(57)【要約】本発明は、多血小板血漿とゼラチンβ-TCPスポンジを含み、血管新生、骨新生、軟骨新生等を促進することを特徴とする、硬組織再生誘導用材料に関する。
2011048803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多血小板血漿及びゼラチンβ-TCPスポンジを含む、硬組織再生誘導用材料。
【請求項２】
硬組織が骨・軟骨組織である、請求項１に記載の材料。
【請求項３】
骨新生又は軟骨新生を促進するためのものである、請求項１又は２に記載の材料。
【請求項４】
血管新生を促進するためのものである、請求項１又は２に記載の材料。
【請求項５】
多血小板血漿が硬組織再生誘導用材料の適用を受ける対象由来のものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の材料。
【請求項６】
ゼラチンβ-TCPスポンジの孔径が10〜500μmである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の材料。
【請求項７】
ゼラチンβ-TCPスポンジ中のゼラチンが架橋されたものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の材料。
【請求項８】
ゼラチンβ-TCPスポンジが、β-TCPとゼラチンを含む組成物に、架橋と凍結乾燥を施して作製されたものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多血小板血漿とゼラチンβ-TCPスポンジを含む、骨・軟骨等の硬組織再生誘導用材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、骨折部の骨癒合や良性骨腫瘍切除後などの骨欠損部の再建には、自己の健常な部分から骨を採取し骨欠損部位に移植する、自家骨移植が行われている。しかし、健常な部分に侵襲を加えるため、骨採取部位の感染や疼痛の遺残、採骨部周辺の神経損傷など、合併症が約３割と高率に発生する。また、骨癒合範囲や骨欠損が大きい症例では、大量の自家骨が必要となるため、自家骨採取部の欠損が臨床上問題となる場合もある。【０００３】
こうした自家骨移植の回避又は自家骨量の不足を補うために、リン酸カルシウムやβ-tricalcium  phosphate(β-TCP)を用いた人工骨が使用されてきた。しかし、人工骨自体には骨誘導能がないため、使用できる部位が、骨再生環境の良好な、比較的小さな骨欠損に限られることや、自家骨に比べて骨形成能が劣るため、力学的な強度が得られるまでに時間を要し、術後長期にわたって荷重制限や安静を要することが大きな問題であった。このような背景から、広範囲にわたる骨癒合や骨欠損に対しても応用可能な骨誘導能を伴った骨再生技術が広く研究されている。【０００４】
近年、自己の骨髄間葉系幹細胞を培養し、人工骨と組み合わせて骨欠損部位に移植する手法が開発され、臨床応用例が報告がされている（非特許文献１）。しかし、細胞培養ができるクリーンルーム(セルプロセッシングセンター)といった専門施設が必要なため、市中病院での実施が事実上困難であること、また、多分化能を持った間葉系細胞の癌化のリスクがあること、分化誘導が必ずしも完璧でないことなど、さまざまな問題が山積しており、汎用性は低い。【０００５】
また、成長因子を用いた骨再生治療として、遺伝子組み換えにより生産されたbone  morphogenetic  protein-2  (BMP-2)が、1997年に欧米のFood  and  Drug  Administrationで椎体間固定術での使用が認可され、米国では臨床応用が行われている。しかし、近年、その有効性と安全性が疑問視されている。例えば、BMP-2を用いた腰椎椎体間固定では、固定椎体や移植骨の骨吸収が高頻度に生じ、骨癒合率が大幅に減少したとの報告がある。また、軟部組織の評価に有用なMRIで、腰椎周囲組織に炎症反応を認めたとの報告や、頚椎の固定術を行った症例で、喉頭浮腫による呼吸困難、嚥下障害及び頚部自体の異常な腫脹といった重篤な合併症を認めたとの報告がある（非特許文献２及び３）。これらの原因として、人工的に生産された成長因子を大量に投与することにより、成長因子が投与部位から周囲組織に拡散し、抗原抗体反応を誘発した結果、軟部組織及び重要臓器での浮腫性変化が生じたことが考えられる。さらに、BMP-2は高価であり、手術費用に加えて、一人あたり数十万円の費用が上乗せされるため、患者にとって金銭的負担が大きい。【０００６】
