(57)【要約】【課題】  本願発明は、ＴＤＭ／ＴＤＢの宿主受容体の特定によって、ワクチンアジュバントの設計に関連する有用な情報がもたらされ、合成のＭｉｎｃｌｅリガンドによって、結核、他の感染性疾患および癌に対する有効なワクチン接種が可能となるアジュバンドのスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  アジュバンドとしてのマイコバクテリア糖脂質ＴＤＭや合成ＴＤＭのスクリーニング方法であって、マイコバクテリア糖脂質ＴＤＭや合成ＴＤＭのアジュバンドレセプターをＭｉｎｃｌｅとしスクリーニングすることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバンドとしてのマイコバクテリア糖脂質ＴＤＭのスクリーニング方法であって、マイコバクテリア糖脂質ＴＤＭのアジュバンドレセプターをＭｉｎｃｌｅとしスクリーニングすることを特徴とするアジュバンドのスクリーニング方法。
【請求項２】
アジュバンドとしての合成ＴＤＭのスクリーニング方法であって、合成ＴＤＭのアジュバンドレセプターをＭｉｎｃｌｅとしスクリーニングすることを特徴とするアジュバンドのスクリーニング方法。
【請求項３】
前記合成ＴＤＭはＴＤＢであることを特徴とする請求項２記載のアジュバンドのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭｉｎｃｌｅがマイコバクテリアＴＤＭの直接の受容体であり、ＴＤＭ依存性の炎症性応答の必須の受容体であることの発見に基づく、Ｍｉｎｃｌｅを利用した新規なアジュバンドのスクリーニング方法に関する。
本出願は、２００９年１１月３０日出願の米国仮出願６１／２６４，９５５の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【背景技術】
【０００２】
結核は、宿主免疫系に影響を及ぼす種々な構成成分を持つＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）によって生じる致死的疾患である。構成成分の中でも、トレハロース−６，６’−ジマイコレート（ＴＤＭ）は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞壁の糖脂質であり、様々な免疫反応を惹起することが知られている。ＴＤＭは半世紀ほど前から研究されている分子であるにも関わらず、直接認識する受容体は未だに明確には特定できていない。【０００３】
多くの病原体は、宿主細胞のトール様受容体（ＴＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様ヘリカーゼ（ＲＬＨ）またはＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）などのパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって直接認識され、そのほとんどが病原体の特徴的な成分を検知する。近年では、Ｃ型レクチンファミリーのいくつかの分子も細菌または真菌のＰＲＲとして特定されている。しかし、ほとんどのＣ型レクチン受容体のリガンドはまだ特定されていない。
Ｃ型レクチン受容体の中でも、Ｍｉｎｃｌｅ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ）は、Ｃｌｅｃ４ｅまたはＣｌｅｃｓｆ９とも呼ばれ、様々なストレスにさらされたマクロファージで発現する（非特許文献１）。Ｍｉｎｃｌｅは細胞外領域に糖認識ドメイン（ＣＲＤ）を保有する。本発明者等は最近、Ｍｉｎｃｌｅがチロシンキナーゼ型免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を持つＦｃ受容体γ鎖（ＦｃＲγ）と会合しており、損傷を受けた自己および非自己の病原性真菌の活性化受容体として機能することを報告している（非特許文献２；非特許文献３）。
結核は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって生じ、これは世界の人口のうち１／３が感染している。Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、同定された受容体および同定されてない受容体の両方を介して宿主の免疫系に影響を及ぼす様々な構成成分を含んでいる。これらのうち、コードファクターは、マイコバクテリア感染の特徴である、肺炎を誘発する場合があることが特定された最初の免疫刺激性成分である。１９５６年には、コードファクターの化学的構造として、マイコバクテリア細胞壁における最も豊富な糖脂質である、トレハロース−６，６’−ジマイコレート（ＴＤＭ）が同定された（非特許文献４）。ＴＤＭの長鎖脂質は、宿主細胞のファゴソーム内のマイコバクテリアの生存に重要である疎水性細胞壁の構造的成分に相当する（非特許文献５）。ＴＤＭは肉芽腫発生、細胞を介する免疫応答のアジュバント活性、ホルモン応答および腫瘍抑制などの固有の免疫刺激性活性を持つことが明らかになっている（非特許文献６）。近年、ＭａｒｃｏおよびＴＬＲがＴＤＭ受容体であると言われているが（非特許文献７）、一方で他のグループは、ＦｃＲγと会合する受容体が候補であることを示唆している（非特許文献８）。従って、ＴＤＭの受容体は依然として議論の余地がある。
いくつかのＣ型レクチンがＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの認識に関与している（非特許文献９）。マクロファージで発現されたマンノース受容体（ＭＲ）は、マイコバクテリアの食作用を介していることが報告されている。別のＣ型レクチン受容体であるＤＣ−ＳＩＧＮはマイコバクテリアを認識することが知られているが、その会合の結果、樹状細胞を介する免疫応答において下方制御が生じる。デクチン−１は、未知のリガンドを通してマイコバクテリアを認識することが報告されている。他のＣ型レクチンは、マイコバクテリアを認識できる可能性があるが、マクロファージ中のマイコバクテリアの活性化レクチン受容体は、明確には特定されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Matsumoto, M. et al. 1999. A novel LPS-inducible C-type lectin is a transcriptional target of NF-IL6 in macrophages. J Immunol. 163:5039-48.
【非特許文献２】Yamasaki, S. et al. 2008. Mincle is an ITAM-coupled activating receptor that senses damaged cells. Nat Immunol. 9:1179-88.
【非特許文献３】Yamasaki, S. et al. 2009. C-type lectin Mincle is an activating receptor for pathogenic fungus, Malassezia. Proc Natl Acad Sci USA. 106: 1 897-902.
【非特許文献４】Noll, H. et al. 1956. The chemical structure of the cord factor of Mycobacterium tuberculosis. Biochim Biophys Acta. 20:299-309.
【非特許文献５】Indrigo, J. et al. 2002. Influence of trehalose 6,6'-dimycolate (TDM) during mycobacterial infection of bone marrow macrophages. Microbiology. 148:1991 -8.
【非特許文献６】Hunter, R.L. et al. 2006. Multiple roles of cord factor in the pathogenesis of primary, secondary, and cavitary tuberculosis, including a revised description of the pathology of secondary disease. Ann Clin Lab Sci. 36:371-86.
