(57)【要約】  レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸残基が付加及び／又は挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸であって、（ａ）レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のＮ末端に脂質修飾シグナルを含むアミノ酸配列が付加されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列、及び（ｂ）レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のマトリックスドメインのアミノ酸配列に、１以上のアミノ酸残基が挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む核酸。本発明は、医薬品等の生産や遺伝子治療のための標的細胞への遺伝子導入に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸残基が付加及び／又は挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸であって、当該核酸配列が下記（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される核酸。
（ａ）レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のＮ末端に脂質修飾シグナルを含むアミノ酸配列が付加されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列
（ｂ）レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のマトリックスドメインのアミノ酸配列に、１以上のアミノ酸残基が挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列
【請求項２】
アミノ酸残基の付加及び／又は挿入が６〜１００アミノ酸残基の付加又は挿入である、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
アミノ酸残基の付加及び／又は挿入が７〜３０アミノ酸残基の付加又は挿入である、請求項２記載の核酸。
【請求項４】
脂質修飾シグナルが、ミリストイル化シグナル、又はミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルである、請求項１〜３いずれか１項に記載の核酸。
【請求項５】
ミリストイル化シグナルがレトロウイルス又はＳｒｃファミリーチロシンキナーゼに由来する、請求項４記載の核酸。
【請求項６】
ミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルが、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、Ｇαタンパク質、又は一酸化窒素合成酵素に由来する、請求項４記載の核酸。
【請求項７】
レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質が、レンチウイルス由来又はオンコレトロウイルス由来のＧａｇタンパク質である、請求項１〜６いずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか１項に記載の核酸を有する、レトロウイルスベクター産生細胞。
【請求項９】
請求項１〜７いずれか１項に記載の核酸を有する、パッケージングプラスミド。
【請求項１０】
請求項１〜７いずれか１項に記載の核酸を有する、パッケージング細胞。
【請求項１１】
レトロウイルスベクター作製システムであって、下記（Ａ）及び（Ｂ）を含むシステム。
（Ａ）請求項９に記載のパッケージングプラスミド又は請求項１０に記載のパッケージング細胞
（Ｂ）レトロウイルス由来の末端反復配列、パッケージングシグナル、及び外来遺伝子を挿入可能なクローニング部位を含むトランスファーベクター
【請求項１２】
請求項８に記載のレトロウイルスベクター産生細胞により産生されるレトロウイルスベクター。
【請求項１３】
レンチウイルスベクター、又はモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に基づくレトロウイルスベクターである、請求項１２記載のレトロウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型Ｇａｇタンパク質をコードする、レトロウイルスベクターの作製に有用な核酸、該核酸を有するレトロウイルスベクター産生細胞、該核酸を有するパッケージングプラスミド、該核酸を有するパッケージング細胞、及び該パッケージングプラスミド又は該パッケージング細胞を含むレトロウイルスベクター作製システム、並びに上記レトロウイルスベクター産生細胞により産生されるレトロウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物への遺伝子導入法としては、ウイルスベクターを用いる方法、裸のＤＮＡを、エンドサイトーシス、電気穿孔法又は遺伝子銃等によって導入する方法が知られている。ウイルスベクターは、遺伝子治療の分野で基礎から臨床まで幅広く利用されている技術である。レトロウイルスベクターを用いる遺伝子導入法は、目的遺伝子を宿主の染色体に組み込むことができ、宿主細胞内での目的遺伝子の恒久的な発現が期待できるため、現在、遺伝子治療に最も広く使用されている遺伝子導入法である。【０００３】
レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクター産生細胞を培養することによりその培養上清中に組換えウイルス粒子として得られる。しかしながら、レトロウイルス粒子は培地に浮遊している状態では失活しやすく、濃縮操作によっても失活しやすい。従って、レトロウイルスベクターを用いる遺伝子導入を効率よく行うためには、レトロウイルスベクター産生細胞が産生するレトロウイルスベクターの力価（単位容積あたりのウイルス粒子の数）や感染性を向上させることが必要とされている。レトロウイルスベクター産生細胞が産生するレトロウイルスベクターの力価を向上させるための試みとして、末端反復配列（ＬＴＲ）よりもプロモーター活性が強いヒトサイトメガロウイルス由来のプロモーターをレトロウイルスベクターの５’ＬＴＲのＵ３領域に導入する方法が知られている（特許文献１）。【０００４】
近年、ホスホリパーゼＣ−δ１のプレクストリン相同ドメイン（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ：ＰＨドメイン）をコードする配列がＮ末端に付加されたＧａｇタンパク質をレトロウイルスベクターの作製システムに用いることにより、高力価のレトロウイルスが得られることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、当該方法を用いて得られたレトロウイルスベクターは、Ｇａｇタンパク質に変異が導入されていないレトロウイルスベクターの作製システムで得られたレトロウイルスベクターと比較して、感染性の向上は認められていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３８６４０４９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ジャーナル  オブ  ジェネラル  ビロロジー（Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．）、第８９巻、第１９４９−１９５５頁（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、遺伝子導入をより効率よく行うことができるレトロウイルスベクター作製システム、及び当該作製システムにより産生されるレトロウイルスベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＭＡドメインにアミノ酸残基が付加及び／又は挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸をレトロウイルスベクターの産生に用いることにより、驚くべきことに、従来のものを利用した場合に比べて多量のレトロウイルスベクター（レトロウイルス粒子）が得られることを見出した。また、こうして得られたレトロウイルスの細胞への感染性が、従来の方法によって得られるレトロウイルスと比較して高いことを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
