(57)【要約】  ＳＰＬ阻害作用によってスフィンゴシン１−リン酸またはジヒドロスフィンゴシン１−リン酸量を増加させる化合物を迅速、簡便、そして高感度に見出すことを目的とする、培養細胞を用いたスクリーニング法を提供すること。  シンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ；  ＳＰＡ）で迅速、簡便に測定する方法、およびアッセイ時に使用する培地中のビタミンＢ６類濃度を調節することによって、化合物作用の検出感度を大幅に向上させた方法の提供等。
2012002274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴシン１−リン酸リアーゼの活性を阻害する化合物を同定、選択または試験する方法であって、（ｉ）スフィンゴシン１−リン酸リアーゼを発現する細胞を播種して培養する工程、（ｉｉ）該細胞に、標識された脂質基質および被験化合物を混合して培養する工程、（ｉｉｉ）該細胞を溶解する工程、または該細胞の培養上清を分取する工程、（ｉｖ）リン酸化された脂質と結合するが、リン酸化されていない脂質とは結合しない担体材料に（ｉｉｉ）の細胞溶解物、または培養上清を接触させる工程、および（ｖ）該担体に結合しているリン酸化されている脂質量を測定する工程、（ｖｉ）被験化合物を含まない場合と比較してリン酸化された脂質量が増加していることを指標としてスフィンゴシン１−リン酸リアーゼの活性が阻害されていると判断する工程、を含む方法。
【請求項２】
脂質基質がスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉ）および／または（ｉｉ）において、ビタミンＢ６類の濃度が通常の培地よりも低い培地を用いて細胞を培養することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ビタミンＢ６類の濃度が２０μＭ以下であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ビタミンＢ６類の濃度が１μＭ以下であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ビタミンＢ６類の濃度が１００ｎＭ以下であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
被験化合物の添加の前に細胞がビタミンＢ６類を含まない培地で洗浄されており、工程（ｉｉ）において培地がビタミンＢ６類を実質的に含まないことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
担体がＳＰＡビーズであることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
ＳＰＡビーズが、ＲＮＡ結合ケイ酸イットリウムＳＰＡビーズであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉ）および／または（ｉｉ）において、セラミドシンターゼ阻害剤が添加されることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
セラミドシンターゼ阻害剤がフモニシンＢ１であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
炎症性腸疾患、自己免疫疾患、多発性硬化症もしくはアレルギー性疾患を予防または治療するための化合物を同定、選択または試験するための請求項１乃至１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性皮膚硬化症、シェーグレン症候群、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症または混合性結合組織病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギーまたは蕁麻疹である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、循環血中リンパ球減少作用に基づく新規免疫抑制剤として有用な、Ｓ１Ｐリアーゼ阻害剤の高速多検体スクリーニング法に係る。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴシン１−リン酸（以下、Ｓ１Ｐ）は、細胞増殖、生存、遊走などを制御する生理活性脂質であり、血管新生やリンパ球遊走に重要な役割を果たすことが知られている（例えば非特許文献１を参照）。循環血中および各組織中におけるＳ１Ｐ濃度は複数の酵素によって厳密に制御されており、とりわけＳ１Ｐを非可逆的に切断する酵素であるＳ１Ｐリアーゼ（以下、ＳＰＬ）は、リンパ球循環に必要な血中−リンパ組織間のＳ１Ｐ濃度勾配の形成に必須の因子と考えられている。事実、ＳＰＬノックアウトマウスを用いた解析では、リンパ組織中におけるＳ１Ｐ濃度の飛躍的な上昇とともに、循環血中のリンパ球数の大幅な減少が観察されている（例えば非特許文献２参照）。また、末梢血中リンパ球数減少作用を有する２−アセチル−４−テトラヒドロキシブチルイミダゾール（以下、ＴＨＩ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでリンパ組織中のＳＰＬ活性を低下させることにより、Ｓ１Ｐ濃度勾配の形成を阻害すると報告されている（例えば非特許文献３参照）。これらの知見から、移植片拒絶反応の回避や各種自己免疫疾患に対して、ＳＰＬ阻害剤が循環血中リンパ球減少作用に基づく新規免疫抑制剤となる可能性が期待されている。【０００３】
ＳＰＬ阻害剤をスクリーニングするにあたっては、これまでに、無細胞系でのＳＰＬ酵素活性を指標としたアッセイ方法がいくつか報告されている（例えば非特許文献４乃至６参照）。しかし、現在までにＳＰＬ特異的な阻害剤は報告されていない。前述のＴＨＩについても、ｉｎ  ｖｉｖｏではＳＰＬ阻害作用を示すにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは作用が確認されていない。一方、ＳＰＬを阻害することによって細胞内Ｓ１Ｐが蓄積することが知られているが、これを指標とした細胞系スクリーニングの実施例は見当たらない。細胞内のＳ１Ｐ量を測定する方法は既にいくつか知られている（例えば非特許文献７乃至１０参照）ものの、いずれも煩雑な脂質抽出操作が必要であり、検体処理能力が低いことが問題と考えられる。また、上述のＴＨＩについては、培養細胞を用いた実験系でも作用は確認されていない。これについては、既存の実験条件が最適化されていないために、作用を検出できていないものと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ．  ２００９；１３（８）：１０１３−１０２５．
【非特許文献２】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２００９；４（１）：ｅ４１１２．
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００５；３０９（５７４１）：１７３５−１７３９．
【非特許文献４】Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ２００７；４８（１２）：２７６９−２７７８．
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００９；３８０（２）：３６６−３７０．
【非特許文献６】Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００９；１０（５）：８２０−８２２．
【非特許文献７】Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９５；２３０：３１５−３２０．
