(57)【要約】  液状試料中の分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法により測定するための検査器具であって；少なくとも液状試料を試薬と反応させる反応室を有し、反応室を構成する面の少なくとも一部に試薬が乾燥付着されており、かつ、試薬が、分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法で測定可能な試薬であり；さらに、液状試料を供給するための供給部；およびその供給部に供給された液状試料を反応室まで移送するための流路を備え；供給部に供給された液状試料を、流路を経由して反応室内に移送させて乾燥付着された試薬を液状試料に接触させて液状試料中に分散させるための供給部と反応室に圧力差を発生させうる、検査器具を用いることにより、可視部での吸光度に基づく測定が可能であり、短い時間で分析対象物を正確に測定でき、ＰＯＣＴ分野に好適な測定が可能である。
2011129220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状試料中の分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法により測定するための検査器具であって；少なくとも液状試料を試薬と反応させる反応室を有し、反応室を構成する面の少なくとも一部に試薬が乾燥付着されており、かつ、試薬が、分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法で測定可能な試薬であり；さらに、液状試料を供給するための供給部；およびその供給部に供給された液状試料を反応室まで移送するための流路を備え；供給部に供給された液状試料を、流路を経由して反応室内に移送させて乾燥付着された試薬を液状試料に接触させて液状試料中に分散させるための供給部と反応室に圧力差を発生させうる、検査器具。
【請求項２】
分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法で測定可能な試薬が、分析対象物質に特異的に結合するパートナー感作貴金属コロイドを含む試薬、または該パートナーと該分析対象物質と同じ物質感作貴金属コロイドを含む試薬である、請求項１に記載の検査器具。
【請求項３】
反応室は、第１の平面、これに対向する第２の平面、および第１の平面および第２の平面それぞれに接し第１の平面と第２の平面との間に空間を形成する第３の面で形成されており、分析対象物質に特異的に結合するパートナー感作貴金属コロイドを含む試薬が、第１の平面またはこれに対向する第２の平面に乾燥付着され、あるいは、該パートナーと該分析対象物質と同じ物質感作貴金属コロイドを含む試薬において、該パートナーが第１の平面またはこれに対向する第２の平面のいずれかに乾燥付着され、その他の平面に該分析対象物質と同じ物質感作貴金属コロイドが乾燥付着された、請求項１または２に記載の検査器具。
【請求項４】
貴金属コロイドが金コロイドまたはパラジウムコロイドである、請求項１から３のいずれかに記載の検査器具。
【請求項５】
流路および反応室は、通気性があり且つ非通液状性の多孔性膜を介して検査器具外部と接続されている、請求項１から４のいずれかに記載の検査器具。
【請求項６】
加圧により圧力差を発生させる、請求項１から５のいずれかに記載の検査器具。
【請求項７】
供給部に供給された液状試料を、加圧部によって加圧して反応室内に移送可能な、請求項１から６のいずれかに記載の検査器具。
【請求項８】
液状試料が生体試料であり、分析対象物質が生体成分である、請求項１から７のいずれかに記載の検査器具。
【請求項９】
供給部と流路の間に、液状試料から固体を分離するための膜を有する、請求項１から８のいずれかに記載の検査器具。
【請求項１０】
分析対象物質を含むと疑われる液状試料を、請求項１から９のいずれかに記載の検査器具の供給部に供給し、次いで、供給部と反応室に圧力差を発生させて流路を経由して液状試料を反応室に移送させ、反応室中の試薬に液状試料を接触させて試薬を液状試料中に分散させ、液状試料中の分析対象物質を試薬と反応させ、得られる混合液に光を照射して透過光または反射光由来の吸光度変化に基づいて液状試料中の分析対象物質を測定する、液状試料中の分析対象物質の測定方法。
【請求項１１】
混合液に光を照射する際、反応室に照射する、請求項１０に記載の測定方法。
【請求項１２】
照射する光の波長が３４０〜８００ｎｍの範囲内である、請求項１０または１１に記載の測定方法。
【請求項１３】
照射する光の波長が３９０〜４２０ｎｍの範囲内である、請求項１２に記載の測定方法。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれかに記載の検査器具に加えて、反応室に光を照射し透過光または反射光を読み取るための可視部分光光度計を組み合わせた、液状試料中の分析対象物質を測定するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の分析対象物質を測定するための検査器具及びそれを用いた分析対象物質の測定方法に関する。更に詳しくは、本発明は、主として臨床検査分野において適用され、特に、患者のベッドサイドや救急現場などのあらゆる場所で迅速で簡便に検査できる所謂ＰＯＣＴ分野に好適な、液状試料中の分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法により測定するための検査器具及びそれを用いた分析対象物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分析技術の進歩により、様々な生体成分を測定することが可能となっている。特に、臨床検査分野においては、抗原と抗体が特異的に反応するという原理に基づく免疫測定法の開発により、病態に関連する体液中の種々の生体成分が測定されている。そのような免疫測定法の分野においては、近年、検体を採取してから検査結果が得られるまでの時間を短縮できる点、また、装置が簡便であるという点、簡単に測定できる点から、ポイント・オブ・ケア・テスティング（以下、Ｐ  Ｏ  Ｃ  Ｔともいう。）分野が注目されている。【０００３】
