(57)【要約】  本発明は、リガンド結合ドメインを欠く新規異型アンドロゲンレセプター（ARaiv）、それをコードする核酸およびそれらの用途を提供する。即ち、本発明は、ARaivタンパク質もしくはARaivを産生する細胞と試験化合物とを接触させ、ARaivの活性（例、アンドロゲン応答遺伝子の転写調節作用）または発現量を測定し、当該活性または発現量を抑制する化合物を選択することを含む、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：６、８、１０または１２で表わされるアミノ酸配列を含む異型アンドロゲンレセプタータンパク質をコードする核酸、およびアンドロゲンに応答するプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含む細胞に試験化合物を接触させる工程、
該レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、および
試験化合物を接触させない対照と比較して、該レポーター遺伝子の発現を抑制する化合物を選択する工程
を含む、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
配列番号：６、８、１０または１２で表わされるアミノ酸配列を含む異型アンドロゲンレセプタータンパク質と試験化合物を接触させる工程、
該タンパク質の活性を測定する工程、および
試験化合物を接触させない対照と比較して、該タンパク質の活性を抑制する化合物を選択する工程
を含む、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
配列番号：６、８、１０または１２で表わされるアミノ酸配列を含む異型アンドロゲンレセプタータンパク質。
【請求項４】
請求項３記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項５】
請求項４記載の核酸が導入された細胞。
【請求項６】
以下の(a)〜(e)のいずれかに記載の核酸。
(a) 請求項３記載のタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸
(b) 請求項３記載のタンパク質をコードするRNAに対するsiRNA
(c) 請求項３記載のタンパク質をコードするRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
(d) 請求項３記載のタンパク質をコードするRNAに対するmiRNA
(e) 請求項３記載のタンパク質をコードするRNAに対するmiRNAを生成し得る核酸
【請求項７】
請求項４記載の核酸が導入された動物やその組織に試験化合物を接触させ、組織の増殖・分化・細胞死や癌化・癌増殖を測定する工程を含む、癌の予防・治療物質の薬効評価方法。
【請求項８】
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列または配列番号：１４で表わされるヌクレオチド配列を特異的に認識する物質を含有してなる、リガンド結合ドメインを欠失する異型アンドロゲンレセプターを発現する癌の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な異型（variant）アンドロゲンレセプター、並びにそれを用いた癌の予防および／または治療剤のスクリーニング方法などに関する。【０００２】
〔発明の背景〕
現在、ホルモン系薬剤による薬物的去勢（内分泌療法）が広く癌治療に使用されている。前立腺癌等の内分泌療法は、男性ホルモンが癌細胞の増殖刺激として働いていることから、この働きを断つことにより癌細胞の増殖を抑制する、というメカニズムを利用している。
アンドロゲンは男性ホルモン作用を持つステロイド・ホルモンの総称であり、精巣で合成されるテストステロンや、副腎皮質で合成されるデヒドロエピアンドロステロンなどが挙げられる。
癌細胞を増殖刺激するテストステロンが細胞に入ってその作用を発揮するためには、テストステロンがジヒドロテストステロンに変換され、癌細胞核内のアンドロゲンレセプター（以下、ARと略記する場合がある）と結合する必要がある。抗アンドロゲン剤はこのARと結合してジヒドロテストステロンとARとの結合を阻止することにより薬効を発揮する。しかし、治療を継続すると効果がなくなり再び癌が増殖してくることが知られている（アンドロゲン非依存性前立腺癌；AIPC）。アンドロゲン非依存性を獲得し再燃した前立腺癌に対する効果的な予防・治療法は未だ開発されていない。内分泌療法に対する再燃前立腺癌の機序は未だ解明されていないが、AR遺伝子の増幅もしくは過剰発現によりアンドロゲン高感受性を獲得した細胞の出現・増加や、ARの変異によりアンドロゲン以外の物質（例えば、グルココルチコイドや抗アンドロゲン剤そのもの）がアゴニストとして作用するようになる等の、複数の要因が明らかになりつつある。例えば、抗アンドロゲン剤であるフルタミドやビカルタミドがアゴニストとして働く変異型アンドロゲン受容体が、前立腺が再燃した患者から分離されている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
一方、Huら（非特許文献１）は、リガンド結合ドメインを欠く7種類のARスプライスバリアント（AR-V1、AR-V2、AR-V3、AR-V4、AR-V5、AR-V6、AR-V7）を見出した。しかしながら、これらのARスプライスバリアントがAIPCの治療標的となるか否かについては何ら実証されていない。その一方、Guoら（非特許文献２）、リガンド結合ドメインを欠く3種類のARスプライスバリアントを見出し、その1種類（AR3; 上記AR-V7と同一のアミノ酸配列を有する）がAIPCの治療標的となり得ることを示唆している。しかしながら、このARスプライスバリアントを標的とした治療薬の具体像については、このバリアントに対するshRNA発現レンチウイルスを単独で使った例が示されているに過ぎない。したがって、ARスプライスバリアントの機能を阻害するsiRNAや低分子化合物の単剤による治療や、別種の有効成分または放射線療法等との併用治療の可能性については何ら実証されていない。
また、上記以外の異型AR （ARv567es; 非特許文献４）や異型ARをコードし得るcDNA断片（AR-V8、AR-V9、AR-V10、AR-V11; 非特許文献５）の存在も報告されている。
なお、ARのN末端ドメインの活性を阻害するいくつかの化合物が知られている（特許文献２、非特許文献３）が、これらがAR3（AR-V7）に代表される、CWR22Rv1、VCaP、JDCaP/ JDCaP-hr等の前立腺癌細胞が生来発現する異型ARを阻害するか否かは実証されていない。【０００４】
ところで、分子シャペロンである90kDa熱ショックタンパク質（HSP90）は、キナーゼ、転写因子、ホルモン受容体など、細胞調節に重要な働きをする種々のタンパク質のフォールディングの促進を介して、これらのタンパク質の相互作用、細胞内輸送、分解、機能を制御し、細胞の増殖・生存の制御において多面的な役割を果たしている。特に、癌細胞においてはHSP90の発現亢進がみられ、その程度は癌の悪性度と相関する。また、HSP90阻害剤は新しいタイプの抗癌剤として期待されており、放射線や従来の抗癌剤の効果を増強する作用が注目されている。
また、HSP90阻害剤は、球脊髄性筋萎縮症の原因遺伝子であるポリグルタミン鎖が異常伸長した変異ARの分解を促進することが知られているが、アンドロゲン非依存性再燃前立腺癌でみられる変異ARや上記異型ARに対する作用については未解明のままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO 2003/102188
【特許文献２】WO 2010/000066
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Cancer Res., 2009, 69(1): 16-22
【非特許文献２】Cancer Res., 2009, 69(6): 2305-2313
【非特許文献３】Cancer Cell., 2010, 17: 535-546
【非特許文献４】The Journal of Clinical Investigation, 2010, 120(8):2715-2730
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010 Sep 7. [Epub ahead of print]
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
内分泌療法に対するアンドロゲン非依存性再燃前立腺癌の予防・治療に有効な薬剤が求められている。本発明の目的は、リガンド結合ドメインを欠く新規な異型ARを同定し、該異型ARのアンドロゲン非依存性再燃前立腺癌への関与を明らかにし、さらに該異型ARの阻害活性を指標とする、アンドロゲン非依存性再燃前立腺癌に対する新規な予防・治療薬の探索方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、独自の研究により、アンドロゲン依存性前立腺癌（ADPC）腫瘍株（JDCaP）がAIPC化（JDCaP-hr）する過程で、C末端を欠損した異型ARが出現することを見出した。mRNAの3’末端配列をクローン化し塩基配列を解析した結果、AR遺伝子の第3エクソン（exon3）の直後に第3イントロン（intron3）の一部が連結して終止コドンを生じた2種の異型ARクローン（ARaiv1およびARaiv2）が同定され、これらの翻訳産物はリガンド結合ドメインを欠く恒常活性型分子であることが予測された。CWR22Rv1細胞およびJDCaP-hr細胞からARaiv1のORF cDNAを取得し配列を解析した結果、ARaiv1には第1エクソンが完全なものに加え、第1エクソン（exon1）の一部を欠く3つのバリアント（ARaiv1Δ1〜Δ3）が存在することが見出された。
これら4種のARaiv1について、リポータージーンアッセイにより、すべてが恒常的活性型分子であることを確認した。第1エクソンに欠失のないARaiv1は、Huら（非特許文献１）およびGuoら（非特許文献２）が報告したARスプライスバリアントの１つ（それぞれAR-V7およびAR3）と同一のアミノ酸配列を有する。ARaiv1は他のAIPC腫瘍株においても高発現しており、さらには前立腺癌の臨床検体の7.9%で発現が亢進していることが明らかになった。
そこで、本発明者らは、ARaiv1高発現腫瘍細胞株においてARaiv1を特異的にノックダウンしたところ、アンドロゲン非存在下での腫瘍細胞の増殖が顕著に抑制されることを見出した。また、野生型ARとARaiv1の両方をノックダウンすると、いずれか一方のみをノックダウンした場合よりも、腫瘍細胞の増殖が顕著に抑制されることが示された。
さらに、ARaiv1とアンドロゲン応答性のレポータープラスミドとを導入したCOS7細胞をHSP90阻害薬ゲルダナマイシンに曝露したところ、HSP90阻害薬はARaiv1によるレポーター遺伝子の転写活性化を阻害することを見出した。
さらに、JDCaP-hr細胞をHSP90阻害薬ゲルダナマイシンに曝露したところ、HSP90阻害薬はARの発現を阻害するが、リガンド結合ドメインを欠く異型ARに対してより高い発現阻害効果を示すことを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、一つの態様として、
［１−Ａ］配列番号：６、８、１０または１２で表わされるアミノ酸配列を含む異型アンドロゲンレセプタータンパク質をコードする核酸、およびアンドロゲンに応答するプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含む細胞に試験化合物を接触させる工程、
該レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、および
試験化合物を接触させない対照と比較して、該レポーター遺伝子の発現を抑制する化合物を選択する工程
を含む、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法、
［２−Ａ］配列番号：６、８、１０または１２で表わされるアミノ酸配列を含む異型アンドロゲンレセプタータンパク質と試験化合物を接触させる工程、
該タンパク質の活性を測定する工程、および
試験化合物を接触させない対照と比較して、該タンパク質の活性を抑制する化合物を選択する工程
を含む、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法、
［３−Ａ］配列番号：６、８、１０または１２で表わされるアミノ酸配列を含む異型アンドロゲンレセプタータンパク質、
［４−Ａ］上記［３−Ａ］記載のタンパク質をコードする核酸、
［５−Ａ］上記［４−Ａ］記載の核酸が導入された細胞、
［６−Ａ］以下の(a)〜(e)のいずれかに記載の核酸、
(a) 上記［３−Ａ］記載のタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸
(b) 上記［３−Ａ］記載のタンパク質をコードするRNAに対するsiRNA
(c) 上記［３−Ａ］記載のタンパク質をコードするRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
(d) 上記［３−Ａ］記載のタンパク質をコードするRNAに対するmiRNA
(e) 上記［３−Ａ］記載のタンパク質をコードするRNAに対するmiRNAを生成し得る核酸
［７−Ａ］上記［４−Ａ］記載の核酸が導入された動物やその組織に試験化合物を接触させ、組織の増殖・分化・細胞死や癌化・癌増殖を測定する工程を含む、癌の予防・治療物質の薬効評価方法、並びに
