(57)【要約】  本発明は、悪性黒色腫の診断マーカー、新規医薬組成物、および、新規免疫抑制剤を提供することを目的とする。ヒスタチン−１ｍＲＮＡ、および、ヒスタチン−１タンパク質は、悪性黒色腫の診断マーカーとして使用できる。また、ヒスタチン−１タンパク質の機能を抑制する機能抑制物質を含有させ、医薬組成物とすることができる。さらに、ヒスタチン−１タンパク質、あるいは、ヒスタチン−１タンパク質を単球に作用させて分化誘導した樹状細胞を含有させ、免疫抑制剤とすることができる。
2012023588.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスタチン−１タンパク質を含有する、免疫抑制剤。
【請求項２】
ヒスタチン−１タンパク質を発現する発現ベクターを含有する、請求項１に記載の免疫抑制剤。
【請求項３】
前記発現ベクターによって形質転換された形質転換細胞を含有する、請求項２に記載の免疫抑制剤。
【請求項４】
免疫抑制性樹状細胞の製造方法であって、
ヒトまたはヒト以外の脊椎動物から単離した単球を、ヒスタチン−１タンパク質の存在下で分化させる工程を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性黒色腫の診断マーカー、ヒスタチン−１タンパク質の機能抑制物質を含有する医薬組成物、および、免疫抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性黒色腫は、皮膚悪性腫瘍のうち、メラノサイトあるいは母斑細胞が悪性化した腫瘍であり、白色人種で特に発症率が高く、大変悪性度の高い腫瘍である。しかしながら、病期Ｉ〜ＩＩに分類される悪性黒色腫の場合、患者の予後は良好であり、適切な診断法による早期発見が重要である。現在、悪性黒色腫に罹患しているか否かの診断、および病期診断には、腫瘍組織の生検診断が行われている。【０００３】
ヒスタチン−１タンパク質は、唾液に含まれるタンパク質として知られ（例えば、Vitorino R. et al., Biomed. Chromatogr. 19 (3): 214-222, 2005参照）、抗菌作用を有することが知られている（例えば、特開２００５−１５４３３８号公報参照）。一方、ヒスタチン−１遺伝子やヒスタチン−１タンパク質と、がんとの関連を示す知見は報告されていない。【０００４】
また、ヒスタチン−１遺伝子やヒスタチン−１タンパク質と、免疫抑制メカニズムとの関連を示す知見も報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、悪性黒色腫の診断マーカー、新規な医薬組成物、および、新規な免疫抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、悪性黒色腫患者の生体試料に、ヒスタチン−１ｍＲＮＡおよびヒスタチン−１タンパク質が検出されることを見出し、悪性黒色腫の診断するためのバイオマーカーを発明するに至った。【０００７】
すなわち、本発明に係るバイオマーカーは、悪性黒色腫の診断をするためのバイオマーカーであって、ヒスタチン−１ｍＲＮＡあるいはヒスタチン−１タンパク質であることを特徴とする。【０００８】
本発明に係る測定方法は、採取された生体試料において、ヒスタチン−１ｍＲＮＡあるいはヒスタチン−１タンパク質の含有量を測定する工程を含むことを特徴とする。ここで、生体試料は、皮膚または血液であることが好ましい。【０００９】
本発明に係る、悪性黒色腫に対する薬剤の効果を判定するための方法は、ヒトまたはヒト以外の悪性黒色腫に罹患した脊椎動物に前記薬剤を投与する前後に前記脊椎動物から採取された生体試料に対し、ヒスタチン−１ｍＲＮＡあるいはヒスタチン−１タンパク質の含有量を測定する工程（１）と、工程１の測定値を、前記薬剤を投与する前と後で比較する工程（２）と、を含むことを特徴とする。【００１０】
本発明に係る、悪性黒色腫に対する薬剤の効果を判定するための方法は、ヒトまたはヒト以外の悪性黒色腫に罹患した脊椎動物に前記薬剤を投与した後に、前記脊椎動物から採取された生体試料に対し、ヒスタチン−１ｍＲＮＡあるいはヒスタチン−１タンパク質の含有量を測定する工程（１）と、前記悪性黒色腫に罹患した脊椎動物と健常脊椎動物を判別するための、ヒスタチン−１ｍＲＮＡあるいはヒスタチン−１タンパク質の含有量の閾値と、工程１の測定値とを比較する工程（２）と、を含むことを特徴とする。【００１１】
本発明に係る、ヒトまたはヒト以外の悪性黒色腫に罹患した脊椎動物に対する治療薬をスクリーニングする方法は、治療薬の候補物質投与前の悪性黒色腫モデル動物から、生体試料を採取する工程（１）と、前記悪性黒色腫モデル動物に、治療薬の候補物質を投与する工程（２）と、前記候補物質を投与後の前記悪性黒色腫モデル動物から、生体試料を採取する工程（３）と、工程１および３で採取された生体試料に対し、ヒスタチン−１ｍＲＮＡあるいはヒスタチン−１タンパク質の含有量を測定する工程（４）と、工程４の測定値を、前記治療薬の候補物質投与前と後で比較する工程（５）と、を含むことを特徴とする。【００１２】
また、本発明者らは、ヒスタチン−１遺伝子、およびヒスタチン−１タンパク質と、悪性黒色腫の細胞遊走能との関連を見出し、ヒスタチン−１タンパク質の機能抑制物質を含有する医薬組成物を発明するに至った。【００１３】
すなわち、本発明に係る医薬組成物は、ヒスタチン−１タンパク質の機能を抑制する機能抑制物質を含有することを特徴とする。ここで、機能抑制物質は、ヒスタチン−１タンパク質に対する特異的抗体、あるいは、ヒスタチン−１タンパク質の発現を抑制する発現抑制物質であることが好ましく、発現抑制物質は、ｓｉＲＮＡであることがより好ましい。【００１４】
本発明に係る悪性黒色腫治療用薬剤は、上記いずれかの、ヒスタチン−１タンパク質の機能を抑制する機能抑制物質を含有することを特徴とする。【００１５】
さらに、本発明者らは、単球にヒスタチン−１タンパク質を作用させることにより、免疫抑制性樹状細胞が分化することを見出し、本発明に係る免疫抑制剤を発明するに至った。【００１６】
すなわち、本発明に係る免疫抑制剤は、ヒスタチン−１タンパク質を含有することを特徴とする。ここで、本発明に係る免疫抑制剤は、ヒスタチン−１タンパク質を発現する発現ベクターを含有していても、あるいは、ヒスタチン−１タンパク質を発現する発現ベクターによって形質転換された形質転換細胞を含有していてもよい。【００１７】
本発明に係る免疫抑制性樹状細胞の製造方法は、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物から単離した単球を、ヒスタチン−１タンパク質の存在下で分化させる工程を含むことを特徴とする。【００１８】
本発明に係る免疫抑制性樹状細胞は、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物から単離した単球を、ヒスタチン−１タンパク質の存在下で分化させる工程を含む製造方法により、製造されたことを特徴とする。本発明に係る免疫抑制剤は、この免疫抑制性樹状細胞を含有していてもよい。【００１９】
＝＝クロスリファレンス＝＝