本発明の第１の態様は、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸残基が付加及び／又は挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸であって、
（ａ）レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のＮ末端に脂質修飾シグナルを含むアミノ酸配列が付加されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列、及び
（ｂ）レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のマトリックスドメインのアミノ酸配列に、１以上のアミノ酸残基が挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列
からなる群より選択される核酸配列を含む核酸に関する。本発明の第１の態様における脂質修飾シグナルとしては、ミリストイル化シグナル、及びミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルが例示され、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質としては、レンチウイルス由来又はオンコレトロウイルス由来のＧａｇタンパク質が例示される。【００１０】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の核酸を有する、レトロウイルスベクター産生細胞に関する。【００１１】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様の核酸を有する、パッケージングプラスミドに関する。【００１２】
本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様の核酸を有する、パッケージング細胞に関する。【００１３】
本発明の第５の態様は、（Ａ）本発明の第３の態様のパッケージングプラスミド又は本発明の第４の態様のパッケージング細胞；並びに（Ｂ）レトロウイルス由来の末端反復配列、パッケージングシグナル、及び外来遺伝子を挿入可能なクローニング部位を含むトランスファーベクターを含む、レトロウイルスベクター作製システムに関する。【００１４】
本発明の第６の態様は、本発明の第２の態様のレトロウイルスベクター産生細胞により産生されるレトロウイルスベクターに関する。本発明の第６の態様のレトロウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクター、又はモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に基づくレトロウイルスベクターが例示される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、レトロウイルスベクターの産生に有用な核酸、当該核酸を含むパッケージング細胞、パッケージングプラスミド、及びレトロウイルスベクター産生細胞、上記パッケージング細胞又はパッケージングプラスミドを含むレトロウイルスベクター作製システム、並びに当該レトロウイルスベクター作製システムによって産生されるレトロウイルスベクターが提供される。本発明の核酸を用いたレトロウイルスベクター作製システムにより産生されるレトロウイルスベクターは、遺伝子導入を効率よく行うことができるため、医薬品等の生産や遺伝子治療のための標的細胞への遺伝子導入に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の核酸を用いて産生したレトロウイルスベクターの産生量及び感染効率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本願明細書においてレトロウイルスとは、ゲノムがＲＮＡで構成され、当該ＲＮＡをＤＮＡに変換する生活環を有するレトロウイルス科に属するＲＮＡウイルスの総称を示し、オンコレトロウイルス及びレンチウイルスを含む。オンコレトロウイルスとしては、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）が挙げられる。また、レンチウイルスとしては、例えばヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）やサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
【００１８】
本願明細書においてＧａｇタンパク質とは、レトロウイルスのｇａｇ遺伝子にコードされるタンパク質のことを示す。レトロウイルスの生活環においてＧａｇタンパク質は、レトロウイルスによって宿主の染色体に挿入されたプロウイルスＤＮＡ上の遺伝子から一本の前駆体タンパク質として発現される。この際、Ｇａｇタンパク質のＣ末端に３種類のウイルス酵素（プロテアーゼ、逆転写酵素、及びインテグラーゼ）が融合した長い前駆体も発現される。これらの前駆体は、そのＮ末端がミリストイル化されると細胞膜に局在化し、ＲＮＡゲノムを包含してウイルス粒子として出芽する。その後、レトロウイルスに由来するプロテアーゼによりプロセッシングを受け、成熟ウイルス粒子となる。Ｇａｇタンパク質は、前駆体タンパク質のＮ末端側から順に、マトリックス（ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、及びヌクレオカプシド（ＮＣ）の三種類のタンパク質で構成される。このうち、ＭＡのＭドメインにミリストイル化シグナルが存在する。
【００１９】
本願明細書において脂質修飾シグナル（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）とは、脂肪酸やイソプレノイド等の脂質によるタンパク質の修飾を指令するアミノ酸配列を指す。脂質修飾シグナルとしては、例えば、ミリストイル化シグナル、パルミトイル化シグナル、ミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナル、Ｏ−アシル化シグナル、並びにイソプレニル化シグナルが知られている。
【００２０】