多血小板血漿（PRP（Platelet  Rich  Plasma）とも称される）は、末梢血を低速で遠心分離して赤血球を除くことにより得られる濃厚血小板血漿である。PRPには、血小板中に含まれる血小板由来成長因子（PDGF）、トランスホーミング成長因子β（TGF-β）、繊維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）などの成長因子が多く含まれており、これらの相乗的作用により血管新生、骨新生、創傷治癒の促進等の効果を有することが知られている。PRPを、ゼラチンハイドロゲルなどの適切なドラッグデリバリーシステム材料と併用することで、長管骨や頭蓋骨欠損モデルにおいて骨新生作用を発揮することも確認されている（特許文献１、非特許文献４及び５）。【０００７】
しかし、広範囲にわたる骨欠損や、解剖学的に癒合していない骨折、及び脊椎骨を癒合させる脊椎固定術において、充分な骨形成を得るためには、PRPの効果だけでは不十分であり、骨芽細胞の分化・誘導を促すための３次元構造を持った足場が必要不可欠である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２１１４７７号
【特許文献２】特開２００４−１２３５７６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Morishita  T,  et.,  Artif.  Organs,  2006
【非特許文献２】Lohn  McClellan,  et  al.,  J.  Spinal  Disord.  Tech.,  2006
【非特許文献３】Ben  B,  et  al.,  Spine,  2006
【非特許文献４】Hokugo  A,  et  al.,  Tissue  Eng.,  2005
【非特許文献５】Hokugo  A,  et  al.,  Oral  Surg.  Oral  Med.  Oral  Pathol.  Oral  Radiol.  Endod.,  2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、多血小板血漿由来成長因子の徐放効果と、組織再生の良好な足場機能を合わせ持つ、安全性及び実用性に優れた、骨・軟骨等の硬組織再生のための新規な材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、上記の課題を達成するために、成長因子のドラッグデリバリーシステムのための材料として優れているゼラチンと生体吸収分解性を有するセラミックスであるβ-TCP顆粒をスポンジ状に加工した、ゼラチンβ-TCPスポンジに、患者の自己血液から精製した多血小板血漿（Platelet  Rich  Plasma：PRP）を含んでなる硬組織再生誘導用材料を作製した。そして、この材料が骨形成を飛躍的に促進させることを、ラット脊椎固定モデルを用いて検証した。【００１２】
本発明は、上記の知見に基づいてなされたものであり、多血小板血漿及びゼラチンβ-TCPスポンジを含む、硬組織再生誘導用材料を提供する。【００１３】
本発明の材料の対象となる硬組織は、再生に足場を必要とする骨・軟骨組織等であり、歯槽骨等の歯科領域も含む。【００１４】
本発明の硬組織再生誘導用材料は、骨新生及び軟骨新生を促進する。また、本発明の硬組織再生誘導用材料は、血管新生も促進する。【００１５】
本発明の硬組織再生誘導用材料は、ゼラチンβ-TCPスポンジが組織再生のための良好な細胞足場として機能するため、足場を必要とする骨・軟骨等の硬組織の再生に好適に用いられる。しかしながら、その適用部位は硬組織に限定されず、骨・軟骨等の硬組織に接した軟組織であってもよい。具体的には、骨・軟骨に接した腱や靭帯等軟組織の移植手術においても、その血管新生促進作用により、腱や靭帯再生を誘導する。したがって、そのような硬組織に接した軟組織の再生を誘導するための使用もまた、本発明に含まれる。【００１６】
本発明で用いられる多血小板血漿は、硬組織再生誘導用材料の適用を受ける対象由来のものが好ましい。なお、本発明の硬組織再生誘導用材料の適用を受ける対象はヒトに限定されず、哺乳動物全般が含まれる。【００１７】
本発明で用いられるゼラチンβ-TCPスポンジの孔径は、10〜500μm程度であることが好ましく、ゼラチンβ-TCPスポンジ中のゼラチンは架橋されたものであることが好ましい。前記架橋は、β-TCPとゼラチンを含む組成物に、架橋と凍結乾燥を施して作製されるが、架橋と凍結乾燥はいずれが先でもよく、架橋を施した組成物を凍結乾燥してもよいし、凍結乾燥した組成物に架橋を施してもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明で用いられるPRPは硬組織再生誘導用材料の適用を受ける対象自身の血液から簡単に採取することができるため、治療上の倫理的問題も全くなく、血液製剤の使用に伴うウイルス感染や免疫不適合などのリスクを回避しうるという長所を有する。さらに、本発明で用いられるゼラチンβ-TCPスポンジは、PRPに含まれる成長因子等の成分を徐放させて、骨新生、軟骨新生、血管新生を促すとともに、組織再生のための良好な細胞足場として機能することで、顕著な骨再生を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ラット脊椎後側方固定モデルにおける4・5横突起間への移植を模式的に示した図である。
