(57)【要約】バイオマス原料から、微生物培養の炭素源として使用することができる糖液を効率よく製造し、得られる糖液を用いて発酵法により目的物質を製造する技術を提供する。目的物質生産能を有する微生物を培地で培養し、同培地から目的物質を回収する、目的物質の製造方法において、前記培地の炭素源として、バイオマス原料を水熱分解処理し、熱水中に移行したヘミセルロースを含む成分を糖化処理し、得られる糖液を吸着剤処理して吸着剤に吸着する成分を除去し、得られる糖を用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質生産能を有する微生物を培地で培養し、同培地から目的物質を回収する、目的物質の製造方法において、
前記培地は、バイオマス原料を水熱分解処理し、熱水中に移行したヘミセルロースを含む成分を糖化処理し、得られる糖液を吸着剤処理して吸着剤に吸着する成分を除去し、得られる糖を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記吸着剤が、活性炭、陰イオン交換樹脂、及び合成吸着樹脂からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記吸着剤処理により、糖以外の分子量３０００以下の不揮発性の物質を除去することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記目的物質がアミノ酸又は核酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物がキシロース資化性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が細菌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物がエシェリヒア属細菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物がエシェリヒア・コリである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマス原料の水熱分解処理を、１７５〜２４０℃の加圧熱水を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオマス原料の水熱分解処理を、バイオマス原料を加圧熱水と対向接触させながら行うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記糖化処理を糖化酵素により行う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖化酵素がセルラーゼまたはヘミセルラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオマス原料がサトウキビバガス又は稲わらである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
下記工程を含む、糖液の製造方法：
ａ）バイオマス原料を水熱分解処理し、
ｂ）加圧熱水中に移行したヘミセルロース成分を糖化処理して糖液を得、
ｃ）得られる糖液を吸着剤処理して吸着剤に吸着する成分を除去する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵法による目的物質の製造法に関し、特に、バイオマス原料を用いて発酵法により目的物質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマス、例えばサトウキビやトウモロコシなどの植物の非可食部は、再生可能エネルギー源としての利用が期待されている。【０００３】
バイオマスを利用する技術として、例えば、希硫酸、濃硫酸による木材等のバイオマス原料の糖化処理後、固液分離し、液相を中和処理し、エタノール発酵等の原料として利用するエタノール等の製造技術が実用化されている（特許文献１、特許文献２）。【０００４】
バイオマスを発酵基質として利用するには、バイオマス固形分中の主な成分であるセルロース及びヘミセルロース等の多糖類を糖化する必要があるが、酵素による糖化はバイオマス成分の構造上効率が低く、また、酸処理による糖化は糖の過分解が起りやすく、ともに効率がよいとはいえない。【０００５】
各種バイオマスを熱水処理して、酵素法により糖化を行う技術が開示されており（特許文献３）、熱水処理を行うことでリグニン成分を可溶化することにより、セルロース及びヘミセルロースの酵素糖化を効率良く行うことができる。【０００６】
熱水処理したバイオマス原料から効率よく糖を得る技術として、バイオマス原料を加圧熱水と対向接触させつつ水熱分解し、加圧熱水中にリグニン成分及びヘミセルロース成分を移行し、バイオマス固体中からリグニン成分及びヘミセルロース成分を分離してなる水熱分解工程と、前記水熱分解工程で排出されるバイオマス固形分中のセルロースを酵素処理して６炭糖を含む第１の糖液に酵素糖化する第１の酵素糖化工程と、前記水熱分解工程で排出される熱水排出液中のヘミセルロース成分を硫酸分解して５炭糖を含む第２の糖液に分解する硫酸分解工程とを含み、前記水熱分解の反応温度が１８０〜２４０℃であることを特徴とするバイオマス原料を用いた有機原料の製造方法が提案されている（特許文献４、５、６）。【０００７】
また、これまでに、糖の過分解物であるフルフラールや５−ヒドロキシメチルフルフラール、あるいはリグニン由来のバリニン等の物質が生育及び代謝阻害を示すことが知られており（非特許文献１）、これらの物質を糖液から除去するために、ナノろ過膜や逆浸透膜を用いた阻害物除去法が提案されている（特許文献７、特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平９−５０７３８６号公報
【特許文献２】特表平１１−５０６９３４号公報
【特許文献３】特開２０１０−１６６８３１号公報
【特許文献４】特許第４４３６４２９号
【特許文献５】特許第４５２４３５１号
【特許文献６】特許第４４２７５８３号
【特許文献７】国際公開ＷＯ２００９/１１０３７４号パンフレット
【特許文献８】国際公開ＷＯ２０１０/０６７７８５号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Klinke HB, Thomsen AB, Ahring BK, Appl Microbiol Biotechnol. 2004 Nov;66(1):10-26. Epub 2004 Aug 6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
加圧水熱処理をすることにより、バイオマス原料から６炭糖への糖化効率のよいセルロース主体のバイオマス固形分を得るとともに、熱水側に移行したヘミセルロースを効率よく５炭糖に糖化することができる。しかしながら、本発明者は、同方法によって得られる、ヘミセルロースを含む熱水由来の糖液を微生物培養の炭素源として用いた場合、生育及び代謝が阻害されることを見出した。【００１１】
本発明は、バイオマス原料から、微生物培養の炭素源として使用することができる糖液を効率よく製造し、得られる糖液を用いて発酵法により目的物質を製造する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、バイオマス原料を水熱分解処理し、熱水中に移行したヘミセルロースを含む成分を糖化処理して得られる糖液には、微生物の生育および代謝を阻害する物質が含まれていることを見出し、該物質を除去することにより、微生物培養及び目的物質生産に好適な炭素源が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）目的物質生産能を有する微生物を培地で培養し、同培地から目的物質を回収する、目的物質の製造方法において、
前記培地は、バイオマス原料を水熱分解処理し、熱水中に移行したヘミセルロースを含む成分を糖化処理し、得られる糖液を吸着剤処理して吸着剤に吸着する成分を除去し、得られる糖を含むことを特徴とする方法。
（２）前記吸着剤が、活性炭、陰イオン交換樹脂、及び合成吸着樹脂からなる群より選ばれる、前記方法。
（３）前記吸着剤処理により、糖以外の分子量３０００以下の不揮発性の物質を除去することを特徴とする前記方法。
（４）前記目的物質がアミノ酸又は核酸である、前記方法。
（５）前記微生物がキシロース資化性を有する、前記方法。
（６）前記微生物が細菌である、前記方法。
（７）前記微生物がエシェリヒア属細菌である、前記方法。
（８）前記微生物がエシェリヒア・コリである、前記方法。
（９）前記バイオマス原料の水熱分解処理を、１７５〜２４０℃の加圧熱水を用いて行うことを特徴とする、前記方法。
（１０）前記バイオマス原料の水熱分解処理を、バイオマス原料を加圧熱水と対向接触させながら行うことを特徴とする、前記方法。
（１１）前記糖化処理を糖化酵素により行う、前記方法。
（１２）前記糖化酵素がセルラーゼまたはヘミセルラーゼである、前記方法。
（１３）前記バイオマス原料がサトウキビバガス又は稲わらである、前記方法。
（１４）下記工程を含む、糖液の製造方法：
ａ）バイオマス原料を水熱分解処理し、
ｂ）加圧熱水中に移行したヘミセルロース成分を糖化処理して糖液を得、
ｃ）得られる糖液を吸着剤処理して吸着剤に吸着する成分を除去する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、目的物質生産能を有する微生物を培地で培養し、同培地から目的物質を回収する、目的物質の製造方法である。本発明において、前記培地は、バイオマス原料を水熱分解処理し、熱水中に移行したヘミセルロースを含む成分を糖化処理し、得られる糖液を吸着剤処理して吸着剤に吸着する成分を除去し、得られる糖を含む。
【００１４】
本発明における糖とは、セルロース含有バイオマスの水熱分解処理により、得られる糖を意味する。本発明の糖とは、主成分として単糖を含む糖であり、具体的にはキシロースまたはグルコースを主成分として含む。また、少量ではあるが、アラビノース、マンノースなどの単糖、セロビオースなどのオリゴ糖を含むこともある。
【００１５】
バイオマスとは、再生可能な、生物由来の有機性資源で化石資源を除いたもの、あるいは、地球生物圏の物質循環系に組み込まれた生物体又は生物体から派生する有機物の集積をいう。本発明において、前記糖を得るためのバイオマス原料としては、バイオマス由来の原料であって、水熱処理により熱水中に移行するヘミセルロース成分を含み、同ヘミセルロース成分が糖化処理により糖を生成し得るものであれば特に制限されないが、未利用バイオマスの有効利用の観点からは、植物の非可食部が好ましく、例えば、サトウキビバガス、サトウキビ又はサトウキビバガスから分離されたピス、稲稈（稲わら）、麦稈（麦わら）、籾殻、廃木材、間伐材、コーンコブ、スイッチグラス、オイルパーム空房及びタピオカ繊維等が挙げられる。
【００１６】
前記バイオマス原料を水熱分解処理する。バイオマス原料は、そのまま使用してもよいが、蒸煮、爆砕、例えば必要に応じて、例えば５ｍｍ以下に粉砕してもよい。水熱分解は、１７５〜２４０℃、より好ましくは２００〜２３０℃の加圧熱水を用いて行うことが好ましい。ヘミセルロース成分は約１４０℃付近から、セルロースは約２３０℃付近から、リグニン成分は１４０℃付近から溶解するため、ヘミセルロース成分を十分に溶解させるためには、上記範囲の温度が好ましい。
【００１７】
上記のような水熱分解処理は、バイオマス原料を加圧熱水と対向接触させることにより行うことができる。このような処理は、特許第４４３６４２９号公報、特許４５２４３５１号公報、又は特許第４４２７５８３号公報に記載された装置を用いて行うことができる。バイオマス原料の水熱分解処理によって、リグニン成分及びヘミセルロース成分は、バイオマス原料から熱水中に移行し、セルロース成分は固形分として残る。
【００１８】
また、水熱分解処理の反応圧力は、装置内部が加圧熱水の状態となる、各温度の水の飽和蒸気圧より更に０．１〜０．５ＭPa高い圧力とするのが好ましい。反応時間は通常20分以下、好ましくは３〜１５分である。
【００１９】
続いて、熱水を固形分から分離し、熱水中のヘミセルロースを含む成分を糖化処理する。ヘミセルロースの糖化は、糖化酵素を用いた酵素分解、又は硫酸を用いた硫酸分解により行うことができるが、本発明においては、酵素分解が好ましい。
【００２０】
糖化酵素としては、ヘミセルロースを分解して５炭糖を生成し得るものであれば特に制限されないが、具体的にはヘミセルラーゼが挙げられる。ヘミセルラーゼとは、ヘミセルロースに含まれるグリコシド結合の加水分解に関与する酵素の総称である。ヘミセルロースは、陸上植物細胞の細胞壁を構成する多糖類のうち、セルロースとペクチン以外のものであり、ヘミセルロース成分にはキシランが多く含まれており、ヘミセルラーゼの主成分は、エンド-1,4-β-キシラナーゼ（EC 3.2.1.8）、及びβ-1,4-キシロシダーゼ（EC 3.2.1.37）等であるが、その他のグルコシド結合加水分解酵素も含まれている。市販のヘミセルラーゼとしてはCellic Htec（Novozyme）等が挙げられるが、セルラーゼであるSpezyme CP（Genencor、Trichoderma reesei由来）、及び、β‐グルコシダーゼであるNovozyme 188（Novozyme、Aspergillus niger由来）を用いてもよい。ヘミセルロースにこれらの酵素を作用させると、キシロース、アラビノース等が生成する。また、熱水中にヘミセルロースだけでなくセルロースが移行又は混入することがあり、糖化処理によってグルコースが生成する場合がある。本発明においては、糖化処理により得られたグルコースも炭素源として用いてもよい。
【００２１】
生成したキシロースやアラビノース等の糖は、用途に応じて、さらに化学反応又は酵素反応によって異性化又は分解させてもよい。
得られた糖液は、用途に応じて、そのまま使用することもできるし、水分を除去して乾燥物として使用することもできる。また、糖液中の成分は適宜分画して使用してもよい。分画物には、粗精製物及び精製物も含まれる。精製物としてはキシロース及びグルコース等が挙げられる。
【００２２】
酵素反応に用いる溶媒は、水熱処理に使用した水そのものであってもよく、さらに緩衝液等の水性溶媒であってもよい。反応温度及びｐＨ等の反応条件は、市販酵素に添付された説明書の記載にしたがって、又は予備実験等によって、適宜設定すればよい。例えば、前記Spezyme CP、及び、Novozyme 188を用いる場合は、45〜60℃、pH4.5〜6.5の条件が挙げられる。酵素量としては、基質固形量当り、通常20〜120FPU（filter paper unit）、反応時間は、通常24〜144時間が挙げられる。反応は静置で行ってもよいが、撹拌しながら行ってもよい。また、酵素反応に先立って、脱リグニン、又はヘミセルロースの部分分解等の前処理を行ってもよい。
【００２３】
糖化を硫酸分解により行う場合、硫酸濃度は通常０．１〜５重量％、好ましくは１〜４重量％が好ましい。分解温度は、通常１００〜１４０℃、好ましくは約１２０℃前後が好ましく、分解時間は通常３０分〜３時間、好ましくは１時間前後が好ましい。分解後、硫酸はイオン交換樹脂処理等により除去することができる（特許文献１、特許文献２）。
【００２４】
糖化処理により得られた糖液は、吸着剤処理して吸着剤に吸着する成分を除去する。そのような吸着剤としては、活性炭、イオン交換樹脂、合成吸着樹脂、ゼオライト、シリカゲル等が挙げられる。これらの吸着剤として具体的には、実施例に記載した吸着剤が挙げられる。前記のようにして得られる糖液には、微生物の生育及び代謝を阻害する物質が含まれている。このような阻害物質は、主として、糖以外の分子量３０００以下の不揮発性の物質である。したがって、吸着剤は、糖に比べて糖以外の分子量３０００以下の不揮発性物質が選択的に吸着するものであることが好ましい。なお、糖以外の分子量３０００以下の不揮発性物質を除去するためには、ゲルろ過、膜処理等が挙げられる。
