(57)【要約】  蛍光検出装置は、所定の周波数で変調したレーザ光の照射を受けて発する測定対象物の蛍光を受光素子で受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を受光素子は出力する。信号処理部は、出力した蛍光信号を前記周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する。分析装置は、測定対象物が発する蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した第１の位相ずれに対して、出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出する。分析装置は、さらに、算出した第２の位相ずれを用いて測定対象物が発する蛍光の蛍光緩和時間を算出する。
2011083754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置であって、
レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射する光源部と、
前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力する、前記出力レベルの調整が可能な受光素子、を備える受光部と、
前記蛍光信号を前記周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する第１の処理部と、
前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記受光部は、前記受光素子に与える調整パラメータ値により、前記出力レベルを調整する調整部を有する、請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記第２の処理部は、前記補正を行うとき、前記調整パラメータ値に応じて定まる補正式を用いる、請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記第２の処理部は、前記補正式に用いる定数の値を予め記憶し、前記補正を行うとき、前記定数の値を呼び出して用いる、請求項３に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記第２の処理部は、前記受光素子に与える調整パラメータ値を予め変更することにより、前記調整パラメータ値と前記出力レベルとの関係を求め、前記関係が前記受光素子の出力レベルの飽和を表していないとき、前記補正式に用いる前記定数の値を抽出する出力レベル調整部を有する、請求項３または４に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
蛍光緩和時間が既知の基準対象物を測定対象物として用いて前記第２の位相ずれから算出される蛍光緩和時間が、前記補正により、前記基準対象物の既知の蛍光緩和時間に近似するように、前記出力レベル調整部は前記定数の値を抽出する、請求項５に記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記受光素子は光電子増倍管であり、前記調整パラメータ値は、前記光電子増倍管の電極に印加する電圧である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項８】
前記電極に印加する電圧をＶ、前記第１の位相ずれをθmeas、前記第２の位相ずれをθτ、としたとき、前記補正式は、下記式で表される、請求項７に記載の蛍光検出装置。
θτ＝  Ｘ−θmeas−Ａ・Ｖ(-1/2) 
（ＸおよびＡは定数。）
【請求項９】
前記受光素子の受光面の前面には、調整可能な減光フィルタが設けられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項１０】
レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置の蛍光検出方法であって、
レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射するステップと、
前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光素子で受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力するステップと、
前記蛍光信号を前記所定の周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成するステップと、
前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項１１】
レーザ光の照射を受けることにより、蛍光緩和時間が既知の基準対象物が発する蛍光の蛍光信号を蛍光検出装置が処理する方法であって、
レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射する第１のステップと、
前記レーザ光に照射されて発する基準対象物の蛍光を受光素子で受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力する第２のステップと、
前記蛍光信号を前記所定の周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する第３のステップと、
前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれと、前記出力レベルを調整するために、前記受光素子に与える調整パラメータ値とを組にして記憶する第４のステップと、
前記調整パラメータ値を変更して、前記第１のステップ〜前記第４のステップを繰り返すことにより、前記第１の位相ずれと前記調整パラメータ値の組を複数組記憶する第５のステップと、
記憶した前記複数組を呼び出し、前記調整パラメータ値と前記第１の位相ずれとの関係を定める回帰式を、呼び出した前記複数組の関係に近似させることにより、前記回帰式に含まれる未知の定数の値を抽出する第６のステップと、
抽出した前記定数の値を記憶する第７のステップと、を有する蛍光信号を処理する方法。
【請求項１２】
前記第１のステップ〜前記第４のステップを繰り返す度に、前記出力レベルが減少するように、前記調整パラメータ値を変更する、請求項１１に記載の蛍光信号を処理する方法。
【請求項１３】
