(57)【要約】  本発明は、真核生物が有するイントロンを含む遺伝子から、該遺伝子に含まれるイントロンを除去してエクソン配列のみを連結し、該連結された配列を含む発現ベクターを作製する方法に関する。詳しくは、イントロンを含むカビの巨大遺伝子から、エクソン配列を一または複数のフラグメントとしてＰＣＲにより増幅し、ギャップリペアークローニング法を利用して該フラグメントおよび制限酵素処理したベクターを連結し、連結されたエクソン配列を含む発現ベクターを作製する方法、巨大遺伝子のｃＤＮＡフラグメントを合成して連結し、全長ｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターを作製する方法、該方法により作製された発現ベクターが導入された形質転換体、該形質転換体により産生されるタンパク質、ならびに該発現ベクターを用いて該タンパク質により産生される化合物を得る方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物が有する、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列の、エクソン配列を連結し、該連結された配列を含む発現ベクターを作製する方法であって、
（ａ）真核生物から抽出したゲノムから、ＰＣＲにより、エクソン配列を複数のフラグメントとして増幅する工程、
ここで、ＰＣＲに用いるフォワードプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、リバースプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのアンチセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、これらのプライマーを用いることにより、増幅するフラグメントの末端に、該フラグメントに連結させるフラグメントの末端部分と相同な配列またはベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を付加する、および
（ｂ）工程（ａ）により得られたフラグメントと、制限酵素処理したベクターとを出芽酵母または分裂酵母に同時に形質転換することにより、相同組換えによってフラグメントとフラグメント、およびフラグメントとベクターとが連結された発現ベクターを得る工程
を含む該方法。
【請求項２】
真核生物が有する、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列の、全長ｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターを作製する方法であって、
（ａ）真核生物から抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡフラグメントを合成し、該ｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅する工程、
ここで、ＰＣＲに用いるフォワードプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、リバースプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのアンチセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、これらのプライマーを用いることにより、増幅するフラグメントの末端に、該フラグメントに連結させるフラグメントの末端部分と相同な配列またはベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を付加する、および
（ｂ）工程（ａ）により得られたｃＤＮＡフラグメントと、制限酵素処理したベクターとを出芽酵母または分裂酵母に同時に形質転換することにより、相同組換えによってフラグメントとフラグメント、およびフラグメントとベクターとが連結された発現ベクターを得る工程
を含む該方法。
【請求項３】
真核生物がカビである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
カビがペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ属）、ケトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属）、またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列が４〜２０ｋｂである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列が、ポリケチド合成酵素または非リボソーム依存性ペプチド合成酵素をコードするものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
連結された配列が、配列番号１５〜２１、２９および４７のいずれかに示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の方法により作製された発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体により産生されるタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜７に記載の方法により作製された発現ベクターを使用して、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列がコードするタンパク質により産生される化合物を得る方法。
【請求項１１】
発現ベクターを導入した形質転換体を培養し、培養液または形質転換体から化合物を採取する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核生物が有するイントロンを含む遺伝子から、該遺伝子に含まれるイントロンを除去してエクソン配列のみを連結し、該連結された配列を含む発現ベクターを作製する方法に関する。詳しくは、イントロンを含むカビの巨大遺伝子から、エクソン配列を複数のフラグメントとしてＰＣＲにより増幅し、ギャップリペアークローニング法を利用して該フラグメントおよび制限酵素処理したベクターを連結し、連結されたエクソン配列を含む発現ベクターを作製する方法、巨大遺伝子のｃＤＮＡフラグメントを合成して連結し、全長ｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターを作製する方法、該方法により作製された発現ベクターが導入された形質転換体、該形質転換体により産生されるタンパク質、ならびに該発現ベクターを用いて該タンパク質により産生される化合物を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カビのゲノム配列の解析結果から、カビゲノム上に、二次代謝産物の生合成遺伝子と推定される複数の遺伝子が存在することが明らかとなったが、これらの遺伝子がコードするタンパク質（二次代謝産物の生合成酵素）の生産は確認されていない。【０００３】
通常、ゲノム配列がコードしているタンパク質を得るためには、まずｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素によってｃＤＮＡを合成した後、該ｃＤＮＡを発現ベクターに導入する必要がある。一般に、遺伝子の読み枠が巨大な場合には完全長のｃＤＮＡを合成することができない可能性が高いため、ｃＤＮＡライブラリーでは網羅できない読み枠が存在することがあり、また、遺伝子を、取得した生物とは異なる宿主に導入して発現させること（異種発現）は困難である。【０００４】
二次代謝産物はこれまでに多くの医薬品リード化合物として用いられており、そのように用いられている二次代謝産物としては、例えばポリケチド系天然物およびペプチド系天然物が挙げられる。これらの天然物は、それぞれポリケチド合成酵素（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＰＫＳ）および非リボソーム依存性ペプチド合成酵素（ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＮＲＰＳ）によって生合成されることが知られている（非特許文献１−３）。【０００５】
カビゲノム配列から明らかとなった二次代謝産物の生合成遺伝子と推定される遺伝子についても、該遺伝子がコードするタンパク質によって合成される二次代謝産物の有用性が期待される。しかしながら、カビは真核生物であるため遺伝子中にはイントロンが含まれており、また、遺伝子が巨大であるので、上記のような従来の方法では完全長のｃＤＮＡを合成することは難しく、二次代謝産物の生合成遺伝子と推定される遺伝子がコードするタンパク質を合成することが出来なかった。【０００６】
以上より、カビの巨大生合成遺伝子からイントロンを除き、該遺伝子がコードしているタンパク質を発現させる方法が必要とされていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｅａｄｌａｙ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９９０
【非特許文献２】Ｋａｔｚ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１
【非特許文献３】Ｓａｍｓｏｎ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８５
