(57)【要約】  抗ＬＲ１１抗体を大量かつ効率的に製造するための手段及び免疫学的測定におけるＬＲ１１標準品を提供する。  悪性腫瘍細胞由来又は尿由来ＬＲ１１を用いることを特徴とする抗ＬＲ１１抗体の製造法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍細胞由来又は尿由来ＬＲ１１を用いることを特徴とする抗ＬＲ１１抗体の製造法。
【請求項２】
悪性腫瘍細胞由来又は尿由来ＬＲ１１が、免疫原として及び／又は抗ＬＲ１１抗体の特異性評価用として使用される請求項１記載の製造法。
【請求項３】
悪性腫瘍細胞由来ＬＲ１１が、細胞表面に発現しているものである請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
悪性腫瘍細胞由来ＬＲ１１が、培養上清中に分泌されるものである請求項１〜３のいずれか１項記載の製造法。
【請求項５】
悪性腫瘍細胞が、造血器腫瘍細胞又は上皮性悪性腫瘍細胞である請求項１〜４のいずれか１項記載の製造法。
【請求項６】
造血器腫瘍細胞が、急性白血病由来又は悪性リンパ腫由来である請求項５記載の製造法。
【請求項７】
上皮性悪性腫瘍細胞が、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、結腸癌、大腸癌、腎臓癌、胆嚢癌、神経腫瘍、黒色細胞腫からなる群より選択される、請求項５記載の製造法。
【請求項８】
尿由来ＬＲ１１が、ヒト尿由来可溶性ＬＲ１１である請求項１又は２記載の製造法。
【請求項９】
悪性腫瘍細胞由来又は尿由来ＬＲ１１を含有するＬＲ１１の免疫学的測定用標準品。
【請求項１０】
悪性腫瘍細胞由来ＬＲ１１が、培養上清中に分泌されるものである請求項９記載の標準品。
【請求項１１】
悪性腫瘍細胞が、造血器腫瘍細胞又は上皮性悪性腫瘍細胞である請求項９又は１０記載の標準品。
【請求項１２】
造血器腫瘍細胞が、ヒト急性白血病由来又はヒト悪性リンパ腫由来である請求項１１記載の標準品。
【請求項１３】
上皮性悪性腫瘍細胞が、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、結腸癌、大腸癌、腎臓癌、胆嚢癌、神経腫瘍、黒色細胞腫からなる群より選択される、請求項１１記載の標準品。
【請求項１４】
尿由来ＬＲ１１が、ヒト尿由来可溶性ＬＲ１１である請求項請求項８又は９記載の標準品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効率的な抗ＬＲ１１抗体の製造法及びＬＲ１１の免疫学的測定用標準品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＲ１１（ＬＤＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  １１  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｐｅａｔｓ、ＳｏｒＬＡ、ＳＯＲＬ１とも称される）は、ＬＤＬ受容体ファミリーに特徴的な構造を有する新規なＬＤＬ受容体類似タンパク質として同定された（特許文献１、非特許文献１）。免疫組織化学分析やｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ分析の結果、ＬＲ１１は平滑筋細胞の遊走及び増殖によって形成された血管内膜肥厚部位で特異的に発現が亢進していることが報告されている（非特許文献２）。
本発明者らは、哺乳動物の血液中に可溶性ＬＲ１１が存在していること、及び動脈硬化性疾患患者血液中の可溶性ＬＲ１１濃度が健常者と比較して有意に高値であることを見出した（特許文献２）。本発明者らはさらに、特定の界面活性剤で試料中のＬＲ１１を処理することにより、抗ＬＲ１１抗体を用いて血液中あるいは骨髄液中の可溶性ＬＲ１１を簡便に測定する方法（特許文献３、非特許文献４）を開発し、様々な疾患における血液中若しくは骨髄液中の可溶性ＬＲ１１の濃度を測定した結果、悪性腫瘍、特に白血病や悪性リンパ腫のような造血器腫瘍疾患で異常高値を示すことを確認し、ＬＲ１１が新たな腫瘍マーカーになり得ることを見出した（特許文献４）。【０００３】
ＬＲ１１の遺伝子配列は解明されている（特許文献１、非特許文献１）ものの、全長ＬＲ１１は２５０ｋＤａという大きな分子量を有しているため、組換え全長ＬＲ１１タンパク質の大量発現には成功していない。また、ＬＲ１１を分泌する培養細胞、ＬＲ１１遺伝子を安定的に発現するＬＤＬ受容体欠損ＣＨＯ細胞、全長ＬＲ１１遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞も報告されている（非特許文献５）が、ＬＲ１１の発現量が非常に僅かであるか、遺伝子工学的な処理が必要であった。このように、抗体を作製するための免疫原の供給源は限られているか、ＬＲ１１産生細胞とするための加工が必要であった。【０００４】
