(57)【要約】【課題】  スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造する方法、対象となる試料のスーパーオキシド消去能を簡便に評価する方法、スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造する装置および対象となる試料のスーパーオキシド消去能を簡便に評価する装置を提供する。【解決手段】  本発明に係るスーパーオキシド製造方法は、（ａ）判定用溶液調製工程、（ｂ）判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、（ｃ）判定用スペクトル取得工程、（ｄ）相似判定工程、（ｅ）フラビン濃度取得工程、（ｆ）原料溶液調製工程、（ｇ）発生工程を有する。
2011071088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の工程を有するスーパーオキシド製造方法；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｆ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程、
（ｇ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生工程。
【請求項２】
フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の工程に代えて下記（ｈ）の工程を有する、請求項１に記載のスーパーオキシド製造方法；
（ｈ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程。
【請求項３】
フラビン濃度取得工程が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得工程である、請求項１または請求項２に記載のスーパーオキシド製造方法。
【請求項４】
電子供与体がＥＤＴＡである、請求項１から請求項３のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。
【請求項５】
スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項１から請求項４のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。
【請求項６】
水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項１から請求項５のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。
【請求項７】
試料のスーパーオキシド消去能を評価する方法であって、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）の工程を有する、前記方法；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程、
（ｊ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成工程、
（ｋ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得工程、
（ｌ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価する比較評価工程。
【請求項８】
フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｉ）の工程に代えて下記（ｍ）の工程を有する、請求項７に記載の方法；
（ｍ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程。
【請求項９】
フラビン濃度取得工程が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得工程である、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
電子供与体がＥＤＴＡである、請求項７から請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項７から請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項７から請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）の手段を備えるスーパーオキシド製造装置；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｖｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段、
（ｖｉｉ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生手段。
【請求項１４】
フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）の手段に代えて下記（ｖｉｉｉ）の手段を備える、請求項１３に記載のスーパーオキシド製造装置；
（ｖｉｉｉ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるように、リボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段。
【請求項１５】
フラビン濃度取得手段が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得手段である、請求項１３または請求項１４に記載のスーパーオキシド製造装置。
【請求項１６】
電子供与体がＥＤＴＡである、請求項１３から請求項１５のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。
【請求項１７】
スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項１３から請求項１６のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。
【請求項１８】
水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項１３から請求項１７のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。
【請求項１９】
試料のスーパーオキシド消去能を評価する装置であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉ）の手段を有する、前記装置；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｉｘ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段、
（ｘ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成手段、
（ｘｉ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得手段、
（ｘｉｉ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価するための比較評価用手段。
【請求項２０】
フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｉｘ）の手段に代えて下記（ｘｉｉｉ）の手段を備える、請求項１９に記載の装置；
（ｘｉｉｉ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段。
【請求項２１】
フラビン濃度取得手段が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得手段である、請求項１９または請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
電子供与体がＥＤＴＡである、請求項１９から請求項２１のいずれかに記載の装置。
【請求項２３】
スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項１９から請求項２２のいずれかに記載の装置。
【請求項２４】
水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項１９から請求項２３のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スーパーオキシド製造方法、スーパーオキシド消去能評価方法、スーパーオキシド製造装置およびスーパーオキシド消去能評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーオキシド（スーパーオキサイド、スーパーオキシドアニオン、スーパーオキシドアニオンラジカル）は酸素分子に電子が１個付加した物質であり、（・Ｏ２−）の化学式で表される。すなわち、スーパーオキシドは不対電子をもつ、ラジカル（フリーラジカル、遊離基）の一種である。不対電子とは、分子や原子の最外殻軌道に位置する、対になっていない電子をいい、ラジカルは一般に、この不対電子を解消しようとして他の物質を酸化ないし還元する、反応性の高い物質である。【０００３】
また、スーパーオキシドは活性酸素の一種である。活性酸素とは、酸素が化学的に活性になり、一般的に非常に不安定で強い酸化力を示す、酸素の誘導体をいう。スーパーオキシドは生体内において最も多く発生する活性酸素であり、エネルギー代謝系、核酸代謝系、免疫系などにおいて、キサンチンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼなどの酵素により常時生成される。また、喫煙、抗癌剤、紫外線、除草剤、ストレス、排気ガスなどの刺激に曝されることにより、スーパーオキシドの生成は促進される。生成されたスーパーオキシドは、免疫系において、侵入した病原微生物に対する殺菌作用を発揮することが知られており、生体防御に重要な役割を果たしている。【０００４】
一方、生体内で過剰に生成されたスーパーオキシドは、自発的な不均化反応により、過酸化水素やヒドロキシラジカル（・ＯＨ−）といった、スーパーオキシドに比べてより強力な酸化力を有する活性酸素に変化する。その結果、スーパーオキシドは、核酸や酵素、細胞膜など、さまざまな物質の酸化変性を引き起こすことから、生体における酸化障害の出発物質のひとつとされ、疾病や老化の原因となっていると考えられている。そこで、昨今、スーパーオキシドによる生体への影響についての研究や、スーパーオキシドの活性を抑制する物質の探索などが行われており、余計なラジカルを発生させずにスーパーオキシドを発生させる技術などが求められている。【０００５】
従来、スーパーオキシドを発生させる方法として、例えば、ヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼを作用させて発生させる方法（非特許文献１）、超酸化カリウム（ＫＯ２）を水に溶解させる方法（非特許文献２）、陽極とレドックスポリマー担持陰極との間に電流を流して発生させる方法（特許文献１）、水に浸漬したアルミニウム陽極酸化皮膜に紫外線を照射して発生させる方法（特許文献２）、混合気体を封入した放電管に高電圧をかけて発生させる方法（特許文献３）、パルスラジオリシス法を用いた方法（非特許文献３）、フラビンおよび電子供与体に光を照射する方法（非特許文献４〜７）などを挙げることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−２７３４３３号公報
【特許文献２】特開２００３−１１２０５３号公報
【特許文献３】特開平１０−１５２３０６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ Ｅ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第１６巻、第６７６−６８５頁、１９７９年
【非特許文献２】Ｈａｒｂｏｕｒ ＪＲ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、第８２巻、第１３７９−１３９９頁、１９７８年
【非特許文献３】Ｒｅｄｐａｔｈ ＪＬ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ｓｔｕｄ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．第３３巻、第３０９−３１５頁、１９７８年
【非特許文献４】Ｍａｓｓｅｙ Ｖ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第３２巻、第５７９−６３８頁、１９６３年
【非特許文献５】Ｍａｓｓｅｙ Ｖ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、第８４巻、第１号、第５−２１頁、１９７７年
【非特許文献６】Ｃ．Ｂｅａｕｃｈａｍら、Ａｎａｌｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第４４巻、第２７６−２８７頁、１９７１年
