(57)【要約】  本発明は、不凍蛋白質と水とを含む組成物の示す熱ヒステリシス活性を増加させる方法であって、前記水に、前記不凍蛋白質と下記添加剤群Ａから選ばれる何れか一種以上の物質とを混合することを含む、前記熱ヒステリシス活性を増加させる方法に関する。本発明によれば、不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性をさらに増加させる方法を提供できる。  添加剤群Ａ；有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、スペルミジン、スペルミン、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド【特許請求の範囲】
【請求項１】
不凍蛋白質と水とを含む組成物の示す熱ヒステリシス活性を増加させる方法であって、
前記水に、前記不凍蛋白質と下記添加剤群Ａから選ばれる何れか一種以上の物質とを混合することを含む、前記熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
添加剤群Ａ；有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、スペルミジン、スペルミン、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
【請求項２】
不凍蛋白質と水とを含む組成物の示す熱ヒステリシス活性の、加熱処理後の失活を低減させる方法であって、
前記水に、前記不凍蛋白質と下記添加剤群Ｂから選ばれる何れか一種以上の物質とを混合することを含む、前記熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
添加剤群Ｂ；有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、アセトン、ジオキサン、２−クロロエタノール、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
【請求項３】
不凍蛋白質と水と添加剤とを含む熱ヒステリシス活性増加用組成物であって、
前記添加剤は、有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、スペルミジン、スペルミン、アセトン、ジオキサン、２−クロロエタノール、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群から選ばれる何れか一種以上の物質を含む、熱ヒステリシス活性増加用組成物。
【請求項４】
前記不凍蛋白質が魚類由来である、請求項１に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
【請求項５】
前記不凍蛋白質が魚類由来である、請求項２に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
【請求項６】
前記不凍蛋白質が魚類由来である、請求項３に記載の熱ヒステリシス活性増加用組成物。
【請求項７】
前記不凍蛋白質がＩ型の不凍蛋白質である、請求項４に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
【請求項８】
前記不凍蛋白質がＩＩ型の不凍蛋白質である、請求項４に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
【請求項９】
前記不凍蛋白質がＩＩＩ型の不凍蛋白質である、請求項４に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
【請求項１０】
前記不凍蛋白質がＡＦＧＰ型の不凍蛋白質である、請求項４に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
【請求項１１】
前記不凍蛋白質がＩ型の不凍蛋白質である、請求項５に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
【請求項１２】
前記不凍蛋白質がＩＩ型の不凍蛋白質である、請求項５に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
【請求項１３】
前記不凍蛋白質がＩＩＩ型の不凍蛋白質である、請求項５に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
【請求項１４】
前記不凍蛋白質がＡＦＧＰ型の不凍蛋白質である、請求項５に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
【請求項１５】
前記水、前記不凍蛋白質及び前記添加剤の混合物における前記不凍蛋白質の含有濃度が、０．０１〜１０質量％である、請求項１に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
【請求項１６】
前記水、前記不凍蛋白質及び前記添加剤の混合物における前記不凍蛋白質の含有濃度が、０．０１〜１０質量％である、請求項２に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
【請求項１７】
前記熱ヒステリシス活性増加用組成物における、前記不凍蛋白質の含有濃度が、０．０１〜１０質量％である、請求項３に記載のヒステリシス活性増加用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱ヒステリシス活性増加方法、熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法、及び熱ヒステリシス活性増加用組成物に関する。
本願は、２０１０年８月２６日に、日本に出願された特願２０１０−１８９７２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
不凍蛋白質（Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰ）は、水溶液中の氷の結晶表面に結合することによって、前記氷の結晶の成長を抑制する作用、及び前記水溶液の凝固点を低下させる作用を有する。このような性質をもつ不凍蛋白質は、１９６９年に南極に生息する魚の血漿から発見されたのを端緒に、現在までに、魚類、昆虫、植物、微生物、又は担子菌類など生物界の広範な領域から種々の不凍蛋白質が発見されている。【０００３】
前記不凍蛋白質を含む水溶液は熱ヒステリシスと呼ばれる特異な性質（融点と凝固点が異なる性質）を有することも知られている。
まず、不凍蛋白質を含む水溶液を冷却して完全に前記水溶液を凍結させて氷にする（ステップ１）。次に徐々に昇温させると前記氷が融解する温度として融点が求まる（ステップ２）。つづいて再度徐々に温度を下げると融点以下であるにも関わらず、氷の結晶が成長しない温度帯が観測され、さらに温度を下げると一気に氷の結晶が成長する温度として凝固点が求まる（ステップ３）。このときの融点と凝固点の温度差は、不凍蛋白質の活性を示す指標として使用されており、それは熱ヒステリシス活性（△Ｔ）と呼ばれている。【０００４】
水溶液中の不凍蛋白質の濃度と前記溶液の熱ヒステリシス活性との関係は、ある濃度までは熱ヒステリシス活性の増加と正の相関を示すが、ある濃度を超えると、それ以上高濃度にしても熱ヒステリシス活性が増加しなくなる。【０００５】
魚類由来の公知の不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性は０．１〜２℃程度であるが、昆虫由来の不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性は、約１０℃に達するものも知られる。魚類由来の不凍蛋白質の水溶液における含有濃度を高くした場合であっても、昆虫由来の不凍蛋白質が示す熱ヒステリシス活性（例えば△Ｔ＝５℃）に達する例は知られていない。【０００６】
このような熱ヒステリシス活性を有する不凍蛋白質を、アイスクリームや冷凍食品に混合することによって、前記アイスクリームの口どけを滑らかにすることや前記冷凍食品における氷結晶成長による食品素材の劣化を防ぐこと等が検討されている。不凍蛋白質を産業用途に用いるためには、安価で大量に不凍蛋白質を供給できる方法が必要であり、例えば、魚類由来の不凍蛋白質をグラム単位で製造する方法が開示されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−０８３５４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、昆虫以外の不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性は必ずしも十分ではないので、前記熱ヒステリシス活性をさらに増加させる方法が望まれている。また、不凍蛋白質を含む食品等を加熱して殺菌することを想定した場合に、前記加熱による前記熱ヒステリシス活性の低下を抑制できることが望まれている。【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性をさらに増加させる方法を提供することを課題とする。
また、本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、不凍蛋白質を含む食品等を加熱して殺菌することを想定した場合に、前記加熱による前記熱ヒステリシス活性の低下を抑制する方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性を増強させることができる、又は不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性の、加熱による低下を抑制することができる、熱ヒステリシス活性増加用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の請求項１に記載の熱ヒステリシス活性増加方法は、不凍蛋白質と水とを含む組成物の示す熱ヒステリシス活性を増加する方法であって、前記水に、前記不凍蛋白質と下記添加剤群Ａから選ばれるいずれか一種以上とを溶解することを特徴とする。
添加剤群Ａ；有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、スペルミジン、スペルミン、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド【００１１】
本発明の請求項２に記載の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法は、不凍蛋白質と水とを含む組成物の示す熱ヒステリシス活性が、加熱処理の後で低下してしまう程度を減少させる方法であって、前記水に、前記不凍蛋白質と下記添加剤群Ｂから選ばれるいずれか一種以上とを溶解することを特徴とする。
添加剤群Ｂ；有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、アセトン、ジオキサン、２−クロロエタノール、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド【００１２】
本発明の請求項３に記載の熱ヒステリシス活性増加用組成物は、不凍蛋白質と添加剤とを含む熱ヒステリシス活性増加用組成物であって、前記添加剤には、有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、スペルミジン、スペルミン、アセトン、ジオキサン、２−クロロエタノール、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのうち何れか一種以上が含まれることを特徴とする、熱ヒステリシス活性増加用組成物。【００１３】