抗ＬＲ１１抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体ともすでに市販されているが、上記した事情より、免疫原としてＬＲ１１の部分アミノ酸配列を有する合成ペプチドを使用して作製されている。そのため、当該市販抗体は、全長ＬＲ１１など生物試料中のＬＲ１１に対する反応性が非常に弱いものであるか又はＬＲ１１を固相に固定化した場合にしか反応しないものであるなど、実用的に十分な性能を有する抗体とは言い難いものであった。【０００５】
また、血液中の可溶性ＬＲ１１を、抗体を作製するための免疫原の供給源とするためには、大量の採血が必要であり供血者への負担を考慮すると非現実的である。【０００６】
上記した各事情は、ＬＲ１１の免疫学的測定用標準品を作製する際の標品ＬＲ１１の供給源として考えた場合においても同様である。
以上のように、抗ＬＲ１１抗体を作製する際の免疫原の供給源、あるいは免疫学的測定用標準品を作製する際の標品ＬＲ１１の供給源として、侵襲性が低い手段で大量かつ簡便にＬＲ１１を収集することができ、さらに生物試料中の存在状態を維持した状態でＬＲ１１を収集できる供給源が求められていたのである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平９−１６３９８８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００８／１５５８９１
【特許文献３】ＷＯ２００９／１１６２６８
【特許文献４】特許２００９−２８５４９２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１，２４７６１−２４７６８
【非特許文献２】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９９９；１９，２６８７−２６９５
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８，２７３３−２７４６
【非特許文献４】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００９；５５，１８０１−１８０８
【非特許文献５】Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００４；９４，７５２−７５８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、抗ＬＲ１１抗体を大量かつ効率的に製造するための手段、特に生物試料中のＬＲ１１に反応する抗ＬＲ１１抗体を製造するための手段、及び免疫学的測定におけるＬＲ１１の標準品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＬＲ１１の新たな供給源について検討した結果、悪性腫瘍細胞の表面にＬＲ１１が発現すること及び悪性腫瘍細胞の培養上清中にＬＲ１１が分泌されること、また、ヒトの尿中にも可溶性ＬＲ１１が存在していることを見出した。さらに悪性腫瘍細胞由来及びヒト尿由来のＬＲ１１を免疫原や抗体の特異性評価用抗原として使用することにより、全長ＬＲ１１など生物試料中のＬＲ１１に反応する抗体の作製に成功した。また、これらの悪性腫瘍細胞由来及びヒト尿由来ＬＲ１１は、ＬＲ１１の免疫学的測定用標準品としても有用であることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。【００１１】
すなわち、本発明は、悪性腫瘍細胞由来又は尿由来のＬＲ１１を用いることを特徴とする抗ＬＲ１１抗体の製造法を提供するものである。
また、本発明は、悪性腫瘍細胞由来又は尿由来のＬＲ１１を含有するＬＲ１１の免疫学的測定用標準品を提供するものである。
なお、本明細書において、「ＬＲ１１」とは、特にことわらない限り抗ＬＲ１１抗体との反応性を有するタンパク質を指す。すなわち、「全長ＬＲ１１」や「可溶性ＬＲ１１」として公知のタンパク質やそれらが部分的に断片化されたり、修飾されたものをいう。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、ＬＲ１１が細胞表面に発現している悪性腫瘍細胞自体、若しくは前記悪性腫瘍細胞の培養上清中に分泌される可溶性ＬＲ１１、又はヒトの尿中に存在している可溶性ＬＲ１１を、免疫原や特異性評価用抗原として用いることにより、工業的に有利にＬＲ１１に対する特異抗体の作製が可能となる。
