(57)【要約】細胞膜上での発現効率が改善されたボルボックス由来の光受容チャネルロドプシンを提供する。  改変されたボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）由来の光受容チャネルロドプシンタンパク質であって、該タンパク質は、ボルボックス由来の光受容チャネルロドプシンタンパク質のＮ末端にクラミドモナス・レインハルトチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域を含むように改変されており、該Ｎ末端領域は細胞膜局在発現に関与しかつクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１の膜貫通ドメインを含まない、前記タンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）由来の光受容チャネルロドプシンタンパク質であって、該タンパク質は、ボルボックス由来の光受容チャネルロドプシンタンパク質のＮ末端にクラミドモナス・レインハルトチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域を含むように改変されており、該Ｎ末端領域は細胞膜局在発現に関与しかつクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１の膜貫通ドメインを含まない、前記タンパク質。
【請求項２】
ボルボックス由来の光受容チャネルロドプシンのＮ末端領域は、これに相当するクラミドモナス・レインハルトチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域で置換されている、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記Ｎ末端領域は、配列番号２に示すアミノ酸配列中の１〜６７番目又は１〜７１番目のアミノ酸を少なくとも含む、請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである、請求項１記載のタンパク質。
（ａ）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号８に示すアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するタンパク質
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである、請求項１記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するタンパク質
【請求項６】
Ｃ末端に蛍光タンパク質をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
プロモーターと機能的に連結された請求項７記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項記載のタンパク質を発現する細胞。
【請求項１０】
視細胞である請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項記載のタンパク質、請求項７記載のポリヌクレオチド、又は請求項８記載の発現ベクターの使用。
【請求項１２】
網膜外層の障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症又は網膜はく離である、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項記載のタンパク質、請求項７記載のポリヌクレオチド、又は請求項８記載の発現ベクターを有効成分として含む、網膜外層の障害を治療するための医薬組成物。
【請求項１４】
網膜外層の障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症又は網膜はく離である、請求項１３記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変型光受容チャネルロドプシン、具体的には細胞膜上での発現効率が改善されたボルボックス由来の光受容チャネルロドプシンに関する。
【背景技術】
【０００２】
本邦に於ける年間失明者数は１６０００人におよび、その要因は、重度の外傷を除き、網膜内層の障害と、外層の障害に起因するものの大きく２つに分けられる。網膜色素変性、加齢黄斑変性といった疾患では、網膜外層が選択的に変性することが知られている。
網膜の光受容とその情報伝達機構についてみると、入射した光、映像情報は網膜外層に位置する光受容細胞（視細胞）で受容され、網膜内層に伝達される。その情報は網膜内層に位置する、視神経を構成する神経節細胞によって脳に伝えられる。このように光すなわち映像を受容できる細胞は網膜において視細胞のみであり、視細胞が何らかの要因で変性、消失すると、その他の細胞が正常であったとしても失明に至る。
視細胞の光受容様式によれば、視細胞に存在する光受容タンパク質で光受容後、様々なタンパク質の連鎖反応が必要であることが分かっている。このような様式から、従来、単一の遺伝子を導入することによって、光受容能を賦与することは不可能であると考えられてきた。これに関連して、神経細胞に光受容能を与えるためには、最低限、３種類のタンパク質（すなわち、アレスチン、オプシン、Ｇ蛋白質αサブユニット）を１つの細胞に導入することが必要であることが報告されている（非特許文献１）。
Ｎａｇｅｌら（非特許文献２）は、緑藻類クラミドモナス（Ｃｈａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）より単離されたチャネルロドプシン−２（以下、「ＣｈＲ２」とも称する）が光受容能と陽イオン選択的透過性を併せ持つこと、及びＣｈＲ２遺伝子を導入することによって培養哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ）等に光受容能を与えることができることを報告した。
本発明者らは、網膜外層の障害に起因する遺伝盲ラットにおいて、チャネルロドプシン−２遺伝子を残存する網膜神経細胞に導入し、視機能を再建することを試みたところ、遺伝子導入前は光に対する視覚野の応答（視覚誘発電位）は全く認められなかったのに対し、遺伝子導入後は光に対する応答が認められること、及び視覚野の応答が見られる最低照度は２４０ｌｕｘであり、正常な網膜に比較して、光感受性が低いことを報告した（非特許文献３）。
このように緑藻類から見出された光受容タンパク質は視覚への応用が期待されている。しかし、クラミドモナス由来のＣｈＲ２は光感受性が青色に限定されているために、視覚が回復したとしても青色のみしか見ることができない。
一方、緑藻類ボルボックスから赤色に感受性を有する同様の遺伝子が見出されたが（非特許文献４）、哺乳類の細胞で発現させた場合、細胞膜上での発現効率が悪く、機能的に不十分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−２１７８６６
