(57)【要約】  UDP-グルコース糖タンパク質グルコース転移酵素１（UGGT1）又はこれをコードする遺伝子を利用した医薬組成物、及びスクリーニング方法などを提供する。UGGT1は既知の膵臓β細胞増殖因子に比べて極めて強い増殖作用を持つので、それ自体が有用な糖尿病治療薬になるほか、新たな糖尿病治療薬の開発のための標的物質としても有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
UGGT1遺伝子を発現するベクターを含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
糖尿病の予防又は治療に用いられることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の医薬組成物を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の膵臓β細胞を増殖させる方法。
【請求項４】
UGGT1遺伝子が導入され、この遺伝子が発現していることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
UGGT1遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したベクターで形質転換された細胞。
【請求項６】
細胞が、膵臓β細胞であることを特徴とする請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
被験物質の存在下で請求項５又は６に記載の細胞を培養する工程、及びレポーター遺伝子の発現量を増大させた被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする糖尿病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
被験物質をUGGT1と共存させ、UGGT1と相互作用をする被験物質を選択する工程、及び前記で選択された被験物質を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の膵臓β細胞を増殖させる被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする糖尿病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、UDP-グルコース糖タンパク質グルコース転移酵素１（UDP-glucose glycoprotein glycosyl transferase 1、以下「UGGT1」という。）又はこれをコードする遺伝子を利用した医薬組成物、及びスクリーニング方法などに関する。UGGT1は既知の膵臓β細胞増殖因子に比べて極めて強い増殖作用を持つので、それ自体が有用な糖尿病治療薬になるほか、新たな糖尿病治療薬の開発のための標的物質としても有用である。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は現代の国民病（予備軍を含めると1470万人程度と予想されている）であり、日本人の場合多くはインスリン分泌不全から発症する。インスリンを唯一分泌する膵臓のランゲルハンス島β細胞は特に糖尿病患者において数が少なく、β細胞の再生医療は極めて重要である。【０００３】
膵臓β細胞を増やす再生因子として現在までに知られているものは複数種類存在する。例えば、Pdx1（非特許文献１、非特許文献２）、Mafa（非特許文献３）、Ngn3（非特許文献３）、GLP-1（非特許文献４）、肝臓のerk（非特許文献５）、オステオカルシン（非特許文献６）等である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Rui Takahashi et al., Journal of Molecular Endocrinology38:127-136, 2007.
【非特許文献２】Junta Imai etal.,  Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 326:4022-409, 2005.
【非特許文献３】Qiao Zhou et al.,Nature 455:627-633, 2008.
【非特許文献４】Doris A Stoffers etal., Diabetes 49:741-748, 2000.
【非特許文献５】Junta Imai et al.,Science 322:1250-1254, 2008.
【非特許文献６】Na Kyung Lee etal.,  Cell 130:456-469, 2007.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した膵臓β細胞増殖因子は、膵臓β細胞を野生型に比べて２〜３倍程度増やすにすぎない。糖尿病の治療のためには、より増殖作用の高い因子が望まれる。本発明は、このような技術的背景のもとになされたものであり、高い増殖作用を持つ膵臓β細胞増殖因子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、UGGT1というタンパク質が膵臓β細胞に対し増殖作用を持つこと、及びその増殖作用が既知の膵臓β細胞増殖因子よりも著しく高いことを見出した。【０００７】
