(57)【要約】  本発明によれば、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程を含むことを特徴とする、メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団を製造する方法が提供される。更に、本発明によれば、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、所望の遺伝子が高効率で導入され高発現している細胞集団を製造する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用してＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程を含むことを特徴とする、メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法。
【請求項２】
Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、（１）〜（３）から選択される工程のいずれかである、請求項１記載の製造方法：
（１）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養する工程、
（２）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、次いで、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの非存在下で該細胞集団を培養する工程、又は
（３）ＣＤ３リガンド存在下かつレチノイン酸類非存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、次いで、レチノイン酸類の存在下で該細胞集団を培養する工程。
【請求項３】
Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で行われる、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団が末梢血単核細胞である、請求項１〜３いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
得られた細胞集団からメモリーＴ様細胞を選択的に回収する工程をさらに含む、請求項１〜４いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載の方法で製造された細胞集団。
【請求項７】
下記工程を包含することを特徴とする、所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法：
（ａ）請求項１記載の方法により、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）の途中又は工程（ａ）の終了後に、該細胞集団に所望の遺伝子を導入する工程。
【請求項８】
下記工程（１）〜（３）のいずれかにより実施される、請求項７記載の製造方法：
（１）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞に所望の遺伝子を導入する工程、
（２）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞集団に所望の遺伝子を導入した後で、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの非存在下で該細胞集団を培養する工程、又は
（３）ＣＤ３リガンド存在下かつレチノイン酸類非存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞集団に所望の遺伝子を導入した後で、レチノイン酸類の存在下で該細胞集団を培養する工程。
【請求項９】
Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で行われる、請求項７又は８記載の製造方法。
【請求項１０】
所望の遺伝子がレトロウイルスベクターによって導入される、請求項７〜９いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で所望の遺伝子が導入される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
所望の遺伝子が抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子である、請求項７〜１１いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
抗原を認識するレセプターがＴ細胞レセプターである、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団が末梢血単核細胞である、請求項７〜１３いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項７〜１４いずれか１項に記載の製造方法により得られる、所望の遺伝子が導入されたＴ細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野、特に免疫療法において有用な、メモリー（ｍｅｍｏｒｙ）Ｔ様細胞を含有する細胞集団を製造する方法に関する。また、本発明は、医療分野において有用な、所望の遺伝子が高効率で導入されたＴ細胞を含有する細胞集団を製造する方法に関する。
なお、本願は、２００９年８月２５日出願の日本国特許出願第２００９−１９４４４４号及び２００９年１２月１８日出願の日本国特許出願第２００９−２８７２５８号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２００９−１９４４４４号及び日本国特許出願第２００９−２８７２５８号の全内容を本願に組み込むものである。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。【０００３】
Ｔ細胞は、末梢ではＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有するＣＤ４陽性Ｔ細胞、及びＣＤ８マーカーを有するＣＤ８陽性Ｔ細胞が大部分を占める。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ（以下、Ｔｈと記載する）細胞と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類が異なるＴｈ１型あるいはＴｈ２型などに分化する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞［Ｔｃ：細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、別名をキラーＴ細胞といい、以下、ＣＴＬと記載することがある］と呼ばれ、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）などのタイプＩサイトカインを産生するＴｃ１型、あるいはＩＬ−４、ＩＬ−１０などのタイプＩＩサイトカインを産生するＴｃ２型に分化する。【０００４】
ＣＴＬには、主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ；以下、ＭＨＣと略す）にコードされるＭＨＣクラスＩ分子（ヒトの場合、ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  クラスＩ分子と呼ばれ、以下、ＨＬＡクラスＩ分子と略す）と抗原との結合物である複合体を特異的なＴ細胞レセプター（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、ＴＣＲと略す）によって認識し、その複合体を細胞表面に提示している細胞を傷害することのできるものがある。【０００５】
外科手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第４のがんの治療法として、免疫療法が近年関心を集めている。免疫療法はヒトが本来有する免疫力を利用するため、患者への肉体的負担が他の治療法と比べて軽いと言われている。免疫療法には体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球などから種々の方法で拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞などを移入する療法、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法、Ｔｈ１細胞療法、更にこれら細胞に種々の効果を期待できる遺伝子を体外で導入して体内に移入する免疫遺伝子治療法などが知られている。【０００６】
リンフォカイン活性化細胞（ＬＡＫ細胞）は、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）、臍帯血、組織液などにＩＬ−２を加えて、数日間試験管内で培養することにより得られる細胞傷害活性を持つ機能的細胞集団である。この際、抗ＣＤ３抗体を加えて培養することにより、ＬＡＫ細胞の増殖は更に加速する。このようにして得られたＬＡＫ細胞は非特異的にさまざまながん細胞及びその他のターゲットに対して傷害活性を有する。【０００７】
前記のＬＡＫ細胞を移入する免疫療法において、体外で誘導した抗原特異的ＣＴＬを拡大培養する際に細胞傷害活性をいかに維持するか、リンパ球を体外でいかに効率よく拡大培養できるかなどの問題について、フィブロネクチン又はそのフラグメントを使用することによる効果が検討されてきた（例えば、特許文献１〜３）。【０００８】
メモリーＴ細胞は、その細胞表面抗原の解析からナイーブＴ細胞と区別される。更に、メモリーＴ細胞は、その機能の違いからもナイーブＴ細胞と区別することができる。すなわち、メモリーＴ細胞はナイーブＴ細胞と比べて、より弱い抗原刺激でより早くエフェクター細胞へ分化することができる（非特許文献１）。更に、メモリーＴ細胞から分化したエフェクター細胞は、１つの細胞が複数のサイトカインを同時に産生することができる点で、機能的にもナイーブＴ細胞と異なっている。しかし、メモリーＴ細胞分化の分子機構は不明である。
メモリーＴ細胞は、ホーミング能又はエフェクター機能の違いから、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞といわれる異なる２つの細胞集団を含んでいる（非特許文献２）。【０００９】
近年、免疫療法では、すでに終末分化したエフェクターＴ細胞よりも、より未分化な状態のナイーブＴ細胞又はセントラルメモリーＴ細胞を生体に投与した方がはるかに高い治療効果が期待できると報告されている（例えば非特許文献３、４）。【００１０】
免疫遺伝子治療法について、例えば目的の抗原を認識するＴＣＲ遺伝子を、ＣＴＬをはじめとするＴ細胞に導入することにより、目的の抗原に特異的な細胞傷害活性を付与することが期待できる。これに基づき、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、ｍＨＡＧ  ＨＡ−２抗原など、様々な抗原を標的としたＴＣＲ遺伝子による遺伝子治療が試みられている。更に、Ｔ細胞に導入するレセプターとして、ヒト由来のＴＣＲ、ヒト以外の生物由来のＴＣＲ、ならびに目的の抗原を認識する抗体の抗原認識部位、ＴＣＲと会合して抗原認識複合体を形成する分子群（例えばＣＤ３）、Ｔ細胞表面抗原（例えばＣＤ８、ＣＤ２８）及びこれらの一部を組み合わせたキメラレセプターをコードする遺伝子による遺伝子治療が試みられている。【００１１】
遺伝子導入には種々のベクターが使用されているが、これまでにヒトでの臨床への応用が研究されてきた遺伝子治療の多くは、組換えレトロウイルスベクター（例えば、複製能欠損レトロウイルスベクター）を用いるものである。レトロウイルスベクターは目的の外来遺伝子を細胞内に効率的に導入し、その染色体ＤＮＡ中に安定に組み込むので、特に長期にわたる遺伝子発現が望まれる遺伝子治療にとって好ましい遺伝子導入手段である。【００１２】
フィブロネクチンは動物の血液中、細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。フィブロネクチン、そのフラグメントなどの機能性物質を用いた遺伝子導入方法は、レトロウイルス産生細胞と標的細胞との共培養を行わずに高効率で遺伝子導入を行うことを可能にする（例えば、特許文献４）。該方法による遺伝子導入効率の向上は、機能性物質がレトロウイルスと標的細胞とを近接した状態に共配置し、両者の相互作用の機会が増加することに起因すると考えられている。【００１３】
このようにレトロウイルスを用いた遺伝子導入においては、レトロウイルスの標的細胞への感染の結果として遺伝子の導入が起こる。しかしながら、レトロウイルスによる遺伝子導入効率は、実際の臨床への応用を考えた場合には今なお満足できるものではなく、感染効率のさらなる向上が強く望まれている。【００１４】
すでに、ビタミンＡ代謝産物であるレチノイン酸がＴ細胞に小腸組織へのホーミング特異性をインプリントする生理的因子であることが報告されている（特許文献５）。しかし、Ｔ細胞をレチノイン酸存在下で培養することにより、培養された細胞への遺伝子導入効率が向上することについては、記載も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／０１８３６号パンフレット
【特許文献５】特開２００５−３３６０６２号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】ネイチャー  イムノロジー（Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１巻、第４７〜５３頁、２０００年
【非特許文献２】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４０１巻、第７０８〜７１２頁、１９９９年
【非特許文献３】ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．）、第１１５巻、第６号、第１６１６〜１６２６頁、２００５年
【非特許文献４】ジャーナル  オブ  イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１７５巻、第２号、第７３９〜７４８頁、２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、がんの免疫療法などの医療での使用に適した、レチノイン酸類存在下での培養を特徴とするメモリーＴ様細胞を高含有する細胞集団の製造方法、ならびに当該方法で得られる、生体への投与に有効な細胞集団を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養することにより、前記培養工程で得られた細胞集団に、所望の遺伝子が高効率で導入され高発現されることのみならず、メモリーＴ様細胞を高含有する細胞集団が得られることを見出し、本発明を完成させた。【００１９】
すなわち本発明を概説すれば、本発明の第１の態様は、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程を含むことを特徴とするメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法に関する。【００２０】
本発明の第１の態様において、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、（１）〜（３）から選択される工程のいずれかである製造方法も、本発明のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法に包含される。
（１）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養する工程、
（２）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、次いで、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの非存在下で該細胞集団を培養する工程、又は
（３）ＣＤ３リガンド存在下かつレチノイン酸類非存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、次いで、レチノイン酸類の存在下で該細胞集団を培養する工程。【００２１】
本発明の第１の態様において、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で行われてもよい。また、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団が末梢血単核細胞であってもよく、更に、得られた細胞集団からメモリーＴ様細胞を選択的に回収する工程を含む製造方法も、本発明のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法に包含される。
本発明の第１の態様により、弱い抗原刺激にも応答して迅速に細胞傷害活性を有する細胞に分化することができる細胞医療用の細胞集団が提供される。【００２２】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様で製造された細胞集団に関する。【００２３】
