(57)【要約】  高感度かつ高い特異性で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定するポリペプチド抗原を用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及びこれを用いた測定方法を提供する。  抗原抗体反応を利用した抗梅毒トレポネーマ抗体の測定に用いる試薬において、梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原のうち、少なくともドメインＣとＤを含み、ドメインＡ１を含まない組み換えポリペプチドを抗原として用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原抗体反応を利用した抗梅毒トレポネーマ抗体の測定に用いる試薬において、梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原のうち、少なくともドメインＣとＤを含み、ドメインＡ１を含まない組み換えポリペプチドを抗原として用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
【請求項２】
抗原が、梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原のうち、ドメインＣとＤ、ドメインＡ２とＣとＤ、又はドメインＢとＡ２とＣとＤからなる組み換えポリペプチドである請求項１記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
【請求項３】
抗原が不溶性担体に固定化されている請求項１記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
【請求項４】
抗原が不溶性担体に固定化されている請求項２記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
【請求項５】
請求項３記載の不溶性担体が高分子重合体から成るラテックスである抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
【請求項６】
請求項４記載の不溶性担体が高分子重合体から成るラテックスである抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
【請求項７】
請求項１記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
【請求項８】
請求項２記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
【請求項９】
請求項３記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
【請求項１０】
請求項４記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
【請求項１１】
請求項５記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
【請求項１２】
請求項６記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感度及び特異性の高い抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及びこれを用いた測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
梅毒は、梅毒トレポネーマ菌（トレポネーマ・パリダム、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ Ｐａｌｌｉｄｕｍ）の感染により引き起こされる疾患である。ペニシリン等の有効な治療薬が開発されたことにより、梅毒の罹患率は、１９４０年代以降減少していたが、近年再び増加傾向を示している。近年の梅毒新規罹患患者の特徴としては、多くがＨＩＶ感染症を合併している点が挙げられる。高い合併率の原因として、梅毒、ＨＩＶともに性感染症であると同時に、梅毒がＨＩＶ感染リスクを高めていると考えられている。このような状況の下、梅毒及びＨＩＶの感染拡大を防ぐために、梅毒患者を早期に発見し治療することが求められている。
梅毒に罹患しているか否かは、血液中の抗梅毒トレポネーマ抗体の存在の有無を免疫学的に検査することにより診断されている。梅毒トレポネーマ菌体の菌体表面には多数の表面抗原が存在しており、この表面抗原と検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応を利用する方法により免疫測定が行われている。梅毒トレポネーマ菌体の菌体表面に存在する表面抗原のうち主なものとしては、分子量４７ｋＤａ、４２ｋＤａ、３７ｋＤａ、１７ｋＤａ及び１５ｋＤａのものが知られている。【０００３】
現在、梅毒診断に用いられている梅毒トレポネーマ菌体の表面抗原としては、梅毒トレポネーマ菌を家兔睾丸で培養し、界面活性剤等で可溶化・抽出し、さらに種々の方法を用いて不溶物の除去・必要成分の精製を行ったものが用いられている。このようにして調製された梅毒トレポネーマ菌由来の抗原は、抗梅毒トレポネーマ抗体との特異性が高いため、梅毒患者の早期発見が可能となる。しかし、前記のような家兔を用いた抗原の製造方法では、家兔睾丸を宿主とすることから収量が限られているうえ、梅毒トレポネーマ菌の増殖状態に家兎固体差があるため、大量に安定した収量を確保するのが困難である。なお、現時点では、梅毒トレポネーマ菌を直接人工培養することには成功していない。【０００４】