ミリストイル化シグナルは、タンパク質のミリストイル化を指令するアミノ酸配列であり、通常６〜９アミノ酸からなる。タンパク質のミリストイル化は、タンパク質のＮ末端のグリシン残基に炭素数１４の飽和脂肪酸であるミリスチン酸から誘導されるミリストイル基が共有結合するタンパク質の脂質修飾であり、ヒトゲノムがコードするタンパク質の約０．５％にこの修飾が生じているものと推定されている。ミリストイル化シグナルを有するウイルス由来のタンパク質としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）やモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）等の各種レトロウイルスのＧａｇタンパク質、ＨＩＶのＮｅｆタンパク質、ＭＭＬＶのチロシンプロテインキナーゼ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のｐｐ６０ｖ−ｓｒｃ、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のプレＳ１コアタンパク質、ポリオウイルスのコアタンパク質ＶＰ４が知られている。また、ミリストイル化シグナルを有する非ウイルス由来のタンパク質としては、Ｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼ等のタンパク質キナーゼ、カルシネウリンＢ等のフォスファターゼ、Ｇαタンパク質等のグアニンヌクレオチド結合タンパク質、リカバリン等のＥＦハンド型Ｃａ２＋結合タンパク質、ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）等の構造タンパク質等が知られている。
【００２１】
ミリストイル化シグナルには、Ｎ末端の開始メチオニンに続いてグリシンが必須である。また、ミリストイル化シグナルを有する一般的なタンパク質にはＮ末端から６番目のアミノ酸にセリン又はトレオニンが存在し、７番目及び／又は８番目のアミノ酸にリジン又はアルギニンが存在するが、例外もある。タンパク質のアミノ酸配列中にミリストイル化シグナルが存在するかどうかは、例えば「Ｔｈｅ  ＭＹＲ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｎｄｅｌ．ｉｍｐ．ａｃ．ａｔ／ｍｙｒｉｓｔａｔｅ／ＳＵＰＬｐｒｅｄｉｃｔｏｒ．ｈｔｍ）を用いて予測することが可能である。
【００２２】
パルミトイル化シグナルは、タンパク質のパルミトイル化を指令するアミノ酸配列であり、システイン残基が必須であることが知られている。システイン残基以外のパルミトイル化シグナルのコンセンサス配列は知られていないが、例えば、アルゴリズム「ＣＳＳ−Ｐａｌｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０」［プロテインエンジニアリング  デザイン  アンド  セレクション（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．）、第２１巻、第１１号、第６３９−６４４頁（２００８）］により、タンパク質のアミノ酸配列中にパルミトイル化シグナルが存在するかどうかを予測することが可能である。
【００２３】
パルミトイル化シグナルを有するタンパク質としては、Ｇαｓサブユニット、Ｇαｑサブユニット等のグアニンヌクレオチド結合タンパク質のαサブユニット（Ｇαサブユニット）、成長関連タンパク質−４３（ＧＡＰ−４３）、カルシウムチャネルβ２ａサブユニット、シナプス後肥厚部タンパク質−９５（ＰＳＤ−９５）、Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子−４（ＲＧＳ４）等が知られている。
【００２４】
ミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルは、タンパク質のミリストイル化及びパルミトイル化の二重脂質修飾を指令するアミノ酸配列である。ミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルを有するタンパク質としては、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒ及びＹｒｋ等のＳｒｃファミリーのチロシンキナーゼ、Ｇαｉ１サブユニット、Ｇαｏサブユニット、及びＧαｚ等のＧαサブユニット、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ−１８）、並びに内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）等が知られている。
【００２５】
上記のミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルを有するＳｒｃファミリーチロシンキナーゼやＧαサブユニットは、Ｎ末端にＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓの配列を有しており、この配列はこれらのタンパク質のミリストイル化及びパルミトイル化に必要で十分な配列と言われている。タンパク質のアミノ酸配列中にミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルが存在するかどうかは、例えば、前記の「Ｔｈｅ  ＭＹＲ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ」及び「ＣＳＳ−Ｐａｌｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０」で予測可能である。
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
（１）本発明の核酸
本発明の核酸は、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸残基が付加及び／又は挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸であって、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のＮ末端に脂質修飾シグナルを含むアミノ酸配列が付加されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸、及び／又はレトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のマトリックスドメイン（ＭＡドメイン）のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸残基が挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸であり、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のＮ末端に脂質修飾シグナルを含むアミノ酸配列が付加されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列からなる核酸、及び／又はレトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のＭＡドメインのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸残基が挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列からなる核酸が好ましい。本発明において「レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列にアミノ酸残基が付加されてなる変異型Ｇａｇタンパク質」とは、Ｇａｇタンパク質が本来有するＮ末端のメチオニン残基又はＮ末端から１〜５残基のアミノ酸残基に換えて新たなアミノ酸残基が付加されてなる変異型Ｇａｇタンパク質のことを言う。なお、本明細書において、アミノ酸残基の「挿入」とは、特定位置のアミノ酸残基の間に、新たなアミノ酸残基が追加される場合を意味する。また、本発明を特に限定するものではないが、上記の「変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列」は、変異型Ｇａｇタンパク質とＰｏｌタンパク質との融合タンパク質コードする核酸配列の一部であることが好ましい。すなわち、変異型Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸は、本発明の核酸の好適な態様の一つである。
