(57)【要約】本発明は、糞便に含まれているＲＮＡから、逆転写反応によりｃＤＮＡを効率よく合成するための方法を提供することを目的とする。本発明は、糞便から抽出されたＲＮＡを、カオトロピック塩及びアルコールで洗浄する洗浄工程と、洗浄後のＲＮＡを鋳型とし、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素を用いて、一本鎖核酸結合タンパク質を含有する反応液中で逆転写反応を行う反応工程とを有する糞便由来核酸の合成方法、及び、前記反応液が、さらにＲＮａｓｅＡ阻害剤を含む糞便由来核酸の合成方法、並びに、カオトロピック塩、アルコール、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素、及び一本鎖核酸結合タンパク質を有する、糞便由来核酸の合成用キットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）糞便から抽出されたＲＮＡを、カオトロピック塩及びアルコールで洗浄する洗浄工程；及び
（ｂ）洗浄後のＲＮＡを鋳型とし、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素を用いて、一本鎖核酸結合タンパク質を含有する反応液中で逆転写反応を行う反応工程；
を有する、糞便由来核酸の合成方法。
【請求項２】
前記反応液が、さらにＲＮａｓｅＡ阻害剤を含む、請求項１記載の糞便由来核酸の合成方法。
【請求項３】
前記洗浄工程（a）が、糞便から抽出されたＲＮＡに、まずカオトロピック塩溶液を添加し、次いでアルコール溶液を添加した後、得られたＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する工程を含む、請求項１又は２記載の糞便由来核酸の合成方法。
【請求項４】
前記洗浄工程（a）が、糞便から抽出されたＲＮＡに、カオトロピック塩を含有するアルコール溶液を添加し、得られたＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する工程を含む、請求項１又は２記載の糞便由来核酸の合成方法。
【請求項５】
前記糞便から抽出されたＲＮＡが、糞便からカオトロピック塩を用いて抽出されたＲＮＡである請求項１〜４のいずれか一項に記載の糞便由来核酸の合成方法。
【請求項６】
前記洗浄工程（a）の前に、
（A）
（i）糞便にアルコール溶液を添加し、懸濁液を調製する工程；
（ii）前記懸濁液から、固形成分を回収する工程；及び
（iii）回収された固形成分にカオトロピック剤を添加して懸濁液を調製し、当該固形成分からＲＮＡを抽出する工程；
を有するＲＮＡ抽出工程
を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の糞便由来核酸の合成方法。
【請求項７】
前記洗浄工程（a）の前に、
（a-1）糞便にカオトロピック塩溶液を添加して懸濁液を調製し、ＲＮＡを抽出する工程；及び
（a-2）前記懸濁液に、さらにアルコール溶液又はカオトロピック塩を含有するアルコール溶液を添加した後、当該懸濁液からＲＮＡを回収する工程；
を行う、請求項１又は２記載の糞便由来核酸の合成方法。
【請求項８】
前記洗浄工程（a）が、
（a-3）糞便にアルコール溶液を添加し、懸濁液を調製する工程；
（a-4）前記懸濁液から、固形成分を回収する工程；
（a-5）回収された固形成分にカオトロピック剤を添加して懸濁液を調製し、当該懸濁液よりＲＮＡを抽出する工程；及び
（a-6）前記懸濁液に、さらにアルコール溶液又はカオトロピック塩を含有するアルコール溶液を添加した後、当該懸濁液からＲＮＡを回収する工程；
である、請求項１又は２記載の糞便由来核酸の合成方法。
【請求項９】
カオトロピック塩、アルコール、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素、及び一本鎖核酸結合タンパク質を含む、糞便由来核酸の合成用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便に含まれているＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを効率よく合成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糞便中の癌遺伝子を増幅し、解析することによって大腸癌を検出する方法が開示されている。例えば、特許文献１及び非特許文献１には、癌細胞由来の核酸に多く観察される非アポトーシス性ＤＮＡを検出することによって大腸癌を検査する方法、特に、Ａｌｕ反復領域・アルフォイド反復領域や、ｐ５３等の癌関連遺伝子の断片長の差異に基づいて大腸癌を検査する方法が開示されている。【０００３】
このように、糞便中の癌細胞由来の核酸等の核酸を解析するためには、糞便から高品質の核酸を回収することが重要である。例えば、糞便中には、消化残留物やバクテリアが大量に含まれているため、核酸は非常に分解されやすいという問題がある。また、糞便から回収された核酸に、糞便中の夾雑物が持ち込まれることにより、解析精度が損なわれるという問題もある。このため、より信頼性の高い核酸解析結果を得るために、糞便から、分解等を防止しつつ精製度の高い核酸を回収するための方法の開発がなされている。【０００４】
例えば特許文献２には、糞便をゲル氷点未満の温度まで冷却することによって便の構造を安定化させ、この状態の糞便からの細胞を分離し、そこから抽出したＤＮＡを解析する方法が開示されている。その他、糞便試料からＲＮＡを回収する方法として、非特許文献２には、糞便試料からタンパク質等の夾雑物を除去した後、フェノールとカオトロピック塩を用いてＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡをさらにシリカ含有固形支持体に吸着させることにより回収する方法が開示されている。【０００５】
特許文献２記載の方法においては、糞便試料の変質を効果的に防止するために、糞便を採便直後に冷却することが重要である。しかしながら、検診等のように家庭において採便が行われる場合には、採取後速やかに糞便試料を冷却することは非常に困難であり、現実的ではない。また、特許文献２記載の方法や非特許文献２記載の方法において行われているように、糞便から夾雑物を除去し、標的となる遺伝子を持つ細胞を分離し、そこから核酸を回収する方法には、細胞を分離する工程が煩雑であり、検査のコストアップにつながるという問題に加えて、細胞を分離する工程後に回収される核酸は、収量が低く、工程による収量の損失が大きいという問題もある。このため、糞便から核酸を回収する場合には、ヒト由来細胞と細菌由来細胞を区別せず、混在した状態で回収するほうが望ましい。【０００６】
糞便から細胞を分離回収せずに、糞便から直接核酸を回収する方法もある。例えば特許文献３には、糞便中の癌遺伝子を解析するための、糞便サンプルの調整方法が開示されている。これは、糞便サンプルを、糞便質量１に対して、少なくとも５の溶媒比でホモジナイズした後、哺乳細胞由来のＤＮＡを、細菌のＤＮＡを含めて回収する方法である。また、特許文献４には、採取された糞便をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、調製された懸濁物から直接ＲＮＡを抽出し、癌遺伝子であるＣＯＸ２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）遺伝子の転写産物を検出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００５−５１４０７３号公報
【特許文献２】特表平１１−５１１９８２号公報
【特許文献３】特表２００２−５３９７６５号公報
【特許文献４】特許第４１３４０４７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ボイントン（Boynton）、他３名、２００３年、クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry ）、第４９巻第７号、第１０５８〜１０６５ページ。
【非特許文献２】アレクサンダー（Alexander）、他１名、１９９８年、ダイジェスティブ・ディシーシズ・アンド・サイエンシズ（Digestive Diseases and Sciences）、第４３巻第１２号、第２６５２〜２６５８ページ。
【非特許文献３】ウィルソン（Wilson IG）、アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY）、１９９７年、第６３巻、第３７４１〜３７５１ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一方で、糞便中には、胆汁酸やその塩等の、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等の核酸合成反応に対して阻害作用を有する物質が含まれている（例えば、非特許文献３参照）。例えば、大人の平均的な排泄糞便量は、約２００〜４００ｇ／日とされるが、健常人ではその糞便中に２００〜６５０ｍｇ／日の胆汁酸が排泄されるという報告がある。すなわち、便１ｇあたりに換算した場合、健常人で約０．５ｍｇ〜３．２５ｍｇ、患者でその１０倍の胆汁酸が含まれることになる。一方で、胆汁酸塩によるＰＣＲの阻害効果は、５０μｇ／ｍＬ程度の濃度で生じるとの報告もある。
また、胆汁酸塩等の核酸合成反応阻害物質は、ＰＣＲのみならず、逆転写反応も阻害する。したがって、糞便から核酸を抽出し、それを用いて逆転写反応やＰＣＲ等による増幅反応を行う場合は、反応効率を向上させるために、これらの核酸合成反応阻害物質による影響を低減させることが好ましい。【００１０】
しかしながら、特許文献３及び４に記載されている方法のように、糞便から直接核酸を回収した場合には、細胞を分離した後に回収する方法に比べて、回収後の核酸に糞便中の夾雑物が大量に持ち込まれてしまうという問題がある。このため、特に逆転写反応を行う際に、鋳型として多量の糞便由来ＲＮＡを反応液中に持ち込んだ場合には、反応阻害が起こり、反応産物が得られないという問題がある。【００１１】
