(57)【要約】  本発明は、（ａ）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程、（ｂ）工程（ａ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンドの非存在下で培養する工程、及び（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程を包含する、サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）〜（ｃ）を包含する、サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法：
（ａ）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンドの非存在下で培養する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程。
【請求項２】
工程（ａ）〜（ｃ）のうち少なくとも一つの工程における細胞集団の培養が、インターフェロン−γ及び／又はインターロイキン−２の存在下で実施される、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ＣＤ３リガンドが抗ＣＤ３抗体である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
工程（ａ）における培養が、フィブロネクチンフラグメントとＣＤ３リガンドとの共存下で実施される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
フィブロネクチンフラグメントが、下記からなる群より選択される領域を含有する、請求項４に記載の製造方法：
ＶＬＡ−４結合領域；
ＶＬＡ−５結合領域；及び
ヘパリン結合領域。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載の方法により得ることができる、サイトカイン誘導キラー細胞。
【請求項７】
請求項６記載のサイトカイン誘導キラー細胞を有効成分として含有する医薬。
【請求項８】
請求項６記載のサイトカイン誘導キラー細胞の有効量を対象に投与する工程を含む疾患の治療方法又は予防方法。
【請求項９】
疾患の治療に用いるための請求項６記載のサイトカイン誘導キラー細胞。
【請求項１０】
下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を包含する、サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法：
（Ａ）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団を、ＣＤ３リガンドを含有する培地中で培養する工程；
（Ｂ）前記培地のＣＤ３リガンド濃度を低下させる工程；
（Ｃ）ＣＤ３リガンド濃度が低下した培地中で細胞集団を培養する工程；及び
（Ｄ）培地にＣＤ３リガンドを添加し、さらに細胞集団を培養する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、養子免疫療法において効力の高いサイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ細胞）の製造方法、当該製造方法により得られるＣＩＫ細胞、当該ＣＩＫ細胞を含有する医薬等に関する。
なお、本願は、２００９年１０月２８日出願の日本国特許出願第２００９−２４７３４７号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２００９−２４７３４７号の全内容を本願に組み込むものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、薬剤治療法や放射線療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法が見直され、より負担の軽い免疫治療法に関心が高まっている。当該療法には、例えば、体外に取り出した免疫関連細胞を培養して細胞数を増加させ、及び／又は治療効果に係る活性を強化して患者に移植する養子免疫治療法が含まれる。【０００３】
養子免疫療法においてエフェクター細胞として利用される細胞として、リンホカイン活性化キラー（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ；ＬＡＫ）細胞、腫瘍内浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｕｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）及びサイトカイン誘導キラー（ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ；ＣＩＫ）細胞が知られている。【０００４】
ＬＡＫ細胞は、インターロイキン（ＩＬ）−２存在下にリンパ球を増殖させて得ることができる細胞集団であり、腫瘍細胞を溶解するが正常細胞を溶解しないという性質を有している。ＬＡＫ細胞の調製に関しては、培養時にＩＬ−２とともに抗ＣＤ３抗体を共存させる方法も開発されている。【０００５】
ＴＩＬは腫瘍組織に浸潤したＴ細胞であり、ＬＡＫ細胞よりも著しい腫瘍抗原特異性を有する。本細胞も体外で増殖させ、治療に使用することができる。しかし、ＴＩＬは患者の腫瘍組織を摘出して入手する必要があるため、採取操作が煩雑であり、また、得られる細胞数も少ないという問題点を有している。【０００６】
ＣＴＬは、ＨＬＡ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ；ヒト白血球抗原）拘束性の腫瘍関連抗原（ペプチド、タンパク質等）、抗原提示細胞及びＩＬ−２の存在下で腫瘍関連抗原特異的にリンパ球を誘導・増殖させて得ることができる細胞集団であり、高い腫瘍抗原特異性を有している。しかし、ＣＴＬは大量培養が困難であり、また、誘導時に使用した腫瘍関連抗原を発現する細胞しか認識しないという性質を有しているため、同じ腫瘍であってもその抗原発現の有無によって効果が著しく異なるという問題点を有している。【０００７】
ＣＩＫ細胞は、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）から、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、抗ＣＤ３抗体、及びＩＬ−２の存在下での培養を行うことにより調製される細胞集団であり、ＣＤ３陽性かつＣＤ５６陽性の細胞を含有する細胞集団として特徴づけられる。ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性の細胞は、ＰＢＭＣ中では希有な細胞であるが、標的細胞の非存在下で優先的に増殖させることができる。ＣＩＫ細胞は、インビボにおいてＬＡＫ細胞に勝る腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を発揮する（例えば、非特許文献１）。ただし、従来の方法により製造されたＣＩＫ細胞に含有されるＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞の比率は一般的には２０％程度であり、また、ＣＩＫ細胞の増殖性も３週間の培養で１０倍程度と非常に低い。そのため、大量のＣＩＫ細胞を培養するためには患者から成分採血をする場合が多く、肉体的負担が大きいという問題点を有している（例えば、非特許文献２及び３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４年，Ｖｏｌ．１５３，ｐ１６８７−１６９６
【非特許文献２】Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，２００８年，Ｖｏｌ．４８，ｐ１６２９−６３９
【非特許文献３】Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００５年，Ｖｏｌ．１１，ｐ１８１−１８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＣＩＫ細胞の拡大培養の過程では、ＰＢＭＣは多くの性質の異なる細胞集団に分化するため、拡大後の細胞集団中のＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞の割合は決して高いものではない。本発明の目的は、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を効率よく大量に得ることができるＣＩＫ細胞の製造方法を提供する事にある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明を概説すれば、本発明の第１の態様は、（ａ）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程、（ｂ）工程（ａ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンドの非存在下で培養する工程、及び（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程を包含するサイトカイン誘導キラー細胞の製造方法に関する。第１の態様において、工程（ａ）〜（ｃ）のうち少なくとも一つの工程における細胞集団の培養が、インターフェロン−γ及び／又はインターロイキン−２の存在下で実施されてもよい。また、第１の態様において、ＣＤ３リガンドとしては、抗ＣＤ３抗体が例示される。また、第１の態様において、工程（ａ）における培養は、フィブロネクチンフラグメントとＣＤ３リガンドとの共存下で実施してもよい。当該フィブロネクチンフラグメントとしては、ＶＬＡ−４結合領域、ＶＬＡ−５結合領域及びヘパリン結合領域からなる群より選択される領域を含有するものが例示される。【００１１】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の製造方法により得ることができる、サイトカイン誘導キラー細胞に関する。【００１２】
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様のサイトカイン誘導キラー細胞を有効成分として含有する医薬に関する。【００１３】
本発明の第４の態様は、対象に、有効量の本発明の第２の態様のサイトカイン誘導キラー細胞を投与する工程を含む、疾患の治療方法又は予防方法に関する。【００１４】
本発明の第５の態様は、医薬の製造のための、本発明の第２の態様のサイトカイン誘導キラー細胞の使用に関する。
また、本発明の第６の態様は、疾患の治療に用いるための、本発明の第２の態様のサイトカイン誘導キラー細胞に関する。【００１５】
本発明の第７の態様は、（Ａ）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団を、ＣＤ３リガンドを含有する培地中で培養する工程、（Ｂ）前記培地のＣＤ３リガンド濃度を低下させる工程、（Ｃ）ＣＤ３リガンド濃度が低下した培地中で細胞集団を培養する工程、及び（Ｄ）培地にＣＤ３リガンドを添加し、さらに細胞集団を培養する工程を包含する、サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、高い細胞傷害活性を有するＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を高含有する細胞集団を大量に拡大培養することが可能な、ＣＩＫ細胞の製造方法が提供される。当該製造方法により大量に得られかつ高品質なＣＩＫ細胞は、生体内において高い治療効果を発揮することから、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、ＣＤ３リガンド存在下で培養された細胞集団をＣＤ３リガンド非存在下で培養し、さらにＣＤ３リガンド存在下で培養することにより、驚くべき事に、細胞表面にＣＤ３及びＣＤ５６の両分子を発現する細胞が高い比率で含まれた細胞集団が大量に得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明のＣＩＫ細胞の製造方法
