(57)【要約】  式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）〔式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２はアルキル基等を示し；Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は水素原子等を示し；Ａｒはフェニル基等を示す。式（ＩＩ）中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ１７はそれぞれ独立に水素原子等を示し；Ｘはリン原子等を示す。式（ＩＩＩ）中、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３はそれぞれ独立に水素原子等を示し；Ｒ２４及びＲ２５はそれぞれ独立にＣ３−６アルキル基等を示す〕で表される化合物又はその塩などを含み、がんや生活習慣病の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として有用なヒストンメチル化酵素Ｐｒ−Ｓｅｔ７に対する阻害剤。2011010715.tif 000026
2011010715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(I)、(II)、又は(III)：
【化１】
2011010715.tif 000025
〔式(I)中、R1及びR2はそれぞれ独立にC1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C1-6アルコキシ基、又はシアノ基を示し；R3、R4、及びR5はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はC1-6アルキル基を示し；Arはフェニル基、ピリジル基、ピリミジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、又はピラニル基を示す。式(II)中、R11、R12、R13、R14、R15、R16、及びR17はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はC1-6アルキル基を示し；Xはリン原子又はイオウ原子を示す。式(III)中、R21、R22、及びR23はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はC1-6アルキル基を示し；R24及びR25はそれぞれ独立にC3-6アルキル基又はトリアルキルシリル基を示す。〕で表される化合物又はその塩を含むヒストンメチル化酵素Pr-Set7に対する阻害剤。
【請求項２】
ヒストンメチル化酵素Pr-Set7に対する特異的阻害剤である請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
R1及びR2がそれぞれ独立にエチル基、ビニル基、エチニル基、メトキシ基、又はシアノ基であり、R3、R4、及びR5が水素原子又はフッ素原子であり、Arがフェニル基又はピリジル基である請求項１又は２に記載の阻害剤。
【請求項４】
R1及びR2が共にシアノ基であり、R3、R4、及びR5が水素原子であり、Arが3-ピリジル基である請求項３に記載の阻害剤。
【請求項５】
R11、R12、R13、R14、R15、R16、及びR17がそれぞれ独立に水素原子又はフッ素原子であり、Xがイオウ原子である請求項１又は２に記載の阻害剤。
【請求項６】
R11、R12、R13、R14、R15、R16、及びR17が水素原子であり、Xがイオウ原子である請求項５に記載の阻害剤。
【請求項７】
R21、R22、及びR23がそれぞれ独立に水素原子又はフッ素原子であり、R24及びR25がそれぞれ独立にイソプロピル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基、又はトリメチルシリル基である請求項１又は２に記載の阻害剤。
【請求項８】
R21、R22、及びR23が水素原子であり、R24及びR25がtert-ブチル基である請求項７に記載の阻害剤。
【請求項９】
請求項１に記載の一般式(I)、(II)、又は(III)で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む医薬。
【請求項１０】
がん又は生活習慣病の予防及び／又は治療のための請求項９に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒストンメチル化酵素であるPr-Set7に対する特異的な阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
真核生物の染色体DNAはヌクレオソームの繰り返し構造がらせん状につながった高次構造をとっており、この構造はクロマチンと呼ばれている。ヌクレオソームは4種のヒストンタンパク質(コアヒストン：H2A、H2B、H3、及びH4)がそれぞれ2分子ずつ集合したヒストンオクタマーに146塩基対のDNAが約2回転巻き付いた構造をとっている。ヌクレオソームを構成するヒストンはリジンなどの塩基性アミノ酸を多数もつタンパク質であり、酸性を示すDNAと強固に結合している。ヒストンは主としてN末端の部分(ヒストンテール)で様々な修飾を受ける。【０００３】
例えば、転写因子が標的遺伝子に結合すると、ヒストンアセチル化酵素(histone acetyl transferase: HAT)活性を有する転写コアクチベーターがリクルートされ周辺のヒストンをアセチル化する。このアセチル化が引き金となってクロマチン・リモデリング複合体がプロモーター上にリクルートされ、基本転写因子とRNAポリメラーゼによる転写が開始する。さらに、ヒストンはリン酸化、ユビキチン化、及びメチル化修飾によりクロマチン構造や遺伝子発現の制御を受けている。ヒストンのメチル化は、ヒストンのリジン残基又はアルギニン残基に対してヒストンメチル化酵素(Histone methyltransferase: HMT)によって触媒される。ヒストンにおける特定のリジン残基に付加されるメチル基は化学的に安定であり、クロマチン高次構造の制御を介したエピジェネティクスの中心的役割を担うものと考えられている。【０００４】
