(57)【要約】  本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置（１）は、対象としての生体に超音波を照射する超音波送信部（１４）を備えている。これにより、生体内におけるＰＧＣ−１の発現を制御し、ＶＥＧＦが関与する血管新生を促す。その結果、患者に過度の負担をかけることなく生体内の血管新生を促し、虚血性疾患を治療する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に超音波を照射する超音波照射手段を備えたことを特徴とするＰＧＣ−１の発現制御装置。
【請求項２】
周波数が０．５〜３ＭＨｚ±１０％の範囲内の超音波を上記対象に照射するように上記超音波照射手段を制御する制御手段をさらに備えていることを特徴とする請求項１に記載のＰＧＣ−１の発現制御装置。
【請求項３】
上記制御手段は、上記対象に超音波を１日あたり２０〜４０分間±１０％の範囲内で照射するように上記超音波照射手段を制御することを特徴とする請求項２に記載のＰＧＣ−１の発現制御装置。
【請求項４】
上記超音波照射手段は、上記対象に対して媒体を介して非侵襲的に接触し、上記対象に照射する超音波を放出する少なくとも１つの超音波放出端子をさらに備えていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＰＧＣ−１の発現制御装置。
【請求項５】
複数の上記超音波放出端子のそれぞれを時分割で順次駆動して超音波を放出させるように上記超音波照射手段を制御する制御手段を備えていることを特徴とする請求項４に記載のＰＧＣ−１の発現制御装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＰＧＣ−１の発現制御装置を備えたことを特徴とする虚血性疾患の治療装置。
【請求項７】
生体に超音波を照射してＰＧＣ−１の発現を促進する発現促進工程を包含することを特徴とする虚血性疾患の治療方法。
【請求項８】
周波数が０．５〜３ＭＨｚ±１０％の範囲内の超音波を上記生体に照射する超音波照射工程をさらに包含することを特徴とする請求項７に記載の虚血性疾患の治療方法。
【請求項９】
上記超音波照射工程において、上記生体に超音波を１日あたり２０〜４０分間±１０％の範囲内で照射することを特徴とする請求項８に記載の虚血性疾患の治療方法。
【請求項１０】
上記超音波照射工程において、複数の超音波放出端子のそれぞれから時分割で順次放出された超音波を、上記生体に照射することを特徴とする請求項８又は９に記載の虚血性疾患の治療方法。
【請求項１１】
上記超音波照射工程において、上記生体の患部に超音波を照射することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の虚血性疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＧＣ−１の発現制御装置、並びにこれを備えた虚血性疾患の治療装置及び治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血流の低下により生じる虚血性疾患として、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症、慢性閉塞性動脈硬化症、ビュルガー病等が挙げられる。慢性閉塞性動脈硬化症（ＡＳＯ：Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ）は、主に下肢において、主に大血管が慢性的に閉塞する疾患である。ＡＳＯの症状は、軽症時には冷感、重症時には下肢の壊死にまで至ることがある。ビュルガー病（ＴＡＯ：Ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｉｔｉｓ  ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ）は、閉塞性血栓血管炎と称する場合もあり、四肢の主幹動脈に閉塞性の血管全層炎をきたす疾患である。【０００３】
ＡＳＯ及びＴＡＯの治療は病状の進行に応じて行われ、軽症の場合には抗血小板剤、魚油、プロスタサイクリン等の内服による治療を行い、さらにプロスタグランジンＥ１製剤、抗トロンビン剤等の点滴による治療が行われる。さらに病状が進行した場合、外科的手術による血管バイパス、バルーン拡張、ステント留置等によって血管内治療が行われる。【０００４】
これらの治療方法以外にも、細胞、生理活性物質、足場材料等を患部に移植することによって、欠失又は機能不全に陥った血管を新生し、血流の改善を図る血管再生治療がある。血管新生を促す細胞治療においては、骨髄細胞、末梢幹細胞（ＰＢＳＣＴ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、末梢血単核球を患部に数十カ所に分けて注入することよって治療を行う。また、血管新生を促すホルモンを発現させる遺伝子（ＨＧＦ、ＶＥＧＦ等）を筋肉注射することによって血管新生の誘導を図る遺伝子治療も行われている。【０００５】
また、他の血管新生治療方法として、特許文献１には、患部に超音波を照射することによって、患部組織内での血管新生を促進する技術が記載されている。超音波治療は、温熱効果を利用した血流促進による治療効果を目的として、多くの疾患の治療に古くから利用されている。例えば、特許文献２には、骨折治療における修復促進を目的として、超音波パルスを利用する技術が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国公表特許公報「特表２００５−５２３１３２号公報（２００５年８月４日公開）」
【特許文献２】米国特許第４５３０３６０号明細書（１９８５年７月２３日）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zoltan Arany et al., nature, Vol 451(21), p1008-1012, February 2008
【非特許文献２】Jiandie Lin et al., nature, Vol 418(15), p797-801, August 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
虚血性疾患の病状が進行した場合、上述した治療方法により治療されるが、これらの治療方法には、以下のような問題がある。外科的手術により治療する場合、観血的治療により感染症等のリスクがあり、患者の身体的負担が大きい。また、患部への細胞移植により治療する場合、大量の骨髄及び血液を採取する必要があり、患者の身体的負担が大きい。さらに、生理活性物質又は足場材料の移植は、移植材料の作製費用が高額であり経済的負担が大きい上に、安全性や安定性に疑問がある。また、遺伝子治療においても、安全性や安定性に疑問があることや、適用が重症患者に限られる等の問題がある。【０００９】
また、特許文献１に記載のように超音波を利用した治療は、血管新生を促すメカニズムが解明されていないため、患者や病状に応じて条件を最適化することができず、適切な治療を行うことが困難である上に、治療の有効性も明らかではない。【００１０】
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、患者に過度の負担をかけることなく生体内の血管新生を促し、虚血性疾患の治療が可能な、ＰＧＣ−１の発現制御装置、並びに治療装置及び治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
