(57)【要約】  遺伝子プールに混在する変異遺伝子の有無を迅速に、また簡便に、また高精度に、そして高感度に検出することができる方法として、各種の高感度検出法、特にはＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の改良法を提供する。  主検出工程の前工程として、（１）野生型遺伝子の配列または野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるクランププライマーと、（２）変異遺伝子の配列を有する標的部位を含む領域を増幅させることのできるプライマーと、（３）前記遺伝子プールと、を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む領域を選択的に増幅させる前増幅工程を実施する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
（１）（１ａ）野生型遺伝子の配列または野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるクランププライマーと、
（１ｂ）変異遺伝子の配列を有する標的部位を含む領域を増幅させることのできるプライマーと、
（１ｃ）前記遺伝子プールと
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む領域を選択的に増幅させる工程、
（２）前記工程（１）で得られた増幅産物又はその一部を鋳型として、遺伝子検出法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に検出することで、該変異遺伝子の有無を検出する工程、
を含む変異遺伝子検出方法。
【請求項２】
前記工程（２）が、
（２ａ）野生型遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなり、工程（１）で用いたクランププライマー（１ａ）と同一又は異なる塩基配列を有するクランププライマーと、
（２ｂ）変異遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、
（２ｃ）前記工程（１）で得られた増幅産物又はその一部と
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する工程
である、請求項１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項３】
前記工程（２）が、
（２ａ’）野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなり、工程（１）で用いたクランププライマー（１ａ）と同一又は異なる塩基配列を有するクランププライマーと、
（２ｂ）変異遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、
（２ｃ）前記工程（１）で得られた増幅産物又はその一部と
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する工程
である、請求項１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項４】
前記工程（２ｃ）における遺伝子増幅法がＰＣＲ法である、請求項２又は３に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項５】
前記変異プローブがＲＮＡを含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項６】
前記変異プローブは、一の末端が蛍光物質により標識され、他の末端が前記蛍光物質を抑制するクエンチャーにより標識されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項７】
前記変異遺伝子の検出領域の増幅産物を、核酸染色剤で染色する、請求項２〜５のいずれか一項に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項８】
前記変異遺伝子の検出領域の増幅産物の増加を、蛍光強度の増加によって経時的に検出する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項９】
前記変異が点突然変異である、請求項２〜８のいずれか一項に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項１０】
前記変異が欠失変異である、請求項２〜８のいずれか一項に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項１１】
前記クランププライマーの鎖長が１４塩基〜１８塩基である、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項１２】
前記工程（２）における遺伝子検出法が、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、スコーピオンアームズ法、ＤＮＡチップ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＨＲＭ法、ｇＦＣＳ法、サザンブロッティング法である、請求項１に記載の変異遺伝子検出方法。
【請求項１３】
前記変異遺伝子がヒト上皮成長因子受容体の変異遺伝子である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型遺伝子群に混在する既知の変異遺伝子を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は心疾患、脳血管疾患と並ぶ三大生活習慣病の一つであり、現在日本における最大の死因となっている。癌発生は通常人体を構成する一部の細胞が癌化して、癌細胞となることに端を発する。多くの場合、細胞の癌化は細胞分裂や細胞増殖等に関与する遺伝子の突然変異に起因している。このような癌の原因となる遺伝子の突然変異は、遺伝子の塩基配列上の一つの塩基が他の塩基に置換した点突然変異であることが多い。【０００３】
癌の早期治療のためには、癌細胞の早期発見が重要となる。癌細胞の有無は通常、検体から病理組織切片や細胞を採取し、固定、染色後に細胞検査士等によって顕微鏡下で診断される。しかし、このような病理診断法は組織形態学の専門的な知識と技術が必要とされる上に、結果が出るまでに数日を要し、また大量な処理が困難であるという問題点があった。そこで近年、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を応用して癌細胞を遺伝子レベルで迅速、かつ簡便に検出する方法が開発されている。例えば、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）やＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）等の核酸類似体をプライマーやプローブとして用いた変異遺伝子検出法が挙げられる。【０００４】
ＰＮＡとは、ペプチド核酸とも呼ばれる人工的に化学合成された核酸類似物である。五単糖とリン酸から構成される核酸の基本骨格を、グリシンを単位とする電荷の無いポリアミド骨格に置換した構造をもつ。相補的な塩基配列を有する核酸に対してＤＮＡやＲＮＡよりも特異的、かつ強力に結合する。一方で、化学合成物質であることから核酸ポリメラーゼやヌクレアーゼが作用しない性質を有する。このような性質を利用して、非特許文献１のように、野生型ｒａｓ遺伝子に特異的なＰＮＡオリゴマーを用いてＰＣＲ法を行うことで野生型遺伝子を抑制し、変異遺伝子のみを選択的に増幅させる方法等が知られている。【０００５】
ＬＮＡは、ロックド核酸とも呼ばれる核酸類似体であり（特許文献１）、リボヌクレオシドのリボース環の２’−酸素と４’−炭素間のメチレン結合によってリンクされた構造をもつ分子の総称である。ＰＮＡと同様に相補的な塩基配列を有する核酸に対して親和性が高く、ＤＮＡやＲＮＡよりも特異的、かつ強力に結合する。一方、ＰＮＡと異なり、ヌクレアーゼに対する感受性を有する他、核酸ポリメラーゼのプライマーとしても機能し得る。このような性質を利用して、非特許文献２のように、ＬＮＡプローブを用いて静脈血栓塞栓症の発症率を高めるＶ因子ライデン変異（Factor V Leiden mutation）をＰＣＲ法によって検出する方法も報告されている。【０００６】
しかし、通常検体から得られる細胞集団の大多数は野生型の遺伝子を有する正常細胞であり、変異遺伝子を有する癌細胞は極僅かに混在するに過ぎない。したがって、上記のような遺伝子増幅法を用いた変異遺伝子検出法を行ったとしても、野生型遺伝子のバックグラウンドが高いために検出感度が低く、また結果の信頼性も十分とは言い難かった。そのため実際臨床で遺伝子検査として使用するにはまだ多くの問題を残していた。しかし、このような多数の野生型遺伝子から変異遺伝子を検出する技術は、癌の早期発見のみならず、臨床上の癌治療においても極めて重要な意味を持つ。その顕著な例が、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer：以下ＮＳＣＬＣとする）に対する分子標的薬ゲフィチニブ（Gefitinib：商品名「イレッサ」Iressa、アストラゼネカ製造・販売）やエルロチニブ（Erlotinib：商品名「タルセバ」Tarceva、中外製薬製造・販売）の感受性である。【０００７】
ＮＳＣＬＳは、肺癌症例の約７５％を占める疾患である。進行性が速いことから半数以上の患者は癌発見時に手術不能な状態であることが多く、また死亡率も高い。このような進行性肺癌には通常抗がん剤としてプラチナ製剤やドセタキセル（Docetaxel）を用いた化学療法と放射線療法の併用による治療が行われるが、一部の例を除き十分な効果はあげられていない。（非特許文献３）【０００８】
従来の抗がん剤の作用がＤＮＡ合成や細胞分裂を広く阻害するのに対して、ゲフィチニブやエルロチニブは、ヒト上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor：以下ＥＧＦＲとする）を標的とする。ＥＧＦＲは、細胞外ドメインに上皮成長因子（ＥＦＧ）等のリガンドが結合すると二量体を形成し、細胞内ドメインのチロシンキナーゼ活性化が起きる。この活性によって自己リン酸化が引き起こされ、下流の細胞内シグナル伝達経路が作動される。ＥＧＦＲの活性化が細胞増殖に関与することや、ＮＳＣＬＣ患者の多くでＥＧＦＲ遺伝子の突然変異が確認されていること、そしてＮＳＣＬＣ患者ではＥＧＦＲタンパク質の過剰発現が見出されること等の結果から、ＥＧＦＲ遺伝子の変異がＮＳＣＬＣの発症の一因であると考えられている。ゲフィチニブは、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害することでシグナルの伝達を遮断する作用を持つために分子標的剤と呼ばれている。【０００９】
ゲフィチニブは日本では２００２年に承認された。当該治療剤の投与によって一部のＮＳＣＬＣ患者は劇的な治療効果が現れている。一方で、間質性肺炎等の副作用により死亡するという例も発生している。ゲフィチニブのこのような作用効果の二面性については、未だに原因は不明であるが、近年になって非特許文献４、及び５において、ＥＧＦＲの遺伝子変異とゲフィチニブの有効性の密接な関係が発表された。これらの文献によれば、ゲフィチニブの投与によって良好な治療効果が得られたＮＳＣＬＣ患者（ゲフィチニブ感受性患者）は、いずれもＥＧＦＲ遺伝子上の特定の位置に変異を有していた。すなわち、ゲフィチニブはＥＧＦＲの活性阻害剤としてではなく、変異したＥＧＦＲの活性阻害剤として作用することが示唆された。したがって、ＥＧＦＲ遺伝子上の特定の変異の有無を検出することができれば、ＮＳＣＬＣ患者へのゲフィチニブ投与の是非を検索することが可能となる。【００１０】
上記の例のように、野生型遺伝子群に混在する変異遺伝子の検出は、癌の早期発見や個々の患者に応じたテーラーメイド治療を実現化する上で極めて重要であり、そのような変異遺伝子を簡便に、かつ高感度に検出できる方法の開発が望まれている。
このような方法として、標的部位に対して、野生型遺伝子の配列を有するＰＮＡからなるクランププライマーと、ＬＮＡを含み変異遺伝子の配列からなる変異プローブを用いて遺伝子増幅反応を行うことにより、遺伝子プールに混在する変異遺伝子の有無を迅速に、また簡便に、また高精度に、そして高感度に検出することができる「ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法」（特許文献２）が公知である。
ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法によれば、遺伝子プールにおける変異遺伝子の混在率が０．１％でも検出が可能であり、また、増幅反応に伴うバックグラウンドの出現はほとんど検出されない。さらに結果が出るまでに要する時間は約２時間で済む。
また非特許文献６にあるように、第２０エクソンにも１種類の点突然変異が知られており、当該変異を検出するＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００２−５２１３１０号公報
【特許文献２】特許第４２１６２６６号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｔｈｉｅｄｅ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９６，２４，９８３−９８４
【非特許文献２】Ｏｒｕｍ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．，１９９９，４５：１１；１８９８−１９０５
【非特許文献３】Ｍｕｈｓｉｎ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，２００３，２（７）；５１５−５１６．
【非特許文献４】Ｐａｅｚ  Ｇ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０４；１４９７−１５００
【非特許文献５】Ｌｙｎｃｈ  Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００４，３５０；２１２９−２１３９
【非特許文献６】Ｍｉｙａｚａｗａ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，２００８，９９；５９５−６００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
患者から比較的採取が容易な検体では、末梢血や正常細胞の混入により腫瘍細胞の比率が低下する場合が多い。たとえば、胸水検体には正常細胞が多く含まれる末梢血が混入して、腫瘍細胞の比率が低下し、その結果、腫瘍細胞に含まれると思われる変異遺伝子の割合が低下する事が予測される。同様に、ブラシ洗浄液検体では採取時にブラシにより搾過された正常細胞が混入し、同様の事が発生している。この様に腫瘍細胞の割合が低下しやすい検体では、検出感度および信頼性の点で充分とは言えず、更に、高感度に検出できる方法が望まれている。特許文献２に記載の実施例では、最大０．１％の変異型遺伝子を検出可能である事が示されている。しかし、この実施例ではＥＧＦＲ遺伝子の特定の領域のみがクローニングされたプラスミドを混合した遺伝子プールでの結果である。臨床で用いられる検体から得られる遺伝子プールでは、ＥＧＦＲ遺伝子以外のヒトゲノムＤＮＡが大多数を占めており、多様な遺伝子が混在した遺伝子プールに占めるＥＧＦＲ遺伝子の割合は、プラスミドを混合した遺伝子プールより低下している。この為に、ＥＧＦＲ変異型遺伝子の検出感度は低下する場合がある。また、臨床検体から得られる遺伝子プールは、正常細胞由来のヒトゲノムＤＮＡ（正常ＥＧＦＲ遺伝子を含む）が混在する可能性が高く、より高い感度にて変異遺伝子を検出する事が求められる。本発明者らは、たとえばＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法に代表される従来の高感度検出法に供する遺伝子プールとして、ＰＮＡクランプ法による前増幅工程（予備的増幅）を実施する事で、変異遺伝子の割合を高め、後工程のＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法にて高感度に検出することで、従来以上に高感度な変異遺伝子の検出方法を発明するに到った。【００１４】
