(57)【要約】  本発明は、脂肪組織へのマクロファージの浸潤を抑制することにより、メタボリックシンドロームにおけるドミノ倒し的な疾患の連鎖を、その上流において停止させることができるメタボリックシンドロームの予防又は治療方法を提供することを目的とする。本発明は、ＡＩＭ阻害剤を対象に投与する工程を含む、メタボリックシンドロームの予防又は治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＩＭ阻害剤を対象に投与する工程を含む、メタボリックシンドローム又はその関連疾患の予防又は治療方法。
【請求項２】
前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭの血液中での安定性を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭとＣＤ３６との結合を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭが標的細胞に取り込まれることを阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭがエンドソームから細胞質に移行することを阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭが脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）と結合することを阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭの発現を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記メタボリックシンドローム又はその関連疾患は、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化性疾患、肝疾患、肝機能障害、脳血管障害、虚血性心疾患、心不全、認知症、脳卒中、神経症、腎疾患、アディポサイトカインの分泌異常、及び血中遊離脂肪酸量の異常からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象は、ヒトである、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象は、非ヒト哺乳動物又は鳥類である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象は、イヌ又はネコである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の群から選択される少なくとも一つを含む、メタボリックシンドローム又はその関連疾患の予防又は治療剤：
抗ＡＩＭ抗体；
抗ＣＤ３６抗体；
ＡＩＭ遺伝子に対するＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸；
ＡＩＭ遺伝子に対するアンチセンス核酸；
ＡＩＭ遺伝子に対するリボザイム；
抗ＡＩＭ抗体と結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質；
ＣＤ３６と結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質；
ＦＡＳと結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質；及び
可溶型ＣＤ３６。
【請求項１３】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は抗体のフラグメントである、請求項１２に記載の治療剤。
【請求項１４】
前記ＦＡＳと結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質は、ＤＨ、ＥＲ、ＴＥ、及びＣＣからなる群より選択される少なくとも一つのドメインと結合する、請求項１２又は１３に記載の治療剤。
【請求項１５】
前記抗ＡＩＭ抗体と結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質は、ＡＩＭフラグメント、ＡＩＭ改変体若しくはそのフラグメント、及び、ＡＩＭキメラタンパク質若しくはそのフラグメント、からなる群より選択される、請求項１２又は１３に記載の治療剤。
【請求項１６】
前記ＣＤ３６と結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質は、ＡＩＭフラグメント、ＡＩＭ改変体、及びＡＩＭキメラタンパク質からなる群より選択される、請求項１２又は１３に記載の治療剤。
【請求項１７】
前記ＦＡＳと結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質は、ＡＩＭフラグメント、ＡＩＭ類縁体、ＡＩＭ変異体、及びＡＩＭキメラタンパク質からなる群より選択される、請求項１２又は１３に記載の治療剤。
【請求項１８】
前記ＡＩＭフラグメントは、ＡＩＭタンパク質の機能ドメイン及び保存領域を含むフラグメントから選択される、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１９】
前記メタボリックシンドローム又はその関連疾患は、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化性疾患、肝疾患、肝機能障害、脳血管障害、虚血性心疾患、心不全、認知症、脳卒中、神経症、腎疾患、アディポサイトカインの分泌異常、及び血中遊離脂肪酸量の異常からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１２から１８のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２０】
前記対象は、ヒトである、請求項１２から１９のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２１】
前記対象は、非ヒト哺乳動物又は鳥類である、請求項１２から１９のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項２２】
前記対象は、イヌ又はネコである、請求項２１に記載の治療剤。
【請求項２３】
請求項１２から２２のいずれか１項に記載の治療剤を投与する工程を含む、メタボリックシンドローム又はその関連疾患の予防又は治療方法。
【請求項２４】
ＡＩＭ阻害剤の製造方法であって、
ＡＩＭをプロテアーゼにより処理し、ＡＩＭフラグメントを得る工程と、
前記ＡＩＭフラグメントを、ＡＩＭの機能ドメイン又は保存領域に結合する抗ＡＩＭ抗体を固定したアフィニティカラムで精製する工程と、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、AIM阻害剤を対象に投与することを特徴とするメタボリックシンドロームの予防又は治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、糖尿病、高脂血症、高血圧、肥満症といった生活習慣病は、一個人に重積して生じやすいことが知られていた。また、これらの疾患は個別にも動脈硬化症のリスクとなるが、重積するとそのリスクが非常に高くなることから、これらの疾患が重積した病態を表す名称が複数提唱されてきた。
現在では、糖尿病、高脂血症、高血圧症、肥満、インスリン抵抗性を基本的な構成要因とし、これらが一個人に重積しやすく、そのことが動脈硬化性疾患の高いリスクとなるという疾患概念が、メタボリックシンドロームという名称で統一されている。【０００３】
一般に、メタボリックシンドロームにおいては、内臓脂肪型肥満、即ち腹腔内に中性脂肪が過剰に蓄積する肥満が病態の中核となり、肥満によって生じたインスリン抵抗性が高血圧、糖尿病、高脂血症などを順次発症し、その重積と連鎖によって動脈硬化性疾患が引き起こされる。このような現象をドミノ倒しにたとえ、近年「メタボリックドミノ」という概念が提唱されている。
つまり、一連の病態は、一度ドミノ倒しが進むと元に戻すのが難しいのと同様に一方向性に進展し、長期間慢性的に様々な疾患が持続的に発症するのである。【０００４】
メタボリックシンドロームの治療は、症状の緩和を目的とするのではなく、その後発症しうる様々な疾患、特に動脈硬化性疾患の発症の予防が目標となる。
上述のとおり、メタボリックドミノの概念の下では、一度進行したものを元通りに戻すのが難しいことから、より上流で進行を抑制することが望ましい。【０００５】
これまでの研究で、メタボリックシンドロームにおいては、腹腔内の脂肪細胞に過剰に中性脂肪が蓄積すると、脂肪細胞からのアディポサイトカインの分泌量の異常、血中遊離脂肪酸の増加、及び脂肪組織における慢性炎症が生じ、その結果インスリン抵抗性、糖尿病、高脂血症、高血圧等の生活習慣病とその後に続く疾患が連鎖的に惹起されることが判明してきた。
従って、メタボリックシンドロームの予防や治療においては、アディポサイトカインの分泌、血中遊離脂肪酸、脂肪組織の慢性炎症といった上流のイベントを標的とすることが好適であると考えられる。【０００６】
この中で、脂肪組織の慢性炎症は、肥満に伴って脂肪組織に浸潤するマクロファージの増加が原因となることが判明している（例えば、非特許文献１及び２を参照）
マクロファージの活性化状態にはM1とM2の2種類がある。M1は、classically activated マクロファージとも呼ばれ、TNF-α、IL-6、IL-12などの炎症性サイトカインや、誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）の産生が増加している。M2は、alternatively activated マクロファージとも呼ばれ、炎症性サイトカインの産生は低下しており、IL-10などの抗炎症性サイトカインやiNOS活性を阻害するアルギナーゼの産生が増加している。
脂肪組織に浸潤しているマクロファージは、非肥満の場合はM2が主体であり、肥満が進行するにつれてM1が主体となることがわかっている（例えば、非特許文献３を参照）。【０００７】
また、マクロファージ特異的にPPARγを欠失したマウスでは、M2が存在せず、高脂肪食負荷による肥満やインスリン抵抗性が増強されること（非特許文献４）；マクロファージのPPARγを不活化すると、標準食の非肥満マウスで耐糖能の悪化と骨格筋及び肝臓におけるインスリン抵抗性を生じること（非特許文献５）；マクロファージでCap（Cbl-associated protein）を欠損したマウスは、脂肪組織におけるマクロファージの浸潤が低下し、高脂肪食負荷によるインスリン抵抗性の発現が減弱すること（非特許文献６）等が報告され、脂肪組織に浸潤したM1マクロファージがインスリン抵抗性の発現に重要な役割を果たしていることが示唆されている。【０００８】
脂肪組織の慢性炎症がメタボリックシンドロームの成因に深く関与していることは、メタボリックシンドロームの患者では軽度の炎症の存在を示す高感度CRP陽性者が多く、抗炎症作用をもつサリチン酸やチアゾリジン系薬剤の投与によりインスリン抵抗性が改善するという報告とも一致する。
また、脂肪組織へのマクロファージの浸潤が減少したCCR2（C-C chemokine receptor 2）ノックアウトマウスでは、野生型マウスと比較して、肥満に伴うアディポサイトカインの産生調節異常が改善される（非特許文献７）。従って、脂肪組織に浸潤したマクロファージは、アディポサイトカイン産生調節の破綻にも関与すると考えられる。【０００９】
以上より、メタボリックシンドロームの予防又は治療において、脂肪組織に浸潤した炎症性マクロファージを標的とすれば、アディポサイトカインの産生調節の破綻、脂肪組織における慢性炎症といった、メタボリックドミノの最上流でその進行を止めることができるものと考えられる。
しかしながら、これまで、肥満に伴って脂肪組織にマクロファージが誘導されるメカニズムは解明されていない。
例えば、単球走化性因子MCP-1のノックアウトマウスや、CCR2のノックアウトマウスでは、マクロファージの誘導効率が減少するとの報告があるが、報告によってその効率が大きく異なる。また、MCP-1のノックアウトマウスでは、かえってマクロファージ浸潤が亢進するとの報告も存在する。
そのため、MCP-1やCCR2と、マクロファージの誘導と因果関係には議論の余地があり、少なくとも一義的（essential）且つ根本的な因子であるとは考えられない。
従って、当然のことながら、脂肪組織のマクロファージへの浸潤を引き起こす根本的な原因を抑制して、メタボリックドミノの最上流でその進行を止める方法も見出されていなかった。【００１０】
ところで、本発明者は、Apoptosis Inhibitor of Macrophage（AIM）を組織マクロファージから発見した（非特許文献９参照）。AIMは、可溶性タンパク質であり、スカベンジャー受容体システインリッチ（Scavenger Receptor Cysteine-Rich; SRCR）スーパーファミリーのメンバーである。AIMは当初、様々なアポトーシス誘導因子からマクロファージを守るアポトーシスインヒビターとして見出された（非特許文献９参照）。
AIMは、SRCRドメインを3つ有する構造がCD5の細胞外ドメインに似ていることから、CD5L（CD5-like）とも呼ばれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Weisberg, S.P. et al., J. Clin. Invest., 2003, 112:1796-1808
【非特許文献２】Xu, H. et al., J. Clin. Invest., 2006, 116:115-124
【非特許文献３】Lumeng, C.N. et al., J. Clin. Invest., 2007, 117:175-184
【非特許文献４】Odegaard, J.L. et al., Nature, 2007, 447:1116-1121
