(57)【要約】本発明は高い特異性を有する入れ子型ＰＣＲに関する。本発明は、標的配列（１）を増幅する方法であって、一本鎖標的配列の高い増幅効率、および非特異的増幅の著しい抑制効果を示す方法を提供する。一実施形態では、入れ子型ＰＣＲの第２段階において、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならないアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合する。
2011114369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−第４非増幅配列（６ｄ）−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端−第５非増幅配列（７ａ）−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−第８非増幅配列（７ｄ）−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）は、前記第７非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、インナーリバースプライマー（５ｉｒ）、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
【請求項２】
前記工程（Ｂ）において、さらにアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）が混合され、
前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−第４非増幅配列（６ｄ）−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端−第５非増幅配列（７ａ）−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−第８非増幅配列（７ｄ）−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
【請求項１０】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高い特異性を有する入れ子型ＰＣＲに関する。
【背景技術】
【０００２】
図１に示されるＮｅｓｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「入れ子型ＰＣＲ」という）は、第１一本鎖ＤＮＡ６および第２一本鎖ＤＮＡ７からなる二本鎖ＤＮＡに含まれる二本鎖標的配列１を増幅する代表的な方法である。【０００３】
以下、図１を参照しながら入れ子型ＰＣＲ法を簡単に説明する。
第１一本鎖ＤＮＡ６は、３’末端−第１非増幅配列６ａ−第２非増幅配列６ｂ−一本鎖標的配列１ａ−第３非増幅配列６ｃ−第４非増幅配列６ｄ−５’末端からなる。第２一本鎖ＤＮＡ７は、５’末端−第５非増幅配列７ａ−第６非増幅配列７ｂ−相補的一本鎖標的配列１ｂ−第７非増幅配列７ｃ−第８非増幅配列７ｄ−３’末端からなる。【０００４】
第５非増幅配列７ａ、第６非増幅配列７ｂ、相補的一本鎖標的配列１ｂ、第７非増幅配列７ｃ、および第８非増幅配列７ｄは、それぞれ、前記第１非増幅配列６ａ、第２非増幅配列６ｂ、一本鎖標的配列１ａ、第３非増幅配列６ｃ、および第４非増幅配列６ｄと相補的である。【０００５】
二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列１ａと相補的一本鎖標的配列１ｂからなる。【０００６】
まず、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、二本鎖ＤＮＡ（６・７）、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を混合して第１の混合液を調製する。【０００７】
アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は５〜４０塩基を有する核酸からなり、かつ第２非増幅配列６ｂに含まれる３’末端の配列部分と相補的である。アウターリバースプライマー（５ｏｒ）は５〜４０塩基を有する核酸からなり、かつ第７非増幅配列７ｃに含まれる３’末端の配列部分と相補的である。そのため、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）は、それぞれ、第２非増幅配列６ｂに含まれる３’末端の配列部分および第７非増幅配列７ｃに含まれる３’末端の配列部分に結合する。【０００８】
次に、当該第１の混合液を９４℃〜１００℃で１秒から１００秒の間加熱する。その後、５０〜７０℃で１秒から１００秒間冷却する。さらに、７０〜８０℃で１秒から６００秒間加熱する。これらを繰り返し、中間二本鎖ＤＮＡを増幅する。【０００９】
中間二本鎖ＤＮＡは、中間一本鎖標的配列６ｍおよび相補的中間一本鎖標的配列７ｍからなる二本鎖ＤＮＡである。中間一本鎖標的配列および相補的中間一本鎖標的配列は、それぞれ、３’末端−第２非増幅配列６ｂ−一本鎖標的配列１ａ−第３非増幅配列６ｃ−５’末端および５’末端−第６非増幅配列７ｂ−相補的一本鎖標的配列１ｂ−第７非増幅配列７ｃ−３’末端からなる。【００１０】
ここまでを「第１段階のＰＣＲ」と呼ぶ。【００１１】
次に、第２段階のＰＣＲが行われる。【００１２】
増幅された中間二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を混合して第２の混合液を調製する。【００１３】
インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は５〜４０塩基を有する核酸からなり、かつ一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端の配列部分と相補的である。インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は５〜４０塩基を有する核酸からなり、かつ相補的一本鎖標的配列１ｂに含まれる３’末端の配列部分と相補的である。そのため、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、それぞれ、一本鎖標的配列１ａに含まれる３’末端の配列部分および相補的一本鎖標的配列１ｂに含まれる３’末端側の配列部分に結合する。【００１４】
最後に、当該第２の混合液を９４℃〜１００℃で１秒から１００秒の間加熱する。その後、５０〜７０℃で１秒から１００秒間冷却する。次いで、７０〜８０℃で１秒から６００秒間加熱する。これらを繰り返し、上記二本鎖標的配列を増幅する。【００１５】
特許文献１および非特許文献１−３は、本発明と関連し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第９６／１７９３２号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４、３７６−３７９（１９９５）
【非特許文献２】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２、６０−６５（１９９２）
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、８６、４９３−４９７（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
第１段階のＰＣＲの後、かつ第２段階のＰＣＲを行う前には、アウタープライマー４ｏｆ・５ｏｒが除去されることが必要である。なぜなら、第２の混合液がアウタープライマー４ｏｆ・５ｏｒを含有していると、図２に示すように、第２段階のＰＣＲにおいて、アウタープライマーからもＤＮＡ伸長反応が生じてしまう。
すなわち、図２に示すように、第２段階のＰＣＲの後に、望まれる標的二本鎖ＤＮＡだけでなく、望まれない不要な増幅産物も得られる。当該望まれない不要な増幅産物は、標的二本鎖ＤＮＡの著しい増幅効率の低下、電気泳動によるＤＮＡ解析の困難化、および遺伝子診断のミスを招き得る。【００１９】
本発明の目的は、入れ子型ＰＣＲを利用して標的配列（１）を効率的に増幅する方法であって、当該望まれない不要な増幅産物の産生を抑制する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上述の課題を解決するために、本発明は、以下に例示したような態様で提供される。
（項目１)  第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−第４非増幅配列（６ｄ）−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端−第５非増幅配列（７ａ）−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−第８非増幅配列（７ｄ）−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）は、前記第７非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、インナーリバースプライマー（５ｉｒ）、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
（項目２)  前記工程（Ｂ）において、さらにアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）が混合され、
前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、項目１に記載の方法。
（項目３)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、項目１に記載の方法。
（項目４)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目１に記載の方法。
（項目５)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目１に記載の方法。
（項目６)  前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、項目２に記載の方法。
（項目７)  前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目２に記載の方法。
（項目８)  前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目２に記載の方法。
（項目９)  第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−第４非増幅配列（６ｄ）−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端−第５非増幅配列（７ａ）−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−第８非増幅配列（７ｄ）−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
（項目１０)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、項目９に記載の方法。
（項目１１)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目９に記載の方法。
（項目１２)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目９に記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、増幅効率を改善し、かつ非特異的増幅を著しく抑制し得る、標的配列を増幅する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、従来の入れ子型ＰＣＲを示す図である。
【図２】図２は、第２段階のＰＣＲにおいて、アウタープライマーからＤＮＡ伸長反応が生じてしまう従来の入れ子型ＰＣＲの問題点を示す図である。
【図３】図３は、本実施の形態１に係る入れ子型ＰＣＲを示す図である。
【図４】図４は、本実施の形態１において、ブロック核酸に代えてブロックプライマーを用いた場合の問題点を示す図である。
【図５】図５は、本実施の形態２に係る入れ子型ＰＣＲを示す図である。
【図６】図６は、比較例１ａ（図６（Ａ））および実施例１（図６（Ｂ））において、プロファイル１Ａによる電気泳動結果を示す図である。
【図７】図７は、比較例１ａ（図７（Ａ））および実施例１（図７（Ｂ））において、プロファイル１Ｂによる電気泳動結果を示す図である。
【図８】図８は、比較例１ａ（図８（Ａ））および実施例１（図８（Ｂ））において、プロファイル１Ｃによる電気泳動結果を示す図である。
【図９】図９は、比較例１ａおよび実施例１における非特異的増幅を定量的に比較した図である。
【図１０】図１０は、比較例１ｂ（図８（Ａ））において、プロファイル１Ａによる電気泳動結果を示す図である。
【図１１】図１１は、比較例２および実施例２において、プロファイル２Ａによる電気泳動結果を示す図である。
【図１２】図１２は、比較例２および実施例２において、プロファイル２Ｂによる電気泳動結果を示す図である。
【図１３】図１３は、比較例２および実施例２において、プロファイル２Ｃによる電気泳動結果を示す図である。
【図１４】図１４は、比較例２および実施例２における非特異的増幅を定量的に比較した図である。
【図１５】図１５は、比較例３ａ（図１５（Ａ））および実施例３（図１５（Ｂ））において、プロファイル３Ａによる電気泳動結果を示す図である。
【図１６】図１６は、比較例３ａ（図１６（Ａ））および実施例３（図１６（Ｂ））において、プロファイル３Ｂによる電気泳動結果を示す図である。
【図１７】図１７は、比較例３ｂにおいて、プロファイル３Ａによる電気泳動結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、図３を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。
【００２４】
（実施の形態１）
本実施の形態では、まず、図１と同様、アウタープライマーを用いて第１段階のＰＣＲが行われる。第１段階のＰＣＲでは、混合液はインナープライマーを含有しない。
【００２５】
本実施の形態は、図３に示すように、第２段階のＰＣＲにおいて、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を用いることによって特徴付けられる。好ましくは、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）およびアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）の両方が用いられる。
【００２６】
アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）およびアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、それぞれ、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的な配列を有する。さらに、いずれのブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）も、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用しない。好ましくは、ブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）は合成オリゴ核酸である。
【００２７】
ブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）の例は、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（以下、「ＬＮＡ」）、およびペプチド核酸（以下、「ＰＮＡ」）である。
【００２８】
核酸は、糖、リン酸基、および塩基から構成される複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を介して連結された生体高分子である。修飾されたＤＮＡおよびＬＮＡの３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基は、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されている。ＬＮＡは人工的に開発された核酸アナログである。ＰＮＡは当該修飾を必要としない。なぜなら、ＰＮＡでは、２アミノエチルグリシン結合が糖−リン酸ジエステル骨格を置換しているからである。
【００２９】
第２段階のＰＣＲを開始する前に、混合液にインナーフォワードプライマー（４ｉｆ）およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）が添加される。さらに、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が混合液に添加される。アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）も添加されることが好ましい。
【００３０】
ブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）が添加されると、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）はアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）に結合し、プライマーダイマーと呼ばれる二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。同様に、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）はアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）に結合し、二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。これらの二本鎖ＤＮＡ構造の形成は、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）の活性を低下させる。従って、図２に示すような、第２段階のＰＣＲにおけるアウタープライマーからのＤＮＡ伸長反応が抑制される。
【００３１】
アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であるに過ぎない単なるプライマーであってはならない。すなわち、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点となってはならない。図４を参照しながら、以下、その理由を説明する。
【００３２】
図４に示すように、図３と同様、アウターフォワードブロックプライマーは、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と共に二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。しかし、第２一本鎖ＤＮＡ７が、アウターフォワードブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分７ｓを有している場合、アウターフォワードブロックプライマーは当該配列部分７ｓにも結合する。そして、アウターフォワードブロックプライマーからＤＮＡ伸長反応が開始する。これは、図２に示すような、不要な増幅産物を引き起こす。同様に、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）もまた、アウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的であるに過ぎない単なるプライマーであってはならない。第１一本鎖ＤＮＡ６が、
アウターリバースブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分６ｓを有する場合、当該配列部分６ｓにアウターリバースブロックプライマーが結合し、ＤＮＡ伸長反応を開始するからである。第１一本鎖ＤＮＡ６および第２一本鎖ＤＮＡ７が複数の類似配列６ｓおよび複数の類似配列７ｓをそれぞれ有する場合には、大量の望まれない増幅産物が引き起こされ得る。この詳細は、実施例１および比較例１ｂ、ならびに実施例３および比較例３ｂを参照されたい。
【００３３】
アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）の濃度よりも高い濃度を有することが好ましい。より具体的には、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）の５倍の濃度を有することが好ましく、１０倍の濃度を有することがさらに好ましい。
【００３４】
アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）も、アウターリバースプライマー（５ｏｒｂ）の濃度よりも高い濃度を有することが好ましい。より具体的には、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、アウターリバースプライマー（５ｏｒ）の５倍の濃度を有することが好ましく、１０倍の濃度を有することがさらに好ましい。
【００３５】
通常のＰＣＲと同様、第１段階のＰＣＲおよび第２段階のＰＣＲにおいて、必要に応じて、ｐＨ緩衝作用を有する成分、ＭｇＣｌ２のような塩、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、牛血清アルブミン、およびｇｌｙｃｅｒｏｌのような試薬がさらに混合され得る。
【００３６】
（実施の形態２）
本実施の形態２を、図５を参照しながら説明する。本実施の形態２と実施の形態１との間の相違点は、インナーリバースプライマー（５ｉｒ）がアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を兼ねることにある。
【００３７】
本実施の形態２においても、まず、図１と同様、アウタープライマーを用いて第１段階のＰＣＲが行われる。実施の形態１とは異なり、実施の形態２における第１段階のＰＣＲでは、混合液はインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を含有する。第１段階のＰＣＲは、第２非増幅配列６ｂ−一本鎖標的配列１ａからなる中間一本鎖標的配列および第６非増幅配列７ｂ−相補的一本鎖標的配列１ｂからなる相補的中間一本鎖標的配列を産生する。
【００３８】
第２段階のＰＣＲの前に、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が混合される。実施の形態１とは異なり、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は混合されない。第２段階のＰＣＲは、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）によって、一本鎖標的配列１ａおよび相補的一本鎖標的配列１ｂを増幅する。
【実施例】
【００３９】
本実施例および比較例で用いられる鋳型ＤＮＡは、自動ＤＮＡ抽出装置ＱＩＡｃｕｂｅ（株式会社キアゲン製）を用いてヒトの血液試料より調製した。【００４０】
全てのプライマーおよびアウターフォワードブロック核酸およびアウターリバースブロック核酸は、つくばオリゴサービス株式会社より購入した。【００４１】
アウターフォワードブロック核酸およびアウターリバースブロック核酸のいずれもが、その３’末端がリン酸基によって修飾されていた。【００４２】
ｄＮＴＰは、インビトロジェン株式会社より購入した。ＰＣＲ後の電気泳動解析のためにＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）が用いられた。【００４３】
以下の実施例１、比較例１ａ、および比較例１ｂでは、標的配列はヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子に含まれるＤＮＡ断片であった。【００４４】
（比較例１ａ）
本比較例１ａでは、アウターフォワードプライマーの配列は５’−ＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡＣ−３’（配列番号１、以降、「ＡＢＯ−ＯＦ」）であった。アウターリバースプライマーの配列は５’−ＣＣＴＧＧＧＴＣＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＣ−３’（配列番号２、以降、「ＡＢＯ−ＯＲ」）であった。このプライマー対は、ＡＢ型の血液型を有するヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子内に含まれる２１０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。このプライマー対は、Ｏ型の血液型を有するヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子内に含まれる２０９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。【００４５】
インナーフォワードプライマーの配列は５’−ＴＧＣＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＣ−３’（配列番号３、以降、「ＡＢＯ−ＩＦ」）であった。インナーリバースプライマーの配列は５’−ＴＴＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＴＴＡＡＣ−３’（配列番号４、以降、「ＡＢＯ−ＩＲ」）であった。このＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲのプライマー対は、上記２１０ｂｐのＤＮＡ断片内に存在する１４０ｂｐのＤＮＡ断片（血液型がＡＢの場合。Ｏ型の場合は１３９ｂｐのＤＮＡ断片）を増幅する。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。【００４６】
第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通りであった。
１×  ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（クロンテック社製）、
１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（クロンテック社製）、
２００μＭ  ｄＮＴＰ、
１μＭ  ＡＢＯ−ＯＦ、
１μＭ  ＡＢＯ−ＯＲ、０．５ｎｇ／μＬ
５ｎｇ／μｌ  ゲノムＤＮＡ（ＡＢ型被験者由来）
全容量：１０μＬ【００４７】
ＰＣＲの温度プロファイル１Ａ〜Ｃは表１の通りであった。【００４８】
【表１】
2011114369.tif 000003
【００４９】
二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に０．５μＬの２０μＭ  ＡＢＯ−ＩＦおよび０．５μＬの２０μＭ  ＡＢＯ−ＩＲを添加することによって調製された。【００５０】
図６（Ａ）は、プロファイル１Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）だけでなく、ＡＢＯ−ＯＦとＡＢＯ−ＯＲとの組み合わせから得られた望まれないＤＮＡ断片も検出されたことを図６（Ａ）は示す。さらに、図６（Ａ）は、これらの増幅産物のピーク以外にも、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、６２．５ｎＭであった。【００５１】
図７（Ａ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ａ）と同様、図７（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１３７．８ｎＭであった。【００５２】
図８（Ａ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ａ）と同様、図８（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１５７．０ｎＭであった。【００５３】
（実施例１）
本実施例１では、比較例１ａと同じアウターフォワードプライマー（ＡＢＯ−ＯＦ）、アウターリバースプライマー（ＡＢＯ−ＯＲ）、インナーフォワードプライマー（ＡＢＯ−ＩＦ）、インナーリバースプライマー（ＡＢＯ−ＩＲ）を用いた。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。【００５４】
第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通り、比較例１ａと全く同じであった。
１×  ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、
１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ
２００μＭ  ｄＮＴＰ
１μＭ  ＡＢＯ−ＯＦ
１μＭ  ＡＢＯ−ＯＲ
０．５ｎｇ／μＬ  ゲノムＤＮＡ
全容量：１０μＬ【００５５】
温度プロファイル１は、比較例１ａと同様であった。【００５６】
二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に、
０．５μＬの２０μＭ  ＡＢＯ−ＩＦ
０．５μＬの２０μＭ  ＡＢＯ−ＩＲ
１μＬのアウターフォワードブロック核酸、および
１μＬのアウターリバースブロック核酸
を添加することによって調製された。【００５７】
当該アウターフォワードブロック核酸は、５’−ＧＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号５）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された濃度１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＡＢＯ−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＡＢＯ−ＯＦに対して相補的であった。【００５８】
当該アウターリバースブロック核酸は、５’−ＧＣＣＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号６）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＡＢＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＡＢＯ−ＯＲに対して相補的であった【００５９】
図６（Ｂ）は、プロファイル１Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）は検出されたが、ＡＢＯ−ＯＦとＡＢＯ−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片はほとんど検出されなかったことを図６（Ｂ）は示す。さらに、図６（Ｂ）は、非特異的な増幅産物を示すピークをほとんど示していない。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、４７８．６ｎＭであった。図６（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＡＢＯ−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＡＢＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲの組み合わせからのＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制される。【００６０】
図９は、非特異的な増幅の抑制を定量的に示している。これらは、電気泳動解析によって検出された全ての非特異的増幅産物が増幅される際に産生されたピロリン酸濃度を計算により求めた棒グラフである。【００６１】
ＤＮＡ伸長反応においては、一塩基の伸長反応が進むごとに一分子のピロリン酸が産生されることは周知である。非特異的に増幅された各ＤＮＡ断片の長さ（ｂｐ）×濃度（ｎＭ）を求め、それらを全て足し合わせることによって、全ての非特異的増幅産物が増幅される際に産生されたピロリン酸濃度を求められ得る。各ＤＮＡ断片の長さおよび濃度はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００より求められ得る。【００６２】
図６（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図６（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ４５％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図９（１）および図９（２）は示す。反応後の溶液が含有するピロリン酸の濃度を測定することによって、ＤＮＡ増幅の濃度が測定され得る。非特異的な増幅により産生されるピロリン酸は大きなノイズとなり得る。しかし、ブロック核酸の添加は、非特異的な増幅により産生されるピロリン酸によるノイズを低減し得る。【００６３】
図７（Ｂ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＢＯ−ＯＦとＡＢＯ−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図７（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５１６．５ｎＭであった。【００６４】
図７（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図７（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ６６％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図９（３）および図９（４）は示す。【００６５】
図８（Ｂ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＢＯ−ＯＦとＡＢＯ−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図８（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、３７５．２ｎＭであった。【００６６】
図７（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図７（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ６１％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図９（５）および図９（６）は示す。【００６７】
実施例１および比較例１ａは、ブロック核酸の添加が、一本鎖標的配列の増幅効率を著しく高め、かつ非特異的増幅を大きく抑制し得ることを示している。【００６８】
念のため、本発明者らは、ＡＢＯ−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋだけを第１段階のＰＣＲ後に添加して実験した。その結果、この場合も、ＡＢＯ−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＡＢＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋの両方を添加した場合ほどではないが、ＡＢＯ−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＡＢＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋのいずれも添加しなかった場合に比べ、標的配列の増幅効率が高められ、かつ非特異的増幅が抑制されたことが確認された。【００６９】
（比較例１ｂ）
比較例１ｂでは、図４のように、３’末端がリン酸化修飾されていないＡＢＯ−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターフォワードプライマー」）および３’末端がリン酸化修飾されていないＡＢＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターリバースプライマー」）が用いられた。プロファイル１Ａが用いられた。【００７０】
図１０はその電気泳動結果を示す。図１０におけるＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片濃度は、図６（Ｂ）のそれにより明らかに小さい。さらに、図１０における非特異的増幅の抑制効果は、図６（Ｂ）のそれより明らかに小さい。【００７１】
以上の結果より、３’末端をリン酸化修飾しないブロックプライマーでは、充分な非特異的増幅の抑制効果を得られなかった。【００７２】
以下の実施例２および比較例２は図５に対応する。以下の実施例２および比較例２では、標的配列はヒトのＡＬＤＨ２遺伝子に含まれるＤＮＡ断片であった。【００７３】
（比較例２）
本比較例２では、アウターフォワードプライマーの配列は５’−ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴ−３’（配列番号７、以降、「ＡＬＤＨ２−ＯＦ」）であった。アウターリバースプライマーの配列は５’−ＧＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣ−３’（配列番号８、以降、「ＡＬＤＨ２−ＯＲ」）であった。このプライマー対は、ヒトのＡＬＤＨ２遺伝子内に含まれる２５１ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。【００７４】
インナーフォワードプライマーの配列は５’−ＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣ−３’（配列番号９、以降、「ＡＬＤＨ２−ＩＦ」）であった。インナーリバースプライマーの配列はＡＬＤＨ２−ＯＲと同じである。ＡＬＤＨ２−ＩＦおよびＡＬＤＨ２−ＯＲとのプライマー対は、上記２５１ｂｐのＤＮＡ断片内に存在する１６０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し得る。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。【００７５】
第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通りである。
０．０５Ｕ／μＬ  ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラバイオ株式会社製）、
１×ＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ  （Ｍｇ２＋  ｐｌｕｓ）（タカラバイオ株式会社製）、
２００μＭ  ｄＮＴＰ、
１μＭ  ＡＬＤＨ２−ＯＦ、
１μＭ  ＡＬＤＨ２−ＯＲ、
０．８３ｎｇ／μＬ  ゲノムＤＮＡ
