(57)【要約】  被験者から採取された検体から抽出されたＲＮＡを増幅し、測定用試料を調製し、当該測定用試料を用いて、特定遺伝子群の各遺伝子の発現量を測定し、前記発現量を解析した結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する。【選択図】図１
2011065533.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）被験者から採取された検体からＲＮＡを抽出する工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で抽出されたＲＮＡを用いて測定用試料を調製する工程、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた測定用試料を用いて、表１および表２に記載の遺伝子群から選ばれた遺伝子の発現量を測定する工程であって、前記遺伝子の発現量が、表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を少なくとも含むものである工程、
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で測定された前記遺伝子の発現量を解析する工程、および
（Ｅ）前記工程（Ｄ）で得られた解析結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する工程、
を含む、乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法。
【表１】
2011065533.tif 000041
【表２】
2011065533.tif 000042
【表３】
2011065533.tif 000043
【請求項２】
前記工程（Ｄ）において、前記発現量を、クラス分け手法を用いて解析する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クラス分け手法が、Ｂｅｔｗｅｅｎ−ｇｒｏｕｐ  ａｎａｌｙｓｉｓである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（Ｃ）において、表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を測定し、測定された各遺伝子の発現量と、下記式（１）：
【数１】
2011065533.tif 000044
｛式（１）中、ｉは表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子に付与された遺伝子番号を示し、ｗiは表４、表５および表６に記載された遺伝子番号ｉの遺伝子に対応する重み係数を示し、Ｘiは下記式（２）：
【数２】
2011065533.tif 000045
〔式（２）中、ｊは各検体に付与された検体番号を示し、ｙijは遺伝子番号ｉの遺伝子の検体番号ｊの検体での標準化された発現量を示し、ｍｉｎは括弧内の値の最小値を示し、ｒｏｕｎｄは括弧内の値の小数点以下第一位を四捨五入した値を示し、ａｂｓは括弧内の値の絶対値を示し、ｙiは下記式（３）：
【数３】
2011065533.tif 000046
（式（３）中、ｘiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量を示し、ｕiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る平均値を示し、ｓiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る標準偏差を示す。）に示される遺伝子番号iの遺伝子の標準化された発現量を示す。〕により標準化され正規化された遺伝子の発現量を示し、Σiは各遺伝子に渡る総和を示す。｝
で表される判別式とを用い、前記判別式の解Ｄが正の値のとき、乳癌術前化学療法に対して感受性であり、解Ｄがゼロまたは負の値のとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であると判定する、請求項３に記載の方法。
【表４】
2011065533.tif 000047
【表５】
2011065533.tif 000048
【表６】
2011065533.tif 000049
【請求項５】
前記工程（Ｃ）において、表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を測定し、測定された各遺伝子の発現量と、下記式（４）：
【数４】
2011065533.tif 000050
｛式（１）中、ｉは表３に記載の遺伝子群の各遺伝子に付与された遺伝子番号を示し、ｗiは表７に記載された遺伝子番号ｉの遺伝子に対応する重み係数を示し、Ｘiは下記式（５）：
【数５】
2011065533.tif 000051
〔式（５）中、ｊは各検体に付与された検体番号を示し、ｙijは遺伝子番号ｉの遺伝子の検体番号ｊの検体での標準化された発現量を示し、ｍｉｎは括弧内の値の最小値を示し、ｒｏｕｎｄは括弧内の値の小数点以下第一位を四捨五入した値を示し、ａｂｓは括弧内の値の絶対値を示し、ｙiは下記式（６）：
【数６】
2011065533.tif 000052
（式（６）中、ｘiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量を示し、ｕiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る平均値を示し、ｓiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る標準偏差を示す。）に示される遺伝子番号iの遺伝子の標準化された発現量を示す。〕により標準化され正規化された遺伝子の発現量を示し、Σiは各遺伝子に渡る総和を示す。｝
で表される判別式とを用い、前記判別式の解Ｄが正の値のとき、乳癌術前化学療法に対して感受性であり、解Ｄがゼロまたは負の値のとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であると判定する、請求項３に記載の方法。
【表７】
2011065533.tif 000053
【請求項６】
前記工程（Ｄ）において、前記発現量を、階層的クラスター分析により解析する、請求項１に記載の方法、
【請求項７】
前記工程（Ｄ）において、前記発現量を、スコア化手法により解析する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記各遺伝子の発現量を、前記各遺伝子に対応する核酸を少なくとも有するマイクロアレイを用いて測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検体が、治療前生検により被験者から採取された検体である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌の治療においては、腫瘍縮小による温存率の向上を目的とした抗癌剤による乳癌術前化学療法が広く普及している。Ｅａｒｌｙ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｉａｌｉｓｔｓ’  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ  （ＥＢＣＴＣＧ）によるメタアナリシスにおいては、術前化学療法を受けた患者と術後化学療法を受けた患者との間では、乳癌の再発の抑制および生存率の向上に関して、差が無いことが示されている。【０００３】
しかも、前記ＥＢＣＴＣＧによるメタアナリシスでは、術前化学療法を受けた患者においては、術前化学療法を受けていない患者に比べて、乳房温存率が有意に高くなっていることが示されている。また、前記ＥＢＣＴＣＧによるメタアナリシスでは、術前化学療法により病理学的完全奏功（ｐＣＲ）の得られた症例では、その後の予後が良好である傾向があることも示されている。そのため、ｐＣＲは、術前化学療法を受けた患者における乳癌の予後予測因子として有用であると考えられている。また、このような背景から、乳癌における術前化学療法は、今後ますます普及していくものと予想されている。【０００４】
しかしながら、術前化学療法は、乳癌の全ての症例に対して有効であるとは限らないため、術前化学療法に反応しない症例では、手術への移行も含めた他の対応が必要となっている。
このように、個々の腫瘍の術前化学療法に対する反応性（術前化学療法に対する感受性）を考慮して、治療の個別化（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）が求められている。しかしながら、術前化学療法に対する感受性を精度良く判定する製品が実現化されていないため、現状では難しい。【０００５】
ところで、乳癌の治療に際しては、治療開始前に、組織が乳癌組織であるかどうかの診断を行なうために、例えば、穿刺吸引生検、コア針生検、吸引装置付き針生検装置を用いた生検（例えば、マンモトーム生検など）等によって、乳癌組織を含む微量な生物試料を得ることができる。【０００６】
近年、このような微量な生物試料から抽出された核酸を用い、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現情報解析を行なうことが可能になっている。前記網羅的遺伝子発現情報解析より、予後などの生物学的特性の違いや治療に対する感受性の違いを癌の個性として遺伝子の発現量で定量化して識別することや、性質が似ている複数の症例で共通の発現パターンを示す遺伝子群を同定すること、類似の発現パターンを示す遺伝子群がある症例を分類することなどが試みられている（例えば、特許文献１参照）。【０００７】
前記特許文献１には、検体における特定の遺伝子の発現を多変量解析して、その解析結果を指標として遺伝子の発現パターンが類似する群ごとに検体を分類し、分類結果から乳癌などの状態を予測することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０２/０７２８２８号パンフレット
【発明の概要】
【０００９】
しかしながら、術前化学療法に対する感受性などをより精度良く判定する方法が求められているのが現状である。