【非特許文献５】Hevener, A.L. et al., J. Clin. Invest., 2007, 117:1658-1669
【非特許文献６】Lesniewski, L.A. et al., Nature Med., 2007, 13:455-462
【非特許文献７】Weisberg, S.P. et al., J. Clin. Invest., 2006, 116:115-124
【非特許文献８】Kanda, H. et ao., J. Clin. Invest., 2006, 116:1494-1505
【非特許文献９】Miyazaki, T. et al., J. Exp. Med. 189, 413-422 (1999)
【非特許文献１０】Arai, S. et al., Cell Metab. 1, 201-213 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、脂肪組織へのマクロファージの浸潤を抑制することにより、メタボリックシンドロームにおけるドミノ倒し的な疾患の連鎖を、その上流において停止させることができるメタボリックシンドロームの予防又は治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、AIMについてさらに研究を進めていく中で、アテローム性動脈硬化病巣においては脂質を取り込んだマクロファージがAIMを産生すること、また、産生されたAIMは、病巣におけるマクロファージのアポトーシス抵抗性をサポートすることによってアテローム性動脈硬化の発生にも関与することを見出した。さらに、AIM欠損マウスを作製し、AIM欠損が動脈硬化を著しく軽減させることを確認した（Arai, S. et al., Cell Metab. 1, 201-213 (2005)）。【００１４】
一方で、本発明者らは、後述する参考例に示すとおり、肥満脂肪組織に浸潤するマクロファージにおいてもAIMが発現していることを見出した。そして、AIM存在下では、脂肪前駆細胞の成熟脂肪細胞への分化が抑制されること；AIM存在下では、成熟脂肪細胞において脂肪滴の融解（lipolysis）が誘導されること；AIM存在下では、脂肪細胞の大きさが小さくなる傾向があること；従って、AIM自体が抗肥満薬として有用であることを見出した。
さらに、脂肪組織において産生されたAIMは、細胞表面のCD36に結合し、エンドサイトーシスによって脂肪細胞中に取り込まれること；細胞内において脂肪酸合成酵素（Fatty Acid Synthase; FAS）に結合しその活性を抑制すること、即ちAIMの直接の標的分子がFASであり、AIMが、FAS活性抑制を通じて脂肪前駆細胞の成熟脂肪細胞への分化抑制や脂肪滴融解の誘導が惹起することも見出した。【００１５】
しかしながら、今般、本発明者は、上記知見とは一見逆とも思われる現象、即ち、AIMがメタボリックシンドロームの成因に直接関与していることを見出した。
具体的には、肥満と共にAIMの血中濃度が上昇すること；肥満してもAIMノックアウトマウスの脂肪組織にはマクロファージ浸潤がほとんど見られないこと；AIMノックアウトマウスに組換えAIMを全身投与すると、脂肪組織に炎症性マクロファージが浸潤することをin vivoの研究によって確認した。
また、脂肪組織に炎症性マクロファージが浸潤するのは、肥満に伴って血中濃度が上昇したAIMが、FAS活性抑制を通じて脂肪滴融解を誘導する結果、マクロファージ遊走を引き起こすことに起因することをin vitroの研究によって確認した。
さらに、AIMノックアウトマウスは、高脂肪食を与えて肥満しても糖代謝が悪化しないこと、従って、AIMを阻害すれば、肥満に至っても、その後ドミノ倒し的にメタボリックシンドロームの一連の疾患が連鎖的に発症し進行するのを止めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕ＡＩＭ阻害剤を対象に投与する工程を含む、メタボリックシンドローム又はその関連疾患の予防又は治療方法；
〔２〕前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭの血液中での安定性を低下させる、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭとＣＤ３６との結合を阻害する、上記〔１〕に記載の方法；
〔４〕前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭが標的細胞に取り込まれることを阻害する、上記〔１〕に記載の方法；
〔５〕前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭがエンドソームから細胞質に移行することを阻害する、上記〔１〕に記載の方法；
〔６〕前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭが脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）と結合することを阻害する、上記〔１〕に記載の方法；
〔７〕前記ＡＩＭ阻害剤は、ＡＩＭの発現を抑制する、上記〔１〕に記載の方法；
〔８〕前記メタボリックシンドローム又はその関連疾患は、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化性疾患、肝疾患、肝機能障害、脳血管障害、虚血性心疾患、心不全、認知症、脳卒中、神経症、腎疾患、アディポサイトカインの分泌異常、及び血中遊離脂肪酸量の異常からなる群より選択される少なくとも一つである、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の方法；
〔９〕前記対象は、ヒトである、上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１０〕前記対象は、非ヒト哺乳動物又は鳥類である、上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１１〕前記対象は、イヌ又はネコである、上記〔１０〕に記載の方法；
〔１２〕以下の群から選択される少なくとも一つを含む、メタボリックシンドローム又はその関連疾患の予防又は治療剤：
抗ＡＩＭ抗体；
抗ＣＤ３６抗体；
ＡＩＭ遺伝子に対するＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸；
ＡＩＭ遺伝子に対するアンチセンス核酸；
ＡＩＭ遺伝子に対するリボザイム；
抗ＡＩＭ抗体と結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質；
ＣＤ３６と結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質；
ＦＡＳと結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質；及び
可溶型ＣＤ３６；
〔１３〕前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は抗体のフラグメントである、上記〔１２〕に記載の治療剤；
〔１４〕前記ＦＡＳと結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質は、ＤＨ、ＥＲ、ＴＥ、及びＣＣからなる群より選択される少なくとも一つのドメインと結合する、上記〔１２〕又は〔１３〕に記載の治療剤；
〔１５〕前記抗ＡＩＭ抗体と結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質は、ＡＩＭフラグメント、ＡＩＭ改変体若しくはそのフラグメント、及び、ＡＩＭキメラタンパク質若しくはそのフラグメント、からなる群より選択される、上記〔１２〕又は〔１３〕に記載の治療剤；
〔１６〕前記ＣＤ３６と結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質は、ＡＩＭフラグメント、ＡＩＭ改変体、及びＡＩＭキメラタンパク質からなる群より選択される、上記〔１２〕又は〔１３〕に記載の治療剤；
〔１７〕前記ＦＡＳと結合し、且つＦＡＳ抑制活性を有しないタンパク質は、ＡＩＭフラグメント、ＡＩＭ類縁体、ＡＩＭ変異体、及びＡＩＭキメラタンパク質からなる群より選択される、上記〔１２〕又は〔１３〕に記載の治療剤；
〔１８〕前記ＡＩＭフラグメントは、ＡＩＭタンパク質の機能ドメイン及び保存領域を含むフラグメントから選択される、上記〔１５〕から〔１７〕のいずれか１項に記載の治療剤；
〔１９〕前記メタボリックシンドローム又はその関連疾患は、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化性疾患、肝疾患、肝機能障害、脳血管障害、虚血性心疾患、心不全、認知症、脳卒中、神経症、腎疾患、アディポサイトカインの分泌異常、及び血中遊離脂肪酸量の異常からなる群より選択される少なくとも一つである、上記〔１２〕から〔１８〕のいずれか１項に記載の治療剤；
〔２０〕前記対象は、ヒトである、上記〔１２〕から〔１９〕のいずれか１項に記載の治療剤；
〔２１〕前記対象は、非ヒト哺乳動物又は鳥類である、上記〔１２〕から〔１９〕のいずれか１項に記載の治療剤；
〔２２〕前記対象は、イヌ又はネコである、上記〔２１〕に記載の治療剤；
〔２３〕上記〔１２〕から〔２２〕のいずれか１項に記載の治療剤を投与する工程を含む、メタボリックシンドローム又はその関連疾患の予防又は治療方法；及び
〔２４〕ＡＩＭ阻害剤の製造方法であって、
ＡＩＭをプロテアーゼにより処理し、ＡＩＭフラグメントを得る工程と、
前記ＡＩＭフラグメントを、ＡＩＭの機能ドメイン又は保存領域に結合する抗ＡＩＭ抗体を固定したアフィニティカラムで精製する工程と、を含む、方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る方法によれば、AIMを阻害することにより、肥満した個体で脂肪組織にマクロファージが浸潤するのを抑制することを通じて、メタボリックシンドロームの致死的な疾患群の発症の連鎖をその上流において止めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、肥満マウスと正常マウスの血中AIM濃度を測定した結果を示す。
【図２】図２は、肥満AIM+/+マウスと肥満AIM-/-マウスの内臓脂肪組織におけるマクロファージ浸潤を抗マクロファージモノクローナル抗体（F4/80）等によって検出した結果を示す。
【図３】図３は、AIM-/-マウスにrAIMを全身投与し、3週間後に内臓脂肪組織におけるマクロファージ浸潤を抗マクロファージモノクローナル抗体（F4/80）等によって検出した結果を示す。
【図４】図４は、マクロファージ遊走能を測定した結果を示す。
【図５】図５は、AIM+/+マウス及びAIM-/-マウスにHFDを12週間負荷後、解剖した結果を示す写真である。
【図６】図６は、AIM+/+マウス及びAIM-/-マウスにHFDを12週間負荷後、体重及び総脂肪量を測定した結果を示す。
【図７】図７は、HFD負荷前のAIM+/+マウス及びAIM-/-マウスに対し、グルコース負荷試験を行った結果を示す。
【図８】図８は、HFD負荷後のAIM+/+マウス及びAIM-/-マウスに対し、グルコース負荷試験を行った結果を示す。
【図９】図９は、HFD負荷前のAIM+/+マウス及びAIM-/-マウスに対し、インスリン負荷試験を行った結果を示す。
【図１０】図１０は、HFD負荷後のAIM+/+マウス及びAIM-/-マウスに対し、インスリン負荷試験を行った結果を示す。
【図１１】図１１は、HFD負荷後のAIM+/+マウス及びAIM-/-マウスに対し、インスリン感受性試験を行った結果を示す。
【図１２】図１２は、正常マウス（高脂肪食負荷を行っていないマウス）及び肥満マウスの内臓脂肪組織から作製した切片を、抗マクロファージモノクローナル抗体、抗マウスAIMポリクローナル抗体、及び抗IL-6抗体で染色した結果を示す。
【図１３】図１３は、3T3-L1細胞の培養におけるrAIM負荷のスケジュールを示す。
【図１４】図１４は、図１３に示すスケジュールのday 12において、細胞をoil-red-Oで染色した結果を示す。
【図１５】図１５は、図１３に示すスケジュールのday 12において、定量的リアルタイムPCRによって脂肪細胞マーカーの発現を測定した結果を示す。
【図１６】図１６Ａは、成熟脂肪細胞にrAIM負荷を行い、oil-red-O染色した結果を示す。図１６Ｂは脂肪滴のサイズ、図１６Ｃは単位面積当たりの脂肪滴含有細胞の数を示す。
【図１７】図１７は、成熟脂肪細胞にrAIM負荷を行い、培養上清中のグリセロール及び遊離脂肪酸を測定した結果を示す。
【図１８】図１８は、成熟脂肪細胞のrAIM負荷を行い、定量的リアルタイムPCRによって脂肪滴形成関連遺伝子の発現を測定した結果を示す。
【図１９】図１９は、AIM+/+マウスとAIM-/-マウスに、HFDを20日間与えた後、脂肪組織の切片をHE染色した結果を示す。
【図２０】図２０Ａは、分化した、又は未文化の3T3-L1細胞にrAIM負荷を行い、AIM、PPARγ2、及びDAPIを染色した結果を示す。図２０Ｂは、図２０Ａの結果に基づいて、PPARγ2の発現量ごとに細胞を分類し、各細胞100個当たりのrAIM含有細胞の数を計測した結果を示す。図２０Ｃは、3T3-L1細胞にrAIM負荷を行い、AIMとエンドソーム、又はAIMとリソソームを染色した結果を示す。
【図２１】図２１は、図２０と同様のサンプルを使用して、AIMを金微粒子で標識し、電子顕微鏡で観察した結果を示す。
【図２２】図２２は、3T3-L1細胞をCD36中和抗体で処理し、rAIMのエンドサイトーシスへの効果を調べた結果である。
【図２３】図２３は、CD36+/+マウスとCD36-/-マウスにrAIMを静注し、脂肪組織から調製した切片においてAIMとマクロファージを染色した結果を示す。
【図２４】図２４は、AIM-/-マウスの脂肪組織に、HAタグを付けたrAIMを直接注射投与し、脂肪組織を用いて抗HA抗体を用いて共免疫沈降を行い、ウエスタンブロッティングで沈降物中のFASを検出した結果を示す。