このような免疫測定法の検査器具はＢＦ分離を伴う検査器具がほとんどである。
そのような検査器具として、イムノクロマト検査器具が知られている（特許文献１）。この検査器具は、例えば、液体が毛管現象で移動可能な多孔質材であるシート上に、試料溶液中に存在しうる分析対象物質に対する第一抗体をクロマトグラフ媒体に固定したものを用いる。その検査器具のクロマトの末端から該分析対象物質に対する標識化された第二抗体、例えば金コロイドで標識化された第二抗体を含む該試料溶液を展開させ、次いで、固定化された第一抗体部位に、第一抗体と分析対象物質と標識第二抗体との複合体を捕捉させる。未反応の標識抗体は下流に移動してしまうため、固定化抗体部位には、分析対象物質が試料中に存在する場合にのみ、金コロイド等による着色が観察される。しかし、この方法は、もともと金コロイド等の着色があるかどうかを目視で分析対象物質の有無を判断するだけであり、定量的に測定することはできないという問題があった。【０００４】
また、分析対象物質を定量するため、ポンプ吸引により試料を空間流路経由で移送させる検査器具も知られている（特許文献２）。この器具は、試料供給口、標識抗体が備えられた試料処理室、固定化抗体が備えられた測定室、廃液室及びポンプ接続口があり、それぞれ、流路により連通している。試料を試料供給口に付し、その試料を吸引により、試料処理室に移送し、そこで標識抗体を遊離させるとともに試料中の分析対象物質と標識抗体とを反応させ、次いで、再び吸引して試料を測定室に移送し、固定化抗体と分析対象物質と標識抗体との結合物を生成させ、そこで一定時間停止させ、試料中の分析対象物以外の成分を吸引して廃液室に移送する。そして測定室にある分析対象物質由来の結合物を測光することによって試料に含まれる分析対象物質の定量測定を実施できる。しかし、この器具は、ポンプによる試料移送が複数の段階で行われるため、制御することが比較的難しく、測定結果が条件により大きな影響を受けるという問題があった。
その問題を解決するため、同様な測定原理において、流路開閉可能な閉塞部材とポンプ加圧とを組み合わせる方法も知られている（特許文献３）。しかし、この方法は、検査器具の構造が複雑になるという問題があった。【０００５】
一方、ＢＦ分離が不要であるラテックス免疫凝集反応に基づく測定対象物質を定量できる検査器具も、ＰＯＣＴの分野では開発例が少ないが、知られている（特許文献４）。この方法は、抗体感作ラテックス等をドライ化（乾燥）したものを、検査器具に組み込むものであるが、そのような場合、あらかじめ、液体試薬を簡単な自然乾燥ではなく、時間がかかる煩雑な凍結乾燥をして製造しなければならない。また、抗体感作粒子はもともと完全に水に溶けるものではなく分散しているだけなので、ドライ化した抗体感作粒子は、再分散しにくいという難点がある。しかし、ラテックス免疫凝集反応の方法では、ＢＦ分離を伴う方法とは異なり、抗体感作粒子を完全に再分散させることが必要である。そのため、ドライケミストリーでラテックス免疫凝集測定法を使う場合、ラテックスを再分散させるため、回転、振動等の空間処理手段を加えて免疫アッセイさせなければならず、その結果、検査器具が複雑になりやすいという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平４−２９９２６２号公報
【特許文献２】特開平９−１９６９２０号公報
【特許文献３】特開２００９−２７０８７８号公報
【特許文献４】特開２００７−１１４１６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ドライケミストリーにより試料中の分析対象物質を正確に測定可能でかつ簡便な検査器具およびそれを用いた短時間で測定できる分析対象物質の測定方法であって、ＰＯＣＴ分野に好適な検査器具および測定方法を提供することにある。更には、可視部での吸光度に基づく測定が可能なため、汎用されている可視分光光度計を用いた装置に適用でき、かつ、分析対象物質を正確に測定できる検査器具およびそれを用いる測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような状況のもとで、本発明者らは、分析対象物質を測定できる簡便な検査器具を開発することを検討した。その結果、抗体を感作するための粒子として貴金属コロイドを用い、それを流路系の検査器具の反応室に付着乾燥させておき、血球分離膜を用いて全血より血球を除去する程度で加圧すると、乾燥試薬が再分散されやすく、その結果、回転操作や振動等のその他の空間移動処理手段を加えないで分析対象物質を正確に測定できることを見出した。本発明はかかる知見に基づき更に研究を重ねて完成させたものである。【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］．液状試料中の分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法により測定するための検査器具であって；少なくとも液状試料を試薬と反応させる反応室を有し、反応室を構成する面の少なくとも一部に試薬が乾燥付着されており、かつ、試薬が、分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法で測定可能な試薬であり；さらに、液状試料を供給するための供給部；およびその供給部に供給された液状試料を反応室まで移送するための流路を備え；供給部に供給された液状試料を、流路を経由して反応室内に移送させて乾燥付着された試薬を液状試料に接触させて液状試料中に分散させるための供給部と反応室に圧力差を発生させうる、検査器具；