全容量：１０μＬ【００７６】
ＰＣＲの温度プロファイル２Ａ〜Ｃは表２の通りであった。【００７７】
【表２】
2011114369.tif 000004
【００７８】
二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に１０μＭ  ＡＬＤＨ２−ＩＦを１μＬ添加することによって調製された。【００７９】
図１１（Ａ）は、プロファイル２Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）だけでなく、ＡＬＤＨ２−ＯＦとＡＬＤＨ２−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片も検出されたことを図１１（Ａ）は示す。さらに、図１１（Ａ）は、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１０．７ｎＭであった。【００８０】
図１２（Ａ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ａ）と同様、図１２（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１３．６ｎＭであった。【００８１】
図１３（Ａ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ａ）と同様、図１３（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、９．９ｎＭであった。【００８２】
（実施例２）
実験例２では、第１段階のＰＣＲ後の反応液に、
１μＬの１０μＭ  ＡＬＤＨ２−ＩＦ、および
１μＬのアウターフォワードブロック核酸
が添加されたＰＣＲ溶液が用いられた。【００８３】
当該アウターフォワードブロック核酸は、５’−ＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＣＴＧＴＡＡＴＴＴＧ−３’（配列番号１０）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された濃度１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＡＬＤＨ２−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＡＬＤＨ２−ＯＦに相補的であった。【００８４】
図１１（Ｂ）は、プロファイル２Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）は検出されたが、ＡＬＤＨ２−ＯＦとＡＬＤＨ２−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片はほとんど検出されなかったことを図１１（Ｂ）は示す。さらに、図１１（Ｂ）は、非特異的な増幅産物を示すピークをほとんど示していない。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５８．６ｎＭであった。図１１（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＡＬＤＨ２−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＡＬＤＨ２−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲの組み合わせからのＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制された。【００８５】
図１４は、図９と同様、非特異的な増幅の抑制を定量的に示している。図１１（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図１１（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ９５％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図１４（１）および図１４（２）は示す。【００８６】
図１２（Ｂ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＬＤＨ２−ＯＦとＡＬＤＨ２−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図１２（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５８．６ｎＭであった。【００８７】
図１２（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図１２（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ８７％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図１４（３）および図１４（４）は示す。【００８８】
図１３（Ｂ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＬＤＨ２−ＯＦとＡＬＤＨ２−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図１３（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５３．５ｎＭであった。【００８９】
図１３（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図１３（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ８１％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図１４（５）および図１４（６）は示す。【００９０】
実施例２および比較例２は、ブロック核酸の添加が、標的配列の増幅効率を高め、かつ非特異的増幅を抑制し得ることを示している。【００９１】
以下の実施例３、比較例３ａ、および比較例３ｂは図３に対応する。以下の実施例３、比較例３ａ、および比較例３ｂでは、標的配列はヒトのジストロフィン遺伝子に含まれるＤＮＡ断片であった。【００９２】
（比較例３）
本比較例３では、アウターフォワードプライマーの配列は５’−ＧＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＣ−３’（配列番号１１、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ」）であった。アウターリバースプライマーの配列は５’−ＴＴＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号１２、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ」）であった。このプライマー対は、ヒトのジストロフィン遺伝子内に含まれる４５９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し得る。【００９３】
インナーフォワードプライマーの配列は５’−ＡＧＧＣＴＴＧＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＴＡＧＡＡＧＴ−３’（配列番号１３、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦ」）であった。インナーリバースプライマーの配列は５’−ＧＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＣ−３’（配列番号１４、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＩＲ」）であった。このＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲのプライマー対は、上記４５９ｂｐのＤＮＡ断片内に存在する１４７ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し得る。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。【００９４】
第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通りであった。
１×  ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（クロンテック社製）、
１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（クロンテック社製）、
２００μＭ  ｄＮＴＰ、
１μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ、
１μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ、
０．５ｎｇ／μＬ  ゲノムＤＮＡ
全容量：１０μＬ【００９５】
ＰＣＲの温度プロファイル３Ａ〜Ｂは表３の通りであった。【００９６】
【表３】
2011114369.tif 000005
【００９７】
二段階目のＰＣＲ溶液は、上記第１段階のＰＣＲ後の反応液に０．５μＬの２０μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦおよび０．５μＬの２０μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＩＲを添加することによって調製された。【００９８】
図１５（Ａ）は、プロファイル３Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）だけでなく、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片も検出されたことを図１５（Ａ）は示す。さらに、図１５（Ａ）は、これらの増幅産物のピーク以外にも、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、２９４．５ｎＭであった。【００９９】
図１６（Ａ）は、プロファイル３Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１５（Ａ）と同様、図１６（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１９６．１ｎＭであった。【０１００】
（実施例３）
本実施例３では、比較例３と同じアウターフォワードプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ）、アウターリバースプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ）、インナーフォワードプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦ）、およびインナーリバースプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＩＲ）が用いられた。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。【０１０１】
第１段階のＰＣＲ溶液の組成および温度プロファイル３Ａ・３Ｂは、比較例３ａと全く同じであった。【０１０２】
二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に、
０．５μＬの２０μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦ
０．５μＬの２０μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＩＲ
１μＬのアウターフォワードブロック核酸、および
１μＬのアウターリバースブロック核酸
を添加することによって調製された。【０１０３】
当該アウターフォワードブロック核酸は、５’−ＧＡＣＴＴＴＴＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣ−３’（配列番号１５）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦに対して相補的であった。【０１０４】
当該アウターリバースブロック核酸は、５’−ＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＴＡＧＡＡ−３’（配列番号１６）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲに対して相補的であった。【０１０５】
図１５（Ｂ）は、プロファイル３Ａによる電気泳動解析結果を示す。図１５（Ｂ）から理解されるように、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲの組み合わせからの増幅産物濃度、およびＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度は、いずれも、検出限界以下であった。【０１０６】
ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は５９３．２ｎＭであった。図１５（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲの組み合わせによるＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制された。【０１０７】
図１６（Ｂ）は、プロファイル３Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１６（Ｂ）から理解されるように、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲの組み合わせからの増幅産物濃度、およびＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度は、いずれも、検出限界以下であった。【０１０８】
ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は５７１．６ｎＭであった。図１６（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせによるＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制された。【０１０９】
（比較例３ｂ）
比較例３ｂでは、図４のように、３’末端がリン酸化修飾されていないＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターフォワードプライマー」）および３’末端がリン酸化修飾されていないＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターリバースプライマー」）が用いられた。プロファイル３Ａが用いられた。【０１１０】
図１７はその電気泳動結果を示す。図１７におけるＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片濃度は、図１５（Ｂ）および図１６（Ｂ）のそれらより明らかに小さい。さらに、図１７における非特異的増幅の抑制効果は、図１５（Ｂ）および図１６（Ｂ）のそれらより明らかに小さい。【０１１１】
以上の結果より、３’末端をリン酸化修飾しないブロックプライマーでは、充分な非特異的増幅の抑制効果を得られなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は、標的配列を増幅する方法であって、標的配列の高い増幅効率、および非特異的増幅の著しい抑制効果を示す標的配列を増幅する方法を提供する。
【符号の説明】
【０１１３】
１  標的配列
１ａ  一本鎖標的配列
１ｂ  相補的一本鎖標的配列
４ｏｆ  アウターフォワードプライマー
４ｏｒｂ  アウターフォワードブロック核酸
４ｉｆ  インナーフォワードプライマー
５ｏｒ  アウターリバースプライマー
５ｉｒ  インナーリバースプライマー
５ｏｒｂ  アウターリバースブロック核酸
６  第１一本鎖ＤＮＡ
６ａ  第１非増幅配列
６ｂ  第２非増幅配列
６ｃ  第３非増幅配列
６ｄ  第４非増幅配列
６ｍ  中間一本鎖標的配列
６ｓ  アウターリバースブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分
７  第２一本鎖ＤＮＡ
７ａ  第５非増幅配列
７ｂ  第６非増幅配列
７ｃ  第７非増幅配列
７ｄ  第８非増幅配列
７ｍ  相補的中間一本鎖標的配列
７ｓ  アウターフォワードブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分
【配列表フリーテキスト】
【０１１４】
配列番号１：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターフォワードプライマー
配列番号２：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターリバースプライマー
配列番号３：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのインナーフォワードプライマー
配列番号４：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのインナーリバースプライマー
配列番号５：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターフォワードプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号６：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターリバースプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号７：ＡＬＤＨ２遺伝子のためのアウターフォワードプライマー
配列番号８：  ＡＬＤＨ２遺伝子のためのアウターリバースプライマーまたはインナーリバースプライマー
配列番号９：  ＡＬＤＨ２遺伝子のためのインナーフォワードプライマー
配列番号１０：ＡＬＤＨ２遺伝子のためのアウターフォワードプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号１１：ジストロフィン遺伝子のためのアウターフォワードプライマー
配列番号１２：ジストロフィン遺伝子のためのアウターリバースプライマー
配列番号１３：ジストロフィン遺伝子のためのインナーフォワードプライマー
配列番号１４：ジストロフィン遺伝子のためのインナーリバースプライマー
配列番号１５：ジストロフィン遺伝子のためのアウターフォワードプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号１６：ジストロフィン遺伝子のためのアウターリバースプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
【図１】
2011114369.tif 000006
【図２】
2011114369.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2011114369000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月28日(2010.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は高い特異性を有する入れ子型ＰＣＲに関する。
【背景技術】
【０００２】