また、悪性腫瘍細胞由来又は尿由来のＬＲ１１を含有する標準品を用いることで、正確にＬＲ１１を免疫学的測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】各種造血器腫瘍細胞株におけるＬＲ１１の発現を、細胞溶解液及び細胞培養液を用いて、ウェスタンブロット法で検出した図である。
【図２】各種造血器腫瘍細胞株の培養液中の可溶性ＬＲ１１をＥＬＩＳＡで測定した結果を表すグラフである。
【図３】各種造血器腫瘍細胞株における細胞表面でのＬＲ１１の発現を、フローサイトメトリーで解析した結果を示した図である。
【図４】各種上皮性悪性腫瘍細胞株における細胞表面でのＬＲ１１発現を、膜画分溶解液を用いて、ウェスタンブロット法で検出した図である。
【図５】各種上皮性悪性腫瘍細胞株の培養液中の可溶性ＬＲ１１をＥＬＩＳＡで測定した結果を表すグラフである。
【図６】ヒト尿由来の可溶性ＬＲ１１、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞株由来の可溶性ＬＲ１１、ヒト血清由来可溶性ＬＲ１１、ＣＯＬＯ２０１細胞株由来の可溶性ＬＲ１１を、ウェスタンブロット法で比較した図である。
【図７】ＮＢ−４細胞株を腹腔内免疫したマウスの血清中の抗ＬＲ１１抗体価を測定した結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において抗ＬＲ１１抗体の作製又はＬＲ１１の免疫学的測定用標準品に用いられるＬＲ１１は、悪性腫瘍細胞由来又は尿由来である。
【００１５】
本発明者らの知見によれば、悪性腫瘍細胞表面にはＬＲ１１が顕著に発現しており、また悪性腫瘍細胞の培養液中には高濃度の可溶性ＬＲ１１が分泌されている。従って、細胞表面にＬＲ１１を発現している悪性腫瘍細胞を直接免疫原として用いることや、当該細胞の培養液から可溶性ＬＲ１１を採取して、免疫原、抗ＬＲ１１抗体の特異性評価、あるいは免疫学的測定用標準品として使用することができる。
【００１６】
本発明で使用できる悪性腫瘍細胞は、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）やヒューマンサイエンス研究資源バンク（Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ）等に登録されている細胞株で、ＬＲ１１が細胞表面に発現しているものであれば特に制限されること無く使用することができる。悪性腫瘍の種類としては、造血器腫瘍または上皮性腫瘍が挙げられ、造血器腫瘍が好ましい。
【００１７】
造血器腫瘍の例として、白血病及び悪性リンパ腫が挙げられる。白血病には急性白血病及び慢性白血病が含まれ、悪性リンパ腫には非ホジキンリンパ腫が含まれる。このうち、急性白血病及び悪性リンパ腫が好ましい。さらに具体的には、造血器腫瘍細胞のうち、急性骨髄性白血病由来株のＨＬ−６０、ＭＬ−２、ＮＢ−４、急性リンパ性白血病由来株のＮＡＬＬ−１、ＭＯＬＴ−４、ＣＣＲＦ−ＳＢ、悪性リンパ腫由来株のＤａｕｄｉ、Ｕ９３７などが好ましく、特に、ＨＬ−６０、ＭＬ−２、ＮＢ−４、ＭＯＬＴ−４、ＣＣＲＦ−ＳＢ、Ｕ９３７が好ましい。また、前記株化された細胞以外に、白血病患者および悪性リンパ腫患者由来の腫瘍細胞の細胞溶解液または細胞培養液から精製等して使用することもできる。
【００１８】
上皮性悪性腫瘍の例として、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、結腸癌、大腸癌、腎臓癌、胆嚢癌、神経腫瘍（グリオーマ）、黒色細胞腫（メラノーマ）が含まれる。特に、上皮性悪性腫瘍のうち、胃癌由来株のＭＫＮ１、ＧＣＩＹ、肝臓癌由来株のＨＬＥ、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ−７、ＪＨＨ−６、膵臓癌由来株のＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、肺癌由来株のＯｋａ−Ｃ−１、前立腺癌由来株のＰＣ−３、膀胱癌由来株のＫＭＢＣ−２、食道癌由来株のＴ．Ｔｎ、乳癌由来株のＹＭＢ−１、子宮頸癌由来株のＨｅＬａ、卵巣癌由来株のＯＶＩＳＥ、結腸癌・大腸癌由来株のＣＯＬＯ２０１、腎臓癌由来株のＣａｋｉ−１、胆嚢癌由来株のＯＣＵＧ−１、神経腫瘍由来株のＫＩＮＧＳ−１、黒色細胞腫由来株のＧ−３６１などが好ましい。また、前記株化された細胞以外に、上皮性悪性腫瘍患者由来の腫瘍細胞の細胞溶解液または細胞培養液から精製等して使用することもできる。
【００１９】
また、本発明者らは、尿中にも可溶性ＬＲ１１が高濃度で存在することを見出した。尿としては、ヒト尿が特に好ましい。尿は、一般に夾雑タンパク質が少なく、また侵襲性が実質的に存在せず、かつ、大量に収集することが容易であるため、本発明におけるＬＲ１１の供給源として好適である。