【００２８】
上記のレトロウイルス由来のＧａｇタンパク質としては、レトロウイルス由来のものであれば特に限定はないが、例えばＭＭＬＶ等のオンコレトロウイルス由来のＧａｇタンパク質、及びＨＩＶ−１やＳＩＶ等のレンチウイルス由来のＧａｇタンパク質が好適に例示される。
【００２９】
本発明における変異型Ｇａｇタンパク質は、脂質修飾シグナルをそのＮ末端領域に有する。例えば、本発明における「レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のＮ末端に脂質修飾シグナルを含むアミノ酸配列が付加されてなる変異型Ｇａｇタンパク質」においては、付加されるアミノ酸配列のＮ末端領域に存在する脂質修飾シグナルが新たに存在することになり、当該Ｇａｇタンパク質が本来有するミリストイル化シグナルはＮ末端へのアミノ酸配列の付加の結果その機能を失うことになる。また、例えば、本発明における「レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のマトリックスドメインのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸残基が挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質」においては、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質が元来有するミリストイル化シグナルをそのまま保持するようにＭＡドメインにアミノ酸残基が挿入されているか、当該レトロウイルスが本来有さない脂質修飾シグナルがＮ末端領域に存在するようにアミノ酸残基が挿入されていればよい。本発明における変異型Ｇａｇタンパク質は、そのＮ末端近傍に塩基性アミノ酸残基に富んだ領域（塩基性領域）を有することが好ましい。この塩基性領域としては、特に本発明を限定するものではないが、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のＮ末端近傍の塩基性領域を利用することができる。
【００３０】
また、本発明における「レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のＮ末端に脂質修飾シグナルを含むアミノ酸配列が付加されてなる変異型Ｇａｇタンパク質」としては、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列に、好ましくは、Ｎ末端のメチオニン残基又はＮ末端から１〜５残基のアミノ酸残基に換えて、１以上の残基、好ましくは６〜１００残基、より好ましくは７〜５０残基、さらに好ましくは７〜３０残基、更により好ましくは８〜２５残基のアミノ酸残基が付加されてなる変異型Ｇａｇタンパク質が例示される。また、本発明における「レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のマトリックスドメインのアミノ酸配列に１以上のアミノ酸残基が挿入されてなる変異型Ｇａｇタンパク質」としては、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のＭＡドメインのアミノ酸配列に、１以上の残基、好ましくは１〜１００残基、より好ましくは６〜１００残基、さらに好ましくは７〜５０残基、さらに好ましくは７〜３０残基、更により好ましくは８〜２５残基のアミノ酸残基が挿入されてなり、かつそのＮ末端領域に脂質修飾シグナルを有する変異型Ｇａｇタンパク質が例示される。なお、本発明における変異型Ｇａｇタンパク質としては、前記位置におけるアミノ酸残基の付加及び／又は挿入があれば特に限定はなく、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列の前記の位置以外においても、例えば１若しくは数個のアミノ酸残基の範囲でアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加等が生じたアミノ酸配列を有するものも包含する。よって、変異型Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列とレトロウイルス由来野生型Ｇａｇタンパク質のアミノ酸配列との相同性は、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上である。本明細書において、相同性は、ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、ＦＳＡ−ＢＬＡＳＴ(http://www.fsa-blast.org/)、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ(http://blast.wustl.edu/)やＦＡＳＴＡ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘなど様々なアルゴリズムを搭載したプログラムにより算出することができる。
【００３１】
付加及び／又は挿入される１以上のアミノ酸残基としては、Ｇａｇタンパク質のＮ末端に付加される場合は、脂質修飾シグナルを含むアミノ酸配列を構成するものであれば特に限定はなく、脂質修飾シグナルとリンカー配列とを含むアミノ酸配列を構成するものであってもよい。Ｇａｇタンパク質のマトリックスドメインに挿入される場合は、レトロウイルス由来Ｇａｇタンパク質が元来有するミリストイル化シグナルをそのまま保持するように挿入されるか、当該レトロウイルスが本来有さない脂質修飾シグナルがＮ末端領域に出現するように挿入されるアミノ酸残基であれば特に限定はない。
【００３２】
本発明に使用される脂質修飾シグナルは、ウイルス由来のものであっても非ウイルス由来のものであってもよい。本発明に使用されるウイルス由来の脂質修飾シグナルとしては、本発明を特に限定するものではないが、ＭＭＬＶ等のオンコレトロウイルス由来のミリストイル化シグナル、及びＨＩＶ−１やＳＩＶ等のレンチウイルス由来のミリストイル化シグナルが好適に例示される。また、本発明に使用される非ウイルス由来の脂質修飾シグナルとしては、本発明を特に限定するものではないが、真核生物由来のタンパク質が有する脂質修飾シグナルが例示される。本発明に使用される非ウイルス由来の脂質修飾シグナルとしては、本発明を特に限定するものではないが、非ウイルス由来のミリストイル化シグナル、並びにミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルが好適に例示される。
【００３３】
脂質修飾シグナルとして、ミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルを利用する場合、本発明を特に限定するものではないが、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、Ｇαタンパク質、又は一酸化窒素合成酵素由来のミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルが好ましい。
【００３４】
また、これらの脂質修飾シグナルのアミノ酸配列を適宜改変して本発明に使用することもでき、例えばミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルの配列を改変してパルミトイル化シグナルを欠損させ、ミリストイル化シグナルとして使用することもできる。さらに、公知の脂質修飾シグナルの配列情報に基づいて新規な脂質修飾シグナルを設計してもよい。
【００３５】