図１に示されるＮｅｓｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「入れ子型ＰＣＲ」という）は、第１一本鎖ＤＮＡ６および第２一本鎖ＤＮＡ７からなる二本鎖ＤＮＡに含まれる二本鎖標的配列１を増幅する代表的な方法である。
【０００３】
以下、図１を参照しながら入れ子型ＰＣＲ法を簡単に説明する。
第１一本鎖ＤＮＡ６は、３’末端−第１非増幅配列６ａ−第２非増幅配列６ｂ−一本鎖標的配列１ａ−第３非増幅配列６ｃ−第４非増幅配列６ｄ−５’末端からなる。第２一本鎖ＤＮＡ７は、５’末端−第５非増幅配列７ａ−第６非増幅配列７ｂ−相補的一本鎖標的配列１ｂ−第７非増幅配列７ｃ−第８非増幅配列７ｄ−３’末端からなる。
【０００４】
第５非増幅配列７ａ、第６非増幅配列７ｂ、相補的一本鎖標的配列１ｂ、第７非増幅配列７ｃ、および第８非増幅配列７ｄは、それぞれ、前記第１非増幅配列６ａ、第２非増幅配列６ｂ、一本鎖標的配列１ａ、第３非増幅配列６ｃ、および第４非増幅配列６ｄと相補的である。
【０００５】
二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列１ａと相補的一本鎖標的配列１ｂからなる。
【０００６】
まず、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、二本鎖ＤＮＡ（６・７）、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を混合して第１の混合液を調製する。
【０００７】
アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は５〜４０塩基を有する核酸からなり、かつ第２非増幅配列６ｂに含まれる３’末端の配列部分と相補的である。アウターリバースプライマー（５ｏｒ）は５〜４０塩基を有する核酸からなり、かつ第７非増幅配列７ｃに含まれる３’末端の配列部分と相補的である。そのため、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）は、それぞれ、第２非増幅配列６ｂに含まれる３’末端の配列部分および第７非増幅配列７ｃに含まれる３’末端の配列部分に結合する。
【０００８】
次に、当該第１の混合液を９４℃〜１００℃で１秒から１００秒の間加熱する。その後、５０〜７０℃で１秒から１００秒間冷却する。さらに、７０〜８０℃で１秒から６００秒間加熱する。これらを繰り返し、中間二本鎖ＤＮＡを増幅する。
【０００９】
中間二本鎖ＤＮＡは、中間一本鎖標的配列６ｍおよび相補的中間一本鎖標的配列７ｍからなる二本鎖ＤＮＡである。中間一本鎖標的配列および相補的中間一本鎖標的配列は、それぞれ、３’末端−第２非増幅配列６ｂ−一本鎖標的配列１ａ−第３非増幅配列６ｃ−５’末端および５’末端−第６非増幅配列７ｂ−相補的一本鎖標的配列１ｂ−第７非増幅配列７ｃ−３’末端からなる。
【００１０】
ここまでを「第１段階のＰＣＲ」と呼ぶ。
【００１１】
次に、第２段階のＰＣＲが行われる。
【００１２】
増幅された中間二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を混合して第２の混合液を調製する。
【００１３】
インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は５〜４０塩基を有する核酸からなり、かつ一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端の配列部分と相補的である。インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は５〜４０塩基を有する核酸からなり、かつ相補的一本鎖標的配列１ｂに含まれる３’末端の配列部分と相補的である。そのため、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、それぞれ、一本鎖標的配列１ａに含まれる３’末端の配列部分および相補的一本鎖標的配列１ｂに含まれる３’末端側の配列部分に結合する。
【００１４】
最後に、当該第２の混合液を９４℃〜１００℃で１秒から１００秒の間加熱する。その後、５０〜７０℃で１秒から１００秒間冷却する。次いで、７０〜８０℃で１秒から６００秒間加熱する。これらを繰り返し、上記二本鎖標的配列を増幅する。
【００１５】
特許文献１および非特許文献１−３は、本発明と関連し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第９６／１７９３２号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４、３７６−３７９（１９９５  ）
【非特許文献２】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２、６０−６５（１９９２）
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、８６、４９３−４９７（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
第１段階のＰＣＲの後、かつ第２段階のＰＣＲを行う前には、アウタープライマー４ｏｆ・５ｏｒが除去されることが必要である。なぜなら、第２の混合液がアウタープライマー４ｏｆ・５ｏｒを含有していると、図２に示すように、第２段階のＰＣＲにおいて、アウタープライマーからもＤＮＡ伸長反応が生じてしまう。
すなわち、図２に示すように、第２段階のＰＣＲの後に、望まれる標的二本鎖ＤＮＡだけでなく、望まれない不要な増幅産物も得られる。当該望まれない不要な増幅産物は、標的二本鎖ＤＮＡの著しい増幅効率の低下、電気泳動によるＤＮＡ解析の困難化、および遺伝子診断のミスを招き得る。
【００１９】
本発明の目的は、入れ子型ＰＣＲを利用して標的配列（１）を効率的に増幅する方法であって、当該望まれない不要な増幅産物の産生を抑制する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上述の課題を解決するために、本発明は、以下に例示したような態様で提供される。
（項目１)  第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−第４非増幅配列（６ｄ）−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端−第５非増幅配列（７ａ）−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−第８非増幅配列（７ｄ）−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）は、前記第７非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、インナーリバースプライマー（５ｉｒ）、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
（項目２)  前記工程（Ｂ）において、さらにアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）が混合され、
前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、項目１に記載の方法。
（項目３)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、項目１に記載の方法。
（項目４)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目１に記載の方法。
（項目５)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目１に記載の方法。
（項目６)  前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、項目２に記載の方法。
（項目７)  前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目２に記載の方法。
（項目８)  前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目２に記載の方法。
（項目９)  第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−第４非増幅配列（６ｄ）−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端−第５非増幅配列（７ａ）−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−第８非増幅配列（７ｄ）−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
（項目１０)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、項目９に記載の方法。
（項目１１)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目９に記載の方法。
（項目１２)  前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、項目９に記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、増幅効率を改善し、かつ非特異的増幅を著しく抑制し得る、標的配列を増幅する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】従来の入れ子型ＰＣＲを示す図
【図２】第２段階のＰＣＲにおいて、アウタープライマーからＤＮＡ伸長反応が生じてしまう従来の入れ子型ＰＣＲの問題点を示す図
【図３】本実施の形態１に係る入れ子型ＰＣＲを示す図
【図４】本実施の形態１において、ブロック核酸に代えてブロックプライマーを用いた場合の問題点を示す図
【図５】本実施の形態２に係る入れ子型ＰＣＲを示す図
【図６】比較例１ａ（図６（Ａ））および実施例１（図６（Ｂ））において、プロファイル１Ａによる電気泳動結果を示す図
【図７】比較例１ａ（図７（Ａ））および実施例１（図７（Ｂ））において、プロファイル１Ｂによる電気泳動結果を示す図
【図８】比較例１ａ（図８（Ａ））および実施例１（図８（Ｂ））において、プロファイル１Ｃによる電気泳動結果を示す図
【図９】比較例１ａおよび実施例１における非特異的増幅を定量的に比較した図
【図１０】比較例１ｂ（図８（Ａ））において、プロファイル１Ａによる電気泳動結果を示す図
【図１１】比較例２および実施例２において、プロファイル２Ａによる電気泳動結果を示す図
【図１２】比較例２および実施例２において、プロファイル２Ｂによる電気泳動結果を示す図
【図１３】比較例２および実施例２において、プロファイル２Ｃによる電気泳動結果を示す図
【図１４】比較例２および実施例２における非特異的増幅を定量的に比較した図
【図１５】比較例３ａ（図１５（Ａ））および実施例３（図１５（Ｂ））において、プロファイル３Ａによる電気泳動結果を示す図
【図１６】比較例３ａ（図１６（Ａ））および実施例３（図１６（Ｂ））において、プロファイル３Ｂによる電気泳動結果を示す図
【図１７】比較例３ｂにおいて、プロファイル３Ａによる電気泳動結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、図３を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。
【００２４】
（実施の形態１）
本実施の形態では、まず、図１と同様、アウタープライマーを用いて第１段階のＰＣＲが行われる。第１段階のＰＣＲでは、混合液はインナープライマーを含有しない。
【００２５】
本実施の形態は、図３に示すように、第２段階のＰＣＲにおいて、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を用いることによって特徴付けられる。好ましくは、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）およびアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）の両方が用いられる。
【００２６】
アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）およびアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、それぞれ、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的な配列を有する。さらに、いずれのブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）も、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用しない。好ましくは、ブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）は合成オリゴ核酸である。
【００２７】
ブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）の例は、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（以下、「ＬＮＡ」）、およびペプチド核酸（以下、「ＰＮＡ」）である。
【００２８】
核酸は、糖、リン酸基、および塩基から構成される複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を介して連結された生体高分子である。修飾されたＤＮＡおよびＬＮＡの３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基は、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されている。ＬＮＡは人工的に開発された核酸アナログである。ＰＮＡは当該修飾を必要としない。なぜなら、ＰＮＡでは、２アミノエチルグリシン結合が糖−リン酸ジエステル骨格を置換しているからである。
【００２９】
第２段階のＰＣＲを開始する前に、混合液にインナーフォワードプライマー（４ｉｆ）およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）が添加される。さらに、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が混合液に添加される。アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）も添加されることが好ましい。
【００３０】
ブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）が添加されると、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）はアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）に結合し、プライマーダイマーと呼ばれる二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。同様に、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）はアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）に結合し、二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。これらの二本鎖ＤＮＡ構造の形成は、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）の活性を低下させる。従って、図２に示すような、第２段階のＰＣＲにおけるアウタープライマーからのＤＮＡ伸長反応が抑制される。
【００３１】
アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であるに過ぎない単なるプライマーであってはならない。すなわち、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点となってはならない。図４を参照しながら、以下、その理由を説明する。
【００３２】
図４に示すように、図３と同様、アウターフォワードブロックプライマーは、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と共に二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。しかし、第２一本鎖ＤＮＡ７が、アウターフォワードブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分７ｓを有している場合、アウターフォワードブロックプライマーは当該配列部分７ｓにも結合する。そして、アウターフォワードブロックプライマーからＤＮＡ伸長反応が開始する。これは、図２に示すような、不要な増幅産物を引き起こす。同様に、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）もまた、アウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的であるに過ぎない単なるプライマーであってはならない。第１一本鎖ＤＮＡ６が、
アウターリバースブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分６ｓを有する場合、当該配列部分６ｓにアウターリバースブロックプライマーが結合し、ＤＮＡ伸長反応を開始するからである。第１一本鎖ＤＮＡ６および第２一本鎖ＤＮＡ７が複数の類似配列６ｓおよび複数の類似配列７ｓをそれぞれ有する場合には、大量の望まれない増幅産物が引き起こされ得る。この詳細は、実施例１および比較例１ｂ、ならびに実施例３および比較例３ｂを参照されたい。
【００３３】
アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）の濃度よりも高い濃度を有することが好ましい。より具体的には、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）の５倍の濃度を有することが好ましく、１０倍の濃度を有することがさらに好ましい。
【００３４】
アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）も、アウターリバースプライマー（５ｏｒｂ）の濃度よりも高い濃度を有することが好ましい。より具体的には、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、アウターリバースプライマー（５ｏｒ）の５倍の濃度を有することが好ましく、１０倍の濃度を有することがさらに好ましい。
【００３５】
通常のＰＣＲと同様、第１段階のＰＣＲおよび第２段階のＰＣＲにおいて、必要に応じて、ｐＨ緩衝作用を有する成分、ＭｇＣｌ2のような塩、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、牛血清アルブミン、およびｇｌｙｃｅｒｏｌのような試薬がさらに混合され得る。
【００３６】
（実施の形態２）
本実施の形態２を、図５を参照しながら説明する。本実施の形態２と実施の形態１との間の相違点は、インナーリバースプライマー（５ｉｒ）がアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を兼ねることにある。
【００３７】