【００２５】
例えば、活性炭としては、以下のものが使用できる。
・ホクエツBA (味の素ファインテクノ)
・ホクエツF (味の素ファインテクノ)
・ホクエツHS (味の素ファインテクノ)
・ホクエツKS (味の素ファインテクノ)
・ホクエツPF (味の素ファインテクノ)
・ホクエツDS (味の素ファインテクノ)
・ホクエツGS (味の素ファインテクノ)
・T-S (クラレケミカル株式会社)
・アルデナイト (日本エンバイロケミカルズ株式会社)
・アルフェマイト (水澤化学工業株式会社)
・クラレコールGG (クラレケミカル株式会社)
・クラレコールGS (クラレケミカル株式会社)
・クラレコールGW (クラレケミカル株式会社)
・クラレコールGL (クラレケミカル株式会社)
・クラレコールGLC (クラレケミカル株式会社)
・クラレコールKW (クラレケミカル株式会社)
・クラレコールGWC (クラレケミカル株式会社)
・クラレコールPW (クラレケミカル株式会社)
・クラレコールPK (クラレケミカル株式会社)
・クラレコールPDX (クラレケミカル株式会社)
・白鷺M  M743 (日本バイオケミカルズ)
・カルボフィラン-6 (日本バイオケミカルズ)
・カルボフィラン (日本バイオケミカルズ)
・カルボフィラン-EX (日本バイオケミカルズ)
・FP-1 (日本バイオケミカルズ)
・FP-3 (日本バイオケミカルズ)
・FP-4 (日本バイオケミカルズ)
・FP-6 (日本バイオケミカルズ)
・FP-7 (日本バイオケミカルズ)
・FP-8 (日本バイオケミカルズ)
・FP-9 (日本バイオケミカルズ)
・WA-3 (株式会社キャタラー)
・FW (株式会社キャタラー)
・WA (株式会社キャタラー)
・DSW-3 (株式会社キャタラー)
・PW (株式会社キャタラー)
・FY-1 (株式会社キャタラー)
・DSW-5 (株式会社キャタラー)
・SE-P1 (株式会社キャタラー)
・FY-2 (株式会社キャタラー)
・GA (株式会社キャタラー)
・FM-150 (株式会社キャタラー)
・梅蜂印活性炭 A印 (太平化学産業株式会社)
・梅蜂印活性炭 Y印 (太平化学産業株式会社)
・梅蜂印活性炭 MA印 (太平化学産業株式会社)
・梅蜂印活性炭H-C印 (太平化学産業株式会社)
・梅蜂印活性炭 F印 (太平化学産業株式会社)
・梅蜂印活性炭 FN印 (太平化学産業株式会社)
・梅蜂印活性炭 FT印 (太平化学産業株式会社)
・梅蜂印活性炭 IE印 (太平化学産業株式会社)
・ブロコールA (太平化学産業株式会社)
・ブロコールB (太平化学産業株式会社)
・ヤシコールL (太平化学産業株式会社)
・ヤシコールM (太平化学産業株式会社)
・ヤシコールS (太平化学産業株式会社)
【００２６】
また、アニオン交換樹脂としては、アクリル系陰イオン交換樹脂、スチレン系ポリアミン型陰イオン交換樹脂、スチレン系ジメチルアミン型陰イオン交換樹脂、ゲル型陰イオン交換樹脂、ポーラス型陰イオン交換樹脂、ハイポーラス型陰イオン交換樹脂、強塩基性I 型陰イオン交換樹脂、強塩基性II型陰イオン交換樹脂、中・弱塩基性陰イオン交換樹脂、弱塩基性陰イオン交換樹脂を使用することができ、具体的には以下の製品を使用することが出来る。
【００２７】
アクリル系陰イオン交換樹脂
・WA10 (ダイヤイオン、日本錬水株式会社)
スチレン系ポリアミン型陰イオン交換樹脂
・WA21 (ダイヤイオン、日本錬水株式会社)
スチレン系ジメチルアミン型陰イオン交換樹脂
・WA30 (ダイヤイオン、日本錬水株式会社)
【００２８】
ゲル型陰イオン交換樹脂
・SA10A, SA11A, SA12A, NSA100, SA20A, SA21A (ダイヤイオン、日本錬水株式会社)
【００２９】
ポーラス型陰イオン交換樹脂
・PA306S, PA308, PA312, PA316, PA318L, PA408, PA412, PA418 (ダイヤイオン、日本錬水株式会社)
【００３０】
ハイポーラス型陰イオン交換樹脂
・HPA25 (ダイヤイオン、日本錬水株式会社)
【００３１】
強塩基性I 型陰イオン交換樹脂
・ダウエックスTM 1X2 50-100 (ダウエックスTM、ダウ・ケミカル社)
・ダウエックスTM 1X2 100-200 (ダウエックスTM、ダウ・ケミカル社)
・ダウエックスTM 1X4 20-50 (ダウエックスTM、ダウ・ケミカル社)
・ダウエックスTM 1X4 50-100 (ダウエックスTM、ダウ・ケミカル社)
・ダウエックスTM 1X4 100-200 (ダウエックスTM、ダウ・ケミカル社)
・ダウエックスTM 1X8 50-100 (ダウエックスTM、ダウ・ケミカル社)
・ダウエックスTM 1X8 100-200 (ダウエックスTM、ダウ・ケミカル社)
・ダウエックスTM 1X8 200-400 (ダウエックスTM、ダウ・ケミカル社)
【００３２】
強塩基性I型陰イオン交換樹脂
スチレン系
・IRA400J (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・IRA402BL (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・IRA404J (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・IRA900J (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・IRA904 (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・IRA458RF (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・ASB-1 (IONAC、IONAC)
・ASB-1P (IONAC、IONAC)
・NA-38 (IONAC、IONAC)
アクリル系
・IRA958 (アンバーライト、オルガノ株式会社)
【００３３】
強塩基性II型陰イオン交換樹脂
スチレン系
・2IRA410J (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・2IRA411 (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・2IRA910CT (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・ASB-2 (IONAC、IONAC)
・A-554 (IONAC、IONAC)
【００３４】
中・弱塩基性陰イオン交換樹脂
アクリル系
・IRA478RF (アンバーライト、オルガノ株式会社)
【００３５】
弱塩基性陰イオン交換樹脂
アクリル系
・IRA67 (アンバーライト、オルガノ株式会社)
スチレン系
・IRA96SB (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・XE583 (アンバーライト、オルガノ株式会社)
【００３６】
合吸着樹脂は、芳香族系合成吸着樹脂、無官能型合成吸着樹脂、スチレン系合成吸着樹脂、アクリル系合成吸着樹脂を使用することが出来、具体的には、以下の製品を使用することが出来る。
【００３７】
芳香族系合成吸着樹脂
・HP20 (ダイヤイオン、日本錬水株式会社)
・HP21 (ダイヤイオン、日本錬水株式会社)
・SP850 (セパビーズ、日本錬水株式会社)
・SP825L (セパビーズ、日本錬水株式会社）
・SP700 (セパビーズ、日本錬水株式会社)
・SP207 (セパビーズ、日本錬水株式会社)
【００３８】
無官能型合成吸着樹脂
・SB74 (デュオライト、住化ケムテックス株式会社)
・SB76 (デュオライト、住化ケムテックス株式会社)
・SB77 (デュオライト、住化ケムテックス株式会社)
・XAD761 (デュオライト、住化ケムテックス株式会社)
【００３９】
スチレン系合成吸着樹脂
・アンバーライトTM XADTM 2000 (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・アンバーライトTM XADTM 4 (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・アンバーライトTM XADTM 2 (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・アンバーライトTM FPX66 (アンバーライト、オルガノ株式会社)
・アンバーライトTM XADTM 1180N (アンバーライト、オルガノ株式会社)
【００４０】
アクリル系合成吸着樹脂
・アンバーライトTM XADTM7HP (アンバーライト、オルガノ株式会社)
【００４１】
本発明の一態様では、「糖液の吸着剤処理」は、「糖液からの糖以外の分子量３０００以下の不揮発性の物質の除去」で置換えることができる。
【００４２】
吸着剤処理は、バッチ処理により、又はカラムを用いて行うことができるが、カラムを用いることが好ましい。バッチ処理では、糖液を入れた容器に吸着剤を入れた後、吸着剤と糖液を分離する。カラムを用いる場合は、吸着剤を充填したカラムに糖液を流し、必要に応じてカラムに洗浄液を流し、貫流液（非吸着画分）を集める。吸着剤処理には、糖化処理により得られた糖液をそのまま用いてもよく、適宜濃縮又は希釈した糖液を用いてもよい。また、吸着剤処理は、２回又はそれ以上繰返してもよく、また、２種又はそれ以上の吸着剤を併用してもよい。
【００４３】
上記のようにして得られる、生育阻害物質が除去された糖液は、微生物を用いた目的物質の製造に用いる培地の炭素源として好適に利用することができる。糖液は、そのまま用いてもよく、適宜濃縮してもよく、また、糖を精製して用いてもよい。
【００４４】
尚、バイオマス原料の水熱処理の後、熱水を分離した残りの固形分の利用は、本発明では必須ではないが、該固形分を利用してもよい。すなわち、固形分中のセルロースをセルラーゼ等で酵素処理すれば、グルコース等の６炭糖を含む糖液が得られる。
【００４５】
前記方法により得られた糖液又はその分画物は、例えば、発酵法により目的物質の製造における炭素源として用いることができる。目的物質としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールが挙げられる。その他、酢酸、乳酸、プロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、コハク酸、クエン酸、アミノ酸、核酸が挙げられる。
【００４６】
特にＬ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギンが挙げられる。
【００４７】
また、本発明のＬ−アミノ酸には上記アミノ酸を出発物質として得られるＬ−アミノ酸誘導体も含まれ、GABA、p-ヒドロキシ-D-フェニルグリシン、DOPA、コハク酸、リンゴ酸、ピルビン酸、カダベリンが挙げられる。
【００４８】
核酸としては、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドなどが挙げられる。プリンヌクレオシドには、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンなどが含まれ、プリンヌクレオチドには、プリンヌクレオシドの５'−燐酸エステル、例えばイノシン酸（イノシン−５'−リン酸。以下「IMP」ともいう）、キサンチル酸（キサントシン−５'−リン酸。以下「XMP」ともいう）、グアニル酸（グアノシン−５'−モノリン酸。以下「GMP」ともいう）、アデニル酸（アデノシン−５'−モノリン酸。以下「AMP」ともいう）などが含まれる。また、本発明の核酸には、上記核酸を出発物質として得られる核酸誘導体も含まれ、Ara-U（ウラシルアラビノシド）、ZVA（Z-バラシクロビル）等が挙げられる。
本発明により製造される目的物質は、１種でもよく、２種又はそれ以上であってもよい。
【００４９】
＜目的物質の製造に用いることが出来る微生物＞
目的物質の製造に用いる微生物は、上記方法で得られる糖、例えばグルコース及び／又はキシロース等を資化することができ、目的物質生産能を有し、液体培地で培養したときに培地又は微生物細胞中に目的物質を蓄積させることができる微生物であれば、特に制限されない。特に、キシロースを資化することができる微生物が好ましい。蓄積する目的物質の量は、培地から回収できる程度に蓄積できればいずれでもよい。
【００５０】
本発明に用いる微生物又はそれを育種するための親株としては、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物や、コリネ型細菌等を用いることができる。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター（Enterobacter）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌が挙げられ、またその他の微生物としては、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、サッカロマイセス属やキャンディダ属等に属する酵母などが挙げられる。
【００５１】
エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所  ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States of America）。すなわち、菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる。各菌株に対応する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている（http://www.atcc.org/参照）。
【００５２】
また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００５３】
コリネ型細菌としては、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌に分類される微生物が利用できる。なお、コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在はコリネバクテリウム属細菌として統合された細菌（Int.J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)）、及びコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。
【００５４】
このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシェンス）
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００５５】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869（コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869）
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