本発明は、糞便に含まれているＲＮＡから、逆転写反応によりｃＤＮＡを効率よく合成するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、糞便から抽出・回収されたＲＮＡを、逆転写反応を行う前に、予めカオトロピック塩及びアルコールで洗浄し、洗浄後のＲＮＡを鋳型とし、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素を用いて、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で反応を行うことにより、反応効率を改善し得ることを見出し、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）  （a）糞便から抽出されたＲＮＡを、カオトロピック塩及びアルコールで洗浄する洗浄工程；及び
（ｂ）洗浄後のＲＮＡを鋳型とし、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素を用いて、一本鎖核酸結合タンパク質を含有する反応液中で逆転写反応を行う反応工程；
を有する、糞便由来核酸の合成方法、
（２）  前記反応液が、さらにＲＮａｓｅＡ阻害剤を含む、前記（１）記載の糞便由来核酸の合成方法、
（３）  前記洗浄工程（ａ）が、糞便から抽出されたＲＮＡに、まずカオトロピック塩溶液を添加し、次いでアルコール溶液を添加した後、得られたＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する工程を含む、前記（１）又は（２）記載の糞便由来核酸の合成方法、
（４）  前記洗浄工程（ａ）が、糞便から抽出されたＲＮＡに、カオトロピック塩を含有するアルコール溶液を添加し、得られたＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収する工程を含む、前記（１）又は（２）記載の糞便由来核酸の合成方法、
（５）  前記糞便から抽出されたＲＮＡが、糞便からカオトロピック塩を用いて抽出されたＲＮＡである、前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の糞便由来核酸の合成方法、
（６）  前記洗浄工程（ａ）の前に、
（A）
（i）糞便にアルコール溶液を添加し、懸濁液を調製する工程；
（ii）前記懸濁液から、固形成分を回収する工程；及び
（iii）回収された固形成分にカオトロピック剤を添加して懸濁液を調製し、当該固形成分からＲＮＡを抽出する工程；
を有する、前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の糞便由来核酸の合成方法、
（７）  前記洗浄工程（a）の前に、
（a-1）糞便にカオトロピック塩溶液を添加して懸濁液を調製し、ＲＮＡを抽出する工程；及び
（a-2）前記懸濁液に、さらにアルコール溶液又はカオトロピック塩を含有するアルコール溶液を添加した後、当該懸濁液からＲＮＡを回収する工程；
を行う、前記（１）又は（２）記載の糞便由来核酸の合成方法、
（８）  前記洗浄工程（a）が、
（a-3）糞便にアルコール溶液を添加し、懸濁液を調製する工程；
（a-4）前記懸濁液から、固形成分を回収する工程；
（a-5）回収された固形成分にカオトロピック剤を添加して懸濁液を調製し、当該懸濁液よりＲＮＡを抽出する工程；及び
（a-6）前記懸濁液に、さらにアルコール溶液又はカオトロピック塩を含有するアルコール溶液を添加した後、当該懸濁液からＲＮＡを回収する工程；
である、前記（１）又は（２）記載の糞便由来核酸の合成方法、
（９）  カオトロピック塩、アルコール、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素、及び一本鎖核酸結合タンパク質を有する、糞便由来核酸の合成用キット、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の糞便由来核酸の合成方法により、夾雑物の多い糞便から回収されたＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する場合に、より多量のｃＤＮＡを合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１において、擬似糞便由来ＲＮＡを鋳型とした場合の、各サンプル中のＣＯＸ２遺伝子の発現量相対値を示した図である。
【図２】実施例１において、ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合の、各サンプル中のＣＯＸ２遺伝子の発現量相対値を示した図である。
【図３】実施例１において、大腸菌含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合の、各サンプル中のＣＯＸ２遺伝子の発現量相対値を示した図である。
【図４】実施例１において、ビリルビン含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合の、各サンプル中のＣＯＸ２遺伝子の発現量相対値を示した図である。
【図５】実施例２において、各逆転写酵素を用いた場合のＣＯＸ２遺伝子の発現量相対値を示した図である。
【図６】比較例１において、各逆転写酵素を用いた場合のＣＯＸ２遺伝子の発現量相対値を示した図である。
【図７】実施例３において、反応液中に各種ＳＳＢを添加した場合のＣＯＸ２遺伝子の発現量相対値を示した図である。
【図８】実施例４において、各サンプル中のＣＯＸ２遺伝子の発現量相対値を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明及び本願明細書において、阻害物質とは、核酸を基質とする酵素反応に対して阻害的に作用する物質を意味する。当該酵素反応としては、核酸を基質とする酵素反応であれば特に限定されるものではなく、逆転写反応やＰＣＲ等の核酸合成反応も含まれる。具体的には、胆汁酸、胆汁酸塩、ビリルビン、ムコ多糖類等が挙げられる。
【００１７】
本発明の糞便由来核酸の合成方法（以下、本発明の合成方法、ということがある。）は、糞便から抽出されたＲＮＡを、カオトロピック塩及びアルコールで洗浄する洗浄工程と、洗浄後のＲＮＡを鋳型とし、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素を用いて、一本鎖核酸結合タンパク質を含有する反応液中で逆転写反応を行う反応工程と、を有することを特徴とする。
【００１８】
すなわち、本発明の合成方法では、糞便から抽出されたＲＮＡを、予めカオトロピック塩及びアルコールで洗浄した後、洗浄後のＲＮＡを鋳型とし、特定の性質を備える逆転写酵素を用いて、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で逆転写反応を行うことにより、逆転写反応の反応効率を飛躍的に改善することができる。このような効果が得られる理由は明らかではないが、以下に述べるように、糞便由来の阻害物質による影響を顕著に低減し得るためと推察される。
【００１９】
糞便から抽出されたＲＮＡ中には、糞便中に含まれていた阻害物質が持ち込まれている。この抽出されたＲＮＡを、カオトロピック塩を含有する溶液やアルコール溶液で洗浄することにより、持ち込まれた阻害物質を効率良く洗浄除去することができる。
【００２０】
糞便から細胞を分離することなく、糞便から直接ＲＮＡを回収する場合、カオトロピック塩やアルコールを用いて洗浄した場合であっても、完全に阻害物質を洗浄除去することは難しい。このため、洗浄後に回収されたＲＮＡにも、一部の阻害物質が残存してしまう。
【００２１】
このような阻害物質による弊害に対する対策として、より逆転写効率の高い逆転写酵素を用いることも考えられるが、高活性の酵素を選択したとしても、阻害物質の持ち込み量によっては、反応産物が得られない場合がある。その他にも、ＰＣＲの反応阻害物質の緩和剤としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質が一般的に用いられているが、糞便由来のＲＮＡを用いた場合には、従来から用いられている緩和剤を反応液に添加するだけでは逆転写反応効率は改善されない場合が多い。
【００２２】
本発明においては、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素を用いて、一本鎖核酸結合タンパク質を含有する反応液中で逆転写反応を行うことにより、糞便中の阻害物質の影響を従来になく顕著に低減させることができる。このように、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素と一本鎖核酸結合タンパク質とを併用することが、特に糞便由来の阻害物質の影響を低減させ、反応効率を改善することに有効であることは、本発明者により初めて見出された知見である。
【００２３】
以下、工程ごとに説明する。
まず、洗浄工程として、糞便から抽出されたＲＮＡを、カオトロピック塩及びアルコールで洗浄する。具体的には、糞便から抽出されたＲＮＡに、カオトロピック塩及びアルコールを添加してＲＮＡ溶液を調製した後、当該ＲＮＡ溶液からＲＮＡを回収することにより、カオトロピック塩及びアルコールで洗浄されたＲＮＡを得ることができる。
【００２４】
洗浄工程においては、ＲＮＡに、カオトロピック塩とアルコールとをそれぞれ添加してもよく、予めカオトロピック塩を含有するアルコール溶液を調製し、これを添加してもよい。また、カオトロピック塩とアルコールとを別個に添加する場合、いずれを先に添加するかは、糞便からのＲＮＡの抽出方法等を考慮して、適宜決定することができる。本発明においては、先にカオトロピック塩を添加した後にアルコールを添加するか、又はカオトロピック塩を含有するアルコール溶液を添加するほうが好ましい。
【００２５】
