(57)【要約】  本発明は、細胞集団の製造方法において、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞を高含有する細胞集団、及びその製造方法を提供することを課題とする。  本発明は、抗ＣＤ３抗体、フィブロネクチンフラグメント及びインターロイキン−４を用いることを特徴とするＣＤ４陽性Ｔ細胞集団の製造方法を提供する。当該方法はＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞を高含有する細胞集団が得られるだけでなく、拡大培養率が高いという特徴を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を包含することを特徴とする、ＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＣＲ７を発現する細胞集団の製造方法。
工程（１）：Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去、又はＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取する工程、及び
工程（２）：工程（１）で得られた細胞集団を、下記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で培養し、かつ当該培養中及び／又は当該培養後の拡大培養中、全部又は一部の期間において、下記（Ｃ）の存在下で培養する工程。
（Ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメント及びそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチド
（Ｂ）ＣＤ３リガンド、又はＣＤ３リガンド及びＣＤ２８リガンド
（Ｃ）インターロイキン−４
【請求項２】
工程（２）が、請求項１記載の（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で、かつ（Ｃ）の存在下で培養し、得られた細胞集団を（Ｃ）の存在下で拡大培養する工程である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
工程（２）が、請求項１記載の（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で、かつ（Ｃ）の非存在下で培養し、得られた細胞集団を（Ｃ）の存在下で拡大培養する工程である、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
工程（２）が、請求項１記載の（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で、かつ（Ｃ）の存在下で培養し、得られた細胞集団を（Ｃ）の非存在下で拡大培養する工程である、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
更に外来遺伝子を導入する工程を包含する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載の（Ａ）及び（Ｂ）の、又は（Ｂ）の存在下で、かつ（Ｃ）の非存在下での培養により得られた細胞集団と比較して、下記（１）〜（５）からなる群より選択される少なくとも１つの細胞が高比率に含有されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法で得られる細胞集団。
（１）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞
（２）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞
（３）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞
（４）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞
（５）：ＣＤ４陽性ＣＸＣＲ４陽性細胞
【請求項７】
医薬に使用するための請求項６記載の細胞集団。
【請求項８】
医薬の製造に用いる、請求項６記載の細胞集団。
【請求項９】
請求項６記載の細胞集団を有効成分として含有する医薬。
【請求項１０】
対象に有効量の請求項６記載の細胞集団を投与する工程を含む、疾患の治療方法又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用な細胞集団を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載する）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載する）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。【０００３】
Ｔ細胞は、末梢ではＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有するＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８マーカーを有するＣＤ８陽性Ｔ細胞が大部分を占める。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ細胞（以下、Ｔｈ細胞と記載する）と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類が異なるＴｈ１型（１型ヘルパーＴ細胞。以下、Ｔｈ１型細胞と記載する）あるいはＴｈ２型（２型ヘルパーＴ細胞。以下、Ｔｈ２型細胞と記載する）に分類される。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞［（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、以下、ＣＴＬと記載する］である。【０００４】
外科手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第４のがんの治療法として、免疫療法が近年関心を集めている。免疫療法は本来ヒトが有する免疫力を利用するため、患者への肉体的負担が他の治療法と比べて軽いと言われている。免疫療法としては、体外で誘導したＣＴＬや末梢血単核球などから種々の方法で拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞などを移入する療法、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法、Ｔｈ１型細胞療法、更にこれら細胞に種々の効果が期待できる遺伝子を体外で導入して体内に移入する免疫遺伝子療法などが知られている。【０００５】
従来、免疫療法において、細胞傷害活性を示すＣＴＬを利用した細胞医療が進められているが、最近、前記ＣＴＬの活性を補助するＴｈ細胞を利用したＴｈ細胞医療が注目されている（例えば、非特許文献１、特許文献１）。前記のとおり、Ｔｈ細胞は、Ｔｈ１型細胞とＴｈ２型細胞に分けられる。Ｔｈ１型細胞は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ）−２などのサイトカインを産生し、細胞性免疫のエフェクターとして働く。一方、Ｔｈ２型細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３などのサイトカインを産生し、液性免疫の調節を担っている。【０００６】
後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）を対象とした細胞療法として、ＨＩＶウイルスの標的細胞であるＣＤ４陽性Ｔ細胞に遺伝子導入等の改変を行い、患者に移入する療法が近年注目されている（例えば、非特許文献２）。例えば、ＨＩＶの構造タンパクの一つであるｇｐ１２０をコードするＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを発現する遺伝子をＨＩＶ患者のＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入し、抗ＨＩＶ効果を付加したＣＤ４陽性Ｔ細胞を患者に移入する臨床試験が米国で実施されている。【０００７】
近年、免疫療法において、すでに終末分化したエフェクターであるＴｈ細胞よりも、より未分化な状態のナイーブＴ細胞やセントラルメモリーＴ細胞が注目されている。ナイーブＴ細胞は、抗原により一度も活性化されておらず、Ｔｈ１型細胞もしくはＴｈ２型細胞への分化方向付けがされていない細胞（Ｔｈ０）であり、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞を抗原とサイトカイン存在下で培養することにより、Ｔｈ１型細胞又はＴｈ２型細胞へ分化誘導できることが明らかとなっている。ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７などのリンパ球の細胞表面抗原マーカーを発現することが知られている。【０００８】
前記のとおり、未分化な状態のナイーブＴ細胞は、細胞医療や遺伝子治療の分野において重要であり、細胞集団の製造においては、細胞増殖効率が高く、治療に適した細胞が多く得られる工程を含む方法の開発が望まれており、Ｔｈ１型細胞の製造方法が開発されている（例えば、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−１７９２９９号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／１４３２５５号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第６６巻、第３号、第１８０９〜１８１７頁（２００６）
【非特許文献２】ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２５巻、第１２号、第１４４４〜１４５４頁（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、細胞医療に有効な細胞集団の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を拡大培養する際、通常、Ｔｈ２型細胞への分化誘導に用いられているインターロイキン−４をＣＤ３リガンド、及びフィブロネクチンフラグメントと共に用いて培養を行ったところ、驚くべきことに、Ｔｈ２型細胞への分化誘導ではなく、ＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＣＲ７を発現する細胞集団、すなわち、より未分化なＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞の含有率が高い細胞集団が得られることを見出し、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明を概説すれば、本発明は、
