(57)【要約】  下記構造式（Ａ）で表される化合物を含有するナンセンス変異により形成される未熟終止コドンのリードスルー誘導剤、前記リードスルー誘導剤を含有するナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬である。    【化５】2011096484.tif 000011
2011096484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（Ａ）で表される化合物を含有することを特徴とするナンセンス変異により形成される未熟終止コドンのリードスルー誘導剤。
【化４】
2011096484.tif 000010
【請求項２】
請求項１に記載のリードスルー誘導剤を含有することを特徴とするナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬。
【請求項３】
ナンセンス変異型遺伝性疾患が、筋ジストロフィーである請求項２に記載のナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナンセンス変異により形成される未熟終止コドンのリードスルー誘導剤、及びナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナンセンス変異型遺伝性疾患は、遺伝子上の点変異により形成される未熟終止コドンのためにタンパク質の発現が阻害されることに起因する疾患であり、例えば、筋ジストロフィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ−サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン−ピック病、マルファン症候群、癌、などが挙げられる。【０００３】
例えば、デュシャンヌ型筋ジストロフィーは、筋繊維鞘におけるジストロフィンタンパク質の欠如に起因する疾患である。当該疾患においては、Ｘ染色体中に存在する筋ジストロフィー遺伝子上に生じた変異により終止コドンが形成され（未熟終止コドン）、翻訳がその変異部位で中断・終了してしまうことにより正常なジストロフィン、及びジストロフィン関連タンパク質の発現が阻害され、結果としてジストロフィンタンパク質が欠如することとなる。【０００４】
このようなナンセンス変異型遺伝性疾患の治療方法として、リードスルー活性を有する化合物を用いる方法が模索されている。前記リードスルー活性とは、ナンセンス変異により未熟終止コドンが生じ特定のタンパク質が欠如している患者に特定の化合物を投与した際に、前記化合物がリボソームに作用し、リボソームが終止コドンを読み越えて翻訳を行うことをいう。そして、リードスルーの結果、野生型正常タンパク質が合成される。【０００５】
前記リードスルー活性を有する化合物としては、例えば、アミノグリコシド系抗生物質であるゲンタマイシン、ジペプチド系抗生物質であるネガマイシン、などが知られている。
ゲンタマイシンについては、Ｐｏｌｉｔａｎｏらが、デュシャンヌ型筋ジストロフィー患者へのゲンタマイシンの投与によりジストロフィンタンパク質の蓄積を確認している（例えば、非特許文献１参照）。また、嚢胞性線維症患者の気道上皮にゲンタマイシンを局所投与することにより、典型的な電気生理学的異常を正常化できることが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。更に、ゲンタマイシンの投与については、遺伝性疾患の療法として米国での臨床試験が行われている。しかしながら、ゲンタマイシンは、毒性が強く、長期的な服用が必要となるナンセンス変異型遺伝性疾患の患者にとって、十分な治療薬とは言えないという問題がある。
ネガマイシンについては、当該化合物を筋ジストロフィーモデルマウスに投与することによりジストロフィンの発現が回復することが確認されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、ネガマイシンは未承認の薬であり、早急に薬を要するナンセンス変異型遺伝性疾患の治療薬としては、現実的ではないという問題がある。
また、デュシャンヌ型筋ジストロフィーなどの薬剤として、リードスルー活性を有するアタルレン（ＰＴＣ１２４）の臨床試験が米国で行われている。しかしながら、現在フェーズＩＩＩで止まっており、早急に薬を要するナンセンス変異型遺伝性疾患の治療薬としては、現実的ではないという問題がある。【０００６】
したがって、毒性が弱く、リードスルー活性を有する化合物を含有するリードスルー誘導剤、及びナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の早急な開発が求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００２／１０２３６１パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｃｔａ．Ｍｙｏｌ．第２２巻、第１５〜２１頁、２００３年
【非特許文献２】Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３４９巻、第１４３３〜１４４１頁、２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、毒性が弱く、リードスルー活性を有する化合物を含有するリードスルー誘導剤、及び前記リードスルー誘導剤を含有するナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ＭＲＳＡ感染症の特効薬として使用されている下記構造式（Ａ）で表される化合物（以下、「アルベカシン」と称することがある。）が、優れたリードスルー活性を有することを見出し、本願発明を完成するに至った。
