(57)【要約】  簡便であり且つ信頼性の高い癌診断用の新規バイオマーカー等を提供する。本発明の癌診断用マーカーは、プロテインキナーゼＣαを含むことを特徴とするものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼＣαを含むことを特徴とする、癌診断用マーカー。
【請求項２】
血中マーカーである、請求項１記載のマーカー。
【請求項３】
早期癌又は再発癌の診断に用いられるものである、請求項１又は２記載のマーカー。
【請求項４】
少なくとも２種以上の癌種の診断に用いられるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマーカー。
【請求項５】
全ての癌種の診断に用いられるものである、請求項４記載のマーカー。
【請求項６】
プロテインキナーゼＣαの基質ペプチド又はプロテインキナーゼＣαに対する抗体を含むことを特徴とする、癌診断用医薬組成物。
【請求項７】
請求項６記載の組成物を含むことを特徴とする、癌診断用キット。
【請求項８】
プロテインキナーゼＣαの基質ペプチドと生体試料とを反応させて、リン酸化された当該ペプチドを検出し、得られる検出結果を指標として癌の状態を評価する方法。
【請求項９】
プロテインキナーゼＣαに対する抗体と生体試料とを反応させてプロテインキナーゼＣαを検出し、得られる検出結果を指標として癌の状態を評価する方法。
【請求項１０】
生体試料が血液である、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
癌の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法であって、
担癌モデル非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程、前記非ヒト哺乳動物の血中のプロテインキナーゼＣαを検出する工程、及び得られる検出結果を指標として目的の癌予防薬及び／又は癌治療薬を選択する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌マーカーとしてのプロテインキナーゼＣα（以下、PKCαと称することがある。）に関する。詳しくは、複数の癌種の癌診断用バイオマーカーとしての細胞外PKCαに関する。
【背景技術】
【０００２】
過去３０年にわたり、癌診断用のバイオマーカーの発見には、癌組織と正常組織との比較が主に関与してきた（非特許文献１〜３参照）。近年、組織サンプルの分析と比べて、サンプルの採取及び扱いが容易なことから血中、尿中又は唾液中のバイオマーカーの探索が大きな関心を呼んでいる（非特許文献４〜７参照）。例えば、血清前立腺特異的抗原(PSA)を広範囲にわたってアッセイして、前立腺癌を診断するか、又は外科的切除もしくは放射線治療後の前立腺癌の再発をモニタリングすることが挙げられる（非特許文献３及び８参照）。【０００３】
生細胞は、細胞外シグナルに応答して、遺伝子発現を制御又は調節する、膨大な数の細胞内シグナル伝達経路を含んでいる。プロテインキナーゼによるリン酸化は、これらの細胞内シグナル伝達経路における標的タンパク質を活性化し、細胞増殖において重要な役割を果たしている（非特許文献９〜１１参照）。リン脂質依存型セリン／スレオニンキナーゼの１つであるプロテインキナーゼＣ(PKC)は、最も重要なキナーゼの一つであり、構成及び活性化の特徴に基づいて３つのサブファミリーに分類される。すなわち、従来又は古典的PKC(cPKC；α、βI、βII及びγ)、新規又は非古典的PKC(nPKC；δ、ε、η及びθ)、ならびに非定型PKC(ζ、ι及びλ)（非特許文献１２〜１４参照）。
PKCアイソザイムのうち、PKCαに関しては、正常組織においてはごくわずかな活性しか示さず、殆どの癌細胞（例えば、肝癌、乳癌及びメラノーマ）において過剰発現又は高活性化されることが知られている（非特許文献１５〜１９参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sidransky, D. (2002) Emerging molecular markers of cancer. Nat. Rev. Cancer 2, 210-219.
【非特許文献２】Harris, L., Fritsche, H., Mennel, R., Norton, L., Ravdin, P., Taube, S., Somerfield, M. R., Hayes, D. F., and Bast Jr., R. C. (2007) American society of clinical oncology 2007 update of recommendations for the use of tumor markers in breast cancer. J. Clin. Oncol. 25, 5287-5312.
【非特許文献３】Chatterjee, S. K., and Zetter, B. R. (2005) Cancer biomarkers: knowing the present and predicting the future. Future Oncol. 1, 37-50.
【非特許文献４】Roos, P. H., Golka, K., and Hengstler, J. G. (2008) Predictive biomarkers and signature in urinary bladder cancer. Cuur. Opin. Mol. Ther. 10, 243-250.
【非特許文献５】Schrohl, A.- S. Wurtz, S., Kohn, E., Banks, R. E., Nielsen, H. J., Sweep, F. C. G. J., and Brunner, N. (2008) Banking of biological fluids for studies of disease-associatedprotein biomarkers. Mol. Cell Proteomics 7, 2061-2066.
【非特許文献６】Decramer, S., de Peredo, A. G., Breuil, B., Mischak, H., Monsarrat, B., Bascands, J.- L., and Schanstra, J. P. (2008) Urine in clinical proteomics. Mol. Cell Proteomics 7, 1850-1862.
【非特許文献７】Wong, D. T. (2006) Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. JADA 137, 313-321.
【非特許文献８】Damber, J.- E., and Aus, G. (2008) Prostate cancer. Lancet 371, 1710-1721.
【非特許文献９】Adjei, A. A., and Hidalgo, M. (2005) Intracellular signal transduction pathway proteins as targets for cancer therapy. J. Clin. Oncol. 23, 5386-5403.
【非特許文献１０】Cross, T. G., Scheel-Toellner, D., Henriquez, N. V., Deacon, E., Salmon, M., and Lord, J. M. (2000) Serine/threonine protein kinases and apoptosis. Exp. Cell Res. 256, 34-41.
【０００５】
【非特許文献１１】Bode, A. M., and Dong, Z. (2005) Signal transduction pathways in cancer development and as targets for cancer prevention. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 79, 237-297.
【非特許文献１２】Newton, A. C. (1997) Regulation of protein kinase C. Curr. Opin. Cell Biol. 9, 161-167.
【非特許文献１３】Blobe, G. C., Obeid, L. M., and Hannun, Y. A. (1994) Regulation of protein kinase C and role in cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 13, 411-431.
【非特許文献１４】Webb, B. L. J., Hirst, S. J., and Giembycz, M. A. (2000) Protein kinase C isoenzymes: a review of their structure, regulation and role in regulating airways smooth muscle tone and mitogenesis. Br. J. Pharmacol. 130, 1433-1452.
【非特許文献１５】Oka, M., and Kikkawa, U. (2005) Protein kinase C in melanoma. Cancer Metast. Rev. 24, 287-300.
【非特許文献１６】Mackay, H. J., and Twelves, C. J. (2003) Protein kinase C: a target for anticancer drugs? Endocrin. Relat. Cancer 10, 389-396.
【非特許文献１７】Hofmann, J. (2004) Protein kinase C isozymes as potential targets for anticancer therapy. Curr. Cancer Drug Targets 4, 125-146.
【非特許文献１８】Goekjian, P. G., and Jirousek, M. R. (2001) Protein kinase C inhibitors as novel anticancer drugs. Expert. Opin. Investig. Drugs 10, 2117-2140.
