(57)【要約】  生体内で、癌細胞が転移し易くなっており又は既に微小癌転移の認められるリンパ節とりわけセンチネルリンパ節を特異的に検出したり治療したりする薬物を選択的に到達させたり、癌原発巣やその周辺組織へ治療に用いられる薬物を選択的に効率良く到達させたりでき、安全であって低侵襲性であり、患者の負担を軽減でき、癌疾患を確実に診療できる薬物輸送剤を提供する。  薬物輸送剤は、リンパ節内皮細胞上に発現しているＩＣＡＭ−１に結合する抗ＩＣＡＭ−１抗体が、蛍光標識剤、放射性同位元素含有標識剤、造影剤、及び抗癌剤のうちの少なくとも一つの薬物で化学修飾されつつ、薬物輸送有効成分として含まれているというものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ節内皮細胞上に発現しているＩＣＡＭ−１に結合する抗ＩＣＡＭ−１抗体が、蛍光標識剤、放射性同位元素含有標識剤、造影剤、及び抗癌剤のうちの少なくとも一つの薬物で化学修飾されつつ、薬物輸送有効成分として含まれていることを特徴とする薬物輸送剤。
【請求項２】
前記薬物が、結合性基で直接に又はスペーサー分子の結合性基を介して、前記化学修飾されて、前記抗ＩＣＡＭ−１抗体に結合していることを特徴とする請求項１に記載の薬物輸送剤。
【請求項３】
前記薬物が、フルオロセイン誘導体、ローダミン誘導体、フィコエルトリン誘導体、スルホン化クマリン誘導体から選ばれる前記蛍光標識剤であることを特徴とする請求項１に記載の薬物輸送剤。
【請求項４】
前記薬物輸送有効成分が、遊離し又はコロイド粒子に内包されていることを特徴とする請求項１に記載の薬物輸送剤。
【請求項５】
生体への経口投与、血管投与、又は癌原発巣近傍の血管外組織への投与によって前記癌原発巣乃至リンパ系に流入するように用いられることを特徴とする請求項１に記載の薬物輸送剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌原発巣から最初にリンパ流を受けるリンパ節特にセンチネルリンパ節で微小癌転移の有無の診断やそこでの治療を施すための薬物を、選択的に輸送するための薬物輸送剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌原発巣から全身の様々な臓器・組織への癌細胞の転移は、主にリンパ行性によって生じる。このような転移性の癌疾患の治療法は、癌原発巣を摘出する外科療法、抗癌剤の経口投与や静脈注射による化学療法などがある。【０００３】
従来のこのような外科療法は、癌原発巣やその周辺組織と共に癌転移している恐れがあるリンパ節を郭清するというものであった。このようなリンパ節の郭清は、術式が複雑となり、患者の身体的負担が大きなものである。郭清したとしても、転移していたリンパ系を完全に郭清できたか、また癌細胞のリンパ系への再転移の可能性が無いかを、術後に検査するために、リンパ節転移を指標とする広範なリンパ系での臨床検査を行なわなければならない。最近、癌原発巣と郭清すべきリンパ節のみとを外科手術で摘出して患者の身体的・精神的負担を軽減しつつ確実な治療をするために、その手術に先立ち、癌原発巣に色素や放射性同位体を注射し、癌原発巣から輸入リンパ管を経てリンパ流を最初に受ける局所リンパ節であるセンチネルリンパ節（ＳＬＮ：Sentinel Lymph Node）、所謂みはりリンパ節を見つけ出し、生検をして癌細胞転移の有無を同定するという病理的臨床検査が、行われるようになってきた。これにより、癌患者の外科手術での摘出組織を適切に特定したり最適な術式を決めたりすることができる。また、術後に同様に検査をして、予後の転移の有無を適宜判定することもできる。【０００４】
しかしセンチネルリンパ節の生検は、生体外へ組織を取り出すものであるから患者の負担が大きいうえ、顕微鏡での病理的臨床検査で、相当量の転移細胞なら検出し易いが極僅かな数個以下の転移細胞を検出し難いという問題がある。【０００５】
一方、抗癌剤の経口投与や静脈注射による化学療法は、癌原発巣の癌細胞を損傷するが、癌細胞にのみ選択的に到達しない所為で正常細胞も損傷してしまうため、悪心、嘔吐、脱毛、白血球・血小板減少、肝機能・腎機能障害などの副作用を誘発してしまうという問題がある。【０００６】
生体内で、癌細胞が転移し易くなっており又は転移しているリンパ系特にセンチネルリンパ節を特異的に検出したり、癌原発巣やその周辺組織やリンパ系へ選択的に薬物を到達させたりして、患者の負担を軽減しつつ安全に診療できる薬物輸送剤が望まれている。【０００７】
ところで、本発明者らは、特許文献１に開示されているように、摘出されたヒトリンパ管の内腔にコラゲナーゼ液を灌流することにより、剥離させて採取したヒトリンパ管由来内皮細胞株を樹立している。【０００８】
本発明者らは、癌原発巣が、転移の前段階でセンチネルリンパ節の微小環境に影響しており、転移前のセンチネルリンパ節中に特定の細胞間接着分子、例えばＩＣＡＭ−１(inter-cellular adhesion molecule-1)が、癌細胞に由来するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）やＣＣＬ２(CC Chemokine Ligand 2)を始めとする様々な原因物質に起因して、発現され、センチネルリンパ節内で、癌細胞とこのリンパ管内皮細胞との接着に関わり、微小転移し易い環境を誘発しているということを見出した。このようなセンチネルリンパ節は、癌細胞のリンパ行性転移が起こり易くなる転移前段階でこのリンパ節内皮の微小環境の変化や僅か数個のリンパ行性微小転移が最初に起こる部位である。このようなセンチネルリンパ節での微小環境変化乃至微小転移や癌細胞転移の検査は、リンパ行性転移の可能性の有無を検知できるので、臨床的に重要であるということが、多くの乳癌患者や消化器系癌患者で実証されている。