(57)【要約】  有用細胞の分離工程、分離工程で分離された有用細胞の培養工程及び培養工程で培養された細胞の洗浄・濃縮工程の全てを一貫して行う、大掛かりな設備によらない簡素な構成の閉鎖系システムを実現し、操作性を向上しながら、安全性及び品質の高い有用細胞の調製を可能にすることを目的とする。  液体流入口（Ｌin）及び液体排出口（Ｌout）を有する細胞培養容器（ＣＣ）と、液体流入口（Ｌin）に接続された、細胞培養に用いる細胞を分離させるための細胞分離キット（Ａ）と、液体排出口（Ｌout）に接続された、細胞培養容器（ＣＣ）で培養された細胞を洗浄濃縮するための細胞回収キット（Ｂ）とを含む細胞培養用ディスポセットを用い、このディスポセットの管路の適宜位置に配設された流路開閉弁及びポンプと、これらを制御する制御装置とにより細胞培養装置を構成する。【選択図】図１
2012002497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体流入口及び液体排出口を有する細胞培養容器と、
前記液体流入口に接続された、細胞培養に用いる細胞を分離させるための細胞分離キットと、
前記液体排出口に接続された、前記細胞培養容器で培養された細胞を洗浄濃縮するための細胞回収キットと、
を含むことを特徴とする細胞培養用ディスポセット。
【請求項２】
前記細胞分離キットが、細胞を含む被処理液から細胞を選択的に捕捉する細胞分離材を含むものである請求項１に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項３】
前記細胞分離キットが、
細胞を含む被処理液から細胞を選択的に捕捉する細胞分離材を収容した細胞分離フィルターと、
前記細胞分離フィルターの上流側に第１管路により接続された、細胞を含む被処理液を収容した被処理液槽と、
前記細胞分離フィルターの下流側に第２管路により接続された廃液槽と、
前記第２管路の途中から分岐した管路により接続された、細胞回収液を導入するための第１細胞回収液導入部と、
前記第１管路の途中から分岐し、前記細胞培養容器の液体流入口に接続された第３管路と、
により構成される請求項１又は２に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項４】
前記第１細胞回収液導入部から前記細胞分離フィルターに導入された前記細胞回収液により回収された細胞を一旦貯留するための細胞貯留バッグを、前記第１管路の前記第３管路よりも上流側位置から分岐した管路に接続してなる請求項３に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項５】
前記被処理液槽が、前記第１細胞回収液導入部から前記細胞分離フィルターに導入された前記細胞回収液により回収された細胞を一旦貯留する細胞貯留バッグを兼ねている請求項３に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項６】
前記細胞分離フィルターは、細胞医療又は再生医療に有用な細胞と夾雑細胞とを含む被処理液を通液して夾雑細胞を実質的に通過させることより細胞医療又は再生医療に有用な細胞を実質的に捕捉し、前記被処理液を通液させた方向とは逆方向へ前記細胞回収液を通液することにより捕捉された細胞が回収される請求項３〜５の何れか１項に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項７】
前記第１細胞回収液導入部が前記細胞回収液を収容したシリンジであり、前記シリンジのプランジャーが気体圧で駆動する外部押圧ユニットにより押圧されて前記細胞分離フィルターに対する前記細胞回収液の供給が行われる請求項３〜６の何れか１項に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項８】
洗浄液を収容した洗浄液槽を前記細胞分離フィルターの上流側に管路により接続してなる請求項３〜７の何れか１項に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項９】
培地を収容した培地槽及び細胞剥離剤を含む細胞剥離液を収容した細胞剥離液槽の少なくともどちらかを、前記第３管路の途中から分岐した管路により接続してなる請求項３〜８の何れか１項に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項１０】
前記細胞回収キットが、培養した細胞を捕捉して夾雑物を通過させる細胞回収材を含むものである請求項１〜９の何れか１項に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項１１】
前記細胞回収キットが、培養した細胞を捕捉して夾雑物を通過させる細胞回収材を収容した細胞回収フィルターと、
前記細胞培養容器の液体排出口と前記細胞回収フィルターの上流側に接続された第４管路と、
前記細胞回収フィルターの下流側に第５管路により接続された廃液槽と、
前記第５管路の途中から分岐した管路により接続された、細胞回収液を導入するための第２細胞回収液導入部と、
前記第４管路の途中から分岐した管路により接続された、前記第２細胞回収液導入部から前記細胞回収フィルターに導入された前記細胞回収液により回収された細胞を回収するための細胞回収槽と、
により構成される請求項１〜１０の何れか１項に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項１２】
前記第４管路の途中に、細胞の凝集塊を除去するための細胞濾過フィルターを介在させてなる請求項１１に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項１３】
前記細胞回収フィルターは、前記細胞培養容器にて培養された細胞を含む細胞懸濁液を通液して培養された細胞を捕捉し、前記細胞懸濁液を通液させた方向とは逆方向へ前記細胞回収液を通液することにより捕捉された細胞が回収される請求項１１又は１２に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項１４】
前記第２細胞回収液導入部が前記細胞回収液を収容したシリンジであり、前記シリンジのプランジャーが気体圧で駆動する外部押圧ユニットにより押圧されて前記細胞回収フィルターに対する前記細胞回収液の供給が行われる請求項１１〜１３の何れか１項に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項１５】
洗浄液を収容した洗浄液槽を前記細胞回収フィルターの上流側に管路により接続してなる請求項１１〜１４の何れか１項に記載の細胞培養用ディスポセット。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか１項に記載の細胞培養用ディスポセットを用い、この細胞培養用ディスポセットの管路の適宜箇所に配設された、前記管路を押し挟んでその流路を開閉する流路開閉弁及び前記管路を順次押圧するポンプと、前記流路開閉弁の開閉制御及び前記ポンプの駆動制御を行う制御装置とを備えたことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１７】
請求項７又１４に記載の細胞培養用ディスポセットを用い、この細胞培養用ディスポセットの管路の適宜箇所に配設された、前記管路を押し挟んでその流路を開閉する流路開閉弁及び前記管路を順次押圧するポンプと、前記シリンジのプランジャーを押圧する圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットと、前記流路開閉弁の開閉制御及び前記ポンプの駆動制御並びに前記外部押圧ユニットの駆動制御を行う制御装置とを備えてなることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１８】
前記圧力気体の供給源が、圧力気体を収容したボンベである請求項１７に記載の細胞培養装置。
【請求項１９】
前記圧力気体が二酸化炭素である請求項１８に記載の細胞培養装置。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の細胞培養装置を用いて、
播種する有用細胞の分離工程と、
前記分離工程で分離された有用細胞の培養工程と、
前記培養工程で培養された細胞の洗浄・濃縮工程と、
を閉鎖系で一貫して行うことを特徴とする細胞調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用細胞の分離工程、分離した有用細胞の培養工程及び培養した細胞の洗浄・濃縮工程の全てを一貫して行うための、細胞培養用ディスポセット（disposable set）、細胞培養装置及び細胞調製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者本人又は提供者の体液や組織から細胞を採取し、それらを培養にて増幅・加工して患部へ移植する治療、いわゆる再生医療・細胞医療が注目を集めている。再生医療・細胞医療においては、多くの場合、体液や組織から採取した細胞群の中から治療に用いられる有用な細胞を分離した後に、培養による細胞増幅が実施される。培養して得られた細胞は、皮膚、骨、軟骨、角膜等への移植が行なわれ、これら一部の疾患においてその安全性と有効性が示されており、患者に有益な治療方法として、普及が待望されている（例えば、非特許文献１参照。）。【０００３】
骨髄液、臍帯血等の中には、骨、軟骨、筋肉、脂肪等多様な細胞に分化し得る性質を持った付着性の成体幹細胞が存在することが近年明らかになってきている（例えば、非特許文献２〜４参照。）。成体幹細胞は多種多様な細胞、臓器に分化し得る能力を有しているので、成体幹細胞を効率良く分離・増幅させる方法は再生医療発展の見地から極めて重要である。現在、成体幹細胞の分離は、フィコールパック分画法（例えば、非特許文献５参照。）等の密度勾配遠心法が主流であるが、当該方法は、分離液と細胞を分けるために遠心分離器を使用して細胞を繰り返し洗浄するという煩雑な操作が必要であり、さらに、遠心操作による細胞へのダメージや、開放系での操作によるコンタミネーションの危険を伴っている。【０００４】
また、分離した成体幹細胞は、骨髄液の有核細胞中に成人で１０4から１０6個に１つという非常に存在頻度が少ないことが報告されており（例えば、非特許文献５参照。）、治療に必要な数まで培養にて増殖させる必要がある。現在、成体幹細胞の増幅は、シャーレやフラスコ、あるいは培養バッグや培養用カートリッジ等を使用して、ＣＯ2インキュベーター内において３７℃の温度環境下で培養するのが一般的である。この場合、培地交換や継代作業は人が実施するために、これらの操作を行なう度にコンタミネーションのリスクや作業時間を要する。【０００５】