本発明の第３の態様は、下記工程を包含することを特徴とする、所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法に関する：
（ａ）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程、及び
（ｂ）工程（ａ）の途中又は工程（ａ）の終了後に細胞集団に所望の遺伝子を導入する工程。【００２４】
本発明の第３の態様は、下記工程（１）〜（３）のいずれかにより実施される製造方法を包含する：
（１）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞に所望の遺伝子を導入する工程、
（２）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞集団に所望の遺伝子を導入した後で、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの非存在下で該細胞集団を培養する工程、又は
（３）ＣＤ３リガンド存在下かつレチノイン酸類非存在下でＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養し、得られた細胞集団に所望の遺伝子を導入した後で、レチノイン酸類の存在下で該細胞集団を培養する工程。【００２５】
本発明の第３の態様において、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程が、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で行われてもよい。また、所望の遺伝子がレトロウイルスベクターによって導入される方法、あるいはフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下に所望の遺伝子が導入される方法も、本発明の所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法に包含される。更に、所望の遺伝子が抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子であってもよく、抗原を認識するレセプターがＴ細胞レセプターであってもよい。また、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団が末梢血単核細胞である方法も、本発明の所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法に包含される。
本発明の第３の態様により、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、所望の遺伝子が高効率で導入され高発現した、細胞医療用の細胞集団が提供される。【００２６】
本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様により得られる、所望の遺伝子が導入されたＴ細胞集団に関する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、免疫療法への使用に適したメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団を製造する方法、及び、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、所望の遺伝子が高効率で導入され高発現している細胞集団を製造する方法が提供される。当該製造方法により得られる細胞集団は、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】第４日目の細胞表面マーカーの分布を示す図である。
【図２】細胞増殖率を示す図である。
【図３】第４日目の細胞表面マーカーの分布を示す図である。
【図４】第７日目の細胞表面マーカーの分布を示す図である。
【図５】ＣＤ８陽性細胞の導入遺伝子の発現率を示す図である。
【図６】遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数を示す図である。
【図７】細胞増殖率を示す図である。
【図８】第７日目の細胞表面マーカーの分布を示す図である。
【図９】第７日目の遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いた導入法での導入遺伝子の発現率を示す図である。
【図１０】第６日目のポリブレンを用いた導入法での導入遺伝子の発現率を示す図である。
【図１１】遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数を示す図である。
【図１２】ＣＤ８単独陽性細胞の導入遺伝子の発現率を示す図である。
【図１３】ＣＤ８単独陽性細胞のＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ非産生細胞率の測定結果を示す図である。
【図１４】ＣＤ８単独陽性細胞のｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率の測定結果を示す図である。
【図１５】遺伝子導入細胞の各Ｅ／Ｔ  ｒａｔｉｏでのＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する特異的細胞傷害活性を示す図である。
【図１６】ＣＤ８単独陽性細胞のテトラマー陽性細胞割合、すなわち導入遺伝子の発現率を示す図である。
【図１７】第１１日目のＣＤ８単独陽性細胞の細胞表面マーカーの分布を示す図である。
【図１８】第１１日目のテトラマー陽性かつＣＤ８単独陽性細胞の細胞表面マーカーの分布を示す図である。
【図１９】ＣＤ８単独陽性細胞のＩＬ−４産生又は非産生、及びＩＦＮ−γ産生又は非産生細胞率の測定結果を示す図である。
【図２０】ＣＤ８単独陽性細胞のＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ非産生細胞率（Ｔｃ２）とＩＬ−４非産生かつＩＦＮ−γ産生細胞率（Ｔｃ１）の比を示す図である。
【図２１】ＣＤ８単独陽性細胞のｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率の測定結果を示す図である。
【図２２】遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する特異的細胞傷害活性を示す図である。
【図２３】ＣＤ８単独陽性細胞のテトラマー陽性細胞割合、すなわち導入遺伝子の発現率を示す図である。
【図２４】テトラマー陽性かつＣＤ８単独陽性細胞におけるテトラマーの発現量を平均蛍光強度の値で示した図である。
【図２５】遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数を示す図である。
【図２６】第１０日目のＣＤ４単独陽性細胞の細胞表面マーカーの分布を示す図である。
【図２７】ＣＤ４単独陽性細胞のＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ非産生細胞率、ＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ産生細胞率、ＩＬ−４非産生かつＩＦＮ−γ産生細胞率の測定結果を示す図である。
【図２８】ＣＤ４単独陽性細胞のＩＬ−４産生、ＩＦＮ−γ産生細胞率の測定結果を示す図である。
【図２９】ＣＤ４単独陽性細胞のＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ非産生細胞率（Ｔｈ２）とＩＬ−４非産生かつＩＦＮ−γ産生細胞率（Ｔｈ１）の比を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明において、「レチノイン酸」は、ビタミンＡ酸とも呼ばれ、鎖部の二重結合がすべてｔｒａｎｓのａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸又は９位がｃｉｓ構造をとる９−ｃｉｓ−レチノイン酸のいずれでもよい。また、その他のレチノイン酸異性体及びレチノイン酸誘導体も本発明において使用することができる。前記のレチノイン酸、レチノイン酸異性体及びレチノイン酸誘導体又はそれらの塩を、本明細書ではレチノイン酸類と総称する。さらに、本発明において、使用するレチノイン酸類は１種類でもよく、複数種類を組み合わせて使用してもよい。
【００３０】
Ｔ細胞とは、Ｔリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味し、分化したＴ細胞及び未分化なＴ細胞を含む。Ｔ細胞としては、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖とβ鎖のＴＣＲを発現するαβＴ細胞、γ鎖とδ鎖のＴＣＲを発現するγδＴ細胞などが知られている。本明細書において「Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団」としては、特に本発明を限定するものではないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナイーブＴ細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球などが例示される。また、Ｔ細胞を含有する血球系細胞由来の種々の細胞集団を本発明に使用できる。これらの細胞はＩＬ−２などのサイトカインにより生体内（イン・ビボ）又は生体外（エクス・ビボ）で活性化されていても良い。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたものをそのまま使用してもよく、凍結保存した後に使用してもよい。また、例えば生体から得られた細胞集団から種々の誘導操作又は分離操作を経て得られた細胞集団、例えば、ＰＢＭＣ等の細胞をＣＤ８＋（陽性）又はＣＤ４＋（陽性）細胞に分離して得られたいずれの細胞集団も使用することができる。更に、本発明の細胞集団の製造方法では、前記細胞を含有する材料、例えば、末梢血液、臍帯血などの血液、又は血液から赤血球もしくは血漿などの成分を除去したもの、骨髄液などを使用することもできる。
【００３１】
メモリーＴ細胞は、前の感染又はワクチン接種にて遭遇したバクテリア又はウイルスのような外来の侵入者を認識できるＴ細胞の特定のタイプである。侵入者との２回目の遭遇の際に、メモリーＴ細胞は、免疫系が最初に侵入者に応答した時よりも早く強く免疫応答を開始する。また、メモリーＴ細胞はホーミング能又はエフェクター機能の違いから、セントラルメモリーＴ細胞とエフェクターメモリーＴ細胞といった異なる２つの細胞集団を含んでいる（非特許文献２）。セントラルメモリーＴ細胞は、メモリー幹細胞としての性質を示すと考えられ、ＳＴＡＴ５として知られる重要な転写因子の高レベルリン酸化によって自己複製能を示す。セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡが陰性であるが、ＣＣＲ７及びＬ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）が共に陽性である。エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡに加えてＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌも陰性である。
【００３２】
メモリーＴ細胞は、その細胞表面抗原の解析からナイーブＴ細胞と区別される。ナイーブＴ細胞は、細胞表面抗原マーカーであるＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌがいずれも陽性であるのに対し、セントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞からなるメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡが陰性である。更に、メモリーＴ細胞は、前記のとおり迅速に免疫応答を開始できる点からもナイーブＴ細胞と区別することができる。
【００３３】
本発明において、「メモリーＴ様細胞」は、セントラルメモリーＴ様細胞及びエフェクターメモリーＴ様細胞の両方を包含する。
【００３４】
本発明において、「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造」とは、メモリーＴ様細胞への分化能を有する前駆細胞からのメモリーＴ様細胞の誘導及びメモリーＴ様細胞の増殖（拡大培養）を含む概念を意味する。本発明により、メモリーＴ様細胞を高い比率で含有する細胞集団を得ることができる。
【００３５】
本発明において、「フィブロネクチン」及びそのフラグメントは、天然から単離されたもの、人為的に作製されたもの、又は遺伝子工学的に調製された組換え体、すなわち非天然のもののいずれでもよい。フィブロネクチン及びそのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ  Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。また、フィブロネクチンフラグメントを調製するための情報であるフィブロネクチンをコードする核酸配列及びフィブロネクチンのアミノ酸配列については、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７にそれぞれ開示されている。本明細書において、実質的に純粋なフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。上記のフィブロネクチン及びそのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。
【００３６】
フィブロネクチンのドメイン構造は７つに分けられ、そのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列は、それぞれＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型と呼ばれている。フィブロネクチン中には１４個のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９及びＩＩＩ−１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目及び１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３及びＩＩＩ−１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５残基のアミノ酸からなる、ＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する。本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメントは、ＩＩＩ−７、８、９、１１、１２、１３又はＣＳ−１のいずれかのドメインを含むフラグメントであればよく、更に複数のドメインが繰り返し連結されたフラグメントであってもよい。例えば、ＶＬＡ−５へのリガンドを含む細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、ＶＬＡ−４へのリガンドであるＣＳ−１ドメインなどを含有するフラグメントが本発明に使用される。前記組換えフラグメントとしては、例えば、ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１）に記載されたＣＨ−２７１（配列表の配列番号１）、ＣＨ−２９６（配列表の配列番号２）、Ｈ−２７１（配列表の配列番号３）、Ｈ−２９６（配列表の配列番号４）、又はこれらの誘導体もしくは改変物が例示される。前記のＣＨ−２９６はレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）の名称で市販されている。
【００３７】
本明細書において、「有効成分」とは、レチノイン酸類、ＣＤ３リガンド、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物、その他の副刺激因子、細胞の培養に用いられる培地中に含まれ得る適当な化合物、タンパク質、サイトカイン類あるいはその他の成分を示す。
【００３８】
以下、本発明を具体的に説明する。
１．メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法−１
本発明のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法は、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程を含むことを特徴とする方法である。本発明によれば生体外でメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団を製造することが可能である。更に、当該方法により得られる細胞集団に含有されるメモリーＴ様細胞は、弱い抗原刺激にも応答して迅速に細胞傷害活性を有する細胞（細胞傷害性リンパ球）へ分化する能力を有しており、免疫療法などへの利用に好適である。
【００３９】