【非特許文献４】Ｈｉｓａｏ  Ｍｏｒｉｙａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏｓ  ＯＮＥ  ２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、逆転写酵素によって全長ｃＤＮＡを合成することができないカビの巨大遺伝子からエクソン配列のみを取り出して連結し、該連結された配列を含む発現ベクターを作製すること、またはそのような巨大遺伝子のｃＤＮＡフラグメントを合成して連結し、全長ｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターを作製すること、および該発現ベクターを用いて該遺伝子がコードするタンパク質を発現させることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、発明者らは、カビの一種であるケトミウムグロボサム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ）ゲノムに存在する推定生合成遺伝子のうちのエクソン配列と予測される配列をＰＣＲによって増幅し、それらエクソン配列と制限酵素処理したベクターとを出芽酵母中での相同組換えにより連結させて発現ベクターを作製し、該発現ベクターを酵母を宿主とするシステムを用いて発現させた。すなわち、本発明者らは、遺伝子中のイントロン配列を除去するためにギャップリペアークローニング法を初めて利用して、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、真核生物が有する、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列の、エクソン配列を連結し、該連結された配列を含む発現ベクターを作製する方法であって、
（ａ）真核生物から抽出したゲノムから、ＰＣＲにより、エクソン配列を複数のフラグメントとして増幅する工程、
ここで、ＰＣＲに用いるフォワードプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、リバースプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのアンチセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、これらのプライマーを用いることにより、増幅するフラグメントの末端に、該フラグメントに連結させるフラグメントの末端部分と相同な配列またはベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を付加する、および
（ｂ）工程（ａ）により得られたフラグメントと制限酵素処理したベクターとを出芽酵母または分裂酵母に同時に形質転換することにより、相同組換えによってフラグメントとフラグメント、およびフラグメントとベクターとが連結された発現ベクターを得る工程を含む該方法を提供する。【００１１】
また、本発明は、真核生物が有する、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列の、全長ｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターを作製する方法であって、
（ａ）真核生物から抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡフラグメントを合成し、該ｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅する工程、
ここで、ＰＣＲに用いるフォワードプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、リバースプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのアンチセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、これらのプライマーを用いることにより、増幅するフラグメントの末端に、該フラグメントに連結させるフラグメントの末端部分と相同な配列またはベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を付加する、および
（ｂ）工程（ａ）により得られたｃＤＮＡフラグメントと、制限酵素処理したベクターとを出芽酵母または分裂酵母に同時に形質転換することにより、相同組換えによってフラグメントとフラグメント、およびフラグメントとベクターとが連結された発現ベクターを得る工程
を含む該方法を提供する。【００１２】
前記方法は、真核生物であるカビの遺伝子に適用することができ、カビはペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ属）、ケトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属）、またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）であってもよい。【００１３】
また、前記方法において、遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列が４〜２０ｋｂであってもよい。【００１４】
さらに、前記方法において、遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列が、ポリケチド合成酵素または非リボソーム依存性ペプチド合成酵素をコードするものであってもよい。【００１５】
前記方法において、連結された配列を、配列番号１５〜２１、２９および４７のいずれかに示される塩基配列を含むポリヌクレオチドとすることができる。【００１６】
また、本発明は、前記方法により作製された発現ベクターが導入されている、形質転換体も提供する。【００１７】
さらに、本発明は、前記形質転換体により産生されるタンパク質も提供する。【００１８】
また、本発明は、前記方法により作製された発現ベクターを使用して、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列がコードするタンパク質により産生される化合物を得る方法も提供する。【００１９】
前記方法は、発現ベクターを導入した形質転換体を培養し、培養液または形質転換体から化合物を採取する工程を含んでもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明を用いると、遺伝子配列からイントロンを除去してエクソンのみを連結させることができることから、本発明により、いわば、人為的にスプライシングを行うことができるといえる。また、本発明を用いると、従来の方法ではｃＤＮＡを合成できないために発現させることが出来なかった、巨大遺伝子がコードするタンパク質を発現させることが出来る。さらに、該発現ベクターを導入した宿主を培養することによって、発現させたタンパク質により産生される化合物も得ることができる。【００２１】
ゲノム配列の情報から遺伝子と推定されるが、その産物が単離および確認されていない配列に対して本発明に係る方法を適用すると、該推定遺伝子がコードする未知タンパク質を合成し、そのタンパク質の機能を特定することができる。【００２２】
また、カビ類の遺伝子について本発明を適用して発現ベクターを作製し、酵母を宿主とするシステムを用いて発現させると、異種発現であっても、カビのタンパク質を変性させることなく合成することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、推定ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿１０１２８）のエクソン配列を示す模式図、および各エクソンを増幅するためのプライマーを示す。
【図２】図２は、推定ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿１０１２８）のエクソン配列をＰＣＲにより増幅した結果を示す。
【図３】図３は、推定ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿１０１２８）のエクソン配列が、出芽酵母中で起こす相同組換えを示す模式図である。
【図４】図４は、推定ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿１０１２８）の発現ベクターの遺伝子発現を確認したウェスタンブロットである。
【図５】図５は、６−ＭＳＡ合成酵素（ＭＳＡＳ）の発現を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットである。
【図６Ａ】図６Ａは、標品６−ＭＳＡの２５４ｎｍの吸収波長を検出したクロマトグラム（ａ）および紫外吸収スペクトル（ｂ）である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、標品６−ＭＳＡの質量分析のクロマトグラム（ａ）および質量スペクトル（ｂ）である。
【図７】図７は、標品６−ＭＳＡのＨＰＬＣデータである。
【図８Ａ】図８Ａは、酵母抽出液サンプルの２５４ｎｍの吸収波長を検出したクロマトグラム（ａ）および紫外吸収スペクトル（ｂ）である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、酵母抽出液サンプルの質量分析のクロマトグラム（ａ）および質量スペクトル（ｂ）である。
【図９】図９は、酵母抽出液サンプルのＨＰＬＣデータである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、酵母抽出液サンプルからＨＰＬＣで分取した画分の、Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａに示したＨ−ＮＭＲスペクトルの一部を拡大したスペクトルである。
