(57)【要約】  【課題】本発明は、新たなスクリーニング方法によるメタボリックシンドロームを改善する新規乳酸菌を提供することを課題とする。  【解決手段】本発明は、３Ｔ３−Ｌ１細胞に対しアディポネクチンの産生を増大させ、かつ、骨髄由来樹状細胞および／またはマクロファージに対し抗炎症性サイトカインの産生を増大させるLactobacillus属菌、該菌の培養物およびその加工物、ならびに、それらを含有する医薬用または食品用組成物に関する。【選択図】なし
2012014971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪細胞に対しアディポネクチン産生を増大させ、かつ、骨髄由来樹状細胞および／またはマクロファージに対し炎症性免疫関連サイトカインの産生を増大させる、Lactobacillus属菌。
【請求項２】
炎症性免疫関連サイトカインがＩＬ−１０である、請求項１に記載のLactobacillus属菌。
【請求項３】
Lactobacillus plantarumである、請求項１または２に記載のLactobacillus属菌。
【請求項４】
Lactobacillus plantarum OLL2712菌株（受託番号：FERM BP-11262）。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の菌の培養物またはその加工物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の菌、請求項５に記載の培養物およびその加工物から選択される１種または２種以上を含む、医薬組成物。
【請求項７】
内臓脂肪の蓄積を抑制するための、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の菌、請求項５に記載の培養物およびその加工物から選択される１種または２種以上を含む、食品組成物。
【請求項９】
内臓脂肪の蓄積を抑制するための、請求項８に記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタボリックシンドロームに対する改善効果を有する乳酸菌ならびに該乳酸菌を含む医薬組成物および食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肥満や糖尿病を含めたメタボリックシンドロームの改善に向けて、種々のアプローチが模索されているが、その１つとしてアディポネクチン（adiponectin）が注目されている。アディポネクチンは、脂肪細胞特異的に発現しており、脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌は、肥満者や糖尿病者において顕著に抑制されている（非特許文献１〜３）。脂肪細胞から分泌されたアディポネクチンは、筋肉細胞に働いてＩＲＳ−１、ＰＩ３−kinaseの活性化を介して糖輸送を亢進させ、脂肪酸輸送蛋白１型（ＦＡＴＰ−１）の発現およびＡＭＰ−kinaseを介して脂肪酸の酸化および排出を高めることにより、インシュリン感受性を上昇させることがわかっている（非特許文献４）。また、アディポネクチンには脂肪組織の慢性炎症状態に対する抗炎症作用も認められており、ＴＮＦαの産生を抑制することによってもインシュリン抵抗性を改善することが知られている（非特許文献５）。したがって、肥満・糖尿病を含めたメタボリックシンドロームの改善には脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌を増加させることが重要であると考えられており、近年、脂肪細胞の機能制御を標的とする研究が注目されており、食品因子の機能のターゲットともなってきている（非特許文献６）。【０００３】
一方、サイトカインとメタボリックシンドロームとの関係についても研究されており、例えば、メタボリックシンドロームの動物モデルにおいて、脂肪組織でのＩＦＮγの増加はメタボリックシンドロームを悪化させるが、ＩＬ−１０の増加はメタボリックシンドロームを改善することが示唆されている（非特許文献７〜１１）。また、アディポネクチンとＩＬ−１０との関係について、ヒト初代培養マクロファージ細胞にアディポネクチンを添加すると、ＩＦＮγ分泌量が減少し、ＩＬ−１０分泌量が増加したとする知見が示されている（非特許文献１２）。【０００４】
アディポネクチンの産生に影響を与える食品由来成分や食品素材などについても研究されており、例えば、トマト抽出物由来のナリンゲニンカルコン（特許文献１）、ブドウ抽出物由来のプロアントシアニジン（特許文献２）、リンゴ抽出物由来ポリフェノール（特許文献３）などがアディポネクチン産生を増大させる傾向に影響を与えることが示唆されている。【０００５】
さらに、乳酸菌のアディポネクチン産生への影響についても研究されており、例えば、Lactobacillus
gasseriやLactobacillus helveticusのある菌株が血中アディポネクチン濃度を増加促進または減少抑制することが報告されている（特許文献４および特許文献５）。しかしながら、これらの報告は、ある菌株がインビボ（in vivo）でのアディポネクチン産生に影響を与えたことを示しているに過ぎず、メタボリックシンドロームに対する効果について一面的な評価をしたに止まるものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１１５１６３号公報
【特許文献２】特開２００６−１８２７０６号公報
【特許文献３】特開２００６−１９３５０２号公報
【特許文献４】特開２００８−６３２８９号公報
【特許文献５】特開２００９−１０７９５６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Maeda,N. et al., "Diet-induced insulinresistance in mice lacking adiponectin/ACRP30", Nature Medicine8(7):pp.731-737,2002
【非特許文献２】Kubota,N. et al., "Disruption ofadiponectin causes insulin resistance and neointimal formation", J BiolChem 277(29):pp.25863-25866,2002
【非特許文献３】Yamauchi,T. et al., "The fat-derivedhormome adiponectin reverses insulin resistance associated with bothlipoatrophy and obesity", Nature Medicine 7(8):pp.941-946,2001
【非特許文献４】Yamauchi,T. et al., "Adiponectinstimulates glucose utilization and fatty-acid oxidation by activatingAMP-activated protein kinase", Nature Medicine 8(11) 1288-1295,2002
【非特許文献５】Zhou,Q. et al., "Evidence foradipose-muscle cross talk: opposing regulation of muscle proteolysis byadiponectin and fatty acids", Endocrinology 148:5696-5705,2007
【非特許文献６】Higurashi,S. et al., "Effect of cheeseconsumption on the accumulation of abdominal adipose and decrease in serumadiponectin levels in rats fed a calorie dense diet", International DairyJournal 17:1224-1231,2007
【非特許文献７】Nishimura,S. et al., "CD8+effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissueinflammation in obesity", Nature Medicine 15:914-920,2009
【非特許文献８】Winer,S. et al., "Normalization ofobesity-associated insulin resistance through immunotherapy", NatureMedicine 15:921-929,2009
【非特許文献９】Feuerer,M. et al., "Lean, but notobese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells thataffect metabolic parameters", Nature Medicine 15:930-939,2009
