(57)【要約】ニトロビンを含む多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤、およびニトロビンを用いる多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導方法ならびに心筋細胞の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトロビンを含む、多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤。
【請求項２】
多能性幹細胞が哺乳類の細胞である、請求項１の分化促進剤。
【請求項３】
多能性幹細胞が霊長類の細胞である、請求項２の分化促進剤。
【請求項４】
多能性幹細胞がヒト由来の細胞である、請求項３の分化促進剤。
【請求項５】
ニトロビンを含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
【請求項６】
ニトロビンを含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法。
【請求項７】
請求項６の方法で製造された心筋細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法、および多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞を所望の細胞へ分化誘導する方法は、再生医療の実現には必須の技術である。また、かかる方法で得られる分化誘導された細胞は再生医療のみならずインビトロでの薬効評価試験や薬剤安全性試験に有用であることが期待される。心疾患は現在日本人の死亡原因の第二位であることから、特に、心疾患を治療するための再生医療や心疾患の薬効評価に用いうる心筋細胞への分化誘導法の確立には大きな期待が寄せられている。また心臓に対して心不全や不整脈など重篤な副作用を引き起こす薬物が多いことからも、心毒性試験に用いることのできる均一な心筋細胞の供給が求められている。【０００３】
これまで、ヒトＥＳ細胞を心筋細胞へ分化させる手法として、マウス由来の支持細胞であるＥＮＤ２細胞とヒトＥＳ細胞を共培養する方法が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、その分化効率は十分ではなく、またマウス由来のＥＮＤ２細胞がヒト心筋細胞に混入しやすいため、純粋なヒト心筋細胞が得られにくいという問題がある。他の手法として、ＥＳ細胞から胚様体を形成し、そこに数種類のサイトカイン（維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、骨形態形成タンパク４（ＢＭＰ４）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、Dickkopf-1 （ＤＫＫ１）、アクチビンＡ））を添加し、心筋細胞への分化を誘導する方法も報告されている（非特許文献２、３）。しかしながら、この方法は大量のサイトカインを必要とするためコストがかかる上、その分化効率も十分ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Mummery, C., et al., Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107(21),  2733-40 (2003).
【非特許文献２】Yang, L., et al., Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453(7194),  524-8 (2008).
【非特許文献３】Leschik, J., et al., Cardiac commitment of primate embryonic stem cells. Nat Protoc. 3(9),  1381-7 (2008).これらの文献は引用により本願に含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は高効率かつ低コストにて均一な心筋細胞を得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、９６００種類のライブラリー化合物について、サルＥＳ細胞から心筋細胞への分化促進効果を検討した。その結果、家畜用抗生物質・成長促進剤として知られる低分子化合物のニトロビンが、既知の心筋分化促進因子と比較して非常に高い心筋分化効率を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
本発明は、ニトロビンを含む、多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤を提供する。【０００８】
また、本発明は、ニトロビンを含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導する方法を提供する。【０００９】
