(57)【要約】  正確で再現性が高く、かつ簡便で比較的安価な種、雑種、及び雑種両親の識別方法を開発し、提供する。  二以上の植物種からなる群において、その群に含まれる特定の種にのみ統計学的に有意に多く蓄積する代謝産物をその種を同定するための種同定用マーカーとして選択する方法、及び被検植物がいずれの種同定用マーカーを統計学的に有意に含むかを判定し、種、雑種又は雑種の両親種を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二以上の植物種からなる群から特定の種を同定するための種同定用マーカーの選択方法であって、
前記群を構成する各植物種の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、
抽出ステップで得られた各植物種の抽出物中に含まれる代謝産物の蓄積量を比較したときに、前記特定の種において、その蓄積量が前記群内の他の種よりも統計学的に有意に多い代謝産物をその特定の種を同定するための種同定用マーカーとして選択する選択ステップ、
を含む前記選択方法。
【請求項２】
前記特定の種における代謝産物の統計学的に有意に多い蓄積量が前記群を構成する他の植物種におけるその蓄積量の２倍以上である、請求項1に記載の選択方法。
【請求項３】
前記群を構成する植物種が同じ属に属する、請求項１又は２に記載の選択方法。
【請求項４】
前記属がユーカリ（ユーカリプタス：Eucalyptus）属又はアカシア（Acacia）属である、請求項３に記載の選択方法。
【請求項５】
前記代謝産物の蓄積量の比較が質量分析法又はNMR法を用いて行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の選択方法。
【請求項６】
前記代謝産物がタンパク質又は低分子化合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の選択方法。
【請求項７】
下記表１に示される特性を有するユーカリプタス・ブラシアーナ（Eucalyptus brassiana）及びユーカリプタス・ペリータ（Eucalyptus pellita）の種同定用マーカー。
【表１】
2011059066.tif 000007
【請求項８】
下記表２に示される特性を有するアカシア・マンギウム（Acacia mangium）及びアカシア・アウリカリフォルミス（Acacia auriculiformis）の種同定用マーカー。
【表２】
2011059066.tif 000008
【請求項９】
二以上の植物種からなる群を構成するいずれかの種と同一であることが予想される被検植物の種を同定する方法であって、
被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、
前記抽出ステップで得られた抽出物が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって選択された種同定用マーカーを包含するかを検索する検索ステップ、
抽出物が前記種同定用マーカーと合致する代謝産物を統計学的に有意に多い蓄積量で１つ包含する場合、被検植物がその種同定用マーカーに対応する種であると判定する種判定ステップ、
を含む前記方法。
【請求項１０】
二以上の植物種からなる群を構成する一組の種に由来することが予想される雑種を同定する方法であって、
被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、
前記抽出ステップで得られた抽出物が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって選択された種同定用マーカーを包含するかを検索する検索ステップ、
抽出物が前記種同定用マーカーと合致する代謝産物を統計学的に有意に多い蓄積量で２つ包含する場合、被検植物がそれぞれの種同定用マーカーに対応する種の雑種であると判定する雑種判定ステップ、
を含む前記方法。
【請求項１１】
二以上の植物種からなる群を構成する一組の種に由来することが予想される被検雑種植物において、その両親種を同定する方法であって、
被検雑種植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、
前記抽出ステップで得られた抽出物が、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって選択された種同定用マーカーを包含するかを検索する検索ステップ、
抽出物が前記種同定用マーカーと合致する代謝産物を統計学的に有意に多い蓄積量で２つ包含する場合、当該被検雑種植物の両親種は前記２つの種同定用マーカーに対応する種であると判定する両親種判定ステップ、
を含む前記方法。
【請求項１２】
二以上の植物種からなる群から特定の種を同定するための種同定表の作成方法であって、
前記群を構成する各植物種の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、
前記群を構成する異なる２種間において、前記抽出ステップで得られた抽出物中に含まれる代謝産物を比較して、一方の種にのみ統計学的に有意に多い代謝産物を種同定表の種同定表構成マーカーとして選択する選択ステップ、
前記群を構成する各植物種が、前記選択ステップで得られた種同定表構成マーカーを前記抽出ステップで得られた抽出物中に包含するか否かを分類し、種同定表を作成する表作成ステップ、
を含む前記作成方法。
【請求項１３】
前記群を構成する植物種が同じ属に属する、請求項１２に記載の作成方法。
【請求項１４】
前記属がユーカリ属である、請求項１３に記載の作成方法。
【請求項１５】
前記代謝産物の比較が質量分析法又はNMR法を用いて行われる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の作成方法。
【請求項１６】
前記代謝産物がタンパク質又は低分子化合物である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の作成方法。
【請求項１７】
ユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・ブラシアーナ、ユーカリプタス・グロブラス、ユーカリプタス・グランディス、ユーカリプタス・カマルドレンシス又はそれらの種間雑種を同定するための、表４で示される存在パターンを示す種同定表構成マーカー群。
【表４】
2011059066.tif 000009
【請求項１８】
二以上の植物種からなる群を構成する種のいずれかと同一であることが予想される被検植物の種を同定する方法であって、
被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、
前記抽出ステップで得られた抽出物において、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法によって作成された種同定表又は請求項１７に記載の種同定表を用いて、当該種同定表に記載の各種同定表構成マーカーの存在の有無を検索し、分類する分類ステップ、
前記分類ステップで得られた被検植物の種同定表構成マーカー群の存在パターンが前記種同定表における構成種のいずれかの種の種同定表構成マーカー群の存在パターンと合致する場合、被検植物は当該合致した種であると判定する種判定ステップ、
を含む前記方法。
【請求項１９】
二以上の植物種からなる群を構成する一組の種に由来することが予想される雑種を同定する方法であって、
被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、
前記抽出ステップで得られた抽出物において、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法によって作成された種同定表又は請求項１７に記載の種同定表を用いて、当該種同定表に記載の各種同定表構成マーカー群の存在の有無を検索し、分類する分類ステップ、
前記分類ステップで得られた被検植物の種同定表構成マーカー群の存在パターンが前記種同定表における構成種のいずれの種の種同定表構成マーカー群の存在パターンとも合致せず、かつ前記種同定表における構成種のいずれか２種を組み合わせたときの存在パターンと合致する場合、被検植物は、当該２種の雑種であると判定する雑種判定ステップ、
を含む前記方法。
【請求項２０】
二以上の植物種からなる群を構成する一組の種に由来することが予想される被検雑種植物において、その両親種を同定する方法であって、
被検雑種植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、
前記抽出ステップで得られた抽出物において、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法によって作製された種同定表又は請求項１７に記載の種同定表を用いて、当該種同定表に記載の各種同定表構成マーカー群の存在の有無を検索し、分類する分類ステップ、
前記分類ステップで得られた被検植物の種同定表構成マーカー群の存在パターンが前記種同定表における構成種のいずれか２種を組み合わせたときの存在パターンと合致する場合、被検植物は、前記２種の雑種であると判定する雑種判定ステップ、
を含む前記方法。
【請求項２１】
請求項９若しくは請求項１８の種同定方法又は請求項１０若しくは１９に記載の雑種同定方法によって植物の種類を同定するステップ、及び
前記同定ステップで種同定された植物を土壌又は培地に植栽するステップ
を含む植栽方法。
【請求項２２】
下記表５に示される特性を有し、表５に記載の各種間において特定のユーカリ種を同定するための種同定用マーカーとして利用するための種同定表構成マーカー。
【表５】
2011059066.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の代謝産物を利用して植物の雑種同定用マーカーを選択する方法及び特定の種を同定するための種同定表を作成する方法、当該マーカー又は種同定表を用いた種、雑種及び雑種両親種の同定方法、その方法により同定された植物の植栽方法、並びに雑種同定用マーカー及び種同定表構成マーカー群に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の種間雑種は、雑種強勢により両親種の優良な形質を受け継ぐことが多い。これは、遺伝的ヘテロ接合により環境に対する適応性の幅が広くなることに起因する。ユーカリプタス属（Eucalyptus）（以下、「ユーカリ属」とする）を例に挙げると、ユーカリプタス・ペリータ（Eucalyptus pellita）は、東南アジアでは他のユーカリ種と比べて成長速度が速く、またユーカリプタス・ブラシアーナ（Eucalyptus brassiana）は、耐病性が高いという形質を有する。一方、これらの種間雑種は、成長速度が速く、かつ耐病性も高いという両親種の有用な形質を兼ね備えている。このような種間雑種は、自然交雑によっても得られる他、より優良な品種を得るために人為的交配によっても作製されている。したがって、植物集団内から目的の雑種を識別し、選択することは、農林業分野において極めて重要な作業といえる。【０００３】
植物雑種の識別は、通常、植物の外部形態の比較に基づき、熟練した育種業者の判断によって行われている。しかし、このような育種業者の経験に基づく主観的判断は、必ずしも正確な識別法とは言えず、時として育種業者間で結果が異なるという問題を包含する。さらに、得られた雑種の外部形態が一方の親種のそれに酷似する場合や両親種が互いに類似する場合には、雑種の識別は、熟練した育種業者であっても困難である。【０００４】
近年では、DNAを用いた客観的、かつ正確な雑種の識別法が開発されている。例えば、RAPD法やゲノムDNAの種特異的塩基配列長の違い（PCR-SSCP法）による種識別方法がその代表として挙げられる（特許文献１、２）。【０００５】
RAPD法は、操作が簡単で、少量のDNAでも分析が可能であり、また個体識別等にも利用できるという利点を有する。しかし、結果の再現性が低いという致命的な欠点を有するため、必ずしも確実な雑種識別法とは言えない。【０００６】
また、PCR-SSCP法は、正確性と再現性の点において現在のところ最も優れた方法である。しかし、雑種を見つけ出すためには、例えば、1000個体以上の大量のサンプルを解析する必要があり、分析時間やコスト面において問題があるため、実用的方法とは言い難い。【０００７】
一方、自然交雑種や系統的に古い品種の中には、雑種であることが明らかであっても、両親種が不明な場合がある。両親種が明らかになれば、その雑種で表現型として現れていない両親種の潜在的な遺伝的形質の存在を推測することが可能となり、育種分野に重要な情報を提供することができる。しかし、雑種の両親種を正確に同定することは、通常、雑種の同定以上に困難である。【０００８】
以上のように、従来、植物雑種又は雑種の両親種を短時間、かつ比較的安価で簡便に、また正確に識別する方法は、知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2005-295925号
【特許文献２】特開平10-229898号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、正確で再現性が高く、かつ簡便で比較的安価に種、雑種及び雑種両親種を同定する方法を開発し、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、植物の代謝産物のいくつかは、近似種間であっても蓄積量において種特異性を示すことを見出した。本発明は、当該知見に基づくものであって、すなわち以下を提供する。【００１２】
（１）二以上の植物種からなる群から特定の種を同定するための種同定用マーカーの選択方法であって、前記群を構成する各植物種の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、抽出ステップで得られた各植物種の抽出物中に含まれる代謝産物の蓄積量を比較したときに、前記特定の種において、その蓄積量が前記群内の他の植物種よりも統計学的に有意に多い代謝産物をその特定の種を同定するための種同定用マーカーとして選択する選択ステップ、を含む前記選択方法。【００１３】
（２）特定の種における代謝産物の統計学的に有意に多い蓄積量が、前記群を構成する他の植物種におけるその蓄積量の２倍以上である、（１）に記載の選択方法。【００１４】
（３）前記群を構成する植物種が同じ属に属する、（１）又は（２）に記載の選択方法。【００１５】
（４）前記属がユーカリ（ユーカリプタス：Eucalyptus）属又はアカシア（Acacia）属である、（３）に記載の選択方法。【００１６】
（５）前記代謝産物の蓄積量の比較が質量分析法又はNMR法を用いて行われる、（１）〜（４）のいずれかに記載の選択方法。【００１７】
（６）前記代謝産物がタンパク質又は低分子化合物である、（１）〜（５）のいずれかに記載の選択方法。【００１８】
（７）下記表１で示される特性を有するユーカリプタス・ブラシアーナ（Eucalyptus brassiana）及びユーカリプタス・ペリータ（Eucalyptus pellita）の種同定用マーカー。
【表１】
2011059066.tif 000002
【００１９】
（８）下記表２で示される特性を有するアカシア・マンギウム（Acacia mangium）及びアカシア・アウリカリフォルミス（Acacia auriculiformis）の種同定用マーカー。
【表２】
2011059066.tif 000003
【００２０】
（９）二以上の植物種からなる群を構成するいずれかの種と同一であることが予想される被検植物の種を同定する方法であって、被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、前記抽出ステップで得られた抽出物が、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法によって選択された種同定用マーカーを包含するかを検索する検索ステップ、抽出物が前記種同定用マーカーと合致する代謝産物を統計学的に有意に多い蓄積量で１つ包含する場合には被検植物がその種同定用マーカーに対応する種であると判定する種判定ステップを含む前記方法。【００２１】
