(57)【要約】【課題】  第一の核酸鎖と第二の核酸鎖と第三の核酸鎖とを用いて、短時間で反応が終了し、且つ放射性アイソトープを使用せず安全に実験を遂行できる、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合方法およびそれを利用した核酸鎖の標識方法を提供すること。【解決手段】  第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５’リン酸基とを結合する方法であって、前記第一の核酸鎖の少なくとも一部と前記第二の核酸鎖の少なくとも一部とに相補的に結合する第三の核酸鎖の存在下において、少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する前記第一の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成、および前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成を、同時にまたは別々に行う工程と、その工程で得られた前記第一の核酸鎖、前記第二の核酸鎖、前記第三の核酸鎖の三者の核酸鎖の混合物に、ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを添加する工程を有し、前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、また前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、且つ前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が、前記第二の核酸鎖の鎖長の１／２未満となるものであることを特徴とする方法。【選択図】  図１
2011052013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５’リン酸基とを結合する方法であって、
前記第一の核酸鎖の少なくとも一部と前記第二の核酸鎖の少なくとも一部とに相補的に結合する第三の核酸鎖の存在下において、少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する前記第一の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成、および前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成を、同時にまたは別々に行う工程と、その工程で得られた前記第一の核酸鎖、前記第二の核酸鎖、前記第三の核酸鎖の三者の核酸鎖の混合物に、ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを添加する工程を有し、
前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、また前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、且つ前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が、前記第二の核酸鎖の鎖長の１／２未満となるものであることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２であることを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が１０塩基以下となるものであることを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記第二の核酸鎖は、ＲＮＡ鎖であることを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記第一の核酸鎖は、単一塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものであることを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記第一の核酸鎖は、色素、蛍光色素またはビオチンによって標識された５’末端を有するものであることを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法に用いるキットであって、
少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する前記第一の核酸鎖と、
ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼと、
前記結合反応のための反応緩衝液と、
を有するものであることを特徴とする、キット。
【請求項８】
請求項７記載のキットにおいて、前記ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２であることを特徴とする、キット。
【請求項９】
請求項７記載のキットにおいて、前記第一の核酸鎖は、単一塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものであることを特徴とする、キット。
【請求項１０】
請求項７記載のキットにおいて、前記第一の核酸鎖は、色素、蛍光色素またはビオチンによって標識された５’末端を有するものであることを特徴とする、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５’リン酸基とを結合する方法、また、これにより前記第二の核酸鎖を修飾する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、分子生物学や遺伝子工学の分野において、ＲＮＡ等の核酸鎖を修飾または標識することは、研究開発をする上で必須となる実験手法のうちの一つであり、同時に、有力な研究手法でもある。また、研究者が頻繁に使用する実験手法であるため、常温常圧で反応を行える酵素を使用し、且つ安全に実験を行える簡便な手法が求められている。【０００３】
このような手法として、非特許文献１では、非放射性アイソトープを用いてＲＮＡ鎖の３’末端を修飾している。この手法では、非放射性アイソトープを用いているため安全に実験を行うことができるが、ＲＮＡ生合成は５’末端から３’末端に伸長するため、修飾後のＲＮＡ鎖では伸長反応を行うことができなくなってしまう。【０００４】
また、非特許文献２では、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 polynucleotide kinase）を用いて５’末端を修飾しているが、同時に、放射性アイソトープである[γ-32P]ATPを使用しなければならないため、専用の施設を必要とし、放射性廃棄物の処理に大きな負担がかかってしまい、また、安全性の面からも取り扱いに習熟した技術が必要となってしまう。【０００５】
このような問題点を解決するために、近年では、非特許文献３や４または特許文献１のような技術を用いて、目的の核酸鎖に、予め用意した修飾鎖を結合させることで、目的の核酸鎖を修飾・標識する手法が提唱されている。この特許文献１では、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖とを、第三の核酸鎖を介して並べることで、当該第一の核酸鎖と第二の核酸鎖とを結合させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１７１９８３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Rosemeyer, V., Laubrock, A., and Seibl, R. 1995. Nonradioactive 3’-end-labeling of RNA molecules of different lengths by terminal deoxynucleotidyltransferase. Anal. Biochem. 224: 446-449.
【非特許文献２】Matschinsky, F. M., Passonneau, J. V., and Lowry, O. H. 1968, Anal. Biochem. 196, 80-83
【非特許文献３】Bain, J.D. and Switzer, C. 1992. Regioselective ligation of oligoribonucleotides using DNA splints. Nucleic Acids Res. 20: 4372.
【非特許文献４】Stark, M.R., Pleiss, J.A., Deras, M., Scaringe, S.A., and Rader, S.D. 2006. An RNA ligase-mediated method for the efficient creation of large, synthetic RNAs. RNA 12: 2014-2019
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、非特許文献３や４または特許文献１の手法では、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖とを結合させるために、第一の核酸鎖の３’末端および第二の核酸鎖の５’末端の２塩基を含むそれぞれ３’末端側配列および５’末端側配列の数塩基がｂｒｏｋｅｎ  ｉｎｔｅｒｉｏｒ  ｌｏｏｐ（非特許文献３参照）と称されるループ構造を生じるように、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖とを第三の核酸鎖上で並べる必要があることに加え、当該生じたループ構造内で塩基同士の塩基対形成が起こらないように配列を構成しておく必要もある。そのため、第一の核酸鎖の３’末端側配列と第二の核酸鎖の５’末端側配列との両方、若しくは少なくとも一方の配列に、構造的な制限が課されてしまう。【０００９】
従って、目的の核酸鎖に予め用意した修飾鎖を結合させようとしたとしても、目的の核酸鎖及び／若しくは修飾鎖の塩基配列の構造的な問題によって、結合できない核酸鎖と修飾鎖の組合せが出てきてしまう。なお、このような塩基配列における構造的な制限は、その使用される酵素がＴ４  ＲＮＡリガーゼ１であることに起因する。【００１０】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖と第三の核酸鎖とを用いて、短時間で反応が終了できる前記第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合方法、およびそれを利用して、放射性アイソトープを使用せず安全に実験を遂行できる核酸鎖の標識方法を提供することを目的とする。  
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一の主要な観点によれば、第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５’リン酸基とを結合する方法であって、
