(57)【要約】  直鎖状ポリユビキチン鎖形成活性を有し、効率よく発現および精製が可能な新規なユビキチンリガーゼを提供する。（ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質と、（ｂ）前記（ａ）と複合体を形成する１種または２種以上のタンパク質との複合体は、直鎖状ポリユビキチン鎖形成活性を有し、効率よく発現および精製が可能な新規なユビキチンリガーゼであることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および（ｂ）の複合体からなるユビキチンリガーゼ。
（ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質
（ｂ）前記（ａ）と複合体を形成する１種または２種以上のタンパク質
【請求項２】
前記（ｂ）が、ＨＯＩＰのＵＢＡ領域と結合可能な領域を含むタンパク質である請求項１に記載のユビキチンリガーゼ。
【請求項３】
前記（ｂ）が、以下の（１）および／または（２）である請求項２に記載のユビキチンリガーゼ。
（１）ＨＯＩＬ−１Ｌ、もしくは、ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
（２）Ｓｈａｒｐｉｎ、もしくは、Ｓｈａｒｐｉｎの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
【請求項４】
前記（１）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記（２）が、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項３に記載のユビキチンリガーゼ。
【請求項５】
前記（ａ）が、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１に記載のユビキチンリガーゼ。
【請求項６】
以下の（Ａ）および／または（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（Ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含み、下記（Ｂ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現する１種または２種以上のタンパク質
【請求項７】
前記（Ｂ）が、ＨＯＩＰのＵＢＡ領域と結合可能な領域を含み、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記（Ｂ）が、以下の（Ｉ）および／または（ＩＩ）である請求項７に記載の発現ベクター。
（Ｉ）ＨＯＩＬ−１Ｌ、もしくは、ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
（ＩＩ）Ｓｈａｒｐｉｎ、もしくは、Ｓｈａｒｐｉｎの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
【請求項９】
前記（Ｉ）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質であり、前記（ＩＩ）が、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記（Ａ）が、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ｂ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記（Ｉ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号６で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号６で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、前記（ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号１３で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記（Ａ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号８で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号８で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ｂ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項６〜１２のいずれかに記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項１４】
被験物質を請求項１〜５のいずれかに記載のユビキチンリガーゼと接触させる工程と、
前記ユビキチンリガーゼの活性レベルを測定する工程と、
前記活性レベルを、被験物質を接触させないときの活性レベルと比較する工程とを包含することを特徴とする直鎖状ポリユビキチン化阻害物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なユビキチンリガーゼおよびその利用に関するものであり、詳細には、複数のタンパク質の複合体からなる新規なユビキチンリガーゼ、当該ユビキチンリガーゼの構成タンパク質を発現する発現ベクター、当該発現ベクターが導入された形質転換体、および当該ユビキチンリガーゼを用いる直鎖状ポリユビキチン化阻害物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチン修飾系はユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の３種の酵素群の働きで、ユビキチンリガーゼが選択的に識別する基質、主としてタンパク質にユビキチンが数珠状に連なったポリユビキチン鎖を付加することで、タンパク質の機能を制御する翻訳後修飾系である。発見当初は、ポリユビキチン化タンパク質はすべて分解に導かれると考えられてきたが、その概念は拡大し、現在では多彩な様式でタンパク質の機能を制御することが明らかになっている。生体にはユビキチン間の結合様式が異なる多様なポリユビキチン鎖が存在し、その種類によって修飾されたタンパク質の制御様式が異なることが示されつつある。従来のポリユビキチン鎖はユビキチンのリジン側鎖を介したイソペプチド結合によって生成されると考えられてきたが、本発明者はＮ末端のメチオニンを介する直鎖状ポリユビキチン鎖が形成されること、および、直鎖状ポリユビキチン化がＮＦ−κＢの活性化に関わることを世界に先駆けて示した。【０００３】
具体的には、本発明者は、ＨＯＩＬ−１ＬとＨＯＩＰとの複合体が直鎖状ポリユビキチン鎖を生成するユビキチンリガーゼであることを見出し、ＨＯＩＬ−１ＬとＨＯＩＰとの複合体をＬＵＢＡＣ（linear ubiquitin chain assemble complex）と命名した（非特許文献１参照）。また、ＬＵＢＡＣユビキチンリガーゼは、ＮＦ−κＢ活性化の古典的経路において、ＩκＢキナーゼを活性化する段階に関与しており、ＩκＢキナーゼであるＩＫＫ複合体を構成するＮＥＭＯ（NF-κB essential modulator）を直鎖状ユビキチン化することで、ＮＦ−κＢの選択的な活性化を引き起こすことを明らかにした（非特許文献２参照）。【０００４】
さらに本発明者は、Ｓｈａｒｐｉｎも直鎖状ポリユビキチン鎖を生成するユビキチンリガーゼの構成成分であることを見出し、Ｓｈａｒｐｉｎ、ＨＯＩＬ−１ＬとＨＯＩＰの３つのタンパク質、またはＨＯＩＬ−１ＬとＨＯＩＰもしくはＳｈａｒｐｉｎとＨＯＩＰの２つのタンパク質で構成されるユビキチンリガーゼ複合体をＬＵＢＡＣと呼称することにした。Ｓｈａｒｐｉｎに関しては、ｃｐｄｍマウスと呼ばれるＳｈａｒｐｉｎの自然変異マウスは、慢性皮膚炎やパイエル板の欠損など免疫系の異常等の症状を呈することが報告されている（非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kurisako, T. et al. A ubiquitin ligase complex assembles linear polyubiquitin chains. EMBO J., 25. 4877-4887 (2006)
【非特許文献２】Tokunaga, F. et al. Involvement of linear polyubiquitylation of NEMO in NF-κB activation. Nature Cell Biol., 11. 123-132 (2009)
【非特許文献３】Seymour, R. E. et al. Spontaneous mutations in the mouse Sharpin gene result in multiorgan inflammation, immune system dysregulation and dermatitis. Genes Immun., 8. 416-421 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、リコンビナントＬＵＢＡＣを効率的に発現するＬＵＢＡＣ発現系の樹立を試みているが、未だ高効率の発現系が得られるに至っていない。そこで、本発明は、直鎖状ポリユビキチン鎖形成活性を有し、効率よく発現および精製が可能な新規なユビキチンリガーゼを提供し、当該ユビキチンリガーゼの構成タンパク質を発現する発現ベクター、当該発現ベクターが導入された形質転換体、および当該ユビキチンリガーゼを用いる直鎖状ポリユビキチン化阻害物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］以下の（ａ）および（ｂ）の複合体からなるユビキチンリガーゼ。
（ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質
（ｂ）前記（ａ）と複合体を形成する１種または２種以上のタンパク質
［２］前記（ｂ）が、ＨＯＩＰのＵＢＡ領域と結合可能な領域を含むタンパク質である前記［１］に記載のユビキチンリガーゼ。
［３］前記（ｂ）が、以下の（１）および／または（２）である前記［２］に記載のユビキチンリガーゼ。
（１）ＨＯＩＬ−１Ｌ、もしくは、ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
（２）Ｓｈａｒｐｉｎ、もしくは、Ｓｈａｒｐｉｎの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
