(57)【要約】母体血に含まれる胎児由来の有核赤血球を選択的に濃縮し、かつ有核赤血球に富んだ濃縮液を回収できるなど、粒状物濃縮機構を有するチップ等の提供、および有核赤血球の濃縮回収方法の提供。有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップ。入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、分離用狭流路は、内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ前記流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする手段を有する。このチップを用いた有核赤血球が濃縮された液の回収方法。有核赤血球濃縮用以外の粒状物濃縮用マイクロ流路チップ。
2011027832.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の粒子径と任意の変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下粒状物Aと呼ぶ)と前記粒状物Aより大きな粒子径と前記粒状物Aより低い変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下粒状物Bと呼ぶ)との混合物から、 前記粒状物Bを濃縮するために用いるマイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、前記粒状物Aは通過しやすく、かつ前記粒状物Bは通過しにくい寸法を有し、かつ
前記流路の内壁の一部を変形または移動させて前記粒状物Bが通過しやすい寸法にする手段を有する
前記マイクロ流路チップ。
【請求項２】
有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ
前記流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする手段を有する
前記マイクロ流路チップ。
【請求項３】
前記分離用狭流路の内壁は、流路に垂直の断面の高さが1μm〜5μmの範囲であり、幅が5μm〜10mの範囲であり、流路の長さは2μm 〜1mの範囲である請求項2に記載のマイクロ流路チップ。
【請求項４】
有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ
前記寸法が、流路に垂直の断面の高さが1μm〜5μmの範囲であり、幅が5μm〜10mの範囲であり、流路の長さは2μm 〜1mの範囲である
前記マイクロ流路チップ。
【請求項５】
複数の分離用狭流路は、スペーサーで隔てられており、スペーサーの出口側流路に面する面は、出口側流路側に凸型形状の曲面であり、及び／又はスペーサーの入口側流路に面する面は、入口側流路側に凸型形状の曲面である請求項1〜3のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
【請求項６】
分離用狭流路の内壁を変形または移動させる手段が、分離用狭流路の内壁の少なくとも一部として設けた可撓性膜及びこの可撓性膜の流路と反対側に設けた圧力調整可能室から構成される請求項1〜3、5のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
【請求項７】
入口側流路、出口側流路及び分離用狭流路はチップに内蔵されており、
チップ表面に入口側流路に連絡する入口、出口側流路に連絡する出口、及び空気室に連絡する口を有する請求項6に記載のマイクロ流路チップ。
【請求項８】
各流路の内壁は、細胞付着防止コーティングや、非特異的吸着防止コーティングで表面処理されている請求項1〜7のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
【請求項９】
請求項2〜3、5〜8のいずれか1項に記載のマイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にした状態で、入口側流路から回収液を供給し、出口側流路から有核赤血球に富む液を回収することを含む、有核赤血球が濃縮された液の回収方法。
【請求項１０】
請求項4に記載のマイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで入口側流路または出口側流路から回収液を供給し、出口側流路または入口側流路から有核赤血球に富む液を回収することを含む、有核赤血球が濃縮された液の回収方法。
【請求項１１】
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料が、percollを用いた密度勾配遠心分離で1.070g/ml〜1.095g/mlの密度の画分を回収したものである請求項9または10に記載の方法。
【請求項１２】
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料が、回収した画分を生理的条件の食塩濃度を有する食塩水で、希釈されたものである請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
請求項6または7に記載のマイクロ流路チップを用い、
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給する際には、圧力調整可能室を分離用狭流路に対して陽圧にして、流路の内壁の一部が空気室側に凹むように変形することを防止する請求項9、11〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項6または7に記載のマイクロ流路チップを用い、
空気室内を分離用狭流路に対して減圧にすることで、流路の内壁の一部を空気室側に凹むように変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする、請求項9、11〜13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項6または7に記載のマイクロ流路チップを用い、
空気室内を分離用狭流路に対して減圧にすることで、流路の内壁の一部を空気室側に凹むように変形または移動させて、液の導入時、または洗浄時、気泡の除去時に、液が容易に分離用狭流路を通過できる寸法にする、請求項9、11〜14のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００９年９月４日出願の日本特願２００９−２０５３４３号の優先権を主張し、それらの全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、粒状物濃縮用マイクロ流路チップ、有核赤血球濃縮回収用チップ及び有核赤血球濃縮回収方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来の出生前の遺伝子診断法では、母体への肉体的・精神的な負担だけでなく、胎児への外傷、流産ほかのリスクが不可避であった。このような中、母体を循環する血液に胎児細胞（胎児由来の有核赤血球）が移行していることが知られるようになった。この母体血に含まれる胎児由来の有核赤血球を選択的に回収し、胎児の遺伝子を分析すれば、胎児への外傷や流産のリスク無く安全に出生前診断を行う事ができる。また、この方法を利用する事で、妊娠の初期での胎児遺伝子の診断を実現し、早期治療への足掛かりとする事が期待される。世界規模では、年間約500 万件の出生前の遺伝子診断が実施されており、この安全な遺伝子診断方法を実用化できれば、世界市場において高い占拠率を占めることが期待される。【０００４】
しかし、母体血1mL 中に1 個程度しか存在しないといわれる胎児由来の有核赤血球を回収するのは容易ではない。有核赤血球の表面の特殊な構造を認識する抗体を利用（抗原抗体反応）し、蛍光標識した血球をFACS（fluorescence activated cell sorting）等を用いて回収する方法などが、各国の研究機関において行われたが、いずれも頓挫している。【０００５】
