(57)【要約】本発明は多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の誘導により神経細胞に分化し得るＧ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４０（ＧＰＲ４０）陽性の骨髄由来間葉系幹細胞の提供を目的とする。すなわち、本発明は哺乳動物由来のＧＰＲ４０陽性の骨髄由来間葉系幹細胞、及びさらにＣＤ２９陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ３陰性、ＣＤ４陰性、ＣＤ８陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３１陰性である骨髄由来間葉系幹細胞である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来のＧＰＲ４０陽性の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
【請求項２】
さらに、ＣＤ２９陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ７３陽性及びＣＤ１０５陽性である、請求項１記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
【請求項３】
さらに、ＣＤ３陰性、ＣＤ４陰性、ＣＤ８陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性及びＣＤ３１陰性である、請求項１又は２に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
【請求項４】
以下の特性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞：
（ｉ）  癌化しない；
（ｉｉ）  ３胚葉系へ分化する能力を有する；及び
（ｉｉｉ）  セルフリニューアル（自己複製）能を有する。
【請求項５】
多価不飽和脂肪酸の刺激により神経細胞へと分化し得る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
【請求項６】
多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である、請求項５記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
【請求項７】
（ｉ）  骨髄単核細胞を接着培養し、接着した細胞を回収し、
（ｉｉ）  回収した細胞から単一細胞由来コロニーを得て、
（ｉｉｉ）  得られたコロニーの細胞をエクスパンド用に調製した培地で低濃度血清条件下で低密度で培養し、エクスパンドし、
（ｉｖ）  （ｉｉｉ）のエクスパンドした細胞をさらにサブクローン化し、単一クローンとして細胞を得て、
（ｖ）  得られた細胞について、細胞表面のＧＰＲ４０、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＣＤ１０５の発現を確認し、ＧＰＲ４０、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＣＤ１０５の発現が認められるものを幹細胞として得る、ことを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞を単離する方法。
【請求項８】
請求項７記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞を単離する方法であって、さらに、細胞表面のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＣＤ３１の発現を確認し、ＣＤ３陰性、ＣＤ４陰性、ＣＤ８陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性及びＣＤ３１陰性であるものを得ることを含む方法。
【請求項９】
骨髄単核細胞から、ＧＰＲ４０陽性の細胞を単離することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
【請求項１０】
さらに、ＣＤ２９陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ７３陽性及びＣＤ１０５陽性である細胞を単離することを含む、請求項９記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
【請求項１１】
さらに、ＣＤ３陰性、ＣＤ４陰性、ＣＤ８陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性及びＣＤ３１陰性である細胞を単離することを含む、請求項１０記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで多価不飽和脂肪酸と接触させて、神経細胞に分化誘導する方法。
【請求項１３】
多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞を含む組織再生用組成物。
【請求項１５】
組織が神経組織、脂肪組織、骨組織又は軟骨組織である、請求項１２記載の組織再生用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄由来の幹細胞、その単離方法、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４０（ＧＰＲ４０）は、７回膜貫通型レセプターであるＧタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）のサブファミリーのメンバーであり、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、アラキドン酸等の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、ＧＰＲ４０レセプター（脂肪酸レセプター、ＦＦＡＲ１とも呼ばれる）の内因性リガンドである。
ＰＵＦＡの中でもＤＨＡは、大脳皮質ニューロンや海馬ニューロンの生存や神経突起形成に関与することが報告されている（非特許文献１及び２を参照）。
２００３年にヒトの膵臓及び脳においてＧＰＲ４０遺伝子が同定されて以来、ＧＰＲ４０の機能に関しては主としてインスリン分泌との関与が研究されてきた。しかしながら、脳におけるＧＰＲ４０の役割については従来全く解明されておらず、例えば、げっ歯類の脳においてはＧＰＲ４０が発現していないという報告すらあった（非特許文献３を参照）。遺伝子レベルの解析では、ＧＰＲ４０は霊長類の脳においては種々の部位に発現しており（非特許文献４を参照）、なかんずく延髄に最も多く発現し、海馬では中程度の発現が認められると報告されていた。一方、タンパク質レベルでの発現に関しては種を問わず未確認であったが、最近になって、ＧＰＲ４０タンパク質は霊長類の神経幹細胞で発現していることが報告された（非特許文献５を参照）。しかし、ＧＰＲ４０の脳やニューロン新生ニッチにおける役割に関しては現在なお不明な点が多い。ＧＰＲ４０レセプターは骨髄全体サンプルや骨髄由来ストローマ細胞株の両者においても検出されることが報告されているが（非特許文献６を参照）、特定の細胞がＧＰＲ４０を発現していることは示されていない。
さらに、ＤＨＡが細胞表面のＧＰＲ４０に結合し、Ｃａ２＋の流入を促し、細胞のプロテインキナーゼＣを刺激するという報告もある（非特許文献３及び４を参照）。
骨髄には組織幹細胞である骨髄間葉系幹細胞が存在することが知られており、これらの細胞は骨、血管等の間葉系組織に分化するため、再生医療への応用が期待されている。しかしながら、骨髄間葉系細胞は、組織幹細胞であり、その分化能には限界がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｃａｌｄｅｒｏｎ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００４；９０：９７９−９８８．
【非特許文献２】Ｃａｏ  ＤＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５；１６：５３８−５４６．
【非特許文献３】Ｉｔｏｈ  Ｙ  ｅｔ  ａｉ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２２：１７３−１７６．
【非特許文献４】Ｂｒｉｓｃｏｅ  ＣＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００３；２７８：１１３０３−１１３１１．
【非特許文献５】Ｍａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．２００８；１８：３２６−３３３．
【非特許文献６】Ｈａｎｓｅｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７；４：３５−３７．
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ＰＵＦＡの誘導により神経細胞に分化し得るＧＰＲ４０陽性の骨髄由来間葉系幹細胞の提供を目的とし、さらに該幹細胞の利用法の提供を目的とする。