本発明者らは、そのＩＣＡＭ−１の特性を利用して、本発明を完成させた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−２２２１５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、生体内で、癌細胞が転移し易くなっており又は既に微小癌転移の認められるリンパ節とりわけセンチネルリンパ節を特異的に検出したり治療したりする薬物を選択的に到達させたり、癌原発巣やその周辺組織へ治療に用いられる薬物を選択的に効率良く到達させたりでき、安全であって低侵襲性であり、患者の負担を軽減でき、癌疾患を確実に診療できる薬物輸送剤を提供することを、目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記の目的を達成するためになされた請求の範囲の請求項１に記載の薬物輸送剤は、リンパ節内皮細胞上に発現しているＩＣＡＭ−１に結合する抗ＩＣＡＭ−１抗体が、蛍光標識剤、放射性同位元素含有標識剤、造影剤、及び抗癌剤のうちの少なくとも一つの薬物で化学修飾されつつ、薬物輸送有効成分として含まれていることを特徴とする。【００１２】
請求項２に記載の薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記薬物が、結合性基で直接に又はスペーサー分子の結合性基を介して、前記化学修飾されて、前記抗ＩＣＡＭ−１抗体に結合していることを特徴とする。【００１３】
請求項３に記載の薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記薬物が、フルオロセイン誘導体、ローダミン誘導体、フィコエルトリン誘導体、スルホン化クマリン誘導体から選ばれる前記蛍光標識剤であることを特徴とする。【００１４】
請求項４に記載の薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、前記薬物輸送有効成分が、遊離し又はコロイド粒子に内包されていることを特徴とする。【００１５】
請求項５に記載の薬物輸送剤は、請求項１に記載されたもので、生体への経口投与、血管投与、又は癌原発巣近傍の血管外組織への投与によって前記癌原発巣乃至リンパ系に流入するように用いられることを特徴とする。このような血管外組織は、例えば組織間隙内、より具体的には粘膜である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の薬物輸送剤は、癌細胞が転移前段階で微小環境の変化により転移し易くなったリンパ節とりわけセンチネルリンパ節内で、必然的にリンパ管内皮細胞上に発現している細胞間接着因子ＩＣＡＭ−１へ、特異的に結合する抗ＩＣＡＭ−１抗体を有する。そのため、ＩＣＡＭ−１を介してそのような組織の細胞へ、特異的に吸着・結合し、集積させて、作用させることができる。【００１７】
従って、この薬物輸送剤によれば、癌原発巣の周辺組織へ治療に用いられる薬物を効率良く到達させたり、その癌原発巣の下流にあって転移前段階での微小環境の変化を起したり癌細胞が転移したりしているリンパ節特にセンチネルリンパ節へ、ＩＣＡＭ−１を検出する薬物や、癌細胞による腫瘍を治療する薬物を、選択的に到達させたりすることができる。【００１８】
特にこの薬物輸送剤によれば、センチネルリンパ節での微小環境の変化によりそこのリンパ管内皮細胞上に僅かに発現したＩＣＡＭ−１と結合し、蛍光標識剤、放射性同位元素含有標識剤、造影剤、及び抗癌剤のような薬剤によって、画像診断、超音波やＸ線・γ線・電子線・重粒子線で例示される放射線のような電磁波による治療、癌細胞への抗癌剤の攻撃による治療など、早期発見・早期治療のような的確で確実な診療をすることができる。最近広く研究されているような１〜数個しか転移していないセンチネルリンパ節内の癌細胞上の分子マーカーを頼りに到達させる方法よりも、この薬物輸送剤を用いることによって、センチネルリンパ節の微小環境変化、乃至は微小癌転移によりそこに発現した分子マーカーを頼りに到達させる方法の方が、遥かに精度が高い。しかも術前・術中にでも簡易かつ迅速に到達させることができる。【００１９】
また、この薬物輸送剤によれば、従来のように皮下組織への色素投与によるリンパ系の着色では色素のリンパ系での滞留時間が短い所為でリンパ系を同定し難いのに比べ、リンパ系へとりわけ流入し易いうえ抗原抗体等の特異的な反応による生体内の強い相互作用に基づいているから、作用発現時間が長く、作用発現が確実である。【００２０】
しかも、この薬物輸送剤によれば、生体内での識別性の高い抗原抗体等の反応を用いるものであるから、多量の薬物に因らずに少量で確実な診療ができるので、安全である。さらに、外科療法に依らずともこれら薬剤を所望の癌原発巣やその下流のリンパ節とりわけセンチネルリンパ節に到達させることができる低侵襲性のものであるから、患者の身体的・精神的負担を軽減できる。しかも、汎用の診断装置や治療装置を用いて、効率よく診療できるので、医療経済の健全化にも資する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】培養リンパ管内皮細胞を、乳癌培養細胞株の培養上清、ＡＴＰ及びＣＣＬ２で刺激したときのＩＣＡＭ−１の発現の程度を示す蛍光画像写真である。
【図２】本発明を適用する薬物輸送剤をラットの尾部に皮下投与後に腰部リンパ節を撮影した明視野画像写真及び蛍光画像写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
【００２３】
本発明の薬物輸送剤の好ましい形態は、リンパ節内皮細胞上に発現しているＩＣＡＭ−１に結合するマウスのモノクローナル抗体である抗ＩＣＡＭ−１抗体が蛍光標識剤のフルオロセイン誘導体であるフルオロセインイソチオアネート（ＦＩＴＣ）で化学修飾されている蛍光標識抗ＩＣＡＭ−１抗体を、薬物輸送有効成分として、含むというものである。
【００２４】