血管新生のメカニズムについては、これまでに種々研究されており、上述した遺伝子治療に用いられる血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｇａｃｔｏｒ）が、血管新生に関与していることが知られている。そして、ＶＥＧＦの転写は、転写因子であるＨＩＦ（Ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ）、又は転写因子コアクチベータであるＰＧＣ−１（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ）によって調節される。【００１２】
非特許文献１には、ＰＧＣ−１αが、ＨＩＦに依存することなく、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦによる血管新生を調節すること、及びＰＧＣ−１αの転写が運動により促されることが記載されている。ＰＧＣ−１は、褐色脂肪や骨格筋等の様々な組織に存在し、ミトコンドリア生発生及び酸化代謝を活性化することが知られている（非特許文献２）。【００１３】
本発明者らは、独自の観点から鋭意検討を重ねた結果、生体に超音波照射による物理的及び機械的刺激を与えることによってＰＧＣ−１の発現が促されることを見出し、ＰＧＣ−１−ＶＥＧＦカスケードを介した血管新生を促すことによる治療を実現し、本発明を完成させるに至った。【００１４】
すなわち、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置は、対象に超音波を照射する超音波照射手段を備えたことを特徴としている。また、本発明に係る虚血性疾患の治療装置は、当該ＰＧＣ−１の発現制御装置を備えたことを特徴としている。さらに、本発明に係る虚血性疾患の治療方法は、生体に超音波を照射してＰＧＣ−１の発現を促進する発現促進工程を包含することを特徴としている。【００１５】
本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置によれば、対象としての生体に超音波を照射する超音波照射手段を備えているので、生体内におけるＰＧＣ−１の発現を制御することが可能である。これにより、ＰＧＣ−１が関与する生体反応を制御することが可能であり、ＶＥＧＦのような、ＰＧＣ−１のより下流の因子の制御が可能である。したがって、本発明に係る虚血性疾患の治療装置及び治療方法によれば、生体に超音波を照射してＰＧＣ−１の発現を制御することによってＶＥＧＦの発現を制御し、ＶＥＧＦが関与する血管新生を促すことが可能である。【００１６】
このように、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置、これを備えた虚血性疾患の治療装置及び治療方法によれば、治療経費が安価である上に、安全性が確立されており、かつ安定性が高いので、適用患者が限定されない。【００１７】
また、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置は、周波数が０．５〜３ＭＨｚ±１０％の範囲内の超音波を上記生体に照射するように上記超音波照射手段を制御する制御手段をさらに備えていることが好ましい。さらに、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置において、上記制御手段は、上記生体に超音波を１日あたり２０分〜４０分間±１０％の範囲内で照射するように上記超音波照射手段を制御することが好ましい。上記の構成によればより効果的にＰＧＣ−１の発現を促進させることができる。【００１８】
さらに、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置において、上記超音波照射手段は、上記生体に対して媒体を介して非侵襲的に接触し、上記生体に照射する超音波を放出する少なくとも１つの超音波放出端子をさらに備えていることが好ましい。これにより、非侵襲的にＰＧＣ−１の発現を制御して血管新生を促すことが可能である。【００１９】
また、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置は、複数の上記超音波放出端子のそれぞれを時分割で順次駆動して超音波を放出させるように上記超音波照射手段を制御する制御手段を備えていることが好ましい。なお、これにより、特定箇所に超音波のエネルギーが集中することなく、生体に効率よく超音波を照射することができる。【００２０】
さらに、本発明に係る虚血性疾患の治療方法は、周波数が０．５〜３ＭＨｚ±１０％の範囲内の超音波を上記生体に照射する超音波照射工程をさらに包含することが好ましい。また、本発明に係る虚血性疾患の治療方法は、上記超音波照射工程において、上記生体に超音波を１日あたり２０〜４０分間±１０％の範囲内で照射することが好ましい。これにより、より効果的に生体におけるＰＧＣ−１の発現を促進させ、虚血性疾患を効率よく治療することができる。【００２１】
また、本発明に係る虚血性疾患の治療方法は、上記超音波照射工程において、複数の超音波放出端子のそれぞれから時分割で順次放出された超音波を、上記生体に照射することが好ましい。これにより、生体の特性箇所に照射される超音波のエネルギーが集中することなく、生体に効率よく超音波を照射することができる。【００２２】
さらに、本発明に係る虚血性疾患の治療方法は、上記超音波照射工程において、上記生体の患部に超音波を照射することが好ましい。このように、治療の対象となる生体の患部に超音波を照射することによって、虚血性疾患を効率よく治療することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置は、対象としての生体に超音波を照射する超音波照射手段を備えているので、生体内におけるＰＧＣ−１の発現を制御することが可能であり、これによりＶＥＧＦが関与する血管新生を促すという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置の一実施形態を示すブロック図である。
【図２】本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置の他の実施形態を示すブロック図である。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１の探触子の構成例を示す模式図である。
【図４】超音波照射によるＰＧＣ−１αの発現量の変化を調査した実験結果を示すグラフである。
【図５】超音波照射によるＶＥＧＦＡの発現量の変化を調査した実験結果を示すグラフである。
【図６】超音波照射によるＶＥＧＦＢの発現量の変化を調査した実験結果を示すグラフである。
【図７】超音波照射によるＶＥＧＦＣの発現量の変化を調査した実験結果を示すグラフである。
【図８】超音波照射によるＨＩＦ−１αの発現量の変化を調査した実験結果を示すグラフである。
【図９】血流回復に及ぼす超音波照射の影響を調査したレーザードップラー撮影写真である。
【図１０】血流回復に及ぼす超音波照射の影響を調査したレーザードップラー撮影写真である。
【図１１】血流回復に及ぼす超音波照射の影響を調査したレーザードップラー撮影写真である。
【図１２】血流回復に及ぼす超音波照射の影響を調査したレーザードップラー撮影写真である。
【図１３】血流回復に及ぼす超音波照射の影響を調査したレーザードップラー撮影写真である。