【００１０】
本発明は、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定することができる乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法を提供することを目的とする。
【００１１】
すなわち、本発明は、
〔１〕  （Ａ）被験者から採取された検体からＲＮＡを抽出する工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で抽出されたＲＮＡを用いて測定用試料を調製する工程、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた測定用試料を用いて、表１および表２に記載の遺伝子群から選ばれた遺伝子の発現量を測定する工程であって、前記遺伝子の発現量が、表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を少なくとも含むものである工程、
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で測定された前記遺伝子の発現量を解析する工程、および
（Ｅ）前記工程（Ｄ）で得られた解析結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する工程、
を含む、乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法、
〔２〕  前記工程（Ｄ）において、前記発現量を、クラス分け手法を用いて解析する、前記〔１〕に記載の方法、
〔３〕  前記クラス分け手法が、Ｂｅｔｗｅｅｎ−ｇｒｏｕｐ  ａｎａｌｙｓｉｓである、前記〔２〕に記載の方法、
〔４〕  前記工程（Ｃ）において、表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を測定し、測定された各遺伝子の発現量と、下記式（１）：
【００１２】
【数１】
2011065533.tif 000003
【００１３】
｛式（１）中、ｉは表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子に付与された遺伝子番号を示し、ｗiは表４、表５および表６に記載された遺伝子番号ｉの遺伝子に対応する重み係数を示し、Ｘiは下記式（２）：
【００１４】
【数２】
2011065533.tif 000004
【００１５】
〔式（２）中、ｊは各検体に付与された検体番号を示し、ｙijは遺伝子番号ｉの遺伝子の検体番号ｊの検体での標準化された発現量を示し、ｍｉｎは括弧内の値の最小値を示し、ｒｏｕｎｄは括弧内の値の小数点以下第一位を四捨五入した値を示し、ａｂｓは括弧内の値の絶対値を示し、ｙiは下記式（３）：
【００１６】
【数３】
2011065533.tif 000005
【００１７】
（式（３）中、ｘiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量を示し、ｕiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る平均値を示し、ｓiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る標準偏差を示す。）に示される遺伝子番号iの遺伝子の標準化された発現量を示す。〕により標準化され正規化された遺伝子の発現量を示し、Σiは各遺伝子に渡る総和を示す。｝
で表される判別式とを用い、前記判別式の解Ｄが正の値のとき、乳癌術前化学療法に対して感受性であり、解Ｄがゼロまたは負の値のとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であると判定する、前記〔３〕に記載の方法、
〔５〕  前記工程（Ｃ）において、表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を測定し、測定された各遺伝子の発現量と、下記式（４）：
【００１８】
【数４】
2011065533.tif 000006
【００１９】
｛式（１）中、ｉは表３に記載の遺伝子群の各遺伝子に付与された遺伝子番号を示し、ｗiは表７に記載された遺伝子番号ｉの遺伝子に対応する重み係数を示し、Ｘiは下記式（５）：
【００２０】
【数５】
2011065533.tif 000007
【００２１】
〔式（２）中、ｊは各検体に付与された検体番号を示し、ｙijは遺伝子番号ｉの遺伝子の検体番号ｊの検体での標準化された発現量を示し、ｍｉｎは括弧内の値の最小値を示し、ｒｏｕｎｄは括弧内の値の小数点以下第一位を四捨五入した値を示し、ａｂｓは括弧内の値の絶対値を示し、ｙiは下記式（６）：
【００２２】
【数６】
2011065533.tif 000008
【００２３】
（式（６）中、ｘiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量を示し、ｕiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る平均値を示し、ｓiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る標準偏差を示す。）に示される遺伝子番号ｉの遺伝子の標準化された発現量を示す。〕により標準化され正規化された遺伝子の発現量を示し、Σiは各遺伝子に渡る総和を示す。｝
で表される判別式とを用い、前記判別式の解Ｄが正の値のとき、乳癌術前化学療法に対して感受性であり、解Ｄがゼロまたは負の値のとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であると判定する、前記〔３〕に記載の乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法、
〔６〕  前記工程（Ｄ）において、前記発現量を、階層的クラスター分析により解析する、前記〔１〕に記載の乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法、
〔７〕  前記工程（Ｄ）において、前記発現量を、スコア化手法により解析する、前記〔１〕に記載の乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法、
〔８〕  前記各遺伝子の発現量を、前記各遺伝子に対応する核酸を少なくとも有するマイクロアレイを用いて測定する前記〔１〕に記載の乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法、ならびに
〔９〕  前記検体が、治療前生検により被験者から採取された検体である、前記〔１〕に記載の乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法
に関する。
【００２４】
本発明の乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法によれば、乳癌の術前化学療法に対する感受性を精度良く判定することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１において、トレーニングセットの５０例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を示す図である。
【図２】実施例２において、バリデーションセットの３４例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を示す図である。
【図３】実施例３において、トレーニングセットの検体それぞれの発現量のデータに基づく樹形図である。
【図４】実施例３において、バリデーションセットの検体それぞれの発現量のデータに基づく樹形図である。
【図５】実施例４において、トレーニングセットの検体それぞれの発現量のデータに基づく第一主成分スコアおよび第二主成分スコアの散布図である。
【図６】実施例４において、バリデーションセットの検体それぞれの発現量のデータに基づく第一主成分スコアおよび第二主成分スコアの散布図である。
【図７】実施例５において、プローブ数と感度×特異度との関係を示すグラフである。
【図８】実施例６において、トレーニングセットの５０例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を示す図である。
【図９】実施例７において、バリデーションセットの３４例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を示す図である。
【図１０】実施例８において、トレーニングセットの５０例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を示す図である。
【図１１】実施例９において、バリデーションセットの３４例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法は、（Ａ）被験者から採取された検体からＲＮＡを抽出する工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で抽出されたＲＮＡを用いて測定用試料を調製する工程、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた測定用試料を用いて、表１および表２に記載の遺伝子群から選ばれた遺伝子の発現量を測定する工程であって、前記遺伝子の発現量が、表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を少なくとも含むものである工程、
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で測定された前記遺伝子の発現量を解析する工程、および
（Ｅ）前記工程（Ｄ）で得られた解析結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する工程、
を含む方法である。
【００２７】
【表１】
2011065533.tif 000009
【００２８】
【表２】
2011065533.tif 000010
【００２９】
【表３】
2011065533.tif 000011
