(57)【要約】  哺乳動物染色体ＤＮＡのユビキチンＣ遺伝子のプロモーターの上流領域1.3kb以上に相当するＤＮＡ断片および所望のタンパク質をコードするDNA断片を含む、発現ベクターを構築し、または該発現ベクターを含む動物細胞を培地に培養し、得られた培養物から所望のタンパク質を採取することによりタンパク質を生産する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物染色体ＤＮＡのユビキチンＣ遺伝子（以下、UbCと略す）のプロモーターの上流領域1.3kb以上に相当するＤＮＡ断片および所望のタンパク質をコードするDNA断片を含む、発現ベクター。
【請求項２】
ヒト人工染色体（HAC）ベクターである、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
UbCのプロモーターより上流約4kbに相当するＤＮＡ断片を含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項４】
UbCのプロモーターより上流約15kbに相当するＤＮＡ断片を含む、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項５】
請求項１記載の発現ベクターを含む動物細胞。
【請求項６】
動物細胞がヒト細胞である、請求項５記載の細胞。
【請求項７】
ヒト細胞が体細胞由来である、請求項６記載の細胞。
【請求項８】
動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５記載の細胞。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の動物細胞を培地に培養し、得られた培養物から所望のタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な発現ベクター、該ベクターを有する動物細胞及び該動物細胞を用いたタンパク質の効率的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ヒト細胞、特にプライマリー細胞やＥＳ細胞において、外来遺伝子の発現や外来遺伝子の導入により異種タンパク質の生産をする際には、メチル化などのエピジェネテイック修飾やヘテロクロマチン化などの宿主染色体の構造変化により、導入した外来遺伝子が不活化又は発現抑制をうけることが知られている。このことは、外来遺伝子の発現効率低下や異種タンパク質の生産性低下の一因となっている。【０００３】
導入した外来遺伝子の不活化又は発現抑制の回避法として、特定機能をもつゲノム配列を用いる方法が知られている。例えば、トリグロビン遺伝子非コード領域に存在するcHS4インスレーターは、宿主ゲノムのヘテロクロマチン化抑制又はサイレンサー効果の遮断により、外来遺伝子の発現抑制を回避することができる（非特許文献１）。
また、一般にゲノム上の遺伝子コード領域の5’上流または3’下流などの非コード領域には、その遺伝子を発現制御するエレメント配列が存在する場合が知られている。【０００４】
ヒトユビキチンC（UbC）遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子の一つであり、線維芽細胞などをはじめとする体細胞で広く発現が認められる。その発現プロモーターは、UbC遺伝子開始コドンから5’末側に約1.3kbの領域であることが知られており、動物細胞における外来遺伝子発現に広く利用されている（特許文献１）。
一方、UbC遺伝子の発現プロモーターより上流のゲノム配列について、外来遺伝子の高発現への関与の報告はこれまでなく、明らかでない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第1998/32869号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature Reviews Genetics 7, 703-713 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
効率的に外来遺伝子を発現させるためのベクター、該ベクターを含有する動物細胞及び該動物細胞を用いた効率的な外来遺伝子発現システムまたは外来タンパク質の製造法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の（１）〜（９）に関する。
（１）哺乳動物染色体ＤＮＡのユビキチンＣ遺伝子（以下、UbCと略す）のプロモーターの上流領域1.3kb以上に相当するＤＮＡ断片および所望のタンパク質をコードするDNA断片を含む、発現ベクター。
（２）ヒト人工染色体（HAC）ベクターである、（１）記載の発現ベクター。
（３）UbCのプロモーターより上流約4kbに相当するＤＮＡ断片を含む、（１）記載の発現ベクター。
（４）UbCのプロモーターより上流約15kbに相当するＤＮＡ断片を含む、（１）記載の発現ベクター。
（５）（１）記載の発現ベクターを含む動物細胞。
（６）動物細胞がヒト細胞である、（５）記載の細胞。
（７）ヒト細胞が体細胞由来である、（６）記載の細胞。
（８）動物細胞がＣＨＯ細胞である、（５）記載の細胞。
