(57)【要約】  新規な作用機序を有する、抗原虫治療薬を開発すること。  以下の化学式（１）において、Ｒ１は、式（４）のＲ１０−か、式（５）のＲ２０−かであり、Ｒ２は、ＣＨＯ−等であり、Ｒ３は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−等であり、Ｒ４は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−等であり、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基等であり、Ｒ１３は、−ＣＨ２−か、−ＣＨ（−ＯＨ）−か、−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基等であり、Ｒ２３は、−ＣＨ２−か、−ＣＨ（−ＯＨ）−か、−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ２４は、水素原子、ヒドロキシル基、メチル基等であることを特徴とする、化合物又は薬学的に許容できる塩を提供する。2011111804.tif 000029
2011111804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式（１）ないし（３）のいずれか１つの構造を有し、
式（１）ないし（３）において、Ｒ１は、式（４）のＲ１０−か、式（５）のＲ２０−かであり、Ｒ２は、ＣＨＯ−か、ＨＯ−ＣＨ２−か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ３は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ４は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はハロゲン原子であり、Ｒ１３は、−ＣＨ２−か、−ＣＨ（−ＯＨ）−か、−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はハロゲン原子であり、Ｒ２３は、−ＣＨ２−か、−ＣＨ（−ＯＨ）−か、−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ２４は、水素原子、ヒドロキシル基、メチル基、又はハロゲン原子であることを特徴とする、化合物又は薬学的に許容できる塩。
【化１】
2011111804.tif 000019
（１）
【化２】
2011111804.tif 000020
（２）
【化３】
2011111804.tif 000021
（３）
【化４】
2011111804.tif 000022
（４）
【化５】
2011111804.tif 000023
（５）
【請求項２】
以下の化学式（６）又は（７）の構造を有し、
式（６）又は（７）において、Ｒ１は、式（８）のＲ１０−か、式（９）のＲ２０−かであり、Ｒ２は、ＣＨＯ−か、ＨＯ−ＣＨ２−か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ３は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ４は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ５は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−かで、Ｒ６は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はハロゲン原子であり、Ｒ１３は、−ＣＨ２−か、−ＣＨ（−ＯＨ）−か、−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はハロゲン原子であり、Ｒ２３は、−ＣＨ２−か、−ＣＨ（−ＯＨ）−か、−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ２４は、水素原子、ヒドロキシル基、メチル基又はハロゲン原子であることを特徴とする、化合物又は薬学的に許容できる塩。
【化６】
2011111804.tif 000024
（６）
【化７】
2011111804.tif 000025
（７）
【化８】
2011111804.tif 000026
（８）
【化９】
2011111804.tif 000027
（９）
【請求項３】
以下の化学式（１０）の構造を有することを特徴とする、化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【化１０】
2011111804.tif 000028
（１０）
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１つに記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩を生成する薬物前駆体であることを特徴とする、化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１つに記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩を含むことを特徴とする、原虫感染症治療用医薬品組成物。
【請求項６】
５価アンチモン剤、ペンタミジン、アミノサイジン、アムホテリシンＢ、リポソームアムホテリシンＢからなるグループから選択される少なくとも１種類の医薬と、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩とを含み、前記少なくとも１種類の医薬と、請求項１又は４のいずれか１つの化合物又はその薬学的に許容できる塩とを、同時に、あるいは、逐次的に投与することを特徴とする、原虫感染症治療用医薬品組成物。
