(57)【要約】  環境要因等における各種ストレスに影響されることなく、その植物における特定の栄養素の状態を反映することのできる栄養状態診断用マーカーを選択する方法、及び前記方法によって選択された栄養状態診断用マーカーを用いることで、その植物における特定の栄養素の状態を診断する方法を提供する。  特定の栄養素の量にのみ依存して量的変化を生じる植物の代謝産物を、その植物における該栄養素の状態を反映する栄養状態診断用マーカーとして選択する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の栄養素を欠乏させた植物及び前記栄養素を供与した前記植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、
抽出ステップで得られたそれぞれの代謝産物の蓄積量を比較し、両者間で統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を前記特定の栄養素の状態を診断する栄養状態診断用マーカーとして選択する選択ステップ、
を含む植物の栄養状態診断用マーカーの選択方法。
【請求項２】
特定の栄養素を欠乏させた状態が特定の栄養素を除去した状態である、請求項１に記載の選択方法。
【請求項３】
特定の栄養素を欠乏させた植物及び前記栄養素を供与した前記植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する第１抽出ステップ、
第１抽出ステップで得られたそれぞれの代謝産物の蓄積量を比較し、両者間で統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を第１マーカー候補として選択する第１選択ステップ、
前記特定の栄養素を第１抽出ステップの欠乏量とは異なる欠乏量で供与した前記植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する第２抽出ステップ、
第１抽出ステップで得られた少なくとも一方の代謝産物と第２抽出ステップで得られた前記代謝産物のそれぞれの蓄積量を比較し、両者間で統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を第２マーカー候補として選択する第２選択ステップ、及び
第１マーカー候補からなる候補群と第２マーカー候補からなる候補群の両候補群に共通して存在する代謝産物を前記特定の栄養素の状態を診断する栄養状態診断用マーカーとして選択する第３選択ステップ
を含む植物の栄養状態診断用マーカーの選択方法。
【請求項４】
第１抽出ステップにおける特定の栄養素を欠乏させた状態が特定の栄養素を除去した状態である、請求項３に記載の選択方法。
【請求項５】
統計学的に有意な量的差異が１．３倍以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の選択方法。
【請求項６】
代謝産物の蓄積量の比較が質量分析法を用いて行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の選択方法。
【請求項７】
統計学的処理が多重比較検定法を用いて行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の選択方法。
【請求項８】
前記特定の栄養素が窒素（N）、リン（P）、カリウム（K）、ホウ素（Ｂ）又はそれらの組合せである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の選択方法。
【請求項９】
前記代謝産物がタンパク質及び／又は低分子化合物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の選択方法。
【請求項１０】
表２で示されるいずれか一の植物の窒素状態診断用マーカー。
【請求項１１】
植物がユーカリプタス・グロブルス（Eucalyptus globulus）であって、かつ表２においてMass No.1〜270で示される、請求項１０に記載の窒素状態診断用マーカー。
【請求項１２】
植物がユーカリプタス・デグルプタ×カマルドレンシス（Eucalyptus degulpta×camaldulensis）であって、かつ表２においてMass No. 15、31、42、42、43、51、57、59、68、84、91、104、110、111、148、149、156、241、263、264及び269で示される、請求項１０に記載の窒素状態診断用マーカー。
【請求項１３】
植物がイネ（Oryza sativa）であって、かつ表２においてMass No. 5、170及び173で示される、請求項１０に記載の窒素状態診断用マーカー。
【請求項１４】
植物がトウモロコシ（Zea mays）であって、かつ表２においてMass No. 7、17、22、29、30、35、37、48、60、65、72、76、77、88、89、92、106、140、142、148、153、154、242及び257で示される、請求項１０に記載の窒素状態診断用マーカー。
【請求項１５】
植物がトマト（Solanum lycopersicum）であって、かつ表２においてMass No. 43、246及び265で示される、請求項１０に記載の窒素状態診断用マーカー。
【請求項１６】
植物がナス（Solanum melongena）であって、かつ表２においてMass No. 104、144、242、257及び265で示される、請求項１０に記載の窒素状態診断用マーカー。
【請求項１７】
植物における特定の栄養素の状態を診断する方法であって、
被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する代謝産物抽出ステップ、
前記代謝産物抽出ステップで得られた抽出物中に含まれる請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によって選択された前記特定の栄養素に関する栄養状態診断用マーカーの蓄積量を対照である前記栄養素を供与した前記植物のそれと比較し、その差異の状態及び度合いから被検植物における該栄養素の不足又は充足を判定する判定ステップ
を含む、前記方法。
【請求項１８】
蓄積量が特定の栄養素の量の増加に伴って増加する性質の栄養状態診断用マーカーを用いる場合には、被検植物の栄養状態診断用マーカーの蓄積量が対照の蓄積量よりも小さいときに被検植物におけるその栄養素が不足傾向にあると判定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
蓄積量が特定の栄養素の量の増加に伴って減少する性質の栄養状態診断用マーカーを用いる場合には、被検植物の栄養状態診断用マーカーの蓄積量が対照の蓄積量よりも大きいときに被検植物におけるその栄養素が不足傾向にあると判定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記代謝産物がタンパク質及び／又は低分子化合物である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項２１】
前記特定の栄養素が窒素（N）、リン（P）、カリウム（K）、ホウ素（Ｂ）又はそれらの組合せである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項２２】
前記特定の栄養素が窒素であり、かつ植物の栄養状態診断用マーカーが表２で示される、請求項２１に記載の診断方法。
【請求項２３】
植物がユーカリプタス・グロブルスであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてNo.1〜270で示される、請求項２２に記載の診断方法。
【請求項２４】
植物がユーカリプタス・デグルプタ×カマルドレンシスであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてMass No. 15、31、42、42、43、51、57、59、68、84、91、104、110、111、148、149、156、241、263、264及び269で示される、請求項２２に記載の診断方法。
【請求項２５】
植物がイネであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてMass No. 5、170及び173で示される、請求項２２に記載の診断方法。
【請求項２６】
植物がトウモロコシであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてMass No. 7、17、22、29、30、35、37、48、60、65、72、76、77、88、89、92、106、140、148、142、153、154、242及び257で示される、請求項２２に記載の診断方法。
【請求項２７】
植物がトマトであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてMass No. 43、246及び265で示される、請求項２２に記載の診断方法。
【請求項２８】
植物がナスであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてMass No. 104、144、242、257及び265で示される、請求項２２に記載の診断方法。
【請求項２９】
請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の植物における特定の栄養素の状態を診断する方法によって得られた診断結果に基づいて、その植物におけるその特定の栄養素の施肥量を決定する施肥量決定方法。
【請求項３０】
前記得られた診断結果が、
前記特定の栄養素が不足傾向にあるという場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を診断直前の施肥量よりも増やし、又は
前記特定の栄養素が充足しているという場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を診断直前の施肥量で維持する、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
同一植物体において、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の診断方法によって得られた特定の栄養素の状態に関する経時的な二以上の診断結果に基づいて、その植物体における成長状態を判定する、植物の成長状態判定方法。
【請求項３２】
特定の栄養素に関する経時的な二以上の診断結果が、
いずれも充足していることを示す場合には、成長状態が良好であると判定し、
不足から充足に移行していることを示す場合には、成長状態が改善傾向にあると判定し、
充足から不足に移行していることを示す場合には、成長状態が悪化傾向にあると判定し、又は
いずれも不足していることを示す場合には、成長状態が悪いと判定する、
請求項３１記載の判定方法。
【請求項３３】
請求項３１又は３２に記載の植物体の成長状態を判定する方法によって得えられた判定結果に基づいて、その植物におけるその特定の栄養素の施肥量を決定する施肥量決定方法。
【請求項３４】
前記特定の栄養素に関する経時的な二以上の診断結果から、その植物体の成長状態が、
良好であるという判定結果が得られた場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を、当該判定のために行なったいずれかの診断直前の施肥量で維持し、
改善傾向にあるという判定結果が得られた場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を、当該判定のために行なった最後の診断直前の施肥量で維持し、
悪化傾向にあるという判定結果が得られた場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を、当該判定のために行なった最初の診断直前の施肥量に戻し若しくは増やし、又は
悪いという判定結果が得られた場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を、当該判定のために行なった診断の施肥量よりも増やす、
請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の栄養状態診断用マーカー選択方法、植物の栄養状態診断方法、成長状態判定方法、及び窒素状態診断用マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
農林業において、目的の植物を短期間で効率よく成長させるためには、必要時に必要な栄養素を過不足なく与えることが重要である。そのためには、植物の栄養状態を正確に判断し、その結果に応じて適切な施肥を行う必要がある。【０００３】
従来、植物の栄養状態は、栽培者の経験と勘に基づいて判断され、施肥もその判断に基づいて施行されるという主観的方法が採られてきた。しかし、このような判断のできる熟練した栽培者の育成には数年を要し、また時として栽培者によって判断が異なるという問題を包含している。さらに、植物が必要とする栄養を必要な時に必要な量だけ本当に供与できているのか否か、あるいは施肥した栄養が植物の成長にどれほど寄与しているのかが客観的に判断できないという問題がある。【０００４】
