(57)【要約】  本発明は、アスタキサンチンおよび３−ヒドロキシ−３’ ，４’−ジデヒドロ−β，Ψ−カロテン−４−オン（ＨＤＣＯ）を含有する組成物を、ｐＨ３以下の酸性媒体又は／及びｐＨ９以上の塩基性媒体と接触せしめることで、当該組成物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を低下させる方法、ならびに当該方法によりＨＤＣＯの相対量を低下させる工程を含む、アスタキサンチン含有組成物の製造方法である本発明によれば、アスタキサンチン含有組成物中含まれる、生物学的機能が未知であるＨＤＣＯの相対量を、簡便な方法で低減させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物を、ｐＨ３以下の酸性媒体又は／及びｐＨ９以上の塩基性媒体に接触せしめ、当該組成物中の、アスタキサンチンに対する３−ヒドロキシ−３’ ，４’−ジデヒドロ−β，Ψ−カロテン−４−オン（ＨＤＣＯ）の相対量を低下させる工程を含む、アスタキサンチン含有組成物の製造方法。
【請求項２】
前記のアスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物が、アスタキサンチン生産能力を有する細胞、細胞の一部、細胞の抽出物、および／または、それらの部分精製物から選ばれたものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記のアスタキサンチン生産能力を有する細胞が、キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属、ブレバンディモナス（Brevundimonas）属、ヘマトコッカス（Haematococcus）属、クラミドモナス（Chlamydomonas）属、モノラフィディウム（Monoraphidium）属、エリスロバクター（Erythrobacter）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ラビリンチュラ類（Labyrinthulea）に属する微生物の細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記のアスタキサンチン生産能力を有する細胞が、キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属に属する微生物である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属に属する微生物のアスタキサンチン含量が２０００μｇ／ｇ乾燥細胞以上である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記のアスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が１％以上である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記酸性媒体のｐＨが２以下である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記塩基性媒体のｐＨが１０以上である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
酸性媒体および／または塩基性媒体に接触せしめた後に、アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が０．１パーセントポイント以上低下する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法により得られるアスタキサンチン含有組成物を含有する飼料、食品、食品添加物、または医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、アスタキサンチン含有組成物の製造方法に関する。とりわけ、３−ヒドロキシ−３’，４’−ジデヒドロ−β，Ψ−カロテン−４−オン（ＨＤＣＯ）を含むアスタキサンチン含有組成物中の、アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を低減する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンは天然に存在するカロテノイドの一種であり、養殖魚の肉や皮膚の色調を改善するための飼料用添加物として広く用いられると共に、近年では、機能性食品素材としても注目されている。【０００３】
アスタキサンチンは、キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属、（旧名：ファフィア（Phaffia)属）、ブレバンディモナス（Brevundimonas）属、ヘマトコッカス（Haematococcus）属、クラミドモナス（Chlamydomonas）属、モノラフィディウム（Monoraphidium）属、エリスロバクター（Erythrobacter）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ラビリンチュラ類（Labyrinthulea）等に属する微生物の細胞により生産されることが知られているほか、化学合成的に製造することも可能である。【０００４】
３−ヒドロキシ−３’，４’−ジデヒドロ−β，Ψ−カロテン−４−オン（以下、ＨＤＣＯと略す）はカロテノイドの一種であり、アスタキサンチンの生合成系における副生成物と見なすことができる。ＨＤＣＯはその生物学的機能が知られていないため、アスタキサンチン含有組成物を、例えば、飼料、食品、食品添加物、または、医薬品として利用する際、当該組成物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量は低い方が好ましい。【０００５】