【非特許文献８】Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９９；２７２：８０−８６．
【非特許文献９】Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０００；２８２：１１５−１２０．
【非特許文献１０】Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ＆  Ｏｈｔｅｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．  ２００７；８４：１５４−１６２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、直接または間接的なＳＰＬ阻害作用によってＳ１Ｐまたはジヒドロスフィンゴシン１−リン酸（以下、ｄｈＳ１Ｐ）量を増加させる化合物を迅速、簡便、そして高感度に見出すことを目的とする、培養細胞を用いたスクリーニング法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、被験化合物の細胞内Ｓ１Ｐ量増加作用を、トリチウム（３Ｈ）などのラジオアイソトープ標識Ｓ１ＰまたはｄｈＳ１Ｐを用いて、シンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ；  ＳＰＡ）で迅速、簡便に測定する方法、およびアッセイ時に使用する培地中のビタミンＢ６類濃度を調節することによって被験化合物のＳＰＬ阻害作用の検出感度を大幅に向上させられることを見出し、本発明を完成させた。なお、上記のＳＰＡを応用したスフィンゴシンキナーゼ阻害剤の無細胞系でのアッセイ方法が知られている（国際公開パンフレットＷＯ０２／０２７３１８）が、本発明で示される培養細胞に化合物を作用させてのＳ１Ｐ量を測定するものではなく、被験化合物のＳＰＬ阻害作用の検出感度の向上を示すものでもない。また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴＨＩの効果がビタミンＢ６類の投与によって解除されることが知られていた（Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００５；３０９（５７４１）：１７３５−１７３９．）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてビタミンＢ６類の除去によってＴＨＩ等のＳＰＬ阻害作用の検出感度が向上可能であることは確認されておらず、本発明に記載のアッセイ法を使用することによって初めて達成された。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）  スフィンゴシン１−リン酸リアーゼの活性を阻害する化合物を同定、選択または試験する方法であって、（ｉ）スフィンゴシン１−リン酸リアーゼを発現する細胞を播種して培養する工程、（ｉｉ）該細胞に、標識された脂質基質および被験化合物を混合して培養する工程、（ｉｉｉ）該細胞を溶解する工程、または該細胞の培養上清を分取する工程、（ｉｖ）リン酸化された脂質と結合するが、リン酸化されていない脂質とは結合しない担体材料に（ｉｉｉ）の細胞溶解物、または培養上清を接触させる工程、および（ｖ）該担体に結合しているリン酸化されている脂質量を測定する工程、（ｖｉ）被験化合物を含まない場合と比較してリン酸化された脂質量が増加していることを指標としてスフィンゴシン１−リン酸リアーゼの活性が阻害されていると判断する工程、を含む方法。
（２）  脂質基質がスフィンゴシンまたはジヒドロスフィンゴシンであることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）  工程（ｉ）および／または（ｉｉ）において、ビタミンＢ６類の濃度が通常の培地よりも低い培地を用いて細胞を培養することを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（４）  ビタミンＢ６類の濃度が２０μＭ以下であることを特徴とする、（３）に記載の方法。
（５）  ビタミンＢ６類の濃度が１μＭ以下であることを特徴とする、（３）に記載の方法。
（６）  ビタミンＢ６類の濃度が１００ｎＭ以下であることを特徴とする、（３）に記載の方法。
（７）  被験化合物の添加の前に細胞がビタミンＢ６類を含まない培地で洗浄されており、工程（ｉｉ）において培地がビタミンＢ６類を実質的に含まないことを特徴とする、（３）に記載の方法。
（８）  担体がＳＰＡビーズであることを特徴とする、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載の方法。
（９）  ＳＰＡビーズが、ＲＮＡ結合ケイ酸イットリウムＳＰＡビーズであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
（１０）  工程（ｉ）および／または（ｉｉ）において、セラミドシンターゼ阻害剤が添加されることを特徴とする、（１）乃至（９）のいずれか一つに記載の方法。
（１１）  セラミドシンターゼ阻害剤がフモニシンＢ１であることを特徴とする、（１０）に記載の方法。
（１２）  炎症性腸疾患、自己免疫疾患、多発性硬化症もしくはアレルギー性疾患を予防または治療するための化合物を同定、選択または試験するための（１）乃至（１１）のいずれか一つに記載の方法。
（１３）  炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、（１２）に記載の方法。
（１４）  自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性皮膚硬化症、シェーグレン症候群、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症または混合性結合組織病である、（１２）に記載の方法。
（１５）  アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギーまたは蕁麻疹である、（１２）に記載の方法。 
【発明の効果】
【０００７】
本発明のスクリーニング法によって、ＳＰＬ阻害作用によってＳ１ＰまたはｄｈＳ１Ｐ量を増加させる化合物を迅速、簡便、そして高感度に見出すことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明のスクリーニング法の原理を示した模式図である。
【図２】ＳＰＡによって、従来のアルカリ−クロロホルム抽出法と同等の効率で、３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐを選択的に検出できることを示した図である。（１）は全放射活性を、（２）はアルカリ‐クロロホルム抽出による放射活性を、（３）ＳＰＡビーズを使用して測定された放射活性を、それぞれ示している。
【図３】ｓｉＲＮＡ導入がＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞に及ぼす各種効果を示した図である。（１）はｓｉＲＮＡ導入によるＳＰＬ  ｍＲＮＡ発現量の変化を、（２）はｓｉＲＮＡ導入によるＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞ライセート中のＳＰＬ活性の変化を、（３）はｓｉＲＮＡ導入によるＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞内の３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの蓄積を、それぞれ示している。なお、各グラフの測定結果は、グラフの左から、それぞれネガティブコントロールｓｉＲＮＡ導入細胞２４時間培養時、ｓ７３６４３導入細胞２４時間培養時、ｓ７３６４４導入細胞２４時間培養時、ｓ７３６４５導入細胞２４時間培養時、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ導入細胞４８時間培養時、ｓ７３６４３導入細胞４８時間培養時、ｓ７３６４４導入細胞４８時間培養時、ｓ７３６４５導入細胞４８時間培養時のものである。