近年になって、葉に含まれる、窒素量、リン量、カリウム量等の元素量をケルダール法やICP（誘導結合プラズマ）分析法により分析し、その数値の大小からその植物の栄養状態を推定して肥料の種類・量を決める方法が開発された（非特許文献１）。この方法は、客観的判断手法に基づくものであり、理論的にも優れた方法である。しかし、一般的に植物は、例えば、同じ肥料を同じ量だけ与えて育ても、生育する環境や場所の違い、すなわち、環境要因が植物に与えるストレスの違いによって含有する元素量に大きな違いを生じる。それ故、この方法は、同一環境下、すなわち、同一ストレス下で栽培している植物にしか適用できず、応用範囲が狭く、あまり実用的ではないという問題がある。【０００５】
また、葉の分光反射特性を利用して、植物体の健全度を推定する方法もある（特許文献１）。この方法は、様々な植物体の分光反射スペクトルのデータベースを作成し、そのデータベースと高解像度衛星のリモートセンシング技術による植物の分光反射率の抽出データを照合することにより植物体の活力度を測定するものである。しかし、この方法も、同一個体内の異なる葉や日時の違いによりスペクトルに相違が生じるため、同一条件で栽培している植物にしか適用できず、あまり実用的ではない等の欠点がある。【０００６】
以上のように、各種ストレスに影響されることなく、植物の栄養状態を正確にかつ客観的判断できる方法は、従来知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１６６９６７
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】（財団法人  日本土壌協会  土壌機能モニタリング調査のための土壌、水質及び植物体分析法）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、環境要因等における各種ストレスに影響されることなく、その植物における特定の栄養素の状態を反映することのできる栄養状態診断用マーカーを選択する方法を開発し、提供することである。【００１０】
また、前記方法によって選択された栄養状態診断用マーカーを用いることで、その植物における特定の栄養素の状態を各種ストレスに影響されることなく正確に診断する方法を提供することである。【００１１】
さらに、前記方法によって選択された栄養状態診断用マーカーを用いることで、被検植物の成長状態を判定し、また将来の成長性を予測する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明者らは、これまで植物の栄養状態との関連性が知られていなかった代謝産物に着目して鋭意研究を行った。その結果、特定の栄養素の状態のみに依存して量的変化を生じる植物の代謝産物が、環境における各種ストレスに影響されることなく、その植物における当該特定の栄養素の状態を反映する栄養状態診断用マーカーとなり得ることを見出した。また、この栄養状態診断用マーカーを用いることで、被検植物における特定の栄養素の状態を正確に診断できること及びその成長状態を判定可能なことも明らかとなった。本発明は、当該知見に基づくものであり、すなわち以下を提供する。【００１３】
（１）特定の栄養素を欠乏させた植物及び前記栄養素を供与した前記植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、抽出ステップで得られたそれぞれの代謝産物の蓄積量を比較し、両者間で統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を前記特定の栄養素の状態を診断する栄養状態診断用マーカーとして選択する選択ステップ、を含む植物の栄養状態診断用マーカーの選択方法。【００１４】
（２）特定の栄養素を欠乏させた状態が特定の栄養素を除去した状態である、（１）に記載の選択方法。【００１５】
（３）特定の栄養素を欠乏させた植物及び前記栄養素を供与した前記植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する第１抽出ステップ、第１抽出ステップで得られたそれぞれの代謝産物の蓄積量を比較し、両者間で統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を第１マーカー候補として選択する第１選択ステップ、前記特定の栄養素を第１抽出ステップの欠乏量とは異なる欠乏量で供給した前記植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する第２抽出ステップ、第１抽出ステップの少なくとも一方の代謝産物と第２抽出ステップで得られた前記代謝産物のそれぞれの蓄積量を比較し、両者間で統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を第２マーカー候補として選択する第２選択ステップ、及び第１マーカー候補からなる候補群と第２マーカー候補からなる候補群の両候補群に共通して存在する代謝産物を前記特定の栄養素の状態を診断する栄養状態診断用マーカーとして選択する第３選択ステップを含む植物の栄養状態診断用マーカーの選択方法。【００１６】
（４）第１抽出ステップにおける２つの植物の一方が前記特定の栄養素を欠乏させた状態が特定の栄養素を除去した状態である、（３）に記載の選択方法。【００１７】
（５）統計学的に有意な量的差異が１．３倍以上である、（１）〜（４）のいずれかに記載の選択方法。【００１８】
（６）代謝産物の蓄積量の比較が質量分析法を用いて行われる、（１）〜（５）のいずれかに記載の選択方法。【００１９】
（７）統計学的処理が多重比較検定法を用いて行われる、（１）〜（６）のいずれかに記載の選択方法。【００２０】
（８）前記特定の栄養素が窒素（N）、リン（P）、カリウム（K）、ホウ素（B）又はそれらの組合せである、（１）〜（７）のいずれかに記載の選択方法。【００２１】
（９）前記代謝産物がタンパク質及び／又は低分子化合物である、（１）〜（８）のいずれかに記載の選択方法。【００２２】
（１０）表２で示されるいずれか一の植物の窒素状態診断用マーカー。【００２３】
（１１）植物がユーカリプタス・グロブルス（Eucalyptus globulus）であって、かつ表２においてMass No.1〜270で示される、（１０）に記載の窒素状態診断用マーカー。【００２４】
（１２）植物がユーカリプタス・デグルプタ×カマルドレンシス（Eucalyptus camaldulensis×degulpta）であって、かつ表２においてMass No. 15、31、42、42、43、51、57、59、68、84、91、104、110、111、148、149、156、241、263、264及び269で示される、（１０）に記載の窒素状態診断用マーカー。【００２５】
（１３）植物がイネ（Oryza sativa）であって、かつ表２においてMass No. 5、170及び173で示される、（１０）に記載の窒素状態診断用マーカー。【００２６】
（１４）植物がトウモロコシ（Zea mays）であって、かつ表２においてMass No. 7、17、22、29、30、35、37、48、60、65、72、76、77、88、89、92、106、140、142、148、153、154、242及び257で示される、（１０）に記載の窒素状態診断用マーカー。【００２７】
（１５）植物がトマト（Solanum lycopersicum）であって、かつ表２においてMass No. 43、246及び265で示される、（１０）に記載の窒素状態診断用マーカー。【００２８】
（１６）植物がナス（Solanum melongena）であって、かつ表２においてMass No. 104、144、242、257及び265で示される、（１０）に記載の窒素状態診断用マーカー。【００２９】
（１７）植物における特定の栄養素の状態を診断する方法であって、被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する代謝産物抽出ステップ、前記代謝産物抽出ステップで得られた抽出物中に含まれる（１）〜（９）のいずれかに記載の方法によって選択された栄養状態診断用マーカーの蓄積量を対照である前記栄養素を供与した前記植物のそれと比較し、その差異の状態及び度合いから被検植物における該栄養素の不足又は充足を判定する判定ステップを含む、前記方法。【００３０】
（１８）蓄積量が特定の栄養素の量の増加に伴って増加する性質の栄養状態診断用マーカーを用いる場合には、被検植物の栄養状態診断用マーカーの蓄積量が対照の蓄積量よりも小さいときに被検植物におけるその栄養素が不足傾向にあると判定する、（１７）に記載の方法。【００３１】
（１９）蓄積量が特定の栄養素の量の増加に伴って減少する性質の栄養状態診断用マーカーを用いる場合には、被検植物の栄養状態診断用マーカーの蓄積量が対照の蓄積量よりも大きいときに被検植物におけるその栄養素が不足傾向にあると判定する、（１７）に記載の方法。【００３２】
（２０）前記代謝産物がタンパク質及び／又は低分子化合物である、（１７）〜（１９）のいずれかに記載の診断方法。【００３３】
（２１）前記特定の栄養素が窒素（N）、リン（P）、カリウム（K）、ホウ素（B）又はそれらの組み合わせである、（１７）〜（２０）のいずれかに記載の診断方法。【００３４】
（２２）前記特定の栄養素が窒素であり、かつ植物の栄養状態診断用マーカーが表２で示される、（２１）に記載の診断方法。【００３５】
（２３）植物がユーカリプタス・グロブルスであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてNo.1〜270で示される、（２２）に記載の診断方法。【００３６】
（２４）植物がユーカリプタス・デグルプタ×カマルドレンシスであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてMass No. 15、31、42、42、43、51、57、59、68、84、91、104、110、111、148、149、156、241、263、264及び269で示される、（２２）に記載の診断方法。【００３７】
（２５）植物がイネであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてMass No. 5、170及び173で示される、（２２）に記載の診断方法。【００３８】
（２６）植物がトウモロコシであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてMass No. 7、17、22、29、30、35、37、48、60、65、72、76、77、88、89、92、106、140、148、142、153、154、242及び257で示される、（２２）に記載の診断方法。【００３９】
（２７）植物がトマトであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてMass No. 43、246及び265で示される、（２２）に記載の診断方法。【００４０】
（２８）植物がナスであり、かつ栄養状態診断用マーカーが表２においてMass No. 104、144、242、257及び265で示される、（２２）に記載の診断方法。【００４１】
（２９）前記（１７）〜（２８）のいずれかに記載の植物における特定の栄養素の状態を診断する方法によって得られた診断結果に基づいて、その植物におけるその特定の栄養素の施肥量を決定する施肥量決定方法。【００４２】
（３０）前記得られた診断結果が、前記特定の栄養素が不足傾向にあるという場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を診断直前の施肥量よりも増やし、又は前記特定の栄養素が充足しているという場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を診断直前の施肥量で維持する、（２９）に記載の方法。【００４３】
（３１）同一植物体において、（１７）〜（２０）のいずれかに記載の診断方法によって得られた特定の栄養素の状態に関する経時的な二以上の診断結果に基づいて、その植物体における成長状態を判定する、植物の成長状態判定方法。【００４４】
（３２）特定の栄養素に関する経時的な二以上の診断結果が、いずれも充足していることを示す場合には、成長状態が良好であると判定し、不足から充足に移行していることを示す場合には、成長状態が改善傾向にあると判定し、充足から不足に移行していることを示す場合には、成長状態が悪化傾向にあると判定し、いずれも不足していることを示す場合には、成長状態が悪いと判定する、（３１）に記載の判定方法。【００４５】
（３３）（３１）又は（３２）に記載の植物体の成長状態を判定する方法によって得えられた判定結果に基づいて、その植物におけるその特定の栄養素の施肥量を決定する施肥量決定方法。【００４６】
（３４）前記特定の栄養素に関する経時的な二以上の診断結果から、その植物体の成長状態が、良好であるという判定結果が得られた場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を、当該判定のために行なったいずれかの診断直前の施肥量で維持し、改善傾向にあるという判定結果が得られた場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を、当該判定のために行なった最後の診断直前の施肥量で維持し、悪化傾向にあるという判定結果が得られた場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を、当該判定のために行なった最初の診断直前の施肥量に戻し若しくは増やし、又は悪いという判定結果が得られた場合には、その植物における当該特定の栄養素の施肥量を、当該判定のために行なった診断の施肥量よりも増やす、（３３）に記載の方法。【００４７】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-200839号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００４８】
