(57)【要約】本発明は、コラーゲンでコーティングをしたゼラチンハイドロゲル上に、角膜内皮細胞を播種して培養することにより得られる、ゼラチンハイドロゲルに角膜内皮細胞を含んでなる角膜移植用シートに関する。本発明のシートは、生体適合性や生体内分解性に加えて、高い透明性を有するため、角膜移植用シートとして極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼラチンハイドロゲルに角膜内皮細胞を含んでなる、角膜移植用シート。
【請求項２】
ゼラチンハイドロゲルが、厚さ１０〜２００μｍである、請求項１に記載の角膜移植用シート。
【請求項３】
ゼラチンハイドロゲルが、厚さ３０〜１００μｍである、請求項１又は２に記載の角膜移植用シート。
【請求項４】
ゼラチンハイドロゲルの含水率が９２〜９９％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の角膜移植用シート。
【請求項５】
ゼラチンハイドロゲル内の細胞密度が２０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の角膜移植用シート。
【請求項６】
ＺＯ−１陽性の角膜内皮細胞を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の角膜移植用シート。
【請求項７】
ゼラチンハイドロゲルが、ゼラチンを加熱架橋処理して作製されたものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の角膜移植用シート。
【請求項８】
ゼラチンハイドロゲルが、移植後生体内で分解されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の角膜移植用シート。
【請求項９】
ゼラチンハイドロゲルが、移植後、１〜６ヶ月に生体内で分解消失することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の角膜移植用シート。
【請求項１０】
ゼラチンハイドロゲルが、生分解せずに実質組織に生着することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の角膜移植用シート。
【請求項１１】
角膜内皮細胞が患者由来の細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の角膜移植用シート。
【請求項１２】
コラーゲンでコーティングをしたゼラチンハイドロゲルシート上に、角膜内皮細胞を播種して培養することにより得られる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の角膜移植用シート。
【請求項１３】
コラーゲンでコーティングをしたゼラチンハイドロゲルシート上に、角膜内皮細胞を播種して培養することを特徴とする、角膜移植用シートの製造方法。
【請求項１４】
コラーゲンをゼラチンハイドロゲルシート表面上に塗布する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
角膜内皮細胞がコンフルエントになってから７日目以降に、角膜内皮細胞を含むゼラチンハイドロゲルシートを培養容器から剥離することを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
得られた角膜移植用シートにおけるゼラチンハイドロゲル内の細胞密度が２０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２以上であることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼラチンハイドロゲルを支持体とする角膜移植用シートに関する。より詳細には、ゼラチンハイドロゲル上で角膜内皮細胞を培養して作成される、透明性の高い角膜移植用シートに関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜は、外側から、角膜上皮層、ボーマン膜、実質角膜層、デスメ膜、角膜内皮層の５層からなる。このうち一番内側に存在する角膜内皮層は単一の細胞層で、角膜に必要な物質を前房水から取り込むとともに、角膜の水分を前房水へ排出して角膜厚を一定に保ち、角膜の透明性を維持する。角膜内皮細胞数が低下すると、水分排出が不十分になり、角膜混濁や、水疱性角膜症等の角膜内皮疾患の原因となる。ヒト角膜内皮細胞は生体内においては増殖しないため、一度損傷を受けると、その根本的な治療は移植以外に方法がない。【０００３】
従来、角膜内皮疾患に関しては、全層角膜移植術が行われているが、絶対的なドナー不足と移植後の拒絶反応という問題がある。これに対し、ヒト輸入アイバンク角膜の角膜内皮（一部実質を含む）を採取し、疾患眼に移植する方法（Ｄｅｓｃｅｍｅｔ  ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ；ＤＳＥＫ）が知られている。ＤＳＥＫでは、角膜内皮細胞を移植するため、全層角膜移植に比較して拒絶反応は軽減されるが、拒絶反応やドナー不足の問題を根本的に解決することはできない。【０００４】
一方、研究段階ではあるが、患者自身の角膜内皮細胞を用いた治療法も開発されている。この方法では、健眼角膜輪部細胞を増殖させて大量の角膜内皮細胞を得ることが可能であるため、前述したドナー不足の問題は解決しうる。しかし、通常培養角膜内皮細胞は単層で、細胞同士の結合もあまり強くないため、これをそのまま移植に用いることは操作性や強度の点で困難を伴う。また、培養した細胞は通常トリプシン等の酵素や化学薬品処理することによって培養容器から剥離・回収されるが、その処理によりデスモソーム構造が壊され、移植後の細胞シートの生着性や強度、機能が著しく低下するという問題もある。【０００５】
上記の問題に対し、発明者らは、０−８０℃の温度範囲内で水和力が変化する温度応答性ポリマーを結合した培養皿を用いた培養角膜内皮細胞シート移植法を開発している。この方法では、酵素を用いずに温度を下げるだけで細胞シートを回収可能で、実験的に家兎角膜への移植に成功している。（特許文献１及び非特許文献１）。しかしながら、この方法はキャリアを用いないため、回収した培養角膜内皮細胞のハンドリングが困難であり、実際に臨床応用することは困難であるといった問題ある。【０００６】
また、動物実験段階ではあるが、アテロコラーゲンを培養角膜内皮細胞の移植用キャリアとして使用する方法も知られている（非特許文献２）。しかし、アテロコラーゲンの生体接着性及び生体分解性は良好でなく、移植後に内皮面から脱落し前房内に残留することが報告されている。このことから、結果として内皮細胞を刺激し、その密度低下の原因となることが懸念される。また、円柱状に加工したゼラチンディスクに培養角膜内皮細胞をのせ、ディスクごと移植する方法も報告されている（非特許文献３）が、ゼラチンディスクは厚さが約８００μｍで生分解に時間がかかり、また分解による炎症の惹起も懸念される。【０００７】