【図４】通常条件下での４−デオキシピリドキシン（ＤＯＰ）によるＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞におけるＳＰＬ阻害作用を示した図である。（１）はＳＰＡビーズアッセイの結果を、（２）はＬＣ−ＭＳによる細胞内Ｓ１Ｐ量の測定結果を、（３）は細胞ライセート中のＳＰＬ活性の測定結果を、それぞれ示している。なお、各グラフにおけるＤＯＰ濃度は、グラフの左から、それぞれ０μＭ、１．６μＭ、８μＭ、４０μＭ、２００μＭ、１０００μＭである。
【図５】ビタミンＢ６類除去条件下での４−デオキシピリドキシンまたは２−アセチル−４−テトラヒドロキシブチルイミダゾール（ＴＨＩ）によるＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞におけるＳＰＬ阻害作用を示した図である。（１）はＳＰＡビーズアッセイの結果を、（２）はＬＣ−ＭＳによる細胞内Ｓ１Ｐ量の測定結果を、（３）は細胞ライセート中のＳＰＬ活性の測定結果を、それぞれ示している。なお、（１）におけるＤＯＰまたはＴＨＩの濃度は、グラフの左から、それぞれ未添加、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭである。また、（２）および（３）におけるＤＯＰの濃度は、グラフの左から、それぞれ未添加、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭである。さらに（２）および（３）におけるＴＨＩの濃度は、グラフの左から、それぞれ未添加、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭである。
【図６】フモニシンＢ１（ＦＢ１）の添加によって、４−デオキシピリドキシンによるＳＰＬ阻害作用（細胞内の３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの蓄積）検出のシグナル／バックグラウンド比が向上することを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．新規ＳＰＬ活性測定系の構築
新たに構築したスクリーニング法の原理を図１に示す。なお、本明細書中におけるスクリーニング法とは、スフィンゴシン１−リン酸リアーゼの活性を阻害する化合物を同定、選択または試験する方法を意味する。培養細胞に標識された脂質基質、例えば３Ｈ標識スフィンゴシン（３Ｈ−Ｓｐｈ）または３Ｈ標識ジヒドロスフィンゴシン（３Ｈ−ｄｈＳｐｈ）を添加して細胞内に取り込ませた後、内在的に発現している、または強制発現させたスフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫｓ）によって、リン酸化された脂質、例えば３Ｈ標識Ｓ１Ｐ（３Ｈ−Ｓ１Ｐ）または３Ｈ標識ｄｈＳ１Ｐ（３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐ）に変換させる。これらのリン酸化脂質は、速やかにＳＰＬによる非可逆的切断またはＳ１Ｐホスファターゼ（ＳＰＰｓ）による脱リン酸化を受けるが、このときＳＰＬ活性を阻害することによって分解速度を遅らせ、これらを細胞内に蓄積させる。すなわち、被験化合物の添加時において、被験化合物の非添加時と比較して３Ｈ−Ｓ１Ｐまたは３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの細胞内における蓄積量が増加していれば、該被験化合物はＳＰＬ阻害活性を有すると判断することができる。また、ある種の細胞株では細胞内で生成されたＳ１ＰまたはｄｈＳ１Ｐは細胞外に分泌されることが示されており（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００６；１０３（４４）：１６３９４−１６３９９）、細胞内に蓄積された３Ｈ−Ｓ１Ｐまたは３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの一部は細胞外に分泌されると考えられる。従って、培養上清中の３Ｈ−Ｓ１Ｐまたは３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐ量が増加していれば、同じく該被験化合物はＳＰＬ阻害活性を有すると判断することができる。なお、このときセラミドシンターゼ阻害剤（例えば、フモニシンＢ１）やＳＰＰｓの阻害剤を処理しておくことにより、シグナル／バックグラウンド比の向上や、ＳＰＬ特異的な化合物の取得確率向上が期待できる。また、Ｓ１Ｐホスファターゼ遺伝子またはセラミドシンターゼ遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることによっても同様の効果が期待できる。Ｓ１Ｐホスファターゼ遺伝子としては、Ｓ１Ｐ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−１、Ｓ１Ｐ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−２を、またセラミドシンターゼ遺伝子としては、ＬＡＧ１  ｈｏｍｏｌｏｇ，ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  １乃至６を挙げることができる。
【００１０】
本発明で使用される培養細胞は、マウス胸腺上皮由来細胞株であるＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞等の細胞をＳＰＬ蛋白質の発現を指標として適宜選択することが可能である。また、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＣＯＳ７細胞などの培養細胞に、ＳＰＬ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した細胞を使用することも可能である。ＳＰＬ遺伝子として使用される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿００３９０１で登録されたヒトＳＰＬ遺伝子、アクセッション番号：ＮＭ＿００９１６３で登録されたマウスＳＰＬ遺伝子、またはアクセッション番号：ＮＭ＿１７３１１６で登録されたラットＳＰＬ遺伝子を挙げることができるが、ＳＰＬ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子である限り、上記の遺伝子群に限定されない。
【００１１】
細胞内に蓄積した３Ｈ−Ｓ１Ｐまたは３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの放射活性は、適当な溶液を用いて細胞を溶解した後に、担体となるシンチレーション試薬（例えば、ＲＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＹＳｉ  ＳＰＡ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と混合し、シンチレーション測定機を用いることにより検出する。また、培養上清に上記の担体を加えることによって、培養上清中の３Ｈ−Ｓ１Ｐまたは３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの放射活性を測定することが可能である。これにより、細胞溶解液または培養上清中に共存する３Ｈ−Ｓｐｈ／３Ｈ−ｄｈＳｐｈや、ＳＰＬ反応によって生成する各種分解産物の影響を受けずに、３Ｈ−Ｓ１Ｐまたは３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの放射活性のみを選択的に検出する。この方法を用いることによって、有機溶媒を用いる抽出操作を必要とせずに、細胞内に蓄積した、または培養上清に分泌された３Ｈ−Ｓ１Ｐまたは３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐ量を簡便、迅速に測定することが可能となり、脂質抽出操作が必要であった既存の方法に比較して、検体処理能力が格段に向上する。