【００５６】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所  P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）より分譲を受けることができる。また、AJ12340株は、1987年10月27日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にFERM BP-1539の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。また、AJ12418株は、1989年１月５日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-2205の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００５７】
バチルス属細菌を用いるときは、バチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス等が挙げられる。
バチルス・ズブチリスとしては、バチルス・ズブチリス168 Marburg（ATCC6051）、バチルス・ズブチリスPY79（Plasmid, 1984, 12, 1-9）等が、バチルス・アミロリケファシエンスとしては、バチルス・アミロリケファシエンスＴ（ATCC23842）、及びバチルス・アミロリケファシエンスＮ（ATCC23845）等が挙げられる。また、バチルス・プミルスとしては、バチルス・プミルス Gottheil No.3218（ATCC No.21005）（米国特許第3,616,206号）等が挙げられる。
【００５８】
以下、上述したような親株にＬ−アミノ酸又は核酸生産能を付与する方法について述べる。
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００５９】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００６０】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むDNA断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレット第95/34672号参照）。
【００６１】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。コリネ型細菌で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、国際公開第00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００６２】
以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【００６３】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001-346578号）等が挙げられる
。
【００６４】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P. et al. 1987. J. Mol. Biol. 194:59-69; 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
【００６５】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（国際公開第98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【００６６】
このようにＬ−スレオニンによるフィ-ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu-ファージ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００６７】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開第95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許第877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開第99/18228号パンフレット、欧州出願公開第1092776号明細書）が挙げられる。
【００６８】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Livshits, V. A. et al. 2003. Res. Microbiol. 154:123-135)、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００６９】
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., 1978. Genetika (in Russian), 14: 947-956)、E. coli VL643及びVL2055 (欧州特許出願公開第1149911号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００７１】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。
【００７２】
エシェリヒア・コリのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号337〜2,799に位置し、GenBank Accession No. AAC73113にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号2,801〜3,733に位置し、GenBank Accession No. AAC73114にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号3,734〜5,020に位置し、GenBank Accession No. AAC73115にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。これら3つの遺伝子は、リーダーペプチドをコードするthrL遺伝子の下流に、thrLABCからなるスレオニンオペロンとしてコードされている。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去することが有効である(国際公開第2005/049808号、国際公開第2003/097839号)。
【００７３】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００７４】
rhtA遺伝子は、ホモセリン及びスレオニンに耐性を与える遺伝子（rht: resistant to threonine/homoserine）として取得されたGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号848,433〜849,320（相補鎖）に位置し、GenBank Accession No. AAC73900にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。また、rthAの発現を向上させるrhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(Livshits, V. A. et al. 2003. Res Microbiol. 154:123-135、欧州特許出願公開第1013765号)。
【００７５】
エシェリヒア・コリのasd遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号3,571,798〜 3,572,901（相補鎖）に位置し、GenBank Accession No. AAC76458にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子である。遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T. J. et al. 1989. Trends Genet. 5: 185-189.参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００７６】
また、エシェリヒア・コリのaspC遺伝子はGenBank Accession No. U00096で登録されているエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列上の塩基番号983,742〜984,932（相補鎖）に位置し、GenBank Accession No. AAC74014にて登録されているタンパク質をコードする遺伝子であり、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００７７】
Ｌ−リジン生産菌
以下、Ｌ−リジン生産菌及びその構築方法を例として示す。
例えば、Ｌ−リジン生産能を有する株としては、Ｌ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以下、「AEC」と略記することがある。）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジン生産菌として具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号明細書参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000-189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開第96/17930号パンフレット参照）を用いることも出来る。
【００７８】
また、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性を上昇させることによっても、Ｌ−リジン生産菌を構築することが出来る。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、または発現調節配列を改変することによって達成できる。
【００７９】
遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中の遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えばgapA遺伝子を含むDNA断片を、宿主細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを細菌に導入して形質転換すればよい。
【００８０】
遺伝子のコピー数を高めることは、上述のような遺伝子を細菌のゲノムDNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。細菌のゲノムDNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、ゲノムDNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。ゲノムDNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。また、ゲノム上に存在するgapA遺伝子の横に、それぞれの遺伝子をタンデムに連結させてもよいし、ゲノム上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。これらの遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはintegrationベクターを用いて達成することが出来る。
【００８１】
あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させてゲノムDNA上に多コピー導入することも可能である。ゲノム上に遺伝子が転移したことの確認は、遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００８２】
さらに、遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載した方法で、ゲノムDNA上またはプラスミド上の遺伝子の各々のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、各遺伝子の−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけること、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又は、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、araBAプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、T7プロモーター、φ10プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、gapA遺伝子のプロモーター領域、SD領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev. 1995. 1:105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変により遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた方法や、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することが出来る。
【００８３】
Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、Ｌ−リジン排出活性を有するタンパク質をコードするybjE遺伝子(WO2005/073390)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(gdhA)( Valle F. et al. 1983. Gene 23:199-209)、または、これらの任意の組み合わせの遺伝子の発現レベルが増大していてもよい。カッコ内は、それらの遺伝子の略記号である。
【００８４】
エシェリヒア・コリ由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、エシェリヒア・コリ由来の野生型アスパルトキナーゼはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、dapA遺伝子及びlysC遺伝子を用いる場合、これらの遺伝子は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型遺伝子であることが好ましい。
【００８５】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするDNAとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするDNAとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするDNAが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型DNAはPCRなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
【００８６】
なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。同プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【００８７】
