(57)【要約】本発明は、ＤＮＡメチル化を効率的に検出できる方法を提供することを目的とし、具体的には、ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供し、重亜硫酸塩処理後のＤＮＡを第１のＰＣＲに供し、次いでＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲに供した後、増幅ＤＮＡを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供することを含む、ＤＮＡメチル化検出方法に関する。
2011132798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供する工程と、
標的領域の外側の領域に対応する第１プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のＤＮＡを第１のＰＣＲに供する工程と、
標的領域に対応する第２プライマーセットを用いて第１のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを第２のＰＣＲに供する工程と、
第２のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程と、
を含み、第２プライマーセットのプライマーのアニーリング位置は、標的領域に対して第１プライマーセットのプライマーのアニーリング位置の内側に存在する、ＤＮＡメチル化検出方法。
【請求項２】
第２プライマーセットの一方のプライマーは、５’側にＧＣ−ｃｌａｍｐ配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
変性剤濃度勾配ゲルが濃度勾配として変性剤濃度勾配のみを有する、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、ＤＮＡメチル化パターン及び連続性等のＤＮＡメチル化を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティクス（Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）とは、ゲノムでは規定されない遺伝子発現の制御機構を明らかにしようとする、遺伝学又は分子生物学の研究分野である。当該エピジェネティクスを支える主要な分子機構がＤＮＡのメチル化である。ＤＮＡメチル化は、化学的に安定であり、ＤＮＡ配列自体に変化を加えることなく、細胞分裂を通じて伝達される情報である。このようなＤＮＡメチル化の特性により、ＤＮＡメチル化は、例えば組織特異的な遺伝子発現、刷り込み、Ｘ染色体の不活性化、癌化等の様々な現象において重要な役割を担っていると考えられている。近年では、ＤＮＡメチル化酵素遺伝子やＤＮＡメチル化状態の異常に起因する先天的又は後天的疾患、クローン動物におけるＤＮＡメチル化の異常等が既に多数同定されている。
従来において、ＤＮＡメチル化を解析すべく様々な方法が存在する。種々のＤＮＡメチル化解析方法は、解析感度、網羅性、解像度、定量性等において異なる特徴を有し、目的に応じて適宜選択される。例えば、特定の遺伝子の転写抑制機構を明らかにする場合には、１塩基レベルの解像度が必要となる。一方、メチル化の頻度を解析する場合には、定量性や精度も考慮しなければならない。
特定領域におけるメチル化ＤＮＡの検出では、重亜硫酸塩（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）処理による塩基置換反応を行い、ＤＮＡの配列を決定する。当該塩基置換反応では、非メチル化シトシンが重亜硫酸ナトリウムと反応して、ウラシルへと変換される。メチル化シトシンは重亜硫酸ナトリウムと反応しないので、原理上全てのシトシンのメチル化状態を塩基の違いとして検出できる。従来における検出方法としては、例えばＰＣＲを使用したメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、定量的ＰＣＲを使用したＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＭＳＰ法、ＴＡクローニングを使用したＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、質量分析を使用したＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、次世代ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用したパイロシークエンス法等が挙げられる。さらに、重亜硫酸塩反応を必要としないＩＣＯＮ−ｐｒｏｖｅ法も開発されている。
目的タンパク質やマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）の発現量は個々のＣｐＧメチル化の程度のみでは判別が難しく、その特定領域のメチル化パターンや連続性が重要となる。ＣｐＧメチル化程度を検出する方法として様々な方法が開発されているものの、そのパターンや連続性を検出する方法としては、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法のみである。
一方、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法は、ＡｂｒａｍｓとＳｔａｎｔｏｎ（非特許文献１）によって提案された変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法を基本とし、Ｐ．Ｇｕｌｄｂｅｒｇ等（非特許文献２）によって開発された方法である。当該方法では、重亜硫酸塩処理後のサンプルをＰＣＲによって増幅した後、そのアプリコンを、ポリアクリルアミドと変性剤の濃度勾配から成るゲルを使用した電気泳動に供する。ポリアクリルアミドの濃度勾配に基づき二本鎖ＤＮＡの分子量の違いによる分離を行い、さらに変性剤の濃度勾配に基づき二本鎖ＤＮＡの変性度の差異による分離を行い、目的領域中のウラシル（非メチル化シトシン）とシトシン（メチル化シトシン）の違いによる分離が行われる。当該方法は、ＭＳＰ法と同様に視覚的評価を行うことができ、さらに、電気泳動後のゲル中のバンドをシークエンス反応に転用することができる。また、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法と比較すると、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法によれば大幅な時間短縮を行うことができる。
しかしながら、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法では、重亜硫酸塩処理後にＰＣＲによる増幅を行うため、非メチル化シトシンがチミンに変換され、もとからＤＮＡ配列に存在するチミンと混在するため類似した配列が増加することとなる。当該増加に伴い、ＰＣＲにおいてミスアニーリングが生じやすく、ＰＣＲのサイクル数を上げると、非特異的アンプリコンが増幅されてしまうこととなる。微量サンプルの解析やマイナーなＤＮＡメチル化パターンの検出を行う際には、ＰＣＲのサイクル数を上げることが必須であり、その結果、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法によると、解像度の低下が生じる。また、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法は、電気泳動ゲルの作製に、ポリアクリルアミドと変性剤の二つのグラジエントを必要とする。そのため、確認したい標的を変更する場合に、ゲルの最適化を検討する必要があり、大変煩雑である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ａｂｒａｍｓ，Ｅ．Ｓ．及びＳｔａｎｔｏｎ，Ｖ．Ｐ．Ｊｒ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．」，１９９２年，第２１２巻，ｐｐ．７１−１０４
【非特許文献２】Ｇｕｌｄｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｇｒｏｎｂａｋ，Ｋ．，Ａｇｇｅｒｈｏｌｍ，Ａ．，Ｐｌａｔｚ，Ａ．，ｔｈｏｒ  Ｓｔｒａｔｅｎ，Ｐ．，Ａｈｒｅｎｋｉｅｌ，Ｖ．，Ｈｏｋｌａｎｄ，Ｐ．，及びＺｅｕｔｈｅｎ，Ｊ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＧＣ−ｒｉｃｈ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」，１９９８年，第２６巻，第６号，ｐｐ．１５４８−１５４９
【発明の概要】