そこで、近年、細胞の播種、培地交換等の培養操作を自動的に実施し、ほとんど人手のかからない自動培養装置が開発されている（例えば、特許文献１〜３参照。）。しかしながら、現在の自動培養装置が搭載するのは、必要な細胞を自動で培養する機能のみであり、必要な細胞を体液、あるいは組織中から分離するという機能は搭載されていない。
また、目的とする細胞を所定数まで増殖させた後は、トリプシン等の酵素処理や、２価カチオンキレート剤等の処理を行い、細胞を培養容器から剥離し、剥離された細胞はこれら酵素液とともに回収されるため、トリプシン等の酵素や２価カチオンキレート剤を除去する作業を別途行なう必要がある。
現在、最も一般的な細胞の洗浄方法として遠心分離法がある。本方法は、遠心分離操作により細胞を沈殿させ、上清を除去後、新しい洗浄液を加えて細胞を再懸濁し、再度遠心分離操作を行なうという方法であり、本操作を数回繰り返すことにより細胞の洗浄を行っている。しかしながら、その操作の煩雑さ、閉鎖系での分離操作が容易でないこと等、細胞洗浄工程におけるコンタミネーションのリスクが指摘されている。【０００６】
また、培養した細胞を不織布等の分離材を使用して捕捉し、洗浄後細胞を回収する方法があるが（例えば、特許文献４参照。）、遠心分離法と同様、このような技術は単独で使用するものであり、特定細胞の分離、培養、回収を１つの装置で実施できるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−３４４１２８号公報
【特許文献２】特開２００４−０８９０９５号公報
【特許文献３】特開２００１−２７５６５９号公報
【特許文献４】特開２００８−０８６２３５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ロバート・ポール・ランザ他著, 大野典也他監訳， 「再生医学〜ティッシュエンジニアリングの基礎から最先端技術まで〜」, 株式会社エヌ・ティー・エス， 2002年
【非特許文献２】Pliard A. et al., "Controlled Conversion of an Immortilized Mesodermal Progenitor Cell Towards Osteogenic, Chondrogenic, or Adipogenic Pathways."， J. Cell Biol. 130(6), pp.1461-72, 1995
【非特許文献３】Mackay A. M. et al., "Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal Stem Cells from Marrow", Tissue Engineering 4(4), pp.414-428, 1998
【非特許文献４】Angele P. et al., "Engineering of Osteochondoral Tissue with Bone Marrow Mesenchymal Progenitor Cells in a Derivatived Hyaluronan Geration Composite Sponge", Tissue Engineering 5(6), pp.545-553, 1999
【非特許文献５】Pittenger et al.， “Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells", Science Vol.284 no.5411, pp.143-147, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のとおり、細胞医療又は再生医療に有用な細胞を調製する場合、（１）播種する有用細胞の分離工程、（２）分離した有用細胞の培養工程、（３）培養した細胞の洗浄・濃縮工程を経る必要があるが、現状では（２）の培養工程のみを行なう自動培養装置があり、他の（１）及び（３）の工程は別工程で処理されており、操作の煩雑さ、コンタミネーションのリスク等が指摘されている。【００１０】
また、特許文献４のような不織布等の分離材を使用して捕捉し、洗浄後細胞を回収する方法において、細胞懸濁液を流した方向とは逆方向から細胞回収液を流して細胞を回収しており、この際に細胞回収液を注入する手段として、ポンプの利用、液体を貯留したバッグを押しつぶす方法、落差による通液、シリンジ等を用いて手動で注入する方法等が考えられる。
しかしながら、捕捉された細胞を回収するためには、細胞を濃縮するという意味からも少量の細胞回収液で一気に回収する必要があり、シリンジやバッグを使用する方法は、手作業に依存し、回収率のばらつきも大きい。また、落差を用いる方法は、流速不足で細胞の回収率が激減する。さらに、ポンプを用いる方法は、シリンジポンプでは流速が不足し、細胞はほとんど回収できず、ローラーポンプでは構造上、立ち上がり時（可動時）の流速が遅く、細胞の回収に必要な圧力に到達する前に所定量の細胞回収液が流れてしまい細胞の回収率が低くなるという問題点がある。
その上、細胞回収液を注入する次のステップとして、回収した細胞をそのままの圧力で培養容器へ送液すると、非常に高い圧力で培養面へ叩きつけられることになり、細胞へのダメージ（分化能の低下、生存性の低下等）が大きく、この点に関しても解決すべき課題が多い。【００１１】
そこで、本発明が前述の状況に鑑み、解決しようとするところは、有用細胞の分離工程、分離した有用細胞の培養工程及び培養した細胞の洗浄・濃縮工程の全てを一貫して行う、大掛かりな設備によらない簡素な構成の閉鎖系システムを実現し、操作性を向上しながら、安全性及び品質の高い有用細胞の調製が可能になる、細胞培養用ディスポセット、細胞培養装置及び細胞調製方法を提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る細胞培養用ディスポセットは、前記課題解決のために、液体流入口及び液体排出口を有する細胞培養容器と、前記液体流入口に接続された、細胞培養に用いる細胞を分離させるための細胞分離キットと、前記液体排出口に接続された、前記細胞培養容器で培養された細胞を洗浄濃縮するための細胞回収キットとを含むことを特徴とする。【００１３】
ここで、前記細胞分離キットが、細胞を含む被処理液から細胞を選択的に捕捉する細胞分離材を含むものであると好ましく、前記細胞回収キットが、培養した細胞を捕捉して夾雑物を通過させる細胞回収材を含むものであると好ましい。【００１４】
また、前記細胞分離キットが、細胞を含む被処理液から細胞を選択的に捕捉する細胞分離材を収容した細胞分離フィルターと、前記細胞分離フィルターの上流側に第１管路により接続された、細胞を含む被処理液を収容した被処理液槽と、前記細胞分離フィルターの下流側に第２管路により接続された廃液槽と、前記第２管路の途中から分岐した管路により接続された、細胞回収液を導入するための第１細胞回収液導入部と、前記第１管路の途中から分岐し、前記細胞培養容器の液体流入口に接続された第３管路とにより構成されると好ましい。【００１５】
さらに、前記第１細胞回収液導入部から前記細胞分離フィルターに導入された前記細胞回収液により回収された細胞を一旦貯留するための細胞貯留バッグを、前記第１管路の前記第３管路よりも上流側位置から分岐した管路に接続してなると好ましい。【００１６】
さらにまた、前記被処理液槽が、前記第１細胞回収液導入部から前記細胞分離フィルターに導入された前記細胞回収液により回収された細胞を一旦貯留する細胞貯留バッグを兼ねていると好ましい。【００１７】
また、前記細胞分離フィルターは、細胞医療又は再生医療に有用な細胞と夾雑細胞とを含む被処理液を通液して夾雑細胞を実質的に通過させることより細胞医療又は再生医療に有用な細胞を実質的に捕捉し、前記被処理液を通液させた方向とは逆方向へ前記細胞回収液を通液することにより捕捉された細胞が回収されると好ましい。【００１８】
さらに、前記第１細胞回収液導入部が前記細胞回収液を収容したシリンジであり、前記シリンジのプランジャーが気体圧で駆動する外部押圧ユニットにより押圧されて前記細胞分離フィルターに対する前記細胞回収液の供給が行われると好ましい。【００１９】
さらにまた、洗浄液を収容した洗浄液槽を前記細胞分離フィルターの上流側に管路により接続してなると好ましい。【００２０】
また、培地を収容した培地槽及び細胞剥離剤を含む細胞剥離液を収容した細胞剥離液槽の少なくともどちらかを、前記第３管路の途中から分岐した管路により接続してなると好ましい。【００２１】
さらに、前記細胞回収キットが、培養した細胞を捕捉して夾雑物を通過させる細胞回収材を収容した細胞回収フィルターと、前記細胞培養容器の液体排出口と前記細胞回収フィルターの上流側に接続された第４管路と、前記細胞回収フィルターの下流側に第５管路により接続された廃液槽と、前記第５管路の途中から分岐した管路により接続された、細胞回収液を導入するための第２細胞回収液導入部と、前記第４管路の途中から分岐した管路により接続された、前記第２細胞回収液導入部から前記細胞回収フィルターに導入された細胞回収液により回収された細胞を回収するための細胞回収槽とにより構成されると好ましい。【００２２】
さらにまた、前記第４管路の途中に、細胞の凝集塊を除去するための細胞濾過フィルターを介在させてなると好ましく、洗浄液を収容した洗浄液槽を前記細胞回収フィルターの上流側に管路により接続してなると好ましい。【００２３】
また、前記細胞回収フィルターは、前記細胞培養容器にて培養された細胞を含む細胞懸濁液を通液して培養された細胞を捕捉し、前記細胞懸濁液を通液させた方向とは逆方向へ前記細胞回収液を通液することにより捕捉された細胞が回収されると好ましい。【００２４】
さらに、前記第２細胞回収液導入部が前記細胞回収液を収容したシリンジであり、前記シリンジのプランジャーが気体圧で駆動する外部押圧ユニットにより押圧されて前記細胞回収フィルターに対する前記細胞回収液の供給が行われると好ましい。【００２５】
本発明に係る細胞培養装置は、前記課題解決のために、前記細胞培養用ディスポセットを用い、この細胞培養用ディスポセットの管路の適宜箇所に配設された、前記管路を押し挟んでその流路を開閉する流路開閉弁及び前記管路を順次押圧するポンプと、前記流路開閉弁の開閉制御及び前記ポンプの駆動制御を行う制御装置とを備えたことを特徴とする。【００２６】
また、本発明に係る細胞培養装置は、前記課題解決のために、前記第１細胞回収液導入部又は前記第２細胞回収液導入部が前記細胞回収液を収容したシリンジである前記細胞培養用ディスポセットを用い、この細胞培養用ディスポセットの管路の適宜箇所に配設された、前記管路を押し挟んでその流路を開閉する流路開閉弁及び前記管路を順次押圧するポンプと、前記シリンジのプランジャーを押圧する圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットと、前記流路開閉弁の開閉制御及び前記ポンプの駆動制御並びに前記外部押圧ユニットの駆動制御を行う制御装置とを備えてなることを特徴とする。【００２７】
