(57)【要約】母体血中に少量含まれる胎児由来有核赤血球を濃縮し回収する方法の提供。  母体血より有核赤血球を濃縮し回収する方法であって、（ｉ）母体血を第１の密度勾配遠心分離に供し、有核赤血球を含む細胞画分を回収し、（ｉｉ）有核赤血球を含む細胞画分において、有核赤血球の密度を選択的に変化させるように処理し、有核赤血球と白血球との密度が重複しないようにし、（ｉｉｉ）処理した有核赤血球を含む細胞画分を第２の密度勾配遠心分離に供し、有核赤血球を含む画分を回収することを含む、有核赤血球を濃縮し回収する方法。
2012023298.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
母体血より有核赤血球を濃縮し回収する方法であって、
（ｉ）母体血を第１の密度勾配遠心分離に供し、有核赤血球を含む細胞画分を回収し、
（ｉｉ）有核赤血球を含む細胞画分において、有核赤血球の密度を選択的に変化させるように処理し、有核赤血球と白血球との密度が重複しないようにし、
（ｉｉｉ）処理した有核赤血球を含む細胞画分を第２の密度勾配遠心分離に供し、有核赤血球を含む画分を回収することを含む、有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項２】
工程（ｉｉ）の有核赤血球の密度を選択的に変化させる処理が、有核赤血球を含む画分を、有核赤血球に対する高張液又は低張液で処理することである、請求項１記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項３】
第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体として、有核赤血球の密度を選択的に変化させることができる液体を用い、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）を同時に行う、請求項１又は２に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項４】
第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体として、有核赤血球の密度を選択的に変化させることができる高張液又は低張液を用い、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）を同時に行う、請求項３記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項５】
工程（ｉ）において、１．０７０〜１．０９５ｇ／ｍＬの密度範囲の血球を回収し、工程（ｉｉ）において、有核赤血球の密度を変化させ、１．０９５ｇ／ｍＬより大きくする、する請求項１〜４のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項６】
密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が、パーコール、フィコール、ショ糖、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）、ＯＰＴＩＰｒｅｐ（商標）及びＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（商標）からなる群から選択される媒体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項７】
第１の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が、浸透圧が２８０±３０ｍＯｓｍであるパーコールであり、第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が浸透圧が３００ｍＯｓｍ以上であるパーコールである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項８】
第１の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体がパーコールであり、第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（商標）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項９】
有核赤血球が胎児由来有核赤血球である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法で回収した有核赤血球を用いて胎児ＤＮＡ診断を行う、胎児ＤＮＡ診断方法。
【請求項１１】
胎児ＤＮＡ診断が、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ＰＥＰ（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ、ＣＧＨ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ＰＲＩＮＳ（ＰＲｉｍｅｄ  ＩＮ  Ｓｉｔｕ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）、ｃｅｌｌ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ、ＤＮＡ  ｃｈｉｐ法、及びこれらの方法を組合せた方法からなる群から選択される方法により行われる、請求項１０記載の胎児ＤＮＡ診断方法。
【請求項１２】
母体血より有核赤血球を濃縮し回収するためのキットであって、
（ａ）有核赤血球と等張の第１の密度勾配遠心分離用媒体、
（ｂ）有核赤血球の密度を選択的に変化させる液体、及び
（ｃ）（ｂ）の高張処理液と等張である第２の密度勾配遠心分離用媒体とを含むか、又は
（ｄ）有核赤血球と等張の第１の密度勾配遠心分離用媒体、及び
（ｅ）有核赤血球の密度を選択的に変化させる液体からなる第２の密度勾配遠心分離用媒体とを含む、有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
【請求項１３】
有核赤血球の密度を選択的に変化させる液体が、有核赤血球に対して高張である高張処理用液である、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
密度勾配遠心分離用媒体が、パーコール、フィコール、ショ糖、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）、ＯＰＴＩＰｒｅｐ（商標）及びＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（商標）からなる群から選択される媒体である、請求項１２又は１３に記載の有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
【請求項１５】
母体血より有核赤血球を濃縮し回収するためのキットであって、
第１の密度勾配遠心分離用媒体として用いるパーコール、
第２の密度勾配遠心分離用媒体として用いるＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（商標）とを含む、有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
【請求項１６】
有核赤血球が胎児由来有核赤血球である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞の分離法に関し、詳細には、血液から有核赤血球を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
出生前の遺伝子診断のために、従来より羊水穿刺により羊水を採取し、羊水中の胎児細胞の染色体を調べる羊水検査が主に行われている。従来の出生前の遺伝子診断法では、母体への肉体的・精神的な負担だけでなく、流産のリスクがあることが大きな問題であった。このような中、母体を循環する血液に胎児細胞（胎児由来の有核赤血球）が移行していることが知られるようになった。この母体血に含まれる胎児由来の有核赤血球を選択的に回収し、胎児の遺伝子を分析すれば、流産のリスク無く安全に出生前診断を行う事ができる。また、この方法を利用する事で、妊娠の初期での胎児遺伝子の診断を実現し、早期治療への足掛かりとする事が期待される。世界規模では、年間約５００万件の出生前の遺伝子診断が実施されており、この安全な遺伝子診断法を実用化できれば、世界市場において高い占拠率を占めることが期待される。しかし、母体血１ｍＬ中に１個程度しか存在しないといわれる胎児由来の有核赤血球を回収するのは容易ではない。有核赤血球の表面の特殊な構造を認識する抗体を利用（抗原抗体反応）した回収方法や、蛍光標識した有核赤血球を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、各血球が発する蛍光を測定することで回収をする方法（ＦＡＣＳ＝ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）などが、各国の研究機関において行われたが、いずれも失敗している。確実性の高い有核赤血球の回収方法として、光学顕微鏡で観察した画像を解析し、検出した有核赤血球を回収する方法が考えられる。高林（金沢医科大学）のＦＤＤ−ＭＢ（登録商標）（Ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ）プロジェクトでは現在、Ｐｅｒｃｏｌｌを用いた密度勾配遠心分離により母体血から胎児由来の有核赤血球を分離し、標本を作製し、これを自動的に画像処理することで、ＮＲＢＣの回収を行っている（非特許文献１及び２を参照）。しかし、有核赤血球を画像処理により検出するには、多くの時間を必要とするのが問題となる。
Ｆｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ等を使った密度勾配遠心による希少細胞の分離が従来から行われている（特許文献１〜６を参照）。しかしながら、それぞれの分離試薬を単独に使用した場合の問題点として、白血球や一部の赤血球と同様の密度（比重）を有核赤血球が持つ（１．０７−１．０８）為に、完全には分離できない事が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１３４４１６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０１４２４６３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７１４，３２５号明細書
【特許文献４】米国特許第６，９４９，３５５号明細書
【特許文献５】米国特許第７，１６６，４４３号明細書
【特許文献６】国際公開第２００８／０４８９３１号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】高林晴夫、遺伝子医学Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３（２００１），ｐ．１０−１１
【非特許文献２】高林晴夫、遺伝子医学Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３（２００１），ｐ．２８−３４