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｚｅｍｅｌｍａｎ  ＢＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．２００２  Ｊａｎ  ３；３３（１）：１５−２２
【非特許文献２】Ｎａｇｅｌ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＳｃｉＵ  Ｓ  Ａ．２００３  Ｎｏｖ  ２５；１００（２４）：１３９４０−５
【非特許文献３】Ｔｏｍｉｔａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．，４８（８）：３８２１−６，２００７
【非特許文献４】Ｆｒｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  １１，Ｎｕｍｂｅｒ  ６，Ｊｕｎｅ  ２００８：ｐ６３１−６３３
【発明の概要】
【０００５】
そこで本発明は、細胞膜上での発現効率が改善されたボルボックス由来の光受容チャネルロドプシンを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、クラミドモナス・レインハルトチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域を、ボルボックス由来のチャネルロドプシンと融合させることで、該チャネルロドプシンの細胞膜上での発現効率を改善できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
（１）改変されたボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）由来の光受容チャネルロドプシンタンパク質であって、該タンパク質は、ボルボックス由来の光受容チャネルロドプシンタンパク質のＮ末端にクラミドモナス・レインハルトチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域を含むように改変されており、該Ｎ末端領域は細胞膜局在発現に関与しかつクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン−１の膜貫通ドメインを含まない、前記タンパク質。
（２）ボルボックス由来の光受容チャネルロドプシンのＮ末端領域は、これに相当するクラミドモナス・レインハルトチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のチャネルロドプシン−１のＮ末端領域で置換されている、上記（１）記載のタンパク質。
（３）前記Ｎ末端領域は、配列番号２に示すアミノ酸配列中の１〜６７番目又は１〜７１番目のアミノ酸を少なくとも含む、上記（１）記載のタンパク質。
（４）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである、上記（１）記載のタンパク質。
（ａ）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号８に示すアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するタンパク質
（５）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかである、上記（１）記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）のポリペプチドと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するタンパク質
（６）Ｃ末端に蛍光タンパク質をさらに含む、上記（１）〜（５）のいずれか記載のタンパク質。
（７）上記（１）〜（６）のいずれか記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（８）プロモーターと機能的に連結された上記（７）記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（９）上記（１）〜（６）のいずれか記載のタンパク質を発現する細胞。
（１０）視細胞である上記（９）記載の細胞。
（１１）網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬の製造における、上記（１）〜（６）のいずれか記載のタンパク質、上記（７）記載のポリヌクレオチド、又は上記（８）記載の発現ベクターの使用。
（１２）網膜外層の障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症又は網膜はく離である、上記（１１）記載の使用。
（１３）上記（１）〜（６）のいずれか記載のタンパク質、上記（７）記載のポリヌクレオチド、又は上記（８）記載の発現ベクターを有効成分として含む、網膜外層の障害を治療するための医薬組成物。
（１４）網膜外層の障害は、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症又は網膜はく離である、上記（１３）記載の医薬組成物。
本発明によれば、細胞膜上での発現効率が改善されたボルボックス由来の光受容チャネルロドプシンが提供される。
本発明に係る光受容チャネルロドプシンは、黄色光〜赤色光、好ましくは青色光〜赤色光に対する感受性を有し、かつ効率的な細胞膜局在発現を示すため、例えば、哺乳類の視機能の再建に利用することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−１８５４５５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、ＣｈＲ−ＨＳＢ（左）及びｈＣｈＲ−ＹＲ（右）発現用のアデノウイルス随伴ウイルスベクターの構成を示す。
図２は、ＣｈＲ−ＨＳＢ（左）及びｈＣｈＲ−ＹＲ（右）の塩基配列を示す。下線部はクラミドモナスＣｈＲ１の配列部分を示す。
図３は、非改変型ＶｏｌＣｈ及び改変型ＶｏｌＣｈのヒト繊維肉腫細胞株ＨＴ１０８０細胞での発現差を示す写真図である。図中、左図は、位相差顕微鏡写真と蛍光顕微鏡写真の合成画像を示し、右図は蛍光顕微鏡写真を示す。
図４は、クラミドモナスＣｈＲ２又はＣｈＲ−ＨＳＢ導入後の視覚誘発電位測定の結果を示す。
図５は、ＣｈＲ−ＨＳＢ発現後の網膜伸展標本の写真図である。図中、左図は低倍率（１００倍）写真を示し、右図は同部位の高倍率（２００倍）写真を示す。
図６は、ｈＣｈＲ−ＹＲ導入後の波長感受性測定の結果を示す。内向き電流（左）、記録された内向き電流より各波長の刺激強度から換算して得られた波長特性（右）
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）由来の改変型光受容チャネルロドプシン（以下、改変型ロドプシンタンパク質とも称する）に関する。
本発明に係る改変型ロドプシンタンパク質は、ボルボックス由来のチャネルロドプシン（以下、ＶｏｌＣｈＲとも称する）が、そのＮ末端にクラミドモナス・レインハルトチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のチャネルロドプシン−１（以下、ＣｈＲ１とも称する）のＮ末端領域を含むように改変されており、その結果、細胞膜上、特に哺乳類の細胞膜上での発現効率が改善されていることを特徴とする。
