(57)【要約】  下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質：（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列によって示される、タンパク質；（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する、タンパク質；（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列によって示される、タンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列によって示される、タンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する、タンパク質；
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する、タンパク質。
【請求項２】
標識ポリペプチドが付加されていることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）のポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号２の塩基配列によって示される、ポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号２の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｄ）配列番号２の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によって示されるポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または４に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項３または４に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項７】
請求項５に記載のベクターが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項８】
請求項１または２に記載のタンパク質と結合することを特徴とする抗体。
【請求項９】
請求項１または２に記載のタンパク質を用いることを特徴とするスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を検出する方法。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のタンパク質、請求項３または４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載のベクター、請求項６または７に記載の形質転換体、および請求項８に記載の抗体からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする脂質ラフト検出用キット。
【請求項１１】
スフィンゴミエリンに対する特異的な結合活性を有する物質およびコレステロールに対する特異的な結合活性を有する物質の少なくとも一方をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の脂質ラフト検出用キット。
【請求項１２】
配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質のホモログであることを特徴とする、タンパク質。
【請求項１３】
請求項１、２又は１２に記載のタンパク質を含むことを特徴とするウイルス感染阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する新規なタンパク質およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質ラフト（lipid raft）は、主にスフィンゴ脂質とコレステロールとにより構成される、直径数十ｎｍ〜１００ｎｍの細胞膜上のドメインである。脂質ラフトは、細胞膜における様々な生理的反応、例えば膜を介した情報伝達、細菌またはウイルスによる感染、細胞内トラフィックなどの重要な反応に関与していると考えられている。【０００３】
スフィンゴ脂質の１つであるスフィンゴミエリンを特異的に認識するタンパク質として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献１には、シマミミズが分泌する毒素タンパク質であるライセニン類の特定のアミノ酸配列を有するタンパク質が記載されている。また、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献２には、ミミズ毒素ライセニン１またはミミズ毒素ライセニン３のＮ末端および／またはＣ末端を欠失させたタンパク質が記載されている。【０００４】
また、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献３には、被験試料中の脂質を固相に固定化し、この固相に結合したライセニンを検出する、スフィンゴミエリンの検出方法が記載されている。【０００５】
コレステロールを特異的に認識する物質として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献４には、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルが記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献５には、ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルが記載されている。また、これらの文献には、これらの物質を含むコレステロール検出試薬が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００２−３５５０３５号公報（２００２年１２月１０日公開）」
【特許文献２】日本国公開特許公報「特開２００３−０６１６８０号公報（２００３年３月４日公開）」
【特許文献３】日本国公開特許公報「特開２００６−２１４７３１号公報（２００６年８月１７日公開）」
【特許文献４】日本国公開特許公報「特開２００３−３４４４１９号公報（２００３年１２月３日公開）」
【特許文献５】日本国公開特許公報「特開２００４−３５４２８４号公報（２００４年１２月１６日公開）」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述した従来技術では、脂質ラフトを構成していないスフィンゴミエリン単独またはコレステロール単独の状態のものを検出してしまうため、脂質ラフトを特異的に検出することができないという問題がある。【０００８】
脂質ラフトの分布、動態、機能等を調べることは、脂質ラフトが関わる反応機構の解明のために必要であり、そのためには脂質ラフトを特異的に検出する技術が望まれている。【０００９】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、脂質ラフトを特異的に検出することを可能にする、新規なタンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に特異的に結合するマイタケ由来の新規のタンパク質を見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明に係るタンパク質は、下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質である。【００１２】
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列によって示される、タンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する、タンパク質；
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する、タンパク質。【００１３】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、上記タンパク質をコードすることを特徴とする。【００１４】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）のポリヌクレオチドであることが好ましい。【００１５】
（Ａ）配列番号２の塩基配列によって示される、ポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号２の塩基配列において、１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｄ）配列番号２の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によって示されるポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。【００１６】
また、本発明に係るベクターは、上記ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。【００１７】
また、本発明に係る形質転換体は、上記ポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする。【００１８】
また、本発明に係る形質転換体は、上記ベクターが導入されていることを特徴とする。【００１９】
また、本発明に係る抗体は、上記タンパク質と結合することを特徴とする。【００２０】
また、本発明に係るスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を検出する方法は、上記タンパク質を用いることを特徴とする。【００２１】
また、本発明に係る脂質ラフト検出用キットは、上記タンパク質、上記ポリヌクレオチド、上記ベクター、上記形質転換体、および上記抗体からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする。【００２２】
