシン残基のみから構成されていることが好ましい。これらにより、げっ歯類（rodent）由来のＩｇＧ抗体への結合性がさらに向上する。
【００４５】
（本発明の核酸分子の用途等）
本発明の核酸分子は、上記の通り、マウス等のげっ歯類由来のＩｇＧ抗体に結合性を有することを特徴とするものである。従って、本発明の核酸分子の用途としては、マウス等のげっ歯類由来のＩｇＧ抗体への結合性を利用する用途であれば特に制約はなく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）法に準じて行われる泳動対象物の検出用として、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法；Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）の測定の対象物若しくはこの対象物を含む複合体の検出用として、ノースウエスタン法に準じて行われる泳動対象物の検出用として、又はマウス等のげっ歯類由来のＩｇＧ抗体若しくはこの抗体を利用した精製用として用いられてもよい。
【００４６】
例えば、本発明の核酸分子をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に用いる場合には、泳動されたタンパク質を検出するために用いられてもよく、泳動されたタンパク質を検出するのに用いられたマウス等のげっ歯類由来のＩｇＧ抗体を検出するのに用いられてもよい。
【００４７】
また、本発明の核酸分子をＥＬＩＳＡ法に用いる場合には、測定の対象となるマウス等のげっ歯類由来ＩｇＧを検出するのに用いられてもよく、また、測定の対象を検出するために用いられたマウス等のげっ歯類由来のＩｇＧ抗体を検出するのに用いられてもよい。
【００４８】
また、本発明の核酸分子をノースウエスタン法に用いる場合には、電気泳動の対象となるマウス等のげっ歯類由来のＩｇＧ抗体を検出するのに用いられてもよく、また、泳動の対象となるタンパク質の検出に用いられるマウス等のげっ歯類由来のＩｇＧ抗体を検出するのに用いられてもよい。
【００４９】
また、本発明の核酸分子をマウス等のげっ歯類由来のＩｇＧの精製に用いる場合、精製の対象となるマウス等のげっ歯類由来のＩｇＧ抗体を精製するのに適当な形態で利用すればよく、例えば、本発明の核酸分子を、アガロースや合成樹脂からなるビーズに結合して、使用してもよい。このようにビーズに結合する形態としては、精製に用いる担体（例えば、アガロースや、合成樹脂からなるビーズ）に結合性を有するように、ビオチン化等、種々の改変が挙げられる。従って、本発明の核酸分子は、ビオチン化等の種々の改変を受けたものであってもよい。
【００５０】
（本発明の核酸分子の応用例）
本発明の核酸分子の応用例としては、得た核酸分子を含有する試薬、この試薬を有するキット等、マウス等のげっ歯類由来のＩｇＧ抗体への結合性を利用したものが挙げられる。例えば、上記の本発明の核酸分子を含有する試薬を用いて、マウス等のげっ歯類由来のＩｇＧ抗体への結合を検出する検出キットとしてもよい。このようなキットの測定対象物としては、溶液、懸濁液のような液体系であってもよく、培養細胞や組織切片等、固形物であってもよい。
【００５１】
また、本発明の検出キットにおいて、本発明の核酸分子以外の試薬としては、標的物質と核酸分子との結合を検出するために必要な物質を適宜選択すればよく、これは、検出キットに用いる核酸分子によって適宜選択すればよい。
【００５２】
例えば、本発明の検出キットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）に準じて行うものであってもよく、この場合、検出キットに含まれる試薬としては、電気泳動の対象となるタンパク質の検出に用いるマウス等のげっ歯類由来ＩｇＧに結合性を有する核酸分子であってもよく、また電気泳動の対象となるマウス等のげっ歯類由来ＩｇＧに結合性を有する核酸分子であってもよい。
【００５３】
また、本発明の検出キットは、ＥＬＩＳＡ法に準じて行うものであってもよく、この場合、検出キットに含まれる試薬としては、測定の対象となるマウス等のげっ歯類由来ＩｇＧに結合性を有する核酸分子が挙げられる。
【００５４】