［２］．分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法で測定可能な試薬が、分析対象物質に特異的に結合するパートナー感作貴金属コロイドを含む試薬、または該パートナーと該分析対象物質と同じ物質感作貴金属コロイドを含む試薬である、上記［１］に記載の検査器具；
［３］．反応室は、第１の平面、これに対向する第２の平面、および第１の平面および第２の平面それぞれに接し第１の平面と第２の平面との間に空間を形成する第３の面で形成されており、分析対象物質に特異的に結合するパートナー感作貴金属コロイドを含む試薬が、第１の平面またはこれに対向する第２の平面に乾燥付着され、あるいは、該パートナーと該分析対象物質と同じ物質感作貴金属コロイドを含む試薬において、該パートナーが第１の平面またはこれに対向する第２の平面のいずれかに乾燥付着され、その他の平面に該分析対象物質と同じ物質感作貴金属コロイドが乾燥付着された、上記［１］または［２］に記載の検査器具；
［４］．貴金属コロイドが金コロイドまたはパラジウムコロイドである、上記［１］から［３］のいずれかに記載の検査器具；
［５］．流路および反応室は、通気性があり且つ非通液状性の多孔性膜を介して検査器具外部と接続されている、上記［１］から［４］のいずれかに記載の検査器具；
［６］．加圧により圧力差を発生させる、上記［１］から［５］のいずれかに記載の検査器具；
［７］．供給部に供給された液状試料を、加圧部によって加圧して反応室内に移送可能な、上記［１］から［６］のいずれかに記載の検査器具；
［８］．液状試料が生体試料であり、分析対象物質が生体成分である、上記［１］から［７］のいずれかに記載の検査器具；
［９］．供給部と流路の間に、液状試料から固体を分離するための膜を有する、上記［１］から［８］のいずれかに記載の検査器具；
［１０］．分析対象物質を含むと疑われる液状試料を、上記［１］から［９］のいずれかに記載の検査器具の供給部に供給し、次いで、供給部と反応室に圧力差を発生させて流路を経由して液状試料を反応室に移送させ、反応室中の試薬に液状試料を接触させて試薬を液状試料中に分散させ、液状試料中の分析対象物質を試薬と反応させ、得られる混合液に光を照射して透過光または反射光由来の吸光度変化に基づいて液状試料中の分析対象物質を測定する、液状試料中の分析対象物質の測定方法；
［１１］．混合液に光を照射する際、反応室に照射する、上記［１０］に記載の測定方法；
［１２］．照射する光の波長が３４０〜８００ｎｍの範囲内である、上記［１０］または［１１］に記載の測定方法；
［１３］．照射する光の波長が３９０〜４２０ｎｍの範囲内である、上記［１２］に記載の測定方法；および
［１４］．上記［１］から［９］のいずれかに記載の検査器具に加えて、反応室に光を照射し透過光または反射光を読み取るための可視部分光光度計を組み合わせた、液状試料中の分析対象物質を測定するための装置
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明においては、ドライケミストリーにより簡便な検査器具を用いて液状試料中の分析対象物質を正確に測定可能である。更には、可視部での吸光度に基づく測定が可能なため、汎用されている可視分光光度計を用いた装置に適用でき、かつ、短い時間で分析対象物を正確に測定でき、本発明の検査器具および測定方法はＰＯＣＴ分野に好適なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明で用いる検査器具の一例を示す縦断面図である。
【図２】本発明で用いる検査器具の一例を示す上面図である。
【図３】本発明で用いる検査器具の一例を示す分解斜視図である。
【図４】本発明の金コロイドを用いたドライケミストリーによる測定方法と既存の液状試薬法による測定方法とでヒトＣＲＰを測定したときの相関性を示した図である。
【図５】本発明の金コロイドを用いたドライケミストリーによる測定方法と既存の液状試薬法による測定方法とでヒトシスタチンＣを測定したときの相関性を示した図である。
【図６】本発明のパラジウムコロイドを用いたドライケミストリーによる測定方法と既存の液状試薬法による測定方法とでヒトＣＲＰを測定したときの相関性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の測定方法は、ドライケミストリーの技術によるものである。本明細書においては、ドライケミストリーとは、分析対象物質を測定するための試薬が乾燥状態で検査器具において用意されていて、そこに液体状の試料が添加されると、試料中の水分を溶媒として試薬が分散されて、液体状の試料と分散された試薬が検査器具の反応室中で反応するものをいうものとする。
【００１３】
本発明の検査器具は、液状試料中の分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法により測定するための検査器具であって；少なくとも液状試料を試薬と反応させる反応室を有し、反応室を構成する面の少なくとも一部に試薬が乾燥付着されており、かつ、試薬が、分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法で測定可能な試薬、例えば、該分析対象物質に特異的に結合するパートナー感作貴金属コロイド、または該パートナーと該分析対象物質と同じ物質感作貴金属コロイドを含む試薬であり；さらに、液状試料を供給するための供給部；およびその供給部に供給された液状試料を反応室まで移送するための流路を備え；供給部に供給された液状試料を、流路を経由して反応室内に移送させて乾燥付着された試薬を液状試料に接触させて液状試料中に分散させるための供給部と反応室に圧力差を発生させうる、検査器具である。
【００１４】
