(57)【要約】  ポジショナルクローニングの手法により、オオムギの開花性／閉花性を支配する新規な遺伝子を同定することに成功すると伴に、オオムギの開花性／閉花性の発症の機構を解明することに成功した。また、同定した遺伝子を利用することにより、特異的かつ効率的に、植物の開花性／閉花性の判定や植物への閉花性の形質の付与を行うことが可能であることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：10の塩基配列からなるマイクロRNAによる切断を受けず、かつ、植物に閉花性を付与する、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：1、2、4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｂ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列のコード領域において１もしくは複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA
【請求項２】
配列番号：11に記載の塩基配列と比較して1若しくは数個の塩基が置換されている塩基配列からなる、マイクロRNA標的部位を有する、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
マイクロRNA標的部位の塩基の置換が、コードするアミノ酸の変化を伴わない、請求項２に記載のDNA。
【請求項４】
マイクロRNA標的部位の塩基の置換が、配列番号：11に記載の塩基配列における2位の「a」、8位の「a」、および14位の「a」からなる群より選択される少なくとも１つの塩基の置換である、請求項２に記載のDNA。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載のDNAが導入された植物細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞を含む植物体。
【請求項８】
請求項７に記載の植物体の子孫またはクローンである植物体。
【請求項９】
請求項７または８に記載の植物体の繁殖材料。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかに記載のDNAを植物に導入する工程を含む、閉花性の形質を有する植物の作出方法。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれかに記載のDNA、または該DNAが挿入されたベクターを含む、植物に閉花性の形質を付与するための薬剤。
【請求項１２】
植物における開花性／閉花性を判定する方法であって、被検植物における下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAの塩基配列を解析し、対照の塩基配列と比較する方法。
（ａ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｂ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列のコード領域において１もしくは複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA
【請求項１３】
植物における開花性／閉花性を判定する方法であって、被検植物における請求項１から４のいずれかにに記載のDNAの転写産物における、配列番号：10に記載の塩基配列からなるマイクロRNAによる切断を検出する方法。
【請求項１４】
閉花性の植物を育種する方法であって、
（ａ）閉花性の植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における開花性／閉花性を、請求項１２または１３に記載の方法により判定する工程、および
（ｃ）閉花性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の開花性／閉花性を支配する遺伝子、並びに、それを利用した植物の開花性／閉花性の判定および閉花性植物の作出に関する。
【背景技術】
【０００２】
イネ、コムギ、オオムギなどの世界の重要穀物はいずれもその種子（胚および胚乳）を食用とする作物であり、いずれも同一の花に雄蘂、雌蘂を生じ、それが自家受粉することにより種子を生成する自家受粉性作物である。これらの作物の花は、一般的に受粉時に開花し、葯が外部に飛び出すのが一般的であるが（開花性）、花の内部で自家受粉が可能であるため、結実のためには開花を必ずしも要せず、環境条件によっては開花せず受粉する閉花受粉となることが知られている（閉花性）（非特許文献１）。一方、オオムギには古くから遺伝的に開花せず、閉花受粉する品種があることが知られている（非特許文献２）。【０００３】
近年、オオムギのこの閉花性は、オオムギの赤かび病の抵抗性向上に有効な遺伝子であることが示されてきており、オオムギの赤かび病の感染防止に閉花性の導入はきわめて有効な手段であることが明らかとなってきた（非特許文献３）。赤かび病は麦類における最も重要な病害であり、その抵抗性の強化が求められているため、閉花性の導入はオオムギの高品質化のために不可欠である。【０００４】
従来、作物の育種は、目標形質を有する栽培品種や野生種等を交配し、多数の個体を実際に栽培して目標形質を有する個体を選抜し、当該目標形質を遺伝的に固定化しなければならず、広大な圃場や多大な人力、相当の年月が必要であった。例えば、開花性／閉花性を目標形質とした場合には、選抜対象集団を栽培し、開花時に各個体が開花性であるか閉花性であるかを調査することにより、選抜すべき個体を特定しなければならなかった。【０００５】
そこで、近年は、育種期間の短縮、労働力および圃場面積の縮減を図るため、遺伝マーカーを指標とした選抜による育種法が用いられるようになってきた。このような遺伝マーカーによる育種では、マーカーの遺伝子型により目標形質の有無の推定が容易となるため、種子や幼苗段階で選抜が可能となる。オオムギにおいても、マーカーを利用した閉花性品種の育種が提案されている（特許文献１、２）
しかしながら、マーカーを利用した閉花性品種の育種では、目的の形質を支配する遺伝子そのものを標的とした育種と比較して、その特異性（精度）が劣るため、より効率的な育種を行うためには、開花性／閉花性の形質を支配する遺伝子を同定する必要がある。【０００６】
このため、長年に渡りオオムギの閉花受粉性を支配する遺伝子の同定が試みられてきたが、オオムギのゲノム解析情報が不十分であることなどから、いまだ、この遺伝子の同定に至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１８０５７０号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９８５４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】星川清親、「イネの生長」、農山漁村文化協会、1975年、p249-252
【非特許文献２】Briggs  D.  E.、「Barley」、Chapman  and  Hall,  London,  ISBN:041211870X、1978年、p.45