【図１１】図１１は、推定ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿００５４２）のエクソン配列を示す模式図、および各エクソンを増幅するためのプライマーを示す。
【図１２】図１２は、推定ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿００５４２）のエクソン配列をＰＣＲにより増幅した結果を示す。
【図１３】図１３は、推定ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿００５４２）のエクソン配列が、出芽酵母中で起こす相同組換えを示す模式図である。
【図１４】図１４は、推定ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿００５４２）の発現ベクターの遺伝子発現を確認したウェスタンブロットである。
【図１５】図１５は、推定ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿００５４２）の発現ベクターを導入した酵母から抽出された固体のＬＣ／ＭＳスペクトルである。
【図１６】図１６は、推定ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿００５４２）の発現ベクターを導入した酵母の培養液から単離された、化合物１（ＣＨＧＧ＿００５４２−１）および化合物２（ＣＨＧＧ＿００５４２−２）のＨ−ＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ギャップリペアークローニング法を利用して、真核生物が有するイントロンを含む遺伝子から、該遺伝子に含まれるイントロンを除去してエクソン配列のみを連結し、該連結された配列を含む発現ベクターを作製する方法に関する。
【００２５】
本発明においては、発現ベクターを作製する際には、発現させたい推定遺伝子配列だけでなく、該遺伝子配列がコードするタンパク質の推定基質を合成する酵素の遺伝子配列等、複数の遺伝子を一つのベクターに導入し、また形質転換する際には得られた発現ベクターの複数個を一つの細胞へ導入し、さらに、複数の遺伝子を染色体上へも導入した。このような手法により、従来のギャップリペアクローニング法（Ｈｉｓａｏ  Ｍｏｒｉｙａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏｓ  ＯＮＥ  ２０１０参照）に比べて効率的に遺伝子を発現させることが可能となり、目的のタンパク質および該タンパク質により合成される化合物の生産収量を増加させることに成功した。
【００２６】
従来、当該技術分野において公知の方法では、（ｉ）巨大なゲノム遺伝子をスプライシングさせて異種発現させることは困難であること、および（ｉｉ）遺伝子を発現させてタンパク質を得たとしても該タンパク質の機能を特定することはこれまでの技術では困難であることから、機能未知で巨大な遺伝子でかつ多くのイントロン配列を含む遺伝子を発現させ、翻訳されたタンパク質の機能を明らかにすることは、極めて困難であった。これに対し、本発明者らは、ギャップリペアクローニング法を利用する本発明の方法を用いて、機能未知で巨大なゲノム遺伝子であっても、該遺伝子のｃＤＮＡと推定される配列を獲得し、該配列がコードするタンパク質を発現させることに成功した。さらに、該タンパク質の推定基質を合成する酵素の遺伝子も発現させることにより、該タンパク質により合成される化合物を得ることに成功した。
【００２７】
また、本発明の一態様では、逆転写酵素によって全長ｃＤＮＡを合成することができない巨大遺伝子について、ｃＤＮＡのフラグメントを合成し、それらをギャップリペアクローニング法を用いて連結することにより、巨大遺伝子のイントロンが除去された読み枠を得ることができる。これまでの知見から、遺伝子中のある配列がエクソン配列であるかイントロン配列であるか推定されているが、それは推定されているに過ぎず、多数のイントロン配列を含む巨大遺伝子の場合にはその推定が誤っている可能性が高くなる。よって、エクソンの推定配列を連結するよりも、ｃＤＮＡのフラグメントを連結する方が、より確実に巨大遺伝子の読み枠を得ることが可能となる。
【００２８】
１．定義
「遺伝子」とは、タンパク質の情報をコードしているＤＮＡ領域をいう。「遺伝子と推定されているゲノム配列」とは、これまでの知見に基づいて、タンパク質の情報をコードしていると予測されているＤＮＡ領域をいう。かかる予測は、市販のソフトウェアを用いて容易に行うことができ、例えばＮＣＢＩのプログラムによって行われた予測結果が公開されている（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
【００２９】
「エクソン」または「エクソン配列」とは、遺伝子中に含まれている、ｍＲＮＡに転写されるＤＮＡ領域、および該ＤＮＡ領域から転写されたｍＲＮＡ領域をいう。「イントロン」または「イントロン配列」とは、遺伝子中に含まれている、タンパク質の情報をコードせず、一次転写産物として転写されてもＲＮＡスプライシングにより除去されてｍＲＮＡには含まれないＤＮＡ領域をいう。真核生物中では、遺伝子は、一次転写産物として転写された後、ＲＮＡスプライシングによりイントロンが除去され、エクソン同士が連結されてｍＲＮＡが形成される。真核生物の遺伝子では、エクソンがイントロンによって分断されていることが多い。また、これまでの知見から、遺伝子中のある配列がエクソン配列であるかイントロン配列であるかを推定することができ、例えばＮＣＢＩのプログラムによって行われた結果が公開されている（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。本明細書においては、「エクソン」および「イントロン」との用語は、それぞれ、エクソンと推定されている配列およびイントロンと推定されている配列を含む意味で用いる。
【００３０】
本発明において、「フラグメント」とは、遺伝子の一部の配列を含むＤＮＡ断片をいう。
【００３１】
本発明において、「５’末端部分」および「３’末端部分」とは、それぞれ、フラグメントの５’末端または３’末端から連続する複数塩基配列を含むポリヌクレオチドのことをいい、複数とは本発明においてプライマーが有効に機能し、かつ相同組換えが起こりうる長さであればよい。本発明において、「制限酵素処理末端部分」とは、制限酵素処理により生じるベクターの末端から連続する複数塩基配列を含むポリヌクレオチドのことをいい、複数とは本発明において相同組換えが起こりうる長さであればよい。
【００３２】
本明細書において、「フォワードプライマー」とは、ＰＣＲにより増幅したいＤＮＡ配列の、センス鎖の５’末端に相補的な配列を有するプライマーをいい、「リバースプライマー」とは、ＰＣＲにより増幅したいＤＮＡ配列の、アンチセンス鎖の５’末端に相補的な配列を有するプライマーをいう。
【００３３】
本発明において、「相補的な配列」とは、ストリンジェントな条件下で、鋳型配列にハイブリダイズできる配列をいい、完全に相補的であることは要しない。具体的には、プライマー配列の８０％以上が相補的であることが好ましく、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは１００％である。
【００３４】
本発明において、「相同な配列」とは、連結させるフラグメント間で相同組換えが起こりうる程度の相同性を有する配列をいう。相同性は十分に高い方が好ましく、好ましくは９９％以上、より好ましくは９９．９％以上が相同であり、さらに好ましくは両配列は同一である。
【００３５】
本発明において「カビ」とは、真菌に分類される微生物をいい、糸状菌のことをいう。限定するものではないが、本発明における「カビ」としては、例えばペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ属）、ケトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属）、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）が挙げられる。
【００３６】
「ポリケチド合成酵素（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＰＫＳ）」とは、ポリケチド化合物の生合成に関与する酵素であり、「ポリケチド化合物」とは、放線菌、糸状菌、植物などから産生される二次代謝産物の総称である。ここで、「二次代謝産物」とは、すべての生物に含まれることはなく、生物の共通の生命現象に直接関与しない物質を生合成する代謝（すなわち二次代謝）によって生じる天然物をいう。限定するものではないが、ポリケチド化合物としては、例えば、テトラサイクリンやエリスロマイシン等の抗生物質、ダウノマイシン等の抗ガン剤が挙げられる。「非リボソーム依存性ペプチド合成酵素（ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、ＮＲＰＳ）」とは、通常の、ｍＲＮＡを鋳型としてペプチドを合成するペプチド翻訳ではなく、規則的に並んだ酵素間で基質を受け渡してペプチドを重合してタンパク質を合成する反応に関与する酵素である。
【００３７】
２．発現ベクターの作製方法
本発明は、イントロンを含む巨大遺伝子に含まれるエクソン配列を、複数のフラグメントとしてＰＣＲにより増幅し、ギャップリペアークローニング法を利用して該フラグメントおよび制限酵素処理したベクターが連結されて得られる発現ベクターを作製する方法を提供する。本発明を用いると、遺伝子配列からイントロンを除去してエクソンのみを連結させることができることから、本発明により、いわば、人為的にスプライシングを行うことができる。
