(57)【要約】本発明は、多種多様な生理活性物質に対して汎用的に利用することができる、生理活性物質の活性の制御方法を提供する。生理活性物質を、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含む光開裂性ゲルに包含させた後、前記光開裂性ゲルに光を照射し、当該酵素を活性化させることを特徴とする酵素の活性制御方法、生理活性物質が、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含む光開裂性ゲルに包含されていることを特徴とする生理活性物質包含ゲル、及び、光開裂性ゲルに酵素が包含されているカプセル化酵素に光を照射して、当該光開裂性ゲルから酵素を放出させる工程を有し、前記光開裂性ゲルは、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含むことを特徴とするカプセル化酵素の活性化方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含む光開裂性ゲルに包含させた後、前記光開裂性ゲルに光を照射し、当該生理活性物質を活性化させることを特徴とする生理活性物質の活性制御方法。
【請求項２】
前記光開裂性架橋剤が、４腕状ポリエチレングリコール化合物の各ポリエチレングリコール鎖に、前記重合性官能基を含む光開裂性基が、連結基を介して結合している分子であることを特徴とする請求項１記載の生理活性物質の活性制御方法。
【請求項３】
前記光開裂性架橋剤が、下記式（ｃ−１）で表される化合物であることを特徴とする請求項１記載の生理活性物質の活性制御方法。
【化１】
2011093461.tif 000026
【請求項４】
前記光開裂性ゲルが、さらに、２以上の重合性官能基を有する非光開裂性カチオン性架橋剤を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の生理活性物質の活性制御方法。
【請求項５】
前記光開裂性架橋剤が、重合性官能基を含む光開裂性基を２以上と、前記光開裂性基同士を連結するカチオン性骨格とを有する分子であることを特徴とする請求項１記載の生理活性物質の活性制御方法。
【請求項６】
前記重合性官能基がアクリル酸残基であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の生理活性物質の活性制御方法。
【請求項７】
前記光開裂性ゲルが、前記光開裂性架橋剤とゲル素材とを共重合して得られるゲルであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の生理活性物質の活性制御方法。
【請求項８】
前記ゲル素材が、アクリル酸若しくはその誘導体の重合体であることを特徴とする請求項７記載の生理活性物質の活性制御方法。
【請求項９】
前記生理活性物質が酵素であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の生理活性物質の活性制御方法。
【請求項１０】
生理活性物質が、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含む光開裂性ゲルに包含されていることを特徴とする生理活性物質包含ゲル。
【請求項１１】
前記光開裂性架橋剤が、４腕状ポリエチレングリコール鎖の各ポリエチレングリコール鎖に、前記重合性官能基を含む光開裂性基が、連結基を介して結合している分子であることを特徴とする請求項１０記載の生理活性物質包含ゲル。
【請求項１２】
前記光開裂性架橋剤が、下記式（ｃ−１）で表される化合物であることを特徴とする請求項１０記載の生理活性物質包含ゲル。
【化２】
2011093461.tif 000027
【請求項１３】
前記光開裂性ゲルが、さらに、２以上の重合性官能基を有する非光開裂性カチオン性架橋剤を含むことを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の生理活性物質包含ゲル。
【請求項１４】
前記光開裂性架橋剤が、重合性官能基を含む光開裂性基を２以上と、前記光開裂性基同士を連結するカチオン性骨格とを有する分子であることを特徴とする請求項１０記載の生理活性物質包含ゲル。
【請求項１５】
前記光開裂性基が、置換基を有していてもよいニトロベンジル基であることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の生理活性物質包含ゲル。
【請求項１６】
前記重合性官能基がアクリル酸残基であることを特徴とする請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の生理活性物質包含ゲル。
【請求項１７】
前記光開裂性ゲルが、前記光開裂性架橋剤とゲル素材とを共重合して得られるゲルであることを特徴とする請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の生理活性物質包含ゲル。
【請求項１８】
前記ゲル素材が、アクリル酸若しくはその誘導体の重合体であることを特徴とする請求項１７記載の生理活性物質包含ゲル。
【請求項１９】
前記生理活性物質が酵素であることを特徴とする請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の生理活性物質包含ゲル。
【請求項２０】
光開裂性ゲルに酵素が包含されているカプセル化酵素に光を照射して、当該光開裂性ゲルから酵素を放出させる工程を有し、
前記光開裂性ゲルは、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含むことを特徴とするカプセル化酵素の活性化方法。
【請求項２１】
平均粒子径が１μｍ未満である生理活性物質包含ゲルを、細胞に接触させることにより、当該生理活性物質包含ゲルを細胞内に導入する導入工程と、
前記導入工程後、前記生理活性物質包含ゲルが導入された細胞に光を照射して、当該光開裂性ゲルから生理活性物質を放出させ、当該生理活性物質を活性化させる活性化工程とを有し、
前記生理活性物質包含ゲルは、生理活性物質が、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含む光開裂性ゲルに包含されていることを特徴とする生理活性物質包含ゲルの活性化方法。
【請求項２２】
下記式（ｃ−１）で表される化合物。
【化３】
2011093461.tif 000028
【請求項２３】
下記式（ｅ−１）で表される化合物。
【化４】
2011093461.tif 000029
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素等の生理活性物質の活性を時期的及び空間的に制御する方法、及び当該方法に好適な生理活性物質包含ゲルに関する。
本願は、２０１０年１月２８日に日本国に出願された特願２０１０−１６２１３号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、基質選択性に優れており、純度の高い生成物を効率よく得ることができる、理想的な触媒である。また、多くの酵素は常温で反応するため、高温環境下等の厳しい反応条件を要することの多い無機触媒に比べて、作業性にも優れている。このため、酵素は物質の生産、検査・診断、標的物質の検出等、様々な分野で利用されている。例えば工業分野では、酵素を物質の合成や変換に利用しており、抗体の製造からプラスチック原料の生産に至るまで、幅広い産業工程に応用されている。また、臨床現場では、生体内物質の選択的な高感度検出にも利用されている。【０００３】
一般的に、酵素は変性し易く、時間と共に活性（機能）が低下することが知られている。また、酵素は主にタンパク質であるため、熱やｐＨの変化に弱く、さらに酵素自身が酵素によって分解されてしまう等、使用可能な条件が限られてしまう。このため、より利用し易くするように酵素を改良する方法が求められている。【０００４】
タンパク質をゲルで包括することにより、当該タンパク質の立体構造を損なうことなく安定化できる（例えば、非特許文献１参照。）。これを利用し、現在までに、酵素を固定化することにより、耐久性や利便性が改善することが報告されている。例えば本発明者らは、酵素をシリカネットワークに固定化することにより、酵素を安定に長期間利用することに成功した（例えば、非特許文献２参照。）。このように、酵素の改良を試みた報告は多数なされているものの、酵素活性を温度やｐＨ等の外部刺激によって制御した例は少ない。【０００５】
光は、局所的に刺激を与えることが出来るため、酵素の機能を制御する外部刺激として非常に有用である。光の照射位置を制御することにより、酵素活性の時空間制御が可能になる。光で反応を制御する手法としては、アゾベンゼン等の光により異性化する化合物を酵素に導入する方法（例えば、非特許文献３参照。）や、ケイジド化合物等の光により分子の一部が開裂する化合物を酵素に導入する方法（例えば、非特許文献４〜６参照。）のように、光反応性基で酵素を修飾する方法が幾つか報告されている。前者は、酵素の活性部位付近に光異性化性官能基を導入して酵素活性を阻害し、光照射によって当該官能基の構造を変化させて酵素活性を回復させる方法である。また、後者は、酵素の各タンパク質ドメインを、光開裂性官能基からなるリンカーで離れた位置に保持し、光照射によって当該リンカーを切断して本来のタンパク質の形状に戻すことにより、酵素活性を回復させる方法である。【０００６】
但し、これらの方法により酵素活性を制御するためには、（１）酵素が光反応性官能基の導入により可逆的に活性阻害を起こすことが必要であり、（２）酵素活性を阻害する光反応性官能基が必要であり、（３）酵素活性を制御する位置に光反応性官能基を選択的に導入することが必要であり、（４）導入した光反応性官能基が酵素に導入された状態で光刺激によって応答し、酵素活性を制御できることが必要であるなど非常に条件が厳しい。このため、実際にこれらの方法により活性を制御できた酵素の成功例は少ない。つまり、これらの方法は、特別な構造のデザインを要し、かつ、酵素の構造によっては光反応基を導入することができない等、汎用的な手法ではなかった。また、光刺激応答性を付加することにより、酵素の形状が変化してしまうため、酵素活性が変化したり、失活する場合があるという問題もある。【０００７】
一方で最近、Kloxinらにより、細胞の機能や分化を制御するために、光開裂基とＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を用いて作製された光開裂性のゲルを用いる研究が報告された（例えば、非特許文献７及び８参照。）。細胞を光開裂性のゲルで内包された状態で培養し、特定の領域に光を照射すると、照射部分のゲルが分解されて脆くなるため、その方向に細胞を移動させることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】加藤（Kato）、外３名、アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）、２００２年、第７４巻、ｐ１９１５−１９２１。
【非特許文献２】加藤（Kato）、外４名、アナリスト（Analyst）、２００９年、第１３４巻、ｐ５７７−５８１。
【非特許文献３】シモボジ（Shimoboji）、外５名、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・ジ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、２００２年、第９９巻、ｐ１６５９２−１６５９６。
【非特許文献４】ゾウ（Zou）、外３名、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Journal of the American Chemical Society）、２００２年、第１２４巻、ｐ８２２０−８２２９。
【非特許文献５】エンドウ（Endo）、外３名、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Angewandte Chemie International Edition）、２００４年、第４３巻、ｐ５６４３−５６４６。
【非特許文献６】リ（Li）、外２名、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Journal of the American Chemical Society）、２００８年、第１３０巻、ｐ１０４７４−１０４７５。
【非特許文献７】クロキシン（Kloxin）、外３名、サイエンス（Science）、２００９年、第３２４巻、ｐ５９−６３。
