(57)【要約】大腸がんの検査マーカーとなり得るマイクロＲＮＡ、この検査マーカーとなり得るマイクロＲＮＡを用いる大腸がんの検査方法、およびこの検査方法に用いることができる検査キットを提供する。配列番号1〜25のいずれかで表されるマイクロRNA分子からなる大腸がんの検査マーカー。被験者の大腸組織または大腸細胞に由来するマイクロRNA分子を含有する試料を調製し、得られた試料中に存在する配列番号1〜25のいずれかで表されるマイクロRNA分子を検出することを含む、被験者における大腸がんを検査する方法。配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子の少なくとも一部と相補的な配列を有すDNA分子を固定化したDNAアレイ。このDNAアレイ、および被験者の大腸組織または大腸細胞からマイクロRNA分子を含有する試料を調製するための試薬を含む、大腸がん検査キット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1〜25のいずれかで表されるマイクロRNA分子からなる大腸がんの検査マーカー。
【請求項２】
配列番号1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、24及び25のいずれかで表されるマイクロRNA分子からなる大腸がんの検査マーカー。
【請求項３】
被験者の大腸組織または大腸細胞に由来するマイクロRNA分子を含有する試料を調製し、得られた試料中に存在する配列番号1〜25のいずれかで表されるマイクロRNA分子を検出することを含む、被験者における大腸がんを検査する方法。
【請求項４】
前記マイクロRNA分子の検出は、配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子の少なくとも一部と相補的な配列を有すDNA分子を固定化したDNAアレイのDNA分子固定化表面に前記試料を接触させて、前記試料中に存在する、固定化DNA分子とハイブリダイズするマイクロRNA分子を検出することで行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロRNA分子の検出は、配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子を鋳型として逆転写反応を行ってDNA分子を合成する工程、得られたDNA分子を増幅する工程、増幅したDNA分子を検出する工程を含む方法で行う、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
配列番号1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、24及び25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子を用いる、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子の少なくとも一部と相補的な配列を有すDNA分子を固定化したDNAアレイ。
【請求項８】
配列番号1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、24及び25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子の少なくとも一部と相補的な配列を有すDNA分子を固定化した、請求項７に記載のDNAアレイ。
【請求項９】
請求項７または８に記載のDNAアレイ、および
被験者の大腸組織または大腸細胞からマイクロRNA分子を含有する試料を調製するための試薬
を含む、大腸がん検査キット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００９年９月３０日出願の日本特願２００９−２２８０２９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、特定のマイクロＲＮＡからなる大腸がん検査マーカーに関する。さらに本発明は、前記マイクロＲＮＡを検査マーカーとして用いる大腸がんの検査方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
マイクロＲＮＡは、細胞内の遺伝子発現制御因子であるが、ある種のマイクロＲＮＡ分子は、エクソソームと呼ばれる脂質膜で包まれた形で細胞外へ放出されることが知られている。また、がん細胞は、一般的にエクソソームの細胞外放出が正常細胞に比べて亢進していることが知られている(非特許文献1、2)。がん細胞から特異的に分泌されるマイクロＲＮＡが、診断マーカーとなり得ることも知られている(非特許文献3、4)。【０００４】
非特許文献1には、卵巣がんの診断マーカーとなり得るマイクロＲＮＡが記載されている。非特許文献2には、肺がんの診断マーカーとなり得るマイクロＲＮＡが記載されている。非特許文献3には、直腸がんの診断マーカーとなり得るマイクロＲＮＡが記載されている。非特許文献4には、末梢血の小胞からマイクロRNAが検出可能であることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１２４９５７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Douglas D. Taylor, Cicek Gercel-Taylor, 卵巣がんの診断バイオマーカーとしての腫瘍由来エクソソームのマイクロRNA署名(MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer) Gynecologic Oncology 110 (2008) 13-21
