(57)【要約】  分子生物学研究分野等で使用される生物学的試料の反応、特に核酸の増幅を実施するために有用な温度サイクル装置を提供すること。  反応液５をインキュベートするための温度サイクル装置であって、（１）反応液５を収容する反応容器４を保持して加熱するためのヒートブロック１を備え、ヒートブロック１は、下層ヒートブロック３と上層ヒートブロック２との２つの層で構成され、更に、（２）下層ヒートブロック３の温度と上層ヒートブロック２の温度とをそれぞれ独立に制御して、反応液５をインキュベートする際に、上層ヒートブロック２の温度を下層ヒートブロック３の温度より高く維持する温度制御手段を備える。これにより、反応液５中の水分やその他の成分の反応容器４内での凝結が起こらず、更に反応容器４の設置位置による温度ムラが生じないことから、ＰＣＲやその他の酵素反応を再現性よく実施することができる。
2011021640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液をインキュベートするための温度サイクル装置であって、
（１）前記反応液を収容する反応容器を保持して加熱するためのヒートブロックを備え、前記ヒートブロックは、下層ヒートブロックと上層ヒートブロックとの２つの層で構成され、
更に、
（２）前記下層ヒートブロックの温度と前記上層ヒートブロックの温度とをそれぞれ独立に制御して、前記反応液をインキュベートする際に、前記上層ヒートブロックの温度を前記下層ヒートブロックの温度より高く維持する温度制御手段を備えることを特徴とする温度サイクル装置。
【請求項２】
前記反応液は核酸を含有し、前記下層ヒートブロックは前記反応液をインキュベートし、前記上層ヒートブロックは前記核酸の増幅効率の低下を防止することを特徴とする請求項１記載の温度サイクル装置。
【請求項３】
前記下層ヒートブロックと前記上層ヒートブロックとの間の熱伝導を妨げるための熱伝導防止手段を備えたことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の温度サイクル装置。
【請求項４】
前記熱伝導防止手段は、前記下層ヒートブロックと前記上層ヒートブロックとの間に設けられた空間であることを特徴とする請求項３に記載の温度サイクル装置。
【請求項５】
前記温度制御手段は、前記下層ヒートブロックの温度を変化および維持するための第一温度手段と、前記上層ヒートブロックの温度を変化および維持するための第二温度手段とを備え、前記第一温度手段は前記下層ヒートブロックの下側に設けられ、前記第二温度手段は前記下層ヒートブロックの上側に設けられていることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の温度サイクル装置。
【請求項６】
前記温度制御手段は、前記上層ヒートブロックの温度を前記下層ヒートブロックの温度より３℃以上高く維持することを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の温度サイクル装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学研究分野等で使用される生物学的試料の反応、特に核酸の増幅を実施するために有用な温度サイクル装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の研究においては、試料の分析等に種々の化学反応、例えば酵素反応が利用される。当該反応に供する試料の量に限りがある場合には、微量の試料で反応を実施できることが好適である。【０００３】
核酸増幅反応は、鋳型となる核酸に相補的及び／又は同一の配列を有する核酸の合成を反復する方法であり、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法といった、原理の異なる複数の方法が開発されている。これらはそれぞれに異なる特徴を有しており、目的等に応じて使い分けされているが、ＰＣＲ法は最も多くの場面で利用されている。【０００４】
ＰＣＲ法は鋳型となる核酸、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応液を「二本鎖核酸の変性」、「オリゴヌクレオチドプライマーの鋳型核酸へのアニーリング」、「鋳型核酸に相補的な核酸の合成」が順次起こるような温度サイクルに供することで実施される。この目的のために、反応液の温度を経時的に、かつ自動で変化させる反応装置（サーマルサイクラー）が開発された。【０００５】
