(57)【要約】  ＭＰＬ遺伝子について、多型を簡便且つ優れた信頼性で判別可能な、多型検出用プローブおよびその用途を提供する。下記（Ｐ１）、（Ｐ１’）、（Ｐ２）および（Ｐ２’）の少なくともいずれかのオリゴヌクレオチドを含むプローブを、ＭＰＬ遺伝子の多型検出用プローブとする。（Ｐ１）塩基長が９〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１１５３５〜１１５４３を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１１５４３の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐ２）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１１５３５〜１１５４４を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１１５４４の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドを含むプローブ、（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブ、（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドを含むプローブおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブの少なくともいずれかであることを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出用プローブ。
（Ｐ１）塩基長が９〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１１５３５〜１１５４３を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１１５４３の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１１５３５〜１１５４４を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１１５４４の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記（Ｐ１）および（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドにおいて、
前記配列番号１に示す塩基配列における塩基番号１１５３４〜１１５３５の塩基配列が、ｔｔ、ａａおよびｔｇの少なくともいずれかである、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項３】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１１５４３の塩基を、３’末端から数えて１〜４番目の位置に有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１１５４４の塩基を、３’末端から数えて１〜４番目の位置に有する、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、配列番号２および３の少なくともいずれかで示されるオリゴヌクレオチドであり、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
ctgaggwdgcagtttc（配列番号２）
gctgaggwdgcagtttc（配列番号３）
ctgaggwdgcagtttcc（配列番号４）
【請求項５】
配列番号２に示すオリゴヌクレオチド、配列番号３に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に示すオリゴヌクレオチドが、それぞれ、配列番号５に示すオリゴヌクレオチド、配列番号６に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号７に示すオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の多型検出用プローブ。
ctgaggttgcagtttc（配列番号５）
gctgaggaagcagtttc（配列番号６）
ctgaggtggcagtttcc（配列番号７）
【請求項６】
前記プローブが、蛍光標識物質を有する標識プローブである、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項７】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、３’末端領域に、前記蛍光標識物質を有し、前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドが、５’末端領域に、前記蛍光標識物質を有する、請求項６に記載の多型検出用プローブ。
【請求項８】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、３’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記蛍光標識物質を有し、
前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドが、５’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記蛍光標識物質を有する、請求項６に記載の多型検出用プローブ。
【請求項９】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１１５４３の塩基に、前記蛍光標識物質を有し、
前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１における塩基番号１１５４３の塩基に相補的な塩基に、前記蛍光標識物質を有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１１５４４の塩基に、前記蛍光標識物質を有し、
前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１における塩基番号１１５４４の塩基に相補的な塩基に、前記標識物質を有する、請求項６に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１０】
前記多型検出用プローブが、Ｔｍ解析用のプローブである、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１１】
請求項１に記載の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出用試薬。
【請求項１２】
さらに、ＭＰＬ遺伝子における検出目的の多型を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項１１に記載の多型検出用試薬。
【請求項１３】
請求項１に記載の多型検出用プローブを用いて、ＭＰＬ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出方法。
【請求項１４】
下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含む、請求項１３に記載の多型検出方法。
（Ａ）被検核酸および請求項１に記載の多型検出用プローブを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｂ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を決定する工程
【請求項１５】
前記反応系が、２種類以上の前記多型検出用プローブを含む、請求項１４に記載の多型検出方法。
【請求項１６】
前記反応系が、
前記多型検出用プローブとして、
配列番号２に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブ、配列番号３に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブおよび配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブのうち、いずれか２種類のプローブを含み、
配列番号２、配列番号３および配列番号４において、ｗｄの塩基配列は、それぞれ異なり、ｔｔ、ａａまたはｔｇである、請求項１５に記載の多型検出方法。
ctgaggwdgcagtttc（配列番号２）
gctgaggwdgcagtttc（配列番号３）
ctgaggwdgcagtttcc（配列番号４）
【請求項１７】
前記反応系が、
前記多型検出用プローブとして、
配列番号２に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブ、配列番号３に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブおよび配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブを含み、
配列番号２、配列番号３および配列番号４において、ｗｄの塩基配列は、それぞれ異なり、ｔｔ、ａａまたはｔｇである、請求項１５に記載の多型検出方法。
ctgaggwdgcagtttc（配列番号２）
gctgaggwdgcagtttc（配列番号３）
ctgaggwdgcagtttcc（配列番号４）
【請求項１８】
配列番号２に示すオリゴヌクレオチド、配列番号３に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に示すオリゴヌクレオチドが、それぞれ、配列番号５に示すオリゴヌクレオチド、配列番号６に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号７に示すオリゴヌクレオチドである、請求項１６に記載の多型検出方法。
ctgaggttgcagtttc（配列番号５）
gctgaggaagcagtttc（配列番号６）
ctgaggtggcagtttcc（配列番号７）
【請求項１９】
２種類以上の前記多型検出用プローブが、それぞれ、異なる標識物質を有する標識プローブである、請求項１５に記載の多型検出方法。
【請求項２０】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸が、鋳型核酸からの増幅物である、請求項１４に記載の多型検出方法。
【請求項２１】
さらに、下記（Ｘ）工程を含み、
前記（Ｘ）工程が、前記多型検出用プローブの存在下、反応系において、前記鋳型核酸から前記増幅物を生成する工程であり、
前記（Ａ）工程において、前記（Ｘ）工程における前記反応系の温度を変化させ、前記シグナル値の測定を行う、請求項２０に記載の多型検出方法。