【非特許文献８】ジャイ（Jay）、外１名、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)、２００９年、第２７巻、ｐ５４３−５４４。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、酵素をはじめとする多種多様な生理活性物質に対して汎用的に利用することができる、生理活性物質の活性の制御方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、酵素等の生理活性物質を、光開裂性基を含むゲルに包含させて固定化した後、当該ゲルに光照射をすることにより、光を照射した部位においてのみ、生理活性物質を活性化させることができることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）  生理活性物質を、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含む光開裂性ゲルに包含させた後、前記光開裂性ゲルに光を照射し、当該生理活性物質を活性化させることを特徴とする生理活性物質の活性制御方法、
（２）  前記光開裂性架橋剤が、４腕状ポリエチレングリコール化合物の各ポリエチレングリコール鎖に、前記重合性官能基を含む光開裂性基が、連結基を介して結合している分子であることを特徴とする前記（１）記載の生理活性物質の活性制御方法、
（３）  前記光開裂性架橋剤が、下記式（ｃ−１）で表される化合物であることを特徴とする前記（１）記載の生理活性物質の活性制御方法、
【化１】
2011093461.tif 000002
（４）  前記光開裂性ゲルが、さらに、２以上の重合性官能基を有する非光開裂性カチオン性架橋剤を含むことを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の生理活性物質の活性制御方法、
（５）  前記光開裂性架橋剤が、重合性官能基を含む光開裂性基を２以上と、前記光開裂性基同士を連結するカチオン性骨格とを有する分子であることを特徴とする前記（１）記載の生理活性物質の活性制御方法、
（６）  前記重合性官能基がアクリル酸残基であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の生理活性物質の活性制御方法、
（７）  前記光開裂性ゲルが、前記光開裂性架橋剤とゲル素材とを共重合して得られるゲルであることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の生理活性物質の活性制御方法、
（８）  前記ゲル素材が、アクリル酸若しくはその誘導体の重合体であることを特徴とする前記（７）記載の生理活性物質の活性制御方法、
（９）  前記生理活性物質が酵素であることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の生理活性物質の活性制御方法、
（１０）  生理活性物質が、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含む光開裂性ゲルに包含されていることを特徴とする生理活性物質包含ゲル、
（１１）  前記光開裂性架橋剤が、４腕状ポリエチレングリコール鎖の各ポリエチレングリコール鎖に、前記重合性官能基を含む光開裂性基が、連結基を介して結合している分子であることを特徴とする前記（１０）記載の生理活性物質包含ゲル、
（１２）  前記光開裂性架橋剤が、下記式（ｃ−１）で表される化合物であることを特徴とする前記（１０）記載の生理活性物質包含ゲル、
【化２】
2011093461.tif 000003
（１３）  前記光開裂性ゲルが、さらに、２以上の重合性官能基を有する非光開裂性カチオン性架橋剤を含むことを特徴とする前記（１０）〜（１２）のいずれか一つに記載の生理活性物質包含ゲル、
（１４）  前記光開裂性架橋剤が、重合性官能基を含む光開裂性基を２以上と、前記光開裂性基同士を連結するカチオン性骨格とを有する分子であることを特徴とする前記（１０）記載の生理活性物質包含ゲル
（１５）  前記光開裂性基が、置換基を有していてもよいニトロベンジル基であることを特徴とする前記（１０）〜（１４）のいずれか一つに記載の生理活性物質包含ゲル、
（１６）  前記重合性官能基がアクリル酸残基であることを特徴とする前記（１０）〜（１５）のいずれか一つに記載の生理活性物質包含ゲル、
（１７）  前記光開裂性ゲルが、前記光開裂性架橋剤とゲル素材とを共重合して得られるゲルであることを特徴とする前記（１０）〜（１６）のいずれか一つに記載の生理活性物質包含ゲル、
（１８）  前記ゲル素材が、アクリル酸若しくはその誘導体の重合体であることを特徴とする前記（１７）記載の生理活性物質包含ゲル、
（１９）  前記生理活性物質が酵素であることを特徴とする前記（１０）〜（１８）のいずれか一つに記載の生理活性物質包含ゲル、
（２０）  光開裂性ゲルに酵素が包含されているカプセル化酵素に光を照射して、当該光開裂性ゲルから酵素を放出させる工程を有し、前記光開裂性ゲルは、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含むことを特徴とするカプセル化酵素の活性化方法、
（２１）  平均粒子径が１μｍ未満である生理活性物質包含ゲルを、細胞に接触させることにより、当該生理活性物質包含ゲルを細胞内に導入する導入工程と、
前記導入工程後、前記生理活性物質包含ゲルが導入された細胞に光を照射して、当該光開裂性ゲルから生理活性物質を放出させ、当該生理活性物質を活性化させる活性化工程とを有し、
前記生理活性物質包含ゲルは、生理活性物質が、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含む光開裂性ゲルに包含されていることを特徴とする生理活性物質包含ゲルの活性化方法、
（２２）  下記式（ｃ−１）で表される化合物、
【化３】
2011093461.tif 000004
（２３）  下記式（ｅ−１）で表される化合物、
【化４】
2011093461.tif 000005
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の生理活性物質の活性制御方法では、外部刺激として光照射を利用することにより、酵素等の生理活性物質の活性の発現を時期的及び空間的に制御することができる。特に、本発明においては、酵素等の生理活性物質に直接修飾等を行う必要がないため、詳細な条件検討等を要することなく、様々な生理活性物質に対して容易に適用することが可能である。
また、本発明の生理活性物質包含ゲルは、安定して長期間保存が可能である上、ゲル中に含まれている光開裂性基に適した波長の光を照射するだけで、簡便かつ精密に、生理活性物質の活性を発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のカプセル化酵素を活性化して利用する工程を模式的に示した図である。
【図２】図２（Ａ）は、光開裂性架橋剤として用いる４腕ＰＥＧ化合物の構造の代表的な構造式であり、図２（Ｂ）は、設定された仮想的なゲル構造の模式図である。
【図３】４腕ＰＥＧ化合物の各ＰＥＧ鎖の先端に、長さの等しいアクリルアミド鎖が重合する理想的な結合状態を、模式的に示した図である。
【図４】実施例１〜５において用いた光開裂性架橋剤の合成経路を示した図である。
【図５】実施例１において製造された光開裂性ゲルに、３６５ｎｍの光を照射することによりゲル中の光開裂性基が開裂する反応を、化学式及び模式図で示している。
【図６】実施例１において、光開裂基の有無、及び紫外（ＵＶ）光照射の有無による各ウェルの蛍光シグナルの測定結果を示した図である。
【図７】実施例２において、照射したＵＶ光の強度ごとの各ウェルの蛍光シグナルの測定結果を示した図である。
【図８】実施例３において、トリプシン含有光開裂性ゲルとトリプシン溶液の保存後に残存する酵素活性の割合（％）を示した図である。
【図９】実施例４において、酵素ごとの各ウェルの蛍光シグナルの測定結果を示した図である。
【図１０】実施例５において、４５０ｎｍの吸光度による、酵素−抗体の相互作用の測定結果を示した図である。
【図１１】実施例６において、各ウェルの蛍光シグナルの測定結果を示した図である。
【図１２】実施例７において、ＵＶ照射前のナノ粒子ゲルのＴＥＭによる顕微鏡画像である。
【図１３】実施例７において、ＵＶ照射前のナノ粒子ゲルの粒子径分布を示した図である。
【図１４】実施例７において、ＵＶ照射後のナノ粒子ゲルのＴＥＭによる顕微鏡画像である。
【図１５】実施例７において、ＵＶ照射後のナノ粒子ゲルの粒子径分布を示した図である。
【図１６】実施例８において、カスパーゼ包含ナノ粒子ゲルを導入した直後の細胞と、２４時間培養後の細胞の蛍光像（テキサスレッド）及び明視野像である。
【図１７】実施例１１において、フルオレセイン包含ナノ粒子ゲル又はフルオレセイン溶液を培養液に添加した細胞の蛍光像（フルオレセイン）と明視野像である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の生理活性物質の活性制御方法は、酵素等の生理活性物質を、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含む光開裂性ゲルに包含させた後、前記光開裂性ゲルに光を照射し、当該生理活性物質を活性化させることを特徴とする。酵素等の生理活性物質をゲルに包含させて固定化することにより、変性や分解等を効果的に抑制することができ、長期間安定化する（非活性の状態で保存する）ことができる。また、本発明においては、酵素等の生理活性物質を包含させるゲルとして、光開裂性基を含有するゲル（光開裂性ゲル）を用いている。生理活性物質が酵素である場合を例に挙げて、活性化の機序を説明する。光開裂性ゲルに当該光開裂性基を開裂させることができる波長の光を照射すると、照射領域中の光開裂性基が開裂してゲルのネットワーク（網目構造）が崩壊する。つまり、酵素を含有する光開裂性ゲルに適当な波長の光を照射すると、照射領域中では、酵素を固定していたゲルのネットワークが崩壊し、酵素の動きの自由度が増すことにより酵素が活性化する。一方で、非照射領域では、ゲルのネットワークは維持されるため、酵素は活性化しない。このように、本発明の生理活性物質の活性制御方法では、光を照射する時期、時間、及び領域を制御することにより、簡便に酵素等の生理活性物質の活性の発現を時期的及び空間的に制御することができる。
【００１５】
なお、本発明及び本願明細書においては、生理活性物質とは、生体内において、何らかの活性や機能を有している物質を意味する。生理活性物質としては、例えば、抗原、ホルモン等の伝達物質等が挙げられる。
【００１６】
本発明及び本願明細書においては、光開裂性ゲルに包含された生理活性物質を、生理活性物質包含ゲルという。また、本発明及び本願明細書においては、光開裂性ゲルに包含された酵素を、カプセル化酵素という。つまり、本発明の生理活性物質包含ゲルにおいて、生理活性物質が酵素であるものを、特に、本発明のカプセル化酵素ということがある。本発明のカプセル化酵素及び生理活性物質包含ゲルは、変性や分解を受け難く、長期間安定して保存することができる。
【００１７】
以下、本発明の生理活性物質の活性制御方法を、主に、生理活性物質が酵素である場合を例に挙げて説明する。
【００１８】
図１は、本発明のカプセル化酵素を活性化して利用する工程を模式的に示した図である。直鎖状のゲル素材２同士を、４腕の光開裂性架橋剤３により架橋されて形成された光開裂性ゲルにおいて、ゲルの網目の空隙に酵素４が包含されているカプセル化酵素１に、基質５を含む溶液６を接触させる（左図）。このカプセル化酵素１に光（図中、塗りつぶし矢印）を照射すると、光開裂性架橋剤３が開裂してゲルが崩壊し、酵素４が溶液中へと放出される（中図）。なお、図中の白抜き矢印は、酵素が溶液中に放出される様子を模式的に示している。ゲルから放出された酵素４は、溶液中の基質５に作用し、酵素反応が進行する（右図）。
【００１９】
光開裂性ゲル中の光開裂性基が開裂する程度は、当該ゲルへ照射する光の量に依存する。光開裂性ゲルへの光照射量が多いほど、照射領域のゲルがより多く崩壊するため、活性化される酵素量も多くなる。したがって、照射する光の強度や照射時間を調整して光の照射量を制御することにより、活性化する酵素量を制御することができる。
【００２０】
また、光開裂性ゲルの表面に対して光を照射することにより、ゲル表面のネットワークの崩壊により、酵素を当該ゲルから放出させることができる。一方、光開裂性ゲルの内部の特定の領域に焦点を合わせて光を照射し、当該焦点領域にのみ充分量の光が照射されるようにすることで、ゲル内部の特定の領域においてのみ、酵素を活性化させることも可能である。
【００２１】
近年の光学技術の発展により、光の照射の時期、時間、領域、及び量は、厳密に制御することが可能である。本発明の酵素の活性制御方法は、酵素活性の制御のための外部刺激として光を用いているため、酵素活性の発現制御を精密に行うことができ、必要な時に必要な場所で、必要な量（程度）の酵素活性を発現させることができる。
【００２２】
酵素を包含させる光開裂性ゲルは、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤を含むものであって、ネットワークが形成されるゲルであればよい。具体的には、重合性官能基を有する光開裂性架橋剤とゲル素材とを共重合して得られるゲルが挙げられる。光開裂性架橋剤の種類によっては、光開裂性架橋剤のみからネットワークが形成されるゲルであってもよい。