【０００４】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、ＤＮＡメチル化を効率良く検出できる方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ＤＮＡを重亜硫酸塩処理（以下、「Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理」と称する場合がある）に供し、重亜硫酸塩処理後のＤＮＡを第１のＰＣＲに供し、次いでＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲに供し、増幅ＤＮＡ（アンプリコン）を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（以下、「ＤＧＧＥ」と称する場合がある）に供することで、標的領域のＤＮＡメチル化を効率良く検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
（１）ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供する工程と、標的領域の外側の領域に対応する第１プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のＤＮＡを第１のＰＣＲに供する工程と、標的領域に対応する第２プライマーセットを用いて第１のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを第２のＰＣＲに供する工程と、第２のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程とを含み、第２プライマーセットのプライマーのアニーリング位置は、標的領域に対して第１プライマーセットのプライマーのアニーリング位置の内側に存在する、ＤＮＡメチル化検出方法。
（２）第２プライマーセットの一方のプライマーは、５’側にＧＣ−ｃｌａｍｐ配列を有する、（１）記載の方法。
（３）変性剤濃度勾配ゲルが濃度勾配として変性剤濃度勾配のみを有する、（１）記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−０９８１６３号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、ヒトムチンコアタンパク質１（ＭＵＣ１）遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域の配列（配列番号２；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。
図２は、本発明に係る方法を用いたＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化を解析した結果を示す。
図３は、ヒトムチンコアタンパク質２（ＭＵＣ２）遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域の配列（配列番号７；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。
図４は、本発明に係る方法を用いたＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化を解析した結果を示す。
図５は、ヒトムチンコアタンパク質４（ＭＵＣ４）遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域の配列（配列番号１２；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。
図６は、本発明に係る方法を用いたＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化を解析した結果を示す。
図７は、本発明に係る方法の検出限界を検討した結果を示す。
図８は、ヒト大腸の正常粘膜と癌組織における本発明に係る方法によるヒトＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と当該遺伝子からのｍＲＮＡの発現解析及び免疫組織化学染色によるタンパク質発現解析との比較を示す。
図９は、ヒト大腸の正常粘膜と癌組織における本発明に係る方法によるヒトＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と当該遺伝子からのｍＲＮＡの発現解析及び免疫組織化学染色によるタンパク質発現解析との比較を示す。
図１０は、ヒト大腸の正常粘膜と癌組織における本発明に係る方法によるヒトＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と当該遺伝子からのｍＲＮＡの発現解析及び免疫組織化学染色によるタンパク質発現解析との比較を示す。
図１１は、ヒト手術症例サンプルにおける本発明に係る方法によるヒトＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と免疫組織化学染色による当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現解析との比較を示す。
図１２は、ヒト手術症例サンプルにおける本発明に係る方法によるヒトＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と免疫組織化学染色による当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現解析との比較を示す。
図１３は、ヒト手術症例サンプルにおける本発明に係る方法によるヒトＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と免疫組織化学染色による当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現解析との比較を示す。
図１４は、ヒトの膵嚢胞性腫瘍の嚢胞内液サンプルと膵癌症例から得られた膵液サンプルにおける本発明に係る方法によるヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と免疫組織化学染色による当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現解析との比較を示す。
図１５は、ヒトの膵嚢胞性腫瘍の嚢胞内液サンプルと膵癌症例から得られた膵液サンプルにおける本発明に係る方法によるヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と免疫組織化学染色による当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現解析との比較を示す。
図１６は、ヒトの胆管嚢胞性腫瘍の嚢胞内液サンプルと肝外胆管癌（ＥＨＢＤＣ）の胆汁サンプルにおける本発明に係る方法によるヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と免疫組織化学染色による当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現解析との比較を示す。
図１７は、ホルマリン固定時間及びパラフィン包埋時間によるＤＮＡメチル化への影響に関する本発明に係る方法による評価を示す。
図１８は、ヒトムチンコアタンパク質５ＡＣ（ＭＵＣ５ＡＣ）遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域の配列（配列番号２９；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。
図１９は、本発明に係る方法を用いたＭＵＣ５ＡＣ遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化を解析した結果を示す。
図２０は、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法と本発明に係る方法とを比較した結果を示す。
図２１は、細胞株においてＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法と本発明に係る方法との検出力を比較した結果を示す。
図２２は、組織サンプルにおいてＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法と本発明に係る方法との検出力を比較した結果を示す。