【００３０】
前記表１および表２において、「Ｎｏ」は、遺伝子番号を示す。「プローブセット．ＩＤ」は、アフィメトリックス社製のマイクロアレイ〔商品名：ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍ〕において、基材上に固定されたプローブの１１〜２０個をまとめたプローブセットそれぞれにつけられているＩＤ番号を示す。「ＵｎｉＧｅｎｅ．ＩＤ」は、ＮＣＢＩが公開しているデータベースであるＵｎｉＧｅｎｅのＩＤ番号を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、前記アフィメトリックス社製のマイクロアレイ〔商品名：ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍ〕において、基材上に固定されたプローブそれぞれの配列の設計に用いられた公開データベースＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号を示す。また、表３は、表１および表２に記載のプローブセットに含まれる１３個のプローブセットを示している。
【００３１】
本発明者らは、前記表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を測定し、かかる発現量を網羅的に解析した結果に基づいて乳癌術前化学療法に対する感受性を評価した場合に、前記感受性を精度良く判定できることを見出した。また、本発明者らは、前記表１および表２に記載の遺伝子群から選ばれた遺伝子の発現量のうち、表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を少なくとも測定することにより、前記感受性を精度良く判定できることを見出した。さらに、特に、前記発現量を、多変量解析を取り入れたクラス分け手法によって解析したとき、乳癌術前化学療法に対する感受性を、精度良く判定できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づき完成させたものである。なお、本明細書において、「表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量」の用語は、表１および表２に記載のプローブセット．ＩＤに対応する表１および表２に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号で示される核酸を保持する遺伝子の発現量を意味する。また、本明細書において、「表１および表２に記載の遺伝子群から選ばれた遺伝子の発現量」の用語は、表１および表２に記載のプローブセット．ＩＤに対応する表１および表２に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号で示される核酸のなかから選ばれた核酸を保持する遺伝子の発現量を意味する。さらに、本明細書において、「表３に記載の遺伝子群から選ばれた遺伝子の発現量」の用語は、表３に記載のプローブセット．ＩＤに対応する表１および表２に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号で示される核酸のなかから選ばれた核酸を保持する遺伝子の発現量を意味する。ＧｅｎＢａｎｋは、米国生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により提供されているデータベースであり、ウェブページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅなどにより利用可能である。そして、前記表１および表２に記載のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が付された配列は、上記データベースより入手することができる。また、前記ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、２００９年３月１１日時点での最新リリースでの番号を示す。なお、本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝子転写産物としてのＲＮＡが抽出される塩基配列の単位であればよく、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）も含む概念である。
【００３２】
本発明の判定方法では、まず、被験者から採取された検体からＲＮＡを抽出する〔工程（Ａ）〕。
【００３３】
前記検体は、治療前生検により被験者から採取した検体が好ましい。前記検体としては、具体的には、治療前生検により被験者から採取した組織などが挙げられる。ここで、生検としては、例えば、穿刺吸引生検、コア針生検、吸引装置付き針生検装置〔例えば、ジョンソン・エンド・ジョンソン（株）製、商品名：マンモトーム（登録商標）など〕を用いた生検（「マンモトーム生検」という）等が挙げられる。これらの中では、容易にかつ低負荷で検体を得ることができることから、前記マンモトーム生検が好ましい。
【００３４】
検体からのＲＮＡの抽出は、公知の方法によって行なうことができる。また、検体からのＲＮＡの抽出は、ＲＮＡを抽出するための市販のキットを用いることもできる。ここで、市販のキットとしては、インビトロジェン社製、商品名：Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）や、キアゲン社製、商品名：Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（登録商標）などが挙げられる。
【００３５】
つぎに、前記工程（Ａ）で抽出されたＲＮＡを用いて測定用試料を調製する〔工程（Ｂ）〕。
【００３６】
本工程（Ｂ）では、遺伝子の発現量、すなわち、当該遺伝子に対応する転写産物（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）の産生量などを測定するのに適した測定用試料を調製する。具体的には、測定用試料は、例えば、前記工程（Ａ）で抽出されたＲＮＡよりｍＲＮＡを精製すること、前記工程（Ａ）で抽出されたＲＮＡを用いて、対応するｃＤＮＡを増幅することなどによって調製することができる。また、本発明においては、遺伝子の発現量を測定することが可能であるのであれば、前記工程（Ａ）で抽出されたＲＮＡをそのまま測定用試料として用いてもよい。
【００３７】
前記ｍＲＮＡの精製は、公知の精製方法を用いて行なうことができる。また、ｍＲＮＡの精製には、市販の精製キットを用いてもよい。
【００３８】
また、ｃＤＮＡの増幅は、公知の方法を用いて行なうことができる。ｃＤＮＡの増幅には、ｃＤＮＡの増幅するための市販のキットを用いることもできる。ここで、前記市販のキットとしては、例えば、ニューゲン・テクノロジーズ（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：ＷＴ−ＯｖａｔｉｏｎTM  ＦＦＰＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２などが挙げられる。
【００３９】
つぎに、前記工程（Ｂ）で得られた測定用試料を用いて、表１および表２に記載の遺伝子群から選ばれた遺伝子の発現量を測定する。ここで、前記遺伝子の発現量は、表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を少なくとも含むものである〔工程（Ｃ）〕。
【００４０】
前記工程（Ｃ）では、発現量を測定する対象となる遺伝子は、表３に記載の遺伝子群の全遺伝子を少なくとも含んでいればよく、用いられる遺伝子の数や種類は、特に限定されるものではない。すなわち、前記工程（Ｃ）で用いられる遺伝子として、前記表１および表２に記載の遺伝子群の７０個全ての遺伝子を選択してもよい（第１の態様）。また、前記工程（Ｃ）で用いられる遺伝子として、表３に記載の遺伝子群を選択してもよい（第２の態様）。さらに、前記工程（Ｃ）で用いられる遺伝子として、前記表１および表２に記載の遺伝子群のなかから、表３に記載の遺伝子群と、他の遺伝子とを選択してもよい（第３の態様）。
【００４１】
本工程（Ｃ）において、遺伝子の発現量は、例えば、マイクロアレイ、定量的ＲＴ-ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、ノーザンブロット解析などにより測定することができる。これらのなかでは、前記遺伝子群の各遺伝子の発現量を迅速、かつ簡便に測定することができることから、マイクロアレイを用いて測定することが好ましい。この場合、前記発現量は、以下の工程において、マイクロアレイにおける蛍光強度のまま用いてもよい。
【００４２】
マイクロアレイによる遺伝子の発現量の測定は、公知の方法を用いて行なうことができる。具体的には、例えば、ヒトゲノムの発現解析が可能なマイクロアレイであるアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製の商品名：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙを用いることにより、表１および表２に記載のプローブセット．ＩＤで示される７０個のプローブによって、前記遺伝子群の各遺伝子の発現量を一度に測定することができる。
【００４３】
つぎに、前記工程（Ｃ）で測定された前記遺伝子の発現量を解析する〔工程（Ｄ）〕。その後、前記工程（Ｄ）で得られた解析結果に基づいて、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定する〔工程（Ｅ）〕。
【００４４】
前記工程（Ｄ）において、前記発現量は、例えば、クラス分け手法、階層的クラスター分析およびスコア化手法を用いて、解析することができる。ここで、前記発現量は、測定された発現量の生データを、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現量などによって正規化したものを用いることができる。
【００４５】
