(57)【要約】  本発明は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、色素マーカー、及び比重増加剤を含む逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用の組成物を提供する。さらには、本発明は、当該組成物を含み、酵素溶液の保存条件として一般的な−２０〜−３０℃の保存条件下でも凍結しない、操作性に優れたワンステップＲＴ−ＰＣＲ用のプレミックス試薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用の組成物であって、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、色素マーカー、及び比重増加剤を含む組成物。
【請求項２】
比重増加剤が、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール及びその組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
色素マーカーが、タートラジン、アシッドレッド１８、キシレンシアノール及びその組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
比重増加剤として、２０〜３０容量％のグリセロール、及び２．５〜７．５重量／容量％のポリエチレングリコールを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
比重増加剤として５〜７．５容量％のエチレングリコールを更に含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物、並びに鋳型として用いるＲＮＡ、及び少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマーを含む逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用の反応液。
【請求項７】
比重増加剤として、４〜６容量％のグリセロール、及び０．５〜１．５重量／容量％のポリエチレングリコールを含む、請求項６に記載の反応液。
【請求項８】
比重増加剤として１〜１．５容量％のエチレングリコールを更に含む、請求項７に記載の反応液。
【請求項９】
ｃＤＮＡの合成方法であって、請求項６〜８のいずれか一項に記載の反応液を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に供する工程を含む方法。
【請求項１０】
ＲＮＡの検出方法であって、
（Ａ）請求項６〜８のいずれか一項に記載の反応液を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に供する工程、及び
（Ｂ）工程（Ａ）において増幅されたｃＤＮＡを、電気泳動により検出する工程、
を含む方法。
【請求項１１】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用のキットであって、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素を含有する酵素溶液、並びに色素マーカー及び比重増加剤を含有する反応緩衝液を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に有用な組成物、該組成物を用いるｃＤＮＡの合成方法、該組成物を用いるＲＮＡの検出方法、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用キットに関する。
なお、本願は、２００９年９月１日出願の日本国特許出願第２００９−２０１５６１号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２００９−２０１５６１号の全内容を本願に組み込むものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）法は、試験管内において簡便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、遺伝子に関する研究のみならず生物学、医学、農業等幅広い分野において不可欠の実験手法となっている。ＰＣＲ法は、ＲＮＡの検出方法にも応用され、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ−ＰＣＲ）法と呼ばれている。ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、すなわち逆転写活性を有する逆転写酵素、あるいは逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡに相補的なＤＮＡ転写物（ｃＤＮＡ）を合成し、続いてこれを鋳型としてＰＣＲを行うことによりＲＮＡ由来のｃＤＮＡを特異的に増幅、検出する方法である。ＲＴ−ＰＣＲ法は、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡのクローニングやｃＤＮＡライブラリーの作製に利用されるほか、特定のｍＲＮＡの発現状態を調べる方法としても有用である。【０００３】
一般的に、ＲＴ−ＰＣＲ法は、まず逆転写反応によってｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅する２段階の反応系を用いる。しかしながら、この方法ではサンプルが多くなればなるほど労力と時間がかかるうえ、サンプル間のコンタミネーションの恐れも高くなる。この問題の改善策として、逆転写反応とＰＣＲとを連続的に１つの容器内で行うことができるワンステップＲＴ−ＰＣＲ法が開発された（非特許文献１）。この方法は、逆転写酵素及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを同一反応系に存在させ、ＲＮＡを鋳型に用いるｃＤＮＡ合成と合成されたｃＤＮＡを鋳型に用いるＰＣＲ増幅とを温度プログラムにより制御可能にしたシステムである。【０００４】
ＲＴ−ＰＣＲ等の遺伝子増幅反応によって生成された増幅産物の解析法としては、増幅産物の鎖長とその量を同時に知ることができる電気泳動法がよく使用されている。電気泳動による増幅産物の解析は、反応後の溶液の一部をとってこれに試料用色素緩衝液（ローディング・バッファー）を添加し、電気泳動に供するのが一般的である。このような試料用色素緩衝液は、泳動距離の指標となる成分として色素（色素マーカー）を含み、反応液をゲルのウェル内に容易にアプライできるように反応液の比重を増加させる成分（比重増加剤）としてグリセロール等を含んでいる。【０００５】
多数の試料について遺伝子増幅法を実施し、その結果の解析を電気泳動によって行う場合、個々の反応液を試料用色素緩衝液と混合して電気泳動に供するのは非常に煩雑な作業である。この作業は増幅反応が終った容器からの反応液の採取、試料用色素緩衝液の添加、混合といった一連の操作を要し、また、混合のための新たな容器も必要である。更に操作中に試料を取り違えてしまう危険もある。この問題を解決するため、ＰＣＲ後の反応液を直接電気泳動に供することができる、予め色素マーカーと比重増加剤とが加えられたＰＣＲ用の反応液が開発されている（特許文献１）。