図２３は、体液サンプルにおいてＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法と本発明に係る方法との検出力を比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るＤＮＡメチル化検出方法（以下、「ＭＳＥ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法」と称する）は、（１）ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供する工程、（２）標的領域の外側の領域に対応する第１プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のＤＮＡを第１のＰＣＲに供する工程、（３）標的領域に対応する第２プライマーセットを用いて第１のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを第２のＰＣＲに供する工程、（４）第２のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程を含む方法である。ＭＳＥ法によれば、例えば微量のＤＮＡサンプルにおいてもＤＮＡメチル化を検出でき、またＤＮＡメチル化パターン又は連続性を効率良く検出できる。
ここで、ＭＳＥ法に適用するＤＮＡは、ＤＮＡメチル化の現象が生じるいずれの生物（例えば細菌、ヒト等の哺乳動物等）由来の生物学的サンプル（例えば器官、組織、細胞、体液等）に由来する（抽出した）ＤＮＡであってもよい。例えば、癌組織由来の組織、体液及び細胞等から抽出したＤＮＡをＭＳＥ法に適用することができる。
以下に、ＭＳＥ法の各工程について説明する。
（１）ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供する工程
ＭＳＥ法では、先ずＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供する。当該処理により、非メチル化シトシンが重亜硫酸塩によりスルホン化され、さらに加水分解により脱アミノ化され、さらに、アルカリ存在下での脱スルホン化により、ウラシルに変換される。これに対して、メチル化されたシトシンは、重亜硫酸塩処理してもウラシルに変換されない。このため、ＣｐＧ含有ＤＮＡの塩基配列中のシトシンがメチル化されているか否かを、重亜硫酸塩処理により、ウラシルに変換されているかどうかで区別する。なお、市販の重亜硫酸塩処理用のキット（例えば、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製））を使用して、当該キットのマニュアルに準じて、ＤＮＡを重亜硫酸塩処理に供することができる。
（２）重亜硫酸塩処理後のＤＮＡを第１のＰＣＲに供する工程
ＭＳＥ法では、次いで標的領域の外側の領域に対応する第１プライマーセットを用いて重亜硫酸塩処理後のＤＮＡを第１のＰＣＲに供する。重亜硫酸塩処理後にＰＣＲによる増幅により、非メチル化シトシンがチミンに変換され、もとからＤＮＡ配列に存在するチミンと混在するため類似した配列が増加することとなる。当該増加に伴い、ＰＣＲにおいてミスアニーリングが生じやすく、ＰＣＲのサイクル数を上げると、非特異的アンプリコンが増幅されてしまうこととなる。そこでＭＳＥ法では、このようなノイズの発生を防止すべく、標的領域の外側に対応する第１プライマーセットを用いて第１のＰＣＲを行い、次いで、第２のＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行うことで、当該ノイズを低下させる。当該ノイズの低下により、ＰＣＲサイクル数の増加が可能となり、検出限界を向上させることができる（すなわち、微量のＤＮＡサンプルを使用することができる）。
ここで、標的領域とは、ＤＮＡにおける検出対象のメチル化状態を有する領域を意味する。標的領域としては、例えばＣＧのジヌクレオチドが偏って存在する領域であり、メチル化の対象であるＣｐＧアイランド（又はＣｐＧ部位）が挙げられる。例えば哺乳動物の多くの遺伝子の５’上流領域にＣｐＧアイランドが存在することが知られている。また、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法によって事前にＤＮＡにおけるＣｐＧ部位を決定し、重要なＣｐＧ部位のみを含む領域を標的領域とすることもできる。当該標的領域決定方法によれば、検出解像度を向上させることができる。標的領域の長さとしては、２００〜４００塩基が挙げられる。
第１プライマーセットの一対のプライマーは、標的領域の外側の領域に対応し、当該外側の領域にアニーリングするように設計される。当該外側の領域は、標的領域の両末端の各々から外側方向に例えば１０〜１００塩基（好ましくは２０〜８０塩基）離れた位置とすることができる。また、第１プライマーセットのプライマーの長さとしては、例えば１５〜３０塩基、好ましくは１８〜２２塩基が挙げられる。
ＰＣＲは、例えば増幅産物の長さやＧＣ含量等を考慮し、ＰＣＲ反応液組成（例えばＰＣＲバッファー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、プライマー等を含む）、熱変性、アニーリング、伸長反応等における温度設定並びにサイクル数を適宜決定し、行うことができる。このようなＰＣＲ条件は、例えば使用するポリメラーゼに最適な条件下で行う等適宜決定することができる。なお、当該ＰＣＲによれば、非メチル化シトシンから変換されたウラシルは、チミンへと変換される。
（３）第１のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを第２のＰＣＲに供する工程
ＭＳＥ法では、第１のＰＣＲ後、標的領域に対応する第２プライマーセットを用いて第１のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ（増幅産物）を第２のＰＣＲに供する。当該第２のＰＣＲは、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲと呼ばれるものである。すなわち、第１のＰＣＲ後の増幅産物の内側に第２のプライマーセットのプライマーを設計し、第１のＰＣＲ後の増幅産物を新たな鋳型として第２のＰＣＲを行う。
第２プライマーセットのプライマーは、アニーニング位置が、標的領域を基準として第１プライマーセットのプライマーのアニーニング位置の内側に存在するように設計する。すなわち、第２プライマーセットのプライマーのアニーニング位置は、標的領域の両末端又はその隣接領域とする。なお、第２プライマーセットのプライマーと第１プライマーセットのプライマーとは、第２プライマーセットのプライマーのアニーリング位置が第１プライマーセットのプライマーのアニーニング位置の内側にある限り、一部重複していてもよい。第２プライマーセットのプライマーの長さとしては、例えば１５〜３０塩基、好ましくは１８〜２２塩基が挙げられる。なお、第２のプライマーの一方のプライマー（例えば、フォワード（センス）プライマー）の５’側にＧＣ−ｃｌａｍｐ配列を付加することで、後続の変性剤濃度勾配ゲル電気泳動工程において、分離能を向上させることができる。ここで、ＧＣ−ｃｌａｍｐ配列とは、３０〜５０塩基程度のＧ−Ｃが豊富で安定な配列を意味し、例えば配列番号１に記載の塩基配列が挙げられる。
また、第１のＰＣＲと同様に、ＰＣＲは、標的領域の長さやＧＣ含量等を考慮し、ＰＣＲ反応液組成（例えばＰＣＲバッファー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰミックス、プライマー等を含む）、熱変性、アニーリング、伸長反応等における温度設定並びにサイクル数を適宜決定し、行うことができる。
（４）第２のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供する工程
ＭＳＥ法では、第２のＰＣＲ後、増幅ＤＮＡを変性剤濃度勾配ゲル電気泳動に供することで、増幅ＤＮＡを分離し、視覚的にメチル化パターンや連続性を評価することができる。
従来のＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法では、サンプル中に非特異的増幅断片が多く、ＤＮＡ鎖長による分離のために分離効率を上げるべく、電気泳動ゲルの作製において、ゲル成分であるアクリルアミドと変性剤の双方の濃度勾配を必要とした。このように、従来のＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法では、２種の濃度勾配を必要とし、標的領域毎にゲルの最適化操作が煩雑であった。一方、ＭＳＥ法では、上記第１のＰＣＲ及び第２のＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行うことで、非特異的な増幅を抑え、非特異的増幅断片によるノイズを低下させる。従って、高い検出感度の増幅ＤＮＡを使用することで、ＭＳＥ法に使用するゲルは変性剤の濃度勾配のみを有するものとすることができ、再現性を向上させ、且つゲルの最適化を容易に行うことができる。
