(57)【要約】  本願発明は、特定の制限酵素やその認識配列を使用せずに、簡便かつ効率的にＤＮＡ断片の末端をつなぎ合わせる方法を利用したクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の製造方法や、該形質転換体を用いた有用物質の製造方法等を提供することを課題とした。  そして、解決手段として、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌の自律複製配列を含まない、２以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入し、所望のＤＮＡ連結体により発現するマーカー遺伝子の発現を指標として、所望のＤＮＡ連結体を含む形質転換体を選択する、又は、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌の自律複製配列を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を、単独又は１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と組み合わせてクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入し、所望の環状ＤＮＡ連結体により発現するマーカー遺伝子の発現を指標として、所望の環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換体を選択することを見いだした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えることを特徴とする、２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなるＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法。
（ａ）自律複製配列を含まない２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程であって、上記２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、それぞれの２本鎖ＤＮＡ断片が単独ではマーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含んでおらず、複数の２本鎖ＤＮＡ断片が連結して所望のＤＮＡ連結体を形成した場合にのみマーカー遺伝子の発現が可能となるような配列を含む２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片である前記工程；
（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、上記所望のＤＮＡ連結体がゲノムＤＮＡ中に挿入された形質転換体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；
【請求項２】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えることを特徴とする、１種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなる環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法。
（ａ）自律複製配列の全部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含む１種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、所望の環状ＤＮＡ連結体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；
【請求項３】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えることを特徴とする、２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなる環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法。
（ａ）自律複製配列の全部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を、１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と組み合わせてクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程であって、上記１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、単独ではマーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含んでおらず、上記自律複製配列を含み、且つ、マーカー遺伝子の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と連結して所望の環状ＤＮＡ連結体を形成した場合にのみマーカー遺伝子の発現が可能となるような配列を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片である前記工程； 
（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、上記所望の環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；
【請求項４】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えることを特徴とする、２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなる環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法。
（ａ）自律複製配列の一部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を、１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と組み合わせてクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程であって、上記１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、単独では自律複製配列の全部と、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部とを含んでおらず、上記自律複製配列の一部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と連結して所望の環状ＤＮＡ連結体を形成した場合にのみ、自律複製配列の全部と、マーカー遺伝子の発現が可能となるような配列とを含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片である前記工程； 
（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、上記所望の環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；
【請求項５】
自律複製配列が、配列番号１〜５のいずれかに示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
ＤＮＡ連結体が、さらに、所望の有用物質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
クルイベロマイセス・マルシアヌス菌が、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５であり、マーカー遺伝子がＵＲＡ３遺伝子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
請求項６又は７記載の製造方法により得られる形質転酵母。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換酵母を培地に培養し、培養物から所望の有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造方法。
【請求項１０】
配列番号１〜５のいずれかに示されるクルイベロマイセス・マルシアヌス菌のＡＲＳ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の製造方法や、該形質転換体を用いた有用物質の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ断片の末端をつなぎ合わせて任意のＤＮＡ分子を作製する技術は、クローニングをはじめとする多くの分子生物学分野における実験操作に必須の基礎的な技術である。現在、ＤＮＡ断片を連結させるために最も一般的に用いられている手法は、ＤＮＡリガーゼを用いて、平滑末端を有するＤＮＡ分子同士、又は相補的な突出末端を有するＤＮＡ分子同士を結合させるものである。また、この手法を応用したクローニング方法として、Ｃｏｈｅｎ−Ｂｏｙｅｒ法（非特許文献１参照）が知られており、この方法では、インサートＤＮＡとベクターとをそれぞれ制限酵素で切断して精製した後に、ＤＮＡリガーゼによって連結させて目的のコンストラクトを作製し、該コンストラクトにより大腸菌を形質転換して増幅させる。しかし、制限酵素とＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結方法においては、あらかじめ末端同士が合うように調製されたＤＮＡ分子同士でなければ連結させることができないため、Ｃｏｈｅｎ−Ｂｏｙｅｒ法は、形質転換用のコンストラクトを作製するためにＰＣＲや制限酵素処理等の複雑なｉｎ ｖｉｔｒｏ操作を必要とし、さらに、形質転換後の大腸菌コロニーの中から目的のコンストラクトを含む大腸菌を選択するために多くの時間が必要とされる。以上のことから、より簡便で効率的なＤＮＡ分子の連結方法の開発が求められていた。【０００３】