（Ｘ）  鋳型核酸から増幅物を生成する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＰＬ遺伝子の多型を検出するためのプローブおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）は、造血幹細胞の異常によるクローン性疾患であり、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、真性赤血球増加症（ＰＶ）、本態性血小板血症（ＥＴ）、原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）等の疾患の総称である。本態性血小板血症および原発性骨髄線維症の患者の一部は、トロンボポエチン受容体をコードする、ＭＰＬ（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）遺伝子の変異により、ＭＰＬタンパク質の５１５番目のトリプトファン（Ｗ）がロイシン（Ｌ）またはリジン（Ｋ）に置換されていることが知られている（非特許文献１）。ロイシン（Ｌ）への前記置換（Ｗ５１５Ｌ）は、配列番号１に示すＭＰＬ遺伝子の塩基配列における塩基番号１１５３５の塩基グアニン（ｇ）のチミン（ｔ）への変異により、また、リジン（Ｋ）への前記置換（Ｗ５１５Ｋ）は、前記塩基配列における塩基番号１１５３４の塩基チミン（ｔ）のアデニン（ａ）への変異および塩基番号１１５３５の塩基グアニン（ｇ）のアデニン（ａ）への変異によることが明らかになっている（非特許文献１）。したがって、ＭＰＬ遺伝子における、これらの変異の有無、すなわち、多型を検出することにより、例えば、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症の診断等が可能となる。【０００３】
他方、遺伝子の多型を検出する方法としては、様々な方法が報告されており、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法等があげられる。【０００４】
前記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、試料の標的ＤＮＡについて、検出目的の領域をＰＣＲで増幅させ、その増幅物を制限酵素処理し、多型による制限断片長の変化を、サザンハイブリダイゼーションによりタイピングする方法である。遺伝子に目的の変異が存在すると、制限酵素の認識部位が消失するため、切断の有無、すなわち、制限断片長の変化によって、変異の有無を検出できる。【０００５】
しかしながら、前記ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、例えば、ＰＣＲの後、得られた増幅物を種々の制限酵素で処理し、解析する必要があり、手間がかかる。また、得られた増幅物の制限酵素処理は、一旦、反応器から前記増幅物を取り出して行う必要がある。このため、１回目の反応で得られた増幅物が飛散し、２回目の別の反応に混入するおそれがある。このような問題から、多型の検出を自動化し難い。【０００６】
このような問題から、近年、多型の検出方法として、Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）解析が注目されている。これは、まず、検出目的の多型を含む領域に相補的なプローブを用いて、被検核酸と前記プローブとのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成させる。そして、得られた前記ハイブリッドに加熱処理を施して、温度上昇に伴う前記ハイブリッドの一本鎖核酸への解離（融解）を、吸光度等のシグナルの測定により検出する。この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって、多型を判断する方法である。Ｔｍ値は、前記ハイブリッドにおける両一本鎖核酸の相補性が高い程高く、相補性が低い程低くなる。そこで、検出対象部位の多型がＸまたはＹの場合、目的の多型（例えば、Ｙ）を含む核酸とそれに１００％相補的なプローブとのハイブリッドについて、予めＴｍ値（評価基準値）を求めておく。続いて、前記被検核酸と前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定する。そして、この測定値が、前記評価基準値と同じ場合、前記被検核酸と前記プローブとはパーフェクトマッチである、すなわち、前記被検核酸の検出対象部位が目的の多型（Ｙ）であると判断できる。他方、前記測定値が前記評価基準値よりも低い場合、前記被検核酸と前記プローブとはミスマッチである、すなわち、前記被検核酸の検出対象部位が他方の多型（Ｘ）であると判断できる。このような方法であれば、例えば、前記プローブを添加したＰＣＲ反応液に温度処理を施し、シグナル測定を行うのみで、多型を検出できる。このため、検出装置の自動化も可能である。【０００７】
しかしながら、このようなＴｍ解析を利用した検出方法は、例えば、一塩基の違いをＴｍ値によって判断しなければならない。このため、特に、野生型の多型と変異型の多型とが混在している場合等であっても、変異の有無を正確に検出することが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】パルダナーニ（Ｐａｒａｄａｎａｎｉ）ら、ｂｌｏｏｄ、２００６年、Ｖｏｌ.１０８、Ｎｏ.１０、ｐ．３４７２−３４７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、ＭＰＬ遺伝子について、多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別可能な、多型検出用プローブおよびその用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明の多型検出用プローブは、下記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドを含むプローブ、（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブ、（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドを含むプローブおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブの少なくともいずれかであることを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出プローブである。
（Ｐ１）塩基長が９〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１１５３５〜１１５４３を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１１５４３の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１１５３５〜１１５４４を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１１５４４の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド【００１１】
本発明の多型検出用試薬は、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出用試薬である。【００１２】
本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを用いて、ＭＰＬ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出方法である。【００１３】
本発明の多型検出用プローブによれば、ＭＰＬ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の実施例１における、ｗｔ  １００％を含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例１における、Ｗ５１５Ｌ  ５０％を含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例１における、Ｗ５１５Ｋ  ５０％を含む反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、ＭＰＬ遺伝子における検出目的の多型は、例えば、配列番号１に示すＭＰＬ遺伝子の塩基配列における塩基番号１１５３４および塩基番号１１５３５の少なくとも一方の塩基における多型である。野生型は、配列番号１に示すＭＰＬ遺伝子の塩基配列において、塩基番号１１５３４の塩基（ｗ）がチミン（ｔ）であり、塩基番号１１５３５の塩基（ｄ）がグアニン（ｇ）であり、ＭＰＬタンパク質の５１５番目のアミノ酸は、トリプトファン（５１５Ｗ）となる。変異型は、２種類あげられる。一方の変異型は、配列番号１に示すＭＰＬ遺伝子の塩基配列において、塩基番号１１５３４の塩基（ｗ）がチミン（ｔ）、塩基番号１１５３５の塩基（ｄ）がチミン（ｔ）であり、ＭＰＬタンパク質の５１５番目のアミノ酸は、ロイシンとなる（Ｗ５１５Ｌ）。他方の変異型は、配列番号１に示すＭＰＬ遺伝子の塩基配列において、塩基番号１１５３４の塩基（ｗ）がアデニン（ａ）、塩基番号１１５３５の塩基（ｄ）がアデニン（ａ）であり、ＭＰＬタンパク質の５１５番目のアミノ酸は、リジンとなる（Ｗ５１５Ｋ）。ＭＰＬ遺伝子において、前記塩基番号１１５３４または塩基番号１１５３５の塩基が、前述のような変異型の場合、例えば、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症等の疾患の可能性があると判断できる。以下、５１５ＷとなるＭＰＬ遺伝子の多型を、「野生型多型または正常型多型」、Ｗ５１５ＬとなるＭＰＬ遺伝子の多型を、「Ｗ５１５Ｌ多型またはＷ５１５Ｌ変異型多型」、Ｗ５１５ＫとなるＭＰＬ遺伝子の多型を、「Ｗ５１５Ｋ多型またはＷ５１５Ｋ変異型多型」ともいう。
【００１６】
ＭＰＬ遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＧ＿００７５２５として登録されている。配列番号１に示す塩基配列は、ＭＰＬ遺伝子の全長塩基配列であり、前記アクセッション番号の塩基配列における塩基番号５００１〜２１６６１の領域である。
【００１７】
本発明において、以下、前記塩基が変異型であるＭＰＬ遺伝子を「変異型ＭＰＬ遺伝子」といい、このうち、Ｗ５１５Ｌ多型を有する変異型ＭＰＬ遺伝子を「Ｗ５１５Ｌ変異型ＭＰＬ遺伝子」といい、Ｗ５１５Ｋ多型を有する変異型ＭＰＬ遺伝子を「Ｗ５１５Ｋ変異型ＭＰＬ遺伝子」という。野生型多型を有するＭＰＬ遺伝子を「野生型ＭＰＬ遺伝子または正常型ＭＰＬ遺伝子」という。
【００１８】
本発明において、前記多型が発生する部位、すなわち、配列番号１の塩基配列（センス鎖）において塩基番号１１５３４および塩基番号１１５３５の塩基、または、その相補配列（アンチセンス鎖）において前記センス鎖の塩基番号１１５３４および塩基番号１１５３５に対応する塩基を「検出対象部位」という。配列番号１の塩基配列（センス鎖）またはその相補配列（アンチセンス鎖）において、前記検出対象部位を含み、前記多型検出用プローブがハイブリダイズ可能な領域を、「検出対象配列、検出対象領域またはハイブリダイズ領域」という。前記検出対象配列の中でも、前記多型検出用プローブとパーフェクトマッチする検出対象配列を「パーフェクトマッチ配列」、前記多型検出用プローブとミスマッチする検出対象配列を「ミスマッチ配列」という。本発明において、パーフェクトマッチは、前記検出対象部位の塩基が前記多型検出用プローブにおける対応塩基と相補的であることを意味し、好ましくは、前記検出対象配列と前記多型検出用プローブとが、完全に相補的であることを意味する。本発明において、ミスマッチは、前記検出対象部位の塩基が前記多型検出用プローブにおける対応塩基と非相補的であることを意味し、好ましくは、前記検出対象配列と前記多型検出用プローブとが、前記検出対象部位以外において完全に相補的であることを意味する。