【図２５】図２５は、HEK 293T細胞内において、HAタグを付けたrAIMと、FLAGタグを付けたFASとの結合を、抗Flag抗体又は抗HA抗体を用いて共免疫沈降によって確認した結果である。
【図２６】図２６は、FASの各ドメインをFlagタグで標識し、AIM-HAを安定的に発現するHEK 293T細胞内で発現させ、抗Flag抗体又は抗HA抗体を用いた共免疫沈降で、FASとAIMの結合を確認した結果である。
【図２７】図２７は、rAIM（5μg/ml）の存在下、非存在下、及びC75（25μM）存在下で6日間処理した3T3-L1細胞におけるFAS活性を測定した結果である。
【図２８】図２８は、AIM+/+マウス及びAIM-/-マウスの脂肪組織におけるFAS活性を測定した結果である。
【図２９】図２９は、脂肪内局所注射によってrAIM又はBSAを3時間前に投与したAIM-/-マウスの脂肪組織におけるFAS活性を測定した結果である。
【図３０】図３０は、ヒトAIMとマウスAIMのアミノ酸配列とコンセンサスを示す。
【図３１】図３１は、FASの構造を示す概念図である。
【図３２】図３２は、HFDを12週間与えたAIM+/+マウスと、AIM-/-マウスにおける内臓脂肪量及び皮下脂肪量の変化を測定した結果を示す。
【図３３】図３３は、AIM-/-マウスに、5週間、HFDを与えながらrAIM又はBSAを週2回投与し、体重の変化を測定した結果を示す。
【図３４】図３４、AIM-/-マウスに、5週間、HFDを与えながらrAIM又はBSAを週2回投与し、内臓脂肪量及び皮下脂肪量の変化を測定した結果を示す。
【図３５】図３５は、図３３及び３４に示す実験の後、AIM-/-マウスの内臓脂肪における、脂肪細胞マーカー等のmRNAレベルを測定した結果を示す。
【図３６】図３６は、イヌ、ネコ及びマウス血清中のAIMタンパク質をウエスタンブロッティングによって検出した結果を示す。
【図３７】図３７は、スクリーニングによって得られた低分子化合物によるAIM抑制活性をFSP27の発現で評価した結果である。
【図３８】図３８は、スクリーニングによって得られた低分子化合物によるAIM抑制活性をFSP27の発現で評価した結果である。
【図３９】図３９は、スクリーニングによって得られた抗AIM抗体によるAIMに対する中和活性をFSP27の発現で評価した結果である。
【図４０】図４０は、人間ドック受診者約550名の血中AIM濃度を測定した結果を示す。
【図４１】図４１は、血液提供者（外国人を含む）の中から、BMIが18〜25の人、及び35以上の人を無作為に選択し、血中AIM濃度を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係るメタボリックシンドローム及びその関連疾患の予防又は治療方法は、AIM阻害剤を対象に投与する工程を含む。
本明細書において、メタボリックシンドロームとは、通常内臓脂肪型肥満（内臓脂肪の蓄積）を端緒とし、脂肪組織の慢性炎症、脂肪細胞からのアディポサイトカインの分泌異常、及び血中遊離脂肪酸量の異常等を経て、インスリン抵抗性を惹起し、その後糖尿病、高脂血症、高血圧等の生活習慣病を引き起こし、最終的には各種の動脈硬化性疾患の発症に至りうる一連の疾患連鎖を表す概念である。疾患連鎖の下流には、肝疾患、肝機能障害、脳血管障害、虚血性心疾患、心不全、認知症、脳卒中、神経症、腎疾患等が含まれうる。
本明細書において、メタボリックシンドローム及び関連疾患とは、メタボリックシンドロームの発症又は進行の機序、及びメタボリックシンドロームの発症又は進行の過程で生じる様々な異常に基づくあらゆる疾患、症状及び異常を含む。例えば、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化性疾患、肝疾患（脂肪肝、肝癌を含む）、肝機能障害、脳血管障害、虚血性心疾患、心不全、認知症、脳卒中、神経症、腎疾患、アディポサイトカインの分泌異常、及び血中遊離脂肪酸量の異常を含むがこれらに限定されない。
【００１９】
本明細書において、メタボリックシンドローム及びその関連疾患の予防又は治療とは、その最も広い意味で用いられ、例えば、インスリン抵抗性の防止、遅延、改善；メタボリックシンドローム及びその関連疾患の発症の遅延、防止、改善；メタボリックシンドローム及びその関連疾患に関連する一つ又は複数の症状の緩和；メタボリックシンドローム及びその関連疾患の診断基準における各項目の数値の改善、等を意味する。
メタボリックシンドロームの診断基準における項目としては、例えば、腹部肥満の指標となるウエスト径、血清トリグリセリド値、HDLコレステロール値、血圧、空腹時血糖値、耐糖能、インスリン抵抗性、尿中アルブミン量、等が挙げられる。
【００２０】
本明細書において、AIM阻害剤とは、AIMタンパク質の機能又は発現を抑制することによって、生体内におけるAIMタンパク質の活性を阻害する物質を意味し、例えば、低分子化合物、高分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２１】
本明細書において、「AIM」とは、上述のとおり、SRCRスーパーファミリーのメンバーである可溶性タンパク質である。一例として、ヒトAIM及びマウスAIMのアミノ酸配列を図３０に示す。
【００２２】
後述する実施例10に示すとおり、健常人（人間ドックを受けるような、病気療養中でない者）の多くにおいて、血中AIM濃度は5〜20μg／mlである。また、実施例11に示すとおり、BMI35以上の人は、BMI18〜25の人に比較して、血中AIM濃度が有意に高い。
【００２３】
本発明のAIM阻害剤はどのような種におけるAIMを阻害するものであってもよい。例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、サル）、鳥類等におけるAIMの相同タンパク質に対する阻害剤も、本発明のAIM阻害剤に該当する。当業者は、他の哺乳動物又は鳥類において、あるタンパク質がAIMの相同タンパク質であるか否か、配列類似性の高さや機能解析により判断することができる。例えば、マウスAIMとヒトAIMとではアミノ酸配列の相同性が80％程度と高い。また、マウスAIMとヒトAIMとでは、SRCRドメインにおけるコンセンサスなシーケンス（CD5、CD6など、SRCRドメインを有する他の分子においても保存されているアミノ酸配列）が完全に一致している。
例として、ヒト、チンパンジー、イヌ、マウス、及びラットのAIMのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：１、２２、２３、２４及び２５に示す。
【００２４】
また、本発明のAIM阻害剤は、AIMの類縁体や変異体を阻害するものであってもよい。AIMの類縁体や変異体としては、例えば、AIMのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたタンパク質であって、且つAIMの機能を保持するものが挙げられる。当業者は、あるタンパク質がAIMの類縁体又は変異体であるか否か、配列類似性の高さや機能解析によって判断することができる。
【００２５】
本発明においてAIM阻害剤が阻害するAIMの機能は、脂肪組織にマクロファージを浸潤させる機能、及び、脂肪組織にマクロファージを浸潤させるために必要であって、AIMが直接的に又は間接的に発揮するあらゆる機能を意味する。脂肪組織にマクロファージを浸潤させるために必要であって、AIMが直接的に又は間接的に発揮するあらゆる機能としては、例えば、脂肪細胞表面のCD36に結合する機能；エンドサイトーシスにより脂肪細胞に取り込まれる機能；脂肪細胞内でFASと結合する機能；FASの酵素活性を抑制する機能；脂肪滴融解を促進する機能；脂肪滴融解により、マクロファージ遊走を引き起こす機能、等が挙げられる。
これらのいずれかのAIMの機能を阻害することによって、マクロファージが脂肪組織に浸潤し、脂肪組織及び全身に慢性的な炎症が生じるのを防ぐことができる。その結果、肥満しても、インスリン抵抗性が引き起こされず、メタボリックシンドロームの連鎖的な疾患の発症を上流で止めることができる。
【００２６】
（AIMの機能を抑制するAIM阻害剤）
AIMの機能を抑制するAIM阻害剤は、AIMに直接的に又は間接的に作用することによって、AIMの機能の全部又は一部を抑制する。AIMの機能を抑制する機序としては、例えば、AIMの血液中での安定性を低下させること、AIMとCD36との結合を阻害すること、AIMが標的細胞に取り込まれるのを阻害すること、AIMが標的細胞に取り込まれることを阻害すること、AIMがエンドソームから細胞質に移行することを阻害すること、AIMがFASと結合することを阻害すること、等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
AIMの血液中での安定性を低下させるAIM阻害剤を投与すれば、AIMはその機能を果たすことなく短時間で分解される。
【００２８】
AIMとCD36との結合を阻害するAIM阻害剤を投与すれば、AIMがエンドサイトーシスで標的細胞に取り込まれるのを抑制することにより、AIMの機能を阻害することができる。
AIMとCD36との結合を阻害するものとしては、タンパク質間の結合を阻害するあらゆる物質を使用することができるが、例えば、抗AIM抗体又は抗CD36抗体が挙げられる。後述する参考例に示されるとおり、抗CD36抗体を投与することにより、AIMが標的細胞に取り込まれるのを抑制することができる。抗AIM抗体は、AIMにおけるCD36との結合部位をエピトープとして認識するものが好ましく、抗CD36抗体は、CD36におけるAIMとの結合部位をエピトープとして認識するものが好ましい。
【００２９】
本明細書において「抗体」は抗体断片も含むものとし、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')2抗体、scFv、二重特異抗体、合成抗体等であり得る。
これらの抗体は、当業者に公知の方法に従って作製することができる。例えば、抗AIMモノクローナル抗体は、AIMで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、AIMで免疫した動物の血清等から得ることができる。
ここで、免疫に用いるAIMは、全長であっても断片であってもよく、当業者が適宜決定することができる。断片である場合、CD36との結合部位を含む断片であることが好ましい。
【００３０】
また、一旦AIMとCD36との結合を効率よく阻害する非ヒトモノクローナル抗体が得られれば、これを遺伝子組換え法により産生させることもできる。例えば、当該抗AIMモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから標準的な手法により全RNAを調製し、市販のキットを用いて抗AIM抗体をコードするmRNAを調製した後、逆転写酵素を用いてcDNAを合成すれば、抗AIM抗体をコードするDNAを得ることができる。かかるDNAを含む発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトし、適当な条件で培養することにより、抗AIM抗体を発現させることができる。
【００３１】
また、上記cDNAを鋳型とするPCR法によって、抗AIM抗体のCDR領域をコードするDNAを得ることもできる。かかるCDR領域をコードするDNAを利用して、常法に従って遺伝子組換え法によりヒト抗体やヒト化抗体を作製することもできる。例えば、非ヒト抗体に由来するCDR領域をコードするDNAと、ヒト抗体のフレームワーク領域を連結するように設計したDNAをPCR法により合成し、さらにヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結することによって、ヒト抗体をコードするDNAを得ることができる。
かかるDNAを公知の方法（制限酵素を利用する方法等）で、発現ベクター（例えば、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、YAC、EBV由来エピソーム）に挿入し、当該発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトさせ、形質転換体を得る。なお、発現ベクターは、さらに抗体遺伝子の発現を調節するプロモータ、複製起点、選択マーカー遺伝子等を含むことができる。プロモータ及び複製起点は、宿主細胞とベクターの種類によって適宜選択することができる。
次に、形質転換体を適当な条件で培養することにより、抗AIM抗体のヒト抗体を発現させることができる。
宿主細胞としては、例えば、哺乳類細胞（CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞等）、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞（サッカロミセス属、アスペルギルス属等）といった真核細胞や、大腸菌（E.Coli）、枯草菌などの原核細胞を用いることができる。
【００３２】
発現させた抗体は、公知の方法（例えば、プロテインA等を用いたアフィニティカラム、その他のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等）を適宜組み合わせて単離・精製することができる。
本発明の抗AIM抗体が、Fab断片、F(ab')2抗体、scFv等の低分子抗体である場合は、低分子抗体をコードするDNAを用いて上記方法で発現させることもでき、また、抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理して作製することもできる。
【００３３】
また、AIMとCD36との結合を阻害するAIM阻害剤として、抗AIM抗体と結合し、且つFAS抑制活性を有しないタンパク質を用いることもできる。かかるタンパク質は、AIMと拮抗的にCD36に結合し、AIMがCD36に結合してFASの活性を抑制することを阻害する。
