(57)【要約】本発明は、プロモーター、エンハンサー等を用いて特に外来遺伝子の発現を上昇させる方法、及びプロモーター、エンハンサー等を含む遺伝子発現を上昇させる得る発現用カセットの提供を目的とし、第１のプロモーターの下流に発現させようとする遺伝子及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物を含む、さらに該ＤＮＡ構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターを含む、遺伝子の発現用カセットにより前記目的を達成する。
2011062298.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のプロモーターの下流に発現させようとする遺伝子及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物を含み、さらに該ＤＮＡ構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターを含む、遺伝子の発現用カセット。
【請求項２】
連結したエンハンサー又は第２のプロモーターの下流に他の遺伝子発現用の機構を有さず、発現させようとする遺伝子を第１のプロモーター１つとエンハンサー１つで挟むか、又は第１のプロモーター１つと第２のプロモーター１つで挟んだ構造を有する、請求項１記載の発現用カセット。
【請求項３】
プロモーターがＣＭＶ  ｉプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、βアクチンプロモーター及びＣＡＧプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項１記載の発現用カセット。
【請求項４】
エンハンサーがＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びｈＴＥＲＴエンハンサーからなる群から選択される少なくとも１つのエンハンサーである請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現用カセット。
【請求項５】
さらに、プロモーターの下流に発現させようとするタンパク質をコードするＤＮＡ及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物の上流に１〜４個のＣＭＶエンハンサーが連結された請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現用カセット。
【請求項６】
さらに以下のエレメント（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくともいずれか１つを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現用カセット：
（ｉ）  外来タンパク質をコードするＤＮＡの直ぐ上流に連結されたＲＵ５’；
（ｉｉ）  エンハンサー及び／又はプロモーターの直ぐ上流に連結されたＵＡＳ；及び
（ｉｉｉ）  発現用カセットの最上流に連結されたＳＶ４０−ｏｒｉ。
【請求項７】
発現させようとする遺伝子が疾患の治療に用い得る治療用遺伝子、又は医薬、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質の遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現用カセット。
【請求項８】
治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子であるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子である、請求項７記載の発現用カセット。
【請求項９】
コンストラクトＮｏ．２（図８）、Ｎｏ．４（図１０）、Ｎｏ．６（図１２）、Ｎｏ．８（図１４）、Ｎｏ．１０（図１６）、Ｎｏ．１２（図１８）及びＮｏ．１４（図２０）に示す構造を有する、請求項１記載の外来遺伝子の発現用カセット。
【請求項１０】
コンストラクトＮｏ．１５（図１６）、Ｎｏ．１６（図３７）、Ｎｏ．１７（図４９）、Ｎｏ．２０（図５７）及びＮｏ．２１（図５８）に示す構造を有する、請求項１記載の外来遺伝子の発現用カセット。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の外来遺伝子の発現用カセットを含むベクター。
【請求項１２】
アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターである請求項１１記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載のベクターを含む疾患検出又は治療用製剤。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発現用カセット又は請求項１１若しくは１２に記載のベクターを用いて発現させようとする遺伝子を発現させる方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発現用カセット又は請求項１１若しくは１２に記載のベクターを細胞に導入し、該細胞を培養することを含む、発現させようとする遺伝子がコードするタンパク質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロモーター、エンハンサー等を用いて遺伝子の発現を上昇させる方法、及びプロモーター、エンハンサー等を含む遺伝子発現を上昇させる発現用カセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
以前より、遺伝子発現効率を上昇させるために、ＣＭＶプロモーターやＣＡＧプロモーターなど様々な遺伝子発現プロモーターが開発されている（特許文献１〜４）。しかしながら、バイオテクノロジーの分野では、これらの従来技術を用いても、細胞の種類や遺伝子の種類によって、遺伝子発現がほとんど起こらない、又は発現タンパク質量が極めて少ないといった問題が日常的に発生している。また、この問題は、遺伝子発現を診断や治療に用いる医療の発展において、大きな障壁となっている。
【特許文献１】特許公報第２８１４４３３号公報
【特許文献２】特許公報第２８１４４３４号公報
【特許文献３】米国特許第５１６８０６２号明細書
【特許文献４】米国特許第５３８５８３９号明細書
【発明の開示】
【０００３】
プロモーター、エンハンサー等を用いて遺伝子の発現を上昇させる方法、及びプロモーター、エンハンサー等を含む遺伝子発現を上昇させる得る発現用カセットの提供を目的とする。
本発明者は、プロモーターを利用した遺伝子発現システムにおいて、より高い効率で遺伝子を発現させることができる新しいシステムの開発を試み、様々な遺伝子のプロモーターやエンハンサーの組み合わせによるプロモーター活性の比較、検討を行った。その結果、第１のプロモーターの下流に発現させようとする遺伝子及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターが連結した、遺伝子の発現用カセットを用いて、発現させようとする遺伝子を２つのプロモーターあるいはプロモーターとエンハンサーで挟むことにより、遺伝子を高効率で発現させ得ることを見出した。本発明者はさらに、前記の発現用カセットにさらに、ｐｏｌｙＡ付加配列、ＲＵ５’、ＵＡＳ、ＳＶ４０−ｏｒｉ等のエレメントを含ませることによりさらに高効率で遺伝子を発現させ得ることを見出した。
本発明の「遺伝子発現を上昇させるシステム及び該システムを保持したベクター」の開発により、ほぼ全ての細胞、遺伝子についてタンパク質の発現を強力に上昇させることができるようになる。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  第１のプロモーターの下流に発現させようとする遺伝子及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物を含む、さらに該ＤＮＡ構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターを含む、遺伝子の発現用カセット。
［２］  連結したエンハンサー又は第２のプロモーターの下流に他の遺伝子発現用の機構を有さず、発現させようとする遺伝子を第１のプロモーター１つとエンハンサー１つで挟むか、又は第１のプロモーター１つと第２のプロモーター１つで挟んだ構造を有する、［１］の発現用カセット。
［３］  プロモーターがＣＭＶ  ｉプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、βアクチンプロモーター及びＣＡＧプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、［１］の発現用カセット。
［４］  エンハンサーがＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びｈＴＥＲＴエンハンサーからなる群から選択される少なくとも１つのエンハンサーである［１］〜［３］のいずれかの発現用カセット。
［５］  さらに、プロモーターの下流に発現させようとするタンパク質をコードするＤＮＡ及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物の上流に１〜４個のＣＭＶエンハンサーが連結された［１］〜［４］のいずれかの発現用カセット。
［６］  さらに以下のエレメントの少なくともいずれか１つを含む［１］〜［５］のいずれかの発現用カセット：
（ｉ）  外来タンパク質をコードするＤＮＡの直ぐ上流に連結されたＲＵ５’；
（ｉｉ）  エンハンサー及び／又はプロモーターの直ぐ上流に連結されたＵＡＳ；及び
（ｉｉｉ）  発現用カセットの最上流に連結されたＳＶ４０−ｏｒｉ。
［７］  発現させようとする遺伝子が疾患の治療に用い得る治療用遺伝子、又は医薬、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質の遺伝子である、［１］〜［６］のいずれかの発現用カセット。
［８］  治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子である、［７］の発現用カセット。
［９］  癌抑制遺伝子がＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子である、［８］の発現用カセット。
［１０］  発現させようとする遺伝子がＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子の断片ＤＮＡである、［９］の発現用カセット。
［１１］  ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子の断片ＤＮＡが、配列番号１８のアミノ酸配列の１〜７８番目のアミノ酸をコードするＤＮＡである、［１０］の発現用カセット。
［１２］  コンストラクトＮｏ．２（図８）、Ｎｏ．４（図１０）、Ｎｏ．６（図１２）、Ｎｏ．８（図１４）、Ｎｏ．１０（図１６）、Ｎｏ．１２（図１８）及びＮｏ．１４（図２０）に示す構造を有する、［１］の外来遺伝子の発現用カセット。
［１３］  コンストラクトＮｏ．１５（図１６）、Ｎｏ．１６（図３７）、Ｎｏ．１７（図４９）、Ｎｏ．２０（図５７）及びＮｏ．２１（図５８）に示す構造を有する、［１］の外来遺伝子の発現用カセット。
［１４］  ［１］〜［１３］のいずれかの外来遺伝子の発現用カセットを含むベクター。
［１５］  アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターである［１４］のベクター。
［１６］  ［１４］又は［１５］のベクターを含む宿主細胞。
［１７］  ［１４］又は［１５］のベクターを含む疾患検出又は治療用製剤。
［１８］  ［１］〜［１３］のいずれかの発現用カセット又は［１４］若しくは［１５］のベクターを用いて発現させようとする遺伝子を発現させる方法。
［１９］  第１のプロモーターの下流に、発現させようとする遺伝子及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターが連結したものを、ベクターに導入し、該ベクターを用いて前記遺伝子を発現させる方法。
［２０］  ［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の発現用カセット又は［１４］若しくは［１５］に記載のベクターを細胞に導入し、該細胞を培養することを含む、発現させようとする遺伝子がコードするタンパク質を製造する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−２６４２９９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＨＥＫ２９３細胞株にＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤを用いて３６時間トランスフェクトした各種外来遺伝子の発現を示す図である。
図２は、種々の細胞株にＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤを用いて３６時間トランスフェクトしたＫＬＦ遺伝子の発現を示す図である。
図３は、ＨＥＫ２９３細胞株に各種トランスフェクト試薬を用いて３６時間トランスフェクトしたＫＬＦ遺伝子の発現を示す図である。
図４は、ＨＥＫ２９３細胞株に全長ＲＥＩＣ遺伝子及びＮ７８−ＲＥＩＣをコードする遺伝子をＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤを用いて３６時間トランスフェクトした場合の発現を示す図である。
図５−１は、Ｎ７８−ＲＥＩＣをコードするＤＮＡを挿入したコンストラクトＮｏ．１４による、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３細胞株の増殖抑制と細胞死誘導を示す図（グラフ）である。
図５−２は、Ｎ７８−ＲＥＩＣをコードするＤＮＡを挿入したコンストラクトＮｏ．１４による、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３細胞株の増殖抑制と細胞死誘導を示す図（写真）である。
図６は、全長ＲＥＩＣ遺伝子を挿入したコンストラクトＮｏ．１４による、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３細胞株の増殖抑制を示す図である。
図７は、コンストラクトＮｏ．１の構造を示す図である。
図８は、コンストラクトＮｏ．２の構造を示す図である。
図９は、コンストラクトＮｏ．３の構造を示す図である。
図１０は、コンストラクトＮｏ．４の構造を示す図である。
図１１は、コンストラクトＮｏ．５の構造を示す図である。
図１２は、コンストラクトＮｏ．６の構造を示す図である。
図１３は、コンストラクトＮｏ．７の構造を示す図である。
図１４は、コンストラクトＮｏ．８の構造を示す図である。
図１５は、コンストラクトＮｏ．９の構造を示す図である。
図１６は、コンストラクトＮｏ．１０の構造を示す図である。
図１７は、コンストラクトＮｏ．１１の構造を示す図である。
図１８は、コンストラクトＮｏ．１２の構造を示す図である。
図１９は、コンストラクトＮｏ．１３の構造を示す図である。
図２０は、コンストラクトＮｏ．１４の構造を示す図である。
図２１は、全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子をコードするアデノウイルスのコンストラクトの構造を示す図である。
図２２−１は、ｐＤＮＲ−１ｒ  Ｄｏｎｏｒ  ｖｅｃｔｏｒの全塩基配列を示す図である。
図２２−２は、ｐＤＮＲ−１ｒ  Ｄｏｎｏｒ  ｖｅｃｔｏｒの全塩基配列を示す図である（図２２−１の続き）。
図２３は、ｐＩＤＴ−ＳＭＡＲＴベクターの全塩基配列を示す図である。
図２４は、ＣＭＶ  ｉプロモーター（ｈＣＭＶ＋イントロンプロモーター）領域の塩基配列を示す図である。