一方で、キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属（旧名：ファフィア（Phaffia)属）の酵母を変異改良してアスタキサンチン含量の向上を図る場合、アスタキサンチン含量が向上すると、アスタキキサンチンに対するHDCOの相対量も上昇する傾向があることが報告されている（特許文献１）。【０００６】
アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が低いアスタキサンチン含有組成物を得る方法として、特許文献１は、突然変異を誘発したキサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属酵母株の中から高アスタキサンチン含量と低HDCO含量を両立する変異株を取得し、当該変異株からアスタキサンチン含有組成物を得る方法を開示している。【０００７】
特許文献１には、目的とする変異株の取得方法として、赤色コロニー（高アスタキサンチン含量でアスタキサンチンに対して比較的高いHDCO含量を有する）の固体群から、高アスタキサンチン含量でアスタキサンチンに対して比較的低いHDCO含量を有する強度に着色したオレンジ色のコロニーを視覚的に選択することが記載されている。しかしながら、アスタキサンチン含量の低い変異株ほどコロニー赤みは弱くなることから、コロニー色調だけを目的株を選択することは非常に難しく、目的の達成は偶然に左右され、また、膨大な時間と労力を要する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３２０２０１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
実際、本発明者らが、アスタキサンチン含量向上を目標としてキサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属の変異改良を行った結果、後で示す通り、取得した高アスタキン含量株におけるHDCOの量は、いずれもアスタキサンチンに対して10％を超えており、特許文献１のような変異株が得られる頻度は、きわめて低いと考えられた。そこで、本願発明は、ＨＤＣＯを含むアスタキサンチン含有組成物中の、アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を低減させ得る、極めて簡便な方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物を、ｐＨ３以下の酸性媒体および／またはｐＨ９以上の塩基性媒体と接触せしめることで、当該組成物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を低下させ得ることを見出し、本願発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本願発明は、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物を、ｐＨ３以下の酸性媒体および／またはｐＨ９以上の塩基性媒体と接触せしめ、当該組成物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を低下させる方法である。また、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物を、ｐＨ３以下の酸性媒体および／またはｐＨ９以上の塩基性媒体と接触せしめ、当該組成物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を低下させる工程を含む、アスタキサンチン含有組成物の製造方法である。さらには、上記方法により得られるアスタキサンチン含有組成物を含有する飼料、食品、食品添加物、および医薬品である。
【発明の効果】
【００１２】
本願発明によれば、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物中の、アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を効率的に低減することができる。アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が低下したアスタキサンチン含有組成物は、例えば、飼料、食品、食品添加物、および医薬品として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本願発明で用いるアスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物は、両化合物を含有するものであれば、それら化合物以外の組成に特に制限はないが、例えば、両化合物を同時に生産する細胞の培養液、培養上清、細胞体、および、細胞体の破砕物、乾燥物、抽出物等が挙げられ、さらに、それらの部分精製物等が挙げられる。また、化学合成的に製造されたアスタキサンチンを含む組成物も、ＨＤＣＯを含有する限りにおいては、本願発明で用いるアスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物に相当する。
【００１４】