［８−Ａ］配列番号：２で表わされるアミノ酸配列または配列番号：１４で表わされるヌクレオチド配列を特異的に認識する物質を含有してなる、リガンド結合ドメインを欠失する異型アンドロゲンレセプターを発現する癌の診断剤、などを提供する。【００１０】
あるいは、本発明の別の態様として、
［１−Ｂ］HSP90阻害薬を含有してなる、リガンド結合ドメインを欠失する異型アンドロゲンレセプターの機能阻害剤、
［２−Ｂ］異型アンドロゲンレセプターが、配列番号：１または２で表わされるC末端アミノ酸配列を含むものである、上記［１−Ｂ］記載の剤、
［３−Ｂ］HSP90阻害薬がゲルダナマイシンもしくはその誘導体である上記［１−Ｂ］記載の剤、
［４−Ｂ］リガンド結合ドメインを欠失する異型アンドロゲンレセプター（特に、配列番号：６、８、１０または１２で表わされるアミノ酸配列を含む異型アンドロゲンレセプタータンパク質）の機能を阻害する物質を含有してなる癌の予防・治療剤、
［５−Ｂ］異型アンドロゲンレセプターが、配列番号：１または２で表わされるC末端アミノ酸配列を含むものである、上記［４−Ｂ］記載の剤、
［６−Ｂ］前記物質が、前記レセプタータンパク質の発現阻害薬である上記［４−Ｂ］記載の剤、
［７−Ｂ］前記物質が、以下の(a)〜(e)のいずれかの核酸である、上記［６−Ｂ］記載の剤、
(a) 前記レセプタータンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸
(b) 前記レセプタータンパク質をコードするRNAに対するsiRNA
(c) 前記レセプタータンパク質をコードするRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
(d) 前記レセプタータンパク質をコードするRNAに対するmiRNA
(e) 前記レセプタータンパク質をコードするRNAに対するmiRNAを生成し得る核酸
［８−Ｂ］前記核酸の標的配列が、前記レセプタータンパク質をコードするmRNAの第4エクソンの全部もしくは一部である、上記［７−Ｂ］記載の剤、
［９−Ｂ］癌が前立腺癌である、上記［４−Ｂ］記載の剤、
［１０−Ｂ］癌がアンドロゲン非依存性前立腺癌である、上記［４−Ｂ］記載の剤、
［１１−Ｂ］癌が前記レセプターを発現するものである、上記［４−Ｂ］記載の剤、
［１２−Ｂ］アンドロゲンレセプターシグナル阻害薬と組み合わせてなる、上記［１１−Ｂ］記載の剤、
［１３−Ｂ］リガンド結合ドメインを欠失する異型アンドロゲンレセプターの機能を阻害する物質の有効量を動物に投与することによる、該動物における癌の予防・治療方法、
［１４−Ｂ］癌の予防・治療剤の製造のための、リガンド結合ドメインを欠失する異型アンドロゲンレセプターの機能を阻害する物質の使用、
［１５−Ｂ］配列番号：１もしくは２で表わされるアミノ酸配列または配列番号：１３もしくは１４で表わされるヌクレオチド配列を特異的に認識する物質を含有してなる、リガンド結合ドメインを欠失する異型アンドロゲンレセプターを発現する癌の診断剤、
［１６−Ｂ］上記［１５−Ｂ］記載の剤を用いて、リガンド結合ドメインを欠失する異型アンドロゲンレセプターを発現する癌を有すると診断された患者に投与される、上記［４−Ｂ］記載の剤、
［１７−Ｂ］配列番号：６、８、１０または１２で表わされるアミノ酸配列を含む異型アンドロゲンレセプタータンパク質、
［１８−Ｂ］上記［１７−Ｂ］記載のタンパク質をコードする核酸、
［１９−Ｂ］上記［１８−Ｂ］記載の核酸が導入された細胞、
［２０−Ｂ］癌の予防・治療物質のスクリーニング方法であって、上記［１８−Ｂ］記載の核酸、およびアンドロゲンに応答するプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含む細胞に試験化合物を接触させ、該レポーター遺伝子の発現量を測定することを含む方法、
［２１−Ｂ］上記［１８−Ｂ］記載の核酸が導入された動物、
［２２−Ｂ］癌の予防・治療物質の薬効評価方法であって、上記［１８−Ｂ］の核酸が導入された動物やその組織に試験化合物を接触させ、組織の増殖・分化・細胞死や癌化・癌増殖を測定することを含む方法、などを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の新規異型ARによる転写調節の阻害を指標とすることにより、該異型ARを発現する癌の予防・治療に有効な物質を探索することができる。また、該異型ARに特異的なC末端配列もしくはexon1の一部欠失により生じた配列を検出することにより、該異型ARを発現する癌の診断が可能となり、前記探索手法により得られた物質の適切な投与対象を選定することができる。
さらに、HSP90阻害薬は、アンドロゲン非依存性再燃前立腺癌の一因となりうるリガンド非依存性（リガンド結合ドメイン欠失）異型ARの機能（発現および／または活性）を阻害することにより、該バリアントを介するARシグナルを遮断することができるので、該異型ARを発現する癌の治療および再発予防に有用である。また、該異型ARの機能（発現および／または活性）を阻害する他の薬剤も、該異型ARによる転写調節作用を阻害し得るので、同様に該異型ARを発現する癌の治療および再発予防に有用である。さらに、従来の全長型ARを介したARシグナルの阻害薬を、上記異型ARの発現/活性阻害薬と併用することにより、薬効増大および／または副作用低減の効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】JDCaPおよびJDCaP-hrにおけるARのウェスタンブロット解析結果を示す図である。N-term. はARのN末端に特異的な抗体、C-term. はARのC末端に特異的な抗体をそれぞれプローブとして用いたことを示す。
【図２】（ａ）ARaiv1 cDNAの3’末端のヌクレオチド配列（配列番号：３、2703位〜4422位）および推定アミノ酸配列（配列番号：４、530位〜643位）および（ｂ）ARaiv2 cDNAの3’末端のヌクレオチド配列（配列番号：５、2703位〜4174位）および推定アミノ酸配列（配列番号：６、530位〜642位）を示す図である。
【図３】ARaiv1 ORFクローン4種の構造を示す模式図である。AF1: 転写活性化ドメイン１; DBD: DNA結合ドメイン; LBD: リガンド結合ドメイン
【図４】ARaiv1 ORFクローン4種の（ａ）リガンド非依存的な転写活性および（ｂ）ビカルタミド抵抗性の転写活性を示す図である。DHT: ジヒドロテストステロン; Bic: ビカルタミド
【図５】種々の前立腺癌細胞株におけるARaiv1 mRNAの発現を示す図である。
【図６】（ａ）各種siRNAの全長型ARおよびARaiv1のノックダウン効率および（ｂ）ARaiv1ノックダウンによるC末欠損AR（ARΔC）の産生阻害を示す図である。NS: 非特異的siRNA導入群
【図７】ARaiv1ノックダウンによるJDCaP-hr細胞の増殖阻害を示す図である。NS: 非特異的siRNA導入群
【図８】ARaiv1ノックダウンによるCWR22Rv1細胞の増殖阻害を示す図である。
【図９】臨床前立腺癌サンプルにおけるARaiv1と全長型ARの発現を示す図である。正常：正常な前立腺組織、正常部位：癌に罹患した前立腺の非病変部、NA: 病期分類の情報なし
【図１０】ゲルダナマイシンによるARaiv1の転写活性作用の阻害を示す図である。EmptyはARaiv1遺伝子を含まない空のベクターを導入した細胞を示す。
【図１１】ゲルダナマイシンによるARaiv1と全長型ARの遺伝子発現とタンパク質産生の阻害を示す図である。
【図１２】ゲルダナマイシンによるJDCaP-hrの細胞増殖阻害を示す図である。
【図１３】パモ酸ピルビニウムによるARaiv1の転写活性阻害を示す図である。
【図１４】パモ酸ピルビニウムによるJDCaP-hr細胞の増殖阻害を示す図である。PP: パモ酸ピルビニウム濃度
【図１５】ARaiv1の3’-UTR配列と結合し得るmiRNAを示す図である。各miRNAの塩基配列を上段（5’→3’）に、標的となるARaiv1の3’-UTRの5’端より169番目〜191番目（ARaiv1 3’-UTR Position 191-169）の塩基配列（3’←5’）を下段に、それぞれ記載している。
【００１３】
〔発明の詳細な説明〕
（１）本発明の異型AR
本発明におけるリガンド結合ドメインを欠失する異型AR（ARaiv）は、ヒトAR遺伝子（そのヌクレオチド配列は、NCBI RefSeq No. NG_009014.1 (GI:213385253) として登録されている。）の第1エクソン（NG_009014.1の5001〜7731位; 配列番号：１５の1〜1616位）にコードされるアミノ酸配列中少なくとも転写活性化作用を保持するのに必要な領域、第1〜3エクソン（第2および第3エクソンは、それぞれNG_009014.1の104225〜104376位および146979〜147095位; 配列番号：１５の1617〜1768位および1769〜1885位）にコードされるアミノ酸配列中少なくとも標的遺伝子への結合に必要な領域を含み、かつ第4〜8エクソン（それぞれNG_009014.1の172371〜172658位、178447〜178591位、182802〜182932位、183796〜183953位および184655〜185246位; 配列番号：１５の1886〜2173位、2174〜2318位、2319〜2449位、2450〜2607位および2608〜2763位）にコードされるアミノ酸配列中リガンドとの結合に必要な領域を欠失したタンパク質である。好ましくは、本発明のARaivとしては、配列番号：１６で表わされる全長型ARのアミノ酸配列中アミノ酸番号625〜920で示されるC末端配列を欠失し、代わりに配列番号：１または２で表わされるC末端アミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列（即ち、配列番号：４ (ARaiv1) または６ (ARaiv2) で表わされるアミノ酸配列）を含むタンパク質、あるいは配列番号：４または６で表わされるアミノ酸配列中アミノ酸番号367〜495で示されるアミノ酸配列の全部もしくは一部を欠失したアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。本明細書において、タンパク質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端（アミノ末端）、右端がC末端（カルボキシル末端）で記載される。【００１４】
上記アミノ酸番号367〜495で示されるアミノ酸配列は、ARの転写活性化ドメイン（AF1）中のtransactivation unit 5（TAU5）と呼ばれる部分に相当し、アンドロゲン依存性癌細胞でアンドロゲン依存的なAR活性を阻害する一方、アンドロゲン非依存性癌細胞ではアンドロゲン非依存的なAR活性を増強する機能を有するとの報告があるが（Cancer Res., 2007, 67: 10067-77）、TAU5を完全に欠失していても、癌細胞の増殖を促進するのに十分な程度でARの転写活性化作用は保持される。具体的なTAU5欠失ARaivとしては、例えば、配列番号：８、１０または１２で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質（それぞれARaiv1Δ1、ARaiv1Δ2、ARaiv1Δ3という）などが挙げられる。【００１５】
尚、ARのN末端配列中ポリグルタミン領域のGlnリピート数には個体差（通常9-34残基程度、前立腺癌細胞ではリピート数が低下している場合がある）があるので、上記の各配列番号で表わされたアミノ酸配列において、ポリグルタミン領域のGlnリピート数が通常みられる範囲内で変化したアミノ酸配列を含むタンパク質もまた、本発明のARaivに包含される。【００１６】
ARaivタンパク質は、ヒトの細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉（例、平滑筋、骨格筋）、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、白色脂肪組織、褐色脂肪組織）など］等、好ましくは前立腺、精巣、乳腺、卵巣、胎盤、子宮等の癌細胞、より好ましくはアンドロゲン非依存性再燃前立腺癌の細胞から、自体公知のタンパク質分離精製技術により単離・精製されるものであってよい。また、例えば、ARaivタンパク質を癌の予防・治療薬のスクリーニングなどに用いる場合には、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成されたタンパク質であってもよいし、あるいは上記いずれかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換えタンパク質であってもよい。【００１７】
本発明におけるARaivには、上記いずれかのアミノ酸配列を含有するタンパク質の他、ヒトで見出される多型もしくは天然のアレル変異体（該変異はARの機能に影響を与えない）、並びにヒト以外の哺乳動物（例、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなど）におけるオルソログも包含される。【００１８】
好ましくは、本発明におけるARaivは、配列番号：６、８または１０で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（即ち、ARaiv1Δ1、ARaiv1Δ2またはARaiv1Δ3）、あるいは配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質（即ち、ARaiv2）である。これらのARaivは、本発明において同定された新規な異型ARである。【００１９】
（２）本発明の異型ARの用途