また、本発明は、ニトロビンを含む培地中で多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、支持細胞を使用することなく、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導し、純粋な心筋細胞を得ることが可能となった。また、本発明により、高効率かつ低コストに心筋細胞への分化を誘導し、心筋細胞を製造することが可能となった。本発明は、薬剤安全性試験として重要なＱＴ延長試験をハイスループットスクリーニングで行うため、あるいは心疾患に対する薬効評価に用いる均一かつ成熟したヒト心筋細胞の大量生産や、心臓疾患などに対する移植用心筋細胞の生産に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】心筋分化促進物質の探索スクリーニング方法。
【図２】スクリーニングシステムとニトロビンの検出。
【図３−１】サルＥＳ細胞におけるニトロビン（最終濃度１、５、２０μＭ）投与時のＧＦＰ発現。
【図３−２】サルＥＳ細胞におけるニトロビンによるＧＦＰ蛍光量および心筋拍動コロニー数の増加。横軸はニトロビンの濃度を示す。左グラフの縦軸はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）投与時（対照）を１００％とした場合のニトロビン投与時のＧＦＰ蛍光量を示す。右グラフの縦軸は１ウェルあたりの拍動コロニー数を示す。
【図４−１】ヒトＥＳ細胞におけるニトロビン（最終濃度５μＭ）投与時のＧＦＰ発現。
【図４−２】ヒトＥＳ細胞におけるニトロビン（最終濃度５μＭ）によるＧＦＰ蛍光量の増加。縦軸はＤＭＳＯ投与時（対照）を１００％とした場合のニトロビン投与時のＧＦＰ蛍光量を示す。
【図５−１】サルＥＳ細胞における、ニトロビン（最終濃度５μＭ）、サイトカイン（ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）（最終濃度各５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ）、またはサイトカイン（同上）＋ニトロビン（最終濃度５μＭ）投与時のＧＦＰ発現。
【図５−２】サルＥＳ細胞におけるニトロビンによるＧＦＰ蛍光量および心筋拍動コロニー数の増加。左グラフの縦軸はＤＭＳＯ投与時（対照）を１００％とした場合のニトロビンおよび／またはサイトカイン投与時のＧＦＰ蛍光量を示す。右グラフの縦軸は１ウェルあたりの拍動コロニー数を示す。
【図５−３】サルＥＳ細胞におけるニトロビンによるＧＦＰおよびトロポニンＴの発現量の増加。縦軸はＤＭＳＯ投与時（対照）を１００％とした場合のニトロビンおよび／またはサイトカイン投与時の発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ニトロビンを含む、多能性幹細胞の心筋細胞への分化促進剤に関する。ニトロビンは、下記の化学式
【化１】
2011071118.tif 000002
（分子式：Ｃ１４Ｈ１２Ｎ６Ｏ６）を有する低分子化合物である。ニトロビンは、公知化合物であり、常套的な有機合成方法により製造することができる。また、関東化学株式会社（日本国東京）などから入手可能である。
【００１３】
本発明において「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能(pluripotency）と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。「多能性幹細胞」には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類である。本発明は、サルまたはヒト多能性幹細胞に特に好適である。
【００１４】
ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、胚盤胞の内部細胞塊または着床後の初期胚のエピブラストから樹立することができる。ＥＳ細胞としては、ヒト（Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998)；アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類（Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995）；Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)）；ウサギ（特表２０００−５０８９１９号）；ハムスター（Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127: 224-227 (1988)）、ブタ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125128 (1990); Piedrahita J.A. et al., Theriogenology 34: 879-891 (1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40: 51-56 (1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554 (1993)）、ヒツジ（Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43: 255-260 (1991)）、ウシ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125-128 (1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201: 134-141 (1992)）、ミンク（Sukoyan M. A. et al., Mol. Reorod. Dev. 33: 418-431 (1993)）などのＥＳ細胞が挙げられる（これらの文献は引用により本願に含まれる）。