【非特許文献１０】Exel,E. et al., "Low productioncapacity of interleukin-10 associates with the metabolic syndrome and type 2diabetes", Diabetes 51:1088-1092,2002
【非特許文献１１】Esposito,K. et al., "Association oflow interleukin-10 levels with the metabolic syndrome in obese women", JClin Endocrinol Metab 88:1055-1059,2003
【非特許文献１２】Wolf,A.M. et al., "Adiponectin inducesthe anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-1RA in human leukocytes",Biochem Biophys Res Commun 323:630-635,2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、メタボリックシンドロームを改善する乳酸菌を探索する際に、アディポネクチンのみを指標とするのではなく、メタボリックシンドロームにより誘導される炎症の抑制を示す指標も加えた方がより強い改善効果が期待できると考えた。そこで、目的の乳酸菌を探索するための新たな試験系を確立する必要があることを見出した。そして本発明者らは、脂肪細胞のアディポネクチン産生能に加え、免疫系細胞から分泌されるＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカイン産生能をインビトロ（in vitro）試験系において評価することによって、脂肪細胞の機能制御によりインシュリン抵抗性を始めとしたメタボリックシンドロームを改善し得るプロバイオティクスを探索することができることを見出し、さらに鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち本発明は、脂肪細胞に対しアディポネクチン産生を増大させ、かつ、骨髄由来樹状細胞および／またはマクロファージに対し炎症性免疫関連サイトカインの産生を増大させる、Lactobacillus属菌に関する。
また本発明は、炎症性免疫関連サイトカインがＩＬ−１０である、前記のLactobacillus属菌に関する。
さらに本発明は、Lactobacillus plantarumである、前記のLactobacillus属菌に関する。
また本発明は、Lactobacillus plantarum OLL2712菌株（受託番号：FERM BP-11262）に関する。
さらに本発明は、前記の菌の培養物またはその加工物に関する。
また本発明は、前記の菌、前記の培養物およびその加工物からなる群から選択される１種または２種以上を含む、医薬組成物に関する。
さらに本発明は、内臓脂肪の蓄積を抑制するための、前記の医薬組成物に関する。
また本発明は、前記の菌、前記の培養物およびその加工物からなる群から選択される１種または２種以上を含む、食品組成物に関する。
さらに本発明は、内臓脂肪の蓄積を抑制するための、前記の食品組成物に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のLactobacillus属菌は、脂肪細胞に対しアディポネクチン産生を増大させ、かつ、骨髄由来樹状細胞および／またはマクロファージに対し抗炎症性サイトカイン産生を増大させることができる。すなわち、アディポネクチンの産生を増大させることに加え、アディポネクチンに依存しない抗炎症性サイトカインの産生増大をも可能とするものであって、極めて信頼性の高い複合的なアプローチでのメタボリックシンドロームの改善効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】図１ａは、３Ｔ３−Ｌ１細胞に対し、ピオグリタゾン（Ｐｉｏ）および／またはＴＮＦα（ＴＮＦ）を添加した場合のアディポネクチンのｍＲＮＡ発現量の結果を示すグラフである。
【図１ｂ】図１ｂは、３Ｔ３−Ｌ１細胞に対し、ピオグリタゾン（Ｐｉｏ）および／またはＴＮＦα（ＴＮＦ）を添加した場合のＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤのｍＲＮＡ発現量の結果を示すグラフである。
【図２ａ】図２ａは、ＴＮＦα添加によるインシュリン抵抗性の誘導を行った場合の３Ｔ３−Ｌ１細胞のアディポネクチンのｍＲＮＡ発現量の結果を示すグラフである。
【図２ｂ】図２ｂは、ＴＮＦα添加によるインシュリン抵抗性の誘導を行った場合の３Ｔ３−Ｌ１細胞のＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤのｍＲＮＡ発現量の結果を示すグラフである。
【図２ｃ】図２ｃは、ＴＮＦα添加によるインシュリン抵抗性の誘導を行った場合の３Ｔ３−Ｌ１細胞のＩＬ−６のｍＲＮＡ発現量の結果を示すグラフである。
【図２ｄ】図２ｄは、ＴＮＦα添加によるインシュリン抵抗性の誘導を行った場合の３Ｔ３−Ｌ１細胞のＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量の結果を示すグラフである。
【図３ａ】図３ａは、ＴＮＦα添加によるインシュリン抵抗性の誘導を行っていない場合の３Ｔ３−Ｌ１細胞のアディポネクチンのｍＲＮＡ発現量の結果を示すグラフである。
【図３ｂ】図３ｂは、ＴＮＦα添加によるインシュリン抵抗性の誘導を行っていない場合の３Ｔ３−Ｌ１細胞のＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤのｍＲＮＡ発現量の結果を示すグラフである。
【図３ｃ】図３ｃは、ＴＮＦα添加によるインシュリン抵抗性の誘導を行っていない場合の３Ｔ３−Ｌ１細胞のＩＬ−６のｍＲＮＡ発現量の結果を示すグラフである。
【図４ａ】図４ａは、乳酸菌死菌体がマウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）のＩＬ−１０産生に及ぼす影響の結果を示すグラフである。
【図４ｂ】図４ｂは、乳酸菌死菌体がマウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）のＩＬ−１２（ｐ７０）産生に及ぼす影響の結果を示すグラフである。
【図５ａ】図５ａは、乳酸菌死菌体がマウスマクロファージＪ７７４．１のＩＬ−６産生に及ぼす影響の結果を示すグラフである。
【図５ｂ】図５ｂは、乳酸菌死菌体がマウスマクロファージＪ７７４．１のＩＬ−１０産生に及ぼす影響の結果を示すグラフである。
【図５ｃ】図５ｃは、乳酸菌死菌体がマウスマクロファージＪ７７４．１のＩＬ−１２（ｐ４０）産生に及ぼす影響の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、乳酸菌の脱脂粉乳培養物が糖尿病・肥満モデルマウス（KKAyマウス）の血中アディポネクチン濃度に及ぼす影響の結果を示すグラフである。平均値±SEを示す。
【図７】図７は、乳酸菌の脱脂粉乳培養物が糖尿病・肥満モデルマウス（KKAyマウス）の内臓脂肪組織由来脂肪細胞のアディポネクチンｍＲＮＡ量に及ぼす影響の結果を示すグラフである。平均値±SEを示す。
【図８】図８は、乳酸菌の脱脂粉乳培養物が糖尿病・肥満モデルマウス（KKAyマウス）の内臓脂肪重量に及ぼす影響の結果を示すグラフである。平均値±SEを示す。
【図９】図９は、乳酸菌の脱脂粉乳培養物が糖尿病・肥満モデルマウス（KKAyマウス）の血中中性脂肪値に及ぼす影響の結果を示すグラフである。平均値±SEを示す。
【図１０】図１０は、乳酸菌の脱脂粉乳培養物が糖尿病・肥満モデルマウス（KKAyマウス）の血中HbA1c値に及ぼす影響の結果を示すグラフである。平均値±SEを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のLactobacillus属菌は、脂肪細胞に対してアディポネクチン産生を増大させる。ここで脂肪細胞は、インビトロ（in vitro）での培養が確立されている脂肪細胞であれば、とくに限定されないが、例えば、脂肪細胞のモデルとして知られるマウス繊維芽細胞由来３Ｔ３−Ｌ１細胞などが挙げられる。
【００１３】
また本発明のLactobacillus属菌は、通常、アディポネクチンを産生しない細胞、例えば、骨髄由来樹状細胞、マクロファージに対し炎症性免疫関連サイトカインの産生を増大させる。好ましくは、骨髄由来樹状細胞および／またはマクロファージに対して炎症性免疫関連サイトカインの産生を増大させる。
本発明のLactobacillus属菌が、脂肪細胞に対してアディポネクチン産生を増大させること、および／または、アディポネクチンを産生しない細胞に対し炎症性免疫関連サイトカインの産生を増大させることは、夫々、インビトロにおいて確認することができる。
