(57)【要約】  細胞毒性が低減されると共に、高い核酸導入効率・遺伝子発現効率を示す、優れた核酸送達用組成物を提供する。本組成物は、非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーと、カチオン性ポリマーと、核酸とを含んでなり、ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーが有する総カチオン基に対する、ブロックコポリマーが有するカチオン基のモル百分率（Ｂ／Ｈ比）が、２５％〜９０％である。
2012005376.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞又は組織に核酸を送達するための核酸送達用組成物であって、
非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーと、カチオン性ポリマーと、核酸とを含んでなり、
ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーが有する総カチオン基に対する、ブロックコポリマーが有するカチオン基のモル百分率（Ｂ／Ｈ比）が、２５％〜９０％である、核酸送達用組成物。
【請求項２】
核酸が有するリン酸基に対する、ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーが有する総カチオン性基のモル比（Ｎ／Ｐ比）が、２〜２００である、請求項１に記載の核酸送達用組成物。
【請求項３】
粒子状である、請求項１又は２に記載の核酸送達用組成物。
【請求項４】
ブロックコポリマーの非荷電親水性ポリマーセグメントが、ポリアルキレングリコールセグメントである、請求項１〜３の何れか一項に記載の核酸送達用組成物。
【請求項５】
ブロックコポリマーのカチオン性ポリマーセグメントが、側鎖にアミノ基を有するポリ（アミノ酸又はその誘導体）からなるセグメントである、請求項１〜４の何れか一項に記載の核酸送達用組成物。
【請求項６】
カチオン性ポリマーが、側鎖にアミノ基を有するポリ（アミノ酸又はその誘導体）である、請求項１〜５の何れか一項に記載の核酸送達用組成物。
【請求項７】
標的細胞又は組織に核酸を送達するための担体組成物であって、
非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーと、カチオン性ポリマーとを含んでなり、
ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーが有する総カチオン基に対する、ブロックコポリマーが有するカチオン基のモル百分率（Ｂ／Ｈ比）が、２５％〜９０％である、担体組成物。
【請求項８】
粒子状である、請求項７に記載の担体組成物。
【請求項９】
ブロックコポリマーの非荷電親水性ポリマーセグメントが、ポリアルキレングリコールセグメントである、請求項７又は８に記載の担体組成物。
【請求項１０】
ブロックコポリマーのカチオン性ポリマーセグメントが、側鎖にアミノ基を有するポリ（アミノ酸又はその誘導体）からなるセグメントである、請求項７〜９の何れか一項に記載の担体組成物。
【請求項１１】
カチオン性ポリマーが、側鎖にアミノ基を有するポリ（アミノ酸又はその誘導体）である、請求項７〜１０の何れか一項に記載の担体組成物。
【請求項１２】
核酸治療に用いられる医薬組成物であって、請求項１〜６の何れか一項に記載の核酸送達用組成物、又は、請求項７〜１１の何れか一項に記載の担体組成物を含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
標的細胞又は組織に核酸を送達するための方法であって、請求項１〜６の何れか一項に記載の核酸送達用組成物を、標的細胞又は組織に接触させることを含んでなる方法。
【請求項１４】
標的細胞又は組織に核酸を送達するための方法であって、
非荷電親水性ポリマーセグメント及びカチオン性ポリマーセグメントを有するブロックコポリマーと、核酸とを含んでなる核酸送達用組成物、並びに、カチオン性ポリマーを、標的細胞又は組織に接触させることを含んでなるとともに、
標的細胞又は組織への接触時における、核酸送達用組成物のブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーが有する総カチオン基に対する、核酸送達用組成物のブロックコポリマーが有するカチオン基のモル百分率（Ｂ／Ｈ比）を、２５％〜９０％とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞又は組織に核酸を送達するための核酸送達用組成物及び担体組成物、それを用いた医薬組成物、並びに核酸送達方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸治療において、標的細胞又は組織に核酸を送達するための担体としては、ウイルスベクターと合成担体（非ウイルス性担体）が検討されてきた。
合成担体は、従来の医療で検討されてきた薬剤送達系（ＤＤＳ）と同様、毒性等に関するリスクは存在するものの、ウイルスベクターに比べれば毒性が少ないと考えられることや、担持させる核酸のサイズに制限がなく、ベクターの精密な分子設計が可能であることから、精力的な開発研究が続けられている。【０００３】
代表的な合成担体としては、負電荷のＤＮＡとイオンコンプレックスを形成するカチオン性脂質やカチオン性ポリマーが挙げられる。
カチオン性脂質（リポフェクチン等）については、インビトロ（in vitro）ではある程度の成果が得られている（例えば非特許文献１参照）が、インビボ（in vivo）では必ずしも所期の効果が得られていない。
一方、カチオン性ポリマーとしては、ポリ（Ｌ−リシン）、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン（例えば非特許文献２参照）、キトサン（例えば非特許文献３参照）等が検討されている。しかし、これらのカチオン性ポリマーは細胞毒性を有する上に、核酸導入効率・遺伝子発現効率も不十分であった。【０００４】
本発明者等は、特定のアミン基を側鎖に有するカチオン性ポリマーセグメントと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非架電親水性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーを自己組織化させて、核酸を内包するポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）型の高分子ミセルを形成することにより、細胞毒性が低減されると共に、一定の核酸導入効率・遺伝子発現効率が得られることを報告した（特許文献１：特開２００４−３５２９７２号公報参照）。しかし、かかるＰＩＣ型高分子ミセルからなる核酸送達系は、核酸導入効率・遺伝子発現効率の面で改善の余地があった。【０００５】
また、本発明者等は、特定のアミン基を側鎖に有するカチオン性ホモポリマーを、核酸と混合することにより、核酸導入効率・遺伝子発現効率を劇的に改善できると共に、動物細胞（特に哺乳類細胞）に対する毒性も比較的抑えられることを報告した（特許文献２：国際公開第２００６／０８５６６４号パンフレット参照）。しかし、かかるホモポリマーからなる核酸送達系については、細胞毒性の更なる低減が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３５２９７２号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／０８５６６４号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】C. F. Benett et al., J. Drug Targeting, 5, 149 (1997)
【非特許文献２】O. Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92, 7297 (1995)
【非特許文献３】S. C. Richardson et al., Int. J. Pharm. 178, (1999) 231
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上の背景から、細胞毒性が低減されると共に、高い核酸導入効率や遺伝子発現効率を示す、優れた核酸送達用組成物及びその担体の提供が、依然として求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は鋭意検討の結果、特定のカチオン性ポリマーセグメントと非架電親水性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーからなるポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）型の高分子ミセルにおいて、特定のカチオン性ホモポリマーを特定の比率で混合することにより、低細胞毒性と高核酸導入効率という両特性を兼ね備えた、優れた核酸送達用組成物が得られることを見出して、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明の主旨は、標的細胞又は組織に核酸を送達するための核酸送達用組成物であって、非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーと、カチオン性ポリマーと、核酸とを含んでなり、ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーが有する総カチオン基に対する、ブロックコポリマーが有するカチオン基のモル百分率（Ｂ／Ｈ比）が、２５％〜９０％である、核酸送達用組成物に存する。
本発明の別の主旨は、標的細胞又は組織に核酸を送達するための担体組成物であって、非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーと、カチオン性ポリマーとを含んでなり、ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーが有する総カチオン基に対する、ブロックコポリマーが有するカチオン基のモル百分率（Ｂ／Ｈ比）が、２５％〜９０％である、担体組成物に存する。
本発明の更に別の主旨は、核酸治療に用いられる医薬組成物であって、前記の核酸送達用組成物又は担体組成物を含んでなる医薬組成物に存する。
本発明の更に別の主旨は、標的細胞又は組織に核酸を送達するための方法であって、前記の核酸送達用組成物を標的細胞又は組織に接触させることを含んでなる方法に存する。
本発明の更に別の主旨は、標的細胞又は組織に核酸を送達するための方法であって、非荷電親水性ポリマーセグメント及びカチオン性ポリマーセグメントを有するブロックコポリマーと、核酸とを含んでなる核酸送達用組成物、並びに、カチオン性ポリマーを、標的細胞又は組織に接触させることを含んでなるとともに、標的細胞又は組織への接触時における、核酸送達用組成物のブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーが有する総カチオン基に対する、核酸送達用組成物のブロックコポリマーが有するカチオン基のモル百分率（Ｂ／Ｈ比）を、２５％〜９０％とする方法に存する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の核酸送達用組成物及び核酸送達方法によれば、細胞毒性が低減されると共に、優れた核酸導入効率が発揮される。また、本発明の担体組成物によれば、斯かる優れた核酸送達用組成物を容易に得ることができる。本発明の核酸送達用組成物及び担体組成物は、例えば核酸治療用の医薬組成物として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１（ａ）及び（ｂ）は各Ｂ／Ｈ比における粒子形状を表す透過型電子顕微鏡写真である。
【図２】図２はＢ／Ｈ比とゼータ電位との関係を表すグラフである。
【図３】図３はトランスフェクション効率とＢ／Ｈ比及びＮ／Ｐ比との関係を表すグラフである。
【図４】図４は細胞毒性とＢ／Ｈ比及びＮ／Ｐ比との関係を表すグラフである。