【００１５】
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞に由来する多能性幹細胞であり、例えば、ヒトＥＧ細胞（Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 7844-7848 (1995))が挙げられる。
【００１６】
本発明において「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞や組織幹細胞などの多能性幹細胞以外の細胞から誘導された多能性幹細胞を意味する。ｉＰＳ細胞の作製方法は、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008) に記載される（これらの文献は引用により本願に含まれる）。しかしながら、多能性幹細胞以外の細胞より人工的に誘導された多能性幹細胞であれば、いかなる方法で作製された細胞も本発明の「ｉＰＳ細胞」に含まれる。
ｉＰＳ細胞は、例えば体細胞から作成される場合にはその体細胞由来の遺伝情報を有している。従って、本発明の分化誘導剤により患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞は、再生医療のみならず個別の患者に対する薬剤の有効性や副作用の検討等に有用である。また、心臓疾患患者由来のｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞は心臓疾患を有する患者特有の遺伝情報を有していることが期待され、遺伝子異常に起因する心臓疾患に対する薬剤のスクリーニング等にも好適に用いられる。
【００１７】
本発明の分化促進剤は、多能性幹細胞の心筋分化培地に、ニトロビンの最終濃度が例えば１〜５μＭとなるよう添加される。心筋分化培地は、一般的に多能性幹細胞の心筋分化に使用される組成であればよく、特に限定はされないが、例えばＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地(本願実施例にて使用している組成のもの)、ＤＭＥＭを基本とした心筋分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO）２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール２μｌ、またはStemPro-34SFM（GIBCO）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）のような培地が例示される。本発明の分化促進剤を使用する場合、ＥＮＤ２細胞のような支持細胞を使用する必要がない。本発明の分化促進剤の添加の時期は、使用する多能性幹細胞の種類や心筋分化培地の組成により適宜変更されうるが、例えばサルまたはヒトＥＳ細胞を実施例に記載のＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地で培養する場合、心筋分化培地での培養開始後６〜１４日目に添加すればよい。本発明の分化促進剤は他の心筋分化促進作用を有する物質、例えばbＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１およびアクチビンＡなどのサイトカインと共に使用してもよい。他の心筋分化促進作用を有する物質を併用する場合、他の物質の添加量、添加の時期は適宜定めればよい。
【００１８】
本発明の心筋細胞の分化誘導方法および心筋細胞の製造方法は、ニトロビンを含む培地中で多能性幹細胞を培養することを特徴とする。ある態様において、本発明の方法は、多能性幹細胞を心筋分化培地中で培養すること、心筋分化培地での培養開始後６〜１４日目にニトロビンを最終濃度１〜５μＭとなるよう添加すること、および培養１８日目に多能性幹細胞の心筋細胞への分化を確認することにより実施される。なお、ニトロビン添加並びに心筋細胞への分化確認の時期は、使用する細胞によって最適な時期を適宜定めればよい。
本発明の方法においては、他の心筋分化促進作用を有する物質、例えばbＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１およびアクチビンＡなどのサイトカインをニトロビンと共に用いてもよい。他の心筋分化促進作用を有する物質の添加量、添加時期は適宜定めればよい。
【００１９】
培養は通常の動物細胞の培養条件、例えばこれに限定されるわけではないが、温度３７℃、湿度１００％、炭酸ガス濃度５％の雰囲気中で行えばよい。
【００２０】
心筋細胞への分化は、例えば、拍動心筋細胞の数、心筋分化マーカーであるα−ＭＨＣ遺伝子の発現量により確認することができる。
【００２１】
本発明の方法により得られた心筋細胞は、インビトロにおける薬剤安全性試験に、あるいは心臓疾患などに対する移植用心筋細胞として、使用することができる。
【実施例１】
【００２２】
サルＥＳ細胞の心筋分化を促進する物質の探索スクリーニング
