(57)【要約】  核酸増幅法によりＭＴＨＦＲ遺伝子の目的領域を特異的に増幅するためのプライマーセットを提供する。Ｆ１プライマーとＲ１プライマーとを含むプライマーセット（１）、および、Ｆ２のプライマーとＲ２プライマーとを含むプライマーセット（２）を含むプライマーセットを使用する。これにより、例えば、同一反応液において同時に、ＭＴＨＦＲ遺伝子の２種類の多型を生じる部分をそれぞれ含む２つの目的領域を増幅できる。（Ｆ１）塩基長が２０〜２８塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８７１５のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド（Ｒ１）塩基長が１８〜２６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８８１７のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ｆ２）塩基長が２６〜３６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０５９０のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド（Ｒ２）塩基長が２２〜３４塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０６９５のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
2011062258.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方を含むプライマーセット（１）、
および、
下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよび下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方を含むプライマーセット（２）
の少なくとも一方を含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセット。
（Ｆ１）塩基長が２０〜２８塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８７１５のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）塩基長が１８〜２６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８８１７のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
（Ｆ２）塩基長が２６〜３６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０５９０のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２）塩基長が２２〜３４塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０６９５のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記（Ｆ１）、（Ｒ１）、（Ｆ２）および（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、下記（Ｆ１−１）、（Ｒ１−１）、（Ｆ２−１）および（Ｒ２−１）のオリゴヌクレオチドである、請求項１記載のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセット。
（Ｆ１−１）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｒ１−１）配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｆ２−１）配列番号２５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｒ２−１）配列番号３８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項３】
請求項１記載のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットおよびＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅物にハイブリダイズ可能なプローブを含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬。
【請求項４】
前記プローブが、下記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチド、（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチド、（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドの少なくともいずれかを含むプローブである、請求項３記載の増幅用試薬。
（Ｐ１）塩基長が１７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号８７４４〜８７６０を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号８７４４の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が１４〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０６４３〜１０６５６を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０６４３の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項５】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号８７４４の塩基に相補的な塩基を、３’末端から数えて１〜４番目の位置に有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０６４３の塩基に相補的な塩基を、３’末端から数えて１〜４番目の位置に有する、請求項４記載の増幅用試薬。
【請求項６】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、下記（Ｐ１−１）および（Ｐ２−１）のオリゴヌクレオチドである、請求項４記載の増幅用試薬。
（Ｐ１−１）配列番号４６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２−１）配列番号５２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項７】
前記プローブが、標識物質を有する標識プローブである、請求項３記載の増幅用試薬。
【請求項８】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、３’末端領域に、前記標識物質を有し、前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドが、５末端領域に、前記標識物質を有する、請求項７記載の増幅用試薬。
【請求項９】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、３’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有し、
前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドが、５’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有する、請求項８記載の増幅用試薬。
【請求項１０】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号８７４４の塩基に相補的な塩基に、前記標識物質を有し、
前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１における塩基番号８７４４の塩基に、前記標識物質を有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０６４３の塩基に相補的な塩基に、前記標識物質を有し、
前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１における塩基番号１０６４３の塩基に、前記標識物質を有する、請求項８記載の増幅用試薬。
【請求項１１】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドを含むプローブおよび前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドを含むプローブを含む、請求項４記載の増幅用試薬。
【請求項１２】
下記（Ａ）工程を含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅物を検出する増幅物検出方法。
（Ａ）反応系において、試料中の核酸を鋳型として、請求項１記載のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程
【請求項１３】
下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程を含む、請求項１２記載の増幅物検出方法。
（Ａ）反応系において、試料中の核酸を鋳型として、請求項１記載のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程における増幅物および前記ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅物にハイブリダイズ可能なプローブを含む反応系の温度を変化させ、前記増幅物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する測定工程
（Ｃ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅物を検出する検出工程
【請求項１４】
前記（Ａ）工程において、前記プローブを含む前記反応系において、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅を行い、
前記（Ｂ）工程において、前記（Ａ）工程の前記反応系の温度を変化させる、請求項１３記載の増幅物検出方法。
【請求項１５】
前記プローブが、前記プローブが、下記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチド、（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチド、（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドの少なくともいずれかを含むプローブである、請求項１３記載の増幅物検出方法。
（Ｐ１）塩基長が１７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号８７４４〜８７６０を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号８７４４の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が１４〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０６４３〜１０６５６を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０６４３の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項１６】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、下記（Ｐ１−１）および（Ｐ２−１）のオリゴヌクレオチドである、請求項１５記載の増幅物検出方法。
（Ｐ１−１）配列番号４６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２−１）配列番号５２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項１７】
前記プローブが、標識物質を有する標識プローブである、請求項１３記載の増幅物検出方法。
【請求項１８】
前記反応系が、前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドを含むプローブおよび前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドを含むプローブを含む、請求項１５記載の増幅物検出方法。
【請求項１９】
下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）工程を含むことを特徴とする多型検出方法。
（Ａ）反応系において、試料中の核酸を鋳型として、請求項１記載のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程における増幅物およびＭＴＨＲ遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブを含む反応系の温度を変化させ、前記増幅物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する測定工程
（Ｄ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の前記多型を検出する検出工程
【請求項２０】
前記（Ａ）工程において、前記プローブを含む前記反応系において、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅を行い、
前記（Ｂ）工程において、前記（Ａ）工程の前記反応系の温度を変化させる、請求項１９記載の多型検出方法。
【請求項２１】
前記プローブが、下記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチド、（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチド、（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドの少なくともいずれかを含むプローブである、請求項１９記載の多型検出方法。
（Ｐ１）塩基長が１７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号８７４４〜８７６０を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号８７４４の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が１４〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０６４３〜１０６５６を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０６４３の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項２２】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、下記（Ｐ１−１）および（Ｐ２−１）のオリゴヌクレオチドである、請求項２１記載の多型検出方法。
（Ｐ１−１）配列番号４６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２−１）配列番号５２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項２３】
前記プローブが、標識物質を有する標識プローブである、請求項１９記載の多型検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅するためのプライマーセット、それを含むＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホモシステインは、メチオニンの代謝経路における中間産物であり、一部はシステインに代謝され、一部は再びメチオニンに代謝される。ホモシステインは、生体内で増加すると、動脈硬化、冠動脈疾患、心疾患等の心血管系疾患、高ホモシステイン血症の原因となることが報告されている。ホモシステインの産生には、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌｉｃ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＭＴＨＦＲ）が関与しており、ＭＴＨＦＲ遺伝子における多型と前述の疾患との関連性も報告されている（例えば、非特許文献１参照）。【０００３】
具体的には、ＭＴＨＦＲ遺伝子の多型に起因するＭＴＨＦＲの活性低下が、血中ホモシステインを増加させ、前記疾患の発症を引き起こすと考えられている。ＭＴＨＦＲ遺伝子の多型は、例えば、ＭＴＨＦＲ＊６７７、ＭＴＨＦＲ＊１２９８等が知られている。前者のＭＴＨＦＲ＊６７７は、ＭＴＨＦＲ遺伝子における８７４７番目の塩基が、野生型はシトシン（ｃ）、変異型はチミン（ｔ）である。後者のＭＴＨＦＲ＊１２９８は、ＭＴＨＦＲ遺伝子における１０６４９番目の塩基が、野生型はアデニン（ａ）、変異型はシトシン（ｃ）である。例えば、ＭＴＨＦＲ遺伝子に、ホモ接合体の変異ＭＴＨＦＲ＊６７７（Ｔ／Ｔ）が生じると、ＭＴＨＦＲ活性が低下し、血中ホモシステイン量が上昇することが報告されている。他方、メカニズムは不明だが、ＭＴＨＦＲ遺伝子に、ヘテロ接合体の変異ＭＴＨＦＲ＊１２９８（Ａ／Ｃ）またはホモ接合体の変異ＭＴＨＦＲ＊１２９８（Ｃ／Ｃ）が生じると、ＭＴＨＦＲ活性が低下し、例えば、メトトレキサート等の関節リウマチ治療薬の必要投与量が減少することが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。このため、ＭＴＨＦＲ遺伝子について、複数の多型を調べることは、血中ホモシステイン量の上昇による心血管系疾患等の疾患の発症、および関節リウマチ等の治療薬の投与量を予測するために、極めて重要である。【０００４】
他方、あらゆる疾患の原因、個体間の疾患易罹患性すなわち疾患のかかり易さ、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、多型の検出が広く行われている。前記多型は、例えば、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）等があげられる。多型の一般的な検出方法は、例えば、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析、ＡＳＰ−ＰＣＲ法等があげられる。前記Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法は、例えば、試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅させ、その全遺伝子配列を解析する方法である。前記ＲＦＬＰ法は、例えば、まず、試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲにより増幅させる。そして、前記検出対象配列における目的の変異の有無により切断作用が異なる制限酵素によって、その増幅物を切断し、電気泳動することでタイピングを行う方法である。ＡＳＰ−ＰＣＲ法は、例えば、３’末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断する方法である。【０００５】
しかしながら、これらの方法は、例えば、試料から抽出したＤＮＡの精製、電気泳動、制限酵素処理等が必須であるため、手間やコストがかかる。また、ＰＣＲを行った後、反応容器を一旦開封する必要がある。このため、前記増幅物が次の反応系に混入し、解析精度が低下するおそれがある。さらに、自動化が困難であるため、大量のサンプルを解析できない。また、前記ＡＳＰ−ＰＣＲ法は、特異性が低いという問題もある。【０００６】
このような問題から、近年、多型の検出方法として、Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）解析が実用化されている。これは、二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ）を解析する方法であり、前記二本鎖の融解曲線の解析により行われることから、融解曲線解析とも呼ばれる。Ｔｍ解析は、例えば、以下のような方法である。まず、検出目的の多型を含む領域に相補的なプローブを用いて、被検核酸と前記プローブとのハイブリッド（二本鎖核酸）を形成させる。そして、得られたハイブリッドに加熱処理を施し、温度上昇に伴う前記ハイブリッドの一本鎖核酸への解離（融解）を、吸光度等のシグナルの変動によって検出する。この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって、多型を判断する方法である。Ｔｍ値は、前記ハイブリッドにおける両一本鎖核酸の相補性が高い程高く、相補性が低い程低くなる。そこで、検出対象部位の多型がＸまたはＹの場合、目的の多型（例えば、Ｙ）を含む核酸とそれに１００％相補的なプローブとのハイブリッドについて、予めＴｍ値（評価基準値）を求めておく。続いて、前記被検核酸と前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定する。そして、この測定値が、前記評価基準値と同じであれば、前記被検核酸と前記プローブとはパーフェクトマッチである、すなわち、前記被検核酸の検出対象部位が目的の多型（Ｙ）であると判断できる。他方、前記測定値が前記評価基準値よりも低ければ、前記被検核酸と前記プローブとはミスマッチである、すなわち、前記被検核酸の検出対象部位が他方の多型（Ｘ）であると判断できる。このような方法であれば、例えば、前記プローブを添加したＰＣＲ反応液に温度処理を施し、シグナル測定を行うのみで、多型を検出できる。このため、検出装置の自動化も可能である。【０００７】
しかしながら、このようなＴｍ解析を利用した検出方法についても、例えば、ＰＣＲにおいて、検出目的の多型を含む領域を、特異的且つ効率的に増幅できなければならないという問題がある。特に、複数の遺伝子多型を有する場合には、１つのサンプルを解析するにも多大な労力を伴うため、大量のサンプルを解析することは実用的ではないという問題もある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】福澤ら、「特集  高血圧  最新の研究動向  基礎編」、日本臨床、株式会社日本臨床社、２００６年７月、６４巻増刊５、１７３〜１７６頁
【非特許文献２】Ｕｒａｎｏら、「Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｗｅｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ａｓ  ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ  ｌｏｃｕｓ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ．」、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００２年４月、１２（３）、１８３〜１９０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、核酸増幅法によりＭＴＨＦＲ遺伝子の目的の領域を特異的に増幅するためのプライマーおよびプライマーセットの提供を目的とする。【００１０】
前記目的を達成するために、本発明のプライマーは、
下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーまたは
下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマー
であることを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅するためのプライマーである。
（Ｆ１）塩基長が２０〜２８塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８７１５のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）塩基長が１８〜２６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８８１７のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
（Ｆ２）塩基長が２６〜３６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０５９０のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２）塩基長が２２〜３４塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０６９５のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド【００１１】
本発明のプライマーセットは、
前記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよび前記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方を含むプライマーセット（１）、および、
前記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよび前記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方を含むプライマーセット（２）
の少なくとも一方を含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅するためのプライマーセットである。【００１２】
本発明の遺伝子増幅用試薬は、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーまたはプライマーセットを含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬である。【００１３】
本発明の増幅方法は、反応系において、試料中の核酸を鋳型として、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーまたはプライマーセットを用いて、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅を行う工程を含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅方法である。【００１４】
本発明の増幅物検出方法は、下記（Ａ）工程を含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅物を検出する増幅物検出方法である。
（Ａ）本発明の増幅方法により、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程【００１５】
本発明の多型検出方法は、下記（Ａ）工程を含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子の多型検出方法である。
（Ａ）本発明の増幅方法により、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程
【発明の効果】
【００１６】
本発明のプライマーおよびプライマーセットによれば、ＭＴＨＦＲ遺伝子における検出対象部位（例えば、ＭＴＨＦＲ＊６７７またはＭＴＨＦＲ＊１２９８）を含む目的の領域を、特異的に増幅できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の実施例１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例２におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、ＭＴＨＦＲ遺伝子における検出目的の多型は、例えば、配列番号１に示すＭＴＨＦＲ遺伝子の塩基配列における塩基番号８７４７および塩基番号１０６４９の少なくとも一方の塩基における多型である。配列番号１の塩基配列において、塩基番号８７４７の塩基（ｙ）は、野生型がシトシン（ｃ）であり、変異型はチミン（ｔ）である。以下、この多型を、ＭＴＨＦＲ＊６７７といい、野生型のホモ接合体をＭＴＨＦＲ＊６７７（Ｃ／Ｃ）または８７４７（Ｃ／Ｃ）、変異型のホモ接合体をＭＴＨＦＲ＊６７７（Ｔ／Ｔ）または８７４７（Ｔ／Ｔ）、ヘテロ接合体をＭＴＨＦＲ＊６７７（Ｃ／Ｔ）または８７４７（Ｃ／Ｔ）という。また、配列番号１の塩基配列において、塩基番号１０６４９の塩基（ｍ）は、野生型がアデニン（ａ）であり、変異型はシトシン（ｃ）である。以下、この多型を、ＭＴＨＦＲ＊１２９８といい、野生型のホモ接合体をＭＴＨＦＲ＊１２９８（Ａ／Ａ）または１０６４９（Ａ／Ａ）、変異型のホモ接合体をＭＴＨＦＲ＊１２９８（Ｃ／Ｃ）または１０６４９（Ｃ／Ｃ）、ヘテロ接合体をＭＴＨＦＲ＊１２９８（Ａ／Ｃ）または１０６４９（Ａ／Ｃ）という。野生型は、正常型ということもできる。
【００１９】
ＭＴＨＦＲ遺伝子の塩基配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション：Ｎｏ．ＡＹ３３８２３２に登録されている。配列番号１の塩基配列は、前記アクセッション番号の塩基配列におけるＭＴＨＦＲ遺伝子の完全長配列である。
【００２０】
本発明において、前記多型が発生する部位、例えば、配列番号１の配列（センス鎖）において塩基番号８７４７および塩基番号１０６４９の塩基、または、その相補配列（アンチセンス鎖）において前記センス鎖の塩基番号８７４７および塩基番号１０６４９に対応する塩基を「検出対象部位」という。また、本発明において、本発明のプライマーおよびプライマーセットにより増幅させる領域を、「目的領域または増幅領域」という。前記目的領域は、前記検出対象部位を含む。前記目的領域は、例えば、ＭＴＨＦＲ遺伝子のセンス鎖における領域でもよいし、アンチセンス鎖における領域でもよいし、両方でもよい。本発明において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、例えば、センス鎖の増幅物、アンチセンス鎖の増幅物の意味も含む。
【００２１】
本発明において、ＭＴＨＦＲ遺伝子における、前記検出対象部位を含み、後述する多型検出用のプローブがハイブリダイズ可能な領域を、「検出対象配列またはハイブリダイズ領域」という。前記検出対象配列の中でも、前記プローブとパーフェクトマッチする検出対象配列を「パーフェクトマッチ配列」、前記プローブとミスマッチする検出対象配列を「ミスマッチ配列」という。本発明において、パーフェクトマッチとは、前記検出対象部位の塩基が前記プローブにおける対応塩基と相補的であることを意味し、好ましくは、前記検出対象配列と前記プローブとが、完全に相補的であることを意味する。本発明において、ミスマッチとは、前記検出対象部位の塩基が前記プローブにおける対応塩基と非相補的であることを意味し、好ましくは、前記検出対象配列と前記プローブとが、前記検出対象部位以外において完全に相補的であることを意味する。
【００２２】
本発明において、塩基配列の末端とは、塩基配列における５’側および３’側の最も端の塩基を意味する。また、５’末端領域とは、塩基配列における５’末端から数塩基の領域であり、３’末端領域とは、塩基配列における３’末端から数塩基の領域である。前記数塩基とは、例えば、前記末端塩基を含む１〜１０塩基、１〜４塩基、１〜３塩基、１〜２塩基である。本発明において、塩基配列の末端からＺ番目の塩基（Ｚは正の整数）とは、末端の塩基を１番目とした順番であり、例えば、末端から１番目の塩基とは、末端の塩基、末端から２番目の塩基とは、末端の隣の塩基を意味する。
【００２３】
＜ＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーおよびプライマーセット＞
本発明のプライマーは、前述のように、
下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーまたは
下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマー
であることを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅するためのプライマーである。
（Ｆ１）塩基長が２０〜２８塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８７１５のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）塩基長が１８〜２６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８８１７のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
（Ｆ２）塩基長が２６〜３６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０５９０のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２）塩基長が２２〜３４塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０６９５のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
【００２４】
本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットは、前述のように、前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
【００２５】
前記本発明のプライマーまたはそれを含むプライマーセットによって、例えば、ＭＴＨＦＲ遺伝子における目的の領域を特異的に増幅することが可能である。本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーおよびプライマーセットは、例えば、ＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマー試薬ということもできる。
【００２６】
本発明のプライマーおよびプライマーセットによれば、前述のように、ＭＴＨＦＲ遺伝子の検出対象部位として、例えば、ＭＴＨＦＲ＊６７７またはＭＴＨＦＲ＊１２９８を含む目的領域を、特異的に増幅でき、また、高効率で増幅できる。このように、ＭＴＨＦＲ遺伝子の前記目的領域を特異的に増幅できることから、例えば、精度よく多型の検出することもできる。具体的には、例えば、得られた増幅物について、さらに、前記検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブを使用したＴｍ解析を行うことで、前記検出対象部位の多型を、より精度よく検出し、多型の接合体型を判定することが可能となる。また、例えば、１つの反応系で、前記目的領域の増幅ならびに多型の検出が可能であることから、操作の自動化も可能となる。さらに、本発明のプライマーおよびプライマーセットを用いれば、例えば、全血および口腔粘膜等の夾雑物が含まれる試料であっても、夾雑物の除去等の前処理を省略できるため、より迅速且つ簡便に増幅反応を行うことができる。また、本発明のプライマーおよびプライマーセットを用いれば、従来よりも優れた増幅効率で増幅反応が行えるため、増幅反応の短縮化も可能である。したがって、本発明のプライマー、プライマーセット、これを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅方法、増幅物の検出方法および多型検出方法によれば、ＭＴＨＦＲ遺伝子の多型を迅速且つ簡便に解析できることから、医療分野においてきわめて有効といえる。
【００２７】
本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットは、例えば、前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）のいずれか一方のみを含んでもよいし、前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）の両方を含んでもよい。後述するが、前記プライマーセット（１）により特異的に増幅し得る目的領域は、ＭＴＨＦＲ遺伝子において、多型ＭＴＨＦＲ＊６７７が発生する部位を含む領域であり、前記プライマーセット（２）により特異的に増幅し得る目的領域は、ＭＴＨＦＲ遺伝子において、多型ＭＴＨＦＲ＊１２９８が発生する部位を含む領域である。本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットが、例えば、前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）の両方を含む場合、ＭＴＨＦＲ遺伝子における、多型ＭＴＨＦＲ＊６７７が発生する部位を含む目的領域と多型ＭＴＨＦＲ＊１２９８が発生する部位を含む目的領域とを、それぞれ、同一反応系で同時に増幅できる。