【非特許文献７】Ｈ．Ｐ．Ｍｉｓｉｒａら、ＡＢＢ、第１８１巻、第３０８−３１２頁、１９７７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、非特許文献１に開示された方法では、酵素活性の低下や喪失を生ずることから、安定したスーパーオキシドの発生を担保することができず、非特許文献２に開示された方法では、スーパーオキシドの発生量を制御することが困難である。また、非特許文献３に開示された方法では、スーパーオキシドの発生と同時に、ヒドロキシラジカルや水和電子などの他の分子も同時に発生してしまうため、スーパーオキシドを選択的に発生させることができない。この点、特許文献１および特許文献２に開示された方法も、スーパーオキシドと同時に、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、あるいはオゾンなどの他の分子も同時に発生してしまうため、同様にスーパーオキシドを選択的に発生させることができない。非特許文献４〜７に開示された方法もまた、スーパーオキシドと同時に電子供与体に由来するラジカル（電子供与体ラジカル、妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）などの他の分子が発生してしまうため、やはりスーパーオキシドを選択的に発生させることができない。さらに、非特許文献３に開示された方法では、放射線を照射する装置を要することから、簡便な方法とはいえないが、この点、特許文献３に開示された方法もまた、高電圧を要するとともに放電管内部を陰圧にしなければならず、同様に簡便な方法とはいえない。【０００９】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造する方法、対象となる試料のスーパーオキシド消去能を簡便に評価する方法、スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造する装置および対象となる試料のスーパーオキシド消去能を簡便に評価する装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）のスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）を生成させた後、電子スピン共鳴によりスペクトルを取得し、このスペクトルとスーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトル（スーパーオキシド標準スペクトル）とが相似するか否かの判定によりフラビンの濃度を取得して、取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液に光を照射することにより、電子供与体ラジカルの発生量を抑えて、スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造できることを見出すとともに、同様にして取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製して光を照射した後、電子スピン共鳴によりスペクトルを取得し、このスペクトルとスーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルとを比較することにより、前記試料のスーパーオキシド消去能を評価できることを見出し、下記の各発明を完成した。【００１１】
（１）下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の工程を有するスーパーオキシド製造方法；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｆ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程、
（ｇ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生工程。【００１２】
（２）フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の工程に代えて下記（ｈ）の工程を有する、（１）に記載のスーパーオキシド製造方法；
（ｈ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程。【００１３】
（３）フラビン濃度取得工程が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得工程である、（１）または（２）に記載のスーパーオキシド製造方法。【００１４】
（４）電子供与体がＥＤＴＡである、（１）から（３）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。【００１５】
（５）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（１）から（４）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。【００１６】
（６）水系溶媒がリン酸緩衝液である、（１）から（５）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造方法。【００１７】
（７）試料のスーパーオキシド消去能を評価する方法であって、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）の工程を有する、前記方法；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程、
（ｊ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成工程、
（ｋ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得工程、
（ｌ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価する比較評価工程。【００１８】
（８）フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｉ）の工程に代えて下記（ｍ）の工程を有する、（７）に記載の方法；
（ｍ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程。【００１９】
（９）フラビン濃度取得工程が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得工程である、（７）または（８）に記載の方法。【００２０】
（１０）電子供与体がＥＤＴＡである、（７）から（９）のいずれかに記載の方法。【００２１】
（１１）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（７）から（１０）のいずれかに記載の方法。【００２２】
（１２）水系溶媒がリン酸緩衝液である、（７）から（１１）のいずれかに記載の方法。【００２３】
（１３）下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）の手段を備えるスーパーオキシド製造装置；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｖｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段、
（ｖｉｉ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生手段。【００２４】
（１４）フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）の手段に代えて下記（ｖｉｉｉ）の手段を備える、（１３）に記載のスーパーオキシド製造装置；
（ｖｉｉｉ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるように、リボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段。【００２５】
（１５）フラビン濃度取得手段が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得手段である、（１３）または（１４）に記載のスーパーオキシド製造装置。【００２６】
（１６）電子供与体がＥＤＴＡである、（１３）から（１５）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。【００２７】
（１７）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（１３）から（１６）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。【００２８】
（１８）水系溶媒がリン酸緩衝液である、（１３）から（１７）のいずれかに記載のスーパーオキシド製造装置。【００２９】
（１９）試料のスーパーオキシド消去能を評価する装置であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉ）の手段を有する、前記装置；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｉｘ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段、
（ｘ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成手段、
（ｘｉ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得手段、
（ｘｉｉ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価するための比較評価用手段。【００３０】
（２０）フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｉｘ）の手段に代えて下記（ｘｉｉｉ）の手段を備える、（１９）に記載の装置；
（ｘｉｉｉ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段。【００３１】
（２１）フラビン濃度取得手段が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得手段である、（１９）または（２０）に記載の装置。【００３２】
（２２）電子供与体がＥＤＴＡである、（１９）から（２１）のいずれかに記載の装置。【００３３】
（２３）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（１９）から（２２）のいずれかに記載の装置。【００３４】
（２４）水系溶媒がリン酸緩衝液である、（１９）から（２３）のいずれかに記載の装置。【００３５】
（２５）下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）の工程を有するスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ製造方法；
（Ａ）任意量のフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する原料投与工程、
（Ｂ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（Ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（Ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（Ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの至適量を取得するフラビン至適量取得工程、
（Ｆ）前記取得した至適量のフラビンおよび電子供与体を前記生体試料または非ヒト動物の体内に投与する至適原料投与工程、
（Ｇ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビンおよび電子供与体が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生工程。【００３６】
（２６）電子供与体がＥＤＴＡである、（２５）に記載のスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ製造方法。【００３７】
（２７）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（２５）または（２６）に記載のスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ製造方法。【００３８】
（２８）ｉｎ ｖｉｖｏにおいて試料のスーパーオキシド消去能を評価する方法であって、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｊ）および（Ｋ）の工程を有する、スーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ消去能評価方法；
（Ａ）任意量のフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する原料投与工程、
（Ｂ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（Ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（Ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（Ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの至適量を取得するフラビン至適量取得工程、
（Ｈ）前記取得した至適量のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料を含む評価検体を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する評価検体投与工程、
（Ｉ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与した評価検体に光を照射してスピンアダクトを生成させるｉｎ ｖｉｖｏスピンアダクト生成工程、
（Ｊ）前記スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得するｉｎ ｖｉｖｏスペクトル取得工程、
（Ｋ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記取得したスペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価するｉｎ ｖｉｖｏ比較評価工程。【００３９】
（２９）電子供与体がＥＤＴＡである、（２８）に記載のスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ消去能評価方法。【００４０】