現在、よく解析されているのはヒストンH3K9やH3K4のメチル化である。ヒストンH3K9のメチル化では、メチル化されたK9をHP1（heterochromatin protein 1）が認識して結合し、HP1はDNAメチル化酵素やHDACをリクルートし、さらにHP1同士が集合化することにより、周辺クロマチン領域を閉じた状態に変換する。このような機構により、遺伝子座のサイレンシングが起こることが知られている。一方、ヒストンH3K4のメチル化は、転写の活性化と相関することが知られている。【０００５】
また、ヌクレオソ−ム結晶構造の解析結果からヒストンH4の16から20番目の残基が隣接する他のヌクレオソ−ムと相互作用してクロマチンの高次構造形成に直接関与する可能性が示唆されており、このうち特に20番目のリジン残基へのメチル化がクロマチン高次構造形成の中心的役割を担うものとしてその重要性が強く示唆されていたが、ヌクレオソ−ム中のヒストンH4の20番目のリジン残基を特異的にメチル化する酵素が見出され(Curr. Biol., 12, pp.1086-1099, 2002)、その機能が解明されつつある(Genes Dev., 16, pp.2225-2230, 2002: 以下、本明細書においてこの酵素を「Pr-Set7」と呼ぶ場合があるが、この酵素は「SET8」と呼ばれる場合もある)。【０００６】
Pr-Set7は70−90kDaのホモ二量体を形成しており、N末端部分がヌクレオソ−ム特異性を担っている。また、この酵素はヒストン・メチル化酵素のコンセンサスであるSETドメインを有しているが、このドメインがメチル化の部位特異性を担っている。Pr-Set7は細胞周期に依存した転写サイレンシング(Mol. Cell, 9, pp.1201-1213, 2002)及び動物における有糸分裂の制御(Genes Dev., 19, pp.431-435, 2005)に関与しているが、Pr-Set7のSETドメイン中のRHRKVLRDN(17-25)配列が酵素機能に必須であるとされている(Genes Dev., 19, pp.1444-1454, 2005; Genes Dev., 19, pp.1455-1465, 2005)。また、最近、この酵素がヒトを含む哺乳類動物におけるがんや生活習慣病に深く関与しているとの知見が報告されている(がんについてはMol. Cell Biol., 28, pp.4459-4468, 2008; 生活習慣病についてはMol. Cell Biol., 29, pp.3544-3555, 2009などを参照のこと)。【０００７】
一方、メチル化酵素はメチル化を行うためのメチル基供与体として補因子S-アデノシルメチオニン(AdoMet)を必要とする。AdoMetはメチル基を与えるとS-アデノシルホモシステイン(AdoHcy)に変化することから、このAdoHcyを反応系内に存在させることによりメチル化酵素は競合阻害を受け、ほとんどのメチル化酵素は強力に阻害される(総説としてGenome Biology, 26, p.227, 2005などを参照のこと)。Pr-Set7については、タンパク質結晶についての構造解析結果とともに阻害剤AdoHcyとの結合の様式が上記文献(Genes Dev., 19, pp.1444-1454, 2005)に詳細に示されている。しかしながら、これらの阻害剤はPr-Set7以外のメチル化酵素に対しても阻害作用を示すことから特異性が低く、医薬として適用する場合には副作用の発現が懸念される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Curr. Biol., 12, pp.1086-1099, 2002
【非特許文献２】Genes Dev., 16, pp.2225-2230, 2002
【非特許文献３】Mol. Cell, 9, pp.1201-1213, 2002
【非特許文献４】Genes Dev., 19, pp.431-435, 2005
【非特許文献５】Genes Dev., 19, pp.1444-1454, 2005
【非特許文献６】Genes Dev., 19, pp.1455-1465, 2005
【非特許文献７】Mol. Cell Biol., 28, pp.4459-4468, 2008
【非特許文献８】Mol. Cell Biol., 29, pp.3544-3555, 2009
【非特許文献９】Genome Biology, 26, p.227, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、Pr-Set7に対して特異的な阻害作用を有しており、がんや生活習慣病の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として有用な物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記の課題を解決すべく、上記刊行物(Genes Dev., 19, pp.1444-1454, 2005)に記載されたPr-Set7についての結晶構造解析の結果(タンパク質構造データバンク(PDB)、ID＝1zkk)を基にしてPr-Set7のリガンド結合部位に結合可能な約3500種類の阻害剤候補化合物をイン・シリコ・スクリーニングにより選抜し、それらのなかから、Pr-Set7に対して強い阻害活性を有しており、かつ他のヒストンメチル化酵素(例えばヒストンメチル化酵素G9aなど)に対しては阻害活性が弱いか、又は実質的に阻害活性を有しない化合物をイン・ビトロ試験により選択することに成功した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。【００１１】