UGGT1やその遺伝子の配列は既知であるが、このタンパク質が膵臓β細胞に対し増殖作用を持つことは知られていなかった。UGGT1遺伝子をノックアウトしたマウスは作製されているが（引用文献１）、胎児期に致死となるため、膵臓の解析は行われていなかった。【０００８】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。【０００９】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（８）を提供する。
（１）UGGT1遺伝子を発現するベクターを含有することを特徴とする医薬組成物。
（２）糖尿病の予防又は治療に用いられることを特徴とする（１）に記載の医薬組成物。
（３）（１）又は（２）に記載の医薬組成物を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の膵臓β細胞を増殖させる方法。
（４）UGGT1遺伝子が導入され、この遺伝子が発現していることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。
（５）UGGT1遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したベクターで形質転換された細胞。
（６）細胞が、膵臓β細胞であることを特徴とする（５）に記載の細胞。
（７）被験物質の存在下で（５）又は（６）に記載の細胞を培養する工程、及びレポーター遺伝子の発現量を増大させた被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする糖尿病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
（８）被験物質をUGGT1と共存させ、UGGT1と相互作用をする被験物質を選択する工程、及び前記で選択された被験物質を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の膵臓β細胞を増殖させる被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする糖尿病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の医薬組成物中に含まれるUGGT1は、膵臓β細胞に対し強い増殖作用を持つ。従って、本発明の医薬組成物は、糖尿病などの予防薬や治療薬として有用である。また、UGGT1は、糖尿病の治療薬の開発のための標的物質としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】UGGT1遺伝子を膵臓β細胞で強制発現させたマウス（以下、単に「UGGT1マウス」という。）の各臓器におけるUGGT1遺伝子のmRNAの量をRT-PCR法で解析した結果を示す図である。膵臓（レーン1）、肝臓（レーン2）、脳（レーン3）、腎臓（レーン4）、骨（レーン5）から抽出したRNAに対してRT-PCRを行った。UGGT1遺伝子のmRNAは、矢印の位置に検出される。図に示すように膵臓から抽出したRNAに対してRT-PCRを行った場合にのみ、UGGT1遺伝子のmRNAは検出される。
【図２】野生型（左）及びUGGT1マウス（右）の膵臓の顕微鏡写真。矢印はランゲルハンス島を示す。両写真とも左下のスケールバーは1000μｍである。
【図３】種々のマウスの膵臓ランゲルハンス島の大きさを示す図。図中の1 WTは野生型マウスを示し、2 PはPdx1遺伝子が導入されたマウス（引用文献２及び３）を示し、3PNMはPdx1遺伝子とNgn3遺伝子とMafa遺伝子が導入されたマウスを示し（引用文献４）、4 GはGLP1遺伝子が導入されたマウスを示し（引用文献５）、5Eは肝臓にerk遺伝子が導入されたマウスを示し（引用文献６）、6 Oはオステオカルシン遺伝子が導入されたマウスを示し（引用文献７）、7 UGGT1はUGGT1マウスを示す。
【図４】ストレプトゾトシンを投与した野生型およびUGGT1マウスの血糖値の変化を示す図。野生型（WT）及びUGGT1（TG）マウスにストレプトゾトシンを投与直前（D0）、48時間後（D2）に採血し、血糖値の測定を行った。野生型マウスはストレプトゾトシン投与により血糖値が有意に（p<0.0001）上昇したが、UGGT1マウスは有意な上昇が見られなかった（#>0.05）。
【図５】ストレプトゾトシンを投与した野生型およびUGGT1マウスのインスリン濃度の変化を示す図。野生型（WT）及びUGGT1（TG）マウスにストレプトゾトシンを投与直前（D0）、48時間後（D2）に採血し、インスリン濃度の測定を行った。野生型マウスはストレプトゾトシン投与によりインスリン濃度が有意に（***;p<0.0001）減少したが、UGGT1マウスは有意な減少が見られなかった（#; p>0.05）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の医薬組成物は、UGGT1遺伝子を発現するベクターを含有することを特徴とするものである。
【００１４】
UGGT1は既知のタンパク質であり、それをコードする遺伝子（UGGT1遺伝子）の塩基配列もNCBIやGenBankなどのデータベース上に公開されている。例えば、マウス由来のUGGT1遺伝子及びヒト由来のUGGT1遺伝子の塩基配列は、それぞれアクセッション番号NM_198899及びNM_020120として登録されている。使用するUGGT1タンパク質やUGGT1遺伝子は天然のものであってもよいが、天然のUGGT1のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、天然のUGGT1と同様にβ細胞増殖作用を有する改変型のUGGT1やそれをコードする遺伝子を使用してもよい。