再生医療の組織工学においては、生体内分解性の培養支持体上で細胞や組織を培養し、支持体とともに患部にそのまま移植する方法が知られている。その支持体の構成材料として、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子やコラーゲン等のハイドロゲルを利用することも知られている（特許文献２）。ゼラチンハイドロゲルは、熱反応等によりゼラチン分子間に架橋を形成させて得られるハイドロゲルで、高い生体吸収性と生体適合性に加えて、優れた徐放効果を有する。そのため、ｂＦＧＦやＢＭＰ等のサイトカインや水難溶性薬物の徐放性基材（特許文献３〜５など）としての利用が報告されている。しかしながら、ゼラチンハイドロゲルを角膜内皮移植用キャリアとして角膜細胞の培養に用いることはこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０７３７６１
【特許文献２】特開２００２−１８６８４７号
【特許文献３】特開２００４−２０３８２９号
【特許文献４】特開２００７−３３２１０６号
【特許文献５】特開２００８−１３７９７５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｄｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００６  Ｆｅｂ．，２７（４）：６０７−６１４
【非特許文献２】Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｎ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２００７  Ｏｃｔ．，４８（１０）：４５１９−２６
【非特許文献３】Ｈｓｉｕｅ  ＧＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００６  Ｆｅｂ．，１５；８１（３）：４７３−６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
角膜移植に用いられる移植用基材には、生体適合性や生体内分解性に加えて、透明性という要件が必要となる。本発明の課題は、これらの条件を満たす最良の角膜内皮移植用基材を決定し、これを用いて患部にそのまま適用可能な角膜移植用シートを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、角膜移植に用いられる移植用基材として、以下の条件を満たす素材を探索し、ゼラチンハイドロゲルを選択した。
１）培養角膜内皮細胞を移植する際に内皮細胞のもつ機能・形態を損なうことなく移植することが可能。
２）実質への生着性が良好でありシートの脱落が起きない、又は、速やかに生分解されるためシートが前房内に脱落しないため移植した角膜内皮への傷害も起きない。
３）移植後の透明性・生体適合性も良好であり、炎症反応等が無く、角膜透明性も維持されている。【００１２】
そして、ゼラチンをシート状に加工し、架橋処理を行ってゼラチンハイドロゲルシートを作製し、これを支持体として角膜内皮細胞を培養した。さらに、このシートを水疱性角膜症モデルマウスの前眼部に移植し、その分解性と治療効果を評価した。その結果、ゼラチンハイドロゲルを支持体とした角膜移植用シートは、高い細胞の生着性と透明性を示し、移植後の経過もきわめて良好であることが確認された。
すなわち、本発明は、ゼラチンハイドロゲルに角膜内皮細胞を含んでなる角膜移植用シートに関する。【００１３】
本発明の角膜移植用シートにおいて、ゼラチンハイドロゲルの厚さは、好ましくは１０〜２００μｍ、より好ましくは３０〜１００μｍである。【００１４】
また、ゼラチンハイドロゲルの含水率は、好ましくは９２〜９９％、より好ましくは９５〜９８％である。さらに、用いられる角膜内皮細胞はＺＯ−１もしくはＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ陽性の細胞である。【００１５】
本発明で用いられるゼラチンハイドロゲルは、ゼラチンを加熱架橋処理して作製されたものである。ゼラチンハイドロゲルは、移植後生体内で分解されるが、その分解速度は架橋度等によって調整が可能である。すなわち、ゼラチンハイドロゲルが、移植後、１〜６ヶ月に生体内で分解消失するように調整してもよいし、１年以上生分解することなく、実質組織に生着するように調整してもよい。
本発明で用いられる角膜内皮細胞は、患者由来の細胞から調製されたものであることが好ましい。【００１６】
本発明の角膜移植用シートは、コラーゲンでコーティングをしたゼラチンハイドロゲルシート上に、角膜内皮細胞を播種して培養することにより得られる。【００１７】
ここで、コラーゲンのコーティングは、従来のコラーゲン溶液に浸漬する方法ではなく、コラーゲン溶液をシート表面に塗布する方法により行う。この方法でコーティングすることにより、シートの細胞接着性とバリア機能が格段に改善される。コーティング処理時の温度、湿度、時間については、特に限定されるものではない。また、コラーゲン溶液濃度と種類についても同様に限定されるものではない。【００１８】
具体的には、コラーゲンでコーティングをしたゼラチンハイドロゲルシート上に、角膜内皮細胞を播種して培養し、角膜内皮細胞がコンフルエントになってから７日目以降に、角膜内皮細胞を含むゼラチンハイドロゲルシートを培養容器から剥離することにより得られる。前述のとおり、得られた角膜移植用シートにおけるゼラチンハイドロゲル内の細胞密度は、２０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２以上、好ましくは２５００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２以上、より好ましくは３０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２以上である。
【発明の効果】
【００１９】
培養角膜内皮細胞は単層であるため移植時のハンドリングが困難であり、安定した移植結果を得るには強度と透明性を有した支持体（キャリア）が必要である。本発明で用いられるゼラチンハイドロゲルは、適切な強度、優れた透明性を有し、移植用キャリアとして用いることにより角膜移植用シートの強度と操作性を格段に向上させる。また、ゼラチンハイドロゲルは生体内で分解され、残存することがないため、これによる角膜内皮障害の心配がなく、移植後早期に角膜透明性が回復する。さらに、ゼラチンハイドロゲルはすでに臨床使用されている材料であるため、これを用いた本発明の角膜移植用シートは、安全に臨床使用に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ゼラチンハイドロゲルシート及びアテロコラーゲンシートの透明性を比較した写真像を示す。