前記クラス分け手法として、公知の方法を用いることができる。かかるクラス分け手法としては、例えば、Ｂｅｔｗｅｅｎ−ｇｒｏｕｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＧＡ）〔カルヘイン（Ｃｕｌｈａｎｅ，Ａ．Ｃ．）ら、バイオインフォマティックス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、２００２年、第１８巻、ｐｐ．１６００−１６０８参照），「マイクロアレイデータのＢｅｔｗｅｅｎ−ｇｒｏｕｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｅｔｗｅｅｎ−ｇｒｏｕｐ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ）」を参照〕、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、対角線形判別（ＤＬＤＡ）およびｋ最近傍分類（ｋＮＮ）、決定木、Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔ、ニューラルネットなどが挙げられる。これらのなかでは、乳癌術前化学療法に対して感受性であるものと、非感受性であるものとを良好にクラス分けをすることができる観点から、ＢＧＡが好ましい。かかるクラス分け手法を用いて発現量を解析する場合、前記発現量に基づいて、乳癌術前化学療法に対して感受性である検体と、非感受性である検体とにクラス分けがされる。したがって、この場合、前記工程（Ｅ）においては、かかるクラス分けの結果によって、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定することができる。前記解析には、例えば、前記工程（Ｃ）で用いられた遺伝子の数や種類（前記第１の態様〜第３の態様）に応じて、ＢＧＡを用いて構築された判別式を用いることができる。
【００４６】
例えば、第１の態様の場合、まず、前記工程（Ｃ）において、前記表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を測定する。そして、測定された各遺伝子の発現量と、下記式（１）で表される判別式とを用いて判定を行なうことができる。
【００４７】
【数７】
2011065533.tif 000012
【００４８】
｛式（１）中、ｉは表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子に付与された遺伝子番号を示し、ｗiは表４、表５および表６に記載された遺伝子番号ｉの遺伝子に対応する重み係数を示し、Ｘiは下記式（２）：
【００４９】
【数８】
2011065533.tif 000013
【００５０】
〔式（２）中、ｊは各検体に付与された検体番号を示し、ｙijは遺伝子番号ｉの遺伝子の検体番号ｊの検体での標準化された発現量を示し、ｍｉｎは括弧内の値の最小値を示し、ｒｏｕｎｄは括弧内の値の小数点以下第一位を四捨五入した値を示し、ａｂｓは括弧内の値の絶対値を示し、ｙiは、下記式（３）：
【００５１】
【数９】
2011065533.tif 000014
【００５２】
（ｘiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量を示し、ｕiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る平均値を示し、ｓiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る標準偏差を示す。）に示される遺伝子番号iの遺伝子の標準化された発現量を示す。〕により標準化され正規化された遺伝子の発現量を示し、Σiは各遺伝子に渡る総和を示す。｝。
【００５３】
【表４】
2011065533.tif 000015
【００５４】
【表５】
2011065533.tif 000016
【００５５】
【表６】
2011065533.tif 000017
【００５６】
また、前記第２の態様の場合、前記工程（Ｃ）において、まず、前記表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を測定する。そして、測定された各遺伝子の発現量と、下記式（４）で表される判別式とを用いて判定を行なうことができる。
【００５７】
【数１０】
2011065533.tif 000018
｛式（４）中、ｉは表３に記載の遺伝子群の各遺伝子に付与された遺伝子番号を示し、ｗiは表７に記載された遺伝子番号ｉの遺伝子に対応する重み係数を示し、Ｘiは下記式（５）：
【００５８】
【数１１】
2011065533.tif 000019
【００５９】
〔式（５）中、ｊは各検体に付与された検体番号を示し、ｙijは遺伝子番号ｉの遺伝子の検体番号ｊの検体での標準化された発現量を示し、ｍｉｎは括弧内の値の最小値を示し、ｒｏｕｎｄは括弧内の値の小数点以下第一位を四捨五入した値を示し、ａｂｓは括弧内の値の絶対値を示し、ｙiは下記式（６）：
【００６０】
【数１２】
2011065533.tif 000020
【００６１】
（式（６）中、ｘiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量を示し、ｕiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る平均値を示し、ｓiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る標準偏差を示す。）に示される遺伝子番号iの遺伝子の標準化された発現量を示す。〕により標準化され正規化された遺伝子の発現量を示し、Σiは各遺伝子に渡る総和を示す。｝。
【００６２】
【表７】
2011065533.tif 000021
【００６３】
さらに、前記第３の態様の例としては、表８および表９（表１および表２に記載の遺伝子群の遺伝子のうち、表３に記載の遺伝子群を含む５０個の遺伝子）に記載の遺伝子群の各遺伝子を用いる判定などが挙げられる。この場合、表８および表９に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を測定する。そして、測定された各遺伝子の発現量と、下記式（７）で表される判別式とを用いて判定を行なうことができる。
【００６４】
【数１３】
2011065533.tif 000022
｛式（７）中、ｉは表８および表９に記載の遺伝子群の各遺伝子に付与された遺伝子番号を示し、ｗiは表８および表９に記載された遺伝子番号ｉの遺伝子に対応する重み係数を示し、Ｘiは下記式（８）：
【００６５】
【数１４】
2011065533.tif 000023
【００６６】
〔式（８）中、ｊは各検体に付与された検体番号を示し、ｙijは遺伝子番号ｉの遺伝子の検体番号ｊの検体での標準化された発現量を示し、ｍｉｎは括弧内の値の最小値を示し、ｒｏｕｎｄは括弧内の値の小数点以下第一位を四捨五入した値を示し、ａｂｓは括弧内の値の絶対値を示し、ｙiは下記式（９）：
【００６７】
【数１５】
2011065533.tif 000024
【００６８】
（式（９）中、ｘiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量を示し、ｕiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る平均値を示し、ｓiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る標準偏差を示す。）に示される遺伝子番号iの遺伝子の標準化された発現量を示す。〕により標準化され正規化された遺伝子の発現量を示し、Σiは各遺伝子に渡る総和を示す。｝。
【００６９】
【表８】
2011065533.tif 000025
【００７０】
【表９】
2011065533.tif 000026
【００７１】
前記判別式を用いて発現量を解析する場合、前記判別式のｘi（例えば、ｉ＝１，２，・・・，７０）に、順に、当該検体の当該遺伝子の発現量の値を代入し、解Ｄを求める。この場合、前記工程（Ｅ）においては、解Ｄが正の値のとき、乳癌術前化学療法に対して感受性であり、解Ｄがゼロまたは負の値のとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であると判定することができる。
【００７２】
前記階層的クラスター分析は、例えば、被験者から採取した検体の発現量のデータ（あるいは発現量に関する蛍光強度のデータ）と、術前化学療法により病理学的完全奏功（ｐＣＲ）が得られたことが既知の検体の群の発現量のデータ（あるいは発現量に関する蛍光強度のデータ）と、非奏功であることが既知の検体の群の発現量のデータ（あるいは発現量に関する蛍光強度のデータ）とを用い、前記発現量（あるいは発現量に関する蛍光強度）に基づいて検体間の類似度を示す距離を計算し、この距離に基づいて種々のクラスターを形成し、クラスターを統合して、樹形図を作成することにより行なうことができる。ここで、前記距離としては、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数、ユークリッド距離などが挙げられる。また、クラスターの統合は、例えば、ｗａｒｄ法、最遠隣法、重心間距離法などにより行なうことができる。これらのなかでは、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数およびｗａｒｄ法を用いることにより、乳癌術前化学療法に対して感受性であるものと、非感受性であるものとを良好に分けることができる。この場合、前記工程（Ｅ）においては、かかる階層的クラスター分析の結果によって、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定することができる。
【００７３】
前記スコア化手法として、公知の方法を用いることができる。かかるスコア化手法としては、例えば、主成分分析、重回帰分析、ロジスティック回帰分析、Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅなどが挙げられる。これらのなかでは、乳癌術前化学療法に対して感受性であるものと、非感受性であるものとを良好に分けることができる観点から、主成分分析が好ましい。かかるスコア化手法を用いて発現量を解析する場合、前記発現量に基づいて、乳癌術前化学療法に対して感受性である検体のスコアと、非感受性である検体のスコアとが分けられるようスコア化がされる。したがって、この場合、前記工程（Ｅ）においては、かかるスコア化の結果によって、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定することができる。