【図５】図５は腫瘍体積の経時変化を表すグラフである。
【図６】図６は核酸送達用組成物の血中滞留性を現すグラフである。
【図７】図７（ａ）〜（ｄ）はいずれも腫瘍組織におけるVenusの発現状況を示すＣＬＳＭ（共焦点レーザー顕微鏡）写真である。具体的に、図７（ａ）は対照、図７（ｂ）はＢ／Ｈ比１００％、図７（ｃ）はＢ／Ｈ比７０％、図７（ｄ）はＢ／Ｈ比５０％の結果である。
【図８】図８（ａ）及び（ｂ）は腫瘍組織のsFlt-1の発現状況を示すＣＬＳＭ写真である。図８（ａ）は対照、図８（ｂ）はＢ／Ｈ比７０％の結果である。
【図９】図９（ａ）は腫瘍組織の血管内皮細胞を免疫染色したＣＬＳＭ写真であり、図９（ｂ）は図９（ａ）の画像解析によって求めた血管密度を表すグラフである。
【図１０】図１０は組成物の経肺投与時のトランスフェクション効率とＢ／Ｈ比との関係を表すグラフである。
【図１１】図１１（ａ）〜（ｄ）はいずれも肺組織の免疫染色写真である。具体的に、図１１（ａ）はＢ／Ｈ比１００％、図１１（ｂ）はＢ／Ｈ比７０％、図１１（ｃ）はＢ／Ｈ比５０％、図１１（ｄ）は対照の結果である。
【図１２】図１２（ａ）〜（ｄ）はいずれもｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。具体的に、図１２（ａ）はＩＬ−６、図１２（ｂ）はＴＮＦ−α、図１２（ｃ）はＣｏｘ−２、図１２（ｄ）はＩＬ−１０のｍＲＮＡのｍＲＮＡの発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明によれば、標的細胞又は組織に核酸を送達するための組成物であって、後述する特定のブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーと、核酸とを含有するとともに、ブロックコポリマーとカチオン性ポリマーとの比率が後述する特定の範囲内である組成物（本発明の核酸送達用組成物）が提供される。
【００１４】
本発明者等の検討によれば、後述する特定のブロックコポリマーとカチオン性ポリマーとを、後述のＢ／Ｈ比が特定の範囲を満たすような比で使用することにより、動物細胞（特に哺乳類細胞）に対する毒性を、ブロックコポリマー単独からなるＰＩＣミセル型の核酸送達系（特許文献１等）と同程度に低く抑えることができると共に、核酸導入効率を、カチオン性ホモポリマー単独の核酸送達系（特許文献２等）と同程度に改善することが可能となる。即ち、本発明によれば、従来のブロックコポリマー単独の核酸送達系及びカチオン性ホモポリマー単独の核酸送達系の双方の利点のみを兼ね備えた核酸送達用組成物が提供される。斯かる効果は、従来の核酸送達系に関する知見の単なる寄せ集めからは予測できない、相乗的な効果である。
【００１５】
また、本発明によれば、標的細胞又は組織に核酸を送達するための担体となる組成物であって、後述する特定のブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーと、核酸とを含有するとともに、ブロックコポリマーとカチオン性ポリマーとの比率が後述する特定の範囲内である組成物（本発明の担体組成物）も提供される。斯かる担体組成物に核酸を担持させることにより、本発明の核酸送達用組成物が得られる。
【００１６】
［ブロックコポリマー］
本発明で使用されるブロックコポリマーは、非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとを有する。ブロックコポリマーは、１種のみを使用してもよいが、２種以上を任意の組合せ及び比率で使用してもよい。
【００１７】
（非荷電親水性ポリマーセグメント）
非荷電親水性ポリマーセグメントは、非荷電且つ親水性の性質を有するポリマーセグメントである。ここで「非荷電」とは、セグメントが全体として中性であることをいう。例としてはセグメントが正・負の電荷を有さない場合が挙げられる。また、セグメントが正・負の荷電を分子内に有する場合であっても、局所的な実効電荷密度が高くなく、高分子ミセルの形成を妨げない程度にセグメント全体の荷電が中和されていれば、やはり「非荷電」に該当する。また、「親水性」とは水性媒体に対して溶解性を示すことをいう。
【００１８】
非荷電親水性ポリマーセグメントの種類は限定されない。単一の反復単位からなるセグメントでもよく、二種以上の反復単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。非荷電親水性ポリマーセグメントの具体例としては、ポリアルキレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリサッカライド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリ（２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリン）、等電点が７付近のペプチド・タンパク質及びそれらの誘導体等が挙げられる。中でもポリアルキレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）等が好ましく、ポリアルキレングリコールが特に好ましい。ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられるが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましい。
【００１９】
非荷電親水性ポリマーセグメントの分子量は、限定されるものではないが、高分子ミセルを効率的に製造する観点からは、所定の範囲内の分子量を有することが好ましい。具体的な分子量の範囲は、非荷電親水性ポリマーセグメントの種類やカチオン性ポリマーセグメントとの組み合わせ等によっても異なるが、非荷電親水性ポリマーセグメントとしてポリエチレングリコールを用いる場合、その分子量（Ｍｗ）は、好ましくは５００以上、より好ましくは１０００以上、また、好ましくは４００００以下、より好ましくは３００００以下の範囲である。非荷電親水性ポリマーセグメントの反復単位数も制限されないが、通常は非荷電親水性ポリマーセグメントの分子量が前記の分子量範囲を満たすように、その反復単位の種類に応じて決定される。
【００２０】
前記条件を満たす非荷電親水性ポリマーセグメントを用いることにより、ブロックコポリマーの水性溶液中での会合・沈殿を防止してこれを安定化し、担体組成物として機能し得る高分子ミセルを効率的に構築することが可能となる。
【００２１】
（カチオン性ポリマーセグメント）
カチオン性ポリマーセグメントは、カチオン基を有し、カチオン性（陽イオン性）を示すポリマーセグメントである。但し、カチオン性ポリマーセグメントは、高分子ミセルの形成を妨げない範囲で、多少のアニオン基を有していてもよい。
【００２２】
カチオン性ポリマーセグメントの種類も限定されない。単一の反復単位からなるセグメントでもよく、二種以上の反復単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。カチオン性ポリマーセグメントとしてはポリアミン等が好ましく、側鎖にアミノ基を有するポリ（アミノ酸又はその誘導体）が特に好ましい。斯かるポリ（アミノ酸又はその誘導体）は、１種のアミノ酸又はその誘導体からなるものでもよく、２種以上のアミノ酸又はその誘導体を任意の組み合わせ及び比率で含んでいてもよい。斯かるポリ（アミノ酸又はその誘導体）を構成するアミノ酸又はその誘導体の例としては、制限されるものではないが、アミノ基含有アスパルタミド、アミノ基含有グルタミド、リシン、アルギニン、ヒスチジン等が挙げられる。これらの中でも、特にアミノ基含有アスパルタミド、アミノ基含有グルタミドが好ましい。
【００２３】
カチオン性ポリマーセグメントの分子量は、限定されるものではないが、高分子ミセルを効率的に製造する観点からは、所定の範囲内の分子量を有することが好ましい。カチオン性ポリマーセグメントの反復単位数も制限されないが、通常はカチオン性ポリマーセグメントの分子量が所定の分子量範囲を満たすように、その反復単位の種類に応じて決定される。具体的には、カチオン性ポリマーセグメントとしてポリアスパラギン酸誘導体又はポリグルタミン酸誘導体を用いる場合、その反復単位数は好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、また、好ましくは３００以下、より好ましくは２００以下の範囲である。
【００２４】
前記条件を満たすカチオン性ポリマーセグメントを用いることにより、ブロックコポリマーの水性溶液中での会合・沈殿を防止して安定化し、担体組成物として機能し得る高分子ミセルを効率的に構築することが可能となる。
【００２５】
（非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとの組み合わせ）
非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとの組み合わせは制限されず、任意の非荷電親水性ポリマーセグメントと任意のカチオン性ポリマーセグメントとを組み合わせることが可能である。
【００２６】
非荷電親水性ポリマーセグメント及びカチオン性ポリマーセグメントの個数も任意であり、各々１つでも２つ以上でもよく、２つ以上の場合には互いに同一でも異なっていてもよい。通常は、非荷電親水性ポリマーセグメント１つに対して、カチオン性ポリマーセグメントが１つ結合することが好ましい。しかし、高分子ミセル内に多量の核酸を保持する観点からは、非荷電親水性ポリマーセグメントが１つに対して、カチオン性ポリマーセグメントが２つ以上結合する形態も好適である。
【００２７】
（連結基）
非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとの結合形態も制限されず、直接結合していてもよいが、連結基を介して結合していてもよい。
連結基の例としては、非荷電親水性ポリマーセグメント及びカチオン性ポリマーセグメントの総個数に対応する価数を有する炭化水素基が挙げられる。連結基としての炭化水素基は脂肪族でも芳香族でもそれらが連結したものでもよく、脂肪族の場合には飽和でも不飽和でもよく、また、直鎖でも分岐でも環状でもよい。連結基としての炭化水素基の分子量は、制限されるものではないが、通常５０００以下、好ましくは１０００以下である。連結基としての炭化水素基の例としては、没食子酸誘導体、３，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体、グリセリン誘導体、シクロヘキサン誘導体、Ｌ−リシン等が挙げられるが、３，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体等が好ましい。
【００２８】
連結基の別の例としては、ジスルフィド基が挙げられる。ジスルフィド基は、非荷電親水性ポリマーセグメント１つとカチオン性ポリマーセグメント１つを連結するのに用いられる。ジスルフィド基を介して非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとを連結することにより、高分子ミセルの置かれた環境や外部からの作用によってジスルフィド基を開裂させ、高分子ミセルの形態や性質を変化させることが可能になる。これを利用すれば、生体内の特定部位でジスルフィド基を開裂させることによって、高分子ミセル内に内包された薬物（この態様については後述する）の部位特異的な放出を促すことも可能になると考えられる。
【００２９】
また、非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとの比率も任意であるが、高分子ミセルを効率的に製造する観点からは、高分子ミセル中に含まれる非荷電親水性ポリマーセグメントの分子量比率を所定の範囲内とすることが好ましい。具体的な比率については、核酸の量も考慮して決定することが好ましいため、［核酸］の欄で後述する。
【００３０】
（ブロックコポリマーの具体例〕
本発明のブロックコポリマーの好ましい具体例としては、非荷電親水性ポリマーセグメントとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントを有し、カチオン性ポリマーセグメントとしてポリ（アミノ酸又はその誘導体）セグメントを有する、下記式（Ｉ）〜（IV）に示すブロックコポリマーが挙げられる。