このようなフルオロセイン誘導体で蛍光標識された抗ＩＣＡＭ−１抗体として、Ｒ＆Ｄシステムズ社のMonoclonal Anti-rat ICAM-1-Fluorescein（製品番号FAB5831F）、Monoclonal Anti-human ICAM-1-Fluorescein (CD54)（製品番号BBA20）が挙げられる。このような蛍光標識抗ＩＣＡＭ−１抗体は、所謂一次抗体であって、ＦＩＴＣのイソチオシアン基と抗ＩＣＡＭ−１抗体のアミノ基、主にリジンのε−アミノ基とが反応して、安定なチオカルバミド結合基で直接、結合したものである。
【００２５】
この蛍光標識抗ＩＣＡＭ−１抗体は、例えば無標識抗ＩＣＡＭ−１抗体の水溶液を用い、炭酸ナトリウム含有水溶液のような緩衝液中で、ＦＩＴＣを添加して反応させてから、リン酸緩衝生理食塩水のような緩衝液に対して透析を行い、次いで遠心して得られた上清を、必要に応じゲル濾過クロマトグラフィー、ジエチルアミノセルロースクロマトグラフィーで精製することにより、得られる。ＦＩＴＣによる蛍光標識は、調製工程が簡便であるうえ、量子効率が高く、検出感度が良いものである。この蛍光標識抗ＩＣＡＭ−１抗体は、抗原ＩＣＡＭ−１に対する特異性が高いものである。
【００２６】
造影剤となる黄緑色蛍光を発する蛍光標識剤のＦＩＴＣを用いて化学修飾して蛍光標識した例を示したが、蛍光標識剤は特に限定されず適宜選択して用いることができる。蛍光標識剤は、ＦＩＴＣに代えて、最大吸収波長や最強蛍光波長をより長波長側に示し赤橙色蛍光を発するローダミンイソチオシアネートやテトラメチルローダミンイソチオシアネートのようなローダミン誘導体であってもよく、最大吸収波長を一層長波長側に示す色素タンパク質であるフィコエルトリンやその誘導体であってもよく、スルホン化クマリン誘導体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、登録商標）３０５や同４８８等の色素シリーズであってもよい。
【００２７】
この抗ＩＣＡＭ−１抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましいが、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００２８】
この抗ＩＣＡＭ−１抗体の由来動物は、マウスの例を挙げたが、ヒトであってもよい。このようなフルオロセイン蛍光標識ヒト抗ＩＣＡＭ−１抗体は、薬物輸送剤として投与されたときに、ヒトに由来するから患者の体内で異物抗原として認識され難いので、異物として排除されることなく所期の部位まで到達される。
【００２９】
蛍光標識抗ＩＣＡＭ−１抗体として、蛍光標識剤中のイソチオシアン基に由来するチオカルバミド結合基で抗体と蛍光標識剤とが直接結合した例を示したが、蛍光標識剤の蛍光骨格と結合し得るものであれば、結合基は特に限定されない。抗体と蛍光標識剤とがスペーサー分子を介して結合していてもよい。スペーサー分子として、タンパク質である二次抗体、ビオチン−アビジン複合体であってもよく、低分子量のマレイン酸誘導体やアゴニット酸誘導体等のポリカルボン酸、ポリエリレングリコール（ＰＥＧ）のようにエステル結合やエーテル結合を介する多官能化合物であってもよい。
【００３０】
蛍光標識抗ＩＣＡＭ−１抗体は、細胞のＩＣＡＭ−１に免疫的に結合した後、レーザービームや、高圧水銀ランプ又はハロゲンランプによる発光が、照射されると、蛍光を生じ、それを蛍光検出器で検出することにより、目視で又は画像処理して確認される。
【００３１】
化学修飾する薬物として、蛍光標識剤の例を挙げたが、放射性同位元素含有標識剤、造影剤、及び抗癌剤であってもよい。例えば、前記のような蛍光標識抗ＩＣＡＭ−１抗体に代えて、放射性同位元素含有標識抗ＩＣＡＭ−１抗体が用いられてもよい。このような放射性同位元素含有標識抗ＩＣＡＭ−１抗体は、例えば安定な放射性ヨウ素１２５Ｉや、１３１Ｉを、Bolton-Hunter試薬である３-(４-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに標識後に、無標識抗ＩＣＡＭ−１抗体へ反応させて直接導入する方法により調製される。クロラミンＴと放射性ヨウ素ナトリウムと抗ＩＣＡＭ−１抗体とを混合してもよい。非放射性ヨード剤、電磁波反射又は吸収剤のような造影剤を、前記と同様に化学修飾して調製されてもよい。またメトトレキセートやアドリアマイシンのような抗癌剤を、前記と同様にして、結合されたものであってもよい。
【００３２】
薬物輸送剤の剤型は特に限定されないが、薬物で化学修飾された抗ＩＣＡＭ−１抗体が遊離したまま薬物輸送有効成分のみからなるものであってもよく、コロイド粒子となってその有効成分を内包又は含有するものであってもよい。このコロイド粒子は、ホスファチジルセリン類、具体的にはホスファチジルセリン塩、より具体的には主成分の水素添加卵黄ホスファチジルセリンナトリウムで形成されているリポソームであることが好ましい。コロイド粒子は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）のようなリン脂質で形成されたリポソームであってもよい。このコロイド粒子は、その他レシチンのようなリン脂質で形成されたリポソーム、生体分解性樹脂ミセル粒子や合成樹脂ミセル粒子であってもよい。中でもリポソームであることが特に好ましい
【００３３】
この薬物輸送剤の投与量は、抗ＩＣＡＭ−１抗体換算で、１０〜３０μｇ／ｋｇが好ましい。
【００３４】
フルオロセイン誘導体で蛍光標識された抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体からなる薬物輸送有効成分を含む薬物輸送剤を例にして、その癌患者のセンチネルリンパ節を描出して診断する際の使用方法について説明する。
【００３５】