抗AIM抗体と結合し、且つFAS抑制活性を有しないタンパク質としては、例えば、AIMフラグメント、AIM改変体又はそのフラグメント、AIMキメラタンパク質又はそのフラグメントが挙げられる。
AIMフラグメントは、AIMの部分ペプチドからなる限り特に限定されないが、例えば、AIMの機能ドメイン又は保存領域を含む5〜150アミノ酸のフラグメントが挙げられる。
また、AIM改変体としては、AIMのアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたタンパク質であって、FAS抑制活性を有しないものが挙げられる。
AIMキメラタンパク質としては、ヒトのAIMタンパク質の一部と他の動物（例えば、マウス）に由来するAIMタンパク質とのキメラタンパク質を意味する。
抗AIM抗体と結合し、且つFAS抑制活性を有しないタンパク質としては、AIM改変体又はAIMキメラタンパク質のフラグメントも含まれる。
抗AIM抗体と結合し、且つFAS抑制活性を有しないタンパク質は、常法により、これをコードするDNAを得て、遺伝子組み換え法によって発現させることができる。CD36に対する親和性や血中安定性を高めるため、アミノ酸配列の改変や、修飾を適宜加えることができる。必要に応じて、他のタンパク質やペプチドとの融合タンパク質として発現させてもよい。
また、AIMフラグメント、AIM改変体フラグメント、AIMキメラタンパク質のフラグメントは、それぞれの全長タンパク質を得てから、タンパク質分解酵素で処理することによって得ることも可能である。
【００３４】
また、AIMとCD36との結合を阻害するAIM阻害剤として、CD36と結合し、且つFAS抑制活性を有しないタンパク質を用いることもできる。かかるタンパク質は、AIMと拮抗的にCD36に結合し、AIMがCD36に結合してFASの活性を抑制することを阻害する。
CD36と結合し、且つFAS抑制活性を有しないタンパク質としては、例えば、AIMフラグメント、AIM改変体又はそのフラグメント、AIMキメラタンパク質又はそのフラグメントが挙げられる。
【００３５】
また、AIMが標的細胞に取り込まれるのを阻害するAIM阻害剤を投与すれば、AIMが標的細胞中でFASと結合しその酵素活性を抑制する機能を阻害することができる。
【００３６】
また、AIMがエンドソームから細胞質に移行することを阻害するAIM阻害剤も、AIMが標的細胞中でFASと結合しその酵素活性を抑制するのを阻害する。
【００３７】
AIMがFASと結合することを阻害するAIM阻害剤を投与すれば、AIMのFASに対する作用を直接的に阻害することができ、例えば、FASに結合し、且つFAS抑制活性を有しないタンパク質を挙げることができる。かかるタンパク質は、AIMと拮抗的にFASに結合し、AIMがFASに結合してその活性を抑制することを阻害する。
かかるタンパク質としては、DH、ER、TE及びCCからなる群より選択される少なくとも一つのFASのドメインと結合するものが好ましい。
FASと結合し、且つFAS抑制活性を有しないタンパク質としては、例えば、AIMフラグメント、AIM改変体又はそのフラグメント、AIMキメラタンパク質又はそのフラグメントが挙げられる。
【００３８】
以上説明したAIMの機能を抑制するAIM阻害剤は、AIMが、脂肪前駆細胞の成熟脂肪細胞への分化を抑制すること、脂肪細胞における脂肪滴融解を誘導すること、脂肪細胞を縮小させること等を利用したスクリーニング方法で、候補化合物の中から容易に選択することができる。
例えば、AIM阻害剤は、
(i)  脂肪前駆細胞を、脂肪細胞に分化する条件で培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(ii)  前記脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を評価する工程と、
(iii)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも分化の誘導効率が上昇するものを選択する工程と、
を含むスクリーニング方法により、容易に選択することができる。
工程(ii)は、例えば、脂肪細胞中の脂肪滴の生成や、脂肪細胞マーカー、脂肪前駆細胞マーカー、及び／又は間葉系幹細胞マーカーの発現を指標として行うことができる。
【００３９】
また、AIM阻害剤は、
(a)  脂肪細胞を培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(b)  前記脂肪細胞中の脂肪滴融解を評価する工程と、
(c)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも脂肪滴融解効率が低下ものを選択する工程と、
を含むスクリーニング方法によっても、容易に選択することができる。
工程(b)は、例えば、脂肪細胞の培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸量、脂肪滴形成関連遺伝子の発現等を指標として行うことができる。
【００４０】
また、AIM阻害剤は、
(1)  脂肪細胞を培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(2)  前記脂肪細胞の大きさを評価する工程と、
(3)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも脂肪細胞が大きくなる化合物を選択する工程と、
を含むスクリーニング方法によっても、容易に選択することができる。
工程(2)は、例えば、細胞をヘマトキシリン−エオシン染色することによって行うことができる。
【００４１】
またAIM阻害剤は、
候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMを培地に加えて脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養する工程と、
前記培養後、前記細胞へのAIMの取り込みを評価する工程と、
を含む。
細胞へのAIMの取り込みは、例えば、細胞の培養工程後、細胞を固定し、透過性を付与してから検出可能に標識した抗AIM抗体を加えてインキュベートすることによって検出することができる。
候補化合物の存在下で細胞への取り込みが減少している場合、当該候補化合物はAIMが細胞に取り込まれるのを阻害することによって、AIMの機能を阻害していると評価することができる。
【００４２】
また、AIM阻害剤は、
候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMを培地に加えて脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養する工程と、
前記細胞中でのAIMとFASの結合を評価する工程と、
を含む。
AIMとFASの結合は、例えば細胞のライゼートを調製し、抗AIM抗体を用いて免疫沈降を行ってから、免疫沈降物に対して抗FAS抗体を用いたイムノブロッティングを行うことにより確認できる。
候補化合物の存在下で、AIMとFASの結合が減少している場合、当該候補化合物はAIMとFASの結合を阻害することによって、AIMの機能を阻害していると評価することができる。
【００４３】
AIMの機能を阻害する低分子化合物として、以下の化合物が挙げられる。
【化１】
2011145723.tif 000002
【化２】
2011145723.tif 000003
【化３】
2011145723.tif 000004
【化４】
2011145723.tif 000005
後述する実施例に示すとおり、これらの化合物は、本来AIMの添加によって誘導される脂肪滴形成関連遺伝子FSP27 mRNA発現の著しい減少を有意に抑制し、AIMの機能を阻害することが確認された。
【００４４】
また、AIMの機能を阻害する分子として、後述する実施例9で作製した中和抗体（クローン11、12及び17）も挙げられる。これらの中和抗体も、本来AIMの添加によって誘導される脂肪滴形成関連遺伝子FSP27 mRNA発現の著しい減少を有意に抑制し、AIMの機能を阻害することが確認された。
【００４５】
（AIMの発現を抑制するAIM抑制剤）
AIMの発現を抑制するAIM阻害剤は、マクロファージにおけるAIMの発現量を低下させることによって、AIMの機能の全部又は一部を抑制するものである。
AIMの発現を抑制するAIM阻害剤としては、例えば、AIM遺伝子に対してRNAi効果を有する二本鎖核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、及びこれらをコードする核酸を挙げることができる。
【００４６】
RNAi効果は、二本鎖核酸によって誘導される配列特異的な遺伝子発現抑制機構である。標的特異性が非常に高く、生体内にもともと存在する遺伝子発現抑制メカニズムを利用する方法なので安全性が高い。
RNAi効果を有する二本鎖核酸としては、例えば、siRNAが挙げられる。siRNAは、哺乳動物細胞に用いられる場合、通常19〜30塩基程度、好ましくは21塩基〜25塩基程度の二本鎖RNAである。また、本発明のAIM阻害剤としては、酵素（Dicer）により切断されてsiRNAとなり得るより長い二本鎖RNAを用いることもできる。
RNAi効果を有する二本鎖核酸は、一般に、その一方が標的核酸の一部と相補的な塩基配列を有し、他方がこれに相補的な配列を有する。RNAi効果を有する二本鎖核酸は、互いに3’末端に2塩基の突出塩基（オーバーハング）を有していることが一般的であるが、オーバーハングを有しないブラントエンド型であってもよい。例えば、25塩基のブラントエンドRNAは、インターフェロン応答遺伝子の活性化を最小にし、センス鎖由来のオフターゲット効果を防ぎ、血清中で安定性が非常に高いという利点を有し、in vivoでの使用にも適している。
RNAi効果を有する二本鎖核酸は、標的遺伝子の塩基配列に基づき、公知の方法に従って設計することができる。また、RNAi効果を有する二本鎖核酸は、二本鎖RNAであってもよいし、DNA-RNAキメラ型二本鎖核酸であってもよく、人工核酸や各種の修飾が施された核酸であってもよい。
【００４７】
アンチセンス核酸は、標的遺伝子（基本的には転写産物であるmRNA）に相補的な塩基配列を有し、一般的には10塩基長〜100塩基長、好ましくは15塩基長〜30塩基長の一本鎖核酸である。アンチセンス核酸を細胞内に導入し、標的遺伝子にハイブリダイズさせることによって遺伝子の発現が阻害される。アンチセンス核酸は、標的遺伝子の発現阻害効果が得られる限り、標的遺伝子と完全に相補的でなくてもよい。アンチセンス核酸は、公知のソフトウエア等を用いて当業者が適宜設計することができる。アンチセンス核酸は、DNA、RNA、DNA-RNAキメラのいずれであってもよく、また修飾されていてもよい。
【００４８】
リボザイムは、標的RNAを触媒的に加水分解する核酸分子であり、標的RNAと相補的な配列を有するアンチセンス領域と、切断反応を担う触媒中心領域から構成されている。リボザイムは当業者が公知の方法に従って適宜設計することができる。リボザイムは一般的にはRNA分子であるが、DNA-RNAキメラ型分子を用いることもできる。
【００４９】
上述したRNAi効果を有する二本鎖核酸、アンチセンス核酸、リボザイムのいずれかをコードする核酸も、本発明のAIM阻害剤として用いることができる。かかる核酸を含むベクターをマクロファージ内に導入すれば、細胞内でRNAi効果を有する二本鎖核酸、アンチセンス核酸、及びリボザイムが発現し、それぞれAIMの発現抑制効果を発揮する。
RNAi効果を有する二本鎖核酸をコードする核酸としては、二本鎖のそれぞれをコードするDNAを用いてもよいし、二本鎖核酸がループを介して連結されてできる一本鎖核酸をコードするDNAを用いてもよい。後者の場合、細胞内で転写により得られる一本鎖RNAは、その相補的な部分が分子内でハイブリダイズし、ヘアピン型の構造を取る。このRNAはshRNA（short hairpin RNA）と呼ばれる。shRNAは細胞質に移行すると酵素（Dicer）によってループ部分が切断され、二本鎖RNAとなって、RNAi効果を発揮する。
【００５０】
本発明に係るメタボリックシンドロームの予防又は治療方法は、上述したAIM阻害剤を対象に投与する。
本明細書において「対象」は、脂肪組織へのマクロファージの浸潤をAIMが引き起こすことによってメタボリックシンドロームを罹患し得るすべての生物を含み、特に限定されないが、例えば、ヒト又はヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、サル）、鳥類等が挙げられる。
例えば、マウスAIMとヒトAIMとではアミノ酸配列の相同性が80％程度と高い。また、マウスAIMとヒトAIMとでは、SRCRドメインにおけるコンセンサスなシーケンス（CD5、CD6など、SRCRドメインを有する他の分子においても保存されているアミノ酸配列）が完全に一致していることから、本発明の方法は、他の動物においても有効であるものと理解される。
また、イヌ、ネコ等のペットも、高脂肪な餌の与えすぎや運動不足によって近年メタボリックシンドロームが問題となっている。従って、本発明の方法はこれらの動物にも特に有用である。
【００５１】
本発明に係る方法は、血中AIM濃度が通常より上昇している対象に用いることが好ましい。後述する実施例に示すとおり、AIMの血液中の濃度は肥満に伴って上昇する。
一方で、本発明者らはこれまでに、血中AIM濃度が低〜中濃度の場合には、AIMは脂肪組織において脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を抑制し、脂肪滴融解を促進することを見出している。
これらの知見から、AIMは、血中AIM濃度が低〜中濃度の場合、脂肪組織において抗肥満効果を示すが、高濃度になると、脂肪組織へマクロファージを誘導し、脂肪組織の炎症を惹起するといえる。
従って、AIM阻害剤をメタボリックシンドロームの予防又は治療剤として用いる場合、対象において、AIMの血中濃度が通常より上昇していることが好ましい。
