(57)【要約】  本発明は、miR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む、腫瘍、特に薬剤耐性がんの治療剤、腫瘍の転移を抑制または予防する剤、がん再発を抑制または予防する剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
miR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む、腫瘍の治療剤。
【請求項２】
核酸が一本鎖または二本鎖である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
miR27bが配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチドである、請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
核酸が配列番号１で表されるヌクレオチド配列またはその部分配列からなるＲＮＡ、或いはその修飾体である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項５】
核酸が配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるＲＮＡまたはその修飾体である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項６】
miR27bを含む核酸が、miR27bおよびその前駆体からなる群から選ばれる少なくとも一種の核酸である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項７】
前駆体が、miR27bのpri-miRNAまたはpre-miRNAである、請求項６に記載の治療剤。
【請求項８】
腫瘍が薬剤耐性がんである、請求項１に記載の治療剤。
【請求項９】
腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、請求項８に記載の治療剤。
【請求項１０】
腫瘍の転移を抑制または予防するための、請求項１に記載の治療剤。
【請求項１１】
がん再発を抑制または予防するための、請求項１に記載の治療剤。
【請求項１２】
がんが乳がんまたは肺がんである、請求項１１に記載の治療剤。
【請求項１３】
（A） miR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
（B） 抗腫瘍剤
とを併用してなる腫瘍の治療剤。
【請求項１４】
腫瘍が薬剤耐性がんである、請求項1３に記載の治療剤。
【請求項１５】
腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、請求項1３に記載の治療剤。
【請求項１６】
腫瘍におけるmiR27bの発現レベルもしくは濃度を測定すること、および該発現レベルもしくは該濃度と薬剤耐性との間の負の相関に基づき、薬剤耐性がんを判定する方法。
【請求項１７】
腫瘍におけるmiR27bの発現レベルを測定することにより、がん幹細胞を判定する方法。
【請求項１８】
がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍におけるmiR27bの発現レベルもしくは濃度を測定し、がん幹細胞の有無を判定することにより、がん治療の予後を判定する方法。
【請求項２０】
がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
miR27bを特異的に検出し得る核酸プローブを含む、薬剤耐性がんを判定するための剤。
【請求項２２】
miR27bを特異的に検出し得る核酸プローブを含む、がん幹細胞を判定するための剤。
【請求項２３】
がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、請求項２２記載の剤。
【請求項２４】
以下の工程を含む、薬剤耐性がんの増殖を抑制し得る物質を探索する方法：
（１）被検物質とmiR27bの発現を測定可能な細胞とを接触させること；
（２）被検物質を接触させた細胞におけるmiR27bの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR27bの発現量と比較すること；並びに
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、miR27bの発現量を上昇制御する被検物質を、薬剤耐性がんの増殖を阻害し得る物質として選択すること。
【請求項２５】
以下の工程を含む、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法：
（１）被検物質とmiR27bの発現を測定可能な細胞とを接触させること；
（２）被検物質を接触させた細胞におけるmiR27bの発現量を測定し、該発現量を被検物質
を接触させない対照細胞におけるmiR27bの発現量と比較すること；並びに
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、miR27bの発現量を上昇制御する被検物質を、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の治療剤、特に薬剤耐性がんの細胞増殖抑制剤、腫瘍の転移を抑制または予防する剤、がん再発を抑制または予防する剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、RNA干渉（RNA interference：RNAi）技術は、生命科学研究に頻繁に利用され、その有用性は広く確認されている。RNAiとは、二本鎖RNAによって、その配列特異的にmRNAが分解され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象をいう。2001年に21塩基の低分子二本鎖RNAが哺乳動物細胞内でRNAiを媒介できることが報告されてから（非特許文献１）、siRNA（small interference RNA）は、標的遺伝子の発現抑制方法として頻用されている。siRNAは、医薬品への応用や、がんを含む種々の難治性疾患の治療への応用が期待されている。【０００３】
miRNA（マイクロRNA）は、ゲノム上にコードされた内在性の20〜25塩基程度の非コード（non-coding）RNAである。miRNAは、ゲノムDNA上のmiRNA遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（Primary miRNA。以下「Pri-miRNA」という）として転写され、次にプロセッシングを受けて約60〜70塩基程度のヘアピン構造を有するpre-miRNA（precusor miRNA）となる。その後、核から細胞質内へ移動し、さらにプロセッシングを受けて20〜25塩基程度の二本鎖成熟miRNAとなる。二本鎖成熟miRNAは、そのうちの一本鎖がRISCと呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、標的遺伝子のmRNAに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。【０００４】
miRNAは、ヒトやマウスなどで1000種類以上が知られており、それぞれが複数の標的遺伝子の発現を調節し、細胞の増殖や分化など、様々な生命現象に関与することが示唆されている。例えば、造血細胞や神経細胞の分化などに関与するmiRNAについての報告がある（例えば、非特許文献２参照）。また、がん細胞の増殖に関与するmiRNAについても報告があり、miRNAの発現パターンをがんの臨床診断に利用することや、miRNAの発現を抑制することでがん細胞の増殖を抑制するがんの治療法について、提案がなされている（例えば、特許文献１，２参照）。【０００５】
一方、がん化学療法における最大のハードルはがん細胞の薬剤耐性の獲得であることが広く知られている。耐性獲得のメカニズムとしては、薬物トランスポーターの１種であるABCトランスポーターの発現上昇や糖鎖修飾酵素であるRPN2遺伝子の発現上昇（非特許文献３)など諸説が提唱されており、近年はがん幹細胞のもつ強力な抗がん剤排出能力が注目されている(非特許文献４)。【０００６】
マイクロRNA-27b(miR27b)は、乳がん細胞(非特許文献５)、前立腺がん細胞（特許文献３）、膵臓がん細胞(特許文献４)などの各種がん細胞で発現が認められている。生理機能面では、非特許文献５では、乳がん低転移細胞であるZR75細胞にmiR27bを強制発現すると細胞増殖が促進されることが述べられている。しかしながら、miR27bについて薬剤耐性がん細胞との関連を報告した文献はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−８６２０１公報
【特許文献２】特開２００６−５０６４６９公報
【特許文献３】国際公開第２００８／１１２２８３号
【特許文献４】国際公開第２００９／０７５７８７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Elbashir SM et. al. Nature 411:494-498(2001)
【非特許文献２】Science 303: 654 83-86 (2004)
【非特許文献３】Nature Medicine 14, 939-948, 2008
【非特許文献４】実験医学 vol.26 No.8 2008
【非特許文献５】J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 34, 23094-23106, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、腫瘍の治療剤、特に薬剤耐性がんの治療剤、腫瘍の転移を抑制または予防する剤、がん再発を抑制または予防する剤、前記剤を利用した医薬、薬剤耐性がんを判定する方法、がん幹細胞を判定する方法、がん治療の予後を予測する方法、薬剤耐性がんまたはがん幹細胞を判定するための剤、薬剤耐性がんの増殖を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法、および腫瘍の転移を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、miR27bの機能解析を鋭意行った結果、薬剤耐性がん細胞においてmiR27bの発現が顕著に減少しており、薬剤耐性がん細胞にmiR27bを恒常発現させると薬剤耐性がん細胞の増殖が抑制されることを見出した。薬剤排出ポンプ分子であるMDR1が高発現しているがん細胞は抗がん剤耐性となることが知られているが、miR27bはMDR1発現を抑制することも新たに判明した。