【００１５】
UGGT1遺伝子は、適当なプロモーターなどと共にベクターに挿入して使用される。プロモーターとしては、UGGT1遺伝子自体のプロモーターを用いてもよく、また、それ以外のプロモーターを用いてもよい。UGGT1遺伝子のプロモーター以外のプロモーターとしては、UGGT1遺伝子を膵臓に発現させ得るものが好ましく、インスリンIIプロモーター、インスリンIプロモーターなどを例示できる。
【００１６】
ベクターは遺伝子治療などに用いられるもの、例えば、ウイルスベクターなどを用いることができる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、AAVベクター、SV40ベクターなどを例示できる。
【００１７】
本発明の医薬組成物の投与方法は特に限定されず、一般的な遺伝子治療法で用いられている方法に従うことができる。例えば、皮内、腹腔内、静脈、動脈、又は脊髄液への注射又は点滴等によって投与することができる。
【００１８】
本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、投与形態、投与経路、投与対象の性質などに応じて適宜選択することができる。一般的な投与量は、成人では一日当たりUGGT1遺伝子の重量にして、10mg〜1000mgの範囲が適当である。
【００１９】
本発明の医薬組成物を注射又は点滴によって投与する場合は、注射液や点滴液に通常含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、液体担体（例えば、リン酸カリウム緩衝液、生理食塩水、リンゲル液、蒸留水、ポリエチレングリコール、植物性油脂、エタノール、グリセリン、ジメチルスルホキサイド、プロピレングリコールなど）、抗菌剤、局所麻酔剤（例えば、塩酸プロカイン、塩酸ジブカインなど）、緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）、浸透圧調節剤（例えば、グルコース、ソルビトール、塩化ナトリウムなど）を例示できる。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、糖尿病の予防や治療に用いることができる。本発明の医薬組成物は１型糖尿病及び２型糖尿病のいずれにも有効であるが、β細胞を再生できることから、１型糖尿病に対して特に有効であると予想される。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、ヒトに用いるものであるが、ヒト以外の動物に投与し、その動物の膵臓β細胞を増殖させてもよい。対象となる動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サルなどを挙げることができる。
【００２２】
UGGT1遺伝子は、医薬組成物のほかに、トラスジェニック動物の作製にも利用できる。例えば、UGGT1遺伝子を発現するベクターをヒト以外の動物の受精卵に注入し、その受精卵を仮親動物に移植することで、UGGT1遺伝子を発現するトラスジェニック動物を作製できる。作製対象とする動物としては、マウス、ラット、イヌ、サルなどを挙げることができる。
【００２３】
UGGT1は膵臓β細胞を増殖させることから、生体内のUGGT1の量を増加させる物質（物質Ａ）やUGGT1の膵臓β細胞増殖作用を高める物質（物質Ｂ）は、糖尿病の治療薬の候補となり得る。従って、物質Ａ又は物質Ｂをスクリーニングすることで新たな糖尿病の予防薬や治療薬を見出すことができる。
【００２４】
物質Ａをスクリーニングする方法としては、被験物質の存在下で、UGGT1遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したベクターで形質転換された細胞を培養する工程、及びレポーター遺伝子の発現量を増大させた被験物質を選択する工程を含む方法を例示できる。
【００２５】
上記細胞中のレポーター遺伝子の発現量を増大させる物質は、生体内のUGGT1遺伝子のプロモーターの活性を高め、生体内のUGGT1遺伝子の発現量も増大させると予測される。従って、このスクリーニング方法によって得られる物質は、糖尿病の予防薬又は治療薬となり得る。
【００２６】
使用するレポーター遺伝子は、スクリーニング方法などに一般的に使用されるものでよく、例えば、GFP遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、βギャル遺伝子などを使用することができる。
【００２７】
UGGT1遺伝子のプロモーターの配列は既知であり、データベース上に公開されている。例えば、マウス由来のUGGT1遺伝子のプロモーターはマウス第１染色体上に存在し、その塩基配列はアクセッション番号NT_039170やNM_001030649等として登録されており、ヒト由来のUGGT1遺伝子はヒト第２染色体上に存在し、その塩基配列はアクセッション番号NT_022135やNW_921507やNW_001838849等として登録されており、ラット由来のUGGT1遺伝子はラット第９染色体上に存在し、その塩基配列はアクセッション番号NW_047814やNW_001084882等として登録されている。
【００２８】