確実性の高い有核赤血球の回収方法として、光学顕微鏡で観察した画像を解析し、検出した有核赤血球を回収する方法が考えられる。しかし、1 mL中に存在する数十億個もの血球から有核赤血球を検出するにはあまりにも多くの時間を必要とするのが問題となる。【０００６】
採血したサンプルを前処理し、有核赤血球の分離・濃縮を行うことで、この問題を解決することが期待される。現在、物理的な構造をフィルターとして用いることで血球を分離する方法として、マイクロサイズ構造（ピラー構造、ポア構造等）を作製し、目的とする細胞の分離・濃縮を行う発明・研究が報告されている。（特許文献１、２、３、非特許文献１、２、３）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2009-509143号公報(WO2007/035585)
【特許文献２】特表2008-538283号公報(WO2006/108101)
【特許文献３】特表2006-501449号公報(WO2004/029221)
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Immunology Letters Vol. 71, pp 5-11, 2000
【非特許文献２】Biomolecular Engineering Vol.21, pp 157-162, 2005
【非特許文献３】Journal of Chromatography A, 1162 (2007)187-192
【０００９】
特許文献１〜３及び非特許文献１〜３の全記載は、ここに特に開示として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したような従来技術では、チップ内で目的とする細胞の分離或いは濃縮は達成されるものの、目的とする細胞を効果的に回収する機構がチップ内に存在しない。【００１１】
例えば、非特許文献３に記載のチップは、細胞を細胞のサイズと変形性に基づいて分離するものであって、幅が１５、１０、５および２．５μmの４段階に狭まるチャンネル（深さは５μmで同一である）を有するものである。このチップに、直径が約８〜１３μmである有核赤血球を含む血液サンプルを流すと、有核赤血球は、幅１５μm、１０μm、および５μmまでのチャンネルは通過するが、２．５μmのチャンネルは通過できず、２．５μmのチャンネルの第一の列に保持される。母体血に比べて有核赤血球濃度が高い臍帯血を用いた実験では、第一の列が有核赤血球で閉塞されると、それ以降に到達した有核赤血球は、２．５μmの２つのチャンネルの間に設けられた退避路を経由して、出口に設けられた回収容器に回収された。この操作に６〜８時間を要し、２．５μmのチャンネルの第一の列に保持されてしまった有核赤血球を回収する術は無く、有核赤血球の回収効率は極めて悪い。母体血に含まれる胎児由来の有核赤血球は極めて少なく（平均１．２細胞／１ｍＬ）、このチップを用いる場合には、第一の列に閉塞した有核赤血球を回収する必要があるが、回収法は示されていない。【００１２】
そこで本発明の目的は、母体血に含まれる胎児由来の有核赤血球を選択的に濃縮し、かつ有核赤血球に富んだ濃縮液を回収できる機構を有するチップおよびそれに類する寸法や変形性の異なる粒状物の混合物から特定の粒状物を回収できるチップを提供することにある。さらに本発明の目的は、母体血から有核赤血球を濃縮し、有核赤血球に富んだ濃縮液を回収する、有核赤血球の濃縮回収方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
[1]
任意の粒子径と任意の変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下粒状物Aと呼ぶ)と前記粒状物Aより大きな粒子径と前記粒状物Aより低い変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下粒状物Bと呼ぶ)との混合物から、 前記粒状物Bを濃縮するために用いるマイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、前記粒状物Aは通過しやすく、かつ前記粒状物Bは通過しにくい寸法を有し、かつ
前記流路の内壁の一部を変形または移動させて前記粒状物Bが通過しやすい寸法にする手段を有する
前記マイクロ流路チップ。
[2]
有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ
前記流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする手段を有する
前記マイクロ流路チップ。
[3]
前記分離用狭流路の内壁は、流路に垂直の断面の高さが1μm〜5μmの範囲であり、幅が5μm〜10mの範囲であり、流路の長さは2μm 〜1mの範囲である[2]に記載のマイクロ流路チップ。
[4]
有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ
前記寸法が、流路に垂直の断面の高さが1μm〜5μmの範囲であり、幅が5μm〜10mの範囲であり、流路の長さは2μm 〜1mの範囲である
前記マイクロ流路チップ。
[5]
複数の分離用狭流路は、スペーサーで隔てられており、スペーサーの出口側流路に面する面は、出口側流路側に凸型形状の曲面であり、及び／又はスペーサーの入口側流路に面する面は、入口側流路側に凸型形状の曲面である1〜3のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
[6]
分離用狭流路の内壁を変形または移動させる手段が、分離用狭流路の内壁の少なくとも一部として設けた可撓性膜及びこの可撓性膜の流路と反対側に設けた圧力調整可能室から構成される[1]〜[3]、[5]のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
[7]
入口側流路、出口側流路及び分離用狭流路はチップに内蔵されており、
チップ表面に入口側流路に連絡する入口、出口側流路に連絡する出口、及び空気室に連絡する口を有する[6]に記載のマイクロ流路チップ。
[8]
各流路の内壁は、細胞付着防止コーティングや、非特異的吸着防止コーティングで表面処理されている[1]〜[7]のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
[9]
[2]〜[3]、[5]〜[8]のいずれかに記載のマイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にした状態で、入口側流路から回収液を供給し、出口側流路から有核赤血球に富む液を回収することを含む、有核赤血球が濃縮された液の回収方法。
[10]
[4]に記載のマイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで入口側流路または出口側流路から回収液を供給し、出口側流路または入口側流路から有核赤血球に富む液を回収することを含む、有核赤血球が濃縮された液の回収方法。
[11]
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料が、percollを用いた密度勾配遠心分離で1.070g/ml〜1.095g/mlの密度の画分を回収したものである[9]または[10]に記載の方法。
[12]
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料が、回収した画分を生理的条件の食塩濃度を有する食塩水で、希釈されたものである[11]に記載の方法。
[13]
[6]または[7]に記載のマイクロ流路チップを用い、
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給する際には、圧力調整可能室を分離用狭流路に対して陽圧にして、流路の内壁の一部が空気室側に凹むように変形することを防止する[9]、[11]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]
[6]または[7]に記載のマイクロ流路チップを用い、
