(57)【要約】  本発明は、ノイラミニダーゼ活性を実質的に有しないβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、当該酵素タンパク質をコードする核酸、及び当該タンパク質をコードする遺伝子で形質転換した微生物を用いる当該酵素の製造方法に関する。本発明のタンパク質は、ビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物に由来するβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質について、特定のアミノ酸残基を変異させることにより、当該タンパク質が有するノイラミニダーゼ活性を実質的に不活化させた改変型酵素タンパク質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質であって、該タンパク質は以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸２−３８６において、配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸へと置換している、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２−３８６において、１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列、ここで、少なくとも配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸へと置換している、前記アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸２−３８６と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、ここで、少なくとも配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸へと置換している、前記アミノ酸配列；及び
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、によりコードされるアミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり、そして、ノイラミニダーゼ活性を実質的に有しない、前記タンパク質。
【請求項２】
アミノ酸配列が、請求項１の（ａ）−（ｄ）において特定されるアミノ酸配列のＮ末端側にさらに、メチオニン、配列番号４のアミノ酸１−２４若しくはシグナルペプチドを有するアミノ酸配列である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基、又はそれに対応するアミノ酸残基が、中性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基へと置換している、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基、又はそれに対応するアミノ酸残基が、中性アミノ酸残基へと置換している、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項５】
以下のａ）−ｌ）
ａ）配列番号２の１２３番目の又はそれに対応するチロシン残基は、改変されていない、あるいはトリプトファン又はフェニルアラニンに置換されている；
ｂ）配列番号２の１２４番目の又はそれに対応するアスパラギン酸残基は、改変されていない、あるいはグルタミン酸に置換されている；
ｃ）配列番号２の１２５番目の又はそれに対応するアスパラギン酸残基は、改変されていない、あるいはグルタミン酸に置換されている；
ｄ）配列番号２の１２６番目の又はそれに対応するグリシン残基は、改変されていない、あるいはアラニン又はバリンに置換されている；
ｅ）配列番号２の１２７番目の又はそれに対応するセリン酸残基は、改変されていない、あるいはスレオニンに置換されている；
ｆ）配列番号２の２９１番目の又はそれに対応するフェニルアラニン残基は、改変されていない、あるいはトリプトファン又はチロシンに置換されている；
ｇ）配列番号２の２９２番目の又はそれに対応するリジン残基は、改変されていない、あるいはアルギニンに置換されている；
ｈ）配列番号２の２９３番目の又はそれに対応するグリシン残基は、改変されていない、あるいはアラニン又はバリンに置換されている；
ｉ）配列番号２の２９４番目の又はそれに対応するヒスチジン残基は、改変されていない、あるいはリジン又はアルギニンに置換されている；
ｊ）配列番号２の２９５番目の又はそれに対応するプロリン残基は、改変されていない、あるいはバリン又はイソロイシンに置換されている；
ｋ）配列番号２の３３６番目の又はそれに対応するセリン残基は、改変されていない、あるいはスレオニンに置換されている；及び
ｌ）配列番号２の３３７番目の又はそれに対応するセリン残基は、改変されていない、あるいはスレオニンに置換されている；
からなる群より選択される１ないし全ての条件を満たす、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質をコードする単離された核酸であって、該タンパク質は実質的にノイラミニダーゼ活性を有しないβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質であり、そして該核酸は以下：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８において、配列番号１の９５５−９５７番目のコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、塩基配列；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８において、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、前記塩基配列；
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８と８０％以上の同一性を有する塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、前記塩基配列；及び
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、前記塩基配列；
からなる群より選択される塩基配列を含んでなる、前記単離された核酸。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項９】
β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質の製造方法であって、該タンパク質は実質的にノイラミニダーゼ活性を有しないβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質であり、そして、以下の工程：
１）請求項６又は７に記載の核酸を含んでなる発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
２）得られた形質転換細胞を培養し；そして、
３）培養した形質転換細胞又はその培養上清から、実質的にノイラミニダーゼ活性を有しない、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を単離する；
を含んでなる、前記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノイラミニダーゼ活性を実質的に有しないβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、当該酵素タンパク質をコードする核酸、及び当該タンパク質をコードする遺伝子で形質転換した微生物を用いる当該酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖とは種々の糖、例えばガラクトースやＮ−アセチルグルコサミン等の単糖で構成される化合物である。糖タンパク質や糖脂質等の糖鎖（以下、複合糖質糖鎖）は、生体内において非常に重要な機能を有している。これまでの研究により、糖鎖の中でもとりわけ、シアル酸という単糖を含む糖鎖が、重要な機能を発現すると考えられている。例えば、主に哺乳類細胞において、シアル酸を含む糖鎖は分化や発生における細胞間及び細胞−細胞外マトリックス間のシグナル伝達や複合糖質のタグとして機能する重要な分子であることや、シアル酸を含有する複合糖質が、脳や神経細胞におけるシナプス形成、神経発達ひいては学習能力の向上に深く関与することが示されている。シアル酸は、ノイラミン酸のアシル誘導体の総称で、その構造中にカルボキシル基を有する酸性単糖の一種である。これまでに５０種類以上の分子種が確認されており、それらは主に哺乳動物、棘皮動物や細菌などから見出されている。これまでに知られている代表的なシアル酸として、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、デアミノノイラミン酸（ＫＤＮ）が挙げられる。これらシアル酸の中で、通常ヒトの生体内に認められるシアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸のみである。特殊な例として、一部のがん化した細胞においてＮ−グリコリルノイラミン酸が存在することが知られている。【０００３】
生体内に存在する糖蛋白質や糖脂質などの複合糖質糖鎖中に見出されるシアル酸は、シアル酸転移酵素と呼ばれる一群の糖転移酵素によって、糖受容体基質となるそれぞれの糖鎖に転移される。より具体的には、シアル酸転移酵素は、その共通の糖供与体基質であるＣＭＰ−シアル酸からシアル酸を各種糖受容体基質に転移する。【０００４】
一方、生体内には、複合糖質糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸残基を遊離させる反応を触媒する酵素であるノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）が存在する。これまでに動物、微生物、ウイルス等から、多くのノイラミニダーゼタンパク質が見つかっており、また、ノイラミニダーゼタンパク質をコードする遺伝子がクローニングされている。主なシアル酸の結合様式としては、α２，３結合、α２，６結合、α２，８結合の３種類が知られているが、これまでに報告されているノイラミニダーゼは、結合様式がα２，３結合若しくはα２，６結合であるシアル酸を半選択的に切断する少数のノイラミニダーゼを除き、シアル酸の結合様式に関係なく、シアル酸を含む複合糖質糖鎖よりシアル酸を切断する場合がほとんどである。【０００５】
上述のごとく、生体内に存在するシアル酸を含む複合糖質糖鎖は、生体内において非常に重要な機能を有している。そこで、シアル酸を含む糖蛋白質や糖脂質などの詳細な機能検討、またそれらの機能を応用した生理活性物質の調製等のため、上述のシアル酸転移酵素は需要の高い酵素の一つである。【０００６】
これまでに報告されているシアル酸転移酵素はいくつかのグループに分類されているが、動物、特に哺乳類由来のものが多く報告されている（Hamamoto, T., et al., Bioorg. Med. Chem., 1, 141-145 (1993); Weinstein, J., et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743 (1987)）。しかし、これらの動物由来の酵素は極めて糖受容体基質特異性が高く、生体内においてシアル酸を転移できる糖鎖構造は限られている。すなわち、シアル酸転移酵素の反応の結果、生じる糖蛋白質、糖脂質はきわめて限定される。一方、細菌由来のシアル酸転移酵素及びその遺伝子としては、フォトバクテリウム・ダムセラ（Photobacterium damselae）に属する微生物から分離されたものが報告されている（国際公開第ＷＯ９８／３８３１５号；米国特許６２５５０９４号公報、Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104-110 (1996)、Tsukamoto, H., et al., J. Biol. Chem., 282 29794−29802(2007)；Takakura, Y., et al., J. Biochem. (Tokyo) 142 403−412(2007)）。これら微生物由来のシアル酸転移酵素は、上述の動物由来の酵素と比較して、極めて糖受容体基質特異性が広く、動物由来のシアル酸転移酵素ではシアル酸を転移できない糖鎖にもシアル酸を転移できることが示されている。そのため、需要の高いシアル酸転移酵素の中でも、微生物由来のシアル酸転移酵素、それらの中でも海洋性細菌由来のシアル酸転移酵素はとりわけ需要の高い酵素となっている。【０００７】
