(57)【要約】  細胞培養空間外からの微生物を含む粒子の侵入や細胞培養空間からの液漏れを防止でき、安全、安心に再生組織が作製できる、細胞培養容器を提供する。細胞培養装置に装着され細胞を保持・培養する細胞培養容器であって、培養液を保持する培養液保持部と、前記培養液を供給、排出するための突起構造部と、前記突起構造部から前記培養液保持部まで通ずる培養液流路を備えることを特徴とする細胞培養容器。
2012008368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養装置に装着され、細胞を保持・培養する細胞培養容器であって、
培養液を保持する培養液保持部と、
前記培養液を供給、排出するための突起構造部と、
前記突起構造部から前記培養液保持部まで通ずる培養液流路を備える、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
前記突起構造部と前記培養液流路をそれぞれ一対備える、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
細胞を保持、培養するため、前記培養液保持部の少なくとも片面にガス透過膜を有する、ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
前記突起構造部は、弾性部材からなるチューブが接続可能である、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
前記培養液保持部は物質透過膜を挟んだ２層構造を有し、前記突起構造部と前記培養液流路が、前記２層構造の各層に形成されている、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
細胞を保持、培養するため、前記培養液保持部の両面にガス透過膜を有する、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項７】
請求項３に記載の細胞培養容器であって、
前記培養液保持部の他の片面が前記細胞培養容器の枠体と一体で形成される、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項８】
請求項３に記載の細胞培養容器であって、
前記ガス透過膜は、前記培養液保持部の少なくとも片面に溶着され、その外周の一部に突出した突出部を備える、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項９】
請求項３に記載の細胞培養容器であって、
前記突起構造部は、前記細胞培養容器の枠体の上面から、前記ガス透過膜の膜面に垂直な方向に突出している、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１０】
請求項３に記載の細胞培養容器であって、
前記突起構造物は、前記細胞培養容器の枠体の側面から、前記ガス透過膜の膜面と平行な方向に突出している、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１１】
請求項２に記載の細胞培養容器であって、
前記培養液保持部は、ほぼ円形形状を有し、一対の前記培養液流路が、円形形状の対抗する位置に接続されている、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１２】
請求項１に記載の細胞培養容器であって、
前記培養液保持部は、前記培養液を保持する枠体と、前記枠体の上部を覆う蓋部を備え、前記培養液流路が、前記枠体に設けられている、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１３】
請求項２に記載の細胞培養容器であって、
前記培養液保持部は、前記培養液を保持する枠体と、前記枠体の上部を覆う蓋部を備え、一対の前記培養液流路の一方が前記枠体に、他方が前記蓋部に設けられている、
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項１４】
細胞培養容器内で細胞を培養する細胞培養装置であって、
前記細胞培養容器を保持する培養ステージと、
培養液を保管するための培養液保管部と、
廃液を溜めるための廃液収容部と、
前記培養液保管部から前記細胞培養容器まで前記培養液を供給するための送液管と、
前記細胞培養容器から廃液を回収し、当該廃液を前記廃液収容部まで送る廃液管を備え、前記細胞培養容器は、前記培養液を保持する培養液保持部と、前記培養液を供給、排出するための突起構造部と、前記突起構造部から前記培養液保持部まで通ずる培養液流路を備え、前記突起構造部と、前記送液管と前記廃液管それぞれの一端が接続される、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞培養装置であって、