【非特許文献２】Guilherme Rabinowits, Cicek Gercel-Taylor, Jamie M. Day, Douglas D. Taylor, Goetz H. Kloecker, エクソソーマル・マイクロRNA: 肺がんのための診断マーカー(Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer) Clinical Lung Cancer, Vol.10, No. 1, 42-46, 2009
【非特許文献３】Enders KO Ng, Wilson WS Chong, hongchuan jin, Emily KY Lam, Vivian Y Shin, Jun Yu, Terence C W Poon, Simon SM Ng and Joseph J Y Sung, 直腸がん患者の原形質におけるマイクロRNA の特異的発現: 大腸がんスクリーニングのための潜在的マーカー(Differential expression of microRNAs in plasma of colorectal cancer patients: A potential marker for colorectal cancer screening)
【非特許文献４】Melissa Piper Hunterら, ヒト末梢血に存在する小胞からのマイクロRNA 発現の検出(Detection of microRNA Expression in Human Peripheral Blood Microvesicles) PLOSONE November 2008, Vol. 3, Issue 11, e3694
【非特許文献５】Hadi Valadiら，mRNAとマイクロRNAのエクソソーム仲介移転は細胞間の遺伝子交換の新規機構である(Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells) Nature Cell Biology Volume 9, Number 6, June 2007, p654-659
【０００７】
特許文献１及び非特許文献１〜５の全記載は、ここに特に開示として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、これまでに大腸がんの診断に用いることができる検査マーカーとなり得る特異的マイクロＲＮＡは知られていない。そこで本発明は、大腸がんの検査マーカーとなり得るマイクロＲＮＡを提供することを目的とする。さらに本発明の目的は、この検査マーカーとなり得るマイクロＲＮＡを用いる大腸がんの検査方法を提供すること、およびこの検査方法に用いることができる検査キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、大腸がんの検査マーカーとなり得るマイクロＲＮＡを提供すべく、検討した結果、25種類のマイクロRNA分子が大腸がんの検査マーカーとして利用でき、大腸がんの検査方法および検査キットを提供することを見出して本発明を完成した。【００１０】
本発明は以下のとおりである。
[１]
配列番号1〜25のいずれかで表されるマイクロRNA分子からなる大腸がんの検査マーカー。
[２]
配列番号1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、24及び25のいずれかで表されるマイクロRNA分子からなる大腸がんの検査マーカー。
[３]
被験者の大腸組織または大腸細胞に由来するマイクロRNA分子を含有する試料を調製し、得られた試料中に存在する配列番号1〜25のいずれかで表されるマイクロRNA分子を検出することを含む、被験者における大腸がんを検査する方法。
[４]
前記マイクロRNA分子の検出は、配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子の少なくとも一部と相補的な配列を有すDNA分子を固定化したDNAアレイのDNA分子固定化表面に前記試料を接触させて、前記試料中に存在する、固定化DNA分子とハイブリダイズするマイクロRNA分子を検出することで行う、[３]に記載の方法。
[５]
前記マイクロRNA分子の検出は、配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子を鋳型として逆転写反応を行ってDNA分子を合成する工程、得られたDNA分子を増幅する工程、増幅したDNA分子を検出する工程を含む方法で行う、[３]に記載の方法。
[６]
配列番号1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、24及び25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子を用いる、[３]〜[５]のいずれかに記載の方法。
[７]
配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子の少なくとも一部と相補的な配列を有すDNA分子を固定化したDNAアレイ。
[８]
配列番号1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、24及び25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子の少なくとも一部と相補的な配列を有すDNA分子を固定化した、[７]に記載のDNAアレイ。