１．改変型ロドプシンタンパク質
１．１  ボルボックスチャネルロドプシン（ＶｏｌＣｈＲ）
本発明において、ＶｏｌＣｈＲとして、チャネルロドプシン−１（以下、ＶｏｌＣｈＲ１とも称する）又はチャネルロドプシン−２（以下、ＶｏｌＣｈＲ２とも称する）のいずれを使用してもよい。ＶｏｌＣｈＲ１遺伝子の塩基配列の一例を配列番号３に示し、配列番号３に示す塩基配列によってコードされるＶｏｌＣｈＲ１のアミノ酸配列を配列番号４に示す。またＶｏｌＣｈＲ２遺伝子の塩基配列の一例を配列番号５に示し、配列番号５に示す塩基配列によってコードされるＶｏｌＣｈＲ２のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
本発明で使用するＶｏｌＣｈＲは、配列番号４又は６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、配列番号４又は６に示すアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつ配列番号４又は６に示すアミノ酸配列からなるＶｏｌＣｈＲ１又はＶｏｌＣｈＲ２と同等又はそれ以上の生物学的活性を有するもの、或いは配列番号４又は６に示すアミノ酸配列と実質的に同一の配列同一性を有し、かつ配列番号４又は６に示すアミノ酸配列からなるＶｏｌＣｈＲ１又はＶｏｌＣｈＲ２と同等又はそれ以上の生物学的活性を有するもの（以下、「ＶｏｌＣｈＲ変異型ポリペプチド」ともいう）を含んでいる。
本明細書において、ＶｏｌＣｈＲ変異型ポリペプチドの関連で使用する「複数個」とは、５０個以下の整数、好ましくは３０個以下の整数、より好ましくは１０個以下の整数、例えば２〜９個、２〜７個、２〜５個である。
また「実質的に同一の配列同一性」とは、配列番号４又は６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有することをいう。なお、同一性の％は、複数（２つ）のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＡＮＡＳＹＳ、ＢＬＡＳＴなど）をデフォルトの設定で使用して算出した値をいう。
本明細書において、ＶｏｌＣｈＲ変異型ポリペプチドの関連で使用する「同等の生物学的活性」とは、例えば光感受性、チャネル機能といった生物学的な活性の強さが実質的に同一であることを指す。またこの用語は、実質的に同質の生物学的活性を有する場合を含んでもよく、ここでいう「同質」の生物学的活性とは、光感受波長や、例えばイオン透過活性の性質が同一であることをいう。
また、ＶｏｌＣｈＲ遺伝子としては、配列番号３又は５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、配列番号３又は５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号４又は６に示すアミノ酸配列からなるＶｏｌＣｈＲと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「ＶｏｌＣｈＲ変異型ポリヌクレオチド」ともいう）、並びに、配列番号３又は５に示す塩基配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％又は９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、配列番号４又は６に示すアミノ酸配列からなるＶｏｌＣｈＲと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「ＶｏｌＣｈＲ変異型ポリヌクレオチド」ともいう）を含む。
本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば３０℃〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは４０℃〜４５℃で、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、および１×ＳＳＣ溶液、０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びＧＣ含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
ＶｏｌＣｈＲ変異型ポリヌクレオチドは、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異は、例えば部位特異的変異導入法、ＰＣＲを利用した変異導入法などを用いて常法により導入することができる（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＳｃｉＵＳＡ．，１９８４  ８１：５６６２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）。
また上述したＶｏｌＣｈＲ変異型ポリペプチド、又はＶｏｌＣｈＲ変異型ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、ＶｏｌＣｈＲと同等の生物学的活性を有するか否かは、例えば、電気生理学的手法を用いた膜電位記録や蛍光プロープを用いた細胞内イオン濃度変化を調べることによってアッセイすることができる。
また本発明において、ＶｏｌＣｈＲとして、必ずしもＶｏｌＣｈＲの全長を使用する必要はなく、光感受性及びチャネル機能を担う７回膜貫通ドメインを保持している限り、ＶｏｌＣｈＲの断片を使用してもよい。そのようなＶｏｌＣｈＲ断片として、これに限定されるものではないが、配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸２４〜３００、及び配列番号６に示すアミノ酸配列のアミノ酸２７〜３００などを挙げることができる。
１．２  クラミドモナスチャネルロドプシン−１（ＣｈＲ１）のＮ末端領域
ＣｈＲ１遺伝子の塩基配列の一例を配列番号１に示し、配列番号１に示す塩基配列によってコードされるＣｈＲ１のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
本発明は、一部には、ＣｈＲ１のＮ末端領域が、細胞膜上、特に哺乳類細胞膜上での局在発現に関与するという知見を基礎としている。したがって、本明細書で使用する用語「ＣｈＲ１のＮ末端領域」とは、ＶｏｌＣｈＲに細胞膜局在発現を付与するＣｈＲ１のＮ末端領域をいい、ＣｈＲ１の推定膜貫通ドメインを含まないことを特徴とする。具体的に、ＣｈＲ１のＮ末端領域は、配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜８３番目のアミノ酸からなるポリペプチド（以下、１〜８３ポリペプチドとも称する）若しくはその変異体（以下、変異型１〜８３ポリペプチドとも称する）、又はそれらの断片である。なお、本明細書で使用する「細胞膜局在発現を付与する」とは、例えば上記ＣｈＲ１のＮ末端領域を含まないＶｏｌＣｈＲに比較して、細胞膜上での発現が増加する又は膜タンパク質としての機能が向上することをいう。