Ｌ−リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。
【００８８】
リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることが好ましい。両遺伝子の発現低下は、WO2006/078039号パンフレットに記載の方法に従って行うことができる。
【００８９】
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（Wang, J. P. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54: 9405-9410; Winkler, W. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9: 594-602; Qiu, Z. and Goodman, M. F. 1997. J. Biol. Chem. 272: 8611-8617; Wente, S. R. and Schachman, H. K. 1991. J. Biol. Chem. 266: 20833-20839）。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、又はトランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００９０】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. 2002. Bacteriol. 184: 5200-5203）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【００９１】
好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196株は、E. coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換することによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC（「WC196LC」とも記載する。）自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である（US20060160191）。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。
【００９２】
なお、WC196ΔcadAΔldcCは、キシロースイソメラーゼをコードするxylA遺伝子に変異が導入されており、キシロース資化能を失っている。配列番号２に、エシェリヒア・コリのキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列を示す。同アミノ酸配列の158位のプロリンが、WC196ΔcadAΔldcCではロイシンに置換されている。本発明においては、このxylAを野生型に復帰した株を用いることが好ましい。xylA遺伝子を野生型に戻すためには、遺伝子置換により、変異型遺伝子を野生株由来のxylA遺伝子で置換してもよいし、実施例に記載したように、P1トランスダクションにより、野生株のxylA遺伝子を導入してもよい。野生型xylA遺伝子を持つようになった株は、キシロースを単一Ｃ源とする培地で生育できるようになるので、この表現型に基づいて選別することができる。。
【００９３】
pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる（国際公開第WO95/16042、WO01/53459号パンフレット）。
【００９４】
上記のようなＬ−リジン生合成に関与する酵素の遺伝子発現を増強する手法、酵素活性を低下させる方法は、その他のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする遺伝子についても同様に適用することができる。
【００９５】
Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌としては、AEC耐性変異株（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）株など：特公昭56-1914号公報、特公昭56-1915号公報、特公昭57-14157号公報、特公昭57-14158号公報、特公昭57-30474号公報、特公昭58-10075号公報、特公昭59-4993号公報、特公昭61-35840号公報、特公昭62-24074号公報、特公昭62-36673号公報、特公平5-11958号公報、特公平7-112437号公報、特公平7-112438号公報参照）；その生育にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078号公報、特公昭56-6499号公報参照）；AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第3825472号明細書参照）；ＤＬ−α-アミノ-ε-カプロラクタム、α-アミノ-ラウリルラクタム、アスパラギン酸-アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ-ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株；オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50-53588号公報、特開昭50-31093号公報、特開昭52-102498号公報、特開昭53-9394号公報、特開昭53-86089号公報、特開昭55-9783号公報、特開昭55-9759号公報、特開昭56-32995号公報、特開昭56-39778号公報、特公昭53-43591号公報、特公昭53-1833号公報）；イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9784号公報、特開昭56-8692号公報）；フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号公報、特開昭53-86090号公報）；エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997号明細書）などが挙げられる。
【００９６】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (特開平11-155571号)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (国際公開第0127307号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ-２-チエニルアラニン、３-ヒドロキシロイシン、４-アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、国際公開第96/06926号に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (欧州特許出願公開第1239041号)が挙げられる。
【００９９】
コリネ型細菌のＬ−イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ−リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α-ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）が挙げられる。
【０１００】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945、ロシア特許第2003677号)、E. coli 80株 (VKPM B-7270、ロシア特許第2119536号)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (欧州特許出願公開第1085087号)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【０１０２】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【０１０３】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株(欧州特許出願公開第1016710号)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【０１０４】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K-12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【０１０５】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素１種又は２種以上の活性が増強された株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼが好ましい。
【０１０６】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、欧州特許出願公開第1078989号、欧州特許出願公開第955368号及び欧州特許出願公開第952221号に開示されたものが挙げられる。
【０１０７】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【０１０８】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【０１０９】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【０１１０】
また、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したコリネ型細菌としては、例えば、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムL30-2株（特開2006-340603号明細書）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP-4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報9401748号明細書)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174；フランス特許公報9401748号明細書)
コリネバクテリウム・グルタミカムL30-2株（特開2006-340603号）
【０１１１】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5,908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【０１１２】
パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所  〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【０１１３】
また、パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417が付与され、2004年2月26日に上記の産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【０１１４】
さらに、パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【０１１５】
さらにコリネ型細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する方法として、メカノセンシティブチャンネル（mechanosensitive channel）をコードするyggB遺伝子を増幅する方法（国際公開WO2006/070944号）、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である。yggB遺伝子は、GenBank Accession No. NC_003450で登録されているコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 13032株のゲノム配列上の塩基番号1,337,692〜1,336,091（相補鎖）に位置し、NCgl1221とも呼ばれるGenBank Accession No. NP_600492にて登録されている膜タンパク質をコードする遺伝子である。
【０１１６】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949  (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
【０１１７】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(国際公開03/044191号)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473号及び2003/0157667、国際公開03/044192号)。
【０１１８】
コリネ型細菌のフェニルアラニン生産菌としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下したコリネバクテリウム・グルタミカBPS-13株 (FERM BP-1777, K77 (FERM BP-2062) 及び K78 (FERM BP-2063)（欧州特許公開公報331145号、特開平 02-303495号）、チロシン要求性株（特開平05-049489）等を使用することができる。
【０１１９】
また、フェニルアラニン生産菌としては、副生物を細胞内に取り込むように改変すること、例えば、Ｌ−トリプトファンの取り込み遺伝子tnaB, mtrや、Ｌ−チロシンの取り込み遺伝子であるtyrPの発現量を向上させることによっても、効率よくＬ−フェニルアラニンを生産する菌株を取得することができる（EP1484410）。
【０１２０】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473及び2003/0157667)。
【０１２１】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３-デオキシ-Ｄ-アラビノヘプツロン酸-７-リン酸シンターゼ(aroG)、３-デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５-エノール酸ピルビルシキミ酸３-リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（chorismate mutase/prephenate dehydrogenase (CM/PDH) ）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３-デオキシ-Ｄ-アラビノヘプツロン酸-７-リン酸シンターゼ、３-デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５-エノール酸ピルビルシキミ酸３-リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (国際公開94/08031号)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【０１２２】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(国際公開2005/103275号)。