［４］前記（１）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記（２）が、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である前記［３］に記載のユビキチンリガーゼ。
［５］前記（ａ）が、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である前記［１］に記載のユビキチンリガーゼ。
［６］以下の（Ａ）および／または（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（Ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含み、下記（Ｂ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現する１種または２種以上のタンパク質
［７］前記（Ｂ）が、ＨＯＩＰのＵＢＡ領域と結合可能な領域を含み、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である前記［６］に記載の発現ベクター。
［８］前記（Ｂ）が、以下の（Ｉ）および／または（ＩＩ）である前記［７］に記載の発現ベクター。
（Ｉ）ＨＯＩＬ−１Ｌ、もしくは、ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
（ＩＩ）Ｓｈａｒｐｉｎ、もしくは、Ｓｈａｒｐｉｎの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
［９］前記（Ｉ）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質であり、前記（ＩＩ）が、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である前記［８］に記載の発現ベクター。
［１０］前記（Ａ）が、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ｂ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である前記［６］に記載の発現ベクター。
［１１］前記（Ｉ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号６で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号６で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、前記（ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号１３で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである前記［９］に記載の発現ベクター。
［１２］前記（Ａ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号８で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号８で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ｂ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである前記［１０］に記載の発現ベクター。
［１３］前記［６］〜［１２］のいずれかに記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
［１４］被験物質を前記［１］〜［５］のいずれかに記載のユビキチンリガーゼと接触させる工程と、前記ユビキチンリガーゼの活性レベルを測定する工程と、前記活性レベルを、被験物質を接触させないときの活性レベルと比較する工程とを包含することを特徴とする直鎖状ポリユビキチン化阻害物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新規なユビキチンリガーゼを提供することができる。また、当該ユビキチンリガーゼの構成タンパク質を発現する発現ベクター、当該発現ベクターが導入された形質転換体を提供することができる。本発明のユビキチンリガーゼは、本発明の発現ベクターおよび形質転換体を用いて高効率で発現させ、高収率で精製することができる。また、本発明のユビキチンリガーゼを用いて、直鎖状ポリユビキチン化阻害物質のスクリーニング方法を提供することができる。得られる直鎖状ポリユビキチン化阻害物質はＮＦ−κＢの活性化を選択的に阻害できるので、ＮＦ−κＢが関与する各種疾病の予防薬または治療薬の有効成分候補となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１（ａ）】ＨＯＩＬ−１ＬとＨＯＩＰとから構成されるＬＵＢＡＣの構造およびＬＵＢＡＣによる直鎖状ユビキチン生成機構の説明図である。
【図１（ｂ）】ＳｈａｒｐｉｎとＨＯＩＰとから構成されるＬＵＢＡＣの構造およびＬＵＢＡＣによる直鎖状ユビキチン生成機構の説明図である。
【図１（ｃ）】ＨＯＩＬ−１ＬとＳｈａｒｐｉｎとＨＯＩＰの３者から構成されるＬＵＢＡＣの構造を示す図である。
【図２】ＬＵＢＡＣによるＮＦ−κＢ活性化メカニズムの模式図である。
【図３】ｐＥＴＤｕｅｔ−１ ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣの構造を示す図である。
【図４】大腸菌で発現させたｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。
【図５】ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣの直鎖状ポリユビキチン形成活性を確認した結果を示す図である。
【図６】ｐＥＴＤｕｅｔ−１ ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎの構造を示す図である。
【図７】大腸菌で発現させたｐｅｔｉｔ−ＳｈａｒｐｉｎをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。
【図８】ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎの直鎖状ポリユビキチン形成活性を確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔ＬＵＢＡＣについて〕
ＬＵＢＡＣ（linear ubiquitin chain assemble complex）は本発明者が見出したユビキチンリガーゼである。図１（ａ）、図１（ｂ）、図１（ｃ）にそれぞれ示したように、ＬＵＢＡＣはＨＯＩＬ−１Ｌ、ＨＯＩＰ、Ｓｈａｒｐｉｎの３種類、あるいはＨＯＩＬ−１ＬとＨＯＩＰ、ＳｈａｒｐｉｎとＨＯＩＰの２種類のタンパク質からなる複合体型のユビキチンリガーゼであり、直鎖状ポリユビキチン鎖を生成する活性を有している。
【００１１】
ＨＯＩＬ−１Ｌは、ＨＯＩＬ−１（heme-oxidized IRP2 ligase-1）よりもＮ末端が伸長しているスプライシングアイソフォームであり、細胞内の主要なＨＯＩＬ−１として見出された。図１（ａ）に示したように、ＨＯＩＬ−１Ｌは５８ｋＤであり、Ｎ末端側からＵＢＬドメイン（ＵＢＬ）、Ｎｐｌ４型ジンクフィンガードメイン（ＮＺＦ）、ＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧドメインを有している。ＨＯＩＬ−１Ｌは配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、これをコードする遺伝子の塩基配列は配列番号２で表わされる。ＨＯＩＬ−１Ｌは、ＲＢＣＫ１またはＲＮＦ５４とも称される。ＨＯＩＬ−１Ｌをコードする遺伝子（RBCK1, transcript variant 2）の塩基配列は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬにアクセッション番号：ＮＭ＿０３１２２９として登録されている。
【００１２】
ＨＯＩＬ−１Ｌ会合タンパク質として同定されたＨＯＩＰ（HOIL-1L-interacting protein）は、図１（ａ）に示したように、Ｎ末端領域にｐ９７／ＶＣＰと結合するＰＵＢドメイン（ＰＵＢ）を持ち、続いて３つのジンクフィンガードメイン（ＺＦ、ＮＺＦ、ＮＺＦ）、ＵＢＡドメイン（ＵＢＡ）、ＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧドメインからなる１２０ｋＤのタンパク質である。ＨＯＩＰは配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、これをコードする遺伝子の塩基配列は配列番号４で表わされる。ＨＯＩＰはＲＮＦ３１とも称される。ＨＯＩＰをコードする遺伝子の塩基配列は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬにアクセッション番号：ＡＢ２６５８１０として登録されている。
【００１３】
ＨＯＩＬ−１ＬとＨＯＩＰは複合体を形成し、細胞内ではオリゴマーとして存在していると考えられる。そして、本発明者は、ＨＯＩＬ−１Ｌ−ＨＯＩＰ複合体が、従来知られているユビキチンのリジン側鎖を介したイソペプチド結合によって生成されるポリユビキチン鎖でなく、Ｎ末端のメチオニンを介する直鎖状ポリユビキチン鎖を生成するユビキチンリガーゼ活性を有することを見出した（非特許文献１）。
【００１４】
さらに本発明者は、Ｓｈａｒｐｉｎ（SHANK-associated RH domain-interacting protein）も直鎖状ポリユビキチン鎖を生成するユビキチンリガーゼの構成成分であることを見出した。つまり、ＨＯＩＬ−１ＬとＳｈａｒｐｉｎとＨＯＩＰ複合体（図１（ｃ）参照）、およびＳｈａｒｐｉｎ−ＨＯＩＰ複合体（図１（ｂ）参照）が、従来知られているユビキチンのリジン側鎖を介したイソペプチド結合によって生成されるポリユビキチン鎖でなく、Ｎ末端のメチオニンを介する直鎖状ポリユビキチン鎖を生成するユビキチンリガーゼ活性を有することを見出した。図１（ｂ）、（ｃ）に示したように、Ｓｈａｒｐｉｎは４０ｋＤであり、Ｎ末端側からコイルドコイルドメイン（ＣＣ）、ＵＢＬドメイン（ＵＢＬ）、Ｎｐｌ４型ジンクフィンガードメイン（ＮＺＦ）、ＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧドメインを有している。Ｓｈａｒｐｉｎは配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、これをコードする遺伝子の塩基配列は配列番号１１で表わされる。Ｓｈａｒｐｉｎをコードする遺伝子の塩基配列は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬにアクセッション番号：ＦＪ６５５９９５として登録されている。