変異型１〜８３ポリペプチドとしては、１〜８３ポリペプチドにおいて、１個若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有し、かつ１〜８３ポリペプチドと同等以上の生物学的活性を有するもの、或いは１〜８３ポリペプチドと実質的に同一の配列同一性を有し、かつ１〜８３ポリペプチドと同等以上の生物学的活性を有するものを含んでいる。
本明細書において、変異型１〜８３ポリペプチドの関連で使用する「数個」とは、１０個以下の整数、好ましくは５個以下の整数、例えば４個、３個、２個をいう。
また「実質的に同一の配列同一性」とは、１〜８３ポリペプチドと少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有することをいう。なお、同一性の％は、複数（２つ）のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＡＮＡＳＹＳ、ＢＬＡＳＴなど）をデフォルトの設定で使用して算出した値をいう。
本明細書において、変異型１〜８３ポリペプチドの関連で使用する「同等の生物学的活性」とは、例えばＶｏｌＣｈＲと融合させた際に、１〜８３ポリペプチドと同程度の細胞膜局在発現を示すことをいう。
また、１〜８３ポリペプチドのコード遺伝子としては、配列番号１に示すヌクレオチド９８〜３４６からなるポリヌクレオチド（以下、９８〜３４６ポリヌクレオチドとも称する）に限定されず、９８〜３４６ポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、１〜８３ポリペプチドと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、「変異型９８〜３４６ポリヌクレオチド」とも称する）を含んでいる。
本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば３０℃〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは４０℃〜４５℃で、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、および１×ＳＳＣ溶液、０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びＧＣ含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
変異型９８〜３４６ポリヌクレオチドは、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異は、例えば部位特異的変異導入法、ＰＣＲを利用した変異導入法などを用いて常法により導入することができる（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＳｃｉＵＳＡ．，１９８４  ８１：５６６２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）。
１〜８３ポリペプチド又は変異型１〜８３ポリペプチドの断片は、ＶｏｌＣｈＲに細胞膜局在発現を付与できる限り、どのような断片であってもよい。好ましくは、前記断片は、少なくとも、配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜６７番目又は１〜７１番目のアミノ酸を含んでいる。
また上述した変異型１〜８３ポリペプチド、変異型９８〜３４６ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、又は１〜８３ポリペプチドの断片が、１〜８３ポリペプチドと同等の生物学的活性を有するか否かは、例えば、これらをＮ末端に含むＶｏｌＣｈＲを蛍光タンパク質との融合タンパク質として細胞内（例えば哺乳類細胞内）で発現させ、細胞膜上での発現の程度を視覚的に確認することによって判定することができる。
１．３  改変型ロドプシンタンパク質
本発明に係る改変型ロドプシンタンパク質は、ＶｏｌＣｈＲのＮ末端にＣｈＲ１のＮ末端領域を含む、融合ポリペプチドである。
この改変型ロドプシンタンパク質は、ＶｏｌＣｈＲのＮ末端にＣｈＲ１のＮ末端領域が単純に付加されたものであってもよいし、ＶｏｌＣｈＲのＮ末端がＣｈＲ１のＮ末端領域で置換されたものであってもよい。
本発明に係る改変型ロドプシンタンパク質において、ＶｏｌＣｈＲのＮ末端がＣｈＲ１のＮ末端領域で置換されたものである場合、置換されるべきＶｏｌＣｈＲのＮ末端領域は、ＶｏｌＣｈＲの７回膜貫通ドメインが保存される限り特に制限されない。したがって、ＶｏｌＣｈＲ１を使用する場合には、配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜２３の全て又は一部をＣｈＲ１のＮ末端領域で置換することができ、同様にＶｏｌＣｈＲ２を使用する場合には、配列番号６に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜２６の全て又は一部をＣｈＲ１のＮ末端領域で置換することができる。
上記のようにして製造される本発明の改変型ロドプシンタンパク質の好ましい例として、配列番号８又は１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（本明細書中、それぞれＣｈＲ−ＨＳＢ、ｈＣｈＲ−ＹＲとも称する）、又はその機能的同等物が挙げられる。ＣｈＲ−ＨＳＢ又はｈＣｈＲ−ＹＲの機能的同等物としては、例えば、ＣｈＲ−ＨＳＢ又はｈＣｈＲ−ＹＲのアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含むか、またはＣｈＲ−ＨＳＢ又はｈＣｈＲ−ＹＲのアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％又は９８％、最も好ましくは９９％の配列同一性を有し、かつＣｈＲ−ＨＳＢ又はｈＣｈＲ−ＹＲと同等又はそれ以上の生物学的活性を有するポリペプチドが挙げられる。なおここでいう「数個」とは、３０個以下の整数、好ましくは１０個以下の整数、例えば２〜９個、２〜７個、２〜５個であり、配列同一性％は、複数（２つ）のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＡＮＡＳＹＳ、ＢＬＡＳＴなど）をデフォルトの設定で使用して算出した値をいう。
本発明の改変型ロドプシンタンパク質の関連で使用する「同等の生物学的活性」とは、光感受性、チャネル機能、細胞膜局在発現といった生物学的な活性の強さが実質的に同一であることをいう。
本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、好ましくは、そのＣ末端に蛍光タンパク質を含むことができる。ここで使用する「蛍光タンパク質」とは、可視光（すなわち、３９０ｎｍ〜７７０ｎｍの波長光）で励起される際にＶｏｌＣｈＲの感受波長の光を発するか、或いは、イオン濃度の変化に伴ってＶｏｌＣｈＲの感受波長の光を発する、任意の蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質の存在により、ＶｏｌＣｈＲは直接入射する光と共に、蛍光タンパク質が発する光も受容することができるため、低照度でのＶｏｌＣｈＲの光受容量を増大させることができる。
