(57)【要約】慢性腎臓病の病期を判定する方法又は装置若しくはその作動方法を提供する。腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、（Ａ−１）当該被験者由来検体をマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定する工程、（Ｂ−１）工程（Ａ−１）において測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、及び（Ｃ−１）工程（Ａ−１）において測定された各マーカーが示す病期が同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程を含むことを特徴とする方法。
2011152339.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ａ−１）当該被験者由来検体を下記以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析に供して、下記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定する工程：
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.08±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ−１）工程（Ａ−１）において測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、及び
（Ｃ−１）工程（Ａ−１）において測定された各マーカーが示す病期が同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（Ａ−１）において測定するマーカーが、マーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項１に記載する方法。
【請求項３】
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ｂ−１）被験者由来検体について、を下記以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて測定されたに供して、下記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を、病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.08±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｃ−１）工程（Ｂ−１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
工程（Ｂ−１）において対象とするマーカーが、マーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項３に記載する方法。
【請求項５】
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ａ−２）当該被験者由来検体を下記条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析に供して、下記のマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの存在を測定する工程
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.12±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.26±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.28±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.15±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.24±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.14±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.28±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ−２）工程（Ａ−２）において少なくとも１種のマーカーが検出さの存在が認められた場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する装置であって、
（Ａ−１）下記以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いてによって、下記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの被験者由来検体における量を測定する手段
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.10±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ−１）手段（Ａ−１）により測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する手段、
（Ｃ−１）手段（Ｂ−１）において決定された各マーカーが示す病期が同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する手段、
を備えることを特徴とする装置。
【請求項７】
手段（Ａ−１）により測定するマーカーが、マーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項６に記載する装置。
【請求項８】
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する装置であって、
（Ａ−２）下記以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いてによって、下記のマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定する手段
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.06±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ−２）手段（Ａ−２）において少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する手段
を備えることを特徴とする装置。
【請求項９】
慢性腎臓病の病期判定用キットであって、
下記以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析によって下記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキット
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.10±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー。
【請求項１０】
マーカーがマーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項９に記載するキット。
【請求項１１】
マーカーがマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項９に記載するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性腎臓病の病期を判定する方法又は装置若しくはその作動方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease：CKD）は、腎障害を示す所見や腎機能低下が慢性的に続く状態のまま放置することにより進行する病気である。そのまま進行すると末期腎不全へと至り、人工透析や腎移植を受けない限り生存が困難となる。【０００３】