【図２】図２は、左右4・5横突起の矢状断再構成画像である。
【図３】図３は、横突起間の骨量を示すグラフである。
【図４】図４は、3点曲げ試験の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、PRPスポンジモデルの4・5横突起間の組織像を示す。横突起間に軟骨内骨化様の変化を認める。一方、〔比較〕においては、無設置群(術後8週間)‐横突起間には靭帯成分を認めるが、骨・軟骨成分は認めない。矢印は、いずれも左：第４横突起、右：第５横突起。上図右の画像はサフラニンＯ染色象。
【００２０】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００９−２４１０４１号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、多血小板血漿（PRP）とゼラチンβ-TCPスポンジを含む、硬組織再生誘導用材料に関する。
１．多血小板血漿（PRP）
本発明に係る「多血小板血漿（Platelet  Rich  Plasma：PRP）」とは、末梢血を低速で遠心分離して赤血球を除くことにより得られる濃厚血小板血漿である。PRPには、血小板中に含まれる血小板由来成長因子（PDGF）、トランスホーミング成長因子β（TGF-β）、幹細胞由来因子（SDF）-1、インスリン様成長因子（IGF）などの成長因子が多く含まれており、これらの相乗的作用により血管新生、骨新生、軟骨新生、創傷治癒の促進等の効果を有することが知られている。
【００２２】
PRP調製における遠心条件については、用いる遠心分離器の種類に応じて、血球成分を効率的に除去する回転数及び時間を適宜選択することができる。必要であれば、血球成分を除去した後、再度遠心分離することにより血小板を濃縮してもよい。あるいは、PRPは膜を用いた血液分離装置により調製することもできる。
【００２３】
本発明で用いられるPRPは、本発明の硬組織再生誘導用材料の投与を必要とする対象自身の自己血由来であることが好ましい。但し、重度の貧血や採血が困難である基礎疾患を有する対象においては、他家血から精製した多血小板血漿を使用してもよい。
【００２４】
２．ゼラチンβ-TCPスポンジ
本発明で使用されるゼラチンβ-TCPスポンジとは、ゼラチンとβ-TCP顆粒からなる多孔質のスポンジ状構造物のことである。
２．１  ゼラチン
本発明で使用されるゼラチンは、牛、豚、魚類などを始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの身体のあらゆる部位から採取できるコラーゲン、あるいはコラーゲンとして用いられている物質から、アルカリ加水分解、酸加水分解、及び酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。ゼラチンの性質は、用いる材料及び処理方法により様々であるが、そのいずれの性質をもつゼラチンも本発明のゼラチンβ-TCPスポンジ材料として利用することができる。
【００２５】
ゼラチンの性質を表す尺度としては、例えば、等電点、分子量、ジータ電位などがある。例えば、市販のゼラチンとしては、シグマ社製タイプＡゼラチン、和光社製ゼラチンがあり、水溶液中のジータ電位が以下のとおりである：
シグマ社製タイプＡゼラチン：約0〜約5mV
和光社製ゼラチン：約-5〜約-2mV
ジータ電位は、物質（ゼラチン）の静電的な荷電の程度を表す尺度である。
【００２６】
本発明で用いられる特に好ましいゼラチンは、以下の物性：
コラーゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンであり、
分子量が、SDS-PAGEの非還元条件下で約10〜約20万ダルトンであり、
水溶液中のジータ電位が、約-15〜約-20mVである
を有するゼラチンである。
【００２７】
また好ましくは、ウシの骨由来のＩ型コラーゲンをアルカリ処理して調製した酸性ゼラチンを用いることができ、新田ゼラチン社の試料等電点（IEP）5.0として入手することもできる。なお、酸処理して調製した塩基性ゼラチンは同じく新田ゼラチン社の試料IEP  9.0として入手することができるが、ジータ電位は以下のように大きく相違する。