【化１】
2011096484.tif 000003
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記構造式（Ａ）で表される化合物を含有することを特徴とするナンセンス変異により形成される未熟終止コドンのリードスルー誘導剤である。
【化２】
2011096484.tif 000004
＜２＞  前記＜１＞に記載のリードスルー誘導剤を含有することを特徴とするナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬である。
＜３＞  ナンセンス変異型遺伝性疾患が、筋ジストロフィーである前記＜２＞に記載のナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬である。
＜４＞  ナンセンス変異型遺伝性疾患を有する個体を治療するための方法であって、前記＜１＞に記載のリードスルー誘導剤、及び前記＜２＞に記載のナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の少なくともいずれかを投与することを特徴とする方法である。
＜５＞  ナンセンス変異型遺伝性疾患が、筋ジストロフィーである前記＜４＞に記載の方法である。
＜６＞  前記＜１＞に記載のリードスルー誘導剤、及び前記＜２＞に記載のナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の少なくともいずれかの投与量が、前記構造式（Ａ）で表される化合物の量として、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜３００ｍｇ／ｋｇ／日である前記＜４＞から＜５＞のいずれかに記載の方法である。
＜７＞  前記＜１＞に記載のリードスルー誘導剤、及び前記＜２＞に記載のナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の少なくともいずれかの投与量が、前記構造式（Ａ）で表される化合物の量として、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である前記＜４＞から＜５＞のいずれかに記載の方法である。
＜８＞  ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療のために用いることを特徴とする前記＜１＞に記載のリードスルー誘導剤である。
＜９＞  ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療に有効な薬剤の製造のための前記＜１＞に記載のリードスルー誘導剤の使用である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、毒性が弱く、リードスルー活性を有する化合物を含有するリードスルー誘導剤、及び前記リードスルー誘導剤を含有するナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、正常マウスの抗ジストロフィン抗体による免疫染色像を示す。
【図２】図２は、正常マウスのヘマトキシリン及びエオジン染色像を示す。
【図３】図３は、生理食塩水のみを投与したｍｄｘマウスの抗ジストロフィン抗体による免疫染色像を示す。
【図４】図４は、生理食塩水のみを投与したｍｄｘマウスのヘマトキシリン及びエオジン染色像を示す。
【図５】図５は、ＡＢＫを投与したｍｄｘマウスの抗ジストロフィン抗体による免疫染色像を示す。
【図６】図６は、ＡＢＫを投与したｍｄｘマウスのヘマトキシリン及びエオジン染色像を示す。
【図７】図７は、試験例５におけるＢ１０マウス、アルベカシンを投与されたｍｄｘマウス、及びアルベカシンを投与されていないｍｄｘマウスの握力を測定した結果を示す図である。
【図８】図８は、試験例６におけるアルベカシンを投与されたｍｄｘマウス、及びアルベカシンを投与されていないｍｄｘマウスの腓腹筋強縮張力を測定した結果を示す図である。
【図９】図９は、試験例７におけるアルベカシンを投与（２．５ｍｇ／日、５ｍｇ／日）されたｍｄｘマウス、及びアルベカシンを投与されていないｍｄｘマウスの腓腹筋単収縮張力を測定した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、試験例８におけるウエスタンブロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（リードスルー誘導剤）
本発明のリードスルー誘導剤は、下記構造式（Ａ）で表される化合物を少なくとも含有し、必要に応じて更にその他の成分を含有してなる。
【化３】
2011096484.tif 000005
【００１５】
前記リードスルーとは、遺伝子上の点変異により１つの塩基が置換され、本来の翻訳終結部位より上流に未熟終止コドンが形成されている場合に、前記未熟終止コドンを読み越えて本来の翻訳終結部位まで翻訳を継続することをいう。前記未熟終止コドンをリードスルーすることにより、機能的な全長タンパク質を合成することができる。
【００１６】
＜構造式（Ａ）で表される化合物（アルベカシン）＞