本発明の核酸をレトロウイルスベクターの産生に利用することにより、高い力価のウイルスベクターを得ることができる。さらには、本発明の核酸を利用して産生されたレトロウイルスベクターは、従来の方法で得られたものと比較して高い感染性（感染効率）を示す。本発明の核酸を利用して産生したレトロウイルスベクターの力価は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によるウイルス粒子の構造タンパク質の定量結果から算出することができる。ウイルス粒子の構造タンパク質の定量には、例えば市販のｐ２４  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社）を用いることができる。あるいは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、産生されたウイルスＲＮＡ分子を定量することにより測定することができる。レトロウイルスベクターの感染性は、例えばルシフェラーゼ遺伝子や蛍光タンパク質遺伝子のようなマーカー遺伝子を保持させたレトロウイルスベクターを作製してこれを標的細胞に導入し、この結果として得られる当該マーカー遺伝子の発現が認められる細胞の出現率を調べることにより確認できる。
【００３６】
また、本発明の核酸には、上記の変異型Ｇａｇタンパク質をコードする遺伝子（変異型ｇａｇ遺伝子）以外に、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子等の他のレトロウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子が含まれていてもよい。この場合、例えば、変異型ｇａｇ遺伝子とｐｏｌ遺伝子とは、変異型Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする変異型ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子として本発明の核酸に含まれていてもよい。ｅｎｖ遺伝子は、エンベロープ（Ｅｎｖタンパク質）をコードする遺伝子であり、Ｅｎｖタンパク質は、標的細胞膜上に存在する受容体を特異的に認識するため、ウイルスが感染できる細胞を決定する重要な因子の一つである。本発明に使用されるｅｎｖ遺伝子としては、ｇａｇ遺伝子と同じウイルス由来のものを使用することができるが、ｇａｇ遺伝子の由来するレトロウイルスとは異なる宿主域を有するシュードタイプベクターの産生に利用するために、ｇａｇ遺伝子とは異なるウイルス由来のｅｎｖ遺伝子を用いることもできる。ｇａｇ遺伝子とは異なるウイルス由来のｅｎｖ遺伝子としては、例えば、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）由来のｅｎｖ遺伝子や水疱性口内炎ウイルス由来のＧ糖タンパク質（ＶＳＶ-Ｇ）遺伝子が例示される。
【００３７】
（２）本発明のレトロウイルスベクター産生細胞
本明細書に記載の「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルスに属するオンコレトロウイルス、レンチウイルス等を基に遺伝子組換え技術により作製された組換えウイルス粒子（レトロウイルスベクター粒子）を示し、オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターが含まれる。オンコレトロウイルスベクターとしては、例えばモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に基づくベクター等が挙げられる。また、レンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に基づくベクターやサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に基づくベクター等が挙げられる。また、Ｇａｇタンパク質やＰｏｌタンパク質とは異なるウイルス由来のＥｎｖタンパク質を利用してシュードタイプ化されたオンコレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターも、本明細書に記載の「レトロウイルスベクター」に含まれる。好ましい態様において、本発明は複製能を欠損する組換えレトロウイルスベクターの作製に使用される。
【００３８】
一般的なレトロウイルスベクターの産生方法としては、あらかじめｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子等のレトロウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子が染色体上に組み込まれたレトロウイルスパッケージング細胞に、外来遺伝子とパッケージングシグナルを搭載したトランスファーベクターを導入することによって産生させる方法、及びレトロウイルスの構造タンパク質を有さない細胞に、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子やｅｎｖ遺伝子等のレトロウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を有するパッケージングプラスミドと同時に、前記のトランスファーベクターをトランスフェクションして産生させる方法が挙げられる。よって、本発明のレトロウイルスベクターの産生方法としては、後述の本発明のパッケージング細胞を用いて本発明のレトロウイルス産生細胞を調製する工程を含む方法、及び後述の本発明のパッケージングプラスミドを用いて本発明のレトロウイルス産生細胞を調製する工程を含む方法が挙げられる。
【００３９】
前者の場合、効率の良い方法を選択してトランスファーベクターをパッケージング細胞に遺伝子導入すれば、一過性にレトロウイルスベクターを産生するレトロウイルス産生細胞を調製することが可能であり、また、長期安定発現株を樹立してレトロウイルスベクター産生細胞株を樹立することも可能である。
【００４０】
後者の場合、ほとんどの場合が一過性のウイルス産生を目的としており、力価の高いウイルスを得るためにはより高いトランスフェクション効率が要求される。例えば、トランスフェクション効率が高い２９３細胞株や２９３Ｔ細胞株、２９３ＦＴ細胞株を宿主としてレトロウイルスベクター産生細胞を調製することが多い。
【００４１】
本発明においてレトロウイルスベクター産生細胞とは、組換えレトロウイルスベクターの産生のために必要な全ての要素を有する細胞のことをいう。組換えレトロウイルスベクターの産生のために必要な要素としては、変異型ｇａｇ遺伝子が含まれるのであれば特に限定されるものではないが、その他に、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、ＬＴＲ、パッケージングシグナル、組換えレトロウイルスベクターに保持させることが望まれる外来遺伝子が挙げられ、さらにはｒｅｖ遺伝子のようなアクセサリー遺伝子が例示される。
【００４２】
本発明のレトロウイルスベクター産生細胞は、本発明の核酸を有し、レトロウイルスベクターを産生することができる。換言すれば、本発明のレトロウイルスベクター産生細胞は、本発明の核酸にコードされる変異型Ｇａｇタンパク質、変異型Ｇａｇ−Ｐｏｌタンパク質、Ｅｎｖタンパク質、並びにＬＴＲ、パッケージングシグナル、及び外来遺伝子を含有する転写産物等を発現し、当該転写産物がパッケージングされたレトロウイルスベクターを出芽させることができる。
【００４３】
本発明のレトロウイルスベクター産生細胞は、本発明の核酸を有するため、多量のレトロウイルスベクター粒子を産生する事ができる。レトロウイルスベクター粒子等のウイルス粒子の産生量は、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によるウイルス粒子の構造タンパク質（例えばｐ２４）の定量や、ＲＴ−ＰＣＲによるゲノムＲＮＡ量の定量により確認する事が出来る。例えば、ＨＩＶ−１のウイルス粒子量を定量する場合、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡキット（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社製）を利用することができる。
