(57)【要約】  本発明は、腫瘍細胞及び単離された可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を含む、腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体であって、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得るように、該腫瘍細胞の表面上に結合している、複合体、該複合体を含む組成物及び腫瘍ワクチンを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞及び単離された可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を含む、腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体であって、
可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得るように、該腫瘍細胞の表面上に結合している、複合体。
【請求項２】
ＴＮＦファミリーメンバーがＦａｓＬ、ＴＮＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ及びＲＡＮＫＬからなる群から選択されるいずれか又は２以上の組み合わせである、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
ＴＮＦファミリーメンバーがＦａｓＬ、ＯＸ４０Ｌ、又はＦａｓＬとＴＮＦとＯＸ４０Ｌの組み合わせである、請求項２記載の複合体。
【請求項４】
可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が多量体化されている、請求項１記載の複合体。
【請求項５】
可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片及び該腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分を含む融合分子である、請求項１記載の複合体。
【請求項６】
該腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分が、該腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基である、請求項５記載の複合体。
【請求項７】
該腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチドが、アビジン又はストレプトアビジンである、請求項６記載の複合体。
【請求項８】
固定されている、請求項１記載の複合体。
【請求項９】
固定がアルデヒド処理により行われている、請求項８記載の複合体。
【請求項１０】
該腫瘍細胞がビオチン化されている、請求項７記載の複合体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の複合体を含む組成物。
【請求項１２】
医薬である、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載の複合体を含む、腫瘍ワクチン。
【請求項１４】
該腫瘍細胞が投与対象の個体から単離されたものである、請求項１３記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１５】
腫瘍の治療用である、請求項１４に記載の腫瘍ワクチン。
【請求項１６】
請求項１に記載の腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体を含む腫瘍ワクチンの製造方法であって、
（ａ）投与対象の個体から単離された腫瘍細胞と可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を水性緩衝液中で混合する工程、
（ｂ）（ａ）の混合液中で腫瘍細胞の表面に可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を結合させ、腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体を得る工程、及び
（ｃ）（ｂ）で得られた腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体を固定する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
腫瘍細胞及び単離された可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を含む、腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体であって、
可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得るように、該腫瘍細胞の表面上に結合している、複合体を含有する腫瘍ワクチンを、腫瘍患者又は腫瘍の罹患暦を有する患者に投与することを含む、腫瘍を治療又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞及び単離された可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を含む複合体、該複合体を含む組成物、医薬組成物、腫瘍ワクチン等に関する。
【背景技術】
【０００２】
摘出された腫瘍組織又は腫瘍細胞を用いた腫瘍ワクチン療法の歴史は古く、１９７８年に最初の動物実験の結果が報告された（非特許文献１、２）。その後１９９３年に最初の臨床試験（非特許文献３）が報告されて以来、膨大な動物実験及び臨床試験が行われてきた（非特許文献４、５）。しかしながら、腫瘍ワクチン療法による明確な治療効果は現在のところ得られていない。【０００３】
最近、腫瘍細胞にサイトカインなどの遺伝子を導入することにより、抗腫瘍効果が上昇するとの報告が数多くなされている。しかしながら、遺伝子導入効率を上げるために使用するウイルスベクターによる副作用の可能性や、長期間の細胞培養を必要とする方法の煩雑さなどの問題もあり、臨床応用には至っていない（非特許文献４、５）。【０００４】
腫瘍細胞にＴＮＦファミリーに属するタンパク質（本明細書中において、ＴＮＦファミリーメンバーとも言う）であるＦａｓリガンド（本明細書中において、ＦａｓＬとも言う）を強制発現させると、腫瘍が速やかに拒絶されることが１９９７年に報告されている（非特許文献６）。本発明者らは、この拒絶現象をさらに詳細に解析した結果、腫瘍細胞にＦａｓＬを発現させることにより、本来免疫学的に自己であるため拒絶されない腫瘍細胞に対して、Ｔ細胞依存性の獲得免疫が成立することを示した（非特許文献７−１２）。しかも、この獲得免疫は複数の腫瘍特異的抗原を認識することが示唆された（非特許文献９）。即ち、自己である腫瘍細胞が異物として自身の免疫系に排除されることが判明した。しかしながら、上記のように、発現ベクターを利用する方法は、時間がかかる上にベクターによる副作用の問題があり、実際の臨床においてはほとんど利用されていない。【０００５】
非特許文献１３には、細胞表面をビオチン化した膵臓に、ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＦａｓＬ融合タンパク質を結合させ、これをアロのレシピエントに移植すると、該膵臓移植片の拒絶が抑制されたことが記載されている。また、非特許文献１４には、細胞表面をビオチン化したアロの血管内皮細胞に、ストレプトアビジン（ＳＡ）−ＦａｓＬ融合タンパク質を結合させ、これをレシピエントに移植すると、該血管内皮細胞移植片の拒絶が抑制されたことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cancer Res. 38: 204-209 (1978).
【非特許文献２】Cancer Res. 39:1353-1360 (1979).
【非特許文献３】J. Clin. Oncol. 11: 390-9 (1993).
【非特許文献４】J. Clin. Invest. 114: 450-62 (2004).
【非特許文献５】Rev. Recent Clin. Trials 1: 283-92 (2006).
【非特許文献６】Nat. Med. 3: 165-70 (1997).
【非特許文献７】Int. J. Mol. Med. 9: 281-285 (2002).
【非特許文献８】Anticancer Res. 22: 831-836 (2002).
【非特許文献９】J. Immunol. 169: 2241-2245 (2002).
【非特許文献１０】Cancer Gene Ther. 10: 134-140 (2003).
【非特許文献１１】Clinical Immunology 39: 532-536 (2003)
【非特許文献１２】Cancer Gene Ther. 14: 262-267 (2007).
【非特許文献１３】Mol. Immunol. 44(11): 2884-2892 (2007)
【非特許文献１４】Circulation 107:1525-1531 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
腫瘍細胞特異的に発現しているタンパク質由来のペプチド抗原等を用いた腫瘍ワクチンは、通常複数の遺伝子変異を有し様々な腫瘍抗原を発現している腫瘍細胞に対して、抗原として用いた特定のタンパク質を発現している細胞を排除できるが、それ以外の腫瘍細胞を排除出来ない。また、従来の投与対象由来の腫瘍組織又は腫瘍細胞を用いた腫瘍治療においては、免疫学的自己である腫瘍細胞に対する免疫を成立させるために、腫瘍細胞を非自己と認識させるための遺伝子を発現させる発現ベクターを用いる必要がある。
そこで、本発明は、特定の腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞のみを排除するだけでなく、発現ベクターを用いずに、投与対象の体内に存在する腫瘍に対して優れた治療又は予防効果を有する腫瘍ワクチン等を提供すること、及びそれに用いられる有効成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題に鑑み、発現ベクターによらず直接腫瘍細胞表面上に免疫賦活化能を有する物質を結合させ、当該細胞に存在する様々な腫瘍抗原に対する免疫を成立させる方法を鋭意検討した。その結果、細胞表面上にＳＡ−ＦａｓＬを結合させた腫瘍細胞を同質遺伝子的なマウスに移入すると、発現ベクターを用いてＦａｓＬを発現させた場合と同様に、当該腫瘍細胞は拒絶され、又は増殖が抑制される事を見出した。さらに当該腫瘍細胞に固定処理を施した上で個体内に移植すると、この同質遺伝子的な腫瘍細胞に対する免疫が成立し、ＳＡ−ＦａｓＬを結合しない同一株の腫瘍細胞を再度移入すると、この腫瘍細胞は拒絶され、増殖が著しく抑制された。驚くべきことに、この腫瘍ワクチン効果は、発現ベクターを用いてＦａｓＬを発現させた場合よりも、強力だった。これらの知見に基づき、更に検討を進め、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
［１］腫瘍細胞及び単離された可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を含む、腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体であって、
可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得るように、該腫瘍細胞の表面上に結合している、複合体。
［２］ＴＮＦファミリーメンバーがＦａｓＬ、ＴＮＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ及びＲＡＮＫＬからなる群から選択されるいずれか又は２以上の組み合わせである、［１］に記載の複合体。
［３］ＴＮＦファミリーメンバーがＦａｓＬ、ＯＸ４０Ｌ、又はＦａｓＬとＴＮＦとＯＸ４０Ｌの組み合わせである、［２］に記載の複合体。
［４］可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が多量体化されている、［１］に記載の複合体。
［５］可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片及び該腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分を含む融合分子である、［１］に記載の複合体。
