(57)【要約】  本発明は、ｍｉＲＮＡを用いた小細胞肺癌の予後診断方法、小細胞肺癌治療方法、小細胞肺癌予後改善方法、小細胞肺癌治療剤及び小細胞肺癌治療薬のスクリーニング方法を提供する。具体的には本発明は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はｍｉＲ−２１６ａを指標とした小細胞肺癌患者の予後の診断方法、それらを指標とした小細胞肺癌予後改善方法、それらをターゲットとした小細胞肺癌治療方法及び小細胞肺癌治療剤、それらを使用した小細胞肺癌の治療剤のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量を測定する、小細胞肺癌患者における予後を判定するための検査方法。
【請求項２】
上記方法において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量が、対照生体試料における発現量より増加している場合に予後が不良であると判定するための、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記方法において、ｍｉＲ−２０３又はその前駆体の発現量が、対照生体試料における発現量より減少している場合に予後が不良であると判定するための、請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記方法において、ｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量が、予後が良好である小細胞肺癌患者由来の生体試料における発現量より減少している場合に予後が不良であると判定するための、請求項１記載の方法。
【請求項５】
小細胞肺癌を治療する方法であって、
（１）小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が対照生体試料と比較して減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、その前駆体、又はそれらを発現するベクターを投与すること；又は／及び、
（２）小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が対照生体試料と比較して増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体の機能を阻害する少なくとも１種の化合物を投与すること；
を含む、小細胞肺癌を治療する方法。
【請求項６】
小細胞肺癌の予後を改善する方法であって、
（１）小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が対照生体試料と比較して減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、その前駆体、又はそれらを発現するベクターを投与すること；又は／及び、
（２）小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が対照生体試料と比較して増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する少なくとも１種の化合物を投与すること；
を含む、小細胞肺癌の予後を改善する方法。
【請求項７】
上記生体試料が、血清、血漿、肺癌組織、細胞からなる群に由来する、請求項１〜６記載の方法。
【請求項８】
ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、それらの前駆体、又はそれらを発現するベクターの少なくとも１種を含む小細胞肺癌治療剤。
【請求項９】
ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の機能を阻害する化合物を含む小細胞肺癌治療剤。
【請求項１０】
ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、それらの前駆体、又はそれらを発現するベクターの少なくとも１種を含む小細胞肺癌の予後改善剤。
【請求項１１】
ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の機能を阻害する化合物を含む小細胞肺癌の予後改善剤。
【請求項１２】
小細胞肺癌治療剤または小細胞肺癌の予後改善剤のスクリーニング方法であって、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の機能の変化を指標とする、スクリーニング方法。
【請求項１３】
機能の変化は、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の発現量の増加である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
機能の変化は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現の阻害である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
機能の変化は、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体が標的とする塩基配列への、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の結合の促進である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
機能の変化は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体が標的とする塩基配列への、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の結合の阻害である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍｉＲＮＡを用いた小細胞肺癌の予後予測、検査、及び診断方法、小細胞肺癌治療方法、小細胞肺癌予後改善方法、及び小細胞肺癌治療剤のスクリーニング方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
高悪性度肺神経内分泌腫瘍は小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）から成る。ＳＣＬＣは非常に悪性度の高い肺癌であるが、一般に化学療法に対する感受性が高いため、手術はあまり行われない。しかし、化学療法に対する感受性は治療初期は高いものの、次第に感受性が低くなることが多く、予後は非常に不良である。【０００３】
一方、マイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」とする）は、タンパク質に翻訳されない２０〜２５程度のヌクレトチドの小さな非コードRNAである。ｍｉＲＮＡは蛋白質をコードしないＤＮＡ領域からまず数百塩基程度の第一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）が転写される。第一次転写物は複合体を伴ったＤｒｏｓｈａによって第二次転写物（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）へとプロセシングされる。その後、細胞質へ輸送された後、Ｄｉｃｅｒによるプロセシングを受け、２０〜２５ヌクレオチド程度の二本鎖の成熟ｍｉＲＮＡとなる。成熟ｍｉＲＮＡは二本のうちの一本がＲＩＳＣと複合体を形成し、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合することで翻訳抑制を引き起こすことが知られている。ｍｉＲＮＡはヒトを含む生物に多数存在することが知られており、近年、疾患、特に癌との関係が注目され、ｍｉＲＮＡの発現パターンを癌の診断に利用することや、ｍｉＲＮＡの発現を制御し癌の治療に使用することが提案されている（特許文献１）。
例えば、肺癌で、ｌｅｔ−７ファミリーの発現が低下し、その発現低下が予後不良因子であることや、肺癌で過剰発現しているｍｉＲ−１７−９２クラスターを過剰発現させると増殖促進作用が見られる一方、アンチセンスオリゴにより発現を抑制すると，ｍｉＲ−１７−９２クラスターを強発現している肺癌細胞株特異的に増殖抑制や細胞死誘導を引き起こすことが示されている（非特許文献１，２）。また、結腸直腸癌では、ｍｉＲ−１４３及びｍｉＲ−１４５の発現量が減少しており、ｍｉＲ−１４３をアゴニストとしてモデル動物に投与したところ、ｍｉＲ−１４３は抗腫瘍効果を示すことが示されている（非特許文献３）。
また、肺腺癌や肺扁平上皮癌ではｈｓａ−ｍｉｒ−１２６、ｈａｓ−ｍｉｒ−２０５及びｈａｓ−ｍｉｒ−２１は発現量が増加又は減少しており、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５の発現が高い又はｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の発現が低い肺腺癌患者は、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５の発現が低い又はｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の発現が高い患者よりも予後が悪いことが示されている（特許文献２）。
また、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者では、ｌｅｔ−７の発現が低下している場合は早期死のリスクが高いことが示されている（非特許文献４）。しかし、ＳＣＬＣにおいてはどのようなｍｉＲＮＡが疾患の予後と関連しているかはよく分かっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０４３３８７号公報
【特許文献２】ＷＯ２００７／０８１７２０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈａｙａｓｈｉｔａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５：９６２８−９６３２  （２００５）
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６：６０９９−６１０５  （２００７）
【非特許文献３】Ａｋａｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１０）、１−１１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｇｔ．２００９．８８
【非特許文献４】Ｔａｋａｍｉｚａｗａ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：３７５３−３７５６（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記の状況に鑑みてなされたものであり、ＳＣＬＣに関連するｍｉＲＮＡを解析し、ｍｉＲＮＡを用いたＳＣＬＣ患者の予後を検査する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はｍｉＲ−２１６ａがＳＣＬＣの予後と関連することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は以下； 
〔１〕小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量を測定する、小細胞肺癌患者における予後を判定するための検査方法。
〔２〕上記方法において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量が、対照生体試料における発現量より増加している場合に予後が不良であると判定するための、〔１〕記載の方法。
〔３〕上記方法において、ｍｉＲ−２０３又はその前駆体の発現量が、対照生体試料における発現量より減少している場合に予後が不良であると判定するための、〔１〕記載の方法。
〔４〕上記方法において、ｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量が、予後が良好である小細胞肺癌患者由来の生体試料における発現量より減少している場合に予後が不良であると判定するための、〔１〕記載の方法。
〔５〕小細胞肺癌を治療する方法であって、
（１）小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が対照生体試料と比較して減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、その前駆体、又はそれらを発現するベクターを投与すること；又は／及び、
（２）小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が対照生体試料と比較して増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体の機能を阻害する少なくとも１種の化合物を投与すること；
を含む、小細胞肺癌を治療する方法。
〔６〕小細胞肺癌の予後を改善する方法であって、
（１）小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が対照生体試料と比較して減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、その前駆体、又はそれらを発現するベクターを投与すること；又は／及び、
（２）小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が対照生体試料と比較して増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する少なくとも1種の化合物を投与すること；
を含む、小細胞肺癌の予後を改善する方法。
〔７〕上記生体試料が、血清、血漿、肺癌組織、細胞からなる群に由来する、〔１〕〜〔６〕記載の方法。
〔８〕ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、それらの前駆体、又はそれらを発現するベクターの少なくとも１種を含む小細胞肺癌治療剤。
〔９〕ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の機能を阻害する化合物を含む小細胞肺癌治療剤。
〔１０〕ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、それらの前駆体、又はそれらを発現するベクターの少なくとも１種を含む小細胞肺癌の予後改善剤。
〔１１〕ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の機能を阻害する化合物を含む小細胞肺癌の予後改善剤。
〔１２〕小細胞肺癌治療剤または小細胞肺癌の予後改善剤のスクリーニング方法であって、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の機能の変化を指標とする、スクリーニング方法。
〔１３〕機能の変化は、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の発現量の増加である、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕機能の変化は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現の阻害である、〔１２〕に記載の方法。
〔１５〕機能の変化は、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体が標的とする塩基配列への、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の結合の促進である、〔１２〕に記載の方法。