本発明の検査器具は、例えば、液状試料を供給するための供給部；検査器具内に設けられ、液状試料を試薬と反応させる反応室；および供給部に供給された液状試料を反応室まで移送するための流路を備え、
流路および反応室は、通気性があり且つ非通液状性の多孔性膜を介して検査器具外部と接続されており、
反応室は、第１の平面、これに対向する第２の平面、および第１の平面および第２の平面それぞれに接し第１の平面と第２の平面との間に空間を形成する第３の面で形成されており、
流路と反応室とは、第３の面に連結孔が形成されることにより、連結されており、
平面の少なくとも一つの面に試薬が乾燥付着されており、
供給部に供給された液状試料を供給部に設けられた加圧部によって加圧して、反応室内に移送する、検査器具である。
【００１５】
本発明において液状試料とは、液体を含むものであればよいが、生体試料が好ましく、例えば、血液試料、尿、髄液等を例示できる。
血液試料としては、血清、血漿、全血等を例示できる。本発明において供給部と流路の間に、液状試料から固体を分離するための膜を有することが好ましい。特に液状試料が全血等で、血球等の固形成分を含む場合は、固液分離をするため、本発明において供給部と流路の間に、液状試料から固体を分離するための膜を有することが好ましい。
膜を用いる場合、液状試料を供給部に適用した後、圧力差、好ましくは押圧を利用して膜分離、例えば、血球等の固形分を分離除去しながら、液状試料のみを流路を経由して反応室に送り込む。その結果、液状試料を、乾燥付着された試薬に衝突させて溶解させることにより貴金属コロイドを液状試料中に分散させ液状試料中の分析対象物質を貴金属コロイド凝集法にて測定することができる。一般に、全血は、多量の複雑な生体成分や血球等の固体を含んでいるのでその中の分析対象物質のみを正確に測定することは通常困難である。しかし、本発明においては圧力差による膜分離を用いる場合、指先等から簡単に採取可能な全血を希釈することなく全血中の分析対象物質を測定することができる。このように、本発明の検査器具においては、液状試料を試薬等で希釈することなく適用できる長所を有する。すなわち、液状試料が、血液試料等の生体試料の場合、その試料の粘性が高くなりコロイドを分散させにくいにもかかわらず、本発明においては、貴金属コロイド等を用いることにより試料を希釈することなく分析対象物質を測定可能である。
【００１６】
本明細書において、貴金属コロイド凝集測定法とは、ラテックス凝集測定法のラテックスの代わりに貴金属コロイドを用いた方法であり、例えば、特定成分が感作されている貴金属コロイド試薬と、試料とを混合して凝集反応を起こさせ、その凝集の度合いからその分析対象物質を測定する方法をいう。
【００１７】
本発明において、試薬は、分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法で測定可能な試薬であれば特に限定しない。
そのような試薬として、分析対象物質に特異的に結合するパートナー感作貴金属コロイドを含む試薬、該パートナーと該分析対象物質と同じ物質感作貴金属コロイドを含む試薬を例示できる。分析対象物質に特異的に結合するパートナーとは、分析対象物質が抗原の場合にはその抗原に対する抗体、分析対象物質が抗体の場合は、その抗体に対する抗原を例示できる。分析対象物質とそれに特異的に結合するパートナーとの他の組み合わせとしては、例えば、ビオチンとアビジンやストレプトアビジン、レクチンとレクチン結合性糖類、ホルモンとホルモンレセプター、サイトカインとサイトカインレセプター、プロテインＡとＩｇＧ、ＤＮＡもしくはＲＮＡとそれらに相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ等の組み合わせが挙げられる。
【００１８】
以下、分析対象物質がＣＲＰやシスタチンＣ等の抗原、そのパートナーが抗ＣＲＰ抗体や抗シスタチンＣ抗体等の抗体の場合を例にとり、試薬を説明する。なお、分析対象物質が抗体の場合は、説明中、抗原と抗体を逆にすればよい。
試薬として分析対象物質（抗原）に特異的に結合するパートナー（抗体）感作貴金属コロイドを用いる場合は、反応中で生成される免疫凝集複合体（抗原抗体複合体）が、分析対象物質（抗原）の量に応じて大きくなる。その大きくなる度合いから分析対象物質（抗原）の濃度を測定できる。
一方、試薬として該パートナー（抗体）と該分析対象物質（抗原）と同じ物質（抗原）感作貴金属コロイドとの両方を含む試薬を用いる場合、反応中で生成される免疫凝集複合体（抗原抗体複合体）が、分析対象物質（抗原）の量に応じて小さくなる。これは一般的に免疫凝集阻止法ともよばれ、試薬としての貴金属コロイドに感作した抗原と、試薬の抗体とを凝集反応させる方法である。この方法では、試料の抗原が測定系内に入ると、試薬の抗原感作貴金属コロイドと試薬の抗体の凝集反応は阻害され、結果的に凝集が小さくなり、その量が減少する。
分析対象物質とそれに特異的に結合するパートナーとして、例えば、ビオチンとアビジンやストレプトアビジン、レクチンとレクチン結合性糖類、ホルモンとホルモンレセプター、サイトカインとサイトカインレセプター、プロテインＡとＩｇＧ、ＤＮＡもしくはＲＮＡとそれらに相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ等の組み合わせを用いる場合にも、上記した抗原もしくは抗体と抗体もしくは抗原の組み合わせと同様にして、貴金属コロイド凝集測定法により測定することができる。
本発明に用いる試薬には、賦形剤、安定化剤、緩衝剤、界面活性剤を加えてもよい。
上記賦形剤としては、例えば、アルブミン等の蛋白質、グリシン等のアミノ酸、マンニトール等のアルコール類、グルコース等の炭化水素化合物を例示できる。
安定化剤としては、水を分子に保持しやすい物質、ソルビトール等の糖類が一般的には好ましい。
【００１９】