通常、ＰＣＲは微量（１０〜２００μＬ程度）の反応液で実施される。容量の大きな反応容器が使用された場合に、反応容器部位間で温度差があると低温の部位、例えば反応液と接触していない反応容器上部の壁面に水蒸気の凝結が生じ、増幅効率の低下や試料間での増幅効率のバラつきの原因となる。この問題を解決し、より正確な温度サイクルを実現するため、試料を収容する反応容器の上面を加熱された部材で覆う機構を有する装置（特開平６−２３３６７０号公報）や循環する空気により前記反応容器全体を加熱／冷却する装置（特表２０００−５１１４３５号公報）が開発されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平６−２３３６７０号公報
【特許文献２】特表２０００−５１１４３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
後者の装置は反応容器周辺に空気が循環するための空間、空気の温度制御と循環のための手段を設けた複雑な構成が必要となるうえ、熱伝導に優れた反応容器（例えばガラス製容器）を使用する必要がある。これに対して前者の装置はヒートブロックとカバーとを主な構成要素とする単純な構成であり、生物化学分野で汎用されているマイクロチューブやマイクロタイタープレートを使用することができる。しかしながら、ヒートブロックとカバーとの間に空隙が生じるため、反応容器のこの部位の温度が低下して水蒸気等の凝結が起こりうる。また、反応容器を設置する場所により、例えばヒートブロックの中央部に設置した場合と、ヒートブロックの端部に設置した場合とでは、温度差が生じてしまう。そのため、ＰＣＲや酵素反応を行った場合、反応容器を設置する位置によって反応にムラができるという問題が生じる。更に反応容器の上面をカバーで覆うことにより、標的核酸の増幅に伴うシグナルの発生を増幅中に検出する核酸検出方法（リアルタイム−ＰＣＲ）では当該シグナルの検出に問題が生じる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、反応液のインキュベーションに使用されるヒートブロックを上層ヒートブロックと下層ヒートブロックとで構成される２層構造とし、上層ヒートブロックの温度を下層ヒートブロックの温度より高く調節することで反応液由来の水蒸気等の凝結が妨げられ、再現性よくＰＣＲを実施できることを見出した。【０００９】
すなわち、本発明は、反応液をインキュベートするための温度サイクル装置であって、（１）反応液を収容する反応容器を保持して加熱するためのヒートブロックを備え、ヒートブロックは、下層ヒートブロックと上層ヒートブロックとの２つの層で構成され、
更に、
（２）下層ヒートブロックの温度と上層ヒートブロックの温度とをそれぞれ独立に制御して、反応液をインキュベートする際に、上層ヒートブロックの温度を下層ヒートブロックの温度より高く維持する温度制御手段を備えることを特徴とする温度サイクル装置に、関する。【００１０】
本発明は、上層ヒートブロック及び下層ヒートブロックの２層で構成されたヒートブロックを備えた温度サイクル装置を提供する。【００１１】
前記ヒートブロックは、インキュベートされる反応液を収容した容器（反応容器）を保持できるくぼみ（ウェル）が形成された構造物である。前記ウェルは使用する反応容器に応じた形状とすればよく、例えば、マイクロチューブ及び／又はマイクロタイタープレート（９６穴、３８６穴等）やキャピラリーを保持できるよう設計される。当該反応容器としては、１ウェルに保持される反応容器あたりに１０〜２０００μＬの容量のものが使用される。また、好ましくは、反応容器内の水分等が蒸発して反応容器外へ出ることを防止するため、反応容器はキャップやシールを付されたうえで本発明の装置に収納される。【００１２】
ヒートブロックは熱伝導率に優れた材質のものであることが望ましく、通常は熱伝導率のよい金属製（例えば、アルミニウム、銅合金など）のヒートブロックが使用される。上層ヒートブロック及び下層ヒートブロックを同じ材質にする構成、異なる材質にする構成、どちらの構成も本発明に適用できる。【００１３】
ヒートブロックは、反応容器が上層ヒートブロックを貫通して下層ヒートブロックに接触するようにして保持される構造に形成される。従って、通常は上層ヒートブロックの厚さは０．５〜１ｃｍの範囲、好ましくは０．６〜０．８ｃｍの範囲に設計される。下層ヒートブロックの厚さは、上層ヒートブロックと組み合わせた際に反応容器を収容できる範囲であれば特に限定はない。好適には、上層ヒートブロックと下層ヒートブロックとの２層で構成されたヒートブロックが、反応容器のほぼ上端まで（例えば、反応容器の全高の７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは８５％以上）ウェル内に収納できる構造であることが好ましい。【００１４】
