(57)【要約】  本発明は、ＲＴ−ＰＣＲ等の反応を検証するためのＲＮＡ標品の供給を実現し得る、ＲＮＡ鎖の安定化方法を提供する。具体的には、本発明は、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡ（または／および０．１〜２．５μＭのアウリントリカルボン酸塩）を含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液；ＲＮＡ鎖溶液の製造方法；ＲＮＡ鎖の安定化方法；ＲＮＡ鎖溶液を含むキット；ＲＮＡ鎖の保存溶液中の保存対象のＲＮＡ鎖を使用する、ＤＮＡ鎖の製造方法；ＲＮＡ鎖の保存溶液中の保存対象のＲＮＡ鎖を、ＲＮＡ発現量の測定のためのＲＮＡ標品として使用する、ＲＮＡ発現量の測定方法などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液。
【請求項２】
ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡがファージＲＮＡである、請求項１記載の保存溶液。
【請求項３】
保存対象のＲＮＡ鎖がＲＮＡ標品である、請求項１記載の保存溶液。
【請求項４】
保存対象のＲＮＡ鎖が一本鎖ＲＮＡである、請求項１記載の保存溶液。
【請求項５】
保存対象のＲＮＡ鎖がトータルＲＮＡである、請求項１記載の保存溶液。
【請求項６】
アウリントリカルボン酸塩をさらに含有する、請求項１記載の保存溶液。
【請求項７】
ＲＮＡ鎖の保存溶液の保存方法であって、
ＲＮＡ鎖の保存溶液を液体状態で保存することを含み、
ＲＮＡ鎖の保存溶液が、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有するＲＮＡ鎖の保存溶液である、方法。
【請求項８】
保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを水溶液中に共存させることにより、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有するＲＮＡ鎖の保存溶液を得ることを含む、ＲＮＡ鎖の保存溶液の製造方法。
【請求項９】
保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを水溶液中に共存させることにより、保存対象のＲＮＡ鎖を安定化させることを含む、ＲＮＡ鎖の安定化方法。
【請求項１０】
以下（ａ）、（ｂ）を含む、キット：
（ａ）保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液；ならびに
（ｂ）目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素。
【請求項１１】
目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素が、逆転写反応用の構成要素、または逆転写反応−目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素である、請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素が、ＲＴ−ＰＣＲ用の試薬である、請求項１０記載のキット。
【請求項１３】
目的ＤＮＡ鎖の製造方法であって、
ＲＮＡ鎖を目的ＤＮＡ鎖の合成反応に供することを含み、
ＲＮＡ鎖が、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液中の保存対象のＲＮＡ鎖である、方法。
【請求項１４】
ＲＮＡ発現量の測定方法であって、
ＲＮＡ鎖を、ＲＮＡ発現量の測定のためのＲＮＡ標品として使用することを含み、
ＲＮＡ鎖が、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液中の保存対象のＲＮＡ鎖である、方法。
【請求項１５】
保存対象のＲＮＡ鎖、および０．１〜２．５μＭのアウリントリカルボン酸塩を含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ鎖の保存溶液、ＲＮＡ鎖の保存溶液の製造方法、およびＲＮＡ鎖の安定化方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡの発現量の測定は、疾患等の所定の状態の診断、および実験等を行う上で、重要である。ＲＮＡの発現量を測定する方法の一つとして、ＲＴ−ＰＣＲがある。【０００３】
ＲＴ−ＰＣＲは、（ｉ）ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写（ＲＴ）反応、および（ｉｉ）合成されたｃＤＮＡの増幅反応により、行われる。ＲＴ−ＰＣＲにおいて標的ＲＮＡ鎖の発現量を測定する場合、コントロールとして、ＲＮＡ標品が必要であるが、従来、ＲＴ−ＰＣＲに使用できる信頼のあるＲＮＡ標品を、臨床等の現場に提供することはできなかった。これは、ＲＮＡは、−２０℃の凍結状態でさえも分解し、長期の保存が困難なためである。したがって、標的ＲＮＡ鎖の発現量を測定する場合、従来のＲＴ−ＰＣＲでは、ＲＴ反応および増幅反応（ＰＣＲ）を別々に行い、そしてＲＴ反応の終了後に、増幅反応のみを検証するため、ＤＮＡ標品を使用していた。【０００４】
しかしながら、ＲＴ−ＰＣＲをより正確に検証するためには、ＲＴ反応および増幅反応のうち増幅反応のみを検証可能なＤＮＡ標品ではなく、ＲＴ反応および増幅反応の双方を検証可能なＲＮＡ標品を用いることが必要である。また、ＲＮＡ標品を提供できれば、ＲＴ反応および増幅反応を同時に行う１ステップＲＴ−ＰＣＲの検証が可能になる。【０００５】
ところで、ＲＮＡの分解を抑制する物質については、幾つかの報告がある。
特許文献１および非特許文献１は、アウリントリカルボン酸（以下、必要に応じて、ＡＴＡと称することがある）等のＲＮａｓｅインヒビターを記載している。
非特許文献１および２は、ＲＮａｓｅインヒビターとしてアウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）を記載している。
非特許文献３は、クエン酸ナトリウムがＲＮＡの塩基の加水分解を抑えるキレート剤として使用できることを記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００２／０９０５３９号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｋｉｄｍｏｒｅ  ＡＦら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２６３（１），Ｐａｇｅｓ  ７３―８０（１９８９）
【非特許文献２】食総研報（Ｒｅｐ．Ｎａｔ’ｌ．Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ．Ｉｎｓｔ），Ｎｏ．６８，Ｐａｇｅｓ  ３３−３８（２００４）
【非特許文献３】Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のホームページ、製品名「ＲＮＡ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」の項目「Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」、２０１０年４月５日検索、インターネット＜ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂ／ｅｎ／ＵＳ／ａｄｉｒｅｃｔ／ａｂ？ｃｍｄ＝ｃａｔＮａｖｉｇａｔｅ２＆ｃａｔＩＤ＝６０３２７２＆ｔａｂ＝ＤｅｔａｉｌＩｎｆｏ＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述したようなＲＮＡ標品を提供することは容易ではない。その理由は、ＲＮＡの分解を抑制する物質が上述のとおり知られているものの、これらの物質は、ＲＮＡ標品の分解を十分に抑制し得るとは限らないからである。また、ＲＮＡの分解を抑制する物質はしばしば強力なタンパク質変性剤であり、タンパク質変性剤を含有するＲＮＡ溶液を、酵素反応であるＲＴ反応および増幅反応に使用した場合、溶液中のタンパク質変性剤がこれらの反応を阻害することから、このような溶液中のＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ等の反応を検証するためのＲＮＡ標品として用いることができないという問題がある。したがって、ＲＴ−ＰＣＲ等の反応を検証するためのＲＮＡ標品の供給を実現する、ＲＮＡ鎖の安定化方法の開発が、切望されている。【０００９】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、ＲＴ−ＰＣＲ等の反応を検証するためのＲＮＡ標品の供給を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、ＲＮＡ鎖を安定化し、かつＲＴ−ＰＣＲ等の反応を阻害し得ない成分を見出すことに成功し、本願発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液。
〔２〕ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡがファージＲＮＡである、〔１〕の保存溶液。
〔３〕保存対象のＲＮＡ鎖がＲＮＡ標品である、〔１〕の保存溶液。
〔４〕保存対象のＲＮＡ鎖が一本鎖ＲＮＡである、〔１〕の保存溶液。
〔５〕保存対象のＲＮＡ鎖がトータルＲＮＡである、〔１〕の保存溶液。
〔６〕アウリントリカルボン酸塩をさらに含有する、〔１〕の保存溶液。
〔７〕ＲＮＡ鎖の保存溶液の保存方法であって、
ＲＮＡ鎖の保存溶液を液体状態で保存することを含み、
ＲＮＡ鎖の保存溶液が、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有するＲＮＡ鎖の保存溶液である、方法。
〔８〕保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを水溶液中に共存させることにより、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有するＲＮＡ鎖の保存溶液を得ることを含む、ＲＮＡ鎖の保存溶液の製造方法。
〔９〕保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを水溶液中に共存させることにより、保存対象のＲＮＡ鎖を安定化させることを含む、ＲＮＡ鎖の安定化方法。