ここで、前記圧力気体の供給源が、圧力気体を収容したボンベであると好ましく、前記圧力気体が二酸化炭素であるとさらに好ましい。【００２８】
本発明に係る細胞調製方法は、前記課題解決のために、前記細胞培養装置を用いて、播種する有用細胞の分離工程と、前記分離工程で分離された有用細胞の培養工程と、前記培養工程で培養された細胞の洗浄・濃縮工程とを閉鎖系で一貫して行うことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２９】
以上のように、本発明に係る細胞培養用ディスポセット、細胞培養装置及び細胞調製方法によれば、有用細胞の分離工程、分離工程で分離された有用細胞の培養工程及び培養工程で培養された細胞の洗浄・濃縮工程の全てを一貫して行う、大掛かりな設備によらない簡素な構成の閉鎖系システムが実現され、操作性を向上しながら、安全性及び品質の高い有用細胞の調製が可能になるという顕著な効果を奏する。【００３０】
その上、細胞回収液を細胞分離フィルターに通液して回収した細胞を被処理液槽又は細胞貯留バッグに一旦貯留した後に細胞培養容器へ移送することにより、回収した細胞がそのままの圧力で細胞培養容器へ送液されないため、細胞回収の際の高い圧力による細胞へのダメージを軽減することができる。
その上さらに、第１細胞回収液導入部又は第２細胞回収液導入部が細胞回収液を収容したシリンジであり、シリンジのプランジャーを圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットにより押圧することにより、一般的なローラーポンプと比較して、細胞の回収に必要な圧力に短時間で到達することから比較的少量の細胞回収液で一気に回収することができるため、細胞の回収率が高くなるとともに回収率のばらつきが小さくなる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の実施の形態１に係る細胞培養用ディスポセット及び細胞培養装置を示す概略構成図である。
【図２】圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットにより細胞回収液導入部の駆動を行う例を示す縦断面図であり、（ａ）は駆動前の状態を、（ａ）は駆動完了状態を示している。
【図３】本発明の実施の形態２に係る細胞培養用ディスポセット及び細胞培養装置を示す概略構成図である。
【図４】回収細胞の軟骨形成評価結果（アルシアンブルー染色）を示す図であり、（ａ）は実施例１を、（ｂ）は参考例１を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明でいう細胞を含む被処理液とは、細胞を含む液体であればその物理的、化学的性状について限定されない。具体的には、骨髄液、末梢血（末梢血、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血等を含む）、アフェレーシス産物（濃厚白血球溶液等）、リンパ液、臍帯血、経血、精液等の体液；臓器又は組織等からコラゲナーゼ等の分解酵素処理により生化学的に、あるいは、超音波処理、ホモジナイザー、鋭利な刃物等で物理的に、細胞を分離した処理液；体細胞に遺伝子組み換え等を行い多分化能を付与させた細胞、例えばｉＰＳ細胞等；受精卵から樹立されるＥＳ細胞等；浮遊系の細胞や細胞同士が凝集したスフェロイド状の細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、上記の体液や処理液は、細胞分離フィルターで処理される前に、生理食塩水、リン酸緩衝液等の適当な液体で希釈されてもよく、あるいは、遠心分離等の適当な方法で濃縮されてもよい。濃縮する方法の具体例としては、フィコール、パーコール、リンフォプレップ、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、バクティナーチューブ等を使用する密度勾配遠心法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
本発明における成体幹細胞とは、生体外で任意条件の下培養すると、コロニー（細胞集団）を形成して増殖し、各種分化誘導刺激に応じた多分化能を有する細胞を指す。例としては、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞等が挙げられるが、この限りではない。
本発明における閉鎖系とは、本発明の細胞培養容器内の環境が、該容器外の環境と遮断されており、外部環境の雑菌等に汚染されない状態をいう。なお、空気やＣＯ2等の気体を細胞培養容器内外で交換する場合は、雑菌の進入を阻止する孔径を有したフィルターを設置するのが好ましく、このフィルターの孔径としては、例えば０．４５μｍや０．２２μｍが好ましい。閉鎖系を維持するためには、バッグ、回路や各種フィルター等の各パーツを予め閉鎖系になるように接続しても良いし、各パーツが分かれており、閉鎖系を保つように使用する直前に各パーツを接続できる構造であってもよい。また、本発明の細胞培養容器は滅菌してから使用することが好ましい。滅菌方法としては、高圧蒸気滅菌やエチレンオキサイドガス滅菌、ガンマ線滅菌や電子線滅菌等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
以下の説明における「管路」は、例えばポリ塩化ビニル、ポリウレタン、シリコーン等のチューブであり、これらの分岐又は合流部には適宜コネクタ（ジョイント）が用いられる。
また、以下の説明における「流路開閉弁」は、前記チューブを押し挟んでその流路を開閉するものであり、例えばピンチバルブ又はローラーバルブ等が用いられる。
さらに、以下の説明における「ポンプ」は、前記チューブをローラー等により順次押圧して送液するものであり、例えばローラーポンプ等が用いられる。
さらにまた、流路開閉弁の開閉制御及びポンプの駆動制御は、図示しないプログラマブルコントローラ等の制御装置により行われる。
また、以下の説明において、細胞分離フィルターＳＦに対する被処理液の入口側及び細胞回収フィルターＣＦに対する細胞懸濁液の入口側をそれぞれ「上流側」と言い、細胞分離フィルターＳＦ，細胞回収フィルターＣＦに捕捉されない廃液の出口側をそれぞれ「下流側」と言う。
【００３５】
実施の形態１．
以下、本発明の実施の形態１に係る細胞培養用ディスポセット及び細胞培養装置について、図１の概略構成図を用いて説明する。
細胞培養用ディスポセットは、液体流入口Ｌin及び液体排出口Ｌoutを有する細胞培養容器ＣＣと、液体流入口Ｌinに接続された、細胞培養に用いる細胞を分離させるための細胞分離キットＡと、液体排出口Ｌoutに接続された、細胞培養容器ＣＣで培養された細胞を洗浄濃縮するための細胞回収キットＢとからなり、（１）播種する有用細胞の分離工程、（２）分離した有用細胞の培養工程、（３）培養した細胞の洗浄・濃縮工程の全ての工程が無菌的に処理できるよう閉鎖系で接続されているとともに、使用後は安全性を高めるために廃棄される。
【００３６】
［細胞分離キット］
細胞分離キットＡは、細胞培養に用いる細胞を分離させるためのものであり、本実施の形態では、細胞分離フィルターＳＦ、被処理液槽Ｔ１及び細胞貯留バッグＴ２並びに廃液槽Ｗ１及び第１細胞回収液導入部Ｃ１等により構成される。
すなわち、細胞分離フィルターＳＦの上流側に管路Ｌ１により被処理液槽Ｔ１が接続され、管路Ｌ１の途中から分岐した管路Ｌ１１により細胞貯留バッグＴ２が接続される。
また、細胞分離フィルターＳＦの下流側に管路Ｌ２により廃液槽Ｗ１が接続され、管路Ｌ２の途中から分岐した管路Ｌ２１により第１細胞回収液導入部Ｃ１が接続される。
さらに、管路Ｌ１１よりも下流側で管路Ｌ１の途中から分岐した管路Ｌ３が、細胞培養容器ＣＣの液体流入口Ｌinに接続される。
ここで、被処理液槽Ｔ１は、任意の方法によって調製された細胞を含む被処理液を収容しており、前記被処理液が閉鎖系の環境下で移送されるために、被処理液槽Ｔ１には被処理液の調製手段と無菌的に連結できる注入口が設けられていることが好ましい。
【００３７】
〔細胞分離フィルター〕
細胞分離フィルターＳＦは、細胞を含む被処理液から細胞を選択的に捕捉する機能を有しており、細胞分離フィルターＳＦに収納されている細胞分離材は、細胞を含む被処理液中の白血球及び赤血球を実質的に通過させることが可能であることを特徴とするものである。
ここでいう「細胞を含む被処理液中の白血球及び赤血球を実質的に通過させる」とは、細胞を含む被処理液を細胞分離材に通液した時、被処理液中の白血球の３０％以上、かつ赤血球の８０％以上が細胞分離材に捕捉されることなく通過することを意味する。
目的細胞である成体幹細胞の分離能の点から、より好ましい細胞分離材は、被処理液中の白血球の４５％以上、かつ赤血球の８５％以上を通過させるものであり、さらに好ましくは、被処理液中の白血球の６０％以上、かつ赤血球の９０％以上を通過させるものであり、最も好ましくは被処理液中の白血球の７０％以上、かつ赤血球の９５％以上を通過させるものである。
【００３８】
上記のような白血球及び赤血球の通過率を達成し、さらに成体幹細胞を選択的に捕捉できるものであれば、細胞分離材の物理的、化学的、生化学的性状等は特に限定されるものではないが、その形態、目開き、密度、材質に関しては、具体的には次のようなものが挙げられる。
細胞分離材の形態は、特に限定されるものではないが、細胞を含む被処理液を接触させやすいこと、接触する面積が大きいことから、連通孔構造の多孔質体、繊維の集合体、織物等であることが好ましい。より好ましくは繊維で構成されるものであり、さらに好ましくは繊維の集合体として不織布である。
細胞分離材が繊維又は繊維の集合体で構成される場合、その繊維径は、成体幹細胞の捕捉・回収率の観点から、３〜４０μｍの範囲が好ましい。細胞分離材を構成する繊維の繊維径が３μｍより細いと白血球等の夾雑有核細胞、赤血球及び血小板等の通過率が低くなり、それらの除去効率が低くなる。繊維径が４０μｍより太いと有効接触面積の低下やショートパスが起こりやすくなり、成体幹細胞の捕捉・回収率の低下につながる。成体幹細胞と細胞分離材との相互作用を上げ、収率を上げるためには、繊維径は５〜３５μｍの範囲がより好ましく、さらに好ましくは５〜３０μｍの範囲である。
【００３９】
細胞分離材の目開きは、成体幹細胞の捕捉・回収率の観点から、短径は３μｍ以上で、長径は１２０μｍ以下が好ましい。細胞分離材の目開きの短径が３μｍより小さいと、白血球等の夾雑有核細胞、赤血球及び血小板の除去効率が著しく低下する。細胞分離材の目開きの長径が１２０μｍより大きいと成体幹細胞の捕捉が困難となる。