本発明の方法において、メモリーＴ様細胞の培養は、通常、本発明の有効成分の存在下、所定の成分を含む培地中で行なわれる。本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば、１０〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１０２〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１０３〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
【００４０】
本発明のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法において使用される培地は有効成分を含有する限り特に限定はなく、Ｔ細胞又はその前駆細胞の維持、生育に適した成分などを混合して作製された公知の培地を使用することができ、例えば、市販の培地又はその改変物であってもよい。これらの培地はその本来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類又はその他の成分を含んでいてもよい。好適には、本発明の製造方法において、ＩＬ−２を含有する培地が使用され得る。ＩＬ−２の培地中の濃度は特に限定されないが、例えば、好適には０．１〜１×１０５ＩＵ／ｍＬ、より好適には１〜１×１０４ＩＵ／ｍＬである。
【００４１】
有効成分として本発明に使用されるレチノイン酸類の培地中の濃度は、特に限定されないが、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸を使用する場合、例えば、好適には、０．０１〜１０４ｎＭ、より好適には０．１〜１０３ｎＭであり、９−ｃｉｓ−レチノイン酸を使用する場合、例えば、好適には、０．１〜１０５ｎＭ、より好適には１〜１０４ｎＭである。
【００４２】
また、有効成分として本発明に使用されるＣＤ３リガンドとしては、ＣＤ３に結合活性を有する物質であれば特に限定されないが、例えば、抗ＣＤ３抗体、ＣｏｎＡ、ＰＨＡ、ＰＭＡ＋イオノマイシンなどが例示される。特に好適には、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、例えば、ＯＫＴ３［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２０６巻、第３４７−３４９頁（１９７９）］が本発明にて使用される。ＣＤ３リガンドの培地中の濃度は、特に限定されないが、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用する場合、０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適である。リンパ球上のレセプターを活性化する目的で、抗ＣＤ３抗体を培地に添加してもよい。
【００４３】
更に、有効成分としてフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物を添加してもよい。フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の培養中の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．００１〜５００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜５００μｇ／ｍＬが好適である。フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物存在下での培養は、本発明において培養工程の一部のみで実施してもよく、培養全体を前記成分の存在下で実施してもよい。また、このほかに、レクチンなどのリンパ球刺激因子を培地に添加することもできる。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られる限り、特に限定されるものではない。
【００４４】
また、本発明において、必要に応じて、ＣＤ２８リガンドなどのその他の副刺激因子を添加することによって副刺激を導入することもできる。その他の副刺激因子として、例えば、所望の抗原、ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ（ＧＩＴＲＬ）、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体などが例示される。
【００４５】
なお、これらの成分のうち、「ＣＤ３リガンド」及び「フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物」は、培地中に溶解して共存させる以外に、適切な固相、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグなどの細胞培養用器材（開放系のもの又は閉鎖系のもののいずれも含む）、又はビーズ、メンブレン、スライドガラスなどの細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。該成分を、例えば、前記器材に固定化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られる限り、特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られる限り、特に限定されるものではない。いずれの場合においても、前記成分の固定化は、公知の方法、例えば、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット及び国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載されたフィブロネクチンフラグメントの固定化方法に準じて行なうことができる。更に「ＣＤ３リガンド」及び「フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物」以外の有効成分を、細胞培養用器材又は細胞培養用担体に固定化してもよい。
【００４６】
前記の種々の成分や、本発明の有効成分から選択されるものを固相に固定化しておけば、本発明の方法によりメモリーＴ様細胞を得た後で該Ｔ細胞と固相とを分離するのみで、有効成分等と該Ｔ細胞を容易に分離することができ、該Ｔ細胞への有効成分などの混入を防ぐことができる。
【００４７】
本発明に使用される培地は、前記の有効成分に加えて、サイトカイン類、適当なタンパク質又はその他の成分を含んでいてもよい。サイトカイン類としては、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１などが例示される。また、レクチンなどのリンパ球刺激因子を添加することもできる。
【００４８】
本発明には血清又は血漿を含有しない培地を使用することもできるが、培地に血清又は血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量は特に限定はされないが、０超〜２０容量％、好適には０超〜５容量％の含有量が例示され、また、培養段階に応じて使用する血清又は血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）又は非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでもよいが、安全性の観点から、自己由来のものが好適に使用される。
【００４９】
本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はされないが、例えば、好適には１０〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１０２〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１０３〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、培養条件に特に限定はなく、細胞培養に通常使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２などの条件で培養することができる。また、適当な時間間隔をおいて細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈する、培地を交換する、細胞培養用器材を交換するなどの操作を行うことができる。
【００５０】
本発明の細胞集団の製造方法において使用される細胞培養用器材として、特に限定されないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクターなどを使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量の細胞集団を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系又は閉鎖系のいずれにおいても実施することができるが、得られる細胞集団の安全性の観点から、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
【００５１】
レチノイン酸類をＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞培養液へ添加する時期は、培養開始時からが好ましい。例えばレチノイン酸類及びＣＤ３リガンドの存在下での培養工程は、培養開始時から少なくとも１日以上、より好ましくは２〜７日間、更に好ましくは２〜５日間実施される。また、レチノイン酸類は培養液中で分解される可能性もあるので、適当時間経過後に新たにレチノイン酸類を添加してもよい。
【００５２】
また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２などの条件下で培養することができる。また、適当な時間間隔をおいて培地を新鮮なものに交換することができる。
【００５３】
本発明の製造方法で得られる細胞集団は、ＣＤ４５ＲＡを発現しないが、ＣＣＲ７及び／又はＣＤ６２Ｌを発現する細胞、ならびにＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌが共に陰性である細胞の含有率が高い。ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌはいずれも、リンパ球の細胞表面抗原マーカーである。すなわち、本発明の製造方法により得られる細胞集団に高比率に含まれる細胞は、メモリーＴ様細胞に分類することができる。前述の非特許文献３及び４に記載のとおり、メモリーＴ細胞は生体に投与した際の生体内での生存率、細胞増殖効果、腫瘍への集積効果及び腫瘍特異的エフェクター細胞の産生率が高く、細胞医療分野において有用であることが記載されている。つまり、本発明の製造方法は、メモリーＴ様細胞の比率を上昇させることができる。ここでメモリーＴ様細胞比率の上昇とは、本発明の有効成分の有無以外は同等の条件で培養を実施した場合に、本発明の方法に使用される有効成分の存在下での培養により得られた細胞集団のメモリーＴ様細胞比率が、前記の有効成分の非存在下での培養と比較して高いことを意味する。好適には、前記の成分の非存在下の場合と比較して５％以上、より好ましくは１０％以上メモリーＴ様細胞の比率が高い細胞集団を得ることができる。また、本発明の製造方法で得られる細胞集団は、Ｔｃ２型及び／又はＴｈ２型の表現型の細胞を高含有する。
【００５４】
本発明の製造方法で得られる細胞集団について、レチノイン酸類を含有する培地又は含有しない培地でさらに培養を行ってもよい。通常、この際の培養は、ＣＤ３リガンドの非存在下で実施される。
本発明において、総培養日数は、好適には４〜１４日間であり、より好適には５〜１４日間、更に好適には７〜１４日間である。
【００５５】
本発明のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法により得られた細胞集団中には、通常、メモリーＴ様細胞以外の細胞も混在している。本発明では、該細胞集団から遠心分離などにより細胞を回収し、本発明の製造方法により得られたメモリーＴ様細胞として、例えば、そのまま使用することができる。しかも、前記有効成分などを細胞培養用器材などに固定化しておけば、得られたメモリーＴ様細胞への該有効成分などの混入を防ぐことができる。
【００５６】
また、本発明の製造方法は、該細胞集団からメモリーＴ様細胞を分離する工程をさらに含んでもよい。すなわち、本発明において、メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団中のメモリーＴ様細胞以外の細胞とメモリーＴ様細胞との分離操作を施すことにより、メモリーＴ様細胞が濃縮された細胞集団を調製し、使用することができる。例えば、ＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を除去する工程を含んでいてもよい。メモリーＴ様細胞の分離は公知の方法に従って実施することができる。例えば、フローサイトメーターを用いて、蛍光標識した抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ４５ＲＡ抗体で共染色することにより区分されるＣＤ３陽性かつＣＤ４５ＲＡ陰性細胞を選択的に回収することによって、メモリーＴ様細胞を分離することができる。また、本発明の製造方法より得られた細胞集団から、メモリーＴ様細胞以外の細胞を除去することにより、メモリーＴ様細胞を高含有する細胞集団を得ることができる。また、本発明におけるメモリーＴ様細胞を高含有する細胞集団には、メモリーＴ様細胞のみの細胞集団も包含され得る。
【００５７】
本発明によれば、「上記の細胞集団の製造方法」を利用して所望の遺伝子が導入された細胞集団を製造する方法が提供される。当該方法は、以下の工程を包含する：
（１）レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドを使用して、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を生体外で培養する工程、及び
（２）所望の遺伝子を工程（１）で得られた細胞集団に導入する工程。
【００５８】
第１の工程の後に遺伝子導入操作を実施することにより、Ｔ細胞への遺伝子導入の効率が向上する。すなわち、本発明の方法により製造される細胞集団は所望の遺伝子が導入されたＴ細胞を高比率で含む細胞集団である。本発明は遺伝子治療用細胞の製造に特に有用である。
【００５９】
本発明においてＴ細胞に導入される所望の遺伝子は特に限定はなく、自己由来の遺伝子又は外来遺伝子から前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類など）をコードするもの以外に、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）又はリボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を上記遺伝子と一緒に導入してもよい。
【００６０】
導入される所望の遺伝子は天然より得られたものでも、又は遺伝子工学的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーションなどの公知の手段によって結合されたものであってもよい。更に、目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
【００６１】
本発明の方法によれば、例えば、癌などの患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子をリンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性を付与することができる。そのようなリンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、それにより、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ）が例示される。一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子をリンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
特に限定はされないが、本発明の一態様として、所望の抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子の導入が例示される。当該遺伝子としては、標的細胞の表面抗原を認識するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）をコードする遺伝子、又は標的細胞の表面抗原に対する抗体の抗原認識部位を有し、かつＴＣＲの細胞内領域を含むキメラレセプターをコードする遺伝子が例示される。この遺伝子が導入されたＴ細胞を含む細胞集団は、所望の抗原を認識するＴ細胞を含有している細胞集団である。当該細胞集団は、レセプターをコードする遺伝子が導入されていない細胞集団と比較して、所望の抗原に対する特異性の高い細胞集団であり、所望の抗原の刺激を受けた際に所望の抗原に特異的に反応することができることから、免疫療法への利用に有用である。
【００６２】