前記突起構造部と前記培養液流路を一対備える、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１６】
請求項１４に記載の細胞培養装置であって、
前記細胞培養容器は、前記細胞を保持、培養するため、前記培養液保持部の少なくとも片面にガス透過膜を有する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１７】
請求項１４に記載の細胞培養装置であって、
前記送液管と前記廃液管は弾性部材からなるチューブで構成される、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１８】
請求項１４に記載の細胞培養装置であって、
前記培養ステージを回転し、搭載される前記細胞培養容器が水平に保持された状態と、垂直に保持される状態を取るよう回転運動する駆動部を更に有する、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１９】
請求項１８に記載の細胞培養装置であって、
前記細胞培養容器の前記培養通路は、前記駆動部によって垂直に保持された状態で、前記培養液保持部の最頂部及び最低部に接続されている、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項２０】
請求項１５に記載の細胞培養装置であって、
前記培養液保持部は、前記培養液を保持する枠体と、前記枠体の上部を覆う蓋部を備え、一対の前記培養液流路の一方が前記枠体に、他方が前記蓋部に設けられている、
ことを特徴とする細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器とそれを用いる細胞培養装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
自分の細胞もしくは他人の細胞を用いて疾病の治療を行う再生医療では、生体から採取した細胞は、しばしば、培養して細胞の数を増やす、あるいはしかるべき形に組織を形成させた後に治療に用いられる。治療に用いる細胞の培養は、細胞プロセシングセンタ（Cell Processing Center：CPC）という細胞培養用クリーンルームの中で、GMP（Good Manufacturing Practice）に準拠して行わなければならない。ここでの課題は、細胞培養は技術者の手によって行われるために、患者１名分の細胞の調製に対して労力とコストが非常にかかるという点と、手動で操作することによる生物学的汚染リスクがあるという点である。【０００３】
これらの課題を解決する手段として、閉鎖系で細胞培養工程を自動化する装置が開発されてきた。これは、培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系培養容器を用いることで、細胞培養工程の自動化と生物学的汚染リスクの低減が達成されるものである。【０００４】
他方、細胞には、増殖させる過程においてフィーダー細胞という栄養細胞を必要とする細胞種と必要としない細胞種がある。再生医療において注目されている、ES（Embryonic Stem）細胞やiPS（Induced Pluripotent Stem）細胞、および皮膚上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞といった細胞種は、しばしばフィーダー細胞が必要である。培養した細胞を治療に用いる場合、フィーダー細胞と治療に用いられる細胞は分離された状態で培養することが望ましい。即ち、２層の培養層を有する細胞培養容器にて細胞培養することが望ましい。ところが、これまで開発されてきた閉鎖系の細胞培養装置は、培養層が１層の細胞培養容器に対応した装置構成であったために、２層培養は困難であった。【０００５】
この課題を解決する手段としては、特許文献１、２に示すような培養装置が提案されている。このような装置構成であれば、例えば特許文献３、４に示すような、２層の培養層を有する細胞培養容器を用いることで、ES細胞やiPS細胞、皮膚上皮細胞、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞といった細胞種を閉鎖系で自動培養することが可能ある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１４９２３７号公報
【特許文献２】特開２００８−２７１９１５号公報
【特許文献３】特開２００８−２７１９１２号公報
