(57)【要約】  画像処理プログラム（ＧＰ）は、撮像装置により所定時間を隔てて細胞塊が撮影された時系列画像を取得するステップＡ１０と、取得した時系列画像から細胞塊の複層化に関する特徴量を順次算出するステップＡ２０と、算出された複層化に関する特徴量の時系列変化を導出するステップＡ３０と、導出された複層化特徴量の時系列変化を出力するステップＡ４０とを備えて構成される。
2011013319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
撮像装置により所定時間を隔てて細胞塊が撮影された時系列画像を取得し、
取得した前記時系列画像から細胞塊の複層化に関する特徴量を順次算出し、算出された前記複層化に関する特徴量の時系列変化を導出して、
前記複層化に関する特徴量の時系列変化に基づいて前記細胞塊の成熟度を判定することを特徴とする細胞塊の成熟判定手法。
【請求項２】
前記複層化に関する特徴量は、前記時系列画像における時刻ｔの第１画像と時刻ｔ＋１第２画像とについて、前記第１画像の細胞塊の局所領域の輝度分布をテンプレートとし、前記第２画像の細胞塊の対応位置を含む近傍部について輝度分布のブロックマッチングを行って算出された最もマッチングの高い位置領域の近似度に基づく統計量であることを特徴とする請求項１に記載の細胞塊の成熟判定手法。
【請求項３】
前記複層化に関する特徴量は、前記細胞塊の輪郭付近の輝度値に基づく統計量であることを特徴とする請求項１に記載の細胞塊の成熟判定手法。
【請求項４】
前記複層化に関する特徴量は、前記細胞塊の輪郭形状に基づく統計量であることを特徴とする請求項１に記載の細胞塊の成熟判定手法。
【請求項５】
コンピュータにより読み取り可能であり、撮像装置により撮影された画像を取得して画像処理する画像処理装置としてコンピュータを機能させるための画像処理プログラムであって、
撮像装置により所定時間を隔てて細胞塊が撮影された時系列画像を取得するステップと、
取得した前記時系列画像から細胞塊の複層化に関する特徴量を順次算出するステップと、
算出された前記複層化に関する特徴量の時系列変化を導出するステップと、
導出された前記複層化に関する特徴量の時系列変化の情報を出力するステップとを備えたことを特徴とする画像処理プログラム。
【請求項６】
前記複層化に関する特徴量は、前記時系列画像における時刻ｔの第１画像と時刻ｔ＋１の第２画像とについて、前記第１画像の細胞塊の局所領域の輝度分布をテンプレートとし、前記第２画像の細胞塊の対応位置を含む近傍部について輝度分布のブロックマッチングを行って算出された最もマッチングの高い位置領域の近似度に基づく統計量であることを特徴とする請求項５に記載の画像処理プログラム。
【請求項７】
前記複層化に関する特徴量は、前記細胞塊の輪郭付近の輝度値に基づく統計量であることを特徴とする請求項５に記載の画像処理プログラム。
【請求項８】
前記複層化に関する特徴量は、前記細胞塊の輪郭形状に基づく統計量であることを特徴とする請求項５に記載の画像処理プログラム。
【請求項９】
前記複層化に関する特徴量の時系列変化の情報に基づいて前記細胞塊の成熟度を判定し、判定結果を出力するステップを備えたことを特徴とする請求項５〜８のいずれか一項に記載の画像処理プログラム。
【請求項１０】
前記時系列画像に複数の細胞塊が含まれる場合において、
前記成熟度情報を出力するステップは、細胞塊ごとに成熟度を判定するとともに、成熟した細胞塊と未成熟の細胞塊とに分別し、分別結果を出力するように構成されることを特徴とする請求項９に記載の画像処理プログラム。
【請求項１１】
撮像装置により所定時間を隔てて細胞塊が撮影された時系列画像を取得して画像を解析する画像解析部と、前記画像解析部による解析結果を出力する出力部とを備えた画像処理装置であって、
前記画像解析部は、前記時系列画像から細胞塊の複層化に関する特徴量を順次算出し、算出された前記複層化に関する特徴量の時系列変化を導出して、
前記出力部が、前記画像解析部により導出された前記複層化に関する特徴量の時系列変化の情報を出力するように構成したことを特徴とする画像処理装置。
【請求項１２】
前記複層化に関する特徴量は、前記時系列画像における時刻ｔの第１画像と時刻ｔ＋１の第２画像とについて、前記第１画像の細胞塊の局所領域の輝度分布をテンプレートとし、前記第２画像の細胞塊の対応位置を含む近傍部について輝度分布のブロックマッチングを行って算出された最もマッチングの高い位置領域の近似度に基づく統計量であることを特徴とする請求項１１に記載の画像処理装置。
【請求項１３】
前記複層化に関する特徴量は、前記細胞塊の輪郭付近の輝度値に基づく統計量であることを特徴とする請求項１１に記載の画像処理装置。
【請求項１４】
前記複層化に関する特徴量は、前記細胞塊の輪郭形状に基づく統計量であることを特徴とする請求項１１に記載の画像処理装置。
【請求項１５】
前記画像解析部は、前記複層化に関する特徴量の時系列変化の情報に基づいて前記細胞塊の成熟度を判定し、前記出力部は、前記画像解析部により判定された判定結果を出力することを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の画像処理装置。
【請求項１６】
前記時系列画像に複数の細胞塊が含まれる場合において、
前記画像解析部は、細胞塊ごとに成熟度を判定するとともに、成熟した細胞塊と未成熟の細胞塊とに分別し、前記出力部は、前記画像解析部により分別された分別結果を出力することを特徴とする請求項１５に記載の画像処理装置。
【請求項１７】
細胞を培養する培養ステップと、
前記培養ステップにおいて培養される細胞を、請求項１１〜１６のいずれかに記載の画像処理装置を用いて観察し、培養により変化する前記細胞における細胞塊の成熟度を判別する判別ステップと、
を備えることを特徴とする細胞塊の製造方法。
【請求項１８】
細胞を培養する培養ステップと、
前記培養ステップにおいて培養される細胞を、撮像装置により所定時間を隔てて撮影し、培養により変化する前記細胞における細胞塊の時系列画像を取得する取得ステップと、
前記取得ステップにおいて取得した前記時系列画像から細胞塊の複層化に関する特徴量を順次算出し、算出された前記複層化に関する特徴量の時系列変化を導出する導出ステップと、
前記導出ステップにおいて導出された前記複層化に関する特徴量の時系列変化に基づいて前記細胞塊の成熟度を判定する判定ステップと、
を備えることを特徴とする細胞塊の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞観察において取得された時系列画像から細胞塊の成熟度を判定する成熟判定手法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞を培養しながら観察する装置の一例として培養顕微鏡が挙げられる。培養顕微鏡は、細胞の培養に好適な環境を形成する培養装置と、培養容器内の細胞を顕微観察する顕微観察系とを備え、生きた細胞を培養しながら、細胞の変化や分裂などを観察できるように構成される（例えば特許文献１を参照）。生細胞の培養過程において、細胞分裂の進行や細胞同士の統合により細胞塊が形成される。平面培養の初期過程では、細胞が単層状態で培地内を水平方向に広がるが、細胞分裂が活発化して細胞塊が成長してくると、細胞が泡立つように上下方向にも広がり、いわゆる複層化が進行する。【０００３】