【非特許文献３】吉田めぐみ、河田尚之、塔野岡卓司、育種学研究4(別2)、p.303  (2002)（日本育種学会第102回講演会要旨集；日本育種学会）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、オオムギなどの植物における開花性／閉花性を支配する新規な遺伝子を同定し、開花性／閉花性の発症の機構を解明することにある。また、本発明は、解明された開花性／閉花性の発症の機構に基づき、植物の開花性／閉花性を効率的に判定する方法を提供することを目的とする。さらなる本発明の目的は、解明された開花性／閉花性の発症の機構に基づき、閉花受粉性の形質を有する植物を効率的に作出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、ポジショナルクローニングの手法により、オオムギの開花性／閉花性を支配する遺伝子の同定を試みた。ここで、オオムギにおいては全ゲノム塩基配列が決定されておらず、既知のオオムギのゲノム情報のみから、目的の遺伝子の同定を行うことは、極めて困難な状況であった。そこで、本発明者らは、まず、独自の手法により、目的遺伝子の存在が示唆されているオオムギの2H染色体（特許文献１）とイネの第四染色体との間で、比較遺伝子地図を構築した（図１）。次いで、この遺伝子地図上のマーカーを利用して、開花性オオムギ品種「アズマムギ」と閉花性オオムギ品種「関東中生ゴール」の大規模な分離F2集団の解析を行い、閉花性遺伝子cly1が存在すると考えられる候補領域を約0.7cMの領域に絞り込んだ（図２、図３Ａ）。この約0.7cMのゲノム領域は、イネの90kbのゲノム領域に相当していた（図２、図３Ａ）。本発明者らは、このイネのゲノム領域内に11の遺伝子を見出し、その中で、AP2ドメインを二つ持つ転写因子をコードする遺伝子が、オオムギの開花性遺伝子Cly1に対応する遺伝子であると推定した。【００１１】
データーベースから、イネのAP2遺伝子に対応するオオムギ遺伝子を部分的にコードするEST塩基配列を抽出し、その配列情報を基に作成したマーカーを使用して、開花性品種MorexのBACライブラリーをスクリーニングした。選抜したBACクローンの塩基配列を決定し、その情報から新たなマーカーを作製し、このマーカーを利用して大規模な分離F2集団の解析を行ったところ、cly1が存在すると考えられる候補領域を約7kbの領域に絞り込むことができた（図３Ａ）。この7kbの領域には、AP2遺伝子以外の遺伝子が存在しないことから、cly1がAP2をコードすることが裏付けられた。【００１２】
各オオムギ品種におけるAP2遺伝子の塩基配列を比較した結果、オオムギの開花性／閉花性と相関する唯一の一塩基多型がAP2遺伝子のマイクロRNA（miR172）標的部位に見出された（図３Ｂ）。このため、この一塩基多型がmiR172とAP2遺伝子のmRNAとの親和性に差を生じさせているものと考えられた。また、開花性型のAP2遺伝子（Cly1）のmRNAは、マイクロRNAの標的部位で切断を受けるのに対し、閉花性型のAP2遺伝子（cly1）のmRNAでは切断を受けなかった（図５Ｄ、Ｅ）。これら事実から、AP2遺伝子のmRNAの切断の有無が、オオムギの開花性／閉花性の表現型の違いを決定していることが判明した。miR172の標的部位の塩基配列は、オオムギ以外の開花性の植物でも高度に保存されており、miR172により切断を受ける塩基配列を有していたことから（図６）、本発明者らは、オオムギを含む植物におけるAP2遺伝子の塩基配列を解析することにより、植物の開花受粉性および閉花受粉性を判定することが可能であることを見出した。さらに、本発明者らは、閉花性型のAP2遺伝子（cly1）を利用することにより、オオムギを含む植物において、閉花性の形質を付与することが可能であることを見出した。【００１３】
従って、本発明は、植物の開花性／閉花性を支配する遺伝子、並びに、それを利用した植物の開花性／閉花性の判定および閉花性植物の作製に関し、より詳しくは、下記を提供するものである。
（１）  配列番号：10の塩基配列からなるマイクロRNAによる切断を受けず、かつ、植物に閉花性を付与する、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：1、2、4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｂ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列のコード領域において１もしくは複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA
（２）  配列番号：11に記載の塩基配列と比較して1若しくは数個の塩基が置換されている塩基配列からなる、マイクロRNA標的部位を有する、（１）に記載のDNA。
（３）  マイクロRNA標的部位の塩基の置換が、コードするアミノ酸の変化を伴わない、（２）に記載のDNA。
（４）  マイクロRNA標的部位の塩基の置換が、配列番号：11に記載の塩基配列における2位の「a」、8位の「a」、および14位の「a」からなる群より選択される少なくとも１つの塩基の置換である、（２）に記載のDNA。
（５）  （１）から（４）のいずれかに記載のDNAを含むベクター。
（６）  （１）から（４）のいずれかに記載のDNAが導入された植物細胞。
（７）  （６）に記載の細胞を含む植物体。
（８）  （７）に記載の植物体の子孫またはクローンである植物体。
（９）  （７）または（８）に記載の植物体の繁殖材料。
（１０）  （１）から（４）のいずれかに記載のDNAを植物に導入する工程を含む、閉花性の形質を有する植物の作出方法。
（１１）  （１）から（４）のいずれかに記載のDNA、または該DNAが挿入されたベクターを含む、植物に閉花性の形質を付与するための薬剤。
（１２）  植物における開花性／閉花性を判定する方法であって、被検植物における下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAの塩基配列を解析し、対照の塩基配列と比較する方法。
（ａ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｂ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列のコード領域において１もしくは複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA
（１３）  植物における開花性／閉花性を判定する方法であって、被検植物における（１）から（４）のいずれかにに記載のDNAの転写産物における、配列番号：10に記載の塩基配列からなるマイクロRNAによる切断を検出する方法。
（１４）  閉花性の植物を育種する方法であって、
（ａ）閉花性の植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における開花性／閉花性を、（１２）または（１３）に記載の方法により判定する工程、および
（ｃ）閉花性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。【００１４】