しかしながら、異なる２つの酵素の両方に対して色素マーカー及び比重増加剤が悪影響を及ぼさないようにする必要があるため、予め色素マーカーと比重増加剤とが加えられたワンステップＲＴ−ＰＣＲ用の反応液の開発は困難と考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３５８７２８４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第１８巻、第４号、第６７８頁−第６８７頁（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、色素マーカーと比重増加剤とを含み、かつ逆転写酵素による逆転写反応及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲの２つの反応を効率よく実施することが可能な、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、色素マーカー及び比重増加剤を含む組成物であっても、逆転写酵素による逆転写反応及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲの両方の反応に悪影響を及ぼすことがなく、反応性に優れたワンステップＲＴ−ＰＣＲが実施可能であり、かつＲＴ−ＰＣＲ後の反応液を電気泳動用ゲルに直接供することが可能であることを見出した。更には、当該組成物を用いて、酵素溶液の保存条件として一般的な−２０〜−３０℃の保存条件下でも凍結しない、操作性に優れたワンステップＲＴ−ＰＣＲ用の５倍濃度のプレミックス試薬を調製することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明の第１の態様は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、色素マーカー、及び比重増加剤を含む逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用の組成物に関する。本発明の第一の態様における比重増加剤としては、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール又はその組合せが、色素マーカーとしては、タートラジン、アシッドレッド１８、キシレンシアノール又はその組合せが例示される。本発明の第１の態様の組成物に含まれる比重増加剤としては、２０〜３０容量％のグリセロール、及び２．５〜７．５重量／容量％のポリエチレングリコールが例示され、更に、５〜７．５容量％のエチレングリコールが比重増加剤として含まれていてもよい。【００１１】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の組成物、並びに鋳型として用いるＲＮＡ、及び少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマーを含む逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用の反応液に関する。本発明の第２の態様の反応液に含まれる比重増加剤としては、４〜６容量％のグリセロール、及び０．５〜１．５重量／容量％のポリエチレングリコールが例示され、更に、１〜１．５容量％のエチレングリコールが比重増加剤として含まれていてもよい。【００１２】
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様の反応液を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に供する工程を含むｃＤＮＡの合成方法に関する。【００１３】
本発明の第４の態様は、（Ａ）本発明の第２の態様の反応液を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に供する工程、及び（Ｂ）工程（Ａ）において増幅されたｃＤＮＡを、電気泳動により検出する工程を含む、ＲＮＡの検出方法に関する。【００１４】
本発明の第５の態様は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素を含有する酵素溶液、並びに色素マーカー及び比重増加剤を含有する反応緩衝液を含む、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用のキットに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、簡便で、コンタミネーションの発生及び試料の取り違いの可能性が低く、かつ反応性が優れた、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用組成物、該組成物を用いるｃＤＮＡの合成方法、該組成物を用いるＲＮＡの検出方法、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】比重増加剤としてポリエチレングリコール含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ用反応液を使用して得られた反応産物の、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図２】比重増加剤として６％のグリセロール及び種々の濃度のポリエチレングリコールを含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ用反応液を使用して得られた反応産物の、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図３】比重増加剤として種々の濃度のグリセロール、ポリエチレングリコール及び／又はエチレングリコールを含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ用反応液を使用して得られた反応産物の、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（１）本発明の組成物
本発明の組成物は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、色素マーカー、比重増加剤、及び反応緩衝剤を含む。
【００１８】
本明細書において、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとは、７５℃以上の温度で３０分間処理した後であっても活性を保持するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをいう。本発明において、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、及び／又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を更に有するものでもよい。
【００１９】
本発明に使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に本発明を限定するものではないが、高度好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼが例示される。高度好熱菌とは、７５℃以上の環境下でも生育できる菌のことをいう。高度好熱菌としては、例えば、真正細菌ではＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、及びＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓのようなＴｈｅｒｍｕｓ属の真正細菌、古細菌ではＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｓｅｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのようなＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属の古細菌、並びにＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｌｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＫＳ−１、及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓのようなＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属の古細菌が挙げられる。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、天然由来酵素又は組換体酵素のいずれも本発明に使用でき、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する範囲で天然由来のアミノ酸配列に改変が施された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼも本発明に使用できる。
