(57)【要約】  本発明は新規なフラボノール8-水酸化酵素を提供することを目的とする。  本発明は、フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド等に関する。本発明は、例えば、配列番号1又は3の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する発現ベクター及び形質転換体、該ポリヌクレオチドを用いた黄色を呈する花を開花させる植物のスクリーニング方法、該ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより黄色の花を開花させる植物を製造する方法並びに前記形質転換体を用いたフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（e）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（a）配列番号1又は3の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2のアミノ酸配列において、1〜100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、70％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（e）配列番号1又は3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の（f）又は（g）のいずれかに記載の請求項1に記載のポリヌクレオチド：
（f）配列番号2のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（g）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号1又は3の塩基配列を含有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
【請求項９】
請求項7に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
【請求項１０】
植物である、請求項8又は9に記載の非ヒト形質転換体。
【請求項１１】
以下の工程を含む、黄色を呈する花を開花させる植物をスクリーニングする方法。
（1）被検植物からポリヌクレオチドを抽出する工程
（2）前記ポリヌクレオチドと、配列番号1又は3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程
（3）前記ハイブリダイゼーションを検出する工程
【請求項１２】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを宿主植物体又はその一部に導入する工程を含む、黄色を呈する花を開花させる植物の製造方法。 
【請求項１３】
請求項8又は9に記載の非ヒト形質転換体を培養することを特徴とする、フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質の製造方法。
【請求項１４】
請求項10に記載の植物又は該植物の一部の加工製品。
【請求項１５】
請求項6に記載のタンパク質又はフラボノール8-水酸化活性を有する前記タンパク質の断片と、フラボノールとを反応させる工程を含む、第8位が水酸化されたフラボノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クエルセタゲチン（6-ヒドロキシクエルセチン）やゴシペチン（8-ヒドロキシクエルセチン）等のフラボノールは、それぞれ、第6位及び第8位が水酸基（ヒドロキシル基）で置換されていることにより、黄色を呈する（非特許文献1）。殆ど全ての植物種がフラボノールを生成するが、このように第6位又は第8位が水酸基で置換されたフラボノールを生成する植物種は、あまり多くは知られていない。【０００３】
フラボノールが呈する黄色は、カロチノイド等の他の色素が呈する黄色と比べ、色彩に落ち着きがあり、上品な雰囲気を醸し出すことから、植物観賞者の間では重宝されている。しかしながら野生種の植物で、フラボノールを色素とした黄色の花を開花させる植物種は限定されている。【０００４】
また、フラボノールは、色素としてだけではなく、薬剤としての有用性の観点からも注目されている。例えば、フラボノールの一種であるゴシペチン（gossypetin）の第8位に糖が付加したゴシピン（gossypin：gossypetin-8-glucoside）は遊離ラジカルスカベンジングを行い，抗腫瘍及び抗発癌活性を有する物質であることが報告されている（非特許文献2)。【０００５】
フラボノールの第6位の水酸化については、いくつかの報告がなされている。Anzelotti and Ibrahimは、Chrysosplenium americanumの葉において、部分的にメチル化されたフラボノールの6位水酸化にフラボノール6-ヒドロキシラーゼが関与していることを報告している（非特許文献3）。一方、Halbwirth et alは、マンジュギクの花弁において6位水酸化に関与するフラボノール6-ヒドロキシラーゼが、シトクロムP450依存的モノオキシゲナーゼであることを報告している（非特許文献4）。さらに、Latunde-Data et alは、エリシター処理ダイズ由来のシトクロムP450依存的フラボノイド6-ヒドロキシラーゼが、6-ヒドロキシイソフラボンの生合成に特異的に関与していることを示唆している（非特許文献5）。【０００６】
一方、フラボノールの第8位の水酸化については、現時点で殆ど報告がなされておらず、Halbwirth and Stichにより、アラゲンシュンギクにおいては、クエルセチンの第8位の水酸化にフラビン酵素が関与することが報告されているに過ぎない（非特許文献6）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報第2006/126294号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Harborne  J.B., 1967. Comparative Biochemistry of the Flavonods. Academic Press, London.
【非特許文献２】Kunnumakkara A.B. et al., 2007. Blood 109, 5112-5121
【非特許文献３】Anzellotti D. and Ibrahim R.K., 2004. BMC Plant Biol. 4, 20.
【非特許文献４】Halbwirth H. et al., 2004. Plant Sci. 167, 129-135.
【非特許文献５】Latunde-Data A.O. et al., 2001. J. Biol. Chem. 276, 1688-1695.
【非特許文献６】Halbwirth H. and Stich K., 2006. Phytochemistry 67, 1080-1087.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のような状況下で、新規なフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素及びその遺伝子を単離し、その酵素又は遺伝子を用いて、フラボノールを色素とした黄色の花を開花させる新たな植物種を開発することが待たれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、マメ科植物のミヤコグサから、開花時ではなく、蕾において高レベルで発現している遺伝子群を網羅的に検索し、さらに候補遺伝子にコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列（一次構造）ではなく、推定タンパク質立体構造（二次構造）の情報からフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を補酵素として用いるタンパク質の遺伝子を検索することにより、フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素をコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下のポリヌクレオチド、タンパク質、発現ベクター、形質転換体、該ポリヌクレオチドを用いた黄色の花を開花させる植物をスクリーニングする方法、該ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより黄色の花を開花させる植物を製造する方法並びに前記形質転換体を用いたフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素の製造方法を提供する。【００１１】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
[1]     以下の（a）〜（e）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（a）配列番号1又は3の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2のアミノ酸配列において、1〜100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、70％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（e）配列番号1又は3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[2]     以下の（f）又は（g）のいずれかに記載の前記[1]に記載のポリヌクレオチド：
（f）配列番号2のアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（g）配列番号2のアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[3]     配列番号1又は3の塩基配列を含有する、前記[1]に記載のポリヌクレオチド。