【００３１】
【化１】
2012005376.tif 000003
（式（Ｉ）及び（II）中、
Ｒ１は、水素原子、又は、未置換若しくは置換の直鎖若しくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、
Ｒ２は、メチレン基又はエチレン基を表し、
Ｒ３は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
Ｒ４は、Ｒ５と同一であるか、又は開始剤残基であり、
Ｒ５は各々独立に、水酸基、オキシベンジル基又は−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、
Ｘは各々独立に、
ｐＫａ値が７．４以下の嵩高いアミン化合物残基、
一級、二級、三級アミン若しくは四級アンモニウム塩のうち一種又は二種以上を含むアミン化合物残基、又は
アミンでない化合物残基を表し、
Ｌ１及びＬ２は各々独立に、連結基を表し、
ａは、１〜５の整数であり、
ｍは、５〜２０，０００の整数であり、
ｎは、２〜５，０００の整数であり、
ｘは、０〜５，０００の整数であり、
但し、ｘはｎより大きくない。）
【００３２】
【化２】
2012005376.tif 000004
（式（III）及び（IV）中、
Ｒ１は、水素原子、又は、未置換若しくは置換の直鎖若しくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、
Ｒ２は、メチレン基又はエチレン基を表し、
Ｒ３は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
Ｒ４は、Ｒ５と同一であるか、又は開始剤残基であり、
Ｒ５は各々独立に、水酸基、オキシベンジル基又は−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、
Ｘは各々独立に、
ｐＫａ値が７．４以下の嵩高いアミン化合物残基、
一級、二級、三級アミン若しくは四級アンモニウム塩のうち一種又は二種以上を含むアミン化合物残基、又は
アミンでない化合物残基を表し、
Ｌ１及びＬ２は各々独立に、連結基を表し、
ａは、１〜５の整数であり、
Ｒ６は各々独立に、水素原子又は保護基であり、
ｍは、５〜２０，０００の整数であり、
ｎは、２〜５，０００の整数であり、
ｙは、０〜５，０００の整数であり、
ｚは、０〜５，０００の整数であり、
但し、ｙ＋ｚはｎより大きくない。）
【００３３】
前記式（Ｉ）〜（IV）における各基の詳細な定義は以下の通りである。
Ｒ１は、水素原子、又は、未置換若しくは置換の直鎖若しくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表すが、Ｃ１−１２アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等が挙げられる。Ｃ１−１２アルキル基が置換される場合の置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基（ここで３つのアルキル基は同一でも異なっていてもよい）、シロキシ基又はシリルアミノ基が挙げられる。
【００３４】
前記置換基がアセタール化ホルミル基である場合は、温和な酸性条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ：アルデヒド基）に転化できる。斯かるホルミル基、カルボキシル基又はアミノ基が、高分子ミセルの外縁部付近に存在する場合には、これらの基を介して、高分子ミセルに他のタンパク質等を共有結合するのに利用できる。斯かるタンパク質等の例としては、抗体若しくはその特異結合性を有する断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）、等）、又はその他の機能性若しくは標的指向性を高分子ミセルに付与し得るタンパク質等が挙げられる。斯かる官能基を片末端に有するＰＥＧセグメントの製法としては、例えばＷＯ９６／３２４３４、ＷＯ９６／３３２３３、ＷＯ９７／０６２０２に記載のブロックコポリマーのＰＥＧセグメントの製法が挙げられる。
【００３５】
Ｒ２は、メチレン基又はエチレン基を表す。ポリ（アミノ酸又はその誘導体）セグメントのＲ２を含む反復単位は、Ｒ２がメチレン基の場合にはアスパラギン酸誘導体単位に相当し、Ｒ２がエチレン基の場合はグルタミン酸誘導体単位に相当する。ポリ（アミノ酸又はその誘導体）セグメントがＲ２としてメチレン基及びエチレン基の双方を有する場合、アスパラギン酸誘導体単位及びグルタミン酸誘導体単位は、それぞれ独立にブロックを形成して存在していてもよく、ランダムに混在していてもよい。
【００３６】
Ｒ３は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表す。保護基としては、Ｃ１−６アルキルカルボニル基が挙げられ、好ましくはアセチル基である。疎水性基としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレン等の誘導体が挙げられる。重合性基としては、メタクリロイル基、アクリロイル基が挙げられる。一般式（Ｉ）又は（III）のコポリマーが斯かる重合性基を有する場合、そのコポリマーは所謂マクロマーとして使用することができる。例えば高分子ミセルを形成した後、必要により他のコモノマーを用い、これらの重合性基を介して架橋させることもできる。
【００３７】
Ｒ４は、Ｒ５と同様に、水酸基、オキシベンジル基又は−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であるか、或いは開始剤残基である。Ｒ４が開始剤残基である場合とは、一般式（Ｉ）〜（IV）のブロックコポリマーを、後述する第２の方法（即ち、低分子の開始剤を用いて保護アミノ酸のＮＣＡを重合させてポリ（アミノ酸又はその誘導体）セグメントを合成してからＰＥＧセグメントと結合させる方法）で製造する場合に、Ｒ４が使用した開始剤に由来する構造をとる場合である。開始剤残基の具体例としては、−ＮＨ−Ｒ９が挙げられる。ここでＲ９は、未置換又は置換の直鎖又は分枝のＣ１−２０アルキル基である。
【００３８】
Ｒ５は、各々独立に、水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であるが、その大部分（通常８５％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは１００％）が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であることが好ましい。
Ｘは、ブロックコポリマーが本発明の条件を満たす（又は本発明の目的に沿う）限り制限されないが、通常は以下のＡ群〜Ｅ群に分類される残基の中から選択される。
【００３９】
・Ａ群：ｐＫａ値が７．４以下の嵩高いアミン化合物残基：
【化３】
2012005376.tif 000005
Ａ群において、Ｘ２は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。
【００４０】
・Ｂ群：一級アミンと二級アミン、三級アミン又は四級アンモニウム塩の両方を含むアミン化合物残基：
【化４】
2012005376.tif 000006
Ｂ群において、Ｘ３は、アミノＣ１−６アルキル基であり、Ｒ７は、水素原子又はメチル基であり、ｄ及びｅは各々独立に、１〜５の整数である。
【００４１】
・Ｃ群：一級アミンのみを含むアミン化合物残基：
【化５】
2012005376.tif 000007
Ｃ群において、ｆは、０〜１５の整数である。
【００４２】
・Ｄ群：二級アミン、三級アミン又は四級アンモニウム塩のみを含むアミン化合物残基でＡ群に含まれないもの：
【化６】
2012005376.tif 000008
Ｄ群において、ｄ及びｅは各々独立に、１〜５の整数であり、Ｒ８は、Ｚ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等の保護基である。
【００４３】
・Ｅ群：アミンでない化合物残基：
【化７】
2012005376.tif 000009
Ｅ群において、ｇは、０〜１５の整数である。
【００４４】
一般式（Ｉ）又は（II）のブロックコポリマーの場合、Ｘとしては、Ａ群及びＢ群の残基から選ばれる何れか一つの残基のみを含んでいてもよいが、Ｃ群はＡ群及びＤ群の残基から選ばれる少なくとも一つの残基を同時に含まなければならず、Ｄ群はＢ群及びＣ群の残基から選ばれる少なくとも一つの残基を同時に含まなければならない。またＥ群はコポリマーの物性を変化させるために含ませることができるが、Ｅ群を除いた部分で前記の条件を満たしていなければならない。
【００４５】
一般式（III）又は（IV）のブロックコポリマーの場合、Ｒ６の少なくとも１個以上が水素原子であるならば、Ａ群、Ｂ群及びＤ群の残基から選ばれるいずれか一つの残基のみを含むのでもよい。Ｃ群及びＥ群は前記の条件と同じである。
【００４６】
Ｒ６は、各々独立に、水素原子又は保護基であるが、その大部分（通常８５％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは１００％）が水素原子であることが好ましい。保護基としては、アミノ基の保護基として通常用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等が挙げられる。
【００４７】
Ｌ１及びＬ２は、各々独立に、連結基を表す。Ｌ１及びＬ２の種類は制限されないが、Ｌ１としては、−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−で表される基（ここでｂは、１〜１５の整数である）が好ましく、Ｌ２としては、−（ＣＨ２）ｃ−ＣＯ−で表される基（ここでｃは、１〜１５の整数である）が好ましい。
【００４８】
ｍは、通常５以上、好ましくは１０以上、より好ましくは４０以上、また、通常２０，０００以下、好ましくは３，０００以下、より好ましくは２，０００以下、特に好ましくは１，０００以下の整数である。
ｎは、通常５以上、好ましくは１０以上、より好ましくは４０以上、また、通常５，０００以下、好ましくは１，０００以下、より好ましくは５００以下、特に好ましくは３００以下の整数である。
ｘは、通常０以上、好ましくは１以上、より好ましくは１０以上、また、通常５，０００以下の整数である。但し、ｘ≦ｎである。
ｙ及びｚは、各々独立に、通常０以上、好ましくは１以上、また、通常５，０００以下の整数である。但し、ｙ＋ｚ≦ｎである。特に好ましくは、１０≦ｙ≦ｎ−１０、１０≦ｚ≦ｎ−１０である。
【００４９】
なお、一般式（Ｉ）〜（IV）において、ポリ（アミノ酸又はその誘導体）セグメントが複数種の反復単位を有する場合、各反復単位は種類毎にブロックを形成していてもよく、ランダムに混在していてもよい。
また、一般式（Ｉ）〜（IV）において、ポリ（アミノ酸又はその誘導体）セグメントが有するカチオン性基は、遊離カチオン性基であってもよいが、塩を形成していてもよい。この場合、塩を形成する対イオンとしては、制限されるものではないが、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、（１／２ＳＯ４）−、ＮＯ３−、（１／２ＣＯ３）−、（１／３ＰＯ４）−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−等が挙げられる。
【００５０】
一般式（Ｉ）〜（IV）のブロックコポリマーの製法は、限定されるものではないが、例としては以下に説明する２種の方法が挙げられる。
第１の方法としては、末端にアミノ基を有するＰＥＧ誘導体を用い、そのアミノ末端から、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後得られたポリ（アミノ酸誘導体）セグメントの保護アミノ酸側鎖を、所望のアミノ酸側鎖に変換する方法が挙げられる。この場合、得られるブロックコポリマーの構造は、一般式（Ｉ）又は（III）となる。
