(57)【要約】  ES細胞又はiPS細胞等の幹細胞から効果的に肝細胞に分化誘導させる場合の遺伝子導入方法を提供する。さらに、肝細胞に分化誘導させるのに有用な遺伝子が導入された幹細胞を提供し、遺伝子が導入された幹細胞から生成した肝細胞を提供する。アデノウイルスベクターを用いることで、ES細胞又はiPS細胞等の幹細胞に、特定の遺伝子を導入することができる。さらに、当該遺伝子を導入することにより、効果的に肝細胞に分化誘導させることができる。具体的には、HEX遺伝子、HNF4A遺伝子、HNF6遺伝子及びSOX17遺伝子から選択されるいずれか１又は複数の遺伝子をES細胞又はiPS細胞等の幹細胞に導入することで、効果的に肝細胞へ分化誘導させうる。
2011052504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスベクターを用いて幹細胞に遺伝子を導入することを特徴とする、幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
【請求項２】
導入する遺伝子が、HEX遺伝子、HNF4A遺伝子、HNF6遺伝子及びSOX17遺伝子から選択されるいずれか１又は複数の遺伝子である請求項１に記載の分化誘導方法。
【請求項３】
少なくともHEX遺伝子を導入し、さらに、HNF4A遺伝子及び／又はSOX17遺伝子を導入する、請求項１又は２に記載の分化誘導方法。
【請求項４】
幹細胞にSOX17遺伝子を導入し、その後HEX遺伝子を導入する、請求項３に記載の分化誘導方法。
【請求項５】
幹細胞にHEX遺伝子を導入し、その後HNF4A遺伝子を導入する、請求項３又は４に記載の分化誘導方法。
【請求項６】
以下の工程を含む、幹細胞から肝細胞への分化誘導方法：
１）アデノウイルスベクターに、HEX遺伝子を組み込む工程；
２）幹細胞と、前記１）で遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを接触させ、HEX遺伝子を細胞内に導入させる工程；
３）遺伝子が導入された幹細胞を培養する工程。
【請求項７】
請求項６に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法であって、前記１）〜３）に記載の工程の前に、以下の工程を含む、請求項６に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法：
ａ）アデノウイルスベクターに、SOX17遺伝子を組み込む工程；
ｂ）幹細胞と、前記ａ）で遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを接触させ、SOX17遺伝子を細胞内に導入させる工程；
ｃ）遺伝子が導入された幹細胞を培養する工程。
【請求項８】
請求項６に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法であって、前記３）のHEX遺伝子が導入された幹細胞を培養する工程の後、培養した細胞と、HNF4A遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターとを接触させ、HNF4A遺伝子を細胞内にさらに導入させる工程を含む、請求項６又は７に記載の分化誘導方法。
【請求項９】
幹細胞を液性の分化誘導因子で処理する工程を含む、請求項１〜８のいずれか１に記載の分化誘導方法。
【請求項１０】
幹細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である請求項１〜９のいずれか１に記載の分化誘導方法。
【請求項１１】
胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞である、請求項１０に記載の分化誘導方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに１に記載の分化誘導方法により、遺伝子が導入された幹細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の遺伝子が導入された幹細胞から生成した肝細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の肝細胞の、薬物毒性評価又は薬物動態評価のための使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞（以下、「ES細胞」ともいう）又は人工多能性幹細胞（以下、「iPS細胞」ともいう）等の多能性幹細胞から肝細胞に分化誘導させる方法に関する。さらに、本発明は肝細胞に分化誘導させるのに有用な遺伝子が導入された幹細胞に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願２００９−２４７３４２号、特願２０１０−１２１２８２号及び特願２０１０−１５４２２５号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
多能性幹細胞とは、多分化能と自己複製能を有する未分化細胞であり、組織損傷後の組織修復力を有することが示唆されている。このため、多能性幹細胞は、各種疾患の治療用物質のスクリーニング、再生医療分野において有用であるとして、さかんに研究されている。多能性幹細胞のうち、iPS細胞(Induced Pluripotent Stem Cells)は、線維芽細胞などの体細胞に、特定の転写因子、例えばOCT3/4、SOX2、KLF4、C-MYC等を導入することにより、体細胞を脱分化して作製された人工多能性幹細胞である。分化万能性を持った細胞は理論上、肝臓等を含む全ての組織や臓器に分化誘導することが可能である。【０００４】
多能性幹細胞から肝細胞への分化誘導方法としては、主として細胞凝集塊（胚様体）を形成させたり、液性因子を培地中に加えたり、適当な細胞外マトリクス、フィーダー細胞、マトリゲル等を選択して用いる方法などが試みられてきた。しかしながら、これらの方法は培養期間が長く、分化誘導効率も極めて低く、得られた肝細胞の薬物代謝酵素活性も低いことが報告されている（非特許文献１〜４）。分化誘導効率を向上させるため、分化に重要な遺伝子を多能性幹細胞などに導入することが考えられるが、効率よい遺伝子導入方法が確立されていないため、遺伝子導入による肝分化誘導に関する報告は殆どない。幹細胞から成熟肝細胞へ分化させるには、幹細胞から内胚葉系細胞、肝幹細胞、幼若肝細胞を経ることが必要である。各分化の工程において、培養系にアクチビン(activin) A、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF; basic Fibroblast Growth Factor)、BMP4 (bone morphogenetic protein 4)、FGF4、レチノイン酸、又はDMSOなどの液性因子が用いられている。また、発生学的に肝細胞へ分化させうる因子として、HEX、HNF4A、HNF6、FOXA2等の転写因子が必要であることが報告されている（非特許文献５）。例えば、HEX遺伝子は、甲状腺、肺、肝臓、血液細胞、血管内皮細胞等に発現が認められる。HEX遺伝子欠損マウスは、肝実質細胞が認められず、胎生10.5日（E10.5）前後に死亡が観察されている。HEX遺伝子は、例えばGATA4、HNF4A、FGF受容体遺伝子等の発現を調節していると考えられる。【０００５】
上述のように、発生において肝細胞特異的な転写因子と考えられるFOXA2をES細胞に導入したところ、ES細胞から肝細胞への分化を一部認めたものの、肝細胞以外の細胞への分化も確認されたことが文献にて言及されている（非特許文献６）。このことから、FOXA2はES細胞のような多能性幹細胞に導入したときに、肝細胞へのみ分化を誘導しうる転写因子ということはできず、その作用は十分には解明されていない。【０００６】
次世代遺伝子治療用ベクターシステムとして、アデノウイルス（以下、単に「Ad」という。）を用いたシステムが開発されている。Adの構造は、２５２のカプソメアよりなる正２０面体構造をしており、頂点にある１２個は突起構造を持ったペントン（ペントンベースとファイバーからなる）と呼ばれ、他の２４０個はヘキソンと呼ばれる。ウイルスの細胞内への進入は、ファイバーがAd受容体(CAR; coxsackievirus-adenovirus receptor)に結合し、その後ペントンベースのRGDモチーフが細胞表面上のインテグリン（αｖβ３、αｖβ５）と結合することによって起こる。しかし、その後の研究において、CARが発現していないか又は発現していても非常に低い細胞に対してもAdベクターを導入可能なように各種の研究がなされており、開示されている（特許文献１〜３）。このような改良型Adベクターを用いた間葉系幹細胞への遺伝子デリバリーについて報告がある（非特許文献７）。ここでは、各種改良型Adベクターを用いて、遺伝子を間葉系幹細胞等へ導入することが示されている。しかしながら、間葉系幹細胞とES細胞は全く相違するものである。また、本非特許文献ではAdベクターが、遺伝子を細胞へ導入しうるDDS (Drug Delivery System)の役割を有することが開示されているに過ぎない。アデノウイルスベクターが、マウスESやiPS細胞の分化のツールとして利用できることが報告されている（非特許文献８、９）。しかしながら、これらの非特許文献には、幹細胞から肝細胞へ分化誘導させる方法については、開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２７２４８０号公報（特許第３６３５４６２号公報）