［１］下記工程を包含することを特徴とする、ＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＣＲ７を発現する細胞集団の製造方法、
工程（１）：Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去、又はＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取する工程、及び
工程（２）：工程（１）で得られた細胞集団を、下記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で培養し、かつ当該培養中及び／又は当該培養後の拡大培養中、全部もしくは一部の期間において、下記（Ｃ）の存在下で培養する工程、
（Ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメント及びそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチド
（Ｂ）ＣＤ３リガンド、又はＣＤ３リガンド及びＣＤ２８リガンド
（Ｃ）インターロイキン−４
［２］工程（２）が、［１］記載の（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で、かつ（Ｃ）の存在下で培養し、得られた細胞集団を（Ｃ）の存在下で拡大培養する工程である、［１］記載の製造方法、
［３］工程（２）が、［１］記載の（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で、かつ（Ｃ）の非存在下で培養し、得られた細胞集団を（Ｃ）の存在下で拡大培養する工程である、［１］記載の製造方法、
［４］工程（２）が、［１］記載の（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で、かつ（Ｃ）の存在下で培養し、得られた細胞集団を（Ｃ）の非存在下で拡大培養する工程である、［１］記載の製造方法、
［５］更に外来遺伝子を導入する工程を包含する、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の製造方法、
［６］［１］記載の（Ａ）及び（Ｂ）の、又は（Ｂ）の存在下で、かつ（Ｃ）の非存在下での培養により得られた細胞集団と比較して、下記（１）〜（５）からなる群より選択される少なくとも１つの細胞が高比率に含有されている、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の製造方法で得られる細胞集団、
（１）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞
（２）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞
（３）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞
（４）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞
（５）：ＣＤ４陽性ＣＸＣＲ４陽性細胞
［７］医薬に使用するための［６］記載の細胞集団、
［８］医薬の製造に用いる、［６］記載の細胞集団、
［９］［６］記載の細胞集団を有効成分として含有する医薬、及び
［１０］対象に有効量の［６］記載の細胞集団を投与する工程を含む、疾患の治療方法又は予防方法、
に関する。
なお本発明において、拡大培養とは所望の細胞を増殖させる培養（細胞数を増加させる培養）を意味する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＣＲ７を発現する細胞集団、すなわちＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞を高含有する細胞集団の製造方法が提供される。当該製造方法は細胞増殖率が高い。また当該製造方法により得られる細胞集団は、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率が高く、細胞免疫療法による疾患の治療に極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、「Ｔ細胞」はＴリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味する。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１型細胞及びＴｈ２型細胞）、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ＣＴＬ、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖とβ鎖のＴＣＲを発現するαβＴ細胞、γ鎖とδ鎖のＴＣＲを発現するγδＴ細胞が含まれる。本発明の原料として用いられる「Ｔ細胞を含有する細胞集団」としては、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄液の他、これらより採取、単離、精製又は誘導された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血球系細胞、造血幹細胞、臍帯血単核細胞などを含む細胞集団が例示される。これらの細胞はＩＬ−２などのサイトカインにより生体内（イン・ビボ）や生体外（エクス・ビボ）で活性化されていてもよい。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたもの、もしくはそれらを凍結保存したもののいずれも使用することができる。
【００１６】
本発明において、「フィブロネクチン（以下、ＦＮと記載）」及び「ＦＮフラグメント」は、天然から得られたもの（天然のＦＮや天然のＦＮを酵素消化により断片化したＦＮフラグメント等）、又は組換えＤＮＡ技術により製造されたもののいずれでもよい。ＦＮ及びＦＮフラグメントは、例えば、ルオスラーティ  Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なＦＮ及びＦＮフラグメントとは、これらが天然においてＦＮと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。本発明において、ＦＮ及びＦＮフラグメントは、単一の分子種を使用してもよく、複数の分子種を混合して使用してもよい。
【００１７】
本発明に使用できるＦＮフラグメント、及び該フラグメントの調製に関する有用な情報は、キミヅカ  Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｚｕｋａ  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット  Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ  Ａ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第４巻、第７号、第１７５５〜１７５９頁（１９８５）〕、及びセキグチ  Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、第４９３６〜４９４１頁（１９８６）〕等より得ることができる。また、ＦＮをコードする核酸配列又はＦＮのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ（ＲｅｆＳｅｑＩＤ）：ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。
【００１８】
本発明には、細胞接着活性及び／又はヘパリン結合活性を有するＦＮフラグメントが好適に使用できる。ＦＮ中には、細胞表面のインテグリンと結合する活性を有する領域が存在する。当該領域として、ＶＬＡ（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）−４又はＶＬＡ−５結合領域が例示される。ＦＮのＣ末端側寄りの部位にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ここはＣＳ−１と呼ばれる２５アミノ酸からなる領域（配列番号１）が含まれており、当該領域はＶＬＡ−４に対して結合活性を示す。
【００１９】
また、ＦＮにはＩＩＩ型と呼ばれる繰り返し配列が存在しており、Ｎ末端側から１０番目のＩＩＩ型の繰り返し配列（配列番号２）には細胞への結合領域が存在している。前記配列中のＶＬＡ−５との結合に中心的な役割を果たす配列は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＲＧＤＳ：配列番号３）の４アミノ酸である。Ｃ−２７４（配列番号４）は前記ＩＩＩ型の繰り返し配列（配列番号２）を含むポリペプチドであり、強い細胞接着活性を有する組換えＦＮフラグメントの１つである。
【００２０】
更に、ＦＮはヘパリンと結合する活性を有している。ＦＮのヘパリン結合領域は、前記ＩＩＩ型の繰り返し配列のＮ末端から１２〜１４番目に相当する。Ｈ−２７１（配列番号５）はこのヘパリン結合領域からなる組換えＦＮフラグメントの１つである。
【００２１】
本発明には、各領域を単独で含有するＦＮフラグメントのほか、これら領域の２つ以上が直接、あるいは適切なリンカーを介して結合されたＦＮフラグメントを使用することができる。これらＦＮフラグメントに含まれるＦＮ由来の領域は同一のものであっても、異なるものであってもよい。複数の結合領域を分子内に有するＦＮフラグメントとしては、ＶＬＡ−４結合領域とヘパリン結合領域を含有するＨ−２９６（配列番号６）、ＶＬＡ−５結合領域とヘパリン結合領域を含有するＣＨ−２７１（配列番号７）、ＶＬＡ−４結合領域、ＶＬＡ−５結合領域及びヘパリン結合領域を含有するＣＨ−２９６（配列番号８）、ＶＬＡ−４結合領域及びＶＬＡ−５結合領域を含有するＣ−ＣＳ１（配列番号９）等のポリペプチドが例示される。これら各種ポリペプチドは、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１）に記載されており、その開示に従って作製することができる。ＣＨ−２９６は、レトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ：登録商標）の名称でタカラバイオ社より販売されている。
【００２２】
更に、本発明に使用するＦＮフラグメントとしては、ＦＮフラグメントにより所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のＦＮのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである改変型ＦＮフラグメントであってもよい。例えば、Ｃ−２７４やＨ−２７１より１つ又は２つのＩＩＩ型の繰り返し配列を欠失させたものであってもよい。当該ＦＮフラグメントとしては、国際公開第２００８／１４３２５５号パンフレットの記載のＦＮフラグメントが例示される。ここで同等の機能を有するとは、当該改変型ＦＮフラグメントの細胞接着活性及び／又はヘパリン結合活性を調べることにより判断することができる。また、後述の「＜３＞本発明の細胞集団の製造方法」において同等の拡大培養率を有すること、もしくは本発明で得られる細胞集団中のＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞の含有率が同等であることにより判断できる。
