(57)【要約】従来のインドシアニングリーンの水及び生理食塩水への溶解性等の問題点を解決した新規インドシアニン化合物、その合成法及び精製法、並びに当該新規インドシアニン化合物を含む診断用組成物を提供することを課題とする。更に、それら診断用組成物を利用した新規インドシアニン化合物の体内動態を評価する方法および生体内動態測定装置、生体における血液等の水分の循環を可視化する方法および装置を提供する。また、近赤外蛍光性インドシアニン分子の疎水性部位を環状糖鎖シクロデキストリンの空洞に包接させ、インドシアニン分子の疎水性部位をグルコースで被覆した新規インドシアニン化合物、その合成法及び精製法をも見出した。更に、上記新規インドシアニン化合物を含む診断用組成物を利用することにより、静脈投与において肝臓以外の器官を蛍光撮像する方法や、新規インドシアニン化合物の体内動態を評価する方法および生体内動態測定装置を見出し、生体における血液等の水分の循環を可視化する方法および装置を見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化１】
2011093098.tif 000028
（式中のR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。又、これらの置換基（カルボン酸、スルホン酸、リン酸）であり、該置換基において水素イオンが解離する場合は、その水素イオンの代わりにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンが置換できる。アミノ基は１級、２級、３級、４級も選択される。さらには、R8とR9は、CH2、CH2CH2、CH2CH2CH2あるいはCH2CH2CH2CH2の環状構造も選択される。又、これらのアルキル基上に、水素原子の代わりにアルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環が置換した官能基も選択される。）
【請求項２】
インドシアニンのナフチル基の少なくとも一部がシクロデキストリンの空洞に包接されることを特徴とする、下記化学式２で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化２】
2011093098.tif 000029
（式中のR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。又、これらの置換基（カルボン酸、スルホン酸、リン酸）であり、該置換基において水素イオンが解離する場合は、その水素イオンの代わりにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンが置換できる。アミノ基は１級、２級、３級、４級も選択される。さらには、R8とR9は、CH2、CH2CH2、CH2CH2CH2あるいはCH2CH2CH2CH2の環状構造も選択される。又、これらのアルキル基上に、水素原子の代わりにアルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環が置換した官能基も選択される。）
【請求項３】
請求項１に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物であって、下記化学式３で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化３】
2011093098.tif 000030
（式中のR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。又、これらの置換基（カルボン酸、スルホン酸、リン酸）であり、該置換基において水素イオンが解離する場合は、その水素イオンの代わりにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンが置換できる。アミノ基は１級、２級、３級、４級も選択される。ｍ、ｎは、１以上６以下の整数である。さらには、R8とR9は、CH2、CH2CH2、CH2CH2CH2あるいはCH2CH2CH2CH2の環状構造も選択される。又、これらのアルキル基上に、水素原子の代わりにアルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環が置換した官能基も選択される。）
【請求項４】
請求項２に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物であって、下記化学式４で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化４】
2011093098.tif 000031
（式中のR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。又、これらの置換基（カルボン酸、スルホン酸、リン酸）であり、該置換基において水素イオンが解離する場合は、その水素イオンの代わりにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンが置換できる。アミノ基は１級、２級、３級、４級も選択される。ｍ、ｎは、１以上６以下の整数である。さらには、R8とR9は、CH2、CH2CH2、CH2CH2CH2あるいはCH2CH2CH2CH2の環状構造も選択される。又、これらのアルキル基上に、水素原子の代わりにアルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環が置換した官能基も選択される。）
【請求項５】
請求項３に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、下記化学式５で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化５】
2011093098.tif 000032
（式中のｍ、ｎ、ｐ、ｑは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）
【請求項６】
請求項４に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、下記化学式６で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化６】
2011093098.tif 000033
（式中のｍ、ｎ、ｐ、ｑは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）
【請求項７】
請求項３に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、下記化学式７で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化７】
2011093098.tif 000034
（式中のｍ、ｎは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）
【請求項８】
請求項４に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、下記化学式８で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化８】
2011093098.tif 000035
（式中のｍ、ｎは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）
【請求項９】
請求項３に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、下記化学式９で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化９】
2011093098.tif 000036
（式中のｍ、ｎは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）
【請求項１０】
請求項４に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、下記化学式１０で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化１０】
2011093098.tif 000037
（式中のｍ、ｎは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）
【請求項１１】
請求項３に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、下記化学式１１で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化１１】
2011093098.tif 000038
（ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）
【請求項１２】
請求項４に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、下記化学式１２で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物。
【化１２】
2011093098.tif 000039
（ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）
【請求項１３】
（１）インドシアニンカルボン酸化合物とアミノシクロデキストリンとを溶媒中で混合する工程と、（２）脱水縮合剤を加えて脱水縮合反応させる工程とを含むことを特徴とする、請求項１、３、５、７、９、１１のいずれか１つに記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の化学合成法。
【請求項１４】
請求項１、３、５、７、９、１１のいずれか１つに記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物を、水中で包接反応させることを特徴とする請求項２、４、６、８、１０、１２のいずれか１つに記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の化学合成法。
【請求項１５】
請求項１乃至１２のいずれか１つに記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の精製法であって、該化合物をＨＣｌを含有する溶媒で溶出するカラムクロマトグラフィーによる精製法。
【請求項１６】
請求項１乃至１２のいずれか１つに記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物を含む水溶液である体内に注入して用いられる診断用組成物。
【請求項１７】
実質的にヨウ素を含まない請求項１６に記載の診断用組成物。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の診断用組成物を投与した生体の一部について、前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物に励起光を照射する励起光照射手段と、
前記励起光照射手段により励起された前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が発する蛍光の強度を測定する蛍光強度測定手段と、
前記蛍光強度測定手段から経時的に取得した前記蛍光強度からその蛍光強度の経時変化を求めることにより前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が前記生体の一部において間質液中に移行する速度及び／又は前記間質外に移行する速度を算出する生体内動態算出手段と、
を有する前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の生体内動態測定装置。
【請求項１９】
請求項１６又は１７に記載の診断用組成物を投与した生体の一部について、前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物に励起光を照射する励起光照射手段と、
前記励起光照射手段により励起された前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が発する蛍光の強度を二次元的に取得して前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の生体内における分布状態データを得る蛍光イメージング手段と、
前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が発する前記蛍光波長以外の波長の光の強度を二次元的に取得して前記生体の一部についての形態データを得る形態イメージング手段と、
前記形態イメージング手段により得られた前記形態データに前記蛍光イメージング手段により得られた前記分布状態データを重ね合わせて前記生体の一部における前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の分布状態を表示する表示手段と、
を有する循環可視化装置。
【請求項２０】
前記表示手段は前記生体の一部において前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の分布量が所定の基準より低い部分を壊死部分として表示する請求項１９に記載の循環可視化装置。
【請求項２１】
前記生体の一部において間質液内外に移行する速度から前記生体の一部において以後に進行する腫脹の程度を予測する腫脹進行予測手段を有する請求項１８に記載の生体内動態測定装置。
【請求項２２】
前記腫脹進行予測手段は、前記診断用組成物を投与されてから、前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が全身の血液中に分散するまでの時間である所定時間経過以降における前記間質液中への移行速度の大きさに応じた程度の腫脹の進行を予測する請求項２１に記載の生体内動態測定装置。
【請求項２３】
請求項１６又は１７に記載の診断用組成物を投与した生体の一部及び対照部位について、前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物に励起光を照射する励起光照射手段と、
前記励起光照射手段により励起された前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が発する蛍光の強度を測定する蛍光強度測定手段と、
前記蛍光強度測定手段から経時的に取得した前記蛍光強度からその蛍光強度の経時変化を求めることにより前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が前記生体の一部において間質液中に移行する速度及び／又は前記間質外に移行する速度を算出する生体内動態算出手段と、
前記生体の一部において間質液内外に移行する速度から前記生体の一部において以後に進行する腫脹の程度を予測する腫脹進行予測手段とを有し、
前記腫脹進行予測手段は、
前記診断用組成物を投与してから前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が全身の血液中に分散するまでの時間である所定時間に至るまでの、前記生体の一部における蛍光強度の変化と前記対照部位における蛍光強度の変化とから、対照部位に流れる血流量と前記生体の一部における血流量との関係を求め、
前記所定時間経過以降における、前記対照部位における蛍光強度の変化を対照とした前記生体の一部における蛍光強度の変化の程度をその関係を用いて算出し、
算出した前記変化の程度の大きさに応じた腫脹の進行を予測する手段であることを特徴とする生体内動態測定装置。
【請求項２４】
請求項１６又は請求項１７に記載の診断用組成物を投与した生体の器官について、前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物に励起光を照射する励起光照射手段と、
前記励起光照射手段により励起された前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が発する蛍光の強度を測定する蛍光強度測定手段と、
前記蛍光強度測定手段から経時的に取得した前記蛍光強度から前記器官における前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の生体内動態を評価する生体内動態算出手段とを有することを特徴とする生体内動態測定装置。
【請求項２５】
前記器官は、腎臓、尿管、膀胱、及び尿道の何れかである請求項２４に記載の生体内動態測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療診断技術、医療外科手術技術、科学測定分析技術、印刷技術、筆記技術、塗装技術、染料技術、染色技術に有用な緑色色素であり、かつ近赤外蛍光を発する性質を有する新規インドシアニン化合物、その合成法及びその精製法、並びに診断用組成物に関する。さらに詳しくは、緑色色素でありかつ近赤外蛍光を発する性質を有する環状糖鎖シクロデキストリン結合インドシアニン化合物、その合成法及びその精製法、そのインドシアニン化合物を用いた診断用組成物、その診断用組成物を使用する生体内動態測定装置、並びに循環可視化装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまで緑色色素であり近赤外蛍光を発するインドシアニン化合物は種々合成されており、それらは、例えば医療分野では、眼の硝子体手術に用いる染色用色素、肝機能検査薬に用いる色素、循環機能検査薬に用いる色素、外科手術に用いる色素、外科手術に用いる近赤外蛍光化合物、科学分野では、タンパク質や糖などの染色や蛍光化用化合物、印刷技術では色素として多くの用途がある。これらのインドシアニン化合物の中でインドシアニングリーン（以下、「ＩＣＧ」と略記する）とよばれる化合物は、５０年近く肝機能検査薬及び循環機能検査薬として用いられている。近年、ＩＣＧの用途として肝機能検査薬及び循環機能検査薬以外に、試行ではあるが、ＩＣＧの生体組織からの光透過性が高い性質を利用して、体内、例えば血管、リンパ管、脳、眼、胃、乳、食道、皮膚、あるいはその他の部位にＩＣＧを局所的投与し、ＩＣＧの近赤外蛍光を観察することによる医療手術及び医療診断が行われるようになった（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】”ＩＣＧ蛍光Navigation Surgeryのすべて” , 草野満夫監修・編集, インターメディカ社, (2008年11月発行).
【非特許文献２】”(商品名) ジアグノグリーン注射用２５ｍｇ” (第一三共株式会社)の添付文書が掲載されているインターネットホームページのＵＲＬ(https://www.daiichisankyo.co.jp/med/contents/di/dg2/pi/pdf/pi_dg2_0909.pdf)
【非特許文献３】R. C. Benson, H. A. Kues, Phys. Med. Biol., 23, 159-163 (1978).
【非特許文献４】S. Yoneyama, T. Saito, Y. Komatsu, I. Koyama, K. Takahashi, J.Duvoll-Young, IOVS, 37, 1286-1290 (1998).
【非特許文献５】Y. Ye, W. P. Li, C. J. Anderson, J. Kao, G. V. Nikiforovich,    S. Achilefu, J. Am. Chem. Soc., 125, 7766-7767 (2003).
【非特許文献６】K. Teranishi and S.  Tanabe, ITELetters on Batteries, New Technologies & Medicine, 1, 53-60 (2000).
【非特許文献７】MICHAEL O’SHAUGHNESSY  et al: 1994 Wiley-Liss, Inc MICROSURGERY 15:40S4121994.