また、本発明に係るタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質のホモログであることを特徴とする。【００２３】
本発明に係るウイルス感染阻害剤は、上記タンパク質を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係るタンパク質は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するので、脂質ラフトを特異的に検出することができる。【００２５】
本発明の他の目的、特徴、及び優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の一実施例におけるタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉと種々のリポソームとを混合した後に上清（Ｓ）と沈殿（Ｐ）とに分離し、電気泳動によりＧＦ−Ｎｎｉを検出した結果を示す図である。
【図２】脂質とコレステロールとの混合物に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。
【図３】スフィンゴミエリン（Ｓ）とコレステロール（Ｃ）との混合物に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。
【図４】種々のスフィンゴミエリンとコレステロールとの混合物に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。
【図５】スフィンゴミエリンと種々のステロールとの混合物に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。
【図６】種々の人工膜に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示す熱分析結果である。
【図７】ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ−Ｎｎｉの結合を示す顕微鏡画像を表す図である。
【図８】ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ−Ｎｎｉの結合を示す顕微鏡画像を表す図である。
【図９】ＨｅＬａ細胞内におけるＧＦ−Ｎｎｉおよびライセニンの局在を示す顕微鏡画像を表す図である。
【図１０】ＨｅＬａ細胞におけるＧＦ−ＮｎｉおよびＢＭＰの局在を示す顕微鏡画像を表す図である。
【図１１】配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質と、そのホモログとのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１２】本発明の一実施例におけるタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉと種々のリポソームとを混合した後に上清（Ｓ）と沈殿（Ｐ）とに分離し、電気泳動によりＧＦ−Ｎｎｉを検出した結果を示す図である。
【図１３】種々のステロールとスフィンゴミエリンとの混合物に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。
【図１４】ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ−Ｎｎｉの結合部位を示す顕微鏡画像を表す図である。
【図１５】細胞膜中におけるＧＦ−Ｎｎｉ、ライセニン、及びＨ−ｒａｓの分布を示す顕微鏡画像を表す図である。
【図１６】細胞膜中におけるＧＦ−Ｎｎｉ、ライセニン、及びＫ−ｒａｓの分布を示す顕微鏡画像を表す図である。
【図１７】細胞内オルガネラへのＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示す顕微鏡画像を表す図である。
【図１８】細胞内におけるＧＦ−Ｎｎｉの結合部位を示す顕微鏡画像を表す図である。
【図１９】ニーマンピック病の細胞の細胞内における脂質分布を示す顕微鏡画像を表す図である。
【図２０】ニーマンピック病細胞の細胞表面における脂質分布を示す顕微鏡画像を表す図である。
【図２１】培養細胞（ＭＤＣＫ）へのインフルエンザウイルス感染に対するＧＦ−Ｎｎｉの効果を示すグラフである。
【図２２】培養細胞（ＭＤＣＫ）へのインフルエンザウイルス感染に対するＧＦ−Ｎｎｉの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。
【００２８】
〔タンパク質〕
本発明に係るタンパク質は、下記（Ａ）または（Ｂ）である。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列によって示されるタンパク質であって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質。
【００２９】
本明細書中において使用される場合、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。本発明に係るタンパク質は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖、イソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００３０】
配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質は、後述する実施例にて示すように、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する。したがって、本発明に係るタンパク質は、当該混合体を特異的に認識することができる。
【００３１】
本明細書中において、「スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体」は、少なくともスフィンゴ脂質とコレステロールとを含む混合体であればよい。「混合体」とは、２つ以上のものが混ざりあっているものをさし、「混合物」と交換可能に使用される。また、「混合体」とは、複合体を含む概念であり、当該混合体は、好ましくはスフィンゴ脂質とコレステロールとの複合体である。当該混合体は、脂質ラフトまたはこれと同じ構成のものであることがより好ましい。スフィンゴ脂質としては、スフィンゴミエリン等が挙げられる。本発明に係るタンパク質は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を特異的に認識することができるため、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体、好ましくは脂質ラフトを特異的に検出することができる。
【００３２】
「スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有する」とは、当該混合体に対する結合活性を有するが、スフィンゴ脂質単独およびコレステロール単独のそれぞれに対する結合活性を有しないことをいう。「結合活性を有する」とは、当該結合活性が、その結合対象以外の物質に対する結合活性よりも高いことを意味する。また、「スフィンゴ脂質単独およびコレステロール単独のそれぞれに対する結合活性を有しない」とは、当該結合活性が、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する結合活性よりも低いことを意味する。
【００３３】
結合活性を調べる方法としては、当該分野において周知の方法を用いて行なうことができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｉｙｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３，９７６６（２００４））等を用いることができる。
【００３４】
本発明に係るタンパク質は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するので、当該混合体、好ましくは脂質ラフトを特異的に認識することができる。したがって、本発明に係るタンパク質を用いれば、脂質ラフトを可視化するなどの方法によって検出することが可能になる。
【００３５】
また、本発明に係るタンパク質は、後述する実施例にて示すように、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体が秩序液体相をとるか無秩序液体相をとるかにかかわらず、結合活性を有するものである。すなわち、本発明に係るタンパク質は、これまでに知られているオストレオリシン（ostreolysin）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるSepcic K, Berne S, Rebolj K, Batista U, Plemenitas A, Sentjurc M, Macek P. (2004) Ostreolysin, a pore-forming protein from the oyster mushroom, interacts specifically with membrane cholesterol-rich lipid domains. FEBS Lett. 575, 81-5.）等とは異なり、混合体の物性ではなく構造を認識して結合するものである。よって、本発明に係るタンパク質を用いることによって、より特異的に混合体を認識することが可能になる。
【００３６】
上記「１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されている」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入もしくは付加できる程度の数（１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このように置換、欠失、挿入もしくは付加されているタンパク質を、「変異タンパク質」または「変異体」とも称する。変異タンパク質は、人為的に変異が導入されたタンパク質であってもよいし、天然に存在する変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３７】