〔１０〕以下（ａ）、（ｂ）を含む、キット：
（ａ）保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液；ならびに
（ｂ）目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素。
〔１１〕目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素が、逆転写反応用の構成要素、または逆転写反応−目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素である、〔１０〕のキット。
〔１２〕目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素が、ＲＴ−ＰＣＲ用の試薬である、〔１０〕のキット。
〔１３〕目的ＤＮＡ鎖の製造方法であって、
ＲＮＡ鎖を目的ＤＮＡ鎖の合成反応に供することを含み、
ＲＮＡ鎖が、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液中の保存対象のＲＮＡ鎖である、方法。
〔１４〕ＲＮＡ発現量の測定方法であって、
ＲＮＡ鎖を、ＲＮＡ発現量の測定のためのＲＮＡ標品として使用することを含み、
ＲＮＡ鎖が、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液中の保存対象のＲＮＡ鎖である、方法。
〔１５〕保存対象のＲＮＡ鎖、および０．１〜２．５μＭのアウリントリカルボン酸塩を含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の保存溶液は、ＲＮＡ鎖を安定化し得るので、ＲＮＡ鎖の保存（特に、常温での保存）に有用である。本発明の保存溶液はまた、目的ＤＮＡ鎖の合成反応（例、ＲＴ反応、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）を実質的に阻害し得ないので、目的ＤＮＡ鎖の合成反応におけるＲＮＡ標品として有用である。
また、本発明の保存溶液は、安定化されたＲＮＡ標品を、凍結乾燥ではなく水溶液の状態で供給できる点で優れている。ＲＮＡ標品を臨床検査等の検査目的で使用する場合、ＲＮＡ標品を凍結乾燥ではなく水溶液の状態で供給することができれば、ＲＮＡ標品を水溶液中に溶解する工程を省略することができるので、検査を簡便に行なうことができる。また、かかる工程を省略することにより、かかる工程について、不注意による人為的な操作ミス（例、ＲＮＡ標品を溶解するための溶液の取り違え、および溶液の添加量のバラツキに基づくＲＮＡ標品濃度の誤差）を確実に排除できる。かかる工程の省略は、製品が世界的に供給され、分子生物学的手法に不慣れな者が製品を使用する場合（例、発展途上国における製品の使用）、精度管理の観点から、特に利点がある。
さらに、本発明の保存溶液は、水溶液の状態で安定化されたＲＮＡ標品を世界中に供給することを実現できる。これは、本発明の保存溶液が長期にわたりＲＮＡ標品を安定化し得るため、輸送期間が長い場合であってもＲＮＡ標品の分解を抑制できるためである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、各成分の存在下において、４℃で７週間保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）について、ＰＣＲ増幅曲線を示す図である。
【図２】図２は、各成分の存在下において、室温で７週間保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）について、ＰＣＲ増幅曲線を示す図である。
【図３】図３は、ＭＳ２  ＲＮＡ水溶液中において、４℃で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化（インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲ）を示す図である。
【図４】図４は、ＭＳ２  ＲＮＡおよびアウリントリカルボン酸アンモニウムの混合水溶液中において、４℃で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化（インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲ）を示す図である。
【図５】図５は、ＭＳ２  ＲＮＡ水溶液中において、室温で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化（インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲ）を示す図である。
【図６】図６は、ＭＳ２  ＲＮＡおよびアウリントリカルボン酸アンモニウムの混合水溶液中において、室温で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化（インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲ）を示す図である。
【図７】図７は、ＭＳ２  ＲＮＡ水溶液中において、４℃で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化（加水分解プローブによるリアルタイムＰＣＲ）を示す図である。
【図８】図８は、ＭＳ２  ＲＮＡおよびアウリントリカルボン酸アンモニウムの混合水溶液中において、４℃で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化（加水分解プローブによるリアルタイムＰＣＲ）を示す図である。
【図９】図９は、ＭＳ２  ＲＮＡ水溶液中において、室温で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化（加水分解プローブによるリアルタイムＰＣＲ）を示す図である。
【図１０】図１０は、ＭＳ２  ＲＮＡおよびアウリントリカルボン酸アンモニウムの混合水溶液中において、室温で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化（加水分解プローブによるリアルタイムＰＣＲ）を示す図である。
【図１１】図１１は、各成分の存在下において、４℃で保存されたトータルＲＮＡのＣｐ値経時変化を示す図である。
【図１２】図１２は、各成分の存在下において、室温で保存されたトータルＲＮＡのＣｐ値経時変化を示す図である。
【図１３】図１３は、ＡＴＡ（アンモニウム塩）水溶液中において、４℃または室温で２週間保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）について、ＰＣＲ増幅曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ＲＮＡ鎖の保存溶液（またはＲＮＡ鎖の溶液。以下同様。）を提供する。本発明の保存溶液は、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を含有する。保存対象のＲＮＡ鎖が、ＲＮＡ鎖を安定化し得る成分により安定化されるべき保存対象物である。ＲＮＡ鎖を安定化し得る成分としては、ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡ、およびアウリントリカルボン酸塩が挙げられる。
【００１５】
保存対象のＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ鎖の構成成分であるリボヌクレオチドから構成される。保存対象のＲＮＡ鎖の構成成分であるリボヌクレオチドとしては、例えば、主要リボヌクレオチドとして、アデニン（Ａ）を核酸塩基として有するアデノシン  ５’−リン酸、グアニン（Ｇ）を核酸塩基として有するグアノシン  ５’−リン酸、シトシン（Ｃ）を核酸塩基として有するシチジン  ５’−リン酸、ウラシル（Ｕ）を核酸塩基として有するウリジン  ５’−リン酸が挙げられる。また、他の代表的なリボヌクレオチドとしては、例えば、イノシン、シュードウラシル、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、ピロロシトシン、５−メチルウラシルが挙げられる。保存対象のＲＮＡ鎖は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。保存対象のＲＮＡ鎖は、同一の種類のリボヌクレオチドから構成されるＲＮＡ鎖（リボヌクレオチドのホモポリマー）であっても、異なる種類のリボヌクレオチドから構成されるＲＮＡ鎖（リボヌクレオチドのヘテロポリマー）であってもよい。
【００１６】
保存対象のＲＮＡ鎖の構成成分であるリボヌクレオチドは、修飾されていてもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「修飾されていてもよいリボヌクレオチド」とは、未修飾のリボヌクレオチド、あるいは核酸塩基部分、糖部分およびリン酸結合部分のうちの少なくとも１つの部分が修飾されたリボヌクレオチドをいう。具体的には、修飾されたリボヌクレオチドとしては、置換基で置換された核酸塩基部分を含むリボヌクレオチド、置換基で置換された糖部分を含むリボヌクレオチド、リン酸結合が他の結合と交換されたリボヌクレオチド、およびこれらの修飾の組合せを含むリボヌクレオチドが挙げられる。
【００１７】
置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、アミノ基、ハロゲン原子（例、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子）、ヒドロキシル基、カルボキシル基、オキソ基（＝Ｏ）、チオ基（＝Ｓ）、ニトロ基が挙げられる。核酸塩基部分または糖部分に結合し得る置換基の数は、１〜３個であり得るが、１または２個が好ましく、１個がより好ましい。リン酸結合部分が他の結合と交換される場合、このような他の結合としては、ホスホロチオエート結合、アミド結合、メチルホスホネート結合、メチルホスホトリエステル結合が挙げられる。
【００１８】
アルキル基としては、直鎖状または分枝状の炭素数１〜１２のアルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどのＣ１〜Ｃ１０アルキルが挙げられるが、Ｃ１〜Ｃ６アルキルが好ましい。
【００１９】
アルケニル基としては、直鎖状または分枝状の炭素数２〜１２のアルケニル、例えば、アリル、クロチル、２−ペンテニル、３−ヘキセニルなどのＣ２〜Ｃ１０アルケニルが挙げられるが、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルが好ましい。
