(57)【要約】【課題】 生体模倣プロセスを用いて金属酸化物の二次元または三次元構造体を提供すること。【解決手段】本発明は、ウレアーゼとしてジャックビーンズ由来のタチナタマメウレアーゼ（ＪＢＵ）を用い、そのテンプレート効果により、尿素を分解させ、金属酸化物のナノ粒子からなる二次元または三次元構造物を製造する。本発明によれば、鉄系酸化物はシート状に形成されて超常磁性を示し、花型階層構造体は好ましい強磁性を示し、MRI造影剤として有用性を示す。チタン系酸化物は３７℃という低温で、高い光触媒活性を示すルチル型チタン酸化物が形成される。【選択図】  図２０
2012026194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属塩、尿素及びタチナタマメウレアーゼ（ＪＢＵ）を含む水溶液中で金属酸化物ナノ粒子構造体を形成する方法であって、室温から８０℃に至る低温度域で尿素を分解させつつ金属酸化物ナノ粒子構造体を水溶液中で直接形成することを特徴とする金属酸化物ナノ粒子構造体の製造方法。
【請求項２】
前記金属塩が、鉄、亜鉛、チタン、ガドリウム、銅、ニッケル、コバルト、ジルコニウム、アルミニウムからなる群から選択される金属の塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タチナタマメウレアーゼからなり、金属塩水溶液中で六量体（ヘキサマー）を形成し、その間隙が尿素を分解させる機能を有することを特徴とする金属酸化物ナノ粒子構造体製造用テンプレート。
【請求項４】
請求項１に記載の方法によって得られる、失活酵素を痕跡として含むナノ粒子金属酸化物からなる二次元または三次元単結晶構造物。
【請求項５】
請求項１に記載の方法によって得られる、光触媒活性に優れるルチル型チタン酸化物である二次元または三次元チタン酸化物構造体。
【請求項６】
請求項１に記載の方法によって得られる、超常磁性を示すプレート状二次元マグネタイト。
【請求項７】
請求項１に記載の方法によって得られる、強磁性を示す階層構造体である三次元マグネタイト。
【請求項８】
請求項６または７に記載の、ナノ粒子マグネタイトを含むMRI造影剤。
【請求項９】
請求項５に記載の、ナノ粒子チタン酸化物を含む光線力学療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジャックビーンズウレアーゼ（ＪＢＵ）をテンプレートとして用いて製造される金属酸化物ナノ粒子構造体およびその製造方法に関する。より詳細には、本発明は、ＪＢＵの酵素活性及び立体構造を利用して低温域常圧で製造される金属酸化物ナノ粒子の二次元または三次元単結晶及びその無焼結製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
粒子の形状は物理的、化学的、生物学的特性を決定する重要なパラメータである。例えば、磁気的、光学的、機械的特性、細胞とりこみ等は粒子の形状に大きく依存する。特にシートやプレート、扁平な紡錘形のような２次元構造（２Ｄ）は異方性を持つため、上記の特性を大幅に変化させる。さらに、二次元（２Ｄ）構造からなる三次元（３Ｄ）階層構造（例えば、花型やピラミッド型）は広い表面積を持つため、触媒活性が向上することや水処理、元素回収などの応用に有効であることが報告されている。【０００３】
これまでの２Ｄ，３Ｄ構造はＶＳＬ（vapor-liquid-solid）合成法（非特許文献１）、臭化テトラブチルアンモニウムをテンプレートした合成法（非特許文献２）、界面活性剤の存在下での加水分解（非特許文献３）、ソルボサーマル法（非特許文献４）で合成されてきた。【０００４】
また、低エネルギーかつ環境フレンドリーな合成方法の一つとして生体模倣プロセスが挙げられ、シリカティンと呼ばれる海面から分離したタンパク質が極めて温和な条件でシリカ針状体（silica spicules）を合成することが知られている（非特許文献５）。【０００５】
他方、材料として金属酸化物に着目すると、種々の物理的化学的性質の有用性が期待され、従来、直径0.1〜１μｍ程度の金属酸化物の粉末の提供が望まれており、水溶液プロセスでは広く尿素法が採用されている（特許文献１）.しかしながら、生成物としては金属水酸化物が得られるに過ぎないので、これを金属酸化物とするためには焼結工程が必須であり、この焼結によって原料に用いられる粉末の粒子形状および／または粒径が不揃いだと、成形時に粒子の充填が不十分な部分（欠陥）が発生するために、焼結の進行が妨げられたり、割れや変形などの原因となる。他方、焼結過程で異常粒成長が生じ、粒径が急激に増加してしまうという問題があり、焼結条件での種々の制御は困難である。また、焼結によって製造される金属酸化物は多結晶であり、物性的に着目される単結晶の製造が難しいという難点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３１６４１８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】A.M.Morales,C.M.Lieber,Science 1998,279,208
【非特許文献２】L.-S.Zhong,J.-S.Hu,A.-H.Cao,Q.Lin,W.-.Song,L.-.Wan,Chem.Mater.2007,19,1648
【非特許文献３】P.D.Cozzoli,A.Komowski,H.Weller,J.Am.Chem.Soc.2003,125,14539
【非特許文献４】F.Lu,W.Cai,Y.Zhang,Adv.Funct.Mater.2008,18,1047
【非特許文献５】J.C.Weaver,D.E.Morse,Microsc.Res.Tech.2003,62,356