従って、本発明の課題は、遺伝子プールに混在する変異遺伝子の有無を迅速に、また簡便に、また高精度に、そして高感度に検出することができる方法として、各種の高感度検出法、特にはＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の改良法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題は、本発明による、
［１］遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、
（１）（１ａ）野生型遺伝子の配列または野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるクランププライマーと、
（１ｂ）変異遺伝子の配列を有する標的部位を含む領域を増幅させることのできるプライマーと、
（１ｃ）前記遺伝子プールと
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む領域を選択的に増幅させる工程、
（２）前記工程（１）で得られた増幅産物又はその一部を鋳型として、遺伝子検出法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に検出することで、該変異遺伝子の有無を検出する工程、
を含む変異遺伝子検出方法、
［２］前記工程（２）が、
（２ａ）野生型遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなり、工程（１）で用いたクランププライマー（１ａ）と同一又は異なる塩基配列を有するクランププライマーと、
（２ｂ）変異遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、
（２ｃ）前記工程（１）で得られた増幅産物又はその一部と
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する工程
である、［１］の変異遺伝子検出方法、
［３］前記工程（２）が、
（２ａ’）野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなり、工程（１）で用いたクランププライマー（１ａ）と同一又は異なる塩基配列を有するクランププライマーと、
（２ｂ）変異遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、
（２ｃ）前記工程（１）で得られた増幅産物又はその一部と
を遺伝子増幅用反応液中に共存させ、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する工程
である、［１］の変異遺伝子検出方法、
［４］前記工程（２ｃ）における遺伝子増幅法がＰＣＲ法である、［２］又は［３］の変異遺伝子検出方法、
［５］前記変異プローブがＲＮＡを含む、［２］〜［４］の変異遺伝子検出方法、
［６］前記変異プローブは、一の末端が蛍光物質により標識され、他の末端が前記蛍光物質を抑制するクエンチャーにより標識されている、［２］〜［５］の変異遺伝子検出方法、
［７］前記変異遺伝子の検出領域の増幅産物を、核酸染色剤で染色する、［２］〜［５］の変異遺伝子検出方法、
［８］前記変異遺伝子の検出領域の増幅産物の増加を、蛍光強度の増加によって経時的に検出する、［２］〜［７］の変異遺伝子検出方法、
［９］前記変異が点突然変異である、［２］〜［８］の変異遺伝子検出方法、
［１０］前記変異が欠失変異である、［２］〜［８］の変異遺伝子検出方法、
［１１］前記クランププライマーの鎖長が１４塩基〜１８塩基である、［２］〜［１０］の変異遺伝子検出方法、
［１２］前記工程（２）における遺伝子検出法が、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、スコーピオンアームズ法、ＤＮＡチップ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＨＲＭ法、ｇＦＣＳ法、サザンブロッティング法である、［１］の変異遺伝子検出方法、
［１３］前記変異遺伝子がヒト上皮成長因子受容体の変異遺伝子である、［１］〜［１２］の変異遺伝子検出方法、
により解決することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、胸水検体やブラシ洗浄液検体等の腫瘍細胞の割合が低下しやすい検体のように、公知の各種の高感度検出法、特にはＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法によっても検出が困難であった検体であっても、高感度かつ高精度に、遺伝子プールに混在する変異遺伝子の有無を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施形態１の原理を説明するための説明図である。
【図２】実施形態５の原理を説明するための説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明方法は、公知の各種の高感度検出法、特にはＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法（例えば、特許第４２１６２６６号明細書に記載のＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法）の改良法であり、各高感度検出法（主検出工程）を実施する前段階として、特定の前増幅工程（予備的増幅）を行う。例えば、高感度検出法としてＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法を利用する場合には、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法における選択的増幅および検出工程（以下、主増幅工程と称する）の前段階として、特定の前増幅工程（予備的増幅）を行うこと以外は、通常のＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法と同様にして実施することができる。
以下、本発明を適用することのできる各種の高感度検出法を例示した後、本発明の好適態様である、通常のＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法について、実施形態１〜実施形態１２に基づいて説明し、本発明方法における前増幅工程について説明する。
【００１９】
本発明を適用することのできる高感度検出方法としては、野生型遺伝子群に混在する既知の変異遺伝子（特には混在率が低い変異遺伝子）を検出することができる遺伝子検出法である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、スコーピオンアームズ法等の遺伝子増幅法や、ＤＮＡチップ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＨＲＭ法、ｇＦＣＳ法、サザンブロッティング法等の遺伝子同定法を挙げることができる。
以下、本発明について、高感度検出方法としてＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法を用いる場合の態様を例にとって説明するが、本発明はＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法に限定されるものではない。
【００２０】
<実施形態１>
実施形態１について説明する。本実施形態は、主に請求項２に関する。本実施形態の概要は、遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、野生型遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるクランププライマーと、変異遺伝子の配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、前記遺伝子プールとを遺伝子増幅用反応液中に共存させ、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることで、該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法である。
【００２１】
実施形態１の要件について説明する。まず、本発明において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、遺伝子、遺伝子発現、コード、相補、鋳型、プロモーター、プローブ、プライマー、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の用語の定義に関しては、現在、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等で広く一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００２２】
本発明において「野生型遺伝子」とは、変異を生じておらず、本来の正常な機能を有する遺伝情報を含む遺伝子である。ここで言う遺伝情報とは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ等の情報をコードする転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。
【００２３】
本発明において「変異遺伝子」とは、変異を生じた遺伝子である。「変異」とはＤＮＡやＲＮＡ等の核酸配列の変化であり、遺伝学等で使用される塩基置換、挿入、欠失、逆位、重複、転座等が該当する。当該変異遺伝子において、変異の存在する領域は転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。なお、変異により変異遺伝子が機能上の変化を有する必要はない。
【００２４】
本発明において「遺伝子プール」とは、多数の遺伝子から構成される遺伝子集団を言う。例えば、患者の胸水に含まれる全細胞から得られるゲノムＤＮＡ等が該当する。このとき、検出の対象である遺伝子における変異遺伝子の存在率は問わない。例えば、１００％が野生型遺伝子であってもよいし、５０％が野生型遺伝子で残り５０％が変異遺伝子であってもよい。また、当該プールの遺伝子は、細胞から得られるゲノムＤＮＡであってもよいし、細胞から調製されたｍＲＮＡを鋳型にして逆転写反応を行って得られるｃＤＮＡであってもよいし、クローン化された多数の遺伝子を人工的に混合したものであってもよい。
【００２５】
本発明において「配列」とは、遺伝子、またはプライマー、またはプローブにおける塩基の並びである塩基配列をいう。当該塩基配列はＤＮＡやＲＮＡ等の核酸によって構成されていてもよいし、ＰＮＡやＬＮＡ等の核酸類似体から構成されていてもよいし、またそれらの組み合わせから構成されていてもよい。本発明においては、例えばその塩基配列が特にＤＮＡで構成されている場合は「ＤＮＡ配列」とし、またその塩基配列がＰＮＡで構成されている場合は「ＰＮＡ配列」とする。また、本発明において「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはＰＮＡ、またはＬＮＡ、あるいはその組み合わせによって構成されているものをいう。
【００２６】
本発明において「標的部位」とは、変異遺伝子において変異が見られる塩基が存在する部位、若しくは変異によって塩基が失われた部位であり、野生型遺伝子を含め、本発明において検出の標的とする部位である。例えば、塩基置換があった場合には野生型遺伝子、変異遺伝子共に当該塩基置換した塩基が該当する。また挿入があった場合には変異遺伝子においては挿入された塩基が該当し、野生型遺伝子においては変異遺伝子で塩基が挿入された部位が該当する。また欠失があった場合には変異遺伝子においては欠失によって塩基が失われた部位が該当し、野生型遺伝子においては変異遺伝子で失われた塩基が該当する。当該標的部位の配列は、遺伝情報をコードする配列を有する側（以下センス側とする）を示すものであってもよいし、センス側に対して相補的な配列を有する側（以下アンチセンス側とする）を示すものであってもよい。
【００２７】
本発明において「ＰＮＡ」とは、通常のＰＮＡだけでなく、ＰＮＡを基礎として改良されたＰＮＡに類似の性質を有するＰＮＡ誘導体を含むものとする。例えば、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社のｇｒｉｐＮＡ等が該当する。
【００２８】
本発明において「クランププライマー」とは、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法における主増幅工程で用いるもの、あるいは、後に詳述する前増幅工程で用いるもののいずれであるかを問わず、標的部位にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるプライマーをいう。当該クランププライマーは、全配列がＰＮＡによって構成されている。したがって、プライマーとしてハイブリダイゼーションする際に、ＰＮＡの性質により塩基配列に対する非常に高い選択性を示す。また、ＰＮＡが核酸ポリメラーゼやヌクレアーゼに作用しない性質から、当該クランププライマーもプライマーとして機能せず、ヌクレアーゼに対しても完全な耐性を有する。本実施形態においては、当該クランププライマーの塩基配列が野生型遺伝子の配列に相補的な配列であることを特徴とする。当該クランププライマーの塩基配列は標的部位の一部、または全部と特異的にハイブリダイゼーションするものであれば、特に限定はされない。クランププライマーの長さは、１０塩基から２５塩基であれば特に問わない。遺伝子プール中には変異遺伝子の数よりも野生型遺伝子の数が多いことから、クランププライマーが野生型遺伝子に十分にハイブリダイゼーションできるために、遺伝子増幅用反応液中でクランププライマーの濃度が変異プローブの濃度の１０倍以上あることが好ましい。例えば変異プローブの濃度を１００ｎｍｏｌ／Ｌとするとき、クランププライマーの濃度は１μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５μｍｏｌ／Ｌ程度にすることである。なお、クランププライマーの合成はＰＮＡオリゴの委託合成を行っている各業者に委託してもよい。例えば、グライナージャパン社に委託してもよい。
【００２９】
本発明において「ＬＮＡ」とは、通常のオキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ等のＬＮＡ変異体はもちろんのこと、ＬＮＡを基礎として改良されたＬＮＡに類似の性質を有するＬＮＡ誘導体の含むものとする。
【００３０】
