(57)【要約】  植物成長調整剤（ＫＯＤＡ）の製造に使用できる高活性アレンオキサイドシンターゼを提供する。
2011125785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）： 
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の同一性を有し、かつアレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；及び
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選ばれるＤＮＡからなる遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡとベクター断片とを結合させてなる発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを、宿主となる微生物、動物細胞又は植物細胞に導入してなる形質転換体。
【請求項４】
請求項３に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、アレンオキサイドシンターゼの製造方法。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｄ）： 
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質；及び
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の同一性を有するＤＮＡによりコードされ、かつアレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質；及び
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつアレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質
からなる群から選ばれるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アオウキクサ由来の新規のアレンオキサイドシンターゼ遺伝子、当該アレンオキサイドシンターゼ遺伝子の発現産物、並びに当該アレンオキサイドシンターゼ遺伝子を用いたアレンオキサイドシンターゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレンオキサイドシンターゼは、ヒドロペルオキシ化した脂肪酸をアレンオキサイドに変換する活性を有する酵素である。当該アレンオキサイドは不安定であるため、非酵素的にケトール体に変換される。アレンオキサイドシンターゼは、植物、動物及び酵母においてその存在が知られている。植物であれば被子植物全般において存在していると考えられており、例えば、大麦、小麦、トウモロコシ、綿、ナス、アマ（種等）、チシャ、エンバク、ホウレンソウ、ヒマワリ等においてその存在が認められている。植物においては、アレンオキサイドシンターゼは、害虫・傷害によるストレス応答におけるジャスモン酸生合成経路に寄与しており、１３−ヒドロキシペルオキシリノレン酸を、１２，１３−エポキシリノレン酸に変換することが一般に知られている（小澤理香, 蛋白質核酸酵素, 48(13) : 1786-1792, 2003）。【０００３】
本発明者らは、花芽形成促進作用、植物賦活作用、及びそれらを包含する植物成長調整作用を有する以下の構造：
【化１】
2011125785.tif 000003
を有するα-ケトール不飽和脂肪酸（以下、ＫＯＤＡと呼ぶ）を見出した（特開平９-２９５９０８号公報）。ＫＯＤＡは、以下のスキーム：
【化２】
2011125785.tif 000004
に従い植物体内で又は酵素的に生成される。すなわち、α-リノレン酸に９位生成物特異性リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）を反応させて９−ヒドロペルオキシリノレン酸を得て、続いて当該９−ヒドロペルオキシリノレン酸にアレンオキサイドシンターゼ（ＡＯＳ）を反応させることにより、９位のヒドロペルオキシ基を脱水してエポキシ基を形成させ、当該エポキシ化合物を非酵素的にケトール体に変換させることによりＫＯＤＡが生成する（特開平１１-２９４１０号公報、特開２００１-１３１００６号公報及び特開２００９-１７８２９号公報）。【０００４】
ＫＯＤＡはさまざまな植物種において存在することが知られていたが、ストレスを受けたアオウキクサ（Lemna paucicostata）が他の植物より極めて高いレベル（数百倍）のＫＯＤＡを放出することが知られていた（特開平１１-２９４１０号公報）。したがって、アオウキクサにおいては、他の植物のアレンオキサイドシンターゼに比べて活性の点で優れたアレンオキサイドシンターゼが存在することが推測されていた。しかしながら、アオウキクサからはアレンオキサイドシンターゼのｃＤＮＡは単離されておらず、配列も未知であった。【０００５】
ＫＯＤＡを、α-リノレン酸やリノール酸等を出発材料として酵素合成によって製造する際には、アレンオキサイドシンターゼが必須である。しかしながら、アレンオキサイドシンターゼは、一般に自殺基質的な性質を有するため、基質の濃度を上げた場合に、却ってＫＯＤＡ生成量の減少をもたらすことになり、ＫＯＤＡを酵素法により大量生産することは難しかった。したがって、高活性型のアレンオキサイドシンターゼの特定が望まれていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決すべき課題は、ＫＯＤＡの生成に有用なアレンオキサイドシンターゼを同定し、ｃＤＮＡを単離すること、当該ｃＤＮＡを組み込んだベクターを提供すること、当該ベクターを導入した形質転換体を提供すること、並びに当該形質転換体を用いてアレンオキサイドシンターゼ遺伝子の発現産物を提供すること、ひいては当該アレンオキサイドシンターゼを用いてＫＯＤＡやジャスモン酸などの化合物を酵素的に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題の解決を目的として鋭意検討を行い、他の植物の数百倍ものＫＯＤＡを放出するアオウキクサから新規アレンオキサイドシンターゼｃＤＮＡを単離するにあたり、より活性の高いアレンオキサイドシンターゼｃＤＮＡを得るため、アオウキクサ株をＫＯＤＡ生産能についてスクリーニングを行った。具体的には、６２種類のアオウキクサ株のスクリーニングを行ったところ、驚くべきことにアオウキクサＳＨ株が、他のアオウキクサ株の平均の１２倍以上のＫＯＤＡ生産能を有することを発見した（図１）。【０００８】