（２−１）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明は、異型AR、特に上記の新規ARaivの機能、即ちアンドロゲン応答遺伝子の転写調節作用（例、前立腺特異抗原（PSA）遺伝子、TMPRSS2遺伝子等の転写活性化、あるいはSERPIN B5遺伝子等の転写抑制）、または該異型AR遺伝子の発現の抑制作用を指標とする、該異型ARが関与する疾患、例えば該異型AR高発現癌の予防および／または治療物質のスクリーニング方法を提供する。
上述の通り、ARaivの発現および／または活性を阻害すると、アンドロゲン応答遺伝子の転写調節が抑制され、ARシグナルが遮断されて癌細胞の増殖が抑制される。従って、ARaivの発現および／または活性を阻害する化合物は、ARaivからのARシグナル遮断薬として、癌、特にARaiv高発現癌（例、前立腺癌など）、就中、アンドロゲン非依存性再燃前立腺癌の予防・治療薬として使用することができる。
したがって、ARaivタンパク質またはARaivを産生する細胞は、ARaivの発現量および／または活性（例、転写調節活性）を指標とすることにより、癌の予防・治療物質のスクリーニングのためのツールとして用いることができる。【００２０】
ARaivの活性を阻害する化合物をスクリーニングする場合、該スクリーニング方法は、(1) ARaivタンパク質もしくはARaivを産生する能力を有する細胞と、試験化合物とを接触させ、
(2) 該タンパク質の活性を測定し、
(3) 試験化合物を接触させない対照における活性と比較して、該タンパク質の活性を抑制する化合物を選択することを含む。
ARaivを産生する能力を有する細胞と試験化合物との接触は、例えば、該細胞を試験化合物の存在下で培養することにより実施することができる。この場合、対照として試験化合物の非存在下で培養した該細胞を用い、両条件下におけるARaivの活性を比較することにより、試験化合物のARaiv活性抑制効果を評価することができる。
ARaivの活性としては、例えば、アンドロゲン応答遺伝子の転写調節活性や、ARaivタンパク質の核移行活性、該遺伝子のアンドロゲン応答配列（ARE）への結合活性が挙げられる。【００２１】
上記のスクリーニング方法において用いられるARaivを産生する能力を有する細胞としては、それらを生来発現しているヒトもしくは他の哺乳動物細胞またはそれを含む生体試料（例、血液、組織、臓器等）であれば特に制限はないが、アンドロゲン非依存性癌細胞株もしくは腫瘍株（例、AIPC化した前立腺癌の細胞株もしくは腫瘍株）等が好ましく挙げられる。非ヒト動物由来の血液、組織、臓器等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体自体に試験化合物を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。
また、ARaivを産生する能力を有する細胞としては、公知慣用の遺伝子工学的手法により作製された各種の形質転換体が例示される。宿主としては、例えば、H4IIE-C3細胞、HepG2細胞、HEK293細胞、COS7細胞、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。また、宿主として、ARaivタンパク質を生来発現していない前立腺癌細胞、例えばLNCaP-FGC細胞、PC-3細胞、DU-145細胞などを用いることも出来る。【００２２】
具体的には、ARaivをコードするDNA（即ち、配列番号：４、６、８、１０もしくは１２、特に配列番号：６、８、１０もしくは１２で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、具体的には、配列番号：３、５、７、９もしくは１１、特に配列番号：５、７、９もしくは１１で表されるヌクレオチド配列（CDS配列）、または該ヌクレオチド配列の相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号：４、６、８、１０もしくは１２、特に配列番号：６、８、１０もしくは１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等のアンドロゲン応答遺伝子転写調節作用を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNA）を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結して宿主動物細胞に導入することにより調製することができる。
ARaivをコードするDNAは、例えば、配列番号：３または５で表されるヌクレオチド配列に基づいて、適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、前記したARaivを産生する細胞・組織由来のcDNAもしくはcDNAライブラリーから、ハイブリダイゼーション法やPCR法を用いてクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第2版（J. Sambrook et al., Cold Spring HarborLab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。【００２３】
DNAのヌクレオチド配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。例えば、クローニングされたDNAから、例えばTAU5領域等の、欠失させてもARaivとしての機能を消失させない領域の一部もしくは全部を欠失させたり、あるいは一部の領域が欠失した変異ARaivをコードするDNAに、当該欠失した領域の全部もしくは一部を挿入・付加したりすることができる。【００２４】
クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5'末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3'末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。【００２５】
発現ベクターとしては、動物細胞発現プラスミド（例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点（以下、SV40 oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと略称する場合がある、メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、amprと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、neorと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
ARaiv活性として核移行活性を測定する場合、ARaivタンパク質の核移行を容易に検出できるように、ARaivがレポータータンパク質との融合タンパク質として発現するようにベクターを設計することもできる。レポータータンパク質の例としては、GFP,YFP, BFP,RFP等の蛍光タンパク質などが挙げられる。【００２６】
上記したARaivをコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換することにより、ARaiv発現細胞を製造することができる。
宿主としては、哺乳動物細胞、例えば、HepG2細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、LNCaP-FGC細胞、PC-3細胞、DU-145細胞、ヒトFL細胞、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、CHO細胞と略記）、dhfr遺伝子欠損CHO細胞（以下、CHO(dhfr-)細胞と略記）、マウスL細胞、マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットH4IIE-C3細胞、ラットGH3細胞などが用いられ得る。【００２７】
形質転換は、リン酸カルシウム共沈殿法、PEG法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などにより行うことができる。例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456 (1973)に記載の方法を用いることができる。【００２８】
上記のようにして得られる形質転換細胞や生来ARaivを産生する能力を有する哺乳動物細胞または該細胞を含む組織・臓器は、例えば、約5〜20%の胎仔牛血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122巻,501(1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology,8巻,396(1959)〕，RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association,199巻,519(1967)〕，199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などの培地中で培養することができる。培地のpHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30〜40℃で行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。【００２９】
試験化合物としては、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。【００３０】
試験化合物の上記細胞との接触は、例えば、上記の培地や各種緩衝液（例えば、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に試験化合物を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。添加される試験化合物の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約0.1nM〜約10000nM、好ましくは約1nM〜約1000nMの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約10分〜約24時間が挙げられる。【００３１】
ARaivを産生する細胞が、非ヒト哺乳動物個体の形態で提供される場合、該動物個体の状態は特に制限されないが、例えば、担癌マウス等のモデル動物であってよい。このような担癌マウスは常法により作製することができる。好ましくは、ARaivのタンパク質コード配列（CDS）を含む核酸、特にARaiv2もしくはARaiv1Δ1〜3のいずれかのCDS配列（即ち、配列番号：６、８、１０もしくは１２で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするCDS配列、具体的には、配列番号：５、７、９もしくは１１で表されるヌクレオチド配列中のCDS配列）を含む核酸を、発現可能な形態で導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることができる。該トランスジェニック動物は常法により作製することができる。
使用される動物の飼育条件に特に制限はないが、SPFグレード以上の環境下で飼育されたものであることが好ましい。試験化合物の該細胞との接触は、該動物個体への試験化合物の投与によって行われる。投与経路は特に制限されないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経口投与、気道内投与、直腸投与等が挙げられる。投与量も特に制限はないが、例えば、１回量として約0.5〜20 mg／kgを、1日1〜5回、好ましくは1日1〜3回、1〜14日間投与することができる。【００３２】
上記のスクリーニング方法におけるARaiv活性の測定は、例えば、アンドロゲン応答遺伝子（例、PSA遺伝子、TMPRSS2遺伝子等）の発現量を指標にして行うことができる。当該遺伝子の発現量は、RT-PCRやノーザンブロット分析を用いてRNAレベルで行っても、あるいはその翻訳産物に対する抗体を用いてタンパク質レベルで行ってもよい。また、アンドロゲンに応答するプロモーター（例、PSAプロモーター等のネイティブなアンドロゲン応答配列（ARE）を有するプロモーター、あるいはARE配列とSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター、HSV-TKプロモーター等の動物細胞用プロモーターとを組み合わせたキメラプロモーターなど）の制御下にあるレポータータンパク質をコードするDNAを導入して該レポータータンパク質の発現を調べることによって、ARaiv活性を評価することがより好ましい。ここで「PSAプロモーター」とは、PSA遺伝子の5’上流配列中、少なくともTATAボックス等の必須プロモーター領域から上流のARE相当配列（ヒトPSA遺伝子の場合、AGAACAGCAAGTGCT；配列番号：１７）までを含む領域をいい、好ましくは、さらに上流のアンドロゲン応答領域（ARR）として知られる35塩基対部分［ヒトPSA遺伝子の場合、GTGGTGCAGGGATCAGGGAGTCTCACAATCTCCTG；配列番号：１８（J. Biol. Chem., 271(11): 6379-6388, 1996）］までを含む領域、より好ましくは転写開始点の上流約6000基対を含む領域、さらに好ましくは転写開始点の上流約600塩基対を含む領域が挙げられる。PSAプロモーターは、実際の前立腺癌細胞におけるARaivの挙動をよく反映するという点で有用である。プロモーターの活性を増強させる必要がある場合には、複数（好ましくは2〜5個、より好ましくは2または3個）のプロモーターをタンデムに繋げることが好ましい。レポータータンパク質としては、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等が使用できる。レポータータンパク質をコードするDNAは、上述の動物細胞発現用ベクター中に挿入して、上述の遺伝子導入法を用いて導入され得る。