【００１２】
本発明において細胞の溶解に使用される溶液の共通の性質として、細胞を溶解する能力を有すること、および担体と３Ｈ−Ｓ１Ｐ／３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの結合（およびシンチレーション発光）を妨げないことを挙げることができる。従って、上記の溶液には、Ｔｒｉｔｏｎ、ノニデット等の界面活性剤が含まれていることが必要である。なお、本明細書の実施例では細胞の溶解に使用されるバッファーとして、市販のバッファーの混合物を使用しているが、使用可能な溶液はこれに限定されるものではない。例えば５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、０．１％ＢＳＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等の自作バッファーを用いた場合でも、本発明の方法で細胞内に蓄積したリン酸化された標識脂質が測定可能であることが確認されている。
【００１３】
さらに、アッセイ時に使用する培地中のビタミンＢ６類の濃度を調節することにより、被験化合物の効果濃度を低下させ、アッセイ系としての感度を向上させる。通常の細胞培養に使用される培地には、ビタミンＢ６類であるピリドキシンが５〜２０μＭ程度含まれているが、これより低い濃度を選択することによって、感度を向上させることが可能である。最も感度を高めるためには、ビタミンＢ６類を完全に除去した培地を使用する。これにより、従来法ではｉｎ  ｖｉｔｒｏのＳＰＬ阻害作用が見出されていなかった化合物（例えばＴＨＩ）についても、その作用を検出することが可能となる。試験に用いる培養細胞の由来種ごとに適切なビタミンＢ６類の濃度を選択することによって、より生体内に近い条件で被験化合物を評価することが可能となる。本発明のアッセイ系における好適な培地はビタミンＢ６類の濃度が１μＭ以下の培地であり、より好適にはビタミンＢ６類の濃度が１００ｎＭ以下の培地であり、さらに好適には、被験化合物の添加の前に細胞がビタミンＢ６類を含まない培地で洗浄されており、ビタミンＢ６類を実質的に含まない培地である。
【００１４】
このアッセイ法は９６穴、３８４穴などのマルチウエルプレートを用いて実施できるため、容易にオートメーション化することができる。従って、細胞内ＳＰＬを直接または間接的に阻害する化合物を高速多検体スクリーニングによって選抜することが可能となる。
【００１５】
被験化合物としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等を挙げることができる。また、ＳＰＬの発現量を低下するように設計された核酸またはその誘導体（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等を含む）を、被験化合物として使用することも可能である。被験化合物の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列を作製するなどして複数種の投与量を設定してもよく、固体、液体等適当な状態で投与することができ、適当なバッファーに溶解するか、あるいは安定化剤等を加えてもよい。本発明のスクリーニング法では培養細胞を用いており、被験化合物を培地に添加して使用する。被験化合物ついては、培養開始時から添加してもよいし、培養途中で添加しても良く、また、添加の回数も１回に限らない。被験化合物存在下で培養する期間も適宜設定してよいが、好ましくは３０分乃至２週間であり、より好ましくは、２時間乃至７２時間であり、さらに好ましくは５時間乃至２４時間である。なお、実施例における化合物処理時間は５時間であるが、この処理時間に限定されるものではない。
【００１６】
２．本発明において使用されるアッセイ方法と担体材料
いくつかのアッセイ形式を、本発明の方法を実施するために使用することができるが、好ましいアッセイ形式は、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）などのシンチレーションアッセイである。ＳＰＡ技術は、ＰＰＯなどの有機シンチラントを含有するシンチラントビーズの使用を伴う。アッセイは通常、水性環境ではそのエネルギーが容易に消失する低エネルギー放射線を放射する、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓまたは３３Ｐなどの放射性同位体を使用して水性緩衝液中で行われる。例えば、３Ｈにより放射される電子は、６ｋｅＶの平均エネルギーを有するにすぎず、水中では非常に短い経路長を有する。これらの同位体の１つで標識された分子が、直接的に、またはビーズに以前に結合させられた別の分子との相互作用を介してビーズ表面に結合した場合、放射される放射線により、シンチラントが活性化され、光が発生する。発生する光の量は、ビーズに結合している標識された分子の量に比例しており、液体シンチレーション（ＬＳ）カウンターで簡便に測定することができる。標識された分子がビーズに結合していない場合、その放射エネルギーは、ビーズに到達する前に周りの水性溶媒によって吸収され、光が発生しない。したがって、結合したリガンドはシンチレーションシグナルをもたらすが、遊離状態のリガンドは非常に低いバックグラウンドをもたらし、したがって、従来の放射性リガンド結合アッセイの特徴である時間のかかる分離工程の必要性がなくなる。アッセイにおいて必要とされる操作は数回の簡単なピペット操作工程に減らされ、これにより、より良好な正確性および再現性ならびにより大きいスループットが得られる。
【００１７】
より好ましい態様において、本発明の方法は、放射能標識されたリン酸化脂質（例えば、スフィンゴシン−１−Ｐ）をＳＰＡビーズに結合させることを含む。結合は、他の結合手段も考えられ得るが、好ましくは、ケイ酸イットリウムビーズまたは酸化イットリウムビーズとの化学的または物理的な相互作用を介して行われる。より具体的には、結合は、リン酸化された基質のリン酸基と担体表面との相互作用（すなわち、共有結合的な結合とは異なる結合）による。標識されたリン酸化されていない脂質（例えば、３Ｈ−Ｓｐｈまたは３Ｈ−ｄｈＳｐｈ）がＳＰＨＫｓによってリン酸化を受け、標識されたリン酸化脂質（例えば、３Ｈ−Ｓ１Ｐまたは３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐ）が生成される。生じたリン酸化脂質は通常ＳＰＬによって速やかに分解されるが、ＳＰＬの作用を阻害する化合物を添加することによって、標識されたリン酸化脂質量の増加が観察される。
【００１８】
次に、本発明は、特定の担体材料を使用してＳＰＬ活性を阻害する化合物をスクリーニングする新規な方法を開示する。担体材料は、リン酸化された脂質などのＳＰＬ反応の基質と結合する能力を有するが、リン酸化されていない脂質などの基質と結合する能力を有していない。したがって、担体に結合した脂質の量は、培養細胞のＳＰＬ活性に対して負の相関を示す。担体は、リン酸化された脂質とリン酸化されていない脂質との該識別を可能にする官能基（抗体または他の反応基など）を含み得るか、あるいは該脂質を識別する能力を有する物質から構成され得る（またはそのような物質を含み得る）。