前記第一の核酸鎖の少なくとも一部と前記第二の核酸鎖の少なくとも一部とに相補的に結合する第三の核酸鎖の存在下において、少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する前記第一の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成、および前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との塩基対形成を、同時にまたは別々に行う工程と、その工程で得られた前記第一の核酸鎖、前記第二の核酸鎖、前記第三の核酸鎖の三者の核酸鎖の混合物に、ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを添加する工程を有し、前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、また前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、且つ前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が、前記第二の核酸鎖の鎖長の１／２未満となるものであることを特徴とする方法、が提供される。【００１２】
このような構成によれば、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合について簡便な方法を提供することができる。また、本発明によれば、ＲＮＡ同士の結合において、従来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ１を用いて行う方法のような、一方のＲＮＡ鎖の３’末端を保護することによって当該ＲＮＡ鎖の自己環状化を防ぐような処理をする必要がなくなる。さらに、本発明によれば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてＲＮＡ同士の結合を行う場合の欠点、すなわち、多量の酵素を使用しなければならず、また、長い反応時間を要し、さらには、収率が低い、という欠点を解消することができる。【００１３】
また、このような構成によれば、核酸鎖自身での環状化を防ぎ、核酸鎖同士の結合を行うことができる。また、これを利用して、核酸鎖の５’末端修飾を可能にすることができる。【００１４】
また、本発明の一実施形態によれば、このような方法において、前記ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２である。【００１５】
また、本発明の別の実施形態によれば、このような方法において、前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が１０塩基以下となるものである。【００１６】
また、本発明のさらに別の実施形態によれば、このような方法において、前記第二の核酸鎖は、ＲＮＡ鎖である。【００１７】
また、本発明のさらに別の実施形態によれば、このような方法において、前記第一の核酸鎖は、単一塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものである。【００１８】
また、本発明のさらに別の実施形態によれば、このような方法において、前記第一の核酸鎖は、色素、蛍光色素またはビオチンによって標識された５’末端を有するものである。【００１９】
本発明の第二の主要な観点によれば、上記のような方法に用いるキットであって、少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する前記第一の核酸鎖と、ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼと、前記結合反応のための反応緩衝液と、を有するものであることを特徴とする、キットが提供される。【００２０】
また、本発明の一実施形態によれば、このようなキットにおいて、前記ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２である。【００２１】
また、本発明の別の実施形態によれば、このようなキットにおいて、前記第一の核酸鎖は、単一塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものである。【００２２】
本発明のさらに別の実施形態によれば、このようなキットにおいて、前記第一の核酸鎖は、色素、蛍光色素またはビオチンによって標識された５’末端を有するものである。【００２３】
なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係るオリゴＲＮＡ鎖のライゲーションによる修飾実験を示す電気泳動図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に係る塩基配列対合実験の概略図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に係る修飾における塩基配列対合の関与を示す電気泳動図である。
【図４】図４は、本発明の一実施形態に係る塩基配列対合の厳密性実験を示す概略図である。
【図５】図５は、本発明の一実施形態に係る修飾における塩基配列対合の厳密性を示す電気泳動図である。
【図６】図６は、本発明の一実施形態に係るｍｉＲＮＡの修飾実験を示す電気泳動図である。
【図７】図７は、本発明の一実施形態に係る４種類のホモオリゴマーによる修飾実験を示す電気泳動図である。
【図８】図８は、本発明の一実施形態に係るオリゴリボヌクレオチドタグの付加反応実験の概略図である。
【図９】図９は、本発明の一実施形態に係るオリゴリボヌクレオチドタグの付加反応実験を示す電気泳動図である。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態に係る７３ｍｅｒＲＮＡの修飾実験を示す電気泳動図である。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態に係るビオチン化によるＲＮＡプルダウン実験を示す電気泳動図である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態に係る対合する部分の配列の鎖長が異なる補助核酸鎖を用いたライゲーションの概略図である。
【図１３】図１３は、本発明の一実施形態に係るライゲーション速度と補助核酸鎖の鎖長との関係を示す電気泳動図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
上述したように、本発明によれば、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖とを、第三の核酸鎖と所定のＲＮＡリガーゼとを用いて結合する方法、およびその方法に用いるためのキットが提供される。【００２６】
また、前記第一の核酸鎖を標識または修飾しておくことで、上記のような方法を用いて、任意の前記第二の核酸鎖を前記第一の核酸鎖を介して標識または修飾することができる。【００２７】
本発明に用いる第一の核酸鎖は、少なくともその３’末端の塩基がＲＮＡであれば、どのような塩基配列の核酸鎖であっても良い。また、前記第一の核酸鎖は、ＤＮＡとＲＮＡとが混在する配列であっても良い。また、本発明に係る第一の核酸鎖は、単一の塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものであっても良い。【００２８】
本発明に用いる第二の核酸鎖は、一本鎖の核酸配列であればどのような塩基配列であっても良い。つまり、前記第二の核酸鎖は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はＤＮＡとＲＮＡとが混在する配列であっても良い。また、前記第二の核酸鎖は、その鎖長は特に制限されるものではなく、７０ｍｅｒ以上の鎖長であっても良い。【００２９】
本発明に用いる第三の核酸鎖は、その５’末端側配列が前記第二の核酸鎖の５’末端側配列と、その３’末端側配列が前記第一の核酸鎖の３’末端側配列と相補的に塩基対を形成するものであり、前記第一の核酸鎖と前記第二の核酸鎖との結合を補助するように働く。また、本発明に係る第三の核酸鎖は、ＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖、またはＤＮＡとＲＮＡとが混在する配列であっても良いが、本発明に係る方法を実施する当業者にとっては、経済的な面において、ＤＮＡ鎖の使用が好ましい。【００３０】
また、本発明に係る第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖と前記第二の核酸鎖とが結合する際に、前記第二の核酸鎖が環状化することを防いでいる。さらに、本発明に係る方法を実施することにより、前記第一の核酸鎖と前記第二の核酸鎖との結合反応が速くなることも前記第二の核酸鎖の自己環状化を防ぐ一因となっている。【００３１】
さらに、本発明に係る方法において、前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３’末端の塩基を有する少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列と、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基を有する少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列とを有するものであることが好ましい。また、前記第一の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との相補的な結合、並びに、前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との相補的な結合は、厳密に塩基対の形成を成していることが好ましい。【００３２】
また、本発明者らは、前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との相補的な結合が、その対合鎖長が短くなると結合反応の速度が増加することを見いだしている（下記、実施例１０参照）。例えば、Ｂｕｌｌａｒｄらは、片鎖にニックのある二本鎖核酸を用いてリガーゼの基質特異性を研究しているが、この酵素活性測定実験で、ニックの無い側の核酸鎖の塩基はニックのある相補核酸鎖の塩基とすべて塩基対形成をしているため、ニック修復活性は遅くなる（Bullard, D.R. and Bowater, R.P. 2006. Direct comparison of nickjoining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem. J. 398: 135-144.）。【００３３】