前記受光素子に受光される前記蛍光は、前記受光素子の出力する前記蛍光信号の出力レベルが飽和しないように、前記受光素子に受光される前に、減光フィルタにより減光される、請求項１１または１２に記載の蛍光信号を処理する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置及び蛍光検出方法と、蛍光信号を処理する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療、生物分野では、フローサイトメータが広く用いられている。このフローサイトメータは、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を光電子増倍管やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器を用いて受光して、細胞や遺伝子等の測定対象物の種類や数、さらには、測定対象物の特性を分析する。【０００３】
具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質等の分析対象物を蛍光試薬でラベル化することにより作られた測定対象物を、圧力を与えて毎秒略１０ｍ以内の速度で管路内を流れるシース液に流してラミナーシースフローを形成する。このフロー中の測定対象物にフローサイトメータがレーザ光を照射することにより、フローサイトメータは、分析対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光を分析対象物のラベルとして識別することで分析対象物を特定する。【０００４】
このフローサイトメータは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、フローサイトメータは、所定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって判別し、判別した細胞や染色体のみを、セル・ソータ等を用いて、生きた状態で短時間で選別収集する。
これのフローサイトメータの使用においては、より多くの測定対象物を、短時間に正確に蛍光の情報から特定することが要求されている。【０００５】
例えば、レーザ光の照射により、測定対象物中の蛍光色素から発せられる蛍光の蛍光寿命（蛍光緩和時間）を算出することにより、多くの測定対象物を、短時間に正確に特定することができる蛍光検出装置および方法が知られている（特許文献１）。
上記蛍光検出装置によると、蛍光検出装置は、レーザ光を強度変調して測定対象物に照射し、測定対象物からの蛍光を光電変換器で受光し、光電変換器が出力した蛍光信号の、レーザ光の強度変調に用いた変調信号に対する位相ずれを求め、この位相ずれから、蛍光緩和時間を算出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２２６６９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記蛍光緩和時間の算出に用いる位相ずれは、蛍光を受光する光電変換器自体の特性に起因する位相ずれ、装置におけるレーザ光や蛍光の光路長の他、電気回路長による位相ずれの影響を除いて算出される。しかし、上記蛍光緩和時間の算出に用いる位相ずれは、光電変換器から出力される蛍光信号の出力レベルに応じて微妙に変化するので、必ずしも、正確な蛍光緩和時間の値が算出されない場合があった。特に、ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）の有無の判定等においては、蛍光緩和時間の値を正確に算出することが望まれる。【０００８】
そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を処理するとき、正確な蛍光緩和時間を算出することができる蛍光検出装置および蛍光検出方法と、この蛍光検出装置および蛍光検出方法に用いる、蛍光信号を信号処理する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置である。当該蛍光検出装置は、
レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射する光源部と、
前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力する、前記出力レベルの調整が可能な受光素子、を備える受光部と、
前記蛍光信号を前記周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する第１の処理部と、
前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、を有する。【００１０】
前記受光部は、前記受光素子に与える調整パラメータ値により、前記出力レベルを調整する調整部を有する、ことが好ましい。
その際、前記第２の処理部は、前記補正を行うとき、前記調整パラメータ値に応じて定まる補正式を用いる、ことが好ましい。
さらに、前記第２の処理部は、前記補正式に用いる定数の値を予め記憶し、前記補正を行うとき、前記定数の値を呼び出して用いる、ことが好ましい。【００１１】
また、前記第２の処理部は、前記受光素子に与える調整パラメータ値を予め変更することにより、前記調整パラメータ値と前記出力レベルとの関係を求め、前記関係が前記受光素子の出力レベルの飽和を表していないとき、前記補正式に用いる前記定数の値を抽出する出力レベル調整部を有する、ことが好ましい。
その際、蛍光緩和時間が既知の基準対象物を測定対象物として用いて前記第２の位相ずれから算出される蛍光緩和時間が、前記補正により、前記基準対象物の既知の蛍光緩和時間に近似するように、前記出力レベル調整部は前記定数の値を抽出する、ことが好ましい。【００１２】
前記受光素子は、例えば光電子増倍管であり、前記調整パラメータ値は、前記光電子増倍管の電極に印加する電圧である。
そのとき、前記電極に印加する電圧をＶ、前記第１の位相ずれをθmeas、前記第２の位相ずれをθτ、としたとき、前記補正式は、下記式で表される、ことが好ましい。
θτ＝  Ｘ−θmeas−Ａ・Ｖ(-1/2) 
（ＸおよびＡは定数。）【００１３】
また、前記受光素子の受光面の前面には、調整可能な減光フィルタが設けられる、ことが好ましい。【００１４】
本発明の他の一態様は、レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置の蛍光検出方法である。当該方法は、
レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射するステップと、
前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光素子で受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力するステップと、
前記蛍光信号を前記所定の周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成するステップと、
前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップと、を有する。【００１５】
本発明のさらに他の一態様は、レーザ光の照射を受けることにより、蛍光緩和時間が既知の基準対象物が発する蛍光の蛍光信号を蛍光検出装置が処理する方法である。当該方法は、
レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射する第１のステップと、
前記レーザ光に照射されて発する基準対象物の蛍光を受光素子で受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力する第２のステップと、
前記蛍光信号を前記所定の周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する第３のステップと、
前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれと、前記出力レベルを調整するために、前記受光素子に与える調整パラメータ値とを組にして記憶する第４のステップと、
前記調整パラメータ値を変更して、前記第１のステップ〜前記第４のステップを繰り返すことにより、前記第１の位相ずれと前記調整パラメータ値の組を複数組記憶する第５のステップと、
記憶した前記複数組を呼び出し、前記調整パラメータ値と前記第１の位相ずれとの関係を定める回帰式を、呼び出した前記複数組の関係に近似させることにより、前記回帰式に含まれる未知の定数の値を抽出する第６のステップと、
抽出した前記定数の値を記憶する第７のステップと、を有する。【００１６】
その際、前記第１のステップ〜前記第４のステップを繰り返す度に、前記出力レベルが減少するように、前記調整パラメータ値を変更する、ことが好ましい。
また、前記受光素子に受光される前記蛍光は、前記受光素子の出力する前記蛍光信号の出力レベルが飽和しないように、前記受光素子に受光される前に、減光フィルタにより減光される、ことが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
上記態様の蛍光検出装置および蛍光検出方法では、測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を処理するとき、正確な蛍光緩和時間を算出することができる。
また、上記一態様の蛍光信号を信号処理する方法では、正確な蛍光緩和時間を算出するための補正式に用いる定数の値を効率よく決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本実施形態の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。
【図２】図１に示すフローサイトメータに用いるレーザ光源部の構成の一例を示す図である。
【図３】図１に示すフローサイトメータに用いる受光部の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
【図４】図１に示すフローサイトメータに用いる光電子増倍管の概略の構成を示す図である。
【図５】図１に示すフローサイトメータに用いる制御・処理部の概略の構成を示す図である。
【図６】図１に示すフローサイトメータに用いる分析装置の概略の構成を示す図である。
【図７】（ａ），（ｂ）は、図４に示す光電子増倍管に与えるコントロール電圧と蛍光の位相ずれ角θmeasとの関係を示すグラフ図である。
【図８】図１に示すフローサイトメータを用いて、補正式に用いる定数Ｘ，Ａの値を決定するフローの例を示す図である。
【図９】図４に示す光電子増倍管が出力する蛍光信号の出力レベルの飽和の例を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の蛍光検出装置、蛍光検出方法、および蛍光信号を処理する方法を詳細に説明する。
図１は、本実施形態の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
【００２０】
フローサイトメータ１０は、信号処理装置２０と、分析装置（コンピュータ）８０とを有する。信号処理装置２０は、測定対象とする試料１２にレーザ光を照射し、試料１２が発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理をする。分析装置（コンピュータ）８０は、信号処理装置２０で得られた処理結果から蛍光強度や蛍光緩和時間を算出する。試料１２の例として、蛍光蛋白（蛍光色素）Ｘ1を付けた細胞（分析対象物）Ｘ2により構成される測定対象物を用いて以降説明する。本実施形態では、蛍光蛋白以外の蛍光色素を用いることもできる。分析対象物も、細胞以外に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質の他、人工的に作製されたマイクロビーズ等を用いることもできる。なお、図１に示す試料１２は、例えば、細胞Ｘ2内に蛍光蛋白Ｘ1が進入し、蛍光蛋白Ｘ1が細胞Ｘ2内に取り込まれて分散した構成である。細胞Ｘ2に付着する蛍光蛋白Ｘ1は１つには限定されず、複数であってもよい。
【００２１】
信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、制御・処理部２８と、管路３０と、を有する。
制御・処理部２８は、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び試料１２が発する蛍光の蛍光信号を処理する信号処理部を含む。管路３０は、高速流を形成するシース液に含ませることで試料１２のフローを形成する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の所定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
【００２２】
レーザ光源部２２は、所定の波長のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料１２の測定点が形成される。
【００２３】
図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、可視光帯域の波長を有し、強度変調したレーザ光を出射する。
レーザ光源部２２は、光源２２ａを有する。光源２２ａは、蛍光蛋白Ｘ1を励起する波長を有するレーザ光ＬをＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、かつこのレーザ光Ｌの強度を所定の周波数ｆの変調信号で強度変調しながら出射する。
【００２４】
さらに、レーザ光源部２２は、レンズ系２３と、レーザドライバ３４と、を有する。レンズ系２３は、レーザ光Ｌを管路３０中の中心に集束させ測定点を形成させる。レーザドライバ３４は、光源２２ａを駆動する。
【００２５】
レーザ光Ｌを出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。レーザ光Ｌは、例えば５〜１００ｍＷ程度を出力する。
一方、レーザ光Ｌの強度変調に用いる周波数（変調周波数）ｆは、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長く、例えば１０〜５０ＭＨｚである。
【００２６】