【００２３】
光開裂性ゲルを構成する光開裂性架橋剤が有する重合性官能基は、共重合性のゲルを作製する際に一般的に用いられている重合性官能基の中から適宜選択して用いることができる。本発明においては、光開裂性架橋剤が有する重合性官能基としては、ラジカル重合やカチオン重合、アニオン重合、配位重合、開環重合により互いに重合する官能基であることが好ましく、ラジカル重合により互いに重合する官能基であることがより好ましく、反応部位としてビニル基を有する官能基であることがさらに好ましい。このような重合性官能基としては、例えば、アクリル酸残基、ビニルフェニル基、スチレン基、ジエン基、ビニルエステル基、ビニルアミド基、塩化ビニル基、ビニルエーテル基等が挙げられる。中でも、アクリル酸残基であることがより好ましい。
【００２４】
光開裂性ゲルを構成するゲル素材としては、光開裂性架橋剤が有する重合性官能基と重合可能な重合性官能基を有しており、かつ、ゲル化の前後において、酵素活性に対する影響の小さいものであれば、特に限定されるものではなく、公知のゲル素材の中から、包含させる酵素の種類等を考慮して適宜選択して用いることができる。なお、本発明において「ゲル素材」とは、重合体等の鎖状構造を有するものと、重合体の構成単位である単量体（重合性モノマー）の両方を含む。
【００２５】
ゲル素材が有する重合性官能基は、光開裂性架橋剤が有する重合性官能基と重合可能であればよく、具体的には、光開裂性架橋剤が有する重合性官能基として前記で列挙された重合性官能基の中から、適宜選択して用いることができる。また、ゲル素材が有する重合性官能基は、光開裂性架橋剤が有する重合性官能基と同種の官能基であってもよく、異種の官能基であってもよい。さらに、ゲル素材としては、1種類のゲル素材のみを用いてもよく、同種の重合性官能基を有する複数のゲル素材を混合して用いてもよく、互いに共重合可能な異種類の重合性官能基を有する複数のゲル素材を混合して用いてもよい。
【００２６】
本発明においては、酵素等の生理活性物質への影響が少なく、取り扱いが容易であることから、アクリル酸又はその誘導体をゲル素材とすることが好ましい。アクリル酸又はその誘導体（以下、両者をまとめて単に「アクリル酸誘導体」ということがある。）としては、具体的には、アクリル酸、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸、アリルデキストリン等が挙げられる。
【００２７】
これらのアクリル酸誘導体の１種類又は２種類以上をゲル素材とし、アクリル酸誘導体と重合可能な重合性官能基（例えば、アクリル酸残基やスチレン残基等）を有する光開裂性架橋剤と共重合させることにより、光開裂性ゲルを製造することができる。本発明においては、汎用されていることから、アクリルアミドとアクリル酸残基を有する光開裂性架橋剤とを共重合させて得られる光開裂性ポリアクリルアミドゲルであることが好ましい。
【００２８】
また、光開裂性架橋剤と共重合可能なゲル素材と、無水マレイン酸等の、それ単独では共重合不可能であるが、他の重合性官能基と共存することにより共重合を起こすような化合物とを、併用して用いてもよい。
【００２９】
その他、例えば、ゲル素材として汎用されている分子中に、光開裂性架橋剤が有する重合性官能基と重合可能な重合性官能基を導入したものを用いることができる。例えば、分子中の水酸基等に適当な重合性官能基を適宜導入したアガロースをゲル素材とし、光開裂性架橋剤と共重合させることにより、光開裂性アガロースゲルを製造することができる。また、分子中の水酸基等に適当な重合性官能基を適宜導入したケイ酸塩をゲル素材とし、光開裂性架橋剤と共重合させることにより、光開裂性シリカゲルを製造することができる。
【００３０】
光開裂性ゲルの作製には、重合性官能基を導入したゲル素材と、導入していないゲル素材とを混合して用いてもよい。例えば、重合性官能基を導入したアガロースと、未修飾のアガロースとを混合して用いることができる。
【００３１】
なお、光開裂性アガロースゲルを作製する場合、ゲル素材として用いるアガロースは、低融点のものであるほうが好ましい。また、アガロース中への重合性官能基の導入部位は、特に限定されるものではないが、両末端の糖の水酸基にそれぞれ１個ずつ導入されたものであることが好ましい。
【００３２】
光開裂性ゲルを構成する光開裂性架橋剤としては、１分子当たり少なくとも２個の重合性官能基と少なくとも１個の光開裂性基を有しているものであれば、特に限定されるものではない。光開裂性基の開裂により、より効率よくゲルのネットワークを崩壊させることができるため、１個の重合性官能基の近傍に、１個の光開裂性基が配置されている分子であることが好ましい。中でも、２以上の腕を持つ化合物を骨格とし、各腕の末端に、重合性官能基含有光開裂性基（重合性官能基に直接若しくは適当な連結基を介して結合している光開裂性基）を結合させた化合物であることが好ましい。
【００３３】
光開裂性架橋剤に含まれる光開裂性基としては、光エネルギーにより開裂する構造を有しており、かつ、重合性官能基に直接若しくは適当な連結基を介して結合することが可能な官能基であれば、特に限定されるものではなく、公知の光開裂性基の中から適宜選択して用いることができる。例えば、ｏ−ニトロベンジルエーテル基（例えば、Wang, J. Org. Chem., 1976, vol.41, p3256-3261参照。）、クマリン−４−イルメチル基等が挙げられる。これらの官能基は、光開裂性を損なわない範囲において、置換基を有していてもよい。このような置換基としては、例えば、アルキル基、アルキルオキシ基等が挙げられる。
【００３４】
具体的には、下記式（ｐ０−１）〜（ｐ０−４）の構造を有する化合物又はこれらに対して適宜修飾した化合物（光開裂性化合物）を、光開裂性基として用いることができる。
【化５】
2011093461.tif 000006
【００３５】
式（ｐ０−１）は、４−（４−（１−ヒドロキシエチル）−２−メトキシ−５−ニトロフェノキシ）酪酸〔4-(4-(1-Hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butyric acid〕であり（例えば、Holmes, J. Org. Chem., 1997, vol.62, p2370-2380参照。）、２６０〜３６５ｎｍの光で開裂させることができる。
式（ｐ０−２）は、３−（４−（１−ヒドロキシエチル）−２−メトキシ−５−ニトロフェノキシ）−１−アミノプロパン〔3-(4-(1-Hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)-1-aminopropan〕であり、式（ｐ０−１）の化合物と同様に、２６０〜３６５ｎｍの光で開裂させることができる。
式（ｐ０−３）は、５−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェノキシ）−２−ニトロベンジルラクテート〔5-(2-chloro-4-trifluoromethylphenoxy)-2-nitrobenzyl lactate〕であり、２６０〜３４５ｎｍの光で開裂させることができる。
式（ｐ０−４）は、［６，７−ビス（カルボキシメトキシ）クマリン−４−イル］メチル−８−ブロモグアノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸〔[6,7-Bis(carboxymethoxy)coumarin-4-yl]methyl-8-bromoguanosine-3',5'-cyclic monophosphate〕であり、３７０〜３９０ｎｍの光で開裂させることができる。
【００３６】
これらの光開裂性化合物と重合性官能基とを、直接又は適当な連結基を介して結合させることにより、重合性官能基含有光開裂性化合物とすることができる。重合性官能基としてアクリル酸残基を用いる場合には、例えば、これらの光開裂性化合物とアクリル酸のカルボキシル基とを、直接又は適当な連結基を介して結合させることにより、アクリル酸残基含有光開裂性化合物とすることができる。アクリル酸残基含有光開裂性化合物としては、具体的には、下記（ｐ１−１）又は（ｐ１−２）の化合物が挙げられる。このアクリル酸残基含有光開裂性化合物中の、開裂部位に対してアクリル酸残基と反対側となる部位に、他の化合物との結合部位を備えて得られた官能基を、アクリル酸残基含有光開裂性基（アクリル酸残基に直接若しくは適当な連結基を介して結合している光開裂性基）という。アクリル酸残基含有光開裂性基を、２以上の腕を有する骨格となる化合物の各腕の先端に、直接又は適当な連結基を介して、それぞれ結合させることにより、本発明の光開裂性架橋剤を得ることができる。
【００３７】
【化６】
2011093461.tif 000007
【００３８】
本発明においては、重合性官能基含有光開裂性基を結合させる骨格となる化合物の大きさや構造を適宜選択することにより、ゲルの網目の大きさを適宜調整することができる。すなわち、重合性官能基含有光開裂性基を結合させる骨格となる化合物は、包含する生理活性物質の大きさを考慮して決定することができる。
【００３９】
本発明においては、ゲルの網目の大きさを、酵素（例えば、２０〜１００ｋＤａ）を包含する上でより好ましい大きさに調整できるため、重合性官能基含有光開裂性基を結合させる骨格となる化合物は、３以上の腕を有することが好ましく、４又は８腕を有することがより好ましく、４腕化合物であることがさらに好ましい。また、同じくゲルの網目の大きさを好ましい大きさに調整できるため、骨格となる化合物の分子量は、２０００〜４００００であることが好ましく、３６００〜１００００であることがより好ましい。
【００４０】
さらに、適当な大きさを有する光開裂性架橋剤の場合は、光開裂性架橋剤のみを重合させることによっても、適当な大きさの網目を有する光開裂性ゲルを作製することができる。
【００４１】
光開裂性架橋剤の骨格とする化合物としては、ＰＥＧを腕として有するＰＥＧ化合物であることが好ましい。ＰＥＧは、酵素等の生体分子に対する影響が小さいためである。また、ＰＥＧは、重合数を適宜調整することにより、腕の長さや化合物の分子量を調整することもできる。
【００４２】
このような分子量の４腕ＰＥＧ化合物として、具体的には下記一般式（ａ）で表される骨格を有し、かつＸとして表１記載の官能基を有する化合物が挙げられる。一般式（ａ）中、ｎは１以上の整数であれば特に限定されるものではなく、包含させる生理活性物質の大きさに応じて適宜決定することができる。例えば、酵素を包含させる場合には、ｎは１１〜２２７の整数であることが好ましい。これらの化合物は、当該技術分野において公知の化合物を用いて、公知の反応により合成することができる。その他、市販されている化合物を用いてもよい。なお、表１の右欄には、日油株式会社から市販されている試薬名（一部）を示している。
【００４３】
【化７】
2011093461.tif 000008
【００４４】
【表１】
2011093461.tif 000009
【００４５】
その他、光開裂性架橋剤の骨格として用いられるＰＥＧ化合物としては、ベンゼン環やナフタレン環等の芳香環から、適当な連結基を解して２本以上のＰＥＧ鎖（ＰＥＧ腕）が延びている化合物を用いることもできる。芳香環から伸びているＰＥＧ腕は、２本以上であれば特に限定されるものではないが、３本、４本、６本又は８本であることが好ましく、４本であることがより好ましい。このようなＰＥＧ化合物として、具体的には下記一般式（ｂ）で表される化合物等が挙げられる。なお、一般式（ｂ）中、ｎ及びＸは、一般式（ａ）と同じである。また、Ａｒはアリール基を表し、Ｙは連結基を表す。Ｙは、アリール基とＰＥＧ鎖を連結可能な基であれば特に限定されるものではなく、アミド基（−ＮＨＣＯ−）等が挙げられる。
【００４６】
【化８】
2011093461.tif 000010
【００４７】
一般式（ｂ）で表される４腕ＰＥＧ化合物を骨格として用いた光開裂性架橋剤としては、例えば、下記一般式（ｂ−１）で表される化合物等が挙げられる。一般式（ｂ−１）中、ｎは一般式（ｂ）と同じである。
【００４８】
【化９】
2011093461.tif 000011
【００４９】
上記一般式（ｂ−１）で表される化合物は、例えば、国嶋試薬（2-chloro-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine）（ＣＡＳ番号：３１４０−７３−６、製品番号：３２９−５３７５１、和光純薬工業社製）等を用いて、メタノール等の溶媒中で、下記一般式（ｂ０−３）で表される化合物の腕の先端にあるアミノ基に、上記式（ｐ１−１）等の重合性基を含有する光開裂性基を結合させることにより合成することができる。また、下記一般式（ｂ０−３）で表される化合物は、下記に示すように、例えば、ベンゼンテトラアミン（ＣＡＳ番号：４５０６−６６−５）水溶液に下記一般式（ｂ０−１）で表される化合物の水溶液を加えて、国嶋試薬を用いて縮合し、得られた化合物について保護基を酸性条件で除去することにより、合成することができる。下記一般式（ｂ０−１）で表される化合物としては、例えば、Boc-NH-(PEG)-COOHDCHA (9atoms)（ＣＡＳ番号：５６００８８−７９−１）、Boc-NH-(PEG)3-COOH(16atoms)（ＣＡＳ番号：７５６５２５−９１−４）（いずれも、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）等を用いることができる。一般式（ｂ０−１）〜（ｂ０−３）中、ｎは一般式（ｂ）と同じである。