【特許文献２】特開２００３−２５０５６６号公報
【特許文献３】特開２００８−１３６３８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Genes to Cells, 13, 731-746 (2008)
【非特許文献２】Stem Cells, 26, 894-902 (2008)
【非特許文献３】Stem Cells, 26, 1117-1127 (2008)
【非特許文献４】Hepatology, 45, 1229-1239 (2007)
【非特許文献５】Nature Reviews Genetics, 3, 499-215 (2002)
【非特許文献６】FASEB Journal, 16, 1444-1446 (2002)
【非特許文献７】Biochem. Biophys. Res. Commun., 332, 1101-1106 (2005)
【非特許文献８】Mol Ther., 12(3), 547-554 (2005)
【非特許文献９】Stem Cells, 27(8), 1802-1811 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、分化誘導に係る遺伝子をES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞に導入し、幹細胞から肝細胞へ分化誘導させる方法を提供することを課題とする。また、本発明は、組織細胞に分化誘導させるのに有用な遺伝子が導入された幹細胞を提供することを課題とし、さらには遺伝子が導入された幹細胞から分化により生成した肝細胞を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を達成するために鋭意検討を重ねた結果、Adベクターを用いることで、ES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞に特定の遺伝子を導入することができることを見出した。当該ベクターを用いて特定の遺伝子を導入することにより、効果的に肝細胞に分化誘導させることができ、本発明を完成した。【００１１】
即ち本発明は、以下よりなる。
１．Adベクターを用いて幹細胞に遺伝子を導入することを特徴とする、幹細胞から肝細胞への分化誘導方法。
２．導入する遺伝子が、HEX遺伝子、HNF4A遺伝子、HNF6遺伝子及びSOX17遺伝子から選択されるいずれか１又は複数の遺伝子である前項１に記載の分化誘導方法。
３．少なくともHEX遺伝子を導入し、さらに、HNF4A遺伝子及び／又はSOX17遺伝子を導入する、前項１又は２に記載の分化誘導方法。
４．幹細胞にSOX17遺伝子を導入し、その後HEX遺伝子を導入する、前項３に記載の分化誘導方法。
５．幹細胞にHEX遺伝子を導入し、その後HNF4A遺伝子を導入する、前項３又は４に記載の分化誘導方法。
６．以下の工程を含む、幹細胞から肝細胞への分化誘導方法：
１）Adベクターに、HEX遺伝子を組み込む工程；
２）幹細胞と、前記１）で遺伝子を組み込んだAdベクターを接触させ、HEX遺伝子を細胞内に導入させる工程；
３）遺伝子が導入された幹細胞を培養する工程。
７．前項６に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法であって、前記１）〜３）に記載の工程の前に、以下の工程を含む、前項６に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法：
ａ）Adベクターに、SOX17遺伝子を組み込む工程；
ｂ）幹細胞と、前記ａ）で遺伝子を組み込んだAdベクターを接触させ、SOX17遺伝子を細胞内に導入させる工程；
ｃ）遺伝子が導入された幹細胞を培養する工程。
８．前項６に記載の幹細胞から肝細胞への分化誘導方法であって、前記３）のHEX遺伝子が導入された幹細胞を培養する工程の後、培養した細胞と、HNF4A遺伝子を組み込んだAdベクターとを接触させ、HNF4A遺伝子を細胞内にさらに導入させる工程を含む、前項６又は７に記載の分化誘導方法。
９．幹細胞を液性の分化誘導因子で処理する工程を含む、前項１〜８のいずれか１に記載の分化誘導方法。
１０．幹細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である前項１〜９のいずれか１に記載の分化誘導方法。
１１．胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞又はヒト人工多能性幹細胞である、前項１０に記載の分化誘導方法。
１２．前項１〜１１のいずれかに１に記載の分化誘導方法により、遺伝子が導入された幹細胞。
１３．前項１２に記載の遺伝子が導入された幹細胞から生成した肝細胞。
１４．前項１３に記載の肝細胞の、薬物毒性評価又は薬物動態評価のための使用方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のAdベクターを用いることで、ES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞の分化誘導に係る遺伝子が効果的に導入され、肝細胞へ分化誘導させうることが確認された。具体的には、HEX遺伝子、HNF4A遺伝子、HNF6遺伝子及びSOX17遺伝子から選択されるいずれか１又は複数の遺伝子をES細胞又はiPS細胞等の幹細胞に導入することで、効果的に肝細胞へ分化誘導させうる。特に、HEX遺伝子を幹細胞に導入することで、効果的に幹細胞から肝細胞へ分化誘導させうることが確認された。さらに、他の遺伝子として、SOX17遺伝子及び／又はHNF4A遺伝子などを細胞の分化の程度に応じて、適宜導入することにより、より効果的に幹細胞から肝細胞へ分化誘導させうることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入することによる、iPS細胞から肝細胞への分化誘導実験についてのスキームを示す図である。（実施例１、３）
【図２】ヒトiPS細胞から肝細胞への分化の様子を免疫染色にて示す写真図である。（実験例１−１）
【図３】ヒトiPS細胞を各種培養条件で培養したときの肝細胞への分化を、αフェトプロテイン(AFP)の発現を指標として確認した結果を示す図である。（実験例１−２）
【図４】ヒトiPS細胞を各種培養条件で培養したときの肝細胞への分化を、アルブミンの発現を指標として確認した結果を示す図である。（実験例１−２）
【図５】ヒトES細胞を各種培養条件で培養したときの肝細胞への分化を、AFPの発現を指標として確認した結果を示す図である。（実験例２）
【図６】ヒトES細胞を各種培養条件で培養したときの肝細胞への分化を、アルブミンの発現を指標として確認した結果を示す図である。（実験例２）
【図７】ヒトiPS細胞から肝細胞への分化の様子を免疫染色にて示す写真図である。（実験例３−１）
【図８】ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入することによる、iPS細胞から肝細胞への分化誘導実験についてのスキームを示す図である。（実施例４）
【図９】ヒトiPS細胞を各種培養条件で培養したときの肝細胞への分化を、AFP及びアルブミンの発現を指標として確認した結果を示す図である。（実験例４−１）
【図１０】ヒトiPS細胞から肝細胞への分化の様子を免疫染色にて示す写真図である。（実験例４−２）
【図１１】ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入することによる、iPS細胞から肝細胞への分化誘導実験についてのスキームを示す図である。（実施例５）
【図１２】３種類のヒト幹細胞を培養したときの、内胚葉マーカーであるFOXA2及びSOX17の発現量を確認した結果を示す図である。（実験例５−１）
【図１３】３種類のヒト幹細胞を培養したときの肝細胞への分化を、αフェトプロテイン(AFP)及びアルブミンの発現を指標として確認した結果を示す図である。（実験例５−１）
【図１４】ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入することによる、iPS細胞から肝細胞への分化誘導実験についてのスキームを示す図である。（実施例６）
【図１５】ヒトiPS細胞から肝細胞への分化の様子を免疫染色にて示す写真図である。（実験例６−１）
【図１６】ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入することによる、iPS細胞から肝細胞への分化誘導実験についてのスキームを示す図である。（実施例７、８）
【図１７】HEX遺伝子を導入したヒトiPS細胞（Tic株）の機能を、薬剤代謝酵素シトクロムP450 3A4(CYP3A4)の発現により確認した結果を示す図である。（実験例７−１）
【図１８】HEX遺伝子を導入したヒトiPS細胞の機能を、薬剤代謝酵素シトクロムP450 3A4(CYP3A4)の機能及び薬剤応答性により確認した結果を示す図である。（実験例７−２）
【図１９】HEX遺伝子を導入したヒトiPS細胞（Tic株、Dotcom株）の肝細胞の分化をアルブミンの発現を指標とし、細胞の機能を薬剤代謝酵素シトクロムP450 3A4(CYP3A4)の発現により確認した結果を示す図である。（実験例８−１）