本発明者らは、アオウキクサＳＨ株からアレンオキサイドシンターゼｃＤＮＡを単離し、ベクターに組み込んで、当該ベクターを大腸菌に導入してアレンオキサイドシンターゼのタンパク質の発現を行い、当該アレンオキサイドシンターゼタンパク質の活性を試験した。アオウキクサＳＨ株由来のアレンオキサイドシンターゼは、従来使用されていたシロイヌナズナのアレンオキサイドシンターゼよりも高い活性を有することを明らかにした（図４）。【０００９】
そこで、本発明者らは、アオウキクサＳＨ株に由来する新規アレンオキサイドシンターゼ遺伝子及び当該遺伝子によりコードされるタンパク質を提供する。具体的に、本発明は、配列番号１に表される塩基配列のＤＮＡからなる遺伝子、及び当該ＤＮＡと実質的に同一なＤＮＡからなる遺伝子、並びにこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質を提供する。さらに、本発明者らは、上記ＤＮＡとベクター断片とを結合させてなる発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、当該発現ベクターが形質転換された微生物、動物細胞又は昆虫細胞などの形質転換体にも関する。本発明に係るアレンオキサイドシンターゼは、上記形質転換体を培養し、当該形質転換体を回収し、当該形質転換体からアレンオキサイドシンターゼを抽出し、そして精製することにより得られる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るアオウキクサＳＨ株由来のアレンオキサイドシンターゼは、従来使用されていたアレンオキサイドシンターゼに比較して活性が高いことが示された（図３）。この高い活性は、一般に知られているアレンオキサイドシンターゼが有する自殺基質的性質を有さないことに起因していると考えられる。したがって、本発明に係るアレンオキサイドシンターゼを用いることにより、α-リノレン酸やリノール酸等を出発材料とする酵素的合成法において、ＫＯＤＡを始めとするα-ケトール不飽和脂肪酸を効率よく製造することが可能になる。また、アレンオキサイドシンターゼは、ジャスモン酸生合成経路にも寄与するため、ジャスモン酸を効率よく製造することも可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、６２種のアオウキクサ株におけるＫＯＤＡ生産量を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、アオウキクサＳＨ株のアレンオキサイドシンターゼ遺伝子の核酸配列とアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａの配列の続きを示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２Ｂの配列の続きを示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、シロイヌナズナＡＯＳを用いたＫＯＤＡ生成のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＳＨＬｐＡＯＳを用いたＫＯＤＡ生成のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図４】図４は、大腸菌において発現されたＳＨ株由来アレンオキサイドシンターゼ（ＳＨＬｐＡＯＳ）、及びコントロールとして用いたシロイズナズナのアレンオキサイドシンターゼ（ＡｔＡＯＳ）のアレンオキサイドシンターゼ活性を比較する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について説明する。本発明は、アオウキクサＳＨ株に由来する新規アレンオキサイドシンターゼ遺伝子及び当該遺伝子によりコードされるタンパク質に関する。具体的に、本発明は、配列番号１で表される塩基配列のＤＮＡ、及び当該ＤＮＡと実質的に同一なＤＮＡからなる遺伝子に関する。さらに、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子、並びに当該アミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子にも関する。さらに、本発明は上記ＤＮＡの断片であって、アレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片にも関する。
【００１３】
「実質的に同一なＤＮＡ」とは、参照元のＤＮＡと塩基配列において少なくとも７０％の同一性を有するＤＮＡをいう。この同一性は、好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．９％である。さらに、「実質的に同一なＤＮＡ」は、参照元のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡのこともいう。これらの「実質的に同一なＤＮＡ」は、転写、翻訳された場合には、参照元のＤＮＡがコードするタンパク質と同じ酵素活性、すなわちアレンオキサイドシンターゼ活性を有する。
【００１４】