（１０）二以上の植物種からなる群を構成する一組の種に由来することが予想される雑種を同定する方法であって、被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、前記抽出ステップで得られた抽出物が、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法によって選択された種同定用マーカーを包含するかを検索する検索ステップ、抽出物が前記種同定用マーカーと合致する代謝産物を統計学的に有意に多い蓄積量で２つ包含する場合、被検植物がそれぞれの種同定用マーカーに対応する種の雑種であると判定する雑種判定ステップ、を含む前記方法。【００２２】
（１１）二以上の植物種からなる群を構成する一組の種に由来することが予想される被検雑種植物において、その両親種を同定する方法であって、被検雑種植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、前記抽出ステップで得られた抽出物が、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法によって選択された種同定用マーカーを包含するかを検索する検索ステップ、抽出物が前記種同定用マーカーと合致する代謝産物を統計学的に有意に多い蓄積量で２つ包含する場合、当該被検雑種植物の両親種は前記２つの種同定用マーカーに対応する種であると判定する両親種判定ステップ、を含む前記方法。【００２３】
（１２）二以上の植物種からなる群から特定の種を同定するための種同定表の作成方法であって、前記群を構成する各植物種の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、前記群を構成する異なる２種間において、前記抽出ステップで得られた抽出物中に含まれる代謝産物を比較して、一方の種にのみ統計学的に有意に多い代謝産物を種同定用構成マーカーとして選択する選択ステップ、前記群を構成する各植物種が、前記選択ステップで得られた種同定表構成マーカーを前記抽出ステップで得られた抽出物中に包含するか否かを分類し、種同定表を作成する表作成ステップ、を含む前記作成方法。【００２４】
（１３）前記群を構成する植物種が同じ属に属する、（１２）に記載の作成方法。【００２５】
（１４）前記属がユーカリ属である、（１３）に記載の作成方法。【００２６】
（１５）前記代謝産物の比較が質量分析法又はNMR法を用いて行われる、（１２）〜（１４）のいずれかに記載の作成方法。【００２７】
（１６）前記代謝産物がタンパク質又は低分子化合物である、（１２）〜（１５）のいずれかに記載の作成方法。【００２８】
（１７）ユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・ブラシアーナ、ユーカリプタス・グロブラス、ユーカリプタス・グランディス、ユーカリプタス・カマルドレンシス又はそれらの種間雑種を同定するための、表４で示される存在パターンを示す種同定表構成マーカー群。
【表４】
2011059066.tif 000004
【００２９】
（１８）二以上の植物種からなる群を構成する種のいずれかと同一であることが予想される被検植物の種を同定する方法であって、被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、前記抽出ステップで得られた抽出物において、（１２）〜（１６）のいずれかに記載の方法によって作成された種同定表又は（１７）に記載の種同定表を用いて、当該種同定表に記載の各種同定表構成マーカーの存在の有無を検索し、分類する分類ステップ、前記分類ステップで得られた被検植物の種同定表構成マーカー群の存在パターンが前記種同定表における構成種のいずれかの種の種同定表構成マーカー群の存在パターンと合致する場合、被検植物は当該合致した種であると判定する種判定ステップ、を含む前記方法。【００３０】
（１９）二以上の植物種からなる群を構成する一組の種に由来することが予想される雑種を同定する方法であって、被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、前記抽出ステップで得られた抽出物において、（１２）〜（１６）のいずれかに記載の方法によって作成された種同定表又は（１７）に記載の種同定表を用いて、当該種同定表に記載の各種同定表構成マーカー群の存在の有無を検索し、分類する分類ステップ、前記分類ステップで得られた被検植物の種同定表構成マーカー群の存在パターンが前記種同定表における構成種のいずれの種の種同定表構成マーカー群の存在パターンとも合致せず、かつ前記種同定表における構成種のいずれか２種を組み合わせたときの存在パターンと合致する場合、被検植物は、当該２種の雑種であると判定する雑種判定ステップ、を含む前記方法。【００３１】
（２０）二以上の植物種からなる群を構成する一組の種に由来することが予想される被検雑種植物において、その両親種を同定する方法であって、被検雑種植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出ステップ、前記抽出ステップで得られた抽出物において、（１２）〜（１６）のいずれかに記載の方法によって作製された種同定表又は（１７）に記載の種同定表を用いて、当該種同定表に記載の各種同定表構成マーカー群の存在の有無を検索し、分類する分類ステップ、前記分類ステップで得られた被検植物の種同定表構成マーカー群の存在パターンが前記種同定表における構成種のいずれか２種を組み合わせたときの存在パターンと合致する場合、被検植物は、前記２種の雑種であると判定する雑種判定ステップ、を含む前記方法。【００３２】
（２１）前記（９）若しくは（１８）の種同定方法又は（１０）若しくは（１９）に記載の雑種同定方法によって植物の種類を同定するステップ、及び前記同定ステップで種同定された植物を土壌又は培地に植栽するステップを含む植栽方法。【００３３】
（２２）下記表５に示される特性を有し、表５に記載の各種間において特定のユーカリ種を同定するための種同定用マーカーとして利用するための種同定表構成マーカー。
【表５】
2011059066.tif 000005
【００３４】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-260080号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の種同定用マーカーの選択方法によれば、様々な植物において量的特異性を示す代謝産物をその特定の種の種同定用マーカーとして得ることができる。【００３６】
本発明の種同定用マーカーの選択方法によって得られた種同定用マーカーを用いれば、植物の代謝産物を利用して種、雑種及び／又は両親種の同定を行うという、前例のない新規な同定方法を提供することができる。当該方法は、従来方法よりも短時間で、簡便、かつ比較的低コストで再現性の高い正確な雑種又は雑種両親を識別することができる。【００３７】
本発明の種同定表の選択方法によれば、二以上の植物種からなる群から特定の種を同定するための種同定表を作成することができる。【００３８】
本発明の種同定表の作成方法によって得られた種同定表を用いれば、前記種同定用マーカーと同様に、植物の代謝産物を利用して種及び／又は雑種の同定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】アカシア属６種について本発明の種同定用マーカーの選択方法で選択された表３で示す各種５つの種同定用マーカーのうち、（ａ）〜（ｃ）で示される種同定用マーカーの前記６種の蓄積量を、それぞれイオン強度によってグラフ化したものである。
【図１−２】アカシア属６種について本発明の種同定用マーカーの選択方法で選択された表３で示す各種５つの種同定用マーカーのうち、（ｄ）〜（ｆ）で示される種同定用マーカーの前記６種の蓄積量を、それぞれイオン強度によってグラフ化したものである。図１−１の結果と共に、いずれの各種同定用マーカーも、そのマーカーに対応する種においてのみ統計学的に有意に多く包含されていることがわかる。
【図２−１】ユーカリプタス・ペリータ（ａ−１）、ユーカリプタス・ブラシアーナ（ｂ−１）及びそれらの雑種（ｃ−１）におけるユーカリプタス・ペリータの種同定用マーカー（黒星ピーク）の蓄積量をイオン強度と保持時間で表したものである。
【図２−２】ユーカリプタス・ペリータ（ａ−２）、ユーカリプタス・ブラシアーナ（ｂ−２）及びそれらの雑種（ｃ−２）におけるユーカリプタス・ブラシアーナの種同定用マーカー（白星ピーク）の蓄積量をイオン強度と保持時間で表したものである。
【図３−１】アカシア・マンギウム（ａ−１）、アカシア・アウリカリフォルミス（ｂ−１）及びそれらの雑種（ｃ−１）におけるアカシア・アウリカリフォルミスの種同定用マーカー（星印ピーク）の蓄積量をイオン強度と保持時間で表したものである。
【図３−２】アカシア・マンギウム（ａ−２）、アカシア・アウリカリフォルミス（ｂ−２）及びそれらの雑種（ｃ−２）におけるアカシア・マンギウムの種同定用マーカー（米印ピーク）の蓄積量をイオン強度と保持時間で表したものである。
【図４−１】ユーカリプタス属５種（ユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・ブラシアーナ、ユーカリプタス・カマルドレンシス、ユーカリプタス・グランディス及びユーカリプタス・グロブラス）の各種における種同定表構成マーカー（M1〜M9）の蓄積量を、それぞれイオン強度によってグラフ化したものである。
【図４−２】ユーカリプタス属５種の各種における種同定表構成マーカー（M1〜M9）を、それぞれイオン強度によってグラフ化したものである。
【図５】三重県亀山市とラオス国タケクにおける年間の降水量及び気温の変化を示す。
【図６−１】亀山市とタケクのそれぞれで栽培したユーカリプタス・ブラシアーナ各２個体における種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図６−２】亀山市とタケクのそれぞれで栽培したユーカリプタス・ペリータ２個体における種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図６−３】亀山市とタケクのそれぞれで栽培したユーカリプタス・ブラシアーナとユーカリプタス・ペリータの種間雑種各２個体における種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図６−４】亀山市とタケクのそれぞれで栽培したユーカリプタス・カマルドレンシス２個体における種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図７−１】ユーカリプタス・ペリータ（個体番号No.1）における植栽１ヶ月目と１年目の種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図７−２】ユーカリプタス・ペリータ（個体番号No.2）における植栽１ヶ月目と１年目の種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図７−３】ユーカリプタス・ペリータ（個体番号No.3）における植栽１ヶ月目と１年目の種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図７−４】ユーカリプタス・ブラシアーナ（個体番号No.4）における植栽１ヶ月目と１年目の種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図７−５】ユーカリプタス・ブラシアーナ（個体番号No.5）における植栽１ヶ月目と１年目の種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図７−６】ユーカリプタス・ブラシアーナ（個体番号No.6）における植栽１ヶ月目と１年目の種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図７−７】ユーカリプタス・カマルドレンシス（個体番号No.7）における植栽１ヶ月目と１年目の種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図７−８】ユーカリプタス・カマルドレンシス（個体番号No.7）における植栽１ヶ月目と１年目の種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図７−９】ユーカリプタス・カマルドレンシス（個体番号No.8）における植栽１ヶ月目と１年目の種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【図７−１０】ユーカリプタス・ペリータ×ユーカリプタス・ブラシアーナ（個体番号No.10）における植栽１ヶ月目と１年目の種同定表構成マーカーをイオン強度によってグラフ化したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
１．種同定用マーカーの選択方法
本発明の第１の態様は、種同定用マーカーの選択方法である。本発明の種同定用マーカーの選択方法は、二以上の植物種からなる群を構成する各植物種において、量的に種特異性を示す代謝産物をその群におけるその特定の種の種同定用マーカーとして選択するように構成されている。本発明の種同定用マーカーの選択方法は、「抽出ステップ」及び「選択ステップ」を含む。以下、各ステップについて具体的に説明をする。
【００４１】
１−１．抽出ステップ
「抽出ステップ」とは、二以上の植物種からなる群を構成する各植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出するステップである。
【００４２】
本明細書において「植物」とは、コケ植物、シダ植物及び種子植物をいう。好ましくは種子植物である。種子植物の場合、裸子植物若しくは被子植物、又は草本類若しくは木本類の種類は問わない。
【００４３】
本明細書において「植物種」は、生物分類学上の種を意味する。したがって、種の下位概念である亜種又は品種も包含することができる。
【００４４】
「二以上の植物種からなる群」（本明細書においては、以降、しばしば「植物種群」と称する）とは、複数の異なる種から構成される群を意味する。２種以上の植物種から構成される群のみならず、単一種からなる群であっても２以上の亜種及び／又は品種で構成される群（例えば、ユーカリ属グロブラス亜種グロブラスとユーカリ属グロブラス亜種マイデニーとからなる群）も本群に含まれる。前記植物種群を構成する各植物種は、系統的に近似種である必要性又は形態的に類似する必要性は必ずしもない。しかし、本発明の一の目的が目視による識別、すなわち形態的相違に基づく識別が困難な場合に有効な種同定用マーカーを選択する方法の提供であることを鑑みれば、植物種群を構成する各植物種は、いずれも植物体の全部又は一部が形態的に類似していることが好ましい。また、植物種群は、異なる分類階級に属する種から構成されていてもよい。例えば、ユーカリ属とアカシア（Acacia）属からなる群が該当する。各構成種は、同一分類階級、例えば、同じ科、同じ亜科、又は同じ属に属する植物種であれば好ましく、同じ属に属する植物種はより好ましい。例えば、植物種群が、ユーカリ属に属する種であれば、ユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・ブラシアーナ、ユーカリプタス・カマルドレンシス、ユーカリプタス・グランディス、ユーカリプタス・グロブラス、ユーカリプタス・ユーロフィラ、ユーカリプタス・デグルプタ、及び／又はユーカリプタス・テレティコンティス等から構成される群が、あるいはアカシア属に属する種であれば、例えば、アカシア・アウリカリフォルミス、アカシア・セネガル、アカシア・アラタ、アカシア・ベイリアナ、アカシア・メラノキシロン、アカシア・フラブ、アカシア・コンフサ、アカシア・キアノフィラ、アカシア・マンギウム、アカシア・デアルバタ等から構成される群が該当する。本発明の植物種群を構成する植物種数は、二以上あれば特に制限はしない。植物種数は多いほど、本発明で得られる種同定用マーカーの特異性、すなわち、種同定用マーカーとしての精度は高くなる。しかし、一般的に種の同定は、互いに系統的及び／又は形態的に近似する種間で行われることから、通常、系統的及び／又は形態的に近似し、かつ比較頻度の高い２〜１０種で構成される群であれば、種同定用マーカーとして十分に機能し得る。
【００４５】
前記植物種群を構成する各植物種は、複数の同種（又は同亜種若しくは同品種）個体を有していてもよい。１種（又は１亜種若しくは１品種）あたり１個体よりも複数個体の方が、より精度の高い代謝産物の蓄積量を算出できるからである。
【００４６】