Ｃｏｈｅｎ−Ｂｏｙｅｒ法に代わる、制限酵素やＤＮＡリガーゼを使用しないクローニング方法として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ相同組換え法や、ｉｎ ｖｉｖｏ相同組換え法が開発されている。上記ｉｎ ｖｉｔｒｏ相同組換え法は、特定の組換え酵素と該酵素の認識配列を使用することによりＤＮＡ分子をつなぎ合わせるものであり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅｗａｙ法や、タカラバイオ社のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法等が知られている。しかし、これらの方法では、インサートＤＮＡの両端、及びベクターに特定のＤＮＡ配列が存在する必要があるため、汎用性に優れた方法とは言えない。また、上記ｉｎ ｖｉｖｏ相同組換え法としては、大腸菌や（非特許文献２及び３参照）、パン酵母を用いた方法（非特許文献４及び５参照）が知られている。これらのｉｎ ｖｉｖｏ相同組換え法は、ファージに由来する複数のタンパク質を発現させた大腸菌株や、パン酵母が極めて高い相同組換え能を持つことを利用した方法である。具体的には、インサートＤＮＡの両端にクローニングベクターと相同な配列が付加されたインサートＤＮＡと、制限酵素等で相同組換えが起こる部分が切断されたクローニングベクターとを調製し、大腸菌又はパン酵母を形質転換することにより、該形質転換細胞内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で相同組換えが起こり、インサートＤＮＡが挿入されたクローニングベクターを得ることができる。この反応は、制限酵素部位とは無関係に起こるため，ベクター配列中の様々な位置にＤＮＡ断片を挿入することが可能である。また、インサートＤＮＡの長さによりクローン化の効率が変化しないことも特長である。しかし、いずれの方法も相同組換え利用したものであることから、インサートＤＮＡにベクターとの相同配列を付加する必要がある。さらに、大腸菌を用いたｉｎ ｖｉｖｏ相同組換え法は、高い形質転換効率を得るためにエレクトロポレーションを行う必要があり、その操作のための高価な装置や器具が必要となる等の短所がある。また、パン酵母を用いたｉｎ ｖｉｖｏ相同組換え法では、ＤＮＡを大量に調製する際にクローニングベクターを大腸菌に移し替えるため、パン酵母−大腸菌シャトルベクターを用いる必要がある。しかし、パン酵母−大腸菌シャトルベクターは一般的に使用されているベクターではなく、その調製には手間と時間がかかる。【０００４】
また、制限酵素やＤＮＡリガーゼを使用しないで、環状ＤＮＡの構築と増幅を行う方法としては、ローリングサークル型増幅法により得られた直鎖状ＤＮＡを用いて原核細胞を形質転換し、該形質転換細胞内で環状ＤＮＡを再構築する方法が知られている（特許文献１参照）。しかし、ローリングサークル型増幅法より作製された増幅ＤＮＡ断片は繰返し配列を含む特殊な構造をしており、この方法が、繰返し配列を含まないＤＮＡ断片の環状化に応用できるかは不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２２９９５０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cohen SN et al., Proc Natl Acad Sci USA. 70,3240-3244 (1973)
【非特許文献２】Zhang Y et al., Nat Genet. 20, 123-128 (1998)
【非特許文献３】Yu D et al., Proc Natl Acad Sci USA. 97,5978-5983 (2000)
【非特許文献４】Marykwas DL and Passmore SE, Proc Natl AcadSci USA. 92, 11701-11705 (1995)
【非特許文献５】Oldenburg KR et al., Nucleic Acids Res. 25,451-452 (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、特定の制限酵素やその認識配列を使用せずに、簡便かつ効率的にＤＮＡ断片の末端をつなぎ合わせてクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体を製造する方法や、該形質転換体を用いた有用物質の製造方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはこれまでに、酵母の一種であるクルイベロマイセス・マルシアヌス菌が他の酵母では認められない種々の優れた性質を有することを明らかにしている（ＰＣＴ／ＪＰ２００７／００１２７０、ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００１２１４）。さらに、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌の形質転換方法に関する研究を行う過程で、相同配列を含まない直鎖状ＤＮＡが効率的にクルイベロマイセス・マルシアヌス菌のゲノムＤＮＡに組み込まれることを示唆している（Nonklang S. et al. Appl Environ Microbiol 74: 7514-7521 (2008)）。これらの知見から、本発明者らは、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌が分子生物学研究の新たなツールとして使用できるのではないかと考え、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌を用いた新たなＤＮＡ断片結合方法の開発を試みた。まず、ＵＲＡ３遺伝子の転写開始コドンＡＴＧのＡから＋７７１までの配列を含むＤＮＡ断片と、ＵＲＡ３遺伝子の＋７７２からストップコドンまでの配列を含むＤＮＡ断片とを、ウラシル要求性遺伝子変異株であるクルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５に導入して、ウラシル欠損培地を用いて培養した。この結果、導入したＤＮＡ断片がつなぎ合わされたＤＮＡ連結体がゲノムＤＮＡに含まれる形質転換体が効率よく得られることが明らかとなった。さらに、本発明者らは、これまで知られていなかったクルイベロマイセス・マルシアヌス菌の自律複製配列（ＡＲＳ）の同定を試み、配列番号１〜５に示される新規ＡＲＳ配列を決定するとともに、該ＡＲＳ配列を含む直鎖状ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入することにより、環状ＤＮＡ連結体の作製が可能となることを見い出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は（１）（ａ）自律複製配列を含まない２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程であって、上記２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、それぞれの２本鎖ＤＮＡ断片が単独ではマーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含んでおらず、複数の２本鎖ＤＮＡ断片が連結して所望のＤＮＡ連結体を形成した場合にのみマーカー遺伝子の発現が可能となるような配列を含む２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片である前記工程；（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、上記所望のＤＮＡ連結体がゲノムＤＮＡ中に挿入された形質転換体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えることを特徴とする、２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなるＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法や、（２）（ａ）自律複製配列の全部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含む１種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程；（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、所望の環状ＤＮＡ連結体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えることを特徴とする、１種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなる環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法や、（３）（ａ）自律複製配列の全部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を、１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と組み合わせてクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程であって、上記１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、単独ではマーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含んでおらず、上記自律複製配列を含み、且つ、マーカー遺伝子の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と連結して所望の環状ＤＮＡ連結体を形成した場合にのみマーカー遺伝子の発現が可能となるような配列を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片である前記工程；（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、上記所望の環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えることを特徴とする、２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなる環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法や、（４）（ａ）自律複製配列の一部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を、１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と組み合わせてクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程であって、上記１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、単独では自律複製配列の全