(57)【要約】ガス透過膜上に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞を配置し、ガス透過性膜側から酸素を供給しつつ肝細胞を培養することを特徴とする、肝細胞培養方法。これにより、肝細胞に早期に極性を誘導させて毛細胆管を形成させることができ、また、極性形成期間を長くすることもできる。
2011024592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガス透過膜上に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞を配置し、ガス透過性膜側から酸素を供給しつつ肝細胞を培養することを特徴とする、肝細胞培養方法。
【請求項２】
ガス透過性膜の表面がコラーゲンコーティングされており、該ガス透過性膜のコラーゲンコート面に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞が配置される、請求項１に記載の肝細胞培養方法。
【請求項３】
ガス透過性膜がコラーゲンコート面を内側にして筒状に配置されており、該筒状の内部で細胞外マトリクスで包埋された肝細胞が配置される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞外マトリクスが溝を構成し、該溝に肝細胞が配置された、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ガス透過性膜がポリジメチルシロキサン膜である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ガス透過性膜がフルオロカーボン膜である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
コラーゲンコーティングが共有結合によるものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
細胞外マトリクスがコラーゲンゲルまたはマトリゲル（商標）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞外マトリクスが非生体成分からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ガス透過膜上に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞を配置し、ガス透過性膜側から酸素を供給しつつ肝細胞を培養することを特徴とする、毛細胆管を形成した培養肝細胞の製造方法。
【請求項１１】
ガス透過性膜の表面がコラーゲンコーティングされており、該ガス透過性膜のコラーゲンコート面に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞が配置される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ガス透過性膜上に溝を有する細胞外マトリクス層が配置され、該細胞外マトリクス層の溝に肝細胞が配列された、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか一項記載の方法により毛細胆管を形成した培養肝細胞を製造し、得られた培養肝細胞を用いて化合物の代謝を評価する、化合物の代謝検定方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法により毛細胆管を形成した培養肝細胞を製造し、得られた培養肝細胞を用いて化合物の輸送を評価する、化合物の輸送検定方法。
【請求項１５】
培養肝細胞を含む本体部と、本体部に化合物を供給する化合物供給部と、本体部から化合物またはその代謝物を回収する回収部とを有する培養肝細胞を用いた化合物検定装置であって、前記本体部は、
ガス透過性膜と、
該ガス透過膜上に配置された細胞外マトリクスと、
該細胞外マトリクスに包埋された肝細胞と、
を有することを特徴とする、装置。
【請求項１６】
ガス透過性膜の表面がコラーゲンコーティングされており、該ガス透過性膜のコラーゲンコート面に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞が配置された、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記ガス透過性膜は、コラーゲンコート面を内側にして筒状にした筒状体を形成しており、該筒状体の内部にコラーゲンコート面に接着された肝細胞とそれを包埋する細胞外マトリクスを含む、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記本体部は、前記化合物供給部からの供給物が流れるように半透膜で画定された空間を前記筒状体の軸方向に形成する流路であって、該半透膜を介して該供給物を前記細胞外マトリクスに包埋された肝細胞に供給可能な供給物用流路を、更に有する請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記回収部が、表面がコラーゲンコーティングされたガス透過性膜をコラーゲンコート面を内側にして筒状にした筒状体と、該筒状体の内側のコラーゲンコート面に接着された肝細胞と、該肝細胞を包埋する細胞外マトリクスと、該肝細胞の毛細胆管によって形成される流路を有する、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記細胞外マトリクスが溝を構成し、該溝に肝細胞が配置された、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ガス透過性膜がポリジメチルシロキサン膜である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２２】
前記ガス透過性膜がフルオロカーボン膜である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２３】
コラーゲンコーティングが共有結合によるものである、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２４】
細胞外マトリクスがコラーゲンゲルまたはマトリゲル（商標）である、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２５】
細胞外マトリクスが非生体成分からなる、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２６】
化合物代謝検定装置である、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
化合物輸送検定装置である、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞に効率よく極性を誘導させ、毛細胆管を形成させることができる肝細胞培養法、該方法による毛細胆管を形成した肝培養細胞の製造方法、該肝培養細胞の使用方法、及び該肝培養細胞を用いた装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬研究において、生体肝組織における薬物等の取り込み・代謝・排出を正しく評価することが極めて重要である。また、大規模な薬物スクリーニング等を簡便に行うため、あるいは、倫理的な面で、インビトロの試験法が望まれている。そのための手段としては培養細胞が用いられるが、できるだけ生体を反映したものが望ましく、例えば、肝細胞培養系としては、細胞膜が血管側と毛細胆管膜の各々の領域に明確に分かれているような生体肝組織の正しい極性を良好に再現可能なものが求められている。【０００３】