近年、遺伝子組換え技術を利用した梅毒トレポネーマ菌の菌体表面抗原の製造方法が提案されている。梅毒４７ｋＤａ抗原については、コードする遺伝子がクローニングされ、４１５のアミノ酸から成るアミノ酸配列が決定されている（例えば、非特許文献１、非特許文献３）。また、その結晶構造や生物学的役割に関しても報告されており、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの４つのドメイン構造を取っていることがわかっている（例えば、非特許文献２、非特許文献３）。
非特許文献３によれば、アミノ酸配列のＮ末端から数えてドメインＡは１〜３４番目（Ａ１ドメイン）と１５７〜２０７番目（Ａ２ドメイン）、ドメインＢは３５〜１５６番目、ドメインＣは２０８〜３３５番目、ドメインＤは３３６〜４１５番目までから成っている（非特許文献３、図１参照）。
さらに上記４７ｋＤａ抗原の抗体認識部位に関しても、抗原活性を示すアミノ酸配列が報告されている（例えば、非特許文献４）。【０００５】
上記抗原を用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法として、梅毒４７ｋＤａ抗原を遺伝子組換え技術により作製し、これを用いて抗梅毒トレポネーマ抗体を免疫学的に測定する方法が開示されている（特許文献１参照）。また、１５ｋＤａ及び１７ｋＤａの抗原のＮ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが融合したタンパク質を用いる方法も開示されている（特許文献２参照）。
一方、遺伝子組換え技術による抗原作製以外に、４７ｋＤａ抗原に関して、抗原活性を有するペプチドを合成し、これを抗原として用いることで抗梅毒トレポネーマ抗体を測定する方法も開示されている（特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ１９８８／０２４０３号パンフレット
【特許文献２】特開平７−２８７０１７号公報
【特許文献３】特開２００１−２６４３３４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．６０（４），ｐ．１５６８−１５７６，（１９９２）
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７７（４４），ｐ．４１８５７−４１８６４，（２００２）
【非特許文献３】ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ），ＭＭＤＢ  ＩＤ：２１０５１
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５７，ｐ．７２０−７３１，（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような方法で調製された梅毒トレポネーマの組換え抗原並びに合成ペプチド抗原を用いても、抗梅毒トレポネーマ抗体の測定を行うことは可能であるものの、遺伝子組換え技術によって作製された梅毒トレポネーマの組換え抗原は、感度や特異性の低さに問題があった。また、合成ペプチド抗原に関しては、同様の問題に加え、抗梅毒トレポネーマ抗体を精度よく測定するには数種のペプチドを組み合わせねばならず、操作において煩雑であるといった問題があった。
これらの問題が発生する要因として、詳細は明確ではないが以下のことが考えられる。すなわち、遺伝子組換え技術によって作製された梅毒トレポネーマの組換え抗原は、梅毒トレポネーマ菌由来の天然抗原と比較して、その立体構造並びに脂質の修飾等に相違があるものと考えられる。一般にタンパク質は翻訳後さまざまな修飾を受ける。糖又は脂質の修飾等はそれらのうちの代表的な修飾であるが、タンパク質はこのような修飾を受けることでその立体構造が変化する。一方、遺伝子組換え技術で主に用いられる大腸菌による発現系では、タンパク質の翻訳後の修飾は行われない。タンパク質の立体構造は、その抗原性を示す上で重要な要因であるが、遺伝子組換え技術によって作製された組換えタンパク質では、翻訳後の修飾を受けないため、天然抗原に比べて立体構造に違いが生じ、これが感度や特異性に影響を与えている可能性が考えられる。
本発明は、上記に鑑み、高感度かつ高い特異性で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定するポリペプチド抗原を用いた抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及びこれを用いた測定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者は、梅毒トレポネーマ菌体の表面抗原である分子量４７ｋＤａ抗原に着目し、遺伝子組み換え技術により当該４７ｋＤａ抗原及びその一部のポリペプチドを作製し、それを用いた抗梅毒トレポネーマ抗体試薬系における感度及び特異性を検討してきたところ、ドメインＣからなる組み換えポリペプチド、及びドメインＤからなる組み換えポリペプチドのそれぞれ単独ではほとんど反応しないにもかかわらず、ドメインＣとＤからなる組み換えポリペプチド、ドメインＡ２とＣとＤからなる組み換えポリペプチド、ドメインＢとＡ２とＣとＤからなる組み換えポリペプチドにおいて、組み換え４７ｋＤａ抗原に比べて感度が顕著に向上し、その感度は天然抗原に匹敵することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）抗原抗体反応を利用した抗梅毒トレポネーマ抗体の測定に用いる試薬において、梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原のうち、少なくともドメインＣとＤを含み、ドメインＡ１を含まない組み換えポリペプチドを抗原として用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
（２）抗原が、梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原のうち、ドメインＣとＤ、ドメインＡ２とＣとＤ、又はドメインＢとＡ２とＣとＤからなる組み換えポリペプチドである（１）記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
（３）抗原が不溶性担体に固定化されている（１）記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
（４）抗原が不溶性担体に固定化されている（２）記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
（５）（３）記載の不溶性担体が高分子重合体から成るラテックスである抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
（６）（４）記載の不溶性担体が高分子重合体から成るラテックスである抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
（７）（１）記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
（８）（２）記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
（９）（３）記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
（１０）（４）記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
（１１）（５）記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
（１２）（６）記載の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、品質的に均一な抗原が大量に安定して得られる組換え梅毒トレポネーマ抗原ポリペプチドを用い、高感度でかつ特異的に抗梅毒トレポネーマ抗体が測定でき、より正確な梅毒診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】反復ＰＣＲイメージ図を示す。
【図２】発現ベクター構築のイメージ図を示す。
【図３】各抗原を用いた場合の３８Ｔ．Ｕ．での吸光度変化量を示す図である。
【図４】各抗原を用いた場合の１１９Ｔ．Ｕ．での吸光度変化量を示す図である。
【図５】各抗原を用いた場合の２４０Ｔ．Ｕ．での吸光度変化量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の抗原抗体反応を利用した抗梅毒トレポネーマ抗体の測定試薬は、抗原として梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原のうち、少なくともドメインＣとＤを含み、ドメインＡ１を含まない組み換えポリペプチドを用いることを特徴とする。
本発明に用いる組み換えポリペプチド抗原の具体例としては、トレポネーマ・パリダム菌体の表面抗原である４７ｋＤａ抗原の一部である、ドメインＣとＤ、ドメインＡ２とＣとＤ、又はドメインＢとＡ２とＣとＤからなる組み換えポリペプチドであり、好ましくは、分子量が小さく、梅毒トレポネーマ菌由来の抗原を用いて作製された試薬（メディエース（登録商標）ＴＰＬＡ，積水メディカル社製）と相関が良好なドメインＣとＤからなる組み換えポリペプチド、ドメインＡ２とＣとＤからなる組み換えポリペプチド、さらに好ましくは、ドメインＣとＤからなる組み換えポリペプチドである。
上記各ポリペプチドとしては、アミノ酸配列で相同性が９０％以上のものが含まれるが、相同性が９５％以上のものがより好ましく、相同性が９８％以上のものがさらに好ましい。
【００１４】
上記４７ｋＤａ抗原の一部であるポリペプチドを発現させるＤＮＡ断片を得る方法としては、ｉ）梅毒菌体から遺伝子のクローニングにより、又は遺伝子合成により４７ｋＤａ抗原遺伝子全長を得、適当な制限酵素等で不要なポリペプチド部分をコードするＤＮＡ断片を削除した後に発現ベクターに入れる方法；ｉｉ）梅毒菌体のｃＤＮＡバンクを作製し、適当なＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法等により各ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を増幅した後に発現ベクターに入れる方法；ｉｉｉ）各ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を直接合成、又は、ＰＣＲ法等により合成した後に発現ベクターに入れる方法等があるが、特に限定されない。