【特許文献４】特開２００８−２７１９１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献３、４に示すような２層の培養層を有する細胞培養容器を用いて自動培養する場合、以下に述べる課題があった。【０００８】
特許文献３に記載の閉鎖系培養容器を用いて、自動で送廃液を行う場合は、例えば、特許文献１、２に装置継ぎ手に備えられた培養液供給手段を、細胞培養容器に備えられた弾性部材に接続して培養液の送廃液を行う方法が記載されている（特許文献１の請求項1参照、特許文献２の請求項1参照）。【０００９】
これらの方法において、弾性部材のスリットに送廃液管を通すことにより生じる通気口から液漏れが発生し、通気口を介した細胞培養空間外からの微生物を含む粒子が混入することが課題となっていた。【００１０】
また、特許文献３に記載の閉鎖系培養容器にて培養した後は、細胞培養容器を培養装置から取り出し、細胞の使用直前に安全キャビネット内にて細胞培養容器内の培養液を排出し、細胞を回収するという操作が必須である。細胞培養容器からの培養液の排出には、細胞培養容器に備えられた弾性部材に何らかの配管を手作業で挿入する必要がある。こうした手作業による操作によって、生物学的汚染の危険性が高くなるということが課題となっていた。【００１１】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、これらの課題を解決する細胞培養容器とそれを利用した細胞培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成する本発明の細胞培養容器は、細胞培養装置に装着され、細胞を保持・培養する細胞培養容器であって、培養液を保持する培養液保持部と、培養液を供給、排出するための突起構造部と、突起構造部から培養液保持部まで通ずる培養液流路を備えた構成の細胞培養容器を提供する。【００１３】
また、細胞培養容器内で細胞を培養する細胞培養装置であって、細胞培養容器を保持する培養ステージと、培養液を保管するための培養液保管部と、廃液を溜めるための廃液収容部と、培養液保管部から細胞培養容器まで培養液を供給するための送液管と、細胞培養容器から廃液を回収し、廃液を廃液収容部まで送る廃液管を備え、細胞培養容器は、培養液を保持する培養液保持部と、培養液を供給排出するための突起構造部と、突起構造部から培養液保持部まで通ずる培養液流路を備え、突起構造部と送液管と廃液管の一端が接続される構成の細胞培養装置を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る細胞培養容器によれば、完全閉鎖系での細胞の自動培養が可能となる。完全閉鎖系で培養することで、細胞培養空間外からの微生物を含む粒子の侵入を抑制でき、安全、安心に細胞培養が実施できる。【００１５】
また、細胞培養終了後に細胞培養容器から培養液を排出する際も、細胞培養空間外からの微生物を含む粒子の侵入を抑制でき、培養後の細胞を安全に回収できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】第１の実施例の細胞培養容器を示す図である。
【図２】第１の実施例に係る、細胞培養容器にチューブを接続した様子を示す図である。
【図３】第１の実施例に係る、細胞培養容器の種々の突起構造を示す図である。
【図４】第１の実施例に係る、細胞培養容器を有する細胞培養装置を示す図である。
【図５】第１の実施例に係る、細胞培養終了後に、細胞培養装置と細胞培養容器の接続を解除する方法を示す図である。
【図６】第１の実施例に係る、細胞培養容器から培養液を排出する方法を示す図である。
【図７】第１の実施例に係る、再生組織を細胞培養容器から回収する手順を示す図である。
【図８】第１の実施例に係る、細胞培養容器に溶着するガス透過膜の形状を示す図である。
【図９】第１の実施例の変形例に係る、１層型の細胞培養容器の一例を示す図である。
【図１０】第１の実施例の変形例に係る、１層型の細胞培養容器の他の例を示す図である。
【図１１】第１の実施例の変形例に係る、細胞培養容器における突起構造の位置の他の例を示す図である。
【図１２】第１の実施例の具体例１における、作製した細胞培養容器枠体の外観を示す図である。
【図１３】第１の実施例の具体例１における、作製した細胞培養容器枠体にガス透過膜等を溶着して密閉し、培養液を保持した状態の外観を示す図である。
【図１４】第１の実施例の具体例１と比較例１における、位相差顕微鏡像と剥離回収した細胞シートの外観を示す図である。
【図１５】第１の実施例の具体例１と比較例１における、角膜上皮組織に含まれる細胞数を示す図である。
