(57)【要約】本発明により、カロテノイド色素の産生能を有する新規な細菌、及び該細菌を利用するカロテノイド色素の製造方法が提供される。本発明は、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＪＰＣＣ  ＭＢ００１７−６株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８）；かかる細菌株を培養して得られた培養物；かかる培養物から分離されたカロテノイド色素含有組成物；前記細菌株を培養する工程を有するカロテノイド色素の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＪＰＣＣ  ＭＢ００１７−６株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８）。
【請求項２】
請求項１に記載の細菌株を培養して得られた培養物。
【請求項３】
請求項２に記載の培養物から分離されたカロテノイド色素含有組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の細菌株を培養する工程を有するカロテノイド色素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌の新規変異株、該変異株を利用して得られた培養物及びカロテノイド色素含有組成物、並びに該変異株を利用するカロテノイド色素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチンやβ−カロテン等をはじめとする各種カロテノイド色素は、多くの生理活性を有しており、サプリメント食品の原料として有用である。一方、近年の天然資源の減少により、これら天然資源の養殖が期待されており、魚介類の人口種苗生産においては、対象種に対して高い餌料効果や付加価値を付与する飼料が求められている。このような中、タイやサケ等の養殖魚の色調をより天然のものに近付けるために、アスタキサンチンを配合した飼料（色揚げ飼料）が使用されることがある。また、タイやニジマス等の体色の鮮やかさが求められる魚種に対しては、アスタキサンチン等の色素を配合した飼料が使用されることがある。【０００３】
色揚げ飼料の添加物としてのアスタキサンチンは、カロリーピンク（合成アスタキサンチン）としてロッシュ社から販売されている。しかし、トレーサビリティーの問題や利用者の天然物志向から、天然由来のアスタキサンチンが注目されている。
アスタキサンチンは、マダイ、サケ等の魚類；カニ、エビ、オキアミ等の甲殻類に広く分布している。そこで、天然由来のアスタキサンチンを得る方法として、甲殻類からアスタキサンチンを抽出する方法が提案されている。しかし、抽出効率が低いため抽出量が少なく、コストが高くなるという問題点があった。また、天然資源の減少から、資源確保の点でも商業的に問題点があった。【０００４】
一方、アスタキサンチンを産生する微生物として、緑藻であるＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓが最も良く知られており、その他にも、赤色酵母であるＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓ （旧Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が知られている。Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓのアスタキサンチン産生量は、４３ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔ程度であることが報告されている（非特許文献１参照）。また、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓ（旧Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）のアスタキサンチン産生量は、０．４ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔ程度であることが報告されている（非特許文献２参照）。【０００５】
そこで、飼料に天然由来のアスタキサンチンを配合する方法として、Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓやＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓをそのまま配合する方法が提案されているが、着色が十分でないなどの問題点があった。これは、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓやＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓの細胞壁が厚いために、対象魚種での消化・吸収率が低いことが原因であった。そこで、吸収率の高い新たな微生物が求められている。【０００６】
原核細胞である細菌は、広い基質利用能力を有し、簡単な培養で高い生育速度を示し、酵母のような厚い細胞壁を有しないことから、有用物質の生産において最も期待される微生物の一つである。これまでに、細菌によるアスタキサンチンの産生では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの遺伝子組換え体で、１．４ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔが達成されている（非特許文献３参照）。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓでは、０．０５ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔの産生量が達成されている（非特許文献４参照）。さらに、海洋細菌であるＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＭＢＩＣ１１４３では、０．１４ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔの産生量が報告されている（非特許文献５参照）。しかし、これら遺伝子組換え体によるアスタキサンチンの産生には、発現量等で問題点があった。
そこで、アスタキサンチンを産生する細菌が探索され、これまでに、フラボバクテリウム属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、アルテロモナス属、ピポモナス属、カリオファノン属、エリスロバクター属、パラコッカス属等に属する細菌が報告されている。【０００７】
また、本発明者らは、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌であるＪＰＣＣＭＢ００１７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−４８）が、カロテノイド色素産生能を有することを、これまでに報告している（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−１９１９１９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】リー及びソー（Ｌｅｅ，Ｙ．−Ｋ．ａｎｄ  Ｓｏｈ，Ｃ．−Ｗ．）、「ジャーナル・オブ・ファイコロジー（Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．）」、米国、1991年、第２７巻、第３号、ｐ．５７５−５７７