光源２２ａは、レーザ光Ｌが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｌによって励起される試料１２は管路３０の測定点を通過する際、測定点でレーザ光Ｌの照射を受ける。このとき、蛍光蛋白Ｘ1が特定の波長で蛍光を発する。
【００２７】
受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されている。受光部２４は、測定点を通過する試料１２によって前方散乱したレーザ光を受光することにより、試料１２が測定点を通過することを知らせる試料１２の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される検出信号は、制御・処理部２８および分析装置８０に供給され、試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせて処理を開始するトリガ信号、処理開始のＯＮ信号、ＯＦＦ信号として用いられる。
【００２８】
一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する光電子増倍管を備える。本実施形態では、光電子倍増管の代わりにアバランシェフォトダイオード等の公知の光電変換器を用いることもできる。
図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
【００２９】
図３に示す受光部２６は、試料１２からの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ＮＤフィルタ２６ｂと、バンドパスフィルタ２６ｃと、電圧調整部２６ｄと、光電子増倍管（受光素子）２７と、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電子増倍管２７の受光面に集束させるように構成されている。
ＮＤフィルタ２６ｂは、受光部２６に入射した蛍光を減光する。受光部２６がＮＤフィルタ２６ｂを用いるのは、後述するように、光電子増倍管２７の陽極に印加するコントロール電圧を最大にしても、蛍光信号の出力レベルが飽和しないように蛍光を減光するためである。
バンドパスフィルタ２６ｃは、光電子増倍管２７の受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみを透過させるフィルタである。
【００３０】
光電子増倍管２７は、光電面で受光した光を電気信号に変換し、蛍光信号を出力する受光素子である。ここで出力される蛍光信号は、出力レベルが調整されている。光電子増倍管２７が受光する蛍光は、所定の周波数で強度変調を受けたレーザ光に基づくので、出力される蛍光信号も所定の周波数で強度が変動する。この蛍光の受光によって出力される蛍光信号は、制御・処理部２８に供給される。
【００３１】
図４は、光電子増倍管２７の概略の構成を示す図である。光電子増倍管２７は、例えば１０-4Ｐａ程度の真空雰囲気を維持する真空容器内に、受光面を表面に持つ陰極２７ａと、集束電極２７ｂと、光電子増倍部２７ｃと、陽極２７ｄ1〜２７ｄ11と、を有し、真空容器の外側にステム２７ｅを有する。
陰極２７ａに光が入射されると、陰極２７ａの光電面から真空容器内の真空中に光電子が放出される。この光電子は集束電極２７ｂによって光電子増倍部２７ｃに導かれる。光電子は陽極２７ｄ1により引っ張られて光電子増倍部２７ｃのダイノード２７ｃ1 に衝突して、ダイノード２７ｃ1 は二次電子を放出する。さらに、ダイノード２７ｃ1で放出された二次電子はダイノード２７ｃ2 の前面に設けられた陽極２７ｄ2により引っ張られてダイノード２７ｃ2 に衝突してダイノード２７ｃ2 は更に二次電子を放出する。こうして、陽極２７ｄn(ｎは２以上１０以下の整数)に引っ張られてダイノード２７ｃ3〜ダイノード２７ｃ10 に衝突し、さらに、ダイノード２７ｃ3〜ダイノード２７ｃ10 から二次電子が順次放出されて、電子が増倍される。増倍された電子は、陽極２７ｄ11により引っ張られてダイノード２７ｃ11に集められることにより、ステム２７ｅを介して蛍光電流が生成される。
このとき陽極２７ｄ1〜２７ｄ11に印加される電圧によって電子の移動速度は決定され、この電子の移動速度によって、ダイノード２７ｃ1〜ダイノード２７ｃ10に衝突する電子のエネルギーは定まる。このため、陽極２７ｄ1〜２７ｄ11に印加される電圧によって、ダイノード２７ｃ1〜ダイノード２７ｃ10で放出される二次電子の量は調整される。フローサイトメータ１０は、上記陽極２７ｄ1〜２７ｄ11に印加する電圧を、蛍光信号（蛍光電流）の出力レベルを制御するコントロール電圧として用いる。
【００３２】
電圧調整部２６ｄ（図３参照）は、蛍光信号の出力レベルを制御するコントロール電圧を設定して光電子増倍管２７に印加する。電圧調整部２６ｄは、後述する分析装置８０の出力レベル調整部９４の指示に応じてコントロール電圧を設定する。電圧調整部２６ｄは、光電子増倍管２７に印加したコントロール電圧の情報を後述する位相ずれ補正部８８（図６参照）に提供する。
【００３３】
制御・処理部２８は、図５に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、信号制御部４４と、を有する。
信号生成部４０は、レーザ光Ｌの強度を所定の周波数ｆで変調するための変調信号を生成する。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６、パワースプリッタ４８及びアンプ５０，５２を有する。信号生成部４０は、生成される変調信号を、レーザ光源部２２のレーザドライバ３４に供給するとともに、信号処理部４２に供給する。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電子増倍管２７から出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、ＤＣ成分に所定の周波数の正弦波信号が載った信号であり、１０〜５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
【００３４】
信号処理部４２は、光電子増倍管２７から出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により発する蛍光の位相ずれ情報を抽出する。信号処理部４２は、アンプ５４と、ＩＱミキサ５８と、ローパスフィルタ６２と、を有する。アンプ５４は、光電子増倍管２７から出力される蛍光信号を増幅する。
【００３５】