両化合物を同時に生産する細胞としては、例えば、キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属（旧名：ファフィア（Phaffia）属）、ブレバンディモナス（Brevundimonas）属、ヘマトコッカス（Haematococcus）属、クラミドモナス（Chlamydomonas）属、モノラフィディウム（Monoraphidium）属、エリスロバクター（Erythrobacter）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ラビリンチュラ類（Labyrinthulea）等に属する微生物、これらの変異株、これらの遺伝子組換え株、および、これらのセルフクローニング株等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
ラビリンチュラ類（Labyrinthulea）に属する微生物としては、例えば、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）属、シゾキトリウム（Schizochytrium）属、および、ラビリンチュラ（Labyrinthula）属に属する微生物を挙げられる。
【００１６】
本願発明で用いる酸性媒体とは、ガラス電極法でｐＨを測定した際に、ｐＨ３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下、さらに好ましくは０．５以下、さらに好ましくは０．１以下を示す液状物を指し、例えば、酸性物質を適当な溶媒に溶解することにより得られる。本願発明の効果が得られるものであれば、酸性物質は特に制限されないが、例としては、塩化水素、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸、ギ酸、酢酸等の有機酸が挙げられ、塩化水素および硫酸が特に好ましい。これらの酸性物質は単独で用いても良いし、任意に組み合わせて用いても良い。
【００１７】
本願発明で用いる塩基性媒体とは、ガラス電極法でｐＨを測定した際に、ｐＨ９以上、好ましくは１０以上、より好ましくは１１以上、さらに好ましくは１２以上、さらに好ましくは１３以上、さらに好ましくは１３．５以上、さらに好ましくは１３．９以上、を示す液状物を指し、例えば、塩基性物質を適当な溶媒に溶解することにより得られる。本願発明の効果が得られるものであれば、塩基性物質は特に制限されないが、例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム等のアルカリ金属あるいはアルカリ土類金属の水酸化物、アンモニア、アミン類等が挙げられ、水酸化ナトリウムが特に好ましい。これらの塩基性物質は単独で用いても良いが、組み合わせて用いても良い。
【００１８】
酸性物質および／または塩基性物質を溶解する溶媒は、本願発明の効果が得られるものであれば特に制限されないが、例としては、水、エタノール、アセトン、メタノール、およびそれらの混合溶媒等が挙げられ、水が好ましい。また、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物中に含まれる溶媒を、酸性媒体および／または塩基性媒体を構成する溶媒として利用することも可能である。
【００１９】
酸性媒体は、上記方法で測定した場合にｐＨ３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下、さらに好ましくは０．５以下、さらに好ましくは０．１以下を示し、本願発明の効果が得られる限り、上記酸性物質と溶媒以外の化合物をも含み得る。また、塩基性媒体は、上記方法で測定した場合にｐＨ９以上、好ましくは１０以上、より好ましくは１１以上、さらに好ましくは１２以上、さらに好ましくは１３以上、さらに好ましくは１３．５以上、さらに好ましくは１３．９以上を示し、本願発明の効果が得られる限り、上記塩基性物質と溶媒以外の化合物をも含み得る。
【００２０】
アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物を酸性媒体および／または塩基性媒体と接触せしめる工程は、本願発明の効果が得られる限り、その実施方法に特に制限は無いが、例えば、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物と、酸性媒体および／または塩基性媒体を適当な容器、反応缶等に入れ、必要に応じて混合することにより実施できる。また、混合は、配管中で実施することも可能である。
【００２１】
この時、当該混合物の温度を適切に調節することが好ましい。上限温度は、通常１４０℃、好ましくは１００℃、より好ましくは９０℃、さらに好ましくは７０℃である。下限温度は、通常−２０℃、好ましくは０℃、より好ましくは１０℃、さらに好ましくは３０℃である。上記上限温度を超過するとアスタキサンチンが不安定となる傾向があり、上記下限温度に満たないと操作がしにくくなる傾向がある。
【００２２】
また、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物を酸性媒体あるいは塩基性媒体と接触せしめる時間は、本願発明の効果が得られる限り特に制限はないが、上限時間は通常１２０００分、好ましくは１２００分、より好ましくは３００分である。下限時間は通常１分、好ましくは１０分、より好ましくは６０分である。
【００２３】
アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物を接触せしめる酸性媒体のおよび／または塩基性媒体のｐＨ、接触せしめる際の温度、接触せしめる時間は、任意の組み合わせから選択することができ、本願発明の効果が得られる限り、その組み合わせは特に制限されない。アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物の形態、使用する酸性媒体および／または塩基性媒体の種類、使用する酸性媒体および／または塩基性媒体のｐＨ、接触処理時の混合条件等に応じ、適宜組合せを選択すればよい。
【００２４】
アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物中の、アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量は、当該組成物をＨＰＬＣで分析し、４７１ｎｍの吸光度で検出して得られる分析チャート上の、アスタキサンチンのピーク面積とＨＤＣＯのピーク面積から、次の計算式により算出できる。
アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量（％）
＝（ＨＤＣＯのピーク面積／アスタキサンチンのピーク面積）×１００
上記のＨＰＬＣによる分析は、例えば、カラムとしてＹＭＣ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ（４．６×２５０ｍｍ；ＹＭＣ社）を使用し、カラム温度を２０℃とし、移動相として、Ａ液：メタノール／メチル−ｔ−ブチルエーテル／１％リン酸水溶液＝８２／１５／３、および、Ｂ液：メタノール／メチル−ｔ−ブチルエーテル／水／リン酸＝７／９０／３／０．０３を用い、試料注入後０〜３０分はＡ液１００％、３０〜９０分はＡ液１００％からＢ液１００％へのリニアグラジエント、９０〜９５分はＢ液１００％の条件で、１．０ｍｌ／分の流速で通液することにより実施できる。
【００２５】
アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物のＨＰＬＣを用いた分析は、例えば、必要に応じて当該組成物を適当な溶媒に溶解し、ＨＰＬＣ装置に注入することで実施できる。当該組成物を溶解する溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン、メタノール、および、これらを任意に組み合わせた混合溶媒を用いることができるが、当該組成物を溶解し得るものであれば特に制限はない。また、当該組成物が、アスタキサンチン生産能を有する細胞の培養液、細胞体、又はこれらの破砕物等、これらの上記溶媒に対して非溶解性の成分を含む場合、例えば、当該組成物を上記溶媒中で機械的に破砕することにより得られる抽出物を、ＨＰＬＣ装置に注入することで、当該分析を実施できる。上記の機械的な破砕方法としては、例えば、ガラスビーズを用いた方法、圧力破砕方法が挙げられる。
【００２６】
本願発明で用いるアスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物は、両化合物を含有するものであれば特に制限されないが、例えば、先述の方法で求めたアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が、好ましくは１％以上、より好ましくは５％以上の組成物が挙げられる。本発明の効果を最大限に発揮させる観点からは、アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が１０％以上であることがさらに好ましく、１５％以上であることが特に好ましい。
【００２７】
前述の通り、キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属（旧名：ファフィア（Phaffia）属）の微生物を改良してアスタキサンチン含量を高めた場合、アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量も向上する傾向がある。従って、本発明に用いるアスタキサンチンとＨＤＣＯを含有する組成物としては、アスタキサンチン含量が２０００μｇ／ｇ乾燥細胞以上であるキサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属微生物の細胞あるいは当該細胞から得られたアスタキサンチン含有組成物が好ましい。より好ましくはアスタキサンチン含量が３０００μｇ／ｇ乾燥細胞以上、更に好ましくは５０００μｇ／ｇ乾燥細胞以上、更に好ましくは８０００μｇ／ｇ乾燥細胞以上、特に好ましくは１００００μｇ／ｇ乾燥細胞以上であるキサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属微生物の細胞または該細胞から得られたアスタキサンチン含有組成物である。これらキサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属微生物または該微生物から得られたアスタキサンチン含有組成物において、アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量は、１０％以上であることが好ましく、１５％以上であることがさらに好ましい。
【００２８】
本願発明においては、アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を低下させる工程、すなわち、酸性媒体および／または塩基性媒体に接触せしめる工程の前後で、上記方法で求めたアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量（％）は、通常０．１パーセントポイント（ｐｐ）以上、好ましくは０．５ｐｐ以上、より好ましくは１ｐｐ以上、さらに好ましくは２ｐｐ以上、さらに好ましくは３ｐｐ以上、さらに好ましくは４ｐｐ以上、さらに好ましくは５ｐｐ以上減少する。１パーセントポイント（ｐｐ）以上の低下とは、
（処理前の組成物におけるアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量（％））−（処理後の組成物のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量（％））
で計算される数値が１以上であることを意味する。
【００２９】