[９]
[７]または[８]に記載のDNAアレイ、および
被験者の大腸組織または大腸細胞からマイクロRNA分子を含有する試料を調製するための試薬
を含む、大腸がん検査キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、大腸がんの検査マーカーとなり得るマイクロＲＮＡを提供することができる。さらに本発明によれば、前記マイクロＲＮＡを検査マーカーとして用いる大腸がんの検査方法および検査キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例1で得られた、大腸がん細胞と正常大腸細胞のエクソソーム画分のマイクロRNAのプロファイルを示す。
【図２】実施例2で得られた、規格化したシグナル強度の分布を示す。
【図３】実施例3で得られた、規格化したシグナル強度の分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
[大腸がんの検査出用マーカー]
本発明は、以下に示す、配列番号1〜25のいずれかで表されるマイクロRNA分子からなる大腸がんの検査マーカーに関する。
【００１４】
miR-638：AGGGAUCGCGGGCGGGUGGCGGCCU (配列番号1)
miR-1915：CCCCAGGGCGACGCGGCGGG (配列番号2)
miR-630：AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU (配列番号3)
miR-1268：CGGGCGUGGUGGUGGGGG (配列番号4)
miR-1207-5p：UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG (配列番号5)
miR-572：GUCCGCUCGGCGGUGGCCCA (配列番号6)
miR-1246：AAUGGAUUUUUGGAGCAGG (配列番号7)
miR-483-5p：AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG (配列番号8)
miR-1225-5p：GUGGGUACGGCCCAGUGGGGGG (配列番号9)
miR-575：GAGCCAGUUGGACAGGAGC (配列番号10)
miR-1202：GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG (配列番号11)
miR-765：UGGAGGAGAAGGAAGGUGAUG (配列番号12)
miR-320c：AAAAGCUGGGUUGAGAGGGU (配列番号13)
miR-513a-5p：UUCACAGGGAGGUGUCAU (配列番号14)
miR-494：UGAAACAUACACGGGAAACCUC (配列番号15)
miR-939：UGGGGAGCUGAGGCUCUGGGGGUG (配列番号16)
miR-1290：UGGAUUUUUGGAUCAGGGA (配列番号17)
miR-1275：GUGGGGGAGAGGCUGUC (配列番号18)
miR-671-5p：AGGAAGCCCUGGAGGGGCUGGAG (配列番号19)
miR-223：UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA (配列番号20)
miR-25：CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA (配列番号21)
miR-92a: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU (配列番号22)
miR-1183：CACUGUAGGUGAUGGUGAGAGUGGGCA (配列番号23)
miR-1224-5p：GUGAGGACUCGGGAGGUGG (配列番号24)
miR-188-5p：CAUCCCUUGCAUGGUGGAGGG (配列番号25)
【００１５】
ヒト大腸がんの早期診断を可能にする検査マーカーを単離するため、大腸がん細胞から特異的に分泌されるマイクロRNAを同定した。具体的な方法は、実施例1において詳述するが、概説すると以下のとおりである。大腸がん細胞株5種類と正常大腸細胞（FHC）を用いて、細胞の培養上清からエクソソームを定法（非特許文献5）に従って濃縮し、エクソソーム画分とした。この画分から、RNAを単離し、Agilent社のmiRNAマイクロアレイを用いて、エクソソーム画分に濃縮されたマイクロRNAを網羅的に解析し、プロファイルを作成した。
【００１６】
その結果、大腸がん細胞と正常大腸細胞のエクソソーム画分のマイクロRNAのプロファイルは著しく異なることが判明した。すなわち、細胞外へ分泌されるマイクロRNAは正常細胞とがん細胞では、大きく異なることを示している（図１）。
【００１７】
また、大腸がん細胞株間では、分泌されるマイクロRNAのプロファイルの類似性が高いことも分かった。これらのプロファイルを利用して、5種類の大腸がん細胞株から共通して分泌され、正常細胞からはほとんど分泌されないマイクロRNAの選別を行った。選別された24種類のマイクロRNAについての5種類の大腸がん細胞株から得られたマイクロRNAからのシグナルの平均値と正常細胞（ＦＨＣ）からのシグナルとの強度対比を表１に示す。
【００１８】