本発明の製造方法は、ＣＩＫ細胞、すなわちＣＤ３陽性かつＣＤ５６陽性として特徴づけられる亜細胞集団を高含有する細胞集団を製造する方法である。本発明のＣＩＫ細胞の製造方法は、（ａ）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程、（ｂ）工程（ａ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンドの非存在下で培養する工程、及び（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程を包含する。 
【００１９】
従来のＣＩＫ細胞の製造方法では、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団に対してＣＤ３リガンドによる刺激を与えた後、ＣＤ３リガンド非存在下で培養することにより完結していた。なお、ＣＤ３リガンドによる刺激後にＣＤ３リガンド非存在下で培養を行う理由は、ＣＤ３リガンドによる過剰な刺激（高濃度、長期間刺激等）が細胞増殖を抑制するためである。これに対して、本発明のＣＩＫ細胞の製造方法は、ＣＤ３リガンドによる刺激〔上記の工程（ａ）；以下、当該工程におけるＣＤ３リガンド刺激を「初期刺激」と記載する〕が与えられた細胞集団をＣＤ３リガンド非存在下で培養〔上記の工程（ｂ）〕した後に、再度ＣＤ３リガンドによる刺激〔上記の工程（ｃ）；以下、当該工程におけるＣＤ３リガンド刺激を「再刺激」と記載する〕を加えることを特徴とする。
【００２０】
なお、初期刺激にＣＤ３リガンドを含有する培地を用いる場合、初期刺激の後に、培地を希釈してＣＤ３リガンドの濃度を細胞増殖抑制作用が認められない程度まで低下させ、さらに細胞集団の培養を継続することにより、上記の工程（ｂ）と同等の効果を得ることができる。すなわち、（Ａ）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団を、ＣＤ３リガンドを含有する培地中で培養する工程、（Ｂ）前記培地のＣＤ３リガンド濃度を低下させる工程、（Ｃ）ＣＤ３リガンド濃度が低下した培地中で細胞集団を培養する工程、及び（Ｄ）培地にＣＤ３リガンドを添加し、さらに細胞集団を培養する工程を含むＣＩＫ細胞の製造方法も、本発明の製造方法の一態様である。本態様の工程（Ａ）は前記の初期刺激、工程（Ｄ）は、前記の再刺激とみなすことができる。上記の工程（Ｃ）における「ＣＤ３リガンド濃度が低下した培地」中のＣＤ３リガンド濃度としては、ＣＤ３リガンドによる細胞増殖抑制作用が認められない濃度であれば特に限定はなく、例えば、工程（Ａ）における培地中のＣＤ３リガンド濃度の約１／５０〜１／２倍の濃度が例示される。
【００２１】
本発明の製造方法に使用される「ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団」としては、末梢血、骨髄、臍帯血等から得ることができる細胞集団、あるいはこれらの材料から分離された血球系細胞の集団が例示される。好ましくは、ＰＢＭＣが本発明に使用される。また、これらの細胞集団から分離されたＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞から実質的になる細胞集団を本発明に使用しても良い。分離は、例えば、セルソーター、磁気ビーズ、アフィニティーカラム等を用いる公知の手法で行うことができる。これらの細胞集団は、生体から採取されたそのまま、もしくは凍結保存されたもののいずれも本発明に使用することができる。また、ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団は、本発明に使用される前にインターフェロン−γ存在下で予め前培養された物であってもよい。
【００２２】
本発明に使用されるＣＤ３リガンドとしては、ＣＤ３に結合活性を有する物質であれば特に限定はないが、例えば、抗ＣＤ３抗体、特に好適には、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、例えば、ＯＫＴ３〔Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．,第１２４巻、第６号、２７０８〜２７１３（１９８０）〕が例示される。
【００２３】
ＣＤ３リガンドの培地中の濃度としては特に限定はなく、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用する場合、初期刺激の際には例えば０．００１〜５００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適であり、再刺激の際には例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．００５〜５０μｇ／ｍＬが好適である。ＣＤ３リガンドは、培地中に溶解して共存させる以外に、適切な固相、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（培養用容器；開放系のもの、及び閉鎖系のもののいずれをも含む）、又はビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は、細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。ＣＤ３リガンドを固相に固定化しておけば、培養終了後、細胞と固相とを分離するのみで前記の成分と得られた細胞集団とを容易に分離することができ、細胞集団への前記成分の混入を防ぐことができる。ＣＤ３リガンドの固定化量は、前記の器材又は担体を培養に供した際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるよう選択されてもよいが、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００２４】
前記の工程（ａ）、すなわち「ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程」の培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。培養期間としては、本発明を特に限定するものではないが、例えば、１〜１０日間、好適には１〜７日間が例示される。また、培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、好適には１×１０４〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０５〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００２５】
前記の工程（ｂ）、すなわち「工程（ａ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンドの非存在下で培養する工程」は、例えば、工程（ａ）により得られた培養物から細胞集団とＣＤ３リガンドとを分離し、さらにＣＤ３リガンド非存在下で当該細胞集団を培養することにより実施される。細胞集団とＣＤ３リガンドとの分離は、特に本発明を限定するものではないが、例えば、工程（ａ）においてＣＤ３リガンドが固定化された細胞培養器材を用いる場合には、細胞集団をＣＤ３リガンドが固定化されていない他の細胞培養器材に移すことにより実施される。また、例えば、工程（ａ）において遊離のＣＤ３リガンドを含む培地を用いる場合には、当該培地をＣＤ３リガンドを含まない培地に交換することにより実施することができる。工程（ｂ）の培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。工程（ｂ）の培養期間としては、本発明を特に限定するものではないが、例えば、１〜２０日間、好適には１〜１０日間が例示される。
【００２６】
前記の工程（ｃ）、すなわち「工程（ｂ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程」は、本発明を特に限定するものではないが、工程（ｂ）により得られた培養物にＣＤ３リガンドを添加することで実施してもよく、工程（ｂ）により得られた培養物をＣＤ３リガンドが固定化された細胞培養器材に移すことで実施してもよい。工程（ｃ）の培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。培養期間としては、本発明を特に限定するものではないが、例えば、１〜２０日間、好適には１〜１５日間が例示される。
【００２７】
また、前記の工程（ｃ）を実施した後に、さらに、工程（ｄ）として「工程（ｃ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンドの非存在下で培養する工程」を実施してもよい。当該工程（ｄ）の培養条件も特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。工程（ｄ）を実施した場合の培養期間としては、特に限定するものではないが、例えば、１〜２０日間、好適には１〜１５日間が例示される。
【００２８】
本発明の製造方法には、培養器材としてシャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等の細胞培養用器材（容器）を使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、好適には閉鎖系で培養が実施される。
【００２９】
本発明の製造方法におけるＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団に対するＣＤ３リガンドによる初期刺激は、本発明を特に限定するものではないが、好適にはフィブロネクチンフラグメントの共存下で行われる。また、ＣＤ３リガンドによる再刺激についてもフィブロネクチンの共存下で行うことができる。
【００３０】
本発明に使用されるフィブロネクチンフラグメントの濃度には特に限定はないが、例えば、０．００１〜５００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜５００μｇ／ｍＬが好適である。フィブロネクチンフラグメントは培地中に溶解して共存させる以外に、細胞培養用器材又は細胞培養用担体に固定化して使用することができる。フィブロネクチンフラグメントの固相への固定化は、例えば、適当な緩衝液に溶解したフラグメントを固相と接触させることにより実施でき、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、又は国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法によっても実施できる。フィブロネクチンフラグメント及びＣＤ３リガンドを固相に固定化しておけば、培養終了後、細胞と固相とを分離するのみで前記の成分と得られた細胞集団とを容易に分離することができ、細胞集団への前記成分の混入を防ぐことができる。
【００３１】
フィブロネクチンフラグメントは、天然から得られたもの（天然のフィブロネクチンを酵素消化により断片化したもの等）、又は組換えＤＮＡ技術により製造されたもののいずれでもよい。フィブロネクチンフラグメントは、例えば、ルオスラーティ  Ｅ．ら〔Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載する「実質的に純粋な形態のフィブロネクチンフラグメント」とは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。本発明において、フィブロネクチンフラグメントは、単一の分子種を使用してもよく、複数の分子種を混合して使用してもよい。
【００３２】