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、母体血中に少量含まれる有核赤血球を、白血球を除いて分離する方法の提供を目的とする。従来から用いられているＦｉｃｏｌｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ等のうち、最も濃縮効率の良かったＰｅｒｃｏｌｌを用いた密度勾配遠心分離でも、有核赤血球は大部分の白血球と同様の比重の分画に出てきてしまい、有核赤血球を豊富に含む分画に、１ｘ１０６個もの白血球が残存することを確認した。これは、図１に示すように、有核赤血球の密度（おおよそ１．０７−１．０９５）が、白血球や一部の赤血球と同様の密度を有するので、完全には分離できないためである。遠心分離後の有核赤血球の豊富な分画に残存する白血球は、その後の赤血球分離チップや、画像処理の時に邪魔になる。さらに、この分画への白血球の混入は、採血から時間が経つと増える傾向にあり、採血サンプルの保存可能時間を決める一つの要因にもなっている。そのため、母体血中の有核赤血球を濃縮する際に、いかにして赤血球の大部分と、特に白血球を除くかが解決すべき課題となる。
本発明者らは、密度勾配遠心分離を用いて母体血から有核赤血球を濃縮し回収する方法について鋭意検討を行った。有核赤血球は、白血球と赤血球の中間的性質を持つことが知られていた。特に、有核赤血球は、パーコールに対しては白血球様の密度を持つことが知られていた。本発明者等は、有核赤血球がフィコール及びＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（ＰＭＰ）に対しては、赤血球と同様に密度を変化させることを見出した。そこで、有核赤血球の密度を変化させないパーコール法で一旦密度遠心分離を行い、これにより大部分の赤血球を除き、その後、有核赤血球の密度を変化させるフィコール液又はＰＭＰ液に作用させることで、有核赤血球の密度を変化させ、再度密度勾配遠心分離を行うことで、有核赤血球を白血球と分離して効率よく濃縮することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  母体血より有核赤血球を濃縮し回収する方法であって、
（ｉ）  母体血を第１の密度勾配遠心分離に供し、有核赤血球を含む細胞画分を回収し、
（ｉｉ）  有核赤血球を含む細胞画分において、有核赤血球の密度を選択的に変化させるように処理し、有核赤血球と白血球との密度が重複しないようにし、
（ｉｉｉ）  処理した有核赤血球を含む細胞画分を第２の密度勾配遠心分離に供し、有核赤血球を含む画分を回収することを含む、有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［２］  工程（ｉｉ）の有核赤血球の密度を選択的に変化させる処理が、有核赤血球を含む画分を、第１の密度勾配遠心分離時よりも高張又は低張の液で処理することである、［１］の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［３］  工程（ｉ）の第１の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離媒体が有核赤血球と等張であり、工程（ｉｉ）の処理が高張液による処理であり、工程（ｉｉｉ）の第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離媒体が工程（ｉｉ）で用いる高張液と等張である、［２］の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［４］  第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体として、有核赤血球の密度を選択的に変化させることができる液体を用い、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）を同時に行う、［１］〜［３］のいずれかの有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［５］  第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体として、有核赤血球の密度を選択的に変化させることができる高張液又は低張液を用い、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）を同時に行う、［４］の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［６］  工程（ｉ）において、１．０７０〜１．０９５ｇ／ｍＬの密度範囲の血球を回収する［１］〜［５］のいずれかの有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［７］  工程（ｉｉ）において、有核赤血球の密度を変化させ、１．０９５ｇ／ｍＬより大きくする、［１］〜［６］のいずれかの有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［８］  密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が、パーコール、フィコール、ショ糖、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）及びＯＰＴＩＰｒｅｐ（商標）からなる群から選択される媒体である、［１］〜［７］のいずれかの有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［９］  第１の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が、浸透圧が２８０±３０ｍＯｓｍであるパーコールであり、第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が浸透圧が３００ｍＯｓｍ以上であるパーコールである、［１］〜［８］のいずれかの有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［１０］  第１の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体がパーコールであり、第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体がＳｏｄｉｕｍ  ｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅを１３．８％（ｗ／ｖ）、Ｄｅｘｔｒａｎ５００を８．０％（ｗ／ｖ）含み、浸透圧が４６０±１５ｍＯｓｍである媒体である、［１］〜［８］のいずれかの有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［１１］  第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（商標）である、［１］〜［８］のいずれかの有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［１２］  母体血より有核赤血球を濃縮し回収する方法であって、
母体血をパーコールを用いた第１の密度勾配遠心分離に供し、有核赤血球を含む細胞画分を回収し、
有核赤血球を含む細胞画分を、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（商標）を用いた第２の密度勾配遠心分離に供し、有核赤血球を含む画分を回収することを含む、有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［１３］  有核赤血球が胎児由来有核赤血球である、［１］〜［１２］のいずれかの有核赤血球を濃縮し回収する方法。
［１４］  ［１］〜［１３］のいずれかの方法で回収した有核赤血球を用いて胎児ＤＮＡ診断を行う、胎児ＤＮＡ診断方法。
［１５］  胎児ＤＮＡ診断が、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ＰＥＰ（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ、ＣＧＨ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ＰＲＩＮＳ（ＰＲｉｍｅｄ  ＩＮ  Ｓｉｔｕ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）、ｃｅｌｌ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ、ＤＮＡ  ｃｈｉｐ法、及びこれらの方法を組合せた方法からなる群から選択される方法により行われる、［１４］の胎児ＤＮＡ診断方法。
［１６］  母体血より有核赤血球を濃縮し回収するためのキットであって、
（ａ）  有核赤血球と等張の第１の密度勾配遠心分離用媒体、
（ｂ）  有核赤血球の密度を選択的に変化させる液体、及び
（ｃ）  （ｂ）の液体と等張である第２の密度勾配遠心分離用媒体とを含む、有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
［１７］  母体血より有核赤血球を濃縮し回収するためのキットであって、
（ａ）  有核赤血球と等張の第１の密度勾配遠心分離用媒体、及び
（ｂ）  有核赤血球の密度を選択的に変化させる液体からなる第２の密度勾配遠心分離用媒体とを含む、有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
［１８］  有核赤血球の密度を選択的に変化させる液体が、有核赤血球に対して高張である高張処理用液である、［１６］又は［１７］の有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
［１９］  密度勾配遠心分離用媒体が、パーコール、フィコール、ショ糖、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）及びＯＰＴＩＰｒｅｐ（商標）からなる群から選択される媒体である、［１６］〜［１８］のいずれかの有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
［２０］  母体血より有核赤血球を濃縮し回収するためのキットであって、
第１の密度勾配遠心分離用媒体として用いるパーコール、
第２の密度勾配遠心分離用媒体として用いるＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（商標）とを含む、有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
［２１］  母体血より有核赤血球を濃縮し回収するためのキットであって、
第１の密度勾配遠心分離用媒体として用いる浸透圧が２８０±３０ｍＯｓｍであるパーコール、
第２の密度勾配遠心分離用媒体として用いる浸透圧が４２０±３０ｍＯｓｍであるパーコールとを含む、有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
［２２］  有核赤血球が胎児由来有核赤血球である、［１６］〜［２１］のいずれかの有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