試薬としての抗体感作貴金属コロイドや抗原感作貴金属コロイド等の物質感作貴金属コロイド試薬は、例えば、以下のようにして調製できる。貴金属コロイド溶液に、抗体等の感作対象物質を加え緩衝液で調製し室温にて静置した後、ＢＳＡコート溶液を加える。次いで、遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収する。この沈殿物にＢＳＡコート溶液を加え沈殿物を懸濁し、超音波処理を行い完全に分散させる。次いで遠心分離を行い得られた沈殿物に懸濁液を加えて懸濁し、物質感作貴金属コロイドを得る。次いで、得られた物質感作貴金属コロイドにソルビトール、界面活性剤等を加え、場合によりその他必要な成分を加えることにより分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法で測定可能な試薬を調製できる。
【００２０】
本発明の検査器具を製造するため、分析対象物質を貴金属コロイド凝集測定法で測定可能な試薬を反応室を構成する面の少なくとも一部に乾燥付着させる。この場合、例えば、液状の該試薬を、反応室を構成する面の少なくとも一部に塗布し、次いで乾燥させればよい。その液状試薬の乾燥としては、例えば、自然乾燥や凍結乾燥が挙げられるが、本発明においては、ラテックス試薬と異なり、試薬安定性から自然乾燥法が好ましい。
【００２１】
分析対象物質を測定するための試薬は、一つの試薬にまとめて、検査器具の反応室を構成する面に乾燥付着させてもよいが、試薬の安定性等を考慮したうえで二試薬に分けて、第１の平面および第２の平面にそれぞれ付着させてもよい。試薬として分析対象物質に対するパートナーと分析対象物質と同じ物質感作貴金属コロイドを含む試薬を用いる場合は、第１の平面と第２の平面に、それぞれを分けて乾燥付着することが好ましい。
【００２２】
凝集測定法は、通常、粒子としてラテックスを使用するが、本発明においては貴金属コロイドを用いる。貴金属コロイドに用いる貴金属としては、金、銀、白金、パラジウムなどを例示できるが、金、銀またはパラジウムが好ましく、金またはパラジウムがより好ましく、金がさらに好ましい。金コロイド又はパラジウムコロイド、特に金コロイドを用いる場合に、本発明の検査器具を用いて分析対象物質を非常に正確に測定することが可能だからである。金コロイドの吸収波長の極大波長は５００ｎｍ以上であるが、本発明において貴金属コロイドとして金コロイドを用いる場合、免疫凝集反応等の凝集反応後に得られる混合液に光を照射して、透過光または反射光由来の吸光度変化に基づいて液状試料中の物質を測定するときに、波長が３９０〜４２０ｎｍでも測定可能である。また、パラジウムコロイドの吸収波長の極大波長は２５０ｎｍ以下であるが、本発明において貴金属コロイドとしてパラジウムコロイドを用いる場合、免疫凝集反応等の凝集反応後に得られる混合液に光を照射して、透過光または反射光由来の吸光度変化に基づいて液状試料中の物質を測定するときに、波長が３９０〜４２０ｎｍでも測定可能である。この場合、光を照射するための光源（ＬＥＤ）が入手しやすいので好ましい。
本発明において、貴金属コロイドの粒径は、通常、１〜２００ｎｍ、好ましくは２０〜１５０ｎｍである。貴金属コロイドとしては、圧力差により液状試料と接触または衝突したとき、分散容易なものが望ましく、貴金属微粒子が保護成分により保護されていてもよい。
そのような貴金属コロイドとしては、本発明の圧力差により液状試料と接触したときに分散可能であれば特に限定しないが、４級アンモニウム塩型貴金属錯体化合物（特開２００１−１９２７１２号公報）、高分子顔料分散剤で保護された貴金属コロイド（特開平１１−７６８００号公報、特開平１１−８０６４７号公報）、分散剤としてクエン酸ナトリウムを用いた貴金属コロイド（特開平１０−６６８６１号公報）、ペプチドの酸化物やグルコサミン化合物の酸化物で保護された貴金属コロイド（国際公開ＷＯ２００５／０２３４６８号パンフレット）、アミノ酸のようなアミノ基とカルボキシル基を持つ化合物で保護された貴金属コロイド（特開２００２−２４５８５４号公報）を例示できる。
【００２３】
本発明において、圧力差を実現するため、流路および反応室は、通気性があり且つ非通液状性の多孔性膜を介して検査器具外部と接続されていることが好ましい。
【００２４】
本発明において、圧力差を出すための手段としては、反応室と供給部とに圧力差が生じ、その結果、液状試料が供給部から流路を経由して反応室に送り込まれ乾燥試薬を分散させることができる程度の手段であればよい。具体的には、加圧手段、引圧手段を例示できるが、検査器具を簡単な構造にするため、加圧手段を用いることが好ましい。すなわち、供給部に供給された試料を供給部に設けられた加圧部によって加圧して、反応室内に移送可能にすることが好ましい。
本発明において引圧手段を用いるときは、例えば、反応室にガスは通すが、液体は通さない膜または物質をとおしてポンプで引くことにより圧力差を生じさせることができる。
【００２５】
本発明においては、混合液に光を照射するときは、反応室に照射することが好ましい。そのため、反応室の上下の面は、透明であることが好ましい。すなわち、反応室は測定室を兼用していることが好ましい。
この場合、混合液に光を照射する際、反応室に照射するため、可視部分光光度計を用いることが好ましい。そのため、反応室の上下の面の少なくとも一部は、透明であることが好ましい。この場合、上から光を照射して透過光または反射光由来の吸光度変化を読み取る可視部分光光度計を用いて、反応後の吸光度変化を測定し、その変化の増減に基づいて分析対象物質を定量することができる。
【００２６】
本発明の測定方法は、本発明の検査器具に加えて、反応室に光を照射し透過光または反射光を読み取るための可視部分光光度計の２つを組み合わせて装置として用いてもよい。この装置には、例えば、供給部を加圧する加圧手段を構成するポンプを備えていてもよい。
【００２７】