本明細書において植物の「全部」とは、対象とする植物体を構成する全ての部分をいう。また、植物の「一部」とは、対象とする植物を構成する器官（例えば、根部、茎部、葉部、花部、又は胞子若しくは種子等）、前記器官を構成する形態的及び／若しくは機能的に分化した細胞群である組織、又は前記組織を構成する細胞をいう。植物の一部は、いずれの部位を用いてもよいが、好ましくは葉部である。これは、入手が容易であり、採取する植物体に与える負荷も比較的小さく、また植物体の中でも代謝産物を最も多く含有していることから、種同定用マーカーとして、より精度の高い代謝産物を得ることができる可能性が高いためである。
【００４７】
本明細書において「代謝」とは、呼吸に代表される異化代謝及び光合成に代表される同化代謝のいずれも包含する。したがって、本明細書において「代謝産物」とは、水、二酸化炭素を除き、植物の代謝によって生じるあらゆる物質を含む。例えば、タンパク質（酵素を含む）、低分子化合物（植物ホルモン、ポリフェノール、糖、アミノ酸、脂肪酸、ヌクレオチドを含む）が該当する。好ましくは、低分子化合物である。また、本明細書における代謝産物は、水溶性又は脂溶性を問わない。
【００４８】
本発明において、代謝産物は、後述する公知の分析手法を用いて同定若しくは特定できればよく、その化学構造まで必ずしも決定されている必要はない。例えば、質量分析法により代謝産物を分析した場合には、保持時間と質量電荷比のみを特定できればよい。
【００４９】
本明細書において「抽出物」とは、複数の代謝産物を包含する植物抽出物、通常は、植物抽出液をいう。抽出物には、代謝産物でない物質、例えば、肥料のように植物が外界から直接取り込んだ物質が混在していても構わない。施肥又は添加した物質が明らかであれば、代謝産物と区別し得るからである。代謝産物は、水溶性及び脂溶性を問わないことから、抽出物の抽出に用いる溶媒は、水溶液又は有機溶媒（例えば、低級アルコール、エーテル、クロロホルム、酢酸エチルエステル、キシレン等）のいずれであってもよい。
【００５０】
前記植物種群を構成する各植物種の生育諸条件、例えば、栄養状態、気象条件（例えば、気温、日照時間、湿度）、土壌条件、時間的条件（例えば、生育期間、生育時期）及びその植物の健康状態は、可能な限り同一であることが好ましい。同一の生育条件下で育成された植物から得られた代謝産物で、蓄積量的に顕著な種特異性を示すものは、精度の高い種同定用マーカーとなり得るからである。二以上の植物種からなる群を構成する各植物種の生育条件を統一化するには、各植物種を、例えば、人工気象器内のような人工的環境下で合成培地によって、好適には水耕栽培で、育成すればよい。
【００５１】
抽出ステップでは、前記植物種群よりなる群を構成する各植物個体の全部又は一部から抽出物を抽出する。個体の一部から抽出する場合、その一部は、各個体間で同一部分を用いることが好ましい。例えば、前記植物種群において、一の構成種の葉から抽出物を抽出する場合には、他の構成種も葉から抽出すればよい。精度の高い種同定用マーカーを得るために、各植物種からの抽出条件を可能な限り同一にするためである。抽出物を抽出する方法は、植物から代謝産物を抽出できる方法であれば特に限定しない。例えば、水溶性の代謝産物を得る場合には、必要に応じて植物体を粉砕等した後、加水し、圧搾後、ろ過すればよい。また脂溶性の代謝産物を得る場合には、必要に応じて植物体を粉砕等した後、メタノール等の有機溶媒に所定の期間浸漬し、その後、ろ過すればよい。これらの抽出方法の詳細については、当該分野で公知の技術を用いることができる。例えば、文献名（Iijima et al., The Plant Journal (2008)54,949-962, Suzuki et al., Phytochemistry (2008) 69, 99-111）に記載の方法を参照されたい。
【００５２】
１−２．選択ステップ
「選択ステップ」とは、抽出ステップで得られた各植物種の抽出物中に含まれる代謝産物の蓄積量を比較したときに、蓄積量が前記群内の他の種よりも統計学的に有意に多い代謝産物をその特定の種を同定するための種同定用マーカーとして選択するステップをいう。
【００５３】
本明細書において「蓄積量」とは、抽出ステップで得られた抽出物に包含される特定の代謝産物の量であって、濃度又は質量分析法の場合であればイオン強度のような相対量であってもよく、また絶対量であってもよい。
【００５４】
本ステップでは、前記抽出ステップで得られた抽出物に包含される代謝産物の蓄積量を、植物種群を構成する各植物種間で比較する。各植物種から得られた抽出物に包含される同一代謝産物を検出し、その蓄積量を比較する方法は、代謝産物を検出及び定量可能な方法であれば特に限定はしない。例えば、質量分析法又はNMR法を用いて検出及び定量することができる。質量分析法は、高速液体クロマトグラフ質量分析法（LC-MS）、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法（LC-MS/MS）、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）、ガスクロマトグラフタンデム質量分析法（GC-MS/MS）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）及びICP質量分析法（ICP-MS）を含む。これらの分析方法は、いずれも当該分野に公知の技術であって、それらの方法に準じて行えばよい。例えば、文献名（Iijima et al., The Plant Journal (2008)54,949-962, Hirai et al. Proc Natl Acad Sci USA (2004) 101(27) 10205-10210, Sato et al., The Plant Journal (2004) 40(1)151-163, Shimizu et al., Proteomics (2005) 5,3919-3931）を参照されたい。
【００５５】
比較の結果、植物種群を構成する特定の種において、代謝産物の蓄積量が前記植物種群における他のいずれの種よりも統計学的に有意に多い場合には、その代謝産物をその特定の種を同定するための種同定用マーカーとして選択する。ここで「統計学的に有意」とは、植物種群を構成する二以上の植物種間で同一代謝産物の蓄積量の量的差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が5％、1％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。したがって、ある代謝産物が植物種群を構成する全ての植物種に存在する場合であっても、特定の種において統計学的に有意に多く包含されていればその代謝産物は種同定用マーカーとなり得る。種同定用マーカーとして最も好ましい代謝産物は、特定の種にのみ特異的に存在し、他の植物種には存在しない代謝産物である。検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の方法であれば、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる（鈴木▼完▲之；統計学の基礎、永田靖ら；統計的多重比較法の基礎）。「統計学的に有意に多い」値は、代謝産物の種類、分析方法等で変化し得るが、通常は、２倍以上、好ましくは2.5倍以上又は３倍以上あればよい。特定の種において、抽出物中に統計学的に有意に多い代謝産物が複数存在する場合、いずれの代謝産物もその種同定用マーカーとなり得る。
【００５６】
本発明によって得られた種同定用マーカーの有効範囲は、原則として、その種同定用マーカーの選択に用いた二以上の植物種からなる群内である。例えば、A〜E種からなる群から得られたA種同定用マーカーは、その群の中からA種を同定するための種同定用マーカーとして有効である。すなわち、被検植物がA〜E種のいずれであるか不明な場合に、A種同定用マーカーは、被検植物がA種であるか否かを正確に同定することができる。一方、A種同定用マーカーの選択時に用いた植物種群に含まれない植物種を含む群の中からA種を同定する場合、例えば、A〜E種よりなる群から得られたA種同定用マーカーを用いて、被検植物がA〜G種（この場合、F及びG種は、前記A種同定用マーカーを選択する際に用いていない）の中のいずれの種であるかを同定する場合、そのA種同定用マーカーは、被検植物がB〜E種でないことは判別できても、A、F及びG種のいずれであるかまでは正確に同定することはできない。したがって、植物種群は、マーカー選択当初から、比較検証をすることが予想される植物種（例えば、形態的及び／又は系統的に類似する種）を可能な限り多く含んでいることが好ましい。そのような植物種群から選択された種同定用マーカーほど、より精度の高い種同定用マーカーとなり得る。
【００５７】
１−３．効果
本態様の種同定用マーカーの選択方法によれば、代謝産物を利用した新規の種同定用マーカーを提供することができる。また、本方法によって選択された種同定用マーカーは、後述する種、雑種、及び雑種両親種の同定方法に利用することができる。
【００５８】
２．種同定用マーカー
本発明の第２の態様は、ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナ、並びにアカシア・アウリカリフォルミス及びアカシア・マンギウムに関する種同定用マーカーである。本態様における種同定用マーカーは、後述する実施例２及び３で示すように前記態様の「種同定用マーカーの選択方法」の方法を用いて選択されたものである。したがって、詳細については、実施例２及び３を参照されたい。ここで、種同定用マーカーの選択方法における二以上の植物種からなる群は、ユーカリ属については、ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナの２種からなる群であり、またアカシア属については、アカシア・アウリカリフォルミス及びアカシア・マンギウムの２種からなる群である。ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナ、並びにアカシア・アウリカリフォルミス及びアカシア・マンギウムは、それぞれ種間雑種を形成し得る。したがって、本発明の種同定用マーカーは、後述する本発明の雑種同定方法において、ユーカリプタス・ペリータとユーカリプタス・ブラシアーナの雑種、及びアカシア・アウリカリフォルミスとアカシア・マンギウムの雑種をそれぞれ同定する際の同定用マーカーとして有用である。
【００５９】
本発明の各植物種の種同定用マーカーを前記表１及び表２に示す。表１及び表２において、各マーカーは、プリカーサイオン及びプロダクトイオンの各質量電荷比、並びにMassにおける保持時間（分）によって特定される。
【００６０】
本態様の種同定用マーカーによれば、後述する雑種同定方法に用いることで、通常、目視では困難なユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナ、並びにアカシア・アウリカリフォルミス及びアカシア・マンギウムの各種間雑種を容易に同定することができる。これにより、大量のユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナ群の中から両種間雑種を迅速に、簡便に、かつ正確に識別できる。それ故、林業育種産業上、極めて有用な同定用マーカーとなり得る。
【００６１】
３．種同定表の作成方法
本発明の第３の態様は、二以上の植物種からなる群（植物種群）から特定の種を同定するための種同定表の作成方法である。
【００６２】
前記第１態様の「種同定用マーカーの選択方法」において得られる種同定用マーカーは、その有効範囲が原則として、種同定用マーカーの選択に用いた二以上の植物種からなる植物種群内であった。したがって、仮に新たな植物種を植物種群に追加する必要性が生じた場合には、その植物種群におけるそれまでの種同定用マーカーは、その有効性を失う可能性がある。また、植物種群を構成する植物種数が増加すると、それに伴い、必然的に個々の植物種のみに特異的に存在する代謝産物は減少してしまうため、植物種群の構成植物種が多い場合には、目的とする種同定用マーカーが存在しないという場合も生じ得る。本態様で得られる種同定表は、第１態様で得られる種同定用マーカーが包含するこのような欠点を補うために開発された発明である。
【００６３】
本態様の種同定表の作成方法は、植物種群を構成する２種間で一方の種においてのみ統計学的に有意に多い代謝産物を種同定表構成マーカーとして選択し、そのマーカーが前記植物種群を構成する他の種にも存在するか否かに基づいて分類することによって、種同定表を作成することを特徴とする。本発明の種同定表の作成方法は、「抽出ステップ」、「選択ステップ」及び「表作成ステップ」を含む。以下、各ステップについて具体的に説明をする。
【００６４】
３−１．抽出ステップ
「抽出ステップ」とは、本態様の種同定表を作成する上で対象となる植物種群を構成する各植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出するステップである。本ステップは、前記第１態様の「１−１．抽出ステップ」と同じ構成を有する。したがって、ここではその説明を省略する。
【００６５】
３−２．選択ステップ
本態様の「選択ステップ」は、前記第２態様の選択ステップとその構成が若干異なる。すなわち、第１態様の選択ステップが、抽出物中に含まれる代謝産物の蓄積量を比較し、植物種群内の他の全ての種よりも統計学的に有意に多い代謝産物をその特定の種を同定するための種同定用マーカーとして選択したのに対して、本態様の選択ステップでは、植物種群を構成する異なる２種間において、前記抽出ステップで得られた抽出物中に含まれる代謝産物の蓄積量を比較して、一方の種においてのみ統計学的に有意に多い代謝産物を種同定表構成マーカーとして選択することを特徴とする。代謝産物の有無を比較する２種の植物は、植物種群を構成する種から任意に選択される。
【００６６】
前記抽出ステップで植物種群を構成する各植物種から得られた抽出物に包含される代謝産物を検出し、定量する方法は、第１態様の選択ステップに準じて行うことができる。例えば、質量分析法又はNMR法を用いて検出及び定量すればよい。
【００６７】
種同定表構成マーカーの選択は、前記任意に選択された２種の植物のそれぞれの抽出物から前記検索方法によって検索された代謝産物を比較し、一方の種にのみ統計学的に有意に多い代謝産物を選択する。具体的な選択方法は、第１態様の方法に準ずる。本ステップで選択された代謝産物は、種同定表構成マーカーであるが、同時に、少なくともその選択された２種の植物間においては、種同定用マーカーにもなり得る。これについては、後述する「４．種同定表構成マーカー群」の章で、具体例を挙げて詳述する。
【００６８】
蓄積量が統計学的に有意に多い代謝産物が、２種間の一方の種に複数種存在する場合、その該当する代謝産物全てが種同定表構成マーカーとなる。逆に、２種間で統計学的に有意に多い蓄積量の代謝産物が存在しない場合、すなわち種同定表構成マーカーとなる代謝産物がない場合、原則として、その２種は、別種ではなく、同種（亜種若しくは品種を含む）となる。
【００６９】
３−３．表作成ステップ
「表作成ステップ」とは、第１態様の種同定用マーカーの選択方法にはない、本態様に特有のステップであって、植物種群を構成する各植物種が、本態様の選択ステップで得られた種同定表構成マーカーを、抽出ステップで得られた抽出物中に統計学的に有意な蓄積量で包含するか否かを分類して、種同定表を作成するステップである。
【００７０】
本ステップでは、要するに、前記選択ステップにおいて２種間で選択された種同定表構成マーカーが、その２種が属する植物種群の他の全ての植物種の抽出物中にも統計学的に有意な蓄積量で存在するか否かを確認し、その存在の有無に基づいて分類をしていくことを特徴とする。分類方法は、第１態様の「１−２．選択ステップ」の方法に準じて統計学的に有意な蓄積量を有するか否かを判定し、その判定結果によって行う。したがって、前記選択ステップにおいて植物種群を構成する様々な２種の組合せから選択された種同定表構成マーカーは、この表作成ステップで、その植物種群を構成する全ての種について、選択された全ての種同定表構成マーカーの有無が検証されることとなる。その結果、植物種群を構成する全ての植物種における、選択された全ての種同定表構成マーカーの存在の有無に基づく分類結果からなる表が構築される。この表が本態様で作成される種同定表となる。本態様で作成される種同定表は、植物種群を構成する植物種と種同定表構成マーカー群からなり、植物種群を構成する各植物種が種同定表構成マーカー群の個々のマーカーをその抽出物中に代謝産物として有するか否かによって構成されている。
【００７１】
当該方法は、種同定用マーカーの選択方法と異なり、既に種同定表を作成している植物種群に新たに一以上の植物種を追加する場合であっても、当該新たに追加する植物種に関して本態様の作成方法を実施して、新たに種同定表を更新すればよい。