【００１９】
担体は、少なくとも一部が、ケイ酸塩、ポリビニルトルエン（ＰＶＴ）、（ポリ）アクリルアミド、アガロース、セファロース、ポリスチレンなどから構成され得る。担体材料の具体的な例には、ＷＧＡ、ストレプトアビジン、ポリリシンなどのリガンドで場合によりコーティングされたＰＶＴまたはケイ酸塩物質が挙げられる。より好ましい物質は、酸化イットリウムもしくはケイ酸イットリウム（ＹｔＳｉ）（これらは場合によりコーティングもしくは官能化される）、またはＰＶＴを含む。
【００２０】
より好ましい態様において、担体はシンチラント（すなわち、有機シンチラント）を含有する。シンチラントは、好ましくは、水に不溶性であり、標識された脂質が担体に結合したときに、より高いエネルギー状態に励起され得る。シンチラントは、好適な装置（例えば、シンチレーションカウンター）を使用して検出される十分な光エネルギーをもたらさなければならない。シンチラントの典型的な例には、ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）がある。このシンチラントは、β線を放出する放射性同位体によって効率的に励起される。
【００２１】
本発明において使用される好適な担体材料は市販品の中に見出すことができ、例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製品のＷＧＡコーティングＰＶＴビーズ（ＲＰＮＱ０００１）、ＰＥＩ処理ＷＧＡ  ＰＶＴビーズ（ＲＰＮＱ０００３）、ストレプトアビジンコーティングＰＶＴビーズ（ＲＰＮＱ０００７）、ポリリシンコーティングケイ酸イットリウムビーズ（ＲＰＮＱ００１０）、ＷＧＡコーティングケイ酸イットリウムビーズ（ＲＰＮＱ００１１）、ストレプトアビジンコーティングケイ酸イットリウムビーズ（ＲＰＮＱ００１２）およびＲＮＡ結合ケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（ＲＰＮＱ００１３）または膜結合酸化イットリウムＳＰＡビーズ（ＲＰＮＱ０２８０）などがある。
【００２２】
本発明で使用される標識された脂質は、好ましくは放射能標識されている。放射能標識は、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３５Ｓ、３３Ｐまたは３２Ｐを含む様々な放射性同位体を使用して行うことができる。放射性同位体は、好ましくは、水性環境においてそのエネルギーが容易に消失する低エネルギー放射線を放出するものである。結合していない標識された基質は、担体材料に含有されるシンチラントを本質的には活性化しないことが必要である。同位体の性質は、シンチラントのタイプに依存してもまた選択され得る。例えば、ＰＰＯがシンチラントとして使用される場合、同位体は、好ましくは例えば３Ｈなど、β線を放射するものである。
【００２３】
アッセイのために使用される標識された脂質の量は当業者によって調節され得る。典型的な実験では、０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．０２〜１μＭの脂質が、０．０１〜０．５μＣｉの３Ｈ−Ｓｐｈまたは３Ｈ−ｄｈＳｐｈが各アッセイについて使用される。なお、本明細書の実施例中では、０．０５μＣｉの標識基質を１μＭの濃度で使用しているが、アッセイに使用される標識された脂質の放射活性および濃度はこれに限定されるものではない。アッセイに使用される細胞数は、該細胞の有するＳＰＬ活性に依存し、当業者によって調節され得る。
【００２４】
３．ＳＰＬ阻害剤を含有する医薬
本発明のスクリーニング方法によって見出される化合物またはその薬学的に許容され得る塩は、優れたＳ１Ｐリアーゼ阻害能を有するので、免疫系の活動を抑制することができる。従って、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病など）、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性皮膚硬化症、シェーグレン症候群、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病など）、多発性硬化症（ＭＳ）、アレルギー性疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、蕁麻疹など）を予防または治療するために、あるいは、移植に対する拒絶反応を抑制するための医薬組成物の有効成分として、本発明のスクリーニング方法によって見出される化合物またはその薬学的に許容され得る塩を用いることができる。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法によって見出される化合物またはその薬学的に許容され得る塩を有効成分として含有する医薬組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタなど、好ましくはヒト）に投与される場合には、全身的または局所的に、経口または非経口で投与され得る。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、投与方法に応じて適切な形態を選択し、通常用いられている各種製剤の調製法によって調製できる。
【００２７】
経口用の医薬組成物の形態としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。かかる形態の医薬組成物の調製は、添加剤として通常用いられる賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、膨潤剤、膨潤補助剤、コーティング剤、可塑剤、安定剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、保存剤、緩衝剤、希釈剤、湿潤剤などを必要に応じて適宜選択し、常法に従って製造され得る。
【００２８】
非経口用の医薬組成物の形態としては、注射剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、点眼剤、点鼻剤、座剤、吸入剤などが挙げられる。かかる形態の医薬組成物の調製は、添加剤として通常用いられる安定化剤、防腐剤、溶解補助剤、保湿剤、保存剤、抗酸化剤、着香剤、ゲル化剤、中和剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張剤、界面活性剤、着色剤、緩衝化剤、増粘剤、湿潤剤、充填剤、吸収促進剤、懸濁化剤、結合剤などを必要に応じて適宜選択し、常法に従って製造され得る。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法によって見出される化合物またはその薬学的に許容され得る塩の投与量は、症状、年齢、体重などにより異なるが、経口投与の場合には、１日１〜数回、成人一人一回当たり、化合物換算量で１〜２０００ｍｇ、好ましくは１〜４００ｍｇであり、非経口投与の場合には、１日１〜数回、成人一人一回当たり、化合物換算量０．０１〜５００ｍｇ、好ましくは０．１〜３００ｍｇである。
【００３０】
実施例
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
ＳＰＡによる３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの検出