（３０）スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、（２８）または（２９）に記載のスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ消去能評価方法。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によれば、生体外および生体内において、スーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを選択的に発生させ、簡便かつ安定的に製造することができることから、疾患や老化現象などにおけるスーパーオキシドの関与についての評価や研究を正確かつ簡便に行うことが可能となり、スーパーオキシドが関与する疾患や老化現象などの治療法・予防法の探索や進行メカニズムの解明を促進することができる。また、本発明によれば、生体外および生体内において、対象となる試料のスーパーオキシド消去能を簡便に評価することができることから、生体にとって真に有効な抗酸化物質の探索や、種々の物質が有する抗酸化能の評価を正確、簡便かつ迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明に係るスーパーオキシド製造装置の一実施形態を示す図である。
【図２】本実施形態のスーパーオキシド製造装置１における各構成部の機能を示す機能ブロック図である。
【図３】本実施形態における判定用溶液調製手段２を示す図である。
【図４】本実施形態における判定用スペクトル取得手段４を示す図である。
【図５】本実施形態における相似判定手段５を示す図である。
【図６】本実施形態における原料溶液調製手段７を示す図である。
【図７】本発明に係るスーパーオキシド消去能評価装置の一実施形態を示す図である。
【図８】本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９における各構成部の機能を示す機能ブロック図である。
【図９】本実施形態における評価溶液調製手段１０を示す図である。
【図１０】ＳＯＤ無添加水系溶液およびＳＯＤ添加水系溶液に可視光を照射した後、電子スピン共鳴（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｉｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＥＳＲ）による測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。図中、スペクトルＡはＳＯＤ無添加水系溶液から得られたスペクトルを示し、スペクトルＢは、ＳＯＤ添加水系溶液から得られたスペクトルを示す。
【図１１】スーパーオキシドとＣＹＰＭＰＯからなるスピンアダクトの、コンピューターシミュレーションにより得られたスペクトル（スーパーオキシド標準スペクトル）を示す図（上図）、およびＥＤＴＡラジカルの、コンピューターシミュレーションにより得られたスペクトル（ＥＤＴＡラジカル標準スペクトル）を示す図（下図）である。
【図１２】酸化還元反応触媒としてリボフラビンを、かつ電子供与体としてテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＤ）を用いて調製した水系溶液に可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。
【図１３】酸化還元反応触媒としてリボフラビンを、かつ電子供与体としてメチオニンを用いて調製した水系溶液に可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。
【図１４】酸化還元反応触媒としてＦＭＮを、かつ電子供与体としてＥＤＴＡを用いて調製した水系溶液に可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。
【図１５】酸化還元反応触媒としてＦＭＮを、かつ電子供与体としてＴＭＤを用いて調製した水系溶液に可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。
【図１６】酸化還元反応触媒としてフルオレセインを、かつ電子供与体としてメチオニンを用いて調製した水系溶液に可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行い、得られたスペクトルを示す図である。
【図１７】リボフラビンの濃度を変えた水系溶液に可視光を照射して、発生したラジカルの特定および定量を行い、発生したラジカルにおけるスーパーオキシドの純度を算出した結果を示す図である。図中、縦軸は発生したラジカル量を、横軸はリボフラビン濃度をそれぞれ示す。
【図１８】可視光の照射時間を変えた水系溶液について、ＥＳＲによる測定により得られたスペクトルのシグナル強度を示す図である。図中、縦軸はシグナル強度を、横軸は可視光照射時間ないし可視光照射停止後の時間を示す。
【図１９】リボフラビンの光照射によりスーパーオキシドを発生させた場合およびキサンチンオキシダーゼによりスーパーオキシドを発生させた場合における、ＳＯＤによるラジカル発生阻害率を示す図である。図中、縦軸はラジカル発生阻害率を、横軸は加えたＳＯＤ濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明に係るスーパーオキシド製造方法、スーパーオキシド消去能評価方法、スーパーオキシド製造装置およびスーパーオキシド消去能評価装置について詳細に説明する。
【００４４】
まず、本発明に係るスーパーオキシド製造方法は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の工程を有する；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｆ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程、
（ｇ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生工程。
【００４５】
本実施形態において「高純度でスーパーオキシドを含有するラジカル」とは、スーパーオキシドと電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）とからなるラジカルの集合であって、その集合においてスーパーオキシドが占める割合（スーパーオキシドの純度）がスーパーオキシド以外の種類のラジカルが占める割合と比較して十分に大きいラジカルをいい、その純度は、７０％以上１００％未満が好ましく、７５．６％以上１００％未満がより好ましく、８３．３％以上１００％未満がさらに好ましい。
【００４６】
なお、スーパーオキシドを含有するラジカルにおけるスーパーオキシドの純度は、常法に従い算出することができ、例えば、まず、水系溶液においてスーパーオキシドを含有するラジカルを発生させて電子スピン共鳴による測定を行い、スーパーオキシド標準スペクトルと相似するスペクトルを得て、このスペクトルに基づいてスーパーオキシド発生量を測定する。次に、スーパーオキシド発生量を測定した場合と同様の組成の水系溶液にスーパーオキシドを特異的に消去する酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を添加した上でラジカルを発生させて電子スピン共鳴による測定によりスペクトルを取得し、このスペクトルに基づいて電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）発生量を測定する。続いて、測定したスーパーオキシド発生量と電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）発生量とから、次式１によりスーパーオキシドの純度を算出することができる。
【００４７】
ここで、電子スピン共鳴（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｉｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＥＳＲ）とは、ラジカルの同定および定量に用いられる方法の一種である。電子スピン共鳴では、サンプルを磁場の中に置き、マイクロ波を照射して前記サンプルに含まれるラジカルの不対電子を共鳴させ、共鳴したときに起こる吸収エネルギーを測定する。磁場を変化させながらこの吸収エネルギーの測定を行い、一連の吸収エネルギー変化をスペクトルとして取得する。ラジカルの種類によりスペクトルの形状が決定されるため、取得されたスペクトルの形状を観察することにより、前記サンプルに含まれるラジカルを同定することができる。
【００４８】
（式１）：スーパーオキシドの純度（％）＝｛スーパーオキシド発生量／（スーパーオキシド発生量＋電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）発生量）｝×１００
【００４９】
本発明において、スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトル（スーパーオキシド標準スペクトル）とは、スーパーオキシドのスピンアダクト、高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルのスピンアダクトまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルのスピンアダクトとラジカルとの混合物について、電子スピン共鳴による測定を行って得られるスペクトルまたは電子スピン共鳴による測定を行った場合に得られると想定されるスペクトルをいう。スーパーオキシド標準スペクトルは、例えば、コンピューターシミュレーションにより得ることができ、既報（ＭＡＳＡＴＯ Ｋ．ら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４０巻、第１１号、第１１６６−１１７２頁、２００６年）に記載のものを用いることができる他、キサンチンオキシダーゼにより高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを発生させて電子スピン共鳴による測定を行うことにより得ることもできる。
【００５０】
工程（ａ）：判定用溶液調製工程において、判定用溶液は、フラビン、電子供与体およびスピントラップ剤を水系溶媒に溶解することにより調製することができ、その特徴を損なわない限りにおいて、他の物質を含んでもよい。
【００５１】
フラビンは、ジメチルイソアロキサジンの１０位に置換基をもつ一群の誘導体である。次式２および３に示すように、フラビンは電子供与体の共存下で光を照射されると、エネルギー順位の高い状態へ励起され、電子供与体から１電子を奪い、フラビンラジカルとなる。同時に、１電子を奪われた電子供与体は不対電子を有することとなるため、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）となる（式２）。続いてフラビンラジカルは酸素分子に１電子を付加し、スーパーオキシドを発生させる（式３）。
【００５２】
（式２）：フラビン＋電子供与体＋光→フラビンラジカル＋電子供与体ラジカル
（式３）：フラビンラジカル＋酸素分子→スーパーオキシド＋フラビン
【００５３】
本発明によれば、上記の反応を利用してスーパーオキシドまたは高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを製造することができる。本発明において用いることができるフラビンとしては、例えば、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、イソアロキサジン、アロキサジン、ルミクロム、ルミフラビン、フラビン−アデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ガラクトフラビン、Ｄ−アラボフラビン、リキソフラビンおよびそれらの任意の組み合わせなどを挙げることができるが、リボフラビン、ＦＭＮ、またはこれらの混合物を好適に用いることができる。
【００５４】
また、本発明において用いる電子供与体は、励起されたフラビンに電子を与える、低い酸化還元電位を有する物質であればよく、酸素含有化合物、窒素含有化合物、リン含有化合物、硫黄含有化合物を挙げることができ、窒素含有化合物が好ましい。そのような窒素含有化合物としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、メチオニン、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＤ，ＴＭＥＤ）などを挙げることができるが、ＥＤＴＡを好適に用いることができる。
【００５５】
スピントラップ剤は、短時間で他の物質に変化する不安定なラジカルと共有結合（アダクト）して、安定なスピンアダクトを生成する試薬である。スーパーオキシドも不安定なラジカルであるため、直接、電子スピン共鳴により検出することは困難であるが、スピンアダクトを生成させることにより検出が可能となる。本発明において用いるスピントラップ剤は、少なくともスーパーオキシドとスピンアダクトを生成するものであればよく、例えば、２−（５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−２λ５−［１，３，２］ｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｉｎａｎ−２−ｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ １−ｏｘｉｄｅ（ＣＹＰＭＰＯ）、５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−ｏｘｉｄｅ(ＤＭＰＯ)、５−Ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ５−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−ｏｘｉｄｅ(ＤＥＰＭＰＯ)、２，５，５−ｔｒｉｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−Ｏｘｉｄｅ(Ｍ３ＰＯ)、３，３，５，５−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−Ｏｘｉｄｅ(ＴＭＰＯ)などを挙げることができるが、ＣＹＰＭＰＯを好適に用いることができる。
【００５６】
また、本発明において用いる水系溶媒は、水系溶媒を含む溶液のｐＨを一定に保つ機能を有する限り特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液などを挙げることができるが、リン酸緩衝液を好適に用いることができる。
【００５７】