上記発現ベクターに関しても、特に限定されるものではない。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウィルス等が挙げられる。
【００１５】
発現ベクターに組込まれた各ポリペプチド抗原を発現させる宿主としては、培養細胞、大腸菌などの微生物、カイコ等、特に限定されるものではないが、大腸菌や培養細胞等が代表的宿主である。
上記各ポリペプチドを効率的に発現させる、あるいは発現後の精製を容易にするために、他のタンパク質（以下、タグタンパク質という）との融合タンパク質として発現させてもよい。タグタンパク質としては、β−ガラクトシターゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、６×ヒスチジン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌由来の殺虫タンパク質であるＣｒｙタンパク質（ＷＯ２０１０／０１３７８９に記載）等があるが、特に限定されるものではない。また、融合タンパク質として発現させた後、精製過程においてはタグタンパク質を必ずしも除去する必要はなく、そのまま用いてもよい。
【００１６】
本発明の免疫学的測定試薬は特に限定されないが、例えば、免疫凝集、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、免疫クロマトグラフィー等に用いることができ、不溶性担体に上記抗原を担持させた免疫凝集に用いる方法が好適である。
【００１７】
上記不溶性担体は特に限定されず、例えば、有機高分子粉末、微生物、血球、細胞膜片等が挙げられる。なかでも有機高分子粉末が好適である。上記有機高分子粉末としては、例えば、天然高分子粉末、合成高分子粉末等が挙げられる。上記天然高分子粉末としては、例えば、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等が挙げられる。上記合成高分子粉末としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。
また、上記不溶性担体は、表面にスルホン酸基、カルボキシル基やアミノ基等を導入したものも用いることができる。
【００１８】
上記不溶性担体としては、合成高分子粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が特に好適である。その他、プラスチック製マイクロタイタープレート；動物の赤血球、細菌の細胞等の生物学的粒子；ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末等の非生物学的粒子なども用いることができる。
上記ラテックス粒子の粒子径は特に限定されないが、電子顕微鏡での測定で、好ましい下限は０．０５μｍ、好ましい上限は１．５μｍである。上記ラテックス粒子の粒子径が０．０５μｍ未満であると、凝集による光学的変化量が小さく、測定に必要な高い感度が得られないことがある。上記ラテックス粒子の粒子径が１．５μｍを超えると、ラテックス粒子の凝集による光学的変化量が測定可能域を超えてしまい、測定範囲が小さくなることがある。上記ラテックス粒子の粒子径の好ましい下限は０．１μｍ、より好ましい上限は０．８μｍである。
【００１９】
上記不溶性担体に前記梅毒トレポネーマ組み換え抗原を固定化させる方法としては特に限定されず、物理的、又は化学的結合により担持させる従来公知の方法を用いることができる。物理的に吸着させる方法としては、例えば、一定条件下で組換え抗原と不溶性担体を混合することにより担持させることができる。さらに上記固定化させる工程の後、アルブミン、カゼイン、界面活性剤等の免疫学的に不活性な物質により不溶性担体を被覆してもよく、アルブミンを用いるのが好適である。
【００２０】
上記アルブミンは特に限定されず、動物の血液中に存在するアルブミンが用いられる。動物種としては、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、及びヒト等が挙げられる。上記被覆する工程において、アルブミンの濃度は特に限定されないが、好ましい下限は０．０１重量％、好ましい上限は１０重量％である。上記アルブミンの濃度が０．０１重量％未満になると不溶性担体表面が十分に被覆されないため非特異的な凝集が生じ、１０重量％より多くなると逆に検量線感度が低下するので、０．１〜５重量％がより好ましい。
【００２１】
上記不溶性担体を不活性な物質で被覆する方法としては、例えば、組換え抗原を不溶性担体に担持させた後、一定条件下で不活性な物質を混合することにより被覆することができる。また反応時のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は２、好ましい上限は１２である。上記ｐＨが２未満、又は１２より高くなると、組み換え抗原が変性する等の問題が生じるため、ｐＨ４〜１０がより好ましい。反応時の温度は特に限定されないが、好ましい下限は２℃、好ましい上限は５０℃である。上記温度は、２℃未満になると十分に反応しない、又は反応系が凍結してしまい、必要な感度を有するものが得難くなり、５０℃より高くなると組み換え抗原が変性する等の問題が生じるため、２〜１０℃がより好ましい。