本発明において「変異プローブ」とは、標的部位にハイブリダイゼーションし、ＤＮＡ配列のうち少なくとも一つ以上がＬＮＡに置換された変異プローブである。本実施形態においては、当該変異プローブの塩基配列が変異遺伝子の配列に相補的な配列であることを特徴とする。当該変異プローブの塩基配列は標的部位の一部、または全部と特異的にハイブリダイゼーションし、Ｔｍ値が好ましくは５０℃から６５℃、より好ましくは５４℃から５６℃の範囲内であれば特に限定はされない。変異プローブの配列は、マニュアルでデザインし、Ｔｍ値をＬＮＡ Ｔｍ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｔｏｏｌ（http://lna-tm.com/）で確認することが好ましい。当該変異プローブの塩基数は１０塩基から５０塩基であり、好ましくは１５塩基から２５塩基である。ＬＮＡの数は１つ以上存在すればよく、全てがＬＮＡに置換されていてもよい。当該変異プローブにおいてＬＮＡと置換する位置については、標的部位において野生型遺伝子では見られない塩基が存在する場合には、当該塩基の少なくとも一つ以上をＬＮＡで置換することが好ましい。例えば、変異が数塩基の挿入の場合には、挿入された数塩基のうち少なくとも一つ以上をＬＮＡで置換するとよい。変異プローブの合成はＬＮＡオリゴの委託合成を行っている各業者に委託してもよい。例えば、オランダＥｘｉｃｏｎ社や米国Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）社等であってもよい。
【００３１】
本発明において「遺伝子増幅法」とは、増幅プライマーを用いて標的部位を含む検出領域を増幅する方法である。本実施形態で使用する遺伝子増幅反応は、検出領域を増幅できれば特に問わない。例えば、ＰＣＲ法であってもよいし、ＩＣＡＮ法（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids法）であってもよいし、ＬＡＭＰ法（Loop-mediated isotheremal amplification法）であってもよい。当該遺伝子増幅法において、遺伝子増幅を行うための化学反応を「遺伝子増幅反応」という。
【００３２】
本発明において「遺伝子増幅用反応液」とは、前記遺伝子増幅法において遺伝子増幅反応を行う上で必要な試薬等を含有する溶液である。当該遺伝子増幅用反応液の組成は、使用する遺伝子増幅法によって多少異なるが、通常は基質としての４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ：以下まとめてｄＮＴＰとする）と、酵素としてのＤＮＡポリメラーゼと、前記酵素の補因子としてのマグネシウムイオンと、伸長用のプライマーとしての増幅プライマーと、をバッファー中に含むことを基本とする。前記ｄＮＴＰの濃度は、４種の各終濃度が１００ｎｍｏｌ／Ｌから４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲で最適な濃度を検討すればよい。前記ＤＮＡポリメラーゼは、当該遺伝子増幅法に適する性質を有したものを使用する。例えば、ＬＡＭＰ法であれば鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用するのがよい。前記マグネシウムイオン濃度は、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌから６ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で最適な濃度を検討すればよい。
【００３３】
前記「増幅プライマー」とは、遺伝子増幅法で検出領域を増幅するために用いられるプライマーである。増幅プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、またはＬＮＡ、またはそれらの組み合わせによって構成される。増幅プライマーの濃度は、終濃度が１００ｎｍｏｌ／Ｌから１μｍｏｌ／Ｌの範囲で最適な濃度を検討すればよい。
この場合は、変異プローブの５’側である上流にハイブリダイゼーションする増幅プライマーが無いことが好ましい。また、この場合には、プライマーの配列中に標的部位を含んでいてもよい。増幅プライマーの数は、標的部位を含む検出領域を前記遺伝子増幅法によって増幅可能であれば特に問わない。例えば、１つのプライマーが、伸長する方向が向かい合うように単独でハイブリダイゼーションできる場合には、増幅プライマーの数は１つであってもよい。また、伸長する方向がお互いに向かい合う形で鋳型にハイブリダイゼーションできるばあいであれば、異なる１つの増幅プライマーであってもよい。増幅プライマーの塩基数は、１０塩基から４０塩基の範囲であれば特に問わないが、好ましくは１５塩基から３０塩基であり、特に好ましくは１８塩基から２５塩基である。増幅プライマー間の距離、すなわち検出領域は１００塩基から５０００塩基（５ｋｂ：以下１０００塩基を１ｋｂで表す）の範囲であれば特に問わないが、好ましくは１５０塩基から２ｋｂである。増幅プライマーの配列は、標的部位を含む検出領域を前記遺伝子増幅法によって増幅可能であり、Ｔｍ値が５０℃から６５℃の範囲内であり、好ましくは５５℃から６０℃の範囲内であれば特に問わない。増幅プライマーの配列のデザインは、マニュアルで行ってもよいし、適当なプライマーデザイン用のソフトウェアを用いてもよい。例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３ ｓｏｆｔｗａｒｅ（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi）等を用いてもよい。前記変異プローブが増幅プライマーとして機能してもよい。
バッファーは、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性が得られる至適ｐＨ、および至適塩濃度を有する。使用する遺伝子増幅法によっては、さらにリボヌクレアーゼＨ（RNaseH）や逆転写酵素（ＲＴ）等を含んでいてもよい。また、遺伝子増幅用反応液は、各遺伝増幅法の反応用として様々なタイプが市販されているが、そのような市販のキットに添付されたものを用いてもよい。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを酵素とする場合、当該遺伝子増幅用反応液の組成の基本的な一例を挙げれば、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）／５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ／２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２／２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。もちろん、この条件に限られるものではない。
【００３４】
本発明において「検出領域」とは、前記増幅プライマーを用いて前記遺伝子増幅反応を行った結果増幅される標的部位を含む領域である。検出領域の増幅産物は、増幅プライマーに由来する部分を除けばＤＮＡ配列からなる断片として増幅される。本発明によれば、検出領域は変異遺伝子由来のものが選択的に増幅される。したがって、当該検出領域の増幅産物を以降の増幅した核酸の検出に用いてもよい。
【００３５】
本発明において「共存」とは、遺伝子増幅用反応液中で共に存在し、お互いが影響し得る状態にあることをいう。
【００３６】
ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の原理を図１で例示し、以下で説明する。なお、図１の例は変異遺伝子の変異が点突然変異で、遺伝子増幅反応がＰＣＲ法の場合を示している。
【００３７】
（プローブ、およびプライマーの鋳型へのハイブリダイゼーション）
まず、野生型遺伝子（０１０３）の標的部位（０１０１）に相補的な配列であるＰＮＡからなるクランププライマー（０１０５）と、変異遺伝子（０１０４）の標的部位（０１０２）に相補的な配列で、かつＬＮＡを含むＤＮＡからなる変異プローブ（０１０６）とを、増幅用プライマー（０１０７）、及び遺伝子プールと共に遺伝子増幅用反応液中に共存させる。通常野生型遺伝子は、遺伝子プール中に多数存在することからクランププライマーは、やや過剰に加えておく。これによって、クランププライマーと、変異プローブと、増幅用プライマーは、検出の対象である遺伝子上のそれぞれに相補的な配列上にハイブリダイゼーションする。標的部位が同じことからクランププライマーと変異プローブは、全部または、一部の塩基配列がお互いに一致する。したがって標的部位への両者のハイブリダイゼーションは本来競合し合う。しかし、ＰＮＡとＬＮＡは相補的な塩基配列に対してそれぞれ高い特異性を有することから、変異がわずか１塩基の相違であっても、実際には図１（Ａ）のようにクランププライマーの大多数は野生型遺伝子の標的部位にハイブリダイゼーションし、また変異プローブの大多数は変異型遺伝子の標的部位にハイブリダイゼーションする。
【００３８】
（プライマー伸張反応）
次に、当該遺伝子増幅用反応液に対して遺伝子増幅法によりプライマーの伸長反応を行う。図１（Ｂ）で示すようにクランププライマーはプライマーとして機能しないため伸張反応は生じない。したがって、野生型遺伝子の標的部位を含む検出領域の増幅は、クランププライマーのハイブリダイゼーションによって抑制される。一方、ＬＮＡにはＰＮＡのようなプライマー伸長を阻害する性質はない。つまり、変異プローブは、プライマーとして機能し得ることから伸長反応が起こり、図１（Ｃ）のように増幅プライマーとの間で、変異遺伝子の標的部位を含む検出領域が増幅される。
【００３９】
（遺伝子増幅反応サイクル）
伸長反応終了後、クランププライマーと、変異プローブと、増幅用プライマーを、検出の対象である遺伝子上のそれぞれに相補的な配列上に再びハイブリダイゼーションさせる。再ハイブリダイゼーションの反応は、例えば、ＰＣＲ法の場合は９０℃前後にまで加熱させる熱変性処理を加えるが、この処理は遺伝子増幅法によっては必ずしも必要としない。例えば、ＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法のように５０℃から６５℃の一定温度で増幅可能な場合が該当する。遺伝子増幅法により遺伝子増幅反応のサイクルを繰り返すことで変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることができる。サイクル数は遺伝子増幅法によって、あるいは使用するＤＮＡポリメラーゼの種類によって異なるが、３０サイクルから５５サイクルの範囲であれば特に問わない。好ましくは３５サイクルから５０サイクル、特に好ましくは４０サイクルから４５サイクルである。
【００４０】
（増幅産物の検出）
前記遺伝子増幅法によって、増幅された変異遺伝子の検出領域の検出を行う。当該検出法については変異遺伝子の検出領域の増幅が確認できれば、その検出方法については問わない。例えば、遺伝子増幅反応後の溶液をフェノール・クロロホルム（１：１）溶液で除タンパク処理後、水層を直接か、あるいはエタノール沈殿や適当な精製キットを用いて精製した後、波長２６０ｎｍの吸光度を吸光光度計を用いて測定してもよいし、増幅産物を電気泳動によりアガロースゲル、またはポリアクリルアミドゲルで展開した後、適当なプローブを用いてサザンハイブリダイゼーション法によって検出してもよいし、金ナノ粒子を用いたクロマトハイブリダイゼーション法によって検出してもよいし、増幅した遺伝子による溶液の濁度を測定してもよい。または増幅プライマーの５’末端を予め蛍光標識しておき、遺伝子増幅反応後にアガロースゲル、またはポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、イメージングプレートに蛍光発光を取り込み、適当な検出装置を用いて検出してもよい。以上の検出方法は、前記コントロールの他、それぞれに適当なコントロールの結果と比較することで、より信用性の高い結果を得ることができる。また、シークエンシングにより増幅産物における変異遺伝子の標的部位の存在を確認することで、さらに正確な結果を得ることができる。
【００４１】
<実施形態２>
実施形態２について説明する。本実施形態は、主に請求項３に関する。本実施形態の概要は、遺伝子プールに混在する既知の変異遺伝子の有無を検出する方法であって、野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるクランププライマーと、変異遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションし、配列の少なくとも一部がＬＮＡにより構成されている変異プローブと、前記遺伝子プールとを遺伝子増幅用反応液中に共存させて遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に増幅させることにより該変異遺伝子の有無を検出する変異遺伝子検出方法である。
【００４２】
すなわち、前記実施形態１が検出の対象とする遺伝子のセンス側の配列を鋳型として変異遺伝子を検出する方法であるのに対して、本実施形態は、検出の対象とする遺伝子のアンチセンス側の配列を鋳型として変異遺伝子を検出する方法である。したがって、本実施形態においては、当該クランププライマーの塩基配列が野生型遺伝子のセンス側と同じ配列であることを特徴とする。さらに、当該変異プローブの塩基配列が変異遺伝子のセンス側と同じ配列であることを特徴とする。これは、本発明の変異遺伝子の検出に用いる鋳型は、センス側の配列に限定されるものではなく、アンチセンス側の配列でも使用できることによる。実施形態１とはこの点のみが異なり、その他の要件や原理に関しては実施形態１と同じであることからここではその説明を省略する。
【００４３】
したがって、本発明において鋳型の配列はセンス側とアンチセンス側のいずれを使用してもよい。好ましくは本発明で用いるクランププライマーの配列中のプリン残基の数が少ない側、またはグアニン残基が３つ以上連続しない側にしてもよい。これは、プリン残基の数が増加，またはグアニン残基が３つ以上連続するとＰＮＡの溶解が困難になる事に起因する。
【００４４】
<実施形態３>
実施形態３について説明する。本実施形態は、主に請求項４に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１または２の方法を基本として、さらに遺伝子増幅法がＰＣＲ法である変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１と同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００４５】
本発明における「ＰＣＲ法」は、最も基本的な原理に基づくＰＣＲ法の他に、それを基礎として開発されたＰＣＲ法のバリエーション方法も含むものとする。例えば、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法等が該当する。
【００４６】
本実施形態の遺伝子増幅用反応液の条件は、実施形態１の遺伝子増幅用反応液の条件と同様であるので、ここではその説明を省略し、本実施形態に特徴的な方法を以下で説明する。
【００４７】
当該ＰＣＲ法で使用するＤＮＡポリメラーゼの種類は、増幅プライマーを伸長する活性を有するものであれば、特に問わないが、好ましくは熱耐性ＤＮＡポリメラーゼである。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼやＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの他、バイオサイエンス関連の各社が独自に開発している各種熱耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いてもよい。
【００４８】
このサイクルの反応は、熱変性とアニーリング／伸長反応からなる２ステップＰＣＲであってもよいし、熱変性とアニーリングと伸長反応からなる３ステップＰＣＲであってもよい。
【００４９】