工程（ｂ）：判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程において、判定用溶液への光の照射は、適当な光源を用いて行うことができる。本発明において用いることができる光源としては、例えば、キセノンランプ、蛍光ランプ、ハロゲンランプ、クリプトンランプ、ナトリウムランプ、水銀ランプ、メタルハライドランプなどを挙げることができる。なお、本発明において用いる光の種類（波長）、光の強さ、照射時間は特に限定されず、光源の種類、光源と照射する対象との位置関係、照射する対象の量、照射する対象の濃度、照射した結果発生するスーパーオキシドの必要量などの条件に応じて、適宜設定することができる。
【００５８】
また、工程（ｂ）：判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程において、判定用溶液に光を照射すると、上記（式２）に示す反応により電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）が、上記（式３）に示す反応によりスーパーオキシドがそれぞれ生成する。生成したスーパーオキシドは、判定用溶液中のスピントラップ剤と共有結合することから、スーパーオキシドのスピンアダクトを生成させることができる。また、判定用溶液中のスピントラップ剤が電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）とスピンアダクトを形成するものである場合は、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）のスピンアダクトが生成する。
【００５９】
工程（ｃ）：判定用スペクトル取得工程において、スーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）のスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）の電子スピン共鳴による検出およびスペクトル（判定用スペクトル）の取得は、常法に従い行うことができ、例えば、ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ（日本電子社）などの市販のＥＳＲ測定装置を用いて行うことができる。なお、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）は、一般に比較的安定で寿命が長いため、スピンアダクトを形成した場合のみならず、スピンアダクトを形成していない場合も電子スピン共鳴により検出することができる。
【００６０】
工程（ｄ）：相似判定工程において、スーパーオキシド標準スペクトルと判定用スペクトルとが相似するか否かの判定は、例えば、スーパーオキシド標準スペクトルと判定用スペクトルとを並べて、または重ねて表示したうえで目視することにより行うことができる他、形状比較プログラムなどを用いてコンピューター処理をすることにより行うこともできる。
【００６１】
ここで、本発明において、複数のスペクトルが「相似する」または「相似関係にある」という場合は、複数のスペクトルが互いに縮小または拡大の関係にある場合のみならず、複数のスペクトルの形状について相同性が高い場合が含まれる。ここにいう、「高い相同性」とは、少なくとも７０％以上相同性をいい、好ましくは８０％以上相同性、より好ましくは８５％相同性、さらに好ましくは９０％以上相同性、よりさらに好ましくは９５％以上相同性をいう。
【００６２】
工程（ｅ）：フラビン濃度取得工程において、フラビンの濃度は、工程（ｄ）によりスーパーオキシド標準スペクトルと相似すると判定される判定用スペクトルが得られた場合に、その判定用溶液に係るフラビンの濃度を取得することができる構成や機能を有していればよい。すなわち、工程（ｅ）によれば、工程（ｄ）においてスーパーオキシド標準スペクトルと判定用スペクトルとが相似しないと判定された場合には、再度、工程（ａ）においてフラビンの濃度を変えた判定用溶液が調製され、以下、工程（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）を行うというように、必要に応じて工程（ａ）〜（ｄ）による判定処理をスーパーオキシド標準スペクトルに相似する判定用スペクトルが得られるまで繰り返されるため、最終的に所望のフラビンの濃度を取得することができる。
【００６３】
なお、工程（ｅ）：フラビン濃度取得工程では、相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％の範囲となるように取得することができる。
【００６４】
工程（ｆ）：原料溶液調製工程において、原料溶液は、フラビンおよび電子供与体を水系溶媒に溶解することにより調製することができる。原料溶液におけるフラビンの濃度は、工程（ｅ）において取得した濃度となるように調製する。なお、本発明において、原料溶液には、その特徴を損なわない限りにおいて、他の物質を含んでもよい。
【００６５】
工程（ｇ）：発生工程において、原料溶液への光の照射は、上述した工程（ｂ）における判定用溶液への光の照射と同様の方法により行うことができる。
【００６６】
なお、本発明に係るスーパーオキシド製造方法において、フラビンがリボフラビンである場合は、上述の工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）に代えて、工程（ｈ）：「リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程」を有することができる。後述の実施例に示すように、リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液に光を照射してラジカルを生成した場合は、生成したラジカルにおいて、スーパーオキシドの純度が７５．６％〜１００％となるように製造することができる。さらに、リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１０となるようにリボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液に光を照射してラジカルを生成した場合は、生成したラジカルにおいて、スーパーオキシドの純度が８３．３％〜１００％となるように製造することができる。
【００６７】
次に、本発明に係るスーパーオキシド消去能評価方法は、試料のスーパーオキシド消去能を評価する方法であって、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）の工程を有する；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程、
（ｊ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成工程、
（ｋ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得工程、
（ｌ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価する比較評価工程。
【００６８】
なお、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）については、本発明に係るスーパーオキシド製造方法と同様である。
【００６９】
工程（ｉ）：評価溶液調製工程において、評価溶液は、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料を水系溶媒に溶解することにより調製することができる。評価溶液におけるフラビンの濃度は、工程（ｅ）において取得した濃度となるように調製する。なお、本発明において、評価溶液には、その特徴を損なわない限りにおいて、他の物質を含んでもよい。
【００７０】
本発明におけるスーパーオキシド消去能を評価する試料としては、例えば、食品や植物抽出物、化粧料組成物、医薬組成物などの化合物を挙げることができる。この評価の対象となる試料は、スーパーオキシドがスピンアダクトに変化する前にスーパーオキシドを消去することにより、「消去能を有する」との評価がなされる。
【００７１】
工程（ｊ）：評価用スピンアダクト生成工程において、評価溶液への光の照射は、上述した工程（ｂ）や（ｇ）における判定用溶液への光の照射と同様の方法により行うことができる。
【００７２】
工程（ｋ）：評価用スペクトル取得工程において、評価用スピンアダクトの電子スピン共鳴による検出およびスペクトル（評価用スペクトル）の取得は、上述した工程（ｃ）における方法と同様の方法により行うことができる。
【００７３】
工程（ｌ）：比較評価工程において、スーパーオキシド標準スペクトルと評価用スペクトルとの比較は、例えば、上述した工程（ｄ）における方法と同様の方法により行うことができる。また、試料のスーパーオキシド消去能の評価は、評価用スペクトルのシグナル強度が、スーパーオキシド標準スペクトルのシグナル強度と比較して小さくなる場合は、スーパーオキシドが消去されたとして、その試料は「スーパーオキシド消去能を有する」と評価される。一方、評価用スペクトルのシグナル強度がスーパーオキシド標準スペクトルのシグナル強度と比較してほとんど変わらない場合は、スーパーオキシドが消去されていないとして、その試料は「スーパーオキシド消去能を有さない」と評価される。すなわち、評価用スペクトルにおけるシグナル強度の減少と試料の抗酸化能とは比例関係にあり、試料が抗酸化能を有する物質である場合、評価用スペクトルのシグナル強度はスーパーオキシド標準スペクトルのシグナル強度と比較して減少し、試料が抗酸化能を有さない物質である場合、評価用スペクトルのシグナル強度はスーパーオキシド標準スペクトルのシグナル強度と比較してほとんど変わらないこととなる。
【００７４】
なお、本発明に係るスーパーオキシド消去能評価方法において、フラビンがリボフラビンである場合は、上述の工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｉ）に代えて、工程（ｍ）：「リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程」を有することができる。
【００７５】
次に、本発明は、スーパーオキシド製造装置を提供する。本発明に係るスーパーオキシド製造装置は、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）の手段を備える；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｖｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段、
（ｖｉｉ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生手段。
【００７６】
本発明に係るスーパーオキシド製造装置の一実施形態について、図面を用いて説明する。図１は、本実施形態のスーパーオキシド製造装置１の基本構成を説明する概念図である。図１に示すように、スーパーオキシド製造装置１は、主として、判定用溶液調製手段２と、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３と、判定用スペクトル取得手段４と、相似判定手段５と、フラビン濃度取得手段６と、原料溶液調製手段７と、発生手段８とから構成されている。
【００７７】
判定用溶液調製手段２は、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を適切に調製することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図３に示すように、判定用溶液収容部２３に挿通する判定用注入管２２が形成され、注入する物質の数に応じて注入量調節機能を備えた判定用容器２１を複数備える構成などを挙げることができる。このような構成の場合、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒がそれぞれ収容された、注入量調節機能を備えた判定用容器２１の各判定用注入管２２から、適切な量のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を判定用溶液収容部２３に注入することができ、その結果、判定用溶液を調製することができる。
【００７８】
なお、判定用溶液調製手段２は、後述する制御信号出力部６２から出力される制御信号によって制御可能に構成されている。また、判定用溶液収容部２３の構成としては、例えば、液体を保持する形体を有する容器からなる構成を挙げることができる。本発明において、容器を構成する素材としては、透明性、耐水性、耐食性、耐薬品性が高いものが好ましく、そのような素材としては、例えば、ガラス、プラスチックなどを挙げることができる。
【００７９】
次に、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３は、判定用溶液に対して適切に光を照射することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、光源からなる構成を挙げることができ、例えば、上述したスーパーオキシド製造方法の（ｂ）の工程において例示したキセノンランプ、蛍光ランプ、ハロゲンランプ、クリプトンランプ、ナトリウムランプ、水銀ランプ、メタルハライドランプなどがある。
【００８０】
次に、判定用スペクトル取得手段４は、判定用溶液に光を照射して得られるスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）のスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）を電子スピン共鳴により検出してそのスペクトルを取得することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図４に示すように、電磁石４１、マイクロ波発振器４２、クリスタルダイオード検出器４３、増幅器４４および記録計４５などを挙げることができる。この構成の場合、電磁石４１により形成した磁場の中に判定用溶液収容部２３を置き、マイクロ波発振器４２によりマイクロ波を照射して判定用溶液に含まれるスピンアダクトの不対電子を共鳴させ、生じた吸収エネルギーをクリスタルダイオード検出器４３で検出し、検出した信号を増幅器４４で増幅した後、記録計４５で記録することにより判定用スペクトルを取得することができる。また、例えばＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ（日本電子社）などの市販のＥＳＲ測定装置に準拠した構成としてもよい。