すなわち、本発明により、下記の一般式(I)、(II)、又は(III)：
【化１】
2011010715.tif 000003
〔式(I)中、R1及びR2はそれぞれ独立にC1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C1-6アルコキシ基、又はシアノ基を示し；R3、R4、及びR5はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はC1-6アルキル基を示し；Arはフェニル基、ピリジル基、ピリミジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、又はピラニル基を示す。式(II)中、R11、R12、R13、R14、R15、R16、及びR17はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はC1-6アルキル基を示し；Xはリン原子又はイオウ原子を示す。式(III)中、R21、R22、及びR23はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はC1-6アルキル基を示し；R24及びR25はそれぞれ独立にC3-6アルキル基又はトリアルキルシリル基を示す。〕で表される化合物又はその塩を含むヒストンメチル化酵素Pr-Set7に対する阻害剤が提供される。【００１２】
上記発明の好ましい態様によれば、ヒストンメチル化酵素Pr-Set7に対する特異的阻害剤である上記の阻害剤；ヒストンメチル化酵素G9aに対して実質的に阻害活性を有しないか、又はヒストンメチル化酵素G9aに対する阻害活性が弱い上記の阻害剤；ヒストンメチル化酵素G9aのメチル化に対する阻害活性が該酵素のメチル化に対するS-アデノシルホモシステインの阻害活性よりも弱い上記の阻害剤；ヒストンメチル化酵素Pr-Set7のメチル化に対する阻害活性が該酵素のメチル化に対するS-アデノシルホモシステインの阻害活性よりも強い上記の阻害剤が提供される。【００１３】
さらに好ましい態様によれば、式(I)においてR1及びR2がそれぞれ独立にエチル基、ビニル基、エチニル基、メトキシ基、又はシアノ基であり、R3、R4、及びR5が水素原子又はフッ素原子であり、Arがフェニル基又はピリジル基である上記の阻害剤；式(I)においてR1及びR2が共にシアノ基であり、R3、R4、及びR5が水素原子であり、Arがピリジル基である上記の阻害剤；式(I)においてR1及びR2が共にシアノ基であり、R3、R4、及びR5が水素原子であり、Arが3-ピリジル基である上記の阻害剤；式(II)において、R11、R12、R13、R14、R15、R16、及びR17がそれぞれ独立に水素原子又はフッ素原子であり、Xがイオウ原子である上記の阻害剤；式(II)において、R11、R12、R13、R14、R15、R16、及びR17が水素原子であり、Xがイオウ原子である上記の阻害剤；式(III)において、R21、R22、及びR23がそれぞれ独立に水素原子又はフッ素原子であり、R24及びR25がそれぞれ独立にイソプロピル基、tert-ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基、又はトリメチルシリル基である上記の阻害剤；及び式(III)において、R21、R22、及びR23が水素原子であり、R24及びR25がtert-ブチル基である上記の阻害剤が提供される。【００１４】
別の観点からは、本発明により、がん又は生活習慣病の予防及び／又は治療のための医薬であって、上記の一般式(I)、(II)、又は(III)で表される化合物又はその塩を有効成分として含む医薬、及びがん又は生活習慣病の予防及び／又は治療のための上記医薬の製造のための上記の一般式(I)、(II)、又は(III)で表される化合物又はその塩の使用が提供される。【００１５】
さらに別の観点からは、がん又は生活習慣病の予防及び／又は治療方法であって、上記の一般式(I)、(II)、又は(III)で表される化合物又はその塩の予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により提供されるPr-Set7阻害剤はPr-Set7に対して強い阻害作用を有しており、従来のヒストンメチル化酵素阻害剤に比べてPr-Set7に対して高い特異性を有していることから、例えば、がん又は生活習慣病の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として用いる場合にも副作用を軽減しつつ所望の薬理効果を確実に発揮させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】阻害剤無添加(control)、ジメチルスルホキシド(DMSO)単独、S-アデノシルホモシステイン(AdoHcy)添加を対照として本発明の阻害剤の作用を評価した結果を示した図である。
【図２】本発明の阻害剤(EBI099)によるメチル化阻害活性の濃度依存性を示した図である。
【図３】本発明の阻害剤(EBI099)についてメチル化酵素阻害の特異性を調べた結果を示した図である。G9aはヒストンメチル化酵素G9aの結果を示し、BIXはBIX01294 (2-(ヘキサヒドロ-4-メチル-1H-1,4-ジアゼピン-1-イル)-6,7-ジメトキシ-N-[1-(フェニルメチル)-4-ピペリジニル]-4-キナゾリンアミン・3塩酸塩・水和物)、AdoHcyはS-アデノシルホモシステインの結果を示す。
【図４】EBI099の白血病細胞増殖抑制効果を示した図である。