末期腎不全は全世界的に増加の一途を辿っており、対処としては、いわゆる「隠れ腎臓病」のうちに早期発見、ひいては早期治療を施すことが重要であるとされる。【０００４】
現在、日本国内には約1,330万人のCKD患者が存在するといわれている。すなわち、成人の約8人に1人がCKD患者である計算になる。【０００５】
透析導入患者の中で最も多い原疾患は糖尿病の3大合併症の一つである糖尿病性腎症である。糖尿病性腎症はCKDであるため、糖尿病はCKD予備軍となる。2006年の国民健康・栄養調査（厚生労働省）によると、糖尿病患者は820万人、さらに糖尿病予備軍を加えると1,870万人と推定されている。このうち3割の患者が腎不全になると考えられるため、今後もCKD患者は増加するとみられる。例えば日本の透析治療にかかる医療費は、一人当たり年間およそ540万円であり、全体で年間1兆5千億円にも上る。透析患者数が増加の一途を辿っているため、透析治療にかかる医療費も増加しており、医療費を抑制するための対策が急務とされている。このため、腎障害を早期発見し、症状を悪化させないよう早期治療を行い、最終的に透析導入患者を1人でも少なくすることが世界中で重要視されている。【０００６】
CKDの病期分類には、腎機能の評価指標である糸球体濾過量（GFR）が用いられている。すなわち、GFR量に応じて、5段階の病期に分類することが行われている（非特許文献１）。【０００７】
しかしながら、このようにして行われているCKDの病期分類の判定では血清クレアチニン濃度が基準とされており、血清クレアチニン濃度は筋肉量に強く影響されるため、その影響を排除して正確な判定を行うことが難しいという問題があった。また、推定GFR量（eGFR）が50％以下になるまで血清クレアチニン濃度の上昇が認められないため、軽度の腎障害を見つけにくいという問題もあった。それにもかかわらず、現在に至るまで、それに代わる適切な判定方法は開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】CKD診療ガイド  2007年5月23日修正、12〜13頁、日本腎臓学会編、2009年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、慢性腎臓病の病期を判定する方法又は装置若しくはその作動方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは試行錯誤を日夜重ねながら、各種病期にあるCKD患者の透析前血漿及び透析前尿を互いに綿密に比較し、多大な労力をかけて病期の進行とその存在量との間に関連が認められる低分子化合物の検索を行った。【００１１】
この長期間に渡る困難な作業を経て、本発明者らは遂に病期の進行とともにその存在量が増加する低分子化合物が存在することを突き止めた。また、本発明者らは、特定の病期においてのみ観察される低分子化合物が存在することも突き止めた。さらに、本発明者らは検討を重ね、これら特定の低分子化合物の血漿中存在量が慢性腎臓病の病期の適切な判定における指標となりうることを明らかにし、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は次の通りである：
（Ｉ）慢性腎臓病の病期を判定する方法
［項Ｉ−１］
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ａ−１）当該被験者由来検体を下記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析に供して、下記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定する工程、及び
（Ｂ−１）工程（Ａ−１）において測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、
を含むことを特徴とする方法：
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
であるものとする。
［マーカー］
マーカー（１）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
マーカー（２）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
マーカー（３）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
マーカー（４）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
マーカー（５）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
マーカー（６）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
マーカー（７）：負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.08±10 mDaであるマーカー；
マーカー（８）：負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
マーカー（９）：負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１０）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１１）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１２）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１３）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１４）：正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
マーカー（１５）：負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
マーカー（１６）：負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー。【００１３】
以下、特に言及しない限り、液体クロマトグラフィーおよび飛行時間型質量分析の条件は上記の条件を、またマーカー（１）〜（１６）は、上記保持時間及び精密質量で特定されるマーカーを、それぞれ意味するものとする。
［項Ｉ−２］
さらに、（Ｃ−１）工程（Ｂ−１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程、
を含むことを特徴とする、（項Ｉ−１）に記載する方法。
［項Ｉ−３］
（Ａ−１）工程において測定するマーカーが、マーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである（項Ｉ−１）または（項Ｉ−２）に記載する方法。
［項Ｉ−４］
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ａ−２）当該被験者由来検体を上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析に供して、上記のマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定する工程、
（Ｂ−２）工程（Ａ−２）において、少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
［項Ｉ−５］
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ｂ−１）上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて測定された、被験者由来検体中の上記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を、病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、及び