本出願は、２０１０年８月１９日付で出願した日本国特許出願２０１０−１８４１５０に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の一実施形態において、ヒト悪性黒色腫細胞株におけるヒスタチン−１ｍＲＮＡの発現を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態において、悪性黒色腫患者のセンチネルリンパ節転移巣におけるヒスタチン−１ｍＲＮＡの高発現群と低発現群における生存率を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施形態において、ヒト悪性黒色腫細胞株Ｃ３２ｍｅｌにヒスタチン−１タンパク質を添加した場合の、細胞遊走能の上昇を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施形態において、ヒト悪性黒色腫細胞株ＳＫｍｅｌ２３においてヒスタチン−１遺伝子をノックダウンした場合の、細胞遊走能の低下を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施形態において、ヒト悪性黒色腫細胞株Ａ３７５においてヒスタチン−１遺伝子を強制発現させた場合の、細胞遊走能の上昇を示すグラフである。
【図６】本発明の一実施形態において、腫瘍なし（非担癌）、ヒスタチン−１非発現腫瘍細胞（ＭＯＣＫ）、ヒスタチン−１発現腫瘍細胞（ヒスタチン−１）をそれぞれマウスに移植した場合の、所属リンパ節への移植細胞の浸潤および転移を示すＦＡＣＳ解析図（Ａ）、および、ＭＯＣＫ群、ヒスタチン−１群の各個体における結果の分布図（Ｂ）である。
【図７】本発明の一実施形態において、腫瘍なし（非担癌）、ヒスタチン−１非発現腫瘍細胞（ＭＯＣＫ）、ヒスタチン−１発現腫瘍細胞（ヒスタチン−１）をそれぞれマウスに移植した場合の、肺組織への移植細胞の浸潤および転移を示すＦＡＣＳ解析図（Ａ）、および、ＭＯＣＫ群、ヒスタチン−１群の各個体における結果の分布図（Ｂ）である。
【図８】本発明の一実施形態において、単球にヒスタチン−１タンパク質を作用させて分化させた樹状細胞の、ＩＬ−１２（Ａ）、ＴＮＦ−α（Ｂ）、ＩＬ−１０（Ｃ）の産生量を示すグラフである。
【図９】本発明の一実施形態において、単球にヒスタチン−１タンパク質を作用させて分化させた樹状細胞の、各細胞表面マーカーの発現を示した図である。
【図１０】本発明の一実施形態において、単球にヒスタチン−１タンパク質を作用させて分化させた樹状細胞とＴ細胞を共培養した場合の、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生量を示すグラフである。
【図１１】本発明の一実施形態において、ヒスタチン−１タンパク質を強制発現させた３９７ｍｅｌをヌードマウスに移植し、３９７ｍｅｌ由来の腫瘍組織または脾臓から単離された樹状細胞をＴ細胞と共培養した場合の、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生量を示すグラフである。なお、陰性対照として、ヒスタチン−１タンパク質を強制発現させていない３９７ｍｅｌを用いた。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００２２】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２４】
ここで、本明細書における悪性黒色腫は、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、末端黒子型黒色腫、および、これらの中間型黒色腫等を含む全ての悪性黒色腫を指すものとし、その進行度によって制限されない。
【００２５】
＝＝バイオマーカー＝＝
本明細書において、悪性黒色腫の診断をするためのバイオマーカー（診断マーカー）は、悪性黒色腫罹患動物を高確率で特定できる診断マーカー（罹患マーカー）、悪性黒色腫の病期を判定できる診断マーカー（病期マーカー）、悪性黒色腫の悪性度を判定できる診断マーカー（悪性度マーカー）、悪性黒色腫罹患動物の予後または余命を判定するための診断マーカー（予後マーカー）、悪性黒色腫の浸潤能や転移能を判定できる診断マーカー（浸潤能マーカーや転移能マーカー）などを含む。
【００２６】
本発明に係るバイオマーカーは、ヒスタチン−１遺伝子の発現量の指標となるものであって、ヒスタチン−１ｍＲＮＡおよびヒスタチン−１タンパク質である。診断対象の脊椎動物から採取した生体試料中のバイオマーカーの含有量を測定することにより、その個体における悪性黒色腫の診断、および悪性黒色腫に対する薬剤の判定やスクリーニングをすることができる。
【００２７】
なお、診断対象の動物は、本発明に係るバイオマーカーを有する脊椎動物であればヒトでもヒト以外でもよいが、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、サル等の哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることが最も好ましい。また、脊椎動物の年齢、性別は制限されない。
【００２８】
ここで、バイオマーカーの含有量（以下、バイオマーカー量とも称する）とは、バイオマーカーの絶対濃度が好ましいが、バイオマーカーの絶対濃度と相関して各個体における絶対濃度の比較ができる値であれば制限されず、相対濃度や、単位体積当たりの含有量や、絶対濃度を知るために測定した生データ等であってもよい。
【００２９】
＝＝バイオマーカーの測定方法＝＝
本発明では、診断対象の動物から採取した生体試料において、ヒスタチン−１遺伝子の発現量を測定することにより、悪性黒色腫の診断をする。ヒスタチン−１遺伝子の発現量を測定するための生体試料の種類は、特に限定されないが、生体試料採取の容易さを考慮すると、診断対象の動物において悪性黒色腫が疑われる皮膚組織、または診断対象の動物の血液であることが好ましい。ヒスタチン−１遺伝子の発現量は、例えば、当業者に周知の方法を用いてヒスタチン−１ｍＲＮＡまたはヒスタチン−１タンパク質の含有量を測定することにより、測定することができる。
【００３０】
[ヒスタチン−１ｍＲＮＡ]
ヒスタチン−１ｍＲＮＡは、診断対象の動物から採取した生体試料において、例えば、ヒスタチン−１ｍＲＮＡに特異的なプローブを用いたin situ hybridization 法によってヒスタチン−１ｍＲＮＡを検出することにより、測定することができる。予め作成した、生体試料における標識量とヒスタチン−１ｍＲＮＡの含有量との検量線と、診断対象の生体試料における標識量とを比較することにより、診断対象の生体試料におけるヒスタチン−１ｍＲＮＡの含有量を算出することができる。あるいは、当業者に周知の方法に従い、生体試料から単離したｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを調製し、ヒスタチン−１に特異的なプライマーペアを用いたＰＣＲによってヒスタチン−１ｍＲＮＡの含有量を測定してもよい。または、生体試料からＲＮＡを単離し、ヒスタチン−１ｍＲＮＡに特異的なプローブを用いたノーザン・ブロット法によってヒスタチン−１ｍＲＮＡを検出してもよい。このように検出したヒスタチン−１ｍＲＮＡは、予め作成した検量線と比較することによって、その生体試料における含有量を算出することができる。
【００３１】
[ヒスタチン−１タンパク質]
ヒスタチン−１タンパク質の含有量は、診断対象の動物から採取した生体試料において、例えば、ヒスタチン−１タンパク質に対する特異的抗体を用いて測定することができる。ヒスタチン−１タンパク質に対する特異的抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、由来する動物種により制限されない。なお、抗体は、免疫グロブリン全長からなる抗体、および、部分抗体を含む。部分抗体とは、抗原結合部位を含み、抗原結合活性を有する抗体の断片であって、Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片を例示できる。
【００３２】