前記ヒートブロックは、上層ヒートブロック及び下層ヒートブロックの２層の温度をそれぞれ独立して制御可能な温度制御手段を備えている。当該温度制御手段は、下層ヒートブロックの温度を変更及び維持するための第一温度手段と、上層ヒートブロックの温度を変更および維持するための第二温度手段と、これらの温度手段を独立に制御して経時的に両層の温度を変化させる制御手段からなる。また、制御手段は実行すべき温度プロファイルに関する情報を記憶しかつその実行を指示するコンピューターと、温度制御のためにヒートブロックの両層の実温度データを取得するセンサーとを含む。すなわち、前記コンピューターは入力された温度プロファイル情報とヒートブロックの両層の実温度データとに基づいてヒートブロックの両層の温度を前記プロファイルのとおりに制御する。なお、本発明の実施態様の一つとして、コンピューターを搭載することなく、適切なインターフェースを介して第一温度手段、第二温度手段及びセンサーを外部のコンピューターに接続することによりヒートブロックの両層の独立した温度制御を実施し得る装置を挙げることができる。【００１５】
前記センサーとしては、例えば電気抵抗の温度変化を利用した抵抗温度検出器を使用できる。センサーは、上層ヒートブロックおよび下層ヒートブロックのそれぞれに備えられ、両層の温度を独立して計測することを可能とする。更に、両層に複数のセンサーを配置してもよい。【００１６】
第一温度手段および第二温度手段には公知のヒーターやクーラーが使用できるが、好適にはペルチェ素子が使用される。また、ヒートブロック冷却時の放熱を促すため、ヒートシンクや冷却用ファンを装置に備えることもできる。第一温度手段は、上層ヒートブロックの温度制御を妨げないように、下層ヒートブロックの下面又は下面と面一になるようにヒートブロック内部に設けられることが好ましい。また、第二温度手段は、下層ヒートブロックの温度制御を妨げないように、上層ヒートブロックの上面又は上面と面一になるようにヒートブロック内部に設けられていることが好ましい。【００１７】
この２層構造のヒートブロックおよび温度制御手段を備えた温度サイクル装置において、反応液のインキュベートは、実質的には反応容器の下部を保持する下層ヒートブロックが行う。温度制御手段は、所定の温度プロファイル情報を用いて下層ヒートブロックにより反応液をインキュベートする。その際、温度制御手段は、上層ヒートブロックの温度を制御して、下層ヒートブロックより高い温度に維持する。すなわち、上層ヒートブロックは、下層ヒートブロックにより反応液がインキュベートされている間、インキュベート温度より高い温度で反応容器の上部を加熱する。【００１８】
上記のように、反応液のインキュベートの際に上層ヒートブロックの温度を下層ヒートブロックの温度より高く維持する温度サイクル装置において、上層ヒートブロックが下層ヒートブロックによる温度プロファイル通りの反応液のインキュベートを妨げないのであれば、両層を接触させてヒートブロックを構成してもよい。しかしながら、一般的には両層はともに熱伝導率の高い材質で構成されるため、両層を接触させると、上層ヒートブロックの熱が下層ヒートブロックに急速に伝わり、下層ヒートブロックの温度を温度プロファイル通りに制御できない虞がある。そこで、温度サイクル装置は、上層ヒートブロックおよび下層ヒートブロック間の熱伝導を防止するため熱伝導防止手段を備えることが好ましい。これによって、反応液のインキュベートの際に、上層ヒートブロックから下層ヒートブロックへの熱伝導を防止または緩和し、下層ヒートブロックの温度が温度プロファイル通りに制御され、適切に反応液がインキュベートされることを確保する。【００１９】
熱伝導防止手段としては、具体的には、上層ヒートブロックの下面及び／又は下層ヒートブロックの上面に熱伝導を妨げるためのコーティング（例えば、シリコン、テフロン（登録商標））を施す構成がある。また、上層ヒートブロック及び下層ヒートブロックの２層の間に、熱伝導を妨げるために断熱材（例えば、シリコン、ポリウレタン（耐熱性））を配置する構成としてもよい。また、上層ヒートブロック及び下層ヒートブロックの２層の間に、両層間の熱伝導を妨げる目的で空間を保持するような構成としてもよい。【００２０】