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、ナノ粒子金属は焼結すると構造、物性等が変化しやすいので、焼結せず、常温常圧で直接、金属酸化物ナノ粒子が得られ、二次元又は三次元単結晶を直接提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は金属酸化物ナノ粒子を焼結することなく直接生成し、二次元または三次元単結晶とするためには生体模倣プロセスを利用するのが最適であることに着目し、鋭意検討の結果、従来、医薬用途に使用されてきたジャックビーンズ由来のウレアーゼであるタチタチナタマメウレアーゼ（以下、ＪＢＵという）が酵素活性に優れ、しかもその六量体（ヘキサマー）を用いると、通常の尿素法と異なり、そのヘキサマーを形成する一対のトリマー構造の間隙が金属酸化物を沈殿させるに有効な反応場となり、テンプレートとして機能するためか,室温から８０℃、好ましくは６０℃に至る低温度域で尿素を分解させつつ金属酸化物ナノ粒子の二次元および三次元単結晶構造物が直接水溶液中で形成されることを見出した。【００１０】
本発明は金属塩、尿素及びタチタチナタマメウレアーゼ（ＪＢＵ）を含む水溶液中で金属酸化物ナノ粒子構造体を形成させる方法であって、室温から８０℃にいたる低温度域で尿素を分解させつつ金属酸化物ナノ粒子単結晶構造体を形成することを特徴とする金属酸化物ナノ粒子構造体の製造方法にある。【００１１】
本発明においては、従来の尿素法と異なり、焼結過程を経ることなく、水溶液中に直接金属酸化物の単結晶が形成される。その反応機構が水溶液中に形成されるタチナタマメウレアーゼ（ＪＢＵ：ジャックビーンズウレアーゼ）の六量体（ヘキサマー）の間隙を反応場とするため、テンプレート効果により金属酸化物構造体を直接形成させるものと思われる。【００１２】
金属酸化物単結晶を形成するための出発物質である前記金属塩としては、チタン族、鉄族、銅族、亜鉛族、アルミニウム族および希土類元素、特に鉄、亜鉛、チタン、ガドリウム、銅、ニッケル、コバルト、ジルコニウム、アルミニウムからなる群から選択される金属の塩、特に塩化物であるのが好ましい。【００１３】
前記水溶液は、前記金属塩に対して過剰の尿素を使用する必要はなく、略等量の尿素を含むことにより、ＪＢＵヘキサマーの反応場で金属イオンを酸化物として沈殿させることができる。【００１４】
本発明によれば、各種ナノ粒子金属酸化物からなる二次元または三次元構造物を焼結せず水溶液中で常温常圧で直接形成することができるので、金属酸化物の新しい物性を提供することができる。鉄系酸化物はシート状に形成されて、好ましい強磁性を示す。ガドリニウム系酸化物は扁平な紡錘形三次元構造をなし、磁気共鳴画像法の造影剤として有用性をしめす。チタン系酸化物は３７℃という低温で、従来高温でしか合成できなかったルチル型チタン酸化物が形成される。コバルト系酸化物では扁平なロッド形状、扁平な紡錘形粒子からなる三次元花型構造が形成された。亜鉛系酸化物ではシート状の構造物が形成された。特に、本発明方法で形成されたチタニア（ＴｉＯ２）及びマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）については以下の物性が見出された。
＜Ｆｅ３Ｏ４に関する性能＞
本発明で生成したプレート状又は花型Ｆｅ３Ｏ４階層構造体はマクロファージによる貪食（取り込み）を回避することができる。これまでの薬物輸送（DDS）やMRI造影剤の開発には球状粒子やリポソームが用いられてきたが、これらの材料では体内に注射すると異物として認識され、目的とする部位に達するまでにマクロファージに貪食されてしまうという問題があった。また、ポリエチレングリコールを修飾し貪食を回避する試みがなされているが、投与量の9割は貪食されてしまい、1割以下しか目的部位に到達しないという問題があった。このため、貪食回避はDDSやMRIを達成するために必要不可欠な技術である。本発明のＦｅ３Ｏ４  （マグネタイト）の花型階層構造体は形状により貪食を回避可能であることを動物実験で証明した。
＜ＴｉＯ２に関する性能＞
本発明方法で生成したＴｉＯ２階層構造体の表面は光触媒活性を向上させるような結晶面｛（110）面｝が豊富であるため、光触媒活性が市販品に比べて優れている。JIS規格に基づいてアセトアルデヒドの分解効率を市販品と比較したところ10倍以上分解効率が良いことが明らかとなり、光線力学療法の光増感剤として応用可能である。従来の光増感剤は有機分子であり、静脈注射すると体全体に拡散してしまうという問題や、光に当たらないように暗室で数日間過ごさなければいけないという問題があったが、本発明ではナノ粒子化することでガン組織に集まりやすくなり、目的とする部位だけを治療できるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１で製造された鉄酸化物の二次元構造物の詳細を示すＳＥＭ像を示す。
【図２】実施例１で製造された鉄酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
【図３】比較例１で製造された鉄酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
【図４】実施例２で製造された鉄酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
【図５】実施例１及び２で製造された鉄酸化物の二次元構造物の詳細を示すＸＲＤ図形を示す。
【図６】実施例１で製造された花型階層構造体（Hierarchical  Structure）の鉄酸化物の磁化曲線であって、強磁性を示す。
【図７】実施例２で製造されたプレート状鉄酸化物の磁化曲線であって、超常磁性を示す。
【図８】実施例３で製造された鉄酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
【図９】実施例４で製造された鉄酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