本発明の栄養状態診断用マーカーを選択する方法によれば、環境要因等における各種ストレスに影響されることなく、その植物における特定の栄養素の状態を反映できる栄養状態診断用マーカーを選択することができる。【００４９】
また、本発明の植物の栄養状態診断方法によれば、被検植物における特定の栄養素の状態を各種ストレスに影響されることなく的確に診断することができる。【００５０】
さらに、本発明の植物の成長状態判定法によれば、被検植物の成長状態を判定し、また将来の成長性を予測することができる。【００５１】
そして、本発明の施肥量決定方法によれば、前記本発明の栄養状態診断方法又は成長状態判定法によって得られた結果から検査に供した植物に、特定の栄養素を適切な量で施肥することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ユーカリプタス・グロブルスの窒素状態診断用マーカーを用いて、被検ユーカリの窒素状態を診断した結果を示す図。
【図２】各群における植栽３ヶ月目の成長量を示す図。
【図３ａ】本発明の栄養診断用マーカーの選択方法によって得られたユーカリプタス・グロブルスの窒素状態診断用マーカーのマススペクトルの例示（１）
【図３ｂ】本発明の栄養診断用マーカーの選択方法によって得られたユーカリプタス・グロブルスの窒素状態診断用マーカーのマススペクトルの例示（２）
【図３ｃ】本発明の栄養診断用マーカーの選択方法によって得られたユーカリプタス・グロブルスの窒素状態診断用マーカーのマススペクトルの例示（３）
【図４】ユーカリプタス・グロブルスの窒素状態診断用マーカーを用いて、野外栽培した当該ユーカリの窒素状態を診断した結果を示す図。
【図５】野外栽培したユーカリプタス・グロブルスの各診断パターン群における植栽３ヶ月目の成長量を示す図。
【図６】ユーカリプタス・デグルプタ×カマルドレンシスの窒素状態診断用マーカーを用いて、野外栽培した当該ユーカリの窒素状態を診断した結果を示す図。
【図７】野外栽培したユーカリプタス・デグルプタ×カマルドレンシスの各診断パターン群における植栽３ヶ月目の成長量を示す図。
【図８】ナスの窒素状態診断用マーカーを用いて、野外栽培した当該ナスの窒素状態を診断した結果を示す図。
【図９】トマトの窒素状態診断用マーカーを用いて、野外栽培した当該トマトの窒素状態を診断した結果を示す図。
【図１０】トウモロコシの窒素状態診断用マーカーを用いて、野外栽培した当該トウモロコシの窒素状態を診断した結果を示す図。
【図１１】イネの窒素状態診断用マーカーを用いて、野外栽培した当該イネの窒素状態を診断した結果を示す図。
【図１２】野外栽培したナスの各診断パターン群における植栽１ヶ月目の成長量を示す図。図中、※は、両水耕液間の成長量に1%以下水準の有意差があったことを示す。
【図１３】野外栽培したトマトの各診断パターン群における植栽１ヶ月目の成長量を示す図。図中、※は、両水耕液間の成長量に1%以下水準の有意差があったことを示す。
【図１４】野外栽培したトウモロコシの各診断パターン群における植栽１ヶ月目の成長量を示す図。図中、※は、両水耕液間の成長量に1%以下水準の有意差があったことを示す。
【図１５】野外栽培したイネの各診断パターン群における植栽６週目の成長量を示す図。図中、※は、両水耕液間の成長量に1%以下水準の有意差があったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
１．栄養状態診断用マーカーの選択方法（１）
本発明の一の態様は、特定の栄養素に関して、一方を欠乏させ、他方を充足的に供与した２つの植物のそれぞれから得られた代謝産物のうち、両者間で統計学的に有意な量的差異の見られる代謝産物を、その植物における前記特定の栄養素に関する栄養状態診断用マーカーとして選択する、栄養状態診断用マーカーの選択方法である。本発明の栄養状態診断用マーカーの選択方法は、抽出ステップ及び選択ステップを含む。以下、各ステップについて具体的に説明をする。
【００５４】
１．１．抽出ステップ
「抽出ステップ」とは、特定の栄養素を欠乏させた植物及び前記栄養素を供与した前記植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出するステップである。
【００５５】
本明細書において「植物」とは、コケ植物、シダ植物及び種子植物をいう。好ましくは種子植物である。種子植物の場合、裸子植物若しくは被子植物、又は草本類若しくは木本類は問わない。
【００５６】
本明細書において「栄養素」とは、その元素の欠乏により植物が生育上又は生殖上何らかの異常を来たし、その症状の回復が他の元素の供給では回復できない元素をいい、原則として植物の必須元素を意味する。一般的な植物の必須元素には、１６種の元素、すなわち、水素（H）、酸素（O）、炭素（C）、窒素（N）、リン（P）、カリウム（K）、マグネシウム（Mg）、カルシウム（Ca）、硫黄（S）、鉄（Fe）、マンガン（Mg）、亜鉛（Zn）、ホウ素（B）、モリブデン（Mo）、銅（Cu）及び塩素（Cl）が含まれ、本明細書における栄養素も、原則としてこれらの元素を指す。必須の元素の中でも、窒素、リン、カリウム、ホウ素、マグネシウム、カルシウム及び硫黄は、本発明の特定の栄養素として好ましく、窒素、リン、カリウム及びホウ素は、特に好ましい。また、必須元素でなくとも、特定の植物の生育及び生殖上、必要な元素も本発明の栄養素に含むことができる。例えば、イネの生育上有用なケイ素（Si）等が挙げられる。本明細書において「特定の栄養素」とは、前記栄養素の群から選択される１以上の栄養素をいう。
【００５７】
本明細書において植物の「全部」とは、対象とする植物体を構成する全ての部分をいう。また、植物の「一部」とは、対象とする植物を構成する器官（例えば、根部、茎部、葉部、花部、又は胞子若しくは種子等）、前記器官を構成する形態的、機能的に分化した細胞群である組織、又は前記組織を構成する細胞をいう。
【００５８】
本明細書において「代謝」とは、呼吸に代表される異化代謝及び光合成に代表される同化代謝のいずれも包含する。したがって、本明細書において「代謝産物」とは、植物の代謝によって生じた又は生じる全ての物質をいう。例えば、同一種の植物個体（群）を栄養素の異なる条件下に置くことにより両個体（群）間で量的差異を生じる物質は、原則として代謝産物とみなすことができる。
【００５９】
本発明において、代謝産物は、化学的分析手法（例えば、質量分析法）、及び／又は生物学的分析手法（例えば、抗原抗体反応）を用いて同定若しくは特定できればよく、代謝産物の化学構造までは必ずしも決定されている必要はない。例えば、質量分析法により代謝産物を分析した場合、保持時間と質量電荷比のみを特定できればよい。また、化学構造等が不明な単一分子に対して特異的な抗体を用いる場合には、抗原抗体反応の有無を判断できればよい。代謝産物には、例えば、タンパク質（酵素を含む）、低分子化合物（植物ホルモン、ポリフェノール、糖、アミノ酸、ヌクレオチドを含む）が含まれる。また、代謝産物は、水溶性若しくは脂溶性を問わない。
【００６０】
「抽出物」とは、複数の代謝産物を包含する植物抽出物、通常は、植物抽出液をいう。抽出物には、代謝産物でない物質、例えば、肥料のような植物が外界から直接取り込んだ物質が混在していても構わない。施肥又は添加した物質が明らかであれば、このような物質は、代謝産物を区別し得るからである。代謝産物が水溶性及び脂溶性を問わないことから、抽出物の抽出に用いる溶媒は、水溶液又は有機溶媒のいずれであってもよい。
【００６１】
「特定の栄養素を欠乏させた植物」とは、対象とする植物において特定の栄養素のみを人為的に欠乏させた植物をいう。ここでいう「欠乏」とは、対象とする植物の正常な生育又は生殖上必要な量（必要基準量）を下回っていることをいい、低減、除去又は実質的除去を包含する。「実質的除去」とは、特定の栄養素をごく僅かに含有するものの、その植物の吸収により直ちに涸渇してしまうため、除去されているに等しい状態をいう。例えば、40μMの窒素供給量は、ユーカリの１種であるユーカリプタス・グロブルス（Eucalyptus globulus）については、当該植物の成長過程で直ちに吸収され、枯渇してしまう量であり、実質的除去された供給量である。
【００６２】
特定の栄養素を欠乏させた状態は、特定の栄養素を除去した状態又は実質的に除去した状態が好ましい。次の「抽出ステップ」において特定の栄養素を供与した個体（群）と対比した際に、代謝産物の蓄積量の明瞭な量的差異が得られるからである。
【００６３】
「前記栄養素を供与した前記植物」とは、特定の栄養素を欠乏させた植物と同一の特定の栄養素を充足的に供与した同一種の植物をいう。「充足的に供与」とは、対象とする植物においてその特定の栄養素の必要基準量以上の量を供与することをいう。特定の栄養素の必要基準量は、植物種によって異なるため、対象とする植物種に応じて公知の必要基準量を勘案しつつ、当該分野の技術範囲内で適宜定めればよい。例えば、前記ユーカリプタス・グロブルスの場合、窒素に関する必要基準量は、通常、約1000μMあれば足りる。
【００６４】
特定の栄養素を欠乏させた植物と前記栄養素を供与した前記植物において、特定の栄養素の供給量の量差は、特に限定はしないが、量差が小さい場合、両者の生育条件が近似する結果、次の「抽出ステップ」で統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を選択できない可能性がある。したがって、量差は、大きい方が好ましい。最も好ましくは、前述のように、特定の栄養素を欠乏させた植物の当該栄養素の供給量が、特定の栄養素を除去した状態（供給量０に相当）又は実質的に除去した状態である。
【００６５】
本ステップで使用する２つの植物個体（群）において、前記特定の栄養素の供給量以外の諸条件、例えば、植物の種類（品種及び株を含む）、他の栄養素、気象条件（例えば、気温、日照時間、湿度）、土壌条件、時間的条件（例えば、生育期間、生育時期）及びその植物の健康状態は、原則として同一とする。このように、２つの植物において目的とする特定の栄養素の供給量のみを特異的に異なる状態に調整するためには、当該植物は、例えば、人工気象器内のような人工的環境下で合成培地によって、好適には水耕栽培によって、育成させることが好ましい。これは、例えば、完全合成培地から目的とする特定の栄養素の供給量を選択的に調整し、他の諸条件を同一にすることで目的とする特定の栄養素の供給量が異なる２つの植物を容易に作製できるからである。例えば、前述のように窒素を特定の栄養素とする場合であれば、一方が40μM（実質的欠乏量）、他方が4000μM（必要基準量以上）の窒素をそれぞれ包含する合成培地で植物を育成することにより、一方を欠乏させ、他方を充足的に供与した、目的とする異なる窒素供給量の植物を容易に得ることができる。
【００６６】
このような特定の栄養素の供給量が異なる植物は、特定の栄養素の供給量を調整した条件下で種子等から育成した実生個体（群）だけでなく、一定期間通常の栄養条件下で育成した後、前記条件下に移した同程度の成長度を有する個体（群）も含まれる。
【００６７】
完全合成培地は、当該分野で公知であるので、それらを使用すればよい。例えば、通常は、文献名（社団法人  日本施設園芸協会編、培養液栽培新マニュアル）に記載の完全合成培地を使用することができる。また、対象とする植物に最適化された特異的合成培地が公知の場合、それを使用してもよい。
【００６８】
抽出ステップでは、２つの植物個体（群）の全部又は一部から抽出物を抽出する。個体（群）の一部から抽出する場合、その一部は両個体（群）間で同一部分を用いる。例えば、一方の抽出物を葉から抽出する場合には、他方も葉から抽出するようにする。抽出物を抽出する方法は、植物から代謝産物を抽出できる方法であれば特に限定しない。例えば、水溶性の代謝産物を得る場合には、必要に応じて植物体を粉砕等した後、加水し、圧搾後、ろ過すればよい。また脂溶性の代謝産物を得る場合には、必要に応じて植物体を粉砕等した後、メタノール等の有機溶媒に所定の期間浸漬し、その後ろ過すればよい。これらの抽出方法の詳細については、当該分野で公知の技術を用いることができる。例えば、文献名（Yoko Iijima et al., The Plant Journal (2008)54,949-962, Hideyuki Suzuki et al., Phytochemistry (2008) 69, 99-111）に記載の方法を参照されたい。
【００６９】
１．２．選択ステップ
「選択ステップ」とは、抽出ステップで得られたそれぞれの代謝産物の蓄積量を比較し、両者間で統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を前記特定の栄養素の状態を診断する栄養状態診断用マーカーとして選択するステップである。
【００７０】
