(57)【要約】  発酵原料と、化学品と、菌体、微生物または培養細胞とを含む発酵液を、分離膜でろ過し、ろ液から化学品を回収し、さらに、未ろ過液を発酵液に保持または還流し、かつ、発酵原料を発酵液に追加する連続発酵による化学品の製造方法であって、分離膜として、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる多孔性中空糸膜であって、平均孔径が０．００１μｍ以上１０．０μｍ以下、５０ｋＰａ、２５℃における純水透過係数が０．５ｍ３／ｍ２／ｈｒ以上１５ｍ３／ｍ２／ｈｒ以下、破断強度が５ＭＰａ以上２０ＭＰａ以下、破断伸度が３０％以上２００％未満、捲縮度が１．３以上２．５以下、空孔率が４０％以上、臨界表面張力が４５ｍＮ／ｍ以上７５ｍＮ／ｍ以下である多孔性中空糸膜を使用することによって、高い物質生産性を維持する連続発酵法による化学品の製造方法を提供する。
2011093241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵原料と、化学品と、菌体、微生物または培養細胞とを含む発酵液を、分離膜でろ過し、ろ液から化学品を回収し、さらに、未ろ過液を発酵液に保持または還流し、かつ、発酵原料を発酵液に追加する連続発酵による化学品の製造方法であって、分離膜として、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる多孔性中空糸膜であって、平均孔径が０．００１μｍ以上１０．０μｍ以下、５０ｋＰａ、２５℃における純水透過係数が０．５ｍ３／ｍ２／ｈｒ以上１５ｍ３／ｍ２／ｈｒ以下、破断強度が５ＭＰａ以上２０ＭＰａ以下、破断伸度が３０％以上２００％未満、捲縮度が１．３以上２．５以下、空孔率が４０％以上、臨界表面張力が４５ｍＮ／ｍ以上７５ｍＮ／ｍ以下である多孔性中空糸膜を使用することを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項２】
前記多孔性中空糸膜の表面がエチレンビニルアルコール共重合体により被覆されていることを特徴とする、請求項１に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項３】
前記多孔性中空糸膜が、エチレンビニルアルコール共重合体と、ポリフッ化ビニリデンに不活性であり、エチレンビニルアルコール共重合体を溶解する溶剤とを含むエチレンビニルアルコール共重合体溶液に、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる多孔性中空糸膜を含浸後、乾燥処理されたものであることを特徴とする、請求項１または２に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項４】
前記発酵原料が、糖類を含む請求項１〜３のいずれかに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項５】
前記化学品が、有機酸またはアルコールまたは核酸である請求項１〜４のいずれかに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連続発酵による化学品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
菌体、微生物または培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Batch発酵法）および流加発酵法（Fed-Batch or Semi-Batch発酵法）と（２）連続発酵法（Continuous発酵法）に分類することができる。回分および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、純菌培養による化学品発酵の場合、培養に必要とした培養菌以外の雑菌による汚染が起きる可能性が低いというメリットがある。しかし、時間経過とともに発酵液中の生産物濃度が高くなり、生産物阻害や浸透圧の上昇などの影響により生産性および収率が低下している。このため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのが困難である。【０００３】
連続発酵法は、発酵槽内で目的物質が蓄積するのを回避する事により、上述の回分および流加発酵法と比べ長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できる。従来の連続培養は、発酵槽へ新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の発酵液を槽外へ排出することによって、発酵槽内の液量を常に一定に保つ培養法である。回分培養では初発基質濃度が消費されると培養が終了するが、連続培養では理論的には無限に培養を持続できる。すなわち、理論的には無限に発酵できる。【０００４】
しかし、従来の連続培養では発酵液とともに微生物も槽外に排出され、発酵槽内の微生物濃度を高く維持することは難しい。そこで、発酵生産を行う場合には発酵を行う微生物を高濃度に保つことができれば、発酵容積当たりの発酵生産効率を向上させることができる。そのためには、微生物を発酵槽内に保持、あるいは還流させる必要がある。【０００５】
微生物を発酵槽内に保持あるいは還流させる方法としては、排出された発酵液を遠心分離により固液分離し、沈殿物である微生物を発酵槽に返送する方法や、ろ過することで固形分である微生物を分離し、発酵液上清のみを槽外に排出する方法があげられる。しかし、遠心分離による方法は動力コストが高く現実的ではない。ろ過による方法は、前述のようにろ過するために高い圧力を要することから、実験室レベルでの検討がほとんどであった。その一例として、L-グルタミン酸やL-リジンの発酵について連続培養法が開示されている(非特許文献1)。しかし、これらの例では、連続発酵は行なっているものの、発酵槽に発酵原料の連続的な供給を行うとともに、菌体、微生物または培養細胞を含んだ発酵液も抜き出すために、発酵液中の菌体、微生物または培養細胞が引き抜きおよび希釈され、発酵槽中の微生物濃度が低下することから、生産効率の向上は限定されたものであった。【０００６】
そこで、連続発酵法において、菌体、微生物または培養細胞を分離膜で分離・ろ過し、ろ液から化学品を回収すると同時に分離された菌体、微生物または培養細胞を発酵液に保持または還流させることで、発酵液中の微生物または細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。例えば、セラミックス膜を用いた連続発酵装置において、膜分離連続発酵に関する技術が開示されている(特許文献1、特許文献2、特許文献3)。これらの技術は、既存の連続発酵と比べ、膜分離による微生物および培養細胞濃度を高く維持するという、膜分離連続発酵の優位性を示した。しかし、開示された技術は、セラミックス膜の目詰まりによるろ過流量やろ過効率の低下などの問題があり、詰まり防止のために、逆圧洗浄等を行っている。【０００７】
一方、近年では、分離膜を用いたコハク酸の製造方法も開示されている(特許文献4)。この技術では、上述のセラミック膜だけではなく有機膜の使用も採用され、連続発酵技術に適用可能な膜の範囲および種類を広げている。しかし、開示された技術では、膜分離において、高いろ過圧(約200kPa)や高速の膜面線速度（2m/s）が採用されている。高いろ過圧および高速の膜面線速度は、コスト的にも不利であるばかりでなく、ろ過処理において菌体、微生物または培養細胞が高圧・高速によって物理的なダメージをうけること、さらに、圧力損失が起きやすい状況になり運転条件を維持することが難しくなることにより、菌体、微生物または培養細胞を連続的に発酵槽に戻す連続発酵法においては適切ではない。【０００８】
一方、分離膜は、上述の発酵分野への適用を含め、河川水等を除濁して飲料水及び工業用水の製造を行う上水分野や、下水（下水二次処理水）の除濁浄化を行う下水分野への応用が盛んになっている。こうした分野で膜が広く使われるためには、有機物等による汚染（目詰まり）をできるだけ起こさせないような処理が必要である。膜の素材としては、セルロース系、ポリアクリロニトリル系、ポリオレフィン系等の多種多様のものが用いられている。中でもポリフッ化ビニリデンは高強度で耐熱性が高いほか、骨格が疎水性のために耐水性が高く水系ろ過膜の素材として適しており、有望と考えられる。【０００９】
ポリフッ化ビニリデン膜の製造方法としては、特許文献5において、ポリフッ化ビニリデン、有機液状体及び無機微粉体を溶融混練してから冷却によりミクロ相分離させ、その後有機液状体と無機微粉体とを抽出する中空糸膜の製造方法が提案されている。また、特許文献6には、ポリフッ化ビニリデンと溶媒系からなる中空糸膜の製造方法が開示されている。しかし、これらの膜は、一般に汚濁分の多い原水をろ過する場合、ろ過を続けていくと膜表面又は膜内部にろ過されずに残った堆積物が新たなろ過抵抗を引き起こすため、ろ過能力が落ちてしまうことが知られている。そのため、ろ過運転の途中にろ過をせずに高流速の水流で堆積物を剥ぎ取るフラッシング、気泡を膜にあてて堆積物を剥ぎ取るエアースクラビング、ろ過の方向を逆にして洗浄する逆洗等が取り入れられている。更には、定期的に薬品洗浄を行ってろ過能力を高く維持することも行われている。フラッシングやエアースクラビングは膜の洗浄効果が高いものの、膜に多大な負荷をかけるために膜破断の可能性が高く、それに加え、従来の膜では、これらの洗浄手段をとっても経時的な汚れ（目詰まり）の膜への蓄積は大きく、必ずしも満足のいく透水性能が得られていない問題があった。【００１０】
一方、近年、微生物の培養を伴う物質生産方法である発酵法に分離膜を適用して連続発酵を行い、菌体、微生物または培養細胞を集積することで、生産速度を増加させる方法を提案している（特許文献7）。この技術では、まず発酵槽を設け、平膜および中空糸膜を入れた膜分離槽を設け、ポンプを用いて前記発酵槽から前記膜分離槽に発酵液を入れ、前記膜分離槽の膜ユニットからさらに別途設けた水頭差制御装置を用いてろ過を制御している。しかし、二つの槽および制御装置を設けることで広い設置面積が必要となり、分離膜交換のためには膜分離槽を発酵槽から遮断して止めることで生産速度が低下するなど、設備の設置および維持管理に問題があった。更には、分離膜を発酵槽中に設置する提案は、分離膜の交換の際、発酵槽を停止しなければならない事になり、分離膜から発生した問題によって生産を停止する場合もあり得る。また、特許文献7で開示された分離膜を用いて連続発酵運転を行った場合、長期にわたって安定して連続運転できないという問題があった。【００１１】
一方、分離膜を適用した発酵により生産速度の向上を試みる研究も近年行なわれている。非特許文献2には、ラクトバシラス・パラカセイ菌を用いて乳酸発酵を行ない、発酵液をポリフッ化ビニリデン素材の膜を用いてろ過を行なうことで、生産速度向上の可能性を示している。しかし、膜詰まりによる膜間差圧の上昇を避けるため次亜塩素酸ナトリウムを用いた洗浄を行なっており、長期ろ過運転により頻繁に洗浄を行なうと、次亜塩素酸による発酵微生物の分解やナトリウム蓄積による発酵への悪影響、さらに中空糸膜の劣化による漏れの発生などの問題が起こりうる。さらに、薬品洗浄を伴う膜ろ過運転であったにもかかわらず最長150hの連続運転しか出来ていなく、連続発酵でも短い運転時間になってしまうと、バッチ運転と比べコスト低下の利点が薄く、現実的な発酵および生産には適用することが困難であり、技術の革新が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平5-95778号公報
【特許文献２】特開昭62-138184号公報
【特許文献３】特開平10-174594号公報
【特許文献４】特開2005-333886号公報
【特許文献５】米国特許第5022990号明細書
【特許文献６】国際公開WO91/17204号パンフレット
【特許文献７】特開2008-237213号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ヒラノ・トシヒコら (Toshihiko Hirao et.al.)、「アプライドマイクロバイアルアンドマイクロバイオロジー」(Appl.Microbiol.Biotechnol.),32,269-273(1989)
【非特許文献２】グオクイアン・ズら（Guo-qian Xu et.al.）、「プロセスバイオケミストリ（Process Biochemistry）」,41,2458-2463(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による化学品の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題を解決するために、本発明は次の構成をとる。【００１６】