（Ｃ−１）工程（Ｂ−１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
［項Ｉ−６］
工程（Ｂ−１）において対象とするマーカーが、マーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである（項Ｉ−５）に記載する方法。
（II）慢性腎臓病の病期を判定する装置及びその作動方法
［項II−１］
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する装置であって：
（Ａ−１）上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて、上記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの被験者由来検体における量を測定する手段、
（Ｂ−１）手段（Ａ−１）により測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する手段、
（Ｃ−１）手段（Ｂ−１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する手段、
を備えることを特徴とする装置。
［項II−２］
手段（Ａ−１）において測定するマーカーが、マーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである、（項II−１）に記載する装置。
［項II―３］
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する装置であって：
（Ａ−２）上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析によって、上記のマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定する手段、
（Ｂ−２）手段（Ａ−２）において、少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する手段
を備えることを特徴とする装置。
［項II−４］
項II―１に記載の装置の作動方法であって：
（ａ−１）被験者から採取した検体におけるマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定するように手段（Ａ−１）を作動する工程、
（ｂ−１）工程（ａ−１）により測定された量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定するように手段（Ｂ−１）を作動する工程、
（ｃ−１）工程（ｂ−１）により決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定するように手段（Ｃ−１）を作動する工程、
からなることを特徴とする作動方法。
［項II−５］
項II−２に記載の装置の作動方法であって：
（ａ−１）被験者から採取した検体におけるマーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定するように手段（Ａ−１）を作動する工程、
（ｂ−１）工程（ａ−１）により測定された量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定するように手段（Ｂ−１）を作動する工程、
（ｃ−１）工程（ｂ−１）により決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定するように手段（Ｃ−１）を作動する工程、
からなることを特徴とする作動方法。
［項II−６］
項II−３に記載の装置の作動方法であって：
（ａ−２）被験者から採取した検体におけるマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定するように手段（Ａ−２）を作動する工程、及び
（ｂ−２）工程（ａ−２）において、検体中に少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定するように手段（Ｂ−２）を作動する工程、
からなることを特徴とする作動方法。
（III）慢性腎臓病の病期判定用キット
［項III−１］慢性腎臓病の病期判定用キットであって、
上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて上記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキット。
［項III−２］
慢性腎臓病の病期判定用キットであって、
上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて上記のマーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキット。
［項III−３］
慢性腎臓病の病期判定用キットであって、
上記の特定の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析によって上記のマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、新規なマーカーを用いることにより、慢性腎臓病の病期の判定を従来よりも適切に行うことができる。【００１５】
特に、本発明によれば、簡便に、低コストで、かつ短時間で慢性腎臓病の病期の判定を行うことができる。【００１６】
また、本発明により慢性腎臓病の病期を判定することで、多くの腎疾患患者、そしてその診断及び治療等に携わる医療機関の双方が大きなメリットを享受できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】各マーカー（ESI-Positive）の病期ステージごとの成分変化(SN>20)を示したグラフである。
【図２】各マーカー（ESI-Positive）の病期ステージごとの成分変化(SN>20)を示したグラフである。
【図３】各マーカー（ESI-Positive）の病期ステージごとの成分変化(SN>20)を示したグラフである。
【図４】各マーカー（ESI-Negative）の病期ステージごとの成分変化(SN>20)を示したグラフである。
【図５】各マーカー（ESI-Positive）の病期ステージごとの成分変化を示したグラフである。
【図６】各マーカー（ESI-Negative）の病期ステージごとの成分変化を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
Ｉ．慢性腎臓病の病期を判定する方法
本発明の慢性腎臓病の病期を判定する第一の方法（方法（１））は、（Ａ−１）以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析による測定で保持時間及び精密質量 (m/z)がそれぞれ下記の通りであるマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの被験者由来検体における存在量を評価する工程
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10
±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10
±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12
±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15
±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12
±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.10
±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13
±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10