【００１５】
図１（ｃ）に示したように、ＨＯＩＬ−１ＬとＳｈａｒｐｉｎとＨＯＩＰとは、３者の複合体を形成することができる。生体内では、これら３者から構成される複合体が安定に存在し、ＨＯＩＬ−１ＬとＨＯＩＰ、またはＳｈａｒｐｉｎとＨＯＩＰからなる複合体は不安定であることを本発明者は見出している。
【００１６】
〔ＬＵＢＡＣによる選択的ＮＦ−κＢ活性化メカニズムについて〕
ＮＦ−κＢは種々の刺激で活性化される転写因子であり、細胞増殖、炎症、免疫応答等に関わっているだけではなく、多発性骨髄腫をはじめとする種々のガンで活性亢進が知られており、その選択的活性化阻害剤はリウマチ・アレルギー性疾患や抗ガン剤の優れたターゲットであると考えられている。
【００１７】
図２にＨＯＩＬ−１ＬとＨＯＩＰとから構成されるＬＵＢＡＣによるＮＦ−κＢ活性化メカニズムの模式図を示した。なお、ＳｈａｒｐｉｎとＨＯＩＰとから構成されるＬＵＢＡＣ、ＨＯＩＬ−１ＬとＳｈａｒｐｉｎとＨＯＩＰとから構成されるＬＵＢＡＣによるＮＦ−κＢ活性化も同様である。図２に示したように、ＮＦ−κＢはヘテロ２量体からなる転写因子で、未刺激の状態では阻害タンパク質であるＩκＢαと結合して細胞質に存在している。種々の刺激によってＩＫＫ複合体が活性化され、その結果としてＩκＢαがリン酸化され、分解へと導かれる。ＩκＢαから遊離したＮＦ−κＢは核に移行し、種々の遺伝子の転写を亢進させる。それゆえ、シグナル依存的なＮＦ−κＢ活性化の理解には刺激依存的なＩＫＫ複合体の活性化機構の解明が必須であり、多くの研究が行われてきたが、現在、従来想定されていたドグマが崩れつつあり、未だコンセンサスが得られていないのが現状である。
【００１８】
本発明者は、ＬＵＢＡＣユビキチンリガーゼが、ＴＮＦ−α等の刺激依存的にＩＫＫ複合体の活性調節サブユニットとして機能しているＮＥＭＯと選択的に結合して、ＮＥＭＯを直鎖状ポリユビキチン化し、これによりＩＫＫ複合体を活性化させることでＮＦ−κＢの活性化を引き起こすことを明らかにした（非特許文献２）。また、これまで調べた限りではＬＵＢＡＣによるＮＥＭＯの直鎖状ポリユビキチン化はＮＦ−κＢを選択的に活性化させると考えられる。
【００１９】
〔新規ユビキチンリガーゼ〕
本発明のユビキチンリガーゼは、以下の（ａ）および（ｂ）の複合体からなるものであればよい。
（ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質
（ｂ）前記（ａ）と複合体を形成する１種または２種以上のタンパク質
【００２０】
上記（ｂ）は、（ａ）と複合体を形成し、ユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質であれば特に限定されない。（ｂ）は２種以上でもよく、したがって、本発明のユビキチンリガーゼは、（ａ）を含む３種以上のタンパク質の複合体であってもよい。（ｂ）として好ましくは、ＨＯＩＰのＵＢＡ領域と結合可能な領域を含むタンパク質が挙げられ、より好ましくは、（１）ＨＯＩＬ−１Ｌ、またはＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質、（２）Ｓｈａｒｐｉｎ、またはＳｈａｒｐｉｎの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質、などが挙げられる。本発明のユビキチンリガーゼは、（ａ）と（１）との複合体、（ａ）と（２）との複合体、（ａ）と（１）と（２）との複合体からなることがより好ましい。
【００２１】
ＨＯＩＬ−１Ｌの全長は上述のように配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＵＢＬ領域は配列番号１の第７０位〜第１３０位に該当する。したがって上記（１）がＨＯＩＬ−１Ｌの場合は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質であればよく、上記（１）がＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質、つまりＵＢＬ領域を含むＨＯＩＬ−１Ｌの部分タンパク質である場合は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質において、その全長を含まず、少なくとも第７０位〜第１３０位のアミノ酸配列を含むタンパク質であればよい。好ましくはＮｐｌ４型ジンクフィンガードメイン（ＮＺＦ）を含まないＨＯＩＬ−１Ｌの部分タンパク質であり、より好ましくはＮＺＦおよびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧドメインを含まないＨＯＩＬ−１Ｌの部分タンパク質である（図１（ａ）参照）。
【００２２】
本明細書において、ＨＯＩＬ−１Ｌは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質に限定されず、ＨＯＩＰと複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現できる限りにおいて、ＨＯＩＬ−１Ｌの変異体であってもよい。このようなＨＯＩＬ−１Ｌの変異体や、当該ＨＯＩＬ−１Ｌの変異体において、ＵＢＬ領域に相当する領域を含む部分タンパク質は、本発明の（ｂ）の（１）のタンパク質として好適に用いることができる。ＨＯＩＬ−１Ｌの変異体としては、例えば、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＯＩＰと複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現できるタンパク質が挙げられる。また、ＨＯＩＬ−１ＬのＵＢＬ領域と同様の領域を有するタンパク質、または当該タンパク質のＵＢＬ領域に該当する領域を含む部分タンパク質は、（ｂ）のタンパク質として好適に用いることができる。
【００２３】
（ｂ）の（１）のタンパク質としてさらに好ましいタンパク質は、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号５で表わされるアミノ酸配列は、配列番号１の第１位〜第１９１位に該当する。もちろん、上記（ａ）のタンパク質と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現できる限りにおいて、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好適に用いることができる。
【００２４】
Ｓｈａｒｐｉｎの全長は上述のように配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＵＢＬ領域は配列番号１０の第２４０位〜第３００位に該当する。したがって上記（２）がＳｈａｒｐｉｎの場合は、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質であればよく、上記（２）がＳｈａｒｐｉｎの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質、つまりＵＢＬ領域を含むＳｈａｒｐｉｎの部分タンパク質である場合は、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分タンパク質において、少なくとも第２４０位〜第３００位のアミノ酸配列を含むタンパク質であればよい。好ましくはＮｐｌ４型ジンクフィンガードメイン（ＮＺＦ）を含まないＳｈａｒｐｉｎの部分タンパク質であり、より好ましくはＮＺＦおよびコイルドコイルドメイン（ＣＣ）を含まないＳｈａｒｐｉｎの部分タンパク質である（図１（ｂ）参照）。
【００２５】
本明細書において、Ｓｈａｒｐｉｎは、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質に限定されず、ＨＯＩＰと複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現できる限りにおいて、Ｓｈａｒｐｉｎの変異体であってもよい。このようなＳｈａｒｐｉｎの変異体や、当該Ｓｈａｒｐｉｎの変異体において、ＵＢＬ領域に相当する領域を含む部分タンパク質は、本発明の（ｂ）の（２）のタンパク質として好適に用いることができる。Ｓｈａｒｐｉｎの変異体としては、例えば、配列番号１０で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＯＩＰと複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現できるタンパク質が挙げられる。また、ＳｈａｒｐｉｎのＵＢＬ領域と同様の領域を有するタンパク質、または当該タンパク質のＵＢＬ領域に該当する領域を含む部分タンパク質は、（ｂ）のタンパク質として好適に用いることができる。
【００２６】
（ｂ）の（２）のタンパク質としてさらに好ましいタンパク質は、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号１２で表わされるアミノ酸配列は、配列番号１０の第１７２位〜第３４６位に該当する。もちろん、上記（ａ）のタンパク質と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現できる限りにおいて、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好適に用いることができる。
【００２７】