［６］該腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分が、該腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基である、［５］に記載の複合体。
［７］該腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチドが、アビジン又はストレプトアビジンである、［６］に記載の複合体。
［８］固定されている、［１］に記載の複合体。
［９］固定がアルデヒド処理により行われている、［８］に記載の複合体。
［１０］該腫瘍細胞がビオチン化されている、［７］に記載の複合体。
［１１］［１］〜［１０］のいずれかに記載の複合体を含む組成物。
［１２］医薬である、［１１］に記載の組成物。
［１３］［１］〜［１０］のいずれかに記載の複合体を含む、腫瘍ワクチン。
［１４］該腫瘍細胞が投与対象の個体から単離されたものである、［１３］に記載の腫瘍ワクチン。
［１５］腫瘍の治療用である、［１４］に記載の腫瘍ワクチン。
［１６］［１］に記載の腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体を含む腫瘍ワクチンの製造方法であって、
（ａ）投与対象の個体から単離された腫瘍細胞と可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を水性緩衝液中で混合する工程、
（ｂ）（ａ）の混合液中で腫瘍細胞の表面に可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を結合させ、腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体を得る工程、及び
（ｃ）（ｂ）で得られた腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体を固定する工程
を含む、方法。
［１７］腫瘍細胞及び単離された可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を含む、腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体であって、
可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得るように、該腫瘍細胞の表面上に結合している、複合体を含有する腫瘍ワクチンを、腫瘍患者又は腫瘍の罹患暦を有する患者に投与することを含む、腫瘍を治療又は予防する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の複合体、組成物及び腫瘍ワクチンを用いることにより、効果的に腫瘍を予防又は治療することができる。特に本発明の複合体に含まれる腫瘍細胞として投与対象の個体から単離された腫瘍細胞を用いることにより、本来的には免疫学的自己である腫瘍細胞に対する免疫が成立し、投与対象の個体内に存在する腫瘍細胞が排除される。従って、本発明の複合体、組成物及び腫瘍ワクチンを、外科的手術等により腫瘍除去の治療を受けた患者に対して投与すると、自己の腫瘍細胞に特異的に発現する多種の腫瘍抗原に対する免疫が活性化し、当該患者の体内に残存する可能性がある腫瘍細胞（例えば、微小転移した腫瘍細胞）を排除することができる。従って、本発明の複合体、組成物及び腫瘍ワクチンは、特に腫瘍治療後の腫瘍の再発の防止に有効である。
また発現ベクターを用いて細胞表面にタンパク質を発現させる場合には、発現ベクターによる遺伝子導入に長い時間を要し、また、（１）ベクターの細胞への導入効率、（２）細胞内におけるベクターのプロモーター・エンハンサー活性、（３）発現させるタンパク質の細胞毒性、などに起因して、目的のタンパク質を高いレベルで発現させることができないことがあるが、本発明の複合体等は、これら細胞や分子自体の特性による製造工程への影響を受けることなく、非常に短い時間で安定して製造することができる。
従って本発明により、種々の腫瘍に対して有効な治療手段及び再発の予防手段を迅速かつ安定的に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ストレプトアビジン−ＦａｓＬ融合タンパク質が強い細胞傷害活性を有することを示す。ヒトＴ細胞を１μｇのストレプトアビジン−ＦａｓＬ融合タンパク質又は１μｇの抗Ｆａｓ抗体の存在下で２４時間培養した後、細胞をAnnexin VとPropidium Iodide（ＰＩ）で染色した。Annexin V陽性細胞はアポトーシス細胞、ＰＩ陽性細胞はアポトーシスを経てネクローシスになった細胞である。ストレプトアビジン−ＦａｓＬ融合タンパク質は、抗Ｆａｓ抗体よりも強く細胞死を誘導する活性を持つことが示された。
【図２】ストレプトアビジン−ＦａｓＬ融合タンパク質の腫瘍細胞表面への結合を示す。腫瘍細胞表面のタンパク質をビオチン化した後、ストレプトアビジン−ＦａｓＬ融合タンパク質を該ビオチン化されたタンパク質に結合させ、細胞表面上のＦａｓＬ発現レベルをフローサイトメトリーにより解析した。
【図３】細胞表面にＦａｓＬを結合させた腫瘍細胞の増殖抑制を示す。Ａ１１肺がん細胞（左）又はＢ１６メラノーマ（右）を用いて、移植後の増殖を調べた。ＦａｓＬを細胞表面に結合させた腫瘍細胞は、移植後拒絶されなかったが、コントロールに比べて増殖の低下が見られた。ベクターを用いてＦａｓＬを発現させた腫瘍細胞は拒絶された。データは、５個体についての平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図４】細胞表面にＦａｓＬを結合させ固定した腫瘍細胞のワクチン効果を示す。ＦａｓＬを細胞表面に結合させ固定した腫瘍細胞又はベクターを用いてＦａｓＬを発現させた腫瘍細胞をワクチンとしてマウス皮下に接種し、２週間後にコントロール腫瘍細胞を移植し、その増殖を調べた。ＦａｓＬを細胞表面に結合させ固定した腫瘍細胞の方が、ベクターを用いた場合と比較して高いワクチン効果を示した。データは、５個体についての平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図５】細胞表面にＦａｓＬを結合させ固定した腫瘍細胞の転移抑制効果を示す。ＦａｓＬを細胞表面に結合させ固定した腫瘍細胞又はベクターを用いてＦａｓＬを発現させた腫瘍細胞をワクチンとしてマウス皮下に接種し、２週間後にコントロール腫瘍細胞を移植し、その肺への転移を調べた。ＦａｓＬを細胞表面に結合させ固定した腫瘍細胞およびベクターを用いてＦａｓＬを発現させた細胞は、コントロールと比較して高い転移抑制効果を示した。データは、５個体についての平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図６】細胞表面に可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を結合させ固定したＡ１１肺がん細胞による転移抑制効果を示す。予め野生型Ａ１１肺がん細胞を移植しておいたマウスに、移植から７日後及び２１日後に、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を結合させ固定したＡ１１肺がん細胞又はコントロール細胞を皮下移植した。野生型Ａ１１肺がん細胞の移植から２９日後に、肺への転移を調べた。ＦａｓＬ単独、ＯＸ４０Ｌ単独、又はＦａｓＬ、ＴＮＦ及びＯＸ４０Ｌを組み合わせて細胞表面に結合させ固定した腫瘍細胞は、コントロール細胞と比較して高い転移抑制効果を示した。データは、５個体についての平均値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体
本発明は、腫瘍細胞及び単離された可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を含む、腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体であって、
可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得るように、該腫瘍細胞の表面上に結合している、複合体（以下、本発明の複合体とも言う）を提供する。
【００１３】
１−１．腫瘍細胞
本発明の複合体に含まれる腫瘍細胞としては、本発明における腫瘍ワクチン等の投与対象である哺乳動物由来の任意の腫瘍細胞を使用することができる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類及びウサギなどの実験動物、イヌ及びネコなどのペット、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ及びヒツジなどの家畜、ヒト、サル、オランウータン及びチンパンジーなどの霊長類などが挙げられ、特に限定されないが、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト等）である。
【００１４】
腫瘍としては、例えば、固形腫瘍（例、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍）、造血組織における腫瘍が挙げられる。より詳細には、固形腫瘍としては、例えば、消化器癌（例、胃癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌）、肺癌（例、小細胞癌、非小細胞癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、肉腫（例、カポシ肉腫）、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、非扁平細胞癌、脳腫瘍等が挙げられるが、これらに限定されない。造血組織における腫瘍としては、白血病（例、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性リンパ球性白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、成人Ｔ細胞白血病（ATL）、骨髄異形成症候群（MDS））、リンパ腫（例、Ｔリンパ腫、Ｂリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、骨髄腫（多発性骨髄腫）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
腫瘍細胞としては、上記の腫瘍を有する個体から摘出した腫瘍組織中に含まれる腫瘍細胞を継代して又は継代することなく使用することができる。腫瘍組織中に含まれる腫瘍細胞を用いる場合には、腫瘍組織自体を用いてもよいし、腫瘍組織をトリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ等のプロテアーゼで処理することにより、細胞を分散し、得られた細胞懸濁液から腫瘍細胞を単離して用いてもよい。
【００１６】
本発明に用いる腫瘍細胞は、単離又は精製されていることが好ましい。「単離」又は「精製」とは、目的とする対象物以外のものを除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製された細胞に含まれる腫瘍細胞の純度（全細胞数に対する腫瘍細胞数の割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば、１００％）である。
【００１７】
１−２．可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子
ＴＮＦファミリーは、腫瘍壊死因子と呼ばれるサイトカインの一群であり、受容体への結合を介して他の細胞に作用し、種々の応答を引き起こさせる。ＴＮＦファミリーメンバーとしては、十数種類以上のタンパク質が知られている。これらはいずれも本発明において用いることができるが、ＴＮＦファミリーメンバーは、好ましくはＴＮＦ（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β又はＬＴ−β）、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ及びＲＡＮＫＬからなる群から選択されるいずれかである。
【００１８】
本発明で使用するＴＮＦファミリーメンバーは、通常、哺乳動物由来のものである。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類及びウサギなどの実験動物、イヌ及びネコなどのペット、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ及びヒツジなどの家畜、ヒト、サル、オランウータン及びチンパンジーなどの霊長類などが挙げられ、特に限定されないが、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト等）であり、より好ましくはヒトである。