【００３８】
ギャップリペアークローニング法とは、出芽酵母が有する組換え修復機構を利用して出芽酵母内または分裂酵母内でプラスミドのコンストラクトを構築する方法であり、ＤＮＡ断片が相同領域を有していれば相同組換えが起こってＤＮＡ断片を連結することができる方法である（例えば、Ｈｉｓａｏ  Ｍｏｒｉｙａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏｓ  ＯＮＥ  ２０１０参照）。よって、ギャップリペアー法を用いると、相同で特異的な配列を有するＤＮＡ断片を調製すれば、精度よく該ＤＮＡ断片を連結することができる。
【００３９】
（１−１）ＰＣＲによるエクソン配列の増幅工程
（ａ）ゲノムの抽出
本発明の方法においては、まず、目的とする遺伝子を含む真核生物からゲノムを抽出する。ゲノムの抽出は、当業者に周知の方法を利用して行うことができる。また、市販のキットを利用することもできる。
【００４０】
（ｂ）プライマーの設計
本発明の方法においては、ＰＣＲにより、エクソン配列を複数のフラグメントとして増幅させる。具体的には、イントロンによってエクソンが分断されている場合に、それぞれのエクソンをフラグメントとして増幅させる。また、一つのエクソンがＰＣＲによって増幅することが難しいほどに大きい場合には、一つのエクソンを、ＰＣＲにより増幅できる長さの複数のフラグメントとして増幅させる。
【００４１】
ギャップリペアークローニング法では、相同領域を有するフラグメント間で相同組換えが起こり、二つのフラグメントが連結されるので（図３参照）、本発明においては、フラグメントは、連結部位に、連結するフラグメントの末端部分または連結するベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を有さなければならない。よって、本発明の方法において使用するプライマーは、ＰＣＲによりフラグメントを増幅するとともに、連結するフラグメントの末端部分または連結するベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を、該フラグメントの末端部分に付加するように設計する。すなわち、本発明において使用することができるプライマーは、鋳型鎖に結合してプライマーとしての機能を果たす配列と、連結させる配列と相同な配列を末端に付加するための配列とから構成される。
【００４２】
プライマーの設計について、以下に、図１に則して、４つのエクソン（５’末端側から順にエクソン１〜４とする）をそれぞれ増幅し、連結して制限酵素処理したベクターに組み込む場合を例に、具体的に説明する。
【００４３】
エクソン１を増幅する場合、センス鎖へのプライマー（エクソン１フォワードプライマー）は、５’末端から３’末端の方向に順番に、ベクターの制限酵素処理末端部分のセンス鎖の３’末端部分に相補的な配列（図１中では大文字太字で示す）と、エクソン１のセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列（図１中では大文字で示す）とからなるものを設計する。アンチセンス鎖へのプライマー（エクソン１リバースプライマー）は、５’末端側から順に、エクソン２のアンチセンス鎖の３’末端部分に相補的な配列（図１中では小文字斜体で示す）と、エクソン１のアンチセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列（図１中では大文字下線付きで示す）とからなるものを設計する。これらのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと、エクソン１の５’末端にベクターの制限酵素処理末端部分の３’末端部分の配列と相同な配列が付加され、３’末端にエクソン２の５’末端部分と相同な配列が付加された配列が、増幅されたフラグメントとして得られる。
【００４４】
エクソン２を増幅する場合、センス鎖へのプライマー（エクソン２フォワードプライマー）は、５’末端から３’末端の方向に順番に、エクソン１のセンス鎖の３’末端部分に相補的な配列（図１中では大文字下線付きで示す）と、エクソン２のセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列と（図１中では小文字斜体で示す）からなるものを設計する。アンチセンス鎖へのプライマー（エクソン２リバースプライマー）は、５’末端側から順に、エクソン３のアンチセンス鎖の３’末端部分に相補的な配列（図１中では小文字で示す）と、エクソン２のアンチセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列（図１中では大文字斜体下線付きで示す）とからなるものを設計する。これらのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと、エクソン２の５’末端にエクソン１の３’末端部分と相同な配列が付加され、３’末端にエクソン３の５’末端部分と相同な配列が付加された配列が、増幅されたフラグメントとして得られる。
【００４５】
エクソン３を増幅する場合、センス鎖へのプライマー（エクソン３フォワードプライマー）は、５’末端から３’末端の方向に順番に、エクソン２のセンス鎖の３’末端部分に相補的な配列（図１中では大文字斜体下線付きで示す）と、エクソン３のセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列（図１中では小文字で示す）とからなるものを設計する。アンチセンス鎖へのプライマー（エクソン３リバースプライマー）は、５’末端側から順に、エクソン４のアンチセンス鎖の３’末端部分に相補的な配列（図１中では大文字破線付きで示す）と、エクソン３のアンチセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列（図１中では大文字二重線付きで示す）とからなるものを設計する。これらのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと、エクソン３の５’末端にエクソン２の３’末端部分と相同な配列が付加され、３’末端にエクソン４の５’末端部分と相同な配列が付加された配列が、増幅されたフラグメントとして得られる。
【００４６】
エクソン４を増幅する場合、センス鎖へのプライマー（エクソン４フォワードプライマー）は、５’末端から３’末端の方向に順番に、エクソン３のセンス鎖の３’末端部分に相補的な配列（図１中では大文字二重線付きで示す）と、エクソン４のセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列（図１中では大文字破線付きで示す）とからなるものを設計する。アンチセンス鎖へのプライマー（エクソン４リバースプライマー）は、５’末端側から順に、ベクターの制限酵素処理末端部分のアンチセンス鎖の３’末端部分に相補的な配列（図１中では大文字太字下線付きで示す）と、エクソン４のアンチセンス鎖の５’末端部分に相補的な配列（図１中では小文字太字で示す）とからなるものを設計する。これらのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと、エクソン４の５’末端にエクソン３の３’末端部分と相同な配列が付加され、３’末端にベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列が付加された配列が、増幅されたフラグメントとして得られる。
【００４７】
エクソン１リバースプライマーとエクソン２フォワードプライマー、エクソン２リバースプライマーとエクソン３フォワードプライマー、エクソン３リバースプライマーとエクソン４フォワードプライマーは、それぞれ相補的な配列からなるものである（図１中で相補的な配列を同じ字体で示す）。
【００４８】
プライマー配列のうち、鋳型鎖に結合してプライマーとしての機能を果たす配列部分の長さ、すなわち、本発明においてはフォワードプライマーおよびリバースプライマーの３’末端側の配列部分の長さは、ＰＣＲにおいてプライマーが有効に機能する長さであればよい。ＰＣＲにおいて有効に機能しうるプライマーの長さは当業者であれば適宜設定することができるものであり、限定するものではないが、例えば５〜５０ｂｐであり、好ましくは１０〜４０ｂｐであり、より好ましくは１５〜３０ｂｐである。また、プライマー全体の長さはギャップリペアークローニング法において相同組換えが起こりうる長さであればよく、そのような相同配列の長さは、約２５ｂｐ、好ましくは約５０ｂｐ、より好ましくは約７５ｂｐである。よって、本発明において使用するプライマー全体の長さは、限定するものではないが、例えば約２５ｂｐ、好ましくは約５０ｂｐ、より好ましくは約７５ｂｐとすることができる。
【００４９】
（ｃ）フラグメントの増幅
真核生物より抽出したゲノムを鋳型とし、前記（ｂ）に記載したように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲにより、エクソン配列を複数のフラグメントとして増幅する。ＰＣＲの反応条件は、当業者であれば適宜設定することができる。また、ＰＣＲ反応は、市販のキットを使用して行うことができる。
【００５０】
前記（ｂ）に記載したように設計したプライマーを用いると、エクソンの両末端に、それぞれ、連結するエクソンまたはベクターの末端部分の配列が付加されたフラグメントを得ることができる。
【００５１】
（１−２）ｃＤＮＡフラグメントの合成および増幅工程
（ａ）ｍＲＮＡの抽出および逆転写酵素を用いたｃＤＮＡフラグメントの合成