本発明で使用することができる蛍光タンパク質として、これに限定されるものではないが、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、ＤｓＲｅｄなどを挙げることができる。
１．４  改変型ロドプシンタンパク質の作製
本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、ＶｏｌＣｈＲ遺伝子及びＣｈＲ遺伝子の配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により製造することができる。
具体的には、まず本発明の改変型ロドプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、「改変型ロドプシン遺伝子」ともいう）を調製する。改変型ロドプシン遺伝子は、当業者に公知の手法によって調製することができる。例えば、ＶｏｌＣｈＲ遺伝子の配列情報と、ＣｈＲ１遺伝子の配列情報とに基づき、所望の改変型ロドプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを化学合成することができる。或いは、上記配列情報に基づいて、ＶｏｌＣｈＲ遺伝子の所望領域を増幅するＰＣＲプライマーと、ＣｈＲ１遺伝子の所望領域を増幅するＰＣＲプライマーとを設計・化学合成し、対象の生物から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって、ＶｏｌＣｈＲ遺伝子領域と、ＣｈＲ１遺伝子領域とをそれぞれ増幅し、これらを連結することによって調製してもよい。
次に、プロモーターと機能的に連結された、本発明の改変型ロドプシン遺伝子を、宿主菌体内で複製維持が可能であり、このタンパク質を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できる発現ベクターに組み込み、得られた組換え発現ベクターを用いて宿主を形質転換し、宿主において本発明の改変型ロドプシンタンパク質を生産させることができる。組換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）を参照することができる。
発現ベクターとしては、これに限定されるものではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２８、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、及び他のプラスミドＤＮＡ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、及び他のプラスミドＤＮＡ）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、及び他のプラスミドＤＮＡ）、λファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）、哺乳動物用プラスミド（ｐＣＭＶ、ｐＳＶ４０）、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクター等）、植物用ベクター（バイナリベクターｐＢＩ系等）、コスミドベクターなどを用いることができる。
本明細書で使用する「機能的に連結された」とは、プロモーター配列が目的のポリヌクレオチド配列の転写を開始することができるような、プロモーター配列と目的のポリヌクレオチド配列との間の機能的な結合をいう。
プロモーターは特に制限されず、宿主に応じて適するプロモーターを選択すればよく、また当該技術分野で公知の構成的プロモーター、誘導性プロモーターのいずれを用いてもよい。本発明においては、特に構成的プロモーターを用いることが好ましい。例えば本発明において使用することができるプロモーターとして、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＣａＭＶプロモーター、解糖系酵素プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ｔｈｙ１プロモーターなどを挙げることができる。
改変型ロドプシン遺伝子の発現ベクターへの挿入は、例えば、改変型ロドプシン遺伝子にフランキングする制限酵素部位を作製又は連結し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行う。発現ベクターは、プロモーター及び改変型ロドプシン遺伝子の他、必要に応じてエンハンサー及び他のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（アンピシリン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカーなどの薬剤耐性遺伝子マーカー、ＬＥＵ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性相補遺伝子マーカー、ＡＰＨ、ＤＨＦＲ、ＴＫなどの優性選択マーカーなど）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）などを含んでもよい。
宿主を形質転換するには、プロトプラスト法、スフェロプラスト法、コンピテントセル法、ウイルス法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ジーンボンバートメント法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション等を用いて行うことができる。
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件で培養する。形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２５〜３７℃で３〜６時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は、必要に応じて、組換え発現ベクターに挿入した選択マーカーに応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。また形質転換に使用する宿主は、本発明の改変型ロドプシンタンパク質を発現できるものであれば特に制限されるものではなく、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）、動物細胞（ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、形質転換体の培養により得られた培養物（培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞若しくは菌体のホモジェネートなど）から一般的な方法によって分取や精製を行い、限外濾過濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等によって、その活性を保持するかたちで得ることができる。或いは、本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、単離・精製を行うことなく、該タンパク質を発現する細胞の形態で提供してもよい。この場合、形質転換に使用する宿主細胞は、その後の用途に適した宿主細胞、例えば視細胞、好ましくヒト視細胞である。
