(57)【要約】  脳虚血時に発生する血液脳関門の脆弱化を抑制し、血液脳関門を保護することのできる物質が望まれている。  本発明は、プロサイモシンαまたはこれと同等の機能を有するタンパク質もしくはペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、血液脳関門障害改善剤を提供する。脳虚血により生じうる血液脳関門の脆弱化を改善することにより、本発明の剤は血液脳関門障害に起因する疾患の治療剤となり得る。
2011019023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロサイモシンα由来のポリペプチドまたはこれと実質的に同等の機能を有するポリペプチドを有効成分として含有してなる、血液脳関門障害改善剤。
【請求項２】
プロサイモシンα由来のポリペプチドが、配列番号４〜６のいずれかから選択されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
プロサイモシンα由来のポリペプチドまたはこれと実質的に同等の機能を有するポリペプチドを有効成分として含有してなる、血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤。
【請求項４】
プロサイモシンα由来のポリペプチドが、配列番号４〜６のいずれかから選択されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、請求項３に記載の剤。
【請求項５】
血液脳関門障害を伴う疾患が、アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害、一過性血流障害、高血圧性脳障害、頭蓋内外の動脈の塞栓症、血栓症に起因する梗塞、動脈瘤、動静脈奇形、脳動脈狭窄性病変、硬膜動静脈瘻、血管外傷、血管性腫瘍、ウィルス感染性脳炎、あるいは脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫または出血疾患である、請求項３または４に記載の剤。
【請求項６】
プロサイモシンα由来のポリペプチドまたはこれと実質的に同等の機能を有するポリペプチド、ならびに血栓溶解成分を有効成分として含有する、脳虚血性疾患用治療剤。
【請求項７】
プロサイモシンα由来のポリペプチドが、配列番号４〜６のいずれかから選択されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、請求項６に記載の治療剤。
【請求項８】
血栓溶解成分が、プラスミノーゲンアクチベータである、請求項６または７に記載の治療剤。
【請求項９】
脳虚血性疾患が、脳梗塞である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項１０】
配列番号４〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１１】
血液脳関門障害改善剤の製造のための、プロサイモシンα由来のポリペプチドまたはこれと実質的に同等の機能を有するポリペプチドの使用。
【請求項１２】
プロサイモシンα由来のポリペプチドが、配列番号４〜６のいずれかから選択されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロサイモシンα由来のポリペプチドなどを有効成分として含有する血液脳関門障害改善剤、血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト脳では数百億個もの神経細胞が複雑なネットワークを構成しているが、数少ない神経幹細胞からの神経新生機構を考慮に入れないならば、基本的にはその細胞数は、生後ただ減少するばかりである。百数十年といわれる長い寿命の期間、様々な外来性、内因性のストレスに対して脳は様々な保護機構を駆使し、生存を維持している。脳自身のもつ保護機構には神経−グリアや神経−神経間に存在するコミュニティーが相互に影響しあってその高度な役割を維持すべく働いている。最もよく知られた神経保護メカニズムは神経栄養因子やサイトカインなどの分子によって機能されているものである。こうした神経栄養因子は様々なストレス条件下に見られるプログラム神経細胞死（アポトーシス）を抑制する働きを有するものとして知られている。もう一つのメカニズムは神経新生であり、最近の報告では脳虚血ストレス下に神経新生が亢進するとの報告はなされているが、大量に細胞死に陥る神経を補うには十分ではないことが予想される。【０００３】
脳虚血時には虚血中心部コアの部分で破壊的な細胞死であるネクローシスが観察されるが、この細胞死は細胞内容物を外部に放散するため、本来ならば細胞傷害作用は更に周囲に拡散するはずである。ところが数日の後には周囲のペナンブラと呼ばれる領域では、細胞の断片化や凝縮、ミクログリアなどによる貪食といったアポトーシスに特有の現象が観察される。このようなペナンブラにみられるアポトーシスは、傷害部位を限局させることにより脳全体の傷害を防止する一種の保護機構として機能するものであると考えられる（非特許文献１参照）。発明者は、上述した脳虚血時にみられるネクローシスからアポトーシスへの細胞死形態の変換が、プロサイモシンαが引き起こすものであることを初めて見出した（非特許文献２参照）。【０００４】
ところで脳卒中は日本人の死亡率第３位、寝たきりの病因で第１位の重要疾患であり、脳虚血が原因で生じる疾患である。脳卒中は予後を改善する意味で急性期治療が重要であるといわれている。現在注目されている主な治療方法はプラスミノーゲンアクチベータ（以下、「ｔＰＡ」と記載する）をはじめとした血栓溶解剤であるが、その使用は３時間以内に限られ、その恩恵をうけることができる患者は十数パーセント程度にすぎない（非特許文献３参照）。これは脳卒中後の時間経過と共に血液脳関門が脆弱になるためであり、ｔＰＡなどの血栓溶解剤の使用により出血性脳卒中の危険性が増すからである。しかしながら、血栓溶解剤と共に用いることができるような、血液脳関門の脆弱化から血液脳関門を保護する作用を有する物質は未だ見出されていない。【０００５】
発明者は近年、プロサイモシンαが神経細胞死保護作用を有する物質であり、この神経細胞死抑制効果によって脳卒中障害を軽減することができる物質であることを初めて見出した（特許文献１参照）。また発明者らはプロサイモシンαがマウス、ラットにおいて脳卒中および虚血性緑内障を抑制する効果を有することも見出した（非特許文献４〜６参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開２００４／０６４８６１号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】植田弘師，濱邉和歌子，日薬理誌，１１９，７９−８８（２００２）
【非特許文献２】Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏ，Ｍａｒｃｈ  ２００８，ｐｐ．８３−８９
【非特許文献３】最新医療：医療：医療と介護：読売新聞オンライン  ２００５年１０月２５日付記事、「脳梗塞に新薬  ｔＰＡ」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｏｍｉｕｒｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｉｒｙｏｕ／ｍｅｄｉ／ｓａｉｓｉｎ／２００５１０２５ｉｋ１４．ｈｔｍ