当業者は、周知技術を使用して、タンパク質を構成するアミノ酸残基のうちの１〜１０個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
【００３８】
本明細書中においてタンパク質に関して用いられる場合、用語「変異体」とは、目的のタンパク質が有する特定の機能、すなわちスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するという機能を保持したタンパク質が意図される。
【００３９】
なお、タンパク質を構成するアミノ酸残基のうちのいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００４０】
また、本発明に係るタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列によって示されるものであってもよい。
【００４１】
また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドが付加された融合タンパク質であってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば標識ポリペプチド等が挙げられる。標識ポリペプチドとは、タンパク質を、エピトープ標識、蛍光標識などの公知の方法によって標識するためのポリペプチドをさす。標識ポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ペプチド、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質などが挙げられる。付加的なポリペプチドは、本発明に係るタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加されてもよい。また、付加的なポリペプチドは、混合体に対する十分な結合活性を保持する観点から、Ｎ末端に付加されることがより好ましい。また、本発明に係るタンパク質は、このような融合タンパク質として組み換え発現されて精製された後に、付加的なポリペプチドが除去されたものであってもよい。
【００４２】
本発明に係るタンパク質は、天然供給源より単離されたものでもよいし、化学合成されたものでもよいし、遺伝子組み換え技術により作製された組み換えタンパク質であってもよい。これらのタンパク質を得る方法としては、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができる。
【００４３】
用語「単離された」タンパク質とは、その天然の環境から取り出されたタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中において組み換え産生された状態のタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組み換えのタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００４４】
組み換えタンパク質とは、宿主から組み換え技術によって産生された産物をさす。組み換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るタンパク質は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。本発明に係るタンパク質はまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。また、組み換え産生手順として、例えば、後述するベクターおよび細胞を用いて行なう方法を用いてもよい。
【００４５】
本発明に係るタンパク質は、当該タンパク質を含む、脂質ラフトを検出するための試薬（脂質ラフト検出用試薬）の形態であってもよい。本発明に係るタンパク質は、上述したように脂質ラフトを特異的に認識できるものであるため、脂質ラフト検出用試薬として有用である。脂質ラフト検出用試薬の具体的な構成は特に限定されるものではなく、用途および目的に応じて、種々の添加剤、緩衝液などを加えればよい。
【００４６】
本発明に係るタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質のホモログであってもよい。当該ホモログとしては、例えば、ブナシメジ（Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ  ｍａｒｍｏｒｅｕｓ）由来のタンパク質（例えば、配列番号１３），Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのタンパク質（ＥＤＰ０７１１０），Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅのタンパク質（ＢＡＦ０３２１８），Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓのタンパク質（ＡＣＶ６０３５６），Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒのタンパク質（ＥＥＲ９７９３６），Ｚｅａ  ｍａｙｓのタンパク質（ＡＣＧ３８１０７），Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａのタンパク質（ＥＡＹ９３５４０）などが挙げられる。
【００４７】
また、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質のホモログには、上述したようなホモログのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されているアミノ酸配列によって示されるタンパク質もまた含まれる。
【００４８】
配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質と、そのホモログとのアミノ酸配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントし、ＢｏｘＳｈａｄｅを用いて配列整形した。図１１は、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質と、そのホモログとのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。なお、図１１に示す略は、以下を意味する：ＧＦ：Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ，ＨＭ：Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ  ｍａｒｍｏｒｅｕｓ，ＣＲ：Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（ＥＤＰ０７１１０），ＨＶ：Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（ＢＡＦ０３２１８），ＣＳ：Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（ＡＣＶ６０３５６），ＳＢ：Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ（ＥＥＲ９７９３６），ＺＭ：Ｚｅａ  ｍａｙｓ（ＡＣＧ３８１０７），ＯＳ：Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（ＥＡＹ９３５４０）。
【００４９】
図１１において、黒色でマスクされるアミノ酸配列は５０％以上の一致度を示し、灰色は類似アミノ酸による一致度が５０％以上の部分を示す。それらの結果はコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）として下段に示される。大文字のアルファベットは１００％マッチを示す。
【００５０】
〔ポリヌクレオチド〕
本発明に係るポリヌクレオチドは、上述した本発明に係るタンパク質をコードするものであればよい。本発明に係るポリヌクレオチドとしては、例えば、下記（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
（Ａ）配列番号２の塩基配列によって示される、ポリヌクレオチド；
（Ｂ）配列番号２の塩基配列において、１〜３０個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｃ）配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【００５１】
配列番号２の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列によって示されるタンパク質をコードするものである。
【００５２】
本明細書中において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用される。本明細書中において使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）又はリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵと省略される）の配列として表記される。
【００５３】
本発明に係るポリヌクレオチドとしては、コードするタンパク質のアミノ酸配列から、当業者であれば容易に設計することができる。
【００５４】