[4]     配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、前記[1]に記載のポリヌクレオチド。
[5]     DNAである、前記[1]〜[4]のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
[6]     前記[1]〜[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
[7]     前記[1]〜[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
[8]     前記[1]〜[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体。
[9]     前記[7]に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
[10]    植物である、前記[8]又は[9]に記載の非ヒト形質転換体。
[11]    以下の工程を含む、黄色を呈する花を開花させる植物をスクリーニングする方法。
（1）被検植物からポリヌクレオチドを抽出する工程
（2）前記ポリヌクレオチドと、配列番号1又は3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程
（3）前記ハイブリダイゼーションを検出する工程
[12]    前記[1]〜[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドを宿主植物体又はその一部に導入する工程を含む、黄色を呈する花を開花させる植物の製造方法。 
[13]    前記[8]又は[9]に記載の非ヒト形質転換体を培養することを特徴とする、フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質の製造方法。
[14]    前記[10]に記載の植物又は該植物の一部の加工製品。
[15]    前記[6]に記載のタンパク質又はフラボノール8-水酸化活性を有する前記タンパク質の断片と、フラボノールとを反応させる工程を含む、第8位が水酸化されたフラボノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のポリヌクレオチドは、種々の宿主細胞（例えば、植物細胞）の形質転換に利用することができ、そのようにして得られる形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質の製造に利用することができる。さらに、本発明のタンパク質とフラボノールとを反応させることにより、第8位が水酸化されたフラボノールを製造することもできる。
【００１３】
また、本発明のポリヌクレオチドで植物細胞を形質転換して得られる植物体は、特に宿主として用いる植物種が野生型において黄色を呈する花を開花させることができない場合、野生型が呈することができない黄色の花を開花させることが可能であるため、観賞に値するものであり、非常に高い市場価値を有することが期待される。さらに、本発明のスクリーニング方法により、試験植物の種子のゲノムをスクリーニングし、フラボノールを色素とした黄色の花を開花させる植物種を選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】本発明のフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素のゲノム遺伝子配列を示す。
【図１Ｂ】本発明のフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素のゲノム遺伝子配列を示す。図1Aの続きである。
【図２】本発明のタンパク質とフラボノール基質（クエルセチン）とを反応させて得られた反応産物の成分をUPLC-TOF MSにより分析した結果を示す図である。
【図３】本発明のタンパク質とフラボノール基質（クエルセチン）とを反応させて得られた反応産物、ゴシペチン、クエルセタゲチン、ネガティブコントロールの質量分析ピークを比較した結果を示す図である。
【図４】本発明のタンパク質とフラボノール基質（クエルセチン）とを反応させて得られた反応産物の成分をイオントラップMS/MSにより分析した結果を示す図である。
【図５】クエルセチンの吸光ピーク（372.00 nm：図5A）が、クエルセチンの第8位が水酸基で置換されることにより別の吸光波長（384.00 nm：図5C）にシフトすることを示す図である。
【図６】本発明のタンパク質とフラバノン基質（エリオジクチオール）とを反応させて得られた反応産物の成分をUPLC-TOF MSにより分析した結果を示す図である。
【図７】本発明のタンパク質とフラバノン基質（エリオジクチオール）とを反応させて得られた反応産物の成分をイオントラップMS/MSにより分析した結果を示す図である。
【図８】エリオジクチオールの吸光ピーク（288.00 nm：図8A）が、エリオジクチオールの第8位が水酸基で置換されることにより別の吸光波長（292.00 nm：図8B）にシフトすることを示す図である。
【図９】本発明のタンパク質とフラボン基質（ルテオリン）とを反応させて得られた反応産物の成分をUPLC-TOF MSにより分析した結果を示す図である。
【図１０】本発明のタンパク質とフラボン基質（ルテオリン）とを反応させて得られた反応産物の成分をイオントラップMS/MSにより分析した結果を示す図である。
【図１１】本発明の形質転換植物において合成された8-水酸化ケンフェロールを高速液体クロマトグラフィーにより検出した結果を示す図である。
【図１２】本発明の形質転換植物において合成された8-水酸化ケンフェロールの吸光スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2010年8 月19日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2010-183875号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１６】
本発明者らは、後述の実施例において詳細に記載するように、ミヤコグサ由来のフラボノール8-水酸化酵素の遺伝子の全長cDNAのクローニングに初めて成功した。また、本発明者らは、ミヤコグサ由来のフラボノール8-水酸化酵素のゲノム遺伝子の塩基配列及び該遺伝子にコードされるフラボノール8-水酸化酵素の推定アミノ酸配列も同定した。ミヤコグサ由来のフラボノール8-水酸化酵素のCDS配列、推定アミノ酸配列及びゲノム遺伝子配列は、それぞれ配列番号1、2及び3である。これらのポリヌクレオチド及び酵素は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
【００１７】
1．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、以下の（a）〜（e）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチドを提供する。
（a）配列番号1又は3の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2のアミノ酸配列において、1〜100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2のアミノ酸配列に対して、70％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（e）配列番号1又は3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００１８】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、DNA又はRNAを意味する。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号1又は3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook ＆ Russell，  Molecular Cloning： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
【００１９】
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃又は5 x SSC、1％ SDS、50 mM Tris-HCl（pH7.5）、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0．5％SDS、50％ホルムアミド、50℃又は0.2 x SSC、0.1％ SDS、65℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２０】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling and Detection System（GE Healthcare）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1％（w/v）SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。あるいは、配列番号1又は3の塩基配列と相補的な塩基配列、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、PCRラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（DIG）ラベルした場合には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００２１】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1又は3のDNA、又は配列番号2のアミノ酸配列をコードするDNAと60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