しかし、これまでに知られている多くの海洋性細菌由来のシアル酸転移酵素は、シアル酸転移酵素活性とノイラミニダーゼ活性を併せ持つ酵素タンパク質であることが示されている（Tsukamoto, H., et al., J. Biol. Chem., 282 29794−29802(2007)；Takakura, Y., et al., J. Biochem. (Tokyo) 142 403−412(2007)）。本発明者らは、ビブリオ科フォトバクテリウム属（Photobacterium）、又はビブリオ科ビブリオ属（Vibrio）に属する微生物の菌株から、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を生産する菌株（フォトバクテリウム・エスピー（Photobacterium sp.）ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株、フォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株など）を見出した（国際公開第ＷＯ２００６／１１２２５３号）。そして、これらの酵素はいずれもシアル酸転移酵素活性及びノイラミニダーゼ活性を併せ持つ酵素であることを示した（Tsukamoto, H., et al., J. Biol. Chem., 282 29794−29802(2007)）。このようにシアル酸転移酵素活性とノイラミニダーゼ活性の両方を有する酵素を利用する場合、長時間の酵素反応を行って、反応系内における反応生成物であるシアル酸含有化合物濃度が上昇すると、これらがノイラミニダーゼの基質となり反応生成物からシアル酸が加水分解されてしまうおそれがあった。そのため、海洋性細菌由来酵素の利点を維持したまま、ノイラミニダーゼ活性を減少させたシアル酸転移酵素及びその遺伝子が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９８／３８３１５号パンフレット
【特許文献２】米国特許６２５５０９４号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００６／１１２２５３号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hamamoto, T. , et al., Bioorg. Med. Chem., 1, 141-145 (1993)
【非特許文献２】Weinstein, J. , et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743 (1987)
【非特許文献３】Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104-110 (1996)
【非特許文献４】Tsukamoto, H., et al., J. Biol. Chem., 282 29794-29802(2007)
【非特許文献５】Takakura, Y., et al., J. Biochem. (Tokyo) 142 403-412(2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物に由来する、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有する酵素タンパク質が有するノイラミニダーゼ活性を不活化、あるいは大幅に減少させることである。また、本発明は、実質的にノイラミニダーゼ活性を有しない、ビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物に由来するβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有する酵素タンパク質、及びそれをコードする核酸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ビブリオ科フォトバクテリウム属（Photobacterium）に属する微生物フォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）からβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を生産する菌株（ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株）を見出しており、当該酵素の諸性質を明らかにしてきた（ＷＯ２００６／１１２２５３）。そして、当該酵素はシアル酸転移酵素活性及びノイラミニダーゼ活性を併せ持つ酵素であることを示した（非特許文献４）。【００１２】
その後、本発明者らは、鋭意研究を進め、フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（配列番号４）の３４２番目のグルタミン酸（これは配列番号２においては３１９番目のグルタミン酸に該当する）を変異させた改変型酵素タンパク質が、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を示し、かつ、ノイラミニダーゼ活性を示さないことを見出し、本発明を完成させた。本発明は、実質的にノイラミニダーゼ活性を有しない、新規なβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質、及びそれをコードする核酸、ならびに、当該タンパク質を製造する方法を提供する。【００１３】
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１４】
態様１：β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質であって、該タンパク質は以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸２−３８６において、配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸へと置換している、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２−３８６において、１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列、ここで、少なくとも配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸へと置換している、前記アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸２−３８６と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、ここで、少なくとも配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸へと置換している、前記アミノ酸配列；及び
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、によりコードされるアミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなり、そして、ノイラミニダーゼ活性を実質的に有しない、前記タンパク質。【００１５】
態様２：アミノ酸配列が、請求項１の（ａ）−（ｄ）において特定されるアミノ酸配列のＮ末端側にさらに、メチオニン、配列番号４のアミノ酸１−２４若しくはシグナルペプチドを有するアミノ酸配列である、態様１に記載のタンパク質。【００１６】
態様３：配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基、又はそれに対応するアミノ酸残基が、中性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基へと置換している、態様１又は２に記載のタンパク質。【００１７】
態様４：配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基、又はそれに対応するアミノ酸残基が、中性アミノ酸残基へと置換している、態様１又は２に記載のタンパク質。【００１８】
態様５：以下のａ）−ｌ）
ａ）配列番号２の１２３番目の又はそれに対応するチロシン残基は、改変されていない、あるいはトリプトファン又はフェニルアラニンに置換されている；
ｂ）配列番号２の１２４番目の又はそれに対応するアスパラギン酸残基は、改変されていない、あるいはグルタミン酸に置換されている；
ｃ）配列番号２の１２５番目の又はそれに対応するアスパラギン酸残基は、改変されていない、あるいはグルタミン酸に置換されている；
ｄ）配列番号２の１２６番目の又はそれに対応するグリシン残基は、改変されていない、あるいはアラニン又はバリンに置換されている；
ｅ）配列番号２の１２７番目の又はそれに対応するセリン酸残基は、改変されていない、あるいはスレオニンに置換されている；
ｆ）配列番号２の２９１番目の又はそれに対応するフェニルアラニン残基は、改変されていない、あるいはトリプトファン又はチロシンに置換されている；
ｇ）配列番号２の２９２番目の又はそれに対応するリジン残基は、改変されていない、あるいはアルギニンに置換されている；
ｈ）配列番号２の２９３番目の又はそれに対応するグリシン残基は、改変されていない、あるいはアラニン又はバリンに置換されている；
ｉ）配列番号２の２９４番目の又はそれに対応するヒスチジン残基は、改変されていない、あるいはリジン又はアルギニンに置換されている；
ｊ）配列番号２の２９５番目の又はそれに対応するプロリン残基は、改変されていない、あるいはバリン又はイソロイシンに置換されている；
ｋ）配列番号２の３３６番目の又はそれに対応するセリン残基は、改変されていない、あるいはスレオニンに置換されている；及び
ｌ）配列番号２の３３７番目の又はそれに対応するセリン残基は、改変されていない、あるいはスレオニンに置換されている；
からなる群より選択される１ないし全ての条件を満たす、態様１ないし４のいずれか１項に記載のタンパク質。【００１９】
態様６：態様１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。【００２０】
態様７：β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質をコードする単離された核酸であって、該タンパク質は実質的にノイラミニダーゼ活性を有しないβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質であり、そして該核酸は以下：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８において、配列番号１の９５５−９５７番目のコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、塩基配列；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８において、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、前記塩基配列；
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８と８０％以上の同一性を有する塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、前記塩基配列；及び
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、前記塩基配列；
からなる群より選択される塩基配列を含んでなる、前記単離された核酸。【００２１】
態様８：態様６又は７に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。【００２２】
態様９：β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質の製造方法であって、該タンパク質は実質的にノイラミニダーゼ活性を有しないβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質であり、そして、以下の工程：
１）態様６又は７に記載の核酸を含んでなる発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
２）得られた形質転換細胞を培養し；そして、
３）培養した形質転換細胞又はその培養上清から、実質的にノイラミニダーゼ活性を有しない、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を単離する；
を含んでなる、前記製造方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、海洋性微生物由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の利点を維持しつつ、実質的にノイラミニダーゼ活性を有しない新規なβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質及びそれをコードする核酸を提供することにより、これまでよりも容易に扱うことができ、また効率的に糖鎖にシアル酸を転移することができる。シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多く、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖である。このため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高い酵素の一つであり、本発明の新規なシアル酸転移酵素の提供は、そのような高い需要に応えるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】図１−１は、３’−シアリルラクト−ス（３’−ＳＬ）、及びシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）のＨＰＬＣ分析結果である。
【図１−２】図１−２は、シグナルペプチド領域をコードするリーダー配列を欠失したＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子（配列番号１）を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、得られた菌体から調製した粗酵素液を、３’−シアリルラクトースに反応させた反応溶液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。反応開始後０時間及び７２時間で分析した。保持時間が２２分のピークは３’−シアリルラクトース、１２分のピークはシアル酸である。