【図２】図２は、ゼラチンハイドロゲルシート及びアテロコラーゲンシートの力学特性の評価結果を示す（Ａ：各シートの引っ張り試験に対する強度（グラフ左から、４８ｈｒ，２４ｈｒ，１２ｈｒ，ａｔｅｌｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ，６ｈｒ）、Ｂ：各シートの引っ張り試験に対する強度、Ｃ：各シートの引っ張り試験におけるブレークポイント（ｂｒｅａｋ  ｐｏｉｎｔ）、Ｄ：各シートの弾性係数（Ｅｌａｓｔｉｃ  ｍｏｄｕｌｕｓ））。
【図３】図３は、アテロコラーゲンおよびゼラチンハイドロゲルシートの物質透過性試験結果を示す（Ａ：アルブミン、Ｂ：グルコース）。
【図４】図４は、角膜内皮細胞を培養したゼラチンハイドロゲルシート上へのコーティング法の違いによる細胞接着性（位相差顕微鏡像）とバリア機能改善（ＺＯ−１発現）の評価結果を示す（左から、（ａ）位相差顕微鏡像（Ｄａｙ１）、（ｂ）ＺＯ−１免疫蛍光染色（Ｄａｙ１０）；、Ａ：０．１５ｍｇ／ｍｌコラーゲン溶液に浸漬したシート（従来法）、Ｂ：３．０ｍｇ／ｍｌコラーゲン溶液を塗布したシート、Ｃ：アテロコラーゲン（比較対照））。
【図５】図５は、角膜内皮細胞を培養したゼラチンハイドロゲルシートの透明度の評価結果を示す（左：アテロコラーゲン、右：ゼラチンハイドロゲルシート）。
【図６】図６は、ゼラチンハイドロゲルシート上で培養した角膜内皮細胞の評価を示す（Ａ：Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１発現解析（免疫染色像）、Ｂ：ＨＥ染色像、Ｃ：走査顕微鏡像、各スケールは２００μｍを示す）。
【図７】図７は、ゼラチンハイドロゲルシートの（ａ）移植前及び（ｂ）家兎前房内移植後のＨＥ染色像を示す（各スケールは２００μｍを示す）。
【図８】図８は、家兎水疱性角膜症モデルに対する、ゼラチンハイドロゲルシートを用いた培養角膜内皮細胞シートの、（ａ）移植後７日及び（ｂ）移植後２１日の角膜厚を移植眼、非移植眼、正常眼で比較した結果を示す。
【図９】図９は、家兎水疱性角膜症モデルに対するゼラチンハイドロゲルシートを用いた培養角膜内皮細胞シートの、移植後２１のＨＥ染色像（Ａ）及びＤｉＩ染色像（Ｂ）を示す。右図は左図ｂｏｘ部の拡大図。
【００２１】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００９−１９０４１５号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．セラチンハイドロゲル
１．１  ゼラチンハイドロゲルとは
本発明にかかる「ゼラチンハイドロゲル」とは、ゼラチンに化学反応、熱脱水処理、放射線、紫外線、あるいは電子線照射等を与えることによりゼラチン分子間に架橋を形成させて得られるハイドロゲルのことである。
【００２３】
ここで「ゼラチン」とは、酸又はアルカリ、あるいは酵素処理等によりコラーゲンのペプチド連鎖間の塩類結合や水素結合が開裂して、非可逆的に水溶性蛋白質に変化した変性コラーゲンを意味する。
【００２４】
本発明で用いられるゼラチンは、酸性ゼラチン及び塩基性ゼラチンのいずれであってもよい。本明細書において「酸性ゼラチン」とは、コラーゲンをアルカリ処理して調製した等電点が７．０未満２．０以上のゼラチン、好ましくは６．５以下４．０以上、より好ましくは５．５以下４．５以上のものが意図される。また「塩基性ゼラチン」とは、コラーゲンを酸処理して調製した等電点が７．０以上１３．０以下のゼラチン、好ましくは７．５以上１０．０以下、より好ましくは８．５以上９．５以下のものが意図される。たとえば、「酸性ゼラチン」としては、新田ゼラチン社の試料等電点（ＩＥＰ）５．０等を使用することができ、塩基性ゼラチンとしては同じく新田ゼラチン社の試料ＩＥＰ９．０等を使用することができる。
【００２５】
いずれのゼラチンを用いるかは、配合する薬効成分や用途に応じて適宜選択される。たとえば、ｂＦＧＦはＩＥＰが４．６であるため、こうした薬剤を配合する場合には酸性ゼラチンが用いられる。一方、ＩＥＰが７以下のタンパク質薬剤を配合する場合には、塩基性ゼラチンが用いられる。
【００２６】
１．２  ゼラチンの架橋
ゼラチンの架橋度は、所望の生体内分解性や含水率、生体吸収性のレベルに応じて適宜選択することができる。架橋は、ゼラチンを構成するコラーゲンのどの部分を架橋するものであってもよいが、特にカルボキシル基と水酸基、カルボキシル基とε−アミノ基、ε−アミノ基同士を架橋することが好ましい。こうして架橋を導入することにより、複合体は所望の機械的強度特性を有するようになる。また、架橋の導入率によって、生体内での分解速度（残存期間）も制御することができる。一般に、ゼラチン及び架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。
【００２７】
ゼラチンの架橋は、熱反応（熱脱水処理等）、架橋剤や縮合剤を用いた化学的手法による架橋、γ線、紫外線、電子線等を用いた物理的手法による架橋などの方法で行うことができる。化学的架橋の場合、用いられる架橋剤としては、例えば、グルタールアルデヒド、ホルムアルデヒド等のアルデヒド系架橋剤；ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のカルボジド系架橋剤；エチレングリコールジエチルエーテル等のポリエポキシ系架橋剤；トランスグルタミナーゼ等が挙げられ、添加する架橋剤の量は、用いる架橋剤によって適宜設定される。架橋度は、所望の含水率、すなわちハイドロゲルの生体吸収性のレベルに応じて適宜選択することができる。生体吸収性高分子としてゼラチンを用いる場合、ハイドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度の好ましい範囲は、ゼラチン濃度１〜２０ｗ／ｗ％、架橋剤濃度０．０１〜１ｗ／ｗ％である。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、０〜４０℃、好ましくは２５〜３０℃で、１〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間で行うことができる。一般に、ゼラチン及び架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。含水率と架橋剤の量については、特開２００４−２０３８２９号に記載されている。