また、本発明者らは、がん細胞にmiR27bを導入することによりRPN2の発現が抑制されることを新たに見出した。RPN2については、RPN2発現を抑制すればがん転移が抑制されることが知られている（Nat. Med. 2008 Sep; 14(9): 939-48）。
さらに、がん幹細胞は、一般的な抗腫瘍剤に抵抗性があり、腫瘍の再発や転移に深く関与しているといわれているが、このがん幹細胞においてmiR27bの発現量が低下していることが判明し、乳がん幹細胞にpre-miR27bを導入するとCD44発現細胞が抑制され、がん幹細胞の割合が減少することを新たに見出した。
本発明者らは、これらの知見により、(1)miR27bは薬剤耐性がんの治療に有用である、(2)miR27bはRPN2の発現を抑制することによりがん転移を抑制することができる、(3)miR27bはがん幹細胞分化療法に有用である、(4)miR27bの発現を指標に薬剤耐性がんやがん幹細胞を判定することができる、ことを見出して本発明を完成させた。【００１１】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］miR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む、腫瘍の治療剤。
［２］核酸が一本鎖または二本鎖である、［１］に記載の治療剤。
［３］miR27bが配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチドである、［１］に記載の治療剤。
［４］核酸が配列番号１で表されるヌクレオチド配列またはその部分配列からなるRNA、或いはその修飾体である、［１］に記載の治療剤。
［５］核酸が配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるRNAまたはその修飾体である、［１］に記載の治療剤。
［６］miR27bを含む核酸が、miR27bおよびその前駆体からなる群から選ばれる少なくとも一種の核酸である、［１］に記載の治療剤。
［７］前駆体が、miR27bのpri-miRNAまたはpre-miRNAである、［６］に記載の治療剤。
［８］腫瘍が薬剤耐性がんである、［１］に記載の治療剤。
［９］腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、［８］に記載の治療剤。
［１０］腫瘍の転移を抑制または予防するための、［1］に記載の治療剤。
［１１］がん再発を抑制または予防するための、［１］に記載の治療剤。
［１２］がんが乳がんまたは肺がんである、［１１］に記載の治療剤。
［１３］（A） miR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
（B） 抗腫瘍剤
とを併用してなる腫瘍の治療剤。
［１４］腫瘍が薬剤耐性がんである、［１３］に記載の治療剤。
［１５］腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、［１３］に記載の治療剤。
［１６］腫瘍におけるmiR27bの発現レベルもしくは濃度を測定すること、および該発現レベルもしくは該濃度と薬剤耐性との間の負の相関に基づき、薬剤耐性がんを判定する方法。
［１７］腫瘍におけるmiR27bの発現レベルを測定することにより、がん幹細胞を判定する方法。
［１８］がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、［１７］記載の方法。
［１９］腫瘍におけるmiR27bの発現レベルもしくは濃度を測定し、がん幹細胞の有無を判定することにより、がん治療の予後を判定する方法。
［２０］がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、［１９］記載の方法。
［２１］miR27bを特異的に検出し得る核酸プローブを含む、薬剤耐性がんを判定するための剤。
［２２］miR27bを特異的に検出し得る核酸プローブを含む、がん幹細胞を判定するための剤。
［２３］がん幹細胞が乳がん幹細胞または肺がん幹細胞である、［２２］記載の剤。
［２４］以下の工程を含む、薬剤耐性がんの増殖を抑制し得る物質を探索する方法：
（１）被検物質とmiR27bの発現を測定可能な細胞とを接触させること；
（２）被検物質を接触させた細胞におけるmiR27bの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR27bの発現量と比較すること；並びに
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、miR27bの発現量を上昇制御する被検物質を、薬剤耐性がんの増殖を阻害し得る物質として選択すること。
［２５］以下の工程を含む、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法：
（１）被検物質とmiR27bの発現を測定可能な細胞とを接触させること；
（２）被検物質を接触させた細胞におけるmiR27bの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR27bの発現量と比較すること；並びに
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、miR27bの発現量を上昇制御する被検物質を、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。
［２６］哺乳動物に対して、有効量のmiR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍を治療する方法。
［２７］腫瘍が薬剤耐性がんである、［２６］に記載の方法。
［２８］腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、［２６］に記載の方法。
［２９］哺乳動物に対して、有効量のmiR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の転移を抑制または予防する方法。
［３０］哺乳動物に対して、有効量のmiR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を投与することを含む、該哺乳動物におけるがん再発を抑制または予防する方法。
［３１］がんが乳がんまたは肺がんである、［３０］に記載の方法。
［３２］哺乳動物に対して、有効量の
（A） miR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
（B） 抗腫瘍剤
を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の治療方法。
［３３］腫瘍が薬剤耐性がんである、［３２］に記載の方法。
［３４］腫瘍が薬剤耐性乳がんまたは薬剤耐性肺がんである、［３２］に記載の方法。
［３５］哺乳動物に対して、有効量の
（A） miR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
（B） 抗腫瘍剤
を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の転移を抑制または予防する方法。
［３６］哺乳動物に対して、有効量の
（A） miR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸と、
（B） 抗腫瘍剤
を投与することを含む、該哺乳動物におけるがん再発を抑制または予防する方法。
［３７］がんが乳がんまたは肺がんである、［３６］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、腫瘍の治療剤、特に薬剤耐性がんの治療剤、腫瘍の転移を抑制または予防する剤、がん再発を抑制または予防する剤、および前記剤を利用した医薬を提供することができる。
また本発明により、薬剤耐性がんを判定する方法、がん幹細胞を判定する方法、がん治療の予後を判定する方法、薬剤耐性がんまたはがん幹細胞を判定するための剤、薬剤耐性がんの増殖を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法、および腫瘍の転移を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法等も提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】MCF7細胞とMCF7-ADR細胞におけるmiR27bの発現量を示す図である。
【図２】miR27bによるRPN2の発現抑制を示す図である。
【図３】miR27bによるMDR1の発現抑制を示す図である。
【図４】乳がん細胞と乳がん幹細胞におけるmiR27bの発現量を示す図である。
【図５】miR27bによるCD44の発現抑制を示す図である。
【図６】miR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞の細胞増殖を示す図である。
【図７】miR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞のがん幹細胞群の存在比率を示す図である。
【図８】PC14細胞とPC14-CDDP細胞におけるmiR27bの発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
１．本発明の剤
本発明者らは、今回このmiR27bが、(1)薬剤耐性がん細胞の増殖を抑制する機能を有すること（実施例参照、後述）、(2)RPN2発現抑制活性を有するので（実施例参照、後述）、がん細胞の転移を抑制する機能を有すること、(3)がん幹細胞分化療法に有効であるので（実施例参照、後述）、がん再発を抑制または予防する機能を有すること、を見出し、miR27bが腫瘍治療剤の有効成分として利用可能であることを見出した。
即ち、本発明は、miR27bまたは配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり且つmiR27bと同等の機能を有するヌクレオチドを含む核酸を含む剤を提供するものである。
すなわち、本発明の剤は、薬剤耐性がんの治療剤乃至細胞増殖抑制剤、腫瘍の転移の抑制または予防剤、およびがん再発を抑制または予防する剤として有用である。
【００１６】