【図１０】実施例３で製造されたチタン酸化物の二次元構造物の詳細を示すＸＲＤ図形を示す。
【図１１】実施例４で製造されたチタン酸化物の二次元構造物の詳細を示すＸＲＤ図形を示す。
【図１２】実施例５で製造された亜鉛酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
【図１３】実施例６で製造された亜鉛酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す
【図１４】実施例７で製造されたニッケル酸化物の三次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
【図１５】実施例８及び９で製造された銅酸化物の三次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
【図１６】実施例１０で製造されたコバルト酸化物の三次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
【図１７】実施例１１で製造されたコバルト酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す
【図１８】実施例１２で製造されたガドリウム酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
【図１９】ガドリウム酸化物構造体の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を示す。
【図２０】本発明方法の各工程を示す工程説明図である。
【図２１】本発明方法でＪＢＵのテンプレート効果によりプレートを形成し、自己組織化して花型から球状に集合する過程を示す電子顕微鏡写真である。
【図２２】変性した酵素を使った場合と酵素の代わりにアンモニアを使った場合に生成する粒子は本発明のプレート又は花型階層形状を示さないことを比較する電子顕微鏡写真である。
【図２３】ＪＢＵを使った時に本発明方法で得られるマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）と酵素を使わないで得られる生成物のＸ線回折の結果を示すグラフである。
【図２４】実施例１で得られる花型マグネタイト階層構造体のIn  vitroでの細胞取り込み効果を時間経過および濃度変化で評価するグラフである。
【図２５】実施例１で得られる花型マグネタイト階層構造体のIn  vitroでの細胞取り込み効果を市販品と比較した体内動態評価の基礎データ表である。
【図２６】本発明品と従来の市販品の粒子を取り込んだマクロファージの顕微鏡写真で、鉄染色により粒子を青く染めている。
【図２７】各種粒子の種々の濃度での細胞生存率により細胞毒性を評価した試験結果を示すグラフである。
【図２８】マウスにMRI診断時に投与する粒子濃度で静脈注射して脾臓及び肝臓における粒子取り込みを比較するIn  vitroでの細胞取り込み評価を示すグラフである。
【図２９】脾臓における粒子分布の組織解析を示す顕微鏡写真である。
【図３０】肝臓における粒子分布の組織解析を示す顕微鏡写真である。
【図３１】本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）の各種画像と市販チタニアの画像とを比較する写真である。
【図３２】本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）のルチル型単結晶の模式図である。
【図３３】本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）の光触媒活性を従来品と比較したときのグラフである。
【図３４】本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）の光線力学療法への応用可能性を示す細胞死誘導効果の試験結果を示すグラフである。
【図３５】本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）の階層構造体に蛍光色素を修飾し、細胞取り込み効果を確認した光学顕微鏡および蛍光顕微鏡写真で、ａ）は蛍光色素を修飾したTiO2階層構造体を取り込んだ細胞の明視野像、ｂ）は蛍光顕微鏡像、ｃ）は明視野像と蛍光顕微鏡像を重ね合わせた像である。
【図３６】本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）の階層構造体の細胞死誘導メカニズムを解明するための蛍光顕微鏡写真である。
【図３７】Fig．３６における条件を示す表である。
【発を実施するための形態】
【００１６】
好適な実施態様によって、本発明方法を具体的に説明する。
【００１７】
本発明の金属酸化物構造体の調製方法は、Fig．２０に示すようにして実施される。まず、金属塩、尿素、およびＪＢＵを溶解した水溶液を調製する。ＪＢＵは水溶液中でトリマー（三量体）を構成し、ヘキサマー（六量体）を形成する。ヘキサマーはその間隙を反応場として（本発明ではこれをＪＢＵのテンプレート効果という）、尿素を分解し、金属イオンから金属水酸化物を形成し、次いで金属水酸化物は脱水縮合して金属酸化物構造体（２Ｄ）のプレートを形成し、プレートが時間経過とともに自己組織化して集合して３Ｄ構造（花型）を形成し、最終的にプレートが多数集まり、球状に近づく。
【００１８】
すなわち、従来の尿素を用いる均一沈殿法においては、
式： (ＮＨ2)2ＣＯ＋３Ｈ2Ｏ → ２ＮＨ4ＯＨ＋ＣＯ2 （I）
で表される尿素の加水分解後、次いで、水溶液中の金属塩は
式： Ｍn+＋ｎＮＨ4ＯＨ → Ｍ(ＯＨ)n＋ｎＮＨ4+ （II）
で示されるように、尿素の加水分解で得られたアンモニアと金属塩との反応によって金属水酸化物を生成する。