【非特許文献２】フローレス-コテラら（Ｆｌｏｒｅｓ−Ｃｏｔｅｒａ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．）、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、米国、２００１年、第５５巻、第２号、ｐ．３４１−３４７
【非特許文献３】ワンら（Ｗａｎｇ，Ｃ．−Ｗ．ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．）、米国、１９９９年、第６２巻、第３号、ｐ．２３５−２４１
【非特許文献４】ヨコヤマら（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、米国、１９９４年、第５８巻、第１０号、ｐ．１８４２−１８４４
【非特許文献５】ペインら（Ｐａｎｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジー・リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．）、米国、１９９６年、第２２巻、ｐ．３０３−３０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、アスタキサンチンをはじめとする各種カロテノイド色素の産生能を有する細菌は、まだ十分に探索されているとは言えず、より産生効率が高いカロテノイド色素の製造方法の開発が強く望まれている。
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、カロテノイド色素の産生能を有する新規な細菌、及び該細菌を利用するカロテノイド色素の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討の結果、以下の発明を完成させるに至った。
（１）スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＪＰＣＣ  ＭＢ００１７−６株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８）。
（２）（１）に記載の細菌株を培養して得られた培養物。
（３）（２）に記載の培養物から分離されたカロテノイド色素含有組成物。
（４）（１）に記載の細菌株を培養する工程を有するカロテノイド色素の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、カロテノイド色素の産生能を有する新規な細菌、及び該細菌を利用するカロテノイド色素の製造方法が提供される。また、本発明の細菌は、カロテノイド色素の産生能が高いので、高品質のカロテノイド色素を簡便且つ大量に製造できる。その結果、安価なカロテノイド色素を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＪＰＣＣ  ＭＢ００１７−６株及びＪＰＣＣＭＢ００１７株のコロニーの撮像データである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳しく説明する。
本発明のスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＪＰＣＣ  ＭＢ００１７−６株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８）は、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＪＰＣＣＭＢ００１７株の変異株である。以下、本明細書において、「スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＪＰＣＣＭＢ００１７株」のことを「野生株」と略記することがある。また、「スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＪＰＣＣ  ＭＢ００１７−６株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８）」のことを「変異株」と略記することがある。
また、本発明において、「カロテノイド色素」とは、炭素数４０のポリエン構造を基本骨格とする色素のことを指し、カロテン、リコペン等の炭化水素や、キサントフィル等のアルコール類を含み、β−カロテン、アスタキサンチン、β−カロテンがアスタキサンチンに変換される過程で生じる種々の有用なカロテノイド色素が例示できる。
カロテノイド色素として、より具体的には、カロテン、リコペン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、ハイドロエキネノン、ルテイン、フコキサンチン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン、β−クリプトキサンチン等が例示できる。
【００１５】
＜変異株の獲得＞
本発明の変異株は、野生株に対して、ケミカルミューテーションを行うことで獲得した。より具体的には、以下の通りである。
【００１６】
（野生株の獲得）
野生株は、本出願人により、平成１６年１２月３日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号  ２９２−０８１８））に寄託されている（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−４８）。
また、本発明者らは、寄託にあたり野生株を天然より獲得しており、以下にその獲得手順を示す。
【００１７】
海洋環境やマングローブ林より採取した海砂、泥、水などからアスタキサンチン及びスフィンゴ糖脂質を産生する微生物の獲得を試みた。酵母エキス５．０ｇ／ｌ、ペプトン１．０ｇ／ｌ、グルコース５．０ｇ／ｌを人工海水（千寿製薬社製）に添加して作製した寒天プレートに、１００μｌのサンプルを塗布した。
【００１８】
２５℃の条件下で７〜１０日間静置培養を行い、オレンジ、赤色のコロニーを形成する海洋微生物を獲得した。これらの微生物を単菌化するため、５ｍｌの上記成分を含む液体培地中に植菌し、１５０ｒｐｍで震とう培養して微生物を生育させ、これを寒天プレートに塗布してコロニーを形成させる操作を繰り返した。
【００１９】
約５０株の海洋細菌からなる菌体粉末０．３ｍｇから、クロロホルム：メタノール＝１：１の溶液で色素及び脂質を抽出し、アスタキサンチン及びスフィンゴ糖脂質のスクリーニングを行った。野性株は、スフィンゴ糖脂質の産生能も有している。
【００２０】
アスタキサンチン及びスフィンゴ糖脂質の有無については、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）を用いて評価した。その結果、唯一アスタキサンチンとスフィンゴ糖脂質を産生する菌株を同定し、これを寄託した（ＪＰＣＣＭＢ００１７株）。
【００２１】