培養顕微鏡を用いた従来の細胞観察手法では、細胞塊の成熟度について、顕微観察画像を目視観察して判定する目視判定や、試薬を投与して細胞分裂の活発度等を検出し成熟度合いを判定する試薬判定により行っていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２２９６１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来行われてきた目視判定の手法では、一定の経験を有する知見者が時間をかけて観察する必要があるとともに、細胞塊の成熟度を定量的に評価・判断することが困難であり、十分な再現性や信頼性が得られないという課題があった。また、試薬判定の手法では、試薬の投与により細胞に与える化学的・物理的影響や、培養された細胞を利用する際の制約が大きいという課題があった。【０００６】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、細胞に試薬投与によるダメージを与えることなく、撮像装置により撮影された時系列画像から細胞塊の成熟度を判断可能な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明を例示する第１の態様に従えば、撮像装置により所定時間を隔てて細胞塊が撮影された時系列画像を取得し、取得した時系列画像から細胞塊の複層化に関する特徴量を順次算出し、算出された複層化に関する特徴量の時系列変化を導出して、複層化に関する特徴量の時系列変化に基づいて細胞塊の成熟度を判定することを特徴とする細胞塊の成熟判定手法が提供される。【０００８】
本発明を例示する第２の態様に従えば、コンピュータにより読み取り可能であり、撮像装置により撮影された画像を取得して画像処理する画像処理装置としてコンピュータを機能させるための画像処理プログラムであって、撮像装置により所定時間を隔てて細胞塊が撮影された時系列画像を取得するステップと、取得した時系列画像から細胞塊の複層化に関する特徴量を順次算出するステップと、算出された複層化に関する特徴量の時系列変化を導出するステップと、導出された複層化に関する特徴量の時系列変化の情報を出力するステップとを備えて画像処理プログラムが提供される。【０００９】
本発明を例示する第３の態様に従えば、撮像装置により所定時間を隔てて細胞塊が撮影された時系列画像を取得して画像を解析する画像解析部と、画像解析部による解析結果を出力する出力部とを備えて画像処理装置が構成される。この画像処理装置において、前記画像解析部は、時系列画像から細胞塊の複層化に関する特徴量を順次算出し、算出された複層化に関する特徴量の時系列変化を導出して、前記出力部が、画像解析部により導出された複層化に関する特徴量の時系列変化の情報を出力するように構成される。【００１０】
なお、以上の本発明において、前記複層化に関する特徴量は、時系列画像における時刻ｔの第１画像と時刻ｔ＋１の第２画像とについて、第１画像の細胞塊の局所領域の輝度分布をテンプレートとし、第２画像の細胞塊の対応位置を含む近傍部について輝度分布のブロックマッチングを行って算出された、最もマッチングの高い位置領域の近似度（例えば、相関値、差分値、乗算値等）に基づく統計量であることが好ましい態様である。また、前記複層化に関する特徴量が、細胞塊の輪郭付近の輝度値に基づく統計量であることも好ましい態様である。あるいは、前記複層化に関する特徴量が、細胞塊の輪郭形状に基づく統計量であることも好ましい態様である。【００１１】
また、本発明の画像処理プログラムまたは画像処理装置において、前記複層化に関する特徴量の時系列変化の情報に基づいて細胞塊の成熟度を判定し、判定結果を出力するように構成することが好ましく、時系列画像に複数の細胞塊が含まれる場合においては、細胞塊ごとに成熟度を判定して成熟した細胞塊と未成熟の細胞塊とに分別し、分別結果を出力するように構成することが望ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の細胞塊の成熟判定手法、画像処理プログラム及び画像処理装置おいては、撮像装置により所定時間を隔てて細胞塊が撮影された時系列画像から細胞塊の複層化に関する特徴量が順次算出され時系列変化が導出されて、この複層化に関する特徴量の時系列変化に基づいて細胞塊の成熟度が判断される。従って、本発明によれば、試薬の投与によって細胞にダメージを与えるようなことがなく、撮像装置により撮影された時系列画像から細胞塊の成熟度を判断可能な手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】第１構成形態の画像処理プログラムＧＰ１を例示するフローチャートである。
【図２】本発明の適用例として示す培養観察システムの概要構成図である。
【図３】上記培養観察システムのブロック図である。
【図４】画像処理装置の概要構成を例示するブロック図である。
【図５】第１、第２形態の画像処理プログラムのサブフローチャートである。
【図６】所定時間を隔てて撮影された細胞塊の第１画像(ａ)及び第２画像(ｂ)である。
【図７】セグメンテーション、ラベリングされた細胞塊の状況を例示する模式図である。
【図８】第１画像において設定される局所領域の構成例(ａ)と、第２画像において対応位置を含む近傍部についてブロックマッチングを実行する状況を説明するための説明図(ｂ)である。
【図９】細胞塊に対する局所領域の大きさを例示する説明図(ａ)と、画像解析により算出された複層化度合いの表示構成例である。
【図１０】複層化度合いの総和の時間的な変化をグラフ化した複層化度合い時系列情報の出力例である。
【図１１】第２構成形態の画像処理プログラムＧＰ２を例示するフローチャートである。
【図１２】複層化部位の占有率の時間的な変化をグラフ化した複層化占有率時系列情報の出力例である。
【図１３】細胞塊の観察画像を模式的に示した説明図であり、(ａ)細胞培養の初期過程、(ｂ)複層化領域が全域に広がった成熟状態である。
【図１４】第３構成形態の画像処理プログラムＧＰ３を例示するフローチャートである。
【図１５】細胞塊の輪郭付近の輝度知総和の時間的な変化をグラフ化した輝度統計量時系列情報の出力例である。
【図１６】第４構成形態の画像処理プログラムＧＰ４を例示するフローチャートである。
【図１７】細胞塊の輪郭の複雑度の時間的な変化をグラフ化した輪郭形状統計量時系列情報の出力例である。
【図１８】細胞塊の製造方法を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態について、図面を参照しながら説明する。本発明の画像処理装置を適用したシステムの一例として、培養観察システムの概要構成図及びブロック図を図２及び図３に示しており、まず培養観察システムＢＳの全体構成について概要説明する。
【００１５】