なお、本発明において「開花性」とは、開花の際に葯が頴花から飛び出す表現型を意味し、「閉花性」とは、開花の際に葯が頴花から飛び出さない表現型を意味する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によって、植物の開花性／閉花性を支配する新規な遺伝子Cly1/cly1が同定され、該遺伝子の染色体上の位置および構造、ならびに開花性／閉花性の発症の機構が解明された。これによりCly1/cly1遺伝子を標的とした植物の開花性／閉花性の判定方法、および該判定方法を利用した閉花性植物の育種方法が提供された。さらに、cly1遺伝子を利用した、閉花性の植物品種の作出方法が提供された。本発明による植物の開花性／閉花性の判定や閉花性の植物品種の作出や育種は、開花性／閉花性を支配するCly1/cly1遺伝子に着目しているため、この遺伝子と連鎖するマーカーを利用した従来法に比して、精度が高い。このため従来法よりも、特異的かつ効率的に、植物の開花性／閉花性の判定や閉花性の植物品種の作出や育種を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Cly1/cly1遺伝子の比較地図を示す。
【図２】Cly1/cly1遺伝子の高精度地図を示す。
【図３】Cly1/cly1遺伝子のポジショナルクローニングを示す図である。Ａは、アズマムギ（AZ）×関東中生ゴール（KNG）のF2集団から構築した遺伝子地図である。Ｂは、miR712標的部位のアレルの配列比較を示す。
【図４】シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギに由来するAP2ホモログの系統発生を示す図である。
【図５】Cly1/cly1遺伝子の発現を示す図である。Ａは、miR172標的部位を持つエクソン10を含む遺伝子の3'末端を示す。Ｂは、アズマムギ（AZ）における芒原基形成段階の未成熟な穂における遺伝子発現を示す写真である。Ｃは、一連の発達段階を通じた、未成熟な穂のにおける遺伝子発現を示す電気泳動写真である。Ｄは、改変5'RACEにより切断された転写産物を検出した結果を示す電気泳動写真である。Ｅは、miR172による切断部位を示す。
【図６】草種におけるCly1/cly1ホモログのmiR172標的部位を示す図である。
【図７】オオムギにおけるCly1/cly1遺伝子配列の系統発生解析を示す図である。
【図８】オオムギにおけるCly1/cly1遺伝子配列の多型部位を示す図である。
【図９】開花性オオムギおよび閉花性オオムギにおける鱗皮を示す写真である。Ａは、雄蕊(st)の基部に位置する鱗皮（lo）が、外花穎（le）と内花穎（pa）を押し広げることにより穂が開いている形態を示す写真である。Ｂは、開花時の開花性オオムギの穂状花序を示す。Ｃは、開花時の閉花性オオムギの穂状花序を示す。Ｄは、開花性オオムギの鱗皮を示す。Ｅは、閉花性オオムギの鱗皮を示す。Ｆは、開花性オオムギの穂の断面を示す。Ｇは、閉花性オオムギの穂の断面を示す。心皮(cp)は他の花器官に囲まれている。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、植物に閉花性の形質を付与するをコードするDNA（以下、「閉花性型DNA」と称する）を提供する。本発明のcly1  DNAは、miR172（配列番号：10に記載の塩基配列からなるマイクロRNA）による切断を受けず、植物において発現した場合、植物に閉花性の形質を付与する。
【００１８】
本発明者らにより同定された、閉花性オオムギ品種「関東中生ゴール」由来のcly1  cDNAの塩基配列を配列番号：1に、cly1  ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：2に、これらDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：3に示す。また、本発明者らにより同定された、閉花性オオムギ品種「SV230」由来のcly1  cDNAの塩基配列を配列番号：4に、cly1  ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：5に、これらDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：6に示す。一方、本発明者らにより同定された、開花性オオムギ品種「アズマムギ」由来のCly1  cDNAの塩基配列を配列番号：7に、Cly1  ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：8に、これらDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：9に示す。
【００１９】
本発明の閉花性型DNAの1つの態様は、配列番号：1または2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA）であり、他の1つの態様は、配列番号：4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA）である。また、本発明の閉花性型DNAには、miR172により切断を受けない転写産物をコードし、植物に閉花性の形質を付与する限り、配列番号：3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA（コドンの縮重に基づく各種DNA）および配列番号：6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA（コドンの縮重に基づく各種DNA）が含まれる。
【００２０】
本実施例において示されたように、開花性オオムギ品種「アズマムギ」由来のcly1遺伝子の塩基配列と閉花性オオムギ品種「関東中生ゴール」由来のcly1遺伝子の塩基配列とを比較すると、miR172標的部位において1カ所の塩基が異なる（図３Ｂ）。また、開花性オオムギ品種「アズマムギ」由来のCly1遺伝子の塩基配列と閉花性オオムギ品種「SV230」由来のcly1遺伝子の塩基配列とを比較すると、miR172標的部位において2カ所の塩基が異なる（図３Ｂ）。miR172標的部位が「アズマムギ」と同一の塩基配列である他のオオムギ品種は開花性の形質を示し、「関東中生ゴール」あるいは「SV230」と同一の塩基配列である他のオオムギ品種は閉花性の形質を示すため、miR172標的部位における塩基の相違が、転写産物（mRNA）におけるmiR172による切断に影響を与え、オオムギの開花性／閉花性を決定していると考えられる。実際、「関東中生ゴール」のcly1遺伝子の転写産物では、「アズマムギ」のCly1遺伝子の転写産物と比較して、miR172による切断が抑制されている（図５Ｄ、Ｅ）。
【００２１】
現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の開花性オオムギ品種（例えば、アズマムギ）のCly1  DNAの塩基配列において、その転写産物におけるmiR172による切断が抑制されるような改変を行うことが可能である。また、特定の閉花性オオムギ品種（例えば、関東中生ゴール、SV230）のcly1  DNAの塩基配列において、その転写産物におけるmiR172による切断の抑制が維持される限りにおいて、種々の改変を行うことが可能である。また、自然界においても、塩基配列が変異することは起こり得ることである。従って、本発明は、miR172による切断をが抑制されており、かつ、植物に閉花性の形質を付与する限り、アズマムギ、関東中生ゴール、あるいはSV230におけるCly1/cly1遺伝子の塩基配列（配列番号：1、2、4、5、7または8）のコード領域において１もしくは複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列を含むDNAをも含むものである。ここで「複数」とは、遺伝子におけるコード領域の塩基配列全体においては、通常、50塩基以内、好ましくは30塩基以内、さらに好ましくは10塩基以内、数個の塩基以内（例えば、5塩基以内、3塩基以内、2塩基以内、1塩基）である。