本発明の方法においては、密度勾配遠心分離を行う際に、母体血中の有核赤血球の密度を選択的に変化させる。例えば、母体血より、胎児由来有核赤血球が濃縮して含まれるが、白血球が少ない画分を得ることができる。該画分より胎児由来有核赤血球を容易に単離同定することが可能であり、単離した胎児由来有核赤血球を用いて胎児の出生前診断を行うことができる。特に単離同定過程で、血球と核の画像より単離同定を行う場合は、本発明により全細胞数を減数せしめ、さらに特に有核赤血球と間違えやすい白血球を除くことは、単離同定過程における作業数や作業時間を大きく改善する効果がある。また、胎児診断において、ＤＮＡの情報に基づく診断を行う場合は、白血球はＤＮＡを持つため、白血球が混入すると、誤診断の率が上がる。本発明により白血球を除くことは、誤診断のリスクを下げ、診断の質を向上させる効果がある。また、通常、母体血を採血後、時間が経つと血球の密度の自然変化により、有核赤血球と同じ密度範囲に属する白血球が多くなり、従来の密度勾配遠心分離法を行った場合、有核赤血球を含む画分への白血球の混入が経時的に多くなる。本発明においては、このような場合でも、有核赤血球の密度を選択的に変化させ白血球の密度範囲と重複しないように処理するため、白血球が混入していない有核赤血球を含む画分を得ることができる。これは、採血後、処理を開始するまでの保存期間を延ばす効果がある。さらに、従来の１回のみ密度遠心分離を行う方法では、白血球の混入をできるだけ避けるため、有核赤血球の回収層として狭い範囲、たとえば１．０７５〜１．０８５［ｇ／ｍＬ］の密度範囲で回収を行っていた。しかし有核赤血球は広い範囲にも分布している。本発明により、白血球の混入なく、より広い密度範囲の有核赤血球が回収でき（図１）、トータルで回収できる有核赤血球の数が増え、診断の成功率や、診断の質を向上させる効果もある。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−１８５６０８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、赤血球、有核赤血球（ＮＲＢＣ）及び各種白血球の密度範囲を示す図である。図１中、「従来の回収領域」で示される密度範囲は、パーコール液を用いた１回の密度勾配遠心分離を行う従来法において有核赤血球を含む画分として回収する密度範囲を示し、「本発明の回収領域」で示される密度範囲は、２度の密度勾配遠心分離を行う本発明の方法において、有核赤血球を含む画分として回収する密度範囲を示す。
図２は、臍帯血を密度勾配遠心分離にかけ、それぞれの密度層の血球の数をカウントした結果を示す図である。
図３は、母体血をＰｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離をした場合の、分離を示す図である。
図４は、Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた密度勾配遠心分離を行い回収した有核赤血球を含む画分をさらにＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて密度勾配遠心分離をした場合の、分離を示す図である。
図５は、Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた密度勾配遠心分離で得られた有核赤血球を含む画分の染色像（Ａ）及びＰｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った後、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて密度勾配遠心分離を行って得られた有核赤血球を含む画分のＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色の結果（Ｂ）を示す図である。
図６は、保存日数ごとで有核赤血球画分に混入する白血球数を示す図である。
図７は、Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた密度勾配遠心分離のみを行った場合と、Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った後、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて密度勾配遠心分離を行った場合の回収できた有核赤血球数の比較を示す図である。
図８は、等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った後、高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行って得られた有核赤血球を含む画分のＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色像を示す図である。
図９は、母体血を、Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った後、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて密度勾配遠心分離を行って得られた有核赤血球を含む画分のＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色像を示す図である。
図１０は、母体血を等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った後、高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った場合の等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた遠心分離後の試料に対する高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた密度勾配遠心分離後の試料の白血球の除去率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、母体血とは、妊婦の末梢血を言う。
母体血中には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球や成熟赤血球の他、胎児由来の未熟な有核赤血球（ＮＲＢＣ）、胎児由来の白血球が含まれている。また、母体由来の未熟な有核赤血球も含まれていることがある。胎児由来の有核赤血球は、妊娠４〜８週程度で母体血中に出現する。従って、本発明も妊娠４〜８週以降の妊産婦を対象とし、好ましくは妊娠４〜３７週の妊婦から採取する。母体末梢血中に含まれる胎児由来有核赤血球は、母体血１ｍｌ中に１個程度と極めて少なく、母体血細胞中の胎児由来赤血球の数は血球１０７〜１０９程度につき１個程度である。
本発明の方法により、母体血中の有核赤血球を含む画分を分離し、胎児由来有核赤血球を濃縮し回収することができる。本発明において、単に「赤血球」という場合、成熟した赤血球を言い、有核赤血球とは区別される。
本発明において、濃縮し回収するとは、母体血から有核赤血球が濃縮された状態で含まれる画分を得ることをいい、濃縮する、回収する、分離する、分離し回収する、ということもできる。有核赤血球が濃縮された状態で含まれる画分中には、母体血に存在していた赤血球の大部分が除かれており、また、白血球の数も大幅に減少している。好ましくは白血球は実質的に含まれず、さらに好ましくは白血球は含まれない。
個体差はあるが、通常母体血（妊婦末梢血）１０ｍＬ中に、有核赤血球約１０個、赤血球約４×１０１０個、白血球約８×１０７個程度含まれる。パーコールのみを用いた１回の密度勾配遠心分離を行った場合（従来法）、有核赤血球が含まれる画分中に、約１０個の有核赤血球、約４×１０６個の赤血球、約１×１０５個〜約２×１０７個の白血球が含まれる。一方、本発明の方法により得られた有核赤血球を含む画分中には、条件によっても異なるが、約１０個の有核赤血球、約４×１０６個の赤血球、約１０個〜５×１０６個の白血球が含まれる。すなわち、本発明の方法により、白血球数を約１０〜１０７分の１程度に減らすことができ、従来法に比べても約２〜１０６分の１程度に減らすことができる。
胎児由来の有核赤血球を用いて遺伝子や染色体の解析を行う場合、胎児由来有核赤血球とそれ以外の血球とを区別し、胎児由来有核赤血球を血球群の中から単離同定する必要がある。例えば、スライドガラスを用いて血液の塗沫標本を作成し、光学顕微鏡画像を得て、画像解析を行い、核染色や形態により母体の赤血球や白血球と区別し、有核赤血球を同定し、有核赤血球を単離する方法が知られていた。しかしながら、白血球は核を有しており、また有核赤血球に類似した形態を有するものが存在し、画像解析では有核赤血球と白血球を完全に区別することは困難であった。また、母体血をそのまま画像診断に供する場合、胎児由来の有核赤血球の少なさから、多数の血球の中から有核赤血球を同定するまで長大な時間を要していた。本発明により、母体血から、大部分の赤血球を除き、少なくとも白血球を大幅に減少させ、好ましくは白血球を含まない、有核赤血球が濃縮されて含む画分を得ることができる。この結果、得られた画分において、容易に有核赤血球を他の細胞と区別し、単離同定することが可能になる。すなわち、本発明の方法により、母体血より胎児由来有核赤血球を分離回収することができる。また、胎児由来有核赤血球が含まれる画分に母体由来の有核赤血球が含まれる場合、有核赤血球のＤＮＡを解析することにより両者は容易に区別することができ、胎児由来有核赤血球を単離同定することが可能である。母体血中の有核赤血球画分中には、胎児由来有核赤血球と同数程度の母体由来有核赤血球が含まれることがある（Ｓｅｋｉｚａｗａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ  ２００７；２７：８４６−８４８）。このように母体由来有核赤血球が含まれている場合でも、本発明の方法により、全体の細胞に対して、有核赤血球を濃縮し回収することができるので、得られた画分中の有核赤血球の数は飛躍的に大きくなり、その中から胎児由来有核赤血球を母体由来有核赤血球と区別して単離同定することは容易である。
母体の赤血球等の密度は、赤血球が１．０７０〜１．１２０ｇ／ｍＬ程度、好酸球は１．０９０〜１．１１０ｇ／ｍＬ程度、好中球は１．０７５〜１．１００ｇ／ｍＬ程度、好塩基球が１．０７０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、リンパ球が１．０６０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、単核球が１．０６０〜１．０７０ｇ／ｍＬ程度である（図１）。一方、胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度であり、胎児由来有核赤血球と母体由来の赤血球や一部の白血球の密度範囲が重なる。血球の密度は、例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌを用いた密度勾配遠心分離により決定することができる。なお、密度は特に指定の無い限り２０℃のものを用いる。
最初に、母体血を密度勾配遠心分離にかけ、母体血に含まれる血球をその密度により分離する。本発明においては、この最初の密度勾配遠心分離を第１の密度勾配遠心分離という場合がある。密度勾配遠心分離法は、遠心管内の溶液に、通常は底部から上部に向かって密度を低下させ、その中で試料を遠心分離すると、目的とする物質や細胞が一定の密度溶液のところで層を形成することを利用して目的物を分取する方法をいう。密度勾配遠心分離により、有核赤血球を含む画分を有核赤血球を含まない画分から分離することができる。密度勾配遠心分離を行った後、有核赤血球を含む密度範囲の血球を回収することにより、胎児由来有核赤血球が濃縮されて含む画分を得ることができる。有核赤血球の密度は、本発明者らの検討によると１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度であるので、１．０６０〜１．１００ｇ／ｍＬ、好ましくは１．０７０〜１．０９５ｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１．０７０〜１．０８５ｇ／ｍＬ、特に好ましくは１．０７５〜１．０８５ｇ／ｍＬの密度の血球を回収する。この密度勾配遠心分離により有核赤血球を含む画分と密度の小さい白血球を含む画分及び密度の大きい赤血球や好酸球を含む画分を分離することができる。特に最も数の多い母体由来赤血球の大部分を除くことができる。回収は、例えばピペットを用いて行うことができる。この際、回収する密度の範囲を大きくすると有核赤血球の回収率は高まるが、上記のように、胎児由来有核赤血球と母体由来の赤血球や白血球とは部分的に密度範囲が重なるので、母体由来の血球の混入も多くなる。本発明においては、上記の第１の密度勾配遠心分離によって、母体血中の血球が混入したとしても、その後の分離工程で胎児由来有核赤血球を含む画分から除くことが可能である。