【図２０】ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入することによる、iPS細胞から肝細胞への分化誘導実験についてのスキームを示す図である。（実施例９）
【図２１】HEX遺伝子を導入したヒトiPS細胞（Tic株）の形態的変化を確認した写真図である。（実験例９−１）
【図２２】ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてSOX17遺伝子及びHEX遺伝子を導入することによる、iPS細胞から肝細胞への分化誘導実験についてのスキームを示す図である。（実施例１０）
【図２３】ヒトiPS細胞から肝細胞への分化の様子を免疫染色にて示す写真図である。（実験例１０−１）
【図２４】ヒトiPS細胞を各種培養条件で培養したときの肝細胞への分化を、AFP 及びアルブミンの発現を指標として確認した結果を示す図である。（実験例１０−２）
【図２５】ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子及びHNF4A遺伝子を導入することによる、iPS細胞から肝細胞への分化誘導実験についてのスキームを示す図である。（実施例１１）
【図２６】各遺伝子を導入したヒトiPS細胞における薬剤代謝酵素シトクロムP450 3A4(CYP3A4)の発現を免疫染色にて示す写真図である。（実験例１１−１）
【図２７】HEX遺伝子及びHNF4A遺伝子を導入したヒトiPS細胞の機能を、薬剤代謝酵素シトクロムP450 2D6(CYP2D6)、3A4(CYP3A4)、及び7A1(CYP7A1)の発現により確認した結果を示す図である。（実験例１１−２）
【図２８】HEX遺伝子及びHNF4A遺伝子を導入したヒトiPS細胞の機能を、薬物代謝活性により確認した結果を示す図である。（実験例１１−３）
【図２９】ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてSOX17遺伝子、HEX遺伝子及びHNF4A遺伝子を導入することによる、iPS細胞から肝細胞への分化誘導スキームを示す図である。（実施例１２）
【図３０】SOX17遺伝子、HEX遺伝子及びHNF4A遺伝子の各組み合わせにより遺伝子を導入したヒトiPS細胞の機能を、薬剤代謝酵素シトクロムP450 2D6(CYP2D6)、3A4(CYP3A4)、及び7A1(CYP7A1)の発現により確認した結果を示す図である。（実験例１２）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、幹細胞にAdベクターを用いて遺伝子を導入し、幹細胞から肝細胞へ分化誘導させる方法に関する。本発明において、幹細胞とはES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞をいい、特に好適にはヒトES細胞又はヒトiPS細胞をいうが、さらにヒトES細胞又はヒトiPS細胞に遺伝子が導入されることにより方向付けられた肝細胞への分化を可能とする細胞、例えば中内胚葉系細胞、内胚葉系細胞や肝幹細胞等も含まれる。本発明における肝細胞、より詳しくは、遺伝子が導入された幹細胞から生成した肝細胞とは、成熟肝細胞のほか、幹細胞に遺伝子が導入されることにより方向付けられた肝細胞への分化を可能とする細胞を含み、例えば肝幹細胞や、幼若肝細胞が挙げられる。
【００１５】
ES細胞とは、一般的には胚盤胞期胚の内部にある内部細胞塊(inner cell mass)と呼ばれる細胞集塊をin vitro培養に移し、未分化幹細胞集団として単離した多能性幹細胞である。ES細胞は、M.J.Evans & M.H.Kaufman (Nature, 292, 154, 1981)に続いて、G.R.Martin (Natl.Acad.Sci.USA, 78, 7634, 1981)によりマウスで多分化能を有する細胞株として樹立された。ヒト由来ES細胞についても、既に多くの株が樹立されており、ES Cell International社、Wisconsin Alumni Research Foundation、National Stem Cell Bank (NSCB)等から入手することが可能である。ES細胞は、一般に初期胚を培養することにより樹立されるが、体細胞の核を核移植した初期胚からもES細胞を作製することが可能である。また、異種動物の卵細胞、又は脱核した卵細胞を複数に分割した細胞小胞(cytoplasts, ooplastoids)に、所望の動物の細胞核を移植して胚盤胞期胚様の細胞構造体を作製し、それを基にES細胞を作製する方法もある。また、単為発生胚を胚盤胞期と同等の段階まで発生させ、そこからES細胞を作製する試みや、ES細胞と体細胞を融合させることにより、体細胞核の遺伝情報を有したES細胞を作る方法も報告されている。本発明で使用されるES細胞は、上記のような自体公知の方法により作製されたES細胞、又は今後開発される新たな方法により作製されるES細胞であってもよい。
【００１６】
また、iPS細胞とは、体細胞へ数種類の遺伝子を導入することにより、卵子、胚やES細胞を利用せずに分化細胞の初期化を誘導し、ES細胞と同様な多能性や増殖能を有する誘導多能性幹細胞をいい、2006年にマウスの線維芽細胞から世界で初めて作られた。さらに、マウスiPS細胞の樹立に用いた４遺伝子のヒト相同遺伝子であるOCT3/4、SOX2、KLF4、C-MYCを、ヒト由来線維芽細胞に導入してヒトiPS細胞の樹立に成功したことが報告されている(Cell 131: 861-872, 2007)。本発明で使用されるiPS細胞は、上記のような自体公知の方法により作製されたiPS細胞、又は今後開発される新たな方法により作製されるiPS細胞であってもよい。
【００１７】
ES細胞又はiPS細胞等の幹細胞の培養方法は特に限定されず、自体公知の方法によることができる。ES細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地や分化誘導に適した培地として、自体公知の培地、又は今後開発される新たな培地を用いることができる。具体的には、DMEM及び／又はDMEM/F12などの市販のほ乳類細胞用基礎培地に、血清又はknock-out serum replacemenc (KSR)、並びにbFGFなどを加えたもの、市販の霊長類ES細胞用培地、霊長類ES細胞増殖用基礎培地hESF-GRO、霊長類ES細胞分化誘導用基礎培地hESF-DIF、霊長類ES細胞増殖培地CSTI-7等を用いることができる。また、培地には、ES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞の培養に適する自体公知の添加物、例えば、N2サプリメント、B27サプリメント、インシュリン、bFGF、アクチビンA、ヘパリン、ROCKインヒビターやGSK-3インヒビターなどの各種インヒビター等から選択される１種又は複数種の添加物を適当な濃度で添加することができる。培地及びその添加物は、使用する細胞、分化状態等により適宜選択し、使用することができる。例えば、Tiss. Cult. Res. Commun., 27: 139-147 (2008) に記載の方法によることができる。
【００１８】
本発明においてAdベクターは、特に限定されず、自体公知の方法で作製されたAdベクターを用いることができる。例えば、CARが発現していないか又は発現していても非常に低い細胞に対してもAdベクターを導入可能なように改良された改良型Adベクターであってもよいし、CARが発現している細胞に対して使用しうるAdベクターであってもよい。具体的には、接着ペプチドの代表である細胞接着ペプチド（RGD配列）をコードするDNA、ヘパラン硫酸との親和性を有するペプチド（K7（KKKKKKK）配列）をコードするDNA、ラミニン受容体との親和性を有するペプチドをコードするDNA、E-セレクチンとの親和性を有するペプチドをコードするDNA等を導入したAdベクターを用いることができ、例えば特許文献１〜３に示すAdベクターを用いることができる。
【００１９】
Adベクターに、下記に示す所望の遺伝子を組み込む方法は、自体公知の方法、又は今後開発されるあらゆる方法を採用することができる。本発明のAdベクターは、１又は複数の制限酵素の認識配列を各々制限酵素で消化し、導入遺伝子を、シャトルベクターを介して、又はシャトルベクターを介することなく、インビトロライゲーションにより導入することができる。
【００２０】
本発明において、Adベクターを用いて導入しうる遺伝子は、ES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞から肝細胞へ効果的に分化を誘導しうる遺伝子であればよい。具体的には、HEX遺伝子、HNF4A遺伝子、HNF6遺伝子及びSOX17遺伝子から選択されるいずれかの遺伝子を幹細胞に導入することができ、特にHEX遺伝子を導入するのが好適である（図１、８、１１、１４、１６、２０参照）。HEX遺伝子を導入することで、幹細胞から肝細胞へ分化誘導させることができる。さらに、効果的に肝細胞への分化誘導を促進させるためには、まずSOX17遺伝子を導入し、幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導の方向付けを行なった後、HEX遺伝子を導入するのが好適である（図２２参照）。また、HEX遺伝子により肝細胞への分化誘導の方向付けを行なった後、さらにHNF4A遺伝子、HNF6遺伝子及びFOXA2遺伝子から選択されるいずれかの遺伝子、特に好ましくはHNF4A遺伝子を導入し、肝細胞への分化誘導を促進させることができる（図２５参照）。最も効果的に幹細胞から肝細胞への分化誘導を行なうためには、SOX17遺伝子を導入し、幹細胞から肝細胞への分化誘導の方向付けを行なった後、HEX遺伝子を導入し、その後さらにHNF4A遺伝子を導入することが最も好適と考えられる（図２９参照）。例えば、以下の工程１）〜３）の工程を含む操作により、ES細胞又はiPS細胞から肝細胞へ分化誘導させることができる。