【００２０】
アルキニル基としては、直鎖状または分枝状の炭素数２〜１２のアルキニル、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ペンチニル、３−ヘキシニルなどのＣ２〜Ｃ１０アルキニルが挙げられるが、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルが好ましい。
【００２１】
シクロアルキル基としては、環状の炭素数３〜１２のシクロアルキル、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルが挙げられる。
【００２２】
アリール基としては、炭素数６〜１２のアリール、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルが挙げられる。
【００２３】
アラルキル基としては、炭素数７〜１２のアラルキル、例えば、フェニル−Ｃ１〜Ｃ４アルキル（例、ベンジル、フェネチル）が挙げられる。
【００２４】
アシル基としては、炭素数２〜１２のアシル、例えば、炭素数２〜４のアルカノイル（例、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル）、あるいは炭素数６から１０のアロイル（例、ベンゾイル、トルオイルなど）が挙げられる。
【００２５】
アミノ基としては、上記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびアシルからなる群より選ばれる置換基でモノ置換またはジ置換されていてもよいアミノ、例えば、アミノ（−ＮＨ２）、メチルアミノ、ジメチルアミノが挙げられる。
【００２６】
保存対象のＲＮＡ鎖は、天然に由来するＲＮＡ鎖であってもよい。天然に由来するＲＮＡ鎖としては、例えば、天然の供給源（例、哺乳動物等の動物、植物、昆虫、微生物、ウイルス）から調製され得る天然ＲＮＡ鎖が挙げられる。また、天然に由来するＲＮＡ鎖は、トータルＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であってもよい。
【００２７】
保存対象のＲＮＡ鎖は、人工的に合成されたＲＮＡ鎖であってもよい。人工的に合成されたＲＮＡ鎖としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、プローブ、ＲＮＡベクターが挙げられる。
【００２８】
保存対象のＲＮＡ鎖中のリボヌクレオチドの個数は、２個以上であれば特に限定されないが、例えば、５個以上、１０個以上、１６個以上、２０個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、または５００個以上であってもよい。ＲＮＡ鎖中のリボヌクレオチドの個数はまた、特に制限されないが、例えば、１００，０００個未満、５０，０００個未満、１０，０００個未満、または５，０００個未満であってもよい。
【００２９】
本発明の保存溶液中に含まれる、保存対象のＲＮＡ鎖は、単一（即ち、１種）のＲＮＡ鎖であっても、複数（例、２種、３種、５種、１０種、５０種、１００種、２００種、５００種、または１０００種以上）のＲＮＡ鎖であってもよい。
【００３０】
保存対象のＲＮＡ鎖は、例えば、ＲＮＡ標品として用いられる。この場合、保存対象のＲＮＡ鎖としては、例えば、ハウスキーピング遺伝子のＲＮＡ鎖、またはＲＮＡ鎖を利用するアッセイにおいて標品として使用され得る、その他のＲＮＡ鎖が挙げられる。ハウスキーピング遺伝子のＲＮＡ鎖としては、例えば、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１、α−チューブリン、Ｌ１９、シクロフィリンＡ、トランスフェリンＲをコードするＲＮＡ鎖が挙げられる。ＲＮＡ鎖を利用するアッセイにおいて標品として使用され得る、その他のＲＮＡ鎖としては、例えば、ＴＥＲＴ、ＣＫ−１９、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＢＣＲ／ＡＢＬ（例、Ｍａｊｏｒ  ＢＣＲ／ＡＢＬ）、ＷＴ−１、ＲＮＡウイルス（例、インフルエンザウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス）をコードするＲＮＡ鎖が挙げられる。保存対象のＲＮＡ鎖は、臨床検査の観点からは、ヒト由来のＲＮＡ鎖であることが好ましい。
【００３１】
保存対象のＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ標品として用いられる場合、逆転写（ＲＴ）反応、またはＲＴ反応を伴う目的ＤＮＡ鎖の増幅反応（例、ＲＴ−ＰＣＲ）についてのＲＮＡ標品であってもよい。ＲＴ−ＰＣＲは、（ｉ）ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写（ＲＴ）反応、および（ｉｉ）合成されたｃＤＮＡの増幅反応により、行われる。従来は、ＤＮＡ標品のみ提供されており、増幅反応のみ検証されていた。一方、本発明によれば、ＲＴ反応、ならびにＲＴ反応および増幅反応の双方を検証可能なＲＮＡ標品を提供できる。また、ＲＮＡ標品の提供により、ＲＴ反応および増幅反応を同時に行う１ステップ  ＲＴ−ＰＣＲの検証が可能になる。
【００３２】
また、保存対象のＲＮＡ鎖は、ＲＮＡ発現プロフィールを測定するアッセイ（例、マイクロアレイ、ノザンブロッティング）におけるＲＮＡ標品として用いられる場合、トータルＲＮＡであってもよい。この場合、保存対象のＲＮＡ鎖（トータルＲＮＡ）は、臨床検査の精度管理のために汎用される管理血清と同様に、アッセイの精度管理のために使用される。
【００３３】
一実施形態では、ＲＮＡ鎖を安定化し得る成分は、ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡである。ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ鎖の分解を抑制し得る一本鎖ＲＮＡであり、保存対象のＲＮＡ鎖と、物質として異なるＲＮＡ鎖である。したがって、本発明の保存溶液は、少なくとも２種のＲＮＡ鎖を含有し得る。
【００３４】
ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡは、精製されたものであってもよい。ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡとしては、ＲＮＡアッセイ用に市販されている一本鎖ＲＮＡを使用してもよい。このような一本鎖ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーのため、好適に使用できる。ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡは、同一の種類のリボヌクレオチドから構成されるＲＮＡ鎖（リボヌクレオチドのホモポリマー）であっても、異なる種類のリボヌクレオチドから構成されるＲＮＡ鎖（リボヌクレオチドのヘテロポリマー）であってもよい。ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡは、上述したようなリボヌクレオチドから構成される。
【００３５】
ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡは、天然に由来するＲＮＡ鎖であってもよい。このような一本鎖ＲＮＡとしては、例えば、天然の供給源（例、哺乳動物等の動物、植物、昆虫、微生物、ファージ等のウイルス）から調製され得る天然の一本鎖ＲＮＡが挙げられる。また、一本鎖ＲＮＡは、人工的に合成されたＲＮＡ鎖であってもよい。一本鎖ＲＮＡは、保存対象のＲＮＡ鎖と、異なる供給源に由来するものであってもよい。したがって、本発明の保存溶液は、第１の供給源（例、ヒト等の動物種）に由来する保存対象のＲＮＡ鎖、および第１の供給源とは異なる第２の供給源（例、ファージ等のウイルス、またはベクター）に由来する一本鎖ＲＮＡを含有していてもよい。また、本発明の保存溶液は、保存対象のＲＮＡ鎖、および当該ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡのうち、一方が人工的に合成され、他方が天然に由来するものであってもよい。さらに、ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡは、調達の容易さの観点から、所定の生物（例、微生物）に感染して増幅し得る自立的な複製能を有する一本鎖ＲＮＡ（例、複製起点を有する一本鎖ＲＮＡ）であってもよい。このような一本鎖ＲＮＡとしては、ファージＲＮＡ（例、ＭＳ２  ＲＮＡ）等のウイルスＲＮＡ、ベクターＲＮＡが挙げられる。ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡの好ましい例としては、ファージＲＮＡ（例、ＭＳ２  ＲＮＡ）が挙げられる。
【００３６】
ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡ中のリボヌクレオチドの個数は、ＲＮＡ鎖を安定化できるような個数である限り特に限定されないが、例えば、１６個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、または２０００個以上であってもよい。ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡ中のリボヌクレオチドの個数はまた、特に制限されないが、例えば、２００，０００個未満、１００，０００個未満、２０，０００個未満、または１０，０００未満であってもよい。
【００３７】
本発明の保存溶液中に含まれる、ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡは、単一（即ち、一種類）の一本鎖ＲＮＡであっても、複数（例、２種、３種）の一本鎖ＲＮＡであってもよいが、含有成分の簡素化および本発明の保存溶液の調製の簡便化という観点からは、単一の一本鎖ＲＮＡであることが好ましい。
【００３８】
