(57)【要約】本発明は、タンパク質結晶の細孔の中に金属を担持した複合材料およびその製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質結晶の細孔に金属を有する、複合材料。
【請求項２】
前記金属がＴｉ，Ｖ，Ｃｒ，Ｍｎ，Ｆｅ，Ｃｏ，Ｎｉ，Ｚｎ，Ｇａ，Ｇｅ，Ｚｒ，Ｎｂ，Ｍｏ，Ｔｃ，Ｒｕ，Ｒｈ，Ｐｄ，Ａｇ，Ｃｄ，Ｉｎ，Ｓｎ，Ｈｆ，Ｔａ，Ｗ，Ｒｅ，Ｏｓ，Ｉｒ，Ｐｔ，Ａｕ，Ｈｇ，Ｔｌ，Ｐｂからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の複合材料。
【請求項３】
前記金属がＲｕ，Ｒｈ，Ｐｄ，Ａｇ，Ｃｄ，Ｉｎ，Ｓｎ，Ｈｆ，Ｔａ，Ｗ，Ｒｅ，Ｏｓ，Ｉｒ，Ｐｔ，Ａｕ，Ｈｇ，Ｔｌ，Ｐｂからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の複合材料。
【請求項４】
前記金属がＦｅ，Ｃｏ，Ｎｉ，Ｇｄからなる群から選ばれる少なくとも１種の強磁性を示す金属である、請求項１に記載の複合材料。
【請求項５】
前記結晶が正方晶、斜方晶、三斜晶、単斜晶、六方晶、三方晶および立方晶からなる群から選ばれる、請求項１に記載の複合材料。
【請求項６】
前記タンパク質が、サーモリシン、エラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ、ヒダントイナーゼ、プロテアーゼ、アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、インシュリン、ソウマチン、グルコースイソメラーゼ、キシラナーゼ、コンカナバリンA、リボヌクレアーゼ、ミオグロビン、フェリチンおよびリゾチームからなる群から選択される、請求項１に記載の複合材料。
【請求項７】
前記タンパク質が、サーモリシン、エラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ、ヒダントイナーゼ、プロテアーゼ、アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、インシュリン、ソウマチン、グルコースイソメラーゼ、キシラナーゼ、コンカナバリンA、リボヌクレアーゼ、ミオグロビン、フェリチンおよびリゾチームからなる群から選択される、請求項１に記載の複合材料。
【請求項８】
前記タンパク質がリゾチームである、請求項１に記載の複合材料。
【請求項９】
タンパク質結晶を金属化合物の溶液に含浸し、前記タンパク質を洗浄し、前記タンパク質に結合した金属イオンを還元することを特徴とする、タンパク質結晶の細孔に金属を有する複合材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質結晶を用いた複合材料及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属の活性は、金属を担持させる担体により大きく変化する。金属担体としては、シリカ、チタニア、ジルコニア、ゼオライト、活性炭などの無機材料がよく使用される。【０００３】
日本蛋白質構造データバンク（PDBj: Protein Data Bank Japan)には、タンパク質の種類、結晶形などにより種々のサイズの細孔を有するタンパク質結晶が登録されている。【０００４】
このようなタンパク質を担体として金属を担持させる試みがなされている。例えば非特許文献１は、ウイルス粒子をグルタルアルデヒドで架橋した後、Ｐｄ、Ｐｔを担持させることを開示する。また、非特許文献２は、リゾチームの正方晶にAgまたはAuを担持させることを開示する。【０００５】
タンパク質は、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２などの金属と配位できる官能基を多数有しているため、金属イオンを配位できることは知られているが、その細孔の中に金属原子を保持するタンパク質結晶は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J.AM.CHEM.SOC.VOL.27, NO.15, 2005 5274-5275
【非特許文献２】Angew Chem. Int. Ed. 2010, 49, 520-523
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はタンパク質結晶の細孔の中に金属を担持した複合材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の複合材料およびその製造方法を提供するものである。
項１．  タンパク質結晶の細孔に金属を有する、複合材料。
項２．  前記金属がＴｉ，Ｖ，Ｃｒ，Ｍｎ，Ｆｅ，Ｃｏ，Ｎｉ，Ｚｎ，Ｇａ，Ｇｅ，Ｚｒ，Ｎｂ，Ｍｏ，Ｔｃ，Ｒｕ，Ｒｈ，Ｐｄ，Ａｇ，Ｃｄ，Ｉｎ，Ｓｎ，Ｈｆ，Ｔａ，Ｗ，Ｒｅ，Ｏｓ，Ｉｒ，Ｐｔ，Ａｕ，Ｈｇ，Ｔｌ，Ｐｂからなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１に記載の複合材料。