例えば、特許文献１では、マイクロスケール基板に結合タンパク質または接着タンパク質を結合させ、その上で肝細胞を培養させることによって、毛細胆管の形成が促進されると考えられると記載されている。また、特許文献２では、小型肝細胞をコラーゲンで被覆したポリカーボネート性の多孔性シート上で培養すると、培養３０日目で毛細胆管様の構造を形成したことが記載されている。
上記の３次元培養方法では極性を持った肝細胞を初代細胞から作製するためには数週間から数カ月の時間を要する。
それに対して、コラーゲンゲルサンドイッチ法（非特許文献１：LeCluyse et al., Am J Physiol Cell Physiol, 1994, vol.266, pp.1764-1774）を用いるとコラーゲンゲル重層後３〜４日程度で毛細胆管の形成と胆汁成分排出活性が検出され始める。しかし、コラーゲンゲルサンドイッチ法を用いても、胆汁成分排出活性が得られるまでには日数を要する。また、生体と同じように出口のある胆管によって連続的に代謝物を解析することはできない。薬物スクリーニングに使用するためには、形成される毛細胆管の数が少なく、活性が低いことも問題となる。【０００４】
さらに、非特許文献２（Tissue Engineering vol.13 Number 8 2007 2105-2117）や非特許文献３（Acta Biomaterialia 5 2009 613-620）では、ガス透過性のPDMS （polydimetylsiloxane）上で肝細胞を培養する際、その表面をPEMでコートするか、直径1〜3μmの細いピラーを造形することで3日間接着を維持できることが示されているが、長期的には接着を維持できず、安定に試験に使用するために問題がある。また、一般的には肝細胞を接着培養するのにPDMSは適していないと考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2008-539787
【特許文献２】WO2005/047496
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】LeCluyse et al., Am J Physiol Cell Physiol, 1994, vol.266, pp.1764-1774
【非特許文献２】Tissue Engineering vol.13 Number 8 2007 2105-2117
【非特許文献３】Acta Biomaterialia 5 2009 613-620
【発明の概要】
【０００７】
従来の方法によれば、肝細胞に極性を誘導して毛細胆管を効率よく形成することが難しく、極性を誘導するのに時間がかかるうえ、その持続期間が短かった。また、培養系の全ての肝細胞に極性を誘導して毛細胆管を形成することはできなかったため、実験間のばらつきの増大や低感度の原因になっていた。さらに、出口のない閉じた毛細胆管をもった肝細胞培養系では、胆汁を連続的に回収して解析することができないばかりでなく、胆汁うったいが生じて、全般的な肝機能が低下することが考えられる。このような培養系では、薬物輸送検定やハイスループットなスクリーニングに利用できるような、安定した品質の高い毛細胆管を形成した肝培養細胞を作製することができなかった。
【０００８】
本発明は、上記の問題に鑑みてなされたものであり、肝細胞に早期に極性を誘導させて毛細胆管を形成させるための細胞培養法、及び、極性（毛細胆管）形成期間を長くできる肝細胞の培養方法を提供することを目的とするものである。さらに、これにより、該細胞培養による毛細胆管を形成した肝培養細胞の製造方法、及び、該肝培養細胞の使用方法、該肝培養細胞を用いた装置など安定して高感度に薬物輸送検定等を行うことができる手段を提供することも目的とする。
【０００９】
上記の課題を解決するために、本発明は以下を提供する。
（１）ガス透過膜上に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞を配置し、ガス透過性膜側から酸素を供給しつつ肝細胞を培養することを特徴とする、肝細胞培養方法。
（２）ガス透過性膜の表面がコラーゲンコーティングされており、該ガス透過性膜のコラーゲンコート面に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞が配置される、（１）に記載の方法。
（３）ガス透過性膜がコラーゲンコート面を内側にして筒状に配置されており、該筒状の内部で細胞外マトリクスで包埋された肝細胞が配置される、（２）に記載の方法。
（４）前記細胞外マトリクスが溝を構成し、該溝に肝細胞が配置された、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記ガス透過性膜がポリジメチルシロキサン膜である、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）前記ガス透過性膜がフルオロカーボン膜である、（１）〜（４）のいずれかの方法。
（７）コラーゲンコーティングが共有結合によるものである、（１）〜（６）のいずれかの方法。
（８）細胞外マトリクスがコラーゲンゲルまたはマトリゲル（商標）である、（１）〜（７）のいずれかの方法。
（９）細胞外マトリクスが非生体成分からなる、（１）〜（７）のいずれかの方法。
（１０）ガス透過膜上に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞を配置し、ガス透過性膜側から酸素を供給しつつ肝細胞を培養することを特徴とする、毛細胆管を形成した培養肝細胞の製造方法。
（１１）ガス透過性膜の表面がコラーゲンコーティングされており、該ガス透過性膜のコラーゲンコート面に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞が配置される、（１０）に記載の方法。
（１２）ガス透過性膜上に溝を有する細胞外マトリクス層が配置され、該細胞外マトリクス層の溝に肝細胞が配列された、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）（１０）〜（１２）のいずれかの方法により毛細胆管を形成した培養肝細胞を製造し、得られた培養肝細胞を用いて化合物の代謝を評価する、化合物の代謝検定方法。
（１４）（１０）〜（１２）のいずれかの方法により毛細胆管を形成した培養肝細胞を製造し、得られた培養肝細胞を用いて化合物の輸送を評価する、化合物の輸送検定方法。
（１５）培養肝細胞を含む本体部と、本体部に化合物を供給する化合物供給部と、本体部から化合物またはその代謝物を回収する回収部とを有する培養肝細胞を用いた化合物検定装置であって、前記本体部は、
ガス透過性膜と、
該ガス透過膜上に配置された細胞外マトリクスと、
該細胞外マトリクスに包埋された肝細胞と、
を有することを特徴とする、装置。
（１６）ガス透過性膜の表面がコラーゲンコーティングされており、該ガス透過性膜のコラーゲンコート面に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞が配置された、（１５）に記載の装置。
（１７）前記ガス透過性膜は、コラーゲンコート面を内側にして筒状にした筒状体を形成しており、該筒状体の内部にコラーゲンコート面に接着された肝細胞とそれを包埋する細胞外マトリクスを含む、（１６）の装置。
（１８）前記本体部は、前記化合物供給部からの供給物が流れるように半透膜で画定された空間を前記筒状体の軸方向に形成する流路であって、該半透膜を介して該供給物を前記細胞外マトリクスに包埋された肝細胞に供給可能な供給物用流路を、更に有する（１７）の装置。
（１９）前記回収部が、表面がコラーゲンコーティングされたガス透過性膜をコラーゲンコート面を内側にして筒状にした筒状体と、該筒状体の内側のコラーゲンコート面に接着された肝細胞と、該肝細胞を包埋する細胞外マトリクスと、該肝細胞の毛細胆管によって形成される流路を有する、（１８）の装置。