３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐ（６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＡＲＴ０６１８）または３Ｈ−ｄｈＳｐｈ（６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＡＲＴ０４６０）を細胞融解バッファー（Ｃｉｓｂｉｏ社製ＩＰ−Ｏｎｅ  Ｔｂ  Ｋｉｔのコンポーネントである、ＩＰ−Ｏｎｅ  Ｔｂ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ＆  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒとＩＰ１  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１×）の３：７混合液）で段階希釈した。【００３２】
全放射活性を調べるために、上記の３Ｈ標識化合物の希釈液それぞれ５０μＬを５ｍＬの液体シンチレーター（Ｈｉｏｎｉｃ−Ｆｌｕｏｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と混合して、液体シンチレーションカウンター（Ａｌｏｋａ）により放射活性を測定した。【００３３】
既存の分離抽出法の効率を調べるために、上記の３Ｈ標識化合物の希釈液それぞれ５０  μＬに対して、５０μＬの０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液と１００μＬのクロロホルム：メタノール（２：１）混合液を添加し、激しく攪拌した後に８，４００Ｇ、室温で３分間遠心し、水層を７０μＬとって５ｍＬの液体シンチレーターと混合後、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。【００３４】
ＳＰＡによる３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの検出効率について調べるために、ＲＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＹＳｉ  ＳＰＡ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓ（ＳＰＡビーズ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＲＰＮＱ００１３）を終濃度５０％のグリセロールを含むように８倍希釈した。これを９６穴白色プレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ−９６（ｗｈｉｔｅ，９６−ｗｅｌｌ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に２０μＬずつ分注した後、上記の３Ｈ標識化合物の希釈液それぞれ５０μＬを添加して混合し、透明なプレートシール（ＴｏｐＳｅａｌ−Ａ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で覆って室温、遮光下で一晩放置した。翌日、マイクロプレートシンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で放射活性を測定した。【００３５】
結果を図２に示す。ＳＰＡによって、従来のアルカリ−クロロホルム抽出法と同等の効率で、３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐを選択的に検出できた。
【実施例２】
【００３６】
ｓｉＲＮＡ導入が及ぼす各種効果の確認
１）細胞培養および培地
マウス胸腺上皮由来細胞株（ＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞、ヒューマンサイエンス振興財団細胞バンク）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養された。トランスフェクションやアッセイで使用する際には、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて剥離させたのち、遠心して細胞を回収した。化合物を処理したり３Ｈ−ｄｈＳｐｈを取り込ませたりする際には、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ）または０．１％ＢＳＡを含むビタミンＢ６類除去ダルベッコ変法イーグル培地（ＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ、細胞科学研究所）（ＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ）を使用した。【００３７】
２）ｓｉＲＮＡトランスフェクション
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｌ（Ｌｏｎｚａ）で１×１０６細胞／１００μＬに調製したＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞に、マウスＳＰＬに対する３種配列のｓｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡ、Ａｍｂｉｏｎ、ｓ７３６４３〜ｓ７３６４５）またはネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を２００ｐｍｏｌ添加し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ（Ａｍａｘａ）を用いて、プログラムＴ−０３０でトランスフェクションした。【００３８】
３）リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析
ノックダウン効率を調べるために、トランスフェクションした細胞をＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用６穴プレート（住友ベークライト）に２×１０５細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間または４８時間培養した。培養後のＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞からＲＮＡ抽出用キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、さらにＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｃＤＮＡを調製した。これを鋳型として、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）と、マウスグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子またはマウスＳＰＬ遺伝子に対する特異的プライマー（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｐｒｉｍｅｒ、タカラバイオ）を用いて、リアルタイムＰＣＲシステム（Ｍｘ４０００  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、各々のサンプルのＳＰＬ  ｍＲＮＡの相対定量解析を行った。結果は、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ導入細胞のＳＰＬ  ｍＲＮＡ発現量に対する比として算出した。【００３９】
４）ｓｉＲＮＡトランスフェクションした細胞ライセート中のＳＰＬ活性測定