本発明の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法において、第１の工程は、前記の「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法」に従って実施される。第１の工程の培養は少なくとも１日以上、より好ましくは２〜７日間、更に好ましくは２〜５日間実施された後で、後述の第２の工程が実施される。
【００６３】
本発明の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法において、得られる細胞集団は、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、抗原特異的にＩＦＮ−γを産生する細胞比率が低下し、ＩＬ−４及びｐｅｒｆｏｒｉｎを産生する細胞比率が向上したＴｃ２型及び／又はＴｈ２型の細胞を高含有する細胞集団である。この細胞集団は液性免疫の増強を介して寄生虫感染に対する免疫応答ならびに臓器移植におけるＧＶＨＤの軽減及びＧＶＬの増強に有用であることから、細胞医療分野への使用に極めて適している。特に、同種造血幹細胞移植後の再発白血病を対象としたドナーリンパ球輸注療法において、副作用として発症する移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＧＶＨＤ）をひき起こす率がＴｃ１細胞あるいはＴｈ１細胞と比して低いとされているので、本発明の細胞集団は有用である［Ｆｏｗｌｅｒ  Ｄ．  Ｈ．  他１名、ロイケミア  アンド  リンフォーマ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、第３８巻、第２２１〜２３４頁（２０００）］。
【００６４】
本発明の細胞集団の製造方法において、第２の工程は、第１の工程で得られた細胞に所望の遺伝子を導入する工程である。なお、細胞に導入する所望の遺伝子の数に限定はなく、１個の遺伝子であっても良く、複数の遺伝子（例えば、１〜９個の遺伝子）であっても良い。例えば、導入する細胞に応じてＴ細胞表面抗原をコードする遺伝子などの適当な遺伝子を、同時に、前もって、又は後で導入することができる。例えば、γδＴ細胞にαβＴＣＲ遺伝子を導入する場合、ＣＤ８をコードする遺伝子を同時に導入することが好ましい。
本発明において、所望の遺伝子の導入手段に特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれも本発明にて使用できる。それらの方法の詳細については、すでに多くの文献が公表されている。
【００６５】
前記ウイルスベクターに特に限定はなく、遺伝子導入方法に通常使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが使用できる。特に好適には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
【００６６】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法として、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合、プラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ又はＲＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
【００６７】
レトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に感染しうることから、本発明の製造方法にて遺伝子導入を行うのに特に好適である。
【００６８】
所望の遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクター又はプラスミドなどに挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、相同組換えにより導入対象のＴ細胞の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に前記の遺伝子を配置してもよい。
【００６９】
本発明に使用できるベクターとして、例えば、ＭＦＧベクター、α−ＳＧＣベクター（国際公開第９２／０７９４３号パンフレット）、ｐＢａｂｅ［Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  Ｊ．  Ｐ．、Ｌａｎｄ  Ｈ．、ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１８巻、第１２号、第３５８７〜３５９６頁（１９９０）］、ｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）、ｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）などのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター［ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ベクター、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来ベクターなど］、又はこれらを改変したベクターが例示される。
【００７０】
また、これらのベクターは公知のパッケージング細胞株、例えば、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＧ１３／ＬＮｃ８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８５）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６４２）、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６４１）、プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８）に記載のψＣＲＩＰなどの細胞株を使用することにより、該ベクターがパッケージングされたウイルス粒子として調製することができる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞又は２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。
【００７１】
本発明には、当該レトロウイルスのゲノムが由来するものとは異種のウイルス由来のエンベロープを有する、シュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）パッケージングによって作製されたレトロウイルスも使用することができる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又はネコ内在性ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｖｉｒｕｓ）由来のエンベロープ又はエンベロープとして機能しうるタンパク質を有するシュードタイプレトロウイルスを使用することができる。更に、糖鎖合成に関与する酵素遺伝子などを導入したレトロウイルス産生細胞を用いて作製された、糖鎖修飾を受けたタンパクをその表面に有するレトロウイルスも本発明に使用できる。前記のウイルスは、それぞれのエンベロープを発現するパッケージング細胞を使用して調製することができる。パッケージング細胞はすでに種々のものが報告されており、市販されているものもある。本発明には、これらの公知のパッケージング細胞を使用することができる。
【００７２】
レトロウイルスベクターを使用して遺伝子導入を行う場合、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質を使用して遺伝子導入効率を向上させることができる。当該方法に使用されるレトロウイルス結合活性を有する機能性物質は、特に限定されるものではなく、例えば、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、前記のポリペプチドのフラグメント、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストランなどがある。フィブロネクチンフラグメントは分子内にヘパリン−ＩＩ結合領域を有するものが好適であり、そのようなフラグメントは国際公開第９５／２６２００号パンフレット、国際公開第９７／１８３１８号パンフレットにも記載されている。ヘパリン−ＩＩ結合領域を有するフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６は、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）の名称で市販されている。またこれらの機能性物質と機能的に同等な物質、例えば、ヘパリン結合性部位を有する機能性物質も使用することができる。また、該機能性物質の混合物、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体なども使用することができる。
【００７３】
また、本発明にて、標的細胞結合活性を有する機能性物質を併用してもよい。当該物質は標的細胞への遺伝子導入効率の向上、又は標的細胞特異的な遺伝子導入の実施に有用である。標的細胞結合活性を有する機能性物質は、特に限定されるものではないが、例えば、標的細胞に結合するリガンドを有する物質であり、該リガンドとして、細胞接着性のタンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンなど）もしくはそのフラグメント、ホルモン、サイトカイン、細胞表面の抗原に対する抗体、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、糖タンパク質、糖脂質由来の糖鎖、標的細胞の代謝物などが挙げられる。また、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体、該機能性物質の機能的同等物などを使用することもできる。標的細胞結合活性を有する機能性物質は、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質と同様に、固相に固定化して使用され得る。更に、前記のレトロウイルス結合活性を有する機能性物質として、標的細胞結合活性を併せ持つものを使用することもできる。
【００７４】
以上説明したように、レチノイン酸類を含む前記の有効成分の存在下で培養した後で遺伝子導入を行う本発明の方法により、Ｔ細胞を含有する細胞集団への遺伝子導入を効率よく行うことが可能となる。また、本発明の方法は、特別な設備、装置を必要とせず、また、多種のレトロウイルスベクター及び標的細胞について有効である。更に、当該方法は閉鎖系での利用に適していることから、遺伝子治療などの臨床用途で非常に有用である。
【００７５】
本発明の細胞集団の製造方法は、第３の工程として、第２の工程で得られた遺伝子導入細胞を培養する工程をさらに包含してもよい。
前記の工程は、通常の細胞培養の方法、例えば、公知のＴ細胞の培養方法により実施してもよい。前記の第１の工程と同一の条件、あるいは前記方法で有効成分として使用されたレチノイン酸類もしくはＣＤ３リガンドのいずれか又は両方の使用を除いて、第１の工程で使用されたものと同様の条件で細胞の培養を行ってもよい。
本発明の細胞集団の製造方法において、総培養日数は、好適には４〜１４日間とすることが好ましい。なお、総培養日数が４日未満の場合は、一般的な免疫療法に使用するには満足のできる細胞数を得ることができない。また、総培養日数が１４日間を超えると細胞増殖率が低下する。本発明において、総培養日数は、より好適には５〜１４日間、更に好適には７〜１４日間である。
【００７６】
２．メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法−２
本発明者らは、驚くべきことに、前記の「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法−１」とはレチノイン酸添加時期を変えて培養を行うことによって、前記方法で製造されるＴｃ２型及び／又はＴｈ２型の細胞を高含有する細胞集団ではなく、Ｔｃ１型及び／又はＴｈ１型の細胞を高含有する細胞集団を製造することができることを見出した。当該製造方法は以下の工程を包含する。
（１）Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を、ＣＤ３リガンドの存在下かつレチノイン酸類非存在下に生体外で培養する工程、及び
（２）工程（１）で得られた細胞集団を、レチノイン酸類存在下に生体外で培養する工程。
【００７７】
当該製造方法において、第１の工程は、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を、ＣＤ３リガンドの存在下に生体外で培養する工程であり、有効成分として使用されるレチノイン酸類の使用を除いて、前記の「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法−１」に準じて実施される。第１の工程の培養は、少なくとも１日以上、より好ましくは２〜７日間、更に好ましくは２〜５日間実施された後で、後出の第２の工程、すなわち第１の工程で得られた細胞集団を、レチノイン酸類存在下に生体外で培養する工程を包含する。第２の工程の培養は少なくとも１日以上、より好ましくは２〜１０日間、更に好ましくは３〜９日間実施される。
【００７８】
当該製造方法において、得られる細胞集団は、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、抗原特異的にＩＬ−４を産生する細胞比率が低下し、かつＩＦＮ−γ及びｐｅｒｆｏｒｉｎを産生する細胞比率が向上したＴｃ１型及び／又はＴｈ１型の細胞を高含有する細胞集団である。これらの細胞集団は、腫瘍に対する強い細胞傷害活性を有し、さらに細胞性免疫を活性化することから、細胞医療分野への使用に極めて適している。
【００７９】
前記の第２の工程は、レチノイン酸類存在下に実施すること以外は通常の細胞培養の方法、例えば、公知のＴ細胞の培養方法に従って実施すればよい。前記の「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法−１」に記載されたものと同一の条件、あるいは前記方法で有効成分として使用されたＣＤ３リガンドの使用を除いて前記方法で使用されたものと同様の条件で細胞の培養を行ってもよい。また、レチノイン酸類は培養液中で分解される可能性もあるので、適当時間経過後に新たにレチノイン酸を添加してもよく、適当な時間間隔をおいて培地を新鮮なものに交換してもよい。
【００８０】
当該製造方法においても、その工程中の適当な時期に遺伝子導入の操作を加えることにより、遺伝子導入細胞の製造を実施することができる。遺伝子導入の操作は、細胞の培養に影響を与えない範囲で任意の時期に実施することができる。例えば、遺伝子導入の操作を前記の第１の工程と第２の工程の間に実施してもよく、第１の工程で得られた細胞集団に遺伝子導入を実施した後に同じ培地で１〜２日培養を継続し、その後、培地にレチノイン酸類を添加してもよい。遺伝子導入方法に特に限定はなく、前記の「メモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法−１」について記載されたものと同じ方法を使用することができる。
当該製造方法において、総培養日数は、好適には４〜１４日間とすることが好ましい。なお、総培養日数が４日未満の場合は、一般的な免疫療法に使用するには満足のできる細胞数を得ることができない。また、総培養日数が１４日間を超えると細胞増殖率が低下する。本発明において、総培養日数は、より好適には５〜１４日間、更に好適には７〜１４日間である。
【００８１】
下記実施例に記載のとおり、当該方法で製造された細胞集団は、Ｔｃ１型及び／又はＴｈ１型のメモリーＴ様細胞を高い比率で含有している。Ｔｃ１型又はＴｈ１型細胞集団は、細胞性免疫の増強を介した作用を発揮することから、細胞内寄生体に対する免疫応答及び腫瘍免疫に有用である。さらに、実施例６に記載のとおり、レチノイン酸を遺伝子導入後に添加することにより、導入遺伝子の発現が上昇する。
【００８２】
以上のとおり、本発明により、ＣＤ３リガンド及びレチノイン酸類を使用し、かつレチノイン酸類の添加時期を調節してＴ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団の培養を実施することを特徴とする、Ｔｃ２及び／又はＴｈ２型あるいはＴｃ１及び／又はＴｈ１型のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造方法が提供される。さらに、本発明は、所望の遺伝子が導入されたＴｃ２及び／又はＴｈ２型あるいはＴｃ１及び／又はＴｈ１型のメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団の製造にも利用することができる。
【００８３】