本発明に用いるＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼとは、国際生化学分子生物学連合が制定するＥＣ番号でＥＣ６．５．１．３に分類される酵素であり、ＡＴＰ＋（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ｎ＋（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ｍ＝ＡＭＰ＋ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ＋（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ｎ＋ｍの反応を触媒する酵素であって、二本鎖核酸におけるニックを修復する活性を有するものである。また、本発明に係るＲＮＡリガーゼは、好ましくは、Ｔ４  バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２である。さらに、本発明に係るＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２、ビブリオファージ（ｖｉｂｒｉｏｐｈａｇｅ）ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＲＮＡリガーゼ、若しくはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ  ＲＮＡリガーゼであっても良く、ＥＣ６．５．１．３に分類されるＲＮＡリガーゼであって二本鎖核酸ニック修復活性を有するものであればこれらのリガーゼに制限されることはない。【００３４】
また、本発明に係る方法において、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合は、本発明に係るＲＮＡリガーゼが機能する条件であれば、分子生物学分野で常用されるリガーゼ反応の条件の範囲内のどのような条件下で反応が行われても良い。例えば、後述する実施例に記載するように、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖と第三の核酸鎖と緩衝液と純水とを混合させ、その混合液に本発明に係るＲＮＡリガーゼを加え、その後当該リガーゼが機能する温度（例えば３７℃）で所定時間（例えば１時間）反応させることによって行われる。また、本発明に係る方法の結合反応に用いられる第一の核酸鎖などの各成分の用量は、当業者によって適宜変更可能である。【００３５】
また、本発明に係る方法を用いることによって、本発明に用いられる第二の核酸鎖は、標識または修飾されることができる。この場合、これらの標識または修飾は、核酸を標識または修飾することができる物質または化合物等によってされるものであれば、特に制限されるものではない。例えば、本発明に係る第二の核酸鎖は、ビオチンや色素又は蛍光色素によって標識されることができ、蛍光色素としては、Ｃｙ（商標）３、Ｃｙ（商標）５、ＦＩＴＣ等でも良く、ビオチン標識、ＤＩＧ標識等でも良い。なお、反応後の標識または修飾された核酸鎖は、そのまま、または精製後、ハイブリダイゼーション等の目的に使用することができる。精製をする場合には、カラム分離や電気泳動の手法が使用できる。電気泳動、カラム分離の条件は分子生物学分野で通常用いられる条件を使用できる。【００３６】
本発明に係る第二の核酸鎖が標識または修飾される場合には、上述したような、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合を介して行われる。すなわち、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合反応を行う前に、前処理として、前記第一の核酸鎖を上記所定の標識物で標識しておき、その標識された第一の核酸鎖を用いて、結合反応を行うことで、前記第二の核酸鎖の修飾または標識を行うことができる。この場合、前記第一の核酸鎖における前記標識物の位置は特に制限されるものではなく、前記第一の核酸鎖の任意の位置に前記標識物を配置することができる。例えば、前記第一の核酸鎖の５’末端であっても良いし、前記第二の核酸鎖と結合する３’末端付近であっても良い。もちろん、このような修飾は、前記第二の核酸鎖の鎖内における標識であっても良い。【００３７】
なお、従来、ＲＮＡ鎖の結合には、ＤＮＡリガーゼを用いるＤＮＡスプリント（ＤＮＡ  ｓｐｌｉｎｔ）法が用いられていたが、反応時間が数時間に及んでしまい、また、反応収量も低く、ＤＮＡリガーゼを大量に使用しなければならないという問題点があった。この解決策として、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１と３’末端を保護したＲＮＡとを用いるＲＮＡリガーゼ介在結合（ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）法が報告されているが、この方法は５’−ｓｉｌｙｌ−２’−ａｃｅｔｏｘｙ  ｅｔｈｙｌ  ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ保護基を持ったＲＮＡが必要となってしまい、実用的ではない（非特許文献４）。また、このＲＮＡリガーゼ介在結合法では、上述のように、結合させる２本の核酸鎖によってｂｒｏｋｅｎ  ｉｎｔｅｒｉｏｒ  ｌｏｏｐを形成させる必要があり、当該２本の核酸鎖における配列に構造的な制限が課されてしまう。さらに、核酸鎖同士を結合させることによって一方の核酸鎖を標識させようとする場合には、ＲＮＡリガーゼ介在結合法では、他方の核酸鎖における蛍光色素など標識の位置を、核酸結合部位の近傍に配置し得るかどうか確認がとれていないのが現状である。【００３８】
ここで、後述する本発明の一実施形態に係るＴ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２は２００２年に発見、クローニングされ（Ｈｏ、Ｓｈｕｍａｎ  ２００２）、その性状が研究されてきた。Ｙｉｎら（２００３）は、２つのＲＮＡからなるステムループＲＮＡを基質としてＴ４  ＲＮＡリガーゼ２の活性を調べた。Ｎａｎｄａｋｕｍａｒら（２００４）は、１２ｂｐの対合をつくる２４塩基の２つの核酸鎖を用い、その核酸鎖の重合をＴ４  ＲＮＡリガーゼ２の活性の指標としている。Ｂｕｌｌａｒｄら（２００６）は、片鎖にニックのある２０ｂｐの二本鎖核酸を用いてリガーゼの基質特異性を研究した。この２０ｂｐの二本鎖核酸基質の作製は終夜実験でおこなわれている。この研究では二本鎖核酸のニックの修復を対象としており、ニックの無い側のある核酸鎖の長さおよび結合する５’リン酸化ＲＮＡの任意性までは知られておらず、任意のＲＮＡをその５’末端の一部の配列を用いて、５’末端修飾をする方法とは大きな隔たりがあった（ Ho, C.K. and Shuman, S. 2002. Bacteriophage T4 RNA ligase 2 (gp24.1) exemplifies a family of RNA ligases found in all phylogenetic domains. Proc Natl Acad Sci USA.99:12709-12714.、Yin, S., Ho, C.K., and Shuman, S. 2003. Structure-function analysis of T4 RNA ligase 2. J. Biol. Chem. 278: 17601-17608.、Nandakumar, J., Ho, C.K., Lima, C.D., and Shuman, S. 2004. RNA substrate specificity and structure-guided mutational analysis of bacteriophage T4 RNA ligase 2. J. Biol. Chem. 279: 31337-31347.、Bullard, D.R. and Bowater, R.P. 2006. Direct comparison of nickjoining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem. J. 398: 135-144.）。【００３９】
本発明に係る方法を用いることで、放射性アイソトープを使用せず、簡便に核酸鎖の５’末端を修飾することができる。上述のように、修飾には、様々な蛍光色素、ビオチン、その他の標識を用いることができる。現在、オリゴＲＮＡ鎖自体は、以前に比べ、安価に、且つ容易に入手できる状況にあるが、標識ＲＮＡ等の標識核酸は価格が高いという現状がある。本発明に係る方法は、任意のＲＮＡ等の核酸鎖を容易に標識できるため、経済的負担が軽減されるなど、有用な方法である。【００４０】
本発明に係る方法により、非放射性アイソトープによって標識された核酸鎖を容易に生成することが可能となり、核酸鎖の５’末端に新たな塩基配列を付加する修飾もできることになる。【００４１】
また、本発明に係る方法と従来の核酸鎖の結合方法とを比較すると以下の表１のようにまとめることができる。【００４２】
【表１】
2011052013.tif 000003
【００４３】
すなわち、＃１および＃２に示すように、ＤＮＡ同士またはＲＮＡ同士を結合させる場合、当該結合に係る２本の核酸鎖ではいずれの酵素を用いたとしても反応は遅く、また核酸鎖の自己環状化の問題も生じる。また、＃３に示すように、ＤＮＡ同士の結合は、従来から、第三の核酸鎖である補助核酸鎖とＴ４  ＤＮＡリガーゼとを用いることで良好な反応が行われることが知られていたが、ＲＮＡ同士の結合に関しては、良好な反応様式は知られていなかった。＃４に示すように第三の核酸鎖である補助核酸鎖とＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてＲＮＡ同士の結合がおこなえるが、反応時間が長い、大量の酵素を必要とする、収率が低い等の問題があった。また、＃５に示すように、第三の核酸鎖である補助核酸鎖とＴ４  ＲＮＡリガーゼ１を用いる方法も報告されているが、上述したＢｒｏｋｅｎ  ｉｎｔｅｒｉｏｒ  ｌｏｏｐ構造を設けねばならず、結合し得るＲＮＡの配列に制限があった。一方、本発明に係る方法では、Ｂｒｏｋｅｎ  ｉｎｔｅｒｉｏｒ  ｌｏｏｐ構造を設けることなく、またＴ４  ＤＮＡリガーゼを利用する場合の問題点をも解決している。なお、＃６に示されるようなＲＮＡ−ＲＮＡ／ＤＮＡの結合では、第三の核酸鎖を用意する必要はないが、結合させる核酸鎖同士の一部について相補的な塩基対を形成させる必要があり、＃５と同様、配列における制限がある。【００４４】
また、以下に、本発明に係る方法の代表的な反応を説明するが、本発明はこれらの反応例に限定されるものではないことは言うまでもない。【００４５】
まず、本発明に係る核酸鎖の結合方法について、代表的な例を説明する。  
１）第一の核酸鎖と第三の核酸鎖とを緩衝液中で塩基対形成させ、その塩基対合した前記第一の核酸鎖と第三の核酸鎖との複合体を得る（核酸鎖複合体Ａ）。その後、核酸鎖複合体Ａと第二の核酸鎖とを緩衝液中で塩基対形成させ、第三の核酸鎖に第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が塩基対合した複合体を得る（核酸鎖複合体Ｂ）。そして、緩衝液中の核酸鎖複合体Ｂに二本鎖核酸鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを加え、この触媒作用により前記第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、前記第二の核酸鎖の５’リン酸基とを共有結合させる。  