【００４４】
本発明のレトロウイルス産生細胞内において、自己複製可能レトロウイルス粒子の出現を防止する観点からは、変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸配列（変異型ｇａｇ遺伝子）とｅｎｖ遺伝子とは隣接して存在しないことが好ましい。例えば、変異型Ｇａｇ−Ｐｏｌタンパク質をコードする配列と、ｅｎｖ遺伝子とが染色体上の異なる位置に組み込まれたレトロウイルスベクター産生細胞や、変異型Ｇａｇ−Ｐｏｌタンパク質をコードする配列を有するプラスミドと、ｅｎｖ遺伝子を含有する異なるプラスミドの両者が導入されたレトロウイルスベクター産生細胞は、本発明のレトロウイルスベクター産生細胞として好適である。
【００４５】
本発明のレトロウイルスベクター産生細胞の調製に使用されるトランスファーベクターに特に限定はないが、例えばｐＢａｂｅ、ｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）、及びｐＤＯＮ−ＡＩ−２（タカラバイオ社製）等の、レトロウイルスベクター発現用のプラスミドベクターに外来遺伝子を挿入したトランスファーベクターが例示される。また、レンチウイルス由来のトランスファーベクターとしては、ｐＬＶＸシリーズ（クロンテック社製）やｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５（インビトロジェン社製）等が例示される。
【００４６】
トランスファーベクター内に挿入される外来遺伝子は、細胞中に導入することが望まれる任意の遺伝子を選択することができる。例えば、外来遺伝子として、治療の対象となる疾患に関連する酵素や、タンパク質（例えば、酵素、抗体、レセプター、構造蛋白質、増殖因子等）、アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡ干渉を誘導するためのＲＮＡ、フォルスプライマー、腫瘍抗原を特異的に認識するＴ細胞受容体遺伝子等をコードするものを使用することができる。
【００４７】
トランスファーベクターは、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を有していてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、細胞に抗生物質に対する耐性を付与する薬剤耐性遺伝子や、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、酵素活性の検出によって遺伝子導入された細胞を見分けることができるレポーター遺伝子が利用できる。
【００４８】
レトロウイルスベクターにより細胞内に導入しようとする外来遺伝子は、適当なプロモーター、例えば、ＬＴＲのプロモーターや外来プロモーターの制御下に、レトロウイルスベクター発現用のトランスファーベクター内に挿入して使用することができる。また、外来遺伝子の転写を達成するためのプロモーター及び転写開始部位と協働する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列がトランスファーベクター内に存在してもよい。さらに、導入される外来遺伝子は、その下流にターミネーター配列を含有することができる。導入される外来遺伝子は、天然のものでも人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源が異なるＤＮＡ分子同士がライゲーションや当該技術分野で公知の他の手段によって結合されたものであってもよい。
【００４９】
（３）本発明のパッケージングプラスミド
本発明のパッケージングプラスミドは、本発明の核酸を有しており、トランスファーベクターと共に細胞にトランスフェクション等の方法で導入することにより、本発明のレトロウイルスベクター産生細胞の調製に使用することができる。
【００５０】
典型的なパッケージングプラスミドは、プロモーターの制御下に配置されたＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を有する。また、ｅｎｖ遺伝子やその他のウイルス由来アクセサリータンパク質の遺伝子を有するものもある。本発明のパッケージングプラスミドとしては、自己複製可能レトロウイルス粒子の出現を防止する観点から、変異型Ｇａｇ−Ｐｏｌタンパク質をコードする本発明の核酸配列を含み、ｅｎｖ遺伝子を含まないものが好適に例示される。この場合、本発明のパッケージングプラスミドに加えて、トランスファーベクターとｅｎｖ遺伝子を含むｅｎｖベクターを宿主細胞にトランスフェクションすることにより、本発明のレトロウイルスベクターを産生する細胞を調製することができる。また、レンチウイルスベクター産生細胞を調製する場合には、さらにｒｅｖ遺伝子を前記のいずれかのベクターに搭載するか、もしくは別にｒｅｖ遺伝子を含むｒｅｖベクターを上記の各ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションしてもよい。
【００５１】
（４）本発明のパッケージング細胞
本発明のパッケージング細胞は、本発明の核酸を有しており、トランスファーベクターをトランスフェクション等の方法で当該細胞に導入することにより、本発明のレトロウイルスベクター産生細胞が調製される。
【００５２】
パッケージング細胞とは、ウイルス粒子のパッケージングに必要なパッケージングシグナル（ψ配列）を有する核酸を欠き、レトロウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を有する細胞のことをいう。一般的に、パッケージング細胞はｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子を有し、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖタンパク質を発現しうる１以上の発現カセットを有する。また、例えばＧＰ２−２９３パッケージング細胞のように、ｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子を含み、ｅｎｖ遺伝子を含まないパッケージング細胞も知られており、このような細胞を用いる場合は、例えばｐＶＳＶ−ＧのようなＥｎｖタンパク質を発現するプラスミドとトランスファーベクターとを共トランスフェクトすることにより、レトロウイルスベクターを産生させることができる。
【００５３】
パッケージング細胞を作製するための細胞宿主としては、トランスフェクションによる遺伝子導入効率が高い細胞や導入後の構造遺伝子の発現が高い細胞を用いることが好ましく、例えば、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３株やヒト胎児腎細胞２９３株を用いることができる。本発明の核酸やその他のレトロウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子の細胞宿主への導入方法としては、リン酸カルシウム法やリポソームによるトランスフェクション法、エレクトロポレーション法等の一般的な遺伝子導入方法が利用できる。得られたパッケージング細胞は、限界希釈した後、各クローンにトランスファーベクターを導入し、産生されるウイルスの力価を測定して、最も高い力価のウイルスを産生する細胞を選択してクローン化することが好ましい。
【００５４】
（５）本発明のレトロウイルスベクター作製システム
本発明のレトロウイルスベクター作製システムは、本発明のパッケージングプラスミド又は本発明のパッケージング細胞、並びに外来遺伝子を挿入可能なクローニング部位を含むトランスファーベクターを含む。
【００５５】