【非特許文献８】RALPH J.P.M et al:1997 Wiley-Liss, Inc.MICROSURGERY 17:402-408 1996.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ＩＣＧの緑色発色団（緑色を呈するに必要な化学構造体）及び近赤外蛍光団（近赤外蛍光を発するに必要な化学構造体）は疎水的であり、その水溶化のためにスルホニル基が側鎖末端に結合している。このため従来のＩＣＧには、以下のように多くの問題点があった。【０００５】
ＩＣＧ製剤の医療での一般的な使用では、ＩＣＧ２５ｍｇに蒸留水を約５ｍＬから１０ｍＬを加え、振動撹拌により溶解する。ＩＣＧが完全に溶解されていない場合は、悪心、吐気、発熱、ショック様症状が現れることがある（非特許文献２）。又、不溶化のため生理食塩水など他の水溶液で初期溶解することはできない（非特許文献２）。【０００６】
ＩＣＧは、上記のようにスルホニル基が結合しているので水溶性ではあるが、化学構造上疎水性の炭化水素基が多く界面活性を有することから脂質への吸着が生じる性質を有する。従って、血管や臓器などの生体組織に注入した際に、その注入部位に付着し、又誤って漏らし、あるいは逆流すことにより目的としない生体組織に付着することがある。生体組織に付着したＩＣＧは、拭取り操作や吸引操作では容易に生体組織から除去することができず、外科手術や医療診断に支障をきたすことがある。【０００７】
ＩＣＧは、水溶液中では分子会合する性質がある。それを要因の１つとして、水溶液中での蛍光強度は低い（非特許文献３、４）。
又、ＩＣＧは、水に溶解後時間とともに不溶化し、水溶液として長期保存することは困難であり、また低温による凍結保存は、不溶化を助長する。【０００８】
又、ＩＣＧ製剤には、５％以下のＮａＩが含有され、場合によってはヨード過敏症を起こす恐れがある問題点をも有している（非特許文献２）。
又、ＩＣＧは、静脈注射した際、速やかに肝臓に集積し肝排泄されるため他の器官、例えば腎臓、尿管、膀胱、尿道、心臓、肺などの器官の蛍光撮像が困難である。
又、ＩＣＧは、静脈注射した際、血液とともに移行することから、末梢組織への移行が少ないため、間質への移行を観ることは困難である。【０００９】
本発明は、上記のような従来のＩＣＧの問題点を解決することを目的とするものである。すなわち、水あるいは生理食塩水での溶解性が高く、生体組織からの除去が容易であり、水溶液中での分子会合性が低く、水溶液中での近赤外蛍光強度が高く、肝臓以外の器官、たとえば腎臓、尿管、膀胱、尿道、心臓、肺をも蛍光撮像することを特徴とする緑色色素で近赤外蛍光を発する新規インドシアニン化合物を提供することを目的とする。さらには、この特徴を有する新規インドシアニン化合物の化学合成法及びその精製法をも提供する。また、上記新規インドシアニン化合物を含む診断用組成物を提供することも解決すべき課題とする。更に、それら診断用組成物を利用することにより、生体内における水分平衡などに関連する新規インドシアニン化合物の体内動態を評価することができる生体内動態測定装置、生体における血液、リンパ液、尿およびその他の水分の循環を可視化する方法および装置を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、近赤外蛍光を発する性質を利用した外科手術や医療診断で使用することが可能であるところの近赤外蛍光を発する化合物を見出すことにより、上記のＩＣＧの問題点を解決した。【００１１】
すなわち、水あるいは生理食塩水での溶解性が高く、生体組織からの除去が容易であり、水溶液中での分子会合が低く、水溶液中での近赤外蛍光強度が高く、緑色色素で近赤外蛍光を発することを特徴とする新規インドシアニン化合物を見出し、本発明を完成するに至った。さらには、その新規インドシアニン化合物の化学合成法及び精製法をも見出し、本発明を完成するに至った。さらには上記新規インドシアニン化合物を含む診断用組成物を提供するに至った。更に、それら診断用組成物を利用することにより、静脈投与においても肝臓以外の器官をも蛍光撮像する方法を提供するに至った。更には、生体内における水分平衡などに関連する新規インドシアニン化合物の体内動態を評価することができる方法および生体内動態測定装置、生体における血液、リンパ液、尿および他の水分の循環を可視化する方法および装置を提供するに至った。【００１２】
本発明の第一の新規インドシアニン化合物は、ＩＣＧの緑色発色団（緑色を呈するに必要な化学構造体）及び近赤外蛍光団（近赤外蛍光を発するに必要な化学構造体）に環状糖鎖シクロデキストリンを共有結合させた化合物である。さらに、本発明の第二の新規インドシアニン化合物は、シクロデキストリンの空洞内にインドシアニン構造の疎水性部位であるナフチル部位を包接させることにより親水性のグルコース基で疎水性部位であるナフチル部位を被覆し、インドシアニン分子構造の多くの領域を３次元的に親水性にすることを特徴とした新規インドシアニン化合物である。従って、ＩＣＧが疎水性部位とスルホニル基の親水性を併せ持つ界面活性様の性質を特徴とするのに対し、本発明の化合物は、その分子内の疎水性部位をシクロデキストリンで被覆しているため界面活性様の性質を有しないことを特徴としている。より詳細には、本発明は、【００１３】
＜１＞インドシアニン類と環状糖鎖シクロデキストリンが共有結合してなることを特徴とする、化学式１で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００１４】
【化１】
2011093098.tif 000002
【００１５】
（式中のR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。又、これらの置換基（カルボン酸、スルホン酸、リン酸、）であり、該置換基において水素イオンが解離する場合は、その水素イオンの代わりにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンが置換できる。アミノ基は１級、２級、３級、４級も選択される（窒素に結合する置換としてはアルキル基などが挙げられる。）。さらには、R8とR9は、CH2、CH2CH2、CH2CH2CH2あるいはCH2CH2CH2CH2の環状構造も選択される。又、これらのアルキル基上に、水素原子の代わりにアルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環が置換した官能基も選択される。）
＜２＞インドシアニンのナフチル基の少なくとも一部がシクロデキストリンの空洞に包接されることを特徴とする、化学式２で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００１６】
【化２】
2011093098.tif 000003
【００１７】
（式中のR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。又、これらの置換基（カルボン酸、スルホン酸、リン酸）であり、該置換基において水素イオンが解離する場合は、その水素イオンの代わりにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンが置換できる。アミノ基は１級、２級、３級、４級も選択される。さらには、R8とR9は、CH2、CH2CH2、CH2CH2CH2あるいはCH2CH2CH2CH2の環状構造も選択される。又、これらのアルキル基上に、水素原子の代わりにアルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環が置換した官能基も選択される。）
＜３＞インドシアニン類と環状糖鎖シクロデキストリンがアミド結合を介して共有結合してなること特徴とする化学式１に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物であって、化学式３で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００１８】
【化３】
2011093098.tif 000004
【００１９】
（式中のR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。又、これらの置換基（カルボン酸、スルホン酸、リン酸）であり、該置換基において水素イオンが解離する場合は、その水素イオンの代わりにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンが置換できる。アミノ基は１級、２級、３級、４級も選択される。ｍ、ｎは、１以上６以下の整数である。さらには、R8とR9は、CH2、CH2CH2、CH2CH2CH2あるいはCH2CH2CH2CH2の環状構造も選択される。又、これらのアルキル基上に、水素原子の代わりにアルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環が置換した官能基も選択される。）【００２０】
＜４＞インドシアニン類と環状糖鎖シクロデキストリンがアミド結合を介して共有結合してなること特徴とする化学式２に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物であって、化学式４で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００２１】
【化４】
2011093098.tif 000005
【００２２】
（式中のR1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。又、これらの置換基（カルボン酸、スルホン酸、リン酸）であり、該置換基において水素イオンが解離する場合は、その水素イオンの代わりにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンが置換できる。アミノ基は１級、２級、３級、４級も選択される。ｍ、ｎは、１以上６以下の整数である。さらには、R8とR9は、CH2、CH2CH2、CH2CH2CH2あるいはCH2CH2CH2CH2の環状構造も選択される。又、これらのアルキル基上に、水素原子の代わりにアルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、リン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環が置換した官能基も選択される。）【００２３】
＜５＞化学式３に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、化学式５で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００２４】
【化５】
2011093098.tif 000006
【００２５】
（式中のｍ、ｎ、ｐ、ｑは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）
＜６＞化学式４に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、化学式６で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００２６】
【化６】
2011093098.tif 000007
【００２７】
（式中のｍ、ｎ、ｐ、ｑは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）【００２８】
＜７＞化学式３に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、化学式７で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００２９】
【化７】
2011093098.tif 000008
【００３０】
（式中のｍ、ｎは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）【００３１】
＜８＞化学式４に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、化学式８で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００３２】
【化８】
2011093098.tif 000009
【００３３】
（式中のｍ、ｎは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）【００３４】
＜９＞化学式３に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、化学式９で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００３５】
【化９】
2011093098.tif 000010
【００３６】
（式中のｍ、ｎは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）【００３７】
＜１０＞化学式４に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、化学式１０で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００３８】
【化１０】
2011093098.tif 000011
【００３９】
（式中のｍ、ｎは２以上６以下の整数である。ｒは５以上７以下の整数である。ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）【００４０】
＜１１＞化学式３に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、化学式１１で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００４１】
【化１１】
2011093098.tif 000012
【００４２】
（ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）【００４３】
＜１２＞化学式４に記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物において、化学式１２で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物である。【００４４】
【化１２】
2011093098.tif 000013
【００４５】
（ｓは０以上４以下の整数である。Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基又は複素環である。）【００４６】
＜１３＞（１）インドシアニンカルボン酸化合物とアミノシクロデキストリンとを溶媒中で混合する工程と、（２）脱水縮合剤を加えて脱水縮合反応させる工程とを含むことを特徴とする、前記の化学式（化学式１，３，５，７，９，１１）のいずれか１つに記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の化学合成法である。【００４７】