【非特許文献７】Bowdish, D.M. et al. 2009. MARCO, TLR2, and CD14 are required for macrophage cytokine responses to mycobacterial trehalose dimycolate and Mycobacterium tuberculosis. PLoSPathog. 5:e1000474.
【非特許文献８】Werninghaus, K. et al. 2009. Adjuvanticity of a synthetic cord factor analogue for subunit Mycobacterium tuberculosis vaccination requires FcRgamma-Syk-Card9-dependent innate immune activation. J Exp Med. 206:89-97.
【非特許文献９】Jo, E.K. 2008. Mycobacterial interaction with innate receptors: TLRs, C-type lectins, and NLRs. Curr Opin Infect Dis. 21:279-86.
【非特許文献１０】Numata, F. et al. 1985. Lethal and adjuvant activities of cord factor (trehalose-6,6'- dimycolate) and synthetic analogs in mice. Chem Pharm Bull (Tokyo). 33:4544-55.
【非特許文献１１】Guidry, T.V. et al. 2004. Failure of CD1D-/- mice to elicit hypersensitive granulomas to mycobacterial cord factor trehalose 6,6'-dimycolate. J Interferon Cytokine Res. 24:362-71.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、ＭｉｎｃｌｅがマイコバクテリアＴＤＭの直接の受容体であることと、さらに、Ｍｉｎｃｌｅ欠損マウスを通じて、ＭｉｎｃｌｅがＴＤＭ依存性の炎症性応答の必須の受容体であることを実証することにより、新規なアジュバンドのスクリーニング方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明者等は、Ｃ型レクチンＭｉｎｃｌｅがＴＤＭに必須の受容体であることを実証した。即ち、加熱殺菌したマイコバクテリアはＭｉｎｃｌｅ発現細胞を活性化したが、その活性は細菌の脱脂の際に失われた。脂質抽出物の分析によってＴＤＭはＭｉｎｃｌｅのリガンドとして特定された。ＴＤＭにより活性化され、Ｍｉｎｃｌｅ欠損のマクロファージでは完全に抑制される炎症性サイトカインおよび一酸化窒素を産生した。インビボにおけるＴＤＭ投与は、血清中の炎症性サイトカインの上昇および肉芽腫形成などの特徴的な肺の炎症を誘発した。しかし、Ｍｉｎｃｌｅ欠損のマウスではＴＤＭ誘導性の肺肉芽腫は形成されなかった。マイコバクテリア死菌では、ＭｙＤ８８欠損マクロファージを活性化できたが、Ｍｉｎｃｌｅ／ＭｙＤ８８の二重欠損のマクロファージでは活性化は有意に低減された。これらの結果によってＭｉｎｃｌｅは、マイコバクテリア糖脂質ＴＤＭに必須の受容体であることが実証された。【０００７】
本発明のアジュバンドのスクリーニング方法は、かかる知見に基づきなされたもので、請求項１記載の通り、アジュバンドとしてのマイコバクテリア糖脂質ＴＤＭのスクリーニング方法であって、マイコバクテリア糖脂質ＴＤＭのアジュバンドレセプターをＭｉｎｃｌｅとしスクリーニングすることを特徴とする。
また、本発明のアジュバンドのスクリーニング方法は、請求項２記載の通り、アジュバンドとしての合成ＴＤＭのスクリーニング方法であって、合成ＴＤＭのアジュバンドレセプターをＭｉｎｃｌｅとしスクリーニングすることを特徴とする。
また、請求項３記載のアジュバンドのスクリーニング方法は、請求項２記載のアジュバンドのスクリーニング方法において、前記合成ＴＤＭはＴＤＢであることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＴＤＭ／ＴＤＢの宿主受容体の特定によって、ワクチンアジュバントの設計に関連する有用な情報がもたらされる。様々なＭｉｎｃｌｅリガンドの論理的なスクリーニングが実現可能であり、かつ理想的な合成アジュバントの開発をもたらし得る可能性があり、このような合成のＭｉｎｃｌｅリガンドによって、結核、他の感染性疾患および癌に対する有効なワクチン接種が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、Ｍｉｎｃｌｅはマイコバクテリア種を認識することを示したグラフ（Ａ〜Ｆ）である。
【図２】図２は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ変異体におけるホスファチジルイノシトールマンノシド（ＰＩＭ）の概略的な構造を示す模式図である。
【図３】図３は、マイコバクテリアの脱脂の工程図（Ａ）と、Ｍｉｎｃｌｅがマイコバクテリアのトレハロース−６，６’−ジマイコレートを認識することを示したグラフ（Ｂ〜Ｄ）である。
【図４】図４は、ＴＤＭの化学的構造の模式図（Ａ）と、精製されたＴＤＭがＭｉｎｃｌｅによって認識されることを示すグラフ（Ｂ〜Ｈ）である。
【図５】図５は、マイコバクテリアと宿主免疫との間の進化的闘争の仮説の概略図である。
【図６】図６は、Ｍｉｎｃｌｅ欠損マクロファージにおけるＴＤＭ媒介性活性化の欠失を示すグラフ（Ａ〜Ｄ）である。
【図７】図７は、ＭｉｎｃｌｅはインビボでのＴＤＭ誘導性炎症に必須であることを示すグラフ（Ａ〜Ｃ，Ｅ）と、写真（Ｄ）である。
【図８】図８は、Ｍｉｎｃｌｅ欠損マウスでのＴＤＭ誘導性肺炎症の欠失を示す写真である。
【図９】図９は、Ｍｉｎｃｌｅ欠損マウスにおけるＴＤＭによる胸腺萎縮を示すグラフ（Ａ）と、写真（Ｂ）である。
【図１０】図１０は、Ｍｉｎｃｌｅが抗マイコバクテリア応答のＴＬＲ非依存性経路を担うことを示すグラフ（Ａ，Ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜Ｍｉｎｃｌｅはマイコバクテリアを認識し得ることの実証＞
まず、以下に、Ｍｉｎｃｌｅはマイコバクテリアを認識し得ることを説明する。