部と、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部とを含んでおらず、上記自律複製配列の一部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と連結して所望の環状ＤＮＡ連結体を形成した場合にのみ、自律複製配列の全部と、マーカー遺伝子の発現が可能となるような配列とを含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片である前記工程；（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、上記所望の環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えることを特徴とする、２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなる環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法や、（５）自律複製配列が、配列番号１〜５のいずれかに示される塩基配列を含むことを特徴とする上記（２）〜（４）のいずれかに記載の製造方法や、（６）ＤＮＡ連結体が、さらに、所望の有用物質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法や、（７）クルイベロマイセス・マルシアヌス菌が、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５であり、マーカー遺伝子がＵＲＡ３遺伝子であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法や、（８）上記（６）又は（７）記載の製造方法により得られる形質転酵母や、（９）上記（８）記載の形質転換酵母を培地に培養し、培養物から所望の有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造方法や、（１０）配列番号１〜５のいずれかに示されるクルイベロマイセス・マルシアヌス菌のＡＲＳ配列に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、特定の制限酵素やその認識配列を使用せずに、２種以上の直鎖状ＤＮＡ断片の連結体がゲノムＤＮＡ中に挿入されたクルイベロマイセス・マルシアヌス菌の形質転換体を製造することができる。また、本発明によると、所望のＤＮＡ配列にクルイベロマイセス・マルシアヌス菌のＡＲＳをコードする配列を付加して、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌に形質転換することにより、該ＤＮＡ配列を含む環状ＤＮＡ連結体を構築することが可能となり、煩雑な操作を行うことなく所望のＤＮＡ配列をクローニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の２種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を用いたＤＮＡ連結体の作製方法の概要を示す図である。
【図２】本発明の方法により、ＵＲＡ３をコードするＤＮＡ連結体の作製を行った結果を示す図である。
【図３】本発明の２種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を結合させる方法の概要を示す図である。
【図４】本発明の方法により、ＵＲＡ３、ＴＤＨ３ｐ、及びｙＣＬｕｃをコードするＤＮＡ連結体の作製を行った結果を示す図である。
【図５】本発明の方法により、ＵＲＡ３をコードするＤＮＡ連結体の作製を行った結果を示す図である。
【図６】本発明のクルイベロマイセス・マルシアヌス菌の自律複製配列（ＫｍＡＲＳ）を取得するために用いたプラスミドを示す図である。
【図７】本発明のクルイベロマイセス・マルシアヌス菌の自律複製配列（ＫｍＡＲＳ）を取得するための実験の概要を示す図である。
【図８】本発明のクルイベロマイセス・マルシアヌス菌の自律複製配列（ＫｍＡＲＳ）を取得するために形質転換体を選択する方法を示す図である。
【図９】本発明のクルイベロマイセス・マルシアヌス菌の自律複製配列（ＫｍＡＲＳ）を含むプラスミドを取得する方法を示す図である。
【図１０】本発明のクルイベロマイセス・マルシアヌス菌の自律複製配列（ＫｍＡＲＳ）を含むプラスミドを示す図である。
【図１１】本発明のクルイベロマイセス・マルシアヌス菌の自律複製配列（ＫｍＡＲＳ）を決定するためのDeletionmutantを示す図である。
【図１２】本発明のクルイベロマイセス・マルシアヌス菌の自律複製配列（ＫｍＡＲＳ）を示す図である。
【図１３】本発明の環状ＤＮＡ連結体の作製方法の概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなるＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法としては、（ａ）自律複製配列を含まない２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程であって、上記２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、それぞれの２本鎖ＤＮＡ断片が単独ではマーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含んでおらず、複数の２本鎖ＤＮＡ断片が連結して所望のＤＮＡ連結体を形成した場合にのみマーカー遺伝子の発現が可能となるような配列を含む２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片である前記工程；（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、上記所望のＤＮＡ連結体がゲノムＤＮＡ中に挿入された形質転換体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備える方法（以下、「製造方法［Ｉ］」ということもある）であれば特に制限されず、ここで、「自律複製配列を含まない２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」とは、それぞれの２本鎖ＤＮＡ断片中に自律複製配列を含まず、さらに、複数のＤＮＡ断片が任意の順序で連結してＤＮＡ結合体を形成した場合にも、該ＤＮＡ結合体中に自律複製配列を含むことのない２本鎖ＤＮＡ断片を意味し、上記「所望のＤＮＡ連結体を形成した場合にのみマーカー遺伝子の発現が可能となるような配列を含む２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」とは、それぞれの２本鎖ＤＮＡ断片が、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内においてマーカー遺伝子を発現させるために必要な配列の一部を含んでいるが、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内においてマーカー遺伝子を発現させるために必要な配列の全部は含んでおらず、さらに、複数の２本鎖ＤＮＡ断片が所望の順序で連結して所望のＤＮＡ連結体を形成した場合にのみ、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内において、マーカー遺伝子を発現させることが可能となるような配列を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片であって、複数の２本鎖ＤＮＡ断片が所望の順序と異なる順序で連結して所望のＤＮＡ連結体とは異なるＤＮＡ連結体を形成した場合には、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内において、マーカー遺伝子を発現させることができない配列を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を意味する。
【００１３】
本発明の製造方法［Ｉ］に用いる２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片としては、その配列や、長さや、末端の形状によって特に制限されるものではなく、クローニングのターゲットとなる所望の有用物質をコードする遺伝子等の任意の遺伝子ＤＮＡや、高発現プロモーターに連結された所望の有用物質をコードする遺伝子等の任意の遺伝子ＤＮＡの他、任意の配列のＤＮＡをさらに含んでいてもよい。例えば、上記本発明の製造方法［Ｉ］において、所望のＤＮＡ連結体が、高発現プロモーター配列、マーカー遺伝子をコードする配列、及び、任意の塩基配列を順次含むＤＮＡ連結体である場合には、以下（ｉ）又は（ii）に例示するような２種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片の組合せを好適に用いることができる。
（ｉ）高発現プロモーター配列と、マーカー遺伝子をコードする配列のうち機能的なマーカー遺伝子発現に必須の３’末端領域を欠失した配列とを含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片、及び、上記機能的なマーカー遺伝子発現に必須の３’末端領域をコードする配列と、その下流に所望の有用物質をコードするＤＮＡ配列等の任意の塩基配列とを含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片；
（ii）高発現プロモーター配列と、マーカー遺伝子をコードする配列のうち転写開始点を含む５’末端領域をコードする配列とを含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片、及び、上記マーカー遺伝子をコードする配列のうち、上記マーカー遺伝子の５’末端領域を含まず、上記マーカー遺伝子の５’末端領域の下流の３’末端までをコードする配列と、その下流に所望の有用物質をコードするＤＮＡ配列等の任意の塩基配列とを含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片；
【００１４】
