(57)【要約】  本発明は、薬剤類の内包率や単胞リポソームの形成効率などの点で従来よりも優れている、二段階の乳化工程および溶媒除去工程を含むリポソームの製造方法を提供する。本発明に係るリポソームの製造方法は、内水相（Ｗ１）および油相（Ｏ）をリポソーム用混合脂質成分（Ｆ１）を用いて乳化しＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程と、Ｗ１／Ｏエマルションおよび外水相（Ｗ２）をリポソーム用混合脂質成分（Ｆ２）を用いて乳化しＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程と、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから油相（Ｏ）の有機溶媒を除去してリポソームを形成させる溶媒除去工程とを含むリポソームの製造方法であって、溶媒除去工程に供されるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの油相（Ｏ）が少なくとも２種類の有機溶媒を含有する混合有機溶媒であることを特徴とする。
2011062255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内水相（Ｗ１）および油相（Ｏ）をリポソーム用混合脂質成分（Ｆ１）を用いて乳化しＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程と、
Ｗ１／Ｏエマルションおよび外水相（Ｗ２）をリポソーム用混合脂質成分（Ｆ２）を用いて乳化しＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程と、
Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから油相（Ｏ）の有機溶媒を除去してリポソームを形成させる溶媒除去工程とを含むリポソームの製造方法であって、
溶媒除去工程に供されるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの油相（Ｏ）が少なくとも２種類の有機溶媒を含有する混合有機溶媒であることを特徴とするリポソームの製造方法。
【請求項２】
前記リポソームが単胞リポソームである、請求項１に記載のリポソームの製造方法。
【請求項３】
前記混合有機溶媒が、クロロホルム、シクロヘキサン、ジクロロメタン、ヘキサン、t‐ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、ペンタン、アセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノール、２‐プロパノールからなる群より選択される少なくとも２種類の有機溶媒を含有するものである、請求項１または２に記載のリポソームの製造方法。
【請求項４】
前記混合有機溶媒が、炭化水素の有機溶媒を含有する、請求項１または２に記載のリポソームの製造方法。
【請求項５】
前記混合有機溶媒が、下記の溶媒Ａ群及び溶媒Ｂ群のそれぞれより少なくとも１種類ずつ選択される少なくとも２種類の有機溶媒を含有する、請求項１または２に記載のリポソームの製造方法。
溶媒Ａ群：炭化水素
溶媒Ｂ群：エーテル、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化エーテル、エステル、アルコール、ケトンおよびアセトニトリル
【請求項６】
前記溶媒Ａ群が、ペンタン、ヘキサン及びシクロヘキサンからなる、請求項５に記載のリポソームの製造方法。
【請求項７】
前記溶媒Ｂ群が、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、メチルエチルケトン及びアセトリニトリルからなる、請求項５または６に記載のリポソームの製造方法。
【請求項８】
前記混合有機溶媒に含まれる前記溶媒Ａの体積比率が５０〜９９％である、請求項５〜７のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項９】
前記混合有機溶媒が、ヘキサン：クロロホルム＝６０：４０〜９０：１０（体積比、合計を１００とする）からなるものである、請求項３に記載のリポソームの製造方法。
【請求項１０】
前記混合有機溶媒が、ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０〜９０：１０（体積比、合計を１００とする）からなるものである、請求項３に記載のリポソームの製造方法。
【請求項１１】
前記混合有機溶媒が、ヘキサン：エタノール＝７０：３０〜９９：１（体積比、合計を１００とする）からなるものである、請求項３に記載のリポソームの製造方法。
【請求項１２】
前記一次乳化工程が、あらかじめ調製された混合有機溶媒を用いて乳化処理に行うステップ、および／またはＷ１／Ｏエマルションが調製されている途中または調製された後にさらに有機溶媒を油相に添加するステップを含むものである、請求項１〜１１のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項１３】
前記一次乳化工程における乳化法が膜乳化法またはマイクロチャネル乳化法である、請求項１〜１２のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項１４】
前記二次乳化工程における乳化法が膜乳化法、マイクロチャネル乳化法または撹拌乳化法である、請求項１〜１２のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項１５】
前記膜乳化法がＳＰＧ膜を用いた膜乳化法である、請求項１３または１４に記載のリポソームの製造方法。
【請求項１６】
前記一次乳化工程がさらにリポソームに内包させるべき物質を前記内水相（Ｗ１）または前記油相（Ｏ）に添加した上で行われる、請求項１〜１５のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項１７】
前記一次乳化工程後にリポソームに内包させるべき物質を前記油相（Ｏ）に添加する、請求項１〜１５のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載のリポソームの製造方法を使用する、リポソーム分散液またはその乾燥粉末の製造方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の製造方法により製造されたリポソーム分散液またはその乾燥粉末。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、化粧品、食品などの分野で用いられるリポソームの、二段階の乳化工程および溶媒除去工程を含む製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、単層または複数層の脂質二重膜からなる閉鎖小胞体であり、内水相および脂質二重膜内部にそれぞれ水溶性および疎水性の薬剤類を保持することができる。リポソームの脂質二重膜は生体膜に類似しているため生体内での安全性が高いことなどから、たとえばＤＤＳ（ドラック・デリバリー・システム）用の医薬品などの、各種用途が注目され、研究開発が進められている。【０００３】
リポソームの製造方法の一つとして、二段階の乳化工程によりＷ／Ｏ／Ｗエマルションを調製した後、その油相（Ｏ）を除去することによりリポソームを形成させる方法（マイクロカプセル化法ないし二段階乳化法と呼ばれる。）が知られている（非特許文献１）。このようなリポソームの製造方法において、従来、油相（Ｏ）は単一の有機溶媒により構成されていた。たとえば特許文献１（実施例）には、油相としてヘキサンのみを用いる、マイクロチャネルによる二段階乳化法の態様が記載されている。【０００４】
また、特許文献２には、「少なくとも１種の有機溶媒」、たとえば「エーテル、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化エーテル、エステル、クロロホルム、およびそれらの組合せ」を油相として使用する二段階乳化法が記載されている（請求項２，３０、［００５４］段落）。しかしながら、この特許文献２に記載された製造方法は、「全体にわたって連続した網目構造として分布する膜を持った複数の非同心円状のチャンバー」を有し、加重平均直径が通常は０．５〜２５μｍ程度のマイクロメーターの範囲にある「多胞状リポソーム」（ＭＶＬ）を対象とするものであり（請求項２、［００１９］段落、）、「単一の水系チャンバーを有するリポソーム構造物」である、通常は平均直径の範囲が約２０〜５００ｎｍである「単膜リポソームまたは小胞体」（ＵＬＶ）（［００１９］段落、本明細書で言う単胞リポソーム）を対象としたものではない。また、２種以上の有機溶媒を用いることが具体的にどのような技術的意義を有するのかについて、上記ＵＬＶを製造対象とする場合はもちろん、上記ＭＶＬを製造対象とする場合にも、全く記載も示唆もされていない。実施例としては、溶剤としてクロロホルム単独を用いて、二段階の撹拌乳化法により、ＭＶＬを調製したことが記載されているのみである（実施例１：［００７５］〜［００７９］等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４００９７３３号公報
【特許文献２】特許第３６７６９７６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ishii et al.  J. Dispersion Sci. Technol.  vol.9, No.1, 1-15, 1988.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