〔１６〕機能の変化は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体が標的とする塩基配列への、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の結合の阻害である、〔１２〕に記載の方法。
を提供するものである。【０００９】
さらに本発明は、
〔１〕小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量を測定する、小細胞肺癌患者における予後を予測、検査および/または診断する方法。
〔２〕上記方法において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量が、対照生体試料における発現量より増加している場合に予後が不良であると診断または判定する、〔１〕記載の方法。
〔３〕上記方法において、ｍｉＲ−２０３又はその前駆体の発現量が、対照生体試料における発現量より減少している場合に予後が不良であると診断または判定する、〔１〕記載の方法。
〔４〕上記方法において、ｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量が、予後が良好である小細胞肺癌患者由来の生体試料における発現量より減少している場合に予後が不良であると診断または判定する、〔１〕記載の方法。
〔５〕小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量が対照生体試料と比較して増加又は減少している小細胞肺癌を治療する方法であって、
（１）ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、その前駆体、又はそれらを発現するベクターを投与すること；又は／及び、
（２）ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体の機能を阻害する少なくとも１種の化合物を投与すること；
を含む、小細胞肺癌を治療する方法。
〔６〕小細胞肺癌を治療する方法であって、
（１）小細胞肺癌患者由来の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量を測定し、
（２）対照生体試料と比較して発現量が減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、その前駆体、又はそれらを発現するベクターを投与すること；又は／及び、
（３）対照生体試料と比較して発現量が増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する少なくとも１種の化合物を投与すること；
を含む、小細胞肺癌を治療する方法。
〔７〕小細胞肺癌患者の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量が対照生体試料と比較して増加又は減少している小細胞肺癌の予後を改善する方法であって、
（１）ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、その前駆体、又はそれらを発現するベクターを投与すること；又は／及び、
（２）ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する少なくとも1種の化合物を投与すること；
を含む、小細胞肺癌の予後を改善する方法。
〔８〕小細胞肺癌の予後を改善する方法であって、
（１）小細胞肺癌患者由来の生体対料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量を測定し、
（２）対照生体試料と比較して発現量が減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、その前駆体、又はそれらを発現するベクターを投与すること；又は／及び、
（３）対照生体試料と比較して発現量が増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する少なくとも1種の化合物を投与すること；
を含む、小細胞肺癌の予後を改善する方法。
〔９〕上記生体試料が、血清、血漿、肺癌組織、細胞からなる群に由来する、〔１〕〜〔８〕記載の方法。
〔１０〕ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、それらの前駆体、又はそれらを発現するベクターの少なくとも１種を含む小細胞肺癌治療剤または小細胞肺癌の予後改善剤。
〔１１〕ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の機能を阻害する化合物を含む小細胞肺癌治療剤または小細胞肺癌の予後改善剤。
〔１２〕小細胞肺癌患者の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量が対照生体試料と比較して増加又は減少している小細胞肺癌を治療するための治療剤であって、
（１）ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の発現量が減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、その前駆体、又はそれらを発現するベクター；又は／及び、
（２）ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量が増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する少なくとも1種の化合物；
を含む、小細胞肺癌を治療するための治療剤。
〔１３〕上記生体試料が、血清、血漿、肺癌組織、細胞からなる群に由来する、〔１２〕記載の治療剤。
〔１４〕小細胞肺癌患者の生体試料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量が対照生体試料と比較して増加又は減少している小細胞肺癌の予後を改善するための予後改善剤であって、
（１）ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の発現量が減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ、その前駆体、又はそれらを発現するベクター；又は／及び、
（２）ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量が増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する少なくとも1種の化合物；
を含む、小細胞肺癌の予後改善剤。
〔１５〕上記生体試料が、血清、血漿、肺癌組織、細胞からなる群に由来する、〔１４〕記載の予後改善剤。
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ｍｉＲＮＡを利用したＳＣＬＣの予後予測、検査および診断方法が提供された。また本発明により、ｍｉＲＮＡを利用したＳＣＬＣ治療方法、ＳＣＬＣ予後改善方法、ＳＣＬＣ治療剤及びＳＣＬＣ治療薬のスクリーニング方法が提供された。本発明は、簡便かつ正確なＳＣＬＣの予後判定に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、６００個のｍｉＲＮＡ発現の階層クラスタリングによる分類を示す。行と列は各々、ｍｉＲＮＡ及び症例を示す。各々のｍｉＲＮＡについて、「７．０」側の色（元データ赤色）は高発現を示し、「−７．０」側の色（元データ青色）は低発現を示す。下のバーに、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（「１」，元データ青色）、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）（「２」，元データ薄青色）、腺癌（Ａｄ）（「３」，元データピンク色）、扁平上皮癌（Ｓｑ）（「４」，元データ茶色）、正常肺（ＮＬ）（「５」，元データ黄色）の別を示した。小細胞肺癌検体は大きく２つのグループに分類され、予後不良患者由来の検体と、予後良好患者由来の検体が、別々のグループによく分離されている。
【図２】図２は、グループ  １のＳＣＬＣ（ＳＣＬＣ  １）とグループ  ２のＳＣＬＣ（ＳＣＬＣ  ２）の生存曲線を示す。
【図３】図３（Ａ）は、各ｍｉＲＮＡ発現量に関する、正常肺の組織検体（ＮＬ）、肺腺癌の組織検体および肺扁平上皮癌の組織検体（Ａｄ＋Ｓｑ）、予後良好群（ＳＣＬＣ２），予後不良群（ＳＣＬＣ１）間の比較を示す。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、ＮＳ：ｐ≧０．０５（対予後不良群（ＳＣＬＣ１））。図３（Ｂ）は、各ｍｉＲＮＡの発現レベルのマイクロアレイと定量的ＲＴ−ＰＣＲとの相関性を示す。
【図４】図４は、各ｍｉＲＮＡと予後との関連を示す。
【図５】図５は、３個のｍｉＲＮＡ発現を用いた階層クラスタリングによる分類を示す。行と列は各々、ｍｉＲＮＡ及び症例を示す。「２．４」側の色（元データ赤色）は高発現を示し、「−２．４」側の色（元データ青色）は低発現を示す。下から２つ目のバーはクラスタリングにより分類された３グループを示す。一番下のバーは、６００個のｍｉＲＮＡによるクラスタリングによる予後不良群（ＳＣＬＣ１群）および予後良好群（ＳＣＬＣ２群）を表す。この３個のｍｉＲＮＡを用いると、６００個を用いたときとほぼ同様の分類が得られ、小細胞肺癌を予後良好群と予後不良群に分類することが出来る。下パネルに、各グループの生存曲線を示した。
【図６】図６は、４個のｍｉＲＮＡ発現を用いた階層クラスタリングによる分類を示す。行と列は各々、ｍｉＲＮＡ及び症例を示す。「３．２」側の色（元データ赤色）は高発現を示し、「−３．２」側の色（元データ青色）は低発現を示す。下から２つ目のバーはクラスタリングにより分類された２グループを示す。一番下のバーは、６００個のｍｉＲＮＡによるクラスタリングによる予後不良群（ＳＣＬＣ１群）および予後良好群（ＳＣＬＣ２群）を表す。この４個のｍｉＲＮＡを用いると、６００個を用いたときとほぼ同様の分類が得られ、小細胞肺癌を予後良好群と予後不良群に分類することが出来る。下パネルに、各グループの生存曲線を示した。
【図７】図７は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２０３、およびｍｉＲ−２１６ａを用いた予後予測モデルにより分類したＳＣＬＣ高リスク群と低リスク群の生存曲線を示す。この３個のｍｉＲＮＡを用いた予後予測モデルによっても、小細胞肺癌を予後良好群と予後不良群に分類することが出来る。
【図８】図８は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２０３、およびｍｉＲ−２１６ａを用いた予後予測モデルにより分類した小細胞肺癌高リスク群（Ａ）および低リスク群（Ｂ）の癌組織の組織切片を示す。
【図９】図９は、３個のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２０３、およびｍｉＲ−２１６ａ）による予後予測モデルの妥当性を評価した結果を示す。無作為抽出されたラーニングセットにおいて構築された分類モデルに基づいてテストセットを分類した。その作業を１，０００回繰り返した。（Ａ）生存解析の結果をｐ値（ログランク試験による）のヒストグラムで示す。ｐ値の中央値および幾何学的平均値は各々０．０４８、０．０４１であり、この予後予測モデルは肺小細胞癌予後を平均的には正確に予測できていることが示された。（Ｂ）６００個のｍｉＲＮＡを用いた階層クラスタリングによる分類と比較したときの、予測エラーの数のヒストグラム。階層クラスタリングとの一致率および不一致率は各々０．８７４、０．１２６であり、この予後予測モデルは６００個のｍｉＲＮＡを用いた分類をおおむね再現出来ることが示された。
【図１０】図１０は、miR-153阻害剤およびmiR-203模倣剤（miR-203 mimic）による肺小細胞癌細胞の増殖抑制を示す。パネル(A)および(C)は、予後不良群（SCLC1群）、予後良好群（SCLC2群）、および各種SCLC細胞株における、それぞれmiR-153およびmiR-203の発現レベルをRT-PCRにより解析した結果を示している。パネル(B)は、SCLC細胞株DMS 53にmiR-153阻害剤をトランスフェクトした結果を、パネル(D)は、SCLC細胞株SCB5にmiR-203（miR-203 mimic）をトランスフェクトした結果を示す。その結果、どちらの場合でも、陰性対照に比べて細胞増殖が抑制されることが確認された。対照と比較した場合のmiR-203 mimicの導入による96 hrの細胞数の低下は統計学的に有意であった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下の定義は、本明細書において説明する本発明の理解を容易にするために提供される。
【００１３】
予後とは、何らかの治療（例えば、化学療法、放射線療法、外科的切除）を行った後の患者の癌の経過についての医学的見通しまたは患者の余命を意味する。予後が不良であるとは、例えば、治療後の生存期間が短くなること、臨床的特徴が悪化するまたは悪化するのが速いこと、病期が進展するまたは進展するのが速いこと、再発が起こるまたは再発までの期間が短いこと、などを意味する。予後が良好とは、例えば、治療後の生存期間が長くなること、臨床的特徴が改善するまたは改善するのが速いこと、病期が進展しないまたは進展するのが遅いこと、再発が起こらないかまたは再発までの期間が長いこと、などを意味する。
【００１４】
癌患者由来の生体試料は、例えば癌患者から採取した癌組織（例えば小細胞肺癌組織）、癌組織に近接したリンパ節、血漿及び血清などの血液を含む体液、細胞を意味するが、これらに限定されない。特に、癌患者から採取した癌組織が好ましい。癌組織は、内視鏡などで採取するか、もしくは手術によって得ることができる。
【００１５】
体液、特に血清又は血漿からのｍｉＲＮＡの分離には、Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（ＰＮＡＳ（２００８）、１０５（３０）、１０５１３−１０５１８）やＺｈｕら（ＢＭＣ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｏｔｅ（２００９）、２（８９））の方法を用いることができる。
【００１６】
細胞は、血液、血清、血漿、尿、滑液、髄液、脳脊髄液、精液、またはリンパ液等の体液に含まれている細胞や癌組織に含まれている細胞であってもよく、血液中の循環癌細胞（「ＣＴＣ」）であってもよい。
【００１７】
循環癌細胞を得る方法として、例えば免疫磁気ビーズを用いた方法が挙げられる。免疫磁気ビーズには、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、サイトケラチン−８、１９などのサイトケラチンなどの癌細胞の表面に選択的に認められる抗原に対する抗体を有するもの、癌細胞の表面には認められず血球系の細胞表面に発現しているＣＤ４５に対する抗体を有するものなどがある。例えば、ＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標）ヒトＥｐＣＡＭ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＥａｓｙＳｅｐ（登録商標） Ｈｕｍａｎ ＣＤ４５ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて循環癌細胞を分離することができる。循環癌細胞を単離する他の方法としては、ＩＳＥＴ法が挙げられる（Ｖｏｎａ Ｇら，２０００，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０００ １５６：５７−６３）。
【００１８】