本発明者は、ＧＰＲ４０タンパク質が脳で発現していること、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）がＧＰＲ４０のリガンドとして機能することに着目し、神経の分化・増殖とＧＰＲ４０との関係について鋭意検討を行った。その結果、本発明者は、ＧＰＲ４０を発現している骨髄由来間葉系幹細胞が存在することを見出し、さらに、この骨髄由来間葉系幹細胞がＰＵＦＡ−ＧＰＲ４０シグナル伝達系を介して神経細胞や他の細胞に分化し得ることを見出した。このようにして、本発明者は、新規の「ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞」を単離し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  哺乳動物由来のＧＰＲ４０陽性の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
［２］  さらに、ＣＤ２９陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ７３陽性及びＣＤ１０５陽性である、［１］の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
［３］  さらに、ＣＤ３陰性、ＣＤ４陰性、ＣＤ８陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性及びＣＤ３１陰性である［１］又は［２］の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
［４］  以下の特性を有する、［１］〜［３］のいずれかの骨髄由来間葉系多能性幹細胞：
（ｉ）  癌化しない；
（ｉｉ）  ３胚葉系へ分化する能力を有する；及び
（ｉｉｉ）  セルフリニューアル（自己複製）能を有する。
［５］  多価不飽和脂肪酸の刺激により神経細胞へと分化し得る、［１］〜［４］のいずれかの骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
［６］  多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である、［５］の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
［７］  （ｉ）  骨髄単核細胞を接着培養し、接着した細胞を回収し、
（ｉｉ）  回収した細胞から単一細胞由来コロニーを得て、
（ｉｉｉ）  得られたコロニーの細胞をエクスパンド用に調製した培地で低濃度血清条件下で低密度で培養し、エクスパンドし、
（ｉｖ）  （ｉｉｉ）のエクスパンドした細胞をさらにサブクローン化し、単一クローンとして細胞を得て、
（ｖ）  得られた細胞について、細胞表面のＧＰＲ４０、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＣＤ１０５の発現を確認し、ＧＰＲ４０、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＣＤ１０５の発現が認められるものを幹細胞として得ることを含む、［１］〜［６］のいずれかの骨髄由来間葉系幹細胞を単離する方法。
［８］  ［７］の骨髄由来間葉系多能性幹細胞を単離する方法であって、さらに、細胞表面のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＣＤ３１の発現を確認し、ＣＤ３陰性、ＣＤ４陰性、ＣＤ８陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性及びＣＤ３１陰性であるものを得ることを含む方法。
［９］  骨髄単核細胞から、ＧＰＲ４０陽性の細胞を単離することを含む、［１］〜［６］のいずれかの骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
［１０］  さらに、ＣＤ２９陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ７３陽性及びＣＤ１０５陽性である細胞を単離することを含む、［９］の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
［１１］  さらに、ＣＤ３陰性、ＣＤ４陰性、ＣＤ８陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性及びＣＤ３１陰性の細胞を単離することを含む、［１０］の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
［１２］  ［１］〜［６］のいずれかの骨髄由来間葉系多能性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで多価不飽和脂肪酸と接触させて、神経細胞に分化誘導する方法。
［１３］  多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である、［１２］の方法。
［１４］  ［１］〜［６］のいずれかの骨髄由来間葉系多能性幹細胞を含む組織再生用組成物。
［１５］  組織が神経組織、脂肪組織、骨組織又は軟骨組織である、［１２］の組織再生用組成物。
本発明のＧＰＲ４０陽性の骨髄由来間葉系幹細胞は、神経細胞のみならず、脂肪細胞や骨芽細胞、軟骨細胞等に分化する多能性を有する。特に、該幹細胞は、ＤＨＡ等の多価不飽和脂肪酸の刺激により、ＧＰＲ４０−多価不飽和脂肪酸シグナル伝達系を介して、神経細胞に分化する。本発明の幹細胞は、多価不飽和脂肪酸と組合せることで神経の再生に利用することができ、さらに、他の組織の再生にも利用することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−０００７３６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞の性状を示す図であり、図１Ａは骨化誘導により、２１日目にフォン・コッサ染色で紫色に染まる石灰化小片の形成を、図１Ｂは脂肪化誘導により、３５日目にオイル・レッド０染色で赤色に染まる脂肪滴の形成を、さらに、図１Ｃは骨化誘導により、３５日目にアルシャン・ブルー染色で青色に染まる軟骨塊の形成を示す。
図２は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞における種々の発現マーカーの発現を示す図である。種々のマーカーの中で、ＣＤ１０５やＣＤ２９、ＣＤ９０が陽性を示す。
図３は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞のコロニー形成能を示す図である。クローン性エクスパンド群は非クローン性のものよりもコロニー形成能が強い。
図４は、クローン性エクスパンド群の骨髄由来間葉系幹細胞の神経細胞分化とＧＰＲ４０発現（培養７日目）を示す図である。ＧＰＲ４０免疫染色では、対象培養群（Ｃ）は図４Ａのごとくわずかに陽性（緑色）を示す。図４ＢはｂＦＧＦを添加した培養群（ｂＦＧＦ）の結果であり、該培養群は強い陽性（緑色）を示し、神経突起の形成もみられる。図４ＣはＤＨＡ添加培養群（ＤＨＡ）の結果を示し、ＧＰＲ４０（緑色）の発現低下を示す。これは、レセプターがリガンドと結合しその役目を果たすと、局在を変え発現が低下するというＧＰＣＲに特異的な’ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ’という現象である。図４ＤはｂＦＧＦとＤＨＡの両者を添加した培養群（ｂＦＧＦ／ＤＨＡ）の結果を示し、ＧＰＲ４０（緑色）の発現増加を示す細胞と低下を示す細胞とが混在する。
図５は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞のＧＰＲ４０の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す図であり、ＧＰＲ４０の遺伝子発現は免疫染色によるタンパク質発現と同様の傾向を示す。
図６は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞のＧＰＲ４０の発現をウエスタンブロットで調べた結果を示す図であり、ＧＰＲ４０のタンパク質発現は免疫染色やＲＴ−ＰＣＲと同様の傾向を示す。
図７は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞のＧＰＲ４０の遺伝子発現の定量的評価の結果を示す図である。
図８は、幼弱神経細胞に分化したＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞における幹細胞マーカー・ネスチンと幼弱神経細胞マーカー・βＩＩＩ−ツブリンの発現（培養７日目）を示す図である。図８ＡはネスチンとβＩＩＩ−ツブリンの２重免疫染色（Ｎｅｓｔｉｎ／βＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ）の結果を示し、対象培養群（Ｃ）は強いネスチン陽性（緑色）を示す。図８Ｂは、ｂＦＧＦを添加した培養群（ｂＦＧＦ）の結果を示し、ネスチン（緑色）の発現低下とβＩＩＩ−ツブリン（赤色）の発現増加がみられる。図８ＣはＤＨＡ添加培養群（ＤＨＡ）の結果を示し、ネスチン（緑色）およびβＩＩＩ−ツブリン（赤色）のいずれも発現は弱い。図８ＤはＤｂＦＧＦとＤＨＡの両者を添加した培養群（ｂＦＧＦ／ＤＨＡ）の結果を示し、ネスチン（緑色）の発現はほとんどみられないのに対し、βＩＩＩ−ツブリン（赤色）の発現は顕著である。