【００５２】
本発明において、AIM阻害剤は、経口的又は非経口的に、全身にあるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。
【００５３】
また、本発明のAIM阻害剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体が添加されていてもよい。製剤上許容しうる担体とは、AIM阻害剤（有効成分）とともに対象に投与可能な材料を意味する。製剤上許容しうる担体は、薬理学的及び製剤学的に許容されるものであればよく、特に制限されない。例えば、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤、賦形剤、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
本発明のAIM阻害剤は、通常の医療製剤の形態に製剤化することができる。当該医療製剤は、上記担体を用いて適宜調製される。医療製剤の形態としては特に限定はなく、治療目的に応じて適宜選択して使用される。その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤、乳剤）等が挙げられる。これら製剤は、通常用いられる方法により製造すればよい。
【００５５】
本発明のAIM阻害剤が核酸を含む場合は、リポソーム、高分子ミセル、カチオン性キャリア等のキャリアに核酸を封入して製剤化することができる。また、プロタミンのような核酸キャリアを利用してもよい。これらのキャリアに抗体等を結合させて、患部を標的化することも好ましい。また、核酸にコレステロール等を結合させて血中滞留性を高めることも可能である。また、本発明のAIM阻害剤が、siRNA等をコードする核酸を含み、投与した後に細胞内で発現させるものである場合、当該核酸を、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターに挿入して細胞内に導入することもできる。
【００５６】
また、本発明のAIM阻害剤に含まれる有効成分の量は、当業者が有効成分の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、抗AIM抗体等の抗体の場合、投与量は、0.025〜50mg/kg、好ましくは0.1〜50mg/kgであり、より好ましくは0.1〜25mg/kg、さらに好ましくは0.1〜10mg/kg又は0.1〜3mg/kgとすることができるが、これに限定されない。
また、本発明のAIM阻害剤は、抗動脈硬化薬、脂質降下薬、FAS阻害剤等、AIM阻害剤と同じ作用効果を有する他の医薬と併用投与することも好ましい。AIM阻害剤と併用投与できる医薬としては、例えば、Probucol、Fibrates、Statins、Aspirin、Coxibsからなる群より選択される少なくとも一つの抗動脈硬化薬、、C75、C93、Cerulenin、PHS11A、2-octanoic acid、thiolactomycin、及び、下記式（１）で表される化合物（Ｒ1は水素原子またはメチル基を示す）若しくはその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される少なくとも一つのＦＡＳ阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【化５】
2011145723.tif 000006
なお、併用投与とは、投与した2以上の薬剤が相加的又は相乗的に効果を示す限り、それぞれの投与時期又は投与量は限定されず、同時に投与しても、別々に投与してもよい。
【００５７】
上述のとおり、これまでは脂肪細胞の分化の抑制や脂肪滴融解（lipolysis）を引き起こし、それ自体に抗肥満効果が認められていたAIMタンパク質であるが、今般、後述する実施例に示されるとおり、マクロファージの脂肪組織への浸潤を誘導することが確認された。また、AIMタンパク質をノックアウトすると内臓脂肪型肥満になっても糖代謝は悪化しないことが示された。
従って、本発明に係るメタボリックシンドロームの予防又は治療方法によれば、AIM阻害剤を投与することによって、脂肪組織にM1マクロファージが浸潤するのを防ぐことを通じて脂肪組織及び全身の慢性的な炎症を防ぐことにより、ドミノ倒し的に進行する疾患の連鎖をその上流で止めることができるので、メタボリックシンドロームを根本的に予防、治療することが可能である。
【００５８】
また、本発明は、AIM阻害剤の製造方法も包含する。
AIM阻害剤の製造方法としては、
AIMをプロテアーゼによって処理し、AIMの部分ペプチドを得る工程と、当該部分ペプチドをAIMの機能ドメイン又は保存領域に結合する抗AIM抗体を固定したアフィニティカラムで精製する工程と、を含む。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが何らこれらに限定されるものではない。【００６０】
実施例１．肥満に伴う血中AIM濃度の上昇
C57BL・6(B6)マウスに高脂肪食（HFD, fat calorie: 60%）を20週間与えた肥満マウスと、正常マウスの血清中のAIM濃度を測定した。結果を図１に示す。
肥満マウス（obese）の血清AIM濃度は、正常マウス（lean）に比較して、4倍以上であった。【００６１】
実施例２．AIMによる脂肪組織へのマクロファージ浸潤の誘導
HFDを与えて肥満させたAIM+/+マウス及びAIM-/-マウスから内臓脂肪組織を採取し、この脂肪組織から作製したパラフィン切片を、抗マクロファージモノクローナル抗体（F4/80）、抗マウスAIMポリクローナル抗体（SA-1）、抗IL-6抗体（MP520F3, R & D systems）にて染色した。
結果を図２に示す。図２に示すとおり、AIMを発現する正常なマウス（AIM+/+）においてはM1マクロファージが脂肪組織に浸潤したが、AIMノックアウトマウス（AIM-/-）においては、脂肪組織へのマクロファージの浸潤はほとんど見られなかった。
なお、上述のとおり、AIMはマクロファージのアポトーシス抑制機能を有する。従って、AIMノックアウトマウスの脂肪組織でマクロファージが検出されないのは、脂肪組織にマクロファージが浸潤した後、アポトーシスが生じたことによる可能性があった。この可能性を確認するため、肥満したAIMノックアウトマウスと肥満した正常マウスの脂肪組織中におけるマクロファージのアポトーシスを測定したところ、その程度に差はなかった（data not shown）。
従って、脂肪組織でマクロファージが検出されなかったのは、マクロファージが脂肪組織に浸潤しなかったためであることが確認された。【００６２】
次に、AIMノックアウトマウスにrAIMを静脈注射により全身投与した（50μg/body/injection）。3週間投与後、内臓脂肪組織から作製した切片を、抗マクロファージモノクローナル抗体（F4/80）で染色した。
結果を図３に示す。図示されたとおり、AIMノックアウトマウスにrAIMを全身投与すると、脂肪組織にマクロファージが浸潤することが観察された。
以上の結果から、AIMが脂肪組織へのマクロファージ浸潤を誘導していること、従って、AIMを阻害すれば、内臓脂肪型肥満においても脂肪組織へのマクロファージ浸潤を抑制できることが示された。【００６３】
実施例３．マクロファージ遊走のメカニズムの解明
マウスマクロファージ細胞株RAW264.8  1x105/wellの24時間での遊走能を解析した。
CELL BIOLABS社、CytoSelectTM96-Well Cell Migration Assay (5 mm, Fluorometric format)を使用した。結果を図４に示す。それぞれのRFU値からバックグラウンド（medium only)を差し引いた値を示す。Fatty Acids CocktailはMyristoleic acid、Palmitic acid、Oleic acid、Linoleic acidからなる。
分化誘導8日目の成熟した3T3-L1脂肪細胞を6日間培養した細胞上清（3T3-L1 CM)、rAIMと共に培養した上清（3T3-L1+AIM CM)、C75と共に培養した上清（3T3-L1+C75 CM)を用いた。CM: conditioned medium, ND: not detected. **: p<0.01
後述する参考例に示すとおり、AIMは成熟脂肪細胞における脂肪滴融解を誘導する。その結果、培養上清中に脂肪滴由来の遊離脂肪酸とグリセロールが放出される。
マクロファージ遊走実験の結果と併せると、肥満に伴って血中濃度が上昇したAIMが脂肪組織において脂肪滴融解を誘導し、これによって脂肪組織へのマクロファージ浸潤が誘導されていることが強く示唆された。【００６４】
実施例４．肥満したAIMノックアウトマウスにおける糖代謝の悪化の抑制
野生型マウスと、AIMノックアウトマウスについて、HFDを12週間負荷し、前（Lean）と後（Obese）において、グルコース負荷試験とインスリン負荷試験により、糖代謝を測定するとともに、インスリン感受性試験を行った。
グルコース負荷試験は、グルコース負荷（3g/kg body；腹腔内注射）後120分間、血糖値を30分ごとに測定し、インスリン負荷試験は、インスリン負荷（0.75U/kg body；腹腔内注射）後120分間、血糖値を30分ごとに測定した。
インスリン感受性試験は、HFD負荷後のAIM+/+マウスとAIM-/-マウスにインスリンを投与し（0.75U/kg body；静脈注射）、2時間後、組織（白色脂肪組織、腓腹筋、及び肝臓）を採取してタンパク質を精製し、ウエスタンブロッティングにより、リン酸化AKT及びリン酸化GSK3βを測定することにより行った。
また、それぞれのマウスについて、HFD負荷後の体重及び総脂肪量を測定した。
図５に負荷後の解剖の結果を、図６に体重及び総脂肪量の測定結果を、図７〜１０に糖代謝の測定結果を、図１１に、インスリン感受性試験の結果を示す。
図５及び６に示されるとおり、HFD負荷により、AIMノックアウトマウス（AIM-/-）及び正常マウス（AIM+/+）の双方において、内蔵型肥満を生じた。体重及び脂肪組織量の増加はAIMノックアウトマウスのほうが顕著していた。
しかしながら、図７〜１０に示されるとおり、肥満した正常マウスにおいては糖代謝が著しく悪化していたところ、肥満したAIMノックアウトマウスにおいては、糖代謝の悪化が見られなかった。
さらに図１１に示されるとおり、AIM-/-マウスは、インスリン投与後、リン酸化AKTとリン酸化GSK3βの発現が見られ、インスリン受容体を介したシグナル伝達が機能していること、即ちインスリン感受性が正常であることが確認された。一方、野生型マウスでは、リン酸化AKTとリン酸化GSK3βが検出されず、インスリン抵抗性を示すことが確認された。
また、正常血糖高インスリンクランプ法（hyperinsulinemic-euglycemic clamp test）によっても、AIM-/-マウスはインスリン感受性が正常であることを確認した（data not shown）。
以上の結果は、肥満したAIMノックアウトマウスにおいては脂肪組織にマクロファージが浸潤せず、従って脂肪組織及び全身の炎症反応が抑制され、インスリン感受性が低下しないという結果を裏付けるものであった。
なお、肥満したAIMノックアウトマウス又は正常マウスから、すい臓ランゲルハンス島を分離し、グルコース負荷によりインスリンの産生及び分泌を調べたところ、両者に差は見られなかった。従って、耐糖能の違いは、インスリン産生・分泌に基づくものではなく、インスリン感受性の差によるものであることが確認された。【００６５】
参考例1.  脂肪組織中のマクロファージにおけるAIMの発現
野生型B6マウスに通常の餌を与えた痩せ型マウス（lean）と、高脂肪食（High Fat Diet：HFD、fat calorie 60%）を20週間与えた肥満マウス（obese）から、内臓脂肪組織を採取し、この脂肪組織から作製したパラフィン切片を抗マクロファージモノクローナル抗体（F4/80）、抗マウスAIMポリクローナル抗体（SA-1）、または抗IL-6抗体（MP520F3, R & D systems）にて二重染色した。【００６６】
図１２に、染色された切片を蛍光顕微鏡で観察した結果の一例を示す。
抗マクロファージ抗体で染色された肥満マウスの脂肪組織中のマクロファージは、AIM特異的な抗体によっても染色された（obese 左レーン）。AIM陽性マクロファージは、IL-6も陽性であったことから（obese 右レーン）、炎症性マクロファージ（M1）であるものと考えられた。
一方、痩せ型マウスから採取した脂肪組織内のマクロファージは、AIM、IL-6のいずれも陰性であった。
また、脂肪細胞でAIMが発現されていないことを確かめるため、肥満マウス由来の脂肪組織（内臓組織の代表として精巣上体脂肪組織を使用）をコラゲナーゼ処理後に分画し、RT-PCRでAIMの発現を調べたが、精製された脂肪細胞においてAIMの発現は見られなかった。さらに、3T3-L1細胞をインスリン、DEX及びIBMXで処理した後、AIMの発現を調べたが、やはり発現は見られなかった。
以上の結果から、脂肪組織に浸潤したマクロファージがAIMを強く発現していることが確認された。【００６７】
参考例2.  AIMによる脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化の抑制機能
［脂肪滴形成による評価］
脂肪組織に浸潤したマクロファージが産生するAIMが周辺の脂肪細胞に対してどのような働きをしているのかを調べるため、3T3-L1脂肪前駆細胞（preadipocyte）を成熟脂肪細胞に分化させる培養過程でAIMを負荷する実験を行った。
図１３に示すように、４つのスケジュールA〜Dにて3T3-L1細胞の培養を行った。（A）はAIMを負荷せず、（B）は分化誘導刺激開始から10日間（day2-day12）AIMを負荷し、（C）は分化誘導刺激の初期のみ（day2-day4）AIMを負荷し、（D）は分化誘導前の増殖（clonal expansion）期間のみ（day(-2)-day2）AIMを負荷した。【００６８】