【図５】EBI099の各種遺伝子に対する発現誘導作用を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のヒストンメチル化酵素Pr-Set7に対する阻害剤は上記の一般式(I)、(II)、又は(III)で表される化合物又はその塩を含んでいる。本発明の阻害剤は、ヒストンメチル化酵素Pr-Set7に対して特異的な阻害作用を有することを特徴としているが、本明細書において用いられる「特異的な阻害作用」又はその同義語は、ヒストンメチル化酵素Pr-Set7に対して十分な阻害作用を有しており、かつPr-Set7以外のメチル化酵素、好ましくはPr-Set7以外のヒストンメチル化酵素（例えばヒストンメチル化酵素G9aなど）に対して、従来知られているメチル化酵素阻害剤であるS-アデノシルホモシステインの阻害活性よりも弱い阻害作用を有することを意味する。
【００１９】
例えば、本発明の阻害剤は、ヒストンメチル化酵素Pr-Set7に対してS-アデノシルホモシステインの阻害活性より強い阻害作用を有しており、かつPr-Set7以外のヒストンメチル化酵素に対してS-アデノシルホモシステインの阻害活性よりも弱い阻害作用を有することが好ましい。Pr-Set7以外のヒストンメチル化酵素に対して実質的に阻害作用を有しないことが特に好ましいが、例えばPr-Set7以外のヒストンメチル化酵素に対しては基質濃度10μM程度の濃度で阻害剤非存在下におけるメチル化活性に対して約90%以上のメチル化活性を与えることが好ましく、及び／又は基質濃度25μM程度の濃度で阻害剤非存在下におけるメチル化活性に対して約50%以上のメチル化活性を与えることが好ましい。
【００２０】
Pr-Set7は、例えばGenes Dev., 19, pp.1444-1454, 2005などの刊行物に記載された方法により容易に入手することが可能であり、メチル化活性についても上記刊行物に具体的に説明された方法により当業者は容易に確認を行うことができる。本明細書の実施例にもメチル化活性の測定方法及びメチル化活性の阻害作用の判定方法について具体的かつ詳細な説明がなされているので、当業者は上記刊行物及び本明細書の実施例を参照することにより、本発明の阻害剤の特異的Pr-Set7阻害作用を容易に確認することが可能である。
【００２１】
本明細書において「アルキル基」の用語は特に言及しない場合には直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。アルキル部分を含む他の置換基(例えばアルコキシ基など)におけるアルキル部分についても同様である。本明細書において「ハロゲン原子」とはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。また、本明細書において言及するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、トリアルキルシリル基、フェニル基、ピリジル基、ピリミジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、又はピラニル基は、置換可能な位置に任意の置換基を1個又は2個以上有していてもよい。2個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、アルキル基やアルコキシ基には1個又は2個以上のハロゲン原子、好ましくはフッ素原子が置換していてもよく、フェニル基やピリジル基の環上には1個又は2個以上のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基などが置換していてもよい。
【００２２】
式(I)中、R1及びR2はそれぞれ独立にC1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C1-6アルコキシ基、又はシアノ基を示す。R1及びR2が示すC1-6アルキル基としてはメチル基、エチル基、又はn-プロピル基が好ましく、R1及びR2が示すC2-6アルケニル基としてはビニル基、1-プロペニル基、又は2-プロペニル基(アリル基)が好ましく、R1及びR2が示すC2-6アルキニル基としてはエチニル基、1-プロピニル基、又は2-プロピニル基が好ましく、R1及びR2が示すC1-6アルコキシ基としてはメトキシ基又はエトキシ基が好ましい。C1-6アルキル基としてはエチル基が好ましく、C2-6アルケニル基としてはビニル基がより好ましく、C2-6アルキニル基としてはエチニル基がより好ましく、C1-6アルコキシ基としてはメトキシ基がより好ましい。例えば、トリフルオロエチル基、ペンタフルオロエチル基、トリフルオロメトキシ基なども好ましい。これらのうち、特に好ましいのはシアノ基であり、R1及びR2が共にシアノ基である場合が最も好ましい。
【００２３】
R3、R4、及びR5はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はC1-6アルキル基を示す。ハロゲン原子としてはフッ素原子が好ましく、C1-6アルキル基としてはメチル基が好ましい。トリフルオロメチル基が好ましい場合もある。R3、R4、及びR5としては水素原子が好ましい。
【００２４】
Arはフェニル基、ピリジル基、ピリミジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、又はピラニル基を示すが、ピリジル基、ピリミジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、又はピラニル基の結合位置は特に限定されない。例えば、ピリジル基については2-ピリジル基、3-ピリジル基、又は4-ピリジル基のいずれであってもよいが、3-ピリジル基が好ましい場合がある。フェニル基、ピリジル基、ピリミジル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、又はピラニル基の環上に置換基が存在する場合の例としては、例えば、フルオロフェニル基、トルイル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、メチルピリジル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。Arとしてはピリジル基が好ましく、3-ピリジル基がさらに好ましい。
【００２５】