２）第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、及び第三の核酸鎖を緩衝液中で混合する。この核酸鎖混合物を緩衝液中で塩基対形成させ、第三の核酸鎖に第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が塩基対合した複合体を得る（核酸鎖複合体Ｂ）。そして、緩衝液中の核酸鎖複合体Ｂに二本鎖核酸鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを加え、この触媒作用により前記第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、前記第二の核酸鎖の５’リン酸基とを共有結合させる。【００４６】
続いて、本発明に係る核酸鎖の修飾方法について、代表的な例を説明する。  
１）５’末端をビオチン、蛍光色素等で標識した第一の核酸鎖を用意する。この第一の核酸鎖と第三の核酸鎖とを緩衝液中で塩基対形成させ、塩基対合した第一の核酸鎖と第三の核酸鎖との複合体を得る（核酸鎖複合体Ａ）。その後、核酸鎖複合体Ａと第二の核酸鎖とを緩衝液中で塩基対形成させ、第三の核酸鎖に第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が塩基対合した複合体を得る（核酸鎖複合体Ｂ）。そして、緩衝液中の核酸鎖複合体Ｂに二本鎖核酸鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを加え、この触媒作用によって標識した第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５’リン酸基とを共有結合させる。これにより前記第二の核酸鎖の５’末端が標識される。  
２）５’末端をビオチン、蛍光色素等で標識した第一の核酸鎖を用意する。この第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、及び第三の核酸鎖を緩衝液中で混合する。その後、この核酸鎖混合物を緩衝液中で塩基対形成させ、前記第三の核酸鎖に前記第一の核酸鎖および第二の核酸鎖が塩基対合した複合体を得る（核酸鎖複合体Ｂ）。そして、緩衝液中の核酸鎖複合体Ｂに二本鎖核酸鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを加え、この触媒作用によって前記第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、前記第二の核酸鎖の５’リン酸基とを共有結合させる。これにより前記第二の核酸鎖の５’末端が標識される。【００４７】
次に、本発明の効果に関して実施例を示して説明する。しかし、本発明は以下に記載された実施例に限定されるものではなく、様々な変更及び修飾は当業者によって容易になされることが理解されるであろう。
【実施例】
【００４８】
以下に、本実施形態による実施例を、図面を参照して詳細に説明する。なお、各実施例において、「アクセプターＲＮＡ」、「修飾対象ＲＮＡ」、「補助核酸鎖」という用語が使用されているが、それぞれ、本発明における「第一の核酸鎖」、「第二の核酸鎖」、「第三の核酸鎖」を示すものである。  【００４９】
後述する実施例１〜１０は、以下の表２に記載されるＤＮＡ鎖若しくはＲＮＡ鎖を用いて実験を行った。【００５０】
【表２】
2011052013.tif 000004
2011052013.tif 000005
2011052013.tif 000006
【実施例１】
【００５１】
［オリゴＲＮＡ鎖のライゲーションによる修飾］  
（実験方法）  
実験ａは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌと、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）とを２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。【００５２】
実験ｂ、ｄは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１を２μｌ、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）０．５ｎｍｏｌを加え、純水を加えて１９μｌにした。【００５３】
実験ｃは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）、０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１を２μｌ、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）０．５ｎｍｏｌ、ポリエチレングリコール２．７μｌを加え、純水を加えて１９μｌにした。【００５４】
アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）２ｎｍｏｌ、補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ２１−６）２ｎｍｏｌを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液とした。【００５５】
実験ｅ、ｆ、ｇは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１を２μｌ、アニーリング溶液５μｌを加え、実験ｆはさらにポリエチレングリコール２．７μｌを加えた後、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。【００５６】
実験ａは１μｌの純水を加え、実験ｂ、ｃ、ｅ、ｆは１．６７μｇのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（１μｌ）、実験ｄ、ｇは０．２９μｇのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇの反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％  ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、紫外線を当て撮影した。その後、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、再度撮影した。【００５７】
（実験結果）  
実験ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇでは、実験ｇのみにおいて修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）にアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）がライゲーションし、修飾対象ＲＮＡ  鎖（ｐＲ２１）をＦＩＴＣ標識することができた（図１、レーン７）。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１を用いた反応（実験ｂ、ｃ、ｅ、ｆ）では、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’リン酸基と３’ヒドロキシル基がライゲーションし、環状化するが、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）とのライゲーションは見られなかった（図１、レーン２、３、５、６）。Ｔ４  ＲＮＡ  リガーゼ２を用いた反応でも補助核酸鎖が無い場合は、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）と修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）ライゲーションしなかった（実験ｄ、図１、レーン４）。アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）と修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）ライゲーションには、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２と補助核酸鎖が必須であり、この反応では修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の自己環状化を防ぎ、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）と修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）を首尾よくライゲーションできる。
【実施例２】
【００５８】
［ライゲーションにおける補助核酸鎖の修飾対象ＲＮＡ鎖の塩基配列対合］  
（実験方法）
アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）１ｎｍｏｌ、補助核酸鎖１ｎｍｏｌを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液１０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液とした。本実験では、ライゲーションにおける修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列と補助核酸鎖の５’側配列の塩基対合を調べるために、それぞれの実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｋに対しそれぞれ補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖）、ＢｒＲ２１−１（ｃ）、ＢｒＲ２１−２（ｄ）、ＢｒＲ２１−３（ｅ）、ＢｒＲ２１−４（ｆ）、ＢｒＲ２１−５（ｇ）、ＢｒＲ２１−６（ｈ）、ＢｒＲ２１−７（ｉ）、ＢｒＲ２１−８（ｊ）、ＢｒＲ２１−Ｆ（ｋ）を使用した。ＢｒＲ２１−１、ＢｒＲ２１−２、ＢｒＲ２１−３、ＢｒＲ２１−４、ＢｒＲ２１−５、ＢｒＲ２１−６、ＢｒＲ２１−７、ＢｒＲ２１−８、ＢｒＲ２１−Ｆはそれぞれ、図２のように修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列に対し、１、２、３、４、５、６、７、８、２１塩基対合となる。【００５９】
実験ａは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌと、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。【００６０】
実験ｂは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。【００６１】
実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１を２μｌ、それぞれのアニーリング溶液５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。実験ａには純水、１μｌ、実験ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊは０．２９μｇのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋの反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％  ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、紫外線を当て撮影した。その後、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、再度撮影した。【００６２】