【００８１】
次に、相似判定手段５は、前記取得した判定用スペクトルがスーパーオキシド標準スペクトルに相似するか否かを判定することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図５に示すように、スペクトルのデータを入力する入力部５１と入力したスペクトルを表示する表示部５２とからなる構成を挙げることができる。この構成の場合、スーパーオキシド標準スペクトルおよび判定用スペクトルのデータを入力部５１に入力し、これらのスペクトルを表示部５２に表示して、その形状を比較することにより相似するか否かを判定することができる。
【００８２】
次に、フラビン濃度取得手段６は、相似判定手段５によりスーパーオキシド標準スペクトルと相似すると判定される判定用スペクトルが得られた場合に、当該判定用溶液に係るフラビンの濃度を取得することができる構成や機能を有していればよい。すなわち、フラビン濃度取得手段６によれば、相似判定手段５においてスーパーオキシド標準スペクトルと判定用スペクトルとが相似しないと判断された場合には、再度、判定用溶液調製手段２においてフラビンの濃度を変えた判定用溶液が調製され、以下、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３→判定用スペクトル取得手段４→相似判定手段５による判定処理をスーパーオキシド標準スペクトルに相似する判定用スペクトルが得られるまで繰り返されるため、最終的に所望のフラビンの濃度を取得することができる。
【００８３】
なお、フラビン濃度取得手段６は、相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％の範囲となるように取得することができる。
【００８４】
上述した相似判定手段５およびフラビン濃度取得手段６は、例えば、パーソナルコンピューターなどによって構成してもよい。具体的には、図２に示すように、上述した相似判定処理およびフラビン濃度取得処理を実行する相似判定プログラムや相似判定に必要な各種のデータ等を記憶する記憶手段Ｒと、この記憶手段Ｒや判定用スペクトル取得手段４から各種のデータを取得して演算処理する演算処理手段Ｃとから構成されている。以下、各構成手段について説明する。
【００８５】
記憶手段Ｒは、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ Ｄｉｓｋ Ｄｒｉｖｅ）、フラッシュメモリなどによって構成されており、各種のデータを記憶するとともに、演算処理手段Ｃが演算処理を行う際のワーキングエリアとして機能するものである。
【００８６】
本実施形態では、図２に示すように、記憶手段Ｒには、相似判定プログラムがインストールされている。そして、演算処理手段Ｃが、相似判定プログラムを実行することにより、コンピューターを後述する各構成部として機能させるようになっている。なお、相似判定プログラムの利用形態は、上記構成に限られるものではなく、ＣＤ−ＲＯＭ等の記録媒体に記憶させておき、この記録媒体から直接起動して実行してもよい。
【００８７】
また、記憶手段Ｒには、相似判定する際の基準となる標準スペクトルのデータが記憶されている。この標準スペクトルデータは、上述したように、例えば、コンピューターシミュレーションや既報によって得られたものをデータベース化したものである。
【００８８】
次に、演算処理手段Ｃは、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）などから構成されており、記憶手段Ｒにインストールされた相似判定プログラムを実行することにより、図２に示すように、判定用スペクトルデータ取得部５３と、標準スペクトルデータ取得部５４と、スペクトル比較判定部５５と、フラビン濃度取得部６１と、制御信号出力部６２として機能するようになっている。以下、これら各構成部についてより詳細に説明する。
【００８９】
判定用スペクトルデータ取得部５３は、判定用スペクトル取得手段４によって取得された判定用スペクトルをデータとして取得するものである。例えば、記録計４５に記録された判定用スペクトルをデジタルデータに変換し、所定のインターフェースからなる入力部５１から入力するようにしてもよい。
【００９０】
標準スペクトルデータ取得部５４は、記憶手段Ｒに記憶されている標準スペクトルのデータを読み出して取得するものである。
【００９１】
スペクトル比較判定部５５は、判定用スペクトルと標準スペクトルとを比較して相似するか否かを判定するものである。具体的には、スペクトル比較判定部５５は、判定用スペクトルデータ取得部５３が取得した判定用スペクトルデータと、標準スペクトルデータ取得部５４が取得した標準スペクトルデータとを取得し、両者を比較し、所定の相似条件に基づいて両者が相似するか否かを判定する。そして、当該判定結果を制御信号出力部６２へ出力するようになっている。
【００９２】
フラビン濃度取得部６１は、判定用溶液調製手段２によって調製された判定用溶液のフラビン濃度を取得するものである。本実施形態では、フラビン濃度取得部６１は、スペクトル比較判定部５５によって、相似していると判定された場合、所定の濃度測定器によって測定した判定用溶液のフラビン濃度をデータとして取得する。
【００９３】
制御信号出力部６２は、判定用溶液調製手段２や原料溶液調製手段７に制御信号を出力するものである。本実施形態における制御信号出力部６２は、スペクトル比較判定部５５から相似していないとの判定結果を受けた場合、判定用溶液調製手段２に対して、フラビン濃度を変更して再調整する旨の制御信号を送信する。一方、相似するとの判定結果を受けた場合、フラビン濃度取得部６１が取得したフラビン濃度によって原料溶液を調製する旨の制御信号を原料溶液調製手段７に対して送信する。
【００９４】
次に、原料溶液調製手段７は、フラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を適切に調製することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図６に示すように、原料溶液収容部７３に挿通可能な原料用注入管７２を備え、注入する物質の数に応じて注入量調節機能を備えた原料用容器７１を複数備える構成などを挙げることができる。この構成の場合、フラビン、電子供与体および水系溶媒がそれぞれ収容された、注入量調節機能を備えた原料用容器７１の各原料用注入管７２から、適切な量のフラビン、電子供与体および水系溶媒が原料溶液収容部７３に注入され、原料溶液が調製される。原料溶液収容部７３の構成としては、例えば、上述した判定用溶液収容部２３と同様の構成を挙げることができる。
【００９５】
なお、原料溶液調製手段７は、上述した制御信号出力部６２から出力された制御信号によって制御可能に構成されている。
【００９６】
次に、発生手段８は、原料溶液に対して適切に光を照射することができる構成や機能を有していればよく、そのような構成としては、例えば、上述した判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３と同様の構成を挙げることができる。
【００９７】
なお、本実施形態のスーパーオキシド製造装置１において、フラビンがリボフラビンである場合は、手段（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）に代えて、手段（ｖｉｉ）：「リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるように、リボフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段７」を備える構成とすることができる。
【００９８】
なお、本実施形態のスーパーオキシド製造装置１において、判定用溶液調製手段２は原料溶液調製手段７を兼ねる構成とし、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３は発生手段８を兼ねる構成としてもよく、別個の構成としてもよい。
【００９９】
また、本発明は、スーパーオキシド消去能評価装置を提供する。本発明に係るスーパーオキシド消去能評価装置は試料のスーパーオキシド消去能を評価する装置であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉ）の手段を有する；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似するフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｉｘ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段、
（ｘ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成手段、
（ｘｉ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得手段、
（ｘｉｉ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価するための比較評価用手段。
【０１００】
なお、工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）については、本発明に係るスーパーオキシド製造装置と同様である。
【０１０１】
本発明に係るスーパーオキシド消去能評価装置の一実施形態について、図面を用いて説明する。図７は、本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９の基本構成を説明する概念図である。図７に示すように、スーパーオキシド消去能評価装置９は、主として、判定用溶液調製手段２と、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３と、判定用スペクトル取得手段４と、相似判定手段５と、フラビン濃度取得手段６と、評価溶液調製手段１０と、評価用スピンアダクト生成手段１１と、評価用スペクトル取得手段１２と、比較評価用手段１３とから構成されている。なお、スーパーオキシド消去能評価装置９の構成のうち、上述したスーパーオキシド製造装置１の構成と同等または相当する構成については同一の符号を付し、再度の説明を省略する。
【０１０２】
評価溶液調製手段１０は、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を適切に調製することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、図９に示すように、評価溶液収容部１０３に挿通する評価用注入管１０２を備え、注入する物質の数に応じて注入量調節機能を備えた評価用容器１０１を複数備える構成などを挙げることができる。この構成の場合、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒がそれぞれ収容された、注入量調節機能を備えた評価用容器１０１の各評価用注入管１０２から、適切な量のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒が評価溶液収容部１０３に注入され、評価溶液が調製される。評価溶液収容部１０３の構成としては、例えば、上述した判定用溶液収容部２３と同様の構成を挙げることができる。なお、評価溶液調製手段１０は、制御信号出力部６２から出力される制御信号によって制御可能に構成されている。
【０１０３】
次に、評価用スピンアダクト生成手段１１は、評価溶液に対して適切に光を照射することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、上述した判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３と同様の構成を挙げることができる。
【０１０４】
次に、評価用スペクトル取得手段１２は、評価溶液に光を照射して得られるスピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、上述した判定用スペクトル取得手段４と同様の構成を挙げることができる。
【０１０５】
次に、比較評価用手段１３は、スーパーオキシド標準スペクトルと評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価することができる構成や機能を有していればよい。そのような構成としては、例えば、上述した相似判定手段５と同様の構成を挙げることができる。この構成の場合、表示部５２に表示されたスーパーオキシド標準スペクトルの形状と、評価用スペクトルの形状とを比較することにより、スーパーオキシド消去能を評価することができる。
【０１０６】
なお、本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９においては、相似判定手段５およびフラビン濃度取得手段６の他に、比較評価用手段１３をパーソナルコンピューターなどによって構成することができる。
【０１０７】
具体的には、図８に示すように、記憶手段Ｒには、別途、比較評価処理を実行するための比較評価プログラムが格納されている。一方、演算処理手段Ｃは、上述したスーパーオキシド製造装置１における演算処理手段Ｃの各構成部の他に別途、評価用スペクトルデータ取得部１３１と、スペクトル比較評価部１３２を有し、機能するようになっている。
【０１０８】
ただし、本実施形態においては、スペクトル比較判定部５５が相似すると判定した場合、制御信号出力部６２は、フラビン濃度取得部６１が取得したフラビン濃度によって評価溶液を調製する旨の制御信号を評価溶液調製手段１０に送信するようになっている。
【０１０９】
また、評価用スペクトルデータ取得部１３１は、評価用スペクトル取得手段１２によって取得された評価用スペクトルをデータとして取得するものである。
【０１１０】
スペクトル比較評価部１３２は、評価用スペクトルと標準スペクトルとを比較して、スーパーオキシド消去能を評価するものである。具体的には、スペクトル比較評価部１３２は、評価用スペクトルデータ取得部１３１が取得した評価用スペクトルデータと、標準スペクトルデータ取得部５４が取得した標準スペクトルデータとを取得し、両者を比較して所定の評価基準に従ってスーパーオキシド消去能を評価するようになっている。