第２の方法としては、所望のアミノ酸側鎖を有するポリ（アミノ酸又はその誘導体）セグメントを合成してから、これをＰＥＧセグメントと結合させる方法も挙げられる。この場合、得られるブロックコポリマーの構造は、一般式（Ｉ）〜（IV）の何れかとなる。
【００５１】
第１及び第２の何れの方法を用いる場合も、ポリ（アミノ酸又はその誘導体）セグメントに所望のアミノ酸側鎖を後から導入する場合、その手法は任意であるが、例えばポリアスパラギン酸構造の場合、特許第２７７７５３０号公報等に記載のポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）部分のアミノ分解によるエステルからアミドへの交換反応等が挙げられる。別法としては、ベンジルエステルを接触還元、酸、アルカリ等により加水分解し、ポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸に変換した後、縮合剤等を用いてこれらの残基を有する化合物を結合させるという方法も挙げられる。
また、第１及び第２の何れの方法を用いる場合も、ブロックコポリマーの末端（Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６）に保護基、疎水性基、重合性基等を後から導入する場合、その手法は任意であるが、酸ハロゲン化物を用いる方法、酸無水物を用いる方法、活性エステルを用いる方法等、通常の合成で用いられる手法が挙げられる。
【００５２】
［カチオン性ポリマー］
カチオン性ポリマーは、カチオン基を有し、カチオン性（陽イオン性）を示すポリマーである。但し、カチオン性ポリマーは、高分子ミセルの形成を妨げない範囲で、多少のアニオン基を有していてもよい。
【００５３】
カチオン性ポリマーの種類も限定されない。単一の反復単位からなるポリマーでもよく、二種以上の反復単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。カチオン性ポリマーとしてはポリアミン等が好ましく、側鎖にアミノ基を有するポリアミノ酸又はその誘導体が特に好ましい。側鎖にアミノ基を有するポリアミノ酸又はその誘導体としては、ポリアスパルタミド、ポリグルタミド、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、及びこれらの誘導体等が挙げられるが、特にポリアスパルタミド誘導体及びポリグルタミド誘導体が好ましい。
【００５４】
カチオン性ポリマーの分子量は、限定されるものではないが、均質な高分子ミセルを効率的に製造する観点からは、所定の範囲内の分子量を有することが好ましい。カチオン性ポリマーの反復単位数も制限されないが、通常はカチオン性ポリマーの分子量が所定の分子量範囲を満たすように、その反復単位の種類に応じて決定される。具体的には、カチオン性ポリマーとしてポリアスパラギン酸誘導体又はポリグルタミン酸誘導体を用いる場合、その反復単位数は、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、また、好ましくは３００以下、より好ましくは２００以下の範囲である。
前記条件を満たすカチオン性ポリマーを用いることにより、ブロックコポリマーの水性溶液中での会合・沈殿を防止して安定化し、担体組成物として機能し得る高分子ミセルを効率的に構築することが可能となる。
【００５５】
（カチオン性ポリマーの具体例〕
本発明のカチオン性ポリマーの好ましい具体例としては、下記式（Ｉ’）〜（IV’）に示すポリ（アミノ酸又はその誘導体）が挙げられる。
【００５６】
【化８】
2012005376.tif 000010
（式（Ｉ’）及び（II’）中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｎ及びｘは、式（Ｉ）及び（II）の同符号の基と同じ定義を表す。）
【化９】
2012005376.tif 000011
（式（III’）及び（IV’）中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ｎ、ｘ、ｙ及びｚは、式（III）及び（IV）の同符号の基と同じ定義を表す。）
【００５７】
式（Ｉ’）〜（IV’）における各基の詳細、式（Ｉ’）〜（IV’）に示すポリ（アミノ酸又はその誘導体）の詳細、並びにその製造方法の詳細は、式（Ｉ）〜（IV）のブロックコポリマーのポリ（アミノ酸又はその誘導体）セグメントについて上述した通りである。
【００５８】
なお、式（Ｉ’）〜（IV’）においてＲ５が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基である場合、Ｘは通常は前記のＡ群〜Ｅ群に分類される残基の中から選択されるが、中でもＢ群が好ましく、特に以下のアミン化合物残基が好ましい。
【化１０】
2012005376.tif 000012
（式中、Ｒ７は、水素原子又はメチル基であり、ｄ及びｅは各々独立に、１〜５の整数である。）
【００５９】
［Ｂ／Ｈ比］
本発明の核酸送達用組成物及び担体組成物が有するブロックコポリマーとカチオン性ポリマーとの比率は、ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーが有する総カチオン基に対する、ブロックコポリマーが有するカチオン基のモル百分率（本明細書ではこれを「Ｂ／Ｈ比」と表示する場合がある。）によって表される。具体的には以下の式で表される。
【数１】
2012005376.tif 000013
【００６０】
本発明では、前記のＢ／Ｈ比を、通常２５％超、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、更に好ましくは５０％以上、また、通常９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下の範囲とする。Ｂ／Ｈ比を前記範囲内に収めることで、低い細胞毒性と高い核酸導入効率という両特性を兼ね備えた、優れた核酸送達用組成物を得ることが可能となる。
【００６１】
本発明において、Ｂ／Ｈ比を前記範囲内に収めることでこのような効果が得られる理由は明らかではないが、Ｂ／Ｈ比を前記下限値以上の範囲とすることで、ゼータ電子を比較的０に近い値に維持し、毒性を十分に抑制することが可能となる一方、Ｂ／Ｈ比を前記上限値以下の範囲とすることで、粒子形状を球状又は略球状に維持し、培地中や血中での粒子の安定性を高め、惹いては核酸導入効率を十分に発揮することが可能となる結果、低い細胞毒性と高い核酸導入効率とが両立されるものと推測される。
【００６２】
なお、本発明の核酸送達用組成物及び担体組成物が、２種以上のブロックコポリマー及び／又は２種以上のカチオン性ポリマーを含有する場合には、それら２種以上のブロックコポリマー全体及び／又は２種以上のカチオン性ポリマー全体のＢ／Ｈ比が、前記範囲を満たしていればよい。
【００６３】
［核酸］
本発明の核酸送達用組成物に使用される核酸は制限されない。即ち、核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、天然又は非天然の核酸類縁体（例えばペプチド核酸等）、改変核酸、修飾核酸等が挙げられるが、何れであってもよい。また、核酸は一本鎖でも二本鎖でもよく、タンパク質のコード化の有無やその他の機能の有無も制限されない。
【００６４】
但し、核酸としては、生体内に送達された場合に生体、組織、細胞等に対して何らかの作用を及ぼし得る機能性核酸であることが好ましい。機能性核酸としては、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ核酸、リボザイム、ＤＮＡ酵素、各種抑制遺伝子（癌抑制遺伝子等）、機能性の改変核酸・修飾核酸（例えば、核酸のリン酸部分がホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスフェートトリエステル、ホスホロアミデート等に改変された核酸や、高分子ミセル安定化等の用途に向けて、コレステロールやビタミンＥ等の疎水性官能基が結合された核酸）等が挙げられる。これらは核酸送達用組成物の用途に応じて選択される。
【００６５】
プラスミドＤＮＡとしては、標的細胞・組織において所望の機能を発揮し得るものであればよい。斯かるプラスミドＤＮＡは種々のものが知られており、当業者であれば核酸送達用組成物の用途に応じて所望のプラスミドＤＮＡを選択することが可能である。
【００６６】
また、ｓｉＲＮＡとしては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用して目的の遺伝子の発現を抑制し得るものであればよい。ＲＮＡ干渉の目的遺伝子としては、癌（腫傷）遣伝子、抗アポトーシス遺伝子、細胞周期関連遺伝子、増殖シグナル遺伝子等が好ましく挙げられる。また、ｓｉＲＮＡの塩基長は限定されないが、通常３０塩基未満、好ましくは１９〜２１塩基である。
【００６７】
核酸は、１種を単独で使用してもよいが、２種以上を任意の組み合わせ及び比率で使用してもよい。
なお、核酸分子はポリアニオンとなるため、前記ブロックコポリマーのポリカチオン部分の側鎖と、静電的相互作用により結合（会合）することができる。
【００６８】
［Ｎ／Ｐ比］
ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーに対する核酸の比率は、［核酸が有するリン酸基］に対する［ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーが有するカチオン性基］のモル比（本明細書ではこれを「Ｎ／Ｐ比」と表示する場合がある。）で表される。
【数２】
2012005376.tif 000014
本発明において、このＮ／Ｐ比は、限定されるものではないが、通常２以上、好ましくは４以上、より好ましくは６以上、また、通常２００以下、好ましくは１００以下、好ましくは５０以下の範囲である。本発明の核酸送達用組成物は、従来のＰＩＣ型高分子ミセル型の核酸送達用組成物と比べて核酸導入効率に優れているため、従来よりも少ない核酸の使用量（即ち、従来よりも低いＮ／Ｐ比）で、効率的に核酸を送達し、遺伝子発現させることが可能である。
【００６９】
［その他の成分］
本発明の核酸送達用組成物及び担体組成物を製造する際に、ブロックコポリマー、カチオン性ポリマー及び核酸に加え、高分子ミセルの形成を妨げない、或いは安定性を下げない範囲で、その他の成分を添加することができる。その他の成分に特に制限はないが、具体例としては、非荷電又は荷電性の重合体、荷電性ナノ粒子等が挙げられる。
【００７０】
非荷電又は荷電性の重合体としては、上述のブロックコポリマー及びカチオン性ポリマー以外の任意の非荷電又は荷電性の重合体が挙げられる。
荷電性ナノ粒子としては、表面に架電を有する金属系ナノ粒子等が挙げられる。
【００７１】
前記その他の成分は、一種を単独で使用してもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
前記その他の成分の使用量も制限されないが、高分子ミセルの形成を妨げない程度に抑えることが好ましい。具体的には、本発明の組成物の総重量に対して、通常３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下とすることが望ましい。
【００７２】
［担体組成物の調製法］
本発明の担体組成物は、通常は、前記のブロックコポリマー及びカチオン性ポリマー、並びに必要に応じて用いられるその他の成分を、混合することにより調製される。
具体的には、前記のブロックコポリマーを含んでなる第１の水性溶液と、前記のカチオン性ポリマーを含んでなる第２の水性溶液とを用意する。第１及び第２の水性溶液は、所望により濾過して精製してもよい。
【００７３】
第１の水性溶液におけるブロックコポリマーの濃度、及び、第２の水性溶液におけるカチオン性ポリマーの濃度は限定されず、ブロックコポリマーとカチオン性ポリマーとの比率、ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーの水性溶液への溶解度、高分子ミセルの形成効率等の条件を勘案して、適宜決定される。