第１の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離媒体としては、２０℃において密度が１．０５０〜１．１００ｇ／ｍＬ程度である媒体を用いることができる。このような媒体として、パーコール（ポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シリカ製品）、フィコール（ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合物）、ショ糖、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）（Ｎ，Ｎ’−Ｂｉｓ（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）−５−［Ｎ−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｏ］−２，４−６−ｔｒｉｉｏｄｏ−ｉｓｏｐｈｔｈａｌａｍｉｄｅ）、ＯＰＴＩＰｒｅｐ（商標）（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌの６０％水溶液）、等を用いることができる。パーコールとしては、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）、フィコールとしては、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ファルマシアバイオテク株式会社）、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）、リンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（登録商標）（ニコメッド）等の市販の製品を用いることができる。この中でも、パーコールを好適に用いることができる。第１の密度勾配遠心分離の際には、血球と密度勾配遠心分離媒体を混合したときに有核赤血球の密度（比重）が変化しないことが必要である。従って、媒体は、浸透圧が有核赤血球等の血球と等張になるように調節して用いる。この際の浸透圧は約２８０ｍＯｓｍである。浸透圧は例えば塩化ナトリウムを用いて調節することができ、媒体としてパーコールを用いる場合、あらかじめ生理食塩水の浸透圧より高い浸透圧になるように高い濃度で調製した塩化ナトリウム溶液やリン酸緩衝食塩水をパーコールに浸透圧が生理食塩水の浸透圧（約２８０ｍＯｓｍ、例えば、２８０±２０ｍＯｓｍ又は２８０±１０ｍＯｓｍ）と同じになるように混合すればよい。また、用いる媒体の密度も適宜調節することができる。例えば、パーコールを用いる場合、パーコールの密度を調節し、１．０７０ｇ／ｍＬのパーコール液と１．０９５ｇ／ｍＬのパーコール液を調製し、両者を重層して遠心分離した場合、１．０７０ｇ／ｍＬの層と１．０９５ｇ／ｍＬの層の中間に有核赤血球を含む画分の層ができるので、この層を回収すればよい。この場合、母体由来赤血球は密度が大きいので底に沈み、白血球の多くは密度が小さいので、媒体表面に層ができ、有核赤血球を含む層と分離することができる。一方、例えば、１．０９５ｇ／ｍＬのパーコール液のみを重層せずに用いてもよい。この場合、母体由来赤血球は底に沈み、白血球と有核赤血球は媒体表面に層を形成する。有核赤血球と白血球は分離できないが、本発明のその後の分離工程で有核赤血球と白血球を分離することができる。
遠心分離は、媒体上に母体血を重層して行えばよい。遠心分離は、例えば１４４０〜２４００Ｇで、好ましくは７５０〜１８００Ｇで、さらに好ましくは７８０Ｇで、２０〜４０分行う。密度勾配遠心分離に用いる遠心チューブは、例えば市販のディスポーザブル遠沈管等を用いることができる。
次いで、密度勾配遠心分離により回収した有核赤血球を含む画分中に含まれる血球（有核赤血球、（無核の）成熟赤血球及び白血球）のうち、選択的に有核赤血球の密度を変化させる。無核の赤血球の密度は同時に変化しても良いが、白血球の密度はなるべく変化しないような条件を選択することが好ましい。有核赤血球の密度は、密度勾配遠心分離により回収した画分を有核赤血球の密度を変化させ得る液体に接触させることにより、選択的に変化させることができる。有核赤血球の密度を変化させ得る液体としては、例えば、有核赤血球に対して高張又は低張の高張液又は低張液が挙げられ、有核赤血球を含む画分を高張液又は低張液に接触させ、高張処理又は低張処理を行うことにより、有核赤血球の密度を選択的に変化させることができる。有核赤血球は、膜を通して水が移動し易いので、高張液（生理食塩水より浸透圧が大きい液）に接触させた場合、血球内から水が排出され密度が上昇し、低張液（生理食塩水より浸透圧が小さい液）に接触させた場合、血球内に水が浸入し密度が低下する。一方、白血球は高張液や低張液と接触させても、密度は変化しにくい。密度は、密度勾配遠心分離により回収した画分中の有核赤血球の密度が該画分に混入している白血球の密度と変わるように変化させる。好ましくは、高張液と混合し、有核赤血球の密度を上昇させる。なお、この際に有核赤血球を含む画分には、成熟赤血球が混入している場合、該赤血球は高張液又は低張液処理した場合に有核赤血球と同様の挙動を示し、最終的に有核赤血球と同じ分画に含まれてくる。ただし、成熟赤血球は有核赤血球と形態的にもあるいは核染色によっても容易に区別することができるので、量的に多過ぎなければその後の遺伝子解析等に対する問題とはならない。
有核赤血球の密度を変化させるために用いる液としては、塩化ナトリウム溶液やショ糖溶液を用いればよい。例えば、高張処理を行う場合、第１の密度勾配遠心分離により回収した有核赤血球を含む画分を２８０ｍＯｓｍを超える浸透圧、例えば３００ｍＯｓｍ以上、好ましくは３０８ｍＯｓｍ以上、さらに好ましくは３１０ｍＯｓｍ以上、あるいは、３００〜３３０ｍＯｓｍ、好ましくは３０８ｍＯｓｍ〜３３０ｍＯｓｍ、さらに好ましくは３１０〜３３０ｍＯｓｍ、あるいは３５０〜６００ｍＯｓｍ、さ好ましくは４００〜４５０ｍＯｓｍの高張液で処理すればよい。例えば、０．９％を超える塩化ナトリウム溶液、好ましくは１．０〜２．０％、さらに、好ましくは１．０〜１．５％の塩化ナトリウム溶液と混合し、数分〜数十分静置すればよい。時間が長すぎると白血球の密度も変化するので、適切な時間を選ぶことが重要である。なお第２の遠心分離の最中も、第２の遠心分離液の性質に応じて密度が変化することに注意する必要がある。第２の遠心分離後に適切な結果が得られるように、浸透圧と時間を調整する。
また、有核赤血球の赤血球膜に、結合により有核赤血球の密度を変化させ得る物質を結合させることによっても、有核赤血球の密度を選択的に変化させることができる。有核赤血球の密度を変化させ得る物質として、デキストラン又はその誘導体が挙げられる。デキストランとして、例えば、デキストラン５００が挙げられ、デキストラン誘導体として、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン等が挙げられる。デキストランを結合させるためには、例えば、有核赤血球を含む画分に、デキストラン濃度が１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜１５％（ｗ／ｖ）になるようにデキストランを添加すればよい。
密度勾配遠心分離により回収した画分の有核赤血球の密度を選択的に変化させたのち、再度密度勾配遠心分離を行う。本発明において、この２回目の密度勾配遠心分離を第２の密度勾配遠心分離という場合がある。第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離媒体としては、第１の密度勾配遠心分離に用い得る媒体と同じ媒体を用いることができる。また、実際に第１の密度勾配遠心分離に用いた媒体と同じ媒体を用いてもよい。この際の媒体の浸透圧は、密度勾配遠心分離により回収した画分の有核赤血球の密度を選択的に変化させる際に用いた液の浸透圧と同等に調節するのが好ましい。
有核赤血球の密度が選択的に変化し、白血球の密度と変わっているため、密度勾配遠心分離により、有核赤血球と白血球を分離することができる。このとき第１の密度勾配遠心分離により有核赤血球を含む画分として回収した細胞層の密度範囲と重複しないように変化させればよい。例えば、第１の密度勾配遠心分離後に１．０７０〜１．０９５ｇ／ｍＬの密度範囲の細胞を有核赤血球を含む画分として回収した場合、高張処理又は低張処理により、１．０７０ｇ／ｍＬより小さい密度又は１．０９５ｇ／ｍＬより大きい密度に変化させればよい。同様に、第１の密度勾配遠心分離後に１．０７０〜１．０８０ｇ／ｍＬの密度範囲の細胞を有核赤血球を含む画分として回収した場合、高張処理又は低張処理により、１．０７０ｇ／ｍＬより小さい密度又は１．０８０ｇ／ｍＬより大きい密度に変化させればよい。遠心分離後、密度を変化させた有核赤血球が存在する密度範囲の血球層を回収することにより、有核赤血球が濃縮され多く含まれる画分を得ることができる。この際、用いる密度勾配遠心分離媒体の密度を調節し、密度を変化させた有核赤血球が遠心管の底に沈むようにしてもよい。第２の遠心分離の最中にも、血球の密度は変化する。選択性を最大にするには、第２の遠心分離の時間も重要である。第２の遠心分離の時間は、密度を変化させる液に依存するが、４２０ｍＯｓｍの高張液を用いた場合は、密度を変化させる処理と合わせた時間が１０〜６０分、好ましくは２０〜４０分である。また、３００ｍＯｓｍ以上の高張液を用いた場合も、密度を変化させる処理と合わせた時間が１０〜６０分、好ましくは２０〜４０分である。
また、第２の密度勾配遠心分離に用いる媒体として、上記の有核赤血球の密度を選択的に変化させ得る性質を持った媒体を用いることもできる。この場合、媒体上に第１の密度勾配遠心分離で回収した有核赤血球を含む分画を、必要に応じて洗浄処理を行った後、第２の密度勾配遠心分離媒体に重層し、第２の密度勾配遠心分離を開始すればよい。このような媒体を用いることにより、第１の密度勾配遠心分離の後の、有核赤血球の密度を変える工程と第２の密度勾配遠心分離工程を同時に行うことができる。ここで、同時とは血球の回収操作等を行うことなしに、密度の変化と密度勾配遠心分離を行うことをいう。例えば、有核赤血球に対して高張の高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を調節し、該高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液に有核赤血球を含む画分を重層した後、密度勾配遠心分離を行えばよい。この際、ＮａＣｌ添加量により浸透圧を調節することができる。このときの浸透圧は２８０ｍＯｓｍを超える浸透圧、例えば３００ｍＯｓｍ以上、好ましくは３０８ｍＯｓｍ以上、さらに好ましくは３１０ｍＯｓｍ以上、あるいは、３００〜３３０ｍＯｓｍ、好ましくは３０８ｍＯｓｍ〜３３０ｍＯｓｍ、さらに好ましくは３１０〜３３０ｍＯｓｍ、あるいは、３５０〜６００ｍＯｓｍ、好ましくは４００〜４５０ｍＯｓｍである。さらに、この際、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（商標）（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ社）を用いてもよい。Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐは、Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅを１３．８％（ｗ／ｖ）、Ｄｅｘｔｒａｎ５００を８．０％（ｗ／ｖ）含む媒体であり、浸透圧は４６０±１５ｍＯｓｍ、密度は２０℃で１．１１３±０．００１ｇ／ｍＬである。Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐは、有核赤血球よりも高張なため、有核赤血球の密度を高くなるように変化させ得る。或いは、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐは、デキストランを含むためデキストランが有核赤血球の膜に結合し、有核赤血球の密度を変化させ得る。具体的には、第１の密度勾配遠心分離後に回収した胎児由来有核赤血球を含む画分を、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液上に重層する。前記画分中の有核赤血球は遠心分離中に画分中を沈み下層のＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液と接触し、密度が変化する。これにより、有核赤血球と白血球を分離することができる。有核赤血球は遠心管の底に沈降するので容易に回収することができる。