本発明の測定方法は、以上に詳細に説明した本発明の検査器具を用いて、液状試料を、本発明の検査器具の供給部に供給し、次いで、供給部と反応室に圧力差を発生させて流路を経由して反応室に移送させ、反応室中の試薬に液状試料を接触させて試薬を液状試薬中に分散させ、液状試料中の分析対象物質を試薬と反応させ、得られる混合液に光を照射して透過光または反射光由来の吸光度変化に基づいて液状試料中の分析対象物質を測定する、液状試料中の分析対象物質の測定方法である。
【００２８】
本発明においては、感作貴金属コロイドの状態が抗原抗体反応等により状態が変化し、その結果、反応前後で光を照射すると、透過光または反射光由来の吸光度変化が起こる。反応前のデータは、試料として分析対象物質を含まない試料を用いて測定でき、反応前後の吸光度の差から分析対象物質の濃度を求めることができる。
【００２９】
本発明の測定方法において、照射する光の波長は、３４０〜８００ｎｍであることが好ましく、３９０〜４２０ｎｍであることがさらに好ましい。３９０〜４２０ｎｍではドライケミストリーに用いる光源として汎用性があるからである。
以下、分析対象物質として抗原を測定するため、抗体感作貴金属コロイドを用いた場合を例として説明する（抗体測定の場合は、抗原と抗体とを逆にすればよい）。貴金属コロイドが金コロイドの場合、試薬の抗体感作金コロイド溶液は、通常、極大吸収波長が５００ｎｍ以上である。抗体感作金コロイド溶液は、極大吸収波長付近では、その抗原（分析対象物質）と反応すると、吸光度の大きな変化がおこる。一方、３９０〜４２０ｎｍでも、抗体感作金コロイド溶液は、抗原と反応すると吸光度の変化が起こる。また、貴金属コロイドがパラジウムコロイドの場合、抗体感作パラジウムコロイド溶液の極大吸収波長は通常２５０ｎｍ以下であり、その抗原と反応した際にはこの極大吸収波長付近で吸光度の大きな変化がおきるが、３９０〜４２０ｎｍでも、抗体感作パラジウムコロイド溶液と抗原とが反応すると吸光度の変化がおこる。本発明においては、抗原抗体反応等の液状試料と試薬との反応による吸光度の変化の度合いから抗原の濃度を定量することができる。
分析対象物質とそれに特異的に結合するパートナーとして、他の組み合わせを用いる場合にも、上記したと同様にして、貴金属コロイド凝集測定法により測定することができる。
反応室では、液状試料により、該試薬を溶解させて反応させるときには、例えば、２０〜４０℃、好ましくは３７℃付近で反応させることにより実施できる。
【００３０】
本発明の測定方法においては、検査器具を、回転操作や振動操作を加えることなく、すなわち、特に空間移動をさせないで実施できる。すなわち、本発明においては、検査器具の供給部と反応室に圧力差を発生させる以外には特に外部からの物理的移動や操作を加えないで検査器具自体を動かすことなく乾燥試薬を分散させ免疫反応等の反応を実施することができる。また、本発明の測定方法においては、ＢＦ分離をする必要がない。その結果、極めて簡単な検査器具を用いて試料中の分析対象物質を正確に測定することができる。
【００３１】
以下に、図面に基づいて、本発明の測定方法およびそれに用いる検査器具について、更に具体的に説明する。
本発明にかかる検査器具の好ましい一実施形態として検査器具を図面に基づいて説明する。図１に検査器具の縦断面図、図２に検査器具の上面図、図３に検査器具の分解斜視図をそれぞれ示す。
検査器具は、図１から３に示すように、第１プレート１、印刷面１（図中符号２）、多孔性膜で形成される中間プレート６、印刷面２（図中符号３）および第２プレート４が、上下方向に積層され一体化された構造を有する。上層側の第１プレート１には、円形の試料供給部７が形成されている。なお、印刷面は黒く塗られた層となっているが、ドライ試薬を塗るための部分には印刷面がないためくぼみを形成し、そのくぼみにドライ試薬を塗布できるよう設定されている。印刷面１（印刷面２）は、第１プレート１（第２プレート４）または中間プレート６の一面にコーティングやスクリーン印刷等により形成されてもよく、これらのプレートとは独立したフィルムとして形成された後にこれらのプレート間に積層されてもよい。試料供給部７の上部周囲には、有底円筒形状の栓体８が着脱可能に設けられている。第１プレート１および第２プレート４には、加工容易な樹脂材料が使用され、例えば、スチレン・アクリロニトリル樹脂（ＡＢＳ樹脂）などが用いられる。中間プレート６には、非通液状性で通気性の多孔質材、例えば、四フッ化エチレン樹脂（ＰＴＦＥ樹脂）などが用いられる。
第１プレート１と第２プレート４との間に、中間プレート６が設けられ、印刷面１（２）および印刷面２（３）を介して接着している。中間プレート６には、液状試薬の流路１０が設けられ、流路１０に通じて反応室１１が設けられている。試料供給部７と流路１０の間には、通気性があり且つ通液状性の多孔性の膜９が設けられている。
反応室１１の第１の平面および第２の平面いずれか、あるいは両方に試薬が所定量塗布され乾燥付着されて、ドライ試薬１（図中符号５）および／またはドライ試薬２（図中符号１２）を形成している。
【００３２】
実際に測定を行う場合には、試料供給部７から液状試料を供給する。そして、栓体８を試料供給部７に被せ、例えば、指で栓体８を加圧する。これにより、反応室１１や流路１０内の空気が、中間プレート６から外部に排出されて、液状試料が反応室１１内に送り込まれる。反応室１１の第１の平面および第２の平面のいずれか、あるいは両方に、試薬が乾燥付着されており、反応室１１の空間内に、液状試料が搬送されると、液状試料中に試薬が分散され、液状試料と試薬との反応が開始する。一つの空間内で試料と試薬と混合されるので、均一に混合される。