二段階の乳化工程および溶媒除去工程を含むリポソームの製造方法については、これまでも、薬剤類の内包率を向上させることやリポソームの粒径を所定の範囲に揃えることなどが課題とされており、そのために様々な手段が用いられてきたが（たとえば特許文献１では、Ｗ／Ｏエマルションの水相を凍結する工程が行われている）、より良好なリポソームを製造する上で改善の余地が残されていた。【０００８】
本発明は、薬剤類の内包率や単胞リポソームの形成効率などの点で従来よりも優れている、二段階の乳化工程および溶媒除去工程を含むリポソームの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、たとえばヘキサンとジクロロメタンのような、少なくとも２種類の有機溶媒を含有する混合有機溶媒をＷ１／ＯエマルションおよびＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの油相（Ｏ）とすることにより、１種類の有機溶媒のみを油相とする場合に比べて、それらのエマルションの分散安定性が飛躍的に高まり、リポソームの薬剤類の内包率や単胞リポソームの形成効率を向上させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
すなわち、本発明に係るリポソームの製造方法は、内水相（Ｗ１）および油相（Ｏ）をリポソーム用混合脂質成分（Ｆ１）を用いて乳化しＷ１／Ｏエマルションを調製する一次乳化工程と、Ｗ１／Ｏエマルションおよび外水相（Ｗ２）をリポソーム用混合脂質成分（Ｆ２）を用いて乳化しＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する二次乳化工程と、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから油相（Ｏ）の有機溶媒を除去してリポソームを形成させる溶媒除去工程とを含むリポソームの製造方法であって、溶媒除去工程に供されるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの油相（Ｏ）が少なくとも２種類の有機溶媒を含有する混合有機溶媒であることを特徴とする。【００１１】
本発明の製造方法は、好ましくは単胞リポソームを製造するためのものである。なお、本発明において、「単胞リポソーム」（ULV、単核リポソームと同義である）は、単一の内水相を有するリポソーム構造物を指し、通常は体積平均粒径の範囲が約２０〜５００ｎｍである。これに対して、「多胞リポソーム」（MVL: multivesicular liposomes）は、複数の非同心円状の内水相を包囲する脂質膜を含んでなるリポソーム構造物を指し、また「多重膜リポソーム」（MLV）は、複数の「タマネギの皮」のような同心円状の膜を有し、その間に殻様の同心円状の水系コンパートメントがあるリポソーム構造物を指す。多胞リポソームおよび多重膜リポソームの特徴は、体積平均粒径がマイクロメーターの範囲であり、通常は０．５〜２５μｍである。【００１２】
前記混合有機溶媒としては、たとえば、クロロホルム、シクロヘキサン、ジクロロメタン、ヘキサン、t‐ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、ペンタン、アセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノール、２‐プロパノールからなる群より選択される少なくとも２種類の有機溶媒が好ましい。【００１３】
本発明の一態様として、前記混合有機溶媒は炭化水素の有機溶媒を含有すること、たとえば、炭化水素からなる溶媒群（溶媒Ａ群）及びエーテル、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化エーテル、エステル、アルコール、ケトンおよびアセトニトリルからなる溶媒群（溶媒Ｂ群）のぞれぞれより少なくとも１種類ずつ選択される少なくとも２種類の有機溶媒を含有することが好ましい。前記溶媒Ａ群は、たとえばペンタン、ヘキサン及びシクロヘキサンからなることが好ましく、前記溶媒Ｂ群は、たとえばジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、メチルエチルケトン及びアセトリニトリルからなることが更に好ましい。また、前記混合有機溶媒に含まれる前記溶媒Ａの体積比率は５０〜９９％が好ましい。【００１４】
より具体的な好ましい混合有機溶媒の態様としては、たとえば、ヘキサン：クロロホルム＝６０：４０〜９０：１０、ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０〜９０：１０、ヘキサン：エタノール＝７０：３０〜９９：１（いずれも体積比、合計を１００とする）からなるものが挙げられる。【００１５】
前記混合有機溶媒を用いるために、前記一次乳化工程は、あらかじめ調製された混合有機溶媒を用いて乳化処理に行うステップ、および／またはＷ１／Ｏエマルションが調製されている途中または調製された後にさらに有機溶媒を油相に添加するステップを含むものとすることができる。【００１６】
また、前記一次乳化工程における乳化法としてはたとえば膜乳化法またはマイクロチャネル乳化法が好ましく、前記二次乳化工程における乳化法としてはたとえば膜乳化法、マイクロチャネル乳化法または撹拌乳化法が好ましい。さらに、これらの膜乳化法としてはたとえばＳＰＧ膜を用いた膜乳化法が好ましい。【００１７】
前記一次乳化工程は、さらにリポソームに内包させるべき物質を前記内水相（Ｗ１）または前記油相（Ｏ）に添加した上で行ってもよく、また、前記一次乳化工程後にリポソームに内包させるべき物質を前記油相（Ｏ）に添加してもよい。【００１８】
このような本発明のリポソームの製造方法は、リポソーム分散液またはその乾燥粉末の製造方法として利用することもできる。
【発明の効果】
【００１９】
混合有機溶媒をＷ１／Ｏエマルションおよび／またはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの油相とすることにより、それらのエマルションの分散安定性が高まるため、溶媒除去工程における粒子同士の接触および凝集を低減し、粒子径の増大（多胞リポソームなどの凝集塊の形成や、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルション内でのＷ１／Ｏエマルションの凝集・合一）を抑制することができる。また、二次乳化工程において膜乳化法やマイクロチャネル乳化法を用いる場合は、乳化基材の目詰まりの問題を解消することもできる。その結果、薬剤の内包率が高く、粒度分布の狭い微小な単胞リポソームを多く含む、医薬品用等として好適なリポソームを効率的に製造することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は試料１で調製したＷ１／Ｏエマルションの光学顕微鏡による観察写真である。
【図２】図２は比較試料１で調製したＷ１／Ｏエマルションの光学顕微鏡による観察写真である。
【図３】図３は比較試料２で調製したＷ１／Ｏエマルションの光学顕微鏡による観察写真である。
【図４】図４は試料５で調製したＷ１／Ｏエマルションの光学顕微鏡による観察写真である。
【図５】図５は試料６で調製したＷ１／Ｏエマルションの光学顕微鏡による観察写真である。
【図６】図６は試料７で調製したＷ１／Ｏエマルションの光学顕微鏡による観察写真である。
【図７】図７は試料１０で調製したＷ１／Ｏエマルションの光学顕微鏡による観察写真である。
【図８】図８は実施例１で調製したＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの光学顕微鏡による観察写真である。
【図９】図９は実施例１で調製したリポソームの光学顕微鏡による観察写真である。
【図１０】図１０は比較例２で調製したリポソームの光学顕微鏡による観察写真である。
【図１１】図１１は実施例４で調製したリポソームの光学顕微鏡による観察写真である。
【図１２】図１２は比較例５で調製したリポソームの光学顕微鏡による観察写真である。
【図１３】図１３は実施例２２で調製したリポソームの光学顕微鏡による観察写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
− リポソームの製造に用いる物質 −
・有機溶媒（Ｏ）
本発明では、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの油相（Ｏ）が、少なくとも２種類の有機溶媒を含有するもの（混合有機溶媒）となるようにする。
【００２２】
混合有機溶媒の配合組成（有機溶媒の種類および割合）は適宜調整することができる。混合有機溶媒に配合することのできる有機溶媒としては、沸点が５〜９５℃の範囲であることが望ましく、従来の一次乳化工程で通常単独で用いられてきたクロロホルム、シクロヘキサン、１，２‐ジクロロエテン、ジクロロメタン、１，２‐ジメトキシエタン、ヘキサン、１，１，２‐トリクロロエテン、t‐ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、ペンタンなどの非水溶性有機溶媒のほかに、従来は乳化の溶媒としてあまり一般的ではなかったアセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノール、２‐プロパノールなどの水溶性有機溶媒や、上記以外のエーテル、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化エーテル、エステル類が挙げられる。なかでもクロロホルム、シクロヘキサン、ジクロロメタン、ヘキサン、t‐ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ギ酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、メチルエチルケトン、ペンタン、アセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノール、２‐プロパノールなどが好ましい。３種以上の有機溶媒を組み合わせてもよいが、条件設定の容易さの観点からは２種の有機溶媒の組み合わせとすることが好ましい。必要に応じて、さらに各種の機能性成分を混合有機溶媒に添加してもよい。