図１は、Ｍｉｎｃｌｅはマイコバクテリア種を認識することを示したグラフである。
図１中、Ａ〜Ｃは、ＦｃＲγのみ（ＦｃＲγ）、Ｍｉｎｃｌｅ＋ＦｃＲγ、およびＭｉｎｃｌｅＥＰＮ→ＱＰＤ＋ＦｃＲγを発現するＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞を、加熱殺菌したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ａ）、Ｍ．ｂｏｖｉｓ（Ｂ）、またはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ（Ｃ）とともに１８時間同時培養し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導をフローサイトメトリーによって分析した結果を示すグラフである。
図１中Ｄは、デクチン−２＋ＦｃＲγを発現するレポーター細胞をＭ．Ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｃ．ａ．）とともに１８時間同時培養し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導をフローサイトメトリーによって分析した結果を示すグラフである。
図１中Ｅは、Ｍｉｎｃｌｅ＋ＦｃＲγを発現するレポーター細胞を、１×１０７個のｓｍｅｇｍａｔｉｓと一緒に抗Ｍｉｎｃｌｅ  ｍＡｂおよびラットＩｇＧ１存在下で１８時間同時培養し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導をフローサイトメトリーによって分析した結果を示すグラフである。
図１中Ｆは、細胞を、野性型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ＷＴ）、ｐｉｍＥ欠損Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ΔｐｉｍＥ）およびｐｉｍＥで再構成されたｐｉｍＥ欠損Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ΔｐｉｍＥ＋ｐｉｍＥ）とともに１８時間同時培養し、ＮＦＡＴ−ＧＦＰの誘導をフローサイトメトリーによって分析した結果を示すグラフである。
尚、全てのデータは、３つのアッセイについての平均±ＳＤであって、同様の結果であった３つの独立した実験からの代表的な結果を示すものである。
【００１１】
本発明者等は、Ｍｉｎｃｌｅが、Ｍｉｎｃｌｅおよびそのシグナル伝達サブユニットＦｃＲγ鎖を発現するＮＦＡＴ駆動ＧＦＰレポーター細胞の使用を通じてマイコバクテリアを認識するか否かをまず検討した。
加熱殺菌されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧはＭｉｎｃｌｅとともにＦｃＲγを発現するレポーター細胞で明らかにＮＦＡＴ−ＧＦＰを活性化した（図１Ａおよび図１Ｂ）。重要なことに、毒性株Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖは、また、Ｍｉｎｃｌｅに対してかなりのリガンド活性を示した（図１Ｃ）。
Ｍｉｎｃｌｅによるマイコバクテリアの認識には、ＣＲＤ内の推定のマンノース結合モチーフであるＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ（ＥＰＮ）配列を要することが示された。なぜなら、ＱＰＤへＥＰＮの変異（ＭｉｎｃｌｅＱＰＤ）を導入することによってその活性が排除されたからである（図１Ｂおよび図１Ｃ）。しかし、同様のＩＴＡＭカップリングＣ型レクチンであるデクチン−２は、マイコバクテリアを認識できず（図１Ｄ）、このことはＭｉｎｃｌｅの特異的な認識を示唆している。実際、マイコバクテリアによるＮＦＡＴの活性化は、抗ＭｉｎｃｌｅｍＡｂの存在下で完全にブロックされた（図１Ｅ）。
Ｍｉｎｃｌｅ内の推定のマンノース結合モチーフは認識プロセスに必須であるので（図１Ｂおよび図１Ｃ）、本発明者等は最初、Ｍｉｎｃｌｅが、ホスファチジルイノシトールマンノシド（ＰＩＭ）、リポマンナン（ＬＭ）またはリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）などのマイコバクテリア分子の末端α１，２マンノース残基を認識できると仮定した。ＰＩＭの寄与を試験するために、末端α１，２マンノース残基を欠いているマイコバクテリアの変異株を用いた。
【００１２】
尚、図２に示すように、マンノシル−トランスフェラーゼＰｉｍＥの欠失変異体であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓΔｐｉｍＥは、成熟ＰＩＭを欠いている。図２は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ変異体におけるホスファチジルイノシトールマンノシド（ＰＩＭ)の概略的な構造を示すもので、野性型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ＷＴ）（右側）およびｐｉｍＥ欠損Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（ΔｐｉｍＥ）（左側）のＰＩＭ構造を示し、ΔｐｉｍＥは、ＰＩＭのα１，２−マンノース部分を欠くことを示したものである。
【００１３】
しかし、ΔｐｉｍＥはやはり、野性型Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびｐｉｍＥ再構成ΔｐｉｍＥ株などのＰｉｍＥ充足株に匹敵するレベルで刺激活性を保持していた（図１Ｆ）。さらに、ＬＭおよびＬＡＭのα１，２マンノース残基を欠く変異体Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ株は、Ｍｉｎｃｌｅによって正常に認識され得、かつ精製されたＬＡＭ単独では、Ｍｉｎｃｌｅ発現細胞を活性化しなかった。
これらの結果、マイコバクテリアは、Ｍｉｎｃｌｅによって認識できるが、それらのα１，２マンノース含有糖脂質は、認識が生じるのに必須ではないと考えられるということが示される。
【００１４】
＜Ｍｉｎｃｌｅによって認識されたマイコバクテリア糖脂質の特定＞
次ぎに、Ｍｉｎｃｌｅによって認識されたマイコバクテリア糖脂質の特定について説明する。
図３は、Ｍｉｎｃｌｅはマイコバクテリアのトレハロース−６，６’−ジマイコレートを認識することを示すグラフである。