【００２２】
本発明の閉花性型DNAは、好ましくは、配列番号：11に記載の塩基配列（miR172により切断を受ける標的配列）と比較して1若しくは数個の塩基が置換されている塩基配列からなる、miR172標的部位を有するものである。ここで「数個の塩基」とは、miR172による切断が抑制される範囲における数であり、通常、数塩基以内（例えば、5塩基以内、3塩基以内、2塩基以内、1塩基）である。miR172標的部位における塩基の置換は、好ましくは、コードするアミノ酸の変化を伴わないものである。このような塩基の置換としては、例えば、配列番号：11に記載の塩基配列における2位の「a」、8位の「a」、および14位の「a」からなる群より選択される少なくとも１つの塩基の置換である。例えば、MG、GP、SV002、SV235、SV241、SV242、SV237、SV235のcly1遺伝子におけるmiR172標的部位の塩基配列は、関東中生ゴールと同様に、配列番号：11に記載の塩基配列における8位の「a」が「g」に置換された塩基配列である（図３Ｂ）。また、例えば、SV223、SV253、SV255のcly1遺伝子におけるmiR172標的部位の塩基配列は、SV230と同様に、配列番号：11に記載の塩基配列における2位と14位の「a」が双方とも「c」に置換された塩基配列である（図３Ｂ）。本発明には、これら品種由来のcly1  DNAが含まれる。
【００２３】
さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定のオオムギ品種（例えば、アズマムギ、関東中生ゴール、SV230）からCly1／cly1遺伝子が得られた場合、その遺伝子の塩基配列情報を利用して、他の植物から、開花性／閉花性を支配する相同遺伝子をコードするDNA（以下、「相同DNA」と称する）を取得することが可能である。さらに、取得した相同DNAの塩基配列を改変して、植物に閉花性の形質を付与するDNAを調製することも可能である。このような相同DNAを取得するための植物としては、例えば、オオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバク、イネ、トウモロコシ、シロイヌナズナなどの草種が挙げられる。好ましくは、オオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバク、イネ、トウモロコシなどのイネ科植物であり、より好ましくは、オムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバクなどの麦類であり、最も好ましくはオオムギである。取得された相同DNAは、通常、特定のオオムギ品種（例えば、アズマムギ、関東中生ゴール、SV230）のCly1／cly1遺伝子をコードするDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズしうる。従って、本発明は、miR172による切断が抑制され、かつ、植物に閉花性の形質を付与する限り、アズマムギ、関東中生ゴール、あるいはSV230におけるCly1／cly1  DNA（配列番号：1、2、4、5、7または8）とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAをも含むものである。
【００２４】
本発明における変異DNAや相同DNAが、miR172による切断を受けるか否かは、例えば、本実施例に記載のRNAリガーゼ介在5'RACE法により、判定することができる（実施例5(2)を参照のこと）。また、植物に閉花性を付与するか否かは、例えば、当該DNAで、開花性品種のcly1遺伝子を組換え、当該DNAをホモで保持する植物を作出し、作出した植物に閉花性の形質が付与されているか否かを検定することにより、判定することができる。植物の開花性／閉花性は、開花の際に葯が頴花から飛び出すか否かを目視調査することにより判定することができる。即ち、開花の際に葯が頴花から飛び出していれば開花性と判定でき、開花の際に葯が頴花から飛び出していなければ閉花性と判定できる。このような開花性／閉花性の相違は、鱗皮の大きさの違いに基づくため、開花性／閉花性は、開花の際の鱗皮の大きさを計測することにより判定することもできる。即ち、開花の際に鱗皮が大きく膨潤していれば開花性と判断でき、開花の際に鱗皮の小さいままであれば閉花性と判断できる（図９）。
【００２５】
本発明の閉花性型DNAは、その導入により、植物に閉花性の形質を付与することが可能であるという意味において、植物に閉花性の形質を付与するための薬剤である。
【００２６】
なお、上記した変異DNAを作製するための、DNAへの人為的な変異の導入は、例えば、部位特異的変異誘発（site-directed  mutagenesis）法（Kramer,  W.  ＆  Fritz,  HJ.,  Methods  Enzymol,  1987,  154,  350.）により行うことができる。
【００２７】
また、上記した相同DNAを単離するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Southern,  E.  M.,  J.  Mol.  Biol.,  98:  503,  1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki,  R.  K.,  et  al.  Science,  230:  1350-1354,  1985、Saiki,  R.  K.  et  al.  Science,  239：  487-491,  1988）が挙げられる。相同DNAを単離するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M  尿素、0.4%  SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M  尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。単離されたDNAは、核酸レベルあるいはアミノ酸配列レベルにおいて、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul  et  al.  J.  Mol.  Biol.,  215:  403-410,  1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  87:2264-2268,  1990,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  90:  5873-5877,  1993)に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=50、wordlength=3とする。また、Gapped  BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic  Acids  Res.  25:  3389-3402,  1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped  BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００２８】