【００２３】
本発明の一つの側面において、混合有機溶媒に配合する少なくとも２種類の有機溶媒は、混合脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）に含まれるリン脂質の溶解性を考慮しながら選択することも可能である。上で挙げた溶媒の中で、リン脂質の溶解性の高いクロロホルムやエタノールなどを単独で用いたＷ１／Ｏエマルションは、分散性は良いが合一が進みエマルション粒径が粗大になる、さらには水相と油相が完全に分離する、もしくは均一に混和してしまうなどの問題がある。一方で、ヘキサンなどのリン脂質の溶解性が低い溶媒のみを単独で用いたＷ１／Ｏエマルションは、エマルション同士の凝集が非常に強く分散安定性が悪い、均一な粒子径のエマルションを得ることが困難なことがある。これらの問題に対し、たとえば、リン脂質に対する溶解性が低い溶媒（本発明においてそのような性質を持つ溶媒を「溶媒Ａ」と称する。）とリン脂質に対する溶解性が高い溶媒（本発明においてそのような性質を持つ溶媒を「溶媒Ｂ」と称する。）とを含有する（好ましくはからなる）混合有機溶媒を用い、それらの比率を適宜調整することで、合一が進みにくく、且つ、凝集しないまたは凝集が強くないＷ１／Ｏエマルションを得ることができる。
【００２４】
このような溶媒Ａとしては、炭化水素が好ましく、ペンタン、ヘキサン、及びシクロヘキサンより選択される少なくとも１種類であることがより好ましい。また、溶媒Ｂとしては、エーテル、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化エーテル、エステル、アルコール、ケトンおよびアセトニトリルより選択される少なくとも１種類であることが好ましく、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、メチルエチルケトン及びアセトリニトリルより選択される少なくとも１種類であることがより好ましい。
【００２５】
このように有機溶媒の組み合わせは、混合脂質成分（リン脂質等）の溶解性、有機溶媒同士の相溶性、溶媒除去工程の条件設定などが好ましいものとなるよう、有機溶媒の極性（親水性・疎水性）、沸点、密度（比重）などが所定の関係性を有するものとなるようにすることができる。なお、この際に必ずしも良溶媒の沸点は貧溶媒の沸点よりも低い必要はない。
【００２６】
混合有機溶媒の一つの態様として、上記の溶媒Ａを主成分とするものは、得られるナノサイズのＷ１／Ｏエマルションの単分散性を向上させるなどの効果に優れるため好ましく、混合有機溶媒中に含まれる溶媒Ａ（溶媒Ａが複数の種類からなるものである場合はその総量）の体積比率が５０〜９９％であることがより好ましい。たとえば、ヘキサンおよびジクロロメタンからなる混合有機溶媒では、それらの体積比（ヘキサン：ジクロロメタン、合計を１００とする）は６０：４０〜９０：１０が好ましい。その他、ヘキサンおよび酢酸エチルからなる混合有機溶媒では、５０：５０〜９０：１０の体積比が好ましく、ヘキサンおよびエタノールからなる混合有機溶媒では、７０：３０〜９９：１の体積比が好ましい。
【００２７】
本発明では、溶媒除去工程に供されるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの油相（Ｏ）が少なくとも２種類の有機溶媒を含有する状態になっていればよい。そのようなＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する手法は特に限定されるものではなく、一次乳化工程および二次乳化工程で用いられる乳化方法に応じて適切な手法を設計することができる。
【００２８】
代表的には、（ｉ）あらかじめ少なくとも２種類の有機溶媒を含有する混合有機溶媒（Ｏ"）を調製しておき、その混合有機溶媒を用いて一次乳化処理を行い、Ｗ１／Ｏ"エマルションを調製するか、（ii）１種単独の有機溶媒（Ｏ'）を用いて一次乳化処理を行い、Ｗ１／Ｏ'エマルションが調製されている途中または調製された後に別の種類の有機溶媒を添加し、油相が混合有機溶媒となったＷ１／Ｏ"エマルションを調製し、そのようにして得られたＷ１／Ｏ"エマルションを二次乳化工程に供してＷ１／Ｏ"／Ｗ２を調製するような手法が挙げられる。上記（ii）の手法を用いる場合は、混合脂質成分の溶解性がより高い溶媒（たとえばジクロロメタン）を用いてＷ１／Ｏエマルションを調製したのち、溶解性がより低い溶媒（たとえばヘキサン）を添加するようにすることで、Ｗ１／Ｏエマルションの合一の過程を止めることができ、エマルションの粒径の制御を行うことが可能である。逆に、溶解性が低い溶媒でＷ１／Ｏエマルションを調製したのちに、溶解性がより高い溶媒を添加することで、Ｗ１／Ｏエマルションの凝集を減らし、分散性を向上させることができる。さらにこの場合には、リポソームを製造した際の当該リポソームの分散性向上の効果が顕著である。また、油相が３種類以上の有機溶媒を含有するものとする場合には、上記（ｉ）および（ii）を組み合わせたような手法、つまり、あらかじめ調製された少なくとも２種類の有機溶媒を含有する混合有機溶媒（Ｏ"）を用いてＷ１／Ｏ"エマルションを調製した上で、さらに別の種類の有機溶媒を添加するようにすることもできる。
【００２９】
一方で、上記のような手法とは異なり、二次乳化工程に供されるのはＷ１／Ｏ'エマルションであっても、二次乳化工程の途中で所定の処理を行うことにより、溶媒除去工程に供される前にＷ１／Ｏ"／Ｗ２が調製されるような手法であってもよい。
【００３０】
・水性溶媒（Ｗ１）・（Ｗ２）
水性溶媒（Ｗ１）および（Ｗ２）は公知の一般的なものを用いることができる。一次乳化工程で用いられる水性溶媒（Ｗ１）はＷ１／Ｏエマルションの水相（内水相）をなし、二次乳化工程で用いられる水性溶媒（Ｗ２）はＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの外水相をなす。水性溶媒としては、たとえば純水に、必要に応じて水と混合する他の溶媒、浸透圧調整のための塩類・糖類、ｐＨ調整のための緩衝液、その他の機能性成分（たとえば分散安定剤）などが添加された水溶液が用いられる。
【００３１】
内水相（Ｗ１）のｐＨは通常２〜１０の範囲であり、混合脂質成分に応じて好ましい範囲に調整することができる。
【００３２】
・混合脂質成分（Ｆ１）・（Ｆ２）
混合脂質成分（Ｆ１）は主としてリポソームの脂質二重膜の内膜を構成し、混合脂質成分（Ｆ２）は主として外膜を構成する。混合脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）は、同一の組成であっても、異なる組成であってもよい。
【００３３】
これらの混合脂質成分の配合組成は特に限定されるものではなく、リポソームの製造用に用いられる各種の混合脂質成分を用いることができるが、一般的には、リン脂質（動植物由来のレシチン；ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸またはそれらの脂肪酸エステルであるグリセロリン脂質；スフィンゴリン脂質；これらの誘導体等）と、脂質膜の安定化に寄与するステロール類（コレステロール、フィトステロール、エルゴステロール、これらの誘導体等）とを中心に構成され、さらに糖脂質、グリコール、脂肪族アミン、長鎖脂肪酸（オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸等）、その他各種の機能性を賦与する化合物が配合されていてもよい。本発明では、上記リン脂質としてジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）等の中性リン脂質が慣用される。また、Ｆ２にＰＥＧ化リン脂質などＤＤＳとしての機能性の付与に必要な脂質成分を配合することで、リポソーム表面の効率的な修飾が可能となる。混合脂質成分の配合比も、脂質膜の安定性やリポソームの生体内での挙動などの性状を考慮しながら、用途に応じて適切に調整すればよい。
【００３４】
・内包させるべき物質
本発明において、リポソームに内包させるべき物質（薬剤類と総称する）は特に限定されるものではなく、リポソームの用途に応じて医薬品、化粧品、食品などの分野で知られている各種の物質を用いることができる。
【００３５】
本発明に使用する水溶性薬剤類は高い水溶性をもつものほどより高い内包率のリポソームを得ることができる。特に本発明に適する水溶性薬剤類としては、水１００ｍＬに対し薬剤１ｇまたは１ｍＬ以上が溶解するものであり、好ましくは１０ｇまたは１０ｍＬ以上が溶解するもの、さらに好ましくは１００ｇまたは１００ｍＬ以上が溶解するものである。なお、薬剤類によるリポソームの体積平均粒径やＣＶ、分散性への影響はあまり見られない。
【００３６】