（１）発酵原料と、化学品と、菌体、微生物または培養細胞とを含む発酵液を、分離膜でろ過し、ろ液から化学品を回収し、さらに、未ろ過液を発酵液に保持または還流し、かつ、発酵原料を発酵液に追加する連続発酵による化学品の製造方法であって、分離膜として、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる多孔性中空糸膜であって、平均孔径が０．００１μｍ以上１０．０μｍ以下、５０ｋＰａ、２５℃における純水透過係数が０．５ｍ３／ｍ２／ｈｒ以上１５ｍ３／ｍ２／ｈｒ以下、破断強度が５ＭＰａ以上２０ＭＰａ以下、破断伸度が３０％以上２００％未満、捲縮度が１．３以上２．５以下、空孔率が４０％以上、臨界表面張力が４５ｍＮ／ｍ以上７５ｍＮ／ｍ以下である多孔性中空糸膜を使用することを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法。【００１７】
（２）前記多孔性中空糸膜の表面がエチレンビニルアルコール共重合体により被覆されていることを特徴とする、前記（１）に記載の連続発酵による化学品の製造方法。【００１８】
（３）前記多孔性中空糸膜が、エチレンビニルアルコール共重合体と、ポリフッ化ビニリデンに不活性であり、エチレンビニルアルコール共重合体を溶解する溶剤とを含むエチレンビニルアルコール共重合体溶液に、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる多孔性中空糸膜を含浸後、乾燥処理されたものであることを特徴とする、前記（１）または（２）に記載の連続発酵による化学品の製造方法。【００１９】
（４）前記発酵原料が、糖類を含む前記（１）〜（３）のいずれかに記載の連続発酵による化学品の製造方法。【００２０】
（５）前記化学品が、有機酸またはアルコールまたは核酸である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に係る膜分離型連続発酵装置の例を説明するための概略図である。
【図２】本発明に係る分離膜モジュールの例を説明するための概略図である。
【図３】本発明に係る酵母用発現ベクターpTRS11のフィジカルマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、発酵原料、化学品、微生物もしくは培養細胞を含む発酵液を、分離膜でろ過し、ろ液から化学品を回収し、さらに、未ろ過液を発酵液に保持または還流し、かつ、発酵原料を発酵液に追加する連続発酵による化学品の製造方法であって、分離膜として、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる多孔性中空糸膜であって、平均孔径が０．００１μｍ以上１０．０μｍ以下、５０ｋＰａ、２５℃における純水透過係数が０．５ｍ３／ｍ２／ｈｒ以上１５ｍ３／ｍ２／ｈｒ以下、破断強度が５ＭＰａ以上２０ＭＰａ以下、破断伸度が３０％以上２００％未満、捲縮度が１．３以上２．５以下、空孔率が４０％以上、臨界表面張力が４５ｍＮ／ｍ以上７５ｍＮ／ｍ以下である多孔性中空糸膜を使用することを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法である。
【００２４】
本発明の対象となる多孔膜の形状は、中空糸膜である。中空糸膜は、実際にろ過に使用する形態（モジュール）にする場合、平膜やシート状膜に比べて単位体積当たりの充填膜面積を多くでき、体積当たりのろ過処理能力を高くできる点で有利である。
【００２５】
ポリフッ化ビニリデンは、高強度で耐熱性が高く、また骨格が疎水性のために耐水性が高く、本発明の素材として適している。本発明に用いられるポリフッ化ビニリデンには、フッ化ビニリデンホモポリマー及びフッ化ビニリデン共重合体が含まれる。また、フッ化ビニリデン共重合体としては、フッ化ビニリデンと、四フッ化エチレン、六フッ化プロピレン、三フッ化塩化エチレン及びエチレンからなる群から選ばれる１種類以上の単量体との共重合体が挙げられる。本発明においては、フッ化ビニリデンホモポリマーを用いることが好ましい。これらのポリマーは単独で用いても２種以上混合して用いても差し支えない。
【００２６】
ポリフッ化ビニリデンの重量平均分子量Ｍｗは、１００，０００以上、１，０００，０００未満であることが好ましい。ポリフッ化ビニリデンのＭｗが１００，０００未満では、得られる中空糸膜の伸びが小さく脆いものとなるため実用的でなく、Ｍｗが１，０００，０００以上であると溶融時の流動性が低くなるため成形性が悪くなる。
【００２７】
本発明においては、ポリフッ化ビニリデン、有機液状体及び無機微粉体の３成分からなる混合物より中空糸膜を製造することが望ましい。無機微粉体は、有機液状体を保持する担体としての機能を持ち、さらにミクロ相分離の核としての機能を持つ。すなわち、無機微粉体は、混合物の溶融混練及び成形時において有機液状体の遊離を防止し、成形を容易にするものであり、ミクロ相分離の核として有機液状体を高度にミクロ分散させ、有機液状体の凝集を防止する働きを有する。無機微粉体としては疎水性シリカを使用することが望ましい。疎水性シリカは凝集を起こしにくいため、溶融混練及び成形時において細かくミクロに分散し、結果として均質な三次元網目状構造を与える。ここで、疎水性シリカとは、シリカの表面のシラノール基をジメチルシランやジメチルジクロロシラン等の有機ケイ素系化合物と化学的に反応させ、シリカの表面をメチル基等で置換し疎水化させたシリカのことである。
【００２８】
本発明における有機液状体とは、沸点が１５０℃以上の液体を指す。有機液状体は、中空糸膜中から抽出され、得られる中空糸膜を多孔性にする。なお、有機液状体は、低温（常温）ではポリフッ化ビニリデンと相溶しないが、溶融成形時（高温）ではポリフッ化ビニリデンと相溶していることが好ましい。
【００２９】
本発明に係る分離膜としては、ポリフッ化ビニリデン及び有機液状体からなる混合物、又はポリフッ化ビニリデン、有機液状体及び無機微粉体からなる混合物を、溶融混練し、押し出して中空糸膜を成形し、中空糸膜から有機液状体又は有機液状体及び無機微粉体を抽出する製造方法によって製作した中空糸膜を使用することができる。中空糸膜の製造工程において、抽出終了前の中空糸膜又は抽出終了後の中空糸膜を糸長方向に延伸し、次いで糸長方向に収縮させる工程を行うことが好ましい。本発明に係る多孔性中空糸膜は、例えば前記の方法で得られた中空糸膜を、エチレンビニルアルコール共重合体と、ポリフッ化ビニリデンに不活性でありエチレンビニルアルコール共重合体を溶解する溶剤とを含むエチレンビニルアルコール共重合体溶液に、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる多孔性中空糸膜を含浸後、乾燥処理することで製造することができる。
【００３０】
本発明においては、また、収縮工程中において、中空糸膜を捲縮することが好ましい。これにより捲縮度の高い中空糸膜を、つぶれ或いは傷つけることなく得ることができる。一般に、中空糸膜は、曲がりの無い直管状の形態をなしているため、束ねてろ過用モジュールとした場合に、中空糸間の隙間が取れずに空隙度の低い糸束になる可能性が高い。これに対して、捲縮度が高い中空糸膜を用いると、個々の糸の曲がりにより平均的に中空糸膜間隔が広がり空隙度の高い糸束とすることができる。また、捲縮度の低い中空糸膜からなるろ過モジュールは、特に外圧で用いる際に糸束の空隙が少なくなり流動抵抗が増大し、糸束の中央部までろ過圧力が有効に伝わらなくなる。更には、逆洗やフラッシングでろ過堆積物を中空糸膜から剥ぎ落とす際にも糸束内部の洗浄効果が小さくなる。捲縮度の高い中空糸膜からなる糸束は、空隙度が大きく外圧ろ過でも中空糸膜間隙が保たれ、偏流が起こりにくい。
【００３１】
本発明においては、中空糸膜の捲縮度が１．３以上２．５以下の範囲であることが好ましい。１．３未満の場合には上記の理由から好ましくなく、また、２．５より大きいと容積当たりのろ過面積が低下するため好ましくない。一般に、中空糸膜は、曲がりの無い直管状の形態をなしているため、束ねてろ過用モジュールとした場合に、中空糸間の隙間が取れずに空隙度の低い糸束になる可能性が高い。これに対して、捲縮度が高い中空糸膜を用いると、個々の糸の曲がりにより平均的に中空糸膜間隔が広がり空隙度の高い糸束とすることができる。また、捲縮度の低い中空糸膜からなるろ過モジュールは、特に外圧で用いる際に糸束の空隙が少なくなり流動抵抗が増大し、糸束の中央部までろ過圧力が有効に伝わらなくなる。更には、逆洗やフラッシングでろ過堆積物を中空糸膜から剥ぎ落とす際にも糸束内部の洗浄効果が小さくなる。捲縮度の高い中空糸膜からなる糸束は、空隙度が大きく外圧ろ過でも中空糸膜間隙が保たれ、偏流が起こりにくい。捲縮度は、中空糸膜約１０００本を束ね幅４ｃｍのＰＥＴ製帯に１ｋｇの張力をかけつつ中空糸膜束の周長を測り、次式により中空糸膜の捲縮度を求めることができる。
【００３２】
捲縮度＝（周長［ｍ］／π） ２ ／（（中空糸直径［ｍ］） ２ ×中空糸本数）
本発明において、中空糸膜の内径は、中空糸管内を流れる液の抵抗（管内圧損）の観点から０．４ｍｍ以上であり、単位体積当たりの充填膜面積の観点から３．０ｍｍ以下である。０．５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下とすることがより好適である。
【００３３】
また、中空糸膜の外径／内径比は、小さすぎると引っ張り、破裂又は圧縮に際しての耐久性が弱く、大きすぎると膜面積に比して膜厚が大きすぎてろ過能力が低くなるため不利である。したがって、中空糸膜の外径／内径比は１．３以上２．３以下とすることが好適である。より好ましくは１．５以上２．１以下、さらにより好ましくは１．６以上２．０以下である。
【００３４】
中空糸膜の空孔率は、透水性能の観点から４０％以上であることが必要であり、好ましくは６０％以上である。より好ましくは６５％以上８５％以下、さらに好ましくは７０％以上８０％以下である。
【００３５】
なお空孔率は、以下の式より決定できる。
【００３６】
空孔率［％］＝１００×（湿潤膜重量[ｇ]−乾燥膜重量[ｇ]）／水比重[ｇ／ｃｍ３]／（膜体積［ｃｍ３］）
ここで、湿潤膜とは、孔内は純水が満たされているが、中空部内には純水が入っていない状態の膜を指す。具体的には、１０〜２０ｃｍ長のサンプル膜をエタノール中に浸漬して孔内をエタノールで満たした後に純水浸漬を４〜５回繰り返して孔内を充分に純水で置換し、かかる後に中空糸膜の一端を手で持って５回ほど良く振り、さらに他端に手を持ちかえてまた５回程よく振って中空部内の水を除去することで得ることができる。また、乾燥膜は、前記湿潤膜の重量測定後にオーブン中で例えば６０℃で恒量になるまで乾燥させて得ることができる。
【００３７】
膜体積は、以下の式
膜体積[ｃｍ３]＝π×｛（外径[ｃｍ]／２）２−（内径[ｃｍ]／２）２｝×膜長[ｃｍ]
により求めることができる。膜１本では重量が小さすぎて重量測定の誤差が大きくなる場合は、複数本の膜を用いることができる。
【００３８】
中空糸膜の孔径としては、平均孔径が０．００１μｍ以上１０．０μｍ以下であることが必要である。好ましくは平均孔径が０．０５μｍ以上１．０μｍ以下であり、より好ましくは０．１μｍ以上０．５μｍ以下である。平均孔径が０．００１μｍより小さい場合はろ過流量が小さくなり好ましくない。平均孔径が１０．０μｍより大きくなると、濁質の有効なろ過分別ができなくなり、また、濁質が膜内部につまり易くろ過量の経時低下が大きくなるため好ましくない。
【００３９】
膜の平均孔径は、ＡＳＴＭ：Ｆ３１６−８６記載の方法（別称：ハーフドライ法）にしたがって決定することができる。なお、このハーフドライ法によって決定されるのは、膜の最小孔径層の平均孔径である。
【００４０】
なお、本発明においては、ハーフドライ法による平均孔径の測定は、使用液体にエタノールを用い、２５℃、昇圧速度０．００１ＭＰａ／秒での測定を標準測定条件とした。平均孔径［μｍ］は、下記式より求まる。
【００４１】
平均孔径［μｍ］＝（２８６０×表面張力[ｍＮ／ｍ]）／ハーフドライ空気圧力[Ｐａ]
エタノールの２５℃における表面張力は２１．９７ｍＮ／ｍである（日本化学会編、化学便覧基礎編改訂３版、ＩＩ-８２頁、丸善（株）、１９８４年）ので、本発明における標準測定条件の場合は、
平均孔径［μｍ］＝６２８３４．２／（ハーフドライ空気圧力[Ｐａ]）
にて求めることができる。
【００４２】
膜の最大孔径は、ハーフドライ法において膜から気泡が初めて出てくる時の圧力から求めることができる（バブルポイント法）。上記のハーフドライ法標準測定条件の場合、中空糸膜から気泡が初めて出てくる時の圧力から、
最大孔径［μｍ］＝６２８３４．２／（気泡発生空気圧力［Ｐａ］）
より求めることができる。
【００４３】
膜の最大孔径と平均孔径の比は、２．０未満であることが好ましい。２．０以上ではリークの問題があり、また、逆洗の効果が弱くなる。
【００４４】