変性剤濃度勾配ゲルは、例えばゲル成分（アクリルアミド）、尿素とホルムアミドとの組合せ等の変性剤、ＴＡＥバッファー等を使用して作製される。具体的には、例えばポリアクリルアミドゲルを使用し、且つ変性剤として尿素及びホルムアミドの組合せを使用する場合には、増幅産物の長さ等に応じて、ゲルにおいて例えば６〜１５％（好ましくは８〜１０％）のアクリルアミド濃度となるように、且つ尿素及びホルムアミドの組合せの濃度勾配が例えば１０％→５０％〜２０％→３０％（好ましくは濃度勾配の幅が１０％以上）となるように作製する。また、最適条件の検討としては、濃度勾配の幅の広い（１０％〜５０％）ゲルで検討し、濃度勾配の幅を狭くする方法を検討する。また、検出したバンドがスメアを呈する場合はアクリルアミドの濃度を上げる。なお、変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（ＤＮＡが泳動する方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつける。
ＭＳＥ法では、第２のＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ（例えば４〜１５μｌ、好ましくは５〜１０μｌ）を変性剤濃度勾配ゲルにアプライし、電気泳動に供する。電気泳動条件としては、例えば泳動槽温度：６０℃、定電圧：７０〜２５０Ｖ及び泳動時間：３００〜９００分が挙げられる。
電気泳動後、変性剤濃度勾配ゲルをエチジウムプロマイド染色、もしくはゲルレッドによる染色に供することで、アプライした増幅ＤＮＡのバンドを視覚的に観察することができる。ＧとＣとの対における水素結合は３本であり、一方、ＡとＴとの対における水素結合は２本である。従って、ＧＣの結合は、ＡＴの結合よりも変性剤に対して耐性を有する。そのため、ＧＣの結合を多数有するＤＮＡは、ＡＴの結合を多数有するＤＮＡと比べて変性剤濃度勾配ゲルにおいてより泳動することとなる。
ＭＳＥ法では、ＤＮＡにおける非メチル化シトシンがウラシル、そしてチミンに変換されているため、非メチル化シトシンを有する標的領域に対応する増幅ＤＮＡは、メチル化シトシンを有する標的領域に対応する増幅ＤＮＡよりも泳動速度が遅く、変性剤濃度勾配ゲルの陰極に近い側に位置することとなる。一方、メチル化シトシンを有する標的領域に対応する増幅ＤＮＡは、泳動速度が早く、変性剤濃度勾配ゲルの陽極に近い側に位置することとなる。従って、当該泳動の違いにより、メチル化シトシンを有する標的領域と非メチル化シトシンを有する標的領域とを判断でき、標的領域におけるメチル化パターン又は連続性を評価することができる。
さらに、電気泳動後の変性剤濃度勾配ゲルから目的のバンドを切り出し、バンド中の増幅ＤＮＡを抽出し、当該抽出した増幅ＤＮＡの塩基配列を決定することで、ＤＮＡメチル化の状態を一塩基レベルで評価することもできる。
以上に説明したＭＳＥ法によれば、ＤＮＡメチル化を効率的に且つ簡便に検出できる。ＤＮＡメチル化は、例えば組織特異的な遺伝子発現、刷り込み、Ｘ染色体の不活性化、癌化等の様々な現象において重要な役割を担っており、またＤＮＡメチル化酵素遺伝子やＤＮＡメチル化状態の異常に起因する先天的又は後天的疾患、クローン動物におけるＤＮＡメチル化の異常が知られている。従って、ＤＮＡメチル化が関与する疾患等の診断にＭＳＥ法を有効に利用することができる。
また、ＭＳＥ法は、従来のＤＮＡメチル化検出方法と比べて以下のような利点を有する。
従来、エピジェネティクスな領域で多用されているＭＳＰ法は、視覚的にＤＮＡメチル化を評価できる。ＭＳＰ法におけるメチル化検出は、プライマーを設計したＣｐＧ部位に依存する。そのため、標的領域中のＣｐＧ部位のメチル化パターンが均一な場合には高い解像度で評価を行うことができるものの、モザイク状の場合、そのメチル化解析の解像度が低下してしまう。また、リアルタイムＭＳＰ法におけるメチル化検出は、プローブを設計したＣｐＧ部位に依存しているため、評価可能な標的領域が狭く、ＭＳＰ法と同様に標的領域中のＣｐＧ部位のメチル化パターンがモザイク状の場合には解像度が落ちる。一方、ＭＳＥ法は、増幅した標的領域において、ＣｐＧ部位のメチル化パターン全てを視覚的に評価することができる。
また、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法では、増幅した標的領域をＴＡクローニングにより配列決定を行う。しかしながら、当該方法では、「確からしさ」を得るために、１０クローン以上が必要であり、時間を要する。また、メチル化パターンの多数を決定するためには低コストで評価できるが、少数のメチル化パターンの評価には向かない。一方、ＭＳＥ法は、ＰＣＲにおける増幅数（サイクル数）を増やすことで、マイナーなメチル化パターンも評価することができる。また、電気泳動後に個々のバンドを切り出し、精製し、当該バンド中の標的領域の配列決定を行うことで、メチル化パターンについて配列を確認することができ、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法と同等の評価を全ての配列で行うことができる。
さらに、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法は、個々のＣｐＧのメチル化を評価するには定量性、解像度ともに優れた方法である。しかしながら、ＣｐＧメチル化パターンの決定を行うことができない。従って、ＣｐＧメチル化パターンが標的領域中に混在する場合には、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法での評価は難しい。一方、ＭＳＥ法は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法と同等の検出感度を有し、メチル化パターンの評価を行うことができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００７】
ＭＳＥ法を用いたムチンコアタンパク質１（ＭＵＣ１）遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析
本実施例では、ＭＳＥ法を使用して、ヒトＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化を解析した。図１は、ヒトＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域の配列（配列番号２；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。当該領域は、ＣｐＧ部位１７２−１８１を有する。本実施例では、当該ＣｐＧ部位を含む領域を標的領域とする。なお、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｙｕｋａｒｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｔｏｍｏｆｕｍｉ  Ｈａｍａｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００８）ＭＵＣ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３−Ｋ９  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８（８）：２７０８−１６）と同様に、ＣｐＧ部位の番号は、ヒトＭＵＣ１遺伝子の推定プロモーター上流（当該遺伝子の転写開始点より上流２，７５３ｂｐ）より順にナンバリングされている。
１−１．サンプル作製及び方法
各細胞株（ＨＰＡＦ  ＩＩ（ヒト膵癌由来）、ＢｘＰＣ３（ヒト膵癌由来）、ＰＡＮＣ１（ヒト膵癌由来）、ＭＣＦ−７（ヒト乳癌由来）、Ｔ−４７Ｄ（ヒト乳癌由来）、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ヒト乳癌由来）、Ｃａｃｏ２（ヒト結腸腺癌由来）、ＬＳ１７４Ｔ（ヒト大腸癌由来）、Ａ４２７（ヒト肺癌由来）及びＮＣＩ−Ｈ２９２（ヒト肺癌由来））からＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して抽出した。
次いで、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、抽出したＤＮＡをＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理に供した。
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡを、以下のプライマーを使用したＰＣＲに供した。
プライマーセット（小文字の塩基配列はＧＣ  ｃｌａｍｐである）：
2011132798.tif 000003
2011132798.tif 000004
各ＰＣＲは、図１に示すように、１ｓｔＰＣＲは上記Ｐｒｉｍｅｒ  １−１とＰｒｉｍｅｒ  １−２を用いて、２ｎｄＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）は上記Ｐｒｉｍｅｒ  １−３とＰｒｉｍｅｒ  １−４を用いて行った。ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用した。ＰＣＲ条件及び温度設定を下記表１に示す。