式(II)中、R11、R12、R13、R14、R15、R16、及びR17はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はC1-6アルキル基を示す。ハロゲン原子としてはフッ素原子が好ましく、C1-6アルキル基としてはメチル基が好ましい。トリフルオロメチル基が好ましい場合もある。R11、R12、R13、R14、R15、R16、及びR17が水素原子であることが好ましい。Xはリン原子又はイオウ原子を示すが、イオウ原子であることが好ましい。
【００２６】
式(III)中、R21、R22、及びR23はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はC1-6アルキル基を示す。ハロゲン原子としてはフッ素原子が好ましく、C1-6アルキル基としてはメチル基が好ましい。トリフルオロメチル基が好ましい場合もある。R21、R22、及びR23が水素原子である場合が好ましい。R24及びR25はそれぞれ独立にC3-6アルキル基又はトリアルキルシリル基を示すが、C3-6アルキル基としては分枝鎖アルキル基、環状アルキル基、又は環状アルキル部分を含むアルキル基が好ましい。例えば、イソプロピル基、イソブチル基、tert-ブチル基、ネオペンチル基などのほか、シクロプロピル基、シクロプロピルメチル基、1-メチルシクロプロピル基、2-メチルシクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロブチルメチル基などを用いることもできる。これらのアルキル基に1個又は2個以上のフッ素原子が置換したアルキル基が好ましい場合もある。トリアルキルシリル基としては、例えばトリメチルシリル基などを用いることができる。R24及びR25がともにtert-ブチル基であることが好ましい。
【００２７】
上記の一般式(I)、(II)、又は(III)で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩などの塩の形態で存在する場合があるが、本発明の阻害剤として任意の塩を使用することができる。酸付加塩としては、塩酸塩若しくは臭化水素酸塩などの鉱酸塩、又はp-トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、シュウ酸塩、若しくは酒石酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、若しくはカルシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩若しくはエタノールアミン塩などの有機アミン塩などを用いることができる。また、グリシン塩などのアミノ酸塩として存在することもできる。
【００２８】
上記の一般式(I)、(II)、又は(III)で表される化合物は、置換基の種類に応じて1個または2個以上の不斉炭素を有する場合があるが、これらの不斉炭素に基づく任意の光学異性体、光学異性体の任意の混合物、ラセミ体、2個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体、ジアステレオ異性体の任意の混合物などを本発明の阻害剤として用いることもできる。また、遊離化合物又は塩の形態の化合物の任意の水和物又は溶媒和物を本発明の阻害剤として用いてもよい。
【００２９】
本発明の阻害剤のうち、特に好ましい化合物としては、一般式(I)においてR1及びR2が共にシアノ基であり、R3、R4、及びR5が水素原子であり、Arが3-ピリジル基である化合物、一般式(II)においてR11、R12、R13、R14、R15、R16、及びR17が水素原子であり、Xがイオウ原子である化合物、及び一般式(III)においてR21、R22、及びR23が水素原子であり、R24及びR25がtert-ブチル基である化合物を挙げることができるが、本発明の阻害剤はこれらに限定されることはない。これらの化合物は、例えば、Chem Cupid (Namiki Shoji Co., Ltd.: http://www.namiki-s.co.jp/chemcupid/)により検索し、試薬メーカーから研究用試薬として入手することが可能である。また、一般式(I)、(II)、及び(III)に包含される化合物は、例えば、試薬メーカーのカタログに収載された刊行物に記載されている上記の好ましい化合物の製造方法を参照しつつ、出発原料、反応試薬、及び反応条件などを適宜改変し、必要に応じて適宜の反応を付加することにより、いずれも容易に製造することが可能である。
【００３０】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の阻害剤はPr-Set7のリガンド結合部位に嵌まり込み、主として以下の結合様式によりリガンド結合部位に結合するものと考えられる。下記の情報は、例えば、Genes Dev., 19, pp.1444-1454, 2005に記載されたPr-Set7のリガンド結合部位についての3次元構造解析の結果を利用しつつ、上記の一般式(I)、(II)、及び(III)で表される化合物のコンフォーメーションを考慮したドッキング実験を行うことにより当業者に容易に入手可能である。従って、当業者は、上記の一般式(I)、(II)、及び(III)で表される化合物がいずれもPr-Set7のリガンド結合部位の空間内に入り込むことができ、阻害剤として機能するために好適なコンフォーメーションでリガンド結合部位に結合できることを容易に理解することができる。
【００３１】
(a)一般式(I)で表される化合物、及びその具体例としてR1及びR2が共にシアノ基であり、R3、R4、及びR5が水素原子であり、Arが3-ピリジル基である化合物の結合様式：R1に隣接するアミノ基とGlu259におけるカルボキシル基のカルボニル基との水素結合、R1に隣接するアミノ基とTyr274のフェノール性水酸基との水素結合、及びR3などが置換するベンゼン環とTyr274におけるフェノール基のベンゼン環とのπ-π相互作用による結合。
【００３２】