反応室１１での液状試料と試薬との反応後の混合液の測定は、透過光または反射光を用いて測定できる。透過光または反射光を用いる光学測定は、第１プレート１および第２プレート４の全体を光透過性のある樹脂で形成し、反応室１１で試薬と液状試料との反応後に混合液に、例えば、第２プレート４の下方から第１プレート１に向かってたとえば、波長４０５ｎｍの透過光を照射し、反応室１１での透過光の吸収により測定すればよい。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例および比較例を用いて更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１
本発明による金コロイドを用いたヒトＣＲＰの測定方法
１．方法
１）抗ヒトＣＲＰ抗体感作金コロイドの調製
金コロイドへの抗ヒトＣＲＰ抗体の感作は以下のように行った。
平均粒径５０ｎｍの金コロイド溶液（ナカライ社販売、保護金コロイド溶液）１０ｍＬに、抗ヒトＣＲＰ抗体をＴｒｉｓ緩衝液で０．２ｍｇ／ｍＬとなるように調整した溶液１０ｍＬを加え室温にて１５分間静置した後、ＢＳＡコート溶液を１０ｍＬ加えた。その後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にＢＳＡコート溶液を２０ｍＬ加え沈殿物を懸濁し、３０秒間超音波処理を行い完全に分散させた。次いで遠心分離を行い得られた沈殿物に懸濁液を１ｍＬ加えて懸濁し、抗ヒトＣＲＰ抗体感作金コロイドを得た。
２）ドライ試薬の調製
上記１）にて得られた抗ヒトＣＲＰ抗体感作金コロイドにソルビトールを終濃度２％、界面活性剤を終濃度０．１％となるように添加した。
３）検査器具の作製およびその操作
上記の通り調製した試薬は、２枚のＰＥＴシート上に、０．３７５μＬ、０．５μＬとなるように各々塗布し自然放置にて乾燥した。乾燥後、塗布されたシートは、検体流路を含むシートをはさみ貼り合わせて、図１から３に示す構成の検査器具を作製した。試料は反応セル体積２．５容中に１容となるように供給部に導入し、押圧にて流路を経由して反応室に導入し、試薬を溶解させた。測定は試料導入後、１０分間、３７℃で反応させ、試薬が塗布された部分に対して波長４０５ｎｍで測光し、反応後の吸光度を求めた。【００３４】
用いた試薬、および試料は、具体的には以下の通りである。
金コロイド調製用試薬：
ＢＳＡコート溶液
Ｔｒｉｓ                                １０ｍＭ  ｐＨ９．２
ＢＳＡ  （ウシ血清アルブミン）          １．０％
ＰＥＧ（平均分子量  ２０，０００）      ０．１％
Ｔｒｉｓ緩衝液
Ｔｒｉｓ                                １０ｍＭ  ｐＨ９．２
懸濁液
Ｔｒｉｓ                                １００ｍＭ  ｐＨ９．２
試料：
インフォームドコンセントの得られたヒト血清（ｎ＝３０）を用いた。【００３５】
４）検査器具による測定
既存法との相関性はインフォームドコンセントの得られたヒト血清（ｎ＝３０）を用い、既存法（ラテックス法）との相関性を確認した。
相関性の確認には既存法として、Ｎ−アッセイ  ＬＡ  ＣＲＰ  Ｄ−ｔｙｐｅ（ニットーボーメディカル社製）を用い、日立７１８０型自動分析装置にて測定を行った。また、ドライ試薬の検量線は、ＣＲＰ濃度既知の管理血清を用い作成した。【００３６】
２．結果
既存法をＸ、本発明法をＹとして相関性を確認した。図４に示したように、Ｙ＝０．９８４９Ｘ＋０．００７、相関係数０．９９２５と良好な結果が得られた。このことから本発明の測定方法は金コロイドを用いてヒトＣＲＰを正確に測定できているといえる。【００３７】
実施例２
本発明による金コロイドを用いたヒトシスタチンＣの測定方法
１．方法
１）抗ヒトシスタチンＣ抗体感作金コロイドの調製
金コロイドへの抗ヒトシスタチンＣ抗体の感作は以下のように行った。平均粒径５０ｎｍの金コロイド溶液（ワインレッドケミカル社製）９ｍＬに、抗ヒトシスタチンＣ抗体をＴｒｉｓ緩衝液で１５０μｇ／ｍＬとなるように調整した溶液３ｍＬを加え室温にて１５分間静置した後、ＢＳＡコート溶液を９ｍＬ加えた。その後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にＢＳＡコート溶液を９ｍＬ加え沈殿物を懸濁し、３０秒間超音波処理を行い完全に分散させた。次いで遠心分離を行い得られた沈殿物に懸濁液を７０５μＬ加えて懸濁し、抗ヒトシスタチンＣ抗体感作金コロイドを得た。
２）ドライ試薬の調製
上記１）にて得られた抗ヒトシスタチンＣ抗体感作金コロイドにソルビトールを終濃度２％、界面活性剤を終濃度０．１％となるように添加した。
３）検査器具の作製およびその操作
上記の通り調製した試薬は、２枚のＰＥＴシート上に、０．３７５μＬ、０．５μＬとなるように各々塗布し乾燥した。乾燥後、塗布されたシートは、検体流路を含むシートをはさみ貼り合わせた。試料は反応セル体積２．５容中に１容となるように導入し、試薬を溶解させた。測定は試料導入後、７分間、３７℃で反応させ、試薬が塗布された部分に対して波長４０５ｎｍ、８００ｎｍで測光し、反応後の吸光度を求めた。【００３８】
用いた試薬、および試料は、具体的には以下の通りである。
金コロイド調製用試薬：
ＢＳＡコート溶液
Ｔｒｉｓ                                １０ｍＭ  ｐＨ９．２
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）            １．０％
ＰＥＧ（平均分子量  ２０，０００）      ０．１％
Ｔｒｉｓ緩衝液
Ｔｒｉｓ                                １０ｍＭ  ｐＨ９．２
懸濁液
Ｔｒｉｓ                                １００ｍＭ  ｐＨ９．２
試料：
インフォームドコンセントの得られたヒト血清（ｎ＝２８）を用いた。【００３９】
４）検査器具による測定
既存法との相関性はインフォームドコンセントの得られたヒト血清（ｎ＝２８）を用い、既存法（ラテックス法）との相関性を確認した。