また、本発明の検出キットは、ノースウエスタン法に準じて行われるものであってもよく、この場合、検出キットに含まれる試薬としては、泳動の対象となるタンパク質の検出に用いられるマウス等のげっ歯類由来ＩｇＧに結合性を有する核酸分子であってもよく、また電気泳動の対象となるマウス等のげっ歯類由来ＩｇＧに結合性を有する核酸分子であってもよい。
【００５５】
つぎに、本発明の検出方法は、
試料中の検出対象物を抗原とし、前記検出対象物と抗体とを反応させて免疫沈降させる免疫沈降工程と、
前記免疫沈降物を変性させて前記試料の他の成分から分離する分離工程と、
前記分離工程で分離した免疫沈降物の前記抗原に抗体を反応させる第１反応工程と、
前記抗体反応工程の抗体に対し特異的に結合する結合剤を反応させる第２反応工程とを有し、
前記第２反応工程の前記結合剤として、前記本発明の結合剤を用いることを特徴とする。
【００５６】
本発明の核酸分子（特に、ＲＮＡ分子）は、マウス等のげっ歯類由来ＩｇＧに特異的に結合し、変性したマウス等のげっ歯類由来ＩｇＧには特異性が低い。したがって、本発明の核酸分子（特に、ＲＮＡ分子）を用いれば、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、マウスＩｇＧを用いたウエスタンブロット法で検出する場合、ＳＤＳで変性した抗体に結合すること少ないため、ノイズを押さえてクリアに検出対象物を検出可能である。したがって、本発明の検出方法において、前記分離工程が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、前記第１反応工程および前記第２反応工程がウエスタンブロット法であることが好ましい。
【００５７】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例で使用した、マウスＩｇＧ抗体に対するアプタマー（以下、「マウスＩｇＧアプタマー」ともいう）のクローンを、下記表１に示す。下記表の「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」は、各配列の修飾を示す。具体的に、「５’−ｂｉｏｔｉｎ」は、５’末端にビオチンが結合していること、「ｄＡ  ５ｍｅｒ」は、５ｍｅｒのポリデオキシヌクレオチド残基、「ｓｔｅｍ  ＬＮＡ−２ｂｐ」および「ｓｔｅｍ  ＬＮＡ−４ｂｐ」は、ステム構造形成可能な領域に２ｂｐまたは４ｂｐのＬＮＡを有すること、「ｓｔｅｍ  ＤＮＡ−２ｂｐ」および「ｓｔｅｍ  ＤＮＡ−４ｂｐ」は、ステム構造形成可能な領域に２ｂｐまたは４ｂｐのＤＮＡを有すること、「＋ｄＴ」は、３’末端にデオキシチミジン残基を有すること、「ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ２１Ｃ」、「ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ３１Ｃ」および「ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  １０Ｕ」は、それぞれ、２１番目のＣ、３１番目のＣ、または１０番目のＵが、メチル化されていることを示す。また、下記表の「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」において、「ｄＮ」は、デオキシリボヌクレオチドを示し、「下線Ｎ」は、ＬＮＡヌクレオチドモノマーを示し、「ｍＮ」は、塩基の２’位のメチル化（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ）を示す。また、これらのアプタマーについて、予想される二次構造を、図１〜３にそれぞれ示す。【００５９】
【表１】
2011021308.tif 000003
［実施例１］【００６０】
まず、前記マウスＩｇＧアプタマーについて、マウス由来ＩｇＧ抗体との結合性を、ノースウエスタンブロット法により評価した。アプタマーとしては、前述のＭＩＧ−ｍ０３４、ＭＩＧ−ｍ０４１およびＭＩＧ−ｍ０４２のアプタマーを使用した。なお、ＭＩＧ−ｍ０４１は、１０番目のウラシル残基がメチル化され、且つ、ステム構造形成可能な領域に、４ｂｐのＤＮＡを有するアプタマーである。また、ＭＩＧ−ｍ０４２は、ＭＩＧ−ｍ０３４において、９番目のウラシル残基がメチル化され、且つ、ステム構造形成可能な領域に、２ｂｐのＬＮＡを有するアプタマーである。【００６１】