本発明の核酸は、RNA、RNAとDNAのキメラ核酸（以下、キメラ核酸と称する）またはハイブリッド核酸である。ここにおいて、キメラ核酸とは、１本鎖又は２本鎖の核酸において一本の核酸の中にRNAとDNAを含むことをいい、ハイブリッド核酸とは、二本鎖において、一方の鎖がRNAまたはキメラ核酸でもう一方の鎖がDNAまたはキメラ核酸である核酸をいう。
【００１７】
本発明の核酸は、1本鎖または2本鎖である。2本鎖の態様には、2本鎖RNA、2本鎖キメラ核酸、RNA／DNAハイブリッド、RNA／キメラ核酸ハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッドおよびキメラ核酸／DNAハイブリッドが含まれる。本発明の核酸は、好ましくは1本鎖RNA、1本鎖キメラ核酸、2本鎖RNA、2本鎖キメラ核酸、RNA／DNAハイブリッド、RNA／キメラ核酸ハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッドまたはキメラ核酸／DNAハイブリッドであり、より好ましくは1本鎖RNA、1本鎖キメラ核酸、2本鎖RNA、2本鎖キメラ核酸、RNA／DNAハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッドまたはRNA／キメラ核酸ハイブリッドである。
【００１８】
本発明の核酸の長さは、哺乳動物（好ましくはヒト）の腫瘍細胞の浸潤能を阻害する活性を有する限り、その長さに上限はない。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、本発明の核酸の長さは、例えば約200塩基以下、好ましくは約130塩基以下、より好ましくは約50塩基以下であり、最も好ましくは30塩基以下である。下限としては、例えば15塩基以上、好ましくは、17塩基以上である。なお、核酸がヘアピンループ型の構造をとることにより2本鎖構造状を形成する場合の核酸の長さは、1本鎖の長さとして考えるものとする。
【００１９】
miR27bは、すでに公知の分子であり、代表的には、成熟型miRNAと呼ばれているものを意味する。ここで、miR27bには、miR27bのisomerも含まれる。具体的には、例えば、配列番号１（MIMAT0000419)で表されるヌクレオチド配列からなるヌクレオチドを意味する。成熟型miR27bとは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなる1本鎖または２本鎖のRNAを意味する。
【００２０】
本発明の核酸は、腫瘍細胞内へ取り込まれると、薬剤耐性がん細胞の増殖抑制活性、腫瘍細胞の浸潤能を抑制する活性、またはがん再発を抑制する活性を有する。本発明において、「miR27bと同等の機能を有するヌクレオチド」とは、miR27bの標的mRNAと生体条件で（例えば0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.0) 25℃で）ハイブリッドを形成するものを意味する。さらに、具体的には、miR27bの標的mRNAと生体条件で（例えば0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.0) 25℃で）ハイブリッドを形成するヌクレオチドを意味する。miR27bの標的mRNAとしては、例えばRPN2やMDR1やCD44を挙げることができる。「miR27bと同等の機能を有するヌクレオチド」は、miR27bの標的mRNAのうち少なくとも１つの標的mRNAとハイブリッドを形成し、該標的mRNAの機能を抑制することができるヌクレオチドであればよい。
【００２１】
腫瘍細胞は、通常、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト、好ましくはヒト）の細胞である。腫瘍の種類としては、乳腺がんや乳管がんを含めた乳がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、骨肉腫、食道がん、肝臓がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、脳腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、腎がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、睾丸腫瘍、カポジ肉腫、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、筋肉腫、皮膚がんなどの固形がん、骨髄腫、白血病等が例示できる。本発明においては、具体的には薬剤耐性がんが好ましい。核酸が薬剤耐性がんの細胞増殖を阻害する活性を有するか否かは、実施例１に記載のMCF7−ADR細胞や実施例８のPC14-CDDP細胞のように、薬剤耐性がん細胞株を用いることにより確認することが出来る。また、核酸が腫瘍細胞の浸潤能を阻害する活性を有するか否かは、例えば以下のアッセイにより確認することが出来る。
即ち、転移能を有するヒト骨肉腫細胞株である143B細胞を1x106細胞/6cm dishで終夜培養後、DharmaFECT transfection（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）によって核酸を30nM導入する。48時間後の細胞を用いてCytoSelectTM 96-Well Cell Invasion Assay kit（Cell Biolab社製）により、細胞浸潤アッセイを行い、20時間後の浸潤細胞数を計測する。
【００２２】
本発明において用いられる「miR27bと同等の機能を有するヌクレオチド」のヌクレオチド配列は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の同一性を有する。
【００２３】
「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのヌクレオチド配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（%）を意味する。
【００２４】
本明細書において、ヌクレオチド配列における同一性は、例えば相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST-2（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝5ペナルティ；ギャップエクステンション＝2ペナルティ；x_ドロップオフ＝50；期待値＝10；フィルタリング＝ON）にて2つのヌクレオチド配列をアラインすることにより、計算することができる。
【００２５】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列としては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列において１もしくは複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入または付加されたヌクレオチド配列、例えば、(1)配列番号１で表されるヌクレオチド配列中の1〜6個（好ましくは1〜3個、より好ましくは1または2個）のヌクレオチドが欠失したヌクレオチド配列、(2)配列番号１で表されるヌクレオチド配列に1〜6個（好ましくは1〜3個、より好ましくは1または2個）のヌクレオチドが付加されたヌクレオチド配列、(3)配列番号１で表されるヌクレオチド配列に1〜6個（好ましくは1〜3個、より好ましくは1または2個）のヌクレオチドが挿入されたヌクレオチド酸配列、(4)配列番号１で表されるヌクレオチド配列中の1〜6個（好ましくは1〜3個、より好ましくは1または2個）のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されたヌクレオチド配列、または(5)上記(1)〜(4)の変異が組み合わせれたヌクレオチド配列（この場合、変異したヌクレオチドの総和が、1〜6個（好ましくは1〜3個、より好ましくは1または2個））である。
【００２６】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有するヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列に含まれる連続する15塩基以上（好ましくは17塩基以上、より好ましくは19塩基以上、最も好ましくは20塩基）の部分配列またはそれを含む配列である。
【００２７】
本明細書において、核酸が「miR27b」や「miR27bと同等の機能を有するヌクレオチド」を含むとは、該核酸のヌクレオチド配列中に「miR27b」や「miR27bと同等の機能を有するヌクレオチド」のヌクレオチド配列が含まれることを意味する。
【００２８】
天然型の核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によって容易に分解されるので、本発明の核酸は、各種分解酵素に対して抵抗性となるように修飾し、修飾体としてもよい。本発明の修飾体には、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と70%以上の同一性を有し、且つ、miR27bと同等の機能を有するヌクレオチドの範囲で、配列の修飾も含めた各種修飾をされた修飾体が含まれる。修飾体における修飾の例としては、例えば、糖鎖部分が修飾されているもの（例えば、2’-Oメチル化）、塩基部分が修飾されているもの、リン酸部分やヒドロキシル部分が修飾されているもの（例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等）を挙げることができるが、これに限定されない。
また、核酸自体を修飾してもよい。また、例えば、miR27bと同一の領域と、その配列と60%〜100%未満相補的である相補領域とを含む合成核酸であってもよい。WO 2006/627171に記載のような合成RNA分子としてもよい。
【００２９】
本発明の核酸は、5’または3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常5塩基以下である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の核酸の好ましい態様としては、成熟型miR27b、その前駆体等の核酸を挙げることができる。本発明の核酸の好ましい別の態様としては、成熟型miRNAと同様の活性を有するヌクレオチドを含む核酸、例えば、内在性の成熟型miR27bを模倣するように合成された、miR27b mimicなどを使用することができる。市販のものを利用することもできる。例えば、Pre-miRTM miRNA precursor molecule （Life Technologies社製。Ambion社は2009年9月時点では合併・買収によりLife Technologies社となっているため、本明細書においては、Ambion社の製品をLife Technologies社製と記載。）が例示できる。