【００１９】
哺乳動物由来とは、ＴＮＦファミリーメンバーのアミノ酸配列が哺乳動物のものであることを意味する。
【００２０】
主要な哺乳動物のＴＮＦファミリーメンバーのアミノ酸配列は、公知であり、ＮＣＢＩ等のデータベースから入手可能である。例えば、ヒトのＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、及びＲＡＮＫＬのアミノ酸配列及びＮＣＢＩアクセション番号を表１に示す。
【００２１】
ＴＮＦファミリーメンバーは、生体内においては、通常は、ＩＩ型膜タンパク質として発現する。本明細書中において、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域とは、膜貫通領域よりもＣ末端側の領域を言う。このＣ末端側の領域が、特異的なプロテアーゼの作用により、膜貫通領域を含むＮ末端側の領域から切り離され、可溶型として放出されて機能することが知られている。ヒトのＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、及びＲＡＮＫＬの細胞外領域及びプロテアーゼによる切断部位を表１に示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
本発明の複合体に含まれる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、少なくともいずれかのＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片を含む。
【００２４】
ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域の機能的断片の長さは、該断片を含む可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が該ＴＮＦファミリーメンバーに対応する受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該受容体を発現する細胞を刺激する活性を有する限り、特に制限されないが、通常、１３０アミノ酸以上、好ましくは１４０アミノ酸以上、より好ましくは１５０アミノ酸以上である。また、細胞外領域における機能的断片の位置は、該断片を含む可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が該ＴＮＦファミリーメンバーに対応する受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該受容体を発現する細胞を刺激する活性を有する限り、特に制限されないが、好ましくはそのＣ末端である。ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域の機能的断片の一態様として、上述のプロテアーゼによる切断部位よりもＣ末端側の領域を挙げることが出来る。
【００２５】
ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域の機能的断片の好適な例としては、ヒトＴＮＦ−αについては配列番号１で表されるアミノ酸配列の第７７番〜第２３３番のアミノ酸からなるポリペプチド、ヒトＦａｓＬについては配列番号４で表されるアミノ酸配列の第１３７番〜第２８１番のアミノ酸からなるポリペプチド、ヒトＣＤ４０Ｌについては配列番号５で表されるアミノ酸配列の第１１３番〜第２６１番のアミノ酸からなるポリペプチド、ヒトＯＸ４０Ｌについては配列番号６で表されるアミノ酸配列の第５２番〜第１８３番のアミノ酸からなるポリペプチド、ヒトＴＲＡＩＬについては配列番号７で表されるアミノ酸配列の第９５番〜第２８１番のアミノ酸からなるポリペプチド、ヒトＲＡＮＫＬについては配列番号８で表されるアミノ酸配列の第１３６番〜第３１７番のアミノ酸からなるポリペプチド、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２６】
ヒトＴＮＦ−αの受容体はヒトＴＮＦＲ１、ヒトＴＮＦ−βの受容体はヒトＴＮＦＲ１、ヒトＬＴ−βの受容体はヒトＬＴβＲ、ヒトＦａｓＬの受容体はヒトＦａｓ、ヒトＣＤ４０Ｌの受容体はヒトＣＤ４０、ヒトＯＸ４０Ｌの受容体はヒトＯＸ４０、ヒトＴＲＡＩＬの受容体はヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）又はヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）、ヒトＲＡＮＫＬの受容体はヒトＲＡＮＫである。
【００２７】
本発明において用いる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、該ＴＮＦファミリーメンバーに対応する受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該受容体を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を刺激する活性を有する。
【００２８】
可溶性ＴＮＦ−α分子は、ＴＮＦＲ１に結合し、且つＴＮＦＲ１を介してＴＮＦＲ１を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を刺激する活性を有する。可溶性ＴＮＦ−α分子による刺激とは、具体的にはアポトーシスの誘導を意味する。
【００２９】
可溶性ＴＮＦ−β分子は、ＴＮＦＲ１に結合し、且つＴＮＦＲ１を介してＴＮＦＲ１を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を刺激する活性を有する。可溶性ＴＮＦ−β分子による刺激とは、具体的にはアポトーシスの誘導を意味する。
【００３０】
可溶性ＬＴ−β分子は、ＬＴβＲに結合し、且つＬＴβＲを介してＬＴβＲを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を刺激する活性を有する。可溶性ＬＴ−β分子による刺激とは、具体的にはアポトーシスの誘導を意味する。
【００３１】
可溶性ＦａｓＬ分子は、Ｆａｓに結合し、且つＦａｓを介してＦａｓを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を刺激する活性を有する。可溶性ＦａｓＬ分子による刺激とは、具体的にはアポトーシスの誘導を意味する。
【００３２】
可溶性ＣＤ４０Ｌ分子は、ＣＤ４０に結合し、且つＣＤ４０を介してＣＤ４０を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を刺激する活性を有する。可溶性ＣＤ４０Ｌ分子による刺激とは、具体的には細胞（例えば、Ｂ細胞）の増殖の促進を意味する。
【００３３】
可溶性ＯＸ４０Ｌ分子は、ＯＸ４０に結合し、且つＯＸ４０を介してＯＸ４０を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を刺激する活性を有する。可溶性ＯＸ４０Ｌ分子による刺激とは、具体的には細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）の増殖の促進を意味する。
【００３４】
可溶性ＴＲＡＩＬ分子は、ＤＲ４又はＤＲ５に結合し、且つＤＲ４又はＤＲ５を介してＤＲ４又はＤＲ５を発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を刺激する活性を有する。可溶性ＴＲＡＩＬ分子による刺激とは、具体的にはアポトーシスの誘導を意味する。
【００３５】
可溶性ＲＡＮＫＬ分子は、ＲＡＮＫに結合し、且つＲＡＮＫを介してＲＡＮＫを発現する細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を刺激する活性を有する。可溶性ＲＡＮＫＬ分子による刺激とは、具体的には細胞死阻害活性または分化の誘導を意味する。
【００３６】
アポトーシス誘導活性は、例えば、後述の実施例２に記載されたように、１μｇ／ｍｌの濃度で可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を含む培地中で、対応するＴＮＦファミリーメンバーの受容体を発現する細胞を２４時間培養し、培養細胞をアネキシンＶに特異的な抗体及びプロピジウムイオダイドで染色し、アポトーシス細胞（アネキシンＶ陽性、ＰＩ陰性）の割合をフローサイトメトリーで解析することにより、評価することができる。
【００３７】
可溶性ヒトＦａｓＬ分子のアポトーシス誘導活性を評価する場合には、例えばヒトＦａｓを発現するＪｕｒｋａｔ細胞が好適に用いられる。可溶性ヒトＴＮＦ−α分子、可溶性ヒトＴＮＦ−β分子、可溶性ヒトＬＴ−β分子および可溶性ヒトＴＲＡＩＬ分子のアポトーシス誘導活性を評価する場合には、例えばこれらの分子の受容体を発現するマウスＬ−９２９細胞が好適に用いられる。
【００３８】
可溶性ＣＤ４０Ｌによる細胞増殖促進活性は、例えば、ＷＯ２００２／０８８１８６に記載されているように、１μｇ／ｍｌの濃度で可溶性ＣＤ４０Ｌを含む培地中で、ＣＤ４０を発現する哺乳動物細胞を３日間培養し、［３Ｈ］チミジンの取り込みにより、細胞の増殖を測定することにより、評価することができる。例えば、可溶性ヒトＣＤ４０Ｌ分子の細胞増殖促進活性を評価する場合には、ヒトＣＤ４０を発現するヒト扁桃腺Ｂ細胞が好適に用いられる。
【００３９】
可溶性ＯＸ４０Ｌによる細胞増殖促進活性は、例えば、Mol. Immunol. 44, 3112-3121, 2007に記載されているように、０．１μｇ／ｍｌの濃度で可溶性ＯＸ４０Ｌを含む培地中で、ＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体刺激下で２日間培養し、［３Ｈ］チミジンの取り込みにより、抗ＣＤ３抗体刺激によるＣＤ４＋Ｔ細胞の可溶性ＯＸ４０Ｌの添加による増殖の促進を測定することにより、評価することができる。例えば、可溶性ヒトＯＸ４０Ｌ分子の細胞増殖促進活性を評価する場合には、ヒトＯＸ４０を発現するヒト末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ−２及びＰＨＡで２日間刺激することにより得られるヒト活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞が好適に用いられる（Mol. Immunol. 44, 3112-3121, 2007）。
【００４０】
可溶性ＲＡＮＫＬ分子による細胞死阻害活性は、例えば、J. Exp. Med., 186:2075(1997) に記載されているように、１μｇ／ｍｌの濃度で可溶性ＲＡＮＫＬを含む培地中で、樹状細胞を２日間培養し、生存細胞数の比率に基づき、樹状細胞の自発的な細胞死に対する可溶性ＲＡＮＫＬの添加による阻害効果を測定することにより、評価することが出来る。可溶性ヒトＲＡＮＫＬ分子の細胞死阻害活性を評価する場合には、J. Immunol. Methods 196: 121-135(1996)に記載された方法により得ることができるヒト末梢ＣＤ１４＋単球由来の樹状細胞が好適に用いられる。
【００４１】
本発明の複合体に含まれるＴＮＦファミリーメンバー分子は、可溶性である。「可溶性」とは、２０℃にて、精製水１ｃｃに０．１μｇ以上溶解可能であることをいう。
【００４２】
本発明の複合体に含まれる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、単離又は精製された分子である。「単離」又は「精製」とは、目的とする対象物以外のものを除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製された可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子に含まれる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子の純度（全タンパク質重量に対する可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子の重量割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば、１００％）である。従って、本発明の複合体に含まれる腫瘍細胞内に存在する遺伝子から発現した可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、「単離又は精製された可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子」には含まれない。即ち、本発明の複合体に含まれる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、該複合体に含まれる前に、該腫瘍細胞外に該腫瘍細胞とは独立に存在する分子である。