【非特許文献１９】O’Brian, C. A., Chu, F., Bornmann, W. G., and Maxwell, D. S. (2006) Protein kinase Cα and ε small-molecule targeted therapeutics: a new roadmap to two holy grails in drug discovery? Expert. Rev. Anticancer Ther. 6, 175-186.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況下において、簡便であり且つ信頼性の高い癌診断用の新規バイオマーカー等の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、癌診断用マーカー、癌診断用医薬組成物、癌診断用キット、癌の状態を評価する方法、癌予防薬及び／又は癌治療薬のスクリーニング方法等を提供するものである。
（１）プロテインキナーゼＣαを含むことを特徴とする、癌診断用マーカー。
本発明のマーカーとしては、例えば、血中マーカーが挙げられる。
本発明のマーカーとしては、例えば、早期癌又は再発癌の診断に用いられるものが挙げられ、また、少なくとも２種以上の癌種、さらには全ての癌種の診断に用いられるものが挙げられる。【０００８】
（２）プロテインキナーゼＣαの基質ペプチド又はプロテインキナーゼＣαに対する抗体を含むことを特徴とする、癌診断用医薬組成物。
（３）上記(2)の医薬組成物を含むことを特徴とする、癌診断用キット。
（４）プロテインキナーゼＣαの基質ペプチドと生体試料とを反応させて、リン酸化された当該ペプチドを検出し、得られる検出結果を指標として癌の状態を評価する方法。
（５）プロテインキナーゼＣαに対する抗体と生体試料とを反応させてプロテインキナーゼＣαを検出し、得られる検出結果を指標として癌の状態を評価する方法。
上記(4)及び(5)の方法において、生体試料としては、例えば血液が挙げられる。【０００９】
（６）癌の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法であって、
担癌モデル非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程、前記非ヒト哺乳動物の血中のプロテインキナーゼＣαを検出する工程、及び得られる検出結果を指標として目的の癌予防薬及び／又は癌治療薬を選択する工程を含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、簡便であり且つ信頼性の高い癌診断用の新規バイオマーカー等を提供することができる。
本発明の癌診断用マーカーは、血中マーカーであるため取扱いが簡便であり、複数の癌種の診断に用いることが可能であり、特に早期癌や再発癌の診断に好適である点で、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】基質ペプチドとU87マウスから採取した血漿とのリン酸化反応から得た代表的なMALDI-TOF MSスペクトルを表す図である。80Daの増加からリン酸化ペプチドを確認した。
【図２】基質ペプチドと、５種類の担癌マウス（U87、A549、A431、HuH-7及びB16メラノーマ；直径1.1cm若しくは1.2cm）及び２種類の正常マウス（対照マウス；BALB/c及びBALD/cN nu/nu）から採取した血漿サンプルとのリン酸化反応の結果を示すグラフである。リン酸化反応の後、各サンプルをMALDI-TOF MSにより分析した。*：P< 0.01；**：P < 0.05
【図３】リン酸化率に対するペプチド濃度の影響を示すグラフである。血液サンプルはB16メラノーママウスから採取した。リン酸化反応の後、各サンプルをMALDI-TOF MSにより分析した。*：P < 0.05
【図４】(Ａ)正常マウス(BALB/cN nu/nu)又はU87マウス、(Ｂ) 正常マウス(BALB/cN nu/nu)又はA549マウス、及び(Ｃ)正常マウス(BALB/c nu/nu)又はB16メラノーママウスから採取した血漿サンプルのウェスタンブロット分析の結果を示す図である。血漿(１サンプル当たり50μgタンパク質)に対して、抗リン酸化PKCα(Ser657)抗体でイムノブロッティングを行った。N：正常マウスから採取した血漿サンプル；T：担癌マウスから採取した血漿サンプル。
【００１２】
【図５】基質ペプチドのリン酸化率に対するキナーゼ阻害剤の影響を示すグラフである。Ro-31-7549については0、50、500又は5000 nM、ロットレリンについては20μM、及びH-89については10μMの濃度で、阻害剤であるRo-31-7549、ロットレリン及びH-89を各リン酸化反応液に添加した。基質ペプチドとB16メラノーママウスから採取した血漿とのリン酸化の後、MALDI-TOF MS分析によりリン酸化率を測定した。
【図６】腫瘍サイズとリン酸化率との関係を示すグラフである。U87又はB16メラノーママウスから３種類の腫瘍サイズ(0.6、0.9及び1.2 cm)を調製した。基質ペプチドと血漿とのリン酸化の後、各サンプルをMALDI-TOF MSにより分析した。
【図７】腫瘍の外科的摘出後の癌の再発による血中の活性化PKCαのレベルの変化を示すグラフである。基質ペプチドと、腫瘍切除の0、7、14、21及び28日後に採取した血漿とのリン酸化の後、各サンプルをMALDI-TOF MSにより分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2009-171144号明細書（2009年7月22日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１４】
１．本発明の概要
プロテインキナーゼCα(PKCα)は、癌細胞の分化、増殖及びアポトーシスにおいて鍵となる役割を果たし、その活性は正常細胞よりも癌細胞において高いことが知られている。
本発明者は、PKCαに特異的な基質ペプチド（アルファトメガ(Alphatomega)）を、1,700種類を超える候補ペプチドを含むライブラリーから同定した（Kang, J.- H. et al. (2008) Proteomics 8, 2006-2011. 等を参照）。このペプチドは、正常組織よりも、癌細胞及び組織においてより高いリン酸化率を示した（Kang, J.- H. et al. (2008) Proteomics 8, 2006-2011.（前掲）；Kang, J.- H. et al. (2008) J. Am. Chem. Soc., 130, 14906-14907. 等を参照）。そのため、アルファトメガはPKCα活性を検出するために使用できる。
【００１５】
本発明者は、アルファトメガを用いて、従来知られていなかった、活性化PKCαが血中に存在するか否かという点について調査した。具体的には、正常マウス（対照マウス）及び癌の異種移植マウスモデル（担癌マウス）から調製した血液サンプルを、ウェスタンブロット分析及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法(MALDI-TOF MS)により調べた。
その結果、対照マウス由来の血液サンプルに比べて、担癌マウス由来の血液サンプル中においては、高い活性化PKCαレベル、及びアルファトメガの高いリン酸化率が認められた。詳しくは、活性化PKCαのレベルは、対照マウスで認められるレベルよりも、担癌マウス(U87、A549、A431、HuH-7及びB16メラノーマ)の血中において高く、アルファトメガのリン酸化率は、腫瘍サイズに比例して高くなった。さらに、PKCαに高度に特異的な阻害剤であるRo-31-7549を添加するとリン酸化率が用量依存的に低下する一方、非PKCα阻害剤であるロットレリン(rottlerin)及びH-89を添加しても、リン酸化率に有意な影響を及ぼさなかった。また、活性化PKCαのレベルは、癌切除後に低下したが、癌が再発した場合には上昇した。
【００１６】
以上の結果から、本発明者は、１）血中の活性化PKCαが、癌診断用の新規バイオマーカー、特に複数種の癌の診断に有用な新規バイオマーカーとなり得ること、２）活性化PKCαのレベルをモニタリングすることにより、再発癌（例えば外科的切除後の再発癌）や早期癌の有無を評価できることを見出した。このように、血中の活性化PKCαの存在を実証したこと、及びこの存在に基づいて癌診断用の新規バイオマーカー等を見出したことは、本発明者が始めてなし得たものである。