【図１−３】図１−３は、配列番号２に記載した３１９番目のグルタミン酸をアラニンに変異させた改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質（Ｅ３１９Ａ変異体）をコードするβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、得られた菌体から調製した粗酵素液を、３’−シアリルラクトースに反応させた反応溶液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。反応開始後０時間及び７２時間で分析した。保持時間が２２分のピークは３’−シアリルラクトース、１２分のピークはシアル酸である。
【図１−４】図１−４は、配列番号２に記載した３１８番目のフェニルアラニンをアラニンに、３１９番目のグルタミン酸をアラニンに変異させた改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質（Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａ変異体）をコードするβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、得られた菌体から調製した粗酵素液を、３’−シアリルラクト−スに反応させた反応溶液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。反応開始後０時間及び７２時間で分析した。保持時間が２２分のピークは３’−シアリルラクトース、１２分のピークはシアル酸である。
【図２−１】図２−１は、シグナルペプチド領域を欠失したＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（野生型）；配列番号２の３１９番目のグルタミン酸をアラニンに変異させた改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（Ｅ３１９Ａ変異体）；及び、配列番号２の３１８番目のフェニルアラニンをアラニンに、３１９番目のグルタミン酸をアラニンに変異させた改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａ変異体）；のそれぞれの酵素について、シアル酸転移酵素活性の３０℃における至適ｐＨを分析した結果を示す図である。
【図２−２】図２−２は、シグナルペプチド領域を欠失したＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（野生型）；配列番号２の３１９番目のグルタミン酸をアラニンに変異させた改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（Ｅ３１９Ａ変異体）；及び、配列番号２の３１８番目のフェニルアラニンをアラニンに、３１９番目のグルタミン酸をアラニンに変異させた変異体β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａ変異体）；のそれぞれの酵素について、シアル酸転移酵素活性のｐＨ６．０における至適温度を分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００２６】
定義
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
【００２７】
本明細書においてタンパク質、核酸又は抗体等の分子について「単離された」とは、当該分子の天然状態で付随する成分を実質的に含まない状態であることを意味する。そのような状態としては、例えば、当該分子を天然に産生する種由来の他の分子を実質的に含まない状態、当該分子を天然に産生する種とは異なる種の細胞若しくは確立された培養細胞系によって発現される状態、又は化学的に合成される状態、などが挙げられる。また、分子が「単離された」状態にある場合には、当該分子は当該技術分野において周知の技術により、天然状態で付随する成分を実質的に含まないように精製されていてもよい。本明細書において、ある成分を「実質的に含まない」とは、天然状態と比較して当該成分の含有量が減少している状態を意味する。ある成分を「実質的に含まない」状態には、例えば、当該成分を完全に含まない場合、検出限界以下の量で含む場合、又は、含有量が天然状態の５０％以下、２５％以下、１０％以下、７％以下、５％以下、３％以下、１％以下、０．５％以下、若しくは０．１％以下に低減されている場合が含まれる。
【００２８】
本明細書において「タンパク質」とは、ペプチド結合によって互いに連結している２以上のアミノ酸残基を含んでなる分子を意味する。また、本明細書において「タンパク質」の語は、「ポリペプチド」とも記載され得る。
【００２９】
本明細書において「核酸」とは、２以上のヌクレオチドで構成されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。また、本明細書において「核酸」の語は、「ポリヌクレオチド」とも記載され得る。ＤＮＡの塩基配列で記載された核酸についてＲＮＡが意図される場合には、ＤＮＡの塩基配列のチミンをウラシルに置き換えて理解すべきであることは当業者に理解されよう。
【００３０】
本明細書において「シアル酸」とは、シアル酸ファミリーに属するノイラミン酸誘導体を示す。具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、５−デアミノ−５−ヒドロキシノイラミン酸（ＫＤＮ）、ジシアル酸（ジＮ−アセチルノイラミン酸：Ｎｅｕ５Ａｃα２，８（９）Ｎｅｕ５Ａｃ）などを示す。
【００３１】
本明細書において「β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素」とは、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）−シアル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖若しくは遊離の糖鎖中のガラクトース残基の３位、ラクトース若しくはＮ−アセチルラクトサミンなどのオリゴ糖に存在するガラクトースの３位、又はガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン若しくはマンノースなどの複合糖質を構成しうる単糖であって３位の炭素に水酸基を有する単糖の３位、に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。本明細書において「β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性」とは、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素について上述した活性を意味する。また、「β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性」は、本明細書において、単に「シアル酸転移酵素活性」と表記される場合がある。
【００３２】
本明細書において「ノイラミニダーゼ」とは、複合糖質糖鎖又は遊離の糖鎖中の非還元末端に存在するシアル酸を当該糖鎖から切断する活性を有するタンパク質を意味する。また、ノイラミニダーゼは、当該技術分野においてシアリダーゼとも称される。また、本明細書において「ノイラミニダーゼ活性」とは、タンパク質についての活性であって、複合糖質糖鎖又は遊離の糖鎖中の非還元末端に存在するシアル酸を当該糖鎖から切断する反応を触媒する活性を意味する。本明細書において「ノイラミニダーゼ活性を実質的に有しない」とは、野生型タンパク質と比較してノイラミニダーゼ活性が低減されている状態を意味する。例えば、ノイラミニダーゼ活性を完全に有しない場合、検出限界以下の活性である場合、又は、ノイラミニダーゼ活性が野生型タンパク質の１０％以下、７％以下、５％以下、３％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下、０．０５％以下、０．０１％以下に低減されている場合が含まれる。
【００３３】
本明細書において「ベクター」とは、それに連結させた核酸を宿主細胞内に導入するために用いることが可能な核酸である。また、「発現ベクター」は、ベクターにより導入された核酸がコードするタンパク質の発現を導くことが可能なベクターである。ベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が含まれる。
【００３４】
本明細書において、「宿主細胞」とは、ベクターにより遺伝子導入又は形質転換を受ける細胞を意味する。宿主細胞は、使用するベクターに応じて当業者が適切に選択することが可能である。宿主細胞は、例えば、大腸菌（E.coli）などの原核生物由来であることが可能であり、あるいは、酵母などの単細胞真核生物、植物細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞又は昆虫細胞）などの、真核生物由来の細胞であることが可能である。
【００３５】
ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来Ｎ２Ｃ０タンパク質
本発明は、ノイラミニダーゼ活性を実質的に有しない、新規なβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性タンパク質を提供する。
【００３６】
本発明者らは、海洋性細菌フォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株からβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質Ｎ０Ｃ０（配列番号４）を見出し、さらにＮ０Ｃ０からシグナルペプチド領域を除去した上で、Ｎ末端にメチオニンを付加してβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質Ｎ２Ｃ０（配列番号２）を得た（ＷＯ２００６／１１２２５３）。このＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来Ｎ２Ｃ０は、他の多くの海洋性細菌由来のシアル酸転移酵素と同様、シアル酸転移酵素活性とノイラミニダーゼ活性の両方を有する酵素タンパク質であった。
【００３７】
本明細書において「Ｎ２Ｃ０」と記載した場合には、特に言及しない限りＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素について、シグナルペプチド領域を欠失したＮ２Ｃ０（配列番号２：以下、本明細書において野生型Ｎ２Ｃ０とも記載する）及びその変異体を意味する。また、配列番号２におけるＮ末端のメチオニンを除去し、適切なシグナルペプチドを付加したものもこれに含まれる。Ｎ２Ｃ０タンパク質の変異体又は変異型とは、配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ酸残基に変異が導入されたタンパク質をいう。Ｎ２Ｃ０タンパク質の変異体の中でも、特に、ノイラミニダーゼ活性を実質的に有しないようにアミノ酸残基を改変させたタンパク質をＮ２Ｃ０タンパク質の改変体又は改変型という。したがって、文意により、「Ｎ２Ｃ０」と記載した場合には、本発明の改変型Ｎ２Ｃ０も含めて、Ｎ２Ｃ０の野生型、変異型、本発明の改変型の総称として使用する場合もある。また、Ｎ２Ｃ０はシアル酸転移酵素活性を示すことから、本明細書においてＮ２Ｃ０を単に「シアル酸転移酵素」と呼称することがある。本発明は、Ｎ２Ｃ０タンパク質の特定のアミノ酸残基を改変させることにより、ノイラミニダーゼ活性を実質的に有しない、改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性タンパク質を提供するものである。
【００３８】
Ｎ２Ｃ０（野生型）は典型的には、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。あるいは、Ｎ２Ｃ０は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、の変異体であって、Ｎ２Ｃ０と同様のシアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってよい。
【００３９】
Ｎ２Ｃ０の変異体は、配列番号２のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。例えば、配列番号２の３１８番目のフェニルアラニン（Ｆ）をアラニン（Ａ）に置換したタンパク質は、その１例である。
【００４０】
アミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487-6500, 1982参照、引用によりその全体を本明細書に援用する)を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１又は複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入及び／又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。また、本明細書において「１又は複数のアミノ酸」とは、場合により、１又は数個のアミノ酸を意味し、限定するものではないが、好ましくは１ないしは１０個、好ましくは９個以下、７個以下、５個以下、３個以下、又は２個以下、より好ましくは１個以下である。