前記アルベカシン（１−Ｎ−ＡＨＢジベカシン）は、ジベカシン（３’，４’−デオキシカナマイシンＢ）に４−アミノ−２−ヒドロキシブチリル（ＡＨＢ）基を付加したものであり、１９９０年末よりＭＲＳＡ感染症の特効薬として使用されている。
【００１７】
前記アルベカシンは、塩の状態であってもよいし、溶媒和物の状態であってもよい。
前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハロゲン化水素酸塩、無機酸塩、カルボン酸塩、アミノ酸塩、有機酸塩、などが挙げられる。これらの中でも、無機酸塩が好ましい。
前記ハロゲン化水素酸塩の具体例としては、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、などが挙げられる。
前記無機酸塩の具体例としては、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、炭酸塩、などが挙げられる。これらの中でも、硫酸塩が好ましい。
前記カルボン酸塩の具体例としては、酢酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ヒドロキシ酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、安息香酸塩、マンデル酸塩、酪酸塩、マレイン酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、リンゴ酸塩、などが挙げられる。
前記アミノ酸塩の具体例としては、アルギニン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、などが挙げられる。
前記有機酸塩の具体例としては、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、などが挙げられる。
【００１８】
前記溶媒和物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水和物、エタノール和物、などが挙げられる。
【００１９】
前記アルベカシンは、化学合成により合成したものを用いてもよいし、市販品を用いてもよい。
前記アルベカシンの合成方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、２６巻、１９７３年、４１２頁に記載の方法、などが挙げられる。
前記アルベカシンの市販品としては、例えば、ハベカシン（明治製菓株式会社製）、などが挙げられる。
また、前記アルベカシンの塩、及び前記アルベカシンの溶媒和物の製造方法としては、特に制限はなく、通常公知の方法を適宜選択することができる。
【００２０】
前記アルベカシンは、その誘導体であってもよい。
【００２１】
前記リードスルー誘導剤中の前記アルベカシンの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記リードスルー誘導剤は、前記アルベカシンそのものであってもよい。
【００２２】
＜その他の成分＞
前記リードスルー誘導剤中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容され得る担体などが挙げられる。
前記薬理学的に許容され得る担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。
前記リードスルー誘導剤中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、アルベカシンの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
＜使用＞
前記リードスルー誘導剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記リードスルー誘導剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用されてもよい。
【００２４】
前記リードスルー誘導剤は、アルベカシンを含むことから、後述する試験例１〜８に示されるように、毒性が弱く、優れたリードスルー活性を有するものである。
したがって、前記リードスルー誘導剤は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療に好適に利用可能である。
【００２５】
＜剤型＞
前記リードスルー誘導剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液状、粉末状、カプセル状、錠剤状、などの剤型とすることができる。これらの剤型の前記リードスルー誘導剤は、常法に従い製造することができる。
【００２６】
＜投与＞
前記リードスルー誘導剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記リードスルー誘導剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記リードスルー誘導剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。前記リードスルー誘導剤の投与量は、例えば、前記構造式（Ａ）で表される化合物（アルベカシン）の量として、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜３００ｍｇ／ｋｇ／日とすることができ、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日とすることが好ましい。