皮膚組織等の生体試料においてヒスタチン−１タンパク質の含有量を測定する場合、例えば、免疫組織化学的手法を用いて、ヒスタチン−１タンパク質を検出してもよい。あるいは、当業者に周知の方法によって、診断対象の動物の組織からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロット法によってヒスタチン−１タンパク質を検出してもよい。このように検出したヒスタチン−１タンパク質は、予め作成した検量線と比較することによって、その組織における含有量を算出することができる。一方、生体試料が血液の場合、ヒスタチン−１タンパク質の含有量は、公知の方法によって測定でき、例えば、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等のＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immunosorbent assay)法、ＲＩＡ(radioimmunoassay)法、フローメトリー法、イムノクロマトグラィー等の周知の方法を用いることができる。なお、測定に供する血液には、前処理をしておくことが好ましい。例えば、静置や遠心分離などによって血液から血清または血漿を分離し、取り出した血清または血漿を測定に用いることが好ましい。
【００３３】
この方法で用いられる、バイオマーカーを検出するためのプローブ、抗体は、可視化のために標識されていることが好ましく、標識物質としては、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標、ルミネックス社）等の蛍光マイクロビーズ、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、酵素等（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジン等の物質を例示できるが、これらに限定されない。
【００３４】
＝＝バイオマーカーの使用方法＝＝
本発明に係るバイオマーカーは、悪性黒色腫の罹患の診断、あるいは悪性黒色腫の病期の診断などの、悪性黒色腫の診断に用いることができる。
【００３５】
[悪性黒色腫の罹患の診断]
本発明に係るバイオマーカーを用いて、ある動物が悪性黒色腫に罹患しているかどうか診断するために、例えば、予め、診断のためのバイオマーカー量の範囲、あるいは閾値を決めておく。
【００３６】
具体的には、悪性黒色腫に罹患していると診断された複数の脊椎動物（本明細書では罹患動物とも称する）、および悪性黒色腫に罹患していないと診断された複数の脊椎動物（本明細書では健常動物とも称する）の生体試料中のバイオマーカー量を測定し、各々の分布の範囲を算出しておく。診断対象である脊椎動物の生体試料のバイオマーカー量が、罹患動物のバイオマーカー量の範囲に入る場合は、悪性黒色腫に罹患しているとする。あるいは、健常動物のバイオマーカー量の範囲に入る場合は、悪性黒色腫に罹患していないとする。あるいは、診断には、健常動物のバイオマーカー量の範囲だけを用い、その範囲に入る場合は健常と診断し、その範囲外であるときは、悪性黒色腫に罹患しているとしてもよい。
【００３７】
また、健常動物の生体試料中のバイオマーカー量の範囲として、診断対象となる脊椎動物個体自身の健常時における生体試料中のバイオマーカー量を予め測定し、健常時のバイオマーカー量の範囲を算出しておき、診断時のバイオマーカー量を、健常時のバイオマーカー量の範囲と比較してもよい。そして、診断時のバイオマーカー量が、健常時のバイオマーカー量の範囲に入る場合は、悪性黒色腫に罹患していないとする。
【００３８】
ここで、罹患動物または健常動物の生体試料中のバイオマーカー量の範囲は、上述したように、実際の含有量の分布範囲と一致させても良いが、複数の脊椎動物の生体試料中のバイオマーカーの測定値の平均値に標準偏差を減じた値から平均値に標準偏差を加えた値までの範囲としてもよく、平均値の下限値から上限値までの範囲としてもよく、特に限定されるものではない。また、罹患動物と健常動物を区別するための閾値の決定方法は、当業者の定法に従えばよい。例えば、罹患動物が、閾値以上にできるだけ高い割合で含まれ、健常動物が、閾値未満にできるだけ高い割合で含まれるように閾値を決定することによって、診断対象の動物が悪性黒色腫に罹患しているか否かをより正確に診断することが可能である。
【００３９】
なお、本発明に係るバイオマーカーによる悪性黒色腫の罹患の診断を、従来の目視や生検法などと組み合わせて行ってもよい。
【００４０】
[悪性黒色腫の病期の診断]
悪性黒色腫の病期は、一般にＩ期からＩＶ期までの４段階に分類される。Ｉ期が最も軽度で、ＩＶ期が最も進行している。本発明に係るバイオマーカーは、悪性黒色腫の病期（進行度）の診断に用いてもよい。
【００４１】
具体的には、予め、複数の健常動物、および、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期の悪性黒色腫に罹患した複数の脊椎動物の生体試料のバイオマーカー量を測定し、上記「悪性黒色腫の罹患の診断」の記載と同様にして、悪性黒色腫の各病期に対応するバイオマーカー量の範囲、あるいは各病期を区分できる閾値を設定する。そして、診断対象の脊椎動物のバイオマーカー量がいずれの病期の範囲に入るかに従って、悪性黒色腫の進行度を診断してもよい。
【００４２】
[悪性黒色腫の治療後の予後の診断]
悪性黒色腫の罹患動物において、その病期が軽度の場合に動物の予後が良好であり、病期が進行している場合に予後が不良である、との傾向が知られる。例えば、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期のそれぞれについて、治療開始後５年以上の生存率（５年生存率）がおおよそ９５〜１００％、７０〜８０％、５０〜６０％、１０％前後であると考えられている。従って、本発明に係るバイオマーカーは、悪性黒色腫の治療後の予後の診断に用いてもよい。すなわち、診断時のバイオマーカー量が高いほど予後が悪いとし、低いほど予後が良好であるとする。あるいは、診断時のバイオマーカー量が所定の値より高い場合に予後が悪いとし、低い場合に予後が良好であるとしてもよい。
【００４３】
本発明に係る予後の診断は、悪性黒色腫の治療開始前に行っても、治療中に行っても、あるいは治療終了後に行ってもよく、それぞれの時点で予測される予後を診断できる。
【００４４】
ここで、予後が良好とは、悪性黒色腫の治療後の見通しが良好であることであり、予後が不良とは、悪性黒色腫の治療後の見通しが良くないことである。例えば、予後の指標として、治療開始後の生存年数に対応する、バイオマーカー量の範囲や閾値を予め設定しておいてもよい。あるいは、がん患者の予後を判断する基準として一般に用いられる、５年生存率を基準にし、治療開始後５年以上の生存が予測される場合を予後が良好、５年未満で死亡が予測される場合を予後が不良と診断できるように、良好の場合と不良の場合のそれぞれに対応する、バイオマーカー量の範囲や閾値を予め設定しておいてもよい。
【００４５】
[悪性黒色腫の浸潤能および転移能の診断]
本発明に係るバイオマーカーは、悪性黒色腫の浸潤能および転移能、並びに悪性度の診断に用いることができる。
【００４６】
具体的には、予め、複数の健常動物、および、浸潤能または転移能の異なる悪性黒色腫に罹患した複数の脊椎動物の生体試料のバイオマーカー量を測定し、上記「悪性黒色腫の罹患の診断」同様に、悪性黒色腫の浸潤能または転移能に対応するバイオマーカー量の範囲、あるいは、浸潤能または転移能の高低を判定できる閾値を設定する。そして、診断対象の脊椎動物のバイオマーカー量がいずれの範囲に入るかに従って、悪性黒色腫の浸潤能または転移能を診断することができる。すなわち、診断時のバイオマーカー量が高いほど浸潤能または転移能が高いとし、低いほど浸潤能または転移能が低いとする。あるいは、診断時のバイオマーカー量が所定の値より高い場合に浸潤能または転移能が高いとし、低い場合に浸潤能または転移能が低いとしてもよい。