他方、本発明においては、ＪＢＵヘキサマーの反応場のみにおいて、８０℃以下、好ましくは６０℃以下の低温で尿素分解酵素（ウレアーゼ）の作用によって尿素の分解が行われ、金属水酸化物が形成され、その後、反応が進行して脱水縮合し、金属酸化物の二次元構造物（プレート）が形成されることになり、その後自己組織化して三次元構造物を形成する。他方、失活した酵素及びアンモニアを用いても上記プレート及び花型階層構造体（Hierarchical Structure）を形成しない。
【００１９】
従って、通常、水溶液全体において、金属水酸化物の沈殿が見られるウレアーゼの尿素分解を利用する尿素法と異なり、本発明方法によれば、ＪＢＵの反応場のみにおいて、８０℃以下の低温で金属酸化物の二次元または三次元構造体が直接得られることになり、従来、例のないことである。さらに、ＪＢＵによる尿素の分解反応および酸化物形成反応は低温（室温以上約８０℃、好ましくは６０℃以下）の穏やかな条件下で進行し、しかも従来高温度でしか得られなかったルチル型チタン酸化物が形成されることは驚くべきことで、従来の尿素法の反応機構と異なるものと思われる。
【００２０】
したがって、本発明によって提供される、尿素／ＪＢＵの組み合わせを金属酸化物ナノ粒子の構造体の合成に利用する技術は従来知られていない。尿素／ウレアーゼの組み合わせは尿素法として金属塩から水溶液中で金属水酸化物を均一沈殿させる方法として知られているが、ＪＢＵが生体模倣プロセスのテンプレートとして使用され、一対のトリマーで形成される間隙のみが反応場として機能し、金属酸化物のナノ粒子の二次元または三次元構造物を形成する、本発明方法は従来の尿素法における単なる均一沈殿法とは全く異なる。ＪＢＵ以外のウレアーゼは尿素分解酵素として有効であるが、反応場を与えるものでなく、テンプレートとしての効果はない。また、ＪＢＵは一対のトリマーで形成される間隙のみが反応場として機能し、ＪＢＵの間隙以外では尿素分解触媒として機能しないので、これまで尿素法の酵素として使用されたことがない。
【００２１】
本発明の方法によって金属酸化物構造体を調製するための出発物質として用いられる金属塩は、アルミニウム、ガリウム、ジルコニウム、チタン、インジウム、スズ、鉄、ニッケル、コバルト、バナジウム、ニオブ、タンタル、クロムなどの任意の金属の塩である。金属の種類は、金属酸化物の最終的な用途に応じて適宜選択される。この金属塩としては、塩酸塩（塩化物）、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩などの当該分野で用いられる任意の塩が使用され得る。使用される塩の種類は、金属の種類に応じて適宜選択される。例えば、鉄塩としてはFeCl2.4H2O,亜鉛としてはZnCl２、チタンとしてはTiCl4,銅としてはCuCl,ニッケルとしてはNiCl2・6H2O，コバルトとしてはCoCl2・6H2Oなどの塩酸塩が好ましく、ガドリウムとしてはGd(CH3COO)3の酢酸塩が好ましい。
【００２２】
本発明によれば、金属酸化物構造体は、まず金属塩、尿素、およびＪＢＵを含む水溶液を調製し、次いでこの水溶液から金属水酸化物をＪＢＵトリマーの間隙に選択的に沈殿させ、これを脱水縮合させることによって調製される。水溶液は単に各成分を混合することによって調製され得る。各成分を加える順序は重要ではないが、通常、金属塩と尿素とを含む水溶液を調製し、この水溶液にＪＢＵを加えることに-よって調製される。水溶液は、本発明の目的に好ましくない影響を与えない限り、水に加えてアルコールなどの水溶性溶媒を含有し得る。また、水溶液は、上記成分に加えて、本発明の目的に好ましくない影響を与えない限り、必要に応じて任意の他の成分、例えば沈殿形成を制御するための塩類などを含有し得る。これらの任意成分は、必要に応じて当業者が適宜選択し得る。
【００２３】
この水溶液における金属塩の初期濃度は金属の種類によって異なるが、好適には２〜500mmol/L、より好適には５〜200mmol/L程度である。金属塩の初期濃度が低すぎると沈殿が生成しにくく、他方、初期濃度が高すぎると沈殿が完結しない場合がある。
【００２４】
尿素は、金属塩に対して等量で水溶液中に含まれることが好ましい。好適には、水溶液は初期濃度で、金属塩１モルに対して約１〜２モルの尿素を含む。また、上述のように尿素はＪＢＵの反応場に適切に供給されればよく、過剰に存在する必要がない。
【００２５】
本発明の方法において用いられるＪＢＵはジャックビーンズ由来のウレアーゼ（タチナタマメウレアーゼ）として市販されている。水溶液におけるＪＢＵの初期濃度は、尿素の分解が急激に進まない程度に低くすることが好ましい。後述の実施例で示されるように、本発明の方法によれば、金属酸化物構造体の沈殿形成速度は金属塩濃度が一定であれば尿素濃度には依存せずＪＢＵ濃度に依存する。従って、ＪＢＵの濃度は0.625〜10mg/ml（0.08〜1.25Ｕ（ユニット）/Ｌ程度）に調節することにより、得られる金属酸化物構造体の粒径を広い範囲で制御することが可能となる。
【００２６】
金属塩、尿素、およびＪＢＵを含む水溶液を上述のように調製すると、ＪＢＵによる尿素の分解によるアンモニアの生成に伴って、金属酸化物構造体の沈殿が徐々に進行する。この反応は、通常、金属塩、尿素、およびＪＢＵを含む水溶液を調製した後、これを室温付近から８０℃好ましくは６０℃の範囲の温度条件下に、静置またはゆるやかに撹拌しながら保持することによって進行する。ＪＢＵによる尿素の分解が進行するにつれて水溶液のｐＨの緩慢な上昇および金属酸化物構造体の沈澱析出が確認できる。前述のように、沈澱生成が完結するのに要する時間は、金属塩濃度が一定の場合、ＪＢＵ濃度に依存する。
【００２７】
以下、実施例と比較例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
〔実施例１〕
【００２８】