図９は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞のネスチン及びβＩＩＩ−ツブリンの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す図であり、ネスチン及びβＩＩＩ−ツブリンの遺伝子発現は免疫染色によるタンパク質発現と同様の傾向を示す。
図１０は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞のネスチン及びβＩＩＩ−ツブリンの遺伝子発現をウエスタンブロットで調べた結果を示す図であり、ウエスタンブロットでも、ネスチン及びβＩＩＩ−ツブリンのタンパク質発現は免疫染色やＲＴ−ＰＣＲと同様の傾向を示す。
図１１は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞のネスチン及びβＩＩＩ−ツブリンの遺伝子発現の定量的評価を示す図である。
図１２は、成熟神経細胞に分化したＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞による成熟神経細胞マーカー・ＮＦ−Ｍ及びＭａｐ２の発現（培養１４日目）を示す図であり、ＮＦ−ＭとＭａｐ２の２重免疫染色（Ｍａｐ２／ＮＦ−Ｍ）でみられる共陽性細胞（黄色）は長い神経突起（矢印）を伸ばしている。
図１３は、成熟神経細胞に分化したＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞による成熟神経細胞マーカー・ＮＦ−Ｍ及びＭａｐ２の発現（培養１４日目）をＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す図であり、ＮＦ−ＭやＭａｐ２の遺伝子発現は対象群（Ｃ）ではみられないのに対し、ＤＨＡ群では軽度、ｂＦＧＦ群では中等度、ｂＦＧＦ／ＤＨＡ群では強度の発現がみられる。
図１４は、成熟神経細胞に分化したＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞におけるＮＦ−ＭとＭａｐ２の遺伝子発現の定量的評価の結果を示す図である。
図１５は、成熟神経細胞に分化したＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞による成熟神経細胞マーカー・ＮＦ−Ｍ及びＭａｐ２の発現（培養１４日目）をウエスタンブロットで調べた結果を示す図であり、ＮＦ−ＭやＭａｐ２の遺伝子発現はＲＴ−ＰＣＲと同様の傾向を示す。
図１６は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞の細胞周期解析の結果を示す図である。図１６ＡはＤＨＡ添加培養群（ＤＨＡ）の結果を示し、ＢｒｄＵ−／Ｋｉ６７＋（緑）の細胞が大部分を占め、ＢｒｄＵ＋／Ｋｉ６７＋細胞（黄色）がわずかに混在する。図１６ＢはｂＦＧＦ添加培養群（ｂＦＧＦ）の結果を示し、ＢｒｄＵ−／Ｋｉ６７＋（緑）の細胞は減少、ＢｒｄＵ＋／Ｋｉ６７＋細胞（黄色）は増加の傾向を示し、ＢｒｄＵ＋／Ｋｉ６７−（赤）の細胞が見え始めている。図１６ＣはｂＦＧＦとＤＨＡの両者を添加した培養群（ｂＦＧＦ／ＤＨＡ）の結果を示し、ＢｒｄＵ＋／Ｋｉ６７−（赤）の細胞が大部分を占め、少数のＢｒｄＵ＋／Ｋｉ６７＋細胞（黄色）もみられる。Ａ１及びＣ１は、それぞれＡ及びＣの写真を拡大したものである。
図１７は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞の細胞周期解析におけるＢｒｄＵ＋／Ｋｉ６７−細胞の定量的評価の結果を示す図である。
図１８は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞の神経細胞分化の概要を示す図である。
図１９は、ＧＰＲ４０陽性骨髄由来間葉系幹細胞が神経細胞に分化してゆくプロセス（上半分）と神経幹細胞が分化してゆくプロセス（下半分）とを比較した模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の幹細胞は、骨髄から単離されるＧＰＲ４０（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４０）陽性の多能性を有する幹細胞である。
ＧＰＲ４０は、７回膜貫通型レセプターであるＧタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）のサブファミリーのメンバーである（Ｙａｍａｓｈｉｍａ  Ｔ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８４（２００８）１０５−１１５；Ｂｒｉｓｃｏｅ  Ｃ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７８（２００３）１１３０３−１１３１１）。
本発明において、「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。
本発明において、幹細胞というときは、幹細胞を少なくとも一定量含む細胞集団をいい、例えば、幹細胞を９０％以上、好ましくは９５％以上含む細胞集団が含まれる。
本発明の幹細胞は、ＧＰＲ４０が陽性であり、また、ＣＤ２９（インテグリン）及びＣＤ９０を比較的強く発現し（ＣＤ２９陽性、ＣＤ９０陽性）、ＣＤ７３及びＣＤ１０５を弱く発現する（ＣＤ７３弱陽性、ＣＤ１０５弱陽性）。さらに、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８等のリンパ球マーカー、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５等の造血幹細胞マーカー及び内皮細胞マーカーであるＣＤ３１は陰性である（ＣＤ３陰性、ＣＤ４陰性、ＣＤ８陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３１陰性）。ここで、ある抗原が陽性であるとは、細胞表面抗原であるその抗原を有していること、すなわち、該表面抗原を細胞表面に発現していることをいう。これらの表面抗原が陽性か陰性か、発現が弱いかどうかは、これらの抗原に対する１次抗体を反応させた後、発色酵素、蛍光化合物等で標識した２次抗体を用いて細胞が染色されたか否かを顕微鏡観察等により調べることにより決定することができる。例えば、これらの抗体を用いて細胞を免疫染色して、表面抗原の有無を決定することができ、また該抗体を結合させた磁気ビーズを用いても決定することができる。また、ＦＡＣＳまたはフローサイトメーターを用いても表面抗原が存在するかどうかを決定することができる。ＦＡＣＳ、フローサイトメーターとしては例えばＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）等を用いることができる。
本発明の骨髄由来幹細胞は、多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有し、３胚葉系（内胚葉系、中胚葉系、外胚葉系）へ分化し得る。また、本発明の骨髄由来幹細胞は、１細胞から増殖しクローンを形成する。さらに、本発明の骨髄由来幹細胞は、無限増殖性を有さず、癌化することはない。
本発明の幹細胞は、骨髄より単離することができる。骨髄としては、ヒト、ヒトを除く霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ等の骨髄を用いることができる。