【００２０】
前記のように、免疫原として細胞表面にＬＲ１１を発現している悪性腫瘍細胞を直接用いることができる。一方、免疫原、抗ＬＲ１１抗体の特異性評価用および免疫学的測定用標準品としては、悪性腫瘍細胞の溶解液若しくは培養液、又は尿から採取されたＬＲ１１を用いるのが好ましい。
悪性腫瘍細胞の溶解液若しくは培養液、又は尿からＬＲ１１を採取するには、例えば、ＲＡＰ（受容体関連タンパク質）等のＬＲ１１親和性物質を担持させた不溶性担体に尿中の可溶性ＬＲ１１を吸着させ、適当な緩衝液を用いて洗浄した後、前記不溶性担体に吸着した可溶性ＬＲ１１を溶出させればよい。
【００２１】
これらのＬＲ１１は、さらに、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、ゲルろ過法及び特異抗体によるアフィニティ法などにより精製して用いてもよい。
【００２２】
当該悪性腫瘍細胞由来又はヒト尿由来のＬＲ１１は、多量かつ安定して製造できるので、ＬＲ１１の免疫学的測定用標準品として有用であり、また抗ＬＲ１１抗体製造時の免疫原として、あるいは抗ＬＲ１１抗体の特異性評価用として有用である。
抗ＬＲ１１抗体作製時の免疫原と特異性評価には、由来の異なるＬＲ１１を組み合わせて用いてもよく、例えば、細胞表面にＬＲ１１が発現している悪性腫瘍細胞を免疫原に使用する場合は、抗ＬＲ１１抗体の特異性評価では、尿由来の可溶性ＬＲ１１を用いること、更に尿由来可溶性ＬＲ１１を免疫原に使用する場合は、抗ＬＲ１１抗体の特異性評価では、悪性腫瘍細胞から分泌された可溶性ＬＲ１１を用いるか、若しくは細胞表面にＬＲ１１が発現している悪性腫瘍細胞そのものを用いることが考えられる。また、免疫原にＬＲ１１の部分アミノ酸配列を有する合成ペプチドを用いた場合においても、特異性評価用に悪性腫瘍細胞由来又はヒト尿由来のＬＲ１１を用いることによって、全長ＬＲ１１など生物試料中のＬＲ１１に対する反応性が強い抗体を得ることができる。上記したように、本発明における免疫原あるいは標準品の供給源は、生物試料の形態としても、存在するＬＲ１１の形態としても、いわゆる天然の状態に極めて近いものであるため、合成ペプチドであったり遺伝子組み換えであったりした従来の供給源に対して、ＬＲ１１の性状の保存の観点から特に有利であるといえる。
【００２３】
前記ＬＲ１１は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれに対しても免疫原ともなりうる。当該抗体は周知の方法にて作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体の作製には、免疫する動物としてマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリなどが用いられる。抗ＬＲ１１ポリクローナル抗体を含有する抗血清は、前記ＬＲ１１を動物の皮下、皮内、腹腔などに一回又は複数回投与し得ることができる。また、免疫賦活効果を有する補液との混合物の免疫がより好ましい。
【００２４】
また、モノクローナル抗体の作製には、公知のモノクローナル抗体作製方法、例えば、長宗香明、寺田弘共著、「単クローン抗体」廣川書店（１９９０年）や、Ｊａｍｅ  Ｗ．Ｇｏｌｄｉｎｇ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９６年）に従い作製することができる。
当該モノクローナル抗体は、常法に従い作製したハイブリドーマを培養し、培養上清から分離する方法、該ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与し、腹水として回収する方法により製造できる。
【００２５】
抗ＬＲ１１抗体は、必要に応じて精製して使用することができる。抗体を精製・単離する手法としては、従来公知の方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、プロテインＡカラムなどによるアフィニティ精製法などがある。
【００２６】
ＬＲ１１を用いて抗ＬＲ１１抗体の特異性を評価するには、免疫染色（ウエスタンブロット法）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリーなどが挙げられる。
【００２７】