【００７４】
以上のように、本発明の乳癌術前化学療法に対する感受性の判定方法によれば、表１および表２に記載の遺伝子群の遺伝子の発現量であって、かつ少なくとも表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を用いているので、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定することができる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００７６】
［実施例１］
（１）被験者からの検体の採取
２００３年から２００８年の間に大阪大学医学部附属病院で術前化学療法が施された９０人の乳癌患者それぞれから、採取針（サイズ１１Ｇ）を取り付けた吸引装置付き針生検装置〔ジョンソン・エンド・ジョンソン（株）製、商品名：マンモトーム（登録商標）〕を用いて検体を採取した。検体の採取後すぐに、当該検体を、液体窒素に入れ、使用時まで、−８０℃で長期間保存した。【００７７】
（２）被験者の分類
前記（１）における検体の採取後、前記９０人の患者に、術前化学療法として、１２週間にわたる毎週１回のパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）８０ｍｇ／ｍ2の投与、つづく３週間毎に計４回のエピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）７５ｍｇ／ｍ2、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）５００ｍｇ／ｍ2および５−ＦＵ  ５００ｍｇ／ｍ2の投与を行なった。また、前記術前化学療法終了後、当該９０人の患者に、乳房温存手術または乳房切除術を施し、さらにセンチネルリンパ節生検術または腋窩リンパ節郭清術を施した。【００７８】
その後、組織病理学的検査によって病理学的診断と抗癌剤の効果の判定とを行ない、前記９０人の患者を、病理学的完全奏功群（ｐＣＲ群）と非奏功群（ｎｐＣＲ群）とに分類した。ここで、「ｐＣＲ」とは、腫瘍が完全消失しているか、または腫瘍が乳管内だけに残存し浸潤部位が無い状態をいう。また、「ｎｐＣＲ」とは、前記ｐＣＲ以外の状態をいう。【００７９】
（３）検体からのＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの調製
前記（１）で得られた検体（約２０ｍｇ）より、ＲＮＡ抽出用試薬〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）〕を用いて、ＲＮＡを抽出して、ＲＮＡ試料を得た。得られたＲＮＡ試料中のＲＮＡの量を、分光光度計〔（株）バイオメディカルサイエンス製、商品名：Ｎａｎｏ−Ｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００〕によって測定した。また、分析装置（アジレント・テクノロジー（株）製、商品名：Ａｇｉｌｅｎｔ  バイオアナライザー）を用いて、得られたＲＮＡ試料中のＲＮＡのＲＩＮ（ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ）を計測し、かかるＲＩＮに基づいて当該ＲＮＡ試料の品質を判定した。以下の実験においては、ＲＮＡの量が５５０ｎｇ以上であり、概ねＲＩＮ＞６のＲＮＡ試料を用いた。【００８０】
前記ＲＮＡ試料（ＲＮＡ５０ｎｇ相当量）と、転写産物増幅用キット〔ニューゲン・テクノロジーズ（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：ＷＴ−ＯｖａｔｉｏｎTM  ＦＦＰＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２〕に添付のランダムプライマーとを用いて、ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡおよびｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成し、Ｒｉｂｏ−ＳＰＩＡTM増幅技術によって、ｃＤＮＡを増幅した。このようにして、９０例の検体に対応する９０種類のｃＤＮＡを得た。【００８１】
（４）遺伝子発現解析
断片化・標識用試薬〔ニューゲン・テクノロジーズ（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：ＦＬ−ＯｖａｔｉｏｎTM  ｃＤＮＡ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｖ２〕を用いて、前記（３）で得られたｃＤＮＡを、ビオチンで標識するとともに、断片化した。【００８２】
得られた断片化ビオチン標識ｃＤＮＡを、ヒトゲノム発現解析用アレイ〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製、商品名：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ〕上の核酸（プローブセット）と一晩ハイブリダイズさせた。なお、前記断片化ビオチン標識ｃＤＮＡと前記アレイ上の核酸（プローブセット）とのハイブリダイゼーションは、製造者〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社〕による推奨条件に従って行なった。【００８３】
つぎに、ハイブリダイゼーション後のアレイを、マイクロアレイ洗浄・染色処理専用機器〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製、商品名：ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０〕に供して、前記アレイ上の核酸（プローブセット）にハイブリダイズしたｃＤＮＡを蛍光染色し、洗浄した。【００８４】
その後、前記アレイをレーザスキャナー〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製、商品名：ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００〕に供して、前記アレイ上の核酸（プローブセット）にハイブリダイズしたｃＤＮＡの蛍光標識物質に基づくシグナルを読み取り、蛍光強度を定量化した。得られた蛍光強度のデータをソフトウェア〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製、商品名：ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ〕によって処理して、ＣＥＬファイルを得た。前記ＣＥＬファイルを遺伝子発現解析およびデータの品質チェックに用いた。このようにして、９０例の検体それぞれにおける前記プローブセットのプローブに対応する核酸に基づく蛍光強度のデータについて、ＣＥＬファイルを得た。【００８５】
（５）遺伝子の選択、および乳癌術前化学療法に対する感受性の判定のための判別式の構築
以下、得られた９０例のＣＥＬファイルのデータの前処理（正規化）は、解析ソフトウェア〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）社製、商品名：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェア〕のＭＡＳ５統計アルゴリズム（ターゲット値５００）を用いて行なった。また、それ以外の解析は、全て統計解析ソフトウェアＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）および統計解析ソフトウェアＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／）を用いて実施した。【００８６】
製造者〔アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社〕のガイドライン〔（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，  ２００４．）に基づいて、９０例の検体それぞれの蛍光強度のデータにおける品質管理パラメータ〔ノイズ（Ｒａｗ-Ｑ）、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチン遺伝子、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子などの３’／５’比、スケーリング・ファクター（Ｓｃａｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、Ｐｒｅｓｅｎｔ  Ｃａｌｌ％（Ｐ-ｃａｌｌ％）〕を評価した。前記９０例の検体それぞれの蛍光強度のデータについて、前記ヒトゲノム発現解析用アレイ上の全５４６７５個のプローブセットを用いた場合のデータに関して、主成分分析（ＰＣＡ）を行ない、品質を評価した。【００８７】
そして、前記９０例の検体それぞれの蛍光強度のデータのうち、ＰＣＡの第一主成分によって母集団から外れる６例のデータを除外し、残りの８４例の検体それぞれの蛍光強度のデータを、以下の解析に用いた。なお、８４例の検体それぞれの蛍光強度のデータにおいては、品質管理パラメータのうち、βアクチン遺伝子の３’／５’比が概ね２１未満であり、ＧＡＰＤＨ遺伝子の３’／５’比が概ね３．０未満であり、Ｐ-ｃａｌｌ％が６０％を超え、かつ７０％未満の範囲であり、スケーリング・ファクターが概ね１０％未満であった。ところが、前記６例の検体それぞれの蛍光強度のデータにおいては、βアクチン遺伝子の３’／５’比、ＧＡＰＤＨ遺伝子の３’／５’比、Ｐ-ｃａｌｌ％およびスケーリング・ファクターの１項目以上で、前記８４例の検体それぞれの蛍光強度のデータの場合の品質管理パラメータのものと顕著に異なる値を示していた。【００８８】