薬剤類のうち医療用の水溶性のものとしては、たとえば、造影剤（Ｘ線造影用の非イオン性ヨード化合物、ＭＲＩ造影用のガドリニウムとキレート化剤とからなる錯体等）、抗がん剤（アドリアマイシン、ビラルビシン、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、マイトマイシン、５−フルオロウラシル、イリノテカン、エストラサイト、エピルビシン、カルボプラチン、イントロン、ジェムザール、メソトレキセート、シタラビン、アイソボリン、テガフール、シスプラチン、エトポシド、トポテシン、ビラルビシン、ネダプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド、テスパミン、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバチン、エノシタビン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、ダウノマイシン、アクラルビシン、イビルビシン、アムルビシン、アクチノマイシン、タキソテール、トラスツブマブ、リツキシマブ、ゲムツズマブ、レンチナン、シゾフィラン、インターフェロン、インターロイキン、アスパラギナーゼ、ホスフェストロール、ブスルファン、ボルテゾミブ、アリムタ、ベバシズマブ、ネララビン、セツキシマブ等）、抗菌剤（マクロライド系抗生物質、ケトライド系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、オキサセフェム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、ベータラクタマーゼ配合剤、アミノグリコシド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、カルバペネム系抗生物質、ペネム系抗生物質）、MRSA・VRE・PRSP感染症治療剤、ポリエン系抗真菌剤、ピリミジン系抗真菌剤、アゾール系抗真菌剤、キャンディン系抗真菌剤、ニューキノロン系合成抗菌剤、抗酸化性剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進性剤、保湿剤、ホルモン剤、ビタミン類、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのセンス鎖もしくはアンチセンス鎖、プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、タンパク質（酵素、抗体、ペプチド等）、ワクチン製剤（破傷風などのトキソイドを抗原とするもの；ジフテリア、日本脳炎、ポリオ、風疹、おたふくかぜ、肝炎などのウイルスを抗原とするもの；DNAまたはRNAワクチン等）などの薬理的作用を有する物質や、色素・蛍光色素、キレート化剤、安定化剤、保存剤などの製薬助剤が挙げられる。
【００３７】
なお、水溶性の薬剤類をリポソームに内包させる方法としては、（ｉ）一次乳化工程の内水相（Ｗ１）に水溶性薬剤類をあらかじめ溶解または懸濁させておき、溶媒除去工程終了時点で当該水溶性薬剤類を内包するリポソームが得られるようにする方法、および（ｉｉ）水溶性薬剤類を内包しない空のリポソームを製造した後に、その空のリポソームの水性分散液に水溶性薬剤類を添加するか、あるいは空のリポソームを一旦乾燥粉末化し、それを水性溶媒に再分散させる際に水溶性薬剤類を添加することにより、リポソームに水溶性薬剤類を取り込ませる方法があり、いずれを用いることもできる。また、脂溶性の薬剤類も、上記（ｉ）に準じて一次乳化工程の油相（Ｏ）にあらかじめ溶解または懸濁させておく方法、上記（ｉｉ）のように空のリポソームの水性分散液に添加する方法により、リポソーム（脂質二重膜中）に内包させることができる。
【００３８】
・分散安定剤
二次乳化工程の外水相には、必要に応じて、薬剤類の内包率の向上および単胞リポソームの効率的な形成にさらに寄与しうる分散安定剤を配合してもよい。
【００３９】
たとえば、カゼインナトリウムのようなタンパク質乳化剤（水溶性乳化剤）は、従来用いられている分散安定剤の一つである。
【００４０】
また、自己による分子集合体（典型的にはミセル）を形成しない分散安定剤または自己による分子集合体を形成するがその体積平均粒径が１０ｎｍ以下である分散安定剤（以下これらを「特定分散安定剤」とよぶ。）は、分散安定剤としての効果に優れるとともに、必要に応じてリポソーム分散液から容易に分離除去することができるため好適である。
【００４１】
代表的な特定分散安定剤としては、タンパク質、多糖類、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤が挙げられる。多糖類は、一次乳化物（Ｗ１／Ｏ）と外水相（Ｗ２）の界面への配向性が比較的小さいため外水相（Ｗ２）全体に分布し、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２同士が接合しないようにすることでリポソームを安定化する。タンパク質および非イオン性界面活性剤は、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの界面への配向性が比較的高く、保護コロイドのようにエマルションを取り囲むことで安定化する。Ｗ１／Ｏ／Ｗ２同士が合一して粒径が大きくなると、液中乾燥法等による溶媒除去が不均一になり内包薬剤が漏れ出しやすくなるなどリポソームが不安定化してしまうが、前者の特定分散安定剤はそのような合一による不安定化を抑制することができ、単胞リポソームの形成効率および薬剤の内包率の向上に寄与する。また、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの界面に配向する後者の特定分散安定剤は、溶媒の除去にともないリポソームが形成されてゆく際に個々のリポソームを解けやすくすることができ、やはり単胞リポソームの形成効率および薬剤の内包率の向上に寄与する。
【００４２】
上記タンパク質としては、ゼラチン（コラーゲンを加熱により変性させた可溶性のタンパク質）、アルブミンやトリプシンなどが挙げられる。ゼラチンは通常、数千〜数百万の分子量分布を有するが、たとえば重量平均分子量が１,０００〜１００,０００であるものが好ましい。医療用ないし食品用として市販されているゼラチンを用いることができる。アルブミンには、卵アルブミン（分子量約４５,０００）、血清アルブミン（分子量約６６,０００…ウシ血清アルブミン）、乳アルブミン（分子量約１４,０００…α−ラクトアルブミン）などが含まれ、たとえば卵アルブミンである乾燥脱糖卵白が好ましい。
【００４３】
上記多糖類としては、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、ペクチン、キトサン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、グァーガム、マルトトリオース、アミロース、プルラン、ヘパリン、デキストリンなどが挙げられ、たとえば重量平均分子量が１,０００〜１００,０００のデキストランが好ましい。
【００４４】
上記イオン性界面活性剤としては、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００４５】
上記非イオン性界面活性剤としては、オクチルグルコシド等のアルキルグリコシド、ポリアルキレンオキサイド系の化合物、たとえば「Tween 80」（東京化成工業株式会社，ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート，分子量1309.68）や「Pluronic F-68」（BASF、ポリオキシエチレン（160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、数平均分子量9600）の製品や、重量平均分子量が1000〜100000のポリエチレングリコール類などが挙げられる。ポリエチレングリコール(PEG)類は、製品として「ユニルーブ」（日油株式会社）、GL4-400NP、GL4-800NP（日油株式会社）、PEG200,000(和光純薬)、マクロゴール（三洋化成工業株式会社）などが挙げられる。
【００４６】
特定分散安定剤の外水相への添加量（特定分散安定剤の濃度）は、種類に応じて適切な範囲で調整すればよい。ある濃度で自己による分子集合体（体積平均粒径が１０ｎｍを超えるもの）を形成する物質であっても、添加量をその濃度に達しない範囲で調節すれば、特定分散安定剤として用いることができる。特定分散安定剤の種類によっては、濃度が高すぎると粒度分布計による測定に支障をきたすこともあるので、そのような支障をきたさない低めの範囲で濃度を調整することが好ましい。
【００４７】
リポソームと特定分散安定剤を濾過工程により分離することを考慮すれば、特定分散安定剤の自己による分子集合体ないしそれらの集合物の体積平均粒径はリポソームの体積平均粒径の１／１０以下が好ましく、１／１００以下がより好ましい。
【００４８】
特定分散安定剤の分子量は、小さすぎると脂質膜中に混入しやすくなってリポソームの形成を阻害するおそれがあり、逆に大きすぎるとＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの外水相中への分散や界面への配向の速度が遅れてリポソームの合一や多胞リポソームの形成につながるおそれがある。そのため、特定分散安定剤の重量平均分子量は１，０００〜１００，０００の範囲内にあることが好ましい。
【００４９】
− リポソームの製造方法 −