【００２８】
架橋は、いずれの方法で行ってもよいが、本発明においては熱架橋（熱脱水処理等）を施すことが好ましい。化学架橋を行うと架橋剤がハイドロゲル内に残存したり、条件によってはハイドロゲル表面のみ架橋されて均一な架橋ができない可能性があるからである。これに対し、熱架橋の場合、ゼラチンハイドロゲル全体に均一な架橋が形成され、所望の生体内分解性が達成される。
【００２９】
熱反応により架橋を形成させる場合、具体的には、真空状態下で１４０℃〜１６０℃にて、６時間から７２時間の範囲の条件で行うことができ、その条件設定によりゼラチンハイドロゲルの生体内での分解速度（残存期間）を制御することが可能である。本発明の実施例では、１６０℃、０．０１Ｔｏｒｒで７２時間真空加熱して作製したゼラチンハイドロゲルを用いた。
【００３０】
１．３  生体内分解性
ゼラチンハイドロゲルの分解性は、前述した架橋度とシートの厚さによって調整することができる。分解性は動物体内、例えば前眼部であれば、１４日〜１年以上の範囲でコントロールが可能である。本発明では分解性が早すぎると角膜内皮細胞の足場としての役割が果たせず、角膜内皮細胞の生着が不良になると考えられる。そこで分解性としては１４日〜６ヶ月、特に１〜３ヶ月程度で設定することが好ましい。又は、ゼラチンハイドロゲルの実質への生着性が良好であり脱落が起きなければ、分解時間を１年以上のほぼ生分解が起きない期間に設定することも考えられる。
【００３１】
ゼラチンの架橋度は含水率を指標として評価することができる。含水率とは膨潤ハイドロゲルの重量に対するハイドロゲル中の水の重量パーセントである。含水率が大きければハイドロゲルの架橋度は低くなり、分解されやすくなる。好ましい分解性を示す含水率としては約９２〜９９ｗ／ｗ％であり、さらに好ましいものとしては、約９５〜９８ｗ／ｗ％のものが挙げられる。
【００３２】
１．４  ゼラチンハイドロゲルの形状
本発明のゼラチンハイドロゲルシートはいずれの形状にも成型可能であるが、培養角膜内皮細胞移植用キャリアへの適用のため、本発明においてはシート上に成型する。シートの厚さは、角膜内皮移植への適用を考慮すると、１０〜２００μｍ程度が好ましく、３０〜１００μｍ程度がより好ましい。
【００３３】
１．５  ゼラチンハイドロゲルの透明度
本発明のゼラチンハイドロゲルは、優れた透明性を有し、従来キャリアとして用いられているアテロコラーゲン等に比較して、その透明度は格段に高い。また、ゼラチンハイドロゲルは、患部に適用後においても、その透明性を維持しうる。
【００３４】
２．角膜内皮細胞
２．１  ドナーあるいは患者由来の角膜内皮細胞
本発明で用いられる角膜内皮細胞は、角膜内皮細胞層に含まれる細胞を包括したものであり、角膜内皮幹細胞、角膜内皮前駆細胞をも含む。また角膜内皮細胞は、患者以外のドナー、例えばヒト輸入アイバンク角膜の角膜内皮を用いてもよいし、移植を受ける患者由来の角膜内皮細胞を用いてもよい。拒絶反応を防止する点では患者由来の細胞を用いることが望ましいが、前述のように角膜内皮細胞は生体内では増殖しないため、患者健常眼から角膜内皮細胞を採取することは技術的には可能であるが、現実的には困難である。
【００３５】
２．２  幹細胞から分化誘導した角膜内皮細胞
角膜内皮細胞は、角膜内皮幹細胞、角膜内皮幹細胞以外の組織幹細胞あるいは胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞から誘導された角膜内皮細胞を利用してもよい。用いられる角膜内皮幹細胞や人工多能性幹細胞の調製方法は特に限定されないが、治療を必要とする患者自身に由来する細胞であることが好ましい。
【００３６】
人工多能性幹細胞とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子を導入することにより、ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有するように再プログラミング（初期化）された細胞を言う。「人工多能性幹細胞」は、Ｙａｍａｎａｋａらにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入することにより、初めて樹立され「ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）」と命名された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６）。このｉＰＳ細胞のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入することにより樹立されたヒトｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．）、さらにｃ−Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１−１０６）も用いることができる。
【００３７】
また、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学のＴｈｏｍｓｏｎらによって、ＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＮＡＮＯＧ，ＬＩＮ２８の４遺伝子をヒト線維芽細胞に導入して作製された人工多能性幹細胞（Ｙｕ  Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７−１９２０．）、Ｈａｒｖａｒｄ大学のＤａｌｅｙらにより、皮膚細胞にＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４，Ｃ−ＭＹＣ，ｈＴＥＲＴ，ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔの６遺伝子を導入して作製した人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ  ＩＨ，Ｄａｌｅｙ  ＧＱ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１−１４６）、Ｓａｋｕｒａｄａらによって、出生後の組織に存在する未分化幹細胞を細胞源として、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ等を導入することで、誘導された人工多能性幹細胞（特開２００８−３０７００７）も用いることができる。
【００３８】