【００２２】
このようにして得られた組換え抗原を担持させたものは特に限定されないが、免疫学的に不活性な物質を含む緩衝液中に懸濁させる。免疫学的に不活性な物質としては、特に限定されず、アルブミン、カゼイン、界面活性剤（合成高分子化合物）、合成リン脂質、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が用いられるが、アルブミン、合成リン脂質が好適である。
【００２３】
上記不溶性担体に担持させる工程、さらに不活性な物質により被覆する工程、及び抗原を担持させたものを懸濁させる工程において、用いる溶媒は、特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
【００２４】
このようにして得られた抗原を担持させたラテックス粒子懸濁液に対して、検体を添加し、一定時間反応させる。反応後に、ラテックス粒子に担持された組換え抗原と、検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを、光学的に測定又は目視にて確認することにより、検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体量を測定することができる。
【００２５】
上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては特に限定されず、公知の方法が用いられ、例えば、凝集の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度分布又は平均粒子径の変化としてとらえる方法、凝集の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球光度濁度法等が挙げられる。また、これらの方法を併用することも可能である。
【００２６】
上記の測定法において、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加速度に基づき凝集の程度を求める速度試験（レートアッセイ）、あるいはある時点（通常は反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験（エンドポイントアッセイ）を利用できる。測定の簡便性、迅速性の点から比濁法による速度試験を行うことが好ましい。
上記測定を行う際の光の波長は、２５０〜１０００ｎｍが好ましく、５４０〜８００ｎｍが更に好ましい。
【００２７】
上記の光学的測定方法に用いる装置は、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学装置が挙げられ、一般に使用されている生化学自動分析装置であればいずれのものであっても用いることができる。
上記凝集の度合いを目視にて観察する方法は、通常、検体とラテックス粒子懸濁液とを含む溶液を判定板上で混合し、混合液を揺り動かした後、凝集の有無を判定する方法等を用いることができる。なお、凝集の度合いの観察には、目視による方法以外に、凝集状態をビデオカメラ等で撮影し、画像処理を施す方法を用いることも可能である。
【００２８】
上記検体としては、抗トレポネーマ抗体が存在する可能性のあるものであれば特に限定されず、例えば、ヒト又は動物の血液、血漿、血清等が挙げられる。
【００２９】
上記抗原抗体反応を行う際の反応系の反応液としては、抗原抗体反応が起こりうる生理的条件を満たす水溶液であれば特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。反応液のｐＨは、４〜１０が好ましく、より好ましくは６〜８である。
上記反応液には、さらに必要に応じて、牛血清アルブミン、ショ糖等の安定化剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤、塩化ナトリウム等の塩濃度調整剤などを添加してもよい。
反応温度は、上記免疫反応が起こりうるものであれば特に限定されず、恒温で１０〜５０℃の範囲内で行うのが好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。反応時間は適宜決められる。
【実施例】
【００３０】
本発明を比較例及び実施例を用いて説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００３１】
（ＴｐＮ４７遺伝子調製のためのプライマー）
ＴｐＮ４７遺伝子を調製するために用いたプライマー（ＤＮＡ合成装置で合成）を表１に示す。なお表１に示す塩基配列において下線部はベクターへのサブクローニングに必要な制限酵素サイトを示す。【００３２】
【表１】
2011125872.tif 000002
【００３３】
（ＴｐＮ４７遺伝子の人工調製）