【００７２】
３−４．効果
本態様の種同定表の作成方法によれば、特定の植物種群の構成種を同定可能な種同定表を作成することができる。本態様の方法によって作成される種同定表は、後述する種、雑種、及び雑種両親種の同定方法に利用することができる。また、本態様の方法によれば、植物種群に新たな植物種を追加する場合であっても、種同定表を更新することで、それまでに得られた種同定表を、その有効性を失うことなく利用することができる。
【００７３】
４．種同定表構成マーカー群
本発明の第４の態様は、種同定表構成マーカー群である。本態様における種同定表構成マーカー群は、後述する実施例４で示すように前記第３態様の「種同定表の作成方法」によって選択されたもので、ユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・ブラシアーナ、ユーカリプタス・グロブラス、ユーカリプタス・グランディス、ユーカリプタス・カマルドレンシス又はそれらの種間雑種を上記表４で示す存在パターンによって同定することができる。
【００７４】
種同定表構成マーカー群の「存在パターン」（以下、特に断りのない限り、単に「存在パターン」とする）とは、前記第３態様で作成される種同定表において、その種同定表に記載された植物種群を構成する各植物種がその抽出物中に、その種同定表に記載された種同定表構成マーカー群を構成する各マーカーを、統計学的に有意な蓄積量で含むか否かの分類結果をパターン化した一つの情報であって、存在の有無が簡単な文字や記号で表記されたものをいう。例えば、各マーカーを含む場合には「○」、含まない場合には「×」のように記号表記で分類するか、含む場合には「有」、含まない場合には「無」のように文字表記で分類するか、あるいは、含む場合には「１」、含まない場合には「０」のように数字表記で分類されたものが挙げられる。
【００７５】
種同定表構成マーカー群の選択に関する詳細については、実施例４を参照されたい。
【００７６】
上記表４で示される種同定表構成マーカー群は、ユーカリ属５種、すなわちユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・ブラシアーナ、ユーカリプタス・グロブラス、ユーカリプタス・グランディス、及びユーカリプタス・カマルドレンシスで構成される植物種群の各構成種の抽出物から第３態様の方法によって選択された種同定表構成マーカーM1〜M9からなる種同定表構成マーカー群と、その存在パターンで構成される。当該種同定表構成マーカーM1〜M9は、表４に記載のように、プリカーサイオン及びプロダクトイオンの各質量電荷比、並びにMassにおける保持時間（分）よって特定される物質である。なお、M1〜M9は、前記特定される個々の同定表構成マーカーを本明細書で呼称するために便宜的につけた名称である。
【００７７】
表４で示すように、種同定表は、ユーカリ属の前記５種における種同定表構成マーカーM1〜M9の存在の有無（有：○印、無：×印）によって構成されている。種同定表構成マーカーには、ユーカリプタス・ブラシアーナに特異的なM4又はユーカリプタス・グロブラスに特異的なM5のように、表４の植物種群において種同定用マーカーと同等の機能を有するものも存在する。一方、M1〜M３及びM6〜M９は、２種以上の植物種に存在しており、個々の種同定表構成マーカーによって、必ずしも植物種群を構成する特定の植物種を同定できるとは限らない。しかし、M1〜M9をまとめた種同定表構成マーカー群としたとき、各マーカーは、各植物種において固有の存在パターンを示すことがわかる。例えば、上記植物種群において、M1〜M3のそれぞれのマーカーは、２種以上に存在するが、種同定表構成マーカーとしてM1〜M3の３つのみを有する植物種は、５種の中ではユーカリプタス・ペリータのみであることがわかる。このように、表４に示される種同定表構成マーカー群は、表４の種同定表に示された各種同定表構成マーカーの存在パターンの情報に基づいて、植物種群を構成する各植物種を迅速に、簡便に、かつ正確に同定することができる。
【００７８】
なお、表４に記載の種同定表構成マーカーM1〜M9は、それぞれ上記表５に記載のように、特定の植物種間であれば、種同定用マーカーになり得る。例えば、表４に示すように、ユーカリ属５種からなる植物種群からユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナの２種を選択した場合、その２種間においてM1はユーカリプタス・ペリータにのみ統計学的に有意に多く存在し、またM4は、ユーカリプタス・ブラシアーナにのみ統計学的に有意に多く存在する。このとき、M1及びM4は、いずれも種同定表構成マーカーとして選択されるが、同時に表５で示すように、少なくともユーカリプタス・ペリータとユーカリプタス・ブラシアーナの２種間の種同定用マーカーにもなり得る。すなわち、ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナの２種間で、M1はユーカリプタス・ペリータを同定するための種同定用マーカーとなり、またM4はユーカリプタス・ブラシアーナを同定するための種同定用マーカーとなる。その他、M1〜M9の各種同定表構成マーカーは、例えば、上記表５に記載のような各２種間又は５種間における種同定用マーカーとしても利用できる。
【００７９】
５．種同定用マーカーを用いた種同定方法
本発明の第５の態様は、二以上の植物種からなる群を構成するいずれかの種と同一であることが予想される被検植物の種を同定する方法である。具体的には、被検植物が外部形態（例えば、葉形、葉序、花序、樹形）から、ある植物種群を構成する種のいずれかと同一であることが予想されるものの、種を特定するにまで至らない場合、その群より得られた各種同定用マーカーを用いて、被検植物がその種であるか否かを同定する方法である。本発明の同定方法は、「抽出ステップ」、「検索ステップ」及び「種判定ステップ」を含む。以下、それぞれのステップについて具体的に説明する。
【００８０】
５−１．抽出ステップ
「抽出ステップ」とは、被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出するステップである。
【００８１】
本明細書において「被検植物」とは、本発明の種同定方法に供される植物であって、本方法で用いる種同定用マーカーを選択する際に用いた二以上の植物種からなる群を構成するいずれかの種と同一であることが予想される植物種である。
【００８２】
本ステップは、抽出物を抽出する対象が被検植物である以外は、第１態様の「種同定用マーカーの選択方法」における「抽出ステップ」と同様の方法で行えばよい。したがって、ここではその具体的説明を省略する。
【００８３】
５−２．検索ステップ
「検索ステップ」とは、本態様の抽出ステップで得られた抽出物が、第１態様の「種同定用マーカーの選択方法」で選択された種同定用マーカーを包含するか否かを検索するステップである。抽出物中に種同定用マーカーと合致する代謝産物が存在するか否かを検索し、該代謝産物が１以上存在する場合にはその検索結果をその代謝産物の定量結果と共に次の種判定ステップに送ることを特徴とする。
【００８４】
本ステップでは、まず、前記抽出ステップで得られた被検植物の抽出物に含まれる代謝産物を検出し、かつそれを定量する。代謝産物を検出し、かつそれを定量する方法は、第１態様に記載したように各種同定用マーカーを検出及び定量可能な方法であれば特に限定はしない。例えば、質量分析法及びNMR法を用いて検出及び定量することができる。各種同定用マーカーが単離されている場合であれば、抗原抗体反応を応用した方法も利用できる。例えば、各種同定用マーカーに対する特異的な抗体を作製し、それを用いてELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法、表面プラズモン共鳴（SPR）法、又は水晶振動子マイクロバランス（QCM）法によって検出及び定量する方法が挙げられる。これらの方法は、いずれも当該分野で公知の技術であり、例えば、永田和弘、及び半田宏, 生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法, シュプリンガー・フェアラーク東京, 東京, 2000、J.Christopher Love,L.A.Estroff，J.K.Kriebel,R.G.Nuzzo,G.M.Whitesides(2005) Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review,105:1103-1169；森泉豊榮，中本高道，(1997) センサ工学，昭晃堂等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００８５】
次に、得られた被検植物の抽出物に、各種同定用マーカーと合致する代謝産物が存在するか否かを検索する。このときに使用する各種同定用マーカーは、被検植物と同一種であることが予想される種を構成種として包含する植物種群から選択されたものであることが必要である。被検植物と同一の種が包含されていない植物種群の種同定用マーカーを選択しても本発明の目的を達成し得ないからである。検索方法は、被検植物の抽出物に包含される代謝産物に種同定用マーカーと合致するものが存在するか否かを検索できる方法であれば特に限定はしない。通常は、適当な検索ソフトウェアを用いて、コンピュータにより実行・処理される。前記ソフトウェアは、例えば、コンピュータに入力された被検植物の代謝産物を特定するデータ（例えば、質量分析法であれば、保持時間と質量電荷比等）を、ハードディスクのような保持部に保存された種同定用マーカーを特定するデータ（被検植物の代謝産物と同じ方法によって得られたデータであることが望ましい）に照合させて、データ上で合致するものがあれば、その被検植物の代謝産物データをその種同定用マーカーのデータと関連させて選択するという一連の処理を行うようにプログラミングされている。このような検索用ソフトウェアは、市販若しくは機器に付属する適当なものを利用することができる。例えば、Marker View 1.1(アプライドバイオシステムズ)やGeneSpring MS(アジレントテクノロジー株式会社)が挙げられる。
【００８６】
５−３．種判定ステップ
「種判定ステップ」とは、被検植物から得られた抽出物が種同定用マーカーと合致する代謝産物を統計学的に有意に多い蓄積量で１つ包含する場合、被検植物がその種同定用マーカーに対応する種であると判定するステップである。
【００８７】
本ステップでは、まず、前記検索ステップから被検植物における特定の種の種同定用マーカーと合致する代謝産物、及びその定量結果、すなわち、蓄積量データを受容する。
【００８８】
次に、その代謝産物の蓄積量が統計学的に有意に多いか否かを判定する。本ステップにおいて統計学的に有意に多いか否かの判定方法は、有意性のある判定ができれば特に限定はしない。以下にいくつかの具体例を挙げて判定方法を示すが、本発明は、これらの方法に限定されるものではない。
【００８９】
一例として、特定の種の種同定用マーカーに有意な蓄積量であることを示す閾値を予め設定しておき、被検植物における当該特定の種の種同定用マーカーの蓄積量がその閾値以上ある場合には、被検植物におけるその代謝産物は統計学的に有意に多いと判定することができる。前記閾値は、種同定用マーカーを選択する際に用いた代謝産物の分析方法、種同定用マーカー選択時に用いた特定の種あたりの個体数、他種におけるその特定の種の種同定用マーカーの蓄積量等を勘案して適宜定めればよい。例えば、A〜E種よりなる植物種群からA種の種同定用マーカーを選択した際のA種と他種（B〜E種）におけるA種同定用マーカーの蓄積量を比較して定めることができる。具体的には、例えば、質量分析法によりA種の種同定用マーカーをA〜E種からなる植物種群から選択した場合、A種同定用マーカーのイオン強度がB〜E種ではいずれも２e5 cps以下であるのに対して、A種ではその2倍以上である場合には、当該閾値は、イオン強度で４e5 cpsと定めることができる。
【００９０】
また、被検植物の前記合致した種同定用マーカーの蓄積量と、その種同定用マーカーを選択する際に検証した植物種群中の他種に含まれるその種同定用マーカーの蓄積量とを統計学的に処理したときに、両者間に有意差がある場合、被検植物におけるその種同定用マーカーと合致する代謝産物が統計学的に有意に多いと判定することができる。例えば、被検植物の抽出物がA種同定用マーカーと合致する代謝産物を包含していた場合、その代謝産物の蓄積量を、A種同定用マーカーを選択した際に検証した植物種群を構成する他種（B〜E種）が包含するA種同定用マーカーの蓄積量と比較し、被検植物におけるA種同定用マーカーがそれら他種よりも統計学的に有意に多い、すなわち、被検植物と前記他種間でのA種同定用マーカーの蓄積量の量的差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差がある場合には、合致する代謝産物の蓄積量は統計学的に有意に多いと判定することができる。
【００９１】
一方、種同定用マーカーが特定の種にのみ存在する種特異性の高いマーカーである場合、その蓄積量の多寡について有意性を検証する必要はなく、被検植物においてその種同定用マーカーが検出されたときに、直ちに統計学的に有意に多いと判定される。
【００９２】
最後に、統計学的に有意に多い蓄積量で種同定用マーカーと合致する代謝産物が一つだけ被検植物に存在すると判定された場合には、被検植物は、その種同定用マーカーに対応する種であると判定する。これによって、被検植物の種を同定することができる。具体例を挙げると、被検植物においてA種同定用マーカーのみが統計学的に有意に多いと判定された場合には、その被検植物はA種であると判定される。本方法によれば、被検植物が、雑種でない限り、原則として、被検植物では一の種の種同定用マーカーしか検出されない。例えば、被検植物がA種である場合には、他種の種同定用マーカーは統計学的に有意に多い蓄積量では検出されないか又は全く検出されないことが予想される。一方、第１態様でA種同定用マーカーが複数選択されている場合であれば、被検植物の抽出物からは、いずれのA種同定用マーカーも統計学的に有意に多い蓄積量で検出されることとなる。仮に被検植物において種同定用マーカーと合致する代謝産物が統計学的に有意に多い蓄積量で二つ存在した場合には、後述する雑種同定方法で処理されることとなる。詳細については、次の態様を参照されたい。
【００９３】
５−４．種同定方法の具体例
本発明の種同定用マーカーを用いた種同定方法について、一例を挙げて具体的に説明をする。ここでは、被検植物の代謝産物から表１に記載のユーカリプタス・ブラシアーナ用の種同定用マーカーを検出する方法を例に挙げる。
【００９４】
タンデム型質量分析器には、４重極（Quadruple）がQ1、Q2、Q3と３つ直列に並んでいる。被検植物から得られた抽出物を質量分析器に適用した場合、その抽出物は３つの４重極を順番に通過した後、検出器で検出される。ユーカリプタス・ブラシアーナ用の種同定用マーカーを検出する場合であれば、まず、同マーカーのプリカーサイオンの質量電荷比である519.1を予めQ1に設定しておく。この設定によって519.1の質量電荷比をもった代謝産物はQ1を通過できるが、それ以外の質量電荷比を有する代謝産物は排除され、次のQ2に進むことはできない。次に、Q2では高電圧がかけられ代謝産物が分解され、プロダクトイオンが発生する。ここで、ユーカリプタス・ブラシアーナ用の種同定用マーカーのプロダクトイオンの質量電荷比である351.1をQ3に予め設定しておく。この設定によって、Q２を通過した代謝産物から351.2の質量電荷比をもったプロダクトイオンを発生する代謝産物のみがQ3を通過し、検出器にて検出される。したがって、被検植物の抽出物中にユーカリプタス・ブラシアーナ用の種同定用マーカーが存在していれば、検出器にて特異的に検出される。この結果は、すなわち、その被検植物がユーカリプタス・ブラシアーナか又はその雑種であることを意味する。このように、予め種同定用マーカーの分解前と分解後の質量を質量分析器にプログラムしておくことによって、そのマーカーに対応する特定の代謝物のみを検出することができる。
【００９５】
前記具体例は、プリカーサイオンとプロダクトイオンの二つの質量電荷比を用いた方法である。この方法は、より高精度に種同定用マーカーである代謝産物を同定することが可能であるが、通常はプリカーサイオンの質量電荷比のみでも種同定用マーカーの同定は可能である。
【００９６】
本発明の態様によれば、植物の代謝産物を利用した、これまでに例のない新たな種同定方法を提供できる。本発明は、短時間で、簡便、かつ比較的低コストで、しかも正確に種を同定することができる点において従来のいずれの方法よりも優れる。