このほか、ＯＣＴ３／４，ＫＬＦ４，低分子化合物をマウス神経前駆細胞等に導入して作製された人工多能性幹細胞（Ｓｈｉ  Ｙ．，Ｄｉｎｇ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ  ５，５６８−５７４，）、ＳＯＸ２，Ｃ−ＭＹＣを内因性に発現しているマウス神経幹細胞にＯＣＴ３／４，ＫＬＦ４を導入して作製された人工多能性幹細胞（Ｋｉｍ  ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ  ＨＲ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６−６５０）、Ｃ−ＭＹＣを用いることなく、Ｄｎｍｔ阻害剤やＨＤＡＣ阻害剤を利用して作製された人工多能性幹細胞（Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ  ７，７９５−７９７）、あるいは、公開されているすべての特許：特開２００８−３０７００７号、特開２００８−２８３９７２号、ＵＳ２００８−２３３６６１０、ＵＳ２００９−０４７２６３、ＷＯ２００７−０６９６６６、ＷＯ２００８−１１８２２０、ＷＯ２００８−１２４１３３、ＷＯ２００８−１５１０５８、ＷＯ２００９−００６９３０、ＷＯ２００９−００６９９７、ＷＯ２００９−００７８５２に記載の人工多能性幹細胞のいずれをも用いることができる。
【００３９】
組織幹細胞やＥＳ細胞、人工多能性幹細胞からの角膜内皮細胞の分化誘導は、直接であってもよいが、神経堤細胞や角膜実質幹細胞を介した間接的なものであってもよい。すなわち、組織幹細胞やＥＳ細胞、人工多能性幹細胞をいったん神経堤細胞や角膜実質幹細胞に分化誘導し、この神経堤細胞や角膜実質幹細胞からさらに、公知技術に従ってＴＧＦｂ２等で分化誘導することで角膜内皮細胞を誘導する（特願２００８−１２３５６２）。
【００４０】
ＥＳ細胞から神経堤細胞を誘導する方法としては、ＳａｓａｉやＭｉｚｕｓｅｋｉらによって報告されたＳＤＩＡ（Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）法が知られている。ＳＤＩＡ法はマウス由来の間質細胞（ＰＡ６細胞）をフィーダー細胞として利用することで、ＥＳ細胞から神経堤細胞を分化誘導する方法である（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ  ２８，３１−４０．、Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１５８０−１５８５、Ｍｉｚｕｓｅｋｉ，Ｋ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，５８２８−５８３３）。このほか、ＥＳ細胞から神経堤細胞を誘導する方法としては、ＳＴ２細胞を用いる方法（Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００７；２５：４０２−１０．）や、ＭＳ−５細胞を用いる方法（Ｌｅｅ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；２５：１４６８−７５．）も知られている。
【００４１】
また、ＥＳ細胞や人工多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導する方法としては、発明者によるＳＦＥＢ法を改変した分化誘導方法（投稿中）もある。ＳＦＥＢ（Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）法は、フィーダー細胞の非存在下で、特別な無血清培養液と浮遊凝集塊培養を組み合わせることで、マウスＥＳ細胞から神経細胞を誘導する方法である（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５；８：２８８−９６）。
【００４２】
３．ゼラチンハイドロゲル上での角膜内皮細胞の培養
本発明の角膜移植用シートは、前述のゼラチンハイドロゲルシートをコラーゲン（タイプＩあるいはタイプＩＶ）でコーティングし、その上に角膜内皮細胞を播種して培養する
ことにより作製される。
【００４３】
３．１  コラーゲンコーティング
ゼラチンハイドロゲル上へのコラーゲンのコーティングは、細胞接着性及び角膜内皮機能の改善を目的として行う。用いるコラーゲンはタイプＩあるいはタイプＩＶが好ましく、抗原性を除去したアテロコラーゲンであることが好ましい。コラーゲンコーディングは、常法にしたがって、コラーゲンを希塩酸（ｐＨ３．０）で１０倍希釈しゼラチンハイドロゲル上に薄く塗り広げ、乾燥させることで実施できる。コーティングしたシートは、使用前にＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅｓ（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄することが好ましい。
【００４４】
コラーゲンの代わりに、ラミニン、血清、ＦＮＣ  ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ａｔｈｅｎａ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）等の細胞接着性をもつタンパク質、ペプチド、糖タンパク質などを単独あるいは混合して用いることもできる。コーティング時の濃度は１０−４〜１００ｍｇ／ｍｌであり、水溶液の組成はどんな種類のものでも用いることができる。
【００４５】
ここで、コラーゲンのコーティングは、従来のコラーゲン溶液に浸漬する方法ではなく、コラーゲン溶液をシート表面に塗布する（塗りつける）方法により行う。この方法でコーティングすることにより、シートの細胞接着性とバリア機能が格段に改善される。コーティングしたシートは、乾燥することによってコーティングしたコラーゲンがゼラチンシート表面近傍に固定される。この表面への固定が、細胞の接着と機能発現に重要である。コーティングをしない場合、細胞接着や内皮機能が低下すると考えられるため、コーティングを実施することが望ましい。
【００４６】
３．２  培地
ゼラチンハイドロゲルシート上での培養は、接着細胞の培養に通常用いられる培地を用いて行うことができる。例えば、ＤＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、α  ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ培地、ウイリアムスＥ培地、及びこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。
【００４７】
これらを基本培地に、角膜内皮細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を適宜添加してもよい。
【００４８】
