(57)【要約】塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する塩基性アミノ酸の側鎖が片面側に、疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有する核酸キャリアと２本鎖核酸分子とを接触させ、塩基性アミノ酸の側鎖とリン酸基との静電相互作用および水素結合の一方または双方を介して前記２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖とを結合させ核酸複合体を形成する工程を有する細胞への核酸導入方法およびそれに用いられる核酸複合体が開示されている。
2012008361.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する前記塩基性アミノ酸の側鎖が片面側に、前記疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有する核酸キャリアと前記２本鎖核酸分子とを接触させ、前記塩基性アミノ酸の側鎖とリン酸基との静電相互作用および前記２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、前記２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖とを結合させ核酸複合体を形成する工程と、前記核酸複合体を細胞に導入する工程とを有することを特徴とする細胞への核酸導入方法。
【請求項２】
前記塩基性アミノ酸が、アルギニン、リジンおよびオルニチンからなる群より選択され、前記疎水性アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項３】
前記ペプチド鎖が（ＲＬ）nおよび（ＬＲ）nのいずれか一方で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１または２記載の細胞への核酸導入方法。
（なお、Ｒはアルギニン残基、Ｌはロイシン残基をそれぞれ表し、ｎは５以上２０以下の自然数を表す。）
【請求項４】
前記核酸複合体を形成する工程において、前記２本鎖核酸分子と核酸キャリアのモル比が１：４〜１：３０であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項５】
前記２本鎖核酸分子がsiRNAであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項６】
前記核酸複合体が標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項７】
前記核酸複合体に含まれる前記２本鎖核酸分子または前記核酸キャリアの少なくとも一部に、標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有するシグナルペプチドが結合していることを特徴とする請求項６記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項８】
前記シグナルペプチドが、下記の配列番号１から配列番号１３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項７記載の細胞への核酸導入方法。
QAKKKKLDK           ［配列番号１］
SPQPKKKP            ［配列番号２］
RQARRNRRRRWR        ［配列番号３］
GPKKKRKV            ［配列番号４］
NSAAFEDLRVLS        ［配列番号５］
RQIKIWFQNRRMKWKKEN  ［配列番号６］
GRKKRRQRRRPPQG      ［配列番号７］
LPPLERLTL           ［配列番号８］
ALQKKLEELELDE       ［配列番号９］
LALKLAGLDI          ［配列番号１０］
SLEGAVSEISLRD       ［配列番号１１］
LPVLENLTL           ［配列番号１２］
LASLMNLGMS          ［配列番号１３］
【請求項９】
前記シグナルペプチドの末端が、前記核酸キャリアに含まれるペプチド鎖または前記２本鎖核酸の末端に結合していることを特徴とする請求項７または８記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項１０】
塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する前記塩基性アミノ酸の側鎖が片面側に、前記疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有する核酸キャリアと２本鎖核酸分子とが、前記核酸キャリアのペプチド鎖に含まれる塩基性アミノ酸の側鎖と、前記２本鎖核酸分子のリン酸基との静電相互作用を介して結合していることを特徴とする核酸複合体。
【請求項１１】
前記塩基性アミノ酸が、アルギニン、リジンおよびオルニチンからなる群より選択され、前記疎水性アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１０記載の核酸複合体。
【請求項１２】
前記ペプチド鎖が（ＲＬ）nおよび（ＬＲ）nのいずれか一方で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１０または１１記載の核酸複合体。
（なお、Ｒはアルギニン残基、Ｌはロイシン残基をそれぞれ表し、ｎは５以上２０以下の自然数を表す。）
【請求項１３】
前記２本鎖核酸分子がsiRNAであることを特徴とする請求項１０から１２のいずれか１項記載の核酸複合体。
【請求項１４】
前記２本鎖核酸分子またはそれに結合した前記核酸キャリアの少なくとも一部に、標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有するシグナルペプチドが結合していることを特徴とする請求項１０から１３のいずれか１項記載の核酸複合体。
【請求項１５】
前記シグナルペプチドが、下記の配列番号１から配列番号１３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１４記載の核酸複合体。
QAKKKKLDK           ［配列番号１］
SPQPKKKP            ［配列番号２］
RQARRNRRRRWR        ［配列番号３］
GPKKKRKV            ［配列番号４］
NSAAFEDLRVLS        ［配列番号５］
RQIKIWFQNRRMKWKKEN  ［配列番号６］
GRKKRRQRRRPPQG      ［配列番号７］
LPPLERLTL           ［配列番号８］
ALQKKLEELELDE       ［配列番号９］
LALKLAGLDI          ［配列番号１０］
SLEGAVSEISLRD       ［配列番号１１］
LPVLENLTL           ［配列番号１２］
LASLMNLGMS          ［配列番号１３］
【請求項１６】
前記シグナルペプチドの末端が、前記核酸キャリアに含まれるペプチド鎖または前記２本鎖核酸の末端に結合していることを特徴とする請求項１４または１５記載の核酸複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞に２本鎖核酸分子を導入する方法、それに用いられる核酸キャリアの改良、および前記核酸キャリアと２本鎖核酸分子より得られる核酸複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNA干渉（RNAi）は、塩基長２１〜２５程度の低分子量の２本鎖RNA（siRNA）が引き金となって塩基配列特異的にmRNAを分解することにより特定の遺伝子の発現を抑制する現象であり、すでに治験段階にあるアンチセンス核酸よりも、有効性および塩基配列特異性に優れていることから、医薬への応用が強く期待されている。しかしながら、siRNAの細胞内への導入、細胞内での安定性および阻害効果の持続性の確保等、解決すべき課題も数多く残されている。【０００３】
siRNAを含むポリ（オリゴ）ヌクレオチドはポリアニオンであるため、そのままでは疎水性の細胞膜との親和性が低く、細胞内への導入が困難である。また、細胞内での安定性および阻害効果の持続性を確保するためには、外因性の核酸を分解するために細胞内に存在するヌクレアーゼから保護する必要がある。上記課題に鑑み、細胞内への核酸の導入について、これまでに種々の方法が提案されているが、それらは、ウイルスベクターを用いる方法と用いない方法とに大別される。【０００４】
ウイルスベクターとは、複製能を欠いたウイルスであり、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法では、ウイルスの増殖様式の利点を利用して細胞内への進入からタンパク質合成までを効率よく進行させることができるという利点を有している。ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス由来の組み換えウイルスベクターが使用されている（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。しかしながら、ウイルスベクターを用いる方法については、ウイルスによる発ガン等の危険性が指摘されており、実際に死亡例も確認されている。また、ウイルス中和抗体産生による不活性化等の問題があると共に、大量産生や品質管理にも困難が伴う。【０００５】