（２０）前記細胞外マトリクスが溝を構成し、該溝に肝細胞が配置された、（１５）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）前記ガス透過性膜がポリジメチルシロキサン膜である、（１５）〜（２０）のいずれかの装置。
（２２）前記ガス透過性膜がフルオロカーボン膜である、（１５）〜（２０）のいずれかの装置。
（２３）コラーゲンコーティングが共有結合によるものである、（１５）〜（２２）のいずれかの装置。
（２４）細胞外マトリクスがコラーゲンゲルまたはマトリゲル（商標）である、（１５）〜（２３）のいずれかの装置。
（２５）細胞外マトリクスが非生体成分からなる、（１５）〜（２３）のいずれかの装置。
（２６）化合物代謝検定装置である、（１５）〜（２５）のいずれかの装置。
（２７）化合物輸送検定装置である、（１５）〜（２５）のいずれかの装置。
【００１０】
本発明では、ガス透過膜上に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞を配置し、ガス透過性膜側から酸素を供給しつつ肝細胞を培養することを特徴とする。好ましくは、コラーゲンでコートしたガス透過性の高い素材上に肝細胞を接着させたのち、細胞外マトリクスに包埋することで、肝細胞に効率よく極性を誘導させることができる。このようにして培養された肝細胞集団内では，周囲の細胞や細胞外マトリクスなどから安定して高い活性の極性誘導シグナルの授受を行うことができると考えられ、それがより広い範囲への毛細胆管誘導と長期間の極性維持につながる。これにより、肝細胞に長く連結した毛細胆管を長期間維持させることができる。また、早期に高感度で薬物輸送検定を行うことが可能となる。
また、「包埋」されている状態とは、該肝細胞の周辺が少なくとも1層の細胞外マトリクスで囲まれていることを言う。毛細胆管が効率的に形成される限り、該細胞外マトリクスは連続的でも非連続的でも構わない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の肝細胞培養方法の一態様の模式図。
【図２Ａ】本発明の肝細胞培養器の一態様の模式図（側面図）。
【図２Ｂ】本発明の肝細胞培養器の一態様の模式図（ａ−ａ断面図）。
【図３Ａ】本発明の化合物検定装置の第一の態様の模式図（側面図）。
【図３Ｂ】本発明の化合物検定装置の第一の態様の模式図（ａ−ａ断面図）。
【図４Ａ】本発明の化合物検定装置の第二の態様の模式図（側面図）。
【図４Ｂ】本発明の化合物検定装置の第二の態様の模式図（ｂ−ｂ断面図）。
【図５】PDMS膜を用いた培養器で培養された肝細胞における5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (CDCF)の代謝を示す図（写真）。
【図６】ポリスチレン培養器を用いた培養器で培養された肝細胞における5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (CDCF)の代謝を示す図（写真）。
【図７】毛細胆管の面積の経時変化を示すグラフ。■がPDMS膜を用いた培養器、●がポリスチレン培養器。
【図８】フルオレセインジアセテートを用いて毛細胆管の形成を観察した結果を示す図（写真）。(a)、(c)がコラーゲンを吸着結合させた培養器であり、(a)が培養4日目、(c)が培養7日目；(b)、（d）がコラーゲンを共有結合させた培養器であり、(b)が培養4日目、(d)が培養7日目。
【図９】フルオレセインジアセテートを用いて毛細胆管の形成を観察した結果を示す図（写真）。コラーゲンゲルサンドイッチ(a)、マトリゲルサンドイッチ群(b)、無処理群(c)。
【図１０】胆汁排出反応5分におけるポリスチレン（PS）とPDMS膜のBEI（胆汁排出インデックス）比較。
【図１１】MRP2タンパク質の局在解析の結果を示す図（写真）。
【図１２】マトリゲル（MG）濃度150μg/mLと50μg/mLのときのBEI比較。
【図１３】肝細胞播種密度2x105個／穴、4x105個／穴、6x105個／穴のときのBEI比較。
【図１４Ａ】コラーゲン吸着結合したPDMS膜製培養器およびコラーゲンコートポリスチレン製プレートにおけるBEI比較。
【図１４Ｂ】コラーゲン吸着結合したPDMS膜製培養器およびコラーゲンコートポリスチレン製プレートにおける２日後および４日後の細胞の蛍光顕微鏡写真。
【図１５】コラーゲン吸着結合したPDMS膜製培養器（４８時間）およびコラーゲンコートポリスチレン製プレート（４８時間および９６時間）におけるMRP2およびCD147の局在を示す蛍光顕微鏡写真。
【図１６】PDMS膜上で培養した肝細胞の電子顕微鏡写真（Ａ）。（Ｂ）はタイト結合部分の拡大写真、（Ｃ）は腔壁に微小絨毛(MV)をもつ毛細胆管の写真である。スケールバーは（Ａ）および（Ｃ）が２μm、（Ｂ）が１μmである。
【図１７】フルオロカーボン膜を使用したガス透過性プレートおよびポリスチレンプレート（PS）におけるBEI比較。
【図１８】連続的毛細胆管の作製手順を示す模式図。（A）は凹部（溝）を持ったゲルの作製手順を示し、（B）は凹部において肝細胞を培養する手順を示す。
【図１９】凹部において培養した肝細胞の顕微鏡写真。
【図２０】連続的毛細胆管におけるCDCFの代謝を示す図（写真）。
【図２１】連続的毛細胆管にCDCFを代謝させてフルオレセインを蓄積させ、毛細胆管の一端を細いガラス管で開口したときの図（写真）。Aは組織の明視野像、Bは開口前、Cは開口約60秒後の蛍光像を示す。白の矢印は開口箇所を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の肝細胞培養方法は、ガス透過膜上に細胞外マトリクスで包埋された肝細胞を配置し、ガス透過性膜側から酸素を供給しつつ肝細胞を培養することを特徴とする。好ましくは、表面がコラーゲンコーティングされたガス透過性膜のコラーゲンコート面に肝細胞を接着させ、該肝細胞を細胞外マトリクスで包埋された状態で、ガス透過性膜側から酸素を供給しつつ培養することを特徴とする。
【００１３】
本発明に用いるガス透過性膜の素材は酸素ガスを透過できるものであれば良いが、多孔質で疎水性の高いものが適している。例えば、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、フルオロカーボン、ポリテトラフルオロエチレン(４フッ化)、ポリウレタンが挙げられ、これらの誘導体や類似物質も含まれる。
【００１４】
PDMS膜の作製方法は非特許文献(M Nishikawa et al. Biotechnology and Bioengineering, vol.99, pp.1472-1481)に述べられている。ただし、PDMS膜の作製方法はこれに限らず、一般的に知られている膜の作製方法を用いて作製することができる。例えば、バーコーターで塗布する方法（バーコート法）やギャップコーターで塗布する方法（ギャップコート法）で作製することができる。他の素材を用いる場合も同様にして膜を作製することができる。
また、フルオロカーボン膜が培養面に配置された培養プレートLumox (In vitro systems and services社製)等、を適宜購入して使用することもできる。
【００１５】
ガス透過性膜の厚さは、ガス透過性の観点から可能な限り薄いことが好ましいが、50μmから2.0mmが適当である。しかしながら、最適な膜の厚さはその材質の丈夫さおよび扱う用途によって異なるため、上記範囲に限定されるものでは無い。
【００１６】
ガス透過性膜を有する培養器の態様としては、培養器全体が該ガス透過性膜で構成されていても良いが、少なくとも肝細胞が播種される部位が該ガス透過性膜で構成されていれば良い。培養器の態様に合わせて、適宜変更することができる。
【００１７】