【００２３】
細胞接着活性は、本発明で使用されるＦＮフラグメント（その細胞接着ドメイン）と細胞の接着を公知の方法でアッセイして調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５２巻、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の接着を測定する方法である。また、ヘパリン結合活性は、本発明に使用されるＦＮフラグメント（そのヘパリン結合ドメイン）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法において、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することにより、同様の方法でフラグメントとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。
【００２４】
組換えＦＮフラグメントの本発明への使用は、入手、取り扱いの容易さの他、その品質の均一性、ウイルス等の混入の危険性が低いという安全面からも好ましい。本発明に使用されるＦＮフラグメントの分子量には特に制限はないが、好適には１〜２００ｋＤａ、より好適には５〜１９０ｋＤａ、更に好適には１０〜１８０ｋＤａである。当該分子量は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定することができる。本発明に使用されるＦＮフラグメントは、上記に記載の複数の異なるＦＮフラグメントを混合して（Ａ）成分として使用することもできる。
【００２５】
以下、本発明の製造工程について具体的に説明する。
本発明は下記工程を包含することを特徴とする、ＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＣＲ７を発現する細胞集団の製造方法である。
工程（１）：Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去、又はＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取することにより培養に供する細胞集団を調製する工程、及び
工程（２）：工程（１）で得られた細胞集団を、下記（Ａ）及び（Ｂ）の存在下で培養し、かつ当該培養中及び／又は当該培養後の拡大培養中、全部もしくは一部の期間において下記（Ｃ）の存在下で培養する工程。
（Ａ）ＦＮ、ＦＮフラグメント及びそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチド
（Ｂ）ＣＤ３リガンド、又はＣＤ３リガンド及びＣＤ２８リガンド
（Ｃ）インターロイキン−４
【００２６】
なお、本願明細書において、前記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を本発明における培養成分と記載することがある。また、「（Ａ）ＦＮ、ＦＮフラグメント及びそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチド」を単に「（Ａ）成分」、「（Ｂ）ＣＤ３リガンド、又はＣＤ３リガンド及びＣＤ２８リガンド」を単に「（Ｂ）成分」、「（Ｃ）インターロイキン−４」を単に「（Ｃ）成分」と記載することがある。
【００２７】
＜１＞本発明の工程（１）
本発明の製造方法の工程（１）では、Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去、又はＣＤ４陽性Ｔ細胞を採取することにより、培養に供する細胞集団を調製することが行われる。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の除去は、細胞表面に発現しているＣＤ８を指標として実施することができ、例えば抗ＣＤ８抗体が固定化されたビーズや培養容器などの担体とＴ細胞を含有する細胞集団とを混合し、前記担体に結合したＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去する、又は、前記担体と結合しない細胞集団を回収することにより実施される。抗ＣＤ８抗体が固定化されたビーズとしては、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ８（インビトロジェン社製）、Ｅｌｉｇｉｘ  ａｎｔｉ−ＣＤ８  ｍＡｂ  ｃｏａｔｅｄ  ｎｉｃｋｅｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（バイオトランスプラント社製）、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）などが好適に使用できる。以下、本明細書において、Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去した細胞集団を「ＣＤ８除去細胞集団」と称する場合がある。
【００２８】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の採取は、細胞表面に発現しているＣＤ４を指標として実施することができ、例えば抗ＣＤ４抗体が固定化されたビーズや培養容器などの担体とＴ細胞を含有する細胞集団とを混合し、前記担体に結合したＣＤ４陽性Ｔ細胞を回収することにより実施される。抗ＣＤ４抗体が固定化された前記担体は、例えば、ＣＤ４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（以上、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ４（インビトロジェン社製）などが好適に使用できる。
【００２９】
本発明において、Ｔ細胞を含有する細胞集団から調製したＣＤ８除去細胞集団、具体的にはＴ細胞を含有する細胞集団としてＰＢＭＣを使用して得られたＣＤ８除去細胞集団は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とともに単球やマクロファージなどを含有する。従って、ＣＤ８除去細胞集団は、細胞表面に発現しているＣＤ４を指標として選別したＣＤ４陽性Ｔ細胞のみからなる細胞集団とは異なる。
【００３０】
本発明の工程（１）又は工程（２）の実施前に、特定の細胞表現型を有する任意の細胞亜集団を採取又は除去することもできる。例えば、ＰＢＭＣからＴ細胞を採取した後に前記工程（１）に供することもでき、またＰＢＭＣからＴ細胞以外の血球成分、例えば単球やマクロファージを除去した後に前記工程（１）に供することもできる。当該操作については、特に限定はないが、細胞表面上の適当なマーカー、例えばＣＤマーカーを指標とすることができる。また、ＰＢＭＣから単球を除去する場合は、単球のプラスティック素材への接着能を利用して、プラスティック製の培養担体で一時的に培養を実施した後に、非接着細胞を回収することで実施することもできる。その他、製造される細胞集団の用途に応じて適宜、任意の細胞亜集団を採取又は除去することができる。
【００３１】
＜２＞本発明の工程（２）
本発明の製造方法の工程（２）では、工程（１）で得られた細胞集団を、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在下で培養し、かつ当該培養中及び／又は当該培養後の拡大培養中、全部もしくは一部の期間において前記（Ｃ）成分の存在下で培養することにより実施される。
【００３２】
当該工程（２）は、工程（１）で得られた細胞集団を、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在下で刺激し、次いで刺激された細胞集団を拡大培養することにより実施される。さらに当該刺激中及び／又は当該刺激後の拡大培養中の全部もしくは一部の期間において、前記（Ｃ）成分の存在下での培養が行われる。
【００３３】
当該工程（２）としては、以下のような態様が例示される。
態様１：工程（１）で得られた細胞集団を、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在下で培養し、かつ当該培養期間中の全部もしくは一部の期間において（Ｃ）成分を共存させる。当該培養により得られた細胞集団を、更に拡大培養し、かつ当該拡大培養中の全部もしくは一部の培養を（Ｃ）成分の存在下で実施する。
態様２：工程（１）で得られた細胞集団を、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在下、かつ（Ｃ）成分の非存在下で培養する。当該培養により得られた細胞集団を、更に拡大培養し、かつ当該拡大培養中の全部又は一部の期間の培養を（Ｃ）成分存在下で実施する。
態様３：工程（１）で得られた細胞集団を、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分存在下で培養し、かつ当該培養中の全部又は一部の期間において（Ｃ）成分を共存させる。当該培養により得られた細胞集団を、更に前記（Ｃ）成分非存在下で拡大培養する。
【００３４】
当該工程（２）中の拡大培養は、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在下による培養後、培養細胞を当該培養容器中で実施することもでき、もしくは、新たな培養容器に移し、新たな培地を添加し希釈して、実施することもできる。当該拡大培養において、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在の有無については特に限定はなく、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分が存在したまま拡大培養を行うこともでき、また前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分のいずれか、もしくは両方を除去した後に拡大培養を行うこともできる。好適には、前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の非存在下で行うことが望ましい。
【００３５】
なお、当該工程（２）は、（Ａ）成分の存在下のみでの培養、（Ｂ）成分の存在下のみでの培養、及び（Ｃ）成分の存在下のみでの培養を個別に実施し、それらを組合せた培養を意味するものではない。
【００３６】