（実験結果）
塩基対合が４ヌクレオチド以下の実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆでは、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）と修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）のライゲーションは見られなかった（図３、レーン３、４、５、６）。塩基対合が５塩基の実験ｇでは弱いライゲーションが見られた（図３、レーン７）。また実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇでは修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の自己環状化が見られる（図３、レーン３から７）。塩基対合が６ヌクレオチド以上の実験ｈ、ｉ、ｊ、ｋでは修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の自己環状化は抑えられ、首尾よくライゲーションがおこなわれ、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）をＦＩＴＣ標識することができた（図３、レーン８、９、１０、１１）。この結果は、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列と補助核酸鎖の５’側配列において６ヌクレオチド対以上の対合がアクセプターＲＮＡと修飾対象ＲＮＡ鎖のライゲーションを促進することを示す。
【実施例３】
【００６３】
[補助核酸鎖の修飾対象RNA鎖の塩基配列対合の厳密性]  
（実験方法）
アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）１．５ｎｍｏｌ、補助核酸鎖１．５ｎｍｏｌを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液１５μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液とした。本実験で用いる補助核酸鎖はその５’側配列８ヌクレオチドが、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列８ヌクレオチドと対合するＢｒＲ２１−８を基準に、その対合配列部分の８ヌクレオチドを一箇所ずつ、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）のヌクレオチドと同じヌクレオチドのものに置換した。ただし、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）のＵに対してはＴを用いた（図４）。具体的には、それぞれの実験ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉに対しそれぞれ補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖）、ＢｒＲ２１−８（ａ）、ＢｒＲ２１−８−１Ｔ（ｂ）、ＢｒＲ２１−８−２Ｇ  （ｃ）、ＢｒＲ２１−８−３Ａ（ｄ）、ＢｒＲ２１−８−４Ｇ（ｅ）、ＢｒＲ２１−８−５Ｇ（ｆ）、ＢｒＲ２１−８−６Ｔ（ｇ）、ＢｒＲ２１−８−７Ａ（ｈ）、ＢｒＲ２１−８−８Ｇ（ｉ）である。【００６４】
それぞれの実験ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）２μｌ、それぞれのアニーリング溶液５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした後、実験ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉに０．２９μｇのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋの反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％  ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、紫外線を当て撮影した。【００６５】
（実験結果）
修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列８ヌクレオチドとの塩基対合において、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’端から６番目までの対合を１塩基置換により無くすと（実験ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ）、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）と修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）のライゲーションは阻害された（図５、レーン２から７）。実験ｈ、ｉのライゲーション反応は実験ａとほぼ同等に進み、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’端から７および８番目の不対合のライゲーションに対する影響は小さい。結果として、補助核酸鎖の５’側配列と、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’側配列の塩基対合は、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）の５’末端から数えて１番目から６番目までの１塩基の不対合で、大きく阻害されることを示している。
【実施例４】
【００６６】
［ｍｉＲＮＡの修飾］  
（実験方法）
本実験では５’末端のヌクレオチドがＵ、Ａ、Ｃ、Ｇと異なる、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓの４種のｍｉＲＮＡ、ｃｅｌ−ｌｉｎ−４（ｐＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＵＣＡＡＧＵＧＵＧＡ、ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃  ＭＩＭＡＴ００００００２）、ｃｅｌ−ｍｉＲ−３４（ｐＡＧＧＣＡＧＵＧＵＧＧＵＵＡＧＣＵＧＧＵＵＧ、ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＭＩＭＡＴ００００００５）、ｃｅｌ−ｍｉＲ−５２（ｐＣＡＣＣＣＧＵＡＣＡＵＡＵＧＵＵＵＣＣＧＵＧＣＵ  ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃  ＭＩＭＡＴ０００００２３）、ｃｅｌ−ｍｉＲ−８７（ｐＧＵＧＡＧＣＡＡＡＧＵＵＵＣＡＧＧＵＧＵＧＣ、ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃  ＭＩＭＡＴ０００００６０）を修飾対象ＲＮＡ鎖とし、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）とのライゲーションによるＦＩＴＣ標識を試みた。【００６７】
実験ａは、修飾対象ｃｅｌ−ｌｉｎ−４を０．１ｎｍｏｌと、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。【００６８】
実験ｂは、修飾対象ｃｅｌ−ｌｉｎ−４を０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００  ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）２μｌを加え、純水を加えて１９μｌにした。【００６９】
実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆのために、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）１．５ｎｍｏｌ、補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖）、ＢｒＬｉｎ−４（実験ｃ）、ＢｒＭｉｒ−３４（実験ｄ）、ＢｒＭｉｒ−５２（実験ｅ）、ＢｒＭｉｒ−８７（実験ｆ）１．５ｎｍｏｌを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液１５μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをそれぞれアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅ、ｆとした。【００７０】
実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆは、それぞれ２チューブずつ（それぞれｃ１とｃ２、ｄ１とｄ２、ｅ１とｅ２、ｆ１とｆ２）、修飾対象ＲＮＡ鎖、ｃｅｌ−ｌｉｎ−４（実験ｃ）、ｃｅｌ−ｍｉＲ−３４（実験ｄ）、ｃｅｌ−ｍｉＲ−５２（実験ｅ）、ｃｅｌ−ｍｉＲ−８７（実験ｆ）を０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）２μｌ、対応するアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。【００７１】
実験ａ、ｃ１、ｄ１、ｅ１、ｆ１には純水１μｌを加えて、実験ｂ、ｃ２、ｄ２、ｅ２、ｆ２は０．２９μｇのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ１、ｃ２、ｄ１、ｄ２、ｅ１、ｅ２、ｆ１、ｆ２の反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％  ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、紫外線を当て撮影した。その後、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、再度撮影した。
（実験結果）
補助核酸鎖とＴ４  ＲＮＡリガーゼ２を用いる方法で、５’末端のヌクレオチドがＵ、Ａ、Ｃ、Ｇと異なる４種のｍｉＲＮＡ、ｃｅｌ−ｌｉｎ−４、ｃｅｌ−ｍｉＲ−３４、ｃｅｌ−ｍｉＲ−５２、ｃｅｌ−ｍｉＲ−８７について、これらのｍｉＲＮＡの自己環状化を防ぎ、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）とのライゲーションによるＦＩＴＣ標識をおこなうことができた。臭化エチジュウム染色像からはすべての反応においてもとのｍｉＲＮＡ、ｃｅｌ−ｌｉｎ−４、ｃｅｌ−ｍｉＲ−３４、ｃｅｌ−ｍｉＲ−５２、ｃｅｌ−ｍｉＲ−８７はほとんどアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）との反応に消費されたことがわかる。修飾対象ＲＮＡについてＴ４  ＲＮＡリガーゼ２の基質特異性により、修飾されにくいＲＮＡがあることも考えられたが、本実験では、５’末端のヌクレオチドがＵ、Ａ、Ｃ、Ｇと異なるｍｉＲＮＡでもすべて修飾できた（図６）。