三次元網目状構造は、膜断面にマクロボイド（粗大孔）が実質的に存在せず、三次元のどの方向にも連通孔が存在する構造を指す。マクロボイドが膜断面に存在すると、膜強度が低下して好ましくない他、連続して存在するとリークの原因となる。マクロボイドは球形近似直径で８μｍ以上の空孔を指す。特に、膜が均質の三次元網目状構造をとる場合は、表面に傷がついても傷が貫通していなければ阻止孔径は実質変わらないという利点を有する。無機微粉体を用いる製造方法により得られる中空糸膜の断面構造は、マクロボイドを持たない均質な三次元網目状構造となっている。ただし、延伸を行っているため糸長方向への網目構造の伸長は認められる。
【００４５】
本発明に係る多孔性中空糸膜の純水透過係数は、引っ張り、破裂又は圧縮に対する耐久性及びろ過性能の観点から０．５ｍ３／ｍ２／ｈｒ以上１５ｍ３／ｍ２／ｈｒ以下とすることが必要である。
【００４６】
なお、純水透過係数は標準的に以下の方法によって測定できる。
【００４７】
エタノール浸漬した後、数回純水浸漬を繰り返した約１０ｃｍ長の湿潤中空糸膜の一端を封止し、他端の中空部内へ注射針を入れた。２５℃の環境下にて注射針から５０ＫＰａの圧力にて２５℃の純水を中空部内へ注入し、外面からろ過してくる純水の透水量を測定し、以下の式より純水透過係数を求めた。
【００４８】
純水透過係数［ｍ３／ｍ２／ｈｒ］＝透過水量［ｍ３］／（π×膜径［ｍ］×膜本数（本）×膜有効長［ｍ］×測定時間［ｈｒ］）
ここで、膜径とは、外圧式中空糸膜使用の場合は膜外径、内圧式中空糸膜使用の場合は膜内径を意味し、膜有効長とは、注射針が挿入されている部分を除いた、正味の膜長を指す。
【００４９】
本発明に係る中空糸膜は、引っ張り破断強度が大きく、圧縮強度や圧縮弾性率が高いにも関わらず、引っ張り弾性率が低いことを大きな特徴としている。引っ張り破断強度が大きいということは、モジュールとしてろ過運転あるいはフラッシングをした時の糸切れに対して耐久性が高いことを意味する。引っ張り破断強度は５ＭＰａ以上２０ＭＰａ以下の範囲であることが必要である。５ＭＰａより小さいと糸切れの頻度が増える。２０ＭＰａより大きいと透水性能が低くなる。好ましくは７ＭＰａ以上である。
【００５０】
引っ張り破断伸度は、３０％以上２００％未満が必要であり、好ましくは５０％以上１５０％未満である。３０％より小さいとフラッシングやエアースクラビングで強制的に糸を揺らす場合に膜破断の可能性が高くなり、２００％より高いと破裂或いは圧縮等の強度面が弱かったり、低延伸倍率により引っ張り弾性率が高くなったりするため好ましくない。また、中空糸膜を延伸し、次いで収縮させる工程を含む場合は、引っ張り破断伸度は低伸度での破断が極めて少なくなり、引っ張り破断伸度の分布を狭くすることができる。
【００５１】
中空糸膜の臨界表面張力は、汚染物の付着しにくさから４５ｍＮ／ｍ以上７５ｍＮ／ｍ以下であることが必要である。ポリフッ化ビニリデン自体の臨界表面張力は３３ｍＮ／ｍ程度であるが、例えばアルカリ水溶液中で処理を行うことで４５ｍＮ／ｍ以上にできる。またエチレンビニルアルコール共重合体の臨界表面張力が７０ｍＮ／ｍ以上であるので、エチレンビニルアルコール共重合体を被覆したポリフッ化ビニリデン中空糸膜では、臨界表面張力を７０ｍＮ／ｍ以上にすることができる。中空糸膜の臨界表面張力の値は、乾燥状態の中空糸膜を濡らすことのできる液体の表面張力の上限値として定義している。中空糸膜の臨界表面張力の値は、例えば、和光純薬工業株式会社製ぬれ指数標準液を用い、ＪＩＳ  Ｋ  ６７６８に準じて測定できる。具体的には、段階的に表面張力が異なる複数の標準液を準備し、その中の一つの標準液を用いて中空糸膜面上に滴下し、液滴を膜面に広げ、滴下した標準液の液膜が破れを生じることなく、２秒以上濡らすことのできる上限の標準液の表面張力値を臨界表面張力とすることで決定できる。
【００５２】
本発明においては、必要に応じて、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる多孔性中空糸膜の表面がエチレンビニルアルコール共重合体により被覆されているものを用いることができる。表面がエチレンビニルアルコール共重合体により被覆されたポリフッ化ビニリデン樹脂からなる多孔性中空糸膜は、エチレンビニルアルコール共重合体と、ポリフッ化ビニリデンに不活性でありエチレンビニルアルコール共重合体を溶解する溶剤とを含むエチレンビニルアルコール共重合体溶液に、ポリフッ化ビニリデン樹脂からなる多孔性中空糸膜を含浸させることで、中空糸膜の内部にある空孔にエチレンビニルアルコール共重合体溶液を浸透させて、その後、中空糸膜の内部の厚み部分にある空孔から溶剤を乾燥除去する工程により本発明に係る多孔性中空糸膜を得ることが好ましい。かかる工程を行うことにより、ろ過安定性の高い中空糸膜が安定的に製造できる。エチレンビニルアルコール共重合体は、耐汚染性、耐熱性に優れ、また水不溶性の素材であるため、膜被覆用素材として好適である。
【００５３】
本発明において、多孔性中空糸膜の表面がエチレンビニルアルコール共重合体により被覆されているとは、多孔性中空糸膜の内表面、外表面、細孔内表面など、特定の表面に限定してエチレンビニルアルコール共重合体により被覆されていても良いし、多孔性中空糸膜の内表面、外表面、細孔内表面の全ての表面がエチレンビニルアルコール共重合体により被覆されていても良い。特定の表面に限定してエチレンビニルアルコール共重合体により被覆される箇所を、特定の表面に限定したり全ての表面に適用したりすることにより、様々な発酵液および菌体、微生物または培養細胞に合わせたろ過膜を提供することができ、長時間安定したろ過ができるようなろ過膜の提供が可能となる。
【００５４】
本発明に係るポリフッ化ビニリデン中空糸膜は、高強度であり耐圧縮性も高いため、ポリフッ化ビニリデン中空糸膜の表面にエチレンビニルアルコール共重合体を更に被覆することにより、高強度、高耐圧であり、かつ耐汚染性に極めて優れた中空糸膜とすることができる。なお、ポリフッ化ビニリデン自体は疎水性であるが、例えばアルカリ処理すると、ポリフッ化ビニリデン中空糸膜表面及び内部にある空孔表面の濡れ性が向上するため、エチレンビニルアルコール共重合体の被覆を効率良く行うことが可能となる。
【００５５】
エチレンビニルアルコール共重合体は、例えば、エチレンと酢酸ビニルとを共重合させた後、酢酸ビニル由来の側鎖の酢酸エステル部分を鹸化（加水分解）し、側鎖を水酸基に転化させることにより合成される結晶性の熱可塑性樹脂である。本発明に用いるエチレンビニルアルコール共重合体中のエチレン含量は、被覆効率の観点から２０モル％以上が好ましく、耐汚染性の観点から６０モル％以下が好ましい。鹸化度は高いほど好ましく、機械的強度の観点から８０モル％以上が好ましい。特に好ましいのは鹸化度９９モル％以上の、実質的に完全鹸化されたものである。なお、エチレンビニルアルコール共重合体中には、必要に応じて酸化防止剤、滑剤等の添加物が、本発明の目的を損なわない範囲で添加されていてもよい。
【００５６】
本発明に係るエチレンビニルアルコール共重合体被覆ポリフッ化ビニリデン中空糸膜の、中空糸膜全体に対するエチレンビニルアルコール共重合体の被覆量は、有機物等に対する耐汚染性の効果の観点から０．１重量％以上が好ましく、透水量の観点から１０重量％以下が好ましい。より好ましい被覆量は０．５重量％以上７重量％以下であり、さらに好ましくは１重量％以上５重量％以下である。被覆は中空糸膜の内外表面及び繊維内部の厚み部分の微細な空孔表面にまんべんなく行われていることが好ましい。
【００５７】
以上の膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転が、より容易に、可能であることがわかった。このとき、本発明では三次元網目構造を有するフッ素樹脂系高分子分離膜の平均細孔径は０．００１μｍ以上１０．０μｍ以下の範囲とする。表面の平均孔径がこの範囲にあると、水中の汚れ物質が細孔に詰まりにくく、透水性能の低下が起こりにくいため、フッ素樹脂系高分子分離膜をより長期間連続して使用することができる。さらに、空孔率が、透水性能の観点から４０％以上、臨界表面張力が４５ｍＮ／ｍ以上７５ｍＮ／ｍ以下とすることにより、発酵液に対するろ過性が増加するとともに、目詰まりを起こす物質が膜に付着しにくい適切な表面張力を持つことができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、かつ、目詰まりが生じにくく、目詰まりが起きた場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好であり、長期間安定なろ過が、より容易に可能になる。
【００５８】
本発明の化学品の製造方法は、発酵原料を使用する。本発明で使用する発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させうるものであればよい。
【００５９】
本発明で使用する発酵原料は、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなどが使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティーブリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【００６０】
本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤を必要に応じて使用する。本発明において、発酵液とは、発酵原料に菌体、微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。
【００６１】
本発明では、発酵液中の糖類濃度は5g/L以下に保持されるのが好ましい。発酵液中の糖類濃度は5g/L以下に保持することが好ましい理由は、発酵液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。
【００６２】
微生物または細胞の培養は、通常、pH3-8、温度15-40℃の範囲で行われるが、一部の高温微生物または細胞を利用する場合には、温度40-65℃での培養も可能である。発酵液のpHは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、pH3-8範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を21%以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００６３】
本発明の化学品の製造方法では、培養初期にBatch培養またはFed-Batch培養を行って、微生物濃度を高くした後に、連続培養(引き抜き)を開始しても良い。本発明の化学品の製造方法では、微生物濃度を高くした後に、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。本発明の化学品の製造方法では、適当な時期から発酵原料液の供給及び培養物の引き抜きを行うことが可能である。発酵原料液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、発酵原料液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
【００６４】
発酵原料液には菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。発酵液中の菌体、微生物または培養細胞の濃度は、発酵液の環境が菌体、微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが、効率よい生産性を得るのに好ましい。発酵液中の菌体、微生物または培養細胞の濃度は、一例として、乾燥重量として、5g/L以上に維持することで良好な生産効率が得られる。
【００６５】
本発明の化学品の製造方法では、必要に応じて発酵槽内から菌体、微生物または培養細胞を引き抜くことができる。例えば、発酵槽内の菌体、微生物または培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなることから、引き抜くことで、閉塞から回避することができる。また、発酵槽内の菌体、微生物または培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあり、生産性能を指標として菌体、微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００６６】
本発明の化学品の製造方法では、発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵槽の数は問わない。本発明の化学品の製造方法では、連続培養操作は、通常、単一の発酵槽で行うのが、培養管理上好ましい。発酵槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵槽を用いることも可能である。この場合、複数の発酵槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。