本発明の閉花性型DNAとしては、その形態に特に制限はなく、cDNAの他、ゲノムDNA、および化学合成DNAが含まれる。これらDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、植物からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、Cly1／cly1遺伝子（例えば、配列番号：1,2,4,5,7または8のいずれかに記載のDNA）の塩基配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、Cly1／cly1遺伝子に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、植物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。また、市販のDNA合成機を用いれば、目的のDNAを合成により調製することも可能である。
【００２９】
＜ベクター、形質転換ソルガム細胞、形質転換ソルガム植物体＞
本発明は、また、上記本発明の閉花性型DNAを含むベクター、上記本発明の閉花性型DNAまたはそれを含むベクターが導入された植物細胞、該植物細胞を含む植物体、該植物体の子孫またはクローンである植物体、および、これら植物体の繁殖材料を提供する。
【００３０】
本発明のベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。本発明のベクターは、本発明のDNAを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネのlip19遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるイネのhsp80遺伝子とhsp72遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのrab16遺伝子のプロモーター、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、rab16は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００３１】
また、本発明は、本発明のベクターが導入された植物細胞を提供する。植物細胞の由来する植物としては特に制限はなく、例えば、オオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバク、イネ、トウモロコシ、シロイヌナズナなどの草種が挙げられる。好ましくは、オオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバク、イネ、トウモロコシなどのイネ科植物であり、より好ましくは、オムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバクなどの麦類であり、最も好ましくはオオムギである。本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉などが含まれる。植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００３２】
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、オオムギに関する形質転換植物体を作出する手法としては、Tingayら（Tingay  S.  et  al.  Plant  J.  11:  1369-1376,  1997）、Murrayら（Murray  F  et  al.  Plant  Cell  Report  22:  397-402,  2004）、およびTravallaら（Travalla  S  et  al.  Plant  Cell  Report  23:  780-789,  2005）に記載された方法を挙げることができる。また、イネにおいて、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Datta,  S.  K.  In  Gene  Transfer  To  Plants(Potrykus  I  and  Spangenberg  Eds.)  pp66-74,  1995）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Toki  et  al.  Plant  Physiol.  100,  1503-1507,  1992）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou  et  al.  Bio/technology,  9:  957-962,  1991）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei  et  al.  Plant  J.  6:  271-282,  1994）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。また、シロイヌナズナであれば、Akamaら（Akama  et  al.  Plant  Cell  Reports  12:  7-11,  1992）の方法が挙げられる。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００３３】
一旦、ゲノム内に本発明の閉花性型DNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００３４】
＜閉花性の形質が付与された植物の作出方法＞
本発明は、また、本発明の閉花性型DNAを植物に導入することを特徴とする、閉花性の形質が付与された植物の作出方法を提供する。本発明の閉花性型DNAは、外因性のDNAとして植物に導入することができるが、本発明の閉花性型DNAを有する品種との交配によって植物に導入することもできる。本発明における「導入」には、これら双方の形態が含まれる。また、本発明において、植物に閉花性の形質を「付与する」とは、開花性の形質を有す品種に閉花性を持たせることのみならず、既に、一定の閉花性を有している品種における、閉花性を、さらに増大させることをも含む意である。植物に閉花性の形質を付与するためには、個体におけるcly1対立遺伝子の双方を閉花性型DNAにすることが好ましい。植物ゲノムへの本発明の閉花性型DNAの導入は、例えば、交配や相同組み換えにより行うことができる。閉花性の形質が付与された植物は、このような形質を有しない植物と比較して、例えば、赤カビ病の感染を防止する能力に優れ、あるいは、花粉の飛散を抑制する能力に優れている。
【００３５】
＜植物における開花性／閉花性を判定する方法＞
−Cly1／cly1遺伝子の塩基配列の解析−
本発明は、また、植物における開花性／閉花性を判定する方法を提供する。本発明の判定方法の一つの態様は、植物におけるCly1／cly1遺伝子の塩基配列を解析し、対照の塩基配列と比較する方法である。植物におけるCly1／cly1遺伝子は、通常、特定のオオムギ品種（例えば、アズマムギ、関東中生ゴール、SV230）のCly1／cly1遺伝子と相同性を有すると考えられるため、典型的には、下記DNAからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