「１若しくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加されている」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリヌクレオチド作製法により置換、欠失、挿入もしくは付加できる程度の数（１〜３０個、好ましくは１〜２１個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜５個）の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このように置換、欠失、挿入もしくは付加されているポリヌクレオチドを、「変異ポリヌクレオチド」または「変異体」とも称する。変異ポリヌクレオチドは、人為的に変異が導入されたポリヌクレオチドであってもよいし、天然に存在する変異ポリヌクレオチドを単離精製したものであってもよい。
【００５５】
当業者は、周知技術を使用して、ポリヌクレオチドを構成する塩基のうちの１〜３０個の塩基を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
【００５６】
本明細書中においてポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」とは、目的のタンパク質が有する特定の機能、すなわちスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するという機能を保持したタンパク質をコードするポリヌクレオチドが意図される。
【００５７】
本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に対する特異的な結合活性を有するタンパク質であってもよい。
【００５８】
ハイブリダイゼーションは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。
【００６０】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列によって示されるものであってもよい。
【００６１】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。アンチセンス鎖は、プローブとしてまたはアンチセンス薬剤として利用できる。またＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列、ベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００６２】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法としては、公知の技術により、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー等をスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
【００６３】
あるいは、本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行ない、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００６４】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、担子菌類から得られたものであることが好ましく、グリフォラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）属から得られたものであることがより好ましい。例えば、配列番号２の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドは、グリフォラ・フロンドーサ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等から、上述した方法を用いて取得することができる。
【００６５】
〔ベクター〕
本発明に係るベクターは、上述したポリヌクレオチドを含むものであればよく、例えば本発明に係るタンパク質を発現させるための発現ベクター等であってもよい。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【００６６】
本発明に係るベクターは、例えば、本発明に係るタンパク質をコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。また、ベクターの作製方法についても公知の方法を用いることができる。
【００６７】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターの種類を適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるためにベクターの種類を選択し、これに本発明に係るポリヌクレオチドを組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。また、本発明に係るベクターは、ベクターに含まれるポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させるためのプロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することが好ましい。このように、本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドと、適宜選択したプロモーター配列とを各種プラスミド等に組み込んだベクターであってもよい。
【００６８】
宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。例えば、原核生物宿主であっても真核生物宿主であってもよく、具体的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌細胞、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などが挙げられる。
【００６９】
ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法は特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００７０】
〔形質転換体〕
本発明に係る形質転換体は、上述した本発明に係るタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体である。ここで「形質転換体」とは、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含む概念である。
【００７１】
本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドが、宿主細胞内に発現可能に導入されたものであることが好ましい。
【００７２】
本発明に係る形質転換体を作製する方法としては、例えば上述した本発明に係るベクターを宿主細胞に導入する方法等を挙げることができる。宿主細胞としては、上述したものを用いることができる。また、本発明に係る形質転換体は、従来公知の方法に従って培養または生育させることができる。
【００７３】
本発明に係る形質転換体を用いれば、当該形質転換体内において本発明に係るタンパク質を生産することができるため、当該タンパク質を容易に大量調製することが可能となる。
【００７４】
〔抗体〕
本発明に係る抗体は、上述した本発明に係るタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988))、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA,講談社(1991)」」に記載の方法が挙げられる。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。こうして作製した抗体は、本発明のタンパク質の検出に有効である。
【００７５】
〔本発明に係るタンパク質の利用方法〕
本発明に係るタンパク質は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を検出する方法に好適に利用することができる。
【００７６】
本発明に係るスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を検出する方法は、上述した本発明に係るタンパク質を用いるものである。例えば、検査対象物中の当該混合体を検出する方法として、以下の工程を有する方法が挙げられる。なお、当該混合体としては、脂質ラフトであってもよい。
１）検査対象物に対して、本発明に係るタンパク質を供する工程；
２）本発明に係るタンパク質との特異的結合の有無を検出する工程；
３）特異的結合がある場合に、検査対象物中にスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体が存在すると判定する工程。
【００７７】
これらの工程としては、従来公知の方法を用いることができる。例えば上記２）の工程において、特異的結合の有無を検出する方法としては、上記１）の工程において特異的結合しなかった本発明に係るタンパク質を除去した後、残った当該タンパク質を検出する方法を用いることができる。タンパク質を検出する方法としては、当該タンパク質に蛍光タンパク質等を付加させて発色または発光させることによって可視化する方法、ＥＬＩＳＡ法によって当該タンパク質を検出する方法等、従来公知の方法が挙げられる。可視化されたタンパク質は、蛍光顕微鏡等によって観察可能である。
【００７８】
上述したような方法を用いることによって、例えば生物サンプル（細胞、組織等）中における脂質ラフトの局在を検出することができる。したがって、本発明は、脂質ラフトの動態、機能等の研究に有用である。
【００７９】
例えば、本発明は、脂質ラフトが関わる疾患の詳細な解析、診断等に用いることが可能である。脂質ラフトが関わる疾患として、脂質代謝異常症が挙げられる。脂質代謝異常症としては、例えばニーマンピック病などが挙げられる。例えば、本発明に係るタンパク質の局在を調べることにより、上述した疾患の細胞における脂質ラフトの局在の解析、上述した疾患か否かの診断等が可能である。
【００８０】