【００２２】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、FASTA(Science 227 (4693): 1435-1441, (1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたblastn、blastx、blastp、tblastnやtblastxと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。blastnを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 100、wordlength = 12とする。また、blastpを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２３】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。
【００２４】
2．本発明のタンパク質
本発明は、次に示すタンパク質を提供する。
（i）上記（a）〜（e）のいずれかのポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（ii）配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（iii）配列番号2のアミノ酸配列における1若しくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質。
（iv）配列番号2のアミノ酸配列に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質。
【００２５】
上記（iii）又は（iv）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在する配列番号2のタンパク質の変異体であるが、例えば、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487（1982）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409（1982）"、"Gene, 34, 315 （1985）"、"Nuc.  Acids.  Res., 13, 4431（1985）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488（1985）"等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
【００２６】
本明細書中、「配列番号2のアミノ酸配列における1若しくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる、フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質」としては、配列番号2のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００２７】
また、このようなタンパク質としては、配列番号2のアミノ酸配列と70％以上、75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつフラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質が挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２８】
ここで、「フラボノール8-水酸化活性」とは、標的フラボノール分子の第8位炭素に結合した水素を水酸基（ヒドロキシル基）で置換する活性をを意味する。
【００２９】
フラボノール8-水酸化活性は、適切な宿主細胞を本発明のポリヌクレオチドで形質転換し、該形質転換体から粗酵素を回収し、該粗酵素と適切なフラボノール化合物（例えば、クエルセチン（Quercetin）等）とを反応させ、反応生成物の組成を高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra （High） Performance Liquid chromatography：UPLC) 等の公知の分析方法によって分析し、前記フラボノール化合物の水酸化物を検出することにより確認することができる。あるいは、反応前後におけるフラボノール化合物の吸光度を測定することによっても、フラボノール8-水酸化活性を測定することができる。前記宿主細胞は、特に限定されないが、天然状態ではフラボノール8-水酸化活性分子を含まない酵母又は大腸菌等の細胞が挙げられる。フラボノール8-水酸化活性の確認方法の具体例としては以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
(i)  酵母を用いた方法
被検ポリヌクレオチドを適切な酵母発現ベクター（例えば、pYES2（Invitrogen））に導入し、得られた酵母発現プラスミドを適切な酵母株（例えば、BJ2168（日本ジーン））に導入する。得られた形質転換酵母を適切な選択培地で12時間以上、好ましくは14時間以上培養し、その後に、酵母を回収する。次に、酵母を適切な発現培地で12時間以上、好ましくは24時間以上、さらに好ましくは48時間以上培養する。培養は、選択培地又は発現培地のいずれを用いる場合でも、大気圧下で25℃〜37℃、好ましくは30℃で行う。
次に、酵母細胞を回収し、細胞破砕を行う。細胞破砕は、ガラスビーズ、ホモジェナイザー又はソニケーター等を用いて行うことができる。細胞破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、被検ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の粗酵素液を調製することができる。
次に、該粗酵素液、NADPH、基質となるフラボノール、及び、好ましくは、フラビンモノヌクレオチド（FMN）又はフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）等のリボフラビンを混合して、25℃〜37℃で15分〜5時間反応させる。
得られた反応生成物を、HPLC又はガスクロマトグラフィー等により成分分析することにより、基質のフラボノールの第8位炭素に水酸基が付加されたかどうかを確認することができる。基質のフラボノールの第8位炭素に水酸基が付加されている場合には、被検ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質は、フラボノール8-水酸化活性を有するといえる。
酵母を用いたフラボノール8-水酸化活性の検出方法の詳細については、Mizutani M et al(国際公開公報WO 00/44907)の記載を参照することができる。
【００３１】
(ii)  放射性同位体標識したフラボノール基質を用いた方法
上記の「（i）酵母を用いた方法」に記載の方法と同様に、被検ポリペプチドにコードされるタンパク質の粗酵素液を調製する。
得られた粗酵素液、KH2PO4/K2HPO4溶液、放射性同位体標識したフラボノール基質（例えば、[14C]標識したクエルセチン）、FAD及びNADPHを混合して、25℃〜37℃で15分〜5時間反応させ、酢酸の添加により反応を終了させる。反応産物に更に酢酸を添加して、フェノール化合物を抽出し、有機層をセルロースプレート上で薄膜クロマトグラフィー（Thin-Layer Chromatography: TLC）分析する。該TLC分析に用いたセルロースプレートをスキャンして（TLC-リニアーアナライザー（Berthold, Wildbad, ドイツ）等を使用可）、その放射能を検出及び定量することにより、放射性同位体標識したフラボノール基質の第8位炭素に水酸基が付加されたかどうかを確認することができる。
放射性同位体標識したフラボノール基質を用いたフラボノール8-水酸化活性の検出方法の詳細については、Halbwirth H and Stich K（Photochemistry 67 (2006) 1080-1087）の記載を参照することができる。
【００３２】
(iii)  吸光度測定による方法
フラボノール化合物は、第8位が水酸基で置換されると、その吸光波長が6〜10 nm程度長波長側にシフトする性質を有する。従って、この性質を利用することにより、フラボノール8-水酸化活性を測定することも可能である。
具体的には、最初に、基質フラボノールの第8位が水酸基で置換されたフラボノール化合物の吸光波長（以下、「ポジティブコントロール吸光波長」）を測定する。
次に、上記の「（i）酵母を用いた方法」に記載の方法と同様に粗酵素液を調製して、該粗酵素の吸光波長（以下、「ネガティブコントロール吸光波長」）を測定する。
次に、前記粗酵素とフラボノール基質とを混合して反応させ、反応生成物の吸光波長を測定する。
反応生成物から、ネガティブコントロール吸光波長のピークより6〜10 nm程度長波長側にシフトした吸光波長ピーク（以下、「長波長シフト吸光ピーク」）が検出され、かつ長波長シフト吸光ピークの波長が、ポジティブコントロール吸光波長と一致すれば、反応生成物には、第8位が水酸基で置換されたフラボノール化合物が含まれるといえる。従って、この場合には、前記粗酵素は、フラボノール8-水酸化活性を有すると判断できる。
例えば、本願実施例では、基質フラボノールであるクエルセチンの吸光波長372 nmが、本発明のタンパク質との反応の後に、384 nmにシフトしていることが確認されている（図5A〜図5C）。
【００３３】
本発明において、「フラボノール」は、下記の一般式（I）により示される化合物であれば特に限定されない。
【化１】
2012023583.tif 000002