【００３１】
miR27bの前駆体とは、細胞内のプロセシングや、2本鎖核酸の開裂の結果、細胞内において成熟型miR27bを生じ得る核酸を意味する。該前駆体としては、miR27bのpri-miRNAやpre-miRNA等を挙げることができる。pri-miRNAはmiRNA遺伝子の一次転写産物（1本鎖RNA）であり、通常数百〜数千塩基程度の長さを有する。pre-miRNAは、pri-miRNAが細胞内プロセシングを受けることにより生じるヘアピン構造を有する1本鎖RNAであり、通常90〜110塩基の長さを有する。
miR27bのpri-miRNAやpre-miRNAは公知の分子であり、例えばサンガー研究所が作成しているmiRBaseデータベース：http://microrna.sanger.ac.uk/等に開示されている。miR27bの好適なpre-miRNAとしては、下記の配列番号２（MI0000440）で表されるヌクレオチド配列からなる1本鎖RNAを挙げることが出来る。
【００３２】
また、ヘアピンループ部分を介して、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列（第1の配列）と、その相補配列（第2の配列）とが連結された1本鎖核酸であって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第1の配列が第2の配列と2本鎖構造状の形状を有する核酸も本発明の核酸の好ましい態様の1つである。
【００３３】
本発明の核酸は、従来公知の手法を用いて、哺乳動物細胞（ヒト細胞等）から単離することにより、または化学的に合成することにより、または遺伝子組み換え技術を用いて産生することにより得ることができる。また、適宜市販されている核酸を用いることも可能である。miR27b mimicは例えばLife Technologies社などから入手可能である。
【００３４】
本発明の剤は、有効量の本発明の核酸に加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができ、医薬組成物の形態で医薬として適用される。
【００３５】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明の核酸の腫瘍細胞内への導入を促進するために、本発明の剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン；リポソーム；ナノパーティクル；リポフェクチン、リポフェクタミン（lipofectamine）、DOGS（トランスフェクタム）、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）(PEI) 等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。
【００３７】
本発明の剤をアテロコラーゲンに含ませることにより、標的となる腫瘍細胞に、本発明の核酸を効率よく送達し、当該細胞に効率よく取り込ませることができる。
【００３８】
本発明の剤は、経口的にまたは非経口的に、哺乳動物に対して投与することが可能であるが、本発明の剤は、非経口的に投与するのが望ましい。
【００３９】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
非経口的な投与に好適な別の製剤としては、噴霧剤等を挙げることが出来る。
【００４０】
医薬組成物中の本発明の核酸の含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0.1ないし100重量%である。
【００４１】
本発明の剤の投与量は、投与の目的、投与方法、腫瘍の種類、大きさ、投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、成人に注射により局所投与する場合、通常、本発明の核酸の量として1 pmol/kg以上10 nmol/kg以下、全身投与では2 nmol/kg以上50 nmol/kg以下が望ましい。かかる投与量を1〜10回、より好ましくは5〜10回投与することが望ましい。
【００４２】
本発明の剤は、その有効成分である本発明の核酸が腫瘍組織（腫瘍細胞）に送達されるように、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト）に対して安全に投与される。
【００４３】
本発明の核酸は、薬剤耐性がんの細胞増殖を抑制する活性、およびMDR1発現を抑制する活性を有するので、本発明の剤を、薬剤耐性がんの患者等に対して投与することにより、薬剤耐性がん疾患を治療することが出来る。
また、本発明の核酸は、RPN2発現抑制活性を有するので、本発明の剤を、腫瘍の患者や、腫瘍の転移リスクを有する腫瘍の治療後の患者等に対して投与することにより、腫瘍の転移を抑制し、腫瘍の転移に起因する疾患を治療または予防することが出来る。
さらに、本発明の核酸は、実施例に記載のように、がん幹細胞を非がん幹細胞に変える活性を有する。がん幹細胞は、一般的な抗腫瘍剤に抵抗性があり、腫瘍の再発や転移に深く関与しているといわれているため（瀬戸口啓夫ら  蛋白質核酸酵素  Vol.50  No.15  1999(2005)、家田敬輔ら  がん分子標的治療 Vol.5  No.3 187(2007)）、本発明の剤を腫瘍の患者に対して投与すれば、腫瘍におけるがん幹細胞数を減少させることができ、がん再発や転移を抑制または予防することが出来る。
従って、本発明の剤は、腫瘍の治療剤として極めて有用である。
【００４４】
ここで、「薬剤耐性がん」とは、抗がん剤に耐性ながんを意味する。
「転移抑制」とは、腫瘍細胞が原発巣から異なる部位へ到達し、該部位において腫瘍を二次的に生じることを抑制することを意味する。
「がん幹細胞」とは、自己複製能とがん形成能を併せもつ細胞で、抗がん剤・放射線療法に耐性でがん再発の原因細胞を意味する。
【００４５】
本発明の剤が適用できる腫瘍としては、例えば、乳がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、骨肉腫、食道がん、肝臓がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、脳腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、腎がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、睾丸腫瘍、カポジ肉腫、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、筋肉腫、皮膚がん、網膜芽腫などの固形がん、骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫、悪性黒色腫、血管腫、真性多血症、神経芽腫等が例示できる。具体的には、薬剤耐性がん、転移性がん、およびがん再発のリスクがあるがんが好ましい。
薬剤耐性がんとしては、例えば、上述の腫瘍で且つ薬剤耐性のがんが例示でき、好ましくは薬剤耐性乳がんや薬剤耐性肺がん、より好ましくは薬剤耐性乳腺がん（乳管がん）が挙げられる。
【００４６】
転移性がんとしては、例えば、乳がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、腎がん、多発性骨髄腫、甲状腺がん、腺がん、白血病およびリンパ腫を含む血液細胞悪性腫瘍；頭頚部がん；胃がん、結腸がん、結腸直腸がん、肝がんを含む消化管がん；卵巣がん、子宮内膜がん、および子宮頚がんを含む女性生殖管の悪性腫瘍；膀胱がん；神経芽細胞腫を含む脳腫瘍；肉腫、骨肉腫；および悪性黒色腫またはへん平上皮がんを含む皮膚がんなどの転移性がんが例示でき、好ましくは、乳がんや肺がんの転移性がんが挙げられる。
また、腫瘍の転移に起因する疾患としては、例えば、転移性がん、腫瘍の増大やがん性胸膜炎による呼吸不全等が挙げられる。
【００４７】
がん再発のリスクがあるがんとは、がん治療や手術後にがんが再発するリスクがあるがんである。がん再発のリスクがあるがんとしては、上述のがんで且つがん再発のリスクがあるがんが例示でき、好ましくはがん再発のリスクがある乳がんや肺がんが挙げられる。
本発明の剤は、腫瘍組織においてmiR27b発現量が減少している患者に投与するのが望ましい。
【００４８】
２．本発明の核酸と抗腫瘍剤との併用
本発明の核酸と抗腫瘍剤とを併用することによって、腫瘍そのものの増殖を抑制するとともに、薬剤耐性がんの増殖抑制、腫瘍の転移抑制、およびがん幹細胞数が減少する効果が得られるため、根治的に腫瘍を治療することができる。従って、本発明は、上述の本発明の核酸と抗腫瘍剤とを併用してなる腫瘍治療剤を提供するものである。
【００４９】
本発明の併用剤に使用することのできる抗腫瘍剤としては、特に制限はないが、腫瘍そのものの増殖を抑制する活性を有するものが好ましい。そのような抗腫瘍剤としては、タキサン類等の微小管作用薬だけでなく、代謝拮抗剤、DNAアルキル化剤、DNA結合剤（白金製剤）、抗がん性抗生物質などが挙げられる。具体的には、塩酸アムルビシン、塩酸イリノテカン、イホスファミド、エトポシドラステット、ゲフィニチブ、シクロフォスファミド、シスプラチン、トラスツズマブ、フルオロウラシル、マイトマイシンC、メシル酸イマチニブ、メソトレキサート、リツキサン、アドリアマイシンなどが挙げられる。
【００５０】
本発明の核酸と抗腫瘍剤との併用に際しては、本発明の核酸と抗腫瘍剤の投与時期は限定されず、本発明の核酸と抗腫瘍剤とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。
投与対象としては、好ましくは薬剤耐性がん患者、転移性がん患者、がん再発患者、がん再発リスクのある患者を挙げることができる。
本発明の剤は腫瘍組織においてmiR27b発現量が減少している患者に投与することが望ましい。
【００５１】
本発明の核酸の投与量は、適用疾患の予防・治療を達成し得る範囲で特に限定されず、上記（１．本発明の剤）の項で記載した投与量範囲で投与可能である。
【００５２】
抗腫瘍剤の投与量は、臨床において当該抗腫瘍剤を単剤で投与する際に採用される投与量に準じて決定することが出来る。