また、本発明の改変型ロドプシンタンパク質を医療用途に使用する場合には、該タンパク質発現用ベクターの形態で提供してもよい。この場合には、細胞への導入効率、該細胞内での複製維持、安定性、発現効率等に優れた発現ベクターを用いることが好ましい。このようなベクターとして、これに限定されるものではないが、例えばアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、（自立複製可能な）プラスミド、トランスポゾンなどを挙げることができる。
本発明の改変型ロドプシンタンパク質発現用ベクターは、例えばＴｏｍｉｔａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００７  Ａｕｇ；４８（８）：３８２１−６；及びＳｕｇａｎｏ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００５  Ｓｅｐ；４６（９）：３３４１−８に記載される方法に従って製造することができる。
２．治療用途
本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、細胞膜上、特に哺乳類細胞膜上での効率的な局在発現を示すチャネルロドプシンである。またこの改変型ロドプシンタンパク質は、黄色光〜赤色光に対する感受性を有するボルボックス由来のチャネルロドプシンの光感受性及びチャネル機能を保持しているため、黄色〜赤色を認識可能な視機能の構築に利用することができる。好ましくは、本発明の改変型ロドプシンタンパク質は、青色〜赤色光に対する感受性を有し、青色〜赤色を認識可能な視機能の構築に利用することができる。
したがって、本発明の改変型ロドプシンタンパク質、及び該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、網膜外層の障害を患う被検体の治療に有用である。
「網膜外層の障害」とは、網膜外層に存在する視細胞が変性、消失するなどして視機能不全又は視機能障害を生じているが、視細胞以外の細胞は依然として正常なままであるか又は機能の一部が保持されている任意の疾患をいう。本発明において、このような疾患として、これに限定されるものではないが、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜はく離などを挙げることができる。
本明細書で使用する「被検体」とは、網膜外層の障害に起因して、失明している被検体、又は失明のリスクを有する被検体を意味する。本発明において、被検体はヒトに限らず、その他の哺乳動物であってもよい。その他の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどが挙げられる。
また本明細書で使用する「網膜外層の障害を患う被検体の治療」とは、網膜外層の障害に起因して失明している又は失明のリスクを有する被検体において、本発明の医薬の投与前と比較して、視機能を回復することを指す。
本発明の改変型ロドプシンタンパク質、及び該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、必要に応じて、光応答域が異なる他の緑藻類由来のチャネルロドプシン（例えばクラミドモナス由来のチャネルロドプシン−１又は−２）と組合せて用いることで、可視光域に対するより広い感受性を有する視機能の再建に利用することができる。
２．１  医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本発明の改変型ロドプシンタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分とし、網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬として製剤化される。すなわち、本発明の医薬は、治療上有効量の融合タンパク質又は発現ベクターを含むものである。「治療上有効量」とは、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量を指し、その量は、動物を用いた試験、臨床試験の実施により当業者によって適宜決定されるが、投与対象の被検体の年齢、体重、性別、疾患の状態又は重篤度、投与方法などが考慮されるべきである。ウイルスの場合、ウイルス量は、例えば１０１２〜１０１３ｃａｐｓｉｄｓ／ｍｌ（例えば、約１０１３ｃａｐｓｉｄｓ／ｍｌ）である。
本発明の医薬の製剤化に際し、上記有効成分は１以上の薬学的に許容される担体と共に製剤化される。薬学的に許容される担体としては、これに限定されるものではないが、各種緩衝液、例えば生理食塩水、リン酸塩、酢酸塩などの緩衝液を挙げることができる。
また本発明の医薬は、本発明による効果を阻害しない限り、上記成分以外の他の治療成分を含有させてもよい。かかる治療成分として、例えば網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、又は網膜はく離の治療剤として公知の薬剤が挙げられる。
本発明の医薬は、例えば局所投与用の注射剤、又は点眼剤若しくは洗眼剤に製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。あるいは、本発明の医薬は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水などで使用前に再構成するための凍結乾燥剤としてもよい。
本発明の医薬の投与は、被検体の患部、すなわち網膜への直接的な注射、又は硝子体への直接的な接触によって行うことが好ましい。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【０００８】
ＣｈＲ−ＨＳＢ及びｈＣｈＲ−ＹＲの構築
ＣｈＲ−ＨＳＢ
クラミドモナス由来のチャネルロドプシン１（ＣｈＲ１；Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ＃ＡＦ３８５７４８）の９８〜３０９領域及びボルボックス由来のチャネルロドプシン２（ｖｏｌＣｈＲ２；ＥＵ２８５６６０）の１２３〜９４５領域をＰＣＲ法により増幅し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した。このアデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドは、マルチクローニングサイトの３’領域に蛍光タンパク質遺伝子ｐｍＣｈｅｒｒｙが配置されており、目的遺伝子はＣ末領域に蛍光タンパク質ｐｍＣｈｅｒｒｙを持つ融合タンパク質として発現される（図１左：ＡＡＶ−ＣｈＲ−ＨＳＢ−Ｃｈｅｒｒｙ）。
ｈＣｈＲ−ＹＲ