本発明の保存溶液は、ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡを、保存対象のＲＮＡ鎖の分解を抑制し得るのに十分な濃度で含有し得る。このような濃度は、用いられる一本鎖ＲＮＡの種類およびサイズ（リボヌクレオチドの個数）、ならびに後述する別の安定化剤の有無等によっても変動し得るが、当業者は、このような濃度を適宜決定することができる。例えば、ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡの濃度は、ＲＮＡ鎖を安定化し得る限り特に限定されないが、例えば０．１〜１０００ｎｇ／μＬ、好ましくは０．５〜５００ｎｇ／μＬ、より好ましくは１．０〜１００ｎｇ／μＬ、最も好ましくは５．０〜５０ｎｇ／μＬである。本発明の保存溶液中に含まれる、ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡが複数用いられる場合、複数の一本鎖ＲＮＡの濃度の合計が、上記濃度の範囲内にあればよい。
【００３９】
別の実施形態では、ＲＮＡ鎖を安定化し得る成分は、アウリントリカルボン酸塩である。アウリントリカルボン酸塩は、高い濃度においてＲＮａｓｅインヒビターとして使用されているが（特許文献１および非特許文献１、２を参照）、低い濃度（例、１０μＭ未満の濃度）においてＲＮａｓｅインヒビターとして使用できること、ならびにアウリントリカルボン酸塩およびＲＮＡ鎖を含有する溶液を逆転写反応に使用することは、報告されていない。
【００４０】
アウリントリカルボン酸の塩としては、金属塩、無機塩、有機塩が挙げられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩が挙げられる。無機塩としては、例えば、アンモニウム塩が挙げられる。有機塩としては、例えば、アルキル基で置換されたアンモニウム塩が挙げられる。アルキル基で置換されたアンモニウム塩としては、モノアルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩が挙げられる。アルキル基で置換されたアンモニウム塩におけるアルキル基は、その炭素数が特に限定されないが、炭素数１〜６のアルキル基であってもよい。炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖または分岐鎖であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。
【００４１】
本発明の保存溶液は、アウリントリカルボン酸塩を、本発明の保存溶液中に含まれる保存対象のＲＮＡ鎖の分解を抑制し得、かつ本発明の保存溶液が逆転写反応および目的ＤＮＡ鎖の増幅反応に供された場合に、これらの反応を阻害し得ない濃度で含有し得る。このような濃度は、用いられる一本鎖ＲＮＡの種類およびサイズ（リボヌクレオチドの個数）、後述する別の安定化剤の有無、ならびに逆転写反応液または増幅反応液に添加される本発明の保存溶液の量等によっても変動し得るが、例えば０．１〜２．５μＭ、好ましくは０．２〜２．０μＭ、より好ましくは０．５〜１．５μＭ、最も好ましくは０．８〜１．２μＭである。
【００４２】
本発明の保存溶液は、ＲＮＡ鎖を安定化し得る成分である、ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡまたは／およびアウリントリカルボン酸塩に加えて、別の安定化剤をさらに含有していてもよい。別の安定化剤としては、例えば、クエン酸塩が挙げられる。別の安定化剤が塩である場合、塩としては、上述した塩、例えば、ナトリウム等の金属塩、およびアンモニウム等の無機塩が挙げられる。
【００４３】
本発明の保存溶液では、ＲＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分が溶解される溶媒は、水溶液である。水溶液としては、例えば、水（例、滅菌蒸留水）、緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、例えば、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝液、塩酸‐塩化カリウム緩衝液、グリシン‐塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸‐リン酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ‐塩酸緩衝液、グリシン‐水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸‐重炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液が挙げられる。水溶液は、ＤＥＰＣで処理されていても、処理されていなくてもよい。
【００４４】
本発明はまた、本発明の保存溶液の保存方法を提供する。本発明の保存方法は、本発明の保存溶液を液体状態で保存することを含む。液体状態での保存は、常温で保存することにより達成されてもよい。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「常温」とは、２〜４０℃の温度をいう。ところで、日本工業規格（ＪＩＳ）では、常温とは、２０℃±１５℃（５〜３５℃）の温度として定められている。一方、日本薬局方では、常温とは、１５〜２５℃の温度として定められている。したがって、本発明の保存溶液は、２〜４０℃の温度で保存されてもよいが、５〜３５℃または１５〜２５℃の温度で保存されてもよい。
【００４６】
保存期間は、本発明の保存溶液中において、保存対象のＲＮＡ鎖の一部が未分解状態で残存し得る期間である限り特に限定されない。保存対象のＲＮＡ鎖の残存の程度は、保存期間によっても異なるため特に限定されないが、例えば、保存対象のＲＮＡ鎖は、本発明の保存溶液中において、保存対象のＲＮＡ鎖の初期量に対して、例えば３０％以上、好ましくは５０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上の量において未分解状態で残存し得る。本発明の保存溶液中における保存対象のＲＮＡ鎖の残存の程度は、当該技術分野で周知の方法により決定することができる（例、ＴＯＦ／ＭＳ検出によるメインピークの残存率の決定）。また、本発明の保存溶液中における保存対象のＲＮＡ鎖の残存は、リアルタイムＰＣＲによるＣｐ値の測定によって確認することもできる。保存期間としては、例えば、１週間以上、２週間以上、３週間以上、１ヶ月以上、２ヶ月以上または３ヶ月以上の期間が挙げられる。また、保存期間は、特に限定されないが、例えば、１年以下、６ヶ月以下または４ヶ月以下の期間であってもよい。
【００４７】
本発明は、本発明の保存溶液の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を水溶液中に共存させる工程を含む。本工程は、例えば、工程（１）保存対象のＲＮＡ鎖を含有する水溶液中に、ＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を添加すること、工程（２）ＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を含有する水溶液中に、保存対象のＲＮＡ鎖を添加すること、ならびに工程（３）水溶液中に、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を同時に添加することにより行われ得る。
【００４８】
工程（１）の場合、保存対象のＲＮＡ鎖を含有する水溶液は、予め調製されたものを用いてもよいが、改めて調製してもよい。したがって、改めて調製される場合、工程（１）は、保存対象のＲＮＡ鎖を水溶液中に添加して、保存対象のＲＮＡ鎖を含有する水溶液を調製し、次いで、調製された水溶液中に、ＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を添加することにより行われる。
【００４９】
工程（２）の場合、ＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を含有する水溶液は、予め調製されたものを用いてもよいが、改めて調製してもよい。したがって、改めて調製される場合、工程（２）は、ＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を水溶液中に添加して、ＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を含有する水溶液を調製し、次いで、調製された水溶液中に、保存対象のＲＮＡ鎖を添加することにより行われる。
【００５０】
工程（３）の場合、同時添加は、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分の混合物を、水溶液中に添加することにより、または保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を、水溶液中に同時に別々に添加することにより、達成される。本発明の保存溶液の製造に際して、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分の混合物が用いられる場合、本発明の製造方法は、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を混合することを含んでいてもよい。
【００５１】
本発明の製造方法において用いられる水溶液は、本発明の保存溶液において上述した水溶液と同様である。保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を水溶液中に共存させる工程は、本発明の保存溶液において上述したような濃度等が達成されるように行われ得る。
【００５２】
本発明の製造方法は、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分に加えて、他の成分（例、別の安定化剤）を水溶液中に添加することを含んでいてもよい。他の成分の水溶液中への添加は、上述した工程（１）〜（３）と同様の方法論により行われ得る。
【００５３】
本発明は、ＲＮＡ鎖の安定化方法を提供する。本発明の安定化方法は、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を水溶液中に共存させることにより、保存対象のＲＮＡ鎖を安定化させることを含む。保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を水溶液中に共存させることは、例えば、上記工程（１）〜（３）と同様に行われ得る。
【００５４】