なお、このトータル２工程で行う方法では、上層に均一に存在している血球は、遠心分離を開始してから沈降を始め、下層と接触して初めて密度を変化させるため、上層の上部にいた血球は上層の下部にいた血球より、密度を変化させる液に接している時間が短くなるため、結果のばらつきにつながる。第２の密度勾配遠心分離を行う前に、浸透圧を調節した液と混合し、密度を変化させるトータル３工程で行う場合、密度を変化させる時間を正確に一定に保つことができるので、再現性が良くなる。
上記方法により得た画分には、胎児由来の有核赤血球が濃縮され高密度で含まれる。胎児由来の有核赤血球の密度は、処理前の母体血中の胎児由来有核赤血球よりはるかに高い。例えば、本発明の方法により得られた画分中の総血球数に対する有核赤血球数の比は、元の母体血の４千倍〜数万倍である。
得られた有核赤血球を高密度で含む分画から胎児由来有核赤血球を単離同定し、該胎児由来有核赤血球を用いて、胎児のＤＮＡ情報や染色体情報を得ることができる。これらのＤＮＡ情報や染色体情報に基づいて胎児の出生前診断を行う。ここで、ＤＮＡ情報とは一塩基多型（ＳＮＰ）に代表されるＤＮＡ多型等のＤＮＡ配列情報をいい、染色体情報はトリソミー等の染色体の異常などをいう。該画分が胎児由来有核赤血球のみを含む場合は、含まれている細胞をそのまま出生前診断に用いればよい。母体血由来の赤血球や白血球が含まれている場合は、前記画分中の血球から有核赤血球を同定し、又はさらに単離すればよい。単離同定した胎児由来有核赤血球は、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ＰＥＰ（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ、ＣＧＨ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ＰＲＩＮＳ（ＰＲｉｍｅｄ  ＩＮ  Ｓｉｔｕ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）、ｃｅｌｌ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ、ＤＮＡ  ｃｈｉｐ法やこれらの方法を組合わせた方法により単一細胞レベルでＤＮＡ分析することができる。
例えば、得られた有核赤血球を含む画分をスライドガラス上に塗付して塗沫標本を作製し、必要に応じてＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色等により染色し、画像処理を行い、血球の形状や染色状況からスライドガラス上に存在する有核赤血球を同定することができる。このようにして同定した有核赤血球についてスライドグラス上でＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法により遺伝子や染色体の解析を行うことができる。また、同定した有核赤血球より遺伝子を単離し、ＳＮＰ等の変異解析を行うこともできる。これらの解析手法は、例えば、高林晴夫、遺伝子医学Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３（２００１），ｐ．１０−１１や高林晴夫、遺伝子医学Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３（２００１），ｐ．２８−３４に記載の方法に従って行うことができる。得られた有核赤血球を高密度で含む画分をスライドガラス上に塗布し塗沫標本を作製し画像処理をする場合、従来の方法に比べて、調製するスライドガラスの枚数が減る。また、白血球の混入がほとんどないので、容易に有核赤血球を見つけることができるので、目視により有核赤血球を見つける場合も、ソフトウェアにより見つける場合も、有核赤血球の同定にかかる時間を大幅に短縮することができ、例えば、従来法に比べ１０倍以上短縮することができる。
上記のような、母体血から得られた胎児有核赤血球を含む画分を用いて、胎児のＤＮＡ分析を行う手法を母体血による胎児ＤＮＡ診断（Ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｆｒｏｍ  Ｍａｔｅｒｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ：ＦＤＤ−ＭＢ（登録商標））という。
通常、母体血を採血後、時間が経つと血球の密度の自然変化により、有核赤血球と同じ密度範囲に属する白血球が多くなり、従来の密度勾配遠心分離法を行った場合、有核赤血球を含む画分への白血球の混入が経時的に多くなる。本発明の方法により、有核赤血球の密度を選択的に変化させ白血球の密度範囲と重複しないようにできるため、採血後、処理を開始するまでの、血液試料の保存期間を延ばすことができる。本発明は、血液試料の保存期間を延ばす方法をも包含する。
本発明は、母体血より有核赤血球を分離回収するためのキットを包含し、該キットを用いて上記の母体血より有核赤血球を分離回収する方法を行うことができる。
該キットは、有核赤血球と等張の第１の密度勾配遠心分離用媒体、有核赤血球の密度を選択的に変化させ、有核赤血球と白血球との密度が重複しないようにするための液体、及び第２の密度勾配遠心分離用媒体とを含む。ここで、当該有核赤血球の密度を選択的に変化させ、有核赤血球と白血球との密度が重複しないようにするための液体は、第２の密度勾配遠心分離用媒体と兼ねることもできる。胎児由来有核赤血球と母体由来白血球との密度が重複しないようにするための液体としては、例えば、有核赤血球に対して高張である高張処理用液を用いることができる。また、結合により有核赤血球の密度を変化させ得る物質の溶液であってもよい。第１の密度勾配遠心分離用媒体は有核赤血球に対して等張であり、第２の密度勾配遠心分離用媒体は、好ましくは高張処理用液と等張である。さらに、有核赤血球の密度を変化させ得る物質として、デキストラン又はその誘導体が挙げられる。デキストランとして、例えば、デキストラン５００が挙げられ、デキストラン誘導体として、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン等が挙げられる。デキストラン溶液は、例えば、有核赤血球を含む画分に混合したときに、デキストラン濃度が１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは２〜１５％（ｗ／ｖ）になるような濃度で用いればよい。
密度勾配遠心分離用媒体としては、パーコール（ポリビニルピロリドンの被膜を有するコロイド状シリカ製品）、フィコール（ショ糖とエピクロロヒドリンの共重合物）、ショ糖、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）（Ｎ，Ｎ’−Ｂｉｓ（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）−５−［Ｎ−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｏ］−２，４−６−ｔｒｉｉｏｄｏ−ｉｓｏｐｈｔｈａｌａｍｉｄｅ）、ＯＰＴＩＰｒｅｐ（商標）（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌの６０％水溶液）、等を用いることができる。パーコールとしては、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）、フィコールとしては、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ファルマシアバイオテク株式会社）、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）、リンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（登録商標）（ニコメッド）等の市販の製品を用いることができる。これらの密度勾配遠心分離用媒体は、ＮａＣｌ溶液を添加する等により浸透圧を調節することができる。有核赤血球と等張の液の浸透圧は生理食塩水の浸透圧と同じであり、約２８０ｍＯｓｍである。また、これらの媒体の密度も適宜調節することができる。
例えば、パーコールを第１の密度勾配遠心分離用媒体として用いる場合、１．０７０ｇ／ｍＬのパーコール液と１．０９５ｇ／ｍＬのパーコール液を用いれば、密度勾配遠心分離後両者の中間層に有核赤血球が存在する。また、例えば、１．０９５ｇ／ｍＬのパーコール液のみを重層せずに用いれば、有核赤血球は媒体表面に存在する。
有核赤血球の密度を選択的に変化させ、有核赤血球と白血球との密度が重複しないようにするための有核赤血球に対して高張である高張処理用液としては、塩化ナトリウム溶液やショ糖溶液が挙げられる。この場合、２８０ｍＯｓｍを超える浸透圧、例えば３００ｍＯｓｍ以上、好ましくは３０８ｍＯｓｍ以上、さらに好ましくは３１０ｍＯｓｍ以上、あるいは、３００〜３３０ｍＯｓｍ、好ましくは３０８ｍＯｓｍ〜３３０ｍＯｓｍ、さらに好ましくは３１０〜３３０ｍＯｓｍ、あるいは、３５０〜６００ｍＯｓｍ、さらに好ましくは４００〜４５０ｍＯｓｍの高張液を用いればよく、例えば、０．９％を超える塩化ナトリウム溶液、好ましくは１．０〜２．０％、さらに、好ましくは１．０〜１．５％の塩化ナトリウム溶液が挙げられる。
第２の密度勾配遠心分離用媒体としては、上記の第１の密度勾配遠心分離用媒体として用い得る媒体を適宜浸透圧密度を調節して用いればよい。また、上記の有核赤血球の密度を選択的に変化させ、有核赤血球と白血球との密度が重複しないようにするための液体が第２の密度勾配遠心分離用媒体であってもよい。このような第２の密度勾配遠心分離用媒体として、例えば、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（商標）（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ社）を用いることができる。Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐは、Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｉａｔｒｉｚｏａｔｅを１３．８％（ｗ／ｖ）、Ｄｅｘｔｒａｎ５００を８．０％（ｗ／ｖ）含む媒体であり、浸透圧は４６０±１５ｍＯｓｍ、密度は２０℃で１．１１３±０．００１ｇ／ｍＬである。また、浸透圧を調節したパーコール、フィコール、ショ糖、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標）、ＯＰＴＩＰｒｅｐ（商標）等を用いることもできる。
さらに、本発明のキットにより、採血後、処理を開始するまでの、血液試料の保存期間を延ばすことができる。本発明は、血液試料の保存期間を延ばすためのキットも包含する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００８】
有核赤血球の密度の決定