図２５は、ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ（３  ｘ  ｓｔｏｐ＋ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ）領域の塩基配列を示す図である。
図２６は、ＣＭＶエンハンサー領域の塩基配列を示す図である。
図２７は、ヒトβアクチンプロモーター領域の塩基配列を示す図である。
図２８は、ＲＵ５’正方向｛ＨＴＬＶ  Ｔｙｐｅ  １  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔのＲセグメント及びＵ５配列の一部（Ｒ−Ｕ５’）｝領域の塩基配列を示す図である。
図２９は、ＲＵ５’逆方向｛ＨＴＬＶ  Ｔｙｐｅ  １  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔのＲセグメント及びＵ５配列の一部（Ｒ−Ｕ５’）｝領域の塩基配列を示す図である。
図３０は、４  ｘ  ＣＭＶエンハンサー領域の塩基配列を示す図である。
図３１は、ＣＡＧプロモーター領域の塩基配列を示す図である。
図３２は、２ＩＲＥＳインサート領域の塩基配列を示す図である。
図３３は、ＳＶ４０ｏｒｉ−ＵＡＳ−ＣＭＶｉ−ＲＵ５’領域の塩基配列を示す図である。
図３４は、３  ｘ  ｓｔｏｐ−ＢＧＨ−ｐｏｌｙＡ−ＵＡＳ−ｈＴＥＲＴエンハンサー＋ＳＶ４０エンハンサー＋ＣＭＶエンハンサー領域の塩基配列を示す図である。
図３５−１は、コンストラクトＮｏ．１４ベクターの全塩基配列を示す図である。
図３５−２は、コンストラクトＮｏ．１４ベクターの全塩基配列を示す図である（図３５−１の続き）。
図３６は、コンストラクトＮｏ．１５の構造を示す図である。
図３７は、コンストラクトＮｏ．１６の構造を示す図である。
図３８は、ＳＶ４０ｏｒｉ−ＵＡＳ−ＳＶ４０  ｅｎｈ−ｉｎｔｒｏｎ  Ａ−ＲＵ５’領域の塩基配列を示す図であり、コンストラクトＮＯ．１５の挿入遺伝子（目的遺伝子）より左側（上流側）の挿入部分の塩基配列を示す図である。
図３９は、ＳＶ４０ｏｒｉ−ＵＡＳ−ｈＴＥＲＴ  ｅｎｈ−ｉｎｔｒｏｎ  Ａ−ＲＵ５’領域の塩基配列を示す図であり、コンストラクトＮＯ．１６の挿入遺伝子（目的遺伝子）より左側（上流側）の挿入部分の塩基配列を示す図である。
図４０は、プラスミド中のＧＦＰ領域の塩基配列を示す図である。
図４１−１は、コンストラクトＮｏ．１４の挿入遺伝子（目的遺伝子）領域にＧＦＰ遺伝子のＤＮＡを挿入したプラスミドの塩基配列を示す図である。
図４１−２は、コンストラクトＮｏ．１４の挿入遺伝子（目的遺伝子）領域にＧＦＰ遺伝子のＤＮＡを挿入したプラスミドの塩基配列を示す図である（図４１−１の続き）。
図４２−１は、コンストラクトＮｏ．１５の挿入遺伝子（目的遺伝子）領域にＧＦＰ遺伝子のＤＮＡを挿入したプラスミドの塩基配列を示す図である。
図４２−２は、コンストラクトＮｏ．１５の挿入遺伝子（目的遺伝子）領域にＧＦＰ遺伝子のＤＮＡを挿入したプラスミドの塩基配列を示す図である（図４２−１の続き）。
図４３−１は、コンストラクトＮｏ．１６の挿入遺伝子（目的遺伝子）領域にＧＦＰ遺伝子のＤＮＡを挿入したプラスミドの塩基配列を示す図である。
図４３−２は、コンストラクトＮｏ．１６の挿入遺伝子（目的遺伝子）領域にＧＦＰ遺伝子のＤＮＡを挿入したプラスミドの塩基配列を示す図である（図４３−１の続き）。
図４４は、ＳＶ４０プロモーター（コンストラクトＮｏ．１５）及びｈＴＥＲＴプロモーター（コンストラクトＮｏ．１６）を含むプラスミドを用いた場合のＧＦＰ遺伝子発現の強さを示す図である。
図４５は、プラスミド中のヒトエリスロポエチン領域の塩基配列を示す図である。
図４６は、コンストラクトＮｏ．１４のプラスミドを用いてヒトエリスロポエチンを発現させた場合の結果を示す図である。
図４７Ａは、プラスミド中のヒトＩｇＧ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ領域（図４４Ａ）の塩基配列を示す図である。
図４７Ｂは、プラスミド中のヒトＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ領域（図４４Ｂ）の塩基配列を示す図である。
図４８は、コンストラクトＮｏ．１４のプラスミドを用いてヒトＩｇＧ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ（図４８Ａ）及びヒトＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（図４８Ｂ）を発現させた場合の結果を示す図である。
図４９は、コンストラクトＮｏ．１７の構造を示す図である。
図５０は、コンストラクトＮＯ．１７の挿入遺伝子（目的遺伝子）領域に全長ヒトＲＥＩＣのＤＮＡを挿入したプラスミドの塩基配列を示す図である。
図５１は、コンストラクトＮｏ．１７のプラスミドを用いて全長ヒトＲＥＩＣを発現させた結果を示す図である。
図５２は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の配列を示す図である。
図５３は、コンストラクトＮｏ．１４の発現プラスミドの発現遺伝子の下流に存在するＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ及び３つのエンハンサーが連結した塩基配列を示す図である。
図５４は、市販プラスミドにコンストラクトＮｏ．１４の発現プラスミドの発現遺伝子の下流に存在するＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ及び３つのエンハンサーが連結した塩基配列を組み込んでｃ−ｍｙｃ遺伝子を発現させた場合の結果を示す図である。
図５５は、コンストラクトＮｏ．１８の構造を示す図である。
図５６は、コンストラクトＮｏ．１９の構造を示す図である。
図５７は、コンストラクトＮｏ．２０の構造を示す図である。
図５８は、コンストラクトＮｏ．２１の構造を示す図である。
図５９−１は、コンストラクトＮｏ．２１の挿入遺伝子（目的遺伝子）領域にＧＦＰ遺伝子のＤＮＡを挿入したプラスミドの塩基配列を示す図である。
図５９−２は、コンストラクトＮｏ．２１の挿入遺伝子（目的遺伝子）領域にＧＦＰ遺伝子のＤＮＡを挿入したプラスミドの塩基配列を示す図である（図５９−１の続き）。
図６０は、目的遺伝子をｈＴＥＲＴプロモーターを含むプラスミドに挿入し発現させた場合の結果を示す図である。
図６１は、異なる外来遺伝子を組込んだ複数の発現ベクターを同時トランスフェクトした場合の発現を示す図である。
図６２は、本発明の発現ベクターを用いたヒトエリスロポエチンの産生を示す図である。
図６３は、本発明の発現ベクターを用いて産生したヒトエリスロポエチンの純度を示す図である。
図６４は、本発明の発現ベクターを用いてのヒトエリスロポエチンの産生量を示す図であり、図６４Ａは培養上清２５ｍＬ中の産生量を示し、図６４Ｂは培養上清１Ｌ中の換算産生量を示す。
図６５は、本発明の発現ベクターを用いたヒトＲＥＩＣタンパク質の産生を示す図である。
図６６は、本発明の発現ベクターを用いて産生したヒトＲＥＩＣタンパク質のイオン交換カラムクロマトグラムを示す図である。
図６７は、本発明の発現ベクターを用いてのヒトＲＥＩＣタンパク質の産生量（培養上清５２０ｍＬ中の産生量及び培養上清１Ｌ中の換算産生量）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、発現させようとするタンパク質の発現用カセットとは、発現させようとするタンパク質の発現を可能とするためのＤＮＡのセットをいう。
該発現用カセットは、少なくとも第１のプロモーターの下流に、発現させようとするタンパク質の遺伝子（発現させようとする遺伝子）及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物を含み、さらに該構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターが連結して含まれる構造を有する。また、発現させようとする遺伝子は、如何なるものも用いることができ、本発明の発現用カセットにおいては、発現させようとする遺伝子を挿入する部位は、マルチクローニングサイトとして存在してもよい。この場合、発現させようとする遺伝子をマルチクローニング部位（挿入部位）に制限酵素が認識する配列を利用して挿入すればよい。このように発現させようとする遺伝子ＤＮＡ自体が含まれておらず、該ＤＮＡを挿入する部分がマルチクローニング部位として含まれる発現用カセットも本発明の発現用カセットに含まれる。なお、発現させようとする遺伝子を標的遺伝子や目的遺伝子と呼び、タンパク質を標的タンパク質や目的タンパク質と呼ぶ場合もある。また、発現カセット構築の観点からは、これらの遺伝子を発現カセットの標的遺伝子の領域に挿入するので、挿入遺伝子ともいう。また、外来遺伝子ということもある。
また、本発明の発現用カセットの最下流には上記のエンハンサー又は第２のプロモーターが存在し、その下流には他の遺伝子発現用の機構を有しない。すなわち、本発明の発現用カセットは、少なくとも発現させようとする遺伝子を第１のプロモーター１つとエンハンサー少なくとも１つで挟むか、又は第１のプロモーター１つと第２のプロモーター１つで挟んだ構造を有する。ここで、他の遺伝子発現用の機構とは、上記の発現させようとする遺伝子以外の遺伝子を発現させるための機構をいい、発現させようとする遺伝子以外の遺伝子を発現させるためのプロモーターやエンハンサー等が含まれる。本発明の発現用カセットにおいては、発現させようとする遺伝子の上流と下流にプロモーターが存在し得るが、この２つのプロモーターは該発現させようとする遺伝子の発現効率増強のために用いられる。
本発明の発現用カセットは、発現ベクターに組込み利用される。本発明は、本発明の発現用カセットを含むベクターも含む。上記のように、本発明の発現用カセットの最下流には上記のエンハンサー又は第２のプロモーターが存在し、その下流には他の遺伝子発現用の機構を有しない。本発明の発現用カセットを含むベクターは、発現用カセットの下流に他の遺伝子発現用の機構を有しない。
本発明において、発現させようとする遺伝子は、人工的に挿入した外来タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含み、ホスト細胞と由来が異なる遺伝子も、由来が同じ遺伝子も含む。この場合、本発明においては、外来遺伝子を挿入遺伝子ともいう。発現させようとする遺伝子の種類は限定されず、組換え体を製造しようとするあらゆるタンパク質をコードするＤＮＡや特定の疾患の治療に用いるために生体内で発現させようとするタンパク質をコードするＤＮＡを用いることができる。また、特定の疾患の治療に用い得る治療用遺伝子として、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子（配列番号１７に塩基配列を示す）、ｐ５３、Ｒｂ等の腫瘍抑制遺伝子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子、肝細胞成長因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インスリン、成長ホルモン、抗体（ＩｇＧ軽鎖やＩｇＧ重鎖）、プロテインＧ、プロテインＡ等の生理活性物質等の医薬として用い得るタンパク質、疾患等の検出に用いる診断薬や研究室における実験、研究等に用いる試薬として有用なタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。発現させる目的タンパク質は細胞外分泌タンパク質が好ましい。また、生物が本来有する遺伝子の下流にエンハンサー又はプロモーターを人工的に連結させることにより、生物が本来有する遺伝子の発現を増強することもできる。すなわち、本発明において発現させようとする遺伝子は生物が本来有する遺伝子も含む。本発明は、このように生物が本来有する遺伝子の下流にエンハンサー又はプロモーターを挿入し、該遺伝子の発現を制御することも含む。また、生物が本来有する遺伝子を含む細胞の該遺伝子の下流にエンハンサー又はプロモーターを挿入した細胞をも含む。さらに、発現させようとする遺伝子として、ＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等をコードするＤＮＡ等が挙げられる。ＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡを用いる場合、トランスファーＲＮＡプロモーターを用いてこれらのＲＮＡを転写製造させることにより特定の遺伝子の発現抑制が可能となる。
例えば、これらの遺伝子のうち、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子等を腫瘍の治療に用いることができ、全長遺伝子ばかりでなくその断片も用いることができ、例えば、配列番号１８に示すＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質のアミノ酸配列中の第１番目のアミノ酸に始まり第３９番目のアミノ酸〜第７８番目のいずれかのアミノ酸に終わるアミノ酸配列、あるいは配列番号１８に示すＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質のアミノ酸配列中の第１番目のアミノ酸に始まり第３９番目のアミノ酸〜第７８番目のいずれかのアミノ酸に終わるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、又は付加してなるアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。これらのＤＮＡの中でも配列番号１８に示すＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質のアミノ酸配列の１〜７８番目のアミノ酸からなるペプチドをコードするＤＮＡ（Ｎ７８−ＲＥＩＣ  ＤＮＡ）が好適に用いられる。
また、検出や疾患の診断のためにレポーター遺伝子が含まれていてもよい。
プロモーターはＤＮＡを鋳型に転写を開始するＤＮＡ上の特定の塩基配列であり、一般的に、共通の配列を持つ。例えば、大腸菌などの原核生物では、通常、転写開始部位の−１０塩基対部位にＴＡＴＡＡＴＧ配列を、−３５塩基対部位にＴＴＧＡＣＡ配列を持つ。また、真核生物では、通常、−２０塩基対部位にＴＡＴＡボックスを持つ。本発明の発現用カセットは、発現させようとする遺伝子の上流に必ず第１のプロモーターを有し、また発現させようとする遺伝子の下流に第２のプロモーターを有してもよい。これら第１のプロモーター及び第２のプロモーターとして用いるプロモーターは限定されず、第１のプロモーターと第２のプロモーターは同じであっても異なっていてもよい。あらゆる細胞や組織で外来遺伝子を発現を促進させ得る非特異的プロモーターも組織若しくは器官特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、発生若しくは分化特異的プロモーター等の特異的あるいは選択的プロモーターも用いることができる。例えば、第１のプロモーターとして特異的プロモーターを用いて、第２のプロモーターとして、非特異的なプロモーターを用いることができる。本発明において用いるプロモーターとして、癌・腫瘍特異的プロモーターとしてはｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ｃ−ｍｙｃ、ＧＬＵＴプロモーターなどが、ＥＳ細胞・癌幹細胞特異的プロモーターとしてはＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧプロモーターなどが、神経幹細胞特異的プロモーターとしてはＮｅｓｔｉｎプロモーターなどが、細胞ストレス感知プロモーターとしてはＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｐ５３プロモーターなどが、肝細胞特異的プロモーターとしてはアルブミンプロモーターなどが、放射線感受性プロモーターとしてはＴＮＦ−ａｌｐｈａプロモーターなどが、感染プラスミドのコピー数を上げるプロモーターとしてはＳＶ４０プロモーターなどが、増殖性細胞特異的プロモーターとしてＥＦ１−ａｌｐｈａプロモーターなどが挙げられる。さらに具体的には、例えば、第１のプロモーターとして、ＣＭＶ−ｉプロモーター（ｈＣＭＶ＋イントロンプロモーター）（配列番号５）、βアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（配列番号１２）、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、第２のプロモーターとしてＣＭＶプロモーター等が用いられる。βアクチンプロモーターの由来動物種は限定されず、哺乳類βアクチンプロモーター、例えば、ヒトβアクチンプロモーター（配列番号８）やニワトリアクチンプロモーターが用いられる。また、上記のＣＭＶ−ｉプロモーター等の人工的なハイブリッドプロモーターも用いることもできる。ＣＭＶ−ｉプロモーターは米国特許第５１６８０６２号明細書や米国特許第５３８５８３９号明細書の記載に基づいて合成することができる。プロモーターはプロモーター活性を有する最小配列からなるコアプロモーターの部分を用いてもよい。コアプロモーターとは、正確な転写開始を導く働きをもつプロモーター領域をいい、ＴＡＴＡボックスを含むことがある。上記のプロモーターのうち、ｈＴＥＲＴプロモーター等の癌・腫瘍特異的プロモーターは、癌をターゲットとして遺伝子発現による遺伝子治療、癌診断用に好適に用いることができ、ｈＴ���ＲＴプロモータを含むコンストラクトＮｏ．２１をこのような用途に用いることができる。