AIMとしては、マウスの組換えAIMタンパク質（rAIM）を用いた。rAIMは、マウスAIMを発現するベクター（pCAGGS-mAIM-HAプラスミド）をトランスフェクションしたヒト由来HEK293T細胞を無血清培地（FreeStyleTM 293 Expression Medium; Invitrogen）で培養し、その培養上清から抗HA抗体カラムで単離精製することにより調製した。なお、以下に示す他の参考例においても、AIMとしては同様のrAIMタンパクを使用した。AIMの負荷は、培養液に5μg/mlの濃度でAIMを添加することにより行った。【００６９】
また、3T3-L1細胞の分化誘導は、図１３に示すように、まず3T3-L1細胞を4日間（day(-2)-day2）培養して増殖させ、その後、インスリン、デキサメタゾン（DEX）、イソブチルメチルキサンチン（IBMX）を含有する培養液で2日間（day2-day4）培養することで分化誘導刺激を開始し、さらにインスリンを含有する培養液で2日間（day4-day6）培養することにより行った。【００７０】
分化誘導刺激期間（day2-day6）後は、これら分化誘導刺激因子を含有しない培養液にて培養を継続した。そして、分化誘導刺激開始から10日目（day12）の細胞をoil-red-Oにて染色し、3T3-L1細胞から成熟脂肪細胞への分化の状況を観察した。【００７１】
図１４に、4つのスケジュールA〜Dのそれぞれについて、染色後の細胞の顕微鏡写真を示す。【００７２】
図１４に示すように、スケジュールCにてAIMを分化誘導刺激の初期のみ（day2-day4）負荷した場合には、脂肪滴を有する細胞はほとんど観察されず、3T3-L1細胞の分化はほぼ完全に抑制されていた。すなわち、AIMは、上述の分化誘導因子の存在下で、3T3-L1細胞の分化を抑制した。【００７３】
なお、分化誘導因子とAIMとを含有する培養液を調製後、当該培養液から精製カラムを用いてAIMを除去した場合であっても、当該分化誘導因子による3T3-L1細胞を分化させる能力は失われなかった（data not shown）。したがって、分化誘導因子とAIMとの間では実質的に化学的な相互作用はないと考えられた。【００７４】
また、スケジュールBにてAIMを分化誘導刺激開始から10日間（day2-day12）負荷した場合も、脂肪滴を有する細胞はほとんど観察されず、3T3-L1細胞の分化はほぼ完全に抑制されていた。また、このようなAIMによる分化抑制効果は、AIMの濃度に依存することも確認された（data not shown）。3T3-L1細胞に負荷するAIMの濃度を1μg/ml、0.1μg/mlと減少させると、AIMによる分化抑制効果も低減された。【００７５】
また、AIMの負荷による死細胞数の増加は認められなかった。したがって、AIMによる分化抑制は、細胞死を誘導することなく、成熟脂肪細胞に分化する3T3-L1細胞の数を減少させることによるものと考えられた。【００７６】
一方、スケジュールDにてAIMを分化誘導前にのみ（day(-2)-day2）負荷した場合には、スケジュールAにてAIMを負荷しなかった場合と同様、ほとんどの細胞が脂肪滴を有しており、ほとんどの3T3-L1細胞が成熟脂肪細胞に分化していることが確認された。すなわち、AIMを分化誘導前のみに負荷しても、3T3-L1細胞の成熟脂肪細胞への分化は抑制されなかった。ただし、AIMを分化誘導前から分化誘導期間を経てその後も継続的に（day(-2)-day12）負荷した場合には、3T3-L1細胞の脂肪細胞への分化は完全に抑制された（data not shown）。【００７７】
また、ヒトrAIMを用いてAIM負荷をいったところ、同様にマウス由来3T3-L1細胞の分化を抑制した。これにより、ヒトとマウスの間で、AIMの機能について互換性のあることが示された。【００７８】
［脂肪細胞マーカーの発現による評価］
図１３に示すスケジュールA〜Dにて培養された細胞を分化誘導刺激開始から10日目（day12）に回収し、脂肪細胞マーカー（C/EBPα, PPARγ1, PPARγ2, CD36, Glut4）のmRNAレベルの発現を、7500 Fast Real-Time PCR system （Invitrogen; CA, USA）を用いてΔΔCT法により測定した。使用したプライマーを表１に示す。
【表１】
2011145723.tif 000007
結果を図１５に示す。スケジュールA及びDでは脂肪細胞マーカーが発現し、脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化していることが示された。一方、分化誘導刺激と同時にAIMを投与したスケジュールB及びDでは、脂肪細胞マーカーの発現が抑制されており、脂肪細胞への分化が抑制されていることが示唆された。この結果は、スケジュールA及びDでは脂肪滴が形成され、スケジュールB及びDでは形成されなかったことと一致する。【００７９】
以上のとおり、AIMは脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制する。また、分化の程度は、脂肪滴の生成の観察、又は、脂肪細胞マーカー、脂肪前駆細胞マーカー、間葉系幹細胞マーカーの検出によって、容易に調べることができる。
従って、脂肪滴の生成やマーカーの検出の結果、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときに比較して、分化の誘導効率が上昇している場合には、当該候補化合物はAIMの機能を抑制する化合物であり、分化の誘導効率が低下している場合には、当該候補化合物はAIMの機能を亢進させる化合物であると評価することができる。【００８０】
参考例3.  AIMによる脂肪細胞の脂肪滴の融解機能
［oil-red-Oによる評価］
分化した3T3-L1細胞に、図１３のEに示すスケジュールでrAIM負荷（5μg/ml）を行った。rAIM負荷の前後でoil-red-O染色を行った。代表的な写真を図１６Ａに示す。細胞内の脂肪滴は、rAIM負荷を行って6日間培養した後、著しく減少した（rAIM(+)）。
また、脂肪滴の相対サイズ（Relative droplet size）は、50個の脂肪滴の直径の平均から求めた。エラーバーは、標準誤差を示す。単位面積当たりの脂肪滴含有細胞の数は、5つの異なる視野において計測し、平均を求めた。それぞれの結果を図１６Ｂ、Ｃに示す。
脂肪滴の相対サイズ、脂肪滴含有細胞の数のいずれも有意に減少した。
この結果は、rAIMが脂肪滴融解を引き起こし、脂肪滴に含まれるグリセロールや遊離脂肪酸が上清中に放出されたことを示唆する。【００８１】
［培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸量による評価］
3T3-L1脂肪細胞にrAIM負荷（5μg/ml）を開始した後、2日目、4日目、及び6日目における培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸の放出量を測定した。rAIM負荷後、PBSで2回洗浄し、無血清培地（FreeStyleTM293 Expression Medium; Invitrogen）中で5時間インキュベートした。バッファーを回収し、グリセロールアッセイキット、脂肪酸アッセイキット（いずれもBio Vision Inc.）を使用して、取扱説明書に従って測定した。
結果を図１７に示す。rAIMを加えて培養すると、培養上清中のグリセロール及び遊離脂肪酸のいずれの量も有意に増加した。
この結果は、rAIMが脂肪滴融解を引き起こし、脂肪滴に含まれるグリセロールや遊離脂肪酸が上清中に放出されたことを示唆する。【００８２】
［脂肪滴形成関連遺伝子の発現による評価］
3T3-L1脂肪細胞にrAIM負荷（5μg/ml）を開始した後、2日目、4日目、及び6日目における脂肪滴形成関連遺伝子（FSP27、Perilipin、及びAdipophilin）のmRNAを、7500 Fast Real-Time PCR system （Invitrogen; CA, USA）を用いてΔΔCT法により測定した（それぞれにつきn=3）。
また、同様に、脂肪前駆細胞マーカーのPREF-1のmRNAも測定した。測定値はGAPDHで標準化した。使用したプライマーを表２に示す。
【表２】
2011145723.tif 000008
結果を図１８に示す。0日目を1.0として相対的発現量を求めた。エラーバーは標準誤差を示す。
脂肪滴形成関連遺伝子の発現は、rAIM処理後2日目ですでに著しく低下していた。一方、脂肪前駆細胞マーカーの発現はrAIM処理の間増加しなかった。このことは、AIMが成熟脂肪細胞を脱分化させるものではないことを示唆する。【００８３】
以上のとおり、AIMは成熟脂肪細胞において脂肪滴を融解させる。また、脂肪滴の融解の程度は、顕微鏡による観察、培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸量の測定、脂肪滴形成関連遺伝子の発現の測定等によって、容易に調べることができる。
従って、培養上清中のグリセロール等を検出した結果、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときに比較して、脂肪滴融解の効率が低下している場合には、当該候補化合物はAIMの機能を抑制する化合物であり、脂肪滴融解の効率が上昇している場合には、当該化合物はAIMの機能を亢進させる化合物であると評価することができる。【００８４】
参考例4.  AIMによる脂肪細胞の縮小機能
［HE染色による評価］
AIM+/+マウス(+/+)とAIM-/-マウス（-/-）（非特許文献１参照）に、高脂肪食（High Fat Diet; HFD）を20日間与え、脂肪組織の切片をHE染色した。顕微鏡の様々な視野において、50個の脂肪細胞の距離を測定し、平均±標準誤差を求めた。結果を図１９Ａに示し、代表的な写真を図１９Ｂに示す。AIM-/-マウスの内臓脂肪細胞は、AIM+/+マウスと比較して有意に大きかった。【００８５】
以上のとおり、AIMは脂肪細胞の大きさを縮小する。縮小の程度は、顕微鏡によって容易に調べることができる。
従って、脂肪細胞の大きさを測定した結果、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときに比較して、細胞の大きさが大きくなっている場合には、当該化合物はAIMの機能を抑制する化合物であり、細胞の大きさが小さくなっている場合には、当該化合物は、AIMの機能を亢進させる化合物であると評価することができる。【００８６】
参考例5.  細胞表面のCD36を介した脂肪細胞へのAIMの取り込み
分化した3T3-L1細胞（ins/DEX/IBMX stimulation (+)）と、未分化の3T3-L1細胞（ins/DEX/IBMX stimulation (−)）を、rAIM（5μg/ml）と共に3時間インキュベートし、AIM、PPARγ2、及びDAPIを染色した。PPARγ2の染色にはウサギ抗PPARγ2ポリクローナル抗体（Abcam社）を用いた。結果を図２０Ａに示す。
上段にAIMとDAPIで核を染色した結果を、中段にAIMとPPARγ2を染色した結果を、下段にAIM、PPARγ2、DAPIを染色した結果の位相コントラスト像を示す。AIMが脂肪細胞の細胞質に散在していることが観察された。
下段からわかるように、PPARγ2が高発現している細胞は、多くの脂肪滴を含んでいる。PPARγ2を高発現している細胞、十分に分化した成熟脂肪細胞である。”pre”と表記された右のレーンは、分化誘導刺激を行っていない未分化の3T3-L1脂肪前駆細胞である。
また図２０Ｂに、PPARγ2の発現量ごとに細胞を分類し、各細胞100個当たりのrAIMが含まれる細胞数を示す。図示されたとおり、PPARγ2が高発現している成熟脂肪細胞ではrAIMが効率よく取り込まれ、PPARγ2の発現が低く十分に分化していない細胞ではrAIMの取り込み効率が著しく低いことがわかった。分化誘導刺激を行わなかった脂肪前駆細胞（pre）は、rAIMを取り込まなかった。【００８７】
また、3T3-L1脂肪細胞をrAIMで3時間処理し、AIMとエンドソーム（FM 1-43FX, Invitrogen社を使用）、AIMとリソソーム（Lyso Tracker Red DND-99, Invitrogen社を使用）を染色し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図２０Ｃに示す。
脂肪細胞内に取り込まれたrAIMは、エンドソームと共局在化しており、リソソームとの共局在化は見られなかった。【００８８】
同じサンプルを使って、AIMを金微粒子で標識し、電子顕微鏡で観察した。具体的には、正常ヤギ血清で30分前処理した細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、SA-1ウサギ抗AIMポリクローナル抗体（1：600希釈）と共に一晩インキュベートした。続いて、1nm金微粒子（1:200; Nanoprobes社）を共有結合させたヤギ抗ウサギIgGと反応させた。HQ silver（Nanoprobes社）を使用して銀増感を行い、osmificateし、脱水し、Epon（Nisshin EM社）に直接埋め込んだ。極薄切片を調製し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡（H-7100; Hitachi Inc.）で観察した。
結果を図２１に示す。Eはエンドソーム、Pはファゴソーム又はファゴリソソーム、Mはミトコンドリア、Nは核、LDは脂肪滴を示す。
金粒子で標識されたrAIMはエンドソーム様の構造をとり、その限界膜付近に特に集積していた（上段左）。細胞膜においては、rAIMのエンドサイトーシスが観察された（上段中央）。rAIMを含むいくつかの粒子は核付近に見られ、後期エンドソームと考えられた（上段右）。後期エンドソームは変性し、これに伴ってrAIMが細胞質に放出され得る。
