(57)【要約】  本発明は、固定液により固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルから遺伝子発現解析に用いるａＲＮＡを調製する方法であって、逆転写およびインビトロ転写によるＲＮＡサンプルの増幅工程において、インビトロ転写で用いるヌクレオチド試薬中のアミノアリルウリジン５’−三リン酸（ＡＡ−ＵＴＰ）の割合を、ウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）とＡＡ−ＵＴＰの総和に対して５モル％以上２５モル％未満とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析に用いるａＲＮＡの調製方法であって、逆転写工程およびインビトロ転写工程を含むＲＮＡの増幅工程を含み、該インビトロ転写工程で用いるヌクレオチド試薬に含まれる５−（３−アミノアリル）ウリジン５’−三リン酸（ＡＡ−ＵＴＰ）の割合が、ウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）と５−（３−アミノアリル）ウリジン５’−三リン酸（ＡＡ−ＵＴＰ）の総和に対して５モル％以上２５モル％未満である、ａＲＮＡの調製方法。
【請求項２】
固定された組織または細胞がパラフィン包埋されてなる、請求項１に記載のａＲＮＡの調製方法。
【請求項３】
ａＲＮＡのヌクレオチド長の平均値が２００ヌクレオチド以上である、請求項１または２に記載のａＲＮＡの調製方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により調製されたａＲＮＡを用いる、固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルの遺伝子発現の解析方法。
【請求項５】
マイクロアレイを用いる、請求項４に記載の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析を行う際に用いられる、ａＲＮＡの調製方法に関する。また、本発明は、固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルから調製されたａＲＮＡを用いる、遺伝子発現の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病院や研究機関等で莫大な数の検体が保管されている、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に代表されるような、固定液により固定された組織、細胞に含まれる遺伝子を解析する技術に対して大いに期待が高まっている。特に、ＦＦＰＥ組織については、過去の膨大な疾患データが蓄積されていることから、ＦＦＰＥ組織から遺伝子を抽出し、それらの発現を解析できる技術を確立すれば、長期間保存された組織を用いた遡及的な研究が可能となり、将来的には疾患の治療や予防に大きく貢献できる。【０００３】
しかしながら、ＦＦＰＥサンプル等の固定組織や固定細胞から抽出したＲＮＡは、一般的な固定条件、保管条件では分解、断片化が進行することから、遺伝子発現解析を行うのは難しいと考えられていた。また、固定液として最も一般的に用いられているホルムアルデヒド（ホルマリン）により、ＲＮＡ−ＲＮＡ間、ＲＮＡ−タンパク質間が架橋されたり、ホルムアルデヒドがＲＮＡに付加、修飾されたりすることがあり、そのような状態のＲＮＡサンプルにおいては、酵素反応および／または化学反応が進行しにくく、遺伝子発現解析が困難となることがあった。そこで、分解、断片化が進行したＲＮＡサンプルや、架橋、付加、修飾がなされたＲＮＡサンプルからでも、遺伝子発現解析を可能とする技術が求められていた。【０００４】
ＦＦＰＥサンプルから遺伝子発現解析に供するＲＮＡサンプルを調製することを目的とした、いくつかのＲＮＡ増幅用試薬キットが市販されている。具体的には、ｃＤＮＡを増幅するＮｕＧｅｎ社の“ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ  ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ”、ａＲＮＡを増幅するＡｍｐＴｅｃ社の“ＥｘｐｒｅｓｓＡｒｔ  ＴＲｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”、ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の“Ｐａｒａｄｉｓｅ  Ｐｌｕｓ  ２  Ｒｏｕｎｄ−Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ”などが挙げられる。これらのキットは、少量のＲＮＡから大量の増幅産物を得ることを主目的とした製品であり、そのため増幅反応を２回以上行うのが標準的である。しかし、ｍＲＮＡの分解挙動は一様ではないため、特にＦＦＰＥサンプルから抽出したような分解、断片化が進んだＲＮＡサンプルを増幅する場合は、増幅操作によるバイアスが生じる可能性が極めて高く、増幅操作を複数回繰り返すことでさらにバイアスが増大される。したがって、上述のキットを用いて遺伝子発現解析を行った場合、得られた結果がもとのＲＮＡの存在量から大きく外れることがあり、定量性を有する解析方法や、試薬、キットの開発が求められていた。【０００５】
ＲＮＡサンプルを増幅する方法として、インビトロ転写反応を用いる方法が知られている。この方法においては、増幅産物を蛍光標識することを目的として、増幅操作におけるインビトロ転写反応の際に、アミノアリル基、ビオチン基などの官能基を有するヌクレオチドを用いて、増幅産物に官能基を導入することがある。この際、蛍光色素の標識効率をできるだけ高くするためには、官能基を有さないヌクレオチドに対して官能基を有するヌクレオチドの割合を多くする。固定液による固定操作がなされていない凍結組織や凍結切片から抽出されたＲＮＡサンプルを用いる例として、例えば特許文献１の実施例では、２回増幅の２ラウンド目において、ヌクレオチドの１種であるウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）の一部にアミノアリル基で修飾された５−（３−アミノアリル）ウリジン５’−三リン酸（ＡＡ−ＵＴＰ）を使用しているが、ＡＡ−ＵＴＰとＵＴＰの割合を、ＡＡ−ＵＴＰ：ＵＴＰ＝３：１（ＡＡ−ＵＴＰの割合が７５モル％）としている。また、非特許文献１においては、ＡＡ−ＵＴＰによる標識効率を高めるためのＡＡ−ＵＴＰとＵＴＰの比率を検討し、ＡＡ−ＵＴＰ：ＵＴＰ＝１：１（ＡＡ−ＵＴＰの割合が５０モル％）が最適な比率であると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１３１２６２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｅｔｅｒ  Ａ．Ｃ．’ｔ  Ｈｏｅｎ，Ｆｌｏｏｒ  ｄｅ  Ｋｏｒｔ，Ｇ．Ｊ．Ｂ．ｖａｎ  Ｏｍｍｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎ  Ｔ．ｄｅｎ  Ｄｕｎｎｅｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃＲＮＡ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（５），ｅ２０，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述の通り、ＲＮＡの増幅操作を複数回行うことは、少量のＲＮＡサンプルから遺伝子発現解析を行うのに十分な量のＲＮＡサンプルを得られるメリットがある。しかし、固定された組織や細胞から抽出されたＲＮＡサンプルは、分解、断片化や修飾、架橋等が生じており、増幅されやすいものと増幅されにくいものとが混在している。そのため、増幅操作を繰り返して増幅倍率が大きくなるほど増幅バイアスが生じ、定量的な評価が困難であった。【０００９】
一方、ＲＮＡを逆転写反応とインビトロ転写反応を組み合わせて増幅する方法は、比較的増幅バイアスが生じにくいとされている。しかし、この方法において、増幅産物に蛍光標識を行うための官能基を導入する場合、インビトロ転写反応においてアミノアリル基等の官能基を有するヌクレオチド試薬を用いる必要があるが、この官能基を有するヌクレオチドの割合が多いと、増幅反応が阻害されてしまう。そのため、分解、断片化等が進んだ固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルを用いる場合には、遺伝子発現の解析を行うのに十分量の増幅産物が得られないということが課題であった。この場合、十分量の増幅産物を確保するために増幅反応を繰り返すと、増幅バイアスが増大するという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、発明者らは鋭意検討した結果、固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析を行うにあたり、インビトロ転写反応で用いるヌクレオチド試薬中のアミノアリル基を有するヌクレオチドの割合を特定範囲に設定することで、インビトロ転写反応の阻害が抑制され、かつ、遺伝子発現解析に必要となる十分な増幅産物量を確保できることを見出した。そして、この方法で調製された増幅ＲＮＡ（ａＲＮＡ）サンプルを用いて遺伝子発現解析を行うと、固定された組織、細胞から抽出したＲＮＡサンプルを用いる場合にも、凍結組織から抽出した分解等のほとんどない無傷の（インタクトな）ＲＮＡサンプルを用いた場合と同等の定量性の高い解析結果が得られる、すなわち増幅バイアスの影響を低減することができることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（５）で構成される。
（１）固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析に用いるａＲＮＡの調製方法であって、逆転写工程およびインビトロ転写工程を含むＲＮＡの増幅工程を含み、該インビトロ転写工程で用いるヌクレオチド試薬に含まれる５−（３−アミノアリル）ウリジン５’−三リン酸（ＡＡ−ＵＴＰ）の割合が、ウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）と５−（３−アミノアリル）ウリジン５’−三リン酸（ＡＡ−ＵＴＰ）の総和に対して５モル％以上２５モル％未満である、ａＲＮＡの調製方法。