【請求項７】
前記原虫はリーシュマニア、トリパノソーマ及びマラリアからなるグループから選択される少なくとも１種類の原虫であることを特徴とする、請求項５又は６に記載の原虫感染症治療用医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腔腸動物由来の抗原虫化合物に関し、より具体的には、腔腸動物ヤギＡｃａｎｔｈｏｐｒｉｍｎｏａ  ｃｒｉｓｔａｔａ由来の抗原虫化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
原虫感染症は未解決の重要な疾患である。例えば、リーシュマニア症はサシチョウバエが媒介する節足動物媒介性人畜共通感染症で、１００種類以上の脊椎動物が保虫宿主となる動物由来原虫性疾患である。ヒトへの伝播にはイヌと齧歯類がとくに重要であり、患者数は８８カ国で約１，２００万人にも達し、３億５千万人が感染の危険に曝されている。近年、患者数は増加傾向にあり、年間約２００万人が新規に発症し、アフガニスタンでは難民を含めた２０万人以上の大発生が認められている。リーシュマニアはマクロファージの細胞内で増殖する偏性細胞内寄生性原虫で、人体に感染する種類は２０種以上知られている。ヒトの臨床症状は３つに大きく分かれ、内臓型では造血機能の低下に伴った致死的経過をとり、皮膚型と皮膚・粘膜型での皮膚病変の醜悪さは著しい精神的苦痛をあたえる。このうち最も重篤な症状となる内蔵型リーシュマニア症の大多数が発展途上国で見られ、９０％以上の症例がインド、バングラデシュ、ブラジル、スーダンの４カ国だけで占められている。こうした事情から、ＷＨＯはリーシュマニア症を対策の最も困難な熱帯感染症（カテゴリーＩ）として位置づけ、重点対策１０大熱帯感染症の１つに指定している。【０００３】
海洋無脊椎動物からは、強い生理活性を有し、独特な構造を有する化合物が多く発見されており、医薬品の探索源として期待されている（特許文献１）。本発明の発明者らは、感染症であるリーシュマニア症に対して有効な治療薬の開発を目指して、日本各地で採集した海洋生物について抗原虫活性スクリーニングを行った。前記スクリーニングの結果、深海より採取した腔腸動物ヤギＡｃａｎｔｈｏｐｒｉｍｎｏａ  ｃｒｉｓｔａｔａが抗原虫活性物質を含むことが発見された。本発明は、かかる発見に基づいて完成された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１６１９０２号公開公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
リーシュマニア症の治療にはすべての病型に対して５価アンチモン剤が第１選択薬である。ＷＨＯが推奨する、本剤の使用法は、２０ｍｇアンチモン／ｋｇ／日で３０日間となっている。ＷＨＯは、５価アンチモン剤による初回治療コースで症状の改善を認めない場合は、ペンタミジン、アミノサイジン、アムホテリシンＢ、リポソームアムホテリシンＢ等の第２選択薬に移行することを推奨する。かかるリーシュマニア症の処方の問題の１つは、第１選択薬及び第２選択薬の両方とも注射によって投与しなければならないことである。医療設備が不備な僻地の患者にアンチモン剤を１か月間連続して注射することはきわめて困難と考えられる。そこで、注射によらずに投与することができる新規の抗リーシュマニア症治療薬を開発する必要がある。また、前記アンチモン剤に対する耐性原虫が出現してきており、第２選択薬に対する耐性原虫の出現も時間の問題である。そこで、新規な作用機序を有する、抗リーシュマニア治療薬を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の化学式（１）ないし（３）のいずれか１つの構造を有し、式（１）ないし（３）において、Ｒ１は、式（４）のＲ１０−か、式（５）のＲ２０−かであり、Ｒ２は、ＣＨＯ−か、ＨＯ−ＣＨ２−か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ３は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ４は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はハロゲン原子であり、Ｒ１３は、−ＣＨ２−か、−ＣＨ（−ＯＨ）−か、−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はハロゲン原子であり、Ｒ２３は、−ＣＨ２−か、−ＣＨ（−ＯＨ）−か、−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ２４は、水素原子、ヒドロキシル基、メチル基、又はハロゲン原子である、化合物又はその薬学的に許容できる塩を提供する。
【化１】
2011111804.tif 000003
（１）
【化２】
2011111804.tif 000004
（２）
【化３】
2011111804.tif 000005
（３）
【化４】
2011111804.tif 000006
（４）
【化５】
2011111804.tif 000007
（５）【０００７】