野生株は、絶対好気性グラム陰性の桿菌である。１６Ｓ  ｒＤＮＡの系統解析より、この野生株は、α−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属し、スフィンゴモナス属とクラスターを形成し、スフィンゴモナス属の特徴であるスフィンゴ脂質も含むことから、スフィンゴモナス属の細菌であることが確認されている。
【００２２】
（ケミカルミューテーション）
野生株に対して、下記手順でＤＮＡアルキル化剤を使用したケミカルミューテーションを行った。
まず、野生株をマリンブロス（Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ、以下、ＭＢと略記することがある）２２１６培地（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で２４時間培養し、遠心分離により回収した。
次いで、１×１０９ｃｅｌｌｓのＪＰＣＣＭＢ００１７株を、１．０〜５．０％のエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）を含む、ｐＨ７．０の１５ｍＭリン酸緩衝液１ｍｌ中で、３０℃にて３０〜６０分間インキュベートし、突然変異誘導を行った。
次いで、得られた菌体をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略記する）で二回洗浄した後、前記ＭＢ２２１６培地で、３０℃にて２時間、復活培養した。
次いで、ＰＢＳで洗浄した後、得られた菌体をＭＢ寒天培地に塗布し、３０℃にて３〜７日間インキュベートした。
以上により、変異株を獲得した。
【００２３】
また、１．０〜５．０％のエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）を含む、ｐＨ７．０の１５ｍＭリン酸緩衝液に代わり、５．０〜１０％のＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を含む、ｐＨ７．０の１５ｍＭリン酸緩衝液を使用したこと以外は、上記と同様の手順でも、変異株を獲得した。
【００２４】
＜変異株の性質＞
獲得した変異株の性質は、コロニーの色以外は、すべて野生株と同じであった。より具体的には、以下の通りである。
【００２５】
（１）形態学的性質
細胞の形状：桿菌
細胞の大きさ：（０．６−０．７）×（２．０−３．０μｍ）（伸長型有り）
胞子の有無：−
運動性（鞭毛の着生状態）：−
多形性：−
【００２６】
（２）培養的性質
（２−１）培地：マリンアガー（マリンブロス２２１６（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）＋１．５％寒天）
温度：２５℃
色素産生：＋
色調：赤色
光沢：＋
（２−２）培地：マリンブロス２２１６
温度：２５℃
表面発育：−
培地の混濁：＋
（２−３）ゼラチン穿刺培養
温度：２５℃
生育：−
ゼラチン液化：−
（２−４）リトマス・ミルク
温度：２５℃
凝固：−
液化：−
【００２７】
野生株のコロニーはオレンジ色であるのに対し、変異株のコロニーは、上記のように赤色であり、色調の点で変異株は野生株と明確に区別できる。図１に変異株及び野生株のコロニーの撮像データをそれぞれ示す。図１中、右側が変異株のコロニーであり、左側が野生株のコロニーである。
【００２８】
（３）生理学的性質
グラム染色性：−
硫酸塩の還元：＋
脱窒反応：−
ＭＲテスト：−
ＶＰテスト：＋
インドール産生：−
硫化水素の生成：−
デンプンの加水分解：−
クエン酸の利用（Ｋｏｓｅｒ）：−
クエン酸の利用（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）：−
無機窒素源の利用（硝酸塩）：−
無機窒素源の利用（アンモニウム塩）：−
ウレアーゼ：−
カタラーゼ：＋
オキシダーゼ：＋
生育（ｐＨ５）：−
生育（ｐＨ８）：＋
生育（ｐＨ９）：＋
生育（２０℃）：＋（弱）
生育（２５℃）：＋
生育（３０℃）：＋
生育（３７℃）：＋（弱）
生育（塩濃度０％）：−
生育（塩濃度１％）：＋（弱）
生育（塩濃度２％）：＋
生育（塩濃度３％）：＋
生育（塩濃度７％）：＋（弱）
生育（塩濃度１０％）：−
嫌気的生育性：−
Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）：−／−
【００２９】
糖類からの酸産生／ガス産生
Ｌ−アラビノース：−／−
Ｄ−グルコース：−／−
Ｄ−フラクトース：−／−
マルトース：−／−
ラクトース：−／−
Ｄ−ソルビトール：−／−
イノシトール：−／−
Ｄ−キシロース：−／−
Ｄ−マンノース：−／−
Ｄ−ガラクトース：−／−
サークロース：−／−
トレハロース：−／−
Ｄ-マンニトール：−／−
グリセリン：−／−
【００３０】
（４）その他の生理学的性質
β−ガラクトシダーゼ活性：＋
アルギニンジヒドラーゼ活性：−
リジンデカルボキシラーゼ活性：−
トリプトファンデアミナーゼ活性：−
ゼラチナーゼ活性：−
エスクリン分解活性：＋（弱）
馬尿酸の分解活性：−
マロン酸利用性：−
オルニチン脱炭酸反応：−
フェニルアラニン脱アミノ反応：−
コアグラーゼ活性：−
溶血性：−
フォスファターゼ活性：＋
リパーゼ活性：＋
レシチナーゼ活性：−
チトクロームオキシダーゼ活性：＋
【００３１】
（５）資化性試験
ブドウ糖：陰性
Ｌ−アラビノース：陰性
Ｄ−マンノース：陰性
Ｄ−マンニトール：陰性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性
マルトース：陰性
グルコン酸カリウム：陰性
ｎ−カプリン酸：陰性
アジピン酸：陰性
ｄ１−リンゴ酸：陰性
クエン酸ナトリウム：陰性
酢酸フェニル：陰性
【００３２】
（６）化学分類学的性質
ＤＮＡ塩基組成（ＧＣ含量）：５９．１モル％
菌体脂質分析
主要キノン：ユビキノンＱ−１０
脂肪酸：
１０：０  ３ＯＨ  ０．２６％
１２：０  ２ＯＨ  ０．１３％
１２：０  ３ＯＨ  ０．３０％
１４：０  ０．１７％
１３：０  ２ＯＨ  ０．２４％
１５：０  １．３２％
１４：０  ２ＯＨ  ３．０５％
１６：０  ５．８２％
１５：０  ２ＯＨ  ２．５８％
１７：０  ＩＳＯ  ０．０８％
１７：１  ｗ８ｃ  ２．８３％
１７：１  ｗ６ｃ  ２．９５％
１７：０  １．３９％
１６：１  ２ＯＨ  ０．０９％
１６：０  ２ＯＨ  １．４０％
１８：１  ｗ７ｃ  ７１．９０％
１８：１  ｗ５ｃ  ０．３９％
１８：０  ０．２０％
１７：０  ＩＳＯ  ３ＯＨ  １．６１％
１８：１  ２ＯＨ  ０．２４％
１９：０  １０  ｍｅｔｈｙｌ  ０．４２％
類似脂肪酸をもつ菌種：Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ
類似度（S.I.）：０．２６７
【００３３】
バクテリオクロロフィル産生（嫌気下）：生育せず
バクテリオクロロフィル産生（好気下）：陰性
スフィンゴ脂質の存在：＋
生育における塩（ＮａＣｌ）要求性：＋
【００３４】
＜変異株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列＞
変異株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を公知の方法で同定した結果、配列番号１に示す通りであり、野生株と同じであった。
【００３５】
＜変異株、培養物、カロテノイド色素含有組成物＞