本実施の形態２においても、まず、図１と同様、アウタープライマーを用いて第１段階のＰＣＲが行われる。実施の形態１とは異なり、実施の形態２における第１段階のＰＣＲでは、混合液はインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を含有する。第１段階のＰＣＲは、第２非増幅配列６ｂ−一本鎖標的配列１ａからなる中間一本鎖標的配列および第６非増幅配列７ｂ−相補的一本鎖標的配列１ｂからなる相補的中間一本鎖標的配列を産生する。
【００３８】
第２段階のＰＣＲの前に、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）が混合される。実施の形態１とは異なり、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は混合されない。第２段階のＰＣＲは、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）によって、一本鎖標的配列１ａおよび相補的一本鎖標的配列１ｂを増幅する。
【実施例】
【００３９】
本実施例および比較例で用いられる鋳型ＤＮＡは、自動ＤＮＡ抽出装置ＱＩＡｃｕｂｅ（株式会社キアゲン製）を用いてヒトの血液試料より調製した。
【００４０】
全てのプライマーおよびアウターフォワードブロック核酸およびアウターリバースブロック核酸は、つくばオリゴサービス株式会社より購入した。
【００４１】
アウターフォワードブロック核酸およびアウターリバースブロック核酸のいずれもが、その３’末端がリン酸基によって修飾されていた。
【００４２】
ｄＮＴＰは、インビトロジェン株式会社より購入した。ＰＣＲ後の電気泳動解析のためにＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）が用いられた。
【００４３】
以下の実施例１、比較例１ａ、および比較例１ｂでは、標的配列はヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子に含まれるＤＮＡ断片であった。
【００４４】
（比較例１ａ）
本比較例１ａでは、アウターフォワードプライマーの配列は５’−ＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＣＣＧＣＡＣ−３’（配列番号１、以降、「ＡＢＯ−ＯＦ」）であった。アウターリバースプライマーの配列は５’−ＣＣＴＧＧＧＴＣＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＣ−３’（配列番号２、以降、「ＡＢＯ−ＯＲ」）であった。このプライマー対は、ＡＢ型の血液型を有するヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子内に含まれる２１０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。このプライマー対は、Ｏ型の血液型を有するヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子内に含まれる２０９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。
【００４５】
インナーフォワードプライマーの配列は５’−ＴＧＣＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＴＣＣＴＣ−３’（配列番号３、以降、「ＡＢＯ−ＩＦ」）であった。インナーリバースプライマーの配列は５’−ＴＴＣＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＣＡＧＴＴＡＡＣ−３’（配列番号４、以降、「ＡＢＯ−ＩＲ」）であった。このＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲのプライマー対は、上記２１０ｂｐのＤＮＡ断片内に存在する１４０ｂｐのＤＮＡ断片（血液型がＡＢの場合。Ｏ型の場合は１３９ｂｐのＤＮＡ断片）を増幅する。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
【００４６】
第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通りであった。
１×  ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（クロンテック社製）、
１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（クロンテック社製）、
２００μＭ  ｄＮＴＰ、
１μＭ  ＡＢＯ−ＯＦ、
１μＭ  ＡＢＯ−ＯＲ、０．５ｎｇ／μＬ
５ｎｇ／μｌ  ゲノムＤＮＡ（ＡＢ型被験者由来）
全容量：１０μＬ
【００４７】
ＰＣＲの温度プロファイル１Ａ〜Ｃは表１の通りであった。
【００４８】
【表１】
2011114369.tif 000023
【００４９】
二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に０．５μＬの２０μＭ  ＡＢＯ−ＩＦおよび０．５μＬの２０μＭ  ＡＢＯ−ＩＲを添加することによって調製された。
【００５０】
図６（Ａ）は、プロファイル１Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）だけでなく、ＡＢＯ−ＯＦとＡＢＯ−ＯＲとの組み合わせから得られた望まれないＤＮＡ断片も検出されたことを図６（Ａ）は示す。さらに、図６（Ａ）は、これらの増幅産物のピーク以外にも、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、６２．５ｎＭであった。
【００５１】
図７（Ａ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ａ）と同様、図７（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１３７．８ｎＭであった。
【００５２】
図８（Ａ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ａ）と同様、図８（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１５７．０ｎＭであった。
【００５３】
（実施例１）
本実施例１では、比較例１ａと同じアウターフォワードプライマー（ＡＢＯ−ＯＦ）、アウターリバースプライマー（ＡＢＯ−ＯＲ）、インナーフォワードプライマー（ＡＢＯ−ＩＦ）、インナーリバースプライマー（ＡＢＯ−ＩＲ）を用いた。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
【００５４】
第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通り、比較例１ａと全く同じであった。
１×  ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、
１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ
２００μＭ  ｄＮＴＰ
１μＭ  ＡＢＯ−ＯＦ
１μＭ  ＡＢＯ−ＯＲ
０．５ｎｇ／μＬ  ゲノムＤＮＡ
全容量：１０μＬ
【００５５】
温度プロファイル１は、比較例１ａと同様であった。
【００５６】
二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に、
０．５μＬの２０μＭ  ＡＢＯ−ＩＦ
０．５μＬの２０μＭ  ＡＢＯ−ＩＲ
１μＬのアウターフォワードブロック核酸、および
１μＬのアウターリバースブロック核酸
を添加することによって調製された。
【００５７】
当該アウターフォワードブロック核酸は、５’−ＧＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号５）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された濃度１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＡＢＯ−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＡＢＯ−ＯＦに対して相補的であった。
【００５８】
当該アウターリバースブロック核酸は、５’−ＧＣＣＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号６）からなり、かつその３'末端がリン酸化修飾された１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＡＢＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＡＢＯ−ＯＲに対して相補的であった
【００５９】
図６（Ｂ）は、プロファイル１Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）は検出されたが、ＡＢＯ−ＯＦとＡＢＯ−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片はほとんど検出されなかったことを図６（Ｂ）は示す。さらに、図６（Ｂ）は、非特異的な増幅産物を示すピークをほとんど示していない。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、４７８．６ｎＭであった。図６（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＡＢＯ−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＡＢＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲの組み合わせからのＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制される。
【００６０】
図９は、非特異的な増幅の抑制を定量的に示している。これらは、電気泳動解析によって検出された全ての非特異的増幅産物が増幅される際に産生されたピロリン酸濃度を計算により求めた棒グラフである。
【００６１】
ＤＮＡ伸長反応においては、一塩基の伸長反応が進むごとに一分子のピロリン酸が産生されることは周知である。非特異的に増幅された各ＤＮＡ断片の長さ（ｂｐ）×濃度（ｎＭ）を求め、それらを全て足し合わせることによって、全ての非特異的増幅産物が増幅される際に産生されたピロリン酸濃度を求められ得る。各ＤＮＡ断片の長さおよび濃度はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００より求められ得る。
【００６２】
図６（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図６（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ４５％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図９（１）および図９（２）は示す。反応後の溶液が含有するピロリン酸の濃度を測定することによって、ＤＮＡ増幅の濃度が測定され得る。非特異的な増幅により産生されるピロリン酸は大きなノイズとなり得る。しかし、ブロック核酸の添加は、非特異的な増幅により産生されるピロリン酸によるノイズを低減し得る。
【００６３】
図７（Ｂ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＢＯ−ＯＦとＡＢＯ−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図７（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５１６．５ｎＭであった。
【００６４】
図７（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図７（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ６６％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図９（３）および図９（４）は示す。
【００６５】
図８（Ｂ）は、プロファイル１Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＢＯ−ＯＦとＡＢＯ−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図８（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、３７５．２ｎＭであった。
【００６６】
図７（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図７（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ６１％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図９（５）および図９（６）は示す。
【００６７】
実施例１および比較例１ａは、ブロック核酸の添加が、一本鎖標的配列の増幅効率を著しく高め、かつ非特異的増幅を大きく抑制し得ることを示している。
【００６８】
念のため、本発明者らは、ＡＢＯ−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋだけを第１段階のＰＣＲ後に添加して実験した。その結果、この場合も、ＡＢＯ−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＡＢＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋの両方を添加した場合ほどではないが、ＡＢＯ−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＡＢＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋのいずれも添加しなかった場合に比べ、標的配列の増幅効率が高められ、かつ非特異的増幅が抑制されたことが確認された。
【００６９】
（比較例１ｂ）
比較例１ｂでは、図４のように、３'末端がリン酸化修飾されていないＡＢＯ−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターフォワードプライマー」）および３'末端がリン酸化修飾されていないＡＢＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターリバースプライマー」）が用いられた。プロファイル１Ａが用いられた。
【００７０】
図１０はその電気泳動結果を示す。図１０におけるＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片濃度は、図６（Ｂ）のそれにより明らかに小さい。さらに、図１０における非特異的増幅の抑制効果は、図６（Ｂ）のそれより明らかに小さい。
【００７１】
以上の結果より、３’末端をリン酸化修飾しないブロックプライマーでは、充分な非特異的増幅の抑制効果を得られなかった。
【００７２】
以下の実施例２および比較例２は図５に対応する。以下の実施例２および比較例２では、標的配列はヒトのＡＬＤＨ２遺伝子に含まれるＤＮＡ断片であった。
【００７３】
（比較例２）
本比較例２では、アウターフォワードプライマーの配列は５’−ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴ−３’（配列番号７、以降、「ＡＬＤＨ２−ＯＦ」）であった。アウターリバースプライマーの配列は５’−ＧＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＣ−３’（配列番号８、以降、「ＡＬＤＨ２−ＯＲ」）であった。このプライマー対は、ヒトのＡＬＤＨ２遺伝子内に含まれる２５１ｂｐのＤＮＡ断片を増幅する。
【００７４】
インナーフォワードプライマーの配列は５’−ＧＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣ−３’（配列番号９、以降、「ＡＬＤＨ２−ＩＦ」）であった。インナーリバースプライマーの配列はＡＬＤＨ２−ＯＲと同じである。ＡＬＤＨ２−ＩＦおよびＡＬＤＨ２−ＯＲとのプライマー対は、上記２５１ｂｐのＤＮＡ断片内に存在する１６０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し得る。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
【００７５】
第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通りである。
０．０５Ｕ／μＬ  ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラバイオ株式会社製）、
１×ＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ  （Ｍｇ2+  ｐｌｕｓ）（タカラバイオ株式会社製）、
２００μＭ  ｄＮＴＰ、
１μＭ  ＡＬＤＨ２−ＯＦ、
１μＭ  ＡＬＤＨ２−ＯＲ、
０．８３ｎｇ／μＬ  ゲノムＤＮＡ
全容量：１０μＬ
【００７６】
ＰＣＲの温度プロファイル２Ａ〜Ｃは表２の通りであった。
【００７７】
【表２】
2011114369.tif 000024
【００７８】
二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に１０μＭ  ＡＬＤＨ２−ＩＦを１μＬ添加することによって調製された。
【００７９】
図１１（Ａ）は、プロファイル２Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）だけでなく、ＡＬＤＨ２−ＯＦとＡＬＤＨ２−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片も検出されたことを図１１（Ａ）は示す。さらに、図１１（Ａ）は、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１０．７ｎＭであった。
【００８０】
図１２（Ａ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ａ）と同様、図１２（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１３．６ｎＭであった。
【００８１】
図１３（Ａ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ａ）と同様、図１３（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、９．９ｎＭであった。
【００８２】
（実施例２）
実験例２では、第１段階のＰＣＲ後の反応液に、
１μＬの１０μＭ  ＡＬＤＨ２−ＩＦ、および
１μＬのアウターフォワードブロック核酸
が添加されたＰＣＲ溶液が用いられた。
【００８３】
当該アウターフォワードブロック核酸は、５’−ＡＧＣＡＧＴＴＧＡＣＣＣＴＧＴＡＡＴＴＴＧ−３’（配列番号１０）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された濃度１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＡＬＤＨ２−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＡＬＤＨ２−ＯＦに相補的であった。
【００８４】