本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメント、ならびに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、例えば、コーンブリット  Ａ．Ｒ．ら〔ＥＭＢＯ  Ｊ．、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、及びセキグチ  Ｋ．ら〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５巻、第１７号、４９３６〜４９４１（１９８６）〕等より得ることができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。
【００３３】
本発明には、細胞接着活性及び／又はヘパリン結合活性を有するフィブロネクチンフラグメントが好適に使用できる。フィブロネクチン中には、細胞表面のインテグリンと結合する活性を有する領域が存在する。前記領域として、ＶＬＡ（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）−４又はＶＬＡ−５結合領域が例示される。フィブロネクチンのＣ末端側寄りの部位にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ここにはＣＳ−１と呼ばれる２５アミノ酸からなる領域が含まれており、当該領域はＶＬＡ−４に対して結合活性を示す。ＣＳ−１領域のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００３４】
また、フィブロネクチンにはＩＩＩ型と呼ばれる繰り返し配列が存在しており、Ｎ末側から１０番目のＩＩＩ型の繰り返し配列には細胞への結合領域が存在している。１０番目のＩＩＩ型の繰り返し配列のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。前記配列中の、ＶＬＡ−５との結合に中心的役割を果たす配列は、配列表の配列番号３に示すＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＲＧＤＳ）の４アミノ酸である。配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列からなるＣ−２７４は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、強い細胞接着活性を有する組換えフィブロネクチンフラグメントである。
【００３５】
さらに、フィブロネクチンはヘパリンと結合する活性を有している。フィブロネクチンのヘパリン結合領域は、前記のＩＩＩ型繰り返し配列のＮ末側から１２番目〜１４番目に相当する。配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列からなるＨ−２７１はこのヘパリン結合領域からなる組換えフィブロネクチンフラグメントである。
【００３６】
本発明には、各領域を単独で含有するフラグメントのほか、これらの領域の２以上が直接、あるいは適切なリンカーを介して結合されたフラグメントを使用することができる。前記フラグメントに含まれるフィブロネクチン由来の領域は同一のものであっても、異なるものであってもよい。複数の結合領域を分子内に有するフィブロネクチンフラグメントとしては、ＶＬＡ−４結合領域及びヘパリン結合領域を含有するＨ−２９６（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）、ＶＬＡ−５結合領域及びヘパリン結合領域を含有するＣＨ−２７１（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）、ＶＬＡ−４結合領域、ＶＬＡ−５結合領域及びヘパリン結合領域を含有するＣＨ−２９６（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）、ＶＬＡ−４結合領域及びＶＬＡ−５結合領域を含有するＣ−ＣＳ１（配列表の配列番号９で表されるアミノ酸配列）等のポリペプチドが例示される。これらの各種ポリペプチドは非特許文献２に記載されており、その開示に従って作製することができる。ＣＨ−２９６は、レトロネクチン（Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ：登録商標）の名称でタカラバイオ社より販売されている。
【００３７】
なお、本発明に使用されるフラグメントとしては、フィブロネクチンフラグメントによる所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフィブロネクチンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるものであってもよい。また、例えば、Ｃ−２７４やＨ−２７１において１又は２のＩＩＩ型繰り返し配列を欠失させたものであってもよい。
【００３８】
細胞接着活性は、本発明で使用されるフラグメント（その細胞結合ドメイン）と細胞との結合を公知の方法でアッセイして調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、第３５２巻、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の結合を測定する方法である。また、ヘパリン結合活性は、本発明に使用されるフラグメント（そのヘパリン結合ドメイン）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法において、細胞の代わりにヘパリン（例えば、標識ヘパリン）を使用することにより、同様の方法でフラグメントとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。
【００３９】
組換えフィブロネクチンフラグメントの本発明への使用は、入手、取り扱いの容易さ以外に、その品質の均一性、ウイルス等の混入の危険性が低いという安全面からも好ましい。本発明に使用されるフィブロネクチンフラグメントの分子量には特に限定はないが、好適には１〜２００ｋＤａ、より好適には５〜１９０ｋＤａ、さらに好適には１０〜１８０ｋＤａである。当該分子量は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定することができる。
【００４０】
本発明のＣＩＫ細胞の製造方法において使用される培地は、（ａ）〜（ｃ）のどの工程についても特に限定はなく、リンパ球の拡大培養等に使用しうる公知の培地を使用することができ、例えば、市販の培地を適宜選択して使用することができる。これらの培地はその本来の構成成分以外にサイトカイン類、適当なタンパク質、又はその他の成分を含んでいてもよい。通常、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２からなる群より選択された少なくとも１種を含有する培地が本発明に使用される。ＩＦＮ−γの培地中の濃度には特に限定はないが、５０〜１００００Ｕ／ｍＬ、より好適には１００〜５０００Ｕ／ｍＬである。ＩＬ−２の培地中の濃度にも限定はないが、１０〜５０００Ｕ／ｍＬ、好適には５０〜２０００Ｕ／ｍＬである。さらに、ＩＬ−１α、ＩＬ−７、ＩＬ−１２等のサイトカイン類を培地に添加してもよい。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００４１】
これらの成分は、前記の工程（ａ）〜（ｃ）のいずれの工程においても使用することができ、本発明を特に限定するものではないが、例えばＩＦＮ−γは前記の工程（ａ）において好適に使用され、ＩＬ−２は前記の工程（ａ）〜（ｃ）の全ての工程において好適に使用される。
【００４２】
また、培地には血清又は血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０容量％超〜２０容量％が例示され、また培養段階に応じて使用する血清又は血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、安全性の観点から自己由来のものが好適である。また、ヒト血清アルブミンのような、単離された血清成分を添加してもよい。
【００４３】
また、培地には増殖能を奪う処理が施された細胞を添加してもよい。本明細書において「増殖能を奪う処理」とは、細胞の増殖能を喪失させるか、もしくは低下させる処理であれば特に限定はなく、例えば、化学的処理及び／又は物理的処理により実施することができる。前記の化学的処理としては、例えば、化学薬剤（ホルマリン等）、抗癌剤（有糸分裂インヒビター、例えば、マイトマイシンＣ等）、加熱・加温、凍結融解又は超音波による処理が例示される。また、前記の物理的処理として、例えば、放射線の照射により前記の処理を実施する場合、例えば、γ線やＸ線が使用される。放射線の照射は照射された細胞の増殖能が失われる量であれば特に限定はないが、例えば、１００〜２００００Ｒ（０．８８〜１７５．４０Ｇｙ）、好ましくは１０００〜８０００Ｒ（８．７７〜７０．１６Ｇｙ）である。本発明の製造方法における培地に増殖能を奪う処理が施された細胞を添加することにより、得られるＣＩＫ細胞の数を増大させることができる。また、肺がん細胞株等に対して高い細胞傷害活性を示す細胞集団を得ることができる。
【００４４】
増殖能を奪う処理が施された細胞は、細胞分裂又はＤＮＡ合成といった増殖に関わる能力を失った、あるいは当該能力が低下した細胞である。例えば、放射線処理を行った細胞は、増殖能が低下しているが、処理直後は生細胞と同様の形態及び形質を示し、サイトカイン等のタンパク質を分泌する代謝能を維持している。「増殖能を奪う処理が施された細胞」は患者自身に由来するものであることが望ましい。本発明に使用される「増殖能を奪う処理が施された細胞」としては、本発明を特に限定するものではないが、放射線の照射によって増殖能を奪う処理を施した、患者自身に由来する細胞（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ−Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ；ＡＩＣ）が好適に例示される。
【００４５】
本発明の方法において使用する「増殖能を奪う処理が施された細胞」の細胞濃度としては、特に限定はないが、例えば、１〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１０〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０２〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００４６】
また、本発明のＣＩＫ細胞の製造方法において使用される培地には、生物応答修飾剤が含まれていてもよい。「生物応答修飾剤」とは、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ（ＢＲＭ）とも呼ばれる、生体において非特異的な免疫応答能を向上させる一群の物質を意味する。
【００４７】
生物応答修飾剤としては、細菌由来製剤［ＯＫ−４３２、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ及びこれらの細胞壁骨格］、担子菌由来多糖（レンチナン、シゾフィラン、ＰＳＫ等）、合成物質（ピランコポリマー、レバミゾール等）、又はサイトカイン類が知られている。「ＯＫ−４３２」とは、Ａ群３型溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の弱毒性自然変異株（Ｓｕ株）をペニシリンで処理した細菌由来製剤の一般名を意味する。本製剤は、ピシバニール（登録商標）の商品名で市販されている。好適な態様において、本発明には微生物由来製剤である生物応答修飾剤が使用され、特に好適にはＯＫ−４３２が使用される。
【００４８】
培地中の生物応答修飾剤の濃度としては、特に本発明を限定するものではないが、例えば、ＯＫ−４３２を使用する場合、０．００１〜１ＫＥ／ｍＬ、好ましくは０．００５〜０．５ＫＥ／ｍＬ、さらに好ましくは０．０１〜０．２ＫＥ／ｍＬが例示される。通常、生物応答修飾剤は、培養開始時に培地に添加され得る。