本発明の安定化方法において用いられる水溶液は、本発明の保存溶液において上述した水溶液と同様である。共存は、本発明の保存溶液において上述したような濃度が達成されるように行われ得る。本発明の安定化方法はまた、保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分に加えて、他の成分（例、別の安定化剤）を水溶液中に添加することを含んでいてもよい。他の成分の水溶液中への添加は、上述した工程（１）〜（３）と同様の方法論により行われ得る。
【００５５】
本発明はまた、本発明の保存溶液を含むキットを提供する。本発明のキットは、以下（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液；ならびに
（ｂ）目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素。
【００５６】
キットに含まれる構成要素（ａ）および（ｂ）は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器（例、チューブ）に格納された形態で提供され得る。本発明のキット中の構成要素（ａ）は、本発明の保存溶液と同様である。本発明のキットは、構成要素（ａ）および（ｂ）に加えて、構成要素（ｃ）ＤＮＡまたはＲＮＡの抽出試薬をさらに含んでいてもよい。
【００５７】
構成要素（ｂ）について、目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素としては、例えば、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素、逆転写反応−目的ＤＮＡ鎖の増幅反応（本明細書中、必要に応じて、「逆転写（ＲＴ）−増幅反応」と省略）用の構成要素が挙げられる。逆転写反応に供されるＲＮＡ鎖は、上述した保存対象のＲＮＡ鎖である。したがって、逆転写反応に供されるＲＮＡ鎖は、天然に由来するＲＮＡ鎖（例、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ）であってもよい。
【００５８】
具体的には、本発明のキットが、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用のキットである場合、以下（ａ１）、（ｂ１）を含む：
（ａ１）保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液；ならびに
（ｂ１）ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素。
【００５９】
この場合、本発明のキットは、目的ＤＮＡ鎖の合成のために利用され得る。ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素としては、このような反応に用いられる試薬および容器が挙げられる。具体的には、このような構成要素としては、逆転写酵素、逆転写反応用のプライマー、ｄＮＴＰ混合物、反応緩衝液、反応容器が挙げられる。
【００６０】
本発明のキットは、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素をさらに含むことにより、逆転写（ＲＴ）−増幅反応用のキットであってもよい。この場合、本発明のキットは、例えば、以下（ａ２）、（ｂ２）を含む：
（ａ２）保存対象のＲＮＡ鎖、およびＲＮＡ鎖を安定化し得る成分を含有する、ＲＮＡ鎖の保存溶液；ならびに
（ｂ２）ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素、および目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素。
【００６１】
目的ＤＮＡ鎖の増幅反応は、ＲＮＡ鎖から合成されたｃＤＮＡを使用する増幅反応である限り特に限定されず、定性的または定量的アッセイ等のために用いられ得る。具体的には、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応としては、ＰＣＲ（例、リアルタイムＰＣＲ、多重化ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（例、国際公開第００／２８０８２号参照）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）（例、国際公開第００／５６８７７号参照）、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）が挙げられる。
【００６２】
本発明のキットが、逆転写（ＲＴ）−増幅反応用のキットである場合、本発明のキットは、検出、定量あるいはクローニング等の目的のために利用され得る。目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素としては、このような反応に用いられる試薬および容器が挙げられる。具体的には、このような構成要素としては、ポリメラーゼ（例、耐熱性ポリメラーゼ）、１以上のプライマー（例、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用のプライマー、および目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用のプライマー、あるいはＲＮＡ鎖の逆転写反応および目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の共通プライマー）、ｄＮＴＰ混合物、反応緩衝液、コントロール用テンプレート、反応容器が挙げられる。
【００６３】
本発明のキットが、逆転写（ＲＴ）−増幅反応用のキットである場合、逆転写（ＲＴ）反応および増幅反応は、別々に行なわれてもよいが、同時に行なわれてもよい。逆転写（ＲＴ）−増幅反応が同時に行なわれる場合、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用のプライマー、および目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用のプライマーは、異なっていてもよいが、共通していてもよい。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明のキットは、リアルタイムＲＴ−増幅反応（例、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＬＡＭＰ）用のキットである。この場合、本発明のキットは、構成要素（ｂ）として、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素、およびリアルタイム増幅反応用の構成要素を含み得る。リアルタイム増幅反応としては、例えば、インターカレーター法、蛍光物質標識プローブ法が挙げられる。したがって、リアルタイム増幅反応用の構成要素（ｂ）は、構成成分として、このような方法を行なうための蛍光物質または蛍光物質標識プローブをさらに含んでいてもよい。蛍光物質としては、例えば、インターカレーター法に用いられる蛍光物質（例、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）が挙げられる。蛍光物質標識プローブとしては、例えば、５’末端または３’末端の一方に蛍光物質が結合し、かつ５’末端または３’末端の他方にクエンチャーが結合しているプローブ（例、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）が挙げられる。
【００６５】
特に好ましい実施形態では、本発明のキットは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用のキットである。この場合、本発明のキットは、構成要素（ｂ）として、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素、およびリアルタイムＰＣＲ用の構成要素を含み得る。具体的には、構成要素（ｂ）の構成成分としては、逆転写酵素、耐熱性ポリメラーゼ、１以上のプライマー、ｄＮＴＰ混合物、反応緩衝液、上述したような蛍光物質および蛍光物質標識プローブ、反応容器が挙げられる。
【００６６】
構成要素（ｂ）の構成成分は、１以上であれば特に限定されず、１個であっても、複数（例、２、３、４、５、６）であってもよい。各構成成分は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器（例、チューブ）に格納された形態で提供されてもよいが、予め混合された形態（例、ＰｒｅＭｉｘ）等で提供されてもよい。
【００６７】
本発明はまた、目的ＤＮＡ鎖の製造方法（または目的ＤＮＡ鎖の合成方法）を提供する。本発明の製造方法は、ＲＮＡ鎖を目的ＤＮＡ鎖の合成反応に供することを含む。ＲＮＡ鎖としては、本発明の保存溶液中の保存対象のＲＮＡ鎖が用いられる。
【００６８】
目的ＤＮＡ鎖の製造反応としては、ＲＮＡ鎖の逆転写反応、またはＲＴ−増幅反応が挙げられる。本方法は、上述した本発明のキットにより行なわれてもよい。好ましくは、目的ＤＮＡ鎖の製造方法は、リアルタイムＲＴ−増幅反応（例、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）による方法である。また、ＲＴ−増幅反応は、ＲＴ反応および増幅反応を同時に行う１ステップ  ＲＴ−増幅反応（例、ＲＴ−ＰＣＲ）であってもよい。
【００６９】
本発明はまた、ＲＮＡ発現量の測定方法を提供する。本発明の測定方法は、本発明の保存溶液中に含有される保存対象のＲＮＡ鎖を、ＲＮＡ発現量の測定のためのＲＮＡ標品（即ち、コントロール）として使用することを含む。
【００７０】
ＲＮＡ発現量の測定で用いられるＲＮＡサンプルとしては、例えば、哺乳動物由来のＲＮＡサンプルが挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギが挙げられる。臨床応用という観点から、哺乳動物種は、好ましくはヒトである。ＲＮＡサンプルとしては、例えば、天然に由来するＲＮＡ鎖（例、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を含むサンプル（例、細胞または組織からの抽出液）が挙げられる。
【００７１】