【００５０】
【化１０】
2011093461.tif 000012
【００５１】
光開裂性ゲルに包含されている酵素は、光開裂性ゲルのネットワークの空隙に存在する。光開裂性ゲルの網目の大きさ（繊維状のゲル及び光開裂性架橋剤とからなるネットワークの空隙の大きさ）があまりに大きい場合には、酵素はネットワークの空隙間を移動してしまうおそれがある。一般的に酵素の大きさは、球形に近似した場合に直径が１０ｎｍ以下となるような大きさであるため、本発明においては、網目の孔径の平均値が３〜２０ｎｍ程度となるように、光開裂性ゲルを調製することが好ましい。ゲルのネットワークでは、網目が重なり合っているため、網目の孔径の平均値がこの程度であれば、各網目に包含された酵素はゲル中を移動し難くなり、ゲル中の光開裂性基を開裂させる前に酵素がゲルから放出されることをより効果的に防止することができ、各網目の中に、酵素を非常に安定的に保持することが期待できる。
【００５２】
包含させる生理活性物質の分子量が比較的小さい場合には、酵素の場合よりも、ゲルの網目の大きさ（網目の孔径）をより小さくすることが好ましい。例えば、２以上の腕を有し、分子量が２００〜４０００である化合物を、重合性官能基含有光開裂性基を結合させる骨格として用いることができる。また、重合性官能基含有光開裂性基を結合させる骨格として、上記一般式（ａ）や（ｂ）で表されるような４腕ＰＥＧ化合物を用いる場合には、一般式（ａ）又は（ｂ）中、ｎが１〜２７の整数であることが好ましい。
【００５３】
その他、下記式（ｃ−１）で表される化合物を光開裂性架橋剤として用いることも好ましい。下記式（ｃ−１）で表される化合物を光開裂性架橋剤として用いることにより、網目の孔径が、低分子化合物のような分子量の小さい生理活性物質を包含するために適した大きさである光開裂性ゲルを作製することができる。
【００５４】
【化１１】
2011093461.tif 000013
【００５５】
また、光開裂性架橋剤の骨格として、正又は負に帯電した化合物を用いることにより、正又は負に帯電した光開裂性ゲルに、生理活性物質を包含させることができる。例えば、光開裂性架橋剤として、重合性官能基を含む光開裂性基を２以上と、前記光開裂性基同士を連結するカチオン性骨格とを有する分子を用いることにより、正に帯電した生理活性物質包含ゲルを得ることができる。
【００５６】
光開裂性架橋剤のカチオン性骨格としては、例えば、DAB-Am-4,Polypropylenimine tetraamine dendrimer,generation 1.0（ＣＡＳ番号：１２０２３９−６３−６（４腕）、製品番号：４６０６９９−５ＭＬ）（以下、「ＤＡＢ−Ａｍ−４」）、DAB-AM-8, Polypropylenimine octaamine Dendrimer, Generation 2.0（ＣＡＳ番号：１５４４８７−８３−９（８腕）、製品番号：４６０７２９）、PAMAM dendrimer, ethylenediamine core, generation 0.0（ＣＡＳ番号：１５５７７３−７２−１（４腕）、製品番号：４１２３６８−５Ｇ）、PAMAM dendrimer, ethylenediamine core, generation 1.0（ＣＡＳ番号：１４２９８６−４４−５（８腕）、製品番号：４１２３８４）、PAMAM dendrimer, ethylenediamine core, generation 2.0（ＣＡＳ番号：９３３７６−６６−０（１６腕）、製品番号：４１２４０６）、PAMAM dendrimer, ethylenediamine core, generation 3.0（ＣＡＳ番号：１５３８９１−４６−４（３２腕）、製品番号：４１２４２２）、N-(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミン（ＣＡＳ番号：１３５３１−５２−７（２腕）、製品番号：１２７１５９）（いずれも、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＣＡＳ番号：４０９７−８９−６、製品番号：５７１−４０８２１、和光純薬工業社製）、N,N’ -bis(3-Aminopropyl)propane-1,3-diamine（ＣＡＳ番号：４６０５−１４−５、広栄化学工業社製）等の第３級アミン又は第２級アミンを用いることができる。これらのアミン類の腕の先端にあるアミノ基に、国嶋試薬等を用いて、上記式（ｐ１−１）等の重合性基を含有する光開裂性基を結合させることにより、カチオン性の光開裂性架橋剤を得ることができる。
【００５７】
ＤＡＢ−Ａｍ−４を骨格として用いた光開裂性架橋剤としては、例えば、下記式（ｄ−１）で表される化合物が挙げられる。下記式（ｄ−１）で表される化合物は、例えば、上記式（ｐ１−１）を精製後メタノールに溶解させた後、ＤＡＢ−Ａｍ−４メタノール溶液と混合し、国嶋試薬等を用いて縮合させることにより、合成することができる。このような光開裂性架橋剤を用いることにより、生理活性物質が、網目の孔径が十分に小さく、かつ正に帯電している光開裂性ゲルに包含された生理活性物質包含ゲルを製造することができる。
【００５８】
【化１２】
2011093461.tif 000014
【００５９】
なお、例えば、電荷を帯びていない化合物を光開裂性架橋剤として用いた場合であっても、電荷を帯びている非光開裂性架橋剤を併用することにより、正又は負に帯電した光開裂性ゲルに、生理活性物質を包含させることができる。例えば、上記式（ｃ−１）で表される化合物と、２以上の重合性官能基を有する非光開裂性カチオン性架橋剤とを併用したり、１以上の重合性官能基を有する非光開裂性カチオン性モノマー等のカチオン性のゲル素材を用いることにより、正に帯電した生理活性物質包含ゲルを製造することができる。当該非光開裂性カチオン性架橋剤としては、例えば、下記式（ｅ−１）で表される化合物が挙げられる。
【００６０】
【化１３】
2011093461.tif 000015
【００６１】
本発明及び本願明細書において、「網目の孔径」とは、ゲルの網目の大きさを指す言葉であって、立体的な網目を真球形の空間に代表させた場合の、当該真球の直径を意味する。光開裂性ゲルの網目の孔径は、光開裂性ゲルの電子顕微鏡写真を用いた画像解析法等の公知の手法により、実測値を求めることもできるが、当該ゲルの仮想的な構造に基づいて算出してもよい。ゲル素材と光開裂性架橋剤とを共重合して得られるゲルの場合には、仮想的なゲル構造は、ゲル素材及び光開裂性架橋剤の形状や大きさ、並びに両者の含有比率等に基づいて設定することができる。同様に、光開裂性架橋剤のみを重合して得られるゲルの場合には、仮想的なゲル構造は、光開裂性架橋剤の形状や大きさ等に基づいて設定することができる。
【００６２】
例えば、ゲル素材がアクリルアミド等の重合性の単量体であり、かつ、光開裂性架橋剤が、アクリル酸残基含有光開裂性基が各腕の先端に結合された４腕ＰＥＧ化合物である場合には、以下のようにして、ゲルの網目の孔径を算出することができる。図２（Ａ）は、光開裂性架橋剤として用いる４腕ＰＥＧ化合物の構造の代表的な構造式を示した図であり、図２（Ｂ）は、設定された仮想的なゲル構造の模式図である。図２（Ｂ）中、十字形が４腕ＰＥＧ化合物を示し、白抜きの四角がポリアクリルアミド鎖を示す。十字形と白抜きの四角とで囲まれた領域が、ゲルの網目（４腕ＰＥＧ化合物とポリアクリルアミド鎖から構成される空隙）である。すなわち、この構造は、ゲルの網目が平面的であり、重なりがなく、かつ、ゲル中の４腕ＰＥＧ化合物とアクリルアミドの含有比（重量）が１：２以上であると仮定した場合の仮想的なゲル構造である。
【００６３】
ポリアクリルアミド鎖は固定されていないため、図中の白抜きの四角の形状は自由に変形可能である。したがって、ゲルの網目は、図中の黒色円形部として近似することができる。図２（Ｂ）示すように、この網目の近似円の円周は、４腕ＰＥＧ化合物の腕の長さ（ＰＥＧ長）をＬｐとし、２個の４腕ＰＥＧ化合物により架橋されるポリアクリルアミド鎖の長さ（図中の白抜きの四角の一辺の長さ）をＬａとした場合に、当該近似円の円周Ｌｓは、理論的には下記式（１）で表される。なお、式（１）中、ｒは当該近似円の直径を示す。
【００６４】
【数１】
2011093461.tif 000016
【００６５】
ここで、ゲル中の４腕ＰＥＧ化合物とアクリルアミドの含有比（重量）が１：ｔ（ｔは２以上の実数）である場合には、４腕ＰＥＧ化合物の腕の長さＬｐと、２個の４腕ＰＥＧ化合物により架橋されるポリアクリルアミド鎖の長さＬａとの関係は、理論的には下記式（２）で表される。
【００６６】
【数２】
2011093461.tif 000017
【００６７】
一方で、ｔが２未満の正の実数である場合、すなわち、ゲル中の４腕ＰＥＧ化合物の含有量が、アクリルアミドの含有量の２倍量未満である場合には、ゲルの最も大きい網目の孔径は、４腕ＰＥＧ化合物の腕の長さＬｐになる。
【００６８】
つまり、ゲル素材がアクリルアミド等の重合性の単量体であり、かつ、光開裂性架橋剤が、アクリル酸残基含有光開裂性基が各腕の先端に結合された４腕ＰＥＧ化合物である場合には、光開裂性ゲルの網目の孔径は、４腕ＰＥＧ化合物の腕の長さと、ゲル中の４腕ＰＥＧ化合物とアクリルアミドの含有比（重量）とから算出することができる。なお、４腕ＰＥＧ化合物の腕の長さは、ＰＥＧの主鎖を構成する各原子の原子間距離を算出することにより求められる。但し、上記式（１）及び（２）により算出される孔径は、ゲルの網目が重なりのない平面状に形成されていると仮定しているため、立体的な影響やＰＥＧ鎖の伸縮等を考慮すれば、実際のゲルの孔径は、算出された孔径よりも小さいと予想される。
【００６９】
光開裂性架橋剤が、アクリル酸残基含有光開裂性基が各腕の先端に結合された４腕ＰＥＧ化合物である場合には、上記式（１）及び（２）を用いた算出方法の他に、Ｒａｅｂｅｒらによるポア孔径算出法（Raeber, et. al., Biophysical Journal, 2005, vol.89, p1374-1388参照。）を応用して求めることもできる。このポア孔径算出法は、４腕ＰＥＧのみからなるゲルの網目（ポア）の孔径を算出する方法であり、具体的には、孔径（ξ）は、下記式（３）により算出される。ここで、ν２、ｓは、ゲル体積全体に占めるポリマー体積の割合［ポリマー（ドライ）体積／ゲル全体体積］であり、膨張率の逆数に等しい。（ｒ２０）１／２は、ゲルを構成する４腕ＰＥＧの平均二乗両端間距離の非摂動値を表す。
【００７０】
【数３】
2011093461.tif 000018
【００７１】
（ｒ２０）１／２は、下記式（４）により算出される。式（４）中、Ｌは、ＰＥＧユニット（繰り返し単位）［−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−］中のＣ−Ｃ結合（炭素−炭素結合）とＣ−Ｏ結合（炭素−酸素結合）の結合距離の平均値であり、０．１４６ｎｍである。また、Ｍｃは、４腕ＰＥＧの平均分子量であり、Ｍｒは、ＰＥＧユニット１個当たりの分子量（４４）である。つまり、式（５）中の［Ｍｃ／Ｍｒ］は、「４腕ＰＥＧ１分子当たりに含まれるＰＥＧユニットの数」に相当する。さらに、Ｃｎは、ＰＥＧに特有の比率であり、４腕ＰＥＧの場合には４である。
【００７２】
【数４】
2011093461.tif 000019
【００７３】
上記式（３）に式（４）を代入することにより、下記式（５）が得られる。つまり、ゲルの製造に４腕ＰＥＧのみを用いた場合には、ＰＥＧの分子量や膨張率から、式（５）を用いてゲルの網目の孔径を算出することができる。
【００７４】
【数５】
2011093461.tif 000020
【００７５】
上記式（５）は、ゲルを構成する４腕ＰＥＧ以外の成分を考慮していないが、ゲルの構造が、全ての４腕ＰＥＧ化合物の各腕（ＰＥＧ鎖）が、長さの等しいアクリルアミド鎖同士を架橋してなる仮想的なゲル構造である場合には、ゲル素材としてアクリルアミドを用いて、アクリル酸残基含有光開裂性基が各腕の先端に結合された４腕ＰＥＧ化合物を架橋剤として構成されたゲルの孔径を算出することができる。この仮想的なゲル構造では、図３に示すように、４腕ＰＥＧ化合物の各ＰＥＧ鎖の先端に長さの等しいアクリルアミド鎖が重合する理想的な結合状態である。
【００７６】