基質となるフラボノール（以下において、「基質フラボノール」）の例としては、3-ヒドロキシフラボン（3-hydroxyflavone）、アザレアチン（Azaleatin）、フィセチン（Fisetin）、ガランギン（Galangin）、ケンフェリド（Kaempferide）、ケンフェロール（Kaempferol）、イソラムネチン（Isorhamnetin）、モリン（Morin）、ミリセチン（Myricetin）、パキポドール（Pachypodol）、クエルセチン（Quercetin）、ラムナジン（Rhamnazin）及びラムネチン（Rhamnetin）等のフラボノール化合物が挙げられるが、これらに限定されない。または、第8位を水酸基で置換可能な限り、上記フラボノール化合物の誘導体、例えば、上記フラボノール化合物のグリコシド等であってもよい。また、フラボノールに類似した骨格を有するルテオリン（Luteorin)、アピゲニン（Apigenin）等のフラボン、エリオジクチオール（Eriodictiol）やナリンゲニン (Naringenin)等のフラバノン、ジヒドロクエルセチン（Dihydroquercetin）等のジヒドロフラボノールも本発明のタンパク質の基質に含まれ得る。
基質フラボノールの好ましい例としては、第8位に水酸基が結合した際に黄色を呈するフラボノール化合物が挙げられる。
このように、第8位に水酸基が結合した際にもとのフラボノールよりも黄色を呈するフラボノール化合物の具体例としては、クエルセチン、ケンフェロール、ミリセチンなどが挙げられる。例えば、基質としてクエルセチンを用いた場合、第8位が水酸基で置換されてゴシペチン（Gossypetin）が生成される。
【００３４】
また、本発明のタンパク質は、エリオジクチオール等のフラバノン及びルテオリン等のフラボンを水酸化する活性も有する（図6〜図10）。
【００３５】
さらに、本発明のタンパク質は、フラビン酵素タンパク質である。本発明において、「フラビン酵素」とは、FAD又はFMN等のリボフラビンを補酵素とする酸化還元酵素を意味する。
従って、本発明のタンパク質は、「フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質」であるが、これは、FAD又はFMN等のリボフラビンの存在下でフラボノール8-水酸化活性を示すタンパク質を意味するものである。
被検タンパク質をリボフラビン（例えば、FAD又はFMN）の存在下又は不存在下で基質フラボノールと反応させ、被検タンパク質が、リボフラビン不存在下と比べてリボフラビン存在下でより高いフラボノール8-水酸化活性を示す場合には、該被検タンパク質は、「フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質」であると判断できる。フラボノール8-水酸化活性の検出方法は、先に述べた通りである。
また、本発明のフラビン酵素は、FAD及びNAD(P)との結合を媒介するRossmann fold構造（ロスマンホールド、Rao S, Rossmann M (1973). J Mol Biol76(2): 241-56）を有するものと予測される。
【００３６】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸；C群：アスパラギン、グルタミン；D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2，4−ジアミノブタン酸、2，3−ジアミノプロピオン酸；E群：プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン；F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００３７】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced Automation Peptide Protein Technologies社製、Perkin Elmer社製、、Protein Technologies社製、PerSeptive社製、Applied Biosystems社製、SHIMADZU社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００３８】
3．本発明のベクター及びこれを導入した形質転換体
本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。
本発明のベクターは、通常、
（i）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ii）該プロモーターに結合した、上記（a）〜（e）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
（iii）RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００３９】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又は複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、trcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、trpC等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の5’側に付加したmac-1プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター等）が挙げられる。
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ura5、niaD）、薬剤耐性マーカー（hygromycine、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ、猪腰淳嗣ら, 生化学, vol. 64, p. 660, 1992；Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991）などが利用可能である。
【００４０】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、前記（a）〜（e）のいずれかのポリヌクレオチド）が導入された形質転換体を提供する。
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、植物細胞、動物細胞等が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物又は植物又は動物が挙げられる。
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000）、パーティクルデリバリー法（特開2005-287403「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978）、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983）、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。
【００４１】
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）"等を参照することができる。
【００４２】
本発明の1つの態様において、形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターを有するベクター又は外的な刺激によって誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
【００４３】
植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモーター、mac-1プロモーター等が挙げられる。
【００４４】
外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、mouse mammary tumor virus（MMTV）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
【００４５】
宿主がフラボノール合成能を有しないものである場合、該宿主内で本発明のポリヌクレオチドを発現させると同時に、フラボノール合成酵素（Flavonol Synthase:FLS）をコードする遺伝子を発現させてもよい。このように同一宿主内で複数の外来遺伝子を発現させる場合、例えば、本発明のポリヌクレオチドを1の発現ベクターに挿入し、フラボノール合成酵素の遺伝子を別の発現ベクターに挿入し、これら複数の発現ベクターのそれぞれを宿主に導入してもよく、あるいは、本発明のポリヌクレオチドとフラボノール合成酵素の遺伝子とを、同一の発現ベクターに組み込んで、この発現ベクターを宿主に導入してもよい。後者の場合のように、複数のインサートを1つの発現ベクターで発現させる場合、各インサートは、同一のプロモーターにより発現されてもよく（例えば、IRES（internal ribosome entry site）システムを使用）、あるいは、個別のプロモーターにより独立して発現されてもよい。複数のインサートを独立して発現するベクターは、例えば、Gateway（登録商標）システム（Invitrogen）を用いることにより作製することができる。
【００４６】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
【００４７】
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃法、PEG法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（1990）27〜31頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Nagel et alの方法（Micribiol. Lett., 67: 325 (1990)）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをPlant Molecular Biology Manual（Gelvin, S.B. et al., Academic Press Publishers）に記載の方法で植物細胞又は植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（pBI121又はpPZP202など）を使用することができる。
【００４８】