【００４３】
ＴＮＦファミリーメンバー分子は、一般に、単量体よりも多量体の方が対応する受容体への結合活性が高く、その結果生理活性が強くなることが知られている。従って、本発明に用いる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は多量体化されていることが好ましい。多量体化とは、２以上の分子が会合することを意味する。ＴＮＦファミリーメンバー分子の多量体に含まれるＴＮＦファミリーメンバー分子の分子数は、該ＴＮＦファミリーメンバーに対応する受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該受容体を発現する細胞を刺激する活性を有する限り限定されないが、通常２〜８個、好ましくは２〜４個である。ＴＮＦファミリーメンバー分子が多量体化されているか否か、及び多量体に含まれるＴＮＦファミリーメンバー分子の数は、ＴＮＦファミリーメンバー分子を適切な水性緩衝液に溶解し、ゲルろ過により分離することにより決定することが出来る。
【００４４】
得られるＴＮＦファミリーメンバー分子の多量体が、該ＴＮＦファミリーメンバーに対応する受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該受容体を発現する細胞を刺激する活性を有する限り、多量体化の様式は特に限定されない。
【００４５】
例えば、ＴＮＦファミリーメンバーは、天然では、細胞膜上において三量体として存在し、ＴＮＦ−α等については、特異的なプロテアーゼ（ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ））による切断により生成される可溶型も三量体として存在することが知られている。従って、一態様において、ＴＮＦファミリーメンバー分子の多量体化は、ＴＮＦファミリーメンバーの有する生来の多量体化能に基づくものである。
【００４６】
また別の態様において、本発明において用いられる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片に加えて多量体化能を有する領域（以下、多量体化領域と言う）を含み、その多量体化能に基づき多量体化される。このような多量体化領域としては、多量体化能を有するポリペプチド、核酸などの化合物を利用することができる。多量体化領域は、好ましくは多量体化能を有するポリペプチドである。多量体化能を有するポリペプチドとしては、ロイシンジッパー（二量体）、Coiled-Coilドメイン（二量体）、コラーゲン（三量体）、ヘムアグルチニン（三量体）、オルニチントランスカルバミラーゼ（三量体）、アビジン（四量体）、ストレプトアビジン（四量体）、ｄｎａＢヘリカーゼ（六量体）、ヘモシアニン（六量体）、ヘムエリスリン（八量体）、ACRP30若しくはACRP30様タンパク質(W096/39429、WO 99/10492、WO 99/59618、WO 99/59619、WO 99/64629、WO 00/26363、WO 00/48625、WO 00/63376、WO 00/63377、WO 00/73446、WO 00/73448又はWO 01/32868)、apMl(Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 221: 286-9,1996)、Clq(Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-90,1991)あるいはClq様タンパク質(WO 01/02565)のような、コレクチンファミリーのポリペプチド、Carilage Matrix Protein (CMP) (Beck & al., 1996, J. Mol. Biol., 256,909-923)のような、「コイルドコイル」ドメイン(Kammerer RA, Matrix Biol 1997 Mar;15(8-9):555-65; discussion 567-8、Lombardi & al., Biopolymers 1996;40(5):495-504; http://mdl.ipc.pku.edu.cn/scop/data/scop.1.008.001.html)を含むポリペプチド、コラーゲンリピートのストレッチ（US2008003226）等が挙げられるが、これらに限定されない。多量体化能を有するポリペプチドは、好ましくはロイシンジッパー、アビジン又はストレプトアビジンであり、より好ましくはアビジン又はストレプトアビジンである。アビジン及びストレプトアビジンは、多量体化能と、ビオチン化された腫瘍細胞の表面に強く結合する活性とを併せ持つため、本発明に好適に用いられる。
【００４７】
ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片と多量体化領域との連結の態様は、本発明の複合体を形成した際に、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片と多量体化領域とが分離しない様式で連結されている限り限定されないが、例えば、ペプチド結合やジスルフィド結合などの共有結合、或いは水素結合、疎水結合、イオン結合などの非共有結合により両者が連結される。結合の安定性の観点から、両者は好ましくは共有結合（例、ペプチド結合）により連結される。これらの結合様式による両者の連結は当業者であれば適宜なし得るものである。
【００４８】
多量体化領域として多量体化能を有するポリペプチドを用いる場合、本発明において用いられる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、好ましくは、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片及び多量体化能を有するポリペプチド残基を含む融合タンパク質である。該融合タンパク質における、多量体化能を有するポリペプチド残基の位置は、該融合タンパク質が、該ＴＮＦファミリーメンバーに対応する受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該受容体を発現する細胞を刺激する活性を有する限り、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片のＮ末端側又はＣ末端側のいずれの位置でもよいが、好ましくはＮ末端側である。
【００４９】
該融合タンパク質におけるＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片と多量体化能を有するポリペプチド残基との距離は、該融合タンパク質が、該ＴＮＦファミリーメンバーに対応する受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該受容体を発現する細胞を刺激する活性を有する限り特に限定されない。しかしながら、合成の容易及びタンパク質の安定性の観点から、該距離は短いほど好ましく、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片と多量体化能を有するポリペプチド残基とは、例えば約１〜１００アミノ酸（好ましくは約１〜５０アミノ酸、より好ましくは約１〜２５アミノ酸、更に好ましくは約１〜１０アミノ酸）からなるリンカーポリペプチド残基又は結合手を介して連結されていることが好ましい。該リンカーポリペプチド残基のアミノ酸配列は、該融合タンパク質が、該ＴＮＦファミリーメンバーに対応する受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該受容体を発現する細胞を刺激する活性を有する限り、特に限定されない。
【００５０】
好適な融合タンパク質の１例として、US7238360、US2009074870、Circulation. 2003; 107: 1525-1531、Mol Immunol. 2007; 44(11): 2884-2892、及びImmunity. 2002; 17: 795-808（これらは全て引用により本明細書に組み込まれる）に開示された、四量体を形成し得る、アビジン又はストレプトアビジン及びＦａｓＬの細胞外領域を含む融合タンパク質が挙げられる。また、別の好適な可溶性ＦａｓＬの多量体が、US2008003226（引用により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００５１】
本発明の複合体に含まれる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、該複合体中に含まれる腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得るように、本発明の複合体中に含まれる腫瘍細胞の表面上に結合する。従って、好ましい態様において、本発明の複合体に含まれる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分を含む。腫瘍細胞表面上の分子と、該分子に親和性を有する部分との組み合わせの例を表２に示すが、これらに限定されない。
【００５２】
【表２】
2012020842.tif 000003
【００５３】
腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分は、好ましくは、腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチドである。腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチドは、好ましくは、アビジン又はストレプトアビジンである。アビジン及びストレプトアビジンは、上記の多量体化能と、ビオチン化された腫瘍細胞の表面に強く結合する活性とを併せ持つため、本発明に好適に用いられる。
【００５４】
ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片と腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分との連結の態様は、本発明の複合体を形成した際に、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片と腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分とが分離しない様式で連結され、且つ可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得る限り限定されないが、例えば、ペプチド結合やジスルフィド結合などの共有結合、或いは水素結合、疎水結合、イオン結合などの非共有結合により両者は連結される。結合の安定性の観点から、両者は好ましくは共有結合（例、ペプチド結合）により連結される。これらの結合様式による両者の結合は当業者であれば適宜なし得るものである。
【００５５】
腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分として腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチドを用いる場合、本発明において用いられる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、好ましくは、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片及び腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基を含む融合タンパク質である。該融合タンパク質における、腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基の位置は、該融合タンパク質が該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得る限り、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片のＮ末端側又はＣ末端側のいずれの位置でもよいが、好ましくはＮ末端側である。
【００５６】