白血球等の夾雑有核細胞、赤血球及び血小板の除去効率等の観点より、好ましくは、目開きの短径が５μｍ以上、長径が８０μｍ以下であり、白血球等の夾雑有核細胞、赤血球及び血小板の除去効率並びに成体幹細胞の捕捉・回収率等の観点から、さらに好ましくは、目開きの短径が５μｍ以上、長径が７０μｍ以下である。ここでいう目開きとは、細胞分離材を走査型電子顕微鏡にて写真撮影し、異なる２本以上の繊維が交差することにより形成される実質的な孔の長径及び短径を画像解析装置にて５０ポイント以上測定した値の平均値である。
【００４０】
細胞分離材の密度は、白血球等の夾雑有核細胞、赤血球及び血小板の除去効率並びに成体幹細胞の捕捉・回収率の観点から、１．０×１０4〜１．０×１０6ｇ／ｍ3の範囲であることが好ましい。白血球等の夾雑有核細胞、赤血球及び血小板の除去効率の観点から、より好ましくは、２．５×１０4〜７．５×１０5ｇ／ｍ3、さらに好ましくは、５．０×１０4〜５．０×１０5ｇ／ｍ3の範囲である。ここでいう密度とは、細胞分離材の重量（ｇ）をその体積（ｍ3）で除した値である。
細胞分離材の材質は、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン等のポリオレフィン、ポリエステル、ポリブチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル重合体（ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル等）、ナイロン、ポリウレタン、ポリイミド、アラミド、ポリアミド、キュプラ、ケブラー、カーボン、ポリアクリレート、フェノール、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿等の少なくとも１種より選択される材質が好ましく、より好ましくは、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル重合体、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ポリエチレン、ナイロン、ポリウレタン等の少なくとも１種より選択される合成又は半合成の高分子である。
【００４１】
細胞分離材として２種類以上の高分子を組み合わせる場合は、その組み合わせに特に限定はないが、ポリエステル及びポリオレフィン、又はレーヨン及びポリオレフィン、又はポリエステル、レーヨン及びビニロン等からなる組み合わせが挙げられる。２種類以上の高分子を組み合わせる場合の繊維の形態としては、１本の繊維が異成分同士の高分子よりなる繊維、あるいは異成分同士が剥離分割した分割繊維でもよい。
また、成分の異なる高分子単独よりなる繊維をそれぞれ複合化した形態でもよい。ここでいう複合化とは、特に限定はないが２種類以上の繊維が混在した状態より構成される形態、あるいは高分子単独よりなる形態をそれぞれ張り合わせたもの等挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
細胞分離材の性能をより向上させるために、材料の親水化処理を行ってもよい。親水化処理することにより、必要細胞以外の細胞の非特異的な捕捉の抑制、体液を偏りなく細胞分離材中に通過させる等の性能の向上、必要細胞の回収効率の向上等を付与することができる。親水化処理方法としては、水溶性多価アルコール、又は水酸基やカチオン基、アニオン基を有したポリマー、あるいはその共重合体（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、あるいはその共重合体等）を吸着させる方法、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の水溶性高分子物質を吸着させる方法、疎水性膜に親水性高分子を固定化する方法（例えば、表面に親水性モノマーを化学的に結合させる方法等）、細胞分離材に電子線照射する方法、含水状態で細胞分離材に放射線を照射することで親水性高分子を架橋不溶化する方法、細胞分離材を乾燥状態で熱処理することにより、親水性高分子を不溶化し固定化する方法、親水性高分子と水不溶性複合体を形成する成分で細胞分離材を処理する方法、疎水性膜の表面をスルホン化する方法、ポリエチレングリコールやポリビニルピロリドン等の親水性高分子物質と、疎水性ポリマードープとの混合物から膜をつくる方法、アルカリ水溶液（ＮａＯＨ，ＫＯＨ等）処理により膜表面に親水基を付与する方法、疎水性多孔質膜をアルコールに浸漬した後、水溶性ポリマー水溶液で処理、乾燥後、熱処理や放射線等で不溶化処理する方法、界面活性作用を有する物質を吸着させる方法等が挙げられる。
【００４２】
界面活性作用を有する物質として、非イオン性の界面活性剤、レシチン、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、エデト酸ナトリウム、セスキオレイン酸ソルビタン、Ｄ−ソルビトール、デヒドロコール酸、グリセリン、Ｄ−マンニトール、酒石酸、プロピレングリコール、マクロゴール、ラノリンアルコール、メチルセルロース等が挙げられる。非イオン性の界面活性剤としては、多価アルコール脂肪酸エステル系とポリオキシエチレン系とに大別される。多価アルコール脂肪酸エステル系の界面活性剤としては、ステアリン酸グリセリンエステル系、ソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタンアシルエステル等が挙げられる。またポリオキシエチレン系の界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルコールエーテル、ポリオキシエチレンアシルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアシルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等が挙げられる。これらは各々単独、又は組み合わせで用いることができる。また成体幹細胞の細胞分離材への付着性を向上させるために、細胞付着性のタンパク質や成体幹細胞上の発現されている抗原に対する抗体を細胞分離材上に固定化してもよい。
【００４３】
細胞付着性のタンパク質としては、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン等が挙げられる。抗体としては、目的細胞が間葉系幹細胞の場合は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５等に対する抗体が、目的細胞が造血幹細胞の場合は、ＣＤ３４、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１等に対する抗体が、目的細胞が筋芽細胞の場合は、Ｍｙｆ５等に対する抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、例えば細胞接着が起こり難いように表面を親水性処理し、細胞同士を凝集させスフェロイド形成を促進させる等の表面修飾を行なってもよい。さらには、細胞培養容器内に細胞の支持体となるスキャフォールド（scaffold）を共存させて細胞とスキャフォールドとの複合化を促進させる、あるいは予め細胞とスキャフォールドの複合体等を培養に供してもよい。
【００４４】
細胞分離フィルターＳＦは、上記で説明した細胞分離材を収納して成るが、その形態、大きさ、構造材料等に関して特に限定はない。
細胞分離フィルターＳＦの形態は、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態をとりうるが、好ましい具体例としては、例えば、容量０．５〜１０００ｍｌ、直径０．３〜１０ｃｍの透明又は半透明の円柱状容器、あるいは一片の長さ１〜２０ｃｍの正方形あるいは長方形で、厚みが０．１〜５ｃｍの四角柱状の形態等が挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
細胞分離フィルターＳＦは、任意の構造材料を使用して作製することができる。具体的には、非反応性ポリマー、生物親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネート、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。
容器の材料として有用な金属材料は、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、及びそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。容器の材料として特に好ましくは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的には、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。
【００４５】
〔細胞分離フィルターを使用した細胞の分離方法〕
次に、細胞分離フィルターＳＦを使用した細胞の分離方法について説明する。
管路Ｌ１１上の流路開閉弁Ｖ１１、管路Ｌ３上の流路開閉弁Ｖ３及び管路Ｌ２１上の流路開閉弁Ｖ２１を閉にし、管路Ｌ１上の流路開閉弁Ｖ１，Ｖ１３及び管路Ｌ２上の流路開閉弁Ｖ２を開にした状態で、ポンプＰ１を駆動することにより、被処理液槽Ｔ１に収容された細胞を含む被処理液を、管路Ｌ１を通して細胞分離フィルターＳＦに通液する。
ポンプＰ１により通液する場合の流速は、０．１〜１００ｍｌ／ｍｉｎが挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。細胞を含む被処理液を、細胞分離フィルターＳＦに通液後は、夾雑している赤血球等を洗浄するために細胞分離フィルターＳＦの洗浄を行なうことが好ましい。この場合、細胞洗浄液は、生理食塩液、リンゲル液、細胞培養に使用する培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液が挙げられるが、安全面から生理食塩液が好ましい。洗浄は、細胞を含む被処理液を送液したポンプにより通液することができる。この場合の流速は、０．１〜１００ｍｌ／ｍｉｎが挙げられる。洗浄量は、細胞分離フィルターＳＦの容量により異なるが、該フィルター容積の約１〜１００倍の体積で洗浄することが好ましい。
【００４６】
〔細胞分離フィルターに捕捉された細胞の回収方法〕
細胞分離フィルターＳＦ中において細胞は上流側に偏在する可能性が高いため、細胞分離フィルターＳＦの下流側に第１細胞回収液導入部Ｃ１を位置させることが好ましい。そして、第１細胞回収液導入部Ｃ１から細胞分離フィルターＳＦに対して、細胞を含む被処理液を流した方向とは逆方向へ細胞回収液を通液することにより細胞を回収する。
すなわち、流路開閉弁Ｖ１，Ｖ２，Ｖ３を閉にし、流路開閉弁Ｖ１１，Ｖ１３，Ｖ２１を開にして第１細胞回収液導入部Ｃ１から細胞回収液を導入することにより細胞分離フィルターＳＦから回収された細胞は、管路Ｌ１及びＬ１１を経由して細胞貯留バッグＴ２内に貯留される。