（２）固定された組織または細胞がパラフィン包埋されてなる、（１）に記載のａＲＮＡの調製方法。
（３）ａＲＮＡのヌクレオチド長の平均値が２００ヌクレオチド以上である、（１）または（２）に記載のａＲＮＡの調製方法。
（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法により調製されたａＲＮＡを用いる、固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルの遺伝子発現の解析方法。
（５）マイクロアレイを用いる、（４）に記載の解析方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のａＲＮＡの調製方法を用いることにより、固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルを用いる遺伝子発現解析を行う場合に必要となる十分量のａＲＮＡを得ることができる。また、本発明のａＲＮＡの調製方法によれば、増幅バイアスの影響が低減されたａＲＮＡが得られることから、元のＲＮＡサンプル中の遺伝子の存在量が相当程度正確に反映された、定量性の高い遺伝子発現解析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（１）：マウス小脳、肝臓のＦＦＰＥ（Ａ）から抽出されたＲＮＡ（Ａ）の電気泳動像。（２）：ＦＦＰＥ（Ｂ）から抽出されたＲＮＡ（Ｂ）の電気泳動像。（３）：ＦＦＰＥ（Ｃ）から抽出されたＲＮＡ（Ｃ）の電気泳動像。（４）：マウス小脳、肝臓の凍結組織サンプルから抽出されたＲＮＡ（Ｄ）の電気泳動像。
【図２】（１）：ＲＮＡ（Ａ）から調製されたａＲＮＡの電気泳動像。（２）：ＲＮＡ（Ｄ）から調製されたａＲＮＡの電気泳動像。
【図３】実施例１において、ＤＮＡチップ解析により凍結組織サンプル（Ｄ）、ＦＦＰＥサンプル（Ａ）ともに発現が確認された共通有効遺伝子について、凍結組織における小脳と肝臓のシグナル比（小脳／肝臓）を縦軸に、ＦＦＰＥサンプルにおける小脳と肝臓のシグナル比（小脳／肝臓）を横軸にプロットした散布図。
【図４】比較例１において、ＤＮＡチップ解析により凍結組織サンプル（Ｄ）、ＦＦＰＥサンプル（Ａ）ともに発現が確認された共通有効遺伝子について、凍結組織における小脳と肝臓のシグナル比（小脳／肝臓）を縦軸に、ＦＦＰＥサンプルにおける小脳と肝臓のシグナル比（小脳／肝臓）を横軸にプロットした散布図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
【００１５】
本発明は、固定された組織または細胞（以下、「固定組織または細胞」ということがある）から抽出されたＲＮＡサンプル（以下、「ＲＮＡサンプル」ということがある）を遺伝子発現解析する際の、ａＲＮＡの調製方法に関する。
【００１６】
本発明において、ａＲＮＡは、元のＲＮＡを増幅工程に供することで増幅産物として得られる、増幅ＲＮＡ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ）を意味する。
【００１７】
本発明のａＲＮＡの調製方法では、固定組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルを増幅工程に供し、ＲＮＡサンプル中のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を増幅する。本発明の増幅工程は、ＲＮＡの逆転写と、得られるＤＮＡのインビトロ転写を組み合わせてＲＮＡの増幅を行い、増幅産物としてａＲＮＡを得るものである。ここで、逆転写は、一本鎖ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を得るものである。また、一般に、インビトロ転写は、インビトロにおいて、鋳型となるＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼによって転写産物としてＲＮＡを得るものである。逆転写反応によりＲＮＡサンプルからｃＤＮＡを得て、二本鎖ＤＮＡを合成した後、インビトロ転写を行うことで、アンチセンス鎖のａＲＮＡが合成される。
【００１８】
逆転写工程の前に、予め逆転写反応の開始点となるプライマーをＲＮＡにアニーリングさせる。ここで用いるプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡを合成する際に３’−ＯＨを供給する役割をもつ短い核酸の断片である。本発明においては、ｍＲＮＡの３’−末端に存在するポリＡとよばれる配列に対して相補的な鎖を有するオリゴｄＴプライマーや、ｍＲＮＡの全ての領域からｃＤＮＡを合成する通常６〜９塩基のランダムプライマーが好適に利用される。また、本発明で用いるプライマーは、プロモーター領域と呼ばれる配列を有することが好ましい。プロモーター領域とは、ＲＮＡを増幅する際に、ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターの塩基配列からなる領域のことをいう。本発明で利用できるプロモーターとしては、例えばＴ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどが挙げられる。プライマーをアニーリングさせるときの反応温度は、３０〜８０℃が好ましく、４０〜７５℃がより好ましい。また反応時間は、５〜１２０分が好ましく、１０〜９０分がより好ましい。
【００１９】
次いで、逆転写工程として、上記で得られるプライマーをアニーリングしたＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素、デオキシヌクレオチドを用いて逆転写反応を行い、１本鎖ｃＤＮＡ（ファースト・ストランドｃＤＮＡ）を合成する。
【００２０】
逆転写酵素は、逆転写反応を進行させるために必須である。本発明においては、例えば、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）由来、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）由来の酵素が利用可能であり、これらにポイントミューテーション、ディレーションミューテーションを入れることで、耐熱性や塩基の伸長性を高めたものも、好ましく利用できる。本発明において好ましく使用される逆転写酵素製品としては、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標、タカラバイオ）、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標、東洋紡）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）が挙げられる。固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルは、架橋や修飾を受けて雑な二次構造を形成していることが多く、そのような構造を崩すために高温で処理すること必要となることがあるため、高温下でも高い活性を有するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩが特に好ましく使用される。
【００２１】
逆転写工程で用いられるヌクレオチドは、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）の４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）である。これらは、逆転写反応で合成されるｃＤＮＡの源になる。
【００２２】
逆転写工程では、逆転写酵素が酸化して活性が低下するのを抑えるために、反応溶液に還元剤を添加することができる。還元剤としては、例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）が好適に用いられる。また、鋳型となるＲＮＡを保護するために、反応溶液にＲＮａｓｅインヒビターを添加することが好ましい。また、反応溶液のｐＨを逆転写反応に適したｐＨ７〜９に調整するために、緩衝液を用いることができる。例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液が好ましく用いられる。さらに、反応溶液にはカリウム塩、マグネシウム塩が含まれることが好ましい。
【００２３】
逆転写反応の温度は、２５〜６０℃が好ましく、３０〜５０℃がより好ましく、３５〜４５℃がさらに好ましい。また、逆転写反応の時間は、３０〜１８０分が好ましく、６０〜１５０分がより好ましい。逆転写反応後、氷上に移すなどして急冷することで、反応を停止させる。
【００２４】
逆転写反応の終了後、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）によって逆転写反応の鋳型となったＲＮＡの一部を分解させる。ここで使用する試薬としては、ＲＮａｓｅ  Ｈが好適である。逆転写反応後の反応液にＲＮａｓｅ  Ｈを添加し、加熱反応させることで、ＲＮＡを分解させることができる。本分解反応の温度は、１０〜５０℃が好ましく、１５〜４０℃がより好ましい。また、本分解反応後に、逆転写酵素を失活させる工程として、例えば９０〜１００℃で１〜１０分間加熱する工程を加えてもよい。
【００２５】
次いで、上記の逆転写工程によって得られた一本鎖ｃＤＮＡ（ファースト・ストランドｃＤＮＡ）を鋳型として、これに相補的なＤＮＡ（セカンド・ストランドｃＤＮＡ）を合成する。プライマーとしては、逆転写工程において分解されなかった一部のＲＮＡをプライマーとしてもよいし、必要に応じて外因性プライマーをアニーリングし、それをプライマーとして利用してもよい。鋳型となるｃＤＮＡにｄＮＴＰを加え、酵素としてＤＮＡポリメラーゼを添加して反応を開始すると、ファースト・ストランドｃＤＮＡを鋳型にしてセカンド・ストランドｃＤＮＡが合成される。このセカンド・ストランドｃＤＮＡの合成反応の結果、プロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡが合成される。