【００２０】
本発明の組成物には、２種類以上の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが含まれていても良い。２種類以上の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さない耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせが例示される。なお、２種類の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液でＰＣＲを行うこのような技術は、ＬＡ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  ＰＣＲ）として知られている。
【００２１】
本発明の組成物中の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、当該組成物を使用して調製されるＲＴ−ＰＣＲ反応液中においてＰＣＲに適した濃度となるように設定すればよい。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応液量２５μＬでＤＮＡ合成反応を行う場合、反応液中の該酵素の量は０．１２５〜５Ｕであってもよい。なお、本明細書に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性は市販の酵素の表示に基づくものであり、例えば、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型／プライマーとして用い、活性測定用反応液（２５ｍＭ  ＴＡＰＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、各２００μＭ  ｄＡＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＴＴＰ、１００μＭ  ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ及び０．２５ｍｇ／ｍＬ  活性化サケ精子ＤＮＡ）中にて、７４℃において３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１Ｕとしてもよい。
【００２２】
本発明に使用される逆転写酵素は、逆転写活性、すなわちＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであればよく、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ由来逆転写酵素）、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ由来逆転写酵素）等のウイルス由来の逆転写酵素、好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の逆転写酵素が例示される。本発明には、ウイルス由来の逆転写酵素が好適に使用され、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素がより好適に使用される。また、逆転写酵素として天然由来酵素又は組換体酵素のいずれも本発明に使用でき、逆転写活性を有する範囲で天然由来のアミノ酸配列に改変が施された逆転写酵素も本発明に使用できる。
【００２３】
本発明の組成物中の逆転写酵素の濃度は、当該組成物を使用して調製されるＲＴ−ＰＣＲ反応液中において逆転写反応に適した濃度となるように設定すればよく、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを行う際の反応液中の濃度が従来のワンステップＲＴ−ＰＣＲにおいて使用されていた濃度となるように設定してもよい。例えば、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素を用いて反応液量５０μＬでワンステップＲＴ−ＰＣＲを行う場合、反応液中の該酵素量は１〜２００Ｕであってもよく、ｃＤＮＡ合成効率の観点から、好ましくは５Ｕ〜６０Ｕであり、更に好ましくは１０〜３０Ｕである。なお、本明細書に記載の逆転写酵素の活性は市販の酵素の表示に基づくものであり、例えば、Ｐｏｌｙ（ｒＡ）・ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８を鋳型／プライマーとし、３７℃、１０分間に１ｎｍｏｌの［３Ｈ］ｄＴＴＰを取り込む酵素活性を１Ｕとしてもよい。
【００２４】
本発明に使用される色素マーカーは、ＲＴ−ＰＣＲ後の電気泳動時に泳動距離の指標として利用可能なものであり、逆転写酵素による逆転写反応と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲとを阻害しないものであれば特に限定はない。電気泳動時に泳動距離の指標として利用可能な色素マーカーとしては、タートラジン、オレンジＧ、オレンジＧＩＩ、ブロモフェノールブルー、アシッドブルー９、ポンソーＳ、アシッドレッド１８、キシレンシアノール、ファーストグリーンＦＣＦ、アミドブラック等が例示される。本発明の組成物には、１種類の色素マーカーのみが含まれていてもよいが、２種類又はそれ以上の色素マーカーが含まれていてもよい。２種類の色素マーカーが本発明の組成物に含まれる場合、本発明を特に限定するものではないが、キシレンシアノールとタートラジンとの組み合わせ、キシレンシアノールとアシッドレッド１８との組み合わせが好適に例示される。
【００２５】
本発明の組成物中の色素マーカーの濃度は、反応液中で逆転写反応及びＰＣＲを阻害せず、かつ電気泳動時に泳動距離の指標として目視可能な濃度であればよい。当該組成物を使用して調製されるＲＴ−ＰＣＲ反応液中での濃度が、例えば、キシレンシアノールであれば１０〜２５０ｎｇ／μＬ、オレンジＧＩＩでは２５〜１００ｎｇ／μＬ、ポンソーＳでは２５〜５０ｎｇ／μＬとなるように設定されるのが適当である。
【００２６】
本発明に使用される比重増加剤とは、ＲＴ−ＰＣＲ後の反応液のゲルのウェルへの添加が容易となるよう、反応液の比重を高めることが可能な化合物のことを言う。比重増加剤としては、例えば、グリセロール、エチレングリコール（ＥＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ショ糖等が挙げられる。その反応液中での濃度は、逆転写酵素による逆転写反応及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲに悪影響を与えず、かつ反応液に適度な比重を与える範囲であれば、特に限定はない。ＲＴ−ＰＣＲを行う際の反応液中の濃度が、例えば、グリセロールでは２〜６容量％（ｖ／ｖ％）、ポリエチレングリコールでは０．５〜１０重量／容量％（ｗ／ｖ％）、エチレングリコールでは１〜３ｖ／ｖ％となるのが適当である。また、ＲＴ−ＰＣＲを行う際の反応液中のポリエチレングリコールが３〜１０ｗ／ｖ％である反応液では、反応産物の増幅量が大きい。従って、本発明の組成物は、このような濃度で比重増加剤を含有する反応液を調製可能なように設計されることが好ましい。
【００２７】