【００２１】
１）Adベクターに、ES細胞又はiPS細胞等の幹細胞から肝細胞へ効果的に分化を誘導しうる遺伝子を組み込む工程。
２）幹細胞と、前記１）で遺伝子を組み込んだAdベクターを接触させ、幹細胞から肝細胞へ効果的に分化を誘導しうる遺伝子を細胞内に導入させる工程。
３）遺伝子が導入された幹細胞を培養する工程。
【００２２】
上記１）において、幹細胞から肝細胞へ効果的に分化を誘導しうる遺伝子は、HEX遺伝子、HNF4A遺伝子及びHNF6遺伝子から選択されるいずれかの遺伝子であり、より好適にはHEX遺伝子である。上記の遺伝子を導入する前に、SOX17遺伝子を幹細胞へ導入し、培養することで、肝細胞への分化の方向付けをより効果的になすことができる。さらには、上記の３）の工程の後に、培養した細胞と、HNF4A遺伝子、HNF6遺伝子及びFOXA2遺伝子から選択されるいずれかの遺伝子、特に好適にはHNF4A遺伝子を細胞内に導入することで、より効果的に肝細胞へ分化誘導させることができる。SOX17、HEX、HNF4A以外にも、GATA4、GATA6、HNF1A、HNF1B、FOXA1/HNF3A、FOXA2/HNF3B、FOXA3/HNF3G、CEBPA、CEBPB、TBX3、PROX1等の肝細胞の分化・増殖に関与する遺伝子を導入することにより、iPS 細胞から効率良く肝細胞を作製することができると考えられる。各遺伝子の導入の工程は、細胞の分化の程度に応じて適宜選択することができる。また、肝細胞をとりまく胆管上皮細胞を作製するためには、Sall4遺伝子及びHNF6遺伝子の導入が有効と考えられる。これらの遺伝子の導入は、所望の遺伝子を組み込んだAdベクターと各分化の状態に応じた幹細胞を接触させ、いずれかの遺伝子をさらに細胞内に導入することができる。
【００２３】
導入する遺伝子について、HEX遺伝子は、例えばGenBank Accession No. BC014336に登録されているものを、HNF4A遺伝子は、例えばGenBank Accession No. NM000457に登録されているものを、HNF6遺伝子は、例えばGenBank Accession No. NM004498に登録されているものを及びFOXA2遺伝子は、例えばGenBank Accession No. BC011780に登録されているものを、SOX17遺伝子は、例えばGenBank Accession No. NM_022454に登録されているものを用いることができる。
【００２４】
本発明のAdベクターは、以下のＡ）及びＢ）の工程を含む製造方法により作製することができる。
Ａ）導入遺伝子の非翻訳領域にプロモーター配列を含む発現コンストラクトを構築する工程。
Ｂ）Adゲノムを制限酵素で切断し、Ａ）で作製した発現コンストラクトをAdゲノムにライゲーションする工程。
【００２５】
本発明のAdベクターは、上記Ａ）とＢ）の工程の間に、Ａ）の発現コンストラクトを含むシャトルベクターを構築し、当該遺伝子発現シャトルベクターをAdゲノムにライゲーションすることにより作製してもよい。
【００２６】
未分化の細胞から成熟肝細胞への分化の各工程において、アクチビンA、bFGF、BMP4、FGF-4などの液性因子が用いられることが公知であるが、本発明によるES細胞又はiPS細胞等の幹細胞から肝細胞への分化誘導の工程においても、各液性因子を併用して細胞に接触させることができる。液性因子を細胞に接触させる工程は、特に限定されず、上記の各種選択された遺伝子の導入前であっても良いし、導入後であっても良い。さらに、複数回の遺伝子を導入する場合には、各遺伝子の導入と導入の間に細胞に接触させても良い。正常細胞の成長・分裂には細胞同士、他の細胞又は基質への接着が必要であり、細胞と細胞、又は細胞と基質の仲立ちをするタンパク質（細胞外マトリクス）も必要である。本発明の肝細胞への分化誘導させる方法においては、上述のような細胞外マトリクスも上記の工程において加えることができる。細胞外マトリクスとしては、マトリジェル、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ニドジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、又はこれらに相当する合成基質等を挙げることができ、本発明においてはマトリジェル又はラミニンを特に好適に使用することができる。具体的には、培養用容器にコーティング又は添加することで、使用することができる。
【００２７】
本発明は、上記の遺伝子を組み込んだAdベクターが導入されたES細胞又はiPS細胞等の幹細胞にも及ぶ。さらには、上記の遺伝子を組み込んだAdベクターが導入された幹細胞から生成した肝細胞にも及ぶ。
【００２８】
本発明の分化誘導方法により作製した肝細胞を用いて、薬物毒性や薬物動態評価を行うことができる。具体的には、本発明により作製した肝細胞に対して、医薬品候補化合物を添加し、肝毒性マーカーの発現変動を解析することで、生体での医薬品候補化合物の毒性を事前に予測することが可能になる。また、本発明により作製した肝細胞に対して、医薬品候補化合物を添加し、化合物の代謝産物を解析することで、生体での医薬品候補化合物の薬物動態（代謝産物）を事前に予測することが可能になる。これにより、毒性や薬物動態の問題により排除されるべき医薬品候補化合物を早期にスクリーニング可能となり、創薬の加速化が期待される。本発明は、本発明の分化誘導方法により作製した肝細胞の、薬物毒性評価や薬物動態評価のための使用方法にも及ぶ。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明の理解を深めるために実施例及び実験例を示して本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。
なお、本実施例及び実験例では、ヒトiPS細胞又はヒトES細胞に対する各種培地が必要であるので、参考例として各種培地の組成について説明し、その後各実施例において、分化誘導方法を説明する。【００３０】
（参考例）各種培地組成
１）ヒトiPS細胞未分化維持用培地として、Tiss. Cult. Res. Commun., 27: 139-147 (2008) の表２に示す組成のうち、基本培地はKnockout DMEM/F12であり、bFGF (10 ng/ml) を含む培地を用いた。以降、当該培地を「培地１」という。【００３１】
２）ヒトES細胞未分化維持用培地として、Tiss. Cult. Res. Commun., 27: 139-147 (2008) の表２に示す組成のうち、基本培地はDMEM/F12であり、bFGF (5 ng/ml) を含む培地を用いた。以降、当該培地を「培地２」という。【００３２】
３）未分化維持用培地として、ヒトES細胞培養用基本培地であるhESF-GRO培地（Cell Science & Technology Institute社）に、インスリン(10μg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、アルブミンコンジュゲートオレイン酸(9.4μg/ml)、2-メルカプトエタノール(10μM)、2-エタノールアミン(10μM) 、亜セレン酸ナトリウム(20 nM)、ヘパリン(100ng/ml)、及びbFGF (10 ng/ml)を含む培地(Proc Natl Acad Sci U S A.; 105(36): 13409-13414 (2008)) を用いた。以降、当該培地を「培地３」という。培地３は、フィーダー細胞を必要とせず、またKnockoOut Serum Replacement (KSR) も必要としないで、ヒトiPS細胞の未分化状態や多分化能を維持して培養を行うことが可能である。【００３３】
４）分化誘導用培地として、ヒトES細胞培養用基本培地であるhESF-GRO（Cell Science & Technology Institute社）に、インスリン(10μg/ml) 、トランスフェリン(5μg/ml)、2-メルカプトエタノール(10μM)、2-エタノールアミン(10μM) 、亜セレン酸ナトリウム(20 nM)及びウシ血清アルブミン(BSA)(1 mg/ml)を含む培地を用いた。以降、当該培地を「培地４」という。【００３４】
５）分化誘導用培地の他の態様として、ヒトES細胞分化誘導用基本培地であるhESF-DIF（Cell Science & Technology Institute社）に、インスリン(10μg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、2-メルカプトエタノール(10μM)、2-エタノールアミン(10μM)、亜セレン酸ナトリウム(20 nM)を含む培地 (FASEB J. 23:114-22 (2009))を用いた。以降、当該培地を「培地５」という。【００３５】
（実施例１）ヒトiPS細胞からの肝細胞への分化誘導方法
本実施例では、ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入し、当該遺伝子を導入したヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導について説明する。本実施例の実験スキームを図１に示した。【００３６】