洗浄工程において糞便から抽出されたＲＮＡに添加されるカオトロピック塩としては、特に限定されるものではなく、当該技術分野において用いられているいずれのカオトロピック塩を用いてもよい。このようなカオトロピック塩として、例えば、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン等のグアニジン塩が好ましい。また、１種類のカオトロピック塩を用いてもよく、２種類以上のカオトロピック塩を併用してもよい。
【００２６】
カオトロピック塩は、適当な溶媒に溶解させたカオトロピック塩溶液として添加することが好ましい。この際用いられる溶媒としては、例えば、水、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、トリスバッファー等を用いることができる。特に、ＲＮＡは非常に分解されやすい物質であるため、チオシアン酸グアニジンや塩酸グアニジン等のＲＮａｓｅ阻害剤を含有したバッファーを用いることが好ましい。なお、当該溶媒として、アルコールを用いることにより、カオトロピック塩含有アルコール溶液（カオトロピック塩を含有するアルコール溶液）を調製することができる。
【００２７】
糞便から抽出されたＲＮＡに添加されるカオトロピック塩溶液の濃度は、阻害物質洗浄除去効果を発揮し得る濃度であれば、特に限定されるものではなく、カオトロピック塩の種類、添加後に得られるＲＮＡ溶液中のカオトロピック塩やアルコールの濃度、アルコールの種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００２８】
洗浄工程において糞便から抽出されたＲＮＡに添加されるアルコールとしては、直鎖構造を有し、室温付近、例えば１５〜４０℃において液状であるものを用いる。本発明においては、水に対する溶解度が１２重量％以上のアルコールであることが好ましく、水に対する溶解度が２０重量％以上のアルコールであることがより好ましく、水に対する溶解度が９０重量％以上のアルコールであることがさらに好ましく、水と任意の割合で混合可能であるアルコールであることが特に好ましい。水と任意の割合で混合可能であるアルコールとして、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール等がある。
【００２９】
具体的には、水溶性アルコールであるメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、メルカプトエタノール等がある。プロパノールは、ｎ−プロパノールであってもよく、２−プロパノールであってもよい。また、ブタノールは、１−ブタノール（水に対する溶解度２０重量％）であってもよく、２−ブタノール（水に対する溶解度１２．５重量％）であってもよい。本発明において用いられるアルコールとしては、入手容易性、取り扱い性、安全性等の点から、エタノール、プロパノール、メタノールであることがさらに好ましい。特にエタノールは、最も安全性が高く、家庭内でも容易に扱うことが可能であるため、定期健診等のスクリーニング検査において特に有用である。なお、糞便から抽出されたＲＮＡに添加するアルコールとしては、１種類のみであってもよく、２種類以上を併用して添加してもよい。
【００３０】
糞便から抽出されたＲＮＡに、直接アルコールとして添加してもよく、適当な溶媒で希釈したアルコール溶液として添加してもよい。添加するアルコールの量、アルコール溶液の濃度や量は、添加後に得られるＲＮＡ溶液中で阻害物質洗浄除去効果を奏することができる濃度となるように添加されるものであれば、特に限定されるものではなく、アルコールの種類、添加後に得られるＲＮＡ溶液の量、添加したカオトロピック塩の種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００３１】
例えば、カオトロピック塩含有アルコール溶液を糞便から抽出されたＲＮＡに添加する場合には、カオトロピック塩含有アルコール溶液中のアルコール濃度は２５％以上であることが好ましく、３５％以上であることがより好ましい。なお、本発明及び本願明細書中においては、特に記載がない限り、「％」は「体積％」を意味する。
【００３２】
洗浄工程に供されるＲＮＡとしては、糞便から所望の細胞を分離回収した後、回収された細胞から抽出されたＲＮＡであってもよいが、細胞分離操作を行うことなく、糞便から直接抽出されたＲＮＡであることが好ましい。糞便から直接ＲＮＡを抽出した場合には、分離回収された細胞から抽出する場合よりも、糞便由来の阻害物質の持ち込み量が多くなるため、本発明の効果がより顕著に奏されるためである。
【００３３】
また、細胞分離操作を行うことなく、糞便から直接ＲＮＡを回収した場合には、糞便に含まれている全ての生物種の核酸、主に当該糞便を排泄した動物由来の核酸と腸内常在菌等のバクテリア由来の核酸とが、同時に糞便から抽出され回収される。これにより、糞便中に比較的微量にしか含まれていない哺乳細胞由来のＲＮＡも、効率よく抽出・回収することができる。ここで、糞便に含まれている核酸としては、動物由来の核酸とバクテリア由来の核酸に加えて、当該動物が摂取した食物由来の核酸等が挙げられる。
【００３４】
洗浄工程に供される糞便から抽出されたＲＮＡは、糞便中の細胞等の固形成分から抽出されたＲＮＡであればよい。例えば、糞便に核酸抽出用溶液を添加して混合することによって、糞便に含まれていた細胞等からＲＮＡが液相に抽出された懸濁液であってもよく、当該懸濁液から固形成分が除去された、比較的清澄な抽出液であってもよく、さらに、これらの懸濁液や粗抽出液から回収・精製されたＲＮＡ溶液であってもよい。
【００３５】
ＲＮＡが液相に抽出された懸濁液を調製するために糞便に添加される核酸抽出用溶液としては、固形成分中のタンパク質を変性させ、この固形成分中の哺乳細胞や腸内常在菌等の細胞から、核酸を核酸抽出用溶液中に溶出させることが可能な溶液であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において用いられているいずれの溶液を用いてもよい。例えば、カオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等の、通常タンパク質の変性剤として用いられている化合物を有効成分として適当な溶媒に添加した溶液を、核酸抽出用溶液として用いることができる。なお、これらの有効成分は２種類以上を組み合わせたものであってもよい。
【００３６】
核酸抽出用溶液の有効成分となり得るカオトロピック塩としては、例えば、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン等がある。
【００３７】
核酸抽出用溶液の有効成分となり得る有機溶媒としては、フェノールであることが好ましい。フェノールは中性であってもよいが、酸性であることが好ましい。酸性のフェノールを用いた場合には、ＤＮＡよりもＲＮＡを選択的に水層に抽出することができる。
【００３８】
これらの有効成分を添加して核酸抽出用溶液を調製する溶媒としては、例えば、水、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、トリスバッファー等を用いることができる。
【００３９】
固形成分からＲＮＡを抽出する前に、糞便をアルコールで処理しておくことも好ましい。糞便をアルコールに懸濁させると、糞便の固形成分中に含まれていた阻害物質が、アルコールに溶出される。この際、ＲＮＡ等の核酸は、固形成分中に留まるため、当該懸濁液の液相を除去し、残った固形成分からＲＮＡを抽出・回収することにより、糞便由来の阻害物質のキャリーオーバーがより低減されたＲＮＡを回収することができる。
【００４０】
特にアルコールには、阻害物質の溶出除去効果のみならず、糞便中の核酸を安定して保存し得る効果もある。これは、アルコールが有する脱水作用により、糞便中に含まれている哺乳細胞や微生物等の細胞活性が顕著に低下するため、及び、アルコールが有するタンパク質変性作用により、糞便中のプロテアーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等の各種分解酵素の活性が顕著に低下するために得られると推察される。つまり、糞便をアルコールと懸濁させることにより、糞便中の核酸の分解等を抑制しつつ、阻害物質を溶出除去することができる。
【００４１】
固形成分からのＲＮＡ抽出前に糞便に添加されるアルコールとしては、洗浄工程で添加し得るものとして列挙されたものと同様のアルコールを用いることができる。また、アルコールとして直接糞便に添加してもよく、適当な溶媒で希釈したアルコール溶液として添加してもよい。糞便に添加するアルコール量、又はアルコール溶液の濃度や量は、懸濁液で核酸の安定化効果及び阻害物質の溶出除去効果を奏することができる濃度となるように添加されるものであれば、特に限定されるものではなく、アルコールの種類、糞便量（固形成分量）と添加したカオトロピック塩溶液やアルコール等の液体成分との混合比等を考慮して、適宜決定することができる。なお、懸濁液中のアルコール濃度が充分に高濃度であることにより、糞便全体にアルコール成分が迅速に浸透し、阻害物質溶出除去効果や核酸安定化効果を速やかに奏することができる。
【００４２】
糞便にアルコール又はアルコール溶液を混合して得られた懸濁液の液相には、阻害物質が多く溶出されている。このため、当該懸濁液から液相を除去し、回収された固形成分に核酸抽出液を添加する等により、ＲＮＡを抽出することが好ましい。固形成分の回収方法は、液体成分と固体成分を分離する場合に通常用いられる分離方法から適宜選択して行うことができる。例えば、懸濁液を遠心分離処理後、上清を除去することにより、沈殿である糞便由来固形成分を回収する遠心分離法により行ってもよく、懸濁液をフィルター濾過し、フィルター面上に残った糞便由来固形成分を回収する濾過法により行ってもよい。
【００４３】
アルコール成分を除去して固形成分を回収した後、核酸抽出液を添加する前に、回収された固形成分を、適当なバッファー等により洗浄してもよい。当該バッファーとして、例えば、前述のカオトロピック塩含有アルコール溶液や、ｐＨが２〜７．５の範囲内に維持されるような緩衝液等が挙げられる。
【００４４】