また、ＬＲ１１を標準品として用いるＬＲ１１の免疫学的測定法は特に限定されないが、抗ＬＲ１１抗体を用いた免疫学的方法、ＲＡＰ等の親和性を利用した方法、並びにそれらを組み合わせた方法により測定することが望ましい。免疫学的方法としては、例えば免疫染色（ウエスタンブロット法）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡやＬＴＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどに加えて、抗体とＲＡＰ等のＬＲ１１に親和性を有する物質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡも利用できる。
本発明者らが構築した、界面活性剤により検体の前処理を行うＥＬＩＳＡ（特許文献３、非特許文献４）は、非常に簡便かつ精度よく測定できることから、特に好ましい。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２９】
参考例１  ＥＬＩＳＡによる可溶性ＬＲ１１の測定
抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ｍ３：特許文献３）をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈し、マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に１ウエルあたり１００μＬ添加して室温で２時間静置した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄後、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（ＢＳＡ−ＰＢＳＴ）を１ウエルあたり２００μＬ添加し室温で１時間ブロッキングした。７％  ＭＥＧＡ−９（同仁化学社製）とＨＢＲ（ＳｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を３：１に混合した検体処理液で、測定対象検体を希釈した。ウサギ血清から精製した可溶性ＬＲ１１も前記検体処理液で段階希釈し、キャリブレーターとした（０〜４ｎｇ／ｍＬ）。これら希釈検体を、１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で一晩反応させた後、ビオチン標識した抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ｒ１４：特許文献３）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈し０．４μｇ／ｍＬとして、１ウエルあたり１００μＬ添加し室温で４時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ社製）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈して０．２μｇ／ｍＬとして１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ＴＭＢ基質液を１ウエルあたり１００μＬ加え室温で３０分間反応させ、１．５Ｎ硫酸を１ウエルあたり１００μＬ加えて反応を停止させた。測定は、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４５０ｎｍ）を用いて行った。キャリブレーターによる検量線より、検体中の可溶性ＬＲ１１濃度を算出し、希釈倍率を掛けて、検体中の可溶性ＬＲ１１濃度とした。【００３０】
実施例１  ヒト尿中の可溶性ＬＲ１１の測定
健常者ボランティア（１０名）の随時尿を数日間ランダムに収集し、参考例１に記載の検体処理液で４倍希釈した。参考例１に記載のＥＬＩＳＡ法と同様に、ヒト尿中の可溶性ＬＲ１１濃度を測定した。濃度分布は０．１〜８．４ｎｇ／ｍＬで、平均３．１ｎｇ／ｍＬであった。ヒト尿中には、健常域の血中濃度（非特許文献４などによる）に匹敵する濃度で可溶性ＬＲ１１が存在することが判明した。【００３１】
実施例２  ヒト尿からの可溶性ＬＲ１１の精製
ヒトＲＡＰ遺伝子を組み込んだｐＧＥＸ２Ｔ（ＧＥヘルスケア社製）ベクターを導入して形質転換した大腸菌ＤＨ５αを培養し、遠心分離により菌体を回収した。３Ｌの培養液から回収した菌体を、リゾチーム及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳに懸濁して超音波処理により菌体を破砕した。この破砕液をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）２００ｍＬに通して遠心上清中のＲＡＰ／ＧＳＴ融合タンパク質を吸着させた後、ＰＢＳで洗浄してＲＡＰ−セファロース樹脂を調製した。