【図１４】血流回復に及ぼす超音波照射の影響を調査したレーザードップラー撮影写真である。
【図１５】血管新生に及ぼす超音波照射の影響を調査したヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１６】血管新生に及ぼす超音波照射の影響を調査したヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１７】血管新生に及ぼす超音波照射の影響を調査したヘマトキシリン・エオジン染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１８】血管新生に及ぼす超音波照射の影響を調査したアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１９】血管新生に及ぼす超音波照射の影響を調査したアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２０】血管新生に及ぼす超音波照射の影響を調査したアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２１】毛細血管密度比に及ぼす超音波照射の影響を調査したアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示すグラフである。
【図２２】ＰＧＣ−１αの発現に及ぼす超音波照射の影響を調査した免疫組織化学染色の実験結果を示す顕微鏡写真である。
【図２３】ＶＥＧＤＡの発現に及ぼす超音波照射の影響を調査した免疫組織化学染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２４】ＶＥＧＦＢの発現に及ぼす超音波照射の影響を調査した免疫組織化学染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２５】ＶＥＧＦＣの発現に及ぼす超音波照射の影響を調査した免疫組織化学染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２６】ウサギネガティブコントロール抗体を用いた免疫組織化学染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２７】ヤギネガティブコントロール抗体を用いた免疫組織化学染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２８】ＣＤ３１抗体を用いた免疫組織化学染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２９】ＣＤ３１抗体を用いた免疫組織化学染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３０】ＣＤ３１抗体を用いた免疫組織化学染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３１】毛細血管密度比に及ぼす超音波照射の影響を調査したＣＤ３１抗体を用いた免疫組織染色の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
〔ＰＧＣ−１の発現制御装置〕
（第１の実施形態）
本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置の一実施形態について、図１を参照して以下に説明する。図１は、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１の一実施形態を示すブロック図である。図１に示すように、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１は、本体部１０及びプローブ２０により構成されている。本体部１０には、ユーザインターフェース（ＵＩ）１１、コントローラ（制御手段）１２、電源部１３及び１つ以上の超音波送信部１４（超音波照射手段）が備えられている。プローブ２０には、１つ以上の探触子（超音波放出端子）２１が備えられている。プローブ２０は、本体部１０とは独立したハウジング内に設けられていてもよく、本体部１０と同一ハウジング内に、本体部１０とは独立して設けられていてもよい。また、プローブ２０を本体部１０にケーブル等により接続し、プローブ２０が本体部２０から離れた位置で動作し得るように構成していてもよい。
【００２６】
図１に示すように、本体部１０には、超音波送信部がｎ個（超音波送信部１４〜超音波送信部１４ｎ）備えられている。そして、各超音波送信部に対応するように、プローブ２０には、探触子がｎ個（探触子２１〜探触子２１ｎ）備えられている。ここで、ｎは任意に設定される１以上の整数を示している。探触子２１〜２１ｎはそれぞれ、超音波送信部１４〜１４ｎに接続されている。
【００２７】
超音波送信部１４〜１４ｎから送信された超音波は、それぞれに接続された探触子２１〜２１ｎから放出され、照射対象としての生体に照射される。なお、超音波送信部１４〜１４ｎはそれぞれ同様に構成されており、探触子２１〜２１ｎもそれぞれ同様に構成されているため、以下では主に超音波送信部１４及び探触子２１について説明する。
【００２８】
ユーザインターフェース１１は、ＰＧＣ−１の発現制御装置１の状態等を表示する表示部と、ユーザからの入力を受け付ける入力部とを備えていてもよい。ユーザインターフェース１１がユーザからの入力を受け付けたとき、当該入力を表す入力信号をコントローラ１２に送信し、コントローラ１２は受信した入力信号に基づいて各構成要素を制御する。
【００２９】
また、ユーザインターフェース１１は、コントローラ１２から送信されたＰＧＣ−１の発現制御装置１の状態を表す信号を受信し、受信した信号に基づいてＰＧＣ−１の発現制御装置１の状態を表示部に表示する。ユーザインターフェース１１の入力部は、例えば、照射する超音波の周波数や照射時間等をユーザが入力できるようになっていてもよい。
【００３０】
コントローラ１２は、ＰＧＣ−１の発現制御装置１の各構成要素を制御する。コントローラ１２は、超音波送信部１４からプローブ２０の探触子２１に超音波を送信し、探触子２１から生体に対して超音波を放出させる。具体的には、コントローラ１２は、超音波送信部１４の送信用発振部１４２から超音波を出力させ、送信器１４１から探触子２１に送信させる。また、コントローラ１２は、ユーザインターフェース１１からのユーザの入力に基づいて、超音波送信部１４からの超音波の送信を制御し、かつユーザインターフェース１１にＰＧＣ−１の発現制御装置１の状態等を表示させるように制御する。さらに、コントローラ１２は、電源部１３からの電力を送信用電源部１４０に供給する。
【００３１】
また、コントローラ１２は、探触子２１から規定の値の超音波を出力するために、送信用発振部１４２からの超音波の出力を制御する。探触子２１からの超音波の出力は、所望の効果を得るために適切な値に設定され、設定された値の超音波を出力するようにコントローラ１２が制御する。また、コントローラ１２は、探触子２１の感度ばらつきを補正するために超音波出力を制御するようになっていてもよい。超音波出力の制御は、送信用発振部１４２の発振周波数を制御する、又は送信器１４３から探触子２１に超音波を送信するときの送信電圧を制御すること等によって行うことができる。
【００３２】
電源部１３は、ＰＧＣ−１の発現制御装置１の各構成要素に電力を供給する。電源部１３は、商用電源又は電池等からの電力をコントローラ１２及び超音波送信部１４の送信用電源部１４０に供給する。
【００３３】