ARaivを産生する細胞が、非ヒト哺乳動物個体の形態で提供される場合、ARaivの活性は、該動物から採取された組織（例、前立腺組織）の増殖、分化、細胞死や癌化、癌増殖を指標として評価することもできる。かかる指標を用いる場合、ARaivを産生する非ヒト哺乳動物個体を用いた当該スクリーニング系は、新規な癌の予防・治療薬の候補物質のスクリーニングだけでなく、既存の癌の予防・治療薬の薬効評価系として特に有用である。【００３３】
活性測定のための被験試料としては、ARaivを産生する細胞が細胞培養、組織、臓器培養の形態で提供される場合は該培養物の抽出液が、該細胞がそれを含む非ヒト哺乳動物個体として提供される場合は、該個体から分離した細胞、組織、臓器の抽出物、例えば、前立腺、精巣、乳腺、あるいはそれらの組織切片等のホモジネートなどが挙げられる。【００３４】
一方、上記のスクリーニング方法において単離されたARaivタンパク質を用いる場合、好ましくは、ARaivとして、配列番号：６、８、１０または１２で表わされるアミノ酸配列を含む異型ARタンパク質が用いられる。該タンパク質は、上述の通り、それらを産生する細胞・組織から単離精製してもよいし、化学的に合成してもよいし、遺伝子工学的に組換えタンパク質として製造してもよい。
該ARaivと試験化合物との接触は、例えば、水もしくは適当な緩衝液中で行うことができる。添加される試験化合物の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約0.1nM〜約10000nMの範囲、好ましくは1nM〜1000nMの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約10分〜約24時間が挙げられる。
ARaivの活性は、例えば、アンドロゲン応答遺伝子（例、PSA遺伝子、TMPRSS2遺伝子等）のコンセンサスなARE配列（例、AGAACAnnnTGTTCT；配列番号：３２）を含むオリゴヌクレオチドをプローブとするゲルシフトアッセイにより測定することができる。【００３５】
例えば、上記のスクリーニング方法において、試験化合物の存在下におけるARaivの活性が、試験化合物の非存在下における活性に比べて、約20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは約50％以上阻害された場合に、該試験化合物を、ARaivの活性阻害物質、従って、癌、特にARaiv高発現癌（例、前立腺癌等）、とりわけアンドロゲン非依存性再燃前立腺癌の予防・治療物質の候補として選択することができる。【００３６】
本発明はまた、ARaiv、特に新規ARaiv（配列番号：６、８、１０または１２で表わされるアミノ酸配列を含む異型ARタンパク質）を産生する能力を有する細胞における該異型ARの発現を、試験化合物の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。本方法において用いられる細胞、試験化合物の種類、試験化合物と細胞との接触の態様などは、上記したARaivの活性を指標とする方法と同様である。【００３７】
ARaivの発現量は、前記したARaivをコードするDNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、即ち、配列番号：３、５、７、９または１１で表されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸を用いて、ARaivのmRNAを検出することにより、RNAレベルで測定することができる。あるいは、該発現量は、ARに対する抗体あるいは後述のARaivに対する抗体を用いて、ARaivタンパク質を検出することにより、タンパク質レベルで測定することもできる。尚、ARaivを全長型ARと共に生来発現している細胞や、全長型ARのみを発現する細胞にARaivをコードする核酸を導入した細胞を使用する場合は、全長型ARのmRNAもしくはタンパク質とARaivのmRNAもしくはタンパク質を区別して測定する必要がある。それには後述の「本発明の診断剤」で用いられた、ARaivに特異的な領域を認識し得る核酸や抗体を使用することが出来る。またタンパク質レベルで測定する場合には、ARに対する抗体を用いてWestern Blotを行い、得られるバンドの分子量でARaivをARと区別して測定することも出来る。【００３８】
例えば、上記スクリーニング法において、試験化合物の存在下におけるARaivの発現量（mRNA量またはタンパク質量）が、試験化合物の非存在下における場合に比べて、約20%以上、好ましくは約30％以上、より好ましくは約50％以上阻害された場合、該試験化合物を、ARaivの発現阻害物質、従って、癌、特にARaiv高発現癌（例、前立腺癌等）、とりわけアンドロゲン非依存性再燃前立腺癌の予防・治療物質の候補として選択することができる。【００３９】
（２−２）核酸医薬の創薬ターゲットとしての異型AR
ARaivは一部のアンドロゲン非依存性再燃前立腺癌で発現しており、リガンド（アンドロゲン、抗アンドロゲン剤）非依存性の恒常活性型分子であるため、ARaiv発現患者においては、本バリアントからのARシグナルがアンドロゲン非依存的な癌細胞の増殖の少なくとも一因であると考えられる。従って、ARaivの機能を阻害する物質は、ARaiv発現癌の予防および／または治療に有効である。【００４０】
「リガンド結合ドメインを欠失する異型AR（ARaiv）の機能を阻害する物質」は、ARaivの発現を阻害する物質（発現阻害薬）とARaivの活性を阻害する物質（活性阻害薬）とに大別される。ARaivの発現阻害薬は、ARaivの転写レベル、転写後調節のレベル、タンパク質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル、ARaivタンパク質細胞内輸送のレベル、ARaivタンパク質の分解等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、ARaivの発現阻害薬としては、例えば、ARaivの転写を阻害する物質、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAの分解を促進する物質、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害する物質、ARaivポリペプチドの正しい構造形成を阻害する物質、ARaivポリペプチドの翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても好ましく用いることができるが、ARaivタンパク質の産生を直接的に阻害するという意味では、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害する物質が好ましい。さらにARaiv ｍRNAを生じる選択的スプライシングを阻害する物質やARaiv ｍRNAを選択的に分解促進する物質もまた好ましい。【００４１】
ARaivのmRNAからタンパク質への翻訳を特異的に阻害し得る物質として、好ましくは、該mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。
ARaivのmRNAのヌクレオチド配列と実質的に相補的なヌクレオチド配列とは、哺乳動物のARaiv発現細胞内の生理的条件下において、該mRNAの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る程度の相補性を有するヌクレオチド配列を意味し、具体的には、例えば、該mRNAのヌクレオチド配列と完全相補的なヌクレオチド配列（すなわち、mRNAの相補鎖のヌクレオチド配列）と、オーバーラップする領域に関して、約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上、特に好ましくは約97％以上の相同性を有するヌクレオチド配列である。
本発明における「ヌクレオチド配列の相同性」は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。ヌクレオチド配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。【００４２】
より具体的には、ARaiv mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列としては、(a) 配列番号：４、６、８、１０もしくは１２、特に配列番号：６、８、１０もしくは１２で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列、さらに詳細には、配列番号：３、５、７、９もしくは１１、特に配列番号：５、７、９もしくは１１で表わされるヌクレオチド配列、または(b) 該ヌクレオチド配列の相補鎖とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、且つ配列番号：４、６、８、１０もしくは１２、特に配列番号：６、８、１０もしくは１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の活性（例、アンドロゲン応答遺伝子転写調節作用）を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列が挙げられる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム塩濃度が約19〜約40mM、好ましくは約19〜約20mMで、温度が約50〜約70℃、好ましくは約60〜約65℃の条件をいう。特に、ナトリウム塩濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が好ましい。【００４３】
ARaiv mRNAは、好ましくは、配列番号：５で表されるヌクレオチド配列を含むヒトARaiv2 mRNA、配列番号：７、９および１１でそれぞれ表されるヌクレオチド配列を含むヒトARaiv1Δ1、ARaiv1Δ2およびARaiv1Δ3のmRNAである。【００４４】
「ARaiv mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列の一部」とは、ARaiv mRNAに特異的に結合することができ、且つ該mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも10塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約20塩基以上含むものである。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、ARaivは、通常のスプライスバリアント（全長型AR）と第1〜第3エクソンを共有するので、ARaiv mRNAからの翻訳を特異的に阻害するには、ARaivの第4エクソン（ARaiv1の場合、配列番号：１３で表わされるヌクレオチド配列（NCBI RefSeq No. NG_009014.1 (GI:213385253) の155642〜157044位）、ARaiv2の場合、配列番号：１４で表されるヌクレオチド配列（NG_009014.1の147929〜149083位））の全部もしくは一部を、少なくとも標的配列の一部として含むことが望ましい。しかし、癌細胞はARaiv mRNAだけでなく全長型ARをコードするmRNAも発現するので、両方のARからのシグナリングを遮断するために、第1〜第3エクソン内の領域を標的配列とすることもまた好ましい。
尚、TAU5欠失ARaivに対応する全長型ARの発現が確認されていないことから、TAU5領域の全部もしくは一部の欠失により生じる、該欠失領域の5’側および3’側フランキング配列の連結部位を標的配列とすることによっても、TAU5欠失ARaiv mRNAからの翻訳を特異的に阻害し得る可能性がある。【００４５】
具体的にはARaiv mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸として、以下の(a)〜(e)のいずれかの核酸が好ましく例示される。
(a) ARaiv mRNAに対するアンチセンス核酸
(b) ARaiv mRNAに対するsiRNA
(c) ARaiv mRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
(d) ARaiv mRNAに対するmiRNA
(e) ARaiv mRNAに対するmiRNAを生成し得る核酸【００４６】
(a) ARaiv mRNAに対するアンチセンス核酸
本発明における「ARaiv mRNAに対するアンチセンス核酸」とは、該mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。
アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。【００４７】
上記の通り、アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。