【００２８】
前述のように、ＭＴＨＦＲ遺伝子のこれら２種類の多型は、生体内のホモシステイン量に影響を与えることが知られている。このため、いずれか１種類の多型だけでなく、２種類両方の多型を調べることが重要視されている。しかしながら、従来法では、１つの反応系において複数の配列を検出することが困難という問題がある。このため、ＭＴＨＦＲ遺伝子の２種類の多型、すなわち、ＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８を両方調べるには、それぞれの多型が生じる部位を含む領域を、別個の反応系において各々増幅させ、得られた増幅物を別個に解析する必要がある。このように、従来法では、ＭＴＨＦＲ遺伝子のみを鋳型とし、且つ、ＭＴＨＦＲ遺伝子において、前記多型が生じる部位をそれぞれ含む２種類の目的領域を特異的に増幅させることは極めて困難である。そして、このように、１つのサンプルを解析するにも多大な労力を伴うため、多数のサンプルを解析することは現実的でないという問題がある。これに対して、本発明のプライマーセットによれば、前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）の両方を含む場合であっても、それぞれの目的領域を、同一反応系において、同時に且つ特異的に増幅できる。このため、前述の従来法とは異なり、手間およびコストの低減が可能となる。また、このように、同一反応系において２つの目的領域が特異的に増幅されることから、例えば、それぞれの目的領域における検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブを使用し、Ｔｍ解析を行うことによって、前記２種類の多型をそれぞれ検出し、また、接合体型を判別することが可能となる。このように、ＭＴＨＦＲ遺伝子における２種類の多型について、同一反応系での解析が可能になることから、本発明のプライマーセットは、例えば、前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）のいずれか１種類を含む場合はもちろんのこと、２種類を含むことも好ましい。このような本発明のプライマーセットを用いて、１つの目的領域はもちろんのこと、２つの目的領域を同時に増幅すれば、従来よりも効率よく、ＭＴＨＦＲ遺伝子の多型を検出できる。
【００２９】
以下、フォワードプライマーをＦプライマー、リバースプライマーをＲプライマーということがある。
【００３０】
前記プライマーセット（１）は、前述のように、下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方を含むプライマーセットである。
（Ｆ１）塩基長が２０〜２８塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８７１５のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）塩基長が１８〜２６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８８１７のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
【００３１】
前記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーは、フォワードプライマーであり、以下、Ｆ１プライマーともいう。前記Ｆ１プライマーは、配列番号１に示す塩基配列における部分配列と同一である。すなわち、ＭＴＨＦＲ遺伝子のセンス鎖における部分配列と同一であり、アンチセンス鎖にアニーリング可能である。
【００３２】
前記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーは、リバースプライマーであり、以下、Ｒ１プライマーともいう。前記Ｒ１プライマーは、配列番号１に示す塩基配列における部分配列に相補的である。すなわち、ＭＴＨＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖における部分配列と同一であり、センス鎖にアニーリング可能である。
【００３３】
前記プライマーセット（１）は、例えば、前記Ｆ１プライマーのみを含んでもよいし、前記Ｒ１プライマーのみを含んでもよく、好ましくは両方を含む。
【００３４】
前記プライマーセット（１）は、配列番号１における塩基番号８７１６〜８８１６の領域を含む核酸配列ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領域内の塩基番号８７４７の塩基、すなわち、配列番号１における塩基番号８７４７の塩基が、前述の多型ＭＴＨＦＲ＊６７７が生じる部位である。以下、このプライマーセット（１）を、「ＭＴＨＦＲ＊６７７用プライマーセット」ともいう。ＭＴＨＦＲ＊６７７の多型のみを解析する場合には、ＭＴＨＦＲ＊６７７用プライマーセットのみを使用すればよい。
【００３５】
前記プライマーセット（１）において、前記Ｆ１プライマーおよび前記Ｒ１プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす３’末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このように各プライマーの３’末端の塩基を固定することによって、前記プライマーセット（１）が、例えば、類似する他の配列に結合することを十分に防止できる。
【００３６】
このように、前記Ｆ１プライマーおよび前記Ｒ１プライマーは、その３’末端の塩基が固定されていればよいことから、前記各プライマーの長さ自体は、特に制限されず、一般的な長さに適宜調整できる。前記各プライマーの長さは、例えば、１３〜５０塩基長の範囲であり、好ましくは１４〜４５塩基長、より好ましくは１５〜４０塩基長である。具体例として、前記Ｆ１プライマーは、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８７１５のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチドであり、その塩基長が、例えば、２０〜２８塩基長であり、好ましくは、２１〜２６塩基長、より好ましくは、２２〜２４塩基長である。前記Ｒ１プライマーは、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８８１７のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドであり、その塩基長が、例えば、１８〜２６塩基長であり、好ましくは、１９〜２５塩基長、より好ましくは、２１〜２３塩基長である。前記Ｆ１プライマーと前記Ｒ１プライマーは、３’末端がそれぞれ固定されていることから、プライマーから伸長する領域は、例えば、前述のように配列番号１における塩基番号８７１６〜８８１６の領域であるが、得られる増幅物の全体の長さは、プライマーの長さに応じて変化する。
【００３７】
前記Ｆ１プライマーは、例えば、配列番号１に示す塩基配列における部分配列と完全に同一でもよいし、完全に同一でなくてもよい。すなわち、ＭＴＨＦＲ遺伝子のセンス鎖の部分配列と、完全に同一でもよいし、完全に同一でなくてもよい。後者の具体例として、前記Ｆ１プライマーは、例えば、前記センス鎖の部分配列と対応させた場合に、３’末端の塩基を除く部分において、前記部分配列と１個〜５個の塩基が異なっていてもよい。
【００３８】
前記Ｒ１プライマーは、配列番号１に示す塩基配列における部分配列に、完全に相補的でもよいし、完全に相補的でなくてもよい。すなわち、ＭＴＨＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖の部分配列と、完全に同一でもよいし、完全に同一でなくてもよい。後者の具体例として、前記Ｒ１プライマーは、例えば、前記アンチセンス鎖の部分配列と対応させた場合に、前記３’末端の塩基を除く部分において、前記部分配列と、１個〜５個の塩基が異なっていてもよい。
【００３９】
以下に、前記Ｆ１プライマーおよびＲ１プライマーの具体例を示すが、本発明は、これには限定されない。
【００４０】
【表１】
2011062258.tif 000003
【００４１】
前記Ｆ１プライマーとＲ１プライマーとの組み合わせは、何ら制限されない。具体例としては、例えば、配列番号７に示すオリゴヌクレオチドからなるＦ１−１プライマーと、配列番号１５に示すオリゴヌクレオチドからなるＲ１−１プライマーとを含むプライマーセットが特に好ましい。前記表における「Ｔｍ（℃）」は、前記表の配列とそれに完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合のＴｍ（℃）であり、ＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）により、所定のパラメーターのもと算出した値である（以下、同様）。前記パラメーターは、パラメーターをオリゴヌクレオチド濃度０．２μｍｏｌ／Ｌ、ナトリウム当量（Ｎａ  ｅｑ．）５０ｍｍｏｌ／Ｌとした。前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）等により算出でき、また、最近隣接法（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄ）によっても決定できる（以下、同様）。
【００４２】
つぎに、前記プライマーセット（２）は、前述のように、下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよび下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方を含むプライマーセットである。
（Ｆ２）塩基長が２６〜３６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０５９０のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２）塩基長が２２〜３４塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０６９５のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
【００４３】
前記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーは、フォワードプライマーであり、以下、Ｆ２プライマーともいう。前記Ｆ２プライマーは、配列番号１に示す塩基配列における部分配列と同一である。すなわち、ＭＴＨＦＲ遺伝子のセンス鎖における部分配列と同一であり、アンチセンス鎖にアニーリング可能である。
【００４４】
前記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーは、リバースプライマーであり、以下、Ｒ２プライマーともいう。前記Ｒ２プライマーは、配列番号１に示す塩基配列における部分配列に相補的である。すなわち、ＭＴＨＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖における部分配列と同一であり、センス鎖にアニーリング可能である。
【００４５】
前記プライマーセット（２）は、例えば、前記Ｆ２プライマーのみを含んでもよいし、前記Ｒ２プライマーのみを含んでもよく、好ましくは両方を含む。
【００４６】
前記プライマーセット（２）は、配列番号１における塩基番号１０５９１〜１０６９４の領域を含む核酸配列ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領域内の塩基番号１０６４９の塩基、配列番号１における塩基番号１０６４９の塩基が、前述の多型ＭＴＨＦＲ＊１２９８が生じる部位である。以下、このプライマーセット（２）を、「ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プライマーセット」ともいう。なお、ＭＴＨＦＲ＊１２９８の多型のみを解析する場合には、ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プライマーセットのみを使用すればよい。
【００４７】
前記プライマーセット（２）における前記Ｆ２プライマーおよびＲ２プライマーは、前記プライマーセット（１）と同様の理由から、３’末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このため、前記Ｆ２プライマーおよびＲ２プライマーの長さ自体は特に制限されず、前述と同様の長さに適宜調整できる。前記各プライマーの長さは、例えば、１３〜５０塩基長の範囲であり、好ましくは１４〜４５塩基長、より好ましくは１５〜４０塩基長である。具体例として、前記Ｆ２プライマーは、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０５９０のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチドであり、その塩基長が、例えば、２６〜３６塩基長であり、好ましくは、２８〜３４塩基長、より好ましくは、３０〜３２塩基長である。前記Ｒ２プライマーは、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０６９５のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドであり、塩基長が、例えば、２２〜３４塩基長であり、好ましくは、２６〜３２塩基長、より好ましくは、２７〜２９塩基長である。前記Ｆ２プライマーとＲ２プライマーは、３’末端がそれぞれ固定されていることから、プライマーから伸長する領域は、例えば、前述のように配列番号１における塩基番号１０５９１〜１０６９４の領域であるが、得られる増幅物の全体の長さは、使用するプライマーの長さに応じて変化する。
【００４８】
前記Ｆ２プライマーは、配列番号１に示す塩基配列における部分配列と、完全に同一でもよいし、完全に同一でなくてもよい。すなわち、ＭＴＨＦＲ遺伝子のセンス鎖の部分配列と、完全に同一でもよいし、完全に同一でなくてもよい。後者の具体例として、前記Ｆ１プライマーは、例えば、前記センス鎖の部分配列と対応させた場合に、３’末端の塩基を除く部分において、前記部分配列と、１個〜５個の塩基が異なっていてもよい。
【００４９】
前記Ｒ２プライマーは、配列番号１に示す塩基配列における部分配列に、完全に相補的でもよいし、完全に相補的でなくてもよい。すなわち、ＭＴＨＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖の部分配列と、完全に同一でもよいし、完全に同一でなくてもよい。後者の具体例として、前記Ｒ２プライマーは、例えば、前記アンチセンス鎖の部分配列と対応させた場合に、前記３’末端の塩基を除く部分において、前記部分配列と、１個〜５個の塩基が異なっていてもよい。
【００５０】
以下に、前記Ｆ２プライマーおよび前記Ｒ２プライマーの具体例を示すが、本発明は、これには限定されない。
【００５１】
【表２】
2011062258.tif 000004
【００５２】
前記Ｆ２プライマーと前記Ｒ２プライマーとの組み合わせは、何ら制限されない。具体例としては、例えば、配列番号２５に示すオリゴヌクレオチドからなるＦ２−１プライマーと配列番号３８に示すオリゴヌクレオチドからなるＲ２−１プライマーとを含むプライマーセットが特に好ましい。
【００５３】
また、前述したプライマーセット（１）および（２）の各プライマーは、例えば、増幅反応の反応温度を上げるために、従来公知の任意の配列を５’末端に付加したものでもよい。
【００５４】
本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットは、例えば、生体試料におけるＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる際に使用することが好ましい。前記生体試料は、特に制限されず、全血試料があげられる。特に、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを、後述するように、多型検出用のプローブとともに使用する場合、増幅反応の反応系における全血試料の割合（全血の含有割合）を、例えば、０．１〜０．５体積％とすることが好ましい。この点については、後述する。
【００５５】
＜増幅方法＞
本発明の増幅方法は、前述のように、反応系において、試料中の核酸を鋳型として、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーまたはプライマーセットを用いて、前記ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅を行う増幅工程を含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅方法である。
【００５６】
本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーまたはプライマーセットを用いて、増幅反応を行うことにより、前述のように、ＭＴＨＦＲ遺伝子の目的領域を増幅できる。本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットが、例えば、前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）の両方を含む場合、ＭＴＨＦＲ遺伝子における、多型ＭＴＨＦＲ＊６７７が発生する部位を含む目的領域と多型ＭＴＨＦＲ＊１２９８が発生する部位を含む目的領域とを、同一反応系で同時に増幅できる。本発明の増幅方法は、前記本発明のプライマーまたはプライマーセットを使用することが特徴であって、核酸の増幅法の種類および条件等は、何ら制限されない。
【００５７】
前記増幅工程において、前記ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅は、プライマーとして前記本発明のプライマーまたはプライマーセットを用いた増幅法により行うことができる。前記核酸の増幅法は、前述のように、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。
【００５８】
前記増幅工程における増幅反応の前記反応系は、例えば、反応液があげられる。前記反応系は、例えば、本発明のプライマーまたはプライマーセットおよび試料を含み、さらに、溶媒、核酸の増幅に使用する各種成分等を含んでもよい。
【００５９】