図１に示すように、サルＥＳ細胞の心筋分化を促進する物質の探索スクリーニングを実施した。サルＥＳ細胞株（カニクイザルＣＭＫ６．４株）に、心筋分化マーカーであるα−ＭＨＣ遺伝子のプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターを導入し、９６ウェルプレート（Greiner/655090：96穴FIAブラックプレート）上に５．０×１０３細胞/ウェルにて播種し、ＩＭＤＭ培地を基本とした心筋分化培地（ＩＭＤＭ培地（Sigma l3390）２００ｍｌ、ウシ胎児血清（GIBCO 10099-141）５０ｍｌ、MEM non-essential amino acid solution （Sigma M7145）２．５ｍｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO 15140）２．５ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ２．５ｍｌ、２−メルカプトエタノール（Sigma M7522）  ２μｌ、５Ｎ  ＮａＯＨ  ２５５μｌを混合したもの）で１４日間培養した。培養後６〜１４日に、９６００種類のライブラリー化合物を、１ウェルあたり１化合物（約１〜５μＭ）投与した。培養後１４日に、ＨＣＳ（high contents screening）システム（モレキュラーデバイス/MetaMorph イメージングシステム）を用いてＧＦＰ発現量を測定したところ、ニトロビンを投与したウェルのＧＦＰ蛍光値が高い値を示した（図２）。
【実施例２】
【００２３】
サルＥＳ細胞におけるニトロビンの心筋分化促進効果
実施例１と同じくサルＥＳ細胞（カニクイザルＣＭＫ６．４株）へ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターを導入した細胞を用いた。サルＥＳ細胞を６ウェルプレート（旭硝子/ 5816-006 ：Ezview カルチャープレート）に４．０×１０５細胞/ウェルにて播種して培養した。培地は実施例１と同じものを用いた。培養６日目に、最終濃度が１μＭ、５μＭ、２０μＭとなるようにニトロビンを添加した。培養１８日目に、ＧＦＰ蛍光量と心筋拍動コロニー数とを測定した。ニトロビンの投与により、最大でＧＦＰ蛍光量は約５倍、心筋拍動コロニー数は約１０倍増加した（図３−１、３−２）。最終濃度５μＭが最も有効であった。
【実施例３】
【００２４】
ヒトＥＳ細胞におけるニトロビンの心筋分化促進効果
実施例１と同様にしてヒトＥＳ細胞株（Ｋｈ−1株）へ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターを導入した細胞を用いた。ヒトＥＳ細胞を６ウェルプレート（旭硝子/ 5816-006 ：Ezview カルチャープレート）に１．２×１０６細胞/ウェルにて播種して培養した。培地は実施例１と同じものを用いた。培養６日目に、最終濃度が１μＭ、５μＭ、２０μＭとなるようにニトロビンを添加した。培養１８日目に、ＧＦＰ蛍光量を測定した。その結果、ヒトＥＳ細胞においても、ニトロビンの投与によりＧＦＰ蛍光量の増加が観察された（図４−１、４−２）。
【実施例４】
【００２５】
ニトロビンとサイトカインとの比較
心筋分化を促進する因子として知られているサイトカイン（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）とニトロビンとを用いて、ＧＦＰ蛍光量の増加、心筋拍動コロニー数の増加、心筋マーカー分子であるトロポニンＴの発現量増加を比較した。
実施例１と同じくサルＥＳ細胞（カニクイザルＣＭＫ６．４株）へ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するベクターを導入した細胞を用いた。培地は実施例１と同じものを用いた。６ウェルプレートにサルＥＳ細胞を播種し、培養６〜１４日目にニトロビン（最終濃度５μＭ）を、培養１〜１４日目にサイトカイン混合物（bＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、アクチビンＡ）（最終濃度各５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ）を投与し、培養１８日目にＧＦＰ蛍光量、心筋拍動コロニー数、トロポニンＴ発現量を測定した。ＧＦＰ蛍光量、心筋拍動コロニー数、トロポニンＴ発現量のいずれについても、ニトロビン単独投与群はサイトカイン混合物投与群よりも高い効果を示した（図５−１〜５−３）。また、ニトロビンとサイトカインを併用することで、ＧＦＰ蛍光量の増加とトロポニンＴ発現量の増加に相乗効果が見られた（図５−１、５−３）。
【図１】
2011071118.tif 000003
【図２】
2011071118.tif 000004
【図３−１】
2011071118.tif 000005
【図３−２】
2011071118.tif 000006
【図４−１】
2011071118.tif 000007
【図４−２】
2011071118.tif 000008
【図５−１】
2011071118.tif 000009
【図５−２】
2011071118.tif 000010
【図５−３】
2011071118.tif 000011
【国際調査報告】
2011071118.tif 000012
2011071118.tif 000013
2011071118.tif 000014
2011071118.tif 000015