酸性ゼラチン  （新田ゼラチン社試料IEP  5.0）：約-15〜約-20mV
塩基性ゼラチン  （新田ゼラチン社試料IEP  9.0）：約+12〜約+15mV
【００２８】
２．２  β-TCP（β-tricalcium  phosphate）
本発明で用いられるβ-TCP（リン酸三カルシウム）は、従来より人工骨材料として汎用されている生分解性セラミックスである。多孔性β-TCPの圧縮強度は3M  パスカル程度で、生体骨（海綿骨で７Ｍパスカル程度）よりは弱いものの、臨床使用には十分な強度といえる。さらに、β-TCPは生体内で徐々に分解してカルシウムイオンとリン酸イオンを放出し、骨芽細胞による、骨の構成成分であるハイドロキシアパタイト合成が容易な環境を実現する。つまり、β-TCPはドラッグデリバリーシステムの担体や骨形成の足場としてだけでなく、それ自体が骨新生、軟骨新生、血管新生等を積極的に促進させる機能を有する。かくして、β-TCPは、ゼラチンと混合されることで得られるゼラチンスポンジの力学強度を高めるとともに、それ自体も骨新生、軟骨新生、血管新生等を積極的に促進することで、良好な足場材料となる。本発明で用いられるβ-TCPは、そのサイズ、気孔率、孔サイズなどはどのようなものであってもよく、全ての種類のβ-TCP顆粒を用いることができる。例えば、市販のβ-TCP-100（粉砕品）：太平化学産業株式会社製、オスフェリン（登録商標）：オリンパス製等を用いることができる。
【００２９】
２．３  ゼラチンβ-TCPスポンジの構造
本発明のゼラチンβ-TCPスポンジにおけるゼラチンとβ-TCPの比率は、乾燥重量で10：1〜1：10、好ましくは5：1〜1：5である。
【００３０】
本発明に係るゼラチンβ-TCPスポンジは、平均孔径が10〜500μmである多数の微細小孔を有するスポンジ状のものである。このように多数の微細小孔を有する構造であることにより、移植した場合に、周辺の細胞がスポンジ内に容易に侵入することができ、組織再生の足場材料としての役割を果たすことが可能となる。更に、接着した細胞へ充分な栄養と酸素を供給することが可能となり、細胞を正常に増殖、分化させることができる。
【００３１】
本発明に係るゼラチンβ-TCPスポンジの微細小孔の平均孔径の下限は10μm、上限は500μmである。10μm未満であると、再生医療用支持体の内部に細胞が侵入できず細胞接着性が極端に劣ったり、接着した細胞が三次元的に伸展できなかったりし、500μmを超えると、細胞の密度が低くなり組織又は器官を再生できない。好ましい下限は50μm、好ましい上限は200μmである。
【００３２】
本発明のゼラチンβ-TCPスポンジにおいて、ゼラチンには架橋が施されている。架橋の度合（架橋度）を評価する指標として含水率がある。含水率は、膨潤ゼラチンβ-TCPスポンジの重量に対するスポンジ中の水の重量パーセントである。含水率が大きければゼラチンβ-TCPスポンジの架橋度は低くなり、分解されやすくなる。つまり、ゼラチンβ-TCPスポンジの生体内での酵素分解性は、この含水率によって変化し、含水率の値がPRPの徐放（徐々に放出）を左右する。
【００３３】
本発明のゼラチンβ-TCPスポンジは、含水率90％〜99.8％であることが好ましい。含水率が90％未満であると、移植に適する柔軟性を損なうことに加え、生体内に移植しても生分解に長時間を要し、生理活性物質が徐放されず支持体内に留まってしまうことがある。99.8％を超えると、支持体が培養液やバッファー中で強度を保つことができなかったり、1〜3日間という短い期間しか生理活性物質が徐放されなかったりすることがある。より好ましい下限は95％、より好ましい上限は98％である。
【００３４】
２．４  ゼラチンβ-TCPスポンジの作製方法
本発明で使用されるゼラチンβ-TCPスポンジは、ゼラチンとβ-TCPを含む組成物に、架橋と凍結乾燥を施して得られる。
【００３５】
具体的には、まず、ゼラチンにβ-TCPを配合する。次いで、ゼラチンに架橋を導入する。架橋方法は特に限定されず、例えば、真空熱脱水法、乾熱法、γ線照射法、紫外線照射法、電子線照射法、Ｘ線照射法、架橋剤を用いる方法等が挙げられる。なかでも、後述するようにいったんスポンジ状に成形した状態のゼラチンを架橋する場合であっても内部にまで均一の架橋度となるように架橋できることから架橋剤を用いる方法が好適である。
【００３６】
用いられる架橋剤は特に限定されず、例えばグルタルアルデヒド、例えばEDC等の水溶性カルボジイミド、例えばプロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基などの間に化学結合を作る縮合剤（エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレンジイソシアネート等）を用いることができる。好ましいものは、グルタルアルデヒドである。