Ｃ−Ｃ結合の結合距離とＣ−Ｏ結合の結合距離は、いずれも単結合ではほとんど変わらないため、アクリルアミド鎖やＰＥＧ鎖の長さは、当該鎖を構成する原子数に比例すると考えてよい。これにより、アクリルアミドユニット（繰り返し単位）３個の長さと、ＰＥＧユニット２個の長さがほぼ等しくなるため、ＰＥＧユニット１個分の長さに対するポリアクリルアミドの分子量は１０６．５となる。前述にように、上記式（５）中の［Ｍｃ／Ｍｒ］は、４腕ＰＥＧ化合物全体にＰＥＧユニットがどれだけ含まれているかを表すが、これは、「４腕ＰＥＧ化合物全体にＰＥＧユニットと同じ長さのものがどれだけ含まれているか」と言い換えることができる。したがって、１分子当たりの４腕ＰＥＧ化合物が架橋するポリアクリルアミド鎖の長さを、相当するＰＥＧユニット数で表すことにより、ポリアクリルアミド鎖を４腕ＰＥＧ化合物で架橋したゲルの孔径を算出することができる。具体的には、下記式（６）及び（７）により算出できる。但し、実際のゲルでは、全てのポリアクリルアミド鎖が架橋剤により架橋されているわけではないため、実際のゲルの網目の孔径は、下記式（６）により算出される値よりも小さくなると予想される。
【００７７】
【数６】
2011093461.tif 000021
【００７８】
【数７】
2011093461.tif 000022
【００７９】
なお、光開裂性架橋剤が、上記一般式（ｂ）や上記式（ｄ−１）等を骨格とし、当該骨格中の各腕の先端に光開裂性基が結合された化合物である場合にも、４腕ＰＥＧ化合物の場合と同様にして、ゲルの網目の孔径を算出することができる。
【００８０】
本発明における酵素等の生理活性物質の安定化は、具体的には、酵素等の生理活性物質を含む水性媒体中で、ゲル素材と光開裂性架橋剤とを共重合させてゲル化することにより、若しくは光開裂性架橋剤のみを重合させてゲル化することにより、光開裂性ゲルを製造することにより行う。水性媒体に添加するゲル素材や光開裂性架橋剤の量は、ゲル化が可能であれば特に限定されるものではなく、ゲル素材や光開裂性架橋剤の種類を考慮して、適宜決定することができる。本発明においては、特に、得られる光開裂性ゲルの網目の孔径の平均値が、包含する酵素等の生理活性物質の大きさに対して適した大きさとなるように、光開裂性架橋剤の腕の長さ、ゲル素材の種類等を考慮して、ゲル素材と光開裂性架橋剤の添加量比を調整することが好ましい。なお、網目の大きさが酵素等の生理活性物質の大きさに適しているとは、包含された酵素等の生理活性物質が網目を自由に通過できない大きさであって、ゲルのネットワークを崩壊させる前に、ゲルから酵素等の生理活性物質が放出されてしまうことを効果的に抑制できる大きさであることを意味する。
【００８１】
ゲル化の反応条件は、光開裂性架橋剤中の重合性官能基とゲル素材中の重合性官能基とを重合させる、又は光開裂性架橋剤中の重合性官能基同士を重合させることができればよく、重合性官能基の種類、重合反応、ゲル素材の種類等を考慮して、適宜設定することができる。例えば、ゲル素材としてアクリルアミドを用いる場合には、酵素等の生理活性物質を添加した水性溶液中に、アクリルアミドと光開裂性架橋剤とを添加したものに、さらに過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）等の重合開始剤や、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチレンジアミド（ＴＥＭＥＤ）等の反応促進剤を添加することにより、ゲル化することができる。
【００８２】
ゲル化反応を、揺動環境下で行うことにより、形成される生理活性物質包含ゲルの粒子径を小さくすることができる。例えば、ゲル化反応を行う反応容器を、ボルテックスミキサー等の振とう機の上に設置し、ゲル化反応を進めることにより、生理活性物質包含ゲルを、粒子径が１μｍ未満のナノ粒子に形成することができる。また、ゲル化反応の反応温度を低くした場合、例えば４℃で行った場合には、室温で行った場合よりも、得られる生理活性物質包含ゲルの粒子径が揃う傾向がある。その他、ゲル素材としてアクリルアミドを用いる場合であって、ゲル化反応にＡＰＳ等の重合開始剤を用いる場合には、反応溶液に添加する重合開始剤の濃度を調整することにより、得られるナノ粒子の平均粒子径を調整することもできる。
【００８３】
本発明においては、本発明の効果を損なわない程度において、光開裂性基を有さない架橋剤（非開裂性架橋剤）を併用してもよい。同様に、酵素等の生理活性物質を包含させる光開裂性ゲルは、本発明の効果を損なわない程度において、光開裂性架橋剤によりゲル素材が架橋されたゲルと、光開裂性架橋剤により架橋されるゲル素材とは異なる種類のゲル素材が非開裂性架橋剤により架橋されたゲルとを混合したゲルであってもよい。
【００８４】
本発明のカプセル化酵素や生理活性物質包含ゲルを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いる場合には、架橋剤として光開裂性架橋剤のみを用いた光開裂性ゲルのみから酵素を包含させることが好ましい。架橋剤として光開裂性架橋剤のみを用いたゲルの場合には、充分量の光を照射することにより、照射領域中のゲルのネットワークを完全に崩壊させることができる。このため、非常に効率よく酵素を活性化したり、ゲルから放出することができる。
【００８５】
その他、本発明においては、酵素等の生理活性物質を包含させる光開裂性ゲルは、光開裂性架橋剤と、当該光開裂性架橋剤と重合可能なゲル素材との他にも、本発明の効果を損なわない限り、その他の化合物を含むことができる。
【００８６】
このカプセル化酵素（光開裂性ゲルで包含された酵素）に、当該ゲル中の光開裂性基を開裂させることができる波長の光を照射することにより、照射領域中の酵素を活性化することができる。すなわち、本発明の酵素の活性化方法は、本発明のカプセル化酵素（光開裂性ゲルに酵素が包含されているカプセル化酵素）に光を照射して、当該光開裂性ゲルから酵素を放出させる工程を有する。
【００８７】
本発明の酵素の活性化方法は、酵素の種類に関わらず、その効果を発揮し得る。このため、当該活性化方法に供される酵素の種類は特に限定されるものではなく、プロテアーゼ、アミラーゼ、ヌクレアーゼ等の各種分解酵素であってもよく、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）等の各種転移酵素であってもよい。
【００８８】
本発明の酵素の活性化方法は、光開裂性ゲル中の網目に安定して包含される大きさを有する限り、酵素以外の多様な生理活性物質に対しても、酵素に対してと同様にその活性を制御し得ると期待できる。酵素の場合と同様に、生理活性物質を含む水性媒体中で、ゲル素材と光開裂性架橋剤とを共重合させてゲル化することにより、当該生理活性物質が包含された光開裂性ゲル（生理活性物質包含ゲル）を製造することができる。ゲルに包含することにより、当該生理活性物質を長期間安定して保存することができる。その後、ゲルに適した波長の光を照射することにより、ゲルのネットワークを崩壊させ、生理活性物質がゲルから放出される。放出された生理活性物質は、ゲルに包含される前の生理活性物質と同様に活性を有し、機能することができる。
【００８９】
光開裂性ゲルへ照射する光の波長は、当該ゲル中に含まれる光開裂性基を開裂させることができる波長であればよく、光開裂性基の種類に応じて、適宜決定することができる。但し、あまりに波長が短い場合には、当該ゲルに包含されている酵素等の生理活性物質がダメージを受けるおそれがある。このため、本発明においては、２６０〜３９０ｎｍの波長の光を照射することが好ましく、３００〜３９０ｎｍの波長の光を照射することがより好ましい。
【００９０】
このように、本発明の生理活性物質の活性制御方法は、酵素等の生理活性物質を光開裂性ゲルで包含させるため、物性の異なる様々な生理活性物質に対して、機能のｏｎ／ｏｆｆを光照射によって制御することができる、汎用性と操作性に優れた実用性の高い方法である。さらに、本発明のカプセル化酵素をはじめとする本発明の生理活性物質包含ゲルは、他のゲルで包含させた酵素等と同様、長期間安定化することができる。このため、本発明のカプセル化酵素や生理活性物質包含ゲルは、酵素チップや分子標的薬の探索アッセイ法等の様々な用途に用いることが可能なバイオ材料として利用できることが期待できる。
【００９１】
また、本発明のカプセル化酵素や生理活性物質包含ゲルは、架橋剤として光開裂性架橋剤を用い、かつ包含させる酵素等の生理活性物質の存在下でゲル化する以外は、汎用されているゲル化方法により製造することができるため、様々な容器中に製造することが可能である。このため、例えば、本発明のカプセル化酵素を、９６ウェルマイクロアッセイプレートのウェルの底に作製し、当該ゲルの上に基質を含む溶液を添加し、その後、ゲル中の光開裂性基に適した波長の光を照射することにより、多くの検体に対して迅速に酵素処理を行うことができる。このため、本発明の生理活性物質の活性制御方法及びカプセル化酵素や生理活性物質包含ゲルは、多検体を処理するようないわゆるハイスループットなアッセイ系にも適用することができる。
【００９２】
ナノ粒子（粒子径が１μｍ未満の粒子）は、エンドサイトーシス等の膜輸送を介して細胞内に取り込ませることができる。特に、正に帯電したナノ粒子は、細胞膜との親和性が高く、より細胞内に取り込まれやすい。そこで、平均粒子径を１μｍ未満とすることにより、本発明の生理活性物質包含ゲルを、マイクロインジェクション等の特段の導入操作を行うことなく、細胞内へ取り込ませることができる。具体的には、本発明の生理活性物質包含ゲルの活性化方法は、平均粒子径が１μｍ未満である生理活性物質包含ゲルを、細胞に接触させることにより、当該生理活性物質包含ゲルを細胞内に導入する導入工程と、当該導入工程後、前記生理活性物質包含ゲルが導入された細胞に光を照射して、当該光開裂性ゲルから生理活性物質を放出させ、当該生理活性物質を活性化させる活性化工程とを有する。
【００９３】
本発明の生理活性物質包含ゲルの活性化方法において細胞内へ導入する生理活性物質包含ゲルは、光開裂性ゲルが形成するナノ粒子である。当該生理活性物質包含ゲルの平均粒子径は、１μｍ未満であれば特に限定されるものではないが、５００ｎｍ以下であることが好ましく、５〜３００ｎｍであることがより好ましい。また、当該生理活性物質包含ゲルを構成する光開裂性ゲルは、細胞膜との親和性の向上が期待できることから、正に帯電している方が好ましく、例えば上記式（ｄ−１）等のようなカチオン性の光開裂性架橋剤を用いて作製されたものであってもよく、また上記式（ｅ−１）で表される化合物等のカチオン性の非光開裂性架橋剤と非カチオン性の光開裂性架橋剤とを併用して作製されたものであってもよい。
【００９４】
本発明の生理活性物質包含ゲルの活性化方法の導入工程においては、生理活性物質包含ゲルを細胞表面に接触させることにより、当該生理活性物質包含ゲルを細胞内へ取り込ませることができる。例えば、培養液中に生理活性物質包含ゲルを添加することにより、培養細胞に生理活性物質包含ゲルを取り込ませることができる。また、経口投与、静脈や皮下、腹腔への注入、経皮投与等の一般的に医薬品等を投与する際に用いられる方法により、生理活性物質包含ゲルを生体内の細胞や組織へ導入させることができる。
【００９５】
導入工程後、生理活性物質包含ゲルが導入された細胞に、当該生理活性物質包含ゲル中に含まれる光開裂性基を開裂させることができる波長の光を照射することにより、当該生理活性物質包含ゲルから生理活性物質を放出させ、活性化させることができる。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００９７】
なお、以下の実施例において用いたTetra-Poly(ethyl glycol)-amine (商品名：SUNBRIGHT PTE-050PA、数平均分子量（Ｍｎ）：５３２８ｇ／ｍｏｌ) （以下、「４腕ＰＥＧ−ａｍｉｎｅ」と表記する。）は、日油株式会社から購入した。また、ＴＥＭＥＤ、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、塩化アクリロイル（ＡＣ）、トリエチルアミン(ＴＥＡ)、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ）、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＡＰＳ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）、塩酸、トリプシン、パパイン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）（ウシ腎臓由来）、ジエチルエーテル、炭酸水素ナトリウム、及び硫酸マグネシウムは、和光純薬工業株式会社から購入した。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、2-(1H-benzotriazole-a-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophoshate（ＨＢＴＵ）、及びサーモリシンは、株式会社ペプチド研究所から購入した。ブタ由来エラスターゼ１（elastase pancreatic type I from porcin）、4-(4-(1-Hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butyric acid、及びウシ膵臓由来２型α−キモトリプシンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）から購入した。ヒトＰＣＳＫ９測定用ＥＬＩＳＡキットは、株式会社サイクレックスから購入した。水は、ｍｉｌｌｉＱ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて精製した。【００９８】