ＴｐＮ４７遺伝子はデータベース上の塩基配列を参考（ＧｅｎＢｎａｋ  ＡＥ０００５２０）に反復（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）  ＰＣＲによって合成した。すなわち、相互に相補的な配列を一端に有するプライマー対ＴｐＮ４７＿１ｆ及びＴｐＮ４７＿２ｒを用いてＰＣＲにより作製したＤＮＡ断片と、相補的な配列末端に有する一連のプライマー対ＴｐＮ４７＿３ｆ、ＴｐＮ４７＿４ｒ、ＴｐＮ４７＿５ｆ，ＴｐＮ４７＿６ｒ、ＴｐＮ４７＿７ｆ，ＴｐＮ４７＿８ｒ、ＴｐＮ４７＿９ｆ，ＴｐＮ４７＿１０ｒ、ＴｐＮ４７＿１１ｆ、ＴｐＮ４７＿１２ｒ、ＴｐＮ４７＿１３ｆ、ＴｐＮ４７＿１４ｒ、ＴｐＮ４７＿１５ｆ、ＴｐＮ４７＿１６ｒ、ＴｐＮ４７＿１７ｆ、ＴｐＮ４７＿１８ｒ、ＴｐＮ４７＿１９ｆ、ＴｐＮ４７＿２０ｒ、ＴｐＮ４７＿２１ｆ、ＴｐＮ４７＿２２ｒ、ＴｐＮ４７＿２３ｆ及びＴｐＮ４７＿２４ｒを用いて、ＴｐＮ４７遺伝子の全体をコードするＤＮＡを作製した。反復（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）ＰＣＲのイメージ図を図１に示す。【００３４】
（ＴｐＮ４７抗原発現用ベクターの構築）
調製したＴｐＮ４７遺伝子をｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＳｍａＩサイトにライゲーションし、それを大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ社製）へカルシウム法により形質転換した。カルシウム法による形質転換の方法は次の通りである。大腸菌ＤＨ５αの一晩培養液０．１ｍＬを５ｍＬのＬＢ培地（表２記載）に植菌し，濁度が０．５になるまで３７℃で振盪培養した。１ｍＬを遠心分離により集菌し、０．５ｍＬの氷冷５０ｍＭ  ＣａＣｌ２に懸濁させ、氷上に３０分静置した。懸濁液を０．２ｍＬ分取し、ライゲーション後のプラスミドＤＮＡを添加し、氷上に３０分放置後，４２℃で３０秒間ヒートショックを与え、ＳＯＢ培地（表２記載）０．８ｍＬを添加（全量１ｍＬ）した。３７℃で１時間培養後、イソプロピル−β−ガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧという）（ナカライテスク社製）、５−クロロ−４−ブロモ−３−Ｄ−ガラクトース（以下、Ｘ−ｇａｌという）（ナカライテスク社製）及びアンピシリン（和光純薬社製）１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地（表２記載）に展開し３７℃で一夜培養した。単一のコロニーをブルーホワイトセレクションにより選択し、終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＢ培地（表２記載）２ｍＬに植菌し一晩培養した。培養した大腸菌はＦａｖｏｒＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ  ＣＯＲＰ社製）によりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドは、制限酵素処理及び、シーケンシングにより塩基配列の確認を行った。
正しい塩基配列であることを確認した後に、ＴｐＮ４７遺伝子を市販のベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）からＯｎｅ  ｄａｙ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法を利用してＧＳＴ遺伝子を削除したｐΔＧＳＴのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩサイトに導入し、ｐΔＧＳＴ−ＴｐＮ４７を構築した。このｐΔＧＳＴ−ＴｐＮ４７のＢａｍＨＩサイトに、ＷＯ２０１０／０１３７８９記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ由来のＣｒｙタンパク質のアミノ酸配列の一部である４ＡａＣｔｅｒ（６９６−８５１）（配列番号４２：以下、Ｔａｇという）を導入したｐΔＧＳＴ−Ｔａｇ−ＴｐＮ４７を構築した。具体的には、はじめにＴａｇをコードする遺伝子を反復（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）ＰＣＲによって作製した。Ｔａｇをコードする遺伝子は５’末端にＢａｍＨＩサイト、ならびに３’末端にリンカー配列をコードする塩基配列およびＢａｍＨＩサイトが付加するように作製した。作製したＴａｇをコードする遺伝子はｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）のＳｍａＩサイトに挿入、クローニングし、シークエンス解析により正しい塩基配列であることを確認した。次にＴａｇをコードする遺伝子をｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）よりＢａｍＨＩにより切り出し、ｐΔＧＳＴ−ＴｐＮ４７のＢａｍＨＩサイトへ挿入し、ｐΔＧＳＴ−Ｔａｇ−ＴｐＮ４７を構築した。発現ベクター構築のイメージ図を図２に示す。構築したｐΔＧＳＴ−Ｔａｇ−ＴｐＮ４７は大腸菌ＢＬ２１（タカラバイオ社製）へ導入し形質転換した。形質転換の方法は前述の通りである。【００３５】
【表２】
2011125872.tif 000003
【００３６】
（ＴｐＮ４７の発現）