本発明の一態様においては、まず、目的とする遺伝子を含む真核生物からｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡの抽出は、当業者に周知の方法を利用して行うことができる。また、市販のキットを利用することもできる。例えば、全ＲＮＡを抽出した後、オリゴｄＴカラムを用いてｍＲＮＡを精製してもよい。次に、逆転写酵素を用いて、得られたｍＲＮＡの１本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）フラグメントを合成する。逆転写反応は、当業者に周知の方法を利用して行うことができる。例えば、オリゴｄＴプライマーまたはオリゴｄＴアダプタープライマーを使用して１本鎖ｃＤＮＡフラグメントを得てもよい。または抽出した全ＲＮＡにオリゴｄＴプライマーまたはオリゴｄＴアダプタープライマーと逆転写酵素を適用し、ｍＲＮＡのみを逆転写させて１本鎖ｃＤＮＡフラグメントを得てもよい。
【００５２】
（ｂ）プライマーの設計
前記（１−１）（ｂ）に記載したのと同様に、相同領域を有するフラグメント間での相同組換えによりフラグメントを連結するため、本発明においては、フラグメントは、連結部位に、連結するフラグメントの末端部分または連結するベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を有さなければならない。よって、本発明の方法において使用するプライマーは、ＰＣＲによりフラグメントを増幅するとともに、連結するフラグメントの末端部分または連結するベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を、該フラグメントの末端部分に付加するように設計する。すなわち、本発明において使用することができるプライマーは、鋳型鎖に結合してプライマーとしての機能を果たす配列と、連結させる配列と相同な配列を末端に付加するための配列とから構成される。
【００５３】
よって、ｃＤＮＡフラグメントを増幅させるために使用するプライマーは、前記（１−１）（ｂ）に記載した方法と同様に、エクソンおよびイントロンの予測配列ならびに導入するベクターの制限酵素処理末端の配列に基づいて設計する。
【００５４】
（ｃ）フラグメントの増幅
前記（ａ）により得られた１本鎖ｃＤＮＡフラグメントを鋳型とし、前記（ｂ）に記載したように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲにより、ｃＤＮＡフラグメントを増幅する。ＰＣＲの反応条件は、当業者であれば適宜設定することができる。また、ＰＣＲ反応は、市販のキットを使用して行うことができる。
【００５５】
（２）ベクターの制限酵素処理
本発明において、ベクターは、制限酵素で消化し、切断してから用いる。制限酵素としては当業者に周知のものを使用し、当業者に周知の方法により制限酵素処理を行うことができる。制限酵素によって、ベクターは１カ所で切断されてもよいし、２カ所以上で切断されてもよい。
【００５６】
ベクターは、出芽酵母または分裂酵母の複製起点および選択マーカーを有するものを使用する。酵母を宿主とするベクターとしては、ＹＩｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベクター、ＹｃＰ型ベクター等が挙げられ、例えばｐＧＰＤ−２等を使用することができる。選択マーカーとしては、例えば栄養要求性レポーター遺伝子や追跡可能なマーカータンパク質をコードする遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、およびシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）をコードする遺伝子、ならびに他のレポーター遺伝子、例えばＬａｃ  Ｚ遺伝子および薬剤耐性遺伝子を含んでもよい。また、ベクターは、プロモーター領域および転写終結領域等を含んでもよい。プロモーター領域および転写終結領域が、目的とする遺伝子および選択マーカーの発現を制御するように、プロモーター領域および転写終結領域はベクター内に配置される。
【００５７】
（３）発現ベクターの作製工程
ＰＣＲにより増幅したフラグメントと制限酵素処理したベクターとを、出芽酵母または分裂酵母に同時に導入して形質転換する。これにより、出芽酵母または分裂酵母内で相同配列を有するフラグメント間およびフラグメントとベクターの制限酵素処理末端部分との間で相同組換えが起こり、フラグメントが連結された発現ベクターが形成される。本発明の方法においては、発現させたい推定遺伝子配列だけでなく、該遺伝子配列がコードするタンパク質の推定基質を合成する酵素の遺伝子や該タンパク質の修飾酵素の遺伝子等、複数の遺伝子についてフラグメントを調製し、一つのベクターに導入してもよい。
【００５８】
前記（１−１）（ｂ）のように、図１に則してエクソン１〜４をそれぞれ増幅し、連結して制限酵素処理したベクターに組み込む場合（図３）を例に、以下に説明する。
【００５９】
ＰＣＲによる増幅工程において、エクソン１〜４の両端に、それぞれ連結するエクソンまたはベクターと相同な配列が付加されたフラグメントが形成されている。よって、ベクターの制限酵素処理３’末端部分の配列とエクソン１の５’末端に付加されたベクターの制限酵素処理３’末端部分に相同な配列との間で、相同組換えが起こる。エクソン１およびエクソン２は、エクソン１の３’末端部分の配列とエクソン２の５’末端部分の配列とからなる配列を、エクソン１は３’末端部分に、エクソン２は５’末端部分に有しているので、この配列間で相同組換えが起こり、その結果、エクソン１の３’末端にエクソン２の５’末端が連結される。エクソン２とエクソン３、およびエクソン３とエクソン４についても、同様に、エクソン２の３’末端にエクソン３の５’末端が、エクソン３の３’末端にエクソン４の５’末端が連結される。エクソン４の３’末端にはベクターの制限酵素処理５’末端部分の配列と相同な配列が付加されているので、係る配列とベクターの制限酵素処理５’末端部分の配列との間で相同組換えが起こる。
【００６０】
これらの相同組換えにより、遺伝子に含まれるエクソン１〜４が、遺伝子にコードされている順番のとおりに連結された配列、すなわち、遺伝子のｃＤＮＡ配列と推定される配列が含まれた発現ベクターを作製することができる。
【００６１】
また、本発明の一態様では、相同組換えにより、ｃＤＮＡフラグメントが連結された配列、すなわち全長ｃＤＮＡ配列が含まれた発現ベクターを作製することができる。
【００６２】
フラグメント等を出芽酵母または分裂酵母に導入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法などの周知の方法を用いることができる。
【００６３】
相同組換えは、複数のフラグメントの末端部分で同時に起こりうるので、本発明の方法を用いると、複数のフラグメントを同時に組み込むことができる。また、本発明の方法においては、約２０ｋｂｐ程度までのフラグメントを組み込むことができる。本発明の方法を用いると、約２０ｋｂｐまで、約１５ｋｂｐまで、約１０ｋｂｐまで、または約５ｋｂｐまでの遺伝子のｃＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込むことができる。
【００６４】
作製された発現ベクターは、選択マーカーを利用して形質転換体を選択し、該形質転換体に含まれる発現ベクターを回収する。
【００６５】
３．ケトミウムグロボサム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ）由来ＰＫＳ遺伝子発現ベクター
本発明の一態様として、上記２．の方法に従って、ケトミウムグロボサム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ）由来ＰＫＳ遺伝子発現ベクターを作製することができる。ケトミウムグロボサムには、ＰＫＳ遺伝子と推定される遺伝子群が存在するが、それらがコードするタンパク質は、天然物として生産を確認されたことはなく、また、合成により得られたこともない。そのような遺伝子（ＣＨＧＧ＿１０１２８、ＡＮＩＤ＿０３３８６、ＡＮＩＤ＿０７９０３、ＣＨＧＧ＿０００４６、ＣＨＧＧ＿００５４２、ＣＨＧＧ＿０４０６８、ＣＨＧＧ＿０５２８６、およびＣＨＧＧ＿０９５８６）からイントロンを除去し、エクソン配列のみを連結して該連結された配列を含む発現ベクターを作製することができる。すなわち、上記遺伝子の推定ｃＤＮＡ配列（配列番号２９および配列番号１５〜２１）を含む発現ベクター（配列番号１４および配列番号２２〜２８）を作製することができる。
【００６６】
また、本発明の一態様では、前記ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿１０１２８、ＡＮＩＤ＿０３３８６、ＡＮＩＤ＿０７９０３、ＣＨＧＧ＿０００４６、ＣＨＧＧ＿００５４２、ＣＨＧＧ＿０４０６８、ＣＨＧＧ＿０５２８６、およびＣＨＧＧ＿０９５８６）のｃＤＮＡフラグメントを連結して得られる、全長ｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターを作製することもできる。
【００６７】
ケトミウムグロボサム由来ＰＫＳ遺伝子発現ベクターは、ＰＫＳを修飾して機能を発揮させる修飾酵素をコードする遺伝子であるｎｐｇＡ遺伝子、およびＰＫＳの基質となるマロニル−ＣｏＡを産生する酵素をコードする遺伝子であるｍａｔＢ遺伝子の一方または両方をさらに含んでもよい。これらの遺伝子は、あらかじめベクターに組み込んでおいてもよいし、ＰＫＳ遺伝子と一緒にフラグメントとして調製して相同組換えにより導入してもよい。
【００６８】
４．発現ベクターを導入した形質転換体