ノースウエスタンブロット法は、まず、抗原として、５０ｎｇ、１００ｎｇおよび２００ｎｇのFLAG-BAP  Control  Protein（SIGMA  #P7582）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜へ転写した。そして、前記ＰＶＤＦ膜の前記抗原に、一次抗体として１／１０００に希釈したANTI-FLAG  M2  Monoclonal  Antibody（SIGMA  #F3165  Lot#086K6012）を結合させ、さらに、前記各アプタマーをそれぞれ前記一次抗体に結合させた。そして、さらに、ペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジン（ＧＥヘルスケア社製）と基質ＣＰＳ−１（SIGMA社製）を添加して、前記基質を発光させ、フィルムへの感光を行った。なお、ＭＩＧ−ｍ０３４のアプタマー濃度は、２０ｎＭとし、ＭＩＧ−ｍ０４１およびＭＩＧ−ｍ０４２のアプタマー濃度は、１０ｎＭとした。【００６２】
これらの結果を図４に示す。図４は、ノースウエスタンブロット法の結果を示す写真である。図４において、（ａ）は、ＭＩＧ−ｍ０３４の結果、（ｂ）は、ＭＩＧ−ｍ０４１の結果、（ｃ）は、ＭＩＧ−ｍ０４２の結果をそれぞれ示し、各図において、レーンＭは、ビオチン化分子量マーカー、レーン１は、２００ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＡＰ、レーン２は、１００ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＡＰ，レーン３は、５０ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＡＰを使用した結果である。図４に示すように、いずれのアプタマーを使用した場合も、抗原に特異的なシグナルが検出できた。中でも、ＭＩＧ−ｍ０４１およびＭＩＧ−ｍ０４２は、アプタマー濃度を１０ｎＭの低濃度としたが、十分にシグナルが確認できた。
［実施例２］【００６３】
前記マウスＩｇＧアプタマーと、各種サブタイプのマウス由来ＩｇＧ抗体との結合を解析した。前記アプタマーとして、前述のＭＩＧ−ｍ０３４、ＭＩＧ−ｍ０４１およびＭＩＧ−ｍ０４２のアプタマーを使用した。【００６４】
前記結合の解析は、ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、その使用説明書にしたがって行った。また、前記ＢＩＡＣＯＲＥで測定したシグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）から、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルで解析を行って、各アプタマーとマウスＩｇＧ抗体との解離定数を求めた。前記ＢＩＡＣＯＲＥの測定条件および手法等は、下記の文献の記載に従った。
（文献）
Yoshihito  Yoshida*,  Nobuya  Sakai*,  Hiromi  Masuda,
Makio  Furuichi,  Fumiko  Nishikawa,  Satoshi  Nishikawa,
Hiroshi  Mizuno  and  Iwao  Waga:
“Rabbit  antibody  detection  with  RNA  aptamers”
Analytical  Biochemistry,  Vol.  375,  pp.  217-222,  (2008)【００６５】