本発明は、以下の化学式（６）又は（７）の構造を有し、式（６）又は（７）において、Ｒ１は、式（８）のＲ１０−か、式（９）のＲ２０−かであり、Ｒ２は、ＣＨＯ−か、ＨＯ−ＣＨ２−か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ３は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ４は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ（−ＯＨ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−かであり、Ｒ５は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−かで、Ｒ６は、水素原子か、ＣＨ３−Ｃ（＝Ｏ）−か、ＣＨ３−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はハロゲン原子であり、Ｒ１３は、−ＣＨ２−か、−ＣＨ（−ＯＨ）−か、−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はハロゲン原子であり、Ｒ２３は、−ＣＨ２−か、−ＣＨ（−ＯＨ）−か、−Ｃ（＝Ｏ）−かであり、Ｒ２４は、水素原子、ヒドロキシル基、メチル基又はハロゲン原子である、化合物又はその薬学的に許容できる塩を提供する。
【化６】
2011111804.tif 000008
（６）
【化７】
2011111804.tif 000009
（７）
【化８】
2011111804.tif 000010
（８）
【化９】
2011111804.tif 000011
（９）【０００８】
本発明は、以下の化学式（１０）の構造を有する化合物又はその薬学的に許容できる塩を提供する。
【化１０】
2011111804.tif 000012
（１０）【０００９】
本発明は、本発明の化合物又はその薬学的に許容できる塩を生成する薬物前駆体である化合物又はその薬学的に許容できる塩を提供する。【００１０】
本発明は、本発明の化合物又はその薬学的に許容できる塩を含む、原虫感染症治療用医薬品組成物を提供する。【００１１】
本発明の原虫感染症治療用医薬品組成物は、５価アンチモン剤、ペンタミジン、アミノサイジン、アムホテリシンＢ、リポソームアムホテリシンＢからなるグループから選択される少なくとも１種類の医薬と、本発明の化合物又はその薬学的に許容できる塩とを含み、前記少なくとも１種類の医薬と、前記本発明の化合物又はその薬学的に許容できる塩とを、同時に、あるいは、逐次的に投与する場合がある。【００１２】
本発明の原虫感染症治療用医薬品組成物は、リーシュマニア、トリパノソーマ及びマラリアからなるグループから選択される少なくとも１種類の原虫感染症治療用医薬品組成物の場合がある。【００１３】
本発明の化合物の化学式において、立体異性体及び／又は幾何学的異性体を区別しない表記の場合には、可能ないずれか１つの立体異性体及び／又は幾何学的異性体か、２つ以上の立体異性体及び／又は幾何学的異性体の混合物かの場合がある。すなわち、本発明の化合物は、特別な立体構造についての記載がある化学結合を例外として、他の化学結合について任意の光学活性体又はラセミ体、ジアステレオ異性体又はそれらの任意の混合物がすべて含まれる。【００１４】
本発明の化合物における「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素のいずれでもよい。【００１５】
本発明の化合物の薬学的に許容できる塩の好ましい例としては、塩酸塩、酢酸塩、又はパラトルエンスルホン酸などの酸付加塩、アンモニウム塩又は有機アミン塩などの塩基付加塩、遊離形態及び塩の形態のペプチド誘導体の任意の水和物及び溶媒和物等があるが、これらに限られない。【００１６】
本発明の医薬品組成物は、本発明の化合物又はその薬学的に許容できる塩の少なくとも１つを有効成分として含む。本発明の医薬品組成物は、少なくとも１つの本発明の化合物又はその薬学的に許容できる塩と、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体とを含む場合がある。本発明の化合物又はその薬学的に許容できる塩を有効成分として含む本発明の医薬品組成物は、リーシュマニア症の予防及び／又は治療を目的として使用することができ、静脈内投与、皮下投与、直腸内投与などの非経口投与のほか、経口投与、経粘膜投与、又は経皮投与により適用可能である。これらの投与経路に適する剤形は当業者に種々知られており、当業者は所望の投与形態に適する剤形を適宜選択し、必要に応じて当業界で利用可能な１種類又は２種類以上の薬学的に許容できる担体又は製剤用添加物を用いて医薬用組成物の形態の製剤を製造することが可能である。例えば、経皮投与には、軟膏その他の塗布剤、湿布その他の貼付剤などが好適である。本発明の医薬の有効成分として、本発明の化合物又はその薬学的に許容できる塩の水和物又は溶媒和物が用いられる場合がある。投与量は特に限定されないが、例えば、経皮投与又は経粘膜投与の場合には単回投与量を０．１〜１０ｍｇとし、経口投与の場合には単回投与量を１〜１００ｍｇとして、一日あたり２〜３回投与することができる。あるいは、通常成人１日あたり約０．１〜１，０００ｍｇ、好ましくは、約１〜３００ｍｇ投与することができる。また、投与量を患者の体重、年齢、遺伝子型、病状等のパラメータと関連づけて設定することができる。【００１７】
本発明の医薬品組成物は、錠剤、顆粒剤（細粒）、カプセル剤、注射剤（点滴静注剤）、貼布剤、坐剤、懸濁液及びエマルジョン、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、点鼻剤、点眼剤等の剤形で提供される場合があるが、これらに限られない。本発明の医薬品組成物は、持続時間を長時間維持することを目的として徐放化される場合がある。【００１８】