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），１７６，８５３−８６２
【非特許文献５】Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００７），１４，１８３９−１８４２
【非特許文献６】Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００９），１６，３４９−３５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
脳虚血により生じうる血液脳関門の脆弱化を抑制し、血液脳関門を保護することのできる物質が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、プロサイモシンαが、従来知られていた神経細胞死保護作用とは別に、脳虚血により生ずる血液脳関門脆弱性を著明に抑制する機能を有することを見出した。プロサイモシンαは虚血時に脳内に移行することが確認されていること、神経細胞死を抑制することに由来する神経保護物質として機能することなどを考慮した上で、発明者は鋭意検討し、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち本発明は、
［１］プロサイモシンα由来のポリペプチドまたはこれと実質的に同等の機能を有するポリペプチドを有効成分として含有してなる、血液脳関門障害改善剤；
［２］プロサイモシンα由来のポリペプチドが、配列番号４〜６のいずれかから選択されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、［１］に記載の剤；
［３］プロサイモシンα由来のポリペプチドまたはこれと実質的に同等の機能を有するポリペプチドを有効成分として含有してなる、血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤；
［４］プロサイモシンα由来のポリペプチドが、配列番号４〜６のいずれかから選択されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、［３］に記載の剤；
［５］血液脳関門障害を伴う疾患が、アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害、一過性血流障害、高血圧性脳障害、頭蓋内外の動脈の塞栓症、血栓症に起因する梗塞、動脈瘤、動静脈奇形、脳動脈狭窄性病変、硬膜動静脈瘻、血管外傷、血管性腫瘍、ウィルス感染性脳炎、あるいは脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫または出血疾患である、［３］または［４］に記載の剤；
［６］プロサイモシンα由来のポリペプチドまたはこれと実質的に同等の機能を有するポリペプチド、ならびに血栓溶解成分を有効成分として含有する、脳虚血性疾患用治療剤；
［７］プロサイモシンα由来のポリペプチドが、配列番号４〜６のいずれかから選択されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、［６］に記載の治療剤；
［８］血栓溶解成分が、プラスミノーゲンアクチベータである、［６］または［７］に記載の治療剤；
［９］脳虚血性疾患が、脳梗塞である、［６］〜［８］のいずれか一に記載の治療剤；
［１０］配列番号４〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
［１１］血液脳関門障害改善剤の製造のための、プロサイモシンα由来のポリペプチドまたはこれと実質的に同等の機能を有するポリペプチドの使用；
［１２］プロサイモシンα由来のポリペプチドが、配列番号４〜６のいずれかから選択されるアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含む、［１１］に記載の使用；などに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の血液脳関門障害改善剤は、脳虚血により生じうる血液脳関門の脆弱化を改善することができる。従って、本発明の剤は血液脳関門障害に起因する疾患の治療剤となり得る。【００１２】
本発明の血液脳関門障害改善剤は、血液脳関門障害を伴う疾患、すなわちアテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害、一過性血流障害、高血圧性脳障害、頭蓋内外の動脈の塞栓症、血栓症に起因する梗塞、動脈瘤、動静脈奇形、脳動脈狭窄性病変、硬膜動静脈瘻、血管外傷、血管性腫瘍、ウィルス感染性脳炎、ならびに脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫または出血疾患における予防、ならびにこれらの治療に有用である。【００１３】
脳虚血により血液脳関門が脆弱化した場合であって、従来では血栓溶解剤を適用できないと判断されるような場合であっても、血栓溶解剤に本発明の剤を併用することによって、血栓溶解剤による脳出血などの副作用を心配することなく脳虚血性疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】図１−１は、ヒト、ラット、マウスなどの生物から実際に得られたプロサイモシンαのアミノ酸配列を示す図である（図１−１のアミノ酸配列の右端と図１−２のアミノ酸配列の左端がつながり、図１−２のアミノ酸配列の右端と図１−３のアミノ酸配列の左端がつながる）。
【図１−２】図１−２は、ヒト、ラット、マウスなどの生物から実際に得られたプロサイモシンαのアミノ酸配列を示す図である（図１−１のアミノ酸配列の右端と図１−２のアミノ酸配列の左端がつながり、図１−２のアミノ酸配列の右端と図１−３のアミノ酸配列の左端がつながる）。
【図１−３】図１−３は、ヒト、ラット、マウスなどの生物から実際に得られたプロサイモシンαのアミノ酸配列を示す図である（図１−１のアミノ酸配列の右端と図１−２のアミノ酸配列の左端がつながり、図１−２のアミノ酸配列の右端と図１−３のアミノ酸配列の左端がつながる）。
【図２】図２は、ヒト、ラット、及びマウス由来のプロサイモシンαのアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図３は、プロサイモシンαの血液脳関門障害に対する抑制効果を示す図である。Ｃｏｎｔｒａは梗塞なし（虚血反対側）を、ｉｐｓｉは梗塞あり（虚血同側）を示す。Ｖｅｈはｖｅｈｉｃｌｅを、ＰｒｏＴαはプロサイモシンαを示す。スケールバーは１００μｍ（２０倍対物レンズ）である。
【図４】図４は、プロサイモシンαの活性部位を探索する目的で、プロサイモシンα由来のポリペプチドの皮質ニューロンに対する生存活性を調べた図である。図中、例えばΔ１−２９は、１１２アミノ酸残基のラットプロサイモシンαのうち１番目から２９番目のアミノ酸を欠失させたポリペプチドを示す。
【図５】図５は、皮質ニューロンに対する生存活性を指標として、ラットプロサイモシンαの４９番目のアミノ酸から７８番目のアミノ酸からなるポリペプチド（ＰｒｏＴα３０）に対してアラニンスキャニングした結果を示す図である。