【００２６】
セカンド・ストランドｃＤＮＡ合成反応で得られた、プロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡは、次のインビトロ転写工程において反応を阻害する塩や不純物を取り除くために、精製することが好ましい。例えば、エタノール沈殿や、市販のＤＮＡ精製用スピンカラムを用いる当業者に公知の方法により精製することができる。
【００２７】
精製されたプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡを用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）工程を行い、ＲＮＡを増幅させると、目的とするａＲＮＡが得られる。インビトロ転写工程は、プロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡに、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン５’−三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）および５−（３−アミノアリル）ウリジン５’−三リン酸（ＡＡ−ＵＴＰ）を含むヌクレオチド試薬、およびプロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写反応を行い、ａＲＮＡが得られる。ここで、インビトロ転写の反応温度は３０〜５０℃が好ましく、３５〜４５℃がより好ましい。また、インビトロ転写の反応時間は１〜２０時間が好ましく、２〜１６時間がより好ましい。インビトロ転写においては、適宜ＲＮａｓｅインヒビター（ジチオトレイトールなど）、還元剤等を用いてもよい。
【００２８】
上記のインビトロ転写工程で用いるヌクレオチド試薬には、調製されるａＲＮＡを蛍光標識するために、アミノアリル基を有するヌクレオチドとして、ウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）をアミノアリル基で修飾した５−（３−アミノアリル）ウリジン５’−三リン酸（ＡＡ−ＵＴＰ）を用いる。本発明では、ＵＴＰとＡＡ−ＵＴＰの総和に対するＡＡ−ＵＴＰの含量割合、すなわち「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」で求められる割合が、５モル％以上２５モル％未満である。このＡＡ−ＵＴＰの含量割合の下限は、好ましくは６モル％以上、より好ましくは８モル％以上、さらに好ましくは１０モル％以上である。また、このＡＡ−ＵＴＰの含量割合の上限は、好ましくは２４モル％以下、より好ましくは２３モル％以下である。また、このＡＡ−ＵＴＰの含量割合の範囲は、好ましくは６モル％以上２４モル％以下、より好ましくは１０モル％以上２３モル％以下である。ＡＡ−ＵＴＰの含量割合が２５モル％以上であると、インビトロ転写反応の進行を阻害され、遺伝子発現解析に必要となる十分量のａＲＮＡが得られないことがある。また、ＡＡ−ＵＴＰの割合が５モル％未満であると、ヌクレオチドに対する蛍光標識量が少なくなり、検出感度が低下する結果、遺伝子発現解析において得られる遺伝子発現の情報が乏しくなってしまうことがある。
【００２９】
インビトロ転写反応後、ａＲＮＡ溶液に残存する二本鎖ＤＮＡを除去するため、ＤＮａｓｅを用いてこのＤＮＡを分解させる。ＤＮａｓｅの添加量は、残存ＤＮＡを十分分解できる量であれば特に限定はない。例えば、ＤＮａｓｅとしてＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（１ＭＢＵ／μＬ）（ＭＢＵ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｔ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を使用する場合は、１μｇのＤＮＡを分解するために、３７℃で１０分間の処理条件において１μＬを使用すればよい。ＤＮａｓｅ処理は、通常、１５〜４０℃で１０〜６０分加温することで、ＤＮＡを分解させることができる。
【００３０】
以上のようにして調製されたａＲＮＡは、ＤＮａｓｅ処理の後、遺伝子発現解析に供する前に精製することが好ましい。ａＲＮＡの精製方法としては、例えば、シリカメンブレンのスピンカラムを用いて、ａＲＮＡをメンブレンに吸着させ、洗浄して不要物を流去した後、吸着したａＲＮＡを溶出させる方法を用いることが好ましい。この場合の洗浄液は、グアニジウム塩およびアルコール類を含む溶液を用いることが好ましい。また、溶出液としては、例えばヌクレアーゼフリー水、ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒが好適に用いられる。溶出液は、室温のまま用いてもよいし、加熱して用いてもよい。
【００３１】
本発明の調製方法によって得られたａＲＮＡの蛍光標識は、遺伝子発現解析におけるハイブリダイゼーション反応の前に行ってもよいし、後に行ってもよい。本発明の方法によって導入されたアミノアリル基に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を末端に持つ蛍光色素と容易にカップリングさせることができる。ここで用いることができる蛍光色素の例としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｈｙｐｅｒ５（ＧＥヘルスケア社）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）、Ｏｙｓｔｅｒシリーズ（Ｄｅｎｏｖｏ  Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ社）、ＤｙＬｉｇｈｔシリーズ（Ｐｉｅｒｃｅ社）、Ｆｌｕｏｌｉｄ−Ｗシリーズ（アイエスティー社）、ＨｙＬｉｔｅ  Ｆｌｕｏｒシリーズ（Ａｎａｓｐｅｃ社）、ＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ  Ｄｙｅ（Ｄｙｏｍｉｃｓ社）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明のａＲＮＡの調製方法に適用される固定組織または細胞は、固定化されたものである。組織または細胞の固定に用いる固定液としては、ホルムアルデヒド溶液、パラホルムアルデヒド溶液、エタノール等のアルコール、アセトン、クロロホルムを含む溶液、ピクリン酸や重クロム酸カリウム等の酸を含む溶液、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛等の金属を含む溶液が挙げられるが、ホルムアルデヒド溶液、パラホルムアルデヒド溶液が好適に使用される。ホルムアルデヒド溶液は、市販のホルマリン（ホルムアルデヒド濃度３７％）を水で希釈したものを使用してもよいし、水で希釈したホルマリン溶液を炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等を加えてｐＨを中性に調整したものや、リン酸緩衝液で希釈してｐＨを中性に調整したものを使用することも好ましい。ホルムアルデヒド溶液中のホルムアルデヒド含量は、１〜３０％が好ましく、２〜２０％がより好ましい。
【００３３】
固定組織または細胞はパラフィンで包埋されていてもよい。例えば、ホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または細胞を好ましく用いることができる。固定組織または細胞は、当業者に公知である一般的な手法でパラフィン包理することができる。例えば、固定組織または細胞をアルコールで置換して脱水し、次いでキシレン、ベンゼン等で置換した後、熱して液化したパラフィンを流し入れた型枠に組織または細胞を入れて包埋し、パラフィンブロックとする。パラフィン包埋された組織または細胞からＲＮＡサンプルを抽出する場合は、回転式ミクロトーム、滑走式ミクロトーム等のミクロトームを用いて薄切したものを使用することができる。この場合の薄切片の厚さは特に限定されないが、１〜１００μｍが好ましく、２〜５０μｍがより好ましい。固定組織または細胞の包埋は、パラフィンの代わりに、主に凍結組織切片作製に用いられるＯＣＴ（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）コンパウンドを用いてもよい。
【００３４】
また、パラフィン包埋された固定組織または細胞は、１〜２０μｍの厚さに薄切し、スライドガラスに貼付したものを作製して、一部の組織または細胞のみを切り出して使用してもよい。この方法により、遺伝子発現解析の対象として意図する目的の組織または細胞のみを解析することができるため好ましい。特に、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または細胞の場合、組織または細胞が固定されているため、上記の操作に適した検体といえる。組織または細胞を切り出す方法としては、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）が用いられる。ＬＣＭで組織または細胞を採取する場合、通常、採取される組織または細胞の量が少ないため、抽出できるＲＮＡ量も少なくなることから、少量のＲＮＡから解析できることが好ましい。
【００３５】
固定組織または細胞は、特に上記のように遺伝子発現解析の対象として意図する目的の組織または細胞のみを採取するときは、組織または細胞の形状や性質等を判別できるようにするために、染色がなされていてもよい。染色液としては、例えばクレシルバイオレット、トルイジンブルー、ヘマトキシリン、ヌクレアファストレッドが好ましく用いられる。
【００３６】
本発明のａＲＮＡの調製方法に適用される固定組織または細胞は、外科手術により摘出された臓器・組織、生体組織診断等のために針生検で採取された臓器・組織、各種実験動物の臓器・組織、初代培養細胞、細胞株などが挙げられる。
【００３７】