第１及び第２の水性溶液の溶媒は、水性溶媒であれば、その種類は限定されない。好ましくは水であるが、高分子ミセルの形成を妨げない範囲で、水に他の成分を混合した溶媒、例えば生理食塩水、水性緩衝液、水と水溶性有機溶媒との混合溶媒等も用いることができる。水性緩衝液としては１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【００７４】
第１及び第２の水性溶液のｐＨは、高分子ミセルの形成を妨げない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくはｐＨ５以上、より好ましくはｐＨ６．５以上であり、また、好ましくはｐＨ９以下、より好ましくはｐＨ７．５以下である。ｐＨの調整は、溶媒として緩衝液を用いることにより、容易に行うことができる。第１及び第２の水性溶液のｐＨを調整して用いることは、ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーの荷電状態を保持し、効率的に高分子ミセルを形成する上で有利である。
【００７５】
第１及び第２の水性溶液の塩濃度は、高分子ミセルの形成を妨げない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、また、好ましくは３００ｍＭ以下、より好ましくは１５０ｍＭ以下である。
第１及び第２の水性溶液の混合方法も限定されない。第１の水性溶液に第２の水性溶液を加えてもよく、第２の水性溶液に第１の水性溶液を加えてもよい。また、容器に第１及び第２の水性溶液を同時に入れて混合してもよい。得られた第１及び第２の水性溶液の混合液を、適宜攪拌してもよい。
【００７６】
第１及び第２の水性溶液の混合時の温度は、高分子ミセルの形成を妨げない範囲であれば限定されないが、ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーの温度に応じた溶解度を勘案して設定することが好ましい。具体的には、通常０℃以上、また、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
【００７７】
混合後、形成された高分子ミセルを含有する担体組成物を、すぐに所望の用途に供してもよいが、系を平衡化させるために、混合液を静置する時間を設けてもよい。混合液を静置する時間は、高分子ミセルの形成効率等の条件によって異なるが、好ましくは５０時間以下、より好ましくは３０時間以下である。但し、前述のように架橋剤を用いない場合、形成された高分子ミセルの径が経時的に増大する傾向があるので、静置時間を設けないことが好ましい場合もある。
【００７８】
ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマー以外のその他の成分を用いる場合、前記の第１及び第２の水性溶液の混合時又は混合後に、当該その他の成分を加えて混合すればよい。当該その他の成分をそのまま加えて混合してもよいが、当該その他の成分を含有する水性溶液を調製し、これを混合してもよい。当該その他の成分の水性溶液の調製における水性溶媒、ｐＨ、温度、イオン強度等の調製条件は、第１及び第２の水性溶液について上述した条件と同様である。
また、更に透析、希釈、濃縮、撹拌等の操作を適宜付加してもよい。
【００７９】
［核酸送達用組成物の調製法］
本発明の核酸送達用組成物は、通常は、前記の核酸を、（ｉ）前記のブロックコポリマー及びカチオン性ポリマー、並びに必要に応じて用いられるその他の成分と混合するか、或いは、（ii）予め調製された本発明の担体組成物と混合することにより調製される。
【００８０】
（ｉ）の場合、上述の担体組成物の調製手順において、前記の第１の水性溶液（ブロックコポリマーの水性溶液）と第２の水性溶液（カチオン性ポリマーの水性溶液）との混合時に、更に核酸を加えて混合すればよい。また、第１の水性溶液又は第２の水性溶液に予め核酸を加えて混合してから、第１の水性溶液と第２の水性溶液とを混合してもよい。
【００８１】
（ii）の場合、前記の第１の水性溶液（ブロックコポリマーの水性溶液）と第２の水性溶液（カチオン性ポリマーの水性溶液）とを混合して得られた担体組成物に、更に核酸を加えて混合すればよい。第１及び第２の水性溶液の混合による担体組成物の調製後、直ぐに核酸を加えて混合してもよいが、混合液を静置して系を平衡化させてから、更に核酸を加えて混合してもよい。
【００８２】
（ｉ）及び（ii）の何れの場合も、核酸はそのまま加えて混合してもよいが、核酸を含有する水性溶液（第３の水性溶液）を調製し、これを加えて混合してもよい。第３の水性溶液の調製における水性溶媒、ｐＨ、温度、イオン強度等の調製条件は、第１及び第２の水性溶液について上述した条件と同様である。
また、更に透析、希釈、濃縮、撹拌等の操作を適宜付加してもよい。
【００８３】
［核酸送達用組成物及び担体組成物の構造］
本発明の核酸送達用組成物及び担体組成物の形状は、限定されないが、通常は球状又は略球状である。
本発明の核酸送達用組成物及び担体組成物の粒径は、ブロックコポリマー及びカチオン性ポリマーの種類及び量比、その他の成分の有無、核酸送達用組成物及び担体組成物の周辺環境（水性媒体の種類）等に応じて異なるが、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上、また、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１５０ｎｍ以下である。
なお、生理環境や生理食塩水中等の塩存在条件下では、核酸送達用組成物及び担体組成物の粒径は経時的に増大する傾向があるが、架橋剤を導入することにより粒径の増大を防止することが出来る。
【００８４】
本発明の核酸送達用組成物及び担体組成物の粒子内構造は定かではないが、後述のようにゼータ電位が０に近いことを考慮すると、以下のように推測される。
担体組成物においては、ブロックコポリマーの親水性セグメントが粒子外殻周辺に密集して存在するとともに、ブロックコポリマーのカチオン性ポリマーセグメント及びカチオン性ポリマーが主に粒子内部側に存在する、ＰＩＣ型高分子ミセルの構造を有しているものと考えられる。
【００８５】
また、核酸送達用組成物においても同様に、ブロックコポリマーの親水性セグメントが粒子外殻周辺に密集して存在する一方、ブロックコポリマーのカチオン性ポリマーセグメント及びカチオン性ポリマーが核酸と静電結合し、主に粒子内部側に内包・担持された状態で存在する、ＰＩＣ型高分子ミセルの構造を有しているものと考えられる。
【００８６】
［核酸送達用組成物及び担体組成物の用途］
本発明の核酸送達用組成物は、インビトロ又はインビボにおいて、核酸を標的細胞又は組織に送達するために使用できる。本発明の核酸送達用組成物によれば、標的細胞内へ安定したまま送達することが困難であった核酸を、容易に安定化した状態で送達することができるとともに、細胞毒性も抑制することが可能となる。また、細胞内外のｐＨの変化を利用し、核酸送達用組成物の粒子内部に内包・担持された核酸を、標的細胞内に効率的に導入する手段として使用することができる。更に、核酸としてタンパク質をコードする遺伝子を用い、これを細胞又は組織に送達して発現させる場合には、本発明の核酸送達用組成物を用いることにより、高い遺伝子発現効率を得ることが可能となる。
【００８７】
本発明の核酸送達用組成物を用いて核酸を標的細胞又は組織に送達するには、核酸送達用組成物が標的細胞又は組織と接触し得る状態にすればよい。
インビトロで本発明の核酸送達用組成物と標的細胞又は組織との接触を達成するには、本発明の核酸送達用組成物の存在下で標的細胞又は組織を培養するか、又は標的細胞又は組織の培養物中に核酸送達用組成物を添加すればよい。
【００８８】
インビボで本発明の核酸送達用組成物と標的細胞又は組織との接触を達成するには、遺伝療法等の当該技術分野で常用されている投与方法により、本発明の核酸送達用組成物を、当該核酸の導入を必要とする個体（又は処置すべき個体）に投与すればよい。このような個体としては、限定されるものでないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ブタ、鳥類等を挙げることができる。投与方法としては、標的細胞又は組織の近傍又は組織内への直接導入又は移植，静脈内注入、動脈内注入、筋肉内注入、経口投与、経肺投与等を挙げることができる。投与量、投与回数及ぴ投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態等に合わせて適宜設定することができる。
なお、特に肺は外来の異物に対する感受性が高く、従来のＤＤＳを用いた薬物送達では炎症が惹起される場合があり、経肺投与は極めて困難であったが、本発明の核酸送達用組成物によれば、毒性を低く抑えつつ高い遺伝子発現効率を得ることが可能であるため、経肺投与にも好適に使用することができる。
【００８９】
また、本発明の担体組成物は、核酸を担持させて本発明の核酸送達用組成物とすることにより、前記核酸送達用組成物と同様の用途に使用することが出来る。核酸を担持させる手法については、［核酸送達用組成物の調製法］で述べたとおりである。
【００９０】
［医薬組成物］
本発明によれば、本発明の核酸送達用組成物又は担体組成物を含んでなる医薬組成物（本発明の医薬組成物）も提供される。本発明の医薬組成物は、例えば、各種疾患の原因となる細胞又は組織を標的として、所望の核酸を送達・導入する治療（遺伝子治療）に用いることができる。
【００９１】
本発明の医薬組成物の投与対象となる個体は、核酸送達用組成物について前記したものと同様である。本発明の医薬組成物による治療対象となる疾患としては、制限されるものではないが、癌（例えば肺癌、膵臓癌、脳腫傷、肝癌、乳癌、大腸癌、神経芽細胞腫及び膀胱癌等）、循環器疾患、運動器疾患、及び中枢系疾患等が挙げられる。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、本発明の核酸送達用組成物又は担体組成物に加えて、薬剤製造上一般に用いられるその他の成分を含んでいてもよい。その他の成分の例としては、賦形剤、増量剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等が挙げられる。斯かる他の成分は１種を単独で用いても、２種以上を任意の組み合わせ及び比率で用いてもよい。これらの他の成分の種類や使用量等の詳細は、医薬組成物の目的、用途、使用方法等に応じて、当業者であれば適宜決定することが可能である。
【００９３】
本発明の医薬組成物の形態も任意であるが、通常は静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
本発明の医薬組成物の使用方法も任意である。核酸送達用組成物を含む医薬組成物であればそのまま投与することが可能である。担体組成物を含み、核酸を含まない医薬組成物の場合には、使用前に核酸と混合し、担体組成物に核酸を担持させてから、投与に供すればよい。
【００９４】
［核酸送達方法］
また、本発明によれば、インビトロ又はインビボにおいて、核酸を標的細胞又は組織に送達する方法（本発明の核酸送達方法）が提供される。本発明の核酸送達方法には、以下の（１）（２）の方法が包含される。
【００９５】
（１）本発明の核酸送達用組成物又は医薬組成物を用いる方法
本方法では、先に説明した本発明の核酸送達用組成物又は医薬組成物を用い、これをインビトロ又はインビボにおいて標的細胞又は組織と接触させることにより、標的細胞又は組織に核酸を送達する。核酸送達用組成物及び医薬組成物の詳細、標的細胞又は組織への接触方法等については、前述したとおりである。本方法によれば、細胞毒性を低く抑えつつ、高い効率で核酸導入を行うことが出来る点も、前述したとおりである。
【００９６】
（２）ブロックコポリマーと核酸を含む組成物を、現位置（in situ）においてカチオン性ポリマーと共存させる方法