＜１４＞前記の化学式（化学式１，３，５，７，９，１１）のいずれか１つに記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物を、水中で包接反応させることを特徴とする前記の化学式（化学式２，４，６，８，１０，１２）のいずれか１つに記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の化学合成法である。【００４８】
＜１５＞前記の化学式（化学式１乃至１２）のいずれか１つに記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の精製法であって、該化合物をＨＣｌを含有する溶媒で溶出するカラムクロマトグラフィーによる精製法である。【００４９】
＜１６＞前記の化学式１乃至１２のいずれか１つに記載のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物を含む水溶液である体内に注入して用いられる診断用組成物である。【００５０】
＜１７＞実質的にヨウ素を含まない前記＜１６＞の診断用組成物である。【００５１】
＜１８＞前記＜１６＞又は＜１７＞の診断用組成物を投与した生体の一部について、前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物に励起光を照射する励起光照射手段と、
前記励起光照射手段により励起された前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が発する蛍光の強度を測定する蛍光強度測定手段と、
前記蛍光強度測定手段から経時的に取得した前記蛍光強度からその蛍光強度の時間変化率の経時変化を求めることにより前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が前記生体の一部において間質液中に移行する速度及び／又は前記間質外に移行する速度を算出する生体内動態算出手段と、
を有する前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の生体内動態測定装置である。【００５２】
＜１９＞前記＜１６＞又は＜１７＞の診断用組成物を投与した生体の一部について、前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物に励起光を照射する励起光照射手段と、
前記励起光照射手段により励起された前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が発する蛍光の強度を二次元的に取得して前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の生体内における分布状態データを得る蛍光イメージング手段と、
前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が発する前記蛍光波長以外の波長の光の強度を二次元的に取得して前記生体の一部についての形態データを得る形態イメージング手段と、
前記形態イメージング手段により得られた前記形態データに前記蛍光イメージング手段により得られた前記分布状態データを重ね合わせて前記生体の一部における前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の分布状態を表示する表示手段と、
を有する循環可視化装置である。【００５３】
＜２０＞前記表示手段は前記生体の一部において前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の分布量が所定の基準より低い部分を壊死部分として表示する前記＜１９＞９に記載の循環可視化装置である。【００５４】
＜２１＞前記生体の一部において間質液内外に移行する速度から前記生体の一部において以後に進行する腫脹の程度を予測する腫脹進行予測手段を有する前記＜１８＞に記載の生体内動態測定装置である。【００５５】
＜２２＞前記腫脹進行予測手段は、前記診断用組成物を投与されてから、前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が全身の血液中に分散するまでの時間である所定時間経過以降における前記間質液中への移行速度の大きさに応じた程度の腫脹の進行を予測する前記＜２１＞に記載の生体内動態測定装置である。【００５６】
＜２３＞前記＜１６＞又は前記＜１７＞に記載の診断用組成物を投与した生体の一部及び対照部位について、前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物に励起光を照射する励起光照射手段と、
前記励起光照射手段により励起された前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が発する蛍光の強度を測定する蛍光強度測定手段と、
前記蛍光強度測定手段から経時的に取得した前記蛍光強度からその蛍光強度の経時変化を求めることにより前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が前記生体の一部において間質液中に移行する速度及び／又は前記間質外に移行する速度を算出する生体内動態算出手段と、
前記生体の一部において間質液内外に移行する速度から前記生体の一部において以後に進行する腫脹の程度を予測する腫脹進行予測手段とを有し、
前記腫脹進行予測手段は、
前記診断用組成物を投与してから前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が全身の血液中に分散するまでの時間である所定時間に至るまでの、前記生体の一部における蛍光強度の変化と前記対照部位における蛍光強度の変化とから、対照部位に流れる血流量と前記生体の一部における血流量との関係を求め、
前記所定時間経過以降における、前記対照部位における蛍光強度の変化を対照とした前記生体の一部における蛍光強度の変化の程度をその関係を用いて算出し、
算出した前記変化の程度の大きさに応じた腫脹の進行を予測する手段であることを特徴とする生体内動態測定装置である。【００５７】
＜２４＞前記＜１６＞又は前記＜１７＞に記載の診断用組成物を投与した生体の器官について、前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物に励起光を照射する励起光照射手段と、
前記励起光照射手段により励起された前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が発する蛍光の強度を測定する蛍光強度測定手段と、
前記蛍光強度測定手段から経時的に取得した前記蛍光強度から前記器官における前記シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の生体内動態を評価する生体内動態算出手段とを有することを特徴とする生体内動態測定装置である。【００５８】
＜２５＞前記器官は、腎臓、尿管、膀胱、及び尿道の何れかである前記＜２４＞に記載の生体内動態測定装置である。
【発明の効果】
【００５９】
本発明の化学式１又は化学式２で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物によれば、ＩＣＧに比べて、水あるいは生理食塩水での溶解性が高く、生体組織からの除去が容易であり、水溶液中での分子会合が低く、水溶液中での近赤外蛍光強度が高く、肝臓以外の器官をも蛍光撮像することができ、ヨードを含まないことを特徴とする緑色色素で近赤外蛍光を発する化合物を提供できる。又、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の合成法によれば、シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の有用な合成を提供することができる。又、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の精製法によれば、シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の有用な精製を提供することができる。更に、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物は、ヨウ素を含有しなくても充分な溶解性を示すため、ヨード過敏症の原因ともなるヨウ素を含有しない診断用組成物を提供することもできる。この診断用組成物は従来のＩＣＧのみを含有する診断用組成物とは異なる体内挙動を示すため、その性質を利用して種々の有益な装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＩＣＧ及び化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）のヒトの皮膚への吸着性試験の結果である。ＩＣＧ及び化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）の１ｍＭ水溶液（０．０３ｍＬ）を腕に塗布した直後（写真左）、５分後に水洗した直後（写真中央）、さらに擦って水洗した直後（写真右）を表す。なお、右側の点は赤色ペンによるマーカーである。
【図２】ＩＣＧ及び化学式化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）のセルロース繊維への吸着性試験の結果である。ＩＣＧ及び化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）の１ｍＭ水溶液（０．０５ｍＬ）を綿棒に塗布した直後（写真上）、３分後に流水で５秒間水洗した直後（写真下）を表す。
【図３】ＩＣＧ及び化化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）の生体の肉モデルへの吸着性試験の結果である。ＩＣＧ及び化学式２０で示される化合物の１ｍＭ水溶液（０．０５ｍＬ）を、豚ロース肉の直径５ｍｍの凹に塗布した直後（写真左）、３分後に流水で１０秒間水洗した直後（写真右）を表す。
【図４】ＩＣＧ及び化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）の生体のタンパク質モデルへの吸着性試験の結果である。ＩＣＧ及び化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）の１ｍＭ水溶液（０．０５ｍＬ）を、鶏ささみ肉の直径５ｍｍの凹に塗布した直後（写真左）、３分後に流水で１０秒間水洗した直後（写真右）を表す。
【図５】ＩＣＧ及び化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）の疎水性化学繊維への吸着性試験の結果である。ＩＣＧ及び化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ−１）の１ｍＭ水溶液（０．０５ｍＬ）をポリプロピレンマスクに塗布した直後（写真左）、２０分放置後に流水で１秒間水洗した直後（写真右）を表す。
【００６１】
【図６】ＩＣＧ及び化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）の分子会合試験の結果である。左図がＩＣＧ、右図が化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）である。
【図７】ＩＣＧ、化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）、及び化学式１５および１６で示される異性化平衡化合物（ＴＫ２）のヒト静脈血中における蛍光強度の濃度依存性を示すグラフである。
【図８】ＩＣＧ、化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）、及び化学式１５および１６で示される異性化平衡化合物（ＴＫ２）をラットに投与する際の観察の様子を示す図である。
【図９】ＩＣＧ、化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）、及び化学式１５および１６で示される異性化平衡化合物（ＴＫ２）をラットに投与した際の腹腔内における蛍光の様子を示す図である。
【図１０】化学式１５および１６で示される異性化平衡化合物（ＴＫ２）0.1mM水溶液0.075mLを雄Wistarラット（14週齢、300ｇ）に尾静脈投与し、浜松ホトニクス社製  近赤外観察システムPDEで撮像した図である。左が可視光による白黒画像、右が蛍光画像である。
【図１１】化学式１５および１６で示される異性化平衡化合物（ＴＫ２）0.1mM水溶液0.075mLを雄Wistarラット（14週齢、300ｇ）に尾静脈投与し、近赤外蛍光内視鏡で撮像した図である。左が可視光による白黒画像、右が蛍光画像である。
【図１２】ＩＣＧ、化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）、及び化学式１５および１６で示される異性化平衡化合物（ＴＫ２）をラットに投与した際の足背部における蛍光の様子を示す図である。
【図１３】ＩＣＧ、化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）、及び化学式１５および１６で示される異性化平衡化合物（ＴＫ２）をラットに投与した際の足背部における蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
【図１４】ＩＣＧ、化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）、及び化学式１５および１６で示される異性化平衡化合物（ＴＫ２）をラットに投与した際の足背部における蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
【図１５】ラットの血管を直接観察する手法を示す図である。
【図１６】ラットの血管を直接観察する部分（精巣挙筋皮弁）を示す図である。
【図１７】ＩＣＧを投与したラットの血管及びその周辺の組織の蛍光の様子を示す図である。
【図１８】化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）を投与したラットの血管及びその周辺の組織の蛍光の様子を示す図である。
【００６２】
【図１９】ＴＫ１に対する試験を行う群について、カラゲニンを投与した群（ｅｄｅｍａ）と投与しない群（ｎｏｒｍａｌ）とについて投与直後（ｐｏｓｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）と一週間後（１ｗ  ａｆｔｅｒ）とに測定したラットの左足容積を示すグラフである。縦軸は容積（ｍＬ）である。
【図２０】ＴＫ１に対する試験を行う群について、カラゲニンを投与した群（ｅｄｅｍａ）と投与しない群（ｎｏｒｍａｌ）とについて投与直後（ｐｏｓｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）と一週間後（１ｗ  ａｆｔｅｒ）とに測定したラットの左足に対するVon Frey testの結果を示すグラフである。縦軸は反応があった荷重（ｇ）である。