上記直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を調製する方法としては、公知の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を調製する方法であれば特に制限されず、比較的短い２本鎖ＤＮＡ断片を調製する方法としては、ホスホロアミダイト法やホスファイト法により合成された１本鎖をアニーリングさせる方法や通常のＰＣＲ法により調製する方法を、長いＤＮＡ断片を調製する方法としては、フュージョンＰＣＲ法（特開２００９−２６８３６０参照）により調製する方法を、好適に例示することができるが、なかでも、ＰＣＲ法であることが好ましい。例えば、本発明の製造方法［Ｉ］において、上記（ｉ）の２種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を用いる場合には、「高発現プロモーター配列と、マーカー遺伝子をコードする配列のうち機能的なマーカー遺伝子発現に必須の３’末端領域を欠失した配列とを含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」をＰＣＲ法によりあらかじめ調製しておき、もう一方の「上記機能的なマーカー遺伝子発現に必須の３’末端領域をコードする配列と、その下流に任意の塩基配列とを含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」を、該任意の塩基配列に対応するプライマーセット、すなわち、上記機能的なマーカー遺伝子発現に必須の３’末端領域をコードする配列と、任意の塩基配列の５’末端領域をコードする配列とを含むセンス（フォワード）プライマーと、任意の塩基配列の３’末端領域に相補的な配列を含むアンチセンス（リバース）プライマーとのプライマーセットを用いて調製することにより、上記共通の「機能的なマーカー遺伝子発現に必須の３’末端領域をコードする配列」が付加された様々な任意の塩基配列を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を簡単に調製することができる。上記本発明の製造方法［Ｉ］により、ライゲーションを行うことなく、２以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を直接酵母に導入するだけで、直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を連結させて所望のＤＮＡ連結体を形成させることが可能であり、さらに、該所望の連結体により形質転換された酵母を培養することにより、該所望のＤＮＡ連結体を増幅させることができることから、効率的な遺伝子のクローニング等を行うことが可能となる。
【００１５】
本発明の１種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなる環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法としては、（ａ）自律複製配列の全部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含む１種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程；（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、所望の環状ＤＮＡ連結体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備える方法（以下、「製造方法［II］」ということもある）であれば特に制限されず、上記製造方法［II］に用いる、「自律複製配列の全部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含む１種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」としては、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内において、機能的な自律複製配列の全部を含み、且つ、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内においてマーカー遺伝子の発現が可能となるような配列を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片であれば、その配列や、長さや、末端の形状によって特に制限されるものではなく、クローニングのターゲットとなる所望の有用物質をコードする遺伝子等の任意の遺伝子ＤＮＡや、高発現プロモーターに連結された所望の有用物質をコードする遺伝子等の任意の遺伝子ＤＮＡの他、任意の配列のＤＮＡをさらに含んでいてもよい。また、上記直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を調製する方法としては、公知の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を調製方法であれば特に制限されず、比較的短い２本鎖ＤＮＡ断片を調整する方法としては、ホスホロアミダイト法やホスファイト法により合成された１本鎖をアニーリングさせる方法や通常のＰＣＲ法により調製する方法を、長いＤＮＡ断片を調製する方法としては、フュージョンＰＣＲ法（特開２００９−２６８３６０参照）により調製する方法を例として好適に挙げることができるが、自律複製配列を含むプライマーを用いたＰＣＲ法であることが特に好ましい。上記製造方法［II］により作製された所望の環状ＤＮＡ連結体は、上記製造方法［II］の工程（ｂ）により選択された形質転換体から、公知の環状ＤＮＡの抽出方法を用いて得ることができる。上記本発明の製造方法［II］により、ライゲーションを行うことなく、自律複製配列を含む１種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を直接酵母に導入するだけで、所望の環状ＤＮＡ連結体を形成させることが可能であり、さらに、上記所望の環状ＤＮＡ連結体により形質転換された酵母を培養することにより、上記所望の環状ＤＮＡ連結体を増幅させることができる。
【００１６】
本発明の２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなる環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法としては、（ａ）自律複製配列の全部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を、１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と組み合わせてクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程であって、上記１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、単独ではマーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含んでおらず、上記自律複製配列を含み、且つ、マーカー遺伝子の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と連結して所望の環状ＤＮＡ連結体を形成した場合にのみマーカー遺伝子の発現が可能となるような配列を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片である前記工程；（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、上記所望の環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備える方法（以下、「製造方法［III］」ということもある）や、（ａ）自律複製配列の一部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を、１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と組み合わせてクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程であって、上記１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、単独では自律複製配列の全部と、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部とを含んでおらず、上記自律複製配列の一部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片と連結して所望の環状ＤＮＡ連結体を形成した場合にのみ、自律複製配列の全部と、マーカー遺伝子の発現が可能となるような配列とを含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片である工程；（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、上記所望の環状ＤＮＡ連結体を含む形質転換体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備える方法（以下、「製造方法［IV］」ということもある）であれば特に制限されず、上記製造方法［III］における「自律複製配列の全部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」としては、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内において、機能的な自律複製配列の全部を含み、且つ、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内において、機能的なマーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含まない２本鎖ＤＮＡ断片であれば特に制限されず、また、「１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」としては、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内において、単独ではマーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含まない２本鎖ＤＮＡ断片であって、所望の環状ＤＮＡ連結体を形成した場合にのみ、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内において、マーカー遺伝子を発現させることが可能となるような配列であれば、その配列や、長さや、末端の形状はどのようなものであってもよい。上記製造方法［IV］における「自律複製配列の一部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」としては、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内において、機能的な自律複製配列の全部を含まず、且つ、クルイベロマイセ��・マルシアヌス菌内において、機能的なマーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含まない２本鎖ＤＮＡ断片であれば特に制限されず、また、上記「１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」としては、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌内において、単独では機能的な自律複製配列の全部を含まず、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含まない２本鎖ＤＮＡ断片であって、上記「自律複製配列の一部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」と連結して所望のＤＮＡ結合体を形成した場合にのみ、該ＤＮＡ結合体中に自律複製配列、及びマーカー遺伝子の発現に必要な配列を含むような２本鎖ＤＮＡ断片であれば、その配列や、長さや、末端の形状はどのようなものであってもよい。