図１１（Ｂ）は、プロファイル２Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）は検出されたが、ＡＬＤＨ２−ＯＦとＡＬＤＨ２−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片はほとんど検出されなかったことを図１１（Ｂ）は示す。さらに、図１１（Ｂ）は、非特異的な増幅産物を示すピークをほとんど示していない。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５８．６ｎＭであった。図１１（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＡＬＤＨ２−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＡＬＤＨ２−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲの組み合わせからのＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制された。
【００８５】
図１４は、図９と同様、非特異的な増幅の抑制を定量的に示している。図１１（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図１１（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ９５％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図１４（１）および図１４（２）は示す。
【００８６】
図１２（Ｂ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＬＤＨ２−ＯＦとＡＬＤＨ２−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図１２（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５８．６ｎＭであった。
【００８７】
図１２（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図１２（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ８７％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図１４（３）および図１４（４）は示す。
【００８８】
図１３（Ｂ）は、プロファイル２Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＬＤＨ２−ＯＦとＡＬＤＨ２−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図１３（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５３．５ｎＭであった。
【００８９】
図１３（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図１３（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ８１％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図１４（５）および図１４（６）は示す。
【００９０】
実施例２および比較例２は、ブロック核酸の添加が、標的配列の増幅効率を高め、かつ非特異的増幅を抑制し得ることを示している。
【００９１】
以下の実施例３、比較例３ａ、および比較例３ｂは図３に対応する。以下の実施例３、比較例３ａ、および比較例３ｂでは、標的配列はヒトのジストロフィン遺伝子に含まれるＤＮＡ断片であった。
【００９２】
（比較例３）
本比較例３では、アウターフォワードプライマーの配列は５’−ＧＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＣ−３’（配列番号１１、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ」）であった。アウターリバースプライマーの配列は５’−ＴＴＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号１２、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ」）であった。このプライマー対は、ヒトのジストロフィン遺伝子内に含まれる４５９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し得る。
【００９３】
インナーフォワードプライマーの配列は５’−ＡＧＧＣＴＴＧＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＴＡＧＡＡＧＴ−３’（配列番号１３、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦ」）であった。インナーリバースプライマーの配列は５’−ＧＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＣ−３’（配列番号１４、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＩＲ」）であった。このＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲのプライマー対は、上記４５９ｂｐのＤＮＡ断片内に存在する１４７ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し得る。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
【００９４】
第１段階のＰＣＲ溶液の組成は、以下の通りであった。
１×  ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（クロンテック社製）、
１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（クロンテック社製）、
２００μＭ  ｄＮＴＰ、
１μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ、
１μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ、
０．５ｎｇ／μＬ  ゲノムＤＮＡ
全容量：１０μＬ
【００９５】
ＰＣＲの温度プロファイル３Ａ〜Ｂは表３の通りであった。
【００９６】
【表３】
2011114369.tif 000025
【００９７】
二段階目のＰＣＲ溶液は、上記第１段階のＰＣＲ後の反応液に０．５μＬの２０μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦおよび０．５μＬの２０μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＩＲを添加することによって調製された。
【００９８】
図１５（Ａ）は、プロファイル３Ａによる電気泳動解析結果を示す。ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片（すなわち、標的配列）だけでなく、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片も検出されたことを図１５（Ａ）は示す。さらに、図１５（Ａ）は、これらの増幅産物のピーク以外にも、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、２９４．５ｎＭであった。
【００９９】
図１６（Ａ）は、プロファイル３Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１５（Ａ）と同様、図１６（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１９６．１ｎＭであった。
【０１００】
（実施例３）
本実施例３では、比較例３と同じアウターフォワードプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ）、アウターリバースプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ）、インナーフォワードプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦ）、およびインナーリバースプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＩＲ）が用いられた。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
【０１０１】
第１段階のＰＣＲ溶液の組成および温度プロファイル３Ａ・３Ｂは、比較例３ａと全く同じであった。
【０１０２】
二段階目のＰＣＲ溶液は、第１段階のＰＣＲ後の反応液に、
０．５μＬの２０μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦ
０．５μＬの２０μＭ  ＤＹＳＴＲＯ−ＩＲ
１μＬのアウターフォワードブロック核酸、および
１μＬのアウターリバースブロック核酸
を添加することによって調製された。
【０１０３】
当該アウターフォワードブロック核酸は、５’−ＧＡＣＴＴＴＴＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＣ−３’（配列番号１５）からなり、かつその３’末端がリン酸化修飾された１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦに対して相補的であった。
【０１０４】
当該アウターリバースブロック核酸は、５’−ＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＴＡＧＡＡ−３’（配列番号１６）からなり、かつその３'末端がリン酸化修飾された１００μＭのオリゴＤＮＡ（以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋ」）であった。この配列は、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲに対して相補的であった。
【０１０５】
図１５（Ｂ）は、プロファイル３Ａによる電気泳動解析結果を示す。図１５（Ｂ）から理解されるように、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲの組み合わせからの増幅産物濃度、およびＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度は、いずれも、検出限界以下であった。
【０１０６】
ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は５９３．２ｎＭであった。図１５（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲの組み合わせによるＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制された。
【０１０７】
図１６（Ｂ）は、プロファイル３Ｂによる電気泳動解析結果を示す。図１６（Ｂ）から理解されるように、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度、ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲの組み合わせからの増幅産物濃度、およびＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＯＲの組み合わせからの増幅産物濃度は、いずれも、検出限界以下であった。
【０１０８】
ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は５７１．６ｎＭであった。図１６（Ｂ）から理解されるように、二段階目のＰＣＲ溶液がＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ−ＢｌｏｃｋおよびＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋを含有するため、ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせによるＰＣＲが極めて効率的に行われ、そして非特異的な増幅が著しく抑制された。
【０１０９】
（比較例３ｂ）
比較例３ｂでは、図４のように、３'末端がリン酸化修飾されていないＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ−Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターフォワードプライマー」）および３'末端がリン酸化修飾されていないＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ−Ｂｌｏｃｋ（図４における「アウターリバースプライマー」）が用いられた。プロファイル３Ａが用いられた。
【０１１０】
図１７はその電気泳動結果を示す。図１７におけるＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片濃度は、図１５（Ｂ）および図１６（Ｂ）のそれらより明らかに小さい。さらに、図１７における非特異的増幅の抑制効果は、図１５（Ｂ）および図１６（Ｂ）のそれらより明らかに小さい。
【０１１１】
以上の結果より、３’末端をリン酸化修飾しないブロックプライマーでは、充分な非特異的増幅の抑制効果を得られなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は、標的配列を増幅する方法であって、標的配列の高い増幅効率、および非特異的増幅の著しい抑制効果を示す標的配列を増幅する方法を提供する。
【符号の説明】
【０１１３】
１  標的配列
１ａ  一本鎖標的配列
１ｂ  相補的一本鎖標的配列
４ｏｆ  アウターフォワードプライマー
４ｏｒｂ  アウターフォワードブロック核酸
４ｉｆ  インナーフォワードプライマー
５ｏｒ  アウターリバースプライマー
５ｉｒ  インナーリバースプライマー
５ｏｒｂ  アウターリバースブロック核酸
６  第１一本鎖ＤＮＡ
６ａ  第１非増幅配列
６ｂ  第２非増幅配列
６ｃ  第３非増幅配列
６ｄ  第４非増幅配列
６ｍ  中間一本鎖標的配列
６ｓ  アウターリバースブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分
７  第２一本鎖ＤＮＡ
７ａ  第５非増幅配列
７ｂ  第６非増幅配列
７ｃ  第７非増幅配列
７ｄ  第８非増幅配列
７ｍ  相補的中間一本鎖標的配列
７ｓ  アウターフォワードブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分
【配列表フリーテキスト】
【０１１４】
配列番号１：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターフォワードプライマー
配列番号２：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターリバースプライマー
配列番号３：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのインナーフォワードプライマー
配列番号４：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのインナーリバースプライマー
配列番号５：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターフォワードプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号６：ＡＢＯ式血液型遺伝子のためのアウターリバースプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号７：ＡＬＤＨ２遺伝子のためのアウターフォワードプライマー
配列番号８：  ＡＬＤＨ２遺伝子のためのアウターリバースプライマーまたはインナーリバースプライマー
配列番号９：  ＡＬＤＨ２遺伝子のためのインナーフォワードプライマー
配列番号１０：ＡＬＤＨ２遺伝子のためのアウターフォワードプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号１１：ジストロフィン遺伝子のためのアウターフォワードプライマー
配列番号１２：ジストロフィン遺伝子のためのアウターリバースプライマー
配列番号１３：ジストロフィン遺伝子のためのインナーフォワードプライマー
配列番号１４：ジストロフィン遺伝子のためのインナーリバースプライマー
配列番号１５：ジストロフィン遺伝子のためのアウターフォワードプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
配列番号１６：ジストロフィン遺伝子のためのアウターリバースプライマーのブロック核酸（ＤＮＡ）
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  Panasonic Corporation
YAKU, Hidenobu 
HAYASHI, Miho 
<120>  a method for amplifying a double-stranded target sequence in a double-stranded DNA
<130>  2040325004
<160>  16    
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Outer Forward primer for ABO gene 
<400>  1
gccagctcca tgtggccgca c                                               21
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Outer Reverse primer for ABO gene
<400>  2
cctgggtctc taccctcggc                                                 20
<210>  3
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Inner Forward Primer for ABO gene
<400>  3
tgcagtagga aggatgtcct c                                               21
<210>  4
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Inner Reverse Primer for ABO gene
<400>  4
ttcttgatgg caaacacagt taac                                            24
<210>  5
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Block DNA of outer forward primer for ABO gene 
<400>  5
gtgcggccac atggagctgg c                                               21
<210>  6
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Block DNA of outer reverse primer for ABO gene
<400>  6