ポリＡ付加配列（ポリアデニル化配列、ｐｏｌｙＡ）の由来は限定されず、成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列（配列番号６に示す塩基配列に含まれる（１３番目の塩基以降の配列））やヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリＡ付加配列、ＳＶ４０ウイルス由来ポリＡ付加配列、ヒトやウサギのβグロビン遺伝子由来のポリＡ付加配列等が挙げられる。ポリＡ付加配列を発現用カセットに含ませることにより、転写効率が増大する。
エンハンサーは、転写により生成するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量を結果的に増加させるものであれば限定されない。エンハンサーはプロモーターの作用を促進する効果を持つ塩基配列であり、一般的には１００ｂｐ前後からなるものが多い。エンハンサーは配列の向きにかかわらず転写を促進することができる。本発明で用いられるエンハンサーは１種類でもよいが、２つ以上の同一のエンハンサーを複数用いたり、又は異なる複数のエンハンサーを組み合わせて用いてもよい。また、異なる複数のエンハンサーを用いる場合、その順番は限定されない。例えば、ＣＭＶエンハンサー（配列番号７）、ＳＶ４０エンハンサー、ｈＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）エンハンサー等を用いることができる。一例として、ｈＴＥＲＴエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサーをこの順で連結したものが挙げられる。
さらに発現させようとするタンパク質をコードするＤＮＡ及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物の上流に複数のエンハンサー、例えば１〜４個のエンハンサーが連結されていてもよい。この上流に連結するエンハンサーは限定されないが、ＣＭＶエンハンサーが好ましい。例えば、ＣＭＶエンハンサーを４つ連結した４×ＣＭＶエンハンサー（配列番号１１）等があげられる。
エンハンサーを「プロモーター−発現させようとする遺伝子−ｐｏｌｙ  Ａ付加配列」からなるＤＮＡ構築物のすぐ下流に挿入すると、従来の一般の遺伝子発現システムと比べて、強力な発現させようとする遺伝子のタンパク質発現が可能となる。
特に、ＣＭＶ  ｉプロモーターとＣＭＶエンハンサーの組合せにより、ほぼ全ての細胞（宿主細胞）において、あらゆる遺伝子を挿入した場合に、如何なるトランスフェクション試薬を用いた場合においても、発現させようとする遺伝子の強力なタンパク質発現が可能となる。
ＣＭＶエンハンサーをプロモーターの上流に１個以上挿入することにより、特定の細胞（例えば、後記の実施例のＨＥＫ２９３細胞株やＭＣＦ７細胞株）において、特定の遺伝子、例えば、後記の実施例のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子やＣＤ１３３遺伝子において、発現がさらに増強される。また、ＣＭＶエンハンサーをプロモーターの前に４個挿入することにより、特定の細胞（例えば、後記の実施例のＨｅｐＧ２細胞株やＨｅＬａ細胞株）によっては、さらに発現が増強される。
なお、上流にＣＭＶエンハンサーを挿入したのみでは、遺伝子発現は少ししか上昇しないか、あるいは、少ししか変化しない（図１及び図２）。本発明の発現用カセットにおいては、ｐｏｌｙ  Ａ付加配列の下流すぐにＣＭＶエンハンサーが挿入連結されていることが重要である。
さらに、ＲＵ５’（配列番号９）が発現させようとするタンパク質をコードするＤＮＡの直ぐ上流に連結されていてもよい。直ぐ上流とは、他の特定の機能を有するエレメントを介さず直接連結していることをいうが、リンカーとして短い配列が間に含まれていてもよい。ＲＵ５’はＨＴＬＶ由来のＬＴＲで、挿入することにより、タンパク質発現を上昇させるエレメントである（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）。ＲＵ５’を報告されているのと逆に挿入することにより、プロモーターのエンハンサー挿入による発現増強効果が打ち消されることがある。
さらに、エンハンサー及び／又はプロモーターの直ぐ上流にＵＡＳが連結されていてもよい。ＵＡＳとは、ＧＡＬ４遺伝子の結合領域であり、後にＧＡＬ４遺伝子を挿入することにより、タンパク質発現が上昇させられる。
さらに、発現用カセットの最上流にＳＶ４０−ｏｒｉが連結されていてもよい。ＳＶ４０−ｏｒｉはＳＶ４０遺伝子の結合領域であり、後にＳＶ４０遺伝子を挿入することにより、タンパク質発現が上昇する。
上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、発現させようとする遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。
図７〜２１、３６、３７、４９、５５〜５８に種々の発現用カセットのコンストラクトの構造を示す。本発明において、コンストラクトをプラスミドの骨格ともいう。本発明の発現させようとする遺伝子の発現を増強するコンストラクトとして、例えば、コンストラクトＮｏ．２（図８）、Ｎｏ．４（図１０）、Ｎｏ．６（図１２）、Ｎｏ．８（図１４）、Ｎｏ．１０（図１６）、Ｎｏ．１２（図１８）、Ｎｏ．１４（図２０）、Ｎｏ．１５（図３６）、Ｎｏ．１６（図３７）、Ｎｏ．１７（図４９）、Ｎｏ．２０（図５７）及びＮｏ．２１（図５８）に示すコンストラクトが挙げられる。また、図２１に示すコンストラクトも含まれる。
これらのコンストラクトの中では、遺伝子発現の上昇という観点からは、目的遺伝子の下流に３つのエンハンサーが連結されているコンストラクトＮｏ．１４、コンストラクトＮｏ．１５及びコンストラクトＮｏ．１６のコンストラクトが最も優れている。例えば、コンストラクトＮｏ．１４に目的遺伝子としてＲＥＩＣ全長遺伝子を用いることにより、そのタンパク質発現量は、１００ＭＯＩでのアデノウイルスベクター（全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子をコード）の場合の発現量に匹敵する。また、コンストラクトＮｏ．１４のプラスミド骨格は、Ｎ７８−ＲＥＩＣをコードするＤＮＡのような遺伝子断片においても、遺伝子発現上昇効果を示す。
例えば、コンストラクトＮｏ．１４のコンストラクトにＮ７８−ＲＥＩＣをコードするＤＮＡ断片を含む製剤を、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３にトランスフェクションすることにより、著明な癌細胞増殖抑制効果及び癌細胞死誘導効果が認められる。コンストラクトＮｏ．１４のコンストラクトに全長ＲＥＩＣ遺伝子をコードした製剤を、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３にトランスフェクションすることにより、癌細胞増殖抑制効果が認められる。
また、コンストラクトＮｏ．１４にヒトエリスロポエチン等のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、発現ベクターを作製し、該発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクトすることにより、該細胞を用いて前記タンパク質を大量に製造することができる。
本発明において上記配列番号の塩基配列で表されるＤＮＡは、それぞれのＤＮＡが有する活性又はそれぞれのＤＮＡがコードするタンパク質若しくはポリペプチドが有する活性を有している限り、塩基配列に変異を有していてもよい。例えば、それぞれの配列番号で表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、それぞれの配列番号で表される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有しているＤＮＡ、又は前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質若しくはポリペプチドのアミノ酸配列に対して１又は複数若しくは数個（１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個若しくは２個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡ構築物の構築に用いることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記のＳＳＣ、ＳＤＳ及び温度の条件の組み合わせは例示であり、ＤＮＡの濃度、ＤＮＡの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間などを適宜組み合わせることにより、必要なストリンジェンシーを実現することが可能である。
本発明の発現用カセットを挿入するベクターとしては、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等のウイルスベクターや生分解性ポリマーなどの非ウイルスベクターが挙げられる。上記発現用カセットを導入したベクターを、感染、エレクトロポレーション等の公知の方法により細胞に導入すればよい。
また、この際、公知のトランスフェクション試薬を用いて導入してもよい。
本発明の発現用カセットを挿入したベクターを細胞に導入し、該細胞をトランスフェクトすることにより、該細胞で目的遺伝子を発現させ、目的タンパク質を産生することができる。本発明の発現カセットを導入し目的タンパク質を産生させるためには、真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属細菌等の細菌細胞が挙げられる。好ましくは、Ｈｅｌａ細胞、ＨＥＫ１９３細胞、ＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等の哺乳類細胞が用いられる。形質転換された前記の宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とするタンパク質を産生させることができる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ等の公知の培養用培地を使用することができる。発現されたタンパク質は、分泌タンパク質の場合は培養液中から、非分泌タンパク質の場合は細胞抽出物中から公知の方法で精製することができる。目的タンパク質を発現し生産する場合、細胞に別々の目的遺伝子を含む複数のベクターを同時にトランスフェクトさせた生産してもよい。このようにすることにより、一度に複数のタンパク質を産生することができる。
さらに、市販のベクターを改変し、本発明の発現用カセットが含まれるようにしてもよい。例えば、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター等の市販のベクターの発現遺伝子カセットの下流領域にエンハンサーを組込んで用いることができる。本発明のベクターは市販のカセットを改変したものも包含する。
本発明は、さらに、上記の発現させようとする遺伝子発現用カセットを含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。該ベクターは、癌等の疾患の特異的診断又は治療を可能とする。該ベクターはアデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスに上記の発現させようとする遺伝子発現用カセットを挿入して作製することができる。
アデノウイルスベクターの特徴として、（１）多くの種類の細胞に遺伝子導入ができる、（２）増殖停止期の細胞に対しても効率よく遺伝子導入ができる、（３）遠心により濃縮が可能であり、高タイター（１０〜１１ＰＦＵ／ｍｌ以上）のウイルスが得られる、（４）ｉｎ  ｖｉｖｏの組織細胞への直接の遺伝子導入に適している、といった点が挙げられる。
遺伝子治療用のアデノウイルスとしては、Ｅ１／Ｅ３領域を欠失させた第１世代のアデノウイルスベクター（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，１３２０，１９９６）から、Ｅ１／Ｅ３領域に加え、Ｅ２もしくはＥ４領域を欠失させた第２世代のアデノウイルスベクター（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８９４４，１９９６；Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．＆Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０，２０１３，１９９９）、アデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（ＧＵＴＬＥＳＳ）第３世代のアデノウイルスベクター（Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，９３０３，１９９９）が開発されているが、本発明に係る遺伝子を導入するには、特に限定されずいずれのアデノウイルスベクターでも使用可能である。
アデノ随伴ウイルスは、パルボウイルス属１本鎖ＤＮＡウイルスであり、（１）遺伝子長期発現、（２）低毒性、（３）分裂及び非分裂細胞に遺伝子導入が可能という特性を有する。コンカタマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ；１本鎖ＤＮＡが連結した複合体）の形成が遺伝子長期発現の原因とされている。
本発明の発現させようとする遺伝子の発現用カセットを含み標的となる発現させようとする遺伝子を発現し得るアデノウイルス（Ａｄ）ベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、疾患検出又は疾患治療に用い得る。疾患としては、癌等が挙げられ、アデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターの外殻に挿入された特定の細胞に発現しているタンパク質に選択的に結合するＲＧＤ等のペプチドにより該細胞を指向し、該細胞に感染し、発現させようとする遺伝子が発現する。発現させようとする遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子の場合、特定の細胞を発光等により検出することができる。特定の細胞が癌細胞の場合、被験体に投与することにより、被験体中の癌細胞を検出し、該被験体が癌に罹患していることを診断することができる。本発明のアデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターは細胞１個を検出することができるので、例えば微小癌の検出に用いることができる。