培養観察システムＢＳは、大別的には、筐体１の上部に設けられた培養室２、複数の培養容器１０を収容保持するストッカー３、培養容器１０内の試料を観察する観察ユニット５、培養容器１０を搬送する搬送ユニット４、システムの作動を制御する制御ユニット６、及び画像表示装置を備えた操作盤７などから構成される。
【００１６】
培養室２は、培養環境を形成する部屋であり、この培養室２に付随して温度調整装置２１、加湿器２２、ＣＯ2ガスやＮ2ガス等のガスを供給するガス供給装置２３、循環ファン２４、培養室２の温度や湿度等を検出する環境センサ２５などが設けられている。ストッカー３は、前後及び上下に仕切られた棚状に形成され各棚に固有の番地が設定される。培養容器１０は、培養する細胞の種別や目的に応じて適宜選択され、例えばディッシュタイプの培養容器に細胞試料が液体培地とともに注入保持される。各培養容器１０にはコード番号が付与され、ストッカー３の指定番地に対応づけて収容される。搬送ユニット４は、培養室２の内部に設けられて上下移動可能なＺステージ４１、前後移動可能なＹステージ４２、左右移動可能なＸステージ４３などからなり、Ｘステージ４３の先端側に培養容器１０を持ちあげ支持する支持アーム４５が設けられている。
【００１７】
観察ユニット５は、試料台１５の下側から試料を照明する第１照明部５１、顕微観察系５５の光軸に沿って試料台１５の上方から試料を照明する第２照明部５２及び下方から試料を照明する第３照明部５３、試料のマクロ観察を行うマクロ観察系５４、試料のミクロ観察を行う顕微観察系５５、及び画像処理装置１００などから構成される。試料台１５には顕微観察系５５の観察領域に透明な窓部１６が設けられている。
【００１８】
マクロ観察系５４は、観察光学系５４ａと、観察光学系により結像された試料の像を撮影するＣＣＤカメラ等の撮像装置５４ｃとを有して構成され、第１照明部５１によりバックライト照明された培養容器１０の上方からの全体観察画像（マクロ像）が取得される。顕微観察系５５は、対物レンズや中間変倍レンズ、蛍光フィルタ等からなる観察光学系５５ａと、観察光学系５５ａにより結像された試料の像を撮影する冷却ＣＣＤカメラ等の撮像装置５５ｃとを有して構成される。対物レンズ及び中間変倍レンズは各々複数設けられ、レンズの組み合わせを変化させることにより任意の観察倍率に設定可能に構成される。顕微観察系５５では、第２照明部５２により照明された細胞の透過像、第３照明部５３により照明された細胞の反射像、第３照明部５３により照明された細胞の蛍光像など、培養容器１０内の細胞を顕微鏡観察した顕微観察像（ミクロ像）が取得される。
【００１９】
画像処理装置１００は、マクロ観察系５４の撮像装置５４ｃ、顕微観察系５５の撮像装置５５ｃにより撮影され、これらの撮像装置から入力された信号を処理して全体観察画像や顕微観察画像などの画像を生成する。また、画像処理装置１００は、これらの観察画像（画像データ）に画像解析を施し、タイムラプス画像の生成、細胞の移動方向予測、細胞の運動状態の解析、細胞塊の複層化の状態の解析などを行う。なお、画像処理装置１００については、後に詳述する。
【００２０】
制御ユニット６は、処理を実行するＣＰＵ６１、培養観察システムＢＳの制御プログラムや制御データ等が設定記憶されたＲＯＭ６２、ハードディスクやＤＶＤ等の補助記憶装置を含み観察条件や画像データ等を一時記憶するＲＡＭ６３などを有し、培養観察システムＢＳの作動を制御する。そのため、図３に示すように、培養室２、搬送ユニット４、観察ユニット５、操作盤７の各構成機器が制御ユニット６に接続されている。ＲＡＭ６３には、観察プログラムに応じた培養室２の環境条件や、観察スケジュール、観察ユニット５における観察種別や観察位置、観察倍率等が設定され記憶される。また、ＲＡＭ６３には、観察ユニット５により撮影された画像データを記録する画像データ記憶領域が設けられ、培養容器１０のコード番号や撮影日時等を含むインデックス・データと画像データとが対応付けて記録される。
【００２１】
操作盤７には、キーボードやスイッチ等の入出力機器が設けられた操作パネル７１、操作画面や観察画像、解析結果等を表示する表示パネル７２が設けられ、操作パネル７１において観察プログラムの設定や条件選択、動作指令等の入力が行われる。通信部６５は有線または無線の通信規格に準拠して構成されており、この通信部６５に外部接続されるコンピュータ等との間でデータの送受信が可能になっている。
【００２２】
このように概要構成される培養観察システムＢＳは、操作盤７において設定された観察プログラムに従ってＣＰＵ６１が各部の作動を制御し、培養容器１０内の試料の撮影を自動的に実行する。観察プログラムがスタートされると、ＣＰＵ６１はＲＡＭ６３に記憶された環境条件に基づいて温度調整装置２１、加湿器２２等の作動を制御する。また、ＲＡＭ６３に記憶された観察条件を読み込み、観察スケジュールに基づいてＸ，Ｙ，Ｚステージ４３，４２，４１を作動させてストッカー３から観察対象の培養容器１０を試料台１５に搬送し、観察ユニット５による観察を開始させる。例えば、観察プログラムにおいて設定された観察が細胞のミクロ観察である場合には、該当する培養容器１０を顕微観察系５５の光軸上に位置決めし、第２照明部５２または第３照明部５３の光源を点灯させて、顕微観察像を撮像装置５５ｃに撮影させる。
【００２３】
以上のように構成される培養観察システムＢＳにおいて、画像処理装置１００は、撮像装置（５４ｃ、５５ｃ）により所定時間を隔てて撮影された時系列画像を取得し、取得した時系列画像を解析して、細胞塊の成熟度を定量的に評価・判断する有用な情報を出力する機能を有している。この機能は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の解析に好適に利用される。
【００２４】
細胞塊の成熟度は、取得した時系列画像から細胞塊の複層化に関する特徴量（以下、便宜的に「複層化特徴量」という）を順次算出し、算出された複層化特徴量の時系列変化を導出して、この複層化特徴量の時系列変化に基づいて判断される。
【００２５】
培養細胞が培地内で平面的に広がる平面培養においては、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの細胞が社会性を有するような細胞塊に成長する過程で複層化が始まり、複層化が細胞塊全域に広がって成熟してゆく。そのため、時系列画像の各観察画像または画像間で細胞塊の複層化特徴量を算出し、その時間的な変化を導出することにより、細胞塊の成熟度（成熟状態）を判断することができる。
【００２６】
本発明では、成熟度判断の基礎となる複層化特徴量として、（Ｉ）観察画像間の局所領域のブロックマッチングによる近似度に基づく統計量を利用する手法、（II）細胞塊の輪郭付近の輝度値に基づく統計量を利用する手法、（III）細胞塊の輪郭形状に基づく統計量を利用する手法を提案する。以下では、これらの複層化特徴量を利用した細胞塊成熟度の判断手法について、それぞれ項分けして順に説明する。
【００２７】
（Ｉ）観察画像間の局所領域のブロックマッチングによる近似度を利用する手法