本発明を適用する試料は、特に制限されず、例えば、鋳型となる核酸を含む試料があげられる。本発明は、例えば、夾雑物が含まれる試料に適用することが好ましい。前記夾雑物が含まれる試料は、例えば、生体試料があげられる。前記生体試料は、例えば、全血、口腔内細胞（例えば、口腔粘膜）、爪および毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液（例えば、胃液洗液）等、それらの懸濁液等があげられる。本発明の増幅方法によれば、例えば、様々な夾雑物が含まれる試料、特に、全血および口腔内細胞等の生体試料であっても、その影響を受け難い。このため、本発明によれば、ＭＴＨＦＲ遺伝子の前記目的領域を特異的に増幅できる。本発明によれば、従来法では増幅が困難であった夾雑物が多く含まれる試料であっても、例えば、前記試料からの夾雑物の除去、前記試料の精製等の前処理を行うことなく、前記試料をそのまま使用することが可能である。したがって、例えば、前記試料の前処理等の観点からも、従来法より、本発明は、さらに迅速にＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅可能といえる。
【００６０】
前記反応系において、前記試料の割合は、特に制限されない。前記試料が、例えば、生体試料の場合の場合、前記反応系における試料の割合は、下限が、例えば、０．０１体積％以上、好ましくは、０．０５体積％以上、より好ましくは、０．１体積％以上であり、上限が、例えば、２体積％以下、好ましくは、１体積％以下、より好ましくは、０．５体積％以下である。具体例として、前記生体試料が全血試料の場合、前記反応系における前記全血試料の割合は、例えば、同様である。
【００６１】
増幅反応後の前記反応系について、例えば、後述するように光学的な検出を行う場合、前記反応系における前記生体試料の割合は、例えば、０．１〜０．５体積％に設定することが好ましい。前記生体試料は、特に制限されず、例えば、全血試料である。前記反応系における全血試料の割合は、前述のような体積割合（例えば、０．１〜０．５体積％）ではなく、ヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）の重量割合で表すこともできる。この場合、前記反応系における全血試料の割合は、Ｈｂ量に換算して、例えば、０．５６５〜１１３ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは、２．８２５〜５６．５ｇ／Ｌの範囲、さらに好ましくは、５．６５〜２８．２５ｇ／Ｌの範囲である。なお、前記反応系における全血試料の割合は、例えば、前記体積割合とＨｂ重量割合の両方を満たしてもよいし、いずれか一方を満たしてもよい。
【００６２】
前記全血は、例えば、生体から採取した全血、採取後に処理した全血のいずれでもよく、具体例として、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含む全血等のいずれであってもよい。
【００６３】
前記増幅工程において、前記試料中の核酸は、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記試料中の核酸は、例えば、ＤＮＡである。前記ＤＮＡは、例えば、生体試料等の試料に元来含まれるＤＮＡでもよいし、核酸の増幅法により増幅させたＤＮＡ増幅物でもよい。後者の場合、例えば、前記試料中のＲＮＡから合成したｃＤＮＡでもよい。前記試料中の前記ＲＮＡは、例えば、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等があげられ、前記ｃＤＮＡは、例えば、前記ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ）により合成できる。
【００６４】
本発明の増幅方法は、例えば、前記増幅工程における増幅反応の開始に先立ち、前記反応系に、さらにアルブミンを添加することが好ましい。アルブミンの添加によって、例えば、前述のような沈殿物および濁りの発生による影響を、より一層低減でき、且つ、増幅効率を、さらに向上できる。具体的には、例えば、前記増幅工程の前に、アルブミンを添加することが好ましい。前記増幅工程の前とは、例えば、増幅工程において、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離する前であってもよい。
【００６５】
前記反応系において、アルブミンの割合は、特に制限されない。前記割合は、例えば、０．０１〜２重量％の範囲、好ましくは、０．１〜１重量％の範囲、より好ましくは、０．２〜０．８重量％の範囲である。前記アルブミンは、特に制限されず、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等があげられる。これらは、いずれか１種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。
【００６６】
つぎに、本発明の増幅方法に関し、全血試料中のＤＮＡを鋳型とし、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットとして前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）を含むプライマーセットを使用し、ＰＣＲによって、一つの反応液中で、同時に、ＭＴＨＦＲ遺伝子の２つの目的領域を増幅する例をあげて説明する。前記２つの目的領域は、多型ＭＴＨＦＲ＊６７７が発生する部位を含む目的領域と多型ＭＴＨＦＲ＊１２９８が発生する部位を含む目的領域である。本発明は、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを使用することが特徴であり、他の構成および条件は何ら制限されない。
【００６７】
まず、ＰＣＲの反応液を調製する。前記反応液は、前記プライマーセットおよび前記全血試料を含み、さらに、前記増幅反応に使用可能な他の成分を適宜含むことが好ましい。
【００６８】
前記反応液において、各プライマーの割合は、特に制限されない。前記反応液において、前記Ｆ１プライマーおよび前記Ｆ２プライマーの割合は、それぞれ、０．１〜２μｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは、０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、前記反応液において、前記Ｒ１プライマーおよび前記Ｒ２プライマーの割合は、それぞれ、０．１〜２μｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは、０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）において、それぞれ、ＦプライマーとＲプライマーとの割合（Ｆ：Ｒ、モル比）は、特に制限されず、例えば、１：０．２５〜１：４、好ましくは、１：０．５〜１：２である。
【００６９】
前記反応液における前記全血試料の割合は、特に制限されず、例えば、前述の範囲が好ましい。前記全血試料は、例えば、そのまま前記反応液に添加してもよいし、予め、溶媒で希釈してから前記反応液に添加してもよい。前記溶媒は、例えば、水および緩衝液等があげられる。前記全血試料を予め希釈する場合、希釈率は、特に制限されず、例えば、前記反応液における最終的な全血割合が、前記範囲となるように設定できる。前記希釈率の具体例は、例えば、１００〜２０００倍、好ましくは、２００〜１０００倍である。
【００７０】
前記他の成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげられ、それらの割合は、特に制限されない。前記成分は、例えば、溶媒等があげられる。前記成分は、例えば、ＰＣＲに使用する各種成分があげられ、具体例として、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸等があげられる。前記成分は、例えば、前述のように、アルブミンがあげられる。前記反応液において、各成分の添加順序は、何ら制限されない。
【００７１】
前記ポリメラーゼは、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例として、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９２／９６８９）（Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ  ４５５  ４３０）（商標Ｖｅｎｔ：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ポリメラーゼが好ましい。
【００７２】
前記反応液において、ＤＮＡポリメラーゼの割合は、特に制限されず、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは、５〜５０Ｕ／ｍＬ、より好ましくは、２０〜３０Ｕ／ｍＬである。ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
【００７３】
前記ヌクレオシド三リン酸は、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応液において、ｄＮＴＰの割合は、特に制限されず、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００７４】
前記溶媒は、例えば、緩衝液、水等があげられる。前記緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液および市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
【００７５】
前記反応液は、前記その他の成分として、例えば、さらに、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
【００７６】
前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、サーマルサイクラー等の使用する機器等に応じて適宜設定できる。前記体積は、通常、例えば、１〜５００μＬであり、好ましくは、１０〜１００μＬである。
【００７７】
つぎに、ＰＣＲを行う。前記ＰＣＲのサイクル条件は、特に制限されない。具体例として、例えば、（１）二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの解離、（２）前記一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長は、それぞれ、下記表３の条件が例示できる。ＰＣＲのサイクル数は、特に制限されず、下記（１）〜（３）の３ステップを１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。前記サイクル数の上限は、特に制限されず、例えば、１００サイクル以下、好ましくは、７０サイクル以下、さらに好ましくは、５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御できる。本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを使用した場合、前述のように、増幅効率に優れる。このため、従来法では、５０サイクルに３時間程度を要していたのに対して、本発明によれば、例えば、約１時間程度、好ましくは１時間以内で、５０サイクルを完了することも可能である。
【００７８】
【表３】
2011062258.tif 000005
【００７９】
このようにして、同一の反応系において、同時に、ＭＴＨＦＲ遺伝子における前記２つの目的領域を増幅できる。前記２つの目的領域のうちいずれか一方を増幅する場合、例えば、前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）のうち、前記目的領域に対応するいずれか一方のプライマーセットを、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットとして使用すればよい。
【００８０】
本発明の増幅方法は、さらに、前記増幅工程において得られた目的領域の増幅物を検出する検出工程を含んでもよい。これによって、例えば、後述するように、前記目的領域の増幅の有無、ＭＴＨＦＲ遺伝子の前記目的領域における多型、例えば、ＭＴＨＦＲ＊６７７またはＭＴＨＦＲ＊１２９８を検出できる。前記増幅の有無および前記多型の検出は、例えば、従来公知の方法によって確認できる。具体的には、例えば、前記増幅工程において、前記反応系に、さらに、ＭＴＨＦＲ遺伝子の検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブを添加しておく。前記プローブは、例えば、蛍光物質を有する標識プローブがあげられる。そして、前記増幅工程後、前記検出工程において、前記反応系について、前記標識プローブの前記蛍光物質について、蛍光強度を測定する。これによって、前記目的領域の増幅の有無および前記検出対象部位の多型を確認できる。また、増幅させる目的領域が２つの場合には、例えば、前記増幅工程において、前記反応系に、さらに、ＭＴＨＦＲ遺伝子の各検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブを２種類添加しておく。そして、前記検出工程において、前記反応系について、前記各標識プローブの前記蛍光物質の蛍光強度を測定する。これによって、前記各目的領域の増幅の有無および各検出対象部位の多型を、それぞれ確認できる。
【００８１】
ＭＴＨＦＲ遺伝子の前記目的領域の増幅物の検出、および、ＭＴＨＦＲ遺伝子における多型、例えば、ＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８の検出については、それぞれ、本発明の増幅方法のその他の形態として、以下に説明する。
【００８２】
＜増幅物検出方法＞
本発明の増幅物の検出方法は、本発明のプライマーまたは本発明のプライマーセットを使用することを特徴し、下記（Ａ）工程を含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅物を検出する増幅物検出方法である。
（Ａ）本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅方法により、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程
前記（Ａ）工程は、例えば、反応系において、試料中の核酸を鋳型として、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程ということもできる（以下、同様）。
【００８３】
本発明の検出方法は、例えば、さらに、プローブを用いて、前記ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅物を検出する工程を含むことが好ましい。具体的には、例えば、下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程を含むことが好ましい。
（Ａ）本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅方法により、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程における増幅物および前記ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅物にハイブリダイズ可能なプローブを含む反応系の温度を変化させ、前記増幅物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する測定工程
（Ｃ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅物を検出する検出工程
【００８４】
本発明の増幅物検出方法において、前記（Ａ）工程は、前述した本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅方法における記載を引用できる。
【００８５】
本発明の増幅物の検出方法は、例えば、前記プローブの存在下で、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅を行ってもよい。すなわち、本発明の増幅物の検出方法は、例えば、前記（Ａ）工程において、前記プローブを含む前記反応系において、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅を行ってもよく、さらに、前記（Ｂ）工程において、例えば、前記（Ａ）工程の前記反応系の温度を変化させ、前記シグナル値の測定を行ってもよい。
【００８６】
本発明の増幅物検出方法は、後述する本発明の多型の検出方法における記載を引用できる。具体的に、例えば、本発明の増幅物検出方法における前記（Ａ）工程および前記（Ｂ）工程は、後述する本発明の多型の検出方法における（Ａ）工程および（Ｂ）工程の記載を引用できる。また、例えば、本発明の増幅物検出方法における前記（Ｃ）工程は、後述する本発明の多型の検出方法における（Ｄ）工程を引用でき、具体的には、後述する（Ｄ）工程において、合わせて前記（Ｃ）工程について説明する。
【００８７】
＜多型検出方法＞
本発明の多型検出方法は、前述のように、下記（Ａ）工程を含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子の多型検出方法である。
（Ａ）本発明の増幅方法により、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程
【００８８】
本発明の多型検出方法は、例えば、さらに、プローブを用いて、ＭＴＨＦＲ遺伝子の検出対象部位の多型を検出する工程を含むことが好ましい。具体的には、例えば、下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）工程を含むことが好ましい。
（Ａ）本発明の増幅方法により、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程における増幅物および前記検出対象部位にハイブリダイズ可能なプローブを含む反応系の温度を変化させ、前記増幅物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する測定工程
（Ｄ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の前記多型を検出する検出工程
【００８９】
本発明のプライマーまたはプライマーセットを用いて、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅することによって、前述のように、ＭＴＨＦＲ遺伝子における前記検出対象部位を含む目的領域を増幅できる。このため、例えば、前記目的領域における前記検出対象部位の多型を、感度良く解析できる。
【００９０】