本方法では、本発明の核酸送達用組成物又は医薬組成物からカチオン性ポリマーを除いた組成物（即ち、ブロックコポリマーと核酸を含む組成物。以降の記載では「ブロックコポリマー系核酸組成物」という場合がある。）を用い、これをインビトロ又はインビボにおいて標的細胞又は組織と接触させるとともに、別途カチオン性ポリマーを標的細胞又は組織に接触させ、現位置（in situ）でブロックコポリマー系核酸組成物と共存させる方法である。更に、標的細胞又は組織におけるブロックコポリマー系核酸組成物のブロックコポリマーとカチオン性ポリマーとの共存比を、Ｂ／Ｈ比が前記特定の範囲を満たすような比に調整する。本方法（２）によっても、前記方法（１）（本発明の核酸送達用組成物を用いて核酸送達を行う方法）と同様、細胞毒性を低く抑えつつ、高い効率で核酸導入を行うことが可能である。
【００９７】
本方法（２）の詳細は以下の通りである。
ブロックコポリマー系核酸組成物を構成するブロックコポリマー及び核酸の詳細については、本発明の核酸送達用組成物について前述したとおりである。ブロックコポリマーと核酸との使用比率も任意であり、核酸送達の目的や条件等に応じて適宜選択すればよいが、原位置で共存するカチオン性ポリマーの共存比率を勘案して、前記Ｎ／Ｐ比の範囲が満たされるような比率で使用することが好ましい。ブロックコポリマー系核酸組成物の調製についても、本発明の核酸送達用組成物の調製に準じて、各成分を混合することにより行うことが可能である。
カチオン性ポリマーの詳細についても、本発明の核酸送達用組成物について前述したとおりである。
【００９８】
ブロックコポリマー系核酸組成物及びカチオン性ポリマーを標的細胞又は組織に接触させる方法としては、前述した本発明の核酸送達用組成物を標的細胞又は組織に接触させる方法を用いることができる。但し、原位置で所望のＮ／Ｐ比を達成するためには、原位置でのブロックコポリマー系核酸組成物及びカチオン性ポリマーの各濃度をある程度正確に制御することが可能な方法を用いることが好ましい。かかる濃度制御をインビトロにおいて達成する好ましい接触方法としては、培養前の培地に予め添加する方法、培養中の培地又は培養物に後から添加する方法、が挙げられる。また、かかる制御をインビボで達成する好ましい接触方法としては、局所投与、血中投与等が挙げられる。なお、特にカチオン性ポリマーについては、細胞又は組織への接触効率を向上させるために、公知のアニオン性ポリマーと混合した状態で投与することも好ましい。
【００９９】
なお、ブロックコポリマー系核酸組成物及びカチオン性ポリマーを標的細胞又は組織に接触させる順番も制限されず、任意である。即ち、ブロックコポリマー系核酸組成物及びカチオン性ポリマーを同時に標的細胞又は組織に接触させてもよいが、まず何れか一方を標的細胞又は組織に接触させ、続いて他方を標的細胞又は組織に接触させてもよい。これらを同時に標的細胞又は組織に接触させる場合、両者を個別に標的細胞又は組織に接触させてもよく、両者を混合してから標的細胞又は組織に接触させてもよい。これらを個別に標的細胞又は組織に接触させる場合、その接触手法は同一でも異なってもよい。
【０１００】
本発明の核酸送達方法は、種々の用途に用いることが可能であるが、中でも、インビトロ又はインビボにおいて、各種疾患の原因となる細胞又は組織を標的とし、所望の核酸を送達・導入する治療（遺伝子治療）に好適に用いることが可能である。
【実施例】
【０１０１】
次に、実施例を参照しながら、本発明をより具体的に説明する。なお、以下の実施例は、あくまでも例示を目的とするものであり、本発明を何ら限定するものではない。【０１０２】
［実施例群Ｉ：核酸送達用組成物の物性及びインビトロ（in vitro）特性の検討］
（ブロックコポリマー）
＜ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の構造＞
ブロックコポリマーとしては、ポリエチレングリコール（以降の記載では「ＰＥＧ」と表示する）セグメントとポリ（アスパラギン酸−ジエチレントリアミン誘導体）（以降の記載では「ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）」と表示する）セグメントとを有する、以下に示すブロックコポリマー（以降の記載では「ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）」と表示する）を用いた。【０１０３】
【化１１】
2012005376.tif 000015
（式中、
ｍはＰＥＧの重合度を表し、約２７０である。
ｎはＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度を表し、約６１である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。
ｃは連結基であるエチレン基の繰り返し数を表し、約３である。）
ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）のＰＥＧセグメントの分子量は約１２０００、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）セグメントの分子量は約１４０００であった。【０１０４】
＜ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の製法＞
ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）は、以下の（１）（２）の手順で作製した。【０１０５】
（１）ＰＥＧ−ポリベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）の合成：
ＮＣＡ（アミノ酸無水物）化合物を少量のＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）に溶解し、そこに塩化メチレンを加えた。重合開始剤として、ジクロロメタンに溶解した片末端に１級アミノ基を有するＰＥＧを加え、３５℃で２日間攪拌した。これらの操作は、乾燥アルゴン雰囲気下で行った。生成したＰＥＧ−ＰＢＬＡは、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（６／４）の混合溶液中に滴下して沈殿させ、濾過後減圧乾燥することによって回収した。生成したＰＥＧ−ＰＢＬＡの分子量分布を、ＰＥＧスタンダードの検量線を用いてゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）解析したところ、Ｍｗ（重量平均分子量）／Ｍｎ（数平均分子量）は１．０５であった。また、１Ｈ ＮＭＲ測定により重合度を求めたところ、６５であった。【０１０６】
（２）ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の合成：
ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）はＰＥＧ−ＰＢＬＡのアミノリシス反応を利用して合成した。乾燥させたＰＥＧ−ＰＢＬＡ５０ｍｇをＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）２ｍＬ中に溶解させ、それぞれ５℃及び０℃に冷却した。別容器にＰＥＧ−ＰＢＬＡのベンジルエステル基に対して５０倍モル量のＤＥＴを等量のＮＭＰで希釈した溶液を調製し、前記ＰＥＧ−ＰＢＬＡ溶液と同じ温度に冷却した。そこに前記ＰＥＧ−ＰＢＬＡ溶液をゆっくりと滴下し、１時間の反応の後、反応溶液をよく冷却した５Ｎ ＨＣｌ（好ましくは１Ｎ程度の希酸）に溶液温度が５℃以下になるよう制御しながら滴下した。その後、０．０１Ｎ程度のＨＣｌ水溶液に対して４℃に保ったまま透析を行い（ｐＨ２）、さらに純水に対して透析を行うことで過剰の酸を取り除いた。最終的に得られたポリマー水溶液を凍結乾燥し、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を塩として回収した。定量的なアミノリシス反応は１Ｈ ＮＭＲ測定により確認した。【０１０７】
（カチオン性ポリマー）
＜Ｈｏｍｏ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の構造＞
カチオン性ポリマーとしては、以下に示すポリ（アスパラギン酸−ジエチレントリアミン誘導体）ホモポリマー（以降の記載では「Ｈｏｍｏ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）」と表示する）を用いた。【０１０８】
【化１２】
2012005376.tif 000016
（式中、
ｎはＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の重合度を表し、約５４である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。）
なお、前記Ｈｏｍｏ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の分子量は約１００００であった。【０１０９】
＜Ｈｏｍｏ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の製法＞
Ｈｏｍｏ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）は、前記＜ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の製法＞に準じて調製した。
即ち、前記＜ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の製法＞の工程（１）において、ＰＥＧの代わりにｎ−ブチルアミンを用いた他は同様の操作を行うことにより、ポリベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＰＢＬＡ）を作製した。ＧＰＣによるＭｗ／Ｍｎは１．０６、１Ｈ ＮＭＲ測定による重合度は６５であった。
次いで、前記＜ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の製法＞の工程（１）において、ＰＥＧ−ＰＢＬＡの代わりに上で得られたＰＢＬＡ５０ｍｇを用いた他は同様の操作を行うことにより、Ｈｏｍｏ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を調製した。【０１１０】
（核酸）
核酸としては、ルシフェラーゼをコードするプラスミド（Luc pDNA）を用いた。このプラスミドは、理研セルバンクより入手し、大腸菌に導入し、培養によって増幅し、NucleoBond Xtra Maxi（日本ジェネティクス社製）を用いて精製した後に使用した。【０１１１】
（核酸送達用組成物の調製）
前記のブロックコポリマー（ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））、カチオン性ポリマー（Ｈｏｍｏ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））及び核酸（Luc pDNA）を用い、以下の手順で組成物（核酸送達用組成物）を調製した。なお、以下の記載において単に「溶液」と表示する場合は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー中溶液を指すものとする。
１ｍｇ／ｍＬブロックコポリマー溶液と、１ｍｇ／ｍＬカチオン性ポリマー溶液とを、Ｂ／Ｈ比が後述の種々の値を満たすように混合した後、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー中でＮ／Ｐ比が後述の種々の値を満たすように所定量のｐＤＮＡと混合することにより、組成物（核酸送達用組成物）を得た。【０１１２】
（形状観察）
Ｂ／Ｈ比を１００％（ブロックコポリマー単独）、７５％、５０％、２５％又は０％（カチオン性ポリマー単独）とし、Ｎ／Ｐ比を３として、上記手順で調製した組成物（核酸送達用組成物）を用いた。各組成物（核酸送達用組成物）について、酢酸ウラニル水溶液を用いて核酸を染色した後、粒子形状を透過型電子顕微鏡で観察した。【０１１３】
各組成物について得られた透過型電子顕微鏡写真を図１（ａ）及び（ｂ）に示す。図１（ｂ）の各写真は図１（ａ）の対応する写真中の代表的な粒子の拡大写真である。Ｂ／Ｈ比が１００％の組成物中では粒径が比較的大きく、粒子形状が比較的細長状であったのに対し、Ｂ／Ｈ比が低下するに従って粒径が徐々に小さくなり、粒子形状が球状に近付くことが分かる。【０１１４】