【００９７】
６．種同定表を用いた種同定方法
本発明の第６の態様は、二以上の植物種からなる群を構成する種のいずれかと同一であることが予想される被検植物の種を同定する方法である。具体的には、被検植物が外部形態（例えば、葉形、葉序、花序、樹形）から、ある植物種群を構成する種のいずれかと同一であることが予想されるものの、種を特定するまでには至らない場合、その群より作成された種同定表を用いて、被検植物を同定する方法である。本態様の同定方法の基本的構成は、前記第５態様の同定方法に類似する。本態様の同定方法は、「抽出ステップ」、「分類ステップ」及び「種判定ステップ」を含む。以下、それぞれのステップについて具体的に説明する。
【００９８】
６−１．抽出ステップ
本ステップは、前記第５態様の抽出ステップに準ずる。したがって、ここではその具体的説明を省略する。
【００９９】
６−２．分類ステップ
本態様の「分類ステップ」は、抽出ステップで得られた被検植物の抽出物中に、前記第３態様に記載の方法によって作成された種同定表、又は表４で示される第４態様に記載の種同定表構成マーカー群について、各マーカーの存在の有無を検索し、分類することを特徴とする。
【０１００】
本ステップでは、まず、前記抽出ステップで得られた被検植物の抽出物に含まれる代謝産物を検出する。代謝産物を検出する方法は、種同定表構成マーカーを検出可能な方法であれば特に限定はしない。具体的な方法については、第５態様の「５−２．検索ステップ」に記載の方法に準じて行えばよい。
【０１０１】
次に、検出された代謝産物中に、前記種同定表に記載の種同定表構成マーカーと合致する代謝産物が存在するか否かを、種同定表に記載の全てのマーカーについて検索し、その結果を存在の有無に基づいて分類する。検索の方法は、被検植物の抽出物に包含される代謝産物に種同定表構成マーカーと合致するものが存在するか否かを検索できる方法であれば特に限定はしない。具体的な方法については、第５態様の「５−２．検索ステップ」に記載の方法に準じて行えばよい。また、分類方法については、第３態様の「３−３．表作成ステップ」に記載の方法に準じて行えばよい。
【０１０２】
本ステップによって、被検植物に関する種同定表に記載の種同定表構成マーカー群の存在パターンが得られる。
【０１０３】
６−３．種判定ステップ
本態様の「種判定ステップ」は、前記第５態様の種判定ステップとは、その構成が異なる。すなわち、第５態様の検索ステップでは、被検植物から得られた抽出物が種同定用マーカーと合致する代謝産物を統計学的に有意に多い蓄積量で１つ包含する場合、被検植物がその種同定用マーカーに対応する種であると判定するのに対して、本態様の種判定ステップでは、分類ステップで得られた被検植物の種同定表構成マーカー群の存在パターンが前記種同定表における構成種のいずれかの種の種同定表構成マーカー群の存在パターンと合致する場合、被検植物は当該合致した種であると判定することを特徴とする。
【０１０４】
本ステップでは、まず、前記分類ステップから被検植物における存在パターンの情報を受容する。続いて、その存在パターンの情報を前記分類ステップで用いた種同定表の植物種群を構成する各植物種の存在パターンと照合する。その結果、種同定表に被検植物の存在パターンと合致する植物種が存在する場合、その被検植物は、当該存在パターンが合致した植物種であると判定する。存在パターンの照合と合致の判断をする方法は特に限定はしない。目視によって照合し、判断してもよい。通常は、前記第５態様の「５−２．検索ステップ」に記載のように、適当な検索ソフトウェアを用いて、コンピュータにより実行・処理すればよい。具体例については、「５−２．検索ステップ」に記載の方法に準ずる。
【０１０５】
６−４．種同定方法の具体例
本態様を具体的に説明すると、例えば、被検植物が表４に示す５種のユーカリ属のいずれかであると予想され、その正確な同定が必要である場合、まず、前記抽出ステップでその被検植物から代謝産物を抽出し、次に、分類ステップで表４に記載の種同定表構成マーカーM1〜M9が前記代謝産物中に存在するか否かを検索し、その結果を存在の有無に基づいて分類する。その結果、該被検植物には、M1、M2、M8及びM9は存在するが、M3〜M7は存在しないという種同定表構成マーカー群存在パターンが得られたとする。続く種判定ステップでは、分類ステップで得られた前記存在パターン情報を受容し、それを表４に記載の各植物種における存在パターンと照合する。本例の場合、表４から被検植物の該存在パターンは、ユーカリプタス・グランディスの該存在パターンと合致する。したがって、被検植物は、ユーカリプタス・グランディスであると判定する。ここで、もし種同定表に記載されたいずれの存在パターンとも合致しない場合には、第８態様に記載の場合を除いて、その被検植物は、用いた種同定表を構成する植物種群のいずれの植物種でもないことを意味する。
【０１０６】
本発明の態様によれば、第５態様と同様に、植物の代謝産物を利用した、これまでに例のない新たな種同定方法を提供できる。本発明は、短時間で、簡便、かつ比較的低コストで、しかも正確に種を同定することができる点において従来のいずれの方法よりも優れる。
【０１０７】
７．種同定用マーカーを用いた雑種同定方法
本発明の第７の態様は、雑種を同定する方法である。第１態様の「種同定用マーカーの選択方法」によって選択された特定の種に対する種同定用マーカーは、原則として、その特定の種にのみに統計学的に有意に多く存在する。しかし、雑種の場合はヘテロ接合体となるため、両親種の種同定用マーカーをそれぞれ統計学的に有意に多く包含することとなる。本発明の態様は、当該知見に基づき、第５態様の「種同定用マーカーを用いた種同定方法」を応用して完成された方法である。
【０１０８】
本発明の同定方法は、「抽出ステップ」、「検索ステップ」及び「雑種判定ステップ」を含む。このうち、「検索ステップ」は、前記第３態様の「検索ステップ」と同一であるので、ここではその説明を省略する。以下、「抽出ステップ」及び「雑種判定ステップ」に関して、本態様に特徴的な事項を具体的に説明する。
【０１０９】
７−１．抽出ステップ
「抽出ステップ」とは、被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出するステップである。
【０１１０】
本発明の態様における「被検植物」は、本発明の雑種同定方法に供される植物であって、本方法で用いる種同定用マーカーを選択する際に用いた二以上の植物種からなる群を構成する一組の植物種に由来する雑種であると予想される種である。したがって、検証段階において雑種であることが必ずしも明らかでなくともよい。
【０１１１】
また、本方法で用いる種同定用マーカーを選択する際に用いた植物種群の構成植物種の少なくとも一組は、雑種形成が実質的に可能であることを要する。ただし、両親種と予想される種が本発明による雑種同定時に実質的に雑種形成が可能であることは必ずしも公知である必要はなく、外部形態等から雑種形成が可能な両親種であろうと予想する程度でよい。本方法で用いる種同定用マーカーは、そのような両親種であると予想される一組の植物種を包含する植物種群から選択されたものを使用する。例えば、被検植物がその外部形態等からA種、B種又はそれらの雑種のいずれかであると予想されるものの、正確な同定ができない場合には、本発明では少なくともA種及びB種を包含する植物種群から選択されたA種同定用マーカー及びB種同定用マーカーを使用すればよい。
【０１１２】
本ステップは、抽出物を抽出する対象が被検植物である以外は、第１態様の「種同定用マーカーの選択方法」における「抽出ステップ」と同一である。したがって、ここでは具体的説明を省略する。
【０１１３】
７−２．雑種判定ステップ
「雑種判定ステップ」とは、抽出物が前記種同定用マーカーと合致する代謝産物を２つ包含する場合、被検植物は、それぞれの種同定用マーカーに対応する種の雑種であると判定するステップである。本ステップの構成は、第３態様の「種判定ステップ」と基本的に同じである。それ故、重複する箇所についてはその説明を省略する。
【０１１４】
第５態様との相違点として、第５態様の「種判定ステップ」では、被検植物の抽出物が特定の種の種同定用マーカーと合致する代謝産物を原則として統計学的に有意に多い蓄積量で１つ包含していたのに対して、本態様の「雑種判定ステップ」では、そのような代謝産物を２つ包含することが挙げられる。つまり、被検植物が異なる２つの特定の種の各種同定用マーカーを有する場合には、その被検植物は、それらの種同定用マーカーに対応する種の雑種であると判定される。また、後述する第９態様の「両親種同定方法」にも関連するが、仮に被検植物の両親種が判明していない場合であっても、それらを同時に同定することができる。一方、本ステップにおいて、抽出物中に前記種同定用マーカーと合致する代謝産物が統計学的に有意に多い蓄積量で1つしか存在しなかった場合には、前述の種同定方法に記載したように、その被検植物は、雑種ではなく、その種同定用マーカーに対応する種であると判定される。例えば、被検植物がその外部形態等からA種、B種又はそれらの雑種のいずれかであると予想される時に、その被検植物から得られた抽出物に、A種同定用マーカーとB種同定用マーカーがそれぞれ統計学的に有意な蓄積量で存在する場合には、被検植物はA種とB種の雑種であると判定する。また、このとき被検植物の両親種は、A種及びB種であることが同時に明らかとなる。一方、A種同定用マーカーのみが統計学的に有意な蓄積量で存在し、B種同定用マーカーは僅かにしか存在しないか又は全く存在しない場合には、その被検植物は雑種ではなく、A種であると判定される。
【０１１５】
７−３．効果
本発明の態様によれば、植物の代謝産物を利用して、植物雑種を同定するというこれまでに例のない雑種同定方法を提供することができる。また、本発明の雑種同定方法によれば、集団の中から優良な形質を有する雑種を短時間で、簡便に、かつ比較的低コストで、しかも正確に同定することができる。
【０１１６】
８．種同定表を用いた雑種同定方法
本発明の第８の態様は、二以上の植物種からなる群を構成する一組の種に由来することが予想される雑種を同定する方法である。第６態様の「種同定表を用いた種同定方法」に記載の存在パターンは、その種同定表の植物種群を構成する各植物種に固有のものである。したがって、第６態様で述べたように、被検植物の存在パターンが種同定表の植物種のいずれの存在パターンとも合致しない場合には、原則として、その被検植物は、その種同定表に包含されるいずれの植物種にも該当しないことになる。しかし、被検植物が雑種の場合にはヘテロ接合体となるため、その被検植物の存在パターンは、両親種の存在パターンを組合せたパターンを示すこととなる。本発明は、当該知見に基づき、第６態様の「種同定表を用いた種同定方法」と第７態様の「種同定用マーカーを用いた雑種同定方法」とを応用して完成された雑種同定方法である。
【０１１７】
本発明の同定方法は、「抽出ステップ」、「分類ステップ」及び「雑種判定ステップ」を含む。このうち、「抽出ステップ」は前記第７態様の「７−１．抽出ステップ」と、また「分類ステップ」は、前記第６態様の「６−２．分類ステップ」と、同一であるので、ここではその説明を省略する。以下、本態様で特徴的な「雑種判定ステップ」に関して具体的に説明する。
【０１１８】
８−１．雑種判定ステップ
本態様の「雑種判定ステップ」は、第６態様の「種判定ステップ」と前記第７態様の「雑種判定ステップ」の原理を組合せたものである。被検植物の存在パターンが種同定表に包含されるいずれの植物種の存在パターンに該当しない場合であっても、種同定表に包含される植物種のいずれか２種を組み合わせたときの存在パターンと合致する場合には、その被検植物は、それぞれの存在パターンに対応する植物種の雑種であると判定するステップである。
【０１１９】
前記第６態様の「種同定表を用いた種同定方法」によれば、被検植物の存在パターンが種同定表内のいずれ構成種の存在パターンと合致しない場合、原則として、その被検植物は、その種同定表を構成する植物種以外の種と判定されるが、本態様の「種同定表を用いた雑種同定方法」は、その例外である。存在パターンの組合せは、組合せるそれぞれの存在パターンにおける種同定表構成マーカーの存在情報（表４を例に挙げれば、○印）を加算して作成すればよい。例えば、種同定表構成マーカー群を構成する種同定表構成マーカーm1〜m6において、A種の存在パターンは、m1〜m3が存在し、m4〜m6が存在しないというものであり、B種の存在パターンは、m3〜m5が存在し、m1、m2及びm6が存在しないというものである場合、これら両種の存在パターンの組合せは、m1〜m3とm3〜m5の種同定表構成マーカーの存在情報を加算し、重複する存在情報（例えば、m3は、いずれの存在パターンにも存在する）は１つの存在情報とみなすことによって、m1〜m5が存在し、m6のみが存在しないという、２つの存在パターンを組合せた新たな存在パターンが得られることとなる。
【０１２０】
本ステップの具体的な判定方法を、表４を例に挙げて説明する。例えば、被検植物の存在パターンがM1〜M4のみであった場合には、表４の種同定表を構成する５種のいずれの存在パターンとも合致しない。したがって、第６態様の「種同定表を用いた種同定方法」によれば、そのような存在パターンを有する被検植物は、原則的には前記５種以外の種と判定される。ここで、ユーカリプタス・ペリータの存在パターンがM1〜M3のみで、またユーカリプタス・ブラシアーナの存在パターンがM2〜M4のみであることに着目すると、ユーカリプタス・ペリータの存在パターンとユーカリプタス・ブラシアーナの存在パターンを組合せた場合、その存在パターンはM1〜M4のみとなり、これは被検植物の存在パターンと合致する。したがって、その被検植物は、ユーカリプタス・ペリータとユーカリプタス・ブラシアーナの雑種であると判定される。
【０１２１】
８−２．効果
本発明の態様によれば、植物の代謝産物を利用して、植物雑種を同定するというこれまでに例のない雑種同定方法を提供することができる。また、本発明の雑種同定方法によれば、集団の中から優良な形質を有する雑種を短時間で、簡便に、かつ比較的低コストで、しかも正確に同定することができる。
【０１２２】
９．種同定用マーカーを用いた両親種同定方法
本発明の第８の態様は、雑種の両親種を同定する方法である。本発明の基本原理は、第７態様の「種同定用マーカーを用いた雑種同定方法」の発明と同一である。ただし、前記発明では被検植物が雑種か否かが通常明らかでない状態であったのに対して、本発明では被検植物が少なくとも雑種である、すなわち被検雑種植物であることが判明している点において相違する。それ故、発明の対象が前者は被検植物であるのに対して、後者は被検雑種植物の両親である点において両発明は大きく異なる。一方、両発明ともに被検（雑種）植物の両親種を同定することが可能である。
【０１２３】
本発明の同定方法は、「抽出ステップ」、「検索ステップ」及び「両親種判定ステップ」を含む。このうち「検索ステップ」は、前記第７態様の「種同定用マーカーを用いた雑種同定方法」と同じであるためその説明は省略する。以下、「抽出ステップ」及び「両親種判定ステップ」に関して、本態様に特徴的な事項を具体的に説明する。
【０１２４】
９−１．抽出ステップ
「抽出ステップ」とは、被検雑種植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出するステップである。
【０１２５】
本発明の態様における「被検雑種植物」は、本発明の両親種同定方法に供される植物であって、本方法で用いる種同定用マーカーを選択する際に用いた二以上の植物種からなる群を構成する一組の植物種に由来すると予想される雑種である。したがって、以降のステップでは、その両親種と予想される種を包含する植物種群より選択された種同定用マーカーを使用することが望ましい。例えば、被検雑種植物がその外部形態等からA種とB種の雑種と予想される場合には、本発明では少なくともA種及びB種を包含する植物種群より選択されたA種同定用マーカー及びB種同定用マーカーを使用すればよい。
【０１２６】
本ステップは、抽出物を抽出する対象が被検雑種植物である以外は、第１態様の「種同定用マーカーの選択方法」における「抽出ステップ」と同一である。したがって、ここではその具体的説明を省略する。
【０１２７】
９−２．両親種判定ステップ
「両親種判定ステップ」とは、抽出物が前記種同定用マーカーと合致する代謝産物を統計学的に有意に多い蓄積量で２つ包含する場合、当該被検雑種植物の両親種は前記２つの種同定用マーカーに対応する種であると判定するステップである。
【０１２８】