例えば、栄養源としては、血清、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム及び硫酸マンガン、各種ビタミン類、アミノ酸類等を含むことができる。
【００４９】
その他必要に応じて、ピルビン酸、βメルカプトエタノール等のアミノ酸還元剤、血清代替物等を添加することができる。なお血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、βメルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、市販のＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。
【００５０】
これらの成分を配合して得られる培地のｐＨは５．５〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の範囲である。
【００５１】
３．３  培養条件
上記の培地を含むゼラチンハイドロゲルに、角膜内皮細胞を５００〜４５００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２の播種密度、好ましくは１５００〜３５００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２の播種密度で播種し、３６℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で、１％〜２５％Ｏ２、１％〜１５％ＣＯ２の条件下で培養する。培養日数は、細胞がコンフルエントになってから少なくとも３日以上、好ましくは７日以上であることがよい。最終的に得られるゼラチンハイドロゲル内の細胞密度は、２０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２以上、好ましくは２５００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２以上、より好ましくは３０００ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２以上である。
【００５２】
４．角膜移植用シート
本発明の角膜移植用シートは、ゼラチンハイドロゲルを支持体としているため、単層で厚さ１０μｍ程度しかない角膜内皮細胞層の強度と操作性を格段に向上させる。シート上の角膜内皮細胞は、バリア機能を示すタイトジャンクションタンパクＺＯ−１を発現し、細胞のシートへの接着性は良好である。シートは、トリプシンやディスパーゼ等の酵素処理を施すことなく培養容器から剥離可能であるため、細胞のデスモソーム構造が維持され、角膜内皮細胞層本来の構造と強度が維持される。
【００５３】
またゼラチンハイドロゲルは透明性が非常に高いため、本発明の角膜移植用シートは、従来公知のアテロコラーゲンを支持体とした角膜移植用シートに比較して、その透明度が格段に高く、その透明性は移植後も維持される。
【００５４】
本発明の角膜移植用シートは、必要に応じて薬効成分を含有することができる。そのような薬効成分としては、例えば、抗腫瘍剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗エイズ剤、ホルモンなどの低分子薬物、骨形成因子又は骨成長因子を含む生理活性ペプチド、蛋白質、糖蛋白質、多糖類、核酸等が挙げられる。これらの薬効成分は天然から得られる物質でも合成により製造される物質でもよい。
【００５５】
具体的には、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、などの細胞増殖因子、特に骨再生に関してはＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）及びＢＭＰ−８（ＯＰ−２）等の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、グリア誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子（ＮＦ）、歯科臨床でひろく用いられている多数の細胞増殖因子を含む多血小板血漿（ＰＲＰ）、インターフェロン、インターロイキン−２、イフォスファミドなどの抗がん剤、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ガチフロキサシンなどの抗生物質、アトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）、プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）、シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）のようなコレステロール低下剤、リドカイン、硫酸プロタミン、ヨウ化ヒプル酸ナトリウム、ヨウ化スルホプロモフタレイン、ヘパリンナトリウム、ブドウ糖、ノルエピネフリン、デキストラン、チオペンタールナトリウム、クロム酸ナトリウム注、キシリトール、塩酸プロカイン、塩酸テトラカイン、塩化ツボクラリン、塩化スキサメトニウム、無晶性インシュリン亜鉛、亜硝酸アミル、アジマリン等が例示される。
【００５６】
上記薬効成分をゼラチンハイドロゲルに含浸させる時期は、当該ゲル上で角膜内皮細胞を培養前、培養最中、もしくは移植用シートを調製する前でも後でも可能である。ゼラチンハイドロゲルに対する薬効成分の配合比は、モル比で約５倍量以下であることが好ましい。さらに好ましくは、約５〜約１／１０４倍量のモル比である。この含浸操作は、通常、４〜３７℃で１５分間〜１時間、好ましくは４〜２５℃で１５〜３０分間で終了し、その間にゼラチンハイドロゲルは薬効成分を含む溶液で膨潤し、ゼラチンハイドロゲルと物理化学的相互作用によって複合化され、ハイドロゲル内に固定される。薬効成分とゼラチンハイドロゲルとの結合には、クーロン力、水酸結合力、疎水性相互作用などの物理学的相互作用の他、薬物の官能基又は金属とハイドロゲル上の官能基との間の配位結合などが単独あるいは複合的に関与していると考えられる。
【００５７】
薬効成分は、ゼラチンハイドロゲルが生体内で分解されゼラチン分子が水可溶化されるに従ってシート外部へと徐々に放出される。この放出速度は、使用するゼラチンハイドロゲルの生体における分解及び吸収の程度、ならびに複合体内での薬効成分とゼラチンハイドロゲルとの結合の強さの程度及び安定性により決定される。ゼラチンハイドロゲルの生体における分解及び吸収の程度は、ハイドロゲル作製時における架橋の程度を調節することにより調節することができる。
【００５８】