本発明の方法に従って得られた、エクソンが連結された配列または全長ｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることができる。宿主細胞としては、大腸菌および酵母のいずれであってもよいが、酵母を宿主とするシステムを用いて発現させると、異種発現であっても、真核生物のタンパク質を変性させることなく合成することが出来るので、酵母を用いることが好ましい。形質転換する際、一または複数個の発現ベクターを一つの細胞へ導入してもよく、さらに、複数の遺伝子を染色体上へ導入してもよい。
【００６９】
５．形質転換体が産生するタンパク質
本発明の一態様において、発現ベクターを導入した形質転換体が産生するタンパク質を得ることができる。
【００７０】
本発明の形質転換体を、発現ベクターに導入されているエクソンが連結された配列または全長ｃＤＮＡ配列が発現可能な条件下で培養し、タンパク質を得ることができる。該形質転換体は、当該分野で汎用されている培地中で培養することができる。培養方法は当業者に周知の方法に従って行うことができ、温度、ｐＨ、培養時間、通気や撹拌を行うか否か、等については、当業者であれば適宜設定できる。
【００７１】
培養した形質転換体からタンパク質を抽出するに際しては、培養後、周知の方法で形質転換体を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、および／または凍結融解などによって形質転換体を破壊した後、遠心分離やろ過により粗抽出液を得る方法などを用いることができる。緩衝液には、界面活性剤やタンパク質変性剤などを適宜添加してもよい。
【００７２】
得られた粗抽出液からタンパク質を分離・精製する方法としては、硫酸アルミニウム沈殿法などの塩析、ゲルろ過等、当該分野で周知の方法を用いることができる。
【００７３】
形質転換体が産生するタンパク質は、遺伝子工学的に常用される融合産生方法を適用し、タグを有する融合タンパク質として発現させることも可能である。タグとしては、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等、周知のものを使用することができる。タグを付加した場合には、分離・精製方法として、アフィニティクロマトグラフィー法等を使用することができる。
【００７４】
６．発現ベクターを使用して、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列がコードするタンパク質により産生される化合物を製造する方法
本発明の一態様において、発現ベクターを導入した形質転換体が産生するタンパク質により合成される化合物を製造することができる。
【００７５】
本発明の形質転換体を、発現ベクターに導入されているエクソンが連結された配列または全長ｃＤＮＡ配列が発現可能な条件下で培養し、該配列がコードしているタンパク質を発現させる。本発明の形質転換体は、当該分野で汎用されている培地中で培養することができる。また、培養方法は当業者に周知の方法に従って行うことができ、温度、ｐＨ、培養時間、通気や撹拌を行うか否か、等については、当業者であれば適宜設定できる。培地、培養方法、培養時間等の培養条件は、化合物の産生量が多くなるように最適化されることが好ましい。
【００７６】
培養することにより、形質転換体内または培養液中に、発現ベクターに導入されているエクソンが連結された配列または全長ｃＤＮＡ配列がコードしているタンパク質により合成される化合物を蓄積させる。形質転換体または培養液から、化合物を採取する。採取する方法は、化合物の物性に応じて、当該分野で公知の方法から適宜選択することができる。例えば、培養液中に化合物が蓄積される場合には、培養液から遠心分離等により形質転換体を除いた後、培養液に対して溶媒抽出法、イオン交換樹脂法または吸着若しくは分配クロマトグラフィー法およびゲル濾過法などを単独又は組み合わせて行なうことにより採取できる。形質転換体内に蓄積される化合物の場合には、培養液から遠心分離等により形質転換体を回収し、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、および／または凍結融解などによって形質転換体を破壊して、遠心分離やろ過により粗抽出液を得た後に、溶媒抽出法、イオン交換樹脂法または吸着若しくは分配クロマトグラフィー法およびゲル濾過法などを単独又は組み合わせて採取することができる。さらに、採取した化合物を、その物性に応じて、当該分野で公知の方法を用いて精製してもよい。
【００７７】
実施例２に示した通り、本発明の発現ベクターを使用して、化合物を製造すると、１Ｌの培養液から１ｇ程度の化合物を得ることができる。実用化レベルの生産効率が１Ｌの培養液から０．１ｇ程度であることから、この生産効率は、実用化レベルの生産効率と比較しても十分に高いといえる。
【００７８】
本発明の一態様では、カビの二次代謝産物の生合成遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列を含む発現ベクターを作製し、該発現ベクターを導入した形質転換体を培養することで、二次代謝産物を得ることができる。よって、本発明の方法を用いると、未知の二次代謝産物を得ることが可能となるので、有用な生物活性物質を創製できる可能性がある。
【００７９】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は、全て参照として本明細書に組み込まれる。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２０１０−１８１２７９号および２０１１−００７３１２号の明細書および図面に記載の内容は、全て参照として本明細書に組み込まれる。
【００８０】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００８１】
ケトミウムグロボサム由来ＰＫＳ遺伝子発現ベクターの作製および遺伝子発現
１．ＣＨＧＧ＿１０１２８
カビの一種であるケトミウムグロボサムについては、全ゲノム配列が解読されており、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のプログラムによって、ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）をコードする遺伝子領域、さらにはその領域中のエクソン配列とイントロン配列が予測されている。ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）をコードしていると推定されている遺伝子のうちの一つ（ＣＨＧＧ＿１０１２８）（配列番号１）について、以下の実験を行った。【００８２】
（１）ＰＣＲによるエクソン配列の増幅
ケトミウムグロボサムからＤＮＡを抽出した。ＣＨＧＧ＿１０１２８はイントロン配列を３つ有していると推定されているため、それらのイントロン配列を除いた４つのエクソン配列をＰＣＲにより増幅した。フォワードプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、リバースプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのアンチセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持つものを合成した（図１）。【００８３】
図１に示す通り、エクソン配列を５’端から順にエクソン１〜４（配列番号１０〜１３）とすると、エクソン１のフォワードプライマーを配列番号２、エクソン１のリバースプライマーを配列番号３、エクソン２のフォワードプライマーを配列番号４、エクソン２のリバースプライマーを配列番号５、エクソン３のフォワードプライマーを配列番号６、エクソン３のリバースプライマーを配列番号７、エクソン４のフォワードプライマーを配列番号８、エクソン４のリバースプライマーを配列番号９に示す。【００８４】
ＰＣＲ反応は、９４℃において２分変性させた後、エクソン１は９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分、エクソン２は９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で５分、エクソン３は９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分、エクソン４は９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分、の反応を３０サイクル行った。ポリメラーゼは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡）を用いた。【００８５】
（２）相同組換えによる発現ベクターの作製
エクソン１、エクソン２、エクソン３、およびエクソン４が増幅されていることを電気泳動により確認した後（図２）、目的バンドを示すＰＣＲ産物、制限酵素処理したベクター、およびタグとしてＨｉｓおよびＨＡタグをコードする配列を出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に導入した。ベクターとして市販のｐＲＳ４２５を、制限酵素としてＳａｌＩおよびＳａｃＩを用いた。酵母内のリコンビナーゼにより相同組換えを起こし、エクソン１、エクソン２、エクソン３、およびエクソン４を含む発現ベクター（配列番号１４）を作製した（図３）。相同組換えにより、エクソン１〜４からなる配列（配列番号２９）が組み込まれた発現ベクターは、Ｌｅｕをマーカーとして使用して選択した。【００８６】
（３）目的タンパク質の酵母での発現
