(57)【要約】  グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性が不活化されると共にイソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌と、このイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性が不活化されると共にイソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項２】
さらに、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ活性が強化されている請求項１記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項３】
前記イソプロピルアルコール生産大腸菌が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与された大腸菌である請求項１又は請求項２のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項４】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、それぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項３記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項５】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が、クロストリジウム属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項３記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項６】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項３記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項７】
さらに、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有する請求項１〜請求項６のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプロピルアルコール生産細菌及びこれを用いたイソプロピルアルコール生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロピレンは、ポリプロピレンなどの合成樹脂や石油化学製品の重要な基礎原料であり、自動車用バンパーや食品容器、フィルム、医療機器などに幅広く使われている。
植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。京都議定書によって２００８年から２０１２年の間に先進国全体で二酸化炭素排出量を１９９０年比で５％削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。【０００３】
植物由来原料を資化してイソプロピルアルコールを生産する細菌は既に知られている。例えば国際公開２００９／００８３７７号パンフレットには、グルコースを原料としてイソプロピルアルコールを高生産するように改変された細菌が開示されており、イソプロピルアルコールの工業生産用生体触媒として優れていると記載されている。しかしながら、該大腸菌によって得られる生成物にはイソプロピルアルコールの他にアセトンが含まれているため、プロピレンの原料として用いるためには生成物からアセトンを分離して除去するか、生成物中のアセトンをイソプロピルアルコールへ変換する必要があった。【０００４】
副生したアセトンをイソプロピルアルコールに変換するプロセスとしては、ラネーニッケル触媒等を用いてアセトンと水素を反応させてイソプロピルアルコールを得る方法が提案されている（例えば、特開平２−１７４７３７号公報参照）。しかし、アセトン含量が多いと水添のための水素の使用量が増えることとなり、コスト上問題であった。【０００５】
このため、イソプロピルアルコール生産大腸菌によって得られる生成物中のアセトン含量を下げ、イソプロピルアルコールの純度を向上させることが強く望まれていた。【０００６】
一方、微生物による物質生産の収率を上げる方法としては、微生物がグルコースを分解する代謝経路（解糖系）を構成する主要な酵素を不活化する方法が知られている。例えば、特表２００７−５１０４１１号公報には、キノンオキシドレダクターゼと可溶性トランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子に加えて、解糖系の主要酵素であるグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ホスホグルコースイソメラーゼ）をコードする遺伝子を欠失させて、エチル−３−ヒドロキシブチラートを生産する細菌が開示されている。
また、特表２００３−５２０５８３号公報には、グルコース−６−リン酸イソメラーゼの活性を減少させた酵母と、この酵素遺伝子を完全に欠失させた酵母とを比較して、酵母でポリオールを生産させる際に、グルコース−６−リン酸イソメラーゼの活性を維持することが生産性の向上に必要であり、酵素活性を欠失させると生産性向上の効果がなくなると記載されている。
更に、２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）生成酵素を導入したＤＯＩ生産大腸菌のグルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子を破壊すると、ＤＯＩの収率が向上することが報告されている（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，１２９，ｐｐ．５０２−５０９，（２００７）参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、イソプロピルアルコール生産大腸菌によって得られる生成物中のアセトン含量を下げ、イソプロピルアルコールの純度を向上させることは、解決すべき大きな課題であった。
本発明は、イソプロピルアルコールを高い純度で生産するために有用なイソプロピルアルコール生産大腸菌及びイソプロピルアルコール生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は上記状況を鑑みてなされたものであり、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌及びイソプロピルアルコール生産方法は、以下のとおりである。【０００９】
〔１〕  グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性が不活化されると共にイソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔２〕  さらに、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ活性が強化されている〔１〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔３〕  前記イソプロピルアルコール生産大腸菌が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与された大腸菌である〔１〕又は〔２〕のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔４〕  前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔３〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔５〕  前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が、クロストリジウム属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔３〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔６〕  前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔３〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔７〕  さらに、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有する〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔８〕  〔１〕〜〔７〕に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性が不活化されると共にイソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌である。【００１１】
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌では、大腸菌が本来有するグルコース−６−リン酸イソメラーゼの活性が不活化されているので、副生物であるアセトンの生成が低減されて、イソプロピルアルコールを高い純度で生産することができる。【００１２】
即ち本発明は、グルコースを分解してイソプロピルアルコールに変換する代謝経路のうち、グルコース分解（解糖系）の主要酵素の一つであるグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性を不活化することによって、該大腸菌による生成物のイソプロピルアルコールの純度が向上することを見出したものである。グルコース−６−リン酸イソメラーゼは解糖系の主要酵素であり、該酵素をコードする遺伝子を不活性化することがイソプロピルアルコールの生産性に関与することを明らかにした知見は、現在までに一切見られない。更に、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の不活化が、イソプロピルアルコールの生産において副生物であるアセトンの蓄積量を低減させる効果を明らかにした知見も一切ない。よって、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の不活化により生産物中のイソプロピルアルコール純度が向上することは、全く予想外であった。【００１３】
なお、本発明における「不活化」とは、既存のあらゆる測定系によっても測定された当該酵素の活性が検出限界以下である状態を指す。
本発明における「遺伝子組み換えにより」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のＤＮＡの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。【００１４】
本発明における「活性」又は「能力」の「付与」又は「強化」とは、酵素をコードする遺伝子を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することの他に、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化すること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子の発現を強化させたものを含む。
なお、本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
以下に、本発明について説明する。【００１５】
本発明におけるグルコース−６−リン酸イソメラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号５．３．１．９に分類され、Ｄ−グルコース−６−リン酸からＤ−フルクトース−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。【００１６】