【００４７】
[悪性黒色腫の悪性度の診断]
腫瘍について、腫瘍細胞の増殖速度が速い、浸潤能が高い、転移能が高い、および／または、予後が不良である場合に、その悪性黒色腫は相対的に悪性度が高いという。一方、腫瘍細胞の増殖速度が遅く、浸潤能が低い、転移能が低い、および／または、予後が良好である場合に、その悪性黒色腫は相対的に悪性度が低いという。従って、本発明に係るバイオマーカーは、悪性黒色腫の悪性度の診断に用いることができる。すなわち、診断時のバイオマーカー量が高いほど悪性度が高いとし、低いほど悪性度が低いとする。あるいは、診断時のバイオマーカー量が所定の値より高い場合に悪性度が高いとし、低い場合に悪性度が低いとしてもよい。
【００４８】
[薬剤の効果の判定]
本発明に係るバイオマーカーは、悪性黒色腫に対する薬剤の効果の判定に用いることができる。
【００４９】
疾患の治療薬は、個体によってその効果がばらつくことがある。従って、ある治療薬の薬効を、各個体において調べることは非常に有益であり、本発明のバイオマーカーを用いれば、容易に悪性黒色腫の治療薬の薬効を調べることができる。例えば、悪性黒色腫の治療薬を投薬する前後で、本発明に係るバイオマーカーを用いて、悪性黒色腫を診断することにより、悪性黒色腫が改善されたかどうか判断でき、それによって、投薬した治療薬の薬効を判断することができる。
【００５０】
[悪性黒色腫に効果のある薬剤のスクリーニング]
本発明に係るバイオマーカーを悪性黒色腫のモデル動物に用いて、悪性黒色腫の治療に効果がある化合物を同定することができる。例えば、悪性黒色腫のモデル動物に悪性黒色腫の治療薬の候補である化合物を投与し、投与前後で生体試料を採取し、本発明に係るバイオマーカーを用いて、悪性黒色腫を診断し、悪性黒色腫が改善されたかどうか判断すれば良い。このように、本発明のバイオマーカーを用いることにより、悪性黒色腫の治療に効果がある化合物を容易にスクリーニングすることも可能である。
【００５１】
[罹患動物に最も効果のある薬剤のスクリーニング]
個体によって薬効が異なる薬剤の場合、悪性黒色腫に罹患した脊椎動物に複数の薬剤を個別に投与した後、薬剤ごとにバイオマーカーによって診断することにより、その個体にとって最も有効な薬剤をスクリーニングすることも可能である。
【００５２】
＝＝医薬組成物＝＝
本発明に係る医薬組成物は、ヒスタチン−１タンパク質の機能を抑制する機能抑制物質を含有することを特徴とする。
【００５３】
ここで、ヒスタチン−１タンパク質の機能抑制物質は、医薬組成物の投与対象の動物において、本来機能すべき細胞全体でヒスタチン−１タンパク質の機能を低下させる物質であれば、そのメカニズムに制限はなく、ヒスタチン−１タンパク質自体の機能を阻害する物質であっても、あるいは、ヒスタチン−１タンパク質の発現を抑制することによって機能を抑制する発現抑制物質であってもよい。ヒスタチン−１タンパク質自身の機能を抑制する物質は、例えば、ヒスタチン−１タンパク質の細胞における作用機序を阻害することによってヒスタチン−１タンパク質の機能を抑制する物質であっても、ヒスタチン−１タンパク質自体に作用してヒスタチン−１タンパク質の機能を抑制する物質であってもよい。ヒスタチン−１タンパク質の細胞における作用機序を阻害する物質としては、例えば、1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene（Ｕ０１２６、Oudhoff MJ et al., FASEB J. 22: 3805 2008 参照）等が挙げられる。また、ヒスタチン−１タンパク質自体に作用する物質としては、例えば、ヒスタチン−１タンパク質に対する特異的抗体等が挙げられる。ここで、ヒスタチン−１タンパク質に対する特異的抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、由来する動物種により制限されない。なお、抗体は、免疫グロブリン全長からなる抗体、および、部分抗体を含む。部分抗体とは、抗原結合部位を含み、抗原結合活性を有する抗体の断片であって、Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片を例示できる。発現抑制物質は、ヒスタチン−１遺伝子の発現を抑制することができる物質であれば制限はなく、ヒスタチン−１遺伝子の転写産物あるいはその一部に対するアンチセンス核酸、ヒスタチン−１遺伝子の転写産物に対するリボザイム活性を持った核酸、ヒスタチン−１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、デコイなどが例示できる。これらの核酸を使用する方法は当業者の技術常識であり、そのための核酸も、当業者は容易に設計できる。これらの核酸は、化学合成し、そのまま医薬組成物として用いることができるが、ＲＮＡの場合、そのＲＮＡを発現するように好適な発現ベクターを医薬組成物とし、剤形化した後、投与対象の罹患動物に投与することによって、その体内でＲＮＡを発現させてもよい。
【００５４】
このような医薬組成物は、当業者に周知の方法で剤形化し、悪性黒色腫治療用薬剤を調製することができる。悪性黒色腫治療用薬剤の剤形化には、当業者に周知の薬学的に許容される担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物が用いられる。その形態は本医薬剤を投与対象の動物体内の患部に送達するために適切な剤形であれば特に特定されず、例えば、経口剤として、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等に剤形化してもよい。また、注射剤に剤形化してもよい。本医薬剤には、上記製剤用添加物の他、異なる医薬組成物を配合することもできる。
【００５５】
このように調製した悪性黒色腫治療用薬剤の投与対象は、ヒスタチン−１タンパク質を有する範囲で特に限定されないが、脊椎動物であることが好ましく、ヒトでもヒト以外でもよいが、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、サル等の哺乳動物であることがより好ましく、ヒトであることが最も好ましい。また、脊椎動物の年齢、性別は制限されない。
【００５６】
また、投与部位は、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、リンパ節投与、腹腔内投与などが考えられ、治療者が適宜選択すれば良い。
【００５７】
＝＝免疫抑制剤＝＝
本発明に係る免疫抑制剤は、ヒスタチン−１タンパク質、ヒスタチン−１タンパク質を発現する発現ベクター、ヒスタチン−１タンパク質を発現する発現ベクターによって形質転換された形質転換細胞、あるいはヒスタチン−１タンパク質を単球に作用させて分化させた免疫抑制性樹状細胞を含有する。
【００５８】
免疫抑制剤の投与対象は、脊椎動物であることが好ましく、ヒトでもヒト以外でもよいが、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、サル等の哺乳動物であることがより好ましく、ヒトであることが最も好ましい。また、脊椎動物の年齢、性別は制限されない。
【００５９】