また、糞便にアルコール又はアルコール溶液を混合して得られた懸濁液は、固形成分を回収する前に、所定時間保存されることが好ましい。懸濁液を保存することにより、糞便由来の固形成分から溶出除去される阻害物質の量を多くすることができる。懸濁液を保存する時間は、アルコールの種類や濃度、懸濁液に占める糞便由来成分の割合、保存温度等を考慮して適宜決定することができる。本発明の合成方法においては、１時間以上保存することが好ましく、１２時間以上保存することがより好ましく、２４時間以上保存することがさらに好ましく、７２時間以上保存することが特に好ましい。また、１６８時間以上保存してもよい。
【００４５】
アルコールによる阻害物質溶出除去効果は、懸濁液を保存する温度が低温の場合よりもむしろ温度が高いほうが高い効果が得られる。具体的には、糞便にアルコール又はアルコール溶液を混合して得られた懸濁液の保存温度は、４℃以上であることが好ましく、２０℃以上であることがより好ましい。但し、保存温度は、５０℃以下で行うことが好ましい。５０℃以上の高温条件下で長期間保存することにより、揮発等により、該懸濁液中のアルコールの濃度が、効果を奏するに充分な濃度よりも低下するおそれがあるためである。
【００４６】
糞便由来の固形成分を含む懸濁液の液相中のＲＮＡを、糞便から抽出されたＲＮＡとして洗浄工程に供する場合には、具体的には、懸濁液に、カオトロピック塩やアルコールを添加した後、得られた懸濁状態のＲＮＡ溶液の液相中に存在するＲＮＡを回収することにより、洗浄済みのＲＮＡを回収することができる。
【００４７】
液相中のＲＮＡを回収する前に、懸濁液から変性させたタンパク質を除去してもよい。
ＲＮＡを回収する前に、予め変性させたタンパク質を除去することにより、回収されるＲＮＡの品質を向上させることができる。懸濁液からのタンパク質の除去は、公知の手法で行うことができる。例えば、遠心分離により、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することにより、変性タンパク質を除去することができる。また、クロロホルムを添加し、ボルテックス等により充分に攪拌混合させた後に遠心分離を行い、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することにより、単に遠心分離を行う場合よりも、より完全に変性タンパク質を除去することができる。
【００４８】
液相中のＲＮＡの回収方法は、例えば、エタノール沈殿法や塩化セシウム超遠心法等の公知の手法で行うことができる。また、液相中のＲＮＡを無機支持体に吸着させた後、この吸着させた核酸を、一定容量の溶媒を用いて無機支持体から溶出させることにより、核酸を回収することができる。その他、カオトロピック塩やアルコールを添加した後の懸濁液の液相中からのＲＮＡの回収は、核酸抽出キット等の市販のキットを用いて行うこともできる。
【００４９】
核酸を吸着させる無機支持体は、核酸を吸着することができる公知の無機支持体を用いることができる。また、該無機支持体の形状も特に限定されるものではなく、粒子状であってもよく、膜状であってもよい。該無機支持体として、例えば、シリカゲル、シリカ質オキシド、ガラス、珪藻土等のシリカ含有粒子（ビーズ）や、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ニトロセルロース等の多孔質膜等がある。吸着させた核酸を無機支持体から溶出させる溶媒は、回収する核酸の種類やその後の核酸解析方法等を考慮して、これらの公知の無機支持体から核酸を溶出するために通常用いられている溶媒を適宜用いることができる。該溶出用溶媒として、特に精製水であることが好ましい。なお、核酸を吸着させた無機支持体は、核酸を溶出させる前に、適当な洗浄バッファーを用いて洗浄することが好ましい。
【００５０】
なお、液相からＲＮＡを回収する際に、ＤＮＡよりもＲＮＡを選択的に回収することも好ましい。例えば、酸性フェノールを用いたフェノール／クロロホルム法により、ＤＮＡよりもＲＮＡを優先的に水層に溶出させた後に、エタノール沈殿や無機支持体を用いた回収方法を行うことにより、ＤＮＡの混入量を低減させたＲＮＡを回収することができる。
また、塩化セシウム超遠心法により、ＲＮＡを選択的に回収することができる。その他、例えば米国特許５，１５５，０１８号明細書において、ギレスピイ(Gillespie)らは、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びその他の細胞内容物を含む生物学的原料から、生物学的に活性なＲＮＡを単離及び精製する方法を開示している。当該方法では、ＲＮＡを含む原料は、例えば細かく粉砕されたガラスのような材料を含むシリカゲルからなる粒子と接触させられる。そこからＲＮＡが前記粒子に吸着される結合バッファーはカオトロピック塩を含む酸性化溶液である。そのような条件下、ＲＮＡはシリカ物質に結合するが、ＤＮＡはしないため、ＲＮＡを選択的に回収することができる。また、特許０４０３６６２５号公報には、グアニジン塩とエタノール濃度を変化させることにより、ＲＮＡを選択的に吸着、回収することができることが記載されている。これらの方法においては、糞便由来の固形成分からＲＮＡが抽出された後の任意の工程において、カオトロピック塩溶液やアルコール溶液、若しくはカオトロピック塩含有アルコール溶液を添加し、その後ＲＮＡを回収することにより、ＤＮＡの混入量を低減させた、洗浄済みのＲＮＡを回収することができる。
【００５１】
また、糞便に核酸抽出用溶液を添加して得られた懸濁液から遠心分離処理等により固形成分を除き、ＲＮＡを含む液相のみを回収した粗抽出液を、糞便から抽出されたＲＮＡとして洗浄工程に供することもできる。具体的には、粗抽出液に、カオトロピック塩やアルコールを添加した後、液相中のＲＮＡを回収することにより、洗浄済みのＲＮＡを回収することができる。同じく、常法により精製されたＲＮＡに、カオトロピック塩溶液やアルコール溶液、若しくはカオトロピック塩含有アルコール溶液を添加した後、液相中のＲＮＡを回収することにより、洗浄済みＲＮＡを回収することができる。なお、液相中のＲＮＡの回収方法は、懸濁液にカオトロピック塩やアルコールを添加した場合に挙げられた方法と同様の方法を用いることができる。
【００５２】
糞便からＲＮＡを抽出する工程において、カオトロピック塩を用いたり、アルコールを用いた場合には、糞便から抽出されたＲＮＡには、既にカオトロピック塩やアルコールが含まれていることもある。例えば、核酸抽出用溶液としてカオトロピック塩溶液を用いた場合や、固形成分からＲＮＡを抽出する前に、糞便をアルコール溶液で保存した場合には、抽出されたＲＮＡには、カオトロピック塩やアルコールが残留している場合がある。この場合にも、さらに、カオトロピック塩やアルコールで洗浄することにより、より効果的に阻害物質を洗浄除去することができる。
【００５３】
また、洗浄工程における洗浄処理は、糞便の固形成分から抽出されたＲＮＡに直接カオトロピック塩やアルコールを接触させた後に、カオトロピック塩やアルコールを含有する液相からＲＮＡを回収する処理である。このため、糞便からＲＮＡを抽出する工程において、カオトロピック塩やアルコールを用いた場合であって、固形成分から抽出されたＲＮＡが、カオトロピック塩やアルコールに接触する処理が行われる場合には、当該処理を本発明の洗浄工程における洗浄処理とすることができる。
【００５４】
例えば、核酸抽出用溶液としてカオトロピック塩溶液を用いて、固形成分からＲＮＡを抽出した場合には、抽出されたＲＮＡが液相中のカオトロピック塩に直接接触するため、当該液相からＲＮＡを回収することにより、その後、新たにカオトロピック塩を添加せずとも、カオトロピック塩で洗浄されたＲＮＡを回収することができる。
【００５５】
具体的には、糞便にカオトロピック塩溶液を添加して懸濁液を調製し、ＲＮＡを抽出した後、カオトロピック塩を含む当該懸濁液に、さらにアルコール溶液又はカオトロピック塩を含有するアルコール溶液を添加した後、当該懸濁液からＲＮＡを回収する。これにより、カオトロピック塩及びアルコールで洗浄されたＲＮＡを回収することができる。
【００５６】
また、糞便にアルコール溶液を添加し、懸濁液を調製した後、当該懸濁液から、固形成分を回収し、アルコール成分と分離された当該固形成分にカオトロピック塩溶液を添加して、再度懸濁液を調製する。カオトロピック塩の働きにより固形成分からＲＮＡを抽出した後、当該懸濁液に、さらにアルコール溶液又はカオトロピック塩を含有するアルコール溶液を添加した後、当該懸濁液からＲＮＡを回収することにより、カオトロピック塩及びアルコールで洗浄されたＲＮＡを回収することができる。
【００５７】
なお、本発明の合成方法に供されるＲＮＡが抽出される糞便は、動物のものであれば特に限定されるものではないが、哺乳動物由来のものであることが好ましく、ヒト由来のものであることがより好ましい。例えば、定期健診や診断等のために採取されたヒトの糞便であることが好ましいが、家畜や野生動物等の糞便であってもよい。また、採取後一定期間保存されたものであってもよいが、採取直後のものであることが好ましい。さらに、採取された糞便は、排泄直後のものであることが好ましいが、排泄後時間を経たものであってもよい。
【００５８】
また、洗浄工程において、カオトロピック塩及びアルコールで洗浄されるＲＮＡは、例えば、重量として１０ｍｇ〜１ｇの糞便から抽出されたＲＮＡであることが好ましい。糞便量があまりに多くなってしまうと、取り扱い性等が低下するおそれがある。逆に糞便量があまりに少量である場合には、糞便中に含まれる大腸剥離細胞等の哺乳細胞数が少なくなりすぎるため、必要なＲＮＡ量を回収できないおそれがある。また、糞便はヘテロジニアスであるため、哺乳細胞の局在の影響を避けるために、採糞時には、糞便の広範囲から採取することが好ましい。
【００５９】
洗浄工程後、さらに反応工程として、洗浄工程において回収された洗浄済みのＲＮＡを鋳型とし、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素を用いて、一本鎖核酸結合タンパク質を含有する反応液中で逆転写反応を行う。特定の性質を備える逆転写酵素と一本鎖核酸結合タンパク質とを併用することにより、鋳型ＲＮＡと逆転写酵素の両方が十分に安定化されるため、阻害物質による反応効率の低下を抑制し得ると考えられる。なお、逆転写反応は、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素を用いることと、反応液に一本鎖核酸結合タンパク質を添加すること以外は、常法により行うことができる。
