(57)【要約】  配列番号１又は配列番号２の塩基配列を含む最大30塩基のアンチセンスDNAと、このアンチセンスDNAと対合できるセンスDNAとがリンカーDNAで連結されたDNA、このDNAから発現するshRNA 又はsiRNA、このDNAを含むベクター、これらを封入したカプセル又はリポソームは、心筋梗塞を抑制し、心筋梗塞時の心筋細胞を延命できる。また、これらとエリスロポエチンとを併用することにより、一層上記効果が増強される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SOCS3の保存領域と完全相補する21〜30塩基のアンチセンスDNAと、このアンチセンスDNAと対合できるセンスDNAとがリンカーDNAで連結されたDNA。
【請求項２】
配列番号１又は配列番号２の塩基配列を含む最大30塩基のアンチセンスDNAと、このアンチセンスDNAと対合できるセンスDNAとがリンカーDNAで連結されたDNA。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のDNAから発現するshRNA 又はsiRNA。
【請求項４】
請求項１又は２のDNAを発現可能に連結したベクター。
【請求項５】
ポリマーカプセル又はリポソーム内に、請求項１若しくは２に記載のDNA、請求項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、又は請求項４に記載のベクターが封入された核酸封入カプセル又はリポソーム。
【請求項６】
請求項１若しくは２に記載のDNA、請求項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、請求項４に記載のベクター、又は請求項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソームと、エリスロポエチンとを含む組成物。
【請求項７】
請求項１若しくは２に記載のDNA、請求項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は請求項６に記載の組成物を有効成分とする、心筋梗塞の予防、改善、又は治療剤。
【請求項８】
請求項１若しくは２に記載のDNA、請求項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は請求項６に記載の組成物を有効成分とする、心筋梗塞時の心筋細胞死の抑制剤。
【請求項９】
心筋梗塞の予防、改善、又は治療のために使用される、請求項１若しくは２に記載のDNA、請求項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
心筋梗塞時の心筋細胞死の抑制のために使用される、請求項１若しくは２に記載のDNA、請求項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
心筋梗塞の予防、改善、又は治療剤の製造のための、請求項１若しくは２に記載のDNA、請求項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は請求項６に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
心筋梗塞時の心筋細胞死の抑制剤の製造のための、請求項１若しくは２に記載のDNA、請求項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は請求項６に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
請求項１若しくは２に記載のDNA、請求項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は請求項６に記載の組成物を哺乳動物に投与する、心筋梗塞の予防、改善、又は治療方法。
【請求項１４】
請求項１若しくは２に記載のDNA、請求項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は請求項６に記載の組成物を哺乳動物に投与する、心筋梗塞時の心筋細胞死の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、SOCS3遺伝子がコードするSOCS3タンパク質の発現を抑制し得るRNA干渉分子、それをコードするDNA、このDNAを含むベクター、及びこれらを封入したナノカプセル又はリポソームに関する。また、本発明は、これらを有効成分とする心筋梗塞、特に急性心筋梗塞の治療剤、及び心筋梗塞時の細胞死の抑制剤に関する。また、本発明は、急性心筋梗塞の治療方法、及び心筋梗塞時の細胞死の抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