但し、断熱材または空間を設けたことにより、両層間の間隔（断熱材の厚さ、または空間の高さ）が大きすぎる場合、反応液をインキュベートする際に、保持された反応容器の両層間の部位の温度が、反応液の温度より低くなり、反応液の成分が凝結する温度に達する恐れがある。そのため、両層の間隔は、反応液のインキュベートの際に反応容器の両層間の部位の温度が、反応液由来の凝結が起こらない温度（露点温度）より高い温度、または反応液より高い温度に維持される範囲内でなければならない。よって、両層間の間隔は、下層ヒートブロックによる温度プロファイル通りのインキュベートを確保でき、かつ、反応容器の両層間の部位における反応液の凝結防止を確保できる最低限必要な間隔でよく、例えば反応容器の全高の１５％以下であることが好ましい。【００２１】
なお、上層ヒートブロックの温度は、反応液がインキュベートされている間、下層ヒートブロックによる温度プロファイル通りのインキュベーションが確保できる範囲内で、下層ヒートブロックよりも高い温度に維持されるように設定されればよい。そして、必ずしも下層ヒートブロックの温度プロファイルに応じて逐次温度を変化させる必要はない。上層ヒートブロックの温度は下層ヒートブロックの温度よりも３℃以上、好ましくは５℃以上高くなるよう設定される。例えば、下層ヒートブロックの温度が４０〜１００℃の範囲では上層ヒートブロックが６０〜１２０℃、好ましくは１０５〜１２０℃に維持され、下層ヒートブロックの温度が４０℃以下では上層ヒートブロックの温度が４５〜６０℃に維持される装置が例示される。通常、上層ヒートブロックの温度の上限は１１５〜１２０℃である。【００２２】
上記構成のヒートブロックを備えた装置を使用した反応液のインキュベーションにおいては、インキュベート温度が高温（例えば７０℃以上）に達した場合であっても、反応容器上部の温度は反応容器中の反応液の温度より高く維持されることから、反応液中の水分又はその他の成分が反応容器上部に凝結することはない。従って反応液中の成分の濃度が所望の反応に起因するもの以上に変化することが防止され、再現性よく反応がおこる。【００２３】
本発明の装置では、下層ヒートブロックが温度制御された上層ヒートブロックで覆われることから、周辺温度による下層ヒートブロックの温度下降が軽減され、下層ヒートブロック全体の温度が均一化され、ヒートブロックの位置の違い（例えば中心部と周辺部間の位置の違い）に起因する温度ムラが抑制される。従って、ヒートブロック上の反応位置の違いによる反応効率のバラつきを防止できる。【００２４】
本発明の装置には、従来の温度サイクル装置に備えられていた、反応容器上面を覆って加熱するための温度手段を有するカバーは必ずしも必要ではない。しかし反応容器キャップの脱落や反応容器シールの剥離を防止するためのカバーを備えていてもよい。更にこのカバーは、上層ヒートブロックが本発明において果たしている機能を強化もしくは補完する目的で、その温度を上層ヒートブロックの温度と同程度に維持するための温度手段ならびにその制御手段を備えていてもよい。また、カバーによってウェル内に保持されている反応容器を下方に押し付けて、反応容器の下部と下層ヒートブロックとの密着性を高め、下層ヒートブロックの熱が反応容器に伝わり易いようにしてもよい。反応液の由来のシグナル（例えば蛍光）を光学的に検出する検出手段（例えば、分光蛍光光度計）を備えた装置の場合には、例えば光透過性のカバーやシグナルを通過させるための開口部を設けたカバーを使用すればよい。【００２５】
通常、本発明の装置は、上記各構成要素が筐体内に収納された装置とすることができる。当該装置は、前記ヒートブロック、温度制御手段を備える他、任意にコンピューターもしくは外部コンピューターとの接続に使用されるインターフェース、実行すべき温度プロファイルを入力するための入力手段（例えばキーボード）、温度プロファイルやその実行状況を表示する表示装置（例えば液晶ディスプレイ）を有していてもよい。更に、反応液の発する蛍光等のシグナルをモニターするための光学装置（グラスファイバー、ＣＣＤカメラ、レンズ、フィルター等）を搭載していてもよい。【００２６】