また、本発明に係るタンパク質は、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に特異的に結合できるため、当該混合体を精製する方法、好ましくは脂質ラフトを精製する方法に好適に用いることができる。当該混合体を精製する方法としては、物質間の特異的結合を利用する従来公知の種々の精製方法を適用することができる。
【００８１】
また、本発明に係るタンパク質は、脂質ラフトに特異的に結合できるため、脂質ラフトが関わる種々の疾病に対する医薬に好適に利用することができる。脂質ラフトが関わる疾病の１つとして、ウイルス感染等が挙げられる。例えばエイズウイルス等は、脂質ラフトに覆われていることが知られている。また、後述する実施例において示すように、本発明に係るタンパク質は、細胞に対するウイルス感染、特にインフルエンザウイルスによる感染を阻害することができる。したがって、本発明に係るタンパク質は、ウイルス感染を抑えるための医薬などに利用できる。
【００８２】
本発明を利用して感染を抑制することができる対象となるウイルスとしては、上述したエイズウイルス及びインフルエンザウイルスに限らず、脂質ラフトをターゲットとする任意のウイルスであればよく、例えばＣ型肝炎ウイルスなどが挙げられる。
【００８３】
また、本発明に係るタンパク質を対象に投与することにより、ウイルス感染を治療することができる。本発明は、本発明に係るタンパク質を対象に投与することを含むウイルス感染の治療方法をも提供する。
【００８４】
また、本発明に係るタンパク質は、上述したように細胞に対するウイルス感染を阻害することができるため、ウイルス感染阻害剤に利用できる。本発明に係るウイルス感染阻害剤は、本発明に係るタンパク質を含んでいればよい。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス等が挙げられる。
【００８５】
また、本発明に係るタンパク質は毒性が極めて低いため、上述した医薬などに好適に用いることが可能である。
【００８６】
〔脂質ラフト検出用キット〕
本発明に係る脂質ラフト検出用キット（以下、単に「キット」ともいう。）は、上述したタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換体、および抗体からなる群より選択される少なくともいずれか１つを含む、脂質ラフトを検出するためのキットである。
【００８７】
本発明に係るキットは、上述したタンパク質を含むことによって、当該タンパク質を用いてスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体、特に脂質ラフトを検出することができる。なお、タンパク質としては、標識ポリペプチドが付加されたものであることが好ましい。また、上述したポリヌクレオチド、ベクターおよび形質転換体は、上述したタンパク質を取得するために用いることができる。また、上述した抗体は、上述したタンパク質を検出するために有用である。
【００８８】
本発明に係るキットは、例えば上述したスフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体を検出する方法に利用することが可能なため、生物サンプル中における脂質ラフトの存在の有無、局在などの調査に好適に利用できる。
【００８９】
本発明に係るキットは、スフィンゴミエリンに対する特異的な結合活性を有する物質をさらに含んでいることが好ましい。当該物質の例としては、例えばライセニン（lysenin）、ライセニン由来のタンパク質等が挙げられる。ライセニンおよびライセニン由来のタンパク質としては、特許文献１および２（特許文献１および２については、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる対応米国特許出願公開第１０／１３８６３４号明細書、第１１／２２３９７４号明細書を参照）に記載されたものを好適に用いることができる。これにより、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体、例えば脂質ラフトの局在と、スフィンゴミエリンの局在とを比較することができるため、脂質ラフトの局在、動態等をより正確に調べることが可能になる。
【００９０】
また、本発明に係るキットは、ライセニンまたはライセニン由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドまたは該ベクターが導入された形質転換体、ライセニンまたはライセニン由来のタンパク質に対する抗体などをさらに含んでいてもよい。
【００９１】
また、本発明に係るキットは、コレステロールに対する特異的な結合活性を有する物質をさらに含んでいることが好ましい。このような物質の例としては、例えばポリエチレングリコールコレステリルエーテル、ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテル等が挙げられる。また、当該物質は、コレステロール検出試薬の形態であってもよい。当該物質、およびこれを含むコレステロール検出試薬としては、特許文献３および特許出願４（特許出願４については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる対応米国特許出願公開第１０／５１６０７２号明細書を参照）に記載されたものを好適に用いることができる。これにより、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体、例えば脂質ラフトの局在と、コレステロールの局在とを比較することができるため、脂質ラフトの局在、動態等をより正確に調べることが可能になる。
【００９２】
本発明に係るキットは、上述したスフィンゴミエリンに対する特異的な結合活性を有する物質およびコレステロールに対する特異的な結合活性を有する物質の両方を含んでいることがより好ましい。これにより、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体、例えば脂質ラフトの局在と、スフィンゴミエリンの局在と、コレステロールの局在とを比較することができるため、脂質ラフトの局在、動態等をさらに詳細に調べることが可能になる。
【００９３】
〔付記事項〕
なお、本発明に係るタンパク質には、標識ポリペプチドが付加されていることが好ましい。
【００９４】
また、本発明に係る脂質ラフト検出用キットは、スフィンゴミエリンに対する特異的な結合活性を有する物質およびコレステロールに対する特異的な結合活性を有する物質の少なくとも一方をさらに含むことが好ましい。
【００９５】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００９６】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００９７】
〔実施例１：新規なタンパク質および遺伝子の同定〕
以下の方法により、本発明者らは、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）から、スフィンゴ脂質とコレステロールとの混合体に特異的に結合する新規なタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉ（配列番号１）を同定した。具体的には、スフィンゴミエリン（Ａｖａｎｔｉより入手）／コレステロール（Ｓｉｇｍａより入手）（１：１）リポソームに結合するタンパク質をマイタケタンパク質粗汁液より精製し、アミノ酸の部分配列（MLYGVEIDEQYLRVMEEYKDKEVITQADMAKVALQRKNVYQDQAEKRQAELKAEYGVGV, XHLLRVYATX, HGQTGNETTAVEY, SFRGHFGAHTREK, TTAYVEYVYSR）を得た。【００９８】
次に、タンパク質ＧＦ−Ｎｎｉをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）を同定した。具体的には、得られた部分配列をもとに雪国まいたけ社が保有するマイタケｃＤＮＡデータベースを用いてｔｂｌａｓｔｎ解析を実施したところ、登録配列中に３７３ｂｐのＤＮＡ配列を見出した。この配列をもとに、ＲＡＣＥ用のプライマー２つ（５’−ＲＡＣＥ−ＧＦ（配列番号３）及び３’−ＲＡＣＥ−ＧＦ（配列番号４））を設計し、ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いたＲＡＣＥ−ＰＣＲ法によって、ＧＦ−Ｎｎｉをコードする遺伝子の上流配列及び下流配列を決定した。【００９９】
次に、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）から、配列番号２の塩基配列で示される遺伝子をクローニングした。具体的には、決定したＧＦ−Ｎｎｉ配列より、クローニング用のフォワードプライマーＮｎｉ−Ｆ（配列番号５）及びリバースプライマーＮｎｉ−Ｒ（配列番号６）を設計し、ＰＣＲ法によってＧＦ−Ｎｎｉの全長遺伝子をクローニングした。ＧＦ−Ｎｎｉの全長はインビトロジェン社のｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入した。【０１００】
この遺伝子を用いて、遺伝子組み換え技術によって、タンパク質ＧＦ−Ｎｎｉを発現精製した。具体的には、ｐＥＴ−２８ｂベクターにＧＦ−Ｎｎｉ遺伝子を導入し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現した後、ニッケルカラムを用いて精製した。【０１０１】
〔実施例２〕
マイタケより精製したタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉを用いて、種々の脂質およびコレステロール（１：１）からなるリポソーム（人工膜）との結合を調べた。人工膜の脂質としては、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を用いた。これらの脂質はAvanti社より購入した。コレステロールはＳｉｇｍａ社より購入した。【０１０２】