「蓄積量」とは、抽出ステップで得られた抽出物中における特定の代謝産物の量であって、濃度のような相対量であってもよく、また比較する両者の抽出物の容量が等しい場合には代謝産物の絶対量であってもよい。
【００７１】
本ステップでは、まず、両抽出物のそれぞれに含まれる同一の代謝産物の蓄積量を比較する。抽出物から特定の代謝産物を検出及び定量する方法は、その特定の代謝産物を検出及び定量可能な方法であれば特に限定はしない。例えば、質量分析法、抗原抗体反応を応用した方法及び電気泳動法等を用いて検出及び定量することができる。質量分析法は、高速液体クロマトグラフ質量分析法（LC-MS）、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法（LC-MS/MS）、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）、ガスクロマトグラフタンデム質量分析法（GC-MS/MS）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）及びICP質量分析法（ICP-MS）を含む。抗原抗体反応を応用した方法は、ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法、表面プラズモン共鳴（SPR）法、又は水晶振動子マイクロバランス（QCM）法を利用することができる。また、分析する代謝産物がタンパク質である場合、電気泳動法として、例えば、二次元電気泳動法を利用することができる。これらの分析方法は、いずれも当該分野に公知の技術であって、それらの方法に準じて行えばよい。例えば、文献名（Yoko Iijima et al., The Plant Journal (2008)54,949-962, Masami Hirai et al. Proc Natl Acad Sci USA (2004) 101(27) 10205-10210, Shigeru Sato et al., The Plant Journal (2004) 40(1)151-163, Motoyuki Shimizu et al., Proteomics (2005) 5,3919-3931）を参照されたい。
【００７２】
次に、前記比較の結果、統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を前記特定の栄養素の状態を診断する栄養状態診断用マーカーとして選択する。統計学的に有意な量的差異は、１．３倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．７倍以上、一層好ましくは２倍以上である。統計学的に有意な量的差異は、特定の栄養素を欠乏させた植物由来の代謝産物が、対照である前記栄養素を供与した前記植物由来の代謝産物よりも多くてもよく又は少なくてもよい。これは、例えば、量的差異が２倍以上で、かつ統計学的に有意な量的差異とする場合、一方の植物由来の代謝産物が他方のそれの２倍以上であってもよいし、１／２以下であってもよいことを意味する。特定の栄養素に関して、一方を欠乏させ、また他方を充足的に供与した植物個体（群）を比較して特異的に増加又は減少する代謝産物は、いずれも本発明の栄養状態診断用マーカーの候補となり得るからである。したがって、一方に存在し、他方には存在しない代謝産物も、統計学的に有意な量的差異が見られれば特定の栄養素の状態を診断する栄養状態診断用マーカーとなり得る。
【００７３】
「統計学的に有意」とは、前記２つの代謝産物の量的差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が5％、1％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。文献名（鈴木▼完▲之、統計学の基礎、永田靖ら、統計的多重比較法の基礎）
なお、各植物種において特定の栄養素を充足的に供与した植物から得られた各種代謝産物の蓄積量をデータベース化しておけば、後述する「植物における特定の栄養素の状態を診断する方法」及び「植物の成長状態判定方法」を実施する際に、対照植物について新たに対照値を得ることなく適用できるので、便利である。
【００７４】
本発明の態様において、代謝産物の蓄積量を対比する同一種の２つの植物個体（群）は、特定の栄養素の供給量以外は原則として同一の条件下で育成される。このように特定の栄養素の供給量のみが異なる場合、対象とする植物には、その特定の栄養素に関連するストレスのみが付与されることとなる。したがって、本発明の選択方法によって得られる栄養状態診断用マーカーとしての代謝産物は、その特定の栄養素のストレスにのみ直接的又は間接的に応答し、他のストレス、例えば、他の栄養素、土壌条件、気象条件、生育期間には影響されないか、又は影響されても軽微であることが予測される。実際に、後述する実施例４で示すように、本発明の選択方法によって選択された栄養状態診断用マーカーを用いることにより、時間的又は環境的に異なるストレス下で栽培された植物であっても同様の診断結果を導き出すことができた。それ故、本発明の栄養状態診断用マーカー選択方法によれば、各種ストレスに影響されることなく、その植物における特定の栄養素の状態を的確に判断できる栄養状態診断用マーカーを提供することができる。各種ストレスに影響されることなく、被検植物の栄養状態を正確に診断できる栄養状態診断用マーカーは、本発明者らが知る限り、従来知られておらず、この点において、本発明は従来技術よりも優れている。
【００７５】
２．栄養状態診断用マーカーの選択方法（２）
本発明の一の態様は、特定の栄養素に関して、一方を欠乏させ、他方を充足的に供与した２つの植物のそれぞれから抽出された代謝産物のうち、両者間で統計学的に有意な量的差異に見られる代謝産物を第１マーカー候補として選択し、加えて、前記特定の栄養素を第１抽出ステップの欠乏量とは異なる欠乏量を供与した前記植物から抽出された代謝産物と、先の２つの植物のいずれか一方から抽出された代謝産物との間で統計学的に有意な量的差異に見られる代謝産物を第２マーカー候補として選択し、両マーカー候補群に共通する代謝産物を前記特定の栄養素の状態を診断する栄養状態診断用マーカーとして選択する選択方法である。すなわち、前記態様における選択方法では、特定の栄養素の供給量が２点であったのに対して、本態様においては、少なくとも３点であることを特徴とする。特定の栄養素について３点以上の異なる供給量間で統計学的に有意な量的差異を有する代謝産物を選択することにより、２点から選択した場合と比べて、より正確な栄養状態診断用マーカーを選択することができる。
【００７６】
本発明の栄養状態診断用マーカーの選択方法は、第１抽出ステップ、第１選択ステップ、第２抽出ステップ、第２選択ステップ及び第３選択ステップを含む。以下、各ステップについて具体的に説明をする。
【００７７】
２．１．第１抽出ステップ
「第１抽出ステップ」とは、特定の栄養素を欠乏させた植物及び前記栄養素を供与した前記植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出するステップである。本ステップは、前記「栄養状態診断用マーカーの選択方法（１）」における「抽出ステップ」と要件及び方法が同一であり、「抽出ステップ」に準じて行えばよいことから、その詳細な説明は省略する。
【００７８】
２．２．第１選択ステップ
「第１選択ステップ」とは、第１抽出ステップで得られたそれぞれの代謝産物の蓄積量を比較し、両者間で統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を第１マーカー候補として選択するステップである。本ステップも、前記「栄養状態診断用マーカーの選択方法（１）」における「選択ステップ」と基本的にその要件及び方法が同一であることから、「選択ステップ」に準じて行えばよい。ただし、本ステップで選択される代謝産物は、前記「選択ステップ」と異なり、栄養状態診断用マーカーの第１マーカー候補となる。一の実施形態で、本ステップでは、第１抽出ステップにおける２つの植物の一方が前記特定の栄養素を欠乏させた植物とすることができる。
【００７９】
２．３．第２抽出ステップ
「第２抽出ステップ」とは、前記特定の栄養素を第１抽出ステップの欠乏量とは異なる欠乏量で供与した前記植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出するステップである。例えば、第１抽出ステップで0μM（窒素欠乏状態）と4000μM（必要基本量充足状態）の窒素供給量を有する２つのユーカリプタス・グロブルス個体（群）から抽出物を抽出するとき、第２抽出ステップでは40μM（窒素欠乏状態）の窒素供給量を有するユーカリプタス・グロブルス個体（群）から抽出物を抽出する場合が該当する。
【００８０】
「欠乏量」とは、対象とする植物において特定の栄養素が欠乏状態にある供給量をいう。例えば、特定の栄養素を全く供与しない、すなわち、除去状態にある供給量（すなわち、供給量０）、特定の栄養素を実質的に除去した状態にある供給量、特定の栄養素を必要基準量よりも低減させた供給量が該当する。
【００８１】
第１抽出ステップにおける特定の栄養素の欠乏量と第２抽出ステップにおけるその特定の栄養素の欠乏量の量差は、特に限定はしないが、量差が小さい場合、両者の生育条件が近似する結果、次の「第２抽出ステップ」で統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を選択できない可能性がある。したがって、量差は、大きい方が好ましい。
【００８２】
第２抽出ステップにおいて、特定の栄養素を「異なる欠乏量」供与した植物は、２以上であってもよい。この場合、合計４点以上の特定の栄養素の供給量に基づいて栄養状態診断用マーカーを選択することとなる。これにより、特定の栄養素に関する栄養状態診断用マーカーとしての信頼度がより高くなることが予想されるが、通常は、合計３点の特定の栄養素の供給量に基づいて栄養状態診断用マーカーを選択すれば十分である。
【００８３】
なお、第２抽出ステップは、第１抽出ステップと並行して実施することも可能である。特定の栄養素について供給量の異なる３つ以上の植物から抽出物を抽出できればよく、抽出する順序は無関係だからである。例えば、対象とする植物について、特定の栄養素を除去した植物、その栄養素の供与を低減した植物、及びその栄養素を充足的に供与した植物のそれぞれから抽出物を抽出すればよい。
【００８４】
２．４．第２選択ステップ
「第２選択ステップ」とは、第１ステップで得られた少なくとも一方の代謝産物と第２抽出ステップで得られた前記代謝産物のそれぞれの蓄積量を比較し、両者間で統計学的に有意な量的差異が見られる代謝産物を第２マーカー候補として選択するステップである。本ステップは、第１選択ステップと同様に、前記「栄養状態診断用マーカーの選択方法（１）」における「選択ステップ」と基本的にその要件及び方法に準じて行うことができる。本ステップと前記「選択ステップ」の異なる点は、「選択ステップ」が特定の栄養素を欠乏させた植物とその栄養素を供与した植物との間で代謝産物の蓄積量を比較するのに対して、本ステップでは、第１抽出ステップにおける２つの植物の少なくとも一方に由来する代謝産物と第２抽出ステップで得られた同一の代謝産物におけるそれぞれの蓄積量を比較することである。例えば、第１抽出ステップにおいて特定の栄養素を欠乏させた植物から得られる抽出物をA及びその栄養素を供与した植物から得られる抽出物をB、第２抽出ステップにおいて得られる抽出物をCとする場合、本ステップでは、A/C間及び／又はB/C間の代謝産物の蓄積量を比較することとなる。好ましくは、B/C間、又はA/C間及びB/C間の代謝産物を比較することである。
【００８５】
２．５．第３選択ステップ
「第３選択ステップ」とは、第１マーカー候補からなる候補群と第２マーカー候補からなる候補群の両候補群に共通して存在する代謝産物を前記特定の栄養素に関する栄養状態診断用マーカーとして選択するステップである。前記両候補群を構成するマーカー候補が多数ある場合には、それぞれの候補群をコンピュータに入力しておけば、両候補群に共通するマーカー候補を選択するように命令することで、目的の栄養状態診断用マーカーを容易に得ることができる。
【００８６】
３．窒素状態診断用マーカー
本発明の他の態様は、植物の窒素状態診断用マーカーである。本発明の態様における窒素状態診断用マーカーは、後述する実施例１、６及び９で示すように前記「栄養状態診断用マーカーの選択方法（１）」の方法を用いて、特定の栄養素を窒素とし、また植物をユーカリプタス・グロブルス、ユーカリプタス・デグルプタ（Eucalyptus degulpta）とユーカリプタス・カマルドレンシス（Eucalyptus camaldulensis）の雑種であるユーカリプタス・デグルプタ×カマルドレンシス、イネ（Oryza sativa）、トウモロコシ（Zea mays）、トマト（Solanum lycopersicum）又はナス（Solanum melongena）として選択されたものである。
【００８７】
本発明の窒素状態診断用マーカーは、表２（表２−１〜表２−４）で示される３１２種のいずれかである。それぞれのマーカーは、Massにおける保持時間（分）及び質量電荷比（ｍ/ｚ）によって特定される。
【００８８】