本発明の装置は、反応液のインキュベートの際に、反応液を収納する反応容器の上部、特にキャップやシールの内面側の結露が防止されることから、結露によって反応液に由来するシグナルの検出が阻害されることはなく、シグナルの検出が容易である。すなわち、本発明の装置は、反応容器中の反応の進行を光学的、経時的に検出する、特に反応容器の上方から検出する検出手段を備えた場合、有用である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の装置を使用した場合には、反応液中の水分やその他の成分の反応容器内での凝結が起こらない。また、反応容器を設置する位置による温度のムラも防げることから、ＰＣＲやその他の酵素反応を再現性よく実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の装置の一実施形態を示す斜視図である。
【図２】本発明の装置の上層ヒートブロックの構成を示す図であって、図２Aは平面図であり、図２Bは正面図である。
【図３】本発明の装置の下層ヒートブロックの構成を示す正面図である。
【図４】本発明の装置において、上層ヒートブロックと下層ヒートブロックとの構成を示す図である。
【図５】本発明の装置において、上層ヒートブロックと下層ヒートブロックとによって構成されたヒートブロックに反応容器を収納して保持した状態を示す断面図である。
【図６】本発明の装置において、上層ヒートブロックと下層ヒートブロックとによって反応容器を保持する際に、両層間に空間を設けた場合の構成を示す図である。
【図７】本発明の装置において、上層ヒートブロックと下層ヒートブロックとによって反応容器を保持する状態を示す図であって、図７Aは両層を接触させた場合の構成を示し、図７Bは両層間に断熱材を設けた場合の構成を示す。
【図８】本発明の装置において、上層ヒートブロックと下層ヒートブロックとによって反応容器を保持する他の構成を示した図である。
【図９】反応性確認実験で用いた各装置の構成を示す図である。
【図１０】反応性確認実験で用いた９６穴プレートの反応位置を示す図である。
【図１１】反応性確認実験で用いた各装置によるＰＣＲ反応後の電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明に係る温度サイクル装置の詳細な構成について、図面を参照して説明する。なお、本発明は、以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。
【００３０】
本願発明に係る温度サイクル装置は、図１に示されるように、反応容器４を加熱するためのヒートブロック１を備える。ヒートブロック１には、反応容器４を収納して保持するため複数のウェル１０が形成される。本実施例におけるヒートブロック１は、８行×１２列の９６穴用ヒートブロックである。このヒートブロック１は、上層ヒートブロック２と下層ヒートブロック３との２つの層で構成される。
【００３１】
上層ヒートブロック２は、図２に示されるように、ヒートブロック１のウェル１０の一部を構成する貫通孔２０が形成されている。貫通孔２０は、図２Bに示されるように、上層ヒートブロック２を上下に貫通し、反応容器４の上部の周側面の形状に対応する形状に形成され、反応容器４が挿通可能である。
【００３２】
この上層ヒートブロック２は、上層ヒートブロック２の温度を変更および維持するためのヒーター２１と、上層ヒートブロック２の温度を観測するための温度センサー２２とを備える。ヒーター２１および温度センサー２２は、上層ヒートブロック２の温度制御に適した位置に設置される。本実施例では、ヒーター２１は、上層ヒートブロック２の上面で、幅方向の両端のそれぞれに設置される。そして、温度センサー２２は、上層ヒートブロック２の上面で、長さ方向の一端に設置される。なお、ヒーター２１及び／または温度センサー２２を、上層ヒートブロック２の上面に配置するのではなく、上層ヒートブロック２の側面に設置してもよい。また、上層ヒートブロック２に、ヒーター２１及び／または温度センサー２２を収納するための収納凹部（図示せず）を形成し、これら２１、２２を、収納凹部に収納して、上層ヒートブロック２内部に設置してもよい。
【００３３】
ヒーター２１および温度センサー２２は、制御部９に接続される。これによって、上層ヒートブロック２の温度を所望の温度に制御し、経時的に変化させることができる。
【００３４】
さらに、上層ヒートブロック２の四角には、下層ヒートブロック３へ取付けおよび位置決めをするため、上下に貫通する位置決め穴２３が形成されている。
【００３５】
下層ヒートブロック３は、図３に示されるように、ヒートブロック１のウェル１０の一部を構成する凹部３０が形成される。凹部３０は、反応容器４の下部の形状に対応する形状に形成される。
【００３６】
