(57)【要約】  乳酸菌の培養上清中から新規で有用な成分を見出し、その成分の有効な利用方法を提供することを目的とする。当該方法は、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養上清中の低分子画分を有効成分とする細胞保護剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養上清中の低分子画分を有効成分とする細胞保護剤。
【請求項２】
低分子画分が、乳酸菌培養上清を限外ろ過またはゲルろ過することにより得られるものである請求項１記載の細胞保護剤。
【請求項３】
低分子画分の分子量が、２０，０００Ｄａ以下である請求項１または２記載の細胞保護剤。
【請求項４】
ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌が、ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２００１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５３８）またはストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７９）である請求項１ないし３の何れかの項記載の細胞保護剤。
【請求項５】
細胞への損傷物質曝露時の細胞数低下を抑制する請求項１ないし４の何れかの項記載の細胞保護剤。
【請求項６】
損傷物質が活性酸素である請求項５記載の細胞保護剤。
【請求項７】
損傷物質がヒドロキシラジカルである請求項５記載の細胞保護剤。
【請求項８】
請求項１ないし７の何れかの項記載の細胞保護剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項９】
化粧品である請求項８記載の皮膚外用剤。
【請求項１０】
ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養上清中の低分子画分を、保護を目的とする皮膚上に適用することを特徴とする皮膚細胞の保護方法。
【請求項１１】
損傷物質曝露時の細胞数低下を抑制することを特徴とする請求項１０記載の皮膚細胞の保護方法。
【請求項１２】
細胞保護剤を製造するためのストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養上清中の低分子画分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞保護剤に関し、更に詳細には、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養上清中の低分子画分を有効成分とする細胞保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌の培養上清、すなわち主に乳を主成分とする培地に乳酸菌を接種して得られた培養物中に、皮膚外用剤としての効果を有する成分が含まれていることが報告されている。例えば、乳酸菌の培養上清が抗酸化作用や光防御作用を有することが報告されている（特許文献１、非特許文献１および２）。また、このもののシワ形成抑制作用が知られており（特許文献２）、更には、乳酸菌抽出物中に、細胞増殖作用を有する成分があることも知られている（特許文献３）。【０００３】
しかしながら、乳酸菌は種類も多いため、その培養上清に含まれる有効成分も多岐にわたることが予想され、また、化粧料や外用剤の有効成分として利用するには、目的に応じ、特に活性の高い部分を選択して利用することが有利であるため、乳酸菌培養上清や乳酸菌抽出物についてより研究を進め、より優れた効果を有する成分の検出が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭５８−１９８５８４
【特許文献２】ＷＯ２００８／０２６３１８
【特許文献３】特許第３１７２５９９
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】日本香粧品科学会第７回学術学会講演要旨，５９，１９８２
【非特許文献２】日本香粧品科学会第８回学術学会講演要旨，２１０，１９８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って本発明の課題は、乳酸菌の培養上清中から新規で有用な成分を見出し、その成分の有効な利用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、種々の乳酸菌培養上清について、これに含まれる有効成分について検討を行っていたところ、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養上清の低分子画分中に、優れた細胞保護効果を有する物質が存在することを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち本発明は、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養上清中の低分子画分を有効成分とする細胞保護剤を提供するものである。【０００９】
また、本発明は、前記細胞保護剤を含有する皮膚外用剤を提供するものである。【００１０】
更に本発明は、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養上清中の低分子画分を、保護を目的とする皮膚上に適用することを特徴とする皮膚細胞の保護方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の細胞保護剤によれば、皮膚等の細胞がヒドロキシラジカル等に曝露された場合であっても、これから細胞を保護することができ、細胞数の減少とこれに引き続いて生じる過剰な細胞生産を起こすことなく、皮膚の肥厚や、皮膚の炎症、皮膚の乾燥、乾燥によるシワ形成、弾力性の低下、シミの発生および増悪を防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１で得た透析液のＨＰＬＣの結果を示す図面である。図中、ａは分子量１０，０００Ｄａの位置を、ｂは分子量３４２Ｄａの位置を、ｃは分子量１８０Ｄａの位置をそれぞれ示す。