【実施例５】
【００７２】
［アクセプターＲＮＡの配列に対する酵素特異性］  
（実験方法）
実験ａは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌに緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。【００７３】
実験ｂは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌに緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）２μｌを加えた後、純水を加えて１９μｌにした。【００７４】
実験ｃのために、２ｎｍｏｌのアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）、２ｎｍｏｌの補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ２１−６）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液ｃとした。【００７５】
実験ｄのために、２ｎｍｏｌのアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−２）、２ｎｍｏｌの補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ２１−１２）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液ｄとした。【００７６】
実験ｅのために、２ｎｍｏｌのアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−３）、２ｎｍｏｌの補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ２１−１３）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液ｅとした。【００７７】
実験ｆのために、２ｎｍｏｌのアクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−４）、２ｎｍｏｌの補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ２１−１４）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液ｆとした。【００７８】
実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）２μｌ、それぞれアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅ、ｆを５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。その後、実験ａは純水１μｌを加えて、実験ｃ、ｄ、ｅ、ｆは０．２９μｇのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆの反応液から１２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％  ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後、ライゲーション産物で蛍光のあるバンドをゲルから切り出し、このゲル切片からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ量を計算した。【００７９】
（実験結果）
アデニンリボヌクレオチド（実験ｃ）、ウリジンリボヌクレオチド（実験ｄ）、グアニンリボヌクレオチド（実験ｅ）、シトシンリボヌクレオチド（実験ｅ）のホモオリゴマーとＲＮＡ鎖ｐＲ２１のライゲーション率は以下の表３に示すとおりで、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチドホモオリゴマーでは反応が進むが、ウリジンリボヌクレオチドホモオリゴマーではほとんど反応が進まない。
【表３】
2011052013.tif 000007
【００８０】
図７では臭化エチジウムの染色像を示すが、ウリジンリボヌクレオチドホモオリゴマーではライゲーション産物に相当するバンドは検出されない。４種のリボヌクレオチドホモオリゴマーではシトシンリボヌクレオチドホモオリゴマーの反応でライゲーション産物が最大であるが、副生成物が多い。図７ではグアニンリボヌクレオチドホモオリゴマーでのライゲーション産物が多く見えるが、これはグアニンリボヌクレオチド鎖が臭化エチジウムに染まりやすいためと思われる。
【実施例６】
【００８１】
［オリゴリボヌクレオチドタグの付加反応］  
（実験方法）
本実験の概略図を図８に示す。  
実験ａは、ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌと、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。【００８２】
実験ｂは、ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）２μｌを加えた後、純水を加えて１９μｌにした。【００８３】
実験ｃ、ｄ、ｅのために、それぞれのアクセプターＲＮＡ、Ａｃ−１、ＡｃＥｘ０９、ＡｃＥｘ１４、を２ｎｍｏｌ、それぞれの補助核酸鎖、ＢｒＲ２１−６、Ｂｒ２１Ｅｘ、ＢｒＲ２１−６を２ｎｍｏｌを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをそれぞれアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅとした。【００８４】
実験ｃ１、ｄ１、ｅ１は、対応するアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅ、５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにした。実験ｃ２、ｄ２、ｅ２、は、ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）０．１ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）２μｌ、対応するアニーリング溶液ｃ、ｄ、ｅ、５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。【００８５】
実験ａ、ｃ１、ｄ１、ｅ１には純水１μｌを加えて、実験ｂ、ｃ２、ｄ２、ｅ２は０．２９μｇのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂ、ｃ１、ｃ２、ｄ１、ｄ２、ｅ１、ｅ２の反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％  ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、撮影した。【００８６】
（実験結果）
補助核酸鎖とＴ４  ＲＮＡリガーゼ２を用いる方法で、ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）について、単鎖オリゴリボヌクレオチドをその５’末端する結合することができた。図９はその臭化エチジウム染色像を示すが、ＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）にアクセプターＲＮＡ、Ａｃ−１、をライゲーションしたのと同様に効率よくＡｃＥｘ０９、ＡｃＥｘ１４を付加できた。レーン４でＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）に８ｍｅｒのＡｃ−１が結合し２９ｍｅｒのバンドが見られると同様に、レーン６ではＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）に１６ｍｅｒのＡｃＥｘ０９が結合し２９ｍｅｒのバンド見られ、レーン９ではＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）に２２ｍｅｒのＡｃＥｘ１４が結合し４５ｍｅｒのバンド見られる。このことによってＲＮＡ鎖（ｐＲ２１）について５’側に突き出す、９または１４ｍｅｒの単鎖オリゴリボヌクレオチドタグを付加できたことになる。
【実施例７】
【００８７】
［７３  ｍｅｒ  ＲＮＡの修飾］  
（実験方法）
プラスミド、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＫＳ  ＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ）、をＥｃｏＲＶで切断し、Ｔ７プロモター配列、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧの、３’側から３番目のＧから７３塩基が続く、ＲＮＡインビトロ転写の鋳型（鋳型７３）を作製した。ＲＮＡインビトロ転写は４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰを含む緩衝液に０．１μｇ／μｌの鋳型７３、２ｕ／μｌ  ｏｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを加え、３７℃で３時間反応させ、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿をして７３ｍｅｒ  ＲＮＡを精製した。精製７３ｍｅｒ  ＲＮＡはアルカリホスファターゼで脱リン酸化され、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで再リン酸化された（ｐＲ７３）。【００８８】
アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）２ｎｍｏｌ、補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＲ７３）２ｎｍｏｌを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをアニーリング溶液とした。【００８９】
実験ａ、ｂは、修飾対象ＲＮＡ鎖（ｐＲ７３）０．０５ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）２μｌ、アニーリング溶液５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。【００９０】
実験ａ、には純水１μｌを加えて、実験ｂは０．２９μｇのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ））を加えて、３７℃で反応を開始し、１時間後、ａ、ｂの反応液から１μｌ取り、これに反応停止液（８０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％  ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１０％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。【００９１】