ｐΔＧＳＴ−Ｔａｇ−ＴｐＮ４７発現ベクターを導入した大腸菌ＢＬ２１を終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンが入ったＴＢ培地５ｍＬで一晩、前培養した。この一晩培養液の０．５ｍＬを５０ｍＬの終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンが入ったＬＢ培地に加えた。培養は、振とう培養機（ＳＡＮＹＯ社製、ＭＩＲ−Ｓ１００）を用いて、２４０ｒｐｍ、３７℃でＯＤ６００が０．６〜０．８となるまで培養した。培養液に最終濃度０．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加えた。さらに３時間培養（２４０ｒｐｍ，３７℃）し，発現を誘導した。【００３７】
（ＴｐＮ４７の精製）
発現誘導した菌体を回収後、１０ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ０．９重量％）に懸濁させ、超音波破砕し、９０００ｒｐｍにて１０分間遠心して不溶性画分を得た。目的のタンパク質を含む不溶性画分を適当量の超純水で遠心洗浄し、沈殿を尿素溶液（８Ｍ  Ｕｒｅａ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）によって可溶化し、これを目的のタンパク質溶液（濃度：４ｍＭ）とした。【００３８】
（ポリペプチド１−８遺伝子調製のためのプライマー）
配列番号３４〜４１記載のポリペプチド１−８に対応する遺伝子を調製するためのプライマー（ＤＮＡ合成装置で合成）を表３に示す。【００３９】
【表３】
2011125872.tif 000004
【００４０】
（ポリペプチド１−８遺伝子の人工調製）
ポリペプチド１−８の遺伝子はｐΔＧＳＴ−Ｔａｇ−ＴｐＮ４７を鋳型とした、Ｏｎｅ  ｄａｙ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法を利用した。すなわちｐΔＧＳＴ−Ｔａｇ−ＴｐＮ４７から削除したい部分を挟む形でプライマーを設計し、それぞれベクターの外向きにＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させて各々のポリペプチドをコードするＤＮＡを作成した。各ポリペプチドを作製する際のプライマーペアは表４に従った。ポリペプチド１〜８の塩基配列は配列番号３４〜４１にそれぞれ示した。【００４１】
【表４】
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【００４２】
（ポリペプチド１−８発現用ベクターの構築）
前述のＰＣＲ産物にＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）及び１０  Ｘ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）を加えセルフライゲーションした。このライゲーション溶液に制限酵素ＤｐｎＩ（東洋紡社製）を加え３７℃にて１時間インキュベートした。大腸菌への挿入以降は、ＴｐＮ４７のベクター構築と同様にした。【００４３】
（ポリペプチド１−８の発現）
各ポリペプチドの発現ベクターを用いた以外は、ＴｐＮ４７の発現に従った。【００４４】
（ポリペプチド１−８の精製）
ポリペプチド１−８を発現誘導させた菌体を用いた以外は、ＴｐＮ４７の精製に従った。【００４５】
（ラテックス粒子の作製）
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器（容量２Ｌ）に、蒸留水１１００ｇ、スチレン２００ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．２ｇ、及び蒸留水５０ｇに過硫酸カリウム１．５ｇを溶解した水溶液を仕込み、容器内を窒素ガスで置換した後、７０℃で攪拌しながら４８時間重合した。
重合終了後、上記溶液をろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。得られたラテックス粒子の粒子径を透過型電子顕微鏡装置（日本電子社製、「ＪＥＭ−１０１０型」）を用いて１００００倍の倍率でラテックス粒子を撮影し、最低１００個以上の粒子について画像解析することにより平均粒子径を測定した。得られた平均粒子径は０．４μｍであった。【００４６】
（抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬の調製）【００４７】
（実施例１）
平均粒子径０．４μｍのラテックス溶液（固形分１０％（ｗ／ｖ））１００μＬに、２０ｍＭのトリス緩衝液（以下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと言う、ｐＨ８．０）に溶解したポリペプチド１（４ｍＭ）を１００μＬ（０．４μｍｏｌ）添加し、４℃にて１時間攪拌した。次いで、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡという、フラクションＶ、ＲｅａｇｅｎｔＧｒａｄｅ、Ｍｉｌｅｓ  Ｃｏｒｐ．社製）を１％（Ｗ／Ｖ）含有するトリス塩酸緩衝食塩水（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、食塩濃度０．９重量％、ｐＨ８．０）１ｍＬを添加し１時間撹拌した。得られた液体を１０℃にて１５分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた沈殿物に、１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含有する１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）溶液２０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させることにより抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。【００４８】