【００１４】
ここで、炎症性免疫関連サイトカインとは、炎症反応に関連する全てのサイトカインを包含する。炎症性免疫関連サイトカインは、炎症反応を促進する性質を有するサイトカインと炎症反応を抑制する性質を有するサイトカインとに大別することができる。炎症反応を促進する性質を有するサイトカインとしては、これに限定するものではないが、例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮγ、ＭＣＰ−１、ＴＮＦα、ＬＩＦなどの炎症性サイトカインなどが挙げられる。炎症反応を抑制する性質を有するサイトカインとしては、これに限定するものではないが、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βなどの抗炎症性サイトカイン、ＩＦＮα、ＩＦＮβなどの抗ウィルス性サイトカインなどが挙げられる。
【００１５】
好ましい炎症性免疫関連サイトカインとしては、メタボリックシンドロームとの関連性が認められるものであり、例えば、ＩＬ−１０やＩＬ−６が挙げられ、とくに好ましくは、ＩＬ−１０である。
本発明において「産生が増大した」とは、供試菌体（生菌または死菌）またはその培養物や培養上清などの試料の刺激によって、対象の細胞が発現するアディポネクチン（タンパク質、ｍＲＮＡ）の発現量や炎症性免疫関連サイトカインの発現量などの指標となる値が、統計的誤差の範囲を超えて増大することを意味する。統計的な解析は、当業者に知られたあらゆる統計解析手法を用いてよく、これに限定するものではないが、例えばＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定や、マンホイットニーのＵ検定などが挙げられる。
【００１６】
本発明に包含されるLactobacillus属菌としては、これに限定されるものではないが、例えば、Lactobacillus delbrueckii subsp. burgaricus、Lactobacillus
delbrueckii subsp. lactis、Lactobacillus casei、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus
acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus
gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus oris、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus
fermentum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus
plantarumなどが挙げられ、好ましくは、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus plantarumなどが挙げられ、とくに好ましくは、Lactobacillus
plantarumが挙げられる。
【００１７】
本発明のLactobacillus属菌は、好ましくは、胃酸または胆汁酸耐性を有するものである。かかる耐性により、腸溶性被覆材などを用いることなく、例えば、乳酸菌含有食品組成物として、生菌のまま腸に到達することができ、腸内環境を改善するとともに、持続的なメタボリックシンドロームの改善および／または予防効果を奏することができる。
【００１８】
本発明のLactobacillus plantarum OLL2712（本明細書において、菌株２３ともいう）は、独立行政法人産業技術総合研究所に、受託番号：FERM BP-11262として寄託されており、以下の特徴を有するLactobacillus
plantarum菌である。
（ａ）形態的性質
桿菌
（ｂ）培養的性質
培地名：  Lactobacilli MRS Broth (Difco, Ref. No. 288130)
ｐＨ：  無調整
培養温度：  ３７℃
培養時間：  １８時間
（１）形状：  円形
（２）直径：  １−２ｍｍ
（３）色調：  白色
（４）隆起状態：  半球状
（５）周縁：  全縁
（６）表面形状：  スムーズ
（７）透明度：  不透明
（８）粘稠度：  バター様
（ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：  陽性
（２）乳酸発酵形式：  ホモ乳酸発酵
（３）酸素要求性：  通性嫌気性
（４）発育温度：  １５℃＋、４５℃−
【００１９】
本発明において、メタボリックシンドロームの改善および／または予防を行う対象としては、肥満や糖尿病を含めたメタボリックシンドロームが関与する疾病に罹患している、または、その虞のある動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物、ペットなど）を含む。
また、本発明において改善および／または予防の対象となるメタボリックシンドロームには、例えば、糖尿病、肥満（とくに内臓脂肪型肥満）、血圧高値、血糖高値、脂質異常症、動脈硬化症などのメタボリックシンドロームと関連するとされる疾患を含み得る。
【００２０】
本発明のLactobacillus属菌をメタボリックシンドロームの改善および／または予防に対して、医薬用または食品用として用いる場合、生菌、死菌、培養物やその加工物を用いることが可能である。前記培養物とは、本発明のLactobacillus属菌の培養終了後の培養上清や培地成分をそのまま用いるものであり、前記加工物は、培養物に由来すればとくに限定されないが、例えば、培養物の濃縮、ペースト化、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、ドラム乾燥、液状化、希釈、破砕などの加工により得られる物が挙げられる。これらの加工には、公知の方法を適宜用いることができる。前記培養物中または前記加工物中において、本発明のLactobacillus属菌は、生菌であっても死菌であってもよい。
また本発明のLactobacillus属菌、その培養物、またはその加工物には、適宜、例えば、培地成分、経口経管摂取に適した添加物および水などの溶媒、糖質、タンパク質、脂質、ビタミン類、生体必須微量金属、香料、薬学的に許容し得る担体、食品添加物などの任意成分を添加し、医薬組成物や食品組成物などとすることができる。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、典型的には、脂肪細胞に対しアディポネクチン産生を増大させ、かつ、骨髄由来樹状細胞および／またはマクロファージに対し炎症性免疫関連サイトカインの産生を増大させる、Lactobacillus属菌、その培養物およびその加工物から選択される１種または２種以上を含む。かかる医薬組成物は、摂取個体の腸内環境を改善し、メタボリックシンドロームに対して改善効果を奏する。さらに本発明の医薬組成物は、内臓脂肪の蓄積を効果的に抑制するために用いることができる。
また、かかる医薬組成物は、投与経路はとくに限定されないが、経口的または非経口的に投与することが含まれ、例えば、経口投与、経管投与、経腸投与を例示できる。簡便かつ安全性の観点から、経口投与が好ましい。また剤型は、とくに限定されないが、投与経路に応じて適宜選択することができ、例えば、エアゾール剤、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、眼軟膏剤、経皮吸収型製剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、注射剤、貼付剤、チンキ剤、点眼剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、リニメント剤、リモナーデ剤、流エキス剤、ローション剤が挙げられる。
【００２２】
経口投与製剤としては、周知の各種剤型とすることができ、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、トローチ剤などの剤型とすることができる。また、腸溶性製剤とすることにより、胃酸の効果を受けることなく、より効率的に腸まで運ぶことも可能である。
非経口的な投与としては、注射剤などの形での投与を挙げることができる。また、本発明のLactobacillus属菌、その培養物またはその加工物を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用により投与することも可能である。
【００２３】
本発明の医薬組成物に用い得る担体としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤などが医薬上許容される担体として挙げられるが、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などを挙げることができる。
