(57)【要約】  従来の免疫療法用移植細胞よりも広範囲の患者を対象とすることができ、かつ、一過性に生着して重症のＧＶＨ病も起こさない、免疫療法用移植細胞を開発すること。  本発明はヒト造血幹細胞由来の細胞を含む医薬品組成物を提供する。本発明の医薬品組成物において、前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩ分子のいずれか１つの遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致する抗原を少なくとも１個含む。また、前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩ及びＩＩ分子の遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を少なくとも１個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさない。
2011021503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト造血幹細胞由来の細胞を含む医薬品組成物であって、
前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩ分子のいずれか１つの遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致する抗原を少なくとも１個含むこと、及び
前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩ及びＩＩ分子の遺伝子座の抗原は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を少なくとも１個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさないことを特徴とする、医薬品組成物。
【請求項２】
前記医薬品組成物は前記患者のリンパ球が除去された後に投与され、
該医薬品組成物は前記患者の体内で一過的に生着するが前記患者のリンパ球が再増殖するとともに消失することを特徴とする、請求項１に記載の医薬品組成物。
【請求項３】
前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩ分子のいずれか１つの遺伝子座はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃからなるグループから選択され、前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩＩ分子の遺伝子座はＤＲＢ１であること、及び、
前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩ及びＩＩ分子の遺伝子座の抗原は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を少なくとも１個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさないことを特徴とする、請求項１又は２に記載の医薬品組成物。
【請求項４】
前記細胞のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＤＲＢ１の遺伝子座の抗原は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を５個ないし６個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさないことを特徴とする、請求項３に記載の医薬品組成物。
【請求項５】
前記ヒト造血幹細胞は臍帯血幹細胞であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の医薬品組成物。
【請求項６】
前記ヒト造血幹細胞由来の細胞は、ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の医薬品組成物。
【請求項７】
癌治療用であることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の医薬品組成物。
【請求項８】
感染症治療用であることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の医薬品組成物。
【請求項９】
前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによる刺激を受けることなく増幅されることを特徴とする、請求項８に記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
前記細胞のＨＬＡ−Ａ遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致する抗原を少なくとも１個含むこと、及び、
前記細胞傷害性Ｔ細胞はウィルムス腫瘍原因遺伝子産物（ＷＴ１）に特異的であることを特徴とする、請求項９に記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
ヒト臍帯血由来の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物であって、
前記細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃのうちいずれか１種類の遺伝子座のＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的であること、
前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによる刺激を受けることなく増幅されること、
前記細胞のいずれか１種類の遺伝子座のＨＬＡクラスＩ分子は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致する抗原を少なくとも１個含むこと、及び、
前記細胞のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＤＲＢ１の遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を５個ないし６個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさないことを特徴とする、医薬品組成物。
【請求項１２】