ＩＱミキサ５８は、光電子増倍管２７から供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号としてミキシングする装置である。具体的には、ＩＱミキサ５８は、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、変調信号と同相の成分を含む、蛍光信号のＩ信号と、変調信号に対して９０度位相のシフトした成分を含む蛍光信号のＱ信号とを生成する。同相の成分を含むＩ信号は、変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成され、９０度位相のシフトした成分を含むＱ信号は、９０度位相のシフトした変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成される。
【００３６】
ローパスフィルタ６２は、ＩＱミキサ５８で生成されたＩ信号、Ｑ信号の低周波信号をろ過する。このろ過により、変調信号と同相の、蛍光信号の成分（Ｒｅ成分）と、変調信号に対して９０度位相のシフトした、蛍光信号の成分（Ｉｍ成分）が、蛍光データとして取り出される。取り出された各成分は、信号制御部４４に送られる。以降では、ＩＱミキサ５８によるミキシング処理とローパスフィルタ６２によるフィルタリング処理を含む処理を周波数ダウン変換処理といい、この処理により得られるデータを蛍光データという。
【００３７】
信号制御部４４は、信号処理部４２から送られた蛍光信号のＲｅ成分およびＩｍ成分を増幅し、ＡＤ変換を行う。
具体的には、信号制御部４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理するシステムコントローラ６０と、信号処理部４２で生成されたＲｅ成分およびＩｍ成分を増幅するアンプ６４と、増幅されたＲｅ成分およびＩｍ成分をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。アンプ６４およびＡ／Ｄ変換器６６は、後述する分析装置８０内で行われることもできる。
【００３８】
分析装置８０は、信号制御部４４にてＡＤ変換されて得られるＲｅ成分、Ｉｍ成分から、レーザ光に対する蛍光の位相ずれ角を求め、さらに、この位相ずれ角から蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）を求める。また、分析装置８０は、Ｒｅ成分、Ｉｍ成分から蛍光強度を求める。図６は、分析装置８０の概略の構成を示す図である。
分析装置８０は、ＣＰＵ８２およびメモリ８４を備えるコンピュータで構成される。分析装置８０は、さらに、位相ずれ算出部８６と、位相ずれ補正部８８と、蛍光緩和時間算出部９０と、蛍光強度算出部９２と、出力レベル調整部９４と、を有する。これらの各部分は、コンピュータ上でソフトウェアが起動されることにより、機能を発揮するソフトウェアモジュールである。勿論、これらの部分を専用回路で構成することもできる。
【００３９】
位相ずれ算出部８６は、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光の蛍光データについて、Ｒｅ成分を実数部としＩｍ成分を虚数部とする複素数の偏角（ｔａｎ-1（蛍光データのＩｍ成分／蛍光データのＲｅ成分)）を、位相ずれ角θmeasとして算出する。位相ずれ算出部８６は、位相ずれ角θmeasを位相ずれ補正部８８に提供する。
【００４０】
位相ずれ補正部８８は、位相ずれ算出部８６において算出した位相ずれ角θmeasに対して、光電子増倍管２７の陽極２７ｄ1〜ｄ11に印加したコントロール電圧（調整パラメータ値）に応じた補正を行うことにより、すなわち、電圧調整部２６ｄを介した蛍光信号の出力レベルの調整条件に応じた補正を行うことにより、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光に由来した位相ずれ角θτを算出する。
この補正は、光電子増倍管２７における光電子および二次電子の移動速度が変化することによって生じる位相ずれ角θの変化を防止し、正確な蛍光緩和時間を算出するために行われる。光電子増倍管２７では、コントロール電圧により、光電子および二次電子の移動速度は異なる。したがって、位相ずれ角θmeasに対して、設定したコントロール電圧に応じた補正が行われる。
【００４１】
光電子増倍管２７において二次電子が生成されるダイノードと二次電子が引っ張られる陽極間の距離ｌを用いて、光電子および二次電子が移動する時間ｔは下記式（１）で表される。
ｔ  ＝  （２ｍｌ2／Ｖ／ｑ）(1/2)                              （１）
ｍは電子の質量、ｑは電子の電荷量、Ｖはコントロール電圧。
一方、位相ずれ角θは、時間ｔに比例する。したがって、光電子増倍管２７内を電子が移動する時間により生じる位相ずれ角（光電子倍増管２７に由来する位相ずれ角）θpmtは、定数Ｂを付加してθpmt＝Ａ・Ｖ(-1/2)＋Ｂで表される。なお、Ａ、Ｂは定数である。
【００４２】
一方、位相ずれ算出部８６で算出される位相ずれ角θmeasは、下記式（２）で表すことができる。
θmeas   ＝  θ0  −（θpmt  ＋  θd  ＋  θτ）                （２）
上記式（２）において、θ0は基準とする位相ずれ角（定数）であり、θpmtは光電子倍増管２７に由来する位相ずれ角であり、θdはフローサイトメータ１０におけるレーザ光および蛍光の経路長と蛍光信号の電気回路長に由来する位相ずれ角であり、θτは蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光に由来する位相ずれ角である。
【００４３】
したがって、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光に由来する位相ずれ角θτは、下記式（３）に示すように表される。
θτ  ＝  θ0  −（θpmt  ＋  θd  ＋  θmeas）                （３）
上記式（３）にθpmt＝Ａ・Ｖ(-1/2)＋Ｂを代入することにより、下記式（４）となる。
θτ  ＝Ｘ−θmeas−Ａ・Ｖ(-1/2)                                （４）
ただし、Ｘは、Ｘ＝θ0−Ｂ−θdで表され、コントロール電圧に依存しない定数である。
【００４４】
分析装置８０のメモリ８４は、上記定数Ｘと定数Ａの値を予め記憶している。位相ずれ補正部８８は、定数Ｘと定数Ａの値をメモリ８４から呼び出して式（４）に付与して補正式を用意する。これにより、位相ずれ補正部８８は、位相ずれ算出部８６から提供された位相ずれ角θmeasと電圧調整部２６ｄから提供されたコントロール電圧Ｖから、用意された補正式を用いて位相ずれ角θτを算出する。
位相ずれ補正部８８は、算出した位相ずれ角θτを蛍光緩和時間算出部９０に提供する。
【００４５】
蛍光緩和時間算出部９０は、位相ずれ補正部８８で算出された位相ずれ角θτを用いて、蛍光蛋白Ｘ1の蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θτ）の式にしたがって算出する。ここで、ｆは、レーザ光Ｌの強度変調に用いた周波数である。蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θτ）の式にしたがって算出することができるのは、蛍光現象が、１次の緩和過程に沿った変化を示すからである。