大きな径を有する不規則な形状のファゴソーム及びファゴリソソーム、ミトコンドリア、脂肪滴では、AIMは検出されなかった（下段）。
以上の結果を総合すると、AIMは、エンドサイトーシスによって脂肪細胞内に取り込まれ、細胞内で機能を発揮することが示唆された。【００８９】
次に、AIMの取り込みに関与する細胞表面分子を特定した。リポタンパク質や脂肪酸等の取り込みを促進すること、及び、AIMの機能のターゲットとなる脂肪細胞とマクロファージの双方で発現していることから、CD36に注目した。
CD36中和抗体（Abcam社；Clone JC63.1 マウスIgA）で3T3-L1脂肪細胞を処理し、rAIMのエンドサイトーシスを阻害した。図２２に、中和抗体で処理した場合と処理しなかった場合の代表的な写真と、細胞100個当たりのrAIMを取り込んだ細胞数を示す。
図示されるとおり、CD36中和抗体で処理することにより、rAIMの取り込みは著しく抑制された。【００９０】
次に、CD36+/+マウス（野生型）とCD36-/-マウス（Febbraio et al., J. Biol. Chem., 1999, 274:19055-19062）にrAIM（300μg/mouse in PBS）を静注し、16時間後に犠牲死させ、脂肪組織から切片を調製した。切片におけるAIM、マクロファージF4/80を染色した。結果を図２３に示す。
図示されるとおり、AIMのシグナルはCD36-/-脂肪細胞において著しく低下しており、CD36-/-脂肪細胞ではrAIM取り込み能が失われることが示された。
これらの結果は、CD36がrAIMの取り込みの原因となっていることを強く示唆する。【００９１】
以上のとおり、AIMは細胞表面のCD36を介して、脂肪細胞に取り込まれる。脂肪細胞によるAIMの取り込みの程度は、例えば、検出可能に標識した抗AIM抗体を用いて細胞内のAIMを可視化することによって、容易に調べることができる。
従って、この方法を用いれば、AIMの機能を抑制する候補化合物の作用機序を明らかにし、当該化合物の効果を検証することができる。
例えば、AIMとAIMの機能を抑制する候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときと比較して、細胞内へのAIMの取り込みが低下している場合には、当該化合物は、細胞内へのAIMの取り込みを阻害することによってAIMの機能を抑制していると考えられる。【００９２】
参考例6.  AIMとFASの結合
［免疫沈降による評価］
AIM-/-マウスの脂肪組織に、HAタグを付けたrAIMを直接注射した（数箇所に計100μg）。3時間後、rAIM-HAと内因性FASの結合を確認するため、脂肪組織を用いて抗HA抗体による共免疫沈降を行った。沈降物中のFASの存在を、ウエスタンブロッティングによって解析した（WB）。
結果を図２４に示す。図示されるとおり、FASとrAIMは共沈し、取り込まれたAIMと細胞質のFASが結合することが確認された。【００９３】
HEK 293T細胞内において、HAタグを付けたrAIMと、FLAGタグを付けたFASを共発現させ、rAIMとFASとの結合を抗Flag抗体又は抗HA抗体を用いた共免疫沈降によって確認した。
結果を図２５に示す。rAIMとFASは共沈し、FASに対するAIMの結合能が示された。【００９４】
次に、FASにおけるAIMの結合領域を調べた。FASは、ケトアシルシンターゼ（KS）、マロニル／アセチルトランスフェラーゼ（MAT）、デヒドラーゼ（DH）、セントラルコア（CC）、エノイルレダクターゼ（ER）、ケトレダクターゼ（KR）、アシルキャリアタンパク質（ACP）、チオエステラーゼ（TE）の8つのドメインを含む。
FASの構造を図３１に示す。
FASの各ドメインのN末端をFlag配列で標識し、AIM-HAを安定的に発現するHEK293T細胞内で発現させた。AIM-HAとFASの各ドメインとの結合を、抗Flag抗体又は抗HA抗体を使った共免疫沈降で確認した。
結果を図２６に示す。AIMと結合するドメインは、ER、DH、TE及びCCであることがわかった。
なお、FLAGタグを付けた全長FAS cDNA（ヌクレオチド：+1〜7515）をコードする配列は、Dr. Ohara（かずさDNA研究所）から提供を受けたcDNAクローンの一部と、RT-PCRでクローニングしたいくつかのフラグメントと、pFLAG-CMV2ベクター（Sigma社）を使用して構築した。
KS、MAT、DH、CC、ER、KR、ACP、又はTEをコードするcDNAフラグメントは、全長FAS cDNAをテンプレートとし、pFLAG-CMV2ベクターにサブクローニングして作製した。【００９５】
［AIMによるFAS酵素活性の抑制］
脂肪細胞または脂肪組織のFAS活性に対するAIMの影響を調べた。FASの活性の測定は、Kelleyらの方法（Kelley et al., Biochem. J., 1986, 235:87-90）にわずかに修正を加えて行った。3T3-L1脂肪細胞、又は肥満マウスの脂肪組織のライゼートを、アセチル−CoA及びNADPH（0.4mM EDTAを含む0.2M リン酸カルシウムバッファー[pH 7.0]中）と混合し、分光光度計のキュベットに入れて、30℃に維持した。20μlのマロニル−CoA溶液（0.2mM）を加えて酵素反応を開始させ、ODの減少をチャートスピード2cm/minで測定した。その結果に基づき、酸化NADPHのモル吸光係数を6220としてFASの酵素活性を評価した。【００９６】
まず、rAIM（5μg/ml）の存在下、非存在下、及びC75（25μM）存在下で6日間処理した3T3-L1細胞におけるFAS活性を測定した。結果を図２７に示す。また、AIM+/+マウス及びAIM-/-マウスの脂肪組織におけるFAS活性、及び、脂肪内局所注射によってrAIM又はBSAを3時間前に投与したAIM-/-マウスの脂肪組織におけるFAS活性を、それぞれ図２８及び２９に示す。
すべてのマウスにはHFDを20週間与えた。サンプルは溶解（lyse）させてFAS活性を測定した。データは、同じサンプルを用いて行ったWBの結果に基づき、FASタンパク質当たりに換算した。各グループn=6とし、エラーバーは標準誤差を示す。
図２７に示されるとおり、rAIM処理によって、3T3-L1脂肪細胞におけるFAS活性は著しく抑制された。抑制の程度は、FASを特異的に阻害するC75と同程度であった。
in vivoにおいては、AIM+/+マウスに比較して、AIM-/-マウスでは、脂肪組織が有意に増加していた（図２８）。また、AIM-/-マウスの脂肪組織にrAIMを直接投与するとFAS活性は低下した。【００９７】
以上のとおり、AIMはFASと結合し、その活性を抑制する。
AIMとFASとの結合の程度は、免疫沈降等により容易に調べることができる。従って、この方法を用いれば、AIMの機能を抑制する候補化合物の作用機序を明らかにし、当該化合物の効果を検証することができる。例えば、AIMとAIMの機能を抑制する候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときと比較して、AIMとFASの結合が低下している場合には、当該化合物は、AIMとFASの結合を阻害することによって、AIMの機能を抑制していると考えられる。
また、活性抑制の程度は、FAS活性を測定する通常の方法で容易に調べることができる。従って、この方法を用いれば、AIMの機能を抑制する候補化合物の作用機序を明らかにし、当該化合物の効果を検証することができる。例えば、AIMとAIMの機能を抑制する候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときと比較して、FAS活性の抑制が抑制されている場合には、当該化合物は、AIMのFAS活性抑制機能を阻害することによって、AIMの機能を抑制していると考えられる。【００９８】
参考例7.  AIMによる体重、脂肪量の変化（in vivo）
AIM+/+マウス（n=7）と、AIM-/-マウス（n=6）にHFDを12週間与え、内蔵脂肪及び皮下脂肪量の変化を測定した。結果を図３２に示す。内臓脂肪（精巣上体脂肪）及び皮下脂肪のいずれも、AIM-/-マウスのほうが増加量が多かった。
次に、AIM-/-マウスに、5週間、HFDを与えながらrAIMを週2回腹腔内投与し（n=6; 300μg/injection/mouse）、体重及び脂肪組織量を測定した。結果を図３３及び３４に示す。rAIM投与群は、ウシ血清アルブミンを投与したコントロール（n=5; 300μg/injection/mouse）に比較して、体重、内臓脂肪、及び皮下脂肪のいずれの増加も有意に少なかった。
rAIM投与群及びBSA投与群のマウスの内臓脂肪組織から抽出したRNAにおける、脂肪細胞マーカー、脂肪前駆細胞マーカー、及び脂肪滴形成関連遺伝子のmRNAレベルをQPCRで測定した。結果を図３５に示す。測定値は、GAPDHの測定値で標準化し、BSA投与した脂肪組織に対する相対的発現量で表した。
rAIM投与群においては、内臓脂肪におけるFSP27、Perilipin、及びAdipophilinのmRNAレベルも低かった。一方、PREF-1のmRNAレベルはrAIMの投与により上昇したが、PPARγ2、C/EBPα、GLUT4のmRNAは、rAIM投与群とBSA投与群で差が見られなかった。【００９９】
参考例8.  イヌ、ネコにおけるAIMの発現
イヌ、ネコ及びマウスの血清中のAIMタンパク質を、抗AIM抗体（SA-1）を用いたウエスタンブロッティング（還元状態）によって検出した。
結果を図３６に示す。図示されるとおり、いずれの動物においてもAIMタンパク質が検出された。種間の分子量の違いは、糖鎖等の修飾によるものと考えられる。  【０１００】
実施例8.  AIM阻害剤
以下のスクリーニング方法により、AIM阻害剤を探索した。
＜細胞＞
3T3-L1（DSバイオファーマ Cat No. EC86052701）
＜試薬＞
・培地
継代用
DMEM(Invitrogen Cat No. 11995-081)/ 10% CS/ PS SM
アッセイ用・・・DMEM/ 10% FBS/ ペニシリン＋ストレプトマイシン 
分化誘導用・・・DMEM/ 10% FBS/ペニシリン＋ストレプトマイシン/ 1ug/mL Insulin/ 1uM Dexamethasone/ 0.5mM IBMX 
・RT-PCR TaqMan Gene Expression Cells-to-Ct kit (Applied Biosystems Cat No. AM1729) 
・Probe mouse FSP27, mouse GAPDH(Applied Biosystems Cat No. AM1729) 
・mAIM FreeStyle CHO Expression Medium(Invitrogen Cat No. 12651-014)を用いて37℃で震盪培養しているCHO-S細胞を106 cells/mLに調製し、終濃度1.25%になるようにDMSOを添加して、37℃で3時間震盪培養した。マウスmAIMのC末端にHis6タグを付加し、CMVあるいはPGKプロモーター下流に連結したプラスミドでCHO-S細胞をトランスフェクションした。37℃で2時間震盪培養した後、29℃に移し、CMVプロモーターを用いた場合は７日間、PGKプロモーターを用いた場合は9日間培養を継続し、培養上清を回収した。回収した培養上清をHisTrap HPカラム（5mL、GEヘルスケア社製）にアプライし、20mMイミダゾールで洗浄した後、300mMイミダゾールで溶出した。回収した溶液をPBSで置換し、濃縮して精製mAIMとした。
＜被検化合物＞
・被検化合物 10 mM DMSO溶液 
＜方法＞
（１）細胞の継代
・Dishで培養中の細胞をPBS(-)で洗浄後、1/10濃度のトリプシンで処理することにより剥がし、継代用培地に懸濁し細胞数をカウントした。
・通常、10cm dishで5x105〜1x106 cells/dishで継代を行った。
・新しい10cm dishに細胞を播種する。
中一日で継代する場合は2x105  cells/dishで、 
中二日で継代する場合は1x105  cells/dishで播種した。 
（２）分化誘導
− Day 1 
・Dishで培養中の細胞をPBS(-)で洗浄後、1/10濃度のトリプシンで処理することにより剥がし、アッセイ用培地に懸濁し細胞数をカウントした。
・5x104 cells/mLに調製し、96 well plate (IWAKI)に100uL/well (5000cells/well)で播種した。
− Day 3 
・mAIM(final 400ug/mL)及び希釈した被検化合物(最終濃度10uM)を添加した分化誘導培地を調整した。
・96 well plateの培地を除去し、上記分化誘導培地100uL/wellを添加した。
− Day 5
・培地を除去し、100uL/wellの4℃に冷却したPBS(-)で洗浄した。
・25uL/wellのLysis Buffer（+1/100 DNase）を添加し、Plate Shakerで細胞を完全に溶解した（室温1分）。
・さらに室温で5分静置した。
・2.5uL/wellのStop Solutionを添加し、Plate Shakerで混合した（室温2分）。
（３）RT-PCRアッセイ
96 well PCR Plateに、下記逆転写反応溶液を調製した。
2xRT Buffer        10 
20xRT Enzyme Mix  1 
Nuclease-free water  5 
Cell lysate          4 
Total               20uL/well 
・ 逆転写反応
37℃ 60min 
95℃ 5min 
4℃ hold 
・384 well PCR Plateに、下記RT-PCR反応溶液を調製した。
TaqMan Gene Expression Master Mix      5
20x TaqMan Probe (mFSP27)              0.5
20x TaqMan Probe (mGAPDH)            0.5