固定組織または細胞からＲＮＡを抽出する方法としては、脱パラフィンを行うための試薬（例えばキシレン、リモネン）、アルコール類（例えばエタノール）、組織又は細胞のタンパク質を消化するための酵素（例えばＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）、および抽出されたＲＮＡの精製手段（例えばシリカ系カラム）を利用する公知の方法を適用することができる。また、市販品では、例えば、“ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（ＴＭ）  Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＦＦＰＥ”（Ａｍｂｉｏｎ社製）、“ＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥ  Ｋｉｔ”（Ｑｉａｇｅｎ社製）、“ＩＳＯＧＥＮ  ＰＢ  Ｋｉｔ”（ニッポンジーン株式会社製）、“ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”（Ｎｏｒｇｅｎ社製）、“ＰｕｒｅＬｉｎｋ（ＴＭ）  ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、“Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏ”（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）等のホルマリン固定パラフィン包埋組織用ＲＮＡ抽出キットを好適に用いることができる。
【００３８】
本発明のａＲＮＡの調製方法において、ＲＮＡ増幅工程に供するＲＮＡの量は、上記のようにして抽出されたトータルＲＮＡとして１０〜２０００ｎｇが好ましく、５０〜１５００ｎｇがより好ましい。
【００３９】
また、本発明のａＲＮＡの調製方法において、増幅工程の実施回数は１回とすることが好ましい。増幅反応を２回以上繰り返すと、１回目の増幅反応により増幅産物にわずかでもバイアスが生じた場合、２回目以降そのバイアスが増大する場合がある。
【００４０】
本発明のａＲＮＡの調製方法において用いる固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルとしては、前記のような分解、断片化あるいは修飾、架橋の発生が比較的少ない、ある程度の品質を保っているものを使用することが、遺伝子発現解析により有用な結果を得ることができる点で好ましい。例えば、抽出したＲＮＡサンプルを、バイオアナライザ２１００（アジレント・テクノロジー社）を用いて電気泳動したときのサイズ分布において、１０００〜４０００ヌクレオチドの割合Ａ（％）と４０００ヌクレオチドを超えるサイズの割合Ｂ（％）とを比べたとき、Ａ≧ＢであるＲＮＡサンプルを用いることが好ましい。ＲＮＡサンプルがこの条件を満たす場合、修飾、架橋したＲＮＡの割合が相対的に少なく、有用な解析結果が得られる可能性が高くなる。また、例えば、抽出したＲＮＡサンプルを、バイオアナライザ２１００を用いて電気泳動したときのサイズ分布において、１０００〜４０００ヌクレオチドの割合Ａ（％）が大きいほど、修飾、架橋や分解、断片化が生じたＲＮＡの割合が少ないＲＮＡであり、無傷の（インタクトな）ＲＮＡサンプルにより近い状態であるといえることから、有用な解析結果が得られる可能性が高くなる。具体的には、１０００〜４０００ヌクレオチドの割合Ａ（％）は、好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは２５％以上であるＲＮＡサンプルを用いることができる。
【００４１】
上記のＲＮＡサンプルのサイズ分布を測定するには、例えばＲＮＡ６０００  Ｎａｎｏ  ｃｈｉｐまたはＲＮＡ６０００  Ｐｉｃｏ  ｃｈｉｐ（ともにアジレント・テクノロジー社）を用いて、取扱説明書に記載された方法でＲＮＡの電気泳動を行った後、専用ソフトウェアに備えられたＳｍｅａｒ解析の機能を用いて、得られた泳動パターンを解析することで、特定の分子量範囲におけるＲＮＡの存在割合を求めることができる。なお、この方法において、分解が生じていないＲＮＡ（インタクトなＲＮＡ）を分析した場合、約４７００ヌクレオチドといわれているリボソームＲＮＡが、４０００ヌクレオチドよりやや小さい分子量をピークとしたバンドとして示されることがある。これは、２８Ｓの分子には２本鎖領域が多く含まれているため、構造がコンパクトになっており、電気泳動においては実際の分子量より泳動速度が速くなるためと考えられる。この現象に関して、アジレント・テクノロジー社ホームページのＦＡＱにおいても、同様の記載がみられる。したがって、本方法においては、リボソームＲＮＡの２８Ｓは、電気泳動における１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲に実質上含まれるものとみなす。また、１８Ｓの分子量は１８７４ヌクレオチドであり、電気泳動においても１０００〜４０００ヌクレオチドの範囲にバンドが見られることから、当該範囲に含まれる。
【００４２】
本発明のＲＮＡサンプルの遺伝子発現の解析方法は、前記の本発明の調製方法によって調製されたａＲＮＡを用いるものである。この解析は、蛍光標識されたａＲＮＡを、発現解析を行いたい目的ＲＮＡと直接的又は間接的に選択的に結合しうる物質である選択結合性物質の結合反応によって行うことができる。例えば、選択結合性物質が表面に固定化されたマイクロアレイを用いることが好ましい。選択結合性物質としては、核酸または他の抗原性化合物が挙げられる。ここでいう核酸には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）などが含まれる。選択結合性物質としては核酸が好ましく、ａＲＮＡ中の解析目的遺伝子と相補的な配列の一部を有するＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴマーがより好ましく、ＲＮＡとより強固に結合するＤＮＡオリゴマーがさらに好ましい。ＤＮＡオリゴマーの長さは、２０〜１００ｍｅｒが好ましく、４０〜８０ｍｅｒがより好ましい。選択結合性物質は、市販のものでもよいし、合成したもの、生体組織又は細胞などの天然源から調製したものでもよい。また、マイクロアレイを用いる場合、アレイ上に固定化された選択結合性物質は、すべて異なる配列を有することが好ましい。
【００４３】
ＲＮＡサンプルの遺伝子発現の解析においては、上記の選択結合性物質と解析目的ＲＮＡとの結合性を高めるために、ａＲＮＡは断片化されていることが好ましい。断片化されたａＲＮＡのサイズは、平均値が１００〜２００ヌクレオチドであることが好ましい。
【００４４】
ａＲＮＡとマイクロアレイに固定化された選択結合性物質を結合させる方法としては、特に選択結合性物質が核酸である場合、ハイブリダイゼーション反応によって結合させることが好ましい。ハイブリダイゼーションで用いられる反応液には、溶液のｐＨを安定させるための緩衝成分（例えばリン酸緩衝液、ＳＳＣ等）や融解温度（Ｔｍ）を下げる働きを持つホルムアミド、界面活性剤（ラウリル硫酸塩、ラウロイルサルコシン塩など）、非特異結合を防ぐブロッキング剤（デンハルト試薬、断片化サケ精子ＤＮＡ、Ｃｏｔ１  ＤＮＡ、ｔＲＮＡ等）が含まれることが好ましい。蛍光標識したａＲＮＡを含む反応液をマイクロアレイにアプライしてハイブリダイゼーション反応をする場合、使用するマイクロアレイに適した条件で実施することが好ましい。また、マイクロアレイに固定化された選択結合性物質と結合したａＲＮＡの核酸量を検出する方法としては、マイクロアレイ用の蛍光スキャナ装置、例えばＧｅｎｅＰｉｘ（登録商標）  ４０００Ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＳｃａｎＡｒｒａｙ(登録商標)  Ｌｉｔｅ、ＳｃａｎＡｒｒａｙ(登録商標)  Ｅｘｐｒｅｓｓ（以上、Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ＣＲＢＩＯ  IIｅ（登録商標）（日立ソフト）、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ（東レ）等により、核酸に標識した蛍光の強度を読み取ることで検出・測定することができる。検出した蛍光強度より、各遺伝子の発現量が定量される。
【００４５】
ａＲＮＡをマイクロアレイで解析する場合に使用されるマイクロアレイとしては、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ステンレス、金（めっき）などの金属類、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴムなどの高分子材料からなる基板に、選択結合性物質が結合されてなるマイクロアレイを用いることができる。また、市販のマイクロアレイも利用できる。
【００４６】
本発明で用いられるマイクロアレイの好ましい例としては、基板表面に凹凸部を具備していてもよく、さらに凸部の上面にカバーが設けられていてもよい。このとき、カバーには、液体を注入するために、空隙に連通する１つ以上の貫通孔を備えることが好ましい。マイクロアレイとカバーの間の空隙に微粒子が封入されたマイクロアレイは、空隙に検体溶液をアプライし、マイクロアレイに振動、振盪、回転、磁力、重力等を加えて封入した微粒子を検体溶液中で移動させることにより検体溶液を攪拌することができ、その結果ハイブリダイゼーション反応が促進されるため、特に好ましい。ここで、微粒子の材質は特に限定されないが、例えばガラス、セラミックス（例えばイットリア安定化ジルコニア）、金属類(例えばステンレス)、ポリマー（例えばナイロン、ポリスチレン）、磁性体などが好適に用いられる。
【００４７】
増幅工程の実施回数は１回とすることが好ましい。増幅反応を２回以上繰り返すと、１回目の増幅反応により増幅産物にわずかでもバイアスが生じた場合、２回目以降そのバイアスが増大する場合がある。
【００４８】
ａＲＮＡをマイクロアレイにより解析する場合、ａＲＮＡの増幅倍率は２〜２０倍であることが好ましい。増幅倍率が２倍に満たない増幅産物しか得られないようなＲＮＡは、ＲＮＡの分解、断片化が激しく、ＲＮＡ鎖長が非常に短くなっているため、あるいはＲＮＡ分子間またはＲＮＡとタンパク質間で生じる架橋や、固定の際にホルムアルデヒド等の固定液由来物質がＲＮＡに結合することで生じる付加・修飾物の影響で、増幅反応が阻害されるため、増幅しないまたは増幅反応が不十分となる可能性があり、その結果として正確なマイクロアレイ解析ができないことがある。また、増幅産物が２０倍を超える増幅倍率である場合、分解等の程度の差による影響として増幅バイアスが顕著に現れる可能性がある。