【００４９】
本発明のＣＩＫ細胞の製造方法において、当該細胞集団に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含することができる。なお、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入対象のＣＩＫ細胞に人為的に導入される遺伝子のことを意味し、遺伝子導入対象の細胞と同種由来のものも包含される。
【００５０】
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、本発明の製造方法における任意の時点で実施することができる。例えば、前記細胞集団の製造と同時もしくは途中で、あるいは該工程の後に実施するのが、作業効率の観点から好適である。遺伝子導入はウイルスベクターを用いて、又はウイルスベクターを用いずに実施することができる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。
【００５１】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が使用される。導入される細胞の染色体ＤＮＡ中にベクターに含まれる外来遺伝子を安定に組み込むことができるレトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターが特に好適である。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際にレトロネクチン（登録商標）などの遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。
【００５２】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法として、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法、あるいはリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ又はＲＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
【００５３】
導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類等のタンパク質をコードするものの以外に、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、リボザイム等をコードするものが使用できる。これら外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下で発現されるようにベクター又はプラスミド等に挿入して使用することができる。また、エンハンサー配列又はターミネーター配列のような制御配列がベクター内に存在していてもよい。
【００５４】
本発明の方法によれば、癌等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子（例えば、多剤耐性遺伝子）を導入してＣＩＫ細胞に薬剤耐性を付与することができる。そのような細胞集団を用いれば、免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子（例えば、チミジンキナーゼ遺伝子）を導入して、ＣＩＫ細胞に該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後の細胞を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。
【００５５】
また、導入される外来遺伝子としては、上記の以外に、例えば、腫瘍抗原特異的なＴ細胞レセプター（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＣＲ）をコードする核酸、あるいは腫瘍細胞上に発現する分子に特異的な抗体（抗ＣＤ１９抗体等）、レセプター分子（ＴＣＲ等）、リガンド、又はこれらの一部分を含む細胞外領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内にシグナルを伝達する他の１種以上のシグナル関連分子の細胞内領域により構成されたキメラレセプターをコードする核酸も利用できる。当該キメラレセプターに関する有用な情報は、例えば、マルク−マリナ  Ｖ．ら〔Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、第９巻、第５号、５７９〜５９１（２００９）〕より得られる。ＣＩＫ細胞に上記のＴＣＲやキメラレセプターをコードする核酸を導入することにより、目的の腫瘍細胞に対して特異的な細胞傷害活性を、ＣＩＫ細胞に付与することができる。前記キメラレセプターの細胞外領域としては、例えば、抗体もしくはレセプター分子の細胞外領域、又は抗体の抗原認識部位もしくはレセプター分子のリガンド認識部位と、他の抗体もしくはレセプター分子（ＣＤ２８等）由来のスペーサー／ヒンジ部位とが融合してなる細胞外領域が例示される。また、前記キメラレセプターの細胞内領域としては、例えば、リンパ球上に存在するシグナル関連分子の細胞内領域が例示される。当該シグナル関連分子の細胞内領域としては、例えば、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ１３４、ＦｃＲ−γ、Ｓｙｋ−ＰＴＫの細胞内領域、又はこれらのシグナル伝達ドメインが例示される。
【００５６】
本発明の製造方法は、前記の方法で得られた細胞集団より、さらに、ＣＤ３陽性かつＣＤ５６陽性の細胞集団を分離する工程を包含してもよい。分離は、例えば、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ５６抗体を用いて、セルソーター、磁気ビーズ、アフィニティーカラム等による公知の手法で行うことができる。こうして分離された細胞集団は高い細胞傷害活性を有する細胞が富化されたものであり、より高い治療効果を発揮することが期待される。
【００５７】
（２）本発明のＣＩＫ細胞
本発明は、上記の本発明のＣＩＫ細胞の製造方法で得ることができるＣＩＫ細胞を提供する。本発明のＣＩＫ細胞は、従来の方法で製造されたＣＩＫ細胞に比べてＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を高比率に含んでいることから、生体内でより強力な細胞傷害活性を発揮することで、高い治療効果を奏する。
【００５８】
本発明のＣＩＫ細胞中のＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞の比率としては、特に本発明を限定するものではないが、例えば、全細胞数の２０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上が例示される。
【００５９】
（３）本発明の医薬
本発明は、ＣＩＫ細胞を有効成分として含有する医薬（治療剤又は予防剤）を提供する。当該ＣＩＫ細胞を含有する前記治療剤は、免疫療法への使用に適している。免疫療法においては、患者の治療に適したＣＩＫ細胞が、例えば、注射又は点滴による投与方法によって、経静脈、経動脈、皮下、腹腔内等の経路で患者に投与される。本発明の治療剤は、本発明を特に限定するものではないが、例えば、癌、白血病、悪性腫瘍、肝炎、感染性疾患（例えば、インフルエンザ、結核、ＡＩＤＳ、ＭＲＳＡ感染症、ＶＲＥ感染症もしくは深在性真菌症）等のＣＩＫ細胞に感受性を有する疾患の治療において非常に有用である。また、当該治療剤は、骨髄移植、放射線照射後等の免疫不全状態での感染症予防又は再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注、抗がん剤治療、放射線治療、抗体療法、温熱療法、他の免疫療法等の従来の治療法と組み合わせて利用できる。
【００６０】
本発明の治療剤及び予防剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により製造された細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合し、点滴剤又は注射剤として調製できる。なお、治療剤における本発明のＣＩＫ細胞の含有量、治療剤の投与量、及び当該治療剤に関する諸条件は、公知の免疫療法に従って適宜決定できる。医薬における本発明のＣＩＫ細胞の含有量としては、特に限定はないが、例えば、好適には１×１０３〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０４〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０５〜２×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、本発明の医薬の投与量としては、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０６〜１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、１×１０７〜５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、さらに好ましくは１×１０８〜２×１０１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。さらに、当該治療剤による免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤治療、放射線治療、又は外科的手術による治療とを併用することもできる。
【００６１】
（４）本発明の治療方法又は予防方法
本発明はまた、対象に、有効量の前述の方法により得ることができるＣＩＫ細胞を投与することを含む、疾患の治療方法又は予防方法を提供する。本明細書中において対象とは、例えば前述のような疾患に罹患した患者を示す。
【００６２】
本明細書中において有効量とは、前記ＣＩＫ細胞を投与した場合に治療もしくは予防効果を発揮しうる当該細胞集団の量である。具体的な有効量は、投与形態、投与方法、使用目的、又は対象の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではない。投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、点滴、注射等により投与すればよい。
【００６３】
また、本発明により、医薬の製造のための本発明により得ることができるＣＩＫ細胞の使用も提供される。さらに、本発明により、疾患の治療に用いるための、本発明により得ることができるＣＩＫ細胞も提供される。当該医薬の製造方法は、前述の医薬と同様に行われる。また、当該医薬の投与される疾患についても、特に限定はないが、前述の医薬と同様である。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。【００６５】
実施例１  抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンを用いたＣＩＫ細胞培養