本ステップは、基本的には前記第７態様の「７−２．雑種判定ステップ」と同様であるため、重複する説明については省略をする。相違点としては、前態様の被検植物が雑種であるか否かが不明であるため、必ずしも両親種由来の種同定用マーカーを統計学的に有意に多く蓄積しているとは限らないのに対して、本態様における被検雑種植物は、雑種であることが判明しているため、両親種の予想に誤りがない限り、すなわち、本方法で用いる種同定用マーカーを選択した植物種群中に実際の両親種が包含されている限り、必ずそれぞれの種の種同定用マーカーが統計学的に有意に多い蓄積量で２つ存在することとなる。両親種の予想は、その雑種の外部形態等に基づいて行えばよい。両親種候補として二以上の種が予想される場合には、使用する種同定用マーカーは、両親種候補の全てを含む植物種群から選択することが好ましい。
【０１２９】
本発明の両親種同定方法によれば、雑種の両親種を短時間で、簡便に、かつ比較的低コストで、しかも正確に同定することができる。
【０１３０】
１０．種同定表を用いた両親種同定方法
本発明の第１０の態様は、雑種の両親種を同定する方法である。本発明の基本原理は、第８態様の「種同定表を用いた雑種同定方法」の発明と、また、その基本概念は、第９態様の「種同定用マーカーを用いた両親種同定方法」と、同一である。
【０１３１】
本発明の同定方法は、「抽出ステップ」、「検索ステップ」及び「両親種判定ステップ」を含む。このうち「抽出ステップ」及び「検索ステップ」は、前記第８態様の「種同定表を用いた雑種同定方法」と基本的に同じであり、それらに準じて行えばよい。したがって、本態様においては、「抽出ステップ」及び「検索ステップ」の説明は省略する。以下、「両親種判定ステップ」について説明する。
【０１３２】
１０−１．両親種判定ステップ
「両親種判定ステップ」とは、雑種である被検植物の存在パターンが、種同定表のいずれか一組の種の存在パターンを組合せたものと合致する場合、その被検植物の両親種は、当該一組の種であると判定するステップである。本ステップは、基本的には前記第８態様の「８−１．雑種判定ステップ」と同様であり、それに準じて行えばよい。
【０１３３】
第８態様の発明では被検植物が雑種か否かが通常明らかでない状態であったのに対して、本発明では被検植物が少なくとも雑種であることが判明している。したがって、その存在パターンは、必ず両親種である一組の植物種のそれぞれの存在パターンを組合せたものとなることが予想される。一方で、本態様の同定方法においては、被検植物の両親種が種同定表を構成する植物種群に含まれていなければならない。両親種が前記植物種群に含まれるか否かの予想は、その雑種の外部形態等に基づいて行えばよい。
【０１３４】
１０−２．効果
本発明の両親種同定方法によれば、雑種の両親種を短時間で、簡便に、かつ比較的低コストで、しかも正確に同定することができる。
【０１３５】
１１．植栽方法
本発明の第１１の態様は、植栽方法に関する。
【０１３６】
「植栽」とは、植物を土壌又は培地に植えることをいう。したがって、本態様における植栽は、草本のみならず、木本を対象とした、いわゆる「植林」も包含する概念である。また、植栽の対象となる「植物」は、例えば、植物体の全部、葉、茎（枝）若しくは根のような植物体の一部、種子、又はカルス等のように、増殖能を有する植物細胞を包含していれば、その形態は特に限定はしない。本態様において、「土壌」は、圃場における土壌又はプランターや鉢のような容器に入れられた土壌のいずれも包含する。「培地」は、液体培地、又は固体若しくは半固体培地（例えば、ゲル状培地）を包含する。
【０１３７】
本発明の植栽方法は「同定ステップ」、及び「植栽ステップ」を含む。以下、各ステップについて、具体的に説明をする。
【０１３８】
１１−１．同定ステップ
「同定ステップ」とは、第５若しくは第６態様の種同定方法、又は第７若しくは第８の雑種同定方法によって植物の種類を同定するステップである。
【０１３９】
１１−２．植栽ステップ
「植栽ステップ」とは、前記同定ステップで種同定された植物を土壌又は培地に植栽するステップである。植栽は、植物の種類、形態、場所、気温、雨量、土壌又は培地の栄養状態等に応じて、当該分野で公知の方法に基づいて適宜行えばよい。
【０１４０】
１１−３．効果
本態様の植栽方法によれば、形態的に類似した別種を区別し、それを選択することが可能となる。それによって、例えば、単一種からなる複数個体の植栽を目的とする場合、別種及び／又は雑種を排除して、その混入を防ぐことができる。例えば、特定地域のプランテーションに同定ステップで選択した目的の雑種のみを植栽することで、その植物種に由来する、品質の均一性や安全性の高い生産物の提供が可能となる。
【実施例】
【０１４１】
＜実施例１：種同定用マーカーの選択＞
アカシア（Acacia）属６種からなる群において、当該群を構成する各種の種同定用マーカーを本発明の種同定用マーカーの選択方法に従って選択した。【０１４２】
１．材料
アカシア・マンギウム（A．mangium）１産地６個体、アカシア・アウリカリフォルミス（A．auliculiformis）１産地６個体、アカシア・デアルバタ（A．dealbata）６個体（３産地×２個体）、アカシア・アラタ（A．elata）６個体（３産地×２個体）、アカシア・フラブ（A．flav）６個体（３産地×２個体）、アカシア・メラノキシロン（A．melanoxylon）６個体（３産地×２個体）
２．葉のサンプリング
同一環境下・同一土壌下で栽培した上記６種のアカシアにおいて、各個体から健全な葉を選択してハサミで葉柄部分から切り取った。採取した葉の主脈部分を取り除き、残りを50℃で一晩乾燥させた。【０１４３】
３．抽出物の抽出（抽出ステップ）
前記アカシア葉サンプルを乾燥重量で約30mgとなるように計量し、セイフロックチューブに入れた。直径5mmのジルコニアボール（東ソー株式会社）を前記チューブに加え、Tissue Lyser II（株式会社キアゲン）で葉サンプルを25Hzにて３０秒間振動させて粉砕した。続いて、チューブに80%メタノール（和光純薬工業株式会社）を1mL加え、Tissue Lyser IIを用いて25Hzで120秒間振動させることによって抽出液を抽出した。それを12000×gで１０分間遠心分離した後、上清約1mLをMillex-LG（ミリポア株式会社)を用いてろ過し、ろ液をガラスバイアル（日本ダイオネクス株式会社）に移した。【０１４４】
４．LC-MS分析（選択ステップ）
得られたろ液のうち2μLを以下の分析条件にてLC-MS分析に供した。具体的な分析方法については、各使用機器に添付の使用説明書に従った。【０１４５】
（液体クロマトグラフィー条件）
・使用機器：UFLC (島津製作所)
・溶離液A：0.1%ギ酸（和光）入り  水クロマトグラフィー用リクロゾルブ (メルク株式会社) 
・溶離液B: 0.1%ギ酸（和光）入り  アセトニトリルLC/MS用ハイパーグレードリクロゾルブ (メルク株式会社)
・カラム： TSKgel ODS-100V  4.6x100mm 粒子3μｍ  （東ソー株式会社）
・ガードカラム： TSKguardgel ODS-100V, 粒子5μｍ  （東ソー株式会社）
・カラム温度：40℃
・流速：0.5 mL/分
・タイムスケジュールグラジュエントB%
0分:3%, 10分:97%, 13分:97%, 13.1:3%, 18分:3%
（MS条件）
・使用機器：3200QTRAP (アプライドバイオシステムズ)
・Mass range: 100-1000
・スキャンモード：Enhanced Mass Scan 
・スキャン速度：4000 amu/sec
・解析ソフトウェア：Analyst 1.4.2 (アプライドバイオシステムズ)
（MSMS条件）
・使用機器：3200QTRAP (アプライドバイオシステムズ)
・Mass range: 50-1000
・スキャンモード：Enhanced Product Ion Scan 
・スキャン速度：4000 amu/sec
・解析ソフトウェア：Analyst 1.4.2 (アプライドバイオシステムズ)
（アライメント条件）
・代謝産物データのアライメント：Marker ViewTM 1.1 Software（アプライドバイオシステムズ）
・溶出時間許容誤差：1分
・Mass 許容誤差：25ppm
・Intensity threshold: 10,000
５．種同定用マーカーの選択（選択ステップ）
前記LC-MS分析で得られた代謝産物データの中から、Marker ViewTM 1.1 Softwareのt-検定により、蓄積量的に種特異性を示す代謝産物を選択した。具体的には、代謝産物の蓄積量が、他の５種のいずれよりも３倍以上のイオン強度を示す代謝産物をその種の種同定用マーカーとして選択した。【０１４６】
６．結果
表３に結果を示す。この表には、前記植物種群を構成するアカシア各種における種同定用マーカーとしての代謝産物をそれぞれ５種類ずつ、質量（Mass）、保持時間（RT）、及び含有量比（Fold change）によって特定している。ここで、含有量比（Fold change）とは、種同定用マーカーとしての代謝産物と他種のその代謝産物との含有比であって、例えば、Fold>3は、種同定用マーカーとしての代謝産物の蓄積量（例えば、蓄積量としてのイオン強度）が他のいずれの種のそれよりも３倍以上多いことを意味する。
【表３】
2011059066.tif 000006
【０１４７】
また、図３は、表３に示された各種の種同定用マーカー５種類のうちマーカー番号No.1（表中の（ａ）〜（ｆ））について、それぞれの種の葉部内の蓄積量をイオン強度によってグラフ化したものである。この図で示すように、それぞれの種の種同定用マーカーは、その特定の種においてのみ統計学的に有意に多く包含されている。したがって、ある特定の種の同定においては、その特定の種用の種同定用イオンマーカーの蓄積量にのみ着目すればよいことがわかる。【０１４８】
＜実施例２：ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナの雑種判定＞
ユーカリ属２種、すなわちユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナからなる群において、本発明の種同定用マーカーの選択方法によって選択されたそれぞれの種同定用マーカーを用いて、被検植物がそれら２種の種間雑種であるか否かを判定した。【０１４９】
１．材料
ユーカリプタス・ペリータ６５個体、ユーカリプタス・ブラシアーナ２８個体及びそれらの種間雑種２個体を用いた。なお、各種及び種間雑種は、RAPD法により予めその種及び種間雑種であることを同定している。【０１５０】
２．抽出物の抽出（抽出ステップ）
前記各個体のそれぞれから健全な葉を採取し、乾燥重量で約30mgとなるように計量し、セイフロックチューブに入れた。直径5mmのジルコニアボール（東ソー株式会社）を前記チューブに加え、Tissue Lyser II（株式会社キアゲン）で葉サンプルを25Hzにて30秒間振動させて粉砕した。続いて、チューブに80%メタノール（和光純薬工業株式会社）を1ml加え、Tissue Lyser IIを用いて25Hzで１２０秒間振動させることによって抽出液を抽出した。抽出液を12000×gで１０分間遠心分離した後、上清約1mLをMillex-LG（ミリポア株式会社)を用いてろ過した後、ろ液をガラスバイアル（日本ダイオネクス株式会社）に移した。【０１５１】
３．種同定用マーカーの選択
（LC-MS分析）
得られたろ液のうち、ユーカリプタス・ペリータ２０個体及びユーカリプタス・ブラシアーナ２０個体について2μLずつを前記実施例１と同一の分析条件にてLC-MS分析に供した。それ故、分析条件等の説明については省略する。また、実施例１と同様に、具体的な分析方法については各使用機器に添付の使用説明書に従った。【０１５２】
（種同定用マーカーの選択）
前記LC-MS分析で得られた代謝産物データの中からMarker ViewTM 1.1 Softwareを用いて、蓄積量的に種特異性を示す代謝産物を以下のように選択した。【０１５３】
（１）供試した全てのユーカリプタス・ペリータの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、ユーカリプタス・ブラシアーナの抽出物中には有意に存在しない代謝産物をユーカリプタス・ペリータの種同定用マーカーとして選択した。より具体的には、ユーカリプタス・ペリータにおける、代謝産物の蓄積量がユーカリプタス・ブラシアーナの対応する代謝産物の蓄積量の３倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物をユーカリプタス・ペリータの種同定用マーカーとした。【０１５４】
（２）供試した全てのユーカリプタス・ブラシアーナの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、ユーカリプタス・ペリータの抽出物中には有意に存在しない代謝産物をユーカリプタス・ブラシアーナの種同定用マーカーとして選択した。より具体的には、ユーカリプタス・ブラシアーナにおける、代謝産物の蓄積量がユーカリプタス・ペリータの対応する代謝産物の蓄積量の３倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物をユーカリプタス・ブラシアーナの種の種同定用マーカーとした。【０１５５】
（LC-MS/MS分析）
前記選択したユーカリプタス・ペリータ、及びユーカリプタス・ブラシアーナの各種同定用マーカーに関してLC-MSMS分析を行い、分解前（プリカーサイオン）と分解後（プロダクトイオン）の質量情報を得た。具体的な分析方法については、各使用機器に添付の使用説明書に従った。液体クロマトグラフィー条件及びMS条件は、実施例１の条件に準じて行った。【０１５６】
（種同定用マーカーの選択結果）
結果を上記表１に示す。表１に示したそれぞれの種同定用マーカーを用いて、以降の検索ステップ、及び雑種判定ステップを行った。【０１５７】
４．種同定用マーカーの検索（検索ステップ） 
前記「代謝産物の抽出」において、残ったユーカリプタス・ペリータ４５個体、ユーカリプタス・ブラシアーナ８個体及びそれらの種間雑種２個体を被検植物として、それらに由来する抽出物について、表１で示す各種同定用マーカーのいずれを包含するかを検索した。各個体の代謝産物の検索には、各種同定用マーカーの分解前と分解後の質量情報を利用するMRM scan(Multiple Reaction Monitoring)を用いた。なお、本ステップにおける上記各個体の代謝産物の同定には、LC-MS分析を用いた。【０１５８】
（液体クロマトグラフィー条件）
実施例１における液体クロマトグラフィー条件と同一であるので、省略する。【０１５９】
（MS条件）
・使用機器：3200QTRAP (アプライドバイオシステムズ)
・Mass target: 
ユーカリプタス・ペリータ用種同定用マーカー：Q1: m/z :549.1, Q3: m/z: 387.1
ユーカリプタス・ブラシアーナ用種同定用マーカー：Q1: m/z:519.1, Q3: m/z: 351.2
・スキャンモード：Multiple Reaction Monitoring Scan
・スキャン速度：4000 amu/sec
・解析ソフトウェア：Analyst 1.4.2 (アプライドバイオシステムズ)
５．雑種判定（雑種判定ステップ）
前記検索ステップの結果を図２−１及び図２−２に示す。図２−１は、ユーカリプタス・ペリータの種同定用マーカー（黒星ピーク）の、図２−２は、ユーカリプタス・ブラシアーナの種同定用マーカー（白星ピーク）の、それぞれの蓄積量をイオン強度で、ユーカリプタス・ペリータ（ａ−１、ａ−２）、ユーカリプタス・ブラシアーナ（ｂ−１、ｂ−２）、及びそれらの雑種（ｃ−１、ｃ−２）について表したものである。このグラフの個体を含むユーカリプタス・ペリータ全４５個体で、いずれの個体の抽出物液中からもユーカリプタス・ペリータ用の種同定用マーカーの統計学的に有意な蓄積が検出された（図２−１：ａ−１）。これに対して、ユーカリプタス・ブラシアーナ用の種同定用マーカーは、いずれのユーカリプタス・ペリータからもほとんど検出されなかった（図２−２：ａ−２）。逆に、ユーカリプタス・ブラシアーナ８個体では、いずれの個体の抽出物液中からもユーカリプタス・ブラシアーナ用の種同定用マーカーの統計学的に有意な蓄積が検出された（図２−２：ｂ−２）。しかし、ユーカリプタス・ペリータ用の種同定用マーカーはほとんど検出されなかった（図２−１：ｂ−１）。一方、これらの雑種２個体においては、いずれもユーカリプタス・ペリータとユーカリプタス・ブラシアーナのそれぞれの種同定用マーカーが検出された（図２−１：ｃ−１；図２−２：ｃ−２）。【０１６０】
６．結果