【００４９】
増幅倍率を２〜２０倍とする方法としては、ＲＮＡの増幅工程に使用する酵素やプライマー、基質等の濃度を増減させることで、試薬の組成を最適化する方法が挙げられるが、これらに限らない。また、反応時間を調整する方法もある。例えば、比較的増幅倍率の大きい試薬を用いて固定組織または細胞から抽出したＲＮＡサンプルを増幅する場合、反応時間を所定の時間より短くするとよい。
【００５０】
本発明の増幅工程によってＲＮＡサンプルを増幅した結果の増幅倍率は、増幅前後におけるＲＮＡ重量比として求めることができる。具体的には、光路長１０ｍｍのセルを用いて分光光度計で測定したときの波長２６０ｎｍにおける蛍光強度値および溶液量から、下式Ａより増幅前後の溶液中のＲＮＡ重量を求め、下式Ｂより増幅倍率を算出すればよい。
【００５１】
式Ａ：ＲＮＡ重量＝（２６０ｎｍの蛍光強度値）×４０（ｎｇ／μＬ）×溶液量（μＬ）
式Ｂ：増幅倍率＝（増幅後のＲＮＡ重量）／（増幅前のＲＮＡ重量）。
【００５２】
本発明のａＲＮＡの調製方法によって、固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルから、分解のない無傷の（インタクトな）ＲＮＡに近い遺伝子発現解析の結果が得られるａＲＮＡが調製できたか否かを判断する基準の一つとして、ａＲＮＡのサイズを確認する方法が挙げられる。ＲＮＡサンプルが激しく分解していたり、ＲＮＡに修飾、架橋が生じていたりすると、逆転写反応で得られるｃＤＮＡの鎖長が短くなり、その結果得られるａＲＮＡの鎖長も短くなる。このようなＲＮＡサンプルは、増幅倍率がかなり低くなる傾向があり、また遺伝子発現解析を行った場合、分解のない無傷の（インタクトな）ＲＮＡと比較して有効スポット数が少なく、かつ両者間の相関関係が悪くなる傾向がある。ａＲＮＡのサイズは、電気泳動、液体クロマトグラフィーなどを用いることで確認できる。例えば、“Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ”（アジレント・テクノロジー社）のようなチップ電気泳動システムを用いて測定するのが好ましい。この方法により増幅産物であるａＲＮＡのサイズ分布を調べて、分布のピークにあたるサイズ（ヌクレオチドの長さ）を確認し、それが２００ヌクレオチド（［ｎｔ］）以上であれば、分解のない無傷の（インタクトな）ＲＮＡの場合と相関性の高い遺伝子発現解析ができる可能性が高いといえる。逆に、分布のピークが２００［ｎｔ］を下回る場合は、もとのＲＮＡサンプルの品質が悪かったことが示唆され、遺伝子発現解析に供しても妥当性の高い結果が得られない可能性が高い。
【実施例】
【００５３】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００５４】
参考例１  ＡＡ−ＵＴＰ、ＵＴＰの定量
５−（３−アミノアリル）ウリジン５’−三リン酸（ＡＡ−ＵＴＰ）およびＵＴＰの含量は、以下の通りＬＣ／ＭＳ分析により定量した。【００５５】
ＡＡ−ＵＴＰ（Ａｍｂｉｏｎ社）、ＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社）の標準品を用いてそれぞれ濃度希釈系列を作成した。ＨＰＬＣ装置としてＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＥ−ＵＶ（島津製作所）、質量分析計としてＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（島津製作所）をそれぞれ用い、カラムはＣａｐｃｅｌＰａｋ  Ｃ１８  ＡＱ（資生堂）を用いてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行った。ＬＣにおいて検出されるＵＴＰ、ＡＡ−ＵＴＰに由来するピークの保持時間のマススペクトルにおいて、ＵＴＰ由来のイオンの理論ｍ／ｚ値＝４８２．９６０７、及びＡＡ−ＵＴＰ由来のイオンの理論ｍ／ｚ値＝５３８．００２９に近い値のピークの面積値から検量線を作成した。そして、測定対象の試料を用いて、同様にマスクロマトグラムを描いてピークの面積値を求めることで、検量線から試料中のＵＴＰ濃度、ＡＡ−ＵＴＰ濃度を定量した。【００５６】
参考例２  ＦＦＰＥサンプルからＲＮＡの抽出および品質の確認
（１）ＲＮＡサンプル（Ａ）〜（Ｃ）
マウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）の肝臓および小脳組織の固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックのサンプルとして、以下のＦＦＰＥ（Ａ）〜（Ｃ）を準備した。
ＦＦＰＥ（Ａ）：１０％中性緩衝ホルマリン溶液で２日間固定後パラフィン包埋し、室温で約６ヶ月間保管されたもの
ＦＦＰＥ（Ｂ）：１０％中性緩衝ホルマリン溶液で２日間固定後パラフィン包埋し、室温で約１年間保管されたもの
ＦＦＰＥ（Ｃ）：４％パラホルムアルデヒド溶液で１日間固定後パラフィン包埋し、室温で約６ヶ月間保管されたもの。【００５７】
上記ＦＦＰＥ（Ａ）〜（Ｃ）のパラフィンブロック（肝臓、小脳）から、ミクロトームを用いて１０μｍ厚の薄切片を肝臓は２枚、小脳は１０枚採取し、それぞれ１．５ｍＬのチューブに入れた。キシレン１ｍＬを加えて攪拌し、パラフィンを溶解させた。１６，０００×ｇで５分間遠心した後、ピペットでキシレンを除いた。次いで、エタノール１ｍＬを加えて攪拌し、１６，０００×ｇで２分間遠心した後、ピペットでエタノールを十分に除去する操作を２回繰り返した。チューブの蓋を開けた状態にして約１０分間風乾させ、各組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼＫ溶液（５００μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加して各組織を懸濁させ、３７℃で１６時間静置した。１６，０００×ｇで２分間遠心して残渣を除いた後、シリカカラムを用いてＲＮＡを精製した。【００５８】
以上のようにして、ＦＦＰＥ（Ａ）、ＦＦＰＥ（Ｂ）、ＦＦＰＥ（Ｃ）から、それぞれＲＮＡ（Ａ）、ＲＮＡ（Ｂ）、ＲＮＡ（Ｃ）を得た。【００５９】
ＲＮＡ（Ａ）〜（Ｃ）の純度（波長２８０ｎｍでの強度に対する波長２６０ｎｍでの強度比）を分光光度計（Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ社）により測定した結果、表１にそれぞれ示す通り、これらのＲＮＡサンプルの純度が高いことがわかった。また、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ  ＲＮＡ６０００  Ｎａｎｏ  ｃｈｉｐ（アジレント・テクノロジー社）を用いて電気泳動を行った結果、図１の（１）〜（３）に示す通り、サンプルによってＲＮＡの分解挙動は異なっていた。【００６０】
上記により抽出されたＲＮＡ（Ａ）〜（Ｃ）の品質を次のようにして評価した。Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザの専用ソフトウェアに備えられた、Ｓｍｅａｒ解析の機能を用いて、各ＲＮＡサンプルの電気泳動のパターンにおける１０００〜４０００ヌクレオチドの割合Ａ（％）および４０００ヌクレオチドを超える割合Ｂ（％）をそれぞれ求め、そのＡとＢの比Ｂ／Ａを算出し、これらを品質の指標とした。ここで、Ａが大きいほど品質が高いといえ、またＢ／Ａが１以下であれば、ＲＮＡの品質は比較的高いといえる。その結果を表１に示す。ＲＮＡ（Ａ）〜（Ｃ）の品質は、良好であった。【００６１】
【表１】
2011132726.tif 000002
【００６２】
（２）コントロール用ＲＮＡサンプル（Ｄ）
コントロールとして、マウス（７週齢、雄、Ｓｌｃ：ＩＣＲ）の肝臓、小脳それぞれの新鮮凍結組織からコントロール用ＲＮＡサンプルとしてＲＮＡ（Ｄ）を抽出した。上記（１）と同様にして、ＲＮＡサンプルの純度および品質を評価した結果を表２に示す。また、上記（１）と同様にして電気泳動を行った結果、図１の（４）に示す通り、肝臓、小脳ともに、リボゾームＲＮＡの１８Ｓ、２８Ｓのバンドが明確に確認できる非常に品質の良いものであった。【００６３】
【表２】
2011132726.tif 000003
【００６４】
（３）ＲＮＡサンプル（Ａ’）〜（Ｃ’）
ＦＦＰＥ（Ａ）〜（Ｃ）の各パラフィンブロックから１０μｍ厚の切片を作製し、レーザーマイクロダイセクション専用のスライドガラスに貼付した。脱パラフィンして、常法によりクレシルバイオレットで染色した後、レーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ）装置（ライカ社製）で組織の一部を採取した。このとき、採取面積は、約１０，０００，０００μｍ２であった。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液の添加量を２５μＬとした以外は、上記（１）と同様にしてＲＮＡを抽出し、それぞれＲＮＡサンプルとしてＲＮＡ（Ａ’）、ＲＮＡ（Ｂ’）、ＲＮＡ（Ｃ’）を得た。上記（１）と同様にして、これらＲＮＡサンプルの純度および品質の測定を行った。純度および品質は表３に示すとおり、対応する各ＲＮＡ（Ａ）〜（Ｃ）とほぼ同等であった。また、ＲＮＡ（Ａ’）〜（Ｃ’）について、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ  ＲＮＡ６０００  Ｐｉｃｏ  ｃｈｉｐ（アジレント・テクノロジー社）を用いて電気泳動を行った結果（図示せず）、それぞれＲＮＡ（Ａ）〜（Ｃ）の場合（図１の（１）〜（３））とほぼ同様の結果であった。【００６５】
【表３】
2011132726.tif 000004
【００６６】
実施例１
（１）ａＲＮＡの調製（抽出したＲＮＡの増幅工程）