（ｂ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列のコード領域において１もしくは複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA
ここで「複数」および「ストリンジェントな条件」の定義は、上記の通りである。「遺伝子の塩基配列の解析」とは、遺伝子の全長の塩基配列の解析のみならず、遺伝子の特定の部分の塩基配列の解析も含む意である。特定の部分の塩基配列は、好ましくは、遺伝子におけるmiR172標的部位の塩基配列を含むものである。
【００３６】
Cly1／cly1遺伝子の塩基配列の解析に際しては、Cly1／cly1遺伝子のDNAをPCRにより増幅した増幅産物を用いることができる。PCRを実施する場合において、用いられるプライマーは、Cly1／cly1遺伝子を特異的に増幅できるものである限り制限はなく、Cly1／cly1遺伝子の配列情報（例えば、配列番号：1,2,4,5,7または8に記載の塩基配列、図８に記載の塩基配列）に基づいて適宜設計することができる。プライマーは、Cly1／cly1遺伝子の全長DNAのみならず、特定の部分のDNAを増幅するものも用いることができるが、少なくともmiR172標的部位の塩基配列を含むDNAを増幅しうるものであることが好ましい。
【００３７】
被検植物におけるCly1／cly1遺伝子の塩基配列と比較する「対照の塩基配列」は、典型的には、開花性型か閉花性型かの判別がなされているCly1／cly1遺伝子の塩基配列である。本発明者らによって既に明らかにされているCly1／cly1遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号：1、2、4、5、7または8に記載の塩基配列、図８に記載の塩基配列）であってもよい。好ましくは、Cly1／cly1遺伝子のmiR172標的部位の塩基配列（例えば、図６に記載の塩基配列）である。
【００３８】
決定した被検植物における遺伝子の塩基配列と対照の塩基配列とを比較することにより、被検植物における遺伝子が、開花性型であるか閉花性型であるかを評価することができる。例えば、開花性型品種におけるCly1遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号：7または8に記載の塩基配列、図８に記載Cly1aの塩基配列）と実質的に同一である場合（特に、miR172標的部位の塩基配列が同一、または相違が少なく転写産物におけるmiR172による切断を抑制しないと考えられる場合）、被検植物の遺伝子は、開花性型である蓋然性が高いと判定される。一方、閉花性型品種におけるcly1遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号：1、2、4、または5に記載の塩基配列、図８に記載cly1bまたはcly1cの塩基配列）と実質的に同一である場合（特に、特に、miR172標的部位の塩基配列が同一、または相違が少なく転写産物におけるmiR172による切断を抑制すると考えられる場合）、被検植物における遺伝子は閉花性型である蓋然性が高いと判定される。
【００３９】
被検植物における遺伝子の塩基配列が、対照の塩基配列と相違するか否かは、上記した直接的な塩基配列の決定以外に、種々の方法により間接的に解析することができる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP(single-strand  conformation  polymorphism、一本鎖高次構造多型)法、制限酵素断片長多型（Restriction  Fragment  Length  Polymorphism／RFLP）を利用したRFLP法やPCR-RFLP法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（denaturant  gradient  gel  electrophoresis：DGGE）、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele  Specific  Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法が挙げられる。
【００４０】
なお、本発明の判定方法における、被検植物からのDNAの調製は、常法、例えば、CTAB法を用いて行うことができる。DNAの採取源としては特に限定されるものではなく、植物体のいずれの組織からも抽出できる。例えば、穂、葉、根、茎、種子、胚乳部、胚等から抽出することができる。DNAの調製は、成長した植物体のみならず、植物の種子や幼植物体を用いることもできるため、これにより早期に植物の開花性／閉花性を判定することができる。
【００４１】
また、塩基配列の決定は、常法、例えば、ジデオキシ法やマキサム-ギルバート法などにより行なうことができる。塩基配列の決定においては、市販のシークエンスキットおよびシークエンサーを利用することができる。
【００４２】
−遺伝子の転写産物のmiR172による切断の検出−
本発明の判定方法の他の一つの態様は、被検植物における遺伝子の転写産物のmiR172による切断を検出することを特徴とする方法である。遺伝子の転写産物のmiR172による切断の検出は、切断により短鎖化した転写産物の検出により実施することができる。短鎖化した転写産物の検出においては、例えば、本実施例に記載のRNAリガーゼ介在5'RACE法を利用することができる。具体的には、植物から抽出した全RNAに対して、切断された転写産物における（3'側の断片）の5'末端にのみ結合するRNAオリゴマーを作用させ、次いで、RNAオリゴマーに対するプライマーと切断された転写産物（3'側の断片）に特異的なリバースプライマーを用いたnested  PCRを行うことにより、miR172により切断された転写産物を特異的に検出することができる。この方法には、市販のキット（例えば、GeneRacer  Kit(Invitrogen社)）を用いることができる。
【００４３】
遺伝子の転写産物がmiR172により切断されると、その後の翻訳過程が抑制されると考えられることから、遺伝子の転写産物のmiR172による切断の検出は、上記した転写産物の直接的な検出法以外に、遺伝子の翻訳産物の検出によって行うこともできる。遺伝子の翻訳産物の検出は、常法、例えば、ウェスタンブロッティング法により、実施することができる。ウェスタンブロッティングに用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。抗体の調製のための抗原としては、例えば、配列番号：3、6、9に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質またはその部分ペプチドを用いることができる。
【００４４】
上記方法に供した結果、被検体におい遺伝子の転写産物のmiR172による切断が検出された場合、被検植物が開花性である蓋然性が高いと判定され、一方、切断が検出されなければ、被検植物が閉花性である蓋然性が高いと判定される。
【００４５】
＜閉花性の植物を育種する方法＞
本発明は、また、閉花性の植物を育種する方法を提供する。本発明の育種方法は、（ａ）開花性の植物品種と任意の植物品種とを交配させる工程、（ｂ）交配により得られた個体における開花性／閉花性を、上記本発明の判定方法により判定する工程、および（ｃ）閉花性を有すると判定された品種を選抜する工程、を含む。