対照生体試料は、例えば健常者、小細胞肺癌以外の癌患者、例えば肺腺癌、肺扁平上皮癌患者の生体試料、又は小細胞肺癌であるが予後が良好と判断された患者の生体試料を意味するが、これらに限定されず、生体試料や測定するｍｉＲＮＡなどによって適宜最適なものを選択すればよい。健常者の対照生体試料は、例えば検査対象となる生体試料と同じ部位に由来する生体試料（例えば同じ組織、器官、細胞、例えば肺組織）を用いることができる。例えば、ｍｉＲ-１５３、ｍｉＲ−２０３及びｍｉＲ−２１６ａを測定する場合、健常者、肺腺癌、肺扁平上皮癌患者の生体試料、又は小細胞肺癌であるが予後が良好と判断された患者の生体試料を対照生体試料として用い、ｍｉＲ−１９６ａを測定する場合は小細胞肺癌であるが予後が良好と判断された患者の生体試料を対照生体試料として用いることができる。
【００１９】
本発明の予後を判定するための検査方法、予後を予測、検査および/または診断する方法において測定する対象は、特定のｍｉＲＮＡ又はその前駆体である。前駆体とは一次転写物であるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又は二次転写物であるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを意味する。
【００２０】
ｍｉＲ−１５３はその成熟型配列がＵＵＧＣＡＵＡＧＵＣＡＣＡＡＡＡＧＵＧＡＵＣ（配列番号１）で示されるｍｉＲＮＡである。ｍｉＲ−１５３前駆体として、例えばｍｉｒ-１５３-１ （配列番号２：ＣＵＣＡＣＡＧＣＵＧＣＣＡＧＵＧＵＣＡＵＵＵＵＵＧＵＧＡＵＣＵＧＣＡＧＣＵＡＧＵＡＵＵＣＵＣＡＣＵＣＣＡＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＣＡＣＡＡＡＡＧＵＧＡＵＣＡＵＵＧＧＣＡＧＧＵＧＵＧＧＣ）、ｍｉｒ-１５３-２（配列番号３：ＡＧＣＧＧＵＧＧＣＣＡＧＵＧＵＣＡＵＵＵＵＵＧＵＧＡＵＧＵＵＧＣＡＧＣＵＡＧＵＡＡＵＡＵＧＡＧＣＣＣＡＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＣＡＣＡＡＡＡＧＵＧＡＵＣＡＵＵＧＧＡＡＡＣＵＧＵＧ）などが挙げられる。
【００２１】
ｍｉＲ−１９６ａはその成熟型配列がＵＡＧＧＵＡＧＵＵＵＣＡＵＧＵＵＧＵＵＧＧＧ（配列番号４）で示されるｍｉＲＮＡである。ｍｉＲ−１９６ａ前駆体として、例えばｍｉｒ-１９６ａ-１ （配列番号５：ＧＵＧＡＡＵＵＡＧＧＵＡＧＵＵＵＣＡＵＧＵＵＧＵＵＧＧＧＣＣＵＧＧＧＵＵＵＣＵＧＡＡＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＵＵＡＡＡＣＣＡＣＣＣＧＡＵＵＣＡＣ）、ｍｉｒ-１９６ａ-２（配列番号６：ＵＧＣＵＣＧＣＵＣＡＧＣＵＧＡＵＣＵＧＵＧＧＣＵＵＡＧＧＵＡＧＵＵＵＣＡＵＧＵＵＧＵＵＧＧＧＡＵＵＧＡＧＵＵＵＵＧＡＡＣＵＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＣＵＧＣＣＵＧＡＧＵＵＡＣＡＵＣＡＧＵＣＧＧＵＵＵＵＣＧＵＣＧＡＧＧＧＣ）などが挙げられる。
【００２２】
ｍｉＲ−２０３はその成熟型配列がＧＵＧＡＡＡＵＧＵＵＵＡＧＧＡＣＣＡＣＵＡＧ（配列番号７）で示されるｍｉＲＮＡである。ｍｉＲ−２０３前駆体として、例えばｍｉｒ-２０３（配列番号８：ＧＵＧＵＵＧＧＧＧＡＣＵＣＧＣＧＣＧＣＵＧＧＧＵＣＣＡＧＵＧＧＵＵＣＵＵＡＡＣＡＧＵＵＣＡＡＣＡＧＵＵＣＵＧＵＡＧＣＧＣＡＡＵＵＧＵＧＡＡＡＵＧＵＵＵＡＧＧＡＣＣＡＣＵＡＧＡＣＣＣＧＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＣＧＡ）などが挙げられる。
【００２３】
ｍｉＲ−２１６ａはその成熟型配列がＵＡＡＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＣＡＡＣＵＧＵＧＡ（配列番号９）で示されるｍｉＲＮＡである。ｍｉＲ−２１６ａ前駆体として、例えばｍｉｒ-２１６ａ（配列番号１０：ＧＡＵＧＧＣＵＧＵＧＡＧＵＵＧＧＣＵＵＡＡＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＣＡＡＣＵＧＵＧＡＧＡＵＧＵＵＣＡＵＡＣＡＡＵＣＣＣＵＣＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＣＵＧＧＧＡＵＵＡＵＧＣＵＡＡＡＣＡＧＡＧＣＡＡＵＵＵＣＣＵＡＧＣＣＣＵＣＡＣＧＡ）などが挙げられる。
【００２４】
これらｍｉＲＮＡ及びそれら前駆体は、例えば従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することにより、又は遺伝子組換え技術を用いることにより産生することで得ることができる。
【００２５】
予後を判定するための検査方法、予後を予測、検査および/または診断する方法において使用するｍｉＲＮＡ又はその前駆体は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよいが、２種以上を組み合わせて用いることが予測、検査および/または診断の精度向上の点で好ましい。例えば、ｍｉＲＮＡとその前駆体を組み合わせてもよく、また異なるｍｉＲＮＡを２つ以上組み合わせてもよい。
【００２６】
例えば、ｍｉＲＮＡ−１５３とｍｉＲＮＡ−２１６ａを少なくとも含む組み合わせは、本発明において好適である。また、ｍｉＲＮＡ−１５３とｍｉＲ−２０３を少なくとも含む組み合わせであってもよく、ｍｉＲＮＡ−２１６ａとｍｉＲ−２０３を少なくとも含む組み合わせであってもよい。本発明においては、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２０３、およびｍｉＲ−２１６ａを少なくとも含む組み合わせが特に好適である。ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ、およびｍｉＲ−１９６ａを含む組み合わせも好ましい。
【００２７】
本発明により予後を判定するための検査方法、予後を予測、検査、または診断する方法では、例えば、まず生体試料からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出する。その抽出方法としては、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ, Ｊ. Ｍ. ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８, ５２９４-５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ, Ｐ.ｅｔ ａｌ., Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ.（１９８７）１６２, １５６-１５９）が挙げられる。
【００２８】
次に、生体試料から得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体の発現量を測定することができる。ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の定量的な測定方法には、公知の方法をいずれも使用できる。具体的には、例えばＲＴ−ＰＣＲ法やその変法、ノーザンブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法やマイクロアレイを用いる方法を挙げることができる。ＲＴ−ＰＣＲ法は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）法により発現量を正確に測定することができる。
【００２９】
次に、予後を判定するために検査する対象の患者由来の生体試料、予後を予測、検査および/または診断する対象の患者由来の生体試料における本発明に係るｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体の発現量を、対照生体試料における本発明に係るｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体の発現量と比較することができる。比較した結果、予後を判定するために検査する対象の患者由来の生体試料、予後を予測、検査および/または診断する対象の患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量が、対照生体試料におけるｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量に比べ上昇している場合は予後が不良と判断等できる。なお、該上昇している場合は予後が不良と判断するとは、そうでない場合（上昇していない場合）は予後が不良ではない（または良好である）と判断するということを意味していてもよい。それらのいずれかが含まれる方法、および両方が含まれる方法が本発明において提供される。
すなわち本発明は、該患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量が、対照生体試料におけるｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量に比べ上昇している場合は予後が不良および/または、そうでない場合に予後が良好である（および/または不良ではない）と予測、判断、診断、検査および/または判定する方法に関する。例えば、予後が不良である患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量は、対照生体試料におけるｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量に比べ２倍、好ましくは３倍、さらに好ましくは５倍、さらに好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０倍、さらに好ましくは５０倍、さらに好ましくは１００倍、更に好ましくは１０００倍、最も好ましくは１００００倍の各値以上に上昇している。また、例えば予後が不良ではない（良好である）患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ、ｍｉＲ−２０３、又はそれらの前駆体の発現量は、対照生体試料における同発現量と同程度であり、具体的には例えば発現の高い試料／低い試料の比として２倍未満、１．８倍未満、１．５倍未満、または１．３倍未満である。
一方、予後を予測、判断、診断、検査および/または判定する対象の患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−２０３又はその前駆体の発現量が、対照生体試料におけるｍｉＲ−２０３又はその前駆体の発現量に比べ減少している場合は予後が不良と判断等できる。また、該減少している場合は予後が不良と判断するとは、そうでない場合（減少していない場合）は予後が不良ではない（または良好である）と判断するということを意味していてもよい。それらのいずれかが含まれる方法、および両方が含まれる方法が本発明において提供される。すなわち本発明は、該患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−２０３又はその前駆体の発現量が、対照生体試料におけるｍｉＲ−２０３又はその前駆体の発現量に比べ減少している場合は予後が不良および/または、そうでない場合に予後が良好である（および/または不良ではない）と予測、判断、診断、検査および/または判定する方法に関する。例えば、予後が不良である患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−２０３又はその前駆体の発現量は、対照生体試料におけるｍｉＲ−２０３又はその前駆体の発現量に比べ１／２倍、好ましくは１／３倍、さらに好ましくは１／５倍、さらに好ましくは１／１０倍、さらに好ましくは１／２０倍、さらに好ましくは１／５０倍、さらに好ましくは１／１００倍、更に好ましくは１／１０００倍、最も好ましくは１／１００００倍の各値以下に低下している。
また、予後を予測、判断、診断、検査および/または判定する対象の患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量が、予後が良好である小細胞肺癌患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量に比べ減少している場合は予後が不良と判断等できる。また、該減少している場合は予後が不良と判断するとは、そうでない場合（減少していない場合）は予後が不良ではない（または良好である）と判断するということを意味していてもよい。それらのいずれかが含まれる方法、および両方が含まれる方法が本発明において提供される。すなわち本発明は、該患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量が、予後が良好である小細胞肺癌患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量に比べ減少している場合は予後が不良および/または、そうでない場合に予後が良好である（および/または不良ではない）と予測、判断、診断、検査および/または判定する方法に関する。例えば、予後が不良である患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量は、予後が良好である小細胞肺癌患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量に比べ１／２倍、好ましくは１／３倍、さらに好ましくは１／５倍、さらに好ましくは１／１０倍、さらに好ましくは１／２０倍、さらに好ましくは１／５０倍、さらに好ましくは１／１００倍、更に好ましくは１／１０００倍、最も好ましくは１／１００００倍の各値以下に低下している。また対照生体試料として例えば健常者、肺腺癌、または肺扁平上皮癌と判断された患者の生体試料を使う場合、予後を予測、判断、診断、検査および/または判定する対象の患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量が、対照生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量に比べ上昇している場合は予後が不良ではない（良好）と判断等でき、そうでない場合は予後が不良と判断等できる。すなわち本発明は、該患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量が、対照生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量に比べ上昇していない場合は予後が不良および/または、上昇している場合に予後が良好である（および/または不良ではない）と予測、判断、診断、検査および/または判定する方法に関する。
例えば、予後が不良ではない（良好である）患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はそれらの前駆体の発現量は、例えば健常者、肺腺癌、または肺扁平上皮癌と判断された患者の対照生体試料における同発現量に比べ２倍、好ましくは３倍、さらに好ましくは５倍、さらに好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０倍、さらに好ましくは５０倍、さらに好ましくは１００倍、更に好ましくは１０００倍、最も好ましくは１００００倍の各値以上に上昇しており、予後が不良な患者由来の生体試料におけるｍｉＲ−１９６ａ又はそれらの前駆体の発現量は、例えば健常者、肺腺癌、または肺扁平上皮癌と判断された患者の対照生体試料における同発現量と同程度であり、具体的には例えば発現の高い試料／低い試料の比として２倍未満、１．８倍未満、１．５倍未満、または１．３倍未満である。
ここで、対照生体試料は一つでもよいが、複数用いても良く、例えば、健常者の生体試料を複数用いてもよく、また健常者の生体試料と癌患者の生体試料を組み合わせて用いてもよい。
【００３０】
以上に説明した本発明に係る予後を判定するための検査方法、予後を予測、検査および/または診断する方法によれば、小細胞肺癌と判定または診断等された患者の予後を化学療法、放射線療法や手術前に予測、判断、判定、検査および/または診断することができる。そのため、その後に行う治療を最適なものとすることができる。また、化学療法中、放射線療法中にも随時本発明に係る予後を予測、判断、判定、検査および/または診断する方法を用いることで、治療効果を確認することも可能である。さらには手術後においても本発明に係る予後を予測、判断、判定、検査および/または診断する方法を用いることで、その後の予後を予測、判断、判定、検査および/または診断することが可能である。