【００６０】
本発明において用いる逆転写酵素は、耐熱性を有する酵素である。なお、本発明において、「耐熱性を有する逆転写酵素」とは、熱に対する不活性化に対して耐性を有する逆転写酵素を意味する。具体的には、９０℃において３０秒間加熱された場合でも、その酵素活性の少なくとも５０％以上を保持する酵素である。
【００６１】
本発明において用いる逆転写酵素は、さらに、ＲＮａｓｅＨ活性が低い酵素である。なお、本発明において、「ＲＮａｓｅＨ活性が低い逆転写酵素」とは、当該酵素のＲＮａｓｅＨ活性が、野生型又は野生型モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）若しくはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素等のＲＮａｓｅＨ＋酵素のＲＮａｓｅＨ活性の約２０％未満である逆転写酵素を意味する。
【００６２】
耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素としては、具体的には、例えば、Ｍ−ＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素等が挙げられる。特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩが最も好ましい。当該酵素は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ−の一塩基変異株である。
【００６３】
本発明において、「一本鎖核酸結合タンパク質」とは、塩基配列に関係なく、二本鎖ＤＮＡよりも一本鎖ＤＮＡに主に結合するタンパク質である。本発明において用いることができる一本鎖核酸結合タンパク質としては、具体的には、例えば、Ｔ４  ｇｅｎｅ  ３２
ｐｒｏｔｅｉｎ（プロメガ社製）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＳＳＢ、耐熱性を示すＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＳＳＢ、メタン細菌（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｕｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＳＳＢ等が挙げられる。なお、これらの一本鎖核酸結合タンパク質は、単体で用いても良く、組み合わせて用いても良い。
【００６４】
逆転写反応において本発明において用いられる一本鎖核酸結合タンパク質としては、非耐熱性の一本鎖核酸結合タンパク質であってもよいが、耐熱性の一本鎖核酸結合タンパク質であることが好ましい。なお、「耐熱性の一本鎖核酸結合タンパク質」とは、一本鎖ＤＮＡに対する結合活性が、熱に対する不活性化に対して耐性を有するタンパク質を意味し、具体的には、９０℃において３０秒間加熱された場合でも、その結合活性の少なくとも５０％以上を保持する一本鎖核酸結合タンパク質である。
【００６５】
本発明においては、逆転写反応の反応液に、さらに、ＲＮａｓｅＡ阻害剤を添加することが好ましい。ＲＮａｓｅＡ阻害剤の存在下で逆転写反応を行うことにより、一本鎖核酸結合タンパク質と、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素とを用いることにより得られる、糞便由来の阻害物質による影響低減効果をより高めることができる。ＲＮａｓｅＡ阻害剤としては、例えば、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,   Ｃｌｏｎｅｄ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴａＫａＲａ社製）等が挙げられる。
【００６６】
本発明の合成方法により合成されたｃＤＮＡは、その他の手法により得られたＤＮＡと同様に、様々な解析に供することができる。遺伝子変異の有無は、例えば、ＲＮＡ上の塩基の挿入、欠失、置換、重複、逆位、又はスプライシングバリアント（アイソフォーム）等の変異を検出することができる。その他、ＲＮＡ発現量を検出する（ｍＲＮＡの発現解析）こともできる。なお、これらの解析は、当該分野において公知の方法により行うことができる。また、Ｋ−ｒａｓ遺伝子変異解析キット等の市販の解析キットを用いてもよい。
【００６７】
本発明の合成方法により合成されたｃＤＮＡは、糞便由来であることから、大腸、小腸、胃等の消化管細胞由来のＲＮＡを解析するために用いることが好ましく、大腸剥離細胞由来のＲＮＡを解析するために用いることがより好ましい。
【００６８】
特に、新生物性転化（癌を含む）のマーカー遺伝子や炎症性消化器疾患のマーカー遺伝子由来のＲＮＡを解析するために用いることが好ましく、大腸癌のマーカー遺伝子由来のＲＮＡを解析するために用いることがより好ましい。なお、「遺伝子由来のＲＮＡ」とは、当該遺伝子のｍＲＮＡ等の発現産物を意味する。該新生物性転化を示すマーカーとして、例えば、ＣＯＸ２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）遺伝子、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴＮ）等の公知の癌マーカーや、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３遺伝子、Ｋ−ｒａｓ遺伝子等の変異の有無等がある。また、ｐ１６、ｈＭＬＨＩ、ＭＧＭＴ、ｐ１４、ＡＰＣ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＳＲ１、ＳＦＲＰ２等の遺伝子のメチル化の検出も、大腸疾患の診断マーカーとして有用である（例えば、Lind et al.、「A CpG island hypermethylation profile of primary colorectal carcinomas and colon cancer cell lines」、Molecular Cancer、２００４年、第３巻第２８章参照。）。一方、炎症性消化器疾患を示すマーカーとして、例えば、ＣＯＸ２遺伝子由来ＲＮＡ等がある。なお、Ｃｏｘ−２遺伝子由来ＲＮＡは、新生物性転化を示すマーカーとしても用いられる。
【００６９】
本発明の合成方法により、糞便由来の阻害物質による影響を顕著に低減し、逆転写反応の反応効率を高めることができ、結果として安定した反応を行うことが可能となる。このため、本発明の合成方法により得られたｃＤＮＡを、糞便由来ＲＮＡの遺伝子発現解析等の核酸解析に用いることにより、信頼性の高い結果を得ることができる。こうして得られた検出結果は、臨床検査のために好適に用いられる。
【００７０】
また、本発明の合成方法において用いる試薬類をキット化することにより、本発明の合成方法をより簡便に行うことができる。このような糞便由来核酸の合成用キットとしては、例えば、カオトロピック塩、アルコール、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素、及び一本鎖核酸結合タンパク質を備えるものが挙げられる。また、当該キットは、糞便からのＲＮＡ抽出や、逆転写反応に用いられる試薬等をさらに備えていてもよい。このような試薬としては、例えば、核酸抽出用溶液、無機支持体、無機支持体からの溶出用溶媒、逆転写反応用バッファー、プライマー、ｄＮＴＰ等が挙げられる。
【００７１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、ＭＫＮ４５細胞は、常法により培養したものを用いた。
【実施例１】
【００７２】
＜擬似糞便由来ＲＮＡの調製＞
ＳＤＳ／フェノール抽出法、グアニジン・エタノール抽出法、及びグアニジン・エタノール・シリカ抽出法の３種類の方法により、擬似大腸癌患者由来糞便試料（大腸癌患者から採取された糞便の擬似試料）からＲＮＡを抽出・回収し、擬似糞便由来ＲＮＡを調製した。【００７３】
擬似大腸癌患者由来糞便試料は、以下のようにして調製した。まず、健常人の糞便５ｇに生理食塩水を等量添加し、よく混ぜて均一化した後、２００×ｇの遠心分離処理をいって夾雑物を沈殿させ、その上清を回収した。この糞便上清と、ＭＫＮ４５細胞が１×１０５個含むように調整した細胞ペレットとを混合し、これを擬似大腸癌患者由来糞便試料とした。なお、ＭＫＮ４５細胞は胃癌由来であるが、大腸癌細胞と同様にＣＯＸ２遺伝子を高発現する培養細胞株である。【００７４】
調製された擬似大腸癌患者由来糞便試料を３００μＬずつ３本の１．５ｍＬチューブに分け、それぞれＳＤＳ／フェノール抽出法、グアニジン・エタノール抽出法、又はグアニジン・エタノール・シリカ抽出法により、ＲＮＡを抽出し、回収した。【００７５】
ＳＤＳ／フェノール抽出法では、まず、３００μＬの擬似大腸癌患者由来糞便試料が入っているチューブに、３００μＬのＡＥバッファー（５０  ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ５．３）を添加して懸濁させた後、３０μＬの１０％ＳＤＳ溶液を添加して、Ｖｏｒｔｅｘを行った。当該チューブに、さらに等量のフェノールを添加してＶｏｒｔｅｘを行った後、６５℃で４分間加熱した。その後、直ちに液体窒素を用いて当該チューブを冷却した。当該チューブの凍らせた内容物を室温で融解させた後、１４０００ｒｐｍ、２分間で遠心処理を行い、上層を別の１．５ｍＬチューブに回収した。当該１．５ｍＬチューブにクロロホルムを添加して混合した後（フェノール／クロロホルム処理）、再度１４０００ｒｐｍ、２分間で遠心処理を行い、上層を別の１．５ｍＬチューブに回収した。得られた上層に３０μＬの３Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ及び等量のイソプロパノールを加えて混和し、４℃、１４０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理を行い、ペレットを得た（エタノール沈殿）。当該ペレットを７５％エタノール溶液でリンスし、乾燥させた後、５０μＬの蒸留水に溶解させたものを、フェノール・クロロホルム抽出ＲＮＡとした。【００７６】