本発明の変異株は、後述するように、同じ条件下でのカロテノイド色素の産生能が野生株よりも際立って高い、新規な細菌である。このように、カロテノイド色素の産生能が高い細菌は、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌ではこれまでに知られていない。
また、本発明の変異株は、多様なカロテノイド色素の産生能を有し、しかも培養温度を調節することで、所望のカロテノイド色素を作り分けることができるという、従来のスフィンゴモナス属に属する細菌には見られない優れた性質を有する。
【００３６】
本発明の変異株は、平成２１年９月０４日付けで受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号  ２９２−０８１８））に受託されている。
【００３７】
変異株を培養して得られた培養物中には、産生したカロテノイド色素を有する前記変異株が含有される。該培養物は、そのまま目的の用途に使用しても良いし、適宜任意の精製操作を行ってから使用しても良い。例えば、培養後の変異株から、カロテノイド色素を含有する組成物を分離して、該組成物を目的の用途に使用しても良いし、さらに該組成物を精製して、純度を向上させたカロテノイド色素を使用しても良い。
【００３８】
＜カロテノイド色素の製造方法＞
本発明のカロテノイド色素の製造方法は、上記本発明の変異株を培養する工程を有するものである。そして、培養温度を適宜調節することで、変異株が産生するカロテノイド色素の組成を調節することができる。
変異株の培養は、野生株と同様の方法で行なうことができる。具体的には、以下の通りである。
【００３９】
培地は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類及び微量成分等の必須成分を含むものであれば特に限定されない。
前記炭素源としては、グルコース、シュークロース等の糖類；エタノール、グリセロール等のアルコール類が例示できる。
炭素源の添加割合は、炭素源の種類にもよるが、概ね０．５〜３．０質量％程度であることが好ましい。
【００４０】
前記窒素源としては、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸カリウム、塩化アンモニウム、尿素等が例示できる。
窒素源の添加割合は、窒素源の種類にもよるが、０．０１％〜０．１質量％程度であることが好ましい。
【００４１】
前記無機塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ素化カリウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化鉄、塩化マンガン、硫酸マンガン、塩化マグネシウム、硫酸銅等が例示できる。
無機塩類の添加割合は、無機塩類の種類にもよるが、０．００１％〜０．０１質量％程度であることが好ましい。
【００４２】
前記微量成分としては、ビタミンや微量金属等が例示できる。
【００４３】
培地は、前記必須成分以外の任意成分を含んでいても良い。任意成分としては、酵母エキス、ペプトン、トリプトン等が例示できる。
任意成分の添加割合は、任意成分の種類にもよるが、０．０１％〜０．５質量％程度であることが好ましい。
【００４４】
培地のｐＨは、６．０〜８．０であることが好ましい。
【００４５】
変異株の培養温度は、変異株の生育を妨げない範囲内において、任意に選択できるが、２０〜４５℃であることが好ましい。
【００４６】
変異株のカロテノイド色素の産生効率は、カロテノイド色素の種類ごとに、培養温度によって変化する。すなわち、変異株の培養温度を所望のカロテノイド色素の産生に適した温度に適宜調節することで、所望のカロテノイド色素の産生量を向上させることができ、カロテノイド色素を作り分けることができる。
アスタキサンチンの産生量を向上させる場合には、培養温度は２０〜３０℃であることが好ましく、２３〜２７℃であることがより好ましい。
エキネノンの産生量を向上させる場合には、培養温度は２５〜４０℃であることが好ましく、２７〜３３℃であることがより好ましい。
アドニキサンチンの産生量を向上させる場合には、培養温度は２５〜４０℃であることが好ましく、３３〜３７℃であることがより好ましい。
ゼアキサンチンの産生量を向上させる場合には、培養温度は３０〜４５℃であることが好ましく、３３〜３７℃であることがより好ましい。
カンタキサンチンの産生量を向上させる場合には、培養温度は２５〜４５℃であることが好ましく、３３〜３７℃であることがより好ましい。
β−クリプトキサンチンの産生量を向上させる場合には、培養温度は３５〜４５℃であることが好ましく、３８〜４２℃であることがより好ましい。
β−カロテンの産生量を向上させる場合には、培養温度は３５〜４５℃であることが好ましく、３８〜４２℃であることがより好ましい。
【００４７】
そして、上記のように変異株の培養温度を調節することで、所望のカロテノイド色素の産生量を以下のように向上させることができる。
例えば、アスタキサンチンの場合、変異株の乾燥菌体中のアスタキサンチン含有量を０．０４質量％以上、全カロテノイド色素中のアスタキサンチン含有量を３０質量％以上とすることができる。
エキネノンの場合、変異株の乾燥菌体中のエキネノン含有量を０．０３質量％以上、全カロテノイド色素中のエキネノン含有量を１１質量％以上とすることができる。
アドニキサンチンの場合、変異株の乾燥菌体中のアドニキサンチン含有量を０．０４質量％以上、全カロテノイド色素中のアドニキサンチン含有量を６．５質量％以上とすることができる。
ゼアキサンチンの場合、変異株の乾燥菌体中のゼアキサンチン含有量を０．１質量％以上、全カロテノイド色素中のゼアキサンチン含有量を１９．５質量％以上とすることができる。
カンタキサンチンの場合、変異株の乾燥菌体中のカンタキサンチン含有量を０．００５質量％以上、全カロテノイド色素中のカンタキサンチン含有量を１．５質量％以上とすることができる。
β−クリプトキサンチンの場合、変異株の乾燥菌体中のβ−クリプトキサンチン含有量を０．０５質量％以上、全カロテノイド色素中のβ−クリプトキサンチン含有量を６質量％以上とすることができる。
β−カロテンの場合、変異株の乾燥菌体中のβ−カロテン含有量を０．５質量％以上、全カロテノイド色素中のβ−カロテン含有量を６５質量％以上とすることができる。
【００４８】
このように、変異株の培養物から分離されたカロテノイド色素含有組成物は、野生株をはじめとするスフィンゴモナス属に属する細菌で、カロテノイド色素産生能を有する細菌の培養物から得られた組成物よりも、各種カロテノイド色素の含有量が際立って高い。また、例えば、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、β−カロテン等の特定のカロテノイド色素の含有量を大幅に向上させることができる。したがって、本発明の前記カロテノイド色素含有組成物は、有用性が極めて高い。
【００４９】
変異株の全カロテノイド色素の産生量（含有量）は、概ね培養温度が高いほど向上する。
例えば、培養温度を好ましくは２０℃以上、より好ましくは２３℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を０．１２質量％以上とすることができる。
また、培養温度を好ましくは２５℃以上、より好ましくは２７℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を０．２５質量％以上とすることができる。