（実験結果）
補助核酸鎖とＴ４  ＲＮＡリガーゼ２を用いる方法で、７３ヌクレオチドからなるＲＮＡ鎖（ｐＲ７３）について、アクセプターＲＮＡ（ＡｃＦ−１）とのライゲーションによるＦＩＴＣ標識がおこなうことができた。臭化エチジュウム染色からは未反応ｐＲ７３は概算で３０％以下であり、７０％以上のｐＲ７３がＦＩＴＣ標識された（図１０）。
【実施例８】
【００９２】
［ＲＮＡ選別のためのビオチン化］  
（実験方法）
アクセプターＲＮＡ、Ａｃ−１または５’末端をビオチン化したＡｃＢ−１を２ｎｍｏｌ、補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖：ＢｒＬｉｎ−４）２ｎｍｏｌを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをそれぞれアニーリング溶液Ｆ、Ｂとした。【００９３】
実験ａ、ｂは、ｐｌｉｎ４の３’末をＦＩＴＣ標識したＲＮＡ鎖（ｐｌｉｎ４−ＦＩＴＣ）０．２ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）２μｌ、アニーリング溶液Ｆを５μｌを加え、純水を加えて１８μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。【００９４】
実験ｃ、ｄは、ＲＮＡ鎖（ｐｌｉｎ４−ＦＩＴＣ）０．２ｎｍｏｌ、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）２μｌ、アニーリング溶液Ｂを５μｌ加え、純水を加えて１８μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。【００９５】
実験ａ、ｃには純水２μｌを加えて、実験ｂ、ｄは０．２９μｇのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（２μｌ）を加えて、３７℃で反応を１時間おこなった。一方、ストレプトアビジン磁気ビーズ懸濁液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ  Ｃ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を磁石によってストレプトアビジン磁気ビーズを集め、これを緩衝液２（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２Ｍ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄した。１時間ライゲーション反応した実験ｂ、ｄからの反応液１０μｌを、もともと２０μｌ懸濁液からの洗浄済みストレプトアビジン磁気ビーズ沈殿と混ぜ、懸濁し、ときどき揺らしながら１５分間放置した。その後を磁石によってストレプトアビジン磁気ビーズを除き、液体部分を回収した（１０μｌ）。ストレプトアビジン磁気ビーズ処理前の実験ａ、ｂ、ｃ、ｄおよび磁気ビーズ処理後の実験ｂ、ｄおよび２．５μｌに対し、反応停止液（８０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％  ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１０％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後は装置からゲルを取り出し、紫外線を当て撮影した。その後、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、再度撮影した。【００９６】
（実験結果）
図１１ではレーン３、５が磁気ビース処理前の実験ｂ、ｄ、レーン５、６が磁気ビーズ処理後の実験ｂ、ｄを示している。実験ｂは磁気ビーズ処理前も処理後もアクセプターＲＮＡ、Ａｃ−１とｐｌｉｎ４−ＦＩＴＣがライゲーションしたバンドが同じように見られる（レーン３と５の比較）。一方、実験ｄは磁気ビーズ処理後ではアクセプターＲＮＡ、ＡｃＢ−１とｐｌｉｎ４−ＦＩＴＣがライゲーションしたバンドが消失し（レーン４と６の比較）、ビオチン化されたＡｃＢ−１結合ｐｌｉｎ４−ＦＩＴＣがストレプトアビジン磁気ビーズに捕捉されたことがわかる。これは、実験ｂのｐｌｉｎ４−ＦＩＴＣが効率的にＡｃＢ−１とライゲーションしたことを示している。
【実施例９】
【００９７】
［Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２の調製］  
Ｔ４ファージゲノムＤＮＡから  Ｔ４  ｇｅｎｅ２４．１を得て、これを大腸菌発現ベクターｐＥＴＢＡ（株式会社バイオダイナミクス研究所）のＢａｍＨＩとＮｏｔＩの制限酵素部位にクローニングした（このプラスミドをｐＥＴＢＴ４Ｌ２とする）。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＥＴＢＴ４Ｌ２にて形質転換し、ｐＥＴＢＴ４Ｌ２を保持した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴＢＴ４Ｌ２を得た。【００９８】
このＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴＢＴ４Ｌ２を０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、ＯＤ６００が０．５に達した時点で１ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を加え、さらに３時間培養し、遠心機にて集菌した。５０ｍｌの培養溶液から得られた菌体ペレットに９ｍｌの５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールｐＨ８．０緩衝液を加え菌体ペレットを再懸濁後、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を１ｍｌ加え攪拌し、氷上で３０分間静置した。これを遠心分離し、上清を得た後、０．２μｍ孔径のシリンジフィルターでろ過をおこない、粗酵素ろ液を得た。【００９９】
樹脂量１ｍｌのＰｒｏｂａｎｄ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０緩衝液で平衡化をおこない、これに前述の粗酵素ろ液を供与し、続いて１０ｍｌの５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０緩衝液および１０ｍｌの５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０緩衝液で洗浄後、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０緩衝液で溶出を行った。得られたＴ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ２溶出画分を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、７０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡに対して４℃で透析を行った。得られた透析内液９１０μｌ（タンパク量：０．５３ｍｇ）に等量のグリセロールを加え酵素溶液とした。タンパク質量の測定には、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用し、ＢＳＡを標準として用いた。
【実施例１０】
【０１００】
［ライゲーション速度と補助核酸鎖の鎖長］  
（実験方法）
本実験では、アクセプターＲＮＡ（Ａｃ−１）とＲＮＡ鎖ｐＲ２１のライゲーションについて、ＲＮＡ鎖ｐＲ２１と対合する配列の鎖長が異なる補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖）、ＢｒＲ２１−６、ＢｒＲ２１−１２、ＢｒＲ２１−Ｆを用いて反応速度を比較した（図１２参照）。【０１０１】
実験ａは、修飾対象ＲＮＡ鎖ｐＲ２１を２μｇ（０．２７ｎｍｏｌ）と緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）を２μｌ加え、純水を加えて１９μｌにした。【０１０２】
実験ｂ、ｃ、ｄのために、アクセプターＲＮＡ（Ａｃ−１）２ｎｍｏｌ、補助核酸鎖（ＤＮＡ鎖）、ＢｒＲ２１−６（実験ｂ）、ＢｒＲ２１−１２（実験ｃ）、ＢｒＲ２１−Ｆ（実験ｄ）２  ｎｍｏｌを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液２０μｌに溶かし、６５℃で５分間、アニーリング処理をし、これをそれぞれアニーリング溶液ｂ、ｃ、ｄとした。【０１０３】
実験ｂ、ｃ、ｄは、修飾対象ＲＮＡ鎖ｐＲ２１を２μｇ（０．２７ｎｍｏｌ）、緩衝液１（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ）５μｌ、対応するアニーリング溶液ｂ、ｃ、ｄを１２．５μｌを加え、純水を加えて１９μｌにし、６５℃で５分間、アニーリング処理をした。【０１０４】
実験ａには純水１μｌを加えて、実験ｂ、ｃ、ｄは０．２９μｇのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（１μｌ）を加えて、室温（２５℃）で反応を開始し、１０分後、３０分後、そして１時間後、反応液から２．５μｌ取り、これに反応停止液（８０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０２５％  ｂｒｏｍｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を等量加え、直ちに８０℃で５分間の熱処理をし、その後氷上に置き急冷し、１２．５％濃度の変性アクリルアミドゲル（１×ＴＢＥ緩衝液、７．５Ｍ尿素を含む）で１×ＴＢＥ緩衝液を泳動液として電気泳動をした。電気泳動後、装置からゲルを取り出し、ゲルを臭化エチジュウムで染色した後、紫外線を当て、再度撮影した。【０１０５】
（実験結果）
図１３ではレーン２、３、４が、補助核酸鎖ＢｒＲ２１−６（ＲＮＡ鎖ｐＲ２１と６塩基対合）を、レーン５、６、７が、ＢｒＲ２１−１２（ＲＮＡ鎖ｐＲ２１と１２塩基対合）を、レーン８、９、１０が、ＢｒＲ２１−Ｆ（ＲＮＡ鎖ｐＲ２１と２１塩基対合）を、用いたアクセプターＲＮＡ鎖Ａｃ−１とＲＮＡ鎖ｐＲ２１のライゲーション実験の結果を示している。【０１０６】
補助核酸鎖ＢｒＲ２１−６を用いた場合、２μｇのＲＮＡ鎖ｐＲ２１の大部分が１０分間でＲＮＡ鎖Ａｃ−１とライゲーションした２９ｍｅｒのＲＮＡ鎖に変換され、３０分後にはＲＮＡ鎖ｐＲ２１がすべて２９ｍｅｒのＲＮＡ鎖に変換され、反応が終了している。補助核酸鎖ＢｒＲ２１−１２を用いた場合、２μｇのＲＮＡ鎖ｐＲ２１は３０分間で約５０％がＲＮＡ鎖Ａｃ−１とライゲーションした２９ｍｅｒのＲＮＡ鎖に変換され、１時間後は６０％以上が２９ｍｅｒのＲＮＡ鎖に変換されているが、反応が終了していない。助核酸鎖ＢｒＲ２１−Ｆを用いた場合、２μｇのＲＮＡ鎖ｐＲ２１は３０分間で少量がＲＮＡ鎖Ａｃ−１とライゲーションした２９ｍｅｒのＲＮＡ鎖に変換され、１時間後でも約５０％のＲＮＡ鎖ｐＲ２１が未反応のまま残っていた。【０１０７】