【００３１】
なお本発明の予測および検査方法は、診断とは切り離して実施することが可能である。例えば診断は医師が行うとしても、検査は例えば医師ではない者（例えば外部機関）が実施し、その検査結果をもとに医師が診断することができる。生体試料を、それが由来する患者とは直接結びつかないように検査することにより、例えば診断方法と切り離して本発明の検査方法を実施することができる。例えば生体試料をＩＤ化してもよい。また、小細胞肺癌患者の予後分布を統計学的に調査する場合など、最終的に患者の診断と結びつかない場面においても、本発明の検査方法は有用である。
また本発明は、本発明の診断方法のための中間的な結果を得るための方法、小細胞肺癌患者における予後を判定するための検査方法、小細胞肺癌患者における予後のマーカーまたは指標を検出する方法、小細胞肺癌患者由来の生体試料がどのような予後を持つ患者に由来するかを検査する方法、小細胞肺癌患者における予後を判定または診断するために資する検査方法、および小細胞肺癌患者における予後を検査するための非診断方法にも関する。各方法の工程は、上記の記載に従って実施すればよく、最終工程において、診断ではなく、中間的または非診断的な結果として、予後に関する情報が提供される。
【００３２】
また本発明は、本発明の検査、予測、判断、判定、および診断における、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種に対するプローブ、プライマー、および該少なくとも一種とハイブリダイズする核酸の使用に関する。該プローブ、プライマー、および核酸は、本発明の検査、予測、判断、判定、および診断を行うための薬剤、すなわち検査剤、診断剤等として有用である。本発明は、該プローブ、プライマー、および核酸を含む該診断剤および該検査剤、該診断剤または該検査剤の製造における該プローブ、プライマー、および核酸の使用にも関する。該プローブ、プライマー、および核酸は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体と特異的にハイブリダイズするものが好ましく、例えばストリンジェントな条件、具体的には、1×SSC（1×SSCは150 mM NaCl、15 mM sodium citrate、pH 7.0）で37℃、または1×SSCで40℃、45℃、50℃、または55℃、好ましくは0.5×SSCで37℃、40℃、45℃、または50℃、好ましくは0.2×SSCで37℃、40℃、45℃、または50℃の条件でハイブリダイズする核酸であってよい。例えばハイブリダイズさせる核酸のどちらかを標識し、他方を膜に固定して、両者をインキュベートする。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5xSSC、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中で行えばよい。十分な時間（例えば3、4、5または6時間以上）インキュベートした後、上記の条件で洗浄を行い、標識した核酸がハイブリダイズしているかを検出することにより、当該条件で核酸がハイブリダイズするか否かを決定することができる。
【００３３】
また本発明は、小細胞肺癌を治療する方法、および小細胞肺癌の予後を改善する方法に関する。実施にあたっては、本発明の診断、予測、判断、判定、および診断方法の記載を参照することができ、それらの記載と本発明の治療方法の記載との任意の組み合わせが、本明細書において開示される。具体的には、例えば本発明の治療方法および予後を改善する方法における、小細胞肺癌患者由来の生体対料、対照生体試料、発現量の測定および比較等については、本発明の診断方法および検査方法の記載と同じである。例えば、ｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量の比較においては、予後が良好である小細胞肺癌患者由来の生体試料における発現量を比較対象とすることができる。本発明に係る小細胞肺癌を治療する方法では、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の発現が減少している患者に対しては、例えば、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体を投与することにより行うことができる。
【００３４】
投与するｍｉＲＮＡ又はその前駆体は、ヌクレアーゼに対する耐性の向上や安定化のためにその一部が修飾されていてもよく、例えば、ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’-ＯＨをフルオロ化またはメチル化してもよく、コレステロール、ステロイド、胆汁酸やポリエチレングリコールなどを付加してもよい。
具体的には、核酸を構成するヌクレオチドは、天然のヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、人工のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであってよい。また核酸はRNAからなっていてもよく、またはRNA・DNAキメラであってよく、あるいはその他の核酸類縁体を含んでもよく、それらの任意の組み合わせを含んでよい。核酸には、リン酸ジエステル結合により結合しているもののみならず、アミド結合やその他のバックボーンを有するもの（ペプチド核酸(PNA)等）が含まれる。核酸には、例えば天然および人工の核酸が含まれ、核酸誘導体、核酸派生体、核酸アナログ等であってよい。そのような核酸類縁体は当該分野において周知であり、例えばホスホロチオエート、ホスホアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2'-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）が含まれるが、これらに限定されない。PNAの骨格には、アミノエチルグリシン、ポリアミド、ポリエチル、ポリチオアミド、ポリスルフィナミド、ポリスルホンアミド、またはそれらの組み合わせからなる骨格を含んでよい（Krutzfeldt, J. et al., Nucleic Acids Res. 35: 2885-2892; Davis, S. et al., 2006, Nucleic Acids Res. 34: 2294-2304; Boutla, A. et al., 2003), Nucleic Acids Res. 31: 4973-4980; Hutvagner, G. et al., 2004, PLoS Biol. 2: E98; Chan, J.A. et al., 2005, Cancer Res. 65: 6029-6033; Esau, C. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 52361-52365; Esau, C. et al., 2006, Cell Metab. 3: 87-98）。
【００３５】
核酸の修飾は、具体的には、2'または3'糖修飾、例えば2'-O-メチル（2'-O-Me）化ヌクレオチドまたは2'-デオキシヌクレオチド、または2'-フルオロ、ジフルオロトルイル、5-Me-2'-ピリミジン、5-アリルアミノ-ピリミジン、2'-O-メトキシエチル（2'-O-MOE）、2'-O-アミノプロピル（2'-O-AP）、2'-O-N-メチルアセタミド（2'-O-NMA）、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル（2'-DMAEOE）、2'-O-ジメチルアミノエチル（2'-O-DMAOE）、2'-O-ジメチルアミノプロピル（2'-O-AP）、2'-ヒドロキシヌクレオチド、ホスホロチオエート、4'-チオヌクレオチド、2'-O-トリフルオロメチルヌクレオチド、2'-O-エチル-トリフルオロメトキシヌクレオチド、2'-O-ジフルオロメトキシ-エトキシヌクレオチド、または2'-アラ−フルオロヌクレオチド、Locked核酸（LNA）、2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸 (2'-O,4'-C-ethylene bridged nucleic acid (ENA)) などのエチレン核酸、その他の bridged nucleic acid (BNA)、ヘキシトール核酸（hexitol nucleic acid; HNA）、モルホリノ核酸、トリシクロ-DNA（tcDNA）、ポリエーテル核酸（US Pat. No. 5,908,845）、シクロヘキセン核酸（CeNA）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。またジフルオロトルイル（DFT）修飾、例えば2,4-ジフルオロトルイルウラシル、またはグアニジンのイノシンへの置換を行ってもよい。
【００３６】
また、核酸は末端に結合体を含んでよい。結合体としては、例えば親油性物質、テルペン、タンパク質結合物質、ビタミン、炭水化物、レチノイド、およびペプチド等が挙げられる。具体的には、C5-アミノアルキルdT、ナプロキセン、ニトロインドール、葉酸、コラン酸、イブプロフェン、レチノイド、ポリエチレングリコール（PEG）、C5ピリミジンリンカー、グリセリド脂質（例えばジアルキルグリセリド誘導体）、ビタミンE、コレステロール、チオコレステロール、dU-コレステロール、アルキル鎖、アリール基、複素環式複合体、および修飾糖（D-リボース、デオキシリボース、グルコースなど）が例示できる。結合体と核酸は、例えば任意のリンカーを介して結合させることができ、具体的には、ピロリジンリンカー、セリノールリンカー、アミノオキシ、またはヒドロキシプロリノールリンカー等が挙げられる。また、核酸には適宜、細胞透過シグナルを付加することができる。例えば、核酸を細胞に導入するための細胞透過性ペプチドが多数知られている（WO2008/082885）。具体的には、例えばポリアルギニンなどのアルギニンリッチなペプチドが挙げられ、例えばHIV-1 Tat(48-60)、HIV-1 Rev(34-50)、FHV Coat(35-49)、BMV Gag(7-25)、HTLV-II Rex(4-16)、それらの部分ペプチド、またはそのインベルソ（inverso）又はレトロインベルソ（retro-inverso）などであってよい。アミノ酸は、適宜d体を用いてよい。細胞透過性ペプチド等は、周知のリンカーにより、核酸に結合させればよい。このような修飾された核酸や核酸誘導体、核酸派生体、核酸アナログなども、本発明のmiRNAまたはその前駆体に含まれる。
【００３７】
天然のmiR-196aおよびmiR-203を模倣したmiR-196a mimicやmiR-203 mimicは既に商業的に入手可能である（例えばMISSIONTM microRNA Mimics, Sigma-Aldrich Corporation; miRIDIAN miRNA Mimic, Dharmacon, Lafayette, LA）。これらをそれぞれmiR-196aおよびmiR-203として、適宜使用することができる。
【００３８】
患者へのｍｉＲＮＡ又はその前駆体の投与方法としては、特に制限はなく、例えば本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体をそのまま投与してもよく、またリポソーム、リポフェクチン、セルフェクチン、ポリカチオンやナノ粒子などと組み合わせて投与してもよい。
【００３９】
また、本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡやｐｒｅ−ｍｉＲＮＡなど）をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入して投与することもできる。ここで発現ベクターとしては、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍｅｄ．ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２７−３２（１９９０））、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５３２２（１９９０））、ｐＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０−８４２（１９８７）、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ、ｐＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７））、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：１３３（１９９０））、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１：１３０７（１９８７））、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＳ３−３、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ １０８：１９３−２００（１９９１））、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等が挙げられる。
【００４０】
RNAを転写させるためのプロモーターは特に制限はなく、Pol Iプロモーター、Pol IIプロモーター、Pol IIIプロモーター、バクテリオファージ（T4ファージやT7ファージのRNAポリメラーゼ認識配列）のプロモーター等を用いることができる。またポリメラーゼII（Pol II）プロモーターとしては、例えばCMVプロモーターやβ-globinプロモーター等を例示することができる。数百塩基以内の比較的短いRNAを発現させるためには、Pol IIよりも高い発現量が見込めるポリメラーゼIII（Pol III）プロモーターを利用することが好ましい。Pol IIIプロモーターとしては、U6プロモーター、H1プロモーター、tRNAプロモーター、7SKプロモーター、7SLプロモーター、Y3プロモーター、5S rRNAプロモーター、Ad2 VAIおよびVAIIプロモーター等を例示することができる（Das, G. et al., 1988, EMBO J. 7:503-512; Hernandez, N., 1992, pp. 281-313, In S. L. McKnight and K. R. Yamamoto (ed.), Transcriptional regulation, vol. 1. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Kunkel, G. R., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088:1-9; Lobo, S. M., and N. Hernandez, 1989, Cell 58:55-67; Mattaj, I. W. et al., 1988, Cell 55:435-442; Geiduschek, E.P. and G.A. Kassavetis, 1992, pp.247-280, In Transcriptional regulation. Monograph 22 (ed. S.L. McKnight and K.R. Yamamoto), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.）。
【００４１】