【図１６】第１の実施例の具体例１と比較例１における、角膜上皮組織切片のヘマトキシリンーエオジン（ＨＥ）染色像を示す図である。
【図１７】第１の実施例の具体例１と比較例１における、角膜上皮組織切片の免疫組織染色像を示す図である。
【図１８】第１の実施例の具体例２と比較例２における、剥離回収した細胞シートの外観を示す図である。
【図１９】第１の実施例の具体例２と比較例２における、角膜上皮組織切片のヘマトキシリンーエオジン（ＨＥ）染色像と、免疫組織染色像を示す図である。
【図２０】第１の実施例の具体例２と比較例２における、角膜上皮組織切片の免疫組織染色像と、p63陽性細胞率を示す図である。
【図２１】第１の実施例の具体例２と比較例２における、コロニー検出像とコロニー形成率を示す図である。
【図２２】第２の実施例に係る細胞培養容器の断面を示す図である。
【図２３】第２の実施例の細胞培養容器の（a）立体及び（b）断面を示す図である。
【図２４】第２の実施例の細胞培養容器の（a）上部及び（b）斜写真を示す図である。
【図２５】第３の実施例に係る細胞培養容器の断面を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下添付図面を参照して本発明の種々の実施例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。なお、本明細書においては、培養液を培地と称する場合がある。
【実施例１】
【００１８】
＜細胞培養容器の構造＞
図１は、第１の実施例における細胞培養容器の構造の一例を示す図である。【００１９】
図１の（a）は上面図、（b）はそのA-A断面図、（c）はそのB-B断面図である。細胞培養容器１は、正方形で扁平形状の容器であって、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレンなどの可塑性と共に剛性有するプラスチックから成る。枠体２は射出成形などにより形成され、その内部に円部３、４及び５が形成されている。そして、円部３にはガス透過膜６、円部４には物質透過膜７、円部５にはガス透過膜８が溶着されている。ガス透過膜６、８と物質透過膜７の円部３、５、４それぞれへの溶着は、細胞の生存に影響を及ぼす接着剤を使用しない熱溶着や超音波溶着が好ましい。これらの各層と枠体２により、本実施例においては、ほぼ円形形状を有する、２層の培養液保持部２８が構成される。【００２０】
同図において、９は培養液保持部２８に培養液を供給し、排出する一対の突起構造部である。突起構造物９は、細胞培養容器１の枠体２の上面から、ガス透過膜６、８の膜面に垂直な方向に突出している。１４は、突起構造部９から円形の培養空間である培養液保持部２８までの一対の培養液流路である。一対の培養液通路１４は、培養液保持部２８のそれぞれの層において、ほぼ円形形状の対抗する側面位置に接続されている。これは、後で説明するように、細胞培養容器１を垂直にしたとき、培養空間の最頂部及び最底部に、一対の培養液通路１４が接続されるようにするためである。なお、円部３、４及び５を楕円部とすることにより、培養液保持部２８をほぼ楕円形状することも可能である。【００２１】
細胞培養容器１の下層からの栄養分を必要とする細胞種を、細胞培養容器１の上層で培養する目的で細胞培養容器１を使用する場合、物質透過膜７の平均孔径は、タンパク質等は通過するが、細胞は通過しない大きさがよい。【００２２】
ガス透過膜６，８と物質透過膜７の素材は、ポリカーボネートやポリスチレンといったガス透過性を有し、細胞培養観察可能な透明のものであればよくこれに限定されるものではない。熱溶着、超音波溶着で対象物同士を溶着させる場合、融点の関係で枠体２とガス透過膜６，８、物質透過膜７の材質は同一または融点が近いものがよい。【００２３】
図２に示すように、細胞培養容器１に設けられた一対の突起構造部９は、細胞培養容器１に一体成形されたものであり、弾性部材から成るチューブ１０を接続できるものである。チューブ１０の内径は、突起構造部９の内径と同等であれば、図２のように突起構造部９にチューブ１０を接続した状態で通液しても液漏れが生じることはない。突起構造部９は先端が台形になっているが、この形状に限定されるものではなく、図３の突起構造１１、１２のようなチューブ１０が接続できる形状であればよい。突起構造部９の高さは特に制限されるものではないが、ユーザビリティーの観点から、チューブ１０を接続するために必要な高さがあればよい。【００２４】