G-CSF(Granulocyte Colony-stimulating Factor)、EPO(Erythropoietin)、LIF(Leukemia Inhibitory Factor)などのサイトカインが心筋細胞の生存を促進させ、急性心筋梗塞の梗塞範囲を縮小させ、心筋リモデリングを抑制することが知られている（非特許文献１など）。しかし、急性心筋梗塞症例に対するG-CSFの臨床試験では有効例や無効例があり、評価は定まっていない。
一方、EPO、G-CSF、及びLIFは、STAT3の活性化を促進し、STAT3が細胞内でJAKキナーゼによりリン酸化され、リン酸化STAT3が核内へ移行し、SOCS3(Suppressor of Cytokine Signaling-3)の発現を誘導する（非特許文献２、３、４）。また、心筋のメカニカルストレス（圧負荷）が心筋のSTAT3をリン酸化し、SOCS3タンパク質の発現を誘導することも知られている(非特許文献５)。
SOCS3タンパク質は、JAKのキナーゼ活性を抑制することにより、サイトカインによる作用を抑制することが知られている（非特許文献６〜１０）。このように、SOCS3は、心筋梗塞を増悪させる作用を有するため、SOCS3タンパク質の発現を効果的に抑制することが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Nat.Med.11,305,2005
【非特許文献２】J.Clin.Invest.108,1459-1467,2001
【非特許文献３】J.Biol.Chem.279,6905-6910,2004
【非特許文献４】J.Biol.Chem.275，29338-29344,2000
【非特許文献５】J.Clin.Invest.108,1459-1467,2001
【非特許文献６】EMBO J,18,1309-1320,1999
【非特許文献７】Annu.Rev.Immunol.18,143-164,2000
【非特許文献８】J.Clin.Invest,111,469-178,2003
【非特許文献９】Circulation,114,2364-2373,2006
【非特許文献１０】J.Clin.Invest,108,1459-1467,2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規な心筋梗塞の治療剤、及び心筋梗塞時の細胞死の抑制剤を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)  心筋特異的にSOCS3遺伝子を破壊し、SOCS3タンパク質の発現を阻止したノックアウトマウスは、心筋梗塞領域の縮小、左心室拡大抑制、心臓収縮機能低下抑制、サイトカイン（EPO、G-CSF、及びLIF）の発現亢進、STAT3リン酸化の増強、アポトーシス抑制、Bcl-xL発現促進、TFAM(Mitochondrial transcriptional factor A)の発現増強、血管新生の亢進、血管新生因子（HGF、IGF、Midkine）の発現亢進が認められた。この結果、SOCS3タンパク質の発現を抑制することで、心筋の壊死の抑制等の効果が確認され、当該蛋白質の発現の阻止、抑制をもたらす物質が、心筋梗塞（特に急性心筋梗塞）の有効な治療薬となることが確認された。
(ii)  配列番号１又は配列番号２の塩基配列を含むアンチセンスDNAと、このアンチセンスDNAと対合できるセンスDNAとがリンカーDNAで連結されたDNAは、SOCS3遺伝子におけるｍRNAを阻害し、SOCS3タンパク質の発現を効果的に抑制するshRNAおよびこれに基づくsiRNAを発現する。これらのshRNA及びこれに基づくsiRNA自体は、SOCS3タンパクの発現阻止能力を有し、筋細胞死を抑制し、心筋梗塞を予防、改善、又は治療できる。
(iii)  SOCS3遺伝子から転写されたｍRNAの分解を導き、SOCS3タンパク質の発現を抑制できる上記siRNAを導くshRNAをコードするDNAおよび当該DNAを含むベクター、プラスミドは、心筋梗塞時に心筋細胞内において、心筋梗塞領域の拡大抑制、左室拡大抑制、心臓収縮機能低下抑制、サイトカイン（EPO、G-CSF、及びLIF）の発現亢進、STAT3リン酸化の増強、アポトーシス抑制、Bcl-xL発現促進、TFAMの発現増強、血管新生の亢進、血管新生因子（HGF、IGF、Midkine）の発現亢進を介して、心筋細胞死を抑制し、心筋梗塞を予防、改善、又は治療できる。