本発明の幹細胞は、以下の方法により骨髄から単離することができる。まず、骨髄よりＢＭ−ＭＳＣ（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａ  ｃｅｌｌ；骨髄由来間葉系ストローマ細胞）を単離する。ＢＭ−ＭＳＣは公知の方法で単離することが可能であるが、例えば上記の動物から骨髄穿刺等により骨髄細胞（ＢＭＣ）を採取し、密度勾配遠心分離を行い、単核細胞フラクションを得る。得られた単核細胞フラクションを培養用プラスチックディッシュ上で接着培養し、ディッシュに接着した細胞をトリプシン処理により剥がし、ＢＭ−ＭＳＣ（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａ  ｃｅｌｌ；骨髄由来間葉系ストローマ細胞）として回収する。回収したＢＭ−ＭＳＣを限界希釈法により培養し、増殖した細胞をさらに限界希釈法により培養し、単一細胞由来コロニーとしてクローンを得る。このようにして得られたコロニーの細胞をエクスパンド用に調製した培地で低濃度血清条件下で低密度で培養し、エクスパンドする。エクスパンドした細胞をさらにサブクローン化し、単一クローンとして細胞を得る。得られた細胞について、細胞表面のＧＰＲ４０の発現をフローサイトメトリー等により確認し、ＧＰＲ４０の発現が認められるもののみを選別し、本発明の単離された幹細胞として用いることができる。この際、用いる培地は限定されず、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の動物血清を含むＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地等の既知の培地を用いることができる。また、公知の幹細胞培養用培地を用いることもでき、例えば、間葉系幹細胞培養用培地（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＢＭ））（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）や増殖用培地ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＧＭ）（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）等も用いることができる。培地には、適宜、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、種々の生理活性物質、ビタミン等を添加してもよい。なお、ＢＭ−ＳＭＣを最初に培養し、単一細胞由来のコロニーとしてクローンを得る際に用いる培地（増殖培地）は、１０〜１５％の血清を含ませるが、得られたクローンをエクスパンドしてさらにサブクローニングする際に用いる培地（エクスパンド培地）の血清濃度は低くするが、具体的には１〜５％、もし可能なら３％程度の濃度である。このように、本発明の幹細胞は、被験者又は成熟個体の骨髄細胞から単離するという点で胚性幹細胞（ＥＳ細胞）とは異なる。
さらに、本発明の幹細胞は、ＧＰＲ４０の発現を指標にして骨髄細胞又はＢＭ−ＭＳＣ集団から培養することなく、直接フローサイトメトリーを用いて単離することもできる。この際、骨髄細胞からあらかじめＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８等のリンパ球マーカー、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５等の造血幹細胞マーカー及び内皮細胞マーカーであるＣＤ３１が陽性の細胞をこれらの抗原に対する抗体を結合させた磁気ビーズを用いて除去し、残った細胞集団の中からＧＰＲ４０陽性細胞を単離してもよい。
上記のように、本発明の幹細胞は骨髄に対して外来遺伝子や外来タンパク質を導入することなく得ることができる。
単離した本発明の幹細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の組織細胞に分化誘導することができる。すなわち、本発明の幹細胞は多能性を有するため、３胚葉起源の任意の組織細胞に分化誘導することができる。分化誘導するための培地が市販されており、これらの市販培地を用いて種々の組織へと分化誘導することができる。例えば、神経細胞へ分化誘導する場合、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＮＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等を用いることができる。また、骨細胞へと分化誘導する場合、ブレットキット骨芽細胞分化培地（誘導培地）（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いることができる。さらに、脂肪細胞へと分化誘導する場合、ブレットキット脂肪細胞分化培地（誘導培地）（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いればよく、軟骨細胞へと分化誘導する場合、ブレットキット軟骨細胞分化培地（誘導培地）（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて培養を行えばよい。神経細胞に分化誘導する場合は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を培地に添加すると分化の効率が高まる。本発明の骨髄由来幹細胞は、脂肪酸をリガンドとするＧＰＲ４０を表面に発現しており、多価不飽和脂肪酸がＧＰＲ４０に結合すると、分化を誘導するシグナル伝達が生じる。多価不飽和脂肪酸としては、ｎ−３（ω３）系統のものも、ｎ−６（ω６）系統のものも用いることができる。ｎ−３系等の多価不飽和脂肪酸としては、ＤＨＡ（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ；ドコサヘキサエン酸）、ＥＰＡ（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ；エイコサペンタエン酸）、αリノレン酸等が挙げられ、ｎ−６系等のものとしては、アラキドン酸、リノール酸、γ−リノレン酸等が挙げられる。この中でも、ＤＨＡは低濃度で本発明の幹細胞を神経細胞に分化誘導できることが確認されており、理想的なリガンドである。また、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を用いても神経細胞への分化が誘導されるので、ｂＦＧＦと多価不飽和脂肪酸を併用してもよい。
これらの組織細胞へと分化した細胞をさらに培養し、組織を再生させることができる。なお、本発明のＧＰＲ４０陽性の骨髄幹細胞は、増殖しているときにはＧＰＲ４０の発現がアップレギュレーションされ高発現を示すが、神経細胞に分化すると、ＧＰＲ４０の発現はダウンレギュレーションされ発現が低下又は停止する。この減少は、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）に特徴的な’ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ’という現象で説明することができる。
本発明の幹細胞が組織細胞へ分化誘導したか否かは、各組織細胞に特有なマーカーの発現を調べることにより決定することができる。例えば、神経細胞への分化は、ＮＦ−Ｍ、ＮＦ−Ｈ（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ  ｏｒ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ；中、高分子ニューロフィラメント）、ＮＳＥ（ｎｅｕｒｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  γ−ｅｎｏｌａｓｅ；神経特異的エノラーゼ）等の発現を指標に調べることができる。さらに、成熟神経微小管やフィラメントの産生を指標にすることもできる。骨芽細胞への分化はフォン・コッサ染色、軟骨細胞への分化はアルシャン・ブルー染色、および脂肪細胞への分化はオイルレッド０染色に対する陽性所見を指標に調べることができる。
本発明の骨髄由来幹細胞は種々の脳血管障害や脳腫瘍、神経変性疾患、脳外傷に対する再生医療等に応用することができる。例えば、本発明の骨髄由来幹細胞を脳梗塞や変性、外傷により損傷した脳に投与することができる。具体的には、脳梗塞や脳出血、くも膜下出血、脳腫瘍をはじめ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索効果症などの神経変性疾患、および脳挫傷等が挙げられる。細胞の投与は、例えば頚動脈等の血管内に投与すれば、動脈経由で脳に幹細胞が到達する。また、脳内に直接投与してもよい。いずれの場合も、脳局所に幹細胞を投与した後又は同時に、静脈注射や経口投与により、多価不飽和脂肪酸を全身投与してもよい。あるいは、あらかじめ本発明の幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで多価不飽和脂肪酸と接触させて初期分化誘導した後に、脳に投与してもよい。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経組織を再生させた後、該再生組織を脳の損傷部位に移植することもできる。脳に投与することにより、幹細胞が神経細胞に分化し、損傷した神経や脳を再生することができる。
これらの再生医療において、移植した細胞または組織のレシピエントによる拒絶反応を避けるためには、再生医療を受けようとする神経疾患を有する患者自身から骨髄を採取し、該骨髄から本発明の骨髄由来ＧＰＲ４０陽性幹細胞を単離し、自家移植することもできる。さらに、単離し増殖した幹細胞をＤＨＡ等の多価不飽和脂肪酸と接触させることで刺激を与え、神経細胞に分化させ、あるいはさらに神経組織を構築させた後、これらの神経細胞や組織を前記患者に移植することで脳再生治療を行うこともできる。また、免疫系による拒絶の問題を免疫抑制剤等により解消することにより、第三者の本発明の骨髄由来幹細胞を患者に投与又は移植し、治療に利用することもできる。
さらに、同様に本発明の幹細胞から脂肪組織、骨組織又は軟骨組織を再生することもできる。
本発明は、本発明の幹細胞を含む、脳等の神経組織、脂肪組織、骨組織又は軟骨組織の再生の目的で用いる組成物も包含する。
さらに、本発明の骨髄由来幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経組織、脂肪組織、骨組織、軟骨組織等の特定の組織に分化させ、薬剤の効果判定や特定の薬剤のスクリーニングに用いることもできる。