本発明の雑種判定方法により、被検植物５５種（４５＋８+２種）のうち２種のみが、ユーカリプタス・ペリータとユーカリプタス・ブラシアーナの種間雑種であると判定された。実際、判定された２個体は、前述のように両種の種間雑種であることがRAPD法により予め確認されている。したがって、本発明の雑種判定方法により、雑種の同定が可能であることが実証された。【０１６１】
＜実施例３：アカシア・マンギウム及びアカシア・アウリカリフォルミスの雑種判定＞
実施例２で用いた雑種判定方法が、ユーカリ属のみならず、他の植物においても普遍的に有効であることを検証するため、ユーカリ属（フトモモ科）とは科レベルで異なるマメ科のアカシア属（Acacia）２種（アカシア・マンギウム及びアカシア・アウリカリフォルミス）からなる群において、本発明の種同定用マーカーの選択方法によって選択されたそれぞれの種同定用マーカーを用いて、被検植物がそれら２種の種間雑種であるか否かを同様に判定した。【０１６２】
１．材料
アカシア・マンギウム１５個体、アカシア・アウリカリフォルミス１７個体及びそれらの種間雑種１１個体を用いた。なお、各種及び種間雑種は、PCR-SSCP法により予めその種及び種間雑種であることを同定している。【０１６３】
２．代謝産物の抽出（抽出ステップ）
これらは、実施例２の「抽出ステップ」と同じであるため、ここではその説明を省略する。【０１６４】
３．種同定用マーカーの選択
（LC-MS分析）
得られた抽出液のうち、アカシア・マンギウム１０個体、アカシア・アウリカリフォルミス１０個体について2μLを前記実施例１と同一の分析条件にてLC-MS分析に供した。それ故、詳細な条件の説明については省略する。また、実施例１と同様に、具体的な分析方法については各使用機器に添付の使用説明書に従った。【０１６５】
（種同定用マーカーの選択）
前記LC-MS分析で得られた代謝産物データの中からMarker ViewTM 1.1 Softwareを用いて、蓄積量的に種特異性を示す代謝産物を以下のように選択した。【０１６６】
（１）供試した全てのアカシア・マンギウムの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、アカシア・アウリカリフォルミスの抽出物中には統計学的に有意に存在しない代謝産物をアカシア・マンギウムの種同定用マーカーとして選択した。より具体的には、アカシア・マンギウムにおける、ある代謝産物の蓄積量が、アカシア・アウリカリフォルミスの対応する代謝産物の蓄積量の３倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物をユーカリプタス・ペリータの種同定用マーカーとした。【０１６７】
（２）供試した全てのアカシア・アウリカリフォルミスの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、アカシア・マンギウムの抽出物中には統計学的に有意に存在しない代謝産物をアカシア・アウリカリフォルミスの種同定用マーカーとして選択した。より具体的には、アカシア・アウリカリフォルミスにおける、ある代謝産物の蓄積量が、アカシア・マンギウムの対応する代謝産物の蓄積量の３倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物をアカシア・アウリカリフォルミスの種の種同定用マーカーとした。【０１６８】
（LC-MS/MS分析）
前記選択したアカシア・マンギウム、及びアカシア・アウリカリフォルミスの各種同定用マーカーに関してLC-MSMS分析を行い、分解前（プリカーサイオン）と分解後（プロダクトイオン）の質量情報を得た。具体的な分析方法については、各使用機器に添付の使用説明書に従った。液体クロマトグラフィー条件及びMS条件は、実施例１の条件に準じて行った。【０１６９】
（種同定用マーカーの選択結果）
結果を上記表２に示す。表２に示したそれぞれの種同定用マーカーを用いて、以降の検索ステップ、及び雑種判定ステップを行った。【０１７０】
４．種同定用マーカーの検索（検索ステップ） 
本実施形態の前記「代謝産物の抽出」において、残ったアカシア・マンギウム５個体、アカシア・アウリカリフォルミス７個体及びそれらの種間雑種１１個体を被検植物として、それらに由来する抽出物について、表２で示す各種同定用マーカーのいずれを包含するかを検索した。各個体の代謝産物の検索には、表２に示す各種同定用マーカーの分解前と分解後の質量情報を用いるMRM scan(Multiple Reaction Monitoring)で行った。なお、本ステップにおける上記各個体の代謝産物の同定には、LC-MS分析を用いた。【０１７１】
（液体クロマトグラフィー条件）
実施例１における液体クロマトグラフィー条件と同一であるので、省略する。【０１７２】
（MS条件）
・使用機器：3200QTRAP (アプライドバイオシステムズ)
・Mass target: 
アカシア・マンギウム用種同定用マーカー：Q1: m/z :496.3, Q3: m/z: 210.0
アカシア・アウリカリフォルミス用種同定用マーカー：Q1: m/z:473.0, Q3: m/z: 351.2
・スキャンモード：Multiple Reaction Monitoring Scan
・スキャン速度：4000 amu/sec
・解析ソフトウェア：Analyst 1.4.2 (アプライドバイオシステムズ)
５．雑種判定（雑種判定ステップ）
前記検索ステップの結果を図３−１及び図３−２に示す。図３−１は、アカシア・アウリカリフォルミスの種同定用マーカー（星印ピーク）の、図３−２は、アカシア・マンギウムの種同定用マーカー（米印ピーク）の、それぞれの蓄積量をイオン強度で、アカシア・マンギウム（ａ−１、ａ−２）、アカシア・アウリカリフォルミス（ｂ−１、ｂ−２）、及びそれらの雑種（ｃ−１、ｃ−２）について表したものである。アカシア・マンギウム５個体では、いずれの個体の抽出物液中からもアカシア・マンギウム用の種同定用マーカーの統計学的に有意な蓄積が検出された（図３−２：ａ−２）。しかし、アカシア・アウリカリフォルミス用の種同定用マーカーはほとんど検出されなかった（図３−１：ａ−１）。【０１７３】
逆に、アカシア・アウリカリフォルミス７個体では、いずれの個体の抽出物液中からもアカシア・アウリカリフォルミス用の種同定用マーカーの統計学的に有意な蓄積が検出された（図３−１：ｂ−１）が、アカシア・マンギウム用の種同定用マーカーはほとんど検出されなかった（図３−２：ｂ−２）。一方、これらの雑種１１個体においては、いずれもアカシア・マンギウムとアカシア・アウリカリフォルミスのそれぞれの種同定用マーカーの双方が検出された（図３−１：ｃ−１；図３−２：ｃ−２）。【０１７４】
６．結果
本発明の雑種判定方法により、被検植物２３種（５+７+１１種）のうち１１種が、アカシア・マンギウムとアカシア・アウリカリフォルミスの種間雑種であると判定された。実際、判定された１１個体は、前述のように両種の種間雑種であることがPCR-SSCP法で予め確認されていることから、本発明の雑種判定方法は、実施例２で検証したフトモモ科ユーカリ属植物のみならず、マメ科アカシア属においても有効な方法であることが実証された。よって、本方法は、特定の植物種群に限らず、広く植物全般に有用な方法であると考えられる。【０１７５】
＜実施例４：種同定表を用いたユーカリプタス種又は雑種の同定＞
ユーカリ属５種、すなわち、ユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・ブラシアーナ、ユーカリプタス・グロブラス、ユーカリプタス・グランディス及びユーカリプタス・カマルドレンシスからなる植物種群において、本発明の第３態様に基づいて種同定表を作成し、その種同定表を用いて、被検植物がその種同定表の構成植物種又は種間雑種であるか否かを判定した。【０１７６】
１．材料
ユーカリプタス・ペリータ３４３個体、ユーカリプタス・ブラシアーナ３９９個体、ユーカリプタス・グランディス５６個体、ユーカリプタス・グロブラス４５個体、ユーカリプタス・カマルドレンシス２１２個体、ユーカリプタス・ペリータ×ブラシアーナ１８０個体、ユーカリプタス・ペリータ×カマルドレンシス４個体を用いた。【０１７７】
２．抽出物の抽出（抽出ステップ）
これらは、実施例１の「抽出ステップ」と同じであるため、ここではその説明を省略する。【０１７８】
３．種同定表構成マーカーの選択（選択ステップ）
（LC-MS分析）
得られたろ液のうち、ユーカリプタス・ペリータ３３個体、ユーカリプタス・ブラシアーナ３９個体、ユーカリプタス・グランディス３０個体、ユーカリプタス・グロブラス３０個体、ユーカリプタス・カマルドレンシス３０個体について2μLずつを、前記実施例１と同一の分析条件にてLC-MS分析に供した。ただし、実施例１〜３では、代謝物の検出方法は、ポジィティブイオンを検出する方法を採用したが、本実施例では、ネガティブイオンを検出する方法を用いた。また、実施例１と同様に、具体的な分析方法については各使用機器に添付の使用説明書に従った。【０１７９】
（種同定表構成マーカーの選択）
前記LC-MS分析で得られた代謝産物データの中からMarker ViewTM 1.1 Software及びGeneSpring MS Softwareを用いて、蓄積量的に種特異性を示す代謝産物を以下のように選択した。【０１８０】
A．ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナの２種間からの種同定表構成マーカーの選択
（１）供試した全てのユーカリプタス・ペリータの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、ユーカリプタス・ブラシアーナの抽出物中には有意に存在しない代謝産物を、種同定表構成マーカーとして選択した。より具体的には、ユーカリプタス・ペリータにおける、代謝産物の蓄積量がユーカリプタス・ブラシアーナの対応する代謝産物の蓄積量の１０倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物を種同定表構成マーカー（マーカー名：M1）とした。これは同時に、ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナの２種間においてユーカリプタス・ペリータの種同定用マーカーにもなり得る。【０１８１】
（２）供試した全てのユーカリプタス・ブラシアーナの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、ユーカリプタス・ペリータの抽出物中には有意に存在しない代謝産物を種同定表構成マーカーとして選択した。より具体的には、ユーカリプタス・ブラシアーナにおける、代謝産物の蓄積量がユーカリプタス・ペリータの対応する代謝産物の蓄積量の１０倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物を種同定表構成マーカー(マーカー名：M4)とした。これは同時に、ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・ブラシアーナの２種間においてユーカリプタス・ブラシアーナの種同定用マーカーにもなり得る。【０１８２】
B．ユーカリプタス・ペリータ及びグランディスの２種間からの種同定マーカーの選択
（１）供試した全てのユーカリプタス・ペリータの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、ユーカリプタス・グランディスの抽出物中には有意に存在しない代謝産物を種同定表構成マーカーとして選択した。より具体的には、ユーカリプタス・ペリータにおける、代謝産物の蓄積量がユーカリプタス・グランディスの対応する代謝産物の蓄積量の１０倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物を種同定表構成マーカー(マーカー名: M3)とした。これは同時に、ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・グランディスの２種間においてユーカリプタス・ペリータの種同定用マーカーにもなり得る。【０１８３】
（２）供試した全てのユーカリプタス・グランディスの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、ユーカリプタス・ペリータの抽出物中には有意に存在しない代謝産物を種同定表構成マーカーとして選択した。より具体的には、ユーカリプタス・グランディスにおける、代謝産物の蓄積量がユーカリプタス・ペリータの対応する代謝産物の蓄積量の１０倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物を種同定表構成マーカー(マーカー名: M8, M9)とした。これは同時に、ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・グランディスの２種間においてユーカリプタス・グランディスの種同定用マーカーにもなり得る。【０１８４】
C．ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・グロブラスの２種間からの種同定表構成マーカーの選択
（１）供試した全てのユーカリプタス・ペリータの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、ユーカリプタス・グロブラスの抽出物中には有意に存在しない代謝産物を種同定表構成マーカーとして選択した。より具体的には、ユーカリプタス・ペリータにおける、代謝産物の蓄積量がユーカリプタス・グロブラスの対応する代謝産物の蓄積量の１０倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物を種同定表構成マーカー(マーカー名:M1, M2, M3)とした。これは同時に、ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・グロブラスの２種間においてユーカリプタス・ペリータの種同定用マーカーにもなり得る。【０１８５】
（２）供試した全てのユーカリプタス・グロブラスの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、ユーカリプタス・ペリータの抽出物中には有意に存在しない代謝産物を種同定表構成マーカーとして選択した。より具体的には、ユーカリプタス・グロブラスにおける、代謝産物の蓄積量がユーカリプタス・ペリータの対応する代謝産物の蓄積量の１０倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物を種同定表構成マーカー(マーカー名:M5, M6, M7)とした。これは同時に、ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・グロブラスの２種間においてユーカリプタス・グロブラスの種同定用マーカーにもなり得る。【０１８６】
D．ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・カマルドレンシスの２種間からの種同定表構成マーカーの選択
（１）供試した全てのユーカリプタス・ペリータの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、ユーカリプタス・カマルドレンシスの抽出物中には有意に存在しない代謝産物を種同定表構成マーカーとして選択した。より具体的には、ユーカリプタス・ペリータにおける、代謝産物の蓄積量がユーカリプタス・カマルドレンシスの対応する代謝産物の蓄積量の１０倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物を種同定表構成マーカー(マーカー名:M1)とした。これは同時に、ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・カマルドレンシスの２種間においてユーカリプタス・ペリータの種同定用マーカーにもなり得る。【０１８７】
（２）供試した全てのユーカリプタス・カマルドレンシスの抽出物中には統計学的に有意に存在するが、ユーカリプタス・ペリータの抽出物中には有意に存在しない代謝産物を種同定表構成マーカーとして選択した。より具体的には、ユーカリプタス・カマルドレンシスにおける、代謝産物の蓄積量がユーカリプタス・ペリータの対応する代謝産物の蓄積量の１０倍以上のイオン強度を示す場合には、その代謝産物を種同定表構成マーカー(マーカー名:M6, M7)とした。これは同時に、ユーカリプタス・ペリータ及びユーカリプタス・カマルドレンシスの２種間においてユーカリプタス・カマルドレンシスの種同定用マーカーにもなり得る。【０１８８】
（LC-MS/MS分析）