【００６７】
本発明の化学品の製造方法に用いることができる微生物または培養細胞について説明する。
【００６８】
本発明の化学品の製造方法で使用される菌体、微生物または培養細胞については、制限はない。本発明で使用される菌体、微生物または培養細胞は、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物または細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【００６９】
本発明の化学品の製造方法で製造される化学品としては、上記微生物または細胞が発酵液中に生産する物質であれば制限はない。本発明の化学品の製造方法で製造される化学品は、アルコール、有機酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、1,3-プロパンジオール、1,4-ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、核酸であれば、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、またカダベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。
【００７０】
次に、本発明の化学品の製造方法に用いることができる菌体、微生物または培養細胞について、具体的な化学品を例示しながら説明する。
【００７１】
本発明の化学品の製造方法において、L-乳酸を製造する場合、L-乳酸の生産に用いることが出来る菌体、微生物または培養細胞としてはL-乳酸を生産することが可能な菌体、微生物または細胞であれば制限はない。本発明の化学品の製造方法において、L-乳酸の生産に用いることが出来る菌体、微生物または培養細胞としては、好ましくは乳酸菌を用いることができる。ここで乳酸菌とは、消費したグルコースに対して対糖収率として50%以上の乳酸を産生する原核微生物として定義することができる。好ましい乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス属(GenusLactobacillus)、ペディオコッカス属(GenusPediococcus)、テトラゲノコッカス属(GenusTetragenococcus)、カルノバクテリウム属(GenusCamobacterium)、バゴコッカス属(GenusVagococcus)、ロイコノストック属(GenusLeuconostoc)、オエノコッカス属(GenusOenococcus)、アトポビウム属(GenusAtopobium)、ストレプトコッカス属(GemsStreptococcus)、エンテロコッカス属(GenusEnterococcus)、ラクトバシラス属(GenusLactococcus)、およびバシラス属(GenusBacillus)に属する乳酸菌が挙げられる。それらの中でも、乳酸の対糖収率が高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。
【００７２】
本発明の化学品の製造方法においては、更に、乳酸の内でも、L-乳酸の対糖収率の高い乳酸菌を選択して乳酸の生産に好ましく用いることができる。L-乳酸とは、乳酸の光学異性体の一種であり、その鏡像体であるD-乳酸と明確に区別することができる。L-乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス(Lactobacillusyamanashiensis)、ラクトバシラス・アニマリス(Lactobacillusanimalis)、ラクトバシラス・アジリス(Lactobacillusagilis)、ラクトバシラス・アビアリエス(Lactobacillusaviaries)、ラクトバシラス・カゼイ(Lactobacilluscasei)、ラクトバシラス・デルブレッキ(Lactobacillusdelbruekii)、ラクトバシラス・パラカゼイ(Lactobacillusparacasei)、ラクトバシラス・ラムノサス(Lactobacillusrhamnosus)、ラクトバシラス・ルミニス(Lactobacillusruminis)、ラクトバシラス・サリバリス(Lactobacillussalivarius)、ラクトバシラス・シャーピイ(Lactobacillussharpeae)、ラクトバシラス・デクストリニクス(Pediococcusdextrinicus)、バシラス・コアグランス（Bacilluscoagulans）およびラクトバシラス・ラクティス(Lactococcuslactis)などが挙げられ、これらを選択して、L-乳酸の生産に用いることが可能である。
【００７３】
本発明の化学品の製造方法でL-乳酸を製造する場合、人為的に乳酸生産能力を付与、あるいは増強した菌体、微生物または培養細胞を用いることができる。例えば、L-乳酸脱水素酵素遺伝子(以下、L-LDHと言うことがある)を導入して、L-乳酸生産能力を付与、あるいは増強した菌体、微生物または培養細胞を用いることができる。L-乳酸生産能力を付与、あるいは増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がL-LDHを組み込むことによりL-乳酸生産能力が増強した組換え微生物が挙げられる。
【００７４】
本発明の化学品の製造方法でL-乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましくは酵母である。酵母のうち好ましくはサッカロマイセス属(GenusSaccharomyces)に属する酵母であり、更に好ましくはサッカロマイセス・セレビセ(SaccharOmyCeSCereViSiae)である。
【００７５】
本発明で使用するL-LDHとしては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)とピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)とL-乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていれば限定されない。例えば、L-乳酸の対糖収率の高い乳酸菌由来のL-LDHを用いることができる。好適にはほ乳類由来L-LDHを用いることができる。このうちホモ・サピエンス(Homosapiens)由来、およびカエル由来のL-LDHを用いることができる。カエルの中でもコモリガエル科(Pipidae)に属するカエル由来のL-LDHを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル(Xenopuslaevis)由来のL-LDHを好ましく用いることができる。
【００７６】
本発明に用いられるヒトまたはカエル由来のL-LDHには、遺伝的多型性や、変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的変異導入用キット(Mutan-K(タカラバイオ社製))を用いる方法や、ランダム変異導入用キット(BDDiversifyPCRRandomMutagenesis(CLONTECH社製))を用いる方法などがある。また、本発明で使用するヒトまたはカエル由来のL-LDHは、NADHとピルビン酸をNAD+とL-乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしているならば、塩基配列の一部に欠失または挿入が存在していても構わない。
【００７７】
本発明の化学品の製造方法でL-乳酸を製造する場合、分離膜によってろ過したろ過液に含まれるL-乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、ろ過液のpHを1以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。好ましくは、ろ過液の水分を蒸発させた濃縮L-乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。L-乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製L-乳酸を得ることができる。留出液としてエタノールや酢酸等の低沸点成分を含むL-乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をL-乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のL-乳酸を得ることもできる。
【００７８】
本発明の化学品の製造方法でD-乳酸を製造する場合、D-乳酸生産に用いることが出来る菌体、微生物または培養細胞としてはD-乳酸を生産することが可能な菌体、微生物または細胞であれば制限はない。D-乳酸生産に用いることが出来る菌体、微生物または培養細胞は、例えば、野生型株では、D-乳酸を合成する能力を有するラクトバシラス属(Lactobacillus)、バシラス属(Bacillus)属およびペディオコッカス(Pediococcus)に属する微生物が挙げられる。
【００７９】
本発明の化学品の製造方法でD-乳酸を製造する場合、野生型株のD-乳酸デヒドロゲナーゼ(以下、D-LDHともいうことがある)の酵素活性を増強していることが好ましい。酵素活性を増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がD-乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組み込むことによりD-乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増強した組換え微生物が挙げられる。
【００８０】
本発明の化学品の製造方法でD-乳酸を製造する場合、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましくは酵母である。
【００８１】
本発明の化学品の製造方法でD-乳酸を製造する場合、D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillusplantarum)、およびペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococcusacidilactici)、およびバシラス・ラエボラクティカス(Bacilluslaevolacticus)由来の遺伝子であることが好ましく、更に好ましくはバシラス・ラエボラクティカス(Bacilluslaevolacticus)由来の遺伝子である。
【００８２】
本発明の化学品の製造方法でD-乳酸を製造する場合、ろ過・分離発酵液に含まれるD-乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。例えば、ろ過・分離発酵液のpHを1以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。
【００８３】
本発明の化学品の製造方法でD-乳酸を製造する場合、好ましくは、ろ過・分離発酵液の水分を蒸発させた濃縮D-乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。D-乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製D-乳酸を得ることができる。留出液として低沸点成分(エタノール、酢酸等)を含むD-乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をD-乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のD-乳酸を得ることもできる。
【００８４】
本発明の化学品の製造方法でエタノールを製造する場合、エタノールの生産に用いることが出来る菌体、微生物または培養細胞としては、ピルビン酸を生産することが可能な菌体、微生物または培養細胞であれば制限はない。エタノールの生産に用いることが出来る菌体、微生物または培養細胞としては、例えば、サッカロミセス属(GenusSaccharomyces)、クルベロマイセス属(GenusKluyveromyces)、シゾサッカロミセス属(GenusSchizosaccharomyces)に属する酵母を用いることができる。このうちサッカロミセス・セレビセ(Saccharomycescere、dsiae)、クルベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyceslactis)、シゾサッカロミセス・ボンベ(Schizosaccharomycespombe)を好適に用いることができる。また、ラクトバチルス属(GenusLactobacillus)、ザイモモナス属(GenusZymomonas)に属する細菌も好ましく用いることができる。このうち、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillusbrevis)、ザイモモナス・モビリス(Zymomonasmobilis)を好適に用いることができる。