(iv)  上記SOCS3タンパク質の発現を阻止・抑制するsiRNA、当該siRNAを導く、shRNA及びshRNAをコードするDNAを含むベクター、プラスミドのいずれかを、上記記載のサイトカイン（EPO,G-CSF、及びLIF）と併用し、心筋細部内に導入することでより効果的に心筋梗塞時に心筋細胞内において、心筋梗塞領域の拡大抑制、左室拡大抑制、心臓収縮機能低下抑制、サイトカイン（EPO、G-CSF、及びLIF）の発現亢進、STAT3リン酸化の増強、アポトーシス抑制、Bcl-xL発現促進、TFAMの発現増強、血管新生の亢進、血管新生因子（HGF、IGF、Midkine）の発現亢進を介して、心筋細胞死を抑制し、心筋梗塞を予防、改善、又は治療できる。
（v）  上記方法やその他の手法によって得られる、shRNA自体や、当該shRNAから導かれるsiRNAそのものも、筋梗塞時に心筋細胞内において、心筋梗塞領域の拡大抑制、左室拡大抑制、心臓収縮機能低下抑制、サイトカイン（EPO、G-CSF、及びLIF）の発現亢進、STAT3リン酸化の増強、アポトーシス抑制、Bcl-xL発現促進、TFAMの発現増強、血管新生の亢進、血管新生因子（HGF、IGF、Midkine）の発現亢進を介して、心筋細胞死を抑制し、心筋梗塞を予防、改善、又は治療できる。
（vi）  本治験を基に、あらたな、shRNA、siRNAやこれらを産生するベクター、プラスミドを心筋梗塞モデル化された心筋細胞中に導入し、SOCS3タンパク質の発現状態を確認する手法により、あらたな、心筋梗塞の治療薬をスクリーニングすることが出来る。
(vii)  上記のshRNA又はsiRNA、DNA、ベクター又はプラスミドの効果は、エリスロポエチン（ＥＰＯ：erythropoietin）と併用することにより増強される。【０００６】
本発明は、上記知見に基づき、さらに研究を重ねて完成されたものであり、下記のDNAなどを提供する。
項１．  SOCS3の保存領域と完全相補する21〜30塩基のアンチセンスDNAと、このアンチセンスDNAと対合できるセンスDNAとがリンカーDNAで連結されたDNA。
項２．  配列番号１又は配列番号２の塩基配列を含む最大30塩基のアンチセンスDNAと、このアンチセンスDNAと対合できるセンスDNAとがリンカーDNAで連結されたDNA。
項３．  項１又は２に記載のDNAから発現するshRNA 又はsiRNA。
項４．  項１又は２のDNAを発現可能に連結したベクター。
項５．  ポリマーカプセル又はリポソーム内に、項１若しくは２に記載のDNA、項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、又は項４に記載のベクターが封入された核酸封入カプセル又はリポソーム。
項６．  項１若しくは２に記載のDNA、項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、項４に記載のベクター、又は項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソームと、エリスロポエチンとを含む組成物。
項７．  項１若しくは２に記載のDNA、項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、項４に記載のベクター、項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は項６に記載の組成物を有効成分とする、心筋梗塞の予防、改善、又は治療剤。
項８．  項１若しくは２に記載のDNA、項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、項４に記載のベクター、項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は項６に記載の組成物を有効成分とする、心筋梗塞時の心筋細胞死の抑制剤。
項９．  心筋梗塞の予防、改善、又は治療のために使用される、項１若しくは２に記載のDNA、項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、項４に記載のベクター、項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は項６に記載の組成物。
項１０．  心筋梗塞時の心筋細胞死の抑制のために使用される、項１若しくは２に記載のDNA、項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、項４に記載のベクター、項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は項６に記載の組成物。