超音波送信部１４は、送信用電源部１４０、送信器１４１及び送信用発振部１４２を備えている。送信用電源部１４０は、コントローラ１２又は電源部１３からの電力を送信器１４１に供給する。送信器１４１は、送信用発振部１４２から出力された超音波を探触子２１に送信する。送信用発振部１４２は、コントローラ１２からの指示に基づいて超音波を発振して送信器１４１に出力する。送信用電源部１４０、送信器１４１及び送信用発振部１４２としては、従来公知の電源部、送信器及び超音波発振部等を使用することができる。
【００３４】
探触子２１は、超音波送信部１４の送信器１４１から送信された超音波を生体に対して放出する。ＰＧＣ−１の発現制御装置１を、例えばＡＳＯの治療装置に用いる場合、ＡＳＯの患部は通常広範囲に及ぶため、広範囲に超音波照射することが好ましい。図１に示すＰＧＣ−１の発現制御装置１は、プローブ２０に複数の探触子２１〜２１ｎを備えているので、より広範囲に超音波を照射することができる。
【００３５】
このとき、複数の探触子２１〜２１ｎを、例えばシリコン材のような可撓性を有する材料に接着等により取り付け、患部を覆うことが可能なように構成する。探触子２１は、生体に対して媒体を介して非侵襲的に接触して、生体に照射する超音波を出力し得るように、プローブ２０のハウジング内に設けられている。探触子２１の構成の詳細については後述する。
【００３６】
ＰＧＣ−１の発現制御装置１は、規定の値の超音波を出力するため、超音波探触子の感度のばらつきを補正するために、及び超音波出力を一定に保つために、送信器１４１からの超音波の送信をモニタリングするフィードバック機構を備えていてもよい。これにより、送信器１４１から超音波の送信状態がコントローラ１２にフィードバックされ、これに基づいてコントローラ１２は送信用発振部１４２及び送信器１４１による超音波の出力を制御する。
【００３７】
また、探触子２１と患部とのカップリング不良を検出するために、探触子２１からの超音波の出力をモニタリングするフィードバック機構も備えていてもよい。これにより、探触子２１から患部とのカップリング状態がコントローラ１２又は送信器１４１にフィードバックされ、これに基づいてコントローラ１２は送信用発振部１４２及び送信器１４１による超音波の出力を制御する。
【００３８】
このように、ＰＧＣ−１の発現制御装置１は、生体に対して超音波を照射する超音波送信部１４を備えているので、生体において超音波が照射される患部におけるＰＧＣ−１の発現を制御することができる。ＰＧＣ−１は、代謝を制御するシグナル伝達経路を統括する転写因子コアクチベータである。ＰＧＣ−１は、ミトコンドリア酸化的代謝の調節や、糖、脂肪及びエネルギー恒常性を維持する役割を担っており、そのファミリーメンバーとして、互いにホモロジーがあるＰＧＣ−１α及びＰＧＣ−１βが知られている。
【００３９】
本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１によりＰＧＣ−１の発現を促進したとき、ＰＧＣ−１の発現促進によりＶＥＧＦの転写が促進する。ＶＥＧＦは、血管新生に関与する因子であり、本発明によればそのファミリーメンバーである、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ等の転写を促進する。
【００４０】
ＰＧＣ−１αの転写が虚血や運動によって促進し、これによりＶＥＧＦの転写が促進して血管新生が促されることが知られていたが（非特許文献１）、本発明者らは新たに、超音波照射によりＰＧＣ−１の転写が促進することを見出した。本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１によれば、ＰＧＣ−１の発現を制御することによってＶＥＧＦの発現を制御することができるので、ＶＥＧＦが関与する血管新生を制御することが可能である。したがって、虚血性疾患の治療に好適に使用することができる。
【００４１】
ここで、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１によるＰＧＣ−１の発現制御、及びこれによるＶＥＧＦの発現制御は、従来公知の方法により、超音波照射部位のＰＧＣ−１又はＶＥＧＦの発現量を測定することにより確認することができる。そして、測定した発現量をコントローラ１２にフィードバックし、これに基づいてコントローラ１２が送信用発振部１４２及び送信器１４１による超音波の出力を制御するようになっていてもよい。
【００４２】
ここで、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１による超音波の照射の対象となる生体には、生細胞、生体組織、動物個体等が含まれる。本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１による超音波の照射の対象を生細胞としたとき、当該生細胞の例としてヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられ、さらにヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト大動脈由来欠陥平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）、マウス筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２）等を対象とすることもできる。
【００４３】
本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１を動物個体に使用する場合、患部を覆う皮膚の表面に、水、ゲル、カップリング剤等の媒体を介して、非侵襲的にプローブ２０が接するように、生体に取り付けて使用することができる。プローブ２０が生体に取り付けられた後、超音波送信部１４から探触子２１に送信された超音波を、探触子２１から生体に対して出力する。
【００４４】
ここで、ＰＧＣ−１の発現制御装置１により生体に照射される超音波の周波数は０．５〜３ＭＨｚの±１０％の範囲内であることが好ましく、１〜２ＭＨｚの±１０％の範囲内であることがさらに好ましく、２ＭＨｚ±１０％であることが最も好ましい。ここで、「±１０％」は誤差範囲を意図しており、すなわち「０．５〜３ＭＨｚ±１０％の範囲内」とは、０．５〜３ＭＨｚの範囲とその誤差範囲±１０％とを含むことを意図している。つまり「０．５〜３ＭＨｚ±１０％」とは、「０．４５〜３．３ＭＨｚ」と表現することもできる。以下、他の数値範囲の記載においても、「±１０％」なる表現を同様の意図で使用する。
【００４５】
また、その照射時間は、１日あたり２０分〜４０分間の±１０％の範囲内であることが好ましく、1日あたり２０分間±１０％であることが最も好ましい。これにより、より効果的にＰＧＣ−１の発現を促進させることができる。また、ＰＧＣ−１の発現制御装置１により生体に照射される超音波の出力は３０ｍＷ／ｃｍ２±１０％であり、ｄｕｔｙ比は１０％±１０％又は２０％±１０％であり、ＰＲＦは１ｋＨｚ±１０％又は１００ｋＨｚ±１０％であることが好ましいが、これに限定されない。コントローラ１２は、上述した周波数、照射時間、出力、ｄｕｔｙ比、及びＰＲＦで、生体に超音波を照射するように超音波送信部１４を制御する。
【００４６】