図３中、Ａは、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの脱脂の概略図であり、脱脂した細菌（白抜きの四角内に示した沈殿物）および脂質抽出物（白抜きの四角内に示した上澄み）を、それぞれリガンドアッセイに加えた。
図３Ｂは、クロロホルム／メタノール（Ｃ：Ｍ）、ヘキサン、アセトンまたは１−ブタノール（ＢｕＯＨ）で処理し、図３Ｃは、プレートコーティング脂質抽出物で処理し、ともに、加熱殺菌したＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを、Ｍｉｎｃｌｅ＋ＦｃＲγを発現するレポーター細胞とともに同時培養した結果を示すものである。
図３Ｄは、Ｃ：Ｍ抽出物のＣ：Ｍ相をＨＰＴＬＣによって分析して、２２の小画分に分け、各々の小画分をプレート上にコーティングして、レポーター細胞を刺激した結果を示すものである。精製されたＴＤＭを参照として用いた（右のレーン）。矢印は、もと、および溶媒の正面を示す。データは３つのアッセイについての平均±ＳＤ（Ｂ、Ｃ）または２つのアッセイについての平均（Ｄ）である。同様の結果である３つの独立した実験からの代表的な結果を示す。
【００１５】
マイコバクテリアはそれらの細胞壁に固有の脂質を豊富に有し、そのいくつかはおそらく宿主の防御システムからその細菌を防御する。他のマイコバクテリアの脂質の、Ｍｉｎｃｌｅのリガンドの可能性のある候補としての寄与を試験するために、種々の有機溶媒を用いてＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓから脂質を抽出した（図３Ａ）。レポーター細胞を用いてクロロホルム：メタノール（Ｃ：Ｍ）で処理したＭ．Ｓｍｅｇｍａｔｉｓでのみ、そのＭｉｎｃｌｅ刺激活性を失っていた（図３Ｂ）。同時に、抽出された脂質画分の活性をプレートコーティングにより刺激を加えて分析したところ、クロロホルム：メタノール（Ｃ：Ｍ）抽出後のクロロホルム：メタノール（Ｃ：Ｍ）相のみが強力な刺激活性を示したことを見出した（図３Ｃ）。さらに、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）によってこの活性な画分を分析し、２２の小画分に分けて、活性な脂質の成分を特定した。これらの小画分から精製された抽出物は、小画分番号７〜９でピークになる強力なリガンド活性を示した（図３Ｄ）。オルシノール染色によって、小画分番号７〜９に相当する位置で紫−赤色のバンドが明らかになり（図３Ｄ、左のレーン）、このことは、このリガンドが糖部分を含むことを示していた。さらに、この紫−赤色のバンドは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の精製ＴＤＭの位置と同様の位置まで移動した（図３Ｄ、右のレーン）。これらの特徴から、本発明者等は、ＴＤＭがＭｉｎｃｌｅのリガンドであると仮定した。小画分番号２はまた、弱い活性を示し、このことはＴＤＭ生合成の前駆体であるトレハロースモノマイコレート（ＴＭＭ）も前に示唆されたとおり弱いリガンドとして作用し得ることを意味する。
【００１６】
＜ＭｉｎｃｌｅのリガンドとしてのＴＤＭ＞
次ぎに、ＭｉｎｃｌｅのリガンドとしてのＴＤＭについて説明する。
図４は、精製されたＴＤＭはＭｉｎｃｌｅによって認識されることを示す図面とグラフである。
図４Ａは、ＴＤＭの化学的構造を模式的に示すもので、図示するα−マイコレート、図示しないが、メトキシ−マイコレートおよびケト−マイコレートは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＴＤＭで見出されるマイコレートの主な小分類である。
図４Ｂは、レポーター細胞を、示した量のプレートコーティングＴＤＭで、図４Ｃは、同様にＴＤＢで刺激した結果を示す。
図４Ｄは、レポーター細胞を、示した量のＴＤＭ、メチルα−マイコレート（α−マイコレート）、またはメチルケト−マイコレート（ケト−マイコレート）を用いて刺激した結果を示す。
図４Ｅは、レポーター細胞を、示した量のＴＤＭ、およびＴＭＭを用いて刺激した結果を示す。
図４Ｆは、Ｍｉｎｃｌｅ−ＩｇによるＴＤＭのＥＬＩＳＡベースの検出結果を示す。ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｉｇ）、Ｍｉｎｃｌｅ−Ｉｇおよびデクチン２−Ｉｇを、０．１ｎｍｏｌ／０．３２ｃｍ２のプレートコーティングしたＴＤＭとともにインキュベートし、結合したタンパク質を抗ｈＩｇＧ−ＨＲＰを用いて、続いて発色基質の添加によって検出した。
図４Ｇは、Ｍｉｎｃｌｅ−IｇによるＴＤＭ認識に対する、トレハロース（１００μｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）、ラットＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）および抗Ｍｉｎｃｌｅ  ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）の効果を示すものである。ＥＬＩＳＡベースの検出を前記図４Ｅの通り行った。
図４Ｈは、レポーター細胞を、後記する通り、トレハラーゼで処理したＴＤＭを用いて刺激し、細胞はまた、負のコントロールとしてトレハラーゼで処理してプレートコーティングした抗Ｍｉｎｃｌｅ  ｍＡｂを用いて刺激した結果を示す。全てのデータは３連のアッセイについての平均±ＳＤであり、同様の結果である３つの独立した実験からの代表的な結果を示す。
【００１７】
実際、本発明者等は、精製されたＴＤＭ（その構造は図４Ａに示す）が、Ｍｉｎｃｌｅ発現細胞を劇的に活性化したことをプレートコーティングにより刺激を加えて見出した（図４Ｂ）。ＴＤＭの類似体であるトレハロースジベヘナート（ＴＤＢ）（合成アジュバントとしても用いられる）もやはり、Ｍｉｎｃｌｅの強力なリガンドであった（図４Ｃ）。
ＴＤＭは、トレハロース部分および２つのマイコレート鎖から構成されるが（図４Ａ）、精製されたマイコレートそれ自体は、Ｍｉｎｃｌｅ発現細胞を活性化しなかった（図４Ｄ）。トレハロースモノマイコレート（ＴＭＭ）がまたリガンド活性を保有するか否かを試験するため、本発明者等は、ＴＤＭの部分的アルカリ脱アシル化によってＴＭＭを作製した。図４Ｅに示されるとおり、ＴＭＭは、ＴＤＭほど強力ではないが、Ｍｉｎｃｌｅ発現細胞を潜在的に活性化可能であった。可溶性のトレハロースは、刺激活性がなく、大過剰のトレハロースは、ＴＤＭ媒介性ＮＦＡＴ活性化をブロックしなかった。従って、糖部分および脂質部分の両方の組み合わせがＴＤＭのリガンド活性に重要であると考えられる。