更に、本発明の製造方法は、各工程の前又は後で、細胞集団を任意の亜細胞集団に分離する工程を包含することもできる。たとえば、前述のとおり本発明の有効成分の存在下で培養して得られた細胞集団には高比率にメモリーＴ様細胞が含有されていることから、所望の表面抗原マーカーを発現する細胞を更に分離、取得することにより、メモリーＴ様細胞又はメモリーＴ様細胞を更に高含有するＴ細胞集団を取得することが出来る。また、遺伝子導入された細胞集団の製造において、本発明の製造方法の途中で、又はその終了後に所望の遺伝子を発現する細胞を分離、取得してもよい。分離操作としては、特に限定はないが、例えば、セルソーター、磁気ビーズ、カラムなどを用いて公知の手法で分離することが出来る。また、適切な手段がある場合、導入された遺伝子を発現する細胞からなる亜細胞集団を選択してもよい。
【００８４】
また、本発明の方法により製造された細胞集団からＴ細胞をクローン化することにより、安定したＴ細胞として維持することもできる。また、本発明の方法により得られた細胞集団を用いて、本発明の方法や公知の方法により更に培養することで細胞集団を新たに得ることもできる。
【００８５】
本発明の方法は、レチノイン酸類及びＣＤ３リガンドによる刺激、及び、所望により、所望の遺伝子の導入工程を含む、養子免疫療法のための新規のＴ細胞拡大培養方法であり、本発明の方法により得られる細胞集団は、生体内へ有効に移植され保持され得る。すなわち、本発明の方法は、移植された生体内で、長期に渡り、高濃度に持続可能で、より有用な細胞医療用の細胞集団の提供を可能とし、Ｔ細胞に基づく全ての遺伝子治療方法に広く適用することが可能である。
【００８６】
なお、本明細書において細胞又は細胞集団の製造方法は、細胞又は細胞集団を培養する工程を含み、当該細胞又は細胞集団の誘導（活性化）、拡大培養、分離の各工程、又はこれらを組み合わせた工程をさらに包含し得る方法を指す。
【００８７】
３．本発明の細胞集団、医薬、治療方法もしくは予防方法又は使用
本発明の方法により製造される細胞集団は、前記のように、免疫療法に適した性質を有している。また、本発明の方法により製造される遺伝子導入された細胞集団は、導入された所望の遺伝子に応じて、所望の効果を有する細胞集団である。例えば、所望の抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子を導入する場合、該遺伝子が導入された細胞集団は導入されたレセプター遺伝子によりコードされるレセプターが認識する抗原を提示している細胞に対して細胞傷害活性を示すことができることから、種々の疾患の治療に有用である。前記の細胞集団を投与される疾患として、特に限定されるものではないが、例えば、がん（白血病、固形腫瘍など）、肝炎、自己免疫疾患、インフルエンザ、ＨＩＶなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患（例えば、結核、ＭＲＳＡ感染症、ＶＲＥ感染症、深在性真菌症）などが例示される。また、本発明の方法により製造される細胞集団は、骨髄移植又は放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注、免疫療法、養子免疫療法などにも利用できる。
【００８８】
更に本発明は、本発明の方法で得られた細胞集団を有効成分として含有する前記疾患のための医薬（治療剤）を提供する。当該細胞集団を含有する前記治療剤は、免疫療法への使用に特に適している。免疫療法において、患者の治療に適したＴ細胞が、例えば、注射又は点滴により患者の静脈、動脈、皮下、腹腔内などに投与される。当該治療剤は、前述の疾患又はドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該治療剤は、製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製された当該Ｔ細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤、安定剤などと混合され、点滴剤、注射剤として調製され得る。なお、治療剤における本発明の細胞集団の含有量、治療剤の投与量といった当該治療剤に関する諸条件は、公知の免疫療法に従って適宜決定され得る。例えば、医薬における本発明のＴ細胞集団の含有量として、特に限定はないが、例えば、好適には１×１０３〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０４〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１×１０５〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、本発明の医薬の投与量として、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０６〜１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、１×１０７〜５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、更に好ましくは１×１０８〜２×１０１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。更に、当該治療剤による免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤治療、放射線治療又は外科的手術による治療との併用を行なうこともできる。
【００８９】
本発明はまた、対象に、前述の方法により得られる細胞集団の有効量を投与することを含む、前記の疾患の治療方法又は予防方法を提供する。本明細書中において対象とは、特に限定されるものではないが、好ましくは、本発明の方法により製造されるＴ細胞集団を投与される前記の疾患を有する生体（例えば、ヒト患者又は非ヒト動物）を示す。なお、Ｔ細胞レセプターをコードする遺伝子を導入された細胞集団を有効成分とする本発明の治療剤は、前記細胞集団の発現するＨＬＡ分子と同一又は３座不一致までのＨＬＡ分子を発現する対象に投与され得る。
【００９０】
また、本明細書中において有効量とは、前記Ｔ細胞集団を上記対象に投与した場合に、該Ｔ細胞集団を投与していない対象と比較して、治療又は予防効果を発揮する該Ｔ細胞集団の量である。具体的な有効量は、投与形態、投与方法、使用目的、対象の年齢、体重又は症状などによって適宜設定され得るものであり、一定ではないが、好ましくは、上記の医薬と同様に設定され得る。投与方法に限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、点滴、注射などにより投与すればよい。
更に、本発明は、当該細胞集団を有効成分として含有する診断薬を提供する。例えば、患者から得られた細胞を本発明の診断薬により解析、スクリーニングすることにより、治療効果の推測、有効な導入遺伝子の選択などが可能である。
【００９１】
また、本発明は、前述の本発明の製造方法により得られる細胞集団に対して、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカイン及びサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子により刺激を与えることにより、活性化されたＴ細胞を含む細胞集団を製造することができる。更に本発明は、前記の製造方法で得られた細胞集団を提供する。このようにして得られる活性化されたＴ細胞を含む細胞集団は、前述の製造方法により得られるＴ細胞集団と同様に、医薬の有効成分として使用できる。本明細書において、刺激因子による刺激とは、当該刺激因子により前述の本発明の製造方法により得られる細胞集団が活性化され得るものであれば特に限定はないが、例えば、本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団と刺激因子の共存下で培養を実施することが例示される。
【００９２】
ここで、提示される抗原としては、ＭＨＣ分子を発現する細胞上にペプチドが提示されるか、又はＴ細胞により認識されＴ細胞を効率よく活性化できるものであれば特に限定はないが、例えば、ペプチド、糖ペプチド、腫瘍細胞抽出物、腫瘍細胞超音波処理物、腫瘍細胞熱水処理物、ウイルスなどの核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、細菌、タンパク質などが例示される。また、ＣＤ３リガンド及びＣＤ２８リガンドとして、前述されたＣＤ３リガンド及びＣＤ２８リガンドが例示される。
【００９３】
また、本明細書において、サイトカインとは、Ｔ細胞に作用し活性化し得るものであれば特に限定はないが、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２７などが例示される。さらに、ケモカインとは、Ｔ細胞に作用し遊走活性を示すものであれば特に限定はないが、例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２１、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２、ＩＰ−１０、ＭＩＧなどが例示される。
【００９４】
本明細書において、サイトカインを産生する能力を有する細胞は、前述のサイトカインを産生し得る能力を有する細胞であれば特に限定はない。
【００９５】
なお、本発明の製造方法で得られる細胞集団に対して、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による共刺激を与えることで、サイトカイン産生能を有する活性化されたリンパ球集団を製造することができる。
【００９６】
本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団に対して抗原刺激を負荷することで、細胞傷害活性が極めて高く、抗原認識能も高い有用な抗原特異的ＣＴＬを誘導することができる。また、当該培養は、上記刺激因子以外に、前述のフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物、あるいはＴ細胞の培養に使用される公知成分の存在下で培養を実施することができる。このようにして製造されたＴ細胞集団は、生体内で長期に渡り、治療効果が高く極めて有用なＴ細胞集団である。
【００９７】
また、本発明は、医薬製造のための前述の方法により得られる細胞集団の使用も提供する。当該医薬の製造方法は、前述の医薬と同様に行われる。当該医薬の投与される疾患についても、特に限定はないが、前述の医薬と同様である。
【実施例】
【００９８】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。【００９９】
実施例１  レチノイン酸存在下での培養
フィブロネクチンフラグメント［レトロネクチン（登録商標）、タカラバイオ社製］を５μｇ／ｍＬ、及び抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ株式会社）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した。この溶解液を表面未処理１２ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルの量で加え、３７℃で５時間放置した。また、抗ＣＤ３抗体単独を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、同様に表面未処理１２ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルで加え、３７℃で５時間放置した。放置後、それぞれの溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回ずつ洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート及び抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。【０１００】
インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン（ブリストルマイヤーズ社製）及び１０ｎＭレチノイン酸（和光純薬社製）を含むＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）に懸濁し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート又は抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６ｍＬ／ウェルとなるように加えた。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を調製して同様にプレートに加えた。各プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。【０１０１】
培養４日後に細胞を回収し、細胞表面マーカーの測定を行った。【０１０２】
細胞表面マーカーの測定結果を図１に示す。培養細胞中のＣＤ８単独陽性細胞中のメモリーＴ細胞比率を、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体及び抗ＣＣＲ７抗体で細胞を染色して測定した。細胞表面マーカーに関して、ナイーブＴ様細胞はＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋であり、セントラルメモリーＴ様細胞はＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋であり、エフェクターメモリーＴ様細胞はＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−である。更に、エフェクターＴ様細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−である。図１の各刺激条件において、棒は左からＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−及びＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−のＣＤ８単独陽性細胞中の割合（％）を表す。また、図１〜１５の各図において、ＯＫＴは抗ＣＤ３抗体単独刺激、ＲＡ−ＯＫＴはレチノイン酸／抗ＣＤ３抗体刺激、ＲＮＴはフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激、ＲＡ−ＲＮＴはレチノイン酸／フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激を示す。【０１０３】
図１より、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激とレチノイン酸刺激との組み合わせでセントラルメモリーＴ様細胞及びエフェクターメモリーＴ様細胞比率が増加することが明らかになった。【０１０４】
実施例２  ＴＣＲ遺伝子導入細胞
国際公開第２００８／１１１５０６号パンフレットの実施例１−（１）〜（４）と同様に、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲ遺伝子のクローニング、ベクターの構築及びプロデューサー細胞の作製の一連の操作を行い、ＭＳ−ｂＰａウイルス液の調製を行った。本ウイルス液のＲＮＡコピー数は、２．５５×１０１１コピー／ｍＬであった。【０１０５】
（１）ＴＣＲ遺伝子導入細胞の調製
フィブロネクチンフラグメントを２５μｇ／ｍＬ、抗ＣＤ３抗体を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解した。この溶解液を表面処理（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ）１２ウェルプレートに０．４ｍＬ／ウェルの量で加え、３７℃で５時間放置した。また、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ株式会社）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、この溶解液を同様に表面処理１２ウェルプレートに０．４ｍＬ／ウェルの量で加え、３７℃で５時間放置した。放置後、それぞれの溶解液をとり除き、ＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）を用い、２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回ずつ洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート又は抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。【０１０６】
インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したＰＢＭＣを、０．１８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ−Ｔ５０３培地に懸濁し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート又は抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６５ｍＬ／ウェルとなるように加えた。この時、コントロールとして、レチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えたプレートを調製した。各プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。【０１０７】