ここで、免疫抑制剤に関し、ヒスタチン−１タンパク質、発現ベクター、形質転換細胞のようにヒスタチン−１タンパク質を、直接的又は間接的に投与する場合、ヒスタチン−１タンパク質は、免疫抑制剤の投与対象の動物に由来することが好ましいが、免疫抑制剤の投与対象の動物に由来する単球に作用して、単球を、免疫抑制性の樹状細胞に分化するように誘導する作用を持つ範囲で制限されず、例えば、免疫抑制剤の投与対象がヒトの場合、GenBank M26664 に登録されたタンパク質（MKFFVFALVLALMISMISADSHEKRHHGYRRKFHEKHHSHREFPFYGDYGSNYLYDN、配列番号１）からシグナル配列を除去したヒトヒスタチン−１タンパク質（DSHEKRHHGYRRKFHEKHHSHREFPFYGDYGSNYLYDN、配列番号２）だけでなく、ヒト単球を免疫抑制性の樹状細胞に分化させる作用を持つ他の動物種のホモログ（オーソログを含む）も含むものとする。また、免疫抑制性樹状細胞を投与する場合、免疫抑制性樹状細胞が由来する動物に由来することが好ましいが、その動物から取得した単球を、免疫抑制性の樹状細胞に分化するように誘導する作用を持つ範囲で制限されず、例えば、その動物がヒトの場合、ヒトヒスタチン−１タンパク質だけでなく、ヒト単球を免疫抑制性の樹状細胞に分化させる作用を持つ他の動物種のホモログ（オーソログを含む）も含むものとする。なお、この免疫抑制性樹状細胞が由来する動物は、免疫抑制剤の投与対象の動物と同じ種類であることが好ましいが、実施目的に重大な問題のない限り、投与対象の動物他以外の動物種であっても構わず、実施者が適宜動物種を選択してもよい。
【００６０】
なお、免疫抑制剤に含まれるヒスタチン−１タンパク質は、所望の免疫抑制機能を有する範囲で、数アミノ酸残基（例えば、１０アミノ酸残基、好ましくは８アミノ酸残基、より好ましくは６アミノ酸残基、さらに好ましくは４アミノ酸残基、さらに好ましくは２アミノ酸残基）が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有していてもよい。
【００６１】
免疫抑制剤の投与対象の疾患には、関節リウマチや炎症性腸疾患などの自己免疫疾患臓や器移植後の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等が挙げられる。
【００６２】
ヒスタチン−１タンパク質の取得方法は特に制限されず、ペプチドを発現する細胞から単離・精製されたペプチドであっても、遺伝子組換え技術によって製造された組換えペプチドであっても、または周知の方法で化学合成したペプチドであってもよい。ヒスタチン−１タンパク質は、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。ヒスタチン−１タンパク質を発現する発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用い、ヒスタチン−１タンパク質をコードするＤＮＡを好適な発現ベクターに挿入して調製することができる。また、形質転換細胞は、そのような発現ベクターを、当業者に周知の形質転換法によって細胞に導入して作製することができる。形質転換に用いる細胞の種類は特に限定されない。
【００６３】
ヒスタチン−１タンパク質存在下で単球を分化させた免疫抑制性樹状細胞は、通常の樹状細胞に比較して、ＩＬ−１２等の炎症性サイトカイン産生量が低く、ＩＬ−１０等の抑制性サイトカイン産生量が高い。また、Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生量を低下させる作用を有している。さらに、ＮＫ細胞活性化に必要なＵＬＢＰ２の発現量は低下し、ＮＫＴ細胞活性化に必要なＣＤ１ｄの発現量も低下している。一方、免疫抑制性樹状細胞に多く発現することが知られるＴＬＲ５の発現量は、亢進している。従って、免疫抑制剤は、ヒスタチン−１タンパク質を単球に作用させて分化させた免疫抑制性樹状細胞を含んでいてもよい。
【００６４】
ヒスタチン−１タンパク質を単球に作用させることによる、免疫抑制樹状細胞の調製は、当業者に周知の単球単離方法（例えば、Sumimoto H. et al., J. Exp. Med. 203: 1651-1656, 2006）、培養方法等を組み合わせて適宜行うことができるが、例えば、以下のようにして調製できる。
【００６５】
まず、脊椎動物の末梢血から単核球（以下ＰＢＭＣともいう）を単離した後、ＣＤ１４陽性単球を単離する。ＰＢＭＣの単離方法は特に制限されず、フィコール遠心分離法等、単離したいＰＢＭＣの種類によって当業者が適宜決定できる。そして、単離したＰＢＭＣ分画から、さらに抗体結合磁気ビーズ分離法等によりＣＤ１４陽性単球を単離できる。単離したＣＤ１４陽性単球を、ヒスタチン−１タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−４を加えた血清添加培地で培養する。ここで培地は、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地やＡＩＭ−Ｖ培地を使用することができる。また、培養時間は、最終的に免疫抑制性樹状細胞が得られる範囲で制限されないが、５〜６日間であることが好ましい。その後、さらにリポポリサッカロイドおよびヒスタチン−１タンパク質で刺激しながら培養することにより、樹状細胞を得ることができる。この培養工程において、培地は、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地やＡＩＭ−Ｖ培地を使用することができる。また、この培養時間は、最終的に免疫抑制性樹状細胞が得られる範囲で制限されないが、１０〜１８時間であることが好ましい。この際、ヒスタチン−１タンパク質の濃度は、特に制限されないが、５μｇ／ｍｌ以上であることが好ましく、１０μｇ／ｍｌ以上であることがより好ましい。また、上限は、１００μｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、５０μｇ／ｍｌ以下であることがさらに好ましく、２０μｇ／ｍｌ以下であることがより好ましい。なお、培地交換は当業者の判断で適宜行うことができ、例えば、培養開始から２日毎に半量ずつ交換すればよい。
【００６６】
免疫抑制剤の剤形化には、当業者に周知の薬学的に許容される担体、希釈剤、腑形剤等の製剤用添加物が用いられる。その形態は本医薬剤を投与対象の動物体内において、投与部位から免疫抑制剤を作用させたい部位に送達するために適切な剤形であれば特に特定されない。例えば、経口投与であれば、経口剤として、錠剤、カプセル、顆粒、散剤、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル、カシュー、咀嚼錠、ドロップ、丸剤、内用液剤、菓子錠剤、徐放錠、徐放性顆粒等に剤形化してもよい。また、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、リンパ節投与、腹腔内投与などであれば、注射剤に剤形化してもよい。このように、投与部位およびそれに応じた剤形は、治療者が適宜選択すれば良い。なお、本医薬剤には、上記製剤用添加物の他、異なる医薬組成物を配合することもできる。
【実施例】
【００６７】
[悪性黒色腫細胞株]
以下の実施例で用いる、３９７ｍｅｌ、５０１ｍｅｌ、５２６ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ、９２８ｍｅｌ、９３８ｍｅｌ、１１０２ｍｅｌ、Ａ３７５、Ｃ３２ｍｅｌ、Ｇ３６１ｍｅｌ、Ｍａｌｍｅ３Ｍ、ＳＫｍｅｌ２３、ＳＫｍｅｌ２８、およびＷＭ２６６は、米国国立衛生研究所のＲｏｕｓｅｎｂｅｒｇ博士より入手した。ＭＭＧ１は信州大学斎田博士より入手した。これらの細胞株は、特記しない限り、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭ１６４０培地において、９５％Ａｉｒ−５％ＣＯ２、３７℃で維持した。メラノサイトは、ｋｕｒａｂｏ社より購入し、ヒトメラノサイト増殖サプリメント（ＨＧＭＳ）添加１５４Ｓ培地において、９５％Ａｉｒ−５％ＣＯ２、３７℃で培養した。【００６８】