前記リードスルー誘導剤の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記リードスルー誘導剤の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、特にヒトが好適に挙げられる。
前記リードスルー誘導剤の投与は、事前に個体から採取した生体試料に含まれる遺伝子における未熟終止コドンの有無を検査し、未熟終止コドンが検出された個体に投与することが好ましい。前記未熟終止コドンの有無の検査方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、サザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、などが挙げられる。
【００２７】
（ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬）
本発明のナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬は、少なくとも前記リードスルー誘導剤を含有し、必要に応じて更にその他の成分を含有してなる。
【００２８】
＜ナンセンス変異型遺伝性疾患＞
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患とは、遺伝子上の点変異により１つの塩基が置換され、本来の翻訳終結部位より上流に未熟終止コドンが形成され、これにより、機能的な全長タンパク質の発現が阻害されることに起因する疾患である。
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患の具体例としては、筋ジストロフィー、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ−サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン−ピック病、マルファン症候群、癌、などが挙げられる。これらの中でも、筋ジストロフィー、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィーが好適に挙げられる。
【００２９】
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬中の前記リードスルー誘導剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬は、前記リードスルー誘導剤そのものであってもよい。
【００３０】
＜その他の成分＞
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容され得る担体などが挙げられる。
前記薬理学的に許容され得る担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、アルベカシンの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
＜使用＞
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用されてもよい。
【００３２】
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬は、前記リードスルー誘導剤を含むことから、後述する試験例１〜８に示されるように、毒性が弱く、優れたリードスルー活性を有するものである。
したがって、前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療に好適に利用可能である。
【００３３】
＜剤型＞
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液状、粉末状、カプセル状、錠剤状、などの剤型とすることができる。これらの剤型の前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬は、常法に従い製造することができる。
【００３４】
＜投与＞
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の投与量は、例えば、前記構造式（Ａ）で表される化合物（アルベカシン）の量として、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜３００ｍｇ／ｋｇ／日とすることができ、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日とすることが好ましい。
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、特にヒトが好適に挙げられる。
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬の投与は、事前に個体から採取した生体試料に含まれる遺伝子における未熟終止コドンの有無を検査し、未熟終止コドンが検出された個体に投与することが好ましい。前記未熟終止コドンの有無の検査方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、サザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、などが挙げられる。