１）HEX遺伝子導入用Adベクターの構築
E1欠損型の５型Adゲノム（pAdHM41-K7）のE1欠損部位に導入遺伝子及びその上流にEF-1α プロモーターを搭載したAdベクターを作製した。導入遺伝子は、GenBank Accession No.BC014336に示す配列からなるHEX遺伝子である。【００３７】
２）ヒトiPS細胞の培養
本実施例では、ヒトiPS 細胞（Tic (JCRB1331)、Dotcom (JCRB1327)、Squeaky (JCRB1329)）を用いた。マウス胎児線維芽細胞(MEF)をフィーダー細胞とし、Tiss. Cult. Res. Commun., 27: 139-147 (2008) に記載の方法に従い、参考例に示す培地１を用いて培養したヒトiPS細胞を準備した。ヒトiPS細胞の分化誘導２日前に、前記培養した培地を、参考例に示す培地３に交換した。【００３８】
次に、細胞剥離液であるAccutase(R) (Invitrogen社) を用いて３７℃３分処理し、浮遊するフィーダー細胞を含む上清を除去した。その後、培地３を用いてヒトiPS細胞を剥がし、1,300rpmで３分間遠心処理を行った。参考例に示す培地４を用いて、1,300rpmで３分間の遠心処理を２回行なった。【００３９】
遠心処理により得られたヒトiPS細胞を、50 ng/mlのアクチビンA (R&D Systems社) 及び10 ng/mlのbFGF (R&D Systems社)を添加した培地４に懸濁後、ラミニン (sigma社) でコーティングした細胞培養用プレート（１２ウェル）の各ウェルに2.5×105 cell/wellのヒトiPS細胞を播種し、３７℃で培養した。50 ng/mlのアクチビンA (R&D Systems社) 及び10 ng/mlのbFGF (R&D Systems社)を添加した培地４で培地交換を毎日行なった。ヒトiPS細胞を播種した時点を、分化誘導０日目とした。【００４０】
３）ヒトiPS細胞へのHEX遺伝子の導入
分化誘導５日目に、0.0125% トリプシン(trypsin)-0.01325 mM EDTAでヒトiPS細胞を細胞培養用プレートから剥離したのち、0.1 mg/ml のトリプシンインヒビターにてトリプシンを中和後、参考例に示す培地５を用いて、1,300rpmで３分間の遠心処理を２回行った。遠心処理により得られたヒトiPS細胞を、50 ng/mlのアクチビンA (R&D Systems社) 及び10 ng/mlのbFGF (R&D Systems社) を添加した培地５に懸濁し、ラミニン (sigma社) でコーティングした細胞培養用プレート（１２ウェル）の各ウェルに5.0×105 cell/wellで播種し、３７℃で培養した。【００４１】
２４時間培養後、上記１）でHEX遺伝子を挿入したK7型Adベクターを3,000 VP(vector particle)/cellで１．５時間感染させた後、10 ng/mlのBMP4 (R&D Systems社) と10ng/mlのFGF-4 (R&D Systems社) を添加した培地５に交換した。その後、10 ng/mlのMBP4 (R&D Systems社) と10 ng/mlのFGF-4 (R&D Systems社) を添加した培地５で培地交換を毎日行った。【００４２】
（実験例１−１）抗体免疫染色法による結果
培養１２日目に、Alexa(R)594で標識した抗αフェトプロテイン(AFP)抗体（Dako社製）及びAlexa(R)488で標識した抗CK7抗体（Invitrogen社製）を用いて免疫抗体染色法により、各遺伝子の発現を確認した。AFPは肝幹細胞のマーカーとなり、CK7は胆管上皮細胞のマーカーとなる。図２に示すように、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入した系では、遺伝子を導入しない系に比べて、各種マーカーが強く反応していることが観察された。このことより、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入することで、ヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導が促進されることが確認された。【００４３】
（実験例１−２）リアルタイムＰＣＲ法による結果
培養０日目（未分化な細胞）、５日目（内胚葉系細胞）及び１２日目の細胞について、TaqMan(R) Gene Expression Assays（Applied Biosystems社、カタログ番号：AFPについてはHs01040607_m1、アルブミンについてはHs00910225_m）を用いてリアルタイムＰＣＲ法により、肝幹細胞のマーカーとなりうるAFP及びアルブミンの発現量を調べた。発現量は、Human Fetal Liver Total RNA（Clontech社、カタログ番号636540）における各遺伝子発現量を基準(100)として、算出した。【００４４】
その結果、AFP及びアルブミンのいずれについても、HEX遺伝子を導入した系で明らかに発現量が増加することが確認され、HEX遺伝子を導入した系で分化誘導傾向を示すことがわかった（図３、４）。【００４５】
（実施例２）ヒトES細胞からの肝細胞への分化誘導方法
本実施例では、ヒトiPS細胞の代わりに、京都大学再生医科学研究所樹立のヒトES細胞(KhES-1)に、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入し、ヒトES細胞から肝細胞への分化誘導実験を行なった。本実施例では、マウス胎児線維芽細胞(MEF)をフィーダー細胞とし、Tiss. Cult. Res. Commun., 27: 139-147 (2008)に記載の方法に従い、参考例に示す培地２を用いて培養したヒトES細胞を準備した他は、実施例１と同手法により、１）HEX遺伝子導入用Adベクターの構築を行い、３）ヒトES細胞へのHEX遺伝子の導入操作を行ない、実験を行なった。【００４６】
（実験例２）リアルタイムＰＣＲ法による結果
培養０日目（未分化な細胞）、５日目（内胚葉系細胞）及び１２日目の細胞について、実験例１−２と同手法にて、リアルタイムＰＣＲ法により分化の指標となりうるAFP及びアルブミンの発現量を調べた。【００４７】
その結果、AFP及びアルブミンのいずれについても、HEX遺伝子を導入した系で明らかに発現量が増加することが確認され、HEX遺伝子を導入した系で分化誘導傾向を示すことがわかった（図５、６）。【００４８】
（実施例３）ヒトiPS細胞からの肝細胞への分化誘導方法
本実施例では、ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入し、当該遺伝子を導入したヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導について説明する。本実施例の実験スキームを図１に示した。１）HEX遺伝子導入用Adベクターの構築、２）ヒトiPS細胞の培養、３）ヒトiPS細胞へのHEX遺伝子の導入については、実施例１と同手法により行なった。ヒトiPS細胞（Squeaky (JCRB1329)）を用いた。【００４９】
（実験例３−１）抗体免疫染色法による結果
培養１２日目に、Alexa(R)594で標識した抗AFP抗体（Dako社製）及びAlexa(R)488で標識した抗CK7抗体（Invitrogen社製）を用いて免疫抗体染色法により、AFP及びCK7の各遺伝子の発現を確認した。AFPは肝幹細胞のマーカーとなり、CK7は胆管上皮細胞のマーカーとなる。図７に示すように、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入した系では、遺伝子を導入しない系に比べて、各種マーカーが強く反応していることが観察された。このことより、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入することで、ヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導が促進されることが確認された。【００５０】
（実施例４）ヒトiPS細胞からの肝細胞への分化誘導方法
本実施例では、ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入し、当該遺伝子を導入したヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導について説明する。本実施例の実験スキームを図８に示した。１）HEX遺伝子導入用Adベクターの構築、２）ヒトiPS細胞の培養、３）ヒトiPS細胞へのHEX遺伝子の導入については、実施例１と同手法により行なった。ヒトiPS細胞（Tic (JCRB1331)）を用いた。【００５１】
（実験例４−１）リアルタイムＰＣＲ法による結果
培養０日目（未分化な細胞）、５日目（内胚葉系細胞）及び１２日目の細胞について、TaqMan(R) Gene Expression Assays（Applied Biosystems社、カタログ番号：AFPについてはHs01040607_m1、アルブミンについてはHs00910225_m）を用いてリアルタイムＰＣＲ法により、肝幹細胞のマーカーとなりうるAFP及びアルブミンの各遺伝子の発現量を調べた。発現量は、Human Fetal Liver Total RNA（Clontech社、カタログ番号636540）における各遺伝子発現量を基準(100)として、算出した。【００５２】