表２で示される本発明の窒素状態診断用マーカーのうち、Mass No. 1〜270は、後述する実施例１で示すように前記「窒素状態診断用マーカーの選択方法（２）」の方法を用いて選択されたものである。好ましくは、ユーカリプタス・グロブルスの窒素状態診断用マーカーである。ユーカリプタス・デグルプタ×カマルドレンシス用の窒素状態診断用マーカーとしては、表２においてMass No. 15、31、42、42、43、51、57、59、68、84、91、104、110、111、148、149、156、241、263、264及び269で示される窒素状態診断用マーカーが特に好ましい。また、イネ用の窒素状態診断用マーカーとしては、表２においてMass No. 5、170及び173で示される窒素状態診断用マーカーが特に好ましい。さらに、トウモロコシ用の窒素状態診断用マーカーとしては、表２においてMass No. 7、17、22、29、30、35、37、48、60、65、72、76、77、88、89、92、106、140、148、142、153、154、242及び257で示される窒素状態診断用マーカーが特に好ましい。また、トマト用の窒素状態診断用マーカーとしては、表２においてMass No. 43、246及び265で示される窒素状態診断用マーカーが特に好ましい。そして、ナス用の窒素状態診断用マーカーとしては、表２においてMass No. 104、144、242、257及び265で示される窒素状態診断用マーカーが特に好ましい。
【００８９】
本発明の表２で示す窒素状態診断用マーカーは、他の単子葉植物若しくは双子葉植物、又は裸子植物若しくは被子植物にも使用することができる。特に上記各植物種と系統的に近い種（例えば、ユーカリであれば、ユーカリプタス・カマルドレンシス、ユーカリプタス・グランディス、ユーカリプタス・ユウロフィラ、ユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・デグルプタ、ユーカリプタス・テレティコンティス）に、好ましく使用することもできる。
【００９０】
本発明の窒素状態診断用マーカーは、窒素量が被検植物において充足しているか否かを客観的に推定するための有効なバイオマーカーとなる。また、本マーカーは、各種環境要因に基づくストレスに対しても影響されず、被検植物の窒素状態を的確に判断することができる。
【００９１】
４．植物における栄養状態診断方法
本発明の一の態様は、植物における特定の栄養素の状態を診断する方法である。本発明の診断方法は、代謝産物抽出ステップ及び判定ステップを含む。以下、それぞれのステップについて具体的に説明する。
【００９２】
４．１．代謝産物抽出ステップ
「代謝産物抽出ステップ」とは、被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出するステップである。
【００９３】
本明細書において「被検植物」とは、栄養状態を診断するために本発明の診断方法に供される植物であって、任意の環境下で育成された植物とすることができる。
【００９４】
本ステップは、前述の「栄養状態診断用マーカーの選択方法（１）」における「抽出ステップ」と同様の方法によって被検植物の全部又は一部から抽出物を抽出すればよい。したがって、ここではその説明を省略する。
【００９５】
４．２．判定ステップ
「判定ステップ」とは、前記代謝産物抽出ステップで得られた代謝産物における前記植物の特定の栄養素に関して、前述の栄養状態診断用マーカーの選択方法のいずれか一の方法によって選択された１以上の栄養状態診断用マーカーの蓄積量を、対照である前記栄養素を充足的に供与した前記植物のそれと比較し、その差異の状態及び度合いから被検植物における該栄養素の不足又は充足を判定するステップである。
【００９６】
本ステップでは、まず、診断を所望する特定の栄養素を決定する。この栄養素は、前記「栄養状態診断用マーカーの選択方法（１）」における「抽出ステップ」で述べたように、原則として、植物の必須元素を意味する。すなわち、水素、酸素、炭素、窒素、リン、カリウム、マグネシウム、カルシウム、硫黄、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、銅及び塩素が含まれる。必須の元素の中でも、窒素、リン、カリウム、ホウ素、マグネシウム、カルシウム及び硫黄は、本発明の特定の栄養素として好ましく、窒素、リン、カリウム及びホウ素は、特に好ましい。また、必須元素でなくとも、特定の植物の生育及び生殖上、必要な元素も本発明の栄養素に含むことができる。例えば、イネの生育上有用なケイ素（Si）等が挙げられる。
【００９７】
次に、被検植物と同一種で、かつ決定した特定の栄養素と同一の栄養素に関して、被検植物と原則同一の部分（例えば、葉）に基づいて、前述の栄養状態診断用マーカーの選択方法によって得られた栄養状態診断用マーカーを１以上選択する。例えば、被検植物がユーカリプタス・グロブルスであり、その個体（群）の窒素に関する栄養状態をその葉から得られた代謝産物より診断する場合であれば、使用する栄養状態診断用マーカーは、ユーカリプタス・グロブルスの葉から得られた代謝産物に基づく窒素状態診断用マーカーから選択すればよい。そのような条件に合致する栄養状態診断用マーカーがない場合には、近似の条件で栄養状態診断用マーカーが得られているものを使用することもできる。
【００９８】
続いて、選択した栄養状態診断用マーカーに関して、前記代謝産物抽出ステップで得られた被検植物の抽出物中の代謝産物の蓄積量と対照における抽出物中の代謝産物の蓄積量とを比較する。ここでいう「対照」とは、被検植物の対照植物であって、前記決定した特定の栄養素を生育上及び生殖上充足する量で供与した、被検植物と同一種、かつ同程度の成長状態を有する植物をいう。対照の抽出物及びその中に含有される栄養状態診断用マーカーの蓄積量は、被検植物からの抽出物の抽出、及び栄養状態診断用マーカーの検出及び定量と並行して実施できるが、事前に得られた対照の栄養状態診断用マーカーの蓄積量がデータベース化されて蓄積されていれば、そのデータベースから条件の合致する蓄積量を選択して利用することもできる。
【００９９】
具体例を挙げれば、被検植物がユーカリプタス・グロブルスであり、その個体（群）の窒素状態をその葉から得られた代謝産物より診断する場合、使用する栄養状態診断用マーカーは、前記「窒素状態診断用マーカー」の項に記載の１以上の窒素状態診断用マーカーを利用することができる。すなわち、「窒素状態診断用マーカー」の項に記載のいずれか１以上の窒素状態診断用マーカーにおける蓄積量を、被検植物と対照とで比較し、その差異の状態及び度合いから被検植物における窒素の不足又は充足を判定すればよい。
【０１００】
被検植物と対照の栄養状態診断用マーカーに関する蓄積量の比較は、両サンプルの蓄積量の差異の状態及び度合いによって行う。「差異の状態」とは、被検植物と対照の栄養状態診断用マーカーの蓄積量に関して、両者で差異が見られる場合にどちらが大きいかを意味する。また「差異の度合い」とは、被検植物と対照の栄養状態診断用マーカーの蓄積量で差異が見られる場合、どれほどの差があるかを意味する。
【０１０１】
前記被検植物と対照の栄養状態診断用マーカーに関する蓄積量の差異の状態及び度合いから、被検植物における該栄養素の不足又は充足を判定する。
【０１０２】
判定方法の具体例としては、以下の方法が挙げられる。
【０１０３】
（１）特定の栄養素に関する栄養状態診断用マーカーの蓄積量がその栄養素の増加量に伴って増加する性質の栄養状態診断用マーカーを用いる場合には、被検植物の栄養状態診断用マーカーの蓄積量が対照の蓄積量よりも小さいときに被検植物におけるその栄養素が不足傾向にあると判定し、逆に同程度若しくは大きいときには、被検植物におけるその栄養素は充足していると判定することができる。例えば、窒素状態診断用マーカーの蓄積量が窒素量の増加に伴って増加する性質の窒素状態診断用マーカーを用いる場合には、被検植物の窒素状態診断用マーカーの蓄積量が対照の蓄積量よりも小さいときに被検植物における窒素が不足傾向にあると判定し、逆に同程度若しくは大きいときには、被検植物における窒素は充足していると判定することができる。
【０１０４】
（２）特定の栄養素に関する栄養状態診断用マーカーの蓄積量がその栄養素の増加量に伴って減少する性質の栄養状態診断用マーカーを用いる場合には、被検植物の栄養状態診断用マーカーの蓄積量が対照の蓄積量よりも大きいときに被検植物におけるその栄養素が不足傾向にあると判定し、逆に同程度若しくは小さいときには、被検植物におけるその栄養素は充足していると判定することができる。例えば、窒素状態診断用マーカーの蓄積量が窒素の増加に伴って減少する性質の窒素状態診断用マーカーを用いる場合には、被検植物の窒素状態診断用マーカーの蓄積量が対照の蓄積量よりも大きいときに被検植物における窒素が不足傾向にあると判定し、逆に同程度若しくは小さいときには、被検植物における窒素は充足していると判定することができる。
【０１０５】
５．植物の成長状態判定方法
本発明の一の態様は、植物の成長状態判定方法である。本方法は、前述の植物における栄養状態診断方法による結果に基づいて、同一植物体の成長状態を判定し、またその判定結果から前記植物の将来の成長性を予測する方法である。具体的には、同一植物体において、前述の「植物における栄養状態診断方法」の項におけるいずれか一の方法によって得られた特定の栄養素の状態に関する二以上の経時的な結果に基づいてその植物体における成長状態を判定する。
【０１０６】
「植物体の成長状態」とは、植物の成長速度、所定期間内における植物の成長の善し悪し又は成長の推移を包含する。
【０１０７】
「二以上の経時的な結果」とは、同一植物体から二以上の異なる時間に採取されたサンプルより同一の診断条件で得られた特定の栄養素に関するそれぞれの栄養状態の診断結果という意味である。各サンプル間の期間は、植物種類、生育環境等に応じて定めればよく、特に限定しないが、期間が短すぎる場合、正確な成長状態を判定できない可能性があることから、適当な期間、例えば、３日以上、好ましくは１週間以上、より好ましくは１ヶ月以上又は３ヶ月以上あるのがよい。
【０１０８】
二以上の経時的な結果に基づいてその植物体における成長状態を判定するための判定方法の具体例としては、以下の方法が挙げられる。
【０１０９】
（１）特定の栄養素に関する二以上の経時的な結果が、いずれも充足していると診断された場合には、その植物体における成長状態は良好であると判定する。この場合、その状態を維持できれば、その植物体の将来の成長性は高いと予測することができる。
【０１１０】
（２）特定の栄養素に関する二以上の経時的な結果が、不足から充足に移行していると診断された場合には、成長状態が改善傾向にあると判定する。この場合、改善された状態を維持できれば、その植物体の将来の成長性は高いと予測することができる。
【０１１１】
（３）特定の栄養素に関する二以上の経時的な結果が、充足から不足に移行していると診断された場合には、成長状態が悪化傾向にあると判定する。この場合、その栄養素を豊富に含む追肥を行う等の適切な措置を施さなければ、その植物体は今後さらに成長性が低くなると予測することができる。
【０１１２】
（４）特定の栄養素に関する二以上の経時的な結果が、いずれも不足していると診断された場合には、成長状態が悪いと判定する。この場合、早急にその栄養素を豊富に含む追肥を行う等の適切な措置を施さなければ、その植物体は今後一層成長性が低くなり、場合によっては枯化する可能性もあると予測することができる。
【０１１３】
６．施肥量決定方法
本発明の一の態様は、施肥量決定方法である。本方法は、被検植物における特定の栄養素に関しての栄養状態診断方法による診断結果又は成長状態判定方法による判定結果に基づいて、今後その被検植物にその特定の栄養素をどの程度与えるべきか、その施肥量の増減又は維持について決定する方法である。
【０１１４】
前記「４．植物における栄養状態診断方法」により、前記特定の栄養素が不足傾向にあるという診断結果が得られた場合には、その被検植物におけるその特定の栄養素が不足していることから、その状態をそのまま維持すれば、被検植物の成長上望ましくない。したがって、この場合、その特定の栄養素の施肥量を診断に供する直前に施肥していた量よりも増やすようにする。一方、前記診断方法により、前記特定の栄養素が充足しているという診断結果が得られた場合には、その被検植物におけるその特定の栄養素の量が現在適切な状態にあり、その状態をそのまま維持することが被検植物の成長上望ましいといえる。したがって、この場合、その特定の栄養素の施肥量を診断に供する直前に施肥していた量で引き続き施肥すればよいことになる。
【０１１５】
また、前記「５．植物の成長状態判定方法」は、経時的な要素を考慮し、被検植物における特定の栄養素の過去から現在までの栄養状態の変化から現在の栄養状態の傾向を判定する。したがって、本方法の判定結果に基づいた施肥量決定法は、前記栄養状態診断方法の診断結果に基づいた施肥量決定法よりも、より正確な施肥量を決定することができる。
【０１１６】