【００２４】
本発明のLactobacillus属菌を医薬組成物に用いる場合、その菌体濃度はとくに限定されないが、濃縮液として利用する場合、２×１０１０個／ｇ以上、乾燥物として利用する場合、３×１０１１個／ｇ以上とするのが好ましい。
本発明の医薬組成物において、Lactobacillus属菌、その培養物またはその加工物の配合量は、とくに限定されないが、剤型、症状、体重、用途などに応じて適宜調整することができる。
本発明の医薬組成物の一日当たりの摂取量は、とくに限定されないが、年齢、症状、体重、用途などに応じて適宜調整することができる。典型的には、０．１〜１００００ｍｇ／ｋｇ体重を摂取することができ、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．１〜３００ｍｇ／ｋｇ体重を摂取することができる。
【００２５】
本発明の食品組成物は、典型的には、脂肪細胞に対しアディポネクチン産生を増大させ、かつ、骨髄由来樹状細胞および／またはマクロファージに対し炎症性免疫関連サイトカインの産生を増大させる、Lactobacillus属菌、その培養物およびその加工物から選択される１種または２種以上を含む。かかる食品組成物は、摂取個体の腸内環境を改善し、メタボリックシンドロームに対して改善効果を奏する。さらに本発明の食品組成物は、内臓脂肪の蓄積を効果的に抑制するために用いることができる。
本発明の食品組成物はさらに、乳酸菌生育を妨げない限り、糖質、タンパク質、脂質、ビタミン類、生体必須微量金属（硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、炭酸カリウムなど）、香料やその他の配合物を含むことができる。
【００２６】
糖質としては、糖類、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテルなど）、食物繊維などが挙げられる。
タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質などの動植物性タンパク質、これら加水分解物；バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖などの各種乳由来成分などが挙げられる。
【００２７】
脂質としては、例えば、ラード、魚油など、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油などの動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油などの植物性油脂などが挙げられる。
ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。
【００２８】
本発明の食品組成物のカテゴリーや種類に制限はなく、機能性食品、特定保健用食品、特定用途食品、栄養機能食品、健康食品、介護用食品でもよく、また、菓子、乳酸菌飲料、チーズやヨーグルトなどの乳製品、調味料などであってもよい。飲食品の形状についても制限はなく、固形、液状、流動食状、ゼリー状、タブレット状、顆粒状、カプセル状など、通常流通し得るあらゆる飲食品形状をとることができ、各種食品（牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、栄養食品、冷凍食品、加工食品その他の市販食品など）に添加してもよい。上記飲食品の製造は、当業者の常法によって行うことができる。
【００２９】
本発明のLactobacillus属菌、その培養物、またはその加工物は、上記のとおり、乳製品・発酵乳を含む一般飲食品に加工できる他、ヨーグルトやチーズなどの乳製品・発酵乳の製造用スターターとして利用することも可能である。スターターとする場合は、本発明のLactobacillus属菌の生存および増殖に支障がない限り、また、乳製品製造に支障がない限り、他の微生物が混合されていてもよい。例えば、ヨーグルト用乳酸菌として主要な菌種であるLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、Streptococcus
thermophilus、Lactobacillus acidophilusなどと混合してもよく、その他、一般にヨーグルト用やチーズ用として用いられる菌種と混合してスターターとすることができる。上記スターターによる乳製品、発酵乳の製造は、常法に従って行うことができる。例えば、加温・混合・均質化・殺菌処理後に冷却した乳または乳製品に、上記スターターを混合し、発酵・冷却することにより、プレーンヨーグルトを製造することができる。
【００３０】
上記スターターとしては、製造する乳製品、発酵乳に応じて適宜選択されるが、具体的には、たとえば、Streptococcus属、Lactobacillus属、Lactococcus属、Leuconostoc属およびPediococcus属などに属する乳酸菌あるいはビフィズス菌を用いることができる。
より具体的には、Streptococcus lactis、Streptococcus
cremoris、Streptococcus diacetylactis、Streptococcus thermophilus、Enterococcus
faecium、Enterococcus faecalis、Lactobacillus
acidophilus、Lactobacillus brevis、Lactobacillus casei、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、Lactobacillus
delbrueckii subsp. lactis、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus oris、Lactobacillus reuteriおよびLactobacillus
rhamnosusなどの乳酸菌や、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium bifidumおよびBifidobacterium
breveなどのビフィズス菌のような微生物ををスターターとすることができる。より好適には、Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus、Streptococcus
thermophilusおよびLactobacillus delbrueckii subsp. lactisがスターターとして用いることができる。これらの微生物をスターターとして用いる場合、必要に応じて、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３１】
これらの微生物を、自然界や発酵乳から単離する方法は公知である。あるいは既に単離された微生物を細胞バンクなどからの分譲によって入手することもできる。さらに、乳酸菌スターターは、市販されている。生成する発酵乳のｐＨや物理的な性状の違いによって複数の製品が販売されている。なお、発酵乳の物理的な性状とは、固さや口当たり(smoothness)などをいう。
【００３２】
本発明において、混合スターターとして原料乳に加える微生物をセルバンクに寄託された微生物から選択することもできる。混合スターターに利用することができる望ましい菌株の例としては、Lactobacillus bulgaricus JCM 1002TおよびStreptococcus
thermophilus ATCC 19258の混合培養物からなる乳酸菌スターター、Streptococcus
thermophilus OLS 3059（FERM BP-10740）、Streptococcus thermophilus OLS3294（NITE P-77）、Streptococcus thermophilus OLS3059（FERMP-15487）、Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus OLL 1073R-1（FERM BP-10741）、Lactobacillus delbrueckii
subspecies bulgaricus OLL 1255（NITE BP-76）およびLactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus OLL1073R-1（FERM P-17227）の混合培養物からなる乳酸菌スターターが挙げられる。
【００３３】
一般的な発酵乳の製造においては、原料乳(ヨーグルトベースミックス)には、これらの乳酸菌以外の乳酸菌や酵母の中から１種または２種以上を選んだものを添加することもある。本発明においては、コーデックス規格でヨーグルトスターターとして規格化されているラクトバチルス・ブルガリカス(L. bulgaricus)とストレプトコッカス・サーモフィルス(S.