本発明において酵素の活性が不活化された大腸菌とは、上記の活性を付与した細菌と同様に、菌体外から菌体内への何らかの方法によって、生来の活性が損なわれた細菌を指す。これらの細菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を破壊すること（遺伝子破壊）により作出することができる。【００１７】
本発明における遺伝子破壊とは、ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変異を入れる、別のＤＮＡを挿入する、あるいは、遺伝子のある部分を欠失させることを示している。遺伝子破壊の結果、例えばその遺伝子がｍＲＮＡへ転写できなくなり、構造遺伝子が翻訳されない、あるいは、転写されたｍＲＮＡが不完全なため、翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じ、本来の機能の発揮が不可能になる。【００１８】
遺伝子破壊株の作製は、当該酵素又は蛋白質が発現しない破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能である。遺伝子破壊の方法は種々の方法（自然育種、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射、ランダム突然変異、トランスポゾン、部位特異的遺伝子破壊）が報告されているが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同組換えによる遺伝子破壊が好ましい。相同組換えによる手法はJ.Bacteriol.,161,1219-1221(1985)やJ.Bacteriol.,177,1511-1519(1995)やProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,97,6640-6645(2000)に記載されており、これらの方法及びその応用によって同業技術者であれば容易に実施可能である。【００１９】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコール生産系を備えた大腸菌であり、遺伝子組み換えにより導入又は改変されたイソプロピルアルコール生産能力を保有する大腸菌をいう。このようなイソプロピルアルコール生産系は、対象となる大腸菌にイソプロピルアルコールを生産させるものであればいずれのものであってもよい。
好ましくは、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性の付与を挙げることができる。本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の４種類の酵素活性が付与されていることが更に好ましい。【００２０】
本発明におけるアセト酢酸デカルボキシラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．１．１．４に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ（Bacillus polymyxa）等のバチルス属細菌由来のものが挙げられる。【００２１】
本発明の宿主細菌に導入されるアセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はバチルス属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、バチルス・ポリミクサ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００２２】
本発明におけるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．８０に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。【００２３】
本発明の宿主細菌に導入されるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００２４】
本発明におけるＣｏＡトランスフェラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．８．３．８に分類され、アセトアセチルＣｏＡからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス（Roseburia intestinalis）等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ（Faecalibacterium prausnitzii）等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス（Coprococcus）属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli：大腸菌）等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。【００２５】
本発明の宿主細菌に導入されるＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ等のファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００２６】
本発明におけるチオラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．９に分類され、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種（Halobacterium sp.）細菌、ズーグロア・ラミゲラ（Zoogloea ramigera）等のズーグロア属細菌、、リゾビウム種（Rhizobium sp.）細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）等のブラディリゾビウム属細菌、、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス（Streptomyces collinus）等のストレプトマイセス属細菌、、エンテロコッカス・ファカリス（Enterococcus faecalis）等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。【００２７】
本発明の宿主細菌に導入されるチオラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種の細菌、ズーグロア・ラミゲラ等のズーグロア属細菌、リゾビウム種の細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス等のエンテロコッカス属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００２８】
このうち、上記４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、なかでも、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム属細菌由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア属細菌由来である場合と、これら４種類の酵素がいずれもクロストリジム属細菌由来である場合が更に好ましい。【００２９】
なかでも本発明にかかる４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジュリンキ又はエシェリヒア・コリのいずれか由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、アセト酢酸デカルボキシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼが、それぞれクロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の酵素であり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼが、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素であることがより好ましく、上記４種類の酵素は、酵素活性の観点から、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来であり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来であることが特に好ましい。【００３０】
本発明においてイソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性が増強され、イソプロピルアルコールを生産する大腸菌の例として、ＷＯ２００９／００８３７７号に記載のｐＩＰＡ/Ｂ株又はｐＩａａａ/Ｂ株を例示できる。【００３１】
本発明における遺伝子のプロモーターとは、上記いずれかの遺伝子の発現を制御可能なものであればよいが、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターであり、具体的にはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターを例示することができる。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のＧＡＰＤＨプロモーターはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、塩基番号３９７−４４０に記されている。【００３２】
大腸菌由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ａｔｏＤ及びａｔｏＡ）とチオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）は、ａｔｏＤ、ａｔｏＡ、ａｔｏＢの順番で大腸菌ゲノム上でオペロンを形成しているため（Journal of Baceteriology Vol.169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkinsら）、ａｔｏＤのプロモーターを改変することによって、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とチオラーゼ遺伝子の発現を同時に制御することが可能である。
このことから、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が宿主大腸菌のゲノム遺伝子より得られたものである場合、充分なイソプロピルアルコール生産能力を獲得する観点から、両酵素遺伝子の発現を担うプロモーターを他のプロモーターと置換する等によって両酵素遺伝子の発現を強化することが好ましい。ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性を強化するために用いられるプロモーターとしては、前述のエシェリヒア・コリ由来ＧＡＰＤＨプロモーター等を挙げることができる。【００３３】
また、本発明におけるグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．４９に分類され、Ｄ−グルコース−６−リン酸からＤ−グルコノ−１，５−ラクトン−６−リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ等のＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌  、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉ等のＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ等のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等のＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ等のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ等のＢａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌由来のものが挙げられる。【００３４】