±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ−１）工程（Ａ−１）において測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、
（Ｃ−１）工程（Ｂ−１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００１９】
また、本発明の慢性腎臓病の病期を判定する第二の方法（方法（２））は、（Ａ−２）以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析による測定で保持時間及び精密質量 (m/z)がそれぞれ下記の通りであるマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの被験者由来検体における存在量を評価する工程
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.06±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ−２）工程（Ａ−２）において少なくとも１種のマーカーの存在が認められた場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する工程
を含むことを特徴とする方法である。
【００２０】
本発明の慢性腎臓病の病期を判定する方法（１）及び（２）は、被験者由来検体を検査対象とし、その被験者がいずれの病期に属するかを判定することができる方法である。
【００２１】
病期としては、例えば、腎機能の評価指標である糸球体濾過量（GFR）を基準とするステージ分類を用いてもよい。すなわち、表１に示すような、GFR量に応じた5段階の病期ステージをそのまま用いることができる。（CKD診療ガイド  2007年5月23日修正、12〜13頁、日本腎臓学会編、2009年発行）。なお、GFR量は、血清クレアチニン値を基にした推算式にて推定することができる。この推定GFR量のことを「eGFR」という。
【００２２】
【表１】
2011152339.tif 000003
【００２３】
現在透析治療を受けていない患者に対しては、本発明の慢性腎臓病の病期を判定する方法（１）又は（２）により判定した病期に基づいて透析治療導入の要否を決定してもよい。すなわち、病期の進行度が高いと判断された場合には、透析治療導入が必要であると判断し、進行度が低いと判断された場合には、透析治療導入が不要であると判断してもよい。
【００２４】
例えば、腎機能の評価指標である糸球体濾過量（GFR）を基準とするステージ分類（表１）における病気ステージが４（GFR高度低下）又は５（腎不全）であると判定された場合に透析治療導入が必要であると判断し、病気ステージが１〜３と判断された場合には、透析治療導入が不要であると判断してもよい。
【００２５】
本発明の慢性腎臓病の病期を判定する方法は、マーカー存在量評価工程（工程（Ａ−１）又は工程（Ａ−２））、及び慢性腎臓病の病期判定工程（工程（Ｂ−１）及び工程（Ｃ−１）、又は工程（Ｂ−２））を含む。以下、各工程に分けて本発明を詳述する。
【００２６】
マーカー存在量評価工程
マーカー存在量評価工程は、ヒトから採取した検体における（１）〜（１６）又は（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの存在量を評価する工程である。
【００２７】
検体としては、例えば、血液由来検体、又は尿検体等を用いることができるが、特に限定されない。血液由来検体としては、例えば、全血、血清、又は血漿を用いることができる。その中では血清及び血漿が好ましい。さらに分離時間を早めることができるという観点、又は評価対象マーカーの分解を防ぐという観点では、血漿がより好ましい。なお、評価対象マーカーの分解を防ぐためにこれらの血液由来検体に対してキレート作用等により抗凝固作用を示す物質を添加してもよい。そのような抗凝固作用を示す物質としてはEDTA（Ethylene Diamine-Tetraacetic Acid）等が挙げられる。また、同じ目的でタンパク質分解酵素阻害作用を示す物質を添加してもよい。そのような抗凝固作用を示す物質としてはアプロチニン等が挙げられる。
【００２８】
また、検体は採取後にいったん凍結保存等された場合には、必要に応じてあらかじめ前処理工程に供してからマーカーの存在量を評価する手段に供してもよい。前処理工程としては、例えば遠心分離等により不要物を除去する工程が挙げられる。例えば、血液由来検体として血漿を用いる場合は、必要に応じて、遠心分離して沈殿物を除去してから手段に供してもよい。遠心分離の条件としては、例えば、3,000〜10,000 g、5〜10分間が好ましい。例えば、10,000g、10分間等が挙げられる。前処理工程としては、さらに、必要に応じて固相抽出工程に供してもよい。例えば、疎水性吸着剤を用いる工程が挙げられる。この場合、疎水性吸着剤を固相抽出カラムとして固相抽出を行ってもよい。疎水性吸着剤である固相抽出カラムとしては例えば、Sep-Pak Light Cartrides C18カラム（日本ウォーターズ株式会社）が挙げられる。この場合、例えば、90%メタノールを用いて溶出することができる。
【００２９】
（１）〜（１６）又は（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの存在量を評価する工程は、これらの存在の有無を確認することができる工程、又は定量的に測定することができる工程であればよく限定されない。
【００３０】
評価手段の検出限界をあるマーカーの基準存在量以上となるように調整すれば、この評価手段を用いることによって、検体においてマーカーが基準存在量以上存在しているか否かを評価することができる。この場合、存在の有無を確認する工程としては、例えば、評価手段の検出限界以下であればマーカーが存在しないと評価し、一方、検出限界以上であればマーカーが存在すると評価する工程が挙げられる。
【００３１】
定量的に測定する工程としては、例えば、液体クロマトグラフ−飛行時間型質量分析計（LC-TOF MS）液体クロマトグラフィー四重極型質量分析計(LC-Q MS)、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、分光光度計、化学発光計測器等が挙げられる。再現性、又は測定精度という観点ではLC-TOF MSが好ましい。
【００３２】
例えば、評価する工程としてLC-TOF MSを用いる場合、あらかじめ検体中に複数種の内部標準物質を添加してからLC-TOF MSにて分析を行い、マーカーに対応するm/zのピーク面積を内部標準物質に対応するm/zのピーク面積の平均面積で割った値を相対面積（以下、「m/zピーク相対面積」という。）とし、これを異なる検体間で比較することにより存在量を評価することが挙げられる。
【００３３】
内部標準物質としては、例えば、benzyloxycarbonyl-L-tyrosyl-glutamic acid (Z-Tyr-Glu)、tosyl-L-arginine methyl ester monohydrochloride (Tos-Arg-OMe・HCl)等を用いることができる。
【００３４】
液体クロマトグラフィー（LC）に用いるカラムは、マーカーを解析することができればよく限定されない。逆相カラムであってもよいし、順相カラムであってもよい。逆相カラムが好ましい。充填剤もマーカーを解析することができればよく限定されない。例えば、C18（オクタデシル）が挙げられる。粒子系や長さは適宜設定することができる。
【００３５】
より迅速な、又はより簡便な判定が求められる場合は、（１）〜（１６）又は（１０）〜（１６）からなる群より選択される１種のマーカーの存在量を評価することが好ましい。より確実な判定が求められる場合は、これらの群より選択される２種以上のマーカーの存在量を評価することが好ましい。求められる確実性の程度に応じて３種のマーカーの存在量を評価してもよいし、４種のマーカーの存在量を評価してもよい。
【００３６】