本発明の測定方法では、ＲＴ−増幅反応が利用され得る。したがって、本発明の測定方法は、例えば、（ａ１’）ＲＮＡサンプルを、ＲＴ−増幅反応に供する工程、（ｂ１’）本発明の保存溶液中の保存対象のＲＮＡ鎖を、ＲＴ−増幅反応に供する工程、および（ｃ１’）工程（ｂ１’）の結果に基づき、工程（ａ１’）のＲＴ−増幅反応を検証する工程、または工程（ｂ１’）の結果に基づき、ＲＮＡサンプル中の標的ＲＮＡの発現量を決定する工程を含んでいてもよい。工程（ａ１’）および（ｂ１’）は、上述のように別々に行なわれてもよいが、一緒に行うこともできる。この場合、本発明の測定方法は、例えば、（ａ２’）ＲＮＡサンプルおよび本発明の保存溶液中の保存対象のＲＮＡ鎖を合わせる工程、（ｂ２’）ＲＮＡサンプルおよび本発明の保存溶液中のＲＮＡ鎖を、ＲＴ−増幅反応に供する工程、および（ｃ２’）ＲＮＡ鎖の反応結果に基づき、工程（ｂ２’）のＲＴ−増幅反応を検証する工程、またはＲＮＡ鎖の反応結果に基づき、ＲＮＡサンプル中の標的ＲＮＡの発現量を決定する工程を含んでいてもよい。ＲＮＡサンプルおよび本発明の測定方法は、上述した本発明のキットにより行なわれてもよい。好ましくは、本発明の測定方法は、リアルタイムＲＴ−増幅反応（例、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）による方法である。また、ＲＴ−増幅反応は、ＲＴ反応および増幅反応を別々に行う２ステップＲＴ−増幅反応（例、２ステップＲＴ−ＰＣＲ）であってもよいが、ＲＴ反応および増幅反応を同時に行う１ステップＲＴ−増幅反応（例、１ステップＲＴ−ＰＣＲ）であってもよい。
【００７２】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７３】
実施例１：一本鎖ＲＮＡ保存試験（１）
保存対象の一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）は、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法を用いて作製した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）による精製を施した後、電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所製）を用いて純度確認を行った。また、精製後の一本鎖ＲＮＡの濃度を、分光光度計ＧｅｎｅＱｕａｎｔ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定した吸光度と分子量の関係により決定した。純度確認・濃度決定が終了した一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）を、ＴＥ緩衝液中に溶解して、４×１０５コピー／μＬの濃度となるように調製して、以下の保存溶液を得た。【００７４】
調製した保存溶液は、以下のとおりである：
（１）ＤＥＰＣ水；
（２）ＭＳ２  ＲＮＡ水溶液（１０ｎｇ／μＬ）；
（３）クエン酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）；および
（４）アウリントリカルボン酸アンモニウム水溶液（０．２５μＭ）。【００７５】
ＭＳ２  ＲＮＡは、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから入手した。ＭＳ２  ＲＮＡは、ファージＭＳ２から抽出された一本鎖ＲＮＡ（ＲＮａｓｅフリー）であり、約１，２００ｋＤａの分子量を有し、３５６９ベースから構成される。
上記で調製した各材料を、チューブへ分注して密閉し、４℃および室温（２５℃。以下同様）で保存した。定期的に各保存チューブからＲＮＡ溶液を採取し、経時的なＲＮＡの分解度合いを、ＲＴ−ＰＣＲにより調査した。一本鎖ＲＮＡ保存試験では、比較のために、ＲＮＡ保存として従来用いられてきたＤＥＰＣ水による−８０℃保存の試料を調製し、同様に測定した。
ＲＴ−ＰＣＲの詳細は、以下のとおりである。先ず、試料から５μＬを採取しＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、総容量２０μＬで逆転写反応を行った。その後、得られた溶液をニシン精子（１０ｎｇ／μＬ）にて１／５希釈したものを、ＰＣＲ反応装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）  ＳＴ３００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いたインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲに供した。このＰＣＲから得られるＣｐ値の経時変化から、各溶液のＲＮＡ分解度合いを調査した。【００７６】
各温度で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化を、表１および２に示す。Ｃｐ（Ｃｒｏｓｓｉｎｇ  Ｐｏｉｎｔ）値は、用いた装置の蛍光強度計の閾値（指数関数的に強度が増加している範囲に通常設定される。）に達するのに必要なＰＣＲサイクル数を示す値である。Ｃｐ値の経時的な維持は、一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）の安定な保存（換言すれば、一本鎖ＲＮＡの分解の抑制）を示す。一方、Ｃｐ値の経時的な増加は、一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）が分解されていることを示す。また、各温度で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）について、ＰＣＲ増幅曲線を、図１および２に示す。【００７７】
【表１】
2011162326.tif 000002
【００７８】
【表２】
2011162326.tif 000003
【００７９】
次いで、上記で調製した各材料を、加水分解プローブ（蛍光物質標識プローブ）によるリアルタイムＰＣＲに供した。リアルタイムＰＣＲの反応条件は、加水分解プローブを検出系として用いた以外は、上記リアルタイムＰＣＲのものと同様であった。加水分解プローブは、当該分野で周知の方法により自社で作製した加水分解プローブを用いた。このＰＣＲから得られるＣｐ値の経時変化から、各溶液のＲＮＡ分解度合いを調査した。各温度で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化を、表３および４に示す。【００８０】
【表３】
2011162326.tif 000004
【００８１】
【表４】
2011162326.tif 000005
【００８２】
その結果、ＭＳ２  ＲＮＡ溶液による保存は、従来法の−８０℃保存と同等の保存安定性を示した（表１〜４および図１、２）。また、ＭＳ２  ＲＮＡを含有する水溶液は、低い初期Ｃｐ値を示した。この理由としては、ＭＳ２  ＲＮＡが測定対象の一本鎖ＲＮＡのチューブ壁への吸着を抑制したことが考えられた。【００８３】
実施例２：一本鎖ＲＮＡ保存試験（２）
実施例１と同様に作製し、純度確認と濃度決定を終えた一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）を、ＴＥ緩衝液中に溶解して、４×１０７コピー／μＬとなるように調製して、以下の２種の保存溶液を得た。
（１）ＭＳ２  ＲＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）水溶液
（２）ＭＳ２  ＲＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）およびアウリントリカルボン酸アンモニウム（１．０μＭ）の混合水溶液
ＭＳ２  ＲＮＡは、実施例１と同じものを用いた。
さらに、一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）について、４×１０７コピー／μＬから４×１０３コピー／μＬまで、１／１０ずつ段階希釈した希釈系列（４×１０７，４×１０６，４×１０５，４×１０４，４×１０３コピー／μＬ）を、２種それぞれの溶液について調製した。
上記で調製した各材料を、チューブに分注して密閉し、４℃および室温で保存した。定期的に各保存チューブからＲＮＡ溶液を採取し、経時的なＲＮＡの分解度合いを、インターカレーター法によるＲＴ−ＰＣＲにより調査した。インターカレーター法によるＲＴ−ＰＣＲは、実施例１と同様にして行った。
各温度で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化を、表５〜８に示す。また、表５〜８のデータについてグラフ化したものを図３〜６に示す。【００８４】
【表５】
2011162326.tif 000006
【００８５】
【表６】
2011162326.tif 000007
【００８６】
【表７】
2011162326.tif 000008
【００８７】
【表８】
2011162326.tif 000009
【００８８】
次いで、経時的なＲＮＡの分解度合いを、加水分解プローブ（蛍光物質標識プローブ）によるＲＴ−ＰＣＲにより調査した。加水分解プローブによるＲＴ−ＰＣＲは、実施例１と同様にして行った。
各温度で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化を、表９〜１２に示す。また、表９〜１２のデータについてグラフ化したものを図７〜１０に示す。
【表９】
2011162326.tif 000010
【００８９】
【表１０】
2011162326.tif 000011
【００９０】
【表１１】
2011162326.tif 000012
【００９１】
【表１２】
2011162326.tif 000013
【００９２】
その結果、（１）ＭＳ２  ＲＮＡ溶液、ならびに（２）ＭＳ２  ＲＮＡおよびアウリントリカルボン酸アンモニウムの混合水溶液のいずれの場合でも、経時的なＣｐ値の変化が認められなかった（表５〜１２、図３〜１０）。したがって、ＲＮＡ標品の保存安定性が、この２種の溶液において維持されていることが示された。【００９３】
実施例３：トータルＲＮＡ保存試験
保存対象のトータルＲＮＡは、ヒト由来培養細胞Ｋ５６２から一般的方法により抽出し、精製を行った。その後、分光光度計ＧｅｎｅＱｕａｎｔ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定した吸光度から得られたトータルＲＮＡの濃度を決定した。濃度決定が終了したトータルＲＮＡを、ＴＥ緩衝液中に溶解して、４０ｎｇ／μＬの濃度となるように調製して、以下の保存溶液を得た。調製した保存溶液は、以下のとおりである。
（１）ＤＥＰＣ水
（２）ＭＳ２  ＲＮＡ水溶液（１０ｎｇ／μＬ）
（３）クエン酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）、