項３．  前記金属がＲｕ，Ｒｈ，Ｐｄ，Ａｇ，Ｃｄ，Ｉｎ，Ｓｎ，Ｈｆ，Ｔａ，Ｗ，Ｒｅ，Ｏｓ，Ｉｒ，Ｐｔ，Ａｕ，Ｈｇ，Ｔｌ，Ｐｂからなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１に記載の複合材料。
項４．  前記金属がＦｅ，Ｃｏ，Ｎｉ，Ｇｄからなる群から選ばれる少なくとも１種の強磁性を示す金属である、項１に記載の複合材料。
項５．  前記結晶が正方晶、斜方晶、三斜晶、単斜晶、六方晶、三方晶および立方晶からなる群から選ばれる、項１に記載の複合材料。
項６．  前記タンパク質が、サーモリシン、エラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ、ヒダントイナーゼ、プロテアーゼ、アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、インシュリン、ソウマチン、グルコースイソメラーゼ、キシラナーゼ、コンカナバリンA、リボヌクレアーゼ、ミオグロビン、フェリチンおよびリゾチームからなる群から選択される、項１に記載の複合材料。
項７．  前記タンパク質が、サーモリシン、エラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ、ヒダントイナーゼ、プロテアーゼ、アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、インシュリン、ソウマチン、グルコースイソメラーゼ、キシラナーゼ、コンカナバリンA、リボヌクレアーゼ、ミオグロビン、フェリチンおよびリゾチームからなる群から選択される、項１に記載の複合材料。
項８．  前記タンパク質がリゾチームである、項１に記載の複合材料。
項９．  タンパク質結晶を金属化合物の溶液に含浸し、前記タンパク質を洗浄し、前記タンパク質に結合した金属イオンを還元することを特徴とする、タンパク質結晶の細孔に金属を有する複合材料の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、タンパク質結晶の細孔内に金属を充填した複合材料を得ることができる。この細孔の内部は、タンパク質のアミノ基、カルボキシル基、イミダゾール基、チオール基などの官能基を有し、特定の立体配置を有する不斉な環境であるため、不斉合成触媒、不斉カラム担体として好適である。【００１０】
タンパク質が酵素の場合には、酵素を安定化し、酵素の活性を保持したまま金属との複合材料を提供できる。【００１１】
金属としてＦｅ，Ｃｏ，Ｎｉ，Ｇｄなどの強磁性を示す金属を使用すれば、磁性を有する複合材料を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】CoPt粒子の合成スキーム。
【図２】Co微粒子の磁性評価。A：Co/正方晶 HEWL Co(0%)。B：Co/斜方晶 HEWL。正方晶 HEWLではCoは結晶の細孔中に導入されず、Co含有率は実質的に０％であった（A）。一方、斜方晶 HEWLではCoが細孔内に充填され、磁性を有することが示された。図２は結晶系の違いによってCo含有率が異なることを示す。
【図３】CoPt微粒子の磁性評価。図3は斜方晶を用いることにより高い磁気異方性(Hc)が得られることを示す。A：CoPt/正方晶 HEWL。B：CoPt/斜方晶 HEWL。
【図４】Co/Ptの組成変化。図4は、Co含有量増加により高い磁気異方性（Hc）が得られることを示す。A：CoPt/正方晶 HEWL  Co:Pt＝1:41。B：CoPt/斜方晶 HEWL  Co:Pt＝1:5。
【図５】Coイオン、Ptイオン、 架橋リゾチーム結晶共存下合成した複合材料の透過型電子顕微鏡（TEM）像と微粒子直径のヒストグラムを示す。A：正方晶 Co:Pt(原子％) 1:35。B：斜方晶 Co:Pt(原子％) 1:41。C：斜方晶 Co:Pt(原子％) 1:5。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に使用するタンパク質は、結晶になり得るものであれば特に限定されず、任意のタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、酵素、生体構造を形成するタンパク質（コラーゲン、ケラチンなど）、ホルモン、受容体、筋肉構成タンパク質（アクチン、ミオシンなど）、抗体、栄養タンパク質(卵、大豆、乳などに含まれるタンパク質)、アルブミンなどが挙げられる。酵素としては、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼ、およびオキシドレダクターゼなどが挙げられ、ヒドロラーゼが好ましい。ヒドロラーゼとしては、サーモリシン、エラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ、ヒダントイナーゼ、プロテアーゼ、アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、リゾチームなどが挙げられ、リゾチームが好ましい。