【００１９】
本発明において、ＭＰＬ遺伝子を増幅させ、さらに、得られた増幅物と本発明の多型検出用プローブとをハイブリダイズさせる場合、ＭＰＬ遺伝子における増幅領域を、以下、「増幅対象領域」という。前記増幅対象領域は、例えば、ＭＰＬ遺伝子のセンス鎖における領域でもよいし、それに対応するアンチセンス鎖における領域でもよいし、両方でもよい。本発明において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、例えば、センス鎖の増幅産物、アンチセンス鎖の増幅産物の意味も含む。
【００２０】
本発明において、塩基配列の末端は、塩基配列における５’側および３’側の最も端の塩基を意味する。また、５’末端領域は、塩基配列における５’末端から数塩基の領域であり、３’末端領域は、塩基配列の３’末端から数塩基の領域である。前記数塩基は、例えば、前記末端塩基を含む１塩基〜１０塩基である。本発明において、塩基配列の末端からＺ番目の塩基（Ｚは正の整数）は、末端の塩基を１番目とした順番であり、例えば、末端から１番目の塩基は、末端の塩基、末端から２番目の塩基は、末端の隣の塩基を意味する。
【００２１】
＜多型検出用プローブ＞
本発明の多型検出用プローブは、前述のように、下記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドを含むプローブ、（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブ、（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドを含むプローブおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブの少なくともいずれかであることを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出用プローブである。
（Ｐ１）塩基長が９〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１１５３５〜１１５４３を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１１５４３の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１１５３５〜１１５４４を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１１５４４の塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００２２】
本発明の多型検出用プローブによれば、前述のように、ＭＰＬ遺伝子の多型を、例えば、Ｔｍ解析によって、簡便且つ優れた信頼性で判別できる。具体的には、例えば、試料中に、目的の多型が野生型であるＭＰＬ遺伝子と変異型であるＭＰＬ遺伝子とが共存している場合、あるいは、異なる変異型の複数のＭＰＬ遺伝子が共存している場合でも、本発明の多型検出用プローブを用いたＴｍ解析を行うことで、多型の種類または変異の有無を、簡便且つ優れた信頼性で検出できる。このため、本発明は、野生型のＭＰＬ遺伝子と変異型のＭＰＬ遺伝子とを両方含む試料、あるいは、異なる変異型のＭＰＬ遺伝子を含む試料に対して、特に有用である。このように、本発明によれば、ＭＰＬ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別できることから、例えば、検出結果を、前述のような疾患の診断等に反映できる。したがって、本発明は、医療分野等において極めて有用といえる。
【００２３】
本発明の多型検出用プローブは、配列番号１に示すＭＰＬ遺伝子の塩基配列において、塩基番号１１５３５の塩基（ｄ）の多型（ｇ／ａ、ｇ／ｔ）、および／または、塩基番号１１５３４の塩基（ｗ）の多型（ｔ／ａ）および塩基番号１１５３５の塩基（ｄ）の多型（ｇ／ａ、ｇ／ｔ）を検出するためのプローブである。配列番号１に示す塩基配列において、ｗは、チミン（ｔ）またはアデニン（ａ）であり、ｄは、グアニン（ｇ）、アデニン（ａ）またはチミン（ｔ）である（以下、同様）。
【００２４】
前記（Ｐ１）および（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、その塩基長が、前述のように、９〜５０塩基長であり、好ましくは、１３〜３０塩基長であり、より好ましくは、１５〜２０塩基長である。前記（Ｐ２）および（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、その塩基長が、前述のように、１０〜５０塩基長であり、好ましくは、１３〜３０塩基長であり、より好ましくは、１５〜２０塩基長である。
【００２５】
前記（Ｐ１）および（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＭＰＬ遺伝子のセンス鎖と相同的であり、ＭＰＬ遺伝子のアンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。前記（Ｐ１）および（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１１５３５の塩基（ｄ）を含み、さらに、塩基番号１１５３４の塩基（ｗ）を含んでもよく、両方含むことが好ましい。
【００２６】
前記（Ｐ１）および（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドにおいて、「ｗｄ」の配列は、例えば、「ｔｇ」、「ｔｔ」または「ａａ」があげられる。「ｗｄがｔｇ」の場合、前記オリゴヌクレオチドは、野生型ＭＰＬ遺伝子のアンチセンス鎖における検出対象配列とパーフェクトマッチする。「ｗｄがｔｔ」の場合、前記オリゴヌクレオチドは、Ｗ５１５Ｌ変異型ＭＰＬ遺伝子のアンチセンス鎖における検出対象配列とパーフェクトマッチする。「ｗｄがａａ」の場合、前記オリゴヌクレオチドは、Ｗ５１５Ｋ変異型ＭＰＬ遺伝子のアンチセンス鎖における検出対象配列とパーフェクトマッチする。したがって、前記オリゴヌクレオチドが、ＭＰＬ遺伝子の検出対象配列とパーフェクトマッチか否かによって、ＭＰＬ遺伝子の多型を検出できる。具体的には、例えば、「ｗｄがｔｇ」の前記オリゴヌクレオチドにより、野生型の多型を検出でき、「ｗｄがｔｔ」の前記オリゴヌクレオチドにより、Ｗ５１５Ｌ変異型の多型を検出でき、「ｗｄがａａ」の前記オリゴヌクレオチドにより、Ｗ５１５Ｋ変異型の多型を検出できる。以下、「ｗｄがｔｇ」の前記オリゴヌクレオチドを、野生型検出用プローブともいい、「ｗｄがｔｔ」の前記オリゴヌクレオチドを、Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブともいい、「ｗｄがａａ」の前記オリゴヌクレオチドを、Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブともいう。これらのオリゴヌクレオチドを含むプローブのうち、いずれか２種類または全てを使用することで、例えば、後述するように、野生型、Ｗ５１５Ｌ変異型およびＷ５１５Ｋ変異型の多型を、同一反応系において検出することも可能である。
【００２７】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号１１５４３の塩基を、前記３’末端領域に有し、好ましくは、３’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（３’末端）または２番目に有する。前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２または配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号１１５４４の塩基を、前記３’末端領域に有し、好ましくは、３’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（３’末端）または２番目に有する。前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドがあげられる。配列番号２、３および４の塩基配列において、下線部のｗｄは、配列番号１に示すＭＰＬ遺伝子の検出対象部位ｗｄに相当する。
ctgaggwdgcagtttc（配列番号２）
gctgaggwdgcagtttc（配列番号３）
ctgaggwdgcagtttcc（配列番号４）
【００２８】
前記（Ｐ１）および前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドにおいて、前記ｗｄは、前述のように、例えば、ｔｔ、ａａおよびｔｇの少なくともいずれかである。
【００２９】
前記配列番号２に示すオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号５に示すオリゴヌクレオチドがあげられる。配列番号５の塩基配列において、下線部のｔｔは、Ｗ５１５Ｌ変異型ＭＰＬ遺伝子のセンス鎖における検出対象部位に相当し、配列番号５に示す前記オリゴヌクレオチドを含むプローブは、Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブとして使用できる。前記配列番号３に示すオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号６に示すオリゴヌクレオチドがあげられる。配列番号６の塩基配列において、下線部のａａは、Ｗ５１５Ｋ変異型ＭＰＬ遺伝子のセンス鎖における検出対象部位に相当し、配列番号６に示す前記オリゴヌクレオチドを含むプローブは、Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブとして使用できる。前記配列番号４に示すオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号７に示すオリゴヌクレオチドがあげられる。配列番号７の塩基配列において、下線部のｔｇは、野生型ＭＰＬ遺伝子のセンス鎖における検出対象部位に相当し、配列番号７に示す前記オリゴヌクレオチドを含むプローブは、野生型検出用プローブとして使用できる。
ctgaggttgcagtttc（配列番号５）
gctgaggaagcagtttc（配列番号６）
ctgaggtggcagtttcc（配列番号７）
【００３０】
前記（Ｐ１’）および（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＭＰＬ遺伝子のセンス鎖と相補的であり、ＭＰＬ遺伝子のセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。前記（Ｐ１’）および（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドにおいて、前記センス鎖の検出対象部位（配列番号１の塩基番号１１５３４）の塩基（ｗ）に相補的な塩基は、ｗで表され、前記ｗは、チミン（ｔ）またはアデニン（ａ）であり、前記センス鎖の検出対象部位（配列番号１の塩基番号１１５３５）の塩基（ｄ）に相補的な塩基は、ｈで表され、前記ｈは、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）またはアデニン（ａ）である（以下、同様）。前記（Ｐ１’）および（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドの塩基長は、前記（Ｐ１）または（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドと同様である。