次に、ＭｉｎｃｌｅとＴＤＭとの間の直接の相互作用を確認するために、可溶性のＭｉｎｃｌｅタンパク質（Ｍｉｎｃｌｅ−Ｉｇ）を調製した。抗ｈＩｇＧによって検出されるとおり、Ｉｇまたはデクチン２−Ｉｇなどの他のコントロールのタンパク質ではなくＭｉｎｃｌｅ−Ｉｇは、プレートコーティングしたＴＤＭに選択的に結合する（図４Ｆ）。この生化学的データは、ＴＤＭが直接のＭｉｎｃｌｅリガンドであるというさらなる証明となる。この結合は、ＥＤＴＡおよび抗Ｍｉｎｃｌｅ  ｍＡｂによってブロックされたが、過剰のトレハロースによってはブロックされず、このことはＭｉｎｃｌｅが特定の糖脂質構造を陽イオン依存性の方式で認識することを示唆している（図４Ｇ）。
マイコバクテリア細胞壁のＴＤＭは、宿主細胞環境でグルコースモノマイコレート（ＧＭＭ）に変換できるということが近年提唱されている。この変換はマイコバクテリアがＭｉｎｃｌｅ媒介性認識から逃げるのに有利であり得るという仮説を試験するために、トレハロースを２つのグルコース単位に加水分解するトレハラーゼを用いることによってインビトロでこの変換を模倣しようと試みた。興味深いことに、トレハラーゼ処理は、ＴＤＭのリガンド活性を損なった（図４Ｈ）。プレートコーティングした抗Ｍｉｎｃｌｅ  ｍＡｂによる刺激はトレハラーゼ処理によって影響されることがなかったので、この酵素的処理は、Ｍｉｎｃｌｅ媒介性の応答を著しく破壊しなかったということに注意する必要がある（図４Ｈ）。
【００１８】
前記知見は、マイコバクテリアが宿主への感染の際にＴＤＭをＧＭＭに変換して、おそらくＭｉｎｃｌｅ媒介性の宿主免疫から逃避するという概念と一致している（図５）。
図５は、マイコバクテリアと宿主免疫との間の仮説的な進化的闘争の概略図を示す。
図５に沿って説明すれば、ナイーブなマイコバクテリアは、それらが人間の体内に最初に侵入するとき、細胞壁に豊富なトレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）を有する（１．侵入）。ＭｉｎｃｌｅはＴＤＭを認識し、炎症性サイトカインおよび一酸化窒素の産生を誘導して、マイコバクテリウムに対する先天性免疫を惹起する（２．先天性免疫）。感染の際、マイコバクテリアは、それらの細胞壁ＴＤＭを、Ｍｉｎｃｌｅに認識されないグルコースモノマイコレート（ＧＭＭ）に変換する（３．逃避）。ＧＭＭは、ＣＤ１ｂ上に存在して（４．提示）、マイコバクテリアに対するＴ細胞媒介性の後天性免疫を誘導し得る（５．後天性免疫）。
【００１９】
興味深いことに、潜在的なカウンター防御として、宿主細胞はヒトにおいて第１群のＣＤ１分子上にこのＧＭＭを提示して、マイコバクテリアに対するＴＣＲ媒介性の後天性の免疫応答を誘導するということも報告されている。重要なことに、本発明者等は、ＴＤＭがヒトのＭｉｎｃｌｅおよびマウスのＭｉｎｃｌｅで認識されることを見出した。
以上の結果から、種々のマイコバクテリア成分のうちでも、Ｍｉｎｃｌｅはトレハロースに対する脂肪酸のエステル結合に特異的であることが示唆される。
【００２０】
＜ＭｉｎｃｌｅはＴＤＭ依存性のマクロファージ活性化に必須である＞
次ぎに、ＭｉｎｃｌｅはＴＤＭ依存性のマクロファージ活性化に必須であることを説明する。
図６は、Ｍｉｎｃｌｅ欠損マクロファージにおけるＴＤＭ媒介性活性化の欠失を示すものである。
図６Ａは、Ｍｉｎｃｌｅ＋／−（Ｍｉｎｃｌｅ野生型）およびＭｉｎｃｌｅ−／−（Ｍｉｎｃｌｅ欠損）由来の骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）を、ＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いてプライムして、プレートコーティングしたＴＤＭまたはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）をコントロールとして用いて刺激し、培養上清を４８時間で収集し、一酸化窒素の濃度を測定した結果を示すものである。
図６Ｂは、ＩＦＮγでプライムしたＢＭＭφを、プレートコーティングしたＴＤＭを用いてＡの通り３６時間刺激し、ｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲによって分析した結果を示すものである。
図６Ｃは、ＩＦＮγプライムしたＢＭＭφをプレートコーティングしたＴＤＭ、図６Ｄは、ＴＤＢを用いて、２４時間刺激し、培養上清を収集して、ＴＮＦおよびＭＩＰ−２の濃度を測定したもので、これらの濃度はＥＬＩＳＡによって決定した。
全てのデータは、３つのアッセイについての平均±ＳＤであり、同様の結果である３つの独立した実験からの代表的な結果を示す。
【００２１】
ＴＤＭはまた、マクロファージを活性化して、マイコバクテリアの直接的な殺傷に重要である一酸化窒素（ＮＯ）を生じる。しかし、Ｍｉｎｃｌｅ−／−マクロファージではＮＯ産生はほとんど完全に抑制された（図６Ａ）。対照的に、ＬＰＳはＭｉｎｃｌｅ−／−細胞においてＷＴ（野性型）細胞の応答と同様の応答を誘導した。誘導性ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）はＮＯの産生を担う酵素である。ＴＤＭ刺激によるｉＮＯＳの転写誘導もまたＭｉｎｃｌｅ−／−マウスではほとんど完全に抑制された（図６Ｂ）。
己免疫疾患のための抗ＴＮＦ療法の際、潜伏的な結核感染の再活性化を被っている患者がいることから、ＴＮＦがあらためて重要であることが明らかになってきている。ＴＤＭ刺激は、ＴＮＦおよびＭＩＰ−２（ＣＸＣＬ２とも呼ばれる）（炎症性細胞の強力な化学誘引物質因子である）の産生を誘導した。しかし、これらのサイトカインは、Ｍｉｎｃｌｅの非存在下ではＴＤＭ刺激の際に産生されなかった（図６Ｃ）。同様に、トレハロースジベヘネート（ＴＤＢ）誘導性のサイトカイン産生はまた、Ｍｉｎｃｌｅ−／−マクロファージでは排除された（図６Ｄ）。
本発明者等は以前、ＭｉｎｃｌｅがＦｃＲγ−ＣＡＲＤ９シグナル伝達系を通じてシグナルを伝達することを報告した（非特許文献２）。これらの観察と一致して、ＴＤＭおよびＴＤＢは、マクロファージをＦｃＲγおよびＣＡＲＤ９依存的に活性化することが最近報告された（非特許文献８）。従って、Ｍｉｎｃｌｅは、ＴＤＭおよびＴＤＢによって誘導されたマクロファージ活性化に必須の受容体である。
【００２２】