（９）（５）〜（８）のいずれかに記載の動物細胞を培地に培養し、得られた培養物から所望のタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の生産方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、効率的な外来遺伝子発現用ベクター、該ベクターを含有する動物細胞を取得し、該動物細胞を用いて効率的な外来遺伝子の発現や外来タンパク質の製造を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、pLN1EPO-Fベクター（WO2008/013067）からpUEWbベクターを構築する過程を示す。図中、「ＣＭＶ」はＣＭＶプロモーターを、「h epo」はヒトエリスロポエチン遺伝子を、「WPRE」はthe posttranscriptional regulatory element of woodchuck hepatitis virusを、「BGH pA」はウシ成長ホルモン遺伝子ポリＡ付加シグナル配列を「UbCP」はユビキチンＣ遺伝子のプロモーターを示す。
【図２】図２は、pUEWベクターからpULEWbベクターを構築する過程を示す。図中、「UL15」は、ユビキチン遺伝子のプロモーターの上流約15kbに相当するＤＮＡ断片を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．本発明の発現ベクター
（１）哺乳動物染色体DNA上のユビキチンC遺伝子のプロモーターの上流1.3kb以上の領域に相当するDNA断片
哺乳動物染色体DNA上のユビキチンC遺伝子（以下、UbCと称す）のプロモーターとは、米国生物工学情報センター（NCBI; National Center for Biotechnology Information）のGenBankなどの塩基配列データベースにおいて検索される哺乳動物染色体DNA中、UbCの発現プロモーターとしてアノテーションが付されている領域、または哺乳動物染色体DNA上のユビキチンCをコードする領域より上流約1.3kbの領域をいう。
【００１２】
本発明において哺乳動物染色体DNA上のUbC遺伝子のプロモーター上流の領域とは、哺乳動物染色体DNA上で、上記の哺乳動物染色体DNA上のUbCの発現プロモーターのさらに上流の領域をいう。
本発明において哺乳動物染色体DNA上のUbCのプロモーターの上流1.3kb以上の領域に相当するDNA断片とは、哺乳動物染色体DNA上のUbCのプロモーターの上流1.3kb以上の領域の塩基配列と同一の塩基配列を有するDNA断片、または哺乳動物染色体DNA上のUbCのプロモーターの上流1.3kb以上の領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNA断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA断片をいう。
【００１３】
上記においてストリンジェントな条件下とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％ SDS／50〜65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
【００１４】
哺乳動物染色体DNA上のUbCのプロモーターの上流1.3kb以上の領域に相当するDNA断片はまた、配列番号１で表される塩基配列のうち、塩基番号１〜１３００番に相当するヒト染色体DNA上のUbCプロモーター上流1.3kbの領域の塩基配列と好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とすることができる。
【００１５】
哺乳動物染色体DNAのUbCのプロモーターの上流領域1.3kb以上に相当するDNA断片とは、上記の哺乳動物染色体DNA上のUbCプロモーターの上流1.3kb以上、好ましくは4kb以上、より好ましくは15kb以上の領域に相当するDNA断片をいう。
哺乳動物染色体DNAとしては、ユビキチンC遺伝子を有する哺乳動物の染色体DNAであればいかなる哺乳動物の染色体DNAであってもよい。
【００１６】
哺乳動物染色体DNA上のUbCプロモーターの上流領域のDNA断片の塩基配列は、例えばNCBI GenBank、European Bioinformatics Institute（EBI）の提供するEMBL Nucleotide Sequence Database、国立遺伝学研究所の提供するDNA Data Bank of Japan(DDBJ)などの塩基配列のデータベースから検索し、取得することができる。
上記のようにして取得される哺乳動物染色体ＤＮＡ上のＵｂＣプロモーターの上流領域のＤＮＡ断片の塩基配列情報をもとに、哺乳動物染色体DNA上のUbCプロモーターの上流領域1.3kb以上に相当するＤＮＡ断片を取得することができる。