【００１４】
タンパク質の結晶としては、正方晶、斜方晶、三斜晶、単斜晶、六方晶、三方晶および立方晶が挙げられ、斜方晶、正方晶などが好ましい。細孔のサイズは、0.1〜500ｎｍ、好ましくは0.5〜50ｎｍである。結晶は、細孔のサイズが大きい方が多量の金属を担持できるので好ましい。
【００１５】
タンパク質の結晶は、そのまま金属を担持させてもよいが、タンパク質を架橋剤により架橋して構造を安定化するのが好ましい。タンパク質の架橋剤としては、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド基を２以上有する架橋剤、ホルムアルデヒド、あるいは、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、スクシンイミドなどのＯＨ，ＳＨ，ＮＨ２などのタンパク質の側鎖官能基と反応し得る基を２以上有する架橋剤などが挙げられる。このような架橋剤は、タンパク質結晶１００重量部に対し、0.1〜100,000重量部、好ましくは1〜5000重量部、より好ましくは10〜200重量部使用される。
【００１６】
金属としては、Ｔｉ，Ｖ，Ｃｒ，Ｍｎ，Ｆｅ，Ｃｏ，Ｎｉ，Ｚｎ，Ｇａ，Ｇｅ，Ｚｒ，Ｎｂ，Ｍｏ，Ｔｃ，Ｒｕ，Ｒｈ，Ｐｄ，Ａｇ，Ｃｄ，Ｉｎ，Ｓｎ，Ｈｆ，Ｔａ，Ｗ，Ｒｅ，Ｏｓ，Ｉｒ，Ｐｔ，Ａｕ，Ｈｇ，Ｔｌ，Ｐｂなどが挙げられ、これらの金属の１種又は２種以上を使用できる。
【００１７】
金属は、酢酸塩、硝酸塩、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩などの金属化合物の形態で水、アルコール(メタノール、エタノール、イソプロパノールなど)、アセトンなどのケトン、ＤＭＦ，ＤＭＳＯなどの極性溶媒に溶解される。この金属化合物の溶液にタンパク質結晶を含浸し、洗浄後、前記タンパク質に結合した金属イオンを還元することでタンパク質結晶の細孔に金属を有する複合材料を製造することができる。
【００１８】
本発明の１つの実施形態において、金属としてＦｅ，Ｃｏ，Ｎｉ，Ｇｄなどの強磁性を示す金属を単独であるいは他の金属と組み合わせて使用すれば、磁性を有する複合材料を得ることができる。
【００１９】
金属は、タンパク質の結晶１００重量部に対し、0.1〜1,000,000重量部、好ましくは、1〜1000重量部より好ましくは10〜100重量部担持される。なお、金属は、結晶の表面と細孔の両方に結合し得るが、表面積は圧倒的に細孔内が大きいので、実質的に細孔内に担持される。
【００２０】
タンパク質の結晶を前記金属化合物の溶媒に含浸し、金属イオンをタンパク質の細孔内においてタンパク質の側鎖官能基（ＮＨ２，ＣＯＯＨ，イミダゾール、ＳＨなど）に捕捉する。金属イオンとして、これらの側鎖官能基との結合の弱いものは、その後の洗浄過程で除去されるが、側鎖官能基との結合の強いものはタンパク質結晶の細孔内に保持される。金属として、よりソフトな大きい遷移金属イオン（Ｒｕ，Ｒｈ，Ｐｄ，Ａｇ，Ｃｄ，Ｉｎ，Ｓｎ，Ｈｆ，Ｔａ，Ｗ，Ｒｅ，Ｏｓ，Ｉｒ，Ｐｔ，Ａｕ，Ｈｇ，Ｔｌ，Ｐｂなど）は細孔内に強く保持される。これらの金属と細孔内でのタンパク質との結合がやや弱い金属（Ｔｉ，Ｖ，Ｃｒ，Ｍｎ，Ｆｅ，Ｃｏ，Ｎｉ，Ｚｎ）などは、タンパク質の種類もしくは結晶構造によっては、洗浄により除去される。例えばリゾチームの正方晶をタンパク質結晶として用いた場合、AgまたはAuは、洗浄により容易に除去されるため、細孔内には実質的に保持されない。
【００２１】
次に保持された金属イオンを還元剤により還元して、細孔内に金属を析出させる。還元剤としては、ＮａＢＨ４などの金属水素化物、次亜リン酸塩、亜硫酸塩、アスコルビン酸、光、メタノール、ヒドラジン、電気化学的還元などが挙げられ、NaBH4が好ましい。
【実施例】
【００２２】
以下に、実施例を挙げてこの発明を具体的に説明する。ただし、下記の実施例はこの発明を例示するだけであって、この発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２３】
（１）鶏卵白リゾチーム（HEWL）の結晶化
Tetragonal結晶は、25 mg/mL HEWL、0.4 M NaCl、0.1 M NaOAc (pH4.5)存在下、20℃でバッチ法により作製した。Orthorhombic結晶は、80 mg/mL  HEWL、0.7 M NaCl、0.1 M NaOAc (pH4.5)存在下、37℃でバッチ法により作製した。【００２４】
（２）HEWL結晶の架橋化
Tetragonal, Orthorhombic結晶を1.0 M NaCl、0.1 M NaOAc (pH4.5)溶液で洗浄した後、1.0 %グルタルアルデヒド水溶液（1.0 M NaCl、0.1 M NaOAc (pH 4.8)）に浸し、リゾチーム結晶を架橋化する。6時間後、水で結晶を洗浄し、水中で結晶を保存した。【００２５】