ハイブリダイゼーションは周知の方法又はそれに準じる方法、例えばJ.Sambrookら、Molecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法に従って行うことができ、そして高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えばＮａＣｌ濃度が約１０〜４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃である条件をいう。
【００１５】
本発明はさらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、並びに当該アミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。さらに、本発明は、配列番号１で表される塩基配列のＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと実質的に同一なＤＮＡによりコードされ、かつアレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質にも関する。さらに、本発明は上記タンパク質の断片であって、アレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質断片にも関する。
【００１６】
「実質的に同一なアミノ酸配列からなるタンパク質」とは、参照元のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ参照元のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性、すなわちアレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質をいう。さらに、「実質的に同一なアミノ酸配列からなるタンパク質とは、参照元のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列からなり、かつアレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質をいう。同一性は、好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．９％である。
【００１７】
本明細書において配列番号１は、アオウキクサＳＨ株由来のアレンオキサイドシンターゼの塩基配列を表し、配列番号２は当該アレンオキサイドシンターゼのアミノ酸配列を表す。これらの具体的な配列を図２Ａ〜Ｃに示す。
【００１８】
アレンオキサイドシンターゼ活性とは、ヒドロペルオキシ化された脂肪酸をアレンオキサイドに変換する酵素活性を意味する。
【００１９】
本発明でいうアレンオキサイドシンターゼ又はアレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質とは、例えば後述の活性測定法によりアレンオキサイドシンターゼ活性を有することの認められたものをいう。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するアレンオキサイドシンターゼの活性と比較し、例えば少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の活性を有するもの、更には１００％以上、例えば１１０％以上、１２０％以上、１５０％以上、２００％以上の活性を有するものを包含する。
【００２０】
本発明の遺伝子（ｃＤＮＡ）は、例えば以下の手順で得ることができる。植物由来のアレンオキサイドシンターゼに共通したアミノ酸配列からプライマーを設計し、ＲＴ-ＰＣＲ等を行って、ｃＤＮＡ断片を得る。この断片を必要に応じて32Ｐまたはジゴキシゲニン等でラベルし、これを用いて５'-ＲＡＣＥまたは３'-ＲＡＣＥ、あるいは作製したｃＤＮＡライブラリーを用いて常法によりスクリーニングを行い、アレンオキサイドシンターゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）全長を得ることができる。塩基配列の決定は、サンガー法やマキサム-ギルバート法等の一般的方法によって行うことができる。
【００２１】
別法としては、アオウキクサ由来アレンオキサイドシンターゼを、硫安分画や各種クロマトグラフィー等の手段を用いて精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜等に電気的に転写し、クマシーブリリアントブルー等の色素で検出されるバンドを切り出した後、プロテインシークエンサーにより、Ｎ末端アミノ酸配列を決定し、この配列を元にプライマーを設計して、上述の方法に準じてＰＣＲを行うことによりアレンオキサイドシンターゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）全長を得ることができる。
【００２２】
単離した遺伝子（ｃＤＮＡ）は例えばプラスミド、ウィルス等に周知の方法により挿入して発現ベクターを調製し、これを宿主細胞、例えば微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等の培養細胞に導入して発現させることにより、当該タンパク質を大量調製することが可能である。さらに、タンパク質発現系として、例えば小麦胚芽抽出物を用いる無細胞タンパク質発現系が使用されることもある。
【００２３】
ベクターとしては、大腸菌（Escherichia coli）由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来のプラスミド、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、酵母由来プラスミド、例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス等の動物ウィルスの他、ｐＡ１-１１、ｐＸＴ１、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ｐＲＣ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられるがこれらに限定されるものではない。本発明においては市販のベクター、pET41a（Novagen）を用いることができる。