参考例２で抽出したマウス肝臓、小脳のＲＮＡ（Ａ）およびＲＮＡ（Ｄ）各１μｇをＰＣＲ用チューブにとり、Ｔ７プロモーター領域を含むプライマーを添加して７０℃で１時間反応させ、アニーリングした。逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）、ＲＮａｓｅインヒビター、ＤＴＴを加えて十分に混和し、４２℃で９０分反応させて、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。反応後氷上で急冷することで、反応を停止させた。ＲＮａｓｅ  Ｈを加えて混和し、３７℃で３０分インキュベートし、さらに９５℃で５分インキュベートした。次に、ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰを添加して、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡに相補的なＳｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成を行った。シリカゲルベースのカラムで、合成したｃＤＮＡを精製した後、ヌクレオチド試薬（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＡＡ−ＵＴＰの混合物）、ＲＮａｓｅインヒビター、ＤＴＴ、およびＴ７プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを添加して、静かに混和した後、４２℃で１０時間反応させることで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応を行い、アミノアリル基を導入したａＲＮＡの増幅反応を行った。参考例１の方法により、本インビトロ転写反応に用いたヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を定量した結果、１６％であった。増幅したａＲＮＡを、シリカゲルベースのカラムを用いて精製し、分光光度計（Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ社）により収量を求めた結果、肝臓ＦＦＰＥ：３．５μｇ、小脳ＦＦＰＥ：４．８μｇ、肝臓凍結組織：１０．９μｇ、小脳凍結組織：１２．７μｇであった（各増幅倍率は、３．５、４．８、１０．９、１２．７（倍））（表４）。Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザ（アジレント・テクノロジー社）を用いてａＲＮＡのサイズを電気泳動により確認したところ、ＦＦＰＥ（Ａ）由来のＲＮＡ（Ａ）から得られたａＲＮＡは、図２の（１）のとおり、肝臓、小脳ともに２００〜３００［ｎｔ］に、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡは図２の（２）のとおり、肝臓、小脳ともに約５００［ｎｔ］にピークがみられる分布をそれぞれ示した。【００６７】
（２）ａＲＮＡの蛍光標識、フラグメンテーション
遠心濃縮機（ＭＶ−１００（トミー精工））を用いて各増幅ａＲＮＡ溶液を濃縮し、約１μＬとした。そこに“３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ”（東レ株式会社）のキットに添付のＳｏｄｉｕｍ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒを２．５μＬ添加してピペッティングにより攪拌し、さらにＤＭＳＯに溶解させたＣｙ５−ＮＨＳ（ＧＥヘルスケア社）を２．５μＬ加えてピペッティングにより攪拌して、４０℃で１時間インキュベートすることでカップリング反応させた。ゲルろ過スピンカラム（バイオラッド社）を用いて未反応のＣｙ５を除去して各反応溶液を精製した後、ヌクレアーゼフリーの水で３２μＬにメスアップした。そこに３Ｄ−Ｇｅｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のキットに添付の５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒをそれぞれ８μＬ加え、軽くピペッティングして攪拌し、９４℃で１５分間処理した。各サンプルをクラッシュアイスで３分間急冷し、マイクロコンＹＭ−１０（ミリポア社）で精製した。【００６８】
（３）マイクロアレイ解析
標識、精製後の各ａＲＮＡについて、以下の操作によりマイクロアレイ解析を行った。各１０００ｎｇ分のＲＮＡを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で１６μＬに調製し、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”（登録商標）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（東レ株式会社）のＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａを２μＬ加えて、９５℃で５分間熱処理した。クラッシュアイスで３分間急冷した後、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂを２３２μＬ加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、２５０μＬの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”マウス全遺伝子型ＤＮＡチップ（東レ株式会社）に２１０μＬアプライした。カバーの孔４箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー（東京理化器械株式会社；ＭＭＳ−２１０）の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー（タカラバイオ株式会社；ＴＸ７１１）にセットした。チャンバー庫内の温度を３７℃とし、２５０ｒｐｍで旋回回転させて攪拌しながら、１６時間ハイブリダイゼーション反応を行った。【００６９】
（４）蛍光シグナル値の測定
ハイブリダイゼーション反応後、分析用チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）に上記基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識ＲＮＡのシグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち、１７５０個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。有効スポット数は、表４のとおり、肝臓ＦＦＰＥ：１５５７１、小脳ＦＦＰＥ：１４８９７、ＦＦＰＥの共通有効スポット：１２５９７、肝臓凍結組織：１７９３７、小脳凍結組織：１９５８２、凍結組織の共通有効スポット：１６６７１であった。ＦＦＰＥサンプル（Ａ）、凍結組織それぞれについて、各遺伝子の小脳、肝臓のシグナル比（小脳／肝臓）を求め、共通有効遺伝子１１９８５種について、凍結組織におけるシグナル比を縦軸に、ＦＦＰＥサンプル（Ａ）におけるシグナル比を横軸にプロットして作成した散布図を図３に示した。【００７０】
ＦＦＰＥ（Ａ）由来のＲＮＡ（Ａ）から得られたａＲＮＡと、コントロールである凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、上記の共通有効遺伝子におけるシグナル比の相関係数Ｒは０．９０５であった（表４）。【００７１】
ここで、相関係数Ｒは、２つのデータ群の相互関係の強さを定量的に表す指標であって、−１から１の間をとり、正の値であれば正の相関、負の値であれば負の相関、ゼロの時は無相関という。一般に、絶対値が０．５以上なら相関がある、０．５未満なら相関がないと判断することができ、２つのデータ群の相関の度合いが強いほど、その絶対値は１に近づく。なお、相関係数を“Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ”（マイクロソフト社）で求める場合は、「ｃｏｒｒｅｌ」という関数を使用すればよい。本発明においては、上記の、固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルから調製されたａＲＮＡと、コントロールである凍結組織由来のＲＮＡサンプルから得られたａＲＮＡの両者間で、共通に発現が確認さられた遺伝子について、上記のシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒが０．７以上であるときに相関が高いと判断した。相関係数Ｒは、０．８以上であることが好ましく、０．９以上であることがさらに好ましい。【００７２】
本実施例１においては、両者の相関が非常に高かったことから、本発明の方法により、固定されたＦＦＰＥサンプルにおいても、増幅バイアスの影響が低減されたａＲＮＡが得られ、その結果定量性の高い遺伝子発現解析が可能であることがわかった。【００７３】
実施例２
ヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を２３モル％とした以外は、実施例１と同様の方法で、ＦＦＰＥ（Ａ）（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ａ）、凍結組織（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ｄ）各１μｇから、それぞれａＲＮＡを調製した。得られたａＲＮＡの収量は、肝臓ＦＦＰＥ：２．１μｇ、小脳ＦＦＰＥ：２．９μｇ、肝臓凍結組織：８．５μｇ、小脳凍結組織：１０．１μｇであった（各増幅倍率は、２．１、２．９、８．５、１０．１（倍））（表４）。ａＲＮＡのサイズを実施例１と同様にして確認したところ、ＦＦＰＥの場合は肝臓、小脳ともに２００〜３００［ｎｔ］の間に、凍結組織の場合は肝臓、小脳ともに約５００［ｎｔ］にそれぞれピークがみられた（図示せず）。【００７４】