［実施例１］
アクリル酸残基含有光開裂性基が各腕の先端に結合された４腕ＰＥＧ化合物を光開裂性架橋剤として用いた光開裂性アクリルアミドゲルで酵素を包含して安定化した後、光照射により酵素を活性化させた。具体的には、下記のようにして行った。【００９９】
＜光開裂性架橋剤の合成＞
光開裂性基として、３６５ｎｍの光を照射することにより開裂可能な２−ニトロベンジルエーテル基を用いた。３６５ｎｍの光は、ゲルに包含された酵素に対して、深刻なダメージを与えるおそれが少ないためである。図４に合成経路を示す。
光開裂性の化合物（１）4-(4-(1-Hydroxyethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butyric acid（１ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭに溶解させた後、得られた溶液を、Ｎ２ガスが充填された遮光性バイアル中で攪拌した。この反応溶液に、無水ＤＣＭに溶解させたＴＥＡ（３ｍｍｏｌ)とＡＣ（２．５ｍｍｏｌ）とを、０℃で滴下して添加した。この反応溶液を室温で一晩攪拌した後、炭酸水素ナトリウム水溶液（５ｗ／ｖ％  ａｑ．）と希塩酸（１ｖ／ｖ％  ａｑ．）と水とで順次洗浄し、さらに濃縮した。濃縮後の反応溶液を、含水アセトン（５０ｖ／ｖ％  ａｑ．）に溶解させ、得られた反応混合物を室温で一晩攪拌した後、アクリル酸残基を有する単量体を回収するために、ＤＣＭで抽出した。得られたＤＣＭ層を、希塩酸（１ｖ／ｖ％  ａｑ．）と水とで順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧濃縮してアクリル酸残基含有光開裂性基を有する単量体である化合物（２）を得た。化合物（２）の構造は、１Ｈ−ＮＭＲによって、確認した。ＮＭＲの結果を以下に示す。【０１００】
1H NMR (DMSO-d6): δ=12.35 (br, CH2COOH), δ=7.55 (s, Aromatic-H), δ=7.15 (s, Aromatic-H), δ=6.35, 5.95 (d, d, OC(=O)CH=CH2), δ=6.25 (dd, OC(=O)CH=CH2), δ=5.25 (q, Aromatic-CH(CH3)OC(=O)CH=CH2), δ=4.1 (t, Aromatic-OCH2CH2CH2COOH), δ=3.9 (s, Aromatic-OCH3), δ=2.4 (t, Aromatic-OCH2CH2CH2COOH), δ=2.0 (m, Aromatic-OCH2CH2CH2COOH), and δ=1.4 (d, Aromatic-CHCH3).【０１０１】
化合物（２）（０．８５ｍｍｏｌ）をＮＭＰに溶解させた後、得られた溶液をＮ２ガスが充填された容器中で攪拌した。さらに、カップリング試薬ＨＢＴＵ（０．９２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．９２ｍｏｌ）とＤＩＥＡ（１．６７ｍｍｏｌ）加えて５分間攪拌した後、ＮＭＰに溶解させた４腕ＰＥＧ−ａｍｉｎｅ（図４中、化合物（３））（０．０４２ｍｍｏｌ）を添加し、溶液中の全ての物質が溶解するまで断続的に反応混合物を攪拌した。反応溶液を室温で一晩攪拌した後、反応生成物を氷上でジエチルエーテル中に沈殿させた。回収した沈殿物をジエチルエーテルで洗浄した後、水に溶解させた。得られた水溶液を透析（(SpectraPor6, CO 1000 g/mol）した後に凍結乾燥することにより、光開裂性架橋剤である化合物（４）（Ｍｎ：６３５４ｇ／ｍｏｌ）を得た。化合物（４）の構造は、１Ｈ−ＮＭＲによって、確認した。ＮＭＲの結果を以下に示す。【０１０２】
1H NMR (DMSO-d6): δ=8.0 (br, C(=O)NHCH2CH2O), δ=7.55 (s, Aromatic-H), δ=7.15 (s, Aromatic-H), δ=6.35, 5.95 (d, d, OC(=O)CH=CH2), δ=6.25 (dd, OC(=O)CH=CH2), δ=5.2 (q, Aromatic-CH(CH3)OC(=O)CH=CH2), δ=4.1 (m, Aromatic-OCH2CH2CH2COOH), δ=3.9 (s, Aromatic-OCH3), δ=3.7 (m, NHCH2 CH2CH2O), δ=3.5 (br, [CH2CH2O]n, n-28), δ=3.3 (s, OCH2C), δ=3.2 (m, NHCH2 CH2CH2O), δ=2.4 (m, Aromatic-OCH2CH2CH2COONH), δ=1.9 (m, Aromatic-OCH2CH2CH2COONH), δ=1.6 (m, NHCH2 CH2CH2O), and δ=1.4 (d, Aromatic-CHCH3).【０１０３】
＜非開裂性架橋剤の合成＞
対照として、光開裂性基を有さない以外は化合物（４）と同じ構造を持つ架橋剤（非開裂性架橋剤）を合成した。
まず、化合物（３）（４腕ＰＥＧ−ａｍｉｎｅ）（０．０１ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭに溶解させた後、得られた溶液を、Ｎ２ガスが充填された遮光性バイアル中で攪拌した。この反応溶液に、無水ＤＣＭに溶解させたＴＥＡ（０．１２ｍｍｏｌ)とＡＣ（０．１ｍｍｏｌ）とを、０℃で滴下して添加して、室温で一晩攪拌した後、反応生成物を氷上でジエチルエーテル中に沈殿させた。この縣濁液を濾過し、回収した沈殿物をジエチルエーテルで洗浄した後、水に溶解させた。得られた水溶液を透析(SpectraPor6, CO 1000 g/mol）した後に凍結乾燥することにより、光開裂性基を有さない以外は化合物（４）と同じ構造を持つ非開裂性架橋剤（以下、化合物（５））を得た。化合物（５）の構造は、１Ｈ−ＮＭＲによって、確認した。ＮＭＲの結果を以下に示す。【０１０４】
1H NMR (DMSO-d6): δ=8.0 (br, C(=O)NHCH2CH2O), δ=6.15 (dd, OC(=O)CH=CH2), δ=6.05, 5.95 (d, d, OC(=O)CH=CH2), δ=3.7 (m, NHCH2 CH2CH2O), δ=3.5 (br, [CH2CH2O]n, n-28), δ=3.3 (s, OCH2C), δ=3.2 (m, NHCH2 CH2CH2O), and δ=1.6 (m, NHCH2 CH2CH2O).【０１０５】
＜ハイドロゲル作製用溶液＞
ゲル素材であるアクリルアミドと光開裂性架橋剤とを含む溶液をハイドロゲル作製用溶液として調製した。具体的には、まず、６Ｍのアクリルアミドと０．０３Ｍの架橋剤とからなるアクリルアミド溶液を調製した。つまり、当該アクリルアミド溶液中の架橋剤とアクリルアミドとのモル比は１：２００になる。次いで、このアクリルアミド溶液と０．３ＭのＡＰＳ溶液とを３：１の割合で混合して、ハイドロゲル作製用溶液を調製した。なお、架橋剤として化合物（４）を用いて調製したものを光開裂性ゲル作製用溶液とし、化合物（５）を用いて調製したものを非開裂性ゲル作製用溶液とした。【０１０６】
＜酵素溶液の調製＞
トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、及びパパインは、それぞれ、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解させて１００μｇ／ｍＬの酵素溶液を調製した。なお、自己消化を防止するために、トリプシン溶液には、塩化カルシウムを２０ｍＭとなるように添加した。また、１ｍｇ／ｍＬのエラスターゼ溶液は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で希釈することにより調製した。さらに１０ｍｇ／ｍＬのγーＧＴＰ溶液は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で希釈することにより調製した。【０１０７】
＜カプセル化酵素の製造＞
カプセル化酵素は、９６ウェルマイクロアッセイプレート（商品名：BD Falcon 96-well assay plate 353241、Becton, Dickinson and Company、Franklin Lakes, NJ, USA）の底に作製した。なお、９６ウェルマイクロアッセイプレートは、市販のプラズマ装置（装置名：Plasma Cleaner PDC210、ヤマト科学株式会社）を用いて、予めプラズマ処理（Ｏ２，１００ｃｃ，２００Ｗ，３ｍｉｎ）し、濡れ性を獲得させた（Bull. TokyoMetropol. Indust. Technol. Res. Inst. 2000, vol.3, p165-166）。
まず、１ウェル当たり、２０μＬのハイドロゲル作製用溶液と１０μＬの酵素溶液とを分注し、１分間振とうした。次いで、各ウェルに、１０μＬのＴＥＭＥＤ溶液（０．１Ｍ  ＴＥＭＥＤ、１Ｍ  トリス−塩酸バッファー、ｐＨ７．０）をそれぞれ添加してゲル化を開始させた。混合溶液は、４℃で一晩置き、ゲル化した。ゲル化後、ゲルは、１Ｍのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。【０１０８】
なお、ここで作製したハイドロゲルは、架橋剤とアクリルアミドとを１：２００のモル比で含有する。ここで、両者の分子量から、当該ハイドロゲル中の架橋剤とアクリルアミドとの重量比は１：２になる。また、化合物（３）の各ＰＥＧ鎖の長さ（ＰＥＧ長）は、主鎖を構成する酸素原子と炭素原子との原子間距離を算出したところ、約７ｎｍである。これらの値を、前記式（１）及び（２）に当てはめると、当該ハイドロゲルの網目の孔径は、約１８ｎｍであると算出された。【０１０９】
同様に、上記式（７）を用いて、当該ハイドロゲルの網目の孔径を算出した。前述したように、式（７）中、Ｌは０．１４６ｎｍであり、Ｃｎは４である。また、ν２、ｓは、ポリアクリルアミドとＰＥＧのいずれも密度が１．１程度であることを考慮し、約１６％（０．１６）と算出した。さらに、化合物（４）中のＰＥＧユニット数は約１４４［６３５４（化合物（４）の分子量）／４４（ＰＥＧユニット１個当たりの分子量）］であり、化合物（４）１分子当たりに結合するポリアクリルアミド鎖の長さに相当するＰＥＧユニットの数は、約１１９［１２７０８（化合物（４）１分子当たりに結合するポリアクリルアミド鎖の分子量）／１０６．５（ＰＥＧユニット１個分の長さに対するポリアクリルアミドの分子量）］である。よって、（Ｍｃ／Ｍｒ）’は２６３と算出された。これらの値を上記式（７）に代入すると、当該ハイドロゲルの網目の孔径は、約１２．４ｎｍであると算出された。【０１１０】
実際の当該ハイドロゲルの網目の孔径は、算出値よりも小さいと予想される。両結果から、当該ハイドロゲルの網目の孔径は、約９〜１３ｎｍ前後であると推定される。【０１１１】
＜ＵＶ光照射＞
トリプシンを含有させたゲル（カプセル化酵素）が底に作製されたウェルに、３６５ｎｍのＵＶ光を照射し、酵素を活性化させた。ＵＶ光照射は市販のＵＶ照射装置Ｓｐｏｔ  ＵＶ  Ｃｕｒｉｎｇ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ＳＰ−７（ウシオ電機株式会社)を用いて行った。なお、照射する３６５ｎｍの光の強度は、２００ｍJとした。
図５は、架橋剤として化合物（４）を用いて作製した光開裂性ゲルに、３６５ｎｍの光を照射することによりゲル中の光開裂性基が開裂する反応を、化学式及び模式図で示している。図中、「ＡＡｍ  ｃｈａｉｎ」はポリアクリルアミド鎖を、「４ａｒｍ−ＰＥＧ」は４腕ＰＥＧ化合物を、それぞれ示す。【０１１２】
＜酵素活性の測定＞
ＵＶ光照射を行ったウェルに対して、基質溶液を添加し、酵素活性を測定した。基質として、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）  ＦＬカゼイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）（以下、蛍光標識カゼイン）を用いた。この蛍光標識カゼインは、プロテアーゼにより消化させると、蛍光が発される化合物である。
まず、上記マイクロアッセイプレートのうち、トリプシンを包含させたカプセル化酵素が底に作製されたウェルに、１ウェル当たり、６０μＬの１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）と１００μＬの１０μｇ／ｍＬの蛍光標識カゼイン溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、各ウェルの蛍光シグナル（Ｅｘ  ４８５ｎｍ，Ｅｍ  ５３５ｎｍ）を、マルチプレートリーダーＡｐｐｌｉｓｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を用いて測定した。対照として、ＵＶ光照射をしなかったウェルに対しても同様の操作を行い、蛍光シグナルを測定した。【０１１３】