空気室内を分離用狭流路に対して減圧にすることで、流路の内壁の一部を空気室側に凹むように変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする、[9]、[11]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15]
[6]または[7]に記載のマイクロ流路チップを用い、
空気室内を分離用狭流路に対して減圧にすることで、流路の内壁の一部を空気室側に凹むように変形または移動させて、液の導入時、または洗浄時、気泡の除去時に、液が容易に分離用狭流路を通過できる寸法にする、[9]、[11]〜[14]のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、母体血における濃度が極めて低い有核赤血球を、高効率で濃縮および回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一態様のチップの三層構造を説明する分解図および流路形成層Aの拡大図を示す。
【図２】本発明の一態様のチップの三層構造を説明するための、流路と平行な面での断面図を示す。
【図３】中間膜の動作と血球の分離の模式説明図である。左図は、空気室を僅かに陽圧にした状態であり、右図は、空気室を負圧にした状態である。
【図４】実施例１においてSU-8で作製した流路鋳型の間隙部を、走査型電子顕微鏡で観察した際のイメージである。この写真は鋳型であり、実際の流路はこの凹凸を反転したものである。
【図５】実施例２における密度勾配遠心分離の様子を示す写真である。左図は、母体血を入れた試験管である。中図は、母体血を生理食塩水で二倍希釈した際の写真である。右図は、1.075 g/mLと1.085 g/mLのPercoll溶液を重層した際の写真である。
【図６】実施例２における密度勾配遠心分離の様子を示す写真である。左図は、試験管に1.075 g/mLと1.085 g/mLのPercoll溶液を重層したのち、生理食塩水で2倍希釈した母体血を導入した際の写真である。中図は、遠心分離後の写真であり、各比重毎に分画されている。右図は、有核赤血球と好中球を主に含む比重に対応する分画を回収し、生理食塩水で2倍希釈した際の写真である。
【図７】実施例２における密度勾配遠心分離の様子を示す写真である。左図は、図6右図を遠心分離した後の写真である。右図は、Percoll多量含有層を取り除いた後の写真である。
【図８】実施例２において密度勾配遠心分離で得られた試料を示す写真である。左図は、全血をメイグリュンワルド-ギムザ染色法で染色し、顕微鏡で有核赤血球を観察した際の画像である。右図は、Percoll遠心分離後の血球をメイグリュンワルド-ギムザ染色法で染色し、顕微鏡で有核赤血球を観察した際の画像である。
【図９】実施例２での有核赤血球の濃縮回収における、中間膜の動作と間隙に留めた有核赤血球のリリースの様子を示す説明図である。
【図１０】実施例２で有核赤血球の濃縮回収に用いたPDMSチップの外観（左図）である。右図は、血球試料溶液を送液し、間隙部に留まる血球を顕微鏡で観察した際の画像である。
【図１１】実施例２での有核赤血球の濃縮回収の様子を示す画像である。左図は、血球試料溶液を送液し、間隙部を通り抜ける血球を顕微鏡で観察した際の画像である。右図は、中間膜を動作させることで、間隙に留まっていた血球がリリースされる様子を顕微鏡で観察した際の画像である。
【図１２】実施例２で濃縮回収された有核赤血球の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［粒状物濃縮用マイクロ流路チップ］
本発明は、任意の粒子径と任意の変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下、粒状物Aと呼ぶ)と前記粒状物Aより大きな粒子径と前記粒状物Aより低い変形性を有する少なくとも1種類の粒状物(以下、粒状物Bと呼ぶ)との混合物から、 前記粒状物Bを濃縮するために用いるマイクロ流路チップである。このマイクロ流路チップは、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、前記粒状物Aは通過しやすく、かつ前記粒状物Bは通過しにくい寸法を有し、かつ
前記流路の内壁の一部を変形または移動させて前記粒状物Bが通過しやすい寸法にする手段を有する。
【００１７】
上記マイクロ流路チップを用いることで、上記粒状物AおよびBの混合物から、粒状物Bを濃縮して、分離することができる。上記粒状物AおよびBの混合物の例としては、例えば、血液を挙げることができ、具体的には、粒状物Aは、無核赤血球を挙げることができ、粒状物Bとしては、有核赤血球を挙げることができる。従って、本発明の粒状物濃縮用マイクロ流路チップの1つの態様として、無核赤血球と有核赤血球との混合物から、有核赤血球を濃縮する際に用いる、有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップを挙げることができる。
【００１８】
本発明の上記粒状物濃縮用マイクロ流路チップでは、分離用狭流路は、内壁が、前記粒状物Aは通過しやすく、かつ前記粒状物Bは通過しにくい寸法を有する。粒状物Aは通過しやすく、かつ粒状物Bは通過しにくい、分離用狭流路の内壁の寸法は、例えば、以下のように決定することができる。
【００１９】
例えば、内壁の寸法を、流路に垂直の断面の高さh、幅wおよび流路の長さLとし、粒状物Aの粒子径φAと変形性dfA、粒状物Bの粒子径φBと変形性dfBとすると、チップの性能として重要な要素である高さhは、以下の条件を満たすように設定することができる。
高さh > φA×dfA×k1
高さh < φB×dfB×k1
ここで、k1は、任意の係数であるが、dfAおよびdfBは全く変形しないものである場合を1とすれば、k=1とすることができる。粒子径φAおよびφBは、公知の方法で適宜決定できる。また、dfAおよびdfBは、主にチップにおけるサンプル液の流速や分離用狭流路入口の寸法により決まるものであり、分離用狭流路入口において粒状物にかかる応力を考慮して決定できる。具体的には、実際のサンプルをチップの試作品に適用し、分離用狭流路入口における粒状物の変形の度合いを顕微鏡などで観察することで、dfAおよびdfBを求めることができる。
【００２０】
また、幅wは高さhに比べれば、粒状物Aの通過しやすさ、および粒状物Bの通過しにくさに対する影響は大きくはない。但し、粒状物Aを通過しやすくするために、少なくとも以下の条件を満たすことが適当である。
幅w > φA×(1/dfA)×k2
この式では、k2は最低1であり、好ましくは例えば、2〜30とすることができる。k2は30を超える値であってもよい。
【００２１】
例えば、有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップにおいては、粒状物Aは無核赤血球に相当し、粒状物Bは有核赤血球に相当し、無核赤血球(粒状物A)の粒子径は約４〜６μmであるが、厚さ約2μmの偏平状の粒子であり、φAとしては厚さ約2μmを採用し、変形性dfAは0.4〜0.6である。有核赤血球(粒状物B)はステージによって粒子径は変化するが、本発明で扱うものは、粒子径φBは約８〜１３μmであり、変形性dfBは0.7〜0.9程度である。
【００２２】
以下、本発明を、有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップを例に説明する。
【００２３】
［有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップ］
図１に基づいて本発明の有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップ１について説明する。図１の右側には、流路形成層Ａ、中間膜Ｂおよび空気室形成層Ｃからなる３層構造を有するチップ１の分解説明図、左上側に流路形成層Ａの上下面をひっくり返した図、左下側に流路形成層Ａの分離用狭流路３０付近の拡大図を示す。
【００２４】