下層ヒートブロック３は、下層ヒートブロック３の温度を変更および維持するためのペルチェ素子３１と、下層ヒートブロック３の温度を観測するための温度センサー３２とを備える。ペルチェ素子３１は下層ヒートブロック３の下面に配置され、温度センサー３２は下層ヒートブロック３の中心部に埋込み配置される。
【００３７】
下層ヒートブロック３のペルチェ素子３１および温度センサー３２は、上層ヒートブロック２のヒーター２１および温度センサー２２と同様に、制御部９に接続される。これによって、下層ヒートブロック３の温度を制御し、経時的に変化させることができる。本発明の温度サイクル装置は、上記構成によって、上層ヒートブロック２の温度と下層ヒートブロック３の温度とをそれぞれ独立に制御する。
【００３８】
さらに、下層ヒートブロック３は、上層ヒートブロック２の位置決めをするための位置決めシャフト３３を備える。シャフト３３は、下層ヒートブロック３の上面の四角に設けられる。各シャフト３３の下端には、上層ヒートブロック２を下層ヒートブロック３に取り付けたときに、二層の間に空間を設けるためのスペーサ６が配置されている。
【００３９】
図４に示されるように、各位置決めシャフト３３が各位置決め穴２３に嵌め込まれるように上層ヒートブロック２を下層ヒートブロック３の上に配置することで、上層ヒートブロック２を下層ヒートブロック３へ取り付ける。これによって、下層ヒートブロック３に対する上層ヒートブロック２の位置決めがなされる。すなわち、図５に示すように、下層ヒートブロック３に形成された各凹部３０の真上に、対応する上層ヒートブロック２の貫通孔２０が配置され、これらが同一鉛直線状になるように位置決めされ、貫通孔２０と凹部３０とによって反応容器４を保持するためのウェル１０が構成される。このとき、上層ヒートブロック２と下層ヒートブロック３との間にスペーサ６が介在するので、両層２、３間に空間７が設けられる。こうして、図１に示されるように、上層ヒートブロック２と下層ヒートブロック３とによってヒートブロック１が構成され、反応液５が収容された反応容器４がウェル１０に収納される。
【００４０】
上記のように構成されたヒートブロック１のウェル１０に、反応液５が収容され、キャップ４０が付された反応容器４が収納されて保持される状態を６図に示す。反応容器４をウェル１０に収納すると、反応容器４の下部は下層ヒートブロック３の凹部３０に嵌め込まれて、密着する。そして、反応容器４の上部の周側面は上層ヒートブロック２の貫通孔２０に密着する。反応容器４のキャップ４０は、貫通孔２０に挿入されず、上層ヒートブロック２の上方に位置する。
【００４１】
反応容器４内の反応液５は、反応液５をインキュベートする下層ヒートブロック３内に位置する。この際、反応液５の液面５０は、下層ヒートブロック３の上面と同じ位置、または図６に示されるように、下層ヒートブロック３の上面より低い位置にあることが好ましい。
【００４２】
両層２、３間の空間７の高さは、両層２、３間の熱伝導を妨げ、下層ヒートブロック３の温度プロファイル通りの温度制御を確保し、かつ、インキュベートの際に反応容器４の両層２、３間の部位における凝結防止を確保できる高さであればよい。また、上層ヒートブロック２の下面及び／または下層ヒートブロック３の上面に熱伝導を妨げるため、テフロンなどのコーティングを施す場合、両層２、３間に空間７を設けず、図７Aに示すように、両層２、３を接触させてもよい。また、上層ヒートブロック２が下層ヒートブロック３による温度プロファイル通りの反応液５のインキュベートを妨げない場合は、コーティングを施すことなく、上層ヒートブロック２と下層ヒートブロック３とを接触させてヒートブロック１を構成してよい。また、図７Bに示すように両層２、３間に熱伝導を妨げるために断熱材８を設けるようにしてもよい。
【００４３】
また、図８A、８B、８Cに示すように、反応容器４がその周側面のほぼ上端までヒートブロック１に収納される構成でもよい。
【００４４】
温度サイクル装置は、上記のようにヒートブロック１により反応容器４を保持した状態で、反応容器内４の反応液５のインキュベートを行う。具体的には、温度サイクル装置が、制御部に入力された温度プロファイル通りに下層ヒートブロック３の温度を制御し、下層ヒートブロック３によって反応容器４の下部全体を加熱し、反応液５のインキュベートを行う。そして、温度サイクル装置は、下層ヒートブロック３が反応液５をインキュベートしている間、上層ヒートブロック２の温度を制御し、下層ヒートブロック３より高い温度に維持することで反応容器４の上部の周側面を加熱し、反応容器４内で反応液５に由来する凝結を防止する。
【００４５】