上記（ａ）は、ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質であれば特に限定されない。ＨＯＩＬ−１Ｌの全長は上述のように配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＵＢＡ領域は配列番号３の第５６４位〜第６１５位に該当し、ＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域は配列番号３の第６９９位〜第９０１位に該当し、ＵＢＡ領域のＮ末端からＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域のＣ末端までの領域は配列番号３の第５６４位〜第９０１位に該当する。したがって（ａ）は、配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分タンパク質であって、少なくとも第５６４位〜第９０１位のアミノ酸配列を含むタンパク質であればよい。好ましくは３つのジンクフィンガードメイン（ＺＦ、ＮＺＦ、ＮＺＦ）を含まない部分タンパク質であり、より好ましくは、ＰＵＢドメイン（ＰＵＢ）および３つのジンクフィンガードメイン（ＺＦ、ＮＺＦ、ＮＺＦ）を含まない部分タンパク質である（図１（ａ）、（ｂ）参照）。
【００２８】
本明細書において、ＨＯＩＰは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質に限定されず、ＨＯＩＬ−１Ｌと複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現できる限りにおいて、ＨＯＩＰの変異体であってもよい。このようなＨＯＩＰの変異体において、ＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域に相当する領域を含む部分タンパク質は、本発明の（ａ）のタンパク質として好適に用いることができる。ＨＯＩＰの変異体としては、例えば、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＯＩＬ−１Ｌと複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現できるタンパク質が挙げられる。
【００２９】
（ａ）のタンパク質としてさらに好ましいタンパク質は、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号７で表わされるアミノ酸配列は、配列番号３の第４７４位〜第１０７２位に該当する。もちろん、上記（ｂ）のタンパク質と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現できる限りにおいて、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も（ａ）のタンパク質として好適に用いることができる。
【００３０】
「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００３１】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、欠失、および付加であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、タンパク質の活性を変化させない。保存性置換と見られる代表的なものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００３２】
本発明のユビキチンリガーゼは付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）やＭｙｃ、ＦＬＡＧ等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。
【００３３】
本発明のユビキチンリガーゼは、例えば、公知の遺伝子工学的手法により、上記（ａ）のタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に挿入した組み換え発現ベクターおよび上記（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に挿入した組み換え発現ベクターをそれぞれ構築し、これらを適当な宿主細胞に共導入して組み換えタンパク質として発現させ、形成された複合体を宿主細胞内または培地中から精製することにより製造することができる。また、複数のタンパク質を１つのベクターで共発現可能な組み換え発現ベクターを用いることもできる。
【００３４】
また、本発明のユビキチンリガーゼは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて製造することもできる。この方法で行う場合には、上記（ａ）のタンパク質をコードするＤＮＡ断片および上記（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ断片と、公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（例えば、大腸菌、小麦胚芽細胞、ウサギ網状赤血球の無細胞抽出液を用いる系）を用いることができる。
【００３５】
得られたタンパク質が複合体を形成していること、およびユビキチンリガーゼ活性を有していることは、公知の方法を用いて確認することができる。複合体形成の確認は、例えば、得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、複数のタンパク質のバンドが出現することにより行うことができる。ユビキチンリガーゼ活性の有無は、例えば、得られたタンパク質と、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、ＡＴＰおよびユビキチンを混和して反応（例えば、３７℃で５分〜１時間程度）させたときに、直鎖状ポリユビキチン鎖が生成されるか否かによって確認することができる。
【００３６】
〔発現ベクター〕
本発明の発現ベクターは、（Ａ）および／または（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであればよい。
（Ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含み、下記（Ｂ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
（Ｂ）前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現する１種または２種以上のタンパク質
【００３７】
（Ｂ）は、本発明のユビキチンリガーゼを構成する上記（ｂ）のタンパク質であればよい。すなわち、（Ｂ）として好ましくは、ＨＯＩＰのＵＢＡ領域と結合可能な領域を含み、（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質が挙げられ、より好ましくは、（Ｉ）ＨＯＩＬ−１Ｌ、もしくは、ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質、（ＩＩ）Ｓｈａｒｐｉｎ、もしくは、Ｓｈａｒｐｉｎの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質、などが挙げられる。
【００３８】
（Ｉ）のＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質、つまりＵＢＬ領域を含むＨＯＩＬ−１Ｌの部分タンパク質であって（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質は、具体的には配列番号１で表わされるアミノ酸配列の一部からなり、少なくとも第７０位〜第１３０位のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、例えば、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質が好適に用いられる。また、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質も好適である。
【００３９】
ＨＯＩＬ−１Ｌをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。当該塩基配列において、ＵＢＬ領域をコードする塩基配列は第２０８位〜第３９０位である。したがって、（Ｉ）がＨＯＩＬ−１Ｌである場合、これをコードするポリヌクレオチドとして、例えば配列番号２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドを好適に用いることができ、（Ｉ）がＵＢＬ領域を含むＨＯＩＬ−１Ｌの部分タンパク質である場合、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、例えば配列番号２で表わされる塩基配列の一部からなり、第２０８位〜第３９０位の塩基配列を含むポリヌクレオチドを好適に用いることができる。
【００４０】
配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号６で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。また、配列番号６で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するＨＯＩＬ−１Ｌの部分タンパク質をコードするポリヌクレオチドも好適に用いることができる。
【００４１】
（ＩＩ）のＳｈａｒｐｉｎの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質、つまりＵＢＬ領域を含むＳｈａｒｐｉｎの部分タンパク質であって（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質は、具体的には配列番号１０で表わされるアミノ酸配列の一部からなり、少なくとも第２４０位〜第３００位のアミノ酸配列を含むタンパク質であり、例えば、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質が好適に用いられる。また、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質も好適である。
【００４２】
Ｓｈａｒｐｉｎをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号１１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。当該塩基配列において、ＵＢＬ領域をコードする塩基配列は第７１８位〜第９００位である。したがって、（ＩＩ）がＳｈａｒｐｉｎである場合、これをコードするポリヌクレオチドとして、例えば配列番号１１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドを好適に用いることができ、（ＩＩ）がＵＢＬ領域を含むＳｈａｒｐｉｎの部分タンパク質である場合、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、例えば配列番号１１で表わされる塩基配列の一部からなり、第７１８位〜第９００位の塩基配列を含むポリヌクレオチドを好適に用いることができる。