本願発明に従って調製された、アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が低減されたアスタキサンチン含有組成物は、必要に応じて酸性媒体および／または塩基性媒体を中和した後、必要に応じて通常の操作でこれらと分離し、必要に応じて洗浄することで、飼料、食品、食品添加物、医薬品等として利用可能なアスタキサンチン含有組成物とすることができる。また、上記で得られた組成物をさらに精製した後、上記用途に用いることもできる。
【００３０】
上記の通常の操作は、例えば、本願発明に従ってアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を低下させた組成物を、溶解することが可能で、且つ、酸性媒体および／または塩基性媒体との間で相分離可能な溶媒が存在する場合、当該組成物を当該溶媒に溶解した溶液を、酸性媒体および／または塩基性媒体と分離した後に水洗し、当該溶媒を留去することにより実施できる。また、当該組成物を溶解可能な溶媒が無い場合、上記の通常の操作は、例えば、連続遠心分離またはろ過等の操作で当該組成物を酸性媒体および／または塩基性媒体と分離し、必要に応じて水洗することにより、実施できる。ただし、上記の通常の操作は、これらに限定されない。このようにして得たアスタキサンチン含有組成物をさらに加工して、飼料、食品、食品添加物、または、医薬品として適した製品形態にすることも可能であり、当該製品も本願発明に包含される。
【００３１】
本願発明において、飼料とは、例えば、魚、甲殻類、貝類等の水産動物、ニワトリ、ウズラ、アヒル等の家禽類、牛、豚、羊等の畜産動物、犬、猫等の愛玩動物等に与える飼料およびサプリメント等を指すが、これらに限定されるものではない。また、本願発明において、食品とは、常食以外に、着色料、サプリメント等をも包含するが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
以上のように、本願発明に従えば、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物中の、アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を効率的に低下させることが可能であり、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物から、飼料、食品、食品添加物、医薬品等としての利用に適した、ＨＤＣＯの混入がより少ないアスタキサンチン含有組成物を効率的に得ることが可能となる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本願発明を更に具体的に説明するが、本願発明の範囲はこれに限定されるものではない。 【００３４】
［アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを分析するための抽出方法］
アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含む組成物が、例えば、微生物菌体等である場合には、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する抽出物を得る方法として、ガラスビーズを用いる機械的な破砕方法を使用することができる。この方法により得られたアスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する抽出物は、ＨＰＬＣ装置を用いた分析に供することができる。【００３５】
当該組成物を密閉可能な１．５ｍｌ容のプラスチック製容器に入れ、遠心分離により沈殿物を得る。沈殿物は水洗後、再度の遠心分離により上清を除去する。得られた沈殿物に、１ｇのガラスビーズ（直径０．５ｍｍ）、１ｍｌのアセトンを加え、マルチビーズショッカー（安井器械社製）により処理する。その後、フィルターろ過（コスモナイスフィルターＳ、０．４５μｍ、ミリポア社製）により固形物とガラスビーズを除去した後、アスタキサンチン、ＨＤＣＯが抽出されたアセトン溶液を得ることができる。【００３６】
なお、マルチビーズショッカーによる当該組成物の破砕は、３０秒の破砕と３０秒の冷却（４℃）を各５回繰り返し、分析には当該組成物が十分に破壊されていることを確認したものを用いる。【００３７】
［アスタキサンチン生産菌におけるＨＤＣＯの相対量］
キサントフィロマイセス・デンドロアス（Xanthophyllomyces dendrorhous）ＮＢＲＣ  １０１２９株（独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8より入手）をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）で変異処理した後、寒天プレート上で赤みの強いコロニーを選別し、アスタキサンチン含量が向上した変異株を取得した。得られた変異株に対して同様の操作を繰り返すことで、さらにアスタキサンチン含量の向上した変異株を取得した。このようにして、アスタキサン含量が向上した変異株であるキサントフィロマイセス・デンドロアス（Xanthophyllomyces dendrorhous）ＫＮＫ−０１株、ＫＮＫ−０２−１株、ＫＮＫ−０２−２株およびＫＮＫ−０３株を取得した。【００３８】
取得した変異株のアスタキサンチン含量とアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を表１に示す。変異株の培養は以下のように行った。５００ｍｌ容の坂口フラスコに３０ｍｌの培地（リン酸アンモニウム１．３％、リン酸カリウム０．７％、コハク酸０．６％、酵母エキス０．３％、ｐＨ５．４）を入れ、オートクレーブで滅菌した。アスタキサンチン生産株を接種し、２０℃で１８０時間振盪培養した。培養開始時にグルコース０．３ｇ添加し、以後１２時間毎に０．３ｇのグルコースを補給した。【００３９】