グアニジン・エタノール抽出法では、まず、３００μＬの擬似大腸癌患者由来糞便試料が入っているチューブに、３００μＬのチオシアン酸グアニジンバッファー（ＲＬＴバッファー、ＱＩＡＧＥＮ社製）を添加し、Ｖｏｒｔｅｘを行った後、等量（約６００μＬ）の７０％エタノールを加えてＶｏｒｔｅｘを行い、懸濁液を得た。その後、当該懸濁液を３００μＬずつ４本の１．５ｍＬチューブに分注し、それぞれに２．５倍容量の９９．５％  エタノール溶液と６０μＬの３Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加して混和した後、４℃、１４０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理を行い、ペレットを得た（エタノール沈殿）。得られた４本のチューブ内のペレットを１つに纏めた後、７５％エタノール溶液でリンスし、乾燥させた後、５０μＬの蒸留水に溶解させたものを、グアニジン・エタノール抽出ＲＮＡとした。【００７７】
グアニジン・エタノール・シリカ抽出法では、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用した。まず、３００μＬの擬似大腸癌患者由来糞便試料が入っているチューブに、３００μＬのＲＴＬバッファー（グアニジン塩を含むバッファー、Ｑｕｉａｇｅｎ社製）を添加し、Ｖｏｒｔｅｘで攪拌した。攪拌後、等量の７０％エタノール溶液を加えて混和したものを、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）のＲＮＡ回収用カラムに通し、添付のプロトコールに従って該ＲＮＡ回収用カラムの洗浄操作及びＲＮＡ溶出操作を行うことにより、ＲＮＡを５０μＬのＲＮＡ溶液として回収した。当該ＲＮＡをグアニジン・エタノール・シリカ抽出ＲＮＡとした。【００７８】
＜比較対象として用いるＲＮＡの調製＞
ＭＫＮ４５細胞が１×１０５個含むようにＰＢＳで調整した細胞試料（ＭＫＮ４５細胞試料）、前記細胞試料に、液体培地で培養して得られた大腸菌を１×１０８個含むように添加したもの（大腸菌含有ＭＫＮ４５細胞試料）、及び前記細胞試料に、最終濃度が１ｍｇ／μＬとなるようにビリルビンを添加したもの（ビリルビン含有ＭＫＮ４５細胞試料）の３種類を比較対象とした。
これらの細胞試料から、擬似大腸癌患者由来糞便試料と同様にして、ＳＤＳ／フェノール抽出法又はグアニジン・エタノール抽出法によりＲＮＡを抽出・回収した。【００７９】
＜逆転写反応＞
得られた各ＲＮＡをそれぞれ鋳型として、逆転写反応を行った。各ＲＮＡの定量を行い、ＲＮＡ濃度の測定結果をもとに、各反応液に１μｇのＲＮＡが添加されるようにした。
具体的には、擬似糞便由来ＲＮＡ、ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡ、大腸菌含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡ、及びビリルビン含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡのそれぞれに対して、表１に示すように、鋳型としてフェノール・クロロホルム抽出ＲＮＡ又はグアニジン・エタノール抽出ＲＮＡを用い、逆転写酵素として非耐熱性かつＲＮａｓｅＨ活性の高いＭ−ＭＬＶ（ＴａｋａＲａ社製）又は耐熱性かつＲＮａｓｅＨ活性の低いＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、４０ｎｇ／μＬのＴ４  ｇｅｎｅ  ３２  ｐｒｏｔｅｉｎ（プロメガ社製）の添加の有無、及びＲＮａｓｅＡ阻害剤（ＴａＫａＲａ社製）の添加の有無の条件を変えた１６種類の反応液（サンプル）を調製し、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。なお、Ｔ４  ｇｅｎｅ  ３２  ｐｒｏｔｅｉｎは、一本鎖核酸結合タンパク質（以下、ＳＳＢ）である。表１中、「ＲＮＡ抽出法」の欄においては、「＋」は当該抽出法で抽出されたＲＮＡを鋳型として添加したことを、「−」は当該抽出法で抽出されたＲＮＡを鋳型として用いなかったことを、それぞれ意味する。また、「逆転写反応」の欄においては、「＋」は当該物質を逆転写反応の反応液に添加したことを、「−」は添加しなかったことを、それぞれ意味する。【００８０】
【表１】
2012014694.tif 000002
【００８１】
＜ＣＯＸ２遺伝子の発現量の測定＞
得られたｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＯＸ２遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ）の検出を行った。リアルタイムＰＣＲのプライマーは、アプライドバイオシステム社製のＣＯＸ２プライマープローブＭＩＸ（カタログＮｏ：Ｈｓ００１５３１３３＿ｍ１）を用いた。具体的には、０．２ｍＬの９６ウェルＰＣＲプレートに、各ｃＤＮＡを１μＬずつ分取した。その後、各ウェルに８μＬの超純水と１０μＬの核酸増幅試薬「ＴａｑＭａｎ  ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（アプライドバイオシステム社製）を添加し、さらに、１μＬのＣＯＸ２プライマープローブＭＩＸ（アプライドバイオシステム社製）をそれぞれ添加して混合し、ＰＣＲ反応液を調製した。該ＰＣＲプレートを、ＡＢＩリアルタイムＰＣＲ装置に設置し、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１分間、５６．５℃で１分間、７２℃で１分間の熱サイクルを４０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間処理することにより、経時的に蛍光強度を計測しながらＰＣＲを行った。【００８２】
蛍光強度の計測結果を分析して、各サンプル中のＣＯＸ２遺伝子のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ量（ＣＯＸ２遺伝子の発現量）を調べた。表１に示す１６種類のサンプルのうち、グアニジン・エタノール抽出ＲＮＡを鋳型とし、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いて、ＳＳＢとＲＮａｓｅＡ阻害剤のいずれも添加しなかったサンプル１２の発現量を１として、他のサンプルの発現量の相対値を算出した。算出結果を図１〜４に示す。図１は擬似糞便由来ＲＮＡを鋳型とした場合の結果であり、図２はＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合の結果であり、図３は大腸菌含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合の結果であり、図４はビリルビン含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合の結果である。【００８３】
この結果、図１〜４のいずれにおいても、他の条件が同じ場合には、Ｍ−ＭＬＶを用いた場合（サンプル１〜４、９〜１２）よりも、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩを用いた場合（サンプル５〜８、１３〜１６）のほうが、ＣＯＸ２遺伝子の発現量が高かった。【００８４】
一方で、ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合（図２）及び大腸菌含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合（図３）には、同じく他の条件が同じ場合には、フェノール・クロロホルム抽出ＲＮＡを用いた場合（サンプル１〜８）とグアニジン・エタノール抽出ＲＮＡを用いた場合（サンプル９〜１６）とでは、ほとんど差がなく、ＲＮＡの抽出方法の相違は、逆転写反応にほとんど影響を与えないことが分かった。また、ＳＳＢの添加の有無とＲＮａｓｅＡ阻害剤の添加の有無は、いずれも発現量に対する影響は観察されなかった。【００８５】
これに対して、擬似糞便由来ＲＮＡを鋳型とした場合（図１）には、他の条件が同じ場合には、フェノール・クロロホルム抽出ＲＮＡを用いた場合（サンプル１〜８）よりも、グアニジン・エタノール抽出ＲＮＡを用いた場合（サンプル９〜１６）のほうが、ＣＯＸ２遺伝子の発現量が高かった。ビリルビン含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合（図４）にも、擬似糞便由来ＲＮＡを鋳型とした場合と同様の傾向が観察された。【００８６】
これらの結果から、ビリルビンをはじめとする糞便由来の阻害物質を含むＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う場合に、ＲＮＡを回収する際に、カオトロピック塩及びアルコールを用いる等によって、ＲＮＡを予めカオオトロピック塩及びアルコールで処理することにより、阻害物質が逆転写反応の反応液中に持ち込まれたことによる影響を低減させられることが明らかである。【００８７】
さらに、擬似糞便由来ＲＮＡを鋳型とした場合（図１）には、グアニジン・エタノール抽出ＲＮＡを鋳型とし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩを用いた場合（サンプル１３〜１６）にのみ、ＳＳＢの添加（サンプル１４）やＲＮａｓｅＡ阻害剤の添加（サンプル１５）、及び両者の併用（サンプル１３）により、いずれも添加しなかった場合（サンプル１６）よりも明らかにＣＯＸ２遺伝子の発現量が高かった。中でもいずれも添加しなかったサンプル１６に比べて、ＳＳＢを添加したサンプル１４のＣＯＸ２遺伝子の発現量はおよそ５倍、両者を併用したサンプル１３はおよそ６倍と非常に多かった。【００８８】