（ゼータ電位の測定）
Ｂ／Ｈ比を１００％（ブロックコポリマー単独）、７５％、５０％、２５％又は０％（カチオン性ポリマー単独）とし、Ｎ／Ｐ比を３として、上記手順で調製した組成物（核酸送達用組成物）を用いた。各組成物（核酸送達用組成物）のゼータ電位を以下の手順により測定した。
各組成物（核酸送達用組成物）を折り畳みキャピラリーセル（folded capillary cells）（Malvern Instruments, Ltd.）に注入し、Malvern Instruments, Ltd.製Nano ZSを用いて測定に供した。得られた結果から、以下のスモルコフスキー（Smoluchowski）方程式によりゼータ電位を算出した。
ζ＝４πηυ／ｅ            ・・・スモルコフスキー（Smoluchowski）方程式
（式中、ζはゼータ電位を表し、ηは溶媒の粘度を表し、υは電気泳動移動度を表し、ｅは溶媒の誘電率を表す。）【０１１５】
得られたゼータ電位とＢ／Ｈ比の値との関係を図２のグラフに示す。Ｂ／Ｈ比が２５％以上の範囲では、ゼータ電位は０ｍＶに近い値であったのに対し、Ｂ／Ｈ比が２５％よりも低下すると、ゼータ電位は急激に上昇した。ここから、Ｂ／Ｈ比が２５％以上の範囲においては、ブロックコポリマーの非荷電親水性ポリマーセグメントが粒子の外側に存在し、ブロックコポリマーのカチオン性ポリマーセグメントが核酸と静電結合して粒子の内側に存在する、ＰＩＣ型の高分子ミセル粒子が形成されているものと推測される。【０１１６】
（トランスフェクション効率及び細胞毒性の測定）
Ｂ／Ｈ比を１００％（ブロックコポリマー単独）、８０％、７０％、６０％、５０％、２５％又は０％（カチオン性ポリマー単独）とし、Ｎ／Ｐ比を４、６、８、１２、１６として、上記手順で調製した組成物（核酸送達用組成物）を用いた。各組成物（核酸送達用組成物）のトランスフェクション効率及び細胞毒性を、以下の手順で測定した。
ＨＵＶＥＣ（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）を２４ウェルプレートに対し、各ウェル２０，０００細胞の細胞密度となるように、４００μＬのＥＢＭ−２とともに播種し、２４時間培養した。その後、各組成物（核酸送達用組成物）を各ウェルに３０μＬずつ加え、更に２４時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、新たなＥＢＭ−２を各ウェルに４００μＬずつ加え、更に２４時間培養した。その後、セルカウンティングキット（Cell Counting Kit-8：同仁化学研究所製）を用い、使用説明書に従って、各ウェル内の生存細胞数を計数することにより、細胞毒性の指標とした。【０１１７】
続いて、培地を除去し、細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄した。細胞溶解液（Cell Culture Lysis Buffer：Promega社製）を２００μＬ／ウェルずつ加え、ルシフェラーゼアッセイキット（Luciferase Assay System Kit：Promega社製）及びＬＢ９４０機器（Mithras社製）を用いてフォトルミネッセンス強度を測定することにより、ルシフェラーゼ活性を決定し、トランスフェクション効率の指標とした。なお、細胞溶解液中のタンパク質量は、ＭｉｃｒｏＢＣＡ（登録商標）タンパク質アッセイ試薬キット（MicroBCA（登録商標） Protein Assay Reagent Kit：Thermo Scientific社製）により決定した。【０１１８】
各組成物（核酸送達用組成物）について得られたトランスフェクション効率とＢ／Ｈ比及びＮ／Ｐ比との関係を表すグラフを図３に示す。Ｂ／Ｈ比が１００％の組成物ではトランスフェクション効率が非常に低いのに対し、Ｂ／Ｈ比が８０％又はそれ以上の組成物ではトランスフェクション効率の明らかな向上が見られた。また、何れのＢ／Ｈ比においても、Ｎ／Ｐ比が高くなるに従って、やはりトランスフェクション効率の向上が見られた。【０１１９】
また、各組成物（核酸送達用組成物）について得られた細胞毒性とＢ／Ｈ比及びＮ／Ｐ比との関係を表すグラフを図４に示す。Ｂ／Ｈ比が２５％以下の組成物では生存細胞数が極めて少なく、細胞毒性が比較的高かったのに対し、Ｂ／Ｈ比が２５％を超える組成物では生存細胞数が増加しており、細胞毒性の明らかな低減がみられた。また、何れのＢ／Ｈ比においても、Ｎ／Ｐ比が高くなるに従って、やはり細胞毒性の低減が見られた。【０１２０】
［実施例群II：核酸送達用組成物のインビボ（in vivo）特性の検討］
（ブロックコポリマー）
ブロックコポリマーとしては、実施例群Ｉの式に示すＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）において、ｃ＝３又はｃ＝６のものを用いた（以降の記載ではそれぞれ「ＰＥＧ−Ｃ３−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）」及び「ＰＥＧ−Ｃ６−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）」と表示する。また、図５中ではそれぞれ「Ｃ３」及び「Ｃ６」と表示する。）。各ポリマーは実施例群Ｉの＜ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の製法＞に記載の手法に準じて合成した。【０１２１】
（カチオン性ポリマー）
カチオン性ポリマーとしては、実施例群Ｉと同じＨｏｍｏ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いた。【０１２２】
（核酸）
核酸としては、以下の何れかを用いた。
・ｓＦｌｔ−１をコードするプラスミド（sFlt-1 pDNA）
sFlt-1はpVL1393バキュロウィルスベクター（ｐＤＮＡ）から切り出されたHuman sFlt-1 cDNA（2.4 kb）であり、東京医科歯科大渋谷教授から供与されたものである。アガロースゲル電気泳動で精製した後、Rapid DNA Ligation Kit（ロシュ社製）を用いてpCAccベクターに挿入し、大腸菌（DH5α）培養で増幅させ、培養プレート上に形成された１０程度のコロニーをそれぞれ取り分けて更に培養し、それぞれのｐＤＮＡをアガロース電気泳動などで調べ、所望の配列が挿入されたｐＤＮＡを選別し、増幅したものを、NucleoBond（登録商標） Xtra（日本ジェネティクス社製）を用いて精製して使用した。【０１２３】
・蛍光タンパク質（Venus）をコードするプラスミド（Venus pDNA）
Venus pDNAは理研セルバンクより入手し、大腸菌に導入した後に培養によって増幅させ、NucleoBond Xtra Maxi（日本ジェネティクス社製）を用いて精製した後に使用した。【０１２４】
・ルシフェラーゼをコードするプラスミド（Luc pDNA）
このプラスミドは、実施例群Ｉと同様に入手・調製した。【０１２５】
・ルシフェラーゼをコードするＣｙ５標識プラスミド（Cy5-pDNA）
上記Luc pDNAにＣｙ５標識を付したプラスミドである。Mirus社から購入したLabel IT Nucleic Acid Labeling Kit を使用し、取扱説明書に記載の手順に従ってCy5をラベルした。【０１２６】
（動物）
８週齢マウスBalb/c（メス、チャールズリバーラボラトリー社より入手）をそのまま（以降「Balb/cマウス」と表示する場合がある）、又は５週齢ヌードマウスBalb/c（メス、チャールズリバーラボラトリー社より入手）にヒト膵臓ガンBxPC3を皮下接種し、腫瘍体積がおよそ４５ｍｍ３に成長するまで２〜３週間飼育したもの（以降「BxPC3皮下接種マウス」と表示する場合がある）を使用した。【０１２７】
（調製法）
前記のブロックコポリマー（ＰＥＧ−Ｃ３−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）又はＰＥＧ−Ｃ６−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））、カチオン性ポリマー（Ｈｏｍｏ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））及び核酸（（sFlt-1 pDNA、Cy5-pDNA、Venus pDNA又はLuc pDNA）を用い、Ｂ／Ｈ比を以下の各項目に記載の値に種々変更し、Ｎ／Ｐ比を８として、実施例群Ｉの（核酸送達用組成物の調製）に記載の手順に従って、組成物（核酸送達用組成物）を調製した。【０１２８】
（血中投与による腫瘍体積の経時変化測定）
ブロックコポリマーとしてＰＥＧ−Ｃ３−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）又はＰＥＧ−Ｃ６−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用い、核酸としてsFlt-1 pDNAを用い、Ｂ／Ｈ比を１００％（ブロックコポリマー単独）、７０％、又は５０％として得られた各組成物（核酸送達用組成物）（２ＯＤ、２００μＬ）を、前記のBxPC3皮下接種マウス（各組成物あたり６頭ずつ）に対して、経静脈注射により全身投与した。各動物に対する投与は、実験開始後０日目、４日目及び８日目に行った。１回の投与量は、マウス１頭あたりの核酸投与量が２０μｇとなるように決定した。実験開始後の腫瘍体積を経時的に測定することにより、核酸送達による腫瘍抑制効果を調べた。
また、対照実験として、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを用いて、上記と同様の手法で投与及び腫瘍体積測定を行った。【０１２９】
各Ｂ／Ｈ比について得られた腫瘍体積の経時変化を表すグラフを図５に示す。ＰＥＧ−Ｃ３−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（図中「Ｃ３」と示す。）及びＰＥＧ−Ｃ６−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（図中「Ｃ６」と示す。）の何れを用いた場合にも、対照（ＨＥＰＥＳバッファー）の場合と比べて腫瘍抑制効果が見られた。その効果はＢ／Ｈ比が１００％の組成物に比べて、Ｂ／Ｈ比が５０％又は７０％の組成物の方が優れており、特にＢ／Ｈ比が７０％の組成物では顕著な腫瘍抑制効果が見られた。【０１３０】
（血中投与による核酸送達用組成物の血中滞留性測定）
ブロックコポリマーとしてＰＥＧ−Ｃ３−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用い、核酸としてCy5-pDNAを用い、Ｂ／Ｈ比を１００％（ブロックコポリマー単独）、７０％、又は５０％として得られた各組成物（核酸送達用組成物）（２ＯＤ、２００μＬ）を、前記のBxPC3皮下接種マウス（各組成物あたり８頭ずつ）に対して、経静脈注射により全身投与した。投与量は、マウス１頭あたりの核酸投与量が２０μｇとなるように決定した。投与後に経時的に採血を行い、採取した血液サンプル中の蛍光強度をIVIS（登録商標）イメージングシステム（Caliper社（Xenogen社）製）で測定した。投与直後の血液サンプル中の蛍光強度に対する、投与２０分後の血液サンプル中の蛍光強度の比率を、血中滞留性の指標として求めた。【０１３１】
各Ｂ／Ｈ比について得られた血中滞留性の指標（投与直後の蛍光強度に対する投与２０分後の蛍光強度の比率）を表すグラフを図６に示す。Ｂ／Ｈ比が７０％の組成物では、投与から２０分後の時点でも、核酸に由来する蛍光強度が、Ｂ／Ｈ比１００％の組成物と同程度に維持されていた。一方、Ｂ／Ｈ比が５０％の組成物では、核酸に由来する蛍光強度は低下していた。【０１３２】
（血中投与による腫瘍における核酸発現観察１）