本発明において用いられるグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ等のＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌  、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉ等のＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ等のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等のＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ等のＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ等のＢａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌  、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属菌、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属などの原核生物に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００３５】
本発明おけるこれらの酵素の活性は、菌体外から菌体内へ導入されたもの又は、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものとすることができる。【００３６】
本発明におけるスクロース非ＰＴＳとは、微生物がスクロースを資化するメカニズムの一つを指す。従来の知見によれば微生物がスクロースを資化するメカニズムは、スクロースＰＴＳ（Phosphoenolpyruvate: Carbohydrate Phosphotransferase System）とスクロース非ＰＴＳの２つに大別される（特開２００１−３４６５７８号公報を参照）。スクロース非ＰＴＳはｃｓｃＢ（スクロースの取り込みを行う）、ｃｓｃＡ（微生物内部でスクロースの分解を行う）、ｃｓｃＫ（フルクトースのリン酸化を行う），ｃｓｃＲ（ｃｓｃＢ，Ａ，Ｋの発現を制御する）の４つの因子から構成されていることが知られている。また、スクロースＰＴＳはｓｃｒＡ（スクロースの取り込みを行う）、ｓｃｒＹ（スクロースのリン酸化を行う）、ｓｃｒＢ（微生物内部でスクロースの分解を行う）、ｓｃｒＲ（ｓｃｒＡ，Ｙ，Ｂの発現を制御する）、ｓｃｒＫ（フルクトースのリン酸化を行う）の５つの因子から構成されていることが知られている。【００３７】
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうち、スクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有することが好ましい。これにより、スクロースを資化できない大腸菌にスクロースを資化する能力が付与される。この結果、サトウキビや甜菜などを原料に使用することができ、安価で大量供給可能なスクロースからイソプロピルアルコールを得ることができる。
特に、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、スクロースの分解産物であるグルコースとフルクトースをほぼ同時に資化して、イソプロピルアルコールを生産することができるのでより効率的である。なお、スクロース資化能を本来は備えていない大腸菌としては、Ｋ１２株、Ｂ株、Ｃ株及びその由来株等を挙げることができる。【００３８】
本発明におけるスクロース非ＰＴＳ遺伝子群とは、微生物のスクロース資化経路のうち非ＰＴＳ系に関与する遺伝子群のことをいう。詳しくは、リプレッサー蛋白質（ｃｓｃＲ）、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）、スクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）で構成される遺伝子群である。なかでも、スクロースを効率的に利用するために、ｃｓｃＡをコードする遺伝子のみを有し、その他の遺伝子を含まないことが好ましい。【００３９】
本発明におけるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号３．２．１．２６に分類され、スクロースからＤ−グルコースとＤ−フルクトースを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
この酵素は、Ｋ１２株及びＢ株等の大腸菌には本来保有されていない酵素であり、スクロース透過酵素、スクロース加水分解酵素、フルクトキナーゼ及びスクロース特異的リプレッサーを含む非ＰＴＳ代謝経路の酵素の１つである（Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol.45, pp418-422参照）。本発明においてこのＣｓｃＡを付与することにより、特にＣｓｃＡのみを付与することにより、菌体外におけるスクロースをおそらく細胞膜の近くでグルコース及びフルクトースに分解して細胞外へ放出し、グルコースＰＴＳ及びフルクトースＰＴＳを介して細胞質内にリン酸化して取り込む。この結果、フルクトースを細菌におけるフルクトース代謝系へ供給して、解糖系を利用した資化が可能となる。【００４０】
本発明の宿主細菌に導入されるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。またｃｓｃＡには、ｃｓｃＡを菌体のペリプラズムへ移行させるためのシグナル配列が付加されていることが好ましい。【００４１】
本発明の宿主細菌に導入されるリプレッサー蛋白質（ＣｓｃＲ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるリプレッサータンパク質（ＣｓｃＲ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００４２】
本発明の宿主細菌に導入されるフルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００４３】
本発明の宿主細菌に導入される、スクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られる、スクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。【００４４】
本発明においてスクロース資化とは、スクロースを、そのまま、低分子化または高分子化して、好ましくは低分子化して、生体内に取り入れる能力、あるいは代謝的に別物質に変換する能力をいう。また、本発明において、資化とはスクロースをより低分子化する分解を含む。詳しくは、スクロースをＤ−グルコースとＤ−フルクトースに分解することを含む。【００４５】
酵素活性の導入は、例えばそれら４種類の酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することにより行うことができる。このとき、導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれであってもよい。菌体外から菌体内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook, J., et al., ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)などに記載されている。【００４６】
本発明において酵素の活性を付与した大腸菌とは、菌体外から菌体内へ何らかの方法によって該酵素活性が与えられた大腸菌を指す。これらの大腸菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を、前述したものと同様の遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内に導入する等の方法を用いて作出することができる。【００４７】
本発明において酵素の活性を強化した大腸菌とは、何らかの方法によって該酵素活性が強化された大腸菌を指す。これらの大腸菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を、前述したものと同様の遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内にプラスミドを用いて導入する又は、宿主大腸菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させる、等の方法を用いて作出することができる。【００４８】
本発明において大腸菌とは、本来、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有し得る大腸菌を意味する。【００４９】
ここで上記の各遺伝子の導入対象となる大腸菌としては、イソプロピルアルコール生産能を有しないものであってもよく、上記の各遺伝子の導入及び変更が可能であればいずれの大腸菌であってもよい。
より好ましくは、イソプロピルアルコール生産能が予め付与された大腸菌であることができ、これにより、より効率よくイソプロピルアルコールを生産させることができる。【００５０】
このようなイソプロピルアルコール生産大腸菌としては、例えば国際公開２００９／００８３７７号パンフレットに記載されているアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成大腸菌などを挙げることができる。【００５１】
本発明のイソプロピルアルコール生産方法は、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産させることを含むものであり、即ち、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、培養する工程と、接触により得られたイソプロピルアルコールを回収する回収工程とを含むものである。【００５２】
上記イソプロピルアルコール生産方法に用いられる植物由来原料は、植物から得られる炭素源であり、植物由来原料であれば特に制限されない。本発明においては、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。【００５３】
このような植物由来原料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、またはこれら成分を多く含む草木質分解産物、セルロース加水分解物など又はこれらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。【００５４】
本発明における植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、又はこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。【００５５】
培養工程におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料との接触は、一般に、植物由来原料を含む培地でイソプロピルアルコール生産大腸菌を培養することにより行われる。【００５６】