例えば上記のようにして取得される哺乳動物染色体ＤＮＡ上のＵｂＣプロモーターの上流領域のＤＮＡ断片の塩基配列に基づき設計することができるプローブを用い、哺乳動物の染色体DNAライブラリーもしくはcDNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、または上記のようにして取得される哺乳動物染色体ＤＮＡ上のＵｂＣプロモーターの上流領域のＤＮＡ断片の塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた哺乳動物染色体DNAを鋳型としたPCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
【００１７】
取得したDNAをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]あるいはABI3700DNAアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。
【００１８】
更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより所望のDNAを調製することもできる。
（２）哺乳動物染色体DNAのUbCのプロモーター上流領域1.3kb以上に相当するDNA断片および所望のタンパク質をコードするDNA断片を含む発現ベクター
上記の哺乳動物染色体DNA上のUbCプロモーター上流領域1.3kb以上に相当するDNA断片をおよび所望のタンパク質をコードするDNA断片を、所望の発現ベクターに挿入することにより、本発明の発現ベクターを取得することができる。
【００１９】
発現ベクターとしては、挿入した所望のタンパク質の発現のための適当な位置にプロモーターを有し、動物細胞中においてタンパク質を発現することができるものであればいずれも用いることができ、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社製）、pAGE107 ［特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8［Nature, 329, 840 (1987)］、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社製）、pcDNA3.1（インビトロジェン社製）、pREP4（インビトロジェン社製）、pAGE103［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、pAGE210、pME18SFL3、またはpKANTEX93（WO97/10354）、またはpPAC4  (BACPAC resources center, Children’s Hospital Oakland Research Institute)、またはレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、などがあげられる。
【００２０】
また、本発明においては発現ベクターとして、ヒト人工染色体（Human Artificial Chromosome; HAC）ベクター（WO2004/031385、Biochem. Biophys. Res. Commun., 321, 280-290 (2004)、WO/2008/013067）を最適に用いることができる。
ヒト人工染色体ベクターとしては、ヒト21番染色体を利用した21HAC(WO2004/031385)、ヒト14番染色体を利用した14HAC(WO2008/013067)などがあげられる。
【００２１】
各DNA断片の発現ベクターへの挿入は、それぞれのDNA断片や発現ベクターに応じて公知の方法（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999）により行うことができる。
特に、発現ベクターとしてヒト人工染色体ベクターを用いる場合には、ヒト人工染色体ベクターに挿入しようとするDNA断片を全て有するプラスミドベクターを公知の方法（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999）により作成した後、WO2008/013067に記載の方法によりヒト人工染色体ベクターに挿入することができる。
【００２２】
ヒト人工染色体上へDNA断片を挿入する方法としては、loxP配列のほか、変異型のlox配列やFRT配列、attL1、attL2、attR1、attR2、attP配列などを利用し、それぞれのＤＮＡ配列を特異的に認識する部位特異的組み換え酵素を用いてヒト人工染色体上の所望の位置へ、ＤＮＡ断片を挿入する方法があげられる。
DNAが挿入されたクローンの選択法として、WO2008/013067に記載のneo耐性遺伝子を5’及び3’領域に分割して、ヒト人工染色体ベクターと挿入するDNA断片とにそれぞれ配置してＤＮＡが挿入されたクローンを選択する方法、neo耐性遺伝子のかわりにHPRT遺伝子を同様に分割配置して使用する方法などがあげられる（特開2007-295860）。