【００８５】
本発明におけるエタノールの生産に用いることができる菌体、微生物または培養細胞は人為的にエタノール生産能力を高めた菌体、微生物または培養細胞であってもよい。本発明におけるエタノールの生産に用いることができる菌体、微生物または培養細胞は、具体的には、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。一部性質が改変されたものの一例としては、リゾパス属に属するカビのグルコアミラーゼ遺伝子を組み込み生でんぶんの資化能力を獲得した酵母を挙げることができる。また、本発明の製造方法により製造されたろ過・分離発酵液に含まれるエタノールの分離・精製は、例えば、蒸留法による精製法や、NF、RO膜、あるいはゼオライト製の分離膜を用いた濃縮・精製法を好適に用いることができる。
【００８６】
本発明の化学品の製造方法に従って、連続発酵をおこなった場合、従来の回分発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における生産速度は、次の式で計算される。
【００８７】
発酵生産速度(g/L/hr)=抜き取り液中の生産物濃度(g/L)×発酵液抜き取り速度(L/hr)÷装置の運転液量(L)
また、回分培養での発酵生産速度は、発酵原料の炭素源をすべて消費した時点の生産物量(g)を、炭素源の消費に要した時間(h)とその時点の発酵液量(L)で除して求められる。
【００８８】
次に、本発明の連続発酵装置について説明する。本発明の連続発酵装置は、エタノール、1,3-プロパンジオール、1,4-ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、L-スレオニン、L-リジン、L-グルタミン酸、L-トリプトファン、L-イソロイシン、L-グルタミン、L-アルギニン、L-アラニン、L-ヒスチジン、L-プロリン、L-フェニルアラニン、L-アスパラギン酸、L-チロシン、メチオニン、セリン、バリン、ロイシンなどのアミノ酸、イノシン、グアノシンなど核酸、カダベリンなどのジアミン化合物、酵素、抗生物質、組換えタンパク質の生産に適用することが可能である。
【００８９】
本発明に係る連続発酵装置は、菌体、微生物または培養細胞の発酵液を分離膜でろ過し、ろ液から化学品を回収するとともに未ろ過液を前記の発酵液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵液に追加する連続発酵による化学品の製造装置である。
【００９０】
本発明の化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置について、図を用いて説明する。
【００９１】
図1は、本発明の化学品の製造方法で用いられる膜分離型連続発酵装置の例を説明するための概略図である。図1において、膜分離型連続発酵装置は、発酵槽1と膜分離モジュール2で基本的に構成されている。ここで、分離膜モジュール2には、中空糸膜が使用されている。また分離膜モジュール2は、発酵液循環ポンプ10を介して発酵槽1に接続されている。
【００９２】
図1において、培地供給ポンプ7によって、培地を発酵槽1に連続的もしくは断続的に投入する。培地は、投入前に必要に応じて加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。また、必要に応じて、気体供給装置4によって必要とする気体を供給することができる。この時、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置4で供給することができる。また必要に応じて、pHセンサ・制御装置9およびよびpH調整溶液供給ポンプ8によって発酵液のpHを調整し、また必要に応じて、温度調節器3によって発酵液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。
【００９３】
ここでは、計装・制御装置による発酵液の物理化学的条件の調節に、pHおよび温度を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やORPの制御、オンラインケミカルセンサーなどの分析装置により、発酵液中の化学品の濃度を測定し、発酵液中の化学品の濃度を指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入は、好ましくは、上記計装装置による発酵液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節する。
【００９４】
さらに、装置内の発酵液は、発酵液循環ポンプ10によって発酵槽1と分離膜モジュール2を循環する。発酵生産物を含む発酵液は、分離膜モジュール2によって微生物と発酵生産物にろ過・分離され、装置系から取り出すことができる。必要に応じて、循環ポンプによって送られた発酵液配管の圧力と、ろ過されたろ過液配管の圧力から差圧を測定し、膜ろ過運転を制御することができる。また、ろ過・分離された微生物は、装置系内にとどまることで装置系内の微生物濃度を高く維持でき、生産性の高い発酵生産を可能としている。
【００９５】
必要に応じて、気体供給装置4によって必要とする気体を分離膜モジュール2内に供給することができる。この時、供給した気体を回収リサイクルして再び気体供給装置4で供給することができる。分離膜モジュール2によるろ過・分離は、必要に応じて、ろ過ポンプ12等による吸引ろ過、あるいは、装置系内を加圧することによりろ過・分離することもできる。また、培養槽で連続発酵に菌体、微生物または培養細胞を培養し、必要に応じて発酵槽内に供給することができる。培養槽で連続発酵に菌体、微生物または培養細胞を培養し、必要に応じて発酵槽内に供給することにより、常にフレッシュで化学品の生産能力の高い菌体、微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。
【００９６】
次に、図2に示す分離膜モジュールについて説明する。分離膜モジュールは、図2に示すように、中空糸膜で構成された分離膜束22と上部樹脂封止層23、下部樹脂封止層21によって主に構成される。分離膜束は上部樹脂封止層23、および下部樹脂封止層21よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層による接着・固定化は中空糸膜の中空部を封止しており、発酵液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層23は中空糸膜の内孔を封止しておらず、集水パイプ24にろ過水が流れる構造となっている。分離膜束22によってろ過されたろ過水は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ24を介して発酵培養槽外部に取り出される。ろ過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引ろ過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００９７】
本発明の化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置の分離膜モジュールを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐久性の部材であることが好ましい。発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない菌体、微生物または培養細胞による汚染の危険を回避でき、より安定した連続発酵が可能となる。分離膜モジュールを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、121℃で20分間に耐久性であることが好ましい。分離膜モジュール部材は、例えば、ステンレス、アルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、PVDF、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂、ポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定できる。
【００９８】
本発明の化学品の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離モジュールは、高圧蒸気滅菌可能なことが望ましい。膜分離モジュールが高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。
【実施例】
【００９９】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために、上記化学品として、L-乳酸、エタノールおよびコハク酸を選定し、それぞれの化学品を生産する能力のある菌体、微生物または培養細胞による図1の概要図に示す装置を用いた連続発酵の具体的な実施形態について、実施例を挙げて説明する。【０１００】
なお、得られた中空糸膜の外径、内径、空孔率、ハーフドライ法による平均孔径、バブルポイント法による最大孔径、純水透過係数、臨界表面張力、捲縮度、引っ張り破断強度、引っ張り破断伸度は、それぞれ「発明を実施するための形態」欄に記載した方法により測定した。【０１０１】
また、得られた中空糸膜の引っ張り弾性率、圧縮弾性率、瞬時耐圧縮強度は、それぞれ下記の方法により測定した。【０１０２】
引っ張り弾性率
引っ張り試験機（ＴＥＮＳＩＬＯＮ（登録商標）／ＲＴＭ−１００）（東洋ボールドウィン製）を用い、湿潤した中空糸膜をチャック間距離５０ｍｍ、引っ張り速度２００ｍｍ／分にて引っ張り、破断時の荷重と変位から、以下の式により引っ張り破断強度及び引っ張り破断伸度を求めた。測定は温度２５℃、相対湿度４０〜７０％の室内で行った。【０１０３】
引っ張り破断強度［Ｐａ］＝破断時荷重［Ｎ］／膜断面積［ｍ２］
ここで、膜断面積［ｍ２］＝π×{（外径［ｍ］／２)２−（内径［ｍ］／２)２}である。【０１０４】
引っ張り破断伸度［％］＝１００×破断時変位［ｍｍ］／５０［ｍｍ］
なお、引っ張り弾性率［Ｐａ］は、上記引っ張り試験の際の０．１％変位荷重と５％変位荷重から１００％変位時の荷重を求め、膜断面積で除して求めた。【０１０５】
圧縮弾性率
圧縮測定機（島津製作所製：ＡＧＳ−Ｈ／ＥＺｔｅｓｔ）により、５ｍｍ幅の圧縮用治具を用い湿潤した中空糸膜の長さ５ｍｍ分について、糸長方向に垂直な方向での圧縮変位と荷重を測った。圧縮速度は１ｍｍ／ｍｉｎで、初期中空糸膜直径に対して０．１％変位時と５％変位時の荷重から１００％変位時の荷重を求め、初期中空糸外径と中空糸膜長５ｍｍを乗じて得られる投影断面積で規格化し圧縮弾性率とした。測定は温度２５℃、相対湿度４０〜７０％の室内で行った。無限軌道式ベルトの厚み方向の圧縮弾性率は、乾燥試料を同様にして測定した。【０１０６】
瞬時耐圧縮強度
４０℃の純水をはった耐圧容器に、片端を封止した湿潤した中空糸膜を入れ、外表面側を純水で液密に満たし、内表面側の中空部を大気に開放した状態にした。エアーにより１５秒間で水圧を０．０５ＭＰａにまで上げ、中空糸の外表面側より内表面側にろ過水を得た（外圧方式）。１５秒間のろ過水量を測定し、その後さらに１５秒間で圧力を０．０５ＭＰａ上げ、再び１５秒間のろ過水量を測定するというサイクルを続けた。なお、このサイクルを続け圧力を上げて行く途中で膜がつぶれろ過水量が減少に転ずる。ろ過水量が最大となった圧力を瞬時耐圧縮強度［Ｐａ］とした。【０１０７】
また、膜断面写真を高分子分離膜の断面を走査型電子顕微鏡（Ｓ−８００）（日立製作所製）を用いて１００００倍で撮影し、この膜断面写真から、三次元の網目状構造の有無および８μｍ以上のマクロボイドの有無を確認した。【０１０８】
参考例1
L-乳酸生産能力を持つ酵母株の作製L-乳酸生産能力を持つ酵母株を下記のように造成した。ヒト由来LDH遺伝子を酵母ゲノム上のPDC1プロモーターの下流に連結することでL-乳酸生産能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(PCR)には、La-Taq(宝酒造)、あるいはKOD-Plus-polymerase(東洋紡)を用い、付属の取扱説明に従って行った。ヒト乳ガン株化細胞(MCF-7)を培養回収後、TRIZOL Reagent(Invitrogen)を用いてtotalRNAを抽出し、得られたtotalRNAを鋳型としてSuper Script Choice System(lnvitrogen)を用いた逆転写反応によりcDNAの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたcDNAを続くPCRの増幅鋳型とした。【０１０９】