【図２】実施例２で得た透析液のＨＰＬＣの結果を示す図面である。図中、ａ、ｂおよびｃは上記と同じ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の細胞保護剤の有効成分である乳酸菌培養上清の低分子画分は、ストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を、培地で培養し、得られた培養物から固形物を除去することにより製造された乳酸菌培養上清を更に限外ろ過等に付し、分子量２０，０００Ｄａ以下の画分を採取することにより得られる。
【００１４】
ここで用いられるストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＹＩＴ２００１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５３８、寄託日：平成１３年（２００１年）１月３１日）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＹＩＴ２０８４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７９、寄託日：２００６年８月１８日）等が挙げられ、それらを単独で、または複数で用いることができる。なお、これらのストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託されている。
【００１５】
このストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌を培養する培地としては、人乳、牛乳、山羊乳等の獣乳や、脱脂乳、粉乳や脱脂粉乳からの還元乳、クリーム等の乳製品が好適なものとして挙げられ、また、豆乳等の大豆加工品を用いることも可能であるが、乳を主成分とする培地であることが望ましい。なお、これらは、そのまま培地として使用してもよく、また、必要に応じて適当な濃度に希釈して使用しても良い。
【００１６】
更に、これらの培地には、乳酸菌の培養において栄養源を補う目的で、一般的に用いられる成分を別途配合してもよい。このようなものとしては、酵母エキス、クロレラエキス、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン類や、各種ペプチド類を含むタンパク分解物、アミノ酸類、カルシウム、マグネシウム等の塩類が挙げられる。
【００１７】
前記培地を用いたストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養は、常法に従って行えば良く、その培養の一例としては、３０℃〜４５℃、より好ましくは３７℃〜４２℃の培養温度、１時間〜４８時間、より好ましくは、４時間〜２４時間の培養時間が挙げられる。なお、このときの他の培養条件としては、静置、攪拌、振盪、通気等が挙げられ、これらから培養に適した方法を適宜選択して行えばよい。
【００１８】
本発明に用いる乳酸菌培養上清は、上記の如くして得られた乳酸菌培養物から、ろ過、遠心分離等の常法に従って固形物を除去することにより得られる。また、乳酸菌培養上清の低分子画分は、乳酸菌培養上清から限外ろ過やゲルろ過の常法により分子量２０，０００Ｄａより大きいものを除去することにより得ることができる。
【００１９】
このようにして得られた本発明の細胞保護剤は、過酸化水素等の損傷物質の曝露前あるいは曝露中に細胞に付加することにより、損傷物質曝露による細胞数の低下を抑制することができるが、損傷物質の曝露前から付加すると効果的に細胞数の低下を予防できるため、損傷物質の曝露前から細胞に付加することが好ましい。
【００２０】
また上記細胞保護効果のメカニズムの詳細は不明であるが、損傷物質曝露時に本発明の細胞保護剤が細胞と共存していない場合であってもその効果が発揮されることから、本発明の細胞保護剤により、細胞自体に損傷に対する耐性が付与されることもメカニズムの一つと考えられる。
【００２１】
上記損傷物質は特に制限されないが、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素、スーパーオキシド等の活性酸素が挙げられる。また細胞数の低下が誘発される紫外線、放射線または変異原性物質等の曝露、ストレス、喫煙といった様々な損傷要因も損傷物質に含まれる。
【００２２】
また本発明の細胞保護剤の対象となる細胞は、損傷物質に曝露される可能性がある生体細胞であれば特に制限はないが、例えば表皮細胞、樹状細胞、線維芽細胞、肥満細胞、形質細胞、ランゲルハンス細胞、血管内皮細胞等が挙げられる。この中でも皮膚細胞、特に線維芽細胞に好適に用いることができる。
【００２３】
なお、本発明で用いるストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の例として、前記のようにストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２００１株およびストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４株は、前出特許文献２において、シワ形成抑制作用を有する培養上清を得るのに使用されたものと同一である。しかしながら、特許文献２で用いる培養上清は、乳酸菌の培養後、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて沈殿させ、更にエタノールを加えることで得られたものである。