＜ＴＤＭ誘導性肺肉芽腫形成にはＭｉｎｃｌｅを要する＞
ＴＤＭ誘導性肺肉芽腫形成にはＭｉｎｃｌｅを要することを説明する。
図７は、ＭｉｎｃｌｅはインビボでのＴＤＭ誘導性炎症に必須であることを示すグラフである。
図７Ａは、Ｍｉｎｃｌｅ＋／＋（Ｍｉｎｃｌｅ野生）、Ｍｉｎｃｌｅ−／−、ＦｃＲγ−／−およびＭｙｄ８８−／−のマウスを、ＴＤＭを含有する水中油型エマルジョンで静脈内注射し（１５０μｇ）、また、ＴＤＭなしのエマルジョンをコントロールとして注射し、注射の１日後、血清中のＩＬ−６およびＴＮＦの濃度をＥＬＩＳＡによって決定した結果を示すグラフである。各々の記号は、個々のマウスに相当する。
図７Ｂは、ＴＤＭ注射したマウスの肺を７日目に取り出して、炎症強度を肺重量係数（ＬＷＩ）の算出によって評価した結果を示すグラフである。
図７Ｃは、ＴＤＭ投与後７日目の肺の炎症促進性メディエーターのｍＲＮＡのレベルをリアルタイムＰＣＲによって評価した結果を示すグラフである。相対発現レベルは２−Ｃｔとして示す。各々の記号は、個々のマウスに相当し、Ｃｔはサイクル閾値、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．００１、ＮＳは有意差なしを示す。
図７Ｄは、未処理（コントロール）マウスおよびＴＤＭ注射した（ＴＤＭ）マウス由来の肺の組織学を、７日目にＨＥ染色によって検査した結果を示す写真である。スケールバーは０．１ｍｍを示す。
図７Ｅは、肺肉芽腫の数。ＴＤＭ注射したマウス由来の肺の肉芽腫を、後記する材料および方法に記載のようにカウントした結果を示すグラフである。
データは、少なくとも３匹の独立したマウスについての平均±ＳＤである。同様の結果である２つの独立した実験からの代表的な結果を示す。
【００２３】
ＴＤＭのインビボ投与によって、結核の特徴である炎症性の症状を誘発できることが知られている。マウスへのＴＤＭの注射によって、血清中でＩＬ−６およびＴＮＦなどの炎症性サイトカインの力強い産生が誘導された。しかし、これらは、Ｍｉｎｃｌｅ−／−マウスでは完全に排除された（図７Ａ）。ＦｃＲγはＭｉｎｃｌｅに必須のシグナル伝達サブユニットである。実際、ＦｃＲγ−／−マウスはインビボでＴＤＭに対して検出可能な応答はしなかった（図７Ａ）。対照的に、ＴＤＭはＭｙＤ８８−／−マウスではサイトカイン産生を誘導可能であって、このことはＴＬＲがＴＤＭ認識に必須ではないことを示唆している（図７Ａ）が、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の潜在的な役割が提唱されている。ＴＤＭはまた肺重量係数（ＬＷＩ）によって評価される炎症性肺腫脹を誘発するが、これは主にＭｉｎｃｌｅ−ＦｃＲγ系に依存性であった（図７Ｂおよび図８）。急性の肺炎症と呼応して、ＴＤＭ治療の際の炎症性サイトカイン／ケモカインのｍＲＮＡの上方制御はＭｉｎｃｌｅ−／−マウスでは重度に損なわれた（図７Ｃ）。さらに、ＴＤＭは、マウスで胸腺萎縮を誘発し、Ｍｉｎｃｌｅ依存性であった（図９）。
【００２４】
尚、図８は、Ｍｉｎｃｌｅ−／−マウスでのＴＤＭ誘導性肺炎症の欠失を示す写真である。Ｍｉｎｃｌｅ＋／＋マウスおよびＭｉｎｃｌｅ−／−マウスを未処置か（コントロール）、またはＴＤＭ含有の水中油型エマルジョンを静脈内注射し（ＴＤＭ)、肺を注射の７日後にヘマトキシリン−エオシン染色にかけた写真である。スケールバーは１ｍｍを示す。
また、図９は、Ｍｉｎｃｌｅ−／−マウスでの損なわれたＴＤＭ誘導性の胸腺委縮を示すグラフと写真である。Ｍｉｎｃｌｅ＋／＋マウスおよびＭｉｎｃｌｅ−／−マウスにＴＤＭ（１５０μｇ）含有の水中油型エマルジョンを静脈内注射し、図９Ａは、総胸腺細胞数を注射の７日後に分析した結果を示し、図９Ｂは、胸腺細胞を、抗ＣＤ４アロフィコシアニンおよび抗ＣＤ８フィコエリトリンを用いてフローサイトメトリーによって分析し、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ胸腺細胞の割合を示す写真である。
【００２５】
肉芽種は免疫細胞の複雑な集合体であって、感染する細菌を物理的に囲むことによってマイコバクテリア感染を制限すると広く考えられている。ＴＤＭ単独で、投与７日後にマイコバクテリア感染の特徴的な肉芽種形成を劇的に誘導した（図７Ｄ）。注目すべきことに、ＴＤＭ治療したＭｉｎｃｌｅ−／−マウスの肺では肉芽種形成は観察されなかった（図７Ｄ）。多数の切片での定量的分析によって、肉芽種はＭｉｎｃｌｅ−／−マウスおよびＦｃＲγ−／−マウスでは完全に排除されたが、ＭｙＤ８８−／−マウスでは正常に誘発されたことが明らかになった（図７Ｅ）。従って、Ｍｉｎｃｌｅは、炎症性サイトカイン／ケモカインの産生を通じて炎症性細胞を補充する可能性が最も高い、ＴＤＭ誘導性の肉芽種形成の重要な受容体である。
これらの結果、ＭｉｎｃｌｅはインビボでＴＤＭ媒介性の炎症性応答の重要な受容体であることが示される。
【００２６】
＜死菌マイコバクテリアに対する応答におけるＭｉｎｃｌｅの役割＞
次ぎに、死菌マイコバクテリアに対する応答におけるＭｉｎｃｌｅの役割について説明する。
図１０は、Ｍｉｎｃｌｅは抗マイコバクテリア応答のＴＬＲ非依存性経路を担うことを示すグラフである。
図１０Ａは、野性型（ＷＴ）、Ｍｉｎｃｌｅ−／−、図１０Ｂは、ＭｙＤ８８−／−、およびＭｙＤ８８−／−Ｍｉｎｃｌｅ−／−のマウス由来のＢＭＭφを、示した数の加熱殺菌したＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖを用い、また、ザイモサンを陽性コントロールとして刺激し、刺激の２日後、上清中のＴＮＦおよびＭＩＰ−２の産生を決定した結果を示すグラフである。
データは、３つのアッセイについての平均±ＳＤであり、同様の結果である３つの独立した実験からの代表的な結果を示す。図中、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【００２７】