ガス透過性膜を覆うコラーゲンは、公知の方法で調製されたものが使用できるが、市販のコラーゲン溶液(例えば、ベクトンディッキンソン社製のラット尾コラーゲン)を用いて酸素を透過できる厚さに被覆することができる。また、該コラーゲンで該ガス透過性膜を覆う方法は、公知方法を使用することができる。例えば、酸素プラズマ処理をして該コラーゲンを該ガス透過性膜に吸着させる方法や化学的に反応する官能基を使用して共有結合させる方法が挙げられる。共有結合を使用したPDMS膜へのコラーゲンの結合方法は、例えば、非特許文献(M. Nishikawa et al. Biotechnology and Bioengineering, 2008, vol.99, pp1472-1481)に述べられている方法に従って行うことができる。効率良く、安定かつ長期的に、毛細胆管を形成した肝細胞を調製することができるため、共有結合によりコラーゲンでガス透過性膜を覆う方が好ましい。
一方、短期的な毛細胆管の形成効率は共有結合でも吸着結合でも同様であることから、短期的な測定に使用する場合には、いずれも使用することができる。試験に必要な毛細胆管を形成できるかぎり、肝細胞の培養条件に合わせて、適宜、最適な結合を選択することができる。
【００１８】
培養可能な肝細胞は、いずれの動物由来でも良く、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ミニブタ、ハムスター、フェレット、ウサギ、ラット、マウスが挙げられる。また、該動物から肝細胞を単離する方法は、公知の方法に従って行うことができる。肝細胞の由来は胎児、新生児、成体のいずれであってもよい。また、胚性幹（ES）細胞および誘導多能性(iPS)幹細胞、または臍帯血、骨髄、脂肪、血液由来組織性幹細胞から分化誘導される肝細胞を用いることもできる。これらの細胞から肝細胞を誘導する方法は公知の方法に従って行うことができる。
播種する細胞密度は、該細胞が正常に増殖可能であれば良い。通常、細胞密度は約0.1〜12.0 x 105cells/cm2の間で播種することが好ましく、細胞が２〜３層になるように播種してもよい。培養条件や使用する培養器具などに合わせて、適宜、好ましい細胞密度を設定することができる。
【００１９】
肝細胞を包埋する細胞外マトリクスとしては、公知のコラーゲンゲルサンドイッチ法で使用可能なものが挙げられる。例えば、コラーゲンI、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、エラスチン、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、マトリゲル（商標：ベクトンディッキンソン社）、グロースファクター（ベーシックFGF,EGF、IGF-1、PDGF、NGF、TGFベータなど）およびこれらの混合物を適宜選択して、細胞外マトリクスゲルとして使用することができるが、効率良く毛細胆管を形成した肝細胞を調製することができるため、コラーゲンゲルやマトリゲルが好ましく、さらに安定かつ長期的に該細胞を調製することができるため、コラーゲンゲルがより好ましい。該細胞外マトリクスゲルの作製方法は（非特許文献１：LeCluyse et al., Am J Physiol Cell Physiol, 1994, vol.266, pp.1764-1774）に記載の方法で行うことができる。この場合の肝細胞を包埋する細胞外マトリクス層の厚さは栄養分や試験化合物の透過性の観点から、適宜決定することができるが、10〜100マイクロメートルが好適である。
【００２０】
また、該細胞外マトリクスのシートを用いて肝細胞を覆うようにしても良い。このような態様も「包埋」に含まれる。例えば、市販のコラーゲン膜（商品名ビトリゲル、旭テクノグラス社製）を肝細胞に重層することによりコラーゲンゲルと同様の効果を導くことができる。この場合のシートの厚さは栄養分や試験化合物の透過性の観点から、適宜決定することができるが、10〜100マイクロメートルが好適である。
【００２１】
また、非生体成分からなる細胞外マトリクス様の物質を用いて肝細胞を覆うようにしても良い。このような態様も「包埋」に含まれる。例えば、非特許文献４（TISSUE ENGINEERING, Volume 12, 2006, 2181-2191）に記載のコラーゲンコーティングセルロース膜や、非特許文献５（Biomaterials, volume 29,2008, 3993-4002）に記載の多孔質の窒化ケイ素膜、非特許文献６（Biomaterials, volume 29,2008, 290-301）に記載のポリエチレンテレフタレート膜のような半透膜の使用は、物理的なシグナルで毛細胆管の形成を誘導し、且つ、培地成分などを供給可能な物質を肝細胞に重層することによりコラーゲンゲルと同様の効果を導くことができる。
また、具体的な非生体成分からなる半透膜の例として、再生セルロース（セロファン）、アセチルセルロース、ポリアクリロニトリル、テフロン（登録商標）、ポリエステル系ポリマーアロイあるいはポリスルホンの多孔質膜が挙げられる。
また、上記の非生体成分の細胞外マトリクス様の物質に、該細胞外マトリクスを組み合わせて使用することもできる。
【００２２】
図１を用いて、単純な本発明の肝細胞の培養方法を説明する。ガス透過性膜をコラーゲンで覆い、その上に肝細胞を播種し、接着進展した肝細胞をコラーゲンゲルなどの細胞外マトリクスゲルで包埋し、ガス透過性膜側から酸素を供給しながら培養を行う。
【００２３】
細胞で覆われていないガス透過性膜の側は、酸素が供給可能なように気相になっていることが望ましい。
この場合、ガス透過性膜越しの気相は細胞への酸素供給のために酸素濃度1〜20%の空気とすることができる。生体内の肝臓に倣って酸素濃度5〜13％の間が最適である。この酸素濃度調節は市販のマルチガスインキュベーター（例えば、サンヨー電機社製MCO-5M）の設定によって容易に行うことができる。
また、上記の酸素供給の別の態様としては、ガス透過性膜越しに配置された人工素材や血管細胞からなる人工血管により供給されてもよい。
【００２４】
培養条件は公知の肝細胞を培養する方法に準じて行えば良く、培地としては、例えば、ダルベッコ修飾イーグル培地やウイリアムズE培地に血清、インスリン・トランスフェリン・セレニウム塩、デキサメタゾンを添加した培地を用いることができる。
そして、一般的な細胞培養と同じく、通常37℃、5%CO2の条件で培養を行う。ただし、特殊な細胞や条件で培養を行う場合は、温度やCO2濃度は適宜変更すればよい。培養条件を調節することによって、肝細胞を２次元あるいは３次元に培養することや、毛細胆管の数を調節することができる。
【００２５】
このようにして培養を行うことにより、肝細胞に3次元的位置情報を付与することができる。
すなわち、本発明の培養方法によれば、肝細胞の膜が分極し、肝細胞同士の間隙に沿って毛細胆管膜が、それ以外の部分には基底膜が形成される。この毛細胆管膜によって形成される毛細胆管は通常幅1〜2マイクロメートル、長さは100マイクロメートル以上連結している。この毛細胆管ネットワークの途中には幅が5マイクロメートル程度に広くなったたまり場が形成されることがある。
【００２６】
基底膜には化合物を取り込むための有機アニオン輸送体群、およびナトリウム/タウロコール酸共輸送体群が発現している。代表的なものはOATP（Organic anion transportingpolypeptide）1a1, OATP1b2, OATP1b3, OAT2, OATP4, OATP8であり、これらに特異的な抗体を用いた細胞抗体染色によって存在を確認することができる。
【００２７】