[実施例１]
本実施例では、ヒスタチン−１が悪性黒色腫細胞株に発現していることを示す。【００６９】
＝＝ヒスタチン−１遺伝子発現解析＝＝
RNeasy total RNA isolation kit（Qiagen 社）を用い、各悪性黒色腫細胞株から全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡから、reverse Superscript III reverse-transcriptase and oligo(dT) primers（インビトロジェン社）を用いてｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを用い、以下のプライマーペアを用いて３５サイクルのＰＣＲ（変性：９４℃、３０秒；アニーリング：５７℃、３０秒；伸長：７２℃、６０秒）を行い、ヒスタチン−１のｍＲＮＡ発現を解析した。なお、内部標準として、ＧＡＰＤＨを用いた。
Histatin-1-F: cgctgattcacatgaaaagagac（配列番号３）
Histatin-1-R: agggaagtatcatgaaacacaga（配列番号４）【００７０】
発現解析の結果を図１に示す。解析に供した１６種類のヒト悪性黒色腫細胞株のうち、５０１ｍｅｌ、５２６ｍｅｌ、６２４ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ、９２８ｍｅｌ、１１０２ｍｅｌ、Ｇ３６１ｍｅｌ、およびＳＫｍｅｌ２３、の８種類では、ヒスタチン−１ｍＲＮＡが発現していた。一方、正常メラノサイトにおいてはヒスタチン−１ｍＲＮＡの発現は検出できなかった。以上の結果は、ヒスタチン−１が悪性黒色腫の診断マーカーとして使用できることを示している。【００７１】
[実施例２]
本実施例では、腫瘍組織のヒスタチン−１ｍＲＮＡの発現と余命が相関することを示す。【００７２】
信州大学医学部にて、悪性黒色腫患者２５名のセンチネルリンパ節転移巣を採取した。採取組織からＲＮＡを単離して、ＴａｑＭａｎ ＲＮＡ-ｔｏ-ＣＴ 1-Ｓｔｅｐキットを用いて定量ＰＣＲを行い、各患者の組織におけるヒスタチン−１ｍＲＮＡの発現を解析した。【００７３】
ヒスタチン−１ｍＲＮＡの高発現群（１３名）と低発現群（１２名）について、ヒスタチン−１ｍＲＮＡ発現解析から９０ヵ月後まで定期的に生存率を追跡した。ヒスタチン−１のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨで標準化し、Ｌｏｇをとった値の中間点である−６．２５を境界として、−６．２５よりも高い値の群を高発現群、−６．２５以下の値の群を低い発現群とした。【００７４】
図２に示すように、高発現群の患者の生存率は、低発現群の患者に比較して、観察期間中常に高い。この結果は、悪性黒色腫の腫瘍細胞のヒスタチン−１ｍＲＮＡの発現量が、余命期間と相関することを示す。従って、ヒスタチン−１ｍＲＮＡおよびヒスタチン−１タンパク質は悪性黒色腫の予後または余命のマーカーとして使用できる。【００７５】
[実施例３]
本実施例では、ヒスタチン−１タンパク質およびヒスタチン−１遺伝子発現が、悪性黒色腫の遊走能を上昇させること、および、ヒスタチン−１遺伝子のノックダウンによって悪性黒色腫の細胞遊走能が低下することを示す。【００７６】
＝＝ヒスタチン−１タンパク質の添加＝＝
Ｃ３２ｍｅｌを３×１０４細胞／ウェルの密度で細胞遊走能解析用１６ウェルプレート（ＣＩＭ−ｐｌａｔｅ １６、Roche Diagnostics GmbH 社）の上層ウェルに播種した。上層ウェルには、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を満たし、下層ウェルには、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地を満たした。上層ウェルに、０、５、１０、あるいは２０μｇ／ｍｌのヒスタチン−１タンパク質を加え、下記遊走能の解析に供した。【００７７】
＝＝ヒスタチン−１遺伝子のノックダウン＝＝
ヒスタチン−１ｍＲＮＡにおける以下の２つの配列（配列番号５、６）を標的とした各ｓｉＲＮＡ５０μＭを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａＡＭＩＮＥ２０００（インビトロジェン社）１μｌ／ウェルを用いてＳＫｍｅｌ２３（４×１０４細胞／５００μｌ/ウェル（24-well plate））にトランスフェクトした。なお、陰性対照のｓｉＲＮＡには、Stealth RNAi Negative Control Low GC Duplex（インビトロジェン社）を用いた。
siRNA-target-seq2: UAUAGAUAAUUUGAUCCAUAGUCCC（配列番号５）
siRNA-target-seq3: AAAUCAUGAGAGCCAAGACUAAAGC（配列番号６）
トランスフェクションの効率を、BLOCK-iT Fluorescent Oligo（インビトロジェン社）により確認したところ、９０％以上の高効率であった。【００７８】
ｓｉＲＮＡを導入したＳＫｍｅｌ２３を１×１０５細胞／ウェルの密度で、ＣＩＭ−ｐｌａｔｅ １６の上層ウェルに播種し、下記遊走能の解析に供した。【００７９】
＝＝ヒスタチン−１遺伝子の強制発現＝＝
ヒスタチン−１ｃＤＮＡを、pCSII-CMV-MCS-IRES (internal ribosomal site)-puroR-PREベクター（pCSII-CMV-MCS-PRE vector にピュロマイシン耐性カセットであるIRES-puroR を挿入して調製、独立行政法人理化学研究所三好博士より入手、Miyoshi H. et al., J. Virol. 72(10): 8150-8157, 1998）のマルチクローニングサイトにクローニングした。このヒスタチン−１ｃＤＮＡ挿入ベクターを、pCAG-HIVgp（第３世代パッケージングプラスミド）、pCMV-VSV-G-RSV-Rev（VSV-Gエンベロープタンパク質とRevタンパク質の発現プラスミド）と共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、ＨＩＶ派生第３世代ヒスタチン−１発現ウイルス（以下、ヒスタチン−１発現ウイルスともいう）を調製した。培養上清を回収、濃縮して、ヒスタチン−１発現ウイルスストックとした。【００８０】
５×１０４細胞／２ｍｌ／ウェル（6-well plate）で播種したＡ３７５に対し、上記ヒスタチン−１発現ウイルスを１５〜３０μｌ／ウェル加え、感染させた。感染から４日後、Ａ３７５をピュロマイシンで選択することにより、ヒスタチン−１遺伝子が強制発現されたＡ３７５を選択した。【００８１】
このＡ３７５細胞を、３×１０４細胞／ウェルの密度で、ＣＩＭ−ｐｌａｔｅ １６の上層ウェルに播種し、下記遊走能の解析に供した。【００８２】
＝＝悪性黒色腫細胞の遊走能の解析＝＝
ＣＩＭ−ｐｌａｔｅ １の上層ウェルには、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を満たし、下層ウェルには、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地を満たした。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（Roche Diagnostics GmbH 社）のＲＴＣＡ ＤＰインスツルメントにプレートを設置し、９５％Ａｉｒ−５％ＣＯ２、３７℃で１５分ごとに細胞の遊走をモニターした。【００８３】
図３に示すように、ヒスタチン−１タンパク質を悪性黒色腫細胞に添加することにより、腫瘍細胞の遊走能が上昇した。【００８４】