【００４３】
配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号１３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。また、配列番号１３で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するＳｈａｒｐｉｎの部分タンパク質をコードするポリヌクレオチドも好適に用いることができる。
【００４４】
（Ａ）は、本発明のユビキチンリガーゼを構成する上記（ａ）のタンパク質であればよい。好ましくは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列の一部からなり、少なくとも第５６４位〜第９０１位のアミノ酸配列を含み、（Ｂ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質が挙げられ、より好ましくは、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（Ｂ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質も好適である。
【００４５】
ＨＯＩＰをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号４で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。当該塩基配列において、ＵＢＡ領域のＮ末端からＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域のＣ末端までの領域をコードする塩基配列は第１６９０位〜第２７０３位である。したがって、（Ａ）をコードするポリヌクレオチドとして、配列番号４で表わされる塩基配列の一部からなり、第１６９０位〜第２７０３位の塩基配列を含むポリヌクレオチドを好適に用いることができる。
【００４６】
配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号８で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。また、配列番号８で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、（Ｂ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するＨＯＩＰの部分タンパク質をコードするポリヌクレオチドも好適に用いることができる。
【００４７】
本明細書において「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用される。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在することができる。ＤＮＡは、二本鎖でもよく一本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）、または、非コード鎖（アンチセンス鎖）のいずれであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。
【００４８】
ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高く（ハイブリダイズし難く）なり、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００４９】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」とは、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。
【００５０】
本発明の発現ベクターに使用するポリヌクレオチドを取得する方法としては、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、配列番号６で表わされる塩基配列の５’側および３’側の配列（またはその相補配列）に基づいてそれぞれプライマーを設計し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、配列番号６で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００５１】
本発明の発現ベクターには、以下の発現ベクターが含まれる。
(i) 上記（Ａ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター
(ii) 上記（Ｂ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター
(iii) 上記（Ａ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび上記（Ｂ）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの両方を含むベクター
また、（Ｂ）のタンパク質が２種以上の場合は、（Ａ）を含めて３種以上のタンパク質をそれぞれコードするポリヌクレオチドを適宜組み合わせて２種以上のポリヌクレオチドを含む共発現ベクターとしてもよい。
本発明の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクターが好ましい。２種以上のポリヌクレオチドを含む場合は、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を２か所以上有することが好ましい。このようなプラスミドベクターは、公知のベクターを適宜選択して用いることができ、市販のプラスミドベクターを容易に入手することができる。
【００５２】
組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。ベクターの具体的な種類は限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のユビキチンリガーゼの構成タンパク質を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これとユビキチンリガーゼの構成タンパク質をコードするポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んで発現ベクターを作製すればよい。
【００５３】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性遺伝子等、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【００５４】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などが挙げられる。上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００５５】
本発明のユビキチンリガーゼが２種類のタンパク質の複合体である場合は、（Ａ）および（Ｂ）をそれぞれコードする２種類のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（共発現ベクター）を宿主細胞に導入するか、または、（Ａ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に共導入すればよい。
本発明のユビキチンリガーゼが３種類以上のタンパク質の複合体である場合は、複合体を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ含む発現ベクターを宿主細胞に共導入するか、単一のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共発現ベクターとを適宜組み合わせて複合体を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入すればよい。
複合体を構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドがすべて導入された宿主細胞（形質転換体）を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、本発明のユビキチンリガーゼを回収、精製することができる。
【００５６】
〔形質転換体〕
本発明は、上記本発明の発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。本発明の形質転換体は、上記本発明の発現ベクターのいずれか１つが導入されているものであればよく、本発明のユビキチンリガーゼを構成するすべてのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが同時に導入されていることは要しない。本明細書において「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含む。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞として例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。
【００５７】
本発明の形質転換体のうち、本発明のユビキチンリガーゼを構成するタンパク質をコードするポリヌクレオチドがすべて導入されている形質転換体は、本発明のユビキチンリガーゼの製造に好適に使用することができる。これらの形質転換体は、本発明のユビキチンリガーゼを安定的に発現するものであることが好ましいが、一過性に発現するものでもよい。
【００５８】
ここで、上述のように、本発明者はリコンビナントＬＵＢＡＣを効率的に発現するＬＵＢＡＣ発現系、すなわち、全長のＨＯＩＬ−１Ｌと全長のＨＯＩＰ、または全長のＳｈａｒｐｉｎと全長のＨＯＩＰとを効率的に発現して複合体が形成されるＬＵＢＡＣ発現系の樹立を試みているが、未だ高効率の発現系が得られるに至っていない。具体的には、非特許文献１の［Materials and methods］の“Preparation of recombinant proteins”において記載されているように、本発明者は、細菌で発現させたＬＵＢＡＣの調製を、ニッケルアフィニティーゲル、ＨｉＴｒａｐＱ、およびゲル濾過という３段階の精製段階を経て行っていた。すなわち、非特許文献１の発現系において、３段階もの精製を行わなければリコンビナントＬＵＢＡＣを取得することができなかった。この記載から、従来のリコンビナントＬＵＢＡＣ発現系では、効率的な発現ができなかったことが理解できる。これに対して、本発明の発現ベクターおよび形質転換体を用いれば、後段の実施例に記載のように、ニッケルアフィニティーゲルによる１段階の精製で本発明のユビキチンリガーゼを容易に取得できることが示された。