つぎに、前記８４例の検体それぞれの蛍光強度のデータを、トレーニングセット５０例とバリデーションセット３４例とに振り分けた。このとき、トレーニングセットにおけるｐＣＲ率とバリデーションセットにおけるｐＣＲ率とがほぼ等しくなるように、ｐＣＲ群およびｎｐＣＲ群それぞれから、無作為に振り分けを実施した。トレーニングセットにおけるｐＣＲ率は、３０％（１５例／５０例）であり、バリデーションセットにおけるｐＣＲ率は、３２．３％（１１例／３４例）であった。以降の解析については、別途記載のあるもの以外は全てトレーニングセットのデータに対して適用した。【００８９】
前記トレーニングセットに振り分けられた５０例の検体それぞれの蛍光強度のデータについて、ｌｏｇ２変換を行なった。そして、前記プローブセットのうち、ハウスキーピング遺伝子などに対応するプローブセット（コントロールプローブ）を除いて、前記５０例の検体の３０％以上において、シグナルの信頼度であるＡｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃａｌｌが”ｐｒｅｓｅｎｔ”となっており、かつ変動係数ｃｖが０．１５以上となっているプローブセット（７９８３個のプローブセット／全５４６７５個のプローブセット）を用いた場合のデータについて、遺伝子発現の解析に用いた。【００９０】
その後、各プローブセットに対応する核酸を保持する遺伝子の発現量（前記遺伝子に基づく蛍光強度）を、下記式（１０）：
〔発現量（蛍光強度）の測定値（生データ）−発現量（蛍光強度）の平均値〕／標準偏差                                                      （１０）
によって正規化した。【００９１】
また、ｐＣＲ群とｎｐＣＲ群との間で有意に蛍光強度、すなわち発現量の差が見られるプローブセットに対応する遺伝子を選択するため、並び替え回数１０００の条件下で、ＳＡＭ（Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）によって、各々のｐ値を計算した〔「ＳＡＭ」については、トゥシャー（Ｔｕｓｈｅｒ，  Ｖ．  Ｇ．）ら、「電離放射線応答に適用したマイクロアレイの有意性分析（Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、２００１年、第９８巻、ｐｐ．５１１６−５１２１参照〕。そして、ＳＡＭによって計算したｐ値の低い順に、５００個のプローブセットに対応する核酸を保持する遺伝子の選択を行なった。【００９２】
つぎに、判別式の構築には、ＢＧＡを用いた。最適な判定精度が得られるように、ｐＣＲ群の重みを１〜１０まで変化させた。そして、各々の重み付けの下で、Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇによって乳癌術前化学療法に対する感受性の判定に最適なプローブセット数を求めた。
具体的には、前記５００個のプローブセットから、ｐ値の低い順に、５００個に達するまで、５個ずつ選択するプローブセットの個数を増加させながら、当該プローブセットを選択し、判別式の構築を行なった。そして、感度と特異度との積が最大となるプローブセットの個数を決定した。なお、感度は、病理学的診断結果がｐＣＲであり、かつｐＣＲと予測された検体の数を、病理学的診断結果がｐＣＲである検体の数で除算することによって求めた。また、特異度は、病理学的診断結果がｎｐＣＲであり、かつｎｐＣＲと予測された検体の数を、病理学的診断結果がｎｐＣＲである検体の数で除算することによって求めた。【００９３】
前記遺伝子の選択から判別式の構築までのプロセスを、３−Ｆｏｌｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎにて繰り返し、各重み付け条件下での感度および特異度を平均値で推定した。推定の結果、最適な重み付け条件は４であり、その条件下において最適なプローブセットは、表１０、表１１および表１２に示されるように、ＳＡＭによって計算したｐ値の低い順で上位７０番目までのプローブセット（表１および表２参照）となった。【００９４】
【表１０】
2011065533.tif 000027
【００９５】
【表１１】
2011065533.tif 000028
【００９６】
【表１２】
2011065533.tif 000029
【００９７】
上記の条件に基づいて、全トレーニングセットのデータを用いて最終的な判別式を構築した。構築された判別式は、下記式（１）で示される判別式である。【００９８】
【数１６】
2011065533.tif 000030
【００９９】
｛式（１）中、ｉは表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子に付与された遺伝子番号を示し、ｗiは表４、表５および表６に記載された遺伝子番号ｉの遺伝子に対応する重み係数を示し、Ｘiは下記式（２）：【０１００】
【数１７】
2011065533.tif 000031
【０１０１】
〔式（２）中、ｊは各検体に付与された検体番号を示し、ｙijは遺伝子番号ｉの遺伝子の検体番号ｊの検体での標準化された発現量を示し、ｍｉｎは括弧内の値の最小値を示し、ｒｏｕｎｄは括弧内の値の小数点以下第一位を四捨五入した値を示し、ａｂｓは括弧内の値の絶対値を示し、ｙiは下記式（３）：【０１０２】
【数１８】
2011065533.tif 000032
【０１０３】
（式（３）中、ｘiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量を示し、ｕiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る平均値を示し、ｓiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る標準偏差を示す。）に示される遺伝子番号iの遺伝子の標準化された発現量を示す。〕により標準化され正規化された遺伝子の発現量を示し、Σiは各遺伝子に渡る総和を示す。｝。【０１０４】
ここで、前記式（１）で表される判別式の解Ｄが正の値のとき、乳癌術前化学療法に対して感受性であり、解Ｄがゼロまたは負の値のとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であると判定する。【０１０５】
（６）判別式による判定結果と、病理学的診断結果との対比
トレーニングセットに振り分けられた全５０例の検体について測定された発現量のデータ（蛍光強度のデータ）と、前記式（１）で表される判別式とを用いて、全５０例の検体がｐＣＲ群およびｎｐＣＲ群のいずれの乳癌患者の検体に該当するかを判定した。そして、病理学的診断結果を真値として、当該病理学的診断結果と前記式（１）で表される判別式による判定結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。実施例１において、トレーニングセットの５０例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果との関係を調べた結果を図１に示す。【０１０６】
図１に示された結果から、トレーニングセットに振り分けられた全５０例の検体のうち、前記式（１）で表される判別式によって、２３例の検体がｎｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定され、２７例の検体がｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定されることがわかる。すなわち、前記式（１）で表される判別式を用いた場合には、前記２３例の検体は、乳癌術前化学療法に対して非感受性である乳癌患者の検体であり、一方、前記２７例の検体は、乳癌術前化学療法に対して感受性である乳癌患者の検体であると判定されることがわかる。【０１０７】
また、病理学的診断結果を真値として前記式（１）で表される判別式の性能を評価した場合、感度１００％、特異度６５．７％、陰性適中率（ＮＰＶ）１００％、および陽性適中率（ＰＰＶ）５５．６％であることがわかる。【０１０８】
したがって、これらの結果から、前記表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量と前記式（１）で表される判別式とを用いることによって、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定できることが示唆される。【０１０９】
［実施例２］
（判別式の判定精度の評価）
バリデーションセットに振り分けられた全３４例の検体について測定された発現量のデータ（蛍光強度のデータ）と、前記式（１）で表される判別式とを用いて、全３４例の検体がｐＣＲ群およびｎｐＣＲ群のいずれの乳癌患者の検体に該当するかを判定することによって、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定した。また、病理学的診断結果を真値として、当該病理学的診断結果と前記式（１）で表される判別式による判定結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。実施例２において、バリデーションセットの３４例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を図２に示す。【０１１０】
図２に示された結果から、バリデーションセットに振り分けられた全３４例の検体のうち、前記式（１）で表される判別式によって、１５例の検体がｎｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定され、１９例の検体がｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定されることがわかる。すなわち、前記式（１）で表される判別式を用いた場合には、前記１５例の検体は、乳癌術前化学療法に対して非感受性である乳癌患者の検体であり、一方、前記１９例の検体は、乳癌術前化学療法に対して感受性である乳癌患者の検体であると判定されることがわかる。【０１１１】