【００２４】
本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターは、本発明に係る遺伝子を適当なベクターのプロモーターの下流に、適当な制限部位を介して周知の方法で連結することにより製造できる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に制限されない。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーター、β-アクチンプロモーター等が挙げられる。宿主が大腸菌等のエシェリヒア属の細菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター等、宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎプロモーター、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等を用いるのが好ましい。宿主が昆虫の場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター等が好ましい。所望により、発現ベクターには更にエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点、等を含んでよい。
【００２５】
宿主細胞には、組換タンパク質を産生するための宿主として従来から利用されている原核又は真核細胞のいずれでもよく、例えば限定することなく、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞であり、そして好ましくは細菌又は真菌などの微生物である。「真菌」なる語は糸状菌及び酵母を包含することを意図する。適当な細菌の例は、エシェリヒア（Escherichia）属、例えば大腸菌、バチルス属、例えばバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、例えばストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）等のグラム陽性菌、シュードモナス（Pseudomonas）属、例えばシュードモナス・セパシア（P. cepacia）等のグラム陰性菌が挙げられる。また、この細胞は真菌、即ち酵母又は糸状菌の細胞であってもよい。酵母は例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）属の細胞、例えばＳ．セレビジエ（S. cerevisiae）であってよい。糸状菌宿主生物は例えばアスペルギルス（Aspergillus）種の株、例えばＡ．ニガー（A. niger）であってよい。昆虫細胞としては、例えばＳｆ細胞、ＭＧ１細胞、ＢｍＮ細胞等が挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細胞ＣＯＳ-７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ等が挙げられる。本発明においては大腸菌細胞を利用するのが特に好ましい。
【００２６】
宿主細胞の形質転換は周知の方法、例えば塩化カルシウム法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチン法、プロトプラストポリエチレン融合法、エレクトロポレーション法等が利用でき、利用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい。
【００２７】
得られる組換宿主細胞を適当な培養培地で培養し、培養液から、慣用の手順、例えば限定することなく、遠心又はろ過により培養液から細胞を分離させ、必要に応じて細胞を破壊し、硫酸アンモニウム等の塩により上清液又は濾液のタンパク質性成分を沈殿させ、次いで様々なクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を行うことにより目的のタンパク質を回収することができる。目的タンパク質の回収を達成するために、タグ配列を含むベクターを用いることもできる。タグとしては、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグなどが挙げられる。
【００２８】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの上流に分泌のための微生物用又は動物用の適当なシグナル配列を接続すれば、当該タンパク質を培地中に分泌発現させることもできる。このような分泌型に改変したＤＮＡは、培地中に分泌した当該タンパク質の精製を容易にする点で有用である。かかるシグナル配列の例としては、大腸菌の場合ｐｅｌＢシグナル（S.P.Lei ら、J. Bacteriology, 169:4379-4383, 1987）、酵母の場合α因子シグナル（A.J. Brake, Yeast Genetic Engineering, p269 Butterworth, 1989）、動物細胞の場合イムノグロブリンのシグナルＳＧ-１（H.Maedaら、Hum. Antibod. Hybridomas, 2:124-134, 1991）、Ｃ２５のシグナル（ＷＯ９４／２０６３２）等が挙げられる。
【００２９】
アレンオキサイドシンターゼ活性の測定は、α−リノレン酸に９位生成物特異性リポキシゲナーゼを作用させ、続いて酵素生成物である９−ヒドロキシペルオキシリノレン酸（９−ＨＰＯＴ）に一定量のアレンオキサイドシンターゼを加えることにより、ＫＯＤＡを生成し、生成されたＫＯＤＡをＨＰＬＣにより定量的に分析することによって行うことができる。
【００３０】