【００５３】
本発明の核酸と抗腫瘍剤の投与形態は、特に限定されず、投与時に、本発明の核酸と抗腫瘍剤とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）本発明の核酸と抗腫瘍剤とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）本発明の核酸と抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）本発明の核酸と抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）本発明の核酸と抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）本発明の核酸と抗腫瘍剤とを別々に製剤化して得られる2種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、本発明の核酸→抗腫瘍剤の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）等が挙げられる。
【００５４】
本発明の核酸と抗腫瘍剤とを併用してなる剤は、上記（１．本発明の剤）の項の記載に準じ、常法により製剤化することが出来る。本発明の核酸と抗腫瘍剤とを別々に製剤化する場合には、抗腫瘍剤の剤型は、臨床において当該抗腫瘍剤を単剤で投与する際に採用される剤型に準じて選択することが出来る。
【００５５】
上述の本発明の核酸と抗腫瘍剤をそれぞれ別々に製剤化して併用投与するに際しては、本発明の核酸を含有する製剤と抗腫瘍剤を含有する製剤とを同時期に投与してもよいが、抗腫瘍剤を含有する製剤を先に投与した後、本発明の核酸を含有する製剤を投与してもよいし、本発明の核酸を含有する製剤を先に投与し、その後で抗腫瘍剤を含有する製剤を投与してもよい。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、抗腫瘍剤を含有する製剤を先に投与する場合、抗腫瘍剤を含有する製剤を投与した後1分〜3日以内、好ましくは10分〜1日以内、より好ましくは15分〜1時間以内に本発明の核酸を含有する製剤を投与する方法が挙げられる。本発明の核酸を含有する製剤を先に投与する場合、本発明の核酸を含有する製剤を投与した後、1分〜1日以内、好ましくは10分〜6時間以内、より好ましくは15分〜1時間以内に抗腫瘍剤を含有する製剤を投与する方法が挙げられる。
【００５６】
本発明の併用剤においては、2種以上の抗腫瘍剤を用いてもよい。
本発明の併用剤は、上記（１．本発明の剤）の項において「本発明の剤が適用できる腫瘍」として詳述されている腫瘍に適用することができる。本発明の併用剤は、具体的には、薬剤耐性がん、転移性がん、がん再発のリスクがあるがんに適用するのが好ましい。
【００５７】
３．薬剤耐性がんを判定する方法
本発明は、腫瘍におけるmiR27bの発現レベルを測定すること、および該発現レベルと薬剤耐性との間の負の相関に基づき、薬剤耐性がんであるかどうかについて判定することを含む、薬剤耐性がんを判定する方法を提供するものである。
【００５８】
本発明の判定方法においては、測定対象患者から摘出された腫瘍の腫瘍組織もしくは腫瘍細胞におけるmiR27bの発現レベルが測定される。本発明の判定方法を適用することの出来る腫瘍の種類としては、上記（１．本発明の剤）の項において、「本発明の剤が適用できる腫瘍」として詳述されている腫瘍を挙げることが出来る。本発明の判定方法は、好ましくは肺がんと乳がんに対して適用できる。
【００５９】
本発明の判定方法において発現レベルが測定されるmiR27bには、成熟型、pri-miRNAおよびpre-miRNAが含まれるが、好ましくは、これら全ての型の発現レベルの合計または成熟型の発現レベル、より好ましくは成熟型の発現レベルが測定される。
【００６０】
例えば、miR27bの発現レベルは、該miRNAを特異的に検出し得る核酸プローブを用いて、自体公知の方法により測定することが出来る。該測定方法としては、例えば、RT-PCR、ノザンブロッティング、in situ ハイブリダイゼーション、核酸アレイ等を挙げることができる。または、市販のキット（例えば、TaqMan（登録商標）MicroRNA Cells-to-CTTM Kit）によっても測定できる。
【００６１】
miR27bを特異的に検出し得る核酸プローブとしては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列に含まれる、15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは約20塩基以上、最も好ましくはその全長の連続したヌクレオチド配列またはその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。
【００６２】
核酸プローブは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。
また、核酸プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：125I、131I、3H、14C等）、酵素（例：β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質（例：FAM、VIC等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００６３】
核酸プローブは、DNA、RNA、キメラ核酸のいずれであってもよく、また、1本鎖であっても2本鎖であってもよい。核酸プローブまたはプライマーは、例えば、配列番号１または２で表されるヌクレオチド配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
【００６４】
次に、測定されたmiR27bの発現レベルに基づいて、腫瘍が薬剤耐性がんであるかどうかについて判定される。後述の実施例に示すように、薬剤耐性ではないがん細胞に比べ、薬剤耐性がん細胞ではmiR27bの発現レベルが低い。上記判定は、miR27bの発現レベルと薬剤耐性との間の負の相関に基づき行われる。
【００６５】
例えば、薬剤耐性がんではないがん患者（ネガティブコントロール）および、薬剤耐性がんである患者（ポジティブコントロール）から腫瘍を摘出し（または腫瘍細胞を得て）、対象患者のmiR27bの発現レベルがポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのそれと比較される。あるいは、腫瘍におけるmiR27bの発現レベルと薬剤耐性がんとの相関図をあらかじめ作成しておき、対象患者から摘出された腫瘍（または腫瘍細胞）におけるmiR27bの発現レベルをその相関図と比較してもよい。発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
そして、miR27bの発現レベルの比較結果より、測定対象のmiR27bの発現レベルが相対的に低い場合には、腫瘍が薬剤耐性がんである可能性が相対的に高いと判定することができる。逆に、測定対象のmiR27bの発現レベルが相対的に高い場合には、腫瘍が薬剤耐性がんである可能性が相対的に低いと判定することができる。
【００６６】
本発明治療剤の治療対象としては、腫瘍組織（または腫瘍細胞）におけるmiR27bの発現レベルが低下している薬剤耐性がんの患者が望ましいため、本発明の方法は患者の選別に有用である。
【００６７】
また、本発明は、上述のmiR27bを特異的に検出し得る核酸プローブを含む、薬剤耐性がんを判定するための剤（以下、「本発明の剤（II）」と呼ぶ。）を提供するものである。本発明の剤（II）は、腫瘍の薬剤耐性を判定するためのキットであり得る。本発明の剤（II）を用いることにより、上述の判定方法により容易に腫瘍が薬剤耐性であるかどうかについて判定することができる。
【００６８】
核酸プローブは、通常、水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該核酸プローブが固相担体上に固定された核酸アレイの態様で、本発明の剤（II）に含まれる。
【００６９】
本発明の剤（II）は、miR27bの測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、ノザンブロッティングや核酸アレイを測定に用いる場合には、本発明の剤（II）は、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。in situ ハイブリダイゼーションを測定に用いる場合には、本発明の剤（II）は、標識化試薬、発色基質等をさらに含むことができる。
【００７０】
４．がん幹細胞を判定する方法
本発明は、腫瘍細胞におけるmiR27bの発現レベルを測定すること、および該発現レベルとがん幹細胞との間の負の相関に基づき、がん幹細胞であるかどうかについて判定することを含む、がん幹細胞を判定する方法を提供するものである。
【００７１】
本発明の判定方法においては、測定対象患者から摘出された腫瘍の腫瘍組織もしくは腫瘍細胞におけるmiR27bの発現レベルもしくは濃度が測定される本発明の判定方法を適用することの出来る腫瘍の種類としては、上記（１．本発明の剤）の項において「本発明の剤が適用できる腫瘍」として詳述されている腫瘍を挙げることが出来る。本発明の判定方法は、好ましくはがん幹細胞がCD44発現により特徴づけられるがん（例、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、頭頸部扁平上皮がん、肺がんなど）、より好ましくは乳がんと肺がんに対して適用できる。
【００７２】
本発明の判定方法において発現レベルもしくは濃度が測定されるmiR27bには、成熟型、pri-miRNAおよびpre-miRNAが含まれるが、好ましくは、これら全ての型の発現レベルの合計または成熟型の発現レベル、より好ましくは成熟型の発現レベルが測定される。
【００７３】
例えば、miR27bの発現レベルおよび濃度は、該miRNAを特異的に検出し得る核酸プローブを用いて、自体公知の方法により測定することが出来る。該測定方法としては、例えば、RT-PCR、ノザンブロッティング、in situ ハイブリダイゼーション、核酸アレイ等を挙げることができる。または、市販のキット（例えば、TaqMan（登録商標）MicroRNA Cells-to-CTTM Kit）によっても測定できる。
【００７４】