鉄塩としてはFeCl2.4H2O及び尿素をそれぞれ0.2 mol/lの割合で水に溶解し、次いでウレアーゼとしてはＪＢＵ（和光純薬製）０．６２５から５ｇ/ｌの範囲で溶解し、６０℃で24時間放置した。その後水洗して酸化物構造体を取り出し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観測を行うとともに、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。シート膜厚は約２５nmであった。
Fig．1には実施例１で製造された鉄酸化物の二次元シートが階層構造を形成して構築された三次元構造物の詳細を示すＳＥＭ像に示すとともに、Fig．２には実施例１で製造された鉄酸化物の三次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
〔比較例〕
【００２９】
鉄塩としてはFeCl2.4H2Oをアンモニア水（アンモニア28%含有）に0.2mol/lで溶解し、60℃で24時間放置した。その後水洗して酸化物構造体を取り出し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。Fig．3には比較例で製造された鉄酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。これよりアンモニアでは２Ｄ、３Ｄ構造は形成できないことが分かる。
〔実施例２〕
【００３０】
放置温度を３７℃とする以外は実施例１と同様にして生成物の形状を二次元構造物の詳細を示すＴＥＭで観測し、そのＴＥＭ像をFig．４に示す。非常に薄いシートが形成されていることが分かる。
実施例１及び２で得られた構造体のＸＲＤを検査すると、Fig．５に示す通りであった。これより、いずれの構造体もＦｅ３Ｏ４の単相であることが分かった。
次いで、実施例１及び２で得られる構造体の磁化曲線を調べた。
Ｆｉｇ．６及び７は実施例１及び２の磁化曲線を示す。実施例１の６０℃での構造体は飽和磁化５４ｅｍｕ／ｇ・残留磁化４.８ｅｍｕ／ｇ・保磁力７２Oeであった。実施例２の３７℃での構造体は飽和磁化４３ｅｍｕ／ｇ、残留磁化０ｅｍｕ／ｇ、保磁力０  Oeであった。60℃で合成した構造体のほうが37℃で合成した構造体よりも飽和磁化が高いのは、より高温で処理しているためである。一方、残留磁化及び保磁力は、37℃で合成した構造体はゼロという超常磁性を示す。これは、形状異方性による効果である。37℃で合成した構造体は2次元的に幅広く広がったシート構造をとるため異方性が出るが、60℃で合成した構造体は異方性を持つプレートが自己集合することにより、異方性を打ち消しているためである。
〔実施例３〕
【００３１】
チタン金属塩としてはTiCl4を用いる以外は実施例１と同様にして６０℃でチタン酸化物構造体を生成した。Fig．８は実施例３で製造されたチタン酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。扁平な紡錘状（２Ｄ）粒子からなる花型３Ｄ階層構造を形成していることが分かる。
〔実施例４〕
【００３２】
チタン金属塩としてはTiCl4を用いる以外は実施例２と同様にして３７℃でチタン酸化物構造体を生成した。Fig．９は実施例４で製造されたチタン酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。花型階層構造を形成する途中であって、扁平な紡錘状（２Ｄ）粒子が少しづつ集まっていき３Ｄ階層構造を形成することが分かる。
【００３３】
Fig．１０は実施例３で製造されたチタン酸化物の二次元構造物の詳細を示すＸＲＤ図形を示し、Fig．１１は実施例４で製造されたチタン酸化物の二次元構造物の詳細を示すＸＲＤ図形を示す。ともにＴｉＯ２が生成していたが、結晶形態は温度により異なっていた。実施例３の６０℃の生成物はルチルとアナターゼの混相であった。一方、実施例４の３７℃の生成物はほぼルチル単相であった．ルチルは一般に６００℃以上の高温でないと合成することができないが、本研究では３７℃で合成することができている。今まではアナターゼが光触媒活性を示すが、ルチルは光触媒活性を示さないと言われてきた。しかし、本合成法は低温で合成できるため、広い比表面積を維持することができ、ルチルでも光触媒活性を示す可能性がある。BET法により測定した比表面積は60℃で合成したTiO2が218.5 m2/g、37℃で合成したTiO2が131.5 m2/gであった。
市販のTiO2（Degussa P-25）（平均粒径21nm）の比表面積は35-45 m2/gであるため、本合成法により得られたTiO2の比表面積は市販品より約4〜6倍大きいことが分かる。本合成で得られる粒子は表面積が広いため、高い光触媒活性を示すことが期待できる。
〔実施例５及び６〕
【００３４】
亜鉛金属塩としてZnCl２を用いる以外は実施例１及び２と同様にして亜鉛酸化物構造体を生成する。Fig．１２は６０℃で放置した実施例５で製造された亜鉛酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示し、Fig．１３は３７℃で放置した実施例６で製造された亜鉛酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。いずれも非常に薄いシート状であることがわかる。
〔実施例７〕
【００３５】
ニッケル金属塩としてNiCl2・6H2Oを用いる以外は実施例１と同様にしてニッケル酸化物構造体を生成する。Fig．１４は実施例７で製造されたニッケル酸化物の三次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。扁平なロッド状（２Ｄ）粒子からなる３Ｄ階層構造を構築していることが分かる。
〔実施例８及び９〕
【００３６】