本発明にかかるタンパク質は、例えば種々のリノール酸、リノレン酸誘導体等の合成に利用するための試薬として有用であり得る。具体的に、本発明に係るタンパク質は、植物成長調整剤として有用なα-ケトール不飽和脂肪酸、特にＫＯＤＡを、リノール酸やリノレン酸から酵素的に合成する場合に使用する酵素として有用である。また、本発明の遺伝子を植物体に導入することで、植物体内に存在するリノール酸やリノレン酸のアレンオキサイドシンターゼによる代謝をコントロールすることも可能になると考えられる。
【００３１】
以下、実施例により、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例等により、本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【実施例】
【００３２】
実施例１：ＫＯＤＡ高生産アオウキクサ株のスクリーニング
様々な場所から採取された６２種類のアオウキクサを準備し、１／２倍に稀釈したＨｕｔｎｅｒの培地中において、２４〜２５℃の昼光色蛍光ライトからの連続的な光照射の下で継代培養した。１／２倍に稀釈したＨｕｔｎｅｒの培地は、次の成分：
スクロース                          １０ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4                      ２００ｍｇ／ｌ
ＮＨ4ＮＯ3                      １００ｍｇ／ｌ
ＥＤＴＡ遊離酸                  ２５０ｍｇ／ｌ
Ｃａ（ＮＯ3）・４Ｈ2Ｏ          １７６ｍｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ              ２５０ｍｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ            １２．４ｍｇ／ｌ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ            ８．９２ｍｇ／ｌ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ            ３２．８ｍｇ／ｌ
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ         １２．６ｍｇ／ｌ
Ｈ3ＢＯ3                        ７．１ｍｇ／ｌ
Ｃｏ（ＮＯ3）・６Ｈ2Ｏ          ０．１ｍｇ／ｌ
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ            １．９７ｍｇ／ｌ
を含み、ＫＯＨ（５０％）を用いてｐＨ６．２〜６．５に調整した。【００３３】
増殖したアオウキクサをろ紙上に広げ、２時間放置した後、水中に１時間浸漬した。その水を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；カラム：TYPE UG120 5μm SIZE 4.6mm I.D×250mm；ガードフィルター：INERTSTL 4.6mm×50mm；溶離液：50%アセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸；条件：吸光度の波長210λ（nm）、流速1mL/min、カラム温度40℃）でＫＯＤＡの濃度を分析した。全てのアオウキクサ株のＫＯＤＡ生産量の平均は４．９７μＭであった。その中で、アオウキクサＳＨ株は６０．２μＭのＫＯＤＡを生産しており、全株の平均ＫＯＤＡ生産量の約１２倍も多く、極めて高い生産量を与えた（図１）。【００３４】
実施例２：アオウキクサ株由来アレンオキサイドシンターゼのクローニングとその活性測定
アオウキクサＳＨ株（Lemna paucicostata, SH）から RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）を用い、全ＲＮＡを抽出し、1.8μg の全ＲＮＡから、LongRange  ２Step  RT−PCR Kit（Qiagen）を用いＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを、以下に示すシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来プライマーを使用し、ＰＣＲのアニーリング温度を４５℃と低めに設定し、ＳＨ株由来アレンオキサイドシンターゼ（ＳＨＬｐＡＯＳ）の一部配列情報を得た。
AOS-Forward     5’-GGA ACT AAC CGG AGG CTA CCG-3’（配列番号３）
AOS-Reverse     5’-CCG TCT CCG GTC CAT TCG ACC ACA A-3’（配列番号４）【００３５】
この配列情報をもとに、３’または５’ＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA end）により全長配列を決定した。
３’-ＲＡＣＥ用プライマー
SH-3’-TP：5’-TCTGGGCAGACTCTTCTTTGGAG-3’（配列番号５）
５’-ＲＡＣＥ用プライマー
SH-5’-TP：5’-CCGGCTTGCGCTATATATCTGAGAATT-3’（配列番号６）
３’−ＲＡＣＥ
上記実験で得られたＳＨ株の全ＲＮＡ２μｇを鋳型として、CapFishingTM target full-length cDNA cloning Kit（Seegene）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型溶液として、キット内アダプタープライマー（３’−ＲＡＣＥプライマー）とＳＨ−３’−ＴＰとそれぞれＰＣＲを行った。
５’−ＲＡＣＥ
上記実験で得られたＳＨ株の全ＲＮＡ２μｇを鋳型として、CapFishingTM target full-length cDNA cloning Kit（Seegene）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型溶液として、キット内アダプタープライマー（５’−ＲＡＣＥプライマー）とＳＨ−５’−ＴＰとそれぞれＰＣＲを行った。【００３６】