実施例１と同様の条件にて、マイクロアレイ解析を実施し、各遺伝子のシグナル値を算出した。表４に示すとおり、有効スポット数は、肝臓ＦＦＰＥ：１５９１０、小脳ＦＦＰＥ：１６２２９、ＦＦＰＥの共通有効スポット：１３３９１、肝臓凍結組織：１８６０１、小脳凍結組織：２０１８６、凍結組織の共通有効スポット：１７１０９であった。ＲＮＡ（Ａ）から得られたａＲＮＡと、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、共通有効遺伝子におけるシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒは０．８６３であり、両者の相関が非常に高かった（表４）。【００７５】
実施例３
ＲＮＡサンプルとして、ＲＮＡ（Ａ）の代わりにＲＮＡ（Ａ’）を用い、ヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を１０モル％とした以外は、実施例１と同様の方法で、ＦＦＰＥ（Ａ）（肝臓、小脳）から抽出したＲＮＡ（Ａ’）、凍結組織（肝臓、小脳）から抽出された（Ｄ）各２５０ｎｇから、それぞれａＲＮＡを調製した。得られたａＲＮＡの収量は、肝臓ＦＦＰＥ：１．９μｇ、小脳ＦＦＰＥ：２．４μｇ、肝臓凍結組織：３．５μｇ、小脳凍結組織：４．３μｇであった（各増幅倍率は、７．６、９．５、１４．１、１７．３（倍））（表４）。ａＲＮＡのサイズを実施例１と同様にして確認した結果、ＦＦＰＥの場合は肝臓、小脳ともに２００〜３００［ｎｔ］の間に、凍結組織の場合は肝臓、小脳ともに約５００［ｎｔ］にそれぞれピークがみられた（図示せず）。【００７６】
実施例１と同様の条件にて、マイクロアレイ解析を実施し、各遺伝子のシグナル値を算出した。表４に示すとおり、有効スポット数は、肝臓ＦＦＰＥ：１２３８５、小脳ＦＦＰＥ：１３９６０、ＦＦＰＥの共通有効スポット：１１４０１、肝臓凍結組織：１６８３２、小脳凍結組織：１７９６８、凍結組織の共通有効スポット：１５５９８であった。ＲＮＡ（Ａ’）から得られたａＲＮＡと、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、共通有効遺伝子におけるシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒは０．８０９であり、両者の相関が高かった（表４）。【００７７】
【表４】
2011132726.tif 000005
【００７８】
実施例４
ＲＮＡサンプルとして、ＲＮＡ（Ａ）の代わりに、ＦＦＰＥ（Ｂ）（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ｂ）を用いて、実施例１と同様にして、ヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を１６モル％として、ＲＮＡ（Ｂ）、（Ｄ）各１μｇから、それぞれａＲＮＡを調製した。得られたａＲＮＡの収量は、肝臓ＦＦＰＥ：２．９μｇ、小脳ＦＦＰＥ：３．９μｇ、肝臓凍結組織：１０．５μｇ、小脳凍結組織：１２．６μｇであった（各増幅倍率は、２．９、３．９、１０．５、１２．６（倍））（表５）。ａＲＮＡのサイズを実施例１と同様にして確認した結果、ＦＦＰＥの場合は肝臓、小脳ともに２００〜３００［ｎｔ］の間に、凍結組織の場合は肝臓、小脳ともに５００［ｎｔ］付近にそれぞれピークがみられた。【００７９】
実施例１と同様の条件にて、マイクロアレイ解析を実施し、各遺伝子のシグナル値を算出した。表５に示すとおり、有効スポット数は、肝臓ＦＦＰＥ：１５９１０、小脳ＦＦＰＥ：１６２２９、ＦＦＰＥの共通有効スポット：１３３９１、肝臓凍結組織：１８６０１、小脳凍結組織：２０１８６、凍結組織の共通有効スポット：１７１０９であった。ＲＮＡ（Ｂ）から得られたａＲＮＡと、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、共通有効遺伝子におけるシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒは０．８６３であり、両者の相関が非常に高かった（表５）。【００８０】
実施例５
ヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を２３モル％とした以外は、実施例４と同様にして、ＦＦＰＥ（Ｂ）（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ｂ）、凍結組織（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ｄ）各１μｇから、それぞれａＲＮＡを調製した。得られたａＲＮＡの収量は、肝臓ＦＦＰＥ：２．０μｇ、小脳ＦＦＰＥ：２．７μｇ、肝臓凍結組織：９．６μｇ、小脳凍結組織：１０．５μｇであった（各増幅倍率は、２．０、２．７、９．６、１０．５（倍））（表５）。ａＲＮＡのサイズを実施例１と同様にして確認した結果、ＦＦＰＥの場合は肝臓、小脳ともに２００〜３００［ｎｔ］の間に、凍結組織の場合「は肝臓、小脳ともに５００［ｎｔ］付近にそれぞれピークがみられた（図示せず）。【００８１】
実施例１と同様の条件にて、マイクロアレイ解析を実施し、各遺伝子のシグナル値を算出した。表５に示すとおり、有効スポット数は、肝臓ＦＦＰＥ：１４２８７、小脳ＦＦＰＥ：１５８１６、ＦＦＰＥの共通有効スポット：１２８１４、肝臓凍結組織：１８８２１、小脳凍結組織：２０１０５、凍結組織の共通有効スポット：１７５０１であった。ＲＮＡ（Ｂ）から得られたａＲＮＡと、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、共通有効遺伝子におけるシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒは０．８５１であり、両者の相関が非常に高かった（表５）。【００８２】
実施例６
ＲＮＡサンプルとして、ＲＮＡ（Ｂ）の代わりにＲＮＡ（Ｂ’）を用い、ヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を１０モル％とした以外は、実施例４と同様にして、ＦＦＰＥ（Ｂ）（肝臓、小脳）から抽出したＲＮＡ（Ｂ’）、凍結組織（肝臓、小脳）から抽出された（Ｄ）各２５０ｎｇから、それぞれａＲＮＡを調製した。得られたａＲＮＡの収量は、肝臓ＦＦＰＥ：１．６μｇ、小脳ＦＦＰＥ：２．０μｇ、肝臓凍結組織：３．８μｇ、小脳凍結組織：４．２μｇであった（各増幅倍率は、６．３、８．１、１５、１６．９（倍））（表５）。ａＲＮＡのサイズを実施例１と同様にして確認した結果、ＦＦＰＥの場合は肝臓、小脳ともに２００〜３００［ｎｔ］の間に、凍結組織の場合は肝臓、小脳ともに５００［ｎｔ］付近にそれぞれピークがみられた（図示せず）。【００８３】
実施例１と同様の条件にて、マイクロアレイ解析を実施し、各遺伝子のシグナル値を算出した。表５に示すとおり、有効スポット数は、肝臓ＦＦＰＥ：１１９８４、小脳ＦＦＰＥ：１３１０７、ＦＦＰＥの共通有効スポット：１０８３５、肝臓凍結組織：１６９１４、小脳凍結組織：１７８１９、凍結組織の共通有効スポット：１５６８１であった。ＲＮＡ（Ｂ’）から得られたａＲＮＡと、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、共通有効遺伝子におけるシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒは０．８０３であり、両者の相関が高かった（表５）。【００８４】
【表５】
2011132726.tif 000006
【００８５】
実施例７
ＲＮＡサンプルとして、ＲＮＡ（Ａ）の代わりに、ＦＦＰＥ（Ｃ）（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ｃ）を用いて、実施例１と同様にして、ヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を１６モル％として、ＲＮＡ（Ｃ）、（Ｄ）各１μｇから、それぞれａＲＮＡを調製した。得られたａＲＮＡの収量は、肝臓ＦＦＰＥ：３．９μｇ、小脳ＦＦＰＥ：５．１μｇ、肝臓凍結組織：１０．３μｇ、小脳凍結組織：１２．１μｇであった（各増幅倍率は、３．９、５．１、１０．３、１２．１（倍））（表６）。ａＲＮＡのサイズを実施例１と同様にして確認した結果、ＦＦＰＥの場合は肝臓、小脳ともに２００〜３００［ｎｔ］の間に、凍結組織の場合は肝臓、小脳ともに５００［ｎｔ］付近にそれぞれピークがみられた（図示せず）。【００８６】
実施例１と同様の条件にて、マイクロアレイ解析を実施し、各遺伝子のシグナル値を算出した。表６に示すとおり、有効スポット数は、肝臓ＦＦＰＥ：１５３２８、小脳ＦＦＰＥ：１６５４０、ＦＦＰＥの共通有効スポット：１４３０９、肝臓凍結組織：１７８９９、小脳凍結組織：１９３１６、凍結組織の共通有効スポット：１６８５０であった。ＲＮＡ（Ｃ）から得られたａＲＮＡと、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、共通有効遺伝子におけるシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒは０．９２５であり、両者の相関が非常に高かった（表６）。【００８７】
実施例８
ヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を２３モル％とした以外は、実施例７と同様にして、ＦＦＰＥ（Ｃ）（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ｃ）、凍結組織（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ｄ）各１μｇから、それぞれａＲＮＡを調製した。得られたａＲＮＡの収量は、肝臓ＦＦＰＥ：２．９μｇ、小脳ＦＦＰＥ：３．８μｇ、肝臓凍結組織：１０．３μｇ、小脳凍結組織：１２．１μｇであった（各増幅倍率は、２．９、３．８、１０．３、１２．１（倍））（表６）。ａＲＮＡのサイズを実施例１と同様にして確認した結果、ＦＦＰＥの場合は肝臓、小脳ともに２００〜３００［ｎｔ］の間に、凍結組織の場合は肝臓、小脳ともに５００［ｎｔ］付近にそれぞれピークがみられた（図示せず）。【００８８】