これらの結果を、図５〜７に示す。図５〜図７は、経時的なシグナル強度の変化を示すグラフである。図５は、サブタイプ１のマウスＩｇＧ抗体とアプタマーとの結合、図６は、サブタイプ２ａのマウスＩｇＧとアプタマーとの結合、図７は、サブタイプ３のマウスＩｇＧとアプタマーとの結合を、それぞれ示し、各図ともに、上から、ＭＩＧ−ｍ０３４、ＭＩＧ−ｍ０４１およびＭＩＧ−ｍ０４２を使用した結果である。また、各グラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、１００秒は、流速２０μＬ／ｍｉｎで解析対象物をフローセルにインジェクション開始した時点であり、前記インジェクションを２分間（１２０秒間）継続し、その後、ランニングバッファーを３分間（１８０秒間）送液しアプタマーとＩｇＧの相互作用を示すセンサグラムを得た。グローバルフィッティング解析を行い、正確なＫｄ値を求めるために、ターゲット濃度の異なる条件下でセンサグラムを得た。６つの結果はそれぞれシグナルの強い順から順にアナライトの濃度が、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび０ｎＭのセンサグラムを示している。【００６６】
また、下記表２に、各マウスＩｇＧアプタマーについて、各サブタイプのマウスＩｇＧ抗体との解離定数を示す。【００６７】
【表２】
2011021308.tif 000004
【００６８】
前記図５〜７および前記表２の結果から、いずれのアプタマーについても、各サブタイプのマウス由来ＩｇＧとの優れた結合性が示された。中でも、ＭＩＧ−ｍ０３４を修飾したＭＩＧ−ｍ０４１およびＭＩＧ−ｍ０４２は、マウス由来ＩｇＧに対して、より高い結合能を示し、特にＩｇＧ１に対しては、極めて特異的な結合を示すことが分かった。ステムのＧＣ対がＬＮＡであるＭＩＧ−ｍ０３４をベースにステム領域をＤＮＡに置換したＭＩＧ−ｍ０４１および９位のウリジンをメチル化したＭＩＧ−ｍ０４２の結合力はほぼ同等である。これらステム領域の塩基対およびその近傍にあるＵはマウスＩｇＧの結合に関与しないことが考えられる。
［実施例３］【００６９】
アプタマーとして、ＭＩＧ−ｍ０３４、ＭＩＧ−ｍ０３５、ＭＩＧ−ｍ０３６、ＭＩＧ−ｍ０３７およびＭＩＧ−ｍ０４０を用いた以外は、実施例２と同様に実験を行った。これらの結果を、図８〜１０に示す。図８〜１０は、経時的なシグナル強度の変化を示すグラフであり、それぞれ、サブタイプ１、サブタイプ２ａおよびサブタイプ３のマウスＩｇＧを用いた結果である。また、前記ＢＩＡＣＯＲＥの測定結果から求めた、前記各アプタマーと前記各サブタイプのマウスＩｇＧとの解離定数を下記表に示す。下記表の結果から、これらのアプタマーは２次抗体試薬として非常に汎用性が高く、結合力に優れていることが確認された。また実施例１よりステム領域の塩基対およびその近傍にあるＵはマウスＩｇＧの結合に関与しないことが考えられたため、系統的な修飾塩基を持つクローンを作成し、Ｋｄ値を求めた。どのクローンに対してもマウス抗体のサブタイプに対して結合力はほぼ変わらないため、どのサブタイプに対しても、ステム領域は結合に関与しないことが考えられ、更に各サブタイプに対するアプタマーの結合様式は同じと考えられた。【００７０】
【表３】
2011021308.tif 000005
［実施例４］【００７１】
前記アプタマーを、ＦＢＳ溶液に添加し、このサンプルを、室温（２０℃）で添加後３０分、１時間、２時間、４時間保持した。保持後の前記サンプルにＲＮａｓｅインヒビター（ＲＮＡｓｅｃｕｒｅ；Ａｍｂｉｏｎ社製）を添加した２×Ｕｒｅａサンプル溶液を等量加えて６０°Ｃで１０分間処理しヌクレアーゼの反応を止めた。前記サンプリングしたＲＮＡを、１５％  ７Ｍ尿素ポリアクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ，１４０ｍｍ×７０ｍｍ×１ｍｍゲル板）に１レーンあたり１０〜２０ｎｇ添加し、２００Ｖ定電圧で８０〜９０分間電気泳動を行った後、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で染色しＵＶトランスイルミネーター上で撮影した。得られた画像データのうち、アプタマー全長のバンドをImageJ  1.37v（Abramoff,M.D.,Magelhaes,P.J.,Ram,S.J.  "Image  Processing  with  ImageJ"  Biophotonics  International,  11,7,36-42,2004.）を用いてデンシトメトリー解析を行い数値化し、各アプタマーの安定性を評価した。前記サンプルにおいて、前記アプタマーの終濃度は、１０μＭとし、前記ＦＢＳの終濃度は、１％とした。前記アプタマーとして、ＭＩＧ−ｍ０３４、ＭＩＧ−ｍ０４１およびＭＩＧ−ｍ０４２を使用した。【００７２】