本発明の細胞集団の製造方法において、総培養日数は４〜２０日間とすることが、得られる細胞の質及び培養効率上、好ましい。すなわち、総培養日数が４〜２０日間である場合、得られる細胞集団は、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞の含有率が高い細胞集団であり、細胞医療分野への使用に極めて適している。なお、総培養日数が４日未満の場合は、一般的な免疫療法に使用するには満足のできる細胞数を得ることができない。本発明において、総培養日数としては、より好適には５〜１８日間、更に好適には６〜１６日間が望ましく、高い拡大培養率を実現し、より多くの細胞を取得するという本発明の所望の効果を実現する観点からは、１０〜１４日間が特に望ましい。
【００３７】
従って、本発明における工程（２）は、培養開始時から４日間以上、好ましくは５〜１８日間、更に好適には６〜１６日間実施される。また工程（２）における前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在下での培養は、培養開始時から１日間以上、好ましくは２〜５日間、より好ましくは２〜４日間実施される。工程（２）における拡大培養は、（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在下の培養後、得られた細胞集団を用いて１日間以上、好ましくは２〜１２日間、より好ましくは２〜１０日間実施される。なお、当該工程（２）における、「一部の期間」とは、（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在下で培養し、かつ当該培養中及び／又は当該培養後の拡大培養中の（Ｃ）成分の存在下での培養期間であって、培養開始から培養途中までの期間、培養中のみの期間、又は培養途中から培養終了までの期間を示す。また、当該一部の期間を複数回としてもよい。
【００３８】
当該工程（２）は、免疫療法への使用のために製造される細胞集団の培養工程の全期間としてもよく、また一部の期間としてもよい。当該培養工程の一部の期間である場合、特に限定はないが、工程（２）の前に、工程（１）で得られた細胞集団を（Ａ）成分、（Ｂ）成分及び（Ｃ）成分を含まない公知の培地で培養を行ってもよい。この場合、当該培養で得られた細胞集団は、工程（１）で得られた細胞集団と実質的に同じ性質を有する細胞集団になるようにすることは言うまでもない。本願発明の工程（２）は培養初期に実施されることが好ましく、培養開始時に実施されることがより好適である。
【００３９】
本発明において、（Ａ）成分の培養中の総濃度としては、特に限定はなく、例えば０．００１〜５００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜５００μｇ／ｍＬがより好適である。
【００４０】
本発明において、（Ｂ）成分中のＣＤ３リガンドとしては、ＣＤ３に結合活性を有する物質であれば特に限定はないが、例えば抗ＣＤ３抗体が例示され、特に好適には抗ＣＤ３モノクローナル抗体が例示され、例えばＯＫＴ３〔ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１２４巻、第６号、第２７０８〜２７１３頁（１９８０）〕が例示される。（Ｂ）成分としてＣＤ３リガンドのみを使用する場合、ＣＤ３リガンドの培養中の濃度としては特に限定はなく、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用する場合、０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適である。
【００４１】
本発明において、（Ｂ）成分中のＣＤ２８リガンドとしては、ＣＤ２８に結合活性を有する物質であれば特に限定はないが、例えば抗ＣＤ２８抗体、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ８０が例示され、好適には抗ＣＤ２８モノクローナル抗体が例示される。（Ｂ）成分としてＣＤ３リガンド及びＣＤ２８リガンドを使用する場合、ＣＤ３リガンド及びＣＤ２８リガンドの培養中の濃度としては、特に限定はない。例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を使用する場合、両抗体の総濃度が０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬがより好適である。
【００４２】
上記（Ａ）成分及び／又は（Ｂ）成分は、培地中に溶解して共存させる他、適当な固相、例えばシャーレ、フラスコ又はバック等の細胞培養用器材（培養用容器：開放系のもの、及び閉鎖系のもののいずれをも含む）、又はビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。上記（Ａ）成分の固相への固定化は、例えば、適当な緩衝液に溶解した（Ａ）成分を固相と接触させることにより実施でき、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、及び国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法によっても実施できる。上記（Ｂ）成分で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を使用する場合は、これらの抗体が固定化されたビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣｌｉｎｉＥｘＶｉｖｏ  ＣＤ３／ＣＤ２８（いずれもｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用することもできる。
【００４３】
上記（Ａ）成分及び／又は（Ｂ）成分を固相に固定化しておけば、培養終了後、細胞と固相とを分離するのみで前記成分と得られた細胞集団とを容易に分離することができ、細胞集団への前記成分の混入を防ぐことができる。前記成分の固定化量は、前記器材又は担体を培養に供した際に、当該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるよう選択されるが、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００４４】
本発明において、（Ｃ）成分であるインターロイキン−４は、天然から得られたもの、又は人為的に合成されたもの、すなわち非天然のもののいずれでもよい。人為的に合成されたものの場合、本発明の所望の効果を有するものであれば、そのフラグメント、例えばＮ末端側の１〜３０アミノ酸が欠損したフラグメントであってもよい。また、工程（１）で得られた細胞集団に発現ベクターを用いてインターロイキン−４遺伝子を導入してインターロイキン−４を産生させても良い。（Ｃ）成分の培養中の総濃度としては、特に限定はなく、例えば０．００１〜１０００ｎｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００ｎｇ／ｍＬがより好適である。
【００４５】
本発明の細胞集団の製造方法において使用される培地は、特に限定はなく、Ｔ細胞の拡大培養に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、例えば市販の培地を適宜選択して使用することができる。これらの培地はその本来の構成成分以外にサイトカイン類、ケモカイン類、適当なタンパク質、又はその他の成分を含んでいてもよい。ここでサイトカイン類とは、インターロイキン−４以外のサイトカイン類を示し、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γなどが例示され、好適には、ＩＬ−２を含有する培地が使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度には特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ、特に１〜１×１０４Ｕ／ｍＬが好適である。また、ケモカイン類とは、Ｔ細胞に作用し遊走活性を示すものであれば特に限定はないが、例えばＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２１、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２、ＩＰ−１０、ＭＩＧが例示される。この他、レクチンなどのリンパ球刺激因子を添加することもできる。
【００４６】
更に、培地中に血清又は血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０容量％超〜２０容量％が例示され、また培養段階に応じて使用する血清又は血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでもよい。また、ヒト血清アルブミンのような、単離された血清成分を添加してもよい。
【００４７】
本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば１０〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１×１０２〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１×１０３〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２などの条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液を新鮮な培地を加えて希釈するか、培地を交換するか、もしくは細胞培養用器材を交換することができる。
【００４８】
本発明の細胞集団の製造方法には、培養器材としてシャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽又はバイオリアクター等の細胞培養用器材（容器）を使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグが好適である。大量の細胞を必要とする場合には大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系、閉鎖系のどちらでも実施することができるが、好適には得られる細胞集団の安全性の観点から閉鎖系で実施される。
【００４９】
本発明の製造方法において、外来遺伝子を導入する工程を更に包含することができる。なお、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入対象の細胞集団に人為的に導入される遺伝子のことを意味し、遺伝子導入対象の細胞集団と同種由来のものも包含される。
【００５０】
上記外来遺伝子を導入する工程は、本発明の任意の時点で実施することができる。例えば、前記工程（１）を実施する前の細胞集団、前記工程（１）で得られた細胞集団、又は前記工程（２）で得られた細胞集団へ実施してもよい。また、前記工程（２）と同時もしくは途中で行ってもよい。
【００５１】
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して実施することができる。例えば、ウイルスベクターを用いて、又はウイルスベクターを用いずに実施することができる。それらの方法の詳細については、既に多くの文献が公表されている。