図４に示すように、悪性黒色腫細胞のヒスタチン−１遺伝子をノックダウンすることによって腫瘍細胞の遊走能が低下した。【００８５】
図５に示すように、悪性黒色腫細胞のヒスタチン−１遺伝子を強制発現させることによって、腫瘍細胞の遊走能が上昇した。【００８６】
これらの結果は、ヒスタチン−１タンパク質が腫瘍細胞の遊走能に関与していること、そして、ヒスタチン−１タンパク質の機能抑制によって、悪性黒色腫細胞の遊走能を低下させることができることを示している。【００８７】
[実施例４]
本実施例では、ヒスタチン−１遺伝子を強制発現させた悪性黒色腫細胞では、浸潤能および転移能が亢進されることを示す。【００８８】
実施例３の「ヒスタチン−１遺伝子の強制発現」の記載に従い、Ａ３７５にヒスタチン−１発現ウイルスを感染させ、ピュロマイシンを用いてヒスタチン−１が強制発現されたＡ３７５を選択した。【００８９】
さらに、実施例３の「ヒスタチン−１遺伝子の強制発現」に記載の方法において、ヒスタチン−１ｃＤＮＡの代わりに改変型ＧＦＰ遺伝子のｃＤＮＡをpCSII-CMV-MCS-PREベクターのマルチクローニングサイトにクローニングして、ＨＩＶ派生第３世代ＧＦＰ発現ウイルスを調製し、回収、濃縮してＧＦＰ発現ウイルスストックを得た。ピュロマイシンで選択されたヒスタチン−１遺伝子発現Ａ３７５を５×１０４細胞／２ｍｌ／ウェル（6-well plate）で播種し、ＧＦＰ発現ウイルスを１５〜３０μｌ／ウェル加え、感染させた。感染から４日後、ＧＦＰの発現を蛍光下で確認し（ほぼ１００%のＧＦＰ発現を確認）、ヒスタチン−１・ＧＦＰ発現Ａ３７５を得た。【００９０】
ヌードマウス（BALB/c nu/nu  ５週齢  ♀）の側腹部に個体あたり３〜５×１０６個のヒスタチン−１・ＧＦＰ発現Ａ３７５を移植し、２〜３週間飼育した（Ｎ＝５）。その後、移植を行ったのと同側の所属リンパ節である脇下リンパ節、鼠径リンパ節、および肺を摘出し、脇下リンパ節と鼠径リンパ節は、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中でハサミにより細断して細胞を解離させた。肺組織に対しては、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中でハサミにより細断した後さらにコラゲナーゼ処理により細胞を解離させた。細胞移植自体を行っていない正常マウスを非腫瘍細胞群（Ｎ＝５）とし、ヒスタチン−１ｃＤＮＡを有していないウイルスを感染させた、ヒスタチン−１非発現・ＧＦＰ発現Ａ３７５を移植した群をＭＯＣＫ群（Ｎ＝４）とした。【００９１】
解離した細胞に含まれるＧＦＰ陽性細胞の割合を、ＦＡＣＳを用いて測定した。【００９２】
図６Ａ、Ｂは、所属リンパ節（脇下リンパ節と鼠径リンパ節）から採取した細胞におけるＧＦＰ陽性細胞率を示す図である。ヒスタチン−１・ＧＦＰ発現Ａ３７５を移植した群（ヒスタチン−１）では、ＭＯＣＫ群に比較し、所属リンパ節から採取した細胞におけるＧＦＰ陽性細胞率が有意に高かった。【００９３】
図７Ａ、Ｂは、肺組織から採取した細胞２００００個中のＧＦＰ陽性細胞の数を示す図である。ヒスタチン−１・ＧＦＰ発現Ａ３７５を移植した群（ヒスタチン−１）では、ＭＯＣＫ群に比較し、肺から採取した細胞におけるＧＦＰ陽性細胞率が有意に高かった。【００９４】
ＧＦＰ陽性細胞は側腹部に移植された細胞であるから、以上の結果は、ヒスタチン−１発現Ａ３７５では、ヒスタチン−１非発現Ａ３７５に比較して、所属リンパ節および肺への浸潤能および転移能が亢進されることを示している。【００９５】
このことから、悪性黒色腫のヒスタチン−１は、悪性黒色腫の浸潤能および転移能の診断マーカーとして使用できる。また、ヒスタチン−１の機能や発現を阻害することにより、悪性黒色腫の浸潤および転移を抑制する悪性黒色腫治療用薬剤になりうる。【００９６】
[実施例５]
本実施例では、ヒスタチン−１タンパク質を用いて、免疫抑制性樹状細胞を調製できることを示す。【００９７】
＝＝樹状細胞の調製＝＝
インフォームドコンセントを行った健常人から、慶應義塾大学医学部において採血を行った。この血液約１００ｍｌに対し、ヘパリン１ｍｌ程度を加え、Lymphoprep（Axis-Shield PoC、AS社）に重層して遠心した（２０００ｒｐｍ、３０分、室温）。中間層を、ＰＢＭＣが含まれるＰＢＭＣ分画として分離した。このＰＢＭＣから、ＣＤ１４ Ｍｉｃｒｏ−Ｂｅａｄｓ（Miltenyi Biotec 社）を用いてＣＤ１４陽性単球を単離した。このＣＤ１４陽性単球を、２〜２．５×１０６細胞／ウェル／２ｍｌの密度で、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に播種し、ここに、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）、およびヒスタチン−１タンパク質（０、５、あるいは１０μｇ／ｍｌ）を加えて培養した。２日に一回、培地の半量を交換して６日間培養を続け、樹状細胞を分化させた。この樹状細胞を洗浄して１〜２．０×１０６細胞／２ｍｌ／ウェルの密度で再播種し、ヒスタチン−１タンパク質（０、５、あるいは１０μｇ／ｍｌ）とリポサッカロイド（１μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに１０〜１８時間培養を続けた。なお、培養は、全段階で、５％ＣＯ２、３７℃で行った。【００９８】
培養終了後に培地を回収し、樹状細胞により産生され、培地中に分泌された、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２をＥＬＩＳＡキット（BD Biosciences Pharmingen 社）を用いて測定した。また、得られた樹状細胞について、細胞表面マーカーであるＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲの発現をＦＡＣＳにより測定した。【００９９】
図８に示すように、炎症性サイトカインであるＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの量は、添加するヒスタチン−１タンパク質の濃度に依存して有意に低下した（Ａ、Ｂ）。一方、抑制性サイトカインであるＩＬ−１０の量は、ヒスタチン−１タンパク質の濃度が５μｇ／ｍｌの時に有意に上昇し、１０μｇ／ｍｌの時にも０μｇ／ｍｌに比較して上昇した（Ｃ）。【０１００】
図９に示すように、ヒスタチン−１タンパク質を添加せずに樹状細胞を分化させた場合と、ヒスタチン−１タンパク質を添加して樹状細胞を分化させた場合とでは、ヒスタチン−１タンパク質濃度にかかわらず、いずれの場合も、得られた樹状細胞はＣＤ１４陰性であり（図９Ａ）、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲの発現量は一定であった（図９Ｂ）。この結果は、ヒスタチン−１タンパク質を添加して分化させてもヒスタチン−１タンパク質を添加せずに従来法で分化させた樹状細胞と同様なマーカーの発現を示し、しかも、それはヒスタチン−１タンパク質濃度によらないことを示している。また、ヒスタチン−１タンパク質添加量にかかわらず、いずれの細胞表面マーカーの発現を示すピークも１つで、形状が一定である（図９Ｂ）ことから、ヒスタチン−１は単球の樹状細胞への分化を阻害しているわけではなく、ヒスタチン−１タンパク質を添加して得られた樹状細胞集団は、添加しないで得られた樹状細胞集団と同程度に均質であることを示している。【０１０１】
このように、ＣＤ１４陽性単球からヒスタチン−１タンパク質を添加して得られた樹状細胞集団は、ヒスタチン−１タンパク質添加量にかかわらず、ヒスタチン−１タンパク質を添加せずに分化させた樹状細胞集団とは、同じマーカー群を発現しながら、機能が抑制性であるという点で性質が異なっている。【０１０２】