【００２３】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のImmediate-Early（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、レンチウイルスのプロモーター、アデノウイルスのプロモーター、アデノ随伴ウイルスのプロモーター、センダイウイルスのプロモーター、単純ヘルペスウイルスのプロモーター、ヒトエロンゲーション因子１α遺伝子プロモーター、コラーゲン遺伝子プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、またはモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーターあるいはエンハンサーがあげられる。
【００２４】
また、本発明の発現ベクターにおいて、UbCのプロモーターを用いてもよい。
さらに、本発明の発現ベクターにおいては、上記のプロモーターのほかに、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーなどの遺伝子発現調節に関わる領域を有していてもよい。
２．本発明の発現ベクターを含む動物細胞
上記の外来遺伝子発現用ベクターを、宿主細胞である動物細胞に導入することにより、本発明の発現ベクターを含む動物細胞（以下、単に本発明の動物細胞と略記する）を取得することができる。
【００２５】
宿主細胞としては、ヒト白血病細胞Namalwa細胞、HEK293細胞、サル細胞COS細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞CHO細胞（Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 , 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900);）、CHO/DG44、CHO-K1（ATCC CCL-61）、DukXB11 （ATCC CCL-9096）、Pro-5（ATCC CCL-1781）、CHO-S（Life Technologies, Cat No. 11619）、Pro-3、ラットミエローマ細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20（またはYB2/0ともいう）、マウスミエローマ細胞NSO、マウスミエローマ細胞SP2/0-Ag14、シリアンハムスター細胞BHKまたはHBT5637（特開昭63-000299）、などがあげられる。
【００２６】
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、またはリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などがあげられる。また、発現ベクターにヒト人工染色体ベクターを用いた場合には、宿主細胞への導入方法としてはミクロセル法（特開平11-313576号）を用いることができる。
３．本発明の生産方法
本発明の動物細胞を培地に培養し、培養物中に所望のタンパク質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該タンパク質を生産することができる。
【００２７】
本発明の動物細胞を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した動物細胞を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
誘導性プロモーターの例としては、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーターをあげることができる。
【００２８】
本発明の動物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)］、EagleのMEM培地［Science, 122, 501 (1952)］、ダルベッコ改変MEM培地［Virology, 8, 396 (1959)］、199培地［Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)］、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium（IMDM）培地、F12培地、またはこれら培地に牛胎児血清（FBS）などを添加した培地などがあげられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
【００２９】
本発明のタンパク質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるタンパク質の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
タンパク質が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)］、ロウらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288 (1990)］、特開平０５−３３６９６３、またはＷＯ９４／２３０２１などに記載の方法を用いることにより、所望のタンパク質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【００３０】
また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（特開平２−２２７０７５）を利用してタンパク質の生産量を上昇させることもできる。