１バッチ分として、このＲＡＰ−セファロース樹脂２００ｍＬに、ヒトボランティアプール尿を５〜８Ｌ通した。ＰＢＳで洗浄後、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にてヒト尿由来可溶性ＬＲ１１を溶出した。濃縮後、ＰＢＳで透析した。さらに、この液を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ａ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）５ｍＬに通し、得られた非吸着画分に、抗可溶性ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ｍ３）結合樹脂を加え、一晩攪拌した。樹脂をＰＢＳで洗浄した後、１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）にてヒト尿由来可溶性ＬＲ１１を溶出した。さらに、溶出液をゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００；ＧＥヘルスケア社製）により、ＰＢＳで分離精製した。可溶性ＬＲ１１の溶出フラクションを集め濃縮したものを、精製ヒト尿由来可溶性ＬＲ１１とした。ＬＲ１１含量は、参考例１に記載の方法に基づき算出された。最終的に１２バッチ分の精製工程を行った結果、平均でヒト尿１Ｌあたり約０．８μｇの精製ヒト尿由来可溶性ＬＲ１１が得られた。参考例１においてキャリブレーターの一番高い濃度は４ｎｇ／ｍＬであり、ヒト尿から免疫学的測定の標準品として十分な量の可溶性ＬＲ１１を容易に確保できることが分かった。【００３２】
実施例３  各種造血器腫瘍細胞株におけるＬＲ１１発現の確認
各種造血器腫瘍細胞株でのＬＲ１１の発現を、ＬＲ１１の部分アミノ酸配列を有するペプチドを免疫して作製した抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ａ２−２−３：特許文献３）を用いたウェスタンブロット法で確認した。細胞株は、急性骨髄性白血病由来３株（ＨＬ−６０、ＭＬ−２、ＮＢ−４）、急性リンパ性白血病由来３株（ＮＡＬＬ−１、ＭＯＬＴ−４、ＣＣＲＦ−ＳＢ）、リンパ腫由来２株（Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７）の合計８種を用いた。これらの細胞株は、ＨＴ培地（１５％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ−１６４０）に懸濁し、５％  炭酸ガスインキュベーター内で３７℃にて培養し、増殖させた。それぞれの細胞株の細胞数をカウントし、１×１０７個となるように分取し、１％  プロテアーゼインヒビター（シグマアルドリッチ社製；Ｐ８３４０）を含むＲＩＰＡ  バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ−４０，１％  Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％  ＳＤＳ）を加えて、細胞を溶解させた。不溶物を遠心分離にて除去した後、細胞溶解液中のタンパク質濃度を測定して、１レーン当たり２０μｇ分をＳＤＳ含有還元条件下で煮沸処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）の各レーンにアプライして電気泳動した。泳動終了後、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜へ転写し、抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ａ２−２−３）を反応させ、マウスＩｇＧ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を用いてＬＲ１１を検出した。
一方、各細胞株の培養上清中に分泌された可溶性ＬＲ１１の検出は、以下のように行った。上記と同様にＨＴ培地で培養したそれぞれの細胞株を１×１０７個となるように分取し、ＲＰＭＩ−１６４０培地２ｍＬにてさらに１４時間培養した。培養上清中の可溶性ＬＲ１１を、ウェスタンブロット法及び参考例１と同様のＥＬＩＳＡで測定した。
各細胞株の細胞溶解液を用いたウェスタンブロットでは、分子量２３０ｋＤａ付近に若干異なる分子量を示す２本のバンドが検出された（図１）。さらに、ＮＡＬＬ−１を除き培養上清中にも可溶性ＬＲ１１が存在していることが確認され、図２に示すようにＨＬ−６０、ＭＬ−２、ＮＢ−４、ＣＣＲＦ−ＳＢ、Ｄａｕｄｉ、Ｕ９３７の６株においては、可溶性ＬＲ１１の分泌量が培養上清２ｍＬあたり１ｎｇを越えていた。中でも、ＣＣＲＦ−ＳＢでは分泌量が５ｎｇ／２ｍＬを越えており、造血器腫瘍細胞を培養することによって、可溶性ＬＲ１１を容易に得られることが分かった。【００３３】