本発明の組成物には、１種類の比重増加剤のみが含まれていてもよいが、２種類又はそれ以上の比重増加剤が含まれていてもよい。２種類以上の比重増加剤が本発明の組成物に含まれる場合、本発明を特に限定するものではないが、その組み合わせとしてグリセロール、ポリエチレングリコール、及びエチレングリコールからなる群より選択された２種以上の比重増加剤の組み合わせが好適に例示される。例えば、６ｖ／ｖ％のグリセロール及び０．５〜２ｗ／ｖ％のポリエチレングリコールを比重増加剤として含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ用の反応液は、６ｖ／ｖ％のグリセロールのみを比重増加剤として含む反応液を用いた場合と比較して反応産物の増幅量が大きいことから、当該反応液の調製に適した組成物は本発明に好適である。本発明の好適な態様として、３０ｖ／ｖ％のグリセロールと２．５〜７．５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコールとを比重増加剤として含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ用の５倍濃度のプレミックス試薬、２０〜３０ｖ／ｖ％のグリセロール、２．５〜７．５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール、及び５〜７．５ｖ／ｖ％エチレングリコールを比重増加剤として含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ用の５倍濃度のプレミックス試薬等が例示される。これらのプレミックス試薬は、−２０〜−３０℃の保存条件下でも凍結せず、かつＲＴ−ＰＣＲに利用した際に優れた反応性を示すため、本発明の組成物として好適である。
【００２８】
本発明の組成物には、反応緩衝剤、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、マグネシウム塩及び／又はマンガン塩が更に含まれていてもよい。
【００２９】
反応緩衝剤とは、反応溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物又は混合物のことをいう。一般に、弱酸及びその塩、あるいは弱塩基及びその塩の混合溶液は強い緩衝作用を持つので、反応緩衝剤としてｐＨコントロールの目的で広く用いられている。本発明の組成物のｐＨは、遺伝子増幅反応が実施される通常の範囲、例えば、ｐＨ８．３〜ｐＨ９．５の範囲に設定されることが適当である。
【００３０】
デオキシリボヌクレオチドは、有機塩基に結合したデオキシリボースにホスホエステル結合によってリン酸基が結合したものである。天然型ＤＮＡは、各々４つの異なるヌクレオチドを含有する。アデニン、グアニン、シトシン及びチミン塩基を有するヌクレオチドが天然型ＤＮＡに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンはそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴと略されることが多い。
【００３１】
本発明に使用されるデオキシリボヌクレオチドは、遊離の三リン酸型（すなわち、リン酸基が３つのリン酸部分を有する）デオキシリボヌクレオチド、すなわち、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）であり、更にそれらの誘導体を使用することもできる。デオキシリボヌクレオチド誘導体は、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ又は核酸分解に抵抗性を示すデオキシヌクレオチド誘導体を含む。ヌクレオチド誘導体は、例えば、検出を可能にするために、３２Ｐもしくは３５Ｓなどの放射性同位体、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分又は酵素で標識されているデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００３２】
反応緩衝剤、デオキシリボヌクレオチド、並びにマグネシウム塩及び／又はマンガン塩）を含有する本発明の組成物は、ＲＴ−ＰＣＲの実施前に鋳型として用いるＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー、及び必要に応じて水を加えるのみでＲＴ−ＰＣＲ用の反応液とすることができる。すなわち、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ用のプレミックス試薬は、本発明の組成物の態様の一つである。この場合、例えば、本発明の組成物に鋳型として用いるＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマーを加え、及び必要に応じて水を加えて本発明の組成物を１．５〜５倍に希釈することにより、ワンステップＲＴ−ＰＣＲの反応液を調製することができる。なお、６倍以上の希釈を必要とするプレミックス試薬は、反応液を調製する際の計量誤差が大きくなりすぎるため、本発明の態様としては好ましくない。
【００３３】
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ用のプレミックス試薬は、酵素溶液の保存で一般的な、−２０〜−３０℃での保存で凍結しないものが好ましい。プレミックス試薬がその保存条件下で凍結しなければ、プレミックス試薬の使用時に融解及び混合の操作を必要とせず、また、凍結／融解の繰り返しによる酵素の失活を避けることができる。
【００３４】
例えば、３０ｖ／ｖ％のグリセロールと２．５〜７．５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコールとを比重増加剤として含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ用のプレミックス試薬、並びに２０〜３０ｖ／ｖ％のグリセロール、２．５〜７．５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール、及び５〜１．５ｖ／ｖ％のエチレングリコールを比重増加剤として含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ用のプレミックス試薬は、−２０〜−３０℃の保存条件下でも凍結せず、かつＲＴ−ＰＣＲに利用した際に優れた反応性を示すので、本発明の組成物として好適である。
【００３５】
また、上記のプレミックス試薬を用いて調製されるＲＴ−ＰＣＲ用の反応液も、本発明に包含される。本発明の反応液は、本発明の組成物と、鋳型として用いるＲＮＡ、及び少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて調製することができる。
【００３６】
鋳型として用いるＲＮＡは、プライマーがハイブリダイズした場合に、プライマーからの逆転写反応の鋳型として働くことができるＲＮＡである。本発明の組成物には、１種類の鋳型を含んでも、又は異なるヌクレオチド配列を有する複数種の鋳型を含んでもよい。特定の鋳型に特異的なプライマーを使用することによって、核酸混合物中の複数種の鋳型についてプライマー伸長産物を作製することができる。複数の鋳型は、異なる核酸内に存在しても、同一の核酸内に存在してもよい。
【００３７】
本発明に適用することができる鋳型として用いるＲＮＡとしては特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子群（例えば、共通の塩基配列モチーフを有するＲＮＡ分子群、ＲＮＡポリメラーゼによる転写物、サブトラクション法によって濃縮されたＲＮＡ分子群）が挙げられ、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能な任意のＲＮＡが挙げられる。
【００３８】
本発明において、鋳型として用いるＲＮＡは、例えば、細胞、組織又は血液のような生体由来試料、食品、土壌又は排水のような生物を含有する可能性のある試料等に含有されたものであっても良く、該試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物に含有されたものであっても良い。該調製物としては、例えば、細胞破砕物又はそれを分画して得られる試料、該試料中の全ＲＮＡ、あるいは特定のＲＮＡ分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が挙げられる。