【図６】図６は、ＰｒｏＴα３０の血液脳関門障害に対する抑制効果を示す図である。Ｃｏｒｔｅｘは大脳皮質を、Ｓｔｒｉａｔｕｍは線条体を示す。スケールバーは１００μｍ（２０倍対物レンズ）である。
【図７】図７は、左中大脳動脈を梗塞して一過的に脳虚血を生じせしめたＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスに対し、ＰｒｏＴα３０を脳室内投与した場合の生存率や運動障害を評価した結果を示す図である。左中大脳動脈梗塞に続く運動障害は次に示す１〜５の臨床スコアで表される。１：右前肢を完全に伸長することができない、２：右方向への旋回行動、３：体勢を保てず右方向に傾く、４：自発運動の消失、５：死
【図８】図８は、左中大脳動脈を梗塞して一過的に脳虚血を生じせしめたＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスに対し、ＰｒｏＴα３０を脳室内投与した場合の梗塞領域体積を評価した結果を示す図である。
【図９】図９は、左中大脳動脈を梗塞して一過的に脳虚血を生じせしめたＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスに対し、ＰｒｏＴα３０の投与量を変えて尾静脈内投与した場合の梗塞領域体積や運動機能を評価した結果を示す図である。ＤＨＡ−ＰｒｏＴα３０はドコサヘキサエン酸をＮ末端修飾したＰｒｏＴα３０を示す。臨床スコアは、図７と同様である。＊は、有意差を示す。
【図１０】図１０は、左中大脳動脈を梗塞して永久的に脳虚血を生じせしめたＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスに対し、ＰｒｏＴα３０を複数回尾静脈内投与した場合の梗塞領域体積を評価した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、左中大脳動脈を梗塞して永久的に脳虚血を生じせしめたＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスに対し、ＰｒｏＴαを尾静脈内投与した場合の、梗塞領域体積、生存率や運動障害を評価した結果を示す図である。臨床スコアは、図７と同様である。ｐＭＣＡＯは、永久脳虚血群を示す。Ｓｈａｍは、シャム手術対照群を示す。＊は、有意差（Ｐ＜０．０５，ｖｓ．Ｖｅｈｉｃｌｅ）を示し、＃は、有意差（Ｐ＜０．０５，ｖｓ．Ｓｈａｍ）を示す。
【図１２】図１２は、左中大脳動脈を梗塞して永久的に脳虚血を生じせしめたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに対し、ＰｒｏＴαを尾静脈内投与した場合の、梗塞領域体積、生存率や運動障害を評価した結果を示す図である。臨床スコアは、図７と同様である。ｐＭＣＡＯは、永久脳虚血群を示す。Ｓｈａｍは、シャム手術対照群を示す。＊は、有意差（Ｐ＜０．０５，ｖｓ．Ｓｈａｍ）を示し、＃は、有意差（Ｐ＜０．０５，ｖｓ．ｐＭＣＡＯ−Ｖｅｈｉｃｌｅ）を示す。
【図１３】図１３は、左中大脳動脈を梗塞して一過的に脳虚血を生じせしめたＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスに対し、ラットプロサイモシンαの５２番目のアミノ酸ないし６０番目のアミノ酸からなるポリペプチド（ＰｒｏＴα９）を尾静脈内投与した場合の梗塞領域体積を、他のポリペプチドを投与した場合と比較した結果を示す図である。ＤＨＡ−ＰｒｏＴα３０はドコサヘキサエン酸をＮ末端修飾したＰｒｏＴα３０を示す。Ｃ−ｔｅｒｍは、ＰｒｏＴαのＣ末端を示す。
【図１４】図１４は、ＰｒｏＴα９の血液脳関門障害の抑制効果を示す図である。Ａは微小血管のトマトレクチン染色を示し、Ｂは、Ａで示される微小血管長の平均値を棒グラフにしたものである。ｔＭＣＡＯは一過的脳虚血群を示す。＊は、有意差（Ｐ＜０．０５，ｖｓ．ｔＭＣＡＯ無しＣｏｎｔｒｏｌ）を示し、＃は、有意差（Ｐ＜０．０５，ｖｓ．ｔＭＣＡＯ  Ｖｅｈ）を示す。Ａにおけるスケールバーは１００μｍ（２０倍対物レンズ）である。
【図１５】図１５は、光誘発性中大脳動脈血栓（ＰＩＴ）モデルマウスに対し、ＰｒｏＴα９等を尾静脈内投与した場合の、梗塞領域体積、臨床スコアを評価した結果を示す図である。臨床スコアは、図７と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
プロサイモシンα（以下、「ＰｒｏＴα」と記載する場合がある）は既知のタンパク質であり、従来、神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能を有することが知られていた。しかしながら本発明は、ＰｒｏＴαの作用として別途の機能である、「脳虚血性の血液脳関門脆弱化を顕著に抑制し、血液脳関門障害を改善する機能」を発見したことに基づき完成したものである。
ＰｒｏＴαの「脳虚血性の血液脳関門脆弱化を抑制する機能」、「血液脳関門障害の改善機能」は、本発明者によって初めて見出されたものである。
【００１６】
血液脳関門とは、血液と脳の組織液との間の物質交換を制御する機構である。血液脳関門による物質交換の制御機構は、アミノ酸やグルコースをはじめとする神経活動のエネルギー源となる必須内因性物質を脳内に取り込むとともに、脳内の毒物や不要な異物などを血中に排出するといった積極的なメカニズムに支えられている。当該メカニズムは脳毛細血管内皮細胞に発現している多くのトランスポーター輸送系によってコントロールされ得る。また血液脳関門を解剖学的に見ると、血液脳関門を構成する脳毛細血管内皮細胞はタイトジャンクションを形成し、細胞間隙の透過性を制限していることがわかる。すなわち血液脳関門の存在により、中枢神経系の生化学的恒常性が高度に維持されている。したがって血液脳関門に異常を生じた場合、脳血管と脳内の選択的な物質透過性に異常が生じ、これらの異常が結果的に中枢神経系に影響を及ぼすこととなる。
【００１７】
また脳梗塞時には、梗塞部位だけでなく血液脳関門にも虚血症状が生じる。虚血症状が生じた部分の血管は急激に弱くなるので、血液流が再開された場合、血液脳関門から出血する可能性が極めて高い。したがって脳梗塞治療に有用である血栓溶解剤は、梗塞後６時間（好ましくは３時間）以内に病態が確認できた場合でしか使用できない点で、ほとんどが適用外となってしまう。本発明で用いられるＰｒｏＴαはこのような状況でも血栓溶解剤を適用できるよう、血液脳関門の脆弱性を改善する目的で用いられるものである。
【００１８】
本発明における「血液脳関門障害」とは、血液脳関門に何らかの異常を生ずることをいう。このような異常としては、血液脳関門における物質の選択的透過性の異常、脳毛細血管内皮細胞のタイトジャンクションの崩壊（細胞間隙の広がり）、脳毛細血管内皮細胞の減少およびそれに伴う発熱、脳浮腫などの脳炎症状に加えて、記憶・学習、食欲、睡眠障害や情動性疼痛などのありとあらゆる高次脳機能障害、および血圧、呼吸、消化器症状を伴う自律神経疾患などが挙げられる。本発明の血液脳関門障害改善剤は、このような血液脳関門の異常を改善し、血液脳関門の機能を回復させるものである。