従来はGFRがCKD重症度の指標とされてきたが、血清クレアチニン濃度を基に算定されるものであり、血清クレアチニン濃度は筋肉量に強く影響されるため、その影響を排除して正確な判定を行うことが難しいという問題があった。また、eGFRが50％以下になるまで血清クレアチニン濃度の上昇が認められないため、軽度の腎障害を見つけにくいという問題もあった。これに対して、マーカー（１）〜（１６）はいずれも従来マーカーとしては用いられてこなかった。これらをマーカーとして用いることにより、慢性腎臓病の病期をより適切に判定することができる。特に、マーカー（１）〜（９）はより軽度の段階で存在量が上昇してくる傾向があるため、これらを利用することでより軽度の腎障害を発見することができる。
【００３７】
慢性腎臓病の病期判定工程
方法（１）における慢性腎臓病の病期判定工程は、工程（Ａ−１）において評価されたマーカーの存在量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較し、全マーカーの存在量が同一の病期の基準存在量範囲内である場合には当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程である。
【００３８】
方法（２）における慢性腎臓病の病期判定工程は、工程（Ａ−２）において少なくとも１種のマーカーの存在が認められた場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する工程である。
【００３９】
病期の分類としては、限定されないが、例えば、表１に記載の分類を用いることができる。また、その他にも当該分野で一般的に受け容れられている分類を用いることもできる。
【００４０】
特定のマーカーの特定の病期における基準存在量範囲は、特に限定されないが、例えば、当該病期に属する複数の患者から採取した検体中の当該マーカーの存在量の平均値や分布を基にして確定することができる。
【００４１】
また、基準となる病期を定め、その基準病期における当該マーカーの存在量に対する倍率を基準存在量範囲としてもよい。例えば、GFRを基準とするステージ分類基準病期を用いる場合、健常人を基準とし、健常人における存在量の平均値に比べて何倍上昇したかに応じてステージ２〜５のいずれかに属すると判定してもよい。このときの基準存在量範囲のことを特別に「基準存在倍率範囲」という。
【００４２】
下記にそれぞれのマーカーについての基準存在倍率範囲の一例を示す。これは各病期に属する各５名の日本人患者から採取した検体に基づいて得られた値である。ただし、実際に本発明の判定方法を実施するに際しては、その目的や対象等に応じて基準存在量範囲を適宜新たに求めてもよい。
【００４３】
健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー（１）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ２は１．５〜３．５倍、ステージ３は３．５〜５．５倍、ステージ４は５．５倍以上である。
【００４４】
健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー（２）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ３は７〜９．５倍、ステージ４は９．５〜２４倍、ステージ５は２４倍以上である。
【００４５】
健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー（３）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ２は２〜２．５倍、ステージ３は２．５〜７倍、ステージ４は７〜２４倍、ステージ５は２４倍以上である。
【００４６】
健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー（４）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ２は１．３〜３倍、ステージ３は３〜４．５倍、ステージ４は４．５〜８倍、ステージ５は８倍以上である。
【００４７】
健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー（５）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ３は１．５〜１５倍、ステージ４は１５〜２４倍、ステージ５は２４倍以上である。
【００４８】
健常人を基準とするとき、正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー（６）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ２は１．５〜６．５倍、ステージ４は６．５〜１１倍、ステージ５は１１倍以上である。
【００４９】
健常人を基準とするとき、負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.08±10 mDaであるマーカー（７）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ２は３〜５倍、ステージ３は５〜１０倍、ステージ４は１０倍以上である。
【００５０】
健常人を基準とするとき、負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー（８）の基準存在倍率範囲は、例えば、ステージ３は１．５〜４倍、ステージ４は４〜１５倍、ステージ５は１５倍以上である。
【００５１】
健常人を基準とするとき、負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー（９）の基準存在倍率範囲は、例えばステージ３は２〜７倍、ステージ４は７〜１８倍、ステージ５は１８倍以上である。
【００５２】
先述の通りマーカー（１）〜（９）はより軽度の段階で存在量が上昇してくる傾向があるため、これらのマーカーを使用する場合、方法（１）における慢性腎臓病の病期判定工程は、例えば、工程（Ａ−１）において評価されたマーカーの存在量を健常人における存在量と比較し、全マーカーの存在量が健常人における存在量よりも多い場合には当該被験者における慢性腎臓病が少なくとも早期段階にあると判定する工程であってもよい。これにより、従来できなかった慢性腎臓病の早期発見が可能となる。ここでいう「早期段階」とは、例えば、腎機能の評価指標である糸球体濾過量（GFR）を基準とするステージ分類（表１）における病期ステージ１（腎障害は存在するが、GFRは正常又は増加）、病期ステージ２（腎障害が存在し、GFRは軽度低下）、及び３（GFR中等度低下）である。また、ここでいう「早期段階」は、好ましくは同ステージ１及びステージ２、若しくは同ステージ１である。
【００５３】
マーカー存在量が健常人に比べてどの程度多い場合に早期段階にあると判定するかは、使用するマーカー、早期段階の定義、及び被験者の属性等によって変動するため、適宜設定することができる。基準としては例えば１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５．５倍、６倍、６，５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、及び１０倍等が挙げられる。
【００５４】
方法（２）における「慢性腎臓病の病期が重症であると判定する工程」とは、例えば、腎機能の評価指標である糸球体濾過量（GFR）を基準とするステージ分類（表１）における病期ステージが４（GFR高度低下）又は５（腎不全）であると判定する工程であってもよい。
【００５５】
ＩＩ．慢性腎臓病の病期を判定する装置及びその作動方法
本発明の慢性腎臓病の病期を判定する第一の装置（装置（１））は、（Ａ−１）以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析による測定で保持時間及び精密質量 (m/z)がそれぞれ下記の通りであるマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの、ヒトから採取した検体における存在量を評価する手段
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が211.10±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.06±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ−１）手段（Ａ−１）により測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する手段、