thermophilus)の混合スターターを利用するのが好ましい。さらに付加的な微生物を加えるときには、この混合スターターに、目的とする発酵乳の発酵温度や発酵条件を勘案して追加の微生物を混入することもできる。混合スターターに付加的に混合する微生物としては、ラクトバチルス・ガッセリ（L. gasseri）、Lactobacillus plantarumやビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)等の他の乳酸菌を示すことができる。
【００３４】
本発明のLactobacillus属菌を食品組成物に用いる場合、その菌体濃度はとくに限定されないが、濃縮液として利用する場合、２×１０１０個／ｇ以上、乾燥物として利用する場合、３×１０１１個／ｇ以上とするのが好ましい。また、食品組成物における本発明のLactobacillus属菌の菌体の含有量(菌体乾燥物質量として)は、食品組成物の固形分中０．０１〜１００ ｗ／ｗ％、より好ましくは1〜８０ｗ／ｗ％さらに好ましくは１０〜４０ｗ／ｗ％とすることができる。
本発明の食品組成物において、Lactobacillus属菌、その培養物またはその加工物の配合量は、とくに限定されないが、剤型、症状、体重、用途などに応じて適宜調整することができる。
本発明の食品組成物の一日当たりの摂取量は、とくに限定されないが、年齢、症状、体重、用途などに応じて適宜調整することができる。典型的には、０．１〜１００００ｍｇ／ｋｇ体重を摂取することができ、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは０．１〜３００ｍｇ／ｋｇ体重を摂取することができる。また、本発明のLactobacillus属菌の菌体の乾燥物質量として０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重および０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、本発明のLactobacillus属菌の菌体数として１０６〜１０１２個、１０７〜１０１１個、および１０8〜１０１０個、を例示することができる。
【００３５】
以下に、本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、かかる実施例は、本発明の例示であり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３６】
例１：マウス繊維芽細胞由来３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いたスクリーニング系の構築
脂肪細胞のモデルであるマウス繊維芽細胞由来３Ｔ３−Ｌ１細胞株を用いた抗肥満・抗糖尿病活性を有する乳酸菌のスクリーニング系を樹立した。
（１）供試菌株
健康なヒト糞便より単離された約２７０菌株より、胃酸または胆汁酸耐性に優れた２０菌株（菌株番号１〜１９、２３）を選抜して用いた。それらの他に、各種発酵乳から単離された多数の菌株より、免疫調節活性の高い３菌株（菌株番号２０〜２２）を加えた、下記表１に示す計２３菌株を用いた。
【表１】
2012014971.tif 000003
【００３７】
（２）乳酸菌の培養および培養上清の調製
乳酸菌は、脱脂粉乳培地（表２）およびＭＲＳ培地（Lactobacilli MRS Broth (Difco,
Ref. No. 288130)）を用い、３７℃で培養した。
培養上清の調製は、まず、乳酸菌を脱脂粉乳培地およびＭＲＳ培地で、３７℃、１８時間培養した後、上清を回収し、次に、回収した上清を０．２２μｍフィルターに通して行った。培養上清は、−２０℃で保存した。
【表２】
2012014971.tif 000004
【００３８】
（３）３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いたアッセイ
３Ｔ３−Ｌ１細胞株（ＤＳファーマバイオメディカル社より購入）を２４ウェルプレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種し、１０％ＣＳ（calf serum）入りＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's
modified Eagle medium））で２日間培養し、１０％ＦＣＳ（fetal calf serum）入りＤＭＥＭに交換し、さらに２日後に分化培地（１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中、インシュリン１０μｇ／ｍｌ、デキサメタゾン２．５μＭ、３−イソブチル−１−メチルキサンチン０．５ｍＭ）に交換した。分化培地で４８時間培養後、維持培地（１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中、インシュリン１０μｇ／ｍｌ）でさらに４８時間培養し、以後は１０％ＦＣＳ入りＤＭＥＭで培養した。維持培地に交換後７日目の細胞をアッセイに使用した。なお、脂肪細胞分化／維持試薬（AdipoInducer Reagent(for animal cell)）はタカラバイオ（株）より購入した。分化培地用添加試薬の組成は、インシュリン溶液（１０μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン溶液（２．５μＭ）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン溶液（０．５ｍＭ）であった。維持培地用添加試薬の組成は、インシュリン溶液（１０μｇ／ｍｌ）であった。
細胞を回収する２２時間前に乳酸菌培養上清１％を添加した培地に交換し、その２時間後にさらにＴＮＦα（Sigma-Aldrich社より購入）１０ｎｇ／ｍｌを添加した。また、乳酸菌培養上清の代わりに、糖尿病治療薬として用いられているピオグリタゾン（pioglitazone、販売元：和光純薬工業、製造元：Alexis）を１０μＭの濃度になるように添加し、ポジティブコントロールとした。その後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen、Life Technologies社より購入）により細胞溶解物を回収し、real-time
PCR system（Applied Biosystems、Life
Technologies社）で遺伝子発現量を測定した。【００３９】
（４）結果
３Ｔ３−Ｌ１細胞において、アディポネクチンおよびＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ（Cu,Zn-Superoxide
Dismutase）の各ｍＲＮＡ量は、ピオグリタゾンで有意に増加した。なお、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤのｍＲＮＡ量は、メタボリックシンドロームの動物では、この測定値が低下することが示され、アディポネクチンの発現上昇と有意に相関することが示されている。