【００３５】
（治療方法）
前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬は、前記リードスルー誘導剤を含有するので、ナンセンス変異型遺伝性疾患を有する個体に投与することにより、ナンセンス変異型遺伝性疾患を有する個体を治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬を投与することを特徴とする、ナンセンス変異型遺伝性疾患を有する個体を治療する方法にも関する。
【実施例】
【００３６】
以下に試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。【００３７】
（試験例１：リードスルー活性解析）
＜リードスルー活性検出用遺伝子導入マウスの作製＞
生体内でのリードスルー活性を解析するために、国際公開ＷＯ２００８／００４６１０号の段落〔００７１〕〜〔００８３〕に記載の方法と同様の方法により、リードスルー活性検出用遺伝子導入マウス（Ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｄｕａｌ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｉｃｅ、以下、「Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウス」と称することがある。)）を作製した。
前記Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウスは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子と、ルシフェラーゼ遺伝子とを連結し、その繋ぎ目に未熟終止コドン（ＴＧＡ）を挿入したコンストラクト（ｍｄｘマウスのエクソン２３の未熟終止コドン前後１２ｍｅｒ周辺配列を含む２７ｍｅｒ）を含む、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβーアクチンハイブリッドプロモーターを有する発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ）を生殖細胞系列に組み込んだものである。作出されたＲ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウスは，正常時はβ−ガラクトシダーゼのみが発現し、未熟終止コドンをリードスルーすることでルシフェラーゼを発現する。【００３８】
＜リードスルー活性の評価＞
同腹のＲ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウスのメス３組（８週齢を１組（７匹）、１０週齢を２組（各組５匹）に、下記表１に記載の投与化合物をそれぞれの投与量で、７日間連日皮下注射した。
前記投与化合物としては、アルベカシン（以下、「ＡＢＫ」と称することがある。）と、ゲンタマイシン（以下、「ＧＭ」と称することがある。）を用いた。
前記アルベカシンは、明治製菓株式会社より供与されたＡＢＫ原末を用いた。また、前記ゲンタマイシンは、比較として用いた。
投与は、前記投与化合物を生理食塩液（大塚製薬社製）で希釈し、０．１ｍＬを投与することにより行なった。
リードスルー効率は、７日間連日皮下注射した後、摘出した筋組織抽出液から、β−ガラクトシダーゼ活性と、ルシフェラーゼ活性とを、ルシフェリン−ガラクトシダーゼと、ルシフェリンとを用いてルミノメータにより測定し、前記測定したルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性で割った値とした。下記表１では、ゲンタマイシンを投与した場合のリードスルー効率を１とした相対的リードスルー効率で表記した。【００３９】
【表１】
2011096484.tif 000006
【００４０】
前記表１の結果から、アルベカシン（ＡＢＫ）は、リードスルー活性を有することが確認された。更に、従来、リードスルー活性を有することが知られているゲンタマイシン（ＧＭ）よりも、アルベカシンのリードスルー活性は、高いことが確認された。【００４１】
（試験例２：毒性試験）
１０週齢の同腹のＲ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウスをオス、メス１組（３匹）ずつ用い、下記表２に記載の投与量となるように、アルベカシン（ＡＢＫ）として、明治製菓株式会社より発売されているハベカシン（アルベカシン硫酸塩）注射液（５０ｍｇ／１ｍＬ）を生理食塩液（大塚製薬社製）で希釈し、０．２ｍＬを７日間連日皮下注射した。
毒性については、７日間連日皮下注射する前後の体重を測定し、体重増加率（６匹の平均値）により、判断した。
また、リードスルー効率は、試験例１と同様にして、β−ガラクトシダーゼ活性と、ルシフェラーゼ活性とを測定し、前記測定したルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性で割った値とした。下記表２では、生理食塩水のみを投与した場合のリードスルー効率を１とした相対的リードスルー効率で表記した。【００４２】
【表２】
2011096484.tif 000007
ＡＢＫの投与量７．５ｍｇ／日では、投与開始２日で１匹死亡（体重：１８．４ｇが１７．３ｇとなっていた。）し、投与開始３日で２匹死亡（体重：１匹は、２１．０ｇが１９．０ｇとなっており、もう１匹は、１９．３ｇが１８．２ｇとなっていた。）した。【００４３】