その結果、AFP及びアルブミンのいずれについても、HEX遺伝子を導入した系で明らかに発現量が増加することが確認され、HEX遺伝子を導入した系で分化誘導傾向を示すことがわかった（図９）。【００５３】
（実験例４−２）抗体免疫染色法による結果
培養１２日目に、Alexa(R)594で標識した抗AFP抗体（Dako社製）、Alexa(R)594で標識した抗アルブミン (ALB)抗体（SIGMA社製）、及びAlexa(R)488で標識した抗CK7抗体（Invitrogen社製）を用いて免疫抗体染色法により、AFP、アルブミン及びCK7の各遺伝子の発現を確認した。AFPは肝幹細胞のマーカー、アルブミンは肝細胞のマーカー、CK7は胆管上皮細胞のマーカーとなる。図１０に示すように、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入した系では、遺伝子を導入しない系に比べて、各種マーカーが強く反応していることが観察された。このことより、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入することで、ヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導が促進されることが確認された。【００５４】
（実施例５）ヒトiPS細胞、ES細胞からの肝細胞への分化誘導方法
１）ヒトiPS細胞及びヒトES細胞の培養
本実施例では、ヒトiPS細胞やES細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入し、当該遺伝子を導入したヒトiPS細胞及びヒトES細胞から肝細胞への分化誘導について説明する。本実施例の実験スキームを図１１に示した。１）HEX遺伝子導入用Adベクターの構築、２）細胞の培養、３）細胞へのHEX遺伝子の導入については、実施例１と同手法により行なった。ヒトiPS細胞は、Tic (JCRB1331)、Dotcom (JCRB1327)を、ES細胞はkhES1 ES細胞を用いた。【００５５】
（実験例５−１）リアルタイムＰＣＲ法による結果
培養０日目（未分化な細胞）、６日目（内胚葉系細胞）及び１２日目の細胞について、内胚葉マーカーとなりうるFOXA2及びSOX17、並びに肝幹細胞のマーカーとなりうるAFP及びアルブミン各遺伝子の発現量を調べた。各遺伝子の発現は、TaqMan(R) Gene Expression Assays（Applied Biosystems社、カタログ番号：FOXA2についてはHs00232764_m1、SOX17についてはHs00751752_s1、AFPについてはHs01040607_m1、アルブミンについてはHs00910225_m）を用いてリアルタイムＰＣＲ法により調べた。発現量は、ヒトiPS細胞Ticにおける培養０日目（未分化な細胞）を基準(1)として、算出した。【００５６】
図１２に示すように、６日目（内胚葉系細胞）において内胚葉マーカーであるFOXA2及びSOX17が、細胞株Dotcomにおいて最も発現量が高かった。さらに、図１３に示すように、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入することで、細胞株Dotcomにおいて、肝幹細胞のマーカーとなりうるAFP及び肝細胞のマーカーとなりうるアルブミンは、最も著しい発現量の増加を確認した。このことより、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入することで、内胚葉系マーカーを強く発現する細胞からより効率的に肝細胞への分化誘導が促進されることが確認された。【００５７】
（実施例６）HEX遺伝子による肝分化誘導効果（培養１８日目）
本実施例では、ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入し、当該遺伝子を導入したヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導について説明する。本実施例の実験スキームを図１４に示した。１）HEX遺伝子導入用Adベクターの構築、及び３）ヒトiPS細胞へのHEX遺伝子の導入については、実施例１と同手法により行なった。２）ヒトiPS細胞は、以下の方法により培養した。【００５８】
２）ヒトiPS細胞の培養
本実施例では、ヒトiPS 細胞（Tic (JCRB1331)）を用いた。分化誘導９日目まで（実験例１）と同様の方法で培養した。その後、培養９日目の細胞を0.0125 %トリプシン-0.01325 mM EDTAで回収し、Stem Cells.,26:1117-27(2008)に記載の通り、SingleQuots(R) (Lonza社)、10 ng/mL 線維芽細胞増殖因子4 (FGF4)、10 ng/mL 肝細胞増殖因子 (HGF)(R&D Systems社), 10 ng/mL オンコスタチンM (R&D Systems社)、10-7 M デキサメタゾン(Sigma社)を添加した HCMTM Hepatocyte Culture Medium (Lonza社)に懸濁後、I型コラーゲン(Nitta Gelatin社)でコーティングした細胞培養用プレート（１２ウェル）に播種した。培地交換は１日毎行った。【００５９】
（実験例６−１）抗体免疫染色法による結果
培養１８日目に、Alexa(R)594で標識した抗アルブミン (ALB)抗体（SIGMA社製）、Alexa(R)594で標識した抗薬剤代謝酵素シトクロムP450 3A4(CYP3A4)抗体（Santa Cruz 社製）、及びAlexa(R)594で標識した抗薬剤代謝酵素シトクロムP450 7A1(CYP7A1)抗体（Santa Cruz 社製）を用いて免疫抗体染色法により、各遺伝子の発現を確認した。アルブミン 、CYP3A4、CYP7A1はいずれも肝細胞マーカーとなる。図１５に示すように、培養１８日目ではAdベクターを用いてHEX遺伝子導入した系では、遺伝子を導入しない系に比べて、いずれの肝細胞マーカーも強く反応していることが観察された。【００６０】
（実施例７）HEX遺伝子導入細胞の機能性評価
本実施例では、ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入し、当該遺伝子を導入したヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導について説明する。本実施例の実験スキームを図１６に示した。１）HEX遺伝子導入用Adベクターの構築、及び３）ヒトiPS細胞へのHEX遺伝子の導入については、実施例１と同手法により行い、２）ヒトiPS細胞の培養は、実施例６と同手法により行なった。本実施例では、ヒトiPS細胞（Tic (JCRB1331)）を用いた。【００６１】
（実験例７−１）リアルタイムＰＣＲ法による結果
培養１８日目の細胞について、薬剤代謝酵素シトクロムP450 3A4 (CYP3A4) の発現量を、TaqMan(R) Gene Expression Assays（Applied Biosystems社、カタログ番号： CYP3A4についてはHs00430021_m1）を用いてリアルタイムＰＣＲ法により調べた。発現量は、Human Adult Liver Total RNA（Clontech社、カタログ番号636531）における各遺伝子発現量を基準(100)として、算出した（図１７）。【００６２】
その結果、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入することで、CYP3A4の発現量は著しく増加し、胎児肝細胞に匹敵する発現量を得ることが出来た。【００６３】
（実験例７−２）薬剤代謝酵素シトクロムP450 3A4 (CYP3A4) の活性測定
分化誘導１８日目のヒトiPS細胞由来の肝細胞又はヒト肝癌細胞株HepG2に25μM リファンピシン(Sigma社)又はDMSOを添加し、７２時間後にP450-GloTM CYP3A4 Assay Kit (Promega社)を用いてCYP3A4の活性を測定した。活性はルミノメーター (Lumat LB 9507、Berthold社)を用いて定量した。【００６４】
その結果、培養１８日目ではAdベクターを用いてHEX遺伝子導入した系では、遺伝子を導入しない系に比べて、CYP3A4の活性が増加するとともに、リファンピシンによる薬剤応答性も増加することが観察された（図１８）。【００６５】
（実施例８）内胚葉分化能の高いiPS細胞株からの肝細胞への分化誘導
本実施例では、ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入し、当該遺伝子を導入したヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導について説明する。本実施例の実験スキームは図１６に示した。１）HEX遺伝子導入用Adベクターの構築、及び３）ヒトiPS細胞へのHEX遺伝子の導入については、実施例１と同手法により行い、２）ヒトiPS細胞の培養は、実施例６と同手法により行なった。本実施例では、ヒトiPS細胞（Tic (JCRB1331)、Dotcom (JCRB1327)）を用いた。【００６６】
（実験例８−１）薬剤代謝酵素シトクロムP450 3A4 (CYP3A4) の活性測定