また、病理学的診断結果を真値として判別式の性能を評価した場合、感度９０．９％、特異度６０．９％、陰性適中率（ＮＰＶ）９３．３％、および陽性適中率（ＰＰＶ）５２．６％であることがわかる。【０１１２】
このように、バリデーションセットに振り分けられた全３４例の検体においても、トレーニングセットに振り分けられた検体の場合と同様に、前記式（１）で表される判別式によって、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定できることがわかる。また、前記表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量と前記式（１）で表される判別式とを用いることによって、用いた検体に関係なく、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定できることが示唆される。【０１１３】
［実施例３］
階層的クラスター分析による判定
実施例１において、トレーニングセットに振り分けられた検体それぞれの蛍光強度（発現量）のデータおよびバリデーションセットに振り分けられた検体それぞれの蛍光強度（発現量）のデータについて、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数およびｗａｒｄ法を用いて、階層的クラスター分析を行ない、樹形図を作成した。実施例３において、トレーニングセットの検体それぞれの発現量のデータに基づく樹形図を図３に示す。また、実施例３において、バリデーションセットの検体それぞれの発現量のデータに基づく樹形図を図４に示す。【０１１４】
図３および図４に示された結果から、樹形図を分割するように付された太線を境界として、乳癌術前化学療法に対して非感受性である乳癌患者の検体と、乳癌術前化学療法に対して感受性である乳癌患者の検体とを分けることができることがわかる。したがって、これらの結果から、前記表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を用いて、階層的クラスター分析を行なうことによって、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定できることがわかる。【０１１５】
［実施例４］
主成分分析による判定
実施例１において、トレーニングセットに振り分けられた検体それぞれの蛍光強度（発現量）のデータについて、表１および表２に記載の遺伝子を用いて主成分分析を行い、各遺伝子の変換係数を算出し、第一および第二主成分スコアを算出した。また、実施例１において、バリデーションセットに振り分けられた検体それぞれの蛍光強度（発現量）のデータについて、当該遺伝子の変換係数に従い第一主成分スコアおよび第二主成分スコアを算出した。実施例４において算出された変換係数を表１３および表１４に示す。また、実施例４において、トレーニングセットの検体それぞれの発現量のデータに基づく第一主成分スコアおよび第二主成分スコアの散布図を図５に示す。また、実施例４において、バリデーションセットの検体それぞれの発現量のデータに基づく第一および第二主成分スコアの散布図を図６に示す。なお、図５および図６中、ＰＣＡ１は、第一主成分スコアを示し、ＰＣＡ２は、第二主成分スコアを示す。図中、白丸は、ｐＣＲ群、クロスは、ｎｐＣＲ群である。【０１１６】
【表１３】
2011065533.tif 000033
【０１１７】
【表１４】
2011065533.tif 000034
【０１１８】
図５および図６に示された結果から、横軸の第一主成分スコアがゼロとなる所を境界として、乳癌術前化学療法に対して非感受性である乳癌患者の検体と、乳癌術前化学療法に対して感受性である乳癌患者の検体とを分けることができることがわかる。したがって、これらの結果から、前記表１および表２に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を用いて、主成分分析を行なうことによって、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定できることがわかる。【０１１９】
［実施例５］
実施例１で得られた７０個の遺伝子のなかから、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定するのに十分な遺伝子の組み合わせを、以下に示される変数減少（Ｂａｃｋｗａｒｄ−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）法によって調べた。【０１２０】
実施例１で得られた７０個の遺伝子のうちの任意の遺伝子Ａを除外し、残りの６９個の遺伝子の組み合わせを選択した。つぎに、選択された６９個の遺伝子の組み合わせを用い、ｐＣＲ群の重み付け条件を４とし、実施例１と同様にして、ＢＧＡを用いて判別式を構築し、３−Ｆｏｌｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎを行ない、感度および特異度を評価した。なお、判別式の構築に際して、感度および特異度の評価には、前記実施例１と同様のトレーニングセットを用いた。３−Ｆｏｌｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎでは、トレーニングセットの症例を３群に分割した。そして、これらのうちの２群を判別式の構築に用い、残りの１群を感度および特異度の評価に用いた。【０１２１】
また、遺伝子Ａの代わりに、実施例１で得られた７０個の遺伝子のうちの遺伝子Ａ以外の遺伝子を除外して６９個の遺伝子の組み合わせを選択したことを除き、前記と同様にして、実施例１で得られた７０個の遺伝子のうちの６９個の遺伝子の組み合わせを用い、遺伝子Ａ以外の遺伝子を除外する６９通りの各々について、判別式を構築した。これら６９通りの判別式について、前記と同様にして、感度および特異度を評価した。そして、６９個の遺伝子の組み合わせの、遺伝子Ａを除外した前記の場合を含む、全７０通りのなかから、感度と特異度との積の値が最大となる組み合わせを選択した。このようにして、選択された組み合わせを構成する遺伝子のなかから、感度と特異度との積の値を小さくする原因となっている遺伝子を除外した。【０１２２】
以下、前記と同様にして、組み合わせを構成する遺伝子の数が２個となるまで、感度と特異度との積の値を小さくする原因となっている遺伝子の除外を繰り返した。そして、組み合わせを構成する遺伝子数（プローブ数）に対して、感度と特異度との積（感度×特異度）の値をプロットした。実施例５において、プローブ数と、感度×特異度との関係を調べた結果を図７に示す。【０１２３】
図７に示された結果から、遺伝子数（プローブ数）が１３〜２４個のとき、感度と特異度との積（感度×特異度）が最も大きくなることがわかる。すなわち、この結果から、感度と特異度との積（感度×特異度）を最大値とする最少の遺伝子数（プローブ数）は、１３個であることがわかる。これら１３個の遺伝子は、前記表３に示されるとおりである。また、構築された判別式は、下記式（４）で示される判別式である。【０１２４】
【数１９】
2011065533.tif 000035
｛式（４）中、ｉは表３に記載の遺伝子群の各遺伝子に付与された遺伝子番号を示し、ｗiは表７に記載された遺伝子番号ｉの遺伝子に対応する重み係数を示し、Ｘiは下記式（５）：【０１２５】
【数２０】
2011065533.tif 000036
【０１２６】
〔式（５）中、ｊは各検体に付与された検体番号を示し、ｙijは遺伝子番号ｉの遺伝子の検体番号ｊの検体での標準化された発現量を示し、ｍｉｎは括弧内の値の最小値を示し、ｒｏｕｎｄは括弧内の値の小数点以下第一位を四捨五入した値を示し、ａｂｓは括弧内の値の絶対値を示し、ｙiは下記式（６）：【０１２７】
【数２１】
2011065533.tif 000037
【０１２８】
（式（６）中、ｘiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量を示し、ｕiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る平均値を示し、ｓiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る標準偏差を示す。）に示される遺伝子番号iの遺伝子の標準化された発現量を示す。〕により標準化され正規化された遺伝子の発現量を示し、Σiは各遺伝子に渡る総和を示す。｝。【０１２９】
ここで、前記式（４）で表される判別式の解Ｄが正の値のとき、乳癌術前化学療法に対して感受性であり、解Ｄがゼロまたは負の値のとき、乳癌術前化学療法に対して非感受性であると判定する。【０１３０】
［実施例６］
実施例１において、トレーニングセットに振り分けられた全５０例の検体について測定された発現量のデータ（蛍光強度のデータ）と、前記式（４）で表される判別式とを用いて、全５０例の検体がｐＣＲ群およびｎｐＣＲ群のいずれの乳癌患者の検体に該当するかを判定した。そして、病理学的診断結果を真値として、当該病理学的診断結果と前記式（４）で表される判別式による判定結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。実施例６において、トレーニングセットの５０例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果との関係を調べた結果を図８に示す。【０１３１】
図８に示された結果から、トレーニングセットに振り分けられた全５０例の検体のうち、前記式（４）で表される判別式によって、２３例の検体がｎｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定され、２７例の検体がｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定されることがわかる。すなわち、前記式（４）で表される判別式を用いた場合には、前記２３例の検体は、乳癌術前化学療法に対して非感受性である乳癌患者の検体であり、一方、前記２７例の検体は、乳癌術前化学療法に対して感受性である乳癌患者の検体であると判定されることがわかる。【０１３２】
また、病理学的診断結果を真値として前記式（４）で表される判別式の性能を評価した場合、感度１００％、特異度６５．７％、陰性適中率（ＮＰＶ）１００％、および陽性適中率（ＰＰＶ）５５．６％であることがわかる。【０１３３】