前記表２の結果から、アルベカシン（ＡＢＫ）は、７．５ｍｇ／日と大量の投与を行なった場合にはマウスが死亡したが、リードスルー活性が見られる２．５ｍｇ／日や、５ｍｇ／日の投与量では、体重の減少が少なく、毒性が弱いことが確認された。
また、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  （ＮＢ５４）  ｗｉｔｈ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｃａｕｓｉｎｇ  Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  Ｓｔｏｐ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２００９，  ５２，  ２８３６−２８４５、Ｆｕｊｉｓａｗａ，  Ｋ．；  Ｈｏｓｈｉｙａ，  Ｔ．；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，  Ｈ．，  Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．  ＶＩＩ．  Ａｃｕｔｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔ．  １９７４，  ２７，  ６７７−６８１、及び、Ｋｏｎｄｏ，  Ｓ．；Ｈｏｔｔａ，  Ｋ．，  Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  １９９９，  ５，  １−９の記載から、マウスにゲンタマイシンを静脈注射した場合のＬＤ５０（５０％  Ｌｅｔｈａｌ  Ｄｏｓｅ）は、およそ７６ｍｇ／ｋｇであるのに対し、マウスにアルベカシンを静脈注射した場合のＬＤ５０は、およそ１１８ｍｇ／ｋｇであることが示せ、この点からも、アルベカシンの毒性が弱いことがわかる。【００４４】
（試験例３：ジストロフィンの発現）
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるｍｄｘマウス（同腹のオス、メス、５ヶ月齢、ｎ＝８）に、明治製菓株式会社より供与されたＡＢＫ原末を生理食塩液（大塚製薬社製）で希釈し、１ｍｇ／０．１ｍＬとし、これを２週間連日皮下投与した。その後、大腿直筋を摘出し作製した凍結切片を、ウサギポリクローナル抗ジストロフィン抗体（ＡｂＣａｍ社製）を一次抗体として免疫染色を行った。
図１は、正常マウスの抗ジストロフィン抗体による免疫染色像を示し、図２は、正常マウスのヘマトキシリン及びエオジン染色像を示し、図３は、生理食塩水のみを投与したｍｄｘマウスの抗ジストロフィン抗体による免疫染色像を示し、図４は、生理食塩水のみを投与したｍｄｘマウスのヘマトキシリン及びエオジン染色像を示し、図５は、ＡＢＫを投与したｍｄｘマウスの抗ジストロフィン抗体による免疫染色像を示し、図６は、ＡＢＫを投与したｍｄｘマウスのヘマトキシリン及びエオジン染色像を示す。【００４５】
図１、及び図２に示されるように、正常マウスではジストロフィンが発現しており、筋組織の大きさが揃っていることがわかる。一方、図３、及び図４に示されるようにｍｄｘマウスでは、ジストロフィンが発現しておらず、筋組織の大きさが揃っていないことがわかる。
図５、及び図６に示されるように、アルベカシン（ＡＢＫ）を投与したｍｄｘマウスでは、ジストロフィンが発現しており、更に、筋組織の大きさが揃っていることがわかる。
したがって、アルベカシンが筋ジストロフィーの治療薬として有効であることが確認された。【００４６】
（試験例４：前肢の張力の測定）
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるｍｄｘマウス（同腹のオス、メス、５ヶ月齢、ｎ＝８）に、明治製菓株式会社より供与されたＡＢＫ原末を生理食塩液（大塚製薬社製）で下記表３の投与量となるように希釈して０．１ｍＬとし、これを２週間連日皮下投与し、２週間後に前肢の張力を測定した。
前記前肢の張力は、小動物握力測定装置（フォースゲージは、日本計測システム株式会社製）で測定した。
下記表３では、体重で補正した正常マウスの前肢の張力を１００とした相対的張力で表記した。【００４７】
【表３】
2011096484.tif 000008
【００４８】
前記表３の結果から、アルベカシン（ＡＢＫ）を投与することにより、ｍｄｘマウスの前肢の張力が回復することがわかった。したがって、アルベカシンが筋ジストロフィーの治療薬として有効であることが確認された。【００４９】
（試験例５：握力の測定）
試験には、（１）正常マウスであるＢ１０マウス（同腹のオス、メス、５ヶ月齢、ｎ＝９）と、（２）デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるｍｄｘマウス（同腹のオス、メス、５ヶ月齢、ｎ＝９）に、明治製菓株式会社より発売されているハベカシン（アルベカシン硫酸塩）注射液を生理食塩液（大塚製薬社製）で希釈したものを１ｍｇ／日で３週間連日皮下投与したマウスと、（３）デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるｍｄｘマウス（同腹のオス、メス、５ヶ月齢、ｎ＝８）とを用いた。