本発明の医薬品組成物に含まれる薬学的に許容できる担体又は製剤用添加物には、安定化剤、界面活性剤、可溶化剤、吸着剤等が含まれるが、これらに限られない。本発明の医薬品組成物に含まれる薬学的に許容できる担体又は製剤用添加物は、上記に列挙される本発明の医薬品組成物の剤形に対応して選択される。【００１９】
本発明において原虫とは、ヒトその他のほ乳類に感染し、人間に害を及ぼすいずれかの原生生物をいい、リーシュマニア、マラリア原虫、トキソプラズマ及びトリパノソーマと、アメーバ赤痢、シャーガス病その他の原虫感染症の病原体とを含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】腔腸動物由来の抗原虫活性物質の分離手順を示すフロー・チャート図。
【図２】腔腸動物由来の抗原虫活性物質の分離手順を示すフロー・チャート図。
【図３】画分３−２成分の逆相ＨＰＬＣ分離パターンを示す波形図。
【図４】画分３−３成分の逆相ＨＰＬＣ分離パターンを示す波形図。
【図５】画分１２−３成分の逆相ＨＰＬＣ分離パターンを示す波形図。
【図６】画分１２−１０成分の逆相ＨＰＬＣ分離パターンを示す波形図。
【図７】ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  ＡのＣＯＳＹ及びＨＭＢＣ相関の結果を示す図。
【図８】ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  ＡのＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）分析結果のデータを示す表。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
１．日本近海産海洋無脊椎動物由来抗原虫活性物質のスクリーニング
日本近海で採取された海洋無脊椎動物について、同じ生物種の検体ごとに個体がメタノールで抽出され、濃縮後水とクロロホルムとで二層分配された。得られた水溶性画分及び脂溶性画分の粗抽出物の乾燥重量が測定された。また、以下の生理活性試験から、リーシュマニア原虫に対する抗原虫活性と、ヒト子宮頚癌由来のＨｅＬａ細胞及びマウスリンパ腫由来のＰ３８８細胞での細胞毒性とが測定された。【００２３】
２．生理活性試験
２−１  抗リーシュマニア活性試験
９６穴プレートに１×１０５個のＥＧＦＰ遺伝子導入リーシュマニア原虫（ＬａＥＧＦＰ、Ｏｋｕｎｏ  Ｔら、Ｅｘｐ．  Ａｎｉｍ．  ５２：１０９（２００３））が播種され、培地で希釈されたサンプルを加えて７２時間培養された。その後、蛍光プレートリーダーで各ウェルの蛍光強度が測定され、試験サンプルの抗リーシュマニア活性が算出された。【００２４】
２−２  細胞毒性試験
ヒト子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞及びマウスリンパ腫由来のＰ３８８細胞の懸濁液（１×１０４個／ｍＬ）が９６穴マイクロプレートのＡ〜Ｈ行１〜１１列のウェルに２００μＬずつ分注され、２４時間３７°Ｃで培養された。その後サンプルのメタノール溶液（１ｍｇ／ｍＬ）が９６穴マイクロプレートのＡ行１〜１０列のウェルに２μＬずつ添加され、Ａ行１１列のウェルには陽性対照としてアドリアマイシン（１ｍｇ／ｍＬ）が２μＬ添加された。Ａ〜Ｄ行１２列のウェルには培地のみが２００μＬずつ添加され、Ｅ〜Ｈ行１２列のウェルには１×１０４個／ｍＬの前記細胞の懸濁液が２００μＬずつ添加された。マルチチャンネルピペットを用いて、Ａ行の各列のウェルの培養液が５０μＬ吸引され、Ｂ行の各列のウェルに添加され、次に、Ｂ行の各列のウェルの培養液が５０μＬ吸引され、Ｃ行の各列のウェルに添加され、というように５倍希釈をＡ列からＨ列まで順に行って、サンプルが８段階に希釈された。７２時間の培養後、ＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル・テトラゾリウム）１ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液が各ウェルに５０μＬずつ添加された。３時間の培養後、各ウェルの培養液が全て除去され、ＤＭＳＯが１５０μＬずつ添加された。各ウェルでＤＭＳＯに溶出した色素の吸光度がマルチウェルプレートリーダによって測定され、細胞の半数が死滅する濃度ＩＣ５０値が決定された。【００２５】
３．結果
腔腸動物ヤギＡｃａｎｔｈｏｐｒｉｍｎｏａ  ｃｒｉｓｔａｔａの検体（検体コード番号：Ｃ０７１１０）は、鹿児島県屋久島新曽根（北緯２９°４６’５５”、東経１３０°２１’９２”水深１３８ｍ〜北緯２９°４６’７１”、東経１３０°２２’０６”、水深１３５ｍ）でドレッジ採取された。検体Ｃ０７１１０と、同時にスクリーニングされた種名未同定の海綿動物の検体（検体コード番号：Ｓ０７１６１）とについてのスクリーニング結果を表１に示す。【００２６】
【表１】
2011111804.tif 000013
【００２７】
表１に示すとおり、検体Ｃ０７１１０の脂溶性画分のリーシュマニア原虫に対するＩＣ５０値は１．１μｇ／ｍＬだが、ヒトＨｅＬａ細胞及びマウスＰ３８８細胞に対するＩＣ５０値は１０μｇ／ｍＬであった。すなわちこの画分の抗原虫活性は、ヒト及びマウスに対する細胞毒性に比べて約１０倍選択性が高い。これに対し、検体Ｓ０７１６１の脂溶性画分のリーシュマニア原虫に対するＩＣ５０値は０．６μｇ／ｍＬでＣ０７１１０より高いが、ヒトＨｅＬａ細胞及びマウスＰ３８８細胞に対するＩＣ５０値が０．０８μｇ／ｍＬで抗原虫活性より高いため、選択性に問題があった。そこで以下では、Ｃ０７１１０からの抗リーシュマニア原虫活性物質単離を行った。