具体的には、例えば、被検植物において、特定の栄養素に関する現在の栄養状態が本発明の植物における栄養状態診断方法により、充足しているとの診断結果が得られた場合であっても、その被検植物の過去の診断結果よりも不足傾向に移行していた場合には、その状態を今後継続した場合、その被検植物の成長が悪化してしまうこととなる。そこで、このような場合には、その特定の栄養素の施肥量を最も高い充足度を示した診断結果が得られたときの診断直前の施肥量に戻すか、又はそれぞれの診断における施肥量が一定であった場合には、より施肥量を増やすようにする。また、特定の栄養素に関する過去及び現在の診断結果がいずれも不足傾向にある場合であっても、現在の診断結果が過去の診断結果よりも充足方向に移行しているのであれば、その被検植物の成長状態は改善傾向にあることから、直ちに施肥量を増やすのではなく、最新の診断時直前の施肥量を維持するようにすればよい。さらに、特定の栄養素に関する経時的な二以上の診断結果がいずれも同程度で充足しているのであれば、その被検植物におけるその特定の栄養素の量が過去から現在に至るまで適切な状態にあることから、その施肥量をそのまま維持することが被検植物の成長上望ましいといえる。一方、特定の栄養素に関する経時的な二以上の診断結果が過去から現在に至るまで不足傾向にあり、改善傾向がみられないか、又は不足傾向がより強くなっている場合には、その被検植物におけるその特定の栄養素の量が不足しており、その状態を今後継続した場合、その被検植物の成長が悪化してしまうこととなるため、その特定の栄養素の施肥量を最も充足に近い診断結果を示した時の診断直前の施肥量よりもより多い量で施肥することが被検植物の成長上望ましい。
【０１１７】
本実施形態を実施する場合、本発明の栄養状態診断方法で被検植物を診断する前に、診断毎に、その被検植物に対して診断直前に与えていた特定の栄養素の量を予め記録しておくことに留意する。
【実施例】
【０１１８】
＜実施例１：栄養状態診断用マーカーの選択＞
本発明の栄養状態診断用マーカーの選択方法により、特定の栄養素を窒素としたときのユーカリプタス・グロブルス（Eucalyptus globulus）（以下、全実施例において、便宜上、単に「ユーカリ」として記す）における栄養状態診断用マーカーを選択した。【０１１９】
１．窒素欠乏ユーカリの作製
樹高30〜50cm程度のユーカリを表１に示す３種の試験系、すなわち、窒素濃度の異なる３種類の栄養条件（第I水耕液：4000μM NO3水耕液、第II水耕液：40μM NO3水耕液、第III水耕液：0μM NO3水耕液）で、１６個体ずつ１ヶ月間水耕栽培した。水耕栽培条件は、水耕栽培装置に研究用水耕栽培装置（M式水耕研究所製）を用い、液量：約50 L、水耕液温度：22〜24℃程度、水耕液pH: 4.0〜6.0、電気伝導率：0.5〜0.7mS/cmを常時維持した。なお、水耕液中の試薬は、ポンプによって水耕液を循環させるため、濃度勾配差は生じていない。また、水耕液を循環させる際に空気が取り込まれることから、常に好機的な環境が維持されている。
【表１】
2011024525.tif 000002
【０１２０】
２．葉のサンプリング
上記３種の試験系で栽培したユーカリにおいて、各試験系から７個体を任意に選び、それぞれの個体から健全な葉を選択してハサミで葉柄部分から切り取った。採取した葉の主脈部分を取り除き、残りを直ちに液体窒素中に投入して生体反応を停止させた。葉サンプルは、2.0mlのプラスチックチューブに入れて、使用直前まで-80℃のディープフリーザに保存した。【０１２１】
３．抽出物の抽出
前記凍結ユーカリ葉サンプルをセイフロックチューブに生重量で約50mg計量した。直径5mmのジルコニアボール（東ソー株式会社）をチューブに加え、Tissue Lyser II（株式会社キアゲン）で葉サンプルを粉砕した(25Hz, 30秒)。続いて、チューブに10μg/mlのFormonetin（フナコシ株式会社）含有80%メタノール（和光純薬工業株式会社）300μlを加え、Tissue Lyser IIを用いて25Hzで120秒間振動させることによって代謝産物を抽出した。抽出液を12000×gで10分間遠心分離した後、上清約1 mlを1 mlのテルモシリンジ（テルモ株式会社）に入れた。Millex-LG（ミリポア株式会社)を用いてろ過した後、抽出液をガラスバイアル（日本ダイオネクス株式会社）に移した。【０１２２】
４．LC-MS分析及びLC-MS/MS分析
得られた抽出液のうち2μlを以下の分析条件にてLC-MS分析及びLC-MS/MS分析に供した。具体的な分析方法については、各使用機器に添付の使用説明書に従った。【０１２３】
（液体クロマトグラフィー条件）
・使用機器：UFLC (島津製作所)
・溶離液Ａ：0.1%ギ酸（和光）入り  水クロマトグラフィー用リクロゾルブ (メルク株式会社) 
・溶離液B: 0.1%ギ酸（和光）入り  アセトニトリルLC/MS用ハイパーグレードリクロゾルブ (メルク株式会社)
・カラム： TSKgel ODS-100V  4.6x250mm, 粒子5μｍ  （東ソー株式会社）
・ガードカラム： TSKguardgel ODS-100V, 粒子5μｍ  （東ソー株式会社）
・カラム温度：40℃
・流速：0.5 ml/min
・タイムスケジュールグラジュエントB%
0min:3%, 45min:97%, 50min:97%, 50.1:3%, 57min:3%
（MS条件）
・使用機器：3200QTRAP (アプライドバイオシステムズ)
・Mass range: 100〜1000
・スキャンモード：Enhanced Mass Scan 
・スキャン速度：4000 amu/sec
・解析ソフトウェア：Analyst 1.4.2 (アプライドバイオシステムズ)
(MSMS条件）
・使用機器：3200QTRAP (アプライドバイオシステムズ)
・Mass range: 50-1000
・スキャンモード：Enhanced Product Ion Scan 
・スキャン速度：4000 amu/sec
・解析ソフトウェア：Analyst 1.4.2 (アプライドバイオシステムズ)
代謝産物データのアライメント：Marker ViewTM 1.1 Software（アプライドバイオシステムズ）
（アライメント条件）
・溶出時間許容誤差：1分
・Mass 許容誤差：25ppm
・Intensity threshold: 10,000
５．栄養状態診断用マーカーの選択
GeneSpring MS (アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて、水耕培地の窒素量に応答して量的変化の認められる代謝産物（バイオマーカー）を以下のように選択した。【０１２４】
（１）第III水耕液（0μM NO3）で栽培したユーカリ７個体と第I水耕液（4000μM NO3）で栽培したユーカリ７個体の間で２群比較(Volcano Plot)を行い、２つの試験区間において２倍以上又は１／２以下の蓄積量を示し、かつ統計的に有意差(P<0.05)のある代謝産物を第１マーカー候補として選択した。【０１２５】
（２）第II水耕液（40μM NO3）で栽培したユーカリ7個体と第I水耕液（4000μM NO3）で栽培したユーカリ７個体の間で２群比較(Volcano Plot)を行い、統計的に２群の間に有意差のある代謝産物を第２マーカー候補として選択した。【０１２６】
（３）前記（１）の第１マーカー候補及び（２）の第２マーカー候補の双方で共通する代謝産物をユーカリの窒素に関する栄養状態診断用マーカーとして選択した。【０１２７】
６．結果
本発明の栄養状態診断用マーカーの選択方法（１）によれば、第１及び第２マーカー候補は、共に栄養状態診断用マーカーとなり得る。したがって、表２で示す３１２個の代謝産物がユーカリの窒素状態診断用マーカーとして選択された。このうち、Mass No．271〜273のマーカーは、前記第２マーカー候補にのみに属する窒素状態診断用マーカーとして得られた。また、Mass No.274〜312のマーカーは、前記第１マーカー候補にのみに属する窒素状態診断用マーカーとして得られた。Mass No.１〜270のマーカーは、本発明の窒素状態診断用マーカーの選択方法（２）により、第１及び第２マーカー候補の双方で共通する窒素状態診断用マーカーである。表２では、各マーカーをLC-MSの測定値（保持時間及び質量電荷比）で表している。また、本実施例で得られた窒素状態診断用マーカーの一部（Mass No. 29、46、63、69、110及び140）のマススペクトルを、図３ａ〜図３ｃに例示する。
【表２−１】
2011024525.tif 000003
【表２−２】
2011024525.tif 000004
【表２−３】
2011024525.tif 000005
【表２−４】
2011024525.tif 000006
【０１２８】
＜実施例２：窒素状態診断用マーカーによる窒素状態の診断＞
実施例１で得られたユーカリの窒素状態診断用マーカーを用いて、窒素状態診断用の被検ユーカリにおける窒素状態を診断した。【０１２９】
１．被検ユーカリの栽培
山土4L、ピートモス3L (FIBROSOIL)、バーミキュライト2L（ハットリ株式会社）、ピーナスライト1L（芙蓉パーライト株式会社）からなる10Lの土壌を入れたポットに、平均樹高約45cmのユーカリの苗を１個体／ポットで２１個体植え、３ヶ月間野外環境下において栽培した。この間、1ポットあたり約500mlの潅水を、朝・夕の２回行った。２１個体は、７個体ずつ３つのグループに分け、Aグループにはハイコントロール肥料（旭チッソ株式会社）を50g（5g/L土壌）、Bグループにはロングマックス肥料（九鬼試料株式会社）を50g（5g/L土壌）それぞれ添加し、Cグループには施肥しなかった。【０１３０】
２．葉のサンプリング、代謝産物抽出及びLC-MS解析
植栽１ヶ月目及び２ヶ月目の被検ユーカリについて、実施例１と同様の方法により葉のサンプリング、代謝産物抽出及びLC-MS解析を行った。【０１３１】
３．窒素状態診断用マーカーによる窒素状態の診断
Marker ViewTM1.1 Softwareを用いて、サンプル間の代謝産物データのアライメントを行った後、GeneSpring MSを用いて、窒素状態診断用マーカーの情報に基づいて被検ユーカリの窒素状態の解析を行った。具体的には、GeneSpring MS のClass Predictionにより、野外ユーカリの窒素状態診断用マーカーの情報と実施例１の水耕栽培ユーカリにおける３種の窒素条件にそれぞれの窒素状態診断用マーカーの情報との対比を行い、被検ユーカリの窒素状態診断用マーカーの情報が水耕培地の３種の窒素状態診断用マーカーの情報のいずれに最も近いかを判定した。なお、窒素状態診断用マーカーには、表２のMass. No.1-270を用いた。解析条件は、以下の通りである。【０１３２】
・計算アルゴリズム：Support Vector Machines
・Kernel Function: Polynomial Dot Product (Order I)
・Marker set: ユーカリプタス・グロブルスの窒素状態診断用マーカー
・Test Sample: 被検ユーカリプタス・グロブルス  ２１個体
・Training Sample: 実施例１における３種の栄養条件の水耕栽培ユーカリプタス・グロブルス（第I水耕培地ユーカリ、第II水耕培地ユーカリ、第III水耕培地ユーカリ）
４．結果
上記診断の結果を図１に示す。診断パターンは、以下の３群に分類された。【０１３３】
・第１群：植栽１、２ヶ月目ともに、実施例１に記載の第I水耕液の窒素状態と同じと判定されたものが６個体あった。これらは、全てAグループ由来の個体であり、Aグループは、そのほとんどが植栽１、２ヶ月目ともに、良好な窒素状態が維持されていることを示している。【０１３４】
・第２群：植栽1ヶ月目は、実施例１に記載の第I水耕液の窒素状態と同じと判定されたが、植栽２ヶ月目では、実施例１に記載の第II水耕液の窒素状態と同じ状態と判定されたものが８個体あった。これらは、１個体がAグループ由来であり、他は全てBグループ由来の個体であった。この群は、植栽当初良好であったが、窒素状態が植栽１ヶ月前後から悪化した群であることを示している。すなわち、50gのロングマックス肥料では、ユーカリを２ヶ月以上好ましい成長状態で育成するには、窒素量が不足していることが明らかとなった。【０１３５】
・第３群：植栽１、２ヶ月目ともに、実施例１に記載の第II水耕液の窒素状態と同じと判定されたもので、７個体が該当した。この群は、植栽当初から窒素に関する窒素状態が悪い群であり、全てCグループの個体であった。Cグループは、施肥を行っていない窒素欠乏状態のグループであることから、診断結果と一致することが明らかとなった。【０１３６】
＜実施例３：窒素状態診断用マーカーによる窒素状態の診断結果と成長状態の関係＞
実施例２で、窒素状態診断用マーカーで分類された各群について、診断結果とその診断結果に基づくその後の成長状態とが相関するか否かを検証した。【０１３７】
実施例２で分類された第１〜３の各群について、植栽３ヶ月目における平均成長量（３ヶ月目の樹高から植栽時の樹高を減じた値の平均値）を測定したところ、第１〜３群の順に平均成長量が悪くなっていく様子が認められた（図２）。すなわち、実施例２で窒素状態が良好と診断された第１群は、平均成長量が60cmで最も成長性が良かった。また、実施例２で窒素状態が植栽１ヶ月前後から悪化していると診断された第２群は、平均成長量が40cmであり、第１群よりも少し劣る成長性を示した。一方、実施例２で窒素状態が悪いと診断された第３群は、平均成長量が20cmで成長性が最も悪いことが明らかになった。【０１３８】
以上の結果から、本発明の窒素状態診断用マーカーによる窒素状態の診断結果から、その窒素状態を維持した場合、その植物のその後の成長状態を予測し得ることが立証された。それゆえ、本発明の診断方法によって、特定の栄養素の栄養状態が悪いと診断された場合には、その診断結果に基づいて追肥等を行うことにより、その植物のその後の成長状態を改善することができる。このように、本発明の特定の栄養素の栄養状態診断方法を定期的に行えば、目的の植物に対して必要時に必要な栄養素を過不足なく与えることが可能である。【０１３９】