また、遺伝子を直接植物細胞又は植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が知られている。パーティクルガンを用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばPDS-1000（BIO-RAD社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料によって異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧力、4〜12cm程度の距離で行う。
遺伝子が導入された細胞又は植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
【００４９】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【００５０】
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、SYBR Green液などによって染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖又は無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体又はその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。従って、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、若しくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、又はこれら由来の組織も含まれる。
【００５１】
また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明に係る形質転換体植物としては、ナス科植物（例えば、ナス、トマト、トウガラシ、ジャガイモ、タバコ、チョウセンアサガオ、ホオズキ、ペチュニア、カリブラコア、ニーレンベルギア等）、マメ科植物（例えば、ダイズ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ、ミヤコグサ等）、バラ科植物（例えば、イチゴ、ウメ、サクラ、バラ、ブルーベリー、ブラックベリー、ビルベリー、カシス、ラズベリー等）、ナデシコ科植物（カーネーション、カスミソウ等）、キク科植物（キク、ガーベラ、ヒマワリ、デイジー等）、ラン科植物（ラン等）、サクラソウ科植物（シクラメン等）、リンドウ科植物（トルコギキョウ、リンドウ等）、アヤメ科植物（フリージア、アヤメ、グラジオラス等）、ゴマノハグサ科植物（キンギョソウ、トレニア等）ベンケイソウ（カランコエ）、ユリ科植物（ユリ、チューリップ等）、ヒルガオ科植物（アサガオ、モミジヒルガオ、ヨルガオ、サツマイモ、ルコウソウ、エボルブルス等）、アジサイ科植物（アジサイ、ウツギ等）、ウリ科植物（ユウガオ等）、フロウソウ科植物（ペラルゴニウム、ゼラニウム等）、モクセイ科植物（レンギョウ等）、ブドウ科植物（例えば、ブドウ等）、ツバキ科植物（ツバキ、チャノキ等）、イネ科植物（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエ、コウリャン、サトウキビ、タケ、カラスムギ、シコクビエ、モロコシ、マコモ、ハトムギ、牧草等）、クワ科植物（クワ、ホップ、コウゾ、ゴムノキ、アサ等）、アカネ科植物（コーヒーノキ、クチナシ等）、ブナ科植物（ナラ、ブナ、カシワ等）、ゴマ科植物（ゴマ等）、ミカン科植物（例えば、ダイダイ、ユズ、ウンシュウミカン、サンショウ）及びアブラナ科植物（赤キャベツ、ハボタン、ダイコン、シロナズナ、アブラナ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー等）が挙げられる。植物の好ましい例としては、現時点までに黄色を呈する花を有することが報告されていない植物、例えば、アジサイ、アサガオ、ペチュニア、ゼラニウム、ベゴニア、シクラメン、セントポーリア、インパチエンスなどが挙げられる。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物体（以下、「本発明の植物」又は「本発明の植物体」）は、フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質を多く含むため、植物体内、特に花弁又は萼内に存在するフラボノールは、第8位が水酸基で置換されることにより、黄色を呈するフラボノイド化合物へと変換される。従って、本発明の植物は、黄色を呈する花を開花させる。
形質転換に用いた宿主植物が、天然状態では黄色以外の色彩の花しか開花させない植物である場合には、これまでに存在しなかった、新たな種類の黄色花を開花させる植物が得られることになる。従って、本発明の植物は、非常に高い商品価値を有することが期待される。また、青や赤い花で8-水酸化フラボノールを蓄積することで色合いの異なる花を作ることができる。
本発明の植物は、土壌育成の状態、鉢植の状態、切り花の状態又は花のみの状態のいずれで鑑賞又は販売することも可能であり、更には、花の一部、例えば、花冠、花弁又は萼のみを鑑賞又は販売することも可能である。本発明の植物は、花だけではなく、その果実も黄色を呈することが期待される。植物観賞の場では、植物の種類によっては花だけではなく、その果実も鑑賞の対象となる。従って、本発明の植物の果実にも高い商品価値が期待される。
また、本発明の植物は、本発明の植物の種子、挿し木、球根等を育成することにより、容易に完全な植物体を得ることができる。
よって、本発明の植物には、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子、球根等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれる。
【００５３】
4．本発明の植物の加工製品
現代では、生花（例えば、土壌育成植物、鉢植植物、切り花等）のみではなく、生花の加工製品も植物観賞用の製品として販売されている。本発明の植物体は、このような生花の加工製品の材料としても非常に有用である。従って、本発明の別の実施形態として、本発明の植物（例えば、生花、切り花）又はその一部（例えば、葉、花弁、茎、根、種子、球根等）の加工製品が挙げられる。前記加工製品の例としては、押し花、ドライフラワー、プリザーブドフラワー、マテリアルフラワー、樹脂密封品等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
5．植物の製造方法
本発明のポリヌクレオチドを植物体又はその一部に導入することにより、本発明の植物を得ることができる。従って、本発明は、1つの実施態様として、本発明の植物の製造方法を提供する。
本発明の植物の製造方法は、以下の工程を含んでいてもよい。
(1)  宿主植物又はその一部に本発明のポリヌクレオチドを導入する工程
宿主植物へ本発明のポリヌクレオチドを導入する方法は、先に述べた通りである。宿主植物は、植物体全体、又はその一部である植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれであってもよい。
(2)  前記工程(1)により得られた形質転換植物を育成する工程
前記工程(1)で用いた宿主植物が、植物器官、植物組織、植物細胞、プロトプラスト、葉の切片又はカルスといった植物体の一部であった場合には、完全な植物体を形成するまで形質転換体を適切な環境で育成してもよい。植物体の一部から完全な植物体を育成する方法については、以下の文献の記載を参照できる：生物化学実験法41  植物細胞工学入門  学会出版センター  ISBN  4-7622-1899-5。
【００５５】
6．黄色を呈する花を開花させる植物をスクリーニングする方法
本発明は、黄色を呈する花を開花させる植物をスクリーニングする方法を提供する。具体的には、前記方法は、以下の(1)〜(3)の工程を含む。
（1）被検植物からポリヌクレオチドを抽出する工程
（2）前記ポリヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程
（3）前記ハイブリダイゼーションを検出する工程
【００５６】
上記工程（1）は、被検植物から、ゲノムDNA又はmRNA等のポリヌクレオチドを抽出することにより行うことができる。ゲノムDNA又はmRNA等のポリヌクレオチドを抽出する被検植物の部位は、特に限定されないが、好ましくは、種子である。mRNAを抽出した場合には、逆転写することにより、mRNA からcDNAを調製してもよい。
【００５７】
工程（2）は、上記で抽出したポリヌクレオチドに対し、本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせることにより行うことができる。ストリンジェントな条件は、既に述べたとおりである。ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドは、好ましくは、5〜500 bp、より好ましくは、10〜200 bp、さらに好ましくは、10〜100 bpの長さである。ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、AKTA oligopilot plus 10/100（GE Healthcare））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Promega社又はTakara社）等に委託することもできる。
【００５８】