【００４６】
蛍光強度算出部９２は、ＡＤ変換器６６から送られた蛍光データについて、Ｒｅ成分を実数部としＩｍ成分を虚数部とする複素数の絶対値を求めることで、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度を算出する。
算出された蛍光蛋白Ｘ1の蛍光強度、位相ずれ角θτおよび蛍光緩和時間τは、図示されないプリンタやディスプレイ等の出力装置に結果情報として出力される。また、この結果情報は、試料１２が管路３０の測定点を通過する度に得られる測定結果として、統計処理の対象とされる。
出力レベル調整部９４は、光電子増倍管２７に印加するコントロール電圧を定めるための制御信号を生成する。コントロール電圧は、光電子増倍管２７から出力される蛍光信号の出力レベルが飽和しない範囲で自在に設定される。出力レベル調整部９４は、少なくとも光電子増倍管２７に印加する現在のコントロール電圧の情報を取得している。また、出力レベル調整部９４は、定数Ｘおよび定数Ａの値を算出するために、後述するキャリブレーションを行う。
【００４７】
図７（ａ）は、定数Ｘおよび定数Ａの値が付与されて用意された補正式から求まる、蛍光蛋白Qdot555の蛍光の位相ずれ角θmeasと、フローサイトメータ１０を用いて分析装置８０が算出した実測の位相ずれ角θmeasとを比較したグラフである。図７（ｂ）は、定数Ｘおよび定数Ａの値が付与されて用意された補正式から求まる、蛍光蛋白PerCPの蛍光の位相ずれ角θmeasと、フローサイトメータ１０を用いて分析装置８０が算出した実測の位相ずれ角θmeasとの比較したグラフである。ここで、蛍光蛋白Qdot555およびPerCPの蛍光緩和時間τは既知であるので、位相ずれ角θτは、θτ＝ｔａｎ-1（２πｆτ）で算出される値を用いた。図７（ａ），（ｂ）中の曲線が補正式による位相ずれ角θmeasの算出結果であり、●が位相ずれ角θmeasの実測結果である。
図７（ａ），（ｂ）から判るように、補正式は、実測結果に極めて一致していることがわかる。これより、補正式を用いた補正、すなわち、式（４）で算出される位相ずれ角θτは、精度の高い蛍光緩和時間を算出することができる。
【００４８】
次に、フローサイトメータ１０で行われる蛍光検出方法について説明する。
まず、フローサイトメータ１０は、所定の周波数ｆで強度変調したレーザ光を照射光としてレーザ光源部２２から出射する。
【００４９】
次に、受光部２６は、蛍光を受光して蛍光信号を出力する。
制御・処理部２８は、出力した蛍光信号を、レーザ光Ｌを強度変調する変調信号とミキシングすることにより、変調信号に対する蛍光信号の位相ずれ角と強度振幅を含む蛍光データを生成する。
分析装置８０の位相ずれ算出部８６は、生成した蛍光データから、位相ずれ角θmeasを算出する。位相ずれ補正部８８は、算出した位相ずれ角θmeasを、定数Ｘ及び定数Ａの値が付与された補正式である式（４）に沿って位相ずれ角θτを算出する。さらに、蛍光緩和時間算出部９０は、位相ずれ角θτを用いて、蛍光蛋白Ｘ1の蛍光緩和時間τをτ＝ｔａｎ（θτ）／（２πｆ）の式にしたがって算出する。一方、蛍光強度算出部９２は、生成した蛍光データの絶対値を求めて蛍光強度を算出する。
算出された蛍光緩和時間、位相ずれ角θτ及び蛍光強度は、図示されない出力装置から出力される。
【００５０】
図８は、フローサイトメータ１０を用いて、メモリ８４に記憶する定数Ｘ，Ａの値を決定するキャリブレーションのフローの例を示す図である。定数Ｘ，Ａの値を決定する際、フローサイトメータ１０で測定に用いる蛍光蛋白Ｘ1は蛍光緩和時間τが既知のものである。
【００５１】
まず、分析装置８０の出力レベル調整部９４は、光電子増倍管（以降、ＰＭＴという）２７のコントロール電圧Ｖを最大化させる（ステップＳ１０）。コントロール電圧Ｖの最大化は、微量な蛍光であっても高感度に蛍光を検出できるようにするためでる。コントロール電圧の調整は、電圧調整部２６ｄを通して行われる。
次に、分析装置８０の出力レベル調整部９４は、ＮＤフィルタ２６ｂを適宜調整する（ステップＳ２０）。ＮＤフィルタによる減光を行うのは、ＰＭＴ２７のコントロール電圧を最大化してＰＭＴ２７を最高感度の状態にするとき、光量に対するＰＭＴ２７の蛍光信号の出力レベルが飽和しないようにするためである。ＮＤフィルタ２６ｂは、例えば、最大減光と最小減光の中間に設定される。
【００５２】
次に、光源２２ａは、周波数ｆで強度変調したレーザ光Ｌを照射する（ステップＳ３０）。これにより、測定点を通過したとき、レーザ光Ｌの照射を受けた試料１２が発する蛍光をＰＭＴ２７は受光する。これにより、ＰＭＴ２７はコントロール電圧Ｖによって調整された出力レベルで、蛍光信号を出力する（ステップＳ４０）。蛍光信号は、信号処理部４２および信号制御部４４で処理されて、Ｒｅ成分とＩｍ成分を含む蛍光データが生成される（ステップＳ５０）。次に、分析装置８０の蛍光強度算出部９２は、蛍光データから蛍光強度を算出する（ステップＳ６０）。蛍光強度は、蛍光データの絶対値で表される。
【００５３】
次に、設定されているコントロール電圧Ｖが、所定の電圧以下であるか否かを出力レベル調整部９４は判定する（ステップＳ７０）。
判定結果が否定である場合、出力レベル調整部９４は、電圧調整部２６ｄを通して、コントロール電圧Ｖを一定の幅で低減させる（ステップＳ８０）。こうして、低減したコントロール電圧を用いてステップＳ３０〜７０が繰り返される。すなわち、蛍光信号のレベルが、ステップＳ３０〜７０を繰り返す度に減少するように、コントロール電圧Ｖの調整が行われる。ステップＳ７０における判定が肯定である場合、出力レベル調整部９４は、さらに、ＰＭＴ２７が出力する蛍光信号の飽和の有無を、コントロール電圧Ｖに対する蛍光強度の変化を用いて判定する（ステップＳ９０）。
【００５４】
ＰＭＴ２７が出力する蛍光信号の飽和の有無の判定は、図示されないディスプレイにグラフ表示した特性結果を確認したオペレータの入力に従って行われてもよい。あるいは、分析装置８０が、図示されないディスプレイにグラフ表示した特性結果を自動的に解析して、蛍光信号の飽和の有無を判定してもよい。例えば、図９に示すように、コントロール電圧Ｖに対して、蛍光強度算出部９２が算出する蛍光強度の値をグラフにより特性結果として表示したとき、コントロール電圧Ｖに対する蛍光強度の特性が、コントロール電圧の上昇に伴って直線から屈曲してなだらかに変化する領域があるか否かを、オペレータの目視による確認結果に基づいて、あるいは分析装置８０の解析結果に基づいて、蛍光信号の飽和の有無を判定する。
この判定の結果が肯定の場合、ステップＳ２０に戻り、ステップＳ２０〜ステップＳ８０が繰り返される。
ステップＳ９０の判定結果が否定の場合、すなわち、ＰＭＴ２７が飽和状態でない場合、出力レベル調整部９４は、回帰式を近似して定数Ｘ及び定数Ａの値を抽出し（ステップＳ１００）、抽出した定数Ｘ及び定数Ａの値をメモリ８４に記憶させる（ステップＳ１１０）。回帰式は、上記式（４）を変形した下記式（５）が用いられる。