また、本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体は、それらをコードする核酸を公知のウイルスベクターに挿入して投与することもできる。たとえば以下のような遺伝子治療用の各種ウイルスベクターが公知である（Ａｄｏｌｐｈ Ｋ.Ｗ. ｅｄ., Ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ, ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ, Ｆｌｏｒｉｄ （１９９６）参照）。
レトロウイルスベクター
アデノウイルスベクター
ワクシニアウイルスベクター
ポックスウイルスベクター
アデノ随伴ウイルスベクター
HVJベクター等
【００４２】
投与は、経口投与でもよく、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、皮膚投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、癌組織への局所投与）でもよい。
【００４３】
本発明に係る小細胞肺癌を治療する方法では、本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体とともに、公知の小細胞肺癌治療剤を投与してもよく、放射線療法を行ってもよい。
【００４４】
本発明に係る小細胞肺癌の予後を改善する方法では、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の発現が減少している患者に対しては、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体を投与することにより行う。投与方法などは本発明に係る小細胞肺癌を治療する方法と同じ方法を用いることができる。用いる化合物や核酸、ベクター、その他の条件についても、本発明に係る小細胞肺癌を治療する方法に関する記載を参照することができ、それらの記載と本発明の改善方法の記載との任意の組み合わせが、本明細書において開示される。
【００４５】
本発明に係る小細胞肺癌を治療する方法では、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現が増加している患者に対しては、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の機能を阻害する。具体的には、例えば、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の機能を低下させる少なくとも1種の化合物を投与することにより行うことができる。
【００４６】
前記機能を低下させる化合物としては、特に制限はないが、例えば、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体に対する二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ構築物を含む）（また１本鎖ＲＮＡが分子内アニールにより二本鎖ＲＮＡになる場合を含む）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、またはそれらを発現する発現ベクターなどを用いることができる。これら化合物は本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を低下させるものであればよく、例えば、該化合物の全部又は一部が本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体の少なくとも一部に結合し、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体が、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体が標的とする塩基配列（標的塩基配列）に結合するのを阻害するものが挙げられる。また、本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を低下させるものであれば、化合物はＲＮＡでもＤＮＡでもよく、同一の鎖にＤＮＡとＲＮＡを含むキメラ型でもよく、また一方の鎖がＤＮＡでもう一方の鎖がＲＮＡであるハイブリッド型も使用することができる。
【００４７】
例えば、ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を低下させる化合物としては、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体にアンタゴニストまたは阻害剤として作用する核酸（核酸アナログを含む）であってよい。例えば該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体に結合するアンチセンス核酸、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体に対するＲＮＡｉ構築物（ｓｉＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡを含む）、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体を切断するリボザイム、及びｍｉＲＮＡ又はその前駆体を阻害する核酸が挙げられる。これらの核酸は、機能を低下させるｍｉＲＮＡ又はその前駆体を認識するために、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の塩基配列の少なくとも一部または全部に対して相補的な塩基配列を含む。
【００４８】
ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子の３’−非翻訳領域に存在する数塩基からなる標的塩基配列を認識する。この標的塩基配列は、例えばｍｉＲＮＡの５’末端の１〜８番目の塩基配列に相補的な塩基配列である（Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：７６９−７７３（２００５））。従って、例えば機能を低下させるｍｉＲＮＡの5'末端の塩基配列と相補的な配列を持つRNAにより、効果的にｍｉＲＮＡを阻害することができる。このようなRNAは、miRNAの上記の5'末端の塩基配列（miRNAの5'末端から1〜8番目、2〜7番目、または3〜8番目の塩基）と完全に相補的であってよく、または1〜2個のギャップがあってもよい。好ましくは、この塩基配列が完全に相補的であって、miRNAに対して、少なくとも8塩基、より好ましくは9塩基、より好ましくは10塩基の相補的な塩基を連続して含む。さらに好ましくは、miRNAに対して、合計11塩基以上、より好ましくは12塩基以上、より好ましくは13塩基以上の相補的な塩基を含む。相補的な塩基は、連続していてもよいし、１または複数（2、3、4個）のギャップを含んでいてもよい。miRNAとのミスマッチは、RISCによる切断を抑制し、miRNAの阻害活性を上昇させ得る。従って、ｍｉＲＮＡと完全に相補的である必要はなく、バルジを含むように設計することもできる。
【００４９】
例えば前記化合物は、本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体の少なくとも一部（例えば6、7、8、9、10、15〜30塩基）または全部に対して少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％の配列相同性（同一性）を有する。
【００５０】
投与する前記化合物は、ヌクレアーゼに対する耐性の向上や安定化のためにその一部が修飾されていてもよく、例えば、ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’-ＯＨをフルオロ化またはメチル化してもよく、コレステロール、ステロイド、胆汁酸やポリエチレングリコールなどを付加してもよい。
【００５１】
例えばｍｉＲＮＡ又はその前駆体に結合するアンチセンス核酸は、約15〜30塩基またはそれ以上を含んでいてよい。またアンチセンス核酸は、一つまたは複数の修飾された主鎖および/または塩基部分を含んでよい。具体的には、アンチセンス核酸は、天然型オリゴヌクレオチド及び改変されたオリゴヌクレオチドが含まれ、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、Ｈ−ホスホネート型、トリエステル、アルファ−アノマー、ペプチド核酸、他の人工核酸、および核酸改変化合物が含まれる。またアンチセンス核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドを含んでもよい。
アンチセンス核酸は、ｍｉＲＮＡの塩基配列に対して、例えば15塩基以上、16、17、18、19、20、25、30、35、40塩基以上相補的な塩基配列を含んでいてよい。相補的な配列は、連続していてもよいし、１または複数（2、3、4個）のギャップを含んでいてもよい（Schmajuk et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 21783-21789, Delihas et al., 1997, Nature, 15, 751-753, Stein et al., 1997, Antisense N.A. Drug Dev., 7, 151, Crooke, 2000, Methods Enzymol., 313, 3-45; Crooke, 1998, Biotech. Genet. Eng. Rev., 15, 121-157, Crooke, 1997, Ad. Pharmacol., 40, 1-49）。アンチセンス核酸は、本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体の少なくとも一部（例えば6、7、8、9、10、15〜30塩基）または全部に対して、例えば少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％の配列相同性（同一性）を有するものであってよい。
【００５２】
ｍｉＲＮＡ又はその前駆体に対するＲＮＡｉ構築物は、例えば標的となるｍｉＲＮＡ又はその前駆体の少なくとも一部に相補的な塩基配列を含み、該ｍｉＲＮＡの機能を低下させる（ｍｉＲＮＡの発現レベルを低下させたり、あるいは該ｍｉＲＮＡの標的遺伝子への結合を阻害したり、該遺伝子の発現レベルを上昇させる）活性を有するＲＮＡが挙げられ、約１４〜５０ヌクレオチド、好ましくは１９〜３０ヌクレオチドであってもよく、またはそれ以上を含んでよい。好ましくは、ＲＮＡｉ構築物の二本鎖部分は、約２１〜２３ヌクレオチド長である。ＲＮＡｉ構築物は、ｓｉＲＮＡ（ヘアピン型の一本鎖ＲＮＡを含む）であってもよく、細胞内でダイサーによるプロセッシングによりｓｉＲＮＡを生成するＲＮＡ（例えば二本鎖ＲＮＡ）であってもよい。ｓｉＲＮＡや二本鎖ＲＮＡなどのＲＮＡｉ構築物はＤＮＡを含んでいてもよい。例えば３’末端にＴＴを含んでもよい。
【００５３】
また、例えば2'-O methyl (2'-OMe) RNA、locked nucleic acid (LNA)、およびアンタゴmirなどのオリゴヌクレオチドにより、効果的に標的ｍｉＲＮＡを阻害できることが知られている他、発現ベクターによる標的ｍｉＲＮＡの阻害方法も公知である（Hutvagner, G. et al. (2004) PLoS Biol, 2, E98; Meister, G. et al. (2004) Rna, 10, 544-550; Orom, U.A. et al. (2006) Gene, 372, 137-141; Krutzfeldt, J. et al. (2005) Nature, 438, 685-689; Ebert, M.S. et al. (2007) Nat Methods, 4, 721-726）。
【００５４】
ｍｉＲＮＡ又はその前駆体を切断するリボザイムは、例えば標的ｍｉＲＮＡ又はその前駆体を開裂するリボザイムが挙げられる（ＷＯ９０／１１３６４；米国特許第５，０９３，２４６号；Sarver et al., Science 247:1222-1225）。リボザイムには、任意の核酸酵素が含まれ、例えばRNA型リボザイム、DNA型リボザイム（デオキシリボザイム）、またはDNA-RNAキメラ型リボザイムであってよい。標的ｍｉＲＮＡ又はその前駆体を特異的に開裂させるために、当業者に周知の技術を利用して、適宜リボザイムを作製することができる（Haselof and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591; Zaug et al., 1984, Science, 224:574-578；Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475；Zaug et al., 1986, Nature, 324:429-433； ＷＯ８８／０４３００； Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216）。
【００５５】
ｍｉＲＮＡ又はその前駆体を阻害する核酸は、好ましくは、miRNA配列と生理的条件下でハイブリダイズする核酸である。生理的条件下とは、例えば1×SSC（1×SSCは150 mM NaCl、15 mM sodium citrate、pH 7.0）、37℃ が挙げられる。より好ましくは、miRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってよい。ストリンジェントな条件とは、例えば1×SSCまたは0.5×SSC、42℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、45℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、50℃の条件である。ハイブリダイゼーションにおいては、例えばmiRNA配列を含むRNAまたはｍｉＲＮＡを阻害する核酸のどちらかを標識し、他方を膜に固定して、両者をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5xSSC、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、例えば37℃、または45℃、または50℃で行えばよい。十分な時間（例えば3、4、5または6時間以上）インキュベートした後、上記の条件で洗浄を行い、標識した核酸がハイブリダイズしているかを検出することにより、当該条件で核酸がハイブリダイズするか否かを決定することができる。尚、核酸はＲＮＡでもＤＮＡでもよく、同一の鎖にＤＮＡとＲＮＡを含むキメラ型でもよく、また一方の鎖がＤＮＡでもう一方の鎖がＲＮＡであるハイブリッド型も使用することができる。
【００５６】
二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムなどはそのまま投与してもよいが、発現ベクターを用いるなど、公知の方法で投与してもよい。発現ベクターとしては、例えば本明細書に記載したものを使用することができる。
【００５７】
効率的なmiRNA阻害剤の製造方法は既に知られている（Vermeulen A et al. RNA 13, 723-730 (2007)）。またmiR-153阻害剤およびmiR-216a阻害剤は既に商業的に入手可能である（例えばSynthetic human miRNA inhibitor oligonucleotide, GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD; miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitor, Dharmacon, Lafayette, LA）。これらを適宜miRNA阻害剤として使用することができる。
【００５８】