植物由来原料とイソプロピルアルコール生産大腸菌との接触密度は、イソプロピルアルコール生産大腸菌の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来原料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して２０質量％以下とすることができ、大腸菌の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を１５質量％以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。【００５７】
また培地中のイソプロピルアルコール生産大腸菌の含有量としては、大腸菌の種類及び活性によって異なるが一般に、培養開始時に投入する前培養の菌液の量を培養液に対して０．１質量％〜３０質量％、培養条件制御の観点から好ましくは１質量％〜１０質量％とすることができる。【００５８】
イソプロピルアルコール生産大腸菌の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及びイソプロピルアルコールを生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた通常用いられる培地であれば特に制限はない。【００５９】
本発明の培養に際して、培養条件は特別の制限はなく、例えば好気条件下でｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜４２℃の範囲内でｐＨと温度を適切に制御しながら培養することができる。【００６０】
前記混合物中への気体の通気量は、特に制限はないが、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）であり、大腸菌への物理的ダメージを抑制する観点から０．１ｖｖｍ〜１．５ｖｖｍで行うことが好ましい。【００６１】
培養工程は、培養開始から混合物中の植物由来原料が消費されるまで、又はイソプロピルアルコール生産大腸菌の活性がなくなるまで継続させることができる。培養工程の期間は、混合物中のイソプロピルアルコール生産大腸菌の数及び活性並びに、植物由来原料の量により異なるが、一般に、１時間以上、好ましくは４時間以上であればよい。一方、植物由来原料又はイソプロピルアルコール生産大腸菌の再投入を行うことによって、培養期間は無制限に連続することができるが、処理効率の観点から、一般に５日間以下、好ましくは５５時間以下とすることができる。その他の条件は、通常の培養に用いられる条件をそのまま適用すればよい。【００６２】
培養液中に蓄積したイソプロピルアルコールを回収する方法としては、特に制限はないが、例えば培養液から菌体を遠心分離などで除去した後、蒸留や膜分離等通常の分離方法でイソプロピルアルコールを分離する方法が採用できる。【００６３】
なお、本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、イソプロピルアルコール生産のための培養工程の前に、使用するイソプロピルアルコール生産大腸菌を適切な菌数又は適度な活性状態とするための前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程は、イソプロピルアルコール生産細菌の種類に応じた通常用いられる培養条件による培養であればよい。【００６４】
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、好ましくは、前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、該イソプロピルアルコール生産大腸菌を培養する培養工程と、前記培養により生成したイソプロピルアルコールを混合物から分離し回収する回収工程とを含む。【００６５】
この方法によれば、混合物に気体を供給しながら生産大腸菌を培養する（通気培養）。この通気培養により、生産されたイソプロピルアルコールは混合物中に放出されると共に、混合物から蒸散し、この結果、生成したイソプロピルアルコールを混合物から容易に分離することができる。また、生成したイソプロピルアルコールが混合物から連続的に分離するため、混合物中のイソプロピルアルコールの濃度の上昇を抑制することができる。これにより、イソプロピルアルコール生産大腸菌のイソプロピルアルコールに対する耐性を特に考慮する必要がない。
なお、本方法における混合物とは、大腸菌の培養に一般的に用いられる基本培地を主体とすればよい。培養条件については、前述した事項がそのまま適用される。【００６６】
回収工程では、培養工程で生成され、混合物から分離したイソプロピルアルコールを回収する。この回収方法としては、通常培養により混合物から蒸散したガス状又は飛沫状のイソプロピルアルコールを収集することができるものであればよい。このような方法としては、一般に用いられる密閉容器等の収集部材へ収容すること等を挙げることができるが、なかでも、イソプロピルアルコールのみを純度高く回収できる観点から、イソプロピルアルコールを捕捉するための捕捉液と、混合物から分離したイソプロピルアルコールとを接触することを含むものであることが好ましい。【００６７】
本方法では、イソプロピルアルコールは、捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収することができる。そのような回収方法としては、例えば国際公開２００９／００８３７７号パンフレットに記載された方法などが挙げられる。回収されたイソプロピルアルコールは、ＨＰＬＣ等の通常の検出手段を用いて確認することができる。回収されたイソプロピルアルコールは、必要に応じて更に精製することができる。このような精製方法としては、蒸留等をあげることができる。
回収されたイソプロピルアルコールが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコールの生産方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコールの脱水は、常法により行なうことができる。【００６８】
捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収可能なイソプロピルアルコールの生産方法に適用可能な装置としては、例えば、国際公開２００９／００８３７７号パンフレットの図１に示される生産装置を挙げることができる。
この生産装置では、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。
また、培養槽には、連結管を介して、捕捉液としてのトラップ液が収容されたトラップ槽が連結されている。このとき、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じる。
これにより、培養槽で通気培養により生成したイソプロピルアルコールは、エアレーションによって蒸散して培地から容易に分離される共に、トラップ槽においてトラップ液に捕捉される。この結果、イソプロピルアルコールを、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。【００６９】
本発明のイソプロピルアルコールの生産方法では、イソプロピルアルコールを高い純度で生成することができ、同様の方法で通常得られる副生物、例えばアセトンの含有率は、本発明を適用しない場合と比較して低い。生産方法の条件や用いられるイソプロピルアルコール生産大腸菌の状態によって異なるが、培養工程終了時において大腸菌の代謝経路を用いて菌体内から菌体外へ放出された全生成物（気体及び水を除く）におけるイソプロピルアルコールの割合は、６５質量％〜１００質量％、好ましくは８０質量％〜１００質量％とすることができる。又は、培養工程終了時における副生アセトンとイソプロピルアルコールの生成量の比は、イソプロピルアルコールの生成量（ｇ／Ｌ）を１としたときの副生アセトンの生成量（ｇ／Ｌ）を０〜０．４、好ましくは０〜０．２とすることができる。【００７０】
このように本発明のイソプロピルアルコール生産方法により得られた生成物は、アセトンなどの副生物のイソプロピルアルコールに対する割合が低いため、例えば、固体酸物質および水添触媒の存在下で、植物由来原料からイソプロピルアルコール生産細菌により生産されたアセトンを含むイソプロピルアルコールからプロピレンを製造した場合、アセトンの水添に使用する水素量を少なくすることができる。
【実施例】
【００７１】
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、記載中の「％」は特に断らない限り、質量基準である。
［実施例１］
＜エシェリヒア・コリＢ株Δｐｇｉ株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ（以下ｐｇｉと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ１５１９６）。ｐｇｉをコードする遺伝子（１，６５０ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ｃａｇｇａａｔｔｃｇｃｔａｔａｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃａｃｇ（配列番号１）、ｃａｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔａｃｔｃｔｔｃｔｇａｔｔｔｔｇａｇ（配列番号２）、ｃａｇｔｃｔａｇａｔｃａｔｃｇｔｃｇａｔａｔｇｔａｇｇｃｃ（配列番号３）及びｇａｃｃｔｇｃａｇａｔｃａｔｃｃｇｔｃａｇｃｔｇｔａｃｇｃ（配列番号４）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号１のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号２および３のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号４のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。【００７２】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１と配列番号２のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号３と配列番号４のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｇｉ−Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、ｐｇｉ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをＸｂａＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本ＤＮＡ断片と、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０６４０４）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＥｃｏＲＩで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の間にカナマイシン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認した。【００７３】
こうして得られたプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【００７４】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｐｇｉ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約３．３ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＢ株ｐｇｉ遺伝子欠失株（以下△ｐｇｉ株と略することがある）と命名した。【００７５】
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株およびエシェリヒア・コリＢ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００７６】