例えば、本装置を用いてＰＣＲにより核酸を増幅する場合に、下層ヒートブロック３の温度を、熱変性の段階では９５℃で３０秒、アニーリングの段階では５５℃で３０秒、伸長反応の段階では７２℃で１分と設定する。この場合、上層ヒートブロック２の温度を、下層ヒートブロック３の温度の上限値（すなわち、９５℃）より高い一定温度、例えば１０５℃に維持されるように設定する。
【００４６】
また、上層ヒートブロック２にヒーター２１の代わりにペルチェ素子を設け、下層ヒートブロック３の温度変化に応じて、上層ヒートブロック２の温度を逐次変化させるようにしてもよい。例えば、下層ヒートブロック３の温度設定が上記と同じ場合に、上層ヒートブロック２の温度を、熱変性の段階では１０５℃で３０秒、アニーリングの段階では６５°で３０秒、伸長反応の段階では８２℃で１分と設定する。こうして、上層ヒートブロック２の温度を、下層ヒートブロック３の温度変化に応じて逐次変化させながらも、常に下層ヒートブロック３の温度より高い温度に維持する構成でもよい。
【００４７】
[反応性確認実験]
本発明の装置の反応性を確認するため、上層ヒートブロック２を図９Ｉ〜ＩＶに示される位置に設けた構成の装置を用いた。尚、図９中、Ｉは本発明の上記実施例における図６に示す装置、ＩＩは上層ヒートブロック２を反応容器最上部に位置させ、上層ヒートブロック２と下層ヒートブロック３との間に反応容器４の全高の３０％の空間７を設けた装置、ＩＩＩは上層ヒートブロック２が反応容器４を保持せず、反応容器４のキャップ４０上に配置された装置、ＩＶは上層ヒートブロック２を使用しない装置を示す。
【００４８】
各装置の増幅効率の確認は、以下に記載のラムダＤＮＡ（タカラバイオ社製）を鋳型とした増幅鎖長８ｋｂｐのＰＣＲ増幅反応により行った。
【００４９】
反応は、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を使用し、取扱説明書に記載の一般的なＰＣＲ反応液量の１／２量（トータル反応液量２５μＬ）で行った。鋳型として２．５ｎｇ／μＬラムダＤＮＡ０．５μＬ、プライマーＦ（配列番号１）及びプライマーＲ（配列番号２）は１０ｐｍｏｌ／μＬ濃度のものを各０．５μＬずつ使用した。上記調製した反応液５は、２５μＬずつ０．２ｍＬ反応チューブ（０．２ｍＬ  ８−ｓｔｒｉｐ  ｔｕｂｅ，  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｆｌａｔ  Ｃａｐｓ、タカラバイオ社製）に分注した。次に、反応液５を分注した反応チューブ４を各装置にセットし、下層ヒートブロック３の温度を、９４℃で１分間加温後、９４℃で３０秒−６５℃で１０分のサイクルを３０回繰り返す温度設定にて反応を行った。上層ヒートブロック２の温度は１０７℃で行った。尚、図１０に反応に用いた９６穴プレートの模式図を示す。図中、斜線で示した場所は反応位置を示す。
【００５０】
反応終了後、図１０に記載の１列、６列及び１２列のＡ行〜Ｈ行までの反応液をそれぞれ抜き出し、１％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ  Ｌ０３「ＴＡＫＡＲＡ」、タカラバイオ社製）／ＴＡＥバッファーに反応液各々３μＬをアプライした。マーカーとしてλ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ（タカラバイオ社製）を使用し、Ｍｕｐｉｄ−２ｐｌｕｓ（アドバンス社製）にて電気泳動を行った。その結果を図１１に示す。すなわち、図１１は各装置の９６穴プレート内の位置によるＰＣＲの反応性を示す電気泳動写真である。図中、例えば１列のＡ行の装置Ｉ〜ＩＶの反応後の結果は、Ａ−１と記載した場所の下側の装置番号の箇所の電気泳動写真である。また、Ｍはマーカーの電気泳動写真を示す。
【００５１】
図１１から明らかなように、装置ＩＩでは１列のＤ〜Ｈ行と６列のＧ行とＨ行、装置ＩＩＩでは１２列のＦ〜Ｈ行、装置ＩＶでは全ての行列において、わずかな増幅が認められるだけか全く増幅していなかった。これらの結果は、反応容器４内の凝結を防止できなかった、または、下層ヒートブロック３に温度ムラが生じたことが原因であると考えられる。これに対して、本発明の装置Ｉは、９６穴プレート内の全ての位置において、良好な増幅結果が得られた。これは、上層ヒートブロック２が、反応容器内の反応液に由来する凝結を防止し、また、下層ヒートブロック３の温度ムラを抑制したことによるものであると考えられる。すなわち、本発明の装置Ｉでは、上層ヒートブロック２が、反応液５の濃度を所望の反応に起因するもの以上に変化することを防止して、反応液の濃度変化による核酸の増幅効率の低下を防止している。さらに、上層ヒートブロック２が、ヒートブロック１上の反応位置の違いによる温度ムラを防止し、反応位置の違いによる核酸の増幅効率の低下を防止している。以上により、本発明の温度サイクル装置では、９６穴プレート内で安定した再現性のあるＰＣＲが可能であることが明らかとなった。