【００１７】
２．癌診断用マーカー
本発明の癌診断用マーカーは、前述した通り、PKCαを含むものである。被験動物の生体試料（特に血液、詳しくは血漿又は血清）中におけるPKCαの量が、正常動物（癌の病態を示さない対照動物）の生体試料（特に血液、詳しくは血漿又は血清）中におけるPKCαの量に比べて多い場合、当該被験動物は癌を発症しているか又は発症する可能性が高いと判断することができる。実質的に癌診断マーカーとなるPKCαの検出対象試料が、生体試料の中でも特に血液であるため、本発明の癌診断用マーカーは、血中マーカー（特に血漿又は血清中マーカー）であることが好ましい。
【００１８】
本発明において診断や評価の対象となる癌（癌種）は、特に限定はされず、２種以上の癌種を診断や評価の対象とすることができ、場合により、好ましくは全ての癌種を診断や評価の対象とすることもできる。詳しくは、本発明の癌診断用マーカーは、癌種に関わらず、何らかの癌を発症している場合又は発症する可能性が高い場合に、その診断をする（癌を検出する）ことができるという特徴を有するものであり、例えば、癌種の特定をする前段階の、第一次的に広く癌の診断及び検出を行い場合に用いることができるという点で、有用なものである。また、血中PKCαの濃度は、癌の再発時や早期の段階において特に高くなるため、本発明の癌診断用マーカーの好ましい用途としては、再発癌及び早期癌の診断が挙げられる。なお、早期癌とは、癌種により異なるが、基本的にはステージＩのみ又はステージＩＩまでの段階の癌を意味する。
【００１９】
３．診断用医薬組成物
３−１．基質ペプチドを含む医薬組成物
本発明の医薬組成物は、前述した通り、PKCαの基質ペプチド（以下、PKCα基質ペプチド）を含むことを特徴とする癌診断用医薬組成物である。
なお、本発明は、PKCα基質ペプチドを用いることを特徴とする癌診断方法や、癌診断用の薬剤を製造するための当該基質ペプチドの使用を含むものである。
【００２０】
(1) PKCαの基質ペプチド
PKCα基質ペプチドは、PKCαにより特異的にリン酸化され得るペプチドであればよく、限定はされないが、例えば、10〜30アミノ酸残基（好ましくは10〜20アミノ酸残基、より好ましくは10〜15アミノ酸残基）からなる基質ペプチドが挙げられる。当該ペプチドとしては、具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列（FKKQGSFAKKK）からなるペプチド、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（FKKQGTFAKKK）等が好ましく挙げられる。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、本明細書中「アルファトメガ」と称する。
PKCα基質ペプチドは、例えば、自動ペプチドシンセサイザーを使用し、標準的なFmoc化学手順に従って合成することができる。合成後は、各種クロマトグラフィー等を用いた公知の精製方法により精製することができる。
【００２１】
(2) 抗体の配合割合
本発明の医薬組成物においては、PKCα基質ペプチドの配合割合は特に限定はされないが、例えば、1〜100重量％が好ましく、より好ましくは10〜100重量％である。
(3) その他の成分
本発明の医薬組成物は、PKCα基質ペプチド以外にも、本発明の効果が著しく損なわれない範囲で、他の構成成分を含んでいてもよく、限定はされない。例えば、リン酸化されたPKCα基質ペプチドに対する抗体等を含むことができる。
【００２２】
(4) リン酸化されたPKCα基質ペプチドの検出及び定量
本発明の医薬組成物は、当該組成物中のPKCα基質ペプチドを、被験者又は患者から採取した生体試料（被験試料；特に血液、詳しくは血漿又は血清）と反応（リン酸化反応）させるために用いられ、その後、リン酸化されたPKCα基質ペプチドを検出及び定量し、健常者における検出量と比較することにより、癌の発症や発症の可能性及び癌の病状の程度を判断（診断）することができる。また、同一被験者において、リン酸化されたPKCα基質ペプチド量を定期的にモニターすることで、癌の状態（病状）や再発の有無を判断することもできる。
【００２３】
(i) リン酸化されたPKCα基質ペプチドの検出
被験試料として採取した血液は、血漿分離等の処理を施しておいた後、例えば、サンプルバッファー等により、1〜100倍に希釈しておいてもよい。当該希釈を行う場合、サンプルバッファーとしては、例えば、phosphate buffered saline等を用いることができる。
上記処理後の被験試料は、本発明の医薬組成物と接触させ、PKCα基質ペプチドとのリン酸化反応に使用する。当該リン酸化反応では、反応媒体は、特に限定はされないが、例えばTris-HCl及び塩化マグネシウム等を混合してなるバッファーを用いることができ、リン酸基供与基質として、例えばアデノシン３リン酸（ATP）等が当該バッファー中に混合して用いることができる。
被験試料とPKCα基質ペプチドとの反応は、30〜40℃（好ましくは37℃）で、10〜60分間（好ましくは30〜60分間）行う。
【００２４】
リン酸化されたPKCα基質ペプチドの検出は、限定はされないが、公知の免疫検定法(immunoassay)を、その常法に従い、利用して行うことができる。免疫検定法としては、標識化免疫測定法や免疫比濁法(TIA)があるが、なかでも前者が好ましく、例えば、ELISA等の酵素免疫検定法(EIA)のほか、放射線免疫検定法(RIA)や蛍光免疫検定法(FIA)等が好ましく挙げられる。また、標識化免疫測定法としては、他の分離方法との組合せを利用したものとして、ウェスタンブロット法（電気泳動法との組合せ）等も好ましく挙げられる。これらの中でも、ELISA及び／又はウェスタンブロット法が好ましい。また、1種又は2種以上の、リン酸化されたPKCα基質ペプチドに対するモノクローナル抗体を用い、2種以上の免疫検定法を組み合わせて検出を行ってもよく、より一層感度及び信頼性等の高い優れた検出を行うことができる。
【００２５】
本発明においては、リン酸化されたPKCα基質ペプチドの検出方法として、さらに、金属ナノ粒子等の金属コロイドを用いた方法を採用することもできる。当該方法は、詳しくは、基質ペプチドとプロテインキナーゼとを金属コロイドの存在下で反応させた場合、又は基質ペプチドとプロテインキナーゼとの反応後に金属コロイドを添加した場合に、プロテインキナーゼによる基質ペプチドのリン酸化のレベルが、金属コロイドの色調変化に基づいて評価することができる、という原理に基づく方法である。この色調変化は、プロテインキナーゼによる基質ペプチドのリン酸化反応において金属コロイドを存在させることにより、金属コロイド粒子の介在によるリン酸化基質ペプチドの凝集が起こり、この凝集の程度に基づいて金属コロイドの色調が変化する、というものである。また、この金属コロイドの色調は、基質ペプチドのリン酸化の割合に実質的に比例した凝集の程度に応じて変化する。
【００２６】
よって、本発明においては、上述のように、被験試料とPKCα基質ペプチドとの反応を金属コロイドの存在下で行うか、又は当該反応後に金属コロイドを添加して、試料の色調の変化を、当該反応前の試料と比較する、又はコントロール（健常者から採取した試料との反応）における色調変化と比較することにより、PKCα基質ペプチドのリン酸化の有無を検出することができる。
上記金属コロイドを用いた方法においては、反応媒体としては、例えば、HEPES（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）と塩化マグネシウムとを混合してなるバッファー等が用いられ、リン酸基供与基質としては、前述と同様にATP等が用いられる。
また、金属ナノ粒子等の金属コロイドとしては、例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、パラジウムコロイド、ロジウムコロイド等が用いられる。これらの金属コロイドのうち、金コロイド、銀コロイド等が好ましく、金コロイドがより好ましい。これら金属コロイドは、公知文献に記載の方法により製造することができ、また市販されている製品を用いることもできる。例えば、金ナノ粒子は、一般には、金イオンを含む溶液に還元液を添加して、金イオンを還元する液相還元法によって製造することができる（例えば、特開2003-253310号公報、特開2006-152438号公報参照。）。