本実施例においては、サンプルとして有核赤血球が多く含まれている臍帯血を用いた。臍帯血とは出産時に臍帯から回収した胎児の血液をいい、有核赤血球が大量に含まれる。本方法の有用性を確認するため、胎児由来有核赤血球の含有量が少ない妊婦の末梢血の代わりに胎児由来の有核赤血球を多く含む臍帯血を用いた。妊婦の末梢血である母体血中の有核赤血球の数は臍帯血よりは少ないが、臍帯血をサンプルとして用いて有核赤血球を濃縮し回収する方法により、母体血を用いた場合でも同様に有核赤血球を濃縮し回収することができる。Ｐｅｒｃｏｌｌ原液（１．１３２ｇ／ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１７−０８９１−０１）を用いて、１．０６５ｇ／ｍＬ〜１．１１９ｇ／ｍＬの勾配を形成し、密度勾配遠心分離を行った。各層の間の細胞層を採取し、各細胞層の成熟赤血球、好中球、リンパ球及び有核赤血球をカウントした。図２に結果を示す。
有核赤血球は密度１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬの層に含まれていた。
【実施例２】
【０００９】
Ｐｅｒｃｏｌｌ液及びＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いた有核赤血球の分離
Ｐｅｒｃｏｌｌ液及びＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液の調製
Ｐｅｒｃｏｌｌ原液（１．１３２ｇ／ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１７−０８９１−０１）４．８４８ｍｌ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ  １．０００ｍｌ及び滅菌水４．１５２ｍｌを混合し（トータル１０．０００ｍｌ）、密度１．０７０ｇ／ｍｌの等張（２８０ｍＯｓｍ）Ｐｅｒｃｏｌｌ液を調製し、Ｐｅｒｃｏｌｌ原液６．７４２ｍｌ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ  １．０００ｍｌ及び滅菌水２．２５８ｍｌを混合し（トータル１０．０００ｍｌ）、密度１．０９５ｇ／ｍｌの等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を調製した。
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ原液（１．１１３ｇ／ｍＬ、ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ社、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１１１４６８３）８．３４８ｍｌ及び０．９％ＮａＣｌ  １．６５２ｍｌを混合し（トータル１０．０００ｍｌ）、密度１．０９５ｇ／ｍｌのＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液（ＰＭＰ液）を調製した。
サンプルとしては、出産時に妊婦より同意を得て、出産後の臍帯血を入手して用いた。
Ｐｅｒｃｏｌｌ液による分離
臍帯血１ｍＬを０．９％ＮａＣｌ  １ｍＬで２倍希釈した。１５ｍＬコニカルチューブに、１．０９５ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液を２ｍｌ入れた。トランスファーピペットを用いて、１．０７０ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液を２ｍｌ重層した。２倍希釈した臍帯血を２ｍｌ重層した。２０℃、３０００ｒｐｍ（１７５０Ｇ）で３０分間遠心分離した。沈降しているのは主に母体由来成熟赤血球及び密度の大きい白血球であり、表面に存在するのは密度の小さい白血球である。実際には、有核赤血球を含む画分に母体由来の白血球が一部混入している。なお、コントロールとしてＰｅｒｃｏｌｌ液を用いた密度勾配遠心分離のみによる分離も行ったが、この場合、１．０８５ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液と１．０７５ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液を重層して用いた。Ｐｅｒｃｏｌｌによる分離の原理を図３に示す。図３の原理図においては、１．０８５ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液と１．０７５ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液を重層して用いた場合を示し、図３中、右図の１．０７５ｇ／ｍＬと１．０８５ｇ／ｍＬの間の層に有核赤血球が含まれる。
Ｐｅｒｃｏｌｌ後の洗浄
マイクロピペットで１．０９５ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液と１．０７０ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液の中層（境界付近）を回収し（有核赤血球含有層）、新しい１５ｍＬコニカルチューブに移した。０．９％ＮａＣｌを添加し、１５ｍｌまでメスアップし、懸濁し、２０℃、１５００ｒｐｍ（４４０Ｇ）で５分間遠心分離（ＦＡＳＴ→ＦＡＳＴ）し、上清をアスピレートした。同様の作業を繰り返し、２回洗浄した。
ＰＭＰによる分離
上清をアスピレートし、０．９％ＮａＣｌを添加し、１ｍＬまでメスアップし、懸濁した。丸底遠心管に１．０９５ｇ／ｍＬのＰＭＰ液を２ｍＬ入れ、サンプルを重層する。遠心分離は重層２０分後に開始した。２０℃、２０００ｒｐｍ（７８０Ｇ）で３０分間遠心分離した（ＳＬＯＷ→ＳＬＯＷ）。この際の細胞の分離の様子を図４に示す。有核赤血球は混入している母体由来成熟赤血球と共に沈降している。白血球はそれよりも低密度の層に存在し、有核赤血球と白血球はほぼ完全に分離できる。
ＰＭＰによる分離後の洗浄
最下層（有核赤血球及び赤血球を含む層）をマイクロピペットで回収し、新しい１５ｍＬコニカルチューブに移した。０．９％ＮａＣｌを添加し、１５ｍｌまでメスアップし、懸濁し、２０℃、１５００ｒｐｍ（４４０Ｇ）で５分間遠心分離（ＦＡＳＴ→ＦＡＳＴ）し、上清をアスピレートした。同様の作業を繰り返し、２回洗浄した。
０．９％ＮａＣｌで適度に希釈し、スメア標本を作製し、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色を行った。
また、得られた有核赤血球を含む画分にＲｅｄ  ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、赤血球を破壊し、残った白血球を血球計算盤を用いてカウントした。この際、当日採血した血液、採血後１日及び２日保存した血液を用いた。
図５に、Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた密度勾配遠心分離で得られた有核赤血球を含む画分の染色像（Ａ）及びＰｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った後、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて密度勾配遠心分離を行って得られた有核赤血球を含む画分のＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色の結果（Ｂ）を示す。図中、矢印で示す細胞が有核赤血球であり、図５Ａにおいて有核赤血球以外の染色細胞は白血球である。また、図５Ａ及びＢの他の細胞は母体由来の赤血球である。
図５Ａに示すように、Ｐｅｒｃｏｌｌ液のみを用いた密度勾配遠心分離では、有核赤血球を含む画分に大量に白血球が混入していた。一方、Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた密度勾配遠心分離を行った後に、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて密度勾配遠心分離を行った場合、白血球の混入は認められなかった。
図６に、保存日数ごとで有核赤血球画分に混入する白血球数を示す。白血球数の測定結果を示す。Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った後、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて密度勾配遠心分離を行って得られた画分で、Ｐｅｒｃｏｌｌ液のみを用いて密度勾配遠心分離を行った場合に比べ、当日採血した血液では２８％、１日保存した血液では８２％、２日保存した血液では８４％白血球が減少していた。この結果は、Ｐｅｒｃｏｌｌ液のみを用いた密度勾配遠心分離を用いた場合には、採取血液を保存すると有核赤血球画分への白血球の混入が増加するが、Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った後、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて密度勾配遠心分離を行った場合、採取血液を保存しても、有核赤血球画分に白血球の混入は増加しないことを示す。血液を保存すると白血球の密度が変化し、白血球と有核赤血球の密度がより重複するようになる可能性があり、本発明の方法によれば、このような場合でも、効果的に有核赤血球と白血球を分離することができる。
Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色後、有核赤血球数をカウントした結果を図７に示す。図７に示すようにＰｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離（１．０７０−１．０９５ｇ／ｍｌ画分回収）を行った後、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて密度勾配遠心分離を行った場合（Ｐｅｒｃｏｌｌ法＋ＰＭＰ法）、Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた密度勾配遠心分離（１．０７５−１．０８５ｇ／ｍｌ画分回収）のみを行った場合（Ｐｅｒｃｏｌｌ法）に比べ、１．４倍多くの有核赤血球が回収できた。
Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた密度勾配遠心分離では、有核赤血球を多く回収するためには、密度範囲を広げる必要があり、回収する血球層の密度範囲を広げることにより白血球も多く混入してしまう。一方、Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った後、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて密度勾配遠心分離を行う場合、最初のＰｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離の際に回収する細胞層の密度範囲を広げて、白血球が混入してしまっても、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて密度勾配遠心分離を行うことにより、有核赤血球と白血球を分離することができる。
【実施例３】
【００１０】
Ｐｅｒｃｏｌｌ液及びＮａＣｌ溶液を用いた有核赤血球の分離
等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液及び高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液の調製