血液脳関門の異常は、具体的には、例えば大脳皮質知覚領域における毛細血管の数量や長さによって確認することができる。すなわち、大脳皮質知覚領域における毛細血管が少なければ、脳梗塞に伴い血液脳関門の異常が発生していると判断することができるし、大脳皮質知覚領域における毛細血管が適量であれば、血液脳関門の異常は無いものと判断することができる。毛細血管の長さや量は自体公知の方法によって判別することができるが、そのような方法としては、「生体の科学；５５（３）巻、２６６−２７２頁（森川俊一、江崎太一著）、２００４年」に記載のレクチン（例、トマトレクチン）による血管内皮細胞の染色が挙げられる。
【００１９】
以上の知見から、プロサイモシンαは、血液脳関門障害改善剤として利用することができる。血液脳関門障害改善剤に使用するプロサイモシンαは特に限定されず、ヒト由来のプロサイモシンα、ラット由来のプロサイモシンα、マウス由来のプロサイモシンαなどいずれの動物種のものも使用することができる。これらの動物種の組織から実際に得られたプロサイモシンαのアミノ酸配列について比較したものを図１−１〜図１−３に示す。なお、図１−１のアミノ酸配列の右端と図１−２のアミノ酸配列の左端がつながり、図１−２のアミノ酸配列の右端と図１−３のアミノ酸配列の左端がつながる。
【００２０】
また、これらのプロサイモシンαの中から特に３種類のプロサイモシンαのアミノ酸配列を配列番号１（ヒト由来）、配列番号２（マウス由来）、配列番号３（ラット由来）とし、更にこれらの配列を整列して比較したものを図２に示す。ヒト、ラット、マウス以外の動物種由来のプロサイモシンαとしては、ウシ由来のプロサイモシンα、カエル由来のプロサイモシンαなども使用することができる。これらのプロサイモシンαのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等にそれぞれＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＴＮＢＯＡ１、ＣＡＣ３９３９７として登録されている。
【００２１】
プロサイモシンαの代わりに、プロサイモシンα由来のポリペプチド、またはこれと実質的に同等の機能を有するポリペプチドを使用することもできる。ここで「プロサイモシンα由来のポリペプチド」、または「これと実質的に同等の機能を有するポリペプチド」は、プロサイモシンαが有する機能、例えば血液脳関門障害を保護、改善する機能（例、ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など）、神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例、ネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能など）を持つポリペプチドである。
【００２２】
「プロサイモシンα由来のポリペプチド」としては、ポリペプチドが上記プロサイモシンα全長のアミノ酸配列の一部または全部と同一のアミノ酸配列を有し、かつプロサイモシンαが有する機能、例えば血液脳関門障害を保護、改善する機能（例、ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など）、神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例、ネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能など）などを持つ限り特に限定されない。
このようなポリペプチドとしては、例えば、配列番号１のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、配列番号３のアミノ酸配列で表されるポリペプチド（図２参照）、またはこれらのポリペプチドを含むポリペプチドが挙げられる。
【００２３】
一方でこれらのポリペプチドは、創薬シーズへの適応目的でより短小化されることが望ましい。ポリペプチドの長さ（短小化の程度）としては上記プロサイモシンαが有する機能を保持し、創薬シーズとして適用可能である限り特に限定されないが、好適には３０アミノ酸以下のポリペプチドが挙げられ、具体的には、例えば配列番号４のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、配列番号５のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、配列番号６のアミノ酸配列で表されるポリペプチドおよび／またはこれらのポリペプチドを含むポリペプチドが挙げられる。
これらのポリペプチドも、後述する本発明の血液脳関門改善剤、血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤、脳虚血性疾患用治療剤の有効成分として好ましく用いることができる。
【００２４】
なお配列番号４のアミノ酸配列で表されるポリペプチドは、ラットプロサイモシンαの４９番目のアミノ酸から７８番目のアミノ酸からなるポリペプチド（本明細書中、「ＰｒｏＴα３０」と記載する場合がある）である。ＰｒｏＴα３０は、後述する実施例２で示されるように、プロサイモシンαの活性本体としての機能を有するポリペプチドである。
さらに配列番号６のアミノ酸配列で表されるポリペプチドは、ラットプロサイモシンαの５２番目のアミノ酸から６０番目のアミノ酸からなるポリペプチド（本明細書中、「ＰｒｏＴα９」と記載する場合がある）である。ＰｒｏＴα９は、後述する実施例３で示されるようにＰｒｏＴα３０の中でもよりプロサイモシンαの活性に重要な部分である。
これらのポリペプチド、またはこれらのポリペプチドを含むポリペプチドは、血液脳関門障害を保護、改善する機能（例、ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など）、神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例、ネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能など）などを有し、後述する本発明の血液脳関門改善剤、血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤、脳虚血性疾患用治療剤の有効成分として好ましく用いることができる。
【００２５】
「プロサイモシンα由来のポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチド」としては、上記「プロサイモシンα由来のポリペプチド」と同様のプロサイモシンαが有する機能、例えば血液脳関門障害を保護、改善する機能（例、ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など）、神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例、ネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能など）などを持ち、かつ「プロサイモシンα由来のポリペプチド」のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、付加、置換若しくは転位したポリペプチドが挙げられる。
ここで、欠失、付加、置換若しくは転位するアミノ酸の個数は、プロサイモシンαと同様の機能を有する限り特に限定されないが、通常は、２０個以内であり、好ましくは１０個以内であり、特に好ましくは５個以内であり、最も好ましくは３個以内である。