本発明の請求項４に記載の熱ヒステリシス活性増加方法は、請求項１において、前記不凍蛋白質が魚類由来であることを特徴とする。
本発明の請求項５に記載の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法は、請求項２において、前記不凍蛋白質が魚類由来であることを特徴とする。
本発明の請求項６に記載の熱ヒステリシス活性増加用組成物は、請求項３において、前記不凍蛋白質が魚類由来であることを特徴とする。【００１４】
すなわち、本発明は以下の態様を有する。
（１）不凍蛋白質と水とを含む組成物の示す熱ヒステリシス活性を増加させる方法であって、前記水に、前記不凍蛋白質と下記添加剤群Ａから選ばれる何れか一種以上の物質とを混合することを含む、前記熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
添加剤群Ａ；有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、スペルミジン、スペルミン、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（２）不凍蛋白質と水とを含む組成物の示す熱ヒステリシス活性の、加熱処理後の失活を低減させる方法であって、前記水に、前記不凍蛋白質と下記添加剤群Ｂから選ばれる何れか一種以上の物質とを混合することを含む、前記熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
添加剤群Ｂ；有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、アセトン、ジオキサン、２−クロロエタノール、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（３）不凍蛋白質と水と添加剤とを含む熱ヒステリシス活性増加用組成物であって、前記添加剤は、有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、スペルミジン、スペルミン、アセトン、ジオキサン、２−クロロエタノール、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドからなる群から選ばれる何れか一種以上の物質を含む、熱ヒステリシス活性増加用組成物。
（４）前記不凍蛋白質が魚類由来である、（１）に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
（５）前記不凍蛋白質が魚類由来である、（２）に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
（６）前記不凍蛋白質が魚類由来である、（３）に記載の熱ヒステリシス活性増加用組成物。【００１５】
（７）前記不凍蛋白質がＩ型の不凍蛋白質である、（４）に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
（８）前記不凍蛋白質がＩＩ型の不凍蛋白質である、（４）に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
（９）前記不凍蛋白質がＩＩＩ型の不凍蛋白質である、（４）に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
（１０）前記不凍蛋白質がＡＦＧＰ型の不凍蛋白質である、（４）に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。【００１６】
（１１）前記不凍蛋白質がＩ型の不凍蛋白質である、（５）に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
（１２）前記不凍蛋白質がＩＩ型の不凍蛋白質である、（５）に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
（１３）前記不凍蛋白質がＩＩＩ型の不凍蛋白質である、（５）に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
（１４）前記不凍蛋白質がＡＦＧＰ型の不凍蛋白質である、（５）に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。【００１７】
（１５）前記水、前記不凍蛋白質及び前記添加剤の混合物における前記不凍蛋白質の含有濃度が、０．０１〜１０質量％である、（１）に記載の熱ヒステリシス活性を増加させる方法。
（１６）前記水、前記不凍蛋白質及び前記添加剤の混合物における前記不凍蛋白質の含有濃度が、０．０１〜１０質量％である、（２）に記載の熱ヒステリシス活性の加熱処理後の失活を低減させる方法。
（１７）前記熱ヒステリシス活性増加用組成物における、前記不凍蛋白質の含有濃度が、０．０１〜１０質量％である、（３）に記載のヒステリシス活性増加用組成物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の熱ヒステリシス活性増加方法によれば、不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性をさらに増加させることができる。
また、本発明の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法によれば、不凍蛋白質を含む食品等を加熱して殺菌することを想定した場合に、前記加熱による、前記不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性の低下を抑制することができる。
さらに、本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物によれば、不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性をさらに増加させることができ、又は不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性の、加熱による低下を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】熱ヒステリシス活性測定時の試料の温度変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について詳しく説明する。
＜熱ヒステリシス活性増加方法＞
本発明の第一の態様である熱ヒステリシス活性増加方法は、不凍蛋白質と水とを含む組成物の示す熱ヒステリシス活性を増加する方法であって、前記水に、前記不凍蛋白質と下記添加剤群Ａから選ばれる何れか一種以上の物質とを混合する方法である。
添加剤群Ａ；有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、スペルミジン、スペルミン、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
【００２１】
前記水は、本発明の効果を損なわないものであれば他の物質を含んだ水溶液又は水含有物であってもよい。本発明の混合物は、水（前記水溶液及び前記水含有物も含む）、前記不凍蛋白質、及び前記添加剤を混合した混合物である。
【００２２】
前記混合物は水を主成分として含有するものであることが好ましい。このとき、前記混合物が前記添加剤を含むことにより、前記混合物の熱ヒステリシス活性を、単に不凍蛋白質を含むだけで前記添加剤を含有しない場合よりも、さらに増加させることができる。すなわち、前記添加剤は、不凍蛋白質が本来有する熱ヒステリシス活性を増強（促進）する効果を奏する。
【００２３】
本発明の熱ヒステリシス活性増加方法における不凍蛋白質としては、熱ヒステリシス活性を有するものであれば特に制限されず、公知の不凍蛋白質を用いることができる。
【００２４】
例えば、前記不凍蛋白質としては、ギスカジカ属（Ｍｙｏｘｏｃｅｐｈａｌｕｓ）、ツマグロカジカ属（Ｇｙｍｎｏｃａｎｔｈｕｓ）、ヨコスジカジカ属（Ｈｅｍｉｌｅｐｉｄｏｔｕｓ）、サラサカジカ属（Ｆｕｒｃｉｎａ）、ワカサギ属（Ｈｙｐｏｍｅｓｕｓ）、シシャモ属（Ｓｐｉｒｉｎｃｈｕｓ）、カラフトシシャモ属（Ｍａｌｌｏｔｕｓ）、ホッケ属（Ｐｌｅｕｒｏｇｒａｍｍｕｓ）、メバル属（Ｓｅｂａｓｔｅｓ）、ニシン属（Ｃｌｕｐｅａ）、マコガレイ属（Ｌｉｍａｎｄａ）、クロガレイ属（Ｌｉｏｐｓｅｔｔａ）、サメガレイ属（Ｃｌｉｄｏｄｅｒｍａ）、ソウハチ属（Ｃｌｅｉｓｔｈｅｎｅｓ）、ババガレイ属（Ｍｉｃｒｏｓｔｏｍｕｓ）、シュムシュガレイ属（Ｌｅｐｉｄｏｐｓｅｔｔａ）、ヌマガレイ属（Ｐｌａｔｉｃｈｔｈｙｓ）、イシガレイ属（Ｋａｒｅｉｕｓ）、ムシガレイ属（Ｅｏｐｓｅｔｔａ）、マダラ属（Ｇａｄｕｓ）、スケトウダラ属（Ｔｈｅｒａｇｒａ）、イカナゴ属（Ａｍｍｏｄｙｔｅｓ）、シワイカナゴ属（Ｈｙｐｏｐｔｙｃｈｕｓ）、マアジ属（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓ）、シチロウウオ属（Ｂｒａｃｈｙｏｐｓｉｓ）、ニシキギンポ属（Ｐｈｏｌｉｓ）、オキカズナギ属（Ｏｐｉｓｔｈｏｃｅｎｔｒｕｓ）、ナガガジ属（Ｚｏａｒｃｅｓ）、ドロギンポ属（Ａｓｃｏｌｄｉａ）、又はムロランギンポ属（Ｐｈｏｌｉｄａｐｕｓ）に属する魚種由来のものが挙げられる。
【００２５】
具体的には、前記不凍蛋白質としては、タンパク質の採取源が、ギスカジカ（Ｍｙｏｘｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓｔｅｌｌｅｒｉ  Ｔｉｌｅｓｉｕｓ）、ツマグロカジカ（Ｇｙｍｎｏｃａｎｔｈｕｓ  ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎｉ  Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｔａｒｋｓ）、トゲカジカ（Ｍｙｏｘｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｐｏｌｙａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌｕｓ  （Ｐａｌｌａｓ））、ナメヨコスジカジカ（Ｈｅｍｉｌｅｐｉｄｏｔｕｓ  ｊｏｒｄａｎｉ  Ｂｅａｎ）、キヌカジカ（Ｆｕｒｃｉｎａ  ｏｓｉｍａｅ  Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｔａｒｋｓ）、チカ（Ｈｙｐｏｍｅｓｕｓ  ｐｒｅｔｉｏｓｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  （Ｂｒｅｖｏｏｒｔ））、イシカリワカサギ（Ｈｙｐｏｍｅｓｕｓ  ｏｌｉｄｕｓ  （Ｄａｌｌａｓ））、シシャモ（Ｓｐｉｒｉｎｃｈｕｓ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｓ  （Ｈｉｋｉｔａ））、カラフトシシャモ（Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｖｉｌｌｏｓｕｓ  （Ｍｕｌｌｅｒ））、キタノホッケ（Ｐｌｅｕｒｏｇｒａｍｍｕｓ  ｍｏｎｏｐｔｅｒｙｇｉｕｓ  （Ｐａｌｌａｓ））、ヤナギノマイ（Ｓｅｂａｓｔｅｓ  ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒｉ  Ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆ）、ニシン（Ｃｌｕｐｅａ  ｐａｌｌａｓｉｉ  Ｖａｌｅｎｃｉｅｎｎｅｓ）、マガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎｉ  Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｎｙｄｅｒ）、スナガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ｐｕｎｃｔａｔｉｓｓｉｍａ  （Ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒ））、クロガシラガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ｓｃｈｒｅｎｋｉ  Ｓｃｈｍｉｄｔ）、コガネガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ａｓｐｅｒａ  （Ｐａｌｌａｓ））、クロガレイ（Ｌｉｏｐｓｅｔｔａ  ｏｂｓｃｕｒａ  （Ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎ））、サメガレイ（Ｃｌｉｄｏｄｅｒｍａ    ａｓｐｅｒｒｉｍｕｍ  （Ｔｅｍｍｉｎｃｋ  ｅｔ  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ））、ソウハチ（Ｃｌｅｉｓｔｈｅｎｅｓ  ｐｉｎｅｔｏｒｕｍｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎｉ  （Ｓｃｈｍｉｄｔ））、ババガレイ（Ｍｉｃｒｏｃｔｏｍｕｓ  ａｃｈｎｅ  （Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｔａｒｋｓ））、アサバガレイ（Ｌｅｐｉｄｏｐｓｅｔｔａ  ｍｏｃｈｉｇａｒｅｉ  Ｓｎｙｄｅｒ）、ヌマガレイ（Ｐｌａｔｉｃｈｔｈｙｓｓｔｅｌｌａｔｕｓ  （Ｐａｌｌａｓ））、イシガレイ（Ｋａｒｅｉｕｓ  ｂｉｃｏｌｏｒａｔｕｓ  （Ｂａｓｉｌｅｗｓｋｙ））、ムシガレイ（Ｅｏｐｓｅｔｔａ  ｇｒｉｇｏｒｊｅｗｉ  （Ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎ））、マダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ  Ｔｉｌｅｓｉｕｓ）、スケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ  ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ  （Ｐａｌｌａｓ））、イカナゴ（Ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ｐｅｒｓｏｎａｔｕｓ  Ｇｉｒａｒｄ）、シワイカナゴ（Ｈｙｐｏｐｔｙｃｈｕｓ  ｄｙｂｏｗｓｋｉｉ  Ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒ）、マアジ（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  （Ｔｅｍｍｉｎｃｋ  ｅｔ  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ））、シチロウウオ（Ｂｒａｃｈｙｏｐｓｉｓ  ｒｏｓｔｒａｔｕｓ  （Ｔｉｌｅｓｉｕｓ））、ニシキギンポ（Ｐｈｏｌｉｓ  ｐｉｃｔａ  （Ｋｎｅｒ））、ガジ（Ｏｐｉｓｔｈｏｃｅｎｔｒｕｓ  ｏｃｅｌｌａｔｕｓ  （Ｔｉｌｅｓｉｕｓ））、ナガガジ（Ｚｏａｒｃｅｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  Ｋｎｅｒ）、ドロギンポ（Ａｓｃｏｌｄｉａ  ｖａｒｉｅｇａｔａ  ｋｎｉｐｏｗｉｔｓｃｈｉ  Ｓｏｌｄａｔｏｖ）、又はムロランギンポ（Ｐｈｏｌｉｄａｐｏｕｓ  ｄｙｂｏｗｓｋｉｉ  （Ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒ））に属する魚種由来のものが挙げられる。
【００２６】
魚類が自ら生産する不凍蛋白質は４つのタイプがあり、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＡＦＧＰ型に分類されている。魚類由来のＩ型蛋白質は分子量約３．３〜５．０ｋＤａであり、α−ｈｅｌｉｃａｌの構造を有する。
魚類由来のＩＩ型蛋白質は分子量約１４ｋＤａ以下であり、Ｓ−Ｓ結合の多いＣ型レクチン様の構造を有する。
魚類由来のＩＩＩ型蛋白質は分子量約７ｋＤａ以下であり、２層のコイル構造を特徴とするモチーフ（two-fold symmetry motif又はpretzel foldと呼ばれる）で特徴づけられる構造を有する。
魚類が自ら生産する不凍糖蛋白質（ＡＦＧＰ）は、分子量約２．２〜３３ｋＤａであり、Ala-Ala-Thrの繰り返し単位で構成され、Thrの位置に糖が結合した構造を有する。
【００２７】
上記の中でも、トウガレイ（学名Pleuronectes pinnifasciatus）由来のＩ型の不凍蛋白質、チカ（学名Hypomesus pretiosus. Japonicus (Brovoort)）由来のＩＩ型の不凍蛋白質、ナガガジ（学名Zoarccs elongatus Kner）由来のＩＩＩ型の不凍蛋白質、又はコマイ（学名Eleginus gracilis）由来のＡＦＧＰ型の不凍蛋白質等は、本発明の効果が十分に得られるため好適な不凍蛋白質として挙げられる。
本発明の効果を損なわないものであれば、本発明のＩ型の不凍蛋白質はトウガレイ由来に限定されず、本発明のＩＩ型の不凍蛋白質はチカ由来に限定されず、本発明のＩＩＩ型の不凍蛋白質はナガガジ由来に限定されない。
【００２８】
本発明の熱ヒステリシス活性増加方法における不凍蛋白質は、魚、植物、微生物、又は担子菌類等から抽出及び精製して得られたものを用いても良いし、公知の遺伝子工学的手法を用いて大腸菌等の微生物や昆虫細胞等の培養細胞中で、不凍蛋白質を発現させたものを抽出及び精製して得られたものを用いることもできる。
【００２９】
本発明の熱ヒステリシス活性増加方法における、魚類由来の不凍蛋白質の前記混合物中における含有濃度としては、０．０１〜１０質量％が好ましく、０．０５〜１０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましく、０．１〜５質量％が特に好ましい。
この含有濃度の範囲の下限値以上であると本発明の効果が十分に得られ、この含有濃度の範囲の上限値付近で前記混合物の熱ヒステリシス活性を増加させる効果は頭打ちとなる。
【００３０】
本発明の熱ヒステリシス活性増加方法における前記添加剤は、有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、スペルミジン、スペルミン、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのうち何れか１種以上の物質であり、前記混合物が前記不凍蛋白質と水のみを含む場合（前記添加剤を含まない場合）の熱ヒステリシス活性よりも前記混合物の熱ヒステリシス活性を増加させることができるものである。前記添加剤は、１種を単独で用いても良いし、２種以上を組み合わせて用いても良い。
【００３１】
前記有機酸の好適なものとしては、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、酒石酸、酢酸、及びＬ−アスコルビン酸などが挙げられる。前記有機酸の前記混合物中における含有濃度としては、０．１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましく、０．８〜１Ｍが特に好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００３２】
前記有機酸塩の好適なものとしては、クエン酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、リンゴ酸二ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、酢酸カルシウム、が挙げられる。前記有機酸塩の前記混合物中における含有濃度としては、０．１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましく、０．８〜１Ｍが特に好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００３３】
前記無機塩の好適なものとしては、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、硫酸カリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、炭酸カリウム、硝酸カリウム、塩化カルシウム、及び硝酸カルシウムなどが挙げられる。前記無機塩の前記混合物中における含有濃度としては、０．１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましく、０．８〜１Ｍが特に好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００３４】
前記アミノ酸又はアミノ酸塩の好適なものとしては、シスチン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、アルギニン塩酸塩、グリシン、及びヒスチジンが挙げられる。前記アミノ酸又はアミノ酸塩の前記混合物中における含有濃度としては、０．１〜１Ｍが好ましく、０．５〜１Ｍがより好ましく、０．８〜１Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００３５】
前記アンモニウム塩の好適なものとしては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム、クエン酸三アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、アルギン酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、クエン酸二アンモニウム、亜硫酸アンモニウム（一水和物）、チオ硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、及び酢酸アンモニウムなどが挙げられる。前記アンモニウム塩の前記混合物中における含有濃度としては、０．０１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００３６】
前記糖類の好適なものとしては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、及びキシロースが挙げられる。前記糖類の前記混合物中における含有濃度としては、０．１〜１Ｍが好ましく、０．２〜０．８Ｍがより好ましく、０．４〜０．６Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００３７】
前記糖アルコールの好適なものとしては、ソルビトール、及びグリセリンが挙げられる。前記糖アルコールの前記混合物中の含有濃度としては、０．１〜１Ｍが好ましく、０．２〜０．８Ｍがより好ましく、０．４〜０．６Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００３８】
前記添加剤として尿素を用いる場合、前記混合物中の尿素の含有濃度は、０．０１〜１Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
前記添加剤としてグアニジン塩酸塩を用いる場合、前記混合物中のグアニジン塩酸塩の含有濃度は０．００１〜１Ｍが好ましく、０．０１〜１Ｍがより好ましく、０．１〜１Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００３９】