このような構造をもつ本実施例の細胞培養容器１は、枠体２に備わる物質透過膜７およびガス透過膜６、８によって形成される培養液保持部２８を培養液で充填することで、密閉空間における細胞培養が可能となる。培養液保持部２８に培養液を充填する際には、気泡が発生しないようにするために、対を形成する一方の突起構造部９が下になるように培養容器１を立て、下側の突起構造部９から培養液を注入して、上側の突起構造部９から培養液を排出する。そのために、２層構造の細胞培養容器１の場合は、効率的な上下層への注液のため、図１のように細胞培養容器の突起構造部９、すなわち、上層の２つの突起構造同士、及び下層の２つの突起構造同士が水平に維持されている必要がある。また、突起構造部９から円形の培養空間である培養液保持部２８までの培養液流路１４は、細胞培養容器１を垂直にしたときの培養空間の最頂部及び最底部に接続されている。これにより、効率的に培養液注入及び排出することができる。また、上述したように、本実施例による細胞培養容器１の中央の培養液保持部２８は、ほぼ円柱又は楕円柱などの円形形状又は楕円形状の空間となっている。これは、例えば角膜等、円形や楕円形の培養対象を円形、楕円形のままで回収するためである。【００２５】
なお、図１の細胞培養容器１は２層型である必要はなく、種々の変形実施例が構成される。例えば、培養する細胞種に応じて、図９に示すように、枠体２９にガス透過膜３０、３１が溶着された１層型の細胞培養容器であってもよい。さらに、１層型の細胞培養容器は、図１０の底部を有する枠体３２のように成形し、１枚のガス透過膜３３を溶着するだけの構造であってもよい。【００２６】
更に、図１、図９、図１０に示した種々の変形実施例の細胞培養容器１の突起構造部９は、細胞培養容器１、２９、３２を水平に置いたとき、対応するそれぞれの培養液保持部２８より上に位置する枠体２の上面に設置する必要はなく、図１１のように細胞培養容器１、２９、３２の枠体２の側面に位置されていてもよい。【００２７】
続いて、以上説明した種々の細胞培養容器を用いた細胞培養装置の構成の一例について説明する。【００２８】
＜細胞培養装置の構成＞
図４は、本実施例の細胞培養容器が適用される細胞培養装置であって、送液管や廃液管であるチューブが接続可能な突起構造を具備する細胞培養容器１が内部に配置された細胞培養装置１５の全体の構成を模式的に示す図である。【００２９】
図４において、細胞培養装置１５は、細胞培養容器１を保持する培養ステージ１６と、培養ステージ１６を回転運動させるための駆動部１７を有している。また、細胞培養容器に繋がる送液管１８および廃液管１９は、制御部２０を介して培養液保管部２１および廃液収容部２２に接続されている。培養液保管部２１と廃液収容部２２は、例えば４℃に設定される保冷庫２３に収納されている。そして、培養液は適宜、制御部２０内の図示を省略したヒータ等で３７℃に温められてから細胞培養容器１に供給される。【００３０】
培養ステージ１６の上もしくは下には、ＺＹＸ可動軸２４を具備した細胞観察用機器２５が設けられており、必要に応じて培養している細胞の状態をモニタ及び記録することができるようになっている。【００３１】
また、細胞培養容器１への培養液の充填は、細胞培養容器内部に気泡が発生しないように以下のように行う。即ち、細胞培養容器１に繋がる送液管１８が下になるように、駆動部１７により培養ステージ１６を矢印Ａ方向に垂直に立て、細胞と培養液の混合液を細胞培養容器１に充填する。細胞と培養液を充填後、培養ステージ１６を駆動部１７により水平にして、所定の温度、湿度、ガス組成および濃度で所定時間培養を実施する。培養途中に培地を交換する時は、細胞培養容器１に繋がる廃液管１９が下になるように駆動部１７により培養ステージ１６を矢印Ｂ方向に垂直に立て、細胞培養容器１から培地を吸引する。吸引後、細胞培養容器１に繋がる送液管１８が下になるように培養ステージ１６を垂直に立て、細胞培養容器１に培地を充填する。培地を充填後、再び培養ステージ１６を駆動部１７により水平にして、所定の温度、湿度、ガス組成および濃度で所定時間培養を再開する。【００３２】
＜細胞培養終了後の細胞培養装置と細胞培養容器の接続解除＞
図５は、本実施例において、細胞培養終了後に、細胞培養装置１５と細胞培養容器１の接続を解除する方法を示す図である。細胞培養容器１の突起構造部９に接続されている、チューブ１０の途中にクレンメ等のチューブを閉鎖する部材２６で、送液管や廃液管であるチューブ１０の途中を遮断し、遮断した先２７を滅菌済のハサミ等で切断することで、細胞培養装置１５から細胞培養容器１を取り出すことができる。【００３３】
容器の取り出し方法は、上記記載方法に限定されるものではなく、チューブの途中に閉鎖系システムを可能とする部材を設けておき、細胞培養容器と細胞培養装置の接続を解除する方法でもよい。【００３４】
＜細胞培養容器からの培養液の排出＞
図６は、細胞培養装置１５から接続を解除した細胞培養容器１からの培養液の排出方法を示す図である。培養液を排出させたい側の突起構造が下になるように細胞培養容器を傾けることで、培養液を簡単に排出することができる。培養液の排出は、再生組織の乾燥を防ぐために、作製した再生組織が必要となる時の直前でよい。【００３５】