【図２１】カラゲニンを投与した群（ｅｄｅｍａ）と投与しない群（ｎｏｒｍａｌ）とについて、カラゲニンを注射した直後にＴＫ１を注射し、その後の左足表面の輝度の変化の様子を示したグラフである。縦軸は輝度（任意単位）であり、横軸は時間（秒）である。
【図２２】カラゲニンを投与した群（ｅｄｅｍａ）と投与しない群（ｎｏｒｍａｌ）とについて、カラゲニンを注射した後一週間経過後にＴＫ１を注射し、その後の左足表面の輝度の変化の様子を示したグラフである。縦軸は輝度（任意単位）であり、横軸は時間（秒）である。
【図２３】ＩＣＧに対する試験を行う群について、カラゲニンを投与した群（ｅｄｅｍａ）と投与しない群（ｎｏｒｍａｌ）とについて投与直後（ｐｏｓｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）と一週間後（１ｗ  ａｆｔｅｒ）とに測定したラットの左足容積を示すグラフである。縦軸は容積（ｍＬ）である。
【図２４】ＩＣＧに対する試験を行う群について、カラゲニンを投与した群（ｅｄｅｍａ）と投与しない群（ｎｏｒｍａｌ）とについて投与直後（ｐｏｓｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）と一週間後（１ｗ  ａｆｔｅｒ）とに測定したラットの左足に対するVon Frey testの結果を示すグラフである。縦軸は反応があった荷重（ｇ）である。
【図２５】カラゲニンを投与した群（ｅｄｅｍａ）と投与しない群（ｎｏｒｍａｌ）とについて、カラゲニンを注射した直後にＩＣＧを注射し、その後の左足表面の輝度の変化の様子を示したグラフである。縦軸は輝度（任意単位）であり、横軸は時間（秒）である。
【図２６】カラゲニンを投与した群（ｅｄｅｍａ）と投与しない群（ｎｏｒｍａｌ）とについて、カラゲニンを注射した後一週間経過後にＩＣＧを注射し、その後の左足表面の輝度の変化の様子を示したグラフである。縦軸は輝度（任意単位）であり、横軸は時間（秒）である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本発明の診断用組成物は後述する本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物を色素として採用することにより、ヨウ素を含有させることなく診断に用いることが可能になった。本診断用組成物は従来から用いられているインドシアニングリーンを含有する診断用組成物を代替することが可能である。例えば、肝機能検査薬、循環機能検査薬などの用途である。また、体内、例えば血管、リンパ管、脳、眼、胃、乳、食道、皮膚、腎臓、尿管、膀胱、尿道、肺、心臓あるいはその他の部位に投与して生成する近赤外蛍光を観察することによる医療手術及び医療診断に適用できる。本発明の診断用組成物に含まれる色素は生体との結合性が少なく、長時間にわたって必要な部位を標識させることが可能であると推測される。診断用組成物には必要に応じて等張化剤としての塩やその他の添加物を含んでいても良い。また、予め水溶液として調製されているものの他、適宜、溶解して用いるような形態を採用することもできる。この診断用組成物は注射、点滴、塗布、経口投与などにより投与することができる。
【００６４】
この診断用組成物は血液、リンパ液、間質水および尿などの水溶液などの循環の様子を可視化する際に好適に使用できる。血液などの循環を可視化することにより、例えば、末梢循環を評価することによる壊死の判断、血行再建術や移植手術後の組織生着の評価、血行不良の診断などに用いることができる。また、従来から可視化が行われている眼底造影、脳循環評価、脳外科手術における術中造影、癌（乳癌、食道癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、皮膚癌など）におけるセンチネルリンパ節同定、リンパ浮腫の評価、術中胆管造影、腫瘍のマーキング、冠動脈造影、腹部血管造影（肝動脈、腹部大動脈、消化管血流など）などにも応用可能である。また、腎臓、尿管、膀胱、尿道などの腎排泄系の蛍光撮像をも可能にする。
【００６５】
＜１．非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物及びその合成＞
本発明における非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物としては、化学式１、化学式３、化学式５、化学式７、化学式９、化学式１１を挙げることができ、その合成法は、インドシアニン化合物とシクロデキストリン化合物を溶液中において反応させることにより成し遂げられる。
【００６６】
化学式１及び３において、シクロデキストリンに相当する部分による包接を考慮すると、Ｒ１〜Ｒ４及びＲ１３〜Ｒ１６はシクロデキストリンによる包接を阻害しないように嵩高くないものであることが望ましい。例えば、水素や、炭素数１〜３程度の、アルキル基又はアルコキシ基である。特に水素、メチル基、メトキシ基が望ましく、更には水素が望ましい。Ｒ５，Ｒ６，Ｒ１１及びＲ１２もシクロデキストリンによる包接のためにはＲ１〜Ｒ４及びＲ１３〜Ｒ１６ほどではないが嵩高くないことが望ましい。例えば、水素、炭素数１〜６程度の、アルキル基又はアルコキシ基である。Ｒ１〜Ｒ６及びＲ１１〜Ｒ１６はシクロデキストリンにより包接される部位であるため親水性の官能基を導入する場合であっても全体としては疎水性にすることが望ましい。Ｒ１７，Ｒ１８，Ｒ２２及びＲ２３はシクロデキストリンの包接にはあまり影響を与えないため上述の置換基であれば特に限定しない。Ｒ７，Ｒ１０，Ｒ１９及びＲ２１は合成の容易さの観点からは水素であることが望ましい。  Ｒ８，Ｒ９及びＲ２０も上述の置換基であれば特に限定しない。
【００６７】
本発明における非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が、アミド結合によりインドシアニン化合物とシクロデキストリン化合物が共有結合してなる場合、その非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物合成法は、インドシアニンカルボン酸化合物とアミノシクロデキストリン化合物を溶液中において脱水縮合反応させることによって成し遂げられる。
【００６８】
＜２．包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物＞
本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物は、化学式２で示されるインドシアニン類と環状糖鎖シクロデキストリンが共有結合してなるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物であり、インドシアニンのナフチル基の少なくとも一部がシクロデキストリンの空洞に包接されていることを特徴とする化合物である。又、インドシアニンのナフチル基がシクロデキストリンの空洞に包接され、近赤外蛍光を発するのであれば、インドシアニン基に置換基を有していても良い。又、シクロデキストリンには、さまざまな種類が知られているが、インドシアニンのナフチル基がシクロデキストリンの空洞に包接されるものであることが必要条件となる。例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンが例示される。好ましくは、β−シクロデキストリンがあげられる。又、シクロデキストリンに置換基が付いていても良い。
【００６９】
化学式２及び４において、Ｒ１〜Ｒ４及びＲ１３〜Ｒ１６はシクロデキストリンによる包接を阻害しないように嵩高くないものであることが望ましい。例えば、水素や、炭素数１〜３程度の、アルキル基又はアルコキシ基である。特に水素、メチル基、メトキシ基が望ましく、更には水素が望ましい。Ｒ５，Ｒ６，Ｒ１１及びＲ１２もシクロデキストリンによる包接のためにはＲ１〜Ｒ４及びＲ１３〜Ｒ１６ほどではないが嵩高くないことが望ましい。例えば、水素、炭素数１〜６程度の、アルキル基又はアルコキシ基である。Ｒ１〜Ｒ６及びＲ１１〜Ｒ１６はシクロデキストリンにより包接される部位であるため親水性の官能基を導入する場合であっても全体としては疎水性にすることが望ましい。Ｒ１７，Ｒ１８，Ｒ２２及びＲ２３はシクロデキストリンの包接にはあまり影響を与えないため上述の置換基であれば特に限定しない。Ｒ７，Ｒ１０，Ｒ１９及びＲ２１は合成の容易さの観点からは水素であることが望ましい。Ｒ８，Ｒ９及びＲ２０も上述の置換基であれば特に限定しない。インドシアニン基とシクロデキストリンの結合は、共有結合であれば良く、特に限定されることはなく、例えば、アルキル結合、アミノ結合、アミド結合、二重結合、三重結合、エステル結合、エーテル結合等が例示できる。ただし、化学合成上、効率的であることを重視するのであれば、アミド結合が好まれる。
【００７０】
インドシアニンのナフチル基の少なくとも一部がシクロデキストリンの空洞に包接されるには、スペーサーを用い、インドシアニン類と環状糖鎖シクロデキストリンがスペーサーを介して共有結合してなることが好ましい。この時、化学式２中のスペーサーの長さを調整することにより、インドシアニンのナフチル基のシクロデキストリンの空洞への包接の程度を制御することが可能となる。
【００７１】
従って、インドシアニン類と環状糖鎖シクロデキストリンがスペーサーを介して共有結合してなるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物であり、インドシアニンのナフチル基がシクロデキストリンの空洞に包接されていることを特徴とする化合物としては、化学式４のものが好ましく例示される。さらには、化学式６、化学式８、化学式１０のものが好ましく例示される。さらには、化学式１２のものがより好ましく例示される。化学式６におけるｍ，ｎ，ｐ及びｑは、ｍ＋ｐ及びｎ＋ｑのそれぞれが５以上７以下であることが望ましい。シクロデキストリンによる包接の容易さを考慮すると、どの化学式（化学式１〜１０）においてもインドシアニンに相当する構造における窒素原子とシクロデキストリンに相当する構造における酸素原子との間の構造（スペーサ）における原子数が７以上９以下であることが望ましい。
【００７２】
＜３．包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の合成＞
本発明における包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物は、以上の通りのものであり、その合成法は、上記で合成した非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物を合成前駆体とし、該化合物を水溶液中に溶解することにより成し遂げられる。水溶液には、包接化を妨げなければ、如何なる物質を含んでいても良く、水含量は、特に限定されることはない。又、包接化に適した温度は、−２０℃から１００℃であり、好ましくは０℃から５０℃である。又、包接化に要する時間は、水溶液に添加した直後から１ヶ月程度である。包接化反応は、以上のごとく非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の性質、包接化反応の温度、水溶液の組成、濃度などによりさまざまな形態をとることは明白である。
【００７３】
又、本発明における非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物は、水を含む溶媒に溶解させることで包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物に変換することができる。溶媒中の水の含有割合は特に限定しないが大きい方が原理的に包接が進行しやすく、５０質量％以上とすることが望ましい。更に、水溶液以外の溶媒において包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物を形成するものがあれば、特に水溶液で包接化を行う必要はない。
【００７４】
又、非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物を合成した段階で包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物を形成する場合があり、この場合は、改めて包接化反応を行う必要はない。
【００７５】
＜４．非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の合成法（合成の一例）＞
化学式１１に示される化合物の合成を一例として挙げる。化学式１１で示されるインドシアニン化合物は、例えば非特許文献５に記載の方法により合成する化学式１３に記載の化合物と、非特許文献６に記載の方法により合成する化学式１４と、脱水縮合剤として例えば水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ：例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩が挙げられる）やジシクロヘキシルカルボ汁イミド（ＤＣＣ）と、溶媒としてのピリジンやＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドあるいは水溶液と、を加え−２０℃から６０℃で１０分から１００時間反応することにより得ることができる。又、反応を活性化させるために活性化剤として例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を添加することもできる。脱水縮合剤の量は、化学式１３に記載の化合物と２倍モルあるいはそれ以上であり、使用する溶媒は、反応物が溶解し、脱水縮合反応を妨げなければ制限されない。活性化剤は、脱水縮合反応を活性化するものであれば制限されず、添加する量は脱水縮合反応が期待どおりに進行する量であれば制限されない。
【００７６】
【化１３】
2011093098.tif 000014
【００７７】
【化１４】
2011093098.tif 000015
【００７８】
＜５．非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の精製法＞
上記の方法で合成した非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物を含む混合物を酸性水溶液に溶解し、逆相カラムクロマトグラフィーに供し、溶出液として例えば酸を含む水とメタノール混合液、あるいは酸を含む水とアセトニトリル混合液、あるいは酸を含む水とエタノール混合液、あるいは酸を含む水とアセトン混合液のうちのいずれかを用いることにより溶出させ、高純度の非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物を単離・精製することができる。酸としては、非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が分解せず、溶出が効率的であり、溶出後の処理が容易であれば制限されないが、例えば塩酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、硫酸、硝酸、蟻酸などをあげることができる。好ましくは塩酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、更に好ましくは塩酸をあげることができる。酸の濃度は、非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物が分解せず、溶出が効率的であり、溶出後の処理が容易であれば制限されないが、０．０１ｍＭから１０ｍＭが好ましく、さらには、０．１ｍＭから１ｍＭがより好ましい。濃度をこの範囲内にすることにより目的の化合物が分解されず且つ速やかに溶出させることができる。溶出された非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物は、溶媒を除去することにより固体として得ることができる。溶媒の除去方法としては凍結乾燥することもできる。