［実施例２］
＜エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
エシェリヒア・コリのチオラーゼおよびエシェリヒア・コリのＣｏＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼをコードする遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２４１３１〜２３２５３１５に記載されている。またＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は上記エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２７８１に記載されている。これらと共に、後述するクロストリジウム属細菌由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させることでイソプロピルアルコールの生産が可能である。上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。【００７７】
ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａｇｃｔａｃａｔａｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号５）、及びｃｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。【００７８】
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ａａｔａｔｇｃａｔｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａｇｇｔｔｔｔｇｃａａｔｇｃｔａｇｇ（配列番号７）、及びｇｃｇｇａｔｃｃｇｇｔａｃｃｔｔａｔａａｔａｔａａｃｔａｃｔｇｃｔｔｔａａｔｔａａｇｔｃ（配列番号８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを回収した。【００７９】
エシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてａｔｇｇａｔｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａａｔｔｇｔｇｔｃａｔｃｇｔｃａｇ（配列番号９）、及びｇｃａｇａａｇｃｔｔｇｔｃｔａｇａｔｔａａｔｔｃａａｃｃｇｔｔｃａａｔｃａｃｃａｔｃ（配列番号１０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１.２ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢを回収した。【００８０】
エシェリヒア・コリ由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｇｃｔｃｔａｇａｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａｃａａａａｔｔｇａｔｇａｃａｔｔａｃａａｇａｃ（配列番号１１）、及びｔａｇｃａａｇｃｔｔｃｔａｃｔｃｇａｇｔｔａｔｔｔｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｃｇ（配列番号１２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼαサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢを制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤを回収した。【００８１】
さらにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてａａｇｔｃｔｃｇａｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｇａｔｇｃｇａａａｃａａｃｇｔａｔｔｇ（配列番号１３）、及びｇｇｃｃａａｇｃｔｔｃａｔａａａｔｃａｃｃｃｃｇｔｔｇｃ（配列番号１４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼβサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤを制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ−ＩＰＡｄｈ−ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡを回収した。【００８２】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ｃａｇｇｔａｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｔｔａａａｇｇａｔｇａａｇｔａａｔｔａａａｃａａａｔｔａｇｃ（配列番号１５）、及びｇｃｇｇａｔｃｃｔｔａｃｔｔａａｇａｔａａｔｃａｔａｔａｔａａｃｔｔｃａｇｃ（配列番号１６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡを制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＧＡＰ-Ｉａａａを回収した。【００８３】
このプラスミドｐＧＡＰ-Ｉａａａを実施例１で作製した△ｐｇｉ株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ△ｐｇｉ株を得た。
同様に、ｐＧＡＰ-Ｉａａａをエシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株を得た。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４、エシェリシア・コリＢ株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００８４】
＜Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株の作製＞
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＣｏＡトランスフェラーゼ  αサブユニットをコードする遺伝子（以下、ａｔｏＤと略することがある）の塩基配列も報告されている。すなわちａｔｏＤはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２１３１に記載されている。
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇｃｔｃａａｔｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号４４）、及びａｃａｇａａｔｔｃｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号４５）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２５１４）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー１０個をそれぞれアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した際、ＧＡＰＤＨプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、ＤＮＡ配列を確認しＧＡＰＤＨプロモーターが正しく挿入されたものをｐＵＣｇａｐＰとした。得られたｐＵＣｇａｐＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した。
さらにａｔｏＤを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａａｔｔｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａｃａａａａｔｔｇａｔｇａｃａｔｔａｃａａｇａｃ（配列番号４６）、及びｇｃｇｇｔａｃｃｔｔａｔｔｔｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｃｇ（配列番号４７）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することで約６９０ｂｐのａｔｏＤフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを先に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＵＣｇａｐＰと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｔｏＤが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰａｔｏＤと命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００８５】
上述した通り、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡにおけるａｔｏＤの塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ｇｃｔｃｔａｇａｔｇｃｔｇａａａｔｃｃａｃｔａｇｔｃｔｔｇｔｃ（配列番号４８）とｔａｃｔｇｃａｇｃｇｔｔｃｃａｇｃａｃｃｔｔａｔｃａａｃｃ（配列番号４９）を用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＧＡＰＤＨプロモーターの配列情報に基づいて作製されたｇｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号５０）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの配列情報に基づいて作製された配列番号４のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターｐＧＡＰａｔｏＤを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤからなる約７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないＬＢ液体培地で３０℃で２時間培養し、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤを含む約７９０ｂｐ断片を増幅させ、ａｔｏＤプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリ、Ｂ：：ａｔｏＤＡＢと命名した。
なお、エシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００８６】
＜プラスミドｐＩａｚの作製＞
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ５５３９２に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ１５７３０７に記載されている。
上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。
ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａｇｃｔａｃａｔａｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号５）、及びｃｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドｐＢＲｇａｐＰを回収した。
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ａａｔａｔｇｃａｔｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａｇｇｔｔｔｔｇｃａａｔｇｃｔａｇｇ（配列番号５１）、及びｇｃｇｇａｔｃｃｔｔａｔａａｔａｔａａｃｔａｃｔｇｃｔｔｔａａｔｔａａｇｔｃ（配列番号５２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しＩＰＡｄｈが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈと命名した。
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ｃａｇｇａｔｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｔｔａａａｇｇａｔｇａａｇｔａａｔｔａａａｃａａａｔｔａｇｃ（配列番号５３）、及びｇｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃｔｔａｃｔｔａａｇａｔａａｔｃａｔａｔａｔａａｃｔｔｃａｇｃ（配列番号５４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｄｃが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＩａと命名した。
グルコース６リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）を取得するためにエシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＰ０００８１９）をテンプレートに用いてｃａｇｇａｔｃｃｃｇｇａｇａａａｇｔｃｔｔａｔｇｇｃｇｇｔａａｃｇｃａａａｃａｇｃｃｃａｇｇ（配列番号５５）、及びｃｇｔｃｔａｇａｃｇｇａｇａａａｇｔｃｔｔａｔｇａａｇｃａａａｃａｇｔｔｔａｔａｔｃｇｃｃ（配列番号５６）を用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで消化することで約１５００ｂｐのグルコース６リン酸１−デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-Ｉａを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社  ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られたプラスミドをｐＧＡＰ−Ｉａｚとした。
このプラスミドｐＩａｚを先に作製したエシェリヒア・コリＢ：：ａｔｏＤＡＢコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで、３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＧＡＰ−Ｉａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢを得た。【００８７】
［実施例３］
＜３Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株及びｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ△ｐｇｉ株及びｐＧＡＰ−Ｉａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株によるグルコースからのイソプロピルアルコール生産＞
本実施例では、ＷＯ２００９／００８３７７号パンフレット図１に示される生産装置を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽には３リットル容のものを使用し、トラップ槽には１０Ｌ容のものを使用した。培養槽、トラップ槽、注入管、連結管、排出管は、すべてガラス製のものとした。トラップ槽には、トラップ液としての水（トラップ水）を９Ｌの量で注入した。なお、培養槽には廃液管を設置して、糖や中和剤の流加により増量した培養液を適宜培養槽外に排出した。【００８８】
実施例２において得られたｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株及びｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ△ｐｇｉ株を、前培養としてアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）１００ｍＬを入れた５００ｍＬ容三角フラスコ植菌し、一晩、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養４５ｍＬを、以下に示す組成の培地８５５ｇの入った３Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＳ−ＰＩ）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．９Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度５５０ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ７．０（ＮＨ３水溶液で調整）で行った。培養開始から８時間後までの間、４５ｗｔ／ｗｔ％のグルコース水溶液を７．５ｇ／Ｌ／時間の流速で添加した。その後は４５ｗｔ／ｗｔ％のグルコース水溶液を１５ｇ／Ｌ／時間の流速で添加した。培養開始から１２０時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中の生成物の蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（９Ｌ）中の合算値である。培養後の生成物の濃度と、イソプロピルアルコールの純度をそれぞれ表１に示した。【００８９】
＜培地組成＞
コーンスティープリカー（日本食品化工製）：２０ｇ／Ｌ
Ｆｅ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．１ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４：２ｇ／Ｌ  
アデカノールＬＧ１２６（旭電化工業）０．１ｇ／Ｌ
（残部：水）【００９０】
【表１】
2011052482.tif 000002
【００９１】
また、得られたｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株及びｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ△ｐｇｉ株のトラップ水をＧＣ分析した結果、ｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ株のトラップ水にはアセトンが２．６質量％、イソプロパノールは４．６質量％含有されていることがわかった。また、ｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ△ｐｇｉ株のトラップ水にはアセトンが０．２４質量％、イソプロパノールは２．８質量％、ｐＧＡＰ-Ｉａｚ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ△ｐｇｉ株のトラップ水にはアセトンが０．２４質量％、イソプロパノールは２．６質量％含有されていることがわかった。【００９２】
これらの結果により、大腸菌が本来有するグルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子（ｐｇｉ）を破壊することによって、グルコース−６−リン酸イソメラーゼの活性が完全に不活化し、イソプロピルアルコールの純度が向上することが確認された。  また、ｐｇｉを破壊すると共にグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）の発現を強化することにより、更にイソプロピルアルコールの純度が向上することが分かった。
これらの遺伝子改変を行うことによって、生成物中のアセトン量を減らすことができるので、副生したアセトンをイソプロピルアルコールに変換するとしても、変換に必要な物質、例えば水素の量を低減させることができる。【００９３】
［比較例１］
＜エシェリヒア・コリＢ株ΔｐｆｋＡΔｐｆｋＢ株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのホスホフルクトキナーゼ−２（以下ｐｆｋＢと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｋ０２５００）。ｐｆｋＢをコードする遺伝子（９３０ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ｔｔｇｇｔａｃｃｔｔｔａｃａｔｇｃｔｇｔａｇｃｃｃａｇｃ（配列番号１７）、ｃｇｔｃｔａｇａｔａｇｇｃｔｇａｔｔｔｃａｇｔｃｔｇｇ（配列番号１８）、ａｔｔｃｔａｇａａｔｃａｔｃａｃｃａａｃｃｔｇｔｃｇ（配列番号１９）及びｇａｔａｔｔｇｃｃｇａａａｇｃｇａｔｃｃ（配列番号２０）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号１７のプライマーは５’末端側にＫｐｎＩ認識部位を、配列番号１８および１９のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号２０のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。【００９４】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７と配列番号１８のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｆｋＢ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号１９と配列番号２０のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｆｋＢ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｆｋＢ−Ｌ断片をＫｐｎＩ及びＸｂａＩで、ｐｆｋＢ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）のＫｐｎＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｆｋＢをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをＸｂａＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本ＤＮＡ断片と、トランスポゾンＴｎ１０（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１８３０）をテンプレートとして、ｃａｇｃｔｇａｃｔｃｇａｃａｔｃｔｔｇｇｔｔａｃｃｇ（配列番号２１）とｃａｇｃｔｇｃａａｇａｇｇｇｔｃａｔｔａｔａｔｔｔｃｇ（配列番号２２）のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行いテトラサイクリン耐性遺伝子を得、このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ処理し、先の平滑末端処理したプラスミドと連結した。その後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｆｋＢをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の間にテトラサイクリン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認した。【００９５】