ヒト臍帯血をＣＤ３／ＣＤ２８免疫ビーズで刺激するステップを含むことを特徴とする、請求項９に記載の医薬品組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト造血幹細胞由来の細胞を含む医薬品組成物に関し、より具体的には、臍帯血由来の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物であって、患者のＨＬＡクラスＩ分子が提示する疾患関連抗原を認識でき、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさない、医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
臍帯血造血幹細胞移植（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、以下、「ＵＣＢＨＣＴ」という。）は、急性骨髄性白血病その他の白血病や、再生不良性貧血その他の造血障害や、先天性免疫不全症、先天性代謝異常、ＥＢＶ感染症等の小児及び成人に有効な治療法である（非特許文献１）。組織適合性の検査データを得たうえで凍結保存する臍帯血バンク制度が各国で普及しているので、ＵＣＢＨＣＴは今日最も普及した幹細胞移植療法となっている。ＵＣＢＨＣＴでは、一般的に、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＤＲＢ１遺伝子座について、移植を受ける小児患者の適合型が非血縁の臍帯血の適合型と一致する抗原を６個の抗原のうち４ないし６個含む場合、すなわち、患者の適合型が臍帯血の適合型と一致しない抗原を０ないし２個含む場合にたいてい移植が成功することが知られている（非特許文献２及び３）。移植された細胞は永続的に宿主である患者の体内に生着する。【０００３】
一方、養子免疫療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、以下、「ＡＣＴ」という。）は、最も治療効果が高い癌の治療法として最近注目を集めている（非特許文献４）。ＡＣＴは、腫瘍組織に浸潤した患者自身（自家）のリンパ球や、疾患関連抗原に試験管内で感作された患者自身のリンパ球を、インターロイキン２存在下で大量培養し、リンパ球除去を施された患者に移植する治療法である。例えば転移性メラノーマでは、腫瘍浸潤リンパ球を用いた自家リンパ球輸注が施された約５０％の症例で客観的な腫瘍の退縮が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ、Ｈ．Ｅ．及びＳｍｉｔｈ、Ｆ．Ｏ．、“Ｔｈｏｍａｓ’  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、”４ｔｈ  ｅｄ．、Ａｐｐｅｌｂａｕｍ、Ｆ．Ｒ．ら編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＩＳＢＮ：９７８１４０５１５３４８５（２００９）、第３９章、ｐｐ５５９−５７６
【非特許文献２】Ｇｌｕｃｋｍａｎ，Ｅ．及びＲｏｃｈａ，Ｖ．、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：５６５−５７０（２００６）
【非特許文献３】Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｇ．ら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１３７：２０−３５（２００７）
【非特許文献４】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．  Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ８，  ２９９−３０８  （２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＵＣＢＨＣＴは不一致抗原が１個又は２個許容されるが、患者のＨＬＡ遺伝子座の適合型によっては移植に適するドナー臍帯血が見つからないことがある。また、ドナー臍帯血が重症ＧＶＨ病と生存に関与する不適合なＨＬＡ型の組合せに該当するために移植に適さない場合もある。さらに、ＵＣＢＨＣＴで患者に永続的に生着することに成功しても、今度は、移植片対宿主病（以下、「ＧＶＨ病」という。）を発症する場合がある。また、移植された細胞由来の白血病（いわゆるドナー細胞白血病）を発症する危険が、骨髄移植や末梢血幹細胞移植の場合に比べてＵＣＢＨＣＴの場合は高い。【０００６】
ＡＣＴは、患者ごとに移植用のリンパ球を調製する必要があり、この作業は、かなり労働集約的で、専門的な技能を必要とする。またＡＣＴにおいても、移植された細胞由来の白血病を発症する危険がある。【０００７】
さらに、ＵＣＢＨＣＴでもＡＣＴでも、特定の患者ごとに移植細胞を調製するため、プリオンのように検出が困難な病原体を検出できないまま移植してしまうことによる、感染症伝播のおそれがある。【０００８】
そこで、従来の免疫療法用移植細胞よりも広範囲の患者を対象とすることができ、かつ、一過性に生着して重症のＧＶＨ病も起こさない、免疫療法用移植細胞を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はヒト造血幹細胞由来の細胞を含む医薬品組成物を提供する。本発明の医薬品組成物において、前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩ分子のいずれか１つの遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致する抗原を少なくとも１個含む。また、前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩ及びＩＩ分子の遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を少なくとも１個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさない。【００１０】
本発明の医薬品組成物は、前記患者のリンパ球が除去された後に投与され、前記患者の体内で一過的に生着するけれども、前記患者のリンパ球が再増殖するとともに消失する場合がある。【００１１】
本発明の医薬品組成物において、前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩ分子の遺伝子座は、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂであり、前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩＩ分子の遺伝子座はＤＲＢ１であり、前記細胞のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ及びＤＲＢ１抗原遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を少なくとも１個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさない場合がある。【００１２】