また、ＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌの添加では有意に抑制され、ピオグリタゾン１０μＭとＴＮＦα１０ｎｇ／ｍｌとの共添加によって有意に回復した（図１ａ〜ｂ）。なお、図１ａ〜ｂにおいて、「control」は、何も添加していない３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、「ＴＮＦ１０ｎｇ／ｍｌ」は、ＴＮＦαを１０ｎｇ／ｍｌで添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、「Ｐｉｏ１０μＭ」は、ピオグリタゾンを１０μＭで添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、「Ｐｉｏ＋ＴＮＦ」は、ピオグリタゾンを１０μＭ、ＴＮＦαを１０ｎｇ／ｍｌで共添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合である。
その他の代表的な抗酸化因子であるカタラーゼ（catalase）についても同様に有意な効果を確認した(データ省略)。【００４０】
例２：各種乳酸菌脱脂粉乳培養上清の抗肥満・抗糖尿病活性
表１の番号１〜２１および２３の計２２菌株の乳酸菌の脱脂粉乳培養上清およびＭＲＳ培養上清が３Ｔ３−Ｌ１細胞のアディポネクチン発現量に及ぼす影響を評価した。
一次スクリーニングの結果、番号１２のLactobacillus amylovorus MEP222812（以下、菌株１２）、番号１７のLactobacillus plantarum MEP222817（以下、菌株１７）、番号２３のLactobacillus plantarum OLL2712（以下、菌株２３）の脱脂粉乳培養上清が、３Ｔ３−Ｌ１細胞のアディポネクチン発現量を有意に亢進する作用を示した。さらに、これら３つの菌株について再現性を確認した結果、菌株１７と菌株２３の２株が安定的な効果を示すことがわかった。【００４１】
また、マウス骨髄由来ＢＭＤＣ細胞のＩＬ−１０産生を顕著に誘導するなどの抗炎症性作用がその死菌体に確認されているLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus MEP222822（以下、菌株２２）の脱脂粉乳培養上清についても同時に評価した。
ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）によってインシュリン抵抗性を誘導した系で評価した結果を図２ａ〜ｄに示す。なお、図２ａ〜ｄにおいて、「control」は、何も添加していない３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、「脱脂粉乳＋ＴＮＦ」は、脱脂粉乳培地およびＴＮＦαを１０ｎｇ／ｍｌを添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、「菌株２２＋ＴＮＦ」は、菌株２２を培養した脱脂粉乳培養上清およびＴＮＦαを１０ｎｇ／ｍｌを添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、「菌株１７＋ＴＮＦ」は、菌株１７を培養した脱脂粉乳培養上清およびＴＮＦαを１０ｎｇ／ｍｌを添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、「菌株２３＋ＴＮＦ」は、菌株２３を培養した脱脂粉乳培養上清およびＴＮＦαを１０ｎｇ／ｍｌを添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、「ｐｉｏ＋ＴＮＦ」は、ピオグリタゾンを１０μＭ、ＴＮＦαを１０ｎｇ／ｍｌで共添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合である。【００４２】
菌株１７と菌株２３の脱脂粉乳培養上清はともに３Ｔ３−Ｌ１細胞のアディポネクチン発現量を有意に増加させた。さらに、菌株２３はＩＬ−６発現量を有意に抑制し、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ発現量を有意に増加させた。一方、菌株２２はＩＬ−６発現量を有意に増加させたが、その他の遺伝子発現量には影響がなかった。
ピオグリタゾンはＩＬ−６の抑制はしなかったが、ＭＣＰ−１を有意に抑制した。一方、菌株２３の脱脂粉乳培養上清はＩＬ−６を抑制し、ＭＣＰ−１には影響しなかった。また、菌株２２の培養上清はＩＬ−６を有意に亢進した。【００４３】
以上の結果より、菌株２３の脱脂粉乳培養上清はピオグリタゾンとは異なる機序によってアディポネクチン発現量を増加させることが示唆された。ピオグリタゾンの作用機序は核内受容体型転写因子ＰＰＡＲγのリガンドであり、アディポネクチンなどのＰＰＡＲγにより転写調節を受ける遺伝子の発現を変化させる。ＰＰＡＲγは特に脂肪細胞に多く発現していることから、脂肪細胞がピオグリタゾンの主要な標的細胞であると考えられる。ピオグリタゾンが脂肪細胞に作用する結果、ＴＮＦαや遊離脂肪酸(free fatty acid: FFA)などの産生を抑制する一方、アディポネクチンの分泌を増加させ、その結果として脂肪細胞や骨格筋などのインシュリン抵抗性を改善する。【００４４】
ＴＮＦα添加によるインシュリン抵抗性の誘導をおこなわない系で同様の検討を実施した結果を図３ａ〜ｃに示す。なお、図３ａ〜ｃにおいて、「control」は、何も添加していない３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、「脱脂粉乳」は、脱脂粉乳培地を添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、「菌株１７」は、菌株１７を培養した脱脂粉乳培養上清を添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合、「菌株２３」は、菌株２３を培養した脱脂粉乳培養上清を添加した３Ｔ３−Ｌ１細胞の場合である。
菌株２３培養上清はＴＮＦαを添加しない系でも３Ｔ３−Ｌ１細胞のアディポネクチンおよびＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ発現量を有意に増加させた。また、ＩＬ−６発現量は有意ではないものの平均値で２０％程度抑制した。一方、菌株１７はいずれの遺伝子発現量にも有意な影響を及ぼさなかった。【００４５】
結果、菌株２３の脱脂粉乳培養上清は、アディポネクチン発現量を亢進してＩＬ−６発現量を抑制したことから、抗肥満・抗糖尿病効果を示す可能性が示唆された。菌株２２の脱脂粉乳培養上清にはこのような活性はなく、抗肥満・抗糖尿病素材としての脱脂粉乳培養物の利用という点では菌株２３は優れた特性を有することが示された。【００４６】
例３：マウス骨髄由来樹状細胞ＢＭＤＣを用いたアッセイ
ＢＭＤＣは、７週齢オスＩＣＲの大腿骨より抽出した。骨髄液を７０μｍセルストレイナーに通した後、溶血し、非特異的吸着を防ぐためにウサギＩｇＧを添加した。さらに、ビオチン標識抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、Ｉ−Ａｄ（ＭＨＣIIマーカー）抗体を添加して、氷上に３０分静置した。さらにstreptoavidin磁気ビーズと抗Ｂ２２０抗体磁気ビーズを添加した。再度４０μｍのセルストレイナーを通した後、auto MACS DEPLETEでネガティブ画分を回収した。この操作により骨髄液中細胞からＴ細胞、Ｂ細胞や抗原提示細胞を除去し、未熟樹状細胞のみを分離できたものとした。【００４７】
これらを１０％ＧＭ−ＣＳＦ（Granulocyte Macrophage
colony-stimulating Factor）入りＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial
Institute）−medium 1640  １０ｍｌで培養し、３日後にＧＭ−ＣＳＦ入りＲＰＭＩ−medium 1640を５ｍｌ追加した。そのさらに５日後にＢＭＤＣと考えられる浮遊細胞を回収し、１×１０５cells/ウェルで９６穴プレートにまき、同時に各濃度の乳酸菌死菌体を添加した。２４時間後に培養上清を回収し、mouse ELISA kitを用いてＩＬ−１０およびＩＬ−１２（ｐ７０）濃度を定量した。なお、抗体類およびELISA kitはBecton, Dickinson and Companyより購入した。【００４８】
乳酸菌体が樹状細胞やマクロファージのサイトカイン産生能に及ぼす影響について検討をおこなった。
３Ｔ３−Ｌ１細胞に対してその脱脂粉乳培養上清が安定的に有意な活性を示した菌株１７と菌株２３に加え、３Ｔ３−Ｌ１細胞での検討で何度か有意な活性を示した菌株１２の３菌株の凍結乾燥死菌体について、ＢＭＤＣ細胞のサイトカイン産生能に及ぼす影響を調べた。比較対象として、活性が既知の菌株２２と、Lactobacillus gasseri MEP222804（以下、菌株４）の死菌体を用いた。各乳酸菌の死菌体（０．５、１、５、１０μｇ／ｍｌ）をＢＭＤＣに添加し、４８時間後のＩＬ−１０とＩＬ−１２（ｐ７０）産生量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を図４ａ〜ｂに示す。なお、図４ａ〜ｂにおいて、「菌株１２」は、菌株１２の死菌体を添加したＢＭＤＣ細胞の場合、「菌株１７」は、菌株１７の死菌体を添加したＢＭＤＣ細胞の場合、「菌株２３」は、菌株２３の死菌体を添加したＢＭＤＣ細胞の場合、「菌株２２」は、菌株２２の死菌体を添加したＢＭＤＣ細胞の場合、「菌株４」は、菌株４の死菌体を添加したＢＭＤＣ細胞の場合、である。【００４９】
菌株２３の死菌体は菌株２２と同程度のＩＬ−１０およびＩＬ−１２の産生誘導活性を示した。菌株１７の死菌体はこれらに比べてＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）産生誘導活性が非常に低く、菌株１２の死菌体はほとんど活性を示さなかった。【００５０】
例４：マウスマクロファージＪ７７４．１細胞株を用いたアッセイ
マウスマクロファージＪ７７４．１細胞（理研セルバンク（ＲＣＢ）より購入）を、１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ培地で培養して３日おきに継代した。１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した細胞懸濁液を２５０μｌ／ウェルずつ４８ウェルプレートに播種し、同時に各種乳酸菌の凍結乾燥死菌体およびＬＰＳ（Ｗａｋｏ）を添加し、その４８時間後に培養上清を回収した。凍結乾燥死菌体はＰＢＳで１０ｍｇ／ｍｌに調製し、各濃度となるようにＲＰＭＩ培地で希釈後１２５μｌ／ウェルずつ細胞に添加した。ＬＰＳは蒸留水で１ｍｇ／ｍｌとした後ＲＰＭＩ培地で４μｇ／ｍｌに調製し、１２５μｌ／ウェルずつ細胞に添加して最終濃度が１μｇ／ｍｌとなるようにした。【００５１】
回収した上清中のＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２（ｐ４０）濃度をmouse ELISA kit（Becton, Dickinson and Company）を用いて定量した。なお、活性型であるＩＬ−１２（ｐ７０）はＪ７７４．１細胞では発現していないため、代わりにＩＬ−１２（ｐ４０）を測定した。【００５２】
菌株１７と菌株２３に加え、菌株１２の３菌株の凍結乾燥死菌体について、Ｊ７７４．１細胞のサイトカイン産生能に及ぼす影響を調べた。また、菌株４の死菌体はＪ７７４．１細胞のＩＬ−１２ｐ４０産生能を顕著に亢進する。菌株２２は、ＢＭＤＣでの結果からＩＬ−１０産生亢進などの抗炎症性作用が予測された。したがって、上記５菌株の死菌体（１、１０μｇ／ｍｌ）をＪ７７４．１細胞に添加し、４８時間後のＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）産生量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を図５ａ〜ｃに示す。なお、図５ａ〜ｃにおいて、「control」は、何も添加していないＪ７７４．１細胞の場合、「菌株１２」は、菌株１２の死菌体を添加したＪ７７４．１細胞の場合、「菌株１７」は、菌株１７の死菌体を添加したＪ７７４．１細胞の場合、「菌株２３」は、菌株２３の死菌体を添加したＪ７７４．１細胞の場合、「菌株２２」は、菌株２２の死菌体を添加したＪ７７４．１細胞の場合、「菌株４」は、菌株４の死菌体を添加したＪ７７４．１細胞の場合である。【００５３】
菌株４は、いずれのサイトカインについても産生誘導能が最も高かった。菌株２３は菌株２２と同程度のＩＬ−１０およびＩＬ−１２（ｐ４０）産生誘導能を有することが明らかとなった。【００５４】
ＢＭＤＣに対して、菌株２３の死菌体は、免疫活性の高い抗炎症性乳酸菌である菌株２２と同程度のＩＬ−１０産生誘導活性を示すことが明らかとなった。また菌株２３の死菌体は、Ｊ７７４．１細胞に対しても菌株２２と同程度のＩＬ−１０産生誘導活性を示すことが明らかとなった。つまり菌株２３は菌株２２と比較しても遜色ない免疫活性の高い抗炎症性乳酸菌と考えられる。【００５５】
以上の結果から、菌株２３は、３Ｔ３−Ｌ１細胞に対して、他の菌株に比べて有意にアディポネクチン産生を増大させ、かつ、マウス骨髄由来樹状細胞においても、マウスマクロファージＪ７７４．１細胞においても、ＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインの産生を、他の菌株に比べて有意に増大させたことが明らかとなった。この結果から、菌株２３は、脂肪細胞のアディポネクチン産生能を高めることを介したメタボリックシンドロームに対する改善効果ばかりでなく、免疫系細胞から分泌されるＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカイン産生能を高めることを介したメタボリックシンドロームに対する改善効果が示唆された。このことは、菌株２３を用いた発酵生成物に抗メタボリックシンドローム効果が有することを示唆するものである。【００５６】
例５．糖尿病・肥満モデルマウスを用いた有効性試験
糖尿病・肥満モデルマウスとして、KKマウスに肥満発症遺伝子AYを導入した、KKAyマウスを使用した。KKAyマウスは、若齢期から肥満、インスリン抵抗性、高脂血症を起こすことが知られている。
（被検物）
・乳酸菌培養物：菌株２３（Lactobacillus plantarum OLL2712、（受託番号：FERM BP-11262））を表２に記載の脱脂粉乳培地で培養したものを生菌のまま投与に用いた。乳酸菌培養物に含まれる、菌株２３の菌数は２×１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。本試験における菌株２３培養物の投与用量は、１×１０８ｃｆｕ／ｂｏｄｙ／ｄａｙ（３．７×１０９ｃｆｕ／ｋｇ／ｄａｙ）である。
・陽性対照薬剤：ピオグリタゾン塩酸塩（Pioglitazone Hydrochloride、フナコシ株式会社）を、カルボシキメチルセルロースナトリウム(Wako)溶液に溶解後、蒸留水で希釈し１ｍｇ／ｍｌに調製して投与に用いた。ピオグリタゾン塩酸塩は、脂肪組織でのＴＮＦα発現を抑制してインスリン抵抗性を改善し、糖の取り込みと利用を促進することが確認されている、２型糖尿病の治療薬である。ピオグリタゾン塩酸塩のCasNo.は112529-15-4、化学名は（5RS）-5-｛4-［2-（5-Ethylpyridin-2-yl）ethoxy］benzyl｝thiazolidine-2,