【００１７】
本発明の製造方法［III］に用いる、「自律複製配列の全部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」、及び、「１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」は、クローニングのターゲットとなる所望の有用物質をコードする遺伝子等の任意の遺伝子ＤＮＡや、高発現プロモーターに連結された所望の有用物質をコードする遺伝子等の任意の遺伝子ＤＮＡの他、任意の配列のＤＮＡをさらに含んでいてもよい。また、本発明の製造方法［IV］に用いる、上記「自律複製配列の一部を含み、且つ、マーカー遺伝子の発現に必要な配列の一部を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」、及び、上記「１種以上の他の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片」は、クローニングのターゲットとなる遺伝子配列を含む塩基配列や、高発現プロモーターとその下流に連結された任意の遺伝子配列を含む塩基配列等の任意の塩基配列をさらに含んでいてもよい。上記の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を調製する方法としては、公知の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を調製方法であれば特に制限されず、比較的短い２本鎖ＤＮＡ断片を調整する方法としては、ホスホロアミダイト法やホスファイト法により合成された１本鎖をアニーリングさせる方法や通常のＰＣＲ法により調製する方法を、長いＤＮＡ断片を調製する方法としては、フュージョンＰＣＲ法（特開２００９−２６８３６０）により調製する方法を例として好適に挙げることができるが、自律複製配列を含むプライマーを用いたＰＣＲ法であることが特に好ましい。上記製造方法［III］や［IV］により作製された所望の環状ＤＮＡ連結体は、上記製造方法［III］や［IV］の工程（ｂ）により選択された形質転換体から、公知の環状ＤＮＡの抽出方法を用いて得ることができる。上記本発明の製造方法［III］や［IV］により、ライゲーションを行うことなく、自律複製配列を含む１種の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を直接酵母に導入するだけで、所望の環状ＤＮＡ連結体を形成させることが可能であり、さらに、上記所望の環状ＤＮＡ連結体により形質転換された酵母を培養することにより、上記所望の環状ＤＮＡ連結体を増幅させることができる。
【００１８】
上記本発明の製造方法［Ｉ］〜［IV］において、直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌の導入する方法としては、酵母の形質転換方法として通常用いられる手法であれば特に制限されず、例えば、酢酸リチウム法（J.Bacteriology, 153, p163 (1983)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual）や、エレクトロポレーション法（Meth. Enzym., 194, p182 (1990)）や、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)）等を好適に挙げることができるが、なかでも、酢酸リチウム法を有利に用いることができる。酢酸リチウム法は非常に簡便な方法であるが、他の形質転換方法と比較して形質転換効率が非常に低いことが知られている。しかし、本発明において用いられるクルイベロマイセス・マルシアヌス菌は、直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片により効率的に形質転換することが可能であるため、酢酸リチウム法であっても十分な形質転換効率を得ることができる。
【００１９】
上記マーカー遺伝子としては、酵母において使用しうるマーカー遺伝子であれば特に制限されるものではなく、例えば、宿主となるクロイベロマイセス・マルシアヌス菌の栄養要求性を相補する栄養要求性マーカー遺伝子や、抗生物質等に対する薬剤耐性マーカー遺伝子や、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子や、βガラクトシダーゼをコードする遺伝子等を好適に挙げることができるが、なかでも、栄養要求性マーカー遺伝子であることが好ましい。上記栄養要求性マーカー遺伝子としては、例えば、トリプトファン、アルギニン、ロイシン等のアミノ酸の栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する栄養要求性マーカー遺伝子であっても、アデニン、ウラシル等の核酸の栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する栄養要求性マーカー遺伝子であってもよいが、ウラシル要求性変異株の栄養要求性を相補するＵＲＡ３遺伝子であることが特に好ましい。さらに、本発明においては、２以上のマーカー遺伝子を組み合わせて用いることもできる。
【００２０】
また、上記クルイベロマイセス・マルシアヌス菌としては、特に制限されるものではなく、野生型株であっても、栄養要求性変異株等の遺伝子変異を有する変異株であってもよいが、栄養要求性マーカー遺伝子の発現を指標として容易に形質転換体を選択できることから、栄養要求性変異株であることが好ましく、なかでも、アデニン、ウラシル等の核酸の栄養要求性変異株であることが特に好ましい。例えば、本発明の製造方法［Ｉ］〜［IV］において、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌のウラシル要求性変異株を用いる場合には、マーカー遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子を組み合わせることにより、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌のアデニン要求性変異株を用いる場合には、マーカー遺伝子としてＡＤＥ２遺伝子を組み合わせることにより、所望のＤＮＡ連結体を含む形質転換体を効率的に選択することができる。また、上記ウラシル要求性変異株としては、具体的には、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ４０７１、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ４０７６、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ４０７７等を、アデニン要求性変異株としては、ＲＡＫ６０３８等を例として好適に挙げることができる。
【００２１】
本発明に用いられる自律複製配列としては、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌において自律複製起点となる配列であれば特に制限されるものではないが、例えば、配列番号１に示される塩基配列からなる自律複製配列ＫｍＡＲＳ７（２０１−２５０）（5'-CAAGACTTCTTGAAGTGAAAACCAACTTTCAGTCTTCAAACTAAAAATGA-3'）や、配列番号２に示される塩基配列からなる自律複製配列ＫｍＡＲＳ１１（４６−１０５）（5'-TCCAAAATTAACTTTCTAAGCTAAATGTCATATTTCGCAATAAAATAATAAGAATATAGA-3'）や、配列番号３に示される塩基配列からなる自律複製配列ＫｍＡＲＳ１６（７２１−７９０）（5'-TTTTATTTTTTTTTAACTCAATTTCCAGTTTAAACACCAAAATACGTTTCCATATAATTGAAAAAGGAAG-3'）や、配列番号４に示される塩基配列からなる自律複製配列ＫｍＡＲＳ１８（８０−１５９）（5'-GATTATTATAAGGCATAATGCCAGGAATCTTTCCATAATTTGGAATTGAAAGTCACTTTAGGTTCACTATATAATGAAAA-3'）や、配列番号５に示される塩基配列からなる自律複製配列ＫｍＡＲＳ３６（２９１−３４０）（5'-TCTTTAATATTATTTTTCATTTCAAAAAGTGTGAAATAAAAATTAAAATG-3'）や、配列番号１〜５のいずれかに示される塩基配列において１又は数個の塩基が決失、置換、又は付加された自律複製配列であることが好ましい。上記配列番号１〜５のいずれかに示される塩基配列を含む自律複製配列や、配列番号１〜５のいずれかに示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された自律複製配列を、ＰＣＲ等の公知の方法により任意のＤＮＡ断片に付与することにより、自律複製配列を含む直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片を作製し、本発明の製造方法［II］〜［IV］に用いることができる。
【００２２】
本発明の有用物質の製造方法としては、上記本発明の製造方法［Ｉ］〜［IV］により得られる所望の有用物質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ連結体により形質転換された酵母を培地に培養し、培養物から所望の有用物質を採取する方法であれば特に制限されず、上記有用物質としては特に制限されないが、例えば、抗体やサイトカイン等の組換え医薬用タンパク質等を好適に挙げることができる。クルイベロマイセス・マルシアヌスは、タンパク質生産性が高く、さらに、耐熱性を有する酵母であることから（Biosci. Biotechnol. Biochem. 71: 1170-82, 2007）、本発明の有用物質の製造方法により、安価で効率的な有用物質の製造を行うことが可能となる。