＜細胞培養容器からの再生組織の回収＞
図７は再生組織を細胞培養容器から回収する手順を示す図である。同図において、７１は角膜上皮細胞、７２はＮＩＨ−３Ｔ３細胞を示す。まず培養液が排出された細胞培養容器から、接続されているチューブをとり、細胞培養容器１の上層に溶着されたガス透過膜６をカッターナイフなどで除去する。その後、再生組織である角膜上皮細胞７１を生理食塩水等で洗浄した後に再生組織を回収することができる。図８に示す変形例のように、細胞培養容器の円部３に形状の一部が突出した突出部をもつガス透過膜２８を溶着すれば、ガス透過膜を切ることなく、ピンセットで持ち上げることでガス透過膜２８の除去が可能である。なお、この突出形状については、ピンセットで持ち上げることができる形状であればよく、図８の形状に限定されるわけではない。【００３６】
再生組織である角膜上皮細胞７１の回収方法としては、ディスパーゼを用いた方法や、フィブリンゲル、羊膜、あるいは温度応答性高分子等を予め細胞培養表面に備えておくことで、細胞培養容器１から組織形状を保ったまま回収することができるが、これらの方法に限定されるものではない。【００３７】
以下に本実施例の細胞培養容器を用いた、角膜上皮細胞培養による角膜上皮組織作製方法、およびその結果の具体例について説明する。【００３８】
（具体例１）
＜閉鎖系細胞培養容器の作製方法＞
まず、図１に示すような枠体２を射出成形によりを作製した（材料はポリカーボネートを採用）。図１２に実際に作製した枠体２の外観を示す。図１の円部３、５にはガス透過膜、図１の円部４には物質透過膜を超音波溶着法で溶着した（超音波溶着機はブランソン社製２０００Xdt 40:0.8を使用）。図１の円部４、５に溶着した膜はプラズマ装置で親水化処理を実施した（プラズマ装置はサムコ社製ＰＣ-３００を使用）。図１３に各膜溶着後、培養液を容器１内に保持した状態の外観を示す。【００３９】
＜角膜上皮細胞培養方法＞
続いて、作製した細胞培養容器を用いた角膜上皮細胞の培養方法について説明する。角膜上皮細胞を培養する前日に、フィーダー細胞として、マイトマイシンC（１０μｇ／ｍｌ）で３７℃２時間処理したＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２×１０４／ｃｍ２となるように、細胞培養容器下層に播種した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を播種した翌日に、フナコシ社より購入したウサギ眼球の角膜輪部から常法に従って角膜上皮細胞を採取し、細胞培養容器の上層に４×１０４／ｃｍ２  なるように播種した。培養液には、通常上皮系細胞の培養に用いられる５％ＦＢＳを含むＫＣＭ培地を用いた。培養液の交換は、細胞培養容器の上層下層共に、培養開始５、７、９〜１６日目に１回行った。９日目以降の培養液交換は２４時間毎とした。【００４０】
＜角膜上皮組織の剥離方法＞
培養１６日目に組織を剥離回収した。組織の剥離はディスパーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）を閉鎖系細胞培養容器の下層に満たし、３７℃で１時間処理した後に実施した。【００４１】
＜角膜上皮組織の細胞数測定方法＞
培養１６日目に０．２５％トリプシン溶液を用いて細胞培養容器より細胞を回収し、トリパンブルー染色後、細胞数カウント装置（ＴＣ１０、バイオラッド社製）で細胞数を計測し、細胞培養容器の培養面積当たりの細胞数を算出した。【００４２】
＜角膜上皮組織の組織切片作製、組織切片染色、免疫組織染色、コロニー形成方法＞
培養１６日目に、角膜上皮細胞が物質透過膜に接着した状態で、常法に従い凍結包埋を実施した。凍結包埋した組織から, ミクロトームで厚さ１０ μｍの切片を作製した。作製した切片を用いて常法に従い、ヘマトキシリンーエオジン染色、核染色、免疫組織染色を行った。免疫組織染色には、抗pan-CK抗体（クローン名Kspan1-8）、抗ＣＫ３抗体（クローン名AE5）、抗クローディン１抗体（クローン名Ａ１０）、抗ｐ６３抗体（クローン名４Ａ４）を用いた。【００４３】
実施例１と比較例１においては、切片５枚よりp63陽性細胞数/全細胞数を求めて、p63陽性細胞率を算出した。コロニー形成率を求めるために、作製した細胞シートを、０．０５％トリプシン溶液を用いて細胞懸濁液として、その内２０００個の細胞を、あらかじめＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２×１０４／ｃｍ２  となるように播種した１０ｃｍディッシュに播種し、約１０日間ＫＣＭ培地にて培養した。【００４４】