毛細胆管ネットワークには主要なATP binding cassette (ABC)トランスポータータンパク質が発現する。代表的なものはMRP2（Multidrug-Resistance Protein 2）, MDR1（Multidrug-Resistance 1）, BCRP（breast cancer resistance protein）であり、それぞれestradiol-17β-glucuronide、Digoxin、Taurocholateの輸送活性から存在の有無を判別できる。また、MRP2, MDR1, BCRPに特異的な抗体を用いた細胞抗体染色によっても確認することができる。
【００２８】
図１のように、肝細胞同士が接触する面に毛細胆管が形成されるので、化合物を肝細胞に添加し、毛細胆管に排出される代謝物を解析することにより、化合物の代謝特性を検定することができる。
すなわち、本発明の化合物検定装置は、本体部と、本体部に化合物を供給する化合物供給部と、本体部から化合物またはその代謝物を回収する化合物またはその代謝物の回収部とを有する培養肝細胞を用いた化合物検定装置であって、前記本体部は、表面がコラーゲンコーティングされたガス透過性膜と、該透過性膜のコラーゲンコート面に接着された肝細胞と、該肝細胞を包埋する細胞外マトリクスを有する。
【００２９】
なお、本発明の別の態様においては、ガス透過性膜には微細加工が施されていてもよい。
例えば、ガス透過性膜に微細加工を施し、ガス透過性膜の表面に溝や窪みや隔壁を形成してもよい。例えば、微細加工で施される隔壁により細胞の接着範囲と方向を限定して、細胞の配列方向および接着範囲、そしてそれにより形成される毛細胆管の配列方向および範囲を制御することができる。
また、ガス透過性膜上にコラーゲンゲルなどの細胞外マトリクスで溝や窪み（凹部）を形成し、その溝や窪みに細胞を配置することで、細胞の配列方向および接着範囲と方向を限定することができ、それにより形成される毛細胆管の配列方向および範囲を制御することで、毛細胆管内に排出された代謝物を連続的に回収することができる。このように、溝を有する細胞外マトリクスの溝に肝細胞を配置することも、「包埋」に含まれる。更に、前記の溝に配置された肝細胞を、細胞外マトリクスで覆うことで毛細胆管の形成を促進することができる。
溝や窪みの形状は、毛細胆管が形成された肝細胞が作製できれば、何でも良いが、生体内の肝細胞の配置を再現するため、肝細胞が約２列で配列できる幅が好ましい。すなわち、幅20μm 以上70μm以下、好ましくは 30μm 以上50μm以下、さらに好ましくは30μm程度が望ましい。また、溝や窪みの底面からガス透過性膜までの距離は狭い方が好ましいが、ガス透過性膜から十分に酸素を供給できる距離であれば良く、側面の高さは10μm以上1mm以下、好ましくは50μm以上500μm以下、更に好ましくは100μm程度が望ましい。
【００３０】
図２Ａに示すように、培養器Ａでは、ガス透過性膜１１上に２つ、同じくガス透過性膜からなる隔壁１１’が設けられており、ガス透過性膜１１と２つの隔壁１１’で囲まれた空間で肝細胞の培養が行われる。図２Ａのａ−ａ断面図である図２Ｂに示すように、ガス透過性膜１１はコラーゲンコート層１２を有し、その上に肝細胞１３を接着させ、コラーゲンマトリクス１５で包埋する。そして、ガス透過性膜１１と２つの隔壁１１’の外側に設置された図示しない酸素供給装置を用いて酸素を供給し、培地１６を添加して培養が行われる。肝細胞１３同士が接触する面に毛細胆管１４が形成される。
この隔壁は隣接する肝細胞同士が接着を妨げられる大きさであればよく、具体的には1マイクロメートル以上であることが好ましい。
また、図１８で、溝や窪みで毛細胆管が形成された肝細胞を培養する方法の一例を説明する。図２のコラーゲンコート層１２を有するガス透過性膜１１の上に、図１８（Ａ）で示した溝が形成されたコラーゲンゲルなどの細胞外マトリクスを配置する。まず、前記ガス透過性膜１１の上に、ゲル化前のコラーゲン溶液（濃度は0.1-30mg/mL、好ましくは0.3-3mg/mL、更に好ましくは約2.0mg/mL）を撒く。次に、該コラーゲン溶液が完全にゲル化する前に、凸部を持ったPDMS製の型を配置して、放置することでゲル化させることで凹部をもったコラーゲンゲルを作製する。前記凸部をもった型の形状としては、形成された溝の幅が、20μm 以上70μm以下、好ましくは 30μm 以上50μm以下、さらに好ましくは30μm程度であり、高さが10μm以上1mm以下、好ましくは50μm以上500μm以下、更に好ましくは100μm程度であり、また、長さは適宜変更して使用できる。また前記凸部をもった型の素材としては、ゲル化したコラーゲンの形を壊さないようなものであれば良く、例えば、重さや加工や取り扱いのし易さからＰＤＭＳ製のものが良い。
続いて、図１８（Ｂ）で示すように、上記で作製した凹部を持ったゲルに、培養培地に溶かした肝細胞を播き、何度か培地で洗浄することで、凹部のみに肝細胞を配列させて培養を行う。
続いて、約２４時間後培養後、ゲル化前のコラーゲン溶液（濃度は0.1-30mg/mL、好ましくは0.3-3mg/mL、更に好ましくは約2.0mg/mL）もしくはマトリゲル溶液（濃度は、5-5000μg/mL、好ましくは50-500μg/mL、更に好ましくは約150μg/mL）を細胞上に重層し、さらに2-9日培養する。2日から毛細胆管の形成が認められるが、長期間培養する方がより長い毛細胆管を作らせることができる。薬物の評価試験等に最適な状態を適宜選択することができる。
【００３１】
また、本発明の別の態様においては、該ガス透過性膜は円柱形または立方形等、筒状の流路を象っていてもよい。
すなわち、ガス透過性膜がコラーゲンコート面を内側にして筒状に配置され、該筒状空間の内部で肝細胞を細胞外マトリクスに包埋して培養する態様も本発明の培養方法に含まれる。
【００３２】
この培養方法によって培養された肝細胞を含む本発明の化合物検定装置の一態様について図３Ａと図３Ａのａ−ａ断面図である図３Ｂを参照して説明する。
本発明の化合物検定装置Ｂは、本体部２と、本体部に化合物を供給する化合物供給部１と、本体部から化合物またはその代謝物を回収する回収部３とを有する装置であって、前記本体部２は、表面がコラーゲンコーティングされたガス透過性膜２１をコラーゲンコート面２２を内側にして筒状にした筒状体２８と、筒状体２８の内側のコラーゲンコート面２２に接着された肝細胞２３と、肝細胞２３を包埋する細胞外マトリクス２５とを有する。
そして、本体部２は、さらに、半透膜２６で画定された空間を筒状体２８の軸方向に形成してなる流路２７を有する。この流路から半透膜２６を介して該供給物を細胞外マトリクスに包埋された肝細胞に供給することができる。
ここで、半透膜の素材は化合物や培地成分を透過できるものであれば特に制限されないが、例えば、再生セルロース（セロファン）、アセチルセルロース、コラーゲンコーティングセルロース、ポリアクリロニトリル、テフロン（登録商標）、多孔質の窒化ケイ素、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステル系ポリマーアロイあるいはポリスルホンの多孔質膜などが例示される。
なお、これらの素材は非生体成分の細胞マトリクス様物質として使用できるものであるため、これらの素材からなる半透膜を肝細胞を覆うように配置することにより、別途細胞外マトリクスを加えなくても極性を誘導させ、毛細胆管を形成させることができる。
化合物検定装置Ｂにおいては、肝細胞を培養・維持するための培地も化合物供給部１から供給され、流路２７を通過する際に、培地成分が半透膜２６を介して肝細胞に供給される。ただし、本発明の化合物検定装置においては、培地を供給する培地供給部は化合物供給部とは別に設けられていてもよい。
なお、流路２７の形状は円筒形状に限定されず、その他の形状であってもよく、枝分かれしていてもよい。また、その径も特に制限されない。また、流路は複数設けられていてもよく、培地が通過する流路と化合物が通過する流路が別々になっていてもよい。