まず、ＧＦ−Ｎｎｉとリポソームとを混合し、その後遠心によって上清（Ｓ）とリポソームを含む沈殿（Ｐ）とに分離した。次に、これらの上清（Ｓ）と沈殿（Ｐ）とをそれぞれ電気泳動し、公知の方法によってタンパク質を染色した。これにより、いずれの画分にＧＦ−Ｎｎｉが含まれるかを調べた。【０１０３】
図１は、本発明の一実施例におけるタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉと種々のリポソームとを混合した後に上清（Ｓ）と沈殿（Ｐ）とに分離し、電気泳動によりＧＦ−Ｎｎｉを検出した結果を示す図である。図１に示すように、ＧＦ−Ｎｎｉは、スフィンゴミエリンとコレステロールとからなるリポソームを用いた場合にのみ、沈殿画分に検出された。この結果から、本発明に係るタンパク質は、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体に特異的に結合することが示唆された。【０１０４】
〔実施例３〕
次に、精製したタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉを用いて、種々の脂質およびコレステロール（１：１）の混合物に対する結合活性をさらに調べた。脂質としては、実施例２にて用いたものの他に、ガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）（Ａｖａｎｔｉより入手）、グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）（Ｍａｔｒｅｙａより入手）、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）（Ａｖａｎｔｉより入手）、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）（ＢｉｏＭｏｌより入手）、ガングリオシド（ＧＭ１）（和光純薬より入手）、およびセラミド（Ｃｅｒ）（Ａｖａｎｔｉより入手）を用いた。【０１０５】
まず、９６穴プラスチックプレートに、種々の脂質とコレステロールとを１：１において含むエタノール溶液を添加し、その後エタノールを蒸発させた。これに、ＧＦ−Ｎｎｉ、抗ＧＦ−Ｎｎｉ抗体（ウサギポリクローナル抗体）、ＨＲＰ結合抗ウサギ抗体をこの順で加え、公知のＥＬＩＳＡ法（固相法）によって、脂質とコレステロールとの混合物に結合したＧＦ−Ｎｎｉの量を定量した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるKiyokawa E, Makino A, Ishii K, Otsuka N, Yamaji-Hasegawa A, Kobayashi T. (2004) Recognition of sphingomyelin by lysenin and lysenin-related proteins. Biochemistry 43, 9766-9773）。【０１０６】
図２は、脂質とコレステロールとの混合物に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。図２に示すように、ＧＦ−Ｎｎｉは、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合物にのみ高い結合活性を示した。この結果から、本発明に係るタンパク質は、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合物に選択的に結合することが示された。【０１０７】
〔実施例４〕
精製したタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉを用いて、上述したＥＬＩＳＡ法によって、スフィンゴミエリンとコレステロールとの比率が異なる混合物に対する結合活性を調べた。【０１０８】
図３は、スフィンゴミエリン（Ｓ）とコレステロール（Ｃ）との混合物に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。図３に示すように、ＧＦ−Ｎｎｉにおける、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合物に対する結合活性は、混合物に含まれるスフィンゴミエリンとコレステロールとの比率（Ｓ／Ｃ）に依存した。【０１０９】
この結果から、ＧＦ−Ｎｎｉは、スフィンゴミエリン／コレステロールの比率が６／４〜１／９である混合物に効率よく結合することが示された。また、スフィンゴミエリンのみ含むサンプル（Ｓ／Ｃ＝１０／０）およびコレステロールのみ含むサンプル（Ｓ／Ｃ＝０／１０）に対する結合活性が、非常に低いことが示された。【０１１０】
以上により、本発明に係るタンパク質は、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体に特異的に結合することが強く示唆された。また、本発明に係るタンパク質は、少なくともスフィンゴミエリン／コレステロールの比率が６／４〜１／９である混合体に対する結合活性が高いものであることが示唆された。【０１１１】
〔実施例５〕
実施例１と同じ方法で発現精製したタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉを用いて、上述したＥＬＩＳＡ法によって、種々のスフィンゴミエリンおよびコレステロール（１：１）の混合物に対する結合活性を調べた。スフィンゴミエリンとして、ブタ脳由来スフィンゴミエリン（ｂｒａｉｎＳＭ）（Ａｖａｎｔｉより入手）、卵黄由来スフィンゴミエリン（ＥｇｇＳＭ）（Ａｖａｎｔｉより入手）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）を有する合成スフィンゴミエリン（ＰａｌＳＭ）（Ａｖａｎｔｉより入手）、オレイン酸（Ｃ１８：１）を有する合成スフィンゴミエリン（ＯｌｅＳＭ）（Ｓｉｇｍａより入手）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）を有する合成スフィンゴミエリン（ＳｔｅＳＭ）（Ｍａｔｒｅｙａより入手）、炭素数２０、２２、２４、６、２の飽和脂肪酸をそれぞれ有する合成スフィンゴミエリン（Ｃ２０ＳＭ、Ｃ２２ＳＭ、Ｃ２４ＳＭ、Ｃ６ＳＭ、Ｃ２ＳＭ）（Ｍａｔｒｅｙａより入手）を用いた。【０１１２】
図４は、種々のスフィンゴミエリンとコレステロールとの混合物に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。図４に示すように、ＧＦ−Ｎｎｉは、ブタ脳由来スフィンゴミエリンおよび卵黄由来スフィンゴミエリンのいずれに対しても高い結合活性を示した。また、ＧＦ−Ｎｎｉは、炭素数１８以上の脂肪酸を有するスフィンゴミエリンであれば、飽和脂肪酸を有するものであるか不飽和脂肪酸を有するものであるかにかかわらず、結合した。【０１１３】
ここで、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体は、スフィンゴミエリンが有する脂肪酸が飽和脂肪酸である場合には秩序液体相をとり、不飽和脂肪酸である場合には無秩序液体相をとる。秩序液体相とは、スフィンゴミエリンの脂肪酸（炭化水素鎖）の配向が揃っている状態をさし、無秩序液体相とは、当該脂肪酸の配向が乱れている状態をさす。【０１１４】
本実施例の結果から、本発明に係るタンパク質は、結合対象である混合体が秩序液体相をとるか無秩序液体相をとるかにかかわらず、結合活性を有するものであることが示された。すなわち、本発明に係るタンパク質は、混合体の物性ではなく構造を認識して結合するものであることが示された。【０１１５】
また、本発明に係るタンパク質は、少なくとも炭素数７以上の長い脂肪酸、特に炭素数１８以上の脂肪酸を有するスフィンゴミエリンを含む混合体に対して結合活性を有することが示された。また、種々の由来のスフィンゴミエリンを含む混合体に対して結合できることが示された。【０１１６】
〔実施例６〕
実施例１と同じ方法で発現精製したタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉを用いて、上述したＥＬＩＳＡ法によって、スフィンゴミエリンおよび種々のステロール（１：１）の混合物に対する結合活性を調べた。ステロールとしては、コレステロール（cholesterol）、エルゴステロール（ergosterol）、ラノステロール（lanosterol）、コプロスタン（coprostane）、コレステリルアセテート（chol acetate）、５α−ｃｈｏｌ（5a chol）、５α−ｃｈｏｌ−３β−ｏｎｅ（5a-chol-3b-one）、５α−ｃｈｏｌ−７−ｅｎ−３ｂ−ｏｌ（5a-chol-7-en-3b-ol）、５α−ｃｈｏｌ−３β−ｏｌ（5a-chol-3b-ol）、および５β−ｃｈｏｌ−３ａ−ｏｌ（5b-chol-3a-ol）を用いた。【０１１７】
図５は、スフィンゴミエリンと種々のステロールとの混合物に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。図５に示すように、ＧＦ−Ｎｎｉは、ステロール構造の違いを見分けていることが示された。【０１１８】
〔実施例７〕
実施例１と同じ方法で発現精製したタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉについて、示差熱分析装置（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるIshitsuka R, Yamaji-Hasegawa A, Makino A, Hirabayashi Y, Kobayashi T. (2004) A lipid-specific toxin reveals heterogeneity of sphingomyelin-containing membranes. Biophys. J. 86, 296-307.）を用いて熱分析を行ない、種々の人工膜に対する結合活性を調べた。人工膜としては、スフィンゴミエリン（Ｍａｔｒｅｙａより入手）とコレステロール（Ｓｉｇｍａより入手）との人工膜（ＳＭ／ｃｈｏｌ）（１：１）、ＤＯＰＣ（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine）（Ａｖａｎｔｉより入手）とコレステロールとの人工膜（ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌ）（１：１）、およびＤＰＰＣ（dipalmitoyl phosphatidyl choline）（Ａｖａｎｔｉより入手）とコレステロールとの人工膜（ＤＰＰＣ／ｃｈｏｌ）（１：１）を用いた。【０１１９】