この手法は、所定時間をおいて撮影された時系列画像（時刻ｔ＝０，１，２，３，…，Ｔ，Ｔ＋１，…）における時刻ｔの観察画像（第１画像とする）と、時刻ｔ＋１の観察画像（第２画像とする）とについて、第１画像における細胞塊の局所領域の輝度分布をテンプレートとし、第２画像の細胞塊の対応位置を含む近傍部について輝度分布のブロックマッチングを行って、算出された最もマッチングの高い位置領域（領域内の輝度分布の変化が最も少ない位置領域）の近似度を当該位置領域の代表近似度とし、この代表近似度に基づく統計量を複層化特徴量とする。
【００２８】
これは、細胞が複層化していない単層領域の部位と、複層化した部位の画像が、以下の特徴をもつことを利用する。細胞塊は複数の細胞が寄せ集まったものであるが、単純に寄せ集まって水平方向に広がる単層の細胞塊は、隣接する時刻の画像間で、個々の細胞の多少の移動や回転が起きることがあっても、細胞の大きさ及び細胞同士の境界を観察することができ、構造は保たれていると考えられる。一方、細胞が複層化される場合には、細胞塊内部において上下方向に分裂や移動が行われて泡立つように変化するため、画像の空間的な構造や明るさが大きく変化する。
【００２９】
このように、単層領域では細胞塊内部の変化が空間的な移動を主体とするため、２画像の対応位置を含む周辺でブロックマッチングを行ったときのマッチングの度合いが高くなるのに対し、複層化領域では、細胞塊内部での変化が空間的な移動だけでなく構造的な変化を伴うため、周辺探索を行ってもマッチングの度合いが低くなる。近似度の指標として相関値や差分値、乗算値等を利用することができ、例えば相関値を用いた場合には、単層領域において代表近似度が高く、複層化領域では代表近似度が低くなり、代表近似度の大きさにより複層化の状態を判断することができる。
【００３０】
従って、第１画像における局所領域を移動させて画像全域（マウス等により解析範囲が指定された場合には指定領域）についてブロックマッチングを行うことにより、各時刻（時刻ｔ＝１，２，３，…）における細胞塊各部の複層化状態を把握することができる。そして、その時系列変化を導出することにより、細胞塊各部および細胞塊全体の複層化の状態を逐次判断することができる。画像間における局所領域のブロックマッチングは画像処理装置１００において実行される。画像処理装置１００のブロック図を図４に示し、本手法の画像処理プログラムＧＰ１，ＧＰ２において複層化部位の検出処理を行う部分Ｐ１のフローチャート（サブフローチャート）を図５に示す。
【００３１】
画像処理装置１００は、撮像装置（５５ｃ，５４ｃ）により撮影された細胞塊の画像を取得して画像を解析する画像解析部１２０と、画像解析部１２０により解析された解析結果を出力する出力部１３０とを備えて構成される。出力部１３０からは、画像解析部１２０による解析結果、例えば、複層化特徴量の時系列変化の情報や成熟度の判定結果、成熟した細胞塊と未成熟の細胞塊の判別結果などが出力され、表示パネル７２への表示や記憶媒体への記録、通信部６５を介して外部へのデータ送信等が行われる。
【００３２】
画像処理装置１００は、ＲＯＭ６２に設定記憶された画像処理プログラムＧＰ（ＧＰ１〜ＧＰ４）がＣＰＵ６１に読み込まれ、ＣＰＵ６１によって画像処理プログラムＧＰに基づく処理が順次実行されることによって構成される。換言すれば、画像処理プログラムＧＰはハードウェア資源であるＣＰＵ６１（コンピュータ）を画像処理装置１００として機能させるためのソフトウェアである。
【００３３】
画像解析部１２０は、画像処理プログラムＧＰに基づき、撮像装置（説明ではミクロ系の撮像装置５５ｃとする）により撮影され、ＲＡＭ６３に記録された細胞塊の画像を以下のように画像処理する。なお、撮像装置５５ｃにより第２画像が撮影されたときに、ＲＡＭ６３に記録された第１画像と新たに取得された第２画像とから、現時点の細胞塊の複層化状態をリアルタイムで画像処理し出力するようにしてもよい。
【００３４】
画像解析部１２０は、まずステップＳ１においてＲＡＭ６３に記憶された時刻ｔの第１画像（例えば、図６(ａ)に示す細胞観察画像）と、所定時間を隔てた次時刻ｔ＋１の第２画像（例えば、図６(ｂ)に示す細胞観察画像）とを取得し、ステップＳ２において各画像に対してレベルセット（Level Set）及び分散フィルタによって細胞塊ＭＣのセグメンテーションを行う。
【００３５】
このとき、図７に示すように、画像中にセグメント化された細胞塊ＭＣが複数含まれるような場合には、各細胞塊ＭＣに対してラベリングを行い、第１画像と第２画像との間で細胞塊の対応をとる。例えば、それぞれの画像でラベリング１，２，３…を施した細胞塊ＭＣについて、像が重なるラベル同士を同じ細胞塊として対応づける。なお、上記所定時間は、観察する細胞の種別や活動状況に応じて適宜選択されるものであるが、細胞の活動が活発な場合には１０分〜１時間程度、低調な場合には３０分〜２時間程度の時間を隔てた画像が選択される。
【００３６】
次いで、第１画像→第２画像間での細胞塊の移動による効果を小さくするため、細胞塊ＭＣの位置合わせを行う（不図示）。位置合わせは、細胞塊の重心位置や外接矩形の頂点位置などを基準として行うことができ、図形モーメントの相関が最大（差分が最小）となるように細胞塊の角度を揃えることにより回転の効果を小さくすることができる。なお、各細胞塊の輪郭形状や輝度分布の差分が最小（相関値が最大）となる位置及び角度で位置合わせを行うようにしてもよい。
【００３７】
ステップＳ３では、第１画像の細胞塊ＭＣにおいて、画像を形成する画素を中心とする局所領域Ａを設定する。「局所領域」Ａは、図８(ａ)に白抜きの枠で囲んで示すように、細胞塊の大きさに比べて十分に小さく設定され、例えば、５×５〜１５×１５画素程度（細胞数個程度の大きさ）に設定される。なお、局所領域の位置設定は、セグメント化された細胞塊の輪郭端部を起点として自動設定されるように構成できるほか、例えば、細胞塊の特定部分（着目部分）について、オペレータがマウス等により解析範囲を指定して解析を実行するような場合に、指定された解析範囲の端部や中央を起点として設定されるように構成してもよい。
【００３８】
こうして設定された局所領域について、ステップＳ４においてブロックマッチングが行われる。ブロックマッチングは、第１画像において図８(ａ)のように設定された局所領域Ａの輝度分布を基準とし、図８(ｂ)に示すように、第２画像における対応位置領域を含む周辺に対し局所領域Ａの輝度分布をスキャンして各位置での近似度を算出し、最もマッチングの高い位置を探索する。
【００３９】
近似度の評価指標として、輝度分布の相関値や差分、あるいは乗算値などを用いることができ、例えば、相関値を用いる場合には相関値が最も大きい（１に近い）位置、評価指標として差分を用いる場合には差分が最も小さい（０に近い）位置を探索する。そして、最もマッチングの高い位置の近似度を当該位置の代表近似度としてＲＡＭ６３に記録する。以降では近似度として相関値を用いた場合について説明を続ける。
【００４０】