実験例７−２と同手法により、CYP3A4の活性を測定した。その結果、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入した場合、内胚葉への分化能が高い細胞株Dotcomから、アルブミンやCYP3A4の発現量がより高い肝細胞を分化誘導することができた（図１９）。【００６７】
（実施例９）分化誘導時の形態変化
本実施例では、ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子を導入し、当該遺伝子を導入したヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導について説明する。本実施例の実験スキームを図２０に示した。１）HEX遺伝子導入用Adベクターの構築、及び３）ヒトiPS細胞へのHEX遺伝子の導入については、実施例１と同手法により行い、２）ヒトiPS細胞の培養は、実施例６と同手法により行なった。本実施例では、ヒトiPS細胞（Tic (JCRB1331)）を用いた。【００６８】
（実験例９−１）形態観察
培養０日目（未分化な細胞）、６日目（内胚葉系細胞）、９日目（肝幹細胞）及び２１日目の細胞の形態を観察した。その結果、緻密な細胞形態（培養０日目）から細胞間の密度が低い分化した細胞に特徴的な形態（培養６日目）へと変化した。さらに培養９日目から２１日目にかけて、Adベクターを用いてHEX遺伝子を導入した系では、肝細胞に特徴的な上皮様の細胞形態へと変化した。したがって、細胞の形態からもHEX遺伝子を導入することで分化誘導された細胞は肝細胞であることが示唆された（図２１）。【００６９】
（実施例１０）SOX17遺伝子とHEX遺伝子の組み合わせによるヒトiPS細胞からの肝細胞への分化誘導方法
本実施例では、ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてSOX17遺伝子ならびにHEX遺伝子を導入し、当該遺伝子を導入したヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導について説明する。本実施例の実験スキームを図２２に示した。【００７０】
１）SOX17遺伝子導入用Adベクターの構築
SOX17遺伝子導入用として、E1欠損型の５型Adゲノム（pAdHM41-K7）のE1欠損部位に導入遺伝子及びその上流にEF-1α プロモーターを搭載したAdベクターを作製した。導入遺伝子は、GenBank Accession No. NM_022454に示す配列からなるSOX17遺伝子である。なお、HEX遺伝子導入用Adベクターは、実施例１と同手法により作製した。【００７１】
２）ヒトiPS細胞の培養
本実施例では、ヒトiPS 細胞（201B7(JCRB)）を用いた。分化誘導３日目まで実施例１と同様の方法で培養した。【００７２】
３）ヒトiPS細胞へのSOX17遺伝子の導入
分化誘導開始から７２時間培養後、上記１）でSOX17遺伝子を挿入したK7型Adベクターを3,000 VP/cellで１．５時間感染させた後、50 ng/mlのアクチビンA (Activin A; R&D Systems社) と10ng/mlのbFGF (R&D Systems社) を添加した培地４に交換した。その後、50 ng/mlのActivin A(R&D Systems社) と10ng/mlのbFGF (R&D Systems社)を添加した培地４で培地交換を毎日行った。【００７３】
４）SOX17遺伝子導入細胞へのHEX遺伝子の導入
分化誘導５日目に、0.0125 %トリプシン-0.01325 mM EDTAでヒトiPS細胞を細胞培養用プレートから剥離したのち、0.1 mg/ml のトリプシンインヒビターにてトリプシンを中和後、参考例に示す培地５を用いて、1,300rpmで３分間の遠心処理を２回行った。遠心処理により得られたヒトiPS細胞を、50 ng/mlのアクチビンA (R&D Systems社) 及び10 ng/mlのbFGF (R&D Systems社) を添加した培地５に懸濁し、ラミニン (sigma社) でコーティングした細胞培養用プレート（１２ウェル）の各ウェルに5.0×105 cell/wellで播種し、３７℃で培養した。２４時間培養後、HEX遺伝子を挿入したK7型Adベクターを3,000 VP/cellで１．５時間感染させた後、10 ng/mlのBMP4 (R&D Systems社) と10ng/mlのFGF4 (R&D Systems社) を添加した培地５に交換した。その後、10 ng/mlの BMP4 (R&D Systems社) と10 ng/mlのFGF4 (R&D Systems社) を添加した培地５で培地交換を毎日行った。【００７４】
（実験例１０−１）抗体免疫染色法による結果
培養９日目及び培養１２日目に、Alexa(R)594で標識した抗αフェトプロテイン(AFP)抗体（Dako社製）、Alexa(R)594で標識した抗アルブミン (ALB)抗体（SIGMA社製）、及びAlexa(R)488で標識した抗CK7抗体（Invitrogen社製）を用いて免疫抗体染色法により、各遺伝子の発現を確認した。AFPは肝幹細胞のマーカー、アルブミンは肝細胞のマーカー、CK7は胆管上皮細胞のマーカーとなる。図２３に示すように、培養９日目ではAdベクターを用いてSOX17遺伝子とHEX遺伝子を導入した系では、HEX遺伝子のみを導入した系に比べて、肝幹細胞マーカーが強く反応していることが観察されたが、胆管上皮細胞マーカーはいずれの系においても発現していなかった。また培養１２日目ではAdベクターを用いてSOX17遺伝子とHEX遺伝子を導入した系では、HEX遺伝子のみを導入した系に比べて、肝細胞マーカーが強く反応していることが観察された。【００７５】
（実験例１０−２）リアルタイムＰＣＲ法による結果
培養９日目及び培養１２日目の細胞について、TaqMan(R) Gene Expression Assays（Applied Biosystems社、カタログ番号：AFPについてはHs01040607_m1、アルブミンについてはHs00910225_m）を用いてリアルタイムＰＣＲ法により、肝幹細胞のマーカーとなりうるAFP及びアルブミンの発現量を調べた。発現量は、Human Fetal Liver Total RNA（Clontech社、カタログ番号636540）における各遺伝子発現量を基準(100)として、算出した。その結果、Adベクターを用いてSOX17遺伝子とHEX遺伝子を導入することで、HEX遺伝子のみを用いた場合と比較し、より効率良くヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導が促進される傾向があることが確認された（図２４）。【００７６】
（実施例１１）HEX遺伝子とHNF4A遺伝子の組み合わせによるヒトiPS細胞からの肝細胞への分化誘導方法【００７７】
本実施例では、ヒトiPS細胞にAdベクターを用いてHEX遺伝子ならびにHNF4A遺伝子を導入し、当該遺伝子を導入したヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導について説明する。本実施例の実験スキームを図２５に示した。【００７８】
１）HNF4A遺伝子導入用Adベクターの構築
E1欠損型の５型Adゲノム（pAdHM41-K7）のE1欠損部位に導入遺伝子及びその上流にEF-1α プロモーターを搭載したAdベクターを作製した。導入遺伝子は、GenBank Accession No. NM_000457に示す配列からなるHNF4A遺伝子である。なお、HEX遺伝子導入用Adベクターは、実施例１と同手法により作製した。【００７９】
２）ヒトiPS細胞の培養
本実施例では、ヒトiPS 細胞（Tic (JCRB1331)、Dotcom (JCRB1327)、201B7）を用いた。分化誘導９日目まで実施例１と同様の方法で培養した。【００８０】
３）ヒトiPS細胞へのHEX遺伝子及びHNF4A遺伝子の導入
分化誘導９日目、上記１）でHNF4A遺伝子を挿入したK7型Adベクターを3,000 VP/cellで１．５時間感染させた後、10 ng/mlの肝細胞増殖因子(HGF)(R&D Systems社) 、10 ng/mlのオンコスタチンM (R&D Systems社)、及び10-7 M デキサメタゾン(Sigma社)を添加したHCMTM培地(Lonza社)に交換した。その後、10 ng/mlのHGF (R&D Systems社) 、10 ng/mlのオンコスタチンM (R&D Systems社)、及び10-7 M デキサメタゾン(Sigma社)を添加したHCMTM培地(Lonza社)で培地交換を２日に１度行った。【００８１】
（実験例１１−１）抗体免疫染色法による結果
培養１８日目に、Alexa(R)594で標識した抗薬剤代謝酵素P450 2D6（CYP2D6）抗体（Santa Cruz 社製）、Alexa(R)594で標識した抗薬剤代謝酵素P450 3A4(CYP3A4)抗体（Santa Cruz 社製）、及びAlexa(R)594で標識した抗薬剤代謝酵素P450 7A1(CYP7A1)抗体（Santa Cruz 社製）を用いて免疫抗体染色法により、各遺伝子の発現を確認した。CYP2D6、CYP3A4、CYP7A1はいずれも肝細胞マーカーとなる。図２６に示すように、培養１８日目ではAdベクターを用いてHEX遺伝子とHNF4A遺伝子を導入した系では、HEX遺伝子のみを導入した系に比べて、いずれの肝細胞マーカーも強く反応していることが観察された。【００８２】
（実験例１１−２）リアルタイムＰＣＲ法による結果