本発明の医薬品組成物において、前記細胞のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＤＲＢ１抗原遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を５個ないし６個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は、前記患者の体内で永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさない場合がある。【００１３】
本発明の医薬品組成物において、前記ヒト造血幹細胞は臍帯血幹細胞の場合がある。【００１４】
本発明の医薬品組成物において、前記ヒト造血幹細胞由来の細胞はヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の場合がある。【００１５】
本発明の医薬品組成物は癌治療用の場合がある。【００１６】
本発明の医薬品組成物は感染症治療用の場合がある。【００１７】
本発明の癌治療用医薬品組成物において、前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによる刺激を受けることなく増幅される場合がある。【００１８】
本発明の癌治療用医薬品組成物において、前記細胞のＨＬＡ−Ａ遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致する抗原を少なくとも１個含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞はウィルムス腫瘍原因遺伝子産物（ＷＴ１）に特異的である場合がある。【００１９】
本発明はヒト臍帯血由来の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物を提供する。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞を含む医薬品組成物において、前記細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃのうちいずれか１種類の遺伝子座のＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的であり、前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによる刺激を受けることなく増幅され、前記細胞のいずれか１種類の遺伝子座のＨＬＡクラスＩ分子は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致する抗原を少なくとも１個含み、前記細胞のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＤＲＢ１の遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を５個ないし６個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさない。【００２０】
本発明は、本発明の癌治療用医薬品組成物であって、前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによる刺激を受けることなく増幅される、癌治療用医薬品組成物の製造方法を提供する。前記製造方法は、ヒト臍帯血をＣＤ３／ＣＤ２８免疫ビーズで刺激するステップを含む。【００２１】
本発明は感染症又は癌の治療方法を提供する。本発明の感染症又は癌の治療方法は、ヒト造血幹細胞由来の細胞を用意するステップと、前記ヒト造血幹細胞由来の細胞を患者に移植するステップとを含むこと、前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩ分子のいずれか１つの遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致する抗原を少なくとも１個含むこと、及び、前記細胞のヒトＨＬＡクラスＩ及びＩＩ分子の遺伝子座の抗原は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を少なくとも１個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさないことを特徴とする。【００２２】
本発明の感染症又は癌の治療方法において、前記細胞を患者に移植するステップの前に、前記患者のリンパ球を除去するステップを含むこと、及び、前記ヒト造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で一過的に生着するが前記患者のリンパ球が再増殖するとともに消失することを特徴とする場合がある。【００２３】
本発明の感染症又は癌の治療方法において、前記造血幹細胞由来の細胞のヒトＨＬＡクラスＩ分子のいずれか１つの遺伝子座はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃからなるグループから選択され、前記ヒトＨＬＡクラスＩＩ分子の遺伝子座はＤＲＢ１であること、及び、前記ヒトＨＬＡクラスＩ及びＩＩ分子の遺伝子座の抗原は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を少なくとも１個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさないことを特徴とする場合がある。【００２４】
本発明の感染症又は癌の治療方法において、前記細胞のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＤＲＢ１の遺伝子座の抗原は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を５個ないし６個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさないことを特徴とする場合がある。【００２５】
本発明の感染症又は癌の治療方法において、前記ヒト造血幹細胞は臍帯血幹細胞の場合がある。【００２６】
本発明の感染症又は癌の治療方法において、前記ヒト造血幹細胞由来の細胞は、ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の場合がある。【００２７】
本発明の感染症又は癌の治療方法において、前記ヒト造血幹細胞由来の細胞を用意するステップは、前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによる刺激を受けることなく該ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を増幅するステップを含む場合がある。【００２８】