実施例４  各種造血器腫瘍細胞株のフローサイトメトリー
実施例３で用いた細胞株８種について、細胞表面にＬＲ１１が発現しているか否かを、フローサイトメトリーにて解析した。各細胞株を、５×１０５個になるよう５０μＬ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（１％  ＦＢＳ／ＰＢＳ）に浮遊させた。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去し、ペレットに、１ｍｇ／ｍＬ  ＦＩＴＣ標識抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ｍ３）を３μＬ添加して、４℃で６０分間反応させた。細胞をＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍにて２回洗浄後、使用説明書に従いＪＳＡＮ（Ｂａｙ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。ＦＩＴＣ標識抗ＬＲ１１モノクローナル抗体の陰性コントロールには、正常マウスＩｇＧ（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いた。結果を図３に示す。実施例３で可溶性ＬＲ１１の分泌が確認された７株の内、ＨＬ−６０、ＭＬ−２、ＮＢ−４、ＭＯＬＴ−４、ＣＣＲＦ−ＳＢ、Ｕ９３７の６株については、強陽性から弱陽性の反応が見られ、これらの細胞の表面には、ＬＲ１１が顕著に発現していることが判明した。【００３４】
実施例５  各種上皮性悪性腫瘍細胞株のＬＲ１１タンパク質発現の確認
各種上皮性腫瘍細胞株でのＬＲ１１タンパク質発現を、実施例１で用いた抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ａ２−２−３）によるウェスタンブロットで確認した。細胞株は、ＨＬＥ（肝臓癌由来）、ＭＫＮ１（胃癌由来）、Ｔ．Ｔｎ（食道癌由来）、ＣＯＬＯ２０１（大腸癌由来）、ＡｓＰＣ−１（膵臓癌由来）、Ｃａｋｉ−１（腎臓癌由来）、Ｏｋａ−Ｃ−１（肺癌由来）、ＰＣ−３（前立腺癌由来）、ＫＭＢＣ−２（膀胱癌由来）、ＨｅＬａ（子宮頸癌由来）、ＯＶＩＳＥ（卵巣癌由来）、ＹＭＢ−１（乳癌由来）、ＫＩＮＧＳ−１（神経腫瘍由来）、Ｇ−３６１（黒色細胞腫由来）の合計１４種を用いた。これら細胞株は、指定された培地（例えば、１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ−１６４０）に懸濁し、５％炭酸ガスインキュベーター内で３７℃にて適当な時間培養し、増殖させた。培養フラスコからの増殖した細胞の回収は、細胞をＰＢＳで数回洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（インビトロジェン社製、２５２００−０７２）を用いて行った。それぞれの細胞株の細胞数をカウントし、１×１０７個となるように分取後、ＰＢＳを適当量加え懸濁させ、遠心分離で細胞を回収した。この操作を３回繰り返して細胞を洗浄した。その後、回収した細胞に、１％プロテアーゼインヒビター（シグマアルドリッチ社製、Ｐ８３４０）を含むＰＢＳ  １００μＬを加え、超音波振動器（ホモジナイザー）で細胞を破砕した。細胞の破砕断片を遠心分離にて除去した後、上清を超遠心分離（１００，０００ｇ、１０分間）にて膜画分を沈殿させた。上清を除去し、ＰＢＳにて沈殿を洗浄した後、１％プロテアーゼインヒビター（シグマアルドリッチ社製；Ｐ８３４０）及び１％ＭＥＧＡ−９を含むＰＢＳ  １００μＬを加え、超音波振動器（ホモジナイザー）にて膜画分を懸濁・溶解させ、再び超遠心分離（１００，０００ｇ、１０分間）にて不溶の膜画分を除去することで、可溶性膜画分溶液を得た。
各細胞株の可溶性膜画分溶液を、１レーン当たり２μＬ分をＳＤＳ含有還元条件下で煮沸処理し、その各処理液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２−１５％）の各レーンにアプライし分離した。泳動終了後、ゲルよりタンパク質をＰＶＤＦ膜へ転写し、一次抗体として抗ＬＲ１１モノクローナル抗体（Ａ２−２−３）を反応させ、その後は、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）及びＨＲＰ標識ストレプトアビジンを組み合わせて、最終的にジアミノベンチジンで発色させて、ＬＲ１１タンパク質を検出した。その結果、１４種すべての細胞株について、ＬＲ１１タンパク質のバンドが検出された（図４）。