【００３１】
本発明の多型検出用プローブは、例えば、前記オリゴヌクレオチドを含むプローブでもよいし、前記オリゴヌクレオチドからなるプローブでもよい。
【００３２】
本発明の多型検出用プローブは、標識物質を有する標識プローブが好ましく、例えば、前記オリゴヌクレオチドが、前記標識物質で標識化（修飾）されていることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されず、例えば、５’末端領域または３’末端領域が好ましく、より好ましくは５’末端または３’末端である。後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）が好ましい。前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を間接的に標識化してもよい。後者の場合、例えば、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化できる。配列番号２〜７に示す前記オリゴヌクレオチドは、例えば、３’末端のシトシン（ｃ）が、前記標識物質で標識化されていることが好ましい。
【００３３】
前記（Ｐ１）および（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、３’末端領域に、前記標識物質を有することが好ましく、具体的には、例えば、３’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、３’末端から数えて１〜４番目の塩基であり、さらに好ましくは、３’末端から数えて１〜３番目の塩基、特に好ましくは、３’末端から数えて２番目または３’末端の塩基である。前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１１５４０〜１１５４３のいずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、前記塩基番号１１５４３の塩基（ｃ）が、前記標識物質を有する。前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１１５４１〜１１５４４のいずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、前記塩基番号１１５４４の塩基（ｃ）が、前記標識物質を有することが好ましい。
【００３４】
前記（Ｐ１’）および（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、５’末端領域に、前記標識物質を有することが好ましく、具体的には、例えば、５’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、５’末端から数えて１〜４番目の塩基であり、さらに好ましくは、５’末端から数えて１〜３番目の塩基、特に好ましくは、５’末端から数えて２番目または５’末端の塩基である。前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１１５４０〜１１５４３のいずれかの塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、前記塩基番号１１５４３の塩基に相補的な塩基（ｃ）が、前記標識物質を有する。前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１１５４１〜１１５４４のいずれかの塩基に相補的な塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、前記塩基番号１１５４４の塩基に相補的な塩基（ｃ）が、前記標識物質を有する。
【００３５】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブが単独であるか、ハイブリッドを形成しているかによって、シグナルを発するものが好ましい。前記シグナルの種類は、特に制限されず、例えば、蛍光、呈色等があげられる。前記呈色は、例えば、発色でもよいし、変色でもよい。前記シグナルが蛍光の場合、シグナル値は、例えば、蛍光強度があげられる。前記シグナルが呈色の場合、前記シグナル値は、例えば、反射率、吸光度、透過率等があげられる。前記シグナルは、例えば、前記標識物質から直接発せられてもよいし、間接的に発せられてもよい。
【００３６】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。市販の蛍光物質は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）等があげられる。前記蛍光物質の検出条件は、特に制限されず、例えば、使用する蛍光物質の種類により適宜決定できる。具体例として、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅは、例えば、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、例えば、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、例えば、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このような標識プローブを使用すれば、例えば、シグナルとして蛍光を検出し、シグナル値として蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の変動から、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。本発明の多型検出用プローブは、前述のように、前記野生型検出用プローブ、前記Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブおよび前記Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブのうち、いずれか２種類または全てを、同一反応系で使用することもできる。これによって、ＭＰＬ遺伝子における、野生型、Ｗ５１５Ｌ変異型およびＷ５１５Ｋ変異型の多型を、同一反応系において判別できる。この場合、前記各プローブは、それぞれ異なる条件で検出される異なる標識物質を有することが好ましい。
【００３７】
前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブが好ましい。前記標識物質が蛍光物質の場合、前記標識プローブは、例えば、前記蛍光物質で標識化され、単独で蛍光を示し、且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象（Quenching  phenomenon）と呼ばれる。この現象を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記蛍光消光プローブは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が前記蛍光物質で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）が好ましい。前記末端の塩基がシトシン（ｃ）の場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、被検核酸とハイブリッドを形成した際、前記被検核酸における、標識化された末端のシトシン（ｃ）と対をなす塩基または前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（ｇ）となるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。前記対をなす塩基から１塩基離れた塩基は、例えば、前記対をなす塩基の隣の塩基を意味する。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。前記グアニン消光プローブが前記被検核酸にハイブリダイズすると、例えば、前記蛍光物質で標識化された末端のシトシン（ｃ）が、前記被検核酸におけるグアニン（ｇ）に近づくことによって、前記蛍光物質の蛍光が弱くなる、すなわち蛍光強度が減少するという現象を示す。前記プローブを使用すれば、例えば、蛍光強度の変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。同様に、前記末端の塩基がグアニン（ｇ）の場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、前記被検核酸とハイブリッドを形成した際、前記被検核酸における、標識化された末端のグアニン（ｇ）と対をなす塩基または前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がシトシン（ｃ）となるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。
【００３８】
本発明の多型検出用プローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、被検核酸は、例えば、ＰＣＲ等の核酸の増幅法によって調製できる。この際、本発明の多型検出用プローブを、核酸増幅反応の反応系に共存させてもよい。このような場合、前記多型検出用プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、前記核酸増幅反応によって前記多型検出用プローブ自体が伸長することを十分に防止できる。前記多型検出用プローブの３’末端に、例えば、前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００３９】
本発明の多型検出用プローブを用いた多型の検出において、検出方法は何ら制限されず、前記検出対象配列とプローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。前記多型の検出方法として、以下に、本発明の多型検出方法を説明する。
【００４０】
＜多型検出方法＞
本発明の多型検出方法は、前述のように、本発明の多型検出用プローブを用いて、ＭＰＬ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出方法である。
【００４１】
本発明の多型検出方法は、例えば、下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含むことが好ましい。
（Ａ）被検核酸および本発明の多型検出用プローブを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｂ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を決定する工程
【００４２】
本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成および条件等は、以下の記載に制限されない。本発明の多型検出用プローブは、前述のように標識プローブが好ましい。本発明において、前記反応系は、例えば、反応液である。