【表１】
2011132798.tif 000005
次いで、下記表２に示すＤＧＧＥゲル条件下の変性剤濃度勾配ゲルを使用し、２ｎｄＰＣＲ後の反応液をＤＧＧＥに供した。なお、電気泳動条件は、泳動槽温度：６０℃、定電圧：２３０Ｖ、泳動時間：３００分であった。電気泳動槽は、Ｄｃｏｄｅシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用した。
【表２】
2011132798.tif 000006
2011132798.tif 000007
１−２．解析結果
各細胞株における解析結果を図２に示す。（Ａ）のパネルは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法による各細胞株のヒトＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域におけるメチル化の評価を示す。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法は、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｙｕｋａｒｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｔｏｍｏｆｕｍｉ  Ｈａｍａｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００８）ＭＵＣ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３−Ｋ９  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８（８）：２７０８−１６）を参照して同様に行った。緑色から黄色、赤色へのグラデーションは、非メチル化（０％）からメチル化（１００％）の程度を示す。四角で囲んだ領域が、本実施例における標的領域のＣｐＧ部位である。一方、（Ｂ）のパネルは、本実施例におけるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける上部から底部方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。
図２に示すように、ＭＳＥ法によるメチル化の評価は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法による評価と高い相関を示した。Ａ４２７株及びＮＣＩ−Ｈ２９２株については、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法による評価を行っていないものの、そのメチル化の程度は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３株やＣａｃｏ２株と同等であることを容易に示唆することができる。
【実施例２】
【０００８】
ＭＳＥ法を用いたムチンコアタンパク質２（ＭＵＣ２）遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析
本実施例では、ＭＳＥ法を使用して、ヒトＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化を解析した。図３は、ヒトＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域の配列（配列番号７；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。当該領域は、ＣｐＧ部位３６−４３を有する。本実施例では、当該ＣｐＧ部位を含む領域を標的領域とする。なお、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｔｏｍｏｆｕｍｉ  Ｈａｍａｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００６）ＭＵＣ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１９（８）：１８５０−７）と同様に、ＣｐＧ部位の番号は、ヒトＭＵＣ２遺伝子の推定プロモーター上流（当該遺伝子の転写開始点より上流１，９８９ｂｐ）より順にナンバリングされている。
２−１．サンプル作製及び方法
実施例１と同様にして、各細胞株（ＨＰＡＦ  ＩＩ、ＢｘＰＣ３、ＰＡＮＣ１、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、Ｃａｃｏ２、ＬＳ１７４Ｔ、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＡＣＣ３（腺様嚢胞癌由来））からＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して抽出した後、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、抽出したＤＮＡをＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理に供した。
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡを、以下のプライマーを使用したＰＣＲに供した。
プライマーセット（小文字の塩基配列はＧＣ  ｃｌａｍｐである）：
2011132798.tif 000008
各ＰＣＲは図３に示すように、１ｓｔＰＣＲは上記Ｐｒｉｍｅｒ  ２−１とＰｒｉｍｅｒ  ２−２を用いて、２ｎｄＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）は上記Ｐｒｉｍｅｒ  ２−３とＰｒｉｍｅｒ  ２−４を用いて行った。ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用した。ＰＣＲ条件及び温度設定を下記表３に示す。
【表３】
2011132798.tif 000009
次いで、下記表４に示すＤＧＧＥゲル条件下の変性剤濃度勾配ゲルを使用し、２ｎｄＰＣＲ後の反応液をＤＧＧＥに供した。なお、電気泳動条件及び電気泳動槽は、実施例１と同様であった。
【表４】
2011132798.tif 000010
２−２．解析結果
各細胞株における解析結果を図４に示す。（Ａ）のパネルは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法による各細胞株のヒトＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域におけるメチル化の評価を示す。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法は、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｔｏｍｏｆｕｍｉ  Ｈａｍａｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００６）ＭＵＣ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１９（８）：１８５０−７）を参照して同様に行った。四角で囲んだ領域が本実施例における標的領域のＣｐＧ部位である。一方、（Ｂ）のパネルは、本実施例におけるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける上部から底部方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。
図４から判るように、ＭＳＥ法によるＭＵＣ２プロモーター領域のメチル化評価においても、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法による評価と高い相関を示した。
【実施例３】
【０００９】
ＭＳＥ法を用いたムチンコアタンパク質４（ＭＵＣ４）遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析
本実施例では、ＭＳＥ法を使用して、ヒトＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化を解析した。図５は、ヒトＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域の配列（配列番号１２；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。当該領域は、ＣｐＧ部位１０８−１１２を有する。本実施例では、当該ＣｐＧ部位を含む領域を標的領域とする。なお、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｙｕｋａｒｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００９）Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ＣｐＧ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＵＣ４．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１００（２）：３４４−５１）と同様に、ＣｐＧ部位の番号は、ヒトＭＵＣ４遺伝子の推定プロモーター上流（当該遺伝子の転写開始点より上流３，６２２ｂｐ）より順にナンバリングされている。