工程（2）において本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして用いた場合には、工程（3）は、通常のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）、マイクロアレイ（Affymetrix社；米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照）、TaqMan PCR（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）、又はFluorescent In Situ Hybridization（FISH）（Sieben V.J. et al., (2007-06). IET Nanobiotechnology 1 (3): 27-35）等のハイブリダイゼーション検出方法により行うことができる。一方、工程（2）において本発明のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドをプライマーとして用いた場合には、工程（3）は、PCR増幅反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動又はシークエンシング（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）等によって解析することにより、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００５９】
7．本発明のタンパク質の製造方法
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体を用いる本発明のタンパク質の製造方法を提供する。
具体的には、上記形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を分離・精製することによって、本発明のタンパク質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体若しくは培養細胞、又は培養菌体若しくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のタンパク質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
具体的には、本発明のタンパク質が培養菌体内若しくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体若しくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明のタンパク質の粗抽出液を得ることができる。本発明のタンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体若しくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明のタンパク質を含む培養上清を得ることができる。
このようにして得られた抽出液若しくは培養上清中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法及び限外ろ過法等を、単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００６０】
8．第8位が水酸化されたフラボノールの製造方法
本発明のタンパク質は、フラボノールの第8位を水酸化する活性を有するので、本発明のタンパク質を用いることにより、効率的に第8位が水酸化されたフラボノールを製造することが可能である。
従って、本発明は、本発明のタンパク質又はフラボノール8-水酸化活性を有する前記タンパク質の断片と、フラボノールとを反応させる工程を含む、第8位が水酸化されたフラボノールの製造方法を提供する。
【００６１】
本方法において、本発明のタンパク質又はフラボノール8-水酸化活性を有する前記タンパク質の断片（以下、「本発明のタンパク質等」）と、フラボノールとを反応させるには、本発明のタンパク質等とフラボノールとを混合すればよい。混合した後に、混合物の組成分布を均一に保つため、混合物を（シェーカー又はローター等を用いて）穏やかに撹拌することが好ましい。本発明の方法は、本発明のタンパク質等のフラボノール8-水酸化活性が十分に得られる温度、例えば、常温（25℃前後）で行われることが好ましい。
【００６２】
第8位が水酸化されたフラボノールは、色素としてだけではなく、抗酸化活性を有する薬剤の原料としても有用である。例えば、ゴシペチンの第8位の水酸基に糖が付加されたゴシピンは、抗炎症活性及び抗腫瘍活性を有することが知られており、Nuclear Factor-κB（NF-κB）の活性化を阻害し、細胞のアポトーシスを促進することが報告されている（非特許文献2）。また、ゴシピンは、extracellular signal-regulated kinase（ERK）を活性化させて、Low Density Lipoprotein Receptor（LDLR）を上方制御することも報告されている（Lu N. et al., (2008) J. Agric. Food Chem.56 (23), 11526-11532）。従って、ゴシピンは、コレステロール代謝障害を改善することが期待される。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。【００６４】
[実施例1]
フラボノール8-水酸化酵素のcDNAのクローニング  cDNAのクローニングは、以下の手順で行った。
かずさDNA研究所のEST解析データ（Asamizu et al, PMB, 54, 405-414, 2004）を用いて、ミヤコグサの開花時の花弁および蕾で特異的に発現している遺伝子の検索を行った。singleton:2306個及びcluster:321個を選抜し、さらにこれらから蕾で強く発現しているクローンを選んだ。  これら全てのクローンのDNA配列の6種類の読み枠について、BlastXによる相同性検索を行い、モノキシゲナーゼ及びUnknown Proteinのクローンを選び出した。フラボノール8-水酸化酵素（F8H）はFAD結合領域を有することがHalbwirth and Stich, Phytochemistry 67 (2006) 1080-1087（非特許文献5）から予測された。そこで、候補DNA配列の推定アミノ酸配列についてFAD結合領域の検索を行ったが、アミノ酸配列比較のためのソフトウェア（Blast,FASTAなど）を用いてアミノ酸配列情報から検索を行うことは困難であることが判明した。そこで、アミノ酸配列ではなく、二次構造に着目して再度FAD結合領域の検索を行った。具体的には、Rossmann fold（Rao S, Rossmann M (1973). J Mol Biol 76 (2): 241-56）の特徴であるbabab 構造（ベータストランド-アルファらせん-ベータストランド-アルファらせん-ベータストランド構造）が上記の読み枠に存在するかどうかを、 検索ソフトpfamサーチ（http://pfam.sanger.ac.uk/search）により行なった。この検索により、FAD結合部位を持つと判断されたDNAクラスターKMC019440Aを同定した。このクラスターは驚くべきことに開花花弁で発現している遺伝子には見られなかった。また、このクラスターは5つのESTから構成されることが判明した。この結果に基づき、そのうちもっとも長い翻訳配列を含むクローンMFB088d08を得た。このクローンを大腸菌のグリセロールストックから培養して、プラスミドを得て、全長のシークエンスを決定した。その配列を配列番号1に示す。このクローンにコードされるcDNA配列をMFB088とする。
【００６５】
また、F8HのcDNAの塩基配列に基づき、ゲノム遺伝子配列の検索を行った。具体的には、かずさDNA研究所のミヤコグサゲノムのBACクローンライブラリー（Sato S. et al., (2008) DNA Research, pp. 1-13）からF8HのcDNAの塩基配列と配列同一性を有する遺伝子配列を有するクローンを検索した。その結果、F8Hの遺伝子は、BACクローンLjB13E21（BM2348）（88,723 bp）に含まれ、ミヤコグサゲノムでは第3染色体（82.8 cM）上に存在することが判明した。
BACクローンLjB13E21におけるF8H遺伝子のエクソン及びイントロンの位置を以下の表に示す。なお、位置は、BACクローンLjB13E21に含まれるミヤコグサゲノムの5‘末端のヌクレオチド残基を1番目の残基として、3’側に向かって順に数えた場合のヌクレオチド残基の番号として示してある。
【００６６】
【表１】
2012023583.tif 000003
【００６７】
F8H 遺伝子を含むイミヤコグサ BAC クローン LjB13E21 の塩基配列中で、F8H 遺伝子の開始コドンの上流 2,000 bp と終止コドンの下流 1,000 bp を含む領域を図1に示す。また、図1において、太字及び下線で示す配列領域は、F8H遺伝子のエクソン領域を示す。また、イミヤコグサF8H ゲノム遺伝子のエクソンIのスタートコドンからエクソンVIのストップコドンまでの塩基配列を配列番号3に示す。
【００６８】
フラボノール8-水酸化活性の測定
(1)  形質転換酵母の作製
上記でクローニングしたcDNAを以下の手順で、酵母細胞に導入し、形質転換酵母を作製した。  クローニングした cDNA の全長翻訳領域を増幅するため、該cDNAの配列に基づいて以下のプライマーを作製した：
F8H-F プライマー：5'-AAGAAAATGGAGAGAAATGAAGATGTGG-3'（配列番号4）
F8H-R プライマー：5'-CTATAGAGTCCCACAATCATAGCGGG-3'（配列番号5）
上記プライマーとKOD-Plus- (TOYOBO Co. Ltd., Japan) ならびにクローニングした cDNA を鋳型に用いて以下の条件でPCR増幅を行った。
PCR反応条件：[98℃：15 秒、60℃：15 秒、74℃：30 秒] x 15 サイクル
【００６９】
PCR増幅した cDNA 断片の両 5’末端に Target Clone (TOYOBO) を用いてアデニンを 1 塩基付加した。アデニン付加後の cDNA を酵母発現用ベクター pYES2 TOPO ベクター (Invitrogen Corporation, California, USA) のガラクトース誘導性プロモーター GAL1 の下流の TA-クローニングサイトに連結した。得られたプラスミド pYESMFB088 の連結向きおよび配列はサンガー法を用いて確認した。
【００７０】