【００３７】
架橋は、凍結乾燥前に行っても、凍結乾燥後に行ってもよい。具体的には、例えば、β-TCPを配合したゼラチン水溶液を、ホモジナイザー等により激しく攪拌して発泡させた後、架橋反応を行った後、型枠に流延し、凍結後更に凍結乾燥してスポンジ状の成形体を得るか、あるいはβ-TCPを配合したゼラチン水溶液を、ホモジナイザー等により激しく攪拌して発泡させた後、型枠に流延し、凍結後更に凍結乾燥してスポンジ状の成形体を得、このスポンジ状成形体を適当な濃度のグルタルアルデヒド溶液に一定時間浸漬することにより架橋を施す（特開２００５−２１１４７７号参照）。
【００３８】
アミノ基と反応するような、例えば、グルタルアルデヒドによる架橋反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいは、pH2.5以下の水溶液を添加すればよい。反応に用いられた架橋剤及び低分子物質を完全に除去する目的で、得られたゼラチンβ-TCPスポンジは、蒸留水、エタノール、2-プロパノール、アセトン等により洗浄し、再度凍結乾燥してもよい。
【００３９】
足場材料として重要なスポンジ構造は、攪拌による発泡と、凍結乾燥工程によって形成される。すなわち、凍結工程によって成長した無数の氷の結晶が、凍結乾燥によって気孔となり、所望の気孔率と気孔径を有する多孔質スポンジ構造を与える。
【００４０】
なお、グルタルアルデヒド等の架橋剤処理において、処理の初期にスポンジ状構造体が膨潤してしまうことを避ける目的で、処理前に熱架橋処理等を施しておいてもよい。また、架橋剤による架橋を行った場合には、反応末端を処理して毒性を除去することが好ましい。例えば、グルタルアルデヒド処理後には、グリシン水溶液等を用いて洗浄することにより、反応末端を失活させて毒性を除去することができる。
【００４１】
ゼラチンβ-TCPスポンジはいかなる形状に成形してもよく、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状などに成形できる。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、通常埋込片として用いられることが多く、あるいは細かく砕いて粒子状にして用いることも可能である。また、球状、粒子状のものは注射投与も可能である。
【００４２】
なお、ゼラチンβ-TCPスポンジは市販品（例えば、β-TCP強化型ゼラチンスポンジ  MedGel(登録商標)  ScaffoldあるいはMedGel(登録商標)  SP（メドジェル））を用いてもよい。
【００４３】
３．本発明の硬組織再生誘導用材料
本発明にかかる「硬組織」とは、骨、軟骨、歯を含む硬い細胞間物質を持つ組織を意味する。本発明の硬組織再生誘導用材料は、骨新生や軟骨新生、血管新生等の再生促進効果をもつPRPと、組織再生の足場として優れたゼラチンβ-TCPスポンジを含むことで、硬組織再生誘導用材料として用いられる。とくに、骨・軟骨組織欠損部の再生誘導用材料として好適に用いられる。
【００４４】
前述のとおり、本発明の硬組織再生誘導用材料は、細胞足場を必要とする骨・軟骨欠損部の再生誘導用材料に好適に用いられるが、その適用部位は硬組織に限定されず、骨・軟骨等の硬組織に接した軟組織であってもよい。具体的には、骨・軟骨に接した腱や靭帯等軟組織の移植手術においても、PRPの血管新生促進作用により、腱や靭帯の再生を誘導する。したがって、そのような硬組織に接した軟組織の再生を誘導するための使用もまた、本発明に含まれる。
【００４５】
本発明の硬組織再生誘導用材料は、整形外科、歯科領域を含む医学・獣医学分野において広く使用可能であり、その適用を受ける対象はヒトに限定されず、哺乳動物全般が含まれる。
【００４６】
本発明の硬組織再生誘導用材料は、上記したゼラチンβ-TCPスポンジにPRPを配合して調製される。PRP含有ゼラチンβ-TCPスポンジは、例えば、上記の凍結乾燥したゼラチンβ-TCPスポンジにPRPを滴下するか、あるいはゼラチンβ-TCPスポンジをPRP中に浸漬させ、スポンジ内にPRPを含浸させることにより得ることができる。この含浸操作は、通常、4〜37℃で15分間〜1時間、好ましくは4〜25℃で15〜30分間で終了し、その間にスポンジはPRPで膨潤し、PRP中に含まれるの成長因子等がスポンジ内のゼラチン分子と相互作用することによって、成長因子等がゼラチン分子と複合体を形成することで、PRPがゼラチンβ-TCPスポンジ内に物理的相互作用によって固定される。PRPとゼラチン分子との間の複合体の形成には、両者の間の静電的相互作用だけでなく、疎水結合、水素結合等の他の相互作用も大きく寄与していると考えられる。