また、図１−１〜図１−３中の配列番号４に対応するアミノ酸配列（図１−１〜図１−３において、「ラット活性本体」のアミノ酸配列と同じ列に位置するアミノ酸配列）で表されるペプチドは、この「プロサイモシンα由来のポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチド」に含まれる。
【００２６】
これらのポリペプチドは、自体公知のペプチド合成法によって製造することが可能である。またアミノ酸の欠失、付加、置換若しくは転位についても、自体公知の方法により行うことが可能である。
【００２７】
さらに、これらのポリペプチドは、上記「プロサイモシンα由来のポリペプチド」と同様のプロサイモシンαが有する機能、例えば血液脳関門障害を保護、改善する機能（例、ＧＬＵＴ４の細胞膜表在化促進作用など）、神経細胞死からの保護機能・神経細胞死抑制機能（例、ネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能など）などを持つ限り、ペプチド修飾されていてもよい。
ペプチドの修飾としては、例えばリン酸化（例、Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｈ２）、Ｔｈｒ（ＰＯ３Ｈ２）、Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）など）、硫酸化（例、Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）など）、アミノ基の修飾（例、アセチル化、スクシニル化、ビオチニル化、Ｚ化、Ｄｎｐ化、Ｄｎｓ化、ミリストイル化など）、チオール基の修飾（例、ファルネシル化、ゲラニル化など）、糖による修飾（例、Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＧａｌＮＡｃ）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｓｅｒ（Ｘｙｌ）、Ｔｈｒ（Ｍａｎ）含有ペプチドなど）、ペプチド結合の修飾（例、還元型、スタチン型など）、蛍光標識（例、ＦＩＴＣ化、Ｄｎｓ化、Ｎｍａ化など）、その他の標識（例、ビオチン標識など）、脂肪酸による修飾（例、ＤＨＡ修飾など）などが挙げられる。
【００２８】
本発明の血液脳関門障害改善剤は、「プロサイモシンα由来のポリペプチド」、または「プロサイモシンα由来のポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチド」を有効成分として含有してなるので、脳虚血により生じる血液脳関門の脆弱性を保護し、血液脳関門障害を改善することができる。従って本発明の血液脳関門障害改善剤は、それが有する神経保護作用によって血液脳関門を保護すると共に、脳血管障害により脆弱化した血液脳関門をも改善することができるので、脳虚血性の疾患全般、特に血液脳関門障害を伴う疾患の予防または治療に有用である。
【００２９】
本発明における「血液脳関門障害を伴う疾患」とは、血液脳関門に異常を生ずることが知られている疾患全般（例えば血液脳関門のタイトジャンクション構造が物理的に脆弱になる疾患、血液脳関門における物質輸送が異常を来す疾患など）や、血液脳関門に異常を生ずることに起因する疾患などが挙げられる。このような疾患は、多くが脳虚血を伴う疾患であり、具体的には、アテローム性動脈硬化または高血圧による二次性の血管障害、一過性血流障害、高血圧性脳障害、頭蓋内外の動脈の塞栓症、血栓症に起因する梗塞、動脈瘤、動静脈奇形、脳動脈狭窄性病変、硬膜動静脈瘻、血管外傷、血管性腫瘍、ウィルス感染性脳炎、あるいは脳梗塞後の脆弱性血管新生による浮腫または出血疾患などのほか、脳卒中、外傷性脳障害、緑内障、糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性障害などが挙げられる。なお、ここでいう「治療」には、疾患を完治させる場合のみならず、病状を軽減させる場合や病状の悪化を阻止する場合なども含まれる。
【００３０】
本発明の「血液脳関門障害改善剤」および「血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤」は、「プロサイモシンα由来のポリペプチド」または「プロサイモシンα由来のポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチド」、あるいはこれらの両方のポリペプチドを、公知の方法に従い薬学的に許容される担体あるいは希釈剤と混合することにより製剤化される。適切な薬学的に許容される担体あるいは希釈剤としては特に限定されず自体公知の担体あるいは希釈剤を適用することが可能であるが、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等に記載されたものが挙げられる。
【００３１】
本発明の「血液脳関門障害改善剤」および「血液脳関門障害を伴う疾患の治療剤」の投与に関して、投与剤型は特に限定されることなく自体公知の投与剤型を適用可能であるが、公知の脳血管障害の治療用医薬と同様に、血管投与用、脳室内投与用の注射剤として調製されることが好ましい。より具体的に言えば、「プロサイモシンα由来のポリペプチド」または「プロサイモシンα由来のポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチド」を、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤とする。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護剤として添加して調製することが可能である。また、リボソーム等の封入体にポリペプチドを包埋させて投与することも可能である。
【００３２】
「プロサイモシンα由来のポリペプチド」または「プロサイモシンα由来のポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチド」を上述した疾患の治療に用いるとき、有効成分としてのその用量は特に限定されず、対象の年齢、体重、病状、および投与経路、その他の要素により異なるが、投薬する医師などが容易に適宜決定することができる。例えば脳卒中治療のために脳室内投与する場合には、１日量約０．０１２ｍｇ〜１．２ｍｇの投与であり、緑内障治療のために硝子体内投与する場合には、１回量約０．００１２ｍｇ〜０．０１２ｍｇの投与である。
【００３３】
「プロサイモシンα由来のポリペプチド」または「プロサイモシンα由来のポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチド」の投与方法は特に限定されず、現在実際に行われている様々な投与方法を採用することができる。このような投与方法の一例として、大槽内投与を挙げることができる。大槽内投与は、脳実質を傷つけないという点で有利である。また非経口投与（例えば、血管内投与（例、静脈内投与）、脳室内投与など）、経口投与などにより投与してもよい。
【００３４】
また、本発明の血液脳関門障害改善剤は、血栓溶解剤と併用することで、血栓溶解剤の適用範囲を広げることができる。