（Ｃ−１）手段（Ｂ−１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する手段、
を備えることを特徴とする装置である。
【００５６】
本発明の慢性腎臓病の病期を判定する第二の装置（装置（２））は、（Ａ−２）以下の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析による測定で保持時間及び精密質量(m/z)がそれぞれ下記の通りであるマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの、ヒトから採取した検体における存在量を評価する手段
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が197.06±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー；並びに
（Ｂ−２）手段（Ａ−２）において、少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する手段、
を備えることを特徴とする装置である。
【００５７】
本発明の慢性腎臓病の病期を判定する装置（１）及び（２）は、マーカー存在量評価手段（手段（Ａ−１）又は手段（Ａ−２））と、慢性腎臓病の病期判定手段（手段（Ｂ−１）及び手段（Ｃ−１）、又は手段（Ｂ−２））とを備える。以下、手段ごとに分けて本発明を詳述する。
【００５８】
マーカー存在量評価手段
マーカー存在量評価手段は、ヒトから採取した検体における（１）〜（１６）又は（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの存在量を評価する手段である。
【００５９】
マーカー存在量評価手段は、本発明の慢性腎臓病の病期を判定する方法において説明したマーカー存在量評価工程を実施する手段である。マーカー存在量評価手段についての説明はこのマーカー存在量評価工程に関する説明と同様であるため省略する。
【００６０】
慢性腎臓病の病期判定手段
慢性腎臓病の病期判定手段は、手段（Ａ−１）により評価されたマーカーの存在量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較し、全マーカーの存在量が同一の病期の基準存在量範囲内である場合には当該検体の提供者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する手段である。
【００６１】
また、手段（Ｂ−２）は、手段（Ａ−２）において少なくとも１種のマーカーの存在が認められた場合に、当該検体の提供者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する手段である。
【００６２】
手段（Ａ−１）はマーカーの存在量を定量的に評価する手段である。本発明の慢性腎臓病の病期を判定する方法の慢性腎臓病の病期判定工程において説明したのと同様にして決定された基準存在量を用いればよい。
【００６３】
手段（Ａ−１）により評価されたマーカーの存在量を基準存在量範囲と比較する手段は、手段（Ａ−１）により評価されたマーカーの存在量をメモリーに記憶された基準存在量範囲と比較する手段であってもよい。
【００６４】
また、手段（Ａ−１）により評価されたマーカーの存在量を基準存在量範囲と比較する手段は、本装置を操作する者が基準存在量範囲と比較することができるようにする手段であってもよい。例えば、手段（Ａ−１）により評価されたマーカーの存在量を、本装置を操作する者に対して視覚的又は聴覚的に伝達する手段を備えていてもよい。視覚的に伝達する手段としては、マーカーの存在量を表示する表示部が挙げられる。聴覚的に伝達する手段としては、マーカーの存在量を音声で知らせる音声発信部が挙げられる。
【００６５】
慢性腎臓病の病期判定手段はさらに判定結果を示す手段を備えていてもよい。判定結果を示す手段は限定されないが、判定結果を別に設ける表示部に視覚的に表示する手段であってもよいし、判定結果を聴覚的に示す手段であってもよいし、又は判定結果をさらに外部に伝達する手段であってもよい。
【００６６】
慢性腎臓病の病期を判定する装置の作動方法
本発明の慢性腎臓病の病期を判定する装置（１）の作動方法は、
（ａ−１）被験者から採取した検体におけるマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定するように手段（Ａ−１）を作動する工程、
（ｂ−１）工程（ａ−１）により測定された量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定するように手段（Ｂ−１）を作動する工程、及び
（ｃ−１）工程（ｂ−１）により決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定するように手段（Ｃ−１）を作動する工程
からなることを特徴とする作動方法である。
【００６７】
また、本発明の慢性腎臓病の病期を判定する装置（２）の作動方法は、
（ａ−２）被験者から採取した検体におけるマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定するように手段（Ａ−２）を作動する工程、及び
（ｂ−２）工程（ａ−２）において、検体中に少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定するように手段（Ｂ−２）を作動する工程
からなることを特徴とする作動方法である。
【００６８】
検体、マーカー、及びマーカーの存在量を評価する工程についての説明は本発明の慢性腎臓病の病期を判定する装置に関する説明と同様であるため省略する。
【００６９】
ＩＩＩ．慢性腎臓病の病期判定用キット
本発明の慢性腎臓病の病期判定用キット（１）は、マーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキットである。
【００７０】
また、本発明の慢性腎臓病の病期判定用キット（２）は、マーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキットである。
【００７１】
マーカーについての説明は、本発明の「慢性腎臓病の病期を判定する方法」においてしたのと同様である。
【００７２】
マーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料は、これらマーカーを検出することができればよく限定されない。例えば、これらマーカーと特異的に反応する物質等が挙げられる。そのような物質を検体に作用させて、反応産物の有無又は濃度を検出することによりマーカーを検出することができる。これらマーカーと特異的に反応する物質としては、例えば、これらマーカーを特異的に代謝する酵素が挙げられる。例えば、酵素として加水分解酵素を用い、この加水分解酵素がマーカーに特異的に作用することにより二酸化炭素（CO2）と水（H2O）が生じて酸素（O2）濃度が減少するような場合には、酸素濃度の減少を例えば酸素電極等を用いて検出することによりマーカー存在量の定量分析が可能となる。
［実施例］
【００７３】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の例にのみ限定されるものではない。ヒト血液検体を用いて、慢性腎臓病の病期の指標となりうるマーカーの探索を行った。
【００７４】
検体としては、血漿検体を用いた。検体としては表２に示す26人の患者から採取したものを用いた。なお、表２中における病期分類は、表１で示したものである。
【００７５】
【表２】
2011152339.tif 000004
【００７６】
分析手段としては、LC-TOF MSを用いた。分析は次の通り行った。血漿検体又は尿検体を10,000 gで15分間遠心分離し、沈殿物を除去した。これを固相カラム（Sep-Pak Light C18cartridge；日本ウォーターズ株式会社）を用いて固相抽出を次の手順で行い、得られたものをLC-TOF MSに供する測定試料とした。