gccgagggta gagacccagg                                                 20
<210>  7
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Outer Forward Primer for ALDH2 gene
<400>  7
caaattacag ggtcaactgc t                                               21
<210>  8
<211>  17
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Outer and Inner Reverse Primer for ALDH2 gene
<400>  8
ggcaggtcct gaacctc                                                    17
<210>  9
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Inner Forward Primer for ALDH2 gene
<400>  9
gtacgggctg caggcataca c                                               21
<210>  10
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Block DNA of outer forward primer for ALDH2 gene
<400>  10
agcagttgac cctgtaattt g                                               21
<210>  11
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Outer Forward Primer for dystrophin gene
<400>  11
gatggcaaaa gtgttgagaa aaagtc                                          26
<210>  12
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Outer Reverse Primer for dystrophin gene
<400>  12
ttctaccaca tcccattttc ttcca                                           25
<210>  13
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Inner Forward Primer for dystrophin gene
<400>  13
aggcttgaaa gggcaagtag aagt                                            24
<210>  14
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Inner Reverse Primer for dystrophin gene
<400>  14
gctgatctgc tggcatcttg c                                               21
<210>  15
<211>  26
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Block DNA of outer forward primer for dystrophin gene
<400>  15
gactttttct caacactttt gccatc                                          26
<210>  16
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Block DNA of outer reverse primer for dystrophin gene
<400>  16
tggaagaaaa tgggatgtgg tagaa                                           25
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−第４非増幅配列（６ｄ）−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端−第５非増幅配列（７ａ）−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−第８非増幅配列（７ｄ）−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）は、前記第７非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、インナーリバースプライマー（５ｉｒ）、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
【請求項２】
前記工程（Ｂ）において、さらにアウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）が混合され、
前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、前記アウターリバースプライマー（５ｏｒ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）を増幅する方法であって、
前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第３非増幅配列（６ｃ）−第４非増幅配列（６ｄ）−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端−第５非増幅配列（７ａ）−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第７非増幅配列（７ｃ）−第８非増幅配列（７ｄ）−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第５非増幅配列（７ａ）、第６非増幅配列（７ｂ）、第７非増幅配列（７ｃ）、および第８非増幅配列（８ｃ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、前記第２非増幅配列（６ｂ）、前記第３非増幅配列（６ｃ）および前記第４非増幅配列（６ｄ）と相補的であり、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、およびアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）、およびインナーリバースプライマー（５ｉｒ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列（６ｂ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列（７ｂ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）は、前記第２非増幅配列（６ｂ）に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマー（５ｉｒ）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）、、およびアウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列（１）を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマー（４ｉｆ）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、前記アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）と相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
【請求項１０】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項９に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2011114369.tif 000026
【図２】
2011114369.tif 000027
【図３】
2011114369.tif 000028
【図４】
2011114369.tif 000029
【図５】
2011114369.tif 000030
【図６】
2011114369.tif 000031
【図７】
2011114369.tif 000032
【図８】
2011114369.tif 000033
【図９】
2011114369.tif 000034
【図１０】
2011114369.tif 000035
【図１１】
2011114369.tif 000036
【図１２】
2011114369.tif 000037
【図１３】
2011114369.tif 000038
【図１４】
2011114369.tif 000039
【図１５】
2011114369.tif 000040
【図１６】
2011114369.tif 000041
【図１７】
2011114369.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月22日(2010.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１一本鎖ＤＮＡおよび第２一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法であって、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ、およびアウターフォワードプライマー、およびアウターリバースプライマーを混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、
前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列および相補的一本鎖標的配列からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡは、３’末端−第１非増幅配列−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−第３非増幅配列−第４非増幅配列−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡは、５’末端−第５非増幅配列−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−第７非増幅配列−第８非増幅配列−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列、前記第５非増幅配列、第６非増幅配列、第７非増幅配列、および第８非増幅配列は、それぞれ、前記一本鎖標的配列、前記第１非増幅配列、前記第２非増幅配列、前記第３非増幅配列および前記第４非増幅配列と相補的であり、
前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−第３非増幅配列−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−第７非増幅配列−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマーは、前記第２非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記アウターリバースプライマーは、前記第７非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー、インナーリバースプライマー、およびアウターフォワードブロック核酸を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマーは、前記一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマーは、前記相補的一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸は、前記アウターフォワードプライマーと相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
【請求項２】
前記工程（Ｂ）において、さらにアウターリバースブロック核酸が混合され、
前記アウターリバースブロック核酸は、前記アウターリバースプライマーと相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アウターフォワードブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アウターフォワードブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アウターフォワードブロック核酸は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アウターリバースブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記アウターリバースブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記アウターリバースブロック核酸は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
第１一本鎖ＤＮＡおよび第２一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法であって、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ、およびアウターフォワードプライマー、およびインナーリバースプライマーを混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、
前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列および相補的一本鎖標的配列からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡは、３’末端−第１非増幅配列−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−第３非増幅配列−第４非増幅配列−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡは、５’末端−第５非増幅配列−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−第７非増幅配列−第８非増幅配列−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列、前記第５非増幅配列、第６非増幅配列、第７非増幅配列、および第８非増幅配列は、それぞれ、前記一本鎖標的配列、前記第１非増幅配列、前記第２非増幅配列、前記第３非増幅配列および前記第４非増幅配列と相補的であり、
前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマーは、前記第２非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマーは、前記相補的一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー、およびアウターフォワードブロック核酸を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマーは、前記一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸は、前記アウターフォワードプライマーと相補的であり、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応の起点とならない、方法。
【請求項１０】
前記アウターフォワードブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アウターフォワードブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記アウターフォワードブロック核酸は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項９に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月18日(2011.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
ブロック核酸（４ｏｆｂ・５ｏｒｂ）が添加されると、アウターフォワードブロック核酸（４ｏｆｂ）はアウターフォワードプライマー（４ｏｆ）に結合し、プライマーダイマーと呼ばれる二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。同様に、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）はアウターリバースプライマー（５ｏｒ）に結合し、二本鎖ＤＮＡ構造を形成する。これらの二本鎖ＤＮＡ構造の形成は、アウターフォワードプライマー（４ｏｆ）およびアウターリバースプライマー（５ｏｒ）の活性を低下させる。従って、図２に示すような、第２段階のＰＣＲにおけるアウタープライマーからのＤＮＡ伸長反応が抑制される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）も、アウターリバースプライマー（５ｏｒ）の濃度よりも高い濃度を有することが好ましい。より具体的には、アウターリバースブロック核酸（５ｏｒｂ）は、アウターリバースプライマー（５ｏｒ）の５倍の濃度を有することが好ましく、１０倍の濃度を有することがさらに好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
図８（Ａ）は、プロファイル１Ｃによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ａ）と同様、図８（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、１５７．０ｎＭであった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
図８（Ｂ）は、プロファイル１Ｃによる電気泳動解析結果を示す。図６（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＢＯ−ＯＦとＡＢＯ−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図８（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＢＯ−ＩＦとＡＢＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、３７５．２ｎＭであった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