本発明のリポソームの製造方法は、下記のような一次乳化工程、二次乳化工程および溶媒除去工程を有し、必要に応じてその他の工程を適宜組み合わせることができるものである。各工程を行うためには、公知の装置・機器類その他適切な手段を用いればよい。また、各工程の手段の選び方によっては連続的に一次乳化から溶媒除去工程までを行うことが可能である。なお、本発明のリポソームの製造方法は、最終的に水性溶媒（外水相）中でリポソームが形成されるものであるので、自ずとリポソームの分散液の製造方法となり、さらに乾燥粉末化工程を設けることによりリポソームの乾燥粉末の製造方法とすることもできる。
【００５０】
本発明の製造方法は、好ましくは単胞リポソームを製造するためのものである。単胞リポソームの製造方法といった場合、その製造方法により得られるリポソームの中に多胞リポソームが一切存在してはならないという趣旨ではなく、主として単胞リポソームを製造することを目的として設計された製造方法であればよい。混合脂質成分の配合組成などの条件によっては、多胞リポソームが比較的できやすい場合もあるが、そのように多胞リポソームが混在しうるような状況であっても本発明の方法を適用することが可能であり、内包率の向上等の効果が得られる。
【００５１】
（１）一次乳化工程
一次乳化工程は、有機溶媒（Ｏ）、水性溶媒（Ｗ１）、および混合脂質成分（Ｆ１）を乳化してＷ１／Ｏエマルションを調製する工程である。
【００５２】
Ｗ１／Ｏエマルションの調製方法としては、超音波乳化法、撹拌乳化法、膜乳化法、マイクロチャネル乳化法、高圧ホモジナイザーを用いた方法など、公知の方法を適用することができる。微小粒径の観点からは超音波乳化や高圧ホモジナイザーを用いた乳化が好ましい。また、熱などに対して不安定な薬剤を封入する際には、乳化に必要なエネルギーの小さいマイクロチャネル乳化法、ＳＰＧ膜などを用いた膜乳化法が好ましい。また、あらかじめ撹拌乳化等で大きな粒径のＷ１／Ｏエマルションを調製した後に、孔径の小さな膜を通過させることでより小さな粒径のＷ１／Ｏエマルションを調製するような、プレミックス膜乳化法を用いてもよい。
【００５３】
油相に少なくとも２種類の有機溶媒を含有するＷ１／Ｏエマルションを、二次乳化工程に供するようにするためには、一次乳化工程は、乳化処理の方法に応じて、（ｉ）あらかじめ調製された混合有機溶媒を用いて乳化処理に行うステップ、および／または（ii）Ｗ１／Ｏエマルションが調製されている途中または調製された後に、さらに有機溶媒を油相に添加するステップ、を含むようにしてもよい。
【００５４】
一次乳化工程における、Ｗ１／Ｏエマルションの平均粒子径、有機溶媒（Ｏ）に添加する混合脂質成分（Ｆ１）の割合、有機溶媒（Ｏ）と水性溶媒（Ｗ１）の体積比、その他の操作条件は、続く二次乳化工程の条件や最終的に調製するリポソームの態様などを考慮しながら、採用する乳化方法に応じて適宜調整することができる。通常、混合脂質成分（Ｆ１）の割合は有機溶媒（Ｏ）に対して１〜５０質量％であり、有機溶媒（Ｏ）と水性溶媒（Ｗ１）の体積比は１００：１〜１：２である。
【００５５】
一次乳化工程では、薬剤類をリポソームに内包させるために、リポソームに内包させるべき物質（水溶性または脂溶性の薬剤類）を内水相（Ｗ１）または油相（Ｏ）に添加し、溶解または懸濁させるようにしてもよい。また、薬剤が脂溶性である場合は、Ｗ１／Ｏエマルション調製後に油相（Ｏ）に添加してもよい。なお、このような方法以外にも、薬剤類を内包しない空のリポソームの分散液を調製した後にそこに薬剤類を添加するか、あるいは一旦凍結乾燥粉末化されたリポソームを水性溶媒に再分散させる際に薬剤類を添加しても、薬剤類をリポソームに内包させることができる。
【００５６】
（２）二次乳化工程
二次乳化工程は、一次乳化工程で調製されたＷ１／Ｏエマルションおよび外水相（Ｗ２）をリポソーム用混合脂質成分（Ｆ２）を用いて乳化し、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製する工程である。
【００５７】
二次乳化工程でＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製するための方法としては、膜乳化法、マイクロチャネル乳化法、撹拌乳化法、液滴法、接触法などが公知であり、本発明では膜乳化法、マイクロチャネル乳化法および撹拌乳化法が好ましい。
【００５８】
本発明の製造方法においては、マイクロチャネル乳化法およびＳＰＧ膜を用いた膜乳化法が好適である。これらの乳化法は、乳化処理に大きなエネルギーを必要としないため、乳化操作時の液滴の崩壊や液滴からの内包物質の漏出を抑えることができ、さらに、流下する連続相に液滴が放出されて滞留することなく運ばれてゆくため、液滴同士の接触、凝集・合一を低減することができる。また、膜乳化法としては、あらかじめ大きな粒径のＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製した後に、孔径の小さな膜を通過させることでより小さな粒径のＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製するようなプレミックス膜乳化法を用いてもよい。プレミックス膜乳化法は、必要とされるエネルギーが小さく、また処理量が多く、リポソームの調製を迅速化することができるため好適である。
【００５９】
上記水性溶媒（Ｗ２）、Ｗ１／Ｏエマルション、混合脂質成分（Ｆ２）、および必要に応じて用いられる分散安定剤の混合態様（添加順序等）は特に限定されるものではなく、適切な態様を選択すればよい。たとえばＦ２が主として水溶性脂質からなる場合、あらかじめそのようなＦ２（および必要に応じて分散安定剤）をＷ２に添加しておき、それにＷ１／Ｏエマルションを添加して乳化処理を行うことができる。また、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製した後、または後述の溶媒除去工程の後にＦ２を添加する方法も可能である。一方、Ｆ２が主として脂溶性脂質からなる場合、あらかじめそのようなＦ２をＷ１／Ｏエマルションの油相に添加しておき、それを必要に応じて分散安定剤が添加されているＷ２に添加して乳化処理を行うことができる。なお、混合脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）が同一の組成であってもよい場合は、一次乳化工程の際に添加した混合脂質成分のうちＦ１としてＷ／Ｏ界面に配向しきれなかった余剰分を、二次乳化工程のＯ／Ｗ界面に配向させるべきＦ２とすることができる。
【００６０】
二次乳化工程における、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの体積平均粒子径、水性溶媒（Ｗ２）ないしＷ１／Ｏエマルションの有機溶媒（Ｏ）に添加する混合脂質成分（Ｆ２）の割合、Ｗ１／Ｏエマルションと水性溶媒（Ｗ２）の体積比、その他の操作条件は、最終的に調製するリポソームの用途などを考慮しながら適宜調節することができる。
【００６１】
・乳化基材の親水化処理
上述した二次乳化工程において、マイクロチャネル乳化法、ＳＰＧ膜などを用いた膜乳化法を行う場合、それらの方法で用いる乳化基材（マイクロチャネル基板、ＳＰＧ膜等）は、親水性薬剤による表面処理がなされたものであることが好ましい。
【００６２】
上記親水性薬剤としては、たとえば、シリカ前駆体モノマー、および表面に親水性基を有するシランカップリング剤（典型的には、親水性基として、ポリオール構造、ポリエーテル構造、ポリアミン構造、３級アミン構造および４級アンモニウム構造のうち少なくとも１つを有するもの）が挙げられる。
【００６３】
このような親水性薬剤を用いた処理により、乳化基材の空気中での水との接触角を、好ましくは０〜５０°、より好ましくは０〜４２°、さらに好ましくは０〜３５°にすることができる。
【００６４】
乳化基材を用いてＷ／ＯエマルションからＷ／Ｏ／Ｗエマルションを製造する一つの方法に、Ｗ／Ｏエマルションを含む油相と外水相とが乳化基材をはさんで隔離された系が用いられる。ここで、Ｗ／Ｏエマルションは、油相と外水相との間に設けられた圧力差によって、乳化基材に形成された孔に進入し、この孔を通過することによって乳化基材を透過する。孔の出口に達し外水相と接したＷ／Ｏエマルションは、その後液滴を形成し、この液滴が孔の出口から外水相に向けて成長する。そして、この液滴が成長するにつれて、この液滴が孔の出口付近で次第にくびれてゆき、しまいにはこの液滴が乳化基材から分離して外水層中に分散する。このようにＷ／Ｏエマルションからなる液滴がくびれて乳化基材から分離する現象は、液滴と外水相と乳化基材表面との間に働く表面張力などの相互作用によって生じると考えられる。
【００６５】
ところが、従来公知のマイクロチャネル基板等の乳化基材を用いてＷ／Ｏ／Ｗエマルションを製造する場合、Ｗ／Ｏエマルションが連続流出するために液滴の粒径が大きくなり、所期の粒径を有するＷ／Ｏエマルションが分散したＷ／Ｏ／Ｗエマルションを作成できない場合があるという問題点がある。その理由として、外水相に接する部分の乳化基材表面における親水性が充分ではないために、Ｗ／Ｏエマルションからなる液滴が乳化基材表面に沿って拡大することが挙げられる。このような現象が生じると、外水相に放出される液滴の巨大化を招き、あるいは、互いに隣接し合う複数の孔の出口からの液滴が合体することにより外水相に接する部分の乳化基材表面にＷ／Ｏエマルションからなる層が生成し、外水相への液滴の放出が起こらなくなる場合がある。
【００６６】