【００２３】
本発明の形質転換酵母の製造方法に有用に用いることができるＤＮＡ連結体製造のためのキットや、環状ＤＮＡ連結体製造のためのキットとしては、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌を備えたものを例示することができ、上記クルイベロマイセス・マルシアヌス菌としては、野生型株であっても、栄養要求性変異株等の遺伝子変異を有する変異株であってもよいが、栄養要求性変異株であることが好ましく、なかでも、アデニン、ウラシル等の核酸の栄養要求性変異株であることが特に好ましい。上記ウラシル要求性変異株としては、具体的には、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ４０７１、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ４０７６、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ４０７７等を、アデニン要求性変異株としては、ＲＡＫ６０３８等を例として好適に挙げることができるが、ウラシル要求性変異株であるクルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５であることが特に好ましい。また、上記本発明の環状ＤＮＡ連結体製造のためのキットは、さらに、配列番号１〜５のいずれかに示される塩基配列を含むプライマーや、配列番号１〜５のいずれかに示される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された自律複製配列を含むプライマーを備えていてもよい。また、上記キットは、マーカー遺伝子をコードする遺伝子配列の全部又は一部を含む２本鎖ＤＮＡや、クルイベロマイセス・マルシアヌス菌を培養するための培地や、緩衝液等を含んでいてもよい。
【００２４】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
［ＵＲＡ３をコードするＤＮＡ連結体の作製］
１．ＤＮＡ断片の調製
サッカロマイセス・セレビシエ  ＢＹ４７０４由来のＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いたＰＣＲ反応を行い、ＵＲＡ３遺伝子の全部又は一部を含むＤＮＡ断片（ＵＲＡ３−２９０−２８０ｃ、ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃ、ＵＲＡ３＋７７２−２８０ｃ）を作製した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列は以下に示す通りである。ＵＲＡ３の全部を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０−２８０ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３−２９０、リバースプライマーとしてＵＲＡ３−２８０ｃを、ＵＲＡ３の一部（Ｎ末端側）を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３−２９０、リバースプライマーとしてＵＲＡ３＋７７１ｃを、ＵＲＡ３の一部（Ｃ末端側）を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７２−２８０ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３＋７７２、リバースプライマーとしてＵＲＡ３−２８０ｃをそれぞれ用いた。
（フォワードプライマー）
ＵＲＡ３−２９０（5'-GAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTC-3'；配列番号６）
ＵＲＡ３＋７７２（5'-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGC-3'；配列番号７）
（リバースプライマー）
ＵＲＡ３＋７７１ｃ（5'-TTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGT-3'；配列番号８）
ＵＲＡ３−２８０ｃ（5'-CAGTCTGTGAAACATCTTTCTACCA-3'；配列番号９）【００２６】
ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間の初期変性を行い、その後、９４℃で２０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で２分３０秒間の伸長反応を３０サイクル行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。反応後、得られたＰＣＲ産物のＤＮＡ濃度を測定し、それぞれのＤＮＡ増幅断片の濃度が１０ｐＭとなるよう調製した。
（反応液）
テンプレート                  ０．４μＬ
１０ｘＢｕｆｆｅｒ            １．０μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ            １．０μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４          ０．４μＬ
フォワードプライマー          ０．２μＬ
リバースプライマー            ０．２μＬ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ  ０．２μＬ
滅菌水                        ６．６μＬ
【実施例２】
【００２７】
２．形質転換体の作製
ウラシル要求性遺伝子変異のクルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５株を、１０ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）に接種して２８℃で２０時間培養した。培養液を回収して２本の１５ｍＬチューブに移し、８０００ｒｐｍで３分間の遠心分離を行った。上清を捨てて、沈殿した細胞に３００μＬ／チューブの形質転換用溶液［２０００μｌの６０％ＰＥＧ３３５０、１５０μＬの４Ｍリチウムアセテート、３００μＬの１Ｍ ＤＴＴ、５５０μＬの滅菌水］を加えて、ボルテックスミキサーにより攪拌した。再び、８０００ｒｐｍで３分間の遠心分離を行って上清を捨て、沈殿した細胞に６００μＬ／チューブの形質転換用溶液を加えた後に、１００μＬ／チューブとなるように１．５ｍＬチューブに分注した。ここに、実施例１で作製したＤＮＡ断片（断片ごとに３μＬずつ）を単独又は組み合わせて加え、４７℃で１５分間熱処理した。１５０μＬの滅菌水を加え、細胞をウラシル欠損培地にスプレッドして２８℃で３日培養し、生育したコロニー数をカウントした。【００２８】
実験の概要を図１に、３回の形質転換実験を行った結果を図２に示す。ＵＲＡ３の全部を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０−２８０ｃにより形質転換した場合には平均２７５個のコロニーが得られた。また、ＵＲＡ３の一部（Ｎ末端側）を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃとＵＲＡ３の一部（Ｃ末端側）を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７２−２８０ｃとを組み合わせて形質転換した場合には平均３６個のコロニーが得られた。一方、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃ、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７２−２８０ｃを単独で用いた場合には、コロニーは全く認められなかった。以上の結果から、ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃ及びＵＲＡ３＋７７２−２８０ｃを組み合わせて導入した形質転換体においては、２つのＤＮＡ断片が結合することにより完全長のＵＲＡ３タンパク質が発現することが明らかとなった。
【実施例３】
【００２９】
［ＵＲＡ３、ＴＤＨ３ｐ、及びｙＣＬｕｃをコードするＤＮＡ連結体の作製］
１．ＤＮＡ断片の調製
サッカロマイセス・セレビシエ  ＢＹ４７０４由来のＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いたＰＣＲ反応を行い、ＵＲＡ３遺伝子の全部又は一部を含むＤＮＡ断片（ＵＲＡ３−２９０−２８０ｃ、ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃ、ＵＲＡ３＋７７２−２８０ｃ）を作製した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーの配列は以下に示す通りである。ＵＲＡ３の全部を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０−２８０ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３−２９０、リバースプライマーとしてＵＲＡ３−２８０ｃを用い、ＵＲＡ３の一部（Ｎ末端側）を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３−２９０、リバースプライマーとしてＵＲＡ３＋７７１ｃを用い、ＵＲＡ３の一部（Ｃ末端側）を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７２−２８０ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３＋７７２、リバースプライマーとしてＵＲＡ３−２８０ｃをそれぞれ用いた。
（フォワードプライマー）
ＵＲＡ３−２９０（5'-GAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTC-3'；配列番号６）
ＵＲＡ３＋７７２（5'-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGC-3'；配列番号７）
（リバースプライマー）
ＵＲＡ３＋７７１ｃ（5'-TTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGT-3'；配列番号８）
ＵＲＡ３−２８０ｃ（5'-CAGTCTGTGAAACATCTTTCTACCA-3'；配列番号９）【００３０】