【表１】
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【００４０】
［調製例１］
５mｌのＹＭ培地（ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、モルトエキス０．３％、グルコース１．０％）を含む試験管４本に、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Xanthophyllomyces dendrorhous）ＫＮＫ−０３株を接種し、２０℃で４８時間培養した。培養液を５０mｌのＹＭ培地を含む５００mｌ容の坂口フラスコ４本に移し、２０℃で４８時間の培養を行なった。培養液を２５００mｌの培地（リン酸アンモニウム１．３％、リン酸カリウム０．７％、酵母エキス０．３％、グルコース１％を含む）を含む５０００mｌ容のジャーファーメンターに移し、２０℃で培養し、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する菌体を含む培養液を得た。培養中は、ｐＨを４．４〜５．６の間にコントロールし、溶存酸素濃度は飽和の３０〜８０％となるようにグルコースを流加した。【００４１】
［調製例２］
調製例１で得た培養液１０ｍｌを５０ｍｌ容遠心チューブに分注し、遠心分離後上清を廃棄して菌体ペレットを得た。これに、０．５ｍｍ径のガラスビーズ２５ｇとアセトン２５ｍｌを添加して密栓後、マルチビーズショッカー（安井機械製）を用いて菌体を破砕した。これを、遠心分離して上清のアセトン相を回収し、減圧下で溶媒を留去して、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する菌体抽出物を得た。当該菌体抽出物中のアスタキサンチン濃度は、６．１ｍｇ／ｇであった。【００４２】
［調製例３］
シリカゲル６０（メルク社製）を充填したガラスカラム（φ４０ｍｍ×６００ｍｍ）をヘキサン／アセトン＝３／１の混合溶媒で平衡化し、これに調製例２で得た菌体抽出物をアプライした。これを同上溶媒で溶出し、赤色を呈するフラクションを集め、減圧下で溶媒を留去して、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する部分精製物を得た。当該菌体抽出物中のアスタキサンチン濃度は、５３ｍｇ／ｇであった。【００４３】
［調製例４］
５ｍｌのＹＭ培地（ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、モルトエキス０．３％、グルコース１．０％）を含む試験管に、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Xanthophyllomyces dendrorhous）ＫＮＫ−０１株を接種し、２０℃で４８時間、振盪培養した。この培養液０．６ｍｌを、リン酸アンモニウム１．３％、リン酸カリウム０．７％、コハク酸０．６％、酵母エキス０．３％を含む培地３０ｍｌ（ｐＨ５．４）に摂取し、５００ｍｌ容の坂口フラスコにて、２０℃で１８０時間振盪培養し、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する菌体を含む培養液を得た。炭素源のグルコースは培養開始時に０．３ｇ添加し、グルコースが消費された後、１２時間毎に０．３ｇのグルコースを補給した。【００４４】
［調製例５］
調製例４で得た培養液５０ｍｌを５０ｍｌ容遠心チューブに分注し、遠心分離後上清を廃棄して菌体ペレットを得た。これに、０．５ｍｍ径のガラスビーズ２５ｇとアセトン２５ｍｌを添加して密栓後、マルチビーズショッカー（安井機械製）を用いて菌体を破砕した。これを、遠心分離して上清のアセトン相を回収し、減圧下で溶媒を留去して、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する菌体抽出物を得た。当該菌体抽出物中のアスタキサンチン濃度は、５．６ｍｇ／ｇであった。【００４５】
［調製例６］
微生物をキサントフィロマイセス・デンドロアス（Xanthophyllomyces dendrorhous）ＫＮＫ−０２−１株とした以外は、調製例４と同様にして培養を行い、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する菌体を含む培養液を得た。【００４６】
［実施例１］キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株の細胞抽出物の硫酸処理
調製例２で得た細胞抽出物１０ｍｇを密閉可能な試験管に入れ、下記の表１に示す濃度の硫酸水溶液３ｍｌを添加、攪拌した。攪拌後の溶液のｐＨをＦ−２２型ｐＨメーター（堀場製作所）を用いて測定した。【００４７】
各試験管を３０、５０、７０℃で２時間振盪後、クロロホルム２ｍｌを添加、攪拌して、菌体抽出物を溶解した。これを遠心分離して水相を除去し、処理後の細胞抽出物を含むクロロホルム相を得た。これをアセトンで１０倍に希釈した後ＨＰＬＣ分析に供し、各処理後の細胞抽出物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を求めた。
アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量は、次の計算式により算出した。
アスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量（％）
＝（ＨＤＣＯのピーク面積／アスタキサンチンのピーク面積）×１００