３−１．サンプル作製及び方法
実施例１と同様にして、各細胞株（ＨＰＡＦ  ＩＩ、ＢｘＰＣ３、ＰＡＮＣ１、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、Ｃａｃｏ２、ＬＳ１７４Ｔ、Ａ４２７、ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＡＣＣ３）からＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して抽出した後、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、抽出したＤＮＡをＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理に供した。
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡを、以下のプライマーを使用したＰＣＲに供した。
プライマーセット（小文字の塩基配列はＧＣ  ｃｌａｍｐである）：
2011132798.tif 000011
2011132798.tif 000012
各ＰＣＲは図５に示すように、１ｓｔＰＣＲは上記Ｐｒｉｍｅｒ  ４−１とＰｒｉｍｅｒ  ４−２を用いて、２ｎｄＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）は上記Ｐｒｉｍｅｒ  ４−３とＰｒｉｍｅｒ  ４−４を用いて行った。ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用した。ＰＣＲ条件及び温度設定を下記表５に示す。
【表５】
2011132798.tif 000013
次いで、下記表６に示すＤＧＧＥゲル条件下の変性剤濃度勾配ゲルを使用し、２ｎｄＰＣＲ後の反応液をＤＧＧＥに供した。なお、電気泳動条件及び電気泳動槽は、実施例１と同様であった。
【表６】
2011132798.tif 000014
2011132798.tif 000015
３−２．解析結果
各細胞株における解析結果を図６に示す。（Ａ）のパネルは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法による各細胞株のヒトＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域におけるメチル化の評価を示す。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法は、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｙｕｋａｒｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００９）Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ＣｐＧ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＵＣ４．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１００（２）：３４４−５１）を参照して同様に行った。四角で囲んだ領域が本実施例における標的領域のＣｐＧ部位である。一方、（Ｂ）のパネルは、本実施例におけるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける上部から底部方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。
図６に示すように、ＭＳＥ法によるメチル化の評価は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法による評価と高い相関を示した。
【実施例４】
【００１０】
ＭＳＥ法の検出限界の検討
ＭＳＥ法の検出限界を検討するために、実施例１におけるヒトＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析においてＤＮＡ高メチル化を呈する細胞株（ＰＡＮＣ１）とＤＮＡ低メチル化を呈する細胞株（ＢｘＰＣ３）の細胞数を計測し、比率に応じて混合したものよりＤＮＡを抽出し、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理を行ったものをサンプルとし、そのバンドの検出限界を確認した。サンプルの調製は、ＢｘＰＣ３細胞株由来のＤＮＡ含有率を１００％から順次０．１％まで低下させ、最終的にＢｘＰＣ３細胞株由来のＤＮＡを含まずＰＡＮＣ１細胞株由来のＤＮＡのみとした。ＰＣＲ及びＤＧＧＥは、実施例１と同様に行った。
結果を図７に示す。（Ａ）のパネルは、本実施例におけるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける上部から底部方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。（Ｂ）のパネルは、同じサンプルを用いて行ったＭＳＰ法によるメチル化解析の結果である。ＭＳＰ法は、ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ：ＭＳＰ−ＵＬ（ＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＡＴＡＡＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴ：配列番号１７）；ＭＳＰ−ＵＲ（ＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡ：配列番号１８）；ＭＳＰ−ＭＬ（ＧＡＴＣＧＧＴＡＴＡＡＡＧＣＧＧＴＡＧＧＣ：配列番号１９）；及びＭＳＰ−ＭＲ（ＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＧ：配列番号２０）を用いて、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｙｕｋａｒｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｔｏｍｏｆｕｍｉ  Ｈａｍａｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００８）ＭＵＣ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３−Ｋ９  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８（８）：２７０８−１６）を参照して行った。
また、（Ｂ）のパネルにおいて「Ｕ」は非メチル化を示し、「Ｍ」はメチル化を示す。（Ｃ）のパネルは、本実施例における非メチル化バンドの発光をＩｍａｇｅＪにより数値化し、ＢｘＰＣ３細胞株由来のＤＮＡ含有率に対してブロットしたグラフである。横軸はＢｘＰＣ３細胞株由来のＤＮＡ含有率（％）を示す。
図７（Ａ）に示すように、非メチル化のバンドがＢｘＰＣ３細胞株由来のＤＮＡ含有率と共に低下しているのが示されている。また、図７（Ｂ）に示すように、この非メチル化バンドの発光をＩｍａｇｅＪにより数値化し、ＢｘＰＣ３細胞株由来のＤＮＡ含有率に対してブロットすると、そのＲ２は０．９９３と非常に高い相関関係を示した。この結果、ＭＳＥ法は、０．１％の含有率においても有意に検出することが可能であり、検出限界はこれ以下に存在することを示唆している。
既知のメチル化測定方法における検出限界は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法で１０％、パイロシークエンス法で５％であることからも、ＭＳＥ法は非常に高い精度で検出していると考えられる。
【実施例５】
【００１１】
ヒト大腸の正常粘膜と癌組織におけるＭＳＥ法によるヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と当該遺伝子からのｍＲＮＡの発現解析及び免疫組織化学染色によるタンパク質発現解析との比較