【００３９】
オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド又は鋳型ＲＮＡから合成されるｃＤＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、使用される反応条件において鋳型として用いるＲＮＡ又はｃＤＮＡに対してアニールするものであれば特に限定されるものではない。なお、オリゴ（ｄＴ）等のオリゴヌクレオチドやランダムな配列を有するオリゴヌクレオチド（ランダムプライマー）もオリゴヌクレオチドプライマーとして本発明に利用することができる。プライマーの鎖長は、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えば公知の方法により化学的に合成することができる。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば、天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製しても良い。
【００４０】
本発明の組成物中のオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、ＲＴ−ＰＣＲを行う際の反応液中の濃度がワンステップＲＴ−ＰＣＲに適した濃度となるように設定すればよく、特に制限はないが、０．１〜１μＭの濃度であれば良い。
【００４１】
（２）本発明のｃＤＮＡの合成方法
本発明のｃＤＮＡの合成方法は、本発明のＲＴ−ＰＣＲ用の反応液を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に供する工程を含む。当該逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、逆転写反応終了後にそのままポリメラーゼ連鎖反応を実施するワンステップ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応であることが好ましい。
【００４２】
本発明のｃＤＮＡの合成方法における逆転写反応の条件は、鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件であれば特に限定はない。鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件とは、特に限定するものではないが、温度条件としては２５〜６０℃が例示され、３０〜５０℃がより好適である。また、反応時間としては、５〜１２０分間が例示され、１５〜６０分間がより好適である。なお、ワンステップＲＴ−ＰＣＲにおける逆転写反応は、一般的な逆転写反応の温度よりも高い温度で実施されることがある［バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第１８巻、第４号、第６７８頁−第６８７頁（１９９５）］。一般的な逆転写反応よりも高い温度での逆転写反応では、反応時間の経過に伴って逆転写酵素が失活するが、その一方で、プライマーのアニーリングの特異性が向上するうえ鋳型として用いるＲＮＡの二次構造による影響も回避でき、結果として逆転写反応の特異性の向上及び反応感度の向上が認められる。例えば、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素を用いる逆転写反応の一般的な逆転写反応の温度は４２℃であり、この逆転写酵素の反応初速度の至適温度は４４〜５０℃［ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、第１４３巻、第２６１頁〜第２６８頁（２００８）］であるが、ＲＴ−ＰＣＲの感度及び特異性の向上のために、４５〜５０℃、あるいはＭＭＬＶ由来逆転写酵素の至適温度よりも高い５０℃以上の温度で逆転写反応を実施してもよい。
【００４３】
本発明のｃＤＮＡの合成方法では、上記の逆転写反応後に、逆転写酵素が不活化する条件で反応液をインキュベートしてもよい。逆転写酵素を不活化する条件としては、例えば、９４℃で２分間でインキュベートする条件が例示される。
【００４４】
本発明のｃＤＮＡの合成方法におけるポリメラーゼ連鎖反応の条件は、一般的なＰＣＲの条件が適用でき、例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング及びプライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、又は「シャトルＰＣＲ」［『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質核酸  酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６）］と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリング及び伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応により実施される。
【００４５】
（３）本発明のＲＮＡの検出方法
本発明のＲＮＡの検出方法は、（Ａ）本発明のＲＴ−ＰＣＲ用の反応液を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に供する工程、及び（Ｂ）工程（Ａ）において増幅されたｃＤＮＡを、電気泳動により検出する工程を含む。上記の工程（Ａ）における逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、「（２）本発明のｃＤＮＡの合成方法」と同様の条件で実施することができる。
【００４６】
上記の工程（Ｂ）における電気泳動としては、例えば、アガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動が例示される。電気泳動に用いられる泳動用緩衝液（泳動バッファー）としては、アガロースゲル電気泳動の場合、ＴＡＥバッファー又はＴＢＥバッファー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の場合、ＴＢＥバッファーが一般的である。アガロースゲル電気泳動の場合、ＴＡＥバッファーは数ｋｂ以上の長鎖のＤＮＡの分離に優れ、ＴＢＥバッファーは単鎖のＤＮＡの分離に優れている。工程（Ａ）において実施されたＲＴ−ＰＣＲ後の反応液は、泳動バッファーとしてＴＡＥバッファー又はＴＢＥバッファーのいずれを用いる場合も、試料用色素緩衝液を加えることなく、そのまま電気泳動に供することが可能である。
【００４７】
（４）本発明の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用のキット
本発明の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用のキットは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素を含有する酵素溶液、並びに色素マーカー及び比重増加剤を含有する反応緩衝液
を含む。
【００４８】
当該酵素溶液に含まれる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素、並びに当該反応緩衝液に含まれる色素マーカー及び比重増加剤としては、前記の「（１）本発明の組成物」において例示されたものが好適に利用できる。なお、比重増加剤は、反応緩衝液だけでなく酵素溶液にも含まれていてもよい。
【００４９】
色素マーカー及び比重増加剤を含有する反応緩衝液には、前記の「（１）本発明の組成物」において例示される、反応緩衝剤、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、マグネシウム塩及び／又はマンガン塩が更に含まれていてもよい。