本発明のレトロウイルスベクター作製システムに含まれる、外来遺伝子を挿入可能なトランスファーベクターとしては、特に本発明を限定するものではないが、ｐＬＸＲＮ、ｐＬＮＨＸ、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２のような一般的なトランスファーベクターが使用可能である。典型的なトランスファーベクターは、外来遺伝子、レトロウイルス由来の末端反復配列（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル、逆転写に必須なプライマー結合部位を有し、これら以外のレトロウイルス由来の遺伝子を有さない。本発明のパッケージング細胞に導入されるトランスファーベクターの５’ＬＴＲのＵ３領域は、目的遺伝子の転写効率を高めるために、例えばサイトメガロウイルス由来のプロモーターのような強力なプロモーターに置換されていてもよい。トランスファーベクターは、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を有していてもよい。また、パッケージング細胞がＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する場合は、ＳＶ４０の複製開始点と結合されたトランスファーベクター用いれば、パッケージング細胞内でのコピー数を増加させることができ、産生されるレトロウイルスベクターの力価を向上させることができる。
【００５６】
本発明のレトロウイルスベクター作製システムの一態様として、本発明のレトロウイルスベクター作製システムに含まれる、外来遺伝子を挿入可能なトランスファーベクターに所望の外来遺伝子を挿入し、得られたトランスファーベクターを本発明のパッケージング細胞にトランスフェクションすることにより、本発明のレトロウイルスベクター産生細胞を調製する事ができる。なお、本発明のパッケージング細胞がｅｎｖ遺伝子を含まない態様の場合は、トランスファーベクターと共にＥｎｖタンパク質を発現可能なエンベローププラスミドをパッケージング細胞にトランスフェクションすることにより、本発明のレトロウイルスベクター産生細胞を調製する事ができる。レンチウイルスベクター産生細胞を調製する場合は、ｒｅｖ遺伝子を含むＲＥＶプラスミドを上記の各ベクターと共にパッケージング細胞にトランスフェクションしてもよい。
【００５７】
また別の態様として、本発明のレトロウイルスベクター作製システムに含まれる、外来遺伝子を挿入可能なトランスファーベクターに所望の外来遺伝子を挿入し、得られたトランスファーベクターと本発明のパッケージングプラスミドとを適切な宿主細胞に共トランスフェクションすることにより、本発明のレトロウイルスベクター産生細胞を調製することができる。本発明のパッケージングプラスミドがｅｎｖ遺伝子を含まない態様の場合は、Ｅｎｖタンパク質を発現可能なエンベローププラスミドを上記のベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションする事により、本発明のレトロウイルスベクター産生細胞を調製する事ができる。レンチウイルスベクター産生細胞を調製する場合は、ｒｅｖ遺伝子を含むＲＥＶプラスミドを上記の各ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションしてもよい。
【００５８】
（６）本発明のレトロウイルスベクター
本発明のレトロウイルスベクターは、本発明のレトロウイルスベクター産生細胞により産生される。本発明のレトロウイルスベクターは高い感染性を示すため、例えば、遺伝子治療や医薬品等の生産のための標的細胞への遺伝子導入に有用である。本発明のレトロウイルスベクターとしては、特に本発明を限定するものではないが、レンチウイルスベクターやＭＭＬＶに基づくオンコレトロウイルスベクターが好適である。
【００５９】
レトロウイルスベクターの感染性は、例えばルシフェラーゼ遺伝子のようなマーカー遺伝子を保持させたレトロウイルスベクターを標的細胞に導入し、この結果として得られる当該マーカー遺伝子の発現が認められる細胞の出現率を調べることにより確認できる。
【００６０】
本発明のレトロウイルスベクターは、本発明の核酸にコードされる変異型Ｇａｇタンパク質がウイルス粒子の成熟過程でプロセッシングを受けて生成するマトリックス（ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、及びヌクレオカプシド（ＮＣ）の三種類のタンパク質を有し、さらにはトランスファーベクターに由来する、ＬＴＲ、パッケージングシグナル、及び目的遺伝子を含有するＲＮＡを有する。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００６２】
実施例１
Ｎ末端を改変したＧａｇタンパク質（及びＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質）を発現する、レンチウイルスベクター作製用のパッケージングプラスミド（ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクター）の構築は、以下のように行った。【００６３】
まず、ＨＩＶ−１の天然型ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクターのｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子をヒト細胞での発現が最適化されるようにコードするアミノ酸配列を変えることなくコドンオプティマイズすることによって構築されたプラスミドｐｇａｇ−ｐｏｌ〔［ジャーナル  オブ  ジェネラル  ビロロジー、第８９巻、第１９４９頁−１９５５頁（２００８）］、ｐｇａｇ−ｐｏｌに含まれるｐｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の配列を配列表の配列番号：１に示す。〕を、野生型ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクタープラスミドＷＴ  ＬＶ＿Ｇａｇとした。【００６４】
次に、Ｌｙｎ由来の１１アミノ酸残基からなるｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ（ミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナル）及びリンカー配列からなる計２４アミノ酸残基（配列番号：２）を野生型Ｇａｇタンパク質のＮ末端側から２残基分のアミノ酸に換えて付加した変異型Ｇａｇタンパク質（変異型Ｇａｇ−Ｐｏｌタンパク質）を発現するベクタープラスミドＬｙｎ  ＭｙＰａ  ＬＶ＿Ｇａｇについて、プラスミドＷＴ  ＬＶ＿Ｇａｇ中のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の核酸配列を改変することにより構築した。プラスミドＬｙｎ  ＭｙＰａ  ＬＶ＿Ｇａｇ中のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の核酸配列を配列番号：３に示す。【００６５】
また、プラスミドＬｙｎ  ＭｙＰａ  ＬＶ＿Ｇａｇの核酸配列を改変することにより、プラスミドＬｙｎ  ＭｙＰａ  ＬＶ＿Ｇａｇにより発現される変異型Ｇａｇタンパク質のＮ末端から３番目のシステインのアラニンへの置換によってＬｙｎ由来ミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾シグナルがミリストイル化シグナルに変換された変異型Ｇａｇタンパク質（変異型Ｇａｇ−Ｐｏｌタンパク質）を発現するベクタープラスミドＬｙｎ  Ｍｙ  ＬＶ＿Ｇａｇを構築した。Ｌｙｎ  Ｍｙ  ＬＶ＿Ｇａｇが発現する変異型Ｇａｇタンパク質のＮ末端２４残基のアミノ酸配列を配列番号：４に示し、Ｌｙｎ  Ｍｙ  ＬＶ＿Ｇａｇ中のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の核酸配列を配列番号：５に示す。【００６６】