また、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を使用する場合、２度目の遺伝子増幅反応の条件は、最初の反応に用いた増幅プライマー（以下、アウター増幅プライマーとする）に代えて、２度目の反応に用いる増幅プライマー（以下、インナー増幅プライマーとする）を使用する点と、最初の遺伝子増幅反応後の遺伝子増幅用反応液を希釈したものを鋳型として用いる点を除けば、非特異的な増幅産物の増幅を抑制することができれば、特に問わない。例えば、最初の反応条件と同じでもよいし、増幅産物の量等に基づいて反応サイクル数を増減する等適宜変更してもよい。１組のインナー増幅プライマーは、少なくとも一方の配列がアウター増幅プライマーの配列よりも１塩基以上３’側（下流側）にあればよい。例えば、一方のインナー増幅プライマーの配列は、アウター増幅プライマーの配列と同一であってもよいし、いずれのインナー増幅プライマーの配列も、アウター増幅プライマーの配列とほとんど重複していてもよい。最初の遺伝子増幅反応後の遺伝子増幅用反応液の希釈は、１／１０７倍から１／１０５倍の範囲で最適な条件を検討すればよい。好ましくは５／１０７倍から５／１０６倍の範囲内である。
【００５０】
ＰＣＲ法は最も広く用いられている遺伝子増幅法であることから当該方法に最適化された様々試薬や機器等が容易に入手できるだけでなく、当該方法に基づいた革新的な技術も多く、汎用性が極めて高い。また、分子生物学、遺伝子工学を行う通常の研究室や検査室では、ＰＣＲ法に必要な試薬や機器が既に設置されていることが多く、新たな試薬や危機の購入を必要としない点からも便利である。
【００５１】
<実施形態４>
実施形態４は、主に請求項５に関する。本実施形態の概要は、実施形態１から３のいずれか一の方法を基本として、さらに変異プローブがＲＮＡを含むことを特徴とする変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から３のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００５２】
本実施形態は、変異プローブの一部がＲＮＡを含む。これによって、例えば後述の実施形態５において変異プローブが増幅産物にハイブリダイゼーションを形成した際に、ＲＮａｓｅＨで処理することにより、当該ＲＮＡが分解されて蛍光物質とクエンチャーが分離することによって蛍光物質の抑制が解除され、蛍光を発することができる。これによって生じる蛍光を測定することで変異遺伝子を検出できる等便利である。
【００５３】
<実施形態５>
実施形態５について説明する。本実施形態は、主に請求項６に関する。本実施形態の概要は、実施形態１から４のいずれか一の方法を基本として、さらに変異プローブは一の末端が蛍光物質により標識され、他の末端が前記蛍光物質を抑制するクエンチャーにより標識されている変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から４のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００５４】
本発明において「蛍光物質」とは、特定波長の励起光を吸収することで励起状態となり、元の基底状態に戻る際に蛍光を発する性質を有する物質を言う。標識に用いる蛍光物質は、変異プローブの末端に標識可能なものであれば、特に問わない。例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ等いずれであってもよい。
【００５５】
本発明において「クエンチャー」とは蛍光物質の励起エネルギー吸収物質等をいう。使用する種類はＢＨＱ１、ＢＨＱ２、Ｄａｂｃｙｌ等いずれであってもよい。ただし、当該抑制する物質の種類によって蛍光の抑制範囲が異なるため、一の変異プローブ上で組となる蛍光物質の発光を抑制できるクエンチャーの種類を選択する必要がある。発光を抑制できる選択範囲内では特に問わない。例えば、蛍光物質がＦＡＭやＴＥＴの場合には、抑制範囲の波長がやや短波寄り（４８０ｎｍ〜５８０ｎｍ）のＢＨＱ１を、また蛍光物質がＣｙ３やＴｅｘａｓ  ｒｅｄの場合には、抑制範囲の波長がやや長波寄り（５５０ｎｍ〜６５０ｎｍ）のＢＨＱ２を、選択してもよい。
【００５６】
本発明において「末端」とは変異プローブの塩基配列における５’末端、あるいは３’末端を言う。
【００５７】
本発明において「標識され」とは、前記蛍光物質、およびクエンチャーが化学結合によって変異プローブの末端部に付されていることを言う。すなわち、前記蛍光物質と前記クエンチャーのうち、いずれか一方は５’末端に、また他方は３’末端に化学的に結合されていることを意味する。通常５’末端に蛍光物質が結合していることが多いが、同様の効果が得られるのであれば３’末端に蛍光物質が結合していても、特に問わない。また、３’末端にクエンチャー、あるいは蛍光物質が結合している場合には、変異プローブは増幅用プライマーとしては機能しない。クエンチャーや蛍光物質が伸長反応を阻害するためである。したがって、この場合には、変異プローブの５’側である上流にハイブリダイゼーションする増幅プライマーが少なくとも一つは必要となる。さらに、標的部位にハイブリダイゼーションしている変異プローブが当該増幅プライマーの伸長を妨げることの無いよう、遺伝子増幅法に用いるＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するようにすることが望ましい。
【００５８】
（実施形態５の検出方法）
本実施形態における検出方法は、前記蛍光物質から発する蛍光を利用することが好ましい。しかし、本実施形態の変異プローブは、通常状態では一の末端に標識された蛍光物質に励起光を照射しても、他の末端に存在するクエンチャーの抑制により蛍光を発しない。したがって、本実施形態で蛍光を利用するためには、クエンチャーによる抑制を解除する必要がある。クエンチャーによる解除ができれば、方法は特に問わない。例えば、５’末端が蛍光物質で標識されている変異プローブにおいて、当該変異プローブの上流にハイブリダイゼーションする増幅用プライマーと、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとを遺伝子増幅用反応液に加え、ＰＣＲ法によって遺伝子増幅反応を行うことで、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により変異プローブが分解され、蛍光物質が変異プローブから遊離することでクエンチャーによる抑制を解除するようにしてもよい。あるいは、前記実施形態４で述べたように変異プローブの一部をＲＮＡで構成することで、ＲＮａｓｅＨの活性を利用して解除してもよい。
【００５９】
本実施形態の検出の原理の一例を図２で例示し、以下で説明する。なお、図２の例は変異遺伝子の変異が点突然変異で、遺伝子増幅反応が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法の場合を示している。
【００６０】
（プローブ、およびプライマーの鋳型へのハイブリダゼーション）
まず、野生型遺伝子（０２０３）の標的部位（０２０１）に相補的な配列であるＰＮＡからなるクランププライマー（０２０５）と、変異遺伝子（０２０４）の標的部位（０２０２）に相補的な配列で、かつＬＮＡを含むＤＮＡからなる変異プローブ（０２０６）とを、２種の増幅用プライマー（０２０７）、及び遺伝子プールと共に遺伝子増幅用反応液中に共存させる。この時変異プローブは５’側に蛍光物質（０２０９）が、また３’側にクエンチャー（０２１０）がそれぞれ結合している。通常はクエンチャーが蛍光物質の蛍光発光を抑制している。前記図１の説明と同様に、ＰＮＡとＬＮＡの相補配列に対する強い特異性から、変異がわずか１塩基の相違であっても、図２（Ａ）のようにクランププライマーの大多数は野生型遺伝子の標的部位にハイブリダイゼーションし、また変異プローブの大多数は変異型遺伝子の標的部位にハイブリダイゼーションする。
【００６１】
（プライマー伸張反応）
次に、当該遺伝子増幅用反応液に対して遺伝子増幅法によりプライマーの伸長反応を行う。図２（Ｂ）で示すようにクランププライマーはプライマーとして機能しないため伸張反応は生じない。また、ＰＮＡのヌクレアーゼ耐性により、伸長反応に用いるＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのような５’→３’エキソヌクレアーゼ活性（０２０８）を有する場合であっても、その分解を受けない。したがって、野生型遺伝子の標的部位を含む検出領域の増幅は、例えクランププライマーを挟み込むようにデザインした増幅用プライマー２種を共存させていたとしても、クランププライマーのハイブリダイゼーションによって抑制される。一方、ＬＮＡにはＰＮＡのようなプライマー伸長を阻害する性質や、核酸ヌクレアーゼに対する耐性はない。ただし、変異プローブの３’側にはクエンチャーが結合しているために伸長反応は阻害される。したがって、この場合は２種の増幅用プライマー（０２０７）間で伸長反応が起こる。すなわち、伸長反応に用いるＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって変異プライマーは分解され、増幅プライマー間で、変異遺伝子の標的部位を含む検出領域が増幅される。この、分解によって蛍光物質は遊離し、クエンチャーによる抑制が解除される。この遊離した蛍光物質から発せられる蛍光物質を検出することにより、増幅した変異遺伝子を検出できる。
【００６２】
<実施形態６>
実施形態６について説明する。本実施形態は、主に請求項７に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１から４のいずれか一を基本として、さらに前記変異遺伝子の検出領域の増幅産物を核酸染色剤で染色する変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から３のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００６３】
本発明において「核酸染色剤」とは、核酸、または核酸類似体に結合、若しくは挿入してそれらを染色する試薬を総称して言う。例えば、２本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして核酸の染色を行うインターカレーターが該当する。インターカレーターも多くの種類が知られている。例えば、エチジウムブロマイド（ＥＢ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、各種Ｈｏｅｃｈｓｔ、各種ＳＹＢＲ、各種ＳＹＮＴＯＸ、各種ＴＯＴＯ等があるが、当該増幅産物を染色する場合には、十分に染色できればその種類は特に問わない。
【００６４】
本発明において「染色」とは、目視によって確認できるような増幅産物の呈色を意味するだけでなく、励起光を照射することで染色が確認できる蛍光染色も含むものとする。
【００６５】
（実施形態６の検出方法）
核酸染色剤は、前記インターカレーターを始めとして、いずれも特定波長の励起光を照射することにより特有の蛍光を発する。したがって、本実施形態における検出方法は、この蛍光発光を利用できるようにすることが好ましい。染色の方法や時期は、結果として染色できれば特に問わない。例えば、遺伝子増幅反応後に核酸染色剤を溶解した染色液中に浸漬して染色してもよいし、反応中に染色してもよい。検出の方法は、染色した増幅産物を検出できれば特に特に問わない。例えば、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、核酸染色剤で染色したゲルをトランスイルミネーター上で励起光を照射し、予想される増幅産物のサイズの位置のバンドとコントロールのバンドとを目視により比較確認してもよいし、ライトキャプチャー（化学発光・蛍光撮影装置）によって蛍光物質から発する発光を検出した後、解析ソフトを用いてコントロールとの蛍光強度の比較定量を行うことで検出してもよい。
【００６６】
<実施形態７>
実施形態７について説明する。本実施形態は、主に請求項８に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１から６のいずれか一の方法を基本として、さらに変異遺伝子の検出領域の増幅産物の増加を蛍光強度の増加によって経時的に検出する変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から６のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００６７】
本発明における「経時的」とは、時間経過的であることを意味する。したがって、「増幅産物の増加を経時的に検出する」とは、増幅産物の増加を遺伝子増幅反応の時間経過を追って検出することを言う。
【００６８】
検出は「蛍光強度の増加」によって行われる。ここで言う、「蛍光」は、実施形態５で述べた蛍光物質や実施形態６で述べた核酸染色剤が励起されて基底状態に戻る際に発する蛍光等をいう。
【００６９】
（実施形態７の検出方法）
本実施形態の検出法については、増幅産物の増加を反映する蛍光強度の増加を経時的に検出できれば、その検出方法については問わない。例えば、実施形態５で述べたように、末端を蛍光ラベルした変異プローブが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって分解され５’が遊離することで発せられる蛍光をリアルタイムで検出してもよい（ＴａｑＭａｎプローブ法）。または、末端を蛍光ラベルしたＲＮＡを含む変異プローブが、ＲＮａｓｅＨの添加によりその活性でＲＮＡ部分が分解されることで発せられる蛍光をリアルタイムで検出してもよい（サイクリングプローブ法）。あるいは、実施形態６のようにＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の核酸染色剤を遺伝子増幅用反応液中に加えて、遺伝子増幅反応とともに染色する。増幅産物の増加をインターカレートした当該核酸染色剤から発せられる蛍光の強度を励起光を照射しながら測定してもよい。
【００７０】
<実施形態８>
実施形態８について説明する。本実施形態は、主に請求項９に関する。本実施形態の要は、前記実施形態１から７のいずれか一の方法を基本として、さらに前記変異が点突然変異である変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から７のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００７１】
本発明において「点突然変異」とは、検出の対象である遺伝子に関して塩基配列上の１塩基が置換した変異だけでなく、１塩基が挿入した変異を含むものとする。したがって、当該点突然変異においては１塩基の置換、若しくは挿入がされた部位が、標的部位となる。
【００７２】
本実施形態で使用する変異プローブは、標的部位が変異遺伝子の配列を有し、かつ少なくとも標的部位はＬＮＡで置換されていることを特徴とする。例えば、変異が１塩基置換で実施形態１を基本とする場合には、当該変異プローブの配列は変異遺伝子に相補的配列であり、さらに少なくとも置換された当該１塩基の配列がＬＮＡで置換されていることが該当する。これにより野生型遺伝子と変異遺伝子が僅か一塩基の相違であっても、変異プローブは変異遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションすることが可能である。また、野生型遺伝子の配列を有するクランププライマーは、当該変異遺伝子に対してハイブリダイゼーションすることが困難となり、標的部位に対する変異プローブとクランププライマーの配列特異性が明確になる。
【００７３】
<実施形態９>