一方で、ビリルビン含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合（図４）には、グアニジン・エタノール抽出ＲＮＡを鋳型とし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩを用い、ＳＳＢを添加した場合（サンプル１３及び１４）には、ＳＳＢを添加しなかった場合（サンプル１５及び１６）よりもＣＯＸ２遺伝子の発現量が高かった。但し、サンプル１３と１４、又は１５と１６の比較から分かるように、擬似糞便由来ＲＮＡを鋳型とした場合とは異なり、ＲＮａｓｅＡ阻害剤の添加の有無による影響はほとんど観察されなかった。【００８９】
つまり、ＲＮａｓｅＡ阻害剤の添加による効果がビリルビン含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合には観察されず、また、ＳＳＢの添加による効果がビリルビン含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合よりも擬似糞便由来ＲＮＡを鋳型とした場合のほうが顕著に大きかった。このような相違は、ビリルビン含有ＭＫＮ４５細胞試料由来ＲＮＡを鋳型とした場合には、反応液に持ち込まれた阻害物質はビリルビン１種類のみであったのに対して、擬似糞便由来ＲＮＡを鋳型とした場合には、糞便由来の様々な阻害物質が反応液に持ち込まれていたため、と推察される。【００９０】
これらの結果から、逆転写反応の反応液にＳＳＢやＲＮａｓｅＡ阻害剤を添加することにより得られる反応効率の改善効果は、反応液中に糞便由来の阻害物質が持ち込まれた場合に顕著に奏されることが分かった。つまり、糞便から回収する際にカオトロピック塩及びアルコールを用いる等により、糞便由来の阻害物質の持ち込み量を低減させたＲＮＡを鋳型とし、耐熱性かつ低ＲＮａｓｅＨ活性である逆転写酵素を用い、逆転写反応の反応液にＳＳＢを添加することにより、糞便由来のＲＮＡから効率よくｃＤＮＡを合成し得ることが明らかである。また、ＳＳＢに加えてさらにＲＮａｓｅＡ阻害剤を添加することにより、ビリルビン以外にも様々な特性を持つ糞便特有の阻害物質による影響を、より効果的に回避し得るといえる。
【実施例２】
【００９１】
健常人由来の糞便中のＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する際の、反応に用いる逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性の影響を調べた。【００９２】
＜糞便由来ＲＮＡの抽出＞
まず、健常人由来の糞便から、実施例１と同様にグアニジン・エタノール抽出法によりＲＮＡを抽出した。具体的には、健常人から採取された糞便検体に、等量のチオシアン酸グアニジンバッファー（ＲＬＴバッファー、ＱＩＡＧＥＮ社製）を添加し、Ｖｏｒｔｅｘを行った後、等量の７０％エタノールを加えてＶｏｒｔｅｘを行い、懸濁液を得た。その後、当該懸濁液を３００μＬずつ４本の１．５ｍＬチューブに分注し、それぞれに２．５倍容量の９９．５％  エタノール溶液と６０μＬの３Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａを添加して混和した後、４℃、１４０００ｒｐｍ、１０分間の遠心処理を行い、ペレットを得た（エタノール沈殿）。得られた４本のチューブ内のペレットを１つに纏めた後、７５％エタノール溶液でリンスし、乾燥させた後、５０μＬの蒸留水に溶解させたものを、糞便から抽出されたＲＮＡサンプルとした。当該ＲＮＡサンプルの定量を行い、ＲＮＡ濃度を測定した。【００９３】
＜逆転写反応及びＣＯＸ２遺伝子の発現量の測定＞
得られたＲＮＡサンプルを鋳型とし、ＲＮａｓｅＨ活性の高いＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）（以下、ＡＭＶ）、ＲＮａｓｅＨ活性のほとんど無いＲｅｖｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ（Ｗａｋｏ社製）、及びＲＮａｓｅＨ活性の低いＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｍ−ＭＬＶ由来、Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製）の３つの耐熱性逆転写酵素をそれぞれ用いて逆転写反応を行った。各反応液は、ＲＮＡサンプルを１μｇのＲＮＡが添加されるように添加し、さらに、耐熱性のＳＳＢであるＴａｑ  ＳＳＢ（バイオアカデミア社製)を５００ｎｇ／μＬになるように、また、ＲＮａｓｅＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴａＫａＲａ社製）を０．５ｕｎｉｔｓ／μＬになるように添加した以外は、それぞれの逆転写酵素に添付されていた取扱説明書に従って調製した。調製された各反応液に対して、各逆転写酵素の取扱説明書に記載通りに反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
その後、実施例１と同様にして、得られたｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＯＸ２遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ）の検出を行った。【００９４】
また、得られたＲＮＡサンプルを鋳型とし、ＡＭＶ、ＲｅｖｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ、又はＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩをそれぞれ用いて、ＲＮａｓｅＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの非存在下で逆転写反応を行った。具体的には、各反応液は、ＲＮＡサンプルを１μｇのＲＮＡが添加されるように添加し、さらに、Ｔａｑ  ＳＳＢ（バイオアカデミア社製)を５００ｎｇ／μＬになるように添加した以外は、それぞれの逆転写酵素に添付されていた取扱説明書に従って調製した。調製された各反応液に対して、各逆転写酵素の取扱説明書に記載通りに反応を行い、実施例１と同様にして、得られたｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＯＸ２遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ）の検出を行った。【００９５】
蛍光強度の計測結果を分析して、各反応液中のＣＯＸ２遺伝子の発現量を調べた。この結果、反応液へのＲＮａｓｅＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの添加の有無に関わらず、ＲＮａｓｅＨ活性の高いＡＭＶを用いた場合が最も発現量が少なく、ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いた場合が最も発現量が多かった。ＲＮａｓｅＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ存在下でＡＭＶを用いた場合の発現量を１として、他の逆転写酵素を用いた場合の発現量の相対値を算出した。算出結果を図５に示す。同じＲＮＡサンプルを鋳型としたにも関わらず、ＲＮａｓｅＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを反応液に添加した場合には、ＡＭＶを用いた場合に比べて、ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いた場合は約４．８倍、ＲｅｖｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶを用いた場合は約３．５倍も発現量が高く検出できた。【００９６】
また、いずれの逆転写酵素を用いた場合にも、ＲＮａｓｅＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを反応液に添加した場合のほうが、添加しなかった場合よりも、ＣＯＸ２遺伝子の発現量が多かった。ＡＭＶを用いた場合には、ＲＮａｓｅＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを反応液に添加した場合の発現量を１とすると、ＲＮａｓｅＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加しなかった場合は約０．７であった。同じく、ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩやＲｅｖｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶを用いた場合には、ＲＮａｓｅＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加しなかった場合の発現量は、添加した場合の発現量の約９５％程度であった。【００９７】
なお、健常人由来の糞便から、実施例１と同様にグアニジン・エタノール・シリカ抽出法によりＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡサンプルを鋳型として、上記３種の逆転写酵素をそれぞれ用いて、上記と同様に、ＲＮａｓｅＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加した反応液中で逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＯＸ２遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ）の検出を行った。この結果、グアニジン・エタノール抽出法により抽出されたＲＮＡを用いた場合と同様に、ＡＭＶを用いた場合が最も発現量が少なく、ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いた場合が最も発現量が多かった。ＡＭＶを用いた場合の発現量を１として、他の逆転写酵素を用いた場合の発現量の相対値を算出したところ、ＲｅｖｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶを用いた場合の発現量は４．１であり、ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いた場合の発現量は４．６であった。【００９８】