続いて、ＨＩＶのミリストイル化シグナル及びリンカー配列からなる計２４アミノ酸残基（配列番号：６）を野生型Ｇａｇタンパク質のＮ末端側から２残基分のアミノ酸に換えて付加した変異型Ｇａｇタンパク質を発現するベクタープラスミドＨＩＶ−１  Ｍｙ  ＬＶ＿Ｇａｇ、及びＭＭＬＶのミリストイル化シグナル及びリンカー配列からなる計２４アミノ酸残基（配列番号：８）を野生型Ｇａｇタンパク質のＮ末端側から２残基分のアミノ酸に換えて付加した変異型Ｇａｇタンパク質を発現するベクタープラスミドＭＬＶ  Ｍｙ  ＬＶ＿Ｇａｇについて、プラスミドＷＴ  ＬＶ＿Ｇａｇ中のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の核酸配列を改変することによりそれぞれ構築した。プラスミドＨＩＶ−１  Ｍｙ  ＬＶ＿Ｇａｇ中のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の核酸配列及びＭＬＶ  Ｍｙ  ＬＶ＿Ｇａｇ中のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の核酸配列をそれぞれ配列番号：７、配列番号：９に示す。【００６７】
上記の各ｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクタープラスミドにより発現されるＧａｇタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列を、表１に示す。なお、各プラスミドにより発現されるＧａｇタンパク質は、Ｎ末端から２番目のグリシンが翻訳後修飾によってミリストイル化される。また、Ｌｙｎ  ＭｙＰａ  ＬＶ＿Ｇａｇにより発現されるＧａｇタンパク質は、Ｎ末端から３番目のシステインが翻訳後修飾によってパルミトイル化される。【００６８】
【表１】
2011062155.tif 000002
【００６９】
実施例２
ウイルス液の調製は以下の手順で行った。６ウェルの培養用プレート（ヌンク社）の各ウェルに５×１０５個の２９３ＦＴ（インビトロジェン社）を添加し２４時間培養した。培地には１０％ウシ胎仔血清（ジャパンバイシーラム社）及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社）を使用した。次に、実施例１で作製したｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクタープラスミド各１μｇについて、それぞれレンチウイルスベクタープラスミドｐｌｅｎｔｉ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（インビトロジェン社、ルシフェラーゼ遺伝子を有するトランスファーベクター）  ０．６５μｇ、ＶＳＶＧエンベロープ発現ベクタープラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（クロンテック社）  ０．４〜０．８μｇ、及びＲｅｖ発現ベクタープラスミドｐＲｅｖｐａｃ〔モレキュラー  セル  バイオロジー、第１５巻、１２号、第５１９７頁−５２０７頁（２００４）〕  ０．０５μｇと共に、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いて２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションし、４−６時間後、新しい６ｃｍシャーレ（ヌンク社）に継代してさらに培養した。トランスフェクションから４８時間後、細胞培養上清を回収し、０．４５μｍ  ｆｉｌｔｅｒでろ過し、このろ液をウイルス上清として以下の実験に使用した。【００７０】
ウイルス産生量は、細胞培養上清中のレトロウイルス構造タンパク質ｐ２４をｐ２４  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社）を用いて定量することにより確認した。感染効率は、ウイルス上清を２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した２９３ＦＴ細胞に８００μＬ添加し、その４８時間後にルシフェラーゼ活性をＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて測定することにより確認した。結果を図１に示す。図１において、「ウイルス産生量」はプラスミドＷＴ  ＬＶ＿Ｇａｇを用いて得られた細胞培養上清中のｐ２４の濃度に対する倍数で表示し、「遺伝子導入効率」はプラスミドＷＴ  ＬＶ＿Ｇａｇを用いて調製したウイルスベクターを細胞に感染させた場合のルシフェラーゼ活性に対する倍数で表示した。【００７１】
図１に示す通り、ウイルスの調製に変異型Ｇａｇタンパク質を発現するｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクタープラスミドを用いた場合には、野生型Ｇａｇタンパク質を発現するｇａｇ−ｐｏｌ発現ベクタープラスミドを用いた場合と比較して、ウイルス産生量が４倍以上、感染効率が１１倍以上向上した。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、医薬品等の生産や遺伝子治療のための標的細胞への遺伝子導入に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７３】
SEQ ID NO:1 ; A gag-pol gene encoding a wild type Gag protein derived from HIV.
SEQ ID NO:3 ; A mutant gag-pol gene in plasmid Lyn MyPa LV Gag.
SEQ ID NO:4 ; An amino acid sequence of N-terminal 24 residues of mutant Gag protein expressed by plasmid Lyn My LV_gag.
SEQ ID NO:5 ; A mutant gag-pol gene in plasmid Lyn My LV_Gag.
SEQ ID NO:7 ; A mutant gag-pol gene in plasmid HIV-1 My LV_Gag.
SEQ ID NO:9 ; A mutant gag-pol gene in plasmid MLV My LV_Gag.
SEQ ID NO:11 ; An amino acid sequence of N-terminal 35 residues of mutant Gag protein expressed by plasmid Lyn MyPa LV_Gag.
SEQ ID NO:12 ; An amino acid sequence of N-terminal 35 residues of mutant Gag protein expressed by plasmid Lyn My LV_Gag.
SEQ ID NO:13 ; An amino acid sequence of N-terminal 35 residues of mutant Gag protein expressed by plasmid HIV-1 My LV_Gag.
SEQ ID NO:14 ; An amino acid sequence of N-terminal 35 residues of mutant Gag protein expressed by plasmid MLV My LV_Gag.
【図１】
2011062155.tif 000003
【配列表】
2011062155000001.app
【国際調査報告】
2011062155.tif 000004
2011062155.tif 000005
2011062155.tif 000006
2011062155.tif 000007