本発明の感染症又は癌の治療方法において、前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによる刺激を受けることなく該ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を増幅するステップは、ヒト臍帯血をＣＤ３／ＣＤ２８免疫ビーズで刺激するステップを含む場合がある。【００２９】
本発明の感染症又は癌の治療方法において、前記造血幹細胞のＨＬＡ−Ａ遺伝子座の少なくとも１個の抗原の適合型は患者の適合型と一致し、前記細胞傷害性Ｔ細胞はウィルムス腫瘍原因遺伝子産物（ＷＴ１）に特異的な場合がある。【００３０】
本発明の感染症又は癌の治療方法において、前記ヒト臍帯血由来の細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃのうちいずれか１種類の遺伝子座のＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的であり、前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、前記ヒトＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによる刺激を受けることなく増幅され、前記細胞のいずれか１種類の遺伝子座のＨＬＡクラスＩ分子は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致する抗原を少なくとも１個含み、前記細胞のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＤＲＢ１の遺伝子座は、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を５個ないし６個含み、かつ、前記造血幹細胞由来の細胞は前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさない場合がある。【００３１】
本発明の技術的範囲は、添付する特許請求の範囲の記載に基づいて定められる。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。【００３２】
本発明のヒト造血幹細胞は、臍帯血と、骨髄と、Ｇ−ＣＳＦを投与後の末梢血とを含むがこれらに限定されない組織に由来する場合がある。好ましいヒト造血幹細胞の出所は臍帯血である。しかし、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から生成される造血幹細胞であってもかまわない。【００３３】
本発明のヒト造血幹細胞由来の細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージと、好中球、好酸球その他の顆粒球とを含む。本発明のヒト造血幹細胞由来の細胞は、臍帯血と、骨髄と、Ｇ−ＣＳＦを投与後の末梢血とに含まれる造血幹細胞を分化誘導して生成される場合があるが、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から直接分化誘導して生成される場合もある。【００３４】
本発明のヒト造血幹細胞由来の細胞は、ＨＬＡクラスＩ及びＩＩ分子の遺伝子座の抗原の適合型を決定したうえで臍帯血その他の造血幹細胞を含む組織を凍結保存しておき、患者のＨＬＡクラスＩ及びＩＩ分子の遺伝子座の抗原の適合型が決定されてから、本発明の要件を満たす適合型を有する前記組織を解凍して、増殖刺激を与えて培養することにより生成される場合がある。代替策として、本発明のヒト造血幹細胞由来の細胞は、予め増殖刺激を与えて培養することにより生成され、増幅された後に凍結保存される場合がある。後者の場合には、予め大量増幅されているので、あらかじめ薬効が確認できた細胞を患者に投与できる。また、均一な品質の細胞を１人以上の患者に投与することができる。【００３５】
ＨＬＡクラスＩ分子には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃの３種類がある。ＨＬＡクラスＩ分子のそれぞれの遺伝子座の遺伝子及びその産物は非常に多くの多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が存在する。ＨＬＡクラスＩ分子はペプチド抗原を細胞傷害性Ｔ細胞に提示する機能を有する一方で、同種間での組織移植の際の自己−非自己の識別の基礎となる免疫原として、宿主細胞が移植された細胞を攻撃するＨＶＧ反応と、移植された細胞が宿主細胞を攻撃するＧＶＨ反応とを惹起する役割も果たす。かかる組織適合性に関する免疫原としての観点からみると、ヒトのそれぞれの遺伝子座について母親と父親とに由来する２本の染色体のそれぞれにエンコードされる２個の遺伝子産物が別々の抗原として区別される。すなわち、ＨＬＡクラスＩ分子のそれぞれの遺伝子座は２個の抗原を有し、ＨＬＡクラスＩ分子の遺伝子座は全部で６個の抗原を有する。そこで、ＨＬＡの適合度を表すときには、１つの遺伝子座の１個の抗原の適合型のみが異なる場合を「１抗原不一致」、１つの遺伝子座の１個又は２個の抗原の適合型が異なる場合を「１座不一致」と表現する。すなわち「１座不一致」は、１抗原不一致及び２抗原不一致の場合を含む。同様に「２座不一致」は、２個ないし４個の抗原が不一致の場合を含む。また、３つの遺伝子座について５個又は６個の抗原が不一致のとき、３座とも不一致である。【００３６】
本明細書において、適合型とは、血清学的検査又はＤＮＡ検査によって決定される場合がある。ＤＮＡ検査には、蛍光ビーズ法（ＰＣＲ−ｒｓｓｏ法）のように中程度の分解能のものと、ＳＢＴ法のように高分解能のものとがある。適合型には、いわゆる４桁アリル名の他、翻訳領域での塩基置換を考慮した６桁アリルや、非翻訳領域での塩基置換を考慮した８桁アリルがある。６桁又は８桁アリルはアミノ酸の変化を伴わない多型なので、免疫学的には４桁アリルと同じに扱うことでよい。【００３７】
ＨＬＡクラスＩＩ分子には、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱという３種類のヘテロダイマーがある。それぞれのヘテロダイマーを構成するアルファ鎖及びベータ鎖は染色体上で隣接する遺伝子座にエンコードされるが、ＨＬＡ−ＤＲのベータ鎖のみ２本存在する。そこで、ＨＬＡクラスＩＩ分子の遺伝子座は、ＤＲＡ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ２、ＤＰＡ、ＤＰＢ、ＤＱＡ及びＤＱＢの７座がある。ＨＬＡクラスＩＩ分子はペプチド抗原をヘルパーＴ細胞に提示する機能を有する一方で、ＨＬＡクラスＩ分子と同様に、同種間での組織移植の際の自己−非自己の識別の基礎となる免疫原として、宿主細胞が移植された細胞を攻撃するＨＶＧ反応と、移植された細胞が宿主細胞を攻撃するＧＶＨ反応とを惹起する役割も果たす。ＨＬＡクラスＩＩ分子の遺伝子座の遺伝子及びその産物にもＨＬＡクラスＩ分子と同様に非常に多くの多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が存在する。【００３８】