一方、各細胞株の培養上清中に分泌された可溶性ＬＲ１１の検出は、以下のように行った。上記でＬＲ１１の発現が確認された細胞株の中から、ＨＬＥ、ＣＯＬＯ２０１、ＡｓＰＣ−１、ＫＩＮＧＳ−１、ＰＣ−３、ＫＭＢＣ−２を選択し、７５ｃｍ２の培養フラスコを用いて、それぞれ指定された培地４０ｍＬでコンフルエントになるまで培養した。また、ＣＯＬＯ２０１は別途無血清のＲＰＭＩ１６４０培地２０ｍＬに１×１０６個／ｍＬになるように撒き、２日間培養した。培養上清中の可溶性ＬＲ１１を、参考例１と同様にＥＬＩＳＡ法で測定した。結果、すべての細胞株の培養上清中に可溶性ＬＲ１１が存在していることが確認された（図５）。検討した細胞株の中でも、ＣＯＬＯ２０１細胞株は、無血清培地で培養することにより分泌量が１ｍＬ当たり５ｎｇを越えていた。このように、培養細胞を用いる場合、培養条件を工夫することで産出量を増加させることもでき、また、血清成分などの夾雑物が存在しない条件でＬＲ１１を効率よく簡便に得ることが出来るので、抗体作製用の免疫原あるいは標準品の作製手段として有効である。【００３５】
実施例６  各種可溶性ＬＲ１１の比較
実施例２で得られたヒト尿由来の可溶性ＬＲ１１と、実施例３で得られた培養細胞（ＣＣＲＦ−ＳＢ）由来可溶性ＬＲ１１、及び実施例５で得られた培養細胞（ＣＯＬＯ２０１）由来可溶性ＬＲ１１を、ウェスタンブロット法にて比較した。対照には、ヒト血清から抽出された可溶性ＬＲ１１（非特許文献４）を用いた。その結果、図６に示すように、いずれの場合も分子量２３０ｋＤａ付近にバンドが認められた。【００３６】
実施例７  細胞免疫
フローサイトメトリーで試験した実施例４でＬＲ１１を細胞表面に顕著に発現していた造血器腫瘍由来細胞の１つであるＮＢ−４株をＨＴ培地で拡大培養し、ＰＢＳにて２回洗浄後、１〜２×１０７個をＰＢＳに懸濁して、ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）の腹腔内に注入し、免疫した。隔週又は毎週免疫し、適切な時期に、次に示す方法によりマウス血清中の抗ＬＲ１１抗体価を確認した。
マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に、実施例２で得られたヒト尿由来精製可溶性ＬＲ１１をＰＢＳで５０ｎｇ／ｍＬに希釈して１ウエルあたり５０μＬ添加し、室温で２時間静置した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄後、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（ＢＳＡ−ＰＢＳＴ）を１ウエルあたり２００μＬ添加し、室温で１時間ブロッキングした。マウスの尻尾より採血して得られた血清を、ＢＳＡ−ＰＢＳＴにより２００、４００、８００、１６００倍希釈して１ウエルあたり５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ウエルをＰＢＳＴで洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を１００００倍希釈して１ウエルあたり５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ｏ−フェニレンジアミン基質液を１ウエルあたり５０μＬ加えて室温で２０分間発色させ、１．５Ｎ硫酸を１ウエルあたり５０μＬ加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Ａｂｓ．４９２ｎｍ）で測定した。
５回免疫した後のマウス血清中の抗ＬＲ１１抗体価を測定した結果を図７に示す。免疫前のマウス血清では、固相化したヒト尿由来精製可溶性ＬＲ１１への反応は認められないのに対し、ＮＢ−４細胞株を免疫したマウスの血清では、希釈濃度変化に応じた吸光度変化が認められたことから、抗ＬＲ１１抗体が産生されたことが確認された。
【図３】
2012008595.tif 000002
【図７】
2012008595.tif 000003
【図１】
2012008595.tif 000004
【図２】
2012008595.tif 000005
【図４】
2012008595.tif 000006
【図５】
2012008595.tif 000007
【図６】
2012008595.tif 000008
【国際調査報告】
2012008595.tif 000009
2012008595.tif 000010
2012008595.tif 000011
2012008595.tif 000012
2012008595.tif 000013
2012008595.tif 000014
2012008595.tif 000015