（１）ＰＢＭＣの分離及び保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーＡ、ドナーＢ及びドナーＣより、それぞれ成分採血を実施した（ここでいう成分採血とは、単核球採取を目的とした採血である）。得られた成分採血液をダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製又は日水製薬社製；以下、ＤＰＢＳと記載する）又は１％ヒト血清アルブミン（製剤名  ブミネート：バクスター社製、以下、ＨＳＡと記載する）を含む生理食塩水（以下、１％ＨＳＡ／生理食塩水と記載する）で約２倍希釈した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ又はＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（いずれもＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）１５ｍＬの上に希釈した成分採血液を３０ｍＬずつそれぞれ重層して、７００×ｇ、室温で２０分間遠心した。遠心後、分離した層のうち、ＰＢＭＣ層をピペットで回収し、ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン社製、シグマ社製又は和光純薬社製）又は１％ＨＳＡ／生理食塩水を用いて４５ｍＬにフィルアップした後、６５０×ｇ、４℃にて１０分間遠心し、上清を除去した。同様の洗浄操作を、６００×ｇ、５００×ｇと段階的に遠心加速度を落としながら計３回行った。【００６６】
こうして各ドナーから採取したＰＢＭＣは、８％ＨＳＡを含むＣＰ−１（極東製薬社製）とＲＰＭＩ１６４０の等量混合液からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。これら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速解凍し、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ（カルビオケム社製）を含むＧＴ−Ｔ５０３（タカラバイオ社製）で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出した後に、以下の各実験に供した。【００６７】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作成
１２穴細胞培養プレート（コーニング社製）に終濃度５μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（製剤名：オルソクローンＯＫＴ３注、ヤンセンファーマ社製）、及び終濃度５μｇ／ｍＬのレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）を含むＡＣＤ−Ａ液（テルモ社製）を０．４５ｍＬ／ウェルずつ添加した。次に、５％ＣＯ２存在下３７℃で５時間インキュベートした後、各ウェルよりＡＣＤ−Ａ液を除去することにより、抗ＣＤ３抗体及びレトロネクチンが固定化された細胞培養プレートを得た。また、終濃度５μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体を含み、レトロネクチンを含まないＡＣＤ−Ａ液を用いる以外は上記と同様の操作を行うことにより、抗ＣＤ３抗体が固定化された細胞培養プレート（レトロネクチンが固定化されていないプレート）も作製した。なお、ここで作製した各プレートは、ＤＰＢＳで２回、及びＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した後に以下の各実験に使用した。【００６８】
（３）ＣＩＫ細胞の培養
０．５％ＨｕｍａｎＡＢ型血清（Ｌｏｎｚａ社製）及び０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３（以下、０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３と記載する）に０．５３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したドナーＡ由来のＰＢＭＣを懸濁した。実施例１−（２）で作成した各種固定化培養プレートに、上記ＰＢＭＣ懸濁液を１ｍＬ／ウェルずつ添加し、さらに０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を０．７５ｍＬ／ウェルずつ添加して、計１．７５ｍＬ／ウェルとした。次に、各ウェルにＩＬ−２（製剤名  プロロイキン：カイロン社製又はノバルティス社製）及びＩＦＮ−γ（製剤名  イムノマックス―γ注：塩野義製薬社製）をそれぞれ終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２存在下３７℃で培養を開始した（培養０日目）。培養４日目に、各ウェルの細胞液の一部を０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を用いて１２．５倍希釈し、希釈液１０ｍＬをＴ−２５細胞培養フラスコ（培養面積１０ｃｍ２、コーニング社製）を立てたものに注ぎ、ここに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した後、このフラスコにて培養を継続した。培養８日目に、各フラスコ内の細胞液の一部を０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を用いて４倍希釈し、希釈液１０ｍＬを新たなＴ−２５細胞培養フラスコ（立てたもの）に注ぎ、ここに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるように遊離の抗ヒトＣＤ３抗体を添加した（抗ヒトＣＤ３抗体再刺激群）。この際、対照群として抗ヒトＣＤ３抗体を添加しない群を設定した。抗ヒトＣＤ３抗体再刺激群及び対照群について培養を継続し、培養１１日目に、各群の各フラスコ内の細胞液の一部を０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を用いて４倍希釈し、希釈液１０ｍＬを新たなＴ−２５細胞培養フラスコ（立てたもの）に注ぎ、ここに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した後、このフラスコにて培養を継続した。【００６９】
培養開始１４日目まで培養を継続し、１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率（総細胞数換算）を算出した。結果を表１に示す。なお、以下の表中、−は無使用、＋は使用を意味する。【００７０】
【表１】
2011052638.tif 000002
【００７１】
（４）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）細胞及びＣＤ８陽性（ＣＤ８＋）細胞含有比率の解析
実施例１−（３）で調製した培養開始後１４日目の細胞について、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率及びＣＤ８＋細胞含有比率をフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００：ベックマンコールター社製）で解析した。すなわち、培養開始後１４日目の細胞をＤＰＢＳで洗浄した後、細胞を１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製、以下、ＢＳＡと記載する）を含むＤＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳと記載する）中に懸濁し、ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８及びＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ５６抗体（全てベックマンコールター社製）を添加した。同様に各細胞集団の一部には、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１（全てベックマンコールター社製）を添加した。各々の抗体を添加後、４℃で３０分インキュベートした。インキュベート後、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ（以下、０．１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳと記載する）で洗浄し、再度ＤＰＢＳに懸濁した。これらの細胞をフローサイトメトリーに供し、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率及びＣＤ８＋細胞含有比率を算出した。結果を表２に示す。【００７２】
【表２】
2011052638.tif 000003
【００７３】
表２に示されるように、抗ヒトＣＤ３抗体を用いた再刺激によってＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞が高い比率で得られた。また、ＣＩＫ細胞の活性本体と言われるＣＤ８＋細胞が高い比率で得られた。また、抗ヒトＣＤ３抗体とレトロネクチンとを組み合わせて細胞集団に初期刺激を与えることによって、これらの効果はさらに高まった。さらに、それらの効果は初期刺激として使用する抗ヒトＣＤ３抗体の固定化濃度に依らず、著効を発揮した。表１に示されるように、高い拡大培養率でありながら、非常に高い比率でＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞を含むＣＩＫ細胞が得られた。【００７４】
このことから本発明の製造方法は、ＣＩＫ細胞の抗腫瘍活性に大きな役割を果たすＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＣＤ８＋細胞が効率よく得られる方法であることが示された。また、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の含有率が高いＣＩＫ細胞を大量に培養できることから、高い治療効果を発揮する細胞集団の製造方法であることが明らかとなった。【００７５】
（５）ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の拡大培養率の評価
実施例１−（１）で調製したドナーＡ由来のＰＢＭＣ、及び実施例１−（３）で調製した培養開始後１４日目の細胞それぞれについて、実施例１−（４）と同様の方法でＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率を測定した。ただし、ＰＢＭＣにおいては赤血球の混入を考慮し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ５６抗体及びＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ４５抗体（全てベックマンコールター社製）を使用し、ＣＤ４５陽性ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞を培養開始時のＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞と定義した。【００７６】
こうして算出されたＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率と実施例１−（３）で算出された拡大培養率（総細胞数換算）とを用いて、培養期間中（１４日間）にＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞が増殖した倍率すなわちＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞拡大培養比率を算出〔下記の式（１）〕した。なお、今回解凍して使用したＰＢＭＣにおけるＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の含有比率（培養開始時のＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率）は１．５４％であった。結果を表３に示す。【００７７】
【数１】
2011052638.tif 000004
【００７８】
【表３】
2011052638.tif 000005
【００７９】