前記増幅工程（Ａ）は、前述の本発明の増幅方法と同様に行うことができる。本発明の増幅物検出方法において、前記（Ａ）工程は、前述した本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅方法における記載を引用できる。
【００９１】
前記測定工程（Ｂ）において、前記プローブは、特に制限されない。前記プローブは、例えば、ＭＴＨＦＲ＊６７７の検出対象部位にハイブリダイズするプローブおよびＭＴＨＦＲ＊１２９８の検出対象部位にハイブリダイズするプローブがあげられる。以下、前者を「ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブ」、後者を「ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブ」ともいう。これらのプローブは、ＭＴＨＦＲ遺伝子において、前記検出対象部位を含む検出対象配列に相補的なプローブであることが好ましい。本発明は、例えば、ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブおよびＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブのうち、いずれか１種類を使用してもよいし、２種類を併用してもよい。本発明において使用するプローブは、例えば、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーまたはプライマーセットによって増幅させる目的領域の種類に応じて、適宜決定できる。２種類のプローブを併用することによって、例えば、同一反応系を用いて、２つの検出対象部位の多型、すなわちＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８を解析できる。
【００９２】
前記プローブは、例えば、ＭＴＨＦＲ遺伝子のセンス鎖にハイブリダイズ可能なプローブでもよいし、アンチセンス鎖にハイブリダイズ可能なプローブでもよい。前記プローブの設計方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。例えば、前記検出対象部位を含む検出対象配列を、ＭＴＨＦＲ遺伝子のセンス鎖の配列に設定し、前記配列に基づいて設計してもよいし、前記検出対象配列を、アンチセンス鎖の配列に設定し、前記配列に基づいて設計してもよい。前記検出対象配列における前記検出対象部位の塩基は、前記検出対象部位における各多型の種類に応じて、適宜決定できる。
【００９３】
ＭＴＨＦＲ＊６７７の場合、配列番号１における塩基番号８７４７の塩基として、「ｃ」および「ｔ」が知られている。そこで、例えば、センス鎖において塩基番号８７４７がシトシン（ｃ）である検出対象配列に相補的なプローブ、および、センス鎖において塩基番号８７４７がチミン（ｔ）である検出対象配列に相補的なプローブがあげられる。これらは、センス鎖にハイブリダイズするセンス鎖の検出用プローブといえる。また、そのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブがあげられ、これらは、アンチセンス鎖にハイブリダイズするアンチセンス鎖の検出用プローブといえる。
【００９４】
ＭＴＨＦＲ＊１２９８の場合、配列番号１における塩基番号１０６４９の塩基として、「ａ」および「ｃ」が知られている。そこで、例えば、センス鎖において塩基番号１０６４９がアデニン（ａ）である検出対象配列に相補的なプローブ、および、センス鎖において塩基番号１０６４９がシトシン（ｃ）である検出対象配列に相補的なプローブがあげられる。これらは、センス鎖にハイブリダイズするセンス鎖の検出用プローブといえる。また、そのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブがあげられ、これらは、アンチセンス鎖にハイブリダイズするアンチセンス鎖の検出用プローブといえる。
【００９５】
このように、多型が生じる検出対象部位の塩基を、前述のいずれかの塩基に決定し、プローブを設計しても、後述の方法により、ＭＴＨＦＲ遺伝子の各検出対象部位が、どのような多型を示すかを判断可能である。
【００９６】
前記プローブの長さは、特に制限されず、例えば、５〜５０塩基長であり、好ましくは、１０〜３０塩基長である。
【００９７】
前記プローブの具体例は、例えば、下記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチド、（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチド、（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドの少なくともいずれかを含むプローブがあげられる。
（Ｐ１）塩基長が１７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号８７４４〜８７６０を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号８７４４の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１’）前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が１４〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０６４３〜１０６５６を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０６４３の塩基に相補的な塩基を、３’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ２’）前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００９８】
前記プローブは、例えば、前記オリゴヌクレオチドを含むプローブでもよいし、前記オリゴヌクレオチドからなるプローブでもよい。
【００９９】
これらのプローブは、一例であって、本発明は、これらには制限されない。以下、前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドを含むプローブをＰ１プローブ、前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブをＰ１’プローブ、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドを含むプローブをＰ２プローブ、前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドを含むプローブをＰ２’プローブという。これらのプローブを、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子の検出用プローブともいう。
【０１００】
前記Ｐ１プローブおよびＰ１’プローブは、前記ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブの一例である。これらのプローブは、配列番号１の塩基配列における塩基番号８７４７の塩基（ｙ）の多型（ｃ／ｔ）を検出するためのプローブである。前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＭＴＨＦＲ遺伝子のセンス鎖に相補的であり、センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＭＴＨＦＲ遺伝子のセンス鎖に相同的であり、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。
【０１０１】
前記（Ｐ１）および（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、その塩基長が、前述のように、１７〜５０塩基長であり、例えば、１７〜４０塩基長が好ましく、より好ましくは、１７〜３０塩基長であり、さらに好ましくは、１７〜２１塩基長である。
【０１０２】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号８７４７の塩基（ｙ）に対応する塩基（ｒ）を含む。前記ｒは、グアニン（ｇ）またはアデニン（ａ）である。前記Ｐ１プローブにおいて、「ｒがｇ」の場合、前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、センス鎖における前記検出対象部位（ｙ）が野生型（ｃ）の検出対象配列とパーフェクトマッチし、「ｒがａ」の場合、前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、センス鎖における前記検出対象部位（ｙ）が変異型（ｔ）の検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、前記増幅方法により得られた前記増幅物と前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドとが、パーフェクトマッチか否かにより、前記検出対象部位の多型が、野生型か変異型かを確認できる。
【０１０３】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号８７４４の塩基に相補的な塩基を、前記３’末端領域に有し、好ましくは、３’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（３’末端）または２番目に有する。前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、下記表４の配列番号４４〜４８のいずれかに示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示できる。前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドの塩基配列において、塩基（ｒ）は、グアニン（ｇ）およびアデニン（ａ）のいずれでもよく、好ましくは、アデニン（ａ）である。
【０１０４】
【表４】
2011062258.tif 000006
【０１０５】
前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、前述のように、前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的である。前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、塩基長が１７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号８７４４〜８７６０を含む塩基配列に相同的な塩基配列からなり、前記塩基番号８７４４の塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチドということもできる。
【０１０６】
前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号８７４７の塩基（ｙ）を含む。前記ｙは、シトシン（ｃ）またはチミン（ｔ）である。前記Ｐ１’プローブにおいて、「ｙがｃ」の場合、前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖における前記検出対象部位（ｒ）が野生型（ｇ）の検出対象配列とパーフェクトマッチし、「ｙがｔ」の場合、前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖における前記検出対象部位（ｒ）が変異型（ａ）の検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、前記増幅方法により得られた前記増幅物と前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドとが、パーフェクトマッチか否かにより、前記検出対象部位の多型が、野生型か変異型かを確認できる。
【０１０７】
前記Ｐ２プローブおよびＰ２’プローブは、前記ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブの一例である。これらのプローブは、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０６４９の塩基（ｍ）の多型（ａ／ｃ）の多型を検出するためのプローブである。前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＭＴＨＦＲ遺伝子のセンス鎖に相補的であり、センス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＭＴＨＦＲ遺伝子のセンス鎖に相同的であり、アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、前記多型を確認できる。
【０１０８】
前記（Ｐ１）および（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、その塩基長が、前述のように、１４〜５０塩基長であり、例えば、１４〜４０塩基長が好ましく、より好ましくは、１４〜３０塩基長であり、さらに好ましくは、１４〜１９塩基長である。
【０１０９】
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号１０６４９の塩基（ｍ）に対応する塩基（ｋ）を含む。前記ｋは、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）またはグアニン（ｇ）である。前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドにおいて、「ｒがｔまたはｕ」の場合、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、センス鎖における前記検出対象部位（ｍ）が野生型（ａ）の検出対象配列とパーフェクトマッチし、「ｒがｇ」の場合、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、センス鎖における前記検出対象部位（ｍ）が変異型（ｃ）の検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、前記増幅方法により得られた前記増幅物と前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドとが、パーフェクトマッチか否かにより、前記検出対象部位の多型が、野生型か変異型かを確認できる。
【０１１０】
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、前記塩基番号１０６４３の塩基に相補的な塩基を、前記３’末端領域に有し、好ましくは、３’末端から数えて１〜４番目の位置、より好ましくは、１〜３番目、特に好ましくは１番目（３’末端）または２番目に有する。前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記表４の配列番号４９〜５４のいずれかに示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示できる。前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドの塩基配列において、塩基（ｋ）は、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）およびグアニン（ｇ）のいずれでもよく、好ましくは、グアニン（ｇ）である。
【０１１１】
前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、前述のように、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的である。前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、塩基長が１４〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０６４３〜１０６５６を含む塩基配列に相同的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０６４３の塩基を、５’末端領域に有するオリゴヌクレオチドということもできる。
【０１１２】
前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号１０６４９の塩基（ｍ）を含む。前記ｍは、アデニン（ａ）またはシトシン（ｃ）である。前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドにおいて、「ｍがａ」の場合、前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖における前記検出対象部位（ｋ）が野生型（ｔ）の検出対象配列とパーフェクトマッチし、「ｍがｃ」の場合、前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖における前記検出対象部位（ｋ）が変異型（ｇ）の検出対象配列とパーフェクトマッチする。このため、前記増幅方法により得られた前記増幅物と前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドとが、パーフェクトマッチか否かにより、前記検出対象部位の多型が、野生型か変異型かを確認できる。
【０１１３】
前記ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブは、前記Ｐ１プローブの中でも、配列番号４６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプローブ（Ｐ１−１）が好ましく、ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブは、前記Ｐ２プローブの中でも、配列番号５２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプローブ（Ｐ２−１）が好ましい。前記表４において、前記Ｐ１プローブの「Ｔｍ（℃）」は、前記塩基（ｒ）がアデニン（ａ）である配列と、それに完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合のＴｍ（℃）であり、前記ＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエアにより、前記パラメーターのもと算出した値である。前記表４において、前記Ｐ２プローブの「Ｔｍ（℃）」は、前記塩基（ｋ）がグアニン（ｇ）である配列と、それに完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合のＴｍ（℃）であり、前述と同様にして算出した値である。
【０１１４】