前記添加剤としてスペルミジンを用いる場合、前記混合物中のスペルミジンの含有濃度は０．００１〜１Ｍが好ましく、０．０１〜１Ｍがより好ましく、０．１〜１Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
前記添加剤としてスペルミンを用いる場合、前記混合物中のスペルミンの含有濃度は０．００１〜１Ｍが好ましく、０．０１〜１Ｍがより好ましく、０．１〜１Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００４０】
前記添加剤としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いる場合、前記混合物中のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの含有濃度は０．１〜６体積％が好ましく、２〜６体積％がより好ましく、３〜６体積％がさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００４１】
ここで例示した添加剤は、それ単独では、熱ヒステリシス活性を生じない。つまり、前記混合物に前記不凍蛋白質が含まれない場合には、前記混合物の熱ヒステリシス活性は実質的に生じない。
【００４２】
前記不凍蛋白質と前記添加剤との好ましい組み合わせとしては、下記の（Ａ１）〜（Ａ５）が挙げられる。これらの組み合わせであると、前記混合物の熱ヒステリシス活性を十分に増加させることができる。
（Ａ１）トウガレイ由来のＩ型の不凍蛋白質に対しては、クエン酸三ナトリウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、リンゴ酸二ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、酢酸カリウム、及び炭酸カリウムのうち、何れか１以上の物質を前記添加剤として用いることが好ましい。
（Ａ２）カジカ由来のＩ型の不凍蛋白質に対しては、塩化ナトリウムを前記添加剤として用いることが好ましい。
【００４３】
（Ａ３）チカ由来のＩＩ型の不凍蛋白質に対しては、硫酸アンモニウムを前記添加剤として用いることが好ましい。
（Ａ４）ナガガジ由来のＩＩＩ型の不凍蛋白質に対しては、クエン酸三ナトリウム、グアニジン塩酸塩、アルギニン、グリシン、スペルミジン、スペルミン、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、クエン酸三アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、マルトース、及びラフィノースのうち、何れか１以上の物質を前記添加剤として用いることが好ましい。
【００４４】
（Ａ５）コマイ由来のＡＦＧＰ型の不凍蛋白質に対しては、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸三ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、リンゴ酸二ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸カリウム、グアニジン塩酸塩、グリシン、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、クエン酸二アンモニウム、亜硫酸アンモニウム（一水和物）、チオ硫酸アンモニウム、及びガラクトースのうち、何れか１以上の物質を前記添加剤として用いることが好ましい。
【００４５】
本発明の熱ヒステリシス活性増加方法は、前記混合物の調製方法又は製造方法としての側面を有する。
本発明の熱ヒステリシス活性増加方法における前記混合物の調製方法としては、前記不凍蛋白質と前記添加剤と前記水とが均一に混合できる方法であれば特に制限されない。例えば、前記不凍蛋白質と前記添加剤とを前記所定濃度になるように水に溶解させた水溶液として混合物を調製する方法が挙げられる。前記水溶液には、前記不凍蛋白質や前記添加物以外のものを含有させてもよい。
【００４６】
前記混合物の例として、例えば食品が挙げられ、好ましくはアイスクリーム、又はアイスキャンデー等の氷菓子、若しくは冷凍麺類、又は冷凍ハンバーグ等の冷凍加工食品が挙げられる。
本発明の前記不凍蛋白質と添加剤と水とを含む混合物が食品である場合、前記食品の熱ヒステリシス活性が増加することにより、前記食品の保冷時における氷結晶の成長が妨げられ、また氷結晶の再結晶化が抑制されるため、前記食品の口当たりがまろやかな好ましいものとすることができる。
【００４７】
また、前記混合物の別の例として、自動車ラジエータに用いる不凍液、生鮮食品を保冷するための保冷剤、並びに医薬品及びバイオ研究用途などに用いられる微生物や細胞等の冷凍保存用保護溶液等の食品以外の用途も挙げられる。
【００４８】
＜熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法＞
本発明の第二の態様である熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法は、不凍蛋白質と水とを含む組成物の示す熱ヒステリシス活性が、加熱処理の後で低下してしまう程度を減少させる方法であって、前記水に、前記不凍蛋白質と下記添加剤群Ｂから選ばれる何れか一種以上の物質とを混合する方法である。
添加剤群Ｂ；有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、アセトン、ジオキサン、２−クロロエタノール、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
【００４９】
すなわち本発明の第二の態様である不凍蛋白質と水とを含む組成物の示す熱ヒステリシス活性の、加熱処理後の失活を低減させる方法は、水に不凍蛋白質と前記添加剤群Ｂから選ばれる何れか一種以上の物質とを混合すること、及び前記混合物を加熱することを含む。
【００５０】
前記水は、本発明の効果を損なわないものであれば他の物質を含んだ水溶液又は水含有物であってもよい。本発明の混合物は、水（前記水溶液及び前記水含有物も含む）、前記不凍蛋白質、及び前記添加剤を混合した物である。
【００５１】
前記混合物は水を主成分として含有するものであることが好ましい。
【００５２】
通常、前記添加剤を含まない、本発明とは異なる混合物を加熱処理する（例えば４０℃〜１２０℃で３０分間）と、前記熱ヒステリシス活性は低下してしまう（これを熱失活と呼ぶ。）。これは、前記不凍蛋白質が前記加熱処理によって変性してしまうからだと考えられる。
しかし、本発明における前記混合物は前記添加剤を含むので、前記混合物を加熱処理した場合でも、前記加熱処理前に有していた熱ヒステリシス活性の低下を抑制することができる。すなわち、本発明の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法における前記添加剤は、前記不凍蛋白質に耐熱性を付与する効果を奏する。これは、前記不凍蛋白質が加熱処理によって熱変性してしまう程度を、前記添加剤が低減することができるからだと推測される。
【００５３】
本発明の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法における前記不凍蛋白質としては、熱ヒステリシス活性を有するものであれば特に制限されず、公知の不凍蛋白質を用いることができる。
【００５４】
例えば、前記不凍蛋白質としては、ギスカジカ属（Ｍｙｏｘｏｃｅｐｈａｌｕｓ）、ツマグロカジカ属（Ｇｙｍｎｏｃａｎｔｈｕｓ）、ヨコスジカジカ属（Ｈｅｍｉｌｅｐｉｄｏｔｕｓ）、サラサカジカ属（Ｆｕｒｃｉｎａ）、ワカサギ属（Ｈｙｐｏｍｅｓｕｓ）、シシャモ属（Ｓｐｉｒｉｎｃｈｕｓ）、カラフトシシャモ属（Ｍａｌｌｏｔｕｓ）、ホッケ属（Ｐｌｅｕｒｏｇｒａｍｍｕｓ）、メバル属（Ｓｅｂａｓｔｅｓ）、ニシン属（Ｃｌｕｐｅａ）、マコガレイ属（Ｌｉｍａｎｄａ）、クロガレイ属（Ｌｉｏｐｓｅｔｔａ）、サメガレイ属（Ｃｌｉｄｏｄｅｒｍａ）、ソウハチ属（Ｃｌｅｉｓｔｈｅｎｅｓ）、ババガレイ属（Ｍｉｃｒｏｓｔｏｍｕｓ）、シュムシュガレイ属（Ｌｅｐｉｄｏｐｓｅｔｔａ）、ヌマガレイ属（Ｐｌａｔｉｃｈｔｈｙｓ）、イシガレイ属（Ｋａｒｅｉｕｓ）、ムシガレイ属（Ｅｏｐｓｅｔｔａ）、マダラ属（Ｇａｄｕｓ）、スケトウダラ属（Ｔｈｅｒａｇｒａ）、イカナゴ属（Ａｍｍｏｄｙｔｅｓ）、シワイカナゴ属（Ｈｙｐｏｐｔｙｃｈｕｓ）、マアジ属（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓ）、シチロウウオ属（Ｂｒａｃｈｙｏｐｓｉｓ）、ニシキギンポ属（Ｐｈｏｌｉｓ）、オキカズナギ属（Ｏｐｉｓｔｈｏｃｅｎｔｒｕｓ）、ナガガジ属（Ｚｏａｒｃｅｓ）、ドロギンポ属（Ａｓｃｏｌｄｉａ）、又はムロランギンポ属（Ｐｈｏｌｉｄａｐｕｓ）に属する魚種由来のものが挙げられる。
【００５５】
具体的には、前記不凍蛋白質としては、タンパク質の採取源が、ギスカジカ（Ｍｙｏｘｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓｔｅｌｌｅｒｉ  Ｔｉｌｅｓｉｕｓ）、ツマグロカジカ（Ｇｙｍｎｏｃａｎｔｈｕｓ  ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎｉ  Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｔａｒｋｓ）、トゲカジカ（Ｍｙｏｘｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｐｏｌｙａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌｕｓ  （Ｐａｌｌａｓ））、ナメヨコスジカジカ（Ｈｅｍｉｌｅｐｉｄｏｔｕｓ  ｊｏｒｄａｎｉ  Ｂｅａｎ）、キヌカジカ（Ｆｕｒｃｉｎａ  ｏｓｉｍａｅ  Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｔａｒｋｓ）、チカ（Ｈｙｐｏｍｅｓｕｓ  ｐｒｅｔｉｏｓｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  （Ｂｒｅｖｏｏｒｔ））、イシカリワカサギ（Ｈｙｐｏｍｅｓｕｓ  ｏｌｉｄｕｓ  （Ｄａｌｌａｓ））、シシャモ（Ｓｐｉｒｉｎｃｈｕｓ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｓ  （Ｈｉｋｉｔａ））、カラフトシシャモ（Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｖｉｌｌｏｓｕｓ  （Ｍｕｌｌｅｒ））、キタノホッケ（Ｐｌｅｕｒｏｇｒａｍｍｕｓ  ｍｏｎｏｐｔｅｒｙｇｉｕｓ  （Ｐａｌｌａｓ））、ヤナギノマイ（Ｓｅｂａｓｔｅｓ  ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒｉ  Ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆ）、ニシン（Ｃｌｕｐｅａ  ｐａｌｌａｓｉｉ  Ｖａｌｅｎｃｉｅｎｎｅｓ）、マガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎｉ  Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｎｙｄｅｒ）、スナガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ｐｕｎｃｔａｔｉｓｓｉｍａ  （Ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒ））、クロガシラガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ｓｃｈｒｅｎｋｉ  Ｓｃｈｍｉｄｔ）、コガネガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ａｓｐｅｒａ  （Ｐａｌｌａｓ））、クロガレイ（Ｌｉｏｐｓｅｔｔａ  ｏｂｓｃｕｒａ  （Ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎ））、サメガレイ（Ｃｌｉｄｏｄｅｒｍａ    ａｓｐｅｒｒｉｍｕｍ  （Ｔｅｍｍｉｎｃｋ  ｅｔ  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ））、ソウハチ（Ｃｌｅｉｓｔｈｅｎｅｓ  ｐｉｎｅｔｏｒｕｍｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎｉ  （Ｓｃｈｍｉｄｔ））、ババガレイ（Ｍｉｃｒｏｃｔｏｍｕｓ  ａｃｈｎｅ  （Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｔａｒｋｓ））、アサバガレイ（Ｌｅｐｉｄｏｐｓｅｔｔａ  ｍｏｃｈｉｇａｒｅｉ  Ｓｎｙｄｅｒ）、ヌマガレイ（Ｐｌａｔｉｃｈｔｈｙｓｓｔｅｌｌａｔｕｓ  （Ｐａｌｌａｓ））、イシガレイ（Ｋａｒｅｉｕｓ  ｂｉｃｏｌｏｒａｔｕｓ  （Ｂａｓｉｌｅｗｓｋｙ））、ムシガレイ（Ｅｏｐｓｅｔｔａ  ｇｒｉｇｏｒｊｅｗｉ  （Ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎ））、マダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ  Ｔｉｌｅｓｉｕｓ）、スケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ  ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ  （Ｐａｌｌａｓ））、イカナゴ（Ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ｐｅｒｓｏｎａｔｕｓ  Ｇｉｒａｒｄ）、シワイカナゴ（Ｈｙｐｏｐｔｙｃｈｕｓ  ｄｙｂｏｗｓｋｉｉ  Ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒ）、マアジ（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  （Ｔｅｍｍｉｎｃｋ  ｅｔ  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ））、シチロウウオ（Ｂｒａｃｈｙｏｐｓｉｓ  ｒｏｓｔｒａｔｕｓ  （Ｔｉｌｅｓｉｕｓ））、ニシキギンポ（Ｐｈｏｌｉｓ  ｐｉｃｔａ  （Ｋｎｅｒ））、ガジ（Ｏｐｉｓｔｈｏｃｅｎｔｒｕｓ  ｏｃｅｌｌａｔｕｓ  （Ｔｉｌｅｓｉｕｓ））、ナガガジ（Ｚｏａｒｃｅｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  Ｋｎｅｒ）、ドロギンポ（Ａｓｃｏｌｄｉａ  ｖａｒｉｅｇａｔａ  ｋｎｉｐｏｗｉｔｓｃｈｉ  Ｓｏｌｄａｔｏｖ）、又はムロランギンポ（Ｐｈｏｌｉｄａｐｏｕｓ  ｄｙｂｏｗｓｋｉｉ  （Ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒ））に属する魚種由来のものが挙げられる。
【００５６】
上記の中でも、トウガレイ（学名Pleuronectes pinnifasciatus）由来のＩ型の不凍蛋白質、チカ（学名Hypomesus pretiosus. Japonicus(Brovoort)）由来のＩＩ型の不凍蛋白質、ナガガジ（学名Zoarccs elongatus Kner）由来のＩＩＩ型の不凍蛋白質、又はコマイ（学名Eleginus gracilis）由来のＡＦＧＰ型の不凍蛋白質等は、本発明の効果が十分に得られるため好適な不凍蛋白質として挙げられる。
本発明の効果を損なわないものであれば、本発明のＩ型の不凍蛋白質はトウガレイ由来に限定されず、本発明のＩＩ型の不凍蛋白質はチカ由来に限定されず、本発明のＩＩＩ型の不凍蛋白質はナガガジ由来に限定されない。
【００５７】
本発明の第二態様における不凍蛋白質は、魚、植物、微生物、又は担子菌類等から抽出及び精製して得られたものを用いても良いし、公知の遺伝子工学的手法を用いて大腸菌等の微生物や昆虫細胞等の培養細胞中で、不凍蛋白質を発現させたものを抽出及び精製して得られたものを用いることもできる。
【００５８】
本発明の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法における魚類由来の不凍蛋白質の前記混合物中における含有濃度としては、０．０１〜１０質量％が好ましく、０．０５〜１０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましく、０．１〜５質量％が特に好ましい。
この含有濃度の範囲の下限値以上であると本発明の効果が十分に得られ、この含有濃度の範囲の上限値付近で前記混合物の熱ヒステリシス活性を増加させる効果は頭打ちとなる。
【００５９】
本発明の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法における前記添加剤は、有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、アセトン、ジオキサン、２−クロロエタノール、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのうち何れか１種以上の物質であり、前記混合物を加熱することによる前記混合物の熱ヒステリシス活性の低下を抑制することができるものである。前記添加剤は、１種を単独で用いても良いし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６０】
前記有機酸の好適なものとしては、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、酒石酸、酢酸、Ｌ−アスコルビン酸などが挙げられる。前記有機酸の前記混合物中における含有濃度としては、０．１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましく、０．８〜１Ｍが特に好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００６１】
前記有機酸塩の好適なものとしては、クエン酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、リンゴ酸二ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム及び酢酸カルシウムなどが挙げられる。前記有機酸塩の前記混合物中における含有濃度としては、０．１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましく、０．８〜１Ｍが特に好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００６２】
前記無機塩の好適なものとしては、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、硫酸カリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、炭酸カリウム、硝酸カリウム、塩化カルシウム、及び硝酸カルシウムなどが挙げられる。前記無機塩の前記混合物中における含有濃度としては、０．１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましく、０．８〜１Ｍが特に好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００６３】
前記アミノ酸又はアミノ酸塩の好適なものとしては、シスチン、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、アルギニン塩酸塩、グリシン、及びヒスチジンが挙げられる。前記アミノ酸又はアミノ酸塩の前記混合物中における含有濃度としては、０．１〜１Ｍが好ましく、０．５〜１Ｍがより好ましく、０．８〜１Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００６４】
前記アンモニウム塩の好適なものとしては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム、クエン酸三アンモニウム、クエン酸鉄アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、アルギン酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、クエン酸二アンモニウム、亜硫酸アンモニウム（一水和物）、チオ硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、及び酢酸アンモニウムなどが挙げられる。前記アンモニウム塩の前記混合物中における含有濃度としては、０．０１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００６５】
前記糖類の好適なものとしては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、及びキシロースが挙げられる。前記糖類の前記混合物中における含有濃度としては、０．１〜１Ｍが好ましく、０．２〜０．８Ｍがより好ましく、０．４〜０．６Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００６６】
前記糖アルコールの好適なものとしては、ソルビトール、及びグリセリンが挙げられる。前記糖アルコールの前記混合物中の含有濃度としては、０．１〜１Ｍが好ましく、０．２〜０．８Ｍがより好ましく、０．４〜０．６Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００６７】
前記添加剤として尿素を用いる場合、前記混合物中の尿素の含有濃度は、０．０１〜１Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましい。
前記添加剤としてグアニジン塩酸塩を用いる場合、前記混合物中のグアニジン塩酸塩の含有濃度は０．００１〜１Ｍが好ましく、０．０１〜１Ｍがより好ましく、０．１〜１Ｍがさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００６８】
前記添加剤としてアセトンを用いる場合、前記混合物中のアセトンの含有濃度は１〜２５体積％が好ましく、１０〜２５体積％がより好ましく、１５〜２５体積％がさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
前記添加剤としてジオキサン（１，４−ジエチレンジオキサン）を用いる場合、前記混合物中のジオキサンの含有濃度は０．１〜６体積％が好ましく、２〜６体積％がより好ましく、３〜６体積％がさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
前記添加剤として２−クロロエタノール（エチレンクロルヒドリン）を用いる場合、前記混合物中の２−クロロエタノールの含有濃度は０．１〜６体積％が好ましく、２〜６体積％がより好ましく、３〜６体積％がさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００６９】