表３に示されるように、抗ヒトＣＤ３抗体とレトロネクチンを組み合わせて細胞集団に初期刺激を与えること、さらには培養途中に抗ヒトＣＤ３抗体を用いて再刺激することによって、培養１４日間でのＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の増殖性が格段に上昇した。また、それらの効果は初期刺激として使用する抗ヒトＣＤ３抗体の固定化濃度に依らず、広い濃度範囲で効果を発揮した。【００８０】
これらのことから、本発明の製造方法によれば、ＣＩＫ細胞の活性成分と考えられているＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞を優位に増殖させることができ、ＣＩＫ細胞の抗腫瘍活性に大きな役割を果たすＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞が効率よく得られることが明らかとなった。【００８１】
実施例２  抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンを用いたＣＩＫ細胞培養（ＩＦＮ−γ添加及びＡｕｔｏｌｏｇｏｕｓ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ使用の比較）
（１）Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ（以下、ＡＩＣと記載する）の調製
実施例１−（１）で調製したドナーＡ由来のＰＢＭＣを０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３に懸濁後、Ｘ線照射装置を使用し３４００Ｒ（２９．８Ｇｙ）のＸ線を照射した（以下、このＸ線照射後の細胞をＰＢＭＣ  ＡＩＣと記載する）。この調製したＰＢＭＣ  ＡＩＣを１．０６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように再度０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３に懸濁した。【００８２】
（２）ＣＩＫ細胞の培養
０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３に１．０６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したドナーＡ由来のＰＢＭＣを懸濁した（ＩＦＮ−γ前日無処理群と記載）。ただし、培養開始前日に同様に調製したＰＢＭＣを一晩ＩＦＮ-γ（終濃度１０００Ｕ／ｍＬ）存在下で培養した後、培養開始時に上記細胞濃度になるように懸濁した群も設定した（以下、ＩＦＮ−γ前日処理群と記載する）。【００８３】
実施例１−（２）と同様の方法で作成した抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレート（ただし、抗ヒトＣＤ３抗体固定化濃度は０．１μｇ／ｍＬとした。）に、上記ＰＢＭＣ（ＩＦＮ−γ前日無処理群）又はＰＢＭＣ（ＩＦＮ−γ前日処理群）を０．８７５ｍＬ／ウェルずつ添加し、さらにＡＩＣを使用する群には実施例２−（２）で調製したＰＢＭＣ  ＡＩＣを０．８７５ｍＬ／ウェルを添加して、計１．７５ｍＬ／ウェルとした。ＡＩＣを使用しない群に対しては、ＡＩＣの代わりに０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を０．８７５ｍＬ／ウェルずつ添加した。各ウェルにＩＬ−２及びＩＦＮ−γをそれぞれ終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２存在下３７℃で培養を開始した（培養０日目）。培養方法は、実施例１−（３）と同様の方法により行い、培養４日目、８日目及び１１日目の希釈、ならびに抗ヒトＣＤ３抗体再刺激群、及び抗ヒトＣＤ３抗体を添加しない群の設定等についても実施例１−（３）と同様に実施した。１４日目まで培養を継続し、培養開始後１１日目及び１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率（総細胞数換算）を算出した。結果を表４に示す。【００８４】
【表４】
2011052638.tif 000006
【００８５】
（３）ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ８＋細胞含有比率の解析
実施例１−（４）と同様の方法で、実施例２−（２）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率及びＣＤ８＋細胞含有比率を解析した。結果を表５に示す。【００８６】
【表５】
2011052638.tif 000007
【００８７】
表５に示されるように、抗ヒトＣＤ３抗体とレトロネクチンを組み合わせて細胞集団に初期刺激を与えること、さらには培養途中に抗ヒトＣＤ３抗体を用いて再刺激することによって、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞が高い比率で得られた。また、これらの効果はＰＢＭＣに対するＩＦＮ−γ処理方法の違い又はＡＩＣ使用の有無に依らず、広く発揮された。このことから、本発明の製造方法は、既存のＣＩＫ細胞培養方法に広く適応可能であり、ＣＩＫ細胞における重要構成成分であるＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞が効率よく得られる方法であることが明らかとなった。【００８８】
（４）ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の拡大培養率の評価
実施例１−（１）で調製したドナーＡ由来のＰＢＭＣ及び細胞実施例２−（２）で調製した培養開始後１４日目の細胞それぞれについて、実施例１−（４）と同様の方法でＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率を測定した。【００８９】
算出されたＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率と実施例２−（２）で算出された拡大培養率（総細胞数換算）を用いて培養期間中（１４日間）にＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞が増殖した倍率（すなわち、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞拡大培養率）を、実施例１−（５）と同様に算出した。なお、培養開始時におけるＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の含有比率は０．６％であった。結果を表６に示す。【００９０】
【表６】
2011052638.tif 000008
【００９１】
表６に示されるように、抗ヒトＣＤ３抗体とレトロネクチンを組み合わせて細胞集団に初期刺激を与えること、さらには培養途中に抗ヒトＣＤ３抗体を用いて再刺激することによって、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の増殖性が格段に上昇し、培養１４日間でのＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞拡大培養率が格段に上昇した。加えて、ＡＩＣを組み合わせることで、その拡大培養率はさらに上昇した。また、これらの効果はＰＢＭＣに対するＩＦＮ−γ処理方法の違いに依らず発揮された。【００９２】
このことから、本発明の製造方法は、ＣＩＫ細胞における重要構成成分であるＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞を効率よく得られる方法であることが明らかとなった。【００９３】
実施例３  抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンを用いたＣＩＫ細胞培養（再刺激時の抗ヒトＣＤ３抗体濃度の比較）
（１）ＰＢＭＣ  ＡＩＣの調製
ＰＢＭＣ  ＡＩＣを、ドナーＡ由来のＰＢＭＣの代わりにドナーＢ由来のＰＢＭＣ又はドナーＣ由来のＰＢＭＣを用いる以外は、実施例２−（１）と同様の方法で調製した。【００９４】
（２）ＣＩＫ細胞の培養
実施例２−（２）と同様の方法でＣＩＫ細胞を培養した。ただし、ＰＢＭＣとしては、ドナーＢ由来のＰＢＭＣ又はドナーＣ由来のＰＢＭＣ（実施例３−（１）で使用したドナーと同じドナー由来ＰＢＭＣを使用）を用い、ＩＦＮ−γ前日処理は行わなかった。また、培養開始８日目の抗ヒトＣＤ３抗体による再刺激の際の抗ヒトＣＤ３抗体の濃度を５０ｎｇ／ｍＬ又は２００ｎｇ／ｍＬとした。【００９５】
培養開始１４日目まで培養を継続し、培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率（総細胞数換算）を算出した。結果を表７に示す。【００９６】
【表７】
2011052638.tif 000009
【００９７】
（３）ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞及びＣＤ８＋細胞含有比率の解析
実施例１−（４）と同様の方法で、実施例３−（２）で調製した培養開始後１４日目の細胞についてＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率を解析した。結果を表８に示す。【００９８】
【表８】
2011052638.tif 000010
【００９９】
表８に示されるように、抗ヒトＣＤ３抗体とレトロネクチンとを組み合わせて細胞集団に初期刺激を与えること、さらには培養途中に抗ヒトＣＤ３抗体を用いて再度刺激することによって、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞が高い比率で得られた。また、これらの効果はドナー又は再刺激時の抗ヒトＣＤ３抗体濃度に依らず発揮された。【０１００】
このことから、本発明の製造方法は、ＣＩＫ細胞における重要構成成分であるＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞が効率よく得られる方法であることが明らかとなった。【０１０１】
（４）ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の拡大培養率の評価
実施例１−（１）で調製したドナーＢ由来のＰＢＭＣ、ドナーＣ由来のＰＢＭＣ及び細胞実施例３−（２）で調製した培養開始後１４日目の細胞それぞれについて、実施例１−（４）と同様の方法でＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率を測定した。【０１０２】
算出されたＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率と実施例３−（２）で算出された拡大培養率（総細胞数換算）とを用いて、培養期間中（１４日間）にＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞が増殖した倍率（すなわち、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞拡大培養率）を実施例１−（５）と同様に算出した。なお、培養開始時におけるＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の含有比率は両ドナーとも１．６２％であった。結果を表９に示す。【０１０３】
【表９】
2011052638.tif 000011
【０１０４】
表９に示されるように、抗ヒトＣＤ３抗体とレトロネクチンを組み合わせて細胞集団に初期刺激を与えること、さらには培養途中に抗ヒトＣＤ３抗体を用いて再度刺激することによって、培養１４日間でのＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の増殖性が格段に上昇した。また、これらの効果はドナーや再刺激時の抗ヒトＣＤ３抗体濃度によらず発揮された。【０１０５】
このことから本発明の製造方法は、ＣＩＫ細胞における重要構成成分であるＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞を効率よく得られる方法であることが明らかとなった。【０１０６】