局所領域が単層構造の場合には、時間経過による細胞塊の変化が細胞の移動を主体とするため、対応位置を含む周辺部でブロックマッチングを行うことによって代表近似度の相関値は大きな値（相関値が１に近い値）をとる。一方、局所領域が複層化された部位である場合には、時間経過による細胞塊の変化が空間的な構造の変形や輝度変動を伴うため、周辺探索を行っても代表近似度の相関値は小さな値（同上、０に近い値）となる。
【００４１】
ステップＳ４では、比較基準である第１画像の局所領域Ａを、画像内で所定画素（単位画素または複数画素）移動させてブロックマッチングを順次行い、細胞塊全域（解析範囲が指定されている場合には指定領域）について各部の代表近似度を算出する。このブロックマッチングにより得られた各部の代表近似度は、当該各部の複層化の状態を表し、代表近似度の分布は細胞塊全体の複層化の状況を表すものとなる。
【００４２】
ここで、近似度として相関値を用いた場合には、相関値の大きさ（絶対値）は、単層状態から複層化が進むにつれて値が小さくなり、複層化の程度を表すには扱いにくい。そこで、画像処理装置１００では、ステップＳ５において代表近似度の相関値を反転させ、複層化が進むにつれて値が大きくなる（０→１に近づく）ように処理している。具体的には、近似度として相関値を用いる場合に１−相関値の処理、近似度として差分値を用いる場合には｜差分値｜の処理を行っている。本明細書においては、この処理により算出される代表近似度を「複層化度合い」と表記する。なお、相関値は計算上では−１〜＋１の値を取り得るが、負の値（−１〜０）は輝度が反転した場合であり、細胞形状では意味をもたないため、算出された相関値が負の値の場合は０と置き換え、１−相関値の処理を行っている。
【００４３】
図９は、(ａ)に局所領域の大きさを点線で例示するとともに、(ｂ)にステップＳ５により算出された複層化度合いの分布を複層化情報として表示パネル７２等に出力する場合の出力例を示したものである。この出力例では、第２画像の細胞塊にステップＳ２で抽出された外形輪郭線Ｌを付加表示するとともに、複層化度合いが低い部位を暗く、複層化度合いが高い部位を明るく、複層化度合いの大きさに応じた多段階のグラデーション表示として表示させている。この画像から、外形輪郭線Ｌで囲まれた細胞塊ＭＣの内部において、明度が高いほど（グレースケールでは白に近いほど）複層化が進んでいると判断でき、細胞塊のどの部位で、どの程度複層化が進行しているかを判断することができる。
【００４４】
画像処理プログラムＰ１は、ステップＳ５において算出された複層化度合いを利用して、複層化された部位と複層化されていない部位とを判別する機能も備えている。すなわち、ステップＳ６では、ステップＳ５において算出された複層化度合いの値と、予め設定された所定の閾値とを対比し、複層化度合いの値が閾値以上である領域を複層化されていると判断する。ステップＳ６の処理は、以降説明する画像処理プログラムの処理フローやオペレータからの表示要求等に応じて実行される。
【００４５】
なお、ステップＳ４のブロックマッチング処理により最も近似すると判断された位置領域について、その領域の輝度分布から空間的な輝度変化（輝度値のばらつき）を算出し、ステップＳ６において、複層化度合いが前記所定の閾値以上であり、且つ、少なくとも第２画像における空間的な輝度変化が所定の閾値以上のときに、当該位置領域は複層化されていると判断するように構成してもよい。
【００４６】
空間的な輝度変化の指標として、輝度値の分散や、空間方向に対する輝度値の微分の総和などが例示される。これは、単層状態の部位は空間的な輝度変化が小さいのに対して、複層化された部位は空間的な輝度変化が比較的大きいことを利用するものである。なお、空間的な輝度変化が大きな位置領域は、複層化された部位のほか、細胞塊内外の境界の部分があるが、境界部分はブロックマッチングによって算出される複層化度合いが小さくなるため、上記複層化状態の識別判断で省かれる。
【００４７】
このように算出される各時刻の細胞塊各部の複層化度合いを利用して、近似度に基づく統計量が算出され、その時系列変化により細胞塊の成熟度が判断される。近似度に基づく統計量として、（１）複層化度合いの総和、（２）複層化部位の占有率が挙げられる。
【００４８】
（Ｉ−１）複層化度合いの総和
この手法は、上記のようにして算出された各時刻の細胞塊各部の複層化度合い（図９(ｂ)を参照）を、細胞塊全体（解析範囲が指定されている場合には指定領域）について総和して、細胞塊ごとに各時刻の複層化度合いの総和を求め、この複層化度合いの総和の時系列変化を導出することにより、得られた時系列の変化情報に基づいて細胞塊の成熟状態（成熟度）を判断する。
【００４９】
上述したブロックマッチングによる複層化部位検出のプログラムＰ１を含み、複層化度合いの総和の時系列変化に基づいて細胞塊の成熟度を判定する画像処理プログラムＧＰ１のフローチャートを図１に示す。
【００５０】
図示するフローチャートでは、ステップＡ１０に、既述した細胞塊の複層化部位検出のプログラムＰ１（Ｓ１〜Ｓ５）が含まれており、このステップＡ１０において、時刻ｔの第１画像と、時刻ｔ＋１の第２画像とから、局所領域のブロックマッチングにより時刻ｔ＋１における細胞塊各部の複層化度合いが算出される。
【００５１】
例えば、時刻ｔ＝０の細胞観察画像（第１画像）と、時刻ｔ＝１の細胞観察画像（第２画像）とから時刻ｔ＝１における細胞塊各部の複層化度合いが算出され、以降同様に次時刻の細胞観察画像との局所領域のブロックマッチングが順次行われて、時刻ｔ＝Ｔの細胞観察画像（第１画像）と、時刻ｔ＝Ｔ＋１の細胞観察画像（第２画像）とから時刻ｔ＝Ｔ＋１における細胞塊各部の複層化度合いが算出される。
【００５２】
ステップＡ２０では、ステップＡ１０で算出された各時刻の細胞塊各部の複層化度合いを細胞塊全体について総和して、細胞塊ごとに各時刻（時刻ｔ＝１，２，３，…，Ｔ，Ｔ＋１，…）の複層化度合いの総和が算出される。これにより、各時刻において各細胞塊がどの程度複層化しているかを把握することができる。
【００５３】
ステップＡ３０では、ステップＡ２０で算出された各時刻の複層化度合いの総和の値を時刻ｔ＝１，２，３，…，Ｔ，Ｔ＋１，…に沿って時系列に並べ、各細胞塊について複層化度合いの総和の時系列変化を導出する。図１０は、ひとつの細胞塊に着目し、ステップＡ２０の時系列変化導出処理により算出された複層化度合いの総和の時間的な変化を、グラフ化して表示パネル７２に表示させた場合の出力例を示す。図中の横軸は時刻ｔ＝０からの経過時間、縦軸は複層化度合いの総和であり、総和の値を局所領域の分割数で除算し正規化した場合には０〜１の値となる。
【００５４】
細胞培養の初期過程では、細胞塊内部に細胞が二次元的に広がっているだけで、細胞個々の構造がはっきりしていることから、複層化度合いの総和は小さい値で推移する。細胞塊が成長して複層化が始まると、細胞の構造が三次元的に激しく変化して複雑化することから複層化度合いの総和の値が上がり始め、複層化領域の拡大とともに上昇する。複層化領域が細胞塊のほぼ全域まで広がると、総和値の上昇が鈍りほとんど上昇しなくなる。さらに時間が経過すると、今度は複層化された領域の細胞個々が非常に小さくなって細かい構造変化となっていくため、複層化度合いの総和は最大値を取った後に若干低下する傾向をもって推移する。