（比較例１）
細胞培養容器を市販の６ウェル用セルカルチャインサート（開放系培養容器）とし、角膜上皮細胞の播種数を２×１０４／ｃｍ２、培養日数を１４日とした以外は具体例１と同様に実験を行った。【００４５】
（具体例１、比較例１の結果）
図１４は、その左側に示す具体例１、右側に示す比較例１それぞれにおける、（a）の位相差顕微鏡像と、（b）の細胞シート外観を示す図である。具体例１において、損傷なく細胞シートが剥離回収可能であった。【００４６】
図１５は細胞シートに含まれる細胞数を示す図である。具体例１は比較例１とほぼ同等の細胞数であり、有意差検定の結果、両者で有意差はなかった。【００４７】
図１６はその左側に具体例１、右側に比較例１における、角膜上皮組織切片のヘマトキシリンーエオジン（ＨＥ）染色像を示す図である。具体例１では、比較例１と同じく細胞層３層以上に重層化した角膜上皮組織が確認できる。【００４８】
図１７は同様にその左側に示す具体例１、右側に示す比較例１それぞれにおける、免疫組織染色像を示す図である。具体例１において、同図の（a）に示す上皮細胞に発現するＣＫタンパク質ファミリ（ＰａｎＣＫ）は全ての細胞で発現し、分化した角膜上皮細胞に発現するＣＫ３は同図の（b）に示すように、基底層以外での細胞で発現し、角膜上皮幹細胞・前駆細胞に発現するp63は、同図の（c）に示すように、基底層の細胞で発現し、上皮組織のバリア機能に必要な閉鎖結合タンパクであるクローディン１は、同図の（d）に示すように、最表層に発現しており、具体例１で作製した細胞シートは、角膜上皮組織として機能をもつことが確認できた。なお、図１７における各写真内部に示すバー（Bars）は５０μｍを示している。【００４９】
本実施例の細胞培養容器で作製した角膜上皮組織は、６ウェル用セルカルチャインサート（開放系培養容器）で作製したものと同等の品質を有することが求められる。図１４〜１７の結果から、具体例１で、比較例１と同等の品質を有し、十分に重層化した角膜上皮組織が作製できていることは明らかであり、本実施例の細胞培養容器は角膜上皮組織作製に適したものであることを示している。【００５０】
（具体例２）
＜閉鎖系培養容器への温度応答性高分子処理と角膜上皮細胞培養＞
閉鎖系培養容器の細胞培養表面に温度応答性高分子モノマーであるN-イソプロピルアクリルアミドを電子線重合させることで、温度応答性培養表面を作製した。本培養表面上での角膜上皮細胞の接着、脱着が正常になされることを確認した上で、具体例１同様に角膜上皮組織を作製した。【００５１】
＜角膜上皮細胞シートの剥離＞
培養１６日目に室温の新鮮な培養液に交換し、室温（約25℃）で３０分静置した。その後、支持膜として、ドーナツ状にカットした親水性PVDFメンブレン（ミリポア社製）を用いて、細胞シートを培養表面より剥離回収した。【００５２】
＜角膜上皮組織の組織切片作製、組織切片染色、免疫組織染色、コロニー形成方法＞
具体例１と同様に実施した。【００５３】
（比較例２）
細胞培養容器を温度応答性高分子処理済６ウェル用セルカルチャインサート（セルシード社製）とした以外は比較例１と同様に実験を行った。【００５４】
（具体例２、比較例２の結果）
図１８は、その左側に具体例２、右側に比較例２における、それぞれ剥離回収した細胞シートの外観を示す図である。具体例２で損傷なく剥離可能であった。【００５５】
図１９は、左側の具体例２、右側の比較例２における、それぞれ角膜上皮組織切片のヘマトキシリンーエオジン染色像（同図の（a））、および免疫組織染色像を示す図である。具体例２において、上皮細胞に発現するＣＫタンパク質ファミリは、同図の（b）に示すように、全ての細胞で発現し、分化した角膜上皮細胞に発現するＣＫ３は、同図の（c）に示すように基底層以外での細胞で発現し、上皮組織のバリア機能に必要な閉鎖結合タンパクであるクローディン１は、同図の（d）に示すように最表層に発現していた。【００５６】
図２０は、具体例２、比較例２において、角膜上皮組織切片上での角膜上皮幹細胞・前駆細胞の存在と陽性細胞率を示す図である。具体例２で、角膜上皮幹細胞・前駆細胞に発現するp63は、同図の（a）に示すように、基底層の細胞で発現し、陽性細胞率は、同図の（b）に示すように、具体例２と比較例２の間で有意な差はなく、両者共３０％以上であった。【００５７】
図２１は、具体例２、比較例２において、細胞シート中に含まれる角膜上皮幹細胞・前駆細胞に由来するコロニー検出像（同図の（a））、及びコロニー形成率（同図の（b））を示す図である。具体例２と比較例２の間で有意な差はなく両者共３％以上であった。
【実施例２】
【００５８】