また、ＨＰＬＣ分析は、カラムとしてＹＭＣ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ（４．６×２５０ｍｍ；ＹＭＣ社）を使用し、カラム温度を２０℃とし、移動相として、Ａ液：メタノール／メチル−ｔ−ブチルエーテル／１％リン酸水溶液＝８２／１５／３、および、Ｂ液：メタノール／メチル−ｔ−ブチルエーテル／水／リン酸＝７／９０／３／０．０３を用い、試料注入後０〜３０分はＡ液１００％、３０〜９０分はＡ液１００％からＢ液１００％へのリニアグラジエント、９０〜９５分はＢ液１００％の条件で、１．０ｍｌ／分の流速で通液することにより実施した。本条件において、アスタキサンチンは分析開始後約１３分、ＨＤＣＯは分析開始後約８０分経過時に検出された。【００４８】
結果を表２に示した。【００４９】
【表２】
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【００５０】
表２は、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含むキサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株の細胞抽出物を硫酸と接触させることにより、当該菌体抽出物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が低下したことを示している。【００５１】
［実施例２］キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株の細胞抽出物の塩酸処理
硫酸に替えて塩酸を用いた以外は実施例１と同様に実施した。結果を表３に示した。【００５２】
【表３】
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【００５３】
表３は、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含むキサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株の細胞抽出物を塩酸と接触させることにより、当該菌体抽出物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が低下したことを示している。また、表２および表３の結果から、本願発明の効果は酸性媒体の種類に関係なく得られた。【００５４】
［実施例３］部分精製したキサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株細胞の抽出物の硫酸処理
調製例２で得た細胞抽出物に替えて、調製例３で得た部分精製物を用いた以外は実施例１と同様に実施した。結果を表４に示した。【００５５】
【表４】
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【００５６】
表４は、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含む、キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株の細胞抽出物の部分精製物を硫酸と接触させることにより、当該菌体抽出物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が低下したことを示している。【００５７】
表２および表４の結果から、本願発明の方法は、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物中の両化合物の濃度に関わらず有効であることが明らかとなった。【００５８】
［実施例４］キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株の細胞抽出物の水酸化ナトリウム処理
硫酸に替えて水酸化ナトリウムを用いた以外は実施例１と同様に実施した。結果を表５に示した。【００５９】
【表５】
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【００６０】
表５は、水酸化ナトリウムを用いた処理により、細胞抽出物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が低下することを示している。【００６１】
［実施例５］キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株の細胞抽出物の水酸化カリウム処理
硫酸に替えて水酸化カリウムを用いた以外は実施例１と同様に実施した。結果を表６に示した。【００６２】
【表６】
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【００６３】
表６は、水酸化カリウムを用いた処理により、細胞抽出物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が低下することを示している。また、表５および表６の結果から、本願発明の効果は塩基性媒体の種類に関係なく得られた。【００６４】
［実施例６］部分精製したキサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株細胞の抽出物の水酸化ナトリウム処理
調製例２で得た細胞抽出物に替えて、調製例３で得た部分精製物を用いた以外は実施例４と同様に実施した。結果を表７に示した。【００６５】
【表７】
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【００６６】