【実施例２】
【００２８】
新規抗原虫活性物質の単離
１．画分５−１０
検体Ｃ０７１１０の腔腸動物ヤギ類９０ｇ由来の抗原虫活性物質の分離手順が図１及び図２に示される。図１を参照して、動物個体がメタノールで抽出され、濃縮後水とクロロホルムとで二層分配された。水層はさらにｎ−ブタノールで抽出され、得られたｎ−ブタノール層はクロロホルム層と混合され、濃縮された。このエキス画分がＫｕｐｃｈａｎ分画（Ｋｕｐｃｈａｎ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３８：１７８−１７９（１９７３）．）に付され、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、６０％メタノール可溶性画分２−３が得られた。前記２−３画分が、ＯＤＳフラッシュカラムクロマトグラフィー［５０％メタノール、７０％メタノール、７０％アセトニトリル、８５％アセトニトリル、メタノール、クロロホルム／メタノール／水（６：４：１）］にて分画された。この画分の中で強い抗リーシュマニア活性を示した７０％メタノール画分（３−２画分、７６．８ｍｇ、このうち７１．２ｍｇがさらなる分離に用いられた。）が、最終的にＣ１８カラム（７０−９０％メタノール）を用いる逆層ＨＰＬＣで分画された。図３は、画分３−２がＣＯＳＭＯＳＩＬ−５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩが充填された直径２ｃｍ、長さ２５ｃｍのカラムに適用され、流速毎分６ｍＬの７０％から９０％までのメタノール勾配で分離された結果を示す波形図である。図３の縦軸は２２０ｎｍの紫外線の吸光度の相対値で、図３の横軸は右から左に保持時間の経過を示す。横軸の矢印は３分間を示す。太線で示されたピーク画分５−１０の収量は１９．７ｍｇであった。画分５−１０はさらなる分析により単一物質からなることが示された。そこで画分５−１０は機器分析に供された。【００２９】
２．画分１３−２及び１３−４
前記ＯＤＳフラッシュカラムクロマトグラフィーの７０％アセトニトリル画分（３−３）にも前記７０％メタノール画分（３−２）と同等の活性が認められた。Ｃ１８カラム（７０−９０％メタノール）を用いる逆層ＨＰＬＣで分画された結果を図４に示す。図４は、画分３−３がＣＯＳＭＯＳＩＬ−５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩが充填された直径２ｃｍ、長さ２５ｃｍのカラムに適用され、流速毎分８ｍＬの７０％から９０％までのメタノール勾配で分離された結果を示す波形図である。図４の縦軸は２２０ｎｍの紫外線の吸光度の相対値で、図４の横軸は右から左に保持時間の経過を示す。横軸の矢印は６分間を示す。太線で示されたピーク画分１２−３、１２−７及び１２−１０の収量は、それぞれ、２．５ｍｇ、３．４ｍｇ及び１．２ｍｇであった。画分１２−３、１２−７及び１２−１０からの抗原虫活性成分の分離手順は図２に示される。図４を参照して、画分１２−３、１２−７及び１２−１０がＣ１８カラムを用いる逆層ＨＰＬＣで分画された。画分１２−３はＣＯＳＭＯＳＩＬ−５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩが充填された直径１ｃｍ、長さ２５ｃｍのカラムに適用され、流速毎分２ｍＬの５０％から７０％までのメタノール勾配で分離された。図５は、画分１２−３がＣＯＳＭＯＳＩＬ−５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩが充填された直径１ｃｍ、長さ２５ｃｍのカラムに適用され、流速毎分２ｍＬの５０％から７０％までのメタノール勾配で分離された結果を示す波形図である。図５の縦軸は２２０ｎｍの紫外線の吸光度の相対値で、図５の横軸は右から左に保持時間の経過を示す。横軸の矢印は６分間を示す。画分１２−３の収量の約半分がカラム分離に用いられ、太線で示されたピーク画分１３−２及び１３−４の収量は、それぞれ、０．２ｍｇ及び０．３ｍｇであった。ピーク画分１３−２及び１３−４には抗原虫活性が認められた。画分１３−２及び１３−４はさらなる分析により単一物質からなることが示された（図示されない）。そこで画分１３−２及び１３−４は機器分析に供された。【００３０】
３．画分１２−７
画分１２−７はさらなる分析により単一物質からなることが示された（図示されない）。そこで画分１２−７は機器分析に供された。【００３１】
４．画分１４−１及び１４−２
画分１２−１０はＣＯＳＭＯＳＩＬ−５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩが充填された直径１ｃｍ、長さ２５ｃｍのカラムに適用され、流速毎分２ｍＬの６５％から７５％までのメタノール勾配で分離された。図６は、画分１２−１０がＣＯＳＭＯＳＩＬ−５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩが充填された直径１ｃｍ、長さ２５ｃｍのカラムに適用され、流速毎分２ｍＬの６５％から７５％までのメタノール勾配で分離された結果を示す波形図である。図６の縦軸は２２０ｎｍの紫外線の吸光度の相対値で、図６の横軸は右から左に保持時間の経過を示す。横軸の矢印は６分間を示す。画分１２−１０の収量の約半分がカラム分離に用いられ、太線で示されたピーク画分１４−１及び１４−２の収量は、それぞれ、０．８ｍｇ及び０．２ｍｇであった。画分１４−１及び１４−２には抗原虫活性が認められた。画分１４−１及び１４−２はさらなる分析により単一物質からなることが示された（図示されない）。そこで画分１４−１及び１４−２は機器分析に供された。