また、培養温度を好ましくは３０℃以上、より好ましくは３３℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を０．５５質量％以上とすることができる。
また、培養温度を好ましくは３５℃以上、より好ましくは３８℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を０．７８質量％以上とすることができる。
【００５０】
培養時間は、培養温度にもよるが、通常は１〜３日間であることが好ましい。
また培養方法は、静置培養、振とう培養、撹拌培養等、培地の種類に応じて適宜選択すれば良い。そして、通気培養することが好ましい。
【００５１】
培養後は、培養物から、又は培養物の遠心分離で回収された沈降物から、カロテノイド色素を分離することができる。
例えば、前記培養物又は沈降物を、必要に応じて洗浄後、凍結乾燥等に供して乾燥菌体を得る。そして、得られた乾燥菌体に有機溶媒を加え、該有機溶媒中にカロテノイド色素を抽出し、必要に応じて該抽出操作を複数回繰り返す。次いで、減圧濃縮等の手法で溶媒を除去することで、カロテノイド色素が得られる。
【００５２】
抽出に使用する有機溶媒は、カロテノイド色素を溶解できるものであれば特に限定されず、極性溶媒及び非極性溶媒のいずれもが使用できる。好ましいものとして具体的には、ヘキサン等の炭化水素類；アセトン等のケトン類；メタノール、エタノール、２−プロパノール等のアルコール類；酢酸エチル等のエステル類；ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；アセトニトリル等のニトリル類等が例示できる。
有機溶媒は、一種を単独で使用しても良いし、二種以上を併用しても良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率は目的に応じて任意に選択すれば良い。
また、これらの有機溶媒は、カロテノイド色素の精製にも使用できる。
【００５３】
カロテノイド色素は、例えば、その分析データを公知化合物の分析データと比較することで同定できる。分析法としては、構造に関するデータが取得できるものであればいずれでも良く、例えば、ＨＰＬＣ、吸光度分析、ＮＭＲ、ＬＣ／ＭＳなど通常汎用される分析法で良い。また、例えば、ＨＰＬＣにより分析時に検量線を作成しておけば、得られた組成物中の各成分の含有量も定量できる。
【００５４】
変異株を培養して得られた培養物、又は変異株の乾燥菌体、凍結菌体、溶媒抽出物、若しくは粉砕・破砕処理物を、動物プランクトンの培養物へ添加して捕食させた後、動物プランクトンを回収することにより、カロテノイド色素を製造することもできる。この製造方法によれば、カロテノイド色素が濃縮された飼料も提供できる。
【００５５】
前記動物プランクトンとしては、例えば、ワムシ、アルテミア、ミジンコ等が例示できる。これら動物プランクトンに、変異株を捕食させることで生物学的濃縮が行われ、その結果得られる動物プランクトンの培養物では、従来の細菌の培養によって産生されたものよりも、カロテノイド色素が格段に濃縮され、その利用価値が極めて高い。
【００５６】
動物プランクトンによりカロテノイド色素が濃縮された飼料は、養殖魚への使用に好適である。稚魚の中には、カロテノイド色素を含有する甲殻類プランクトンを摂餌しているものがあり、この摂餌により魚の色が影響されることが知られている。そこで、これらの稚魚類を養殖する際に、上記方法で製造された飼料を色揚げ用飼料として給餌すると、濃縮されたカロテノイド色素を給餌でき、従来よりも効率的に魚を色揚げできる。
【実施例】
【００５７】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。【００５８】
［実施例１］
＜変異株を使用したカロテノイド色素の製造（１）＞
ＭＢ２２１６（３７．４g）、グルコース３g及び純水１Ｌを混合して培地を調製し、１Ｌメディアボトル中で前記培地を１２１℃にて２０分間滅菌処理した。
次いで、前記培地を常温まで冷却した後、これをクリーンベンチ内で１Ｌ三角フラスコに２００ｍｌ分注し、予め１０ｍｌのＬ型試験管中で培養した変異株１０ｍｌを、分注した前記培地に植菌した。植菌後の培地のｐＨは７．６〜７．８であった。
次いで、恒温振とう培養機バイオシェーカー（商品名、タイテック社製）を使用して、培養温度３０℃、撹拌速度１２０ｒｐｍの条件で二日間、変異株を振とう培養した。
次いで、培養物を遠心分離して変異株を回収し、凍結乾燥させた後、乳鉢で破砕して、粉末状の乾燥菌体を得た。
そして、得られた乾燥菌体から、ジクロロメタン／メタノール（３／１、体積比）の混合溶媒を使用して、カロテノイド色素を抽出し、分離した。
分離したカロテノイド色素をメタノールに溶解させ、得られた溶液からフィルタを使用して夾雑物を除去し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。また、分離したカロテノイド色素をアセトンに溶解させ、得られた溶液からフィルタを使用して夾雑物を除去し、吸光スペクトル分析用サンプルとした。そして、下記条件でＨＰＬＣ分析及び吸光スペクトル分析を行った。ＨＰＬＣ分析時のカロテノイド色素のプロファイルにおけるピーク強度（面積値）の比から、各カロテノイド色素の含有量の比を算出し、吸光スペクトル分析時のデータから、全カロテノイド色素の含有量（カロテノイド色素の総含有量）を算出して、これらの値から、各カロテノイド色素の含有量を算出した。【００５９】
（ＨＰＬＣ分析条件）
ＨＰＬＣ分析器：ＬＣ−ＶＰシリーズ（島津製作所社製）
カラム：逆相カラムＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：４０℃
移動相：アセトニトリル／メタノール／２−プロパノール（４５／３／２、体積比）の混合溶媒
移動相の流速：０．５ｍＬ／分
（吸光スペクトル分析）
分光光度計：ＵＶ−２４００（島津製作所社製）
セル：１ｃｍ幅【００６０】
その結果、乾燥菌体１ｇ中の全カロテノイド色素の含有量は１．２４６ｍｇ（０．１２５質量％）であり、乾燥菌体１ｇ中のアスタキサンチンの含有量は０．１６ｍｇ（０．０１６質量％）であった。そして、全カロテノイド色素中のアスタキサンチンの含有量は１２．８質量％であった。【００６１】
［比較例１］
＜野生株を使用したカロテノイド色素の製造（１）＞
変異株に代わり野生株を使用したこと以外は、実施例１と同様に粉末状の乾燥菌体を得て、カロテノイド色素を分離した。
その結果、得られた乾燥菌体１ｇ中の全カロテノイド色素の含有量は０．１６２ｍｇ（０．０１６質量％）であり、乾燥菌体１ｇ中のアスタキサンチンの含有量は０．０１ｍｇ（０．００１質量％）であった。そして、全カロテノイド色素中のアスタキサンチンの含有量は６．２質量％であった。【００６２】
実施例１及び比較例１の結果から明らかなように、変異株の全カロテノイド色素の含有量（全カロテノイド色素の産生量）は野生株の約８倍であり、変異株のアスタキサンチンの含有量は野生株の約１６倍であった。【００６３】
［実施例２］
＜変異株を使用したカロテノイド色素の製造（２）＞
大豆タンパク質由来ペプチド：ハイニュートＲ（商品名、不二製油社製）１０g、イースト１ｇ、クエン酸鉄ＩＩＩ０．１ｇ、硫酸アンモニウム０．００１６ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．００８ｇ、グルコース３g、人工海水３７ｇ及び純水１Ｌを混合して培地４Ｌを調製し、微生物培養装置ＢＭＬ−１０ＰＩ（商品名、エイブル社製）の容量１０Ｌの容器中で、前記培地を１２１℃にて２０分間滅菌処理した。