また、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ４９６０株由来のＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いたＰＣＲ反応を行い、ＴＤＨ３ｐ及びｙＣＬｕｃをコードする配列を含むＤＮＡ断片（ＵＲＡ３＋７７２ＴＡＡ＋１６６２ｃ、ＵＲＡ３＋７７２ＴＡＡ＋１７＋１６６２ｃ）を作製した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下に示す通りである。ＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７２ＴＡＡ＋１６６２ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３＋７７２ＴＡＡ−ＴＤＨ−５２７を、リバースプライマーとしてｙＣＬｕｃ＋１６６２ｃを用い、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７２ＴＡＡ＋１７＋１６６２ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３＋７７２ＴＡＡ＋１７−ＴＤＨ−５２７を、リバースプライマーとしてｙＣＬｕｃ＋１６６２ｃをそれぞれ用いた。
（フォワードプライマー）
ＵＲＡ３＋７７２ＴＡＡ−ＴＤＨ−５２７（5'-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGCAAAACTAAgctgtaacccgtacatgcccaa-3'；配列番号１０）
ＵＲＡ３＋７７２ＴＡＡ＋１７−ＴＤＨ−５２７（5'-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGCAAAACTAAaaaactgtattataagtGCTGTAACCCGTACATGCCCAA-3'；配列番号１１）
（リバースプライマー）
ｙＣＬｕｃ＋１６６２ｃ（5'-CTACTTGCACTCATCTGGGACC-3'；配列番号１２）【００３１】
ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間の初期変性を行い、その後、９４℃で２０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３分間の伸長反応を３０サイクル行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。反応後、得られたＰＣＲ産物のＤＮＡ濃度を測定し、それぞれのＤＮＡ増幅断片の濃度が１０ｐＭとなるよう調製した。
（反応液）
テンプレート                  ０．４μＬ
１０ｘＢｕｆｆｅｒ            １．０μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ            １．０μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４          ０．４μＬ
フォワードプライマー          ０．２μＬ
リバースプライマー            ０．２μＬ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ  ０．２μＬ
滅菌水                        ６．６μＬ
【実施例４】
【００３２】
２．形質転換体の作製
ウラシル要求性遺伝子変異のクルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５株を、２ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）に接種して一晩時間培養した。１．５ｍＬの培養液を回収して別のチューブに移し、１２０００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行った。上清を捨てた後、沈殿した細胞に２００μＬ／チューブの形質転換用溶液［２０００μｌの６０％ＰＥＧ３３５０、１５０μＬの４Ｍリチウムアセテート、３００μＬの１Ｍ ＤＴＴ、５５０μＬの滅菌水］を加えて、ボルテックスミキサーにより攪拌した。再び、１２０００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行って上清を捨て、沈殿した細胞に５０μＬの形質転換用溶液と、実施例３で作製したＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ごとに３μＬずつ）を組み合わせて加えてボルテックスミキサーにより攪拌し、４７℃で１５分間熱処理した。その後、１５０μＬの滅菌水を加え、細胞をウラシル欠損培地にスプレッドして２８℃で３日培養し、生育したコロニー数をカウントした。【００３３】
実験の概要を図３に、形質転換実験を行った結果を図４に示す。ＵＲＡ３の全部を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０−２８０ｃにより形質転換した場合には３２７個のコロニーが、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃとＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７２−２８０ｃとを組み合わせて形質転換した場合には２４３個のコロニーが得られた。また、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃと、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７２ＴＡＡ＋１６６２ｃとを組み合わせて形質転換した場合には１３０個のコロニーが、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃと、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７２ＴＡＡ＋１７＋１６６２ｃとを組み合わせて形質転換した場合には９５個のコロニーが得られた。
【実施例５】
【００３４】
［一部重複又は欠損した配列を有するＤＮＡ断片からなるＤＮＡ連結体の作製］
１．ＤＮＡ断片の調製
サッカロマイセス・セレビシエ  ＢＹ４７０４由来のＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（TOYOBO社製）を用いたＰＣＲ反応を行い、ＵＲＡ３遺伝子の全部又は一部を含むＤＮＡ断片（ＵＲＡ３−２９０−２８０ｃ、ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃ、ＵＲＡ３＋７７２−２８０ｃ、ＵＲＡ３＋７７３−２８０ｃ、ＵＲＡ３＋７７４−２８０ｃ、ＵＲＡ３＋７７０−２８０ｃ、ＵＲＡ３＋７７１−２８０ｃ）を作製した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下に示す通りである。ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０−２８０ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３−２９０、リバースプライマーとしてＵＲＡ３−２８０ｃを、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３−２９０、リバースプライマーとしてＵＲＡ３＋７７１ｃを、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７２−２８０ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３＋７７２、リバースプライマーとしてＵＲＡ３−２８０ｃを、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７３−２８０ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３＋７７３、リバースプライマーとしてＵＲＡ３−２８０ｃを、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７４−２８０ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３＋７７４、リバースプライマーとしてＵＲＡ３−２８０ｃを、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７０−２８０ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３＋７７０、リバースプライマーとしてＵＲＡ３−２８０ｃを、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７１−２８０ｃの作製にはフォワードプライマーとしてＵＲＡ３＋７７１、リバースプライマーとしてＵＲＡ３−２８０ｃをそれぞれ用いた。
（フォワードプライマー）
ＵＲＡ３−２９０（5'-GAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTC-3'；配列番号６）
ＵＲＡ３＋７７２（5'-GCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGC-3'；配列番号７）
ＵＲＡ３＋７７３（5'-CATATTtGAGAAGATGCGGCCA-3'；配列番号１３）
ＵＲＡ３＋７７４（5'-ATATTtGAGAAGATGCGGCCAG-3'；配列番号１４）
ＵＲＡ３＋７７０（5'-AaGCATATTtGAGAAGATGCGG-3'；配列番号１５）
ＵＲＡ３＋７７１（5'-aGCATATTtGAGAAGATGCGGC-3'；配列番号１６）
（リバースプライマー）
ＵＲＡ３＋７７１ｃ（5'-TTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGT-3'；配列番号８）
ＵＲＡ３−２８０ｃ（5'-CAGTCTGTGAAACATCTTTCTACCA-3'；配列番号９）【００３５】
ＰＣＲ反応は、９４℃で１分間の初期変性を行い、その後、９４℃で２０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で２分３０秒間の伸長反応を３０サイクル行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。反応後、得られたＰＣＲ産物のＤＮＡ濃度を測定し、それぞれのＤＮＡ増幅断片の濃度が１０ｐＭとなるよう調製した。
（反応液）
テンプレート                  ０．４μＬ