チップ１は、流路形成層Ａに入口側流路１０、出口側流路２０及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路３０を有する。分離用狭流路３０は、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有する狭流路である。無核赤血球は直径が約４〜６μmであるのに対して、有核赤血球は直径が約８〜１３μmである。さらに、非特許文献３にも記載されているように、赤血球等の細胞は変形が可能であるので、上記サイズより狭い狭流路でも通過できる。前記分離用狭流路３０は、具体的には、狭流路に垂直の断面の高さが1μm〜5μmの範囲であり、幅が5μm〜10mの範囲であり、流路の長さは2μm 〜1mの範囲であることができる。有核赤血球の分離には、特に、断面の寸法の影響が、図１に示す例では、断面の寸法のうちの高さの影響が大きい。実施例に示す実験の結果によれば、狭流路の高さが1μmに近いほど、有核赤血球の回収率は高くなり、5μmに近づくほど有核赤血球の回収率は低下する。狭流路に垂直の断面の高さは、好ましくは1〜2μmの範囲であり、幅が10μm〜10cmの範囲であり、流路の長さは20〜300μmの範囲であることができる。尚、上記有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップにおいては、無核赤血球のみならず白血球も分離用狭流路を通過させることができ、有核赤血球を白血球からも分離することができる。
【００２５】
分離用狭流路３０は、図１に示すように、複数の狭流路３０ａ、３０ｂ、３０ｃ・・・３０ｊを有することが好ましく、例えば、分離用狭流路３０は、5〜20個の狭流路を有することができる。ただし、狭流路の数に制限はなく、狭流路は、例えば、1〜20000個の範囲で有することができる。
【００２６】
複数の分離用狭流路３０は、スペーサー３１で隔てられており、スペーサー３１の出口側流路２０に面する面３２ａは、出口側流路側に凸型形状の曲面であり、スペーサーの入口側流路１０に面する面３２ｂは、入口側流路側に凸型形状の曲面であることが、スペーサーの入口側および出口側に血球塊が形成しにくく、血液試料の流通を妨げないという観点から好ましい。凸型形状の曲面は、具体的には、設計上、直径20〜40μmの半円で行った。さらに、分離用狭流路３０を形成するための堤３３の側面３３ｂ（入口側流路１０に面する面）および側面３３ａ（出口側流路２０に面する面、図示せず）も同様に凸形状（側面３３ｂおよび３３ａの全体としては波形状）にすることもできる。
【００２７】
入口側流路１０、出口側流路２０及び分離用狭流路３０はチップ１に内蔵されており、チップ１の表面には、入口側流路に連絡する入口１１、出口側流路に連絡する出口２１、及び空気室に連絡する口５１を有する。チップ１は、図１および２（断面図）に示す様に、例えば、流路形成層Ａ、中間膜Ｂおよび空気室形成層Ｃからなる３層構造を有することができる。流路形成層Ａは、一方の面に入口側流路１０、出口側流路２０及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路３０を有する。流路形成層Ａは、他方の面（対向する面）に入口側流路に連絡する入口１１と出口側流路に連絡する出口２１を有する。さらに、流路形成層Ａは、他方の面に、空気室に連絡する口５１を有する。
【００２８】
中間膜Ｂは、流路形成層Ａおよび空気室形成層Ｃの平面寸法と同様の平面寸法を有することができ、流路形成層Ａが有する空気室５０に連絡する口５１と空気室形成層Ｃが有する空気室５０との間を連絡する開口４１を有する。
【００２９】
チップ１は、さらに、分離用狭流路３０の狭流路３０ａ、３０ｂ、３０ｃ・・・３０ｊの内壁の一部を変形または移動させて、分離用狭流路３０を有核赤血球が通過しやすくする手段を有する。分離用狭流路の内壁を変形または移動させる手段は、分離用狭流路の内壁の少なくとも一部として設けた可撓性膜４０及びこの可撓性膜の流路と反対側に設けた空気室５０から構成されることができる。中間膜Ｂの一部である可撓性膜４０はダイアフラム機能を有し、空気室５０を流路側に対し陽圧にすることで可撓性膜４０は、分離用狭流路３０を形成するスペーサー３１に押し付けられ、分離用狭流路３０が、上記所定の寸法を有するように制御される。なお、中間膜B自体の弾性や、中間膜とスペーサーの間の接着性等によって所定の寸法を維持できる場合は、特に空気室５０を流路側に対して陽圧にしなくてもよい。この状態では、有核赤血球は分離用狭流路３０を通過できないか、または通過しにくい。それに対して、空気室５０を減圧することで、可撓性膜４０は、空気室５０側に撓み、可撓性膜４０と分離用狭流路３０の可撓性膜４０と対向する面との間の距離は大きくなり、分離用狭流路３０を有核赤血球が通過しやすくなる。
【００３０】
本発明のチップを用いた有核赤血球の濃縮と回収について、図３を用いてさらに説明する。本発明のチップ１は、分離用狭流路３０の一部に、空圧制御により変形するダイアフラム機能を有する可撓性膜４０と空気室５０からなるダイアフラム駆動機構を組み込んだ狭流路（マイクロ間隙）を有する。母体から採取した、目的とする細胞(有核赤血球)を含む血液サンプルを図３左の様な、狭流路（マイクロ間隙）を持つマイクロ流路を通す。有核赤血球は、他の赤血球に比べ、狭流路を通りにくい（大きいか変形し難い）ので、有核赤血球を選択的に狭流路の前にトラップし、狭流路を通りやすい他の細胞（主に無核の赤血球）と分離（分離が不完全な場合、濃縮）できる。その後、図３の右図のように、ダイアフラム機能を有する可撓性膜４０を空気室５０を減圧にすることで変形させて、狭流路の前にトラップされていた有核赤血球を含む、有核赤血球が濃縮された細胞群を回収することができる。
【００３１】
可撓性膜４０は、空気室５０を流路側に対し陽圧にして有核赤血球を選択的に狭流路の前にトラップする際には、狭流路が所定の寸法を維持でき、空気室５０を減圧にした際には、有核赤血球が狭流路を通過できる程度の隙間を狭流路に与えられる物性を有するものであることが適当である。そのような観点から、可撓性膜４０（あるいは中間膜Ｂ）は、例えば、シリコーン樹脂製で適度な弾性と硬さを有するものであることが適当である。適度な弾性と硬さとは、例えば、流路側に対し陽圧にした際は、間隙の寸法を保つのに十分変形しにくく、流路側に対し負圧にした際は有核赤血球を回収するのに十分変形することである。したがってこの適度な弾性と硬さは、スペーサー３１とスペーサー３１の間隔や、空気室５０の大きさや形に依存する値である。尚、シリコーン樹脂膜の弾性と硬さは、膜厚によっても変化するので、同一の材質のシリコーン樹脂を用い、膜厚を調整することで、所望の弾性と硬さを有する膜とすることもできる。シリコーン樹脂としては、例えば、ポリジメチルシロキサンを挙げることができ、スペーサー３１の間隔が30μmであり、空気室５０が十分大きい場合は、膜厚は、例えば、20〜200μｍの範囲とすることができる。
【００３２】
各流路の内壁は、例えば、細胞付着防止用コーティング剤や非特異吸着防止用コーティング剤で表面処理されることができる。この表面処理により、血球や血小板、たんぱく質などの各流路の内壁への付着や凝集を抑制して、上記分離を容易に行うことができる。非特異吸着防止用コーティング剤の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を主成分とするＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ−５１０(JSR株式会社)及びLipidure (日油株式会社)等を挙げることができる。
【００３３】
本発明は、入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、分離用狭流路は、内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ前記寸法が、流路に垂直の断面の高さが1μm〜5μmの範囲であり、幅が5μm〜10mの範囲であり、流路の長さは2μm 〜1mの範囲である有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップも包含する。この態様のマイクロ流路チップにおける入口側流路、出口側流路及び分離用狭流路は、上記で説明した態様の有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップと同様である。また、分離用狭流路の内壁の寸法が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ前記寸法が、流路に垂直の断面の高さが1μm〜5μmの範囲であり、幅が5μm〜10mの範囲であり、流路の長さは2μm 〜1mの範囲であることが適当であることは、上記で説明した態様の有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップと同様である。