【００５５】
θmeas  ＝Ｘ−θτ−Ａ・Ｖ(-1/2)                                （５）
ただし、θτ＝ｔａｎ-1（２πｆτ）
ここで、ｆはレーザ光の強度変調の周波数（既知）であり、τは測定に用いる蛍光蛋白Ｘ1の蛍光緩和時間（既知）である。
【００５６】
出力レベル調整部９４は、上記式（５）を用いて予測された位相ずれ角θmeasが、実測の位相ずれ角θmeasに近似されるように、上記式（５）等の回帰式を用いて、実測の位相ずれ角θmeasから、定数Ｘと定数Ａの値を抽出する。言い換えると、実測の位相ずれ角θmeasnを上式（４）を用いて補正された位相ずれ角（式（４）の右辺の値）が、既知の蛍光緩和時間τによって定まる位相ずれ角θτに近似するように、更に言うと、式（４）の右辺に示す補正された位相ずれ角から算出される蛍光緩和時間が、既知の蛍光緩和時間τに近似するように、定数Ｘと定数Ａの値を抽出する。
図７（ａ）に示す例では、定数Ｘの値として３．７５８４、定数Ａの値として０．６３６０が抽出される。定数Ｘおよび定数Ａの値は、最小二乗近似法等の公知の方法を用いて抽出される。定数Ｘ及び定数Ａの値は、蛍光蛋白Ｘ1に関わらず、装置固有の値であり、蛍光蛋白の種類を変えても用いることのできる値である。
【００５７】
分析装置８０は、図７（ａ），（ｂ）に示すように、設定された回帰式を用いて、ＰＭＴ２７のコントロール電圧に対する位相ずれ角θmeasの変化を正確に予測することができる。したがって、分析装置８０は、この回帰式に用いる定数Ｘ及び定数Ａの値を定めた補正式である式（４）を用いて、実測された位相ずれ角θmeasから蛍光蛋白Ｘ1に由来する位相ずれ角θτを算出することができる。すなわち、位相ずれ角θmeasを補正することができる。
したがって、分析装置８０は、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光緩和時間を正確に算出することができる。
【００５８】
以上、本発明の蛍光検出装置、蛍光検出方法および蛍光信号を信号処理する方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００５９】
１０  フローサイトメータ
１２  試料
２０  信号処理装置
２２  レーザ光源部
２２ａ  光源
２３，２６ａ  レンズ系
２４，２６  受光部
２６ｄ  電圧調整部
２７  光電子増倍管
２７ａ  陰極
２７ｂ  集束電極
２７ｃ  電子増倍部
２７ｃ1〜２７ｃ11  ダイノード
２７ｄ1〜２７ｄ11  陽極
２７ｅ  ステム
２８  制御・処理部
３０  管路
３２  回収容器
３４  レーザドライバ
４０  信号生成部
４２  信号処理部
４４  信号制御部
４６  発振器
４８  パワースプリッタ
５０，５２，５４，６４  アンプ
５８  ＩＱミキサ
６０  システムコントローラ
６２  ローパスフィルタ
６６  Ａ／Ｄ変換器
８０  分析装置
８２  ＣＰＵ
８４  メモリ
８６  位相ずれ算出部
８８  位相ずれ補正部
９０  蛍光緩和時間算出部
９２  蛍光強度算出部
９４  出力レベル調整部
【図１】
2011083754.tif 000003
【図２】
2011083754.tif 000004
【図３】
2011083754.tif 000005
【図４】
2011083754.tif 000006
【図５】
2011083754.tif 000007
【図６】
2011083754.tif 000008
【図７】
2011083754.tif 000009
【図８】
2011083754.tif 000010
【図９】
2011083754.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月25日(2011.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置であって、  レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射する光源部と、  前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力する、前記出力レベルの調整が可能な受光素子と、前記受光素子に与える調整パラメータ値により、前記出力レベルを調整する調整部と、を備える受光部と、  前記蛍光信号を前記周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する第１の処理部と、  前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記調整パラメータ値に応じて定まる補正式であって、予め記憶した定数の値が付与された補正式を用いて前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、を有し、 前記第２の処理部は、前記受光素子に与える調整パラメータ値を予め変更することにより、前記調整パラメータ値と前記出力レベルとの関係を求め、前記関係が前記受光素子の出力レベルの飽和を表していないとき、前記補正式に用いる前記定数の値を抽出する出力レベル調整部を有し、  前記第２の処理部は、蛍光緩和時間が既知の基準対象物を測定対象物として用いて前記第２の位相ずれから算出される蛍光緩和時間が、前記補正により、前記基準対象物の既知の蛍光緩和時間に近似するように、前記出力レベル調整部は前記定数の値を抽出する、ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記受光素子は光電子増倍管であり、前記調整パラメータ値は、前記光電子増倍管の電極に印加する電圧である、請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記電極に印加する電圧をＶ、前記第１の位相ずれをθmeas、前記第２の位相ずれをθτ、としたとき、前記補正式は、下記式で表される、請求項２に記載の蛍光検出装置。      θτ＝  Ｘ−θmeas−Ａ・Ｖ(-1/2) （ＸおよびＡは定数。）
【請求項４】