UGGT1遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したベクターの作製及びそれによる細胞の形質転換は常法に従って行うことができる。この際、UGGT1遺伝子のプロモーターと細胞は同種の生物に由来するものを使用するのが好ましい。
【００２９】
使用する細胞は、膵臓β細胞であることが好ましい。膵臓β細胞としては、例えば、NIT-1細胞、MIN6細胞、RIN5細胞などを使用することができる。
【００３０】
被験物質がレポーター遺伝子の発現量を増大させたかどうかは、被験物質の非存在下で培養した細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較することにより判定できる。
【００３１】
物質Ｂをスクリーニングする方法としては、被験物質をUGGT1と共存させ、UGGT1と相互作用をする被験物質を選択する工程、及び前記で選択された被験物質を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の膵臓β細胞を増殖させる被験物質を選択する工程を含む方法を例示できる。
【００３２】
UGGT1と相互作用をする物質は、UGGT1のβ細胞増殖作用に影響を与える物質である可能性が高いので、このような物質を選択することにより、被験物質を絞り込むことができる。しかし、ここで選択された物質の中には、UGGT1と相互作用をするが、β細胞増殖作用に影響を与えない物質やUGGT1のβ細胞増殖作用を逆に阻害してしまう物質も含まれている。そこで、選択された物質を非ヒト動物に投与し、その非ヒト動物の膵臓β細胞の増殖状態を調べることにより、前述したような物質を排除し、β細胞増殖作用を高める物質のみを選択できる。
【００３３】
UGGT1と相互作用をするかどうかは、スクリーニング方法などに一般的に適用される方法に従って判断できる。そのような方法としては、Two-hybrid、one-hybrid、FRET、HTRF、LANCE等などを例示できる。
【００３４】
被験物質を投与する非ヒト動物としては、前述したトランスジェニック動物と同様の動物を使用できる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。【００３６】
〔実施例１〕  UGGT1マウスの作製
ラットインスリンIIプロモーター遺伝子（GeneBankに登録されているRATINSIIに記してある配列の243から1125）にUGGT1遺伝子を組み込んだ発現ベクターを構築し、C3Hマウス及びC57Black6マウスの受精卵に注入し、仮親マウスに同受精卵を入れた。F0マウス出生後、遺伝子型をPCRプライマー199M(5’-GCTCTGACTGACCGCGTTACTCC-3’: 配列番号１)及び201M(5’-GGGAGTGTCCCAGGAATCAGG-3’: 配列番号２)にて確認し、C57Black6マウスへ6回交配させた。そのF6マウス（6ヶ月齢）のUGGT1遺伝子の発現をRT-PCRにより解析した。その結果、導入したUGGT1遺伝子はRNAレベルで膵臓に特異的に発現していた（図１）。【００３７】
また、F6マウス（6ヶ月齢）の膵臓の病理的解析を行うと、同マウスは野生型マウスよりも極めて多い（100倍程度）β細胞の出現が見られた（図２）。このような多くのβ細胞の出現は、6ヶ月齢のマウスだけでなく、1、3、12ヶ月齢のマウスにもみられ、また、F6マウスだけでなく、F3、F4、F5マウスにもみられた。【００３８】
UGGT1マウス、及び既知の膵臓β細胞増殖因子を発現させたマウスの膵臓ランゲルハンス島の細胞数を図３に示す。細胞数は、既知の因子が記載されている論文（引用文献２〜７）中の文章や図等に存在するデータをもとに計算し、各論文の野生型を１とした場合の相対値で表した。図に示すように、膵臓ランゲルハンス島の細胞数は、既知因子を発現させたマウスでは多くても野生型の数倍程度であったが、UGGT1マウスでは100倍程度であった。【００３９】
〔実施例２〕  糖尿病モデル動物におけるUGGT1による治療効果の解析
図２及び図３に示すように、UGGT1マウスでは、膵臓ランゲルハンス島の細胞数が顕著に増加していた。そこで、UGGT1マウスにストレプトゾトシンを投与し、糖尿病を誘発させて、UGGT1の治療効果の解析を試みた。ストレプトゾトシンは、膵臓β細胞を特異的に殺し、インスリン濃度を下げて、糖尿病を誘発させる試薬である。投与前に採血し（D0）、投与後48時間後さらに採血し（D2）、その血糖値、インスリン濃度の検定を行った。【００４０】
血糖値については、投与前は野生型、UGGT1マウス共に200mg/dL以下となり、有意差は見られなかった。しかし、投与後の野生型の血糖値は、400mg/dL程度となり、投与前に比べて有意に（p<0.0001）血糖値を上げ、糖尿病を誘発した。一方、UGGT1マウスの血糖値は250mg/dL程度であり、投与前と有意差がなく、糖尿病を誘発しなかった（図４）。【００４１】
インスリン濃度については、野生型は予想通り投与後に濃度が有意に下がったが、UGGT1マウスは下がらなかった（図５）。この結果から、UGGT1マウスはストレプトゾトシンによるβ細胞殺傷に抵抗性があることが判明し、また、UGGT1の抗糖尿病活性がマウス生体において証明された。【００４２】
〔引用文献〕
引用文献１：Maurizio Molinari, Camela Galli, Omar Vanoni, Stacey M Arnold, Randal J Kaufman.