したがって、これらの結果から、前記表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量と前記式（４）で表される判別式とを用いることによって、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定できることが示唆される。【０１３４】
［実施例７］
実施例１において、バリデーションセットに振り分けられた全３４例の検体について測定された発現量のデータ（蛍光強度のデータ）と、前記式（４）で表される判別式とを用いて、全３４例の検体がｐＣＲ群およびｎｐＣＲ群のいずれの乳癌患者の検体に該当するかを判定することによって、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定した。また、病理学的診断結果を真値として、当該病理学的診断結果と前記式（４）で表される判別式による判定結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。実施例７において、バリデーションセットの３４例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を図９に示す。【０１３５】
図９に示された結果から、バリデーションセットに振り分けられた全３４例の検体のうち、前記式（４）で表される判別式によって、１４例の検体がｎｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定され、２０例の検体がｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定されることがわかる。すなわち、前記式（４）で表される判別式を用いた場合には、前記１４例の検体は、乳癌術前化学療法に対して非感受性である乳癌患者の検体であり、一方、前記２０例の検体は、乳癌術前化学療法に対して感受性である乳癌患者の検体であると判定されることがわかる。【０１３６】
また、病理学的診断結果を真値として前記式（４）で表される判別式の性能を評価した場合、感度８１．８％、特異度５２．２％、陰性適中率（ＮＰＶ）８５．７％、および陽性適中率（ＰＰＶ）４５．０％であることがわかる。【０１３７】
このように、バリデーションセットに振り分けられた全３４例の検体においても、トレーニングセットに振り分けられた検体の場合と同様に、前記式（４）で表される判別式によって、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定できることがわかる。また、前記表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量と前記式（４）で表される判別式とを用いることによって、乳癌術前化学療法に対する感受性を十分な精度で判定できることが示唆される。【０１３８】
［実施例８］
実施例５において、遺伝子数（プローブ数）が５０個のときに感度と特異度との積（感度×特異度）が最大値となる遺伝子の組み合わせは、表８および表９に示される遺伝子群の組み合わせである。また、構築された判別式は、下記式（７）で表される判別式である。【０１３９】
【数２２】
2011065533.tif 000038
｛式（７）中、ｉは表８および表９に記載の遺伝子群の各遺伝子に付与された遺伝子番号を示し、ｗiは表８および表９に記載された遺伝子番号ｉの遺伝子に対応する重み係数を示し、Ｘiは下記式（８）：【０１４０】
【数２３】
2011065533.tif 000039
【０１４１】
〔式（８）中、ｊは各検体に付与された検体番号を示し、ｙijは遺伝子番号ｉの遺伝子の検体番号ｊの検体での標準化された発現量を示し、ｍｉｎは括弧内の値の最小値を示し、ｒｏｕｎｄは括弧内の値の小数点以下第一位を四捨五入した値を示し、ａｂｓは括弧内の値の絶対値を示し、ｙiは下記式（９）：【０１４２】
【数２４】
2011065533.tif 000040
【０１４３】
（式（９）中、ｘiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量を示し、ｕiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る平均値を示し、ｓiは遺伝子番号ｉの遺伝子の発現量の検体に渡る標準偏差を示す。）に示される遺伝子番号iの遺伝子の標準化された発現量を示す。〕により標準化され正規化された遺伝子の発現量を示し、Σiは各遺伝子に渡る総和を示す。｝。【０１４４】
実施例１において、トレーニングセットに振り分けられた全５０例の検体について測定された発現量のデータ（蛍光強度のデータ）と、前記式（７）で表される判別式とを用いて、全５０例の検体がｐＣＲ群およびｎｐＣＲ群のいずれの乳癌患者の検体に該当するかを判定した。そして、病理学的診断結果を真値として、当該病理学的診断結果と前記式（７）で表される判別式による判定結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。実施例８において、トレーニングセットの５０例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果との関係を調べた結果を図１０に示す。【０１４５】
図１０に示された結果から、トレーニングセットに振り分けられた全５０例の検体のうち、前記式（７）で表される判別式によって、２３例の検体がｎｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定され、２７例の検体がｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定されることがわかる。すなわち、前記式（７）で表される判別式を用いた場合には、前記２３例の検体は、乳癌術前化学療法に対して非感受性である乳癌患者の検体であり、一方、前記２７例の検体は、乳癌術前化学療法に対して感受性である乳癌患者の検体であると判定されることがわかる。【０１４６】
また、病理学的診断結果を真値として前記式（７）で表される判別式の性能を評価した場合、感度１００％、特異度６５．７％、陰性適中率（ＮＰＶ）１００％、および陽性適中率（ＰＰＶ）５５．６％であることがわかる。【０１４７】
したがって、これらの結果から、前記表８および表９に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量と前記式（７）で表される判別式とを用いることによって、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定できることが示唆される。【０１４８】
［実施例９］
実施例１において、バリデーションセットに振り分けられた全３４例の検体について測定された発現量のデータ（蛍光強度のデータ）と、前記式（７）で表される判別式とを用いて、全３４例の検体がｐＣＲ群およびｎｐＣＲ群のいずれの乳癌患者の検体に該当するかを判定することによって、乳癌術前化学療法に対する感受性を判定した。また、病理学的診断結果を真値として、当該病理学的診断結果と前記式（７）で表される判別式による判定結果とを比較することによって、当該判別式の性能を評価した。実施例９において、バリデーションセットの３４例の乳癌患者の検体について、判別式による判定結果と、病理学的診断結果とを比較した結果を図１１に示す。【０１４９】
図１１に示された結果から、バリデーションセットに振り分けられた全３４例の検体のうち、前記式（７）で表される判別式によって、１５例の検体がｎｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定され、１９例の検体がｐＣＲ群の乳癌患者の検体に該当すると判定されることがわかる。すなわち、前記式（７）で表される判別式を用いた場合には、前記１５例の検体は、乳癌術前化学療法に対して非感受性である乳癌患者の検体であり、一方、前記１９例の検体は、乳癌術前化学療法に対して感受性である乳癌患者の検体であると判定されることがわかる。【０１５０】
また、病理学的診断結果を真値として前記式（７）で表される判別式の性能を評価した場合、感度８１．８％、特異度５６．５％、陰性適中率（ＮＰＶ）８６．７％、および陽性適中率（ＰＰＶ）４７．４％であることがわかる。【０１５１】
このように、バリデーションセットに振り分けられた全３４例の検体においても、トレーニングセットに振り分けられた検体の場合と同様に、前記式（７）で表される判別式によって、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定できることがわかる。また、前記表８および表９に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量と前記式（７）で表される判別式とを用いることによって、乳癌術前化学療法に対する感受性を十分な精度で判定できることが示唆される。【０１５２】
以上説明した結果から、表１および表２に記載の遺伝子群から選ばれた遺伝子の発現量のうち、表３に記載の遺伝子群の各遺伝子の発現量を少なくとも測定することにより、乳癌術前化学療法に対する感受性を精度良く判定できることが示唆される。
【図１】
2011065533.tif 000054
【図２】
2011065533.tif 000055
【図３】
2011065533.tif 000056
【図４】
2011065533.tif 000057
【図５】
2011065533.tif 000058
【図６】
2011065533.tif 000059
【図７】
2011065533.tif 000060
【図８】
2011065533.tif 000061
【図９】
2011065533.tif 000062
【図１０】
2011065533.tif 000063
【図１１】
2011065533.tif 000064
【国際調査報告】
2011065533.tif 000065
2011065533.tif 000066
2011065533.tif 000067
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