表１に示すように、24種類のマイクロRNAが5種類すべてのがん細胞株から分泌されていることが示された。これらの中には、miR-572や1225-5pなどのように正常細胞に比べて50倍以上もがん細胞からの分泌が亢進しているものが含まれていた。また、最低のmiR-765についても、がん細胞からの分泌が正常細胞に比べて3.6倍亢進していた。したがって、これら24種類のマイクロRNA分子は、大腸がんの診断に用いることができる検査マーカーとして応用が可能である。がん細胞からの分泌の亢進の度合いが高いという観点から、正常細胞に比べて10倍以上亢進しているマイクロRNA分子が、大腸がんの診断に用いる検査マーカーとしては好ましく、正常細胞に比べて20倍以上亢進しているマイクロRNA分子が、大腸がんの診断に用いる検査マーカーとしてはより好ましく、正常細胞に比べて30倍以上亢進しているマイクロRNA分子が、大腸がんの診断に用いる検査マーカーとしてはさらに好ましい。
【００１９】
【表１】
2011040525.tif 000002
【００２０】
表１に示す24種類のmiRNAは、前述のように上から順番に配列番号1から24を付して配列表に示される。
【００２１】
上記24種類のマイクロRNAは、大腸がん細胞株から特異的に分泌されるものであり、がんの血清診断へ応用できる可能性がある。その中でも、早期段階の大腸がんから分泌されているマイクロRNAについては、大腸がんの早期診断用の検査マーカーとして利用できる。
【００２２】
さらに、実施例2及び3に示したように、健常者（healthy control）及び大腸がん患者(colorectal cancer)の血液検体より回収したクロモソーム(exosomes)について行った血漿エクソソームmiRNAの比較結果から、表1に示されたマイクロRNAの内、配列番号1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、及び24で示される11種類のマイクロRNAは、いずれもがんの血清診断へ応用できる可能性が極めて大きいマイクロRNAであることが判明した。さらに、表1には記載されていないが、miR-188-5p(配列番号25)と称されるマイクロRNAも、血漿エクソソームmiRNAの比較結果から、上記11種類のマイクロRNAと同様に、がんの血清診断へ応用できる可能性が極めて大きいことが判明した。
【００２３】
[大腸がんの検査方法]
本発明は、上記本発明の検査マーカーを用いた大腸がんの検査方法を包含する。本発明の大腸がんの検査方法は、配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子を用いる方法である。上記本発明のマイクロRNA分子は検査マーカーとなり得るものであり、マイクロRNA分子を検査マーカーとして実施できる種々の方法を採用できる。例えば、(a)配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子の少なくとも一部と相補的な配列を有すDNA分子を固定化したDNAアレイを用いる方法、(b)配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子を鋳型として逆転写反応を行ってDNA分子を合成する工程、得られたDNA分子を増幅する工程、増幅したDNA分子を検出する工程を含む方法、(c)配列番号１〜25のいずれかで表わされる少なくとも1種類のマイクロRNA分子の少なくとも1部と相補的な配列を有する合成核酸を搭載した固相化ビーズまたはビーズに類似する担体を用いた高感度検出法等を挙げることができる。
【００２４】
上記(a)〜(c)いずれの方法でも、被験者の大腸組織または大腸細胞由来と考えられるマイクロRNA分子を含有する試料を調製する。被験者の大腸組織または大腸細胞由来のマイクロRNAは、例えば、患者体液（血清など）尿、便等から適宜調製することができる。
【００２５】
上記(a)においては、DNAアレイを用いる。まず、DNAアレイについて説明する。
【００２６】
本発明で用いるDNAアレイは、配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子の少なくとも一部と相補的な配列を有すDNA分子を固定化した物である。本発明で用いるDNAアレイは、配列番号1〜25で表される25種類全てのマイクロRNA分子を固定化した物であっても良いし、25種類マイクロRNA分子の一部(1種または2種以上)を固定化した物であっても良い。マイクロRNA分子の少なくとも一部と相補的な配列を有すDNA分子は、具体的には、例えば、マイクロRNA分子の10〜20個の塩基配列と相補的な配列を有すDNA分子であることが、標的とするマイクロRNA分子と確実にかつ特異的にハイブリダイズできるという観点から適当である。但し、10〜20個の範囲に限定される意図ではない。さらに、DNA分子は、標的とするマイクロRNA分子がハイブリダイズしたことを検出するための標識を有する物であることが適当である。例えば、標的とするマイクロRNA分子および固定化したDNA分子の一方にcy3、他方にcy5を標識することができる。cy3およびcy5での標識は常法により行うことができる。
【００２７】
本発明は上記DNAアレイも包含する。
【００２８】
上記で得られた試料はDNAアレイのDNA分子固定化表面と接触させる。この接触は、通常のマイクロRNA分子を含む試料とDNAアレイとの接触と同様に実施することができ、例えば、(i)Cy3標識した患者及び被験者由来のマイクロRNAをDNAアレイ上に添加し、ハイブリダイゼーションに最適な温度でインキュベートする。(ii)Cy3標識した患者及び被験者由来のマイクロRNA及びCy5標識した健常人由来検体を混合しDNAアレイ上に添加し、接触させることにより、患者検体で特異的なマイクロRNAの配列を特定することができる。