【００４３】
本発明の多型検出方法において使用する前記多型検出用プローブは、前述のように、１種類でもよいし、２種類でもよいが、３種類を併用することが好ましい。具体的には、前記野生型検出用プローブ、前記Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブおよび前記Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブのうち、いずれか１種類でもよいし、２種類以上でもよいが、３種類を併用することが好ましい。これらの多型検出用プローブを併用することによって、配列番号１に示すＭＰＬ遺伝子の塩基番号１１５３４および１１５３５の多型が、前記野生型、前記Ｗ５１５Ｌ変異型および前記Ｗ５１５Ｋ変異型のいずれであるかを、例えば、一つの反応系において検出できる。前記多型検出用プローブの組み合わせは、特に制限されず、例えば、配列番号５に示すオリゴヌクレオチドを含むＷ５１５Ｌ変異型検出用プローブと、配列番号６に示すオリゴヌクレオチドを含むＷ５１５Ｋ変異型検出用プローブと、配列番号７に示すオリゴヌクレオチドを含む野生型検出用プローブとの組み合わせが例示できる。
【００４４】
一つの反応系に２種類以上の多型検出用プローブを添加する場合、前記多型検出用プローブは、それぞれ前記標識プローブが好ましい。前記各標識プローブは、それぞれ、異なる検出条件の標識物質で標識化されていることが好ましい。これによって、検出条件を変えるのみで、例えば、同じ反応系を用いて、２種類以上の多型を簡便に検出できる。
【００４５】
本発明において、前記被検核酸は、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記被検核酸が前記二本鎖核酸の場合、例えば、後述するように、前記（Ａ）工程において、前記反応系を加熱して、二本鎖の前記被検核酸を解離させる工程を含むことが好ましい。前記二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、本発明の多型検出用プローブと前記一本鎖核酸とがハイブリダイズできる。
【００４６】
本発明において、前記被検核酸は、例えば、試料中に元来含まれる核酸でもよいし、前記核酸の増幅物でもよい。後者は、例えば、検出精度を向上できることから好ましく、前記増幅物は、例えば、前記試料中の前記核酸を鋳型核酸として、核酸の増幅法により増幅させることで調製できる。前記増幅物は、例えば、前記試料中のＤＮＡを鋳型とした増幅物でもよいし、前記試料中のＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型とした増幅物でもよい。前記試料中のＲＮＡは、例えば、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡがあげられ、前記ｃＤＮＡは、例えば、前記ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ）により合成できる。
【００４７】
本発明の多型検出方法は、前記被検核酸が前記増幅物の場合、例えば、さらに、下記（Ｘ）工程を含んでもよい。前記（Ｘ）工程は、例えば、前記（Ａ）工程に先立って行うことが好ましい。また、前記（Ｘ）工程は、例えば、前記多型検出用プローブの存在下、反応系において、前記鋳型核酸から前記増幅物を生成する工程でもよい。
（Ｘ）  鋳型核酸から前記増幅物を生成する工程
【００４８】
前記（Ａ）工程において、前記多型検出用プローブは、例えば、前記反応系に含まれていればよく、その添加のタイミングは、特に制限されない。前記被検核酸が前記増幅物の場合、前記（Ａ）工程における前記反応系は、例えば、前記（Ｘ）工程で得られた前記増幅物と前記多型検出用プローブとを用いて、新たに調製してもよいし、前記（Ｘ）工程における前記増幅反応の反応系でもよい。後者の場合、前記多型検出用プローブは、例えば、前記（Ｘ）工程の前または途中に、前記増幅反応の反応系に添加されてもよく、前記（Ｘ）工程の後、前記増幅反応の反応系に添加されてもよい。
【００４９】
前記核酸増幅法は、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。前記核酸増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行える。
【００５０】
前記鋳型核酸からの前記核酸増幅物の生成は、例えば、ＭＰＬ遺伝子における検出目的の多型を含む領域を増幅するためのプライマーを使用することが好ましい。前記プライマーの配列は、特に制限されず、例えば、前記検出対象部位を含む検出対象配列を増幅できればよく、前記検出対象配列およびその周辺配列等に応じて、従来公知の方法により適宜設定できる。前記プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さに設定でき、例えば、１０〜３０塩基長があげられる。
【００５１】
前記プライマーは、例えば、遺伝子のセンス鎖を増幅するフォワードプライマー（以下、「Ｆプライマー」ともいう）およびアンチセンス鎖を増幅するリバースプライマー（以下、「Ｒプライマー」ともいう）のいずれか一方を使用でき、両者を一対とするプライマーセットを使用することが好ましい。以下に、ＦプライマーおよびＲプライマーを例示するが、これらは一例であって、本発明を制限するものではない。
【００５２】
Ｆプライマー
5'-tgggccgaagtctgacccttt-3'（配列番号８）
Ｒプライマー
5'-acagagcgaaccaagaatgcctgt-3'（配列番号９）
【００５３】
前記反応系において、前記プライマーの添加割合は、特に制限されず、例えば、１種類のプライマーについて、例えば、０．１〜２μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは、０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、ＦプライマーとＲプライマーとを使用する場合、前記Ｆプライマー（Ｆ）とＲプライマー（Ｒ）との添加割合（モル比Ｆ：Ｒ）は、特に制限されず、例えば、１：０．２５〜１：４が好ましく、より好ましくは、１：０．５〜１：２である。
【００５４】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸に対する前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、特に制限されず、検出シグナルを十分に確保できることから、１倍以下が好ましく、より好ましくは、０．１倍以下である。この際、前記被検核酸は、例えば、パーフェクトマッチ配列を有するパーフェクトマッチ核酸とミスマッチ配列を有するミスマッチ核酸との合計でもよいし、パーフェクトマッチ配列を含む増幅物とミスマッチ配列を含む増幅物との合計でもよい。前記被検核酸におけるパーフェクトマッチ核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、パーフェクトマッチ核酸（パーフェクトマッチ配列を含む増幅物）に対して１０倍以下となることが好ましく、より好ましくは５倍以下、さらに、好ましくは３倍以下である。また、その下限は、特に制限されず、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．１倍以上である。前記被検核酸に対する前記多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００５５】
前記反応系における前記多型検出用プローブの添加割合は、特に制限されず、例えば、１種類の前記多型検出用プローブを１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。また、例えば、十分なシグナル値を確保できることから、前記反応系において、前記被検核酸に対する前記多型検出用プローブのモル比は、例えば、１倍以下が好ましく、より好ましくは、０．１倍以下である。前記被検核酸に対する前記多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００５６】
本発明の多型検出方法を適用する試料は、特に制限されず、例えば、生体試料があげられる。前記生体試料の具体例は、例えば、全血、白血球細胞等の血球、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液等があげられる。本発明において、前記試料の採取方法、前記試料からの被検核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００５７】
本発明の多型検出方法は、前述のような、いわゆるＴｍ解析に利用できる。Ｔｍ解析におけるＴｍ値について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示す。これによって、融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度（Ｔｍ）は、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００５８】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナルの測定は、例えば、前述した、２６０ｎｍにおける吸光度測定でもよいし、前記標識物質のシグナル測定でもよい。具体的には、前記多型検出用プローブとして、前述したように、前記標識物質で標識化された標識プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、前記増幅物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱により前記増幅物から前記プローブが解離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、前記増幅物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱により前記増幅物から前記プローブが解離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、前記標識物質のシグナルの検出によって、前記２６０ｎｍにおける吸光度測定と同様に、ハイブリッドの融解の進行の検出、Ｔｍ値の決定等を行える。前記標識物質のシグナル検出は、例えば、前記標識物質のシグナルに特有の条件で検出すればよい。前記検出条件は、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。前記標識プローブならびに前記標識物質は、前述のとおりである。
【００５９】
つぎに、本発明の多型検出方法について、一例をあげて説明する。本例は、本発明の多型検出用プローブとして、蛍光物質で標識された標識プローブを使用し、前記多型検出用プローブの存在下、鋳型核酸の増幅を行い、得られた増幅物を、前記被検核酸とする例である。本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程および条件については何ら制限されない。
【００６０】