実施例４  ガス透過性培養バッグを用いたＣＩＫ細胞培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５の作製
培養面積を８６ｃｍ２になるようにシールしたガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標）  ２１５（タカラバイオ社製）に終濃度０．１または０．３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体、及び終濃度５μｇ／ｍＬのレトロネクチン（登録商標）を含むＡＣＤ−Ａ液を１０．４ｍＬ添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で５時間インキュベートした。なお、こうして作製した抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン固定化ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５は、使用直前に１％ＨＳＡ／生理食塩水で３回洗浄した。【０１０７】
（２）ＣＩＫ細胞集団の拡大培養
実施例４−（１）で作製した抗ＣＤ３抗体／レトロネクチン固定化ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  ２１５に、実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを１．２×１０７ｃｅｌｌｓずつ添加し、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＦＮ−γをそれぞれ添加し、０．５％自己血漿（ＰＢＭＣドナー由来の非働化処理済み血漿）及び０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３（以下、０．５％血漿／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３と記載する）を用いて最終的に総液量を４０ｍＬとした。細胞液を添加した培養バッグを５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養を開始した（培養０日目）。培養開始４日目には、培養面積を３００ｃｍ２になるようにシールしたガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標）  Ｅｖａ（タカラバイオ社製）に細胞液２３．４ｍＬを移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した後、０．５％血漿／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を用いて最終的に総液量を３００ｍＬとした。８日目には、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標）  Ｅｖａ内の細胞液７５ｍＬを、新たに培養面積を３００ｃｍ２になるようにシールしたガス透過性培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標）  Ｅｖａに移し替え、０．５％血漿／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を用いて４倍希釈し総液量を３００ｍＬとした後、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。さらに終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるように抗ヒトＣＤ３抗体を添加することで再刺激を行った。１１日目には、０．５％血漿／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を用いて２倍希釈し総液量を６００ｍＬとした後、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養は１５日目まで継続した。培養開始後１５日目にサンプリングした細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。また、実施例１−（４）と同様の方法で、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率を測定した。結果を表１０に示す。【０１０８】
【表１０】
2011052638.tif 000012
【０１０９】
表１０に示されるように、ガス透過性培養バッグを用いて本発明の製造方法を実施しても、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞を高い比率で含有する細胞集団が高い拡大培養率で得られた。また、これらの効果は、初期刺激時の抗ヒトＣＤ３抗体濃度に依らず発揮された。【０１１０】
実施例５  ＯＫ−４３２を用いたＣＩＫ細胞培養（ＡＩＣ有無の比較）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作成
実施例１−（２）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。ただし、抗ヒトＣＤ３抗体は終濃度０．１μｇ／ｍＬとなるようにした。【０１１１】
（２）ＣＩＫ細胞集団の拡大培養
実施例５−（１）で作成した抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを用いて、実施例２−（２）と同様の方法で培養を行った。ただし、ＩＦＮ−γ前日処理群は設定せず、すべての群に終濃度０．０５ＫＥ／ｍＬとなるようにＯＫ−４３２（製剤名  ピシバニール：中外製薬社製）を添加した。また、ＡＩＣ添加の影響についても検討した。培養は１５日目まで継続した。培養開始後１５日目にサンプリングした細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。また、実施例１−（４）と同様の方法で、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率を測定した。結果を表１１に示す。【０１１２】
【表１１】
2011052638.tif 000013
【０１１３】
表１１に示されるように、ＯＫ−４３２を添加した場合においても、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞を高い比率で含む細胞集団が高い拡大培養比率で得られた。また、ＡＩＣを添加することで拡大培養率が大幅に増加した。【０１１４】
（３）細胞傷害活性の測定
実施例５−（２）で調製した培養開始後１５日目の細胞について、細胞傷害活性を測定した。細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ  Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ.  Ｉｍｍｕｎｏｌ.  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。すなわち、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞及び肺がん細胞株Ａ５４９細胞をそれぞれ（１〜２）×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０に懸濁した後で、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。こうして得られた細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄したものを、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。【０１１５】
実施例５−（２）で調製した培養開始後１５日目の細胞をエフェクター細胞として３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ＨｕｍａｎＡＢ型血清、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ  ｍｉｘｔｕｒｅ、１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＬｏｎｚａ社製）、及び１％  ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコＢＲＬ社製）又は１００μｇ／ｍＬ  硫酸ストレプトマイシン（明治製菓社製）を含むＲＰＭＩ１６４０で希釈後、９６穴細胞培養プレート（コーニング社製）の各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注した。続いて、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を、各ウェルに１００μＬずつ添加した。この際、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比、すなわちＥ／Ｔ比は、３０及び１０の２とおりとした。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間インキュベートした。その後、各ウェルから培養上清１００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０：ベルトールド社製）（励起４８５ｎｍ／測定５３５ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「細胞傷害活性（％）」は以下の式（２）に従って算出した。【０１１６】
【数２】
2011052638.tif 000014
【０１１７】
上記式において、最小放出量はＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞のみを含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量はＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。細胞傷害活性測定の結果を表１２に示す。【０１１８】
【表１２】
2011052638.tif 000015
【０１１９】
表１２に示されるように、本発明の製造方法により得られた細胞集団は、高い細胞傷害活性を発揮した。また、ＡＩＣを添加することで、肺がん細胞株に対して高い細胞傷害活性を示す細胞集団が得られることが明らかになった。【０１２０】
実施例６  ＣＩＫ細胞への遺伝子導入
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートの作成
実施例１−（２）と同様の方法で抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチン固定化プレートを作製した。ただし、抗ヒトＣＤ３抗体は終濃度０．３μｇ／ｍＬとなるようにした。【０１２１】
（２）ＡｃＧＦＰ発現レトロウイルスベクタープラスミドの構築
ＡｃＧＦＰ発現ベクターＭＴ−ＡｃＧＦＰを以下のように調製した。ｐＩＲＥＳ２−ＡｃＧＦＰ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、配列表の配列番号１０に記載の核酸配列からなるＡｃＧＦＰ５プライマー及び配列表の配列番号１１に記載の核酸配列からなるＡｃＧＦＰ３プライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅断片をｐＭＴベクター［ジーン  セラピー  第７巻、第７９７−８０４項（２０００）に記載されるｐＭベクター］に挿入してＭＴ−ＡｃＧＦＰプラスミドを調製した。【０１２２】
（３）プロデューサー細胞の作製