さらに、ARaivだけでなく全長型ARをも標的とする場合には、アンチセンス核酸は、ARaivのmRNAとハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるAR遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。【００４８】
アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のDNAもしくはRNAでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2'位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2'-O-Me）、CH2CH2OCH3（2'-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。【００４９】
RNAの糖部のコンフォーメーションはC2'-endo（S型）とC3'-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2'酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA(LNA)（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。【００５０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ARaivのcDNA配列情報に基づいてmRNAの標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。【００５１】
(b) ARaiv mRNAに対するsiRNA
本明細書においては、ARaiv mRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、ARaiv mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として汎用されている。siRNAは標的となるmRNAのヌクレオチド配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：RNAi Designer; Invitrogen）を用いて適宜設計することができる。より具体的には、後述の実施例において使用されるsiRNA等が本発明のARaivに対するsiRNAとして好ましく例示され得るが、それらに限定されない。【００５２】
siRNAを構成するリボヌクレオシド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のアンチセンス核酸の場合と同様の修飾を受けていてもよい。但し、siRNAの場合、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。【００５３】
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるショートヘアピンRNA（shRNA）を合成し、これをダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。【００５４】
(c)ARaiv mRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
本明細書においては、生体内で上記のARaiv mRNAに対するsiRNAを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、ARaiv mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上記したshRNAやそれを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば15から25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結したヌクレオチド配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。shRNAの発現カセットを含む発現ベクターは、上記shRNAをコードする二本鎖DNAを常法により作製した後、適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。shRNAの発現ベクターとしては、U6やH1などのPol III系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたshRNAは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー（dicer）などによってプロセシングされることにより成熟siRNAが形成される。【００５５】
(d)ARaiv mRNA に対するmiRNA
本明細書においては、ARaiv mRNAの3’-非翻訳領域に相補的な短い塩基配列を有する内在性の一本鎖RNA、いわゆるmiRNAもまた、ARaiv mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。より具体的には、hsa-mir-98、hsa-let-7a-1/2/3、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f-1/2、hsa-let-7ｇ、hsa-let-7i、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-134、hsa-miR-149*、hsa-miR-491-5p、hsa-miR-574-5p等が本発明のARaivに対するmiRNAとして好ましく例示され得るが、それらに限定されない。【００５６】
(e) ARaiv mRNA に対するmiRNAを生成し得る核酸
本明細書においては、生体内で上記のARaiv mRNAに対するmiRNAを生成し得るようにデザインされた核酸（pre-miRNA、pri-miRNA等）もまた、ARaiv mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。【００５７】
ARaiv mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該mRNAをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイムが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。ARaiv mRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。【００５８】
ARaiv mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが付加された形態で供与され得る。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3'端または5'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3'端または5'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。【００５９】
〔アンチセンス核酸、siRNA、その前駆体核酸、miRNA、その前駆体核酸を含有する医薬〕
ARaivの転写産物に相補的に結合し、該転写産物からのタンパク質の翻訳を抑制することができるアンチセンス核酸や、ARaivの転写産物における相同な（もしくは相補的な）ヌクレオチド配列を標的として該転写産物を切断し得るsiRNA（もしくはリボザイム）、さらに該siRNAの前駆体であるshRNA、ARaivの転写産物に相補的に結合し、該転写産物からのタンパク質の翻訳を抑制したり、該転写産物の分解を促進するmiRNA、さらに該miRNAの前駆体であるpre-miRNAなど（以下、包括的に「本発明の核酸」という場合がある）は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。【００６０】
本発明の核酸を再燃前立腺癌の予防・治療剤として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。即ち、本発明の核酸を、単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどの適当な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記核酸を単独またはリポソームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。【００６１】
本発明の核酸を含有してなる医薬組成物としては、本発明の核酸と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。【００６２】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の核酸を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。【００６３】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。【００６４】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明の核酸は、例えば、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。【００６５】
本発明の核酸を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の前立腺癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の核酸を１回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。【００６６】
なお前記した各組成物は、本発明の核酸との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分（例、後述のHSP90阻害薬、パモ酸ピルビニウム等）を含有してもよい。
さらに、本発明の核酸は、他の薬剤、例えば、アルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、5-フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシド、イリノテカン、タキソテール、アンドロゲン低下薬（例、LH-RHアナログ（例、酢酸リュープロレリン等）、LH-RH拮抗薬（例、デガレリックス））、アンドロゲン合成阻害薬（例、アビラテロン等）、抗アンドロゲン剤（例、フルタミド、ビカルタミド等）、エストロゲン剤、プレドニゾロン等の合成副腎皮質ホルモン薬、抗体医薬（例、トラスツズマブ、セツキシマブ、ペルツズマブ等）、低分子分子標的薬（例、ラパチニブ、イマチニブ、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス等）、癌ワクチンなどと併用してもよい。本発明の核酸および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。【００６７】
（２−３）ARaiv発現癌の診断剤
本発明におけるARaiv1（ここでは、配列番号：１で表されるC末端アミノ酸配列を含むARaivの総称を意味する）およびARaiv2（ここでは、配列番号：２で表されるC末端アミノ酸配列を含むARaivの総称を意味する）は、全長型ARにはない特異的なC末端アミノ酸配列を有するので、癌細胞において、該アミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは該アミノ酸配列をコードするARaiv1およびARaiv2の第4エクソンのヌクレオチド配列（それぞれ配列番号：１３および１４）を有するRNAの存在の有無を調べることにより、該癌細胞がARaiv1またはARaiv2を発現しているか否かを判定することができる。
したがって、本発明はまた、配列番号：１もしくは２で表されるアミノ酸配列または配列番号：１３もしくは１４で表されるヌクレオチド配列を特異的に認識する物質を含有してなる、ARaiv1もしくはARaiv2を発現する癌の診断剤を提供する。検査対象となる癌患者は特に制限はないが、好ましくは前立腺癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌の患者、より好ましくはアンドロゲン非依存性再燃前立腺癌患者である。検体としては、バイオプシーや循環癌細胞(circulating tumor cell :CTC)を用いることが出来る。
配列番号：１もしくは２で表されるアミノ酸配列を特異的に認識する物質としては、例えば、当該アミノ酸配列をエピトープとする抗体が挙げられる。そのような抗体は、配列番号：１もしくは２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを化学合成し、該ペプチドを免疫原としてウサギやマウスなどを免疫し、常法に従ってポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製することにより取得可能である。ARaiv1またはARaiv2タンパク質の検出は、自体公知の免疫学的手法（例、ウェスタンブロッティング、ELISA、免疫組織化学、フローサイトメトリー等）を用いて行うことができる。またCell Search System等のCTC検出システムと組み合わせて行うことが出来る。