【００７９】
＜６．包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の合成法（合成の一例）及び精製法（精製の一例）＞
上記の方法で合成及び精製した化学式１１で記載される非包接型シクロデキストリン結合インドシアニン化合物は、例えばＤＭＳＯ中では非包接型であるが、水に溶解するとすぐに、包接型である化学式１２で記載の化合物となる。この現象は、１Ｈ
ＮＭＲで確認することができる。
【００８０】
従って、包接型化合物は水溶液中であれば、包接型化合物として存在し、包接型化合物として用いることができる。又、水溶液中の包接型化合物は、その水溶液の水を除去することにより固体とし、包接型化合物の固体とすることも可能である。
【００８１】
＜７．診断用組成物を投与した生体に対して適用される、生体内動態測定装置及び循環可視化装置＞
・生体内動態測定装置
本装置は本発明の診断用組成物に採用した本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（以下、適宜「本発明化合物」と称することがある）が間質内に移行する程度などの体内動態がＩＣＧと異なることに基づき完成したものである。
【００８２】
つまり、本発明化合物における代謝速度、血液やリンパ液などの循環系から間質への移行速度がＩＣＧとは異なることにより、本発明化合物が間質に取り込まれる割合がＩＣＧに比べて相対的に大きくなっているため、本発明化合物の生体内での動態を分析することにより、生体内における体液移動（生体内動態）の機序を正確に評価することができる。なお、本装置は、測定条件（生体の活動状態、雰囲気温度など）をできるだけ定常状態とすることで生体内動態をより正確に測定できる。
【００８３】
生体内における体液移動の異常の一形態として浮腫の発生がある。ここで、いわゆるスターリングの仮説によると、生体内における体液（水分）移動は、動脈から間質へ、そして間質から静脈へと流れるものと大きく考えられている。
この動脈から静脈に向けての水分移動は、動脈の圧力と間質圧との差に基づき循環系外に向けて流れる水分移動（Ａ）と、静脈の圧力と間質圧との差に基づき循環系内に向けて流れる水分移動（Ｂ）と、間質液の浸透圧と動脈血の浸透圧との差に基づき間質から動脈内に向けて流れる水分移動（Ｃ）と、間質液の浸透圧と静脈血の浸透圧との差に基づき間質から静脈内に向けて流れる水分移動（Ｄ）とから（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）＋（Ｄ）として算出できると考えることができる。
【００８４】
従って、心不全などにより動脈圧と静脈圧との差が小さくなったり、栄養失調により間質液の浸透圧が低くなったりすることにより、水分移動（Ａ）〜（Ｄ）のバランスが崩れて浮腫が生じることとなる。また、糖尿病などのように毛細血管の透過性に異常（物質透過の選択性の異常）を来した場合も水分移動（Ａ）〜（Ｄ）のバランスが崩れて浮腫が生じることとなる。ここで、毛細血管の透過性異常を直接的に評価する簡便な方法がなく、従来、現象としての浮腫の発生は検知できても、浮腫の詳しい発生原因の特定は困難であるという現状があった。
【００８５】
以上の知見より、毛細血管の血管壁における物質透過の異常が生じた場合には、本発明化合物の移行が動脈圧と静脈圧との差の低下や細胞内の浸透圧の低下などにより浮腫が発生する場合と比べて変化することが期待される。そのため、水分移動に相当する量以上（又は以下）の本発明化合物の移行が認められた場合には毛細血管の透過性異常が生じていることが判別できる。毛細血管の透過性に異常が生じていない場合には水分移動の変化に相当する程度だけ本発明化合物の移行の変化が認められるものと考えられるため血管壁に異常が生じた場合と判別可能であるものと考えられる。
【００８６】
特に間質内への移行速度が異なる２種以上の本発明化合物を採用し、それら化合物の生体内動態をそれぞれ測定して比較することにより、毛細血管の透過性の変化の程度を評価することができる可能性がある。つまり、毛細血管の血管壁における透過性に違いのある２種以上の本発明化合物を採用してその透過性を測定することにより、血管壁での透過性異常の発生の有無を更に正確に評価することが可能になる。すなわち、血管壁の透過性異常に対して異なる感受性をもつ２種以上の本発明化合物を採用してその体内動態を測定することで水分移動の変動の要因を更に正確に評価することが可能になる。なお、本発明化合物による水分移動の評価に加えて常法により水分移動を測定することもできる。
【００８７】
本発明の生体内動態測定装置は励起光照射手段と蛍光強度測定手段と生体内動態算出手段とその他の手段とを有する。その他の手段は必要に応じて選択され、例えば蛍光強度測定手段により測定された蛍光強度からシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の濃度を算出する生体内濃度算出手段がある。
本装置は上述した本発明の診断用組成物を投与した生体の少なくとも一部について測定を行う装置である。診断用組成物の投与量としては測定する部位において励起光を照射した際に蛍光が観測可能な量とする。従って、測定部位に応じて適正量は変化する。診断用組成物に含まれる本発明化合物の種類としては特に限定しない。本発明化合物は１種類で用いることもできるし、２種類以上混合して用いることもできる。また、測定の途中に同一又は異なる組成をもつ診断用組成物を追加して投与することもできる。
【００８８】
励起光照射手段は投与された診断用組成物に含有されている本発明化合物に蛍光を生じることができる波長の励起光を照射する手段である。照射する励起光の波長は適正な範囲に制限することができる。できるだけ狭い範囲の波長に制限することにより蛍光と励起光との分離を確実に行うことができる。波長の制限は、光源として適正な波長をもつ光を発するものを選択したり、フィルタにより波長を制限したりすることができる。
【００８９】
励起光の照射の態様は発生する蛍光が後述する蛍光強度測定手段により測定可能であれば特に限定しない。例えば、励起光としては連続したもの、パルス状のもの、強度が変化するものなどが挙げられる。強度を変化させる場合には励起光のパルスを所定間隔で照射するなど励起光の強度を変調することができる。励起光の変調は、パルス振幅変調を採用して励起光の強度を変調することが望ましい。
【００９０】
励起光は適正な光学系により、照射すべき部位に照射される。照射すべき部位は生体内動態の測定を欲する部位であり、例えば浮腫が発生している部位について評価したい場合には浮腫が発生している部位に直接励起光を照射することが望ましい。
励起光を照射する範囲としては特に限定しない。必要に応じて照射する範囲を決定する。狭い範囲に照射すると、照射された狭い部分において細分化された生体内動態を精密に測定できる。広い範囲に照射すると、励起光を照射されて蛍光を発することとなる本発明化合物の相対的な量が増えるため蛍光強度を更に精密に測定することができる。
【００９１】
更に、励起光照射手段による励起光の照射は環境光の影響を抑制した状態で行うことが好ましい。例えば、暗所にて励起光を照射したり、励起光を照射する部分を外光から覆った状態で励起光を照射したりすることが好ましい。
蛍光強度測定手段は励起光照射手段によって励起光を照射する部位から発せられる蛍光の強度を測定する手段である。蛍光強度の測定は、発せられる蛍光を選択的に透過できるフィルタを介して行うことで蛍光以外の光（環境光、励起光など）を除外して測定することが好ましい。
【００９２】
励起光照射手段として強度を変調した励起光を照射する手段を採用する場合は、測定された光の強度からその変調に対応した変化を示す成分を分離して蛍光強度とすることができる。例えば、励起光の強度をパルス振幅変調にて変調する場合には、変調されたパルスの強度に応じて変化する光の成分を復調してその強度を測定することで蛍光強度を分離することができる。そのため、環境光が蛍光強度の測定結果に与える影響を低減できる。
【００９３】
生体内濃度算出手段は、蛍光強度測定手段が測定した蛍光強度に基づいて本発明化合物の生体内濃度を算出する手段である。蛍光強度と本発明化合物の生体内濃度との関係は適正な方法にて算出することができる。例えば、検量線を予め作成し、その検量線に基づいて本発明化合物の生体内濃度を算出することができる。また、蛍光強度の絶対値をそのまま本発明化合物の生体内濃度に関連する値として用いることもできる。生体内濃度算出手段は、本発明化合物の生体内濃度を経時的に算出する。
【００９４】
生体内動態算出手段は、生体内濃度算出手段により経時的に取得された本発明化合物の生体内濃度のデータからその生体内濃度の時間変化率の経時変化を求める手段である。生体内動態算出手段は求めた生体内濃度の時間変化率から本発明化合物が生体の一部において循環系から間質内に移行する速度及び間質から循環系に移行する速度を算出する。生体内濃度を用いずに蛍光強度測定手段から経時的に得られる蛍光強度の変化から直接間質内外への移行速度を算出しても良い。
【００９５】
ここで、間質内（外）への本発明化合物の移行と体液中の水分移動とは高い相関性をもつことが推測されるため、本発明化合物の体内動態を測定することで測定部位における水分移動の様子を評価することができる。更に、血管壁に異常が生じ物質の透過性が正常でなくなった場合には本発明化合物の生体内での動態が変化するものと考えられるため、本発明化合物の動態を評価することにより血管の透過性の評価を行うことができる。
【００９６】
蛍光強度（又は生体内濃度）の時間変化率は蛍光強度（又は生体内濃度）の経時変化を時間で微分して求めたり、所定時間毎の蛍光強度（又は生体内濃度）を算出して所定時間前（所定時間後）の蛍光強度（又は生体内濃度）との差として求めたりすることができる。
【００９７】
求めた蛍光強度（又は生体濃度）の時間変化率から本発明化合物がその生体の一部における間質液中に取り込まれる速度、排出される速度を算出する。ここで、間質液中に取り込まれる速度、排出される速度は蛍光強度から相対的な値として求ることが可能であり、より精密に求める場合には、間質内における本発明化合物の濃度及び間質液の量に基づき算出できる。それに加えて血液やリンパ液における本発明化合物の濃度及びその量を考慮することにより更に精密に算出できる。血液などにおける本発明化合物の濃度は実際に血液を採取することで精度良く測定可能である。
【００９８】
間質液中の濃度を算出する方法としては以下の方法が例示できる。第１の方法としては、算出した本発明化合物の生体内濃度）は、そのままその生体の一部における間質液中における濃度であると近似する方法がある。第１の方法に関連する方法として間質液の量を考慮して間質液中の濃度を算出することもできる。第２の方法としては、実際に血液中に存在する本発明化合物の濃度を測定した上で、間質に移行しない他の標準物質（ＩＣＧなど）を用いるなどの手法によって血管内に存在する物質が蛍光強度測定手段により測定された測定値に寄与する割合を算出し、実測した血液中の本発明化合物の濃度が与える影響を除くことで間質液中の濃度を算出する方法も考えられる。
【００９９】
間質液中における本発明化合物の濃度の時間変化率は間質内への移行速度から間質外への移行速度を引くことで算出できる。ここで、間質内（外）への本発明化合物の移行が体液中の水分移動速度に相関する速度で進行すると仮定し、且つ、その水分移動が平衡に達していると仮定できる場合に、間質内への移行速度と間質外への移行速度は定数と見なすことができるため、本発明化合物の血液中における濃度変化（代謝、排出、組織への移行などによる変化）と間質液中の濃度の時間変化率の推移とから、それらの移行速度を算出することができる。また、それらの移行速度が変化する場合であっても、その変化に相当するモデルを作成して当てはめることにより、それらの移行速度を算出することができる。
算出された移行速度が正常な血管壁が示す値の範囲より外れている場合には血管壁に異常が生じていることが推測できる。なお、血管壁に異常が生じた結果、本発明化合物の透過性は向上する場合も低下する場合も両方ありうる。
【０１００】
ここで、急性炎症、阻血、外傷といった様々な組織障害により組織が急性に腫脹することはよく知られた事実であり、領域を問わず医療の現場においては極めて重要な組織反応である。
例えば、純粋に腫脹の発生自体が問題になる場合の他、手術時などにおいて腸管などの縫合の評価、肺炎等の炎症の程度の評価、臓器移植における適合性の評価、脳，腎臓などにおける機能不全の評価など、全臓器に関連する事項である。
【０１０１】
しかし、現時点では組織の腫脹の可能性や程度を正確に予測する手段はなく、組織障害の程度から経験的に予測されているのみである。この為殆どのケースでは腫脹の発生を確認してから対応を検討せざるを得ず、大きな治療上の制約となっている。
早期に高い精度を持って腫脹の可能性を予測できれば、腫脹を軽減する処置を早期に施すことで影響を最小限に抑えられることになる。たとえば脳出血直後にその後発生する脳浮腫の程度を正確に予測ができれば早期に減圧処置や血管透過性を低める対策をとることでその影響を最小限にとどめることができる。同様に虚血ストレスによる影響を事前に予測できれば心筋梗塞や四肢外傷などによる2次性の障害を最小限にとどめることも可能となる。このように腫脹の高精度定量的予測という技術は医療全般に対して少なからぬインパクトを与える可能性を秘めている。
【０１０２】
浮腫を含む組織の腫脹の定量化はこれまでは外観より定性的に判定してきた。定量化も試みられているが、適応はごく限られた状況でのみ可能であり、また、腫脹が生じた後でのみ評価可能であるという欠点があった。
このような問題に対して、本発明の生体内動態測定装置を用いることにより、間質内外の水分移行速度を算出することで腫脹の進行を予測することができる。実施例にて詳述するようにＩＣＧは腫脹の進行時には間質への移行はしないことが分かっている。それに対して本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物は間質内外の移行が可能であり、間質内への移行は、腫脹の進行時には水分の移行に伴い、更に促進されることが分かっている。そのため、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の間質内への移行を評価することで腫脹の進行を予測することができる。
【０１０３】