上記操作で得られたcDNAを増幅鋳型とし、配列番号1および配列番号2で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるPCRによりL-1dh遺伝子のクローニングを行った。各PCR増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase(TAKARA社製)によりリン酸化後、pUC118ベクター(制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの)にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2(TAKARA社製)を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH5αを形質転換し、プラスミドDNAを回収することにより各種L-1dh遺伝子(配列番号3)がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたL-1dh遺伝子が挿入されたpUC118プラスミドを制限酵素XhoIおよびNotIで消化し、得られた各DNA断片を酵母発現用ベクターpTRS11(図3)のXhoI/NotI切断部位に挿入した。このようにしてヒト由来L-ldh遺伝子発現プラスミドpL-ldh5(L-ldh遺伝子)を得た。なお、ヒト由来のL-ldh遺伝子発現ベクターである上記pL-ldh5は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6)にFERMAP-20421として寄託した。【０１１０】
ヒト由来LDH遺伝子を含むプラスミドpL-ldh5を増幅鋳型とし、配列番号4および配列番号5で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたPCRにより1.3kbのヒト由来LDH遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のTDH3遺伝子のターミネーター配列含むDNA断片を増幅した。また、プラスミドpRS424を増幅鋳型として、配列番号6および配列番号7で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたPCRにより1.2kbのサッカロミセス・セレビセ由来のTRP1遺伝子を含むDNA断片を増幅した。それぞれのDNA断片を 1.5% アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。【０１１１】
ここで得られた1.3kb断片、1.21kb断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号4および配列番号7で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたPCR法によって得られた産物を1.5%アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来LDH遺伝子及びTRP1遺伝子が連結された2.5kbのDNA断片を常法に従い調整した。この2.5kbのDNA断片で出芽酵母NBRC10505株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。【０１１２】
得られた形質転換細胞がヒト由来LDH遺伝子を酵母ゲノム上のPDC1プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムDNAを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号8および配列番号9で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたPCRにより0.7kbの増幅DNA断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、SC培地(METHODS IN YEAST GENETICS、2000 EDITION、CSHL PRESS)で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でHPLC法により乳酸量を測定することで確認した。【０１１３】
カラム:Shim-PackSPR-H(島津社製)
移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/min)
反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ピストリス、0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/min)
検出方法:電気伝導度
温度:45℃。【０１１４】
また、L-乳酸の光学純度測定は以下の条件でHPLC法により測定した。【０１１５】
カラム:TSK-gel EnantioL1(東ソー社製)
移動相:1mM 硫酸銅水溶液
流速:1.O m1/min
検出方法:UV254nm
温度:30℃。【０１１６】
また、L-乳酸の光学純度は次式で計算される。【０１１７】
光学純度(%)=100×(L-D)/(L+D)
ここで、LはL-乳酸の濃度、DはD-乳酸の濃度を表す。【０１１８】
HPLC分析の結果、4g/LのL-乳酸が検出され、D-乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がL-乳酸生産能力を持つことを確認した。得られた形質転換細胞を酵母SW-1株として、続く実施例に用いた。【０１１９】
参考例2
多孔性中空糸膜の製作1
平均一次粒径０．０１６μｍ、比表面積１１０ｍ２／ｇの疎水性シリカ（日本アエロジル社製；ＡＥＲＯＳＩＬ（登録商標）−Ｒ９７２）２３重量％、フタル酸ジオクチル３０．８重量％、フタル酸ジブチル６．２重量％をヘンシェルミキサーで混合し、これに重量平均分子量２８００００のポリフッ化ビニリデン（呉羽化学工業（株）製：ＫＦポリマー＃１０００（商品名））４０重量％を添加し、再度ヘンシェルミキサーで混合した。得られた混合物を４８ｍｍφ二軸押し出し機で更に溶融混練し、ペレットにした。【０１２０】
このペレットを３０ｍｍφ二軸押し出し機に連続的に投入し、押し出し機先端にとりつけた円環状ノズルより、中空部内にエアーを供給しつつ、２４０℃にて溶融押し出しした。押し出し物を、約２０ｃｍの空中走行を経て４０℃の水槽中に２０ｍ／ｍｉｎの紡速で通過させることで冷却固化して中空糸膜を得た。この中空糸膜を連続的に一対の第一の無限軌道式ベルト引き取り機で２０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り、空間温度４０℃に制御した第一の加熱槽（０．８ｍ長）を経由した後、２０℃の冷却水槽の水面に位置する一対の周長が約０．２０ｍであり且つ４山の凹凸ロールに１７０ｒｐｍの回転速度で中空糸膜を連続的に挟んで周期的に曲げつつ冷却し、その後、更に第一の無限軌道式ベルト引き取り機と同様な第二の無限軌道式ベルト引き取り機で４０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り２．０倍に延伸した。そして更に、空間温度８０℃に制御した第二の加熱槽（０．８ｍ長）を出た後に、第三の無限軌道式ベルト引き取り機で３０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り、１．５倍まで収縮させた後、周長約３ｍのカセで巻き取った。【０１２１】
次いで、この中空糸膜を束として３０℃の塩化メチレン中に１時間浸漬させ、これを５回繰り返してフタル酸ジオクチル、フタル酸ジブチルを抽出した後、乾燥させた。続いて、５０重量％エタノール水溶液に３０分間浸漬し、更に水中に移して３０分間浸漬して、中空糸膜を水で濡らした。更に、４０℃の５重量％苛性ソーダ水溶液中へ１時間浸漬させ、これを２回行った後、４０℃の温水へ１時間浸漬することによる水洗を１０回行い、疎水性シリカを抽出した後、乾燥した。【０１２２】
得られた中空糸膜は、ハーフドライ法による平均孔径は０．２９μｍ、バブルポイント法による最大孔径は０．３７μｍ、純水透過係数は５.８ ｍ３／ｍ2／hr、引っ張り破断強度は８．５ＭＰａ、引っ張り破断伸度は１３５％、捲縮度は２．４５、空孔率７３％、臨界表面張力は５４ｍＮ／ｍであった。結果を表１にまとめた。【０１２３】
【表１】
2011093241.tif 000003
【０１２４】
参考例3
多孔性中空糸膜の製作2
疎水性シリカを２０重量％、重量平均分子量２９００００のポリフッ化ビニリデン（ＳＯＬＶＡＹ社製:Ｓｏｌｅｆ（登録商標）６０１０）を４３重量％使用した以外には、参考例2と同様に混合物を作製した。得られた混合物を参考例2と同様に溶融および押し出しを行い、中空糸膜を得た。【０１２５】
この中空糸膜を連続的に一対の第一の無限軌道式ベルト引き取り機で２０m/minの速度で引き取り、空間温度８０℃に制御した第一の加熱槽（０．８m長）を経由して、更に第一の無限軌道式ベルト引き取り機と同様な第二の無限軌道式ベルト引き取り機で４０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り２倍に延伸した。そして更に、空間温度８０℃に制御した第二の加熱槽（０．８ｍ長）を出た後に、第三の無限軌道式ベルト引き取り機で３０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り、１，５倍まで収縮させた後、カセで巻き取った。【０１２６】
次いで、この中空糸膜を参考例2と同様に、塩化メチレン浸漬、５０重量％エタノール水溶液浸漬、水浸漬、５重量％苛性ソーダ水溶液浸漬、温水浸漬を行い、疎水性シリカを抽出した後、得られた中空糸膜をオーブン中で１４０℃・２時間の加熱処理を行った。【０１２７】
得られた中空糸膜は、ハーフドライ法による平均孔径は０．１５μｍ、バブルポイント法による最大孔径は０．２４μｍ、純水透過係数は２．２ｍ３／ｍ2／hr、引っ張り破断強度は１５．２ＭＰａ、引っ張り破断伸度は１００％、捲縮度は１．４２、空孔率６８％、臨界表面張力は５４ｍＮ／ｍであった。結果を表１にまとめた。【０１２８】
参考例4
多孔性中空糸膜の製作3
疎水性シリカを１８重量％、参考例3に使用のポリフッ化ビニリデンを４５重量％使用した以外には、参考例3と同様に混合成分を用いて混合物を作製した。得られた混合物を参考例3と同様に溶融および押し出しを行い、中空糸膜を得た。【０１２９】
得られた中空糸膜を、２０重量％苛性ソーダ水溶液を用いて浸漬を行った以外には、参考例3と同様の処理を行い、中空糸膜を得た。【０１３０】
得られた中空糸膜は、ハーフドライ法による平均孔径は０．１１μｍ、バブルポイント法による最大孔径は０．２３μｍ、純水透過係数は１．２ｍ３／ｍ2／hr、引っ張り破断強度は１８．８ＭＰａ、引っ張り破断伸度は８０％、捲縮度は１．４１、空孔率６５％、臨界表面張力は５１ｍＮ／ｍであった。結果を表１にまとめた。【０１３１】
参考例5
多孔性中空糸膜の製作4
疎水性シリカを２６重量％、フタル酸ジオクチル３３．３重量％、フタル酸ジブチル３．７重量％、参考例3に使用のポリフッ化ビニリデンを３７重量％使用した以外には、参考例3と同様に混合成分を用いて混合物を作製した。得られた混合物を、３５ｍｍφ二軸押し出し機で更に溶融混練してペレットにしたこと、溶融押し出しの温度を２３０℃、４０℃の水槽中に２０ｍ／ｍｉｎの紡速で通過させたこと以外には参考例3と同様の工程を行い、中空糸膜を得た。【０１３２】
この中空糸膜を連続的に一対の第一の無限軌道式ベルト引き取り機で１０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り、空間温度４０℃に制御した第一の加熱槽（０．８ｍ長）を経由した後、更に第一の無限軌道式ベルト引き取り機と同様な第二の無限軌道式ベルト引き取り機で２０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り２．０倍に延伸した。そして更に、空間温度８０℃に制御した第二の加熱槽（０．８ｍ長）を出た後に、２０℃の冷却水槽の水面に位置する一対の周長が約０．２０ｍであり且つ４山の凹凸ロールに１７０ｒｐｍの回転速度で中空糸膜を連続的に挟んで周期的に曲げつつ冷却し、その後、第三の無限軌道式ベルト引き取り機で１５ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り、１．５倍まで収縮させた後、周長約３ｍのカセで巻き取った。【０１３３】
得られた中空糸膜について参考例3と同様、塩化メチレン洗浄、エタノール洗浄、水洗浄、苛性ソーダ処理、水洗浄および１４０℃乾燥を行った。【０１３４】