さらに、流路２７および半透膜２６は必須ではなく、ガス透過性膜によって形成される筒状体の内部全てが肝細胞とそれを包埋する細胞外マトリクスであってもよい。この場合は、培地や化合物が筒状体の内部に封入された細胞外マトリクスの中を通過するようにすればよい。
【００３３】
図３Ｂでは、ガス透過性膜２１の内壁（コラーゲンコート面２２）に沿って肝細胞２３が並べられており、その内側には細胞外マトリクス２５、さらにその内側には半透膜２６により仕切られた培地および化合物を添加するためのスペース（流路２７）が設けられており、ガス透過性膜２１の外側から酸素を供給して培養することにより、細胞外マトリクスによって毛細胆管２４が誘導されている。ガス透過性膜２１の外側は気相となっており、肝細胞へ触れる酸素濃度の調節が可能となっている。
【００３４】
このような本発明の装置を用いることにより、化合物の代謝特性の評価を行うこともできる。すなわち、培地供給部１から試験化合物を流路２７へ供給することにより、半透膜２６を介して、肝細胞が化合物に暴露される。そして、肝細胞によって代謝された化合物が回収部３において、回収され、分析される。
【００３５】
化合物またはその代謝物を回収する回収部は流路または細胞外マトリクスから化合物または代謝物を含む培地などの液体を分取できる部材であればよいが、本体部に接続された筒状体であって、表面がコラーゲンコーティングされたガス透過性膜をコラーゲンコート面を内側にして筒状にした筒状体と、該筒状体の内側のコラーゲンコート面に接着された肝細胞と、該肝細胞を包埋する細胞外マトリクスと、該肝細胞の毛細胆管によって形成される流路を有するものであってもよい。
すなわち、本発明の方法で培養された肝細胞集団によって形成された胆管が集合して流路（腔）を形成し、代謝物が流れるようにしたものであってもよい。
このような態様の本発明の肝細胞培養装置について図４Ａと図４Ａのｂ−ｂ断面図である４Ｂを参照して説明する。なお、ａ−ａ断面図は図３Ｂと同様である。
図４Ａに示すように、本体部１０２はその径が徐々に小さくなるように形成され、回収部１０３に接続されている。そして、回収部１０３では、ガス透過性膜の内部に、毛細胆管腔を中心に形成するように肝細胞が導入されている。
形成させた毛細胆管からは極細の管や胆管上皮細胞からなる流路が設けられており、毛細胆管に排出された代謝物が滞りなく排泄され、分析のためのリザーバーに回収される。
このような化合物検定装置は後述するような薬物（化合物）輸送検定に好適に用いることができる。
【００３６】
本発明の方法で作製した毛細胆管を形成した肝細胞は、薬物輸送検定や医薬候補物質のハイスループットなスクリーニングに使用することができる。
薬物輸送検定としては、薬物がどのくらいの量と速度で肝細胞に取り込まれ、胆汁に排出されるかどうかの検定が例示される。または、ある化合物Aが化合物Bの輸送を阻害・促進するかどうかの検定が例示される。
薬物輸送検定の方法としては、例えば、非特許文献（Liu X et al., Am J Physiol, 1999, vol.277, pp.G12-21）の方法が挙げられる。
ハイスループットなスクリーニングの具体的な方法としては、例えば、微細な流路と高感度な検出器でごく微量の化合物を解析でき、さらにこれを自動あるいは半自動で行うような以下の方法などが挙げられる。
ハイスループットなスクリーニングのためには、ガス透過性膜上の区切られたごく微小な区画、または図２のようなガス透過性流路の極細流路の中で細胞外マトリクスに包埋され毛細胆管を形成した肝細胞が培養されている培養部分それぞれに、試験化合物暴露させる注入口と、それぞれの区画の肝細胞で代謝され毛細胆管に排出される代謝物を回収するための口が設けられたマイクロ流路デバイスを構築することで可能となる。
【００３７】
上記マイクロ流路デバイスの注入口には化合物ライブラリから化合物溶液を分取し送液するポンプ、出口には代謝物を高速液体クロマトグラフィやLC/MS/MSに送って代謝物の定量や組成分析結果を導く流路が接続され、これらの動作をコンピューターなどで操作するようなものが例示される。
【００３８】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
本発明の方法による肝細胞の培養と毛細胆管形成の確認
肝細胞の単離
5週齢のラット（購入先：三共ラボサービス）の肝臓から非特許文献（Seglen PO, 1976, in Methods in cell biology (Prescott DM ed) 13th ed, pp29-83, Academic press, New York）に従って肝臓由来の細胞を分離した。【００４０】
コラーゲンを共有結合させたPDMS膜製24穴培養器の作製
方法は非特許文献(M. Nishikawa et al. Biotechnology and Bioengineering, 2008, vol.99, pp.1472-1481)に述べられている方法に従った。Silpot 184(東レ・ダウコーニング社製)の主剤と硬化剤を10:2で混合した混合液30gを258mm×174mm×45mmのプラスチック製容器に薄く伸ばし、80℃で2時間加熱し硬化させ、厚さ約1mmのPDMS膜を作製した。主剤と硬化剤の割合は10:2に限らず、10:1〜10:2の間で作製されるのが通常である。このPDMS膜を24個の穴が開いたポリカーボネート製の枠と、枠と同じ位置に穴の開いた厚さ1.5mmのSUS製板の間に挟み、ねじで固定することでPDMS膜製24穴培養器を作製した。これに酸素プラズマ処理（５秒）を行った後、ウェルに1%酢酸,2%アミノシラン（信越シリコン社製）を加えて、室温で45分反応させた後、80℃で90分間加熱した。次いで、このように処理されたウェルに0.5mM Sulfosuccinimidyl 2-(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1, 3'-dithiopropionate溶液（Thermo Fisher Scientific社製）を加えて紫外線照射（1分を2回）したのち、0.3mg/mLコラーゲン溶液（新田ゼラチン社製）を添加して18時間室温で放置し、PBSで洗浄して当日のうちに以下の実験に使用した。【００４１】
コラーゲンゲルサンドイッチ法による肝細胞の培養と毛細胆管形成の確認
コラーゲンゲルサンドイッチ法は非特許文献１（LeCluyse et al., Am J Physiol, 1994, vol.266, pp.1764-1774）に準じた。上記で調製した培養器に1穴あたり肝実質細胞を2x105個播種し、その4時間後、培地を交換した後、播種24時間後に1.7mg/mlコラーゲン溶液(ベクトンディッキンソン社製)を20μL重層して、37℃で1時間ゲル化を行わせたあと、血清不含培地を500μL加え、37℃/5%CO2で培養を行った。また、培養液は２日に１度の割合で交換した。【００４２】
肝細胞は、5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (CDCF)を投与すると、この物質を細胞質に取り込み代謝することにより、蛍光物質であるフルオレセインにして毛細胆管内に排出するという性質を有する。この性質を利用して、毛細胆管の形成過程と面積を調べた。5μMの濃度で培養液にフルオレセインジアセテートを添加し、37℃で１５分静置した後、冷却した培養液で細胞を洗浄し、蛍光観察装置を付けた顕微鏡でフルオレセインの蛍光を観察した。図５に示すように、PDMS膜上で培養した肝細胞は、2日目から管状構造が蛍光色素で染色されはじめた。このことは、毛細胆管が形成されていることを示す。【００４３】
一方、図６に示すように、従来のポリスチレン培養器（製品名：BioCoatコラーゲンIコート２４穴ウェル、ベクトンディッキンソン社製）上で培養した肝細胞は、２日目には管状構造はほとんど見られず、排出活性を持たないため細胞内が染色された細胞が多数を占めた。