本明細書において、一過性生着とは、移植から１ヶ月経過後も移植された細胞が宿主体内、例えば、末梢血中で検出できているが、３ヶ月後、６ヶ月後、１２ヶ月、あるいは、１８ヶ月後には検出できなくなることをいう。永続的生着とは、宿主が生きている間ずっと宿主体内で移植された細胞が検出できることをいう。ここで、移植された細胞の検出には、ＰＣＲ法などの遺伝子検査、ＦＩＳＨ法や染色体分析などの染色体検査、抗ＨＬＡ抗体を用いたフローサイトメトリーなどの細胞免疫組織化学検査法を用いることができる。【００３９】
本明細書において、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病とは、１９９４年開催の急性ＧＶＨ病の重症度に関する会議で提案され、Ｐｒｅｚｅｐｉｏｒｋａ，  Ｄ．ら（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、１５：８２５−８５５（２００２））に記載される重症度の分類の４段階のグレードの最も重篤な段階とこれに続く段階とをいう。万一ＧＶＨ病を発症する場合には、本発明の医薬品組成物を移植する前に患者から採血して白血球アフェレーシスにより精製分取して凍結保存されたリンパ球を凍結保存しておき、これをインターロイキン２及び／又はＣＤ３／ＣＤ２８で刺激増幅して患者に戻すこと（自己リンパ球輸注）によって治療することができる。【００４０】
ＨＬＡクラスＩ分子及びクラスＩＩ分子の遺伝子座の抗原の不一致が造血幹細胞移植に及ぼす影響は、遺伝子座によって異なることや、移植される幹細胞の細胞数、すなわち、投与量によっても異なることが知られている。一般的に、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＤＲＢ１遺伝子座について、移植を受ける小児患者の適合型が非血縁の臍帯血の適合型と一致する抗原を６個の抗原のうち４ないし６個含む場合、すなわち、患者の適合型が臍帯血の適合型と一致しない抗原を０ないし２個含む場合には、たいてい移植が成功することが知られている（日本さい帯血バンクネットワーク・移植データ管理小委員会、「わが国における非血縁者間さい帯血移植の成績（２００７年度解析結果）」、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊ−ｃｏｒｄ．ｇｒ．ｊｐ／ｊａ／ｗｎｅｗ／ｉｓｙｏｋｕｓｅｉｓｅｋｉ２００７．ｐｄｆ、Ｇｌｕｃｋｍａｎ，Ｅ．及びＲｏｃｈａ，Ｖ．、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：５６５−５７０（２００６）、Ｂｒｕｎｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｇ．ら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１３７：２０−３５（２００７））。前記日本さい帯血バンクネットワーク・移植データ管理小委員会の報告書には、若年成人ＡＬＬ患者に１個ないし４個の抗原が不一致の臍帯血移植を行ったところ術後５００日の無イベント生存率（ＥＦＳ）が２０ないし５６％であったが、５個の抗原が不一致の臍帯血移植を行った２名の患者の術後５００日の無イベント生存率は０であったとのデータが記載される（図５−３５）。この結果から、不一致抗原が５個ある場合には永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさないことが示唆される。一方で、重篤な中性子被爆患者に臍帯血を移植したときに、ＤＲＢ１遺伝子座の１個の抗原のみが不一致の臍帯血を移植しても、移植後５１日目には末梢血からも骨髄からも移植された臍帯血由来の単核球が消失したとの報告（Ｎａｇａｙａｍａ，Ｈ．ら、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２９：１９７−２０４（２００２））がある。この結果から、不一致抗原が少なくとも１個ある場合には永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさないことが示された。【００４１】
したがって、本発明の細胞のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＤＲＢ１遺伝子座について、該細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を少なくとも１個含む場合には、臍帯血移植の分野の専門家は、臍帯血由来の細胞が前記患者の体内で、永続的生着も、重症度ＩＩＩ又はＩＶの急性ＧＶＨ病も起こさない条件を決定することができる。本発明の細胞のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＤＲＢ１遺伝子座について、該細胞の適合型が患者の適合型と一致しない抗原を、４、５又は６個含むことがより好ましい。【００４２】
本発明の医薬品組成物は、１人のドナー由来の細胞であっても、従来より格段に広範囲の患者に移植することができる。また、薬効のある細胞、例えば、さまざまな疾患関連抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を単一の臍帯血から調製することができる。そのため、従来の臍帯血バンクや骨髄バンクと比較して小規模のライブラリを用意することによって、多くの異なる患者のさまざまな疾患に適用することができる。【００４３】
本発明の造血幹細胞由来の細胞は、樹状細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞に分化することができるいずれかの細胞タイプを含む。すなわち、リンパ系共通前駆細胞と、樹状細胞と、ＣＤ４及びＣＤ８の両方とも発現しないいわゆる二重陰性Ｔ細胞と、ＣＤ４及びＣＤ８の両方とも発現するいわゆる二重陽性Ｔ細胞と、ＣＤ８陽性Ｔ細胞との他、桂及び河本により提唱された、骨髄−リンパ系共通前駆細胞、骨髄−Ｔ細胞共通前駆細胞及びマクロファージ−Ｔ細胞共通前駆細胞とを含むが、これらに限られない。【００４４】