（４）アウリントリカルボン酸アンモニウム（０．２５μＭ）水溶液。
ＭＳ２  ＲＮＡは、実施例１と同じものを用いた。【００９４】
上記で調製した各材料を、チューブへ分注して密閉し、４℃および室温で保存した。定期的に各保存チューブからＲＮＡ溶液を採取し、経時的なＲＮＡの分解度合いを、実施例１と同様に、ＲＴ−ＰＣＲにより調査した。ＲＴ−ＰＣＲは、ヒトＧＡＰＤＨをターゲットとした以外は、実施例１と同様にして行った。トータルＲＮＡ保存試験では、比較のために従来のトータルＲＮＡ保存として用いられてきたＤＥＰＣ水溶液による−８０℃保存の材料を調製し同様に測定を行った。
各温度で保存されたトータルＲＮＡのＣｐ値経時変化を、表１３、１４に示す。また、表１３、１４のデータについてグラフ化したものを図１１、１２に示す。【００９５】
【表１３】
2011162326.tif 000014
【００９６】
【表１４】
2011162326.tif 000015
【００９７】
その結果、トータルＲＮＡのＣｐ値測定結果は、ＭＳ２  ＲＮＡ水溶液、およびアウリントリカルボン酸アンモニウム水溶液の場合に安定していることが示された（表１３、１４、および図１１、１２）。【００９８】
実施例４：逆転写反応に対するアウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）の影響の調査（１）
ＲＮＡ安定化剤候補物質のアウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）は、核酸及び核酸結合タンパク質の核酸結合部位に結合する性質を有し、核酸に対するほぼ全ての酵素反応を阻害するという報告がある（Ｔｈｏｍａｓ  Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５５（３），６８０−６８８（１９７３）を参照）。しかしながら、ＡＴＡによりＲＴ−ＰＣＲ（逆転写反応および／または増幅反応）が阻害されるか否か、ならびに阻害される場合、その阻害濃度については報告されていない。ＡＴＡによりＲＴ−ＰＣＲが阻害されない場合、あるいは阻害される場合であっても低濃度では阻害を無視できる場合には、安定化剤として実験を進める余地がある。したがって、ＲＴ−ＰＣＲに対するＡＴＡの影響を調べた。
逆転写反応の試料として、ヒト由来培養細胞Ｋ５６２から一般的方法により抽出し、精製したトータルＲＮＡを用いた。その後、分光光度計ＧｅｎｅＱｕａｎｔ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定した吸光度の値を用いてトータルＲＮＡ濃度を決定した。次に、トータルＲＮＡ濃度４０ｎｇ／μＬの溶液（トータルＲＮＡを溶解するための溶媒としては、ＤＥＰＣ水を使用）を、ＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度が０ｍＭ（添加なし）、０．０１ｍＭ、０．１ｍＭ、１．０ｍＭとなるように調製した４種の保存溶液を得た。
上記保存溶液を用いて、保存期間を設けることなく、２ステップＲＴ−ＰＣＲを行った。具体的には、上記保存溶液から５μＬを採取し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、２０μＬの系で逆転写反応を行った。その後、逆転写反応後の溶液をニシン精子（１０ｎｇ／μＬ）にて１／５希釈したものをテンプレートとして、ＰＣＲ反応装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）  ＳＴ３００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、一般的なインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲを、ヒトＷＴ−１をターゲットにして行った。なお、逆転写反応液（総量２０μＬ）中に占める保存溶液の容量は５μＬであったので、逆転写反応液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度は、保存溶液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度の１／４であった。また、ＰＣＲ液（総量２０μＬ）中に占める逆転写反応液の１／５希釈液の容量は５μＬであったので、ＰＣＲ液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度は、保存溶液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度の１／８０であった。
その結果、保存溶液として１．０ｍＭおよび０．１ｍＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）溶液を用いた場合、増幅が見られないため、ＲＴ−ＰＣＲが阻害されることが判明し、保存溶液として０．０１ｍＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）を用いた場合には、ＲＴ−ＰＣＲが若干阻害されることが確認された（表１５）。【００９９】
【表１５】
2011162326.tif 000016
【０１００】
実施例５：逆転写反応に対するＡＴＡの影響の調査（２）
実施例４の結果を受けて、ＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度が０．０１ｍＭ（１０μＭ）よりも低い濃度では、逆転写反応がどの程度阻害されるか、確認した。
実施例４と同じ方法により調製された、トータルＲＮＡ濃度４０ｎｇ／μＬの溶液を用いて、ＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度が０μＭ（添加なし）、０．１μＭ、１．０μＭとなるように調製した３種の保存溶液を得た。次いで、保存期間を設けることなく、逆転写反応、およびインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲ（即ち、２ステップＲＴ−ＰＣＲ）を、実施例４と同様にヒトＷＴ−１をターゲットにして行った。なお、逆転写反応液（総量２０μＬ）中に占める保存溶液の容量は５μＬであったので、逆転写反応液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度は、保存溶液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度の１／４であった。また、ＰＣＲ液（総量２０μＬ）中に占める逆転写反応液の１／５希釈液の容量は５μＬであったので、ＰＣＲ液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度は、保存溶液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度の１／８０であった。
その結果、保存溶液として１．０μＭおよび０．１μＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）溶液を用いた場合、ＰＣＲは殆ど阻害されなかった（表１６）。【０１０１】
【表１６】
2011162326.tif 000017
【０１０２】
実施例６：逆転写反応に対するＡＴＡの影響の調査（３）
実施例４、５の結果を受けて、ＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度２．５〜７．５μＭでは、逆転写反応がどの程度阻害されるか、確認した。
実施例４と同じ方法により調製された、トータルＲＮＡ濃度４０ｎｇ／μＬの溶液を用いて、ＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度が０μＭ（添加なし）、２．５μＭ、５．０μＭ、７．５μＭとなるように調製した４種の保存溶液を得た。次いで、保存期間を設けることなく、逆転写反応、およびインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲ（即ち、２ステップＲＴ−ＰＣＲ）を、実施例４と同様にヒトＷＴ−１をターゲットにして行った。なお、逆転写反応液（総量２０μＬ）中に占める保存溶液の容量は５μＬであったので、逆転写反応液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度は、保存溶液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度の１／４であった。また、ＰＣＲ液（総量２０μＬ）中に占める逆転写反応液の１／５希釈液の容量は５μＬであったので、ＰＣＲ液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度は、保存溶液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度の１／８０であった。
その結果、保存溶液として５．０〜７．５μＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）溶液を用いた場合、ＲＴ−ＰＣＲが阻害された（表１７）。一方、保存溶液として２．５μＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）を用いた場合、ＲＴ−ＰＣＲは殆ど阻害されなかった。実施例４〜６の結果より、ＲＴ−ＰＣＲを阻害し得ないＡＴＡ（アンモニウム塩）の濃度は２．５μＭ以下であること、ならびにＲＴ−ＰＣＲを阻害しないＡＴＡ（アンモニウム塩）の至適濃度が１．０μＭであることが確認された。【０１０３】
【表１７】
2011162326.tif 000018
【０１０４】
実施例７：加水分解プローブによるＲＴ−ＰＣＲに対するＡＴＡの影響の調査
実施例４〜６によって、ＲＴ−ＰＣＲを阻害しないＡＴＡ（アンモニウム塩）の至適濃度は１．０μＭであることが、一般的なインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲにて確認された。そこで、本実施例では、加水分解プローブ（蛍光物質標識プローブ）を用いたリアルタイムＰＣＲに対する、１．０μＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）の影響を調査した。加水分解プローブは、当該分野で周知の方法により自社で作製した加水分解プローブを用いた。