項１１．  心筋梗塞の予防、改善、又は治療剤の製造のための、項１若しくは２に記載のDNA、項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、項４に記載のベクター、項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は項６に記載の組成物の使用。
項１２．  心筋梗塞時の心筋細胞死の抑制剤の製造のための、項１若しくは２に記載のDNA、項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、項４に記載のベクター、項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は項６に記載の組成物の使用。
項１３．  項１若しくは２に記載のDNA、項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、項４に記載のベクター、項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は項６に記載の組成物を哺乳動物に投与する、心筋梗塞の予防、改善、又は治療方法。
項１４．  項１若しくは２に記載のDNA、項３に記載のshRNA若しくはsiRNA、項４に記載のベクター、項５に記載の核酸封入カプセル若しくはリポソーム、又は項６に記載の組成物を哺乳動物に投与する、心筋梗塞時の心筋細胞死の抑制方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、SOCS3遺伝子のノックアウトにより心筋梗塞を効果的に改善できることが、初めて示された。さらに、心筋梗塞の心筋壊死を促進させるSOCS3タンパク質の生成を効果的に抑制できるshRNAをコードする核酸配列が提供された。この核酸配列は、ベクター、プラスミドに組み込み、心筋梗塞（特に急性心筋梗塞）時の心筋細胞に導入することで、心筋梗塞に伴う心筋細胞の壊死の進行を抑制する効果をもたらす。
同様に、本発明により産生されるshRNAもしくは当該shRNAの酵素による切断により導かれるsiRNAを直接当該心筋梗塞時の心筋細胞に導入することにより、SOCS３タンパク質の発現を抑制し、その結果、心筋細胞の壊死の進行を抑制する効果がもたらされる。
上記の本発明のshRNA、siRNA、これらをコードするDNA、それを含むベクター又はプラスミドは、エリスロポエチンと併用することにより、一層効果的に、心筋細胞の壊死の進行を抑制する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１で作製した心筋特異的SOCS3欠損ノックアウトマウスにおいて、心臓特異的にSOCS3がノックアウトされていることを示す図である。
【図２】実施例１で作製した心筋特異的SOCS3欠損ノックアウトマウスで、梗塞巣のサイズが著しく抑制されていることを示す図である。
【図３】野生型マウス及び心筋特異的SOCS3欠損マウスの生存曲線を示す図である。
【図４】野生型マウス及び心筋特異的SOCS3欠損マウスの心エコーの結果を示す図である。
【図５】心筋特異的SOCS3ノックアウトマウスの心臓からの抽出タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図６】SOCS3のセンスとアンチセンスの双方を有するshRNA発現ベクターを示す図である。
【図７】SOCS3 shRNA安定発現細胞におけるインターロイキン-6誘発SOCS3発現の抑制を示す図である。
【図８】心筋特異的SOCS3欠損ノックアウトマウスにエリスロポエチンを投与した場合の、心筋梗塞巣サイズの減少を示す図である。図８中、Shamは野生型マウス、AMIは心筋特異的SOCS3欠損ノックアウトマウス（急性心筋梗塞マウス:acute myocardial infarction）、Infarct areaは心筋梗塞面積を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳しく説明する。
（Ｉ）siRNA、shRNA、DNA、ベクター
本発明のDNAは、SOCS3の保存領域と完全相補する21〜30塩基のアンチセンスDNAと、このアンチセンスDNAと対合できるセンスDNAとがリンカーDNAで連結されたDNAである。アンチセンスDNAの長さは、19〜30塩基が好ましく、21〜29塩基がより好ましい。
特に効果的にSOCS3遺伝子をノックダウンできるRNA干渉分子を発現し得るDNAとして以下のものが挙げられる。
即ち、本発明のDNAの中でも好ましいのは、配列番号１又は配列番号２の塩基配列を含むアンチセンスDNAと、このアンチセンスDNAと対合できるセンスDNAとがリンカーDNAで連結されたDNAである。
CCGCT TCGAC TGTGT ACTCA AGCTG GTGC（配列番号１）