本発明の造血幹細胞由来の細胞を用意するためには、本技術分野の専門家に知られたさまざまな手順を用いることができる。例えば臍帯血から白血球を分離する際には、Ｆｉｃｏｌｌ比重遠心法を用いることができる。前記白血球からＴ細胞を分離する際には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＤｙｎａｌビーズ（商標）や、ミルテニーバイオテック社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）を含むがこれらに限定されない免疫磁気ビーズを用いて、細胞表面抗原ＣＤ３、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２８を発現する細胞を分離精製することができる。得られた細胞を培養するための培地としては、ＸＶｉｖｏ１５培地その他のリンパ球等の血液系細胞の増殖に適する無血清培地を用いることができる。この培地には、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社その他から入手可能なヒトＡＢ型血清（０ないし１５％）や、日本赤十字社から入手可能な献血ヒト血清アルブミン（０ないし１０％）が添加される場合がある。また、ペプロテック社その他から入手可能なインターロイキン２（０ないし１０，０００ＩＵ／ｍＬ）、インターロイキン１５（０ないし１００ｎｇ／ｍＬ）及び／又はインターロイキン２１（０ないし１００ｎｇ／ｍＬ）を含むがこれらに限定されない細胞増殖因子が添加される場合がある。【００４５】
増殖刺激剤は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社その他のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの場合がある。この場合には、本発明のヒト造血幹細胞由来の細胞は、ＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによらずに増殖刺激を受けることができる。代替策として、本発明のヒト造血幹細胞由来の細胞は、ＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによる増殖刺激を受けることができる。例えば、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（ＨＬＡ−Ａ*２４０２拘束性ＷＴ１由来ペプチド断片）、ＡＤＶＥＦＣＬＳＬ（配列番号２）又はＳＡＤＶＥＦＣＬＳＬ（配列番号３）のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（ＨＬＡ−Ｂ*４００２拘束性チロシナーゼ由来ペプチド断片）、癌抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１の第８１ないし１１０番目のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（ＨＬＡ−Ｂ*３５０１又はＨＬＡ−Ｃ*０３０４拘束性ペプチド断片）のような癌特異的ペプチドや、ＥＢウイルス、サイトメガロウイルス、エイズウイルスその他のウイルスのタンパク質又はそのペプチド断片がＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープとして知られている。かかるタンパク質又はペプチドを添加した培地中で、本発明のヒト造血幹細胞由来の細胞、例えば、臍帯血の白血球から精製された細胞表面抗原ＣＤ３、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２８を発現する細胞を培養することによりＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによる増殖刺激を行うことができる。ＨＬＡクラスＩ分子拘束性エピトープによる増殖刺激は、癌細胞や、ウイルスその他の病原体に感染した細胞の溶解物と共培養された臍帯血由来樹状細胞との共培養によっても実施することができるが、これらに限定されない。【００４６】
増殖刺激された細胞は５ないし７％ＣＯ2存在下３７°Ｃで培養される場合がある。細胞は１×１０6個／ｍＬの濃度で播種され、２ないし４日後に培地交換され、新たな培地に１×１０6個／ｍＬの濃度で播種される場合がある。総数１×１０8個以上の大量培養の場合には、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ２／１０（商標）のような装置が用いられる場合がある。【００４７】
本発明の医薬品組成物は、前記ヒト造血幹細胞由来の細胞の他、患者の血管内に移植するための細胞製剤として薬学的に許容されるいかなる成分を含むものであってもよい。本発明の医薬品組成物が、凍結保存状態で輸送される場合には、解凍時に移植用細胞製剤として十分な量の有効な細胞傷害性Ｔ細胞が得られるような凍結保存液を含む場合がある。【００４８】
本発明の医薬品組成物は、患者のリンパ球が除去された後に移植される場合がある。これは、一般の養子免疫療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＡＣＴ）と同様に、本発明の医薬品組成物に含まれる細胞の増殖に必要なサイトカイン（インターロイキン７、インターロイキン１５等）をめぐって患者のリンパ球と競合することを避けるため、及び、患者のリンパ球との間の細胞間相互作用によって本発明の医薬品組成物に含まれる細胞の活性が低減することを避けるためである。患者のリンパ球を除去する方法には、シクロホスファミド（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ、２日間）、フルダラビン（例えば、２５ｍｇ／ｍ2、５日間）等の薬剤投与及び／又は放射線照射（例えば、２又は１２Ｇｙ）と、インターロイキン２投与（８時間ごとに７．２×１０5ＩＵ／ｋｇ、２ないし３日間）とを含むがこれらに限定されない。【００４９】
以下の実施例に示すとおり、本発明の医薬品組成物は、臍帯血細胞のＨＬＡ−Ａ拘束性の癌抗原ＷＴ１ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を含む。したがって、本発明の医薬品組成物は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座について臍帯血と同じ適合型の抗原を少なくとも１個有する患者に移植されるとき、ＷＴ１を過剰発現する患者の癌細胞を攻撃することができる。【００５０】