前記添加剤としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いる場合、前記混合物中のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの含有濃度は０．１〜６体積％が好ましく、２〜６体積％がより好ましく、３〜６体積％がさらに好ましい。この含有濃度の範囲であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００７０】
ここで例示した添加剤は、それ単独では、熱ヒステリシス活性を生じない。つまり、前記混合物に前記不凍蛋白質が含まれない場合には、前記混合物の熱ヒステリシス活性は生じない。
【００７１】
前記不凍蛋白質と前記添加剤との好ましい組み合わせとしては、下記の（Ｂ１）〜（Ｂ５）が挙げられる。これらの組み合わせであると、前記混合物を加熱した場合に生じる前記混合物の熱ヒステリシス活性の低下を十分に抑制することができる。
（Ｂ１）トウガレイ由来のＩ型の不凍蛋白質に対しては、乳酸ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、リンゴ酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、酢酸カリウム、尿素、グアニジン塩酸塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、クエン酸二アンモニウム、亜硫酸アンモニウム（一水和物）、及びチオ硫酸アンモニウムのうち、何れか１種以上の物質を前記添加剤として用いることが好ましい。
（Ｂ２）カジカ由来のＩ型の不凍蛋白質に対しては、塩化ナトリウムを前記添加剤として用いることが好ましい。
【００７２】
（Ｂ３）チカ由来のＩＩ型の不凍蛋白質に対しては、硫酸アンモニウムを前記添加剤として用いることが好ましい。
（Ｂ４）ナガガジ由来のＩＩＩ型の不凍蛋白質に対しては、酢酸ナトリウム、尿素、グアニジン塩酸塩、アセトン、ジオキサン、２−クロロエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アスパラギン、リジン、アルギニン、アルギニン塩酸塩、グリシン、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、クエン酸三アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、及びソルビトールのうち、何れか１種以上の物質を前記添加剤として用いることが好ましい。
【００７３】
（Ｂ５）コマイ由来のＡＦＧＰ型の不凍蛋白質に対しては、クエン酸、リンゴ酸、乳酸ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、リンゴ酸二ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、酢酸カリウム、尿素、グアニジン塩酸塩、グリシン、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、クエン酸二アンモニウム、亜硫酸アンモニウム（一水和物）、及びチオ硫酸アンモニウムのうち、何れか１種以上の物質を前記添加剤として用いることが好ましい。
【００７４】
本発明の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法は、前記混合物の調製方法又は製造方法としての側面を有する。
本発明の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法における前記混合物の調製方法としては、前記不凍蛋白質と前記添加剤と前記水とが均一に混合できる方法であれば特に制限されない。例えば、前記不凍蛋白質と前記添加剤とを前記所定濃度になるように水に溶解させた水溶液として混合物を調製する方法が挙げられる。前記水溶液には、前記不凍蛋白質や前記添加物以外のものを含有させてもよい。
【００７５】
前記混合物を加熱する際の温度は、例えば４０〜１２０℃の温度範囲が挙げられる。この温度範囲に加熱することにより、前記混合物に含まれる雑菌等を殺菌することができる。
この場合、前記混合物を加熱する時間は、１〜３０分間で行えばよい。
前記混合物を前記温度範囲に加熱する方法としては特に制限されず、前記混合物を容器に入れて前記容器を公知の方法で加熱する方法や、前記混合物にマイクロウェーブを照射する方法等が挙げられる。
このような加熱処理を行う場合としては、前記混合物の調理加工、乾燥、濃縮、又は殺菌等の他、前記混合物に所望の成分を溶解又は分散させる場合が挙げられる。
【００７６】
本発明の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法における前記混合物の例として、例えば食品が挙げられ、好ましくはアイスクリーム、又はアイスキャンデー等の氷菓子、若しくは冷凍麺類、又は冷凍ハンバーグ等の冷凍加工食品が挙げられる。本発明の前記不凍蛋白質と添加剤と水とを含む混合物が食品である場合、前記食品の熱ヒステリシス活性が増加することにより、前記食品の保冷時における氷結晶の成長が妨げられ、また氷結晶の再結晶化が抑制されるため、前記食品の口当たりがまろやかな好ましいものとすることができる。
【００７７】
また、前記混合物の別の例として、自動車ラジエータに用いる不凍液、生鮮食品を保冷するための保冷剤、並びに医薬品及びバイオ研究用途などに用いられる微生物や細胞等の冷凍保存用保護溶液等の食品以外の用途も挙げられる。
【００７８】
＜熱ヒステリシス活性増加用組成物＞
本発明の第三の態様である熱ヒステリシス活性増加用組成物は、不凍蛋白質と水と添加剤とを含む熱ヒステリシス活性増加用組成物であって、前記添加剤には、有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、スペルミジン、スペルミン、アセトン、ジオキサン、２−クロロエタノール、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのうち何れか一種以上の物質が含まれる熱ヒステリシス活性増加用組成物である。
【００７９】
前記水は、本発明の効果を損なわないものであれば他の物質を含んだ水溶液又は水含有物であってもよい。前記水溶液には、前記不凍蛋白質や前記添加物以外のものを含有させてもよい。
【００８０】
本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物は、不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性をさらに増加させることができ、又は不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性の、加熱による低下を抑制することができる。
以下の説明において、不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性を増強させることができる本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物を、熱ヒステリシス活性増加用組成物Ａという。
また、不凍蛋白質の有する熱ヒステリシス活性の、加熱による低下を抑制することができる本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物を、熱ヒステリシス活性増加用組成物Ｂという。
【００８１】
（Ａ）本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物Ａによる前記熱ヒステリシス活性は、前記不凍蛋白質が有する熱ヒステリシス活性に主に依存するものであるが、前記添加剤を含有することにより、前記熱ヒステリシス活性を増強（促進）して、一層前記熱ヒステリシス活性を増加させることができる。すなわち、前記添加剤は、本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物Ａにおける不凍蛋白質が本来有する熱ヒステリシス活性を増強（促進）する効果を奏する。
【００８２】
（Ｂ）本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物Ｂによる前記熱ヒステリシス活性は、前記不凍蛋白質が有する熱ヒステリシス活性に主に依存するものである。ここで、前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ｂを添加した水溶液又は水含有物を加熱処理（例えば４０℃〜１２０℃で３０分間）した場合において、前記加熱処理前に有していた熱ヒステリシス活性の低下を抑制することができる。これは、前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ｂが前記添加剤を含有することにより、前記不凍蛋白質の熱ヒステリシス活性が熱変性によって低下してしまう程度を低減することができるからだと推測される。すなわち、前記添加剤は、本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物Ｂにおける不凍蛋白質に耐熱性を付与する効果を奏する。
【００８３】
本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物Ａ又はＢにおける前記不凍蛋白質としては、熱ヒステリシス活性を有するものであれば特に制限されず、公知の不凍蛋白質を用いることができる。
【００８４】
例えば、前記不凍蛋白質としては、ギスカジカ属（Ｍｙｏｘｏｃｅｐｈａｌｕｓ）、ツマグロカジカ属（Ｇｙｍｎｏｃａｎｔｈｕｓ）、ヨコスジカジカ属（Ｈｅｍｉｌｅｐｉｄｏｔｕｓ）、サラサカジカ属（Ｆｕｒｃｉｎａ）、ワカサギ属（Ｈｙｐｏｍｅｓｕｓ）、シシャモ属（Ｓｐｉｒｉｎｃｈｕｓ）、カラフトシシャモ属（Ｍａｌｌｏｔｕｓ）、ホッケ属（Ｐｌｅｕｒｏｇｒａｍｍｕｓ）、メバル属（Ｓｅｂａｓｔｅｓ）、ニシン属（Ｃｌｕｐｅａ）、マコガレイ属（Ｌｉｍａｎｄａ）、クロガレイ属（Ｌｉｏｐｓｅｔｔａ）、サメガレイ属（Ｃｌｉｄｏｄｅｒｍａ）、ソウハチ属（Ｃｌｅｉｓｔｈｅｎｅｓ）、ババガレイ属（Ｍｉｃｒｏｓｔｏｍｕｓ）、シュムシュガレイ属（Ｌｅｐｉｄｏｐｓｅｔｔａ）、ヌマガレイ属（Ｐｌａｔｉｃｈｔｈｙｓ）、イシガレイ属（Ｋａｒｅｉｕｓ）、ムシガレイ属（Ｅｏｐｓｅｔｔａ）、マダラ属（Ｇａｄｕｓ）、スケトウダラ属（Ｔｈｅｒａｇｒａ）、イカナゴ属（Ａｍｍｏｄｙｔｅｓ）、シワイカナゴ属（Ｈｙｐｏｐｔｙｃｈｕｓ）、マアジ属（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓ）、シチロウウオ属（Ｂｒａｃｈｙｏｐｓｉｓ）、ニシキギンポ属（Ｐｈｏｌｉｓ）、オキカズナギ属（Ｏｐｉｓｔｈｏｃｅｎｔｒｕｓ）、ナガガジ属（Ｚｏａｒｃｅｓ）、ドロギンポ属（Ａｓｃｏｌｄｉａ）、又はムロランギンポ属（Ｐｈｏｌｉｄａｐｕｓ）に属する魚種由来のものが挙げられる。
【００８５】