また、本発明の幹細胞を多数の被験体から採取しておいた上で凍結保存し、組織を再生する必要が生じた場合に、保存しておいた幹細胞から、組織再生を必要とする被験体に遺伝的特性が適合した細胞を選択し、該細胞を用いて拒絶反応を起こすことなく再生治療を行うことができる。本発明の幹細胞をこのように利用するために、多数の被験体から採取した幹細胞について細胞バンクを構築すればよい。
さらに、本発明は、疾患の治療のために、本発明の幹細胞を治療を必要としている患者に投与することを含む再生治療方法を包含する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
ＧＰＲ４０陽性の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の検討
１．方法
骨髄細胞の採取
日本バイオリソース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、岡崎生理研）より供与された、年齢が２〜３歳、体重が３〜４ｋｇの３頭のニホンザル（Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃａｔａ）よりＫｕｓｈｉｄａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｉ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．（２００２）２０：１５５−１６２に記載の方法により骨髄細胞を採取した。
サルＢＭ−ＭＳＣ（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｈｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）からの骨髄由来幹細胞の単離
本実施例における培地の使用法を表１に示す。
【表１】
2011083752.tif 000002
2011083752.tif 000003
ＢＭ−ＭＳＣ由来のクローンは、Ｎ−２サプリメント（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補足した無血清ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地で培養した。実験群は、ｂＦＧＦ又はＤＨＡ単独で誘導する群（ｂＦＧＦ単独群又はＤＨＡ単独群）、並びにＤＨＡ及びｂＦＧＦで誘導する群（ＤＨＡ＋ｂＦＧＦ群）とした。
ピペッティングした新鮮な骨髄細胞（ＢＭＣ）をＤｅｎｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｅｄｉａ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）上に穏やかに重層して単一細胞懸濁液を得て、３０分間、１５０×１０ｒｐｍ、２０℃で遠心分離した。次いで、単核細胞フラクションを遠心分離した全骨髄細胞サンプルの界面より回収した単核骨髄細胞をプラスチックに接着させてＢＭ−ＭＳＣ（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｈｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）を得た。すなわち、密度勾配遠心分離により回収した骨髄単核細胞を５ｍｌの増殖培地（ＧＭ）（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧＩＢＣＯ）、１０〜１５％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）及び１％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧＩＢＣＯ）を含む増殖培地（ＧＭ）に１×１０４細胞／ｃｍ２で再懸濁し、２４〜４８時間培養した。この際、２４時間ごとに培地の半分を交換した。その後、線維芽細胞の形態を示す単一接着細胞以外の細胞を捨て、さらにＧＭを用いて７２時間ごとに培地の半分を交換し、９±２日間培養したところ、接着細胞が５０〜６０％のコンフルエント状態に達した。
次いで、細胞をクローニングし、クローンを得た。接着した骨髄単核細胞をＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシンを用いて剥がし、ＧＭを含む４８ウェルプレート中に段階希釈した。８時間後、１０個以下の接着細胞を含むウェルをさらにエクスパンドした。７±１日でコロニーが形成され、次いでトリプシン処理し、２４ウェルプレート及び３ｃｍのディッシュに移した。３頭のニホンザルそれぞれから、３クローンの株を確立した（以下、クローン性エクスパンドと称す）。
クローン性エクスパンドは、エクスパンド用培地（ＥＭ）に低密度で細胞を播き、低濃度血清条件で行った。ＢＭ−ＭＳＣの非クローン化株の培養は、１０％のＦＢＳを含むＧＭ中に高密度で播き行い、コントロール（非クローン性エクスパンド）群とした。
クローン性エクスパンドの方法の詳細を以下に記す。
０．５〜１×１０３／ｃｍ２のＢＭ−ＭＳＣを５ｍｌのＥＭを含む培養フラスコ中で培養し（５％ＣＯ２、３７℃）、細胞が５０〜６０％コンフルエントに達するまで７２時間ごとに培地を交換した。細胞をＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシンで懸濁し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、０．５〜１×１０３／ｃｍ２の密度でＥＭ中に再懸濁した。得られた細胞をｐａｓｓａｇｅ  １とした。
非クローン性エクスパンドの詳細を以下に記す。
１×１０４／ｃｍ２のＢＭ−ＭＳＣを５ｍｌのＧＭを含む培養フラスコ中で培養し（５％ＣＯ２、３７℃）、細胞が５０〜６０％コンフルエントに達するまで７２時間ごとに培地を交換した。
細胞生存率は、トリパンブルーを用いて算出した。
エクスパンドの間それぞれのサブクローニング前に少なくとも９０％の生存率を有していることを確認した。
クローン性エクスパンドにより得られた細胞については、ＧＰＲ４０の発現が陽性であることを確認した上で、本発明の骨髄由来幹細胞とした。
骨髄由来間葉系幹細胞の神経への分化
０．５〜１×１０５の骨髄由来間葉系幹細胞を５ｍｌのＦＢＳを含まないニューロン培地（ＮＭ）を含む細胞培養フラスコ（２５ｃｍ２）中で培養した（５％ＣＯ２、３７℃）。ＮＭは、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧＩＢＣＯ、Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧＩＢＣＯ、ＧＬＵＴＡＭＡＸ、３５０５００６１）、Ｎ−２Ｐｌｕｓ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＲ００３）、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧＩＢＣＯ）を含んでいた。この際、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を含む条件（ｂＦＧＦ単独群）、及びｂＦＧＦとＤＨＡを含む条件（ＤＨＡ＋ｂＦＧＦ群）で培養を行った。
ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は１０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた。ＤＨＡはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）との複合体の形態で最終濃度１０μＭで用いた（ＢＳＡ：ＤＨＡ複合体）。すなわち、２５ｍｇの乾燥ＤＨＡ（分子量３２８．５）を含む容器に１ｍｌの９９％エタノールを添加し、４つの１ｍｌの滅菌エッペンドルフチューブに分注し、真空エバポレータでエバポレーションした（それぞれのチューブに６．２５ｍｇのＤＨＡを含む）。０．５ｇの遊離脂肪酸不含ＢＳＡパウダーを３．１３ｍｌの滅菌した２回蒸留水で溶解した（２．４ｍＭ）。前記の６．２５ｍｇのＤＨＡを２５μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨに溶解し、１．９ｍｌの２．４ｍＭ遊離脂肪酸不含ＢＳＡを添加し、５０℃で５分間インキュベートし、１０ｍＭ（×１０００）のＢＳＡ：ＤＨＡ複合体ストック溶液を得た。該ストック溶液は、−２０℃で凍結保存し、２週間以内に使用した。
骨髄由来間葉系幹細胞の脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）及び軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）への分化
脂肪細胞への分化
骨髄由来間葉系幹細胞を脂肪細胞誘導／維持培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３サイクルのインキュベーションを行った。すなわち、脂肪細胞誘導培地を用いて４日間培養し、次いで脂肪細胞維持培地を用いて３日間培養した。この誘導／維持を３サイクル繰り返した後、さらに脂肪細胞維持培地を用いて７日間培養した。