ＳＰＬ遺伝子をノックダウンしたＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞のライセートを調製するために、トランスフェクションした細胞をＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用１２穴プレート（住友ベークライト）に１．５×１０５細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間または４８時間培養した。培養後のＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞を回収し、１２０μＬのホモジェナイズバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ＝７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ））を添加し、ソニケーター（ＨａｎｄｙＳｏｎｉｃ、トミー精工）で超音波処理を施した後、１，０００Ｇ、４℃で３分間遠心して得た上清を細胞ライセートとした。このうち一部を用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク定量を実施した。【００４０】
細胞ライセート中のＳＰＬ活性を測定するために、ホモジェナイズバッファーにて０．６ｍｇタンパク質／ｍＬに希釈し、基質である３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐ（３．４ｎＭ）と反応バッファー（０．１Ｍ  リン酸カリウム溶液（ｐＨ＝７．４）、２５ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２μＭｃｏｌｄ  ｄｈＳ１Ｐ）と混合して５０μＬとし、３７℃で１時間反応させた。氷上で１時間反応させたものを陰性対照とした。反応後に５０μＬの０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液と１００μＬのクロロホルム：メタノール（２：１）混合液を添加し、激しく攪拌した後に８，４００Ｇ、室温で３分間遠心し、有機層を３０μＬとって５ｍＬの液体シンチレーターと混合後、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。得られたカウントはＳＰＬ反応による分解産物量を反映しているものとし、結果はネガティブコントロールｓｉＲＮＡ導入細胞のＳＰＬ活性に対する比として算出した。【００４１】
５）ｓｉＲＮＡトランスフェクションした細胞のＳＰＡ
ＳＰＬ遺伝子をノックダウンしたＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞内の３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの蓄積をＳＰＡで検出するために、トランスフェクションした細胞を２５μＭ  フモニシンＢ１（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用９６穴プレート（住友ベークライト）に１×１０４細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間または４８時間培養した。培養上清を一旦除去した後、８．３ｎＭ  ３Ｈ−ｄｈＳｐｈおよび１μＭ  ｄｈＳｐｈ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡを５０μＬ添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３０分間培養した。培養上清を除去した後、７０μＬの細胞融解バッファーを加えて室温で２時間放置した。このうち５０μＬを、予め９６穴白色プレートに２０μＬずつ分注したＳＰＡビーズ（終濃度５０％のグリセロールを含むように８倍希釈したもの）と混合し、透明なプレートシールで覆って室温、遮光下で一晩放置した。翌日、マイクロプレートシンチレーションカウンターで放射活性を測定した。【００４２】
結果を図３に示す。ｓｉＲＮＡ導入によって、ＳＰＬ  ｍＲＮＡ発現量は２４時間後で８６％以上、４８時間後で６７％以上抑制された。また、これに応じたライセート中ＳＰＬ活性の低下も確認できた。さらに、構築したＳＰＡによって、細胞内３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐの蓄積を検出することができた。
【実施例３】
【００４３】
既知阻害剤を用いたＳＰＬ活性測定
１）既知ＳＰＬ阻害剤を用いたＳＰＡ
被験化合物の３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐ蓄積作用を評価するために、ＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞を２５μＭフモニシンＢ１を含むＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用９６穴プレートに１×１０４細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一昼夜培養した。翌日、培養上清を一旦除去した後、段階希釈した被験化合物を含むＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ（またはＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ）を４０μＬ添加して３７℃、５％ＣＯ２存在下で４．５時間培養した後、８３ｎＭの３Ｈ−ｄｈＳｐｈおよび５μＭ  ｄｈＳｐｈを含むＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ（またはＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ）を１０μＬ添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３０分間培養した。培養上清を除去した後、７０μＬの細胞融解バッファーを加えて室温で２時間放置した。このうち５０μＬを、予め９６穴白色プレートに２０μＬずつ分注したＳＰＡビーズ（終濃度５０％のグリセロールを含むように８倍希釈したもの）と混合し、透明なプレートシールで覆って室温、遮光下で一晩放置した。翌日、マイクロプレートシンチレーションカウンターで放射活性を測定した。なお、ＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭを用いて実施する場合は、被験化合物を含む培地を添加する前に１５０μＬのＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ−０．１％  ＢＳＡで２回洗浄することにより、播種時に用いたＤＭＥＭに含まれるＶＢ６類のキャリーオーバーを防止した。【００４４】
２）細胞内Ｓ１ＰのＬＣ−ＭＳ測定
被験化合物のＳ１Ｐ蓄積作用を評価するために、ＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞を２５μＭフモニシンＢ１を含むＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用２４穴プレートに５×１０４細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一昼夜培養した。翌日、培養上清を一旦除去した後、段階希釈した被験化合物を含むＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ（またはＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ）を４５０μＬ添加して３７℃、５％ＣＯ２存在下で４．５時間培養した後、１０μＭ  Ｓｐｈ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ（またはＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ）を５０μＬ添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３０分間培養した。培養上清を除去し、ＰＢＳで洗浄した後に細胞を回収し、アセトニトリル：１Ｍ塩酸（４：１）混合液を１５０μＬ添加してソニケーターで超音波処理を施した。Ｓ１Ｐ量は、ＬＣ−ＭＳにより三菱化学メディエンス株式会社で測定された。なお、ＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭを用いて実施する場合は、被験化合物を含む培地を添加する前に６００μＬのＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ−０．１％  ＢＳＡで２回洗浄することにより、播種時に用いたＤＭＥＭに含まれるＶＢ６類のキャリーオーバーを防止した。【００４５】