また、発現させようとする遺伝子が治療用遺伝子の場合、特定の細胞中で標的となる発現させようとする遺伝子が発現し、治療効果を発揮し得る。例えば、特定の細胞が癌細胞であり、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子等の癌抑制遺伝子を用いた場合、被験体に投与することにより、被験体の癌細胞に癌治療用遺伝子がデリバリーされ、癌細胞中で遺伝子が発現し、治療効果を発揮する。本発明は、このようなアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターを含む診断又は治療用ウイルス製剤を包含する。治療用遺伝子として、ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子等の癌抑制遺伝子を用いた場合の治療対象となる癌としては、本発明の治療対象となる癌としては、例えば、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。本発明のアデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターは原発性癌の治療にも転移性癌の治療にも用いることができる。
本発明のアデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターは、遺伝子治療の分野において使用可能な方法、例えば、静脈内投与や動脈内投与などの血管内投与、経口投与、腹腔内投与、気管内投与、気管支内投与、皮下投与、経皮投与等により投与することができる。特に、本発明のアデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターは特定の組織、細胞への指向性が大きく、標的遺伝子を効率的に特定の組織、細胞へデリバリーすることができるので、血管内投与によっても、効率的に診断、治療を行うことができる。
アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターは、治療上有効量を投与すればよい。治療上の有効量は、遺伝子治療分野の当業者であれば容易に決定することができる。さらに、投与量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣等によって適宜変更することができる。例えば、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルススベクターを、０．５×１０１１〜２．０×１０１２ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重、好ましくは１．０×１０１１〜１．０×１０１２ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重、さらに好ましくは１．０×１０１１〜５．０×１０１１ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重の量で投与すればよい。ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅは、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスのゲノムの分子数（ウイルス粒子数）を表し、ｐａｒｔｉｃｌｅということもある。製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
さらに、目的遺伝子を含む本発明の発現カセットを含む発現ベクターを癌等に対するワクチンやＤＮＡワクチンとして用いることもできる（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｈ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２，２１２２−２１３２（２００４）；ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７，４２５−４３０（２００９））。例えば、癌特異的抗原を標的タンパク質とし、該タンパク質をコードする遺伝子を組込んだ本発明の発現カセットを含む発現ベクターを皮下への注入等により生体内に投与し、前記抗原を生体内で発現させ、該抗原に対する宿主の細胞性免疫や抗体免疫の活性化を誘導することができる。このようにワクチンとして用いることにより、本発明の発現カセットを癌等の疾患の予防や治療に用いることができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
ＣＭＶプロモーターを含む発現用カセット
本発明の発現用カセットを作成し、トランスフェクトし、発現タンパク質をウエスタンブロットにより分析した。
（１）用いた発現用カセットのコンストラクト
コンストラクトＮｏ．１（図７）
発現させようとする遺伝子の上流にＣＭＶ  ｉプロモーターを搭載した遺伝子発現プラスミドである。また、前記遺伝子の下流にＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ（ウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡ付加配列）が連結されている。すなわち、一般的に使用されているＣＭＶ  ｉプロモーターを用いた発現プラスミドと、タンパク質発現力は同等と考えられる。
コンストラクトＮｏ．２（図８）
コンストラクトＮｏ．１のＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａの下流すぐにＣＭＶエンハンサーを挿入したものである。
コンストラクトＮｏ．３（図９）
コンストラクトＮｏ．１のＣＭＶ  ｉプロモーターを、ヒトβアクチンプロモーターに置換したものである。
コンストラクトＮｏ．４（図１０）
コンストラクトＮｏ．３のＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａの下流すぐにＣＭＶエンハンサーを挿入したものである。
コンストラクトＮｏ．５（図１１）
コンストラクトＮｏ．３のヒトβアクチンプロモーターの下流すぐにＲＵ５’領域を挿入したものである。
コンストラクトＮｏ．６（図１２）
コンストラクトＮｏ．５のＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａの下流すぐにＣＭＶエンハンサーを挿入したものである。
コンストラクトＮｏ．７（図１３）
コンストラクトＮｏ．５のヒトβアクチンプロモーターの上流すぐにＣＭＶエンハンサーを挿入したものである。
コンストラクトＮｏ．８（図１４）
コンストラクトＮｏ．７のＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａの下流すぐにＣＭＶエンハンサーを挿入したものである。
コンストラクトＮｏ．９（図１５）
コンストラクトＮｏ．７のＲＵ５’領域を逆の塩基配列にしたものである。
コンストラクトＮｏ．１０（図１６）
コンストラクトＮｏ．９のＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａの下流すぐにＣＭＶエンハンサーを挿入したものである。
コンストラクトＮｏ．１１（図１７）
コンストラクトＮｏ．５のヒトβアクチンプロモーターの上流すぐに４×ＣＭＶエンハンサー（４つのＣＭＶエンハンサー）を挿入したものである。
コンストラクトＮｏ．１２（図１８）
コンストラクトＮｏ．１１のＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａの下流すぐにＣＭＶエンハンサーを挿入したものである。
コンストラクトＮｏ．１３（図１９）
ＣＡＧプロモーターを搭載した遺伝子発現プラスミドである。すなわち、一般的に使用されているＣＡＧプロモーターを用いた発現プラスミドと、タンパク質発現力は同等と考えられる。
コンストラクトＮｏ．１４（図２０）
これまでの様々な上記のコンストラクトを調べた結果より、ＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａの下流すぐにＣＭＶエンハンサーを挿入することにより、遺伝子発現が著しく増強することが判明したので、コンストラクトＮｏ．１４ではさらに、他のエンハンサーであるｈＴＥＲＴエンハンサーとＳＶ４０エンハンサーを連結した。その結果として、コンストラクトＮｏ．２よりも優れたコンストラクトになったと考えられる。
全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子をコードするアデノウイルスのコンストラクト（図２１）
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３（Ａｄ−ＲＥＩＣ）の全長ｃＤＮＡをコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔに組込み、次いでＣＯＳ−ＴＰＣ  ｍｅｔｈｏｄ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ）によりアデノウイルスベクターにトランスファーした。この際、ＬａｃＺ遺伝子を保持するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＬａｃＺ）をコントロールとして用いた。用いたアデノウイルスベクターは、特許３８１３８７２号公報に記載されているものと同じである。
図２２〜図３５に以下のエレメント又はコンストラクトの塩基配列を示す。
図２２−１及び図２２−２（図２２−１の続き）は、ｐＤＮＲ−１ｒ  Ｄｏｎｏｒ  ｖｅｃｔｏｒ（プロモーターの無いクローニング用プラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、品番ＰＴ３６１６−５））の全塩基配列を示す。
図２３は、ｐＩＤＴ−ＳＭＡＲＴベクター（プロモーターの無いクローニング用プラスミドベクター（ＩＤＴ社））の全塩基配列を示す。
図２４は、ＣＭＶ  ｉプロモーター（ｈＣＭＶ＋イントロンプロモーター）領域の塩基配列を示す。該領域は、ＣＭＶ  ｉプロモーター領域の塩基配列の既知の情報を元に、人工合成により作成した。
図２５は、ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ（３×ｓｔｏｐ＋ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ）領域の塩基配列を示す。
該塩基配列中の「ＴＡＡＴＡＡＡ」の部分は、ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ配列の中でも、より重要な配列である。該配列は、ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ領域の塩基配列の既知の情報を元に、人工合成により作成した。
図２６は、ＣＭＶエンハンサー領域の塩基配列を示す。該配列は、ＣＭＶエンハンサー領域の塩基配列の既知の情報を元に、人工合成により作成した。
図２７は、ヒトβアクチンプロモーター領域の塩基配列を示す。該配列は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社のｐＤＲＩＶＥ−ｈβ  Ａｃｔｉｎ−ＲＵ５’のプラスミドを入手し、その当該部分の塩基配列をＰＣＲして増幅することにより作成した。
図２８は、ＲＵ５’正方向｛ＨＴＬＶ  Ｔｙｐｅ  １  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔのＲセグメント及びＵ５配列の一部（Ｒ−Ｕ５’）｝領域の塩基配列を示す。該配列は、｛ＨＴＬＶ  Ｔｙｐｅ  １  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔのＲセグメント及びＵ５配列の一部（Ｒ−Ｕ５’）｝領域の塩基配列の既知の情報を元に、人工合成により作成した。
図２９は、ＲＵ５’逆方向｛ＨＴＬＶ  Ｔｙｐｅ  １  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔのＲセグメント及びＵ５配列の一部（Ｒ−Ｕ５’）｝領域の塩基配列を示す。該配列は、｛ＨＴＬＶ  Ｔｙｐｅ  １  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔのＲセグメント及びＵ５配列の一部（Ｒ−Ｕ５’）｝領域の塩基配列の既知の情報を元に、人工合成により作成した。
図３０は、４×ＣＭＶエンハンサー領域の塩基配列を示す。図３０の塩基配列の中で、下線が引いてある部分は、いわゆる「短いＣＭＶエンハンサー」と呼ばれるもので、これが４つあるので、４×ＣＭＶエンハンサーとなる。なお、前述のＣＭＶエンハンサーは「短いＣＭＶエンハンサー」を含んでおり、一般的にはＣＭＶエンハンサーと言う場合、長い方を指す。前記配列は、ＣＭＶエンハンサー領域の塩基配列の既知の情報を元に、人工合成により作成した。
図３１は、ＣＡＧプロモーター領域の塩基配列を示す。公知のＣＡＧプロモーター領域の塩基配列である。オリエンタル酵母社より提供を受けたＣＡＧプロモーター搭載の遺伝子発現ベクターであるｐＣＡＧＧＳプラスミドを元に、その当該部分の塩基配列をＰＣＲして増幅することにより作成した。
図３２は、２ＩＲＥＳインサート領域の塩基配列を示す。後記の図５及び図６のＩＲＥＳコントロール遺伝子の塩基配列である。ＢｉＰ−ＩＲＥＳ領域（図３２の塩基配列中の（１）の枠で囲んだ小文字の部分）とＭｙｃ−ＩＲＥＳ領域（図３２の塩基配列中の（２）の枠で囲んだ小文字の部分）の二つの正常ヒトＤＮＡの塩基配列をこの順でつなげたものであり、挿入遺伝子のコントロール遺伝子として用いられる遺伝子である。前記配列は、ＢｉＰ−ＩＲＥＳ領域とＭｙｃ−ＩＲＥＳ領域の塩基配列の既知の情報を元に、人工合成により作成した。
図３３は、ＳＶ４０ｏｒｉ−ＵＡＳ−ＣＭＶｉ−ＲＵ５’領域の塩基配列を示す。コンストラクトＮｏ．１４（最も良いコンストラクト）の挿入遺伝子（外来遺伝子）より左側の挿入部分の塩基配列である。該配列は、当該部分に含まれるそれぞれの領域の塩基配列の既知の情報を元に、人工合成により作成した。図３３の塩基配列中の（１）の枠で囲んだ部分はＳＶ４０  ｏｒｉ領域を示し、（２）の枠で囲んだ部分はＣＭＶ  ｉプロモーター領域を示し、（３）の枠で囲んだ部分は、ＲＵ５’領域を示す。
図３４は、３×ｓｔｏｐ−ＢＧＨ−ｐｏｌｙＡ−ＵＡＳ−ｈＴＥＲＴエンハンサー＋ＳＶ４０エンハンサー＋ＣＭＶエンハンサー領域の塩基配列を示す。コンストラクトＮｏ．１４（最も良いコンストラクト）の、挿入遺伝子（外来遺伝子）より右側（下流側）の挿入部分の塩基配列である。該配列は、当該部分に含まれるそれぞれの領域の塩基配列の既知の情報を元に、人工合成により作成した。図３４中の塩基配列中の（１）の枠で囲んだ大文字の部分はＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ領域を、（２）の枠で囲んだ小文字の部分はｈＴＥＲＴエンハンサー領域を、（３）の枠で囲んだ大文字の部分はＳＶ４０エンハンサー領域を、（４）の枠で囲んだ小文字の部分はＣＭＶエンハンサー領域を示す。
図３５−１及び３５−２は、コンストラクトＮｏ．１４ベクターの全塩基配列を示す。図２０に示したコンストラクトＮｏ．１４（最も良いコンストラクト）の塩基配列を示し、ｐＩＤＴ−ＳＭＡＲＴベクター部分（図３５−１中塩基配列の第１０行目の太字部分までの領域及び図３５−２中塩基配列の下から２４行の枠で囲まれたＧＣＧＣＧＣの後ろの領域）も含む、全ての塩基配列である。該配列は、前述のｐＩＤＴ−ＳＭＡＲＴベクターに、直前の２つに示した（コンストラクトＮｏ．１４の）挿入遺伝子（外来遺伝子）左右の挿入部分を組み込むことにより作成した。（１）はＳＶ−４０  ｏｒｉ領域、（２）はＣＭＶ  ｉプロモーター領域を、（３）はＲＵ５’領域を、（４）はＢｉＰ  ＩＲＥＳ領域を、（５）はＭｙｃ  ＩＲＥＳ領域を、（６）はｈＴＥＲＴエンハンサー領域を、（７）はＳＶ４０エンハンサー領域を示す。
（２）用いた外来遺伝子（挿入遺伝子）