前記Ｐ１プローブおよび前記Ｐ２プローブは、例えば、前記表４に示す各配列番号に示すオリゴヌクレオチドからなるプローブでもよいし、前記オリゴヌクレオチドを含むプローブでもよい。
【０１１５】
前記プローブは、例えば、標識物質を有する標識プローブが好ましく、例えば、前記オリゴヌクレオチドが、前記標識物質で標識（修飾）されていることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されず、例えば、５’末端領域または３’末端領域が好ましく、より好ましくは、５’末端または３’末端である。後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）が好ましく、より好ましくは、シトシン（ｃ）である。前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を間接的に標識化してもよい。後者の場合、例えば、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化できる。
【０１１６】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、３’末端領域に、前記標識物質を有することが好ましく、具体的には、例えば、３’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、３’末端から数えて１〜４番目の塩基であり、さらに好ましくは、３’末端から数えて１〜３番目の塩基、特に好ましくは、３’末端から数えて２番目または３’末端の塩基である。前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号８７４４〜８７４７の塩基に相補的ないずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、前記塩基番号８７４４の塩基に相補的な塩基（ｃ）が、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１０６４３〜１０６４６の塩基に相補的ないずれかの塩基が、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、前記塩基番号１０６４３の塩基に相補的な塩基（ｃ）が、前記標識物質を有することが好ましい。
【０１１７】
前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、５’末端領域に、前記標識物質を有することが好ましく、具体的には、例えば、５’末端から数えて１〜４番目の塩基の位置に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、５’末端から数えて１〜４番目の塩基であり、さらに好ましくは、５’末端から数えて１〜３番目の塩基、特に好ましくは、５’末端から数えて２番目または５’末端の塩基である。前記（Ｐ１’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号８７４４〜８７４７のいずれかの塩基に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、前記塩基番号８７４４の塩基（ｇ）に、前記標識物質を有することが好ましい。前記（Ｐ２’）のオリゴヌクレオチドは、例えば、前記塩基番号１０６４３〜１０６４６の塩基のいずれかの塩基に、前記標識物質を有することが好ましく、より好ましくは、前記塩基番号１０６４３の塩基（ｇ）に、前記標識物質を有することが好ましい。
【０１１８】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブが単独であるか、ハイブリッドを形成しているかによって、シグナルを発するものが好ましい。前記シグナルの種類は、特に制限されず、例えば、蛍光、呈色等があげられる。前記呈色は、例えば、発色でもよいし、変色でもよい。前記シグナルが蛍光の場合、シグナル値は、例えば、蛍光強度があげられる。前記シグナルが呈色の場合、前記シグナル値は、例えば、反射率、吸光度、透過率等があげられる。前記シグナルは、例えば、前記標識物質から直接発せられてもよいし、間接的に発せられてもよい。
【０１１９】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。市販の蛍光物質は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（商標名、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（商標名、モレキュラープローブ社製）等があげられる。前記蛍光物質の検出条件は、特に制限されず、例えば、使用する蛍光物質の種類により適宜決定できる。具体例として、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅは、例えば、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、例えば、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、例えば、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このような標識プローブを使用すれば、例えば、前記シグナルとして蛍光を検出し、前記シグナル値として蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の変動から、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。
【０１２０】
本発明は、前述のように、例えば、同一反応系で、ＭＴＨＦＲ遺伝子の２つの目的領域を増幅できる。このため、前記ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブと前記ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブとを、同一反応系で併用することによって、ＭＴＨＦＲ遺伝子におけるＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８の多型を、同一反応系において判別できる。この場合、前記各プローブは、それぞれ、異なる条件で検出される異なる標識物質を有することが好ましい。このように、異なる標識物質を使用することによって、同一反応系であっても、例えば、検出条件を変えることによって、各検出対象部位の多型を、別個に解析可能となる。
【０１２１】
２種類以上のプローブを併用する場合、各プローブは、例えば、前記標識物質として、異なる蛍光色素、具体的には、異なる波長で検出される蛍光色素を有することが好ましい。前記プローブがグアニン消光プローブの場合、例えば、前記表４に示すＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブ（Ｐ１プローブ）およびＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブ（Ｐ２プローブ）は、例えば、３’末端領域、好ましくは３’末端のシトシン（ｃ）を、前記蛍光色素で標識化する。具体的には、それぞれ、前記蛍光色素として、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ等の異なる蛍光色素で標識化することが好ましい。前記プローブの５’末端を蛍光色素で標識化した場合、前記プローブは、例えば、その３’末端に、さらにリン酸基が付加されてもよい。これによって、例えば、前記プローブ自体が伸長することを防止できる。
【０１２２】
前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブが好ましい。前記標識物質が蛍光物質の場合、前記標識プローブは、例えば、前記蛍光物質で標識化され、単独で蛍光を示し、且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象（Quenching  phenomenon）と呼ばれる。この現象を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記蛍光消光プローブは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が前記蛍光物質で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）が好ましい。前記末端の塩基がシトシン（ｃ）の場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、被検核酸とハイブリッドを形成した際、前記被検核酸における、標識化された末端のシトシン（ｃ）と対をなす塩基または前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（ｇ）となるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。前記対をなす塩基から１塩基離れた塩基とは、例えば、前記対をなす塩基の隣の塩基を意味する。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。前記グアニン消光プローブが前記被検核酸にハイブリダイズすると、例えば、前記蛍光物質で標識化された末端のシトシン（ｃ）が、前記被検核酸におけるグアニン（ｇ）に近づくことによって、前記蛍光物質の発光が弱くなる、すなわち蛍光強度が減少するという現象を示す。前記プローブを使用すれば、例えば、蛍光強度の変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。同様に、前記末端の塩基がグアニン（ｇ）の場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、前記被検核酸とハイブリッドを形成した際、前記被検核酸における、標識化された末端のグアニン（ｇ）と対をなす塩基または前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がシトシン（ｃ）となるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。
【０１２３】
前記プローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。前述のように、前記増幅工程は、例えば、プローブの共存下で行ってもよい。このような場合、前記プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、前記増幅工程において前記プローブ自体が伸長することを十分に防止できる。また、前記プローブの３’末端に、例えば、前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【０１２４】
前記測定工程（Ｂ）の前記反応系において、前記プローブの割合は、特に制限されず、例えば、１種類のプローブについて、１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは、２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。
【０１２５】
前記プローブが、前記標識物質として蛍光物質を有する標識プローブの場合、例えば、検出する蛍光強度を調整するために、前記標識プローブと同じ配列である非標識プローブを併用してもよい。前記非標識プローブは、例えば、その３’末端にリン酸が付加されてもよい。前記標識プローブと前記非標識プローブとのモル比は、例えば、１：１０〜１０：１が好ましい。前記反応系において、前記増幅物と前記プローブとのモル比は、例えば、１：１０〜１０：１が好ましい。前記増幅物と前記プローブとのモル比は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【０１２６】
前記測定工程（Ｂ）において、前記プローブは、例えば、前記増幅工程（Ａ）で得られた増幅物を含む反応系に、含まれていればよく、その添加のタイミングは、特に制限されない。前記測定工程（Ｂ）における前記反応系は、例えば、前記増幅工程（Ａ）で得られた増幅物と前記プローブとを用いて、新たに調製してもよいし、前記増幅工程（Ａ）における前記増幅反応の反応系であってもよい。後者の場合、前記プローブは、例えば、前記増幅工程（Ａ）の前または途中に、前記増幅反応の反応系に添加されてもよく、前記増幅工程（Ａ）の後、前記増幅反応の反応系に添加されてもよい。中でも、例えば、前記増幅工程（Ａ）における前記増幅反応の前に、予め、前記プローブを、前記増幅反応の反応系に添加することが好ましい。この場合、前記増幅工程（Ａ）は、前記プローブの存在下、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させることが好ましい。これにより、例えば、前記プローブの添加のために、増幅反応の途中または後で、前記反応系を外部環境に露出する必要がなく、また、前記増幅反応とシグナル値の測定とを、連続的に行うことが可能である。
【０１２７】
前述のように、前記測定工程（Ｂ）の前記反応系は、例えば、前記増幅工程（Ａ）の前記反応系を使用できる。前記増幅工程（Ａ）の前記反応系において、前記試料の割合は、特に制限されず、前記本発明の増幅方法において述べた通りである。ここで、前記試料が生体試料であり、前記測定工程（Ｂ）において、前記反応系として前記増幅工程（Ａ）の前記反応系を使用し、前記プローブの存在下、光学的にシグナルの検出を行う場合、前記増幅工程（Ａ）の前記反応系における試料の割合は、例えば、０．１〜０．５体積％に設定することが好ましい。前記生体試料が、例えば、全血試料の場合、前記反応系における試料の割合は、例えば、０．１〜０．５体積％が好ましい。ＰＣＲ等の増幅反応では、通常、ＤＮＡ変性、つまり一本鎖ＤＮＡへの解離のため、試料に熱処理が施される。しかし、この熱処理によって、前記試料に含まれる糖およびタンパク質等が変性し、不溶化の沈殿物および濁り等が発生するおそれがある。このため、前述のようにシグナルを検出する場合、前記沈殿物および濁り等の発生が、測定精度に影響を及ぼす可能性がある。これに対して、前記増幅工程（Ａ）の前記反応系における前記試料の割合を、例えば、前述の範囲に設定すれば、メカニズムは不明であるが、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止でき、光学的手法による測定精度の低下を防止できる。また、前述の範囲に設定すれば、例えば、前記試料中の夾雑物による増幅反応の阻害も十分に抑制でき、増幅効率の低下防止をより一層向上できる。このため、本発明のプライマーまたはプライマーセットの使用に加えて、さらに、前記反応系における前記試料の割合を前述の範囲に設定することで、より一層、試料の前処理の必要性を排除できる。
【０１２８】
前記試料が全血試料の場合、前記反応系における全血試料の割合は、前述のような体積割合、例えば、０．１〜０．５体積％ではなく、例えば、ヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）の重量割合で表すこともできる。前記反応系における全血試料の割合は、Ｈｂ量に換算して、例えば、０．５６５〜１１３ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは、２．８２５〜５６．５ｇ／Ｌの範囲、さらに好ましくは、５．６５〜２８．２５ｇ／Ｌの範囲である。前記反応系における全血試料の割合は、例えば、前記体積割合と前記Ｈｂ重量割合の両方を満たしてもよいし、いずれか一方を満たしてもよい。
【０１２９】
本発明の多型検出方法は、前述のような、いわゆるＴｍ解析に利用できる。Ｔｍ解析におけるＴｍ値について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示す。これによって、融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度（Ｔｍ）とは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【０１３０】
前記測定工程（Ｂ）において、前記増幅物と前記プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナルの測定は、例えば、前述した、２６０ｎｍにおける吸光度測定でもよいし、前記標識物質のシグナル測定でもよい。具体的には、前記プローブとして、前述のように、前記標識物質で標識化された標識プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、前記増幅物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱により前記増幅物から前記プローブが解離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、前記増幅物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱により前記増幅物から前記プローブが遊離するとシグナルが減少（または消失）する。したがって、前記標識物質のシグナルの検出によって、前記２６０ｎｍにおける吸光度測定と同様に、ハイブリッドの融解の進行の検出、Ｔｍ値の決定等を行うことができる。前記標識物質のシグナル検出は、例えば、前記標識物質のシグナルに特有の条件で検出すればよい。前記検出条件は、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。前記標識プローブならびに前記標識物質は、前述のとおりである。
【０１３１】
前記（Ｄ）工程または前記（Ｃ）工程において、シグナル値の変動からの前記多型の検出は、従来の方法により行うことができる。具体例としては、例えば、前記シグナル値の変動を、前記多型検出用プローブと変異型の検出対象配列とのハイブリッドの変動および／または前記多型検出用プローブと野生型の検出対象配列とのハイブリッドの変動と比較し、多型が変異型か野生型かを判断できる。つまり、変異型と同様であれば変異型、野生型と同様であれば野生型と判断できる。また、例えば、前記シグナルの変動からＴｍ値を求め、評価基準のＴｍ値との比較により、多型を判断できる。まず、前記シグナル値の変動から、Ｔｍ値を求める。つぎに、測定した前記Ｔｍ値を、予め求めた、野生型の検出対象配列についてのＴｍｗｔ値および／または変異型の検出対象配列についてのＴｍｍｔ値と比較する。そして、測定したＴｍ値が、評価基準のＴｍｗｔ値と同じまたは同程度であれば野生型、Ｔｍｗｔ値よりも低いならば変異型、評価基準のＴｍｍｔ値と同じまたは同程度であれば変異型、Ｔｍｍｔ値よりも低いならば野生型と判断できる。
【０１３２】