３）化合物処理した細胞ライセート中のＳＰＬ活性の測定
被験化合物を処理した細胞のライセートを調製するために、ＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞を２５μＭフモニシンＢ１を含むＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用１２穴プレートに１×１０５細胞／ウエルで播種して、３７℃，５％ＣＯ２存在下で一昼夜培養した。翌日、培養上清を一旦除去した後、段階希釈した被験化合物を含むＤＭＥＭ−０．１％  ＢＳＡ（またはＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ−０．１％  ＢＳＡ）を５００μＬ添加して３７℃、５％  ＣＯ２存在下で４．５時間培養した後、１０μＭ  ｄｈＳｐｈを含むＤＭＥＭ−０．１％  ＢＳＡ（またはＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ）を５５μＬ添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３０分間培養した。ＰＢＳで洗浄した後にＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞を回収し、１５０μＬのホモジェナイズバッファーを添加してソニケーターで超音波処理を施した後、１，０００Ｇ、４℃で３分間遠心して得た上清を細胞ライセートとした。このうち一部を用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク定量を実施した。なお、ＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭを用いて実施する場合は、被験化合物を含む培地を添加する前に１ｍＬのＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ−０．１％  ＢＳＡで２回洗浄することにより、播種時に用いたＤＭＥＭに含まれるＶＢ６類のキャリーオーバーを防止した。【００４６】
化合物処理した細胞から調製したライセート中のＳＰＬ活性を測定するために、ホモジェナイズバッファーにて１ｍｇタンパク質／ｍＬに希釈し、基質である３Ｈ−ｄｈＳ１Ｐ（３．４ｎＭ）と反応バッファー（０．１Ｍ  リン酸カリウム溶液（ｐＨ＝７．４）、２５ｍＭ  ＮａＦ、５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２μＭｃｏｌｄ  ｄｈＳ１Ｐ）と混合して５０μＬとし、３７℃で１時間反応させた。氷上で１時間反応させたものを陰性対照とした。反応後に５０μＬの０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液と１００μＬのクロロホルム：メタノール（２：１）混合液を添加し、激しく攪拌した後に８，４００Ｇ、室温で３分間遠心し、有機層を３０μＬとって５ｍＬの液体シンチレーターと混合後、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。得られたカウントはＳＰＬ反応による分解産物量を反映しているものとし、各サンプルのＳＰＬ活性は、化合物非処理群に対する比として算出した。【００４７】
図４は、通常条件下での各種アッセイ結果を示す。非特異的ＳＰＬ阻害剤である４−デオキシピリドキシン（ＤＯＰ）は、ＳＰＡで濃度依存的なレスポンスを示した。同様に、細胞内Ｓ１Ｐ量や、ライセート中ＳＰＬ活性についても、ほぼ同じ濃度域でＤＯＰの作用を検出した。【００４８】
図５は、ＶＢ６−ｆｒｅｅ  ＤＭＥＭ使用条件での各種アッセイ結果を示す。非特異的ＳＰＬ阻害剤である４−デオキシピリドキシン（ＤＯＰ）のＳＰＡにおける効果濃度は、通常ＤＭＥＭ使用時に比べて大幅に低下した。さらに、ＴＨＩにも濃度依存的な作用を検出した。これらの被験化合物は、細胞内Ｓ１Ｐ量や、ライセート中ＳＰＬ活性についても、ほぼ同じ濃度域で作用を示した。【００４９】
なお、別途、ビタミンＢ６類のＳＰＬ活性阻害作用に対する影響を確認したところ、通常のＤＭＥＭ（約２０μＭのピリドキシンを含む）を用いた場合のＤＯＰのＥＣ５０は４６μＭであったが、１μＭピリドキシン存在下では１．６μＭ、１００ｎＭピリドキシン存在下では２７ｎＭであった。また、ＴＨＩは通常のＤＭＥＭを用いた場合、または１μＭピリドキシン存在下ではＳＰＬ活性に対する阻害作用は観察できなかったが、１００ｎＭピリドキシン存在下でのＥＣ５０は約２５０μＭであり、ＳＰＬ阻害活性が観察可能であった。このようにビタミンＢ６類の濃度を通常の細胞培養に使用される培地よりも低下させることによって、ＳＰＬ阻害作用測定の感度を向上させることが可能であった。
【実施例４】
【００５０】
フモニシンＢ１処理の影響検討
フモニシンＢ１処理によるシグナル／バックグラウンド比の向上効果について検討するために、ＩＴ−７９ＭＴＮＣ３細胞を０または２５μＭフモニシンＢ１を含むＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに懸濁し、細胞培養用９６穴プレートに１×１０４細胞／ウエルで播種して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一昼夜培養した。翌日、培養上清を一旦除去した後、ＤＯＰを含む（または含まない）ＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡを４０μＬ添加して３７℃、５％ＣＯ２存在下で４．５時間培養した後、４２ｎＭの３Ｈ−ｄｈＳｐｈおよび５μＭ  ｄｈＳｐｈを含むＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡを１０μＬ添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３０分間培養した。培養上清を除去した後、７０μＬの細胞融解バッファーを加えて室温で２時間放置した。このうち５０μＬを、予め９６穴白色プレートに２０μＬずつ分注したＳＰＡビーズ（終濃度５０％のグリセロールを含むように８倍希釈したもの）と混合し、透明なプレートシールで覆って室温、遮光下で一晩放置した。翌日、マイクロプレートシンチレーションカウンターで放射活性を測定した。【００５１】
結果を図６に示す。フモニシンＢ１を予め処理しておくことによって、アッセイのシグナル／バックグラウンド比を向上させることが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のスクリーニング法によって、ＳＰＬ阻害作用により免疫抑制作用を示す化合物を迅速、簡便、そして高感度に見出すことが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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