次いで、前記容器を微生物培養装置の反応部にセットし、前記培地を常温まで冷却した後、クリーンベンチ内で予め１Ｌ三角フラスコ中で培養した変異株２００ｍｌを、前記培地に植菌した。植菌後の培地のｐＨは７．６〜７．８であった。
次いで、培養温度２５℃、撹拌速度２００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ（一分間あたりの通気量（体積）が前記培養液（４．２Ｌ）に対して１倍）の条件で二日間、変異株を振とう培養した。
次いで、培養物を遠心分離して変異株を回収し、凍結乾燥させた後、乳鉢で破砕して、粉末状の乾燥菌体を得た。
そして、実施例１と同様の方法で、得られた乾燥菌体からカロテノイド色素を抽出して分離し、各カロテノイド色素の含有量を算出した。
得られた乾燥菌体１ｇ中のカロテノイド色素の組成を表１に示す。
表１から明らかなように、全カロテノイド色素中、アスタキサンチンが最も含有量が高かった。【００６４】
【表１】
2011052003.tif 000002
【００６５】
［実施例３］
＜変異株を使用したカロテノイド色素の製造（３）＞
変異株の培養温度を２５℃でなはく３０℃としたこと以外は、実施例２と同様にカロテノイド色素を分離し、各カロテノイド色素の含有量を算出した。
得られた乾燥菌体１ｇ中のカロテノイド色素の組成を表２に示す。
表２から明らかなように、全カロテノイド色素中、β−カロテンが最も含有量が高かった。【００６６】
【表２】
2011052003.tif 000003
【００６７】
［実施例４］
＜変異株を使用したカロテノイド色素の製造（４）＞
変異株の培養温度を２５℃でなはく３５℃としたこと以外は、実施例２と同様にカロテノイド色素を分離し、各カロテノイド色素の含有量を算出した。
得られた乾燥菌体１ｇ中のカロテノイド色素の組成を表３に示す。
表３から明らかなように、全カロテノイド色素中、β−カロテンが最も含有量が高かった。【００６８】
【表３】
2011052003.tif 000004
【００６９】
［実施例５］
＜変異株を使用したカロテノイド色素の製造（５）＞
変異株の培養温度を２５℃でなはく４０℃としたこと以外は、実施例２と同様にカロテノイド色素を分離し、各カロテノイド色素の含有量を算出した。
得られた乾燥菌体１ｇ中のカロテノイド色素の組成を表４に示す。
表４から明らかなように、全カロテノイド色素中、β−カロテンが最も含有量が高かった。【００７０】
【表４】
2011052003.tif 000005
【００７１】
［比較例２］
＜野生株を使用したカロテノイド色素の製造（２）＞
変異株に代わり野生株を使用したこと、培養温度を２５℃でなはく３０℃としたこと以外は、実施例２と同様にカロテノイド色素を分離し、各カロテノイド色素の含有量を算出した。
得られた乾燥菌体１ｇ中のカロテノイド色素の組成を表５に示す。【００７２】
【表５】
2011052003.tif 000006
【００７３】
表５から明らかなように、野生株を培養した比較例２では、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンの産生が認められなかった。そして、全カロテノイド色素の含有量も極めて低かった。
一方、変異株を比較例２と同じ培養温度で培養した実施例３では、表２及び５から明らかなように、全カロテノイド色素の含有量は、比較例２の約３９倍であった。
そして、カロテノイド色素の含有量は、すべての種類において実施例３の方が比較例２よりも顕著に高かった。比較例２で産生が認められたカロテノイド色素で比較すると、アドニキサンチンは約１８倍、β−クリプトキサンチンは約３１倍であった。【００７４】
また、表１〜４から明らかなように、変異株の培養温度を調節することによって、各カロテノイド色素の含有量を向上させることができた。
具体的には、アスタキサンチンは培養温度２５℃で、エキネノンは培養温度３０℃で、アドニキサンチン、ゼアキサンチン及びカンタキサンチンは培養温度３５℃で、β−クリプトキサンチン及びβ−カロテンは培養温度４０℃で、それぞれ最も含有量が高くなった。
このように、培養温度を適宜調節することで、所望のカロテノイド色素を効率良く得られた。【００７５】
さらに、実施例１〜５から明らかなように、変異株を使用してカロテノイド色素を産生させた場合、変異株を大量培養しても、カロテノイド色素の産生能は低下せず、カロテノイド色素の製造効率が極めて高いことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、健康食品の原料や飼料の添加物の製造に利用可能であるため、産業上極めて有用である。
【受託番号】
【００７７】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８
【図１】
2011052003.tif 000007
【配列表】
2011052003000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月9日(2010.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルターエリスロバクター属ＪＰＣＣ  ＭＢ００１７−６株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８）。
【請求項２】
請求項１に記載の細菌株を培養して得られた培養物。
【請求項３】
請求項２に記載の培養物から分離されたカロテノイド色素含有組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の細菌株を培養する工程を有するカロテノイド色素の製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
技術分野
［０００１］
本発明は、アルターエリスロバクター属に属する細菌の新規変異株、該変異株を利用して得られた培養物及びカロテノイド色素含有組成物、並びに該変異株を利用するカロテノイド色素の製造方法に関する。
背景技術
［０００２］
アスタキサンチンやβ−カロテン等をはじめとする各種カロテノイド色素は、多くの生理活性を有しており、サプリメント食品の原料として有用である。一方、近年の天然資源の減少により、これら天然資源の養殖が期待されており、魚介類の人口種苗生産においては、対象種に対して高い餌料効果や付加価値を付与する飼料が求められている。このような中、タイやサケ等の養殖魚の色調をより天然のものに近付けるために、アスタキサンチンを配合した飼料（色揚げ飼料）が使用されることがある。また、タイやニジマス等の体色の鮮やかさが求められる魚種に対しては、アスタキサンチン等の色素を配合した飼料が使用されることがある。
［０００３］
色揚げ飼料の添加物としてのアスタキサンチンは、カロリーピンク（合成アスタキサンチン）としてロッシュ社から販売されている。しかし、トレーサビリティーの問題や利用者の天然物志向から、天然由来のアスタキサンチンが注目されている。
アスタキサンチンは、マダイ、サケ等の魚類；カニ、エビ、オキアミ等の甲殻類に広く分布している。そこで、天然由来のアスタキサンチンを得る方法として、甲殻類からアスタキサンチンを抽出する方法が提案されている。しかし、抽出効率が低いため抽出量が少なく、コストが高くなるという問題