Ｐｅｒｃｏｌｌ原液４．８４８ｍｌ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ  １．０００ｍｌ及び滅菌水４．１５２ｍｌを混合し（トータル１０．０００ｍｌ）、密度１．０７０ｇ／ｍｌの等張（２８０ｍＯｓｍ）Ｐｅｒｃｏｌｌ液を調製し、Ｐｅｒｃｏｌｌ原液６．７４２ｍｌ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ  １．０００ｍｌ及び滅菌水２．２５８ｍｌを混合し（トータル１０．０００ｍｌ）、密度１．０９５ｇ／ｍｌの等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を調製した。
さらに、Ｐｅｒｃｏｌｌ原液６．５２９ｍｌ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ  １．４７０ｍｌ及び滅菌水２．００１１ｍｌを混合し（トータル１０．０００ｍｌ）、密度１．０９５ｇ／ｍｌの高張（４２０ｍＯｓｍ）Ｐｅｒｃｏｌｌ液を調製した。
サンプルとしては、出産時に妊婦より同意を得て、出産後の臍帯血を入手して用いた。
等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液による分離
臍帯血１ｍＬを０．９％ＮａＣｌ  １ｍＬで２倍希釈した。１５ｍＬコニカルチューブに、１．０９５ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液を２ｍｌ入れた。トランスファーピペットを用いて、１．０７０ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液を２ｍｌ重層した。２倍希釈した母体血を２ｍｌ重層した。２０℃、３０００ｒｐｍ（１７５０Ｇ）で３０分間遠心分離した（ＳＬＯＷ→ＳＬＯＷ）。
マイクロピペットで１．０９５ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液と１．０７０ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液の中層（境界付近）を回収し（有核赤血球含有層）、新しい１５ｍＬコニカルチューブに移した。０．９％ＮａＣｌを添加し、１５ｍｌまでメスアップし、懸濁し、２０℃、１５００ｒｐｍ（４４０Ｇ）で５分間遠心分離した（ＦＡＳＴ→ＦＡＳＴ）し、上清をアスピレートした。同様の作業を繰り返し、２回洗浄した。
洗浄後、以下のＡ〜Ｄの条件で第２の密度勾配遠心分離を行った。
Ａ〜Ｄのいずれの条件においても、第１の密度勾配遠心分離に用いた分離媒体の浸透圧は２８０ｍＯｓｍであり、第２の密度勾配遠心分離に用いた分離媒体の浸透圧は４２０ｍＯｓｍであった。
Ａ  ０．９％ＮａＣｌに懸濁後、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて第２の密度勾配遠心分離
洗浄後、上清をアスピレートした。０．９％ＮａＣｌで１ｍＬまでメスアップし、懸濁した。丸底遠心管に１．０９５ｇ／ｍＬのＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を２ｍＬ入れ、サンプルを重層した。２０℃、２０００ｒｐｍ（７８０Ｇ）で３０分間遠心分離した（ＳＬＯＷ→ＳＬＯＷ）。遠心分離は重層２０分後に開始した。
Ｂ  ０．９％ＮａＣｌに懸濁後、高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて第２の密度勾配遠心分離
洗浄後、上清をアスピレートした。０．９％ＮａＣｌで１ｍＬまでメスアップし、懸濁した。丸底遠心管に１．０９５ｇ／ｍＬの高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液（４２０ｍＯｓｍ）を２ｍＬ入れ、サンプルを重層した。２０℃、２０００ｒｐｍ（７８０Ｇ）で３０分間遠心分離した（ＳＬＯＷ→ＳＬＯＷ）。
Ｃ  ０．９％ＮａＣｌに懸濁後、高張ＰｅｒｃｏｌｌとＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液の混合液を用いて第２の密度勾配遠心分離
洗浄後、上清をアスピレートした。０．９％ＮａＣｌで１ｍＬまでメスアップし、懸濁した。丸底遠心管に１．０９５ｇ／ｍＬの高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液（４２０ｍＯｓｍ）と１．０９５ｇ／ｍＬのＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を容積比１：１で混合した混合液２ｍＬ入れ、サンプルを重層した。２０℃、２０００ｒｐｍ（７８０Ｇ）で３０分間遠心分離した（ＳＬＯＷ→ＳＬＯＷ）。
Ｄ  １．３％ＮａＣｌに懸濁後、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を用いて第２の密度勾配遠心分離
洗浄後、上清をアスピレートした。１．３９％ＮａＣｌで１ｍＬまでメスアップし、懸濁した。丸底遠心管に１．０９５ｇ／ｍＬのＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ液を２ｍＬ入れ、サンプルを重層した。２０℃、２０００ｒｐｍ（７８０Ｇ）で３０分間遠心分離した（ＳＬＯＷ→ＳＬＯＷ）。遠心分離は重層２０分後に開始した。
第２の密度勾配遠心分離後の洗浄
最下層（有核赤血球及び赤血球を含む層）をマイクロピペットで回収し、新しい１５ｍＬコニカルチューブに移した。０．９％ＮａＣｌを添加し、１５ｍｌまでメスアップし、懸濁し、２０℃、１５００ｒｐｍ（４４０Ｇ）で５分間遠心分離（ＦＡＳＴ→ＦＡＳＴ）し、上清をアスピレートした。同様の作業を繰り返し、２回洗浄した。
０．９％ＮａＣｌで適度に希釈し、スライドガラス上でスメア標本を作製し、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色を行った。
上記のＡ〜Ｄのいずれの条件でも、得られた有核赤血球画分において、白血球はほとんど認められなかった。また、スライドガラス上の血球の総数もほぼ同じであった。１スライドガラス上の有核赤血球の数は、上記Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでそれぞれ２２２個、２１３個、２７７個及び２５７個と同等であった。
図８に等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った後、高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行って得られた有核赤血球（上記Ｂ）を含む画分のＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色の結果を示す。図中、矢印で示す細胞が有核赤血球である。図８に示すように、得られた画分には、白血球はほぼ存在せず、母体由来の成熟赤血球と有核赤血球が観察された。図に示すように、成熟赤血球と有核赤血球は核染色の有無で容易に区別することができる。
実施例３の結果より、第１の密度勾配遠心分離に用いる分離用媒体及び第２の密度勾配遠心分離に用いる分離用媒体の密度及び浸透圧を調節することにより、母体血中の有核赤血球を濃縮した状態で回収できることが判明した。
【実施例４】
【００１１】
母体血を用いた分離
母体血（妊婦末梢血）を用いて実施例３に記載の等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液及び高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた分離方法（条件Ｂ）により有核赤血球の分離を行った。母体血では、有核赤血球の数が非常に少ないが、本法において分離できることが確認できた。図９に等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行った後、高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて密度勾配遠心分離を行って得られた有核赤血球を含む画分のＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色の結果を示す。
【実施例５】
【００１２】
等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液及び高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた有核赤血球の分離
等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液及び高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液の調製
Ｐｅｒｃｏｌｌ原液４．８４８ｍｌ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ  １．０００ｍｌ及び滅菌水４．１５２ｍｌを混合し（トータル１０．０００ｍｌ）、密度１．０７０ｇ／ｍｌの等張（２８０ｍＯｓｍ）Ｐｅｒｃｏｌｌ液を調製し、Ｐｅｒｃｏｌｌ原液６．７４２ｍｌ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ  １．０００ｍｌ及び滅菌水２．２５８ｍｌを混合し（トータル１０．０００ｍｌ）、密度１．０９５ｇ／ｍｌの等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を調製した。
さらに、Ｐｅｒｃｏｌｌ原液３２．５９ｍｌ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ  ５．２０ｍｌ及び滅菌水１２．２１ｍｌを混合し（トータル５０．０００ｍｌ）、密度１．０９０ｇ／ｍｌの高張（３１２ｍＯｓｍ）Ｐｅｒｃｏｌｌ液を調製した。
さらに、Ｐｅｒｃｏｌｌ原液３２．４８ｍｌ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ  ５．４５ｍｌ及び滅菌水１２．０７ｍｌを混合し（トータル５０．０００ｍｌ）、密度１．０９０ｇ／ｍｌの高張（３３０ｍＯｓｍ）Ｐｅｒｃｏｌｌ液を調製した。
サンプルとしては、妊婦より同意を得て、採血した末梢血を母体血として用いた。
等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液による分離（第１の密度勾配遠心分離）
母体血１ｍＬを０．９％ＮａＣｌ  １ｍＬで２倍希釈した。１５ｍＬコニカルチューブに、１．０９５ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液を２ｍｌ入れた。トランスファーピペットを用いて、１．０７０ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液を２ｍｌ重層した。２倍希釈した母体血を２ｍｌ重層した。２０℃、３０００ｒｐｍ（１７５０Ｇ）で３０分間遠心分離した（ＳＬＯＷ→ＳＬＯＷ）。
マイクロピペットで１．０９５ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液と１．０７０ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ液の中層（境界付近）を回収し（有核赤血球含有層）、新しい１５ｍＬコニカルチューブに移した。０．９％ＮａＣｌを添加し、１５ｍｌまでメスアップし、懸濁し、２０℃、１５００ｒｐｍ（４４０Ｇ）で５分間遠心分離した（ＦＡＳＴ→ＦＡＳＴ）し、上清をアスピレートした。同様の作業を繰り返し、２回洗浄した。５本の試験管を用い上記操作を行い、６０μｌの体積の有核赤血球を含む画分を得た。
５μＬを評価用に回収し、９５μＬのＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）を加え（試料：ＦＣＳ＝１：１９）、懸濁し、２．５μＬを用いスライドガラス上でスメア標本を作製し、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色を行った。