【００２９】
上記接触の後、試料中に固定化DNA分子とハイブリダイズするマイクロRNA分子が存在するか否かを、例えば、上記マイクロRNA分子と固定化DNA分子への標識を用いて検出することができる。標識が、例えば、蛍光標識である場合には、蛍光の有無や蛍光の色を検出することもできる。また、２種類の蛍光標識を行った検体についても、蛍光強度の比を検出することが可能である。
【００３０】
上記(b)においては、前記マイクロRNA分子の検出は、(i)配列番号1〜25のいずれかで表される少なくとも１種のマイクロRNA分子を鋳型として逆転写反応を行ってDNA分子を合成する工程、(ii)得られたDNA分子を増幅する工程、(iii)増幅したDNA分子を検出する工程を含む方法で行う。
【００３１】
(i)マイクロRNA分子を鋳型とする逆転写反応
マイクロRNA分子を鋳型とする逆転写反応は、逆転写酵素および酵素の基質となるヌクレオチド、さらにプライマーの存在下に実施できる。逆転写反応は、配列番号1〜25で表される25種類全てのマイクロRNA分子を鋳型として行える条件下に行うこともできるし、25種類マイクロRNA分子の一部(1種または2種以上)を鋳型として行える条件下に行うこともできる。
【００３２】
(ii)得られたDNA分子を増幅する工程
得られたDNA分子を増幅する工程は、例えば、PCR法を用いて行うことができる。PCR法も、25種類全てのマイクロRNA分子からの逆転写物を鋳型として用いることができる条件下に行うこともできるし、25種類マイクロRNA分子の一部(1種または2種以上)を鋳型として用いることができる条件下に行うこともできる。
【００３３】
(iii)増幅したDNA分子を検出する工程
増幅したDNA分子の検出は、DNA分子の増幅の際に増幅に用いるヌクレオチドに蛍光標識を導入しておき、この蛍光標識を用いて適宜実施できる。また、特異的な増幅産物を蛍光検出できるプローブ（たとえば、Applied Biosystems社TaqManプローブ）なども応用できる。
【００３４】
(b)の方法は、DNAアレイを用いる方法に比べて、DNA分子を増幅する工程を含むことから、増幅の程度に応じて高感度化が可能である。例えば、検出感度をマイクロアレイの10倍程度に上昇させることにより、早期段階のがんを血清診断することも可能である。
【００３５】
(c)の方法は、以下のように実施できる。配列番号1〜25のいずれかで表わされる少なくとも1種類のマイクロRNA分子の少なくとも1部と相補的な配列を有する合成核酸は、例えば、マイクロRNA分子の１０〜２０個の塩基配列と相補的な配列を有すDNA分子であることが、標的とするマイクロRNA分子と確実にかつ特異的にハイブリダイズできるという観点から適当である。但し、１０〜２０個の範囲に限定される意図ではない。合成核酸は、常法により固相化ビーズ等の担体に搭載することができる。さらに、合成核酸は、標的とするマイクロRNA分子がハイブリダイズしたことを検出するための標識を有する物であることが適当である。例えば、標的とするマイクロRNA分子および固定化した合成核酸の一方にcy3、他方にcy5を標識することができる。cy3およびcy5での標識は常法により行うことができる。上記で得られたマイクロRNA分子を含有する試料は、合成核酸を搭載した固相化ビーズと接触させ、次いで、試料中に固定化合成核酸とハイブリダイズするマイクロRNA分子が存在するか否かを、例えば、上記合成核酸と固定化DNA分子への標識を用いて検出することができる。尚、1つのビーズには、例えば、1種類のマイクロRNA分子が固定化され、そのようなビーズを複数種類、並列で用いることができる。但し、これに限定される意図ではない。
【００３６】
マイクロRNA分子を検出する方法は、上記(a)〜(c)に記載の方法以外に、特許文献1の記載を参照して実施することもできる。
【００３７】
[検査キット]
本発明は、前記本発明のDNAアレイと、被験者の大腸組織または大腸細胞に由来するマイクロRNA分子を含有する試料を調製するための試薬を含む、大腸がん検査キットも包含する。マイクロRNA分子を含有する試料を調製するための試薬としては、例えば、血液検体中のRNAを回収するためのバッファーや血液中の不要な抗体などを除去するためのプロテインA及びGを固定化したビーズが含まれる。さらにRNA分子を回収するための、有機溶媒や酸性フェノールなどが含まれる。また、RNA分子のサイズにより分離精製するための樹脂を含有したカラムなどを挙げることができる。また、特異的マイクロRNA（25種類のマイクロRNA）を検出するためのPCRプライマーのセット、並びにPCR反応に必要な酵素類、バッファー、蛍光標識ヌクレオチドなども挙げることができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。但し、以下の実施例は例示であり、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される意図ではない。
実施例１
<大腸がん細胞株から分泌されるmiRNAの同定>
ヒト大腸がんの早期診断マーカーを単離するため、大腸がん細胞から特異的に分泌されるマイクロRNAを同定した。【００３９】
(方法)
細胞株
ヒト胎児大腸由来細胞FHC（正常細胞）及び5種類の大腸がん細胞株（HCT 116, HT-29, RKO, SW48, SW480）を用いた。【００４０】
エクソソームの単離