【００５９】
したがって、本発明により提供される新規なユビキチンリガーゼ、その発現ベクターおよび形質転換体は、従来樹立することができなかった直鎖状ポリユビキチン鎖形成活性を有するユビキチンリガーゼの高効率発現と高収率の精製を可能とするものであり、極めて有用性の高い発明である。
【００６０】
〔スクリーニング方法〕
本発明のスクリーニング方法は、被験物質を本発明のユビキチンリガーゼと接触させる工程、被験物質と接触させたユビキチンリガーゼの活性レベルを測定する工程、測定した活性レベルを、被験物質を接触させないときの活性レベルと比較する工程、を包含するものであればよい。本発明のスクリーニング方法により、直鎖状ポリユビキチン化阻害物質を簡便かつ効率的にスクリーニングすることができる。
【００６１】
被験物質と本発明のユビキチンリガーゼとの接触は、例えば、ユビキチンリガーゼを含む溶液に被験物質を添加し、溶解または懸濁させることにより行うことができる。接触時間、接触温度は特に限定されず、適宜選択すればよい。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。
【００６２】
ユビキチンリガーゼの活性レベルの測定は、測定対象のユビキチンリガーゼ、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、ＡＴＰおよびユビキチンを混和して反応させ（例えば、３７℃で５分〜１時間程度）、生成した直鎖状ポリユビキチン鎖を定量することにより行うことができる。Ｅ１、Ｅ２、ＡＴＰ、ユビキチンは市販のものも使用可能である。
【００６３】
被験物質を接触させたユビキチンリガーゼの活性レベルを、被験物質を接触させていないユビキチンリガーゼの活性レベルと比較することで、被験物質が直鎖状ポリユビキチン化阻害物質であるか否かを判定することができる。被験物質を接触させていないユビキチンリガーゼの活性レベルと比較して、被験物質を接触させたユビキチンリガーゼの活性レベルが低ければ、被験物質が直鎖状ポリユビキチン化阻害物質であると判定できる。好ましくは５０％以下、より好ましくは２５％以下であるときに直鎖状ポリユビキチン化阻害物質であると判定する。
【００６４】
上述のように、本発明者はＬＵＢＡＣユビキチンリガーゼが、ＮＦ−κＢ活性化の古典的経路において、ＩＫＫ複合体のＮＥＭＯと選択的に結合して、ＮＥＭＯを直鎖状ポリユビキチン化し、これによりＩＫＫ複合体を活性化させることでＮＦ−κＢの活性化を引き起こすことを明らかにしており（非特許文献２参照）、ＬＵＢＡＣによるＮＥＭＯの直鎖状ポリユビキチン化はＮＦ−κＢを選択的に活性化させることも見出している。本発明のユビキチンリガーゼは、ＬＵＢＡＣを構成するＨＯＩＬ−１Ｌの部分タンパク質とＨＯＩＰの部分タンパク質との複合体、Ｓｈａｒｐｉｎの部分タンパク質とＨＯＩＰの部分タンパク質との複合体、または、ＨＯＩＬ−１Ｌの部分タンパク質とＳｈａｒｐｉｎの部分タンパク質とＨＯＩＰの部分タンパク質との複合体であるので、本発明のスクリーニング方法により得られる直鎖状ポリユビキチン化阻害物質は、ＮＥＭＯの直鎖状ポリユビキチン化を阻害し、その結果ＮＦ−κＢの活性化を選択的に阻害する物質であると考えられる。したがって、本発明のスクリーニング方法により得られる直鎖状ポリユビキチン化阻害物質は、ＮＦ−κＢが関与する各種疾病の予防薬または治療薬の有効成分候補物質として極めて有用である。
【００６５】
ＮＦ−κＢが関与する疾病としては、例えば、慢性関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、気管支ぜんそく、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられる。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本実施例において、ＨＯＩＬ−１Ｌの第１位〜第１９１位アミノ酸配列（配列番号７）からなるタンパク質を「ＨＯＩＬ−１Ｌ（１−１９１）」と称し、ＨＯＩＰの第４７４位〜第１０７２位のアミノ酸配列（配列番号５）からなるタンパク質を「ＨＯＩＰ（４７４−１０７２）」と称する。また、本発明のユビキチンリガーゼを「ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣ」と称する。【００６７】
〔実施例１：ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣ発現ベクターの構築〕
共発現用ベクターであるｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＭＣＳ１のＨｉｓ−Ｔａｇの下流にＨＯＩＰ（４７４−１０７２）をコードするＤＮＡ（配列番号６）を挿入し、ＭＣＳ２にＨＯＩＬ−１Ｌ（１−１９１）をコードするＤＮＡ（配列番号８）を挿入することにより、ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣ発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１ ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣを構築した（図３参照）。このｐＥＴＤｕｅｔ−１ ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣにより、２種類のタンパク質、すなわちＨＯＩＰ（４７４−１０７２）の上流（Ｎ末端側）に「ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＳＱＤＰＮＳＥＮＬＹＦＱ」（配列番号９）が付加されたタンパク質、および、ＨＯＩＬ−１Ｌ（１−１９１）が発現される。【００６８】
〔実施例２：ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣの発現および精製〕
以下の手順により、ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣの発現および精製を行った。
（１）ｐＥＴＤｕｅｔ−１ ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣをＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬに形質転換し、ＬＢ−アンピシリンプレートに播種。
（２）１つのコロニーを２ｍＬのＬＢアンピシリン培地で３７℃一晩培養。
（３）（２）の培養液１ｍＬを５０ｍＬのＬＢアンピシリン培地に添加し、３７℃でＯＤ６００＝０．６になるまで培養。
（４）（３）の培養液５０ｍＬ（全量）を１ＬのＬＢアンピシリン培地に加え、２８℃でＯＤ６００＝０．６になるまで培養。
（５）ＩＰＴＧを終濃度０．４ｍＭになるように加え、２８℃でさらに２時間培養。
（６）大腸菌を集菌し、８０ｍＬのｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ培地（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２−ＭＥ、タンパク質分解酵素阻害剤)に懸濁。
（７）超音波破砕機で大腸菌を破砕。
（８）大腸菌破砕液を１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、上清（大腸菌抽出液）を回収。
（９）大腸菌抽出液に終濃度０．２ｍＭのイミダゾールを添加。
（１０）Ｎｉ−ＮＴＡビーズ １ｍＬを加え、４℃で１時間反応。
（１１）洗浄液１（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２−ＭＥ、３ｍＭ イミダゾール）にて洗浄。
（１２）洗浄液２（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２−ＭＥ、２０ｍＭ イミダゾール）にて洗浄。
（１３）溶出液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２−ＭＥ、２００ｍＭ イミダゾール）にて溶出。
（１４）ＰＤ−１０カラムにて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＤＴＴにバッファー置換して、−８０℃で保存。【００６９】
得られた精製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。結果を図４に示した。図４から明らかなように、ＨＯＩＰ（４７４−１０７２）のバンドとＨＯＩＬ−１Ｌ（１−１９１）のバンドの２本のバンドが現れた。この結果から、ＨＯＩＰ（４７４−１０７２）とＨＯＩＬ−１Ｌ（１−１９１）とが複合体を形成し、ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣとして存在していることが明らかとなった。【００７０】
〔実施例３：ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣによる直鎖状ポリユビキチン形成活性の確認〕
ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ＵｂｃＨ５ｃ（Ｅ２）、ＡＴＰ、ユビキチンの混合溶液に、実施例２で得られたｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣを、４段階の濃度（無添加を含む）で添加し、３７℃でインキュベートしてポリユビキチン生成の有無を電気泳動により確認した。
結果を図５に示した。図５において左のレーンから順に、ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣ無添加、低濃度添加、中濃度添加、高濃度添加の結果である。図５から明らかなように、ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣを添加すると濃度に依存してラダー状のバンドが出現し、ポリユビキチンが形成されていることが示された。この結果から、ｐｅｔｉｔ−ＬＵＢＡＣは直鎖状ポリユビキチン形成活性を有することが明らかとなった。【００７１】