該融合タンパク質における、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片と腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基との距離は、該融合タンパク質が該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得る限り、特に限定されない。しかしながら、合成の容易及びタンパク質の安定性の観点から、該距離は短いほど好ましく、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片と腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基とは、例えば約１〜１００アミノ酸（好ましくは約１〜５０アミノ酸、より好ましくは約１〜２５アミノ酸、更に好ましくは約１〜１０アミノ酸）からなるリンカーポリペプチド残基又は結合手を介して連結されていることが好ましい。該リンカーポリペプチド残基のアミノ酸配列は、該融合タンパク質が該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得る限り、特に限定されない。
【００５７】
好適な融合タンパク質の１例として、US7238360、US2009074870、Circulation. 2003; 107: 1525-1531、Mol Immunol. 2007; 44(11): 2884-2892、及びImmunity. 2002; 17: 795-808（これらは全て引用により本明細書に組み込まれる）に開示された、四量体を形成し得る、アビジン又はストレプトアビジン及びＦａｓＬの細胞外領域を含む融合タンパク質が挙げられる。
【００５８】
好ましい態様において、本発明において用いられる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片、多量体化能を有するポリペプチド残基、及び腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基を含む融合タンパク質である。該融合タンパク質における、３つの構成因子の位置関係は、該融合タンパク質が該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得る限り、特に限定されないが、好ましくは、Ｎ末端側から、腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基、多量体化能を有するポリペプチド残基、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片の順序で、これらの構成要素が融合タンパク質に含まれる。
【００５９】
この場合、多量体化能を有するポリペプチド残基と腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基との距離は、該融合タンパク質が該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得る限り、特に限定されない。しかしながら、合成の容易、タンパク質の安定性の観点から、該距離は短いほど好ましく、多量体化能を有するポリペプチド残基と腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基とは、例えば約１〜１００アミノ酸（好ましくは約１〜５０アミノ酸、より好ましくは約１〜２５アミノ酸、更に好ましくは約１〜１０アミノ酸）からなるリンカーポリペプチド残基又は結合手を介して連結されていることが好ましい。該リンカーポリペプチド残基のアミノ酸配列は、該融合タンパク質が該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得る限り、特に限定されない。また、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片と、多量体化能を有するポリペプチド残基との距離は、上述の通りである。
【００６０】
尚、上述の様に、アビジン及びストレプトアビジンは、多量体化能と、ビオチン化された腫瘍細胞の表面に強く結合する活性とを併せ持つため、１つのアビジン又はストレプトアビジンの残基で、多量体化能を有するポリペプチド残基と、腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基の両方の機能を担うことが出来る。従って、最も好ましい態様において、本発明に用いられる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片、及びアビジン又はストレプトアビジンのポリペプチド残基を含む、融合タンパク質である。該融合タンパク質における、アビジン又はストレプトアビジンの残基の位置は、該融合タンパク質が該腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得る限り、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片のＮ末端側又はＣ末端側のいずれの位置でもよいが、好ましくはＮ末端側である。この融合タンパク質の好適な１例として、US7238360、US2009074870、Circulation. 2003; 107: 1525-1531、Mol Immunol. 2007; 44(11): 2884-2892、及びImmunity. 2002; 17: 795-808（これらは全て引用により本明細書に組み込まれる）に開示された、アビジン又はストレプトアビジン及びＦａｓＬの細胞外領域を含む融合タンパク質が挙げられる。
【００６１】
本発明において用いられる、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子はまた、腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得る限り、任意のアミノ酸配列を、そのＮ末端及び／又はＣ末端に含んでいてもよい。そのようなアミノ酸配列としては、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子の精製又は検出のためのアフィニティータグを挙げることができる。そのようなアフィニティータグは、当該分野で周知であり、例えば、ＦＬＡＧペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6: 1204 (1988))、ｃ−Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｃタグ、ＨＡタグ等を例示することが出来る。
【００６２】
可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、種々の公知の方法により取得することができる。例えばＴＮＦファミリーメンバー分子を天然に発現するヒト、ラット、マウスなどの哺乳動物の組織、細胞、又は培養上清から自体公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて単離・精製する方法；ペプチド・シンセサイザー等を使用する自体公知のペプチド合成方法で化学的に合成する方法；可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を作製し培養する方法；あるいは、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子をコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成する方法等によって取得することができる。
【００６３】
ＴＮＦファミリーメンバー分子を天然に発現する哺乳動物の組織又は細胞から上記ポリペプチドを調製する場合、該組織又は細胞をホモジナイズした後、酸、又はアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を自体公知のタンパク質分離技術（例：塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等）に付すことにより単離・精製することができる。また培養上清からも同様にして単離・精製することができる。
【００６４】
化学的な可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子の合成は、市販のペプチド・シンセサイザーを用いることにより行うことが出来る。
【００６５】
ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて上記ポリペプチドを調製する場合、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子をコードするポリヌクレオチドを取得し、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該ポリペプチドを製造することができる。例えば、Molecular Cloning, 2nd ed.; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989) に記載の方法などを参照のこと。可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子をコードするポリヌクレオチドは、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分を構成する上述の各構成要素（ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片、多量体化能を有するポリペプチド残基及び腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有するポリペプチド残基）をコードするポリヌクレオチドを、リガーゼなどの適切な酵素を用いて公知の遺伝子組換え技術により連結することにより、製造することが出来る。可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を構成する各構成要素をコードするポリヌクレオチドは、それぞれの公知の配列情報や本明細書の配列表に記載された配列情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、各構成要素をコードするＤＮＡクローン等を鋳型として用い、ＰＣＲによって直接増幅することができる。或いは、配列情報に基づいて、ポリヌクレオチド合成装置により各構成要素をコードするポリヌクレオチドを合成してもよい。
【００６６】
取得されたポリヌクレオチドは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ポリヌクレオチドはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。また、効率的に細胞外へ可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を分泌させるため、分泌タンパク質（例、ＩＬ−４等）のシグナル配列を５’末端に付加してもよい。このようなシグナル配列は当業者に周知であり、当業者であれば適宜選択することが出来る。これらの翻訳開始コドン、翻訳終止コドン及びシグナル配列は、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
【００６７】
得られたポリヌクレオチドを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を発現し得る発現ベクターを製造することができる。発現ベクターの種類は、使用する宿主に応じて適宜選択することが出来る。そして、当該発現ベクターを自体公知の遺伝子導入法（例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロプラスト融合法、エレクトロポレーション法、DEAEデキストラン法、Gene Gunによる遺伝子導入法等）に従って宿主へ導入することにより、該ベクターが導入された形質転換体を製造することができる。該形質転換体を、宿主の種類に応じて、自体公知の方法で培養し、培養物から可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を単離又は精製することにより、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を製造することが出来る。
【００６８】
無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記と同様、公知のクローニング方法により調製した上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した発現ベクター（例えば、該ＤＮＡがＴ７、ＳＰ６プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼ及び基質（ＮＴＰｓ）を含む転写反応液を用いてｍＲＮＡを合成した後、該ｍＲＮＡを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。