得られた所望のタンパク質は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
所望のタンパク質が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、またはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００３１】
所望のタンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該タンパク質の不溶体を回収する。回収した該タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該タンパク質を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【００３２】
所望のタンパク質またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該タンパク質またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【実施例１】
【００３３】
ヒト正常繊維芽細胞におけるエリスロポエチンの発現
エリスロポエチン（以下EPOと略す）をコードする遺伝子の上流にUbCプロモーターを挿入した構造を有する14HACベクターを以下の手順で作製した。
ｐLN1EPO-Fベクター（WO2008/013067）のEPO遺伝子の5’側のCMVプロモーターをUbCプロモーターに、SV40ポリＡ配列をBGHポリＡ配列へ置換したUbC-EPO-BGHpA_Revを作製した（以下、pUEbベクターと称す）。【００３４】
pUEbベクターをWO2008/013067に記載の方法によりCHO細胞中のヒト人工染色体14AΔqHACベクターへ挿入した。
得られたpUEbベクターが挿入された14AΔqHACベクターを、ミクロセル法を用いてプライマリーのヒト正常線維芽細胞HFL-1細胞（理化学研究所細胞バンクより入手）に導入した。当該細胞を培地に培養し、細胞内のEPO発現量およびブラストサイジン耐性遺伝子の発現量ならびにHFL-1細胞に由来する内在性UbC遺伝子の発現量をRT-PCR法により解析した。【００３５】
その結果、EPO発現及びブラストサイジン耐性遺伝子の発現は、内在性UbC遺伝子発現と比べて低く、EPOの発現は内在性UbCの発現に比べて顕著に抑制されていた。
【実施例２】
【００３６】
UbCゲノム配列を付加したエリスロポエチン発現ベクターの構築
配列番号１で表される塩基配列からなる、上記のヒトUbC遺伝子プロモーター5’上流のゲノム配列約15kbに相当するＤＮＡ断片（以下UL15と称す)をヒト染色体BACクローンRP11-592O2（GenBank Accession No. AC126309）からクローニングし、以下の発現ベクターを構築した。【００３７】
UL15とUbCプロモーター支配下にEPOをコードするＤＮＡ断片、WPRE配列（the posttranscriptional regulatory element of woodchuck hepatitis virus、Donello et al., Journal of Virology, 1998, 72; p.5085-5092）、BGHポリA配列(Rottman, F. M., 1992, J.Biol. Chem. 267; 16330-16334.)を配置した発現ベクターを作製した(pLN1UbClongEPO/WPRE/BGHpA、以下pULEWbベクターと称す)。発現ベクターの構成について概略を図１および図２に示す。【００３８】
ｐLN1EPO-Fベクター（WO2008/013067）のEPO遺伝子の5’側のCMVプロモーターをUbCプロモーターに置換し、EPO遺伝子3’側に配列番号２で表される塩基配列からなるWPRE配列を挿入して、pLN1UbCEPO/WPREを作製した（以下pUEWベクターと称す)。
更にpUEWベクターのSV40ポリＡ配列をBGHポリＡ配列へ置換して、pLN1UbCEPO/WPRE/BGHpAを作製した（以下pUEWbベクターと称す)。【００３９】
pUEWベクターをNot I及びFse Iで消化しUL15を挿入した後、Not IからSal Iサイト間のEPO遺伝子を含むＤＮＡ断片をpUEWbベクターのNot IからSal Iサイト間と置換してpULEWbベクターを作製した。
また、pLN1EPO-FベクターのEPO遺伝子の5’側のCMVプロモーターをUbCプロモーターに、SV40ポリＡ配列をBGHポリＡ配列へ置換したUbC-EPO-BGHpA_Revを作製した（以下、pUEbベクターと称す）。【００４０】
また、UbC遺伝子5’上流のゲノム配列約4kb、約1.3kbとUbCプロモーター支配下にEPO遺伝子、WPRE配列、BGHポリA配列を配置した発現ベクターを以下の手順で作製した(以下それぞれpUL4Ewbベクター, pUL1.3Ewbベクターと称す)。
まずpUL4Ewbベクターは、pULEWbベクターをPci I及びPml Iで消化しUbC遺伝子5’上流のゲノム配列約4kbを含むDNA断片を精製後、平滑末端化しセルフライゲーションして作製した。【００４１】