【００５２】
本発明の温度サイクル装置は、核酸の増幅の他に、逆転写反応などの酵素反応にも適当することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により、反応液中の水分やその他の成分の反応容器内での凝結がなく、また、反応容器を設置する位置による温度のムラも防ぐことが可能な温度サイクル装置が提供される。本発明の装置は、分子生物学研究分野等で使用される生物学的試料の反応、特に核酸の増幅を実施するために非常に有用である。
【符号の説明】
【００５４】
１  ヒートブロック
２  上層ヒートブロック
２０  貫通孔
２１  ヒーター
２２  温度センサー
２３  位置決め穴
３  下層ヒートブロック
３０  凹部
３１  ペルチェ素子
３２  温度センサー
３３  位置決めシャフト
４  反応容器
４０  キャップ
５  反応液
５０  液面
６  スペーサ
７  空間  
８  断熱材
９  制御部
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
SEQ ID NO:1; Primer F to amplify lambda DNA.
SEQ ID NO:2; Primer R to amplify lambda DNA.
【図１】
2011021640.tif 000003
【図２】
2011021640.tif 000004
【図３】
2011021640.tif 000005
【図４】
2011021640.tif 000006
【図５】
2011021640.tif 000007
【図６】
2011021640.tif 000008
【図７】
2011021640.tif 000009
【図８】
2011021640.tif 000010
【図９】
2011021640.tif 000011
【図１０】
2011021640.tif 000012
【図１１】
2011021640.tif 000013
【配列表】
2011021640000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年12月27日(2011.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
反応液をインキュベートするための温度サイクル装置であって、
（１）前記反応液を収容する反応容器を保持して加熱するためのヒートブロックを備え、前記ヒートブロックは、下層ヒートブロックと上層ヒートブロックとの２つの層で構成され、
前記下層ヒートブロックは、前記反応容器の下部を嵌め込んで保持するための凹部を備え、前記凹部に前記反応容器の下部を密着させて加熱し、
前記上層ヒートブロックは、前記反応容器の上部を挿通して保持するための貫通孔を備え、前記反応容器の上端と前記下層ヒートブロックとの間に位置し、前記貫通孔に前記反応容器の上部の周側面を密着させて加熱し、
更に、
（２）前記下層ヒートブロックの温度と前記上層ヒートブロックの温度とをそれぞれ独立に制御して、前記反応液をインキュベートする際に、前記上層ヒートブロックの温度を前記下層ヒートブロックの温度より高く維持する温度制御手段を備えることを特徴とする温度サイクル装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
前記温度制御手段は、前記下層ヒートブロックの温度を変化および維持するための第一温度手段と、前記上層ヒートブロックの温度を変化および維持するための第二温度手段とを備え、前記第一温度手段は前記下層ヒートブロックの下側に設けられ、前記第二温度手段は前記上層ヒートブロックの上側に設けられていることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の温度サイクル装置。
【国際調査報告】
2011021640.tif 000014
2011021640.tif 000015
2011021640.tif 000016
2011021640.tif 000017