【０１２３】
コリネ型細菌としてはサルフアグアニジンに耐性株であるコリネバクテリウム・グルタミクムAJ12118（FERM BP-478  特許01681002号）、トリプトファンオペロンが導入されたコリネ型細菌（特開昭63240794号公報）、コリネ型細菌由来のシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子を導入したコリネ型細菌（特開01994749号公報）を用いることができる。
【０１２４】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (欧州特許公開公報1,172,433号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (欧州特許公開公報1,239,041号)が挙げられる。
【０１２６】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【０１２７】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315号)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2,001,112,869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (欧州特許公開公報1,170,358号)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(欧州特許公開公報1,170,361号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【０１２９】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(国際公開96/06926号)を親株として用いることができる。
【０１３０】
コリネ型細菌のＬ−バリン生産菌としては、例えば、Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変した菌株を挙げることができる。Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、ilvBNCオペロンによりコードされる酵素、すなわちilvBNによりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼやivlCによりコードされるイソメロリダクターゼ(国際公開00/50624号)が挙げられる。尚、ilvBNCオペロンは、Ｌ−バリン及び/又はＬ−イソロイシン及び/又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するためにアテニュエーションを解除することが望ましい。
【０１３１】
Ｌ−バリン生産能を有するコリネ型細菌としては、Ｌ−バリン産生を減少させる物質代謝経路に関与する、少なくとも１種の酵素の活性を低下あるいは欠損させることにより行ってもよい。例えば、Ｌ−ロイシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼやD-パントセナート合成に関与する酵素の活性を低下させることが考えられる（国際公開00/50624号）。
【０１３２】
Ｌ−バリン生産能を付与する別の方法として、アミノ酸アナログなどへの耐性を付与する方法も挙げられる。
例えば、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−メチオニン要求性，ならびにＤ-リボ-ス，プリンリボヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し，かつＬ−バリン生産能を有する変異株（FERM P-1841、FERM P-29、特公昭53-025034） や、ポリケトイド類に耐性を有する変異株(FERM P-1763、FERM P-1764、特公平06-065314) 、更には酢酸を唯一の炭素源とする培地でＬ−バリン耐性を示し、且つグルコースを唯一の炭素源とする培地でピルビン酸アナログ(フルオロピルビン酸等)に感受性を有する変異株（FERM BP-3006、FERM BP-3007、特許3006929号）が挙げられる。
【０１３３】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６-ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【０１３４】
コリネ型細菌のＬ−イソロイシン生産菌としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ−リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α-ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）が挙げられる。
【０１３５】
Ｌ−メチオニン生産菌
Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−スレオニン要求株、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられるが、これらに限定されない(特開2000-139471号)。さらに、メチオニンリプレッサーを欠損した株や、ホモセリントランスサクシニラーゼ、シスタチオニンγ-シンテースなどのＬ−メチオニン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開2000-139471号)。
【０１３６】
次に、微生物に核酸生産能を付与する方法と核酸生産菌について例示する。
核酸生産能を有する細菌微生物は、上記のような細菌微生物に、例えば、プリンヌクレオシド要求性、又はさらにプリンアナログ等の薬剤に対する耐性を付与することにより、取得することが出来る（特公昭３８−２３０９９、特公昭５４−１７０３３、特公昭５５−４５１９９、特公昭５７−１４１６０、特公昭５７−４１９１５、特公昭５９−４２８９５参照）。例えば、栄養要求性及び薬剤耐性を持つバチルス属細菌は、Ｎ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）、またはＥＭＳ(エタンメタンスルフォネート)等の通常の変異処理に用いられている変異剤による処理によって取得することが出来る。
【０１３７】
プリンヌクレオシドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
バチルス属に属するイノシン生産株の具体例として、バチルス・ズブチリスKMBS16株を使用することができる。同菌株は、プリンオペロンリプレッサーをコードするpurR遺伝子の欠損（purR::spc）、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするpurA遺伝子の欠損（purA::erm）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子の欠損（deoD::kan）が導入された、既知のバチルス・ズブチリスtrpC2株（168 Marburg）の誘導体である（特開2004-242610、US2004166575A1）。また、バチルス・ズブチリス菌株AJ3772（FERM P-2555）（特開昭62-014794）等を使用することもできる。
【０１３８】
グアノシン生産能を有するバチルス属細菌としては、ＩＭＰ脱水素酵素の活性が上昇したバチルス属細菌（特開平3-58787）、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性遺伝子が組み込まれているベクターをアデニン要求性変異株に導入したバチルス属細菌（特公平4-28357）等が挙げられる。
【０１３９】
またプリンヌクレオチドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズブチリスのフォスファターゼ活性が弱化したイノシン生産株が報告されている（Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259）。グアニル酸生産菌としては、アデニン要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を有し、かつ５'−グアニル酸（グアノシン−５'−モノリン酸、以下「GMP」ともいう）生産能を有するバチルス属の変異株が挙げられる（特公昭５６−１２４３８号公報）。
【０１４０】
また、キサンチル酸生産菌は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammmoniagenes）を中心とするコリネ型細菌の育種に用いたられる方法を使用して構築することができる。例えば、PRPP amidotransferaseを強化株（特開平8-168383）、脂肪族アミノ酸耐性株（特開平4-262790）、デヒドロプロリン耐性株（韓国特許公開公報2003-56490）を取得することによって、キサンチル酸生産菌を構築することができる。
【０１４１】
また、プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌を育種する方法として、以下の方法が挙げられる。プリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドに共通のプリン生合成に関与する酵素、すなわちプリン生合成酵素の細胞内での活性を上昇させる方法が挙げられる。該酵素の細胞内での活性は、バチルス属細菌の非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌よりも上昇させることが好ましい。「活性が上昇する」とは、例えば、細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの比活性が上昇した場合などが該当する。例えば、前記酵素の遺伝子の発現量を上昇させることにより活性を上昇させることができる。前記プリン生合成に関与する酵素としては、たとえばホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ（PRPP synthetase  [EC:2.7.6.1]）などが挙げられる。
【０１４２】
ペントースリン酸系に取り込まれたグルコースなどの糖源が代謝により生成したカタボライトの一部は、リブロース−５−リン酸を経由して、リボース−５−リン酸となる。生合成されたリボース−５−リン酸より、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成の不可欠な前駆物質であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）が生成される。具体的には、リボース−５−リン酸は、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼによりＰＲＰＰに転換される。したがって、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇するように改変することにより、バチルス属細菌にプリン系物質生産能を付与又は増強することができる。
【０１４３】
「ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇する」とは、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性は例えば、Switzer等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11）、Roth等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17）により、測定することができる。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇したバチルス属細菌は、例えば、特開2004-242610号公報に記載の方法と同様にして、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子をバチルス属細菌で高発現させることにより作製することができる。
【０１４４】
一方、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成に不可欠な前駆物質であるPRPPが生成されると、その一部は、プリン生合成に関与する酵素群によりプリンヌクレオチド、プリンヌクレオシドへと変換される。そのような酵素群をコードする遺伝子としては、バチルス・ズブチリスのプリンオペロン、具体的にはpurEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purDオペロンの遺伝子（Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87）（現在では、purEKBCSQLFMNHDとも呼ばれる：Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002。GenBank Accession No.NC_000964）、およびエシェリヒア・コリのpurレギュロンの遺伝子（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が例示される。
【０１４５】
したがって、これらの遺伝子の発現を増強することにより、プリン系物質生産能を付与又は増強することもできる。なお、本発明に用いることが出来るプリンオペロン遺伝子はこれらのものには限定されず、他の微生物や動植物由来の遺伝子も利用することも出来る。
【０１４６】
プリンオペロンの発現量を増大させる方法としては、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、プリンオペロン遺伝子をバチルス属細菌で高発現させる方法が挙げられる。
【０１４７】
プリンオペロンの発現量を増大させる第２の方法として、プリンオペロン固有のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することや、固有のプロモーターの-35、-10領域をコンセンサス配列に置換することが挙げられる。
【０１４８】
例えば、バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）では、プリンオペロンの-35配列はコンセンサス配列（TTGACA）であるが、-10配列はTAAGATであり、コンセンサス配列TATAATとは異なっている（Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287）。したがって、-10配列（TAAGAT）をコンセンサス配列にすること、あるいはコンセンサス配列に近づけ、TATAAT、またはTATGAT、もしくはTAAAATとなるように改変することで、プリンオペロンの転写活性を上昇させることができる。なお、プロモーター配列の置換は、下記の遺伝子置換と同様の方法で行うことが出来る。
【０１４９】
プリンオペロンの発現量を増大させる第３の方法として、プリンオペロンのリプレッサーの発現量を低下させる方法も挙げられる（USP6,284,495号）。「プリンオペロンのリプレッサーの発現」とは、プリンオペロン遺伝子の転写、及び転写産物の翻訳の両方を含む。また、「発現量を低下させる」とは、発現量が、非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌における発現量よりも低いこと、及び、発現が実質的に消失していることを含む。