【００６９】
１−３．可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子と腫瘍細胞との結合
本発明の複合体においては、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得るように、該腫瘍細胞の表面上に結合している。
【００７０】
本明細書において、複合体とは、複数の構成因子が共有結合又は非共有結合することにより得られる物質を意味する。
【００７１】
可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、腫瘍細胞の表面上に結合した状態で、該腫瘍細胞以外の細胞の表面上に発現した該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体に結合し、且つ当該受容体を介して当該細胞を刺激し得るか否かは、上記（１−２．可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子）の項において詳述した、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子の活性を評価する試験において、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子に替えて、腫瘍細胞及び可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を含む複合体を用いることにより評価することが出来る。この評価においては、腫瘍細胞及び可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を含む複合体と、該ＴＮＦファミリーメンバーの受容体を発現する細胞とを、例えば１：１の細胞数の比率で混合する。
【００７２】
腫瘍細胞と可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子との結合は、結合定数が少なくとも１０７Ｍ、好ましくは１０９Ｍ以上、より好ましくは１０１２Ｍ以上となるような態様でなされる。このような結合は、ペプチド結合やジスルフィド結合などの共有結合、水素結合、疎水結合などの非共有結合から選択することができる。
【００７３】
上述のように、本発明の複合体に含まれる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が本発明の複合体に含まれる腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分を含む場合には、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子に含まれる当該親和性を有する部分が、当該腫瘍細胞表面上の分子に結合することにより、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が腫瘍細胞の表面上に結合する。腫瘍細胞表面上の分子と、該分子に親和性を有する部分との組み合わせの例を表２に示す。
【００７４】
本発明の複合体に含まれる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子の量は、該複合体が対応するＴＮＦファミリーメンバーの受容体を発現する細胞を、当該受容体を介して刺激し得る限り限定されないが、通常１個の腫瘍細胞につき、１，０００〜１００，０００個、好ましくは５，０００〜５０，０００個の可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、細胞表面上に結合している。
【００７５】
本発明の複合体は、２種類以上の異なる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を含むことができる。例えば、それぞれ異なるＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片を含む２種類以上（例えば２〜５種類、好ましくは２又は３種類）の可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が、１個の腫瘍細胞に結合される。２種類の可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を用いる場合における、ＴＮＦファミリーメンバーの組み合せとしては、例えば、ＦａｓＬ＋ＴＮＦ−α；ＦａｓＬ＋ＴＮＦ−β；ＦａｓＬ＋ＬＴ−β；ＦａｓＬ＋ＣＤ４０Ｌ；ＦａｓＬ＋ＯＸ４０Ｌ；ＦａｓＬ＋ＴＲＡＩＬ；ＦａｓＬ＋ＲＡＮＫＬ；ＴＮＦ−α＋ＴＮＦ−β；ＴＮＦ−α＋ＬＴ−β；ＴＮＦ−α＋ＣＤ４０Ｌ；ＴＮＦ−α＋ＯＸ４０Ｌ；ＴＮＦ−α＋ＴＲＡＩＬ；ＴＮＦ−α＋ＲＡＮＫＬ；ＴＮＦ−β＋ＬＴ−β；ＴＮＦ−β＋ＣＤ４０Ｌ；ＴＮＦ−β＋ＯＸ４０Ｌ；ＴＮＦ−β＋ＴＲＡＩＬ；ＴＮＦ−β＋ＲＡＮＫＬ；ＬＴ−β＋ＣＤ４０Ｌ；ＬＴ−β＋ＯＸ４０Ｌ；ＬＴ−β＋ＴＲＡＩＬ；ＬＴ−β＋ＲＡＮＫＬ；ＣＤ４０Ｌ＋ＯＸ４０Ｌ；ＣＤ４０Ｌ＋ＴＲＡＩＬ；ＣＤ４０Ｌ＋ＲＡＮＫＬ；ＯＸ４０Ｌ＋ＴＲＡＩＬ；ＯＸ４０Ｌ＋ＲＡＮＫＬ；ＴＲＡＩＬ＋ＲＡＮＫＬ等が挙げられる。３種類の可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を用いる場合における、ＴＮＦファミリーメンバーの組み合せとしては、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ及びＲＡＮＫＬからなる群から選択される任意の３種類の可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子の組み合わせが挙げられるが、後述の実施例６に示すように転移抑制効果が高いことから、ＦａｓＬ＋ＴＮＦ−α＋ＯＸ４０Ｌが好ましい。各可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子の腫瘍細胞への結合はそれぞれ異なる様式であっても同じ様式であってもよいが、本発明の複合体の効率的な製造の観点から、同じ様式であることが好ましい。例えば、一態様として、本発明の複合体に含まれる全ての可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子は、ＴＮＦファミリーメンバーの細胞外領域又はその機能的断片、及びアビジン又はストレプトアビジンのポリペプチド残基を含む、融合タンパク質であり、該融合タンパク質が該複合体に含まれる腫瘍細胞表面上のビオチンに結合する。２種類以上の異なる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を組み合わせて用いる場合、本発明の複合体に含まれる各可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子の量は、該複合体がそれぞれのＴＮＦファミリーメンバーに対応する受容体を発現する細胞を、当該受容体を介して刺激し得る限り、特に限定されない。このように２種類以上の異なる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を組み合わせて用いると、異なるＴＮＦファミリーメンバーの受容体を発現する細胞を同時に刺激することができるため、１種類の可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子のみを用いた場合よりも多種類の細胞に作用することができる。２種類以上の異なる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を組み合わせて用いると、１種類の可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子のみを用いた場合と比較して、（１）投与量を軽減することができる、（２）治療効果の持続を図ることができる、（３）相乗効果が得られ���、等の優れた効果が期待できる。
【００７６】
本発明の複合体は、腫瘍細胞と、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子とを、水性緩衝液中で混合し、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を腫瘍細胞の表面へ結合させることにより、製造することが出来る。ここで、水性緩衝液としては、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を製造する際に用いた宿主細胞の培養上清、腫瘍細胞を培養するための細胞培養液又はリン酸緩衝液等があげられるが、これらに限定されない。
【００７７】
また腫瘍細胞と可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子との混合比は、得られる本発明の複合体が、対応するＴＮＦファミリーメンバーの受容体を発現する細胞を、当該受容体を介して刺激し得る限り限定されないが、例えば１個の腫瘍細胞当り、１，０００個以上、５，０００個以上、１０，０００個以上、５０，０００個以上、好ましくは１００，０００個以上の可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が混合される。
【００７８】
腫瘍細胞は、生存した状態又は死滅した状態で、本発明の複合体の製造に用いられる。生存した状態の腫瘍細胞には、個体から摘出した腫瘍組織、腫瘍組織から単離された腫瘍細胞、これらの腫瘍組織又は腫瘍細胞を継代して得られた腫瘍細胞、継代した又は継代していない腫瘍組織又は腫瘍細胞を放射線照射で処理したもの等が含まれる。死滅した状態の腫瘍細胞としては、固定された腫瘍組織又は腫瘍細胞、凍結保存された腫瘍組織又は腫瘍細胞等が含まれる。
【００７９】
放射線照射による処理を行なう場合、腫瘍細胞の増殖を阻止するのに十分かつ適切な線量が、腫瘍細胞の種類、試料の状態に応じて選択される。例えば放射線に対する感受性の高い腫瘍細胞に対しては２０〜４０Ｇｙの線量を、感受性の低い腫瘍細胞に対しては７０Ｇｙ以上の線量を照射し得る。放射線には、Ｘ線、γ線、重粒子線、陽子線等が含まれる。
【００８０】
腫瘍細胞の固定は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒドなどのアルデヒド系の固定液、ピクリン酸、タンニン酸、オスミウム酸などの酸を含む固定液、塩化第二水銀、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの金属塩を含む固定液、メタノール、エタノール、アセトンなどの脱水剤系の固定液を用いて、公知の方法により行なうことができる。中でも、腫瘍細胞に含まれる抗原の立体構造を維持する観点から、アルデヒド系の固定液を用いるアルデヒド処理が好ましく、特にパラホルムアルデヒドを用いることが好ましい。このような腫瘍細胞の固定の方法は当業者に周知である。
【００８１】
凍結保存を行なう場合、細胞を培地などの溶媒に懸濁し、耐凍性容器に分注し、０℃以下、好ましくは−２０℃以下、特に好ましくは−７０℃以下で凍結する。また腫瘍細胞を含む組織、例えば個体から摘出した組織を凍結により固定する場合には、耐凍性容器に入れ、凍結用包埋材と共に、又はそのまま凍結する。凍結は、急速凍結装置、加圧凍結装置などの市販の装置を用いて行なうことができる。
【００８２】
本発明の複合体に含まれる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が本発明の複合体に含まれる腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分を含む場合には、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子に含まれる当該親和性を有する部分が、当該腫瘍細胞表面上の分子に結合することにより、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が腫瘍細胞の表面上に結合する。
【００８３】
腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分としてアビジン又はストレプトアビジンを用いる場合には、腫瘍細胞の表面を予めビオチン化することが好ましい。腫瘍細胞の表面のビオチン化は、例えば、Sulfo-NHS-biotin（Pierce社製）等のビオチン化試薬で、腫瘍細胞の表面を処理することにより行うことが出来る。