【００２４】
そして、ＴＣＡ沈殿を行うことでタンパク質が除去され、更にエタノール抽出で主に多糖類が得られ、かつ低分子成分が除去されるから、特許文献２の培養上清は、タンパク質が含まれておらず、かつ平均分子量が９０万程度の多糖類である。
【００２５】
これに対し、本願発明のストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養上清の低分子画分（以下、「培養上清低分子画分」という）は、後記するようにＴＣＡ沈殿を行わないのでタンパク質も存在し、かつ、分子量２０，０００Ｄａ以下のものを採取しているので、低分子のものであることは明らかであって、構成成分およびその分子量の点において特許文献２のものとは相違する。
【００２６】
本発明の細胞保護剤は、上記の培養上清低分子画分を有効成分とし、使用される培養上清低分子画分としては、乳酸菌の培養上清から分子量２０，０００Ｄａを越える部分を除去したものをそのまま或いは、濃縮または希釈した液状物として、またはこれを噴霧乾燥や凍結乾燥等の手段により乾燥した粉末状物として使用することができる。
【００２７】
また、本発明の細胞保護剤は、これを化粧品、医薬品、医薬部外品等の皮膚外用剤組成物に配合することができる。この皮膚外用剤組成物の製造は、常法に従って行うことができ、例えば、精製水や化粧水基剤、クリーム基剤、乳液基剤等に本発明の細胞保護剤を所望の作用効果を発揮できる程度に適量溶解若しくは分散させればよい。
【００２８】
より具体的な皮膚外用剤組成物の例としては、化粧水、乳液、各種クリーム、パック、美容液等の基礎化粧料、シャンプー、リンス、トリートメント、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアクリーム、ヘアミルク等の頭髪用製品、入浴剤等の浴用化粧品、ファンデーション、口紅、マスカラ、アイシャドウ等のメーキャップ化粧品、日焼け止め等を挙げることができる。
【００２９】
これら皮膚外用剤組成物への、細胞保護剤としての培養上清低分子画分の配合量は、特に限定されるものではなく、使用する細胞保護剤の剤型や用途に応じて決めればよいが、好ましくは、培養上清低分子画分をそのまま使用する場合は、０．０１〜１００質量％であり、特に好ましくは０．１〜９０質量％程度、さらに好ましくは１〜２０質量％である。また培養上清低分子画分を乾燥させて使用する場合の配合量は、０．００１〜１０質量％であり、特に好ましくは０．０１〜９質量％程度、さらに好ましくは０．１〜２質量％である。
【００３０】
また、上記皮膚外用剤組成物には、必須成分である本発明の細胞保護剤の他に、通常、皮膚外用剤に配合される任意成分を配合することができる。このような任意成分としては、界面活性剤、油分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収・散乱剤、粉体、ビタミン類、アミノ酸類、水溶性高分子、発泡剤、顔料、植物抽出物、動物由来成分、海藻抽出物、各種薬剤、添加剤、水等を挙げることができる。
【００３１】
また更に、本発明の細胞保護剤は、食経験のある乳酸菌の培養上清低分子画分を有効成分としていることから、各種飲食品にも配合することもできる。例えば前記培養上清低分子画分に、適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよく、また各種の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子などに添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用しても良い。
【実施例】
【００３２】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。【００３３】
実  施  例  １
ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４の−８０℃保存菌株を、２ｍＬ試験管中のＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）中に１白金耳植菌し、４０℃で一晩静置培養した。次に、この培養物を、２ｍＬの１０％脱脂粉乳水溶液（１０％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ））中に１％となるよう植菌した後、４０℃で一晩静置培養を行い、前々培養とした。【００３４】
更に同様に前培養を行い、この前培養物を本培養培地（３％脱脂粉乳水溶液）１００ｍＬに１％で植菌し、４０℃で２４時間静置培養した。【００３５】
培養後の菌液を、４℃、８，０００×ｇで１５分間遠心分離し、沈殿物を除去した。得られた沈殿物除去液を、セントリカットミニＶ−２０（分画分子量２０，０００Ｄａ；倉敷紡績）を用い、４℃、３０００×ｇで１時間限外ろ過を行なって透過液１を１０ｍＬ得た。【００３６】
得られた透過液１を凍結乾燥し、これを５０ｍＭ  ＮａＣｌに溶解後、下記条件でＨＰＬＣを行った。この結果を図１に示す。ＨＰＬＣの結果から、上記透過液１の平均分子量は、３００Ｄａであることが明らかになった。【００３７】
［  ＨＰＬＣ条件  ］
装  置：  Ｗａｔｅｒｓ−６００Ｅ
検出器：  ＩＳＩ  ＲＩ−９８０
カラム：  ＳｈｏｄｅｘＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０４
カラム温度：  ８０℃
移動相：  ５０ｍＭ  ＮａＣｌ
フローレート：  １ｍＬ／分
注入量：  １０μＬ【００３８】
実  施  例  ２  
ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０８４を、ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２００１に代える以外は実施例１と同様にして透過液２を１０ｍＬ得た。【００３９】
この透過液２についても実施例１と同様にしてＨＰＬＣを行い、図２の結果を得た。この透過液２の平均分子量は、３００Ｄａであることが明らかになった。【００４０】
実  施  例  ３
過酸化水素を利用した細胞の曝露試験：
マウス皮膚由来線維芽細胞３Ｔ３を９６穴プレートに１．３×１０４個播種し、１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間培養した。【００４１】
培養後、培地を取り除き、ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｄ−ＭＥＭ培地（１００μＬ）に交換した。透過液１および透過液２、並びにこれをそれぞれＰＢＳを用いて２倍に希釈した液の各１０μＬをプレート穴に添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４時間培養した。上記透過液は乳酸菌の培養上清から分子量２０，０００Ｄａを越える部分を除去したものをそのまま使用した。【００４２】
再度培地を取り除き、ＰＢＳで２回洗浄した後Ｈ２Ｏ２およびＦｅＳＯ４をそれぞれの終濃度が４００μＭおよび５μＭとなるように添加し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で６時間培養した。なお、非曝露群は、ＰＢＳのみを加えた後、同一条件で培養した。【００４３】
最後に、細胞をクリスタルバイオレットを用いて染色し、５９０ｎｍの吸光度を生細胞数の指標とした。なお、対照として透過液を用いず、ＰＢＳのみのものを利用した。この結果を、表１に示す。【００４４】
【表１】
2012026346.tif 000002
【００４５】
上記のように、透過液１および２は、濃度依存的に５９０ｎｍの吸光度が高くなっており、細胞保護作用を有することが明らかになった。また、表１での過酸化水素非曝露（なし）に対する過酸化水素曝露の場合の細胞生存の割合を対比すると、透過液１では、１．０４倍であり、過酸化水素曝露によっても細胞数が減少していなかった。【００４６】
実  施  例  ４
過酸化水素除去作用：
５０μＭのＨ２Ｏ２液に、それぞれ透過液１および透過液２並びにそれらをＰＢＳで２、４および８倍希釈した希釈液を加え、３７℃で３０分インキュベートした後のＨ２Ｏ２濃度を測定した。この結果を表２に示す。【００４７】
【表２】
2012026346.tif 000003
【００４８】
この結果から、透過液１および透過液２の過酸化水素に対する作用はほぼ同様であった。
このことから前記実施例３で見られた透過液１の効果は、過酸化水素の消去等によるものでなく、他のメカニズムによるものであることが示唆された。【００４９】
実  施  例  ５
化粧水の調製：
下記組成で、化粧水を調製した。なお、調製方法は、（７）と（６）を混合して、これに（１）〜（５）を加えて十分に攪拌して化粧水を得た。透過液１は培養上清低分子画分をそのまま使用した。【００５０】
【表３】
2012026346.tif 000004
【００５１】
実  施  例  ６
乳液の調製：
下記組成で、乳液を調製した。なお、調製方法は、（１１）に（７）、（８）及び（１０）を加えて加温し、８０℃で（１）〜（６）を加えて乳化し、その後、（９）を加えて攪拌し、室温まで冷却して乳液を得た。透過液１は培養上清低分子画分をそのまま使用した。【００５２】
【表４】
2012026346.tif 000005
【００５３】
実  施  例  ７
クリームの調製：
下記組成で、クリームを調製した。なお、調製方法は、（１４）に（９）、（１０）、（１２）及び（１３）を加えて加温し、８０℃で（１）〜（８）を加えて乳化し、その後、（１１）を加えて攪拌し、室温まで冷却してクリームを得た。透過液１は培養上清低分子画分をそのまま使用した。【００５４】
【表５】
2012026346.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の細胞保護剤は、上記実施例で示されるように、過酸化水素等の損傷物質から細胞を保護する働きを有するものである。そして、細胞が保護され、細胞数が維持されれば十分な細胞間脂質の形成が起こり、角層のバリア機能が充実するために水分損失が抑制され、水分含量が増加し、肌荒れ等が改善される。また、老化と共に細胞数が減少するので、本発明の細胞保護剤により抗老化作用も期待できる。【００５６】
このように、本発明の細胞保護剤は、過酸化水素等の損傷物質から細胞を保護する効果を有するため、皮膚外用剤や化粧品の有用な配合成分として利用できるものである。【００５７】
また、上記細胞保護剤の有効成分であるストレプトコッカス・サーモフィルスに属する乳酸菌の培養上清中の低分子画分は、上記のように損傷物質から細胞を保護する作用を有するので、これを保護しようとする皮膚上、例えば角層、基底層などを含む表皮や真皮等に適用することで、皮膚細胞を保護することが可能となる。
【図１】
2012026346.tif 000007
【図２】
2012026346.tif 000008
【国際調査報告】
2012026346.tif 000009
2012026346.tif 000010
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2012026346.tif 000012
2012026346.tif 000013
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