実施形態９について説明する。本実施形態は、主に請求項１０に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１から７のいずれか一の方法を基本として、さらに前記変異が欠失変異である変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から７のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００７４】
本発明において「欠失変異」とは、検出の対象である遺伝子に関して野生型遺伝子の塩基配列上の一塩基が失われた場合、若しくは二塩基以上の連続性が失われた変異をいう。したがって、遺伝学上の欠失の意味に留まらない。例えば、染色体の転座や逆位、あるいはレトロウィルスの挿入等によって検出の対象である遺伝子が分断された場合も該当する。したがって、当該欠失変異においては、野生型遺伝子の塩基配列上の一塩基が失われた部位、若しくは二塩基以上の連続性が失われた部位が標的部位となる。
【００７５】
本実施形態で使用する変異プローブは、標的部位が変異遺伝子の配列を有し、かつ変異プローブの配列のうち少なくとも一つ以上がＬＮＡで置換されている。特に、標的部位において野生型遺伝子では見られない特異な塩基配列が存在する場合には、当該特異な塩基配列のうち少なくとも一つ以上はＬＮＡで置換されていることが好ましい。例えば、変異が３塩基挿入の場合には、挿入された３塩基のうち少なくとも一つ以上をＬＮＡで置換することが好ましい。変異プローブは当該特異な塩基配列の全部または一部を有していればよい。また、標的部位において野生型遺伝子で見られる塩基が存在しない場合、すなわち遺伝学上の欠失の場合には、変異プローブの配列のうち、少なくともいずれか一つ以上をＬＮＡで置換することが好ましい。特に好ましくは欠失の結果として連結された部位の塩基のうち少なくとも一方がＬＮＡで置換されていることである。本実施形態により変異プローブは、欠失変異であっても変異遺伝子により特異的、かつ強固にハイブリダイゼーションできる。
【００７６】
<実施形態１０>
実施形態１０について説明する。本実施形態は、主に請求項１１に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１から９のいずれか一の方法を基本として、さらに前記クランププライマーの鎖長が１４塩基から１８塩基である請求項２から１０のいずれか一に記載の変異遺伝子検出方法である。本実施形態において、前記実施形態１から９のいずれかと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００７７】
本実施形態は、クランププライマーが１４塩基から１８塩基である点を特徴とする。ＰＮＡからなるクランププライマーは１３塩基以下では十分なクランピングの効果が得られず、また１９塩基以上はプライマー自体の合成精度が落ちている等の問題がある。しかし、１４塩基から１８塩基の範囲内では、本発明においてはいずれの長さであっても顕著な差異は見出せない。本発明のクランププライマーの鎖長としては最適、かつ十分な長さであるとして本実施形態がある。
【００７８】
<実施形態１１>
実施形態１１について説明する。本実施形態は、主に請求項１３に関する。本実施形態の概要は、前記実施形態１から１０のいずれか一の方法を基本として、さらに前記変異遺伝子がヒトＥＧＦＲの変異遺伝子であることを特徴とする変異遺伝子検出法である。
【００７９】
本実施形態において、前記実施形態１から１０のいずれかと同じ要件等に関してはその説明を省略し、ここでは本実施形態に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００８０】
（検出用遺伝子プールの調製）
本実施形態において使用する遺伝子プールは、ヒトＥＧＦＲの変異遺伝子の有無を検査する目的で、その対象者から得られるゲノムＤＮＡやｃＤＮＡを用いる。好ましくは、当該対象者の喀痰、または胸水、またはブラシ洗浄液などの気管支洗浄液、または手術により得られる組織の一部、病理組織切片等の一般に肺癌診断に使用される全ての試料から得ることである。これらの試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡを調製する方法は、例えばアルカリ法のように広く一般に使用されているゲノムＤＮＡやｍＲＮＡの調製方法でよい。また、市販のＤＮＡ調製キットやｍＲＮＡ調製キットを用いてもよい。ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する方法も、ＲＴを用いた広く一般に使用されている方法でよい。また、市販のｃＤＮＡ調製キットを用いてもよい。
【００８１】
（ＥＧＦＲの既知の変異遺伝子について）
非特許文献４、及び５にあるように、現在までにＮＳＣＬＣ患者由来のＥＧＦＲ遺伝子変異は、以下に示す１１種類が報告されている。当該１１種類の変異は、４種類の点突然変異と、７種類の欠失変異の二つに大別される。また、当該全ての変異がＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼドメインをコードする第１８エクソン、または第１９エクソン、または第２１エクソンのいずれかに存在している。また非特許文献６にあるように、第２０エクソンにも１種類の点突然変異が知られている。
【００８２】
１．Ｇ７１９Ｃ：第１８エクソンにコードされる２１５５番塩基（開始コドンのＡを１番塩基としたｃＤＮＡ上の塩基番号とする、以下同じ）ＧがＴに置換した点突然変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７１９番目のグリシン残基がシステイン残基に置換したものである。
【００８３】
２．Ｇ７１９Ｓ：第１８エクソンにコードされる２１５５番塩基ＧがＡに置換した点突然変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７１９番目のグリシン残基がセリン残基に置換したものである。
【００８４】
３．Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−１：第１９エクソンにコードされる２２３５番塩基Ｇから２２４９番塩基Ｃまでの１５塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４６番目のグルタミン酸残基から７５０番目のアラニン残基が欠失したものである。
【００８５】
４．Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ−２：第１９エクソンにコードされる２２３６番塩基Ｇから２２５０番塩基Ａまでの１５塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４６番目のグルタミン酸残基から７５０番目のアラニン残基が欠失したものである。
【００８６】
５．Ｌ７４７−Ａ７５０ｄｅｌＴ７５１Ｓ：第１９エクソンにコードされる２２４０番塩基Ｔから２２５１番塩基Ａまでの１２塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４７番目のロイシン残基から７５０番目のアラニン残基が欠失し、また７５１番目のチミジン残基がセリン残基に置換したものである。
【００８７】
６．Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＰ７５３Ｓ：第１９エクソンにコードされる２２４０番塩基Ｔから２２５７番塩基Ｃまでの１６塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４７番目のロイシン残基から７５２番目のセリン残基が欠失し、また７５３番目のプロリン残基がセリン残基に置換したものである。
【００８８】
７．Ｌ７４７−Ｅ７４０ｄｅｌＡ７５０Ｐ：第１９エクソンにコードされる２２３９番塩基Ｔから２２４７番塩基Ａまでの９塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４７番目のロイシン残基から７４０番目のグルタミン酸残基が欠失し、また７５０番目のアラニン残基がプロリン残基に置換したものである。
【００８９】
８．Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌＥ７４６Ｖ：第１９エクソンにコードされる２２３８番塩基Ａから２２５５番塩基Ｃまでの１８塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７４７番目のロイシン残基から７５２番目のセリン残基が欠失し、また７４６番目のグルタミン酸残基がバリン残基に置換したものである。
【００９０】
９．Ｓ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌ：第１９エクソンにコードされる２２５４番塩基Ｔから２２７７番塩基Ｃまでの２４塩基が欠失した欠失変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の７５２番目のセリン残基から７５９番目のイソロイシン残基が欠失したものである。
【００９１】
１０．Ｌ８５８Ｒ：第２１エクソンにコードされる２５７３番塩基ＴがＧに置換した点突然変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の８５８番目のリジン残基がアルギニン残基に置換したものである。
【００９２】
１１．Ｌ８６１Ｑ：第２１エクソンにコードされる２５８２番塩基ＴがＡに置換した点突然変異遺伝子であり、その結果、ヒトＥＧＦＲタンパク質の８６１番目のリジン残基がグルタミン残基に置換したものである。
【００９３】
以上、遺伝子プールを出発材料（被検試料）として用いる、通常のＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法について、具体的な実施形態１〜１１に基づいて説明したが、本発明では、遺伝子プールを出発材料として使用し、特定のクランププライマーの存在下において、遺伝子増幅法により変異遺伝子の標的部位を含む領域を選択的に増幅させた後（前増幅工程）、得られた増幅産物又はその一部（好ましくは、得られた増幅産物の希釈したもの）を鋳型として、通常のＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法における主増幅工程を実施することができる。なお、先述したとおり、本発明では、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法に代えて、公知の各種高感度検出法を用いることもできる。
【００９４】
前増幅工程で用いる「クランププライマー」（以下、前増幅工程用クランププライマーと称する）は、野生型遺伝子の配列または野生型遺伝子に相補的な配列を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションするＰＮＡからなるものであれば、特に限定はされない。前増幅工程用クランププライマーについて、主増幅工程用クランププライマーと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは前増幅工程用クランププライマーに特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００９５】
前増幅工程用クランププライマーの塩基配列は、主増幅工程用クランププライマーと同一であることもできるし、異なる塩基配列であることもできる。
例えば、主増幅工程用クランププライマーが、野生型遺伝子の配列（例えば、センス配列）を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションする配列である場合、前増幅工程用クランププライマーは、野生型遺伝子の配列（センス配列）を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションする配列であることもできるし、野生型遺伝子に相補的な配列（アンチセンス配列）を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションする配列であることもできる。前者の場合、主増幅工程用クランププライマーの配列と前増幅工程用クランププライマーの配列とは、完全一致、部分一致（すなわち、部分重複）、重複する配列を含まないのいずれであってもよい。
逆に、主増幅工程用クランププライマーが、野生型遺伝子に相補的な配列（アンチセンス配列）を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションする配列である場合、前増幅工程用クランププライマーは、野生型遺伝子の配列（センス配列）を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションする配列であることもできるし、野生型遺伝子に相補的な配列（アンチセンス配列）を有する標的部位の全部または一部にハイブリダイゼーションする配列であることもできる。後者の場合、主増幅工程用クランププライマーの配列と前増幅工程用クランププライマーの配列とは、完全一致、部分一致、重複する配列を含まないのいずれであってもよい。
前増幅工程に用いられるクランププライマーの使用濃度は、鋳型となる遺伝子プール量や遺伝子プールに存在する野生型遺伝子の量により異なるが、一般的には０．０１μｍｏｌ／Ｌから１０μｍｏｌ／Ｌである。好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌから５μｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌから１μｍｏｌ／Ｌである。
【００９６】
前増幅工程で用いる「増幅プライマー」及び「遺伝子増幅用反応液」について、主増幅工程で用いるのと同じである要件等に関してはその説明を省略し、ここでは前増幅工程に特徴的な要件等に関してのみ説明する。
【００９７】
（前増幅反応）
野生型遺伝子と変異型遺伝子を含む遺伝子プールと、ＰＮＡクランププライマーと、増幅プライマーとを、遺伝子増幅用反応液中に共存させる。通常野生型遺伝子は、遺伝子プール中に多数存在することからクランププライマーは、やや過剰に加えておく。これによって、クランププライマーと、増幅用プライマーは、検出の対象である遺伝子上のそれぞれに相補的な配列上にハイブリダイゼーションする。野生型遺伝子および変異型遺伝子の標的部位が、変異箇所を除き、同一配列であることから、標的部位へのクランププライマーのハイブリダイゼーションは本来競合し合う。しかし、ＰＮＡは相補的な塩基配列に対してそれぞれ高い特異性を有することから、変異がわずか１塩基の相違であっても、実際にはクランププライマーの大多数は野生型遺伝子の標的部位にハイブリダイゼーションする。
【００９８】
次に、当該遺伝子増幅用反応液に対して遺伝子増幅法によりプライマーの伸長反応を行う。クランププライマーはプライマーとして機能しないため伸張反応は生じない。したがって、野生型遺伝子の標的部位を含む領域の増幅は、クランププライマーのハイブリダイゼーションによって抑制される。一方、変異型遺伝子の大多数には、クランププライマーがハイブリダイゼーションしていないので、プライマー伸長を阻害する要因はなく、増幅プライマーによる伸長反応が起こり、変異遺伝子の標的部位を含む領域が選択的に増幅される。
【００９９】
得られた増幅産物は、そのまま、あるいは、適宜希釈した上で、その全部または一部を鋳型として、次の主検出工程を実施する。例えば、一般的には、得られた増幅産物を、主検出工程の増幅を阻害しないヌクレアーゼフリーの溶媒、例えば滅菌処理された超純水にて１００〜１０，０００倍に希釈して、鋳型として使用する。
該前増幅工程は、主検出工程の前に２回以上実施することもできる。
【０１００】
<実施形態１２>