miR27bを特異的に検出し得る核酸プローブとしては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列に含まれる、15塩基以上、好ましくは18塩基以上、より好ましくは約20塩基以上、最も好ましくはその全長の連続したヌクレオチド配列またはその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。
【００７５】
核酸プローブは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。
また、核酸プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：125I、131I、3H、14C等）、酵素（例：β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質（例：FAM、VIC等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００７６】
核酸プローブは、DNA、RNA、キメラ核酸のいずれであってもよく、また、1本鎖であっても2本鎖であってもよい。核酸プローブまたはプライマーは、例えば、配列番号１または２で表されるヌクレオチド配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
【００７７】
次に、測定されたmiR27bの発現レベルもしくは濃度に基づいて、細胞ががん幹細胞であるかどうかにについて判定される。後述の実施例に示すように、がん幹細胞におけるmiR27bの発現レベルが低い。上記判定は、miR27bの発現レベルもしくは濃度と腫瘍のがん幹細胞との間のこのような負の相関に基づき行われる。そして、miR27bの発現レベルまたは濃度の比較結果より、測定対象のmiR27bの発現レベルまたは濃度が相対的に低い場合には、がん幹細胞であると判定することができる。
【００７８】
抗腫瘍剤治療後の患者の腫瘍のがん幹細胞の有無は、がん再発リスクや腫瘍の転移発生リスクと正の相関を示すと考えられるため、がん幹細胞の有無を測定することにより、患者の予後を予測することができる。
【００７９】
また、本発明は、上述のmiR27bを特異的に検出し得る核酸プローブを含む、がん幹細胞を判定するための剤（本発明の剤（III）と呼ぶ。）を提供するものである。本発明の剤（III）は、がん再発リスクまたはがん患者の生命予後を判定するためのキットであり得る。本発明の剤（III）を用いることにより、上述の判定方法により容易にがん患者の予後を判定することができる。
【００８０】
核酸プローブは、通常、水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該核酸プローブが固相担体上に固定された核酸アレイの態様で、本発明の剤（III）に含まれる。
【００８１】
本発明の剤（III）は、miR27bの測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、ノザンブロッティングや核酸アレイを測定に用いる場合には、本発明の剤（III）は、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。in situ ハイブリダイゼーションを測定に用いる場合には、本発明の剤（III）は、標識化試薬、発色基質等をさらに含むことができる。
【００８２】
５．薬剤耐性がんの増殖を抑制し得る物質、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質等を探索する方法
本発明はまた、被検物質がmiR27bの発現を増強するか否かを評価することを含む、薬剤耐性がんの増殖を抑制する物質を探索する方法、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法、がん幹細胞を非がん幹細胞に変える物質を探索する方法、並びに当該方法により得られうる物質を提供する。本発明の探索方法においては、miR27bの発現を上方制御する物質が、薬剤耐性がんの増殖を抑制しえる物質、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質、またはがん幹細胞機能抑制剤として選択される。
【００８３】
本発明の探索方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００８４】
本発明の探索方法は、以下の工程を含む：
（１）被検物質とmiR27bの発現を測定可能な細胞とを接触させること；
（２）被検物質を接触させた細胞におけるmiR27bの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR27bの発現量と比較すること；並びに
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、miR27bの発現量を上昇制御する被検物質を、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。
【００８５】
本発明の探索方法において、発現レベルが測定されるmiR27bには、成熟型、pri-miRNAおよびpre-miRNAが含まれるが、好ましくは、これら全ての型の発現レベルの合計または成熟型の発現レベル、より好ましくは成熟型の発現レベルが測定される。
【００８６】
「発現を測定可能な細胞」とは、測定対象のmiRNAの発現レベルを評価可能な細胞をいう。該細胞としては、測定対象のmiRNAを天然で発現可能な細胞が挙げられる。
【００８７】
測定対象、即ちmiR27bを天然で発現可能な細胞は、miR27bを潜在的に発現するものである限り特に限定されず、当該細胞として、哺乳動物（例えばヒト、マウス等）の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株などを用いることができる。miR27bを天然で発現可能な細胞としては、例えば上記（１．本発明の剤）の項において「本発明の剤が適用できる腫瘍」として詳述されている腫瘍の細胞（乳がん細胞や肺がん細胞）を挙げることができる。好ましくは、乳がん細胞や肺がん細胞であり、より好ましくは、薬剤耐性乳がん細胞や薬剤耐性肺がん細胞である。
【００８８】
被検物質とmiR27bの発現を測定可能な細胞との接触は、培養培地中で行われる。培養培地は、miR27bの発現を測定可能な細胞に応じて適宜選択されるが、例えば、約5〜20%のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）などである。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6〜約8であり、培養温度は通常約30〜約40℃であり、培養時間は約12〜約72時間である。
【００８９】
miR27bの発現量の測定は、（３．薬剤耐性がんを判定する方法）の項で述べた方法に従い行うことができる。
【００９０】
発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質を接触させない対照細胞におけるmiR27bの発現量は、被検物質を接触させた細胞におけるmiR27bの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００９１】
そして、比較の結果得られた、miR27bの発現量を上方制御する物質が、薬剤耐性がん細胞の増殖を抑制し得る物質、腫瘍の転移または腫瘍細胞の浸潤能を阻害し得る物質、またはがん幹細胞治療剤として選択される。
【００９２】
本発明の探索方法で得られる化合物は、新たな腫瘍の治療剤の開発のための候補物質として有用である。
【００９３】
尚、本願の配列表において、ヌクレオチド配列を便宜的にRNAの配列を用いて記載したが、これは、該配列番号により特定された核酸がRNAのみを示すことを意味するものではなく、適宜U（ウラシル）をT（チミン）と読み替えることにより、DNAやキメラ核酸のヌクレオチド配列をも示すものであることを理解するべきである。
【実施例】
【００９４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例になんら限定されるものではない。【００９５】
参考例１  薬剤耐性MCF7細胞(MCF7-ADR細胞)におけるmiR27bの発現
MCF7細胞およびMCF7-ADR細胞をDMEM培地にウシ胎児血清（FBS）を10%添加した培地を用いて培養し、両細胞株からマイクロRNAをmirVana RNA Isolation kit (Life Technologies社製) を用いてキット添付のプロトコールに従って抽出した。次に、得られたマイクロRNAを鋳型としてTaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit (Life Technologies社製) およびmiR27b TaqMan MicroRNA Assay、U6 TaqMan MicroRNA Assay (Life Technologies社製) を用いて逆転写反応を行った。即ち、マイクロRNA 5 μL、100 mM dNTPs (with dTTP) 0.15 μL、MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/μL) 1 μL、10×Reverse Transcription Buffer 1.5 μL、RNase Inhibitor (20 U/μL) 0.19 μL、Nuclease-free water 4.16 μL、TaqMan MicroRNA Assay (5×) 3 μLを混合し、16℃ 30分間、42℃ 30分間、85℃ 5分間の保温を行った。続いて、当該反応液の15倍希釈液 1.33 μL、TaqMan MicroRNA Assay (20×) 1 μL、TaqMan 2×Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNGa (Life Technologies社製) 10 μL、Nuclease-free water 7.67 μLを混合し、95℃ 10分間の保温後、95℃ 15秒間、60℃ 1分間の保温サイクルを40回繰り返すPCR反応を7300 Real Time PCR System (Life Technologies社製) を用いて行うことにより、MCF7、MCF7-ADR細胞におけるmiR27b、U6の発現量を定量した。その結果、図1に示される通り、MCF7細胞と比較してMCF7-ADR細胞におけるmiR27bの発現量が減少していることが分かった。【００９６】
実施例１  miR27bのRPN2発現抑制活性