これらの結果を、図１１に示す。図１１は、一定時間保持した後のアプタマーサンプルの電気泳動写真である。図１１において、ｍ０３４、ｍ０４１およびｍ０４２は、それぞれ、前記アプタマーの種類を示す。また、各レーンは、Ｍが、ＲＮＡマーカー、１〜５は、それぞれ保持時間０時間、０．５時間、１．０時間、２．０時間および４．０時間の結果を示す。前記保持時間は、ＦＢＳ溶液へのアプタマーの添加時を０時間とした。【００７３】
また、電気泳動の解析結果を定量化した結果を、図１２に示す。図１２は、電気泳動におけるバンドの強度の経時的変化を示すグラフである。縦軸は、relative  intensity（％）を示し、横軸は、保持時間（ｈｒ）を示す。同図に示すように、１／１００希釈ＦＢＳ中での前記アプタマーの半減期は１〜２時間と算出された。以上の結果から、ＩｇＧとの結合に関与しない部位に修飾を施すことにより、アプタマーの半減期を延長できることが分かった。
［実施例５］【００７４】
まず、前記ＭＩＧ−ｍ０４１アプタマーについて、マウス由来ＩｇＧ抗体との結合の特異性を、ノースウエスタンブロット法により評価した。実験条件は、抗原として、抗ＦＬＡＧマウスＩｇＧ（０．５μｇ）、抗ＦＬＡＧマウスＩｇＧ（０．５μｇ）およびＦＬＡＧ−ＢＡＰタンパク質（１００ｎｇ）、並びに、ＦＬＡＧ−ＢＡＰタンパク質（１００ｎｇ）を用い、アプタマーとして、２０ｎＭのＭＩＧ−ｍ０４１を用いた以外は、実施例１と同様に行った。
［比較例１］【００７５】
実施例５の比較例として、上記の抗原に対するウエスタンブロット法を行った。前記ＭＩＧ−ｍ０４１アプタマーに代えて、ビオチン化抗マウスＩｇＧヤギ抗体（CHEMICON社製  AP124B）を用いた以外は、実施例５と同様にして、ブロッティングを行った。【００７６】
実施例５および比較例１の結果を、図１３に示す。同図（ａ）は、実施例５のノースウエスタンブロット法の結果を示す写真であり、同図（ｂ）は、比較例１のウエスタンブロット法の結果を示す写真である。同図（ａ）および（ｂ）において、レーンＭは、ビオチン化分子量マーカー、レーン１は、抗ＦＬＡＧマウスＩｇＧ（０．５μｇ）、レーン２は、抗ＦＬＡＧマウスＩｇＧ（０．５μｇ）およびＦＬＡＧ−ＢＡＰタンパク質（１００ｎｇ）、レーン３は、ＦＬＡＧ−ＢＡＰタンパク質（１００ｎｇ）を使用した結果である。同図（ａ）に示すように、前記ＭＩＧ−ｍ０４１アプタマーを使用した場合、目的タンパク質であるＦＬＡＧ−ＢＡＰタンパク質のシグナルのみ検出された。一方、同図（ｂ）に示すように、通常の二次抗体を用いたウエスタンブロット法の場合、抗ＦＬＡＧマウスＩｇＧが変性して生じた抗体重鎖および抗体軽鎖のシグナルが検出された。この結果から、このアプタマーは、ネイティブな形態のＩｇＧにのみ結合し、変性したＩｇＧには結合しないことが明らかになった。また、このアプタマーを免疫沈降後のサンプルのブロッティングに用いると、抗体重鎖および抗体軽鎖のバックグラウンドの無いきれいな結果が得られることが分かった。【００７７】
以上、本発明の好適な実施の形態により本発明を説明した。ここでは特定の具体例を示して本発明を説明したが、特許請求の範囲に定義された本発明の広範な趣旨および範囲から逸脱することなく、これら具体例に様々な修正および変更を加えることができることは明らかである。すなわち、具体例の詳細および添付の図面により本発明が限定されるものと解釈してはならない。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の核酸分子は、げっ歯類由来のＩｇＧ抗体を使用するあらゆる分野に適用でき、例えば、臨床検査、生化学検査など広い分野に適用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図４】
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【図１１】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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