【００３４】
但し、この態様のチップは、流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする手段を有さない。この態様のチップを用いる場合、有核赤血球の濃縮と回収は、マイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで入口側流路または出口側流路から回収液を供給し、出口側流路または入口側流路から有核赤血球に富む液を回収することで行うことができる。即ち、この態様のチップは、流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする手段を有さないが、上記方法で、有核赤血球が濃縮された液を回収することができる。
【００３５】
［粒状物濃縮用マイクロ流路チップおよび有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップの作製方法］
本発明のチップを作製するためには様々な技術を利用することができ、利用される技術は一部には最適な材料に基づいて選択される。本発明のチップを作製するための代表的材料には、ガラス、シリコン、スチール、ニッケル、ポリメタクリル酸メチル（PMMA）、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、シリコン類（例、ポリジメチルシロキサン）、およびそれらの組み合わせが含まれる。その他の材料は、当技術分野において知られている。これらの材料で流路を作製する方法は当技術分野において知られている。これらの方法には、フォトリソグラフィー（例、立体リソグラフィーまたはX線フォトリソグラフィー）、モールディング法、エンボス加工法、シリコン微細加工法、湿式もしくは乾式化学エッチング法、ミリング法、ダイアモンド切削法、リソグラフィーによる電気めっきおよび成形法（LIGA）および電気めっき法が含まれる。例えば、ガラスについては、後に湿式（KOH）または乾式エッチング（フッ素またはその他の反応ガスを用いた反応性イオンエッチング）を実施する伝統的なフォトリソグラフィーによるシリコン作製法を利用できる。レーザー微細加工法などの技術は、高度の光子吸収効率を備えるプラスチック材料のために採用できる。この技術は、この工程が連続的種類であるため、低スループット作製のために適合する。大量生産されるプラスチック製チップには、熱可塑性射出成形法、および圧縮成形法が適合する。本発明のチップを作製するためには、（サブミクロンで機能の忠実度を保存する）コンパクトディスクの大量生産に使用される従来的な熱可塑性射出成形法もまた利用されてよい。例えば、チップの機能は従来型のフォトリソグラフィーによってガラスマスター上で複製される。ガラスマスターを電気鋳造すると、頑丈で耐熱衝撃性、熱伝導性かつ硬質の型が作り出される。この型は、機能をプラスチック製チップに成形する射出成形法または圧縮成形法のためのマスターテンプレートとして機能する。チップを作製するために使用されるプラスチック材料並びに光学的品質および最終製品のスループットに関する要件に依存して、製造方法として圧縮成形法または射出成形法を選択できる。圧縮成形法（ホットエンボス加工法またはリリーフインプリンティング法とも呼ばれる）には、小型構造にとって卓越しているが高縦横比構造を複製する際に使用するのは困難でサイクル時間が長い高分子量ポリマーと適合する利点がある。射出成形法は、高縦横比構造とも良好に作用するが、低分子量ポリマーにとって最も適合する。
【００３６】
チップは、一つまたは複数のピースで作製され、その後に組立てられてよい。1つの態様では、このチップの流路形成層A，中間膜B，空気室形成層Cの各層は図1に示されているように、流路あるいは貫通孔等を有している。チップの層は、クランプ、接着剤、熱、陽極結合、または表面基間の反応（例、ウエハー結合）によって一緒に結合されてよい。または、一つより多くの平面内に流路を備えるチップは、例えば立体リソグラフィーまたはその他の三次元作製技術を使用して、単一ピースとして作製されてよい。
【００３７】
1つの態様では、このチップはPMMAから製造される。
【００３８】
［有核赤血球濃縮液の調製方法］
本発明は、有核赤血球濃縮液の調製方法も包含する。この有核赤血球濃縮液の調製方法は、上記本発明のマイクロ流路チップを用いる方法である。具体的には、
（１）チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで
（２）流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にした状態で、入口側流路から回収液を供給し、出口側流路から有核赤血球に富む液を回収すること
を含む方法である。
【００３９】
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料は、母体から採取した、目的とする細胞(有核赤血球)を含む血液サンプルである。１回に採取される血液サンプル量は、通常５〜１０ｍＬ程度である。本発明ではこれらの全量または一部を用いて有核赤血球に富む液を回収することができる。
【００４０】
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料は、チップでの濃縮処理に先立って、有核赤血球含有濃度の高い画分としておくことが、効率的に有核赤血球を回収するという観点から好ましい。有核赤血球含有濃度の高い画分は、例えば、percollを用いた密度勾配遠心分離で例えば、1.070g/ml〜1.095g/ml、あるいは 1.075g/ml〜1.085g/mlの密度の画分を回収したものであることができる。前者の範囲であれば、より広範囲から有核赤血球を回収でき、一方後者の範囲であれば、範囲は前者の範囲より狭まるが、有核赤血球に共存する無核赤血球等の割合が低下するので分離効率はよくなる。但し、この方法に限定される意図ではなく、その他にも、Ficoll法、赤血球凝集法等の方法を用いても、有核赤血球含有濃度の高い画分を得ることはできる。また有核赤血球よりも大きいか変形しにくい細胞、たとえば白血球は、適当な方法を用いて除いておくことが望ましい。この目的のために、本発明を寸法を変えて用いることもできる。
【００４１】
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料は、回収した画分を生理的条件の食塩濃度を有する食塩水で、希釈されたものであることが、チップの狭流路での血球の詰まりやその他の流路の内壁への血球の付着を抑制できるという観点から適当である。生理的条件の食塩濃度は、例えば、８〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。食塩水による希釈の程度は、流速、流路構造等を考慮して適宜決定され、血球濃度が1.1x106〜2.3x106ｃｅｌｌｓ／μＬの範囲になるように希釈することが適当である。
【００４２】
チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収する操作は、試料の供給速度（流量）を、例えば、１〜１００μＬ／分の範囲で実施することができる。試料の供給は、マイクロシリンジポンプ（IC3100 / KN3319040  テックジャム社）等を用いて行うことができる。
【００４３】