ＰＣＲ産物の配列を決定し、以下に示すプライマーと前述のｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡの全配列をｐＴＡＣ−２ベクター（BioDynamics）にサブクローニングした。尚、発現ベクターに挿入するために、5’側にＮｃｏＩ、3’側にＸｈｏＩサイトをそれぞれ付加した。
SHAOS-F: 5’-CCGCGCCATGGAGAAGAGAATGTCTGTCTCGC-3’（配列番号７）
SHAOS-R: 5’-CCGCGCTCGAGGTTGAATAAGCACGAGTGT-3’（配列番号８）
この結果、ＳＨ株より１配列の新規ＡＯＳホモログ（核酸配列１４４３ｂｐ、アミノ酸配列４８０ａａ、推定分子量５３．３ＫＤａ）が得られた（図２Ａ−Ｃ）。このアオウキクサＳＨ株より得られたアレンオキサイドシンターゼをＳＨＬｐＡＯＳと名付けた。【００３７】
上記の方法でｐＴＡＣ−２ベクターに組み込んだ、ＳＨＬｐＡＯＳ配列を、それぞれＮｃｏＩ、ＸｈｏＩで切断した後に、市販のタンパク質発現用ベクターpET41a（Novagen）に導入し、アオウキクサ・アレンオキサイドシンターゼ発現用プラスミドｐＥＴ４１ａ／ＳＨＬｐＡＯＳを得た。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Novagen）に形質転換した。そして、３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地３ｍｌに植菌し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩振盪培養した。この培養液を同濃度のカナマイシンと１%グルコースを含むＬＢ培地１０ｍｌに対して１００μｌ添加し、３７℃、２５０ｒｐｍで３〜４時間振盪培養した。この培養液２５ｍｌから遠心分離にて菌体を回収し、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（和光純薬）、３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＴＢ培地５０ｍｌに移し、２５℃、２５０ｒｐｍで一晩振盪培養し、アレンオキサイドシンターゼの誘導を行った。培養終了後、遠心分離を行い、菌体湿重量１ｇに対し、５ｍｌのBugBusterTM（Novagen）を加え、菌体を溶解した。その後遠心分離を行い（９，０００ｒｐｍ、５分、４℃）、上清を回収し、酵素液とした。この酵素液を用いてＫＯＤＡ製造における活性試験を行った。【００３８】
ＫＯＤＡ製造における活性試験は、５ｍＭリノレン酸溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液に溶解）を作成し、ｐＨ７の条件下で、イネの胚芽より抽出したリポキシゲナーゼと室温で１０分間反応させ、９−ヒドロキシペルオキシリノレン酸（９−ＨＰＯＴ）溶液を合成した。この９−ＨＰＯＴ反応溶液２０μｌに対し、ＳＨＬｐＡＯＳタンパク質又はシロイヌナズナ由来ＡＯＳ（ＡｔＡＯＳ）タンパク質０．３２ｎｇを加え、室温で１０分間反応させた。反応後、５０℃で３分間の加熱処理により反応を終了させた。１０μｌのこの溶液をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析は、カラム：カプセルパックＣ−１８  ＵＧ１２０（４．６×２５０ｍｍ、資生堂）、カラム温度：４０℃、移動相：５０％アセトニトリル溶液（０．０２％ＴＦＡ）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍで行った。当該HPLCの結果を図３（Ａ，Ｂ）に示す。HPLCチャートに示すように、ＫＯＤＡのピークが確認され、アオウキクサＳＨ株由来のアレンオキサイドシンターゼはＫＯＤＡ製造に利用可能であることが示された。また、ＳＨＬｐＡＯＳタンパク質はＡｔＡＯＳタンパク質より７倍近く活性が強かった（図４）。【００３９】
アオウキクサＳＨ株より得られたＳＨＬｐＡＯＳのカイネティクス解析を行った。４０ｍＭＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、１％ＥｔＯＨの反応液を用い、反応温度は２５℃で行った。基質である９−ＨＰＯＴは５〜５３μＭの基質濃度で試験した。なお、基質となる９−ＨＯＰＴはＥｔＯＨ溶液として添加し、ＥｔＯＨ終濃度が１％となるように調製した。反応液１００μＬをキュベットに加えＳｍａｒｔＳｐｅｃ  Ｐｌｕｓスペクトロフォトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、２３４ｎｍの吸光度の減少を、２秒のインターバルで経時的に１分間スキャニングした。測定したＡ234から反応産物の量を算出した（ｅ＝２５，０００）。カイネティックパラメーターはＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット（［Ｓ］／ｖ  ｖｅｒｓｕｓ  ［Ｓ］プロット）を用いて決定した。この結果、表１に示すようにＳＨＬｐＡＯＳでは、Ｋｍ値がＡｔＡＯＳより大幅に低く、９−ＨＰＯＴとの親和性は約５倍高かった。また、ＶmaxはＡｔＡＯＳの約２．８倍と非常に高かった。ｋcat値もＳＨＬｐＡＯＳのほうがＡｔＡＯＳの約２．８倍と高いものであり、反応回転が非常に効率的に起こっている。ｋcat／Ｋm値は、ＳＨＬｐＡＯＳがＡｔＡＯＳの約１４倍となった。ＳＨＬｐＡＯＳがＡｔＡＯＳと比較して、実用的なＫＯＤＡ製造において非常に有用なＡＯＳであると考えられる。以上のことから、アオウキクサＳＨ株からクローニングしたＳＨＬｐＡＯＳは、これまでに報告のない、非常に高い活性を有するＡＯＳであることが明らかとなった。【００４０】
【表１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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