【０１５０】
プリンペオペロンのリプレッサー（プリンリプレッサー）の発現量を低下させるためには、例えば、バチルス属細菌を紫外線照射またはＮＴＧもしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、プリンリプレッサーの発現量が低下した変異株を選択する方法を採用することができる。
【０１５１】
また、プリンリプレッサーの発現量が低下したバチルス属細菌は、変異処理の他に、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202）により、染色体上のプリンリプレッサーをコードする遺伝子（purR；GenBank Accession NC_000964（コード領域は塩基番号54439〜55293）を、正常に機能しない遺伝子（以下、「破壊型遺伝子」ということがある）で置換することによって得ることができる。
【０１５２】
さらに、プリン系物質の細胞内への取り込みを弱化することによっても、プリン系物質生産能を強化することができる。例えば、プリンヌクレオシドの細胞内へ取り込みは、プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応を遮断することによって弱化することができる。上記プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応は、たとえばヌクレオシドパーミアーゼに触媒される反応である。
【０１５３】
さらに、プリンヌクレオシドを製造する場合には、プリンヌクレオシド生産能を増強させるためにプリン系物質を分解する酵素の活性を低下させてもよい。このような酵素として、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼが挙げられる。
【０１５４】
PRPPから、プリン生合成に関与する酵素群により生合成されたプリンヌクレオチドは、脱リン酸化されて、プリンヌクレオシドに変換される。プリンヌクレオシドを効率的に蓄積せしめるためには、プリンヌクレオシドを更に分解してヒポキサンチン等とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼの活性を低下させることが好ましい。すなわち、イノシンをはじめとするプリンヌクレオシドを基質とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼを弱化、あるいは欠損させるように改変することが望ましい。
【０１５５】
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の低下は、具体的には、バチルス属細菌でプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子とpupG遺伝子を破壊することによって達成することができる。本発明のバチルス属細菌は、上記のようなdeoD遺伝子とpupG遺伝子を単独、または同時に破壊するように改変されたものであってもよい。deoD遺伝子、pupG遺伝子は、例えばバチルス属由来の遺伝子（deoD;GenBank Accession No. NC_000964(コード領域は2134672-2135370), pupG;GenBank Accession No. NC_000964(コード領域は2445610-2446422)が利用できる。
【０１５６】
また、プリン系物質生産能を増強させるために、サクシニル−AMPシンターゼの活性を低下させてもよい。サクシニル−AMPシンターゼをコードする遺伝子としては、purA遺伝子が挙げられる。purA遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NC_000964（コード領域は相補鎖の塩基番号4153460-4155749）で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。
【０１５７】
さらに、プリン系物質生産能を増強させるために、イノシンモノリン酸（IMP）脱水素酵素の活性を低下させてもよい。ＩＭＰ脱水素酵素をコードする遺伝子としては、guaB遺伝子が挙げられる。guaB遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No.NC_000964(コード領域は15913-17376)で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。
【０１５８】
また、プリン系物質生産能を増強させる方法として、プリン系物質を排出する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を増幅することが考えられる。このような遺伝子が増幅された細菌としては、例えば、rhtA遺伝子を増幅したバチルス属細菌が挙げられる（特開2003-219876）。
【０１５９】
遺伝子組換えにより、上記のＬ−アミノ酸生産菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、保存的バリアント、すなわちコードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、その遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【０１６０】
さらに本発明においては、キシロース資化に関する遺伝子を増幅してもよい。キシロース資化に関与する遺伝子としては、キシロースパーミアーゼをコードするxylE遺伝子(国際公開WO2006/043730号パンフレット)、キシロースイソメラーゼをコードするxylA遺伝子、キシルロキナーゼをコードするxylB遺伝子、キシロースABCトランスポーターをコードするxylF,G,H遺伝子が挙げられる（US2009/0117623号公報）。また、キシロース資化性遺伝子であるxylABFGHR遺伝子は、オペロン構造を形成しているので、これらの遺伝子群をまとめて増幅したり、xylA上流のプロモーターを強化してもよい。
【０１６１】
＜目的物質の製造における微生物の培養＞
本発明の方法により製造された糖液又はその分画物（以下、併せて「糖」と記載することがある。）を炭素源として、目的物質生産能を有する微生物を培養し、培地又は微生物細胞から目的物質を採取する。
炭素源として上記糖を用いること以外は、通常の発酵法と同様の方法を用いることができる。
【０１６２】
本発明の方法は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養法（continuous culture）のいずれも用いることができ、本発明により得られる糖は、初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよいし、これらの両方に含まれていてもよい。
【０１６３】
流加培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加し、培養終了時までその培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。また連続培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加するとともに容器から培地（通常、流加する培地と等量）を抜き取る方法をいう。また、初発培地とは、流加培養または連続培養において流加培地を流加させる前の回分培養（batch培養）に用いる培地（培養開始時の培地）のことを意味し、流加培地とは流加培養または連続培養を行う際に発酵槽に供給する培地を意味する。また、回分培養（batch培養）とは、一回毎に新たな培地を用意し、そこへ株を植えて収穫まで培地を加えない方法を意味する。
【０１６４】
糖は、目的物質を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の糖濃度としては、好ましくは0.1w/v%〜50w/v%程度、より好ましくは0.5w/v%〜40w/v%程度、特に好ましくは1w/v%〜30w/v%程度培地に含有させる。
【０１６５】
なお、本発明において得られた糖液には、キシロース、アラビノースを中心とした５単糖が中心に含まれるが、グルコース、マンノース等の６単糖も糖液に含まれる場合がある。従って、５単糖、６単糖を両方含む糖液を本発明の糖液として用いてもよい。本発明で用いた糖液であれば混合比率はいずれもよいが、５単糖、６単糖の混合比率（重量比）は、好ましくは１０：０．１〜１００、より好ましくは１０：０．１〜１０、より好ましくは１０：０．１〜５、より好ましくは１０：１〜５、さらに好ましくは１０：１〜３である。
【０１６６】
本発明の方法により製造される糖は、単独で用いることも出来るし、他の方法で得られたキシロース、グルコース、あるいは、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの他の炭素源と組み合わせて用いることも出来る。この場合、本発明の方法により得られる糖と他の炭素源は任意の比率で混合することが可能である。他の炭素源として好ましいのは、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物や、他のバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。混合比率はいずれでもよいが、本発明の糖液との混合比率（重量比）は、好ましくは１：０．５〜１０、より好ましくは１：１〜５、特に好ましくは１：２〜３である。
【０１６７】
使用する培地は、炭素源として本発明の方法により得られる糖を用いる以外は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等の無機アンモニウム塩または硝酸塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用できる。培地中にこれらの窒素源が１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と異なるものを使用してもよい。
【０１６８】
培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【０１６９】
また、培地には、上記成分の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【０１７０】
また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ−リジン生産菌は、後述のようにＬ−リジン生合成経路が強化されており、Ｌ−リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、硫黄濃度が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１７１】
なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、及び必要に応じてその他の成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【０１７２】
培養は好気的条件下で1〜7日間実施するのがよく、培養温度は20℃〜45℃、好ましくは24℃〜45℃、特に好ましくは33〜42℃で培養することが好ましい。培養は通気培養が好ましく、酸素濃度は、飽和濃度に対して5〜50%に、望ましくは10%程度に調節して行うことが好ましい。また、培養中のpHは5〜9が好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等を使用することができる。
【０１７３】
上記のような条件下で、好ましくは10時間〜120時間程度培養することにより、培養液中に著量の目的物質が蓄積される。
【０１７４】
また、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のpHが6.5〜9.0、培養終了時の培地のpHが7.2〜9.0となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御する、あるいは、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが少なくとも2g/L以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP1813677A）。
【０１７５】
また、Ｌ−グルタミン酸発酵においては、Ｌ−グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、pH5.0〜4.0、好ましくはpH4.5〜4.0、さらに好ましくはpH4.3〜4.0、特に好ましくはpH4.0を挙げることができる。（欧州特許出願公開第1078989号明細書）
【０１７６】
培養液からの目的物質の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内に目的物質が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、目的物質を回収することができる。目的物質がアミノ酸又は核酸の場合は、回収される目的物質は、フリー体であっても、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む塩であってもよい。
【０１７７】
また、本発明において採取される目的物質は、目的物質以外に微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。採取された目的物質の純度は、50%以上、好ましくは85%以上、特に好ましくは95%以上である（US5,431,933, JP1214636B, US4,956,471, US4,777,051, US4946654, US5,840358, US6,238,714, US2005/0025878）。
【実施例】
【０１７８】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。【０１７９】
〔実施例１〕
サトウキビバガス（粒径：0.35〜1.0 mm）２００gを0.05 %(w/v)になるように水に懸濁させ、5L容の反応器中、175℃、60分水熱分解処理した。このスラリーを固液分離して、冷却後、熱水画分にSpezyme CP (Genencor社、60 FPU/g-固形量)、及びNovozyme 188 (Novozyme社、64 FPU/g-固形量)を添加して、pH 5.0-5.5で、50℃、96時間糖化処理した。上記方法を５回繰り返すことで糖液を得た。
得られた糖液をHPLCにより下記条件で分析した。【０１８０】
HPLC分析システム：Dionex ISC-3000
カラム：CarboPac PA1 Analytical (2.0mm×250mm)
ガードカラム：CarboPac PA1 Guard (2.0mm×50mm)
移動相：
A：水
B：0.1M NaOH
C：0.5M CH3COONa/0.1M-NaOH
グラジエントパターンは表１に示す。
カラム温度：30℃
流速：０.25ml/分
検出器：電気化学検出（PAD）
注入量：5.0μL【０１８１】
【表１】
2012026581.tif 000002
【０１８２】
上記分析の結果、得られた糖液には、キシロース：グルコースが13：2の割合（乾燥重量比）で含まれていた。【０１８３】
〔実施例２〕