【００５２】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター等が使用される。導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に当該ベクターに外来遺伝子を安定に組込むことができるレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターが特に好適である。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際にレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）などの遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。
【００５３】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、リポソーム、又はリガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法、あるいはリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、又はパーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ又はＲＮＡに組込まれた外来遺伝子が導入される。
【００５４】
導入される外来遺伝子には特に限定はなく、本発明の製造方法により得られる細胞集団を使用する免疫療法や対象疾患に応じて、任意の遺伝子〔酵素、サイトカイン類、又はレセプター類等のタンパク質をコードするものの他、細胞内抗体、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、リボザイムをコードするもの〕が使用できる。これら外来遺伝子としては、例えば、配列特異的ＲＮＡ分解酵素であるＭａｚＦを発現する遺伝子を外来遺伝子としてＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入することにより抗ＨＩＶ効果を示すＣＤ４陽性Ｔ細胞を取得することができる（例えば、国際公開第２００７／０２０８７３号パンフレット及び国際公開第２００８／１３３１３７号パンフレット）。また、Ｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒの細胞外ドメイン遺伝子（ΔＬＮＧＦＲ）等の、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。
【００５５】
前記外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクター又はプラスミド等に挿入して使用することができる。また、エンハンサー配列、ターミネーター配列、又はイントロン配列がベクター内に存在していてもよい。
【００５６】
＜３＞本発明の細胞集団の製造方法
本発明の製造方法は、その製造の過程において細胞集団の細胞増殖率が高いことを１つの特徴とする。本明細書において、細胞増殖率は拡大培養率とも記載する。細胞増殖率は、ある一定の培養期間において、培養開始時の細胞数が培養後に何倍に増殖したのかを示す数値である。ここで、細胞増殖率が高いとは、本発明の細胞集団の製造方法の培養条件（以下、本発明の培養条件と記載する）における細胞集団の細胞増殖率が、（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の存在下で、かつ（Ｃ）成分の非存在下での培養、又は（Ｂ）成分のみの存在下で、かつ（Ｃ）成分の非存在下での培養条件（以下、本発明の培養条件でない場合と記載する）における細胞集団の細胞増殖率と比較して高いことを意味する。好適には本発明の培養条件は、本発明の培養条件ではない場合と比較して、培養開始から７日目以降において、５％以上、より好ましくは１０％以上高い細胞増殖率で細胞集団を得ることができる。
【００５７】
本発明の製造方法により、ＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＣＲ７を発現する細胞の含有率が高い細胞集団、すなわちＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞の含有率の高い細胞集団が得られる。得られた細胞集団中のＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞比率やＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞比率を調べるには、細胞表面抗原マーカーを測定することにより実施できる。例えば、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性、ＣＸＣＲ４陽性を示す細胞である。ＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＣＲ７陽性、ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ６２Ｌ陽性、ＣＸＣＲ４陽性を示す細胞である。これら細胞表面抗原マーカーの陽性率を測定することにより、本発明の製造方法により得られた細胞集団がＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞の含有率が高い細胞集団であることを確認できる。
【００５８】
更に、本発明の製造方法は、前記の方法で得られた細胞集団より、更に、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞を分離する工程を包含してもよい。分離は、例えばセルソーター、磁気ビーズ、又はアフィニティーカラム等による公知の手法で行うことができる。
【００５９】
また、本発明の方法により製造された細胞集団から、必要に応じてＴ細胞をクローン化することにより、安定したＴ細胞株として維持することもできる。本発明の方法により得られた細胞集団を用いて、公知の方法により更に培養することで新たに細胞集団を得ることもできる。
【００６０】
当該工程を実施することにより、更にＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞の含有率が高い細胞集団を得ることが可能である。
【００６１】
＜４＞本発明により製造される細胞集団、およびその使用
本発明は、前記方法により製造される細胞集団も提供する。当該細胞集団は、前述のとおりＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞の含有率が高い細胞集団である。すなわち、当該細胞集団は、（Ａ）成分及び（Ｂ）成分の、又は（Ｂ）成分の存在下で、かつ（Ｃ）成分の非存在下での培養により得られた細胞集団と比較して、下記（１）〜（５）からなる群より少なくとも１つが高比率に含有されている細胞集団である。
（１）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞
（２）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞
（３）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＣＲ７陽性Ｔ細胞
（４）：ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ６２Ｌ陽性Ｔ細胞
（５）：ＣＤ４陽性ＣＸＣＲ４陽性細胞
当該細胞集団としては、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及びＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞をより高含有することが望ましいという観点から、好ましくは前記（１）−（５）のうち少なくとも２つ以上、より好ましくは３つ以上、さらに好ましくは４つ以上、さらにより好ましくはすべてが高比率に含有されている細胞集団であることが例示される。
【００６２】
本発明は医薬に使用するための細胞集団、医薬の製造に使用するための細胞集団を提供する。当該細胞集団は、本発明により製造される細胞集団である。当該細胞集団を含有する医薬は免疫療法への使用に適している。例えば、本発明により製造された細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦活剤又は安定剤と混合し、点滴剤又は注射剤とすることができる。なお、これら治療剤における本発明の細胞集団の含有量、治療剤の投与量、及び当該治療剤に関する諸条件は公知の免疫療法に従って適宜決定できる。例えば、医薬における本発明の細胞集団の含有量としては、特に限定はないが、例えば、好適には１×１０３〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０４〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１×１０５〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、本発明の医薬の投与量としては、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０６〜１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、５×１０６〜５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、更に好ましくは１×１０７〜２×１０１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。更に、当該治療剤による免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤療法治療や放射線治療、又は外科的手術による治療との併用を行うこともできる。
【００６３】
前記の細胞集団の投与が有効である疾患としては、特に限定はないが、例えば、がん、白血病、悪性腫瘍、肝炎、又は感染症疾患（例えばインフルエンザ、結核、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ、ヒト免疫不全ウイルス）感染症、ＡＩＤＳ、ＭＲＳＡ感染症、ＶＲＥ感染症、もしくは深在性真菌症）等が例示される。特に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に感染するＨＩＶが原因となるＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）の治療に有用である。また、本発明の方法により製造される細胞集団は、骨髄移植、放射線照射後等の免疫不全状態での感染症予防又は再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注、抗がん剤治療、放射線治療、抗体治療、温熱治療、他の免疫療法等、従来の治療法と組み合わせて利用できる。また、所望の外来遺伝子を導入する工程を包含することにより、得られた細胞集団は所望の外来遺伝子の発現により効果を示すさまざまな疾患の治療又は予防に有用である。