ここで、外水相に接する部分の乳化基材表面、少なくとも、孔の出口およびその周辺部における乳化基材表面に充分な親水性を付与すれば、外水相に接する部分の乳化基材表面の全体が外水相に濡れることとなり、これによって、Ｗ／Ｏエマルションからなる液滴が乳化基材表面に沿って拡大することなく乳化基材から分離しやすくなる。さらに、乳化基材における孔の内部の親水性も高ければ、外水相とＷ／Ｏエマルションからなる液滴との界面が孔の出口を超えて孔の内部に達しやすくなり、これによりＷ／Ｏエマルションからなる液滴がくびれやすくなり、結果、Ｗ／Ｏエマルションからなる液滴が乳化基材からさらに分離しやすくなると考えられる。
【００６７】
（３）溶媒除去工程
溶媒除去工程は、二次乳化工程により調製されたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから油相（Ｏ）の有機溶媒を除去し、混合脂質成分（Ｆ１）および（Ｆ２）からなる脂質二重膜を有するリポソームを形成させる工程である。有機溶媒の除去の進行につれて、リポソームを構成する脂質の水和が進み、多胞リポソームが解けて単胞のリポソーム状態にばらけるか、またはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの界面に近い位置から単胞のリポソームがちぎれて形成されるものと考えられる。本発明において、油相が少なくとも２種類の有機溶媒を含有することは、そのようなメカニズムによりリポソームが形成される際に良好な影響を与えるものと考えられる。
【００６８】
溶媒除去の方法としては、たとえばエバポレータで蒸発させる方法や液中乾燥法が挙げられる。液中乾燥法は、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを回収し、開放容器内に移して静置あるいは撹拌することで、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションに含まれる有機溶媒（Ｏ）を蒸発除去する方法である。
【００６９】
この際、さらに加温や減圧によって溶媒除去を促進することができる。温度条件や減圧条件は、常法に従って水が揮発し過ぎない範囲で、用いる有機溶媒の種類などに応じて適宜調整すればよい。温度条件は、たとえば０〜６０℃の範囲が好ましく、０〜２５℃がより好ましい。また、減圧条件は溶媒の飽和蒸気圧〜大気圧の範囲内に設定されることが好ましく、溶媒の飽和蒸気圧の＋１％〜１０％の範囲内に設定されることがより好ましい。なお、有機溶媒が突沸するような条件であってもリポソームの調製は可能である。また、溶媒除去の際には温度条件と減圧条件とを組み合わせてもよい。たとえば、熱に弱い薬剤を使用する際は、より低温側でかつ減圧条件で溶媒を除去することが好ましい。
【００７０】
本発明では、油相（Ｏ）は少なくとも２種類の有機溶媒を含有するが、飽和蒸気圧の高い有機溶媒に合わせた条件（より低温および／またはより小さな減圧）から飽和蒸気圧の低い有機溶媒に合わせた条件（より高温および／またはより大きな減圧）に段階的に条件を変化させ、最終的に全ての種類の有機溶媒を除去するようにすることが好ましい。
【００７１】
また、溶媒除去の際にはＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを攪拌しなくともよいが、撹拌すればより均一に溶媒除去が進み、気液界面が広がることで溶媒除去に係る時間も短縮される。二次乳化工程において撹拌乳化法によりＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを調製した場合は、その後さらに撹拌を継続して溶媒を除去するといったように、二次乳化工程と溶媒除去工程を連続的に行うこともできる。
【００７２】
二段階乳化法によって得られるリポソームには、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルション由来の多胞リポソームがある程度の割合含まれることがあるが、これを減じるためにも、撹拌または減圧、好ましくはそれらを組み合わせて行うことがより効果的である。溶媒の大半が除去される時間より長く減圧および／または撹拌を行なうことが重要であり、それにより、リポソームを構成する脂質の水和が進み、多胞リポソームが解けて、単胞リポソームの状態にばらけると考えられる。
【００７３】
（４）その他の工程
必要に応じて用いられるその他の工程としては、リポソームの粒径を所望の範囲（たとえば５０〜５００ｎｍ程度）に調整し、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションから副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる、フィルターを用いる整粒工程や、外水相中にある遊離した薬剤や分散剤を除く分離工程、リポソームを保管に適した形態にする（使用時に水性溶媒中に再分散させる）ための乾燥粉末化工程、リポソーム粒径が十分に小さいときに限るがろ過滅菌工程、など、従来のリポソームの製造にも用いられていた各種の工程が挙げられる。特に驚くべきことに、上記目的での整粒工程の操作において、フィルターでのリポソームの捕集や内包物の漏出はほとんど起こらない。このような操作をしても多胞リポソームが残った場合には、粒子除去用のフィルターにより捕集・除去することができる。これらの工程は、溶媒除去工程の後に設けられ、溶媒除去工程から引き続き連続的に行われるようにしてもよい。
【００７４】
− リポソームの形態および用途 −
本発明の製造方法により最終的に製造されるリポソームの形態や用途は特に限定されるものではないが、たとえば医療用のリポソーム製剤として用いる場合は、体積平均粒径は好ましくは５０〜１，０００ｎｍであり、より好ましくは５０〜３００ｎｍである。このようなサイズのリポソームは、毛細血管を閉塞するおそれがほとんどなく、またがん組織近辺の血管にできる間隙を通過することもできるため、医薬品等として人体に投与されて使用する上で好都合である。
【実施例】
【００７５】
以下に述べる実施例および比較例で得られたリポソームの内包率は、下記の方法に従って測定した。【００７６】
（カルセインの内包率の測定方法）
リポソーム水溶液（３ｍＬ）全体の蛍光強度（Ｆtotal）を分光光度計（Ｕ−３３１０、日本分光株式会社）により測定した。次に０．０１Ｍ，ＣｏＣｌ2トリス塩酸緩衝液３０μＬを加えて外水相に漏出したカルセインの蛍光をＣｏ2+により消光することで、リポソーム内の蛍光強度（Ｆin）を測定した。さらに、カルセインを加えないでサンプルと同じ条件でリポソームを作製し、脂質自身が発する蛍光（Ｆl）を測定した。内包率は下記式より算出した；
内包率Ｅ（％）  ＝  (Ｆin−Ｆl)／(Ｆtotal−Ｆl)×１００
（siRNAの内包率の測定方法）
リポソーム液を超遠心分離して外液とリポソームを分離し、それぞれのｓｉＲＮＡ量をＨＰＬＣで測定することで、ｓｉＲＮＡの内包率を求めた。【００７７】
（粒度分布の測定方法）
以下に述べる各種試料として得られたＷ１／Ｏエマルションならびに実施例および比較例で得られたリポソームの体積平均粒径およびＣＶ値は、下記の方法に従って測定した。【００７８】
Ｗ１／Ｏエマルションをヘキサン／ジクロロメタン混合有機溶媒（体積比：１／１）で１０倍に希釈し、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（ＵＰＡ−ＥＸ１５０、日機装株式会社）を用いて粒度分布を測定し、これに基づき体積平均粒径およびＣＶ値（＝（標準偏差／体積平均粒径）×１００［％］）を算出した。また、リポソームの体積平均粒径は、同装置を用いて、作製したリポソーム懸濁液をそのまま測定した。【００７９】
（混合有機溶媒を用いた一次乳化工程によるＷ１／Ｏエマルションの製造）
試料１
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）「COATSOME MC-6060」（日油株式会社）１．５ｇ、およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）「COATSOME MG-6060LA」（日油株式会社）０．２５ｇを含む混合有機溶媒（ヘキサン／ジクロロメタン＝３／１）１５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）とし、カルセイン（０．４ｍＭ）を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍＭ）５ｍＬを内水相用の水分散相（Ｗ１）とした。５０ｍＬのビーカーにこれらの混合液を入れ、φ２０ｍｍのプローブをセットした超音波分散装置（ＵＨ−６００Ｓ、株式会社エスエムテー）により、２０℃にて１５分間超音波を照射し乳化処理を行った。上記方法に従って測定したところ、この一次乳化工程で得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径約１９０ｎｍ、ＣＶ値３３％の単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、分散性は良好であった。室温下で３時間静置しても同様の体積平均粒径・ＣＶ値・分散性を示した。光学顕微鏡観察では、単分散なエマルションを確認することは困難であり、緩やかな凝集が若干確認されたが、時間による変化は見られなかった（図１）。【００８０】
試料２
用いた混合有機溶媒をヘキサン／ジクロロメタン＝６／４に換え、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径１７０ｎｍ、ＣＶ値３２％の単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、その分散性は良好であった。室温下で３時間静置したところ体積平均粒径１９０ｎｍと僅かに合一が進んだが、ＣＶ値・分散性に変化は無かった。また、光学顕微鏡観察では、ほとんど凝集が確認されず、時間による変化は見られなかった。【００８１】