遺伝子導入用ウイルス結合プレートを以下のように調製した。
フィブロネクチンフラグメントを２０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、この溶解液を表面未処理２４ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルで加え、３日間、４℃に放置した。放置後、溶解液を除去し、ＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で２回ずつ洗浄し、ＭＳ−ｂＰａウイルス液０．９ｍＬをウェルに加え、３２℃、２０００×ｇ、２時間遠心した。遠心後ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡ含有ＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で３回ずつ洗浄し、ウイルス結合プレートを調製した。【０１０８】
遺伝子導入操作を下記のように行った。ウイルス結合プレートに、抗ＣＤ３抗体単独又はフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体で４日間刺激した上記ＰＢＭＣを０．８×１０６ｃｅｌｌｓ、２．０ｍＬ／ウェルとなるように加え、一晩、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。培養後の細胞を０．６８×１０６ｃｅｌｌｓ／１．９ｍＬ／ウェルとなるように５ｍＭ酪酸ナトリウム（和光純薬社製）を含むＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩＩＩ培地（タカラバイオ社製）に懸濁し、新たなウイルス結合プレートに撒き、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間培養した。培養終了後、回収した細胞を０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ−Ｔ５０３培地に懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレートに撒き直した後で、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を用いて、同様の遺伝子導入操作及び遺伝子導入後の細胞の培養を行った。
ＰＢＭＣの刺激開始後、第７日目に０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞を撒き、１０日目まで培養した。第４、５、７及び１０日目に細胞増殖率を測定し、第４日目にウイルス結合プレートに移す前の細胞表面マーカーを、第１０日目に細胞表面マーカー、導入ＴＣＲの発現及び導入遺伝子のコピー数を測定した。【０１０９】
細胞増殖率の測定結果を図２に示す。図２の縦軸は培養開始時の細胞数に対する増殖比率（％）、横軸は培養日数を示す。図２より、レチノイン酸刺激の有無に関係なく、抗ＣＤ３抗体単独刺激と比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激の細胞増殖率が高かった。【０１１０】
ＰＢＭＣの刺激開始後、第４日目の培養細胞中のＣＤ８単独陽性細胞の細胞表面マーカーの測定結果を図３に、第７日目の培養細胞中のＣＤ８単独陽性細胞の細胞表面マーカーの測定結果を図４に示す。メモリーＴ細胞比率を抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体及び抗ＣＣＲ７抗体で細胞を染色して測定した。図３及び図４の各刺激条件において、棒は左からＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−及びＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−のＣＤ８陽性細胞中の割合（％）を表す。図３及び図４より、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸刺激との組み合わせでセントラルメモリーＴ様細胞及びエフェクターメモリーＴ様細胞比率が増加することが明らかになった。【０１１１】
ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲの発現をテトラマーアッセイにより測定することにより、遺伝子導入効率の測定を行った。
国際公開第２００８／１１１５０６号パンフレットの記載に従い、ＨＬＡ−Ａ２４０２重鎖のＣ末端にビオチンプロテインリガーゼＢｉｒＡの基質となる配列を付加したポリペプチド及びβ２−ミクログロブリンを不溶性封入体として大腸菌に発現させた。前記の封入体をＰ１４３ペプチドの存在下、インビトロでリフォールディングさせることにより、ＨＬＡ−Ａ２４０２／β２−ミクログロブリン／Ｐ１４３複合体を形成させた。得られた複合体にビオチンプロテインリガーゼ（アビディティー社製）を作用させ、フィコエリスリン標識ストレプトアビジン（Ｓｔｒａｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥ、インビトロジェン社製）を用いてテトラマーを調製した。
ＰＢＭＣの刺激開始後、第１０日目の細胞をテトラマーと混合して３７℃、３０分間反応させた後、ＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ８抗体（ベクトンディッキンソン社製）で４℃、２０分間反応させた。反応終了後の細胞を洗浄した後、ＦＡＣＳｃａｎｔ（べクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。【０１１２】
テトラマー測定結果を図５に示す。縦軸がＣＤ８単独陽性細胞中のテトラマー陽性細胞率（％）を示す。その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸刺激との組み合わせにより、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲの発現細胞率の上昇が見られた。【０１１３】
遺伝子導入細胞における導入遺伝子のプロウイルスコピー数をＰｒｏｖｉｒｕｓ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ．  Ｈｕｍａｎ（タカラバイオ社製）で測定した。その測定結果を図６に示す。図６の縦軸は、遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数である。その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸の添加により、遺伝子導入効率の上昇と相関したコピー数の上昇が見られた。【０１１４】
実施例３  ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子導入細胞の調製
（１）ウイルス液の調製
レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ−ＺｓＧｒｅｅｎを、以下の手順で作製した。まず、ＺｓＧｒｅｅｎ発現ベクターｐＺｓＧｒｅｅｎ−Ｎ１（クロンテック社製）を制限酵素ＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑化処理後、更に制限酵素ＢａｍＨＩで消化して約７２０ｂｐのＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子断片を得た。次に、レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｐａＩで消化して得られたベクターに、ＺｓＧｒｅｅｎ  ＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて挿入し、ＺｓＧｒｅｅｎ発現組換えレトロウイルスベクターｐＤＯＮ−ＡＩ−ＺｓＧｒｅｅｎを得た。
ｐＤＯＮ−ＡＩ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター及びＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用いた一過性のウイルス産生を行い、エコトロピックＤＯＮ−ＡＩ−ＺｓＧｒｅｅｎウイルスを獲得した。エコトロピックＤＯＮ−ＡＩ−ＺｓＧｒｅｅｎウイルスを、ＧＡＬＶレトロウイルスパッケージング細胞ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）にポリブレン存在下で感染させ、遺伝子導入細胞ＰＧ１３／ＤＯＮ−ＡＩ−ＺｓＧｒｅｅｎを獲得した。ＰＧ１３／ＤＯＮ−ＡＩ−ＺｓＧｒｅｅｎを１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）で培養し、セミコンフルエントまで生育したところで、０．１ｍＬ／ｃｍ２の新鮮な１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭで培地を交換し、２４時間後に上清を０．４５μｍフィルター（ミリポア社製）でろ過して、ＧＡＬＶ／ＤＯＮ−ＡＩ−ＺｓＧｒｅｅｎウイルス液を得た。得られたウイルス液を小分けして分注し、−８０℃フリーザーで保存し、以下の遺伝子導入細胞の調製に供した。本ウイルス液の力価は、６．７６×１０５ｃｆｕ／ｍＬであった。【０１１５】
（２）ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子導入細胞の調製
実施例１記載の操作により、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート及び抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。【０１１６】
インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したＰＢＭＣを０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ−Ｔ５０３培地に懸濁し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート又は抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６ｍＬ／ウェルとなるように加えた。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えたプレートを調製した。各プレートを、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。【０１１７】
遺伝子導入用ウイルス結合プレートは以下のように作製した。
フィブロネクチンフラグメントを２０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、この溶解液を表面未処理２４ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルで加え、一晩４℃に放置した。放置後、溶液を除去しＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で２回ずつ洗浄し、上記（１）で調製したＧＡＬＶ／ＤＯＮ−ＡＩ−ＺｓＧｒｅｅｎウイルス液１ｍＬをウェルに加え、３２℃、２０００×ｇで、２時間遠心した。遠心後にウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡ含有ＰＢＳを用いて２ｍＬ／ウェルの量で３回ずつ洗浄し、ウイルス結合プレートを作製した。【０１１８】
遺伝子導入操作を下記のように行った。ウイルス結合プレートに、抗ＣＤ３抗体単独又はフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体で４日間刺激した上記ＰＢＭＣを０．８×１０６ｃｅｌｌｓ、０．８０ｍＬ／ウェルとなるように、５ｍＭ酪酸ナトリウムを含むＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩＩＩ培地に懸濁して加え、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間培養した。培養後の細胞を０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ−Ｔ５０３培地に懸濁し、得られた懸濁液を１２ウェルプレートに撒き、３７℃で３日間培養した。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を用いて、同様の遺伝子導入操作及び遺伝子導入後の細胞の培養を行った。更に、遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いないポリブレン法による遺伝子導入を、ＺｓＧｒｅｅｎウイルス液を用いて行った。４日間刺激したＰＢＭＣを上記（１）で調製したＧＡＬＶ／ＤＯＮ−ＡＩ−ＺｓＧｒｅｅｎウイルス液に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁し、この懸濁液にポリブレン（Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  Ｂｒｏｍｉｄｅ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を終濃度８μｇ／ｍＬになるように添加し、２４ウェルプレートに２ｍＬ／ウェルの量で加え、３２℃、１０００×ｇで１時間遠心した。遠心後にウイルス液を除去し、０．５３×１０６ｃｅｌｌｓ、２．６５ｍＬ／ウェルとなるように表面処理１２ウェルプレートに播き、３７℃で２日間培養した。
遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いた遺伝子導入について、第４及び７日目に細胞増殖率を測定し、第７日目に細胞表面マーカー、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞率及び導入遺伝子のコピー数を測定した。ポリブレン法による遺伝子導入を行った細胞に関して、第６日目にＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞率を測定した。【０１１９】
細胞増殖率測定の結果を図７に示す。図７の縦軸は培養開始時の細胞数に対する増殖比率（％）、横軸は培養日数を示す。図７より、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸の有無に関係なく、細胞増殖率が高かった。【０１２０】
培養細胞中のＣＤ８単独陽性及びＣＤ４単独陽性細胞中の細胞表面マーカーについて、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体及び抗ＣＣＲ７抗体を用いて測定した結果を図８に示す。図８の各刺激条件において、棒は左からＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−及びＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＣＲ７−のＣＤ８単独陽性及びＣＤ４単独陽性細胞中の割合（％）を表す。図８より、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸刺激との組み合わせでセントラルメモリーＴ様細胞比率及びエフェクターメモリーＴ様細胞比率が増加することが明らかになった。【０１２１】
ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞率を測定した。
ＰＢＭＣの刺激開始後、遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いた遺伝子導入では第７日目の細胞を、ポリブレン法による遺伝子導入では第６日目の細胞を、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ８抗体（ベクトンディッキンソン社製）で４℃で２０分間反応させ、細胞を洗浄した後、ＦＡＣＳｃａｎｔ（べクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。測定結果を図９及び図１０に示す。なお図９及び図１０の縦軸はＣＤ８単独陽性及びＣＤ４単独陽性細胞中のＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞率（％）を表す。その結果、図９に示す遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いた遺伝子導入では、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共にレチノイン酸添加条件において、無添加条件と比べて１．５倍のＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞率の上昇が見られた。一方、図１０に示すポリブレン法による遺伝子導入では、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共にレチノイン酸刺激に関わらず導入効率の差はあまり見られなかった。図９及び図１０より、レチノイン酸刺激及びフィブロネクチンフラグメントを用いた遺伝子導入法の組み合わせによる高効率な遺伝子導入が示された。【０１２２】