実施例１と同様の条件にて、マイクロアレイ解析を実施し、各遺伝子のシグナル値を算出した。表６に示すとおり、有効スポット数は、肝臓ＦＦＰＥ：１５９４４、小脳ＦＦＰＥ：１７０２７、ＦＦＰＥの共通有効スポット：１４８９５、肝臓凍結組織：１８７８２、小脳凍結組織：２０７９９、凍結組織の共通有効スポット：１７２４４であった。ＲＮＡ（Ｃ）から得られたａＲＮＡと、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、共通有効遺伝子におけるシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒは０．８９３であり、両者の相関が非常に高かった（表６）。【００８９】
実施例９
ＲＮＡサンプルとして、ＲＮＡ（Ｃ）の代わりにＲＮＡ（Ｃ’）を用い、ヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を１０モル％とした以外は、実施例７と同様にして、ＦＦＰＥ（Ｃ）（肝臓、小脳）から抽出したＲＮＡ（Ｃ’）、凍結組織（肝臓、小脳）から抽出された（Ｄ）各２５０ｎｇから、それぞれａＲＮＡを調製した。得られたａＲＮＡの収量は、肝臓ＦＦＰＥ：２．２μｇ、小脳ＦＦＰＥ：２．５μｇ、肝臓凍結組織：３．７μｇ、小脳凍結組織：４．３μｇであった（各増幅倍率は、８．５、１０．１、１４．８、１７（倍））（表６）。ａＲＮＡのサイズを実施例１と同様にして確認した結果、ＦＦＰＥの場合は肝臓、小脳ともに２００〜３００［ｎｔ］の間に、凍結組織の場合は肝臓、小脳ともに５００［ｎｔ］付近にそれぞれピークがみられた（図示せず）。【００９０】
実施例１と同様の条件にて、マイクロアレイ解析を実施し、各遺伝子のシグナル値を算出した。表６に示すとおり、有効スポット数は、肝臓ＦＦＰＥ：１２５４３、小脳ＦＦＰＥ：１４１３９、ＦＦＰＥの共通有効スポット：１１７３４、肝臓凍結組織：１６６４０、小脳凍結組織：１７６９３、凍結組織の共通有効スポット：１５３４２であった。ＲＮＡ（Ｃ’）から得られたａＲＮＡと、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、共通有効遺伝子におけるシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒは０．８６１であり、両者の相関が高かった（表６）。【００９１】
【表６】
2011132726.tif 000007
【００９２】
比較例１
ヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を３４モル％とし、ＲＮＡの増幅工程を２回行った以外は、実施例１と同様の方法で、ＦＦＰＥ（Ａ）（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ａ）、凍結組織（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ｄ）各１μｇから、次のようにしてそれぞれａＲＮＡを調製した。【００９３】
マウス小脳、肝臓のＲＮＡ（Ａ）各１０ｎｇから、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））を用いてＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成し、次にＤＮＡ合成酵素を添加してＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡに相補的なＳｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成を行った。シリカゲルベースのカラムを用いて合成したｃＤＮＡを精製した後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応を４２℃、８時間行い、ａＲＮＡの増幅反応を行った。ここで得られた増幅産物を用いて、同様にＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成、ｓｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成を行い、ＡＡ−ＵＴＰを含む試薬を用いてインビトロ転写反応を４２℃、１０時間行い、アミノアリル基を導入したａＲＮＡの増幅反応を行った。本インビトロ転写反応に用いたヌクレオチド試薬に含まれるＵＴＰ＋ＡＡ−ＵＴＰに対するＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」は、３４％であった。増幅したａＲＮＡを、シリカゲルベースのカラムを用いて精製し、分光光度計（Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ社）により収量を求めた結果、肝臓ＦＦＰＥ：３７．１μｇ、小脳ＦＦＰＥ：３６．６μｇ、肝臓凍結組織：５３．５μｇ、小脳凍結組織：７０．７μｇであった（各増幅倍率は、３７１０、３６６０、５３５０、７０７０（倍））（表７）。ａＲＮＡのサイズを実施例１と同様にして確認した結果、ＦＦＰＥの場合は肝臓、小脳ともに１００〜２００［ｎｔ］の間に、凍結組織の場合は肝臓、小脳ともに４００〜５００［ｎｔ］の間にそれぞれピークがみられた（図示せず）。【００９４】
実施例１と同様の条件にて、マイクロアレイ解析を実施し、各遺伝子のシグナル値を算出した。表７に示すとおり、有効スポット数は、肝臓ＦＦＰＥ：１３４５７、小脳ＦＦＰＥ：１４１３８、ＦＦＰＥの共通有効スポット：１０８５２、肝臓凍結組織：１５８２４、小脳凍結組織：１６６９９、凍結組織の共通有効スポット：１３６４７であった。また、ＦＦＰＥ、凍結組織それぞれについて、各遺伝子の小脳、肝臓のシグナル比（小脳／肝臓）を求め、共通有効遺伝子９５５６種について、凍結組織におけるシグナル比を縦軸に、ＦＦＰＥサンプル（Ａ）におけるシグナル比を横軸にプロットして作成した散布図を図４に示した。ＲＮＡ（Ａ）から得られたａＲＮＡと、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、共通有効遺伝子におけるシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒは０．４９５であり、両者の相関が低かった（表７）。【００９５】
比較例２
ヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を５０モル％とした以外は、実施例１と同様にして、ＦＦＰＥ（Ａ）（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ａ）、凍結組織（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ｄ）各１μｇから、それぞれａＲＮＡを調製した。しかし、ＲＮＡ（Ａ）においては、１μｇのＲＮＡから増幅を開始しても十分量のａＲＮＡを得ることができなかったため、ＲＮＡ量を３μｇに変更して増幅工程を行った。得られたａＲＮＡの収量は、肝臓ＦＦＰＥ：３．６μｇ、小脳ＦＦＰＥ：５．１μｇ、肝臓凍結組織：５．４μｇ、小脳凍結組織：７．７μｇであった（各増幅倍率は、１．２、１．７、５．４、７．７（倍））（表７）。ａＲＮＡのサイズを実施例１と同様にして確認した結果、ＦＦＰＥの場合は肝臓、小脳ともに１００〜２００［ｎｔ］の間に、凍結組織の場合は肝臓、小脳ともに４００〜５００［ｎｔ］の間にそれぞれピークがみられた。【００９６】
実施例１と同様の条件にて、マイクロアレイ解析を実施し、各遺伝子のシグナル値を算出した。有効スポット数は、表７に示すとおり、肝臓ＦＦＰＥ：１５０９１、小脳ＦＦＰＥ：１６２０９、ＦＦＰＥの共通有効スポット：１３６２２、肝臓凍結組織：１８６６９、小脳凍結組織：２０８７１、凍結組織の共通有効スポット：１７０４９であった。ＲＮＡ（Ａ）から得られたａＲＮＡと、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、共通有効遺伝子におけるシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒは０．６８７であり、両者の相関が低かった（表７）。【００９７】
比較例３
ヌクレオチド試薬に含まれるＡＡ−ＵＴＰの割合「ＡＡ−ＵＴＰのモル量／（ＵＴＰのモル量＋ＡＡ−ＵＴＰのモル量）」を３モル％とした以外は、実施例１と同様にして、ＦＦＰＥ（Ａ）（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ａ）、凍結組織（肝臓、小脳）から抽出されたＲＮＡ（Ｄ）各１μｇから、それぞれａＲＮＡを調製した。得られたａＲＮＡの収量は、肝臓ＦＦＰＥ：９．５μｇ、小脳ＦＦＰＥ：１３．０μｇ、肝臓凍結組織：１８．８μｇ、小脳凍結組織：２１．３μｇであった（各増幅倍率は、９．５、１３、１８．８、２１．３（倍））（表７）。ａＲＮＡのサイズを実施例１と同様にして確認した結果、ＦＦＰＥは肝臓、小脳ともに１００〜２００［ｎｔ］の間に、凍結組織は肝臓、小脳ともに４００〜５００［ｎｔ］の間にそれぞれピークがみられた。【００９８】
実施例１と同様の条件にて、マイクロアレイ解析を実施し、各遺伝子のシグナル値を算出した。有効スポット数は、表７に示すとおり、肝臓ＦＦＰＥ：６０３６、小脳ＦＦＰＥ：７３１２、ＦＦＰＥの共通有効スポット：５０１１、肝臓凍結組織：１２７８９、小脳凍結組織：１４８７１、凍結組織の共通有効スポット：１１０４９であった。本比較例で有効スポット数が少なかった原因として、インビトロ転写反応におけるアミノアリル基の導入量が少なかったため、蛍光標識体であるＣｙ５の標識量が少なくなり、バックグラウンド値が高くなったことが考えられた。ＲＮＡ（Ａ）から得られたａＲＮＡと、凍結組織由来のＲＮＡ（Ｄ）から得られたａＲＮＡとの間の、共通有効遺伝子におけるシグナル比（小脳／肝臓）の相関係数Ｒは０．６５３であり、両者の相関が低かった。【００９９】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明のａＲＮＡの調製方法は、固定された組織または細胞から抽出されたＲＮＡサンプルを用いる遺伝子発現解析において、増幅バイアスの影響が低減されたａＲＮＡを得る方法を提供する。本発明は定量性の高い遺伝子発現解析を可能とするものであり、特に医療分野において有用である。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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