あるいは、図１における細胞貯留バッグＴ２を備えない構成として、被処理液槽Ｔ１に細胞を回収するようにしてもよい。
このように、回収した細胞を細胞貯留バッグＴ２又は被処理液槽Ｔ１に回収して、回収した細胞をそのままの圧力で細胞培養容器ＣＣへ送液しないようにすることにより、細胞回収の際の高い圧力による細胞へのダメージを軽減することができる。
【００４７】
細胞回収液の量及び流速は、フィルター容量により異なり、フィルター容積の１〜１００倍量の細胞回収液を、０．５〜２０ｍｌ／ｓｅｃで注入することが好ましいが、これに限定されるものではない。
細胞分離フィルターＳＦに細胞回収液を導入する方法としては、ローラーポンプ等により送液する方法もあるが、図２に示すような圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットＤを用いるのがより好ましいものである。すなわち、第１細胞回収液導入部Ｃ１を細胞回収液を収容したシリンジにより構成し、シリンジの外筒を固定具Ｅに固定し、シリンジのプランジャーを外部押圧ユニットＤである例えばエアシリンダーＤ１のピストンロッドにより押すことにより、図２（ａ）から図２（ｂ）のようにシリンジ内の細胞回収液が管路Ｌ２１内に押し出される。
【００４８】
エアシリンダーＤ１の駆動は、管路Ｌ０から加圧気体（空気、酸素、窒素、二酸化炭素等の気体であり、特に限定されないが、ＣＯ2インキュベーター等に二酸化炭素が使用されていることから、二酸化炭素が好ましい。）を供給するポートＰ１，Ｐ２を流路切換弁Ｄ２により切り換えることにより行うことができ、このような駆動制御は図示しないプログラマブルコントローラ等の制御装置により行われる。
すなわち、加圧気体をポートＰ１に供給することにより図２（ｂ）のようにピストンロッドが突出し、加圧気体をポートＰ２に供給することにより図２（ａ）の状態にピストンロッドが復帰する。
なお、加圧気体の供給源として、加圧気体を収容したボンベを用いることにより、管路Ｌ０への加圧気体の供給が容易になる。特に、加圧気体の供給源を二酸化炭素ボンベにすることにより、二酸化炭素ボンベはＣＯ2インキュベーター等に使用されていることから利用しやすいため、より好ましい実施態様である。
【００４９】
また、シリンジのプランジャーを押圧する際の圧力は、０．０５ＭＰａ〜１ＭＰａが好ましく、細胞の回収率を向上し、かつ細胞へのダメージを軽減する観点から０．１ＭＰａ〜０．７５ＭＰａがより好ましく、安定した高い細胞の回収率、及び細胞の高機能発現という観点から、０．２ＭＰａ〜０．５ＭＰａがさらに好ましい。
一般的なローラーポンプと比較して、圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットＤを用いることにより、細胞の回収に必要な圧力に短時間で到達することから比較的少量の細胞回収液で一気に回収することができるため、細胞の回収率が高くなるとともに回収率のばらつきが小さくなる。
【００５０】
細胞回収液は、等張液であれば特に限定はないが、細胞分離フィルターＳＦから回収された細胞は、引き続き、細胞培養容器ＣＣにおいて培養されることから、細胞回収液として、成体幹細胞を増殖させる機能を有する液体、すなわち成体幹細胞の培地であることが好ましい。この場合の成体幹細胞の培地の具体例としては、Ｄ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＩＭＤＭ（イスコフ改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＣＤＢ１３３培地、ＡＳＦ培地等の培地が挙げられるが、これらに限定されることはない。
また、回収された幹細胞の増殖能や分化能を高めるために、上記の培地に血清、血漿等の生体成分、ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子−β）、インスリン、トランスフェリン、ラミニン、フィブロネクチン等の蛋白性因子、レチノイン酸、アスコルビン酸、各種アミノ酸、各種糖類、５−アザシチジン、２−メルカプトエタノール、亜セレン酸ナトリウム、ハイドロコルチゾン、デキサメサゾン等の低分子物質を加えてもよい。
さらに、幹細胞の培養過程における雑菌汚染を避けるために、上記の液体にカナマイシン、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ポリミキシンB、バンコマイシン、アンホテリシンB等の抗生物質、抗真菌剤を加えてもよい。またこれらの培地には、必要に応じて血清を５〜２０％程度添加しても良い。
【００５１】
〔細胞培養容器、及び回収した細胞の培養方法〕
細胞貯留バッグＴ２又は被処理液槽Ｔ１に貯留された細胞懸濁液は、流路開閉弁Ｖ１３を閉にし、流路開閉弁Ｖ１１又はＶ１及びＶ３を開にしてポンプＰ２を駆動することにより、管路Ｌ１１、Ｌ１及びＬ３又は管路Ｌ１及びＬ３を経由して細胞培養容器ＣＣへ移送される。
細胞培養容器ＣＣとしては、回収された細胞に含まれる成体幹細胞を培養し、その細胞数を増幅することができるものであれば、いかなる器具、装置を用いることができるが、操作が簡便であること、雑菌汚染やクロスコンタミネーション等の危険性が低いことから、細胞培養バッグ、細胞培養カセット、あるいは細胞培養皿を用いることが好ましい。
また、これら構造体の材質は、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、塩化ビニル、ポリエチレン、ポリオレフィン、スチレンブタジエン熱可塑性樹脂等のエラストマー、ポリカーボネート、ポリプロピレン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
細胞培養容器ＣＣの形状は、平面視で円形又は多角形等、特に限定されるものではないが、多くの細胞を培養することができながら省スペース化を図るために、底面積が大きい扁平な形状が好ましい。また、一度に大量の細胞が培養できるように、細胞培養バッグ、細胞培養カセット又は細胞培養皿は、積み重ね合った多段形で使用してもよいし、容器内部が多段に分離されており、一度に多くの細胞が培養できる形態をとってもよい。さらに、細胞培養容器ＣＣへの細胞の播種数は、細胞の種類によっても異なるが、単位培養面積あたり５×１０2〜３×１０4（個／ｃｍ2）が好ましく、細胞の増殖性及び回収率の観点から、より好ましくは、１×１０3〜１×１０4（個／ｃｍ2）である。
【００５３】
〔細胞回収キット］
細胞回収キットＢは、培養された細胞を洗浄濃縮するためのものであり、本実施の形態では、細胞回収フィルターＣＦ、細胞濾過フィルターＲＦ、廃液槽Ｗ２及び第２細胞回収液導入部Ｃ２並びに細胞回収槽Ｔ３等により構成される。
すなわち、細胞培養容器ＣＣの液体排出口Ｌoutに接続された管路Ｌ４が細胞濾過フィルターＲＦを介して細胞回収フィルターＣＦの上流側に接続される。
また、細胞回収フィルターＣＦの下流側に管路Ｌ５により廃液槽Ｗ２が接続され、管路Ｌ５の途中から分岐した管路Ｌ５１により第２細胞回収液導入部Ｃ２が接続される。
さらに、細胞回収フィルターＣＦの上流側に管理Ｌ４から分岐した管路Ｌ６により細胞回収槽Ｔ３が接続される。
【００５４】
〔細胞培養容器からの培養細胞の剥離方法〕
次に細胞培養容器ＣＣからの培養細胞の剥離方法について説明する。
細胞培養容器ＣＣにて所定期間培養した細胞は、トリプシン等の酵素処理やキレート剤処理等により剥離し、管路Ｌ４を介して細胞回収フィルターＣＦに導入する。この際、剥離された細胞は一部で凝集塊を形成し、そのままの状態で細胞回収フィルターに送液すると、フィルターが詰まることが懸念される。
そこで、細胞培養容器ＣＣから細胞回収フィルターＣＦの間に、孔径３０μｍ〜５００μｍ、より好ましくは５０μｍ〜４００μｍの細胞濾過フィルターＲＦを設置し、細胞の凝集塊を除去した後に細胞回収フィルターＣＦに通液を行う。
【００５５】
細胞剥離剤による細胞の処理時間は、目安として１〜１５分間が好ましく、細胞剥離剤が容器全体にわたり均一に広がるように細胞培養容器ＣＣを揺動してもよい。
間葉系幹細胞のように細胞外マトリックスの分泌量が多い細胞では、細胞が例えば培養皿一面に広がってこれ以上増えないコンフルエント（confluent）な状態まで培養を続けると、細胞剥離剤で処理を行なった際にシングル細胞として回収し難く、回収率が低下する可能性がある。また、増殖初期に回収してしまうと、細胞数が少ない可能性が高い。
そこで、細胞を回収する際には、培養面積に対して細胞が占める面積の割合が５０％以上であることが好ましい。また、上述の理由から７０％から９０％の範囲がより好ましいが、本発明はこれに限定されない。細胞剥離剤で剥離した細胞は、全ての細胞を次の細胞回収工程に供してもよいが、一部の細胞を細胞培養容器内に残し、再度培養を継続してもよい。また本操作を数回繰り返すことにより、細胞数の増幅を行なってもよい。
【００５６】
〔細胞回収フィルター〕
細胞回収フィルターＣＦは、その中に収納された細胞回収材により、培養した細胞を捕捉して夾雑物を通過させる機能を有している。ここでいう夾雑物とは、細胞培地に含まれる目的細胞である成体幹細胞以外の細胞や細胞膜断片等の固形物の他、細胞由来の分泌物、細胞培地、細胞剥離時に使用するトリプシン等の酵素、キレート剤等が挙げられる。
細胞回収材の材質は、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン等のポリオレフィン、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル（ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、アクリロニトリル、アクリル酸、アクリル酸エステル等）、ナイロン、ポリウレタン、ポリイミド、アラミド、ポリアミド、キュプラ、ケブラー、カーボン、ポリアクリレート、フェノール、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿等の少なくとも１種類より選択される材質が好ましく、より好ましくは、ポリエステル、ポリスチレン、アクリル、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ポリエチレン、ナイロン、ポリウレタン等の少なくとも１種類より選択される合成高分子である。
【００５７】