（実施例２）
ポリペプチド２溶液を抗原液として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。【００４９】
（実施例３）
ポリペプチド３溶液を抗原液として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。【００５０】
（比較例１）
精製したＴｐＮ４７溶液を抗原液として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。【００５１】
（比較例２）
ポリペプチド４溶液を抗原液として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。【００５２】
（比較例３）
ポリペプチド５溶液を抗原液として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。【００５３】
（比較例４）
ポリペプチド６溶液を抗原液として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。【００５４】
（比較例５）
ポリペプチド７溶液を抗原液として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。【００５５】
（比較例６）
ポリペプチド８溶液を抗原液として用いたこと以外は、実施例１と同様にして抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。【００５６】
（測定）
実施例１〜３、比較例１〜６にて調製した抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いて、下記の方法により測定を行った。
（１）抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液の測定
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度，単位：Ｔ．Ｕ．＊）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製：Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ＢＬ）を０．８（ｗ／ｖ）％添加したもの）１００μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬１００μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。なお、測定は自動分析装置７１７０形を使用した。
結果を表５及び図３〜図５に示した。表５、図３〜図５に示されるように、実施例で調製された試薬の反応性が高いことが分かった。
＊Ｔ．Ｕ．は、メディエース（登録商標）ＴＰＬＡ（積水メディカル社製）により測定される抗トレポネーマ抗体価の単位であるＴＩＴＥＲ  ＵＮＩＴＳの略称であり、国際標準品を測定した場合、１Ｔ．Ｕ．は、２ｍＩＵである。【００５７】
【表５】
2011125872.tif 000006
【００５８】
（２）陽性検体測定
梅毒陽性と判定された血清検体（１０Ｔ．Ｕ，以上）を検体とした以外は（１）と同様にして吸光度変化量（ΔＡｂｓ）を求め、（１）の標準品測定結果に基づいて作成した検量線から抗体価を算出した。実施例及び比較例にて調製した抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬での抗体価と、市販品試薬（積水メディカル社製、メディエース（登録商標）ＴＰＬＡ）との抗体価の相関性を求めた。結果を表６に示した（ｘ：市販品試薬，ｙ：実施例１〜３及び比較例１にて調製した抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬）。実施例で調製された試薬は、既存の試薬との相関性が良好であることが分かった。【００５９】
【表６】
2011125872.tif 000007
【００６０】
（３）陰性検体測定
梅毒陰性と判定された血清検体（０Ｔ．Ｕ．）を検体とした以外は（１）と同様にして吸光度変化量（ΔＡｂｓ）を求め、（１）の標準品測定結果に基づいて作成した検量線から抗体価を算出した。
結果を表７に示した。この測定方法では、１０Ｔ．Ｕ．以上を陽性と判定する。比較例１では、非特異反応が多く偽陽性が認められたのに対し、実施例１〜３では、非特異反応が殆んどなく、偽陽性は認められなかった。【００６１】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の組み換え抗原を用いれば、感度、特異性の高い抗梅毒トレポネーマ抗体を測定することができる抗梅毒レポネーマ抗体測定試薬を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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