本発明に係る小細胞肺癌の予後を改善する方法では、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現が増加している患者に対しては、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体に対する二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムなどを投与することにより行う。投与方法などは本発明に係る小細胞肺癌を治療する方法と同じ方法を用いることができる。また用いる化合物や核酸、ベクター、その他の条件についても、本発明に係る小細胞肺癌を治療する方法に関する上記の記載を参照することができ、それらの記載と本発明の改善方法の記載との任意の組み合わせが、本明細書において開示される。
【００５９】
本発明に係る治療剤および予後改善剤は、有効成分として本発明に係るｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、それらの前駆体又はそれらを発現するベクター、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の機能を阻害する化合物の少なくとも一種を含有し、必要に応じて、製薬上許容される賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤などの医薬組成物として調製することができ、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
【００６０】
本発明に係る治療剤および予後改善剤は、患者の状態に応じて適宜調整し好ましい量を用いることができる。例えば、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができるが、特に限定するものではない。また、例えば、かかる投与量を数回に分けて投与してもよく、また、かかる投与量を数回投与してもよい。
【００６１】
本発明に係る治療剤および予後改善剤は、例えば以下のようなin vitro又はin vivoの系で薬理評価を行うことができる。
【００６２】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬理評価としては、例えば、細胞増殖阻害アッセイおよびコロニー形成阻害アッセイが挙げられる。細胞増殖阻害アッセイでは、例えば本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体が発現している癌細胞に本発明に係る治療剤または予後改善剤を接触させ、所定の時間経過後に３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ、ＭＴＴアッセイなどによって細胞増殖阻害活性を評価することができる。また、コロニー形成アッセイでは、例えば本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体が発現している癌細胞に、本発明に係る治療剤または予後改善剤を接触させ、培養後ギムザ染色し、耐性コロニー数を計数することで評価することができる。尚、本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体が発現している癌細胞のほか、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体をコードする核酸を直接導入した動物細胞や酵母細胞や、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体をコードする核酸を発現するベクターを動物細胞や酵母細胞などの宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞を用いることができる。ｍｉＲＮＡとしては、例えばｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体などを用いることができるが、それらに限定されない。
【００６３】
In vivoでの薬理評価としては、癌動物モデルに適切な量の本発明に係る治療剤または予後改善剤を適切な回数投与することにより行うことができる。評価は例えば、腫瘍の大きさを指標とするができる。癌動物モデルとして、例えば本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体を発現する癌細胞を移植した担癌動物モデルを使用できるが、特にこれに限定されない。
【００６４】
また本発明は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ、それらの前駆体、それらの発現ベクター、および該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する化合物（発現ベクターを含む）からなる群より選択される少なくとも一つの、小細胞肺癌の治療のための使用、該肺癌の予後を改善するための使用、該肺癌の治療のための医薬または薬剤の製造における使用、および該肺癌の予後を改善するための医薬または薬剤の製造における使用に関する。また本発明は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ、それらの前駆体、それらの発現ベクター、および該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する化合物（発現ベクターを含む）からなる群より選択される少なくとも一つの、小細胞肺癌細胞の増殖を抑制するための使用、該細胞の増殖を抑制するための医薬または薬剤の製造における使用に関する。また本発明は、該群より選択される少なくとも一つを含む、小細胞肺癌治療剤、および小細胞肺癌の予後改善剤に関する。また本発明は、該群より選択される少なくとも一つを含む、小細胞肺癌細胞の増殖抑制剤に関する。また本発明は、該群より選択される少なくとも一つおよび薬学的に許容される担体を含む、小細胞肺癌細胞の増殖を抑制するための組成物、小細胞肺癌の治療のための組成物、および小細胞肺癌の予後を改善するための組成物に関する。薬学的に許容される担体としては、例えば蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が例示できる。また植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。
【００６５】
また本発明は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ、それらの前駆体、それらの発現ベクター、および該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する化合物（発現ベクターを含む）からなる群より選択される少なくとも一つの、小細胞肺癌患者由来の生体試料においてｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量が対照生体試料と比較して変化（増加又は減少）している小細胞肺癌を治療するための使用、および、該小細胞肺癌の予後を改善するための使用に関する。また本発明は、該群より選択される少なくとも一つの、小細胞肺癌患者由来の生体試料においてｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量が対照生体試料と比較して変化（増加又は減少）している小細胞肺癌を治療するための医薬または薬剤の製造における使用、および、該小細胞肺癌の予後を改善するための医薬または薬剤の製造における使用に関する。
具体的には、該治療または該予後の改善は、
（１）ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ又は、その前駆体、又はそれらを発現するベクターを投与すること；又は／及び、
（２）ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はそれらの前駆体の機能を阻害する少なくとも1種の化合物を投与すること；を含んでよい。
【００６６】
また本発明は、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、それらの前駆体、およびそれらの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１つの、小細胞肺癌を治療するための使用、小細胞肺癌の予後を改善するための使用、小細胞肺癌を治療するための医薬または薬剤の製造における使用、および小細胞肺癌の予後を改善するための医薬または薬剤の製造における使用に関する。具体的には、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が減少している小細胞肺癌を治療するための使用、該小細胞肺癌の予後を改善するための使用、該小細胞肺癌を治療するための医薬または薬剤の製造における使用、および該小細胞肺癌の予後を改善するための医薬または薬剤の製造における使用に関する。
【００６７】
また本発明は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の機能を阻害する化合物（発現ベクターを含む）の、小細胞肺癌を治療するための使用、小細胞肺癌の予後を改善するための使用、小細胞肺癌を治療するための医薬または薬剤の製造における使用、および小細胞肺癌の予後を改善するための医薬または薬剤の製造における使用に関する。具体的には、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の少なくとも１種の発現量が増加している小細胞肺癌を治療するための使用、該小細胞肺癌の予後を改善するための使用、該小細胞肺癌を治療するための医薬または薬剤の製造における使用、および該小細胞肺癌の予後を改善するための医薬または薬剤の製造における使用に関する。
【００６８】
また本発明は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ、それらの前駆体、および該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する化合物（発現ベクターを含む）からなる群より選択される少なくとも一つの、小細胞肺癌を治療するための使用、小細胞肺癌の予後を改善するための使用、および、該治療または該予後を改善するための医薬または薬剤の製造における使用であって、該治療または該予後の改善は、
（１）小細胞肺癌患者由来の生体対料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量を測定し、
（２）対照生体試料と比較して発現量が減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ又は、その前駆体、又はそれらを発現するベクターを投与すること；又は／及び、
（３）対照生体試料と比較して発現量が増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する少なくとも一種の化合物（発現ベクターを含む）を投与すること工程；
を含む、使用に関する。
【００６９】
また本発明は、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、それらの前駆体、およびそれらの発現ベクターからなる群より選択されるの少なくとも１つの、小細胞肺癌を治療するための使用、小細胞肺癌の予後を改善するための使用、小細胞肺癌を治療するための医薬または薬剤の製造における使用、および小細胞肺癌の予後を改善するための医薬または薬剤の製造における使用であって、該治療または該予後の改善は、
（１）小細胞肺癌患者由来の生体対料において、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量を測定し、
（２）対照生体試料と比較して発現量が減少している場合は、該減少している少なくとも１種のｍｉＲＮＡ又は、その前駆体、又はそれらを発現するベクターを投与すること、
を含む、使用に関する。
また本発明は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ、それらの前駆体の少なくとも１種機能を阻害する化合物（発現ベクターを含む）の、小細胞肺癌を治療するための使用、小細胞肺癌の予後を改善するための使用、小細胞肺癌を治療するための医薬または薬剤の製造における使用、および小細胞肺癌の予後を改善するための医薬または薬剤の製造における使用であって、該治療または該予後の改善は、
（１）小細胞肺癌患者由来の生体対料において、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ、又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の発現量を測定し、
（２）対照生体試料と比較して発現量が増加している場合は、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の機能を阻害する少なくとも1種の化合物（発現ベクターを含む）を投与すること工程、
を含む、使用に関する。
【００７０】
上記の使用においては、本発明の診断、予測、および検査方法の記載を参照することができ、それらの記載と上記の使用に関する記載との任意の組み合わせが、本明細書において開示される。例えば小細胞肺癌患者由来の生体試料、対照生体試料、発現量の測定および比較等については、本発明の診断方法および検査方法に関する記載と同じである。例えば、ｍｉＲ−１９６ａ又はその前駆体の発現量の比較においては、予後が良好である小細胞肺癌患者由来の生体試料における発現量を比較対象とすることができる。
【００７１】
また本発明は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の機能の変化を指標とする、小細胞肺癌治療剤、小細胞肺癌予後改善剤、およびそれらの候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明に係るスクリーニング方法は小細胞肺癌患者由来の生体試料中で特定のｍｉＲＮＡの発現量と予後が関連していることを見出したことに基づくものである。従って、本発明に係る小細胞肺癌治療剤、小細胞肺癌予後改善剤、およびそれらの候補化合物のスクリーニング方法は、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体からなる群より選択される少なくとも一種の機能の変化を指標とするスクリーニング方法である。
【００７２】
ここで「機能の変化」には、例えば本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体の発現量自体が変化する場合が挙げられる。また、本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体の発現量自体は変化しないが該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体が修飾されることによって該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の標的塩基配列を有する遺伝子の発現量を変化させる活性が変化する場合、本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体の発現量自体は変化しないが該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の標的塩基配列を有する遺伝子の発現量を変化させる因子の発現や活性が変化する場合などにより、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の標的塩基配列を有する遺伝子の発現量が変化する場合も含まれる。
【００７３】
第一のスクリーニング方法は、例えば、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の発現量の増加を指標に実施することができる。
より具体的には、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含むスクリーニング方法を挙げることができる。