【化２】
2011010715.tif 000004
【００３３】
(b)一般式(II)で表される化合物、及びその具体例としてR11、R12、R13、R14、R15、R16、及びR17が水素原子であり、Xがイオウ原子である化合物の結合様式：Xを含む6員環を構成する環構成窒素原子とそれぞれTyr336のフェノール性水酸基及びGlu259におけるカルボキシル基のカルボニル基との水素結合、及びベンゼン環とTyr336におけるフェノール基のベンゼン環とのπ-π相互作用による結合。
【００３４】
【化３】
2011010715.tif 000005
【００３５】
(c)一般式(III)で表される化合物、及びその具体例としてR21、R22、及びR23が水素原子であり、R24及びR25がtert-ブチル基である化合物の結合様式：ナフタレン環に置換する水酸基とTyr271のカルボニル基及びTyr245のフェノール性水酸基との水素結合、及びオキサゾリジン環における環構成窒素原子とMet272のカルボニル基との水素結合。
【化４】
2011010715.tif 000006
【００３６】
上記の一般式(I)、(II)、及び(III)で表される化合物はPr-Set7に対して特異的な阻害作用を有していることから、Pr-Set7によるメチル化の異常、特にメチル化の異常亢進が関与する各種の疾患や症候群の予防及び／又は治療に有効な医薬の有効成分として利用することができる。Pr-Set7のメチル化を阻害することにより予防及び／又は治療可能な疾患としては、例えば、がん(Mol. Cell Biol., 28, pp.4459-4468, 2008など)及び生活習慣病（Mol. Cell Biol., 29, pp.3544-3555, 2009など）を挙げることができる。本発明の医薬により予防及び／又は治療可能ながんの種類は特に限定されないが、例えば、白血病、悪性リンパ腫などの非固形癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、大腸癌、直腸癌、食道癌、皮膚癌、悪性脳腫瘍などの固形癌を挙げることができるが、これらに限定されることはない。生活習慣病としては、例えば、高血圧、高脂血症などの脂質異常症、高尿酸血症、脂肪肝、動脈硬化、糖尿病、心筋梗塞などの虚血性心疾患、脳梗塞などの虚血性脳疾患などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。Pr-Set7に対して特異的な阻害作用を有する上記の一般式(I)、(II)、及び(III)で表される化合物を有効成分として含む医薬がこれらの疾患に対して有効性を示すことは、上記の刊行物の教示及び示唆を基にして当業者に容易に理解される。
【００３７】
本発明の医薬は、上記の一般式(I)、(II)、又は(III)で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含んでいるが、有効成分としては、上記の一般式(I)、(II)、又は(III)で表される化合物又はその塩のほか、水和物又は溶媒和物を用いてもよい。本発明の医薬としては上記物質それ自体を投与してもよいが、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な経口用あるいは非経口用の医薬組成物として投与することができる。経口投与に適する医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤等を挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００３８】
上記の医薬組成物は、薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物を加えて製造することができる。薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物の例としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００３９】
本発明の医薬の投与量は特に限定されず、疾患の種類、予防又は治療の目的、有効成分の種類などに応じて適宜選択することができ、さらに患者の体重や年齢、症状、投与経路など通常考慮すべき種々の要因に応じて、適宜増減することができる。例えば、経口投与の場合には成人一日あたり 0.01 〜1,000 mg程度の範囲で用いることができるが、投与量は当業者に適宜選択可能であり、上記の範囲に限定されることはない。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例1：Pr-Set7阻害剤のイン・シリコ・スクリーニング
Genes Dev., 19, pp.1444-1454, 2005において報告されているPr-Set7の結晶構造(タンパク質構造データバンク、ID＝1zkk)から分子動力学シミュレーションを用いて6種類の緩和構造物を作成した。ドッキングソフトとして「Sievgene」(Journal of Molecular Graphics and Modeling, 24, pp.34-45, 2005)を用いて、Multiple target screening (MTS)法にてこれら7種類の標的タンパク質構造に対して200万個の化合物をスクリーニングし、各標的タンパク質構造に対して10万個の化合物に絞り込んだ (10万個×7種類の標的タンパク質構造)。その際、データ量が膨大であることから、200万化合物を1万個ずつの200グループに分けた後、並列化して計算を行い、各グループについて上位500個を抽出することで10万個の化合物を取得した。【００４１】