【００４７】
ゼラチンβ-TCPスポンジ（乾燥重量）に対するPRPの重量比は約１倍〜約10000倍の範囲内であることが好ましい。より好ましくは、ゼラチンβ-TCPスポンジに対してPRPは約2倍〜約5000倍の重量比であり、さらに好ましくは約10倍〜約1000倍の重量比である。
【００４８】
本発明の硬組織再生誘導用材料は、患部に直接包埋（適用）され、それぞれの用途に応じて適宜剤型を工夫することができる。すなわち、ゼラチンβ-TCPスポンジを、その適用部位に合わせて、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状など、所望の形態に成形すればよい。
【００４９】
本発明の硬組織再生誘導用材料中のPRPの用量は、疾患の重篤度、対象の年齢、体重等により適宜調製することができるが、通常ヒトの場合であれば、成人患者当たり約0.1〜約500ｍｌの範囲、好ましくは、約1〜約50ｍｌの範囲から投与量が選択され、これを患部又はその周辺部位に注入することができる。また１回の投与で効果が不十分であった場合は、該投与を複数回行うことも可能である。
【００５０】
本発明の硬組織再生誘導用材料は、必要に応じて、適宜他の薬剤や薬理学的に許容しうる担体を含有していてもよい。そのような薬剤や担体としては、血管新生や骨再生を促進する薬剤、骨芽細胞の活性化又は破骨細胞の抑制剤、細胞の増殖分化を促す足場担体、あるいはそれらの組合せ等が挙げられる。
【００５１】
４．本発明の硬組織再生誘導用材料の効果
４．１  PRP徐放性効果
本発明の硬組織再生誘導用材料は、PRPの徐放性効果と安定化効果を併せ持つため、PRPに含まれる各種成長因子等の機能を少量で長時間にわたって発揮し得る。そのため、局所投与した部位において、これらの成長因子等の血管新生促進機能及び骨新生・軟骨新生機能が効果的に発揮される。
【００５２】
この徐放のメカニズムは、PRPに含まれる各種成長因子等が、スポンジ内のゼラチンβ-TCPに物理的に固定化されていることに基づく。本発明者らは、これまで、成長因子、サイトカイン、モノカイン、リンホカイン、その他の生理活性物質などの生体吸収性高分子ハイドロゲルを用いた徐放化を試み、これにより他の材料では達成できない生理活性を有した成長因子等の徐放化とその徐放期間のコントロールに成功してきた。本発明においては、PRPに含まれる成長因子等が同様のメカニズムによってゼラチンβ-TCPから徐放されると考えられる。ゼラチンβ-TCPに固定化された状態では、成長因子等はスポンジから放出されない。生体内でゼラチンβ-TCPスポンジが分解されるにつれて、ゼラチンβ-TCP分子が水可溶性となり、それに伴って、ゼラチンβ-TCP分子に固定化されている成長因子等が放出されるようになる。すなわち、ゼラチンβ-TCPスポンジの分解によって、成長因子等の徐放性を制御することができる。ゼラチンβ-TCPスポンジの分解性は、ゼラチンβ-TCPスポンジ作製時における架橋程度を調節することにより変えることができる。また、PRPに含まれる各種成長因子等がゼラチンβ-TCPと相互作用することによって、これらの生体内での安定性、例えば酵素分解抵抗性などが向上する。また、成長因子等の徐放化に伴ない、ゼラチンβ-TCPスポンジは消失するため、細胞の増殖分化による骨再生過程を物理的に阻害しないという特徴を持つ。
【００５３】
４．２  血管新生促進及び骨新生・軟骨新生促進効果
本発明の硬組織再生誘導用材料に配合されるPRPは、各種成長因子等を含み、血管新生促進効果、骨新生促進効果、軟骨新生促進効果、創傷治癒促進効果、皮膚潰瘍治療効果等のさまざまな効果を有する（前掲）。
【００５４】
後述する実施例に示すように、発明者らは、本発明の硬組織再生誘導用材料が顕著な骨再生作用を有することを確認した。骨形成には、血管新生の関与も報告されており、骨新生・軟骨新生促進効果のみならず、血管新生促進効果等、PRPの有する種々の効果が寄与することで、欠損部における組織再生が促進され、良好な骨再生が達成される。
【００５５】
４．３  足場材料としての効果
本発明の硬組織再生誘導用材料は、架橋されたゼラチンβ-TCPスポンジを主体とし、一定の孔径の多数の微細小孔を有する基材からなることにより細胞が容易に浸入することができ、再生の足場材料としての役割を果たすことができる。また、基材の表面にはPRP成分が静電結合しており基材の分解に合わせて徐放されることから、長期間に渡って細胞に該PRP成分を作用させ続けることができ、骨形成効果を飛躍的に増大させることができる。この徐放速度は、ゼラチンの架橋度を調整することにより調節することが可能である。即ち、本発明の硬組織再生誘導用材料は、再生のための足場材料と再生促進剤の２つの役割を同時に果たし得るものである。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００５７】