【００４１】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。
【００４２】
なお、生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入又は付加し、次いで連結する方法もある。限定されるものではないが、本発明におけるＮ２Ｃ０は、配列番号２において１ないしは１０個、好ましくは９個以下、７個以下、５個以下、３個以下、２個以下、より好ましくは１個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質である。
【００４３】
Ｎ２Ｃ０の変異体はさらに、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上、より好ましくは９９．３％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってよい。ここで、Ｎ２Ｃ０の変異体は野生型Ｎ２Ｃ０と同様のシアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
【００４４】
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査及び数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Needleman, S. B. 及びWunsch, C. D.  （J. Mol. Biol., 48: 443−453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Henikoff, S.  及びHenikoff, J. G.  （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００４５】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）、あるいはDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。又は、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、又は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
【００４６】
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、又はより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（unary）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列及び構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、Gribskov及びBurgess，  Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、又はＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（Wootton及びFederhenのＳＥＧプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996 「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（Claverie及びStates（Computers and Chemistry, 1993）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ−スコア（Karlin及びAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、又は好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１���−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、又は１ｅ−１００である。
【００４７】
Ｎ２Ｃ０の変異体はまた、配列番号１の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であってよい。ここで、Ｎ２Ｃ０の変異体は野生型Ｎ２Ｃ０と同様のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
【００４８】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第３版，第６章，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、例えば５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣないし６×ＳＳＣ、好ましくは５×ＳＳＣないし６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び例えば、約５０℃ないし６８℃、０．１×ＳＳＣないし６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。
【００４９】
一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、０．５％程度のＳＤＳを含み、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ、あるいは０．１×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６５℃、ないし６８℃、０．２×ＳＳＣないし０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーション及び洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、及び１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間ないし１時間程度行う。
【００５０】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ECL direct labeling ＆ detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のhybridization bufferにBlocking試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％  ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣ中で、５５℃で２０分を２回、２×ＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
【００５１】
Ｎ２Ｃ０の変異体のシアル酸転移酵素活性は、公知の手法、例えば、J. Biochem., 120, 104-110 (1996)（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定してもよい。例えば、糖供与体基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を、そして糖受容体基質としてラクトースを用いて酵素反応を行い、反応生成物であるシアリルラクトースの量を評価することで酵素活性を評価することができる。なお、シアル酸転移酵素についての酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量である。
【００５２】
糖受容体基質に転移したシアル酸の結合様式の決定方法としては、限定するわけではないが、ピリジルアミノ化糖鎖を用いる手法、反応生成物の核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）による分析など、当業者に公知の手法のいずれかを用いて行うことができる。ピリジルアミノ化糖鎖を用いる手法は、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行うことを含む。具体的には、ピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製）を糖受容体基質、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを糖供与体基質として用いて酵素反応を行い、反応生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、反応生成物の保持時間からシアル酸が転移された位置を特定する。
のいずれかにより測定することが可能である。
【００５３】
本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質において、改変しないことが望ましいアミノ酸残基については後述する。
【００５４】
改変型シアル酸転移酵素タンパク質
本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質は、野生型Ｎ２Ｃ０タンパク質又は変異型Ｎ２Ｃ０タンパク質のアミノ酸配列に対して、特定のアミノ酸残基の置換により、ノイラミニダーゼ活性を実質的に有しないように改変させたタンパク質である。
【００５５】
すなわち、本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質は、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸２−３８６において、配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸へと置換している、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２−３８６において、１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列、ここで、少なくとも配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸へと置換している、前記アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸２−３８６と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、ここで、少なくとも配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸へと置換している、前記アミノ酸配列；及び
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、によりコードされるアミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってよい。ここで、本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質は、実質的にノイラミニダーゼ活性を有しないβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質であってよい。
【００５６】
また、上記（ａ）〜（ｄ）で特定されるアミノ酸配列のＮ末端側にはさらに、メチオニン残基、または、配列番号４のアミノ酸１−２４もしくは酵母α因子シグナルリーダー等のシグナルペプチドが付加されていてもよい。
【００５７】
「グルタミン酸以外のアミノ酸」とは、天然型または非天然型のアミノ酸であって、グルタミン酸以外のアミノ酸を意味する。好ましくは、グルタミン酸以外のアミノ酸、とはグルタミン酸以外の天然型のＬ−アミノ酸をいう。
【００５８】
好ましい態様において、本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質は、配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基が中性アミノ酸残基又は塩基性アミノ酸残基へと置換されている。より好ましい態様において、本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質は、配列番号２の３１９番目のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基が中性アミノ酸残基へと置換されている。
【００５９】
中性アミノ酸残基とは、アスパラギン、セリン、グルタミン、トレオニン、グリシン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンである。そして、塩基性アミノ酸残基とは、リジン、アルギニン、ヒスチジンである。改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質について、配列番号２の３１９番目のアミノ酸残基を置換するのに、より好ましい中性アミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニンである。さらに好ましくは、グリシン、アラニン、バリン、セリン、システインである。さらにより好ましくは、アラニン、バリン、セリンである。
【００６０】
このような改変型Ｎ２Ｃ０は、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するが、ノイラミニダーゼ活性を実質的に有しない。
【００６１】