銅金属塩としてはCuCl以外は実施例１及び２と同様にして銅酸化物構造体を生成する。Fig．１５は６０℃で放置した実施例８で製造された銅酸化物、３７℃で放置した実施例９で製造された銅酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。いずれも３Ｄ花型構造を形成していることがわかる。
〔実施例１０及び１１〕
【００３７】
コバルト金属塩としてはCoCl2・6H2Oを使用する以外は実施例１及び２と同様にしてコバルト酸化物構造体を生成する。Fig．１６は実施例１０で製造されたコバルト酸化物の三次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示し、Fig．１７は実施例１１で製造されたコバルト酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示す。
〔実施例１２〕
【００３８】
ガドリウム金属塩としてはGd(CH3COO)3の酢酸塩を使用する以外は実施例２と同様にしてガドリウム酸化物構造体を生成する。Fig．１８は実施例１２で製造されたガドリウム酸化物の二次元構造物の詳細を示すＴＥＭ像を示し、Fig．１９はガドリウム酸化物構造体の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を示す。
Ｔ１強調画像では１０〜１００μｇ／ｍｌのとき信号強度増強しており、陽性造影剤として働くことが分かる。
Ｔｌ強調画像では５００〜１０００μｇ／ｍｌのとき、信号強度低下しており、陰性造影剤として働くことが分かる、Ｔ２強調画像では１０〜１０００μｇ／ｍlで信号強度が低下しており、陰性造影剤として働くことが分かる。
＜Ｆｅ３Ｏ４に関する性能試験＞
【００３９】
本発明で生成した花型Ｆｅ３Ｏ４階層構造体はマクロファージによる貪食（取り込み）を回避することができるということが分かった。これまでの薬物輸送（DDS）やMRI造影剤の開発には球状粒子やリポソームが用いられてきたが、これらの材料では体内に注射すると異物として認識され、目的とする部位に達するまでにマクロファージに貪食されてしまうという問題があった。また、ポリエチレングリコールを修飾し貪食を回避する試みがなされているが、投与量の9割は貪食されてしまい、1割以下しか目的部位に到達しないという問題があった。このため、貪食回避はDDSやMRIを達成するために必要不可欠な技術であり、世界中の研究者が注力している技術である。本研究は形状により貪食を回避し、これが可能であることを動物実験で証明した。
【００４０】
花型マグネタイト階層構造体はFig．２１に示すように、JBUのテンプレート効果によりプレートが生成され、時間経過とともにプレートが自己組織化し、花形になっていき、最終的にはプレートが多数集まり、球状に近づく。これを本明細書では花型階層構造体（Flower-like Hierarchical Structure）と称する。階層構造体のサイズはプレートの自己集合を制御することで調整が可能である。
【００４１】
Fig．２２は以下の条件で鉄酸化物マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）を変性したJBUを使った場合とJBUの代わりにアンモニアを使った場合で生成する粒子の形状を比較した。JBUを１００℃で２４時間処理して変性させてから使用した場合、変性したJBUの中にナノサイズの粒子が存在しているのが確認された。尿素とJBUを使用せずにアンモニアを使用した場合、球状粒子しかできず、JBUがテンプレートとして必要であることが証明された。変性したJBUは本来のJBUの構造を保つことができないためテンプレートとして働かず、そして酵素活性も失われるためアンモニアも発生しない。変性したJBUを用いた場合は、ナノサイズの球状ヘマタイト（a-Fe2O3）ができたことを示し、JBUの構造と酵素活性がテンプレート及び触媒として働いていることが証明される。
（試験方法）
実施例1と同様の方法で合成し、JBUの変わりに変性したJBUを用いた。鉄塩としてはFeCl2.4H2O及び尿素をそれぞれ0.2 mol/lの割合で水に溶解し、次いでウレアーゼとしてはＪＢＵ（和光純薬製）０．６２５から５ｇ/ｌの範囲で溶解し、６０℃で24時間放置した。その後水洗して酸化物構造体を取り出し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観測を行うとともに、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。シート膜厚は約２５nmであった。
【００４２】
ＪＢＵを使った時に本発明方法で得られる実施例１のマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）と酵素を使わないで得られる生成物のＸ線回折の結果をFig．２３に示す。この結果より、酵素（ＪＢＵ）を用いた場合に強磁性体のＦｅ３Ｏ４（マグネタイト）が得られ、酵素を用いない場合は特に使用用途のないAkaganeiteしか得られない。酵素がＦｅ３Ｏ４作成の触媒として働いているのが証明された。
【００４３】
本発明方法によれば、種々の金属酸化物を水溶液中で直接製造することができることはFig.８,１４,１５及び１６で示した通りである。本発明で製造される金属酸化物はＪＢＵを使用する方法によって得られるため、焼成するとおよそ２０％の重量損失が生まれるため、失活酵素を粒子間に含んでいる。したがって、製造後失活酵素を除去する作業後にも痕跡として失活酵素を含むナノ粒子金属酸化物からなる二次元または三次元単結晶構造物となる。
【００４４】
本発明方法で製造されるマグネタイトのIn  vitroでの細胞取り込みを評価した。細胞内に取り込まれた酸化鉄粒子を青く染色し、青色（波長４３０ｎｍ）の吸光度を測定することで、細胞内に取り込まれた粒子の量を見積もった。細胞としてマクロファージを用い、吸光度差Ａ−Ａ０を測定した。Fig．２４は各粒子のIn  vitroでの細胞取り込み効果を時間経過および濃度変化で評価するグラフである。