図６は、種々の人工膜に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示す熱分析結果である。図６に示すように、ＧＦ−Ｎｎｉは、ＳＭ／ｃｈｏｌには結合したが、ＤＯＰＣ／ｃｈｏｌおよびＤＰＰＣ／ｃｈｏｌには結合しなかった。秩序液体相をとるＤＰＰＣ／ｃｈｏｌにＧＦ−Ｎｎｉが結合しなかったことから、ＧＦ−Ｎｎｉが、結合対象の物性ではなく構造を認識していることが示された。【０１２０】
〔実施例８〕
精製したタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉの細胞表面に対する結合能を調べた。【０１２１】
まず、未処理のＨｅＬａ細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）、スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）を処理してスフィンゴミエリンを除いたＨｅＬａ細胞、およびメチルベータサイクロデキストリン（ＭβＣＤ）を処理してコレステロールを除いたＨｅＬａ細胞をそれぞれ固定した。次に、これらのＨｅＬａ細胞の表面にＧＦ−Ｎｎｉを結合させた後、抗ＧＦ−Ｎｎｉ抗体、およびＡｌｅｘａ５４４標識抗ウサギ抗体を用いてこのＧＦ−Ｎｎｉを可視化した。【０１２２】
また、比較のために、スフィンゴミエリンを認識するライセニン（lysenin）、およびコレステロールを認識するθ−毒素のコレステロール結合ドメイン（Ｄ４）についても同様に、上述したＨｅＬａ細胞に結合させた後、蛍光抗体を用いてこれらを可視化した。【０１２３】
図７は、ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ−Ｎｎｉの結合を示す顕微鏡画像を表す図である。図７に示すように、ＧＦ−Ｎｎｉは、未処理のＨｅＬａ細胞の表面に対して結合するが、ＳＭａｓｅを処理した細胞およびコレステロールを除いた細胞に対しては結合しなかった。一方、ライセニンは、コレステロールを除いた細胞に対して結合し、Ｄ４は、ＳＭａｓｅを処理した細胞に対して結合した。【０１２４】
〔実施例９〕
種々の人工膜を共存させた条件下における、ＧＦＰ標識したＧＦ−Ｎｎｉの細胞への結合能を調べた。【０１２５】
ＧＦ−ＮｎｉのＮ末にＧＦＰを融合させたタンパク質ＧＦＰ−ＧＦ−Ｎｎｉ（配列番号７）をコードする遺伝子（配列番号８）を作製し、この遺伝子を用いて、遺伝子組み換え技術によって、ＧＦＰ標識したＧＦ−Ｎｎｉを発現精製した。具体的にはｐＥＴ−２８ｂベクターにＥＧＦＰをコードする遺伝子とＧＦ−Ｎｎｉをコードする遺伝子とを導入し、これを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いてＧＦＰ−ＧＦ−Ｎｎｉを発現させた後、ニッケルカラムを用いて精製した。【０１２６】
精製したタンパク質とＨｅＬａ細胞の表面との結合能を、人工膜を共存させない条件（ｃｏｎｔｒｏｌ）、スフィンゴミエリン／コレステロール（１：１）の人工膜（ＳＭ／Ｃｈｏｌ）共存下、およびホスファチジルコリン／コレステロール（１：１）の人工膜（ＰＣ／Ｃｈｏｌ）共存下において調べた。【０１２７】
図８は、ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ−Ｎｎｉの結合を示す顕微鏡画像を表す図である。図８に示すように、ＧＦ−Ｎｎｉは、人工膜を共存させない条件下ではＨｅＬａ細胞表面に結合した。この結合は、ＳＭ／Ｃｈｏｌ共存下では阻害されたが、ＰＣ／Ｃｈｏｌ共存下では阻害されなかった。この結果から、ＧＦ−Ｎｎｉは、スフィンゴミエリンとコレステロールとの混合体を介して細胞表面に結合することが支持された。【０１２８】
〔実施例１０〕
ＨｅＬａ細胞内におけるＧＦ−Ｎｎｉおよびライセニンの局在を調べた。具体的には、細胞を固定した後、凍結融解を行なうことによって膜を透過性にし、ＧＦ−Ｎｎｉとライセニンとを添加し、それぞれのタンパク質に対する抗体を用いてＧＦ−Ｎｎｉとライセニンの細胞内局在を可視化した。【０１２９】
図９は、ＨｅＬａ細胞内におけるＧＦ−Ｎｎｉおよびライセニンの局在を示す顕微鏡画像を表す図である。具体的には、図９は、ＧＦ−Ｎｎｉの局在を示す画像（ＧＦ−Ｎｎｉ）と、ライセニンの局在を示す画像（Ｌｙｓｅｎｉｎ）と、これらを重ね合わせた画像（Ｌｙｓｅｎｉｎ＋ＧＦ−Ｎｎｉ）とを表す図である。ＧＦ−Ｎｎｉとライセニンとの局在が一致していることから、ＧＦ−Ｎｎｉが結合するスフィンゴミエリンおよびコレステロールの混合体の局在と、ライセニンが結合するスフィンゴミエリンの局在とが一致することが明らかとなった。【０１３０】
このように本発明に係るタンパク質を用いれば、細胞内におけるスフィンゴミエリンおよびコレステロールの混合体（脂質ラフト）の局在を容易に検出することができる。また、本発明に係るタンパク質は、ライセニンと組み合わせて用いることによって、脂質ラフトと、脂質ラフトを形成していないスフィンゴミエリンとの局在、動態等を比較することができる。【０１３１】
〔実施例１１〕
ＨｅＬａ細胞内におけるＧＦ−Ｎｎｉおよび後期エンドソームマーカーＢＭＰの局在を調べた。具体的には、細胞を固定した後、凍結融解することによって膜を透過性にし、ＧＦ−Ｎｎｉとエンドソーム特異的脂質であるＢＭＰに対する抗体とを添加し、それぞれを蛍光抗体法により可視化し、局在を顕微鏡観察によって調べた。【０１３２】
図１０は、ＨｅＬａ細胞におけるＧＦ−ＮｎｉおよびＢＭＰの局在を示す顕微鏡画像を表す図である。具体的には、図１０は、ＧＦ−Ｎｎｉの局在を示す画像（ＧＦ−Ｎｎｉ）と、ＢＭＰの局在を示す画像（ＢＭＰ）と、これらを重ね合わせた画像（ＢＭＰ＋ＧＦ−Ｎｎｉ）とを表す図である。図１０から、ＧＦ−Ｎｎｉが結合するスフィンゴミエリンおよびコレステロールの混合体と後期エンドソームとの局在は、一部一致していることが明らかとなった。【０１３３】
このように本発明に係るタンパク質を用いれば、細胞内におけるスフィンゴミエリンおよびコレステロールの混合体（脂質ラフト）の局在を、他の細胞内器官の局在と比較することができ、これにより、脂質ラフトの細胞内における動態、機能等を予測することができる。【０１３４】
以上のように、本発明は、脂質ラフトの細胞内における局在、動態、機能等を調べるために有用である。【０１３５】
〔実施例１２〕
本発明の一実施例として、タンパク質ＧＦ−Ｎｎｉと相同性を有する、ブナシメジ（Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ  ｍａｒｍｏｒｅｕｓ）のホモログタンパク質ＨＭ−Ｎｎｉをコードする遺伝子を、下記の方法を用いて見出した。すなわちＧＦ−Ｎｎｉのアミノ酸配列をもとに雪国まいたけ社が保有するブナシメジｃＤＮＡデータベース対してｔｂｌａｓｔｎ解析を実施し、アミノ酸で３６％のホモロジーを有するＤＮＡ断片２２８ｂｐを得た。この配列をもとに、ＲＡＣＥ用のプライマー２つ（５’−ＲＡＣＥ−ＨＭ（配列番号９）及び３’−ＲＡＣＥ−ＨＭ（配列番号１０））を設計し、ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （タカラバイオ株式会社）を用いてＲＡＣＥ−ＰＣＲ法によって未知上流配列並びに下流配列を決定した（配列番号１４）。決定したＨＭ−Ｎｎｉ配列より、クローニング用のフォワードプライマーＨＭ−Ｆ（配列番号１１）及びリバースプライマーＨＭ−Ｒ（配列番号１２）を設計し、PCRによってＨＭ−Ｎｎｉの全長遺伝子をクローニングした。この遺伝子を用いて、実施例１と同様の方法によってタンパク質ＨＭ−Ｎｎｉ（配列番号１３）を発現精製した。【０１３６】
〔実施例１３〕
実施例１と同じ方法で発現精製したタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉを用いて、実施例２と同様の方法により、ＧＦ−Ｎｎｉとリポソームとの結合を調べた。リポソームとしては、スフィンゴミエリン／ホスファチジルコリン／コレステロールリポソーム（１：０：１，１：０．２：１，１：０．５：１，１：１：１）を用いた。【０１３７】
図１２は、本発明の一実施例におけるタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉと種々のリポソームとを混合した後に上清（Ｓ）と沈殿（Ｐ）とに分離し、電気泳動によりＧＦ−Ｎｎｉを検出した結果を示す図である。【０１３８】
図１２に示すように、リポソームにおけるホスファチジルコリンの割合が増加するほど、ＧＦ−Ｎｎｉの結合が阻害された。この結果から、ＧＦ−Ｎｎｉは、スフィンゴミエリンとコレステロールとの複合体を形成することができず、あらかじめ存在するスフィンゴミエリン／コレステロール複合体に結合することができることが示された。【０１３９】
〔実施例１４〕
実施例１と同じ方法で発現精製したタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉを用いて、上述したＥＬＩＳＡ法（固相法）によって、種々のステロールとスフィンゴミエリンとの混合物（１：１）に対する結合活性を調べた。【０１４０】