つぎに、本発明の多型の検出方法について、一例をあげて説明する。本例は、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットとして、前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）を含むプライマーセットを使用し、前記プローブとして、蛍光物質で標識された２種類の下記プローブを使用する例である。本例では、前記プライマーセットを用いたＰＣＲによって、一つの反応液中で、ＭＴＨＦＲ遺伝子の２つの目的領域を同時に増幅させ、さらに、前記プローブを用いて、ＭＴＨＦＲ遺伝子における２つの多型ＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８を検出する。下記ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブは、配列番号４６に示す塩基配列からなり、塩基（ｒ）がアデニン（ａ）であり、３’末端を蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化したプローブである。下記ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブは、配列番号５２に示す塩基配列からなり、塩基（ｋ）がグアニン（ｇ）であり、３’末端を蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬで標識化したプローブである。本発明は、これらには制限されない。
【０１３３】
（プローブ）
ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブ
5'-gtgatgatgaaatcgActc-(TAMRA)-3'          （配列番号５５）
ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブ
5'-aagacacttGcttcac-(BODIPYFL)-3'          （配列番号５６）
【０１３４】
まず、ＰＣＲの反応液を調製し、前述のようにＰＣＲを行い、同一反応液中で、ＭＴＨＦＲ遺伝子の２つの目的領域を同時に増幅させる。前記反応液は、例えば、前記プライマーセット（１）、プライマーセット（２）および試料を含み、さらに、前記増幅反応に使用可能な他の成分を適宜含むことが好ましい。本発明によれば、前述のように、例えば、全血等の夾雑物が含まれる試料であっても、前処理を行うことなく、前記試料をそのまま使用可能である。
【０１３５】
前記反応液は、例えば、前述のように、さらに、前記プローブを含んでもよい。この場合、例えば、前記プローブの存在下、前記ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅を行ってもよい。
【０１３６】
次に、得られた増幅物（二本鎖ＤＮＡ）の一本鎖ＤＮＡへの解離、および、解離により得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記標識プローブの存在下、前記反応液の温度を変化させることで行える。この場合、前述のように、予め前記標識プローブを添加した前記反応液について、増幅反応を行った後、前記反応液を温度変化させることが好ましい。
【０１３７】
前記解離工程における加熱温度は、例えば、二本鎖の前記増幅物を一本鎖に解離できる温度があげられる。前記加熱温度は、特に制限されず、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間は、特に制限されず、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは、１秒〜５分である。
【０１３８】
解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行える。温度条件は、例えば、４０〜５０℃である。前記温度での処理時間は、特に制限されず、例えば、１〜６００秒である。
【０１３９】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅物と前記標識プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液を加熱し、すなわち、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、グアニン消光プローブ、すなわち、末端のシトシン（ｃ）が標識化されたプローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１４０】
前記蛍光強度の変動を測定する際、その温度範囲は、特に制限されない。前記開始温度は、例えば、室温〜８５℃であり、好ましくは、２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。温度の上昇速度は、特に制限されず、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは、０．３〜５℃／秒である。
【０１４１】
つぎに、前記シグナル値の変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度変化量／ｄｔまたはｄ蛍光強度変化量／ｄｔ）を算出し、最も変化した値を示す温度をＴｍ値として決定できる。前記標識プローブが前記蛍光消光プローブの場合、例えば、蛍光強度の増加量を測定し、単位時間当たりの蛍光強度増加量（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）が最も低い値を示す温度、または、単位時間当たりの蛍光強度増加量（ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）が最も高い値を示す温度を、Ｔｍ値として決定することもできる。一方、前記標識プローブとして、前記蛍光消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合は、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【０１４２】
前記標識プローブとして、例えば、検出波長の異なる標識物質を標識した複数のプローブを用いた場合、前記検出波長ごとに、前記シグナル値の変動を解析してもよい。
【０１４３】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）等により算出でき、また、最近接塩基対法（Nearest  Neighbor  Method）によって決定することもできる。
【０１４４】
本例においては、２つの多型ＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８を検出するため、前記２種類のプローブの各標識物質に応じた条件で、シグナル値の測定を行う。そして、前記各プローブのシグナルについて、それぞれのＴｍ値を決定する。ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブのＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブのＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで、それぞれ検出できる。
【０１４５】
そして、これらのＴｍ値から、各検出対象部位における遺伝子型を決定する。つまり、配列番号１の塩基配列における塩基番号８７４７および塩基番号１０６４９の塩基が、前記野生型であるか、前記変異型であるかを決定する。Ｔｍ解析では、例えば、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、一塩基以上が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、前記検出対象部位における多型を決定できる。具体的には、例えば、以下のように決定できる。前記検出対象部位の塩基を変異型、例えば、配列番号１における塩基番号８７４７の塩基がチミン（ｔ）と仮定し、それを含む検出対象配列に相補的なプローブを使用した場合、形成したハイブリッドのＴｍ値が、完全に相補的なハイブリッドのＴｍ値と同じであれば、前記増幅物の多型は、変異型のホモ接合体と判断できる。また、形成したハイブリッドのＴｍ値が、一塩基異なるハイブリッドのＴｍ値と同じ（完全に相補的なハイブリッドのＴｍ値より低い値）であれば、前記増幅物の多型は、野生型のホモ接合体、例えば、配列番号１における塩基番号８７４７の塩基がシトシン（ｃ）のホモ接合体と判断できる。さらに、両方のＴｍ値が検出された場合には、ヘテロ接合体と決定できる。このようにして、前記各プローブに対する２つのＴｍ値から、多型ＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８の遺伝子型を判断できる。
【０１４６】
このようにシグナル値の変動からＭＴＨＦＲ遺伝子の多型を検出できることから、同様に、前記多型を含む前記目的領域が増幅されているか否かも、検出できる。このため、前記（Ｄ）工程と同様にして、前述した本発明の増幅物検出方法の前記（Ｃ）工程を行うことで、前記増幅物の検出を行うことができる。
【０１４７】
本発明は、前述のように、前記プローブを含む反応系の温度を上昇させて、すなわち、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを含む反応系の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、例えば、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【０１４８】
具体例として、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合を例にあげる。この場合、前記標識プローブは、一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応系の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブを使用した場合、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応系の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１４９】
本発明において、ＭＴＨＦＲ遺伝子の２種類の多型ＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８のうち１種類の多型を解析する場合は、例えば、前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）のうち目的領域に対応する１種類のプライマーセットを含む、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを使用し、さらに、目的の検出対象部位にハイブリダイズする１種類のプローブを使用すればよい。
【０１５０】
＜ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅用試薬＞
本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬は、前述のように、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーまたはプライマーセットを含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅用試薬である。本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬は、前記本発明のプライマーセットを含むことが特徴であり、これ以外の組成等については何ら制限されない。
【０１５１】
本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬は、例えば、前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）のいずれか一方を含むことが好ましく、より好ましくは、両方を含む。
【０１５２】
本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬は、例えば、本発明のプライマーセットを用いた増幅方法により得られる増幅物を検出するため、さらに、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅物にハイブリダイズ可能なプローブを含むことが好ましい。前述のように、本発明のプライマーセットによれば、例えば、それに含まれる前記プライマーセット（１）および前記プライマーセット（２）の種類に応じて、ＭＴＨＦＲ遺伝子における１つまたは２つの目的領域の増幅物が得られる。このため、前記プローブによって、例えば、増幅の有無および検出対象部位の多型等を、前述の方法によって検出可能である。前記プローブは、前述の通りである。前記プローブは、例えば、前記Ｐ１プローブおよび前記Ｐ２プローブの少なくとも一方を含むことが好ましく、より好ましくは両方を含む。
【０１５３】
本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬は、例えば、全血等の生体試料におけるＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる際に使用することが好ましい。特に、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬を、例えば、前記プローブとともに使用する際には、増幅反応の反応系における全血試料の割合を０．１〜０．５体積％とすることが好ましい。
【０１５４】
本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬は、この他にも、例えば、核酸の増幅反応に必要な成分を含んでもよい。具体例としては、例えば、前述のような、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、緩衝液、各種触媒等があげられる。本発明の多型検出用試薬において、各成分は、例えば、同じ容器に収容されてもよいし、別の容器に収容されてもよい。
【０１５５】
本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬の形態は、特に制限されず、例えば、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを含有する液体試薬でもよいし、使用前に溶媒で懸濁する乾燥試薬であってもよい。また、ＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットの含有量も、特に制限されない。
【０１５６】
本発明の増幅用試薬は、例えば、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅に使用するキットともいえる。本発明の増幅用キットにおいて、各成分は、例えば、同じ容器に収容されてもよいし、別の容器に収容されてもよい。本発明の増幅用キットは、さらに、使用説明書を含んでもよい。
【０１５７】
＜増幅物検出用試薬および多型検出用試薬＞
本発明の増幅物検出用試薬は、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅物の検出用試薬である。また、本発明の多型検出用試薬は、本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子の多型の検出用試薬である。本発明においては、前記本発明のＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットを含むことが特徴であり、その他の構成および条件は何ら制限されない。本発明の増幅物検出用試薬および多型検出用試薬は、特に示さない限り、前記ＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用試薬と同様である。
【０１５８】
本発明の多型検出用プローブは、前述の通りであって、前記（Ｐ１）および（Ｐ２）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする。本発明の多型検出方法は、本発明の多型検出用プローブを用いて、ＭＴＨＦＲ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子の多型検出方法である。本発明のプローブおよびこれを用いた各種方法は、前述の記載を参照できる。
【０１５９】
つぎに、本発明の実施例について説明する。本発明は、下記実施例により制限されない。下記実施例において、特に示さない限り、％は、ｗ／ｖ％を示す。
【実施例】
【０１６０】
［実施例１］
本例では、試料として、前処理をしていない全血試料を使用し、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅を行い、多型を解析した。【０１６１】
被験者３人から、ヘパリンリチウム採血管を用いて、全血を採取した。それぞれ、サンプル１、２、３とした。下記組成の希釈液１  ７０μＬに、前記全血１０μＬを添加して混合し、この混合液１０μＬを、下記組成の希釈液２  ７０μＬに添加し、希釈試料を調製した。蓋付きのチューブに前記希釈試料１７μＬを入れ、蓋を開けた状態で、９５℃で１０分間加熱し、前記希釈試料を約４μＬにまで濃縮した。前記濃縮試料に下記表５に示す反応試薬４６μＬを添加して、ＰＣＲ反応液とした。前記ＰＣＲ反応液について、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６６℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から７５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。測定波長は、５１５〜５５５ｎｍ（蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの検出）および５８５〜７００ｎｍ（蛍光色素ＴＡＭＲＡの検出）とした。【０１６２】
（希釈液１）
濃度                    成分                
１０ｍｍｏｌ／Ｌ      Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）
０．１ｍｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ
０．０５％            ＮａＮ３
０．３％              ＳＤＳ
（希釈液２）
濃度                    成分                