配列番号：１３もしくは１４で表されるヌクレオチド配列を特異的に認識する物質としては、当該ヌクレオチド配列および／またはその相補鎖の全部もしくは一部に対して相補的なヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。そのような核酸は、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて化学合成して取得することができる。ARaiv1またはARaiv2 mRNAの検出は、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、RT-PCR、in situハイブリダイゼーション等の自体公知の核酸検出法を用いて行うことができる。またCell Search System等のCTC検出システムと組み合わせて行うことが出来る。
上記診断の結果、ARaiv1またはARaiv2を発現する癌を有すると判定された患者は、本発明のARaiv発現/活性阻害薬の好ましい投与対象である。したがって、本発明はまた、上記診断剤を用いてARaiv1を発現する癌を有すると診断された患者に対して投与される、ARaiv発現/活性阻害薬を含有してなる癌の予防・治療剤を提供する。【００６８】
（３）他のARaiv発現/活性阻害薬
（３−１）HSP90阻害薬
本発明におけるARaiv発現阻害薬は、上記のようなARaiv mRNAのヌクレオチド配列と相補的もしくは実質的に相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含む核酸に限定されず、ARaivタンパク質の産生を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物などの他の物質であってもよい。そのような低分子化合物の例としては、下記のHSP90阻害薬などが挙げられる。
本発明で用いられるHSP90阻害薬は、ARaivの機能、即ちアンドロゲン応答遺伝子の転写調節作用（例、前立腺特異抗原（PSA）遺伝子、TMPRSS2遺伝子等の転写活性化、あるいはSERPIN B5遺伝子等の転写抑制）を阻害しうる限り、HSP90の阻害様式などに特に制限はなく、例えば、HSP90のATP結合ポケットに結合してそのシャペロン機能を阻害する薬剤（例、ゲルダナマイシンやその誘導体）、ATP結合ポケット以外でHSP90に結合してその機能を阻害する薬剤（例、セラストロール、ゲデュニンなど）等が挙げられる。【００６９】
ゲルダナマイシン誘導体としては、例えば、Tian ZQ et al., Bioorg. Med. Chem. 12 (2004) 5317-5329、米国特許第5,387,584号、米国特許第4,261,989号、米国特許第3,987,035号、WO 00/03737、WO 02/079167、WO 99/21552、WO 99/22761に記載の化合物が挙げられる。好ましいゲルダナマイシン誘導体として、ゲルダナマイシンの17位のメトキシ基をアルキルアミノ基に置換して得られる化合物（17-アルキルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン）を挙げることができる。このような化合物は、ゲルダナマイシンの毒性を軽減し得る点で有利である。具体的には、例えば、17-アリルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン（17-AAG）、17-(2-ジメチルアミノエチル)アミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン（17-DMAG）、17-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)アミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン、17-(2-(カルボキシ)エチル)アミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン、17-(2-(N-メチルエチルアミノ)エチル)アミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン、17-(2-(ピロリジン-1-イル)エチル)アミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン、17-(2-(ピペラジン-1-イル)エチル)アミノ−デメトキシゲルダナマイシン、17-(4-(ジメチルアミノ)ブチル)アミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン等を用いることができる。【００７０】
他のHSP90阻害剤としては、ラジシコールおよびその誘導体、アデノシン誘導体PU3（WO02/036075）、ピラゾール環が結合した1,3-ジヒドロキシベンゼン誘導体（WO 03/055860、WO 2004/050087、WO 2004/056782）またはイソキサゾール環が結合した1,3-ジヒドロキシベンゼン誘導体（WO 2004/072051）、窒素原子で直接結合した含窒素置換基を有するピラゾール環が結合した1,3-ジヒドロキシベンゼン誘導体（特開2006-306755）、セラストロール、ゲデュニン（Cancer Cell, 2006 10(4): 321-30）などが挙げられるが、それらに限定されない。【００７１】
HSP90阻害薬は上記のいずれかの化合物の塩の形態であってもよい。塩の例としては、ハロゲン化水素酸塩（具体的にはフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等）、無機酸塩（具体的には硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）、有機カルボン酸塩（具体的には酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（具体的にはメタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等）、アミノ酸塩（具体的にはアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（具体的にはナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（具体的にはマグネシウム塩、カルシウム塩等）等が挙げられる。【００７２】
HSP90阻害薬は、ARaivの機能（アンドロゲン応答遺伝子の転写調節作用）を阻害することができるため、ARaiv1発現癌細胞の増殖阻害剤、ARaiv1発現癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など、好ましくは、前立腺癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌など、より好ましくはアンドロゲン非依存性再燃前立腺癌）の予防・治療剤として使用することができる。【００７３】
HSP90阻害薬を含有するARaivの転写調節作用阻害剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。投与に用いられる医薬組成物としては、HSP90阻害薬と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。【００７４】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、HSP90阻害薬を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、HSP90阻害薬を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。【００７５】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。【００７６】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。HSP90阻害薬の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgが好ましい。【００７７】
HSP90阻害薬を含有する上記製剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の前立腺癌の治療・予防のために使用する場合には、HSP90阻害薬を1回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。【００７８】
HSP90阻害薬を含有する医薬組成物は、HSP90阻害薬との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、HSP90阻害薬は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシド、イリノテカン、LH-RHアナログ（例、酢酸リュープロレリン等）、抗アンドロゲン剤（例、フルタミド、ビカルタミド等）、アンドロゲン合成阻害薬（例、アビラテロン等）、抗体医薬（例、トラスツズマブ、セツキシマブ等）などと併用してもよい。HSP90阻害薬および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。また、抗体医薬と併用する場合、HSP90阻害薬と抗体とを自体公知の手法によりコンジュゲートとすることにより、分子標的薬とすることができる。HSP90阻害薬と抗体との結合は、好ましくはリンカーを介して行われる。リンカーは、例えば置換または未置換の脂肪族性アルキレン鎖を含み、その両末端に、HSP90阻害薬または抗体の官能基と結合可能な基、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド基、エステル基、チオール基、イミドカルボネート基、アルデヒド基などを含むものである（抗体工学入門、地人書館、1994年）。【００７９】
（３−２）ARaiv活性阻害薬
本発明におけるARaivの活性阻害薬は、いったん機能的に産生されたARaivタンパク質がアンドロゲン応答遺伝子の転写調節作用を発揮するのを阻害する限りいかなるものでもよく、例えば、ARaivとコファクターとの複合体形成を阻害する物質や、ARaiv複合体の標的遺伝子への結合を阻害する物質、ARaivの核移行を阻害する、ARaivの分解を促進する物質等が挙げられる。【００８０】
具体的には、ARaivタンパク質の活性を阻害する物質として、例えば、ARaivタンパク質に対する抗体が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。このとき、ARバリアントの中でARaivを特異的に認識する抗体を得るためには、免疫原としてARaivの第4エクソンによりコードされる領域、第3エクソンと第4エクソンとのジャンクション領域の部分ペプチドを用いるか、DNA免疫法によりコンフォーメーショナル抗体を作製することが望ましい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
好ましい一実施態様において、ARaivタンパク質に対する抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウスやファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。【００８１】
ARaivは核内受容体バリアントであり、アンドロゲン応答遺伝子の転写調節において中心的な役割を担っているので、ARaivの活性阻害薬は、細胞内移行性、核移行性に優れた物質であることが望ましい。したがって、ARaivの活性を阻害するより好ましい物質は、Lipinski's Ruleに見合った低分子化合物である。そのような化合物は、例えば、上述の本発明のスクリーニング法を用いて取得することができる。一方、ARaiv活性阻害薬として上記の抗ARaiv抗体を用いる場合、細胞内移行性を高めるために、リポソームに封入することもできる。好ましいリポソームは、正電荷リポソーム、正電荷コレステロール、膜透過性ペプチド結合リポソームなどである（中西守ら,タンパク質核酸酵素44:1590-1596 (1999)、二木史朗,化学と生物43:649-653 (2005)、Clinical Cancer Research 59:4325-4333 (1999)など）。また、標的の癌細胞に抗ARaiv抗体を選択的に送達するために、該癌細胞で特異的に高発現する表面抗原分子に対する二重特異的抗体として調製することもできる。【００８２】
本発明のARaivの機能を阻害する物質は、ARaivによるアンドロゲン応答遺伝子の転写調節を阻害することによりARシグナルを遮断するので、癌、特にARaiv高発現癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など、好ましくは、前立腺癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌など、より好ましくはアンドロゲン非依存性再燃前立腺癌）の予防および／または治療剤として使用することができる。【００８３】
〔ARaivに対する抗体、ARaivの発現または活性を阻害する低分子化合物等を含有する医薬〕
ARaivに対する抗体や、ARaivの発現または活性を阻害する低分子化合物（例、HSP90阻害薬、パモ酸ピルビニウム等）を含有する医薬は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。【００８４】