細胞回収材として２種類以上の合成高分子を組み合わせる場合は、その組み合わせに特に限定はないが、ポリエステル及びポリオレフィン、又はレーヨン及びポリオレフィン、又はポリエステル、レーヨン及びビニロン等からなる組み合わせが挙げられる。２種類以上の合成高分子を組み合わせる場合の繊維の形態としては、１本の繊維が異成分同士の合成高分子よりなる繊維、あるいは異成分同士が剥離分割した分割繊維でもよい。また成分の異なる合成高分子単独よりなる繊維をそれぞれ複合化した形態でもよい。ここでいう複合化とは、特に限定はないが２種類以上の繊維が混在した状態より構成される形態、あるいは合成高分子単独よりなる形態をそれぞれ張り合わせたもの等挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。また、細胞回収材の形状は、連通孔構造の多孔質体形状でも、繊維の集合体、織物等でも良いが、不織布であることがより好ましい。
細胞回収材の繊維径は、成体幹細胞の回収率から、３〜４０μｍが好ましい。３μｍより細いと白血球との相互作用が高まり、不要細胞の除去効率が低くなる。また４０μｍより太いと有効接触面積の低下やショートパスが起こりやすくなり、成体幹細胞の回収率の低下につながる。成体幹細胞とフィルターとの相互作用を上げ、収率を上げるためには、５〜３５μｍがより好ましい。さらに好ましくは５μｍから３０μｍである。
【００５８】
細胞回収材の目開きは、成体幹細胞の捕捉性から、短径は３μｍ以上で、長径は１２０μｍ以下が好ましい。細胞回収材の目開きの短径が３μｍより小さいと、夾雑物の除去効率が低下する恐れがある。細胞回収材の目開きの長径が１２０μｍより大きいと、成体幹細胞の捕捉が困難となる。
赤血球等の比較的大きな夾雑物の除去効率から、細胞回収材の目開きは、より好ましくは５〜８０μｍであり、成体幹細胞の捕捉性から、さらに好ましくは５〜３０μｍである。ここでいう目開きとは、細胞回収材を走査型電子顕微鏡にて写真撮影し、異なる２本以上の繊維が交差することにより形成される実質的な孔の長径及び短径を画像解析装置にて５０ポイント以上測定した値の平均値である。
【００５９】
細胞回収フィルターＣＦの形態は、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態をとりうるが、好ましい具体例としては、例えば、容量０．１〜１０００ｍｌ、直径０．３〜１５ｃｍの透明又は半透明の円柱状容器、あるいは一片の長さ０．１〜２０ｃｍの正方形あるいは長方形で、厚みが０．１〜５ｃｍの四角柱状の形態等が挙げられる。
また、細胞回収フィルターＣＦは適切な大きさに切断した平板状で体液を処理してもよいし、またロール状に巻いた形状で体液の処理を行ってもよい。ロール状で使用する場合、該ロールの内側から外側に向け体液を処理することにより、必要細胞の捕捉を行ってもよいし、あるいはこの逆に、ロールの外側から内側に体液を流入させ、成体幹細胞の捕捉を行ってもよい。以上、具体例を挙げたが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６０】
〔細胞回収フィルターを使用した培養細胞の洗浄濃縮方法〕
次に細胞回収フィルターＣＦを使用した培養細胞の洗浄濃縮方法について説明する。
所定期間培養後の細胞を剥離するために使用したトリプシン等の酵素やキレート剤等を含む細胞懸濁液は、管路Ｌ６上の流路開閉弁Ｖ６及び管路Ｌ５１上の流路開閉弁Ｖ５１を閉にし、管路Ｌ４上の流路開閉弁Ｖ４及び管路Ｌ５上の流路開閉弁Ｖ５を開にした状態で、ポンプＰ３を駆動することにより、細胞培養容器ＣＣから管路Ｌ４を通して細胞回収フィルターＣＦに送液される。
トリプシン等の酵素やキレート剤等を含む細胞懸濁液を、細胞回収フィルターＣＦに通液した後は、フィルター内に残存しているトリプシン等の酵素やキレート剤等を洗浄するために細胞回収フィルターの洗浄を行なうことが好ましい。
この場合、細胞洗浄液は、生理食塩液、リンゲル液、細胞培養に使用する培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液が挙げられる。洗浄は、トリプシン等の酵素やキレート剤等を含む細胞懸濁液を送液したポンプにより通液することができる。この場合の流速は、０．１〜１００ｍｌ／ｍｉｎが挙げられる。洗浄量は、細胞回収フィルターＣＦの容量により異なるが、該フィルター容積の約１〜１００倍の体積で洗浄することが好ましい。
【００６１】
細胞回収フィルターＣＦ中において細胞は上流側に偏在する可能性が高いため、細胞回収フィルターＣＦの下流側に第２細胞回収液導入部Ｃ２を位置させることが好ましい。そして、第２細胞回収液導入部Ｃ２から細胞回収フィルターＣＦに対して、前記細胞懸濁液を流した方向とは逆方向へ細胞回収液を通液することにより細胞を回収する。
すなわち、流路開閉弁Ｖ４，Ｖ５を閉にし、流路開閉弁Ｖ６，Ｖ５１を開にして第２細胞回収液導入部Ｃ２から細胞回収液を導入することにより細胞回収フィルターＣＦから回収された細胞は、管路Ｌ４，Ｌ６を経由して細胞回収槽Ｔ３内に貯留され、最終産物の細胞を得ることができる。
細胞回収槽Ｔ３としては、いかなる器具を用いることができるが、雑菌汚染やクロスコンタミネーション等の危険性が低いこと、持ち運びが簡便であること等から、バッグ、試験管、チューブ等を用いることが好ましい。またこれら構造体の材質は、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、塩化ビニル、ポリエチレン、ポリオレフィン、スチレンブタジエン熱可塑性樹脂等のエラストマー、ポリカーボネート、ポリプロピレン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
細胞回収液の量及び流速は、フィルター容量により異なり、フィルター容積の１〜５０倍量の細胞回収液を、０．５〜２０ｍｌ／ｓｅｃで注入することが好ましいが、これに限定されるものではない。
細胞回収液は、等張液であれば特に限定はないが、細胞回収フィルターＣＦから回収された細胞は、移植等に使用されるために、生理食塩液やリンゲル液等の医療用途に使用される実績のあるもの、血漿、血清、あるいは生理食塩液やリンゲル液等にアルブミンや血漿、血清を添加した溶液等が好ましい。
細胞回収フィルターＣＦに細胞回収液を導入する方法としては、ローラーポンプ等により送液する方法もあるが、図２に示すような圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットＤを用いるのがより好ましいものである。すなわち、第２細胞回収液導入部Ｃ２を細胞回収液を収容したシリンジにより構成し、シリンジの外筒を固定具Ｅに固定し、シリンジのプランジャーを外部押圧ユニットＤである例えばエアシリンダーＤ１のピストンロッドにより押すことにより、図２（ａ）から図２（ｂ）のようにシリンジ内の細胞回収液が管路Ｌ５１内に押し出される。
【００６３】
エアシリンダーＤ１の駆動は、管路Ｌ０から加圧気体（空気、酸素、窒素、二酸化炭素等の気体であり、特に限定されないが、ＣＯ2インキュベーター等に二酸化炭素が使用されていることから、二酸化炭素が好ましい。）を供給するポートＰ１，Ｐ２を流路切換弁Ｄ２により切り換えることにより行うことができ、このような駆動制御は図示しないプログラマブルコントローラ等の制御装置により行われる。
すなわち、加圧気体をポートＰ１に供給することにより図２（ｂ）のようにピストンロッドが突出し、加圧気体をポートＰ２に供給することにより図２（ａ）の状態にピストンロッドが復帰する。
【００６４】
また、シリンジのプランジャーを押圧する際の圧力は、０．０５ＭＰａ〜１ＭＰａが好ましく、細胞の回収率を向上し、かつ細胞へのダメージを軽減する観点から０．１ＭＰａ〜０．７５ＭＰａがより好ましく、安定した高い細胞の回収率、及び細胞の高機能発現という観点から、０．２ＭＰａ〜０．５ＭＰａがさらに好ましい。
一般的なローラーポンプと比較して、圧力気体を駆動源とした外部押圧ユニットＤを用いることにより、細胞の回収に必要な圧力に短時間で到達することから比較的少量の細胞回収液で一気に回収することができるため、細胞の回収率が高くなるとともに回収率のばらつきが小さくなる。
【００６５】
実施の形態２．
次に、本発明の実施の形態２に係る細胞培養用ディスポセット及び細胞培養装置について、図３の概略構成図を用いて説明する。図３における図１と同一符号は同一又は相当部分を示しているため、以下において、図１と同一符号のものについては詳細説明を省略する場合がある。
本実施の形態は、成体幹細胞を含む被処理液から成体幹細胞を細胞分離フィルターＳＦで分離し、分離した細胞を細胞培養容器ＣＣにて培養した後に、細胞回収フィルターＣＦにより、細胞を酵素やキレート剤等から洗浄し、濃縮した状態で回収する、より好ましい方法を示している。
【００６６】
［細胞分離キット］
実施の形態２の細胞分離キットＡは、実施の形態１の細胞回収バッグＴ２を無くして被処理液槽Ｔ１を細胞回収に併用しており、実施の形態１の細胞分離キットＡに加えて、管路Ｌ１の途中から分岐した管路Ｌ１２により洗浄液槽ＷＡ１が接続され、管路Ｌ３の途中から分岐した管路Ｌ３１により培地槽Ｔ４が接続され、管路Ｌ３１の途中から分岐した管路Ｌ３２により細胞剥離液槽Ｔ５が接続される。
〔細胞回収キット］
実施の形態２の細胞回収キットＢは、実施の形態１の細胞回収キットＢに加えて、管路Ｌ７により廃液槽Ｗ３が細胞培養容器ＣＣの液体排出口Ｌoutに接続され、管路Ｌ６の途中から分岐した管路Ｌ８により洗浄液槽ＷＡ２が接続される。
【００６７】
被処理液層Ｔ１に収納された成体幹細胞を含む被処理液は、実施の形態１と同様にポンプＰ１を駆動することにより、管路Ｌ１を通って細胞分離フィルターＳＦに通液される。
細胞分離フィルターＳＦへの被処理液の通液速度は、特に限定されないが、細胞分離材の厚さに対する被処理液の通過速度（線速）で表した時、０．１〜１０００ｍｍ／ｍｉｎの範囲にあることが好ましい。線速が０．１ｍｍ／ｍｉｎより低いと処理時間が長期化し、１０００ｍｍ／ｍｉｎより高いと被処理液の流水圧により成体幹細胞が分離材に捕捉されにくくなる。より好ましい線速は、０．５〜５００ｍｍ／ｍｉｎであり、さらにより好ましくは１〜２５０ｍｍ／ｍｉｎである。
【００６８】
成体幹細胞を含む被処理液を細胞分離フィルターＳＦに通液する前に、生理食塩液等の等張液で細胞分離フィルターＳＦの洗浄を行なう場合は、流路開閉弁Ｖ１，Ｖ３及びＶ２１を閉にし、流路開閉弁Ｖ２及び管路Ｌ１２上の流路開閉弁Ｖ１２を開にしてポンプＰ１を駆動することにより、洗浄液槽ＷＡ１に収容した生理食塩液等の洗浄液が、管路Ｌ１２及び管路Ｌ１を介して細胞分離フィルターＳＦに通液され、廃液は管路Ｌ２を介して廃液槽Ｗ１に収容される。このときの線速は、特に限定されないが０．１〜１０００ｍｍ／ｍｉｎの範囲にあることが好ましい。
成体幹細胞を含む被処理液が細胞分離フィルターＳＦに通液されることによって、被処理液中の成体幹細胞は細胞分離材に捕捉され、捕捉されなかった赤血球、成体幹細胞以外の有核細胞、血漿成分、酵素、希釈に用いた緩衝液等の不要成分は、管路Ｌ２を通って廃液槽Ｗ１に移送される。
【００６９】