【実施例３】
【００３２】
新規抗原虫活性物質の構造解析
１．画分５−１０
抗リーシュマニア活性物質画分５−１０の機器分析データは以下のとおりであった。［α］２１．７Ｄ  ＋９０．５°（ｃ  ０．２２，  ＭｅＯＨ）；ＩＲ  ２９３１、１７５５、１６８１、１６１６、１４５４、１３７１、１３４０、１２０９、１１７６、１１０８、１０７６、１０１５  ｃｍ−１  ；ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  ２３１  ｎｍ  （ｌｏｇε  ４．２８）；ＦＡＢＭＳ  ｍ／ｚ  ４３１［Ｍ＋Ｈ］＋、４５３［Ｍ＋Ｎａ］＋：ＨＲＦＡＢＭＳ  ｍ／ｚ  ４３１．２０８９（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２４Ｈ３１Ｏ７  ４３１．２０７０）【００３３】
高解像高速原子衝撃質量分析（ＨＲＦＡＢＭＳ）の結果、画分５−１０として単離された抗リーシュマニア活性物質の分子式はＣ２４Ｈ３０Ｏ７であることがわかった。１Ｈ  ＮＭＲスペクトル分析の結果、前記抗リーシュマニア活性物質は、２個のアセチル基（δＨ  ２．１０、２．０５）と、１個のアルデヒド基（δＨ  ９．２７）と、２個のメチル基（δＨ  １．７５、１．６８）とを有することが示された。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル分析結果から、２４本のスペクトルが確認され、前記抗リーシュマニア活性物質は共役ケトン基（δ  １９８．２）を有することがわかった。１Ｈ−１Ｈ相関2次元ＮＭＲスペクトル分析（ＣＯＳＹ）の結果、３つのスピン系が得られた。ＨＭＢＣ分析の結果、前記アルデヒド基からＣ−６（δ  １５３．４）、Ｃ−７（δ  １４４．９）、Ｃ−８（δ  ２１．２）に相関がみられたことから、前記抗リーシュマニア活性物質において、前記アルデヒド基はＣ−７に結合していることがわかった。また、Ｈ−１８（δＨ  ６．９８）からアセチル基のカルボニル炭素へ相関が見られることから、前記抗リーシュマニア活性物質の前記アセチル基の１個は酸素原子を介してＣ−１８に結合していることがわかった。また、Ｈ−１８からＣ−１０（δ  ２８．８）、Ｃ−１１（δ  １２０．６）、Ｃ−１１ａに相関が見られることから、２つのスピン相関系がつながり、９員環を形成することがわかった。一方、Ｈ−１（δ  ５．８６）からアセチル基へ相関が見られたことから、前記アセチル基のもう１個は酸素原子を介してＣ−１に結合していることがわかった。Ｈ−３からＣ−４（δ  １２０．２）、Ｃ−４ａ（δ  ３５．９）、Ｃ−１（δ  ９４．５）への相関と、Ｈ−３（δＨ  ７．６８）及びＨ−１（δＨ  ５．８６）のケミカルシフトとから、前記抗リーシュマニア活性物質はジヒドロピラン環構造を持つことがわかった。前記２個のメチル基（Ｈ−１６及びＨ−１７）からＣ−１５（δ  １３４．９）、Ｃ−１４（δ  １１６．９）への相関が見られることから、前記２個のメチル基はＣ−１５へ結合していることがわかった。Ｈ−３、Ｈ−１３ａ、Ｈ−１３ｂからＣ−１２（δ  １９８．２）への相関が見られることから、前記共役ケトン基はＣ−１３とＣ−４の間に位置していることがわかった。図７はＣＯＳＹ及びＨＭＢＣ相関の結果を示す。図８は前記抗リーシュマニア活性物質のＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）分析結果のデータを示す。以上の分析結果に基づいて、前記抗リーシュマニア活性物質は、以下の化学式（１１）で表される構造を有する新規Ｘｅｎｉｃａｎｅ型テルペノイドと決定された。この物質は出所の生物種名から、ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａと命名された。【００３４】
【化１１】
2011111804.tif 000014
【００３５】
前記抗リーシュマニア活性物質の相対配置について、Ｈ−１１ａとＨ−１及びＨ−４ａとの間の結合定数が大きい（Ｊ＝９．５、１１．４Ｈｚ）ことから、これらはアキシャルプロトンであり、互いにａｎｔｉの関係にあることが示唆された。【００３６】
２．画分１２−７
実施例２で説明されたＣ１８カラムを用いる逆層ＨＰＬＣによって、画分１２−７はｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａと保持時間が同じであるため、構造も同一であると結論された。【００３７】
３．画分１３−２及び１３−４
画分１３−２及び１３−４は収量が少なかった。図５から、画分１２−３には画分１３−２及び１３−４以外の主要成分が含まれないことが明かなので、画分１３−２及び１３−４の混合物として、画分１２−３の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを測定した。なお、以下では、画分１３−２及び１３−４の成分は、それぞれ、化合物Ａ及び化合物Ｂという。その結果、画分１２−３でｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａに類似したピーク群が観測されたので、画分１２−３の成分、すなわち、化合物Ａ及びＢはｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａの類縁体であることが示唆された。ＥＳＩＭＳを測定した結果、４６９．２  ［Ｍ＋Ｎａ］＋と、４８５．２  ［Ｍ＋Ｋ］＋とのピークが観測され、分子式はｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａより酸素が１つ多いＣ２４Ｈ３０Ｏ８と推定された。ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルと比較した結果、ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  ＡにみられたＨ−１３（δＨ  ３．３３／３．４０）、Ｈ−１４（δＨ  ５．３０）のピークが消失し、代わりに低磁場側に２つのダブレットオレフィンのピーク［δＨ  ６．６８  ｄ（１５．８Ｈｚ）、６．９１  ｄ（１５．８Ｈｚ）］が観察された。また、ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａの側鎖末端の２つのシングレットのメチル基が高磁場シフト（１．３６  ｓ、１．３７  ｓ）をしていることが明らかとなった。これらの解析の結果、化合物ＡおよびＢは、ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａの類縁体ではあるが、ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａとはピラン環に結合している側鎖の部分構造が異なることが示唆された。【００３８】
化合物ＡおよびＢの１３Ｃ  ＮＭＲ及びＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトル解析の結果、ケトン基のスペクトルが高磁場シフト（δ  １９０付近）しており、ダブレットオレフィンピーク［δＨ  ６．６８  ｄ（１５．８Ｈｚ）、６．９１  ｄ（１５．８Ｈｚ）］からケトン基へＨＭＢＣ相関が確認されたことから、１２Ｃ−１３およびＣ−１４間で２重結合を形成し、Ｃ−１２のケトンと共役していることが明らかになった。Ｃ−１４および２つのシングレットメチル基Ｃ−１６、Ｃ−１７のプロトンからδ  ８２．５のカーボンシグナルにＨＭＢＣ相関が観測されたことから、このカーボンシグナルはＣ−１５に位置することが明らかになった。以下の化学式１２に前記ＨＭＢＣ相関を示す。化学シフトの値（δ  ８２．５）から、Ｃ−１５にはヒドロキシル基が結合していると示唆された。以前に報告されているｔｓｉｔｓｉｘｅｎｉｃｉｎ  Ｃ（Ｈｏｏｐｅｒ，  Ｇ．Ｊ．及びＤａｖｉｅｓ−Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｍ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１：９９７３（１９９５））には推定された部分構造と同じユニットが存在しており、  １Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを比較したところ、スペクトルがほぼ一致した（化合物Ａ又はＢについて化学式１３、ｔｓｉｔｓｉｘｅｎｉｃｉｎ  Ｃについて化学式１４）。以上の結果から、化合物Ａ又はＢのいずれか一方は以下の化学式１５の構造を有する。【００３９】
【化１２】
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【００４０】
【化１３】
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【００４１】
【化１４】
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【００４２】
【化１５】
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【００４３】
４．画分１４−１及び１４−２
画分１４−１はＮＭＲ解析結果の比較により、ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａと同一であることが確認された。画分１４−２は、プロトンＮＭＲの解析結果が画分１４−１とは異なるので、画分１４−２の成分（以下、化合物Ｃという。）の構造は画分１４−１と同一ではない。
【実施例４】
【００４４】
新規抗原虫活性物質の生理活性
１．抗リーシュマニア活性試験
９６穴プレートに１×１０５個のＥＧＦＰ遺伝子導入リーシュマニア原虫（ＬａＥＧＦＰ、Ｏｋｕｎｏ  Ｔら、Ｅｘｐ．  Ａｎｉｍ．  ５２：１０９（２００３））が播種され、培地で希釈されたサンプルを加えて７２時間培養された。その後、蛍光プレートリーダーで各ウェルの蛍光強度が測定され、試験サンプルの抗リーシュマニア原虫活性が算出された。【００４５】
２．抗トリパノソーマ原虫活性試験
９６穴プレートに２ｘ１０５個のアフリカトリパノソーマ原虫Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ（血流型）が播種され、培地で希釈されたサンプルを加えて４８時間培養された。その後、生細胞数の計測のためＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ  ＯＮＥ（生化学バイオビジネス株式会社）が各ウェルに１０μＬずつ添加され、４時間後に４５０ｎｍの吸光度が測定された。【００４６】
３．抗マラリア原虫活性試験