骨芽細胞への分化
コンフルエントに達していない骨髄由来間葉系幹細胞を骨芽誘導培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて形態変化が認められるまで５週間培養した。骨芽誘導培地は３〜４日ごとに交換した。
軟骨細胞への分化
骨髄由来間葉系幹細胞を軟骨培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に添加し、２〜３日ごとに培地を交換し、５週間培養した。
骨髄由来間葉系幹細胞のＦＡＣＳ分析
骨髄由来間葉系幹細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシンを用いて剥がした。回収した細胞をＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）又はＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合抗ヒト霊長類ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体、抗ヒトＣＤ９０（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）、ＣＤ７３（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＣＤ１０５（Ｓｅｒｏｔｅｃ）抗体を用いて染色し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
免疫蛍光分析
増殖させた骨髄由来間葉系幹細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で、室温又は２０℃のメタノール中で１５分間固定し、免疫蛍光染色を行った。
用いた一次抗体は、ウサギポリクローナル抗ＧＰＲ４０抗体（１：１００）、マウスモノクローナル抗ＧＰＲ４０抗体（１：２５０、ＴｒａｎｓＧｅｎｉｃ  Ｉｎｃ）、マウスモノクローナル抗ｎｅｓｔｉｎ抗体（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウスモノクローナル抗ニューロンβＩＩＩ−ツブリン抗体（１：５００、Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｃｌｏｎｅ  Ｔｕｊ１、ＭＭＳ−４３５Ｐ）、マウスモノクローナル抗神経フィラメント中鎖（ＮＦ−Ｍ）抗体（１：１０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗Ｍａｐ２抗体であった。二次抗体としては、緑色蛍光の抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）並びに赤色蛍光の抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。
デジタルイメージは、共焦点レーザ顕微鏡（ＬＳＭ５１０；カールツァイス）及びＬＳＭ５１０ソフトウェア（バージョン３．２ＳＰ２、カールツァイス）を用いて得た。全視野の陽性細胞をＤＡＰＩ標識細胞核の総数に対する％として得た。
ウエスタンブロット分析
ＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシンを用いて剥がした骨髄由来間葉系幹細胞から遠心分離により細胞ペレットを得て、ＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて懸濁した（ＧＰＲ４０を含む培養の場合は、さらに０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを添加）。次いで遠心分離し、タンパク質を抽出した。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定した。
各サンプルのタンパク量を合わせて、ウエスタンブロット分析を行った。用いた抗体は、マウスモノクローナル抗ＧＰＲ４０抗体（１：１０００、ＴｒａｎｓＧｅｎｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｏｎｅ  Ｎｏ．Ｇ１６）、ウサギポリクローナル抗ＧＰＲ４０抗体（１：１０００）、マウスモノクローナル抗ｎｅｓｔｉｎ抗体（１：１０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウスモノクローナル抗βＩＩＩツブリン抗体（１：５００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｌｏｎｅ  ＳＤＬ．３Ｄ１０、Ｔ８６６０）、ウサギ抗Ｍａｐ２抗体（１：２０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及びマウスモノクローナル抗ＮＦ−Ｍ抗体（１：１０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。
細胞周期分析
骨髄由来間葉系幹細胞を１０μＭのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に２時間インキュベートし、ＤＰＢＳを用いて１０分間、２回洗浄し、ラット抗ＢｒｄＵ及びマウス抗Ｋｉ６７一次抗体を用いて免疫染色した。表現型分布の評価は分化誘導の２４及び７２時間後にレーザ共焦点顕微鏡を用いて行った。
半定量ＲＴ−ＰＣＲ
１×１０６個の骨髄由来幹細胞からトータルＲＮＡをＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＩｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて採取し、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）を用いて１μｇのトータルＲＮＡから逆転写を行った。遺伝子特異的プライマーは、ＮＣＢＩ  Ｐｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／）及びＮＣＢＩ参照配列（（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｉｕｍ（Ｍｍｕｌ＿０５１２１２、２００６年２月、全ゲノムショットガン配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｓｃ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｒｍａｃａｑｕｅ／））を用いて作製した。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。用いた特異的プライマー配列を表２に示す。
【表２】
2011083752.tif 000004
２．結果
クローン性エクスパンドにより得られた骨髄由来間葉系幹細胞の特徴
クローン性エクスパンドにより得られた骨髄由来間葉系幹細胞は、Ｄｏｎｉｍｉｃｉらが定めた多能性細胞の基準（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，９，３１５−７，２００６）を満たしていた。すなわち、特徴的な表面分子を有しており、３胚葉に分化し、５０継代以上にわたってセルフリニューアル（自己複製）能を有していた。
骨髄由来間葉系幹細胞をフローサイトメーターを用いて評価した結果を図２に示す。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などのリンパ球マーカー、内皮細胞マーカーであるＣＤ３１、並びに造血細胞マーカーであるＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ４５については陰性であった。一方、ＣＤ２９及びＣＤ９０は強い陽性を示し、ＣＤ７３及びＣＤ１０５は弱い陽性を示した。ＣＤ１４及びＣＤ３１が陰性であることは、クローン性エクスパンドにより得られた細胞中にマクロファージや内皮細胞が含まれないことを示す。
１０％血清条件で高密度でのエクスパンドにより得られた非クローン性エクスパンドに対して、低血清条件で、低密度でエクスパンドした、ニホンザルの骨髄由来間葉系幹細胞の単一細胞から得られたコロニーは、顕著なコロニー形成を示す上に、３回継代後にはサブカルチャーした後も増殖能が認められた（図３）。クローン性エクスパンドにより得られた骨髄由来間葉系幹細胞は多能性ストローマ細胞の特徴を示し、約５０継代にわたって３胚葉への分化能を維持していた（図１Ａ、Ｂ、Ｃ）。すなわち、軟骨細胞への分化はパラフィン包埋切片を用いたアルシャン・ブルー染色により確認された（図１Ａ）。脂肪細胞誘導の４週間後にオイル・レッド０染色により脂肪細胞への分化が確認された（図１Ｂ）。さらに、骨芽細胞への分化はフォン・コッサ染色により確認された（図１Ｃ）。
増殖中又は分化した骨髄由来間葉系幹細胞におけるＧＰＲ４０レセプター発現