この薬物輸送剤を、癌患者例えば乳癌患者の血管外組織、例えば描出すべきセンチネルリンパ節を含むリンパ系の上流に存する癌原発巣の近傍の粘膜下又は皮下組織下へ投与する。この薬物輸送剤は、組織間隙に滲出した血漿成分由来のリンパ液と共にリンパ系の輸入リンパ管に流入し、緩々とリンパ管を流れ、遂にはセンチネルリンパ節に到達する。センチネルリンパ節では、癌原発巣の癌細胞に起因して微小環境変化を起して、細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１を発現している。薬物輸送剤中のフルオロセイン誘導体で蛍光標識された抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体は、抗原抗体反応により、ＩＣＡＭ−１に結合する。そこへレーザー光を照射すると、フルオロセイン骨格に基づく光励起により蛍光を発するので、それを蛍光プローブで検出する。蛍光が検出され、必要に応じてそのデータを画像で映し出されると、薬物輸送剤中のフルオロセイン誘導体で蛍光標識された抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体が、リンパ系の内皮細胞に発現したＩＣＡＭ−１へ結合したことを意味するから、そこに癌細胞が転移しているか少なくとも微小環境変化して癌細胞が転移し易くなっていることが、分かる。
【００３６】
蛍光による診断の例を示したが、放射性同位元素含有標識剤で標識された抗ＩＣＡＭ−１抗体からなる薬物輸送有効成分を含む薬物輸送剤の場合、ガイガーカウンターを用いて放射性同位元素を検出する。その他、電磁波による造影剤による診断の場合も、それに応じた検出器で検知する。例えば超音波画像診断の場合にエコー検出プローブを用いて反射・共鳴超音波を検出したり、ＭＲＩ診断の場合に核磁気共鳴による電磁波の吸収や放出を検出したりする。そのような転移やその恐れのある部位が検出されたら、癌原発巣やその周辺組織と共に癌細胞転移しているリンパ節ごと郭清してもよく、強超音波やＸ線・γ線・電子線・重粒子線で例示される放射線のような電磁波の照射による治療を行ってもよい。
【００３７】
抗癌剤で化学修飾された抗ＩＣＡＭ−１抗体からなる薬物輸送有効成分を含む薬物輸送剤の場合、同様に投与しただけで、癌細胞の転移乃至は微小環境変化したリンパ節へ、自ずから選択的に到達し、癌細胞を死滅に至らしめる。癌疾患として、乳癌の例を挙げて説明したが、その他の臓器の癌疾患に対しても使用でき、例えば、複数のセンチネルリンパ節を含む着色領域（Basin）としてしか確認し難いと言われていた消化器系臓器、より具体的には食道から大腸、特に胃・小腸・直腸・大腸での腫瘍組織近傍のセンチネルリンパ節を、個々に、確実に特定して、診療することができる。
【００３８】
この薬物輸送剤は、癌細胞に由来するＡＴＰやＣＣＬ２を始めとする様々な原因物質に起因して転移前のセンチネルリンパ節中で発現した特定の分子例えばＩＣＡＭ−１のように、液状因子が影響を及ぼして微小環境変化したり微小癌転移したりしたセンチネルリンパ節を、特に腫瘍組織が癌原発巣にまで成長する以前の比較的前期の段階で、特定して、診療できる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の薬物輸送剤を、動物へｉｎ ｖｉｖｏで投与した実施例について、詳細に説明する。【００４０】
先ず、薬物輸送剤の投与に先立ち、リンパ系で癌細胞により発現される細胞間接着分子を同定した。【００４１】
（調製例１．細胞培養及びヒトリンパ管内皮細胞由来内皮細胞株の調製）
ヒトリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）の単離及び培養は、乳癌患者のセンチネルリンパ節に最も近接している輸入リンパ管を用い、Kawai Yらの手法（Lymphatic Research and Biology(リンパティック リサーチ アンド バイオロジー)、２００７年、第５巻、ｐ.１１５−１２６、及び２００８年、第６巻、ｐ.１５〜２７）に準じて行った。その実験プロトコルは、国立大学法人信州大学医学部内の医倫理委員会で承認されたものである。その乳癌患者に研究の目的やリスクに関し全て告知したうえで、同意書を提出してもらってある。【００４２】
（1.1  ヒトリンパ管内皮細胞由来内皮細胞株（ヒトＬＥＣ）の調製）
国立大学法人信州大学医学部乳腺外科内での乳癌患者の乳腺内分泌外科手術によるセンチネルリンパ節生検症例のうち、その手術前に同意が得られた患者から摘出したセンチネルリンパ節輸入リンパ管の内腔に、無菌ポリエチレン管を挿入し、予め３７℃に温めたトリプシン・エチレンジアミン四酢酸溶液５００Ｕ／ｍｌで１０分間灌流した。その内腔を酵素分解した後、その内腔に存在している内皮細胞を含んだ液を得た。それに１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する内皮増殖培地（ＥＧＭ）−２（米国Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）入りの遠心分離管に、静かに流し込んだ。それを、４℃で５分間、２,０００ｒ.ｐ.ｍ.で遠心分離した。上澄みを取り除き、得られた沈殿している細胞成分をＥＧＭ−２培地に再懸濁させ、それを、Ｉ型コラーゲン（新田ゼラチン株式会社製）でコーティングした直径３５ｍｍの培養皿（米国Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に付した。このようにして得られたヒト乳癌センチネルリンパ節輸入リンパ管由来リンパ管内皮細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＥＧＭ−２に保存し、第５〜７継代培養して使用した。リンパ管内皮細胞を、酸素５％、二酸化炭素５％及び窒素ガス９０％の大気条件下、３７℃で培養した。【００４３】