【００６４】
また本発明は、対象に有効量の前述の方法により得られる細胞集団を投与することを含む疾患の治療方法又は予防方法を提供する。当該対象とは、前述のような疾患に罹患した患者を示す。当該対象としては、ヒトのほか、非ヒト対象などが挙げられる。
【００６５】
本明細書中において有効量とは、前記細胞集団を上記対象に投与した場合に、該細胞集団を投与していない対象と比較して、治療もしくは予防効果を発揮する当該細胞集団の量である。具体的な有効量は、投与形態、投与方法、使用目的及び対象の年齢、体重、症状などによって適宜設定され一定ではないが、好ましくは、上記の医薬と同様にすればよい。投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、点滴や注射などにより投与すればよい。
【００６６】
また、本発明は、前記の本発明の製造方法により得られる細胞集団に対して、少なくとも１つの刺激因子により刺激を与えることにより、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造することが可能である。従って、本発明は、更にこうして得られた細胞集団をも提供する。このようにして得られる活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞を含む細胞集団は、前記の製造方法により得られるＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞を含有する細胞集団と同様に医薬の有効成分として使用できる。ここで刺激因子による刺激とは、刺激因子により前記の本発明の製造方法により得られる細胞集団が活性化されるものであれば特に限定はなく、例えば、本発明の製造方法により得られるＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞を含有する細胞集団と刺激因子の共存下での培養により実施することができる。
【００６７】
本明細書において、前記の刺激因子としてのサイトカインとは、（Ｃ）成分以外のＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞に作用し活性化できるものであれば特に限定はないが、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２７などが例示され、細胞性免疫を増強させる観点からは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２が例示される。
【００６８】
なお、本明細書において細胞集団の製造は、当該細胞集団の誘導（活性化）、維持、拡大培養の各工程、又はこれらを組み合わせた工程を包含する工程を指す。
【実施例】
【００６９】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の実施例で、各実施例中で用いる刺激因子を固定化した培養器材を用いて細胞を培養することを「刺激」と記載することがある。【００７０】
実施例１  インターロイキン−４（ＩＬ−４）及びＦＮフラグメントＣＨ−２９６を用いたＣＤ８除去細胞集団の拡大培養【００７１】
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ社製）及び配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するＦＮフラグメント〔商品名：レトロネクチン（登録商標）、タカラバイオ社製、以下、ＣＨ−２９６と記載〕を固定化した。すなわち１２穴細胞培養プレート（ファルコン社製）に終濃度５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体と終濃度２５μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液（テルモ社製）を０．４ｍＬ／ウェルずつ添加した後、３７℃で５時間インキュベートした。その後、各ウェルからＣＨ−２９６を含むＡＣＤ−Ａ液を吸引除去後、各ウェルを０．５ｍＬ  ＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）で２回洗浄し各実験に供した（以下、抗ヒトＣＤ３抗体／ＣＨ−２９６固定化プレートと記載）。【００７２】
（２）ＣＤ８除去細胞集団の調製
インフォームド・コンセントの得られた健常人ドナーから常法に従い調製したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、Ｂｕｆｆｅｒ１と称す）を用いて１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁した。その後、Ｂｕｆｆｅｒ１で洗浄したＣＤ８ポジティブセレクションビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ８：インビトロジェン社製）をＰＢＭＣ  １×１０７ｃｅｌｌｓあたり２×１０７ビーズとなるように添加し、ローテーターを用いて４℃で３０分間緩やかに攪拌した後、磁気分離装置ＭＰＣ−１５（Ｄｙｎａｌ社製）上に２〜３分静置してビーズ非結合細胞を回収した（以下、ＣＤ８除去細胞集団と記載）。回収したＣＤ８除去細胞集団を５００×ｇで５分間遠心したのち、１％ヒト自己血清、１００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、ニプロ社製）、０．２％ヒト血清アルブミン（バクスター社製）、２．５μｇ／ｍＬ  ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（ブリストルマイヤーズ社製）、及び５０Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン社製）を含むＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製、以下、ＧＴ−Ｔ５０３ＣＭと称す）を用いて４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁した。【００７３】
（３）細胞集団の拡大培養
実施例１−（２）で調製したＣＤ８除去細胞集団の培養を行った。なお、培養は１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭで全期間培養する区（Ｄ０−１２区）及び培養開始４日目以降に上記濃度のＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭで培養する区（Ｄ４−１２区）を設定した。ネガティブコントロールとして、ＩＬ−４を添加しない区を設定した（無添加区）。【００７４】
まず、実施例１−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体／ＣＨ−２９６固定化プレートに、実施例１−（２）で調製したＣＤ８除去細胞集団を１．３ｍＬ／ウェルで添加した。更にｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、０．１％  ＨＳＡを含むＰＢＳで１０μｇ／ｍＬとなるように溶解したもの）をＧＴ−Ｔ５０３ＣＭに２０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、上記各ウェルに１．３ｍＬずつ添加した（ＩＬ−４終濃度：１０ｎｇ／ｍＬ）。Ｄ４−１２区及び無添加区には１．３ｍＬのＧＴ−Ｔ５０３ＣＭを添加し、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。【００７５】
培養開始４日目に、各試験区の細胞数をトリパンブルー染色法にてカウントし、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＧＴ−Ｔ５０３ＣＭで懸濁し、何も固定化していない１２穴細胞培養プレート（ファルコン社製）に４ｍＬ／ウェルで添加して更に希釈培養した。この際、Ｄ０−１２区及びＤ４−１２区は１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭで希釈培養を行った。培養７日目に、何も固定化していない１２穴細胞培養プレート（ファルコン社製）に、Ｄ０−１２区及びＤ４−１２区は上記と同様の濃度のＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭで５倍希釈し、無添加区はＩＬ−４を含まないＧＴ−Ｔ５０３ＣＭで５倍希釈し、４ｍＬ／ウェルで添加して培養した。培養開始１１日目には、２倍希釈する以外は培養開始７日目と同様に希釈培養した。培養開始１２日目の拡大培養率を表１に示す。なお、拡大培養率はトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数を１として、培養開始１２日目の細胞数の倍数を算出した。【００７６】
【表１】
2012020757.tif 000002
【００７７】
表１に示されるように、ＩＬ−４添加培地で培養した区では、無添加区と比較して高い拡大培養率が得られた。すなわち、抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養において、ＩＬ−４を用いることにより拡大培養率が増加することが明らかになった。また、培養４日目以降にＩＬ−４添加培地を使用するよりも、培養全期間に使用する方が拡大培養率が高いことが明らかになった。【００７８】
（４）細胞表面マーカーの解析
実施例１−（３）で得られた培養１２日目の細胞集団を、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社製）を含むＰＢＳ（以下、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳと記載）で洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞集団を懸濁し、抗体反応液１として、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体（ベックマンコールター社製）、ＰｅｒＣＰ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＰＥ‐Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、及びＡＰＣ‐Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を含む抗体液を、更に抗体反応液２として、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体、ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＸＣＲ４抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＰｅｒＣＰ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、及びＡＰＣ‐Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体を含む抗体液をそれぞれ添加し、抗体反応を行った。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞集団を２回洗浄し、再度０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。この細胞集団をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ：ベクトン・ディッキンソン社製）に供し、各々の細胞集団のＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞中の各種細胞表面マーカーの含有率を算出した。なお、全細胞中のＣＤ３陽性率はすべての試験区で９４％以上であった。結果を表２に示す。【００７９】