ヒト大腸の正常粘膜と癌組織について、間質の混入を来すことなく理想的に分離できるヒト大腸の腺管分離サンプルにおいて、ヒトＭＵＣ１（図８）、ＭＵＣ２（図９）及びＭＵＣ４（図１０）遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析を実施例１〜３と同様にＭＳＥ法にて行い、またこれら遺伝子のｍＲＮＡの発現解析及び免疫組織化学染色によるこれら遺伝子によりコードされるタンパク質の発現確認との比較を行った。
結果を図８〜１０に示す。図８〜１０において、「Ｎ」はヒト大腸正常粘膜サンプルを示し、「Ｔ」はヒト大腸癌組織サンプルを示す。（Ａ）のパネルは、ＲＴ−ＰＣＲにより検出した各サンプルにおけるｍＲＮＡ発現量を示す。（Ｂ）のパネルは、ＭＳＥ法によるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける上部から底部方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。従って、「Ｕ」は非メチル化を示し、「Ｍ」はメチル化を示す。（Ｃ）のパネルは、免疫組織化学染色によるヒトＭＵＣ遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を示す写真である。
なお、タンパク質の発現を検索する免疫組織化学染色に際して、ＭＵＣ１に関しては、従来の抗ＭＵＣ１抗体である「ＭＵＣ１−ＤＦ３」（ＴＦＢ社製）のみでなく、「ＭＵＣ１  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ」に対する新規開発の抗ＭＵＣ１抗体（ハイブリドーマ株ＭＵＣ１−ｃｏｍｍｏｎ（ｃｌｏｎｅ  ０１４Ｅ）由来（特願２０１０−０２８７２９、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８６７）；以下、「ＭＵＣ１−０１４Ｅ」と称する）をも用いた。また、ＭＵＣ２に関しては、抗ＭＵＣ２抗体「ＭＵＣ２−Ｃｃｐ５８」（ｎｏｖｏ社製）を使用した。さらに、ＭＵＣ４に関しては、Ｎ末端側ｓｕｂｕｎｉｔに対する抗体である抗ＭＵＣ４抗体「ＭＵＣ４−８Ｇ７」（ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｎｅｂｒａｓｋａ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｅｎｔｅｒ，ｏｍａｈａ）とＣ末端側ｓｕｂｕｎｉｔに対する抗体である抗ＭＵＣ４抗体「ＭＵＣ４−１Ｇ８」（ｚｙｍｅｄ社製）の双方を用いた。以下の実施例６〜９においても同様の抗体を使用した。
ヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化の程度とこれら遺伝子からのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現とは概ね逆相関関係を示す。
図８に示すように、ＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、従来の抗ＭＵＣ１抗体である「ＭＵＣ１−ＤＦ３」の染色結果とは一致しないが、ＲＴ−ＰＣＲによるＭＵＣ１ｍＲＮＡの測定値、並びに「ＭＵＣ１−０１４Ｅ」免疫組織化学染色の結果とは高い相関を示し、ヒト大腸の腺管分離サンプルにおいてＭＳＥ法によるＭＵＣ１遺伝子のメチル化解析が可能であることを示すことができた。
図９に示すように、ＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、大腸正常粘膜では、大多数の検体が「低メチル化」であり、ＲＴ−ＰＣＲによるＭＵＣ２ｍＲＮＡの測定値、並びにＭＵＣ２の陽性所見と一致した。一方、癌組織においては、大多数の検体が「低メチル化」であり、ＲＴ−ＰＣＲによるＭＵＣ２ｍＲＮＡの測定値と概ね一致したが、ＭＵＣ２の免疫組織化学染色結果とは一致しない例がかなり多く、この所見は、大腸癌組織におけるＭＵＣ２タンパク質の発現には、ＭＵＣ２ｍＲＮＡの発現後の「ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ」因子の影響があることを示していると考えられる。以上を総合すると、ＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、ＭＵＣ２ｍＲＮＡの発現とは概ね一致しており、ＭＳＥ法によるＭＵＣ２遺伝子のメチル化解析が可能であることを示すことができた。
図１０に示すように、ＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、全例において、大腸正常粘膜も大腸癌も「低メチル化」であり、ＲＴ−ＰＣＲによるＭＵＣ４ｍＲＮＡの測定値と一致したが、「ＭＵＣ４−８Ｇ７」の免疫組織化学染色結果とは一致する例と一致しない例があり、この所見は、大腸癌組織におけるＭＵＣ４タンパク質の発現には、ＭＵＣ４ｍＲＮＡの発現後の「ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ」因子の影響があることを示していると考えられる。以上を総合すると、ＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、ＭＵＣ４ｍＲＮＡの発現とは完全に一致しており、ＭＳＥ法によるＭＵＣ４遺伝子のメチル化解析が可能であることを示すことができた。
図８〜１０に示すように、ＭＳＥ法において、低メチル化を呈したサンプル全てにおいて、ｍＲＮＡの高発現を示した。さらに、メチル化の程度は、タンパク質の発現とも高い相関を示した。従って、ヒト大腸の腺管分離サンプルにおいてもＭＳＥ法によるメチル化解析が可能であると考えられる。
【実施例６】
【００１２】
ヒト手術症例サンプルにおけるＭＳＥ法によるヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と免疫組織化学染色による当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現解析との比較
大腸癌及び膵癌のヒト手術症例標本の腫瘍部と正常組織から得られたサンプルにおいて、ヒトＭＵＣ１（図１１）、ＭＵＣ２（図１２）及びＭＵＣ４（図１３）遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析を実施例１〜３と同様にＭＳＥ法にて行い、またこれら遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を免疫組織化学染色によって確認し、比較を行った。
結果を図１１〜１３に示す。図１１〜１３において、「Ｎ」は正常組織サンプルを示し、「Ｔ」は癌組織サンプルを示す。（Ａ）のパネルは、ＭＳＥ法によるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける上部から底部方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。従って、「Ｕ」は非メチル化を示し、「Ｍ」はメチル化を示す。（Ｂ）のパネルは、免疫組織化学染色によるヒトＭＵＣ遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を示す写真である。
図１１に示すように、ＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、従来の抗ＭＵＣ１抗体である「ＭＵＣ１−ＤＦ３」の染色結果と、正常組織においては一致せず、腫瘍部でも一致しないことがあったが、ＭＵＣ１のｍＲＮＡ発現を反映すると考えられる「ＭＵＣ１−０１４Ｅ」の染色性とは高い相関を示し、ヒト手術症例サンプルにおいてＭＳＥ法によるＭＵＣ１遺伝子のメチル化解析が可能であることを示すことができた。
図１２に示すように、ＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、一部の大腸癌組織において不一致例をみたが、概ね高い相関を示し、常にＭＵＣ２が陽性である大腸正常粘膜では、図９の腺管分離サンプルの場合と同様全例「低メチル化」であり、常にＭＵＣ２が陰性である膵正常組織においては全例「高メチル化」、ＭＵＣ２が陰性の膵癌組織でも「高メチル化」であったが、例外的に癌腺管の一部が腸上皮化生をきたした膵癌組織では「低メチル化」バンドも観察され、ヒト手術症例サンプルにおいてＭＳＥ法によるＭＵＣ２遺伝子のメチル化解析が可能であることを示すことができた。
図１３に示すように、ＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、Ｎ末端側ｓｕｂｕｎｉｔに対する抗体である「ＭＵＣ４−８Ｇ７」とＣ末端側ｓｕｂｕｎｉｔに対する抗体である「ＭＵＣ４−１Ｇ８」の双方による免疫組織化学染色を総合した結果と高い相関を示し、ヒト手術症例サンプルにおいてＭＳＥ法によるＭＵＣ４遺伝子のメチル化解析が可能であることを示すことができた。
【実施例７】
【００１３】