また、コントローラ１２は、複数の探触子２１〜２１ｎのそれぞれを、時分割で順次駆動して同一の周波数で超音波を放出させるように超音波送信部１４を制御してもよい。例えば、４つの探触子２１を用いて、ＰＲＦ１ｋＨｚ及びｄｕｔｙ比２０％で超音波を照射する場合、１つの探触子２１を２００μｓｅｃ駆動し、５０μｓｅｃ休止した後、他の１つの探触子２１を２００μｓｅｃ駆動し、これを４つの探触子２１の全てについて順次繰り返し、総照射時間及び総出力が上述した範囲内になるように制御する。探触子２１の駆動順については特に限定されない。このように超音波照射することによって、特定箇所に超音波の照射エネルギーが集中することなく、生体に効率よく超音波を照射することができる。
【００４７】
（第２の実施形態）
本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置の他の実施形態について、図２を参照して以下に説明する。図２は、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１ａの他の実施形態を示すブロック図である。図２に示すように、本実施形態に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１ａは、超音波送信部１４が１つである点と、切り替えスイッチ１５を備えている点とにおいて第１の実施形態のＰＧＣ−１の発現制御装置１と異なっている。本実施形態においては、第１の実施形態と異なる点についてのみ詳細に説明し、他の説明は省略する。
【００４８】
ＰＧＣ−１の発現制御装置１ａにおいては、本体部１０ａの１つの超音波送信部１４によって、プローブ２０ａの複数の探触子２１〜２１ｎに対して所定の超音波を送信する。超音波送信部１４の送信用発振部１４２から発振されて送信器１４１に出力された超音波は、切り替えスイッチ１５において複数の探触子２１〜２１ｎに対して所定の超音波を送信するように切り替えられ、各探触子２１に送信される。このように、探触子２１を複数備えることによって、広範囲の超音波照射を実現しつつ、超音波送信部１４の数を減らすことができるので、本体部１０ａの小型化及び低コストな超音波照射を実現できる。
【００４９】
（探触子２１）
次に、ＰＧＣ−１の発現制御装置１及び１ａのプローブ２０又は２０ａに備えられた探触子２１の構成について、図３（ａ）及び（ｂ）を参照して説明する。図３（ａ）及び（ｂ）は、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置の１及び１ａの探触子２１の構成例を示す模式図である。図３中（ａ）は、探触子２１の上面図を示しており、図３中（ｂ）は探触子２１の断面図を示している。
【００５０】
図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、探触子２１は、探触子ハウジング２１０内に、複数の振動子２１１と感度データ格納素子２１２とを備え、これらがコネクタ２１３により接続されている。振動子２１１は、ハウジング２１０内に２行３列に配列して設けられている。なお、本実施形態において振動子２１１を６素子用いて２行３列に配列して設けたが、本発明はこれに限定されない。ハウジング２１０はシリコン等によって形成される。探触子２１は、図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、生体への接触面積を増大させ、超音波の照射面積を増大させるために、矩形状であることが好ましい。プローブ２０ａにおいては、矩形状の探触子２１を複数設け、隣接する探触子２１を互いに接続させて構成する。
【００５１】
複数の振動子２１１はそれぞれ、超音波送信部１４から送信される超音波を受信して振動し、生体に対して超音波を照射する。感度データ格納素子２１２は、探触子２１の感度データを格納して記憶する。各探触子２１毎に記憶された感度データは、コントローラ１２又は送信器１４１にフィードバックされ、これに基づいて探触子の感度ばらつきが補正される。また、探触子２１は、探触子の感度分類を示すデータを格納する素子を備えていてもよく、当該データをコントローラ１２等にフィードバックして、感度ばらつきを補正するようになっていてもよい。
【００５２】
〔虚血性疾患の治療装置及び治療方法〕
本発明に係る虚血性疾患の治療装置は、上述した本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１を備えている。本発明に係る虚血性疾患の治療方法は、生体に超音波を照射してＰＧＣ−１の発現を促進する発現促進工程を包含している。また、本発明に係る虚血性疾患の治療方法は、生体に超音波を照射する超音波照射工程をさらに包含していてもよい。本発明に係る虚血性疾患の治療方法において、発現制御工程及び超音波照射工程は本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１によって行うことができる。
【００５３】
本発明に係る虚血性疾患の治療装置及び治療方法の治療の対象となる疾患は、血流の低下により生じる虚血性疾患であり、ＰＧＣ−１の発現を制御することによって治療効果を発揮することができる疾患であれば特に限定されない。例えば、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症、慢性閉塞性動脈硬化症（ＡＳＯ）、ビュルガー病（ＴＡＯ）等が挙げられ、特にＡＳＯ、ＴＡＯ等の重症虚血性末梢血管疾患の治療に好適に使用可能である。
【００５４】
本発明に係る虚血性疾患の治療装置及び治療方法においては、治療の対象となる生体の虚血性疾患部位（患部）に超音波を照射してＰＧＣ−１の発現を制御することによって、ＶＥＧＦが関与する血管新生を促進し、上述したような虚血性疾患を治療する。本発明に係る虚血性疾患の治療装置及び治療方法によるＰＧＣ−１の発現の制御は、本発明に係るＰＧＣ−１の発現制御装置１の超音波送信部１４から生体の患部に超音波を照射することによって行うことができる。
【００５５】
本発明に係る虚血性疾患の治療装置及び治療方法において、生体に照射される超音波の周波数は０．５〜３ＭＨｚの±１０％の範囲内であることが好ましく、１〜２ＭＨｚの±１０％の範囲内であることがさらに好ましく、２ＭＨｚ±１０％であることが最も好ましい。また、その照射時間は、１日あたり２０分〜４０分間の±１０％の範囲内であることが好ましく、1日あたり２０分間±１０％であることが最も好ましい。また、本発明に係る虚血性疾患の治療装置及び治療方法において、生体に照射される超音波の出力は３０ｍＷ／ｃｍ２±１０％であり、ｄｕｔｙ比は１０％±１０％又は２０％±１０％であり、ＰＲＦは１ｋＨｚ±１０％又は１００ｋＨｚ±１０％であることが好ましいが、これに限定されない。
【００５６】
また本発明に係る虚血性疾患の治療装置及び治療方法においては、複数の探触子のそれぞれから時分割で順次放出された超音波を、生体に照射してもよい。これにより、特定箇所に超音波の照射エネルギーが集中することなく、生体に効率よく超音波を照射することができる。
【００５７】
本発明に係る虚血性疾患の治療装置は、患部を覆う皮膚の表面に、ＰＧＣ−１の発現制御装置１のプローブ２０が接するように、生体に取り付けて使用することができる。プローブ２０が生体に取り付けられた後、超音波送信部１４から探触子２１に送信された超音波を、探触子２１から生体に対して出力する。
【００５８】
本発明に係る虚血性疾患の治療装置及び治療方法においては、生体の患部全体に超音波を照射することが好ましい。したがって、治療の対象となる患部が広範囲に及ぶ場合、一度の照射では患部全体に超音波を照射できないため、一度目の超音波照射の後にプローブ２０を取り外し、他の箇所にプローブを取り付けて二度目の超音波照射を行い、患部全体に超音波を照射するまでこれを繰り返せばよい。本明細書中において、「患部」とは、疾患が生じている部分（病状が観察される部分）を意図しており、「患部全体」とは、一定範囲内において疾患が生じている部分の全てを意図している。