まず、前記生体試料からゲノムＤＮＡを単離する。前記生体試料からのゲノムＤＮＡの単離は、特に制限されず、従来公知の方法により行える。具体例としては、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名GFX  Genomic  Blood  DNA  Purification  kit；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００６１】
つぎに、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に前記標識プローブを添加して、反応液を調製する。前記標識プローブは、例えば、前述のように、ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）が好ましい。
【００６２】
前記標識プローブは、例えば、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ用の反応液等の核酸増幅用反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００６３】
前記標識プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、核酸増幅反応の前、途中または後に添加できる。中でも、例えば、前記標識プローブの添加のために前記反応液を外部環境に露出する必要がなく、また、前記核酸増幅反応とシグナル値の測定とを、連続的に行うことが可能であるため、前記核酸増幅反応前に前記反応液に添加することが好ましい。この場合、前記標識プローブは、前述のように、その３’末端が標識物質またはリン酸基で修飾されていることが好ましい。
【００６４】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記標識プローブの存在下、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の多型を含む検出対象配列を増幅させる。以下、核酸増幅法としてＰＣＲを例にあげて説明するが、本発明は、これには制限されない。ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行える。
【００６５】
具体的には、前記ゲノムＤＮＡ、前記標識プローブおよび前記プライマーを含む前記反応液について、ＰＣＲを行う。前記反応液の組成は、特に制限されず、当業者であれば適宜設定できる。前記反応液は、例えば、前記ゲノムＤＮＡ、前記標識プローブおよび前記プライマーの他に、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、緩衝液、各種触媒等を含んでもよい。前記反応液における前記標識プローブおよび前記プライマーの添加割合は、特に制限されず、例えば、それぞれ、前述の範囲があげられる。
【００６６】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例として、例えば、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９２／９６８９）（Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ  ４５５  ４３０（商標Ｖｅｎｔ）：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
【００６７】
前記反応液におけるＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されず、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、５〜５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは、２０〜４０Ｕ／ｍＬである。ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
【００６８】
前記ヌクレオシド三リン酸は、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されず、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００６９】
前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液および市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
【００７０】
前記反応液は、さらに、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
【００７１】
前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、サーマルサイクラー等の使用する機器等に応じて適宜設定できるが、通常、１〜５００μＬであり、好ましくは１０〜１００μＬである。
【００７２】
つぎに、ＰＣＲを行う。前記ＰＣＲのサイクル条件は、特に制限されない。具体例として、例えば、（１）被検核酸である二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの解離、（２）前記一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ポリメラーゼ反応による前記プライマーの伸長は、それぞれ、下記表１の条件が例示できる。ＰＣＲのサイクル数は、特に制限されず、下記（１）〜（３）の３ステップを１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。前記サイクル数の合計の上限は、特に制限されず、例えば、１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは、５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御できる。
【００７３】
【表１】
2011052755.tif 000002
【００７４】
前記反応液における前記標識プローブの添加割合は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブを１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。例えば、十分なシグナル値を確保できることから、前記反応液において、前記被検核酸に対する前記標識プローブのモル比は、例えば、１倍以下が好ましく、より好ましくは、０．１倍以下である。前記被検核酸に対する前記標識プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００７５】
つぎに、得られた増幅物（二本鎖ＤＮＡ）の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記標識プローブの存在下、前記反応液の温度を変化させることで行える。この場合、前述のように、予め前記標識プローブを添加した前記反応液について、増幅反応を行った後、前記反応液を温度変化させることが好ましい。
【００７６】
前記解離工程における加熱温度は、例えば、二本鎖の前記増幅物を一本鎖に解離できる温度があげられる。前記加熱温度は、特に制限されず、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間は、特に制限されず、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００７７】
解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行える。温度条件は、例えば、４０〜５０℃である。前記温度での処理時間は、特に制限されず、例えば、１〜６００秒である。
【００７８】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅物と前記標識プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液を加熱し、すなわち、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、グアニン消光プローブ、すなわち、末端のシトシン（ｃ）が標識化されたプローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００７９】
前記蛍光強度の変動を測定する際、その温度範囲は、特に制限されない。前記開始温度は、例えば、室温〜８５℃であり、好ましくは、２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。温度の上昇速度は、特に制限されず、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは、０．３〜５℃／秒である。
【００８０】
つぎに、前記シグナル値の変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度変化量／ｄｔまたはｄ蛍光強度変化量／ｄｔ）を算出し、最も変化した値値を示す温度をＴｍ値として決定できる。前記標識プローブが前記蛍光消光プローブの場合、例えば、蛍光強度の増加量を測定し、単位時間当たりの蛍光強度増加量（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）が最も低い値を示す温度、または、単位時間当たりの蛍光強度増加量（ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）が最も高い値を示す温度を、Ｔｍ値として決定することもできる。一方、前記標識プローブとして、前記蛍光消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合は、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００８１】
前記標識プローブとして、例えば、検出波長の異なる標識物質を標識した複数の標識プローブを用いた場合、前記検出波長ごとに、前記シグナル値の変動を解析してもよい。
【００８２】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）等により算出でき、また、最近接塩基対法（Nearest  Neighbor  Method）によって決定することもできる。
【００８３】
そして、前記Ｔｍ値から、前記検出対象配列において、配列番号１に示すＭＰＬ遺伝子の塩基配列における塩基番号１１５３４または１１５３５の塩基が、前記野生型であるか、前記変異型であるかを決定する。前記Ｔｍ解析では、例えば、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、一塩基以上が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記標識プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基以上が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、前記検出対象配列の塩基が、前記野生型であるか、前記変異型であるかを決定できる。また、前述のように、前記野生型検出用プローブ、前記Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブおよび前記Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブを併用すれば、例えば、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値を示したのが、いずれのプローブであるかによって、前記多型の種類を決定することもできる。