Persistent glycoprotein misfolding activities the glucosidase II/UGT1-driveb Calnexin cycle to delay aggregation and loss of folding competence.
Molecular Cell vol20, p503-512, 2005
引用文献２：Rui Takahashi, Hisanitsu Ishuhara, KazumaTakahashi, Akira Tamura, Suguru Yamaguchi, Takahiro Yamada, Hideki Katagiri, Yoshitomo Oka.
Efficient and controlled gene expression in mouse pancreatic isltes by arterial delivery of tetracycline-inducible adenoviral vectors.
Journal of Molecular Endocrinology 38:127-136, 2007.
引用文献３：Junta Imai, Hideki Katagiri, Tatsuya Yamada, Yasushi Ishigaki, Takehide Ogihara, Kenji Uno, Yutaka Hasegawa, Junhong Gao, Hisamitsu Ishihara, Hironobu Sasano, Hiroyuki Mizuguchi, Tomoichiro Asano, Yoshitomo Oka.
Constitutively active PDX1 induced efficient insulin production in adult murine liver.
Biochemical and Biophysical Research Communications 326:4022-409, 2005.
引用文献４：Qiao Zhou, Juliana Brown, Andrew Kanarek, Jayaraj Rajagopal, Douglas A Melton.
In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to b-cells.
Nature 455:627-633, 2008.
引用文献５：Doris A Stoffers, Timothty J Kieffer, Mehboob A Hussain, Daniel J Drucker, Susan Bonner-Weir, Joel F Habener, Josephine M Egan.
Insulinotropic Glucagon-like peptide 1 stimulate expression of homeodomain protein IDX-1 and increase islet size in mouse pancreas.
Diabetes 49:741-748, 2000.
引用文献６：Junta Imai, Hideki Katagiri, Tetsuya Yamada, Yasushi Ishigaki, Toshinobu Suzuki, Hirohito Kudo, Kenji Uno, Yutaka Hasegawa, Junhong Gao, Keizo Kaneko, Hisamitsu Ishihara, Akira Niijima, Masamitsu Nakazato, Tomoichiro Asano, Yasuhiro Minokoshi, Yoshitomo Oka.
Reluration of pancreatic b cell mass by neuronal signals from the liver.
Science 322:1250-1254, 2008.
引用文献７：Na Kyung Lee, Hideaki Sowa, Eiichi Hinoi, Mathieu Ferron, Jong Deok Ahn,
Cyrille Confavreux, Romain Dacquin, Patrick J Mee, Marc D McKee, Dae Young Jung, Zhiyou Zhang, Jason K Kim, Franck Mauvais-Jarvis, Patricia Ducy, Gerard Karsenty.
Endocrine regulation of energy metabolism by the skeleton.
Cell 130:456-469, 2007.
【産業上の利用可能性】
【００４３】
糖尿病の予防薬や治療薬として有用である。また、糖尿病の新たな治療薬の開発にも有用である。【００４４】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願2010-140444号）の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図３】
2011162115.tif 000002
【図４】
2011162115.tif 000003
【図５】
2011162115.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【配列表】
2011162115000001.app
【国際調査報告】
2011162115.tif 000007
2011162115.tif 000008
2011162115.tif 000009
2011162115.tif 000010