実施形態１２について説明する。本実施形態は、主に請求項１２に関する。本実施形態は、請求項１に記載の（２）工程（すなわち主検出工程）における変異遺伝子の標的部位を含む検出領域を選択的に検出する方法であり、当該業者にて、一般的に用いられている検出手法である。その一例として、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、スコーピオンアームズ法、ＤＮＡチップ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＨＲＭ法、ｇＦＣＳ法、サザンブロッティング法を挙げる。より望ましくは検出感度の高さが知られている、インベーダー法や、スコーピオンアームズ法が望ましい。
【実施例】
【０１０１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【０１０２】
《実施例１：高感度検出法に供する鋳型ＤＮＡの前増幅工程におけるＰＮＡクランププライマー添加効果の検証１》
本実施例では、ヒトゲノムＤＮＡプール中に混在する変異型ＥＧＦＲ遺伝子をターゲットとして、欠失変異ＥＧＦＲ遺伝子（エクソン１９中のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異）と点変異ＥＧＦＲ遺伝子（エクソン２１中のＬ８５８Ｒ点変異）のそれぞれについて、高感度検出法（ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法）に供する鋳型ＤＮＡの前増幅工程におけるＰＮＡクランププライマー添加効果の有効性と検出感度について検証を行った。ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の条件については、特許第４２１６２６６号明細書を参考にした。【０１０３】
（材料）
変異ＥＧＦＲ遺伝子として、コリエルインスティテュート（Coriell Institute）より購入した培養細胞ＰＣ９（EGFR Exon19 E746-A750 欠失変異型）及び１１−１８（EGFR Exon21 L858R 点変異型）を定法により培養し、市販キット（DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen社)）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを使用した。また野生型ＥＧＦＲ遺伝子として、コリエルインスティテュートより購入したHapMapDNAを用いた。【０１０４】
これらのＤＮＡを用いて、表１（PC9 希釈系列、Exon19 E746-A750 欠失変異型）又は表２（11-18 希釈系列、Exon21 L858R 点変異型）に示す１７段階の希釈系列を各々１５μＬとなるように調製した。
すなわち、全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数を５００コピー（ヒトゲノムＤＮＡ量として１６５０ｐｇ相当）とし、全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数中の変異ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の割合が、５０％、１０％、２％、０．４％、０％となるように、調製した。
同様に、
全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数を１００コピー（ヒトゲノムＤＮＡ量として３３０ｐｇ相当）とし、全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数中の変異ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の割合が、５０％、１０％、２％、０．４％、０％となるように；
全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数を２０コピー（ヒトゲノムＤＮＡ量として６６ｐｇ相当）とし、全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数中の変異ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の割合を、５０％、１０％、２％、０％となるように；
全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数を５コピー（ヒトゲノムＤＮＡ量として１６．５ｐｇ相当）とし、全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数中の変異ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の割合を、５０％、１０％、０％となるように；
それぞれ調製した。【０１０５】
ＰＣ９希釈系列（Exon19欠失）
【表１】
2012002477.tif 000002
【０１０６】
11-18希釈系列（Exon21-L858R）
【表２】
2012002477.tif 000003
【０１０７】
（ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法に供する鋳型ＤＮＡの前増幅工程の実施）
１７段階の希釈系列ＤＮＡを、下記に示す（１）〜（４）系列の条件で、遺伝子増幅用反応液に供し、前増幅工程を実施した。（１）及び（２）系列はＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９中のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を検出する系列、（３）及び（４）系列はＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１中のＬ８５８Ｒ点変異を検出する系列であり、（１）及び（３）系列はＰＮＡクランププライマー無添加系列（ＰＮＡ−）であり、（２）及び（４）系列はＰＮＡクランププライマー添加系列（ＰＮＡ＋）である。【０１０８】
（１）ＥＧＦＲ遺伝子のExon19 E746-A750 欠失変異を検出（ＰＮＡ−）
（１）系列の遺伝子増幅用反応液として以下の試薬を混合して調製した。10xPCR buffer（Qiagen社：HotStarTaq polymerase 酵素製品に添付）: 2 μL, 10 mmol/L dNTPmix（＝dATP, dTTP, dGTP, dCTP）: 0.4 μL, 25 μmol/L 増幅フォワードプライマーｅｘ１９−ｏｕｔ−Ｆ（塩基配列：5’- GTGCATCGCTGGTAACATCC -3’：配列番号１）: 0.4 μL, 25 μmol/L 増幅リバースプライマーｅｘ１９−ｏｕｔ−Ｂ（塩基配列：5’- TGAGGTTCAGAGCCATGGAC -3’：配列番号２）: 0.4 μL, 0.5 U HotStarTaq polymerase（Qiagen社）を混和し、５μＬになるように滅菌水を加え調製した。【０１０９】
（２）ＥＧＦＲ遺伝子のExon19 E746-A750 欠失変異を検出（ＰＮＡ＋）
（２）系列の遺伝子増幅用反応液として以下の試薬を混合して調製した。10xPCR buffer（Qiagen社：HotStarTaq polymerase 酵素製品に添付）: 2 μL, 10 mmol/L dNTPmix（＝dATP, dTTP, dGTP, dCTP）: 0.4 μL, 25 μmol/L 増幅フォワードプライマーｅｘ１９−ｏｕｔ−Ｆ（塩基配列：5’- GTGCATCGCTGGTAACATCC -3’）: 0.4 μL, 25 μmol/L 増幅リバースプライマーｅｘ１９−ｏｕｔ−Ｂ（塩基配列：5’- TGAGGTTCAGAGCCATGGAC -3’）: 0.4 μL, 100 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＤｅｌｃ１（Panagene社：塩基配列：NH2- AGATGTTGCTTCTCTTAA -CONH2）: 1 μL, 0.5 U HotStarTaq polymerase（Qiagen社）を混和し、５μＬになるように滅菌水を加え調製した。【０１１０】
（３）ＥＧＦＲ遺伝子のExon21 L858R 点変異を検出（ＰＮＡ−）
（３）系列の遺伝子増幅用反応液として以下の試薬を混合して調製した。10xPCR buffer（Qiagen社：HotStarTaq polymerase 酵素製品に添付）: 2 μL, 10 mmol/L dNTPmix（＝dATP, dTTP, dGTP, dCTP）: 0.4 μL, 25 μmol/L 増幅フォワードプライマーｅｘ２１−Ｆ（塩基配列：5’- GCATGAACTACTTGGAGGAC -3’：配列番号３）: 0.4 μL, 25 μmol/L 増幅リバースプライマーｅｘ２１−Ｂ（塩基配列：5’- ACCTAAAGCCACCTCCTTAC -3’：配列番号４）: 0.4 μL, 0.5 U HotStarTaq polymerase（Qiagen社）を混和し、５μＬになるように滅菌水を加え調製した。【０１１１】
（４）ＥＧＦＲ遺伝子のExon21 L858R 点変異を検出（ＰＮＡ＋）
（４）系列の遺伝子増幅用反応液として以下の試薬を混合して調製した。10xPCR buffer（Qiagen社：HotStarTaq polymerase 酵素製品に添付）: 2 μL, 10 mmol/L dNTPmix（＝dATP, dTTP, dGTP, dCTP）: 0.4 μL, 25 μmol/L 増幅フォワードプライマーｅｘ２１−Ｆ（塩基配列：5’- GCATGAACTACTTGGAGGAC -3’）: 0.4 μL, 25 μmol/L 増幅リバースプライマーｅｘ２１−Ｂ（塩基配列：5’- ACCTAAAGCCACCTCCTTAC -3’）: 0.4 μL, 100 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＬ８５８ｃ（Panagene社：塩基配列：NH2- TTTGGCCAGCCCAA -CONH2）: 1 μL, 0.5 U HotStarTaq polymerase（Qiagen社）を混和し、５μＬになるように滅菌水を加え調製した。【０１１２】
調製した（１）〜（４）系列の遺伝子増幅用反応液に、１７段階の希釈系列ＤＮＡを添加し、サーマルサイクラー（GeneAmp9700 (AppliedBioSystems社)）にてＤＮＡを増幅した。ＤＮＡ増幅は、９５℃で１５分加温後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒のステップを４０サイクル、７２℃で１０分加温後、１０℃で保存した。【０１１３】
（前増幅した鋳型ＤＮＡを用いたＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の実施）
増幅した（１）〜（４）系列のＤＮＡ溶液を、滅菌水にて２０００倍に希釈し、その一部をＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の鋳型とした。【０１１４】
（Ａ）ＥＧＦＲ遺伝子のExon19 E746-A750 欠失変異の検出
前記のように調製し希釈した（１）及び（２）系列のＤＮＡ溶液を、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９中のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を検出するＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法にて解析した。【０１１５】
具体的には、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の遺伝子増幅用反応液として下記の試薬を混合して調製した。Premix Ex Taq Hot Start Version（タカラバイオ社）: 12.5 μL, 100 μmol/L 増幅フォワードプライマーｅｘ１９−ｏｕｔ−Ｆ（塩基配列：5’- GTGCATCGCTGGTAACATCC -3’）: 0.05 μL, 100 μmol/L 増幅リバースプライマーｅｘ１９−ｏｕｔ−Ｂ（塩基配列：5’- TGAGGTTCAGAGCCATGGAC -3’）: 0.05 μL, 100 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＤｅｌｃ１（Panagene社：塩基配列：NH2- AGATGTTGCTTCTCTTAA -CONH2）: 1 μL, 100 μmol/L ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ１Ｆ: 0.025 μL, 100 μmol/L ＬＮＡ−変異プローブE746-A750del-1pF: 0.025 μL, 2000倍希釈したＤＮＡ溶液: 5 μLを加え、２５μＬになるように滅菌水を加え調製した。
なお、ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ１Ｆは、ＥＧＦＲ野生型およびＥＧＦＲ変異型に共通な配列を検出できるように設計した。【０１１６】
上記プローブは全てＩＤＴ社へ合成を委託した。それぞれプローブの詳細を以下に示す。ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ１Ｆの配列は：５’−（Cy5）ｔｔａａＣｔＴＴＣｔＣａＣｃｔ（BHQ2）−３’。ＬＮＡ−変異プローブE746-A750del-1pFの配列は：５’−（6FAM）ｃｔａｔｃａａＡａＣａｔｃｔｃｃｇａａａｇｃ（BHQ1）−３’。ここで、配列の小文字はＤＮＡを、大文字はＬＮＡを、６ＦＡＭ，Ｃｙ５は蛍光色素を、ＢＨＱ１，ＢＨＱ２は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。【０１１７】
ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９中のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を検出するＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法は、サーマルサイクラー（Smart Cycler II (Cepheid Sunnyvale社)）を用いて実施した。ＰＣＲクランプ反応のサイクルは、９５℃で１０秒保持した後、９５℃３秒と６２℃３０秒のステップを６０サイクルで行った。増幅の有無は、機器の添付の解析ソフトにて行い、ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ１Ｆの陽性基準を５＜Ｃｔ値＜２５、ＬＮＡ−変異プローブE746-A750del-1pFの陽性基準を５＜Ｃｔ値＜２５とした。ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ１Ｆにて、全ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を確認し、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法が正常に行われていることを確認し、ＬＮＡ−変異プローブE746-A750del-1pFによって、該ＥＧＦＲの遺伝子変異を検出することができるか検討した。【０１１８】
（ＥＧＦＲ遺伝子のExon19 E746-A750 欠失変異検出における結果）