【００５５】
このため、ステップＡ３０の処理により導出される複層化度合いの総和の時系列変化情報（複層化度合い時系列情報という）から、細胞塊の成熟状態を判断することができる。例えば、複層化度合い時系列情報において、複層化度合いの総和が上昇し始めたときに、当該細胞塊で複層化の成長が始まったと判断することができ、複層化度合いの総和が上昇しているときに成長中であると判断することができる。また、複層化度合いの総和が最大値をとったとき、あるいはピークを越えて安定期または減少期に入ったときに、当該細胞塊が成熟したと判断することができる。
【００５６】
図１に示す画像処理プログラムＧＰ１では、ステップＡ３０において導出された複層化度合いの時系列情報から、ステップＡ４０において複層化度合いの総和が最大値をもつか否かを計算し、最大値を持つ場合には細胞塊が成熟したと判断してその時期を算出し、細胞塊成熟期の判定結果を出力する構成例を示す。
【００５７】
画像解析結果の表示パネル７２等への表示形態は適宜行うことができ、例えば、個々の細胞塊について、複層化度合い時系列情報として、図１０に示したｔ＝０から現在までの複層化度合いの総和の推移をグラフ表示し、細胞塊が十分成熟したと判定される場合には、判定結果として成熟時期の時刻ｔを表示する態様が例示される。観察画像中に複数の細胞塊が含まれるような場合には、十分成熟したと判定された細胞塊と、そうでない細胞塊とを分別し、色分け表示等により表示する態様などが例示される。この際、各細胞塊の成熟度（未成長、成長中、成熟）に応じて色彩や輝度を変化させて表示するように構成してもよい。
【００５８】
（Ｉ−２）複層化部位の占有率
この手法は、細胞塊各部の複層化度合いに基づき複層化していると判別された部位について、各時刻の細胞塊における細胞塊全体（解析範囲が指定されている場合には指定領域）に対する複層化部位の占める比率、すなわち複層化部位の占有率を算出し、この複層化部位の占有率の時系列変化を導出することにより、得られた時系列変化情報に基づいて細胞塊の成熟状態（成熟度）を判断する。
【００５９】
既述したブロックマッチングによる複層化部位検出のプログラムＰ１を含み、複層化部位の占有率の時系列変化に基づいて細胞塊の成熟度を判定する画像処理プログラムＧＰ２のフローチャートを図１１に示す。
【００６０】
図示するフローチャートでは、ステップＢ１０に、既述した細胞塊の複層化部位検出のプログラムＰ１（Ｓ１〜Ｓ６）が含まれており、このステップＢ１０において、時刻ｔの第１画像と、時刻ｔ＋１の第２画像とから、局所領域のブロックマッチングにより時刻ｔ＋１における細胞塊各部の複層化度合いが算出され、算出された複層化度合いの大きさに応じて複層化された部位の検出が行われる。
【００６１】
例えば、時刻ｔ＝０の細胞観察画像（第１画像）と、時刻ｔ＝１の細胞観察画像（第２画像）とから時刻ｔ＝１における細胞塊の複層化部位が検出され、以降同様に次時刻の細胞観察画像とのブロックマッチングが順次行われて、時刻ｔ＝Ｔの細胞観察画像（第１画像）と、時刻ｔ＝Ｔ＋１の細胞観察画像（第２画像）とから時刻ｔ＝Ｔ＋１における細胞塊の複層化部位が検出される。
【００６２】
ステップＢ２０では、ステップＢ１０で検出された複層化部位について、各細胞塊に占める複層化部位の占有率（面積比率）が算出され、細胞塊ごとに各時刻（時刻ｔ＝１，２，３，…，Ｔ，Ｔ＋１，…）における複層化部位の占有率が算出される。これにより、各時刻において各細胞塊がどの程度複層化しているかを把握することができる。
【００６３】
ステップＢ３０では、ステップＢ２０で算出された各時刻の複層化部位の占有率の値を時刻ｔ＝１，２，３，…，Ｔ，Ｔ＋１，…に沿って時系列に並べ、各細胞塊について複層化部位占有率の時系列変化を導出する。図１２は、ひとつの細胞塊について、ステップＢ２０の時系列変化導出処理により算出された複層化部位占有率の時間的な変化を、グラフ化して表示パネル７２に表示させた場合の出力例を示す。図中の横軸は時刻ｔ＝０からの経過時間、縦軸は複層化部位の占有率であり０〜１００％の値となる。
【００６４】
細胞培養の初期過程では、複層化部位がほとんど存在しないため複層化部位の占有率は低い値で推移する。細胞塊が成長して複層化が始まると占有率は上がり始め、複層化領域の拡大とともに上昇する。複層化領域が細胞塊のほぼ全域まで広がると、占有率の上昇が鈍り高い占有率でほとんど上昇しなくなる。
【００６５】
従って、ステップＢ３０の処理により導出される複層化部位の占有率の時系列変化情報（複層化占有率時系列情報という）から、細胞塊の成熟状態を判断することができる。例えば、複層化占有率時系列情報において、複層化部位の占有率が上昇し始めたときに、当該細胞塊で複層化の成長が始まったと判断することができ、複層化部位の占有率が上昇しているときに成長中であると判断することができる。また、複層化部位の占有率が所定以上となったときに、当該細胞塊が成熟したと判断することができる。
【００６６】
図１１に示す画像処理プログラムＧＰ２では、ステップＢ３０において導出された複層化占有率時系列情報から、ステップＢ４０において、各時刻の複層化部位の占有率と、成熟度の判定基準として予め設定された規定占有率とを対比し、細胞塊の複層化部位の占有率が規定占有率以上である場合に細胞塊が成熟したと判断して規定占有率を超えた時期を算出し、細胞塊成熟期の判定結果を出力する構成例を示す。規定占有率は観察対象の細胞の種別や特性、観察目的等に応じて適宜に設定されるが、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の場合には、一般的に７０〜９０％程度の範囲内で設定される。
【００６７】
画像解析結果の表示パネル７２等への表示形態は、前述した構成形態と同様に適宜行うことができ、例えば、個々の細胞塊について、複層化占有率時系列情報として、図１２に示したグラフに規定占有率（例えば８０％）の指標線と、ｔ＝０から現在までの占有率の推移をグラフ表示し、細胞塊の成熟度の判定結果とともに、成熟したと判断された場合には規定占有率を超えた時刻ｔを表示するような態様が例示される。観察画像中に複数の細胞塊が含まれるような場合には、十分成熟したと判定された細胞塊と、そうでない細胞塊とを分別し、色分け表示等により表示する態様や、各細胞塊の成熟度（未成長、成長中、成熟）に応じて色彩や輝度を変化させて表示する態様などが例示される。
【００６８】
このように、以上説明した（Ｉ）画像間の局所領域のブロックマッチングによる近似度を利用する手法によれば、所定時間を隔てた二枚の画像から、画像間の局所領域の近似度に基づく複層化特徴量（複層化度合いの総和、複層化部位の占有率）を算出し、その時系列変化を導出することにより、導出された時系列の変化情報から細胞塊の成熟度を定量的に判断することができる。次に、複層化特徴量として「細胞塊の輪郭付近の輝度値に基づく統計量」を利用した成熟度判定手法について説明する。
【００６９】
（II）細胞塊の輪郭付近の輝度値に基づく統計量を利用する手法