一般に血栓溶解剤は、脳梗塞急性期であって、血液脳関門をはじめとした従来の血管構造が保たれている発症後３時間以内の患者に適用が限定されており、ＣＴやＭＲＩで頭蓋内出血がない事を確認した上で用いることが求められている。これは、血液脳関門は脳虚血により脆弱化するので、発症初期の血液脳関門の構造が比較的維持されている状態でないと血栓溶解剤の効果により出血などの副作用が生じる危険性が高まるためである。
そこで本発明の血液脳関門障害改善剤を用いることにより、血液脳関門の構造が維持され、血栓溶解剤の副作用として考えられる脆弱血管からの出血の心配がなくなるので、血栓溶解剤の使用に際し本発明の剤を併用することにより、発症時期に左右されること無く血栓溶解剤を用いることができる。これにより効果的に脳虚血性疾患を治療できるようになる。
【００３５】
従って、本発明は「プロサイモシンα由来のポリペプチド」または「プロサイモシンα由来のポリペプチドと実質的に同等の機能を有するポリペプチド」、ならびに血栓溶解成分を有効成分として含有する、脳虚血性疾患用治療剤を提供する。
【００３６】
本発明で用いられる血栓溶解剤（血栓溶解成分）としては、具体的にはｔＰＡ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ナットウキナーゼ、プロウロキナーゼ、スタフィロキナーゼ、デスモテプラーゼ、ＡＰＳＡＣなど、あるいはこれらの血栓溶解成分に由来するポリペプチドが挙げられる。好ましくはｔＰＡである。ここで「これらの血栓溶解成分に由来するポリペプチド」とは、上記血栓溶解成分が有する活性をそれぞれ有し、かつ各血栓由来成分（蛋白質）全長のアミノ酸配列の一部または全部と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。
【００３７】
ｔＰＡは、市販されているものを用いてもよいし、また自体公知の方法で合成したものを用いてもよい。
【００３８】
本発明の血液脳関門障害改善剤および脳虚血性疾患用治療剤は、他の脳血管障害治療剤と併用して用いることができる。他の脳血管障害治療剤としては脳血管障害を治療することができる限り特に限定されないが、上記血栓溶解剤の他に、例えばラジカルスカベンジャー（エダラボン）が挙げられる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。【００４０】
［実施例１］  プロサイモシンαの血液脳関門障害に対する抑制効果
Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウス（雄性、体重２１−２６ｇ）の左中大脳動脈を梗塞して作成した脳虚血モデルマウスを０．５あるいは１時間維持し、次いで再灌流した。再灌流の１時間後にｖｅｈｉｃｌｅまたはＰｒｏＴα（０．１ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与（ｉ．ｖ．）し、さらに再灌流２４時間後にペントバルビタール５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与することにより全身麻酔を施し、処置マウスを３７℃に保温したベッドの上に静置し、ＰＢＳに溶解した１ｍｇ／ｍＬのビオチン化トマトレクチン（ＳＩＧＭＡ、Ｌｏｔ番号０４８Ｋ３７８６）１００μＬを２〜３分かけてゆっくりと静脈内投与した。５分後パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により全身を灌流固定し、脳を取り出し、室温にてさらに３時間４％ＰＦＡ処置した。その後２５％蔗糖液に入れ４℃で一晩なじませた。脳はＯＣＴコンパウンドにより凍結包埋し、大脳皮質知覚領Ｓ１（ＣＳ１）やＳ２（ＣＳ２）を含む面で５０μｍの厚さの切片を作製し、シランコーティングされたスライドガラス上で貼付し、一晩ヒーター上で乾燥させた。その後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８でラベルされたストレプトアビジン（２％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ液にて３００倍希釈）を用いてトマトレクチンの蛍光染色を行い、その後蛍光退色防止剤であるＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（日本ターナー株式会社）で固定し、一晩暗所静置し、後に共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ５  ＰＡＳＣＡＬ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で観察した。蛍光シグナルはデコンボリューション法により、およそ３０μｍの範囲の蛍光全量を積算解析した。
０．５時間の中大脳動脈虚血（ＭＣＡＯ）後再灌流し、その１時間後のＣＳ２領域のトマトレクチン染色は、虚血反対側では大凡３０μｍ長のシグナルとして観察された（スケールバーは１００μｍ、２０倍対物レンズ）。これに対し、虚血同側ではそのシグナルは断片としてのみ観察され、脳血管破綻として評価できた。１時間のＭＣＡＯ再灌流でもその蛍光シグナルはほぼ同等であったが、血管障害を示す脳領域の拡大として時間依存性が観察された（図３Ａ）。
マウスリコンビナントＰｒｏＴα（０．１ｍｇ／ｋｇ）を虚血後１時間に投与したマウスでは、虚血側のＣＳ２と線条体における脳血管破壊はほぼ完全に消失した（図３Ｂ）。【００４１】
［実施例２］  プロサイモシンαの活性本体の探索
ラットプロサイモシンαの配列（図４Ａ）を参照し、図４Ｂに示すようなラットプロサイモシンαの欠失変異体を作成した。次いでＵｅｄａ等の方法（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７６，ｐｐ．８５３−８６２，２００７）を適用して、皮質ニューロンの生存率を指標にプロサイモシンαの活性本体の探索を行った。
１７日胚のラット大脳皮質から得た２ｘ１０４細胞／ｃｍ２の神経細胞初代培養を無血清条件下で開始した。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを融合した、ラットプロサイモシンαの各欠失変異体(ＧＳＴ−ＰｒｏＴαフラグメント)を１００ｎＭとして培養初期からそれぞれ添加し、５％ＣＯ２インキュベーター（３７℃）内で１２時間培養を継続したのち、ＷＳＴ−８による生存活性を評価した。
その結果、４９番目のアラニンから７８番目のアスパラギン酸の３０アミノ酸からなるポリペプチド（以下、「ＰｒｏＴα３０」と記載する場合がある）が、プロサイモシンαの活性本体であることが確認できた。結果を図４Ｃに示す。【００４２】
［実施例３］  ＰｒｏＴα３０のアラニンスキャニング
実施例１で得られたプロサイモシンα活性本体の各アミノ酸残基（３０個）について、Ｎ末端から順に各アミノ酸残基をアラニンに置換した変異ペプチドを作成した。次いでＵｅｄａ等の方法（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７６，ｐｐ．８５３−８６２，２００７）を適用して、皮質ニューロンの生存率を指標に活性本体のＰｒｏＴα３０のどの領域が活性発現に関連しているかを評価した。
その結果、ＰｒｏＴα３０の中でも５２−６０に相当するＥＶＤＥＥＥＥＥＧ（配列番号６）の配列がその活性発現において重要な配列であることが分かった。結果を図５に示す。【００４３】