上記のように、１７段階希釈したＤＮＡを用いて、前増幅におけるＰＮＡクランププライマー添加の効果を比較した。本検討は、３回個別に繰り返し実施して、２回以上変異を検出した場合を「変異検出」と判定した。その結果を、表３に示す。HapMapDNA（野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）とＰＣ９由来ＤＮＡ（変異型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）を８．３ｐｇずつ等量混合した例（換算細胞数で５細胞中のＤＮＡにおける２．５コピーのＥＧＦＲ遺伝子変異）にて、ＰＮＡクランププライマーを添加した前増幅による検出感度の増大を確認できた。
なお、表３（及び後述の表４）において、３回の試験の内、２回以上変異ＥＧＦＲを検出した場合「○」、その他の場合「×」とした。また、グレーの網掛にて示した部分は、前増幅でＰＮＡ添加の効果が表れた部分を示す。【０１１９】
Exon19 E746-A750 欠失変異
【表３】
2012002477.tif 000004
【０１２０】
（Ｂ）ＥＧＦＲ遺伝子のExon21 L858R 点変異の検出
前記のように調製し希釈した（３）及び（４）系列のＤＮＡ溶液を、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１中のＬ８５８Ｒ点変異を検出するＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法にて解析した。【０１２１】
具体的には、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の遺伝子増幅用反応液として下記の試薬を混合して調製した。Premix Ex Taq Hot Start Version（タカラバイオ社）: 12.5 μL, 100 μmol/L 増幅フォワードプライマーｅｘ２１−Ｆ（塩基配列：5’- GCATGAACTACTTGGAGGAC -3’）: 0.05 μL, 100 μmol/L 増幅リバースプライマーｅｘ２１−Ｂ（塩基配列：5’- ACCTAAAGCCACCTCCTTAC -3’）: 0.05 μL, 100 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＬ８５８ｃ（Panagene社：塩基配列：NH2- TTTGGCCAGCCCAA -CONH2）: 1 μL, 100 μmol/L ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ２Ｆ: 0.025 μL, 100 μmol/L ＬＮＡ−変異プローブＬ８５８ＲｐＦ: 0.025 μL, 2000倍希釈したＤＮＡ溶液: 5 μLを加え、２５μＬになるように滅菌水を加え調製した。
なお、ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ２Ｆは、ＥＧＦＲ野生型およびＥＧＦＲ変異型に共通な配列を検出できるように設計した。【０１２２】
上記プローブは全てＩＤＴ社へ合成を委託した。それぞれプローブの詳細を以下に示す。ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ２Ｆの配列は：５’−（Cy5）ｃｃａＧｇａａＣｇｔａＣｔｇ（BHQ2）−３’。ＬＮＡ−変異プローブＬ８５８ＲｐＦの配列は：５’−（6FAM）ｔｔｔｇｇｃｃＣｇｃｃｃａａ（BHQ1）−３’。ここで、配列の小文字はＤＮＡを、大文字はＬＮＡを、６ＦＡＭ，Ｃｙ５は蛍光色素を、ＢＨＱ１，ＢＨＱ２は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。【０１２３】
ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１中のＬ８５８Ｒ点変異を検出するＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法は、サーマルサイクラー（Smart Cycler II (Cepheid Sunnyvale社)）を用いて実施した。ＰＣＲクランプ反応のサイクルは、９５℃で１０秒保持した後、９５℃３秒と６２℃３０秒のステップを６０サイクルで行った。増幅の有無は、機器の添付の解析ソフトにて行い、ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ１Ｆの陽性基準を５＜Ｃｔ値＜２５、ＬＮＡ−変異プローブＬ８５８ＲｐＦの陽性基準を５＜Ｃｔ値＜３０とした。ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ２Ｆにて、全ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を確認し、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法が正常に行われていることを確認し、ＬＮＡ−変異プローブＬ８５８ＲｐＦによって、該ＥＧＦＲの遺伝子変異を検出することができるか検討した。【０１２４】
（ＥＧＦＲ遺伝子のExon21 L858R 点変異検出における結果）
上記のように、１７段階希釈したＤＮＡを用いて、前増幅におけるＰＮＡクランププライマー添加の効果を比較した。本検討は、３回個別に繰り返し実施して、２回以上変異を検出した場合を「変異検出」と判定した。その結果を、表４に示す。HapMapDNA（野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）３２３．４ｐｇと１１−１８由来ＤＮＡ（変異型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）を６．６ｐｇずつ混合した例（換算細胞数で１００細胞中のＤＮＡにおける２コピーのＥＧＦＲ遺伝子変異）にて、ＰＮＡクランププライマーを添加した前増幅による検出感度の増大を確認できた。【０１２５】
Exon21 L858R 点変異
【表４】
2012002477.tif 000005
【０１２６】
《実施例２：高感度検出法に供する鋳型ＤＮＡの前増幅工程におけるＰＮＡクランププライマー添加効果の検証２》
本実施例では、ヒトゲノムＤＮＡプール中に混在する変異型ＥＧＦＲ遺伝子をターゲットとして、欠失変異ＥＧＦＲ遺伝子（エクソン１９中のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異）について、高感度検出法（ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法）に供する鋳型ＤＮＡの前増幅工程におけるＰＮＡクランププライマー添加効果の有効性と検出感度について検証を行った。ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の条件については、特許第４２１６２６６号明細書を参考にした。【０１２７】
（材料）
実施例１と同様、変異ＥＧＦＲ遺伝子として、コリエルインスティテュート（Coriell Institute）より購入した培養細胞ＰＣ１４（EGFR Exon19 E746-A750 欠失変異型）を定法により培養し、市販キット（DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen社)）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを使用した。また野生型ＥＧＦＲ遺伝子として、コリエルインスティテュートより購入したHapMapDNAを用いた。【０１２８】
これらのＤＮＡを用いて、表５（PC14 希釈系列、Exon19 E746-A750 欠失変異型）に示す６段階の希釈系列を各々１５μＬとなるように調製した。
すなわち、全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数を１００００コピー（ヒトゲノムＤＮＡ量として３３０００ｐｇ相当）とし、全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数中の変異ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の割合が、２％、１％、０．２％、０．１％、０．０２％、０％となるように調製した。【０１２９】
ＰＣ１４希釈系列（Exon19欠失）
【表５】
2012002477.tif 000006
【０１３０】
（ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法に供する鋳型ＤＮＡの前増幅工程の実施）
６段階の希釈系列ＤＮＡを、（１）又は（２）系列の遺伝子増幅用反応液に供し、前増幅工程を実施した。（１）系列はＰＮＡクランププライマー無添加系列（ＰＮＡ−）であり、（２）系列はＰＮＡクランププライマー添加系列（ＰＮＡ＋）である。【０１３１】
（１）系列の遺伝子増幅用反応液の調製（ＰＮＡ−）
（１）系列の遺伝子増幅用反応液として以下の試薬を混合して調製した。10xPCR buffer（Qiagen社：HotStarTaq polymerase 酵素製品に添付）: 2 μL, 10 mmol/L dNTPmix（＝dATP, dTTP, dGTP, dCTP）: 0.4 μL, 25 μmol/L 増幅フォワードプライマーｅｘ１９−ｏｕｔ−Ｆ（塩基配列：5’- GTGCATCGCTGGTAACATCC -3’：配列番号１）: 0.4 μL, 25 μmol/L 増幅リバースプライマーｅｘ１９−ｏｕｔ−Ｂ（塩基配列：5’- TGAGGTTCAGAGCCATGGAC -3’：配列番号２）: 0.4 μL, 0.5 U HotStarTaq polymerase（Qiagen社）を混和し、１９μＬになるように滅菌水を加え調製した。【０１３２】
（２）系列の遺伝子増幅用反応液の調製（ＰＮＡ＋）
100 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＤｅｌｃ１（Panagene社：塩基配列：NH2- AGATGTTGCTTCTCTTAA -CONH2）: 1 μLを加えること以外は、（１）系列と同様に調製した。【０１３３】
調製した（１）又は（２）系列の遺伝子増幅用反応液に、６段階の希釈系列ＤＮＡを１μL添加し、サーマルサイクラー（GeneAmp9700 (AppliedBioSystems社)）にてＤＮＡを増幅した。ＤＮＡ増幅は、９５℃で１５分加温後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒のステップを４０サイクル、７２℃で１０分加温後、１０℃で保存した。【０１３４】
増幅した（１）又は（２）系列のＤＮＡ溶液を、滅菌水にて５０００倍に希釈し、その一部をＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の鋳型とした。【０１３５】
（前増幅した鋳型ＤＮＡを用いたＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の実施）
前記のように調製し希釈した（１）又は（２）系列のＤＮＡ溶液を、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９中のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を検出するＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法にて解析した。【０１３６】
具体的には、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の遺伝子増幅用反応液として下記の試薬を混合して調製した。Premix Ex Taq Hot Start Version（タカラバイオ社）: 12.5 μL, 100 μmol/L 増幅フォワードプライマーｅｘ１９−ｉｎ−Ｆ（塩基配列：5’- TGTCATAGGGACTCTGGATCC -3’：配列番号５）: 0.05 μL, 100 μmol/L 増幅リバースプライマーｅｘ１９−ｉｎ−Ｒ（塩基配列：5’- AGCAGAAACTCACATCGAG -3’ ：配列番号６）: 0.05 μL, 100 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＤｅｌｃ１: 1 μL, 100 μmol/L ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ１Ｆ: 0.025 μL, 100 μmol/L ＬＮＡ−変異プローブE746-A750del-1pF: 0.025 μL, 5000倍希釈したＤＮＡ溶液: 5 μLを加え、２５μＬになるように滅菌水を加え調製した。
なお、ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ１Ｆは、ＥＧＦＲ野生型およびＥＧＦＲ変異型に共通な配列を検出できるように設計した。【０１３７】
上記プローブは全てＩＤＴ社へ合成を委託した。それぞれプローブの詳細を以下に示す。ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ１Ｆの配列は：５’−（Cy5）ｔｔａａＣｔＴＴＣｔＣａＣｃｔ（BHQ2）−３’。ＬＮＡ−変異プローブE746-A750del-1pFの配列は：５’−（6FAM）ｃｔａｔｃａａＡａＣａｔｃｔｃｃｇａａａｇｃ（BHQ1）−３’。ここで、配列の小文字はＤＮＡを、大文字はＬＮＡを、６ＦＡＭ，Ｃｙ５は蛍光色素を、ＢＨＱ１，ＢＨＱ２は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。【０１３８】
ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９中のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を検出するＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法は、サーマルサイクラー（Smart Cycler II (Cepheid Sunnyvale社)）を用いて実施した。ＰＣＲクランプ反応のサイクルは、９５℃で１０秒保持した後、９５℃３秒と６２℃３０秒のステップを４５サイクルで行った。増幅の有無は、機器の添付の解析ソフトにて行い、ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ１Ｆの陽性基準を５＜Ｃｔ値＜２５、ＬＮＡ−変異プローブE746-A750del-1pFの陽性基準を５＜Ｃｔ値＜２５とした。ＬＮＡ−トータルプローブＡＬＬ１Ｆにて、全ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を確認し、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法が正常に行われていることを確認し、ＬＮＡ−変異プローブE746-A750del-1pFによって、該ＥＧＦＲの遺伝子変異を検出することができるか検討した。【０１３９】
（ＥＧＦＲ遺伝子のExon19 E746-A750 欠失変異検出における結果）
上記のように、６段階希釈したＤＮＡを用いて、前増幅におけるＰＮＡクランププライマー添加の効果を比較した。本検討は、変異を検出した場合を「変異検出」と判定した。その結果を表６に示す。HapMapDNA（野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）３２９６７ｐｇにＰＣ１４由来ＤＮＡ（変異型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）を３３ｐｇ混合した例（換算細胞数で５０００細胞中のＤＮＡにおける２コピーのＥＧＦＲ遺伝子変異）にて、ＰＮＡクランププライマーを添加した前増幅による検出感度の増大を確認できた。なお、表６において変異ＥＧＦＲを検出した場合「○」、検出できなかった場合「×」とした。