【００２７】
金属コロイドの粒径は、特に限定はされないが、例えば、約1nm〜500nmであることが好ましく、より好ましくは3nm〜200nm、さらに好ましくは5nm〜100nmである。
金属コロイドは、その粒径にも依存するが、通常、金コロイドであれば赤色を呈し、銀コロイドであれば黄色を呈する。これに対し、例えば、金コロイドを存在させた場合においては、PKCα基質ペプチドがリン酸化され凝集することにより、当該金コロイドの色調は赤色から青色に変化する。このような色調変化に基づいて、リン酸化されたPKCα基質ペプチドを検出することができる。なお、金属コロイドの色調変化は、好ましくは約600nm〜800nmの範囲、より好ましくは約600nm〜750nmの範囲、さらに好ましくは約700nm前後の吸光度を測定することによって調べることが望ましい。
【００２８】
(ii) リン酸化されたPKCα基質ペプチドの定量
定量は、限定はされないが、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法(MALDI-TOF MS)を用いて、反応に用いたPKCα基質ペプチドに対するリン酸化率（リン酸化基質と非リン酸化基質とのイオン強度比）を求めることにより行うことができる。
また、前述の金属コロイドを用いる方法により、リン酸化されたPKCα基質ペプチドを検出する場合は、その金属コロイドの色調変化の程度に基づいて（具体的には、適当なコントロールでの色調変化の程度や予め作成した検量線との比較を行うことにより）、当該リン酸化基質ペプチドを実質的に定量することができる。
リン酸化されたPKCα基質ペプチドの定量又は検出は、市販のキットを用いることもできる。
【００２９】
(iii) 癌の状態の評価
本発明においては、上記のようにして検出及び定量した、リン酸化されたPKCα基質ペプチドの検出結果（検出量）を指標として、癌の状態を評価することができる。すなわち、本発明は、PKCα基質ペプチドと生体試料（被験試料；特に血液、詳しくは血漿又は血清）とを反応させてリン酸化された当該基質ペプチドを検出し、得られる検出結果を指標として癌の状態を評価する方法を含むものである。
ここで、「癌の状態を評価する」とは、癌（再発癌、早期癌）の発病の有無、進行度、重症度、治療反応性、予後等を判断することを意味する。評価は、リン酸化されたPKCα基質ペプチドの検出量のほか、自覚症状等を組み合わせて行ってもよい。定期健診のように、年に１〜２回の頻度で、リン酸化されたPKCα基質ペプチドを測定することにより評価することもできるが、当該リン酸化基質ペプチドの検出量の推移を定期的にモニタリングすることで、総合的に癌の状態を評価する（癌の再発の有無をモニタリングすることも含む）ことが好ましい。このような評価法として、例えば、リン酸化されたPKCα基質ペプチドの検出量が一定値を超えれば何らかの癌が発症している可能性高いと診断する、既に治療中の癌症例において当該リン酸化基質ペプチドの検出量が低下すれば治療が奏功していると診断する、当該リン酸化基質ペプチドの検出量が一定値を超え高値で推移する症例は治療及び回復が不能であると診断する、といったことも可能になる。
【００３０】
３−２．抗体を含む医薬組成物
本発明の医薬組成物は、前述した通り、PKCαに対する抗体（以下、抗PKCα抗体）を含むことを特徴とする癌診断用医薬組成物である。
なお、本発明は、抗PKCα抗体を用いることを特徴とする癌診断方法や、癌診断用の薬剤を製造するための抗PKCα抗体の使用を含むものである。
【００３１】
(1) 抗PKCα抗体
抗PKCα抗体は、以下のようにして作製することができる。
(A) ポリクローナル抗体の作製
(i) 抗原及びその溶液の調製
抗PKCα抗体を作製するに当たり、まず、免疫源（抗原）として用いるタンパク質を調製又は入手することが必要である。
抗原タンパク質としては、精製PKCαを用いることができるが、これに限定はされず、例えば、PKCαのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつPKCα活性を有するタンパク質を用いることもできる。なお、PKCαとしては、例えば哺乳動物由来のPKCα、具体的にはヒト由来のPKCα、マウス由来のPKCα又はラット由来のPKCα等を用いることができる。ここで、各動物由来のPKCαの塩基配列及びアミノ酸配列情報は、それぞれ以下のアクセッション番号から入手可能である。
【００３２】
＜ヒト由来のPKCα＞
・GenBankのアクセッション番号：NM 002737（塩基配列；配列番号３），NP 002728（アミノ酸配列；配列番号４）
・GenBankのアクセッション番号：X52479（塩基配列；配列番号５），CAA36718（アミノ酸配列；配列番号６）
＜マウス由来のPKCα＞
・GenBankのアクセッション番号：NM 011101（塩基配列；配列番号７），NP 035231（アミノ酸配列；配列番号８）
・GenBankのアクセッション番号：M25811（塩基配列；配列番号９），AAA39934（アミノ酸配列；配列番号１０）
＜ラット由来のPKCα＞
・GenBankのアクセッション番号：XM 343935（塩基配列；配列番号１１），XP 343976（アミノ酸配列；配列番号１２）
【００３３】
抗原となる精製PKCαの調製方法としては、限定はされないが、例えば、適当な宿主細胞（ヒト由来の培養繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、酵母等）の形質転換体を用いてPKCαを産生し、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いて、調製する方法が挙げられる。
次に、得られた精製PKCαを、緩衝液に溶解させて抗原溶液を調製する。その際、必要に応じて、免疫を効果的に行うためのアジュバントを添加してもよい。アジュバントとしては、例えば、市販のフロイント完全アジュバントやフロイント不完全アジュバント等を用いることができる。これらアジュバントは、1種のみで用いても2種以上を併用してもよく、限定はされない。
【００３４】
(ii) 免疫、及び抗血清の採取
免疫は、上記精製PKCαを含む溶液を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）に投与することにより行う。投与は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入して行う。
抗原溶液の1回当たりの投与量は、限定はされず、例えば、動物1匹に対して精製PKCαが2〜500μgとなる量とすることが好ましく、より好ましくは10〜100μgである。
投与間隔は、限定はされず、例えば、数日〜数週間間隔であることが好ましく、より好ましくは2〜3週間間隔である。また投与回数は、例えば、2〜10回である。
上記免疫により得られる血清（抗血清）の採取は、限定はされないが、例えば、最終投与の日から1〜28日後に行うことが好ましく、より好ましくは2〜14日後である。抗血清の採取方法は、常法に従い、免疫した動物の血液から採取することができる。
【００３５】
(iii) 目的の抗血清の選別
免疫した動物のそれぞれから採取した抗血清の中から、目的の抗血清、すなわち抗PKCα抗体を含む抗血清をスクリーニングする。
スクリーニング方法は、限定はされないが、例えば、採取した抗血清と、抗原としての精製PKCαや組換えPKCα（ヒト由来の培養繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、酵母等で産生されたもの）又はそれらの変異型酵素とを用い、公知の免疫検定法(immunoassay)を、その常法に従い、利用して行うことができる。免疫検定法としては、標識化免疫測定法や免疫比濁法(TIA)があるが、なかでも前者が好ましく、例えば、ELISA等の酵素免疫検定法(EIA)のほか、放射線免疫検定法(RIA)や蛍光免疫検定法(FIA)等が好ましく挙げられる。また、標識化免疫測定法としては、他の分離方法との組合せを利用したものとして、ウェスタンブロット法（電気泳動法との組合せ）等も好ましく挙げられる。なお、ウェスタンブロット法の場合は、検出対象となるタンパク質サンプルを熱及び界面活性剤により変性させて用いるため、スクリーニング法における抗原は変異型酵素となる。
【００３６】