つまり、最終的にどの程度の大きさの腫脹が形成されるかは間質内外への水分の移行速度に影響を受けるものと推測されるため、水分の移行速度に関連がある本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の移行速度を評価することで最終的な腫脹の進行の程度まで評価することができる。移行速度は、シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の濃度を算出して行うこともできるし、蛍光強度をそのまま用いて算出しても良い。また、間質内外への移行速度は絶対的な値として算出することができるのは勿論、相対的な値（例えば蛍光強度の変化率をそのまま移行速度に関連する値として採用しても良い）として算出し、その値に応じた腫脹の進行を予測することもできる。
【０１０４】
腫脹の進行は腫脹が進行していない平常時の間質内への移行速度を基準として算出することが望ましい。しかしながら、平常時の間質内への移行速度が分からない場合もあるので、その場合には腫脹が進行していない部位を対照部位として選定し、その部位における移行速度を求めることで代用できる。また、間質内に移行しないＩＣＧを用いて血液の循環量と代謝の程度とを評価して、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の間質内への移行の程度を評価しても良い。
【０１０５】
本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物が間質内に移行する程度を測定するのは、生体内に本発明の診断用組成物を投与してから所定時間経過以降に行う。所定時間とは本発明の診断用組成物が血液中に分布するまでに要する時間である。所定時間経過以降のデータを用いて評価を行う理由としては、診断用組成物を投与した後、所定時間をかけて血液中に分布するまでは腫脹の進行の程度には殆ど影響を受けずに速やかに血中濃度が上昇するため、腫脹の進行の有無によらず殆ど蛍光強度の変化の様子に差異が生じないためである。一旦、血中に分布した後は間質内に移行する速度が腫脹の進行の有無により変化するため、移行が進行する部位（すなわち腫脹が進行する部位）において選択的に蛍光強度の向上が認められることになる。
【０１０６】
具体的な腫脹進行の推定方法の例としては、体重などから血液量を推定し、推定された血液量から蛍光強度のピークの大きさ、ピークに至るまでの時間を算出する。その時間、強度を考慮して浮腫の発生に伴い変化するであろう時間における蛍光強度を測定し、その結果ら浮腫の進行の程度、及び、将来発生するであろう浮腫の程度を推測する方法が挙げられる。
【０１０７】
・循環可視化装置
本装置は本発明の診断用組成物に採用した本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（以下、適宜「本発明化合物」と称することがある）が間質内に移行する程度などの体内動態がＩＣＧと異なることに基づき完成したものである。
【０１０８】
つまり、本発明化合物は間質液中に移行しやすく、本発明化合物の挙動を追跡することによって、血液やリンパ液の循環の様子を可視化することが可能になる。
本発明の循環可視化装置は励起光照射手段と蛍光イメージング手段と形態イメージング手段と表示手段とを有する。本装置は上述した本発明の診断用組成物を投与した生体の少なくとも一部について測定を行う装置である。診断用組成物の投与量としては測定する部位において励起光を照射した際に蛍光が観測可能な量とする。従って、測定部位に応じて適正量は変化する。診断用組成物に含まれる本発明化合物の種類としては特に限定しない。本発明化合物は１種類で用いることもできるし、２種類以上混合して用いることもできる。また、測定の途中に同一又は異なる組成をもつ診断用組成物を追加して投与することもできる。
【０１０９】
励起光照射手段は投与された診断用組成物に含有されている本発明化合物に蛍光を生じることができる波長の励起光を照射する手段である。照射する励起光の波長は適正な範囲に制限することができる。できるだけ狭い範囲の波長に制限することにより蛍光と励起光との分離を確実に行うことができる。波長の制限は、光源として適正な波長をもつ光を発するものを選択したり、フィルタにより波長を制限したりすることができる。
【０１１０】
励起光の照射の態様は発生する蛍光が後述する蛍光イメージング手段により測定可能であれば特に限定しない。例えば、励起光としては連続したもの、パルス状のもの、強度が変化するものなどが挙げられる。強度を変化させる場合には励起光のパルスを所定間隔で照射するなど励起光の強度を変調することができる。励起光の変調は、パルス振幅変調を採用して励起光の強度を変調することが望ましい。
【０１１１】
励起光は適正な光学系により、照射すべき部位に照射される。照射すべき部位は生体において循環の様子の可視化を欲する部位であり、例えば、熱傷や、凍傷、炎症、創傷、梗塞などによる組織の壊死が進行している部位及びその周辺である。組織における壊死した部分には血液が循環しておらず、そのまま放置しても有利なことが無い場合が殆どであるため、除去することが考えられる。その場合、壊死部分と正常部分とのうちの壊死部分のみを完全に除去することが理想である。
従来、壊死部分の特定は、造影剤を投与して行う血管造影法や血液循環定価に伴う体温低下を検知する方法などにより行われていたが、血管造影法はＸ線照射装置などの装置の取り扱いが容易でなかったり、体温により判断する方法は正確な判断を行うことは容易でなかったりする問題があった。
【０１１２】
本発明装置では壊死部分と正常部分とを体液（血液）の循環の有無にて評価する用途に用いることができる。循環がない部分が可視化できればその部分を除去することは容易である。壊死部分の可視化の他にも血液の循環を直接観察できるため、循環機能に生じた異常の発生を簡単に判別することが可能になる。例えば、壊死には至ってはいないものの、梗塞などが発生して循環機能が低下している部分を可視化することができる。
【０１１３】
励起光を照射する範囲としては循環の可視化を欲する部分を含むように必要に応じて照射する範囲を決定する。
更に、励起光照射手段による励起光の照射は環境光の影響を抑制した状態で行うことが好ましい。例えば、暗所にて励起光を照射したり、励起光を照射する部分を外光から覆った状態で励起光を照射したりすることが好ましい。
【０１１４】
蛍光イメージング手段は励起光照射手段により励起された本発明化合物が発する蛍光の強度を二次元的に取得して本発明化合物の生体内における分布状態データを得る手段である。つまり、本手段は生体の一部について本発明化合物の分布の様子を二次元の画像データとして表している分布状態データとして取得するための手段である。
例えば、適正な光学系と、ＣＣＤなどの撮像素子との組み合わせにより構成できる。二次元的に取得するデータの解像度としては目的に応じて必要な値に設定される。蛍光強度の測定は、発せられる蛍光を選択的に透過できるフィルタを介して行うことで蛍光以外の光（環境光、励起光など）を除外して測定することが好ましい。
【０１１５】
励起光照射手段として強度を変調した励起光を照射する手段を採用する場合は、測定された光の強度からその変調に対応した変化を示す成分を分離して蛍光強度とすることができる。例えば、励起光の強度をパルス振幅変調にて変調する場合には、変調されたパルスの強度に応じて変化する光の成分を復調してその強度を測定することで蛍光強度を分離することができる。そのため、環境光が蛍光強度の測定結果に与える影響を低減できる。
形態イメージング手段は本発明化合物が発する蛍光波長以外の波長の光の強度を二次元的に取得して生体の一部についての形態データを得る手段である。つまり、本手段は生体の一部についてその形態を二次元の画像データとして表している形態データとして取得するための手段である。
【０１１６】
形態イメージング手段としては適正な光学系とＣＣＤなどの撮像素子とにより構成することができる。二次元的に取得するデータの解像度としては目的に応じて必要な値に設定される。その場合に励起光により発する蛍光は検出しない（又は検出感度を低くする）ようにする。形態イメージング手段は前述の蛍光イメージング手段と光学系の殆どを共用した上で、最終的に撮像素子に導入する前の光路において分光プリズムなどにより蛍光に対応する波長の光を蛍光イメージング手段に導き、その他の波長の光を形態イメージング手段に導く構成を採用することができる。分光プリズムはダイクロイック膜などを適正に形成することにより分離する光の波長を適正に制御することができる。
【０１１７】
更に、蛍光イメージング手段と形態イメージング手段とは１つの撮像装置にて共用することができる。つまり、蛍光とその他の光との分離は二次元の画像データにした後に数学的に分離するものであっても良い。更に、分布状態データは生体の一部の表面から深さ方向に向けて複数の画像データとして得ることもできる。蛍光イメージング手段に採用した光学系における焦点を深さ方向に移動させることで深さ方向における二次元の画像データを複数得ることができる。また、励起光照射手段として光学系に焦点距離を変更できるものを採用して生体の一部の表面ではなく深さ方向内部に焦点を移動させたり、励起光を細く絞って生体の一部に照射するなどすることで生体の表面のみではなく生体の深さ方向内部において選択的に蛍光を発生することもでき、その部分の循環の様子を可視化することができる。
【０１１８】
表示手段は形態イメージング手段により得られた形態データに蛍光イメージング手段により得られた分布状態データを重ね合わせて表示することにより、生体の一部における本発明化合物の分布状態を表示する手段である。蛍光の波長が可視光の範囲にない場合には蛍光の波長を適正な波長の可視光に変換して表示する。分布状態データの表示は形態データよりも優先して表示することが循環の可視化の観点からは望ましい。特に、本発明化合物の分布量（すなわち蛍光強度）が低い部分（低いか否かは、循環を可視化する目的に応じて決定する。例えば、壊死部分を可視化する目的においては、循環していない部分、すなわち蛍光が認められない部分である）を他の部分と判別可能に表示する。例えば、その部分を他の部分と異なる色で表示したり、点滅させて表示したりすることができる。分布状態データと形態データとの重ね合わせはコンピュータ上のロジックなどにより実現可能である。二次元データの表示は一般的なディスプレイ装置により実現可能である。このディスプレイ装置は生体と測定者との間に設置することによりディスプレイ装置を見ながら生体に対して処置を行うことも可能である。
【０１１９】
＜８．定義等＞
本発明において、「アルキル基」とは、置換基を有していてもよい炭素数１個〜２０個の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基をいい、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルなどの直鎖の基、又は分岐状に結合した基をいう。
【０１２０】
本発明において、「アルコキシル基」とは、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、メチキシエトキシ、メトキシプロポキシ、エトキシエトキシ、エトキシプロポキシ、メトキシエトキシエトキシ基などの炭素数１個〜２０個のアルコキシル基が直鎖上に又は分岐状に結合したものなどを挙げることができる。
本発明において、「アリール基」とは、フェニル、ナフチルなどの炭素数６〜２０個の芳香族炭化水素を挙げることができる。
【実施例】
【０１２１】
以下に本発明の好適な一実施の形態を実施例によって具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の実施形態によって限定されるものでなく、本発明の範囲で様々に改変して実施することができる。【０１２２】
＜試験１：化学式１５及び化学式１６で示される化合物の合成及び精製＞
化学式１３で示される化合物０．２０ｇ、化学式１４で示される化合物０．９４ｇ、ＷＳＣ０．１８ｇ、ＨＯＢｔ０．１２ｇ、ピリジン４．０ｍＬ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２．０ｍＬの混合物を０℃、暗所において６時間撹拌した。その後、アセトン５０ｍＬを加え、析出物を減圧濾過し、析出物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。溶出液に１ｍＭ塩酸を含む水及びメタノールの混合液を使用し、化学式１５で示される化合物を溶出した。溶出液を減圧濃縮し緑色固体の化学式１６で示される包接型化合物０．６５ｇを得た（溶出液の減圧濃縮では、濃縮の最後は水の含有量が高いので自然と包接型となる）。【０１２３】
【化１５】
2011093098.tif 000016
【０１２４】
【化１６】
2011093098.tif 000017
【０１２５】
次に、化学式１６で示される目的物の機器分析データを示す。1H NMR (500 MHz, D2O, 26 ℃, Acetone: 2.10 ppm) 1.43 (2H, m), 1.55 (2H, m), 1.99 (6H, s), 2.09 (6H, s), 2.63 (6H, m), 2.80 (6H, m), 2.92 (2H, m), 3.02 (2H, dd,  J = 3.7, 9.8 Hz), 3.08 (2H, t,
J = 9.2 Hz), 3.2-4.1 (m), 4.19 (2H, t, J = 9.8 Hz), 4.26 (2H, t, J = 9.8 Hz), 4.33 (2H, m), 4.43 (2H, m), 4.71 (2H, d, J = 2.4 Hz), 4.81 (4H, d, J = 3.7 Hz), 4.91 (2H, d, J = 3.7 Hz), 4.99 (2H, d, J = 3.7 Hz), 5.08 (2H, d, J = 3.7 Hz), 5.13 (2H, d, J = 3.1 Hz), 6.15 (2H, d, J = 13 Hz), 6.52 (2H, t, J = 12 Hz), 7.43 (4H, m), 7.57 (1H, d, J = 12 Hz), 7.57 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.78 (2H, m), 8.06 (3H, m), 8.15 (2H, d, J = 8.5 Hz).ESI-MS m/z calcd for C131H191N4O722972,
found 2973 [M]+. 【０１２６】
＜試験２：化学式１９及び化学式２０で示される化合物の合成及び精製＞
化学式１７で示される化合物０．１７ｇ、メタノール５ｍＬ、ｔ−ＢｕＯＫ０．３０ｇの混合物を室温で１２時間撹拌した。その後、１Ｍ塩酸３ｍＬを加え、さらに水５０ｍＬを加えた。析出物をろ過し、析出体を水で洗浄した後、減圧乾燥し化学式１８で示される化合物０．１７ｇを得た。【０１２７】
【化１７】
2011093098.tif 000018
【０１２８】
【化１８】
2011093098.tif 000019
【０１２９】
化学式１８で示される化合物０．０２ｇ、化学式１４で示される化合物０．０８１ｇ、ＷＳＣ０．０１６ｇ、ＨＯＢｔ０．０１１ｇ、ピリジン０．３ｍＬ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド０．２ｍＬの混合物を０℃、暗所において６時間撹拌した。その後、アセトン５ｍＬを加え、析出物を減圧濾過し、析出物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。溶出液に１ｍＭ塩酸を含む水及びメタノールの混合液を使用し、化学式１９で示される化合物を溶出した。溶出液を減圧濃縮し緑色固体の化学式２０で示される包接型化合物０．０４５ｇを得た。（溶出液の減圧濃縮では、濃縮の最後は水の含有量が高いので自然と包接型となる。）【０１３０】