マイクロ流路チップは、前記本発明のチップであり、具体的には、分離用狭流路の内壁を変形または移動させる手段が、分離用狭流路の内壁の少なくとも一部として設けた可撓性膜及びこの可撓性膜の流路と反対側に設けた空気室から構成されるものであり、さらに、入口側流路、出口側流路及び分離用狭流路はチップに内蔵されており、チップ表面に入口側流路に連絡する入口、出口側流路に連絡する出口、及び空気室に連絡する口を有するチップを用いることが適当である。その上で、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給する際には、必要なら空気室を流路側に対して陽圧にして、流路の内壁の一部が空気室側に凹むように変形または移動することを防止する。
【００４４】
分離用狭流路を透過した液の回収が終了したら、流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にした状態で、入口側流路から回収液を供給し、出口側流路から有核赤血球に富む液を回収する。具体的には、上記マイクロ流路チップにおいて、空気室内を減圧にすることで、流路の内壁の一部を空気室側に凹むように変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする。有核赤血球に富む液の回収にも、例えば、上記の希釈で使用した生理的条件の食塩濃度を有する食塩水を用いることができる。
【００４５】
回収された有核赤血球に富む液は、胎児診断等に用いることができる。より具体的には、たとえば、メイグリュンワルド・ギムザ染色液で、血球の染色が行われる。顕微鏡観察用のプレパラート上に溶液を2.5μLずつ滴下し引きガラスを使って塗抹し、乾燥させる。その後、染色液を満たしたガラス容器に浸し染色、洗浄後、乾燥させる。顕微鏡観察によって形態学的に有核赤血球の選別、回収が行われ、最終的に有核赤血球のDNAの抽出、遺伝子の解析が行われる。
【００４６】
本発明の粒状物濃縮用マイクロ流路チップは、有核赤血球の濃縮に限らず、同様にサイズや硬さ、変形のしやすさが異なる粒子状のものの分離、濃縮に用いることができる。特に、白血球と赤血球を分離、回収することもできる。この場合、赤血球が粒状物A(任意の粒子径と任意の変形性を有する少なくとも1種類の粒状物)であり、白血球が粒状物B(前記粒状物Aより大きな粒子径と前記粒状物Aより低い変形性を有する少なくとも1種類の粒状物)である。また間隙の寸法の違う本発明のチップを、複数直列に接続することにより、様々な画分を回収することもできる。また、本発明のチップの上流に、有核赤血球よりも大きい細胞、特に白血球を通さない間隙を有する粒状物濃縮用マイクロ流路チップを別途設けることは、特に有効である。但し、前述のように、本発明のマイクロ流路チップを用いることで、無核赤血球のみならず白血球も分離用狭流路を通過させることができ(その際、有核赤血球は分離用狭流路を通過しない)、その結果、白血球からも有核赤血球を分離することができる(実施例3参照)。
【００４７】
本発明のチップを用いた濃縮および回収を実施する際は、通常、マイクロ流路内に空気のみが満たされた状態から、最初になんらかの液をいれる操作が必要になる場合がある。その際、しばしば、気泡が狭い部分、この場合は分離用狭流路３０付近に留まったり、液が狭い部分を乗り越えるのに長時間や、強い圧力が必要になる場合がある。本発明においては、このときにダイアフラムを変形させ、液導入を容易にすることができる。
【００４８】
前述のように、本発明は、流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする手段を有さないチップも包含するが、この態様のチップを用いる場合、有核赤血球の濃縮と回収は、マイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで入口側流路または出口側流路から回収液を供給し、出口側流路または入口側流路から有核赤血球に富む液を回収することで、有核赤血球が濃縮された液を回収することができる。無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料及び回収液は、前記の説明と同様のものである。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定される意図ではない。
実施例１
チップの作製
PDMS (polydimethylsiloxane) 樹脂によるチップを完成させるまでの一連の工程は、流路パターンの設計、光リソグラフィー用のマスクの作製、流路鋳型の作製、鋳型を使ったPDMS流路層の作製、各層の貼り合わせに大別できる。【００５０】
流路パターンの設計
流路パターンは、PC上でIllustrater (Adobe社) を用いて作図した。【００５１】
光リソグラフィー用のマスクの作成
流路パターンを透明なOHPフィルムに印刷する。このフィルムを透明なガラス板に張り付け、光リソグラフィーのためのマスクを完成させた。【００５２】
流路鋳型の作製
流路鋳型の材料には、光硬化性レジストSU-8 (米国 MICRO CHEM社) を用いた。  6インチの片面鏡面研磨シリコンウェハー(CZ-N, 信越化学工業株式会社、厚み625μm  結晶面＜100＞) を基板として使用した。  基板表面を超純水で洗浄し、窒素ガスで乾燥させた後、Acetone (EL grade, 関東化学株式会社) で洗浄し、窒素ガスで再び乾燥させた。スピンコーター (1H-DX2、ミカサ株式会社) に、洗浄後の基板を固定し、SU-8を鏡面側に適量を滴下した後、スピンコートした。  次にSU-8を塗布した基板をホットプレート(DATAPLATE, アズワン株式会社)上に置き、65℃で1分間、95℃で1分間加熱した後、ホットプレートの電源を切り、基板温度が室温程度に下がるまで放置した (プリベイク)。  次にコンタクト露光型マスクアライナー (Suss MJB3 UV400、米国 Karl Suss社) に前述した流路パターンを有するガラスマスクをセットし、波長365nm(i線)の紫外線を、基板のSU-8塗布側に照射した。UV露光後の基板をホットプレート上に置き、65℃で1分間、95℃で1分間加熱した後、ホットプレートの電源を切り、基板温度が室温程度に下がるまで放置した (ポストベイク) 。次に基板を、現像液(SU-8 Developer、MICRO CHEM社) に1分30秒浸し、マスクによってUV露光されていないSU-8部位を除去した後、窒素ガスで基板を乾燥させ、SU-8による流路鋳型を完成させた。【００５３】
鋳型を使ったPDMS流路層の作成
シリコーン系樹脂であるPDMS (polydimethylsiloxane) の材料として、SYLGARD 184 silicone elastomer Kit (Dow corning Toray社) を使用した。  PDMS主剤と架橋剤とを重量比10:1の割合で混合し、混合時に取り込まれた空気を除去するためにベルジャー内にPDMSを静置し、完全に脱泡されるまでロータリー真空ポンプで減圧した。周囲にPDMSが流れ出さないようにシリコーンゴムで作製した枠を取り付けたSU-8流路鋳型に、脱泡したPDMSを流し込んだ。  次に、これをオーブン (DKN 301, ヤマト科学株式会社) に入れ、65℃で5時間静置することでPDMSを硬化させた。硬化したPDMS流路を流路鋳型から丁寧に剥がし、アセトンで洗浄したベルト用の穴空けを使ってPDMS流路の必要な部位に穴をあけ、溶液導入用のリザーバーあるいは空圧制御用のチューブを取り付ける穴を作製した。【００５４】
各層の貼り合わせ
PDMSに付着した埃等の不純物を取り除くため、超純水で洗浄し窒素ガスで乾燥させた。表面を洗浄したB層とC層を、反応性イオンエッチング装置(Reactive Ion Etching-10NR、サムコ株式会社) により、100sccm、100W、8.8Paで10秒間、酸素プラズマ処理した。  このプラズマ処理によって親水性に改質された表面に触れぬよう注意しながら、B層とC層をピンセットで操作し、これらを貼り合わせ、PDMSチップを完成させた。【００５５】