これらの結果から、逆転写反応、及びその後のＰＣＲ等の核酸増幅反応により、糞便から抽出されたＲＮＡを検出する場合には、ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩＩやＲｅｖｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＶのような、耐熱性を示し、かつＲＮａｓｅＨ活性の低い逆転写酵素を用いることにより高感度に検出し得ること、及び、逆転写反応をＲＮａｓｅＡ阻害剤存在下で行うことにより、さらに検出感度を高められることが明らかである。【００９９】
［比較例１］
阻害物質が少ないと考えられる培養細胞から抽出されたＲＮＡを鋳型として、実施例２と同様にして３種類の逆転写酵素を用いてそれぞれｃＤＮＡ合成及びＣＯＸ２遺伝子の発現産物の発現量を測定し、反応に用いる逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性の影響を調べた。
具体的には、ＭＫＮ４５細胞が１×１０５個含むように調整した細胞ペレットから、実施例１と同様にグアニジン・エタノール抽出法によりＲＮＡを抽出し、これをＲＮＡサンプルとした。得られたＲＮＡサンプルを鋳型とし、実施例２と同様にして、ＡＭＶ、ＲｅｖｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ、又はＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いて逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＯＸ２遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ）の検出を行った。【０１００】
蛍光強度の計測結果を分析して、各反応液中のＣＯＸ２遺伝子の発現量を調べた。この結果、実施例２と同様に、ＡＭＶを用いた場合が最も発現量が少なく、ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用いた場合が最も発現量が多かったが、発現量にあまり差はなかった。
ＡＭＶを用いた場合の発現量を１として、他の逆転写酵素を用いた場合の発現量の相対値を算出したところ、ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩやＲｅｖｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶを用いた場合の発現量は約１．６〜１．７にすぎなかった。算出結果を図６に示す。これらの結果から、阻害物質の量が少ない培養細胞から抽出されたＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＮａｓｅＨ活性の低い逆転写酵素を用いたとしても、ＲＮａｓｅＨ活性の高い逆転写酵素を用いた場合に比べて反応効率はあまり改善されないことが明らかである。
【実施例３】
【０１０１】
健常人由来の糞便中のＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する際の、反応液に添加するＳＳＢの耐熱性の影響を調べた。
実施例２において糞便から抽出したＲＮＡサンプルを鋳型とし、同じく実施例２において用いた逆転写酵素ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用い、下記４種のＳＳＢを各濃度となるように反応液を調製した。
・Ｔ４  ｇｅｎｅ  ３２  ｐｒｏｔｅｉｎ（非耐熱性、バイオアカデミア社製）、５００ｎｇ／μＬ
・Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢ（非耐熱性、バイオアカデミア社製）、５００ｎｇ／μＬ
・ＥＴ  ＳＳＢ（耐熱性、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂ社製）、４ｎｇ／μＬ
・Ｔａｑ  ＳＳＢ（耐熱性、バイオアカデミア社製）、５００ｎｇ／μＬ【０１０２】
具体的には、各反応液は、ＲＮＡサンプルを１μｇのＲＮＡが添加されるように添加し、さらに、各種ＳＳＢを各濃度となるように添加した以外は、ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩに添付されていた取扱説明書に従って調製した。調製された各反応液に対して、ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩの取扱説明書に記載通りに反応を行い、実施例１と同様にして、得られたｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＯＸ２遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ）の検出を行った。【０１０３】
蛍光強度の計測結果を分析して、各反応液中のＣＯＸ２遺伝子の発現量を調べた。Ｔ４  ｇｅｎｅ  ３２  ｐｒｏｔｅｉｎを用いた場合の発現量を１として、他のＳＳＢを用いた場合の発現量の相対値を算出した。算出結果を図７に示す。この結果、同じＲＮＡサンプルを鋳型としたにも関わらず、ＥＴ  ＳＳＢ及びＴａｑ  ＳＳＢを用いた場合には、Ｔ４  ｇｅｎｅ  ３２  ｐｒｏｔｅｉｎ及びＥ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢを用いた場合に比べて、ＣＯＸ２遺伝子の発現量が多かった。これらの結果から、糞便から抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行う際には、反応液に耐熱性のＳＳＢを添加することにより、非耐熱性のＳＳＢを添加した場合よりも、反応効率を改善し得ることが明らかである。
【実施例４】
【０１０４】
健常人由来の糞便中のＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する際に、さらにＢＳＡを反応液に添加した場合の反応効率を調べた。
実施例２において糞便から抽出したＲＮＡサンプルを鋳型とし、同じく実施例２において用いた逆転写酵素ＳｕｐｅｒSｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを用い、４００ｎｇ／μＬとなるようにＢＳＡ（プロメガ社製）を添加し、さらに４０ｎｇ／μＬのＴ４  ｇｅｎｅ  ３２  ｐｒｏｔｅｉｎ（プロメガ社製）の添加の有無及びＲＮａｓｅＡ阻害剤（ＴａＫａＲａ社製）の添加の有無の条件を変えた４種類の反応液（サンプル１７〜２０）を調製し、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。各サンプル中のＴ４  ｇｅｎｅ  ３２  ｐｒｏｔｅｉｎ（表中、「ＳＳＢ」）、ＢＳＡ、及びＲＮａｓｅＡ阻害剤の添加の有無を、表２に示す。表２中、「＋」は当該物質を逆転写反応の反応液に添加したことを、「−」は添加しなかったことを、それぞれ意味する。なお、サンプル１７〜２０は、ＲＮＡの抽出条件及び逆転写反応の反応液の組成において、実施例１のサンプル１３〜１６にそれぞれＢＳＡを添加した条件に相当する。【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
サンプル１７〜２０の４種の反応液中で、実施例１と同様にして逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＯＸ２遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ）の検出を行った。蛍光強度の計測結果を分析して、各反応液中のＣＯＸ２遺伝子の発現量を調べた。この結果、実施例１のサンプル１３〜１６と同様に、反応液にＳＳＢとＲＮａｓｅＡ阻害剤の両方を添加した場合（サンプル１７）が最も発現量が多く、ＳＳＢとＲＮａｓｅＡ阻害剤のいずれも添加しなかった場合（サンプル２０）が最も発現量が少なかった。また、ＳＳＢとＲＮａｓｅＡ阻害剤のうち、反応液にＳＳＢのみを添加した場合（サンプル１８）のほうが、ＲＮａｓｅＡ阻害剤のみを添加した場合（サンプル１９）よりも発現量が多かった。【０１０７】
実施例１の擬似糞便由来ＲＮＡを鋳型とした場合（図１）のサンプル１２の発現量を１として、サンプル１７〜２０のサンプルの発現量の相対値を算出した。算出結果を図８に示す。また、参考値として、図１のサンプル１３〜１６の発現量相対値も同じグラフに示した。この結果、反応液にＳＳＢを添加したサンプル（サンプル１３、１４、１７、及び１８）では、ＢＳＡをさらに添加することにより、ＣＯＸ２遺伝子の発現量が若干低下する傾向が観察された。逆に、反応液にＳＳＢを添加していないサンプル（サンプル１５、１６、１９、及び２０）では、ＢＳＡの添加の有無によって発現量はほとんど変化がみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明の合成方法を用いることにより、糞便に含まれているＲＮＡからｃＤＮＡを効率よく合成することができるため、学術研究のみならず、糞便を検体とする臨床検査等の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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