【０１１１】
なお、本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９において、フラビンがリボフラビンである場合は、上述の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉｉｉ）の手段に代えて、手段（ｘｉｉ）：「リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段１０」を備える構成とすることができる。
【０１１２】
本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９において、判定用溶液調製手段２は評価溶液調製手段１０を兼ねる構成とし、判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段３は評価用スピンアダクト生成手段１１を兼ねる構成とし、判定用スペクトル取得手段４は評価用スペクトル取得手段１２を兼ねる構成とし、相似判定手段５は比較評価用手段１３を兼ねる構成としてもよく、別個の構成としてもよい。また、本実施形態のスーパーオキシド消去能評価装置９はスーパーオキシド製造装置１を兼ねる構成としてもよい。
【０１１３】
次に、本発明に係るスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ製造方法は、生体試料または非ヒト動物の体内において本発明に係るスーパーオキシド製造方法を適用した方法であり、生体試料または非ヒト動物の体液を水系溶媒として利用している点、フラビンの濃度を取得する代わりにフラビンの量（至適量）を取得する点、および投与したフラビンおよび電子供与体が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドを発生させる点で本発明に係るスーパーオキシド製造方法と異なっている。具体的には、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）の工程を有する；
（Ａ）任意量のフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する原料投与工程、
（Ｂ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビンおよび電子供与体が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（Ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（Ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（Ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの至適量を取得するフラビン至適量取得工程、
（Ｆ）前記取得した至適量のフラビンおよび電子供与体を前記生体試料または非ヒト動物の体内に投与する至適原料投与工程、
（Ｇ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビンおよび電子供与体が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生工程。
【０１１４】
本発明における生体試料としては、ヒトを含む動物、特に哺乳類から分離・採取された生体試料を用いることができ、例えば、罹患した哺乳類や老齢の哺乳類、実験動物などから分離・採取した生体試料を用いることができる。その形態としては、例えば、組織切片、細胞などの固形試料が望ましい。また、本発明において非ヒト動物としては、ヒト以外の動物を挙げることができ、例えば、ウシ、サル（サル目からヒトを除いたもの）、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ハムスター、ラット、マウスなどの哺乳類、ニワトリや七面鳥などの家禽、は虫類、両生類、魚類などを挙げることができる。
【０１１５】
本発明において、フラビンおよび電子供与体などの物質を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する方法は、常法に従い行うことができ、例えば、生体試料に投与する方法としては、フラビンおよび電子供与体を封入したリポソームを膜融合させる方法やマイクロインジェクション法などを、非ヒト動物に投与する方法としては、経口投与法や皮下注射法などを挙げることができる。
【０１１６】
また、体液としては、細胞外液のみならず細胞内液が含まれ、細胞外液としては血液やリンパ液の他、組織間液、細胞間液、間質液などの組織液、漿膜腔液、脳脊髄液、関節液、眼房水などの体腔液、消化液、尿、精液、膣液、羊水、乳汁などが含まれる。
【０１１７】
次に、本発明に係るスーパーオキシドｉｎ ｖｉｖｏ消去能評価方法は、生体試料または非ヒト動物の体内において本発明に係るスーパーオキシド消去能評価方法を適用した方法であり、生体試料または非ヒト動物の体液を水系溶媒として利用している点、フラビンの濃度を取得する代わりにフラビンの量（至適量）を取得する点、および投与したフラビンおよび電子供与体、もしくは投与したフラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料を含む評価検体に光を照射して、スーパーオキシドを発生させる、またはスピンアダクトを生成させるという点で本発明に係るスーパーオキシド製造方法と異なっている。具体的には、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）の工程を有する；
（Ａ）任意量のフラビン、電子供与体およびスピントラップ剤を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する原料投与工程、
（Ｂ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与したフラビンおよび電子供与体が存在する箇所に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（Ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（Ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（Ｅ）前記相似判定により相似するフラビンの至適量を取得するフラビン至適量取得工程、
（Ｈ）前記取得した至適量のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料を含む評価検体を生体試料または非ヒト動物の体内に投与する評価検体投与工程、
（Ｉ）前記生体試料または非ヒト動物の体内において前記投与した評価検体に光を照射してスピンアダクトを生成させるｉｎ ｖｉｖｏスピンアダクト生成工程、
（Ｊ）前記スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得するｉｎ ｖｉｖｏスペクトル取得工程、
（Ｋ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記取得したスペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価するｉｎ ｖｉｖｏ比較評価工程。
【０１１８】
工程（Ｈ）：評価検体投与工程において、評価検体を投与する際、投与する前に、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料から評価検体を調製してもよく、また、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤およびスーパーオキシド消去能を評価する試料を、それぞれ直接生体試料または非ヒト動物の体内に投与し、生体試料内または非ヒト動物の体内において評価検体を調製してもよい。
【０１１９】
また、評価検体には、その特徴を損なわない限りにおいて、フラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料に加え、緩衝液や溶媒、賦形剤などの他の物質を含んでもよい。
【０１２０】
以下、本発明に係るスーパーオキシド製造方法、スーパーオキシド消去能評価方法、スーパーオキシド製造装置およびスーパーオキシド消去能評価装置について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【０１２１】
＜実施例１＞リボフラビン、ＥＤＴＡ、ＣＹＰＭＰＯを含む水系溶液に光を照射して発生させたラジカルの電子スピン共鳴による測定
酸化還元反応触媒としてリボフラビン、電子供与体としてＥＤＴＡ、スピントラップ剤としてＣＹＰＭＰＯを含む水系溶液を調製し、これに光を照射してラジカルを発生させ、発生したラジカルを、電子スピン共鳴（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｉｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＥＳＲ）により同定および定量した。【０１２２】
（１）水系溶液の調製
５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にリボフラビン、ＥＤＴＡ、ＣＹＰＭＰＯ（ラジカルリサーチ社）をそれぞれ１μｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、水系溶液（ＳＯＤ無添加水系溶液）を調製した。調製した水系溶液に、スーパーオキシドを特異的に消去する酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）（Ｓｉｇｍａ社）を１０Ｕ／ｍＬとなるように加え、ＳＯＤ添加水系溶液を別途調製した。【０１２３】
（２）ＥＳＲによる測定
本実施例（１）で調製した水系溶液（ＳＯＤ無添加水溶液およびＳＯＤ添加水溶液）を電子スピン共鳴装置ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ（日本電子社）の試料管にそれぞれ導入した。この試料管にキセノンランプを用いて１５００ルックスの可視光を３０秒間照射した後、以下に示す測定条件でＥＳＲによる測定を行ってスペクトルを得た。ＳＯＤ無添加水系溶液のスペクトルをスペクトルＡとし、ＳＯＤ添加水系溶液のスペクトルをスペクトルＢとした。その結果を図１０に示す。なお、スーパーオキシドとＣＹＰＭＰＯからなるスピンアダクトの、コンピューターシミュレーションにより得られたスペクトル（スーパーオキシド標準スペクトル；Ｍ．Ｋａｍｉｂａｙａｓｈｉら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４０巻、第１１号、第１１６６−１１７２頁、２００６年）およびラジカル化したＥＤＴＡ（ＥＤＴＡラジカル）の、コンピューターシミュレーションにより得られたスペクトル（ＥＤＴＡラジカル標準スペクトル）を図１１に示す。【０１２４】
ＥＳＲによる測定の条件
出力： ６ｍＷ
磁場掃引幅： ± ７．５ｍＴ
測定時間： ２分間
変調幅： ０．１ｍＴ
時定数： ０．１秒【０１２５】
図１０および図１１に示すように、図１０のスペクトルＡの形状と図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状とはほとんど同じであること、およびスペクトルＡのシグナル強度と比較して、スーパーオキシド標準スペクトルのシグナル強度はほとんど変わらないことが確認された。また、図１０のスペクトルＢの形状と図１１下図のＥＤＴＡラジカル標準スペクトルの形状とはほとんど同じであることが確認された。また、図１０に示すように、スペクトルＡのシグナル強度と比較してスペクトルＢのシグナル強度は小さく、スペクトルＡでみられるピークがスペクトルＢではみられないことが確認された。【０１２６】
このことから、スペクトルＡでみられるピークはスーパーオキシドのスピンアダクトに由来することが示され、ＳＯＤ無添加水系溶液において、スーパーオキシドが多量に発生したことが示された。また、スペクトルＢでみられるピークはＥＤＴＡラジカルに由来することが示され、スペクトルＡでみられたピークがスペクトルＢではみられないことからも、ＳＯＤ添加水系溶液において少量のＥＤＴＡラジカルが発生し、スーパーオキシドが発生しなかったことが示された。【０１２７】
以上のことから、本実施例に係る水系溶液により、スーパーオキシドおよび電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）の２種類のラジカルを発生させて、そのうちのスーパーオキシドを選択的に発生させることができることが明らかとなり、この水系溶液にスーパーオキシド消去能を有する物質を加えることにより、スーパーオキシドの発生を抑制することが明らかとなった。【０１２８】
＜実施例２＞酸化還元反応触媒および電子供与体の検討
酸化還元反応触媒あるいは電子供与体を変えて、光照射によりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行い、スーパーオキシド発生に好適な酸化還元反応触媒および電子供与体を検討した。【０１２９】
（１）電子供与体としてテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＤ）を用いた場合のスーパーオキシド発生
実施例１で用いたＥＤＴＡの代わりにテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＤ）を電子供与体として水系溶液を調製し、光を照射することによりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行った。【０１３０】
５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にリボフラビン、ＴＭＤ、ＣＹＰＭＰＯ（ラジカルリサーチ社）をそれぞれ１０μｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、水系溶液を調製した。【０１３１】
この水系溶液について実施例１（２）と同様の操作によりＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。得られたスペクトルを図１２に示す。【０１３２】