得られた中空糸膜は、ハーフドライ法による平均孔径は０．９０μｍ、バブルポイント法による最大孔径は１．２２μｍ、純水透過係数は１４．４ｍ３／ｍ2／hr、引っ張り破断強度は１３．７ＭＰａ、引っ張り破断伸度は１２０％、捲縮度は２．４３、空孔率７２％、臨界表面張力は５３ｍＮ／ｍであった。結果を表１にまとめた。【０１３５】
参考例6
多孔性中空糸膜の製作5
疎水性シリカ２８重量％、フタル酸ジオクチル３３．３重量％、フタル酸ジブチル３．７重量％、参考例3に使用のポリフッ化ビニリデンを３５重量％使用した以外には、参考例2と同様に混合物を作製した。得られた混合物を３５ｍｍφ二軸押し出し機で更に溶融混練し、ペレットにした。【０１３６】
このペレットを３０ｍｍφ二軸押し出し機に連続的に投入し、押し出し機先端にとりつけた円環状ノズルより、中空部内にエアーを供給しつつ、２３０℃にて溶融押し出しした。押し出し物を、約２０ｃｍの空中走行を経て４０℃の水槽中に１０ｍ／ｍｉｎの紡速で通過させることで冷却固化して中空糸膜を得た。【０１３７】
次いで、この中空糸膜を束として３０℃の塩化メチレン中に１時間浸漬させ、これを５回繰り返してフタル酸ジオクチル、フタル酸ジブチルを抽出した後、乾燥させた。続いて、５０重量％エタノール水溶液に３０分間浸漬し、更に水中に移して３０分間浸漬して、中空糸膜を水で濡らした。更に、４０℃の２０重量％苛性ソーダ水溶液中へ１時間浸漬させ、これを２回行った後、４０℃の温水へ１時間浸漬することによる水洗を１０回行い、疎水性シリカを抽出した後、乾燥した。【０１３８】
この中空糸膜を連続的に一対の第一の無限軌道式ベルト引き取り機で１０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り、空間温度４０℃に制御した第一の加熱槽（０．８ｍ長）を経由した後、２０℃の冷却水槽の水面に位置する一対の周長が約０．２０ｍであり且つ４山の凹凸ロールに１７０ｒｐｍの回転速度で中空糸膜を連続的に挟んで周期的に曲げつつ冷却し、その後、更に第一の無限軌道式ベルト引き取り機と同様な第二の無限軌道式ベルト引き取り機で２０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り２．０倍に延伸した。そして更に、空間温度８０℃に制御した第二の加熱槽（０．８ｍ長）を出た後に、第三の無限軌道式ベルト引き取り機で１５ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り、１．５倍まで収縮させた後、周長約３ｍのカセで巻き取った。得られた中空糸膜は１００℃で１時間乾燥した。【０１３９】
得られた中空糸膜は、ハーフドライ法による平均孔径は０．２７μｍ、バブルポイント法による最大孔径は０．３５μｍ、純水透過係数は１０.２ ｍ３／ｍ2／hr、引っ張り破断強度は６．７ＭＰａ、引っ張り破断伸度は１３０％、捲縮度は１．７４、空孔率７２％、臨界表面張力は４７ｍＮ／ｍであった。結果を表１にまとめた。【０１４０】
参考例7
多孔性中空糸膜の製作6
疎水性シリカ２２重量％、参考例3に使用のポリフッ化ビニリデンを４１重量％使用した以外には、参考例3と同様に混合物を作製した。その後、参考例3と同様に押しだしおよび紡糸を行った。得られた中空糸膜を連続的に一対の第一の無限軌道式ベルト引き取り機で２０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り、空間温度８０℃に制御した第一の加熱槽（０．８ｍ長）を経由した後、２０℃の冷却水槽の水面に位置する一対の周長が約０．２０ｍであり且つ４山の凹凸ロールに１７０ｒｐｍの回転速度で中空糸膜を連続的に挟んで周期的に曲げつつ冷却し、その後、更に第一の無限軌道式ベルト引き取り機と同様な第二の無限軌道式ベルト引き取り機で４０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り２．０倍に延伸した。その後、参考例3と同様に延伸、収縮、洗浄および乾燥を行い中空糸膜を得た。【０１４１】
エチレンビニルアルコール共重合体（日本合成化学工業製：ソアノール（登録商標）ＥＴ３８０３、エチレン含量３８モル％）を、水とイソプロピルアルコールの５０重量％ずつの混合溶剤１００重量部に対して３重量部加熱混合し溶解させた。得られたエチレンビニルアルコール共重合体溶液中（６８℃）に、得られた加熱処理後の中空糸膜を両端の開口した１５０ｃｍの中空糸膜１００本からなる糸束にして５分間完全に浸漬し、溶液中から取り出した中空糸膜束を３０分間室温で風乾し、次いで６０℃のオーブンで１時間乾燥することで、エチレンビニルアルコール共重合体被覆ポリフッ化ビニリデン中空糸膜を得た。【０１４２】
得られた中空糸膜は、ハーフドライ法による平均孔径は０．１３μｍ、バブルポイント法による最大孔径は０．２４μｍ、純水透過係数は３.２ ｍ３／ｍ2／hr、引っ張り破断強度は１１ＭＰａ、引っ張り破断伸度は１００％、捲縮度は１．７４、空孔率７０％、臨界表面張力は７３ｍＮ／ｍであった。結果を表１にまとめた。【０１４３】
参考例8
多孔性中空糸膜の製作7
疎水性シリカ２５重量％、参考例3に使用のポリフッ化ビニリデンを３８重量％使用した以外には、参考例6と同様に混合物を作製した。その後、参考例6と同様に押し出し、紡糸、塩化メチレン洗浄、エタノール洗浄、水洗浄を行った。その後、得られた中空糸膜を連続的に一対の第一の無限軌道式ベルト引き取り機で１０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り、空間温度４０℃に制御した第一の加熱槽（０．８ｍ長）を経由した後、更に第一の無限軌道式ベルト引き取り機と同様な第二の無限軌道式ベルト引き取り機で２０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り２．０倍に延伸した。その後、参考例6と同様に、１００℃で１時間の乾燥まで行った。【０１４４】
得られた中空糸膜を、参考例7と同様、エチレンビニルアルコール共重合体を用いてエチレンビニルアルコール共重合体被覆ポリフッ化ビニリデン中空糸膜を作製した。【０１４５】
得られた中空糸膜は、ハーフドライ法による平均孔径は０．２２μｍ、バブルポイント法による最大孔径は０．３４μｍ、純水透過係数は８.８ ｍ３／ｍ2／hr、引っ張り破断強度は１３．７ＭＰａ、引っ張り破断伸度は１２０％、捲縮度は１．４３、空孔率７２％、臨界表面張力は７０ｍＮ／ｍであった。結果を表１にまとめた。【０１４６】
参考例9
多孔性中空糸膜の製作8
疎水性シリカ８重量％、フタル酸ジオクチル３３．３重量％、フタル酸ジブチル３．７重量％、参考例3に使用のポリフッ化ビニリデンを５５重量％使用した以外には、参考例2と同様に混合物を作製した。得られた混合物を３５ｍｍφ二軸押し出し機で更に溶融混練し、ペレットにした。【０１４７】
このペレットを３０ｍｍφ二軸押し出し機に連続的に投入し、押し出し機先端にとりつけた円環状ノズルより、中空部内にエアーを供給しつつ、２３０℃にて溶融押し出しした。押し出し物を、約２０ｃｍの空中走行を経て４０℃の水槽中に１０ｍ／ｍｉｎの紡速で通過させることで冷却固化して中空糸膜を得た。この中空糸膜を連続的に一対の第一の無限軌道式ベルト引き取り機で２０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り、空間温度４０℃に制御した第一の加熱槽（０．８ｍ長）を経由した後、周長約３ｍのカセで巻き取った。【０１４８】
次いで、この中空糸膜を束として３０℃の塩化メチレン中に１時間浸漬させ、これを５回繰り返してフタル酸ジオクチル、フタル酸ジブチルを抽出した後、乾燥させた。続いて、５０重量％エタノール水溶液に３０分間浸漬し、更に水中に移して３０分間浸漬して、中空糸膜を水で濡らした。更に、４０℃の５重量％苛性ソーダ水溶液中へ１時間浸漬させ、これを２回行った後、４０℃の温水へ１時間浸漬することによる水洗を１０回行い、疎水性シリカを抽出した後、乾燥した。得られた中空糸膜をオーブン中で１４０℃・２時間の加熱処理を行った。【０１４９】
得られた中空糸膜は、ハーフドライ法による平均孔径は０．２０μｍ、バブルポイント法による最大孔径は０．２８μｍ、純水透過係数は０.８ ｍ３／ｍ2／hr、引っ張り破断強度は２１ＭＰａ、引っ張り破断伸度は５０％、捲縮度は１．３５、空孔率６６％、臨界表面張力は４３ｍＮ／ｍであった。結果を表１にまとめた。【０１５０】
参考例10
多孔性中空糸膜の製作9
疎水性シリカ３３重量％、参考例3に使用のポリフッ化ビニリデンを３０重量％使用した以外には、参考例5と同様に混合物を作製した。得られた混合物を用いて、紡糸速度を２０ｍ／ｍｉｎにした以外には、参考例9と同様に紡糸までを行った。得られた中空糸膜を、連続的に一対の第一の無限軌道式ベルト引き取り機で１０ｍ／ｍｉｎの速度で引き取り、空間温度８０℃に制御した第一の加熱槽（０．８ｍ長）を経由した後、周長約３ｍのカセで巻き取った。その後、得られた中空糸膜を２０℃の冷却水槽の水面に位置する一対の周長が約０．２０ｍであり且つ４山の凹凸ロールに１７０ｒｐｍの回転速度で中空糸膜を連続的に挟んで周期的に曲げつつ冷却することを２回繰り返し行った。その後、参考例4と同様に、塩化メチレン洗浄、エタノール洗浄、苛性ソーダ処理、水洗浄および乾燥を行った。【０１５１】
得られた中空糸膜は、ハーフドライ法による平均孔径は１．０６μｍ、バブルポイント法による最大孔径は１．６７μｍ、純水透過係数は１９.０ ｍ３／ｍ2／hr、引っ張り破断強度は５．４ＭＰａ、引っ張り破断伸度は１８０％、捲縮度は２．６６、空孔率７２％、臨界表面張力は４４ｍＮ／ｍであった。結果を表１にまとめた。【０１５２】
参考例11
多孔性中空糸膜の製作10
参考例9と同様の混合物を用いて、同様の方法で中空糸膜を作製して乾燥した後、参考例7と同様、エチレンビニルアルコール共重合体を用いてエチレンビニルアルコール共重合体被覆ポリフッ化ビニリデン中空糸膜を作製した。【０１５３】
得られた中空糸膜は、ハーフドライ法による平均孔径は０．２２μｍ、バブルポイント法による最大孔径は０．３２μｍ、純水透過係数は０．９ ｍ３／ｍ2／hr、引っ張り破断強度は２１．２ＭＰａ、引っ張り破断伸度は６５％、捲縮度は１．３２、空孔率６７％、臨界表面張力は６３ｍＮ／ｍであった。結果を表１にまとめた。【０１５４】
参考例12
多孔性中空糸膜の製作11
参考例10と同様の混合物を用いて、同様の方法で中空糸膜を作製して乾燥した後、参考例7と同様、エチレンビニルアルコール共重合体を用いてエチレンビニルアルコール共重合体被覆ポリフッ化ビニリデン中空糸膜を作製した。【０１５５】
得られた中空糸膜は、ハーフドライ法による平均孔径は０．９６μｍ、バブルポイント法による最大孔径は１．３２μｍ、純水透過係数は２１．０ ｍ３／ｍ2／hr、引っ張り破断強度は５．８ＭＰａ、引っ張り破断伸度は１８８％、捲縮度は２．５８、空孔率６９％、臨界表面張力は６８ｍＮ／ｍであった。結果を表１にまとめた。【０１５６】
実施例1
酵母を用いた連続発酵によるL-乳酸の製造1
図1の連続発酵装置と表2に示す組成の酵母乳酸発酵培地を用い、L-乳酸の製造を行った。培地は高圧蒸気滅菌(121℃、15分)して用いた。分離膜モジュール部材としてはポリカーボネート樹脂の成型品を用いた。分離膜としては参考例2で作製した多孔性中空糸膜を用いた。実施例1における運転条件は、特に断らない限り、以下のとおりである。【０１５７】
【表２】
2011093241.tif 000004
【０１５８】
発酵槽容量:2(L)
膜分離モジュール容量:0.02(L)
使用分離膜: 参考例2のポリフッ化ビニリデン中空糸膜
膜分離モジュール有効ろ過面積:200（平方cm）
発酵槽温度:30(℃)
発酵槽通気量:0.05(L/min)
発酵槽攪拌速度:100(rpm)
pH調整:5N NaOHによりpH5に調整
乳酸発酵培地供給:発酵槽液面レベル制御
発酵液循環装置による循環液量:4(L/min)
ろ過流量:170mL/h（一定）
微生物として参考例1で造成した酵母SW-1株を用い、培地として表2に示す組成の乳酸発酵培地を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例1に示したHPLCを用い、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーC(和光純薬)を用いた。【０１５９】
まず、SW-1株を試験管で5mLの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した(前々々培養)。得られた培養液を新鮮な乳酸発酵培地100mLに植菌し、500mL容坂口フラスコで24時間、30℃で振とう培養した(前々培養)。前々培養液を、図1に示す連続発酵装置の1.5Lの乳酸発酵培地に植菌し、発酵槽1を付属の攪拌機5によって攪拌し、発酵槽1の通気量の調整、発酵槽温度、pH調整を行い、発酵液循環ポンプ10を稼働させることなく、24時間培養を行った(前培養)。前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプ10を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、乳酸発酵培地の連続供給を行い、発酵槽液面のレベル制御によって発酵液量を2Lとなるようしながら連続発酵によるL-乳酸の製造を行った。適宜、膜ろ過液中の生産されたL-乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。【０１６０】