【００８４】
本発明の複合体に含まれる可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子が本発明の複合体に含まれる腫瘍細胞表面上の分子に親和性を有する部分を含まない場合には、化学架橋等の方法を用いることにより、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を腫瘍細胞の表面に結合することが出来る。例えば、Sulfo-NHS-Diazirine（Pierce社製）等の光反応性架橋剤を用いることで、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を腫瘍細胞の表面に共有結合させることができる。
【００８５】
腫瘍細胞の表面への可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子の結合は、上記ビオチン-ストレプトアビジン相互作用や化学架橋等の手段に応じて、使用する試薬の製造者の提供するプロトコールに従って、又は自体公知の反応条件で、達成することができる。特に、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用は非常に強いため、このような相互作用を利用すれば、例えば４℃で５分間、ローテーター等で穏やかに撹拌するだけで、腫瘍細胞−可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子複合体を得ることができる。
【００８６】
可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を腫瘍細胞の表面へ結合させた後に、得られた複合体を適切な緩衝液等で洗浄し、未反応の可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を除去することにより、本発明の複合体を単離又は精製することが出来る。単離又は精製された本発明の複合体に含まれる当該複合体の純度（全タンパク質重量に対する当該複合体のタンパク質重量の割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば、１００％）である。
【００８７】
本発明の複合体は、固定されていることが好ましい。本発明の複合体を固定することにより、腫瘍ワクチン効果が高まるためである。本発明の複合体の固定は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒドなどのアルデヒド系の固定液、ピクリン酸、タンニン酸、オスミウム酸などの酸を含む固定液、塩化第二水銀、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの金属塩を含む固定液、メタノール、エタノール、アセトンなどの脱水剤系の固定液を用いて、公知の方法により行なうことができる。中でも、腫瘍細胞に含まれる抗原の立体構造を維持する観点から、アルデヒド系の固定液を用いるアルデヒド処理が好ましく、特にパラホルムアルデヒドを用いることが好ましい。このような腫瘍細胞の固定の方法は当業者に周知である。
【００８８】
２．本発明の複合体の用途
本発明の複合体を用いれば、腫瘍細胞に対する特異的な免疫反応を活性化させることが可能となる。従って、本発明の複合体を腫瘍ワクチンとして投与することにより、該患者における腫瘍細胞に対する免疫反応を活性化させ、腫瘍を治療又は予防し、腫瘍細胞の転移を抑制し、或いは腫瘍の再発を予防することが可能である。
【００８９】
腫瘍の種類は、特に限定されないが、例えば、固形腫瘍（例、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍）、造血組織における腫瘍である。より詳細には、固形腫瘍としては、例えば、消化器癌（例、胃癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌）、肺癌（例、小細胞癌、非小細胞癌）、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌（例、子宮内膜癌、子宮頚癌）、骨癌、皮膚癌、肉腫（例、カポシ肉腫）、黒色腫、芽細胞腫（例、神経芽細胞腫）、腺癌、扁平細胞癌、非扁平細胞癌、脳腫瘍が挙げられる。造血組織における腫瘍としては、白血病（例、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性リンパ球性白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、成人Ｔ細胞白血病（ATL）、骨髄異形成症候群（MDS））、リンパ腫（例、Ｔリンパ腫、Ｂリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、骨髄腫（多発性骨髄腫）が挙げられる。
【００９０】
本発明の複合体を腫瘍ワクチンとして使用する場合は、常套手段に従って医薬組成物として製剤化することができる。本発明の複合体は低毒性であり、そのまま液剤として、又は適当な剤形の医薬組成物として、哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒト等）に対して経口的又は非経口的（例、血管内投与、皮下投与等）に投与することができる。本発明の複合体は、通常、非経口的に投与される。
【００９１】
好ましい態様において、本発明の複合体に含まれる腫瘍細胞は、投与対象の個体から分離されたものである。例えば、腫瘍患者から手術やバイオプシーにより、該患者に含まれる腫瘍組織や腫瘍細胞の一部を分離し、これを用いて、本発明の複合体を製造する。そして、この複合体を同一の腫瘍患者に投与することにより、この腫瘍細胞に対する特異的な免疫反応が活性化され、この免疫反応が該患者中の腫瘍細胞を攻撃することにより、該患者中の腫瘍が縮小又は消失し、或いは腫瘍細胞が他の部位に転移するのを抑制することができる。患者が腫瘍を有するか否か、及び腫瘍の縮小又は消失は、内視鏡検査、Ｘ線検査、ＣＴ検査、超音波検査、ＭＲＩ検査等の画像診断、細胞診、血液検査、触診など、当分野において公知の方法によって判断され得る。
【００９２】
また、別の好ましい態様としては、外科的手術、化学療法、放射線療法等の治療により、腫瘍が縮小又は消失したと判断された患者（腫瘍の罹患歴を有する患者）に、その治療前、あるいはその治療の過程で当該患者から分離された腫瘍細胞を含む本発明の複合体が投与される。この投与により、この腫瘍細胞に対する特異的な免疫反応が活性化され、当該患者の体内に残存する可能性がある腫瘍細胞（例えば、微小転移）を排除することができるので、治療の対象となった腫瘍が生体内の同じ又は近傍の部位で再発するのを抑制し、腫瘍細胞が他の部位に転移して増殖するのを抑制することができる。
【００９３】
本発明の腫瘍ワクチンは、その有効成分である本発明の複合体自体を投与しても良いし、又は適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、上記本発明の複合体と薬学的に許容され得る担体を含むものが挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤などが添加され得る。賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトールなどの糖類、でんぷん類、結晶セルロースなどのセルロース類などの有機系賦形剤、炭酸カルシウム、カオリンなどの無機系賦形剤などが、結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが、滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸塩などの脂肪酸塩、タルク、珪酸塩類などが、溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが、崩壊剤としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、化学修飾されたセルロースやデンプン類などが、溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが、懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが、等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素などが、安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のアミノ酸類などが、無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどが、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが、抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが、矯味矯臭剤としては、医薬分野などにおいて通常に使用される甘味料、香料などが、着色剤としては、医薬分野などにおいて通常に使用される着色料が挙げられる。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
【００９４】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈剤に成分溶解させた液剤、成分を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に成分を懸濁させた懸濁液剤、成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００９５】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入等）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤が挙げられ、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。これらの製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容可能な担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存してもよい。
【００９６】
また本発明の医薬組成物は、本発明の複合体及び上記他の成分の他、さらにその使用目的に応じた活性成分を含んでもよい。活性成分としては、免疫賦活剤（アジュバント）などが挙げられる。免疫賦活剤としては水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、カルボキシルビニルポリマー等の沈降性アジュバント、パラフィンとアラセルの混合物である不完全フロイントアジュバント、この不完全フロイントアジュバントに死滅したバクテリア、結核菌等の死菌を加えた完全フロイントアジュバント等の油性アジュバントがあるが、これらに限定されない。
【００９７】
医薬組成物中には有効量の本発明の複合体が含まれる。医薬組成物中の本発明の複合体の含有量は、通常、医薬組成物全体の約０．１〜１００重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
【００９８】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００９９】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。また本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【実施例】
【０１００】
実施例１：ストレプトアビジン−ＦａｓＬ融合タンパク質（ＳＡＦａｓＬ）の調製
（１）放線菌（独立行政法人製品評価技術基盤機構  生物遺伝資源部門より入手）よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法を用いてストレプトアビジン（ＳＡ）をコードする遺伝子を増幅し単離した。一方、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株（American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）より入手）よりメッセンジャーＲＮＡを抽出し、それを鋳型にしてｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲ法を用いて、ヒトＦａｓＬの細胞外領域をコードするｃＤＮＡ領域、及びヒトインターロイキン４（ＩＬ−４）のシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ領域を増幅し単離した。