PR-set7を含むSETドメインを有するファミリーはコファクターとしてS-アデノシルメチオニン(AdoMet)を用いて特定のリジン残基をメチル化することが知られており、コファクターとの結合ポケットはSETファミリータンパク間に共通性が認められる。従って、コファクター結合領域をドッキングモデルに用いるとスクリーニングにより得られる薬物の特異性が低下することが予想されることから、本スクリーニングではPr-Set7とS-アデノシルホモ-システインとを含んだ複合体タンパク質構造を用いて、コファクターが結合するポケット以外の部分に結合する化合物を探索した。なお、この領域はチロシンを多く含むポケットであることから、環同士の引力を考えて化合物は環を含む分子に限定した。【００４２】
次に、絞り込んだ10万化合物で構成される相互作用行列を標的タンパク構造毎に作成し、上位1,000個のリストを作成した(1,000個×7種類の標的タンパク質構造)。重複している化合物を除いた4,802化合物についてMTS法にて順位付けを行った後、フィルターツール(「最新創薬化学-探索研究から開発まで-上巻」、C.G. Wermuth著、長瀬博翻訳、テクノミック発行、2006年7月)にて医薬の有効成分としての適格を有しないと判断される1,258化合物を除き、得られた3,554化合物をイン・シリコ・スクリーニング結果とした。これらの化合物のなかから、入手可能な上位161化合物についてイン・ビトロ試験を行った。【００４３】
【表１】
2011010715.tif 000007
【００４４】
【表２】
2011010715.tif 000008
【００４５】
【表３】
2011010715.tif 000009
【００４６】
【表４】
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【００４７】
【表５】
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【００４８】
【表６】
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【００４９】
【表７】
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【００５０】
【表８】
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【００５１】
【表９】
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【００５２】
【表１０】
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【００５３】
【表１１】
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【００５４】
【表１２】
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【００５５】
【表１３】
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【００５６】
【表１４】
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【００５７】
【表１５】
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【００５８】
【表１６】
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【００５９】
【表１７】
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【００６０】
【表１８】
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【００６１】
例2：Pr-Set7に対する阻害剤のイン・ビトロ試験
(a)Pr-Set7タンパク質発現ベクターの構築
ヒトPr-Set7遺伝子(Invitrogen社)を鋳型にし、5'端側にHindIIIサイト、3'端側にEcoRIサイトをPCRにより付加するプライマー(配列番号1：Fwプライマー、配列番号2：Rvプライマー)を用いてSETドメインを含むアミノ酸配列195-353 aa部分の増幅を行った。PCR後、制限酵素HindIII、EcoRIにて処理を行った。制限酵素処理をしたサンプルを電気泳動の後にゲル精製した。同様にpPAL7ベクター(BIO-RAD社製)も酵素処理を実施し、ゲル精製を行った。精製したベクター及びPCR産物は2×Rapid Ligation BufferとT4DNA Polymerase(ともにPromega社)を用いて指定の方法でライゲーションを実施した。大腸菌のトランスフォーメーションは50マイクロリットルのDH5αコンピテントセル(TOYOBO社製)に対し、2マイクロリットルのライゲーション産物を添加し実施した。プラスミドの抽出はMiniprep Kit(QIAGEN社製)を用いて実施し、得られたプラスミドについてシーケンス解析により配列の確認を実施した。【００６２】
(b)組換えタンパク質の発現
ワイルドタイプストレプトアビジン及びミュータントストレプトアビジンの遺伝子配列を組み込んだpPAL7発現ベクターを常法に従い大腸菌BL21(BIO-RAD社)にトランスフェクションした。各タンパク質の発現は以下のように実施した。すなわち、大腸菌培養液の細胞密度がOD(600nm)0.5-0.7となるまで37℃にて培養を行い、適当な密度になったところに最終濃度1 mMになるようにIPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyanoside)を添加し、タンパク質発現を誘導し、20℃にて24時間の培養を行った。24時間の培養の後、菌体を遠心分離により細胞を集め、タンパク質精製まで-20℃で保存した。【００６３】
(c)組換えタンパク質の精製