増殖中の細胞及び神経細胞へ分化した細胞のＧＰＲ４０  ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を免疫組織化学（図４Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、ＲＴ−ＰＣＲ（図５及び７）、並びにウエスタンブロット（図６）により分析した。ＥＭ中で増殖中の細胞は、安定的なＧＰＲ４０の発現が認められた。一方、ニューロン培地を用いた場合、ＧＰＲ４０産生は減弱した（図４Ａ）。ｂＦＧＦ単独群（図４Ｂ）とｂＦＧＦ＋ＤＨＡ群（図４Ｄ）による神経誘導の間でＧＰＲ４０発現に差が認められた。すなわち、ｂＦＧＦ単独の場合、ＧＰＲ４０の免疫染色性は最も高く、ｂＦＧＦ＋ＤＨＡを用いた場合、免疫染色性は低下した。これは、ＧＰＲ４０レセプターにＤＨＡが結合しＧＰＲ４０レセプターが活性化したために細胞内へと移動（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）したためであると解された。サイトカインで誘導される神経分化の過程でのＧＰＲ４０発現に関して、ＤＨＡ依存的神経表現型獲得の程度を調べるために、神経誘導の前に幹細胞をＥＭ又はＮＭで培養し、結果を比較した。
一方、ＤＨＡ単独の場合、ＧＰＲ４０の発現は有意に低かった（図５〜７）。細胞質の分布は少なく、細胞膜上の免疫蛍光シグナルも認められなかった（図２Ｃ）。ＤＨＡ＋ｂＦＧＦの場合でも、ＧＰＲ４０発現のコントロールと比べて有意な変化は認められなかった。ＤＨＡ＋ｂＦＧＦ群と、ＤＨＡ単独群を比べると、ＤＨＡ＋ｂＦＧＦ群でＧＰＲ４０発現が有意に低かった（図５〜７）。
増殖中又は分化した骨髄由来間葉系幹細胞における未成熟神経細胞マーカーの発現
ＥＭでの増殖中のＢＭ−ＭＳＣのｎｅｓｔｉｎ及び神経βＩＩＩ−ツブリン（Ｔｕｊ１）の発現は弱かった。血清不含ＮＭ中で７２時間増殖させた骨髄由来間葉系幹細胞において、ｎｅｓｔｉｎとβＩＩＩ−ツブリンの両方の発現が認められた（図８Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。免疫蛍光染色の結果より、２つの条件での神経誘導の結果に差があることがわかった。ＤＨＡ単独群では調べたマーカー発現の変動は認められなかった（図８Ｃ、図９〜１１）。一方、ＥＭ中でｂＦＧＦと共に増殖させた骨髄由来間葉系幹細胞はｎｅｓｔｉｎのアップレギュレーションとβＩＩＩ−ツブリンのわずかな発現が認められ、一方、ｂＦＧＦ＋ＤＨＡで誘導させた骨髄由来間葉系幹細胞は前駆マーカーのｎｅｓｔｉｎの発現は弱く、未成熟神経マーカーのβＩＩＩ−ツブリンのアップレギュレーションが認められた（図１０）。ＲＴ−ＰＣＲ（図９及び１１）及びウエスタンブロット（図１０）の結果は免疫蛍光染色の結果と一致し、ｎｅｓｔｉｎ及びβＩＩＩ−ツブリンの有意に異なるレベルの発現を示した。神経誘導前にＮＭで増殖させた骨髄由来間葉系幹細胞はｂＦＧＦ単独及びｂＦＧＦ＋ＤＨＡ誘導条件の間で有意の差はなかった。
分化した骨髄由来間葉系幹細胞における成熟神経マーカーの発現
ｂＦＧＦ単独及びｂＦＧＦ＋ＤＨＡ誘導条件での神経誘導の１週間後に、成熟神経マーカーであるＮＦ−Ｍ及びＭａｐ２の発現を調べた。通常の培地で培養した骨髄由来間葉系幹細胞もＤＨＡ単独で培養した骨髄由来間葉系幹細胞も成熟神経マーカーの発現は、特にタンパク質レベルで認められなかった（図１３〜１５）。しかしながら、ｂＦＧＦ単独群とｂＦＧＦ＋ＤＨＡ群では、成熟神経マーカーの発現が認められた（図１３〜１５）。ｂＦＧＦ単独群とｂＦＧＦ＋ＤＨＡ群ではＮＦ−Ｍ及びＭａｐ２  ｍＲＮＡを誘導し、ｂＦＧＦ単独群は有意なＭａｐ２タンパク質発現を誘導しなかった。さらに、ＤＨＡ＋ｂＦＧＦ群ではＮＦ−Ｍレベルは、有意にＭａｐ２レベルより高かった（図１４）。誘導の前にＥＭ中で増殖させた骨髄由来間葉系幹細胞は小さな細胞体より長い神経突起が伸びているという独特な形態を示し（図１２）、一方、ＮＭ中で増殖させた骨髄由来間葉系幹細胞は線維芽細胞のような形態を呈し、突起は短かった。
分化した骨髄由来間葉系幹細胞の細胞周期分析
ＢｒｄＵはＳ期の細胞に取り込まれ、Ｋｉ６７は増殖にある細胞全てに取り込まれる。免疫２重染色により、細胞周期から外れたＫｉ６７−／ＢｒｄＵ＋細胞を計測した（図１６Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ）。ＢｒｄＵ取り込みの２４時間後では、コントロールとｂＦＧＦ、ＤＨＡ及びｂＦＧＦ／ＤＨＡの４群間で有意差は認められなかった。しかし、神経分化を誘導した７２時間後には、コントロール群と比べｂＦＧＦ単独群（図１６Ｂ）において骨髄由来間葉系幹細胞の増殖率は低下し、この傾向はことにｂＦＧＦ＋ＤＨＡ群で顕著であった（図１６Ｃ）。つまり、細胞周期を外れた細胞はコントロール群と比べｂＦＧＦ＋ＤＨＡ群で激増していた（図１７）。
参考例  ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＲＰ４０のニューロン新生への役割
一過性脳虚血負荷により促進される海馬のニューロン新生サルモデルを用いて、ＧＰＲ４０とリン酸化ｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ｐＣＲＥＢ）との位置関係や成体の神経形成、学習と記憶に関与する転写因子について検討を行った。さらに、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びその受容体トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）（これらのいずれもｐＣＲＥＢの遺伝子トランスクリプトの下流に存在している）についても検討を行った。
ｐＣＲＥＢの発現はウエスタンブロットで検索したところ、一過性全脳虚血負荷後に顕著にアップレギュレートしており、海馬におけるニューロン新生の亢進と時期的に相関していた。免疫蛍光顕微鏡観察により、ＧＰＲ４０とｐＣＲＥＢの局在パターンが完全に対応していることがわかった。両者は成熟ニューロンにおいても新生ニューロンにおいても共発現し、下歯状回（ＳＧＺ：ｓｕｂｇｒａｎｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）に存在する星状膠細胞においても同様であった。ＧＰＲ４０／ｐＣＲＥＢ共陽性細胞はＳＧＺにおいて、虚血後１５日で顕著に増加した。プロＢＤＮＦは虚血後９日目で最大になったが、成熟ＢＤＮＦ（ｍＢＤＮＦ）及びＴｒｋＢ受容体はウエスタンブロットで確認したところ大きな変化は認められなかった。免疫蛍光顕微鏡観察により、新生ニューロンにおいてＢＤＮＦが発現するが、ＴｒｋＢは発現しないことがわかった。これらの結果は、ＰＵＦＡ、ＧＰＲ４０、ｐＣＲＥＢ及びＢＤＮＦは同じシグナル伝達系に密接に関与し、霊長類の成体ニューロン新生ニッチにおけるニューロン分化に関与していることを示している。
一過性の虚血負荷後に生じるＳＧＺにおける成体のニューロン新生を促進するシグナルに関し、本発明者は遊離の脂肪酸受容体であるＧＰＲ４０の関連を示唆した。海馬のニューロン新生ニッチにおいて、ＧＰＲ４０は正常（非虚血）成体ニホンザルのＳＧＺに存在する星状膠細胞におけるのと同様に成熟ニューロンにおいて、（神経の又はニューロンの）前駆細胞として見出された。さらに、虚血促進成体ニューロン新生サルモデルを用いて、ＧＰＲ４０が虚血の後に特にＳＧＺの新生ニューロンにおいてアップレギュレートされることを見出した。これらの知見は、ＧＰＲ４０が成体におけるニューロン新生に関与し、ＰＵＦＡシグナルを導く主要な因子であることを示唆する。さらに、最近の研究でＡＲＡ又はＤＨＡは、ＧＰＲ４−ＰＬＣ／ＩＰ３（フォスフォリパーゼＣ／イノシトール３リン酸）シグナル伝達系の活性化を通して、ＧＰＲ４０遺伝子で形質転換されたＰＣ１２細胞又はラット胎児能神経幹細胞において、細胞内Ｃａ２＋を増加させることがわかった。
ニューロン新生ニッチにおけるＧＰＲ４０の発現は最近になって、成体ニューロン新生の虚血サルモデルを用いて見出された。同様の実験により、ｐＣＲＥＢの発現パターンをプロファイリングし、ｐＣＲＥＢの細胞内分布はＧＰＲ４０の海馬ニューロン新生ニッチにおけるそれと同様であることがわかった。ＧＰＲ４０及びｐＣＲＥＢタンパク質は、歯状回（ＤＧ）の顆粒細胞層（ＧＣＬ）の成熟ニューロンのほとんどすべてと新生ニューロンの一部において、そしてＳＧＺの星状膠細胞においても共分布していた。さらに、ｐＣＲＥＢ及びＧＰＲ４０のいずれも同様に虚血の２週間後にアップレギュレートされ、そのピークは１５日目であった。これらの知見より、ＧＰＲ４０及びｐＣＲＥＢは機能的に関連しており、ＰＵＦＡの効果を導く同じシグナル伝達系において作用し得ることを示している。
上記の検討は、ＧＰＲ４０レセプターはＤＨＡに代表されるＰＵＦＡの信号を受け、重要な転写因子の一つであるＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のリン酸化をきたし、最終的に、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）を産生することで、新生ニューロンの分化やシナプスの可塑性に関与している可能性が高いことを示している。