一方、ウイルスベクターを使用せずに標的細胞に核酸を導入する方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、ハイドロダイナミック法、抗体、ペプチド等のキャリアと核酸との複合体を利用する方法等の様々な方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。【０００６】
しかしながら、ウイルスベクターを使用しない従来の核酸導入方法は、siRNAを始めとする核酸を細胞に導入するための遺伝子医薬の構築には未だ十分とはいえない。すなわち、細胞種に関係なく核酸導入を高効率かつ高い再現性での達成、細胞内ヌクレアーゼに対する耐性の向上、標的核酸との配列特異的結合および親和性の向上、低い細胞毒性等を併せ持つ新規な核酸キャリアが求められている。【０００７】
これまでに種々の核酸キャリアや細胞への核酸の導入方法が開発されているが、近年、生体内シグナルペプチド等の機能性ペプチドを用いた核酸キャリアおよび細胞への核酸の導入方法が特に注目されている。例えば、核局在化シグナルペプチド（例えば、特許文献２，３参照）、その他のシグナルペプチド（例えば、特許文献４参照）、デザインペプチド（例えば、特許文献５参照）を用いてアニオン性の核酸を細胞内に導入する方法、糖修飾ペプチドを用いて細胞特異性を向上させた核酸キャリア（例えば、特許文献６参照）、両親媒性ポリマーとペプチドを結合させた機能性分子（例えば、特許文献７参照）、既存の核酸キャリアとペプチドを併用する方法（例えば、特許文献８参照）等がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−１４６１９１号公報
【特許文献２】特表２００３−５１４５６４号公報
【特許文献３】特開２００１−２８８２００号公報
【特許文献４】特表平１０−５０６００１号公報
【特許文献５】特開２００２−３１６９９７号公報
【特許文献６】特開平１１−２９００７３号公報
【特許文献７】特表２００３−５０３３７０号公報
【特許文献８】特開２００４−６５２３８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】仲嶋  一範、北村  義浩編、「必ず上手くいく遺伝子導入と発現解析プロトコール」、羊土社、２００３年９月、ISBN 9784897064116
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のとおり、これまでに様々な核酸キャリアおよび細胞への核酸の導入方法が開発されているが、未だ確立されたものはない。また、その多くがDNAをターゲットとするものであるため、低分子量であり、DNAよりも反応性の高いsiRNAの細胞への導入には必ずしも好適ではない。【００１１】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、siRNA等の２本鎖核酸分子を標的細胞に高効率で導入可能であり、２本鎖核酸分子にヌクレアーゼへの高い耐性をもたらすことが可能であり、かつ細胞毒性による副作用のリスクが低い細胞への核酸導入方法、核酸キャリアおよび核酸複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、下記の（１）〜（９）に記載の細胞への核酸導入方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
（１）塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する前記塩基性アミノ酸の側鎖が片面側に、前記疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有する核酸キャリアと前記２本鎖核酸分子とを接触させ、前記塩基性アミノ酸の側鎖とリン酸基との静電相互作用および前記２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、前記２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖とを結合させ核酸複合体を形成する工程と、前記核酸複合体を細胞に導入する工程とを有する細胞への核酸導入方法。
（２）前記塩基性アミノ酸が、アルギニン、リジンおよびオルニチンからなる群より選択され、前記疎水性アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選択される（１）記載の細胞への核酸導入方法。
（３）前記ペプチド鎖が（ＲＬ）ｎおよび（ＬＲ）ｎのいずれか一方で表されるアミノ酸配列を有する（１）または（２）記載の細胞への核酸導入方法。
（なお、Ｒはアルギニン残基、Ｌはロイシン残基をそれぞれ表し、ｎは５以上１０以下の自然数を表す。）
（４）前記核酸複合体を形成する工程において、前記２本鎖核酸分子と核酸キャリアのモル比が１：４〜１：３０である（１）から（３）のいずれかに記載の細胞への核酸導入方法。
（５）前記２本鎖核酸分子がsiRNAである（１）から（４）のいずれかに記載の細胞への核酸導入方法。
（６）前記核酸複合体が標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有する（１）から（５）のいずれかに記載の細胞への核酸導入方法。
（７）前記核酸複合体に含まれる前記２本鎖核酸分子または前記核酸キャリアの少なくとも一部に、標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有するシグナルペプチドが結合している（６）記載の細胞への核酸導入方法。
（８）前記シグナルペプチドが、下記の配列番号１〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する（７）記載の細胞への核酸導入方法。
QAKKKKLDK           ［配列番号１］
SPQPKKKP            ［配列番号２］
RQARRNRRRRWR        ［配列番号３］
GPKKKRKV            ［配列番号４］
NSAAFEDLRVLS        ［配列番号５］
RQIKIWFQNRRMKWKKEN  ［配列番号６］
GRKKRRQRRRPPQG      ［配列番号７］
LPPLERLTL           ［配列番号８］
ALQKKLEELELDE       ［配列番号９］
LALKLAGLDI          ［配列番号１０］
SLEGAVSEISLRD       ［配列番号１１］
LPVLENLTL           ［配列番号１２］
LASLMNLGMS          ［配列番号１３］
（９）前記シグナルペプチドの末端が、前記核酸キャリアに含まれるペプチド鎖または前記２本鎖核酸の末端に結合している（７）または（８）記載の細胞への核酸導入方法。【００１３】
本発明の第２の態様は、下記の（１０）〜（１６）に記載の核酸複合体を提供することにより上記課題を解決するものである。
（１０）塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する前記塩基性アミノ酸の側鎖が片面側に、前記疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有する核酸キャリアと２本鎖核酸分子とが、前記核酸キャリアのペプチド鎖に含まれる塩基性アミノ酸の側鎖と、前記２本鎖核酸分子のリン酸基との静電相互作用を介して結合している核酸複合体。
（１１）前記塩基性アミノ酸が、アルギニン、リジンおよびオルニチンからなる群より選択され、前記疎水性アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選択される（１０）記載の核酸複合体。
（１２）前記ペプチド鎖が（ＲＬ）ｎおよび（ＬＲ）ｎのいずれか一方で表されるアミノ酸配列を有する（１０）または（１１）記載の核酸複合体。
（なお、Ｒはアルギニン残基、Ｌはロイシン残基をそれぞれ表し、ｎは５以上２０以下の自然数を表す。）
（１３）前記２本鎖核酸分子がsiRNAであることを特徴とする（１０）から（１２）のいずれかに記載の核酸複合体。
（１４）前記２本鎖核酸分子またはそれに結合した前記核酸キャリアの少なくとも一部に、標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有するシグナルペプチドが結合している（１０）から（１３）のいずれかに記載の核酸複合体。
（１５）前記シグナルペプチドが、上記の配列番号１から配列番号１３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する（１４）記載の核酸複合体。