上記の抗体や低分子化合物を含有してなる医薬組成物としては、上記の抗体もしくは低分子化合物またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。ここで薬理学的に許容され得る担体、希釈剤および賦形剤としては、HSP90阻害薬を含有する製剤について上記したと同様のものを、好ましく使用することができる。【００８５】
上記の抗体もしくは低分子化合物またはその塩を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の前立腺癌の治療・予防のために使用する場合には、抗体もしくは低分子化合物を1回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。【００８６】
なお前記した各組成物は、上記抗体や低分子化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、上記の抗体もしくは低分子化合物は、本発明の核酸を含有する医薬において前記したと同様の他の薬剤と併用してもよい。上記の抗体もしくは低分子化合物とそれらの他の薬剤とは、同時または異なった時間に患者に投与すればよい。【００８７】
（４）ARaiv発現前立腺癌におけるARaiv発現/活性阻害薬とARシグナル阻害薬との併用
本発明のARaivの機能を阻害する物質（即ち、上記ARaiv発現もしくは活性阻害薬）は、少なくともARaivからのARシグナルを遮断することができるが、ARaiv発現癌細胞では通常、全長型AR（アンドロゲン依存性AR）も同時に発現している。後述の実施例に示されるとおり、全長型ARとARaivの両方を阻害する方が、ARaivのみを特異的に阻害する場合よりもARaiv発現癌細胞の増殖抑制効果が高い。しかしながら、ARaiv発現/活性阻害薬のみで、ARaivだけでなく全長型ARも阻害しようとすると、投与量を上げる必要が生じる可能性がある。例えば、HSP90は癌細胞だけでなく正常な細胞でも発現し、種々の生理機能を担っていることから、高用量で投与する場合、副作用の発現が懸念される。
全長型ARはリガンド結合ドメインを有し、アンドロゲン依存的にAR活性を発現するので、アンドロゲンの供給自体を遮断するか、ARに対してアンドロゲンと拮抗して作用する物質を共存させることにより、全長型ARからのARシグナルを遮断し、アンドロゲン応答遺伝子の転写調節を阻害することができる。したがって、ARシグナル阻害薬を、本発明のARaiv発現/活性阻害薬と組み合わせることにより、ARaiv発現/活性阻害薬をARaivの発現または活性阻害のために選択的に作用させることができ、その結果、ARaiv発現/活性阻害薬の投与量を低減して副作用を軽減することができる。
したがって、本発明はまた、本発明のARaiv発現/活性阻害薬とARシグナル阻害薬とを併用することによる、ARaiv発現癌の予防・治療剤を提供する。該併用剤の投与対象は、ARaivを発現する癌を有する動物であれば特に制限はないが、例えば、後記（４）の診断剤を用いてARaivを発現する癌を有すると診断された動物である。
ここで用いられるARaiv発現/活性阻害薬は上記されたものであれば特に制限はないが、例えば、ARaivの発現または活性を特異的または優先的に阻害する物質が好ましい。例えば、HSP90阻害薬の場合、後述の実施例に示されるとおり、全長型ARよりもARaivに対してより低濃度で発現阻害効果を発揮することができるので、ARaiv発現/活性阻害薬の好ましい一例として挙げることができる。
一方、ここで用いられるARシグナル阻害薬としては、例えば、アンドロゲン低下薬（例、LH-RHアナログ（例、酢酸リュープロレリン等）、LH-RH拮抗薬（例、デガレリックス））、アンドロゲン合成阻害薬（例、アビラテロン等）、5α還元酵素阻害薬(例、デュタステリド等）、AR拮抗（抗アンドロゲン）薬（例、ビカルタミド、フルタミド等）、エストロゲン剤等などが挙げられるが、それらに限定されない。【００８８】
上記の併用において、ARaiv発現/活性阻害薬は、単独投与の場合について上記されたと同等量、あるいはそれよりも適宜低減した量を患者に投与することができる。また、ARシグナル阻害薬は、各々について単独投与の場合に適用される自体公知の投与量と同等か、あるいはそれよりも適宜低減した量を患者に投与することができる。ARaiv発現/活性阻害薬とARシグナル阻害薬とは、同時または異なった時間に患者に投与すればよい。【００８９】
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（selenocysteine）【００９０】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ARaiv1に特異的なC末端アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ARaiv2に特異的なC末端アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
ARaiv1 cDNAのヌクレオチド配列を示す。
〔配列番号：４〕
ARaiv1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
ARaiv2 cDNAのヌクレオチド配列を示す。
〔配列番号：６〕
ARaiv2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
ARaiv1Δ1 cDNAのヌクレオチド配列を示す。
〔配列番号：８〕
ARaiv1Δ1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
ARaiv1Δ2 cDNAのヌクレオチド配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ARaiv1Δ2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ARaiv1Δ3 cDNAのヌクレオチド配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ARaiv1Δ3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ARaiv1 mRNAの第4エクソンのヌクレオチド配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ARaiv2 mRNAの第4エクソンのヌクレオチド配列を示す。
〔配列番号：１５〕
野生型ARのCDS配列を示す。
〔配列番号：１６〕
野生型ARのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ヒトPSAプロモーター中のARE配列を示す。
〔配列番号：１８〕
ヒトPSAプロモーター中のARR配列を示す。
〔配列番号：３２〕
コンセンサスなARE配列を示す。
配列番号：１９〜３１、３３〜５２については、実施例を参照のこと。【００９１】
実施例３で得られたARaiv1クローンを保持するEscherichia coli TOP10/pcDNA3.1-hARaiv1は、平成21（２００９）年７月１５日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）；〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１４４として寄託されている。
実施例３で得られたARaiv1Δ1クローンを保持するEscherichia coli TOP10/pcDNA3.1-hARaiv1Δ1は、平成21（２００９）年７月１５日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）；〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１４５として寄託されている。
実施例３で得られたARaiv1Δ2クローンを保持するEscherichia coli TOP10/pcDNA3.1-hARaiv1Δ2は、平成21（２００９）年７月１５日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）；〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１４６として寄託されている。
実施例３で得られたARaiv1Δ3クローンを保持するEscherichia coli TOP10/pcDNA3.1-hARaiv1Δ3は、平成21（２００９）年７月１５日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）；〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１４７として寄託されている。
実施例２で得られたARaiv2クローンを保持するEscherichia coli TOP10/pGEM-T easy-hARaiv2-3’cDNAは、平成21（２００９）年７月１５日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）；〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１４８として寄託されている。
【実施例】
【００９２】
以下において、実施例および参考例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。【００９３】
実施例１：
前立腺癌患者の皮膚転移巣から得られた生検サンプルを2〜3 mm厚に切断し、雄ヌードマウス(BALB-nu/nu, Charles River Japan) の皮下に移植した。この担癌マウスの腫瘍をJDCaP腫瘍と名付けた。JDCaP腫瘍は雄ヌードマウスの皮下への移植を繰り返すことで維持した。JDCaP腫瘍を有する担癌マウスを去勢することで完全に腫瘍を退縮させ、約6ヶ月飼育することで再燃腫瘍を形成させた。この再燃腫瘍をJDCaP-hr (hormone refractory)と名付けた。
JDCaP-hr細胞株は、JDCaP-hr腫瘍より樹立した。JDCaP-hr腫瘍を細かく切断し、10% DCC-FBSを含むフェノールレッド不含RPMI1640 (Invitrogen) 中で培養した。数回の継代の後、培地を3% DCC-FBSおよび100ng / mlのIGF (JRH Biosciences) を含むRPMI1640に変更し、マウス由来の間質細胞の増殖を抑えて純化した。
JDCaP腫瘍およびJDCaP-hr腫瘍におけるARタンパク質を、ARのN末端（N-20）あるいはC末端（C-19）に対する特異的抗体（Santa Cruz）を用いてウエスタンブロッティング解析した。Loading controlとしてβ-actinをAC-15抗体(Sigma) を用いて検出した。結果を図１に示す。AIPC株であるJDCaP-hrにおいて約75kDaのC末端欠損型ARタンパク質が認められた。【００９４】
実施例２：
JDCaP-hrの培養細胞およびxenograft腫瘍から、RNeasy Mini kit (Invitrogen) およびRNase-Free DNase set (Qiagen) を用いてtotal RNAを抽出し、GeneRacer kit (Invitrogen) を用いて3’ rapid amplification of cDNA end (RACE) を行った。１次PCRには、ARのexon1に特異的なフォワードプライマー (5’-gcatggtgagcagagtgccctat-3’；配列番号：１９) およびキット付属のリバースプライマーを用いた。次に、１次PCR反応液の希釈液を鋳型として、exon1に特異的なnestedフォワードプライマー (5’-tactccggaccttacggggacat-3’；配列番号：２０) およびキット付属のリバースプライマーを用いてnested PCRを行った。得られた3'-RACE産物をクローニングし、Big Dye Terminator v3.1およびABI PRISM7700 (Applied Biosystems) を用いてヌクレオチド配列を解析した。その結果、ARの既知3’配列クローンに加えて、AR exon 3 の直下流にintron3 の一部が連結し、in-frame のstop codonが生じているクローンが２種見出された（図２ａおよびｂ）。これらの3’配列を有するARバリアントの翻訳産物として、AF1，DNA結合ドメインおよびhinge region の一部を有し、リガンド結合ドメインを欠いた分子が予測された。リガンド結合ドメインの無いARはアンドロゲン非依存性となることが予想されることから、配列番号１の3’末端を有し、C末端アミノ酸配列EKFRVGNCKHLKMTRP（配列番号：１）で特徴付けられるARバリアントをARaiv1（AR androgen-independent variant 1）、GSSLLPATSKKMCLS（配列番号：２）の3’末端を有するARバリアントをARaiv2（AR androgen-independent variant 2）と名づけた。【００９５】
実施例３：