4-dione monohydrochlorideである。本試験におけるピオグリタゾン塩酸塩の投与用量は、０．５ｍｇ／ｂｏｄｙ／ｄａｙである。この用量は、Mohapatraらの論文を参考に設定した(Mohapatra J,et
al.,Pharmacology.84-4:203,2009)。【００５７】
（動物試験）
５週齢の雄KKAyマウス（日本クレア社）を、マイクロベント飼育装置（アレンタウン社製）で個飼いし、1週間の馴化飼育を行った。馴化飼育後、マウスを血糖値、HbA1c値、体重を基に３群（コントロール群、乳酸菌投与群、陽性対照群、各ｎ＝４）に分けた(day0)。この時、各群の体重の平均値は約２７gであった。さらに、day1からday21までの３週間、コントロール群に表２に記載の脱脂粉乳培地、乳酸菌投与群に乳酸菌培養物、陽性対照群に陽性対照薬剤を１日1回、０．５ｍｌ／ｂｏｄｙ経口投与した。被検物の投与期間中、水は自由摂取、餌はCRF-1の自由摂取とした。
被検物の投与期間中、週一回(day0、day7、day14およびday21)、３時間半の絶食後に尾静脈より血液を採取し、血糖値、ヘモグロビンA1c値を測定した。採血後は、CRF-1を自由摂取させた。また、３週間の投与期間中、週２回(day0、day4、day7、day11、day14、day18およびday21)、体重と摂餌量を測定した。
投与終了後に頚椎脱臼による安楽死後に解剖し、腎周囲脂肪組織、精巣上体周囲脂肪組織を採取し、各湿重量(g)を測定し、その合計を内臓脂肪重量(g)とした。さらに、脂肪組織を遠心分離により成熟脂肪細胞画分（MAF画分）と間質血管画分（SVF画分）に分離し、MAF画分はアディポネクチンmRNA発現量の解析を行った。【００５８】
（測定方法）
・血糖値：血糖測定機器（Breeze2、バイエル薬品社)にて測定した。
・血中ヘモグロビンA1c（HbA1c）：Hemoglobin A1c Testing Analyzer(DCA2000 system、バイエルメディカル社)を用いて血中のヘモグロビンA1cの濃度を測定した。
・血中アディポネクチン：mouse adiponectin ELISA kit(大塚製薬)を用いて血中のアディポネクチンの濃度を測定した。
・血中トリグリセリド：富士ドライケムシステム及び富士ドライケムスライドTG-PIII(富士フィルム)を用いて血中のトリグリセリドの濃度を測定した。
・MAF画分のアディポネクチンmRNA発現：TRizol試薬(invitrogen)を用いてMAF画分からtotal RNAを抽出し、PrimeScript RT reagent kit（Takara）を用いてcDNAを合成し、ABI 7300 real time PCR system(ABI)を用いてMAF画分のアディポネクチンmRNA発現量を測定した。【００５９】
（結果）
・試験期間中の摂餌量及び体重変化に群間の差はなかった。
・乳酸菌投与群（菌株２３）及び陽性対照群（pio）では全ての個体で試験期間中に血中アディポネクチン濃度が増加したが、コントロール群（脱脂粉乳）では半数が減少した（図６、day21の血中アディポネクチン濃度からday0の血中アディポネクチン濃度を差し引いた値を血中アディポネクチン濃度の変化量として算出した。）。
・内臓脂肪組織由来脂肪細胞のアディポネクチン遺伝子発現量は、乳酸菌投与群で増加傾向であった（図７）。(P=0.08  vs. コントロール群、マンホイットニーのU検定)。脂肪組織中の脂肪細胞においてアディポネクチンmRNA量が増加すると、アディポネクチン産生量が増加し、全身の組織における糖の取り込みが促進されると考えられる。また、アディポネクチンは脂肪の燃焼を促進することから、脂肪の蓄積を抑制するとも考えられる。
・内臓脂肪重量は乳酸菌投与群で有意に低値であった（図８）。(P=0.02  vs. コントロール群、マンホイットニーのU検定)
・血中トリグリセリド値は乳酸菌投与群で増加が抑制される傾向があった（図９）。(P=0.08（day21）  vs. コントロール群、マンホイットニーのU検定、Student’s t-test)
・血中HbA1c値は乳酸菌投与群及び陽性対照群において増加が抑制された個体が多かった(図10、day21の血中HbA1c値からday0の血中HbA1c値を差し引いた値を血中HbA1cの変化量として算出した)。【００６０】
例６：ヨーグルトの製造
ヨーグルトベースミックスを常法に従って調製し、混合スターター（Lactobacillus
bulgaricus およびStreptococcus thermophilus）のみを接種したものと、混合スターターに菌株２３（Lactobacillus plantarum OLL2712、（受託番号：FERM
BP-11262））を加えて接種したものとを、夫々発酵させ、ヨーグルトを製造した。
結果、菌株２３を加えて接種して得られたヨーグルトは、加えないで得られたヨーグルトに比べて、同等以上の好ましい風味と物性を持っていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のLactobacillus属菌によれば、アディポネクチンの産生を増大させることに加え、アディポネクチンに依存しない炎症性免疫関連サイトカインの産生の増大をも可能とするものであって、極めて信頼性の高い複合的なアプローチでのメタボリックシンドロームの改善効果を奏するので、医薬組成物や食品組成物に含有させることによって、簡便にかつ効果的に摂取することができ、メタボリックシンドロームの改善が可能である。
【００６２】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年4月17日(2012.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Lactobacillus plantarum OLL2712菌株（受託番号：FERM BP-11262）。
【請求項２】
請求項１に記載の菌株の培養物またはその加工物。
【請求項３】
請求項１に記載の菌株、請求項２に記載の培養物およびその加工物から選択される１種または２種以上を含む、医薬組成物。
【請求項４】
内臓脂肪の蓄積を抑制するための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
脂肪細胞に対しアディポネクチン産生を増大させ、かつ、骨髄由来樹状細胞および／またはマクロファージに対し炎症性免疫関連サイトカインの産生を増大させるための、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
炎症性免疫関連サイトカインがＩＬ−１０である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の菌株、請求項２に記載の培養物およびその加工物から選択される１種または２種以上を含む、食品組成物。
【請求項８】
内臓脂肪の蓄積を抑制するための、請求項７に記載の食品組成物。
【請求項９】
脂肪細胞に対しアディポネクチン産生を増大させ、かつ、骨髄由来樹状細胞および／またはマクロファージに対し炎症性免疫関連サイトカインの産生を増大させるための、請求項７または８に記載の食品組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月13日(2012.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum） OLL2712菌株（受託番号：FERM BP-11262）。
【国際調査報告】
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