図８（Ａ）に示される入れ子型ＰＣＲの結果と比較して、図８（Ｂ）に示される入れ子型ＰＣＲは、およそ６１％の非特異的増幅を抑制し得ることを、図９（５）および図９（６）は示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
図１３（Ａ）は、プロファイル２Ｃによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ａ）と同様、図１３（Ａ）もまた、非特異的な増幅産物を示す多数のピークを示している。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、９．９ｎＭであった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
図１３（Ｂ）は、プロファイル２Ｃによる電気泳動解析結果を示す。図１１（Ｂ）と同様、標的配列は検出されたが、ＡＬＤＨ２−ＯＦとＡＬＤＨ２−ＯＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片を含め、非特異的な増幅産物を示すピークを図１３（Ｂ）はほとんど示していない。ＡＬＤＨ２−ＩＦとＡＬＤＨ２−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片の濃度は、５３．５ｎＭであった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
（比較例３ａ）
本比較例３ａでは、アウターフォワードプライマーの配列は５’−ＧＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＴＣ−３’（配列番号１１、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ」）であった。アウターリバースプライマーの配列は５’−ＴＴＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号１２、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ」）であった。このプライマー対は、ヒトのジストロフィン遺伝子内に含まれる４５９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
インナーフォワードプライマーの配列は５’−ＡＧＧＣＴＴＧＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＴＡＧＡＡＧＴ−３’（配列番号１３、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦ」）であった。インナーリバースプライマーの配列は５’−ＧＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＣ−３’（配列番号１４、以降、「ＤＹＳＴＲＯ−ＩＲ」）であった。このＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲのプライマー対は、上記４５９ｂｐのＤＮＡ断片内に存在する１４７ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し得る。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
（実施例３）
本実施例３では、比較例３ａと同じアウターフォワードプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＯＦ）、アウターリバースプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＯＲ）、インナーフォワードプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＩＦ）、およびインナーリバースプライマー（ＤＹＳＴＲＯ−ＩＲ）が用いられた。これらのプライマーを用いて以下の通り入れ子型ＰＣＲを行った。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
図１７はその電気泳動結果を示す。図１７におけるＤＹＳＴＲＯ−ＩＦとＤＹＳＴＲＯ−ＩＲとの組み合わせから得られたＤＮＡ断片濃度は、図１５（Ｂ）および図１６（Ｂ）のそれらより明らかに小さい。さらに、図１７における非特異的増幅の抑制効果は、図１５（Ｂ）および図１６（Ｂ）のそれらより明らかに小さい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
１  標的配列
１ａ  一本鎖標的配列
１ｂ  相補的一本鎖標的配列
４ｏｆ  アウターフォワードプライマー
４ｏｆｂ  アウターフォワードブロック核酸
４ｉｆ  インナーフォワードプライマー
５ｏｒ  アウターリバースプライマー
５ｉｒ  インナーリバースプライマー
５ｏｒｂ  アウターリバースブロック核酸
６  第１一本鎖ＤＮＡ
６ａ  第１非増幅配列
６ｂ  第２非増幅配列
６ｃ  第３非増幅配列
６ｄ  第４非増幅配列
６ｍ  中間一本鎖標的配列
６ｓ  アウターリバースブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分
７  第２一本鎖ＤＮＡ
７ａ  第５非増幅配列
７ｂ  第６非増幅配列
７ｃ  第７非増幅配列
７ｄ  第８非増幅配列
７ｍ  相補的中間一本鎖標的配列
７ｓ  アウターフォワードブロックプライマーに相補的な配列と同一または類似の配列部分
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月14日(2011.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１一本鎖ＤＮＡおよび第２一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法であって、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ、およびアウターフォワードプライマー、およびアウターリバースプライマーを混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、
前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列および相補的一本鎖標的配列からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡは、３’末端−第１非増幅配列−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−第３非増幅配列−第４非増幅配列−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡは、５’末端−第５非増幅配列−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−第７非増幅配列−第８非増幅配列−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列、前記第５非増幅配列、第６非増幅配列、第７非増幅配列、および第８非増幅配列は、それぞれ、前記一本鎖標的配列、前記第１非増幅配列、前記第２非増幅配列、前記第３非増幅配列および前記第４非増幅配列と相補的であり、
前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−第３非増幅配列−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−第７非増幅配列−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマーは、前記第２非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記アウターリバースプライマーは、前記第７非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー、インナーリバースプライマー、およびアウターフォワードブロック核酸を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマーは、前記一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマーは、前記相補的一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸は、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡ、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、または
ペプチド核酸
からなる、方法。
【請求項２】
前記工程（Ｂ）において、さらにアウターリバースブロック核酸が混合され、
前記アウターリバースブロック核酸は、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡ、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、または
ペプチド核酸
からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１一本鎖ＤＮＡおよび第２一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法であって、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ、およびアウターフォワードプライマー、およびインナーリバースプライマーを混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、
前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列および相補的一本鎖標的配列からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡは、３’末端−第１非増幅配列−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−第３非増幅配列−第４非増幅配列−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡは、５’末端−第５非増幅配列−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−第７非増幅配列−第８非増幅配列−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列、前記第５非増幅配列、第６非増幅配列、第７非増幅配列、および第８非増幅配列は、それぞれ、前記一本鎖標的配列、前記第１非増幅配列、前記第２非増幅配列、前記第３非増幅配列および前記第４非増幅配列と相補的であり、
前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマーは、前記第２非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマーは、前記相補的一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー、およびアウターフォワードブロック核酸を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマーは、前記一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸は、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡ、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、または
ペプチド核酸
からなる、方法。
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月10日(2011.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１一本鎖ＤＮＡおよび第２一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法であって、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ、およびアウターフォワードプライマー、およびアウターリバースプライマーを混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、
前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列および相補的一本鎖標的配列からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡは、３’末端−第１非増幅配列−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−第３非増幅配列−第４非増幅配列−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡは、５’末端−第５非増幅配列−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−第７非増幅配列−第８非増幅配列−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列、前記第５非増幅配列、第６非増幅配列、第７非増幅配列、および第８非増幅配列は、それぞれ、前記一本鎖標的配列、前記第１非増幅配列、前記第２非増幅配列、前記第３非増幅配列および前記第４非増幅配列と相補的であり、
前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−第３非増幅配列−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−第７非増幅配列−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマーは、前記第２非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記アウターリバースプライマーは、前記第７非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー、インナーリバースプライマー、およびアウターフォワードブロック核酸を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマーは、前記一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマーは、前記相補的一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸は、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡ、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、または
ペプチド核酸
からなり、
前記アウターフォワードブロック核酸は、前記アウターフォワードプライマーに相補的な配列を有し、
前記工程（Ｂ）において、前記アウターフォワードブロック核酸は、前記アウターフォワードプライマーに結合する、
方法。
【請求項２】
前記工程（Ｂ）において、さらにアウターリバースブロック核酸が混合され、
前記アウターリバースブロック核酸は、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡ、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、または
ペプチド核酸
からなり、
前記アウターリバースブロック核酸は、前記アウターリバースプライマーに相補的な配列を有し、
前記工程（Ｂ）において、前記アウターリバースブロック核酸は、前記アウターリバースプライマーに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１一本鎖ＤＮＡおよび第２一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法であって、
前記方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を包含する：
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ、およびアウターフォワードプライマー、およびインナーリバースプライマーを混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて中間二本鎖ＤＮＡを増幅する工程（Ａ）、
ここで、
前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列および相補的一本鎖標的配列からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡは、３’末端−第１非増幅配列−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−第３非増幅配列−第４非増幅配列−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡは、５’末端−第５非増幅配列−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−第７非増幅配列−第８非増幅配列−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列、前記第５非増幅配列、第６非増幅配列、第７非増幅配列、および第８非増幅配列は、それぞれ、前記一本鎖標的配列、前記第１非増幅配列、前記第２非増幅配列、前記第３非増幅配列および前記第４非増幅配列と相補的であり、
前記中間二本鎖ＤＮＡは、中間標的配列および相補的中間標的配列からなり、
前記中間標的配列は、３’末端−第２非増幅配列−前記一本鎖標的配列−５’末端からなり、
前記相補的中間標的配列は、５’末端−第６非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−３’末端からなり、
前記アウターフォワードプライマーは、前記第２非増幅配列に含まれる３’末端側の配列の部分と相補的であり、
前記インナーリバースプライマーは、前記相補的一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記中間二本鎖ＤＮＡ、インナーフォワードプライマー、およびアウターフォワードブロック核酸を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記標的配列を特異的に増幅する工程（Ｂ）、
前記インナーフォワードプライマーは、前記一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列部分と相補的であり、
前記アウターフォワードブロック核酸は、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡ、
３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、または
ペプチド核酸
からなり、
前記アウターフォワードブロック核酸は、前記アウターフォワードプライマーに相補的な配列を有し、
前記工程（Ｂ）において、前記アウターフォワードブロック核酸は、前記アウターフォワードプライマーに結合する、
方法。
【国際調査報告】
2011114369.tif 000043
2011114369.tif 000044
2011114369.tif 000045
2011114369.tif 000046