（１）FLuc-hRPN2-3’UTRの構築
ヒト乳がんcDNAライブラリー溶液 2 μL、配列番号３で示された塩基配列からなるプライマー 100 pmol、配列番号４で示される塩基配列からなるプライマー 100 pmol、Taqポリメラーゼ（Life Technologies社製）0.1 μL、Taqポリメラーゼ添付のバッファー 2 μLおよびTaqポリメラーゼ添付のdNTP mixture 2 μLを含む20 μLの反応液を調製した。PCRは、まず95℃で9分間処理し、次いで95℃で30秒間、62℃で30秒間、更に72℃で1分間からなる保温サイクルを25回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。PCR後、アガロース電気泳動で約281 bpを示すPCR産物を回収した。次いで回収されたPCR産物をpGL-3 vector (Promega社製) のXbaIサイトにサブクローニングした後、当該プラスミドでE. coli DH5α株コンピテントセル（TOYOBO社製）を形質転換した。形質転換された細胞を50 μg/mL カナマイシン含有LB培地 100 mLで培養することにより得られる培養菌体から、QIAGEN Plasmid Maxi kit (QIAGEN社製) を用いて分離・精製することにより、ヒト由来RPN2遺伝子の3’UTR領域をFirefly luciferase遺伝子の3’側に連結したプラスミドFLuc-hRPN2-3’UTRを得た。得られたプラスミドを鋳型として、BigDye（登録商標）Terminator v3.1 Cycle Sequencing キット（Life Technologies社製）およびABI PRISM（登録商標）3100 Genetic Analyzer配列読み取り装置（Life Technologies社製）を用いて配列番号５で示される塩基配列からなるヒト由来RPN2遺伝子の3’UTR領域の塩基配列を決定した。【００９７】
（２）ルシフェラーゼアッセイ
つぎにmiR27bのRPN2発現抑制活性を上記（１）記載の方法で得られたFLuc-hRPN2-3’UTRを用いて評価した。50000 cells/mlに調製したMCF7-ADR細胞を96-wellプレート上にそれぞれ100 μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、FLuc-hRPN2-3’UTR 300 ng、Renilla luciferase expression vector 50 ng、および2 μMのPre-miRTM miRNA27b Precursor Molecule (Life Technologies社製) もしくはPre-miRTM miRNA Precursor Molecules-Negative Control (NC1) (Life Technologies社製) 1 μlをLipofectamine 2000試薬 (Invitrogen社製) を用いて上述した細胞にトランスフェクションした。次いで、当該細胞を5% CO2存在下、37℃で1日間培養した後、Dual-Glo Luciferase Assay System（Promega社製）を用いてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現量をEnvision 2101 Multilabel Reader（パーキンエルマー社製）で測定した。その結果、Pre-miRTM miRNA27b Precursor Molecule (Life Technologies社製) を導入した細胞のルシフェラーゼ活性はコントロールであるPre-miRTM miRNA Precursor Molecules-Negative Control (NC1) (Life Technologies社製) を導入した細胞と比較して減少していることが分かった (図２)。即ち、miR27bによりRPN2発現が抑制されることが示された。【００９８】
実施例２  miR27bのMDR1発現抑制活性
（１）FLuc-hMDR1-3’UTRの構築
MCF7-ADR細胞由来のcDNAライブラリー溶液 2 μL、配列番号６で示された塩基配列からなるプライマー 100 pmol、配列番号７で示される塩基配列からなるプライマー 100 pmol、Taqポリメラーゼ（Life Technologies社製）0.1 μL、Taqポリメラーゼ添付のバッファー 2 μLおよびTaqポリメラーゼ添付のdNTP mixture 2 μLを含む20 μLの反応液を調製した。PCRは、まず95℃で9分間処理し、次いで95℃で30秒間、62℃で30秒間、更に72℃で1分間からなる保温サイクルを25回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。PCR後、アガロース電気泳動で約575 bpを示すPCR産物を回収した。次いで回収されたPCR産物をpGL3 vector (Promega社製) のXbaIサイトにサブクローニングした後、当該プラスミドでE. coli DH5α株コンピテントセル（TOYOBO社製製）を形質転換した。形質転換された細胞を50 μg/mL カナマイシン含有LB培地 100 mLで培養することにより得られる培養菌体から、QIAGEN Plasmid Maxi kit (QIAGEN社製) を用いて分離・精製することにより、ヒト由来RPN2遺伝子の3’UTR領域をFirefly luciferase遺伝子の3’側に連結したプラスミドFLuc-hMDR1-3’UTRを得た。得られたプラスミドを鋳型として、BigDye（登録商標）Terminator v3.1 Cycle Sequencing キット（Life Technologies社製）およびABI PRISM（登録商標）3100 Genetic Analyzer配列読み取り装置（Life Technologies社製）を用いて配列番号８で示される塩基配列からなるヒト由来MDR1遺伝子の3’UTR領域の塩基配列を決定した。【００９９】
（２）ルシフェラーゼアッセイ
つぎにmiR27bのMDR1発現抑制活性を上記（１）記載の方法で得られたFLuc-hMDR1-3’UTRを用いて評価した。50000 cells/mlに調製したMCF7-ADR細胞を96-wellプレート上にそれぞれ100 μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、FLuc-hRPN2-3’UTR 300 ng、Renilla luciferase expression vector 50 ng、および2 μMのPre-miRTM miRNA27b Precursor Molecule (Life Technologies社製) もしくはPre-miRTM miRNA Precursor Molecules-Negative Control (NC1) (Life Technologies社製) 1 μlをLipofectamine 2000試薬 (Invitrogen社製) を用いて上述した細胞にトランスフェクションした。次いで、当該細胞を5% CO2存在下、37℃で1日間培養した後、Dual-Glo Luciferase Assay System（Promega社製）を用いてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現量をEnvision 2101 Multilabel Reader（パーキンエルマー社製）で測定した。その結果、Pre-miRTM miRNA27b Precursor Molecule (Life Technologies社製) を導入した細胞のルシフェラーゼ活性は、コントロールであるPre-miRTM miRNA Precursor Molecules-Negative Control (NC1) (Life Technologies社製) を導入した細胞と比較して減少していた (図３)。即ち、miR27bによりMDR1発現が抑制されることが示された。【０１００】
実施例３  乳がん幹細胞におけるmiR27bの発現
1×106個のMCF7細胞と10 μLのCD24-PE抗体（BDバイオサイエンス社製）を4℃、30分間インキュベートした。PBSを用いて細胞を2度洗浄した後、5 μLの0.1 mg/mL Propidium iodideを含む500 μLのPBSに細胞を懸濁した。得られた細胞懸濁液をCell sorter (ベイバイオサイエンス社製) に供し、CD24陽性細胞群（がん細胞群）とCD24陰性細胞群 (がん幹細胞群) に分画した。両細胞画分からmirVana miRNA isolation kit（Life Technologies社製）を用いてRNAを調製し、参考例1記載の方法でmiR27bの発現量を定量した。その結果、CD24陰性細胞群 (がん幹細胞群) においてmiR27bの発現量が低下していることが分かった (図４)。【０１０１】
実施例４  miR27bのCD44発現抑制活性
（１）FLuc-hCD44-3’UTRの構築
MCF7-ADR細胞由来のcDNAライブラリー溶液 2 μL、配列番号９で示された塩基配列からなるプライマー 100 pmol、配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマー 100 pmol、Taqポリメラーゼ（Life Technologies社製）0.1 μL、Taqポリメラーゼ添付のバッファー 2 μLおよびTaqポリメラーゼ添付のdNTP mixture 2 μLを含む20 μLの反応液を調製した。PCRは、まず95℃で9分間処理し、次いで95℃で30秒間、62℃で30秒間、更に72℃で1分間からなる保温サイクルを25回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。PCR後、アガロース電気泳動で約840 bpを示すPCR産物を回収した。次いで回収されたPCR産物をpGL-3 vector (Promega社製) のXbaIサイトにサブクローニングした後、当該プラスミドでE. coli DH5α株コンピテントセル（TOYOBO社製）を形質転換した。形質転換された細胞を50 μg/mL カナマイシン含有LB培地100 mLで培養することにより得られる培養菌体から、QIAGEN Plasmid Maxi kit (QIAGEN社製) を用いて分離・精製することにより、ヒト由来RPN2遺伝子の3’UTR領域をFirefly luciferase遺伝子の3’側に連結したプラスミドFLuc-hCD44-3’UTRを得た。得られたプラスミドを鋳型として、BigDye（登録商標）Terminator v3.1 Cycle Sequencing キット（Life Technologies社製）およびABI PRISM（登録商標）3100 Genetic Analyzer配列読み取り装置（Life Technologies社製）を用いて配列番号１１で示される塩基配列からなるヒト由来CD44遺伝子の3’UTR領域の塩基配列を決定した。【０１０２】