別な方法として、以下のようにしてヒト集合リンパ管由来内皮細胞株を分離し培養した。同じく同意が得られた乳癌患者から、手術時に摘出された周囲組織が付着したままヒト腋窩リンパ節輸入リンパ管であるヒト集合リンパ管の提供を受けた。ヒト集合リンパ管由来の細胞以外の混入を避けるため、実体顕微鏡下で、このリンパ管外周の脂肪、毛細血管などの組織を剥離した。灌流、洗浄、細胞採取を行うために細いポリエチレンチューブを、ヒト集合リンパ管内腔に挿入して留置した。この内腔を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）で灌流して洗浄した。この内腔に、０．０５％のコラゲナーゼII液（米国Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製；品番Ｓ２Ｂ５４５６）を充填した。それを３７℃の培養器内で内皮細胞の剥離が認められる時間、主に１０分間静置した。培地および培地添加物として、血管内皮細胞用増殖培地ブレットキットＥＧＭ−２（三光純薬株式会社；品番ＣＣ−３１６２）５００ｍｌ、および牛胎児血清（Fetal Bovine Serum：ＦＢＳ）（Ｊａｐａｎ Ｂｉｏｓｅｒｕｍ社製；品番Ｓ１５６０）４０ｍｌを用いた。ヒト集合リンパ管内腔を１０％ＦＢＳ添加ＥＧＭ−２の１ｍｌで灌流し、この内腔に剥離した内皮細胞を回収した。この内皮細胞の回収液をチューブに入れ、２０００ｒ.ｐ.ｍ.で５分間遠心し、内皮細胞成分を採取した。これによりヒト集合リンパ管由来内皮細胞株が分離できた。細胞の接着を向上させるためＩ型コラーゲン（新田ゼラチン株式会社製；品番Ｉ−Ｐ）を塗布した３５ｍｍ細胞培養用プレートに、採取したうちの１×１０５個の内皮細胞を播種し、培地として１．５ｍｌの１０％ＦＢＳ添加ＥＧＭ−２を入れて、３７℃で、５％酸素、５％二酸化炭素および９０％窒素の低酸素環境下で培養した。ダブリングタイムは、約４８時間であった。コンフルエントになったらそれを、ＰＢＳ溶液で洗浄し、０．２５％トリプシン液により３７℃で３分間処理した後、細胞を回収して２０００ｒ.ｐ.ｍ.で５分間遠心し、Ｉ型コラーゲンを塗布した３〜４枚の新しい３５ｍｍ細胞培養用プレートに播種した。またコンフルエントになったら適宜継代培養を施行した。これらの細胞は、患者由来の細胞のためか初代継続代時すでにマイコプラズマ感染を認める症例もあるため、２継代目にまずマイコプラズマ感染測定キットＭｙｃｏｐｌａｓｍａＰｌｕｓ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製；商品名）を用いて感染の有無を計測した。計測の結果、マイコプラズマ陽性である場合には、培養細胞用マイコプラズマ除去剤であるＭｙｎｏｘ（独国Ｍｉｎｅｒｖａ ｂｉｏｌａｂｓ社製；商品名）１５倍希釈液およびＭＣ−２１０（大日本製薬株式会社製；商品名）０．５μｇ／ｍｌの単独もしくは併用方法にてマイコプラズマ除去を行った。マイコプラズマが陰転した後も、適時（２継代毎程度）マイコプラズマ感染状況を上記感染測定キットにて確認し、マイコプラズマ陰性の細胞株を樹立した。【００４４】
（1.2  ヒトリンパ管由来内皮細胞株の増殖能評価）
酸素５％という低酸素環境下と酸素２０％という通常の酸素環境下とでそれぞれ９６時間かけてこのヒトリンパ管由来内皮細胞株を培養した場合に、顕微鏡でそれぞれの１視野の細胞数を数えることにより、酸素濃度毎の内皮細胞株の増殖能の相違を検討した。その結果、通常の酸素環境下での内皮細胞株の培養よりも低酸素環境下での内皮細胞株の培養の方が、一層優れた増殖能を示していた。【００４５】
（1.3  ヒトリンパ管由来内皮細胞株の保存）
ヒトリンパ管由来内皮細胞株の保存条件は、０．２５％トリプシン液で内皮細胞株を回収し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および９０％ＦＢＳからなる凍結保存液を用いて細胞懸濁液を調製した後、凍結チューブに入れ、バイセルを用いて段階的に冷却し、最終的に液体窒素内で保存するというものである。その融解条件および融解時培養条件は、凍結チューブを３７℃の恒温槽で融解させ、２０００ｒ.ｐ.ｍ.で５分間遠心して内皮細胞株を回収し、細胞培養液として１０％ＦＢＳ添加ＥＧＭ−２を用いて細胞懸濁液を調製し、前記の内皮細胞株の培養の条件と同様にして培養するというものである。【００４６】
（1.4  ヒトリンパ管由来内皮細胞株の生物学的特性）
(1.4  Ａ．  ＣＤ３１（platelet endothelial cell adhesion molecule：ＰＥＣＡＭ）による免疫染色観察)
培養系に移行したヒト集合リンパ管由来内皮細胞株をスライドガラス上に播種した。培養を継続し、コンフルエントになったところで、これを１０％ホルマリンにて固定した。０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＰＢＳ溶液にてブロッキングした後、一次抗体として内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−８３０６）を１：１００に０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で希釈して加え、４℃で一晩静置した。その一次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後に、この一次抗体に見合う二次抗体として色素で蛍光標識してあるヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣ（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−２０１２）を０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で１：１００に希釈して加え、室温で１時間静置した。その二次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後、Ｍｏｂｉ ＧＬＯＷ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（独国ＭｏＢｉＴｅｃ社；品番ＭＧＭ０１）に封入して蛍光顕微鏡で観察したところ、この内皮細胞株は、緑の蛍光色を示し、ＣＤ３１に対して陽性であることが確認された。【００４７】