遺伝子導入用ウイルス結合プレートを用いて導入した遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数の測定結果を図１１に示す。図１１において、縦軸は遺伝子導入細胞における導入遺伝子のコピー数である。その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸添加条件において、無添加条件の約２倍のコピー数を示し、コピー数は遺伝子導入効率に相関していた。【０１２３】
実施例４  ＴＣＲ遺伝子導入細胞の抗腫瘍活性の測定
国際公開第２００８／１１１５０６号パンフレットの実施例１−（１）〜（４）と同様に、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲ遺伝子のクローニング、ベクターの構築及びプロデューサー細胞の作製の一連の操作を行い、ＭＳ−ｂＰａウイルス液の調製を行った。本ウイルス液のＲＮＡコピー数は、２．５５×１０１１コピー／ｍＬであった。【０１２４】
（１）ＴＣＲ遺伝子導入細胞の調製
実施例２−（１）と同様の操作により、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート及び抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。【０１２５】
インフォームドコンセントが得られた健常人のＰＢＭＣを０．２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ−Ｔ５０３培地に懸濁し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体接着プレート又は抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６５ｍＬとなるように加えた。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えたプレートを調製した。各プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。【０１２６】
遺伝子導入用ウイルス結合プレートを以下のように作製した。
フィブロネクチンフラグメントを２０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、この溶解液を表面未処理２４ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルで加え、４日間、４℃で放置した。放置後、溶解液を除去しＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で２回ずつ洗浄した後、ＭＳ−ｂＰａウイルス液０．９ｍＬをウェルに加え、３２℃、２０００×ｇで２時間遠心した。遠心後にウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡ含有ＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で３回ずつ洗浄し、ウイルス結合プレートを作製した。【０１２７】
遺伝子導入操作を下記のように行った。ウイルス結合プレートに、抗ＣＤ３抗体単独又はフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体で４日間刺激した上記ＰＢＭＣを０．８×１０６ｃｅｌｌｓ、２．０ｍＬ／ウェルとなるように５ｍＭ酪酸ナトリウムを含むＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩＩＩ培地に懸濁し、一晩、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。培養後の細胞を０．８×１０６ｃｅｌｌｓ、１．０ｍＬ／ウェルとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ−Ｔ５０３培地に懸濁して新たなウイルス結合プレートに撒き、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間培養した。培養終了後、細胞を回収して０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞培養用１２ウェルプレートに撒き直し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。この時、コントロールとしてレチノイン酸を含まない細胞懸濁液を用いて、同様の遺伝子導入操作及び遺伝子導入後の細胞の培養を行った。
ＰＢＭＣの刺激開始後、第８日目に０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞培養用１２ウェルプレートに撒き、１１日目まで細胞を培養した。第１０日目に導入ＴＣＲ特異的ペプチドに対する細胞傷害性解析を行った。第１１日目にＣＤ８単独陽性細胞中の導入ＴＣＲの発現ならびにＩＬ−４及びｐｅｒｆｏｒｉｎの産生細胞率を測定した。【０１２８】
実施例２−（１）と同様に、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲの発現をテトラマーアッセイにより測定した。【０１２９】
テトラマー測定結果を図１２に示す。図１２において縦軸はテトラマー陽性率（％）である。その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激の両群共に、レチノイン酸刺激によりＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲの発現上昇、すなわち遺伝子導入効率の上昇が見られた。【０１３０】
遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対するＩＬ−４及びｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率を測定した。第１１日目の細胞とＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチド結合Ｔ２Ａ２４細胞［クリニカル  キャンサー  リサーチ、第１１巻、第５５８１〜５５８９頁（２００５）］を１：１の比で２時間共存培養し、ブレフェルディンＡ（シグマアルドリッチ社製）を添加後、更に２時間細胞を培養し、１０倍量の冷却したＰＢＳで反応を止めた。これらの細胞にＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ８抗体（ベクトンディッキンソン社製）を加え、４℃で２０分間染色を行った。次いで、イントラプレップ（ベックマンコールター社製）を用いて細胞を固定・浸透化した後に、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（ベクトンディッキンソン社製）、ＡＰＣ標識抗ヒトｐｅｒｆｏｒｉｎ抗体（ベクトンディッキンソン社製）及びＰＥ標識抗ヒトＩＬ−４抗体（ベックマンコールター社製）を加えて、室温で２０分間の染色を行った。細胞を洗浄後、ＦＡＣＳｃａｎｔ（べクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。ＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ非産生細胞率の結果を図１３に、ｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率の結果を図１４に示す。すなわち図１３の縦軸はＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ非産生細胞率（％）、図１４の縦軸はｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率（％）を示す。
また、図１３、１９、２７及び２８の各図において、ＩＦＮ−γはＩＦＮｇと記載する。【０１３１】
その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共に、レチノイン酸刺激によりＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ非産生細胞率及びｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率の上昇が見られた。これらの結果より、本発明のメモリーＴ様細胞はＴｃ２型細胞に分類される。【０１３２】
遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する細胞傷害性の解析を行った。３時間、ペプチドと共培養したＴ２Ａ２４細胞を０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ウシ胎児血清、ＳＡＦＣ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ〔ドータイト（Ｄｏｔｉｔｅ）社製〕を添加し、懸濁物を３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、１０倍量のＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）と混合し、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。なお、Ｋ５６２細胞を、レスポンダー細胞中に混入するＮＫ細胞による非特異的細胞傷害活性を排除するために用いた。培養開始後第１０日目の細胞をエフェクター細胞として１×１０５〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で段階希釈した後で、９６穴細胞培養プレートの各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注しておき、これらに１×１０５／ｍＬに調製したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を１００μＬ／ウェルずつ添加した。上記細胞懸濁液の入ったプレートを１８０×ｇで２分間遠心後、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、細胞懸濁液の入ったプレートを１８０×ｇで２分間遠心し、各ウェルから培養上清１００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍ／５３８ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「特異的細胞傷害活性（％）」は以下の数１にしたがって算出した。
【数１】
2011024791.tif 000002
上式において、最小放出量は標的細胞及びＫ５６２細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は、標的細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。【０１３３】
遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する細胞傷害性解析の結果を図１５に示す。図１５の横軸は、培養開始後第１０日目に回収したＰＢＭＣとＭＡＧＥ−Ａ４パルスしたＴ２Ａ２４細胞の比（Ｅ／Ｔ  ｒａｔｉｏ）を示す。その結果、抗ＣＤ３抗体単独刺激及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体刺激共にレチノイン酸刺激の有り無しでの細胞傷害活性（％）を比較したところ、レチノイン酸刺激群の特異的標的細胞に対する細胞傷害活性が高く、抗腫瘍活性が上昇することが認められた。【０１３４】
実施例５  レチノイン酸添加時期によるＴＣＲ遺伝子導入細胞の特性への影響
国際公開第２００８／１１１５０６号パンフレットの実施例１−（１）〜（４）と同様に、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲ遺伝子のクローニング、ベクターの構築及びプロデューサー細胞の作製の一連の操作を行い、ＭＳ−ｂＰａウイルス液の調製を行った。本ウイルス液のＲＮＡコピー数は、２．５５×１０１１コピー／ｍＬであった。【０１３５】
（１）ＴＣＲ遺伝子導入細胞の調製
実施例２−（１）と同様の操作により、抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。【０１３６】
インフォームドコンセントが得られた健常人のＰＢＭＣを０．２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ−Ｔ５０３培地に懸濁し、得られた懸濁液を抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６５ｍＬとなるように加えた。この時、コントロールとして、レチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えたプレートを調製した。各プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。【０１３７】
遺伝子導入用ウイルス結合プレートを以下のように作製した。
フィブロネクチンフラグメントを２０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、この溶解液を表面未処理１２ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルで加え、４日間で４℃に放置した。放置後、溶解液を除去し、ＰＢＳを用いて２ｍＬ／ウェルの量で２回ずつ洗浄した後、ＭＳ−ｂＰａウイルス液１．８ｍＬをウェルに加え、３２℃、２０００×ｇで１．５時間遠心した。遠心後にウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡ含有ＰＢＳを用いて１ｍＬ／ウェルの量で３回ずつ洗浄し、ウイルス結合プレートを作製した。【０１３８】
遺伝子導入操作は下記のように行った。ウイルス結合プレートに、抗ＣＤ３抗体で４日間刺激したＰＢＭＣを１．６×１０６ｃｅｌｌｓ、４．０ｍＬ／ウェルとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ−Ｔ５０３培地で懸濁して加え、懸濁液を一晩、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。この時、コントロール用プレート中の、レチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えて抗ＣＤ３抗体で４日間刺激したＰＢＭＣを用いて、同様の遺伝子導入操作及び遺伝子導入後の細胞の培養を行った。【０１３９】
一晩培養後の上記遺伝子導入細胞を回収し、１０ｎＭの終濃度レチノイン酸を添加または非添加した１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ及び２．５μｇ／ｍＬファンギゾン含むＧＴ−Ｔ５０３培地に０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁後、得られた懸濁物を４．０ｍＬ／ウェルの量で細胞培養用１２ウェルプレートに撒き、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。
ＰＢＭＣの刺激開始後、第８日目に細胞を回収し、引き続き終濃度１０ｎＭレチノイン酸を添加または非添加した１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ及び２．５μｇ／ｍＬファンギゾン含むＧＴ−Ｔ５０３培地に０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁後、懸濁物を細胞培養用１２ウェルプレートに撒き、１１日目まで培養した。第１１日目にＣＤ８単独陽性細胞中の細胞表面マーカー及び導入したＴＣＲの発現細胞率、導入ＴＣＲ特異的ペプチドに対するＩＬ−４、ＩＦＮ−γ及びｐｅｒｆｏｒｉｎの産生細胞率の測定ならびに細胞傷害性解析を行った。【０１４０】
また、図１６〜２５の各図において、「ＲＲ」がＰＢＭＣの刺激開始から１１日目まで終始レチノイン酸を添加し培養した細胞群、「Ｒ−」がＰＢＭＣの刺激開始から遺伝子導入（５日目）までレチノイン酸を添加し遺伝子導入後レチノイン酸を添加せずに培養した細胞群、「ＯＲ」がＰＢＭＣの刺激開始から遺伝子導入（５日目）までレチノイン酸を添加せずに遺伝子導入後レチノイン酸を添加し培養した細胞群、「Ｏ−」がＰＢＭＣの刺激開始から１１日目まで終始レチノイン酸を添加せずに培養した細胞群を示す。【０１４１】
実施例２−（１）と同様に、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲの発現をテトラマーアッセイにより測定した。【０１４２】