６Ｈｉｓ−Ｓ１００Ａ１１−ＨＡ
ヒト正常線維芽細胞の当該ｃＤＮＡをテンプレートとして、その５’側に６Ｈｉｓのリンカーをつけたプライマーと３’側にＨＡのリンカーをつけたプライマーとでＰＣＲして作成した。
ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製品のＧＦＰ発現ベクターである、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２をテンプレートとしてプライマーを設定し、ＰＣＲして作成した。
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３（全長）
ヒト正常線維芽細胞の当該ｃＤＮＡをテンプレートとしてプライマーを設定し、ＰＣＲして作成した。
Ｎ７８‐ＲＥＩＣ−６Ｈｉｓ
上記で得た全長のＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子の３’側に６Ｈｉｓがつくようにプライマーを設定し、ＰＣＲして作成した。
コントロール遺伝子（ＩＲＥＳ）
ここで言うこのＩＲＥＳコントロール遺伝子は、ＢｉＰ−ＩＲＥＳ遺伝子とＭｙｃ−ＩＲＥＳ遺伝子の２つの正常ヒトＤＮＡの既知の塩基配列をこの順でつなげたものであり、人工合成により作成した。この遺伝子をコンストラクトＮｏ．１４の挿入遺伝子（外来遺伝子）の部分に挿入することにより、後記の図５及び図６においてＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３（全長）遺伝子及びＮ７８‐ＲＥＩＣ−６ＨｉｓをコードするＤＮＡのコントロール遺伝子とした。
ＣＤ１３３−６Ｈｉｓ
ヒト正常線維芽細胞の当該ｃＤＮＡをテンプレートとしてプライマーを設定し、ＰＣＲして作成した。
ＬＧＲ５−ＨＡ
ヒト正常線維芽細胞の当該ｃＤＮＡをテンプレートとしてプライマーを設定し、ＰＣＲして作成した。
Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−６Ｈｉｓ
ヒト正常線維芽細胞の当該ｃＤＮＡをテンプレートとしてプライマーを設定し、ＰＣＲして作成した。
ＫＬＦ１６
ヒト正常線維芽細胞の当該ｃＤＮＡをテンプレートとしてプライマーを設定し、ＰＣＲして作成した。
（３）トランスフェクション法とウエスタンブロット分析（ＷＢ法）
各種の細胞（６ウェルプレートで７０〜８０％コンフルエントに培養したもの）への各種遺伝子の導入は、各社のトランスフェクション試薬：ＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｔｒａｎｓ−ＩＴ−Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ社）を用いて行った。その手技は、それぞれの製品のマニュアルに記載の通りに行った。
発現された外来遺伝子（挿入遺伝子）ウエスタンブロット分析は以下の方法で行った。
細胞をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）を用いて２回洗浄し、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  ＮＰ−４０，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，５μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，５μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，１ｍＭ  ＮａＦ，１０ｍＭ  β−ＧＰ）で溶解し、タンパク質を抽出した。遠心分離後、各実験に用いる各上清のタンパク質量を同濃度に調整し、同量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを用いて希釈した。次いで、９５℃で５分間熱処理した。サンプル（１０μｇタンパク質）を７．５％又はグラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）で分離しポリフッ化ピニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。ブロットを１０％脂肪不含ミルクパウダー、６％グリシン及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で室温１時間ブロッキングした。次いで、タンパク質を以下の一次抗体（１：１０００希釈）を用いて同定した。
抗ＨＡ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）
抗ＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）
抗ＲＥＩＣ抗体（ウサギ抗ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３ポリクローナル抗体）
抗６Ｈｉｓ抗体（ＭＢＬ社）
抗ＫＬＦ１６抗体（Ａｂｃａｍ社）
０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ（Ｔ−ＴＢＳ）で十分洗浄し、ブロットを西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体と反応させた。Ｔ−ＴＢＳで十分洗浄した後、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ検出法（ＥＣＬ  ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）により検出した。
細胞培養は以下の方法で行った。
ＨＥＫ２９３（ヒト正常腎臓由来）、ＭＣＦ７（ヒト乳癌由来）、ＰＣ３（ヒト前立腺癌由来）、ＨｅＬａ（ヒト子宮癌由来）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓癌由来）の各細胞株はＡＴＣＣ（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））より入手した。用いた培地は以下のとおりであった。
ＨＥＫ２９３：ＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
ＭＣＦ７：ＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
ＰＣ３：Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
ＨｅＬａ：ＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
ＨｅｐＧ２：ＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
上記細胞株を１０％（ｖ／ｖ）ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００ＩＵ／ｍｌ）及びｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）を補足した上記培地で増殖させ５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。
結果を図１〜図６に示す。
図１は、ＨＥＫ２９３細胞株にＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤを用いて３６時間トランスフェクトした各種外来遺伝子の発現を示す。コンストラクトＮｏ．１のタンパク質発現力は、一般的に使用（販売）されているＣＭＶ  ｉプロモーターを用いた発現プラスミドと同等であった。すなわち、これらの発現プラスミドのタンパク質発現力と比べて、コンストラクトＮｏ．２のタンパク質発現力は著しく強いと言える。また、以下の様々な遺伝子において同様の結果であり、コンストラクトＮｏ．２は、全ての種類の遺伝子の発現において、現在広く使われている遺伝子発現システムを凌駕していると言える。
Ｓ１００Ａ１１：癌増殖に関与すると考えられる；細胞質内―核内移行タンパク質
ＧＦＰ：蛍光タンパク質；細胞質内タンパク質
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）：癌抑制タンパク質；分泌タンパク質
Ｎ７８‐ＲＥＩＣ：上記の遺伝子断片を元に作られる断片タンパク質（配列番号２に示すＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質のアミノ酸配列の１〜７８番目のアミノ酸からなる断片ペプチド）
ＣＤ１３３：癌幹細胞のマーカー；細胞表面にも発現
ＬＧＲ５：正常細胞及び癌細胞の幹細胞のマーカー；細胞膜貫通タンパク質
Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ：細胞の老化や不死化に関与；細胞質内タンパク質
ＫＬＦ１６：タンパク質の転写に関与；核内タンパク質
図２は、種々の細胞株にＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤを用いて３６時間トランスフェクトしたＫＬＦ遺伝子の発現を示す。図に示した全ての細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＭＣＦ７細胞、ＰＣ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞）において、コンストラクトＮｏ．２のタンパク質発現力（ＫＬＦ１６の遺伝子発現）は、コンストラクトＮｏ．１と比べて著しく強いと言える。すなわち、コンストラクトＮｏ．２は、全ての種類の細胞での遺伝子発現において、現在広く使われている遺伝子発現システムを凌駕していると言える。
図３は、ＨＥＫ２９３細胞株に各種トランスフェクト試薬を用いて３６時間トランスフェクトしたＫＬＦ遺伝子の発現を示す。いずれのトランスフェクション試薬においても、コンストラクトＮｏ．２の場合で、ＷＢ法により最も多くのＫＬＦ１６タンパク質が発現されている。コンストラクトＮｏ．１は、一般に入手可能で一般に良く使用されているＣＭＶ  ｉプロモーターを含むコンストラクトであり、コンストラクトＮｏ．１３は同じく一般に良く使用されているＣＡＧプロモーターを含むコンストラクトである。すなわち、現在世界中において遺伝子発現用のプラスミドコンストラクトとして普及・使用されているコンストラクトを著しく凌駕する量のタンパク質発現（遺伝子発現の過程全体としての効率の向上）が、本発明のコンストラクトＮｏ．２を使用することにより可能となった。
図４は、ＨＥＫ２９３細胞株に全長ＲＥＩＣ遺伝子及びＮ７８−ＲＥＩＣをコードする遺伝子ＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤを用いて３６時間トランスフェクトした場合の発現を示す。左パネルは、ＷＢ法により、コンストラクトＮｏ．１４ではコンストラクトＮｏ．２の場合よりＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３タンパク質（全長）が多く発現されていることを示す。すなわち、図１のＷＢ法の結果（コンストラクトＮｏ．１〜Ｎｏ．１２の中でＮｏ．２が最もタンパク質を多く発現）及び図３のＷＢ法の結果（コンストラクトＮｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．１１、Ｎｏ．１２、Ｎｏ．１３の中でＮｏ．２が最もタンパク質を多く発現）を踏まえると、検討したプラスミドコンストラクトの中で最も多くタンパク質を発現できるもの（有用なもの）は、コンストラクトＮｏ．１４であった。このコンストラクトＮｏ．１４によるタンパク質発現の能力は、１００ＭＯＩにおけるＡｄ−ＲＥＩＣ（全長ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子をコードするアデノウイルス）の投与時と同等な程強力であった。右パネルは、断片遺伝子であるＮ７８‐ＲＥＩＣ−６ＨｉｓをコンストラクトＮｏ．１４に挿入した時も、左パネルと同様のことが言えることを示す。すなわち、提示したプラスミドコンストラクトの中で最も多くタンパク質を発現できるもの（有用なもの）は、コンストラクトＮｏ．１４であった。
図５は、Ｎ７８−ＲＥＩＣをコードするＤＮＡを挿入したコンストラクトＮｏ．１４による、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３細胞株の増殖抑制と細胞死誘導を示す。
細胞生存率アッセイ
ＰＣ３細胞株を６ウェルプレートに１ウェル当たり５０，０００細胞の密度で完全培地中に播いた。２４時間のインキュベーション後、完全培地中で細胞を所定のプラスミドにＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤ試薬を用いてトランスフェクトし、所定の日数インキュベートした。インキュベーション後、細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。
統計分析
２群間でＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔを行い、ｐ＜０．０５のとき有意差があると判定した。
図に示すようにＮ７８−ＲＥＩＣをコードするＤＮＡを挿入したコンストラクトＮｏ．１４の投与後２日目と５日目において、コントロール遺伝子（ＩＲＥＳ）を挿入したコンストラクトＮｏ．１４の投与群と比べ、有意にＰＣ３細胞株の増殖が抑制された（ＰＣ３細胞の数がＮ７８−ＲＥＩＣをコードするＤＮＡ−コンストラクトＮｏ．１４の投与により減っていることより、有意に多く細胞死が誘導されたと言える）。
図６は、全長ＲＥＩＣ遺伝子を挿入したコンストラクトＮｏ．１４による、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３細胞株の増殖抑制を示す。
細胞生存率アッセイ
ＰＣ３細胞株を６ウェルプレートに１ウェル当たり５０，０００細胞の密度で完全培地中に播いた。２４時間のインキュベーション後、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ中で細胞を所定のプラスミドにＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤ試薬を用いてトランスフェクトし、所定の日数インキュベートした。インキュベーション後、細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。
統計分析
２群間でＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔを行い、ｐ＜０．０５のとき有意差があると判定した。
図に示すように全長ＲＥＩＣ遺伝子挿入したコンストラクトＮｏ．１４の投与後２日目において、コントロール遺伝子（ＩＲＥＳ）を挿入したコンストラクトＮｏ．１４の投与群と比べ、有意にＰＣ３細胞の増殖が抑制された。
【実施例２】
【０００７】
ＳＶ４０プロモーター又はｈＴＥＲＴプロモーターを含む発現用カセット
ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を目的遺伝子（挿入遺伝子）として含む本発明の発現用カセットを作成し、Ｈｅｌａ細胞をトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を観察することにより発現の強さを分析した。トランスフェクトは、リポフェクタミン２０００を用いて行い、４８時間後にＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡下で観察した。