【００５０】
本発明のキットに含まれる酵素溶液と反応緩衝液とを混合し、鋳型として用いるＲＮＡ、オリゴヌクレオチドプライマー、及び必要に応じて水を更に加えることにより、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用の反応液を調製することができる。
【実施例】
【００５１】
実施例１
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ用反応液への、色素マーカー及び比重増加剤の添加を検討した。ＲＴ−ＰＣＲ用反応液の調製には、逆転写酵素及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）に含まれるＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  １  ｓｔｅｐ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを用いた。鋳型として、ＨＬ６０細胞から取得した全ＲＮＡを用い、プライマーとして、ＣＣＮＤ２遺伝子の２．８ｋｂの領域を増幅するためのプライマー対、ＣＣＮＤ２Ｆ（配列番号：１）及びＣＣＮＤ２Ｒ（配列番号：２）を用いた。【００５２】
まず、対照として、色素マーカー及び比重増加剤を添加しない２５μＬの反応液５種類（それぞれ５０ｐｇ、５００ｐｇ、５ｎｇ、５０ｎｇ及び５００ｎｇの鋳型全ＲＮＡを含む）を調製した。対照の反応液の調製には、逆転写酵素及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２に含まれるＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  １  ｓｔｅｐ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを１μＬ使用した。また、反応液の酵素及び鋳型全ＲＮＡ以外の組成は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１４ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、各０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、１２．５ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％  ＢＳＡ、４００ｎＭ  ＣＣＤＮ２Ｆ、及び４００ｎＭ  ＣＣＤＮ２Ｒとした。上記のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  １  ｓｔｅｐ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘは、ＭＭＬＶ由来の逆転写酵素であるＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＲＴａｓｅと、２種類の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの混合物であるＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）ＨＳとを含む酵素混合液である。なお、上記反応液は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  １  ｓｔｅｐ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘから持ち込まれる終濃度２ｖ／ｖ％のグリセロールを含む。【００５３】
次に、色素マーカーとしてＸｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ＦＦ（ナカライテスク社製）又はＴａｒｔｒａｚｉｎｅ（ナカライテスク社製）を含み、比重増加剤としてグリセロールを含む２５μＬの反応液１〜７を、５０ｐｇ、５００ｐｇ、５ｎｇ、５０ｎｇ及び５００ｎｇの鋳型全ＲＮＡのそれぞれについて調製した。反応液１〜７は、表１に示す通り、グリセロール濃度がそれぞれ異なる反応液である。また、各鋳型全ＲＮＡ量に対する反応液１〜７は、表１に示す濃度で色素マーカー、及びグリセロールを含む点以外は、前記の対照の反応液と同じ成分を含有する。【００５４】
【表１】
2011027722.tif 000002
【００５５】
調製した各２５μＬの反応液について、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標、タカラバイオ社製）を用いてワンステップＲＴ−ＰＣＲを行った。ワンステップＲＴ−ＰＣＲは、４２℃での３０分間の逆転写反応、それに続く９４℃での２分間の加温の後、９８℃で１０秒間〜５５℃で３０秒間〜７２℃で３分間のインキュベーションを１サイクルとする計３０サイクルのＰＣＲにより実施した。反応終了後の反応液のそれぞれより３μＬを採取して１％アガロース電気泳動に供し、ＵＶ照射により増幅産物量を確認した。【００５６】
その結果、色素マーカー及び比重増加剤を含む反応液であっても、ワンステップＲＴ−ＰＣＲによって鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを増幅できることが明らかとなった。また、色素マーカー及び終濃度２ｖ／ｖ％以上のグリセロールを含む反応液は、アガロース電気泳動の泳動バッファーとしてＴＡＥバッファー又はＴＢＥバッファーのどちらを用いた場合も、反応終了後に試料用色素緩衝液を添加することなく、直接アガロースゲルにアプライすることが可能であった。色素マーカー及び比重増加剤を含む反応液は、対照と比べ、グリセロール濃度４ｖ／ｖ％までは感度及び増幅量とも同等であったが６ｖ／ｖ％では増幅量が若干低下し、８ｖ／ｖ％以上では感度及び増幅量ともに低下した。【００５７】
実施例２
色素マーカー及び比重増加剤を含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ用反応液の比重増加剤として、ポリエチレングリコールを使用した場合の効果を検討した。【００５８】
表２に記載の濃度のポリエチレングリコール  ＃６０００（ナカライテスク社製；以下の実施例において、単にポリエチレングリコール又はＰＥＧと記載する）を比重増加剤として含む反応液１〜７を調製した以外は、実施例１と同様の方法でＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した。調製した各反応液について、実施例１と同様の方法でワンステップＲＴ−ＰＣＲを行った。アガロース電気泳動の結果を図１に示す。【００５９】
【表２】
2011027722.tif 000003
【００６０】
その結果、比重増加剤としてポリエチレングリコールを含む色素マーカー入り反応液であっても、ワンステップＲＴ−ＰＣＲによって鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを増幅できることが明らかとなった。また、色素マーカー及び終濃度０．５ｗ／ｖ％以上のポリエチレングリコールを含む反応液は、アガロース電気泳動の泳動バッファーとしてＴＡＥバッファー又はＴＢＥバッファーのどちらを用いた場合も、反応終了後に試料用色素緩衝液を添加することなく、直接アガロースゲルにアプライすることが可能であった。比重増加剤としてポリエチレングリコールを３〜１０ｗ／ｖ％含む反応液においては、増幅量が対照よりも増大した。また、ポリエチレングリコールを０．５〜５ｗ／ｖ％含む反応液においては、対照と同等の検出感度を示した。【００６１】
実施例３
色素マーカー及び比重増加剤を含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ用反応液の比重増加剤として、エチレングリコールを使用した場合の効果を検討した。【００６２】