前記握力（Ｇｒｉｐ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の測定装置として、小動物用の握力測定装置を参考にして、市販のフォースゲージ（日本計測システム株式会社製）に縦７０ｍｍ、横５５ｍｍのステンレス製の金網を取り付けたものを作製した。このフォースゲージは、精度：±０．２％ＦＳ、繰り返し精度：±０．１％ＦＳ、最大１００Ｎ（１０ｋｇｆ）の測定が可能であり、０．０１Ｎ（１ｇｆ）の１／１００００の分解能力をもち、ピーク測定が可能である。
マウスの握力測定は以下の通りで行った。
マウスを測定用の網上に置き、尾を手で水平に引いた時、前記マウスが引かれた力に耐え切れず掴んだ網を離してしまうまでの最大の力（握力）を測定した。この握力測定は、２分間のインターバルを挟みながら、５回測定を行い、その平均値を算出した。なお、測定された握力は体重で除することにより標準化した。【００５０】
前記握力の測定結果を図７に示す。
図７中、「Ｂ１０」は正常マウスであるＢ１０マウス（前記（１））の結果を示し、「ｍｄｘ−ＡＢＫ」はアルベカシンを投与されたｍｄｘマウス（前記（２））の結果を示し、「ｍｄｘ」はアルベカシンを投与されていないｍｄｘマウス（前記（３））の結果を示す。
図７の結果から、アルベカシンを投与することにより、筋力の改善傾向がみられることが確認された。【００５１】
（試験例６：腓腹筋強縮張力の測定）
試験には、（１）デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるｍｄｘマウス（同腹のオス、４ヶ月齢）に、明治製菓株式会社より発売されているハベカシン（アルベカシン硫酸塩）注射液を生理食塩液（大塚製薬社製）で希釈したものを２．５ｍｇ／日で３週間連日皮下投与したマウスと、（２）デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるｍｄｘマウス（同腹のオス、４ヶ月齢）とを用いた。
前記腓腹筋強縮張力の測定は、パーソナルコンピューター、ＡＤ／ＤＡコンバーター、電極、フォースゲージにより構成される等尺性収縮張力測定システムを用い、以下のようにして行った。
まず、ネンブタール麻酔下でマウス下腿三頭筋を剖出し、下腿三頭筋の長さを測定した。
次に、アキレス腱を踵骨部で切り離して木綿糸で縛り、フォースゲージに装着した。同時に、電気刺激用の白金電極１本を膝の位置に挿入し、診断用神経筋電気刺激装置（日本光電工業株式会社製）により電気刺激を行った。
測定に際し、最大等尺性収縮張力が得られるように筋長（筋の長さ）や刺激電圧量を調整した。等尺性収縮張力は、筋横断面積（筋重量、筋長、密度１．０６ｍｇ／ｍｍ３より算出）により標準化した。
なお、下腿三頭筋表面の乾燥を防ぐために、表面に生理食塩水を塗布した。
前記腓腹筋強縮張力の測定は、最大単収縮張力を示す刺激電圧（０．５ｍｓ幅の短矩形波）の大きさと筋の長さで、振動数８０Ｈｚ〜１００Ｈｚ、２００ｍｓバーストで行った。なお、測定された発揮張力は、筋横断面積（筋重量、筋長、密度１．０６ｍｇ／ｍｍ３より算出）により標準化した。
刺激電圧の大きさ（０Ｖ〜２０Ｖ）と筋の長さを調節し、単発電気刺激で発生した、単収縮張力が最大になるようにした。なお、筋の長さの測定はマイクロメーターで行った。【００５２】
前記腓腹筋強縮張力（Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｅｎｓｉｏｎ）の測定結果を図８に示す。
図８中、「Ａ」はアルベカシンを投与されたｍｄｘマウスの結果を示し、「Ｂ」はアルベカシンを投与されていないｍｄｘマウスの結果を示す。
図８の結果から、アルベカシンを投与することにより、筋力の改善傾向がみられることが確認された。【００５３】
（試験例７：腓腹筋単収縮張力の測定）
試験には、（１）デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるｍｄｘマウス（同腹のオス、４ヶ月齢）に、明治製菓株式会社より発売されているハベカシン（アルベカシン硫酸塩）注射液を生理食塩液（大塚製薬社製）で希釈したものを２．５ｍｇ／日で３週間連日皮下投与したマウスと、（２）デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるｍｄｘマウス（同腹のオス、４ヶ月齢）に、明治製菓株式会社より発売されているハベカシン（アルベカシン硫酸塩）注射液を生理食塩液（大塚製薬社製）で希釈したものを５ｍｇ／日で３週間連日皮下投与したマウスと、（３）デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるｍｄｘマウス（同腹のオス、４ヶ月齢）とを用いた。
前記腓腹筋単収縮張力の測定は、短い幅の電気刺激を与えた以外は、前記腓腹筋強縮張力の測定と同様にして行った。【００５４】
前記腓腹筋単収縮張力（Ｔｗｉｔｃｈ  Ｔｅｎｓｉｏｎ）の測定結果を図９に示す。
図９中、「Ｃ」はアルベカシンを２．５ｍｇ／日で３週間連日皮下投与されたｍｄｘマウス（前記（１））の結果を示し、「Ｄ」はアルベカシンを５ｍｇ／日で３週間連日皮下投与されたｍｄｘマウス（前記（２））の結果を示し、「Ｅ」はアルベカシンを投与されていないｍｄｘマウスの結果を示す。
図９の結果から、アルベカシンを投与することにより、筋力の改善傾向がみられることが確認された。【００５５】
（試験例８：ＤＭＤ患者由来培養筋細胞におけるジストロフィンの発現）
＜筋細胞の培養＞
ナンセンス変異型デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者由来の筋細胞を２種類（＃９１９、＃８０９、いずれもＵＡＡナンセンス変異を有する患者由来の筋細胞）用い、以下のようにしてＤＭＤ患者由来培養筋細胞におけるジストロフィンの発現を試験した。