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
４３では、０．１４ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔの産生量が報告されている（非特許文献５参照）。しかし、これら遺伝子組換え体によるアスタキサンチンの産生には、発現量等で問題点があった。
そこで、アスタキサンチンを産生する細菌が探索され、これまでに、フラボバクテリウム属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、アルテロモナス属、ピポモナス属、カリオファノン属、エリスロバクター属、パラコッカス属等に属する細菌が報告されている。
［０００７］
また、本発明者らは、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌であるＪＰＣＣＭＢ００１７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−４８）が、カロテノイド色素産生能を有することを、これまでに報告している（特許文献１参照）。なお、その後の解析により、ＪＰＣＣＭＢ００１７株（ＮＩＴＥ  Ｐ−４８）は、スフィンゴモナス属ではなく、アルターエリスロバクター属に属することが明らかになっている。
先行技術文献
特許文献
［０００８］
特許文献１：特開２００６−１９１９１９号公報
非特許文献
［０００９］
非特許文献１：リー及びソー（Ｌｅｅ，Ｙ．−Ｋ．ａｎｄ  Ｓｏｈ，Ｃ．−Ｗ．）、「ジャーナル・オブ・ファイコロジー（Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．）」、米国、１９９１年、第２７巻、第３号、ｐ．５７５−５７７
非特許文献２：フローレス−コテラら（Ｆｌｏｒｅｓ−Ｃｏｔｅｒａ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．）、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、米国、２００１年、第５５巻、第２号、ｐ．３４１−３４７
非特許文献３：ワンら（Ｗａｎｇ，Ｃ．−Ｗ．ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．）、米国、１９９９年、第６２巻、第３号、ｐ．２３５−２４１
非特許文献４：ヨコヤマら（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
ｙ）、米国、１９９４年、第５８巻、第１０号、ｐ．１８４２−１８４４
非特許文献５：ペインら（Ｐａｎｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジー・リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．）、米国、１９９６年、第２２巻、ｐ．３０３−３０８
発明の概要
発明が解決しようとする課題
［００１０］
しかし、アスタキサンチンをはじめとする各種カロテノイド色素の産生能を有する細菌は、まだ十分に探索されているとは言えず、より産生効率が高いカロテノイド色素の製造方法の開発が強く望まれている。
本発明は上記事情に鑑みて為されたものであり、カロテノイド色素の産生能を有する新規な細菌、及び該細菌を利用するカロテノイド色素の製造方法を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
［００１１］
上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討の結果、以下の発明を完成させるに至った。
（１）アルターエリスロバクター属ＪＰＣＣ  ＭＢ００１７−６株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８）。
（２）（１）に記載の細菌株を培養して得られた培養物。
（３）（２）に記載の培養物から分離されたカロテノイド色素含有組成物。
（４）（１）に記載の細菌株を培養する工程を有するカロテノイド色素の製造方法。
発明の効果
［００１２］
本発明によれば、カロテノイド色素の産生能を有する新規な細菌、及び該細菌を利用するカロテノイド色素の製造方法が提供される。また、本発明の細菌は、カロテノイド色素の産生能が高いので、高品質のカロテノイド色素を簡便且つ大量に製造できる。その結果、安価なカロテノイド色素を提供できる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
図面の簡単な説明
［００１３］
［図１］ＪＰＣＣ  ＭＢ００１７−６株及びＪＰＣＣＭＢ００１７株のコロニーの撮像データである。
発明を実施するための形態
［００１４］
以下、本発明について詳しく説明する。
本発明のアルターエリスロバクター属ＪＰＣＣ  ＭＢ００１７−６株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８）は、アルターエリスロバクター属ＪＰＣＣＭＢ００１７株の変異株である。以下、本明細書において、「アルターエリスロバクター属ＪＰＣＣＭＢ００１７株」のことを「野生株」と略記することがある。また、「アルターエリスロバクター属ＪＰＣＣ  ＭＢ００１７−６株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８）」のことを「変異株」と略記することがある。
また、本発明において、「カロテノイド色素」とは、炭素数４０のポリエン構造を基本骨格とする色素のことを指し、カロテン、リコペン等の炭化水素や、キサントフィル等のアルコール類を含み、β−カロテン、アスタキサンチン、β−カロテンがアスタキサンチンに変換される過程で生じる種々の有用なカロテノイド色素が例示できる。
カロテノイド色素として、より具体的には、カロテン、リコペン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、クリプトキサンチン、エキネノン、ハイドロエキネノン、ルテイン、フコキサンチン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン、β−クリプトキサンチン等が例示できる。
［００１５］
＜変異株の獲得＞
本発明の変異株は、野生株に対して、ケミカルミューテーションを行うことで獲得した。より具体的には、以下の通りである。
［００１６］
（野生株の獲得）
野生株は、本出願人により、平成１６年１２月３日付けで、独立行政法人
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号  ２９２−０８１８））に寄託されている（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−４８）。
また、本発明者らは、寄託にあたり野生株を天然より獲得しており、以下にその獲得手順を示す。
［００１７］
海洋環境やマングローブ林より採取した海砂、泥、水などからアスタキサンチン及びスフィンゴ糖脂質を産生する微生物の獲得を試みた。酵母エキス５．０ｇ／ｌ、ペプトン１．０ｇ／ｌ、グルコース５．０ｇ／ｌを人工海水（千寿製薬社製）に添加して作製した寒天プレートに、１００μｌのサンプルを塗布した。