＜実施例４：異なる環境条件で栽培したユーカリの窒素状態診断用マーカーによる窒素状態の診断＞
本発明の栄養状態診断用マーカーの選択方法で得られた栄養状態診断用マーカーが、各種ストレスに影響されることなく、植物の特定の栄養素の状態を診断できることを検証するため、実施例１で得られたユーカリの窒素状態診断用マーカーを用いて、実施例２とは、異なる環境条件で栽培した被検ユーカリにおける窒素状態を診断した。【０１４０】
１．被検ユーカリの栽培
2009年5月7日に10Lの山砂を入れたポットに、平均樹高50cmのユーカリの苗を1個体/ポットで６個体植え、３ヶ月間野外環境下に置いて栽培した。６個体を３個体ずつ２つのグループに分け、A’グループにはハイコントロール肥料（旭チッソ株式会社）を200g（20g/L土壌）施肥した。これは、実施例２におけるAグループと同一栄養条件である。また、B’グループには施肥しなかった。これは、実施例２におけるＣグループと同一栄養条件となる。【０１４１】
２．葉のサンプリング、代謝産物抽出及びLC-MS解析、窒素状態の診断
植栽１、２ヶ月目の被検ユーカリについて、実施例２と同様の方法により葉のサンプリング、代謝産物抽出、LC-MS解析及び窒素状態診断用マーカーによる窒素状態の診断を行った。窒素状態診断用マーカーには、実施例２と同一のマーカーを用いた。【０１４２】
実施例２と本実施例の気象条件及び土壌条件の違いをそれぞれ表３及び４に示す。実施例２と本実施例は、それぞれ2008年と2009年で、試験年度が異なる。ユーカリ栽培試験地付近の気象データによると、2008年と2009年では雨量の違いが大きく見られた（表３）。また、ポット栽培に使用した土壌に関しても、実施例２で使用した土壌は一般的な土壌（表４）であるため水の保水性があるが、本実施例で使用した土壌は100%山砂であるため保水力がほとんどなく、潅水しても土壌表面が乾燥することが多い上に、また栄養分もほとんど包含していないという違いがある。したがって、本実施例の実施例２とは、時間的条件、土壌条件、気象条件等が異なる。それ故、両実施例における個体は、異なる環境ストレスを受けていることになる。
【表３】
2011024525.tif 000007
【表４】
2011024525.tif 000008
【０１４３】
３．結果
上記の条件でそれぞれ栽培したユーカリの診断結果を図４に示す。実施例２の診断パターン（第１〜３群）に基づいて分類した結果、以下の２群に分類された。【０１４４】
・第１群（植栽１、２ヶ月目ともに、第I水耕液の栄養状態と同じ）：３個体が該当した。これらは、全てA’グループ由来の個体であった。A’グループは、実施例２のAグループ（７個体中６個体が第１群に属する）と同一栄養条件である。【０１４５】
・第３群（植栽１、２ヶ月目ともに、第II水耕液の栄養状態と同じ）：３個体が該当した。これらは、全てB’グループの個体であった。B’グループは、実施例２のCグループ（７個体全てが第３群に属する）と同一栄養条件である。【０１４６】
前述のように、実施例２及び本実施例は、実施例１で選択した同一の栄養状態診断用マーカーを用いて、異なる条件下で栽培したユーカリのそれぞれの栄養状態を診断したものである。両診断結果を対比すると、異なる条件下で栽培した、すなわち異なるストレスを付与された場合であっても、窒素状態については、両者ともほぼ同一の診断結果となった。これらの結果は、本発明の栄養状態診断用マーカーを用いることで、栽培環境の相違に基づく様々なストレスに影響されることなく、被検植物におけるそのマーカーに特有の栄養素の状態を正確に診断することが可能であることを示している。【０１４７】
＜実施例５：異なる環境条件で栽培したユーカリの窒素状態診断用マーカーによる窒素状態の診断結果と成長状態の関係＞
実施例４で、窒素に関する窒素状態診断用マーカーで分類された各群について、診断結果とその診断結果に基づくその後の成長状態の相関が実施例２及び３におけるその相関と一致するか否かを検証した。【０１４８】
実施例４で分類された第１及び第３群について、成長状態を検証した。その結果を図５に示す。それぞれの群の植栽３ヶ月目の平均成長量（３ヶ月目の樹高から植栽時の樹高を減じた値の平均値）を測定したところ、窒素状態が良好と診断された第１群は、平均成長量が76cmで成長性が良かった。一方、植栽１，２ヶ月目の窒素状態が悪いと診断された第３群は平均成長量が18cmで成長性が悪いことが明らかになった。【０１４９】
以上の結果は、実施例２及び３で得られた診断結果とその診断結果に基づくその後の成長状態の相関と一致する。すなわち、本発明の栄養状態診断方法によれば、異なる環境条件で栽培され、異なるストレスを受けたユーカリであっても、そのストレスに影響されることなく対象とする植物のその後の成長状態を正確に予測し得ることが立証された。【０１５０】
＜実施例６：ユーカリ他種栄養状態診断用マーカーの選択＞
本発明の栄養状態診断用マーカーの選択方法により、特定の栄養素を窒素としたときのユーカリプタス・デグルプタ（Eucalyptus degulpta）とユーカリプタス・カマルドレンシス（Eucalyptus camaldulensis）の雑種であるユーカリプタス・デグルプタ×カマルドレンシス（Eucalyptus degulpta×camaldulensis）（以下の実施例において、便宜上、単に「ユーカリ他種」として記す）における栄養状態診断用マーカーを選択した。【０１５１】
１．窒素欠乏ユーカリ他種の作製
樹高30〜50cm程度のユーカリ他種を、山土4L、ピートモス3L (FIBROSOIL)、バーミキュライト2L（ハットリ株式会社）、ピーナスライト1L（芙蓉パーライト株式会社）からなる10Lの土壌を入れたポットに、１個体／ポットで１０個体植え、１ヶ月間野外環境下において栽培した。この間、1ポットあたり約500mlの潅水を、朝・夕の２回行った。１０個体は、５個体ずつ２つのグループに分け、Aグループにはハイコントロール肥料（旭チッソ株式会社）を50g（5g/L土壌）、Bグループには施肥しなかった。【０１５２】
２．葉のサンプリング、代謝産物抽出及びLC-MS解析
植栽１ヶ月目のユーカリ他種について、実施例１と同様の方法により葉のサンプリング、代謝産物抽出及びLC-MS解析を行った。【０１５３】
３．ユーカリ他種診断用栄養状態診断用マーカーの選択
GeneSpring MS (アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて、ユーカリ他種栄養状態診断用のバイオマーカーを以下のように選択した。【０１５４】
(1)  Aグループの条件で栽培したユーカリ他種5個体とBグループの条件で栽培したユーカリ他種５個体の間で２群比較(Volcano Plot)を行い、２つの試験区間において２倍以上又は１／２以下の蓄積量を示し、かつ統計的に有意差(P<0.05)のある代謝産物をマーカー候補として選択した。【０１５５】
(2) 実施例１で選択した栄養診断用マーカー(表２：Mass No.1〜270)と上記(1)で選択したマーカー候補代謝物の双方で共通するする代謝産物をユーカリ他種の窒素に関する栄養状態診断用マーカーとして選択した。【０１５６】
４．結果
本発明の栄養状態診断用マーカーの選択方法によれば、実施例１にて選択した栄養診断用マーカーの中で、上記のようなマーカー選択過程を経ることによりユーカリ他種用栄養状態診断マーカー２１種を選択できることを見出した（表２；Mass No.15、31、41、42、43、51、57、59、68、84、91、104、110、111、148、149、156、241、263、264、269）。【０１５７】
＜実施例７：ユーカリ他種の窒素状態診断用マーカーによるユーカリ他種の窒素状態の診断＞
前記実施例６で得られたユーカリ他種窒素状態診断用マーカーを用いて、被検ユーカリ他種における窒素状態を診断した。【０１５８】
１．ユーカリ他種の栽培
山土4L、ピートモス3L (FIBROSOIL)、バーミキュライト2L（ハットリ株式会社）、ピーナスライト1L（芙蓉パーライト株式会社）からなる10Lの土壌を入れたポットに、平均樹高約40cmのユーカリ他種の苗を１個体／ポットで１５個体を植え、３ヶ月間野外環境下において栽培した。この間、１ポットあたり約500mlの潅水を、朝・夕の２回行った。１５個体は、５個体ずつ３つのグループに分け、Aグループにはハイコントロール肥料（旭チッソ株式会社）を50g（5g/L土壌）、Bグループにはロングマックス肥料（九鬼試料株式会社）を50g（5g/L土壌）それぞれ添加し、Cグループには施肥しなかった。【０１５９】
２．葉のサンプリング、代謝産物抽出及びLC-MS解析
植栽１ヶ月目及び２ヶ月目のユーカリ他種について、実施例１と同様の方法により葉のサンプリング、代謝産物抽出及びLC-MS解析を行った。【０１６０】
３．窒素状態診断用マーカーによる窒素状態の診断
植栽１ヶ月目及び２ヶ月目のユーカリ他種について、実施例１と同様の方法により、代謝産物データのアライメントならびにGeneSpring MSを用いたユーカリ他種の窒素状態の解析を行った。解析条件は、以下の通りである。【０１６１】
・計算アルゴリズム：Support Vector Machines
・Kernel Function: Polynomial Dot Product (Order I)
・Marker set: ユーカリプタス・デグルプタ×カマルドレンシスの窒素状態診断用マーカー：２１種（表２；Mass No.15、31、42、42、43、51、57、59、68、84、91、104、110、111、148、149、156、241、263、264、269）
・Test Sample: 被検ユーカリプタス・デグルプタ×カマルドレンシス  １５個体
・Training Sample：実施例１における３種の栄養条件の水耕栽培ユーカリプタス・グロブルス（第I水耕培地ユーカリ、第II水耕培地ユーカリ、第III水耕培地ユーカリ）
４．結果
上記診断の結果を図６に示す。診断パターンは、以下の３群に分類された。【０１６２】
・第１群：植栽１、２ヶ月目ともに、実施例１に記載の第I水耕液の窒素状態と同じと判定されたものが５個体あった。これらは、全てAグループ由来の個体であり、Aグループは、そのほとんどが植栽１、２ヶ月目ともに、良好な窒素状態が維持されていることを示している。【０１６３】
・第２群：植栽１ヶ月目は、実施例１に記載の第I水耕液の窒素状態と同じと判定されたが、植栽２ヶ月目では、実施例１に記載の第III水耕液の窒素状態と同じ状態と判定されたものが５個体あった。これらは、全てBグループ由来の個体であった。この群は、植栽当初窒素状態が良好であったが、植栽１ヶ月前後から悪化した群であることを示している。すなわち、ユーカリ他種についても50gのロングマックス肥料では２ヶ月以上好ましい成長状態で育成するには、窒素量が不足していることが明らかとなった。【０１６４】
・第３群：植栽１、２ヶ月目ともに、実施例１に記載の第III水耕液の窒素状態と同じと判定されたもので、５個体が該当した。この群は、植栽当初から窒素に関する窒素状態が悪い群であり、全てCグループの個体であった。Cグループは、施肥を行っていない窒素欠乏状態のグループであることから、診断結果と一致することが明らかとなった。【０１６５】
本実施例により、実施例２におけるユーカリプタス・グロブルスの診断結果と同様の結果が得られた。この結果は、実施例１にて選択した栄養診断マーカーは、ユーカリプタス・グロブルスのみならず、他のユーカリ種にも共通するマーカーを選択して、診断に用いることにより、他のユーカリ種についても窒素状態の診断が可能であることを示している。【０１６６】
＜実施例８：ユーカリ他種窒素状態診断用マーカーによる窒素状態の診断結果と成長状態の関係＞
前記実施例７で、ユーカリ他種の窒素状態診断用マーカーで分類された各群について、診断結果とその診断結果に基づくその後の成長状態とが相関するか否かを検証した。【０１６７】
結果を図７に示す。実施例７で分類された第１〜３の各群について、植栽３ヶ月目における平均成長量（３ヶ月目の樹高から植栽時の樹高を減じた値の平均値）を測定したところ、第１〜３群の順に平均成長量が悪くなっていく様子が認められた。すなわち、実施例７で窒素状態が良好と診断された第１群は、平均成長量が50cmで最も成長性が良かった。また、実施例７で窒素状態が植栽１ヶ月前後から悪化していると診断された第２群は、平均成長量が40cmであり、第１群よりも少し劣る成長性を示した。一方、実施例７で窒素状態が悪いと診断された第３群は、平均成長量が20cmで成長性が最も悪いことが明らかになった。【０１６８】
以上の結果は、実施例６にてユーカリ他種用に選択した窒素状態診断用マーカーによる診断結果とその後の成長性の間に相関が認められることを示しており、ユーカリ他種用に選択した窒素状態診断マーカーを用いれば、その植物のその後の成長状態を予測し得ることが立証された。【０１６９】
＜実施例９：様々な植物種用の栄養状態診断マーカーの選択＞
ユーカリ属以外の植物種用の栄養状態診断用マーカーを、特定の栄養素を窒素として本発明の選択方法によって選択した。【０１７０】
１．窒素欠乏植物の作製
ユーカリ以外の植物種として、トウモロコシ（Zea mays）、ナス（Solanum melongena）、トマト（Solanum lycopersicum）及びイネ（Oryza sativa）を用いた。【０１７１】