こうして得られたプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコールを１０μｇ／ｍｌの濃度で含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【００９６】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、テトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらのクローンの染色体ＤＮＡを用いて、野生株Ｂ株においてｐｆｋＢ遺伝子を含むｐｆｋＢ遺伝子近傍領域の約３．０ｋｂｐ断片を増幅させるプライマーペア配列番号１７と配列番号２０を使ってＰＣＲを行い、ｐｆｋＢ遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子に置換されていることで約３．２ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜した。得られた株をＢ株ｐｆｋＢ遺伝子欠失株（以下△ｐｆｋＢ株と略することがある）と命名した。【００９７】
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのホスホフルクトキナーゼ−１（以下ｐｆｋＡと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６  ４１０５５７５―４１０６５３７）。ｐｆｋＡをコードする遺伝子（９６３ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ａｔｃｔｇｃａｇｔａｃｔａｇｃｇｔｃａｇｔｔｇａｔａｇｃ（配列番号２３）、ｃｇｔｃｔａｇａｔｃｃｔｇｃｔｇａａｔｔｇａｔｔｃａｇｇ（配列番号２４）、ｔｃｔｃｔａｇａｃｔｇａａａｃｃｇａｔｇａｃａｇａａｇｃ（配列番号２５）及びａａｇｇｔａｃｃａｇｇｃａａｔｃａｇｔａｃａｔｃｇ（配列番号２６）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号２３のプライマーは５’末端側にPｓｔＩ認識部位を、配列番号２４および２５のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号２６のプライマーは５’末端側にＫｐｎＩ認識部位をそれぞれ有している。【００９８】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２３と配列番号２４のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｆｋＡ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号２５と配列番号２６のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｆｋＡ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｆｋＡ−Ｌ断片をＰｓｔＩ及びＸｂａＩで、ｐｆｋＡ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＫｐｎＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）のＫｐｎＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｆｋＡをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをＸｂａＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本ＤＮＡ断片と、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０６４０４）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＥｃｏＲＩで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｆｋＡをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の間にカナマイシン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認した。【００９９】
こうして得られたプラスミドをエシェリヒア・コリΔｐｆｋＢ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１００】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらのクローンの染色体ＤＮＡを用いて、野生株Ｂ株においてｐｆｋＡ遺伝子を含むｐｆｋＡ遺伝子近傍領域の約３．０ｋｂｐ断片を増幅させるプライマーペア配列番号７と配列番号１０を使ってＰＣＲを行い、ｐｆｋＡ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約３．１ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜した。得られた株をＢ株ｐｆｋＡ，ｐｆｋＢ遺伝子欠失株（以下△ｐｆｋＡΔｐｆｋＢ株と略することがある）と命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株およびエシェリヒア・コリＢ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１０１】
＜△ｐｆｋＡｐｆｋＢ株に、エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターを導入した形質転換体の構築＞
実施例２で作製したプラスミドｐＧＡＰ-Ｉａａａを△ｐｆｋＡΔｐｆｋＢ株コンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ△ｐｆｋＡΔｐｆｋＢ株を得た。【０１０２】
＜３Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ△ｐｆｋＡΔｐｆｋＢ株によるグルコースからのイソプロピルアルコール生産＞
実施例３と同様な方法でイソプロピルアルコールを生産させた。但し、菌体はｐＧＡＰ-Ｉａａａ／Ｂ△ｐｆｋＡΔｐｆｋＢ株を用いた。培養開始から１２０時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中の生成物の蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（９Ｌ）中の合算値である。培養後の生成物の濃度及びイソプロピルアルコールの純度を表２に示した。【０１０３】
【表２】
2011052482.tif 000003
【０１０４】
この結果と実施例３の結果により、大腸菌が本来有する解糖系の酵素の１種であるグルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子（ｐｇｉ）を破壊した場合にはイソプロピルアルコールの純度が向上するのに反し、同様な解糖系の酵素であるホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（ｐｆｋＡ及びｐｆｋＢ）を破壊した場合には純度が低下することが確認された。【０１０５】
［実施例４］
＜３Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡ／ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株ｐｇｉ破壊株によるスクロースからのイソプロピルアルコール生産＞
（エシェリヒア・コリＢ株ゲノム上ａｔｏＤプロモーターのＧＡＰＤＨプロモーターへの置換）
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＣｏＡトランスフェラーゼ  αサブユニットをコードする遺伝子（以下、ａｔｏＤと略することがある）の塩基配列も報告されている。すなわちａｔｏＤはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２１３１に記載されている。【０１０６】
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇｃｔｃａａｔｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号２７）、及びａｃａｇａａｔｔｃｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号２８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２５１４）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー１０個をそれぞれアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した際、ＧＡＰＤＨプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、ＤＮＡ配列を確認しＧＡＰＤＨプロモーターが正しく挿入されたものをｐＵＣｇａｐＰとした。得られたｐＵＣｇａｐＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した。【０１０７】
さらにａｔｏＤを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａａｔｔｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａｃａａａａｔｔｇａｔｇａｃａｔｔａｃａａｇａｃ（配列番号２９）、及びｇｃｇｇｔａｃｃｔｔａｔｔｔｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｃｇ（配列番号３０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することで約６９０ｂｐのａｔｏＤフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを先に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＵＣｇａｐＰと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｔｏＤが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰａｔｏＤと命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１０８】
上述した通り、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡにおけるａｔｏＤの塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ｇｃｔｃｔａｇａｔｇｃｔｇａａａｔｃｃａｃｔａｇｔｃｔｔｇｔｃ（配列番号３１）とｔａｃｔｇｃａｇｃｇｔｔｃｃａｇｃａｃｃｔｔａｔｃａａｃｃ（配列番号３２）を用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。【０１０９】
また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＧＡＰＤＨプロモーターの配列情報に基づいて作製されたｇｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号３３）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの配列情報に基づいて作製された配列番号３０のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターｐＧＡＰａｔｏＤを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤからなる約７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。【０１１０】