図２２〜図２４により、第２の実施例の細胞培養容器の構成を説明する。【００５９】
＜細胞培養容器の構造＞
図２２は、第２の実施例における細胞培養容器の構造（断面図）の一例を示す図である。細胞培養容器４０は正方形の容器であって、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレンなどの可塑性と共に剛性有するプラスチックから成る。容器を構成する枠体３４と蓋部３５は射出成形などにより形成され、内部にインサート容器３６を挿入可能な構造となっている。インサート容器は市販のものでよく、ＢＤ社製、コーニング社製、グライナー社製などで、使用可能な製品は限定されない。蓋部３５もしくは枠体３４には、Ｏリングなどの弾性部材４１が設けられ、それにより外部からの気体や菌を含む粒子が混入しない。蓋部３５の枠体３４への接続は、蓋部３４および枠体３５に設けられたネジ山により固定できるが、これに限定されるものではない。【００６０】
枠体３４には、空気および水蒸気を注入および排出するための突起構造３８を有する流路３７が設けられている。流路３７の先端にチューブ４３が取り付けられる。この流路３７の枠体における位置は、容器内に導入する培養液の量によって変えるべきであるが、培養液面よりも上部であればよい。また枠体３４には、培養液をチューブ４３を介して、注入および排出するための突起構造を有する流路４２が設けられている。この流路４２は、枠体３４の底面と流路４２内径の最下部が同じ高さとなるように設置することが望ましい。そうすることで、培養液の効率的な排出を可能とする。培養液を全て交換する場合は、枠体３４を適宜傾ければよい。【００６１】
蓋部３５には、インサート容器内に培養液を注入および排出するための突起構造を有する流路３９が設けられている。この流路３９は、細胞観察に支障がないように配置されるのが好ましい。流路３９の長さは、インサート容器の底面に触れないような長さがよい。【００６２】
図２３は、図２２に示した模式図の立体図を示す。同図の（a）は斜視立体構造を、同図の（b）は断面立体構造を示している。図２４は本実施例の細胞培養容器を試作した試作品の外観を示す。同図の（a）は上部方向からの写真、同図の（b）は斜め方向からの写真を示している。再生組織の回収は、蓋部３５を枠体３４から外すことで容易に可能となる。
【実施例３】
【００６３】
図２５に第３の実施例の細胞培養容器の構成を示す。同図において、図２２と同一番号を有する部位は同一物を示している。
＜細胞培養容器の構造＞
図２５に示すように、１層培養の際は、基本構造は実施例２と同様であるが、流路なしの蓋部４４を新たに用いる細胞培養容器４５とすることにより、枠体４２の内部空間４６に蓄えられた培養液を用いて細胞培養が行われる。【００６４】
なお、第２、第３の実施例に係る細胞培養容器についても、先に図４を用いて説明した細胞培養装置に設置することにより、安全、安心に再生組織の作製が可能となる。【００６５】
以上詳述した種々の実施例の細胞培養容器、細胞培養装置によれば、突起に適合する内径を持つ弾性部材から成るチューブを、突起に直接接続することで、液漏れが全く発生せず、細胞培養容器内へ培養液の送廃液が可能となり、完全閉鎖系での細胞の自動培養が可能となる。完全閉鎖系で培養することで、細胞培養空間外からの微生物を含む粒子の侵入を抑制でき、安全、安心に細胞培養が実施できる。【００６６】
また、細胞培養終了後に細胞培養容器から培養液を排出する際に、細胞培養容器内に培養液回収用器具を挿入することなく培養液を排出できるため、細胞培養空間外からの微生物を含む粒子の侵入を抑制でき、培養後の細胞を安全に回収できる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、細胞培養容器と、それを用いる細胞培養装置として有用である。
【符号の説明】
【００６８】
１…細胞培養容器
２…枠体
３、４及び５…円部
６…ガス透過膜
７…物質透過膜
８…ガス透過膜
９…突起構造部
１０…チューブ
１１及び１２…突起構造部
１４…培養液流路
１５…細胞培養装置
１６…培養ステージ
１７…回転運動の駆動部
１８…送液管
１９…廃液管
２０…制御部
２１…培養液保管部
２２…廃液収容部
２３…保冷庫
２４…ＸＹＺ可動軸
２５…細胞観察用機器
２６…チューブを閉鎖する部材
２８…培養液保持部
３４…枠体
３５…蓋部
３６…インサート容器
３７、３９、４２…流路
３８…突起
４０、４５…細胞培養容器
４１…弾性部材
４３…チューブ
４４…蓋部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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