以上の結果はアクセプターＲＮＡ鎖Ａｃ−１と修飾対象ＲＮＡ鎖ｐＲ２１のライゲーションに関して、用いる補助核酸鎖のＲＮＡ鎖ｐＲ２１と塩基対合する鎖長によって反応速度が変化し、塩基対合する鎖長が長いほど反応が遅いことを示している。一方、別の実験結果から、塩基対合する鎖長が短いＢｒＲ２１−６を用いた場合、酵素量０．５μｇ、室温（２５℃）反応で、少なくとも１０μｇのＲＮＡ鎖ｐＲ２１がアクセプターＲＮＡ鎖Ａｃ−１とライゲーションしている。【０１０８】
その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。
【図１】
2011052013.tif 000008
【図２】
2011052013.tif 000009
【図３】
2011052013.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2011052013.tif 000017
【図１１】
2011052013.tif 000018
【図１２】
2011052013.tif 000019
【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年3月29日(2010.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５’リン酸基とを、前記第一の核酸鎖の少なくとも一部と前記第二の核酸鎖の少なくとも一部とに相補的に結合する第三の核酸鎖の存在下において結合する方法であって、
（１）ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを、前記第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、及び第三の核酸鎖の混合物に添加する工程を有し、
（２）前記第三の核酸鎖は、第一の核酸鎖の３’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、また前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、且つ前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３’末端の塩基と相補的となる前記第三の核酸鎖上の塩基と、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基と相補的となる前記第三の核酸鎖上の塩基とが、前記第三の核酸鎖上において直接隣接してホスホジエステル結合をしているものであり、且つ
（３）前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が、前記第二の核酸鎖の鎖長の１／２未満の鎖長となる核酸鎖である
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２であることを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が１０塩基以下となるものであることを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記第二の核酸鎖は、ＲＮＡ鎖であることを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記第一の核酸鎖は、単一塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものであることを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記第一の核酸鎖は、色素、蛍光色素またはビオチンによって標識された５’末端を有するものであることを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法に用いるキットであって、
少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する前記第一の核酸鎖と、
ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼと、
前記結合反応のための反応緩衝液と、
を有するものであることを特徴とする、キット。
【請求項８】
請求項７記載のキットにおいて、前記ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２であることを特徴とする、キット。
【請求項９】
請求項７記載のキットにおいて、前記第一の核酸鎖は、単一塩基が６塩基以上連続する塩基配列を有するものであることを特徴とする、キット。
【請求項１０】
請求項７記載のキットにおいて、前記第一の核酸鎖は、色素、蛍光色素またはビオチンによって標識された５’末端を有するものであることを特徴とする、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
［０００９］
従って、目的の核酸鎖に予め用意した修飾鎖を結合させようとしたとしても、目的の核酸鎖及び／若しくは修飾鎖の塩基配列の構造的な問題によって、結合できない核酸鎖と修飾鎖の組合せが出てきてしまう。なお、このような塩基配列における構造的な制限は、その使用される酵素がＴ４ＲＮＡリガーゼ１であることに起因する。
［００１０］
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖と第三の核酸鎖とを用いて、短時間で反応が終了できる前記第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合方法、およびそれを利用して、放射性アイソトープを使用せず安全に実験を遂行できる核酸鎖の標識方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
［００１１］
本発明の第一の主要な観点によれば、少なくとも１以上のリボヌクレオチドを３’末端に有する第一の核酸鎖の３’ヒドロシル基と、第二の核酸鎖の５’リン酸基とを、前記第一の核酸鎖の少なくとも一部と前記第二の核酸鎖の少なくとも一部とに相補的に結合する第三の核酸鎖の存在下において結合する方法であって、（１）ＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを、前記第一の核酸鎖、第二の核酸鎖、及び第三の核酸鎖の混合物に添加する工程を有し、（２）前記第三の核酸鎖は、第一の核酸鎖の３’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、また前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基を含む少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列を有し、且つ前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３’末端の塩基と相補的となる前記第三の核酸鎖上の塩基と、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基と相補的となる前記第三の核酸鎖上の塩基とが、前記第三の核酸鎖上において直接隣接してホスホジエステル結合をしているものであり、且つ（３）前記第三の核酸鎖は、前記第二の核酸鎖に対して相補的となる前記第三の核酸鎖における塩基配列が、前記第二の核酸鎖の鎖長の１／２未満の鎖長となる核酸鎖であることを特徴とする方法、が提供される。
［００１２］
このような構成によれば、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖との結合について
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
の５’末端側配列と、その３’末端側配列が前記第一の核酸鎖の３’末端側配列と相補的に塩基対を形成するものであり、前記第一の核酸鎖と前記第二の核酸鎖との結合を補助するように働く。また、本発明に係る第三の核酸鎖は、ＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖、またはＤＮＡとＲＮＡとが混在する配列であっても良いが、本発明に係る方法を実施する当業者にとっては、経済的な面において、ＤＮＡ鎖の使用が好ましい。
［００３０］
また、本発明に係る第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖と前記第二の核酸鎖とが結合する際に、前記第二の核酸鎖が環状化することを防いでいる。さらに、本発明に係る方法を実施することにより、前記第一の核酸鎖と前記第二の核酸鎖との結合反応が速くなることも前記第二の核酸鎖の自己環状化を防ぐ一因となっている。
［００３１］
さらに、本発明に係る方法において、前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３’末端の塩基を有する少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列と、前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基を有する少なくとも１以上の連続する塩基配列と相補的な塩基配列とを有し、且つ前記第三の核酸鎖は、前記第一の核酸鎖の３’末端の塩基と相補的となる前記第三の核酸鎖上の塩基と前記第二の核酸鎖の５’末端の塩基と相補的となる前記第三の核酸鎖上の塩基とが、前記第三の核酸鎖上において直接隣接してホスホジエステル結合をしているものである、という特徴を有する。また、前記第一の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との相補的な結合、並びに、前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との相補的な結合は、厳密に塩基対の形成を成していることが好ましい。
［００３２］
また、本発明者らは、前記第二の核酸鎖と前記第三の核酸鎖との相補的な結合が、その対合鎖長が短くなると結合反応の速度が増加することを見いだしている（下記、実施例１０参照）。例えば、Ｂｕｌｌａｒｄらは、片鎖にニックのある二本鎖核酸を用いてリガーゼの基質特異性を研究しているが、この酵素活性測定実験で、ニックの無い側の核酸鎖の塩基はニックのある相補核酸鎖の塩基とすべて塩基対形成をしているため、ニック修復活性は遅くなる（Ｂｕｌｌａｒｄ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ  Ｂｏｗａｔｅｒ，Ｒ．Ｐ．２００６．Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｎｉｃｋ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９８：１３５−１４４．）。
［００３３］
本発明に用いるＥＣ６．５．１．３に分類され且つ二本鎖核酸ニック修復
【国際調査報告】
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