高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液による分離（第１の密度勾配遠心分離）
Ｐｅｒｃｏｌｌ処理後の試料３２．５μＬを、０．９％ＮａＣｌで１ｍＬまでメッスアップした。コニカルチューブに（Ａ）高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液（１．０９９ｇ／ｍＬ，３３０ｍＯｓｍ）又は（Ｂ）高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液（１．０９０ｇ／ｍＬ，３１２ｍＯｓｍ）を２ｍＬ入れ、等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて分離した試料１ｍＬを重層した。２０℃、２０００ｒｐｍ（７８０Ｇ）で３０分間遠心分離した（ＳＬＯＷ→ＳＬＯＷ）。
第２の密度勾配遠心分離後の洗浄
最下層（有核赤血球及び赤血球を含む層）をマイクロピペットで回収し、新しい１５ｍＬコニカルチューブに移した。０．９％ＮａＣｌを添加し、１５ｍｌまでメスアップし、懸濁し、２０℃、１５００ｒｐｍ（４４０Ｇ）で５分間遠心分離（ＦＡＳＴ→ＦＡＳＴ）し、上清をアスピレートした。同様の作業を繰り返し、２回洗浄した。
それぞれ、５本の試験管を用い上記操作を行い、６（Ａ）高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液（１．０９９ｇ／ｍＬ，３３０ｍＯｓｍ）を用いた場合も（Ｂ）高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液（１．０９０ｇ／ｍＬ，３１２ｍＯｓｍ）を用いた場合も、３０μＬの有核赤血球を含む画分が得られた。それぞれ、５μｌを評価用に回収し、９６μＬのＦＣＳを加え（試料：ＦＣＳ＝１：１９）、懸濁し、２．５μＬを用いスライドガラス上でスメア標本を作製し、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａ染色を行った。上記の方法は、３１２ｍＯｓｍ及び３３０ｍＯｓｍの浸透圧の高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた場合の方法であるが、その他、母体血を用いて第２の密度勾配遠心分離を３０８ｍＯｓｍ、３２２ｍＯｓｍ、３５３ｍＯｓｍ及び３８３ｍＯｓｍの高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いて行った。回収できた有核赤血球を含む画分の体積、及びＮＲＢＣの濃度は実験により異なっていた。
等張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた第１の密度勾配遠心分離で得られた試料中の白血球数うに対して、高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液を用いた第２の密度勾配遠心分離で得られた試料中の白血球数を顕微鏡観察により計測し、第１の密度勾配第１の密度勾配遠心分離で得られた試料中の白血球の何％の白血球が第２の密度勾配遠心分離で除去されたかを計算し、白血球（ＷＢＣ）除去率として表した。図１０に結果を示す。図１０においては、実験Ｒｕｎ、用いた血液、第２の密度勾配遠心分離後の白血球のバンドの有無（バンドが出現した場合は該バンドを取り除いた）、並びに高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液として種々の浸透圧のＰｅｒｃｏｌｌ液を用いた場合の白血球除去率を示す。白血球除去率は、９０％以上又は９５％以上が好ましく、さらには９７％以上が好ましく、さらには９８％以上が好ましく、特には９９％以上が好ましい。
第２の密度勾配遠心分離の際に用いる高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液の浸透圧が３１０〜３３０ｍＯｓｍの時にＷＢＣの除去率が高かった。この結果は、第２の密度勾配遠心分離の際に用いる高張Ｐｅｒｃｏｌｌ液の浸透圧が３１０〜３３０ｍＯｓｍの時に高密度で有核赤血球を回収できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００１３】
本発明により、母体血中から胎児由来の有核赤血球を濃縮し回収することができ、回収した有核赤血球を用いて胎児の遺伝子や染色体を解析することができ、出生前遺伝子診断を容易に行うことができるようになる。
【符号の説明】
【００１４】
１  有核赤血球
２  赤血球
３  白血球
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2012023298.tif 000003
【図２】
2012023298.tif 000004
【図１０】
2012023298.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2012023298.tif 000009
【図７】
2012023298.tif 000010
【図８】
2012023298.tif 000011
【図９】
2012023298.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成25年2月6日(2013.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
母体血より有核赤血球を濃縮し回収する方法であって、
(i)  母体血を第１の密度勾配遠心分離に供し、有核赤血球を含む細胞画分を回収し、
(ii)  有核赤血球を含む細胞画分において、有核赤血球の密度を選択的に変化させるように処理し、有核赤血球と白血球との密度が重複しないようにし、
(iii)  処理した有核赤血球を含む細胞画分を第２の密度勾配遠心分離に供し、有核赤血球を含む画分を回収することを含む、有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項２】
工程(ii)の有核赤血球の密度を選択的に変化させる処理が、有核赤血球を含む画分を、有核赤血球に対する高張液又は低張液で処理することである、請求項１記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項３】
第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体として、有核赤血球の密度を選択的に変化させることができる液体を用い、工程(ii)と工程(iii)を同時に行う、請求項１又は２に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項４】
第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体として、有核赤血球の密度を選択的に変化させることができる高張液又は低張液を用い、工程(ii)と工程(iii)を同時に行う、請求項３記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項５】
工程(i)において、1.070〜1.095g/mLの密度範囲の血球を回収し、工程(ii)において、有核赤血球の密度を変化させ、1.095g/mLより大きくする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項６】
密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が、パーコール、フィコール、ショ糖、Nycodenz（登録商標）、OPTIPrep（商標）及びPolymorphprep（商標）からなる群から選択される媒体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項７】
第１の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が、浸透圧が280±30mOsmであるパーコールであり、第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が浸透圧が300mOsm以上であるパーコールである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項８】
第１の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体がパーコールであり、第２の密度勾配遠心分離に用いる密度勾配遠心分離用媒体が、Polymorphprep（商標）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項９】
有核赤血球が胎児由来有核赤血球である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収する方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法で回収した有核赤血球を用いて胎児DNA診断のためのデータを収集する、胎児DNA診断を補助する方法。
【請求項１１】
胎児DNA診断を補助する方法が、PCR、FISH（fluorescence in situ hybridization）、PEP(primer extension preamplification)、TaqMan（登録商標）PCR、CGH(comparative genomic hybridization)、PRINS(PRimed IN Situ labeling)、cell recycling、DNA chip法、及びこれらの方法を組合せた方法からなる群から選択される方法により行われる、請求項１０記載の胎児DNA診断を補助する方法。
【請求項１２】
母体血より有核赤血球を濃縮し回収するためのキットであって、
(a)  有核赤血球と等張の第１の密度勾配遠心分離用媒体、
(b)  有核赤血球の密度を選択的に変化させる液体、及び
(c)  (b)の高張処理液と等張である第２の密度勾配遠心分離用媒体とを含むか、又は
(d)  有核赤血球と等張の第１の密度勾配遠心分離用媒体、及び
(e)  有核赤血球の密度を選択的に変化させる液体からなる第２の密度勾配遠心分離用媒体とを含む、有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
【請求項１３】
有核赤血球の密度を選択的に変化させる液体が、有核赤血球に対して高張である高張処理用液である、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
密度勾配遠心分離用媒体が、パーコール、フィコール、ショ糖、Nycodenz（登録商標）、OPTIPrep（商標）及びPolymorphprep（商標）からなる群から選択される媒体である、請求項１２又は１３に記載の有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
【請求項１５】
母体血より有核赤血球を濃縮し回収するためのキットであって、
第１の密度勾配遠心分離用媒体として用いるパーコール、
第２の密度勾配遠心分離用媒体として用いるPolymorphprep（商標）とを含む、有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
【請求項１６】
有核赤血球が胎児由来有核赤血球である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の有核赤血球を濃縮し回収するためのキット。
【国際調査報告】
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