各細胞株を48時間培養し、その培養液（培養上清）を回収した。培養上清を500xgで5分間遠心し、その上清を回収した。さらに、高速で遠心（16,500 x g）し不溶性画分を取り除いたのち、0.2μmのフィルターでろ過した。そのろ液を120,000xgで超遠心し、エクソソーム画分を単離した。【００４１】
RNAの調製
エクソソーム画分に含まれる総RNAは、Trizol-LS（Invitrogen）を用いて調製した。RNAの品質は、Agilent2100 Bioanalyzerで確認した。【００４２】
マイクロRNAマイクロアレイ解析
調製した総RNA100ngを鋳型としてCy3標識した。miRNAの検出は、アジレント(Agilent)社のmiRNAマイクロアレイ(microarray)を用いて行った。このアレイはヒト851種類のマイクロRNAを特異的に検出するオリゴプローブ(oligo probe)が搭載されている。シグナル値の数値化及び統計学的解析は、GeneSpringGX10ソフトウェアーを使用した。【００４３】
結果を図１に示す。ネガティブコントロール(Negative control)は、10%ウシ胎児血清を含む培地（細胞を培養していない培地のみ）である。大腸がん細胞と正常大腸細胞のエクソソーム画分のマイクロRNAのプロファイルは著しく異なることが判明した。【００４４】
さらに、表1に示す24種類のmiRNAが、すべてのがん細胞株から分泌されていることが示された。【００４５】
実施例２
健常者（healthy control）14名及び化学療法前の大腸がん患者(colorectal cancer)10名(40−60歳:表2参照)の血液検体（−20℃保存  血漿試料1ml）より、超遠心法を用いてエクソソーム(exosomes)を回収した。回収したエクソソーム(exosomes)全量よりRNAを抽出し、10μlに調整した一部をアジレントオリゴヌクレオチドマイクロアレイ(Agilent oligonucleotide microarray)/ ヒトmiRNA V3マイクロアレイ(human miRNA V3 microarray) (851 miRNA搭載)のサンプルとした。得られたアレイデータ（シグナル強度）を、RNA量(ng)で割り、算出したものを規格化したシグナル強度（normalized signal intensity(AU)）とした。【００４６】
【表２】
2011040525.tif 000003
【００４７】
ヒト正常大腸由来FHC細胞および5種類の大腸がん細胞株（HCT116, HT29, RKO, SW48, SW480）の培養上清由来のエクソソーム(exosomes)の実験結果により、選出された31種類のmiRNAの中から、以下の2つの条件を満たす14種類のmiRNAを選出した(表3参照)。【００４８】
・  大腸がん患者で、7割(7人)以上で検出されている
・  健常者のデータと比較して有意に高いもの（Student’s t-test  two-tailed assay p<0.05）【００４９】
【表３】
2011040525.tif 000004
【００５０】
図２に規格化したシグナル強度を示す。
青・・・健常者
赤・・・大腸がん患者
バ−・・・平均値
縦軸・・・規格化したシグナル強度（normalized signal intensity(AU)）
横軸・・・miRNAの種類：左から、大腸がん患者の結果(平均値)の高い順で並んでいる。【００５１】
実施例３
健常者（healthy control）20名及び化学療法前の大腸がん患者(colorectal cancer)21名(27−78歳:表4参照)の血液検体（−20度保存  血漿試料1ml）より、超遠心法を用いてexosomesを回収した。以下、図２の説明と同様である。条件1は、14人以上で検出されているものとした（表5  参照）。【００５２】
1. 大腸がん患者で、7割(7人)以上で検出されている
2. 健常者のデータと比較して有意に高いもの（Student ‘s t-test  two-tailed assay p<0.05）【００５３】
【表４】
2011040525.tif 000005
【００５４】
【表５】
2011040525.tif 000006
【００５５】
図３に規格化したシグナル強度を示す。
青・・・健常者
赤・・・大腸がん患者
バ−・・・平均値
縦軸・・・規格化したシグナル強度(normalized signal intensity(AU))
横軸・・・miRNAの種類：左から、大腸がん患者の結果(平均値)の高い順で並んでいる【００５６】
図２及び３に示す結果は、平均値及びp値に多少違いは見られたが、選出されたmiRNAは同じであった。図２及び３に示す結果から、表１に示す24種類のmiRNAの内、配列番号1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、及び24で示される11種類のマイクロRNA、並びにmiR-188-5p(表1には記載なし)(配列番号25)の12種類のマイクロRNAは、いずれもがんの血清診断へ応用できる可能性が極めて大きく、大腸がんの早期診断用の検査マーカーとしても利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、大腸がんの検査方法やキットに関係する分野に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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