（３）CoPt粒子の作製
リゾチーム結晶を50 mM CoCl2, 50 mM K2PtCl4、0.1 M NaOAc (pH4.5)溶液に浸し撹拌する。16時間後、結晶を水で洗浄し、結晶内部に取り込まれていないCo, Ptイオンを除去する。0.1 M NaBH4を加え、Co, Ptイオンを還元させ、CoPt粒子を作成する。結晶を水で洗浄後、真空乾燥した。CoPt粒子の作製のスキームを図１に示す。【００２６】
上記の条件は、CO:Pt付加＝1:1のときの条件であるが、
CO:Pt付加＝200:1の場合は、500mM CoCl2、2.5mM K2PtCl4
CO:Pt付加＝40:1の場合は、100mM CoCl2、2.5mM K2PtCl4
であった。【００２７】
（４）CoPt内包リゾチーム結晶のキャラクタリゼーション
乾燥させたCoPt内包リゾチーム結晶の磁化測定を超伝導磁束量子干渉計(SQUID)を用いて行い、CoとPtの比は、蛍光X線測定により算出した。CoPt粒子の形状、サイズは、透過型電子顕微鏡(TEM)で観察した(図５)。結果を図１〜図５に示す。結晶中のCoとPtの比は、以下の表1で「CO:Pt(原子%)」として示す。【００２８】
また、金属内包リゾチーム結晶の磁気特性を表１に示す。【００２９】
なお、表１において、「CO:Pt付加」とは、結晶を浸漬したCoCl2とK2PtCl4の濃度比である。【００３０】
【表１】
2011083735.tif 000002
【００３１】
表１の結果より、本発明の複合材料は、優れた磁気特性を有することが明らかになった。
【図１】
2011083735.tif 000003
【図２】
2011083735.tif 000004
【図３】
2011083735.tif 000005
【図４】
2011083735.tif 000006
【図５】
2011083735.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成24年3月19日(2012.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋されたタンパク質結晶の細孔に金属を有する、複合材料であって、前記金属がＦｅ，Ｃｏ，Ｎｉからなる群から選ばれる強磁性を示す金属を含み、前記タンパク質がサーモリシン、エラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ、ヒダントイナーゼ、プロテアーゼ、アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、インシュリン、ソウマチン、グルコースイソメラーゼ、キシラナーゼ、コンカナバリンＡ、リボヌクレアーゼ、ミオグロビンおよびリゾチームからなる群から選択され、前記結晶が正方晶、斜方晶、三斜晶、単斜晶、六方晶、三方晶および立方晶からなる群から選ばれる、複合材料。
【請求項２】
前記金属が、強磁性を示す金属に加えてさらにＺｎ，Ｇａ，Ｇｅ，Ｚｒ，Ｎｂ，Ｍｏ，Ｔｃ，Ｒｕ，Ｒｈ，Ｐｄ，Ａｇ，Ｃｄ，Ｉｎ，Ｓｎ、Ｈｆ，Ｔａ，Ｗ，Ｒｅ，Ｏｓ，Ｉｒ，Ｐｔ，Ａｕ，Ｈｇ，Ｔｌ，Ｐｂからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属を含む、請求項１に記載の複合材料。
【請求項３】
強磁性を示す前記金属がＣｏである、請求項１に記載の複合材料。
【請求項４】
前記金属がＣｏとＰｔを含む、請求項１に記載の複合材料。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
前記タンパク質がリゾチームである、請求項１に記載の複合材料。
【請求項９】
タンパク質結晶を金属化合物の溶液に含浸し、前記タンパク質を洗浄し、前記タンパク質に結合した金属イオンを還元することを特徴とする、タンパク質結晶の細孔に金属を有する複合材料の製造方法であって、前記金属がＦｅ，Ｃｏ，Ｎｉからなる群から選ばれる強磁性を示す金属を含み、前記タンパク質がサーモリシン、エラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ、ヒダントイナーゼ、プロテアーゼ、アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、インシュリン、ソウマチン、グルコースイソメラーゼ、キシラナーゼ、コンカナバリンＡ、リボヌクレアーゼ、ミオグロビンおよびリゾチームからなる群から選択され、前記結晶が正方晶、斜方晶、三斜晶、単斜晶、六方晶、三方晶および立方晶からなる群から選ばれる、複合材料の製造方法。
【国際調査報告】
2011083735.tif 000008
2011083735.tif 000009
2011083735.tif 000010
2011083735.tif 000011