用いた発現用カセットのコンストラクトは実施例１で用いたコンストラクトＮｏ．１４（図２０）並びにコンストラクトＮｏ．１４のＣＭＶ  ｉプロモーターをＳＶ４０プロモーターに置換したコンストラクトＮｏ．１５（図３６）及びコンストラクトＮｏ．１４のＣＭＶ  ｉプロモーターをｈＴＥＲＴプロモーターに置換したコンストラクトＮｏ．１６（図３７）であった。ＧＦＰ遺伝子はＣｌｏｎｔｅｃｈ社製品のＧＦＰ発現ベクターである、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２をテンプレートとしてプライマーを設定し、ＰＣＲを行って作成し、これを各コンストラクトの目的遺伝子挿入部に挿入して用いた。コントロールとして市販のＧＦＰ発現プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いた。
コンストラクトＮｏ．１５の発現ベクターのＳＶ４０  ｏｒｉ＋ＵＡＳ＋ＳＶ４０  ｅｎｈ＋ｉｎｔｒｏｎ  Ａ＋ＲＵ５’の領域からなる部分断片の塩基構造を図３８に示し、その塩基配列を配列番号１９に示す。また、コンストラクトＮｏ．１６の発現ベクターのＳＶ４０  ｏｒｉ＋ＵＡＳ＋ｈＴＥＲＴ  ｅｎｈ＋ｉｎｔｒｏｎ  Ａ＋ＲＵ５’の領域からなる部分断片の構造を図３９に示し、塩基配列を配列番号２０に示す。さらに、図４０に制限酵素部位を連結したＧＦＰをコードするＤＮＡの塩基配列を示す（配列番号２１）。図３８の塩基配列中の（１）、（２）、（３）及び（４）の枠で囲んだ部分は、それぞれＳＶ４０  ｏｒｉ、ＳＶ４０プロモーター、ｉｎｔｒｏｎ  Ａ及びＲＵ５’を示し、図３９の塩基配列中の（１）、（２）、（３）及び（４）の枠で囲んだ部分は、それぞれＳＶ４０  ｏｒｉ、ｈＴＥＲＴプロモーター、ｉｎｔｒｏｎ  Ａ及びＲＵ５’を示す。コンストラクトＮｏ．１４の発現ベクターにＧＦＰ遺伝子を挿入したベクターの全長塩基配列を図４１−１及び図４１−２（図４１−１の続き）に示す（配列番号２２）。また、コンストラクトＮｏ．１５の発現ベクターにＧＦＰ遺伝子を挿入したベクターの全長塩基配列を図４２−１及び図４２−２（図４１−１の続き）に示す（配列番号２３）。さらに、コンストラクトＮｏ．１６の発現ベクターにＧＦＰ遺伝子を挿入したベクターの全長塩基配列を図４３−１及び図４３−２（図４３−１の続き）に示す（配列番号２４）。図４１−１及び図４１−２の塩基配列中の（１）、（２）、（３）及び（４）の枠で囲んだ部分は、それぞれＣＭＶｉプロモーター（Ｐ−ＣＭＶｉＲＵ）、ＧＦＰ遺伝子、Ｍｙｃ  ＩＲＥＳ、３つのエンハンサー（ｐＡ−３ｅｎｈ）を示し、図４２の塩基配列中の（１）、（２）、（３）及び（４）の枠で囲んだ部分は、それぞれＳＶ４０プロモーター（Ｐ−ＳＶｉＲＵ）、ＧＦＰ遺伝子、Ｍｙｃ  ＩＲＥＳ、３つのエンハンサー（ｐＡ−３ｅｎｈ）を示し、図４３の塩基配列中の（１）、（２）、（３）及び（４）の枠で囲んだ部分は、それぞれｈＴＥＲＴプロモーター（Ｐ−ＴｉＲＵ）、ＧＦＰ遺伝子、Ｍｙｃ  ＩＲＥＳ、３つのエンハンサー（ｐＡ−３ｅｎｈ）を示す。
コンストラクトＮｏ．１５はＳＶ４０タンパク質が高発現する環境での遺伝子の強発現に有利なプラスミドベクターであり、コンストラクトＮｏ．１６は癌細胞中等のｈＴＥＲＴタンパク質が高発現する環境での遺伝子の強発現に有利なプラスミドベクターである。
結果を図４４に示す。図４４Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ市販のＧＦＰ発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）、コンストラクトＮｏ．１４のＧＦＰ発現プラスミド、コンストラクトＮｏ．１５のＧＦＰ発現プラスミド、及びコンストラクトＮｏ．１６のＧＦＰ発現プラスミドの結果を示す。図中上段のパネルは明視野を示す。図に示すように、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター及びｈＴＥＲＴプロモーターのいずれも、市販のプラスミドと比べて、強いＧＦＰ遺伝子発現が認められた。本実施例は、本システム（コンストラクトＮｏ．１４のコンストラクト骨格）は、このようにプロモーターを変化させても、遺伝子増強のための使用が可能であることを示す。
【実施例３】
【０００８】
ヒトエリスロポエチンの発現
ヒトエリスロポエチンを外来遺伝子（挿入遺伝子）として含む本発明の発現用カセットを作成し、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、発現タンパク質をウエスタンブロットにより分析した。トランスフェクトは、ＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤを用いて行い、２４時間後に細胞培養液中のヒトエリスロポエチンをウエスタンブロッティングにより検出した。
用いた発現用カセットのコンストラクトは実施例１で用いたコンストラクトＮｏ．１４（図２０）であり、目的遺伝子（挿入遺伝子）としてヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡを挿入した。図４５に制限酵素部位を連結したヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡの塩基配列を示す（配列番号２５）。コントロールとして、市販の発現プラスミドであるｐＴｒａｃｅｒ（登録商標）−ＥＦ／Ｖ５−Ｈｉｓ−Ａ（インビトロジェン社）及びｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−Ａ（インビトロジェン社）を用い、それぞれのプラスミドの制限酵素サイトＥｃｏＲ１−Ｘｂａ１の部位にヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡを挿入した。
ウエスタンブロッティングは、抗６Ｈｉｓ抗体（ＭＢＬ社）を用いて行い、トランスフェクト２４時間後の培養液１ｍＬを６Ｈｉｓアミノ酸でトラップして回収し、回収したタンパク質全量をウエスタンブロッティングに用いた。
結果を図４６に示す。レーン１がｐＴｒａｃｅｒ（登録商標）−ＥＦ／Ｖ５−Ｈｉｓ−Ａを用いて発現させたもの、レーン２がｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−Ａを用いて発現させたもの、レーン３がコンストラクトＮｏ．１４の発現プラスミドを用いて発現させたものを示す。図に示すように、コンストラクトＮｏ．１４の発現プラスミドを用いた場合に最も強い発現が認められた。この結果は、本システム（コンストラクトＮｏ．１４のコンストラクト骨格）は、エリスロポエチン等の医薬品、診断薬、あるいは試薬として用いられるタンパク質の生産に、遺伝子増強に基づく量的生産の観点から有用であることを示す。
【実施例４】
【０００９】
ヒトＩｇＧの発現
ヒトＩｇＧ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ及びヒトＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎを目的遺伝子（挿入遺伝子）として含む本発明の発現用カセットを作成し、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、発現タンパク質をウエスタンブロットにより分析した。トランスフェクトは、ＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤを用いて行い、２４時間後に細胞抽出液及び細胞培養液中のヒトＩｇＧ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ及びヒトＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎをウエスタンブロッティングにより検出した。
用いた発現用カセットのコンストラクトは実施例１で用いたコンストラクトＮｏ．１４（図２０）であり、目的遺伝子（挿入遺伝子）としてヒトＩｇＧ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ又はヒトＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎをコードするＤＮＡを挿入した。図４７に、制限酵素部位を連結したヒトＩｇＧ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ（図４７Ａ）及びヒトＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ（図４７Ｂ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す（それぞれ、配列番号２６及び配列番号２７）。コントロールとして、市販の発現プラスミドであるｐＴｒａｃｅｒ（登録商標）−ＥＦ／Ｖ５−Ｈｉｓ−Ａ（インビトロジェン社）及びｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−Ａ（インビトロジェン社）を用い、それぞれのプラスミドの制限酵素サイトＥｃｏＲ１−Ｘｂａ１の部位にヒトＩｇＧ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ又はヒトＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎをコードするＤＮＡを挿入した。
ウエスタンブロッティングは、抗６Ｈｉｓ抗体（ＭＢＬ社）を用いて行い、トランスフェクト２４時間後の細胞抽出液（トータルのタンパク質量は１０μｇ）と、培養液１ｍＬを６Ｈｉｓアミノ酸でトラップして回収し、回収したタンパク質全量を用いた。
結果を図４８に示す。図４８ＡがヒトＩｇＧ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎの結果、図４８ＢがヒトＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎの結果を示す。図４８Ａ、４８Ｂ共にレーン１がｐＴｒａｃｅｒ（登録商標）−ＥＦ／Ｖ５−Ｈｉｓ−Ａを用いて発現させたもの、レーン２がｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−Ａを用いて発現させたもの、レーン３がコンストラクトＮｏ．１４を用いて発現させたものを示す。また、細胞抽出液を用いた細胞内発現の結果と、培養液を用いた結果を示す。図に示すように、コンストラクトＮｏ．１４を用いた場合に最も強い発現が認められた。この結果は、本システム（コンストラクトＮｏ．１４のコンストラクト骨格）は、抗体等の医薬品、診断薬あるいは試薬として用いられるタンパク質の生産に、遺伝子増強に基づく量的生産の観点から有用であることを示す。
【実施例５】
【００１０】
市販のプラスミドベクターを改変した発現ベクターを用いてのＲＥＩＣタンパク質の発現
ヒトＲＥＩＣ遺伝子を外来遺伝子（挿入遺伝子）として含む本発明の発現用カセットを作成し、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、発現タンパク質をウエスタンブロットにより分析した。トランスフェクトは、ＦｕＧＥＮＥ（商標）ＨＤを用いて行い、２４時間後に細胞抽出液中のＲＥＩＣタンパク質をウエスタンブロッティングにより検出した。
用いた発現用カセットのコンストラクトは、市販のｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＸｂａ１−Ｋｐｎ１の挿入部にＲＥＩＣをコードするＤＮＡを挿入し、さらに該ＲＥＩＣをコードするＤＮＡの下流のＫｐｎ１−ＥｃｏＲ１の挿入部位に、実施例１で用いたコンストラクトＮｏ．１４（図２０）の発現プラスミドの発現遺伝子の下流に存在する３つのエンハンサー（ｈＴＥＲＴエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサー）をＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａ＋３つのエンハンサーの形で挿入して構築したコンストラクトＮｏ．１７であった（図４９）。コントロールとして、市販のｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＸｂａ１−Ｋｐｎ１の挿入部にＲＥＩＣをコードするＤＮＡを挿入して構築したベクターを用いた。図５０にＲＥＩＣをコードするＤＮＡを挿入したコンストラクトＮｏ．１７の発現ベクターの全塩基配列を示す（配列番号２８）。図５０の塩基配列中の（１）及び（２）の枠で囲んだ部分は、それぞれＲＥＩＣをコードするＤＮＡ及び３つのエンハンサー（３ｘｅｎｈ）を示す。
ウエスタンブロッティングは、抗ＲＥＩＣ抗体を用いて行い、トランスフェクト２４時間後の細胞抽出液（トータルのタンパク質量は１０μｇ）を用いた。
結果を図５１に示す。レーン１が外来タンパク質を発現させていない細胞の細胞抽出液の結果、レーン２が市販のｐＳｈｕｔｔｌｅベクターにＲＥＩＣをコードするベクターでトランスフェクトした細胞の細胞抽出液の結果、レーン３が市販のｐＳｈｕｔｔｌｅベクターにＲＥＩＣをコードするＤＮＡを挿入し、さらに３つのエンハンサーをＲＥＩＣをコードするＤＮＡの下流（ＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａの下流）に挿入した発現ベクターでトランスフェクトした細胞の細胞抽出液の結果を示す。図に示すように、コンストラクトＮｏ．１７を用いた場合に最も強い発現が認められた。この結果は、本システム（コンストラクトＮｏ．１４のコンストラクト骨格）の３つのエンハンサー部分を、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター等の市販のプラスミドの発現遺伝子カセットの下流に組込むことにより、該遺伝子発現の増強が可能になることを示す。すなわち、３つのエンハンサー領域を種々の遺伝子コンストラクトに挿入して目的遺伝子の発現を増強させることが可能であることを示している。
【実施例６】
【００１１】
市販のプラスミドベクターを改変した発現ベクターを用いてのｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現
ヒトｃ−ｍｙｃＣ遺伝子を目的遺伝子（挿入遺伝子）として含む本発明の発現用カセットを作成し、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、発現タンパク質をウエスタンブロットにより分析した。トランスフェクトは、ＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤを用いて行い、２４時間後に細胞抽出液中のＲＥＩＣタンパク質をウエスタンブロッティングにより検出した。
用いた発現用カセットのコンストラクトは、市販のｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＸｂａ１−Ｋｐｎ１の挿入部にＲＥＩＣをコードするＤＮＡを挿入し、さらに該ＲＥＩＣをコードするＤＮＡの下流のＫｐｎ１−ＥｃｏＲ１の挿入部位に、実施例１で用いたコンストラクトＮｏ．１４（図２０）の発現プラスミドの発現遺伝子の下流に存在する３つのエンハンサー（ｈＴＥＲＴエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサー）をＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａ＋３つのエンハンサーの形で挿入して構築したコンストラクトであった。コントロールとして、市販のｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＸｂａ１−Ｋｐｎ１の挿入部にヒトｃ−ｍｙｃをコードするＤＮＡを挿入して構築したベクターを用いた。図５２に挿入したｃ−ｍｙｃ遺伝子の塩基配列を示し（配列番号２９）、図５３にコンストラクトＮｏ．１４に含まれるＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａと３つのエンハンサーを含む領域の塩基配列（配列番号３０）を示す。
ウエスタンブロッティングは、抗ｃ−ｍｙｃＣ抗体（サンタクルーズ社、Ｃａｔ  Ｎｏ．：ｓｃ−７０４６９）を用いて行い、トランスフェクト２４時間後の細胞抽出液（トータルのタンパク質量は１０μｇ）を用いた。