【００５９】
本発明に係る虚血性疾患の治療方法においては、治療効果を確認する工程をさらに包含していてもよい。当該工程において、超音波照射部位のＰＧＣ−１又はＶＥＧＦの発現量を測定することにより治療効果を確認してもよい。
【００６０】
本発明に係る虚血性疾患の治療装置及び治療方法によれば、非侵襲的に超音波を患部に照射し、ＰＧＣ−１の発現を制御することによって、ＶＥＧＦが関与する血管新生を促すので、患者に過度の負担を与えることなく治療することが可能である。また、治療経費が安価である上に、安全性が確立されており、かつ安定性が高いので、適用患者が限定されない。
【００６１】
〔実施例〕
（実施例１）
ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いて、超音波照射によるＰＧＣ−１及びＶＥＧＦの発現量の変化について調査した。
【００６２】
ヒト間葉系幹細胞（Ｒ１７、Ｒ２２、Ｒ３７、Ｒ４４）（患者腸骨髄より採取）を、６穴プレート上でサブコンフルエント（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）になるように４８時間培養した。その後、細胞を１５時間血清飢餓状態（０．１％ＢＳＡ）においた。
【００６３】
次に細胞を、１０ｃｍディシュ２枚にそれぞれ播種し、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）含有低グルコースＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製；Ｄ６０４６）で培養して継代後、５ディッシュに分けた。９５％コンフルエントに達したときに、培地を除去してＰＢＳにおいて細胞を洗浄し、２ｍＬの０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡを加えて３分間放置した。その後、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）含有低グルコースＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製；Ｄ６０４６）を８ｍＬ加え、細胞懸濁液５０ｍＬをチューブに移した。
【００６４】
この細胞懸濁液を含むチューブを遠心分離（１１００ｒｐｍで５分間）した後上清を除去し、５０％コンフルエントとなるように適量の１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）を含む低グルコースＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製；Ｄ６０４６）に再懸濁させた。この再懸濁液を２ｍＬずつ６ウエルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーターで培養した。培養２日後に、培地を除去してＰＢＳで２回洗浄した後、０．１％ＢＳＡ含有低グルコースＤＭＥＭ培地を２ｍＬ添加して血清飢餓状態においた。
【００６５】
血清飢餓状態においてから１６時間後、超音波照射群の細胞に周波数（１ＭＨｚ、１．５ＭＨｚ、２ＭＨｚ及び３ＭＨｚ）、出力（３０ｍＷ／ｃｍ２）、ｄｕｔｙ比（２０％）、ＰＲＦ（１ｋＨｚ）の条件で２０分間、４つの探触子２１を備えた図１に示す装置を用いて超音波照射を行った。超音波の照射は、１つ目の探触子２１を２００μｓｅｃ駆動し、５０μｓｅｃ休止した後、２つ目の探触子２１を２００μｓｅｃ駆動し、これを４つの探触子２１の全てについて順次繰り返し、総照射時間及び総出力が上述した値になるように行った。具体的には、バット上に図１に示す装置を載置してバット内に水を張り、当該バット内の水上に細胞懸濁液を播種した６ウエルプレートを浮かべ、水でカップリングして当該装置から超音波を細胞に照射した。超音波照射開始から１、３、６、９、及び１２時間後にそれぞれ培地を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。
【００６６】
洗浄後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ社製）を０．６ｍＬ添加してピペットで混合した。その後細胞を回収してＲＮＡ抽出まで−８０℃でサンプルを凍結保存した。超音波を照射しないコントロール細胞についても同様に準備した。
【００６７】
凍結保存したサンプルから、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、Ｒｏｃｈｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔマニュアルに従ってＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。
【００６８】
抽出したＲＮＡ  ５００μｇを反応プレートに入れ、液量が１０μＬとなるように、Ｒｎａｓｅ／Ｄｎａｓｅフリー水を加えた。１μＬのＯＬＩＧＯ  ｄＴ２０を（２ｐｍｏｌ／μＬ）さらに加え、６５度で５分間ＲＮＡを変性させた。ＲＮＡ変性後、プレートを急速に常温に戻した後、１分間遠心分離した。さらに、表１に示すＲＴ−ＰＣＲ反応液を９μＬ加えて攪拌し、遠心分離した。４２度で２０分間、９９度で５分間反応させ、ＲＴ−ＰＣＲを行った。逆転写酵素としてＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（登録商標）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。
【００６９】
【表１】
2011058600.tif 000003
【００７０】
ＲＴ−ＰＣＲステップ後の反応液を遠心分離し、８０μＬのＲｎａｓｅ／Ｄｎａｓｅフリー水を加えて攪拌した。得られた２μＬのｃＤＮＡを、表２に示すリアルタイムＰＣＲ反応液  ８μＬを加えたプレートの各ウエルに入れて攪拌した後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離後の反応液を９５度で１０分間反応させた後、最大４５サイクルまで９５度で１０秒間、６０度で２５秒間反応させ、リアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩを用いて行った。リアルタイムＰＣＲにより増幅したｃＤＮＡに対して、ＨＰＲＴ１遺伝子を内部標準としてＰＧＣ−１α、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、及びＶＥＧＦ−ＣのＲＮＡ発現量を定量した。
【００７１】
【表２】
2011058600.tif 000004
【００７２】
結果を図４〜７に示す。図４〜７においては、超音波照射後の細胞における遺伝子の転写量を、超音波照射していないコントロール細胞における遺伝子の転写量に対する相対比として表している。
【００７３】
図４に示すように、コントロール細胞のＰＧＣ−１αのＲＮＡ発現量（ＨＲＰＴ１比）を１としたときの、超音波照射細胞のＰＧＣ−１αのＲＮＡ発現量の相対比は、超音波の周波数１ＭＨｚ〜３ＭＨｚのいずれにおいても、超音波照射６時間後まで増加した。また、図５〜７に示すように、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、及びＶＥＧＦ−ＣそれぞれのＲＮＡ発現量も、超音波照射により増加した。