これ以外にも、試験管内でその他の抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を増幅できること、及び、かかる細胞傷害性Ｔ細胞を患者に移植すると臨床効果が得られることは従来から知られている。例えば、Ｇｏｄｅｔ、Ｙ．ら、（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５８：  ２７１−２８０（２００９））メラノーマに特異的な癌抗原チロシナーゼ由来のＨＬＡ−Ｂ拘束性ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を得た。Ｓｔｒａａｔｈｏｆ、Ｋ．  Ｃ．  Ｍ．ら、（Ｂｌｏｏｄ、１０５：  １８９８−１９０４（２００５））は、ＥＢウイルス関連抗原ＬＭＰ２のＨＬＡ−Ｂ拘束性エピトープ、ＥＢウイルス関連抗原ＥＢＮＡ１のＨＬＡ−Ｂ拘束性エピトープ、ＥＢウイルス関連抗原ＥＢＮＡ３のＨＬＡ−Ｂ拘束性エピトープ、ＥＢウイルス関連抗原ＢＺＬＦ１のＨＬＡ−Ｂ拘束性エピトープなどに特異的なＣＴＬを、ＥＢウイルス関連鼻咽頭癌患者に移植して臨床効果を得た。Ｗａｌｔｅｒ、Ｅ．  Ａ．  ら、（Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３３３：  １０３８−４４（１９９５））はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的ＣＴＬを、白血病治療のためにＣＭＶ陽性血縁者から骨髄移植を受けた後、免疫抑制剤を投与されている間にＣＭＶが再活性化した患者に移植して臨床効果を得た。【００５１】
なお、Ｂｉｏｌｅｙ  Ｇ．ら（Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １５：  ２９９−３０６（２００９））によると、癌抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１をワクチン接種した患者から当該抗原由来のＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃ拘束性ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が得られた。そこで、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＷＴ１タンパク由来のペプチドのようなＨＬＡ−Ａ拘束性エピトープに特異的なものだけでなく、ＨＬＡ−Ｂ又はＨＬＡ−Ｃ拘束性エピトープに特異的なものであってもよい。【００５２】
本発明の医薬品組成物においては、ヒト造血幹細胞由来の細胞のヒトＨＬＡクラスＩ分子のいずれか１つの遺伝子座が、前記細胞の適合型が患者の適合型と一致する抗原を少なくとも１個含む。そのため、患者の細胞が疾患関連抗原、例えば、癌抗原や病原体由来抗原を発現するときには、該疾患関連抗原がヒトＨＬＡクラスＩ分子とともに本発明の医薬品組成物の細胞傷害性Ｔ細胞に提示される。すなわち本発明の医薬品組成物は、患者と共通のＨＬＡクラスＩ分子遺伝子座アリルのコンテキストで前記疾患関連抗原を認識して、該疾患関連抗原を発現する患者の細胞を特異的に攻撃する。【００５３】
患者の細胞が発現する疾患関連抗原は、ＷＴ１、チロシナーゼ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＥＡ，ＮＳＥ、ＰＳＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−３を含むが、これらに限られない腫瘍関連抗原と、ＥＢＥＲ，ＬＭＰ−１等のＥＢウイルス関連抗原のように癌細胞で（過剰に）発現する抗原の場合と、ＣＭＶｇｐ６５等のサイトメガロウイルス特異抗原、ＨＩＶｇｐ１６０等のエイズウイルス特異抗原を含むが、これらに限られないウイルス特異抗原のように感染細胞で発現する抗原の場合とがある。したがって本発明の医薬品組成物は、癌治療に用いられる場合と、感染症治療に用いられる場合とがある。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞の増殖条件の検討結果を示すグラフ。
【図２】免疫ビーズで刺激され、１４日間培養増幅された臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞を、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ８マウスモノクローナル抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ*２４０２ＷＴ１（ｗｉｌｄ）ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ−テトラマーとで二重染色したフロー・サイトメトリー解析図。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下に説明する本発明の実施例は、例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本明細書で言及されるすべての特許文献及び非特許文献はそれらの全体が引用によって本明細書に取り込まれる。
【００５６】
以下の実施例で説明する実験は、東京大学医科学研究所の倫理審査委員会によって承認された後に実施された。
【実施例１】
【００５７】
ヒト臍帯血
ヒト臍帯血試料は、母親のインフォームド・コンセント署名を得た後に採血され、理化学研究所バイオリソースセンター内の液体窒素システムで凍結保存された。採血方法はＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．ら（Ｂｌｏｏｄ，８１：１６７９−１６９０（１９９３））に説明され、凍結保存方法はＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．ら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２：１０１１９−１０１２２（１９９５））に説明される。【００５８】
培地及び試薬
培地としてＸ−Ｖｉｖｏ１５（商標、ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ、滋賀）が使用された。一部の実験では最終濃度０ないし５％のヒトＡＢ型血清（Ｌｏｎｚａ）が添加された。Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ニュージャージー州）製の組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）が最終濃度０ないし１，５００ＩＵ／ｍＬ添加された。【００５９】
臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞の精製