【００８４】
本発明は、前述のように、前記多型検出用プローブを含む反応系の温度を上昇させて、すなわち、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記多型検出用プローブを含む反応系の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、例えば、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００８５】
具体例として、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合を例にあげる。この場合、前記標識プローブは、一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブを使用した場合、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００８６】
＜多型検出用試薬＞
本発明の多型検出用試薬は、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出用試薬である。本発明は、前記本発明の多型検出用プローブを含むことが特徴であり、その他の構成および条件は何ら制限されない。
【００８７】
前記多型検出用試薬は、例えば、前記多型検出用プローブを、１種類含んでもよいし、２種類含んでもよいが、３種類含むことが好ましい。具体的には、前記野生型検出用プローブ、前記Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブおよび前記Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブのうち、いずれか１種類でもよいし、２種類以上でもよいが、３種類を含むことが好ましい。本発明の多型検出用プローブの組み合わせは、特に制限されず、例えば、配列番号５に示すオリゴヌクレオチドを含む前記Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブと、配列番号６に示すオリゴヌクレオチドを含む前記Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブと、配列番号７に示すオリゴヌクレオチドを含む前記野生型検出用プローブとの組み合わせが例示できる。
【００８８】
本発明の多型検出用試薬は、さらに、ＭＰＬ遺伝子における前記検出目的部位を含む領域を増幅するためのプライマーまたはプライマーセットを含んでもよい。前記プライマーは、例えば、前述のものがあげられる。
【００８９】
本発明の多型検出用試薬は、この他にも、例えば、核酸増幅反応に必要な成分を含んでもよい。具体例としては、例えば、前述のような、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、緩衝液、各種触媒等があげられる。本発明の多型検出用試薬において、各成分は、例えば、同じ容器に収容されてもよいし、別の容器に収容されてもよい。
【００９０】
本発明の多型検出用試薬は、例えば、ＭＰＬ遺伝子の多型の検出に使用するプローブキットともいえる。本発明の多型検出用キットにおいて、各成分は、例えば、同じ容器に収容されてもよいし、別の容器に収容されてもよい。本発明の多型検出キットは、さらに、使用説明書を含んでもよい。
【００９１】
本発明のＭＰＬ遺伝子増幅用プライマーは、前述の通りであって、配列番号８〜９に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一つである。本発明の増幅方法は、反応系において、試料中の核酸を鋳型として、本発明のＭＰＬ遺伝子増幅用プライマーを用いて、前記ＭＰＬ遺伝子の増幅を行う増幅工程を含むことを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の増幅方法である。本発明の増幅物の検出方法は、本発明のプライマーを使用することを特徴し、本発明のＭＰＬ遺伝子の増幅方法により、ＭＰＬ遺伝子を増幅させる増幅工程を含むことを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の増幅物を検出する増幅物検出方法である。本発明の検出方法は、例えば、さらに、本発明のプローブを用いて、前記ＭＰＬ遺伝子の増幅物を検出する工程を含むことが好ましい。本発明のプライマーおよびこれを用いた各種方法は、前述の記載を参照できる。
【００９２】
つぎに、本発明の実施例について説明する。本発明は、下記実施例により制限されない。下記実施例において、特に示さない限り、％は、ｗ／ｖ％を示す。
【実施例】
【００９３】
［実施例１］
本例では、野生型プラスミドと変異型プラスミドとの共存下で、Ｔｍ解析を行い、ＭＰＬ遺伝子の多型を検出した。【００９４】
野生型プラスミド（ｗｔ）、変異型プラスミド（Ｗ５１５Ｌ）および変異型プラスミド（Ｗ５１５Ｋ）を作製した。前記ｗｔは、配列番号１の塩基番号１１５３４の塩基ｗがチミン（ｔ）であり、塩基番号１１５３５の塩基ｄがグアニン（ｇ）である、野生型ＭＰＬ遺伝子の部分配列（配列番号１の塩基番号１１３９１〜１１７１１）を挿入した二本鎖プラスミドとした。前記Ｗ５１５Ｌは、前記塩基番号１１５３５の塩基ｄがチミン（ｔ）に変異したＷ５１５Ｌ変異型ＭＰＬ遺伝子の部分配列（配列番号１の塩基番号１１３９１〜１１７１１）を挿入した二本鎖プラスミドとした。前記Ｗ５１５Ｋは、前記塩基番号１１５３４の塩基ｗがアデニン（ａ）に変異し、かつ、塩基番号１１５３５の塩基ｄがアデニン（ａ）に変異したＷ５１５Ｋ変異型ＭＰＬ遺伝子の部分配列（配列番号１の塩基番号１１３９１〜１１７１１）を挿入した二本鎖プラスミドとした。そして、前記ｗｔと、前記Ｗ５１５ＬまたはＷ５１５Ｋとを、所定の割合で混合し、下記に示す３種類の核酸試料を調製した。【００９５】
（核酸試料）
核酸試料                  各プラスミドの混合割合      
ｗｔ      Ｗ５１５Ｌ    Ｗ５１５Ｋ    
ｗｔ  １００％        １００％        ０％          ０％
Ｗ５１５Ｌ  ５０％      ５０％      ５０％          ０％
Ｗ５１５Ｋ  ５０％      ５０％        ０％        ５０％【００９６】
チューブ内に、前記核酸試料１μＬ（１×１０４コピー／μＬ）および下記表２の反応試薬４９μＬを添加し、ＰＣＲ反応液とした。前記ＰＣＲ反応液について、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６２℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から７５℃に加熱していき、前記多型検出用プローブの蛍光物質の種類に応じた検出波長において、経時的な蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。【００９７】
【表２】
2011052755.tif 000003
【００９８】
前記ＦプライマーおよびＲプライマーは、下記配列のプライマーを使用した。
Ｆプライマー（配列番号８）
5'-tgggccgaagtctgacccttt-3'
Ｒプライマー（配列番号９）
5'-acagagcgaaccaagaatgcctgt-3'【００９９】
前記各多型検出用プローブは、下記の配列のプローブを使用した。
Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブ１（配列番号５）
5'-ctgaggTTgcagtttc-(TAMRA)-3'
Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブ１（配列番号６）
5'-gctgaggAAgcagtttc-(BODIPY FL)-3'
野生型検出用プローブ１（配列番号７）
5'-ctgaggTGgcagtttcc-(Pacific Blue)-3'【０１００】
前記Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブ１、前記Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブ１および前記野生型検出用プローブ１は、それぞれ、ＭＰＬ遺伝子のアンチセンス鎖にパーフェクトマッチする配列であり、各配列において、大文字の塩基が、配列番号１における塩基番号１１５３４〜１１５３５の塩基（ｗｄ）に相当する。各プローブの３’末端は、それぞれ、蛍光物質で標識化されており、ＴＡＭＲＡは、４４５〜４８０ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、５２０〜５５５ｎｍ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅは、５８５〜７００ｎｍの波長で検出した。【０１０１】
これらの結果を図１〜３に示す。図１〜３は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１はｗｔ  １００％、図２はＷ５１５Ｌ  ５０％、図３はＷ５１５Ｋ  ５０％の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」とした。図１〜３において、黒丸（●）は、前記野生型検出用プローブによる検出結果、白丸（○）は、前記Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブによる検出結果、白三角（△）は、前記Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブによる検出結果である。形成されるハイブリッドがパーフェクトマッチの場合、評価基準となるＴｍは、以下の通りである。ｗｔのＴｍ値は、５８℃、Ｗ５１５ＬのＴｍ値は、５５℃、Ｗ５１５ＫのＴｍ値は、５７℃である。【０１０２】
図１に示すように、ｗｔ  １００％の試料については、ｗｔのＴｍ値でのみピークが確認された。そして、図２に示すように、Ｗ５１５Ｌを５０％およびｗｔを５０％含む試料については、ｗｔのＴｍ値およびＷ５１５ＬのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。図３に示すように、Ｗ５１５Ｋを５０％およびｗｔを５０％含む試料については、ｗｔのＴｍ値と、Ｗ５１５ＫのＴｍ値の両方で、ピークが確認された。このように、本実施例の前記野生型検出用プローブ、前記Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブおよび前記Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブを用いれば、いずれの多型が存在する場合であっても、野生型および２種類の変異型の多型を検出可能であることがわかった。【０１０３】
［比較例１］
本例では、前記多型検出用プローブとして、下記の各多型検出用プローブをそれぞれ使用した以外は、前記実施例１と同様にして、ＭＰＬ遺伝子の多型を検出した。下記配列において、Ｐは、３’末端のリン酸化を示す。【０１０４】