（１６）前記シグナルペプチドの末端が、前記核酸キャリアに含まれるペプチド鎖または前記２本鎖核酸の末端に結合している（１４）または（１５）記載の核酸複合体。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の核酸キャリアは、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する塩基性アミノ酸の側鎖が片面側に、疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有している。β−シート構造を形成するペプチドは、２本鎖DNA等の２本鎖核酸分子と、２本鎖核酸分子とペプチドとの間の水素結合等を介して結合し、複合体を形成しうることが報告されている（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 74 (1977), p. 1458-1462 参照）。本発明の核酸キャリアに含まれるペプチド鎖において、塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に並んでいるため、β−シート構造を形成した際に、正電荷を有する塩基性アミノ酸の側鎖が約７ｎｍの間隔でβ−シート構造の片面側に配置される。この間隔は、ヌクレオチド鎖におけるリン酸基間の間隔とほぼ一致する。したがって、本発明の核酸キャリアは、β−シート構造を形成したペプチド鎖部分で、塩基性アミノ酸の側鎖とリン酸基との静電相互作用および２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、２本鎖RNA、２本鎖DNA等の２本鎖核酸分子と強く結合することにより、これらの２本鎖核酸分子のヌクレアーゼ耐性を大幅に向上させることができると共に、疎水性アミノ酸の側鎖が複合体の外面に露出するため、脂質二分子膜からなる細胞膜の透過性が向上し、細胞への２本鎖核酸分子の導入効率を高めることができる。また、ペプチド鎖部分のアミノ酸配列を適宜選択することにより、核酸キャリアの２本鎖核酸分子への親和性や塩基配列特異性を増大させることもできる。また、本発明の核酸キャリアはポリペプチドをベースとしているため細胞毒性が低く、遺伝子治療や遺伝子製剤に応用する場合の副作用を軽減できる。さらに、シグナルペプチドで修飾すること等により細胞内における局在化の制御や細胞特異性の増大を図ることもでき、核酸導入効率の増大、遺伝子治療における副作用の軽減等の種々の機能を付与することができる。【００１５】
本発明の細胞への核酸の導入方法では、上記のような特徴を有する核酸キャリアを用いて２本鎖核酸分子を標的細胞に導入するため、siRNA等の２本鎖核酸分子を標的細胞に高効率で導入可能であり、２本鎖核酸分子にヌクレアーゼへの高い耐性をもたらすことが可能であり、かつ細胞毒性による副作用のリスクが低いという効果を有する。
また、本発明の核酸複合体は、高効率で標的細胞内にsiRNA等の２本鎖核酸分子を導入できると共に、ヌクレアーゼへの高い耐性を有している。さらに、ポリペプチドをベースとしているため細胞毒性が低く、遺伝子治療や遺伝子製剤に応用する場合の副作用を軽減でき、これらの用途に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】siRNA、核酸キャリア（RL)7および核酸複合体の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルである。
【図２】Jurkat細胞への核酸複合体の導入効率に及ぼす核酸キャリア中のペプチド鎖の長さの効果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３】Jurkat細胞への核酸複合体の導入効率に及ぼす２本鎖核酸分子に対する核酸キャリアのモル比の効果を示す蛍光顕微鏡写真および蛍光スペクトルである。
【図４】Jurkat細胞への核酸複合体の導入効率に及ぼす（RL)7への核局在化シグナル(NLS)ペプチドおよび長鎖カルボン酸のコンジュゲートの効果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図５】HeLa細胞への核酸複合体の導入効率に及ぼす２本鎖核酸分子に対する核酸キャリアのモル比の効果を示す蛍光顕微鏡写真および蛍光スペクトルである。
【図６】HeLa細胞への核酸複合体の導入効率に及ぼす（RL)7への核外輸送シグナル(NES)ペプチドのコンジュゲートの効果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図７】核酸複合体に含まれるsiRNAの10％ウシ胎児血清(FBS)中での経時変化を示すゲル電気泳動の結果である。
【図８】核酸複合体に含まれるsiRNAの10％ウシ胎児血清(FBS)中での経時変化を示すゲル電気泳動の結果である。
【図９】Jurkat細胞について、核酸キャリアおよびRNAiFectの存在下でインキュベートした場合の生存率の経時変化を示すグラフである。
【図１０】K562細胞について、核酸キャリアおよびRNAiFectの存在下でインキュベートした場合の生存率の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
本発明の第１の実施の形態に係る細胞への核酸導入方法（以下、「細胞への核酸導入方法」または「本方法」と略称する場合がある。）は、塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する塩基性アミノ酸の側鎖が片面側に、疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有する核酸キャリアと２本鎖核酸分子とを接触させ、塩基性アミノ酸の側鎖とリン酸基との静電相互作用および２本鎖核酸分子とペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖とを結合させ核酸複合体を形成する工程と、核酸複合体を細胞に導入する工程とを有する。
【００１８】
まず、本方法に用いられる核酸キャリア（以下、「核酸キャリア」と略称する場合がある。）および本発明の第２の実施の形態に係る核酸複合体（以下、「核酸複合体」または「複合体」と略称する場合がある。）についてより詳細に説明する。
【００１９】
（１）核酸キャリア
核酸キャリアは、塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する塩基性アミノ酸の側鎖が片面側に、疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有している。上述のとおり、β−シート構造をとるポリペプチド鎖は２本鎖DNA（dsDNA）等の２本鎖核酸分子と複合体を形成することができるが、特に、ペプチド鎖が、正電荷を有する塩基性アミノ酸の側鎖がシート構造の片面側に、疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されるような二次構造をとると、塩基性アミノ酸の側鎖とリン酸基との静電相互作用および２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、両者の間で強い結合を形成することができる。このようにして形成された核酸複合体において、疎水性アミノ酸の側鎖は外側を向くため、複合体の脂質二分子膜からなる細胞膜に対する親和性が増大し、細胞内への導入効率が向上する。
【００２０】
ペプチド鎖のアミノ酸配列は、上記の条件、すなわち、塩基性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する塩基性アミノ酸の側鎖が片面側に、疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成し、塩基性アミノ酸の側鎖とリン酸基との静電相互作用および２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、両者の間で強い結合を形成することができるという条件を満たす限りにおいて、特に制限されない。また、β−シート構造は、上記の条件を満たす限りにおいて、平行β−シートおよび逆平行β−シート構造のいずれであってもよい。
β−シート構造の形成は、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル等の任意の公知の方法を用いて確認することができる。
【００２１】
ペプチド鎖の好ましいアミノ酸配列としては、アルギニン、リジンおよびオルニチンからなる群より選択される塩基性アミノ酸と、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選択される疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列が挙げられる。塩基性アミノ酸および疎水性アミノ酸の種類は、複合体を形成する２本鎖核酸分子の種類や構造等に応じて適宜選択される。また、ポリペプチド鎖の長さは、複合体を形成する２本鎖核酸分子の鎖長、すなわち２本鎖核酸分子の有するリン酸基（負電荷）の数等に応じて適宜選択される。２本鎖核酸分子に対してポリペプチド鎖が短すぎると、安定な複合体が形成されないと共に、ヌクレアーゼから２本鎖核酸分子を保護する効果が得られなくなる。一方、２本鎖核酸分子に対してポリペプチド鎖が長すぎると、塩基性アミノ酸残基の有する正電荷により、細胞への核酸複合体の導入効率が低下する。
【００２２】
より好ましいペプチド鎖のアミノ酸配列としては、（ＲＬ）ｎおよび（ＬＲ）ｎのいずれか一方で表されるアミノ酸配列が挙げられる。なお、Ｒはアルギニン残基、Ｌはロイシン残基をそれぞれ表す。アルギニン（Ｒ）残基は、塩基性の基としてグアニジル基を有しているが、下記の化学式で表されるように、リン酸基と強く相互作用することができるため、安定な複合体を形成する上で好ましい。
【００２３】
【化１】
2012008361.tif 000003
【００２４】
また、ｎは、ＲＬまたはＬＲの繰り返し回数を表す自然数であり、複合体を形成する２本鎖核酸分子の鎖長、すなわち２本鎖核酸分子の有するリン酸基（負電荷）の数等に応じて適宜選択される。二本鎖核酸がsiRNAの場合、ｎは、例えば、５以上、好ましくは５以上２０以下、より好ましくは７以上１０以下の自然数である。ｎが５を下回ると２本鎖核酸分子と安定な結合を形成することが困難になり、一方、ｎが大きくなりすぎると、細胞毒性が発現したり、リン酸基の負電荷を完全に中和することが困難になったりする等の問題が生じるおそれがある。
【００２５】
核酸キャリアは、標的細胞および標的細胞内の特定の部位もしくはオルガネラ（細胞内小器官）の一方または双方に対する局在化活性を有していることが好ましい。核酸複合体の局在化の対象となる標的細胞、あるいは標的細胞内の特定の部位もしくはオルガネラについては、標的細胞内に導入しようとする２本鎖核酸分子の種類およびその細胞内における機能等に応じて適宜選択される。