表３に記載の各濃度のエチレングリコール（ナカライテスク社製）を比重増加剤として含む反応液１〜７を調製する以外は、実施例１と同様の方法で、ＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した。調製した各反応液について、実施例１と同様の方法でワンステップＲＴ−ＰＣＲを行った。表３中、ＥＧはエチレングリコールを意味する。【００６３】
【表３】
2011027722.tif 000004
【００６４】
その結果、比重増加剤としてエチレングリコールを含む、色素マーカー入り反応液であっても、ワンステップＲＴ−ＰＣＲによって鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを増幅できることが明らかとなった。また、色素マーカー及び終濃度１ｖ／ｖ％以上のエチレングリコールを含む反応液は、アガロース電気泳動の泳動バッファーとしてＴＡＥバッファー又はＴＢＥバッファーのどちらを用いた場合も、反応終了後に試料用色素緩衝液を添加することなく、直接アガロースゲルにアプライすることが可能であった。比重増加剤としてエチレングリコールを１ｖ／ｖ％含む反応液において、対照と同等の増幅量を示した。また、エチレングリコールを１〜３ｖ／ｖ％含む反応液において、対照と同等の検出感度が示された。【００６５】
実施例４
種々の色素マーカーが１ステップＲＴ−ＰＣＲに及ぼす影響について検討した。【００６６】
Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ＦＦ及びＴａｒｔｒａｚｉｎｅの代わりにＯｒａｎｇｅＧ（ナカライテスク社製）、ＯｒａｎｇｅＧＩＩ（ナカライテスク社製）、Ｂｒｏｍｏ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ（ナカライテスク社製）、Ａｃｉｄ  Ｂｌｕｅ９（メルク社製）、Ａｍａｒａｎｔｈ（ナカライテスク社製）、Ａｃｉｄ  Ｒｅｄ１８（東京化成工業社製）、又はＰｏｎｃｅａｕＳ（メルク社製）を表４記載の濃度で色素マーカーとして含み、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  １  ｓｔｅｐ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘから持ち込まれる終濃度２ｖ／ｖ％のグリセロール以外に比重増加剤を含まない反応液を調製する以外は、実施例１と同様の方法でワンステップＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した。調製した各反応液について、実施例１と同様の方法でワンステップＲＴ−ＰＣＲを行った。【００６７】
【表４】
2011027722.tif 000005
【００６８】
その結果、いずれの色素マーカーを含有する反応液についても、ワンステップＲＴ−ＰＣＲによって、鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを増幅できることが明らかとなった。また、どの色素マーカーを添加した反応液についても、検出感度及び増幅量は、対照の反応液と同等であった。【００６９】
実施例５
色素マーカーの含有量が１ステップＲＴ−ＰＣＲに及ぼす影響について検討した。【００７０】
Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ＦＦ及びＴａｒｔｒａｚｉｎｅの代わりに、Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ  ＦＦ、ＯｒａｎｇｅＧＩＩ、又はＰｏｎｃｅａｕＳを表５記載の濃度で色素マーカーとして含み、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  １  ｓｔｅｐ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘから持ち込まれる終濃度２ｖ／ｖ％のグリセロール以外に比重増加剤を含まない反応液を調製する以外は、実施例１と同様の方法でＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した。調製した各反応液について、実施例１と同様の方法でワンステップＲＴ−ＰＣＲを行った。【００７１】
【表５】
2011027722.tif 000006
【００７２】
１０〜２５０ｎｇ／μＬのＸｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌを含む反応液はどの色素濃度でも検出感度及び増幅量とも対照と同等であった。一方、ＯｒａｎｇｅＧＩＩを含む反応液は、２５〜１００ｎｇ／μＬの色素マーカー濃度までは検出感度及び増幅量とも対照と同等であったが、２５０ｎｇ／μＬの色素マーカー濃度では、検出感度及び増幅量とも対照よりも低下した。ＰｏｎｃｅａｕＳを含有する反応液は、２５〜５０ｎｇ／μＬの色素マーカー濃度までは検出感度及び増幅量ともに対照と同等であったが、１００ｎｇ／μＬ以上の色素マーカー濃度では、検出感度及び増幅量ともに対照よりも低下した。【００７３】
実施例６
−３０℃の保存条件下でも凍結しない、操作性に優れたワンステップＲＴ−ＰＣＲ用の５倍濃度のプレミックス試薬について検討した。【００７４】
（１）グリセロール濃度の検討
１０ｖ／ｖ％、１５ｖ／ｖ％、２０ｖ／ｖ％、２５ｖ／ｖ％及び３０ｖ／ｖ％のグリセロールを含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ用の５倍濃度のプレミックス試薬（以下、５×プレミックス）をそれぞれ２ｍＬずつ調製した。当該５×プレミックスのグリセロール以外の成分を、表６に示す。【００７５】
【表６】
2011027722.tif 000007
【００７６】
調製した各５×プレミックスを１．５ｍＬのチューブに６５０μＬずつ分注し、−３０℃に設定した冷凍庫［ＭＥＤＩＣＡＬ  ＦＲＥＥＺＥＲ（三洋電機社製）］で１〜２日間静置した後、凍結の有無を確認した。結果を表７に示す。【００７７】
【表７】
2011027722.tif 000008
【００７８】
表７に示す通り、グリセロール濃度を３０ｖ／ｖ％とした５×プレミックス（ＲＴ−ＰＣＲ時のグリセロール濃度は６ｖ／ｖ％）は、−３０℃の保存において凍結しなかった。【００７９】
（２）ポリエチレングリコール濃度の検討
−３０℃の保存条件下でも凍結しない、操作性に優れたワンステップＲＴ−ＰＣＲ用の５倍濃度のプレミックス試薬について検討した。【００８０】
３０ｖ／ｖ％のグリセロール及び前記の表６の成分を有する５×プレミックス、並びに３０ｖ／ｖ％のグリセロール及び前記の表６の成分に加えて２．５ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、７．５ｗ／ｖ％、あるいは１０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコールを含有する４種類の５×プレミックスを２ｍＬずつ調製した。対照として、２ｖ／ｖ％のグリセロール及び表６の組成を有する５×プレミックスを２ｍＬ調製した。【００８１】
調製した上記６種類の５×プレミックスを１．５ｍＬのチューブに６５０μＬずつ分注し、−３０℃に設定した冷凍庫（ＭＥＤＩＣＡＬ  ＦＲＥＥＺＥＲ）で１〜２日間静置した後、凍結の有無を確認した。対照の５×プレミックスは凍結していたが、他の５種類の５×プレミックスはいずれも凍結していなかった。次に、各５×プレミックス５μＬに２０μＭのＣＣＤＮ２Ｆを０．５μＬ、２０μＭのＣＣＤＮ２Ｒを０．５μＬ、ＨＬ６０から取得した鋳型全ＲＮＡ溶液を１μＬ、及び滅菌蒸留水１８μＬをそれぞれ加え、ＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製した。このとき、鋳型全ＲＮＡ溶液は５０ｐｇ／μＬ、５００ｐｇ／μＬ、５ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ、及び５００ｎｇ／μＬのものを使用し、それぞれの５×プレミックスについて鋳型量の異なる５種類の反応液を調製した。調製した反応液について、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）を用いてワンステップＲＴ−ＰＣＲを行った。ワンステップＲＴ−ＰＣＲは、４２℃で３０分間の逆転写反応とそれに続く９４℃で２分間の加温の後、９８℃で１０秒間〜５５℃で３０秒間〜７２℃で３分間のインキュベーションを１サイクルとする計３０サイクルのＰＣＲにより実施した。反応終了後の反応液のそれぞれより３μＬを採取して１％アガロース電気泳動に供し、ＵＶ照射により増幅産物量を確認した。結果を表９に示す。なお、表９の操作性、反応性及び総合評価の欄に記した印の意味を表８に示す。また、アガロース電気泳動の結果を図２に示す。【００８２】