【００７４】
（比較例１）
実施例１と同様に調製したヒト間葉系幹細胞において、超音波照射によるＨＩＦ−１αの発現量の変化を実施例１と同様に調査した。結果を図８に示す。図８に示すように、ＨＩＦ−１αのＲＮＡ発現量は、超音波照射によって変化しなかった。
【００７５】
（実施例２）
血管新生モデルマウスを用いて、超音波照射によるＰＧＣ−１及びＶＥＧＦの発現量の変化について調査した。
【００７６】
抗ウサギＰＧＣ−１抗体（ｓｃ−１３０６７）、抗ウサギＶＥＧＦ抗体（ｓｃ−１５２）、抗ヤギＶＥＧＦ−Ｂ抗体（ｓｃ−１８７６）、及び抗ヤギＶＥＧＦ−Ｃ抗体（ｓｃ−１８８１）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より購入した。抗ＣＤ３１抗体を、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社より購入した。ヒストファインシンプルステインマウスＭＡＸ−ＰＯ（Ｒ）、ヒストファインシンプルステインマウスＭＡＸ−ＰＯ（Ｇｏａｔ）、シンプルステインＤＡＢ溶液を、株式会社ニチレイバイオサイエンス社より購入した。アルカリ性ホスファターゼ染色キットを、シグマアルドリッチ社から購入した。
【００７７】
マウス（Ｃ５７Ｂ６／６Ｊ、♂、８週齢）を日本チャールズ・リバー株式会社より購入した。血管新生モデルマウスの作製を、定法に従って行った(参考文献１：Am J Pathol 1998. 152:1667-1679)。血管新生モデルマウスの虚血処理を施した足（患足）にカップリング剤を塗布し、当該カップリング剤を介して図１に示す装置から患足に超音波を照射した。照射する超音波の周波数を１ＭＨｚ及び２ＭＨｚとした以外は、実施例１と同様の照射条件で超音波照射を行った。超音波照射の前日、並びに超音波照射開始日の１日後、４日後、７日後、１１日後、１４日後、１８日後、２１日後、２５日後、及び２８日後に、レーザードップラー血流解析（Moor LDI; Moor Instruments, Axminster, UK）により血流回復を評価した。
【００７８】
結果を図９〜１４に示す。図９は、周波数１ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ１０の結果を示しており、図１０は、周波数１ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ１５の結果を示している。図１１は、周波数２ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ２０の結果を示しており、図１２は、周波数２ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ２１の結果を示している。図１３は、超音波を照射していないコントロール個体ＩＤ２６の結果を示しており、図１４は、超音波を照射していないコントロール個体ＩＤ７の結果を示している。
【００７９】
図９〜１２の各レーザードップラー撮影写真に示すように、周波数１ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ１０及びＩＤ１５、並びに周波数２ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ２０及びＩＤ２１については、２８日目までに十分な血流回復が確認された。一方、図１３及び１４の各レーザードップラー撮影写真に示すように、超音波を照射していないコントロール個体ＩＤ２６及びＩＤ７については、２８日目までに十分な血流回復が確認できなかった。
【００８０】
マウスを取り扱う際は、実験動物用ガス麻酔システム(ＤＳファーマ社製)を用いて、イソフルラン(アボットジャパン株式会社製)吸入麻酔下で行った。２８日目のレーザードップラー血流解析後、ペントバルビタール（２５ｍｇ／ｋｇ）麻酔下で頚動脈切断並びに脱血させることで、マウスを死に至らしめた。その後、速やかに両足の大腿筋を摘出し、６％トラガントゴムを盛り付けた５ｍｍコルク（φ２１ｍｍ）の上に乗せ、液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速冷凍した。凍結組織をプラスチック瓶内に保存し、薄切するまで−８０℃で保管した。
【００８１】
＜ヘマトキシリン・エオジン染色＞
−８０℃で保存していた凍結組織を、クリオスタット（ＬＥＩＣＡ  ＣＭ１９５０）内で−２５℃に戻し、５μｍの厚みになるように薄切した。薄切組織切片をＡＰＳコートスライドガラス（Ｓ８４４１；松浪硝子工業株式会社製）に接着させた。室温で３０分間風乾させ、１０％中性緩衝ホルマリン液中（０６２−０１６６１；和光純薬工業株式会社製）で１０分間固定した。固定した組織切片をマイヤーヘマトキシリン（サクラファインテックジャパン株式会社製）で１２分間染色後、温水発色し、さらにエオジン（サクラファインテックジャパン株式会社製）で１０分間染色後、流水水洗した。染色後の組織切片の脱水及び透徹処理を行い、封入した。封入した組織切片について、倒立式光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ８１）により顕微鏡写真を撮影した。結果を図１５〜１７に示す。
【００８２】
図１５〜１７に示すように、各標本において筋線維の断面が表示され、血管組織も確認された。したがって、これらの個体の標本を用いて、以下に示すアルカリ性ホスファターゼ染色及び免疫組織染色を行い、血管新生を観察した。また、血管数の増加を確認するために、血管内皮のマーカーであるＣＤ３１の増加を免疫組織染色により観察した。
【００８３】
＜アルカリ性ホスファターゼ染色＞
−８０℃で保存していた凍結組織を、クリオスタット（ＬＥＩＣＡ  ＣＭ１９５０）内で−２５℃に戻し、５μｍの厚みになるように薄切した。薄切組織切片をＡＰＳコートスライドガラス（Ｓ８４４１；松浪硝子工業株式会社製）に接着させた。室温で３０分間風乾させ、アルカリ性ホスファターゼ染色キットを用い、定法に従ってアルカリ性ホスファターゼ染色を行った。染色した組織切片を、倒立式光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ８１）により顕微鏡写真を撮影した（図１８〜２０）。
【００８４】
図１８〜２０に示すように、周波数１ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ１５、ＩＤ１０、及びＩＤ１６、並びに周波数２ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ２１、ＩＤ２０、及びＩＤ１９については、血管新生が観察された一方で、超音波を照射していないコントロール個体ＩＤ７、ＩＤ２６及びＩＤ４については、血管新生が観察されなかった。
【００８５】
また、得られた写真像からＡＬＰａｓｅ陽性反応を得たスポット数を計数して、同写真像に含まれる筋線維数で除し、片足あたり５視野ずつ計数して、その平均値を求めた。患足から得た平均値を、もう片方の虚血処理を施していない足（健足）から得た平均値で除することによって、標準化処理を行った。結果を図２１に示す。
【００８６】
図２１は、健足に対する患足の毛細血管密度比をグラフ化したものである。図２１に示すように、超音波照射群では多数の血管新生が確認された一方で、超音波を照射していないコントロール個体ＩＤ７、ＩＤ２６及びＩＤ４については、確認された血管新生は少ないものであった。