【００２６】
局在化活性を付与する手段は、核酸複合体の局在化の対象となる標的細胞、あるいは標的細胞内の特定の部位もしくはオルガネラに応じて、任意の公知の手段を用いることができる。例えば、標的細胞に対する局在化活性を付与するための手段の具体例としては、その標的細胞に特異的に存在する受容体に対するリガンドを核酸キャリアに結合させることが挙げられる。また、標的細胞内の特定の部位もしくはオルガネラに対する局在化活性を付与するための手段の具体例としては、標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有するシグナルペプチドを核酸キャリアに結合させることが挙げられる。結合させることができるシグナルペプチドの具体例としては、各種の核局在化シグナル（NLS）および核外輸送シグナル（NES）等が挙げられる。
【００２７】
核内への局在化は、NLSに運搬タンパク質であるインポーチンとGTP結合タンパク質の一種であるRanが結合し、これを核孔複合体が認識して細胞質から核内に通過させることにより達成される。
NLSの具体例としては、下記の配列番号１〜７のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
QAKKKKLDK           ［配列番号１］（ヌクレオプラスミン由来NLS配列）
SPQPKKKP            ［配列番号２］（ヒトp53由来NLS配列）
RQARRNRRRRWR        ［配列番号３］（HIV-1 Revタンパク由来NLS配列）
GPKKKRKV            ［配列番号４］（SV40 T抗原由来NLS配列）
NSAAFEDLRVLS        ［配列番号５］（インフルエンザウィルスヌクレオプラスミン由来NLS配列）
RQIKIWFQNRRMKWKKEN  ［配列番号６］（アンテナペディアペネトラチン由来NLS配列）
GRKKRRQRRRPPQG      ［配列番号７］（HIV-1 Tatタンパク由来NLS配列）
【００２８】
核内から細胞質への移送は、NESに運搬タンパク質であるCRM1とGTP結合タンパク質の一種であるRanが結合し、これを核孔複合体が認識して核から細胞質に通過させることにより達成される。
NESの具体例としては、下記の配列番号８〜１３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
LPPLERLTL           ［配列番号８］（HIV-1 Revタンパク由来NES配列）
ALQKKLEELELDE       ［配列番号９］（MAPKK由来NES配列）
LALKLAGLDI          ［配列番号１０］（PKI-α由来NES配列）
SLEGAVSEISLRD       ［配列番号１１］（Dsk-1由来NES配列）
LPVLENLTL           ［配列番号１２］（TFIIIA由来NES配列）
LASLMNLGMS          ［配列番号１３］（Matrin3由来NES配列）
【００２９】
これらのシグナルペプチドは、複合体の形成および細胞内への導入を阻害しない限りにおいて、核酸キャリア分子内の任意の位置、例えば、２本鎖核酸分子と結合を形成するポリペプチド鎖のＮ−末端側またはＣ−末端側、あるいはβ−シート構造の発現を阻害しない限りにおいて側鎖に結合させることができ、シグナルペプチドのＮ−末端側およびＣ−末端側のどちら側が２本鎖核酸分子と結合していてもよいが、シグナルペプチドのＣ−末端が、２本鎖核酸分子と結合を形成するペプチド鎖のＮ−末端に結合しているのが好ましい。２本鎖核酸分子と結合を形成するポリペプチド鎖とシグナルペプチドとは、直接結合していてもよく、適当なスペーサー分子を介して結合していてもよい。スペーサー分子の具体例としては、アルキレン基、ポリオキシエチレン基、オリゴペプチド等が挙げられる。
【００３０】
核酸キャリアには、標的細胞上の受容体に対するリガンドやシグナルペプチド以外の機能性分子が結合していてもよい。機能性分子の具体例としては、細胞膜に対する親和性を向上させるために長鎖アルキル基、脂質分子等が挙げられる。
【００３１】
核酸キャリアは、ポリペプチドを主な構成要素とするものであるため、カチオン系リポソーム等の従来の核酸キャリアに比べ細胞毒性が低く、遺伝子治療や遺伝子製剤に応用する場合の副作用を軽減でき、これらの用途に好適に用いることができる。
核酸キャリアの細胞毒性は、標的細胞へ導入し、所定時間経過後の細胞生存率により評価することができる。
【００３２】
（２）核酸複合体
核酸キャリア中の塩基性アミノ酸の側鎖と、２本鎖核酸分子中のリン酸基との静電相互作用を介して両者を結合させることにより、核酸複合体が得られる。
複合体の形成に用いられる２本鎖核酸分子としては、DNA、RNAのいずれでもよく、細胞内への導入の目的についても、例えば、所望のタンパク質を産生させること、２本鎖DNAの配列を認識する転写因子などを「おとり」の短鎖核酸でトラップすること（デコイ法）、あるいはRNA干渉法（RNAi）等の任意のものであってよい。したがって、２本鎖核酸分子としては、細胞内で発現させようとするタンパク質をコードする２本鎖DNA、デコイ核酸、siRNA等が挙げられる。２本鎖核酸分子の塩基長および塩基配列は、核酸複合体の細胞への導入目的、標的細胞、治療の対象となる疾患の種類等に応じて異なるが、siRNAの場合、塩基数は、９〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１８〜２８塩基である。ヒトの場合、塩基数が１７以上であれば、得られるポリヌクレオチドの総数（４１７＝１．７×１０１０）がヒトの遺伝子総数（６×１０９）を上回るため、特定遺伝子のみの発現の阻害が統計的には可能になる。
【００３３】
塩基配列については、発現対象となるタンパク質のアミノ酸配列または標的遺伝子の塩基配列が既知の場合には、GenBank、EMBL、PDB、DDBJ等のデータベースから得られた配列データを元に、任意の公知の方法を用いて標的細胞に導入する２本鎖核酸分子を設計することができる。あるいは、任意の公知の方法により単離した標的タンパク質のアミノ酸配列またはそれをコードするmRNAの塩基配列を任意の公知の方法により決定し、それらに基づいて２本鎖核酸分子を設計することもできる。
【００３４】
導入しようとする２本鎖核酸分子と相補的な塩基配列を有する標的核酸の発現を阻害する機構としては、（１）RNA/DNAハイブリッド鎖のRNA鎖を特異的に加水分解するリボヌクレアーゼHによるmRNA/ポリヌクレオチド複合体の分解、（２）リボソーム複合体による翻訳の阻害、（３）ポリヌクレオチドがイントロンとエキソンの境界部を標的とする場合には、mRNAのスプライシングの阻害、（４）RNA干渉によるmRNAの塩基配列特異的な加水分解、（５）デコイ核酸による転写制御因子の阻害等が挙げられる。
【００３５】
核酸複合体は、標的細胞および標的細胞内の特定の部位もしくはオルガネラ（細胞内小器官）の一方または双方に対する局在化活性を有していることが好ましい。核酸複合体の局在化の対象となる標的細胞、あるいは標的細胞内の特定の部位もしくはオルガネラについては、標的細胞内に導入しようとする２本鎖核酸分子の種類およびその細胞内における機能等に応じて適宜選択される。
【００３６】
局在化活性を付与する手段は、核酸複合体の局在化の対象となる標的細胞、あるいは標的細胞内の特定の部位もしくはオルガネラに応じて、任意の公知の手段を用いることができる。例えば、標的細胞に対する局在化活性を付与するための手段の具体例としては、上述のように、その標的細胞に特異的に存在する受容体に対するリガンドを核酸キャリアに結合させること、あるいは該リガンドを２本鎖核酸分子に結合させることが挙げられる。また、標的細胞内の特定の部位もしくはオルガネラに対する局在化活性を付与するための手段の具体例としては、上述のように、シグナルペプチドを核酸キャリアの少なくとも一部に結合させること、あるいは該シグナルペプチドを２本鎖核酸分子に結合させることが挙げられる。なお、核酸複合体へのシグナルペプチドの導入量が多すぎると、核酸複合体の疎水性の低下による細胞導入効率の低下等を招くおそれがあるため、核酸複合体へのシグナルペプチドの導入量は、２本鎖核酸分子の分子量、標的細胞内の特定の部位もしくはオルガネラ、シグナルペプチドの分子量および親水性等に応じて適宜調節される。好ましくは、シグナルペプチドのＮ−末端またはＣ−末端が、２本鎖核酸分子の５’−末端または３’−末端と結合している。
核酸キャリアまたは２本鎖核酸分子に結合させることができるシグナルペプチドの具体例については、上述の場合と同様であるため、詳しい説明を省略する。
【００３７】
（３）細胞への核酸導入方法
核酸複合体の調製は、任意の公知の方法を用いて行うことができるが、例えば、２本鎖核酸分子と核酸キャリアとを所定のpHの緩衝溶液に溶解、混合し、所定の温度で所定時間（例えば、室温で３０分間）放置することにより調製することができる。２本鎖核酸分子と核酸キャリアの混合比（モル比）は、確実に複合体が形成されるように後者が過剰となるようにするのが好ましい。好ましい２本鎖核酸分子と核酸キャリアの混合比は、１：４〜１：３０、好ましくは１：１０〜１：３０、より好ましくは１：１５〜１：２０である。必要に応じて、過剰の核酸キャリアを除去するために、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー等の任意の公知の方法を用いて核酸複合体を精製してもよい。
【００３８】