試料３
用いた混合有機溶媒をヘキサン／ジクロロメタン＝９／１に換え、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径２００ｎｍ、ＣＶ値３８％の単分散Ｗ／Ｏエマルションであることが確認され、その分散性は良好であった。室温下で３時間静置したところ体積平均粒径・ＣＶ値・分散性に変化は無かった。また、光学顕微鏡観察では、緩やかな凝集が確認されたが、時間による変化は見られなかった。【００８２】
試料４
用いた混合有機溶媒をヘキサン／ジクロロメタン＝５／５に換え、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径１６０ｎｍ、ＣＶ値３３％のＷ／Ｏエマルションであることが確認され、その分散性は良好であった。室温下で３時間静置したところＣＶ値・分散性に変化は無かったものの、体積平均粒径が４００ｎｍと合一がやや進んでいた。光学顕微鏡観察では凝集は確認されず、単分散のエマルションを確認することは困難であったが、３時間後には合一して微細なエマルションが確認された。【００８３】
比較試料１
用いた混合有機溶媒をヘキサンのみに換え、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径２５０ｎｍ、ＣＶ値４５％のＷ／Ｏエマルションであることが確認されたが、その分散性は悪く静置するとすぐに沈降した。室温下で３時間静置したところ体積平均粒径・ＣＶ値・分散性に変化は無かった。光学顕微鏡観察ではかなりの凝集が確認され、また、粒度分布測定とは異なり不均一なＷ／Ｏエマルションが観測されたが、時間による変化は見られなかった（図２）。【００８４】
比較試料２
用いた混合有機溶媒をジクロロメタンのみに換え、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルションは体積平均粒径１２０ｎｍ、ＣＶ値３４％のＷ／Ｏエマルションであり、その分散性は良好であったが、室温下で３０分間静置のみでＣＶ値・分散性に変化は無かったものの、体積平均粒径が１μｍ以上と合一が非常に進んでしまった。光学顕微鏡観察では凝集は確認されないものの、エマルションが合一して巨大化する様子が確認され、３時間後には合一した数μｍのエマルションが確認された（図３）。【００８５】
試料５〜１３
表１に記載のように混合有機溶媒の組成を変更する以外は、試料１と同様の操作を行った。各評価の結果を表１に示す。【００８６】
【表１】
2011062255.tif 000003
【００８７】
（混合有機溶媒を用いたリポソームの製造）
実施例１
（二次乳化工程によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造）
試料１により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、ＳＰＧ膜乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。ＳＰＧ膜乳化装置（ＳＰＧテクノ社製、商品名「外圧式マイクロキット」）に直径１０ｍｍ、長さ２０ｍｍ、細孔径１０μｍの円筒形ＳＰＧ膜を用い、装置出口側に外水相溶液（Ｗ２）である０．１％のプルロニックＦ６８を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍＭ）を満たしておき、装置入口側から上記Ｗ１／Ｏエマルションを供給して、Ｗ１：Ｗ２が１：４０となるようにＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。このとき、ＳＰＧ膜より連続流出などは起こらずに液滴が形成され、乳化後もこのエマルションは安定であった（図８）。【００８８】
尚、ＳＰＧ膜は事前にＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミドで表面修飾し、より親水化させたものを用いた。グルコンアミド修飾ＳＰＧ膜の調製方法は次の通りである。ＳＰＧテクノ社製の直径１０ｍｍ、長さ２０ｍｍ、細孔径１０μｍの円筒形ＳＰＧ膜を有機溶媒（エタノールなど）により脱脂、超純水にて洗浄および乾燥させた後、２０倍重量のエタノールで希釈したＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド液（Gelest社製：カタログ番号SIT8189）に浸漬させ、５０℃で２時間反応させ、その後、１００℃で３時間加熱乾燥させた。【００８９】
（有機溶媒相の除去によるリポソームの製造）
上記二次乳化工程により得られたＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを密閉容器に移し替え、２０℃・５００ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間攪拌し、次いで２０℃・１８０ｍｂａｒの減圧条件下で約８時間撹拌し、段階的に溶媒を揮発させた。得られたリポソーム懸濁液は半透明の黄色であり、この粒子内にはカルセインが含まれていることが確認された。得られたリポソームの体積平均粒径は８０ｎｍであり、ＣＶ値は３９％であった。リポソームのカルセイン内包率は８４％であった（図９）。【００９０】
なお、得られたリポソーム懸濁液中のヘキサン・ジクロロメタンの残留溶媒量をGC/MS（検出下限１０ｐｐｍ）を用いて測定したところ、ヘキサン・ジクロロメタンともに検出されず、リポソーム懸濁液中にほとんど残留していないことを確認した。【００９１】
また、二次乳化工程における外水相溶液中の０．１％プルロニックＦ６８の代わりに、０．０１％プルロニックＦ６８や３％デキストラン（分子量１０万）、３％精製ゼラチン（株式会社ニッピ，ニッピ  ハイグレードゼラチンタイプAP）および０．１％コール酸ナトリウムをそれぞれ添加剤に用いても、同様に微細なリポソーム懸濁液を得ることができている。【００９２】
実施例２
試料１により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、実施例１と同様の液組成で撹拌乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行った。撹拌乳化は、スターラーによりＷ２を強く撹拌しているところに、上記Ｗ１／Ｏエマルションを供給し、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。【００９３】
次いで実施例１と同様の方法で有機溶媒を除去し、微細なリポソーム粒子の懸濁液を得た。得られたリポソームの体積平均粒径は８５ｎｍであり、ＣＶ値は４３％であった。リポソームのカルセイン内包率は８２％であった。【００９４】
実施例３
試料１により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、実施例２と同様の操作でＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを得たうえで、ＳＰＧ膜乳化装置を用いたプレミックス膜乳化を行った。ＳＰＧ膜の細孔径は１μｍを用い、窒素ガスを用いて４ＭＰａで加圧して処理し、体積平均粒径０．８μｍ前後のＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを製造した。【００９５】
次いで実施例１と同様の方法で有機溶媒を除去し、微細なリポソーム粒子の懸濁液を得た。得られたリポソームの体積平均粒径は７５ｎｍであり、ＣＶ値は３７％であった。リポソームのカルセイン内包率は８１％であった。【００９６】
比較例１
比較試料１により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、実施例１と同様にＳＰＧ膜乳化法によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を試みたが、乳化開始から数分で乳化が止まり、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２を効率的に調製できなかった。この原因は膜のＷ１／Ｏエマルションによる目詰まりであった。【００９７】
比較例２
比較試料１により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、実施例２と同様に撹拌乳化によるＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションの製造を行い、次いで有機溶媒の除去を行った。リポソームの体積平均粒径は１７０ｎｍであり、ＣＶ値は＞５０％で単分散ではなかった。光学顕微鏡での観察では、多胞リポソームが複数観察された。リポソームのカルセイン内包率は５１％であった（図１０）。【００９８】
比較例３
比較試料２により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、実施例１と同様に二次乳化にＳＰＧ膜乳化法を用いたリポソームの製造を試みたが、二次乳化の処理が進むにつれてＳＰＧ膜が目詰まりを起こしてしまい、所定量のＷ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを得ることができなかった。【００９９】
比較例４
比較試料２により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として、実施例２と同様に二次乳化に撹拌乳化を用いたリポソームの製造を行った。得られたリポソームの体積平均粒径は＞２μｍとかなり粗大になっており、ＣＶ値は＞５０％であった。リポソームのカルセイン内包率は６７％であった。【０１００】