上記スクリーニングによる目的の抗血清に含まれる、抗PKCα抗体は、通常、ポリクローナル抗体である。当該抗体の精製を必要とする場合は、例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を、1種のみ又は2種以上組み合わせて、適宜採用し実施すればよい。
当該抗PKCα抗体が特異的に結合し得る（認識し得る）PKCα中の反応部位は、特に限定はされない。
【００３７】
(B) モノクローナル抗体の作製
(i) 抗原及びその溶液の調製
抗原及びその溶液の調製は、上記ポリクローナル抗体の作製の場合と同様に行うことができる。
(ii) 免疫、及び抗体産生細胞の採取
免疫方法や、上記抗原溶液を用いた投与量、投与間隔及び投与回数は、上記ポリクローナル抗体の作製の場合と同様の方法及び条件が採用できる。
上記免疫により得られる抗PKCα抗体を産生する細胞（抗体産生細胞）の採取は、限定はされないが、例えば、最終投与の日から1〜14日後に行うことが好ましく、より好ましくは2〜4日後である。
抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞（特に、局所リンパ節細胞）、末梢血細胞等が好ましく挙げられるが、なかでも脾臓細胞や局所リンパ節細胞（例えば、膝下リンパ節細胞等）がより好ましい。
【００３８】
(iii) 細胞融合
採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことにより、融合細胞（ハイブリドーマ）を得ることができる。
ミエローマ細胞としては、例えば、マウス等の哺乳動物において一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。詳しくは、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミン含有培地）で生育できないが、抗体産生細胞と融合した状態では生育できる性質の株化細胞が好ましい。具体的には、マウスミエローマ細胞としては、例えば、PAI、P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、NS-Iなどを用いることができる。
上記細胞融合は、例えば、血清を含まないRPMI-1640培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合して融合反応させることにより行う。抗体産生細胞とミエローマ細胞との混合比は、例えば5：1である。
融合反応は、一般には、細胞融合促進剤の存在下で行うことが好ましく、当該促進剤としては、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
融合反応後の細胞は、例えばHAT選択培地による培養を行う。上記培養後、HAT選択培地での増殖が認められる細胞が融合細胞（ハイブリドーマ）となる。
【００３９】
(iv) 目的のハイブリドーマの選別、及びそのクローニング
上記培養により得られたハイブリドーマから、目的のハイブリドーマ、すなわち抗PKCα抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。具体的には、培養上清中に、目的とする抗PKCα抗体が存在するものをスクリーニングする。
スクリーニング方法は、限定はされないが、例えば、培養上清の一部を採取し、抗原として精製PKCαや組換えPKCα（ヒト由来の培養繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、酵母等で産生されたもの）又はそれらの変異型酵素を用いて、公知の免疫検定法(immunoassay)を、その常法に従い、利用して行うことができる。免疫検定法としては、例えばELISA等の酵素免疫検定法(EIA)のほか、放射線免疫検定法(RIA)や蛍光免疫検定法(FIA)等が好ましく挙げられる。また、ウェスタンブロット法（電気泳動法との組合せ）等も好ましく挙げられる。なお、ウェスタンブロット法の場合は、検出対象となるタンパク質サンプルを熱及び界面活性剤により変性させて用いるため、スクリーニング法における抗原は変異型酵素となる。
【００４０】
上記スクリーニング後の目的のハイブリドーマの培養上清に含まれる抗PKCα抗体は、ハイブリドーマのクローニング前に得られている抗体であるが、単一の分子からなる抗体（モノクローナル抗体）であってもよく、限定はされない。
当該抗PKCα抗体が特異的に結合し得る（認識し得る）PKCα中の反応部位は、特に限定はされない。
上記スクリーニングによる目的のハイブリドーマのクローニング、すなわちモノクローナル抗体産生細胞株の樹立は、一般には、限界希釈法を用いた培養等により、1細胞由来のコロニーを選択することによって行うことができる。
【００４１】
(v) モノクローナル抗体の採取
上記クローニングにより得られたハイブリドーマから、モノクローナル抗体を採取する方法としては、限定はされないが、一般には、細胞培養法もしくは腹水形成法等を採用することができる。
細胞培養法では、クローニングにより得られたハイブリドーマを、例えば、動物細胞培養用培地中で、37℃、5％CO2の条件下で、7〜14日間培養し、その後の培養上清から目的のモノクローナル抗体を採取することができる。
腹水形成法では、例えば、細胞融合の際に用いたミエローマ細胞の由来元である哺乳動物と同種系列の動物の腹腔内に、クローニングにより得られたハイブリドーマを、動物1匹当たり106個程度投与して、当該ハイブリドーマを大量増殖させ、投与してから7〜14日間後に採取した腹水又は血清から、目的のモノクローナル抗体を採取することができる。
細胞培養法及び腹水形成法のいずれにおいても、モノクローナル抗体の採取時又は採取後に当該抗体の精製を必要とする場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を、1種のみ又は2種以上組み合わせて、適宜採用し実施することができる。
【００４２】
(2) 抗体の配合割合
本発明の医薬組成物においては、抗PKCα抗体の配合割合は特に限定はされないが、例えば、1〜100重量％が好ましく、より好ましくは10〜100重量％である。
(3) その他の成分
本発明の医薬組成物は、抗PKCα抗体以外にも、本発明の効果が著しく損なわれない範囲で、他の構成成分を含んでいてもよく、限定はされない。例えば、１次抗体検出用試薬、発色基質等を含むことができる。
【００４３】
(4) PKCαの検出及び定量
本発明の医薬組成物は、採取した被験者又は患者の生体試料（被験試料；特に血液、詳しくは血漿又は血清）中のPKCαを検出し定量するために用いられ、健常者における検出量との比較により癌の有無やその発症の可能性及び病状の程度を判断（診断）することができる。また、同一被験者のPKCα量を定期的にモニターすることで、癌の状態（病状）を判断することもできる。
(i) PKCαの検出
被験試料として採取した血液等は、例えば血清分離等の処理を施しておいた後、一般には、サンプルバッファー等により、1〜100倍に希釈しておく。サンプルバッファーとしては、例えば、phosphate buffered saline等を用いることができる。
上記処理後の被験試料は、本発明の医薬組成物と接触させ、抗PKCα抗体（一般にはモノクローナル抗体が好ましい）との反応に使用する。
被験試料と抗PKCα抗体との反応は、20〜40℃（好ましくは30〜37℃）で、30〜720分間（好ましくは30〜90分間）行う。
【００４４】
PKCαの検出は、公知の免疫検定法(immunoassay)を、その常法に従い、利用して行うことができる。免疫検定法としては、標識化免疫測定法や免疫比濁法(TIA)があるが、なかでも前者が好ましく、例えば、ELISA等の酵素免疫検定法(EIA)のほか、放射線免疫検定法(RIA)や蛍光免疫検定法(FIA)等が好ましく挙げられる。また、標識化免疫測定法としては、他の分離方法との組合せを利用したものとして、ウェスタンブロット法（電気泳動法との組合せ）等も好ましく挙げられる。これらの中でも、ELISA及び／又はウェスタンブロット法が好ましい。また、1種又は2種以上の抗PKCαモノクローナル抗体を用い、2種以上の免疫検定法を組み合わせて検出を行ってもよく、より一層感度及び信頼性等の高い優れた検出を行うことができる。
【００４５】
(ii) PKCαの定量