［００１８］
２５℃の条件下で７〜１０日間静置培養を行い、オレンジ、赤色のコロニーを形成する海洋微生物を獲得した。これらの微生物を単菌化するため、５ｍｌの上記成分を含む液体培地中に植菌し、１５０ｒｐｍで震とう培養して微生物を生育させ、これを寒天プレートに塗布してコロニーを形成させる操作を繰り返した。
［００１９］
約５０株の海洋細菌からなる菌体粉末０．３ｍｇから、クロロホルム：メタノール＝１：１の溶液で色素及び脂質を抽出し、アスタキサンチン及びスフィンゴ糖脂質のスクリーニングを行った。野性株は、スフィンゴ糖脂質の産生能も有している。
［００２０］
アスタキサンチン及びスフィンゴ糖脂質の有無については、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）を用いて評価した。その結果、唯一アスタキサンチンとスフィンゴ糖脂質を産生する菌株を同定し、これを寄託した（ＪＰＣＣＭＢ００１７株）。
［００２１］
野生株は、絶対好気性グラム陰性の桿菌である。１６Ｓ  ｒＤＮＡの系統解析より、この野生株は、α−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属し、アルターエリスロバクター属とクラスターを形成し、アルターエリスロバクター属の特徴であるスフィンゴ脂質も含むことから、アルターエリスロバクター属の細菌であることが確認されている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
産生能が野生株よりも際立って高い、新規な細菌である。このように、カロテノイド色素の産生能が高い細菌は、アルターエリスロバクター属に属する細菌ではこれまでに知られていない。
また、本発明の変異株は、多様なカロテノイド色素の産生能を有し、しかも培養温度を調節することで、所望のカロテノイド色素を作り分けることができるという、従来のアルターエリスロバクター属に属する細菌には見られない優れた性質を有する。
［００３６］
本発明の変異株は、平成２１年９月０４日付けで受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８０８として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号  ２９２−０８１８））に受託されている。
［００３７］
変異株を培養して得られた培養物中には、産生したカロテノイド色素を有する前記変異株が含有される。該培養物は、そのまま目的の用途に使用しても良いし、適宜任意の精製操作を行ってから使用しても良い。例えば、培養後の変異株から、カロテノイド色素を含有する組成物を分離して、該組成物を目的の用途に使用しても良いし、さらに該組成物を精製して、純度を向上させたカロテノイド色素を使用しても良い。
［００３８］
＜カロテノイド色素の製造方法＞
本発明のカロテノイド色素の製造方法は、上記本発明の変異株を培養する工程を有するものである。そして、培養温度を適宜調節することで、変異株が産生するカロテノイド色素の組成を調節することができる。
変異株の培養は、野生株と同様の方法で行なうことができる。具体的には、以下の通りである。
［００３９］
培地は、生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類及び微量成分等の必須成分を含むものであれば特に限定されない。
前記炭素源としては、グルコース、シュークロース等の糖類；エタノール、グリセロール等のアルコール類が例示できる。
炭素源の添加割合は、炭素源の種類にもよるが、概ね０．５〜３．０質量
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
β−クリプトキサンチンの場合、変異株の乾燥菌体中のβ−クリプトキサンチン含有量を０．０５質量％以上、全カロテノイド色素中のβ−クリプトキサンチン含有量を６質量％以上とすることができる。
β−カロテンの場合、変異株の乾燥菌体中のβ−カロテン含有量を０．５質量％以上、全カロテノイド色素中のβ−カロテン含有量を６５質量％以上とすることができる。
［００４８］
このように、変異株の培養物から分離されたカロテノイド色素含有組成物は、野生株をはじめとするアルターエリスロバクター属に属する細菌で、カロテノイド色素産生能を有する細菌の培養物から得られた組成物よりも、各種カロテノイド色素の含有量が際立って高い。また、例えば、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、β−カロテン等の特定のカロテノイド色素の含有量を大幅に向上させることができる。したがって、本発明の前記カロテノイド色素含有組成物は、有用性が極めて高い。
［００４９］
変異株の全カロテノイド色素の産生量（含有量）は、概ね培養温度が高いほど向上する。
例えば、培養温度を好ましくは２０℃以上、より好ましくは２３℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を０．１２質量％以上とすることができる。
また、培養温度を好ましくは２５℃以上、より好ましくは２７℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を０．２５質量％以上とすることができる。
また、培養温度を好ましくは３０℃以上、より好ましくは３３℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を０．５５質量％以上とすることができる。
また、培養温度を好ましくは３５℃以上、より好ましくは３８℃以上とすることで、変異株の乾燥菌体中の全カロテノイド色素の含有量を０．７８質量％以上とすることができる。
［００５０］
培養時間は、培養温度にもよるが、通常は１〜３日間であることが好まし
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
［表５］
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［００７３］
表５から明らかなように、野生株を培養した比較例２では、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、エキネノン及びβ−カロテンの産生が認められなかった。そして、全カロテノイド色素の含有量も極めて低かった。
一方、変異株を比較例２と同じ培養温度で培養した実施例３では、表２及び５から明らかなように、全カロテノイド色素の含有量は、比較例２の約３９倍であった。
そして、カロテノイド色素の含有量は、すべての種類において実施例３の方が比較例２よりも顕著に高かった。比較例２で産生が認められたカロテノイド色素で比較すると、アドニキサンチンは約１８倍、β−クリプトキサンチンは約３１倍であった。
［００７４］
また、表１〜４から明らかなように、変異株の培養温度を調節することによって、各カロテノイド色素の含有量を向上させることができた。
具体的には、アスタキサンチンは培養温度２５℃で、エキネノンは培養温度３０℃で、アドニキサンチン、ゼアキサンチン及びカンタキサンチンは培養温度３５℃で、β−クリプトキサンチン及びβ−カロテンは培養温度４０℃で、それぞれ最も含有量が高くなった。
【国際調査報告】
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