（Ａ）被検化合物とｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体をコードする核酸が発現している細胞を接触させる工程、
（Ｂ）ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体をコードする核酸の発現量を測定する工程、
（Ｃ）被検化合物を添加しない場合に比べて、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体をコードする核酸の発現量を増加させた被検化合物を選択する工程
【００７４】
第二のスクリーニング方法は、例えば、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の発現量の低下を指標に実施することができる。
より具体的には、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含むスクリーニング方法を挙げることができる。
（Ａ）被検化合物とｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体をコードする核酸が発現している細胞を接触させる工程、
（Ｂ）ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体をコードする核酸の発現量を測定する工程、
（Ｃ）被検化合物を添加しない場合に比べて、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体をコードする核酸の発現量を低下させた被検化合物を選択する工程
【００７５】
第三のスクリーニング方法は、例えば、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体が標的とする塩基配列への、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体の結合の促進を指標に実施することができる。標的塩基配列へのｍｉＲＮＡの結合は、物理的な結合を検出してもよいし、あるいは結合による生物学的効果を指標として、機能的に結合を検出してもよい。
より具体的には、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含むスクリーニング方法を挙げることができる。
（Ａ）被検化合物とｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体をコードする核酸が発現している細胞を接触させる工程、
（Ｂ）ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体が標的とする塩基配列を有する遺伝子（標的遺伝子）の発現量を測定する工程、
（Ｃ）被検化合物を添加しない場合に比べて、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はそれらの前駆体が標的とする塩基配列を有する遺伝子（標的遺伝子）の発現量を低下させた被検化合物を選択する工程
【００７６】
第四のスクリーニング方法は、例えば、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体が標的とする塩基配列への、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体の結合の阻害を指標に実施することができる。
より具体的には、例えば、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を含むスクリーニング方法を挙げることができる。
（Ａ）被検化合物とｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体をコードする核酸が発現している細胞を接触させる工程、
（Ｂ）ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体が標的とする塩基配列を有する遺伝子（標的遺伝子）の発現量を測定する工程、
（Ｃ）被検化合物を添加しない場合に比べて、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体が標的とする塩基配列を有する遺伝子（標的遺伝子）の発現量を増加させた被検化合物を選択する工程
【００７７】
本発明に係る工程（Ａ）における「被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸（核酸アナログを含む）、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、それらを発現するベクター、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物を挙げることができる。核酸は修飾されていてもよく、結合体を含んでいてもよい。それらの具体例は本明細書に記載した通りである。上記被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識を挙げることができる。また、「複数の被検化合物」としては、特に制限はなく、例えば、上記被検化合物に加えて、これらの被検化合物を複数種混合した混合物も含まれる。
【００７８】
本発明において「接触」は、被検化合物が細胞の外および/または中に結果的に接触することであってよく、例えば、細胞の培養液に被検化合物を添加することにより行うことができる。また、適宜トランスフェクション試薬やウイルスベクター等を利用することができる。
【００７９】
ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体、および/または標的塩基配列を有する遺伝子を発現している細胞としては、天然にそれらを発現する細胞や、人工的にそれらを発現する細胞を用いることができる。具体的には、本発明に係るｍｉＲＮＡ又はその前駆体をコードする核酸が発現している細胞としては、例えば、癌細胞のほか、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体をコードする核酸を直接導入した動物細胞や酵母細胞や、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体をコードする核酸を発現するベクターを動物細胞や酵母細胞などの宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞を用いることができる。例えば、ｍｉＲＮＡと標的との結合を指標とする場合や、ｍｉＲＮＡの発現量をｍｉＲＮＡの安定性や分解を指標として検出する場合などにおいては、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体を発現する細胞は、例えば発現ベクター等により、外来的に発現させることができる。転写活性の増減により発現量を変化させる化合物をスクリーニングする場合などにおいては、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ又はそれらの前駆体を発現する細胞は、好ましくは、天然にそれらを発現する細胞が用いられる。
【００８０】
本発明に係る工程（Ｂ）の該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体をコードする核酸及び、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の標的塩基配列を有する遺伝子の発現量の測定には、公知の測定方法をいずれも使用できる。具体的には、例えばＲＴ−ＰＣＲやその変法、ノーザンブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法やマイクロアレイを用いる方法を挙げることができる。また、該ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の標的塩基配列を、公知の適当なレポーター遺伝子発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入し、その細胞と被検物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現を指標に本発明に係るスクリーニングを実施することもできる。すなわち、本発明に係る工程（Ｂ）の標的塩基配列を有する遺伝子としては、該ｍｉＲＮＡの天然の標的遺伝子であってもよいし、該ｍｉＲＮＡの標的塩基配列を組み込んで作製したレポーター遺伝子であってもよい。例えば、レポーター遺伝子（ＧＦＰやルシフェラーゼ遺伝子など）の３’−ＵＴＲ等に標的塩基配列を組み込んで使用することができる。標的塩基配列としては、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズする配列を適宜使用することができ、ｍｉＲＮＡと完全に相補的でなくても、バルジを有するものであっても標的となりうる。また標的塩基配列は、例えばタンデムに、複数コピー挿入して標的遺伝子を構築することができる。具体的なレポーター遺伝子の作製は、公知の方法に従えばよい（Vermeulen A et al. RNA 13, 723-730 (2007); Ebert, M.S. et al., Nat. Methods 4, 721-726 (2007)）。
【００８１】
ｍｉＲＮＡ又はその前駆体が標的とする塩基配列（標的塩基配列）とは、ｍｉＲＮＡ又はその前駆体が翻訳抑制を引き起こすｍＲＮＡの３’−非翻訳領域に存在するｍｉＲＮＡ又はその前駆体によって認識される数塩基からなる核酸の塩基配列をいう。例えば、ｍｉＲＮＡの５’末端の１〜８番目の塩基配列に相補的な塩基配列が標的塩基配列であり（Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：７６９−７７３（２００５））、そのような配列を３’−非翻訳領域に有する遺伝子は標的遺伝子である可能性が高い。標的遺伝子は、例えば、標的塩基配列を用いて遺伝子ＤＡＴＡベースを検索する方法、ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ法（Ｎａｔｕｒｅ  ４６０：４７９−４８６（２００９））によって得ることができる。
【００８２】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。なお本明細書に記載した文献およびその他の参照は、本明細書の一部として組み込まれる。
【実施例１】
【００８３】
材料及び方法
財団法人癌研究会附属病院ないし有明病院で１９９５年から２００８年の間に手術切除された肺癌組織検体のうち、３５人の小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の組織検体、１１人の大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）の組織検体、４人の腺癌（Ａｄ）の組織検体、５人の扁平上皮癌（Ｓｑ）の組織検体、８人の正常肺（ＮＬ）の組織検体を解析に用いた。すべてのサンプルは患者の同意を得て収集され、その使用は当院の倫理委員会の承認を得て行われた。【００８４】
患者背景を表１に示した。大部分は手術前又は後に化学療法を併用されていた。
【表１】
2011125245.tif 000002
【００８５】
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出とマイクロＲＮＡ解析
凍結された組織切片を薄切してＨＥ染色を行い、切片中に腫瘍細胞の占める割合が70％以上であった標本をＴｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出に使用した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製） にて行った。抽出されたＲＮＡの質の評価を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ バイオアナライザ （Ａｇｉｌｅｎｔ社製） にて行った。Ｃｙ３にて標識したＴｏｔａｌ ＲＮＡを、ｍｉＲＢａｓｅデータベースｖ１２．０に登録された８６６個のヒトｍｉＲＮＡが搭載されたＨｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ （Ａｇｉｌｅｎｔ社製） へハイブリダイゼーションした。【００８６】
マイクロアレイデータのコンピューター解析
マイクロアレイのデータはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ１０ソフト（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて解析した。各サンプルのｍｉＲＮＡ発現量の７５%ｔｉｌｅ値にてノーマライゼーションを行い、生シグナル値が５以上のｍｉＲＮＡ ６００個にて解析を行った。発現に差のあるｍｉＲＮＡの抽出は、シグナル比（２．０以上）、およびＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙ ｐｏｓｔ ｈｏｃ検定（ｐ＜０．０５）にて行った。多重検定の補正のためＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を使用した。階層クラスタリングはピアソン係数を類似性の尺度に用いて行った。【００８７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
Ｔａｑｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３、およびｍｉＲ−２１６ａのｃＤＮＡを合成した。上記ｍｉＲＮＡに適合するＴａｑｍａｎプローブとプライマーが含有されたＴａｑｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｓｓａｙｓ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ｍｉＲＮＡ発現量補正のための内因性コントロールとして、Ｕ６を使用した。【００８８】
＜結果＞
ＳＣＬＣで発現変動の見られるｍｉＲＮＡ
統計解析により、ＳＣＬＣと正常肺の間で有意に発現が異なるｍｉＲＮＡが１０１個抽出された。６７個がＳＣＬＣで有意に低下、３４個がＳＣＬＣで有意に上昇していた。【００８９】
階層クラスタリングで分類されるＳＣＬＣのサブグループ
階層クラスタリングにより、２つの群に分類された（図１、  グループ  １、２）。グループ  １には神経内分泌癌のみ（ＳＣＬＣ２０例、ＬＣＮＥＣ３例）で構成されたのに対し、グループ  ２は神経内分泌癌（ＳＣＬＣ１５例、ＬＣＮＥＣ８例）と共に非神経内分泌癌（扁平上皮癌４例）が分類された。残りの非神経内分泌癌もグループ  ２の近縁に分類された。以前本発明者らが行ったｍＲＮＡ発現プロファイリングによる分類（Jones M.H. et al., Lancet, 2004, 363: 775-781）とｍｉＲＮＡ発現プロファイリングによる分類はほぼ一致していた。【００９０】
グループ  １のＳＣＬＣ（ＳＣＬＣ  １）とグループ  ２のＳＣＬＣ（ＳＣＬＣ  ２）の生存曲線及び臨床病理学的背景の比較を、それぞれ図２及び表２に示す。
【表２】
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（表は、６００のｍｉＲＮＡを用いた教師なし階層クラスタリングにより同定されたＳＣＬＣサブグループ間の臨床的特徴の比較を表す。）【００９１】
ＳＣＬＣ  ２は、ＳＣＬＣ  １に比べて有意に予後良好であった（５年生存率７９％対０％、ｐ＝０．００７）。手術前に化学療法が施行され治療効果判定が可能であった１２例を検討したところ、ＳＣＬＣ  １では奏功６例／不変３例、ＳＣＬＣ  ２では奏功２例／不変１例であり、化学療法の感受性に明らかな相違は認められなかった。【００９２】