【化１９】
2011093098.tif 000020
【０１３１】
【化２０】
2011093098.tif 000021
【０１３２】
次に、化学式２０で示される目的物の機器分析データを示す。1H NMR (500 MHz, D2O, 40 ℃, Acetone: 2.26 ppm) 1.54 (2H, m), 1.68 (2H, m), 1.98 (2H, m), 2.19 (6H, s), 2.20 (2H, m), 2.30 (6H, s), 2.6-2.85 (10H, m), 2.95 (2H, m), 3.00 (4H, m), 3.08 (2H, t, J = 12
Hz), 3.17 (2H, dd, J = 3.7, 9.8 Hz), 3.26 (2H, t, J = 9.8 Hz), 3.35-4.30 (m), 4.35 (2H, t, J = 9.2 Hz), 4.50 (2H, t, J =9.2 H), 4.52 (2H, m), 4.63 (2H, m), 4.87 (2H, d,
J = 3.7 Hz), 4.95 (d, J = 3.1 Hz), 4.97 (2H, d, J = 3.7 Hz), 5.08 (2H, d, J = 3.7 Hz), 5.15 (2H, d, J = 4.3 Hz), 5.25 (2H, d, J = 3.7 Hz), 5.29 (2H, d, J = 3.7 Hz), 6.30 (2H, d, J = 14.6 Hz), 7.58 (4H, m), 7.73 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.95 (2H, m), 8.25 (2H, m), 8.32 (2H, d, J = 14.6 Hz), 8.35 (2H, d, J = 8.5 Hz).ESI-MS m/z calcd for C135H197N4O733042,
found 3042 [M]+.【０１３３】
＜試験３：化学式２１で示される化合物の合成及び精製＞
化学式１３で示される化合物０．０４ｇ、モノ-6-アミノ-6-デオキシ-β−シクロデキストリン０．１８ｇ、ＷＳＣ０．０５ｇ、ＨＯＢｔ０．０２５ｇ、ピリジン０．８ｍＬ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド０．４ｍＬの混合物を０℃、暗所において３時間撹拌した。その後、アセトン１０ｍＬを加え、析出物を減圧濾過し、析出物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。溶出液に１ｍＭ塩酸を含む水及びメタノールの混合液を使用し、化学式２１で示される化合物を溶出した。溶出液を減圧濃縮し緑色固体の化学式２１で示される化合物０．１１ｇを得た。【０１３４】
【化２１】
2011093098.tif 000022
【０１３５】
次に、化学式２１で示される目的物の機器分析データを示す。1H NMR (500 MHz, D2O,
29 ℃,
Acetone: 2.10 ppm) 1.79 (12H, br.), 2.68 (4H, br.), 3.0-4.5 (98H), 4.4 (4H, br.), 4.5-5.3 (14H, br.), 6.18 (2H, br.), 6.46 (2H, br.), 7.3-8.2 (15H).ESI-MS m/z calcd for C125H179N4O702856,
found 2856 [M]+. 【０１３６】
＜試験４：化学式２３で示される化合物の合成及び精製＞
化学式２２で示される化合物０．０２ｇ、モノ-6-アミノ-6-デオキシ-β−シクロデキストリン０．０９６ｇ、ＷＳＣ０．０３２ｇ、ピリジン０．５ｍＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液０．０５ｍＬの混合物を室温、暗所において２４時間撹拌した。その後、アセトン１０ｍＬを加え、析出物を減圧濾過し、析出物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。溶出液に水及びアセトニトリルの混合液を使用し、化学式２３で示される化合物を溶出した。溶出液を減圧濃縮し緑色固体の化学式２３で示される化合物０．０１４ｇを得た。【０１３７】
【化２２】
2011093098.tif 000023
【０１３８】
【化２３】
2011093098.tif 000024
【０１３９】
次に、化学式２３で示される目的物の機器分析データを示す。1H NMR (500 MHz, D2O,
26 ℃,
Acetone: 2.15 ppm) 1.26 (4H, m), 1.5-2.25 (24H, br), 2.7-4.2 (88H), 4.82 (2H, br), 4.90 (8H, br), 4.97 (2H, br), 5.03 (2H, br), 6.11 (2H, br), 6.36 (2H, br), 7.3-8.01 (15H, br).ESI-MS m/z calcd for C131H191N4O702940,
found 2940 [M]+.【０１４０】
＜試験５：化学式２４で示される化合物の合成及び精製＞
化学式２２で示される化合物０．２０ｇ、3-アミノ-3-デオキシ-β−シクロデキストリン０．０２ｇ、ＷＳＣ０．０９６ｇ、ＨＯＢｔ０．０１３ｇ、ピリジン０．４ｍＬ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド０．２ｍＬの混合物を室温、暗所において１時間撹拌した。その後、アセトン１０ｍＬを加え、析出物を減圧濾過し、析出物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。溶出液に水及びメタノールの混合液を使用し、化学式２４で示される化合物を溶出した。溶出液を減圧濃縮し緑色固体の化学式２４で示される化合物０．０１３ｇを得た。【０１４１】
【化２４】
2011093098.tif 000025
【０１４２】
次に、化学式２４で示される目的物の機器分析データを示す。1H NMR (500 MHz, D2O,
29 ℃,
Acetone: 2.10 ppm) 1.1-2.5 (28H), 3.0-4.25 (88H), 4.5-5.2 (14H), 7.3-8.02(15H).ESI-MS m/z calcd for C131H191N4O702940,
found 2940 [M]+. 【０１４３】
＜試験６：化学式２５で示される化合物の合成及び精製＞
化学式２２で示される化合物０．０２ｇ、化学式１４で示される化合物０．１ｇ、ＷＳＣ０．０３２ｇ、ピリジン０．５ｍＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液０．０５ｍＬの混合物を室温、暗所において２４時間撹拌した。その後、アセトン１０ｍＬを加え、析出物を減圧濾過し、析出物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。溶出液に水及びメタノールの混合液を使用し、化学式２５で示される化合物を溶出した。溶出液を減圧濃縮し緑色固体の化学式２５で示される化合物０．０２１ｇを得た。【０１４４】
【化２５】
2011093098.tif 000026
【０１４５】
次に、化学式２５で示される目的物の機器分析データを示す。1H NMR (500 MHz, D2O,
25 ℃,
Acetone: 2.10 ppm) 1.0-2.5 (32H), 3.0-4.5 (96H), 4.8-5.2 (14H), 6.09 (2H,br), 6.37 (2H, br), 7.3-8.02 (15H, br).ESI-MS m/z calcd for C137H203N4O723056,
found 3056 [M]+. 【０１４６】
＜試験７：本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の溶解性＞
ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）の水及び生理食塩水への溶解性試験を行った。水及び生理食塩水を用いたMolecular Probe社の粉末状のＩＣＧの溶解には１分間ほどの激しい振動撹拌が必要であるが、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物、特に化学式１６及び化学式２０で示される化合物では振動撹拌は不要であり速やかに溶解した。【０１４７】
＜試験８：本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物のヒトの皮膚への吸着性＞
ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）のヒトの皮膚への吸着性試験を行った。ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）のそれぞれの１ｍＭ水溶液（０．０３ｍＬ）を腕にのせ、５分後に水洗し、さらに擦って水洗した。その結果、ＩＣＧは水洗では完全に洗えなかったが、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物、特に化学式１６及び化学式２０で示される化合物は容易に水洗でき、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物のヒトの皮膚への吸着性は、ＩＣＧよりはるかに低いことが示された（図１）。【０１４８】
＜試験９：本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物のセルロース繊維への吸着性＞
ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）のセルロース繊維への吸着性試験を行った。セルロース繊維のモデルとして綿棒（株式会社三洋）を用い、ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）のそれぞれの１ｍＭ水溶液０．０５ｍＬを塗布し、３分後に流水（水道水、１Ｌ／ｍｉｎ）で５秒間水洗した。その結果、ＩＣＧは水洗では完全に洗えなかったが、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物、特に化学式１６及び化学式２０で示される化合物は容易に水洗でき、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物で示される化合物のセルロース繊維への吸着性は、ＩＣＧよりはるかに低いことが示された（図２）。【０１４９】
＜試験１０：本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の生体の肉モデルへの吸着性＞
ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）の生体の肉モデルへの吸着性試験を行った。生体の肉モデルとして市販の豚ロース肉を用い、豚ロース肉に直径５ｍｍの凹を作り、ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）のそれぞれの１ｍＭ水溶液０．０５ｍＬを塗布し、３分後に流水（水道水、１Ｌ／ｍｉｎ）で１０秒間水洗した。その結果、ＩＣＧは水洗では完全に洗えなかったが、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物、特に化学式１６及び化学式２０で示される化合物は容易に水洗でき、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の生体の肉モデルへの吸着性は、ＩＣＧよりはるかに低いことが示された（図３）。【０１５０】
＜試験１１：本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の生体のタンパク質モデルへの吸着性＞
ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）の生体のタンパク質モデルへの吸着性試験を行った。生体のタンパク質モデルとして市販の鶏ささみ肉を用い、鶏ささみ肉に直径５ｍｍの凹を作り、ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）のそれぞれの１ｍＭ水溶液０．０５ｍＬを塗布し、３分後に流水（水道水、１Ｌ／ｍｉｎ）で１０秒間水洗した。その結果、ＩＣＧは水洗では完全に洗えなかったが、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物、特に化学式１６及び化学式２０で示される化合物は容易に水洗でき、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の生体のタンパク質モデルへの吸着性は、ＩＣＧよりはるかに低いことが示された（図４）。【０１５１】
＜試験１２：本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の疎水性化学繊維への吸着性＞
ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）の疎水性化学繊維への吸着性試験を行った。疎水性化学繊維のモデルとしてポリプロピレンマスク（玉川衛材株式会社）を用い、ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）のそれぞれの１ｍＭ水溶液０．０５ｍＬを塗布し、２０分放置後（サンプルの水分が有るとマスクに付着しないため、水分を除去するために２０分放置）に流水（水道水、１Ｌ／ｍｉｎ）で１秒間水洗した。その結果、ＩＣＧは水洗では完全に洗えなかったが、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物、特に化学式１６及び化学式２０で示される化合物は容易に水洗でき、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の疎水性化学繊維への吸着性は、ＩＣＧよりはるかに低いことが示された（図５）。【０１５２】
＜試験１３：本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の水溶液中での分子会合性＞
ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）の水溶液中での分子会合性について検討した。ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）の０．０１ｍＭ、０．０２５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ水溶液をそれぞれ調整し、光路長１ｍｍの石英セルに入れ、２５℃で６００ｎｍから１０００ｎｍの光吸収スペクトルを測定した。その結果、ＩＣＧはこの濃度範囲においてH-aggregationとよばれる分子会合が生じたが（図６左図）、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物、特に化学式１６及び化学式２０で示される化合物はこの濃度範囲においてH-aggregationとよばれる分子会合は生じないことが示された（図６右図）。【０１５３】