前記患者由来の筋細胞を、ゼラチンコートされた６ウエルプレート（ＩＷＡＫＩ）を用い、増殖培養液（２０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、４％  Ｕｌｔｒｏｃｅｒ  Ｇ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及び１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベッコ改変イーグル最少必須培養液（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ））中で増殖させた。
前記増殖させた細胞を筋管へ分化させるために、分化培養液（２％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベッコ改変イーグル最少必須培養液（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ））中で２週間培養した。前記培養において、２日に１度、培養液交換と、アルベカシン添加（４００μｇ／ｍＬ）とを行った。なお、アルベカシン無添加の場合は、培養液の交換のみを行った。前記アルベカシンは、明治製菓株式会社より発売されているハベカシン（アルベカシン硫酸塩）注射液の濃度を前記濃度に調整したものを使用した。【００５６】
＜ウエスタンブロット＞
前記培養終了後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄した後、１×Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で細胞を溶解し、回収した。前記回収した総タンパク質（アルベカシン無添加の細胞：６０μｇ、アルベカシンを添加した細胞：３０μｇ）を３−１０％のポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥＬ、アトー株式会社）に泳動した。前記泳動で分画されたタンパク質をＨＹＢＯＮＤ−Ｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にトランスファーした。
ウエスタンブロットは、ＥＣＬ  ａｄｖａｎｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、製造業者のマニュアルに従って行った。抗ジストロフィンＣ端抗体には、ＮＣＬ−ＤＹＳ２（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１０倍希釈したものを用い、ジストロフィンと抗ジストロフィン免疫複合体の検出には、抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。
また、同様にして、デスミン（Ｄｅｓｍｉｎ）についてのウエスタンブロットを行った。抗デスミン抗体は、Ｈ−７６（サンタクルズ社）を５０倍希釈したものを用い、デスミン−抗デスミン免疫複合体の検出には、抗ラビットＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。
前記ウエスタンブロットの結果を表４、及び図１０に示す。【００５７】
【表４】
2011096484.tif 000009
【００５８】
表４、及び図１０の結果から、ＵＡＡナンセンス変異をもつ患者由来の培養細胞２種（＃９１９、＃８０９）でジストロフィンの発現回復がみられた。未熟終止コドンの抑制によりジストロフィンタンパク質の発現を誘導することができることで、日常生活での筋収縮による筋損傷を軽減することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のリードスルー誘導剤は、アルベカシンを含有することにより、毒性が弱く、優れたリードスルー活性を有することから、ナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬として好適に利用できる。
また、前記アルベカシンは、ＭＲＳＡ感染症に対する治療薬として承認を得ているものであることから、本発明のナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬は、速やかな提供が強く求められているナンセンス変異型遺伝性疾患治療薬として、好適に利用できる。
【図１】
2011096484.tif 000012
【図２】
2011096484.tif 000013
【図３】
2011096484.tif 000014
【図４】
2011096484.tif 000015
【図５】
2011096484.tif 000016
【図６】
2011096484.tif 000017
【図７】
2011096484.tif 000018
【図８】
2011096484.tif 000019
【図９】
2011096484.tif 000020
【図１０】
2011096484.tif 000021
【国際調査報告】
2011096484.tif 000022
2011096484.tif 000023
2011096484.tif 000024
2011096484.tif 000025
2011096484.tif 000026
2011096484.tif 000027
2011096484.tif 000028