酵母 BJ2168 株 (a; prc1-407, prb1-1122, pep4-3, leu2, trp1, ura3-52、ニッポンジーン社）をタンパク質発現宿主として用いた。酵母へのプラスミド導入には Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit (Zymo Research, California, USA) を用い、キットのマニュアルに従って酵母の形質転換処理を行った。形質転換処理をした酵母は、yeast nitrogen base without amino acids (6.7 g/l, Invitrogen Corporation)、グルコース (20 g/l)、ロイシン (30 mg/l)、トリプトファン (20 mg/l)、寒天 (20 g/l) を含む選択培地 (以下、選択寒天培地) に塗布し、30℃ で 3 日間静置培養して生育した酵母を形質転換体とした。以下の 2 種類の形質転換酵母を作成した：(1)コントロール酵母 (pYES2 を導入)、(2)F8H 発現酵母(pYESMFB088 を導入)
【００７１】
(2)  MFB088粗酵素液の調製
上記で作製した形質転換酵母を以下の条件で培養した。  選択寒天培地上に生育している形質転換酵母を、選択液体培地 (寒天を含まない選択寒天培地) 20 ml へ無菌的に植菌し、30℃ 、200 rpm の条件で 24 時間振とう培養した。振とう培養後の形質転換酵母は 3000 x g で 10 分間遠心することにより集菌した。タンパク質の発現誘導には、yeast nitrogen base without amino acids (6.7 g/l, Invitrogen)、ガラクトース (20 g/l)、ロイシン (30 mg/l)、トリプトファン (20 mg/l) を含む液体培地 (以下、誘導液体培地) を用いた。集菌した全量の形質転換酵母を誘導液体培地 100 ml に懸濁し、30℃ 、200 rpm の条件で 48 時間振とう培養を行うことでタンパク質の発現を誘導した。
酵母細胞を遠心して回収した後、ガラスビーズを用いて細胞破砕を行い、破砕物を8000 x gで10分間遠心処理した。上清を回収し、この上清を更に15000 x gで10分間遠心することにより、MFB088にコードされるタンパク質の粗酵素画分（以下MFB088粗酵素とする）を得た。【００７２】
(3)   フラボノール8-水酸化活性測定サンプルの調製
以下を含む反応液を調製した：
MFB088粗酵素液2 μl（2.5μgのタンパク質を含有）；
0.1 MのKH2PO4/K2HPO4溶液（0.4％のアスコルビン酸を含有：pH7.0）88 μl；
0.048 nmolのクエルセチン/5 μlのH2O；
0.001 nmolのFAD及び0.48 nmolのNADPH/5 μlのH2O。
NADPHの添加により反応を開始させた。30℃で15分間反応を進行させた後に、10 μlの氷酢酸を添加して反応を停止させた。さらに酢酸水溶液を添加して、フェノール化合物を2回抽出し（添加した酢酸水溶液：70μl 及び50μl）、有機層を回収し、これをサンプル（以下、「MFB088粗酵素反応産物」）として、その成分をUPLC-TOF MS及びイオントラップMS/MSにより分析した。  インサートを含まないpYES2ベクターのみを導入した酵母細胞から、上記と同様に有機層を回収し、これを成分分析のネガティブコントロールとした。
【００７３】
(4)  超高性能液体クロマトグラフ飛行時間型質量分析（UPLC-TOF MS）
MFB088粗酵素反応産物の成分をUPLC-TOF MSにより分析した。
MFB088粗酵素反応産物の分析には、飛行型質量分析計 LCT Premier (Waters Corporation, Massachusetts, USA) を備えた Waters Acquity UPLCTM システム (Waters Corporation) を使用した。ACQUITY UPLCTM BEH C18 カラム (粒子径 1.7 μm、カラムサイズ 2.1 mmI.D. x 100 mm, Waters Corporation) で、流速 0.3 ml/分、カラム温度 40℃ の条件で分析を行った。溶媒 A (0.1% ギ酸アセトニトリル) と溶媒 B (0.1% ギ酸水溶液) を用いて、0 分、70％ B; 20 分、70% A の直線的グラジエント勾配により反応産物の溶出を行った。反応産物の検出は、以下のように設定した飛行型質量分析計の陽イオン検出モードで行った：capillary voltage 2500 V, sample cone 100 V, desolvation temperature 250℃, source temperature 120℃, nitrogen gas flow 600 l/hour。
その結果、MFB088粗酵素反応産物からは、ゴシペチンに相当するピークが検出された（Retention Time: 8.51 min）。これに対し、ネガティブコントロールからは、ゴシペチンに相当するピークは検出されなかった（図2）。【００７４】
次に、MFB088粗酵素反応産物、クエルセチンの第8位が水酸基で置換された8-ヒドロキシクエルセチン（=ゴシペチン：スタンダード）、クエルセチンの第6位が水酸基で置換された6-ヒドロキシクエルセチン（=クエルセタゲチン）、ネガティブコントロールのピークを比較した（図3）。
MFB088粗酵素反応産物及び8-ヒドロキシクエルセチンでは、Retention Time: 8.51（min）にピークが認められたが、6-ヒドロキシクエルセチン及びネガティブコントロールでは、認められなかった（図3）。【００７５】
MFB088粗酵素反応産物の成分をイオントラップMS/MSにより分析した。MS/MS 分析には、イオントラップ型質量分析計 LTQ XL (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) を備えた高速液体クロマトグラフィー (High Performance Liquid Chromatography: HPLC) システム Agilent 1200 series (Agilent Technologies, California, USA) を使用した。TSKgel ODS-80TM カラム (粒子径 5 μm、カラムサイズ 4.6 mmI.D. x 150 mm, TOSOH、Japan) で、流速 0.5 ml/分、カラム温度 40℃ の条件で HPLC を行った。溶媒 A (0.1% ギ酸アセトニトリル) と溶媒 B (0.1% ギ酸水溶液) を用いて、0 分、70％ B; 30 分、85% A の直線的グラジエント勾配により反応産物の溶出を行った。反応産物のイオン化はエレクトロスプレーイオン化法で行い、以下の条件で陽イオンの検出を行った：spray voltage 4.0 kV, capillary temperature 300℃, nitrogen sheath 40 unit, auxiliary gas 15 unit。反応産物 [M+H]+ の MS/MS 分析は、以下の設定で衝突誘起解離 (CID) を行い、フラグメントピークの検出を行った：normalized collision energy 35, activation Q 0.25, activation time 30 ms。
MFB088粗酵素反応産物（図4A）と、スタンダードであるゴシペチン（図4B）とでは、得られたピークパターンが酷似していた。
UPLC-TOF MS及びイオントラップMS/MSの結果は、MFB088粗酵素により、クエルセチンは、第8位が水酸基で置換され、ゴシペチンに変換されたことを示している。【００７６】
MFB088反応産物の吸光波長を測定した。
上記イオントラップMS/MSで使用した HPLC システム Agilent 1200 series (Agilent Technologies) の photodiode array を用いて、溶出物の 200 nm から 600 nm の紫外可視光吸収の検出を行った。分析に用いたカラム、溶媒ならびに溶出条件は上記イオントラップMS/MSの条件と同様である。
図5A及び図5Bに示すように、クエルセチンが有する吸光ピークのうち、372.00 nmのピークは、ゴシペチンでは384.00 nmの吸光ピークにシフトしている。
MFB088反応産物の吸光波長を測定したところ、ゴシペチンと同様に384.00 nmの吸光ピークを有していた（図5C）。【００７７】
[実施例2]
(1)   フラバノン水酸化活性測定サンプルの調製
以下を含む反応液を調製した：
MFB088粗酵素液2 μl（2.5μgのタンパク質を含有）；
0.1 MのKH2PO4/K2HPO4溶液（0.4％のアスコルビン酸を含有：pH7.0）88 μl；
0.048 nmolのエリオジクチオール/5 μlのH2O；
0.001 nmolのFAD及び0.48 nmolのNADPH/5 μlのH2O。
NADPHの添加により反応を開始させ、実施例1と同様に反応生成物を回収し、その成分をUPLC-TOF MS及びイオントラップMS/MSにより分析した。  インサートを含まないpYES2ベクターのみを導入した酵母細胞から、上記と同様に有機層を回収し、これを成分分析のネガティブコントロールとした。
【００７８】
(2)  超高性能液体クロマトグラフ飛行時間型質量分析（UPLC-TOF MS）
MFB088粗酵素反応産物の成分を実施例1と同様にUPLC-TOF MSにより分析した。
その結果、MFB088粗酵素反応産物からは、エリオジクチオールに酸素原子が1つだけ付加された分子に相当するピークが検出された（Retention Time: 13.57 min）。これに対し、ネガティブコントロールからは、上記分子に相当するピークは検出されなかった（図6）。【００７９】
MFB088粗酵素液とエリオジクチオールとの混合物を、反応の前後において、実施例1と同様にイオントラップMS/MSにより分析した。【００８０】
次に、反応前後のMFB088粗酵素液とエリオジクチオールとの混合物のピークを比較した（図7A：反応前、図7B：反応後）。対応する分子構造のピークが、水酸基の付加によってシフトしていることが判明した。例えば、反応前に153.13（m/z）、179.13（m/z）及び271.09（m/z）にピークを示した分子構造は、水酸基が付加することにより、それぞれピークが169.10（m/z）、195.10（m/z）及び287.12（m/z）へとシフトしている。本酵素はフラバノンであるエリオジクチオールを水酸化する活性を有していることが分かった。