実施例４
ＤＰＰＣに換えて卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社）を用いたこと以外は試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルション（試料１４）の分散性は良好であった。試料１４のＷ１／Ｏエマルションを分散相として用いることを除いては、実施例１と同様にリポソームを作製した。得られたリポソームの体積平均粒径は１８５ｎｍであり、ＣＶ値は４４％であった。リポソームのカルセイン内包率は８７％であった。光学顕微鏡観察では、実施例１とは異なり、多胞リポソームが複数あることを確認できた（図１１）。【０１０１】
比較例５
ＤＰＰＣに換えて卵黄レシチン「COATSOME NC-50」（日油株式会社）を用いたこと以外は比較試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルション（比較試料３）のの分散性は悪く、静置するとすぐに沈降した。比較試料３により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として用いることを除いては、実施例２と同様の操作を行い、リポソームを得た。得られたリポソームの体積平均粒径は２７０ｎｍであり、ＣＶ値は＞５０％であった。リポソームのカルセイン内包率は４５％であった。光学顕微鏡観察では、かなりの個数の多胞リポソームがあることを確認できた（図１２）。【０１０２】
比較例６
比較試料３により得られたＷ１／Ｏエマルションを分散相として用い、また撹拌乳化法の代わりにＳＰＧ膜乳化を用いることを除いては、実施例２と同様の操作を行い、Ｗ１／Ｏ／Ｗ２エマルションを得ようとしたところ、比較例１と同様にＳＰＧ膜が目詰まりし、乳化を行うことができなかった。【０１０３】
実施例５
試料１のＷ１／Ｏエマルションを調製した後に、ＰＥＧ修飾リン脂質（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）「SUNBRIGHT DSPE-020CN」０．０７５ｇを添加することを除いては、実施例１と同様にリポソームを作製した。得られたリポソームの体積平均粒径は１３５ｎｍであり、ＣＶ値は４１％であった。リポソームのカルセイン内包率は８０％であった。【０１０４】
実施例６〜１４
試料５〜試料１３のＷ１／Ｏエマルションを用いて、溶媒に合わせた減圧条件を設定した以外は実施例１と同様の操作を行い、リポソームを得た。得られたリポソームの物性を表２に示す。【０１０５】
実施例１５
用いた混合有機溶媒をヘキサン／ギ酸エチル＝８/２に換えたこと以外は、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルション（試料１５）の分散性は良好であり、室温下で３時間静置したところ分散性に変化はなかった。試料１５のＷ１／Ｏエマルションを用いて、溶媒に合わせた減圧条件を設定することを除いて、実施例１と同様にリポソームを作製した。リポソームの体積平均粒径は１００ｎｍ・ＣＶ値は４３％であり、カルセイン内包率は７６％であった。また、途中で得られるＷ１／Ｏエマルションは単分散なエマルションで分散安定性が高く、３時間での変化は見られなかった。【０１０６】
実施例１６
用いた混合有機溶媒をシクロヘキサン／酢酸イソプロピル＝７／３に換えたこと以外は、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルション（試料１６）の分散性は良好であり、室温下で３時間静置したところ分散性に変化はなかった。試料１６のＷ１／Ｏエマルションを用いて、溶媒に合わせた減圧条件を設定することを除いて、実施例１と同様にリポソームを作製した。リポソームの体積平均粒径は７５ｎｍ・ＣＶ値は４１％であり、カルセイン内包率は６７％であった。また、途中で得られるＷ１／Ｏエマルションは単分散なエマルションで分散安定性が高く、３時間での変化は見られなかった。【０１０７】
実施例１７
用いた混合有機溶媒をヘキサン／酢酸メチル＝３／１に換えたこと以外は、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルション（試料１７）の分散性は良好であり、室温下で３時間静置したところ分散性に変化はなかった。試料１７のＷ１／Ｏエマルションを用いて、溶媒に合わせた減圧条件を設定することを除いて、実施例１と同様にリポソームを作製した。リポソームの体積平均粒径は７０ｎｍ・ＣＶ値は３８％であり、カルセイン内包率は７１％であった。また、途中で得られるＷ１／Ｏエマルションは単分散なエマルションで分散安定性が高く、３時間での変化は見られなかった。【０１０８】
実施例１８
用いた混合有機溶媒をヘキサン／アセトニトリル＝５／１に換えたこと以外は、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルション（試料１８）の分散性は良好であり、室温下で３時間静置したところ分散性に変化はなかった。試料１８のＷ１／Ｏエマルションを用いて、溶媒に合わせた減圧条件を設定することを除いて、実施例１と同様にリポソームを作製した。リポソームの体積平均粒径は１００ｎｍ・ＣＶ値は４７％であり、カルセイン内包率は６１％であった。また、途中で得られるＷ１／Ｏエマルションは単分散なエマルションで分散安定性が高く、３時間での変化は見られなかった。【０１０９】
実施例１９
用いた混合有機溶媒をペンタン／メタノール＝９５／５に換えたこと以外は、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルション（試料１９）の分散性は良好であり、室温下で３時間静置したところ分散性に変化はなかった。試料１９のＷ１／Ｏエマルションを用いて、溶媒に合わせた減圧条件を設定することを除いて、実施例１と同様にリポソームを作製した。リポソームの体積平均粒径は９５ｎｍ・ＣＶ値は４１％であり、カルセイン内包率は６４％であった。また、途中で得られるＷ１／Ｏエマルションは単分散なエマルションで分散安定性が高く、３時間での変化は見られなかった。【０１１０】
実施例２０
用いた混合有機溶媒をヘキサン／アセトン＝８／２に換えたこと以外は、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルション（試料２０）の分散性は良好であり、室温下で３時間静置したところ分散性に変化はなかった。試料２０のＷ１／Ｏエマルションを用いたことを除いて、実施例１と同様にリポソームを作製した。リポソームの体積平均粒径は１４０ｎｍ・ＣＶ値は４１％であり、カルセイン内包率は７５％であった。また、途中で得られるＷ１／Ｏエマルションは単分散なエマルションで分散安定性が高く、３時間での変化は見られなかった。【０１１１】
実施例２１
カルセインに換えて２００μｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ（ランダム配列）を用いたこと以外は、試料１と同様の操作を行った。得られたＷ１／Ｏエマルション（試料２１）の分散性は良好であった。試料２１のＷ１／Ｏエマルションを用いたことを除いては、実施例１と同様にリポソームを作製した。得られたリポソーム液は白色の半透明であり、体積平均粒径は７０ｎｍ・ＣＶ値は３９％であった。リポソーム中のｓｉＲＮＡ内包率は８０％であった。調製は、リポソーム分散液としてのｓｉＲＮＡ濃度が計算上５μｇ／ｍＬとなるようにしたところ、実際に得られたｓｉＲＮＡ濃度は４．５μｇ／ｍＬであった。【０１１２】
実施例２２
ＤＰＰＣ１．５ｇおよびＤＰＰＧ０．２５ｇが溶解したヘキサン１１．２５ｍＬを有機溶媒相（Ｏ）としたこと以外は試料１と同様の操作を行い、超音波乳化法で一次乳化処理を行った後、ジクロロメタン３．７５ｍＬを添加した。得られたＷ１／Ｏエマルション（試料２２）の分散性は良好であった。試料２２のＷ１／Ｏエマルションを用いたことを除いては、実施例２と同様にリポソームを作製した。得られたリポソームの体積平均粒径は１４０ｎｍであり、ＣＶ値は４１％であった。また、リポソームのカルセイン内包率は８３％であった。【０１１３】
以上のすべての実施例および比較例において得られたリポソームは単胞リポソームであることが顕微鏡により確認できた。【０１１４】
【表２−１】
2011062255.tif 000004
【０１１５】
【表２−２】
2011062255.tif 000005
【図１】
2011062255.tif 000006
【図２】
2011062255.tif 000007
【図３】
2011062255.tif 000008
【図４】
2011062255.tif 000009
【図５】
2011062255.tif 000010
【図６】
2011062255.tif 000011
【図７】
2011062255.tif 000012
【図８】
2011062255.tif 000013
【図９】
2011062255.tif 000014
【図１０】
2011062255.tif 000015
【図１１】
2011062255.tif 000016
【図１２】
2011062255.tif 000017
【図１３】
2011062255.tif 000018
【国際調査報告】
2011062255.tif 000019
2011062255.tif 000020
2011062255.tif 000021
2011062255.tif 000022
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