【００４６】
開花性の植物品種と交配させる「任意の植物品種」としては、例えば、閉花性品種、閉花性品種と開花性品種との交配により得られた個体が挙げられるが、これらに制限されない。本発明の育種方法を利用すれば、閉花性の植物を、種子や幼植物の段階で選抜することが可能となり、閉花性の形質を有する品種の育成を、短期間で行うことが可能となる。また、連鎖マーカー分子を標的とするのではなく、植物の開花性／閉花性を支配する遺伝子を直接の標的として選抜を行うため、精度が高いと言える。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４８】
（実施例１）  オオムギとイネの比較遺伝地図の構築
137個のオオムギのEST配列をイネの染色体4上の配列に照合させたところ、24個をオオムギの染色体2Hに位置づけることができた。24個のうち18個をSTSマーカーに、4個をSNPマーカーに、残りの2個をSSRマーカーに変換した（表１）。【００４９】
【表１】
2011046202.tif 000002
【００５０】
本発明者が作製したイネの染色体４の物理地図とオオムギの遺伝地図との比較を図１に示す。関東中生ゴール（ＫＮＧ）×アズマムギ（ＡＺ）の個体において、ｃｌｙ１は、ＭＳＵ２１、ｅ１１ｍ１９−３ＳＴＳ、ＡＪ４６５８３３およびＧＢＭ１４９８と共分離した。これらの配列について、イネの染色体４のゲノム配列に対して、ＢＬＡＳＴ検索したところ、ＧＢＭ１４９８とＡＪ４６５８３３が、それぞれＲＭ１１５３とＣ１０１６に相同であることが明らかとなった。一方、ＭＳＵ２１とｅ１１ｍ１９−３ＳＴＳは、イネのゲノム配列とは関連がなかった。イネの染色体４における３０．１３Ｍｂと３４．６８Ｍｂの間の配列は、オオムギにおいて共線的に配置されたが、３１．６６Ｍｂから３３．５２Ｍｂの領域については、オオムギにおいて反転していた。その他いくつかの遺伝子順の崩壊が見いだされた。【００５１】
（実施例２）  F2集団の遺伝子型解析
大規模なKNG×AZのF2集団（2652個体）の遺伝的解析により、cly1遺伝子座は、AV932221から0.66cMの遠位に、CA002095から0.15cMの近位に、位置付けられた(図３Ａ)。AV932221とCA002095は、それぞれイネのOs04g0650000とOs04g0648900に相同であり、これら2つの座位の間に11の遺伝子が見出された(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)。その一つであるOs04g0649100は、cDNAの部分配列に基づき、AP2蛋白質をコードしていることが推測された。BF623536は、Os04g0649100に対して相同なオオオムギのESTであった。BF623536がCly1の一部であるとの推定に基づき、Cly1の全長ゲノム配列を同定するために、Morex  BACライブラリー（Yu  Y,  et  al.  Theor  Appl  Genet  101:  1093-1099,  2000）を、BF623536の配列で、PCRスクリーニングした。その結果、5つのクローン(M060H23、M191K21、M601E22、M799P16、M796O24)を選抜し、そのうち2つ(M191K21およびM601E22)の塩基配列を決定した。これら2つのBACクローンの配列に基づいて、さらに5つの新規マーカーを作製し(表２)、地図上に位置付けた(図３Ａ)。【００５２】
【表２】
2011046202.tif 000003
【００５３】
1つの組み換えイベント(0.02cM)がP101AP25’をcly1から分離し、2つの組み換えイベント(0.04cM)がM191K21A11をcly1から分離した。これら結果から、cly1を含むゲノム領域が7kbpに狭められた。このDNA領域は、Cly1のコード領域のほとんどを含んでおり、他の遺伝子は存在しなかった。AZにおける配列(Cly1.a)は、KNGの配列(cly1.b)と、2つの塩基部位において異なっていた。【００５４】
（実施例３）  遺伝子の塩基配列の解析
Cly1遺伝子は、開始コドンから終止コドンまでで2691bpであり、GC含量が60.8%で、10のエクソンと9のイントロンに分断していた(図３Ａ)。コード配列は1464bpで、5’UTR(480bp)と3’UTR(346〜368bp)に挟まれていた。Cly1は、2つのAP2ドメイン(Jofuku  KD,  et  al.,  Plant  Cell  6:  1211-1225,  1994、Okamuro  JK,  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  94:  7076-7081,  1997)を有する487残基のポリペプチドをコードしていた。AP2ドメインの1つは112位〜178位に、2つめは203〜270位に存在していた。エクソン10には、推定のmiR172標的配列が存在しており(図３Ａ)、この配列は多くのAP2遺伝子にも存在している(Aukerman  MJ,  Sakai  H  15:  2730-2741,  2003、Chen  X  Science  303:  2022-2025,  2004)。2つのオーキシン反応性エレメント(Guilfoyle  T.  et  al.,  How  does  auxin  turn  on  genes?  Plant  Physiol  118:  341-347,  1998)が、開始コドンの上流（一つは〜3kbp上流、他の一つは〜2kbp上流）に存在していた。Cly1遺伝子の塩基配列は、シロイヌナズナ（A.  thaliana）のAP2(AT4G36920.1)およびTOE3(AT5G67180.1)と似ており、euAP2分岐群（clade）に属していた(図４)。転写産物は、イネのAP2様遺伝子Os04g0649100と高度に相同性があった。P22AP23’における一塩基多型（エクソン10における推定miR172標的配列の中に存在）は、アミノ酸変化を伴わなかった。【００５５】
（実施例４）  miR172標的部位の多型の解析
miR172標的部位の配列の多型は、鱗皮の大きさおよび閉花性と相関していた。274オオムギ系統の間における配列の多様性が、miR172標的配列内の3つの塩基位置に見出された(図３Ｂおよび表３〜７)。【００５６】
【表３】
2011046202.tif 000004
【００５７】
【表４】
2011046202.tif 000005
【００５８】
【表５】
2011046202.tif 000006
【００５９】
【表６】
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【００６０】
【表７】
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【００６１】
この配列の多様性は、コドンの3番目の塩基に位置していたため、ペプチド配列における多様性をもたらさなかった。第一のバリアント「…C(A/C)G…」は閉花性と相関しなかったが、第二および第三のバリアント「...(A/G)TCATC(A/C)…」は相関していた。非閉花性型のすべてが、後者の部位において、ハプロタイプ「ATCATCA」であったという事実から、このハプロタイプが非閉花性の決定に必要であることが示唆された(図３Ｂ)。閉花性型のハプロタイプは、「GTCATCA」か「ATCATCC」のいずれかであった(図３Ｂ)。最初のGは、KNGに加えて、7つの閉花性集団において存在していたため、この一塩基の変化が非閉花性から閉花性への変化に十分であることが示唆された。第二のcly1アレルは、オルタナティブハプロタイプ（alternative  haplotype）「ATCATCC」(非閉花性型と比較した場合、CはAを置換している)を有していた。このハプロタイプは、4つの閉花性集団に存在していた(図３Ｂ)。【００６２】