得られた発現ベクターを酵母に導入し、形質転換させた。ＳＣ／Ｌｅｕ（２％ラフィノース）培養液で２４時間培養し、最終濃度２％になるようにガラクトースを投入した。１２時間培養後、酵母を回収し、酵母からタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質をウェスタンブロッティングに供し、遺伝子発現を確認した。エクソン１〜４を連結した配列（配列番号２９）に基づくＰＫＳの分子量は２７９ｋＤａであり、タグペプチドの分子量が８ｋＤａであるので、分子量２８７ｋＤａにバンドが検出されると予測されるところ、実際にその付近にバンドを確認した（図４）。ウエスタンブロッティングでは、１次抗体として抗Ｈｉｓ抗体（Ｓｉｇｍａ）（４０００倍）、２次抗体として抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１倍）を使用し、検出にはアルカリフォスファターゼによる化学発光を使用した。【００８７】
２．その他の遺伝子
ＰＫＳをコードしていると推定されている他の遺伝子（ＡＮＩＤ＿０３３８６、ＡＮＩＤ＿０７９０３、ＣＨＧＧ＿０００４６、ＣＨＧＧ＿００５４２、ＣＨＧＧ＿０４０６８、ＣＨＧＧ＿０５２８６、およびＣＨＧＧ＿０９５８６）についても上記１と同様に実験を行い、これら遺伝子のｃＤＮＡ配列と推定される配列（順に配列番号１５〜２１に示す）を含む発現ベクター（順に、配列番号２２〜２８に示す）を作製した。上記１と同様に、これらの発現ベクターを酵母に導入して形質転換すると、タンパク質の発現が確認された。
【実施例２】
【００８８】
インビボにおける化合物（６−メチルサリチル酸）の生産
６−メチルサリチル酸（６−ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ，６−ＭＳＡ）は代表的な真菌由来ポリケチドとして研究がなされており、また、その合成酵素（６−メチルサリチル酸シンテターゼ、６−ＭＳＡ合成酵素、ＭＳＡＳ）は大腸菌でも発現させることが可能であることがわかっている。そこで、本発明の方法によって作製した発現ベクターを導入した形質転換体が実際に化合物を生産できることを示すため、６−メチルサリチル酸合成酵素について、以下のような実験を行った。【００８９】
１．発現ベクターの構築およびＭＳＡＳの発現
カビであるアスペルギルステレウスからＤＮＡを抽出した。６−ＭＳＡ合成酵素の遺伝子（配列番号３０）はイントロン配列を１つ有しているため、そのイントロン配列を除いた２つのエクソン配列をＰＣＲにより増幅した。このとき、各フラグメントに、連結させるフラグメントの末端またはベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列が付加されるように、フォワードプライマー（配列番号３１）とリバースプライマー（配列番号３２）、およびフォワードプライマー（配列番号３３）とリバースプライマー（配列番号３４）を設計して使用した。【００９０】
実施例１と同様に、相同組換えを利用して、増幅させたエクソン配列のフラグメントおよびタグとしてＨＡをコードする配列をｐＫＷ１２５０（Ｌｅｕ２ｄ）のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）に導入し、６−ＭＳＡ合成酵素遺伝子のｃＤＮＡを含む発現ベクター（配列番号３５）を構築した。また、ＧＲＣ法を用い、ｎｐｇＡおよびｍａｔＢも合わせて組込んだ。発現ベクターは、Ｕｒａ（ウラシル）をマーカーとして使用して選択した。【００９１】
係る発現ベクターを酵母に導入して形質転換を行い、ＭＳＡＳ（２０４ｋＤａ）の発現を確認した。具体的には、得られた発現ベクターを酵母に導入して形質転換させた後、ＳＣ／Ｌｅｕ（２％ラフィノース）培養液で２４時間培養し、最終濃度２％になるようにガラクトースを投入した。１２時間培養後、酵母を回収した。回収した酵母をビーズで破砕抽出し、係る抽出物をニッケルカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製して、以下のサンプルを得た（図５）；無細胞抽出液（レーン１）、可溶性画分（レーン２）、非吸着画分（レーン３）、洗浄画分（レーン４）、溶出画分（イミダゾール濃度１００ｍＭ）（レーン５）、溶出画分（イミダゾール濃度２００ｍＭ）（レーン６）、溶出画分（イミダゾール濃度５００ｍＭ）（レーン７）。得られたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングに供し、遺伝子発現を確認した。ゲルはＣＢＢ染色を行い、ウエスタンブロッティングでは、１次抗体として抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）（１０００倍）、２次抗体として抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１倍）を使用し、検出にはアルカリフォスファターゼによる化学発光を使用した。結果を図５に示す。コントロールとして、マロニル−ＣｏＡ合成酵素（ＭＡＴＢ）（５７ｋＤａ）およびホスホパンテテイン基転移酵素（ＳＦＰ）（３２ｋＤａ）も検出したところ、ＭＳＡＳのみ、極端に生成量が少なかった。なお、酵母におけるタンパク質の発現方法はＪａｙ  Ｄ．  ＫｅａｓｌｉｎｇらのＮａｔｕｒｅ（２００６）を参考にした。【００９２】
２．６−ＭＳＡのレファレンス
ＭＳＡＳはインビトロでは酵素反応できなかったため、米Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ社より６−ＭＳＡを購入し、酵素反応により生産される化合物の標品とした。係る化合物をＬＣ／ＭＳおよび分取用ＨＰＬＣで検出し、レファレンスデータを得た。【００９３】
ＬＣ／ＭＳの測定条件は、電子イオン化法によりイオン化し検出した。ＬＣ／ＭＳの結果を図６Ａおよび図６Ｂに示す。図６Ａのａは２５４ｎｍの吸収波長を検出したクロマトグラム、図６Ａのｂは目的化合物の紫外吸収スペクトル、図６Ｂのａは質量分析のクロマトグラム、図６Ｂのｂは目的化合物の質量スペクトルである。図６Ａのｂおよび図６Ｂのｂより、６−ＭＳＡはイオン化されにくいため、ＭＳでの検出は困難であるが、ＵＶでは検出容易であることがわかった。【００９４】
分取用ＨＰＬＣの測定条件は、Ｃ１８カラムを用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、２５４ｎｍの吸収波長を検出した。分取用ＨＰＬＣの結果を図７に示す。図７より、保持時間２７．４分のピークが６−ＭＳＡに相当することがわかった。【００９５】
３．インビボにおける６−ＭＳＡの生産
上記１．において作製した発現ベクターを酵母に導入して形質転換を行い、該酵母を以下の通り、培養した。
１：ＳＣ／Ｕｒａ  ｐｌａｔｅで４８時間、３０℃にて培養
２：ＳＣ／Ｕｒａ  ２ｍＬ、２４時間、３０℃にて震盪培養
３：ＳＣ／Ｌｅｕ  ２５ｍＬ、４８時間、３０℃にて震盪培養
４：ＹＰＤ  １Ｌ、１２時間、３０℃にて震盪培養
５：最終濃度２％となるようにガラクトースを添加
６：６日間震盪培養【００９６】
培養液を遠心して上清を回収した後、ＨＣｌを用いて上清のｐＨを１−２に調製した。上清と等量の酢酸エチルで目的化合物（６−ＭＳＡ）を抽出して乾燥させたところ、１Ｌの培養液から約１ｇの目的化合物が得られた。得られた固体をメタノールに溶解させてＬＣ／ＭＳで解析し、ＨＰＬＣで分取した。測定条件は、上記２．と同様である。ＬＣ／ＭＳのスペクトルを図８に、ＨＰＬＣのスペクトルを図９に示す。図８Ａのａは２５４ｎｍの吸収波長を検出したクロマトグラム、図８Ａのｂは目的化合物の紫外吸収スペクトル、図８Ｂのａは質量分析のクロマトグラム、図８Ｂのｂは目的化合物の質量スペクトルである。上記２．で得たレファレンスデータに基づいて、ＨＰＬＣで保持時間２７分の画分を分取した。分取した画分を乾燥させた後、重水素化メタノール（ＭｅＯＤ（４Ｄ））に溶解し、ＮＭＲスペクトル解析を行った。結果を図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。【００９７】
これらの結果より、形質転換された酵母が、６−ＭＳＡを産生していることが確認できた。すなわち、本発明の方法に従って作製した発現ベクターを導入した形質転換体が、実際に二次代謝産物を生産できることが確認された。
【実施例３】
【００９８】
ケトミウムグロボサム由来ＰＫＳ遺伝子（ＣＨＧＧ＿００５４２）発現ベクターの作製および遺伝子発現
１．ＣＨＧＧ＿００５４２遺伝子発現ベクターの構築
ケトミウムグロボサムが有するポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）をコードしていると推定されている遺伝子のうちの一つ（ＣＨＧＧ＿００５４２）であって、５つのアデニン（４９２、３９２５、３９６５、４５２９、および６０７７残基）をグアニンに置換した配列（配列番号３６）について、以下の実験を行った。【００９９】
（１）ＰＣＲによるエクソン配列の増幅
ケトミウムグロボサムからＤＮＡを抽出した。ＣＨＧＧ＿００５４２はイントロン配列を３つ有していると推定されているため、それらのイントロン配列を除いた４つのエクソン配列（５’端から順にエクソン１〜４（配列番号３７〜４０）とする）をＰＣＲにより増幅した。このとき、各フラグメントに、連結させるフラグメントの末端またはベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列が付加されるように、エクソン１フォワードプライマー（配列番号４１）とエクソン１リバースプライマー（配列番号４２）、エクソン２フォワードプライマー（配列番号４３）とエクソン２リバースプライマー（配列番号４４）、およびエクソン３フォワードプライマー（配列番号４５）とエクソン３・４リバースプライマー（配列番号４６）を設計して使用した（図１１）。エクソン３・４リバースプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、ベクターの制限酵素処理末端部分のアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、エクソン４のアンチセンス鎖の配列に相補的な配列、およびエクソン３のアンチセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持つものを合成した（図１１）。【０１００】