実施例１で得られた糖液を、糖濃度が5.19%(w/v)（糖純度34%、pH 4.82）になるまで濃縮した。得られた糖液に、活性炭ホクエツBA（味の素ファインテクノ。以下、「BA炭」と記載する。）を、糖液中の総単糖重量に対して10%(w/w)、50%(w/w)、又は、100%(w/w)添加し、50℃、60分攪拌を行い、ガラス漏斗及びろ紙を用いてろ液を回収した。得られたろ液の糖純度は、それぞれ37%、53%、56%に向上した。また各ろ液のpHは、それぞれ4.90、4.90、5.08であった。
一方、実施例１で得られた糖液に活性炭を添加せずに同条件で攪拌を行い、ろ液を回収した。この方法により得られたろ液は、糖濃度、pHに変化は見られなかった。【０１８４】
糖純度は「(糖濃度／全固形分量)×100」で算出し、全固形分量はカールフィッシャー水分計(京都電子、MKA-210)を用い、サンプル中の水分量を測定し、「100−水分値」で算出した。カールフィッシャー水分計を用いての測定は、滴定溶剤にアクアミクロン滴定剤SS 10mgを、脱水溶剤にアクアミクロン脱水溶剤CP（ともに三菱化学製）を用いた。【０１８５】
続いて、未処理糖液又はBA炭処理によって得られた３種類の糖液を炭素源として用いて、Ｌ−リジン生産菌の生育を評価した。E. coli Ｌ−リジン生産菌をLB寒天培地（500mg/Lのピルビン酸ナトリウムを含む）上で37℃、24時間培養した。得られた菌体をプレートからかき取り、Ｌ字型試験管(ADVANTEC、日本)に下記に示すMS-Xyl10培地培地を4ml入れたものにOD620が0.25となるように植え、37℃、70 rpmにて振とう培養し、経時的にOD600を測定した。振とう培養及びOD600の測定には小型試験管培養装置BIO PHOTORECORDER TVS062CA (ADVANTEC、日本)を用いた。培養１０時間目の結果を表２に示す。【０１８６】
〔MS-Xyl10培地〕
炭素源 *                     10 g/L(フィルター濾過滅菌)
MgSO4・7H2O                   1 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4                    24 g/L
KH2PO4                        1 g/L
Yeast Extract                 2 g/L
FeSO4                         0.01 g/L
MnSO4                         0.01 g/L
HEPES                         4.76 g/L
炭素源：試薬キシロース(和光純薬工業、日本)、又は活性炭処理糖液（濃度は単糖換算）【０１８７】
【表２】
2012026581.tif 000003
【０１８８】
その結果、BA炭での処理を行った糖液を炭素源とした場合、未処理糖液を使用した場合と比較して、最大20倍の菌体生育が見られた。【０１８９】
〔実施例３〕
実施例１に記載の糖液を、糖濃度が5.19%（糖純度34%、pH 4.82）になるまで濃縮した。得られた糖液に、活性炭ホクエツF（味の素ファインテクノ。以下、「F炭」と記載する。）を、糖液中の総単糖重量に対して10%(w/w)、50%(w/w)、又は、100%(w/w)添加し、50℃、60分攪拌を行い、ろ液を回収した。得られたろ液の糖純度はそれぞれ40%、56%、56%に向上した。またpHはそれぞれ4.98、5.17、5.62であった。
一方、実施例１で得られた糖液に活性炭を添加せずに同条件で攪拌を行い、ろ液を回収した。この方法により得られたろ液は糖濃度、pHに変化は見られなかった。糖純度の算出は実施例２と同様に行った。【０１９０】
続いて、未処理糖液糖液又はF炭処理によって得られた３種類の糖液を炭素源として用いてE. coli Ｌ−リジン生産菌の生育を評価した。糖液の処理に用いた活性炭をF炭に変更した以外は、実施例２と同様の方法で培養を実施した。培養１０時間目の結果を表３に示す。【０１９１】
【表３】
2012026581.tif 000004
【０１９２】
その結果、F炭での処理を行った糖液を炭素源とした条件において、未処理糖液を使用した条件と比較して最大18倍の菌体生育が見られた。【０１９３】
〔実施例４〕
実施例１に記載の糖液を、糖濃度が5.45%になるまで濃縮した。得られた糖液200 mL（糖純度37%、pH4.88）を、スチレン系ポリアミン型の陰イオン交換樹脂（日本錬水株式会社 WA20）100 mlを充填したカラムに流速3.3 ml/分で60分で流し、さらに同カラムに100 mLの水を流した。【０１９４】
糖液は、カラム出口で60mL、190mL、45mLの３画分（各々、画分１、２、３）に分けて回収した。各画分の糖濃度は順に0.08%、3.93%、1.77%であった。また、全体としての糖の回収率は78%であった。【０１９５】
上記方法により得られた画分２の貫流液（以下、「陰イオン交換樹脂処理糖液」と呼ぶ。)は、糖純度が37%から57%へと向上した。またpHは9.23であった。糖純度の算出は実施例２と同様に行った。【０１９６】
続いて、未処理糖液又は陰イオン交換樹脂処理糖液を炭素源として用いてE. coli Ｌ−リジン生産菌の生育を評価した。Ｌ−リジン生産菌の培養評価は、実施例２に記載の方法に従って実施した。対照として、糖液の代りに試薬グルコース及びキシロースの混合モデル糖液（グルコース：キシロース（重量比）＝7:10）を炭素源として、同様に培養評価を行った。対照での菌体量を100として、糖液での菌体量を求めた。培養１５時間目の結果を表４に示す。【０１９７】
【表４】
2012026581.tif 000005
【０１９８】
その結果、陰イオン交換樹脂処理糖液を炭素源とした条件において、未処理糖液を使用した条件と比較して最大4.4倍の菌体生育が見られた。【０１９９】
〔実施例５〕
実施例１に記載の糖液を糖濃度が5.45%になるまで濃縮した。得られた糖液200 mL(糖純度37%%、pH4.88)を、メタクリル酸エステル系の合成吸着樹脂（日本錬水株式会社 HP2MG）100 mlを充填したカラムに流速3.3 ml/分で60分で流し、さらに同カラムに105 mLの水を流した。【０２００】
糖液は、カラム出口で73mL、200mL、27mLの３画分（各々、画分１、２、３）に分けて回収した。各画分の糖濃度は順に0.01%、4.85%、2.42%であった。また、全体としての糖の回収率は97%であった。【０２０１】
上記方法により得られた画分２の貫流液（以下、「合成吸着樹脂処理糖液」と呼ぶ。)は、糖純度が37%から65%へと向上した。またpHは5.22であった。糖純度の算出は実施例２と同様に行った。【０２０２】
続いて、未処理糖液又は合成吸着樹脂処理糖液を炭素源として用いてE. coli Ｌ−リジン生産菌の生育を、実施例４と同様にして評価した。培養１５時間目の結果を表５に示す。【０２０３】
【表５】
2012026581.tif 000006
【０２０４】
その結果、合成吸着樹脂処理糖液を炭素源とした条件において、未処理糖液を使用した条件と比較して最大3.1倍の菌体生育が見られた。【０２０５】
〔実施例６〕
特許第４４３６４２９号公報に記載の方法にしたがって、稲わらを水熱分解し、熱水排出液を得た。この熱水排出液に糖化酵素を添加して、糖化処理を行った。得られた糖液を、実施例１と同様にしてHPLCにより分析したところ、キシロース：グルコース（重量比）が3：2の割合で含まれていた。この糖液を糖濃度が7.66%になるまで濃縮し、3000rpm、20分遠心分離し、その上清をガラスフィルター（Whatman GFC 150 mmf）を用いて減圧濾過して固形分を除いた。得られた糖液の糖濃度は7.64%であった。【０２０６】
得られた清澄な糖液1200mL（糖純度40%、pH4.04）を、スチレン系ポリアミン型の陰イオン交換樹脂（日本錬水株式会社 WA20）850 mlを充填したカラムに流速19.2ml/分で60分流し、さらに同カラムに1300mLの水を流した。【０２０７】
糖液は、カラム出口で630mL、2100mL、1000mLの３画分（各々、画分１、２、３）に分けて回収した。各画分の糖濃度は順に0.15%、5.26%、1.00%であった。また、全体としての糖の回収率は78%であった。さらに、2800mＬの水をカラムに流すことで、糖の回収率は85%まで上昇し、3800mLの1N硫酸をカラムに流すことで、糖の回収率は93%まで上昇した。【０２０８】
上記方法により得られた画分２の貫流液（以下、「陰イオン交換樹脂処理糖液」と呼ぶ。）は、糖純度が40%から41%へと向上した。またpHは8.81であった。糖純度の算出は実施例２と同様に行った。【０２０９】
続いて、E. coli Ｌ−リジン生産菌を用いて、未処理糖液又は陰イオン交換樹脂処理糖液を炭素源として用いてＬ−リジン生産を行った。Ｌ−リジン生産菌は、LB寒天培地（500mg/Lのピルビン酸ナトリウムを含む）上で37℃、24時間培養した。得られた菌体をプレートからかき取り、1L容ジャーファーメンター（小島特殊ガラス）に入れた300mlのリジン生産培地にOD620が0.14となるように植え、900 rpmで撹拌しながら37℃、pH 6.7にて前培養を行った。得られた前培養液45 mLを、1L容ジャーファーメンターに入れたリジン生産培地255mlに加え、37℃、pH 6.7で900rpmで撹拌しながら本培養を行った。リジン生産培地の炭素源としては、未処理糖液または陰イオン交換樹脂処理糖液を用いた。なお、培地中の糖として、未処理の糖液のみを用いた条件では、菌体の生育及びＬ−リジンの蓄積が観察されなかったため、培地中に含まれる糖の1/3量を未処理の糖液由来、残り2/3量を試薬グルコース及びキシロース（グルコース：キシロース（重量比）＝7：10）を用いて作製した培地にて培養した。この条件を、未処理糖液（×3希釈）と定義した。【０２１０】
培養開始から10時間後にサンプリングを行い、OD620とＬ−リジン濃度を測定した。OD620は、培養液を水で26倍に希釈し、分光光度計 UV-1620（島津製作所、日本）を用いて測定した。培養液中のＬ−リジン濃度は、リジンアナライザーBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。培養開始からサンプリングまでの菌体量の増分をΔCell、Ｌ−リジン生産量の増分をΔLysと定義し、それぞれ陰イオン交換樹脂処理の有無による回復率を求めた。培養１０時間目の結果を表６に示す。【０２１１】
【表６】
2012026581.tif 000007
【０２１２】
その結果、陰イオン交換樹脂処理糖液を炭素源とした条件では、菌体量の増加、Ｌ−リジン生産量の増加ともに、未処理糖液を炭素源とする条件を上回った。さらに、樹脂処理の有無によるＬ−リジン生産の回復率は、菌体生育の回復率を上回った。本結果より、陰イオン交換樹脂による糖液の精製により、Ｌ−リジン生産菌のＬ−リジン生産能が向上することが示された。【０２１３】
〔実施例７〕
実施例６と同様にして稲わらの水熱分解、糖化、濃縮及び減圧濾過により得られた清澄な糖液930mL（糖純度40%、pH4.04）を、メタクリル酸エステル系の陰イオン交換樹脂（日本錬水株式会社 HP2MG）700 mlを充填したカラムに流速15.8ml/分で60分流し、さらに同カラムに1200 mLの水を流した。【０２１４】
糖液は、カラム出口で450 mL、1010 mL、570 mLの３画分（各々、画分１、２、３）に分けて回収した。各画分の糖濃度は順に0.02%、5.06%、3.41%であった。また、全体としての糖の回収率は99.5%であった。【０２１５】
上記方法により得られた画分２の貫流液（以下、「合成吸着樹処理糖液」と呼ぶ。）は、糖純度が40%から48%へと向上した。またpHは4.41であった。糖純度の算出は実施例２と同様に行った。【０２１６】
続いて、E. coli L-リジン生産菌を用いて、未処理糖液又は合成吸着樹脂処理糖液を炭素源として用いてＬ−リジン生産を行った。炭素源として、陰イオン交換樹脂処理糖液に代えて合成吸着樹脂処理糖液を用いた以外は、実施例６と同様にして培養を行った。培養１０時間目の結果を表７に示す。【０２１７】
【表７】
2012026581.tif 000008
【０２１８】
その結果、合成吸着樹脂処理糖液を炭素源とした条件では、菌体量の増加、Ｌ−リジン生産量の増加ともに、未処理糖液を炭素源とする条件を上回った。さらに、樹脂処理の有無によるＬ−リジン生産の回復率は、菌体生育の回復率を上回った。本結果より、合成吸着樹脂による糖液の精製により、Ｌ−リジン生産菌のＬ−リジン生産能が向上することが示された。【０２１９】
〔実施例８〕
実施例７で糖液及び水を流した後の合成吸着樹脂を、さらに10Lの水で洗浄し、その樹脂に吸着した物質を7000mlの40%メタノールで溶離した。さらに、5500mlの100%メタノールで溶離した。これらの溶出液中の溶媒をエバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて除去後、残渣を水に溶解し、合成吸着樹脂吸着成分サンプルを調製した。なお、樹脂から回収された吸着成分のうち、40%メタノール溶液を用いて合成吸着樹脂から溶離された画分をEL-1、100%メタノールを用いて溶離された画分をEL-2とした。【０２２０】
上記の各々の合成吸着樹脂吸着成分がＬ−リジン生産菌の生育に及ぼす影響を評価した。培地の炭素源としては試薬キシロースを用い、実施例２と同様の方法で培養を行った。EL-1及びEL-2の各々の画分を、樹脂処理前の糖液中と比較して単糖濃度に対する不純物濃度が等しくなるよう調整して、培地中に添加した。培養１０時間目の結果を表８に示す。【０２２１】
【表８】
2012026581.tif 000009
【０２２２】
その結果、合成吸着樹脂吸着成分を添加しない条件と比較して、EL-1添加条件において44%、EL-2添加条件において52%の菌体生育の低下が認められた。本結果より、合成吸着樹脂に吸着される成分が、Ｌ−リジン生産菌の菌体生育に悪影響を及ぼすことが示された。【０２２３】
〔実施例９〕
未利用バイオマス由来糖液中に含まれる菌体生育阻害を示す物質の特徴把握のため、以下の検討を行った。実施例６と同様にして得られた稲わらの水熱分解、糖化、濃縮及び減圧濾過により得られた清澄な糖液（糖濃度7.64%、pH4.04）120gを、エバポレーターを用いて濃縮乾固し、揮発成分を濃縮ドレンとして95g得た。【０２２４】
続いて、未利用バイオマス由来糖液中の揮発性不純物のＬ−リジン生産菌の生育に及ぼす影響を評価した。培地の糖濃度に対する揮発成分の濃度が未処理糖液と同等になるように、試薬キシロースを炭素源とする培地に前記濃縮ドレンを添加した。Ｌ−リジン生産菌の培養は、実施例２に記載の方法により行った。培養１０時間目の結果を表９に示す。【０２２５】
【表９】
2012026581.tif 000010
【０２２６】
その結果、濃縮ドレンを添加した条件においては、不純物を添加しない条件と同等の菌体生育を示した。本結果より、未利用バイオマス由来糖液中に含まれる不純物のうち、Ｌ−リジン生産菌の菌体生育を阻害する成分は不揮発性であることが示された。【０２２７】
〔実施例１０〕
未利用バイオマス由来糖液中に含まれる菌体生育阻害を示す物質の特徴把握のため、以下の検討を行った。実施例６と同様にして得られた稲わらの水熱分解、糖化、濃縮及び減圧濾過により得られた清澄な糖液（糖濃度7.64%、pH4.04）を、糖濃度4.71%まで希釈した糖液21gを、分子量分画膜（Millipore社 Amicon Ulitra-15 3K）を用い、4500×g、60分の条件で分離し、分画分子量3000以上の物質を含む膜濃縮液4g、および分画分子量3000以下の低分子画分である濾液17gを得た。膜濃縮液（高分子画分）及び濾液（低分子画分）の糖濃度は、それぞれ5.25%、4.67%であった。この分離操作における糖の回収率は102%であった。【０２２８】