９６穴プレートに同調化された０．５％  ｒｉｎｇ  ｓｔａｇｅマラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  Ｋ−１株が９０μＬずつ添加されたた後、培地で希釈されたサンプルを加えて４８時間培養された。その後、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ  ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００８％（ｗｔ／ｖｏｌ）サポニン、０．０８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）１ｍＬに対してＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ０．２μＬを添加した混合液が１００μＬずつ添加され、ヴォルテックスミキサーにより撹拌された。暗所に１時間静置された後、励起波長４８５ｎｍ、検出波長５３０ｎｍの蛍光プレートリーダーで測定された。【００４７】
４．細胞毒性試験
ヒト子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞、ヒト前骨髄球性白血病由来のＨＬ−６０細胞及びマウスリンパ腫由来のＰ３８８細胞の懸濁液（１×１０４個／ｍＬ）が９６穴マイクロプレートのＡ〜Ｈ行１〜１１列のウェルに２００μＬずつ分注され、２４時間３７°Ｃで培養された。その後サンプルのメタノール溶液（１ｍｇ／ｍＬ）が９６穴マイクロプレートのＡ行１〜１０列のウェルに２μＬずつ添加され、Ａ行１１列のウェルには陽性対照としてアドリアマイシン（１ｍｇ／ｍＬ）が２μＬ添加された。Ａ〜Ｄ行１２列のウェルには培地のみが２００μＬずつ添加され、Ｅ〜Ｈ行１２列のウェルには１×１０４個／ｍＬの前記細胞の懸濁液が２００μＬずつ添加された。マルチチャンネルピペットを用いて、Ａ行の各列のウェルの培養液が５０μＬ吸引され、Ｂ行の各列のウェルに添加され、次に、Ｂ行の各列のウェルの培養液が５０μＬ吸引され、Ｃ行の各列のウェルに添加され、というように５倍希釈をＡ列からＨ列まで順に行って、サンプルが８段階に希釈された。７２時間の培養後、ＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル・テトラゾリウム）１ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液が各ウェルに５０μＬずつ添加された。３時間の培養後、各ウェルの培養液が全て除去され、ＤＭＳＯが１５０μＬずつ添加された。各ウェルでＤＭＳＯに溶出した色素の吸光度がマルチウェルプレートリーダによって測定され、細胞の半数が死滅する濃度ＩＣ５０値が決定された。【００４８】
５．結果
前記ＬａＥＧＦＰに対するｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  ＡのＩＣ５０値は３６ｎｇ／ｍＬであった。これはリーシュマニア症の第２選択薬であるアムホテリシンＢのＩＣ５０値（約２０ｎｇ／ｍＬ）より高い。なお、リーシュマニア症の第１選択薬である５価アンチモン剤のリーシュマニアに対するＩＣ５０値は９μｇ／ｍＬとの報告（Ｖｅｒｍｅｅｒｓｃｈ，  Ｍ．ら、ＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢ．  ＡＧＥＮＴＳ  ＣＨＥＭＯＴＨＥＲ．５３：３８５５（２００９））があり、ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａのほうがはるかに活性が高い。【００４９】
Ｔ．  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅに対するｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  ＡのＩＣ５０値は１０７ｎｇ／ｍＬであった。これはトリパノソーマ原虫に活性を有すると報告があるアムホテリシンＢのＩＣ５０値（８１１ｎｇ／ｍＬ）より低い。なお、家畜トリパノソーマ症の第１選択薬であるジミナゼンのＴ．  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅに対するＩＣ５０値は０．１〜１μｇ／ｍＬとの報告（Ｋａｍｉｎｓｋｙら、Ｖｅｔ  Ｐａｒｓｉｔｏｌ  ５２：２３５（１９９４））があり、ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａがトリパノソーマ原虫に対しても活性が高いことが示された。また、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  Ｋ−１株に対するｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  ＡのＩＣ５０値は４．６μｇ／ｍＬであった。なお、画分１２−３（化合物Ａ及びＢの混合物）と、画分１２−１０（ｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａ及び化合物Ｃの混合物）との抗リーシュマニア原虫活性ＩＣ５０値は、それぞれ、１，２０９ｎｇ／ｍＬと、２８６ｎｇ／ｍＬとであった。【００５０】
ヒト子宮頚癌由来のＨｅＬａ細胞、ヒト前骨髄球性白血病由来のＨＬ−６０細胞及びマウスリンパ腫由来のＰ３８８細胞に対するｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  ＡのＩＣ５０値は、それぞれ、２．０μｇ／ｍＬ、０．７２７μｇ／ｍＬ及び０．８９μｇ／ｍＬであった。したがってｃｒｉｓｔａｘｅｎｉｃｉｎ  Ａは、ヒト培養細胞と比較して約２０倍ないし約５６倍の選択毒性をリーシュマニアに対して示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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