GCCAC CTGGA CTCCT ATGAG AAAGT GACC（配列番号２）
このDNAにおいて、アンチセンスDNAは、配列番号１又は配列番号２の5’末端及び／又は3’末端に合計1〜3塩基、好ましくは１〜2塩基、さらにより好ましくは１塩基のヌクレオチドが付加されていてよい。即ち、アンチセンスDNAは最大33塩基のDNAであってよい。配列番号１又は配列番号２の塩基配列からなるアンチセンスDNAが、標的であるSOCS3遺伝子に対する特異性が最も高く好ましい。
【００１０】
配列番号１、２のアンチセンスDNA配列は、SOCS3の部分と完全相補する配列である。一方、アンチセンスDNAと対合できるセンスDNAは、アンチセンスDNAとの間でミスマッチ配列を含んでいてもよい。センスDNA中のミスマッチ塩基数は、1〜3個が好ましく、1〜2個がより好ましく、1個がさらにより好ましい。また、センスDNAとアンチセンスDNAとの間でミスマッチ塩基がなくてもよい。
ミスマッチは、一般的には置換により相補しない他の塩基に置き換えることにより形成されるが、センスDNA配列からアンチセンスDNAの特定塩基と対応する塩基を欠失させることにより形成された不対合、センスDNA配列にアンチセンスDNAと対応しない塩基を挿入することにより形成された不対合、センスDNA配列の3'又は5'末端に任意の塩基を付加することより形成される不対合もミスマッチ配列に含まれる。中でも、標的認識効率がよい点で、塩基置換型のミスマッチが好ましい。
【００１１】
アンチセンスDNAとセンスDNAをつなぐリンカーDNAは、shRNAのヘアピン構造を形成させるための構造体である。リンカーDNAの塩基配列は、shRNAの生成を妨げるターミネーション配列を除き、特に限定されない。リンカーDNAの長さは、6〜11塩基が好ましく、7〜9塩基がより好ましい。
このようなリンカー配列から発現するshRNAのループ配列の例として、UUで始まる配列、例えばUUCAAGAGA、CUUCCUGUCA(配列番号３)、CCACACC等が挙げられる（Lee NS. et al.（2002）Nat. Biotech. 20, 500-505；Paddison PJ. et al.（2002）Genes and Dev. 16, 948-958；Sui G. et al.（2002）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5515-5520；Paul CP. et al.（2002）Nat. Biotech. 20, 505-508；Kawasaki H. et al.（2003）Nucleic Acids Res. 31, 700-707）。
【００１２】
shRNAをコードする上記のDNAは適切なプロモーターの下でshRNAを発現する。プロモーターは、shRNAを発現させることができるものであれば、polII系、polIII系のいずれでもよいが、shRNAのような短いRNAの発現に適したpolIII系が好ましい。polIII系のプロモーターとしては、例えば、U6プロモーター、SV40アーリープロモーター、H1プロモーター、ｔRNAプロモーター、レトロウイルス性LTRプロモーター、アデノウイルスVA1プロモーター、5S rRNAプロモーター、7SK RNAプロモーター、7SL RNAプロモーター、H1 RNAプロモーターなどが挙げられる。中でも、U6プロモーターが好ましい。
また、shRNAのような短い配列を精度よく発現させるために、shRNAをコードするDNAの３'末端にターミネーターを備えることが好ましい。ターミネーター配列は特に制限されないが、例えば、T（チミン）やA（アデニン）が４個以上連続した配列、パリンドローム構造を形成し得る配列などが挙げられる。中でも、Tが４個以上連続した配列が好ましく、TTTTがより好ましい。
プロモーター、shRNAをコードするDNA、及び好ましくはターミネーターからなるshRNA発現ユニットを含ませるベクターとしては、哺乳動物細胞では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。また、プラスミドベクターとしては、pBAsiベクター、pSUPERベクター、pSilencer、pRS shRNA等が挙げられる。
特に、遺伝毒性、腫瘍原性、免疫原性が低い点で、プラスミドベクターが好ましく、中でもpRS shRNAベクターが好ましい。
【００１３】
本発明のDNAは、心筋細胞内でshRNAを発現させてSOCS3の発現を抑制することを目的としている。