図１１上図および図１２に示すように、図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状と図１２のスペクトルの形状とは異なることが確認された。【０１３３】
（２）電子供与体としてメチオニンを用いた場合のスーパーオキシド発生
実施例１で用いたＥＤＴＡの代わりに、メチオニンを電子供与体として用いて水系溶液を調製し、光を照射することによりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行った。【０１３４】
ＴＭＤをメチオニンに換えて本実施例（１）と同様の操作により水系溶液を調製し、ＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。得られたスペクトルを図１３に示す。【０１３５】
図１１上図および図１３に示すように、図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状と図１３のスペクトルの形状とは異なることが確認された。【０１３６】
（３）酸化還元反応触媒としてフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を用いた場合のスーパーオキシド発生
実施例１で用いたリボフラビンの代わりにフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を酸化還元反応触媒として水系溶液を調製し、光を照射することによりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行った。【０１３７】
５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にＦＭＮ、ＥＤＴＡ、ＣＹＰＭＰＯ（ラジカルリサーチ社）をそれぞれ５μｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、水系溶液を調製した。【０１３８】
この水系溶液について実施例１（２）と同様の操作によりＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。得られたスペクトルを図１４に示す。【０１３９】
図１１および図１４に示すように、図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状と図１４のスペクトルの形状とが相似関係にある一方で、図１１下図のＥＤＴＡラジカル標準スペクトルの形状と図１４のスペクトルの形状とは異なることが確認された。【０１４０】
（４）酸化還元反応触媒としてフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を用い、かつ電子供与体としてテトラエチレンジアミン（ＴＭＤ）を用いた場合のスーパーオキシド発生
実施例１で用いたリボフラビンの代わりにフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を酸化還元反応触媒として、またＥＤＴＡの代わりにテトラエチレンジアミン（ＴＭＤ）を電子供与体として、それぞれを用いて水系溶液を調製し、光を照射することによりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行った。【０１４１】
リボフラビンをＦＭＮに換えて本実施例（１）と同様の操作により水系溶液を調製し、ＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。得られたスペクトルを図１５に示す。【０１４２】
図１１上図および図１５に示すように、図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状と図１５のスペクトルの形状とは異なることが確認された。【０１４３】
（５）酸化還元反応触媒としてフルオレセインを用い、かつ電子供与体としてメチオニンを用いた場合のスーパーオキシド発生
実施例１で用いたリボフラビンの代わりにフルオレセインを酸化還元反応触媒として、またＥＤＴＡの代わりにメチオニンを電子供与体として、それぞれを用いて水系溶液を調製し、光を照射することによりラジカルを発生させ、ＥＳＲにより発生したラジカルの同定および定量を行った。【０１４４】
リボフラビンをフルオレセインに、ＴＭＤをメチオニンにそれぞれ換えて、本実施例（１）と同様の操作により水系溶液を調製し、ＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。得られたスペクトルを図１６に示す。【０１４５】
図１１上図および図１６に示すように、図１１上図のスーパーオキシド標準スペクトルの形状と図１６のスペクトルの形状とは異なることが確認された。【０１４６】
以上、本実施例（１）から（５）の結果より、酸化還元反応触媒としてリボフラビンを用い、かつ電子供与体としてＴＭＤを用いた場合、酸化還元反応触媒としてリボフラビンを用い、かつ電子供与体としてメチオニンを用いた場合、酸化還元反応触媒としてＦＭＮを用い、かつ電子供与体としてＴＭＤを用いた場合および酸化還元反応触媒としてフルオレセインを用い、かつ電子供与体としてメチオニンを用いた場合のいずれと比較しても、酸化還元反応触媒としてリボフラビンあるいはＦＭＮを用い、かつ電子供与体としてＥＤＴＡを用いた場合の方が、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）の発生を抑えて、高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルを得ることができることが明らかとなった。【０１４７】
＜実施例３＞リボフラビン濃度とスーパーオキシド発生量およびスーパーオキシドの純度との関係の検討
水系溶液におけるリボフラビンの濃度を変えることにより、スーパーオキシドおよび電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）の発生量の変化を確認した。【０１４８】
実施例１（１）で調製した水系溶液（ＳＯＤ添加水系溶液およびＳＯＤ無添加水系溶液）において、リボフラビン濃度が、それぞれ０．１μｍｏｌ／Ｌ、０．５μｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、２．５μｍｏｌ／Ｌ、５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１５μｍｏｌ／Ｌ、２５μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌとなるように水系溶液を調製した。【０１４９】
これらの水系溶液それぞれについて実施例１（２）と同様の操作によりＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。【０１５０】
これらのスペクトルに基づき、それぞれの水系溶液において発生したラジカルの同定ないし発生したラジカル量の数値化を行った。すなわち、ＳＯＤ添加水系溶液のスペクトルに基づいて、発生したＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル）量の数値化を行い、ＳＯＤ無添加水系溶液のスペクトルに基づいて、発生したスーパーオキシド量の数値化を行った。なお、スーパーオキシド量の数値化は、スーパーオキシド標準スペクトル（図１１上図）の形状に基づいて、スーパーオキシド固有のスペクトル形状を有しているとの判断をした場合に行った。また、数値化した結果に基づき、次式４により、各リボフラビン濃度の水系溶液において発生したラジカルにおけるスーパーオキシドの純度を算出した。その結果を図１７に示す。【０１５１】
（式４）：スーパーオキシドの純度（％）＝［発生したスーパーオキシド量／｛発生したスーパーオキシド量＋発生したＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル量）｝］×１００【０１５２】
図１７に示すように、リボフラビン濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌの水系溶液では、スーパーオキシドおよびＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル）のいずれも発生しないことが確認され、リボフラビン濃度が０．５μｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌおよび２．５μｍｏｌ／Ｌの水系溶液では、スーパーオキシドが発生するのに比較して、ＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル）はほとんど発生せず、スーパーオキシドの純度は約８８．９％であることが確認された。また、リボフラビン濃度が５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌおよび１５μｍｏｌ／Ｌの水系溶液では、スーパーオキシドが多量に発生するのに比較して、ＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル）はほとんど発生せず、スーパーオキシドの純度はそれぞれ８７．５％、約８３．３％および約７６．５％であることが確認された。なお、リボフラビン濃度が２５μｍｏｌ／Ｌおよび５０μｍｏｌ／Ｌの水系溶液ではＥＤＴＡラジカル（妨害ラジカル）に由来するシグナルが強くなるため、発生したスーパーオキシド量の数値化およびスーパーオキシドの純度の算出は行わなかった。【０１５３】
以上の結果より、リボフラビン濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ＜２５である水系溶液、特にリボフラビン濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．５≦Ｃ≦１５である水系溶液では、電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）はほとんど発生せず、スーパーオキシドが多量に発生することが明らかとなった。【０１５４】
＜実施例４＞光照射時間とスーパーオキシド発生量との関係の確認
光照射開始からスーパーオキシド発生までの時間、光照射停止からスーパーオキシド発生停止までの時間および光照射時間とスーパーオキシド発生量との関係を確認した。【０１５５】
（１）水系溶液の調製
５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にリボフラビン、ＥＤＴＡ、ＣＹＰＭＰＯ（ラジカルリサーチ社）をそれぞれ１μｍｏｌ／Ｌ、３ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、水系溶液を調製した。調製した水系溶液を１６サンプルに分け、それぞれ試料１〜試料１６とした。【０１５６】
（２）ＥＳＲによる測定
本実施例（１）で調製した水系溶液を電子スピン共鳴装置ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ（日本電子社）の試料管に順次導入し、照射時間を変えて可視光を照射した後、ＥＳＲによる測定を行うことによりスペクトルを得た。各試料における可視光の照射時間を以下に示す。ＥＳＲの観測磁場は３３５．７ｍＴ（実施例１においてスーパーオキシド由来のピークが確認された磁場と同じ磁場）に固定して、ＥＳＲによる測定を行った。その他の光照射条件およびＥＳＲによる測定の条件は実施例１（２）と同様にした。【０１５７】
可視光照射時間
試料１：照射開始前３０秒（−３０）
試料２：照射開始前１５秒（−１５）
試料３：照射開始前０秒（０）
試料４：照射時間５秒（５）
試料５：照射時間１０秒（１０）
試料６：照射時間１５秒（１５）
試料７：照射時間２０秒（２０）
試料８：照射時間３０秒（３０）
試料９：照射時間４５秒（４５）
試料１０：照射時間６０秒（６０）
試料１１：６０秒照射し、照射停止後５秒（＋５）
試料１２：６０秒照射し、照射停止後１０秒（＋１０）
試料１３：６０秒照射し、照射停止後２０秒（＋２０）
試料１４：６０秒照射し、照射停止後３０秒（＋３０）
試料１５：６０秒照射し、照射停止後６０秒（＋６０）
試料１６：６０秒照射し、照射停止後１２０秒（＋１２０）【０１５８】
得られたスペクトルのシグナル強度を縦軸に、可視光照射時間を横軸に表してグラフ化した。その結果を図１８に示す。【０１５９】
図１８に示すように、光照射開始後すぐにシグナルが確認され、シグナル強度は可視光照射時間に比例して大きくなることが確認された。換言すれば、産生されたスーパーオキシドのスピンアダクトの量が光照射時間に比例して増加することを示している。また、光照射の停止とともに、シグナル強度が時間に比例して緩やかに小さくなることが確認された。すなわち、産生されたスーパーオキシドのスピンアダクトの量が時間に比例して徐々に減少することを示している。【０１６０】
以上の結果より、光照射の開始とともにスーパーオキシドが発生し、光照射の停止とともにスーパーオキシドの発生も停止することが明らかとなった。また、光を照射している間は、継続的、安定的にスーパーオキシドが発生することが確認された。【０１６１】
＜比較例１＞リボフラビンの光照射により発生させたラジカルにおけるスーパーオキシドの純度とキサンチンオキシダーゼにより発生させたラジカルにおけるスーパーオキシドの純度との比較
リボフラビンの光照射によりスーパーオキシドを発生させた場合と、キサンチンオキシダーゼによりスーパーオキシドを発生させた場合とで、ＳＯＤによるラジカルの発生阻害の程度を比較することにより、リボフラビンの光照射により発生させたラジカルにおけるスーパーオキシドの純度について検討した。【０１６２】
（１）リボフラビンの光照射によるラジカル発生量の定量
実施例１（１）におけるＳＯＤ添加水系溶液のＳＯＤ濃度がそれぞれ０．５Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、１．５Ｕ／ｍＬとなるようにＳＯＤ添加水系溶液とＳＯＤ無添加水系溶液とを調製した。【０１６３】
調製したそれぞれの水系溶液について、実施例１（２）と同様の操作によりＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。この得られたスペクトルに基づいて、ラジカルの発生量を定量した。【０１６４】
（２）キサンチンオキシダーゼによるラジカル発生量の定量