ここで、Ａ０は細胞だけの場合の波長４３０ｎｍの吸光度で、Ａは粒子を取り込んだ細胞の場合の波長４３０ｎｍの吸光度である。
本発明の粒子はHSs、従来品はKC及びResovistで示す。本発明のHSｓは長時間、高濃度条件でも吸光度差が非常に小さいが、従来品KC（Kishida Chemical Co.の鉄酸化物粒子）及びResovist（現在使用されているMRI造影剤）はよくマクロファージに取り込まれることがわかった。三者の体内動態評価の基礎データ表をFig．２５に示す。ここで、HDとはHydrodynamic Diameterを示し、ZPはZeta  potentialを示す。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中での粒子サイズはここでの粒子が生体内でこのサイズで存在していると考えられる。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でのゼータ電位は生体内で各粒子がこのゼータ電位で存在していると考えられる。かかる特性比較から本発明のHSｓとKCはほぼ同じサイズで生体内で存在しているが現行のMRI造影剤はかなり小さい。すべての粒子についてゼータ電位は負であり、値もほぼ同じと考えられ、生体内での表面電荷に違いはほとんどない。粒子を取り込んだマクロファージの顕微鏡写真を見ると（Fig．２６）、マクロファージに取り込まれた粒子は鉄染色により粒子を青く染めているので、本発明のHSｓはマクロファージにほとんど取り込まれていないが、KCや現行のMRI造影剤ではほとんどすべての細胞に取り込まれていることがわかる。これより本発明のHSｓは貪職回避能力に優れ、優れたMRI造影効果が期待される。そこで、動物実験でマクロファージの貪食回避能力を評価した。次いで、各種粒子の種々の濃度での細胞生存率により細胞毒性を評価した。Fig．２７はマウスにMRI診断時に投与する粒子濃度（０．８mg/kg）で静脈注射して脾臓及び肝臓における粒子取り込みを比較した。マウスに0.8 mg/kgの粒子濃度で静脈注射したが、この濃度はMRI診断のときに投与する量と同じである。
マクロファージが最も多い臓器である脾臓と肝臓の粒子取り込みを調べた。脾臓と肝臓を等量50 mg切り取り、生理活性食塩水1.4 mLに入れ、ホモジナイズして（すり潰して）吸光度を測定した。
その結果、本発明のHSｓは脾臓及び肝臓にほとんど蓄積していないが、従来のKC及びResovistは大量に脾臓及び肝臓に蓄積している。この結果はFig.２９及び３０の組織分析によって追認される。即ち、Fig.２９ではKC及びResovistはMZ（辺縁帯：マクロファージがいる領域）に偏在しているが、本発明のHSｓはMZでなく、TL（脾柱）の血管内にいる。これにより本発明のHSｓは貪食を回避していることが組織学的に証明される。またFig.３０では、本発明のHSｓはS（類洞：マクロファージがいる領域）にはほとんどいないが、クッパー細胞はディッセ腔に存在するため、KCやResovistは肝細胞索に付着しているように見えるが、本発明のHSｓは血管内を漂っている。これは貪食を回避していることを証明している。
さらに、In  vitroでの細胞取り込み評価を示す試験結果をFig.２７に示す。本発明のHSｓはマクロファージにほとんど取り込まれていないため、毒性が低く、現行のMRI造影剤よりも毒性が低いので本発明の鉄酸化物は医療応用において問題がないと思われる。また、HSsをマウスに投与してから一ヶ月経過しても、マウスは生存しており、体重変化はHSsを投与しないものと比べて変化がなかった。  なお、肝細胞索：肝臓を主に形成している肝細胞の列、類洞：肝細胞索の間を走る毛細血管、ディッセ腔：類洞の内皮と肝細胞索の間にある隙間、クッパー細胞：ディッセ腔に偏在しているマクロファージを意味する。
【００４５】
＜ＴｉＯ２に関する性能＞
本発明方法で生成したＴｉＯ２階層構造体の表面は光触媒活性を向上させるような結晶面｛（110）面｝が豊富であるため、光触媒活性が市販品に比べて優れていることが分かった。光触媒性能評価を調べるために、JIS規格に基づいてアセトアルデヒドの分解効率を市販品と比較したところ10倍以上分解効率が良いことが明らかになり、光線力学療法の光増感剤として応用可能であることが分かった。従来の光増感剤は有機分子であり、静脈注射すると体全体に拡散してしまうという問題や、光に当たらないように暗室で数日間過ごさなければいけないという問題があったが、ナノ粒子化することでガン組織に集まりやすくなり、目的とする部位だけを治療できるという利点がある。
Fig．３１は本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）の各種画像と市販チタニアの画像とを比較する写真である。a)酸化チタン階層構造体の走査型電子顕微鏡（SEM）画像,b, c) 透過型電子顕微鏡（TEM）画像,d)電子線回折,e)高分解能透過型電子顕微鏡（HRTM）画像である。市販の酸化チタン粒子と比較すると、市販品は特定の結晶面が表面に出ていないが、本発明の酵素（JBU）を使って合成したものは市販のものとは形状・結晶成長が全く異なり、（110）面が豊富な表面構造を持つことが分かった。
Fig．３２は本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）のルチル型単結晶の模式図である。隣接するTi原子間の距離の値から今見えている面が(110)面であることが分かり、TiO2階層構造体の表面が主に（110）面で占められていることが分かる。また、ルチル結晶が[001]軸方向に伸びていること、つまり（110）面に平行に結晶成長していることが分かる。このような特定の方向への結晶成長や表面は市販のものとは明らかに異なる。市販品はランダムな方向への結晶成長であり、特定の結晶面が出ているのではない。