成体幹細胞を含む被処理液を細胞分離フィルターＳＦに通液することにより、成体幹細胞が細胞分離材に捕捉されるが、同時に一部の赤血球や有核細胞が細胞分離材中に留まっている可能性がある。これらの不要な細胞を除去するために、洗浄液槽ＷＡ１から洗浄液を管路Ｌ１２及び管路Ｌ１を介して細胞分離フィルターＳＦに通液してもよい。この場合の洗浄液流入口は、細胞分離フィルターＳＦに通液した被処理液流入口と同位置か、上流側にあることが好ましい。
ここで用いられる洗浄液は、成体幹細胞に対して負の影響を与えない液体であれば特に限定されないが、具体例としては、生理食塩液、リンゲル液、血清、血漿、細胞培養に用いられる培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液等が挙げられる。成体幹細胞への負の影響が小さいこと、医療用途に用いられている実績があることから、生理食塩液を用いることが好ましい。いずれの場合にも、洗浄液の通液条件は、被処理液を細胞分離フィルターＳＦに通液した場合に準じるものを用いることが好ましい。
【００７０】
洗浄液が細胞分離フィルターＳＦに通液されることによって、細胞分離フィルターＳＦ内に残存している、成体幹細胞以外の不要細胞は細胞分離フィルターＳＦ内から、管路Ｌ２を通って洗浄液とともに廃液槽Ｗ１に移送される。
細胞分離フィルターＳＦに捕捉された成体幹細胞は、第１細胞回収液導入部Ｃ１より管路Ｌ２１を介して細胞回収液を細胞分離フィルターＳＦに通液することによって、管路Ｌ１を介して被処理液槽Ｔ１に一旦貯留され、その後管路Ｌ１，Ｌ３を介して細胞培養容器ＣＣに移送されて、そのまま培養される。
この時、細胞回収液として、幹細胞培養用の培地等の、幹細胞を増殖させる機能を有する液体を用いると、移送後そのまま培養することができるので好ましい。
また、細胞分離フィルターＳＦ中において成体幹細胞は上流側に偏在する可能性が高いため、管路Ｌ２１は細胞分離フィルターＳＦの下流側に位置する管路Ｌ２に連結されていることが好ましい。
【００７１】
さらに、必要に応じて、管路Ｌ３上の流路開閉弁Ｖ３を閉にし、管路Ｌ３１上の流路開閉弁Ｖ３１を開にしてポンプＰ２を駆動することにより、培地を充填した培地槽Ｔ４から管路Ｌ３１及びＬ３を経由して細胞培養容器ＣＣに培地の追加を行なうことができる。
細胞分離フィルターＳＦから回収された成体幹細胞は、細胞培養容器ＣＣを用いて培養され、必要な細胞数まで増幅されるが、この時、成体幹細胞としての性質を保ったまま増幅されてもよいし、適当な特定の細胞や組織に分化誘導されてもよい。成体幹細胞としての性質を保ったまま増幅された細胞組成物も、特定の細胞や組織に分化誘導された細胞組成物も本発明の範疇に含まれる。また、細胞培養容器ＣＣ中で、必要な細胞数まで増幅された成体幹細胞は、その後一部の細胞を残して、更に続けて細胞培養容器ＣＣ内で培養を続けてもよい。
【００７２】
細胞培養容器ＣＣ内にて増殖した細胞を剥離する際には、ポンプＰ４を駆動することにより、培地を管路Ｌ７から廃液槽Ｗ３に排液する。
また、細胞培養容器ＣＣ内に培地が残っている場合は、培地中のタンパク質成分や二価カチオン等の影響により細胞剥離剤の効きが悪くなる可能性があるため、ポンプＰ２を駆動して、洗浄液槽ＷＡ１内の洗浄液を管路Ｌ１２及び管路Ｌ３を経て細胞培養容器ＣＣ内に注入することにより、残っている培地を洗浄してもよい。
洗浄を行った場合は、ポンプＰ４を駆動して洗浄液を管路Ｌ７から廃液槽Ｗ３に排液する。
次に、ポンプＰ２を駆動して、細胞剥離液槽Ｔ５内の細胞を剥離するためのトリプシン等の酵素、キレート剤等の細胞剥離剤を、管路Ｌ３２，Ｌ３１及びＬ３を経て細胞培養容器ＣＣ内に注入する。この際、細胞剥離剤が細胞培養容器ＣＣ全体に行き渡るように、細胞培養容器ＣＣの揺動を行なってもよい。
【００７３】
細胞剥離剤による細胞の処理時間は、目安として１〜１５分間が好ましく、所定時間経過後、細胞剥離剤を失活させるために培地槽Ｔ４から管路Ｌ３１及びＬ３を経由して培地を追加する。細胞培地を追加する前に、細胞を十分に剥離させるために細胞剥離剤が入った状態で細胞培養容器ＣＣの揺動を行なってもよい。
細胞剥離剤と培地が混合された細胞懸濁液は、管路Ｌ４から細胞濾過フィルターＲＦを介して細胞回収フィルターＣＦへ通液することにより、増殖した細胞が細胞回収フィルターＣＦに捕捉される。
捕捉されなかった細胞以外の有核細胞、血清成分、酵素、キレート剤、培地等の不要成分は、管路Ｌ５を通って廃液槽Ｗ２に移送される。
【００７４】
細胞剥離に使用したトリプシン等の酵素やキレート剤等が細胞回収フィルターＣＦ内に留まっている可能性があることから、これらの不要成分を除去するために、洗浄液槽ＷＡ２内の生理食塩液等の洗浄液を、管路Ｌ８，Ｌ６，Ｌ４を通して細胞回収フィルターＣＦに通液してもよい。
細胞回収フィルターＣＦへの被処理液の通液速度、及び、細胞回収フィルターＣＦを洗浄する際の流速は、特に限定されないが、フィルターの厚さに対する被処理液の通過速度（線速）で表した時、０．１〜１０００ｍｍ／ｍｉｎの範囲にあることが好ましく、より好ましい線速は、０．５〜５００ｍｍ／ｍｉｎであり、さらに好ましくは１〜２５０ｍｍ／ｍｉｎである。
ここで用いられる洗浄液は、細胞に対して負の影響を与えない液体であれば特に限定されないが、具体例としては、生理食塩液やリンゲル液等注射用剤として使用実績のあるもの等が挙げられる。
また、洗浄量は、細胞回収フィルターＣＦの容量により異なるが、該フィルター容積の約１〜１００倍の体積で洗浄することが好ましい。
【００７５】
細胞回収フィルターＣＦに捕捉された細胞は、細胞懸濁液を流した方向とは逆方向に細胞回収液を流すことにより回収することができる。具体的には、第２細胞回収液導入部Ｃ２から、管路Ｌ５１，Ｌ５を介して、細胞回収液を細胞回収フィルターＣＦに通液することにより、管路Ｌ４，Ｌ６を介して細胞回収槽Ｔ３に回収される。
細胞回収フィルターＣＦ中において細胞は上流側に偏在する可能性が高いため、管路Ｌ５１は細胞回収フィルターＣＦの下流側に位置する管路Ｌ５に連結されていることが好ましい。細胞回収液としては、細胞に対して負の影響を与えない液体であれば特に限定されないが、具体例としては、生理食塩液やリンゲル液等注射用剤として使用実績のあるものや、血漿、血清等が挙げられる。また、生理食塩液やリンゲル液等に血漿、血清等を添加して使用してもよい。
【００７６】
（実施例１）
図３の構成の細胞培養容器ＣＣ、細胞分離キットＡ及び細胞回収キットＢからなる細胞培養用ディスポセットを用い、図３に示した位置に流路開閉弁及びポンプを備えるとともに、流路開閉弁の開閉制御及びポンプの駆動制御並びに図２に示す外部押圧ユニットＤの駆動制御を行う制御装置を備えた細胞培養装置を用いた。
また、細胞分離フィルターＳＦとして、出入口を備えた外径２６ｍｍ、内径２２ｍｍの円筒状のカラムに、ポリエステルとプロピレンからなる不織布（密度（目付け（ｇ／ｍ2）／厚み（ｍ））＝１．８×１０5（９５／（５．２×１０-4））（ｇ／ｍ3）、繊維径＝１５±１０μｍ、目開き＝５〜５０μｍ）を３６枚積層し、不織布の厚みが９ｍｍになるまで圧縮してなる細胞分離材を収容したものを用いた。
【００７７】
まず、洗浄液槽ＷＡ１内の生理食塩液３０ｍｌを、管路Ｌ１２及びＬ１を通して流速３０ｍｌ／ｍｉｎで細胞分離フィルターＳＦに通液して洗浄を行なった。
次に、購入したヒト骨髄液２０ｍｌを被処理液槽Ｔ１に入れ、被処理液槽Ｔ１内のヒト骨髄液を、管路Ｌ１を通して流速６ｍｌ／ｍｉｎで細胞分離フィルターＳＦに導入し、細胞分離フィルターＳＦより導出された被処理液について管路Ｌ２からサンプリングを行い、自動血球計測装置（シスメックスＫ−４５００）により血球数の測定を実施した。
次に、洗浄液槽ＷＡ１内の生理食塩液３０ｍｌを、管路Ｌ１２及びＬ１を通して流速６ｍｌ／ｍｉｎにて細胞分離フィルターＳＦに流すことにより、赤血球や白血球、血小板の洗浄除去を行った。
【００７８】
次に、細胞回収液としてウシ胎児血清１０％を含む細胞培地（α−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製））１５０ｍｌを第１細胞回収液導入部Ｃ１としてのシリンジに収容した。そして、圧力気体を二酸化炭素とした図２に示す外部押圧ユニットＤにより前記シリンジのプランジャーを押圧し、第１細胞回収液導入部Ｃ１から管路Ｌ２１及びＬ２を通して骨髄液を流した方向と逆方向から、流速３００ｍｌ／ｍｉｎ、圧力０．３ＭＰａで細胞分離フィルターＳＦに注入することにより、細胞分離フィルターＳＦから管路Ｌ１を通して目的とする細胞画分を被処理液槽Ｔ１に一旦貯留した。
次に、管路Ｌ１及びＬ３を介して細胞培養容器ＣＣ（直径２５０ｍｍ）に移送して管路Ｌ３からサンプリングを行い、自動血球計測装置（シスメックスＫ−４５００）により血球数の測定を実施した。
【００７９】
細胞分離フィルターＳＦ通過後の血球数を通過前の血球数で割ることにより血球の通過率を求めたところ、赤血球及び血小板の通過率はいずれも９５％以上であり、白血球の通過率は７０％であった。
また、回収溶液中の細胞数を細胞分離フィルターＳＦ通過前の血球数で割ることにより細胞の回収率を求めたところ、表１に示すように、赤血球が０．５％、血小板が４％であり、白血球は２５％であった。
以上より、細胞分離フィルターＳＦにより、赤血球及び血小板はほとんど除去されることがわかる。
【００８０】
【表１】
2012002497.tif 000003
【００８１】
細胞培養容器ＣＣに送液された細胞画分を含む細胞回収液は、５％ＣＯ2インキュベーター内において３７℃の温度環境下で１４日間培養を行った。この際、２〜３日ごとに培地交換を行ない、細胞培養容器ＣＣ底面積のほぼコンフルエントになるまで細胞を増殖させた。
【００８２】
次に、ヒト骨髄液由来間葉系幹細胞を培養した後の洗浄濃縮方法を示す。
細胞回収フィルターＣＦとして、出入口を備えた外径２６ｍｍ、内径２２ｍｍの円筒状のカラムに、ポリエステルからなる不織布（密度（目付け（ｇ／ｍ2）／厚み（ｍ））＝１．６×１０5（８５／（５．３×１０-4））（ｇ／ｍ3）、繊維径＝１２±２μｍ、目開き＝１０〜２６μｍ）を３６枚積層し、不織布の厚みが９ｍｍになるまで圧縮してなる細胞回収材を収容したものを用いた。
洗浄液槽ＷＡ２内の生理食塩液３０ｍｌを、管路Ｌ８を通して流速３０ｍｌ／ｍｉｎで細胞回収フィルターＣＦに通液することにより洗浄を行なった。
【００８３】
次に、管路Ｌ７を通して細胞培地を廃液槽Ｗ３に排液し、洗浄液槽ＷＡ２内の生理食塩液１００ｍｌを、管路Ｌ８、Ｌ６及びＬ４を通して細胞培養容器ＣＣに注入した。
次に、細胞培養容器ＣＣ内の生理食塩液を、管路Ｌ７を通して廃液槽Ｗ３に排液し、細胞培養容器ＣＣ内を洗浄した。
次に、細胞剥離液槽Ｔ５内のトリプシン-ＥＤＴＡ液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ，ＧＩＢＣＯ社製）７５ｍｌを、管路Ｌ３２、Ｌ３１及びＬ３を通して、生理食塩液を除去した細胞培養容器ＣＣに加え、細胞培養容器ＣＣの揺動を行なった後に、３７℃の温度条件下で１０分間静置した後、細胞培養容器ＣＣの揺動を再度行なうことによって細胞を剥離した。