＝＝樹状細胞によるＴ細胞の刺激＝＝
Ｔ細胞を、上記健常人から採取した血液から、ＣＤ３ ＭＡＣＳ ｂｅａｄｓ（Miltenyi Biotec 社）を用いて単離した。このＴ細胞２．０×１０５個を、上記で調製した２．０（樹状細胞：Ｔ細胞＝１：１０）、０．６７（樹状細胞：Ｔ細胞＝１：３０）あるいは０．２２×１０４個（樹状細胞：Ｔ細胞＝１：９０）の樹状細胞（約２０分間、計３２Ｇｙの放射線処理済み）と共に９６ウェルプレートに播種し、各ウェル当たり２００μｌの５％ＡＢ型ヒト血清添加ＡＩＭ−Ｖ培地で、９５％Ａｉｒ−５％ＣＯ２、３７℃で培養を行った。培養開始３日目、培地を回収し、Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡキット（M700A、M701B、Endogen 社）を用いて測定した。【０１０３】
図１０に示すように、樹状細胞：Ｔ細胞比が１：１０の場合、樹状細胞分化工程で作用させたヒスタチン−１タンパク質の濃度依存的に、ＩＦＮ−γ量が低下した。Ｔ細胞は、樹状細胞の刺激を受けてＩＦＮ−γを分泌する。従って、この結果は、ヒスタチン−１タンパク質を作用させて単球から分化させた樹状細胞群は、そのヒスタチン−１タンパク質の濃度に依存してＴ細胞に対する刺激能が低下することを示している。【０１０４】
このように、ヒスタチン−１タンパク質は、単球に作用して樹状細胞の分化を免疫抑制性の方向に誘導する作用を有している。そして、ヒスタチン−１タンパク質を作用させて分化誘導された樹状細胞は、炎症性サイトカインの産生量が低く、免疫抑制性サイトカインの産生量が高く、さらに、Ｔ細胞に対する刺激能が低い。よって、ヒスタチン−１タンパク質、および、ヒスタチン−１タンパク質を用いて分化誘導した樹状細胞は、免疫抑制作用を有している。【０１０５】
＝＝樹状細胞の発現遺伝子＝＝
前述の「樹状細胞の調製」により得られた、ヒスタチン−１タンパク質を添加せずに分化させた樹状細胞（正常分化樹状細胞）と、ヒスタチン−１タンパク質を添加して分化させた樹状細胞（ＨＴＮ樹状細胞）からRNeasy total RNA isolation kit（Qiagen 社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを用い、Gene Chip（Aglient 社、Whole Human GenomeオリゴDNAマイクロアレイキット  （4x44K））を用いて遺伝子発現を網羅的に解析した。【０１０６】
表１に示すように、ヒスタチン−１タンパク質を添加せずに分化させた樹状細胞（正常分化樹状細胞）に対して、ヒスタチン−１タンパク質を添加して分化させた樹状細胞（ＨＴＮ樹状細胞）で１．５倍以上の発現量が認められたのは、５４５８個の遺伝子である。また、ＨＴＮ樹状細胞では、正常分化樹状細胞に比較して、ＮＫ細胞活性化に必要なＵＬＢＰ２の発現量は１／２０に低下し、ＮＫＴ細胞活性化に必要なＣＤ１ｄの発現量は３／１０に低下した。一方、免疫抑制性樹状細胞に多く発現することが知られるＴＬＲ５（Vicente-Suarez I et al., Immunol Lett. 125 114-8, 2009)の発現量は、正常分化樹状細胞に比較してＨＴＮ樹状細胞で４８．４倍高かった。また、制御性Ｔ細胞などに高発現していることが一般的に知られているＣＣＲ４は、正常分化樹状細胞に比較してＨＴＮ樹状細胞で１０８．２６倍高かった。
【表１】
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【０１０７】
このように、ＣＤ１４陽性単球からヒスタチン−１タンパク質を添加して得られた樹状細胞（ＨＴＮ樹状細胞）と、正常分化樹状細胞とではその遺伝子発現は大きく異なっている。特に、ヒスタチン−１タンパク質を添加して得られた樹状細胞では、遺伝子発現のパターンが免疫抑制性を示している。【０１０８】
[実施例６]
本実施例では、マウス個体に、ヒスタチン−１タンパク質を強制発現させた細胞を投与することにより、in vivoで樹状細胞の性質を抑制性に変えることができることを示す。【０１０９】
５×１０４細胞／２ｍｌ／ウェル（6-well plate）で播種したヒト悪性黒色腫３９７ｍｅｌに対し、実施例３に記載のヒスタチン−１発現ウイルスを１５〜３０μｌ／ウェル加えて感染させた。感染から４日後、３９７ｍｅｌをピュロマイシンで選択することにより、ヒスタチン−１遺伝子が強制発現されたクローンを選択し、３９７ｍｅｌ−Ｈｉｓｔａｔｉｎ−１とした。【０１１０】
３９７ｍｅｌ−Ｈｉｓｔａｔｉｎ−１を１００μｌのＲＰＭＩ１６４０に懸濁し、ヌードマウス(BALB/c nu/nu  ５週齢  ♀)の下腿部に皮下接種（３ｘ１０６個／匹）した。陰性コントロール群として、ヒスタチン−１を組み込まれていないＨＩＶウイルスを３９７ｍｅｌに感染させて得られたクローン（３９７ｍｅｌ−ＭＯＣＫ）を接種した。約３０日後に両群のマウスから、接種した３９７ｍｅｌ由来の腫瘍組織及び脾臓を単離し、それぞれから、ＣＤ１１ｃ  ＭＡＣＳ  ｂｅａｄｓ（Miltenyi Biotec社）を用いてＣＤ１１ｃ陽性である樹状細胞を分離した。これらの樹状細胞について、以下のようにＴ細胞の活性化能を評価した。【０１１１】
まず、マウス（Balb/c）の脾臓よりＣＤ９０．２マイクロビーズ（Miltenyi Biotec社）を用いてＴ細胞を分離した。一方、分離した樹状細胞は、約２０分間、計３２Ｇｙの放射線で処理し、細胞分裂を止めた。そして、ウェル（96-well plate）当たり２００μｌの培養液（１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０）で、Ｔ細胞１．６ｘ１０５個と樹状細胞１．６ｘ１０４個を播種し、さらに抗マウスＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）（BD Biosciences Pharmingen 社）を添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。培養開始４日後に培地を回収し、Ｔ細胞から分泌されたＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡキット（BD Biosciences Pharmingen 社）を用いて測定した。【０１１２】
図１１に示すように、腫瘍組織及び脾臓のどちらにおいても、３９７ｍｅｌ−Ｈｉｓｔａｔｉｎ−１を皮下接種されたマウス由来の樹状細胞は、３９７ｍｅｌ−ＭＯＣＫを皮下接種されたマウス由来の樹状細胞に比べて、Ｔ細胞から分泌されたＩＦＮ−γ量が低く、Ｔ細胞の活性化能が低下していた。このことは、in vivoにおいて、３９７ｍｅｌが発現する外来性のヒスタチン−１タンパク質が樹状細胞の機能を抑制したことを示している。しかも、３９７ｍｅｌ由来の腫瘍組織に存在する樹状細胞だけでなく、脾臓中の樹状細胞の機能も抑制されていることは、３９７ｍｅｌから分泌されたヒスタチン−１タンパク質が、血液を通じて、全身性に作用したことを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明によって、悪性黒色腫の診断マーカーを提供することができる。【０１１４】
また、本発明によって、新規な医薬組成物を提供することができる。【０１１５】
さらに、本発明によって、新規な免疫抑制剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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