次いで、JIS規格R 1701-2に基づきアセトアルデヒドの除去効率を調べた。供給するアセトアルデヒドの濃度（約5 ppm）とし、UV照射後のアセトアルデヒドの濃度を測定した。Fig．３３は本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）の光触媒活性を従来品と比較したときのグラフである。これより、本発明のTiO2階層構造体はアセトアルデヒドの除去効率が市販品より10倍以上高いことが分かった。これはTiO2階層構造体の表面が光触媒活性を向上させる結晶面（110）でほとんど占められているためであると思われる。（110）面の有効性を実験的に証明することができた。
光線力学療法への応用のために、細胞死誘導効果を調べた。
TiO2階層構造体を細胞に取り込ませて、UV光を照射し、細胞死誘導効果を調べた。Fig．３４は本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）の光線力学療法への応用可能性を示す細胞死誘導効果の試験結果を示すグラフである。縦軸は細胞生存率であり、この値が低いほど、細胞死が効率的に誘導されていることを示す。本発明のTiO2階層構造体は光触媒活性が強く効率的に活性酸素を出すことができるため、UV照射することで効率的に細胞死を誘導することができることが分かった。これによりがん治療、動脈硬化治療への応用が期待できる。
次いで、細胞がTiO2階層構造体を取り込んでいることをTiO2階層構造体に蛍光色素を修飾し、蛍光顕微鏡で観察した。Fig．３５は本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）の階層構造体に蛍光色素を修飾し、細胞取り込み効果を確認した細胞取り込み効果を確認した光学顕微鏡および蛍光顕微鏡写真で、ａ）は蛍光色素を修飾したTiO2階層構造体を取り込んだ細胞の明視野像、ｂ）は蛍光顕微鏡像、ｃ）は明視野像と蛍光顕微鏡像を重ね合わせた像である。  これより完全にTiO2階層構造体が細胞に取り込まれていることを確認した。
細胞死誘導メカニズムの解明を試みた。結果をFig．３６に示す。本発明に係る実施例で製造したチタニア（TiO2）の階層構造体の細胞死誘導メカニズムを解明するために、
DAPI: 生きている細胞も死んだ細胞も青く染める
Annexin V: アポトーシスで死んだ細胞を緑に染めるが、ネクローシスの場合も一部染まる
7-AAD: ネクローシスで死んだ細胞を赤く染める
ことにより、Fig.38の結果を得た。
なお、アポトーシスは細胞の自殺であり、ネクローシスは周りを巻き込んだ細胞死であり、ネクローシスは周りの正常な細胞も巻き込んで死ぬため、アポトーシスで死滅してくれることが望ましい。
Fig．３７はFig．３６における条件を示す表である。
上記結果から、UV照射だけではネクローシスが誘導されるが、 TiO2階層構造体を用いることでアポトーシスを誘導することができるようになることが分かった。これは光線力学療法に望ましい特徴であることを示す。
【図５】
2012026194.tif 000003
【図６】
2012026194.tif 000004
【図７】
2012026194.tif 000005
【図１０】
2012026194.tif 000006
【図１１】
2012026194.tif 000007
【図３３】
2012026194.tif 000008
【図３４】
2012026194.tif 000009
【図３７】
2012026194.tif 000010
【図１】
2012026194.tif 000011
【図２】
2012026194.tif 000012
【図３】
2012026194.tif 000013
【図４】
2012026194.tif 000014
【図８】
2012026194.tif 000015
【図９】
2012026194.tif 000016
【図１２】
2012026194.tif 000017
【図１３】
2012026194.tif 000018
【図１４】
2012026194.tif 000019
【図１５】
2012026194.tif 000020
【図１６】
2012026194.tif 000021
【図１７】
2012026194.tif 000022
【図１８】
2012026194.tif 000023
【図１９】
2012026194.tif 000024
【図２０】
2012026194.tif 000025
【図２１】
2012026194.tif 000026
【図２２】
2012026194.tif 000027
【図２３】
2012026194.tif 000028
【図２４】
2012026194.tif 000029
【図２５】
2012026194.tif 000030
【図２６】
2012026194.tif 000031
【図２７】
2012026194.tif 000032
【図２８】
2012026194.tif 000033
【図２９】
2012026194.tif 000034
【図３０】
2012026194.tif 000035
【図３１】
2012026194.tif 000036
【図３２】
2012026194.tif 000037
【図３５】
2012026194.tif 000038
【図３６】
2012026194.tif 000039
【国際調査報告】
2012026194.tif 000040
2012026194.tif 000041
2012026194.tif 000042
2012026194.tif 000043
2012026194.tif 000044
2012026194.tif 000045