チップは、図１および２に示すように、流路層と薄膜層(中間膜層)、空気層の3層構造で作製した。但し、図１では空気室５０の空気注入口５１を流路１０の入り口１１と流路２０の出口２１と同じ面に設けているのに対して、図２では、空気室５０の空気注入口５１を流路１０の入り口１１と流路２０の出口２１と反対の面に設けている。図２は、チップの三層構造を説明するための、流路と平行な面での断面図であり、A層には母体血を導入する流路が微細加工されている。B層は、C層の空気室部分を流路側に対し陽圧または負圧する事で変形し、図面中央の間隙部で上下する。【００５６】
流路中央部には、微小な隙間(微小間隙)３０を作製した。流路１０の入り口１１と流路２０の出口２１として、直径5mmの穴を作製し、中間膜Bとの張り合わせにより、リザーバーを作製した。【００５７】
図３は、中間膜の動作と血球の分離の模式説明図であり、微小な隙間(微小間隙)３０付近を拡大して示している。図３の左図は、C層の空気室を流路側に対し僅かに陽圧にすることで、溶液の流れによる圧力でB層の中間膜が下がるのを防ぐことができ、変形のし易い有核赤血球以外の血球が、間隙を通り流れていく様子を表した。図３の右図は、C層の空気室を減圧する事で、B層の中間膜を下げ、間隙部の流路が拡張するので、留まった有核赤血球を回収のためにリリースする状態を示す。【００５８】
図3に示すように、中間膜Bは、空気室５０に注入させる空気により上下に振幅し、ダイアフラム駆動の一部とした。ダイアフラムの駆動は、空気室５０の空気注入口５１を下側に作製することで容易に行えるようにした。ダイアフラムの駆動による中間膜Bの振幅は、空気室５０に注入する空気の圧力により操作した。【００５９】
図4は、SU-8で作製した流路鋳型の間隙部を、走査型電子顕微鏡で観察した際のイメージである。この写真は鋳型であり、実際の流路はこの凹凸を反転したものである。図4に示すように、一本の流路から計10本の流路に分岐する流路層を作製した。複数に分岐している流路部は、間隙部であり、高さ1.4μm 以下になるよう作製した。間隙の高さは、本実施例における回収対象である有核赤血球が留まるように作製しなければならない。そこで、間隙の高さを2.5μm以下から始め、流速0.1〜10 μL/minで行ったところ、有核赤血球は、間隙の高さが1.4μmの時点で留まっていた。以上のことから、本チップについては高さ1.4μm 以下になるよう作製した。流路のスペーサーは、微小な間隙によってチップが撓む現象を抑えるために作製した。間隙部のスペーサー入り口の形状は、四角状から丸状にする（エッジを丸める）ことで血液通過時に発生する淀み現象を抑えられるよう作製した。【００６０】
実施例２
実施例１で作製したチップを用いて、以下の方法により母体血から有核赤血球の濃縮および回収を行った。
＜血液導入方法＞
採血した時の血液量では、チップで有核赤血球を濃縮するまでに時間を要する。このため、血液量を減らす工程が必要となる。そこで、密度勾配遠心分離を行い有核赤血球を濃縮し、血液量を少なくした。【００６１】
1.密度勾配遠心分離
母体血(6.0mL〜7.0mL)は、ピペットを用いて分取し、半分づつ遠沈管へ移す。  母体血の採血量は、個人差のある血液の粘性などに影響され若干変化するが6.0mL以上は、確実に採取されている。半分に分けた母体血は、0.9%(g/mL)NaCl水溶液を用いて2倍希釈する。別の遠沈管に、密度の異なるPercoll(1.075 g/mL、1.085 g/mL)を用いて密度勾配を作製する。この結果を図5の、母体血を入れた試験管の写真（左図）、母体血を生理食塩水で二倍希釈した際の写真（中図）、および1.075 g/mLと1.085 g/mLのPercoll溶液を重層した際の写真（右図）として示す。【００６２】
次いで、密度勾配を作製した遠沈管へ、2倍に希釈した母体血を注ぐ。遠心機を用いて遠心分離する。(3000rpm、1750×g、30min)遠心後に発現した有核赤血球含有層をピペットを用いて回収する。回収した有核赤血球含有層を0.9%(g/mL)NaCl水溶液を用いて2倍希釈する。結果を図6の、試験管に1.075 g/mLと1.085 g/mLのPercoll溶液を重層したのち、生理食塩水で2倍希釈した母体血を導入した際の写真（左図）、遠心分離後の写真（中図、各比重毎に分画されている）、および有核赤血球と好中球を主に含む比重に対応する分画を回収し、生理食塩水で2倍希釈した際の写真（右図）として示す。【００６３】
密度勾配遠心分離後、回収し、0.9%(g/mL)NaCl水溶液を用いて2倍希釈した有核赤血球含有層は、Percollを多量に含んでいる。このため、残留しているPercollは、遠心分離をさらに行うことで、血球の上層へ多く移動し、アスピレーターを用いて除去する。上記のPercoll除去法を洗浄と呼称する。洗浄は、3回以上行う。この結果を、図7に示す。図6右図の試料を遠心分離した後の写真（左図）、およびPercoll含有層を取り除いた後の写真（右図）である。【００６４】
洗浄し、回収した血液の全量は、約30μL〜60μLにすることができ、全体量を少量にした。有核赤血球の濃縮は、1視野あたりの血球数が減少していたことから、できていると言える。結果を図8に示す。左図は、全血をメイグリュンワルド-ギムザ染色法で染色し、顕微鏡で有核赤血球を観察した際の画像である。右図、Percoll遠心分離後の血球をメイグリュンワルド-ギムザ染色法で染色し、顕微鏡で有核赤血球を観察した際の画像である。【００６５】
2.  密度勾配遠心分離後の血液をチップへ導入する
2.1 チップの原理
実施例１で作製したチップを用いての有核赤血球の回収は、分離用狭流路である流路の間隙部に有核赤血球を留めかつ無核赤血球等は通過させ（図９左図）、その後、中間膜を動作させる（図９右図）ことで行う。間隙部の高さは、微小間隙部の最適化で行い1.0μmにした。血液が流路通過時に淀みを生じることがあり、これに対する解消案は、微小間隙部の最適化で述べた。【００６６】
2.2 血液をチップへ導入する
2.1で血液量を少なくした母体血(30μL〜60μL)を4倍希釈しチップへ導入する。導入する速度は、10μL/minで行う。中間膜動作前にリザーバー部まで通過した血液は、マイクロピペッターを用いて逐次回収した。図10（左図）に用いたPDMSチップの外観を示す。右図は、血球試料溶液を送液し、間隙部に留まる血球を顕微鏡で観察した際の画像である。【００６７】
間隙部に留まった血球は、0.9%(g/mL)NaCl水溶液を追加して導入し、中間膜を動作させ、リザーバー部で回収する。図１１が、この時の様子を示す画像である。左図は、血球試料溶液を送液し、間隙部を通り抜ける血球を顕微鏡で観察した際の画像である。右図は、中間膜を動作させることで、間隙に留まっていた血球がリリースされる様子を顕微鏡で観察した際の画像である。【００６８】
＜導入後の血球＞
間隙部入口に留まった血球をリリースし、リザーバー部から回収した。回収した溶液をギムザ染色して標本を作製し、顕微鏡で有核赤血球を確認した写真を図１２に示す。矢印は、有核赤血球を示す。【００６９】
上記操作を、間隙（分離用狭流路）の高さが1.0μm、1.4μmまたは1.85μmである３種類のチップを用いて実施した。発見した有核赤血球の数は、間隙の高さに応じて減少していた。間隙（分離用狭流路）の高さが1.0μm、1.4μm、1.85μmの時、留まった有核赤血球は、各々8細胞、6細胞、3細胞だった。それぞれの回収率は、8/8、6/8、3/8であった。有核赤血球の回収率は、間隙の高さ1.0μmの時もっとも高い値を指している。つまり、有核赤血球を留めるに有利な間隙の高さは、1.0μm以下であるといえる。回収されたサンプル中に赤血球は、確認できなかった。これは、赤血球がほとんど間隙部を通過していたためだと考えられる。以上のことから、チップへ導入した後では、チップへ導入する前よりも有核赤血球以外の血球がほとんどなかったため、有核赤血球の濃縮ができたといえる。【００７０】
実施例３
次に実施例２のチップを用いて、白血球と赤血球の除去率を求めた。まず、母体血１ｍL中のもとの白血球数と赤血球数をFACSで計測する。また同じ母体血１ｍLを微小間隙1.0 μmのチップに通し、回収した通過液中の 白血球数と赤血球数をFACSで計測する。 間隙通過後の液中の血球数を、もとの母体血中の血球数で割って100を掛けたものを通過率（％）とし、１００−通過率を捕捉率とし、これを赤血球と白血球についてもとめる。そのほかの条件は実施例２と同じである。【００７１】