標的細胞への核酸複合体の導入についても、任意の公知の方法を用いて行うことができる。培養細胞へのin vitroでの核酸遺伝子の導入では、例えば、標的細胞を含む培地または培養液中に核酸複合体を添加し、所定温度で所定時間インキュベートすることにより行うこともでき、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、超音波照射法等の他の公知の方法を用いて行うこともできる。in vivoでの標的細胞への核酸複合体は、注射、点滴等の方法を用いた全身投与または局所投与等により行うことができる。細胞への導入効率は、蛍光標識を付した２本鎖核酸分子を用い、蛍光顕微鏡観察等により行うことができる。
【００３９】
核酸複合体の導入対象となる標的細胞に特に制限はなく、外因性の核酸を導入することにより遺伝子の発現を制御できる限りにおいて任意の細胞を標的細胞とすることができる。
【００４０】
本発明により提供される細胞への核酸の導入方法、核酸キャリアおよび核酸複合体は、細胞内において欠損している遺伝子を補ったり、異常遺伝子を持っているため機能不全に陥っている細胞の欠陥を修復または修正したりすることにより疾患を治療する遺伝子治療等に適用することができる。
【実施例】
【００４１】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
［実験操作］
（１）核酸キャリア
本実施例で使用した核酸キャリアは、下記の表１に示すとおりである。なお、表１のアミノ酸配列は１文字略号を用いて表されている。また、表１において、「-C18」はＮ−末端がオクタデシル基で修飾されたペプチドを表し、「-Cholic A」は、Ｎ−末端にアミド結合を介してコール酸が結合したペプチドを表し、「Ac-」はＮ−アセチルアミドを表す。
下記の表１に示した核酸キャリア（下記のエントリー１〜２１）との比較のために、カチオン性リポソーム系核酸キャリアであるRNAiFect（キアーゲン社）を使用した。【００４２】
【表１】
2012008361.tif 000004
【００４３】
（２）標的細胞
急性リンパ芽球性白血病細胞であるJurkat細胞、慢性随性白血病細胞であるK562細胞、および子宮頸がん細胞であるHela細胞を標的細胞として使用した。【００４４】
（３）２本鎖核酸分子
Jurkat細胞およびHela細胞に対しては、hTERT（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素：がん細胞の不死化に関与している。）遺伝子に対するsiRNA（２１塩基対）を２本鎖核酸分子として使用した。Jurkat細胞およびHela細胞のhTERT遺伝子に対するsiRNAの塩基配列は、それぞれ、下記の配列番号３２および３３に示すとおりである。
5'-GGAGCAAGUUGCAAAGCAUTT-3'  ［配列番号３２］
5'-AUGCUUUGCAACUUGCUCCTT-3'  ［配列番号３３］【００４５】
K562細胞に対しては、Bcr/abl（９番染色体上のabl遺伝子と２２番染色体上のbcr遺伝子が融合して生じるキメラ遺伝子であるフィラデルフィア染色体に存在する慢性随性白血病の原因遺伝子であり、細胞増殖シグナルを異常に亢進させ、白血病細胞を無秩序に増殖させる。）遺伝子に対するsiRNA（２１塩基対）を２本鎖核酸分子として使用した。使用したsiRNAの塩基配列は、下記の配列番号３４および３５に示すとおりである。
5'-GCAGAGUUCAAAAGCCCUUTT-3'  ［配列番号３４］
5'-AACGGCUUUUGAACUCUGCTT-3'  ［配列番号３５］【００４６】
（４）核酸複合体の調製
２００μＭペプチド水溶液(超純水)１０μＬと、２０μＭ  siRNA水溶液(超純水)１０μＬを室温で混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。【００４７】
（５）標的細胞への導入
標的細胞の培養液または培地に、上記（４）で調製した核酸複合体を添加した。添加量は、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または４００ｎＭのいずれかである。核酸複合体を添加後、３７℃で所定時間インキュベートした。インキュベート時間は、Jurkat細胞およびK562細胞の場合２４時間、HeLa細胞の場合４８時間である。【００４８】
（６）標的細胞への核酸複合体の導入効率の評価
標的細胞への核酸複合体の導入効率は、蛍光ラベルで標識した２本鎖核酸分子を用いて調製した核酸複合体とインキュベートした後の標的細胞の蛍光顕微鏡観察により評価を行った。【００４９】
（７）半減期の評価
３７℃の１０％FBS中における核酸複合体に含まれるsiRNAの分解率の経時変化より、核酸複合体に含まれるsiRNAの半減期を求めた。siRNAの分解率は、核酸複合体を加熱後単離したsiRNAのホルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動法により求めた。【００５０】
（８）細胞毒性の評価
核酸キャリアの細胞毒性は、核酸キャリアと共にインキュベートした標的細胞の生存率の経時変化より求めた。【００５１】
（９）RNAiによる標的遺伝子のサイレンシング効果の検討
RNAiによる標的遺伝子のサイレンシング効果は、インキュベート後の細胞を溶解させ、RT-PCR法を用いて標的遺伝子を増幅後、β−アクチン遺伝子を内部標準として発現量の変化を定量的に求めることにより検討した。【００５２】
［結果］
（１）核酸複合体における核酸キャリアのコンホメーション
核酸複合体の調製に用いたsiRNA、アミノ酸配列（ＲＬ）７からなる核酸キャリア３（表１中のエントリー番号。以下同じ。）、およびこれらより得られた核酸複合体の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを図１に示す。核酸キャリア３単独ではランダムコイル構造に由来するＣＤスペクトルが観測されたのに対し、核酸複合体においては、２１７ｎｍに、β−シート構造に特有の強い負のCotton効果が観測された。これらの結果より、核酸キャリア３は、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有するアルギニン（Ｒ）の側鎖が片面側に、疎水性のロイシン（Ｌ）の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成していることがわかる。また、アミノ酸配列の異なるペプチドについては、２本鎖核酸との複合体形成およびβ−シート構造の発現が観測されないことから、アルギニンのグアニジル基とリン酸基との静電相互作用および２本鎖核酸分子と核酸キャリア３のペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、両者の間で強い結合が形成されていることが示唆される。【００５３】
（２）標的細胞への核酸複合体の導入効率
塩基性アミノ酸であるアルギニンと疎水性アミノ酸であるロイシンとが交互に並んだアミノ酸配列（ＲＬ）ｎ（５≦ｎ≦１０）からなる核酸キャリア１〜６について、JurkatへのhTERTに対する蛍光標識siRNAの導入効率を検討した結果を図２に示す。比較のためRNAiFectを用いた場合の結果を合わせて示す。これらの結果より、siRNA単独では細胞内部に侵入することができないが、RNAiFect、およびｎが７以上の核酸キャリア３〜６を用いると、siRNAを細胞内部に導入できることが確認された。【００５４】
アミノ酸配列（ＲＬ）７からなる核酸キャリア３を用いて、siRNAに対する核酸キャリア３のモル比がJurkat細胞へのsiRNAの導入効率に及ぼす効果を併せて検討した。結果を図３に示す。これらの結果より、Jurkat細胞へのsiRNAの導入効率を十分に確保するためには、siRNAに対する核酸キャリア３のモル比が１：６以上、より好ましくは１：１０以上である必要があることが確認された。【００５５】
核酸キャリア３および４への疎水性基またはシグナルペプチド（NLS）の導入がJurkat細胞へのsiRNAの導入効率に及ぼす効果を図４に示す。これらの結果より、核酸キャリア３とJurkat細胞との組み合わせ（核酸キャリア１２）において、Ｎ−末端へのオクタデシル基およびHIV-1 Revタンパク質由来NLSの導入により、Jurkat細胞へのsiRNAの導入効率が大幅に向上することが確認された。【００５６】
同様の実験をHeLa細胞について行った結果を図５および図６に示す。図５の結果より、HeLa細胞へのsiRNAの導入効率を十分に確保するためには、siRNAに対する核酸キャリア３のモル比が１：１５以上である必要があることが確認された。また、図６の結果より、HeLa細胞へのsiRNAの導入については、核酸キャリア３にHIV-1 Revタンパク質由来NES配列（核酸キャリア１６）、Dsk-1由来NES配列（核酸キャリア１９）、およびMatrin3由来NES配列（核酸キャリア２１）を導入した場合に、siRNAの導入効率が増大することが確認された。【００５７】
（３）核酸複合体に含まれるsiRNAの半減期
１０％FBS中でのsiRNAおよび核酸複合体に含まれるsiRNAの分解率の経時変化をゲル電気泳動でモニタした結果を図７、図８、下記の表２および３に示す。図７の結果より、siRNAは１０％FBS中で速やかに（半減期２時間程度）で分解するが、核酸キャリア３〜６と核酸複合体を形成させることにより、半減期が数倍〜２０倍程度に増大することが確認された。また、細胞へのsiRNAの導入効率の増大が観測されなかった核酸キャリア１および２については、このような半減期の増大が観測されなかったことから、１０％FBS中での半減期の増大は核酸複合体の形成によるものであると考えられる。また、RNAiFectについては、複合体の形成による半減期の増大は観測されなかった。また、図８に示すように、NES配列を導入した核酸キャリア１６〜２１についても半減期の増大が観測され、特に核酸キャリア１６について顕著な効果が見られた。【００５８】