相関性の確認には既存法として、Ｎ−アッセイ  ＬＡ  シスタチンＣ（ニットーボーメディカル社製）を用い、日立７１８０型自動分析装置にて測定を行った。また、ドライ試薬の検量線は、シスタチンＣ濃度既知の管理血清を用い作成した。【００４０】
２．結果
既存法をＸ、本発明法をＹとして相関性を確認した。図５に示したように、Ｙ＝０．９４２９Ｘ＋０．０６３５、相関係数０．９７１０と良好な結果が得られた。このことから本発明の測定方法は金コロイドを用いてヒトシスタチンＣを正確に測定できているといえる。【００４１】
実施例３
本発明によるパラジウムコロイドを用いたヒトＣＲＰの測定方法
１．方法
１）抗ヒトＣＲＰ抗体感作パラジウムコロイドの調製
パラジウムコロイドへの抗ヒトＣＲＰ抗体の感作は以下のように行った。
平均粒径７６ｎｍのパラジウムコロイド溶液（ワインレッドケミカル社製）８ｍＬに、タンパク濃度０．２ｍｇ／ｄＬとなるようにＴｒｉｓ緩衝液で調整した抗ヒトＣＲＰ抗体溶液を８ｍＬ加え、室温で１５分間静置した後、ＢＳＡコート溶液を８ｍＬ加え、１５分静置した。その後、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にＢＳＡコート溶液を１６ｍＬ加え沈殿物を懸濁し、６０秒間超音波処理を行い完全に分散させた。次いで、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、得られた沈殿物に懸濁液を６００μＬ加えて懸濁し、抗ヒトＣＲＰ抗体感作パラジウムコロイドを得た。
２）ドライ試薬の調製
上記１）にて得られた抗ヒトＣＲＰ抗体感作パラジウムコロイドにグルコースを終濃度２％、界面活性剤を終濃度０．６％となるように添加した。
３）検査器具の作製およびその操作
上記の通り調製した試薬は、１枚のＰＥＴシート上に、０．５μＬとなるように塗布し乾燥した。乾燥後、試薬を塗布したＰＥＴシートと試薬を塗布していないもう一枚のＰＥＴシートとで、検体流路を含むシートをはさみ貼り合わせた。試料は反応セル体積  ２．５容中に１容となるように導入し、試薬を溶解させた。測定は試料導入後、１０分間、３７℃で反応させ、試薬が塗布された部分に対して波長４０５ｎｍで測光し、反応後の吸光度を求めた。【００４２】
用いた試薬、および試料は、具体的には以下の通りである。
パラジウムコロイド調製用試薬：
ＢＳＡコート溶液
Ｔｒｉｓ                                １０ｍＭ  ｐＨ９．２
ＢＳＡ  （ウシ血清アルブミン）          １．０％
ＰＥＧ（平均分子量  ２０，０００）      ０．１％
Ｔｒｉｓ緩衝液
Ｔｒｉｓ                                １０ｍＭ  ｐＨ９．２
懸濁液
Ｔｒｉｓ                                ２００ｍＭ  ｐＨ９．２
試料：
インフォームドコンセントの得られたヒト血漿（ｎ＝２１）を用いた。【００４３】
４）検査器具による測定
既存法との相関性はインフォームドコンセントの得られたヒト血清（ｎ＝２１）を用い、既存法（ラテックス法）との相関性を確認した。
相関性の確認には既存法として、Ｎ−アッセイ  ＬＡ  ＣＲＰ  Ｄ−ｔｙｐｅ（ニットーボーメディカル社製）を用い、日立７１８０型自動分析装置にて測定を行った。また、ドライ試薬の検量線は、ＣＲＰ濃度既知の管理血漿を用い作成した。【００４４】
２．結果
既存法をＸ、本発明法をＹとして相関性を確認した。図６に示したように、Ｙ＝１．０２０７Ｘ＋０．２５２、相関係数０．９８１７と良好な結果が得られた。このことから本発明の測定方法はパラジウムコロイドを用いてヒトＣＲＰを正確に測定できているといえる。【００４５】
比較例１
貴金属コロイド以外を用いたヒトＣＲＰの測定
貴金属コロイドの代わりにラテックスを用いた抗ヒトＣＲＰ抗体感作ラテックス（ポリスチレン重合体）試薬を調製し、実施例１と同様の実験を行った。
ラテックス試薬では測光時の濁度によって生じた吸光度はラテックスの散乱光によって阻害され、濃度依存的に吸光度を得ることが出来なかった。加えて、ラテックス試薬は分散、拡散性に乏しく、検体供給後に乾燥状態の粒子を完全に分散、拡散させることは不可能だった。
分散、拡散性の問題は散乱光を生じにくい着色ラテックス粒子を用いても同様であり、ドライ試薬として適応させることはできなかった。
また、ＴＩＡ法を用いたドライ試薬の検討では、得られる吸光度変化が極端に小さく、ＣＲＰのような低濃度のタンパク質を定量することはできなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の検査器具およびそれを用いた分析対象物質の測定方法においては、ドライケミストリーにより簡便な検査器具を用いて液状試料中の分析対象物質を正確に測定可能である。更には、可視部での吸光度に基づく測定が可能なため、汎用されている可視分光光度計を用いた装置に適用でき、かつ、短い時間で分析対象物を正確に測定でき、本発明の検査器具および測定方法はＰＯＣＴ分野に好適なものである。
【符号の説明】
【００４７】
１  第１プレート
２  印刷面１
３  印刷面２
４  第２プレート
５  ドライ試薬１
６  中間プレート
７  供給部
８  栓体
９  膜
１０  流路
１１  反応室
１２  ドライ試薬２
【図１】
2011129220.tif 000003
【図２】
2011129220.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
2011129220.tif 000009
2011129220.tif 000010
2011129220.tif 000011
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