（２）ルシフェラーゼアッセイ
つぎにmiR27bのCD44発現抑制活性を上記（１）記載の方法で得られたFLuc-hCD44-3’UTRを用いて評価した。50000 cells/mlに調製したMCF7-ADR細胞を96-wellプレート上にそれぞれ100 μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、FLuc-hRPN2-3’UTR 300 ng、Renilla luciferase expression vector 50 ng、および2 μMのpre-miR27bもしくはNC1 (Life Technologies社製) 1 μlをLipofectamine 2000試薬 (Invitrogen社製) を用いて上述した細胞にトランスフェクションした。次いで、当該細胞を5% CO2存在下、37℃で1日間培養した後、Dual-Glo Luciferase Assay System（Promega社製）を用いてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現量をEnvision 2101 Multilabel Reader（パーキンエルマー社製）で測定した。その結果、Pre-miRTM miRNA27b Precursor Molecule (Life Technologies社製) を導入した細胞のルシフェラーゼ活性はコントロールであるPre-miRTM miRNA Precursor Molecules-Negative Control (NC1) (Life Technologies社製) を導入した細胞と比較して減少していた (図５)。即ち、miR27bによりCD44発現が抑制されることが示された。【０１０３】
実施例５  miR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞の細胞増殖活性
（１）miR27b発現ベクターの作製
配列番号１２で示される塩基配列からなる10 nMの合成miR27b 4 μlとpcDNA6.2-GW/EmGFP-miR (Invitrogen社製) 10 ngを混合した後、ligationキット（Invitrogen社製）を用いて室温で5分間ライゲーション反応した。反応後、当該ライゲーション反応液 2 μLおよびE. coli TOP10株コンピテントセル（Invitrogen社製）を用いて、E. coli TOP10形質転換細胞を得た。形質転換された細胞を50 μg/mLスペクチノマイシン含有LB培地100 mLで培養することにより得られる培養菌体から、QIAGEN Plasmid Maxi kitを用いて分離・精製することにより、miR27b発現ベクターであるところのpcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-miR27bを得た。【０１０４】
（２）miR27b恒常発現細胞の作製
MCF7-ADR-luc細胞に上述した方法で作製されたpcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-miR27bをLipofectamine 2000試薬を用いて導入した。該細胞を2 μg/mLのBlastcidinを含む培地にて14日間培養を継続した後、生き残った細胞を単離し、miR27b恒常発現細胞を得た。一方、これと同様の方法でpcDNA6.2-GW/EmGFP-miRを導入した細胞を作製し、以降の実験のコントロール細胞に使用した。【０１０５】
（３）miR27b恒常発現細胞の細胞増殖活性
10,000 cells/mlに調製したmiR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞とコントロール細胞を96穴プレートに播き込み、4日間、細胞増殖活性をTetracolor one for cell proliferation assay (生化学工業製) を用いて測定した。その結果、miR27b恒常発現細胞の細胞増殖速度がコントロール細胞と比較して遅いことが分かった (図６)。【０１０６】
実施例６  miR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞のがん幹細胞存在比率
1×106個のmiR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞とコントロール細胞をそれぞれ10 μLのCD24-PE抗体（BDバイオサイエンス社製）と4℃、30分間インキュベートした。PBSを用いて細胞を2度洗浄した後、5 μLの0.1 mg/mL Propidium iodideを含む500 μLのPBSに細胞を懸濁した。得られた細胞懸濁液をCell sorter (ベイバイオサイエンス社製) に供し、GFP、CD24共に陽性の細胞群（がん細胞群）とGFP陽性、CD24陰性の細胞群 (がん幹細胞群) の細胞数を計測したところ、miR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞のがん幹細胞群の割合がコントロール細胞に比べて減少しているのに対して非がん幹細胞群の割合が増加していることが分かった (図７)。【０１０７】
実施例７  薬剤耐性PC14細胞 (PC14細胞) におけるmiR27bの発現
肺がん細胞株であるPC14細胞および薬剤耐性肺がん細胞株PC14-CDDP細胞をDMEM培地にウシ胎児血清（FBS）を10%添加した培地を用いて培養し、両細胞株からマイクロRNAをmirVana RNA Isolation kit (Life Technologies社製) を用いてキット添付のプロトコールに従って抽出した。次に、得られたマイクロRNA を鋳型としてTaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit (Life Technologies社製) およびmiR27b TaqMan MicroRNA Assay、U6 TaqMan MicroRNA Assay (Life Technologies社製) を用いて逆転写反応を行った。即ち、マイクロRNA 5 μL、100 mM dNTPs (with dTTP) 0.15 μL、MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/μL) 1 μL、10×Reverse Transcription Buffer 1.5 μL、RNase Inhibitor (20 U/μL) 0.19 μL、Nuclease-free water 4.16 μL、TaqMan MicroRNA Assay (5×) 3 μLを混合し、16℃ 30分間、42℃ 30分間、85℃ 5分間の保温を行った。続いて、当該反応液の15倍希釈液 1.33 μL、TaqMan MicroRNA Assay (20×) 1 μL、TaqMan 2×Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNGa (Life Technologies社製) 10 μL、Nuclease-free water 7.67 μLを混合し、95℃ 10分間の保温後、95℃ 15秒間、60℃ 1分間の保温サイクルを40回繰り返すPCR反応を7300 Real Time PCR System (Life Technologies社製) を用いて行うことにより、MCF7、MCF7-ADR細胞におけるmiR27b、U6の発現量を定量した。その結果、図８に示される通り、PC14細胞と比較してPC14-CDDP細胞におけるmiR27bの発現量が減少していることが分かった。【０１０８】
実施例８  miR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞の腫瘍形成能
同じ細胞数のmiR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞とコントロール細胞をヌードマウスの乳腺付近にそれぞれ移植する。移植後毎日、生体イメージングによりルシフェラーゼ発光量を計測すると、同じ細胞数移植したにも関わらず、miR27b恒常発現MCF7-ADR-luc細胞の発光量はコントロール細胞に比べて減少していることが示される。すなわち、miR27bを強制発現させることで、腫瘍形成能が落ちることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明の腫瘍の治療剤は、薬剤耐性がん、がん再発または腫瘍の転移に起因する疾患に対する治療や予防に有用である。本発明の方法により、薬剤耐性がんやがん幹細胞を判定することができ、薬剤耐性がんやがん幹細胞を判定するための剤、および薬剤耐性の増殖を抑制する作用を有する物質や、腫瘍の転移を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することができる。【０１１０】
本出願は、2009年10月1日付で日本国に出願された特願2009-230016を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含される。
【図１】
2011040613.tif 000002
【図２】
2011040613.tif 000003
【図３】
2011040613.tif 000004
【図４】
2011040613.tif 000005
【図５】
2011040613.tif 000006
【図６】
2011040613.tif 000007
【図７】
2011040613.tif 000008
【図８】
2011040613.tif 000009
【配列表】
2011040613000001.app
【国際調査報告】
2011040613.tif 000010
2011040613.tif 000011
2011040613.tif 000012
2011040613.tif 000013
2011040613.tif 000014
2011040613.tif 000015
2011040613.tif 000016
2011040613.tif 000017