【表２】
2012008361.tif 000005
【００５９】
【表３】
2012008361.tif 000006
【００６０】
（４）細胞毒性
Jurkat細胞およびK562細胞について、核酸キャリア１〜６およびRNAiFectの存在下でインキュベートした場合の生存率の経時変化を検討した。２４時間後の生存率を図９および９に示す。図９に示すように、Jurkat細胞に対しては、核酸キャリア１〜６の全てが殆ど細胞毒性を示さないことがわかった。一方、K562細胞に対しては、図１０に示すように、核酸キャリア２〜５を高濃度で添加した場合に２４時間後の生存率の低下が観測された。しかし、実際に使用される１〜２μＭ程度の濃度では、核酸キャリア１〜６の全てが９０％以上と、RNAiFectよりもはるかに高い細胞生存率を示した。特に、核酸キャリア１および６は、K562細胞に対しても殆ど細胞毒性を示さないことがわかった。【００６１】
（５）核酸複合体を用いたRNAiによるJurkat細胞hTERT遺伝子のサイレンシング効果
Jurkat細胞のhTERT遺伝子に対するsiRNA（２１塩基対：配列番号３２）と核酸キャリア３との複合体の存在下でJurkat細胞をインキュベート（４８時間）した場合におけるhTERT遺伝子の発現量の測定結果を下記の表４に示す。この結果より、核酸キャリア３は、RNAiFectと同程度の核酸導入効率を示すことが確認された。【００６２】
【表４】
2012008361.tif 000007
【００６３】
（６）核酸複合体を用いたRNAiによるHeLa細胞hTERT遺伝子のサイレンシング効果
HeLa細胞のhTERT遺伝子に対するsiRNA（２１塩基対：配列番号３３）と核酸キャリア３との複合体の存在下でHeLa細胞をインキュベート（４８時間）した場合におけるhTERT遺伝子の発現量の測定結果を下記の表５に示す。この結果より、核酸キャリア３は、RNAiFectを用いた場合よりも少ないsiRNAの添加量で、RNAiFectと同程度のサイレンシング効果を示すことが確認された。【００６４】
【表５】
2012008361.tif 000008
【００６５】
（７）核酸複合体を用いたRNAiによるK562細胞Bcr/abl遺伝子のサイレンシング効果
K562細胞のbcr/abl遺伝子に対するsiRNA-revNESコンジュゲート(共有結合体)（１００ｎＭ）(配列番号３４で表される塩基配列を有するsiRNAの５’−末端に、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するHIV-1revタンパクNES配列のＮ−末端が直接共有結合している。）と核酸キャリア３（１０当量）または核酸キャリアLRALLRALLRALLRALLRALLRAL（配列番号３６、１０当量）との複合体の存在下にK562細胞をインキュベート(48時間）した場合におけるbcr/abl遺伝子の発現量の測定結果を下記の表６に示す。
これらの結果より、K562細胞の場合には、シグナルペプチドを結合させたsiRNAを用いて調製された核酸キャリアを用いることにより、核酸の細胞への導入効率およびK562細胞Bcr/abl遺伝子のサイレンシング効果が大幅に向上することが確認された。【００６６】
【表６】
2012008361.tif 000009
【図１】
2012008361.tif 000010
【図２】
2012008361.tif 000011
【図３】
2012008361.tif 000012
【図４】
2012008361.tif 000013
【図５】
2012008361.tif 000014
【図６】
2012008361.tif 000015
【図７】
2012008361.tif 000016
【図８】
2012008361.tif 000017
【図９】
2012008361.tif 000018
【図１０】
2012008361.tif 000019
【配列表】
2012008361000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月1日(2012.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニンまたはオルニチンと疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する前記アルギニンまたはオルニチンの側鎖が片面側に、前記疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有する核酸キャリアと前記２本鎖核酸分子とを接触させ、β−シート構造を形成した前記ペプチド鎖中の前記アルギニンまたはオルニチンの側鎖とリン酸基との静電相互作用および前記２本鎖核酸分子と、β−シート構造を形成した前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、前記２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖とを結合させ核酸複合体を形成する工程と、前記核酸複合体を細胞に導入する工程とを有することを特徴とする細胞への核酸導入方法。
【請求項２】
前記疎水性アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項３】
前記ペプチド鎖が（ＲＬ）ｎおよび（ＬＲ）ｎのいずれか一方で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１または２記載の細胞への核酸導入方法。
（なお、Ｒはアルギニン残基、Ｌはロイシン残基をそれぞれ表し、ｎは５以上２０以下の自然数を表す。）
【請求項４】
前記核酸複合体を形成する工程において、前記２本鎖核酸分子と核酸キャリアのモル比が１：４〜１：３０であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項５】
前記２本鎖核酸分子がｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項６】
前記核酸複合体が標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項７】
前記核酸複合体に含まれる前記２本鎖核酸分子または前記核酸キャリアの少なくとも一部に、標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有するシグナルペプチドが結合していることを特徴とする請求項６記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項８】
前記シグナルペプチドが、下記の配列番号１から配列番号１３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項７記載の細胞への核酸導入方法。
2012008361.tif 000020
【請求項９】
前記シグナルペプチドの末端が、前記核酸キャリアに含まれるペプチド鎖または前記２本鎖核酸の末端に結合していることを特徴とする請求項７または８記載の細胞への核酸導入方法。
【請求項１０】
アルギニンまたはオルニチンと疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する前記アルギニンまたはオルニチンの側鎖が片面側に、前記疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有する核酸キャリアと２本鎖核酸分子とが、前記核酸キャリアのβ−シート構造を形成したペプチド鎖に含まれる前記アルギニンまたはオルニチンの側鎖と、前記２本鎖核酸分子のリン酸基との静電相互作用および前記２本鎖核酸分子とβ−シート構造を形成した前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して結合していることを特徴とする核酸複合体。
【請求項１１】
前記疎水性アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１０記載の核酸複合体。
【請求項１２】
前記ペプチド鎖が（ＲＬ）ｎおよび（ＬＲ）ｎのいずれか一方で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１０または１１記載の核酸複合体。
（なお、Ｒはアルギニン残基、Ｌはロイシン残基をそれぞれ表し、ｎは５以上２０以下の自然数を表す。）
【請求項１３】
前記２本鎖核酸分子がｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１０から１２のいずれか１項記載の核酸複合体。
【請求項１４】
前記２本鎖核酸分子またはそれに結合した前記核酸キャリアの少なくとも一部に、標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有するシグナルペプチドが結合していることを特徴とする請求項１０から１３のいずれか１項記載の核酸複合体。
【請求項１５】
前記シグナルペプチドが、下記の配列番号１から配列番号１３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１４記載の核酸複合体。
2012008361.tif 000021
2012008361.tif 000022
【請求項１６】
前記シグナルペプチドの末端が、前記核酸キャリアに含まれるペプチド鎖または前記２本鎖核酸の末端に結合していることを特徴とする請求項１４または１５記載の核酸複合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
特許文献２：特表２００３−５１４５６４号公報
特許文献３：特開２００１−２８８２００号公報