各ウェルの蛍光シグナルの測定結果を図６に示す。図中、「Ｐｈｏｔｏ  Ｇｅｌ  ｗｉｔｈ  ＵＶ」はトリプシン含有光開裂性ゲルにＵＶ光を照射したウェルの結果を、「Ｐｈｏｔｏ  Ｇｅｌ」はトリプシン含有光開裂性ゲルにＵＶ光を照射しなかったウェルの結果を、「Ｇｅｌ  ｗｉｔｈ  ＵＶ」はトリプシン含有非開裂性ゲルにＵＶ光を照射したウェルの結果を、「Ｇｅｌ」はトリプシン含有非開裂性ゲルにＵＶ光を照射しなかったウェルの結果を、それぞれ示す。また、エラーバーは標準偏差を示す。トリプシン含有光開裂性ゲルにＵＶ光を照射したウェルでは、蛍光シグナルが検出されたが、その他のウェルではほとんど検出されなかった。これらの結果から、ゲルに含有させた状態では、酵素は不活性であること、光開裂性ゲルに包含させた酵素は、ＵＶ光を照射することにより活性化されること、非開裂性ゲルに包含させた酵素は、ＵＶ光を照射したとしても活性化されないことが確認された。【０１１４】
［実施例２］
酵素の活性化の程度に対する、カプセル化酵素に照射する光の強度の影響を調べた。
まず、実施例１と同様にして製造したトリプシン含有光開裂性ゲルが底に作製されたウェルに対して、２５、５０、１００、２００ｍＪのＵＶ光（３６５ｎｍ）を照射した。その後各ウェルに、１ウェル当たり、６０μＬの１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）と１００μＬの１０μｇ／ｍＬの蛍光標識カゼイン溶液を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、実施例１と同様にして、各ウェルの蛍光シグナルを測定した。対照として、ＵＶ光照射をしなかったウェルに対しても同様の操作を行い、蛍光シグナルを測定した。【０１１５】
照射したＵＶ光の強度ごとの各ウェルの蛍光シグナルの測定結果を、図７に示す。図中、エラーバーは標準偏差を示す。この結果、検出される蛍光シグナルは、照射したＵＶ光強度依存的に強くなっていた。これはおそらく、光の強度が強いほど、ゲル中の光開裂性基をより多く開裂させることができ、崩壊するゲルの量が多くなる結果、ゲルから放出される酵素量が多くなったためと推察される。これらの結果から、本発明のカプセル化酵素は、照射する光の強度を調節することにより、活性化させる酵素量を調整できることが明らかである。【０１１６】
［実施例３］
ゲルで包含させていない酵素とカプセル化酵素の安定性を比較した。
実施例１と同様にして製造したトリプシン含有光開裂性ゲルと、１０μＬのトリプシン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）とを３７℃で１２時間保存した。なお、トリプシン溶液は、２０ｍＭの塩化カルシウムを含有する１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）に、トリプシンを溶解させて調製した溶液である。次に、トリプシン含有光開裂性ゲルには、実施例１と同様にしてＵＶ光を照射した後、６０μＬの１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）と１００μＬの１０μｇ／ｍＬの蛍光標識カゼイン溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。トリプシン溶液には、ＵＶ光は照射せずに、６０μＬの１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）と１００μＬの１０μｇ／ｍＬの蛍光標識カゼイン溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、実施例１と同様にして、各ウェルの蛍光シグナルを測定した。対照として、１２時間保存しなかったトリプシン含有光開裂性ゲル及びトリプシン溶液に対しても同様の操作を行い、蛍光シグナルを測定した。【０１１７】
保存前の蛍光シグナルを１００％とした場合の、保存後の蛍光シグナルの割合を算出し、保存後に、どれだけの酵素活性が残存しているかを求めた。図８は、トリプシン含有光開裂性ゲルとトリプシン溶液の保存後に残存する酵素活性の割合（％）を示した図である。この結果、トリプシン溶液ではほとんどの酵素活性が失われていたが、トリプシン含有光開裂性ゲルでは、８０％程度の酵素活性が残存していた。これらの結果から、本発明のカプセル化酵素は、長期間安定して保存可能であることが明らかである。なお、本実施例では、３７℃で保存を行ったが、酵素の保存により適した温度（例えば４℃）で保存を行うことにより、より長期間安定して保存できることが期待できる。【０１１８】
［実施例４］
トリプシン以外の様々な酵素に対して本発明の酵素の活性制御方法により、活性の制御を試みた。
具体的には、キモトリプシン、サーモリシン、パパイン、エラスターゼ、及びγーＧＴＰに対して行った。キモトリプシンとエラスターゼはセリンプロテアーゼであり、サーモリシンは金属プロテアーゼであり、パパインはシステインプロテアーゼであり、γーＧＴＰはアミノトランスフェラーゼである。また、これらの酵素は、分子量もｐＩ値もそれぞれ異なる。例えば、これらの酵素の分子量は、２５〜９０ｋＤａの範囲内であり、ｐＩ値は５．４〜８．５の範囲内である。【０１１９】
まず、実施例１に記載の方法で調製した各酵素溶液を用いて、実施例１のトリプシン溶液を用いた場合と同様にして、各酵素を含有させたゲル（カプセル化酵素）を、それぞれ９６ウェルマイクロアッセイプレートの底に作製した。次いで、実施例１と同様にして、ゲルにＵＶ光（３６５ｎｍ）を照射した後、１ウェル当たり、６０μＬの１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）と１００μＬの１０μｇ／ｍＬの蛍光標識カゼイン溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、実施例１と同様にして、各ウェルの蛍光シグナルを測定した。対照として、ＵＶ光照射をしなかったウェルに対しても同様の操作を行い、蛍光シグナルを測定した。【０１２０】
酵素ごとの各ウェルの蛍光シグナルの測定結果を、図９に示す。図中、「Ｂｅｆｏｒｅ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ」はＵＶ光を照射しなかったウェルの結果を、「Ａｆｔｅｒ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ」はＵＶ光を照射したウェルの結果を、それぞれ示す。また、エラーバーは標準偏差を示す。この結果、５種類全てにおいて、ＵＶ光照射をしなかったウェルに比べて、ＵＶ光照射を行ったウェルでは、検出されるシグナルが顕著に強くなっており、ＵＶ光照射をすることにより、酵素が活性化されたことが分かった。これらの結果から、本発明の酵素の活性制御方法は、大きさやｐＩ等の物理的性状が異なる様々な酵素に対して効果を発揮し得ることが明らかである。【０１２１】
［実施例５］
ＰＣＳＫ９（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ−ｔｙｐｅ  ９）を光開裂性ゲルに包含させた。ＰＣＳＫ９は、循環ＬＤＬコレステロール代謝経路において重要な役割を果たしている酵素である。また、ＰＣＳＫ９の測定は、前述のヒトＰＣＳＫ９測定用ＥＬＩＳＡキットを用いて行った。【０１２２】
まず、トリプシン溶液に換えてＰＣＳＫ９溶液（ＰＣＳＫ９をキット付属緩衝液に溶解させた溶液）を用いた以外は、実施例１と同様にして、９６ウェルマイクロアッセイプレートのウェルの底に、ＰＣＳＫ９含有光開裂性ゲルを作製した。このＰＣＳＫ９含有光開裂性ゲル中のＰＣＳＫ９濃度は、４０ｎｇ／ｍＬである。１ウェル当たり、１００μＬのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体溶液（キットに添付されている抗体溶液）を添加した後、実施例１と同様にして、当該ウェルにＵＶ光（３６５ｎｍ）を照射した。光照射後、アッセイプレートを１時間振とうし、ＰＣＳＫ９を光開裂性ゲルから放出させて、溶液中の抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体と反応させた。次いで、ウェル中の上清（１００μＬ）を、抗ＰＣＳＫ９ポリクローナル抗体がコートされたウェルに移し、１時間インキュベートし、ＰＣＳＫ９−抗ＰＣＳＫ９抗体複合体を抗ＰＣＳＫ９ポリクローナル抗体に結合させた。当該ウェルを洗浄後、基質であるテトラメチルベンジジン（キットに添付のもの）を添加した。１Ｎの硫酸を加えて反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を、マルチプレートリーダーＡｐｐｌｉｓｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を用いて測定した。対照として、ＵＶ光照射をしなかったウェルに対しても同様の操作を行い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０１２３】
各ウェルの４５０ｎｍの吸光度の測定結果を図１０に示す。図中、「Ｂｅｆｏｒｅ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ」はＵＶ光を照射しなかったウェルの結果を、「Ａｆｔｅｒ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ」はＵＶ光を照射したウェルの結果を、それぞれ示す。また、エラーバーは標準偏差を示す。この結果、ＵＶ光照射を行うことにより、抗ＰＣＳＫ９ポリクローナル抗体に結合したＰＣＳＫ９-抗ＰＣＳＫ９抗体複合体の量が顕著に多くなることが確認された。これは、ＵＶ光照射により、ＰＣＳＫ９含有光開裂性ゲルからＰＣＳＫ９が放出されること、放出されたＰＣＳＫ９は、ゲルに包含される前のＰＣＳＫ９と同様に抗ＰＣＳＫ９抗体と結合し得ることを示している。すなわち、この結果から、光開裂性ゲルを用いることにより、酵素の活性の制御のみならず、酵素の放出量を制御することによって、抗原−抗体間のタンパク質−タンパク質相互作用を制御することも可能であることが明らかである。【０１２４】
［実施例６］
重合性官能基としてメタクリル酸残基を含有する光開裂性基が各腕の先端に結合された４腕ＰＥＧ化合物を光開裂性架橋剤とし、当該光開裂性架橋剤のみからなる光開裂性アクリルアミドゲルで酵素（トリプシン）を包含して安定化した後、光照射により酵素を活性化させた。具体的には、下記のようにして行った。
まず、図４に記載の合成経路のうち、化合物（１）に添加するＡＣに代えて塩化メタクリロイルを用いた以外は、実施例１における化合物（４）の合成と同様にして、光開裂性架橋剤である化合物（６）を得た。【０１２５】
【化１４】
2011093461.tif 000023
【０１２６】
また、対照として、光開裂性基を有さない以外は化合物（６）と同じ構造を持つ非開裂性架橋剤（以下、化合物（７））を得た。具体的には、化合物（３）に添加するＡＣに代えて塩化メタクリロイルを用いた以外は、実施例１における化合物（５）の合成と同様にして、化合物（７）を得た。【０１２７】
次いで、化合物（６）又は（７）を水に溶解させて、０．１Ｍの架橋剤溶液を調製した。この架橋剤溶液と０．３ＭのＡＰＳ溶液とを３：１の割合で混合して、ハイドロゲル作製用溶液を調製した。なお、化合物（６）を用いて調製したものを光開裂性ゲル作製用溶液とし、化合物（７）を用いて調製したものを非開裂性ゲル作製用溶液とした。
その後、実施例１と同様にして前処理を施した９６ウェルマイクロアッセイプレートに、１ウェル当たり、２０μＬのハイドロゲル作製用溶液と１０μＬのトリプシン溶液（１００μｇ／ｍＬ）とを分注し、実施例１と同様にしてゲル化することにより、９６ウェルマイクロアッセイプレートの底に、化合物（６）又は（７）のみからなるゲルでトリプシンを包含したカプセル化酵素を作製した。なお、トリプシン溶液は、実施例１で調製した溶液を用いた。【０１２８】
このようにして作製されたカプセル化酵素に対して、実施例１と同様にして、ＵＶ光（３６５ｎｍ）を照射した後、１ウェル当たり、６０μＬの１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）と１００μＬの１０μｇ／ｍＬの蛍光標識カゼイン溶液を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、実施例１と同様にして、各ウェルの蛍光シグナルを測定した。対照として、ＵＶ光照射をしなかったウェルに対しても同様の操作を行い、蛍光シグナルを測定した。【０１２９】