野生型検出用プローブ２（配列番号１０）
5'-(TAMRA)-ctgcCAcctcagcagca-P-3'
Ｗ５１５Ｌ変異型検出用プローブ２（配列番号１１）
5'-aggaaactgcAacc-(TAMRA)-3'
Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブ２（配列番号１２）
5'-ggaaactgcTTcc-(TAMRA)-3'
Ｗ５１５Ｋ変異型検出用プローブ３（配列番号１３）
5'-(TAMRA)-ctgaggAAgcagtttc-P-3'【０１０５】
これらの多型検出用プローブを使用した場合、前記実施例１の結果とは異なり、検出目的のプラスミドが存在する場合であっても、蛍光が消光せず、蛍光変化量のピークを確認できなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
以上のように、本発明によれば、ＭＰＬ遺伝子の多型を、例えば、Ｔｍ解析によって、簡便且つ優れた信頼性で判別できる。本発明は、野生型のＭＰＬ遺伝子と変異型のＭＰＬ遺伝子とを両方含む試料、あるいは、異なる変異型のＭＰＬ遺伝子を含む試料に対して、特に有用である。このように、本発明によれば、ＭＰＬ遺伝子の多型を、簡便且つ優れた信頼性で判別できることから、例えば、検出結果を、前述のような疾患の判定および治療等に反映することもできる。したがって、本発明は、医療分野等において極めて有用といえる。【０１０７】
以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。【０１０８】
この出願は、２００９年１０月３０日に出願された日本出願特願２００９−２５１４２９を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【図１】
2011052755.tif 000004
【図２】
2011052755.tif 000005
【図３】
2011052755.tif 000006
【配列表】
2011052755000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月1日(2011.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドを含むプローブ、（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブ、（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドを含むプローブおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブの少なくともいずれかであることを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出用プローブ。
（Ｐ１）塩基長が９〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１１５３５〜１１５４３を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１１５４３の塩基を、３’末端領域に有し、蛍光標識物質を、３’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、蛍光標識物質を、５’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が１０〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１１５３５〜１１５４４を含む塩基配列からなり、前記塩基番号１１５４４の塩基を、３’末端領域に有し、蛍光標識物質を、３’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、蛍光標識物質を、５’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に有するオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記（Ｐ１）および（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドにおいて、
前記配列番号１に示す塩基配列における塩基番号１１５３４〜１１５３５の塩基配列が、ｔｔ、ａａおよびｔｇの少なくともいずれかである、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項３】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１１５４３の塩基を、３’末端から数えて１〜４番目の位置に有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１１５４４の塩基を、３’末端から数えて１〜４番目の位置に有する、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、配列番号２および３の少なくともいずれかで示されるオリゴヌクレオチドであり、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
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【請求項５】
配列番号２に示すオリゴヌクレオチド、配列番号３に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に示すオリゴヌクレオチドが、それぞれ、配列番号５に示すオリゴヌクレオチド、配列番号６に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号７に示すオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の多型検出用プローブ。
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【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１１５４３の塩基に、前記蛍光標識物質を有し、
前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１における塩基番号１１５４３の塩基に相補的な塩基に、前記蛍光標識物質を有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１１５４４の塩基に、前記蛍光標識物質を有し、
前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１における塩基番号１１５４４の塩基に相補的な塩基に、前記標識物質を有する、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１０】
前記多型検出用プローブが、Ｔｍ解析用のプローブである、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１１】
請求項１に記載の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出用試薬。
【請求項１２】
さらに、ＭＰＬ遺伝子における検出目的の多型を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項１１に記載の多型検出用試薬。
【請求項１３】
請求項１に記載の多型検出用プローブを用いて、ＭＰＬ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、ＭＰＬ遺伝子の多型検出方法。
【請求項１４】
下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含む、請求項１３に記載の多型検出方法。
（Ａ）被検核酸および請求項１に記載の多型検出用プローブを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｂ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を決定する工程
【請求項１５】
前記反応系が、２種類以上の前記多型検出用プローブを含む、請求項１４に記載の多型検出方法。
【請求項１６】
前記反応系が、
前記多型検出用プローブとして、
配列番号２に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブ、配列番号３に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブおよび配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブのうち、いずれか２種類のプローブを含み、
配列番号２、配列番号３および配列番号４において、ｗｄの塩基配列は、それぞれ異なり、ｔｔ、ａａまたはｔｇである、請求項１５に記載の多型検出方法。
2011052755.tif 000009
2011052755.tif 000010
【請求項１７】
前記反応系が、
前記多型検出用プローブとして、
配列番号２に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブ、配列番号３に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブおよび配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを含むプローブを含み、
配列番号２、配列番号３および配列番号４において、ｗｄの塩基配列は、それぞれ異なり、ｔｔ、ａａまたはｔｇである、請求項１５に記載の多型検出方法。
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【請求項１８】
配列番号２に示すオリゴヌクレオチド、配列番号３に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に示すオリゴヌクレオチドが、それぞれ、配列番号５に示すオリゴヌクレオチド、配列番号６に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号７に示すオリゴヌクレオチドである、請求項１６に記載の多型検出方法。
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【請求項１９】
２種類以上の前記多型検出用プローブが、それぞれ、異なる標識物質を有する標識プローブである、請求項１５に記載の多型検出方法。
【請求項２０】
前記（Ａ）工程において、前記被検核酸が、鋳型核酸からの増幅物である、請求項１４に記載の多型検出方法。
【請求項２１】
さらに、下記（Ｘ）工程を含み、
前記（Ｘ）工程が、前記多型検出用プローブの存在下、反応系において、前記鋳型核酸から前記増幅物を生成する工程であり、
前記（Ａ）工程において、前記（Ｘ）工程における前記反応系の温度を変化させ、前記シグナル値の測定を行う、請求項２０に記載の多型検出方法。
（Ｘ）  鋳型核酸から増幅物を生成する工程
【国際調査報告】
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