【００８７】
＜免疫組織化学染色＞
−８０℃で保存していた凍結組織（虚血側下肢）を、クリオスタット（ＬＥＩＣＡ  ＣＭ１９５０）内で−２５℃に戻し、５μｍの厚みになるように薄切した。薄切組織切片をＡＰＳコートスライドガラス（Ｓ８４４１；松浪硝子工業株式会社製）に接着させた。室温で３０分間風乾させ、１０％中性緩衝ホルマリン液中で１０分間固定した。ＴＢＳＴで十分に洗浄し、１．５％過酸化水素水加メタノール処理により内在性ペルオキシダーゼを失活させた。ＴＢＳＴで十分に洗浄した後、ＴＢＳＴ中に溶解させた０．５％ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（１０９６１７６；ロシュダイアグノスティックス株式会社）を用いて、ブロッキング処理を室温で１時間行った。
【００８８】
０．５％ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ／ＴＢＳＴで適当に希釈した各種一次抗体を組織切片上に滴下し、４℃で一晩、抗原−抗体反応を行った。組織切片をＴＢＳＴで十分に洗浄した後、各種ヒストファインシンプルステインを用いて、定法に従って処理した。ＴＢＳＴで十分に洗浄した組織切片上にシンプルステインＤＡＢ溶液を滴下し、室温で５〜２０分間反応させた後、流水洗浄により反応を停止させた。組織切片を精製水によりよく洗浄した後、５倍希釈したマイヤーヘマトキシリンで３０秒間反応させ、温水発色させた。組織切片の脱水・透徹処理を行い、封入した。封入した組織切片について、倒立式光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ８１）により顕微鏡写真を撮影した。結果を図２２〜２７に示す。
【００８９】
図２２は、抗ウサギＰＧＣ−１抗体を用いてＰＧＣ−１αの発現を確認した結果を示す写真図であり、図２３は、抗ウサギＶＥＧＦＡ抗体を用いてＶＥＧＦＡの発現を確認した結果を示す写真図である。これらのネガティブコントロールとして、図２６に、ウサギネガティブコントロール抗体を用いた結果を示す。また、図２４は、抗ヤギＶＥＧＦ−Ｂ抗体を用いてＶＥＧＦＢの発現を確認した結果を示す写真図であり、図２５は、抗ヤギＶＥＧＦ−Ｃ抗体を用いてＶＥＧＦＣの発現を確認した結果を示す写真図である。これらのネガティブコントロールとして、図２７に、ヤギネガティブコントロール抗体を用いた結果を示す。
【００９０】
図２２〜２５に示すように、周波数１ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ１５、ＩＤ１０、及びＩＤ１６、並びに周波数２ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ２１、ＩＤ２０、及びＩＤ１９については、それぞれＰＧＣ−１α、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、及びＶＥＧＦＣの発現が確認された。一方、超音波を照射していないコントロール個体ＩＤ７、ＩＤ２６及びＩＤ４については、ＰＧＣ−１α及びＶＥＧＦＡの発現が超音波照射個体よりも少なく、また、ＶＥＧＦＢ及びＶＥＧＦＣの発現が超音波照射個体と同等であった。
【００９１】
また、ＣＤ３１抗体を用いて、同様に免疫組織化学染色を行った組織切片について、立式光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ８１）により撮影した顕微鏡写真を、図２８〜３０に示した。また、上述したアルカリ性ホスファターゼ染色で得られた切片と同様に、ＣＤ３１陽性反応を得たスポット数を計数し、健足に対する患足の毛細血管密度比をグラフ化した（図３１）。
【００９２】
図２８〜３０に示すように、周波数１ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ１５、ＩＤ１０、及びＩＤ１６、並びに周波数２ＭＨｚで超音波を照射した個体ＩＤ２１、ＩＤ２０、及びＩＤ１９については、患足においてＣＤ３１陽性反応が多数確認された。一方、超音波を照射していないコントロール個体ＩＤ７、ＩＤ２６及びＩＤ４の患足におけるＣＤ３１陽性反応の数は少なかった。図３１に示すように、ＣＤ３１陽性反応を得たスポット数に基づく毛細血管密度比は、超音波を照射していないコントロール群に対して、超音波照射群の方が高かった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明に係るＰＧＣ−１αの発現制御装置は、生体内におけるＰＧＣ−１αの発現を制御することによってＶＥＧＦの発現量を制御し、血管新生を促進することができるので、慢性閉塞性動脈硬化症（ＡＳＯ）やビュルガー病のような虚血性疾患の治療装置に利用することができる。
【符号の説明】
【００９４】
１、１ａ      ＰＧＣ−１の発現制御装置
１０、１０ａ  本体部
１１          ユーザインターフェース
１２          コントローラ（制御手段）
１３          電源部
１４          超音波送信部（超音波照射手段）
１５          切り替えスイッチ
２０、２０ａ  プローブ
２１          探触子（超音波放出端子）
【図１】
2011058600.tif 000005
【図２】
2011058600.tif 000006
【図３】
2011058600.tif 000007
【図４】
2011058600.tif 000008
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図２１】
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【図３１】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年5月11日(2012.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に超音波を照射する超音波照射手段を備えたことを特徴とするＰＧＣ−１の発現制御装置。
【請求項２】
周波数が０．５〜３ＭＨｚ±１０％の範囲内の超音波を上記対象に照射するように上記超音波照射手段を制御する制御手段をさらに備えていることを特徴とする請求項１に記載のＰＧＣ−１の発現制御装置。
【請求項３】
上記制御手段は、上記対象に超音波を１日あたり２０〜４０分間±１０％の範囲内で照射するように上記超音波照射手段を制御することを特徴とする請求項２に記載のＰＧＣ−１の発現制御装置。
【請求項４】
上記超音波照射手段は、上記対象に対して媒体を介して非侵襲的に接触し、上記対象に照射する超音波を放出する少なくとも１つの超音波放出端子をさらに備えていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＰＧＣ−１の発現制御装置。
【請求項５】
複数の上記超音波放出端子のそれぞれを時分割で順次駆動して超音波を放出させるように上記超音波照射手段を制御する制御手段を備えていることを特徴とする請求項４に記載のＰＧＣ−１の発現制御装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＰＧＣ−１の発現制御装置を備えたことを特徴とする虚血性疾患の治療装置。
【国際調査報告】
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