一過性のSOCS3遺伝子抑制を行なう場合には、染色体外に存在するベクターやプラスミドを用いることが好ましく、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アルファウイルスベクター、pBAsiベクター、pSUPERベクター、pSilencer、pRS shRNAのようなベクターを用いればよい。安定的にSOCS3遺伝子の発現抑制を行なう場合には、染色体内にインテグレーションする能力を有するベクターを選択することが好ましく、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、EBウイルスベクターのようなベクターを用いればよい。
【００１４】
急性心筋梗塞においては、一過性（数日間）にSOCS3をノックダウンすれば、血流再開によって心筋細胞はレスキューされるので、染色体内にインテグレーションし、安定的にSOCS3遺伝子の発現抑制を行う必要はない。このことから、安全性の高いプラスミドベクターの使用が推奨される。
染色体内にインテグレーションできるベクターを人を含む動物に導入することにより、簡便にSOCS3遺伝子（mRNA）をノックアウトすることができる。
これらベクターにより心筋特異的にSOCS3遺伝子をノックダウンする方法としては、心筋特異的に送達可能なバイオナノカプセルにshRNAもしくはsiRNAを包含させ、経静脈的に生体に投与する方法や、心筋特異性の非常に高い、アデノ関連ウィルス９（AAV9）にSOCS3-shRNAを組み込んだベクターを作成し、経静脈的に生体に投与する方法などが挙げられる。
ベクターは、選択マーカーを含んでいてよい。選択マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子のような薬剤耐性マーカー、ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得るマーカー、GFPなどの蛍光発光などを指標に選択し得るマーカー、EGFレセプター、B7-2やCD4などの表面抗原を指標に選択し得る選択マーカーなどを用いてもよい。
特に選択マーカーはDNA調整の際には必要であり、発現をモニターするためにもマーカーを用いることが推奨される。
本発明のDNAから発現したshRNAは、生体内でプロセシングを受けてsiRNAを生成する。
【００１５】
（ＩＩ）核酸封入ポリマーカプセル又はリポソーム
上記説明したsiRNA、shRNA、これらをコードするDNA、ベクターは、ポリマーカプセル、又はリポソームに封入することができる。RNAはRNAseにより分解され易いため、このようにカプセルやリポソームに封入することにより医薬として使用し易くなる。
カプセルを構成するポリマーとしては、高分子ナノミセル、PGLA名のスフェア、バイオナノカプセルなどが挙げられる。中でも、高分子ミセルが好ましい。カプセルの平均粒子径は、通常、約50〜250nmが好ましく、約90〜150nmがより好ましい。このような核酸封入カプセルは、例えばエマルジョン法により作製できる。
また、核酸封入リポソームの作製方法は周知であり、例えば特開2004-143200号公報、特開2004-302250号公報に記載の方法により作製できる。また、ポリマーカプセル、又はリポソームには、その他の有効成分や、医薬に使用される添加剤も共に封入することができる。
【００１６】
（ＩＩＩ）医薬
上記説明した本発明のsiRNA、shRNA、これらをコードするDNA、ベクター、及び核酸封入ポリマーカプセル又はリポソームは、心筋梗塞の予防、改善、又は治療剤や、心筋梗塞時の心筋細胞死の抑制剤又は心筋細胞の壊死抑制剤の有効成分として使用できる。
製剤は、経口投与剤、又は非経口投与剤の何れであってもよい。経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。固形製剤は、上記有効成分に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合して調製される。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、でんぷんのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが配合される。さらに、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化したりしてもよい。また、液体製剤は、例えば、上記の有効成分を、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、又はこれらの混液などに、溶解又は分散させることにより調製される。
経口投与剤の有効成分の含有量は、特に限定されないが、例えばベクター重量として、約1μｇ〜１ｇ、好ましくは約1〜500ｍｇとすればよい。