毛細胆管の面積を経時的に比較したところ、2日目から10日目までPDMS膜上のほうが従来のポリスチレン上での培養より、毛細胆管形成面積が広かった。一方、従来のポリスチレン上での培養では毛細胆管の経時的な漸減が見られたが、PDMS膜上の培養では顕著な毛細胆管の減少は見られなかった（図７）。
以上より、PDMS膜上で培養することにより、効率よく、安定かつ長期的に、毛細胆管を形成した肝細胞を調製できることがわかった。
【実施例２】
【００４４】
PDMS膜の前処理方法検討
実施例１で作製したコラーゲンを共有結合させたPDMS膜培養器と、コラーゲンを吸着結合させたPDMS膜培養器との、毛細胆管形成の効率を比較した。【００４５】
PDMS膜24穴培養器の作製
コラーゲンを共有結合させたPDMS膜２４穴培養器は実施例１と同様に作製した。コラーゲンを吸着結合させたPDMS膜２４穴培養器は、実施例１のアミノシラン処理工程の後、酸素プラズマ処理したPDMS膜製24穴培養器に対して、1.7mg/mLのコラーゲン溶液（ベクトンディッキンソン社製）をウェルに少量添加して覆い、18時間室温で置いた後、PBSで洗浄して作製した。いずれも、当日のうちに以下の実験に用いた。【００４６】
コラーゲンゲルサンドイッチの作製と毛細胆管の可視化
実施例１と同様の方法でコラーゲンゲルサンドイッチ肝細胞カルチャーを作製した。フルオレセインジアセテートを用いて毛細胆管の形成を観察したところ(図８)、培養4日目(コラーゲンゲル重層3日後）にはコラーゲンを吸着結合させた培養器(a)、共有結合させた培養器(b)どちらとも毛細胆管の形成が見られた。しかしながら、培養7日目では、コラーゲンを吸着結合させた培養器(c)のほうが共有結合させた培養器(d)より細胞の剥離が顕著となり、毛細胆管も消失してしまった。
このことから、コラーゲンを共有結合させた方が、安定かつ長期的に毛細胆管を形成した肝細胞を調製できる。
【実施例３】
【００４７】
重層する細胞外マトリクス成分の検討
実施例１で作製したコラーゲンを共有結合させたPDMS膜培養器において、重層する細胞外マトリクス成分による毛細胆管形成の効率を比較した。【００４８】
重層する細胞外マトリクス成分以外は、実施例１の方法に従って実施した。上記で調製した培養器に1穴あたり肝実質細胞を2x105個播種し、その4時間後、培地を交換した。播種24時間後に1.7mg/mlコラーゲン溶液(ベクトンディッキンソン社製) 20μLを重層して、37℃で1時間ゲル化を行わせたものをコラーゲンゲルサンドイッチ群とした。一方、播種後24時間後に血清不含培地でマトリゲル（ベクトンディッキンソン社製）を50倍希釈（150μg/mLに相当）して添加したものをマトリゲルサンドイッチ群とした。何も添加しないものを無処理群とした。【００４９】
フルオレセインジアセテートを用いて毛細胆管の形成を見たところ(図９)、培養4日目
（細胞外マトリクス成分添加3日後）にはコラーゲンゲルサンドイッチ(a)、マトリゲルサンドイッチ群(b)とも毛細胆管の形成が観察され、培養7日目まで維持された。無処理群では毛細胆管が全く形成されず、培養３日目から細胞の剥離が顕著になり、５日目にはほとんどの細胞が剥がれてしまった(c)。
以上より、PDMS膜上ではコラーゲンの重層でもマトリゲルの重層でも毛細胆管の形成が可能なことがわかった。
【実施例４】
【００５０】
5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (CDCF)によるMRP2活性測定
実施例１で作製したPDMS膜培養器で培養された毛細胆管を形成したコラーゲンゲルサンドイッチ肝細胞を使用して、5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (CDCF)の取り込みによる薬物トランスポーター（ＭＲＰ２）の活性を非特許文献（Liu X et al., Am J Physiol, 1999, vol.277, pp.12-21）に従って以下のように測定した。また、従来のポリスチレン培養器で培養された肝細胞を比較として使用した。【００５１】
材料
Ca/Mg(+) HBSSは、HBSS (Invitrogen, 14175-079) を50mL、14g/L CaCl2を500μL、10g/L MgCl2/6H2Oを500μL加え用時調製した。CDCF溶液は、用時に1mM CDCF (in dimethyl sulfoxide: Molecular Probes, C-369)を用いて、Ca/Mg(+) HBSSで5μM CDCF溶液を作成し、37℃ウォーターバスで保温した。Ca/Mg(-) HBSSは、HBSS (Invitrogen, 14175-079) 50mLに100mM EGTAを500μL加えて調製した。0.5% Triton X-100/PBSは、ＰＢＳバッファーに０．５％になるようにTriton X-100を加えて調製した。【００５２】
化合物適用・回収操作（24穴プレートの場合）
培養開始4日後（ゲル重層3日後）の肝細胞培養を二つ用意した。続いて、それぞれの培養を別々に温Ca/Mg(+) HBSS または 温Ca/Mg(-) HBSSバッファ0.5mLで２回洗浄した。続いて、それぞれの培養を別々に温Ca/Mg(+) HBSS または 温Ca/Mg(-) HBSSバッファ0.5mL中で37℃に10分間放置したのち、液を除いた。続いて、両培養に5μM CDCFを含んだ温Ca/Mg(+) HBSSバッファ0.5mLを加え、5分間インキュベートののち、CDCF溶液を除去した。続いて、両培養を0.5mLの冷Ca/Mg(+) HBSSバッファで３回洗浄し、液を除いた。続いて、0.5% Triton X-100を含むPBS を500μL加えて、室温で20分間浸透したのち、回収した液を13000 x g, 15分、４℃で遠心して、上澄みを回収し、100μLを取って、励起492nm、蛍光530nmを蛍光マイクロプレートリーダーで計測して、CDCF量を定量した。また、原液25μLをBCAプロテインアッセイキット（Thermo社製）によりタンパク量を計測した。胆汁排出インデックス(Bile Excretion Index: BEI)はタンパク量当たりの蛍光輝度値(Accumulation)からの以下の計算式より求めた。【００５３】
【数１】
2011024592.tif 000003
【００５４】
結果を図１０に示す。ガス透過性膜を使用した場合は、ＢＥＩ値は約４０％であり、ポリスチレン（ＰＳ）基板を使用した場合は、ＢＥＩ値は約２０％であった。
以上より、ガス透過性膜のほうがポリスチレン製基板を用いるより、肝細胞にMRP排出活性が高い毛細胆管構造を構築させることができることがわかり、高感度（少量の化合物で精度良く）に化合物の評価を行えることがわかった。
【実施例５】
【００５５】
MRP2タンパク質の局在解析
実施例１で作製したPDMS膜培養器で培養された毛細胆管を形成した肝細胞を使用して、MRP2タンパク質の局在を、常法に従い細胞抗体染色により調べた。また、従来のポリスチレン培養器で培養された肝細胞を比較として使用した。
PDMS培養器と従来のポリスチレン培養器ともにMRP2タンパクが細胞間に検出されるが、PDMS培養器のほうがより広範囲にMRP2タンパクが発現している（図１１）。MRP2は胆汁排出に関わる主要なトランスポーターであることから、PDMS培養器で作製した毛細胆管のほうがより高い胆汁排出活性を持っていると推測できる。
【実施例６】
【００５６】
コラーゲン吸着結合したPDMS膜とマトリゲルによる早期極性形成の検討
実施例２で作製したコラーゲン吸着結合したPDMS膜製２４穴培養器およびコラーゲンコートポリスチレン製２４穴プレート（Beckton Dickinson）に、ラットから調製した肝細胞を播種した。播種2時間後に培地を除いてマトリゲルを含んだWilliam's Medium E（含5μg/mLインスリン、5μg/mLトランスフェリン、5μg/mL亜セレン酸，１μMデキサメタゾン）に交換した。