次にpUL1.3Ewbベクターは、pULEWbベクターをPci I及びEco RIで消化しUbC遺伝子5’上流のゲノム配列約1.3kbを含むDNA断片を精製後、平滑末端化しセルフライゲーションして作製した。
【実施例３】
【００４２】
UbCゲノム配列を付加したEPO発現14HACのヒト正常線維芽細胞でのEPO発現
特許文献WO2008/013067に記載の方法に従い、実施例２で作製したpULEWbベクター及びpUEbベクターをCHO細胞クローン12t97sF1-5中の14AΔqF-HACベクターへ挿入した。得られたHACベクターをそれぞれULEWb−HAC、UEb-HACと命名した。
上記HACベクターをミクロセル法によりCHO細胞からヒト正常線維芽細胞HFL-1(理化学研究所細胞バンクより入手)へ移入した。【００４３】
PCR及びサザン解析で上記のHACベクター構造を確認したブラストサイジン耐性クローン；ULEWb-HAC移入3株（ULEW1H1, ULEW3H2, ULEW3H8）及びUEb-HAC移入6株（UbC2-13、UbC11-7、UbC11-8、UbC11-10、UbC11-18、UbC11-19）をコラーゲンI型でコートした24穴細胞培養ディッシュ（FALCON社製）上でコンフレント到達後も更に6日間培養し、PBSにて3回洗浄後新たな培地1ml添加して24時間培養後に培養上清を回収した。培養上清中のEPO発現量は、ELISA法で定量した。その結果を表１に示す。【００４４】
【表１】
2011071147.tif 000002
【００４５】
表１に示す通り、UbCゲノム配列を付加したULEWb-HACは、UbCプロモーターのみのUEb-HACと比べて48倍のEPOを産生できた。また、CMVプロモーター支配下にEPO遺伝子とSV40ポリA配列を配置し同様に作製したHAC（CMV-HAC）移入クローン3株（t5H26, 27, 28、WO2008/013067）の場合と比べて890倍向上することができた。
【実施例４】
【００４６】
UbCゲノム配列を付加したEPO発現14HACのCHO細胞でのEPO発現１
実施例３で作製したULEWb-HAC、UEWｂ-HAC及びUEｂ-HACを保持するCHO細胞を、12穴プレートで培養し、フルコンフレント到達後から更に2日間培養し、PBSにて3回洗浄後新たな培地1ml添加して24時間培養後に培養上清を回収し細胞数を計測した。EPO発現量はELISA法（Quantikine IVD, Huiman Epo Immunoassay, R&D systems社）で定量した。その結果を表２に示す。【００４７】
【表２】
2011071147.tif 000003
【００４８】
表２に示す通り、ULEWｂ−HACは、UEWｂ−HACと比べて4.5倍の、UEｂ−HACと比べて8.5倍のEPOを産生できた。また、UEWｂ−HACは、UEｂ−HACと比べて1.9倍のEPOを産生できた。
【実施例５】
【００４９】
UbCゲノム配列を付加したEPO発現14HACのCHO細胞でのEPO発現２
pUL4EWb、pUL1.3EWb発現ベクターをCHO細胞中で14NΔｑHACベクターへ挿入した(UL4EWb-HAC, UL1.3EWb−HAC)。方法は、上記発現ベクターとCre発現ベクターpBS185（ライフテックオリエンタル社製）とともに14NΔｑHACベクターを保持するCHO細胞クローンG4S39-13へ特許文献WO2008/013067に従いエレクトロポレーション法で行った。パルス後、48穴プレート（FALCON）5枚へ播種し、48−72時間後に0.8 mg/ml G418と10% FBSを含むF12培地で培養し、薬剤耐性コロニーを取得した。PCR、サザンブロット解析により、HAC構造がインタクトなクローンをpUL4EWb導入シリーズから７株（以下、UL4EWb-HAC）、pUL1.3EWb導入シリーズから７株（以下、UL1.3EWB-HAC）を選定した。【００５０】
上記UL4EWb-HAC及びUL1.3EWb-HACを保持するCHOクローンを12穴プレートで培養し、フルコンフレント到達後から更に2日間培養し、PBSにて3回洗浄後新たな培地1ml添加して24時間培養後に培養上清を回収し細胞数を計測した。EPO発現量はELISA法で定量した（表３）。その結果、培養上清中へUbCプロモーターのみのUEWb-HACと比べてUL4EWb-HACでは2.5倍のEPOを産生できた。一方、UL1.3EWb-HACでは1.2倍のEPOを産生できた。【００５１】
【表３】
2011071147.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により、動物細胞における効率的なタンパク質の生産を行うことができる。
【図１】
2011071147.tif 000005
【図２】
2011071147.tif 000006
【配列表】
2011071147000001.app
【国際調査報告】
2011071147.tif 000007
2011071147.tif 000008
2011071147.tif 000009
2011071147.tif 000010