トウモロコシ、ナス又はトマトについては、樹高15cm程度の植物体を、山土4L、ピートモス3L (FIBROSOIL)、バーミキュライト2L（ハットリ株式会社）、ピーナスライト1L（芙蓉パーライト株式会社）からなる10Lの土壌を入れたポットに、各植物種につき１個体／ポットで１０個体植え、野外環境下において栽培した。この間、1ポットあたり約500mlの潅水を、朝・夕の２回行った。１０個体は、５個体ずつ２つのグループに分け、Aグループにはハイコントロール肥料（旭チッソ株式会社）を50g（5g/L土壌）、Bグループには施肥しなかった。【０１７２】
また、イネについては、樹高10cm程度の苗を、黒木土8L（ハットリ株式会社）、赤玉土2L(ハットリ株式会社)、ハイコントロール肥料5gからなる10Lの土壌を入れたポットに、1個体/ポットで１０個体植え、１ヶ月間野外環境下において栽培した。１０個体は、５個体ずつ２つのグループに分け、Aグループには、ハイコントロール肥料200g(20.5g/L土壌)、Bグループには、最初から土壌に含まれている肥料以上には施肥しなかった（初期肥料：0.5g/L土壌）。【０１７３】
２．葉のサンプリング、代謝産物抽出及びLC-MS解析
ナス、トマト、トウモロコシについては植栽２週目の植物体について、イネについては植栽４週目の植物体について、前記実施例１と同様の方法により葉のサンプリング、代謝産物抽出及びLC-MS解析を行った。【０１７４】
３．各種植物種用栄養状態診断用マーカーの選択
GeneSpring MS (アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて、前記植物種（トウモロコシ、ナス、トマト及びイネ）ごとに栄養状態診断用のバイオマーカーを選択した。【０１７５】
（１）Aグループの条件で栽培した植物体５個体とBグループの条件で栽培した植物体５個体の間で２群比較(Volcano Plot)を行い、２つの試験区間において２倍以上又は１／２以下の蓄積量を示し、かつ統計的に有意差(P<0.05)のある代謝産物を各植物種用のマーカー候補として選択した。【０１７６】
(２)実施例１で選択した栄養診断用マーカー（表２；No.1〜270）と上記(1)で選択したマーカー候補代謝物の双方で共通するする代謝産物を植物種ごとの窒素に関する栄養状態診断用マーカーとして選択した。【０１７７】
４．結果
以下に、本発明の栄養状態診断用マーカーの選択方法によって得られた前記各種植物の窒素に関する栄養状態診断用マーカーを以下に示す。【０１７８】
・ナス用：５種（表２；Mass No. 104、144、242、257、265）
・トマト用：３種（表２；Mass No. 43、246、265）
・トウモロコシ用：２４種（表２；Mass No. 7、17、22、29、30、35、37、48、60、65、72、76、77、88、89、92、106、140、142、148、153、154、242、257）
・イネ用：３種（Mass No. 5、170、173）
本発明の栄養状態診断用マーカーの選択方法によれば、実施例１にて選択した栄養診断用マーカーの中からユーカリ属（フトモモ科）のみならず、イネ科（トウモロコシ、イネ）及びナス科（ナス、トマト）のように、属や科を問わず、また、単子葉類及び双子葉類を問わず、広く様々な植物について、その種用の栄養状態診断マーカーを選択できることを見出した。【０１７９】
＜実施例１０：他植物種用窒素状態診断マーカーによる他植物種の窒素状態の診断＞
前記実施例９で得られた各種植物の窒素状態診断用マーカーを用いて、被検サンプル個体における窒素状態を診断した。【０１８０】
１．被検植物の栽培
山土4L、ピートモス3L (FIBROSOIL)、バーミキュライト2L（ハットリ株式会社）、ピーナスライト1L（芙蓉パーライト株式会社）からなる10Lの土壌を入れたポットに、平均樹高約15cmの植物種（ナス、トマト、トウモロコシ）の苗を１個体／ポットで１５個体を植え、１ヶ月間野外環境下において栽培した。この間、１ポットあたり約500mlの潅水を、朝・夕の2回行った。１５個体は、５個体ずつ３つのグループに分け、Aグループにはハイコントロール肥料（旭チッソ株式会社）を50g（5g/L土壌）、Bグループにはロングマックス肥料（九鬼試料株式会社）を50g（5g/L土壌）それぞれ添加し、Cグループには施肥しなかった。【０１８１】
イネについては、樹高10cm程度の苗を、黒木土8L（ハットリ株式会社）、赤玉土2L(ハットリ株式会社)、ハイコントロール肥料5gからなる10Lの土壌を入れたポットに、1個体/ポットで１０個体植え、１ヶ月間野外環境下において栽培した。１０個体は、５個体ずつ２つのグループに分け、Aグループには、ハイコントロール肥料200g(20.5g/L土壌)、Bグループには、最初から土壌に含まれている肥料以上には施肥しなかった（初期肥料：0.5g/L土壌）。【０１８２】
２．葉のサンプリング、代謝産物抽出及びLC-MS解析
植栽２週間目における各植物個体について、実施例１と同様の方法により葉のサンプリング、代謝産物抽出及びLC-MS解析を行った。【０１８３】
３．窒素状態診断用マーカーによる窒素状態の診断
植栽２週目の被検植物個体について、実施例１と同様の方法により、代謝産物データのアライメントならびにGeneSpring MSを用いた被検ユーカリの窒素状態の解析を行った。ただし、イネのみは、植栽２週目及び４週目について解析を実施した。【０１８４】
解析条件は、以下の通りである。【０１８５】
・計算アルゴリズム：Support Vector Machines
・Kernel Function: Polynomial Dot Product (Order I)
・Marker set: 各植物種用の窒素状態診断用マーカー
ナス用窒素状態診断マーカー:表２のMass No. 104、144、242、257、265
トマト用窒素状態診断マーカー：表２のMass No. 43、246、265
トウモロコシ用窒素状態診断マーカー：表２のMass No. 7、17、22、29、30、35、37、48、60、65、72、76、77、88、89、92、106、140、142、148、153、154、242、257
イネ用窒素状態診断マーカー：表２のMass No. 5、170、173
・Test Sample: 被検植物個体各１５個体（ナス、トマト、トウモロコシ、イネ）
・施肥タイプ
(ナス、トマト、トウモロコシ)
A.ハイコントロール肥料(5g/L土壌)
B.ロングマックス肥料（5g/L土壌）
C.無施肥
（イネ）：
A.ハイコントロール肥料（20g/L土壌）
B.ハイコントロール肥料（5g/L土壌）
C.初期肥料（0.5g/L）
・Training Sample: 実施例１における３種の栄養条件の水耕栽培ユーカリプタス・グロブルス（第I水耕培地ユーカリ、第II水耕培地ユーカリ、第III水耕培地ユーカリ）
４．結果
各植物種の植栽２週目における栄養診断を実施した。イネに関してのみ植栽２週目及び植栽４週目における栄養診断を実施した。【０１８６】
（ナス）
図８に結果を示す。【０１８７】
・施肥タイプA及びB：植栽２週目の時点で、第I水耕液の窒素状態と同じ栄養状態と判定されたのは、全１０個体中１０個体であった。すなわち、植栽２週目では、これらの施肥法の植物体は、良好な窒素状態が維持されていたことを示している。【０１８８】
・施肥タイプC：第III水耕液の窒素状態と同じ栄養状態と判定されたのは、全５個体中５個体であった。すなわち、これらの５個体は、窒素状態が不十分であったことを示している。これは、施肥を実施していない結果と一致している。【０１８９】
（トマト）
図９に結果を示す。【０１９０】
・施肥タイプA及びB：植栽２週目の時点で、第I水耕液の窒素状態と同じ栄養状態と判定されたのは、全１０個体中８個体であった。すなわち、植栽２週目では、これらの施肥法を用いたほとんどの植物体は、良好な窒素状態が維持されていたことを示している。【０１９１】
・施肥タイプC：第III水耕液の窒素状態と同じ栄養状態と判定されたのは、全５個体中５個体であった。すなわち、これらの５個体は、窒素状態が不十分であったことを示している。これは、施肥を実施していない結果と一致している。【０１９２】
（トウモロコシ）
図１０に結果を示す。【０１９３】
・施肥タイプA及びB：植栽２週目の時点で、第I水耕液の窒素状態と同じ栄養状態と判定されたのは、全１０個体中９個体であった。すなわち、植栽２週目では、これらの施肥法を用いたほとんどの植物体は、良好な窒素状態が維持されていたことを示している。【０１９４】
・施肥タイプC：第III水耕液の窒素状態と同じ栄養状態と判定されたのは、全５個体中５個体であった。すなわち、これらの５個体は、窒素状態が不十分であったことを示している。これは、施肥を実施していない結果と一致している。【０１９５】
（イネ）
図１１に結果を示す。【０１９６】
・施肥タイプA及びB：植栽２週目及び４週目ともに、第I水耕液の窒素状態と同じ栄養状態と判定されたのは、全１０個体中１０個体であった。すなわち、これらの１０個体は植栽２週目及び４週目ともに、良好な窒素状態が維持されていたことを示している。【０１９７】
・施肥タイプC：植栽２週目の時点で、第I水耕液の窒素状態と同じ栄養状態と判定されたのは、全５個体中４個体であり、２週目の時点では良好な栄養状態を維持した個体が多いと判定された。また、植栽４週目の時点では、第III水耕液の窒素状態と同じ栄養状態と判定されたのは、全５個体中４個体であった。すなわち、施肥タイプ３では、土壌に最初から含まれている初期肥料（0.5g/L土壌）により植栽２週目の時点では窒素状態が良好と判定されたが、植栽４週目の時点では窒素状態が悪化したことを示している。つまり、初期肥料（0.5g/L土壌）でイネを4週間良好に生育させるのは好ましくないことが明らかとなった。【０１９８】
本実施例の結果から、実施例１で選択した本発明の窒素状態診断マーカーは、ユーカリ属のみならず、他の様々な植物種に適用させることができ、それによって、その栄養状態を診断できることが明らかとなった。【０１９９】
＜実施例１１：他植物種窒素状態診断用マーカーによる窒素状態の診断結果と成長状態の関係＞
前記実施例１０で、他植物種窒素状態診断用マーカーで診断された各群について、診断結果とその診断結果に基づくその後の成長状態とが相関するか否かを検証した。【０２００】
（ナス）
図１２に結果を示す。第I水耕液と同じ窒素状態と診断された１０個体の植栽１ヶ月目の平均成長量をみると26.4cmであった。一方、第III水耕液と判定された５個体の成長量は16.6cmであった。また、両者の間に1%以下水準の有意差が認められた。【０２０１】
（トマト）
図１３に結果を示す。第I水耕液と同じ窒素状態と診断された８個体の植栽１ヶ月目における平均成長量をみると40.5cmであった。一方、第III水耕液と同じと判定された7個体は26.4cmであった。また、両者の間に1%以下水準の有意差が認められた。【０２０２】
（トウモロコシ）
図１４に結果を示す。第I水耕液と同じ窒素状態と診断された９個体の植栽１ヶ月目における平均成長量をみると30.7cmであった。一方、第III水耕液と同じと判定された６個体は11.3cmであった。また、両者の間に1%以下水準の有意差が認められた。【０２０３】
（イネ）
図１５に結果を示す。植栽２週目４週目ともに第I水耕液と同じ窒素状態と診断された１０個体の植栽６週目における平均成長量をみると48.9 cmであった。一方、植栽２週目では第I水耕液と診断され、植栽４週目では第III水耕液と同じと判定された４個体は22 cmであった。また、両者の間に1%以下水準の有意差が認められた。【０２０４】
本実施例の結果から、実施例９において選択した各種植物用の窒素状態診断マーカーを用いて診断することにより、種を問わず、また単子葉類及び双子葉類を問わず、広く様々な植物についてその後の成長状態を予測し得ることが実証された。【０２０５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2011024525.tif 000009
【図２】
2011024525.tif 000010
【図３ａ】
2011024525.tif 000011
【図３ｂ】
2011024525.tif 000012
【図３ｃ】
2011024525.tif 000013
【図４】
2011024525.tif 000014
【図５】
2011024525.tif 000015
【図６】
2011024525.tif 000016
【図７】
2011024525.tif 000017
【図８】
2011024525.tif 000018
【図９】
2011024525.tif 000019
【図１０】
2011024525.tif 000020
【図１１】
2011024525.tif 000021
【図１２】
2011024525.tif 000022
【図１３】
2011024525.tif 000023
【図１４】
2011024525.tif 000024
【図１５】
2011024525.tif 000025
【国際調査報告】
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2011024525.tif 000027
2011024525.tif 000028
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