次にこの結果を示す。母体血１ｍL中のもとの赤血球数は３．６３ｘ１０９個であった。通過した赤血球数は３．４０ｘ１０９個であった。これより赤血球通過率は  ９３．６％、赤血球捕捉率は６．３４％であった。また、母体血１ｍL中の白血球数は１．６６ｘ１０７個であった。通過した白血球数は１．６４ｘ１０７個であった。これより白血球通過率は９８．７％であり、白血球捕捉率は１．２７％であった。【００７２】
有核赤血球よりも、大きい白血球がかなりの率で除去できることは特筆すべきことである。これは、白血球は、脱核前の有核赤血球よりも、生きた核を持っており、柔軟性に富み、変形しやすいからと考えられる。【００７３】
以上より、本実施例における白血球と赤血球の除去率はおよそ９５％であり、全体の血球数を約20分の１に減らすことができる。これは、そのまま自動画像処理に要する時間を20分の１に短縮できることを示し、効果は絶大である。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明は、有核赤血球濃縮用チップの製造および利用分野に有用である。
【符号の説明】
【００７５】
１    チップ
１０  入口側流路
１１  入口側流路に連絡する入口
２０  出口側流路
２１  出口側流路に連絡する出口
３０  分離用狭流路
３１  スペーサー
４０  可撓性膜（中間膜B）
５０  空気室
５１  空気室に連絡する口
【図１】
2011027832.tif 000003
【図２】
2011027832.tif 000004
【図３】
2011027832.tif 000005
【図４】
2011027832.tif 000006
【図５】
2011027832.tif 000007
【図６】
2011027832.tif 000008
【図７】
2011027832.tif 000009
【図８】
2011027832.tif 000010
【図９】
2011027832.tif 000011
【図１０】
2011027832.tif 000012
【図１１】
2011027832.tif 000013
【図１２】
2011027832.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月30日(2011.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の粒子径と任意の変形性を有する少なくとも１種類の粒状物（以下粒状物Ａと呼ぶ）と前記粒状物Ａより大きな粒子径と前記粒状物Ａより低い変形性を有する少なくとも１種類の粒状物（以下粒状物Ｂと呼ぶ）との混合物から、前記粒状物Ｂを濃縮するために用いるマイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁の少なくとも一部が可撓性膜であり、かつこの可撓性膜の流路と反対側に空気室が設けられ、前記内壁が、前記粒状物Ａは通過しやすく、かつ前記粒状物Ｂは通過しにくい寸法を有し、かつ
前記空気室の気圧を調整することで前記可撓性膜を変形させて前記粒状物Ｂが通過しやすい寸法にする手段を有する
前記マイクロ流路チップ。
【請求項２】
有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁の少なくとも一部が可撓性膜であり、かつこの可撓性膜の流路と反対側に空気室が設けられ、流路に垂直の断面の高さが１μｍ〜２μｍの範囲であり、前記内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ
前記空気室の気圧を調整することで前記可撓性膜を変形させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする手段を有する
前記マイクロ流路チップ。
【請求項３】
前記分離用狭流路の内壁は、流路に垂直の断面の高さが１〜２μｍであり、幅が１０μｍ〜１０ｃｍの範囲であり、流路の長さは２０μｍ〜３００μｍの範囲である請求項２に記載のマイクロ流路チップ。
【請求項４】
有核赤血球濃縮用マイクロ流路チップであって、
入口側流路、出口側流路及び入口側流路と出口側流路の間に分離用狭流路を有し、
分離用狭流路は、内壁が、無核赤血球は通過しやすく、かつ有核赤血球は通過しにくい寸法を有し、かつ
前記寸法が、流路に垂直の断面の高さが１μｍ〜２μｍの範囲であり、幅が１０μｍ〜１０ｃｍの範囲であり、流路の長さは２０μｍ〜３００μｍの範囲である
前記マイクロ流路チップ。
【請求項５】
複数の分離用狭流路は、スペーサーで隔てられており、スペーサーの出口側流路に面する面は、出口側流路側に凸型形状の曲面であり、及び／又はスペーサーの入口側流路に面する面は、入口側流路側に凸型形状の曲面である請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
入口側流路、出口側流路及び分離用狭流路はチップに内蔵されており、
チップ表面に入口側流路に連絡する入口、出口側流路に連絡する出口、及び空気室に連絡する口を有する請求項１〜３、５に記載のマイクロ流路チップ。
【請求項８】
各流路の内壁は、細胞付着防止コーティングや、非特異的吸着防止コーティングで表面処理されている請求項１〜５、７のいずれかに記載のマイクロ流路チップ。
【請求項９】
請求項２〜３、５、７〜８のいずれか１項に記載のマイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで流路の内壁の一部を変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にした状態で、入口側流路から回収液を供給し、出口側流路から有核赤血球に富む液を回収することを含む、有核赤血球が濃縮された液の回収方法。
【請求項１０】
請求項４に記載のマイクロ流路チップの入口側流路から、無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給し、出口側流路から分離用狭流路を透過した液を回収し、次いで入口側流路または出口側流路から回収液を供給し、出口側流路または入口側流路から有核赤血球に富む液を回収することを含む、有核赤血球が濃縮された液の回収方法。
【請求項１１】
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料が、ｐｅｒｃｏｌｌを用いた密度勾配遠心分離で１．０７０ｇ／ｍｌ〜１．０９５ｇ／ｍｌの密度の画分を回収したものである請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料が、回収した画分を生理的条件の食塩濃度を有する食塩水で、希釈されたものである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項７に記載のマイクロ流路チップを用い、
無核赤血球及び有核赤血球を含有する試料を供給する際には、圧力調整可能室を分離用狭流路に対して陽圧にして、流路の内壁の一部が空気室側に凹むように変形することを防止する請求項９、１１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項７に記載のマイクロ流路チップを用い、
空気室内を分離用狭流路に対して減圧にすることで、流路の内壁の一部を空気室側に凹むように変形または移動させて有核赤血球が通過しやすい寸法にする、請求項９、１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項７に記載のマイクロ流路チップを用い、
空気室内を分離用狭流路に対して減圧にすることで、流路の内壁の一部を空気室側に凹むように変形または移動させて、液の導入時、または洗浄時、気泡の除去時に、液が容易に分離用狭流路を通過できる寸法にする、請求項９、１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2011027832.tif 000015
2011027832.tif 000016
2011027832.tif 000017
2011027832.tif 000018