ブロックコポリマーとしてＰＥＧ−Ｃ３−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用い、核酸としてVenus pDNAを用い、Ｂ／Ｈ比を１００％（ブロックコポリマー単独）、７０％、又は５０％として得られた各組成物（核酸送達用組成物）（２ＯＤ、２００μＬ）を、前記のBxPC3皮下接種マウス（各組成物あたり１頭ずつ）に対して、経静脈注射により全身投与した。投与量は、マウス１頭あたりの核酸投与量が２０μｇとなるように決定した。投与から２日後に腫瘍を切除し、１０μｍ厚の切片を作製した。この切片を共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）で観察し、Venusの発現量及び発現部位を調べることにより、核酸送達による核酸発現有効性の指標とした。なお、Venusの発現部位の基準として、同切片の細胞核及び血管内皮細胞を免疫染色し、その部位も観察した。
また、対照実験として、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを用いて、上記と同様の手法で投与及びＣＬＳＭ観察を行った。【０１３３】
各Ｂ／Ｈ比について得られた腫瘍組織切片のＣＬＳＭ写真を図７（ａ）〜（ｄ）に示す。本ＣＬＳＭ写真において、青色は細胞核、赤色は血管内皮細胞、緑色はVenus発現部位を表す。対照（ＨＥＰＥＳバッファー）（図７（ａ））やＢ／Ｈ比が１００％（図７（ｂ））および５０％（図７（ｃ））の組成物ではVenus発現が殆ど見られなかったのに対し、Ｂ／Ｈ比が７０％の組成物（図７（ｄ））では、血管から離れた細胞においてもVenusの発現が見られた。【０１３４】
（血中投与による腫瘍における核酸発現観察２）
ブロックコポリマーとしてＰＥＧ−Ｃ３−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用い、核酸としてsFlt-1 pDNAを用い、Ｂ／Ｈ比を７０％として得られた各組成物（核酸送達用組成物）（２ＯＤ、２００μＬ）を、前記のBxPC3皮下接種マウス（各組成物あたり１頭ずつ）に対して、経静脈注射により全身投与した。投与量は、マウス１頭あたりの核酸投与量が２０μｇとなるように決定した。投与から２日後に腫瘍を切除し、１０μｍ厚の切片を作製し、血管内皮細胞を免疫染色した。免疫染色には血管内皮細胞マーカーであるPECAM-1と、蛍光標識した二次抗体を使用した。また、sFlt-1の発現部位の基準として、同切片の細胞核及び血管内皮細胞も免疫染色した。染色後の切片を共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）で観察し、sFlt-1の発現量及び発現部位を調べることにより、核酸送達による核酸発現有効性の指標とした。
また、対照実験として、核酸送達用組成物の代わりに１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを用い、上記と同様の手法で投与、免疫染色及びＣＬＳＭ観察を行った。【０１３５】
対照（ＨＥＰＥＳバッファー）について得られた腫瘍組織切片のＣＬＳＭ写真を図８（ａ）に、Ｂ／Ｈ比７０％の核酸送達用組成物について得られた腫瘍組織切片のＣＬＳＭ写真を図８（ｂ）に示す。本ＣＬＳＭ写真において、青色は細胞核、赤色は血管内皮細胞、緑色はsFlt-1発現部位を表す。対照（ＨＥＰＥＳバッファー）ではsFlt-1発現が殆ど見られなかったのに対し、Ｂ／Ｈ比７０％の核酸送達用組成物では、血管から離れた細胞においてもsFlt-1の顕著な発現が見られた。【０１３６】
（血中投与による腫瘍における血管密度測定）
ブロックコポリマーとしてＰＥＧ−Ｃ３−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用い、核酸としてsFlt-1 pDNAを用い、Ｂ／Ｈ比を１００％（ブロックコポリマー単独）、７０％、又は５０％として得られた各組成物（核酸送達用組成物）（２ＯＤ、２００μＬ）を、前記のBxPC3皮下接種マウス（各組成物あたり３頭ずつ）に対して、経静脈注射により全身投与した。各動物に対する投与は２回、実験開始後０日目及び４日目に行った。投与量は、マウス１頭あたりの核酸投与量が２０μｇとなるように決定した。投与から６日後に腫瘍を切除し、１０μｍ厚の切片を作製し、血管内皮細胞を免疫染色した。免疫染色には血管内皮細胞マーカーであるPECAM-1と、蛍光標識した二次抗体を使用した。染色後の切片を共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）で観察し、各切片あたり７枚のＣＬＳＭ写真を撮像した。得られたＣＬＳＭ写真をLSM510（カールツァイス社製）で画像解析して、緑色発光画素比率（血管内皮細胞比率に相当）を計測し、各切片の平均値を血管密度として求め、核酸送達による血管新生の抑制効果の指標とした。【０１３７】
また、比較実験として、ブロックコポリマーとしてＰＥＧ−Ｃ３−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用い、核酸としてLuc pDNAを用い、Ｂ／Ｈ比を７０％として得られた組成物（核酸送達用組成物）を用いて、上記と同様の手法で投与、免疫染色及びＣＬＳＭ観察を行った。
更に、対照実験として、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを用いて、上記と同様の手法で投与、免疫染色及びＣＬＳＭ観察を行った。【０１３８】
各Ｂ／Ｈ比について得られた腫瘍組織の免疫染色ＣＬＳＭ写真の例を図９（ａ）に、免疫染色ＣＬＳＭ写真の画像解析によって求めた血管密度を表すグラフを図９（ｂ）に示す。対照実験（ＨＥＰＥＳバッファー）と比べて、Luc pDNAを用いた組成物（Ｂ／Ｈ比７０％）では血管密度の増減が見られなかったのに対し、sFlt-1 pDNAを用いた組成物では特にＢ／Ｈ比が７０％の組成物で血管密度が有意に低減されており、顕著な血管新生の抑制効果が認められた。【０１３９】
（経肺投与によるトランスフェクション効率の評価）
ブロックコポリマーとしてＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用い、核酸としてLuc pDNAを用い、Ｂ／Ｈ比を１００％（ブロックコポリマー単独）、７５％、５０％、２５％又は０％（カチオン性ポリマー単独）として得られた各組成物（４ＯＤ、５０μＬ）を、前記のBalb/cマウス（各組成物あたり５頭ずつ）に対して経肺投与した。経肺投与は、マイクロスプレー（microsprayer Model IA-1C-R, Penn Century社製）を用い、前記各組成物ををマウスの気管支内に直接噴射することにより行った。
投与から２４時間後、肺内の細胞３０ｍｇを採取し、細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄した。細胞溶解液（Cell Culture Lysis Buffer：Promega社製）を２００μＬずつ加え、ルシフェラーゼアッセイキット（Luciferase Assay System Kit：Promega社製）及びＬＢ９４０機器（Mithras社製）を用いてフォトルミネッセンス強度を測定することにより、ルシフェラーゼ活性を決定し、トランスフェクション効率の指標とした。なお、細胞溶解液中のタンパク質量は、MicroBCA（登録商標）タンパク質アッセイ試薬キット（MicroBCA（登録商標） Protein Assay Reagent Kit：Thermo Scientific社製）により決定した。
また、市販の遺伝子導入試薬である直鎖状ポリエチレンイミン（Linear Polyethylenimine：LPEI, Exgen 500, Fermentas社製）についても、同様の手順で投与、肺細胞採取、ルシフェラーゼ活性の決定を行った（図１０中「ＬＰＥＩ」）。
また、対照として、Luc pDNA １０ｍｇを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー溶媒５０μｌに溶解させた溶液についても、同様の手順で投与、肺細胞採取、ルシフェラーゼ活性の決定を行った（図１０中「核酸単独」）。
各組成物のトランスフェクション効率を表すグラフを図１０に示す。Ｂ／Ｈ比１００％（ブロックコポリマー単独）及び、Ｂ／Ｈ比０％（カチオン性ポリマー単独）の組成物に比べて、Ｂ／Ｈ比が７５％及び５０％の各組成物では、トランスフェクション効率の明らかな向上が見られた。【０１４０】
（経肺投与による細胞毒性の評価）
ブロックコポリマーとしてＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用い、核酸としてLuc pDNAを用い、Ｂ／Ｈ比を１００％（ブロックコポリマー単独）、５０％又は０％（カチオン性ポリマー単独）として得られた各組成物（４ＯＤ、５０μＬ）を用い、上記と同様に各組成物の肺内投与を行ったBalb/cマウス（各組成物あたり１頭ずつ）について、投与から４時間後に肺組織を採取し、ヘマトキシリンとエオジンによって組織染色し、光学（明視野？）顕微鏡写真によって炎症の有無を観察した。
また、対照として、肺内投与を行わなかったBalb/cマウスについても、同様の手順により炎症の有無を観察した。
各組成物について得られた光学顕微鏡写真を図１１（ａ）〜（ｄ）に示す。Ｂ／Ｈ比０％（カチオン性ポリマー単独）の組成物を投与した個体（図１１（ａ））では、肺組織に炎症が惹起された（図中丸で囲んだ箇所）のに対して、Ｂ／Ｈ比５０％の組成物を投与した個体（図１１（ｂ））及びＢ／Ｈ比１００％（ブロックコポリマー単独）の組成物を投与した個体（図１１（ｃ））の肺組織では、対照個体（図１１（ｄ））の肺組織と比べて大きな変化はなく、炎症はほとんど見られなかった。【０１４１】
（経肺投与による炎症性サイトカイン発現の評価）
ブロックコポリマーとしてＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用い、核酸としてLuc pDNAを用い、Ｂ／Ｈ比を１００％（ブロックコポリマー単独）、５０％又は０％（カチオン性ポリマー単独）として得られた各組成物（４ＯＤ、５０μＬ）を用い、上記と同様に各組成物の肺内投与を行ったBalb/cマウス（各組成物あたり５頭ずつ）について、投与から４時間後に肺内の細胞30mgを採取し、炎症性サイトカインであるＩＬ−６、ＴＮＦ−α、Ｃｏｘ−２及びＩＬ−１０のｍＲＮＡの発現量を測定した。各ｍＲＮＡの発現量の測定は、TaqMan Gene Expression Assays及びABI Prism 7500 Sequence Detector（Applied Biosystems社）を用いて定量PCRにより行った。また、測定されたｍＲＮＡ発現量は、非投与群において測定された値に対する比の値（相対発現量）として表示した。
また、対照として、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー５０μｌを用いて、上記と同様の手法で肺内投与及び各炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量の測定を行った。
得られたＩＬ−６、ＴＮＦ−α、Ｃｏｘ−２及びＩＬ−１０のｍＲＮＡの相対発現量を、それぞれ図１２（ａ）〜（ｄ）に示す。Ｂ／Ｈ比０％（カチオン性ポリマー単独）の組成物を投与した個体では、いずれの炎症性サイトカインについても、対照群と比べて発現量が大幅に増加したのに対して、Ｂ／Ｈ比５０％の組成物及びＢ／Ｈ比１００％（ブロックコポリマー単独）の組成物を投与した個体では、いずれの炎症性サイトカインについても、その発現量は低く保たれていた。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明によれば、高い核酸導入効率を示すと同時に、細胞毒性が顕著に抑制された、優れた核酸送達用組成物及び核酸送達方法、並びにその担体組成物が提供される。かかる核酸送達用組成物及び担体組成物は、例えば核酸治療用の医薬組成物として好適に使用でき、その産業上の価値はきわめて高い。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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