実施例４と同じ方法により調製された、トータルＲＮＡ濃度４０ｎｇ／μＬの溶液を用いて、ＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度が０μＭ（添加なし）、１．０μＭとなるように調製した２種の保存溶液を得た。次いで、保存期間を設けることなく、２ステップＲＴ−ＰＣＲを行なった。具体的には、逆転写反応を、実施例４と同様に行った。逆転写反応後の溶液をニシン精子（１０ｎｇ／μＬ）にて１／５希釈したものをテンプレートとして、ＰＣＲ反応装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）  ＳＴ３００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、加水分解プローブによるリアルタイムＰＣＲを、ヒトβ−アクチンをターゲットにして行った。なお、逆転写反応液（総量２０μＬ）中に占める保存溶液の容量は５μＬであったので、逆転写反応液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度は、保存溶液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度の１／４であった。また、ＰＣＲ液（総量２０μＬ）中に占める逆転写反応液の１／５希釈液の容量は５μＬであったので、ＰＣＲ液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度は、保存溶液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度の１／８０であった。
その結果、保存溶液として１．０μＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）溶液を用いた場合、加水分解プローブによるＲＴ−ＰＣＲは阻害されないことが確認された（表１８）。【０１０５】
【表１８】
2011162326.tif 000019
【０１０６】
実施例８：一本鎖ＲＮＡをテンプレートとして用いたＲＴ−ＰＣＲに対するＡＴＡの影響の調査
実施例４〜７では、トータルＲＮＡをテンプレートして用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ＲＴ−ＰＣＲを阻害しないＡＴＡ（アンモニウム塩）の至適濃度が１．０μＭであることが確認された。本実施例では、一本鎖ＲＮＡをテンプレートとして用いたＲＴ−ＰＣＲに対するＡＴＡ（アンモニウム塩）の影響を確認した。
実施例１と同じ方法により調製された、一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）濃度４×１０５コピー／μＬの溶液を用いて、ＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度が０μＭ（添加なし）、０．１μＭ、１．０μＭとなるように調製した３種の保存溶液を得た。次いで、保存期間を設けることなく、逆転写反応、およびインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲ（即ち、２ステップＲＴ−ＰＣＲ）を、実施例４と同様に行った。なお、逆転写反応液（総量２０μＬ）中に占める保存溶液の容量は５μＬであったので、逆転写反応液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度は、保存溶液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度の１／４であった。また、ＰＣＲ液（総量２０μＬ）中に占める逆転写反応液の１／５希釈液の容量は５μＬであったので、ＰＣＲ液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度は、保存溶液中のＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度の１／８０であった。
その結果、保存溶液として、一本鎖ＲＮＡおよび１．０μＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）を含有する溶液を用いた場合、ＲＴ−ＰＣＲは阻害されなかった（表１９）。また、１．０μＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）溶液は、ＡＴＡ（アンモニウム塩）を含有しない溶液（０μＭ）よりも低いＣｐ値を示した（表１９）。【０１０７】
【表１９】
2011162326.tif 000020
【０１０８】
実施例９：ＡＴＡによる一本鎖ＲＮＡの保存試験
これまでの実験によってＲＴ−ＰＣＲを阻害しないことが確認された１．０μＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）を含有する溶液中における、一本鎖ＲＮＡの安定性を試験した。
実施例１と同じ方法により調製された、一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）濃度４×１０５コピー／μＬの溶液を用いて、ＡＴＡ（アンモニウム塩）濃度が０μＭ（添加なし）、１．０μＭとなるように調製した２種の保存溶液を得た。
上記で調製した各材料を、チューブに分注して密閉し、４℃および室温で保存した。２週間後、５週間後に各チューブからＲＮＡ溶液を採取し、経時的なＲＮＡの分解度合いを、ＲＴ−ＰＣＲにより調査した。ＲＴ−ＰＣＲについて、逆転写反応、およびインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲ（即ち、２ステップＲＴ−ＰＣＲ）を、実施例４と同様に行った。比較のために、ＲＮＡ保存として従来用いられてきたＤＥＰＣ水による−８０℃保存の試料を調製し、同様に測定した。
各温度で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化を、表２０および２１に示す。また、４℃および室温で２週間保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）について、ＰＣＲ増幅曲線を、図１３に示す。【０１０９】
【表２０】
2011162326.tif 000021
【０１１０】
【表２１】
2011162326.tif 000022
【０１１１】
その結果、１．０μＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）を含有する保存溶液を用いた場合、２週後のＣｐ値は、４℃および室温で、−８０℃コントロールのものよりも低かったことから（表２０、２１、および図１３）、２週後の１．０μＭ  ＡＴＡ（アンモニウム塩）溶液は、４℃および室温で、−８０℃コントロールよりも分解を抑制したことが確認された。【０１１２】
実施例１０：ＡＴＡによる一本鎖ＲＮＡの保存試験
次いで、リボソームＲＮＡ（ＲＮＡ鎖を安定化し得る一本鎖ＲＮＡ）のみ、ならびにリボソームＲＮＡおよびＡＴＡ（アンモニウム塩）の双方を含有する溶液中における、一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）の安定性を試験した。
実施例１と同じ方法により純度確認・濃度決定が終了した一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）を、ＴＥ緩衝液中に溶解して、４×１０５コピー／μＬの濃度となるように調製して、以下の保存溶液を得た。【０１１３】
調製した保存溶液は、以下のとおりである：
（１）ＤＥＰＣ水；
（２）リボソームＲＮＡ水溶液（１０ｎｇ／μＬ）；および
（３）リボソームＲＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）、およびＡＴＡ（アンモニウム塩）（１．０μＭ）を含有する水溶液。【０１１４】
リボソームＲＮＡ（１６ｓ、２３ｓ）は、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから入手した。このリボゾームＲＮＡ（１６ｓ、２３ｓ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００由来の一本鎖ＲＮＡ（ＲＮａｓｅフリー）であり、１５００ベース（１６ｓ）および２９００ベース（２３ｓ）から構成される。
上記で調製した各材料を、チューブに分注して密閉し、４℃、室温および３７℃で保存した。１週間後、２週間後に各チューブからＲＮＡ溶液を採取し、経時的なＲＮＡの分解度合いを、ＲＴ−ＰＣＲにより調査した。ＲＴ−ＰＣＲについて、逆転写反応、およびインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲ（即ち、２ステップＲＴ−ＰＣＲ）を、実施例４と同様に行った。比較のために、ＲＮＡ保存として従来用いられてきたＤＥＰＣ水による−８０℃保存の試料を調製し、同様に測定した。
各温度で保存された一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）のＣｐ値経時変化を、表２２〜２４に示す。【０１１５】
【表２２】
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【０１１６】
【表２３】
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【０１１７】
【表２４】
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【０１１８】
その結果、リボソームＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ（ヒトＴＥＲＴ遺伝子）の分解を抑制した。なお、本実施例および上記実施例における室温での保存試験の結果を考慮すると、ファージＲＮＡ（ＭＳ２  ＲＮＡ）の方が、リボソームＲＮＡ（１６ｓ、２３ｓ）よりも、ＲＮＡ鎖の安定化に優れていた。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明は、ＲＮＡ鎖の安定化に有用である。したがって、本発明は、ＲＮＡ鎖を利用する方法、例えば、ＲＮＡ鎖からの目的ＤＮＡ鎖の合成反応（例、逆転写反応、ＲＴ−ＰＣＲ）において、またはＲＮＡ鎖からの目的ＤＮＡ鎖の合成反応の試薬およびキットとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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