JDCaP-hrのRNAからSuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) を用いてcDNAを調製した。得られたcDNAから、PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase (Stratagene) 、ARの開始コドンを含むフォワードプライマー (5’-atggaagtgcagttagggctgggaag-3’；配列番号：２１) およびARaiv1 transcriptの3’末端をコードするexon4bに特異的なリバースプライマー (5’-ggtctggtcattttgagatgcttgcaatt-3’；配列番号：２２) を用いて、ARaiv1のORFを増幅した。得られたORF断片をpGEM-T easy vector (Promega) にクローニングし、配列解析を行った。その結果、exon1のTAU5 (transcription activation unit 5) 領域にin-frameの欠損を持つクローンが３種得られた（図３）。これらのARaiv1クローンをそれぞれ、ARaiv1Δ1，ARaiv1Δ2，ARaiv1Δ3と名づけた。【００９６】
実施例４：
CWR22Rv1 細胞のRNAからSuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) を用いてcDNAを調製した。得られたcDNAから、PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase (Stratagene) 、ARの開始コドンを含むフォワードプライマー (5’-atggaagtgcagttagggctgggaag-3’；配列番号：２１) およびexon4bに特異的なリバースプライマー (5’-ggtctggtcattttgagatgcttgcaatt-3’；配列番号：２２) を用いて、ARaiv1のORFを増幅した。得られたORF断片をpGEM-T easy vector (Promega) にクローニングし、配列解析を行った。その結果、完全な exon1を持ち、N末端側に欠損のないARaiv1のORFクローンが得られた（図３）。【００９７】
実施例５:
上記のARaiv1クローン4種（ARaiv1およびARaiv1Δ1，ARaiv1Δ2，ARaiv1Δ3）をそれぞれpcDNA3.1発現ベクターへとサブクローニングし、リポータージーンアッセイにより転写活性を調べた。ARaiv1クローンの発現ベクターとpGL3-2×PSA reporter をCOS7細胞にコ・トランスフェクトし、24時間後にDHTあるいはAR拮抗薬であるビカルタミドを添加、さらに24時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、4種のARaiv1クローンは、いずれも DHT 非依存的なリポーター活性の上昇を示した（図４ａ）。またARaiv1クローン4種の転写活性はいずれもビカルタミドで阻害されないことが明らかとなった（図４ｂ）。【００９８】
実施例６：
各種前立腺癌細胞株におけるARaiv1およびARの発現を定量的RT-PCR法で調べた。定量的RT-PCRはABI PRISM7700 (Applied Biosystems)、QuantiTect Probe RT-PCR kit (Qiagen)および遺伝子特異的プライマー、プローブを用いて行った。プライマーおよびプローブは、AR (フォワードプライマー : 5’-aaatgttatgaagcagggatgactct-3’(配列番号：２３); リバースプライマー: 5’-gcttctgggttgtctcctcagt-3’(配列番号：２４); プローブ: 5’-FAM-actacaggaggaaggaga-MGB-3’(配列番号：２５)) 、ARaiv1 (フォワードプライマー : 5’-catcttgtcgtcttcggaaatg-3’(配列番号：２６); リバースプライマー: 5’-tgccaacccggaatttttct-3’(配列番号：２７); プローブ : 5’-FAM-cagggatgactctggg-MGB-3’(配列番号：２８))、GAPDH (Hs99999905, TaqManR Gene Expression Assays, Applied Biosystems) 、を用いた。その結果、JDCaP-hr細胞、22Rv1細胞およびVCaP細胞においてARaiv1の高発現が認められた（図５）。【００９９】
実施例７：
ARaiv1に特異的なexon4bをターゲットするsiRNA (siARaiv1 : 5’-gattgttcttgatcacata-3’(配列番号：２９)) をデザインし、Qiagenにて合成した。またARに特異的なexon8をターゲットとするsiRNA (siAR : Hs_AR_6_HP Validated siRNA : 5’-ggaacucgaucguaucauu-3’(配列番号：３０)) およびARとARaiv1に共通のexon1をターゲットするsiRNAを含むsiRNAカクテル (siDual : OTP SMART pool, L-003400-00-0005) はQiagen およびDharmaconよりそれぞれ購入した。JDCaP-hr細胞にsiAR、siARaiv1あるいはsiDualを導入した。siRNA導入から48時間後の細胞からRNAを抽出し、定量的RT-PCRにてターゲット遺伝子の発現量を解析した結果、各siRNAによる遺伝子ノックダウンが十分に効率的に行われたことが確認された（図６ａ）。ARaiv1ノックダウンによるC末端欠損型ARタンパク質産生の変化を調べる為、siRNA導入から48時間後の細胞から抽出液を調製し、ウエスタンブロッティングによってARおよびβ-actinの産生を調べた。siAR導入群では全長ARのみが、siARaiv1導入群ではC末端欠損型ARのみが、siDual導入群では両者が産生低下していた（図６ｂ）。この結果から、ARaiv1が実際にC末端欠損型ARをコードしていることが示された。【０１００】
実施例８：
JDCaP-hr細胞に対し、AR特異的なexon8をターゲットとするsiRNA（siAR）、ARaiv1特異的なexon4bをターゲットとするsiRNA（siARaiv1）あるいは両者に共通するexon1をターゲットとするsiRNA（siDual）を導入し、アンドロゲン除去培地中にDHTあるいはDMSOを添加した条件で5日間培養した後、細胞増殖を測定した（図７）。アンドロゲン除去状況下の場合、siARaiv1およびsiDual導入群において顕著な増殖阻害を認めた。一方でsiAR導入群では増殖阻害効果は部分的であった。DHTを添加した場合、siARaiv1導入群ではDHTによる増殖促進が観察されたが、siARおよびsiDual導入群ではDHTによる増殖促進は顕著に阻害された。この結果から、JDCaP-hr細胞においてARaiv1はアンドロゲン非存在下での増殖に必須であることが明らかになった。【０１０１】
実施例９：
AR特異的なexon8をターゲットとするshRNA（shAR）、ARaiv1特異的なexon4bをターゲットとするshRNA（shARaiv1）および両者に共通するexon1をターゲットとするshRNA（shDual）の発現プラスミドを、siSTRIKE U6 hairpin cloning system (Promega) を用いて構築した。shARおよびshARaiv1のターゲット配列は上記siARおよびsiARaiv1と同じ配列を用いた。exon1に特異的なshRNA (shDual) のターゲット配列としては、siDualに含まれるexon1特異的siRNAの配列（5’-gcagaaatggattgcactat-3’(配列番号：３１)）を用いた。
22Rv1細胞にshAR、shARaiv1あるいはshDualの発現ベクターを導入し、アンドロゲン除去条件下におけるコロニーフォーメーションアッセイを行った。結果を図８に示す。shARaiv1導入群では、コロニー数が非特異的shRNA（shNS）導入群（NS群）の19%に低下した。shDual導入群では、コロニー数がNS群の4%に低下しており、顕著なコロニー形成の抑制を認めた。一方で、shAR導入群では、NS群の54%と、コロニー形成能の低下はARaiv1ノックダウン群に比べて弱かった。この結果、22Rv1細胞の増殖においても、ARaiv1が重要な役割を担っていることが示された。また、ARaiv1とfull-length ARの両方を阻害することによってAIPCの増殖をより強力に抑制できることが示された。【０１０２】
実施例１０：
ARaiv1の3’-UTR塩基配列と400種以上のヒトmiRNAの塩基配列間で相同性解析を行った結果、hsa-mir-98、hsa-let-7a-1/2/3、hsa-let-7b、hsa-let-7ｃ、hsa-let-7ｄ、hsa-let-7e、hsa-let-7f-1/2、hsa-let-7ｇ、hsa-let-7i、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-134、hsa-miR-149*、hsa-miR-491-5p、hsa-miR-574-5pはARaiv1の3’-UTRに結合し得ると考えられた (表１−１および１−２)。【０１０３】
【表１−１】
2011040421.tif 000002
【０１０４】
【表１−２】
2011040421.tif 000003
【０１０５】
実施例１１：
臨床前立腺癌のcDNAとしてTissue ScanTM Real-Time, Prostate Cancer Array II（Origene）を用い、定量的RT-PCRにてAR、ARaiv1およびβ-actinの発現量を測定した。定量的RT-PCRはABI PRISM7700 (Applied Biosystems)、QuantiTect Probe RT-PCR kit (Qiagen) および遺伝子特異的プライマー、プローブを用いて行った。プライマーおよびプローブは、AR (フォワードプライマー : 5’-aaatgttatgaagcagggatgactct-3’(配列番号：２３); リバースプライマー: 5’-gcttctgggttgtctcctcagt-3’(配列番号：２４); プローブ: 5’-FAM-actacaggaggaaggaga-MGB-3’(配列番号：２５)) 、ARaiv1 (フォワードプライマー : 5’-catcttgtcgtcttcggaaatg-3’(配列番号：２６); リバースプライマー: 5’-tgccaacccggaatttttct-3’(配列番号：２７); プローブ : 5’-FAM-cagggatgactctggg-MGB-3’(配列番号：２８))、β-actin (Human ACTB, Pre-Developed TaqManR Assay Reagents, PE Biosystems) を用いた。結果を図９に示す。調べた38検体中の3検体 (7.9%) においてARaiv1の顕著な発現上昇が、5検体(13.2%) においてARの発現上昇が認められた。そのうち2検体 (5.3%) はARaiv1およびAR共に発現上昇が見られた。【０１０６】
実施例１２：
COS7細胞を106 cells / 6cm径培養皿に播種し、24時間後に200ngのARaiv1発現プラスミドと7μgの2xPSAリポータープラスミドをlipofectoamine2000を用いてトランスフェクションした。6時間後に細胞を剥がし、10%ステロイド除去牛胎児血清を含むRPMI1640培地にて96穴培養プレートに再度播種した。24時間後にゲルダナマイシンあるいは溶媒であるDMSOを添加し培養を継続、さらに24時間後にBright-Glo luciferase assay system (Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、ARaiv1の転写活性はゲルダナマイシンによって阻害されることがわかった（図１０）。【０１０７】
実施例１３：
JDCaP-hr細胞にゲルダナマイシンを添加し、細胞増殖、ARaiv1 mRNA発現およびARaiv1タンパク質産生に対する影響を調べた。ゲルダナマイシンはARaiv1 mRNAおよびタンパク質産生を顕著に低下させ（図１１）、JDCaP-hrの増殖を顕著に阻害することが明らかとなった（図１２）。ゲルダナマイシンは全長型ARよりもARaiv1に対して優先的で顕著なmRNA発現/タンパク質産生低下作用を示した（図１１）。【０１０８】
実施例１４：
パモ酸ピルビニウム (PP)は、ARの転写活性をアンドロゲン拮抗とは異なる作用機序で阻害することが報告されている。PPがARaiv1転写活性へ及ぼす影響をリポータージーンアッセイで調べた。LNCaP-FGCにemptyベクターあるいはARaiv1発現ベクターを2x PSA reporterと共に導入し、24時間後にPPを添加、さらに24時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、PPが濃度依存的にARaiv1による転写を阻害することが明らかとなった（図１３）。【０１０９】
実施例１５：
JDCaP-hr細胞にパモ酸ピルビニウム (PP)を添加し、細胞増殖に対する影響を調べた。PPはJDCaP-hrの増殖を顕著に阻害することが明らかとなった（図１４）。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
ARaivによる転写活性化などの阻害を指標とすることにより、ARaiv発現癌の予防・治療に有効な物質のスクリーニングが可能となる。ARaivの発現を特異的に阻害し得るアンチセンス核酸、siRNA、miRNA、あるいはHSP90阻害薬およびARaivの発現または活性を阻害する他の物質は、ARaiv発現癌の治療および再発予防に有用である。また、ARaivのC末端配列を検出することにより、ARaiv発現癌の診断が可能となる。【０１１１】
本出願は、2009年9月29日付で日本国に出願された特願2009-225541を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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