特許文献４：特表平１０−５０６００１号公報
特許文献５：特開２００２−３１６９９７号公報
特許文献６：特開平１１−２９００７３号公報
特許文献７：特表２００３−５０３３７０号公報
特許文献８：特開２００４−６５２３８号公報
非特許文献
［０００９］
非特許文献１：仲嶋  一範、北村  義浩編、「必ず上手くいく遺伝子導入と発現解析プロトコール」、羊土社、２００３年９月、ＩＳＢＮ  ９７８４８９７０６４１１６
発明の概要
発明が解決しようとする課題
［００１０］
上述のとおり、これまでに様々な核酸キャリアおよび細胞への核酸の導入方法が開発されているが、未だ確立されたものはない。また、その多くがＤＮＡをターゲットとするものであるため、低分子量であり、ＤＮＡよりも反応性の高いｓｉＲＮＡの細胞への導入には必ずしも好適ではない。
［００１１］
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、ｓｉＲＮＡ等の２本鎖核酸分子を標的細胞に高効率で導入可能であり、２本鎖核酸分子にヌクレアーゼへの高い耐性をもたらすことが可能であり、かつ細胞毒性による副作用のリスクが低い細胞への核酸導入方法、核酸キャリアおよび核酸複合体を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
［００１２］
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、下記の（１）〜（９）に記載の細胞への核酸導入方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
（１）アルギニンまたはオルニチンと疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する前記アルギニンまたはオルニチンの側鎖が片面側に、前記疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成す
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
るペプチド鎖を有する核酸キャリアと前記２本鎖核酸分子とを接触させ、β−シート構造を形成した前記ペプチド鎖中の前記アルギニンまたはオルニチンの側鎖とリン酸基との静電相互作用および前記２本鎖核酸分子と、β−シート構造を形成した前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、前記２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖とを結合させ核酸複合体を形成する工程と、前記核酸複合体を細胞に導入する工程とを有する細胞への核酸導入方法。
（２）前記疎水性アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選択される（１）記載の細胞への核酸導入方法。
（３）前記ペプチド鎖が（ＲＬ）ｎおよび（ＬＲ）ｎのいずれか一方で表されるアミノ酸配列を有する（１）または（２）１項記載の細胞への核酸導入方法。
（なお、Ｒはアルギニン残基、Ｌはロイシン残基をそれぞれ表し、ｎは５以上１０以下の自然数を表す。）
（４）前記核酸複合体を形成する工程において、前記２本鎖核酸分子と核酸キャリアのモル比が１：４〜１：３０である（１）から（３）のいずれか１項記載の細胞への核酸導入方法。
（５）前記２本鎖核酸分子がｓｉＲＮＡである（１）から（４）のいずれか１項記載の細胞への核酸導入方法。
（６）前記核酸複合体が標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有する（１）から（５）のいずれか１項記載の細胞への核酸導入方法。
（７）前記核酸複合体に含まれる前記２本鎖核酸分子または前記核酸キャリアの少なくとも一部に、標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有するシグナルペプチドが結合している（６）記載の細胞への核酸導入方法。
（８）前記シグナルペプチドが、下記の配列番号１〜１３のいずれかで表
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
されるアミノ酸配列を有する（７）記載の細胞への核酸導入方法。
2012008361.tif 000023
（９）前記シグナルペプチドの末端が、前記核酸キャリアに含まれるペプチド鎖または前記２本鎖核酸の末端に結合している（７）または（８）記載の細胞への核酸導入方法。
［００１３］
本発明の第２の態様は、下記の（１０）〜（１６）に記載の核酸複合体を提供することにより上記課題を解決するものである。
（１０）アルギニンまたはオルニチンと疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有する前記アルギニンまたはオルニチンの側鎖が片面側に、前記疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有する核酸キャリアと２本鎖核酸分子とが、前記核酸キャリアのβ−シート構造を形成したペプチド鎖に含まれる前記アルギニンまたはオルニチンの側鎖と、前記２本鎖核酸分子のリン酸基との静電相互作用および前記２本鎖核酸分子とβ−シート構造を形成した前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して結合している核酸複合体。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
（１１）前記疎水性アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選択される（１０）記載の核酸複合体。
（１２）前記ペプチド鎖が（ＲＬ）ｎおよび（ＬＲ）ｎのいずれか一方で表されるアミノ酸配列を有する（１０）または（１１）記載の核酸複合体。
（なお、Ｒはアルギニン残基、Ｌはロイシン残基をそれぞれ表し、ｎは５以上２０以下の自然数を表す。）
（１３）前記２本鎖核酸分子がｓｉＲＮＡであることを特徴とする（１０）から（１２）のいずれか１項記載の核酸複合体。
（１４）前記２本鎖核酸分子またはそれに結合した前記核酸キャリアの少なくとも一部に、標的細胞および／またはその特定の部位に対する局在化活性を有するシグナルペプチドが結合している（１０）から（１３）のいずれか１項記載の核酸複合体。
（１５）前記シグナルペプチドが、上記の配列番号１から配列番号１３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有する（１４）記載の核酸複合体。
（１６）前記シグナルペプチドの末端が、前記核酸キャリアに含まれるペプチド鎖または前記２本鎖核酸の末端に結合している（１４）または（１５）記載の核酸複合体。
発明の効果
［００１４］
本発明の核酸キャリアは、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有するアルギニンまたはオルニチンの側鎖が片面側に、疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有している。β−シート構造を形成するペプチドは、２本鎖ＤＮＡ等の２本鎖核酸分子と、２本鎖核酸分子とペプチドとの間の水素結合等を介して結合し、複合体を形成しうることが報告されている（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７４（１９７７），ｐ．１４５８−１４６２参照）。本発明の核酸キャリアに含まれるペプチド鎖において、アルギニンまたはオルニチンと疎水性アミノ酸とが交互に並んでいるため、β−シート構造を形成した際に、正電荷を有するアルギニンまたはオルニチンの側鎖が約７ｎｍの間隔でβ−
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
シート構造の片面側に配置される。この間隔は、ヌクレオチド鎖におけるリン酸基間の間隔とほぼ一致する。したがって、本発明の核酸キャリアは、β−シート構造を形成したペプチド鎖部分で、アルギニンまたはオルニチンの側鎖とリン酸基との静電相互作用および２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、２本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＤＮＡ等の２本鎖核酸分子と強く結合することにより、これらの２本鎖核酸分子のヌクレアーゼ耐性を大幅に向上させることができると共に、疎水性アミノ酸の側鎖が複合体の外面に露出するため、脂質二分子膜からなる細胞膜の透過性が向上し、細胞への２本鎖核酸分子の導入効率を高めることができる。また、ペプチド鎖部分のアミノ酸配列を適宜選択することにより、核酸キャリアの２本鎖核酸分子への親和性や塩基配列特異性を増大させることもできる。また、本発明の核酸キャリアはポリペプチドをベースとしているため細胞毒性が低く、遺伝子治療や遺伝子製剤に応用する場合の副作用を軽減できる。さらに、シグナルペプチドで修飾すること等により細胞内における局在化の制御や細胞特異性の増大を図ることもでき、核酸導入効率の増大、遺伝子治療における副作用の軽減等の種々の機能を付与することができる。
［００１５］
本発明の細胞への核酸の導入方法では、上記のような特徴を有する核酸キャリアを用いて２本鎖核酸分子を標的細胞に導入するため、ｓｉＲＮＡ等の２本鎖核酸分子を標的細胞に高効率で導入可能であり、２本鎖核酸分子にヌクレアーゼへの高い耐性をもたらすことが可能であり、かつ細胞毒性による副作用のリスクが低いという効果を有する。