非経口投与剤としては、注射剤、坐剤などが挙げられる。注射剤としては、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などが挙げられる。注射剤は、上記の有効成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが挙げられる。適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil））などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられる。溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
注射剤中の有効成分の含有量は、本発明のベクター重量に換算して、例えば数μｇ〜数百ｍｇ、好ましくは50〜200ｍｇ程度、より好ましくは100ｍｇ程度とすればよい。
また、何れの剤形を取る場合も、G-CSF（顆粒球コロニー刺激因子）、EPO（エリスロポエチン）、LIF（白血病細胞増殖因子）などの心筋細胞の生存を促進させるサイトカインを併用することができ、これにより、心筋梗塞治療効果、又は心筋細胞の延命効果が増強する。
中でも、EPOと併用することが特に好ましい。EPOは、165アミノ酸で構成される分子量約34000の糖タンパク質である。EPOは、赤血球の産生を促進するホルモンとして機能する。EPOは主に腎臓の尿細管間質細胞で生成される。このため、慢性腎不全になると、必要量のEPOが生産されなくなり、貧血が起り易い。
EPOは、遺伝子組み換えEPOが市販されており、これらを購入できる。EPOの市販品としては、例えば、エポエチンα（商品名：エスポー、協和発酵キリン）、エポエチンβ（商品名：エポジン、中外製薬）が挙げられる。
本発明は、siRNA、shRNA、DNA、ベクター、又は核酸封入ポリマーカプセル若しくはリポソームとEPOとの組成物を包含する。この組成物において、siRNA、shRNA、DNA、ベクター、又は核酸封入ポリマーカプセル若しくはリポソームとEPOとの重量比（siRNA、shRNA、DNA、ベクター、又は核酸封入ポリマーカプセル若しくはリポソーム：EPO）は、約1: 0.1〜20が好ましく、約1: 1〜10がより好ましく、約1: 3〜6がさらにより好ましい。
【００１７】
（Ｖ）その他
本発明は、上記説明した有効成分（上記説明した本発明のsiRNA、shRNA、これらをコードするDNA、ベクター、核酸封入ポリマーカプセル若しくはリポソーム、又はEPO含有組成物）を、哺乳動物、特に人に投与する、心筋梗塞の予防、改善、又は治療方法、心筋梗塞における心筋細胞死の抑制方法、又は心筋細胞の延命方法を包含する。
投与対象は心筋梗塞患者が好ましい。
また、上記有効成分の投与量は、注射剤又は坐剤の場合、１日当たり、約10〜1000μgが好ましく、約30〜300μgがより好ましく、約50〜200μgがさらにより好ましい。
また、本発明は、上記説明した有効成分の、心筋梗塞の予防、改善、若しくは治療剤、心筋梗塞における心筋細胞死の抑制剤、又は心筋梗塞における心筋細胞の延命剤の製造のための使用を包含する。
また、本発明は、心筋梗塞の予防、改善、若しくは治療、心筋梗塞における心筋細胞死の抑制、又は心筋梗塞における心筋細胞延命のために使用される上記有効成分を包含する。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００１９】
[実施例１]
Cre-loXpシステムを用いて、心筋特異的SOCS3欠損マウスをUCSD(University of California, San Diego)において作製した。Cre-loXpシステムは、特定条件のノックアウトマウス作製システムであり、欠損させたい部分を方向性を持ったloxpで挟んでおき、酵素Creリコンビナーゼを発現させることで、loxpに挟まれた部分を切り出すことにより、当該部分を含む遺伝子をノックアウトするシステムである。
具体的には、まずSOCS3遺伝子のexon2を挟んだloxpを発現するマウスと、心筋特異的にCreを発現するマウスをそれぞれ作製して、交配させた。心筋特異的に発現するCreにより、loxpは切断されるので、loxpで挟んだSOCS3遺伝子は発現しない。SOCS3のノックアウトは、SOCS3抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。コントロールとして肝臓を用いた。その結果、心臓特異的にSOCS3がノックアウトされていることが確認できた（図1）。
マウス（BALBc、雄、体重は約20〜25g）に急性心筋梗塞を作製し、梗塞巣のサイズを、解剖により、野生型マウスと比較評価した。その結果、心筋特異的SOCS3欠損マウスにおける梗塞巣のサイズは著しく抑制されていた。