表７は、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含む、キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株の細胞抽出物の部分精製物を水酸化ナトリウムと接触させることにより、当該菌体抽出物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が低下したことを示している。【００６７】
表５および表７の結果から、本願発明の方法は、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物中の両化合物の濃度に関わらず有効であることが明らかになった。【００６８】
［実施例７］キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０１株細胞の抽出物の硫酸処理
調製例２で得た細胞抽出物に替えて、調製例５で得た細胞抽出物を用いた以外は実施例１と同様に実施した。結果を表８に示した。【００６９】
【表８】
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【００７０】
表８は、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含む、キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０１株の細胞抽出物の部分精製物を硫酸と接触させることにより、当該菌体抽出物中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量が低下したことを示している。【００７１】
表２および表８の結果から、本願発明の方法は、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する組成物が由来する細胞株に関わらず有効であることが明らかとなった。【００７２】
［実施例８］キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株細胞の硫酸処理
調製例１で得た培養液に表９に記した終濃度となるように硫酸を添加した。硫酸添加後の培養液のｐＨを実施例１と同様に測定した結果を表９に示した。次に、各培養液を密閉可能なガラス容器に１０ｍｌずつ分注し、３０℃、５０℃、または、７０℃で、２時間攪拌した
２時間の処理後、各培養液０．０５ｍｌを密閉可能な２ｍｌ容のポリプロピレン製チューブに入れ、遠心分離により細胞を沈降させた。上清を除去した後、１ｍｌの水に細胞を再懸濁し、再度の遠心分離により細胞を沈降させ、上清を除去した。これに、１ｇのガラスビーズ（φ０．５ｍｍ）と１ｍｌのアセトンを加え、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて細胞を破砕した。破砕処理後、チューブの内容物をフィルターろ過（コスモナイスフィルターＳ、０．４５μｍ、ミリポア社製）し、ろ液をＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析、およびアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量の算出は、実施例１と同様に行った。結果を表９に示した。【００７３】
【表９】
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【００７４】
［実施例９］キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株細胞の水酸化ナトリウム処理
硫酸に替えて水酸化ナトリウムを使用した以外は、実施例８と同様に実施した。結果を表１０に示した。【００７５】
【表１０】
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【００７６】
［実施例１０］キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０３株細胞の硫酸処理
調製例１で得た培養液５０ｍｌを密閉可能なガラス容器に分注し、硫酸を添加してｐＨ７．０およびｐＨ３．０に調整した。これを密栓後、７０℃の水浴中で攪拌した。０時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後に各々０．０５ｍｌを分取し、実施例８と同様に、細胞中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を算出した。結果を表１１に示した。【００７７】
【表１１】
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【００７８】
［実施例１１］キサントフィロマイセス・デンドロアスＫＮＫ−０２−１株細胞の硫酸処理
調製例６で得た培養液５０ｍｌを密閉可能なガラス容器に分注し、硫酸を添加してｐＨ７．０およびｐＨ1．０に調整した。これを密栓後、７０℃の水浴中で攪拌した。０時間後、３時間後、６時間後に各々０．０５ｍｌを分取し、実施例８と同様に、細胞中のアスタキサンチンに対するＨＤＣＯの相対量を算出した。【００７９】
結果を表１２に示した。【００８０】
【表１２】
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【００８１】
表９〜１２の結果は、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含む組成物としてキサントフィロマイセス・デンドロアスの細胞を用いた場合においても、本願発明の効果が得られることを示している。
【国際調査報告】
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