クラミドモナス由来のチャネルロドプシン１（ＣｈＲ１；Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ＃ＡＦ３８５７４８）の９８〜２９７領域（２４４の位置のＣをＡに置換）及びボルボックス由来のチャネルロドプシン１（ｖｏｌＣｈＲ１；ＥＵ６２２８５５）の７２〜９０３領域をＰＣＲ法により増幅し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した。このアデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドは、マルチクローニングサイトの３’領域に蛍光タンパク質遺伝子ｐｍＣｈｅｒｒｙが配置されており、目的遺伝子はＣ末領域に蛍光タンパク質ｐｍＣｈｅｒｒｙを持つ融合タンパク質として発現される（図１右：ＡＡＶ−ｈＣｈＲ−ＹＲ−Ｃｈｅｒｒｙ）。図２にＣｈＲ−ＨＳＢ、ｈＣｈＲ−ＹＲの塩基配列を示す。
ウイルスベクターの作製
ウイルスベクターの作製はＡＡＶヘルパーフリーシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ  Ｊａｌｌａ，ＣＡ）のマニュアルに従い行った。目的遺伝子を含むプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣｈＲ−ＨＳＢ−ｐｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＡＡＶ−ｈＣｈＲ−ＹＲ−ｐｍＣｈｅｒｒｙ）以外のウイルス作製に必要な２種のプラスミド（ｐＡＡＶ−ＲＣ、ｐＨｅｌｐｅｒ）は、ＡＡＶヘルパーフリーシステムと同様のプラスミドを使用した。
１５ｃｍ培養皿に培養した２９３Ｔ細胞に３種類のプラスミド各１５μｇ（ｐＡＡＶ−ＣｈＲ−ＨＳＢ−ｐｍＣｈｅｒｒｙ又はｐＡＡＶ−ｈＣｈＲ−ＹＲ−ｐｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＡＡＶ−ＲＣ、及びｐＨｅｌｐｅｒ）をリン酸カルシウム法により共トランスフェクトした。詳細には、３種類のプラスミドを加えたチューブをタッピングし、０．３Ｍ  ＣａＣｌ２１．５ｍｌを添加、転倒攪拌した。このプラスミドを別のチューブに用意した１．５ｍｌの２Ｘ  ＨＢＳ（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１）へ加えた。再度転倒攪拌し、２９３Ｔ細胞へ滴下添加した。この２９３Ｔ細胞を３７℃で培養し、３日後に細胞を回収した。この細胞からウイルス粒子を精製し、ウイルスベクターを得た。
培養細胞による遺伝子発現部位の確認
１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）で培養したヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０細胞を用いて導入遺伝子（ＣｈＲ−ＨＳＢ又はｈＣｈＲ−ＹＲ）の細胞内の発現部位を調べた。ＣｈＲ−ＨＳＢ又はｈＣｈＲ−ＹＲを含むウイルス溶液を２％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で１００倍希釈し、４時間培養し感染させた。感染３日後に蛍光顕微鏡下で細胞内の局在を観察した（図３）。
図３から、非改変型ＶｏｌＣｈＲは主に小胞体で発現している一方、改変型ＶｏｌＣｈＲは細胞質及び細胞膜でも発現していることがわかる。このように、ＶｏｌＣｈＲへのＣｈＲ１Ｎ末端領域の付加が、遺伝子発現効率の上昇、及び細胞膜上での発現をもたらすことが明らかになった。
実験動物
６ヶ月齢のＲｏｙａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ（ＲＣＳ：ｒｄｙ／ｒｄｙ）ラットを実験に用いた。ＲＣＳラットは生後一旦正常に網膜が形成されるものの、生後三週より視細胞の変性が始まり、生後３ヶ月で視細胞がほぼ消失し失明に至る。６ヶ月齢のＲＣＳラットでは視覚誘発電位は記録されない。
網膜への遺伝子導入
ケタミン（６６ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（３．３ｍｇ／ｋｇ）の混合麻酔下で、眼球結膜を１ｍｍ程度切開し、毛様体扁平部より、３２ゲージマイクロシリンジを刺入し、硝子体内に５μｌのウイルス溶液を注入した。今回作製したＣｈＲ−ＨＳＢとクラミドモナスから既に単離されている、青色に感受性を持つクラミドモナス由来ＣｈＲ２の機能的な差を調べるために、片眼にＣｈＲ−ＨＳＢを含むウイルス、対側眼にクラミドモナス由来のＣｈＲ２を含むウイルスを投与し、視覚誘発電位を測定した。
視覚誘発電位測定
硝子体内へのウイルス注入後２ヶ月に視覚誘発電位を測定した。視覚誘発電位測定は、日本光電のＮｅｕｒｏｐａｃｋ（ＭＥＢ−９１０２）を使用し記録した。ＶＥＰ記録の電極は頭皮を切開し頭蓋を露出させた状態でブレグマからラムダへ正中線を６．８ｍｍ、その中心から３ｍｍの左右の位置の硬膜上へ設置した。また、基準電極はブレグマからラムダへ正中線を１２ｍｍの位置へ設置した。電極設置後は歯科用セメントで固定した。ケタミン（６６ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（３．３ｍｇ／ｋｇ）の混合麻酔下で、１％のアトロピンと２．５％のフェニレフリン塩酸塩により散瞳した状態で測定した。視覚刺激は青色ＬＥＤを光源とし、照射時間２０ｍｓ、刺激周波数１Ｈｚで、１００回刺激を繰り返し、加算平均により記録した（図４）。
図４から明らかな通り、ＣｈＲ−ＨＳＢを投与した眼で有意に高い視覚誘発電位の振幅を示した。このように、クラミドモナスＣｈＲ２に比較して、ＣｈＲ−ＨＳＢはより高い感度を有することが示された。
網膜伸展標本の作製
ウイルス注入後、遺伝子の発現を確認する目的で網膜伸展標本を作製した。眼球を摘出後、４％パラフォルムアルデヒド溶液で直ちに固定した。固定後、前眼部を取り除き、神経網膜を脈絡膜より剥離した。神経網膜はスライドガラス上に伸展し、蛍光顕微鏡で遺伝子の発現を確認した（図５）。図５から、網膜全体に発現が認められることが分かる。
ＨＥＫ細胞への遺伝子導入
ＣＡＧプロモーターの下流にｈＣｈＲ−ＹＲ、ＩＲＥＳ２、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターを作製し、培養ＨＥＫ細胞にエレクトロポレーション法により導入した。導入２４時間後からピューロマイシン（１ｕｇ／ｍｌ）を含む１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で培養し、遺伝子導入された細胞のみ選別し、継代培養した。この細胞を、以下の実験に用いた。
パッチクランプ法による波長感受性測定
使用機器：
パッチクランプ増幅器：ＡＸＯＰＡＴＣＨ２００Ａ
Ａ／Ｄコンバーター：ＡＸＯＮ  ＤＩＧＩＴＡＬＤＡＴＡ１２００
電極内液：
１２０ｍＭ  ＣｓＯＨ
１００ｍＭ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ
２．５ｍＭ  ＭｇＡＴＰ
５ｍＭ  Ｎａ２ＥＧＴＡ
１．２ｍＭ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ
ｐＨ７．４，ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｂｙ  １  Ｎ  ＣｓＯＨ
細胞外液（Ｔｙｒｏｄｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）：
１３８ｍＭ  ＮａＣｌ
３ｍＭ  ＫＣｌ
１ｍＭ  ＣａＣｌ２
１ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
４ｍＭ  ＮａＯＨ
ｐＨ７．４，ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｂｙ  １  Ｎ  ＨＣｌ
パッチクランプ法により、光刺激に伴う内向き電流を測定した。測定に際しては、ホールセルモードで膜電位を−６０ｍＶに固定し、イオンチャネルに流れる電流を測定した。光刺激にはキセノンランプを使用し、フィルターを使用して各波長光を得た。
各波長光の刺激強度は以下のとおりである。
４００ｎｍ  ０．０２１ｍＷ
４２０ｎｍ  ０．０１８ｍＷ
４４０ｎｍ  ０．０２７ｍＷ
４６０ｎｍ  ０．０２７ｍＷ
４８０ｎｍ  ０．０１８ｍＷ
５００ｎｍ  ０．０２１ｍＷ
５２０ｎｍ  ０．０１５ｍＷ
５４０ｎｍ  ０．０１４ｍＷ
５６０ｎｍ  ０．０１２ｍＷ
結果を図６に示す。各波長光刺激によって誘起された内向き電流を記録し（左）、各波長の刺激強度から換算して波長特性を示すグラフ（右）を得た。
その結果、ｈＣｈＲ−ＹＲ導入後の細胞においては、赤方への波長感受性だけでなく、青色領域にも感受性を持つことが明らかとなった。
この結果は、ｈＣｈＲ−ＹＲの１つの遺伝子を失明した網膜に導入することによって、可視光全域を見ることができる視覚を再生できる可能性を示唆する。
これまでのＣｌＣｈＲ２を利用した視覚再生法では、波長感受性が青色に限定されていたために、緑または赤に感受性を持つ同様の遺伝子を複合導入する必要があった（Ｂｉ  Ａ，Ｃｕｉ  Ｊ，Ｍａ  ＹＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ−ｔｙｐｅ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｎ  ２００６；５０：２３−３３；Ｔｏｍｉｔａ  Ｈ，Ｓｕｇａｎｏ  Ｅ，Ｉｓａｇｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｏ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖｉｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｂｌｉｎｄ  ｒａｔｓ．Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ２０１０；９０：４２９−４３６；Ｔｏｍｉｔａ  Ｈ，Ｓｕｇａｎｏ  Ｅ，Ｙａｗｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａｇｅｄ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ＲＣＳ  ｒａｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｏｐｓｉｎ−２  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００７；４８：３８２１−３８２６）。あるいは提示する画像の全てをカメラなどの工学的技術を用いて、青色画像に変換し、遺伝子導入した網膜に提示するなどが考えられてきた。しかし、上記結果より明らかなように幅広い波長感受性を持つｈＣｈＲ−ＹＲが得られたことにより、単一の遺伝子導入で可視光全域を見ることができる可能性を示唆する。
また、視覚以外への応用として、ｈＣｈＲ−ＹＲは青色光に比べ組織透過性が高い赤方に波長感受性を持つことから、組織表層からより深い部位を光で刺激することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明によれば、細胞膜上での発現効率が改善されたボルボックス由来の光受容チャネルロドプシンが提供される。
本発明に係る光受容チャネルロドプシンは、黄色光〜赤色光、好ましくは青色光〜赤色光に対する感受性を有し、かつ効率的な細胞膜局在発現を示すため、例えば、哺乳類の視機能の再建に利用することができる。
また、チャネルロドプシンは、神経細胞に発現させることで人為的に神経細胞を光で活性化できることから、神経機能解析ツールとして広く用いられている。したがって、本発明の光受容チャネルロドプシンも、このような研究分野において有用なツールとして使用できると考えられる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
2011019081.tif 000002
2011019081.tif 000003
2011019081.tif 000004
2011019081.tif 000005
2011019081.tif 000006
2011019081.tif 000007
2011019081.tif 000008
2011019081.tif 000009
2011019081.tif 000010
2011019081.tif 000011
2011019081.tif 000012
2011019081.tif 000013
2011019081.tif 000014
2011019081.tif 000015
2011019081.tif 000016
2011019081.tif 000017
2011019081.tif 000018
2011019081.tif 000019
2011019081.tif 000020
2011019081.tif 000021
2011019081.tif 000022
2011019081.tif 000023
2011019081.tif 000024
2011019081.tif 000025
2011019081.tif 000026
2011019081.tif 000027
2011019081.tif 000028
2011019081.tif 000029
2011019081.tif 000030
2011019081.tif 000031
2011019081.tif 000032
2011019081.tif 000033
【図２】
2011019081.tif 000034
【図４】
2011019081.tif 000035
【図６】
2011019081.tif 000036
【図１】
2011019081.tif 000037
【図３】
2011019081.tif 000038
【図５】
2011019081.tif 000039
【国際調査報告】
2011019081.tif 000040
2011019081.tif 000041
2011019081.tif 000042
2011019081.tif 000043
2011019081.tif 000044
2011019081.tif 000045