定量は、限定はされないが、抗原量（抗原濃度：PKCα濃度）とその検出値との関係に基づく検量線から、被験試料に含まれるPKCαを定量することが好ましい。上記検量線は、精製PKCαを抗原とし、前述した抗PKCα抗体を用いて得られる検出値（検出データ）を基に、予め作成しておく。詳しくは、検出の方法として説明した免疫検定法（ELISAやウェスタンブロット法等）と同様の方法により、抗原濃度に対する検出値の情報を取得し、これを基に作成しておくようにする。当該検量線と、実際の検出値（実測値）とを対比させることで、被験試料中のPKCα量を求めることができる。
PKCαの定量又は検出は、市販のキットを用いることもできる。
【００４６】
(iii) 癌の状態の評価
本発明においては、上記のようにして定量又は検出したPKCα値を指標として、癌の状態を評価することができる。すなわち、本発明は、抗PKCα抗体と生体試料（被験試料）とを反応させてPKCαを検出し、得られる検出結果を指標として癌の状態を評価する方法を含むものである。
ここで、「癌の状態を評価する」とは、癌（再発癌、早期癌）の発病の有無、進行度、重症度、治療反応性、予後等を判断することを意味する。評価は、PKCα量のほか、自覚症状等を組み合わせて行ってもよい。定期健診のように、年に１〜２回の頻度でPKCαを測定することにより評価することもできるが、PKCα量の推移を定期的にモニタリングすることで総合的に癌の状態を評価する（癌の再発の有無をモニタリングすることも含む）ことが好ましい。このような評価法として、例えば、PKCα量が一定値を超えれば何らかの癌が発症している可能性高いと診断する、既に治療中の癌症例においてPKCα量が低下すれば治療が奏功していると診断する、PKCα量が一定値を超え高値で推移する症例は治療及び回復が不能であると診断する、といったことも可能になる。
【００４７】
４．癌診断用キット
癌の診断を行うに当たっては、癌診断用キットを用いることができ、例えば、構成要素として前記３−１.項及び３−２.項において述べた癌診断用医薬組成物を含むキットを挙げることができる。
当該キットにおいて、PKCα基質ペプチドを含む場合は、当該基質ペプチドは、安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して、粉末の状態又は溶液の状態（純水、バッファー、生理食塩水などに溶かした状態）で、冷蔵又は冷凍（-30℃〜-80℃）の条件下で保存することが好ましい。
当該キットにおいて、抗PKCα抗体を含む場合は、当該抗体は、安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して、溶解した状態で備えられていることが好ましい。
【００４８】
当該キットは、上記のPKCα基質ペプチド又は抗PKCα抗体以外に、他の構成要素を含むことができる。他の構成要素としては、例えば、ELISAやウェスタンブロットに用い得る1次抗体検出用試薬及び発色基質等を挙げることができる。
当該キットは、構成要素として、少なくとも上記のPKCα基質ペプチド又は抗PKCα抗体を備えているものであればよい。従って、癌の診断に必須となる構成要素の全てを、PKCα基質ペプチド又は抗PKCα抗体と共に備えているものであってもよいし、そうでなくてもよく、限定はされない。
【００４９】
５．スクリーニング方法
本発明の癌の予防及び／又は治療薬をスクリーニングする方法は、前述したように、以下の(a)〜(c)の工程を含む方法である。なお、本発明のスクリーニング方法は、必要に応じ、他の工程を含んでいてもよい。
(a) 担癌モデル非ヒト哺乳動物に候補物質を投与する工程（投与工程）
(b) 上記担癌モデル非ヒト哺乳動物の血中のPKCαを検出する工程（検出工程）
(c) 得られる検出結果を指標として目的の癌予防薬及び／又は癌治療薬を選択する工程（評価工程）
【００５０】
以下に、上記各工程について説明する。
(a) 投与工程
被験動物となる担癌モデル非ヒト哺乳動物、及び対照動物としては、特に限定されないが、通常、正確な比較実験を行うことができる点で、同種の非ヒト哺乳動物を用いることが好ましく、同腹の非ヒト哺乳動物を用いることがより好ましく、同性及び同齢の非ヒト哺乳動物を用いることがさらに好ましい。また、被験動物及び対照動物は、飼料の摂取量以外の飼育条件は同様であることが好ましい。
被験動物としては、正常非ヒト哺乳動物に公知の方法により腫瘍組織や腫瘍細胞を移植して癌を発症させた、担癌モデル非ヒト哺乳動物を用いることができる。さらに本発明においては、上記担癌モデル非ヒト哺乳動物から、腫瘍組織や腫瘍細胞を外科的に切除した非ヒト哺乳動物も用いることができる。当該切除後の非ヒト哺乳動物を被験動物として用いた場合、例えば、再発癌の予防薬のスクリーニング方法を行うこともできる。本発明においては、当該切除後の非ヒト哺乳動物も担癌モデル非ヒト哺乳動物に含まれるものとする。
対照動物としては、被験動物との比較対照に使用されるに適している限り限定されるものではなく、例えば、腫瘍組織等を移植していない正常非ヒト哺乳動物が用いられるほか、候補物質を投与しない担癌モデル非ヒト哺乳動物又は候補物質を投与する前の被験動物を対照動物として用いることもできる。
【００５１】
被験動物に投与する候補物質としては、限定はされないが、天然又は人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質（酵素や抗体を含む）、核酸（ポリヌクレオチド(DNA, RNA)、オリゴヌクレオチド(siRNA等)、ペプチド核酸(PNA)など）、低分子又は高分子有機化合物等を例示することができる。
候補物質の投与は、経口的又は非経口的に行うことができ、限定はされず、いずれの場合も公知の投与方法及び投与条件等を採用することができる。投与量についても、被験動物の種類及び状態、並びに候補物質の種類等を考慮して、適宜設定可能である。
【００５２】
(b) 検出工程
本工程では、候補物質が投与された被験動物の血中（血液サンプル）からPKCαを検出する。血液サンプルの採取方法は、公知の方法が適用できる。PKCαの検出回数及び検出期間等は、特に限定はされず、目的の癌予防薬又は癌治療薬の効能等を考慮して適宜設定することができる。
血中のPKCαの検出及び定量方法は、限定はされないが、前記３−１.項及び３−２.項（特に、３−１.(4)項及び３−２.(4)項）において説明した方法を適宜採用することができる。
【００５３】
(c) 評価工程
癌予防薬及び／又は癌治療薬をスクリーニングする場合は、例えば、候補物質が投与された被験動物、及び候補物質が投与されていない対照動物について、血中PKCα検出量（検出レベル）を比較評価する。この評価により、候補物質が目的の癌予防薬及び／又は癌治療薬であるかどうかを選択することが好ましい。
具体的には、血中PKCα量が同レベルの担癌モデル非ヒト哺乳動物について、一方を候補物質を投与する被験動物とし、他方を候補物質を投与しない対照動物とした場合は、被験動物における血中PKCα量が、対照動物における血中PKCα量よりも低いレベルとなったとき、候補物質を目的の癌治療薬として選択することができる。これに対し、被験動物における血中PKCα量が、対照動物における血中PKCα量と同レベルを維持するか又はより高いレベルとなったときは、候補物質は目的の癌治療薬として選択することはできない。この場合、対照動物としては、候補物質を投与する前の被験動物自体とすることもできる。
【００５４】
また、腫瘍組織等を外科的切除した担癌モデル非ヒト哺乳動物、又は外科的切除以外の方法（内科的方法等）により一旦癌の治療が完了した担癌モデル非ヒト哺乳動物を、候補物質を投与する被験動物とし、正常非ヒト哺乳動物を対照動物とした場合は、被験動物における血中PKCα量が、対照動物における血中PKCα量と同レベルを継続的に維持したときに、候補物質を癌予防薬（詳しくは再発癌の予防薬）として選択することができる。これに対し、被験動物における血中PKCα量が、対照動物における血中PKCα量より高いレベルとなったときは、候補物質は目的の癌予防薬として選択することはできない。この場合、対照動物としては、候補物質を投与する直前の（再発前の）被験動物自体とすることもできる。
【００５５】
なお、血中PKCα量に基づく癌の予防及び／又は治療薬のスクリーニングは、複数の癌種（好ましくは全ての癌種）に対して行うことが可能であるため、担癌モデル非ヒト哺乳動物として、特定の癌種の担癌モデル非ヒト哺乳動物を作製し使用した場合は、当該特定の癌種についての予防及び／又は治療薬をスクリーニングすることができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