結果を図５４に示す。レーン１が市販のｐＳｈｕｔｔｌｅベクターにＲＥＩＣをコードするベクターでトランスフェクトした細胞の細胞抽出液の結果、レーン２が市販のｐＳｈｕｔｔｌｅベクターにｃ−ｍｙｃをコードするＤＮＡを挿入し、さらに３つのエンハンサーをｃ−ｍｙｃをコードするＤＮＡの下流（ＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａの下流）に挿入した発現ベクターでトランスフェクトした細胞の細胞抽出液の結果を示す。図に示すように、市販のｐＳｈｕｔｔｌｅベクターにｃ−ｍｙｃをコードするＤＮＡを挿入し、さらに３つのエンハンサーをｃ−ｍｙｃをコードするＤＮＡの下流（ＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａの下流）に挿入した発現ベクターを用いた場合に最も強い発現が認められた。この結果は、本システム（コンストラクトＮｏ．１４のコンストラクト骨格）の３つのエンハンサー部分を、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター等の市販のプラスミドの発現遺伝子カセットの下流に組込むことにより、該遺伝子発現の増強が可能になることを示す。すなわち、３つのエンハンサー領域を種々の遺伝子コンストラクトに挿入して目的遺伝子の発現を増強させることが可能であることを示している。本実施例の結果は、本システム（コンストラクトＮｏ．１４のコンストラクト骨格）の３つのエンハンサー部分を、ｉＰＳ細胞の作製に用いられるｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現用プラスミドの発現遺伝子カセットの下流に組み込むことにより、ｃ−ｍｙｃの遺伝子発現が増強されることを示している。ｉＰＳ細胞は様々な種類の再生医療に有用であると考えられ、すなわち、該エンハンサー部分は、ｃ−ｍｙｃなどのいわゆるレプログラミング遺伝子のより強い遺伝子発現を可能にする手段として、また発現タンパク質そのものを再生因子としてｉｎ  ｖｉｖｏあるいはｅｘ  ｖｉｖｏで使用する手段として、再生医療等に有用であることを示している。
【実施例７】
【００１２】
プロモーターとしてｈＴＥＲＴを用いた場合の発現増強
ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を外来遺伝子（挿入遺伝子）として含む本発明の発現用カセットを作成し、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、発現タンパク質をウエスタンブロットにより分析した。トランスフェクトは、ＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤを用いて行い、２４時間後に細胞培養液中のＧＦＰをウエスタンブロッティングにより検出した。
用いた発現用カセットのコンストラクトは実施例１で用いたコンストラクトＮｏ．２（図８）並びにコンストラクトＮｏ．１８、１９、２０及び２１であった。コンストラクトＮｏ．１８、１９、２０及び２１の構造を、それぞれ図５５、５６、５７及び５８に示す。コンストラクトＮｏ．１８は、ｈＴＥＲＴプロモーターを含む一般的な遺伝子発現ベクターである。ｈＴＥＲＴが高発現する環境で、すなわち癌細胞での遺伝子強発現に有利であり、癌細胞特異的遺伝子発現を期待する場合に用いる。しかしながら、その遺伝子発現が極めて微弱であることが、遺伝子治療や、特異な細胞でのタンパク質（医薬）産生等への臨床応用の妨げとなっていた。コンストラクトＮｏ．１９はｈＴＥＲＴプロモーターを含む一般的な遺伝子発現ベクター（コンストラクトＮｏ．１８）の発現遺伝子の上流に、ＲＵ５配列を挿入したプラスミドである。コンストラクトＮｏ．２０はｈＴＥＲＴプロモーターを含む一般的な遺伝子発現ベクター（コンストラクトＮｏ．１８）のＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａ配列の下流に、ｈＴＥＲＴエンハンサー配列を挿入したプラスミドである。コンストラクトＮｏ．２１はｈＴＥＲＴプロモーターを含む一般的な遺伝子発現ベクター（コンストラクトＮｏ．１８）の発現遺伝子の上流に、ＲＵ５’配列を挿入し、さらにＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａ配列の下流に、ｈＴＥＲＴエンハンサー配列を挿入したプラスミドである。図５９−１及び図５９−２（図５９−１の続き）にコンストラクトＮｏ．２１の発現ベクターの全塩基配列を示す（配列番号３１）。図５９−１及び図５９−２の塩基配列中の（１）、（２）、（３）、（４）及び（５）の枠で囲んだ部分は、それぞれｈＴＥＲＴコアプロモーター、最小ＣＭＶプロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ  ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＲＵ５’、ＧＦＰ遺伝子、ＢＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａ、ｈＴＥＲＴコアプロモーターを示す。
発現の結果を図６０に示す。レーン１が外来タンパク質を発現させていない細胞の細胞抽出液の結果、レーン２〜６は、それぞれコンストラクトＮｏ．２、Ｎｏ．１８、Ｎｏ．１９、Ｎｏ．２０及びＮｏ．２１を用いて発現させた結果を示す。図に示すように、コンストラクトＮｏ．１８、Ｎｏ．１９、Ｎｏ．２０、Ｎｏ．２１及びＮｏ．２の順番で強い発現が認められた。本実施例の結果は、本システム（目的発現遺伝子を、プロモーターとエンハンサーではさむ当該コンストラクトの形）は、癌特異的遺伝子発現を可能とするｈＴＥＲＴプロモーターのような、遺伝子発現能力の極めて弱いプロモーターの、遺伝子発現を著しく増強させるのに有用であることを示している。
【実施例８】
【００１３】
異なる外来遺伝子を組込んだ複数の発現ベクターを同時トランスフェクトした場合の発現
コンストラクトＮｏ．２（図２０）にＤｓＲｅｄ（赤色蛍光タンパク質）をコードするＤＮＡを組込んだプラスミド、コンストラクトＮｏ．２１（図５８）にＹｅａｓｔ  ＧＳＴ（グラタチオンＳトランスフェラーゼ）をコードするＤＮＡを組込んだプラスミド、コンストラクトＮｏ．２１（図５８）にＧＦＰをコードするＤＮＡを組込んだプラスミドを細胞に同時にトランスフェクトし、発現タンパク質をウエスタンブロットにより分析した。トランスフェクトは、ＦｕＧＥＮＥ（商標）−ＨＤを用いて行った。細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＰＣ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＭＣＦ７細胞の癌細胞株を用い、さらに正常細胞株としてヒト由来の線維芽細胞であるＯＵＭＳ−２４細胞及びヒト由来のケラチノサイト細胞であるＮＨＫ細胞を用いた。トランスフェクトの４８時間後に細胞抽出液中のそれぞれのタンパク質をウエスタンブロッティングにより検出した。ＤｓＲｅｄをコードするＤＮＡ及びＹｅａｓｔ  ＧＳＴをコードするＤＮＡは公知のｃＤＮＡ配列に基づいて人工合成によりｃＤＮＡを作製した。
ウエスタンブロッティングは、抗ＧＦＰ抗体、抗６Ｈｉｓ抗体（ＭＢＬ社、６Ｈｉｓを付加したＴｅｌｏｍｅｒａｓｅの検出に使用）、抗ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（シグマ社）、抗ＤｓＲｅｄ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及び抗Ｙｅａｓｔ  ＧＳＴ抗体を用いて行い、トランスフェクト２４時間後の細胞抽出液（トータルのタンパク質量は１０μｇ）を用いた。
結果を図６１に示す。図６１に示すようにｈＴＥＲＴプロモーターを含むプラスミドコンストラクト（コンストラクトＮｏ．２１）では、種々の癌細胞、正常細胞において、癌細胞のみに特異的な遺伝子発現を行うのに有用である。すなわちこの場合は、癌細胞のみで強く遺伝子が発現され、かつ正常細胞での遺伝子発現を抑制することができる。この点、例えば、ＣＭＶプロモーターを含むプラスミドコンストラクト（コンストラクトＮｏ．２）では、ヒト癌細胞・正常細胞のいずれにおいても遺伝子発現が見られ、癌細胞に特異的な遺伝子発現を達成することができない。ｈＴＥＲＴプロモーターを含むプラスミドは、このように癌細胞特異的に遺伝子発現を達成できるという点で有用である。
【実施例９】
【００１４】
本発明の遺伝子発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ）によるヒトエリスロポエチン（Ｈｕｍａｎ  ＥＰＯ）の生産量の検討
ヒトエリスロポエチンを分泌発現させるためにＣ末端側にＨｉｓ  ｔａｇを付加したＥＰＯ−Ｈｉｓ  ｔａｇのＤＮＡ断片を、コンストラクトＮｏ．１４のコンストラクトを含むベクター（ＳＧＥ（Ｓｕｐｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ベクターと呼ぶ）及び対照としてｐＴｒａｃｅｒ（登録商標）−ＥＦベクター（ＥＦ−１αプロモーター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にそれぞれ組み込んだ。
ヒトエリスロポエチンの分泌発現の宿主細胞として、対数増殖期にあるヒト腎臓由来細胞：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５〜６×１０５細胞／ｍＬの濃度で１２５ｍＬフラスコに３０ｍＬ幡種し、３７℃、８％ＣＯ２存在下でＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  １Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて一晩振とう培養（１２５ｒｐｍ）した。翌日、１×１０６細胞／ｍＬの濃度に調整し、１２５ｍＬフラスコに３０ｍＬ幡種した２９３−Ｆ細胞に対し、各３０μｇのＳＧＥ−ＥＰＯ−Ｈｉｓ  ｔａｇ及びｐＴｒａｃｅｒ（登録商標）−ＥＦ−ＥＰＯ−Ｈｉｓ  ｔａｇのプラスミドＤＮＡを遺伝子導入試薬：２９３  Ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合して遺伝子導入を行った。トランスフェクト後４日間、３７℃、８％ＣＯ２存在下にて振とう培養し、培養上清を回収した。この培養上清のうち１８μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ＣＢＢ染色によって分子量約３５ｋＤａの糖鎖付加型のＥＰＯタンパク質を検出した（図６２）。
ＥＰＯ生産量を見積もるために４日後に回収した培養上清２５ｍＬ中に分泌されたヒトエリスロポエチンタンパク質をヒスチジン親和性カラムクロマトグラフィー（ＴＡＬＯＮ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を用いて精製し、溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ＣＢＢ染色によってＥＰＯタンパク質の純度を確認した（図６３）。さらにこの精製ＥＰＯタンパク質のタンパク質量をＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量し、２５ｍＬ培養時の精製タンパク質量から、１Ｌ培養時に得られるタンパク質量を算出した（図６４Ａ及びＢ）。この結果、ヒトエリスロポエチンはＳＧＥベクターを用いるとｐＴｒａｃｅｒ（登録商標）−ＥＦベクターでの発現量と比較して約８倍量のタンパク質を生産することができ、１Ｌの培養液に換算すると約１５０ｍｇの超高効率な発現量を達成した。
【実施例１０】
【００１５】
本発明の遺伝子発現カセットを含む発現ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ）によるヒトＲＥＩＣ（Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ）タンパク質の生産量の検討
実施例１に記載の方法に準じ、２９３−Ｆ細胞を１×１０６細胞／ｍＬの濃度に調整し、５００ｍＬフラスコに１８０ｍＬ幡種したフラスコを３本分準備し、各フラスコへＲＥＩＣ発現ＳＧＥベクター（コンストラクトＮｏ．１４のコンストラクトを含むベクター）１８０μｇを遺伝子導入試薬：２９３  Ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト後４日間、３７℃、８％ＣＯ２存在下にて振とう培養し、培養上清を回収した。この培養上清１８μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ＣＢＢ染色によって分子量約５５ｋＤａの糖鎖付加ＲＥＩＣタンパク質を検出した（図６５）。
回収した培養上清は限外濾過により５２０ｍＬから３５ｍＬに濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ２５Ｍカラムクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア社）を用いて溶媒を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）へ置換し、ＲＥＩＣタンパク質含有画分を回収した。その後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）６５０Ｍ，東ソー）を用いて、タンパク質を吸着させた後、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）中で、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０〜０．７Ｍ）により溶出を行い、塩化ナトリウム濃度が０．３５Ｍ程度の条件で、ＲＥＩＣタンパク質のピーク画分を確認した。各ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、高純度のＲＥＩＣタンパク質のみで構成される画分を回収した（図６６）。この精製ＲＥＩＣタンパク質のタンパク質量を吸光度（２８０ｎｍ）により算出し、さらに５２０ｍＬ培養時の精製タンパク質量から換算することで、１Ｌ培養時に得られるタンパク質量を算出した（図６７）。この結果、ＲＥＩＣ発現ＳＧＥベクターをトランスフェクトした培養上清より高純度の精製タンパク質を約５０ｍｇ得ることができた。すなわち、１Ｌの培養液に換算すると約１００ｍｇの大容量の精製タンパク質が実際に回収可能なことを証明した。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明の、第１のプロモーターの下流に、発現させようとする遺伝子及びポリＡ付加配列を含むＤＮＡ構築物を含む、さらに該ＤＮＡ構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターが連結した、遺伝子の発現用カセットは、細胞の種類、遺伝子の種類、トランスフェクション試薬の種類を問わず、遺伝子発現による発現させようとする目的タンパク質の超高発現による大量生産を実現するものであり、バイオテクノロジーの分野での試薬としての適用のみならず、治療用のタンパク質医薬としての適用や臨床での遺伝子を用いた治療・検査・診断のために幅広い応用が可能である。例えば、（１）従来解析ができなかった未知の遺伝子の特定細胞や組織での機能解析、（２）遺伝子治療においてウイルスのみならず非ウイルスベクターへの搭載による治療効果の向上、（３）抗体医薬など近年のバイオ医薬品の生産法として、特定のヒト機能性タンパク質をヒト細胞で大量に生産するスパーセルの作製、（４）各種アッセイや臨床診断に用いる試薬や診断薬の効率的かつ安価な製造法などへの応用など、バイオテクノロジーの領域に革命的進化をもたらすことができる。
本発明の発現用ＤＮＡカセットは、バイオテクノロジーの分野での試薬としての適用のみならず、臨床での遺伝子を用いた治療・検査・診断のために幅広い応用が可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００１７】
配列番号１〜１６、１９〜３１  合成
［配列表］