本発明において、例えば薬効成分として核酸等の負に荷電した物質を用いる場合には、薬効成分とゼラチンハイドロゲルとの安定な複合体が形成されるよう、ゼラチンハイドロゲルが正に荷電していることが好ましい。薬効成分の有する負の電荷と、ゼラチンハイドロゲルの有する正の電荷とが強力に結合（イオン結合）することによって安定なゼラチンハイドロゲル複合体が形成される。ゼラチンハイドロゲルを正に荷電させるためには、ゼラチンハイドロゲルに予めアミノ基等を導入することによってカチオン化することができる。このことにより、ゼラチンハイドロゲルと薬効成分との結合力が増し、より安定したゼラチンハイドロゲル複合体を形成することができる。逆に、薬効成分が正電荷をもつ物質の場合には、薬効成分とゼラチンハイドロゲルとの安定な複合体が形成されるようになり、ゼラチンを相互作用にアニオン化する。これにより薬効成分がゼラチンと相互作用して、安定にハイドロゲル内に複合化固定される。このように、薬効成分の化学性質、物性にあわせて相互作用できるようにゼラチンを化合誘導体化、あるいは修飾することによって、異なる薬効成分をゼラチンハイドロゲルから徐放化することができる。
【００５９】
カチオン化の工程は、生理条件下でカチオン化する官能基を導入し得る方法であれば特に限定されないが、ゼラチンの有する水酸基あるいはカルボキシル基等に１、２又は３級のアミノ基又はアンモニウム基を温和な条件下で導入する方法が好ましい。例えばエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−ジアミノプロパン等のアルキルジアミンや、トリメチルアンモニウムアセトヒドラジド、スペルミン、スペルミジン又はジエチルアミド塩化物等を、種々の縮合剤、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、塩化シアヌル、Ｎ，Ｎ’−カルボジイミダゾール、臭化シアン、ジエポキシ化合物、トシルクロライド、ジエチルトリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタン酸ジ無水物等のジ無水物化合物、トリシルクロリド等を用いて反応させる方法がある。中でもエチレンジアミンを反応させる方法が簡便且つ汎用性があり好適である。
【００６０】
薬効成分含有角膜移植用シートは、薬効成分の徐放性効果と安定化効果を持つため、所望の部位において薬効成分を制御された方向性をもって長時間にわたって放出することができる。そのため、薬効成分の作用が病巣部位内で効果的に発揮される。
【００６１】
角膜移植対象者は世界で１００万人、国内において数万人いるとされ、その中でも角膜内皮の障害により生じる水疱性角膜症患者は角膜移植対象疾患全体の約８０％を占めている。角膜内皮は一度障害を受けると再生しないため、現在角膜移植以外に有効な治療方法は存在しない。
【００６２】
以上のとおり、本発明の角膜移植用シートは、製造方法が簡便で、操作性、生着性、分解性に優れ、前述のとおり薬剤徐放効果も有している。角膜内皮細胞として、患者由来のものを用いれば、拒絶反応の問題も回避され、迅速に角膜内皮の再生を図ることが可能となる。さらに、ゼラチンハイドロゲルには薬効成分を徐放させる機能も有するため、生物活性をもつ薬効成分を含有させて、これを必要な期間放出させ、疾患の治癒をさらに促進することもできる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６４】
実施例１：ゼラチンハイドロゲルシートの作製
豚皮もしくは牛骨よりアルカリ処理によってコラーゲンから抽出した（分子量９８，０００等電点５．０）。ゼラチンの１０ＷＴ％水溶液を調整した。これをプラスチックシャーレに流し込み室温で数日放置することで水を蒸発させ、ゼラチンシートを得た。これを１６０℃０．０１Ｔｏｒｒで７２時間熱脱水処理を行い、ゼラチン分子間を化学架橋した。得られたゼラチンシートは、含水率９７％、厚さ：１００μｍ、であった。なお、厚さは目的に応じて、３０μｍ〜で調整可能である。【００６５】
（１）透明度
上記のようにして調製したゼラチンハイドロゲルシート（４８時間架橋）と、アテロコラーゲンシート（株式会社高研）の透明度を目視で比較した（図１）。さらに、ゼラチンハイドロゲルシートの架橋時間を変えて（６〜４８時間）、その光透過率を比較した。表１に示すように、いずれの架橋時間においても、ゼラチンハイドロゲルの光透過率はアテロコラーゲンより高かった。
【表１】
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（２）力学的特性
ゼラチンハイドロゲルシートの力学特性をアテロコラーゲンと比較評価した。
架橋時間の異なる（６〜４８時間架橋）ゼラチンハイドロゲルシート、及びアテロコラーゲンシートの引っ張り試験に対する強度（図２Ａ及びＢ）とブレークポイント（図２Ｃ）を測定するとともに、弾性係数（Ｅｌａｓｔｉｃ  ｍｏｄｕｌｕｓ）を算出した（図２Ｄ）。
ゼラチンハイドロゲルシートは架橋時間依存的に引っ張り強度が増加し、逆に弾性係数は低下する傾向が認められた。また、ゼラチンハイドロゲルシートは、いずれの架橋時間についても、アテロコラーゲンと同等かそれ以上の強度及び弾性を有することが確認された。【００６６】
（３）物質透過性
ゼラチンハイドロゲルシート（４８時間架橋）の物質透過性をアテロコラーゲンシートと比較評価した。物質透過性は、常法にしたがいアルブミンとグルコースに対する拡散係数を求めることで評価した。【００６７】
ゼラチンハイドロゲルシートはアテロコラーゲンシートに比較して、有意に高いアルブミン透過性を示した。一方、グルコース透過性に対しては、ゼラチンハイドロゲルシートはアテロコラーゲンシートと同等であった。このことから、ゼラチンハイドロゲルシートはキャリアシートして有用であると考えられた。【００６８】
実施例２：ゼラチンハイドロゲルシート上での細胞培養
１．角膜内皮細胞の調製
家兎眼球より強角膜片を作成し、デスメ膜を剥離した。デスメ膜は、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡと３７℃１０分インキュベートして、細胞を単離した。２ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０％血清（Ｊａｐａｎ  ｂｉｏ  ｓｅｒｕｍ）入りのＤＭＥＭ培地（Ｌｏｗ  ｇｌｕｃｏｓｅ、日研生物医学研究所）を添加し、３００ｇ  ｘ  ５ｍｉｎ遠心分離し、上清を吸引し、残った細胞塊を同様の培地に懸濁させた。【００６９】
２．角膜内皮細胞の培養及びコーティング条件の検討