ＰＣＲ反応は、９４℃において２分変性させた後、エクソン１は９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒、エクソン２は９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で３０秒、エクソン３・４は９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で６分、の反応を３０サイクル行った。ポリメラーゼは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いた。【０１０１】
（２）相同組換えによる発現ベクターの作製
エクソン１、エクソン２、およびエクソン３・４が増幅されていることを電気泳動により確認した後（図１２）、目的バンドを示すＰＣＲ産物、制限酵素処理したベクター、およびタグとしてＨｉｓおよびＨＡタグをコードする配列を出芽酵母に導入した。ベクターとして市販のｐＲＳ４２５を、制限酵素としてＳａｌＩおよびＳａｃＩを用いた。酵母内のリコンビナーゼにより相同組換えを起こし、エクソン１、エクソン２、およびエクソン３・４を含む発現ベクターを作製した（図１３）。相同組換えにより、エクソン１〜４からなる配列（配列番号４７）が組み込まれた発現ベクターは、Ｌｅｕをマーカーとして使用して選択した。また、ＧＲＣ法を用い、ｎｐｇＡおよびｍａｔＢも合わせて組込んだ。【０１０２】
（３）目的タンパク質の酵母での発現
実施例１と同様の方法により、目的タンパク質の酵母での発現を確認した。エクソン１〜４を連結した配列に基づくＰＫＳの分子量は２３９ｋＤａであり、タグペプチドの分子量が８ｋＤａであるので、分子量２４７ｋＤａにバンドが検出されると予測されるところ、実際にその付近にバンドを確認した（図１４）。【０１０３】
２．ｉｎ  ｖｉｖｏ合成系によるＣＨＧＧ＿００５４２の酵素機能解析、ならびに合成産物の単離および構造決定
上記１．により得られた酵母培養液を遠心して上清を回収した後、上清と等量の酢酸エチルで目的化合物を抽出して乾燥させた。１Ｌの培養液から約０．０１ｇの固体が得られた。得られた固体をメタノールに溶解させてＬＣ／ＭＳで解析し、ＨＰＬＣで分取した。測定条件は、６−ＭＳＡの場合（実施例２の２．）と同様である。ＬＣ／ＭＳのスペクトルを図１５に、ＨＰＬＣのスペクトルと共に示す。２種の化合物が分取されたため、一方を化合物１（ＣＨＧＧ＿５４２−１）、もう一方を化合物２（ＣＨＧＧ＿５４２−２）とした。分取したこれら化合物を乾燥させた後、それぞれ重水素化アセトン（ａｃｅｔｏｎｅ（６Ｄ））に溶解し、ＮＭＲスペクトル解析を行った。【０１０４】
１ＨＮＭＲスペクトル（図１６）の解析結果から、単離された化合物１（ＣＨＧＧ＿５４２−１）は既に化学構造の決定されている化合物であり、化合物２（ＣＨＧＧ＿５４２−２）は新規化合物であることが明らかとなった。【０１０５】
これらの結果より、形質転換された酵母が、化合物１（ＣＨＧＧ＿５４２−１）および化合物２（ＣＨＧＧ＿５４２−２）を産生していることが確認できた。すなわち、本発明の方法に従って作製した発現ベクターを導入した形質転換体が、実際に新規化合物を生産できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明により、遺伝子配列からイントロンを除去してエクソンのみを連結させることができることから、いわば、人為的にスプライシングを行うことができるようになったといえる。本発明を用いると、未知の生合成遺伝子群を発現させることができるので、これまでに単離構造決定されていない該遺伝子群がコードしているタンパク質、および該タンパク質が合成する有用な生物活性物質を創製できる可能性がある。よって、本発明により、新しい医薬品、農薬、またはそれらのリード化合物を提供しうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年9月24日(2012.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物が有する、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列の、エクソン配列を連結し、該連結された配列を含む発現ベクターを作製する方法であって、
（ａ）真核生物から抽出したゲノムから、ＰＣＲにより、エクソン配列を複数のフラグメントとして増幅する工程、
ここで、ＰＣＲに用いるフォワードプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、リバースプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのアンチセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、これらのプライマーを用いることにより、増幅するフラグメントの末端に、該フラグメントに連結させるフラグメントの末端部分と相同な配列またはベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を付加する、および
（ｂ）工程（ａ）により得られたフラグメントと、制限酵素処理したベクターとを出芽酵母または分裂酵母に同時に形質転換することにより、相同組換えによってフラグメントとフラグメント、およびフラグメントとベクターとが連結された発現ベクターを得る工程
を含み、ここで、遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列が、ポリケチド合成酵素または非リボソーム依存性ペプチド合成酵素をコードするものである、該方法。
【請求項２】
真核生物が有する、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列の、全長ｃＤＮＡ配列を含む発現ベクターを作製する方法であって、
（ａ）真核生物から抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡフラグメントを合成し、該ｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅する工程、
ここで、ＰＣＲに用いるフォワードプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、リバースプライマーは、５’末端から３’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のアンチセンス鎖の３’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのアンチセンス鎖の５’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、これらのプライマーを用いることにより、増幅するフラグメントの末端に、該フラグメントに連結させるフラグメントの末端部分と相同な配列またはベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を付加する、および
（ｂ）工程（ａ）により得られたｃＤＮＡフラグメントと、制限酵素処理したベクターとを出芽酵母または分裂酵母に同時に形質転換することにより、相同組換えによってフラグメントとフラグメント、およびフラグメントとベクターとが連結された発現ベクターを得る工程
を含み、ここで、遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列が、ポリケチド合成酵素または非リボソーム依存性ペプチド合成酵素をコードするものである、該方法。
【請求項３】
真核生物がカビである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
カビがペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ属）、ケトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ属）、またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列が４〜２０ｋｂである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
連結された配列が、配列番号１５〜２１、２９および４７のいずれかに示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の方法により作製された発現ベクターが導入されている、形質転換体。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
請求項１〜７に記載の方法により作製された発現ベクターを使用して、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列がコードするタンパク質により産生される化合物を得る方法。
【請求項１１】
発現ベクターを導入した形質転換体を培養し、培養液または形質転換体から化合物を採取する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【国際調査報告】
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