「複数の癌の診断用バイオマーカーとしての細胞外PKCα」
＜材料及び方法＞
ペプチド合成
自動ペプチドシンセサイザーを使用し、標準的なFmoc化学手順に従って、基質ペプチドとしてのアルファトメガ（FKKQGSFAKKK (配列番号１)）を合成した。トリフルオロ酢酸(TFA)で処理した後、ペプチドをInertsil ODS-3カラム(250×20 mm、3.5μm；ジーエルサイエンス、東京、日本)上で、BioCADパーフュージョンクロマトグラフィー系(池本理化工業株式会社)、及び流速8 ml/分のＡ-Ｂ直線勾配(溶離液Ａは0.1％TFA含有水、溶離液Ｂは0.1％TFA含有アセトニトリル)を使用して精製した。【００５７】
MALDI-TOF MS分析
α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)マトリックス(10 mg/ml)を、50％水／アセトニトリル及び0.1％TFA中で調製した。このマトリックスとサンプルとを、20：1の比率で混合した。合計1μl容量の検体／マトリックス混合液をサンプルプレートに塗布し、乾燥させて結晶化させた。本実施例では、Voyager DE RPバイオスペクトロメトリーワークステーション(Applied Biosystems)を、陽イオン又は陰イオンリフレクトロンモードで使用して行った。加速電圧は20 kV、抽出遅延時間は100 nsとした。典型的に、100本のレーザショットを平均化して、シグナル／ノイズ比を改善した。Data Exploreソフトウェア(Applied Biosystems)を用いて、全てのスペクトルを分析した。リン酸化率は、リン酸化物質対非リン酸化物質のイオン強度比と規定し、既存の説明に従って計算した(Kang, J.- H. et al. (2007) J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 106-112.；Kang J.- H. et al. (2007) J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1925-1931.)。【００５８】
血漿サンプルでの基質ペプチドのリン酸化
全ての動物実験は、九州大学が提示する動物実験規則に従って行った。癌細胞を、10％ウシ胎仔血清、ペニシリン(100 U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)及びアムホテリシンＢ(0.25μg/ml；全てInvitrogen)を補ったダルベッコ改変イーグル培地中で維持させた。当該癌細胞を、5％CO2及び95％空気を含む37℃の加湿雰囲気中においた。B16メラノーマについては５週齢のBALB/c雄マウス、ヒト癌(A549、U87、HuH-7及びA431)についてはBALB/cヌードマウス(体重は約20g)を、使用した。B16メラノーマ細胞については100μlのハンクス平衡塩溶液(Invitrogen)、ヒト癌(A549、U87、HuH-7及びA431)については100μlのマトリゲル(BD Biosciences)に入った1×107細胞を背部皮下注射によりマウスに接種した。平均直径が約1.2 cmになるまで癌を成長させた。外科的切除後の癌の再発をモニタリングするために、それぞれの癌に対して90％の切除を行った(直径1.1又は1.2 cm)。血液採取のために、3 U／体重(g)の用量のヘパリンを腹腔内注射した。15分後にマウスを屠殺し、後大静脈から血液サンプルを採取した。血液サンプルを、2,000 rpm、４℃にて15分間遠心分離し、上清(血漿)を、基質ペプチドとのリン酸化反応のために使用した。基質ペプチドのリン酸化は、30μMの合成ペプチドを含む30μl緩衝液(20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、10 mM MgCl2、100μM ATP及び2 mg/ml血漿)中で行った。37℃にて60分間のインキュベーションの後、サンプルをMALDI-TOF MSにより分析した。【００５９】
ウェスタンブロット分析
血漿(50μg)に対して、抗リン酸化PKCα(Ser657)抗体(日本ミリポア)でイムノブロッティングを行った。免疫反応は化学発光により可視化した。なお、PKCαの活性化のためには、PKCαのSer657部位がリン酸化されなければならないが、抗リン酸化PKCα(Ser657)抗体は、リン酸化されたSer657部位を特異的に認識するモノクローナル抗体である。【００６０】
統計的分析
結果は、３つ又は４つのサンプルの平均として標準偏差と共に示した。全ての測定を２回ずつ行った。統計的分析は、Student t-testを用いた平均値の差の有意性検定により行った。【００６１】
＜結果＞
MALDI-TOF MSを使用して、PKCα特異的基質ペプチドであるアルファトメガ(FKKQGSFAKKK (配列番号１))のリン酸化の状態を確認した。従来の研究では、CHCAをマトリックスとして使用した場合には、混入物質及び生体分子(例えば、塩、タンパク質及び脂質)が、結晶形成を阻み、イオン化を妨げることが報告されており、本発明者も同様の問題に直面したが、これらの障害を克服するために、20：1のCHCA対サンプル容量比で、サンプルをCHCAで希釈する希釈法を採用した。MALDI-TOF MSを使用すれば、広範囲なペプチド濃度(10-4M(100 pmol/μl)から10-8 M(10 fmol/μl))を分析できた。本実施例において、ペプチドの濃度(20：1希釈で1.5μM)は、十分にこの範囲内であった。m/z値における80 Daの増加によって、基質ペプチドのリン酸化を確認した(図１)。
PKCα特異的基質ペプチドが血液サンプルによってリン酸化され得るか否かを調査するために、対照マウス、ならびに1.1〜1.2 cmの大きさの腫瘍を持つ５種類の異なる癌のマウス(U87、A549、A431、HuH-7及びB16メラノーマ)に由来する血液サンプルを調製した。基質ペプチドと血漿とのリン酸化反応の後、各サンプルをMALDI-TOF MSにより分析した。癌の異種移植マウスモデルから採取した５つの血液サンプルにおいて、正常マウスの血液のものよりも、基質ペプチドの高いリン酸率を確認した(図２)。【００６２】
次に、基質ペプチドの濃度(15〜100μM)によってリン酸化率に影響があるか否かを、B16メラノーママウス由来の血漿を用いて調べた。基質ペプチドの濃度が30μMから100μMに上がるとリン酸化率が低下したが、15μMと30μMとの間ではリン酸化率の差はなかった。15μM及び30μMのペプチド濃度と比べて、100μMのペプチド濃度においてはリン酸化率の有意な低下(P < 0.05)が観察された(図３)。
担癌マウスの血中に活性化PKCαが存在するか否かを確認するために、ウェスタンブロット分析を採用した。正常マウスの血液よりも、担癌(U87、A549又はB16メラノーマ)マウスの血中で、より高レベルの活性化PKCαが認められた(図４)。次に、リン酸化率に対する阻害剤の影響を、３つのプロテインキナーゼ阻害剤(Ro-31-7549、ロットレリン及びH-89)を用いて調査した。B16メラノーママウスから採取した血漿を含むリン酸化反応混合液にRo-31-7549を添加すると、リン酸化の用量依存的な低下が生じ、5μMでは100％低下した。しかし、ロットレリン又はH-89の添加ではリン酸化率の有意な低下は見られなかった(図５)。これらの結果は、担癌マウスの血中に存在する活性化PKCαによって、ペプチドがリン酸化されたことを強く示すものであった。【００６３】
次に、腫瘍サイズとリン酸化率との関係について調査した。0.6 cm、0.9 cm及び1.2 cmのB16メラノーマ又はU87腫瘍を持つマウス由来の血漿を調製した。リン酸化率は腫瘍サイズが大きくなると共に上昇した。対照マウスと比較して、腫瘍サイズが≧0.9 cmのマウスでリン酸化率の有意な上昇(P < 0.05)を確認した(図６)。これらのデータは、血中の活性化PKCαのレベルが腫瘍サイズに関係することを示すものであった。
最後に、血中の活性化PKCαのレベルを、腫瘍の外科的切除後の癌の再発をモニタリングするために適用できるか否かを調べた。B16メラノーマの腫瘍の外科的切除後に採取した血液サンプル中ではリン酸化率が有意に低下したが、21日後には腫瘍の再発と共にリン酸化率が上昇した(図７)。これらの結果は、血漿PKCαが、癌の再発をモニタリングするために適用できることを示すものであった。【００６４】