実施例
１．多血小板血漿の（PRP）調製
SDラット(雄性、8週齢、240〜290g、清水実験材料、京都)、250μLのペントバルビタールを腹腔内注射し全身麻酔を行った。開胸し、21G針を用いて心臓から5CCの採血を行った。あらかじめACD-A液(W/V%:  クエン酸0.85、クエン酸三ナトリウム2.32、グルコース2.59)を2CC入れておいた15  cc遠心チューブに、血液を移した。遠心チューブを、遠心分離機(KN-70、久保田製作所製)を用いて1500回転で10分間遠心分離した。遠心分離後、上層にある透明な血清部分を、14Gサーフロー針を用いて吸引し、別の遠心チューブに移した。さらに、3000回転で10分間遠心分離した。上層の血清部分を、14Gサーフロー針を用いて、200μL残して吸引し、残った溶液を撹拌し、多血小板血漿（PRP）200μLを得た。得られた200μLのPRPを、一片2mmの立方体に切断したゼラチンβ-TCPスポンジ（β-TCP強化型ゼラチンスポンジ  MedGel(登録商標)  Scaffold（メドジェル））計20mgに含浸させ、4℃で一晩放置した。対照として、Phosphate  buffer  saline(以下、PBS)200μLを同形同量のゼラチンβ-TCPスポンジに含浸させ、4℃で一晩放置した。【００５８】
２．ラット脊椎後側方固定モデル
SDラット(雄性、8週齢、240〜290g、清水実験材料、京都)に、250μLのペントバルビタールを腹腔内注射し全身麻酔を行った。背部正中の皮膚に40mmの縦切開を加えた。正中から左右5mmの位置で、傍脊柱筋に25mmの縦切開を加え、第4及び5腰椎の横突起(以下、4・5横突起)を両側露出させた。先端が直径0.5mmのスチールバー  (オサダサクセス-40M、OS-40MV、長田電機工業社製)を用いて、横突起の背側皮質骨を、骨髄からの出血が確認できるまで掘削した。左右の4・5横突起間に以下に示すマテリアルを移植し、切開した傍脊柱筋と皮膚を3-0  ナイロン糸(社製で)縫合した。移植するマテリアルは1:  PRP含浸ゼラチンβ-TCPスポンジ(以下PRPスポンジ)、2:  PBS  (phosphate  buffer  saline)含浸ゼラチンβ-TCPスポンジ(MedGel(登録商標)  Scaffold（メドジェル）：以下、PBSスポンジ)、3:  PRP単独、4:  自家腸骨とし、何も移植しない群と合わせて、計5群で検討を行った。3のPRP単独モデルでは、200μLのPRP  のみを横突起間に散布した。4の自家腸骨は移植予定部と同側の腸骨先端を5×2×2mmの大きさで採取した。図１に、ラット脊椎後側方固定モデルにおける4・5横突起間への移植を模式的に示す。【００５９】
３．骨形成の評価及び力学的強度の評価
手術後8週間でペントバルビタールの大量投与で安楽死させ、腰椎を摘出した。μCT(マイクロフォーカス2D/3D  X線CT装置、ScanXmate-E090S40、コムスキャンテクノ社製)を用いて4・5横突起の矢状断再構成画像を作成し、横突起間の癒合の有無を評価した。また、得られた画像を元に、画像解析ソフト(FanCT  ver1.3  コムスキャンテクノ社製)を用いて横突起間のみを抽出し、骨量を計測した。その後、3点曲げ試験機(東京試験機、LSC-200/30-2)を用い腰椎の3点曲げ試験を行った。幅40mmの間隔をあけた治具の上に、腰椎を前方が上に向くように設置し、直径5mmの円柱治具を用いて、10mm/minの早さで第4/5腰椎椎間板前方に圧迫力をかけた。変位距離が10mmの時点での荷重を各群で比較した。次に、4%パラホルムアルデヒドで、1週間、4℃で組織固定を行った。0.5MEDTA(ethylenediaminetetraacetic  acid)液で、2週間、脱灰を行った後、20%スクロースに2日間浸漬させた。4・5横突起間断面の凍結組織切片(厚さ12μm)を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色およびサフラニンＯ染色(軟骨基質を赤染)を行った。【００６０】
４．結果
図２に、左右4・5横突起の矢状断再構成画像の結果を示す。PRPスポンジモデル及び自家腸骨モデルでは左右横突起間の癒合傾向が認められた。また、PRPスポンジモデルでは、自家腸骨モデルに比べて、著しい横突起前後径の増大が認められた。PBSスポンジ、PRP単独及び無設置モデルでは横突起間の増大はなく、骨癒合傾向は認められなかった。【００６１】