(1.4  Ｂ．  ＶＥＧＦ−Ｒ３（vascular endothelial growth factor receptor 3）による免疫染色観察)
培養系に移行したヒト集合リンパ管由来内皮細胞株をスライドガラス上に播種した。培養を継続し、コンフルエントになったところで、これを１０％ホルマリンにて固定した。０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＰＢＳ溶液にてブロッキングした後、一次抗体としてリンパ管内皮細胞の特異的なマーカーであるＶＥＧＦ−Ｒ３（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−６３７）を１：１００に０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で希釈して加え、４℃で一晩静置した。その一次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後に、この一次抗体に見合う二次抗体として蛍光標識してあるヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣ（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−２０１２）を０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で１：１００に希釈して加え、室温で１時間静置した。その二次抗体をＰＢＳ溶液で洗浄した後、Ｍｏｂｉ ＧＬＯＷ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（独国ＭｏＢｉＴｅｃ社；品番ＭＧＭ０１）に封入し、蛍光顕微鏡で観察したところ、この内皮細胞株は、緑の蛍光色を示し、ＶＥＧＦ−Ｒ３に対して陽性であることが確認された。【００４８】
(1.4  Ｃ．  ＬＹＶＥ−１（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1）による免疫染色観察)
一次抗体としてリンパ管内皮細胞の特異的な別のマーカーであるＬＹＶＥ−１（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−１９３１６）を用い、二次抗体として蛍光標識であるロバ抗ヤギ免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣ（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製；品番ｓｃ−２０２４）を用いたこと以外は、ＶＥＧＦ−Ｒ３による免疫染色と同様に観察したところ、この内皮細胞株は、緑の蛍光色を示し、ＬＹＶＥ−１に対して陽性であることが確認された。これらのＣＤ３１、ＶＥＧＦ−Ｒ３およびＬＹＶＥ−１の免疫染色の観察の結果から明らかなように、リンパ管由来内皮細胞株は培養系に移行させても、ＣＤ３１、ＶＥＧＦ−Ｒ３およびＬＹＶＥ−１の発現が認められ、内皮細胞の生物学的特性が維持されていた。したがって、リンパ管由来内皮細胞株の分離・培養が樹立できたと確認された。【００４９】
(1.4  Ｄ．  細胞骨格蛋白Ｆ−アクチンによる染色観察)
培養系に移行したヒト集合リンパ管由来内皮細胞株をスライドガラス上に播種した。培養を継続し、コンフルエントになったところで、刺激因子として腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（米国ＳＩＧＭＡ社製；品番Ｔ−０１５７）の１０ｎｇ／ｍｌ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）（米国ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製；品番２００−０１Ｂ）の１ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのそれぞれを３％ＦＢＳ添加ＥＢＭ−２（三光純薬株式会社；品番ＣＣ−３１５６）にて溶解して細胞上に付加し、２時間３７℃で培養した。これを、３．７％ホルマリンにて固定した。これをＰＢＳ溶液にて洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（米国ＳＩＧＭＡ社製；品番Ｘ−１００）添加ＰＢＳ溶液内で５分間静置した。ＰＢＳ溶液にて洗浄し、ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ抗体（米国ＳＩＧＭＡ社製；品番Ｐ−５２８２）を０．１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ溶液で１：５００に希釈して加え、室温で２時間静置した。ＰＢＳ溶液にて洗浄した後、Ｍｏｂｉ ＧＬＯＷ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍに封入した。また、刺激因子を用いないこと以外は同様にしてネガティブコントロールを調製した。これらを蛍光顕微鏡で観察し比較したところ、刺激因子がないネガティブコントロールは不明瞭な緑の蛍光色を示しＦ−アクチンの発現が少なかったのに対し、ＴＮＦ−αやＩＬ−１βで刺激されたものは明瞭な緑の蛍光色を示しＦ−アクチンの発現の増加が確認された。【００５０】
（1.5．  その他のヒトリンパ管由来内皮細胞株の形態的特徴・培養的性質・生理学的性質）
(1.5.1.  形態的性質)
(1)形、大きさ
培養内皮細胞の特徴である多角形を示し、単層で敷石状配列を呈する。大きさは直径50μm前後である。
(2)多形性
内皮細胞はほぼ同様の形態を示しており、多形性は認められない。
（1.5.2.  培養的性質）
(1)培地
血管内皮細胞用増殖培養液であるEGM-2に、最終濃度が10%になるよう牛胎児血清(Fetal Bovine Serum：FBS)を添加したものを用いている。
(2)培養条件
37℃の細胞培養器を用い、5%酸素、5%二酸化炭素、90%窒素環境下で培養を行う。