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【図５−１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
2011062298.tif 000078
【図３３】
2011062298.tif 000079
【図３４】
2011062298.tif 000080
【図３５−１】
2011062298.tif 000081
【図３５−２】
2011062298.tif 000082
【図３６】
2011062298.tif 000083
【図３７】
2011062298.tif 000084
【図３８】
2011062298.tif 000085
【図３９】
2011062298.tif 000086
【図４０】
2011062298.tif 000087
【図４１−１】
2011062298.tif 000088
【図４１−２】
2011062298.tif 000089
【図４２−１】
2011062298.tif 000090
【図４２−２】
2011062298.tif 000091
【図４３−１】
2011062298.tif 000092
【図４３−２】
2011062298.tif 000093
【図４５】
2011062298.tif 000094
【図４７Ａ】
2011062298.tif 000095
【図４７Ｂ】
2011062298.tif 000096
【図４９】
2011062298.tif 000097
【図５０】
2011062298.tif 000098
【図５２】
2011062298.tif 000099
【図５３】
2011062298.tif 000100
【図５５】
2011062298.tif 000101
【図５６】
2011062298.tif 000102
【図５７】
2011062298.tif 000103
【図５８】
2011062298.tif 000104
【図５９−１】
2011062298.tif 000105
【図５９−２】
2011062298.tif 000106
【図６４】
2011062298.tif 000107
【図６６】
2011062298.tif 000108
【図６７】
2011062298.tif 000109
【図１】
2011062298.tif 000110
【図２】
2011062298.tif 000111
【図３】
2011062298.tif 000112
【図４】
2011062298.tif 000113
【図５−２】
2011062298.tif 000114
【図４４】
2011062298.tif 000115
【図４６】
2011062298.tif 000116
【図４８】
2011062298.tif 000117
【図５１】
2011062298.tif 000118
【図５４】
2011062298.tif 000119
【図６０】
2011062298.tif 000120
【図６１】
2011062298.tif 000121
【図６２】
2011062298.tif 000122
【図６３】
2011062298.tif 000123
【図６５】
2011062298.tif 000124
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月15日(2011.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（ｉ）  第１のプロモーター、発現させようとする遺伝子及びポリＡ付加配列をこの順で連結したＤＮＡ構築物、
（ｉｉ）  エンハンサー又は上流にＵＡＳが連結したエンハンサーを、（ｉ）及び（ｉｉ）の順で含み、
ポリＡ付加配列の直ぐ下流にエンハンサー又は上流にＵＡＳが連結したエンハンサーが連結した、エンハンサーを第１のプロモーターの上流に挿入したときと比べて遺伝子のタンパク質発現を増強し得る、遺伝子の発現用カセット。
【請求項１８】
連結したエンハンサーの下流に他の遺伝子発現用の機構を有さず、発現させようとする遺伝子を第１のプロモーターとエンハンサーで挟んだ構造を有する、請求項１７記載の発現用カセット。
【請求項１９】
プロモーターがＣＭＶｉプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、βアクチンプロモーター及びＣＡＧプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項１７記載の発現用カセット。
【請求項２０】
ポリＡ付加配列の下流に連結したエンハンサーがＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びｈＴＥＲＴエンハンサーからなる群から選択される少なくとも１つのエンハンサーである請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の発現用カセット。
【請求項２１】
ポリＡ付加配列の下流に連結したエンハンサーが、ｈＴＥＲＴエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーである、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の発現用カセット。
【請求項２２】
さらに、（ｉ）  第１のプロモーター、発現させようとする遺伝子及びポリＡ付加配列をこの順で連結したＤＮＡ構築物の上流に１〜４個のＣＭＶエンハンサーが連結された請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の発現用カセット。
【請求項２３】
さらに以下のエレメント（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくともいずれか１つを含む請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の発現用カセット：
（ｉ）  発現させようとする遺伝子の直ぐ上流に連結されたＲＵ５’；及び
（ｉｉ）  発現用カセットの最上流に連結されたＳＶ４０−ｏｒｉ。
【請求項２４】
発現させようとするタンパク質をコードするＤＮＡが疾患の治療に用い得る治療用遺伝子、又は医薬、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の発現用カセット。
【請求項２５】
治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子であるＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子である、請求項２４記載の発現用カセット。
【請求項２６】
以下に示す構造を有するコンストラクトＮｏ．１４、コンストラクトＮｏ．１６及びコンストラクトＮｏ．１７からなる群から選択されるコンストラクトの構造を有する、請求項２１記載の外来遺伝子の発現用カセット。
2011062298.tif 000125
2011062298.tif 000126
【請求項２７】
請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の外来遺伝子の発現用カセットを含むベクター。
【請求項２８】
アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターである請求項２７記載のベクター。
【請求項２９】
請求項２７又は２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２７又は２８に記載のベクターを含む疾患検出又は治療用製剤。
【請求項３１】
請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の発現用カセット又は請求項２７若しくは２８に記載のベクターを用いて発現させようとする遺伝子を発現させる方法。
【請求項３２】
請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の発現用カセット又は請求項２７若しくは２８に記載のベクターを細胞に導入し、該細胞を培養することを含む、発現させようとする遺伝子がコードするタンパク質を製造する方法。
【請求項３３】
第１のプロモーター、発現させようとする遺伝子、ポリＡ付加配列及びエンハンサーを含む遺伝子の発現のための発現用カセットにおいて、第１のプロモーター、発現させようとする遺伝子及びポリＡ付加配列をこの順で連結したＤＮＡ構築物のポリＡ付加配列の直ぐ下流にエンハンサー又は上流にＵＡＳが連結したエンハンサーを連結させることにより、エンハンサーを発現させようとする遺伝子からなるＤＮＡ構築物のすぐ下流に挿入することにより、エンハンサーを第１のプロモーターの上流に挿入したときと比べて、遺伝子のタンパク質発現を増強する方法。
【請求項３４】
ポリＡ付加配列の下流に連結したエンハンサーがＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びｈＴＥＲＴエンハンサーからなる群から選択される少なくとも１つのエンハンサーである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ポリＡ付加配列の下流に連結したエンハンサーが、ＴＥＲＴエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーである、請求項３３又は３４に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月17日(2012.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)  第１のプロモーター、発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列をこの順で連結したDNA構築物、
(ii) エンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーを、(i)及び(ii)の順で含み、
ポリA付加配列の直ぐ下流にエンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーが連結した、エンハンサーを第１のプロモーターの上流に挿入したときと比べて遺伝子のタンパク質発現を増強し得る、遺伝子の発現用カセット。
【請求項２】
連結したエンハンサーの下流に他の遺伝子発現用の機構を有さず、発現させようとする遺伝子を第１のプロモーターとエンハンサーで挟んだ構造を有する、請求項１記載の発現用カセット。
【請求項３】
プロモーターがCMV iプロモーター、SV40プロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター及びCAGプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項１記載の発現用カセット。
【請求項４】
ポリA付加配列の下流に連結したエンハンサーがCMVエンハンサー、SV40エンハンサー及びhTERTエンハンサーからなる群から選択される少なくとも１つのエンハンサーである請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現用カセット。
【請求項５】
ポリA付加配列の下流に連結したエンハンサーが、hTERTエンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現用カセット。
【請求項６】
さらに、(i)  第１のプロモーター、発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列をこの順で連結したDNA構築物の上流に１〜４個のCMVエンハンサーが連結された請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現用カセット。
【請求項７】
さらに以下のエレメント(i)及び(ii)の少なくともいずれか１つを含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現用カセット：
(i)  発現させようとする遺伝子の直ぐ上流に連結されたRU5'；及び
(iii)  発現用カセットの最上流に連結されたSV40-ori。
【請求項８】
発現させようとするタンパク質をコードするDNAが疾患の治療に用い得る治療用遺伝子、又は医薬、診断薬若しくは試薬に用い得るタンパク質をコードするDNAである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現用カセット。
【請求項９】
治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子であるREIC/Dkk-3遺伝子である、請求項８記載の発現用カセット。
【請求項１０】
以下に示す構造を有するコンストラクトNo.14、コンストラクトNo.16及びコンストラクトNo.17からなる群から選択されるコンストラクトの構造を有する、請求項５記載の遺伝子の発現用カセット。
2011062298.tif 000127
、
2011062298.tif 000128
、及び
2011062298.tif 000129
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子の発現用カセットを含むベクター。
【請求項１２】
アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターである請求項１１記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載のベクターを含む疾患検出又は治療用製剤。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発現用カセット又は請求項１１若しくは１２に記載のベクターを用いて発現させようとする遺伝子を発現させる方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の発現用カセット又は請求項１１若しくは１２に記載のベクターを細胞に導入し、該細胞を培養することを含む、発現させようとする遺伝子がコードするタンパク質を製造する方法。
【請求項１７】
第１のプロモーター、発現させようとする遺伝子、ポリA付加配列及びエンハンサーを含む遺伝子の発現のための発現用カセットにおいて、第１のプロモーター、発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列をこの順で連結したDNA構築物のポリA付加配列の直ぐ下流にエンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーを連結させることにより、エンハンサーを発現させようとする遺伝子からなるDNA構築物のすぐ下流に挿入することにより、エンハンサーを第１のプロモーターの上流に挿入したときと比べて、遺伝子のタンパク質発現を増強する方法。
【請求項１８】
ポリA付加配列の下流に連結したエンハンサーがCMVエンハンサー、SV40エンハンサー及びhTERTエンハンサーからなる群から選択される少なくとも１つのエンハンサーである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ポリA付加配列の下流に連結したエンハンサーが、hTERTエンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したエンハンサーである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【国際調査報告】
2011062298.tif 000130
2011062298.tif 000131
2011062298.tif 000132
2011062298.tif 000133
2011062298.tif 000134
2011062298.tif 000135
2011062298.tif 000136
2011062298.tif 000137
2011062298.tif 000138
2011062298.tif 000139
2011062298.tif 000140