培養１８日目の細胞について、TaqMan(R) Gene Expression Assays（Applied Biosystems社、カタログ番号：CYP2D6についてはHs02576168_g1、CYP3A4についてはHs00430021_m1、CYP7A1についてはHs00167982_m1）を用いてリアルタイムＰＣＲ法により、肝細胞マーカーとなりうるCYP2D6、CYP3A4、CYP7A1の発現量を調べた。発現量は、Human Adult Liver Total RNA（Clontech社、カタログ番号636531）における各遺伝子発現量を基準(100)として、算出した。その結果、Adベクターを用いてHEX遺伝子とHNF4A遺伝子を導入することで、HEX遺伝子のみを用いた場合と比較し、CYP2D6、CYP3A4、CYP7A1の発現量は著しく増加し、従来よりも薬剤代謝の発現量が高い肝細胞を得ることが出来た（図２７）。【００８３】
（実験例１１−３）薬剤代謝酵素P450 3A4の活性測定
分化誘導１８日目のヒトiPS細胞由来の肝細胞又はヒト肝癌細胞株HepG2に25μM リファンピシン (Sigma社)又はDMSOを添加し、７２時間後にP450-GloTM CYP3A4 Assay Kit (Promega社)を用いてCYP3A4の活性を測定した。活性はルミノメーター (Lumat LB 9507、Berthold社)を用いて定量した。その結果、Adベクターを用いてHEX遺伝子とHNF4A遺伝子を導入することで、HEX遺伝子のみを用いた場合と比較し、CYP3A4の活性が増加するとともに、リファンピシンによる薬剤応答性も増加することが観察された。したがって、本方法により、Adベクターを用いてHEX遺伝子とHNF4A遺伝子を導入することで、従来よりも薬剤代謝酵素の活性が高い肝細胞を得ることが出来た（図２８）。【００８４】
（実施例１２）SOX17、HEX遺伝子、HNF4A遺伝子の組み合わせによるヒトiPS細胞からの肝細胞への分化誘導方法
本実施例では、ヒトiPS細胞にAdベクターを用いて適時SOX17遺伝子、HEX遺伝子、HNF4A遺伝子を導入し、ヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導について説明する。本実施例の実験スキームを図２９に示した。【００８５】
１）SOX17遺伝子、HEX遺伝子、HNF4A遺伝子導入用Adベクター
出願例１と同様のAdベクターを使用した。【００８６】
２）ヒトiPS細胞の培養
本実施例では、ヒトiPS 細胞（Tic (JCRB1331)）を用いた。分化誘導３日目まで実施例１と同様の方法で培養した。【００８７】
３）SOX17遺伝子の導入
分化誘導開始から３日後、SOX17遺伝子を挿入したK7型Adベクターを3,000 VP/cellで１．５時間感染させた後、50 ng/mlのアクチビンA (R&D Systems社) と10 ng/mlのbFGF (R&D Systems社) を添加した培地４に交換した。その後、50 ng/mlのアクチビンA (R&D Systems社) と10ng/mlのbFGF (R&D Systems社)を添加した培地４で培地交換を毎日行った。SOX17遺伝子を導入していない細胞をコントロール群とした。【００８８】
４）HEX遺伝子の導入
分化誘導６日目に、0.0125 %トリプシン-0.01325 mM EDTAで上記の各細胞を細胞培養用プレートから剥離したのち、0.1 mg/ml のトリプシンインヒビターにてトリプシンを中和後、参考例に示す培地５を用いて、1,300rpmで３分間の遠心処理を２回行った。遠心処理により得られたヒトiPS細胞を、50 ng/mlのアクチビンA (R&D Systems社) 及び10 ng/mlのbFGF (R&D Systems社) を添加した培地５に懸濁し、ラミニン (sigma社) でコーティングした細胞培養用プレート（12ウェル）の各ウェルに5.0×105 cell/wellで播種し、３７℃で培養した。２４時間培養後、HEX遺伝子を挿入したK7型Adベクターを3,000 VP/cellで１．５時間感染させた後、10 ng/mlのBMP4 (R&D Systems社) と10ng/mlのFGF4 (R&D Systems社) を添加した培地５に交換した。その後、10 ng/mlの BMP4 (R&D Systems社) と10 ng/mlのFGF4 (R&D Systems社) を添加した培地５で培地交換を毎日行った。HEX遺伝子を導入していない細胞をコントロール群とした。【００８９】
５）HNF4A遺伝子の導入
分化誘導９日目、上記１）でHNF4A遺伝子を挿入したK7型Adベクターを3,000 VP/cellで１．５時間感染させた後、10 ng/mlのHGF (R&D Systems社) 、10 ng/mlのオンコスタチンM (R&D Systems社)、及び10-7 M デキサメタゾン(Sigma社)を添加したHCMTM培地(Lonza社)に交換した。その後、10 ng/mlのHGF (R&D Systems社) 、10 ng/mlのオンコスタチンM (R&D Systems社)、及び10-7 M デキサメタゾン(Sigma社)を添加したHCMTM培地(Lonza社)で培地交換を２日に１度行った。HNF4A遺伝子を導入していない細胞をコントロール群とした。【００９０】
導入する遺伝子の組み合わせは、表１に従った。
【表１】
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【００９１】
（実験例１２）リアルタイムＰＣＲ法による結果
培養１８日目の細胞について、TaqMan(R) Gene Expression Assays（Applied Biosystems社、カタログ番号：アルブミン（ALB）についてはHs00910225_m 、CYP2D6についてはHs02576168_g1、CYP3A4についてはHs00430021_m1、CYP7A1についてはHs00167982_m1）を用いてリアルタイムＰＣＲ法により、肝細胞マーカーとなりうるALB、CYP2D6、CYP3A4、CYP7A1の発現量を調べた。発現量は、ヒト成人肝組織（Human Adult Liver Total RNA：Clontech社、カタログ番号636531）における各遺伝子発現量を基準(100)として、算出した。その結果を図３０に示した。図３０の横軸に示す番号は、表１の遺伝子の組み合わせによるものである。その結果、Adベクターを用いてSOX17遺伝子、HEX遺伝子、HNF4A遺伝子を３種全て導入した細胞において、他の組み合わせの遺伝子を導入した場合と比較し、アルブミン、CYP2D6、CYP3A4、CYP7A1の発現量が著しく増加し、従来よりも薬剤代謝の発現量が高い肝細胞を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
以上詳述したように、本発明のAdベクターを用いることで、ES細胞又はiPS細胞等の多能性幹細胞の分化誘導に係る遺伝子が効果的に導入され、肝細胞へ分化誘導させうることが確認された。具体的には、HEX遺伝子、HNF4A遺伝子、HNF6遺伝子及びSOX17遺伝子から選択されるいずれか１又は複数の遺伝子をES細胞又はiPS細胞等の幹細胞に導入することで、効果的に肝細胞へ分化誘導させうる。特にHEX遺伝子を幹細胞に導入することで、効果的に幹細胞から肝細胞へ分化誘導させうることが確認された。さらに、他の遺伝子として、SOX17遺伝子及び／又はHNF4A遺伝子などを細胞の分化の程度に応じて、適宜導入することにより、より効果的に幹細胞から肝細胞へ分化誘導させうることが確認された。【００９３】
本発明の分化誘導方法により作製した肝細胞を用いて、例えば薬物毒性評価や薬物動態評価を行うことができる。具体的には、本発明により作製した肝細胞に対して、医薬品候補化合物を添加し、肝毒性マーカーの発現変動を解析することで、生体での医薬品候補化合物の毒性を事前に予測することが可能になる。また、本発明により作製した肝細胞に対して、医薬品候補化合物を添加し、化合物の代謝産物を解析することで、生体での医薬品候補化合物の薬物動態（代謝産物）を事前に予測することが可能になる。これにより、毒性や薬物動態の問題により排除されるべき医薬品候補化合物を早期にスクリーニング可能となり、創薬の加速化が期待される。【００９４】
本発明の方法により、ES細胞又はiPS細胞のような多能性幹細胞から肝細胞へ分化誘導させることができれば、in vitroで肝細胞構造の再構築が可能となり、さらには成熟肝細胞や、分化誘導による肝臓の作製が期待される。本発明のAdベクターを用いることで、種々のES細胞やiPS細胞から、特定の遺伝子を発現する安定株を作製せずに、肝細胞を分化誘導することができる。したがって、iPS細胞を用意さえすれば、迅速にそのヒト特有の自己由来肝臓の作製が可能となる。また、本発明の方法により、従来臓器移植でしか対応できなかった疾患に対しても、再生医療により治療することの可能性が開かれ、非常に有用である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図３０】
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【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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