各ウェルの蛍光シグナルの測定結果を図１１に示す。図中、「Ｐｈｏｔｏ  Ｇｅｌ  ｗｉｔｈ  ＵＶ」はトリプシン含有光開裂性ゲルにＵＶ光を照射したウェルの結果を、「Ｇｅｌ」はトリプシン含有非開裂性ゲルにＵＶ光を照射しなかったウェルの結果を、それぞれ示す。また、エラーバーは標準偏差を示す。トリプシン含有光開裂性ゲルにＵＶ光を照射したウェルでは、蛍光シグナルが検出されたが、その他のウェルではほとんど検出されなかった。これらの結果から、光開裂性架橋剤のみから光開裂性ゲルを作製した場合であっても、酵素活性を制御できることが明らかである。【０１３０】
［実施例７］
ゲル化反応を揺動環境下で行い、平均粒子径が１μｍ未満の粒子である生理活性物質包含ゲル（以下、生理活性物質包含ナノ粒子ゲル）を製造した。
まず、実施例６と同様にして、光開裂性ゲル作製用のハイドロゲル作製用溶液を調製した。次いで、エッペンドルフチューブに２０μＬのハイドロゲル作製用溶液と１０μＬのＴＥＭＥＤ溶液（０．１Ｍ  ＴＥＭＥＤ、１Ｍ  トリス−塩酸バッファー、ｐＨ７．０）をそれぞれ添加した後、４℃又は室温で２０分間ボルテックスミキサーを用いて攪拌することにより、ナノ粒子化したゲルを得た。【０１３１】
得られたナノ粒子ゲルを、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、日立ハイテク社製、製品名：Ｈ−７０００）及びダイナミック光散乱光度計（ＤＬＳ、大塚電子社製、製品名：ＤＬＳ−８０００ＤＬＴＫＹ）を用いて観察した。ＴＥＭにより得られた顕微鏡画像を図１２に、ナノ粒子ゲルの粒子径分布を図１３に、それぞれ示す。この結果、粒子径が約１５０ｎｍの粒子径の揃ったナノ粒子が調製されていた。なお、図１２及び１３は、室温でゲル化させた場合の結果を示す。また、室温よりも４℃でゲル化反応を行った場合のほうが、より粒子径の揃った粒子が得られる傾向が観察された。
実施例１と同様にして、このナノ粒子ゲルにＵＶ光（３６５ｎｍ）を照射した。照射後、ＴＥＭ及びＤＬＳで大きさを測定した。測定結果を図１４及び１５にそれぞれ示す。この結果、ＵＶ照射後には粒子径が１００ｎｍ以上の粒子は存在せず、全てが数１０ｎｍ以下にまで分解されていた。【０１３２】
次いで、トリプシンを包含させたナノ粒子ゲルを調製し、ＵＶ照射前後の活性を調べた。具体的には、エッペンドルフチューブに２０μＬのハイドロゲル作製用溶液と１０μＬのトリプシン溶液（１００μｇ／ｍＬ）とを分注し、１分間振とうした。次いで、各チューブに、１０μＬのＴＥＭＥＤ溶液（０．１Ｍ  ＴＥＭＥＤ、１Ｍ  トリス−塩酸バッファー、ｐＨ７．０）をそれぞれ添加し、室温で２０分間ボルテックスミキサーを用いて攪拌することにより、トリプシン包含ナノ粒子ゲルを得た。【０１３３】
各チューブ内のトリプシン包含ナノ粒子ゲルを９６ウェルマイクロアッセイプレートに移した後、実施例１と同様にして、各ウェルにＵＶ光（３６５ｎｍ）を照射した後、１ウェル当たり、６０μＬの１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．０）と１００μＬの１０μｇ／ｍＬの蛍光標識カゼイン溶液を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、実施例１と同様にして、各ウェルの蛍光シグナルを測定した。対照として、ＵＶ光照射をしなかったウェルに対しても同様の操作を行い、蛍光シグナルを測定した。
この結果、ＵＶ光を照射したウェルでは強いトリプシン活性が観察されたが、ＵＶ光を照射しなかったウェルではトリプシン活性は観察されなかった。これらの結果から、光開裂性ゲルは、ナノ粒子に成形した後も、ＵＶ光等の適当な波長の光によって分解され、包含していた分子を放出するという性質を維持していることが確認された。【０１３４】
［実施例８］
細胞死を誘導するカスパーゼ−３を内包したナノ粒子ゲル（カスパーゼ包含ナノ粒子ゲル）を細胞内へ導入し、当該細胞内において、活性化させた。
具体的には、トリプシン溶液に代えて、カスパーゼ−３溶液（１μｇ／ｍＬを２０μＬ）を用いた以外は実施例７と同様にして、カスパーゼ包含ナノ粒子ゲルを得た。
得られたカスパーゼ包含ナノ粒子ゲルをテキサスレッドと混合し、マイクロインジェクション法によりＨｕＨ−７細胞に注入した。マイクロインジェクションに成功した細胞は、テキサスレッドに由来する赤色の蛍光が観察された。カスパーゼ包含ナノ粒子ゲルを導入した細胞に、ＵＶ光を１分間程度照射した後、当該細胞をインキュベーター内で２４時間程培養した。その後、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製、製品名：ＬＳＭ５１０）を用いて観察した。【０１３５】
図１６に、カスパーゼ包含ナノ粒子ゲルを導入した直後の細胞と、２４時間培養後の細胞の蛍光像（テキサスレッド）と明視野像を示す。この結果、ＵＶ光を照射しなかった細胞では、導入直後と同様に、テキサスレッドの赤色蛍光が観察される細胞が存在していたが、ＵＶ光を照射した細胞では、１日培養後には、テキサスレッドの赤色蛍光を発する細胞は観察されなかった。すなわち、カスパーゼ−３がゲルに内包された状態で維持された細胞は、１日培養後でも生存していたが、ＵＶ光の照射によってカスパーゼ−３がゲルから放出された細胞では、細胞死が引き起こされた。これらの結果から、カスパーゼ−３は、ナノ粒子ゲル内に存在している場合には不活性の状態であるが、光照射によってナノ粒子が崩壊して細胞内に放出されることによって機能を発現したといえる。つまり、カスパーゼ−３を内包したナノ粒子ゲルを利用することにより、細胞の運命を光によって制御することに成功した。このように、生理活性物質包含ゲルを用いることにより、本発明の光を照射した時点で、光が照射された場所のみで、生理活性物質の機能を発現することができる。【０１３６】
［実施例９］
ゲル化反応における重合開始剤の濃度を調整することにより、生理活性物質包含ナノ粒子ゲルの平均粒子径を調整した。
具体的には、実施例６において調製された０．１Ｍの架橋剤溶液と、０．０１〜１ＭのＡＰＳ溶液とを３：１の割合で混合して、ＡＰＳ含有量の異なるハイドロゲル作製用溶液を調製した。
その後、エッペンドルフチューブに２０μＬの各ハイドロゲル作製用溶液と１０μＬのトリプシン溶液（１００μｇ／ｍＬ）とを分注し、１分間振とうした。次いで、各チューブに、１０μＬのＴＥＭＥＤ溶液（０．１Ｍ  ＴＥＭＥＤ、１Ｍ  トリス−塩酸バッファー、ｐＨ７．０）をそれぞれ添加し、室温で２０分間ボルテックスミキサーを用いて攪拌することにより、トリプシン包含ナノ粒子ゲルを得た。
実施例７と同様にして、粒子径分布を測定したところ、得られたトリプシン包含ナノ粒子ゲルの粒子径は約７０〜３００ｎｍの範囲内であった。また、ハイドロゲル作製用溶液中のＡＰＳ添加量が多いほど、得られたトリプシン包含ナノ粒子ゲルの粒子径は小さくなる傾向が観察された。これらの結果から、ナノ粒子ゲルの調製条件を変化させることにより、ナノ粒子ゲルの粒子径を制御することが可能であると期待される。【０１３７】
［実施例１０］
低分子化合物を安定して包含するための網目構造が小さい光開裂性ゲルを作製するために、架橋剤として使用する新規化合物（上記式（ｃ−１）で表される化合物）を合成した。
具体的には、ジクロロメタンに溶解させた式（ｐ０−１）で表される光リンカー（4-[4-(1-Hydroxyethyl)-2-methoxyl-5-nitorophenoxyl]butyric acid、ＣＡＳ番号：１７５２８１−７６−２）（Ｆｌｕｋａ社製、製品番号：５５２６２）に、塩化アクリロイル（ＣＡＳ番号：８１４−６８−６）（和光純薬工業社製、製品番号：０１７−１２４８３）のジクロロメタン溶液を滴下して反応させた。反応物（式（ｐ１−１）で表される化合物）を精製後、ジクロロメタンに溶解させ、アクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＣＡＳ番号：８１８−６１−１）（和光純薬工業社製、製品番号：０８６−０４４２２）を加え、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＣＡＳ番号：２５９２−９５−２）（ペプチド研究所製、製品番号：１０２２）及びＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、ＣＡＳ番号：９４７９０−３７−１）（ペプチド研究所製、製品番号：１０４６）を用いて縮合させることにより、式（ｃ−１）で表される化合物を得た。【０１３８】
【化１５】
2011093461.tif 000024
【０１３９】
［実施例１１］
架橋剤として使用する新規化合物を合成し、低分子化合物を安定して包含することができる、網目構造が小さい光開裂性ゲルを作製した。低分子化合物として、分子量３３２のフルオレセインを用いた。【０１４０】
まず、式（ｅ−１）で表される化合物を合成した。具体的には、ジクロロメタンに溶解させたＤＡＢ−Ａｍ−４に、塩化アクリロイルのジクロロメタン溶液を滴下して反応させることにより、式（ｅ−１）で表される化合物を得た。その後、メタノールを加えて、不溶化した式（ｅ−１）で表される化合物を溶解させた。【０１４１】
【化１６】
2011093461.tif 000025
【０１４２】
次いで、実施例６において用いた化合物（６）と式（ｅ−１）で表される化合物とを、０．０３Ｍずつ等モルで混合した架橋剤溶液を調製した。この架橋剤溶液と０．１ＭのＡＰＳ溶液とを３：１の割合で混合して、ハイドロゲル作製用溶液を調製した。エッペンドルフチューブに２０μＬのハイドロゲル作製用溶液と１０μＬのフルオレセイン溶液とを分注し、１分間振とうした。その後、各チューブに、１０μＬのＴＥＭＥＤ溶液（０．１Ｍ  ＴＥＭＥＤ、１Ｍ  トリス−塩酸バッファー、ｐＨ７．０）をそれぞれ添加し、室温で２０分間ボルテックスミキサーを用いて攪拌することにより、正に帯電したフルオレセイン包含ナノ粒子ゲルを得た。【０１４３】
得られたフルオレセイン包含ナノ粒子ゲルを、ＨｕＨ−７細胞の培養液中に添加し、１時間インキュベートした。対照として、同一濃度のフルオレセイン溶液を、ＨｕＨ−７細胞の培養液中に直接添加し、１時間インキュベートした。インキュベート後の細胞を、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製、製品名：ＬＳＭ５１０）を用いて観察した。図１７に、フルオレセイン包含ナノ粒子ゲル又はフルオレセイン溶液を培養液に添加した細胞の蛍光像（フルオレセイン）と明視野像を示す。フルオレセイン包含ナノ粒子ゲルを添加した場合には、フルオレセインの蛍光が観察される細胞が存在しており、フルオレセイン包含ナノ粒子ゲルがエンドサイトーシス等の膜輸送により細胞内へ取り込まれたことが確認された。これに対して、フルオレセイン溶液を添加した場合には、フルオレセインの蛍光を発する細胞は観察されなかった。これらの結果から、生理活性物質や蛍光物質等の標識物質が低分子化合物であった場合でも、これらをナノ粒子ゲルに包含させることによって、マイクロインジェクションなどの侵襲的な導入手法を用いずに、簡便に細胞内へ導入可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明の生理活性物質の活性制御方法及び生理活性物質包含ゲルは、酵素をはじめ、生理活性物質の種類を問わず、簡便に生理活性物質を長期間安定化することができる上に、生理活性物質の活性化における時期的、空間的及び量的制御も可能であることから、学術分野のみならず、臨床検査や創薬等の酵素を利用する多くの分野において利用が可能である。
【符号の説明】
【０１４５】
１…カプセル化酵素、２…ゲル素材、３…光開裂性架橋剤、４…酵素、５…基質、６…溶液。
【図１】
2011093461.tif 000030
【図２】
2011093461.tif 000031
【図３】
2011093461.tif 000032
【図４】
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【図５】
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【図６】
2011093461.tif 000035
【図７】
2011093461.tif 000036
【図８】
2011093461.tif 000037
【図９】
2011093461.tif 000038
【図１０】
2011093461.tif 000039
【図１１】
2011093461.tif 000040
【図１３】
2011093461.tif 000041
【図１５】
2011093461.tif 000042
【図１２】
2011093461.tif 000043
【図１４】
2011093461.tif 000044
【図１６】
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【図１７】
2011093461.tif 000046
【国際調査報告】
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2011093461.tif 000048
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