治療開始前のｐｒｏＧＲＰ値が測定されていたＳＣＬＣ  １の１４例とＳＣＬＣ  ２の１３例では、ＳＣＬＣ  ２で血清ｐｒｏＧＲＰ値が有意に低かった（２６．４ｐｇ／ｍｌ対５０．９ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０１）。ｐｒｏＧＲＰ値は腫瘍量とも相関するが、ｐｒｏＧＲＰが測定された症例の病期は、両群で有意な差を認めなかった（ＳＣＬＣ  １；Ｓｔａｇｅ  Ｉが６例、Ｓｔａｇｅ  ＩＩ−ＩＶが８例。ＳＣＬＣ  ２；Ｓｔａｇｅ  Ｉが４例、Ｓｔａｇｅ  ＩＩ−ＩＶが９例。ｐ＝０．８０）。喫煙指数がＳＣＬＣ  ２で有意に高かった（１３４７対８２４、ｐ＝０．０３）。腫瘍径はＳＣＬＣ  ２で大きい傾向があった。ｐｒｏＧＲＰ値は腫瘍量にも影響されるが、今回の検討では両群の間に病期の差は明らかでなく、値の相違はｐｒｏＧＲＰ産生能の相違を反映している可能性があると考えられた。これらの結果から、神経内分泌性がＳＣＬＣの予後に関与することが推測される。また、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ発現低下群、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３発現増加群は、神経内分泌癌で上昇する血清ｐｒｏＧＲＰ値が低い傾向にあり、神経内分泌マーカーの陽性率（免疫染色）が低い傾向にあった。
【実施例２】
【００９３】
ＳＣＬＣの予後とｍｉＲＮＡ発現
実施例１で解析に用いたＳＣＬＣ患者の組織検体のうち、3年以上無再発生存したＳＣＬＣ10例の組織検体と3年未満に癌により死亡したＳＣＬＣ患者14例の組織検体を選択し、両者間で発現に差があるｍｉＲＮＡを探索した。発現に差のあるｍｉＲＮＡの抽出は、シグナル比（２．０以上）、およびＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙ ｐｏｓｔ ｈｏｃ検定（ｐ＜０．０５）にて行った。【００９４】
解析の結果、両者間で発現に差があるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はｍｉＲ−２１６ａを見出した。正常肺の組織検体（ＮＬ）、肺腺癌の組織検体（Ａｄ）、肺扁平上皮癌の組織検体（Ｓｑ）、および階層クラスタリングで分類されたSCLC予後良好群（ＳＣＬＣ２）と予後不良群（ＳＣＬＣ１）のｍｉＲＮＡ発現量を比較した（図３（Ａ））。４個のうち、miR-153、miR-203、miR-216aはSCLC予後不良群（SCLC1）のみで発現変動が見られ、SCLC予後良好群（SCLC2）における発現は、正常肺やSCLC以外の肺癌と同様であった。特に、ｍｉＲ−１５３及びｍｉＲ−２１６ａの発現量は予後不良群において、いずれの群よりも増加しており、ｍｉＲ−２０３の発現量はいずれの群よりも低下していた。また、ｍｉＲ−１９６ａの発現量は、予後不良群に比べ、予後良好群で発現が増加していた。
予後良好なSCLCのmiRNA発現プロフィールは正常肺や非神経内分泌癌に近いことが、階層クラスタリングにより示唆されたので、これらmiR-153、miR-216a、miR-203は特に予後に関連する可能性が高いと考えられた。そこで、これら３個については定量RT-PCRでも発現量を測定した。マイクロアレイのデータと定量RT-PCRの結果はよく相関した（図３（Ｂ））。また予後不良群（SCLC1）と比べた場合、予後良好群（SCLC2）ではmiR-153とmiR-216aの発現が有意に低下、miR-203とmiR-196aの発現が有意に上昇していた。【００９５】
実施例１で解析に用いたＳＣＬＣ患者３５例を、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−２０３又はｍｉＲ−２１６ａのそれぞれについて、中央値をカットオフ値として発現低下群と発現増加群に分類した。両群の臨床学的特徴と生存曲線を、表３および図４に示した。ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２１６ａ発現低下群、ｍｉＲ−１９６ａ発現増加群は有意に予後良好であった。ｍｉＲ−２０３発現増加群も予後良好な傾向であった。【００９６】
【表３】
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（表は、ＳＣＬＣ症例をｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１６ａ、およびｍｉＲ−１９６ａの高／低発現群に分類したときの臨床的特徴の比較を示す。喫煙インデックスおよび化学療法への反応性は表２の脚注を参照。）【００９７】
また、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１５３、およびｍｉＲ−２１６ａの３つを用いた階層クラスタリングにより、実施例１で解析に用いたＳＣＬＣ患者３５例を分類した結果と各グループの生存曲線を図５に、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−１５３、およびｍｉＲ−２１６ａの４つを用いた同様のクラスタリングによる分類と各グループの生存曲線を図６に示した。全ＳＣＬＣ患者を、予後良好な群と不良な群に分類することができた。【００９８】
ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２０３、およびｍｉＲ−２１６ａの３つを用いて構築された予後予測モデルに基づいて、３５例のＳＣＬＣ患者の分類を行った。本モデルのアルゴリズムについて簡潔に述べると、３つの各ｍｉＲＮＡについて判定樹法によりカットオフ値を決定し（ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−２０３、およびｍｉＲ−２１６ａはそれぞれ、−０．７６４、−１．４６、および−１．６７；ｌｏｇ１０値、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる測定）、これをもとに３つのｍｉＲＮＡの多数決にて患者を高リスク群と低リスク群に分類した。【００９９】
分類された予後不良群（高リスク）および予後良好群（低リスク）のＳＣＬＣ特異的生存曲線を図７に、患者の臨床特性を表４に示す。【０１００】
【表４】
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【０１０１】
高リスク群に比べ、低リスク群は有意に予後良好であった（５年生存で０％対８０．４％；ｐ＝０．００４）。病期の分布は２群で類似していたが、治療前にｐｒｏＧＲＰレベルを測定した２７患者において、血清ｐｒｏＧＲＰレベルは高リスク群に比べ低リスク群で有意に低値を示した（２６．５ｐｇ／ｍｌ対５９．９ｐｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０１）。累積的喫煙は低リスク群の方が高リスク群より有意に高かった（１３０６対８３１；ｐ＝０．０４）。また術前化学療法を実施した１２ケースにおいて感受性の明らかな違いは認められなかった（ＰＲ：ＮＣ比は高リスク群で６：３、低リスク群で２：１）。腫瘍の組織学的所見は２群で緊密に似通っており、予備知識なく見分けるのは困難であった（図８）。従って、本発明は組織学的所見からは区別が難しい試料においても適用できる。【０１０２】
パフォーマンスの検証のために３５例のＳＣＬＣ患者をランダムにラーニングセット（患者数２０）およびテストセット（患者数１５）に分けた。なおラーニングセットはＳＣＬＣ１患者１１人とＳＣＬＣ２患者９人で構成されるように選択した。ラーニングセットにおいて決定されたカットオフ値を基にテストセットの患者を分類し、ログランク試験による生存解析と、６００個のｍｉＲＮＡの階層クラスタリングによる分類との一致性の評価を行った。この作業を１，０００回反復した。その結果、ログランク試験のｐ値の中央値および幾何学的平均は各々０．０４８および０．０４１で、本モデルによる予後予測は平均的には正確であることが示された（図９（Ａ））。階層クラスタリングとの一致率および不一致率の平均は各々０．８７４および０．１２６であり、本モデルによる分類は６００のｍｉＲＮＡによる分類をおおむね正確に再現できることが示された（図９（Ｂ））。
【実施例３】
【０１０３】
癌細胞増殖抑制のアッセイ
ＳＣＬＣ細胞株である、ＭＳ１およびＤＭＳ５３を用いる。ＭＳ１は１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭI培地、ＤＭＳ53は１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて、それぞれ培養する。ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ／Ｍｉｍｉｃ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，  Ｃｏ，  ＵＳＡ）により、ｍｉＲ−１５３およびｍｉＲ−２１６ａの機能阻害とｍｉＲ−２０３とｍｉＲ−１９６ａの機能増強を行う。ＭＳ１細胞への導入はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ａｍａｘａ）を用いてエレクトロポレーション法にて行う。ＤＭＳ５３細胞への導入はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行う。ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ／Ｍｉｍｉｃネガティブコントロールを導入した細胞を、対照として使用する。導入細胞の増殖曲線により、ｍｉＲＮＡの機能制御による治療効果を検出する。
また導入細胞よりセルブロックを作成し、神経内分泌マーカー（Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ，  ＣｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎＡ，  ＮＣＡＭ）の免疫染色を行い、また導入細胞よりタンパクを抽出し、神経内分泌マーカー（Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ，  ＣｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎＡ，  ＮＣＡＭ）の定量を行って、導入細胞の神経内分泌性格を評価する。
【実施例４】
【０１０４】
miRNAおよびmiRNA阻害剤による小細胞肺癌細胞の増殖抑制
接着性SCLC細胞株であるDMS53（ATCC CRL-2062）及びSBC-5（JCRB NO: JCRB0819, Mitsuhashi,Y. et al., Cancer, 70:2540-2546, 1992）を用いた。DMS-53ではmiR-153は高発現し、SBC-5ではmiR-203の発現は低い(図10 (A) および (C))。DMS53及びSBC-5は10%FBS添加DMEM培地にて培養した。miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors/Mimic (Dharmacon, Lafayette, Co, USA) により、miRIDIAN miR-153 inhibitor及びmiRIDIAN miR-203 mimicを作製し、miR-153の機能阻害とmiR-203の機能増強を行った。
(1) miRIDIAN Hairpin Inhibitor IH-300616-08-0005, Human hsa-miR-153, MIMAT0000439, MI0000464, 5nmol (Mature microRNA Sequence: UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC／配列番号：1) ：ThermoFisher Dharmacon製
(2) miRIDIAN Mimic C-300562-03-0005, Human hsa-miR-203, MIMAT0000264, MI0000283, 5nmol (Mature microRNA Sequence: GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG／配列番号：7) ：ThermoFisher Dharmacon製【０１０５】
(1) DMS-53におけるmiR-153 inhibitor導入実験
実験前日に1ディッシュ (35mm) に5.0x105cellずつ植えた。当日、LipofectamineTM 2000 (Invitrogen：cat. #11668-019) 3μLにOPTI-MEMTM I (GIBCO：cat.#31985)(以下OPTI-MEMとする) 150μLの割合で加えた。軽くボルテックス、スピンダウンの上、室温にて5分間放置した。一方でオリゴ (miR-153 inhibitorならびにnegative control*1) も同様にそれぞれ60pmol/3μLに希釈し、そのうち3μLにOPTI-MEM 150μLの割合で加えて軽くボルテックス、スピンダウンした。これらを加え室温で20分放置し、細胞と培養液の入った上記のディッシュに306μLずつ分注し、よく混和した。37℃、5% CO2 インキュベーター内で数日間培養し増殖を確認した。0hr、48hrs、122hrs(confluent)にて細胞数をカウントし比較検討した。
(*1: miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitor Negative Control #1 IN-001005-01-05(catalog item))【０１０６】
(2) SBC-5におけるmiR-203mimic導入実験
DMS-53における実験と同様に、実験前日に1ディッシュ (35mm) に3.0x105cellずつ植えた。当日、LipofectamineTM 2000 3μLにOPTI-MEM 150μLの割合で加えた。軽くボルテックス、スピンダウンの上、室温にて5分間放置した。一方でオリゴ (miR-203 mimicならびにnegative control*2) も同様にそれぞれ60pmol/3μLに希釈し、そのうち3μLにOPTI-MEM 150μLの割合で加えて軽くボルテックス、スピンダウンした。これらを加え室温で20分放置し、細胞と培養液の入った上記のディッシュに306μLずつ分注し、よく混和した。37℃、5% CO2 インキュベーター内で数日間培養し増殖を確認した。0hr、23hrs、48hrs、51hrs、69hrs、96hrs、120hrs(confluent)にて細胞数をカウントし比較検討した。
(*2: miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1 CN-001000-01-05(catalog item))【０１０７】
(3) 結果
miRIDIAN miR-153 inhibitorはDMS-53の増殖を抑制することが確認された。また、miRIDIAN miR-203 mimicはSBC-5の増殖を低下させた（図１０）。
従って、miR-153の阻害剤は、特にmiR-153が高発現している患者において、小細胞肺癌の治療剤として使用できる可能性があることが明らかとなった。また、miR-203のmimicは、特にmiR-203の発現が低下している患者において、小細胞肺癌の治療剤として使用できる可能性があることが明らかとなった。これらの結果から、miR-216aの阻害剤及びmiR-196aのmimicも同様に小細胞肺癌の治療剤として使用できる可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明により、ｍｉＲＮＡを利用したＳＣＬＣの予後の予測、検査、および診断方法が提供された。また本発明により、ｍｉＲＮＡを利用したＳＣＬＣ治療方法、ＳＣＬＣ予後改善方法、ＳＣＬＣ治療剤、ＳＣＬＣ予後改善剤、及びＳＣＬＣ治療薬・予後改善剤のスクリーニング方法が提供された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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