最終的に、本発明者等は、毒性株Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖを用いて死菌マイコバクテリアに対する応答におけるＭｉｎｃｌｅの役割を検討した。加熱殺菌したマイコバクテリアは、マクロファージでＴＮＦおよびＭＩＰ−２の強力な産生を誘導したが、Ｍｉｎｃｌｅ欠損はＴＮＦの産生を検出できるほど損なわず、ＭＩＰ−２産生を部分的に損なっただけであった（図１０Ａ）。この理由は、おそらく、死菌マイコバクテリアが、ＴＬＲリガンドを含めてＴＤＭ以外に多くの免疫刺激性の成分を保有するからである。実際、サイトカイン産生は顕著に低減されたが、ＭｙＤ８８−／−マクロファージではかなり誘導された（図１０Ｂ）。しかし、これらのサイトカインのレベルは、ＭｙＤ８８−／−マクロファージと比較した場合、ＭｙＤ８８−／−Ｍｉｎｃｌｅ−／−の二重欠損マクロファージでは有意に減少された（図１０Ｂ）。対照的に、デクチン−１およびＴＬＲ２によって認識されることが知られているザイモサンに対する応答は、ＭｙＤ８８−／−マクロファージでは、ＭｙＤ８８−／−Ｍｉｎｃｌｅ−／−細胞での応答と同様であった（図１０）。これらの結果によって、Ｍｉｎｃｌｅは、マイコバクテリアのＴＬＲ依存性認識で主要な役割を果たすことが示唆される。ＭｙＤ８８−／−Ｍｉｎｃｌｅ−／−のマクロファージで観察されたマイコバクテリアによるサイトカインの残っている産生（図１０Ｂ）は、ムラミルジペプチドを通じてマイコバクテリアを認識することが報告されたＮＬＲファミリーのＮＯＤ２の潜在的な寄与を反映する場合がある。
【００２８】
以下に前記の材料および方法の詳細を補足説明する。
マウスは、Ｍｉｎｃｌｅ欠損マウスをＣ５７ＢＬ／６および１２９混合の遺伝子バックグラウンドとして用いた。ＭｙＤ８８欠損マウスはオリエンタル酵母から入手した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに対するＦｃＲγ欠損マウスはＴ．Ｓａｉｔｏ（理研）から贈呈されたものを使用した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、日本クレアまたは九動から入手した。全てのマウスは空気を濾過した層流の囲いの中で飼育し、標準的な実験室の食物および水を自由に与えた。
【００２９】
細菌については、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｍｅｇｍａｔｉｓ株ｍｃ２１５５を、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９ブロス中で培養した。Ｍ．ｂｏｖｉｓ  Ｂａｃｉｌｌｅ  ｄｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  ｅｔ  Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）は、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ＡＤＣエンリッチメントおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−８０を補充したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９中で培養した。マンノシルトランスフェラーゼ  ＰｉｍＥの欠失変異体であるＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ΔｐｉｍＥは、ＰＩＭ．Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのα１，２−マンノース部分を欠き、Ｍ．ｂｏｖｉｓは６３℃で４０分間の低温殺菌によって加熱殺菌した。毒性株Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖを使用前にオートクレーブした。Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＩＦＭ  Ｎｏ．５４３４９）は、Ｔ．Ｇｏｎｏｉ（千葉大学）から提供された。
【００３０】
脱脂については、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓは、クロロホルム／メタノール（Ｃ：Ｍ，２：１）、ヘキサン、アセトンまたは１−ブタノール（ＢｕＯＨ）を用いて脱脂した。不溶性の画分を脱脂された細菌として収集した。可溶性の画分をさらにＣ：Ｍ：Ｗ（８：４：３、ｖ／ｖ）によって下部の有機相（Ｃ：Ｍ）および上部の水相（Ｍ：Ｗ）に分配した。上部の水相（Ｍ：Ｗ）をさらに、１−ブタノール：水（１：１，ｖ／ｖ）によって上部のブタノール相（ＢｕＯＨ）および下部の水相（水）に分配した。各々の画分を乾燥し、もとの細胞ペレット重量に対してＤＭＳＯ中に再懸濁し、脂質抽出物として試験した。
【００３１】
試薬については、ＴＤＭ、メチルα−マイコレート、メチルケト−マイコレート、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）は、ナカライテスクより入手し、ＴＤＢはＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓより入手した。Ｄ−トレハロース二水和物（Ｔ３６６３）、トレハラーゼ（Ｔ８７７８）、ＬＰＳ（Ｌ４５１６）およびザイモサン（Ｚ４２５０）はＳＩＧＭＡから入手した。レポーター細胞およびＢＭＭφの刺激のために、クロロホルム中に１ｍｇ／ｍｌで溶解したＴＤＭおよびＴＤＢをイソプロパノール中に希釈して、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２０μｌ添加し、続いて前記の通り溶媒をエバポレーションした。ＴＭＭの作製のために、ＴＤＭを０．４ＭのＮａＯＨを用いて１０分間、部分的にアシル化して、ＴＤＭおよびＴＭＭの量をＨＰＴＬＣでオルシノール染色することによって決定した。ＴＤＭおよびＴＭＭに相当する画分を収集して、アッセイのために用いた。
【００３２】
細胞については、ＷＴ（野性型）ＭｉｎｃｌｅまたはＭｉｎｃｌｅＱＰＤ（Ｅ１６９Ｑ／Ｎ１７１Ｄ）変異体を発現する２Ｂ４−ＮＦＡＴ−ＧＦＰレポーター細胞、および骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）を非特許文献２の記載の通り調製した。１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを用いて４時間前処理したＢＭＭφおよびレポーター細胞を、種々の細菌および細菌細胞壁成分を用いて刺激した。ＮＦＡＴ−ＧＦＰの活性化は、フローサイトメトリーによってモニターした。サイトカインのレベルはＥＬＩＳＡによって決定した。Ｇｒｉｅｓｓアッセイでは産生は測定されなかった。
【００３３】