図３に、左右4・5横突起間の骨量を示す。PRPスポンジモデルでは、他のモデルに比べて著しい骨量の増大が認められた。【００６２】
図４に、3点曲げ試験の結果を示す。PRPスポンジモデルでは、他群に比べて平均59.6倍の強度が認められた。【００６３】
図５に、PRPスポンジモデルの4・5横突起間の組織像を示す。横突起間では、骨基質および硝子軟骨成分が混在した像を呈しており、軟骨内骨化に類似した現象が生じていた。サフラニンＯ染色では、硝子軟骨周辺の一部が赤染色像を呈しており、軟骨基質であることが証明された。比較として、無設置群の4・5横突起間の組織像  (術後8週間)  を示す。図５に示されるように、横突起間には靭帯成分を認めるが、骨・軟骨成分は認めない。【００６４】
５．結論
以上の結果から、PRPとゼラチンβ-TCPスポンジを組み合わせることにより、自家骨移植を上回る、極めて高い骨・軟骨形成能が達成され、癒合部位における力学的強度が著明に増強することが証明された。【００６５】
参考例．ゼラチンβ-TCPスポンジの作製
ゼラチンとしては、新田ゼラチン社製の酸処理品（酸処理ゼラチン）を用いた。また、β-TCPとしては、β-TCP-100(粉砕品)（太平化学産業株式会社）を用いたが、オスフェリンを用いてもよい。【００６６】
酸処理ゼラチンを蒸留水に溶解して3重量％のゼラチン水溶液を調製した。得られたゼラチン水溶液60mLにβ-TCP  1.8gを配合し、0.16重量％グルタルアルデヒド水溶液0.4ｍLとを加えて、ホモジナイザーで、5000rpm、3分間攪拌することにより発泡させた。発泡したゼラチンβ-TCP水溶液を12cm×12cmの型枠に流延し、4℃、12時間静置して架橋反応を行った後、−40℃にて凍結した後、凍結乾燥を行いスポンジ体を得た。【００６７】
得られたスポンジ体を、0.1Nグリシン水溶液を用いて1時間洗浄を3回行った後、更に水洗し、再度凍結乾燥してゼラチンβ-TCPスポンジを得た。【００６８】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明で用いられる多血小板血漿は硬組織再生誘導用材料の適用を受ける対象自身の血液を遠心操作するだけで精製できるため、特別な施設や機器を必要とせず、多施設での実施が可能である。また、自己血由来の多血小板血漿を用いるため、遺伝子組換え成長因子に比べて、副作用の生じる可能性は極めて低い。さらにゼラチンβ-TCPスポンジは臨床で使用されている材料のみを使用しており人体への安全性が高いため、本発明の硬組織再生誘導用材料は極めて迅速な臨床応用が期待できる。本発明の普及により、従来から一般的に行われてきた自家骨採取の必要性が劇的に減少するだけでなく、骨形成能促進作用により早期荷重や早期リハビリテーションが可能となることから、その恩恵は計り知れない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年3月18日(2011.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多血小板血漿及びゼラチンβ−ＴＣＰスポンジを含む、硬組織再生誘導用材料。
【請求項２】
ゼラチンβ−ＴＣＰスポンジを構成するゼラチンが酸性ゼラチンである、請求項１に記載の材料。
【請求項３】
硬組織が骨・軟骨組織である、請求項１又は２に記載の材料。
【請求項４】
骨新生又は軟骨新生を促進するためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の材料。
【請求項５】
血管新生を促進するためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の材料。
【請求項６】
多血小板血漿が硬組織再生誘導用材料の適用を受ける対象由来のものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の材料。
【請求項７】
ゼラチンβ−ＴＣＰスポンジの孔径が１０〜５００μｍである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の材料。
【請求項８】
ゼラチンβ−ＴＣＰスポンジ中のゼラチンが架橋されたものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の材料。
【請求項９】
ゼラチンβ−ＴＣＰスポンジが、β−ＴＣＰとゼラチンを含む組成物に、架橋と凍結乾燥を施して作製されたものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の材料。
【国際調査報告】
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