続いて、未処理糖液、又は前記膜濃縮液もしくは濾液を用いてＬ−リジン生産菌の生育を評価した。炭素源として、試薬グルコース及びキシロースの混合糖液を用いた以外は、実施例２と同様にして培養を行った。前記膜濃縮液又は濾液を、培地中の糖濃度に対する不純物濃度が未処理糖液と等しくなるように培地に添加した。培養１０時間目の結果を表１０に示す。【０２２９】
【表１０】
2012026581.tif 000011
【０２３０】
その結果、膜濃縮液を添加した条件では、対照（膜濃縮液及び濾液を添加しない条件）に比べて85％の生育を示したのに対し、未処理糖液では対照に比べて2%、濾液を添加した条件では対照に比べて1%の生育を示し、著しい生育阻害効果を示した。本結果より、Ｌ−リジン生産菌の菌体生育を阻害する不純物は、分子量3000以下の物質であることが示された。【０２３１】
〔実施例１１〕
実施例６と同様に稲わらを水熱分解し、熱水排出液を得た。この熱水排出液に糖化酵素を添加して、糖化処理を行った。得られた糖液を濃縮後、2.5μmのフィルターペーパー(Whatman)を用いて0.2MPaで加圧ろ過して固形分を除いた。得られた清澄な糖液の糖濃度は4.72%(w/v)であった。【０２３２】
得られた清澄な糖液(糖純度40.5%、pH4.04)に、BA炭を、糖液中の総単糖重量に対して50%(w/w)、又は、100%(w/w)添加し、50℃、60分攪拌を行い、ろ液を回収した。得られたろ液の糖純度は、それぞれ42.4％、46.5％に向上した。また各ろ液のpHは、それぞれpH4.10, pH4.18であった。【０２３３】
一方、前記清澄な糖液に活性炭を添加せずに同条件で攪拌を行い、ろ液を回収した。この方法により得られたろ液は、糖濃度、pHに変化は見られなかった。糖純度の算出は実施例２と同様に行った。【０２３４】
続いて、未処理糖液又はBA炭処理によって得られた2種類の糖液を炭素源として用いて、Ｌ−リジン生産菌の培養を行った。菌株はWC196LC xylA/pCABD2を用いた。WC196LCxylA/pCABD2株は、WC196LC（WC196ΔcadAΔldcC）株がxylA遺伝子の変異によりキシロース資化能を失っていることが認められたため、変異型xylA遺伝子を、P1トランスダクション法を用いて野生型E coli MG1655株の遺伝子型に復帰させた株を作製し、得られた復帰株に、pCABD2プラスミドを導入したものである。
配列番号１及び２に、MG1655株のxylA遺伝子の塩基配列及び同塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を各々示す。WC196LC株のxylA遺伝子では、配列番号１の473位のCがTに置換されており、その結果、コードされるアミノ酸配列の158位のProがLeuに置換されている。【０２３５】
xylA復帰は、具体的には以下の方法で行った。MG1655株を4 ml LB液体培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養して得られた前培養液100 μlを、20 μl のP1ライセートおよび 5 mM CaCl2を含む4 ml のLB液体培地に植菌した。続いて37℃で3〜6時間振とう培養して溶菌させた培養液1 mlにクロロホルムを適量加え、ボルテックスミキサーで3分間混合した後、12,00 rpm、10 分間遠心分離し、得られた上清をMG1655株由来P1ライセートとした。【０２３６】
WC196LC株を、5 mM CaCl2を含む4 ml LB培地で OD660が 0.3〜0.6程度まで培養した培養液 1 mlと、上記で調製したMG1655株由来P1ライセート 50 μlを混合し、37℃で15分間静置した。集菌し、0.9 ml LB培地及び0.1 ml 1M クエン酸ナトリウム溶液に懸濁させ、37℃で1時間培養した。集菌し、炭素源を含まないM9培地で洗浄した後、0.4%キシロースを含むM9寒天培地に塗布し、37℃で12時間程度、静置培養した。寒天培地上に出現したコロニーをWC196LCxylA株とした。WC196LCxylA株aをpCABD2で形質転換してWC196LCxylA/pCABD2株を得た。【０２３７】
WC196LCxylA/pCABD2株をLB寒天培地（20 mg/Lのストレプトマイシンを含む）上で37℃、24時間培養した。得られた菌体を寒天培地から1/10量かき取り、500ml容坂口フラスコに下記に示すMS-10培地を20ml入れたものに植菌し、37℃、120 rpmにて振とう培養し、経時的にOD600とＬ−リジン（Lys）濃度を測定した。培養１０時間目の結果を表１１に示す。【０２３８】
〔MS-10培地〕
炭素源 *                     10 g/L(フィルター濾過滅菌)
MgSO4・7H2O                  1 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4                    24 g/L
KH2PO4                       1 g/L
Yeast Extract                 2 g/L
FeSO4                        0.01 g/L
MnSO4                        0.01 g/L
ストレプトマイシン硫酸塩      20 mg/L
CaCO3                         30 g/L
*炭素源：未処理糖液又は、試薬キシロース、アラビノース、ガラクトース、グルコース(いずれも和光純薬工業、日本)を未処理糖液と等しい組成に混合した試薬モデル糖、又は活性炭処理糖液を使用（濃度は単糖換算）。【０２３９】
【表１１】
2012026581.tif 000012
【０２４０】
その結果、BA炭処理を行った糖液を使用した場合、未処理糖液を使用した場合と比較して菌体量で最大3倍、L-リジン蓄積濃度で最大4倍の回復が見られた。この結果から、バイオマス由来のC5糖液のBA炭処理は、菌体生育及びL-リジン生産の回復に効果的であることが示された。【０２４１】
〔実施例１２〕
実施例６と同様に稲わらを水熱分解し、熱水排出液を得た。この熱水排出液に糖化酵素を添加して、糖化処理を行った。得られた糖液を濃縮後、2.5μmのフィルターペーパー(Whatman)を用いて0.2Mpaで加圧ろ過して固形分を除いた。得られた糖液の糖濃度は4.72%(w/v)であった。得られた清澄な糖液に、F炭を、糖液中の総単糖重量に対して50%(w/w)、又は、100%(w/w)添加し、50℃、60分攪拌を行い、ろ液を回収した。得られたろ液の糖純度はそれぞれ41.2％、45.8％に向上した。またpHはそれぞれでpH4.24, pH4.49であった。【０２４２】
一方、前記清澄な糖液に活性炭を添加せずに同条件で攪拌を行い、ろ液を回収した。この方法により得られたろ液は糖濃度、pHに変化は見られなかった。糖純度の算出は実施例２と同様に行った。【０２４３】
続いて、未処理糖液又はF炭処理によって得られた2種類の糖液を炭素源として、WC196LCxylA/pCABD2株の培養評価を実施した。培養方法は、糖液の処理に用いた活性炭をBA炭からF炭に変更した以外は、実施例１１と同様の方法を用いた。培養１０時間目の結果を表１２に示す。【０２４４】
【表１２】
2012026581.tif 000013
【０２４５】
その結果、F炭処理を行った糖液を使用した場合、未処理糖液を使用した場合と比較して菌体量で最大3.2倍、L-リジン蓄積濃度で最大4.5倍の回復が見られた。この結果から、バイオマス由来のC5糖液へのF炭処理は、菌体生育及びL-リジン生産能の回復に効果的であることが示された。【０２４６】
〔実施例１３〕
実施例６と同様に稲わらを水熱分解し、熱水排出液を得た。この熱水排出液に糖化酵素を添加して、糖化処理を行った。得られた糖液を、糖濃度7.64%まで濃縮し、10,000g、10分遠心分離して固形分を除いた。得られた糖液の糖濃度は8.06%であった。【０２４７】
得られた清澄な糖液520mL（糖純度41.5%、pH4.08）を、スチレン系ポリアミン型の陰イオン交換樹脂（日本錬水株式会社 WA20）370 mlを充填したカラムに流速8.0ml/分で60分流し、さらに同カラムに710mLの水を流した。【０２４８】
糖液は、カラム出口で300mL、620mL、350mLの３画分（各々、画分１、２、３）に分けて回収した。各画分の糖濃度は順に0.38%、4.94%、2.32%であった。また、全体としての糖の回収率は77%であった。さらに、230mＬの水をカラムに流すことで、糖の回収率は82%まで上昇し、560mLの1N硫酸をカラムに流すことで、糖の回収率は85%まで上昇した。【０２４９】
上記方法により得られた画分２の貫流液（以下、「陰イオン交換樹脂処理糖液」と呼ぶ。）は、糖純度41%であった。またpHは6.98であった。糖純度の算出は実施例２と同様に行った。【０２５０】
続いて、WC196LCxylA/pCABD2株を用いて、未処理糖液又は陰イオン交換樹脂処理糖液を炭素源として用いてＬ−リジン生産を行った。WC196LCxylA/pCABD2株は、LB寒天培地（20mg/Lのストレプトマイシン硫酸塩を含む）上で37℃、24時間培養した。得られた菌体を1/10量プレートからかき取り、1L容ジャーファーメンター（小島特殊ガラス）に入れた前培養培地300mlに、OD620が0.14となるように植菌し、900 rpmで撹拌しながら37℃、pH 6.7にて24時間、前培養を行った。得られた前培養液45 mLを、1L容ジャーファーメンターに入れた本培養培地255mlに加え、900rpmにて撹拌しながら37℃、pH 6.7にて本培養を行った。本培養培地の炭素源としては、未処理糖液または陰イオン交換樹脂処理糖液を用いた。【０２５１】
〔前培養培地〕
グルコース                   40 g/L(別殺菌)
MgSO4・7H2O                  1.2 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4                     8 g/L
KH2PO4                       1 g/L
大豆加水分解物*               0.6 g/L
FeSO4・7H2O                  0.03 g/L
MnSO4・4H2O                  0.03 g/L
L-イソロイシン                0.3 g/L
DL-メチオニン                 0.2 g/L
L-スレオニン                  0.3 g/L
ストレプトマイシン硫酸塩     20 mg/L
* 大豆加水分解物：濃度は総窒素換算【０２５２】
〔本培養培地〕
炭素源 **                    30 g/L(フィルターろ過滅菌)
MgSO4・7H2O                  1.2 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4                     8 g/L
KH2PO4                       1 g/L
大豆加水分解物                0.6 g/L
FeSO4・7H2O                  0.03 g/L
MnSO4・4H2O                  0.03 g/L
L-イソロイシン                0.3 g/L
DL-メチオニン                 0.2 g/L
L-スレオニン                  0.3 g/L
ストレプトマイシン硫酸塩     20 mg/L
** 炭素源：未処理糖液又は、試薬キシロース、アラビノース、ガラクトース、グルコース(いずれも和光純薬工業、日本)を未処理糖液と等しい組成に混合した試薬モデル糖、又は陰イオン交換樹脂処理糖液を使用（濃度は単糖換算）。【０２５３】
培養開始から10時間後にサンプリングを行い、OD620とＬ−リジン濃度を測定した。OD620は、培養液を水で26倍に希釈し、分光光度計 UV-1620（島津製作所、日本）を用いて測定した。培養液中のＬ−リジン濃度は、リジンアナライザーBF-5（王子計測機器）を用いて測定した。培養１０時間目の結果を表１３に示す。【０２５４】
【表１３】
2012026581.tif 000014
【０２５５】
その結果、陰イオン交換樹脂処理糖液を炭素源とした場合は、未処理糖液を炭素源とした場合と比較して菌体量が4.2倍、L-リジン蓄積が4.6倍に回復した。一方、試薬モデル糖液を炭素源とした場合と比較すると、菌体量が1.2倍、L-リジン蓄積が0.9倍と、ほぼ匹敵する成績を示した。この結果より、バイオマス由来のC5糖液への陰イオン交換樹脂処理は、菌体生育及びアミノ酸生産能の回復に有効であることが示された。【０２５６】
〔実施例１４〕
実施例６と同様にして稲わらの水熱分解、糖化、濃縮及び遠心分離により得られた清澄な糖液520mL（糖純度41%、pH4.08）を、メタクリル酸エステル系の合成吸着樹脂（日本錬水株式会社 HP2MG）370ｍlを充填したカラムに流速8.0ml/分で60分流し、さらに同カラムに450mLの水を流した。【０２５７】
糖液は、カラム出口で260mL、460mL、210mLの３画分（各々、画分１、２、３）に分けて回収した。各画分の糖濃度は順に0.10%、4.91%、6.55%であった。また、全体としての糖の回収率は87%であった。さらに、280mＬの水をカラムに流すことで、糖の回収率は97%まで上昇し、620mLの100%-メタノールをカラムに流すことで、糖の回収率は98%まで上昇した。【０２５８】
上記方法により得られた画分２の貫流液（以下、「合成吸着樹処理糖液」と呼ぶ。）は、糖純度が4１%から4７%へと向上した。またpHは4.37であった。糖純度の算出は実施例２と同様に行った。【０２５９】
続いて、WC196LCxylA/pCABD2株を用いて、未処理糖液又は合成吸着剤処理糖液を炭素源として用いてＬ−リジン生産を行った。培養方法は、糖液の処理に用いた樹脂を合成吸着樹脂に変更した以外は、実施例１３と同様の方法で行った。培養10時間目の結果を表１４に示す。【０２６０】
【表１４】
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【０２６１】
その結果、合成吸着樹脂処理糖液を炭素源とした場合は、未処理糖液を炭素源とした場合と比較して菌体量が4倍、L-リジン蓄積が4.2倍に回復した。一方、試薬モデル糖液を炭素源とした場合と比較すると、菌体量が1.1倍、L−リジン蓄積が0.8倍と、ほぼ匹敵する成績を示した。この結果より、バイオマス由来のC5糖液の合成吸着樹脂処理は、菌体生育及びアミノ酸生産能の回復に有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２６２】
本発明により、バイオマス原料、特にサトウキビバガスや稲わらのような食料として未利用のバイオマス原料を用いて、発酵法により目的物質を効率よく製造することができる。特に、従来の熱水処理及び糖化処理により得られるバイオマス由来の５炭糖を含む糖液に比べて、本発明により得られる糖液は、微生物の生育および代謝を阻害しない。また、本発明により得られる糖液を発酵の炭素源として用いると、微生物の生育以上に目的物質の生産効率が向上する。
【配列表】
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【国際調査報告】
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