具体的には、前記不凍蛋白質としては、タンパク質の採取源が、ギスカジカ（Ｍｙｏｘｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓｔｅｌｌｅｒｉ  Ｔｉｌｅｓｉｕｓ）、ツマグロカジカ（Ｇｙｍｎｏｃａｎｔｈｕｓ  ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎｉ  Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｔａｒｋｓ）、トゲカジカ（Ｍｙｏｘｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｐｏｌｙａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌｕｓ  （Ｐａｌｌａｓ））、ナメヨコスジカジカ（Ｈｅｍｉｌｅｐｉｄｏｔｕｓ  ｊｏｒｄａｎｉ  Ｂｅａｎ）、キヌカジカ（Ｆｕｒｃｉｎａ  ｏｓｉｍａｅ  Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｔａｒｋｓ）、チカ（Ｈｙｐｏｍｅｓｕｓ  ｐｒｅｔｉｏｓｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  （Ｂｒｅｖｏｏｒｔ））、イシカリワカサギ（Ｈｙｐｏｍｅｓｕｓ  ｏｌｉｄｕｓ  （Ｄａｌｌａｓ））、シシャモ（Ｓｐｉｒｉｎｃｈｕｓ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｓ  （Ｈｉｋｉｔａ））、カラフトシシャモ（Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｖｉｌｌｏｓｕｓ  （Ｍｕｌｌｅｒ））、キタノホッケ（Ｐｌｅｕｒｏｇｒａｍｍｕｓ  ｍｏｎｏｐｔｅｒｙｇｉｕｓ  （Ｐａｌｌａｓ））、ヤナギノマイ（Ｓｅｂａｓｔｅｓ  ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒｉ  Ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆ）、ニシン（Ｃｌｕｐｅａ  ｐａｌｌａｓｉｉ  Ｖａｌｅｎｃｉｅｎｎｅｓ）、マガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎｉ  Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｎｙｄｅｒ）、スナガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ｐｕｎｃｔａｔｉｓｓｉｍａ  （Ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒ））、クロガシラガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ｓｃｈｒｅｎｋｉ  Ｓｃｈｍｉｄｔ）、コガネガレイ（Ｌｉｍａｎｄａ  ａｓｐｅｒａ  （Ｐａｌｌａｓ））、クロガレイ（Ｌｉｏｐｓｅｔｔａ  ｏｂｓｃｕｒａ  （Ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎ））、サメガレイ（Ｃｌｉｄｏｄｅｒｍａ    ａｓｐｅｒｒｉｍｕｍ  （Ｔｅｍｍｉｎｃｋ  ｅｔ  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ））、ソウハチ（Ｃｌｅｉｓｔｈｅｎｅｓ  ｐｉｎｅｔｏｒｕｍｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎｉ  （Ｓｃｈｍｉｄｔ））、ババガレイ（Ｍｉｃｒｏｃｔｏｍｕｓ  ａｃｈｎｅ  （Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  Ｓｔａｒｋｓ））、アサバガレイ（Ｌｅｐｉｄｏｐｓｅｔｔａ  ｍｏｃｈｉｇａｒｅｉ  Ｓｎｙｄｅｒ）、ヌマガレイ（Ｐｌａｔｉｃｈｔｈｙｓｓｔｅｌｌａｔｕｓ  （Ｐａｌｌａｓ））、イシガレイ（Ｋａｒｅｉｕｓ  ｂｉｃｏｌｏｒａｔｕｓ  （Ｂａｓｉｌｅｗｓｋｙ））、ムシガレイ（Ｅｏｐｓｅｔｔａ  ｇｒｉｇｏｒｊｅｗｉ  （Ｈｅｒｚｅｎｓｔｅｉｎ））、マダラ（Ｇａｄｕｓ  ｍａｃｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ  Ｔｉｌｅｓｉｕｓ）、スケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ  ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ  （Ｐａｌｌａｓ））、イカナゴ（Ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ｐｅｒｓｏｎａｔｕｓ  Ｇｉｒａｒｄ）、シワイカナゴ（Ｈｙｐｏｐｔｙｃｈｕｓ  ｄｙｂｏｗｓｋｉｉ  Ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒ）、マアジ（Ｔｒａｃｈｕｒｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  （Ｔｅｍｍｉｎｃｋ  ｅｔ  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ））、シチロウウオ（Ｂｒａｃｈｙｏｐｓｉｓ  ｒｏｓｔｒａｔｕｓ  （Ｔｉｌｅｓｉｕｓ））、ニシキギンポ（Ｐｈｏｌｉｓ  ｐｉｃｔａ  （Ｋｎｅｒ））、ガジ（Ｏｐｉｓｔｈｏｃｅｎｔｒｕｓ  ｏｃｅｌｌａｔｕｓ  （Ｔｉｌｅｓｉｕｓ））、ナガガジ（Ｚｏａｒｃｅｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  Ｋｎｅｒ）、ドロギンポ（Ａｓｃｏｌｄｉａ  ｖａｒｉｅｇａｔａ  ｋｎｉｐｏｗｉｔｓｃｈｉ  Ｓｏｌｄａｔｏｖ）、又はムロランギンポ（Ｐｈｏｌｉｄａｐｏｕｓ  ｄｙｂｏｗｓｋｉｉ  （Ｓｔｅｉｎｄａｃｈｎｅｒ））に属する魚種由来のものが挙げられる。
【００８６】
上記の中でも、トウガレイ（学名Pleuronectes pinnifasciatus）由来のＩ型の不凍蛋白質、チカ（学名Hypomesus pretiosus. Japonicus (Brovoort)）由来のＩＩ型の不凍蛋白質、ナガガジ（学名Zoarccs elongatus Kner）由来のＩＩＩ型の不凍蛋白質、又はコマイ（学名Eleginus gracilis）由来のＡＦＧＰ型の不凍蛋白質等は、本発明の効果が十分に得られるため好適な不凍蛋白質として挙げられる。
本発明の効果を損なわないものであれば、本発明のＩ型の不凍蛋白質はトウガレイ由来に限定されず、本発明のＩＩ型の不凍蛋白質はチカ由来に限定されず、本発明のＩＩＩ型の不凍蛋白質はナガガジ由来に限定されない。
【００８７】
本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物Ａ又はＢにおける不凍蛋白質は、魚、植物、微生物、又は担子菌類等から抽出及び精製して得られたものを用いても良いし、公知の遺伝子工学的手法を用いて大腸菌等の微生物や昆虫細胞等の培養細胞中で、不凍蛋白質を発現させたものを抽出及び精製して得られたものを用いることもできる。
【００８８】
本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物Ａ又はＢにおける魚類由来の不凍蛋白質の含有濃度としては、０．０１〜１０質量％が好ましく、０．０５〜８質量％がより好ましく、０．１〜５質量％がさらに好ましい。
この含有濃度の範囲の下限値以上であると本発明の効果が十分に得られ、この含有濃度の範囲の上限値付近で前記組成物の熱ヒステリシス活性を増加させる効果は頭打ちとなる。
【００８９】
前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ａにおける添加剤は、有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、スペルミジン、スペルミン、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのうち何れか１以上の物質であり、前記不凍蛋白質のみを添加した水溶液又は水含有物の熱ヒステリシス活性よりも、前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ａを添加した水溶液又は水含有物の熱ヒステリシス活性の方を大きくすることができるものである。前記添加剤は、１種を単独で用いても良いし、２種以上を組み合わせて用いても良い。
【００９０】
前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ａにおける添加剤の好適なものの説明は、前述の熱ヒステリシス活性増加方法において、好適な添加剤として例示したものの説明と同様である。
【００９１】
また、前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ａにおける前記不凍蛋白質と前記添加剤との好ましい組み合わせの説明は、前述の熱ヒステリシス活性増加方法において、好ましい組み合わせとして例示したものの説明と同様である。
【００９２】
前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ｂにおける添加剤は、有機酸、有機酸塩、無機塩、アミノ酸、アミノ酸塩、アンモニウム塩、糖類、糖アルコール類、尿素、グアニジン塩酸塩、アセトン、ジオキサン、２−クロロエタノール、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのうち何れか１以上の物質であり、前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ｂを添加した水溶液又は水含有物を加熱処理（例えば４０℃〜１２０℃で３０分間）した場合において、前記加熱処理前に有していた熱ヒステリシス活性の低下を抑制することができるものである。前記添加剤は、１種を単独で用いても良いし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９３】
前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ｂにおける添加剤の好適なものの説明は、前述の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法において、好適な添加剤として例示したものの説明と同様である。
【００９４】
また、前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ｂにおける前記不凍蛋白質と前記添加剤との好ましい組み合わせの説明は、前述の熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法において、好ましい組み合わせとして例示したものの説明と同様である。
【００９５】
前記有機酸の前記組成物における含有濃度としては、０．１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましく、０．８〜１Ｍが特に好ましい。
前記有機酸塩の前記組成物における含有濃度としては、０．１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましく、０．８〜１Ｍが特に好ましい。
前記無機塩の前記組成物における含有濃度としては、０．１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましく、０．８〜１Ｍが特に好ましい。
前記アミノ酸又はアミノ酸塩の前記組成物における含有濃度としては、０．１〜１Ｍが好ましく、０．５〜１Ｍがより好ましく、０．８〜１Ｍがさらに好ましい。
前記アンモニウム塩の前記組成物における含有濃度としては、０．０１〜３Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましい。
前記糖類の前記組成物における含有濃度としては、０．１〜１Ｍが好ましく、０．２〜０．８Ｍがより好ましく、０．４〜０．６Ｍがさらに好ましい。