＜試験１４：本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の水溶液中での蛍光性＞
ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）の水溶液中での蛍光性について検討した。ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）のそれぞれの０．１μＭ水溶液を２５℃で１ｃｍ角石英セルに入れ、７２０ｎｍの励起光（バンドパス：１０ｎｍ）で励起し、蛍光スペクトル（バンドパス：１０ｎｍ）を測定した。蛍光効率は、ＩＣＧの蛍光効率０．１３（ｉｎ
ＤＭＳＯ、２５℃）をもとに算出した。その結果、ＩＣＧの蛍光量子効率は０．０２１であり、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物、特に化学式１６及び化学式２０で示される化合物の蛍光量子効率は０．０５４及び０．０４２であり、蛍光量子効率はＩＣＧの２．６倍と２倍であった。【０１５４】
＜試験１５：本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の血液中での蛍光性＞
ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）の血液中での蛍光性について検討した。ＩＣＧ及び本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物（化学式１６，２０，２１，２３乃至２５）のそれぞれを１００μＭになるように血液（人）中に溶解させた。それらの血液を２５℃で三角石英セルに入れ、７６０ｎｍの励起光（バンドパス：１０ｎｍ）で励起し、表面蛍光スペクトル（バンドパス：１０ｎｍ）を測定した。極大蛍光波長における蛍光強度は、ＩＣＧは５８（任意単位）であった。本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物、特に化学式１６及び化学式２０で示される化合物の蛍光強度は２７０（任意単位）及び１９０（任意単位）であり、ＩＣＧの４．７倍と３．３倍であった。これは本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物が生体内において、発光を阻害されないためであると考えられた。【０１５５】
＜試験１６：本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の生体内での挙動について＞
代表例として、化学式１９および２０で示される異性化平衡化合物（ＴＫ１）と化学式１５および１６で示される異性化平衡化合物（ＴＫ２）とについて、生体対象物としてのヒト血液およびラット体内での挙動を評価した。【０１５６】
・ヒト血液中での蛍光挙動
ＩＣＧ，ＴＫ１、及びＴＫ２について、三角セル中におけるヒト静脈血中における表面蛍光強度の濃度依存性について評価を行った。具体的には、三角石英セルにヒト静脈血液1.0 mLをいれ、ＩＣＧ，ＴＫ１、及びＴＫ２を所定の濃度加えた。25℃で760 nm（バンドパス：10 nm）の励起光を照射し、表面蛍光（バンドパス：10 nm）を測定した。結果を図７に示す。【０１５７】
図７から明らかなように、ＴＫ１、及びＴＫ２はいずれもヒト静脈血中において励起光の照射により蛍光を発することが分かった。
・ラット体内への投与可能性の検討
ＩＣＧ，ＴＫ１，及びＴＫ２のそれぞれについて濃度1ｍＭの水溶液を調製し、それぞれについて０．１ｍＬずつ、開腹したラットの大腿静脈を露出して注射した。その後、７６０ｎｍの励起光を開腹部に照射して蛍光の有無を評価した。【０１５８】
その結果、開腹部における内臓からの蛍光が観察された。ＴＫ１及びＴＫ２は腎臓への集積が高いこと（既知のごとくＩＣＧは肝臓に集積が高い）が観察された。また、これらの投与によるラットへの重篤な影響は認められず、比較的安全に生体内に投与できる可能性が認められた。
・ラット体内での分布の観察
Wistar雄ラット（９週齢、体重は350ｇ）をエーテル麻酔後、ネンブタール０．１ｍＬ２６Ｇ針で腹腔内投与にて麻酔した。ラットの尾付け根をゴム帯で駆血し、24Ｇサーフロ針で尾静脈を確保して、3方活栓と延長チューブを装着して末梢ラインを確保した。ラットを平面な台上に仰臥位に固定した（図８）。浜松ホトニクス製のＰＤＥカメラユニットをラットの体から１６cmの位置に正確に設置した。ただし全身を広範囲に撮影する場合は２０cmとした。観察範囲は図８における黒丸で示した程度の範囲となった。その後、確保しておいた末梢ラインより、濃度１ｍＭで、ＩＣＧ並びにＴＫ１、及びＴＫ２を投与した。投与量は０．１ｍＬとした。投与２０分後に開腹した際の腹腔内における蛍光の様子を図９に、足背部における蛍光の様子（最高輝度になった時点での画像）を図１２に示す。【０１５９】
図９は、ＩＣＧが主に肝臓（図９（ａ））、ＴＫ１は主に腎臓（図９（ｂ））、ＴＫ２も主に腎臓（図９（ｃ））に集積していることを示している。投与直後から内臓の近赤外撮像を行うと、腎臓、尿管、膀胱を鮮明に撮像できることが示された(図１０)。また、近赤外内視鏡で尿管の撮像が可能であることが示された（図１１）。
撮像図１２より明らかなように、足背部においては血流の流れに応じて蛍光を発する様子が明らかになった。なお、図には示さないが、ラットの右大腿動脈結紮による下肢虚血モデルついて、ＩＣＧ、ＴＫ１、及びＴＫ２を同様に投与して蛍光を観察したところ、虚血部分においては蛍光が認められず、蛍光の有無を頼りに血流の程度を評価することができることが分かった。【０１６０】
ここで、足背部における蛍光強度の時間変化を図１３及び図１４に示す。また、最大蛍光強度値(Imax)に達する時間、Imax値、Imax値の半分になった時間(t1/2)を表１に示す。【０１６１】
【表１】
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【０１６２】
表１、図１３、及び図１４より明らかなように、ＴＫ１及びＴＫ２は、最大蛍光強度値に達する時間、半減する時間共に、ＩＣＧと比較して長いことが分かった。つまり、長時間体内において蛍光を発することができることが分かった。例えば、ＩＣＧでは投与後１０分足らずで蛍光強度が初期値程度にまで低下しているのに対して、投与後１時間経過後であっても、ＴＫ１及びＴＫ２は高い蛍光強度を示すことが分かった。
・血管レベルでの観察【０１６３】
非特許文献７及び８に開示の方法（図１５）により、ラットの血管を直接露出させて観察した状態でＩＣＧ、ＴＫ１を投与した。露出後の精巣挙筋皮弁の様子を図１６に示す。血管を露出した状態でＩＣＧ、ＴＫ１を投与して観察を行った。その結果、ＩＣＧはＴＫ１と比べて血管内に偏在しているように見えた。つまり、ＴＫ１は血管から間質液中に移行していることが分かった。より精密な検討を行うため、投与後の血管の顕微鏡写真を図１７（ＩＣＧ）及び図１８（ＴＫ１）に示す。図１７及び１８から明らかなように、血管における蛍光強度とその周辺の組織における蛍光強度とをそれぞれ比較すると、ＩＣＧでは間質内では殆ど蛍光が認められなかったのに対して、ＴＫ１では間質内での蛍光が認められた。また、詳細は示さないが、間質内での蛍光強度の経時的な増加が認められた。従って、ＩＣＧでは血管から間質液中への移行は殆ど認められないのに対して、ＴＫ１では血管から間質液中への移行が認められることが分かった。【０１６４】
・本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物が間質内に移行する程度と浮腫形成の大きさとの関連の評価
（評価方法）
ラット（雄、Wister rat）10週齢約350gを試験動物として選択した（ｎ=4）。ラットにイソフルレンで全身麻酔を導入し、左後足蹠に0.5％λカラゲニン０．１ｍＬを26G針で注射する。結果、速やかに足浮腫が出現した。15分後ラット足蹠容積測定器（室町機械株式会社製：MK-101CMP PLETHYSMOMETER）にてラットの左足容積を測定した。【０１６５】
その後イソフルレンをoffにしラットの覚醒を確認した。Von Frey testを行った後、イソフルレンで再度全身麻酔を導入する。ラット尾静脈を24Gサーフロ針で確保した後、仰臥位とし水平な台の上に固定する。浜松ホトニクス社製PDEカメラを設置し、ラットの足背から16ｃｍの高さに合わせ固定した。【０１６６】
ＰＤＥカメラにて測定する部位（ＲＯＩ）を足背中央部に設定し消灯した。計測をスタートした後、１ｍｍｏｌＴＫ１水溶液０．１ｍＬを尾静脈より注入し、１ｍＬの生理食塩水にて5秒かけてフラッシュした。注入より最初の５分間は連続で撮影しＲＯＩにおける輝度を計測した。以後は5分間隔で1分間輝度を計測し注入後120分に至るまで継続した。計測終了後、イソフルレンをoffとし覚醒させケージに戻した（急性炎症実験）。【０１６７】
7日後、ラットのVon Frey
testを行った後速やかにラットにイソフルランで全身麻酔を導入しラット足蹠容積測定器にてラットの左足容積を測定した。ラット尾静脈を24Gサーフロ針で確保した後、仰臥位とし水平な台の上に固定した。浜松ホトニクス社製PDEカメラを設置し、ラットの足背から１６ｃｍ高さに合わせ固定し、ROIを足背中央部に設定、消灯の後計測をスタートした。１ｍｍｏｌＴＫ１水溶液０．１ｍＬを尾静脈より注入し、１ｍＬの生理食塩水にて5秒かけてフラッシュした。注入より最初の５分間は連続で撮影しＲＯＩにおける輝度を計測した。以後は5分間隔で1分間輝度を計測し注入後120分に至るまで継続した。計測終了後、イソフルレンをoffとし覚醒させケージに戻した。λカラゲニンを注射しない群についても同様に試験を行った。
以上の過程をICGでも同様に行った。【０１６８】
（結果）
結果を図１９〜２６に示す。ＴＫ１を投与した群について測定したラットの左足容積を図１９（縦軸は上方に行くほど体積大）に、Von Frey testの結果を図２０（縦軸は下方に行くほど痛覚過敏）に、注射直後の輝度の変化の様子を図２１（縦軸は上方に行くほど輝度大）に、カラゲニン注射後１週間経過後の輝度の変化の様子を図２３（縦軸は上方に行くほど輝度大）に示す。ＩＣＧを投与した群について測定したラットの左足容積を図２３（縦軸は上方に行くほど体積大）に、Von Frey testの結果を図２４（縦軸は下方に行くほど痛覚過敏）に、注射直後の輝度の変化の様子を図２５（縦軸は上方に行くほど輝度大）に、カラゲニン注射後１週間経過後の輝度の変化の様子を図２６（縦軸は上方に行くほど輝度大）に示す。全てのグラフの縦軸の値は任意単位である。【０１６９】
ＩＣＧとＴＫ１の間にはＲＯＩにおける輝度の変化パターンに大きな差異を認めた。ＩＣＧでは投与後短時間で急速に増強した輝度はその後速やかに減少に転じ、約10分でベースラインにまで低下した。これに対し、ＴＫ１では投与後早期の輝度の増強はICGと同様の軌跡を示したが、その後輝度は高止まりし、ベースラインにまで回復するには6時間を要した。この結果から我々はＩＣＧは間質に漏れ出すことなく血管内に留まり、この為急峻な輝度の増強とその後の急速な減衰はＲＯＩに分布する血管内の通過によるものと考えた。これに対し、ＴＫ１では当初の急速な血管内の通過を反映する部分(以後「血管相」と称する。)とその後徐々に間質に漏れ出したＴＫ１が蛍光を発している相（以下「間質相」と称する）の2つのフェーズを反映するものと考えられる。血管相から間質相に移行する時間が所定時間に対応する。【０１７０】
急性炎症実験ではＴＫ１、ＩＣＧ両群において、ラット足容積はλカラゲニン注射後で著明な容積増加を認めたが、1週間後腱側と同等まで正常化した（図１９、２３）。またＴＫ１、ＩＣＧ両群においてVon Frey testはλカラゲニン注射後で著明な痛覚過敏を認め、1週間後腱側と同等まで正常化した（図２０、２４）。
足背の輝度において、TK1群は血管相での輝度変化の状況はコントロール群との間で差を認めなかったが、間質相ではλカラニゲン投与群でより早い輝度の増加を認め、評価時間を通じて高い値を保つことが認められた
(図２１)。λカラニゲン投与による炎症が消腿した投与1週間後においてはカラゲニン投与側と健側の間に間質相の輝度変化には差を認めなかった(図２２)。図２１のグラフに明瞭に示されているように間質相における輝度の推移はなめらかな曲線を描いて推移し、その山の高さは間質相の立ち上がりの変化率に依存していることが分かる。言い換えると間質相の値の変化は時系列解析により高い精度で予測可能であることを示しており、我々の作業仮説を立証する重要な根拠を示している。【０１７１】
ＩＣＧ群ではλカラゲニン注射直後も1週間後も輝度に差を認めなかった(図２５、図２６)。この結果は従来臨床応用されている疎水性の高いＩＣＧではλカラニゲンによるような高度の急性炎症が存在しても血管外への蛍光物質の漏出は起こらないことを示すことが分かった。
以上の結果から、ＴＫ１を生体に投与した後、間質相に相当する期間について、腫脹の進行を予測した部位の蛍光強度を経時的に測定することで、その後の蛍光強度の推移が予測可能であり、その蛍光強度の推移がその部位における腫脹の進行に関連することが明らかになった。従ってＴＫ１は、ＩＣＧを用いては行うことができない腫脹の予測に用いることができることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
本発明の化学式１又は化学式２で示されるシクロデキストリン結合インドシアニン化合物によれば、ＩＣＧに比べて、水あるいは生理食塩水での溶解性が高く、生体組織からの除去が容易であり、水溶液中での分子会合が低く、水溶液中での近赤外蛍光強度が高く、ヨードを含まないことを特徴とする緑色色素で近赤外蛍光を発する化合物を提供できる。又、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の合成法によれば、シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の有用な合成を提供することができる。又、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物の精製法によれば、シクロデキストリン結合インドシアニン化合物の有用な精製を提供することができる。更に、本発明のシクロデキストリン結合インドシアニン化合物は、ヨウ素を含有しなくても充分な溶解性を示すため、ヨード過敏症の原因ともなるヨウ素を含有しない診断用組成物を提供することもできる。この診断用組成物は従来のＩＣＧのみを含有する診断用組成物とは異なる体内挙動を示すため、その性質を利用して種々の有益な診断法および診断装置を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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