上記選択した各種同定表構成マーカーに関してLC-MSMS分析を行い、分解前（プリカーサイオン）と分解後（プロダクトイオン）の質量情報、及び保持時間を得た。具体的な分析方法については、各使用機器に添付の使用説明書に従った。液体クロマトグラフィー条件及びMS条件は、実施例１の条件に準じて行った。なお、本方法においても、検出するイオンはネガティブイオンとした。【０１８９】
（種同定表の作成）
ユーカリ属５種のそれぞれにおける上記選択した各種同定表構成マーカーの存在の有無の結果に基づいて上記表４に示す種同定表を作成した。【０１９０】
４．各ユーカリプタス種及び種間雑種の存在パターンの確認
前記「３．種同定表構成マーカーの選択」において使用したユーカリプタス・ペリータ３３個体及びユーカリプタス・ブラシアーナ３９個体、ユーカリプタス・グランディス３０個体、ユーカリプタス・グロブラス３０個体及びユーカリプタス・カマルドレンシス３０個体、さらに２雑種、すなわち、ユーカリプタス・ペリータ×ユーカリプタス・ブラシアーナ３０個体及びユーカリプタス・ペリータ×ユーカリプタス・カマルドレンシス３個体の抽出物について、それぞれの種が表４に示す種同定表構成マーカー群の存在パターンと合致することを確認した。また、２雑種については、種同定表構成マーカー群の一組の構成種の存在パターンの組合せと合致するか否かを確認した。各個体の代謝産物の検索には、表４に示す各種同定表構成マーカーの分解前と分解後の質量情報を用いるMRM scanで行った。なお、本ステップにおける上記各個体の代謝産物の同定には、LC-MS分析を用いた。【０１９１】
（液体クロマトグラフィー条件）
・使用機器：UFLC (島津製作所)
・溶離液A：0.1%ギ酸（和光）入り  水クロマトグラフィー用リクロゾルブ (メルク株式会社) 
・溶離液B: 0.1%ギ酸（和光）入り  アセトニトリルLC/MS用ハイパーグレードリクロゾルブ (メルク株式会社)
・カラム： TSKgel ODS-100V  4.6x100mm 粒子3μm  （東ソー株式会社）
・ガードカラム： TSKguardgel ODS-100V, 粒子5μm  （東ソー株式会社）
・カラム温度：40℃
・流速：0.5 ml/min
・タイムスケジュールグラジュエントB%
0分:30%, 10分:80%, 10.1分: 97%, 12分:97%, 12.1分:30%
（MS条件）
・使用機器：3200QTRAP (アプライドバイオシステムズ)
・スキャンモード：Multiple Reaction Monitoring
・検出方法：ESI-Negative
・スキャン速度：4000 amu/sec
・解析ソフトウェア：Analyst 1.4.2 (アプライドバイオシステムズ)
・Mass Target: 
M1：Q1: m/z :433.2, Q3: m/z:300.2
M2：Q1: m/z :707.0, Q3: m/z:191.0
M3: Q1: m/z :397.1, Q3: m/z:235.2
M4:Q1: m/z :497.2, Q3: m/z:166.8
M5:Q1: m/z :561.0, Q3: m/z:257.3
M6:Q1: m/z :537.0, Q3: m/z:124.8
M7:Q1: m/z :497.0, Q3: m/z:124.8
M8:Q1: m/z :529.1, Q3: m/z:253.3
M9:Q1: m/z :425.0, Q3: m/z:249.4
５．ユーカリプタス種ごとの存在パターンの結果
結果を図４に示す。ユーカリプタス・ペリータでは、３３個体いずれの個体に関しても、M1〜M3の種同定表構成マーカーが検出され、一方、M4〜M9の種同定表構成マーカーは検出されなかった。ユーカリプタス・ブラシアーナ３９個体では、いずれの個体についてもM2〜M4のマーカーが検出されたが、M1、M5〜M9のマーカーに関しては検出されなかった。ユーカリプタス・グロブラス３０個体の場合、M5〜M7のマーカーは検出されたが、M1〜M4、M8、M9のマーカーは検出されなかった。ユーカリプタス・カマルドレンシス３０個体の場合、M2、M3、M6、M7のマーカーは検出されたが、M1、M4、M5、M8、M9のマーカーは検出されなかった。ユーカリプタス・グランディス３０個体の場合、M1、M2、M8、M9のマーカーが検出されたが、M3〜M7のマーカーは検出されなかった。以上のように、ユーカリプタス種ごとに種同定表構成マーカー群の固有の存在パターンがあり、被検植物の種同定表構成マーカー群の存在パターンから種を同定できることが明らかとなった。この結果から、その被検植物からM1〜M3のみが検出された場合、その被検植物はユーカリプタス・ペリータであり、M2〜M4のマーカーのみが検出された場合、その被検植物はユーカリプタス・ブラシアーナであり、M5〜M7のマーカーのみが検出された場合、その被検植物はユーカリプタス・グロブラスであり、M2、M3、M6及びM7のマーカーが検出された場合、その被検植物はユーカリプタス・カマルドレンシスであると同定することができる。【０１９２】
ところで、上記のように、ユーカリプタス・ペリータではM1〜M3のマーカーが検出され、ユーカリプタス・ブラシアーナでは、M2〜M4のマーカーが検出されたことから、ユーカリプタス・ペリータとユーカリプタス・ブラシアーナの種間雑種であるユーカリプタス・ペリータ×ユーカリプタス・ブラシアーナの場合、その存在パターンは、当該２種の組合せとなり、M1〜M4のマーカーが検出されることになる。実際、ユーカリプタス・ペリータ×ユーカリプタス・ブラシアーナ３０個体の場合、M1〜M4のマーカーが検出されたが、M5〜M9のマーカーは検出されなかった。同様に、ユーカリプタス・ペリータではM1〜M3のマーカーが検出され、ユーカリプタス・カマルドレンシスでは、M2、M3、M6、M7のマーカーが検出されたことから、ユーカリプタス・ペリータとユーカリプタス・カマルドレンシスの種間雑種であるユーカリプタス・ペリータ×ユーカリプタス・カマルドレンシスの場合、その存在パターンは、当該２種の組合せとなり、M1〜M3、M6、M7のマーカーが検出されることになる。実際、ユーカリプタス・ペリータ×ユーカリプタス・カマルドレンシス３個体の場合、M1〜M3、M6、M7のマーカーのみが検出され、M4、M5、M8、M9のマーカーは検出されなかった。【０１９３】
６．存在パターンに基づく種及び雑種判定
前記「（LC-MS分析）」において、残ったユーカリプタス・ペリータ３１３個体及びユーカリプタス・ブラシアーナ３６０個体、ユーカリプタス・グランディス２６個体、ユーカリプタス・グロブラス１５個体、ユーカリプタス・カマルドレンシス２８２個体、及びユーカリプタス・ペリータ×ブラシアーナ１５０個体及びユーカリプタス・ペリータ×カマルドレンシス１個体についても、その存在パターンが表４で示す存在パターンと合致するかを調べた。各個体の代謝産物の検索には、表４に示す各種同定表構成マーカーの分解前と分解後の質量情報を用いるMRM scanで行った。なお、本ステップにおける上記各個体の代謝産物の同定には、LC-MS分析を用いた。【０１９４】
（液体クロマトグラフィー条件）
本実施形態の前記「４．各ユーカリプタス種及び種間雑種の存在パターンの確認」に記載の液体クロマトグラフィー条件と同一であるので省略する。【０１９５】
（MS条件）
本実施形態の前記「４．各ユーカリプタス種及び種間雑種の存在パターンの確認」に記載のMS条件と同一であるので省略する。【０１９６】
（結果）
ユーカリプタス・ペリータでは、３１３個体いずれもM1〜M3のマーカーのみが検出され、ユーカリプタス・ペリータと判定された。ユーカリプタス・ブラシアーナ３６０個体では、いずれもM2〜M4のマーカーのみが検出され、ユーカリプタス・ブラシアーナと判定された。ユーカリプタス・グロブラス１５個体の場合、いずれもM5〜M7のマーカーのみが検出され、ユーカリプタス・グロブラスと判定された。ユーカリプタス・カマルドレンシス２８２個体の場合、いずれもM2、M3、M6、M7のマーカーのみが検出され、ユーカリプタス・カマルドレンシスと判定された。ユーカリプタス・グランディス２６個体の場合、いずれもM1、M2、M8、M9のマーカーのみが検出され、ユーカリプタス・グランディスと判定された。ユーカリプタス・ペリータ×ブラシアーナ１５０個体の場合、いずれもM1〜M4のマーカーのみが検出され、ユーカリプタス・ペリータ×ブラシアーナと判定された。ユーカリプタス・ペリータ×カマルドレンシス１個体は、M1〜M3、M6、M7のマーカーのみが検出されたことから、ユーカリプタス・ペリータ×カマルドレンシスと判定された。【０１９７】
以上のように本発明の第６態様の種同定方法及び第８態様の雑種同定方法により、被検植物種１２１８個体のうち、３１３個体がユーカリプタス・ペリータ、３６０個体がユーカリプタス・ブラシアーナ、１５個体がユーカリプタス・グロブラス、２８２個体がユーカリプタス・カマルドレンシス、２６個体がユーカリプタス・グランディス、１５０個体がユーカリプタス・ペリータ×ブラシアーナ、１個体がユーカリプタス・ペリータ×カマルドレンシスと判定された。これら分析にて判定された個体は、前述のように、それぞれの種及び種間雑種であることがRAPD法により予め確認されている。したがって、本発明の種及び雑種判定方法により、種ならびに雑種の同定が可能であることが実証された。【０１９８】
＜実施例５：環境要因の違いが種又は雑種同定方法の結果に与える影響＞
実施例４でそれぞれ選択した本発明の第６態様の種同定方法及び第８態様の雑種同定方法による判定結果が環境要因の違いによって影響されるか否かを検証した。【０１９９】
気象条件が大きく異なる三重県亀山市とラオス国タケクのそれぞれの土地で栽培したユーカリ４種について調査した。【０２００】
１．気象条件
ラオス国・タケクは、年平均気温26.2℃、年降水量2353mmの亜熱帯気候であるのに対し、三重県亀山市は、年平均気温15.1℃、年降水量1763mmの温帯気候と２つの気象条件は多く異なっている（図５）。【０２０１】
２．材料
タケク及び三重県亀山市のそれぞれで栽培したユーカリ属４種（ユーカリプタス・ペリータ４個体、ユーカリプタス・ブラシアーナ４個体、ユーカリプタス・カマルドレンシス４個体、及びユーカリプタス・ペリータ×ブラシアーナ４個体）を材料とした。【０２０２】
３．抽出物の抽出
実施例１の「抽出ステップ」に準じて行った。【０２０３】
４．各ユーカリプタス種及び種間雑種の種同定表構成マーカーの存在パターン
上記の各個体に由来する抽出物から代謝産物を検出し、表４で示す各種同定表構成マーカーのいずれを包含するかを検索し、その結果を存在の有無に基づいて分類した。各個体の代謝産物の検索には、表４に示す各種同定表構成マーカーの分解前と分解後の質量情報を用いるMRM scanで行った。代謝産物の同定には、LC-MS分析を用いた。液体クロマトグラフィー条件及びMS条件は実施例４と同一の方法で行った。【０２０４】
４．結果
結果を図６に示す。図６では、各栽培地につき各種２個体の結果を例として示した。ユーカリプタス・ブラシアーナについては、亀山市及びタケクで栽培した調査したところ、全てのサンプルにおいて、M2〜M4マーカーのみが検出され、全てユーカリプタス・ブラシアーナの存在パターンと合致した（図６−１）。また、ユーカリプタス・ペリータについても、栽培地とは無関係に全ての個体についてM1〜M3マーカーのみが検出され、全てユーカリプタス・ペリータの存在パターンと合致した（図６−２）。またユーカリプタス・カマルドレンシスについても、栽培地とは全ての個体について、M2、M3、M6、M7マーカーのみが検出され、全てユーカリプタス・カマルドレンシスの存在パターンと合致した（図６−４）。さらに、ユーカリプタス・ペリータ×ユーカリプタス・ブラシアーナについては、全ての個体についてM1〜M4マーカーが検出され、ユーカリプタス・ペリータの存在パターンとユーカリプタス・ブラシアーナの存在パターンを組合せたものと合致した（図６−３）。したがって、本発明の前記種同定方法及び雑種同定方法による判定結果は、気象条件等の環境要因の違いによって影響を受けないことが立証された。【０２０５】
＜実施例６：成長段階が種又は雑種同定方法の結果に与える影響＞
実施例４でそれぞれ選択した本発明の第６態様の種同定方法及び第８態様の雑種同定方法による判定結果が個体の成長段階によって影響されるか否かを検証した。【０２０６】
ユーカリ属４種１０個体に関して、成長段階の違いによって、実施例４でそれぞれ選択した種同定表構成マーカー群の存在パターンに違いが生じるかを調べた。【０２０７】
１．材料
ラオス国タケクで栽培したユーカリ属４種（ユーカリプタス・ペリータ３個体：個体番号No.1〜No.3、ユーカリプタス・ブラシアーナ３個体：個体番号No.4〜No.6、ユーカリプタス・カマルドレンシス３個体：個体番号No.7〜No.9、及びユーカリプタス・ペリータ×ブラシアーナ１個体：個体番号No.10を材料とし、それぞれ植栽１ヶ月目及び１年目に葉をサンプリングして材料とした。【０２０８】
２．抽出物の抽出
実施例１の「抽出ステップ」に準じて行った。【０２０９】
３．各ユーカリ種及び種間雑種の種同定表構成マーカー群の存在パターン
上記の個体の抽出物に含まれる代謝産物について、表４で示す各種同定表構成マーカーのいずれを包含するかを検索し、その結果を存在の有無に基づいて分類した。各個体の代謝産物の検索には、表４に示す各種同定表構成マーカーの分解前と分解後の質量情報を用いるMRM scanで行った。上記各個体の代謝産物の同定には、LC-MS分析を用いた。液体クロマトグラフィー条件及びMS条件は実施例４と同一の方法で行った。【０２１０】
４．結果
図７に結果を示す。ユーカリプタス・ペリータ３個体（No.1〜No.3）については、全てのサンプルにおいて植栽１ヶ月目及び植栽１年目のいずれにおいてもM1〜M3のマーカーのみが検出され、ユーカリプタス・ペリータの存在パターンと合致した（図７−１〜図７−３）。また、ユーカリプタス・ブラシアーナ（No.4〜No.6）についても、全てのサンプルにおいて植栽１ヶ月目及び植栽１年目のいずれにおいてもM2〜M4のマーカーのみが検出され、ユーカリプタス・ブラシアーナの存在パターンと合致した（図７−４〜図７−６）。さらに、ユーカリプタス・カマルドレンシス（No.7〜No.9）も、全てのサンプルにおいて植栽１ヶ月目及び植栽１年目のいずれにおいてもM2、M3、M6、M7マーカーが検出され、ユーカリプタス・カマルドレンシスの存在パターンと合致した（図７−７〜図７−９）。そして、種間雑種であるユーカリプタス・ペリータ×ブラシアーナ（No.10）の植栽１ヶ月目及び植栽１年目もM1〜M４のマーカーのみが検出され、ユーカリプタス・ペリータの存在パターンとユーカリプタス・ブラシアーナの存在パターンを組合せたものと合致した（図７−１０）。【０２１１】
以上の結果から、各ユーカリプタス種及び種間雑種のいずれにおいても、成長段階によって種同定表構成マーカー群の存在パターンに差は認められないことが明らかとなった。したがって、本発明の前記種同定方法及び雑種同定方法による判定結果は、成長段階によって影響を受けないことが立証された。
【産業上の利用可能性】
【０２１２】
本発明の種、雑種及び両親種同定方法は、農林業界の育種分野において、優良な品種を選択する上で、客観的、かつ正確な手段となる。【０２１３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１−１】
2011059066.tif 000011
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
2011059066.tif 000023
【図７−１】
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【図７−２】
2011059066.tif 000025
【図７−３】
2011059066.tif 000026
【図７−４】
2011059066.tif 000027
【図７−５】
2011059066.tif 000028
【図７−６】
2011059066.tif 000029
【図７−７】
2011059066.tif 000030
【図７−８】
2011059066.tif 000031
【図７−９】
2011059066.tif 000032
【図７−１０】
2011059066.tif 000033
【国際調査報告】
2011059066.tif 000034
2011059066.tif 000035
2011059066.tif 000036
2011059066.tif 000037
2011059066.tif 000038
2011059066.tif 000039
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