〔実施例４：ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎ発現ベクターの構築〕
共発現用ベクターであるｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＭＣＳ１のＨｉｓ−Ｔａｇの下流にＨＯＩＰ（４７４−１０７２）をコードするＤＮＡ（配列番号６）を挿入し、ＭＣＳ２にＳｈａｒｐｉｎ（１７２−３４６）をコードするＤＮＡ（配列番号１３）を挿入することにより、ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎ発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１ ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎを構築した（図６参照）。このｐＥＴＤｕｅｔ−１ ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎにより、２種類のタンパク質、すなわちＨＯＩＰ（４７４−１０７２）の上流（Ｎ末端側）に「ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＳＱＤＰＮＳＥＮＬＹＦＱ」（配列番号９）が付加されたタンパク質、および、Ｓｈａｒｐｉｎ（１７２−３４６）のＮ末端にメチオニンが付加されたタンパク質が発現される。【００７２】
〔実施例５：ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎの発現および精製〕
以下の手順により、ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎの発現および精製を行った。
（１）ｐＥＴＤｕｅｔ−１ ｐｅｔｉｔ−ＳｈａｒｐｉｎをＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬに形質転換し、ＬＢ−アンピシリンプレートに播種。
（２）１つのコロニーを２ｍＬのＬＢアンピシリン培地で３７℃一晩培養。
（３）（２）の培養液１ｍＬを５０ｍＬのＬＢアンピシリン培地に添加し、３７℃でＯＤ６００＝０．６になるまで培養。
（４）（３）の培養液５０ｍＬ（全量）を１ＬのＬＢアンピシリン培地に加え、２８℃でＯＤ６００＝０．６になるまで培養。
（５）ＩＰＴＧを終濃度０．４ｍＭになるように加え、２８℃でさらに２時間培養。
（６）大腸菌を集菌し、８０ｍＬのｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ培地（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２−ＭＥ、タンパク質分解酵素阻害剤)に懸濁。
（７）超音波破砕機で大腸菌を破砕。
（８）大腸菌破砕液を１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、上清（大腸菌抽出液）を回収。
（９）大腸菌抽出液に終濃度０．２ｍＭのイミダゾールを添加。
（１０）Ｎｉ−ＮＴＡビーズ １ｍＬを加え、４℃で１時間反応。
（１１）洗浄液１（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２−ＭＥ、３ｍＭ イミダゾール）にて洗浄。
（１２）洗浄液２（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２−ＭＥ、２０ｍＭ イミダゾール）にて洗浄。
（１３）溶出液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２−ＭＥ、２００ｍＭ イミダゾール）にて溶出。
（１４）ＰＤ−１０カラムにて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＤＴＴにバッファー置換して、−８０℃で保存。【００７３】
得られた精製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。結果を図７に示した。図７から明らかなように、ＨＯＩＰ（４７４−１０７２）のバンドとＳｈａｒｐｉｎ（１７２−３４６）のバンドの２本のバンドが現れた。この結果から、ＨＯＩＰ（４７４−１０７２）とＳｈａｒｐｉｎ（１７２−３４６）とが複合体を形成し、ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎとして存在していることが明らかとなった。【００７４】
〔実施例６：ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎによる直鎖状ポリユビキチン形成活性の確認〕
ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ＵｂｃＨ５ｃ（Ｅ２）、ＡＴＰ、ユビキチンの混合溶液に、実施例５で得られたｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎを、４段階の濃度（無添加を含む）で添加し、３７℃でインキュベートしてポリユビキチン生成の有無を電気泳動により確認した。
結果を図８に示した。図８において左のレーンから順に、ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎ無添加、低濃度添加、中濃度添加、高濃度添加の結果である。図８から明らかなように、ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎを添加すると濃度に依存してラダー状のバンドが出現し、ポリユビキチンが形成されていることが示された。この結果から、ｐｅｔｉｔ−Ｓｈａｒｐｉｎは直鎖状ポリユビキチン形成活性を有することが明らかとなった。【００７５】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明のユビキチンリガーゼは、ＮＦ−κＢが関与する各種疾病の予防薬または治療薬の有効成分候補物質のスクリーニングに用いることができ、極めて有用である。
【図１（ａ）】
2011016540.tif 000002
【図１（ｂ）】
2011016540.tif 000003
【図１（ｃ）】
2011016540.tif 000004
【図２】
2011016540.tif 000005
【図３】
2011016540.tif 000006
【図４】
2011016540.tif 000007
【図５】
2011016540.tif 000008
【図６】
2011016540.tif 000009
【図７】
2011016540.tif 000010
【図８】
2011016540.tif 000011
【配列表】
2011016540000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月7日(2011.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）と（２）との複合体、または、（ａ）と（１）と（２）との複合体からなるユビキチンリガーゼ。
（ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質
（１）ＨＯＩＬ−１Ｌ、もしくは、ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
（２）Ｓｈａｒｐｉｎ、もしくは、Ｓｈａｒｐｉｎの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
前記（１）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記（２）が、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１に記載のユビキチンリガーゼ。
【請求項５】
前記（ａ）が、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１に記載のユビキチンリガーゼ。
【請求項６】
請求項１、４または５に記載のユビキチンリガーゼの製造に用いられる発現ベクターであって、以下の（Ａ）、（Ｉ）および（ＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（Ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含み、下記（Ｉ）または（ＩＩ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
（Ｉ）ＨＯＩＬ−１Ｌ、もしくは、ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
（ＩＩ）Ｓｈａｒｐｉｎ、もしくは、Ｓｈａｒｐｉｎの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
前記（Ｉ）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質であり、前記（ＩＩ）が、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記（Ａ）が、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酘が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ｉ）または（ＩＩ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記（Ｉ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号６で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号６で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、前記（ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号１３で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記（Ａ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号８で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号８で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ｉ）または（ＩＩ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項６、９〜１２のいずれかに記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項１４】