【表２】
2012020757.tif 000003
【００８０】
表２に示されるように、ＩＬ−４添加培地で培養した区では、無添加区と比較してＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋比率、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋比率及びＣＸＣＲ４＋比率の高い細胞集団が得られた。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋はナイーブＴ細胞の、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋はセントラルメモリーＴ細胞の、ＣＸＣＲ４はナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞の細胞表面マーカーである。すなわち、抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養において、ＩＬ−４を添加することにより、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及びＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞を高含有する細胞集団を効率的に取得できることが明らかとなった。【００８１】
実施例２  ＩＬ−４及びＦＮフラグメントＣＨ−２９６を用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞集団の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
実施例１−（１）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体のみを１２穴細胞培養プレート（ファルコン社製）への固定化、及び洗浄を行い、各実験に供した（以下、抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレートと記載）。更に、抗ヒトＣＤ３抗体／ＣＨ−２９６固定化プレートも調製し、各実験に供した。【００８２】
（２）ＣＤ４陽性Ｔ細胞集団の調製
インフォームド・コンセントの得られた健常人ドナーＴＫ１９及びＴＫ２９から常法に従い調製したＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅを含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭに懸濁した。その後、５００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。得られた細胞集団をＢｕｆｆｅｒ１で１×１０７ｃｅｌｌｓ／８０μＬになるように懸濁後、ｈｕｍａｎ  ＣＤ４  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を１×１０７ｃｅｌｌｓに対して２０μＬ添加し、４℃で１５分間放置した。その後、１×１０７ｃｅｌｌｓに対して１．８ｍＬのＢｕｆｆｅｒ１を添加し、３００×ｇ、１０分間遠心後、上清を除去し、５００μＬのＢｕｆｆｅｒ１に懸濁した。ＶａｒｉｏＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）にＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ＬＳ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）をセットし、３ｍＬ  Ｂｕｆｆｅｒ１を通した後、上記細胞懸濁液を添加した。その後、５ｍＬ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した後、カラムをセパレーターから取り外し、５ｍＬのＢｕｆｆｅｒ１を添加してシリンジにより細胞液を押し出し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞集団を取得した。【００８３】
（３）細胞集団の拡大培養
実施例２−（２）で調製したＣＤ４陽性Ｔ細胞集団の培養を行った。培養は、培養全期間１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭを用い、抗ヒトＣＤ３抗体単独刺激を行う区（抗ＣＤ３刺激区）及び抗ヒトＣＤ３抗体とＣＨ−２９６刺激を行う区（抗ＣＤ３／ＣＨ−２９６刺激区）を設定した。ネガティブコントロールとしてＩＬ−４を添加しない区を設定した（無添加区）。【００８４】
まず、実施例２−（２）で調製したＣＤ４陽性Ｔ細胞集団を遠心して上清を除去後、ＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭ又はＩＬ−４を含まないＧＴ−Ｔ５０３ＣＭでそれぞれ懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。実施例２−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート及び抗ヒトＣＤ３抗体／ＣＨ−２９６固定化プレートに、上記調製した細胞集団をそれぞれ２．６ｍＬ／ウェルで添加した。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。【００８５】
培養開始４日目に、各試験区の細胞数をトリパンブルー染色法にてカウントした。すべての試験区の細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、ＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭ又はＩＬ−４を含まないＧＴ−Ｔ５０３ＣＭでそれぞれ懸濁し、なにも固定化していない１２穴細胞培養プレート（ファルコン社製）に４ｍＬ／ウェルで添加し希釈培養した。培養７日目に、それぞれの培養用培地で４倍希釈し、なにも固定化していない１２穴細胞培養プレート（ファルコン社製）に４ｍＬ／ウェルで培養した。培養開始１０日目には、２倍希釈する以外は培養開始７日目と同様に希釈培養した。培養開始１２日目の拡大培養率を表３に示す。なお、拡大培養率は、トリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数を１として、培養開始１２日目の細胞数の倍数を算出した。表中、＋はＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭを用いた試験区を示し、−は無添加区を示す。【００８６】
【表３】
2012020757.tif 000004
【００８７】
表３に示されるように、抗ＣＤ３／ＣＨ−２９６刺激区ではＩＬ−４添加培地で培養することにより、無添加区と比較して顕著に高い拡大培養率が得られた。また、抗ＣＤ３刺激区ではドナーによっては増殖促進効果が見られなかった。すなわち、ＩＬ−４によるＣＤ４陽性Ｔ細胞集団の拡大培養率は、抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を用いた刺激により特に顕著に高くなることが明らかになった。【００８８】
（４）細胞表面マーカーの解析
実施例２−（３）で得られた培養１２日目の細胞集団を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞を懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体、ＰｅｒＣＰ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ＰＥ‐Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体、及びＡＰＣ‐Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体を含む抗体液を添加し、抗体反応を行った。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、再度０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、各々の細胞集団のＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞中の各種細胞表面マーカーの含有率を算出した。結果を表４及び表５に示す。なお、表中、＋はＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭを用いた試験区を示し、−は無添加区を示す。【００８９】
【表４】
2012020757.tif 000005
【００９０】
【表５】
2012020757.tif 000006
【００９１】
表４及び表５に示されるように、ＩＬ−４添加培地で培養した区では、無添加区と比較してＣＣＲ７＋比率、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋比率、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋比率、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋比率、及びＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋比率の高い細胞集団が得られた。これらの陽性細胞率は、抗ＣＤ３刺激区と比較して抗ＣＤ３／ＣＨ−２９６刺激区でいずれも高く、ＩＬ−４添加培地で培養した場合、更にそれらの陽性率の向上が示された。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋はナイーブＴ細胞の、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋はセントラルメモリーＴ細胞の細胞表面マーカーである。すなわち、抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞集団の培養において、ＩＬ−４を添加することにより、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及びＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞を含む細胞集団を高効率に取得できることが明らかとなった。【００９２】