UPLC-TOF MS及びイオントラップMS/MSの結果は、MFB088粗酵素により、エリオジクチオールが水酸基で置換されたことを示している。【００８１】
次に、実施例1と同様に、MFB088粗酵素反応産物の吸光波長を測定した。
図8A及び図8Bに示すように、エリオジクチオールが有する吸光ピークのうち、288.00 nmのピークは、反応後では292.00 nmの吸光ピークにシフトしている。【００８２】
[実施例3]
(1)   フラボン水酸化活性測定サンプルの調製
以下を含む反応液を調製した：
MFB088粗酵素液2 μl（2.5μgのタンパク質を含有）；
0.1 MのKH2PO4/K2HPO4溶液（0.4％のアスコルビン酸を含有：pH7.0）88 μl；
0.048 nmolのルテオリン/5 μlのH2O；
0.001 nmolのFAD及び0.48 nmolのNADPH/5 μlのH2O。
NADPHの添加により反応を開始させ、実施例1と同様に反応生成物を回収し、その成分をUPLC-TOF MS及びイオントラップMS/MSにより分析した。  インサートを含まないpYES2ベクターのみを導入した酵母細胞から、上記と同様に有機層を回収し、これを成分分析のネガティブコントロールとした。
【００８３】
(2)  超高性能液体クロマトグラフ飛行時間型質量分析（UPLC-TOF MS）
MFB088粗酵素反応産物の成分を実施例1と同様にUPLC-TOF MSにより分析した。
その結果、MFB088粗酵素反応産物からは、ルテオリンに酸素原子が1つだけ付加された分子に相当するピークが検出された（Retention Time: 13.85 min）。これに対し、ネガティブコントロールからは、上記分子に相当するピークは検出されなかった（図9）。【００８４】
MFB088粗酵素液とルテオリンとの混合物を、反応の前後において、実施例1と同様にイオントラップMS/MSにより分析した。【００８５】
次に、反応前後のMFB088粗酵素液とルテオリンとの混合物のピークを比較した（図10A：反応前、図10B：反応後）。対応する分子構造のピークが、水酸基の付加によってシフトしていることが判明した。例えば、反応前に153.12（m/z）にピークを示した分子構造は、水酸基が付加することにより、ピークが169.08（m/z）へとシフトしている。
UPLC-TOF MS及びイオントラップMS/MSの結果は、MFB088粗酵素により、ルテオリンに水酸基が付加されたことを示している。【００８６】
[実施例4]  ケンフェロール及びアピゲニンを基質とした場合の反応性について解析した。、上述の実施例と同様にして反応生成物を回収し、その成分をUPLC-TOF MSにより分析した。その結果、ケンフェロールの8位に水酸基が付加した化合物、及びアピゲニンに水酸基が付加した化合物が観察された。
また、ナリンゲニン及びジヒドロケルセチンを基質として同様の実験を行った場合には、両基質において、2箇所に水酸基が付加した化合物が検出された。
【００８７】
以上の実施例1〜4の結果から、本発明のポリヌクレオチドは、フラボノール8-水酸化活性を有するフラビン酵素タンパク質をコードするものであることが確認された。また、本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質は、クエルセチンやケンフェロールをはじめとするフラボノールの8位を水酸化する活性を有することが確認された。本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質は、また、エリオジクチオールやナリンゲニンをはじめとするフラバノン、ルテオリンやアピゲニンをはじめとするフラボン、ジヒドロケルセチンをはじめとするジヒドロフラボノールを水酸化する活性を有することが確認された。酵素の位置特異性を考慮すれば、これらフラバノン、フラボン、ジヒドロフラボノールについても、フラボノールを基質とした場合同様に、8位が水酸化されたものと考えられる。
さらに、本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質は、ナリンゲニン及びジヒドロケルセチンを基質として用いた場合、2箇所に水酸基を付加することが確認された。このことから、当該タンパク質は、ナリンゲニンやジヒドロケルセチンの8位の水酸化に加え、さらに別の位置も水酸化する活性を有すると考えられる。【００８８】
[実施例5]植物で発現させるベクターの構築及び形質転換植物の作製
ベクターの構築には、制限酵素およびGateway System（Invitrogen社）を用いた。Gateway Systemは、Invitrogen社が提供しているプロトコールに沿って使用した。
5'側にattL1配列（Invitrogen社）を付加したEl235Sプロモーター(WO2005/017147に記載)と3’側にattR5配列（Invitrogen社）を付加したマノピンシンターゼターミネーターの間にマルチクローニングサイトを持ち、pDONR207（Invitrogen社）をバックボーンとして持つプラスミドをpSPB3868 とした。このマルチクローニングサイトに、実施例１で得られたF8H cDNA（MFB088：配列番号１）を正の方向に挿入したプラスミドをpSPB5205とした。
【００８９】
El235Sプロモーターとマノピンシンターゼターミネーターの間にマルチクローニングサイトを持ち、pUCAP(WO2005/017147に記載)をバックボーンとして持つプラスミドをpSPB3647 とした。バラ由来のフラボノール合成酵素（FLS）cDNA（配列番号6）を含むDNA断片をpSPB3647のマルチクローニングサイトに正方向に挿入したプラスミドをpSPB5207とした。
バラ由来フラボノール合成酵素遺伝子の配列はDNAデータベースGenBankのアクセション番号AB038247に記載されている。バラ由来フラボノール合成酵素遺伝子の取得に関しては、Tanaka Y, Fukuchi-Mizutani M, Mason JG (2003) Cloned genes. In: Roberts AV (ed) Rose Encyclopedia. Elsevier, Amsterdam, pp 341-347  に記載されている。
5'側にattL5配列を付加したEl235Sプロモーターと3’側にattL2配列を付加したマノピンシンターゼターミネーターの間にマルチクローニングサイトを持ち、pDONR207をバックボーンとして持つプラスミドをpSPB3869 とした。pSPB5207をAscIとPacIで消化して得られるEl235Sプロモーターとバラ由来フラボノール合成酵素cDNAとマノピンシンターゼターミネーターとを含むDNA断片を、AscIとPacIで消化したpSPB3869と連結し、pSPB5208を得た。
【００９０】
Gateway cassette A （attR1配列とattR2配列を含む、Invitrogen社)をpUC19のSmaI部位に挿入し、pSPB3840を得た。このプラスミドをHindIIIをSacIで消化して得られるGateway cassette A を含むDNA断片を、HindIIIをSacIで消化したpBinPLUS(WO2005/017147に記載)に挿入し、pSPB3862とした。
pSPB5205、pSPB5208、pSPB3862を用いてGateway LR反応を行い、F8H cDNAとバラFLScDNAを植物細胞内で構成的に発現させるためのプラスミドpSPB5213を得た。pSPB5213を導入したアグロバクテリウムをPetunia hybrida系統Skr4xSw63（WO93/01290に記載）の葉片に感染させることにより形質転換ペチュニアを作製した。ペチュニアの形質転換方法については国際公開公報WO93/01290に記載されている。
【００９１】
得られたペチュニアの花弁のフラボノールを国際公開公報WO2008/156211に記載の方法で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。この条件では、ケンフェロールは約10.8分に溶出される。遺伝子組換えペチュニア花弁にはホスト花弁には見られない約9.2分の位置にピークが観察された(図11参照)。このピークの吸収スペクトルを測定したところ、328nmと381nmに吸収極大が観察された(図12参照)。ケンフェロールの吸収極大値はXとYで、新しいピークに見られる381nmの吸収極大は、上述の8-水酸化ケルセチンと同様、ケンフェロールの8位が水酸化されたため生じたと考えられた。
【００９２】
この吸収極大の長波長シフトは、ケンフェロールが、より黄色を呈する（人の目にとって）化合物に変化したことを示している。このことから、得られたF8H遺伝子が異種の植物でも活性を維持して機能し、8-水酸化フラボノールを生じさせることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明のポリヌクレオチドを植物体に導入すれば、植物体内、特に花弁、萼、果実内のフラボノール化合物の第8位が水酸基で置換されて黄色発光フラボノールに変換され、その結果、黄色を呈する花を開花させる植物体を得ることができる。特定の種類の植物は、天然状態では黄色を呈する花を開花させることができないため、本発明のポリヌクレオチドは、天然状態では存在し得ない、新たな色彩の花を開花させる植物等の製造に非常に有用である。また、本発明のポリヌクレオチドを用いて作製した植物は、天然状態では存在し得ない、新たな色彩の花を開花させるので、観賞に値するものであり、高い市場価値を有することが期待される。さらに、本発明のポリヌクレオチドを用いることにより、第8位が水酸化されたフラボノール、及び水酸化されたフラバノンやフラボンを製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号4：合成DNA
配列番号5：合成DNA
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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