５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液にヒポキサンチン、ＣＹＰＭＰＯ（ラジカルリサーチ社）およびジエチレントリアミノ五酢酸（ＤＥＴＡＰＡＣ）を、それぞれ０．３９ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加えて水系溶液（ＳＯＤ無添加水系溶液）を調製した。さらに、この水系溶液にＳＯＤ（Ｓｉｇｍａ社）をそれぞれ０．５Ｕ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、１．５Ｕ／ｍＬとなるように加えることにより、ＳＯＤ添加水系溶液を別途調製した。【０１６５】
調製したＳＯＤ無添加水系溶液およびＳＯＤ添加水系溶液に、それぞれキサンチンオキシダーゼを０．２Ｕ／ｍＬとなるように加えた後、実施例１（２）と同様の操作によりＥＳＲによる測定を行い、スペクトルを得た。続いて、得られたスペクトルに基づいてラジカルの発生量を定量した。ＥＳＲによる測定は、キサンチンオキシダーゼを加えた後、６０秒経過後に行った。【０１６６】
本実施例（１）および（２）のラジカル発生量の定量結果に基づいて、ＳＯＤによるラジカル発生阻害率を、次式５により算出した。その結果を図１９に示す。
（式５）：ＳＯＤによるラジカル発生阻害率＝（Ｓ０−Ｓ）／Ｓ
Ｓ０：ＳＯＤを加えない場合のラジカル発生量
Ｓ：ＳＯＤを加えた場合のラジカル発生量【０１６７】
なお、ＳＯＤは電子供与体ラジカル（妨害ラジカル、ＴＨ・ラジカル）には作用せず、スーパーオキシドのみを分解することから、ＳＯＤによるラジカル発生阻害率は、スーパーオキシドの純度を表している。すなわち、発生したラジカルにおいて、スーパーオキシドの純度が高いほどＳＯＤによるラジカル発生阻害率は高くなる。【０１６８】
図１９に示すように、リボフラビンの光照射によりスーパーオキシドを発生させた場合と、キサンチンオキシダーゼによりスーパーオキシドを発生させた場合とを比較した場合、加えたＳＯＤ濃度にかかわらず、ラジカル発生阻害率はほぼ同値を示すことが確認された。【０１６９】
キサンチンオキシダーゼにより発生させたラジカルにおけるスーパーオキシドの純度は高いことが知られていることから、以上の結果より、本実施例における反応条件でリボフラビンの光照射によりラジカルを発生させた場合、高純度でスーパーオキシドを含有するラジカルが得られることが明らかとなった。
【符号の説明】
【０１７０】
１  スーパーオキシド製造装置
２  判定用溶液調製手段
３  判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段
４  判定用スペクトル取得手段
５  相似判定手段
６  フラビン濃度取得手段
７  原料溶液調製手段
８  発生手段
９  スーパーオキシド消去能評価装置
１０  評価溶液調製手段
１１  評価用スピンアダクト生成手段
１２  評価用スペクトル取得手段
１３  比較評価用手段
２１  注入量調節機能を備えた判定用容器
２２  判定用注入管
２３  判定用溶液収容部
４１  電磁石
４２  マイクロ波発振器
４３  クリスタルダイオード検出器
４４  増幅器
４５  記録計
５１  入力部
５２  表示部
５３  判定用スペクトルデータ取得部
５４  標準スペクトルデータ取得部
５５  スペクトル比較判定部
６１  フラビン濃度取得部
６２  制御信号出力部
７１  注入量調節機能を備えた原料用容器
７２  原料用注入管
７３  原料溶液収容部
１０１  注入量調節機能を備えた評価用容器
１０２  評価用注入管
１０３  評価溶液収容部
１３１  評価用スペクトルデータ取得部
１３２  スペクトル比較評価部
Ｃ      演算処理手段
Ｒ      記憶手段
【図１】
2011071088.tif 000003
【図２】
2011071088.tif 000004
【図３】
2011071088.tif 000005
【図４】
2011071088.tif 000006
【図５】
2011071088.tif 000007
【図６】
2011071088.tif 000008
【図７】
2011071088.tif 000009
【図８】
2011071088.tif 000010
【図９】
2011071088.tif 000011
【図１０】
2011071088.tif 000012
【図１１】
2011071088.tif 000013
【図１２】
2011071088.tif 000014
【図１３】
2011071088.tif 000015
【図１４】
2011071088.tif 000016
【図１５】
2011071088.tif 000017
【図１６】
2011071088.tif 000018
【図１７】
2011071088.tif 000019
【図１８】
2011071088.tif 000020
【図１９】
2011071088.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月13日(2011.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の工程を有するスーパーオキシドを選択的に製造する方法；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を、含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似すると判定される判定用スペクトルが得られた場合の判定用溶液に係るフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｆ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製工程、
（ｇ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生工程。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
フラビン濃度取得工程が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得工程である、請求項１に記載のスーパーオキシドを選択的に製造する方法。
【請求項４】
電子供与体がＥＤＴＡである、請求項１から請求項３のいずれかに記載のスーパーオキシドを選択的に製造する方法。
【請求項５】
スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項１から請求項４のいずれかに記載のスーパーオキシドを選択的に製造する方法。
【請求項６】
水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項１から請求項５のいずれかに記載のスーパーオキシドを選択的に製造する方法。
【請求項７】
試料のスーパーオキシド消去能を評価する方法であって、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）の工程を有する、前記方法；
（ａ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製工程、
（ｂ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成工程、
（ｃ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得工程、
（ｄ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定する相似判定工程、
（ｅ）前記相似判定により相似すると判定される判定用スペクトルが得られた場合の判定用溶液に係るフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得工程、
（ｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程、
（ｊ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成工程、
（ｋ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得工程、
（ｌ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価する比較評価工程。
【請求項８】
フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｉ）の工程に代えて下記（ｍ）の工程を有する、請求項７に記載の方法；
（ｍ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製工程。
【請求項９】
フラビン濃度取得工程が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得工程である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
電子供与体がＥＤＴＡである、請求項７から請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項７から請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項７から請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉｉ）の手段を備えるスーパーオキシドを選択的に製造する装置；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似すると判定される判定用スペクトルが得られた場合の判定用溶液に係るフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｖｉ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体および水系溶媒を含む原料溶液を調製する原料溶液調製手段、
（ｖｉｉ）前記原料溶液に光を照射してスーパーオキシドを発生させる発生手段。
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
フラビン濃度取得手段が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得手段である、請求項１３に記載のスーパーオキシドを選択的に製造する装置。
【請求項１６】
電子供与体がＥＤＴＡである、請求項１３から請求項１５のいずれかに記載のスーパーオキシドを選択的に製造する装置。
【請求項１７】
スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項１３から請求項１６のいずれかに記載のスーパーオキシドを選択的に製造する装置。
【請求項１８】
水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項１３から請求項１７のいずれかに記載のスーパーオキシドを選択的に製造する装置。
【請求項１９】
試料のスーパーオキシド消去能を評価する装置であって、下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｉｘ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉ）の手段を有する、前記装置；
（ｉ）フラビン、電子供与体、スピントラップ剤および水系溶媒を含む判定用溶液を調製する判定用溶液調製手段、
（ｉｉ）前記判定用溶液に光を照射してスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを生成させる判定用スピンアダクト／ラジカル生成手段、
（ｉｉｉ）前記生成させたスーパーオキシドのスピンアダクト、電子供与体ラジカルのスピンアダクトおよび／または電子供与体ラジカルを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する判定用スペクトル取得手段、
（ｉｖ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記判定用スペクトルとが相似するか否かを判定するための相似判定手段、
（ｖ）前記相似判定により相似すると判定される判定用スペクトルが得られた場合の判定用溶液に係るフラビンの濃度を取得するフラビン濃度取得手段、
（ｉｘ）前記取得した濃度のフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段、
（ｘ）前記評価溶液に光を照射してスピンアダクトを生成させる評価用スピンアダクト生成手段、
（ｘｉ）前記評価用スピンアダクトを電子スピン共鳴により検出してスペクトルを取得する評価用スペクトル取得手段、
（ｘｉｉ）スーパーオキシドのスピンアダクトの標準スペクトルと前記評価用スペクトルとを比較してスーパーオキシド消去能を評価するための比較評価用手段。
【請求項２０】
フラビンがリボフラビンである場合において、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｉｘ）の手段に代えて下記（ｘｉｉｉ）の手段を備える、請求項１９に記載の装置；
（ｘｉｉｉ）リボフラビンの濃度Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）が０．１＜Ｃ≦１５となるようにリボフラビン、電子供与体、スピントラップ剤、スーパーオキシド消去能を評価する試料および水系溶媒を含む評価溶液を調製する評価溶液調製手段。
【請求項２１】
フラビン濃度取得手段が、前記相似判定により相似するフラビンの濃度を、生成するラジカルにおいてスーパーオキシドの純度が７５．６〜１００％となるように取得するフラビン濃度取得手段である、請求項１９に記載の装置。
【請求項２２】
電子供与体がＥＤＴＡである、請求項１９から請求項２１のいずれかに記載の装置。
【請求項２３】
スピントラップ剤がＣＹＰＭＰＯである、請求項１９から請求項２２のいずれかに記載の装置。
【請求項２４】
水系溶媒がリン酸緩衝液である、請求項１９から請求項２３のいずれかに記載の装置。
【国際調査報告】
2011071088.tif 000022
2011071088.tif 000023
2011071088.tif 000024
2011071088.tif 000025
2011071088.tif 000026
2011071088.tif 000027
2011071088.tif 000028