抗体については、抗Ｍｉｎｃｌｅ  ｍＡｂを非特許文献２の記載通り確立し、そしてクローン  １Ｂ６（ＩｇＧ１，ｋ）を用いた。ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（１０９−０３５−０８８）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。
【００３４】
Ｉｇ融合タンパク質にてついては、Ｍｉｎｃｌｅの細胞外ドメイン（アミノ酸４６〜２１４）およびデクチン２の細胞外ドメイン（アミノ酸４３〜２０９）を、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ領域に融合して、非特許文献３の記載通り調製した。
【００３５】
トレハラーゼ処理については、０．８μｇのＴＤＭを上記の通り９６ウェルプレート上にコーティングし、続いて１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ５．９）に含有される１〜１０ｍＵ／ｍｌのトレハラーゼとともに３７℃で６時間インキュベーションした。
【００３６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲについては、総ＲＮＡを刺激されたＢＭＭφまたはＴＤＭ投与したマウスの肺から単離して、リアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にかけた。
【００３７】
ＴＤＭの投与については、ＴＤＭは、非特許文献１０の記載通り、鉱油（９％）、Ｔｗｅｅｎ−８０（１％）、および生理食塩水（９０％）からなる水中油型エマルジョンとして調製した。１５０μｇのＴＤＭを含む１００μｌのエマルジョンを６〜１１週齢のマウスに静脈内注射した。ＴＤＭなしのエマルジョンをビヒクルコントロールとして注射した。７日目に、胸腺細胞数を計算して、肺を秤量して、ヘマトキシリン−エオシン染色のために１０％ホルムアルデヒド中で固定した。肺の一部を定量的ＲＴ−ＰＣＲのために凍結した。肺重量指数（ＬＷＩ）を非特許文献１１の記載通り算出した。肉芽腫の数は、マウス１匹あたり無作為に１０個の顕微鏡視野（０．８ｍｍ２）中で病巣の単核球浸潤をカウントすることによって決定した。
【００３８】
統計については、全ての統計学的分析について対応のない両側スチューデントｔ検定を用いた。
【００３９】
ＴＤＭ（コードファクターとも呼ばれる）は、宿主細胞内でのマイコバクテリアの生存を可能にする必須の成分であるが、ＴＤＭは脊椎動物にはほとんど存在しない。従って、マイコバクテリア感染のシグナルとしてＴＤＭを認識することは宿主にとっては合理的な戦略であろう。本発明者等は、Ｃ型レクチンＭｉｎｃｌｅをＴＤＭの必須の受容体として特定した。
ＴＤＭのマイコレート鎖内のシクロプロパンがその免疫刺激活性に重要であることが実証されている。しかし、炭素鎖のシクロプロパンを欠くＴＤＢは、やはり、マクロファージおよびＭｉｎｃｌｅ発現細胞を活性化できる（図４Ｃおよび図６Ｄ）。他方では、ＴＤＭの特定の構成はその活性を発揮するのに必須であることが示唆されている。従って、ＴＤＭの炭素鎖における「ｋｉｎｋ」は、Ｍｉｎｃｌｅの直接結合部位としてではなく、Ｍｉｎｃｌｅに対する極性頭部の最適の提示に寄与し得る。２つのＭｉｎｃｌｅ受容体が、ＴＤＭの１つの二糖頭部を、おそらくマイコレートの近位領域と一緒に認識するという仮説がなされ得るが、この論点を明らかにするためにはさらなる構造分析が必要である。
【００４０】
ＴＤＭは、インビボで肺肉芽種を誘発することが知られており、本発明者等はＴＤＭがＭｉｎｃｌｅに全体として依存するということを実証した。本発明者等らは近年、Ｍｉｎｃｌｅがまた、死細胞を検知して、炎症性細胞を集積させることを見出した（非特許文献２）。肉芽種の中心の壊死細胞の存在は、結核の特徴であるので、ＴＤＭおよび死細胞の両方が、炎症性サイトカイン／ケモカインのＭｉｎｃｌｅ媒介性分泌を通じて肉芽種の形成に協同的に寄与し得る。悪性の感染の間のＭｉｎｃｌｅの生理学的役割は、重要な課題であって、明らかにされる必要があり、かつ現在Ｍｉｎｃｌｅ−／−マウスを用いて検討中である。なぜならマイコバクテリアの毒性におけるＴＤＭの寄与は依然として議論の余地があるからである。Ｍｉｎｃｌｅの肉芽種誘発能力を考慮すれば、Ｍｉｎｃｌｅはまた、肉芽種によって特徴付けられる疾患に関与し得る。
最近の報告では、Ｔ細胞は、ＣＤ１媒介性ＴＤＭ提示の証拠が少ないにもかかわらず、ＴＤＭに応答できることが示唆されている。Ｍｉｎｃｌｅはまた、活性化の際にＴ細胞で発現され、いくつかのＴ細胞集団はＦｃＲγを利用する。このようなＴ細胞は直接ＴＤＭを認識して、ＩＦＮγまたはＩＬ−１７などのＴ細胞特異的サイトカインを、「ＴＣＲ非依存的」だが「Ｍｉｎｃｌｅ依存的」方式で産生し得ると推測することができる。
【００４１】
本発明者等は、Ｍｉｎｃｌｅがまた、病原性真菌Ｍａｌａｓｓｅｚｉａを認識することを最近見出している（非特許文献３）。本発明者等の現在の知見で、Ｍｉｎｃｌｅは、マンノース結合モチーフとして一般に考えられているモチーフを通じて糖脂質を独自に認識するということが示唆できるであろう。従って、本発明者等は、Ｍｉｎｃｌｅ−Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ相互作用が、ＴＤＭと同様の固有の真菌糖脂質によって媒介され得ると推測する。興味深いことに、他の真菌のうちでもＭａｌａｓｓｅｚｉａ種は独自で、その増殖に脂質を必要とする。
【００４２】
ＴＤＭおよびその合成類似体ＴＤＢは有効なアジュバントであるので、広く研究されている。ＴＤＭは、ＣＦＡの効果の一部を占めると考えられる。ＴＤＭ／ＴＤＢの宿主受容体の特定によって、ワクチンアジュバントの設計に関連する有用な情報がもたらされる。なぜなら合成のＭｉｎｃｌｅリガンドの論理的なスクリーニングが実現可能であり、かつ理想的な合成アジュバントの開発をもたらし得る可能性があるからである。このような合成のＭｉｎｃｌｅリガンドによって、結核、他の感染性疾患および癌に対する有効なワクチン接種が可能になるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、ＴＤＭ／ＴＤＢの宿主受容体の特定によって、ワクチンアジュバントの設計に関連する有用な情報がもたらされ、合成のＭｉｎｃｌｅリガンドによって、結核、他の感染性疾患および癌に対する有効なワクチン接種が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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