ノイラミニダーゼ活性は、公知の手法で測定することができる。例えば、シアル酸含有糖鎖に対しノイラミニダーゼを作用させてシアル酸加水分解反応を行い、反応生成物である、シアル酸が脱離した糖鎖の量又は遊離のシアル酸の量を評価することで酵素活性を評価することができる。なお、ノイラミニダーゼについての酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を遊離させる酵素量である。
【００６２】
アミノ酸の改変方法
Ｎ２Ｃ０のアミノ酸を改変して、本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質を得るための方法は、公知のアミノ酸配列に変異を施す方法を使用でき、特に限定されない。好ましくは本発明の改変タンパク質をコードする核酸の塩基配列に修飾を施し改変する。
【００６３】
例えば、アミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸を改変するには、例えばＰＣＲを利用した方法が挙げられる（Higuchi et al (1988) Nucleic Acid Res 16:7351-7367, Ho et al.(1989) Gene 77:51-59）。すなわち、標的変異のミスマッチコドンを含むプライマーを利用してＰＣＲを行ない、目的の改変体をコードするＤＮＡを作成しこれを発現させることにより、目的の改変体を得ることができる。
【００６４】
また、アミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加による改変体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、前述の周知技術である部位特異的変異誘発を施すなどの方法により作成することができる。
【００６５】
改変型Ｎ２Ｃ０において改変されないことが望ましいアミノ酸残基
本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質におけるアミノ酸残基の改変は、改変型Ｎ２Ｃ０がβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を維持するような改変である。
【００６６】
ところで、野生型Ｎ２Ｃ０については、他の海洋性微生物由来のシアル酸転移酵素の配列との比較研究から、非常によく保存されており、シアル酸転移酵素活性に重要と考えられるモチーフ配列（ＹＤＤＧＳモチーフ、ＦＫＧＨＰモチーフ、ＳＳモチーフ）が、発明者らによって特定されている（Yamamoto et al.(2008)BBRC 365: 340-343）。よって、配列番号２において、Ｙ１２３、Ｄ１２４、Ｄ１２５、Ｇ１２６、Ｓ１２７（ＹＤＤＧＳモチーフ）、Ｆ２９１、Ｋ２９２、Ｇ２９３、Ｈ２９４、Ｐ２９５（ＦＫＧＨＰモチーフ）、Ｓ３３６、Ｓ３３７（ＳＳモチーフ）については、改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはシアル酸転移酵素活性を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが望ましく、例えばチロシン（Ｙ）の場合はトリプトファン（Ｗ）又はフェニルアラニン（Ｆ）へ、より好ましくはフェニルアラニン（Ｆ）へ、アスパラギン酸（Ｄ）の場合はグルタミン酸（Ｅ）へ、グリシン（Ｇ）の場合はアラニン（Ａ）又はバリン（Ｖ）へ、より好ましくはアラニン（Ａ）へ、セリン（Ｓ）の場合はスレオニン（Ｔ）へ、フェニルアラニン（Ｆ）の場合はトリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）へ、より好ましくはチロシン（Ｙ）へ、リジン（Ｋ）の場合はアルギニン（Ｒ）へ、ヒスチジン（Ｈ）の場合はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）へ、より好ましくはアルギニン（Ｒ）へ、プロリン（Ｐ）の場合はバリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）へ、より好ましくはバリン（Ｖ）へ、それぞれ改変することが望ましい。
【００６７】
改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質をコードする核酸
本発明は、本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質をコードする核酸を提供する。このような核酸の塩基配列は、Ｎ２Ｃ０の塩基配列（配列番号１）を、改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質の改変アミノ酸をコードする塩基配列に改変したものである。
【００６８】
すなわち、本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質をコードする核酸は、以下：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８において、配列番号１の９５５−９５７番目のコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、塩基配列；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８において、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、前記塩基配列；
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８と８０％以上の同一性を有する塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、前記塩基配列；及び
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド４−１１５８の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、ここで、少なくとも配列番号１の９５５−９５７番目の塩基配列に対応するコドンがグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに変化している、前記塩基配列；
からなる群より選択される塩基配列を含んでなる核酸であってよい。ここで、本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質をコードする核酸は、実質的にノイラミニダーゼ活性を有しないβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素タンパク質をコードする単離された核酸であってよい。
【００６９】
本発明の核酸は、Ｎ末端側にメチオニンをコードするコドン、配列番号３のヌクレオチド１−７２に相当するリーダー配列、又は酵母α因子リーダーなどの他の生物源由来のリーダー配列を含んでいてもよい。
【００７０】
上記の（ａ）〜（ｄ）において、「グルタミン酸以外のアミノ酸」とは、“改変型シアル酸転移酵素タンパク質”の項目において記載したように、グルタミン酸以外の天然型のＬ−アミノ酸、好ましくは中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸、より好ましくは中性アミノ酸である。
【００７１】
本発明のタンパク質を製造する方法
本発明は、本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質を製造する方法にも関する。好ましい態様において本発明の方法は、本発明のタンパク質を生産する方法である。
【００７２】
（1）組換えタンパク質を製造する方法
本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクター、及び当該発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。そして、本発明は、当該発現ベクターを含有する宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に適する条件下で培養して、発現された組換えタンパク質を回収することにより組換え改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質を製造する方法も提供する。
【００７３】
本発明の組換えタンパク質を製造するためには、使用する宿主に応じて選ばれた発現ベクターに、哺乳動物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子等から誘導された適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能に連結した、改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質をコードする核酸配列を挿入する。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに、転写及び翻訳の開始及び終結を制御する適切な配列が挙げられる。
【００７４】
本発明のベクターに挿入される、改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質をコードする核酸配列は、上述した本発明の核酸の塩基配列である。この配列は、リーダー配列を含んでいても、含んでいなくてもよい。リーダー配列を含む場合、配列番号３のヌクレオチド１−７２に相当するリーダー配列であってもよく、また他の生物源由来のリーダー配列に置き換えてもよい。リーダー配列を置き換えることによって、発現したタンパク質を宿主細胞の外に分泌させるように発現システムを設計することも可能である。
【００７５】
また、本発明の組換え改変型Ｎ２Ｃ０組換えタンパク質は、当該タンパク質をコードする核酸に続いて、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧＴＭタグ（アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号５）を含むタグ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードする核酸などを連結した核酸をベクターに挿入することにより、融合タンパク質として発現することも可能である。本発明の酵素をこのような融合タンパク質として発現させることにより、当該酵素の精製及び検出を容易にすることができる。
【００７６】
本発明のタンパク質の発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニング及び発現ベクターは、例えば、Pouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。
【００７７】
原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、大腸菌又は枯草菌が含まれる。大腸菌のような原核細胞を宿主として使用する場合、本発明のタンパク質は、原核細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含むようにしてもよい。このＮ末端メチオニンは、発現後に組換えタンパク質から切り離すこともできる。
【００７８】
原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に１又は２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、又は独立栄養要求性を付与する遺伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例には、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のような市販のプラスミド又はそれらから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するのが容易である。適切なプロモーターならびに改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質をコードする核酸のＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３２２ベクター内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, スウェーデン、ウプサラ）及びｐＧＥＭ１（Promega Biotech.、米国、ウイスコンシン州、マディソン）などが含まれる。
【００７９】
原核宿主細胞用の発現ベクターにおいて通常用いられるプロモーター配列には、ｔａｃプロモーター、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター、ラクトースプロモーター（Changら、Nature 275:615, 1978;及びGoeddelら、Nature 281:544, 1979、引用によりその全体を本明細書に援用する。）などが含まれる。
【００８０】