さらに、Ｌ８５８Ｒ等の変異についても検討を行い、同様の結果が得られた。【０１４０】
Exon19 E746-A750 欠失変異
【表６】
2012002477.tif 000007
【０１４１】
《実施例３：前増幅工程における好適条件の検討１》
本実施例では、ヒトゲノムＤＮＡプール中に混在する変異型ＥＧＦＲ遺伝子をターゲットとして、欠失変異ＥＧＦＲ遺伝子（エクソン１９中のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異）について、高感度検出法（ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法）に供する鋳型ＤＮＡの前増幅工程におけるＰＮＡクランププライマーの好適濃度について検証を行った。【０１４２】
（材料）
実施例１と同様、変異ＥＧＦＲ遺伝子として、コリエルインスティテュート（Coriell Institute）より購入した培養細胞ＰＣ１４（EGFR Exon19 E746-A750 欠失変異型）を定法により培養し、市販キット（DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen社)）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを使用した。また野生型ＥＧＦＲ遺伝子として、コリエルインスティテュートより購入したHapMapDNAを用いた。【０１４３】
これらのＤＮＡを用いて、表７（PC14 希釈系列、Exon19 E746-A750 欠失変異型）に示す５段階の希釈系列を各々１５μＬとなるように調製した。
すなわち、全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数を１００コピー（ヒトゲノムＤＮＡ量として３３０ｐｇ相当）とし、全ＥＧＦＲ遺伝子コピー数中の変異ＥＧＦＲ遺伝子コピー数の割合が、１０％、５％、２％、１％、０％となるように調製した。【０１４４】
ＰＣ１４希釈系列（Exon19欠失）
【表７】
2012002477.tif 000008
【０１４５】
（ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法に供する鋳型ＤＮＡの前増幅工程の実施）
５段階の希釈系列ＤＮＡを、以下の（１）〜（６）系列の遺伝子増幅用反応液に供し、前増幅工程を実施した。（１）系列はＰＮＡクランププライマー無添加系列（０μmol/L  ＰＮＡ）であり、（２）系列は０．０５μmol/LのＰＮＡクランププライマー添加系列（０．０５μmol/L  ＰＮＡ）であり、（３）系列は０．１μmol/LのＰＮＡクランププライマー添加系列（０．１μmol/L  ＰＮＡ）であり、（４）系列は０．５μmol/LのＰＮＡクランププライマー添加系列（０．５μmol/L  ＰＮＡ）であり、（５）系列は１μmol/LのＰＮＡクランププライマー添加系列（１μmol/L  ＰＮＡ）であり、（６）系列は５μmol/LのＰＮＡクランププライマー添加系列（５μmol/L  ＰＮＡ）である。【０１４６】
（１）系列の遺伝子増幅用反応液の調製（０μmol/L  ＰＮＡ）
実施例２の（１）系列と同様に調製した。【０１４７】
（２）系列の遺伝子増幅用反応液の調製（０．０５μmol/L  ＰＮＡ）
1 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＤｅｌｃ１: 1 μLを加えること以外は、（１）系列と同様に調製した。【０１４８】
（３）系列の遺伝子増幅用反応液の調製（０．１μmol/L  ＰＮＡ）
2 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＤｅｌｃ１: 1 μLを加えること以外は、（１）系列と同様に調製した。【０１４９】
（４）系列の遺伝子増幅用反応液の調製（０．５μmol/L  ＰＮＡ）
10 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＤｅｌｃ１: 1 μLを加えること以外は、（１）系列と同様に調製した。【０１５０】
（５）系列の遺伝子増幅用反応液の調製（１μmol/L  ＰＮＡ）
20 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＤｅｌｃ１: 1 μLを加えること以外は、（１）系列と同様に調製した。【０１５１】
（６）系列の遺伝子増幅用反応液の調製（５μmol/L  ＰＮＡ）
100 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＤｅｌｃ１: 1 μLを加えること以外は、（１）系列と同様に調製した。【０１５２】
調製した（１）〜（６）系列の遺伝子増幅用反応液に、６段階の希釈系列ＤＮＡを１μL添加し、実施例２と同様の条件でＤＮＡを増幅した。【０１５３】
増幅した（１）〜（６）系列のＤＮＡ溶液を、滅菌水にて５０００倍に希釈し、その一部をＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の鋳型とした。【０１５４】
（前増幅した鋳型ＤＮＡを用いたＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法の実施）
前記のように調製し希釈した（１）〜（６）系列のＤＮＡ溶液を、実施例２と同様の方法で、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９中のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を検出するＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法にて解析した。【０１５５】
（ＥＧＦＲ遺伝子のExon19 E746-A750 欠失変異検出における結果）
上記のように、５段階希釈したＤＮＡを用いて、前増幅におけるＰＮＡクランププライマー添加の効果を比較した。本検討は、変異を検出した場合を「変異検出」と判定した。その結果を表８に示す。HapMapDNA（野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）３２６．７ｐｇにＰＣ１４由来ＤＮＡ（変異型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）を３．３ｐｇ混合した例（換算細胞数で５０細胞中のＤＮＡにおける１コピーのＥＧＦＲ遺伝子変異）、または、HapMapDNA（野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）３２３．４ｐｇにＰＣ１４由来ＤＮＡ（変異型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）を６．６ｐｇ混合した例（換算細胞数で５０細胞中のＤＮＡにおける２コピーのＥＧＦＲ遺伝子変異）にて、ＰＮＡクランププライマーを添加した前増幅（０．０５〜５μmol/L  ＰＮＡ）による検出感度の増大を確認できた。なお、表８において変異ＥＧＦＲを検出した場合「○」、検出できなかった場合「×」とした。【０１５６】
Exon19 E746-A750 欠失変異
【表８】
2012002477.tif 000009
【０１５７】
《実施例４：前増幅工程における好適条件の検討２》
本実施例では、ヒトゲノムＤＮＡプール中に混在する変異型ＥＧＦＲ遺伝子をターゲットとして、欠失変異ＥＧＦＲ遺伝子（エクソン１９中のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異）について、高感度検出法（ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法）に供する鋳型ＤＮＡの前増幅工程におけるＰＮＡクランププライマーの添加の有無と、好適なアニーリング温度について検証を行った。【０１５８】
（材料）
実施例１と同様、変異ＥＧＦＲ遺伝子として、コリエルインスティテュート（Coriell Institute）より購入した培養細胞ＰＣ１４（EGFR Exon19 E746-A750 欠失変異型）を定法により培養し、市販キット（DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen社)）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを使用した。また野生型ＥＧＦＲ遺伝子として、コリエルインスティテュートより購入したHapMapDNAを用いた。【０１５９】
実施例３と同様、これらのＤＮＡを用いて、表７（PC14 希釈系列、Exon19 E746-A750 欠失変異型）に示す５段階の希釈系列を各々１５μＬとなるように調製した。【０１６０】
（ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法に供する鋳型ＤＮＡの前増幅工程の実施）
５段階の希釈系列ＤＮＡを、（１）〜（８）系列の条件で、遺伝子増幅用反応液に供し、前増幅工程を実施した。（１）系列はＰＮＡクランププライマー無添加系列でアニーリング温度６３℃（０μmol/L  ＰＮＡ  ６３℃）であり、（２）系列はＰＮＡクランププライマー添加系列でアニーリング温度６３℃（５μmol/L  ＰＮＡ  ６３℃）であり、（３）系列はＰＮＡクランププライマー無添加系列でアニーリング温度６０℃（０μmol/L  ＰＮＡ  ６０℃）であり、（４）系列はＰＮＡクランププライマー添加系列でアニーリング温度６０℃（５μmol/L  ＰＮＡ  ６０℃）であり、（５）系列はＰＮＡクランププライマー無添加系列でアニーリング温度５５℃（０μmol/L  ＰＮＡ  ５５℃）であり、（６）系列はＰＮＡクランププライマー添加系列でアニーリング温度５５℃（５μmol/L  ＰＮＡ  ５５℃）であり、（７）系列はＰＮＡクランププライマー無添加系列でアニーリング温度５０℃（０μmol/L  ＰＮＡ  ５０℃）であり、（８）系列はＰＮＡクランププライマー添加系列でアニーリング温度５０℃（５μmol/L  ＰＮＡ  ５０℃）である。【０１６１】
（１）（３）（５）（７）系列の遺伝子増幅用反応液の調製（０μmol/L  ＰＮＡ）
実施例２の（１）系列と同様に調製した。【０１６２】
（２）（４）（６）（８）系列の遺伝子増幅用反応液の調製（５μmol/L  ＰＮＡ）
100 μmol/L ＰＮＡクランププライマーＤｅｌｃ１: 1 μLを加えること以外は、（１）系列と同様に調製した。【０１６３】
ＤＮＡの増幅
調製した反応液に、５段階の希釈系列ＤＮＡを１μL添加し、アニーリングをそれぞれ５０℃、５５℃、６０℃、６３℃で行うこと以外は、実施例２と同様の条件でＤＮＡを増幅した。【０１６４】
増幅した（１）〜（８）系列のＤＮＡ溶液の一部を、自動電気泳動法の検体とした。【０１６５】
（前増幅した鋳型ＤＮＡを用いた自動電気泳動法の実施）
前記のように調製した（１）〜（８）系列のＤＮＡ溶液を、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９中のＥ７４６−Ａ７５０欠失変異を検出する自動電気泳動法にて解析した。なお、自動電気泳動装置として、ＱＩＡｘｃｅｌ（キアゲン社）を使用した。本機器により、正常型と欠失型のＰＣＲ増幅産物を区別することができる。【０１６６】
具体的には、増幅した（１）〜（８）系列のＤＮＡ溶液の一部（６μＬ）を、96well PCRプレート（ＢＭｂｉｏ社）に分取し、ＱＩＡｘｅｌ  ＤＮＡ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、５ｋＶ、２４０秒の条件で、電気泳動を実施した。【０１６７】
（ＥＧＦＲ遺伝子のExon19 E746-A750 欠失変異検出における結果）
上記のように、５段階希釈したＤＮＡを用いて、前増幅におけるＰＮＡクランププライマー添加の効果を比較した。本検討は、変異を検出した場合を「変異検出」と判定した。その結果を表９に示す。アニーリング温度５０〜６３℃の条件において、HapMapDNA（野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）３２６．７ｐｇにＰＣ１４由来ＤＮＡ（変異型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）を３．３ｐｇ混合した例（換算細胞数で５０細胞中のＤＮＡにおける１コピーのＥＧＦＲ遺伝子変異）、または、HapMapDNA（野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）３２３．４ｐｇにＰＣ１４由来ＤＮＡ（変異型ＥＧＦＲ遺伝子を含む）を６．６ｐｇ混合した例（換算細胞数で５０細胞中のＤＮＡにおける２コピーのＥＧＦＲ遺伝子変異）にて、ＰＮＡクランププライマーを添加した前増幅（０．０５〜５μmol/L  ＰＮＡ）による検出感度の増大を確認できた。なお、表９において変異ＥＧＦＲを検出した場合「Ｍ」、正常型ＥＧＦＲを検出した場合「Ｗ」、何れも検出できなかった場合「×」とした。【０１６８】
Exon19 E746-A750 欠失変異
【表９】
2012002477.tif 000010
【０１６９】
以上の結果から、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法に供する鋳型ＤＮＡを、ＰＮＡクランププライマーを含んだ遺伝子増幅反応液にて前増幅工程を実施することにより、更に検出感度を高められる事が判明した。従って、この方法は、臨床検査において、正常細胞が多数混入する検体、たとえば血液が混入した胸水、腫瘍細胞の割合が少ない組織／喀痰、血液中に循環しているであろう腫瘍組織由来のＤＮＡやＲＮＡを更に高感度に検出可能とする。また、これらの効果は、ＰＮＡクランププライマーで前増幅することによって、変異型ＤＮＡの検出法に供する鋳型中の変異ＤＮＡの割合を高めることによると推察されるので、ＰＮＡ−ＬＮＡ−ＰＣＲクランプ法以外の高感度検出法、たとえば、インベーダー法やスコーピオンアームズ法に供する鋳型ＤＮＡの調製へも応用可能と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明は、変異遺伝子検出のための遺伝子検査法として、臨床上の利用性が非常に高い。また、発明の実施に関しても、専用の装置等を必要とせず、一般的な臨床検査室に設置された機器や機材の利用が可能である。さらに、従来の病理組織切片や細胞診用による臨床検査にあっては、結果の判断に専門的知識と熟練が必要とされることから、事業化には細胞検査士等の養成等も必須であった。しかし、本発明によれば、一定の操作技術のみを習得すれば、特段の専門的知識や熟練性を必要としない。また、検査のルーチン化が極めて容易であり、大量のサンプルを短時間で処理できる。したがって、事業化も容易である。【０１７１】
特に、ＥＧＦＲの変異遺伝子の検出によりゲフィチニブやエルロチニブの感受性を直接検索することが可能であることから、ＮＳＣＬＣ患者に対するゲフィチニブ又はエルロチニブ投与の早期判断や、ゲフィチニブ又はエルロチニブへの感受性が低い患者への投与の回避が可能となる。すなわち、本発明によりＮＳＣＬＣに対する最も実現性の高いテーラーメイド治療が可能となる。したがって、社会的なニーズは非常に高い。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１７２】
配列表の配列番号１〜６の各塩基配列はプライマー配列である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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