実施例３  ＩＬ−４及びＦＮフラグメントＣＨ−２９６を用いたΔＬＮＧＦＲ及びＭａｚＦ遺伝子導入ＣＤ４陽性Ｔ細胞集団の拡大培養
（１）ΔＬＮＧＦＲ及びＭａｚＦ遺伝子搭載レトロウイルスベクターの調製
ΔＬＮＧＦＲ及びＭａｚＦ遺伝子搭載レトロウイルスベクターの調製は国際公開第２００８／１３３１３７号パンフレットの実施例１及び２と同様の方法で行った。すなわち、ＨＩＶ−ＬＴＲ−ＭａｚＦカセットがレトロウイルスベクターゲノムの転写とは逆方向に挿入され、かつヒトΔＬＮＧＦＲがヒトＰＧＫプロモーターの下流に順方向に挿入された組換えレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２を取得し、当該プラスミドを用いてエコトロピックＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２ウイルスを作製した後、これをＧａＬＶレトロウイルスパッケージング細胞ＰＧ１３に感染させ、高力価のウイルス産生細胞をクローニングしてレトロウイルスベクター産生細胞株ＰＧ１３／ＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２を樹立した。更に当該産生細胞を用いて、常法によりＧａＬＶ／ＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２ウイルス液を取得した。【００９３】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６の固定化
実施例１−（１）と同様の方法で、抗ヒトＣＤ３抗体／ＣＨ−２９６固定化プレートを調製し、各実験に供した。【００９４】
（３）ＣＤ４陽性Ｔ細胞集団の調製
実施例２−（２）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られた健常人ドナーからＣＤ４陽性Ｔ細胞集団を取得した。【００９５】
（４）遺伝子導入及び拡大培養
実施例３−（３）で調製した細胞集団を遠心して上清を除去後、ＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭ又はＩＬ−４を含まないＧＴ−Ｔ５０３ＣＭでそれぞれ懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。実施例３−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体／ＣＨ−２９６固定化プレートに、上記調製した細胞を２．６ｍＬ／ウェルで添加した。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０日目）。【００９６】
培養開始４日目に、各試験区の細胞数をトリパンブルー染色法にてカウントし、細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、ＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭ又はＩＬ−４を含まないＧＴ−Ｔ５０３ＣＭでそれぞれ調製した。次に、あらかじめ２４穴細胞培養プレート（ファルコン社製）にＣＨ−２９６を固定化したプレート（以下、ＣＨ−２９６固定化プレートと記載する）に実施例３−（１）で調製したＧａＬＶ／ＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２ウイルス液をＧＴ−Ｔ５０３で２倍希釈した後、０．５ｍＬ／ウェルで添加し、３２℃、２０００×ｇ、２時間の条件で遠心操作を行い、プレートへのレトロウイルスベクターの結合を行った。次に上清を除き、ウェルを１ｍＬ  １．５％ＨＳＡを含むＰＢＳで２回洗浄し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した培養開始４日目の細胞液を１ｍＬ添加して３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養し、レトロウイルスベクターによる感染を行った。培養開始６日目に、なにも固定化していない１２穴細胞培養プレートに４ｍＬ／ウェルで５倍希釈培養した。培養開始８日目に、４倍希釈する以外は培養開始６日目と同様に希釈培養した。培養開始１２日目の拡大培養率を表６に示す。なお、拡大培養率はトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数を１として、培養開始１２日目の細胞数の倍数を算出した。表中、＋はＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭを用いた場合を示し、−は無添加の場合を示す。【００９７】
【表６】
2012020757.tif 000007
【００９８】
表６に示されるように、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入を行った場合においても、ＩＬ−４添加培地を使用することにより、無添加区と比較して高い拡大培養率が得られることが明らかになった。【００９９】
（５）遺伝子導入効率及び細胞表面マーカーの解析
実施例３−（４）で得られた培養開始１２日目の細胞集団を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞を懸濁し、抗体反応液１として、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体、ＰｅｒＣＰ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ＰＥ‐Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＬＮＧＦＲ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）、及びＡＰＣ‐Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体を含む抗体液１、更に抗体反応液２として、ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＸＣＲ４抗体（ＰｅｒＣＰ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体、及びＡＰＣ‐Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体を含む抗体液を添加し、抗体反応を行った。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、再度０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、各々の細胞集団のＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞中の各種細胞表面マーカーの含有率を算出した。結果を表７〜１０に示す。表中、＋はＩＬ−４を含むＧＴ−Ｔ５０３ＣＭを用いた場合を示し、−は無添加の場合を示す。【０１００】
【表７】
2012020757.tif 000008
【０１０１】
【表８】
2012020757.tif 000009
【０１０２】
【表９】
2012020757.tif 000010
【０１０３】
【表１０】
2012020757.tif 000011
【０１０４】
表７〜１０に示されるように、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入細胞調製法において、ＩＬ−４添加培養区では、遺伝子導入効率への負の影響はなく、更にＣＣＲ７＋比率、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋比率、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋比率、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋比率、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋比率、及びＣＸＣＲ４＋比率の高い細胞集団が得られることが明らかになった。すなわち、抗ヒトＣＤ３抗体及びＣＨ−２９６を用いた遺伝子導入ＣＤ４陽性Ｔ細胞の培養においても、ＩＬ−４を用いることにより、遺伝子導入ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び遺伝子導入ＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞を含む細胞集団を高効率で増殖できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明により、拡大培養率が高く、ＣＤ６２Ｌ及び／又はＣＣＲ７を発現する細胞集団、すなわちＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性セントラルメモリーＴ細胞を高含有する細胞集団の製造方法が提供される。当該製造方法により得られる細胞集団は、細胞医療及び遺伝子治療による疾患の治療に極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-10.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named RGDS
SEQ ID NO:4 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:5 ; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:6 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:7 ; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:8 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named C-CS1.
【配列表】
2012020757000001.app
【国際調査報告】
2012020757.tif 000012
2012020757.tif 000013
2012020757.tif 000014
2012020757.tif 000015
2012020757.tif 000016
2012020757.tif 000017