400時間の連続発酵試験を行った結果を表3に示す。図1に示す連続発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したL-乳酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、10kPa以下で推移した。【０１６１】
【表３】
2011093241.tif 000005
【０１６２】
実施例2
酵母を用いた連続発酵によるL-乳酸の製造2
分離膜としては参考例3で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例1と同様のL-乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表3に示す。その結果、安定したL-乳酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、10kPa以下で推移した。【０１６３】
実施例3
酵母を用いた連続発酵によるL-乳酸の製造3
分離膜としては参考例4で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例1と同様のL-乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表3に示す。その結果、安定したL-乳酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、10kPa以下で推移した。【０１６４】
実施例4
酵母を用いた連続発酵によるL-乳酸の製造4
分離膜としては参考例5で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例1と同様のL-乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表3に示す。その結果、安定したL-乳酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、10kPa以下で推移した。【０１６５】
実施例5
酵母を用いた連続発酵によるL-乳酸の製造5
分離膜としては参考例6で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例1と同様のL-乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表3に示す。その結果、安定したL-乳酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、10kPa以下で推移した。【０１６６】
実施例6
酵母を用いた連続発酵によるL-乳酸の製造6
分離膜としては参考例7で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例1と同様のL-乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表3に示す。その結果、安定したL-乳酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、10kPa以下で推移した。【０１６７】
実施例7
酵母を用いた連続発酵によるL-乳酸の製造7
分離膜としては参考例8で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例1と同様のL-乳酸連続発酵試験を行った。その結果を表3に示す。その結果、安定したL-乳酸の連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の全期間中の膜間差圧は、10kPa以下で推移した。【０１６８】
比較例1
酵母を用いた連続発酵によるL-乳酸の製造8
分離膜としては参考例9で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例1と同様のL-乳酸連続発酵試験を行った。培養開始後36時間で、膜間差圧が20kPaを超え膜の閉塞が発生したため、連続発酵を停止した。このことから、参考例9で作製した多孔性中空糸膜膜は、L-乳酸の製造に不適であることが明らかになった。【０１６９】
比較例2
酵母を用いた連続発酵によるL-乳酸の製造9
分離膜としては参考例10で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例1と同様のL-乳酸連続発酵試験を行った。培養開始後23時間で、膜間差圧が20kPaを超え膜の閉塞が発生したため、連続発酵を停止した。このことから、参考例10で作製した多孔性中空糸膜膜は、L-乳酸の製造に不適であることが明らかになった。【０１７０】
比較例3
酵母を用いた連続発酵によるL-乳酸の製造10
分離膜としては参考例11で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例1と同様のL-乳酸連続発酵試験を行った。培養開始後40時間で、膜間差圧が20kPaを超え膜の閉塞が発生したため、連続発酵を停止した。このことから、参考例11で作製した多孔性中空糸膜膜は、L-乳酸の製造に不適であることが明らかになった。【０１７１】
比較例4
酵母を用いた連続発酵によるL-乳酸の製造11
分離膜としては参考例12で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例1と同様のL-乳酸連続発酵試験を行った。培養開始後28時間で、膜間差圧が20kPaを超え膜の閉塞が発生したため、連続発酵を停止した。このことから、参考例12で作製した多孔性中空糸膜膜は、L-乳酸の製造に不適であることが明らかになった。【０１７２】
実施例8
連続発酵によるエタノールの製造
図1の連続発酵装置と表4に示す組成のエタノール発酵培地を用い、エタノールの製造を行った。該培地は高圧蒸気滅菌(121℃、15分)して用いた。分離膜としては参考例4で作製した多孔性中空糸膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、実施例1と同様の連続発酵試験を行った。【０１７３】
【表４】
2011093241.tif 000006
【０１７４】
使用分離膜:参考例4のポリフッ化ビニリデン中空糸膜
発酵槽温度:30(℃)
微生物としてNBRC10505株を用い、培地として表4に示す組成のエタノール発酵培地を用い、生産物であるエタノールの濃度の評価には、エタノール濃度は、ガスクロマトグラフ法により定量した。Shimadzu GC-2010 キャピラリーGC TC-1(GL science) 15 meter L. * 0.53 mm I.D., df1.5μmを用いて、水素炎イオン化検出器により検出・算出して、評価した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーC(和光純薬)を用いた。【０１７５】
まず、NBRC10505株を試験管で5mLのエタノール発酵培地で一晩振とう培養した(前々々培養)。得られた培養液を新鮮なエタノール発酵培地100mLに植菌し、500mL容坂口フラスコで24時間、30℃で振とう培養した(前々培養)。前々培養液を、図1に示した膜分離型連続発酵装置の1.5Lのエタノール発酵培地に植菌し、発酵槽1を付属の攪拌機5によって100rpmで攪拌し、発酵槽1の通気量の調整、発酵槽温度、pH調整を行い、発酵液循環ポンプ10を稼働させることなく、24時間培養を行った(前培養)。前培養完了後直ちに、発酵液循環ポンプ10を稼働させ、前培養時の運転条件に加え、エタノール発酵培地の連続供給を行い、発酵槽液面のレベル制御によって発酵液量を2Lとなるようしながら連続発酵によるエタノールの製造を行った。適宜、膜ろ過液中の生産されたエタノール濃度および残存グルコース濃度を測定した結果を表5に示す。【０１７６】
図1に示す連続発酵装置を用いた本発明の化学品の製造方法により、安定したエタノールの連続発酵による製造が可能であった。連続発酵の期間中の膜間差圧は、10kPa以下で推移した。【０１７７】
【表５】
2011093241.tif 000007
【０１７８】
実施例9
連続発酵によるコハク酸の連続製造
図1に示す連続発酵装置を用いたコハク酸の製造を行った。コハク酸の製造におけるコハク酸およびグルコースは、特に断らない限り、以下の方法で測定した。コハク酸は、発酵液の遠心上清について、HPLC(島津LC10A、RIモニター:RID-10A、カラム:アミネックスHPX-87H)で分析した。カラム温度は50℃、0.01N H2SO4でカラムを平衡化した後、サンプルをインジェクションし、0.01N H2SO4で溶出して分析を行った。グルコースは、グルコースセンサー(BF-4、王子計測機器)を用いて測定した。使用する培地は高圧蒸気滅菌(121℃、15分)して用いた。分離膜としては参考例4で作製した多孔性中空糸膜を用いた。本実施例における運転条件は、特に断らない限り、実施例1と同様の連続発酵試験を行った。【０１７９】
発酵槽温度:39(℃)
発酵槽CO2通気量:10(mL/min)
pH調整:2M Na2CO3でpH6.4に調整
本実施例ではコハク酸の生産能力のある微生物として、アナエロビオスピリラム・サクシニシプロデュセンス(Anaerobiospirillum succiniciproducens)ATCC53488株によるコハク酸の連続製造を行った。【０１８０】
20g/L グルコース、10g/L ポリペプトン、5g/L 酵母エキス、3g/L K2HPO4、1g/L NaCl、1g/L (NH4)2SO4、0.2g/L MgCl2、0.2g/L CaCl2・2H2Oからなる種培養用培地100mLを、125mL容三角フラスコに入れ加熱滅菌した。嫌気グローブボックス内で、30mM Na2CO3 1mLと180mM H2SO4 0.15mLを加え、さらに、0.25g/L システイン・HCl、0.25g/L Na2Sからなる還元溶液0.5mLを加えた後、ATCC53488株を接種し、39℃で一晩静置培養した(前々培養)。図1に示す連続発酵装置の1.5Lのコハク酸発酵培地(表6)に、0.25g/L システイン・HCl、0.25g/L Na2S・9H2Oからなる還元溶液5mLを加えた後、前々培養液50mLを植菌し、発酵槽1を付属の攪拌機5によって200rpmで攪拌し、発酵槽1のCO2通気量の調整、発酵槽温度、pH調整を行い、24時間培養を行った(前培養)。【０１８１】
【表６】
2011093241.tif 000008
【０１８２】
前培養完了後直ちに、コハク酸発酵培地の連続供給を行い、発酵槽液面のレベル制御によって発酵液量を2Lとなるようしながら連続発酵によるコハク酸の製造を行った。適宜、膜ろ過液中の生産されたコハク酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該コハク酸、及びグルコース濃度から算出されたコハク酸生産速度およびコハク酸の生成収率を、表7に示した。すべての連続発酵の全期間中の膜間差圧は、10kPa以下で推移した。【０１８３】
【表７】
2011093241.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法による化学品の製造方法である。本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【符号の説明】
【０１８５】
1  発酵槽
2  分離膜モジュール
3  温度調節器
4  気体供給装置
5  撹拌機
6  差圧計
7  培地供給ポンプ
8  pH調整溶液供給ポンプ
9  pHセンサ・制御装置
10  発酵液循環ポンプ
11  レベルセンサー
12  ろ過ポンプ
21  下部樹脂封止層
22  分離膜束
23  上部樹脂封止層
24  集水パイプ
【図１】
2011093241.tif 000010
【図２】
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【図３】
2011093241.tif 000012
【配列表】
2011093241000001.app
【国際調査報告】
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2011093241.tif 000014
2011093241.tif 000015
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