細胞を平面培養したときの観察画像を図１３に模式的に示す。培養初期では、同図(ａ)に示すように、寄せ集まった細胞Ｃがシャーレ等の培地底面に接着して細胞塊が二次元的に広がっている。そのため、細胞塊ＭＣの輪郭付近にいわゆる「ハロ」はあまり生じない。一方、細胞塊が成長して複層化し三次元的に増殖するようになると、細胞塊の輪郭部に厚みが出てくるため、同図(ｂ)に示すように、細胞塊ＭＣの輪郭付近にハロＨが生じることになる。輪郭付近のハロは、観察光学系（５４ａ，５５ａ）が位相差顕微鏡の場合に、より明瞭に現れる。
【００７０】
本手法は、このように細胞塊が複層化して成熟するに伴い、輪郭付近にハロが生じて輝度値が変化する特性を利用する。輝度値に基づく統計量の例として、細胞塊の輪郭付近の輝度値を総和した輝度総和、細胞塊の総輪郭長に対する輪郭に沿った一定の輝度値以上の部分（ハロ）の長さの割合（ハロ長さ／総輪郭長）を提示する。これらの統計量を利用した細胞塊の成熟度判定は、ＲＯＭ６２に設定記憶された画像処理プログラムＧＰ３がＣＰＵ６１に読み込まれ、ＣＰＵ６１によって画像処理プログラムＧＰ３に基づく処理が順次実行されることによって実現される。画像処理プログラムＧＰ３のフローチャートを図１４に示す。
【００７１】
画像解析部１２０は、まず、ステップＣ１０においてＲＡＭ６３に記録された時刻ｔ＝０，１，２，３，…，Ｔ，Ｔ＋１，…の時系列画像を読み出し、ステップＣ１５において各時刻の観察画像に対して細胞塊の最外輪郭の抽出、セグメンテーションを行う。最外輪郭の抽出は、SnakesやLevel Set法などの動的輪郭抽出法を利用して行われる。このとき、セグメント化された細胞塊が観察画像中に複数含まれるような場合には、図７に示したように、各細胞塊ＭＣに対してラベリングを行い、画像間での細胞塊の対応をとる。
【００７２】
ステップＣ２０では、ステップＣ１５で抽出された各時刻の細胞塊の輪郭部に対し、上述した輝度値に基づく統計量を算出する。例えば、輝度値に基づく統計量が輪郭付近の輝度総和の場合には、細胞塊の輪郭に沿った近接領域について輝度値の総和を算出する。近接領域の大きさ、すなわちステップＣ１５で抽出された輪郭線に対する外周方向の枠の幅は、観察対象の細胞塊が複層化したときに当該観察系で観察されるハロの出現域に応じて適宜設定される。輝度値に基づく統計量が細胞塊の総輪郭長に対するハロの長さの割合である場合には、ステップＣ１５で抽出された細胞塊の輪郭線の総輪郭長に対する、細胞塊の近接領域で一定の輝度値以上である部分の輪郭線に沿った方向の長さの割合を算出する。
【００７３】
ステップＣ３０では、ステップＣ２０で算出された各時刻の輝度値に基づく統計量を時刻ｔ＝１，２，３，…，Ｔ，Ｔ＋１，…に沿って時系列に並べ、各細胞塊について輝度値に基づく統計量の時系列変化を導出する。図１５は、ひとつの細胞塊について、ステップＣ２０の時系列変化導出処理により算出された付輪郭付近の輝度総和の時間的な変化を、グラフ化して表示パネル７２に表示させた場合の出力例を示す。図中の横軸は時刻ｔ＝０からの経過時間、縦軸は輪郭付近の輝度値の総和である。
【００７４】
図１３に模式的に示したように、(ａ)細胞培養の初期過程では、寄せ集まった細胞Ｃが培地底面に接着して二次元的に広がるため、個々の細胞Ｃや集合した細胞塊ＭＣの輪郭付近に殆どハロは現れず、輪郭付近の輝度総和は低い状態で変化する。細胞塊が成長して複層化が始まると、複層化により厚さが増大した部位に近い輪郭付近に明るいハロが現われて輝度総和が徐々に増加し始め、複層化領域の拡大とともに増大する。そして(ｂ)のように複層化領域が細胞塊ＭＣのほぼ全域まで広がると細胞塊全体が明るいハロＨに囲まれ、輪郭付近の輝度総和がほとんど増加しなくなる。輝度値に基づく統計量として細胞塊の総輪郭長に対するハロの長さの割合を用いた場合にも同様の時系列変化で推移する。
【００７５】
従って、ステップＣ３０の処理により導出される輝度値に基づく統計量の時系列変化情報（輝度統計量時系列情報という）から、細胞塊の成熟状態を判断することができる。例えば、輝度統計量時系列情報において、輪郭付近の輝度総和が増加し始めたときに、当該細胞塊で複層化の成長が始まったと判断することができ、輝度総和が増大しているときに成長中であると判断することができる。そして、輝度総和の増加傾向が緩やかになり増加率が所定以下となったとき、あるいは輝度総和が規定の総和閾値以上となったときに、当該細胞塊が成熟したと判断することができる。
【００７６】
図１４に示す画像処理プログラムＧＰ３では、ステップＣ３０において導出された輝度統計量時系列情報から、ステップＣ４０において、各時刻の輪郭付近の輝度総和と、成熟度の判定基準として予め設定された規定の総和閾値とを対比し、輪郭付近の輝度総和が規定の総和閾値以上である場合に細胞塊が成熟したと判断して総和閾値を超えた時期を算出し、細胞塊成熟期の判定結果を出力する。輝度値に基づく統計量が、細胞塊の総輪郭長に対するハロ長さの割合の場合も同様であり、各時刻の細胞塊の総輪郭長に対するハロ長さの割合と、成熟度の判定基準として予め設定されたハロの規定割合とを対比し、総輪郭長に対するハロ長さの割合が規定割合以上である場合に細胞塊が成熟したと判断し規定割合を超えた時期を成熟期として判定結果を出力する。画像解析結果の表示パネル７２等への表示は、既述した各構成形態と同様に適宜行うことができる。
【００７７】
以上説明した（II）細胞塊の輪郭付近の輝度値に基づく統計量を利用する手法によれば、所定時間を隔てた時系列画像群から、各時刻における細胞塊の輪郭付近の輝度値に基づく複層化特徴量（輪郭付近の輝度総和、総輪郭長に対するハロ長さの割合）を算出し、その時系列変化を導出することにより、導出された時系列の変化情報から細胞塊の成熟状態を定量的に判断することができる。次に、複層化特徴量として「細胞塊の輪郭形状に基づく統計量」を利用した成熟度判定手法について説明する。
【００７８】
（III）細胞塊の輪郭形状に基づく統計量を利用する手法
図１３(ａ)に示したように、細胞培養の初期過程では、細胞Ｃが寄せ集まって細胞塊ＭＣが形成されるため、二次元的に広がる細胞塊ＭＣの輪郭付近には細胞個々が存在しており、細胞塊の輪郭形状は多くの凹凸を含んだ複雑な形状となる。細胞塊の成長が進むと輪郭部の凹凸が徐々に吸収されて輪郭形状がなだらかになってゆき、複層化により細胞構造が三次元的に形成される頃には、図１３(ｂ)に示すように細胞塊ＭＣの輪郭形状が比較的丸くなってくる。
【００７９】
本手法は、このように、細胞塊が成熟してゆく過程で、細胞塊の輪郭形状が変化する特性を利用する。細胞塊の輪郭形状に基づく統計量の代表例として、細胞塊の輪郭の複雑度を提示する。細胞塊の輪郭の複雑度は、例えば、細胞塊の面積に対する周囲長の割合（周囲長／面積）で規定することができる。
【００８０】
細胞塊の成熟度判定は、画像処理プログラムＧＰ４がＣＰＵ６１に読み込まれ、ＣＰＵ６１によって画像処理プログラムＧＰ４に基づく処理が順次実行されることによって実現される。画像処理プログラムＧＰ４のフローチャートを図１６に示す。
【００８１】