また、本発明の組換えタンパク質を酵母宿主内で発現させてもよい。好ましくは、サッカロミセス属（Saccharomyces、例えば、S. cerevisiae ）を用いるが、ピキア属（Pichia）又はクルイベロミセス属（Kluyveromyces）のような他の酵母の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自立複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多い。酵母α因子リーダー配列を用いて、改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質の分泌を行わせることもできる。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列も知られている。酵母を形質転換する方法は、例えば、Hinnenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929-1933, 1978（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。
【００８１】
哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて、本発明の組換えタンパク質を発現することもできる。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから得ることができる。通常用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウイルス２などから誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、及びポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。哺乳動物宿主細胞内で用いるためのベクターは、例えば、Okayama及びBerg（Mol. Cell. Biol., 3: 280, 1983、引用によりその全体を本明細書に援用する。）の方法で構築することができる。
【００８２】
本発明の組換え改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質を産生する１つの方法は、当該タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、当該タンパク質が発現する条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現系に応じて当該タンパク質を培養培地又は細胞抽出液から回収する。
【００８３】
組換え改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質を精製する操作は、用いた宿主の型及び本発明のタンパク質を培養培地中に分泌させるかどうかといった要因に従って適宜選択される。例えば、組換えタンパク質を精製する操作には、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、ＣＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、ＣＭＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、疎水性カラム等のカラムクロマトグラフィー及びネイティブ−ＰＡＧＥ等、又はそれらの組み合わせが含まれる。また、組換えタンパク質に精製を容易にするタグなどを融合させて発現させた場合には、アフィニティークロマトグラフィーによる精製方法を利用してもよい。例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧＴＭタグ、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを融合させた場合には、それぞれ、Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）カラム、抗ＦＬＡＧ抗体を連結したカラム、又はグルタチオンを連結したカラム、などを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００８４】
組換え改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質は電気泳動的に単一バンドになるまで精製してもよいが、部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質は精製品であってもよく、又は部分精製品であってもよい。
【００８５】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・限定を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８６】
実施例１：変異型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の作製
（１）ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０変異体の作製
フォトバクテリウム・フォスフォレウム（Photobacterium phosphoreum）ＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来のβ−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素Ｎ２Ｃ０（特許文献３：ＷＯ２００６／１１２２５３）について、アミノ酸が置換された変異体を作製した。本発明者らが作製したＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０／ｐＴｒｃ９９Ａ（特許文献３：ＷＯ２００６／１１２２５３）を鋳型として、ＰＣＲを行った（１ｓｔ  ＰＣＲ）。反応に用いたプライマー配列及びその組み合わせを表１及び２に示した。５０μｌ反応液中、プラスミド、１０×PyroBest buffer  ５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μｌ、プライマー  各５ピコモル、PyroBest DNA Polymerase (ＴａＫａＲａ社製)０．５μｌをそれぞれ含み、９６℃  ３分を１回、９６℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ２分を１５回、７２℃  １分を１回行った（１ｓｔ  ＰＣＲ）。ＰＣＲに用いたプライマーセットを表２に示した。これらのＰＣＲ産物を、低融点アガロース（SeaPlaqueGTG）を用いてＴＡＥ緩衝液中でアガロース電気泳動を行った。各ＤＮＡ断片をゲルごと切り出し、ゲルと等量の２００ｍＭ  ＮａＣｌを加え、７０℃で１０分間処理し、ゲルを融解した。このサンプルをフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を各１回行い、エタノール沈殿によってＤＮＡ断片を回収した。得られた５’側断片と３’側断片を鋳型として、１ｓｔ ＰＣＲと同様に反応液を調製し、５’側断片増幅に用いたＦｗプライマー及び３’側断片増幅に用いたＲｖプライマーを用いて、Ｆｕｓｉｏｎ−ＰＣＲを行った（２ｎｄ  ＰＣＲ）。この２ｎｄ  ＰＣＲ産物についても、上述の通りに電気泳動した後に精製した。なお、今回作製した変異体には、表１に記載したＩＳＨ４６７−２３ＳＴ−Ｃ０−Ｈｉｓ−ＢａｍＨＩを用いてＨｉｓ×６−Ｔａｇを付加したＰＣＲ産物も含まれる。【００８７】
【表１−１】
2012014980.tif 000002
【００８８】
【表１−２】
2012014980.tif 000003
【００８９】
【表２】
2012014980.tif 000004
【００９０】
以下に、ＰＣＲの具体例を１つ示す。ＩＳＨ４６７−２３ＳＴ−Ｅ３１９Ａ変異体の１ｓｔ  ＰＣＲは、５’側断片増幅に、ＦｗプライマーとしてＩＳＨ４６７−２３ＳＴ−Ｎ２−Ｎｃｏを、ＲｖプライマーとしてＩＳＨ４６７−２３ＳＴ−Ｅ３１９Ａ−Ｒを、３’側断片増幅に、ＦｗプライマーとしてＩＳＨ４６７−２３ＳＴ−Ｅ３１９Ａ−Ｆを、ＲｖプライマーとしてＩＳＨ４６７−２３ＳＴ−Ｃ０−Ｂａｍ（一部については、ＩＳＨ４６７−２３ＳＴ−Ｃ０−Ｈｉｓ−ＢａｍＨＩ）を、それぞれ用いた。２ｎｄ ＰＣＲは、ＦｗプライマーとしてＩＳＨ４６７−２３ＳＴ−Ｎ２−Ｎｃｏを、ＲｖプライマーとしてＩＳＨ４６７−２３ＳＴ−Ｃ０−Ｂａｍを（一部については、ＩＳＨ４６７−２３ＳＴ−Ｃ０−Ｈｉｓ−ＢａｍＨＩ）を、それぞれ用いた。【００９１】
次に、これらの２ｎｄ  ＰＣＲ断片を、ベクターｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯ（Invitrogen社）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書に従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてプラスミドを導入し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition）に従いプラスミドＤＮＡを抽出した。インサートの確認されたクローンに関して、Ｍ１３プライマー（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社）で、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定した。【００９２】
変異型Ｎ２Ｃ０／ｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯを、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化した後、低融点アガロースを用いて電気泳動し精製を行った。ベクターは、ｐＴｒｃ９９Ａを制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化し、電気泳動したとき約３ｋｂのバンドを切り出して、同様に調製した。制限酵素処理したＤＮＡ断片とベクターを、Ligation kit（Ｔａｋａｒａ社）を用いてライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＴＢ１に形質転換し、コロニーＰＣＲにより挿入遺伝子を含むクローンを決定した。常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサーで、組み換えた全塩基配列を決定した。なお、プライマーは、ｐＴｒｃ９９Ａ  ＦＷ５、ｐＴｒｃ９９Ａ  ＲＶ３  プライマーを用いて行った。ｐＴｒｃ９９Ａ  ＦＷ５及びｐＴｒｃ９９Ａ  ＲＶ３  プライマーの配列は、以下のとおりである。
ｐＴｒｃ９９Ａ  ＦＷ５：５’−GGAAGCTGTGGTATGGCTG−３’（19mer；配列番号２５）
ｐＴｒｃ９９Ａ  ＲＶ３：５’−CGTTTCACTTCTGAGTTCGG−３’(20mer；配列番号２６)【００９３】
このようにして、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０の変異体として、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０−Ｆ３１８Ａ（以下、単にＦ３１８Ａと記載する）；ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０−Ｅ３１９Ａ（以下、単にＥ３１９Ａと記載する）；ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０−Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａ（以下、単にＦ３１８ＡＥ３１９Ａと記載する）；ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０−Ｓ３３７Ａ（以下、単にＳ３３７Ａと記載する）；ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０−Ｆ３１８ＡＥ３１９ＡＳ３３７Ａ（以下、単にＦ３１８ＡＥ３１９ＡＳ３３７Ａと記載する）；ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０−Ｅ３１９Ｖ（以下、単にＥ３１９Ｖと記載する）；ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０−Ｅ３１９Ｓ（以下、単にＥ３１９Ｓと記載する）；ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０−Ｅ３１９Ｋ（以下、単にＥ３１９Ｋと記載する）；及び、ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０−Ｅ３１９Ｈ（以下、単にＥ３１９Ｈと記載する）を調製した。ここで、例えば、Ｅ３１９Ａは野生型Ｎ２Ｃ０（配列番号２）の３１９番目のグルタミン酸がアラニンに置換されていることを意味するものとして命名した。その他の変異体の命名法についても同様である。  【００９４】
（２）Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含む変異型Ｎ２Ｃ０タンパク質の発現と精製