組換えタンパク質の精製は、Profinity eXact Protein Purification System(BIO-RAD社製)の方法を用い実施した。BugBuster(Novagen社)を培養容量の1/20添加し細胞の溶解を行った。遠心分離後上清を総可溶性タンパク質とした。回収した可溶性画分は、Profiniaタンパク精製システム(BIO-RAD)の用法容量に従い処理を行った。総可溶性タンパク質、カラム通過画分、洗浄画分、溶出画分を10-20%  レディーゲルJ(BIO-RAD社製)を用いてSDS-PAGE電気泳動した。泳動後、タンパク質をSimplyBlue SafeStain(Invitrogen社製)で染色し精製純度の確認を実施した。精製したタンパク質はVibaspin限外ろ過(GE Healthcare社)による遠心濃縮を行った。【００６４】
(d)質量分析計によるヒストンメチル化酵素活性測定
精製した大腸菌発現ヒストンメチル化酵素Pr-Set7を用いて酵素活性測定を行った。100 mM HEPSE、1 mM ジチオスレイトール緩衝液中に2μM Pr-Set7、1 mM S-アデノシルメチオニン、100 μMヒストンH4ペプチド(ヒストンH4 の15-24アミノ酸の合成ペプチドのN末端をアセチル化、C末端をアミド化したペプチド：Ac-AKRHRKVLRD-NH2)を加え30℃で反応させ、30分及び60分でサンプリングを行った。阻害活性の測定には阻害剤S-アデノシルホモシステインを5 mM又は阻害剤候補化合物を100 μg/mlの濃度で加えて酵素反応を行った。阻害剤候補化合物は10 mg/mlの濃度でジメチルスルホキシドに溶解して反応液中に1/100量加えた。【００６５】
酵素反応を反応液と等量の2.5%トリフルオロ酢酸を加えることによって停止し、脱塩チップを使用して脱塩を行った。脱塩後の試料はペプチド濃度が2.5 pmol/μlになるように2%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸に再可溶化し、1 μlをマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry : MALDI-TOF MS）での測定に使用した。【００６６】
脱塩後の試料1 μlをMALDI-TOF MSのサンプルプレートにスポットし風乾後1.5 mg/mlのα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸1 μlを上層し測定試料とした。リフレクトロンモード、ポジティブイオンモードで測定を行い基質ペプチドのm/z値1319.81とメチル化ペプチドのm/z値1333.83のピーク面積を計算しメチル化比率を求めた。メチル化比率を計算した後、阻害剤無添加、ジメチルスルホキシド単独、S-アデノシルホモシステイン添加を対照として阻害効果の評価を行った。結果を図1に示す。表中のS-079、S-099、S-141、S-167、S-225、S-383、S-435、及びS-455にPr-Set7に対する強い阻害活性が認められ、特にS-099(1-アミノ-3-(3-ピリジル)-3,10-ジヒドロピリジノ[2,1-b]ベンゾチアゾール-2,4-ジカルボニトリル)、S-435(スピロ[5H-ジベンゾ[b,e]1,4-アザホスフィン-10,10'-5H-ジベンゾ[b,e]1,4-アザホスフィン])、及びS-455(1-[5,7-ビス(tert-ブチル)-2,3-ジヒドロベンゾオキサゾール-2-イル]ナフタレン-2-オール)は陽性対照として用いたS-アデノシルホモシステイン(AdoHcy)に比べて強い阻害作用を示した。【００６７】
S-099（以下、「EBI099」と呼ぶ）についてメチル化阻害活性の濃度依存性を調べた結果を図2に示す。また、EBI099についてメチル化酵素阻害の特異性を調べた結果を図3に示す。図3においてはメチル化酵素としてヒストンメチル化酵素G9a(Molecular Cell, 25, pp.473-481, 2007)を用いて、基質濃度10μM及び25μMにおける阻害活性を調べた。この結果、EBI099はPr-Set7に対して高い特異性を有していることが示された。【００６８】
例3
EBI099の白血病細胞増殖抑制効果を調べた。K562細胞(3×104 cells/ml)にEBI099のジメチルスルホキシド(DMSO)溶液(0、25、50、75、及び100μg/ml)を入れて20時間及び60時間後の細胞数を血球計算盤にてカウントした。結果を図4に示す。EBI099は白血病細胞に対して増殖抑制効果を有していることが示された。【００６９】
例4
EBI099の各種遺伝子に対する発現誘導を調べた。K562細胞にDMSOに溶解したEBI099 (100μg/ml)を添加し、24時間後にRNAを抽出した。アフィメトリックス社製マイクロアレイ(Human Genome U133 Plus 2.0 array)にて製品添付のプロトコールに従いRNAより逆転写反応にて蛍光標識を取り込ませたターゲットcDNAをハイブリダイズさせた後、蛍光イメージアナライザーにてシグナルを検出した。DMSO処理した検体を対照としてfold changeを算出し、EBI-099による遺伝子発現変動を評価した。結果を図5に示す。図5に示す各遺伝子に対して発現誘導活性を有していることから、例えばがんや生活習慣病などの疾患に対する有効性を有するものと考えられる。
【図１】
2011010715.tif 000027
【図２】
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【図３】
2011010715.tif 000029
【図４】
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【図５】
2011010715.tif 000031
【配列表】
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【国際調査報告】
2011010715.tif 000032
2011010715.tif 000033
2011010715.tif 000034
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