画像解析部１２０は、ステップＤ１０において時刻ｔ＝０，１，２，３，…，Ｔ，Ｔ＋１，…の時系列画像を読み出し、ステップＤ１５で各時刻の観察画像に対して動的輪郭抽出法による最外輪郭の抽出、セグメンテーションを行う。観察画像中にセグメント化された細胞塊が複数含まれるような場合には、各細胞塊に対してラベリングを行い、画像間での細胞塊の対応をとる（図７）。
【００８２】
ステップＤ２０では、ステップＤ１５で抽出された各時刻の細胞塊の輪郭部に対し、上述した細胞塊の輪郭形状に基づく統計量を算出する。本実施例においては、細胞塊の輪郭の複雑度について、最外輪郭が抽出された細胞塊の面積に対する周囲長（総輪郭長）の割合を算出する。
【００８３】
ステップＤ３０では、ステップＤ２０において算出された各時刻の輪郭形状に基づく統計量を時刻ｔ＝１，２，３，…，Ｔ，Ｔ＋１，…に沿って時系列に並べ、各細胞塊について輪郭形状に基づく統計量の時系列変化を導出する。図１７は、ひとつの細胞塊について、ステップＤ２０の時系列変化導出処理により算出された細胞塊輪郭の複雑度の時間的な変化をグラフ化して、表示パネル７２に表示させた場合の出力例である。図中の横軸は時刻ｔ＝０からの経過時間、縦軸は輪郭の複雑度である。
【００８４】
図１３(ａ)，(ｂ)に示したように、細胞培養の初期過程では、細胞が寄せ集まって細胞塊が二次元的に広がり、細胞塊の輪郭は多くの凹凸を含んだ複雑な形状であるため、ステップＤ２０において算出される輪郭の複雑度は高い値で変動する。細胞塊の成長が進むと凹凸が徐々に吸収されて輪郭形状がなだらかになってゆき、輪郭の複雑度は時間の経過とともに低下する。さらに細胞塊内部で複層化が進むと、細胞塊の輪郭形状が楕円〜丸くなり、輪郭の複雑度は低い値でほとんど減少しなくなる。
【００８５】
そのため、ステップＤ３０の処理により導出される細胞塊の輪郭形状に基づく統計量の時系列変化情報（輪郭形状統計量時系列情報という）から、細胞塊の成熟状態を判断することができる。例えば、輪郭形状統計量時系列情報において、輪郭の複雑度が低下し始めたときに、当該細胞塊は複層化への移行期にあると判断することができ、輪郭の複雑度が低下しているときに複層化の成長中であると判断することができる。そして、輪郭の複雑度の低下傾向が緩やかになり低下率が所定以下となったとき、あるいは輪郭の複雑度が規定の複雑度以下となったときに、当該細胞塊が成熟したと判断することができる。
【００８６】
図１６に示す画像処理プログラムＧＰ４では、ステップＤ３０において導出された輪郭形状統計量時系列情報から、ステップＤ４０において、各時刻の細胞塊の輪郭の複雑度と、成熟度の判定基準として予め設定された規定の複雑度とを対比し、輪郭の複雑度が規定の複雑度以下である場合に細胞塊が成熟したと判断して規定複雑度を下回った時期を算出し、細胞塊成熟期の判定結果を出力する。画像解析結果の表示パネル７２等への表示は、既述した各構成形態と同様に適宜行うことができる。
【００８７】
従って、以上説明した（III）細胞塊の輪郭形状に基づく統計量を利用する手法によれば、所定時間を隔てた時系列画像群から、各時刻における細胞塊の輪郭形状に基づく複層化特徴量（細胞塊の輪郭の複雑度）を算出し、その時系列変化を導出することにより、導出された時系列の変化情報から細胞塊の成熟状態を定量的に判断することができる。
【００８８】
以上説明したように、本発明の画像処理装置１００においては、撮像装置により所定時間を隔てて細胞塊が撮影された時系列画像群から細胞塊の複層化に関する特徴量が順次算出され、時系列変化が導出されて、複層化に関する特徴量の時系列変化に基づいて細胞塊の成熟度が判断される。従って、本発明によれば、試薬の投与によって細胞にダメージを与えるようなことがなく、撮像装置により撮影された時系列画像から細胞塊の成熟度を判断可能な手段を提供することができる。
【００８９】
なお、以上説明した実施形態では、培養観察システムＢＳにおいて撮像装置に撮影され、ＲＡＭ６３に記憶された時系列画像（画像データ）を読み出して複層化状態を解析する構成を例示したが、撮像装置により撮影された画像を逐次第１、第２画像としてリアルタイムで解析し現時点における細胞塊の成熟度を表示するように構成してもよく、他の観察システムにおいて撮影され磁気記憶媒体等に記録された時系列画像や、通信回線を介して転送されてきた時系列画像等を読み込んで成熟状態を解析するように構成してもよい。また、オペレータが観察画像の所定範囲（例えば、特定の細胞塊や、細胞塊における特定部位）をマウス等により解析範囲として設定し、設定された解析範囲について画像処理装置が成熟状態の解析を実行するように構成してもよい。
【００９０】
次に、本発明の実施形態に係る細胞塊の製造方法について、図１８を参照して説明する。この製造方法は、基本的には、細胞を培養する培養ステップ（Ｓ１１０）と、この培養ステップにおいて培養される細胞を、前述した画像処理装置を用いて観察し、培養により変化する細胞における細胞塊の成熟度を判定する判定ステップ（Ｓ１２０−Ｓ１４０）とを備える。
【００９１】
より具体的には、細胞を培養する培養ステップ（Ｓ１１０）と、この培養ステップにおいて培養される細胞を、撮像装置により所定時間を隔てて撮影し、培養により変化する細胞における細胞塊の時系列画像を取得する取得ステップ（Ｓ１２０）と、この取得ステップにおいて取得した時系列画像から細胞塊の複層化に関する特徴量を順次算出し、算出された複層化に関する特徴量の時系列変化を導出する導出ステップ（Ｓ１３０）と、この導出ステップにおいて導出された複層化に関する特徴量の時系列変化に基づいて細胞塊の成熟度を判定する判定ステップ（Ｓ１４０）と、所定の基準に基づいて、細胞塊を選別する選別ステップ（Ｓ１５０）と、選別した細胞塊を採取、保存する採取保存ステップ（Ｓ１６０）とを備えて、製造方法が構成される。なお、培養される細胞は、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス等の動物由来の細胞であってもよいし、植物由来の細胞であってもよい。また、細胞塊の保存は凍結保存であってもよい。
【符号の説明】
【００９２】
Ａ  局所領域
ＢＳ  培養観察システム
Ｃ  細胞
ＭＣ  細胞塊
Ｐ１，ＧＰ１〜ＧＰ４  画像処理プログラム
５  観察ユニット                    ６  制御ユニット
５４  マクロ観察系                  ５４ｃ  撮像装置
５５  顕微観察系                    ５５ｃ  撮像装置
６１  ＣＰＵ（コンピュータ）        ６２  ＲＯＭ
６３  ＲＡＭ                        １００  画像処理装置
１２０  画像解析部                  １３０  出力部
【図１】
2011013319.tif 000003
【図２】
2011013319.tif 000004
【図３】
2011013319.tif 000005
【図４】
2011013319.tif 000006
【図５】
2011013319.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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