（１）で作製したＨｉｓ×６−Ｔａｇを含む変異型Ｎ２Ｃ０を含む大腸菌４菌株（Ｆ３１８Ａ、Ｅ３１９Ａ、Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａ及びＳ３３７Ａ）を、アンピシリンを最終濃度１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地５０ｍｌに接種し、３０℃で一晩振とう培養した。回収した菌体を、１０〜２０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３％トリトンＸ−１００を含む、２０ｍＭ  ビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．０）（以下「Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ」という。）１．６ｍｌに穏やかに懸濁し、氷冷下で超音波破砕した後、遠心分離し上清を回収した。回収した上清に、さらにＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ３．４ｍｌを加えて、全量５ｍｌにしたものを２本に分注し、あらかじめＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ社製）を１本につき２５０μｌ加え、４℃で１時間、回転させながらインキュベートした。これを、オープンカラムに通し、２０〜４０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３％トリトンＸ−１００を含む、２０ｍＭ  ビス−トリス(ｐＨ６．０)（以下「Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ」という。）を２．５ｍｌで４回洗浄した。次いで、２５０ｍＭイミダゾール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３％トリトンＸ−１００を含む、２０ｍＭ ビス−トリス(ｐＨ６．０)（以下「Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ」という。）を０．５ｍｌ加えて、３回溶出し、Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含む変異型Ｎ２Ｃ０タンパク質を精製した。【００９５】
（３）Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含まないＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０変異体の発現
（１）で作製した変異型Ｎ２Ｃ０を含む大腸菌６菌株(改変型Ｎ２Ｃ０は、Ｅ３１９Ａ、Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａ、Ｅ３１９Ｈ、Ｅ３１９Ｋ、Ｅ３１９Ｓ又はＥ３１９Ｖ）の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（５ｍｌ）に接種し、Ａ６００＝０．５程度になるまで３０℃で菌を前培養し、その後ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業製）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え、３０℃でさらに４時間振とう培養した。培養液２ｍｌ中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、２００μｌの０．３％トリトンＸ−１００及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  ビス−トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液とし、活性測定に供試した。【００９６】
（４）Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含まない変異型Ｎ２Ｃ０変異体の抽出及び精製
ＬＢＡｍｐ平板培地上で継代培養した変異型Ｎ２Ｃ０のクローンが組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１のコロニーから菌体をループで採取し、３０μｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）を添加した６ｍｌ−ＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し、３０℃、毎分１８０回転で８時間振とう培養した。【００９７】
本培養は、以下の手順で実施した。１．５ｍｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）＋３００μｌの１Ｍ  ＩＰＴＧ（１．１９２ｇ／５ｍｌ）を添加した３００ｍｌ−ＬＢ培地を１０００ｍｌ容のコブ付フラスコに３００ｍｌ張り込み、これに前培養液１２ｍｌを接種し、３０℃、毎分１８０回転で２４時間振とう培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収した。【００９８】
この菌体を、０．３％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  ビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。菌体破砕液を４℃、１００，０００×ｇで１時間、遠心分離を行い、上清を得た。【００９９】
この粗酵素液を、０．３％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  ビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したHiLoad ２６／１０ Ｑ Sepharose ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）陰イオン交換カラムに吸着させ、０．３％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）から１Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が０．２５Ｍ付近で溶出された酵素活性を有する画分を回収した。【０１００】
回収した画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、予め０．３％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に吸着させ、０．３％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）から０．３％トリトンＸ−１００を含む５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）へ直線濃度勾配法で溶出させ。その結果、リン酸緩衝液濃度が１３０ｍＭ付近に溶出された酵素活性を有する画分を回収した。【０１０１】
この画分をＭｏｎｏＱ  ５／５０  ＧＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）陰イオン交換カラムに吸着させ、０．３％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  ビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．０）から１Ｍ  塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が０．２５Ｍ付近で溶出される酵素活性を有する画分を回収し、Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含まない変異型Ｎ２Ｃ０タンパク質を精製した。【０１０２】
実施例２：変異型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の活性測定
（１）Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含む変異型Ｎ２Ｃ０のシアル酸転移酵素活性の測定
実施例１−（２）で精製したＨｉｓ×６−Ｔａｇを含む変異型Ｎ２Ｃ０タンパク質（Ｆ３１８Ａ、Ｅ３１９Ａ、Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａ及びＳ３３７Ａの４種類の変異体）について、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性測定を行った。シアル酸転移活性は、J. Biochem., 120, 104−110 (1996) （引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定した。具体的には、糖供与体基質ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（７０ｎｍｏｌ、１４ＣでＮｅｕＡｃをラベルしたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ  ２５０００ｃｐｍを含む、３５６ｃｐｍ／ｎｍｏｌ。ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を表す）、糖受容体基質としてラクトース（１．２５μｍｏｌ）、ＮａＣｌを０．５Ｍ濃度になるように添加し、及び上記に記した方法で調製した酵素を含む反応溶液（３０μｌ）を用いて酵素反応を行った。酵素反応は３０℃で５分間行った。反応終了後、反応溶液に１．９７ｍｌの５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加え、この溶液をＤｏｗｅｘ１×８（ＰＯ４３−フォーム、０．２×２ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ製）カラムに供した。このカラムの溶出液（０〜２ｍｌ）に含まれる反応生成物、すなわち、シアリルラクトースに含まれる放射活性を測定することで、酵素活性を算出した。酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量とした。その結果、Ｆ３１８Ａ、Ｅ３１９Ａ、Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａについては、シアル酸転移活性が認められたが、Ｓ３３７Ａについてはシアル酸転移活性が認められなかった。【０１０３】
（２）Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含む変異型Ｎ２Ｃ０のノイラミニダーゼ活性の測定（Ａｍｉｎｏｆｆ法）
Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含むＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０変異体（Ｆ３１８Ａ、Ｅ３１９Ａ、Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａ、及びＳ３３７Ａの４種類の変異体）について、ノイラミニダーゼ活性の測定を行った。具体的には、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）を基質として反応させ、分解産物のシアル酸を過ヨウ素酸−チオバルビツール酸法（Ａｍｉｎｏｆｆ法）で比色定量した。【０１０４】
１００ｍＭ  カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、１３ｍＭ  ３’−シアリルラクトースから成る反応液に酵素溶液を添加し、３０℃で反応を行った。反応後、１Ｍ  ＫＰＢ（ｐＨ８．０）を４５μｌ加え、全量５００μｌにして、ｐＨ７．０に調製した。２５ｍＭ過ヨウ素酸／０．１２５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を２５０μｌ加えて、３７℃で３０分間インキュベートした後、２％亜ヒ酸ナトリウム／０．５Ｎ  ＨＣｌを２００μｌ、０．１Ｍ  ２−チオバルビツール酸 (ｐＨ ９．０)を２ｍｌ加えて混ぜ、１００℃で７．５分間熱した。室温程度に冷ましてから、５％ＨＣｌ／ｎ−ブタノールを５ｍｌ加えて混ぜ、軽く遠心してから１５分程度静置した後、Ｏ．Ｄ．＝５４９ｎｍを測定した。【０１０５】
その結果、Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含む変異型Ｎ２Ｃ０（Ｆ３１８Ａ）については、ノイラミニダーゼ活性が認められたが、３種類のＨｉｓ×６−Ｔａｇを含む変異型Ｎ２Ｃ０（Ｅ３１９Ａ、Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａ及びＳ３３７Ａ）については、ノイラミニダーゼ活性が認められなかった。【０１０６】
実施例２−（１）及び（２）の結果から、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７菌株由来Ｎ２Ｃ０タンパク質の３１９番目のグルタミン酸を改変することにより、実質的にノイラミニダーゼを有さず、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を得ることに成功した。以下、ＪＴ−ＩＳＨ−４６７菌株由来Ｎ２Ｃ０タンパク質の３１９番目のグルタミン酸が改変されているタンパク質は、実質的にノイラミニダーゼを有さず、β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するため、改変型と称する。【０１０７】
実施例３：改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の性質