また、本発明の核酸複合体は、高効率で標的細胞内にｓｉＲＮＡ等の２本鎖核酸分子を導入できると共に、ヌクレアーゼへの高い耐性を有している。さらに、ポリペプチドをベースとしているため細胞毒性が低く、遺伝子治療や遺伝子製剤に応用する場合の副作用を軽減でき、これらの用途に好適に用いることができる。
図面の簡単な説明
［００１６］
［図１］ｓｉＲＮＡ、核酸キャリア（ＲＬ）７および核酸複合体の円偏光二色性（ＣＤ）ス
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ペクトルである。
［図２］Ｊｕｒｋａｔ細胞への核酸複合体の導入効率に及ぼす核酸キャリア中のペプチド鎖の長さの効果を示す蛍光顕微鏡写真である。
［図３］Ｊｕｒｋａｔ細胞への核酸複合体の導入効率に及ぼす２本鎖核酸分子に対する核酸キャリアのモル比の効果を示す蛍光顕微鏡写真および蛍光スペクトルである。
［図４］Ｊｕｒｋａｔ細胞への核酸複合体の導入効率に及ぼす（ＲＬ）７への核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチドおよび長鎖カルボン酸のコンジュゲートの効果を示す蛍光顕微鏡写真である。
［図５］ＨｅＬａ細胞への核酸複合体の導入効率に及ぼす２本鎖核酸分子に対する核酸キャリアのモル比の効果を示す蛍光顕微鏡写真および蛍光スペクトルである。
［図６］ＨｅＬａ細胞への核酸複合体の導入効率に及ぼす（ＲＬ）７への核外輸送シグナル（ＮＥＳ）ペプチドのコンジュゲートの効果を示す蛍光顕微鏡写真である。
［図７］核酸複合体に含まれるｓｉＲＮＡの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中での経時変化を示すゲル電気泳動の結果である。
［図８］核酸複合体に含まれるｓｉＲＮＡの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中での経時変化を示すゲル電気泳動の結果である。
［図９］Ｊｕｒｋａｔ細胞について、核酸キャリアおよびＲＮＡｉＦｅｃｔの存在下でインキュベートした場合の生存率の経時変化を示すグラフである。
［図１０］Ｋ５６２細胞について、核酸キャリアおよびＲＮＡｉＦｅｃｔの存在下でインキュベートした場合の生存率の経時変化を示すグラフである。
発明を実施するための形態
［００１７］
続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
本発明の第１の実施の形態に係る細胞への核酸導入方法（以下、「細胞への核酸導入方法」または「本方法」と略称する場合がある。）は、アルギニンまたはオルニチンと疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有するアルギニンまたはオルニチンの側鎖が片面側に、疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有する核酸キャリアと２本鎖核酸分子とを接触させ、β−シート構造を形成したペプチド鎖中のアルギニンまたはオルニチンの側鎖とリン酸基との静電相互作用および２本鎖核酸分子とβ−シート構造を形成したペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖とを結合させ核酸複合体を形成する工程と、核酸複合体を細胞に導入する工程とを有する。
［００１８］
まず、本方法に用いられる核酸キャリア（以下、「核酸キャリア」と略称する場合がある。）および本発明の第２の実施の形態に係る核酸複合体（以下、「核酸複合体」または「複合体」と略称する場合がある。）についてより詳細に説明する。
［００１９］
（１）核酸キャリア
核酸キャリアは、アルギニンまたはオルニチンと疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有するアルギニンまたはオルニチンの側鎖が片面側に、疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成するペプチド鎖を有している。上述のとおり、β−シート構造をとるポリペプチド鎖は２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）等の２本鎖核酸分子と複合体を形成することができるが、特に、ペプチド鎖が、正電荷を有するアルギニンまたはオルニチンの側鎖がシート構造の片面側に、疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されるような二次構造をとると、アルギニンまたはオルニチンの側鎖とリン酸基との静電相互作用および２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、両者の間で強い結合を形成することができる。このようにして形成された核酸複合体において、疎水性アミノ酸の側鎖は外側を向くため、複合体の脂質二分子膜からなる細胞膜に対する親和性が増大し、細胞内への導入効率が向上する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
［００２０］
ペプチド鎖のアミノ酸配列は、上記の条件、すなわち、アルギニンまたはオルニチンと疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列を有し、二重らせん構造を有する２本鎖核酸分子の存在下で、正電荷を有するアルギニンまたはオルニチンの側鎖が片面側に、疎水性アミノ酸の側鎖が反対面側にそれぞれ配置されたβ−シート構造を形成し、アルギニンまたはオルニチンの側鎖とリン酸基との静電相互作用および２本鎖核酸分子と前記ペプチド鎖との間の水素結合の一方または双方を介して、両者の間で強い結合を形成することができるという条件を満たす限りにおいて、特に制限されない。また、β−シート構造は、上記の条件を満たす限りにおいて、平行β−シートおよび逆平行β−シート構造のいずれであってもよい。
β−シート構造の形成は、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル等の任意の公知の方法を用いて確認することができる。
［００２１］
ペプチド鎖の好ましいアミノ酸配列としては、アルギニンまたはオルニチンと、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選択される疎水性アミノ酸とが交互に並んだアミノ酸配列が挙げられる。アルギニンまたはオルニチンおよび疎水性アミノ酸の種類は、複合体を形成する２本鎖核酸分子の種類や構造等に応じて適宜選択される。また、ポリペプチド鎖の長さは、複合体を形成する２本鎖核酸分子の鎖長、すなわち２本鎖核酸分子の有するリン酸基（負電荷）の数等に応じて適宜選択される。２本鎖核酸分子に対してポリペプチド鎖が短すぎると、安定な複合体が形成されないと共に、ヌクレアーゼから２本鎖核酸分子を保護する効果が得られなくなる。一方、２本鎖核酸分子に対してポリペプチド鎖が長すぎると、アルギニンまたはオルニチン残基の有する正電荷により、細胞への核酸複合体の導入効率が低下する。
［００２２］
より好ましいペプチド鎖のアミノ酸配列としては、（ＲＬ）ｎおよび（ＬＲ）ｎのいずれか一方で表されるアミノ酸配列が挙げられる。なお、Ｒはアルギニン残基、Ｌはロイシン残基をそれぞれ表す。アルギニン（Ｒ）残基は、塩基性の基としてグアニジル基を有しているが、下記の化学式で表されるように、リン酸基と強く相互作用することができるため、安定な複合体を形成する上で好ましい。
［００２３］
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
ない限りにおいて、核酸キャリア分子内の任意の位置、例えば、２本鎖核酸分子と結合を形成するポリペプチド鎖のＮ−末端側またはＣ−末端側、あるいはβ−シート構造の発現を阻害しない限りにおいて側鎖に結合させることができ、シグナルペプチドのＮ−末端側およびＣ−末端側のどちら側が２本鎖核酸分子と結合していてもよいが、シグナルペプチドのＣ−末端が、２本鎖核酸分子と結合を形成するペプチド鎖のＮ−末端に結合しているのが好ましい。２本鎖核酸分子と結合を形成するポリペプチド鎖とシグナルペプチドとは、直接結合していてもよく、適当なスペーサー分子を介して結合していてもよい。スペーサー分子の具体例としては、アルキレン基、ポリオキシエチレン基、オリゴペプチド等が挙げられる。
［００３０］
核酸キャリアには、標的細胞上の受容体に対するリガンドやシグナルペプチド以外の機能性分子が結合していてもよい。機能性分子の具体例としては、細胞膜に対する親和性を向上させるために長鎖アルキル基、脂質分子等が挙げられる。
［００３１］
核酸キャリアは、ポリペプチドを主な構成要素とするものであるため、カチオン系リポソーム等の従来の核酸キャリアに比べ細胞毒性が低く、遺伝子治療や遺伝子製剤に応用する場合の副作用を軽減でき、これらの用途に好適に用いることができる。
核酸キャリアの細胞毒性は、標的細胞へ導入し、所定時間経過後の細胞生存率により評価することができる。
［００３２］
（２）核酸複合体
核酸キャリア中のアルギニンまたはオルニチンの側鎖と、２本鎖核酸分子中のリン酸基との静電相互作用を介して両者を結合させることにより、核酸複合体が得られる。
複合体の形成に用いられる２本鎖核酸分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよく、細胞内への導入の目的についても、例えば、所望のタンパク質を産生させること、２本鎖ＤＮＡの配列を認識する転写因子などを「おとり」の短鎖核酸でトラップすること（デコイ法）、あるいはＲＮＡ干渉法（ＲＮＡｉ）等の任意の
【国際調査報告】
2012008361.tif 000024
2012008361.tif 000025
2012008361.tif 000026
2012008361.tif 000027