前記受光素子の受光面の前面には、調整可能な減光フィルタが設けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置の蛍光検出方法であって、  レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射するステップと、  前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光素子で受光して、前記受光素子に与える調整パラメータ値により出力レベルの調整された蛍光信号を出力するステップと、  前記蛍光信号を前記所定の周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成するステップと、  前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、前記調整パラメータ値に応じて定まる補正式であって、予め記憶した定数の値が付与された補正式を用いて、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップと、を有し、 前記補正式に付与される前記定数の値は、蛍光緩和時間が既知の基準対象物を測定対象物として用いて前記第２の位相ずれから算出される蛍光緩和時間が、前記補正により前記基準対象物の既知の蛍光緩和時間に近似するように、抽出された値であり、  前記定数の値の抽出は、前記受光素子に与える調整パラメータ値を予め変更することによって求められる前記調整パラメータ値と前記出力レベルとの関係が前記受光素子の出力レベルの飽和を表していないとき、行われる、ことを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項６】
前記受光素子の受光面の前面には、調整可能な減光フィルタが設けられ、前記減光フィルタは、前記受光素子の出力レベルが飽和しないように、減光する、請求項５に記載の蛍光検出方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】  そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、測定対象物が、レーザ光の照射を受けることにより発する蛍光の蛍光信号を処理するとき、正確な蛍光緩和時間を算出することができる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することを目的とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】  本発明の一態様は、レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置である。当該蛍光検出装置は、  レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射する光源部と、  前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光して、出力レベルの調整された蛍光信号を出力する、前記出力レベルの調整が可能な受光素子と、前記受光素子に与える調整パラメータ値により、前記出力レベルを調整する調整部と、を備える受光部と、  前記蛍光信号を前記周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成する第１の処理部と、  前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記調整パラメータ値に応じて定まる補正式であって、予め記憶した定数の値が付与された補正式を用いて前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、を有する。 前記第２の処理部は、前記受光素子に与える調整パラメータ値を予め変更することにより、前記調整パラメータ値と前記出力レベルとの関係を求め、前記関係が前記受光素子の出力レベルの飽和を表していないとき、前記補正式に用いる前記定数の値を抽出する出力レベル調整部を有する。  前記第２の処理部は、蛍光緩和時間が既知の基準対象物を測定対象物として用いて前記第２の位相ずれから算出される蛍光緩和時間が、前記補正により、前記基準対象物の既知の蛍光緩和時間に近似するように、前記出力レベル調整部は前記定数の値を抽出する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】  本発明の他の一態様は、レーザ光の照射を受けることにより測定対象物が発する蛍光の蛍光信号を処理する蛍光検出装置の蛍光検出方法である。当該方法は、  レーザ光を、所定の周波数の変調信号で強度変調して出射するステップと、  前記レーザ光に照射されて発する測定対象物の蛍光を受光素子で受光して、前記受光素子に与える調整パラメータ値により出力レベルの調整された蛍光信号を出力するステップと、  前記蛍光信号を前記所定の周波数の変調信号とミキシングすることにより、位相および強度の情報を含む蛍光データを生成するステップと、  前記蛍光データを用いて、前記蛍光の、前記変調信号に対する第１の位相ずれを算出し、前記調整パラメータ値に応じて定まる補正式であって、予め記憶した定数の値が付与された補正式を用いて、算出した前記第１の位相ずれに対して、前記出力レベルの調整条件に応じた補正をして第２の位相ずれを算出し、算出した前記第２の位相ずれを用いて前記蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップと、を有する。 前記補正式に付与される前記定数の値は、蛍光緩和時間が既知の基準対象物を測定対象物として用いて前記第２の位相ずれから算出される蛍光緩和時間が、前記補正により前記基準対象物の既知の蛍光緩和時間に近似するように、抽出された値である。前記定数の値の抽出は、前記受光素子に与える調整パラメータ値を予め変更することによって求められる前記調整パラメータ値と前記出力レベルとの関係が前記受光素子の出力レベルの飽和を表していないとき、行われる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】  前記蛍光検出方法において、前記受光素子の受光面の前面には、調整可能な減光フィルタが設けられ、前記減光フィルタは、前記受光素子の出力レベルが飽和しないように、減光する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】  図７（ａ）は、定数Ｘおよび定数Ａの値が付与されて用意された補正式から求まる、蛍光蛋白Qdot555の蛍光の位相ずれ角θmeasと、フローサイトメータ１０を用いて分析装置８０が算出した実測の位相ずれ角θmeasとを比較したグラフである。図７（ｂ）は、定数Ｘおよび定数Ａの値が付与されて用意された補正式から求まる、蛍光蛋白PerCPの蛍光の位相ずれ角θmeasと、フローサイトメータ１０を用いて分析装置８０が算出した実測の位相ずれ角θmeasとの比較したグラフである。ここで、蛍光蛋白Qdot555およびPerCPの蛍光緩和時間τは既知であるので、位相ずれ角θτは、θτ＝ｔａｎ-1（２πｆτ）で算出される値を用いた。図７（ａ），（ｂ）中の曲線が補正式による位相ずれ角θmeasの算出結果であり、●、○が位相ずれ角θmeasの実測結果である。  図７（ａ），（ｂ）から判るように、補正式は、実測結果に極めて一致していることがわかる。これより、補正式を用いた補正、すなわち、式（４）で算出される位相ずれ角θτは、精度の高い蛍光緩和時間を算出することができる。
【国際調査報告】
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