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）に含まれているプラスミドｐＧＰ、ｐＥ−ｅｃｏ及び実施例６−（１）で調製したＭＴ−ＡｃＧＦＰで形質転換された２９３Ｔ細胞よりエコトロピックエンベロープを持つレトロウイルスを作製した。得られたレトロウイルスをプロデューサー細胞ＰＧ１３（ＡＴＣＣ＃：ＣＲＬ−１０６８６）に３回感染させた後、限界希釈にて複数のクローンを取得した。リアルタイムＰＣＲによる培養上清中のウイルスＲＮＡ量の測定結果と、上清と接触させた培養細胞についてフローサイトメトリーで測定したＡｃＧＦＰの陽性細胞率の結果を指標に１株のクローンを選択し、これをレトロウイルスベクタープロデューサー細胞として以下の実験に用いた。【０１２３】
（４）ウイルス溶液の調製
実施例６−（３）で作製したプロデューサー細胞の培養上清を除き、ＤＰＢＳで１回洗浄した後、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡで処理して細胞を剥離し、１０％牛胎児血清（インビトロジェン社製）及び５０Ｕ／ｍＬペニシリン／５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（ナカライテスク社製）含有Ｄ−ＭＥＭ（シグマアルドリッチ社製）に懸濁した後、１００ｍｍ  ｄｉｓｈ（イワキ社製）に細胞密度が２５０００細胞／ｃｍ２となるように播種した。２４時間培養した後で培養上清を除き、新たな培地８ｍＬを添加した。さらに２４時間の培養を行い、上清を回収して０．４５μｍのフィルターでろ過し、−８０℃で保存した。【０１２４】
（５）レトロネクチン固定化プレートの作成（遺伝子導入時）
１２穴ノントリートメントプレート（コーニング社製）に終濃度５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体及び終濃度２５μｇ／ｍＬのレトロネクチン（登録商標）を含むＤＰＢＳ液を０．９５ｍＬ／ウェルずつ添加した。次に、５％ＣＯ２存在下３７℃で５時間インキュベートした後、各ウェルよりＤＰＢＳ液を除去することにより、抗ＣＤ３抗体及びレトロネクチンが固定化された細胞培養プレートを得た。なお、ここで作製したプレートは、ＤＰＢＳで３回洗浄した後に以下の各実験に使用した。【０１２５】
（６）遺伝子導入用プレートの作成（ウイルスの固定化）
実施例６−（５）で作製したプレートに実施例６−（４）で作製したウイルス液を１ｍＬ／ウェルずつ添加し、３２℃、１０００×ｇで２時間遠心した。ただし、ウイルス液を添加しないウェルも作製した。このときウイルスを含まないウイルス希釈液（５％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ）を１ｍＬ／ウェルずつ添加し、同様に遠心した。遠心後はウイルス液を吸引除去し、１．５％ＨＳＡを含むＤＰＢＳを１ｍＬ／ウェルずつ添加しすることで、洗浄した。【０１２６】
（７）ＣＩＫ細胞集団への遺伝子導入および拡大培養
実施例６−（１）で作成した抗ヒトＣＤ３抗体及びレトロネクチンの固定化プレートを用いて、実施例２−（２）と同様の方法で培養を行った。ただし、ＩＦＮ−γ前日処理群は設定しなかった。さらに、培養開始４日目に遺伝子導入（以下、１回感染群と記載する）、培養開始４及び５日目に連続して遺伝子導入（以下、２回感染群と記載する）、またそれぞれの感染群に対してウイルスを感染させない非遺伝子導入群（以下、対照群と記載する）を設定した。すなわち、１回感染群では、培養開始４日目に、実施例６−（６）で作製したプレートに細胞液０．４ｍＬを移し、０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を４．６ｍＬ添加し、１２．５倍希釈した後に終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。このプレートにて８日目まで培養を継続した。２回感染群では、培養開始４日目に実施例６−（６）で作製したプレートに細胞液１．５ｍＬを移し、０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を１．５ｍＬ添加し、２倍希釈した後に、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。さらに培養開始５日目に実施例６−（６）で作製したプレートに細胞液０．８ｍＬを移し、０．５％ＨＡＢ／０．２％ＨＳＡ／ＧＴ−Ｔ５０３を４．２ｍＬ添加し、６倍希釈した後に終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。このプレートにて８日目まで培養を継続した。対照群では、１回感染群及び２回感染群ともにウイルスを固定していないプレートを用いて、同様の操作を行った。培養は１４日目まで継続した。培養開始後１４日目にサンプリングした細胞についてトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。また、実施例１−（４）と同様の方法でＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞含有比率を測定した。さらに、遺伝子導入により発現したタンパク質ＡｃＧＦＰの発現率を、遺伝子導入効率としてフローサイトメーターで解析した。結果を表１３に示す。【０１２７】
【表１３】
2011052638.tif 000016
【０１２８】
表１３に示されるように、ＣＩＫ細胞拡大培養時に遺伝子導入を実施しても、高いＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞比率を保ったまま目的とする遺伝子を発現するＣＩＫ細胞が得られた。また、感染回数が多いほど高い遺伝子導入効率が得られることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明により、養子免疫療法に好適な亜細胞集団といわれているＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を高い割合で含有するＣＩＫ細胞を大量に提供することが可能になる。本発明によって得ることができる細胞集団は、養子免疫療法において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１３０】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-10.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin in III-10.
SEQ ID NO:4 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:5 ; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:6 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:7 ; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:8 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named C-CS1.
SEQ ID NO:10 ; Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment encodeing AcGFP.
SEQ ID NO:11 ; Designed oligonucleotide primer to amplify DNA fragment encodeing AcGFP.
【配列表】
2011052638000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月4日(2012.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）〜（ｃ）を包含する、サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法：
（ａ）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンドの非存在下で培養する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞集団をＣＤ３リガンド存在下で培養する工程。
【請求項２】
工程（ａ）〜（ｃ）のうち少なくとも一つの工程における細胞集団の培養が、インターフェロン−γ及び／又はインターロイキン−２の存在下で実施される、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ＣＤ３リガンドが抗ＣＤ３抗体である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
工程（ａ）における培養が、フィブロネクチンフラグメントとＣＤ３リガンドとの共存下で実施される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
フィブロネクチンフラグメントが、下記からなる群より選択される領域を含有する、請求項４に記載の製造方法：
ＶＬＡ−４結合領域；
ＶＬＡ−５結合領域；及び
ヘパリン結合領域。
【請求項６】
下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を包含する、サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法：
（Ａ）ＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞に分化しうる細胞及び／又はＣＤ３陽性ＣＤ５６陽性細胞を含有する細胞集団を、ＣＤ３リガンドを含有する培地中で培養する工程；
（Ｂ）前記培地のＣＤ３リガンド濃度を低下させる工程；
（Ｃ）ＣＤ３リガンド濃度が低下した培地中で細胞集団を培養する工程；及び
（Ｄ）培地にＣＤ３リガンドを添加し、さらに細胞集団を培養する工程。
【手続補正書】
【提出日】平成24年8月15日(2012.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）〜（ｃ）を包含する、サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法：
（ａ）末梢血単核細胞を抗ＣＤ３抗体存在下で培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）により得られた細胞集団を抗ＣＤ３抗体の非存在下で培養する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）により得られた細胞集団を抗ＣＤ３抗体存在下で培養する工程。
【請求項２】
工程（ａ）〜（ｃ）のうち少なくとも一つの工程における細胞集団の培養が、インターフェロン−γ及び／又はインターロイキン−２の存在下で実施される、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
工程（ａ）における培養が、フィブロネクチンフラグメントと抗ＣＤ３抗体との共存下で実施される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
フィブロネクチンフラグメントが、下記からなる群より選択される領域を含有する、請求項３に記載の製造方法：
ＶＬＡ−４結合領域；
ＶＬＡ−５結合領域；及び
ヘパリン結合領域。
【請求項５】
下記工程（Ａ）〜（Ｄ）を包含する、サイトカイン誘導キラー細胞の製造方法：
（Ａ）末梢血単核細胞を、抗ＣＤ３抗体を含有する培地中で培養する工程；
（Ｂ）前記培地の抗ＣＤ３抗体濃度を低下させる工程；
（Ｃ）抗ＣＤ３抗体濃度が低下した培地中で細胞集団を培養する工程；及び
（Ｄ）培地に抗ＣＤ３抗体を添加し、さらに細胞集団を培養する工程。
【国際調査報告】
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