１０ｘＢｕｆｆｅｒ            １．０μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ            １．０μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４          ０．４μＬ
フォワードプライマー          ０．２μＬ
リバースプライマー            ０．２μＬ
ＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ  ０．２μＬ
滅菌水                        ６．６μＬ
【実施例６】
【００３６】
２．形質転換体の作製
ウラシル要求性遺伝子変異のクルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５株を、２ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）に接種して一晩時間培養した。１．５ｍＬの培養液を回収して別のチューブに移し、１２０００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行った。上清を捨てた後、沈殿した細胞に２００μＬ／チューブの形質転換用溶液［２０００μｌの６０％ＰＥＧ３３５０、１５０μＬの４Ｍリチウムアセテート、３００μＬの１Ｍ ＤＴＴ、５５０μＬの滅菌水］を加えて、ボルテックスミキサーにより攪拌した。再び、１２０００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行って上清を捨て、沈殿した細胞に５０μＬの形質転換用溶液と、実施例５で作製したＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片ごとに３μＬずつ）を組み合わせて加えてボルテックスミキサーにより攪拌し、４７℃で１５分間熱処理した。その後、１５０μＬの滅菌水を加え、細胞をウラシル欠損培地にスプレッドして２８℃で３日培養し、生育したコロニー数をカウントした。【００３７】
形質転換実験を行った結果を図５に示す。ＵＲＡ３の全部を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０−２８０ｃにより形質転換した場合には３２９個のコロニーが得られた。また、ＵＲＡ３の一部（Ｎ末端側）を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃとＵＲＡ３の一部（Ｃ末端側）を含むＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７２−２８０ｃとを組み合わせて形質転換した場合には１８２個のコロニーが得られた。また、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃとＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７３−２８０ｃ、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃとＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７４−２８０ｃの２つの組合せは、ＤＮＡ断片が結合してもＵＲＡ３をコードする塩基配列から１又は２塩基が欠損した連結配列となるＤＮＡ断片を組合せたものであるが、このような組合せであっても、それぞれ少数のコロニー（それぞれ４、１個）が確認できた。一方、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃとＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７０−２８０ｃ、ＤＮＡ断片ＵＲＡ３−２９０＋７７１ｃとＤＮＡ断片ＵＲＡ３＋７７１−２８０ｃの２つの組合せはＤＮＡ断片が結合した場合にＵＲＡ３をコードする塩基配列から１又は２塩基が重複した連結配列を形成するＤＮＡ断片の組合せであるが、このような組合せの結果、それぞれ２８、２１個のコロニーが確認できた。
以上の結果から、ＵＲＡ３遺伝子のＮ末端側をコードするＤＮＡ断片と、ＵＲＡ３遺伝子のＣ末端側をコードする配列を５’側に配置したＤＮＡ断片を作製し、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５株に導入することにより、目的のＤＮＡ配列を含む形質転換体を得ることができることが明らかとなった。
【実施例７】
【００３８】
［クルイベロマイセス・マルシアヌスの自律複製配列の同定］
クルイベロマイセス・マルシアヌスにおける自律複製配列（ＡＲＳ）を特定する目的で以下の実験を行った。クルイベロマイセス・マルシアヌス由来のゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、出芽酵母用単コピーベクターｐＲＳ３１６（Sikorski and Hieter, 1989; Genetics 122, 19-27）に挿入した（図６）。このベクターを大腸菌に導入して６８６８個のコロニーを得た。これらのコロニーからプラスミドを抽出／精製して、クルイベロマイセス・マルシアヌスのゲノムＤＮＡライブラリを作製し、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入した（図７）。５−ＦＯＡ培地を用いてＵＲＡ３の脱落した株を選抜することにより、形質転換したプラスミド配列がゲノムに挿入されていないコロニーのみを選択した（図８）。【００３９】
このようにして得られた１６８株の形質転換体を培養して、Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep Kit II（Zymoresearch社製）を用いてプラスミドを精製し、大腸菌の形質転換を行った。さらに、大腸菌からプラスミドを抽出／精製し、ウラシル要求性遺伝子変異のクルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５を形質転換した（図９）。その結果、図１０に示すような１４種類のプラスミドを取得した。プラスミドＫｍＡＲＳ７に含まれる配列を配列番号１７に、プラスミドＫｍＡＲＳ１１に含まれる配列を配列番号１８に、プラスミドＫｍＡＲＳ１４に含まれる配列を配列番号１９に、プラスミドＫｍＡＲＳ１６に含まれる配列を配列番号２０に、プラスミドＫｍＡＲＳ１８に含まれる配列を配列番号２１に、プラスミドＫｍＡＲＳ２２に含まれる配列を配列番号２２に、プラスミドＫｍＡＲＳ３６に含まれる配列を配列番号２３に、プラスミドＫｍＡＲＳ４５に含まれる配列を配列番号２４に、プラスミドＫｍＡＲＳ５１に含まれる配列を配列番号２５にそれぞれ示す。【００４０】
続いて、ＫｍＡＲＳ領域を決定する目的でDeletion mutant を作製して実験を行った。図１１に実験の概要を示す。実験の結果、図１２に示すように、ＫｍＡＲＳ７の２０５〜２５０ｂｐにあたる領域（配列番号１）、ＫｍＡＲＳ１１の４６〜１０５ｂｐにあたる領域（配列番号２）、ＫｍＡＲＳ１６の７２１〜７００ｂｐにあたる領域（配列番号３）、ＫｍＡＲＳ７の８０〜１５９ｂｐにあたる領域（配列番号４）、ＫｍＡＲＳ３６の２９１〜３４０ｂｐにあたる領域（配列番号５）が、ＫｍのＡＲＳであることが決定された。
以上のことから、図１３に示すように、今回同定された５０〜６０ｂｐのＫｍのＡＲＳを、任意のＤＮＡ断片に付加して、クルイベロマイセス・マルシアヌスに導入することにより、形質転換細胞内で環状ＤＮＡを構築できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年9月26日(2011.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片からなるＤＮＡ連結体を含む形質転換酵母の製造方法であって、前記２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、それぞれ単独ではマーカー遺伝子の発現に必要な配列の全部を含んでおらず、複数の２本鎖ＤＮＡ断片が連結して所望のＤＮＡ連結体を形成した場合にのみマーカー遺伝子の発現が可能となるような配列を含む、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えることを特徴とする方法。
（ａ）前記２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片をクルイベロマイセス・マルシアヌス菌に導入する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）により得られる、上記所望のＤＮＡ連結体を含む形質転換体を、マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程；
【請求項２】
２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、自律複製配列を含まないＤＮＡ断片であって、所望のＤＮＡ連結体が、ゲノムＤＮＡ中に挿入されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片のうち１種が、自律複製配列の全部を含み、所望のＤＮＡ連結体が、環状であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
２種以上の直鎖状の２本鎖ＤＮＡ断片が、自律複製配列の一部を含み、それぞれ単独では自律複製配列の全部を含んでおらず、複数の２本鎖ＤＮＡ断片が連結した場合にのみ、自律複製配列の全部の発現が可能となるような配列を含むＤＮＡ断片であって、所望のＤＮＡ連結体が環状であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
自律複製配列が、配列番号１〜５のいずれかに示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項３又は４に記載の製造方法。
【請求項６】
ＤＮＡ連結体が、さらに、所望の有用物質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
クルイベロマイセス・マルシアヌス菌が、クルイベロマイセス・マルシアヌス  ＲＡＫ３６０５であり、マーカー遺伝子がＵＲＡ３遺伝子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
配列番号１〜５のいずれかに示されるクルイベロマイセス・マルシアヌス菌のＡＲＳ配列。
【国際調査報告】
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