【００８４】
次に、培地槽Ｔ４内の細胞培地１５０ｍｌを、管路Ｌ３１及びＬ３を通して細胞培養容器ＣＣに加え、培養細胞を剥離した細胞懸濁液を調製した。
該細胞懸濁液を管路Ｌ４を通し、細胞濾過フィルターＲＦ（７０μｍ）を介して、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで細胞回収フィルターＣＦに通液し、細胞回収フィルターＣＦより導出された廃液は、管路Ｌ５を通して廃液槽Ｗ２に廃液した。
細胞回収フィルターＣＦに導入し、細胞回収フィルターＣＦより導出された細胞懸濁液は、管路Ｌ５からサンプリングを行った。
【００８５】
次に、洗浄液槽ＷＡ２内の生理食塩液３０ｍｌを、管路Ｌ８を通して流速１０ｍｌ／ｍｉｎで細胞回収フルターＣＦに流すことにより、細胞回収フィルターＣＦに捕捉された細胞から、細胞剥離時に使用したトリプシン等の細胞剥離剤の除去を行った。
次に、細胞回収液として血清１０ｍｌを第２細胞回収液導入部Ｃ２としてのシリンジに収容した。そして、圧力気体を二酸化炭素とした図２に示す外部押圧ユニットＤにより前記シリンジのプランジャーを押圧し、第２細胞回収液導入部Ｃ２から管路Ｌ５１及びＬ５を通して細胞懸濁液を流した方向と逆方向から、流速３００ｍｌ／ｍｉｎ、圧力０．３ＭＰａで細胞回収フィルターＣＦに注入することにより、細胞回収フィルターＣＦから管路Ｌ６を通して洗浄後の細胞を細胞回収槽Ｔ３に回収した。
【００８６】
ここで、細胞回収フィルターＣＦ通過後の細胞数を細胞回収フィルターＣＦ通過前の細胞数で割ることにより、細胞回収フィルターＣＦの培養細胞の通過率を求めた。
また、細胞回収槽Ｔ３に回収された培養細胞の細胞数を細胞回収フィルターＣＦ通過前の細胞数で割ることにより、細胞回収フィルターＣＦによる細胞の回収率を求めた。
なお、細胞数は血球計算盤にて測定した。
その結果、表２に示すように、１４日間の培養後に得られた細胞数は、２．０×１０7個と非常に高い値を示した。
これは、後述する比較例１（一般的に使用されている幹細胞分離方法）の骨髄液処理量（２ｍｌ）を細胞分離フィルターＳＦでの処理液量（２０ｍｌ）に換算したものと比較して約２．５倍多い細胞が得られている。
【００８７】
前記細胞懸濁液を細胞回収フィルターＣＦで処理した時の細胞数は、血球計算盤の検出限界以下であり、細胞の通過率は０％となり、ほぼ全ての細胞が細胞回収フィルターＣＦに捕捉された。この時の細胞回収フィルターＣＦから回収された細胞数は、表２に示すように１．８×１０7個であり、回収率は９０％という非常に高い値を示している。
ここで、トリプシン溶液を含む細胞懸濁液は、２２５ｍｌから１０ｍｌまで細胞懸濁液量を減少することができ、細胞が濃縮されていることを確認した。
また、細胞回収フィルターＣＦに細胞懸濁液を通液した後に生理食塩液にて細胞回収フィルターＣＦの洗浄を行なった際における、細胞回収フィルターＣＦ出口側の生理食塩液中の最終トリプシン濃度は、表２に示すように、２８０ｎｍにおける紫外吸収スペクトル測定で検出限界以下であり、トリプシンは十分に洗浄除去されていた。
【００８８】
【表２】
2012002497.tif 000004
【００８９】
次に、細胞培養容器ＣＣで培養した細胞を用いて軟骨形成評価を行った。上述のとおり培養して増幅させた細胞を、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製ＤＭＥＭ−ハイグルコース培地２０ｍｌで１回洗浄し、遠心分離操作（１０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）で集めた。
ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製ＤＭＥＭ−ハイグルコース培地に軟骨分化誘導を促す添加物（ＴＧＦβ３ヒトリコンビナント  最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ：フナコシ製，デキサメサゾン  最終濃度１００ｎＭ（ｎｍｏｌ／ｌ）：Ｓｉｇｍａ製，アスコルビン酸リン酸エステル  最終濃度５０μｇ／ｍｌ：ＷＡＫＯ製，ピルビン酸ナトリウム  最終濃度１００μｇ／ｍｌ：コスモバイオ製，Ｌ−プロリン  最終濃度４０μｇ／ｍｌ：コスモバイオ製）を所定量添加した培地に、さらにＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、セレン、ウシ血清アルブミン）を市販原液の１／１００量添加した培地で間葉系細胞濃度が４×１０5個／ｍｌになるように懸濁した。
この細胞懸濁液を０．５ｍｌ取り、１５ｍｌファルコンチューブに入れた。その後遠心分離操作（１０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）を行うと細胞がペレット状になるが、そのままチューブの蓋を緩めて、５％ＣＯ2インキュベーター内において３７℃の温度環境下で３週間培養した。
なお、この間に培地は週２回実施した。培養終了後は球形となった細胞塊を回収し、組織固定用ホルマリンで固定し、軟骨基質染色剤であるアルシアンブルー染色を行った。組織切片を顕微鏡観察した結果、図４（ａ）に示すように軟骨基質が青色に染まる異染色性（メタクロマジー）が観察され、得られた細胞は分化能を有する幹細胞であることを確認した。
【００９０】
（参考例１）
前記軟骨分化誘導を促す添加物を培地に添加しないこと以外は実施例１と同様の方法にて、軟骨基質形成能を評価した。その結果、図４（ｂ）に示すように軟骨基質が紫色に染まる異染色性（メタクロマジー）は観察されなかった。
【００９１】
（比較例１）
実施例１と同一のヒト骨髄液２ｍｌを、リン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略す。）２ｍｌと混合（２倍希釈）した。
次に、１５ｍｌ遠沈管に、Ｆｉｃｏｌｌ  ｐａｑｕｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）を３ｍｌ添加し、該溶液の上層に先に調製した希釈骨髄液４ｍｌを積層し、遠心分離操作（１４００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，室温）を行うことにより、成体幹細胞を含む単核球画分層を回収した。
ＰＢＳを約１０ｍｌ入れ、遠心分離操作（１３００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）により細胞の洗浄を行った。
次に、同様にＰＢＳを約１０ｍｌ入れ、遠心分離操作（１２００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）を行い、細胞の再洗浄を行った。再洗浄液を２ｍｌのＰＢＳに懸濁し、血球数の測定を行い、細胞回収率を求めた。また実施例１と同様の方法で細胞数の測定を行なった。
【００９２】
その結果、表１に示すように、赤血球の回収率は１％未満、血小板の回収率は９％、白血球の回収率は２５％であった。
得られた単核球画分を、α−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）に懸濁し、５％ＣＯ2インキュベーター内において３７℃の温度環境下で１４日間培養を行った。この際、２〜３日ごとに培地交換を行なった。
次に、トリプシン-ＥＤＴＡ液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ，ＧＩＢＣＯ社製）を１ｍｌ添加し、５％ＣＯ2インキュベーター内において３７℃の温度環境下で５分間静止後、ピペッティングを行なって細胞を剥離し、さらに等量の培地を加えて再度ピペッティングを行なって細胞を回収した。
【００９３】
その結果、得られた細胞数は、表２に示すように骨髄液２ｍｌ処理時で０．８×１０6個であり、骨髄液２０ｍｌ処理時に換算すると０．８×１０7個と概算され、細胞分離フルターＳＦによる処理時の１／２．５の値であった。
その後、遠心分離操作（１５００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）を行い、細胞を沈殿させて上清を除去した後に、生理食塩液を加えて細胞を再懸濁した。本操作を合計３回繰り返すことによりトリプシン-ＥＤＴＡの洗浄を行った。
表２に示すように、得られた総細胞数は０．６×１０6個、回収率は７５％であり、残存トリプシン濃度は細胞剥離時に使用したトリプシン-ＥＤＴＡ液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ，ＧＩＢＣＯ社製）の濃度を１００％とした時の３％であった。
【００９４】
以上の実験結果から、本発明の細胞培養用ディスポセット、細胞培養装置及び細胞調製方法を使用することにより、成体幹細胞を分離する方法として現在使用されている密度勾配遠心法以上の間葉系幹細胞を得られ、得られた細胞は軟骨への分化能を有していることがわかる。
また、本発明の細胞培養用ディスポセット、細胞培養装置及び細胞調製方法を使用することにより、有用細胞の分離工程、分離工程で分離された有用細胞の培養工程及び培養工程で培養された細胞の洗浄・濃縮工程の全てを一貫して行う、大掛かりな設備によらない簡素な構成の閉鎖系システムが実現され、操作性を向上しながら、安全性及び品質の高い有用細胞の調製が可能になる。
【符号の説明】
【００９５】
Ａ  細胞分離キット
Ｂ  細胞回収キット
Ｃ１  第１細胞回収液導入部
Ｃ２  第２細胞回収液導入部
ＣＣ  細胞培養容器
ＣＦ  細胞回収フィルター
Ｄ  外部押圧ユニット
Ｄ１  エアシリンダー
Ｄ２  流路切換弁
Ｅ  固定具
Ｌ０，Ｌ１，Ｌ１１，Ｌ１２，Ｌ２，Ｌ２１，Ｌ３，Ｌ３１，Ｌ３２，Ｌ４，Ｌ５，Ｌ５１，Ｌ６，Ｌ７，Ｌ８  管路
Ｌin  液体流入口
Ｌout  液体排出口
Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４  ポンプ
ＲＦ  細胞濾過フィルター
ＳＦ  細胞分離フィルター
Ｔ１  被処理液槽
Ｔ２  細胞貯留バッグ
Ｔ３  細胞回収槽
Ｔ４  培地槽
Ｔ５  細胞剥離液槽
Ｖ１，Ｖ１１，Ｖ１２，Ｖ１３，Ｖ２，Ｖ２１，Ｖ３，Ｖ３１，Ｖ３２，Ｖ４，Ｖ５，Ｖ５１，Ｖ６，Ｖ８  流路開閉弁
Ｗ１，Ｗ２，Ｗ３  廃液槽
ＷＡ１，ＷＡ２  洗浄液槽
【図１】
2012002497.tif 000005
【図２】
2012002497.tif 000006
【図３】
2012002497.tif 000007
【図４】
2012002497.tif 000008
【国際調査報告】
2012002497.tif 000009
2012002497.tif 000010