ステロールとしては、コレステロール（cholesterol）、エルゴステロール（ergosterol）、ラノステロール（lanosterol）、コプロスタン（coprostane）、コレステリルアセテート（chol acetate）、５α−コレスタン（5a-cholestane）、５α−コレスタン−３−ｏｎｅ（5a-cholestan-3-one）、ラソステロール（lathosterol，上述した5a-chol-7-en-3b-olと同じ）、ジヒドロコレステロール（dihydrocholesterol，上述した5a-chol-3b-olと同じ）、エピコプロスタノール（epicoprostanol，上述した5b-chol-3a-olと同じ）、６−ケトコレスタノール（6-ketocholestanol）、７−デヒドロコレステロール（7-dehydrocholesterol）、５α−ｃｈｏｌｅｓｔ−８（１４）−ｅｎ−３β−ｏｌ−１５−ｏｎｅ（5a-cholest-8(14)-en-3b-ol-15-one）、カンペステロール（campesterol）、スチグマステロール（stigmasterol）、β−シトステロール（b-sitosterol）、デスモステロール（desmosterol）、エピコレステロール（epicholesterol）、コプロスタノール（coprostanol）、及びコプロステノール（coprostenol）を用いた。【０１４１】
図１３は、種々のステロールとスフィンゴミエリンとの混合物に対するＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示すグラフである。縦軸は、コレステロールの値を１００としたときの相対値を表す。図１３に示すように、ＧＦ−Ｎｎｉの結合には、ステロールの３β−ヒドロキシル基が重要であることがわかった。【０１４２】
〔実施例１５〕
免疫電子顕微鏡解析により、細胞表面におけるＧＦ−Ｎｎｉの結合部位を調べた。具体的には、固定したＨｅＬａ細胞の表面に、実施例１に示す方法で発現精製したタンパク質ＧＦ−Ｎｎｉを結合させた。その後、抗ＧＦ−Ｎｎｉ抗体で処理した後、金コロイド標識抗ウサギ抗体を加え、電子件微鏡で観察した。【０１４３】
図１４は、ＨｅＬａ細胞表面へのＧＦ−Ｎｎｉの結合部位を示す顕微鏡画像を表す図である。図１４に示すように、ＧＦ−Ｎｎｉは、細胞膜上でクラスターを形成していた。【０１４４】
〔実施例１６〕
超高解像能蛍光顕微鏡により、ＧＦ−Ｎｎｉ、ライセニン、Ｈ−ｒａｓ及びＫ−ｒａｓの細胞膜中での分布を調べた。具体的にはＤｒｏｎｐａおよびＡｌｅｘａ６４７標識したＧＦ−Ｎｎｉ、ライセニン、Ｈ−ｒａｓ及びＫ−ｒａｓを調製し、細胞表面を標識した後、ＰＡＬＭ（photoactivation localization microscope）により観察した。【０１４５】
図１５は、細胞膜中におけるＧＦ−Ｎｎｉ、ライセニン、及びＨ−ｒａｓの分布を示す顕微鏡画像を表す図である。また図１６は、細胞膜中におけるＧＦ−Ｎｎｉ、ライセニン、及びＫ−ｒａｓの分布を示す顕微鏡画像を表す図である。【０１４６】
本実施例では、細胞膜におけるＧＦ−Ｎｎｉ結合ドメインは、ライセニン結合ドメインの一部に存在することがわかった。また、細胞膜外層に分布するＧＦ−Ｎｎｉは、細胞膜内層のＨ−ｒａｓとはよく一致していたが、Ｋ−ｒａｓとは一致していなかった。なお、従来、Ｈ−ｒａｓは脂質ラフトに存在すると予想されていた。本実施例においてＨ−ｒａｓの分布がＧＦ−Ｎｎｉの分布と一致したことから、Ｈ−ｒａｓはスフィンゴミエリン／コレステロールドメインの裏側に実際に存在することが示された。【０１４７】
このように、ＧＦ−Ｎｎｉを用いることにより、Ｈ−ｒａｓが脂質ラフトに実際に存在することを示すことができた。【０１４８】
〔実施例１７〕
ＨｅＬａ細胞における細胞内オルガネラへのＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を調べた。具体的には細胞を固定化した後、凍結融解によって膜を透過性にし、種々のオルガネラマーカーとＧＦ−Ｎｎｉとの二重標識を行った。【０１４９】
図１７は、細胞内オルガネラへのＧＦ−Ｎｎｉの結合活性を示す顕微鏡画像を表す図である。図１７に示すように、ＧＦ−Ｎｎｉの局在は、ＢＭＰとのみ一致し、ＥＥＡ１、ＧＭ１３０とは一致しなかった。この結果から、ＨｅＬａ細胞内ではＧＦ−Ｎｎｉが後期エンドソームに結合するため、後期エンドソームがスフィンゴミエリン／コレステロールの蓄積の場であることが示された。【０１５０】
このように、ＧＦ−Ｎｎｉを用いることにより、脂質ラフトの局在を容易に検出することができる。【０１５１】
〔実施例１８〕
免疫電子顕微鏡解析により、細胞内におけるＧＦ−Ｎｎｉの結合部位を解析した。具体的にはＨｅｌａ細胞の切片を調製し、ＧＦ−Ｎｎｉを結合させた後、抗ＧＦ−Ｎni抗体、金コロイド標識抗ウサギ抗体で処理を行った。【０１５２】
図１８は、細胞内におけるＧＦ−Ｎｎｉの結合部位を示す顕微鏡画像を表す図である。この結果から、ＧＦ−Ｎｎｉは、後期エンドソームに特徴的な多重膜構造に結合することが示された。【０１５３】
〔実施例１９〕
ニーマンピック病は、先天性の脂質代謝異常症であり、Ａ型、Ｃ型などが知られている。Ａ型は、酸性スフィンゴミエリナーゼの欠損であり、Ｃ型は、ニーマンピックＣタンパク質というコレステロールの細胞内輸送にかかわるタンパク質を欠損している。Ａ型の細胞は細胞内にスフィンゴミエリンを蓄積し、Ｃ型はコレステロールを蓄積する。どちらも脂質ラフトの機能に異常があることが示唆されているが、脂質ラフトそのものの細胞内および細胞表面での分布はわかっていなかった。【０１５４】
そこで、本実施例では、脂質結合タンパク質であるＧＦ−Ｎｎｉ、ライセニン及びＤ４を用いて、ニーマンピック病細胞の細胞内及び細胞表面における脂質の分布を調べた。【０１５５】
まず、正常な細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ニーマンピック病Ａ型の細胞（ＮＰＡ）、およびニーマンピック病Ｃ型の細胞（ＮＰＣ）に対し、凍結融解することより細胞に穴をあけ、膜を透過性にした。次いで、ＧＦ−Ｎｎｉ、ライセニン及びＤ４を添加し、それぞれのタンパク質に対する抗体を用いて細胞内局在を可視化した。【０１５６】
図１９は、ニーマンピック病の細胞の細胞内における脂質分布を示す顕微鏡画像を表す図である。ニーマンピック病のＡ型、Ｃ型どちらの細胞においても、コントロール細胞に比べ、細胞内におけるＧＦ−Ｎｎｉの有意な蓄積が示された。したがって、ＧＦ−Ｎｎｉを用いることにより、ニーマンピック病の細胞では、細胞内に脂質ラフトが蓄積していることを示すことができた。【０１５７】
次に、これらの細胞をそれぞれ固定し、細胞の表面にＧＦ−Ｎｎｉ、ライセニン及びＤ４のそれぞれを結合させた。その後、ＧＦ−Ｎｎｉについては抗ＧＦ−Ｎｎｉ抗体、およびＡｌｅｘａ５４４標識抗ウサギ抗体を用いて可視化した。また、ライセニン、Ｄ４についても同様に、蛍光抗体を用いて可視化した。【０１５８】
図２０は、ニーマンピック病細胞の細胞表面における脂質分布を示す顕微鏡画像を表す図である。ニーマンピック病のＣ型では、ＧＦ−Ｎｎｉによって染色される脂質ラフト（スフィンゴミエリン・コレステロール複合体）が細胞表面にかたまりとなって存在していることがわかった。【０１５９】
以上のように、ＧＦ−Ｎｎｉを用いることによって、脂質ラフトが関係する遺伝病等の疾患の詳細な解析が可能である。【０１６０】
〔実施例２０〕
脂質ラフトは、インフルエンザウイルスをはじめとするウイルス感染において重要な役割を果たすと考えられている。そこで、インフルエンザウイルス感染に対するＧＦ−Ｎｎｉの効果を調べた。【０１６１】
まず、インフルエンザウイルスの感染１時間前又は４時間後に培養細胞（ＭＤＣＫ）にＧＦ−Ｎｎｉを添加した場合における効果を調べた。具体的には、培養細胞（ＭＤＣＫ）にＧＦ−Ｎｎｉを一定時間処理した後、インフルエンザウイルスを感染させ、一定時間後にウイルスのタイターを測定した。【０１６２】
図２１は、培養細胞（ＭＤＣＫ）へのインフルエンザウイルス感染に対するＧＦ−Ｎｎｉの効果を示すグラフである。なお、図２１は、感染後２４時間後における結果を示す。また、縦軸は、コントロール（ＧＦ−Ｎｎｉを添加しないＭＤＣＫ）のウイルス感染に対する割合（％）を表す。図２１に示すように、感染１時間前にＧＦ−Ｎｎｉを添加した場合、感染４時間後にＧＦ−Ｎｎｉを添加した場合の両方において、コントロールよりもウイルス感染が阻害されていることが示された。【０１６３】
次に、上述した方法を用いて、細胞とＧＦ−Ｎｎｉとの接触時間を、インフルエンザウイルスの感染１時間前から感染後２時間までとした場合（実験１）、感染後３時間後から８時間後までとした場合（実験２）、感染１時間前から感染後８時間までとした場合（実験３）における効果を調べた。【０１６４】
図２２は、培養細胞（ＭＤＣＫ）へのインフルエンザウイルス感染に対するＧＦ−Ｎｎｉの効果を示すグラフである。なお、図２２は、感染後８時間後における結果を示す。また、縦軸は、コントロール（ＧＦ−Ｎｎｉを添加しないＭＤＣＫ）のウイルス感染に対する割合（％）を表す。【０１６５】
図２２に示すように、実験１、すなわちインフルエンザウイルスの感染初期の細胞への吸着・細胞内侵入時点のみＧＦ−Ｎｎｉを接触させた場合には、ウイルス感染に対する阻害効果は低かった。一方、実験２では、高い阻害効果が見られた。したがって、ＧＦ−Ｎｎｉの作用点は感染の中〜後期であると推察される。また、ＧＦ−Ｎｎｉは、ウイルスの細胞への吸着ではなく細胞からのウイルスの遊離を阻害していることが示唆される。【０１６６】
以上の結果は、ＧＦ−Ｎｎｉが、細胞に対するウイルス感染を阻害する目的、例えばウイルス感染阻害剤に好適に使用できることを示唆している。【０１６７】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。【０１６８】
なお、本出願は、２０１０年５月１４日付けで出願された日本特許出願（特願２０１０−１１２６８１）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明は、脂質ラフトを特異的に検出することができるので、脂質ラフトに関する研究用試薬、キットなどに好適に利用できるとともに、脂質ラフトが関わる疾病に対する医薬、ウイルス感染阻害剤などにも好適に利用できる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【図１３】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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