【表８】
2011027722.tif 000009
【００８３】
【表９】
2011027722.tif 000010
【００８４】
表９中、グリセロール及びポリエチレングリコールの濃度は、反応に供したＲＴ−ＰＣＲ用反応液における濃度を示す。表９に示す通り、グリセロール濃度が６ｖ／ｖ％の反応液を用いたＲＴ−ＰＣＲにおいて、反応液に０．５〜２ｗ／ｖ％のポリエチレングリコールを更に含有させることにより、反応性が向上することが明らかになった。ただし、１０ｗ／ｖ％ポリエチレングリコールを含む５×プレミックス（ＲＴ−ＰＣＲ反応時のポリエチレングリコール濃度が２ｗ／ｖ％）は、５×プレミックスの状態での粘度が非常に高く、マイクロピペットによる吸い上げ及び排出が困難であった。本実施例により、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ用の５倍濃度プレミックス試薬として、グリセロールを３０ｖ／ｖ％、及びポリエチレングリコールを２．５〜７．５ｗ／ｖ％（ＲＴ−ＰＣＲ反応時のグリセロール濃度が６ｖ／ｖ％、ポリエチレングリコール濃度が０．５〜１．５ｗ／ｖ％）含むものが優れた性質を示すことが明らかとなった。【００８５】
（３）エチレングリコール濃度及びポリエチレングリコール濃度の検討−１
実施例６−（１）において、−３０℃の保存条件下での凍結が認められたグリセロール濃度が２０ｖ／ｖ％又は２５ｖ／ｖ％の５×プレミックス（ＲＴ−ＰＣＲ反応時のグリセロール濃度がそれぞれ４ｖ／ｖ％及び５ｖ／ｖ％）について、エチレングリコール及びポリエチレングリコールの添加を検討した。【００８６】
前記の表６の組成に加え、下記表１０に示す濃度の比重増加剤を有する計２０種類の５×プレミックスを２ｍＬずつ調製した。対照として、２ｖ／ｖ％のグリセロール及び表６の成分を有する５×プレミックスを２ｍＬ調製した。【００８７】
【表１０】
2011027722.tif 000011
【００８８】
調製した５×プレミックスを１．５ｍＬのチューブに６５０μＬずつ分注し、−３０℃に設定した冷凍庫（ＭＥＤＩＣＡＬ  ＦＲＥＥＺＥＲ）で１〜２日間静置した後、凍結の有無を確認した。次に、各５×プレミックス５μＬに２０μＭのＣＣＤＮ２Ｆを０．５μＬ、２０μＭのＣＣＤＮ２Ｒを０．５μＬ、ＨＬ６０から取得した鋳型全ＲＮＡ溶液を１μＬ、及び滅菌蒸留水１８μＬをそれぞれ加え、ＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製した。このとき、鋳型全ＲＮＡ溶液は５０ｎｇ／μＬ、５ｎｇ／μＬ、及び５００ｐｇ／μＬのものを使用し、それぞれの５×プレミックスについて鋳型量の異なる３種類の反応液を調製した。調製した反応液について、実施例６−（２）と同様の方法でワンステップＲＴ−ＰＣＲを行った。反応終了後の反応液を１％アガロース電気泳動に供し、ＵＶ照射により増幅産物量を確認した。結果を表１１に示す。表１１の操作性、反応性及び総合評価の欄に記した印の意味は、前記の表８に示す通りである。また、アガロース電気泳動の結果を図３に示す。【００８９】
【表１１】
2011027722.tif 000012
【００９０】
表１１中、グリセロール、ポリエチレングリコール、及びエチレングリコールの濃度は、１倍濃度のＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した際の濃度を示す。表１１に示す通り、３０ｖ／ｖ％未満のグリセロール濃度（ＲＴ−ＰＣＲ反応時のグリセロール濃度が６ｖ／ｖ％未満）の５×プレミックスであっても、ポリエチレングリコール及び５〜７．５ｖ／ｖ％のエチレングリコール（ＲＴ−ＰＣＲ反応時のエチレングリコール濃度が１〜１．５ｖ／ｖ％）を共存させることにより、−３０℃の保存条件下でも凍結せず、かつＲＴ−ＰＣＲの反応性に優れた５×プレミックスとすることが可能であることが明らかとなった。【００９１】
（４）エチレングリコール濃度及びポリエチレングリコール濃度の検討−２
実施例６−（３）において認められた、グリセロール、ポリエチレングリコール、及びエチレングリコールを共存させることによる効果について、ポリエチレングリコールの濃度による影響を確認した。【００９２】
前記の表６の成分に加え、下記表１２に示す比重増加剤を含む計２０種類の５×プレミックスを２ｍＬずつ調製した。対照として、２ｖ／ｖ％のグリセロール及び表６の組成を有する５×プレミックスを２ｍＬ調製した。【００９３】
【表１２】
2011027722.tif 000013
【００９４】
調製した５×プレミックスを１．５ｍＬのエッペンチューブに６５０μＬずつ分注し、−３０℃に設定した冷凍庫（ＭＥＤＩＣＡＬ  ＦＲＥＥＺＥＲ）で１〜２日間静置した後、凍結の有無を確認した。次に、実施例６−（３）と同様の方法でＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ワンステップＲＴ−ＰＣＲを行った。反応終了後の反応液を１％アガロース電気泳動に供し、ＵＶ照射により増幅産物量を確認した。結果を表１３に示す。表１３の操作性、反応性及び総合評価の欄に記した印の意味は、前記の表８に示す通りである。【００９５】
【表１３】
2011027722.tif 000014
【００９６】
表１３中、グリセロール、ポリエチレングリコール、及びエチレングリコールの濃度は、１倍濃度のＲＴ−ＰＣＲ用反応液を調製した際の濃度を示す。表１３に示す通り、２０〜２５ｖ／ｖ％のグリセロール濃度（ＲＴ−ＰＣＲ反応時のグリセロール濃度が４〜５ｖ／ｖ％）の５×プレミックスであっても、２．５〜７．５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール（ＲＴ−ＰＣＲ反応時のポリエチレングリコール濃度が０．５〜１．５ｗ／ｖ％）及び５〜７．５ｖ／ｖ％のエチレングリコール（ＲＴ−ＰＣＲ反応時のエチレングリコール濃度が１〜１．５ｖ／ｖ％）を共存させることにより、−３０℃の保存条件下でも凍結せず、かつＲＴ−ＰＣＲの反応性に優れた５×プレミックスとすることが可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明は、遺伝子工学、生物学、医学、農業等幅広い分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
SEQ ID NO:1 ; Primer CCND2F to amplify a 2.8k bp fragment of CCND2 gene.
SEQ ID NO:2 ; Primer CCND2R to amplify a 2.8k bp fragment of CCND2 gene.
【図１】
2011027722.tif 000015
【図２】
2011027722.tif 000016
【図３】
2011027722.tif 000017
【配列表】
2011027722000001.app
【国際調査報告】
2011027722.tif 000018
2011027722.tif 000019
2011027722.tif 000020
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