（実施例５）  miR172によるCly1  mRNAの切断の解析
（１）芒原基形成段階の穂よりRNAを抽出し、第一鎖cDNA合成をSuperScipt  II(Invitrogen社)を用いて行った。RT-PCRは、miR172標的部位(BF623536U514M060H23U540「ACCAGCAGCAGCAACAGAGGC／配列番号：12」、BF623536U514M060H23L919「GCTGGTAATGGCTGTGGGACG／配列番号：13」)、または3'UTR(BF623536U514U794「TCAAGAGCAGCCAGCCAAGAA／配列番号：14」、BF623536U514M060H23L1053「CCGCATCCGTCCTCCTCTCAA／配列番号：15」)のいずれかに対するプライマーを用いて行った。その結果、Cly1.a(AZ)アレルを持つ個体とcly1.b(KNG)アレルを持つ個体では、遺伝子発現のパターンは、本質的に同一であった(図５Ｃ)。発現レベルは、KNGにおいては、AZより、わずかに高かったが、RT-PCRでは、有意な経時的な変化を同定することはできなかった(図５Ｃ)。miR172標的部位における遺伝子断片の転写レベルは、3'UTR遺伝子断片の転写レベルと類似していた。
（２）miR172によるCly1  mRNAの切断を調査するために、改変5’RACEを実施した。GeneRacer  Kit(Invitrogen社)を用いたRNAリガーゼ介在5’RACE(Kasschau  KD,  et  al.  Dev  Cell  4:  205-217,  2003)を、芒原基形成段階の完全な穂から抽出した全RNAに対して適用した。切断された転写産物の5'末端にのみGeneRacer  RNAオリゴマーが連結されるように、脱リン酸化および脱キャッピングのステップは省略した。nested  PCRにおいては、GeneRacer  RNAオリゴマーに対するプライマーを採用し、最初は、遺伝子特異的なリバースプライマー(BF623536U514M060H23L1053)との組み合わせで、次いで、プライマー(BF623536U514M060H23L1031「TCCATCTCTCGCTCTCACCCA／配列番号：16」）との組み合わせで用いた。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動で分離し、TAベクター(Invitrogen社)にクローニングした。事前にサイズによる選抜を行っていないランダムに選択したクローンを、DNA塩基配列決定に用いた。【００６３】
その結果、miR172標的部位を標的としたnested  PCRにより、Cly1.aを持つ個体においては、〜400bpのアンプリコンが生じたが、cly1.bを持つ個体では生じなかった(図５Ｄ)。このことは、miR172による切断が、前者では生じているが、後者では生じていないことを示唆する(図５Ｄ)。Cly1.a  RACEアンプリコンからクローン化した配列の多く(32/48)には、miR172標的部位における切断部位が存在しており、その大部分は、AとUのヌクレオチドの間であった(図５Ｅ)。しかしながら、cly1.bアンプリコンクローンのほとんどは、リボソームRNAか、Cly1とは無関係の遺伝子のmRNAであり、48クローンのうちわずか2つのみがCly1の配列を含んでいた(図５Ｅ)。このため、cly1.b  RACE生産物のほとんどにおいて、ランダムなmRNAの破損が生じていると考えられた。以上より、鱗皮の発達とそれによる閉花性が、miR172によるCly1転写産物の切断の違いによってもたらされることが明らかとなった。【００６４】
なお、miR172標的部位は、オオムギに限らず、他の多くの植物のESTにおいて見出されたことから、miR172による転写産物の切断は、広く植物に存在するものと考えられる（図６）。【００６５】
（実施例６）  閉花性オオムギの起源
系統発生解析を行った。この解析におけるアミノ酸の整列には、ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)を用いた。また、系統樹は、PAUP4.0b10を用いて、近隣結合法により構築した(Swofford  D  PAUP*.  Phylogenetic  analysis  using  parsimony  (*and  other  methods),  ver.4.  (Sinauer,  Sunderland,  Massachusetts,  USA)  1998)。【００６６】
系統発生解析により、閉花性の2つの異なる系統が見出された(図７)。KNGハプロタイプ(cly1.b)は、野生型AZ配列と、わずか2つの塩基置換で異なっており、一つは、miR712標的配列内にある3084位であり、他の一つは、第一エクソン内の626位であった(図８)。KNGハプロタイプは、野生型AZハプロタイプに直接由来するように思われる(図７)。2522位のGが、非閉花性栽培品種と野生型オオムギとの間で共有されているため、AZハプロタイプは、SV012ハプロタイプに由来するかもしれない(図８)。第二の閉花性ハプロタイプ(cly1.c)の起源は、不明である。しかしながら、2つの閉花性ハプロタイプは、独立した突然変異イベントを現わしているように思われる(図７)。3kbのCly1コード配列は、双方の閉花性ハプロタイプを通じて不変であり、このことは閉花性オオムギの起源がおそらく比較的最近であることを示唆するものである。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
上記した通り、本発明により、植物の開花性／閉花性を支配する新規な遺伝子Cly1/cly1が同定され、同定されたCly1/cly1遺伝子を利用して、植物の開花性／閉花性の判定や閉花性植物の作出・育種が可能となった。本発明における開花性／閉花性の判定は、それを支配する遺伝子を標的としており、しかも、育成早期の個体（例えば、種子、幼植物）を用いて実施することが可能である。このため、本発明の判定方法を利用すれば、閉花性品種を特異的かつ効率的に育種することが可能である。
cly1遺伝子を利用して作出・育種される閉花性の植物は、赤カビ病に対する耐性が増強している。従って、本発明は、赤カビ病の被害軽減に貢献することができる。また、植物への閉花性の形質の付与により、花粉の飛散を防止することもできる。近年、遺伝子組換えなどにより人為的に改変された遺伝子が自然界に飛散し、その生態系を脅かし、野生種の保存に影響を与える可能性が指摘されているが、その防止のためにも、植物への閉花性の導入は有効である。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１０
＜２２３＞  マイクロRNA
配列番号１１
＜２２３＞  マイクロRNA標的部位
配列番号１２〜１６
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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