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないＬＢ液体培地で３０℃で２時間培養し、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１１１】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤを含む約７９０ｂｐ断片を増幅させ、ａｔｏＤプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤ欠失ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株と命名した。
なお、エシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１１２】
（エシェリヒア・コリＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株ｐｇｉ破壊株の作製）
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ（以下ｐｇｉと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ１５１９６）。ｐｇｉをコードする遺伝子（１，６５０ｂｐ）の塩基配列近傍領域をクローニングするため、ｃａｇｇａａｔｔｃｇｃｔａｔａｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃａｃｇ（配列番号３４）、ｃａｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔａｃｔｃｔｔｃｔｇａｔｔｔｔｇａ  ｇ（配列番号３５）、ｃａｇｔｃｔａｇａｔｃａｔｃｇｔｃｇａｔａｔｇｔａｇｇｃｃ（配列番号３６）及びｇａｃｃｔｇｃａｇａｔｃａｔｃｃｇｔｃａｇｃｔｇｔａｃｇｃ（配列番号３７）に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号１のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号２および３のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号４のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。【０１１３】
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３４と配列番号３５のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ−Ｌ断片と呼ぶことがある）。また、配列番号３６と配列番号３７のプライマーペアで、ＰＣＲを行うことにより約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下ｐｇｉ−Ｒ断片と呼ぶことがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｇｉ−Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、ｐｇｉ−Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをＸｂａＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本ＤＮＡ断片と、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０６４０４）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＥｃｏＲＩで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の間にカナマイシン体性遺伝子が正しく挿入されていることを確認した。【０１１４】
こうして得られたプラスミドを前述のエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤ欠失ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、更にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【０１１５】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤ欠失ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株におけるｐｇｉ遺伝子を含むｐｇｉ遺伝子近傍領域の約３．７ｋｂｐ断片を増幅させ、ｐｇｉ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約３．３ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株ｐｇｉ遺伝子欠失株（以下ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入△ｐｇｉ株と略することがある）と命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１１６】
（クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリＯ１５７由来インベルターゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築）
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ５５３９２に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１５７３０７に記載されている。
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ａａｔａｔｇｃａｔｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａｇｇｔｔｔｔｇｃａａｔｇｃｔａｇｇ（配列番号３８）、及びｇｃｇｇａｔｃｃｔｔａｔａａｔａｔａａｃｔａｃｔｇｃｔｔｔａａｔｔａａｇｔｃ（配列番号３９）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しＩＰＡｄｈが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈと命名した。【０１１７】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ｃａｇｇａｔｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｔｔａａａｇｇａｔｇａａｇｔａａｔｔａａａｃａａａｔｔａｇｃ（配列番号４０）、及びｇｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃｔｔａｃｔｔａａｇａｔａａｔｃａｔａｔａｔａａｃｔｔｃａｇｃ（配列番号４１）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｄｃが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-Ｉａと命名した。【０１１８】
エシェリヒア・コリＯ１５７株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＥ００５１７４）、エシェリヒア・コリＯ１５７株のインベルターゼをコードする遺伝子（以下、ｃｓｃＡと略することがある）の塩基配列も報告されている。すなわちｃｓｃＡはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ００５１７４に記載のエシェリヒア・コリＯ１５７株ゲノム配列の３２７４３８３〜３２７５８１６に記載されている。【０１１９】
ｃｓｃＡを取得するために、エシェリヒア・コリＯ１５７株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてａｔｇｇｔａｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａｃｇｃａａｔｃｔｃｇａｔｔｇｃａｔｇ（配列番号４２）、及びｃｇａａｔｔｃｔｔａａｃｃｃａｇｔｔｇｃｃａｇａｇｔｇｃ（配列番号４３）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１４７０ｂｐのｃｓｃＡフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントと先述のｐＧＡＰ−Ｉａ（クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｃｓｃＡが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡと命名した。【０１２０】
（ｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡ／ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入△ｐｇｉ株の構築）
前述のプラスミドｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡをＢ株ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入△ｐｇｉ株のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡ／ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入△ｐｇｉ株（以下ｐＧＡＰ−Ｉａ−ｃｓｃＡ／ＢＧＡＰｐａｔｏＤ△ｐｇｉ株と略することがある）を得た。【０１２１】
（ｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡ／ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入△ｐｇｉ株によるスクロースからのイソプロピルアルコール生産）
実施例３と同様にイソプロピルアルコールを生産した。但し、糖源はグルコースの代わりに５０％（ｗ／ｗ）スクロースを使用した。培養開始から１２０時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中の生成物の蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（９Ｌ）中の合算値である。培養後の生成物の濃度と、イソプロピルアルコールの純度をそれぞれ表３に示した。【０１２２】
【表３】
2011052482.tif 000004
【０１２３】
これらの結果により、スクロース加水分解酵素遺伝子をさらに有するイソプロピルアルコール生産大腸菌は、スクロースを原料とした場合にも、大腸菌が本来有するグルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子（ｐｇｉ）を破壊することによってイソプロピルアルコールの純度が向上することが確認された。また、生産されるイソプロピルアルコールの量も増加することが確認された。【０１２４】
すなわち、本発明によれば、イソプロピルアルコールを高い純度で生産するために有用なイソプロピルアルコール生産大腸菌及びイソプロピルアルコール生産方法を提供することができる。【０１２５】
２００９年１０月２９日に出願の日本国出願番号第２００９−２４９４１８号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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