実施例１−（４）で精製したＨｉｓ×６−Ｔａｇを含まない改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質（Ｅ３１９Ａ、Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａの２種類）及びＨｉｓ×６−Ｔａｇを含まない野生型Ｎ２Ｃ０タンパク質を用いて、それらのラクトース及びＣＭＰ−シアル酸に対する速度定数を算出した（表３）。Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含まないＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０のラクトース及びＣＭＰ−シアル酸に対するＫｍ及びＶｍａｘはそれぞれ、８．４ｍＭ、０．７２ｍＭであった。Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含まないＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０変異体Ｅ３１９Ａ及びＦ３１８ＡＥ３１９Ａの変異体のラクトース及びＣＭＰ−シアル酸に対するＫｍ及びＶｍａｘはそれぞれ、２２ｍＭ、０．５３ｍＭ及び８５ｍＭ、１．５９ｍＭであった。【０１０８】
【表３】
2012014980.tif 000005
【０１０９】
実施例４：改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素のノイラミニダーゼ活性測定
実施例１−（４）で精製したＨｉｓ×６−Ｔａｇを含まない改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質（Ｅ３１９Ａ、Ｆ３１８ＡＥ３１９Ａの２種類）及びＨｉｓ×６−Ｔａｇを含まない野生型Ｎ２Ｃ０タンパク質を用いて、以下のようにノイラミニダーゼ活性を測定した。【０１１０】
（１）ノイラミニダーゼ反応
対照として、野生型のＮ２Ｃ０タンパク質（Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含まない）については、１００ｍＭ  ビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、４０ｍＭ  ３’−シアリルラクトースから成る反応液に酵素溶液を終濃度  ２Ｕ／ｍｌ（シアル酸転移酵素活性換算）となるように添加して反応液を調整した。また、改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質については、１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、４０ｍＭ  ３’−シアリルラクトースから成る反応液に酵素溶液を終濃度  ２Ｕ／ｍｌ（シアル酸転移酵素活性）となるように添加して反応液を調整した。反応は、各シアル酸転移酵素の至適温度で実施した。酵素溶液添加直後を反応０時間とし、経時的に１０μｌをサンプリングして直ちに９５℃で３分間処理を行い、酵素を失活させて反応を停止させた。【０１１１】
（２）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるノイラミニダーゼ活性の定性分析
上記により経時的にサンプリングした反応液にアセトニトリル／１５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．２）（７５：２５、Ｖ／Ｖ）を３００μｌ添加し、そのうち１５０μｌをＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０  ５μｍ（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）カラムを用いたＨＰＬＣ分析に供試した。移動相Ａとしてアセトニトリル／1５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．２）（５０：５０、Ｖ／Ｖ）、移動相Ｂとしてアセトニトリル／１５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．２）（７５：２５、Ｖ／Ｖ）を使用し、０分から１５分を移動相Ｂが１００％、１５分から４５分を移動相Ｂが１００％→０％の直線濃度勾配、４５分から６０分を移動相Ｂが０％の条件化、１９５ｎｍの吸光度を測定することにより分析を行った。【０１１２】
結果を図１−１ないし図１−４に示す。図に示すとおり、野生型のＮ２Ｃ０タンパク質の場合、反応開始後７２時間で反応系に添加した３’−ＳＬ（３’−シアリルラクトース）が消失したが、２種類の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質Ｅ３１９Ａ及びＦ３１８ＡＥ３１９Ａについては、反応開始後７２時間においても反応系に添加した３’−ＳＬはほぼ全量残存していた。これらの結果から、２種類の変異型ＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０Ｅ３１９Ａ及びＦ３１８ＡＥ３１９Ａについては、それらのノイラミニダーゼ活性が消失若しくは大幅に減少したと判断した。【０１１３】
実施例５：改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素の至適ｐＨ、至適温度
実施例１−（４）で精製した酵素を用い、改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（Ｅ３１９Ａ及びＦ３１８ＡＥ３１９Ａ）の至適ｐＨ、至適温度を調べた。【０１１４】
（１）改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（Ｅ３１９Ａ及びＦ３１８ＡＥ３１９Ａ）の酵素活性の至適ｐＨ
酢酸バッファー（ｐＨ４−５）、ＭＥＳバッファー（ｐＨ５−６）、ビス−トリスバッファー（ｐＨ６−７）、リン酸バッファー（ｐＨ６−９．５）、ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８−９）、ＣＨＥＳバッファー（ｐＨ９−１０）、ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ１０−１１）をそれぞれ調製し、これらを用いて、３０℃で各ｐＨにおける酵素活性を測定した。【０１１５】
その結果、図２−１に示すように、２種類の改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（Ｅ３１９Ａ及びＦ３１８ＡＥ３１９Ａ）とも、ｐＨ８．０において酵素活性が最大であった。なお、各ｐＨにおける酵素活性はｐＨ８．０における酵素活性を１とする相対活性で示した。一方、変異がない野生型のＮ２Ｃ０（Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含まない）の場合、酵素活性はｐＨ６．０において最大であった。【０１１６】
（２）改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（Ｅ３１９Ａ及びＦ３１８ＡＥ３１９Ａ）の酵素活性の至適温度
リン酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いて、１０℃から５０℃までの５℃毎の反応温度において、酵素活性を測定した。【０１１７】
その結果、図２−２に示すように、変異がない野生型のＮ２Ｃ０（Ｈｉｓ×６−Ｔａｇを含まないＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０）の場合、３０℃において、酵素活性が最大であった。  一方、２種類の改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（Ｅ３１９Ａ及びＦ３１８ＡＥ３１９Ａ）とも、３５から４０℃において、酵素活性が最大であった。【０１１８】
実施例６：各種改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素のシアル酸転移酵素活性及びノイラミニダーゼ活性
実施例２において、Ｎ２Ｃ０の３１９番目のグルタミン酸をアラニンに変異させることによって、ノイラミニダーゼ活性が失活することが明らかになった。そこで、アラニン以外のアミノ酸に置換した場合の影響を確認するために、４種類の改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（Ｅ３１９Ｖ、Ｅ３１９Ｓ、Ｅ３１９Ｋ及びＥ３１９Ｈ）を作製し、下記の方法で粗酵素液を調製して、それらのシアル酸転移活性及びノイラミニダーゼ活性を測定した。【０１１９】
実施例１−（１）で作製したＩＳＨ４６７−Ｎ２Ｃ０変異体を含む大腸菌株の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（５ｍｌ）に接種し、Ａ６００＝０．５程度になるまで３０℃で菌を前培養し、その後ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業製）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え、３０℃でさらに４時間振とう培養した。培養液２ｍｌ中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、２００μｌの０．３％トリトンＸ−１００及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  ビストリス緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液とし、活性測定に供試した。なお、シアル酸転移酵素活性は実施例２−（１）に記載の方法により、ノイラミニダーゼ活性は実施例４に記載の方法により測定した。その結果、いずれの改変型β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素（Ｅ３１９Ｖ、Ｅ３１９Ｓ、Ｅ３１９Ｋ及びＥ３１９Ｈ）も、シアル酸転移酵素活性を示し、またノイラミニダーゼ活性を示さないことを見出した。結果を表４に示す。【０１２０】
【表４】
2012014980.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明の改変型Ｎ２Ｃ０タンパク質は、ノイラミニダーゼ活性を実質的に有しないβーガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質である。本発明の酵素は、シアル酸転移反応において、糖受容体基質特異性が広いという海洋性細菌由来酵素の利点を維持したまま、シアル酸の加水分解を低減することが可能である。本発明のタンパク質の上記の性質により、シアル酸を含む複合糖質糖鎖の合成における有用性が期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０１２２】
配列番号１：β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素Ｎ２Ｃ０（フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素Ｎ０Ｃ０遺伝子よりシグナル配列を除去した後、組換え発現が可能となるようにＮ末端にＭｅｔを付加した）をコードする核酸配列
配列番号２：β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素Ｎ２Ｃ０のアミノ酸配列
配列番号３：フォトバクテリウム・フォスフォレウムＪＴ−ＩＳＨ−４６７株由来β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素Ｎ０Ｃ０をコードする核酸
配列番号４：β−ガラクトシド−α２，３−シアル酸転移酵素Ｎ０Ｃ０のアミノ酸配列
配列番号５：ＦＬＡＧペプチド
配列番号６：プライマー  467-23ST-N2-Nco
配列番号７：プライマー  ISH467-23ST-C0-BamHI
配列番号８：プライマー  ISH467-23ST-C0-His-BamHI
配列番号９：プライマー  ISH467-23ST-F318A-F
配列番号１０：プライマー  ISH467-23ST-F318A-R
配列番号１１：プライマー  ISH467-23ST-E319A-F
配列番号１２：プライマー  ISH467-23ST-E319A-R
配列番号１３：プライマー  ISH467-23ST-F318AE319A-F
配列番号１４：プライマー  ISH467-23ST-F318AE319A-R
配列番号１５：プライマー  ISH467-23ST-S337A-F
配列番号１６：プライマー  ISH467-23ST-S337A-R
配列番号１７：プライマー  ISH467-23ST-E319V-F
配列番号１８：プライマー  ISH467-23ST-E319V-R
配列番号１９：プライマー  ISH467-23ST-E319S-F
配列番号２０：プライマー  ISH467-23ST-E319S-R
配列番号２１：プライマー  ISH467-23ST-E319K-F
配列番号２２：プライマー  ISH467-23ST-E319K-R
配列番号２３：プライマー  ISH467-23ST-E319H-F
配列番号２４：プライマー  ISH467-23ST-E319H-R
配列番号２５：プライマー  pTrc99A FW5
配列番号２６：プライマー  pTrc99A RV3
【図２−１】
2012014980.tif 000007
【図２−２】
2012014980.tif 000008
【図１−１】
2012014980.tif 000009
【図１−２】
2012014980.tif 000010
【図１−３】
2012014980.tif 000011
【図１−４】
2012014980.tif 000012
【配列表】
2012014980000001.app
【国際調査報告】
2012014980.tif 000013
2012014980.tif 000014
2012014980.tif 000015
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