［固相抽出条件］
手順１．固相カラムを1 mL MetOHでコンディショニングする。
手順２．固相カラムを1 mL超純水で平衡化する。
手順３．血漿検体500 μLを固相カラムにロードする。
手順４．超純水2 mLで洗浄する。
手順５．90％ MetOH 300μLで溶出する。
手順６．溶出した試料に内部標準物質としてbenzyloxycarbonyl-L-tyrosyl-glutamic acid (Z-Tyr-Glu)、tosyl-L-arginine methyl ester monohydrochloride (Tos-Arg-OMe・HCl)を添加した。
【００７７】
この測定試料をLC-TOF MSに供した。液体クロマトグラフィー（LC）の条件は次の二通りでそれぞれn=3ずつ行った。
条件１：
［LC条件］
LC装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL  
飛行時間型質量分析（TOF MS）の条件は次の通りとした。
［TOF MS条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
【００７８】
血漿検体に、内部標準物質として2種類のアミノ酸誘導体を混合して分析を行い、その[M+H]+ (ESI Positive) イオン又は [M-H]-(ESI Negative) イオンのピーク面積を内部標準物質のピーク面積の平均値で割った値を相対面積として比較した。マーカー候補物質の保持時間、及び精密質量を表３に示す。
【００７９】
【表３】
2011152339.tif 000005
【００８０】
病期ステージ毎の、各マーカーの変化を図１〜６に示す。
【００８１】
その結果、マーカー（１）〜（９）（それぞれ順にＰ−Ｎｏ．１４，２３，４４，５４，８６，及び１８４；並びにＮ−Ｎｏ．２７，３３，及び４９）については、ステージの上昇とともに相対面積も大きくなる傾向が認められた。マーカー（１）〜（９）については、さらに健常人を基準としてマーカー存在量がどの程度増加したかについても検討した（表４及び５）。
【００８２】
【表４】
2011152339.tif 000006
【００８３】
【表５】
2011152339.tif 000007
【００８４】
また、マーカー（１０）〜（１６）（それぞれ順にＰ−Ｎｏ．１６，８２，８８，９７，及び１１３；並びにＮ−Ｎｏ．１８，及び２１）については、健常人およびステージ２〜３で相対面積が確認できなかったのに対して、ステージ４及び５で相対面積が大きくなる傾向が認められた。特にマーカー（１４）（Ｐ−Ｎｏ．１１３）は、健常人およびステージ２〜４では相対面積が確認できなかったのに対して、ステージ５で相対面積が大きくなる傾向が認められた。
【００８５】
これらの結果から、マーカー（１）〜（１６）を測定することによって、慢性腎臓病の病期を予測することができることが分かった。特にマーカー（１）〜（９）を測定することによって、より早期段階にある慢性腎臓病を発見できることが分かった。また、特にマーカー（１０）〜（１６）が測定された検体の由来患者については、病期がステージ４又は５にあると予測することができることも分かった。特に、マーカー（１４）が測定された検体の由来患者については、病期がステージ５にあると予測することができることも分かった。
【図１】
2011152339.tif 000008
【図２】
2011152339.tif 000009
【図３】
2011152339.tif 000010
【図４】
2011152339.tif 000011
【図５】
2011152339.tif 000012
【図６】
2011152339.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月9日(2012.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ａ−１）当該被験者由来検体を下記の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析に供して、下記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を測定する工程：
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が211.08±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー、
（Ｂ−１）工程（Ａ−１）において測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程、並びに
（Ｃ−１）工程（Ａ−１）において測定された各マーカーが示す病期が同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（Ａ−１）において測定するマーカーが、マーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項１に記載する方法。
【請求項３】
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ｂ−１）被験者由来検体について、下記の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて測定された、下記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの量を、病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する工程：
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が211.08±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー、並びに
（Ｃ−１）工程（Ｂ−１）において決定された各マーカーが示す病期がすべて同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
工程（Ｂ−１）において対象とするマーカーが、マーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項３に記載する方法。
【請求項５】
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する方法であって、
（Ａ−２）当該被験者由来検体を下記条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析に供して、下記のマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定する工程：
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が495.26±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が529.28±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が304.15±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が389.24±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が197.14±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が327.28±10 mDaであるマーカー、並びに
（Ｂ−２）工程（Ａ−２）において少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する装置であって、
（Ａ−１）下記の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて、下記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの被験者由来検体における量を測定する手段