マトリゲル（MG）濃度の検討のため、コラーゲン吸着結合したPDMS膜製２４穴培養器１穴辺り2x105個の細胞を播種し、播種2時間後に交換する培地中のマトリゲル濃度を50および150μg/mLにして４８時間培養した後に実施例４に記載の方法の通りBEI測定した。その結果、図１２に示すように、150μg/mLマトリゲルの方が50μg/mLより高いBEIを示した。
また、細胞播種密度の検討のため、肝細胞播種密度をコラーゲン吸着結合したPDMS膜製２４穴培養器１穴辺り2x105個、4x105個、6x105個にして、150μg/mLマトリゲルで48時間培養した後に実施例４に記載の方法の通りBEI測定した。その結果、図１３に示すように、2x105個がもっともBEIが高く、4x105個、6x105個の順にBEIは低下した。【００５７】
続いて、培養期間の最適ポイントの検討を行った。上記のようにして決定したマトリゲル濃度(150μg/mL)と細胞播種密度(2x105個)において、肝細胞播種後２４、４８、７２、９６時間に実施例４に記載の方法の通りBEI測定した。
図１４Ａに示すように、PDMS膜上では播種後２４時間および４８時間後に、ポリスチレン上で96時間培養した肝細胞と同等のBEIを示した。図１４ＢはPDMS膜製２４穴培養器およびコラーゲンコートポリスチレン製２４穴プレート上に肝細胞を播種後48時間および96時間後にCDCFが蓄積している部位を蛍光顕微鏡で撮影したものである。この像からもPDMS膜上の肝細胞のほうが従来の培養方法のそれより早期に活性をもった毛細胆管が形成されていることが確認できる。以上の結果から、PDMS膜製24穴培養器を用いてマトリゲルを重層して極性を誘導すると、播種後24時間後には極性が形成され、機能的な毛細胆管が現れる。これは、従来法によるものが同等のBEI値に到達するより72時間も早いことがわかった。
【実施例７】
【００５８】
極性マーカーの局在・発現の実証
実施例６で作製した毛細胆管を形成した肝細胞を使用して、MRP2および基底膜マーカーCD147の局在を、常法に従い細胞抗体染色により調べた。また、コラーゲンコートポリスチレン製２４穴プレートで培養した肝細胞と比較した。
図１５に示すように、PDMS膜上で培養すると、培養48時間後にはMRP2タンパク質とCD147タンパク質が細胞間に検出される。一方、従来のポリスチレン上ではCD147の発現は見られるがMRP2タンパク質の局在はほとんど見られない。ポリスチレン上でも極性が形成されている培養120時間後と比較してもPDMS膜上の肝細胞のほうが広範囲にMRP2タンパクが発現している。CD147の局在様式は両者でほとんど同様である。これらの結果から、PDMS膜上で培養された肝細胞はポリスチレン上によるものに比べてより早くMRP2分子の局在が生じるとともに、MRP2の発現はポリスチレン上より増強されることが示された。
【実施例８】
【００５９】
超微細構造観察による極性形成の実証
実施例６で作製した培養48時間後の肝細胞の微細構造を透過型電子顕微鏡(JEM1400 JEOL社製)で観察した。
図１６Ａで示すように、PDMS膜上で極性を誘導した肝細胞において、極性をもった肝細胞に典型的に見られる、毛細胆管腔(BC)、タイト結合(TJ)が見られる。図１６Ｂはタイト結合部分の拡大写真、図１６Ｃは腔壁に微小絨毛(MV)をもつ毛細胆管を示した。
この結果から、本法によって培養される肝細胞には構造的に生体と同等の極性が形成されることが示された。
【実施例９】
【００６０】
フルオロカーボン膜を使用したガス透過性プレートによる肝細胞の早期極性形成の検討
ガス透過性を持つフルオロカーボン膜が培養面に配置された24穴培養プレートLumox (In vitro systems and services社製)にラットから調製した肝細胞を１穴辺り1.0x105個または2.0x105個播種した。播種2時間後に培地を除いて150μg/mLマトリゲルを含んだWilliam's Medium E（含5μg/mLインスリン、5μg/mLトランスフェリン、5μg/mL亜セレン酸，１μM  デキサメタゾン）に交換した。肝細胞播種後４８時間に実施例４に記載の方法の通りBEI測定し、極性形成の程度を解析した。コラーゲンコートポリスチレン製２４穴プレートで培養した細胞を比較対照とした。
図１７に示すように、Lumox上ではポリスチレン（ＰＳ）製２４穴プレートより高いBEIを示した。細胞播種密度1穴辺り1.0x105個と2.0x105個では1.0x105個のほうが高いBEIを与えた。
【実施例１０】
【００６１】
代謝物の連続解析のための連続的毛細胆管の作製
実施例１に記載の要領で作製したフルオロカーボン製の膜に100μg/mL コラーゲンI-P（新田ゼラチン社製）を含む0.001N HCl溶液を塗布したのち乾燥させ、コラーゲンコート処理を行った。
次に、前記で作製した基板の上に肝細胞を規則正しく並べた。図１８Aに示すように、ゲル化前のコラーゲン溶液（濃度2.1mg/mL）に、幅が30μmで高さが100μmで長さが10mmの凸部を持ったPDMS製の型を配置して、37℃で60分間放置することでゲル化させることで凹部をもったコラーゲンゲルを作製した。
次に、図１８Bに示したように、作製した凹部を持ったゲルに、培養培地に懸濁したラットの肝細胞を播き、２回培地で洗浄することで、凹部のみに肝細胞を配列させて培養を行った。
24時間後に、コラーゲン溶液（濃度2.1mg/mL）を細胞上に重層し、さらに9日間培養した。このようにして配列させた９日目の肝細胞の写真を図１９に示す。連続的に毛細胆管が形成しているように観察された。【００６２】
次に、上記の毛細胆管が、実際に連続的に形成しているか確認するため、実施例１に記載したようにしてCDCFを培地中に添加して、上記で作製した連続的毛細胆管に代謝物のフルオロセインを蓄積させて、その蛍光を観察した。2日目では、一部に毛細胆管が形成している様子が観察でき、6日目では、それらの毛細胆管が連続している様子が観察できた。そして、9日目には、更に長く連続している様子が観察できた。9日目の結果を図２０に示す。蛍光が連続的に観察されていることから、1mmを超える連続した毛細胆管を作製できることが確認できた。【００６３】
さらに、作製した連続的毛細胆管にフルオレセインを蓄積させ、毛細胆管の一端（図２１A）を細いガラス管で開口した。その結果、開口前(図２１B)に毛細胆管内に蓄積していたフルオロセインが、開口約60秒後(図２１C)に消失したことがわかった。これによりこの毛細胆管の連続性が実証でき、さらに、胆汁の連続回収解析への利用可能であることも実証された。
また、上記において、フルオロカーボン製酸素透過膜のコラーゲンコート処理の有無は結果に影響しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の培養方法によって得られる培養肝細胞は肝細胞を用いた医薬品候補化合物スクリーニングの試験などに利用できる。そして、医薬品候補化合物等の肝細胞における取り込み・代謝・排泄の解析精度と効率の上昇に寄与し、創薬プロセスの高効率化につながる。
【符号の説明】
【００６５】
Ａ：培養器、Ｂ、Ｃ：化合物検定装置、
１、１０１：化合物供給部；２、１０２：本体部；３、１０３：回収部；１１：ガス透過性膜；１１’：隔壁；１２：コラーゲンコート層；１３：肝細胞；１４：毛細胆管；１５：コラーゲンマトリクス；１６：培地；２１：ガス透過性膜；２２：コラーゲン；２３：肝細胞；２４：毛細胆管；２５：細胞外マトリクス；２６：半透膜；２７：流路；２８：筒状体。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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