実施例１で調製したゼラチンハイドロゲルシートをコラーゲンタイプＩもしくはタイプＩＶ（新田ゼラチン）にてコーティングした。コーティング方法としては、３．０ｍｇ／ｍｌコラーゲン溶液原液（ｐＨ３．０）を、実施例１で作製したゼラチンハイドロゲルシート上に、セルスクレイパー等を用いて直接塗布する方法と、希塩酸で１０倍に希釈したコラーゲン溶液中にゼラチンハイドロゲルシートを浸漬する方法で、ともにクリーンベンチ内で３０分以上置き静置させることでコーティングした。コーティングしたシートは、使用前にＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅｓ（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回洗浄した。【００７０】
このシート上にデスメ膜より単離された角膜内皮細胞を播種密度１．５〜４．５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２にて播種し、３７℃、１０％ＣＯ２、前項で用いた血清入りの内皮培養培地を用いて１４日間培養した。比較として、アテロコラーゲン上に同様の条件で角膜内皮細胞を播種して培養した。【００７１】
コラーゲン溶液を直接塗布したゼラチンハイドロゲルシートとコラーゲン溶液に浸漬したゼラチンハイドロゲルシートについて、シート上への細胞接着性を評価した。細胞播種翌日の内皮細胞の形態を位相差顕微鏡で観察すると、コラーゲン溶液原液を塗布したシートにおいては大部分の内皮細胞が接着しているのに対して、１０倍希釈コラーゲン溶液中に浸漬したシートの場合では、接着細胞が明らかに少なかった（図４Ａ−（ａ）及びＢ−（ａ））。また、培養１０日後の培養細胞を位相差顕微鏡により観察するとともに、ＺＯ−１抗体（Ｚｙｍｅｄ）及びＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。その結果、コラーゲン溶液原液を塗布したシートにおいては、細胞間においてタイトジャンクションタンパクＺＯ−１および内皮マーカーであるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの明瞭な発現が観察された（図４Ｂ−（ｂ）及び（ｃ））。比較対象のアテロコラーゲンシート上では、コラーゲン溶液原液を塗布したゼラチンシート同様に、明瞭なＺＯ−１発現が認められた（図４Ｃ−（ｂ））。このことから、ゼラチンハイドロゲルシートにコラーゲン溶液原液を塗布することにより、アテロコラーゲンと同様の細胞接着性及び機能発現が認められると考えられた。【００７２】
３．角膜内皮細胞シートの評価
コラーゲンを塗布したゼラチンハイドロゲルを支持体として培養した角膜内皮細胞シートと、アテロコラーゲンを支持体として培養した角膜内皮細胞シートの透明度を目視で比較した。培養後のアテロコラーゲンは白濁し、透明性が低下しているのに比較して、ゼラチンハイドロゲルシートは培養による透明性の低下は認められなかった（図５）。
ゼラチンハイドロゲル上に培養した角膜内皮細胞は内皮ポンプマーカーＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（図６Ａ）およびタイトジャンクションマーカーであるＺＯ−１（図６Ｂ）を発現していた。また走査顕微鏡観察により、内皮細胞に特有の微絨毛が細胞表面に観察された（図６Ｃ）。以上のことからゼラチンハイドロゲルシートは角膜内皮細胞の足場として正常な生育をサポートすることが示された。【００７３】
実施例３：ゼラチンハイドロゲルシートの家兎前房内移植（生分解性の検討）
家兎水晶体摘出術（超音波乳化吸引術）後、デスメ膜を剥離した。その後８ｍｍトレパンにて打ち抜いたゼラチンハイドロゲルシートのみを前房内に移植した。【００７４】
（１）眼表面観察像
移植後２８日目では、前房内に移植したシートの透明性及び角膜透明性は共に保たれており、虹彩が透見可能であった。また、炎症や浮腫等も認められなかった。【００７５】
（２）移植後のゼラチンハイドロゲルシート
術後２８日目にて安楽死させ、眼球摘出後１０％中性緩衝ホルマリン液にて化学固定を行った。その後ヘマトキシリン＆エオジン染色により角膜組織を観察した（図７（ａ）移植前、（ｂ）移植後）。角膜組織とゼラチンハイドロゲルシートは良好に接着しており、ゼラチンハイドロゲルによる炎症細胞の遊走・浸潤は認められず、角膜透明性も良好であった。移植前ゼラチンハイドロゲルシートの厚さは約１９２．７±３．２μｍ（Ｎ＝９）であったのに対して、移植後２８日目では１６３．８μｍ（Ｎ＝９）に減少し、良好な分解性が確認された。【００７６】
実施例４：ゼラチンハイドロゲルシートを用いた培養角膜内皮細胞シートの家兎水疱性角膜症モデルへの移植
実施例２の方法に基づき、家兎由来角膜内皮細胞をゼラチンハイドロゲル上で培養し、移植用の培養角膜内皮細胞シートを作製した。作製した培養角膜内皮細胞シートを、角膜内皮を完全に除去した家兎水疱性角膜症モデルに移植を行った。移植後、パキメーターを用いた角膜厚測定及び前眼部観察を行った。【００７７】
（１）眼表面観察像
移植後２８日目では、前房内に移植したシートの透明性及び角膜透明性は共に良好で、虹彩が透見可能である。前眼部スリット観察により炎症や浮腫等は認められず、またシートの脱落も認められなかった。【００７８】
（２）移植後７日及び２１日における移植眼、非移植眼、正常眼の角膜厚
移植後７日及び２１日における移植眼、非移植眼、正常眼の角膜厚を比較した結果、ゼラチンシートをキャリアに用いて移植した培養角膜内皮細胞は、術後２１日において機能しており、角膜厚及び透明性の改善が認められた（図８）。【００７９】
別に、移植後２１日における眼球を摘出し、ＨＥ染色（図９Ａ）及びＤｉＩ染色（図９Ｂ）を実施した。ＨＥ染色では、切片作製時にゼラチンシートが実質部より剥離したが、実質との接着部分においては炎症細胞の集積は認められなかった（右図は左図のｂｏｘ部の拡大図）。ＤｉＩ染色では、ゼラチンシート上にＤｉＩ陽性の移植した培養内皮細胞が残存していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明のゼラチンハイドロゲルを支持体とする角膜移植用シートは、内皮細胞のもつ機能・形態を損なうことなく移植することが可能である。本発明の角膜移植用シートは移植後の透明性、組織への生着が良好である。また、作製条件により生体内での生分解速度を調整可能であり、炎症反応等の問題もない。さらに素材であるゼラチンハイドロゲルは既に臨床使用されているものである。したがって、従来の全層角膜移植術に代わる角膜内皮疾患の治療法として極めて有用である。本発明の角膜移植用シートを用いた治療法の対象となる水疱性角膜症等の患者は、国内でも年間数万に達すると予想されるため、その治療法は事業化する価値も高い。【００８１】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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