１０ｍｍｏｌ／Ｌ      Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）
０．１ｍｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ
０．０５％            ＮａＮ３【０１６３】
【表５】
2011062258.tif 000007
【０１６４】
（プローブ）
ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブ
5'-gtgatgatgaaatcgActc-(TAMRA)-3'          （配列番号５５）
ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブ
5'-aagacacttGcttcac-(BODIPY  FL)-3'        （配列番号５６）【０１６５】
（プライマーセット）
ＭＴＨＦＲ＊６７７  Ｆ１プライマー
5'-cagggagctttgaggctgacctg-3'              （配列番号７）
ＭＴＨＦＲ＊６７７  Ｒ１プライマー
5'-gatggggcaagtgatgcccatg-3'              （配列番号１５）
ＭＴＨＦＲ＊１２９８  Ｆ２プライマー
5'-gctgaaggactactacctcttctacctgaag-3'      （配列番号２５）
ＭＴＨＦＲ＊１２９８  Ｒ２プライマー
5'-gcatcactcactttgtgaccattccgg-3'          （配列番号３８）【０１６６】
Ｔｍ解析において、形成されるハイブリッドがパーフェクトマッチの場合、評価基準となるＴｍは、以下の通りである。ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブとパーフェクトマッチするハイブリッドのＴｍ値は６２．５℃、ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブとミスマッチするハイブリッドのＴｍ値は５６℃、ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブとパーフェクトマッチするハイブリッドのＴｍ値は５７℃、ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブとミスマッチするハイブリッドのＴｍ値は４７℃である。【０１６７】
これらの結果を図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１において、縦軸は、各温度における蛍光強度の変化（以下、「蛍光強度変化量」ともいう）を示す。縦軸の単位は、微分値「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」であり、「ｄＦ／ｄｔ」と示す。図１において、横軸は、測定時の温度（℃）を示す。【０１６８】
図１に示すシグナルのピークから、各サンプルにおけるＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８の遺伝子型を決定した。その結果、サンプル１は、ＭＴＨＦＲ＊６７７の遺伝子型が、変異型のホモ接合体６７７（Ｔ／Ｔ）であり、ＭＴＨＦＲ＊１２９８の遺伝子型が、野生型のホモ接合体１２９８（Ａ／Ａ）であった。サンプル２は、ＭＴＨＦＲ＊６７７の遺伝子型が、野生型と変異型とのヘテロ接合体６７７（Ｃ／Ｔ）であり、ＭＴＨＦＲ＊１２９８の遺伝子型が、野生型と変異型とのヘテロ接合体１２９８（Ａ／Ｃ）であった。サンプル３は、ＭＴＨＦＲ＊６７７の遺伝子型が、野生型のホモ接合体６７７（Ｃ／Ｃ）であり、ＭＴＨＦＲ＊１２９８の遺伝子型が、野生型のホモ接合体１２９８（Ａ／Ａ）であった。【０１６９】
前記実施例１の結果を裏付けるために、前記サンプル１、２および３について、従来法のＲＦＬＰ法によって、ＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８の遺伝子型を確認した。従来法のＲＦＬＰ法による前記各サンプルの遺伝子タイプは、実施例１と同じ結果であった。【０１７０】
このように、本発明のプライマーセットを使用することにより、前処理をしていない全血試料を使用して、ＭＴＨＦＲ遺伝子の２つの領域を同一反応液中で同時に増幅し、且つ、前記同一反応液を用いて２種類の多型を解析し、接合体型を判定できた。【０１７１】
［実施例２］
本例では、試料として、精製核酸を使用し、ＭＴＨＦＲ遺伝子の増幅を行い、多型を解析した。【０１７２】
前記実施例１における前記濃縮試薬４μＬに代えて、精製したヒトゲノム  ４μＬを使用した。そして、前記ヒトゲノムに前記加熱処理を行うことなく、前記表５に示す反応試薬４６μＬを添加した以外は、前記実施例１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。前記精製ヒトゲノムは、前記実施例１のサンプル１、２および３の全血から、調製した。具体的には、ＧＦＸ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）を用いて、前記キット添付のゲノムＤＮＡ抽出プロトコールに従い、前記全血を精製して、前記精製ヒトゲノムを調製した。【０１７３】
Ｔｍ解析において、形成されるハイブリッドがパーフェクトマッチの場合、評価基準となるＴｍは、前述と同様である。すなわち、ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブとパーフェクトマッチするハイブリッドのＴｍ値は６２．５℃、ＭＴＨＦＲ＊６７７用プローブとミスマッチするハイブリッドのＴｍ値は５６℃、ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブとパーフェクトマッチするハイブリッドのＴｍ値は５７℃、ＭＴＨＦＲ＊１２９８用プローブとミスマッチするハイブリッドのＴｍ値は４７℃である。【０１７４】
これらの結果を図２に示す。同図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図２において、縦軸は、各温度における蛍光強度の変化（以下、「蛍光強度変化量」ともいう）を示す。縦軸の単位は、微分値「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」であり、「ｄＦ／ｄｔ」と示す。図２において、横軸は、測定時の温度（℃）を示す。【０１７５】
図２に示すシグナルのピークから、各サンプルにおけるＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８の遺伝子型を決定した。その結果、サンプル１は、ＭＴＨＦＲ＊６７７の遺伝子型が、野生型のホモ接合体６７７（Ｃ／Ｃ）であり、ＭＴＨＦＲ＊１２９８の遺伝子型が、変異型のホモ接合体１２９８（Ｃ／Ｃ）であった。サンプル２は、ＭＴＨＦＲ＊６７７の遺伝子型が、変異型のホモ接合体６７７（Ｔ／Ｔ）であり、ＭＴＨＦＲ＊１２９８の遺伝子型が、野生型のホモ接合体１２９８（Ａ／Ａ）であった。サンプル３は、ＭＴＨＦＲ＊６７７の遺伝子型が、野生型と変異型とのヘテロ接合体６７７（Ｃ／Ｔ）であり、ＭＴＨＦＲ＊１２９８の遺伝子型が、野生型と変異型とのヘテロ接合体１２９８（Ａ／Ｃ）であった。【０１７６】
前記実施例２の結果を裏付けるために、前記サンプル１、２および３について、従来法のＲＦＬＰ法によって、ＭＴＨＦＲ＊６７７およびＭＴＨＦＲ＊１２９８の遺伝子型を確認した。従来法のＲＦＬＰ法による各サンプルの遺伝子タイプは、実施例と同じ結果であった。【０１７７】
このように、本発明のプライマーセットを使用することにより、ＭＴＨＦＲ遺伝子の２つの領域を同一反応液中で同時に増幅し、且つ、前記同一反応液を用いて２種類の多型を解析し、接合体型を判定できた。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
以上のように、本発明のプライマーおよびプライマーセットによれば、ＭＴＨＦＲ遺伝子における検出対象部位（例えば、ＭＴＨＦＲ＊６７７またはＭＴＨＦＲ＊１２９８）を含む目的の領域を、特異的に増幅できる。したがって、本発明のプライマー、プライマーセット、これを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅方法および多型検出方法によれば、ＭＴＨＦＲ遺伝子の多型を迅速且つ簡便に解析できることから、医療分野においてきわめて有効といえる。【０１７９】
以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。【０１８０】
この出願は、２００９年１１月１９日に出願された日本出願特願２００９−２６４０５２を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【図１】
2011062258.tif 000008
【図２】
2011062258.tif 000009
【配列表】
2011062258000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月11日(2011.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチド、および（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方の標識物質を有する標識オリゴヌクレオチドからなるプローブであることを特徴とする、ＭＴＨＦＲ遺伝子にハイブリダイズ可能な多型検出用プローブ。
（Ｐ１）塩基長が１７〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号８７４４〜８７６０を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号８７４４の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
（Ｐ２）塩基長が１４〜５０塩基長であり、配列番号１における塩基番号１０６４３〜１０６５６を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号１０６４３の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号８７４４の塩基に相補的な塩基を、３’末端から数えて１〜４番目の位置に有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０６４３の塩基に相補的な塩基を、３’末端から数えて１〜４番目の位置に有する、請求項１記載の多型検出用プローブ。
【請求項３】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号８７４４の塩基に相補的な塩基を、３’末端に有し、
前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号１０６４３の塩基に相補的な塩基を、３’末端に有する、請求項１記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドおよび（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、下記（Ｐ１−１）および（Ｐ２−１）のオリゴヌクレオチドである、請求項３記載の多型検出用プローブ。
（Ｐ１−１）配列番号４６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｐ２−１）配列番号５２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項５】
請求項１記載のＭＴＨＦＲ遺伝子にハイブリダイズ可能な多型検出用プローブを含むことを特徴とする試薬。
【請求項６】
前記多型検出用プローブとして、前記（Ｐ１）のオリゴヌクレオチドからなるプローブおよび前記（Ｐ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブを含む、請求項５記載の試薬。
【請求項７】
さらに、ＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットとして、下記プライマーセット（１）および下記プライマーセット（２）の少なくとも一方を含む、請求項５記載の試薬。
プライマーセット（１）
下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方を含むプライマーセット
（Ｆ１）塩基長が２０〜２８塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８７１５のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）塩基長が１８〜２６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８８１７のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
プライマーセット（２）
下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよび下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方を含むプライマーセット
（Ｆ２）塩基長が２６〜３６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０５９０のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２）塩基長が２２〜３４塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０６９５のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
【請求項８】
前記（Ｆ１）、（Ｒ１）、（Ｆ２）および（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、下記（Ｆ１−１）、（Ｒ１−１）、（Ｆ２−１）および（Ｒ２−１）のオリゴヌクレオチドである、請求項７記載の試薬。
（Ｆ１−１）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｒ１−１）配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｆ２−１）配列番号２５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｒ２−１）配列番号３８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項９】
請求項１記載の多型検出用プローブを用いて、ＭＴＨＦＲ遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とするＭＴＨＦＲ遺伝子の多型検出方法。
【請求項１０】
下記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）工程を含む、請求項９記載の多型検出方法。
（Ａ）請求項１記載の多型検出用プローブを含む反応系において、試料中の核酸を鋳型として、ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程における増幅物および前記多型検出用プローブを含む反応系の温度を変化させ、前記増幅物と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する測定工程
（Ｄ）前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の前記多型を検出する検出工程
【請求項１１】
前記（Ａ）工程が、ＭＴＨＦＲ遺伝子増幅用プライマーセットとして下記プライマーセット（１）および下記プライマーセット（２）の少なくとも一方を用いて、前記ＭＴＨＦＲ遺伝子を増幅させる増幅工程である、請求項１０記載の多型検出方法。
プライマーセット（１）
下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよび下記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方を含むプライマーセット
（Ｆ１）塩基長が２０〜２８塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８７１５のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ１）塩基長が１８〜２６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号８８１７のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
プライマーセット（２）
下記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーおよび下記（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方を含むプライマーセット
（Ｆ２）塩基長が２６〜３６塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０５９０のグアニン（ｇ）を３’末端とするオリゴヌクレオチド
（Ｒ２）塩基長が２２〜３４塩基長であり、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０６９５のシトシン（ｃ）を５’末端とするオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド
【請求項１２】
前記（Ｆ１）、（Ｒ１）、（Ｆ２）および（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、下記（Ｆ１−１）、（Ｒ１−１）、（Ｆ２−１）および（Ｒ２−１）のオリゴヌクレオチドである、請求項１１記載の多型検出方法。
（Ｆ１−１）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｒ１−１）配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｆ２−１）配列番号２５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｒ２−１）配列番号３８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
（削除）
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
（削除）
【国際調査報告】
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