＜考察＞
リン酸化ペプチドは、MS利用型分析、[32P]ATPチップ技術を利用した放射性アッセイ、及びホモジニアスアッセイを含む様々な技術によって検出されてきた。これらアッセイのうち、MS利用型分析の利用が過去十年にわたって大幅に増加している。最も広く使用されるMS技術はMALDI-TOF MSであり、これは高感度かつ同定速度が速い。従って、本実施例においてもMALDI-TOF MSをリン酸化ペプチドのアッセイに使用した。希釈法を取り入れ、サンプルをCHCAに希釈することで、混入物質又は生体分子による結晶形成及びイオン化の妨げを回避した。これにより、リン酸化ペプチドを十分に検出することができるようになった(図１)。
PKCαは、多くの組織で広く発現し、癌細胞の分化、増殖及びアポトーシスにおいて鍵となる役割を果たすものである。PKCα活性が、正常細胞よりも腫瘍細胞において高いことが、いくつか報告されている。さらに、PKCαアクティベーター[ジアシルグリセロール(DAG)]及び補因子[ホスファチジルセリン(PS)及びCa2+]の濃度、ならびにサイトゾルから膜へのPKCαの移動が、癌細胞において増加した。従って、PKCαは、抗癌治療の潜在的な標的として注目されてきた。【００６５】
本実施例において、PKCαが血中に存在することが確認された。ウェスタンブロット分析により、正常マウスの血液中よりも担癌マウスの血液中でより高いレベルの活性化PKCαを検出した(図４)。さらに、担癌マウス由来の血液は、正常マウス由来の血液と比べて、アルファトメガに対するリン酸化率がより高かった(図２)。本発明者は、プロテインキナーゼ阻害剤であるRo-31-7549、ロットレリン及びH-89を用いて、ペプチドリン酸化率をさらに調べた。ロットレリン(20μM)はプロテインキナーゼＡ(PKA)、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２(MAPKAP-K2)、p38調節／活性化キナーゼ(PRAK)及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ３(GSK3)を＞80％阻害できるが、PKCαはこのキナーゼ阻害剤によって比較的影響を受けなかった(＜10％の阻害)。一方、H-89(10μM)による、MAPKAP-K1b、PKA、マイトジェン及びストレス活性化プロテインキナーゼ１(MSK1)、プロテインキナーゼＢα(PKBα)、血漿及びグルココルチコイド誘導性キナーゼ(SGK)、p70リボソームタンパク質S6キナーゼ(S6K1)、Rho関連プロテインキナーゼ-II(ROCK-II)、チェックポイントキナーゼ１(CHK1)、ならびにAMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)の阻害は＞80％であったが、PKCαに対しては＜30％であった。他方、Ro-31-7549は、PKCαに高度に特異的な阻害剤であり(5μMで＞90％)、Ro-31-7549は、リン酸化率の用量依存的な低下をもたらしたが、ロットレリン又はH-89では有意な低下は認められなかった(図５)。これらの結果は、基質ペプチドが活性化PKCαによりリン酸化され、血中の活性化PKCαが癌診断用のバイオマーカーとして使用できることを示すものであった。【００６６】
血流へのPKCα放出メカニズムは明確にはされていない。しかし、これまでに、癌細胞が細胞外空間にPKAを分泌でき、PKAのＮ末端ミリストイル化が分泌に必須であることが示されている。Ｎ-ミリストイル化は、ミリスチン酸をタンパク質のＮ末端グリシンに付着させるアシル化プロセスである。タンパク質のＮ-ミリストイル化は、脆弱かつ可逆的なタンパク質-膜相互作用を生じる。これらの観察から、細胞膜とのPKA相互作用が、PKAの分泌の決め手となる役割を果たすことが示される。PKCαの活性化は、サイトゾルから膜へのPKCαの移動、ならびにアクティベーター(DGA)及び補因子(PS及びCa2+)との相互作用を必要とする。従って、細胞外空間に存在する活性PKCαは、膜にドッキングしたPKCαの分泌から誘導され得る。
血管化を伴わない場合、癌性腫瘍の成長は、酸素及び栄養素の拡散範囲が限られるために0.2〜0.3 cmに限定される。それ以上の成長のためには、血液供給を得るための血管新生が必須である。血管新生は、血管内皮成長因子(VEGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、腫瘍壊死因子(TNF)及びインターロイキン８(IL-8)等の血管新生促進因子、ならびにインターフェロン(IFN)及びアンギオスタチン等の抗血管新生因子により調節される。血管密度の増加は、癌細胞への酸素及び栄養素の供給量を増やし、癌成長につながる。本実施例では、成長マウスと比較して、直径≧0.9 cmの腫瘍を持つ担癌マウスにおいて活性化PKCαの有意な上昇を確認した(図６)。これは、血中の活性化PKCαのレベルが、癌成長に必須な血管密度に密接に関係していることを示すものであった。【００６７】
前立腺癌用のPSA、及び乳癌用のヒト上皮成長因子受容体２(HER2)等の特定の腫瘍の診断のためのバイオマーカーがいくつか発見されており、臨床的に使用されている。しかし、初期段階の腫瘍診断、及び１つ以上の癌の広範囲な診断スクリーニングのために利用可能なバイオマーカーはほとんど発見されていない。本実施例では、５種類の癌のマウスの血中において活性化PKCαのレベルが、正常マウスの血中よりも高いことを発見した(図２)。これらの結果は、血漿中の活性化PKCαが、複数の癌の診断用マーカーとして有用であり得ることを示すものであった。
血中バイオマーカーは、外科的切除後の癌の再発をモニタリングするため、又は放射治療もしくは抗癌薬治療をモニタリングするためにも使用される。いくつかの血中バイオマーカーのレベルが、腫瘍の外科的切除（摘出）、化学療法又は放射線治療の後に劇的に低下するが、癌の再発と共に上昇することが示されている。同様に、本発明者は、PKCαレベルが、癌切除後14日間は低いが、21日後にレベルが上昇するのを確認した(図７)。従って、血漿PKCαレベルは、癌再発をモニタリングするための指標として使用できることが分かった。
【実施例２】
【００６８】
「ヒト血清サンプル中のPKCα活性検出」
＜材料及び方法＞
ペプチド合成
実施例１と同様の方法により、基質ペプチドとしてのアルファトメガ（Ac-FKKQGSFAKKK-NH2 (配列番号１)）を合成した。
MALDI-TOF MS分析
実施例１と同様の手法により、全てのスペクトルを分析し、基質ペプチドのリン酸化率を計算した。
ヒト血清サンプルでの基質ペプチドのリン酸化
14名の肺癌患者の血清を採取し、これをサンプルとして用いて基質ペプチドのリン酸化を行った。終濃度で30μM基質ペプチド（アルファトメガ）、2.5倍希釈したヒト血清サンプル（サンプル1〜14；下記表１参照）、0.3 mM ATP、1 mM Mg2+、10 mM HEPESを含む溶液を調製し、37℃で1時間、基質ペプチドのリン酸化反応を行った。
その後、MALDI-TOF-MSよりリン酸化率を決定した。【００６９】
＜結果及び考察＞
14名中8名の血清サンプル（case 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 13）で、基質ペプチドのリン酸化が確認された（下記表１参照）。特にcase 9及びcase 13の血清サンプルでは、既存の腫瘍マーカー（ProGRP、CEA、CYFRA）では陽性反応が認められなかったが、本発明の基質ペプチド（アルファトメガ）のリン酸化が確認され、陽性反応が認められた。【００７０】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、簡便であり且つ信頼性の高い癌診断用の新規バイオマーカー等を提供することができる。本発明の癌診断用マーカーは、血中マーカーであるため取扱いが簡便であり、複数の癌種の診断に用いることが可能であり、特に早期癌や再発癌の診断に好適である点で、極めて有用なものである。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列番号１：合成ペプチド
配列番号２：合成ペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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