（２）増幅したＤＮＡ断片を遺伝子組み換え技術を用いて連結し、ＩＬ−４シグナルペプチド、ＳＡ、及びＦａｓＬ細胞外領域がＮ末端からこの順番で連結された分泌型ＳＡＦａｓＬをコードするキメラ遺伝子を構築した。
（３）構築したキメラ遺伝子を（pCDNA3、Invitrogen社）に組み込んで得られた発現ベクターを、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣより入手）に一過性に導入した。細胞を１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地(シグマ社)  で、５％ＣＯ２、３７℃の培養条件で３日間培養した後、培養上清を回収した。
（４）培養上清中にＳＡＦａｓＬが分泌されていることをウェスタンブロットにより確認した。【０１０１】
実施例２：ＳＡＦａｓＬのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害活性
分泌されたＳＡＦａｓＬの細胞障害活性を、ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株を用いて評価した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は細胞表面にＦａｓを発現し、ＦａｓＬ又は抗Ｆａｓ抗体の結合により、アポトーシスを経て細胞死に陥ることが知られている。１ｍｌ（２．５×１０５個）のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に、３０μｌのＳＡＦａｓＬを含む実施例１で得た培養上清又は１μｇ／ｍｌの濃度になるよう抗Ｆａｓ抗体（BD Biosciences社より入手）を加え、２４時間培養した後、アポトーシスのマーカーであるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（横軸）及び死細胞を染めるＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（縦軸）で染色した。図１に示すように、抗Ｆａｓ抗体を加えた場合、アポトーシス細胞が２９％で、死細胞が２８％であるのに対し、ＳＡＦａｓＬを加えた場合、死細胞が８７％に達することが分かった。即ち、３０μｌの上清中に１μｇの抗Ｆａｓ抗体の３倍も強い細胞傷害活性があることが判明した。【０１０２】
実施例３：ＳＡＦａｓＬの腫瘍細胞表面への結合
市販のビオチン化試薬（Sulfo-NHS-Biotin、PIERCE社）を製造者のプロトコールに従って用いて、腫瘍細胞Ａ１１（千葉県がんセンターの竹永博士より分与）の表面タンパク質をビオチン化した。
ビオチン化した細胞（１×１０６個）と実施例１で得たＳＡＦａｓＬを含む培養上清（５ｍｌ）とを混合し、ローテーターで攪拌しながら、４℃で５分間反応した後、細胞を１０ｍｌの１００ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅを含む生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、未反応のＳＡＦａｓＬを除去した。
ＳＡＦａｓＬを結合させたＡ１１腫瘍細胞を、抗ＦａｓＬ抗体（BD Biosciences社）で染色した後、ＦＡＣＳでＦａｓＬの発現を確認した。
図２左に示すように、ＳＡＦａｓＬが高いレベルで発現していることが分かった。
ＳＡＦａｓＬを細胞に結合させた後、室温でローテーターで緩やかに攪拌しながら１％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定した後、１０ｍｌのＰＢＳで細胞を３回洗浄した。上記と同様にして細胞表面におけるＳＡＦａｓＬの存在量を調べたところ、固定した後２４時間経過しても、結合直後と同レベルのＳＡＦａｓＬが細胞表面に発現していることが分かった（図２右）。【０１０３】
実施例４：ＳＡＦａｓＬを細胞表面に結合した腫瘍細胞の移植後の増殖抑制
発現ベクターを用いてＦａｓＬを発現させた腫瘍細胞は、免疫学的には自己であるにもかかわらず、移植後速やかに拒絶されることが知られている（Int. J. Mol. Med. 9: 281-285 (2002)）。そこで、ＳＡＦａｓＬを結合させた腫瘍細胞が、発現ベクターによりＦａｓＬを発現させた腫瘍細胞と同様に拒絶されるかについて、Ａ１１肺がん細胞又はＢ１６メラノーマ細胞を用いて調べた。これらの腫瘍細胞はいずれもＢ６マウス起源である。
実施例３に記載の方法（但し固定は行なわなかった）により、ＳＡＦａｓＬを細胞表面に結合させたＡ１１細胞を作製した。発現ベクターによりＦａｓＬを発現させたＡ１１細胞は、Int. J. Mol. Med. 9: 281-285 (2002)に記載されたように調製した。コントロール細胞、ＳＡＦａｓＬを細胞表面に結合させた細胞、又はＦａｓＬを発現させた細胞を、Ｂ６マウス皮下に２×１０５個移植し、移植後経時的に腫瘍の大きさを測定した。図３左に示すように、ベクターを用いてＦａｓＬを発現させたＡ１１細胞は、移植後生育できずに拒絶された。これは以前得られた結果と同じである（Int. J. Mol. Med. 9: 281-285 (2002)）。一方、ＳＡＦａｓＬを結合させたＡ１１細胞は、拒絶されなかったが、コントロール細胞に比べて増殖が遅くなっていた。
同様な結果はＢ１６メラノーマ細胞（ＡＴＣＣより入手）を用いた実験でも得られた（図３右）。即ち、腫瘍に結合したＳＡＦａｓＬは、腫瘍細胞に対して一定の増殖抑制効果を発揮した。
この結果は、ＳＡＦａｓＬを細胞表面に結合させた腫瘍細胞の有用性を実証するものである。【０１０４】
実施例５：ＳＡＦａｓＬを結合させ固定したＡ１１肺がん細胞の野生型Ａ１１細胞の増殖に対するワクチン効果および転移抑制効果
実施例４に記載の通り、腫瘍細胞を固定しない場合には、ＳＡＦａｓＬの結合により腫瘍細胞の増殖は完全には抑制されない。一方、腫瘍細胞を固定すれば、腫瘍細胞の増殖能が失われる。そこで、ＳＡＦａｓＬを細胞表面に結合させた上で固定した腫瘍細胞のワクチン効果および転移抑制効果を検証した。
実施例４と同一の細胞を試験に用いた。細胞の固定は、実施例３に記載した方法により行った。２×１０５個のＳＡＦａｓＬを結合させ固定したＡ１１細胞、発現ベクターを用いてＦａｓＬを発現させたＡ１１細胞、又はコントロールとして生理食塩水を、ワクチンとしてＢ６マウスの皮下に接種した。２週間後、２×１０５個の野生型Ａ１１細胞を皮下に接種し、腫瘍の増殖および肺への転移を測定した。
図４に示すように、ＳＡＦａｓＬを結合させ固定したＡ１１細胞、発現ベクターを用いてＦａｓＬを発現させたＡ１１細胞のいずれを用いた場合においても、野生型Ａ１１細胞の増殖が抑制された。この結果は、可溶性ＦａｓＬを細胞表面に結合させ、固定した腫瘍細胞を投与することにより、発現ベクターを用いてＦａｓＬを発現させた腫瘍細胞を用いた場合と同様に、同質遺伝子的な腫瘍細胞に対する免疫反応が惹起され、この免疫反応により、ＦａｓＬを発現していない腫瘍細胞も含めて同質遺伝子的な腫瘍細胞が拒絶されることを示す。
また、驚くべきことに、図４に示すように、ＳＡＦａｓＬを結合させ固定したＡ１１細胞は、発現ベクターを用いてＦａｓＬを発現させたＡ１１細胞よりも強い抗腫瘍効果を示した。腫瘍細胞が生存した状態においては、ＳＡＦａｓＬを結合させた腫瘍細胞よりも、発現ベクターの導入によりＦａｓＬを発現させた腫瘍細胞を用いた場合の方が腫瘍の増殖が強力に抑制されたが（実施例４）、腫瘍細胞を固定することにより、発現ベクターの導入によりＦａｓＬを発現させた腫瘍細胞よりも、ＳＡＦａｓＬを結合させた腫瘍細胞のほうが抗腫瘍ワクチン効果が強くなった。この結果は、可溶性ＦａｓＬを結合させた腫瘍細胞を固定することにより、抗腫瘍ワクチン効果が強化されることを示す。
図５に示すように、ＳＡＦａｓＬを結合させ固定したＡ１１細胞、発現ベクターを用いてＦａｓＬを発現させたＡ１１細胞のいずれを用いた場合においても、野生型Ａ１１細胞の肺への転移が抑制された。この結果から、ＳＡ−ＦａｓＬを結合させ固定した腫瘍細胞が、ＦａｓＬを発現させた腫瘍細胞と同等の、高い腫瘍転移抑制効果を有することが示された。【０１０５】
実施例６：可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を結合させ固定したＡ１１肺がん細胞の野生型Ａ１１肺がん細胞の転移に対する抑制効果
既に体内に固形腫瘍又は腫瘍細胞が存在する個体において腫瘍細胞の転移抑制効果を有することは、臨床応用上重要な腫瘍ワクチンとしての特性の１つである。そこで可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を結合させ固定したＡ１１肺がん細胞について、野生型Ａ１１肺がん細胞を予め接種して固形腫瘍を形成させた個体における肺がん腫瘍細胞の肺転移に対する抑制効果を調べた。
実施例１と同様な手法により、ヒトＦａｓＬの細胞外領域、ヒトＴＮＦ−αの細胞外領域及びマウスＯＸ４０Ｌ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０３３４７８（配列番号９））の細胞外領域（５１−１９８）を用いて、それぞれストレプトアビジン−ＦａｓＬ融合タンパク質（ＳＡＦａｓＬ）、ストレプトアビジン−ＴＮＦ融合タンパク質（ＳＡＴＮＦ）及びストレプトアビジン−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質（ＳＡＯＸ４０Ｌ）を作製した。
ＴＮＦファミリーメンバー分子を結合させ固定したＡ１１肺がん細胞は、実施例３と同様な手法により、(1) ＳＡＦａｓＬ、(2) ＳＡＴＮＦ、(3) ＳＡＯＸ４０Ｌ、(4) ＳＡＦａｓＬ＋ＳＡＴＮＦ（１：１（モル比））及び(5) ＳＡＦａｓＬ＋ＳＡＴＮＦ＋ＳＡＯＸ４０Ｌ（１：１：１（モル比））を用いて作製した。また(6)コントロール上清（１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）を用いて同様に処理したＡ１１肺がん細胞をコントロール細胞とした。
肺転移抑制効果は以下の方法で調べた。Ｂ６マウスの皮下に、２×１０５個の野生型Ａ１１肺がん細胞を移植した。その７日後に、可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を結合させ固定したＡ１１肺がん細胞又はコントロール細胞（２×１０５個）を皮下に移植した。野生型Ａ１１肺がん細胞移植から２１日後に、７日後に移植したのと同じ可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を結合させ固定したＡ１１肺がん細胞又はコントロール細胞（２×１０５個）を再度皮下に移植した。野生型Ａ１１肺がん細胞移植から２９日後、肺を摘出し、腫瘍をカウントした。
図６に示すように、ＳＡＦａｓＬ又はＯＸ４０Ｌを単独で細胞表面に結合させた腫瘍細胞を移植した場合、コントロール細胞の場合と比べて肺の腫瘍数が少なかった。ＳＡＦａｓＬ、ＳＡＴＮＦ及びＳＡＯＸ４０Ｌを組み合わせて細胞表面に結合させた腫瘍細胞を移植した場合には、肺の腫瘍数は更に少なかった。これらの結果から、ＴＮＦファミリーメンバーが、ＦａｓＬ単独、ＯＸ４０Ｌ単独、又はＦａｓＬ、ＴＮＦ−α及びＯＸ４０Ｌの組み合わせである場合に、特に高い腫瘍転移抑制効果が得られることが示された。尚、本実験系は腫瘍転移抑制効果が現れにくい系であることから、本実験系で腫瘍転移抑制効果が確認されない場合であっても、使用した可溶性ＴＮＦファミリーメンバー分子を結合させた腫瘍細胞の臨床上の有効性が否定されるものではない。一方、上記腫瘍転移抑制効果が確認されたことから、本発明の複合体（特に、ＴＮＦファミリーメンバーが、ＦａｓＬ単独、ＯＸ４０Ｌ単独、又はＦａｓＬ、ＴＮＦ−α及びＯＸ４０Ｌの組み合わせである複合体）が臨床上も腫瘍転移抑制効果を示すことが強く示唆される。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明の複合体は、迅速かつ安定的に調製することができるため、種々の腫瘍に対する有効な治療剤及び再発予防剤を腫瘍患者に迅速に提供することができる。また本発明の複合体は、このような腫瘍ワクチンの製造を可能とする。【０１０７】
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本出願は日本で出願された特願２０１０−１８１３９４（出願日：２０１０年８月１３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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