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が211.10±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー、
（Ｂ−１）手段（Ａ−１）により測定された被験者由来検体中のマーカーの量を病期ごとに定められる基準存在量範囲と比較して、各マーカーが示す病期を決定する手段、並びに
（Ｃ−１）手段（Ｂ−１）において決定された各マーカーが示す病期が同一である場合に、当該被験者における慢性腎臓病が当該病期にあると判定する手段、
を備えることを特徴とする装置。
【請求項７】
手段（Ａ−１）により測定するマーカーが、マーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項６に記載する装置。
【請求項８】
腎臓病に罹患した被験者について、慢性腎臓病の病期を判定する装置であって、
（Ａ−２）下記の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析を用いて、下記のマーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを測定する手段
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が197.06±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー、並びに
（Ｂ−２）手段（Ａ−２）において少なくとも１種のマーカーが検出された場合に、当該被験者における慢性腎臓病の病期が重症であると判定する手段
を備えることを特徴とする装置。
【請求項９】
慢性腎臓病の病期判定用キットであって、
下記の条件の液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析によって下記のマーカー（１）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーを検出するために必要な材料を含むキット
［液体クロマトグラフィー条件］
液体クロマトグラフィー装置：Agilent1100 Series（Agilent）
カラム：Cadenza C18 2×150 mm, 3 μm（Imtakt）
プレカラム：TCI OPTI-GURD Fit ODS（TCI）
移動相A：0.05% ギ酸
移動相B：アセトニトリル
溶離：移動相A中5%から95 %への移動相Bの直線勾配  0〜15 min
移動相A中95%から100%への移動相Bの直線勾配  15〜20 min
移動相Bを100%保持  20〜35 min
流速：0.2 mL/min
測定試料量：5μL
［飛行時間型質量分析条件］
測定範囲：m/z 70〜1,000
オリフィス1電圧：10〜40V、-10〜 (-40) V 掃引
イオンガイド電圧：500〜2,500 V掃引
検出器：2,800 V
測定装置：The Accu TOF JMS-T100LC（JEOL）
［マーカー］
（１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.03±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が104.10±10 mDaであるマーカー；
（２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が3.80±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が257.10±10 mDaであるマーカー；
（３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.52±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が312.12±10 mDaであるマーカー；
（４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が6.87±0.5（min）かつ精密質量 (m/z)が232.15±10 mDaであるマーカー；
（５）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が265.12±10 mDaであるマーカー；
（６）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が10.54±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が300.22±10 mDaであるマーカー；
（７）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が6.57±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が211.10±10 mDaであるマーカー；
（８）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が7.19±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が411.13±10 mDaであるマーカー；
（９）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が8.25±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が263.10±10 mDaであるマーカー；
（１０）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が2.26±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が286.13±10 mDaであるマーカー；
（１１）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.29±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が495.23±10 mDaであるマーカー；
（１２）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.32±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が529.22±10 mDaであるマーカー；
（１３）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が8.64±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が304.13±10 mDaであるマーカー；
（１４）正イオン測定 [M+H]+で保持時間が9.24±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が389.21±10 mDaであるマーカー；
（１５）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が3.93±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が197.05±10 mDaであるマーカー；及び
（１６）負イオン測定 [M-H]-で保持時間が5.55±0.5（min）かつ精密質量(m/z)が327.09±10 mDaであるマーカー。
【請求項１０】
マーカーが、マーカー（１）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項９に記載するキット。
【請求項１１】
マーカーが、マーカー（１０）〜（１６）からなる群より選択される少なくとも１種のマーカーである請求項９に記載するキット。
【国際調査報告】
2011152339.tif 000014
2011152339.tif 000015
2011152339.tif 000016
2011152339.tif 000017
2011152339.tif 000018
2011152339.tif 000019
2011152339.tif 000020