すなわち、ＧＰＲ４０はｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、ＰＵＦＡのシグナルを伝達し、神経幹細胞を分化させること、ＧＰＲ４０陽性の骨髄由来間葉系多能性幹細胞はｉｎ  ｖｉｖｏでのニューロン新生に関与していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明の幹細胞は、再生医療等の医療に利用することができ、さらに薬剤の効果判定等新たな医薬の開発のツールとしても利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図３】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年11月7日(2011.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の骨髄単核細胞から単離された、ＣＤ２９陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ７３陽性及びＣＤ１０５陽性かつＣＤ３陰性、ＣＤ４陰性、ＣＤ８陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性及びＣＤ３１陰性であり、多価不飽和脂肪酸のシグナル刺激により神経細胞へと分化し得る、ＧＰＲ４０陽性の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
以下の特性を有する、請求項１記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞：
（ｉ）  癌化しない；
（ｉｉ）  ３胚葉系へ分化する能力を有する；及び
（ｉｉｉ）  セルフ・リニューアル（自己複製）能を有する。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である、請求項１記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
【請求項７】
（ｉ）  骨髄単核細胞を接着培養し、接着した細胞を回収し、
（ｉｉ）  回収した細胞から単一細胞由来コロニーを得て、
（ｉｉｉ）  得られたコロニーの細胞をエクスパンド用に調製した培地で低濃度血清条件下で低密度で培養し、エクスパンドし、
（ｉｖ）  （ｉｉｉ）のエクスパンドした細胞をさらにサブクローン化し、単一クローンとして細胞を得て、
（ｖ）  得られた細胞について、細胞表面のＧＰＲ４０、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＣＤ１０５の発現を確認し、ＧＰＲ４０、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＣＤ１０５の発現が認められるものを幹細胞として得る、ことを含む、請求項１、４及び６のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞を単離する方法。
【請求項８】
請求項７記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞を単離する方法であって、さらに、細胞表面のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＣＤ３１の発現を確認し、ＣＤ３陰性、ＣＤ４陰性、ＣＤ８陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性及びＣＤ３１陰性であるものを得ることを含む方法。
【請求項９】
骨髄単核細胞から、ＧＰＲ４０陽性の細胞を単離することを含む、請求項１、４及び６のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
【請求項１０】
さらに、ＣＤ２９陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ７３陽性及びＣＤ１０５陽性である細胞を単離することを含む、請求項９記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
【請求項１１】
さらに、ＣＤ３陰性、ＣＤ４陰性、ＣＤ８陰性、ＣＤ１４陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性及びＣＤ３１陰性である細胞を単離することを含む、請求項１０記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
【請求項１２】
請求項１、４及び６のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで多価不飽和脂肪酸と接触させて、神経細胞に効率よく分化誘導する方法。
【請求項１３】
多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１、４及び６のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞を含む組織再生用組成物。
【請求項１５】
組織が神経組織、脂肪組織、骨組織又は軟骨組織である、請求項１４記載の組織再生用組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月12日(2012.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の骨髄単核細胞から単離された、CD29陽性、CD90陽性、CD73陽性及びCD105陽性かつCD3陰性、CD4陰性、CD8陰性、CD14陰性、CD34陰性、CD45陰性及びCD31陰性であり、多価不飽和脂肪酸のシグナル刺激により神経細胞へと分化し得る、GPR40陽性の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
【請求項２】
以下の特性を有する、請求項１記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞：
(i)  癌化しない；
(ii)  ３胚葉系へ分化する能力を有する；及び
(iii)  セルフ・リニューアル（自己複製）能を有する。
【請求項３】
多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（DHA）である、請求項１記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞。
【請求項４】
(i)  骨髄単核細胞を接着培養し、接着した細胞を回収し、
(ii)  回収した細胞から単一細胞由来コロニーを得て、
(iii)  得られたコロニーの細胞をエクスパンド用に調製した培地で低濃度血清条件下で低密度で培養し、エクスパンドし、
(iv)  (iii)のエクスパンドした細胞をさらにサブクローン化し、単一クローンとして細胞を得て、
(v)  得られた細胞について、細胞表面のGPR40、CD29、CD90、CD73及びCD105の発現を確認し、GPR40、CD29、CD90、CD73及びCD105の発現が認められるものを幹細胞として得る、ことを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞を単離する方法。
【請求項５】
請求項４記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞を単離する方法であって、さらに、細胞表面のCD3、CD4、CD8、CD14、CD34、CD45及びCD31の発現を確認し、CD3陰性、CD4陰性、CD8陰性、CD14陰性、CD34陰性、CD45陰性及びCD31陰性であるものを得ることを含む方法。
【請求項６】
骨髄単核細胞から、GPR40陽性の細胞を単離することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
【請求項７】
さらに、CD29陽性、CD90陽性、CD73陽性及びCD105陽性である細胞を単離することを含む、請求項６記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
【請求項８】
さらに、CD3陰性、CD4陰性、CD8陰性、CD14陰性、CD34陰性、CD45陰性及びCD31陰性である細胞を単離することを含む、請求項７記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞の単離方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞をin vitroで多価不飽和脂肪酸と接触させて、神経細胞に効率よく分化誘導する方法。
【請求項１０】
多価不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸（DHA)である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨髄由来間葉系多能性幹細胞を含む組織再生用組成物。
【請求項１２】
組織が神経組織、脂肪組織、骨組織又は軟骨組織である、請求項１１記載の組織再生用組成物。
【国際調査報告】
2011083752.tif 000028
2011083752.tif 000029
2011083752.tif 000030
2011083752.tif 000031