梗塞巣のサイズの測定は以下の通りである。まず、それぞれのマウスの左心室全体の面積と左心室における心筋梗塞巣の面積を測定した。次いで、心筋梗塞巣の面積／左心室全体の面積比を計算して％で値を出した。その結果、野性型では約６０％の心筋梗塞巣が認められたが、心筋特異的SOCS3欠損マウスでは約３６％の心筋梗塞巣しか認められなかった。従って、野性型マウスに比べて心筋特異的SOCS3欠損マウスでは心筋梗塞を起こし難いことが示唆された（図２）。
さらに、心筋特異的SOCS3欠損マウスの心臓では、血管新生が有意に亢進していた。これらの結果よりSOCS3が欠損した心筋細胞では、細胞死が抑制され血管新生が亢進することによって、急性心筋梗塞が予防されることが明らかになった。【００２０】
[実施例２]
野生型マウス(n=10)、及び実施例１で作製した心筋特異的SOCS3欠損マウス(n=10)を常法により飼育した。各群マウスの生存率をKaplan-Meier法を用いて算出した。生存曲線を図３に示す。また、心エコーの結果を図４に示す。
野生型マウス(n=10)は2週間以内に40％が死亡したが、心筋特異的SOCS3欠損マウス(n=10)は全てのマウスが2週間後にも生存し、心エコーによる解析において、心機能の低下が抑制されていた。【００２１】
[実施例３]
心筋特異的SOCS3ノックアウトマウスの心臓を摘出し、可溶化バッファー中にてホモジェナイズしてタンパク質を抽出した。抽出タンパク質をSDS-PAGEに供し、SOCS3、Bcl-xl、Bad、caspase3、Baxに対する各抗体を用いてウエスタンブロットにより、その発現を確認した。結果を図５に示す。コントロールとしてGAPDHを示す。
急性心筋梗塞後の心筋特異的SOCS3欠損マウスの心臓では、アポトーシス抑制蛋白であるBcl-xlの発現が亢進し、アポトーシス促進蛋白であるBadやBax、caspase3の発現が抑制されていた。【００２２】
[実施例４]
SOCS3のセンスとアンチセンスの双方を有するshRNA発現ベクターを作成し、NIH3T3細胞に安定発現させた。
具体的には、培養したNIH3T3細胞にSOCS3 shRNA発現ベクターをLipofectamine 2000を用いてトランスフェクションを行った（図６）。
この細胞にインターロイキン-6で刺激し、２４〜４８時間後細胞を回収し、可溶化バッファーを加えて遠心分離を行い、上清を回収してタンパク質を抽出した。SDS-PAGEを行い、SOCS3抗体を用いてウエスタンブロットにより発現を確認した（図７）。
上記の標的配列を持つshRNA発現ベクターによって、明らかにSOCS3タンパクの生成が抑制されることが確認された。したがって、心筋梗塞時にこのshRNA発現ベクターによってSOCS3の発現を抑制し、心筋細胞死を抑制することによって、急性心筋梗塞を予防できると考えられる。【００２３】
[実施例５]
野生型マウス(Sham)(n=12)、及び実施例１で作製した心筋特異的SOCS3欠損ノックアウトマウス（AMI）(n=12)に、EPOを1000 U/kgを1日1回、5日間にわたり皮下注射した。2週間後に両マウスを解剖して、梗塞巣のサイズを比較評価した。
心臓のAZAN染色写真を図８の上段に示す。野生型マウスの急性心筋梗塞モデルにEPOを投与した群に比べ、SOCS3欠損ノックアウトマウスにEPOを投与した群では、心筋梗塞範囲が有意に小さかった。この結果から、EPO投与にSOCS3の抑制を併用することで、心筋梗塞抑制効果が増強されたことが分かる。
また、各マウスの左心室全体の面積と左心室における心筋梗塞巣の面積を測定した。次いで、心筋梗塞巣の面積／左心室全体の面積の比を計算して％で値を出した。その結果、野性型では約60％の心筋梗塞巣が認められ、野性型にEPOを投与すると約50％の心筋梗塞巣が認められた。一方、SOCS3欠損ノックアウトマウスでは約40％の心筋梗塞巣しか認められなかった。さらに、SOCS3ノックアウトマウスにEPOを投与すると、心筋梗塞巣は約35％に減少していた。SOCS3を欠損させたマウスに、さらにEPOを投与することで心筋梗塞抑制効果が増強されたことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
SOCS3の保存領域と完全相補する21〜30塩基のアンチセンスDNAと、このアンチセンスDNAと対合できるセンスDNAとがリンカーDNAで連結されたDNAから発現するshRNA 又はsiRNAは、心筋梗塞の予防、改善、又は治療剤として好適に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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