被験物質を請求項１、４または５に記載のユビキチンリガーゼと接触させる工程と、
前記ユビキチンリガーゼの活性レベルを測定する工程と、
前記活性レベルを、被験物質を接触させないときの活性レベルと比較する工程とを包含することを特徴とする直鎖状ポリユビキチン化阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
以下の（ａ）および（１’）の複合体からなるユビキチンリガーゼ。
（ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質
（１’）ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり、ＵＢＬ領域を含み、ＮＺＦおよびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含まないタンパク質
【請求項１６】
以下の（ａ）および（１’）のタンパク質、（ａ）および（２）のタンパク質、または、（ａ）および（１）および（２）のタンパク質を組み換えタンパク質として細菌に発現させるタンパク質発現工程と、
細菌内または培地中から（ａ）と（１’）との複合体、（ａ）と（２）との複合体、または、（ａ）と（１）と（２）との複合体を精製する複合体精製工程とを包含し、
細菌に発現させる組み換えタンパク質の少なくとも一種にタグ配列が付加されており、当該タグ配列を利用した１段階の精製により複合体を回収することを特徴とするユビキチンリガーゼの製造方法。
（ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質
（１）ＨＯＩＬ−１Ｌ、もしくは、ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
（１’）ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり、ＵＢＬ領域を含み、ＮＺＦおよびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含まないタンパク質
（２）Ｓｈａｒｐｉｎ、もしくは、Ｓｈａｒｐｉｎの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
【請求項１７】
前記（１）または（１’）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記（２）が、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１６に記載のユビキチンリガーゼの製造方法。
【請求項１８】
前記（ａ）が、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１６に記載のユビキチンリガーゼの製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成24年2月20日(2012.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）と（２）との複合体、または、（ａ）と（１）と（２）との複合体からなるユビキチンリガーゼ。
（ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質
（１）ＨＯＩＬ−１Ｌ、もしくは、ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
（２）Ｓｈａｒｐｉｎ、もしくは、Ｓｈａｒｐｉｎの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
【請求項２】
前記（１）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記（２）が、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１に記載のユビキチンリガーゼ。
【請求項３】
前記（ａ）が、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１に記載のユビキチンリガーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のユビキチンリガーゼの製造に用いられる発現ベクターであって、以下の（Ａ）、（Ｉ）および（ＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（Ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含み、下記（Ｉ）および／または（ＩＩ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
（Ｉ）ＨＯＩＬ−１Ｌ、もしくは、ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
（ＩＩ）Ｓｈａｒｐｉｎ、もしくは、Ｓｈａｒｐｉｎの一部からなり、少なくともＵＢＬ領域を含み、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
【請求項５】
前記（Ｉ）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質であり、前記（ＩＩ）が、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記（Ａ）が、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記（Ｉ）および／または（ＩＩ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記（Ｉ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号６で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号６で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、前記（ＩＩ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号１３で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ａ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記（Ａ）をコードするポリヌクレオチドが、配列番号８で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号８で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記（Ｉ）および／または（ＩＩ）と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれかに記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項１０】
被験物質を請求項１〜３のいずれかに記載のユビキチンリガーゼと接触させる工程と、
前記ユビキチンリガーゼの活性レベルを測定する工程と、
前記活性レベルを、被験物質を接触させないときの活性レベルと比較する工程とを包含することを特徴とする直鎖状ポリユビキチン化阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）および（１’）の複合体からなるユビキチンリガーゼ。
（ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質
（１’）ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり、ＵＢＬ領域を含み、ＮＺＦおよびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含まないタンパク質
【請求項１２】
以下の（ａ）および（１’）のタンパク質、（ａ）および（２）のタンパク質、または、（ａ）および（１）および（２）のタンパク質を組み換えタンパク質として細菌に発現させるタンパク質発現工程と、
細菌内または培地中から（ａ）と（１’）との複合体、（ａ）と（２）との複合体、または、（ａ）と（１）と（２）との複合体を精製する複合体精製工程とを包含し、
細菌に発現させる組み換えタンパク質の少なくとも一種にタグ配列が付加されており、当該タグ配列を利用した１段階の精製により複合体を回収することを特徴とするユビキチンリガーゼの製造方法。
（ａ）ＨＯＩＰの一部からなり、少なくともＵＢＡ領域およびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含むタンパク質
（１）ＨＯＩＬ−１Ｌ、もしくは、ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
（１’）ＨＯＩＬ−１Ｌの一部からなり、ＵＢＬ領域を含み、ＮＺＦおよびＲＩＮＧ−ＩＢＲ−ＲＩＮＧ領域を含まないタンパク質
（２）Ｓｈａｒｐｉｎ、もしくは、Ｓｈａｒｐｉｎの一部からなり少なくともＵＢＬ領域を含むタンパク質
【請求項１３】
前記（１）または（１’）が、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号５で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記（２）が、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１２に記載のユビキチンリガーゼの製造方法。
【請求項１４】
前記（ａ）が、配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号７で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１２に記載のユビキチンリガーゼの製造方法。
【国際調査報告】
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