前記糖アルコールの前記組成物における含有濃度としては、０．１〜１Ｍが好ましく、０．２〜０．８Ｍがより好ましく、０．４〜０．６Ｍがさらに好ましい。
前記添加剤の含有濃度が前記範囲内であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００９６】
前記組成物中の尿素の含有濃度は、０．０１〜１Ｍが好ましく、０．１〜１Ｍがより好ましく、０．５〜１Ｍがさらに好ましい。
前記組成物中のグアニジン塩酸塩の含有濃度は、０．００１〜１Ｍが好ましく、０．０１〜１Ｍがより好ましく、０．１〜１Ｍがさらに好ましい。
【００９７】
前記組成物中のアセトンの含有濃度は、１〜２５体積％が好ましく、１０〜２５体積％がより好ましく、１５〜２５体積％がさらに好ましい。
前記組成物中のジオキサン（１，４−ジエチレンジオキサン）の含有濃度は０．１〜６体積％が好ましく、２〜６体積％がより好ましく、３〜６体積％がさらに好ましい。
前記組成物中の２−クロロエタノール（エチレンクロルヒドリン）の含有濃度は０．１〜６体積％が好ましく、２〜６体積％がより好ましく、３〜６体積％がさらに好ましい。
前記添加剤の含有濃度が前記範囲内であると、本発明の効果が十分に得られる。
【００９８】
前記組成物中のスペルミジンの含有濃度は、０．００１〜１Ｍが好ましく、０．０１〜１Ｍがより好ましく、０．１〜１Ｍがさらに好ましい。
前記組成物中のスペルミンの含有濃度は、０．００１〜１Ｍが好ましく、０．０１〜１Ｍがより好ましく、０．１〜１Ｍがさらに好ましい。
前記組成物中のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの含有濃度は、０．１〜６体積％が好ましく、２〜６体積％がより好ましく、３〜６体積％がさらに好ましい。
前記添加剤の含有濃度が前記範囲内であると、本発明の効果が十分に得られる。  
【００９９】
前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ａ、及び前記熱ヒステリシス活性増加用組成物Ｂは、例えば、公知の方法で抽出及び精製された前記不凍蛋白質を凍結乾燥して得られた粉末を、前記添加剤及び前記水と所定の割合で混合することによって製造することができる。
本発明の効果を損なわないものであれば、前記不凍蛋白質、前記添加剤、及び前記水の混合の方法や混合の順序などは特に限定されない。
【０１００】
粉末状となった本発明の熱ヒステリシス活性増加用組成物は、所定量を水又は水含有物に均一に混合することによって、前記水又は水含有物の熱ヒステリシス活性を増加させることができる。
【０１０１】
より具体的には、前記熱ヒステリシス活性増加用組成物を、アイスクリーム、又はアイスキャンデー等の氷菓子、若しくは冷凍麺類、又は冷凍ハンバーグ等の冷凍加工食品に混合した場合には、これら食品の熱ヒステリシス活性が増加することにより、前記食品の冷凍時における氷結晶の成長が妨げられ、また氷結晶の再結晶化が抑制されるため、前記食品の口当たりがまろやかな好ましいものとすることができる。また、前記熱ヒステリシス活性増加用組成物を、自動車ラジエータに用いる不凍液、生鮮食品を保冷するための保冷剤、並びに医薬品及びバイオ研究用途などに用いられる微生物や培養細胞等の冷凍保存用保護溶液等の食品以外の製品に混合して使用することもできる。
【実施例】
【０１０２】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。【０１０３】
（魚類由来の不凍蛋白質の調製）
以下の実施例に用いた魚類由来の不凍蛋白質は、北海道野付郡別海町の野付漁協で漁獲された、表１に記載の４魚種から抽出及び精製して得られた。【０１０４】
当該不凍蛋白質の抽出及び精製方法は、つぎの通りである。
まず、魚原料の質量と等量の脱イオン水とをミキサー中にて粉砕混合後、得られた懸濁液を遠心分離して上清と沈殿とに分離した。得られた上清をフィルター孔径１００μｍの精密ろ過膜に通して、上清に含まれる夾雑物を除去した。【０１０５】
つぎに、Ｉ型ＡＦＰ、ＩＩ型ＡＦＰ、及びＡＦＧＰについては分画分子量３０，０００（Ｄａ）の限外ろ過膜を用いて、ＩＩＩ型ＡＦＰについては分画分子量１０，０００（Ｄａ）の限外ろ過膜を用いて、１回目の限外ろ過を行うことにより、上清に含まれる当該不凍蛋白質よりも大きい分子量の夾雑蛋白質を除去して、当該不凍蛋白質をろ液（膜透過液）として得た。つづいて、いずれのＡＦＰについても分画分子量３，０００（Ｄａ）の限外ろ過膜を用いて、２回目の限外ろ過を行うことにより、前記ろ液に含まれる当該不凍蛋白質よりも小さい分子量の夾雑蛋白質を除去して、当該不凍蛋白質を濃縮液（限外ろ過膜を通過しない側の液）として得た。【０１０６】
【表１】
2012026596.tif 000002
【０１０７】
（熱ヒステリシス活性測定用試料の調製）
実施例１〜９２及び比較例１〜４では、精製した不凍蛋白質の終濃度が５質量％（５０ｍｇ／ｍｌ）で、添加剤の終濃度が表２〜９に示す濃度となるように、不凍蛋白質と添加剤と脱イオン水を混合して、熱ヒステリシス活性測定用試料とした。【０１０８】
実施例９３〜３１４では、精製した不凍蛋白質の終濃度及び添加剤の終濃度が表１０〜１９に示す濃度となるように、不凍蛋白質と添加剤と脱イオン水を混合して、熱ヒステリシス活性測定用試料とした。【０１０９】
前記試料の調製方法は、各試料における添加剤の終濃度が前記添加剤の飽和濃度の１／２以下である場合は、終濃度の２倍濃度の添加剤を溶解した水溶液と、１０質量％の不凍蛋白質とを等量ずつ混合する方法で行った。また、各試料における添加剤の終濃度が前記添加剤の飽和濃度の１／２以上である場合は、飽和濃度の添加剤を溶解した水溶液と１０質量％の不凍蛋白質とを混合した後で脱イオン水を加えて、所定の添加剤濃度になるように希釈した。各試料を均一に混合後、１０，０００ｒｐｍ（１２，０００Ｇ）、１０分間の遠心を４℃にて行い、不溶画分を除去した試料を熱ヒステリシス活性測定用試料（Ｉ）とした。【０１１０】
（熱ヒステリシス活性（℃）の測定方法）
試料中の氷結晶の形態観察を可能とするための温度制御機構を有する装置（ＬＫ−６００ＰＭ；Ｌｉｎｋａｍ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）を備えた顕微鏡（ＢＸ５１；オリンパス株式会社）を使用して、以下のステップ１〜３によって、試料の熱ヒステリシス活性を測定した。【０１１１】
ステップ１；顕微鏡ステージに設置した円型カバーガラスの上に試料１μｌを滴下した後、毎分５０℃の速度で試料全体が凍結する温度まで冷却した（図１参照）。
ステップ２；試料の凍結を確認後、試料の融点付近まで毎分１０℃で昇温させ、試料中の氷結晶が完全に融解しないよう留意しながら、ステージ温度を制御する。視野内の氷結晶が融解して少なくなってきたら、毎分１〜５℃程度の昇温速度に変更して、視野内の氷結晶数を５個以下にした。その後、ステージの温度を毎分０．５〜５℃くらいで厳密に制御しながら、残存する氷結晶の溶け始めの温度を融点として求めた（小数点以下２桁まで）。
ステップ３； ステップ２で融点が求まったら、毎分０．２〜１℃程度の速度で冷却しながら、残存する氷結晶が大きく成長し始める温度（凝固点）を求めた。【０１１２】
上記ステップ３において、試料中の不凍蛋白質が氷結晶成長を抑制しうる温度帯よりもステージ温度が低くなると、氷結晶が急激に成長し始める。このときの温度と前記融点との温度差を熱ヒステリシス活性（℃）として測定した。その結果を表３〜１９に併記する。【０１１３】
（熱ヒステリシス活性ｈ（℃）の測定方法）
前記調製した熱ヒステリシス活性測定用試料（Ｉ）を、ウォーターバスを用いて９０℃、３０分間で加熱した後、１０，０００ｒｐｍ（１２，０００Ｇ）、１０分間、４℃で遠心して、不溶画分を除去した試料を熱ヒステリシス活性測定用試料（ＩＩ）とした。
得られた試料（ＩＩ）の熱ヒステリシス活性ｈ（℃）を、前述の熱ヒステリシス活性（℃）の測定と同様の方法で測定した。その結果を表３〜９に併記する。【０１１４】
また、比較例として、前記不凍蛋白質の終濃度が５質量％（５０ｍｇ／ｍｌ）となるように、不凍蛋白質と脱イオン水のみを混合して、熱ヒステリシス活性測定用試料（ＩＩＩ）とした。
得られた試料（ＩＩＩ）の熱ヒステリシス活性（℃）及び熱ヒステリシス活性ｈ（℃）を、前述と同様の方法で測定した。その結果を表２に示す。【０１１５】
【表２】
2012026596.tif 000003
【０１１６】
【表３】
2012026596.tif 000004
【０１１７】
【表４】
2012026596.tif 000005
【０１１８】
【表５】
2012026596.tif 000006
【０１１９】
【表６】
2012026596.tif 000007
【０１２０】
【表７】
2012026596.tif 000008
【０１２１】
【表８】
2012026596.tif 000009
【０１２２】
【表９】
2012026596.tif 000010
【０１２３】
【表１０】
2012026596.tif 000011
【０１２４】
【表１１】
2012026596.tif 000012
【０１２５】
【表１２】
2012026596.tif 000013
【０１２６】
【表１３】
2012026596.tif 000014
【０１２７】
【表１４】
2012026596.tif 000015
【０１２８】
【表１５】
2012026596.tif 000016
【０１２９】
【表１６】
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【０１３０】
【表１７】
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【０１３１】
【表１８】
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【０１３２】
【表１９】
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【０１３３】
上記表３〜１９に示した実施例１〜３１４において、熱ヒステリシス活性が比較例よりも１．５倍以上促進された場合の促進効果を「Ａ」とし、１．０倍超１．５倍未満促進された場合の促進効果を「Ｂ」とし、１．０倍以下で促進されなかった場合の促進効果を「Ｃ」として評価した。
また、上記表３〜９に示した実施例１〜９２において、熱ヒステリシス活性ｈが比較例よりも１．５倍以上である場合の耐熱効果を「Ａ」とし、１．０倍超１．５倍未満である場合の耐熱効果を「Ｂ」とし、１．０倍以下で促進されなかった場合の促進効果を「Ｃ」として評価した。促進効果又は耐熱効果を評価していない場合は「−」と表記した。【０１３４】
以上の結果から、本発明に係る熱ヒステリシス活性増加方法、熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法及び熱ヒステリシス活性増加用組成物は、前記増加効果及び／又は前記低減効果に優れることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明の熱ヒステリシス活性増強方法、熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法及び熱ヒステリシス活性増加用組成物は、水を含有する食品や工業用薬液等に適用することによって、前記食品や前記工業用薬液を保冷する際の氷結晶の成長や氷の再結晶化を抑制して、前記食品の口溶けを滑らかにしたり、前記食品や前記工業用薬液中で氷が成長することによる弊害を防止したりするために広く利用することが可能である。
【図１】
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【国際調査報告】
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