テトラマー測定結果を図１６に示す。図１６において縦軸はＣＤ８単独陽性細胞中のテトラマー陽性率（％）である。その結果、テトラマー陽性細胞率は、終始レチノイン酸を添加し培養した「ＲＲ」が最も高く、次に遺伝子導入後レチノイン酸を添加し培養した「ＯＲ」、その次に遺伝子導入までレチノイン酸を添加し培養した「Ｒ−」、最も低かったのがレチノイン酸を添加せず培養した「Ｏ−」であった。「Ｒ−」が「Ｏ−」より高い陽性率であったことから、レチノイン酸添加によって遺伝子導入効率が上昇することが明らかとなった。「ＯＲ」が「Ｏ−」より高い陽性率であったこと、また「ＲＲ」が「Ｒ−」より高い陽性率であったことから、レチノイン酸添加によって導入遺伝子の発現も上昇することが明らかとなった。【０１４３】
ＣＤ８単独陽性細胞の細胞表面マーカーの測定結果を図１７に、ＣＤ８単独陽性かつテトラマー陽性細胞の細胞表面マーカーの測定結果を図１８に示す。メモリーＴ細胞比率を抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体で細胞を染色して測定した。図１７及び図１８の各細胞群において、棒は左からＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋（ナイーブＴ様細胞）、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ６２Ｌ＋（セントラルメモリーＴ様細胞）、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ６２Ｌ−（エフェクターメモリーＴ様細胞）及びＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ−（エフェクターＴ様細胞）の割合（％）を表す。図１７及び図１８より、レチノイン酸を添加した場合、非添加（Ｏ−）の場合と比べて、セントラルメモリーＴ様細胞及びエフェクターメモリーＴ様細胞比率が増加することが明らかになった。【０１４４】
実施例４−（１）と同様の操作により、遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対するＩＬ−４及びｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率を測定した。【０１４５】
ＣＤ８単独陽性細胞中のＩＬ−４産生又は非産生、及びＩＦＮ−γ産生又は非産生細胞率の結果を図１９に、ＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ非産生細胞率（Ｔｃ２）とＩＬ−４非産生かつＩＦＮ−γ産生細胞率（Ｔｃ１）の比を図２０に、ＣＤ８単独陽性細胞中のｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率の結果を図２１に示す。図１９の各細胞群において、棒は左からＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ非産生、ＩＬ−４非産生かつＩＦＮ−γ産生、ＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ産生細胞の割合（％）を表す。図２０の各細胞群において、棒は左からＴｃ１／Ｔｃ２及びＴｃ２／Ｔｃ１をそれぞれ示し、縦軸の目盛りは、左側（０〜７０）がＴｃ１／Ｔｃ２に対応し、右側（０〜０．６）がＴｃ２／Ｔｃ１に対応する。【０１４６】
その結果、図１９よりタイプＩＩサイトカインであるＩＬ−４の産生細胞率が最も高いのは「ＲＲ」であり、タイプＩサイトカインであるＩＦＮ−γの産生細胞率が最も高いのは「ＯＲ」であった。また、非添加の「Ｏ−」と比べると、「Ｒ−」、「ＲＲ」および「ＯＲ」においてＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ産生細胞の割合が高かった。図２０よりＴｃ２とＴｃ１との比において「ＯＲ」より「Ｒ−」が高いことから、遺伝子導入前の培養時にレチノイン酸が存在することがＴｃ２型ＣＴＬを誘導するために重要であることが明らかになった。また、ｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率は「ＯＲ」、「ＲＲ」、「Ｒ−」、「Ｏ−」の順番で高かった。以上の結果より、本発明により製造されるメモリーＴ様細胞は、レチノイン酸の添加時期を調節することにより、Ｔｃ１型もしくはＴｃ２型ＣＴＬにそれぞれ誘導することが可能であり、また、レチノイン酸を添加することによって、より高いｐｅｒｆｏｒｉｎ産生細胞率を示す細胞集団を製造できることが明らかとなった。【０１４７】
培養開始後第１１日目の細胞をエフェクター細胞として１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で段階希釈後、９６穴細胞培養プレートの各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注して用いた以外は、実施例４−（１）と同様に、遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する細胞傷害性の解析を行った。【０１４８】
遺伝子導入細胞のＭＡＧＥ−Ａ４由来ペプチドｐ１４３に対する細胞傷害性の解析結果を図２２に示す。図２２は、培養開始後第１１日目に回収したＰＢＭＣとＭＡＧＥ−Ａ４パルスしたＴ２Ａ２４細胞を１：１の比で共培養した時の細胞傷害率を示す。その結果、レチノイン酸添加の有り無しでの細胞傷害活性（％）を比較したところ、レチノイン酸刺激有りの細胞群（「ＲＲ」、「ＯＲ」、「Ｒ−」）の特異的標的細胞に対する細胞傷害活性がレチノイン酸刺激無しの細胞群（「Ｏ−」）より高く、レチノイン酸刺激により抗腫瘍活性が上昇することが認められた。【０１４９】
実施例６  レチノイン酸添加による遺伝子導入効率と導入遺伝子発現効果
国際公開第２００８／１１１５０６号パンフレットの実施例１−（１）〜（４）と同様に、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲ遺伝子のクローニング、ベクターの構築及びプロデューサー細胞の作製の一連の操作を行い、ＭＳ−ｂＰａウイルス液の調製を行った。本ウイルス液のＲＮＡコピー数は、２．５５×１０１１コピー／ｍＬであった。【０１５０】
（１）ＴＣＲ遺伝子導入細胞の調製
実施例５−（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体接着プレートの調製、遺伝子導入前のＰＢＭＣの培養、遺伝子導入用ウイルス結合プレートの作製、抗ＣＤ３抗体で４日間刺激したＰＢＭＣへのＴＣＲ遺伝子導入操作及びＴＣＲ遺伝子導入後の細胞の培養の一連の操作を行い、ＴＣＲ遺伝子導入細胞の調製を行った。【０１５１】
ＰＢＭＣの刺激開始から第１１日目に、導入したＴＣＲの発現細胞率、発現量及びプロウイルスコピー数を測定した。【０１５２】
また、実施例２−（１）と同様に、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲの発現をテトラマーアッセイにより測定した。
テトラマー測定結果を図２３と図２４に示す。図２３において、縦軸はテトラマー陽性率（％）である。図２４において、縦軸はテトラマー陽性かつＣＤ８単独陽性細胞におけるテトラマーの発現量を平均蛍光強度の値を用いて示している。その結果、テトラマー陽性細胞率は、終始レチノイン酸を添加し培養した「ＲＲ」が最も高く、次に遺伝子導入後にレチノイン酸を添加し培養した「ＯＲ」、その次に遺伝子導入までレチノイン酸を添加し遺伝子導入後レチノイン酸を添加せずに培養した「Ｒ−」、最も低かったのがレチノイン酸を添加せず培養した「Ｏ−」の順番であった。また、ＣＤ８単独陽性かつテトラマー陽性細胞におけるテトラマー発現量すなわち平均蛍光強度もこれに相関した結果であった。つまり、製造工程においてレチノイン酸を添加することにより、特に遺伝子導入後にレチノイン酸を添加した細胞群（「ＯＲ」、「ＲＲ」）は非添加の細胞群「Ｏ−」と比べて、導入遺伝子の陽性細胞率と発現量が上昇した細胞を得ることができた。【０１５３】
培養細胞における導入遺伝子のプロウイルスコピー数を、Ｐｒｏｖｉｒｕｓ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ．  Ｈｕｍａｎ（タカラバイオ社製）を用いて測定した。その測定結果を図２５に示す。図２５の縦軸は培養細胞における導入遺伝子のコピー数を示す。その結果、レチノイン酸を添加せず遺伝子導入を行った「Ｏ−」に比べ、レチノイン酸を添加し遺伝子導入を行った「Ｒ−」の方がプロウイルスコピー数の上昇が認められた。つまり、レチノイン酸を遺伝子導入前に添加することにより、遺伝子導入効率が上昇することが明らかとなった。
一方、遺伝子導入（５日目）まで同一のウェルで培養した細胞群（「Ｏ−」及び「ОＲ」又は「Ｒ−」及び「ＲＲ」）におけるプロウイルスコピー数の差が僅かであるのに対し、図２３と図２４の結果より遺伝子導入後にレチノイン酸を添加した細胞群（「ＯＲ」、「ＲＲ」）ではレチノイン酸を添加しなかった細胞群（「Ｏ−」及び「Ｒ−」）よりテトラマー陽性細胞率及びその発現量が高かった。つまり、レチノイン酸を遺伝子導入後に添加することにより導入遺伝子の発現が上昇することが明らかとなった。【０１５４】
実施例７  レチノイン酸添加によるＣＤ４単独陽性細胞の特性への影響【０１５５】
実施例２−（１）と同様の操作により、抗ＣＤ３抗体接着プレートを調製した。【０１５６】
インフォームドコンセントが得られた健常人のＰＢＭＣを０．２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭレチノイン酸を含むＧＴ−Ｔ５０３培地に懸濁し、該懸濁液を抗ＣＤ３抗体接着プレートに２．６５ｍＬとなるように加えた。この時、レチノイン酸を含まない細胞懸濁液を加えたプレートも調製した。各プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４日間培養した。【０１５７】
レチノイン酸を加えずに抗ＣＤ３抗体単独で４日間刺激したＰＢＭＣ、及びレチノイン酸存在下で抗ＣＤ３抗体単独で４日間刺激したＰＢＭＣを各々０．１×１０６ｃｅｌｌｓ、２．０ｍＬ／ウェルとなるように、１％自己血漿、７２０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、０．２％ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬファンギゾン及び１０ｎＭのレチノイン酸を含む培地に懸濁し、得られた懸濁液を細胞培養用１２ウェルプレートに撒き直し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。この時、レチノイン酸を加えずに抗ＣＤ３抗体単独で４日間刺激したＰＢＭＣを、レチノイン酸を含有しない培地に同じ細胞濃度で懸濁し、コントロールとして同様に培養した。
ＰＢＭＣの刺激開始後、第７日目に０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、２．０ｍＬ／ウェルとなるように最終濃度１０ｎＭのレチノイン酸を含む培地に懸濁して各々のＰＢＭＣを細胞培養用１２ウェルプレートに撒き、更に１０日目まで培養した。上記のコントロールは、レチノイン酸を含有しない培地を用いて同じ操作を行い、１０日目まで同様の培養を行った。
第１０日目に各培養物中のＣＤ４単独陽性細胞中の細胞表面マーカー及びＰＭＡ＋イオノマイシン刺激に対するＣＤ４単独陽性細胞中のＩＬ−４並びにＩＦＮ−γの産生細胞率を測定した。
【０１５８】
培養細胞のＰＭＡ＋イオノマイシン刺激に対するＩＬ−４及びＩＦＮ−γ産生細胞率を測定した。第１０日目の培養細胞に最終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ及び最終濃度１μｇ／ｍＬのイオノマイシンを加えて、１時間培養し、ブレフェルディンＡ（シグマアルドリッチ社製）を添加後、更に３時間培養し、１０倍量の冷却したＰＢＳで反応を止めた。これらの細胞にＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４抗体（ベクトンディッキンソン社製）を加え、室温で１５分間の染色を行った。次いで、イントラプレップ（ベックマンコールター社製）を用いて細胞を固定・浸透化した後に、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（ベクトンディッキンソン社製）及びＰＥ標識抗ヒトＩＬ−４抗体（ベックマンコールター社製）を加えて、室温で２０分間の染色を行った。細胞を洗浄した後で、ＦＡＣＳｃａｎｔ（べクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。【０１５９】
また、図２６〜２９の各図において、「ＲＲ」がＰＢＭＣの刺激開始から１０日目まで終始レチノイン酸を添加し培養した細胞群、「ＯＲ」がＰＢＭＣの刺激開始から４日目までレチノイン酸を添加せずにその後レチノイン酸を添加し培養した細胞群、及び「Ｏ−」がＰＢＭＣの刺激開始から１０日目まで終始レチノイン酸を添加せずに培養した細胞群（コントロール）をそれぞれ示す。【０１６０】
ＣＤ４単独陽性細胞の細胞表面マーカーの測定結果を図２６に示す。メモリーＴ細胞比率を抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体で細胞を染色して測定した。図２６の各細胞群において、棒は左からＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋（ナイーブＴ様細胞）、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ６２Ｌ＋（セントラルメモリーＴ様細胞）、ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ６２Ｌ−（エフェクターメモリーＴ様細胞）及びＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ−（エフェクターＴ様細胞）の割合（％）を表す。図２６より、レチノイン酸を添加した場合、非添加（Ｏ−）の場合と比べて、セントラルメモリーＴ様細胞及びエフェクターメモリーＴ様細胞比率が増加することが明らかになった。【０１６１】
ＣＤ４単独陽性細胞中のＩＬ−４産生又は非産生、及びＩＦＮ−γ産生又は非産生細胞率の結果を図２７に、ＣＤ４単独陽性細胞中のＩＬ−４産生、ＩＦＮ−γ産生細胞率の結果を図２８に示す。また、ＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ非産生細胞率（Ｔｈ２）とＩＬ−４非産生かつＩＦＮ−γ産生細胞率（Ｔｈ１）との比を図２９に示す。図２７の各細胞群において、棒は左からＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ非産生、ＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ産生、ＩＬ−４非産生かつＩＦＮ−γ産生細胞の割合（％）を表す。図２８の各細胞群において、棒は左からＩＬ−４産生、ＩＦＮ−γ産生細胞の割合（％）を表す。図２９の各細胞群において、棒は左からＴｈ１／Ｔｈ２及びＴｈ２／Ｔｈ１をそれぞれ示し、縦軸の目盛りは、左側（０〜１．４）がＴｈ１／Ｔｈ２に対応し、右側（０〜３．５）がＴｈ２／Ｔｈ１に対応する。【０１６２】
その結果、図２８よりタイプＩＩサイトカインであるＩＬ−４の産生細胞率が高いのは「ＲＲ」「ОＲ」であり、タイプＩサイトカインであるＩＦＮ−γの産生細胞率が最も高いのは「ＯＲ」であった。また、非添加の「Ｏ−」と比べると、「ＲＲ」および「ＯＲ」においてＩＬ−４産生かつＩＦＮ−γ産生細胞の割合が高かった。図２９より、Ｔｈ２/Ｔｈ１比が「ＯＲ」より「ＲＲ」の方が高いことから、ＰＢＭＣの刺激開始から４日目までの培養時にレチノイン酸が存在することがＴｈ２型ヘルパーＴ細胞を誘導するのに重要であることが明らかになった。以上の結果から、レチノイン酸の添加時期を調節することにより、ＣＤ８単独陽性細胞と同様に、タイプＩＩサイトカイン産生又はタイプＩサイトカイン産生のＣＤ４単独陽性細胞を誘導できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明により、免疫療法への使用に適したメモリーＴ様細胞を含有する細胞集団を製造する方法、及び、メモリーＴ様細胞の比率が増加し、所望の遺伝子が高効率で導入され高発現した細胞集団を製造する方法が提供できる。当該製造方法により得られる細胞集団は、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６４】
SEQ ID NO:1; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:2; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:3; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:4; Fibronectin fragment named H-296. 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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