(3)生理学的性質
(3.1)リンパ管内皮細胞マーカーの発現
本細胞は、内皮細胞マーカーであるCD31、リンパ管内皮細胞マーカーであるProx-1・LYVE-1・podoplaninの発現が確認できた。
(3.2)生物学的特長
細胞の倍加時間は約48時間であり、リンパ管新生因子であるbasic-FGF、VEGF、VEGF-Cで増殖能の亢進が確認できた。【００５１】
なお、このヒトリンパ管由来内皮細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１）に平成１８年１月１８日に受領され国内受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７６８が付されたものであり、同センターに平成２１年１月１６日に国際寄託へ移管申請され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０８９が付されたものである。【００５２】
（試験１：培養リンパ管内皮細胞のＩＣＡＭ−１の発現）
ヒトの乳癌細胞株である高転移株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１として、米国Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社から購入したものを用いた。この癌細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／養分混合Ｆ１２ハム培地で保存した。癌細胞を、酸素２１％、炭酸ガス５％、及び窒素ガス７４％の標準酸素条件下、３７℃で培養した。一方、リンパ管内皮細胞を、酸素５％、炭酸ガス５％、及び窒素ガス９０％の大気条件下、３７℃で培養した。【００５３】
間接免疫組織化学的方法を用いて、ＩＣＡＭ−１のようなヒトリンパ管内皮細胞の接着分子に対して、癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の培養上清の作用について検討した。１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２に癌細胞を播種した。翌日その培地を、３％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２に置換し、一晩培養した後、回収した。回収した溶液を、４℃で５分間、２,０００ｒ.ｐ.ｍ.で遠心分離した。ヒトリンパ管内皮細胞での接着分子発現に対するこの上清の作用について解析するために、回収した溶液１ｍＬを、ヒトリンパ管内皮細胞の３％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２飢餓培地に加えた後、４８時間培養した。なお、この上清のＡＴＰ濃度はルシフェリン・ルシフェラーゼ反応測定により１．０×１０−７Ｍであった。別途、上清に代え、ＡＴＰの１０−７Ｍ水溶液と、ＣＣＬ２の１０ｎｇ／ｍＬとで、夫々刺激したこと、上清と同様に処理したものを、作製した。刺激しなかったものをコントロールとして作製した。【００５４】
夫々、Ｉ型コラーゲンコーティングスライドガラス上に播種した培養リンパ管内皮細胞について、間接免疫組織化学的観察を行い、その細胞を、３．３％ホルマリン含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により２０分間、常温で固定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４（希釈１０μｇ／ｍＬ、米国Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）の一次ポリクローナルヒト抗血清と共に、４℃で一晩、培養した。【００５５】
一次染色前に、癌細胞を、０．１％のトリトンＸに浸透させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を、１：１００に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗マウス免疫グロブリンＧ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、常温で１時間培養した。培養細胞の細胞核を対比染色剤で染色し、４',６−ジアミジン−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（米国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）添加のＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ非退色試薬を加え、蛍光顕微鏡（スイス国Ｌｅｉｃａ社製）で観察し、撮影した。【００５６】
その結果を図１に示す。図１から明らかな通り、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の培養上清による刺激、ＡＴＰによる刺激、及びＣＣＬ２による刺激をした培養リンパ管内皮細胞で、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に特有な緑色蛍光が観察された。このことは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の培養上清、ＡＴＰ及びＣＣＬ２で刺激した細胞で、ＩＣＡＭ−１の発現が増強しており、抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体がこれらの細胞に多く結合したためであると考えられる。一方、コントロールである刺激をしていない細胞では、緑色蛍光が観察されなかった。従って、癌細胞から分泌される因子のうちの一つであるＡＴＰや、ＣＣＬ２によって、培養リンパ管内皮細胞の特性即ち微小環境を変化させ、ＩＣＡＭ−１の発現が増強することが明らかとなった。【００５７】