理化学研究所から入手した臍帯血２５ｍＬは３７°Ｃの温水浴で解凍され、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に重層され、室温にて１，５００ｒｐｍ、３０分間遠心された。バフィーコートが回収され、ＰＢＳ中に再浮遊された、得られた白血球はＰＢＳでさらに３回洗浄された。その後、前記白血球懸濁液に細胞１０7個あたり２５μＬのＤｙｎａｌ（商標）免疫磁気ビーズＣＤ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加され、氷上又は４°Ｃで３０分以上攪拌された。ＣＤ１４陽性細胞と、ビーズを貪食した単球マクロファージとが磁気粒子分離器（ＭＰＣ−１、Ｄｙｎａｌ）を用いて除去された。残りの細胞はＰＢＳ中に再浮遊され、細胞１０7個あたり２５μＬのＤｙｎａｌ（商標）免疫磁気ビーズＣＤ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加され、氷上又は４°Ｃで３０分以上攪拌された。ＣＤ３陽性細胞が磁気粒子分離器（ＭＰＣ−１、Ｄｙｎａｌ）を用いて分離された。【００６０】
臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞の培養
前記ＣＤ３陽性細胞は５％ヒトＡＢ型血清を添加したＸＶｉｖｏ１５培地に１０6個／ｍＬの濃度で浮遊され、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、組換えＩＬ−２とを添加して培養された。培養４、７、９、１２及び１４日目にトリパンブルー染色を用いて生細胞数が測定された。組換えＩＬ−２を含む５％ヒトＡＢ型血清を添加したＥｘＶｉｖｏ１５培地で、１０6個／ｍＬの細胞濃度になるように希釈された。【００６１】
結果
図１に臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞の増殖条件の検討結果を示す。図１の縦軸は培養開始時のＣＤ３陽性細胞の総数を１とする増殖倍率を表し、横軸は培養開始後の日数を表す。刺激に用いるＣＤ３／ＣＤ２８免疫ビーズは細胞１個あたりビーズ約２個の割合で用いられた。培地に添加される組換えＩＬ−２及びヒト血清の濃度とに関係なく、いずれの培養条件でも臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞は培養９日目までほぼ同様の速度で増殖した。しかし、培養１２日目になると、ＩＬ−２濃度が１，５００ＩＵ／ｍＬで、かつ、ヒト血清が５％の培養条件の細胞だけが増殖速度を維持し、他の培養条件の細胞は増殖速度の低下や細胞数の減少がみられた。培養１４日目になると、ＩＬ−２濃度が１，５００ＩＵ／ｍＬの条件で培養された細胞のみが同じ速度で増殖した。以上に示したとおり、臍帯血由来の白血球から、ＣＤ３陽性のＴ細胞のみを精製し、これに分裂刺激を与えて選択的に増殖することが可能になった。
【実施例２】
【００６２】
癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の増幅
ＣＤ３／ＣＤ２８免疫ビーズで刺激され、５％ヒトＡＢ型血清及び１，５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加したＥｘＶｉｖｏ１５培地で培養増幅された臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞を培養１４日目に回収して、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ８マウスモノクローナル抗体と、ＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ*２４０２ＷＴ１（ｗｉｌｄ）ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ−テトラマーとで二重染色し、フロー・サイトメトリー解析を行った。【００６３】
結果
図２に前記フロー・サイトメトリー解析結果を示す。図の縦軸はＰＥの蛍光強度で、ＨＬＡ−Ａ*２４０２ＷＴ１（ｗｉｌｄ）ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ−テトラマーとの反応を表し、横軸はＡＰＣの蛍光強度で、抗ＣＤ８抗体との反応を表す。図２に示すとおり、増幅された臍帯血由来ＣＤ３陽性細胞のうちＣＤ８陽性細胞、すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞の約１１．６％は、ＨＬＡ−Ａ*２４０２アリルのコンテキストで癌抗原であるＷＴ１由来ペプチドを特異的に認識した。ＷＴ１特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、リンパ腫その他のＷＴ１を過剰発現する悪性細胞とは反応するが、ＷＴ１を比較的少量しか発現しない正常細胞を攻撃しないことが知られている（Ｇａｏ，Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９５：２１９８−２２０３（２０００）、Ｏｋａ、Ｙ．ら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０：２１１−２２０（２００８））。【００６４】
図２の結果から、臍帯血由来の白血球を特定の表面抗原に基づいて選別し、適切な条件で刺激及び増幅を行うと、特定アリルのＨＬＡ−Ａ拘束性で癌抗原を特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞が大量に得られることが証明された。【００６５】
本実施例では、ＷＴ１ペプチドは細胞傷害性Ｔ細胞の増殖刺激には用いられなかったのに、ＷＴ１由来ペプチドを特異的に認識する細胞傷害性Ｔ細胞が得られたが、これは、ＷＴ１は臍帯血白血球で発現しており、培養に用いられたリンパ球には樹状細胞に分化するものが含まれるため、培養下で樹状細胞から細胞傷害性Ｔ細胞にＷＴ１が抗原として提示された可能性がある。臍帯血では成人末梢血には存在しない胸腺選択を受ける前の幼弱なＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞集団が存在するが、これは臍帯血に特異的な細胞集団である。ナイーブＴ細胞を抗原特異的に活性化する（プライミング）には樹状細胞が必須であるが、ＷＴ１のような正常細胞でも発現している自己蛋白の場合、既に胸腺選択を受ける前の幼弱なＣＤ４陽性ＣＤ８陽性の自己反応性メモリー細胞が臍帯血中に存在しているため、これらの細胞集団からＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞が増幅されている可能性がある。成人ではこれらの細胞集団は自己反応性クローンとして既に胸腺選択の段階で取り除かれているため、成人末梢血の増幅では得ることが出来ず、臍帯血からのみ調整可能である。本実施例の実験は、臍帯血からのみこの細胞集団が調整可能であることを世界で初めて示したものである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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