［実施例４］  ＰｒｏＴα３０の血液脳関門障害に対する抑制効果  
実施例１に示したものと同様の実験をＰｒｏＴαと活性本体のＰｒｏＴα３０を用いて行い、その効果を比較解析した。結果を図６に示す。
その結果、ＰｒｏＴα３０は、ＰｒｏＴαと同様に脳血管破綻を抑制するものとして評価できた。したがって、ＰｒｏＴα３０も血液脳関門障害の抑制効果を有することが観察された。
一方で有効性に関し、ＰｒｏＴα３０はＰｒｏＴαより強力な血液脳関門障害の抑制効果を有するという結論は必ずしも得られなかったが、脳移行の可能性、経済性、誘導体化の可能性などの点において有望なサイズであることが明らかとなった。またＰｒｏＴα３０も脳虚血急性期に生じうる神経細胞死を抑制する機能（ネクローシス抑制機能）を有することが明らかとなった。【００４４】
［実施例５］  一過性脳虚血モデルマウスに対するＰｒｏＴα３０の効果（１）
Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの左中大脳動脈を梗塞して作成した脳虚血モデルマウスを１時間維持し、次いで再灌流した。再灌流の１時間後にｖｅｈｉｃｌｅまたはＰｒｏＴα３０（１０μｇ）を脳室内投与（ｉ.ｃ.ｖ.）して２４時間毎にマウスの経過を観察して運動機能とともに生存率を評価した。また、左中大脳動脈梗塞に続く運動障害を表す臨床スコアは、１：右前肢を完全に伸長することができない、２：右方向への旋回行動、３：体勢を保てず右方向に傾く、４：自発運動の消失、５：死、に対応して評価した。
その結果、虚血再灌流１時間後にＰｒｏＴα３０（１０μｇ）を脳室内投与したマウス（ｎ＝４）では、非投与群（ｎ＝４）において虚血再灌流の５日後には完全致死に至る生存率が、２週間後でも８０％程度までに改善した（図７Ａ）。また運動機能評価においては、虚血再灌流の３日後に自発運動の消失に至るものが、ＰｒｏＴα３０（１０μｇ）脳室内投与により多少の片麻痺は残るものの、有意に改善することが明らかとなった（図７Ｂ）。
一方、虚血再灌流の１時間後にＰｒｏＴα３０（０μｇ（Ｖｅｈ）、０．１μｇあるいは１０μｇ）を脳室内投与し、同２４時間後に取り出した全脳を、ＰＢＳに溶解した２％ＴＴＣ（２，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）染色液で処置し、ＰＢＳ洗浄後、ブレグマから厚さ１ｍｍの冠状断面切片を、前２ｍｍ及び後３ｍｍで５枚作製した。ＴＴＣ染色はミトコンドリアの還元反応に基づく細胞生存活性の指標で、障害されていない領域が赤く染色され、障害領域は染色されない。この実験によりＰｒｏＴα３０の投与により脳梗塞が改善されるかを調べた。脳梗塞領域は以下の式に従って評価した。虚血側においてＴＴＣ染色（赤色）されない部分は白く抜けるが、その部分は同側の梗塞領域とみなす。同側全体積とは正中線から分割し虚血側の梗塞、非梗塞全領域を指し、反対側全体積とは非虚血側の全領域を指す。【００４５】
【数１】
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【００４６】
その結果、溶媒のみの試料では４８％梗塞が観察され（ｎ＝７）、０．１μｇＰｒｏＴα３０では４４％（ｎ＝２）、１０μｇＰｒｏＴα３０では３８％（ｎ＝２）と用量依存的に梗塞を抑制した（図８Ａおよび図８Ｂ）。【００４７】
［実施例６］  一過性脳虚血モデルマウスに対するＰｒｏＴα３０の効果（２）
実施例５と同様の処置を行い、再灌流の１時間後にｖｅｈｉｃｌｅ、ＰｒｏＴα３０または脳移行性向上を目的としてドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）をＮ末端修飾したＰｒｏＴα３０（以下、「ＤＨＡ−ＰｒｏＴα３０」と記載する）をそれぞれ１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。結果を図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃに示す。
その結果、溶媒による対照実験では４８％梗塞が認められたが（ｎ＝７）、再灌流後１時間にＰｒｏＴα３０を０．２７５（ｎ＝３）および１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）で一回投与した場合は、それぞれ３９％および１３％梗塞にまで用量依存的に抑制した。しかしＤＨＡ−ＰｒｏＴα３０を０．３（ｎ＝２）および１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）投与した場合は、当初期待した梗塞領域抑制効果は認められなかった（図９Ａ、図９Ｂ）。
一方、臨床スコアの解析においては、３程度の片麻痺（ｎ＝１１）はＰｒｏＴα３０の０．２７５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．、ｎ＝４）投与では効果が観察されないが、ＰｒｏＴα３０の１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．、ｎ＝３）投与では有意に改善した（図９Ｃ）。同様な改善効果はＤＨＡ−ＰｒｏＴα３０を１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．、ｎ＝３）投与した場合に観察されたが、０．３ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．、ｎ＝４）では観察されなかった。ＤＨＡ誘導化ペプチドが梗塞領域に対して有意な効果を持たなかったことは、この誘導化によるＰｒｏＴαに対する未知の障害作用が存在することを示唆している。【００４８】
［実施例７］  永久脳虚血モデルに対するＰｒｏＴα３０の複数回投与の効果
Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの中大脳動脈を梗塞して作成した永久脳虚血モデルマウスに対し、再灌流することなく虚血開始から２時間後、４時間後にＰｒｏＴα３０を静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。次いで２４時間後、上記方法と同様の方法で、梗塞領域体積を測定した。結果を図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。
その結果、溶媒による対照実験では６０％梗塞が認められたが（ｎ＝３）、梗塞後２時間にＰｒｏＴα３０を１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）で１回投与（ｎ＝２）した場合、２時間と４時間の２回投与（ｎ＝１）した場合はそれぞれ、３４％および２７％梗塞にまで抑制した。しかしＤＨＡ−ＰｒｏＴα３０を１ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．、ｎ＝２）で１回投与した場合では、当初期待した梗塞領域抑制効果は認められなかった（図１０Ａ、Ｂ）。【００４９】
［実施例８］  永久脳虚血モデルマウスに対するＰｒｏＴαの効果
Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの中大脳動脈を梗塞して作成した永久脳虚血モデルマウスに対し、再灌流することなく虚血開始から２、７、あるいは１２時間後に、１００μｇ／ｋｇでＰｒｏＴαを尾静脈内投与した。次に上記方法と同様の方法で、梗塞領域体積を測定した。その結果、永久脳虚血モデルマウスにおいても短時間であれば梗塞領域抑制効果が認められた（図１１Ａ）。また同じマウスで運動機能を評価した。運動機能障害を表す臨床スコアは、実施例５と同様の方法で評価した。その結果、永久脳虚血モデルマウスにおいても短時間であれば運動機能が改善することがわかった（図１１Ｃ）。
一方、虚血開始から２および４時間後にｖｅｈｉｃｌｅまたはＰｒｏＴα（１００μｇ）を尾静脈内投与（ｉ．ｖ.）し、２４時間毎にマウスの経過を観察して運動機能とともに生存率を評価した。その結果、ＰｒｏＴα（１００μｇ）を尾静脈内投与（ｉ．ｖ．）したマウス（ｎ＝５）では、非投与群（ｎ＝５）において虚血５日後には完全致死に至る生存率が、約２週間後でも６０％程度までに改善した（図１１Ｄ）。また運動機能評価においては、虚血１日後に自発運動の消失または死に至るものが、ＰｒｏＴαを投与することにより多少の片麻痺は残るものの、有意に改善することが明らかとなった（図１１Ｂ）。【００５０】
［実施例９］  永久脳虚血モデルラットに対するＰｒｏＴαの効果
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの中大脳動脈を梗塞して作成した永久脳虚血モデルラットに対し、再灌流することなく虚血開始から４時間後にＰｒｏＴαを尾静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。次いで２４時間後、上記方法と同様の方法で、梗塞領域体積を測定した。結果を図１２Ａおよび図１２Ｂに示す。
その結果、溶媒による対照実験では４０％梗塞が認められたが（ｎ＝５）、梗塞後４時間にＰｒｏＴαを１００μｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）で投与（ｎ＝５）した場合は、２５％梗塞にまで抑制した。（図１２Ａ、Ｂ）。
さらに２４時間毎にラットの経過を観察して運動機能とともに生存率を評価した。その結果、ＰｒｏＴα（１００μｇ）を尾静脈内投与したラット（ｎ＝５）では、非投与群（ｎ＝５）において虚血後１日で５０％に至ってしまう生存率が、約２週間後でも７５％程度までに改善した（図１２Ｄ）。また運動機能評価においては、虚血再灌流の２日後に自発運動の消失または死に至るものが、ＰｒｏＴαの投与により多少の片麻痺は残るものの、有意に改善することが明らかとなった（図１２Ｃ）。【００５１】
［実施例１０］  一過性脳虚血モデルマウスに対する、ＰｒｏＴα９の効果
実施例５と同様の梗塞領域体積の測定を、一過性脳虚血モデルマウスに対し０．３ｍｇ／ｋｇの尾静脈内投与（ｉ．ｖ．）によるＰｒｏＴα９、活性本体のＰｒｏＴα３０、ＤＨＡ−ＰｒｏＴα３０などを投与した場合についてそれぞれ行い、各ポリペプチドの効果を比較解析した。結果を図１３に示す。
その結果、ＰｒｏＴα９は、ＰｒｏＴα３０と同様に一過性の脳虚血に対する脳梗塞領域の抑制効果を有することが観察された。【００５２】
［実施例１１］  ＰｒｏＴα９の血液脳関門障害に対する抑制効果
Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの左中大脳動脈を梗塞して作成した脳虚血モデルマウスを１時間維持し、次いで再灌流した。再灌流の１時間後にｖｅｈｉｃｌｅ、ＰｒｏＴα（１００μｇ／ｋｇ）、ＰｒｏＴα３０（１ｍｇ／ｋｇ）、ＰｒｏＴα９（０．３ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ−ｔｅｒｍ（アミノ酸配列ＴＫＫＱＫＫＴＤＥＤＤ；０．３ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ尾静脈内投与（ｉ．ｖ．）した。さらに実施例１記載の方法と同様の方法によりトマトレクチンの蛍光染色を行い、微小血管の解析を行った。結果を図１４に示す。
１時間の中大脳動脈虚血（ＭＣＡＯ）後再灌流した場合の大脳皮質知覚領域のトマトレクチン染色は、虚血反対側（Ｃｏｎｔｒａ）では大凡３０μｍ長のシグナルとして観察された。これに対し、虚血同側（ｉｐｓｉ）では、ＶｅｈｉｃｌｅまたはＣ−ｔｅｒｍを投与した場合のシグナルは断片としてのみ観察され、脳血管破綻として評価できた（図１４Ａ）。
一方、ＰｒｏＴα、ＰｒｏＴα３０（Ｐ３０）、ＰｒｏＴα９（Ｐ９）を投与した場合においては、虚血同側において虚血反対側よりも長いシグナルを示した（図１４Ｂ）。すなわちＰｒｏＴα９は、ＰｒｏＴα３０と同様に脳血管破綻を抑制効果を有するものとして評価できた。したがって、ＰｒｏＴα９も血液脳関門障害の抑制効果を有することが観察された。
一方で有効性に関し、ＰｒｏＴα９はＰｒｏＴαやＰｒｏＴα３０より強力な血液脳関門障害の抑制効果を有するという結論は必ずしも得られなかったが、脳移行の可能性、経済性、誘導体化の可能性などの点において有望なサイズであることが明らかとなった。【００５３】
［実施例１２］  光誘発性中大脳動脈血栓（ＰＩＴ）モデルマウスに対する、ＰｒｏＴα９の効果
Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの左中大脳動脈を硬膜下に露出し、光増感性色素であるローズベンガルを３０ｍｇ／ｋｇ尾静脈内投与したのち一定波長の緑色光を１０分間中大脳動脈に照射することで血栓を作成させ、この血栓による梗塞を引き起こした。光照射の１時間後にｖｅｈｉｃｌｅ、ＰｒｏＴα（１００μｇ／ｋｇ）、ＰｒｏＴα３０（１ｍｇ／ｋｇ）、ＰｒｏＴα９（０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈内投与した。次に虚血２４時間後、上記方法と同様の方法で梗塞領域体積を測定し、運動機能を評価した。結果を図１５に示す。
溶媒による対照実験では４８％梗塞が認められたが（ｎ＝１７）、梗塞後１時間にＰｒｏＴαを１００μｇ／ｋｇで投与（ｎ＝６）した場合は、２３％梗塞にまで抑制し、ＰｒｏＴα３０を１ｍｇ／ｋｇ投与（ｎ＝４）した場合にも３０％梗塞にまで抑制し、ＰｒｏＴα９（各用量ｎ＝２）を投与した場合、用量依存的に梗塞傷害領域が減少し、１ｍｇ／ｋｇ投与において３０％梗塞にまで抑制した（図１５Ａ、Ｂ）。また運動機能評価においては、虚血２４時間後には体勢が保てず傾くか自発運動が消失するものが、ＰｒｏＴα、ＰｒｏＴα３０またはＰｒｏＴα９の投与により有意に改善することが明らかとなった（図１５Ｃ）。【００５４】
本明細書中で述べられた全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の血液脳関門障害改善剤は、脳虚血により生じうる血液脳関門の脆弱化を改善することができる。従って、本発明の剤は血液脳関門障害に起因する疾患の治療剤となり得る。
本願は、日本で出願された特願２００９−１８５８１６（出願日：２００９年８月１０日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号４は、共通するアミノ酸配列である。
配列番号６は、共通するアミノ酸配列である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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