（試験２：培養リンパ管内皮細胞と乳癌細胞との接着試験）
Ｉ型コラーゲンでコーティングした直径３５ｍｍの培養皿上で、ヒトリンパ管内皮細胞を単層に形成してコンフルエントになるまで、３７℃で、酸素５％、炭酸ガス５％、及び窒素ガス９０％の条件下、培養した。それらリンパ管内皮細胞を、３％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２血清飢餓培地で保存した。培養皿を、
(i)  血清飢餓培地のみ（ネガティブコントロール）
(ii) １０−７ＭのＡＴＰ添加（ポジティブコントロール）
(iii)１０−７ＭのＡＴＰ  ＋  １０−６Ｍのスラミン
(iv) １０−７ＭのＡＴＰ  ＋  抗ＩＣＡＭ−１抗体
(v)  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の培養上清（ポジティブコントロール）
(vi) ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の培養上清  ＋  １０−６Ｍのスラミン
(vii)ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の培養上清  ＋  抗ＩＣＡＭ−１抗体
で、夫々４８時間刺激した。なお、１０−６Ｍのスラミンは、ＡＴＰ受容体の阻害薬として作用するもので、１０−７ＭのＡＴＰ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清で４８時間刺激する際に、同時に添加した。また、培養皿を、１０−７ＭのＡＴＰ又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清で４８時間刺激した後、抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体(米国Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製)で３０分間処理した。【００５８】
ＰＫＨ２６蛍光染料（米国ＳＩＧＭＡ社製）で染色した乳癌細胞を、培養皿毎に５×１０４個の細胞ずつ付加し、３０分間３７℃で培養した。接着しなかった細胞を、吸引して取り除き、培養皿をＤＭＥＭ／Ｆ１２で３回洗浄した。細胞付着は、顕微鏡（スイス国Ｌｅｉｃａ社製）を用いて１００倍に拡大して細胞数をカウントすることにより定量した。【００５９】
このようにしてリンパ管内皮細胞をＡＴＰや高転移乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清で刺激後ＰＫＨ２６で蛍光染色した乳癌細胞を接着させたところ、何れも接着能が有意に増強し、ＡＴＰ受容体を阻害するスラミンによる前処理で、増強した接着能が低下した。またリンパ管内皮細胞を、抗ＩＣＡＭ−１抗体で前処理を行っても、接着能が低下した。このことから、リンパ管内皮細胞は、癌細胞から分泌される因子の一つであるＡＴＰによりＩＣＡＭ−１の発現が亢進し、そのＩＣＡＭ−１を用いて癌細胞が接着することが確認でき、癌細胞からリンパ流を受けるセンチネルリンパ節は、癌細胞が接着し易くなる環境を作り出すことが示唆された。【００６０】
（実施例１）
Monoclonal Anti-rat ICAM-1-Fluorescein（Ｒ＆Ｄシステムズ社、製品番号FAB5831F）を、ＦＩＴＣ標識抗ラットＩＣＡＭ−１抗体を薬物輸送有効成分として含む薬物輸送剤とし、センチネルリンパ節の描出に用いた例を以下に示す。【００６１】
ラットをエーテルで麻酔し、リンパ節のリンパ管内皮細胞にＩＣＡＭ−１を発現させるため、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に濃度１０−６ＭのＡＴＰのＰＢＳ溶液０．１ｍｌを、尾部の付け根部分に皮下投与した。翌日、このラットを再びエーテルで麻酔し、ラットを開腹し、腰部リンパ節を着色するため、色素としてエバンスブルーを０．１ｍｇ、尾部付け根部分へ皮下投与し、５分間、静置した。その後、目視で観察し、自然光下で撮影したところ、図２の「ＡＴＰの１０−６Ｍ投与あり」の明視野画像に示す通り、腰部リンパ節（中央）が色素で着色されたのが確認された。次いで、ＦＩＴＣ標識抗ラットＩＣＡＭ−１抗体からなる薬物輸送剤の０．１ｍｌをラットの尾部の付け根部分に皮下投与し、５分後、蛍光検出器であるライカ蛍光顕微鏡を用いて４７０〜４９０ｎｍの波長光を照射して緑色の蛍光を観察し、撮影したところ、図２の「ＡＴＰの１０−６Ｍ投与あり」の蛍光画像に示す通り、腰部リンパ節（中央）が蛍光しているのが確認された。【００６２】
なお、対照として、別のラットでＡＴＰを投与しないこと以外は前記と同様の方法で、腰部リンパ節について、自然光下での明視野画像と、蛍光発光下での蛍光画像とを撮影した結果を、図２の「ＡＴＰの１０−６Ｍ投与なし」に示す。【００６３】
同図のＡＴＰの投与の有無による比較の通り、ＡＴＰによってラットのリンパ節に誘発されたＩＣＡＭ−１を、この薬物輸送剤で選択的に描出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の薬物輸送剤は、外科手術による癌治療の際、その外科手術前や最中に、郭清すべきセンチネルリンパ節を特定し、病理学的検査を行うのに用いられる。また、その外科手術後に癌が再発してリンパ行性転移が起こっていないかを病理学的検査を行うのに用いられる。さらに、治療の他、人間ドックのような検診、予防医学にも利用できる。【００６５】
また、本発明の薬物輸送剤は、癌細胞の転移し易い微小環境変化を起したり既に癌細胞転移してしまったりしたリンパ節に、選択的に診断や治療のための薬物を到達させることができるので、癌疾患の確実で正確な診療に有用である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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