Nuclease-free water                      2
cDNA sample                            2
Total                                    10uL/well 
・ABI7900HTにてRT-PCR反応を行った。
50℃ 2min 
95℃ 10min 
以下40サイクル 
95℃ 15sec 
60℃ 1min 【０１０１】
1280点で1次スクリーニング（n=1、10μM）を行い、FSP27の発現量（GAPDで標準化）が、(-)AIM＋3SD以下のヒットで、各96プレート上位2点の32点を1次ヒットとした。
再現性試験（n=3、10μM、AIM4Lot）を行い、FSP27の発現量（GAPDで標準化）が、AIMタンパク質の4Lotすべてで(+)AIM＋3×SD以上活性化したものを選択し、以下の化合物を得た。順に、DST-1、DST-2、DST-3、DST-4と呼ぶ。
【化６】
2011145723.tif 000009
【化７】
2011145723.tif 000010
【化８】
2011145723.tif 000011
【化９】
2011145723.tif 000012
DST-1〜DST-4の再現性試験の結果を図３７、３８に示す。いずれの化合物も、本来AIMの添加により誘導されるFSP27 mRNA発現の著しい減少を有意に抑制し、AIMの機能を阻害することが確認された。【０１０２】
実施例9.  中和抗体
以下の材料及び方法で中和抗体を作製した。
＜動物感作＞
抗原としてマウスAIM（2mg/ｍｌ）を等量のTiterMaxGold（G-1フナコシ）と混合しエマルジョンを作製した。免疫動物にはＪｃｌ：Ｗｉｓｔａｒラット（日本クレア(株)）６週齢のメス2匹を用い、後ろ足底部へ50μLを投与した。2週間後に同様の投与を行い、更に2週間以上をおいて抗原溶液50μｇを足底部へ投与し3日後の細胞融合に備えた。
＜ミエローマ細胞＞
ミエローマ細胞にはマウスP3U1を用い、増殖培養には、RPMI1640（11875-119  GIBCO）にグルタミンとピルビン酸を加えFBS（S1560  BWT社）を10％になるように添加した培地を用いた。抗生物質としてはペニシリン、ストレプトマイシンを適量加えた。
＜細胞融合＞
麻酔下にて心臓採血を行ったラットから無菌的に膝窩リンパ節を摘出し、＃200メッシュ付ビーカーにのせシリコン棒で押しながら細胞浮遊液を調整した。細胞はRPMI1640にて2回の遠心洗浄を行った後、細胞数をカウントした。
対数増殖期の状態のミエローマ細胞を遠心により集め洗浄後、リンパ細胞に対して5対１となるように調整し、混合遠心を行った。
細胞融合はPEG1500（783641 ロシュ）を用いて行った。すなわち細胞ペレットへ１mLのPEG液を3分間かけて反応させ、その後段階的に希釈を行い遠心にて洗浄した後、培地を加え96ウェルプレート15枚へ200μLずつ入れ、1週間の培養を行った。培地にはミエローマ細胞用培地にHATサプリメント（21060-017 GIBCO）を加え、FBS濃度を15％にしたものを用いた。
＜マウス腹水採取＞
凍結保存された細胞を解凍し、増殖培養を行った後、１週間以上前に0.5ｍｌのプリスタン（42-002 コスモバイオ）を腹腔内投与したヌードマウス（BALB/cAJcl-nu/nu 日本クレア）の腹腔へ1×10７乗個を投与し、およそ2週間後に4〜12mlの腹水を得た。遠心処理にて固形物を除去した後、凍結保存を行った。
＜電気泳動解析＞
解凍し5μｍのフィルターにて腹水を処理した後、セルロースアセテート膜電気泳動にて腹水中に含まれるモノクローナル抗体のバンドの確認を行った。
電気泳動条件は、0.05MBarbital Na Buffer pH8.6（020-13415  和光純薬）、SELECA-V（ADVANTEC）、1mA/cm、25min で行い、固定、染色には0.1％ニグロシン（2％酢酸）を用いた。
＜抗体アッセイ＞
24個の抗マウスAIMラットモノクローナル抗体を、それぞれ200mg/mlの濃度でrAIMと室温30分間処理したのち、rAIM最終濃度5mg/mlで分化した3T3-L1脂肪細胞（分化誘導4日目）に添加し、24時間培養した。RNAを細胞より単離し、quantitative RT-PCRにて、FSP27のmRNA量を定量化した。
結果を図３９に示す。
Clone11, 12, 17の3クローンについては、本来rAIM添加により誘導されるFSP27 mRNA発現の著しい減少が有意に抑制された。Control rat IgGやclone15との処理では抑制されなかった。【０１０３】
実施例10.  人間ドック受診者の血中hAIM濃度の測定
抗原としてヒトrAIMを用いたこと以外実施例9と同様に抗AIM抗体を得た。
得られたクローンのうち、AIM-CL-6及びAIM-CL-7はブダペスト条約の規定に従って寄託した。受託番号は、それぞれNITE BP-1092、NITE BP-1093である。
受託機関：独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ：National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary；日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）
受託日：2011年5月2日
AIM-CL-6及びAIM-CL-7を用いて、約550名の人間ドック受診者の血中hAIM濃度を測定した。具体的には、AIM-CL-6を捕捉用、AIM-CL-7を検出用とし、血清を50μL使用してduplicateで解析した。濃度は、ヒトrAIMを倍率希釈して定量線を設け、それによって決定した。
ヒトrAIMはHAタグをつけたヒトAIMタンパク質をHEK293T細胞で産生させ、培養上清から抗HA抗体を用いカラム精製したものである。
結果を図４０に示す。【０１０４】
実施例11.  BMIと血中AIM濃度との関係
血液提供者（外国人を含む）から、BMIが18〜25の人と35以上の人を無作為に選択し、図6と同様の方法で血中AIM濃度を測定した。一般に、BMIが高いほどメタボリックシンドロームのリスクは高くなるといわれる。
結果を図４１に示す。BMI35以上の人は、BMI18〜25の人に比較して、血中AIM濃度が有意に高かった。このことは、AIMの血中濃度がメタボリックシンドロームのリスクと相関し、AIMを阻害することによりメタボリックシンドロームの予防又は治療が可能であることを強く示唆する。
【配列表フリーテキスト】
【０１０５】
配列番号：１は、ヒトAIMのアミノ酸配列である。
配列番号：２は、定量的リアルタイムPCRによるPPARγ1発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：３は、定量的リアルタイムPCRによるPPARγ1発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：４は、定量的リアルタイムPCRによるPPARγ2発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：５は、定量的リアルタイムPCRによるPPARγ2発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：６は、定量的リアルタイムPCRによるC/EBPα発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：７は、定量的リアルタイムPCRによるC/EBPα発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：８は、定量的リアルタイムPCRによるCD36発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：９は、定量的リアルタイムPCRによるCD36発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：１０は、定量的リアルタイムPCRによるGLUT4発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：１１は、定量的リアルタイムPCRによるGLUT4発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：１２は、定量的リアルタイムPCRによるFsp27発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：１３は、定量的リアルタイムPCRによるFsp27発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：１４は、定量的リアルタイムPCRによるPerilipin発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：１５は、定量的リアルタイムPCRによるPerilipin発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：１６は、定量的リアルタイムPCRによるAdipophilin発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：１７は、定量的リアルタイムPCRによるAdipophilin発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：１８は、定量的リアルタイムPCRによるGAPDH発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：１９は、定量的リアルタイムPCRによるGAPDH発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：２０は、定量的リアルタイムPCRによるPREF1発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：２１は、定量的リアルタイムPCRによるPREF1発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：２２は、チンパンジーAIMのアミノ酸配列である。
配列番号：２３は、イヌAIMのアミノ酸配列である。
配列番号：２４は、マウスAIMのアミノ酸配列である。
配列番号：２５は、ラットAIMのアミノ酸配列である。
【図１３】
2011145723.tif 000013
【図１５】
2011145723.tif 000014
【図３０】
2011145723.tif 000015
【図３９】
2011145723.tif 000016
【図１】
2011145723.tif 000017
【図２】
2011145723.tif 000018
【図３】
2011145723.tif 000019
【図４】
2011145723.tif 000020
【図５】
2011145723.tif 000021
【図６】
2011145723.tif 000022
【図７】
2011145723.tif 000023
【図８】
2011145723.tif 000024
【図９】
2011145723.tif 000025
【図１０】
2011145723.tif 000026
【図１１】
2011145723.tif 000027
【図１２】
2011145723.tif 000028
【図１４】
2011145723.tif 000029
【図１６Ａ】
2011145723.tif 000030
【図１６Ｂ】
2011145723.tif 000031
【図１６Ｃ】
2011145723.tif 000032
【図１７Ａ】
2011145723.tif 000033
【図１７Ｂ】
2011145723.tif 000034
【図１８Ａ】
2011145723.tif 000035
【図１８Ｂ】
2011145723.tif 000036
【図１８Ｃ】
2011145723.tif 000037
【図１９Ａ】
2011145723.tif 000038
【図１９Ｂ】
2011145723.tif 000039
【図２０Ａ】
2011145723.tif 000040
【図２０Ｂ】
2011145723.tif 000041
【図２０Ｃ】
2011145723.tif 000042
【図２１】
2011145723.tif 000043
【図２２】
2011145723.tif 000044
【図２３】
2011145723.tif 000045
【図２４】
2011145723.tif 000046
【図２５】
2011145723.tif 000047
【図２６】
2011145723.tif 000048
【図２７】
2011145723.tif 000049
【図２８】
2011145723.tif 000050
【図２９】
2011145723.tif 000051
【図３１】
2011145723.tif 000052
【図３２】
2011145723.tif 000053
【図３３】
2011145723.tif 000054
【図３４】
2011145723.tif 000055
【図３５】
2011145723.tif 000056
【図３６】
2011145723.tif 000057
【図３７】
2011145723.tif 000058
【図３８】
2011145723.tif 000059
【図４０】
2011145723.tif 000060
【図４１】
2011145723.tif 000061
【配列表】
2011145723000001.app
【国際調査報告】
2011145723.tif 000062
2011145723.tif 000063
2011145723.tif 000064
2011145723.tif 000065
2011145723.tif 000066
2011145723.tif 000067