ヒトの膵嚢胞性腫瘍の嚢胞内液サンプルと膵癌症例から得られた膵液サンプルにおけるＭＳＥ法によるヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と免疫組織化学染色による当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現解析との比較
ヒトの膵嚢胞性腫瘍である膵管内乳頭粘液性腫瘍・腸型（ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）手術症例の嚢胞内液サンプル又は膵癌（ＰＤＡＣ）症例から逆行性膵管造影時に得られた膵液サンプルにおいて、ヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析を実施例１〜３と同様にＭＳＥ法にて行い、また由来する腫瘍組織におけるこれら遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を免疫組織化学染色によって検索し、比較を行った。
結果を図１４に示す。図１４において、（Ａ）のパネルは、ＭＳＥ法によるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける上部から底部方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。従って、「Ｕ」は非メチル化を示し、「Ｍ」はメチル化を示す。（Ｂ）のパネルは、免疫組織化学染色によるヒトＭＵＣ遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を示す写真である。
図１４の左パネルに示すように、ＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌとＰＤＡＣの双方において「低メチル化」であり、従来の抗ＭＵＣ１抗体である「ＭＵＣ１−ＤＦ３」の染色結果とは一致しない場合でも、ＭＵＣ１のｍＲＮＡ発現を反映すると考えられる「ＭＵＣ１−０１４Ｅ」が陽性の染色結果とは相関を示した。
図１４の中央パネルに示すように、ＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌにおいて「低メチル化」であり、ＭＵＣ２陽性の染色結果と一致していたが、ＰＤＡＣにおける「低メチル化」が主体である結果はＭＵＣ２陰性の染色結果と一致しなかった。
図１４の右パネルに示すように、ＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌにおいて「低メチル化」から「高メチル化」にわたり、多くのバンドが認められ、「ＭＵＣ４−８Ｇ７」の陽性と陰性が混じり合った免疫組織化学染色と相関を示した。ＰＤＡＣにおける「低メチル化」の結果は、「ＭＵＣ４−１Ｇ８」の陽性の染色結果と一致していた。
以上の結果から、ヒトの膵嚢胞性腫瘍（ＩＰＭＮ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）の嚢胞内液サンプルや膵癌症例から得られた膵液サンプルにおいてもＭＳＥ法によるメチル化解析が有用である可能性が示された。
【実施例８】
【００１４】
ヒトの膵嚢胞性腫瘍の嚢胞内液サンプルと膵癌症例から得られた膵液サンプルにおけるＭＳＥ法によるヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と免疫組織化学染色による当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現解析との比較
ヒトの膵管内乳頭粘液性腫瘍・胃型（ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃ）手術症例の嚢胞内液サンプルにおいて、ヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析を実施例１〜３と同様にＭＳＥ法にて行い、由来する腫瘍組織におけるこれら遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を免疫組織化学染色によって検索し、比較を行った。なお、ＰＤＡＣについての結果は、図１４と同一のものである。
結果を図１５に示す。図１５において、（Ａ）のパネルは、ＭＳＥ法によるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける上部から底部方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。従って、「Ｕ」は非メチル化を示し、「Ｍ」はメチル化を示す。（Ｂ）のパネルは、免疫組織化学染色によるヒトＭＵＣ遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を示す写真である。
図１５の左パネルに示すように、ＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃにおいて「低メチル化」と「高メチル化」のバンドが認められ、「ＭＵＣ１−０１４Ｅ」が陽性の染色結果とは、「低メチル化」のバンドは相関を示したが、「高メチル化」のバンドは相関を示さなかった。
図１５の中央パネルに示すように、ＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃにおいて「高メチル化」であり、ＭＵＣ２陰性の染色結果と一致していた。
図１５の右パネルに示すように、ＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃにおいて「高メチル化」であり、「ＭＵＣ４−８Ｇ７」と「ＭＵＣ４−１Ｇ８」の双方とも陰性の染色結果と一致していた。
以上の結果から、ヒトの膵嚢胞性腫瘍（ＩＰＭＮ−ｇａｓｔｒｉｃ）の嚢胞内液サンプルや膵癌症例から得られた膵液においてもＭＳＥ法によるメチル化解析が有用である可能性が示された。
【実施例９】
【００１５】
ヒトの胆管嚢胞性腫瘍の嚢胞内液サンプルと肝外胆管癌（ＥＨＢＤＣ）の胆汁サンプルにおけるＭＳＥ法によるヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析と免疫組織化学染色による当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現解析との比較
ヒトの粘液産生性胆管腫瘍・円柱細胞型（ＭＰＢＴ−ｃｏｌｕｍｎａｒ）手術症例の嚢胞内液サンプル又は肝外胆管癌（ＥＨＢＤＣ）の胆嚢管浸潤症例の胆嚢内胆汁サンプルにおいて、ヒトＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析を実施例１〜３と同様にＭＳＥ法にて行い、また由来する腫瘍組織におけるこれら遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を免疫組織化学染色によって確認し、比較を行った。
結果を図１６に示す。図１６において、（Ａ）のパネルは、ＭＳＥ法によるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける上部から底部方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。従って、「Ｕ」は非メチル化を示し、「Ｍ」はメチル化を示す。（Ｂ）のパネルは、免疫組織化学染色によるヒトＭＵＣ遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を示す写真である。
図１６の左パネルに示すように、ＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、ＭＰＢＴ−ｃｏｌｕｍｎａｒにおいて「低メチル化」であったが、由来する腫瘍組織の「ＭＵＣ１−ＤＦ３」と「ＭＵＣ１−０１４Ｅ」の双方とも陰性の染色結果とは相関を示さなかった。一方、ＥＨＢＤＣにおいては「低メチル化」のバンドは、由来する腫瘍組織の「ＭＵＣ１−ＤＦ３」と「ＭＵＣ１−０１４Ｅ」の双方とも陽性の染色結果と一致したが、「高メチル化」に近いバンドも認められた。
図１６の中央パネルに示すように、ＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、ＭＰＢＴ−ｃｏｌｕｍｎａｒにおいては「低メチル化」でありＭＵＣ２陽性の染色結果と一致し、ＥＨＢＤＣにおいては「高メチル化」でありＭＵＣ２陰性の染色結果と一致した。
図１６の右パネルに示すように、ＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域に関するＭＳＥ法の結果は、ＭＰＢＴ−ｃｏｌｕｍｎａｒにおいては「低メチル化」であり「ＭＵＣ４−８Ｇ７」と「ＭＵＣ４−１Ｇ８」の双方の免疫組織化学染色の陽性部分と相関を示した。ＥＨＢＤＣにおいては「低メチル化」から「高メチル化」にわたり多くのバンドが認められ、「ＭＵＣ４−８Ｇ７」と「ＭＵＣ４−１Ｇ８」の陽性と陰性が混じり合った免疫組織化学染色と相関を示した。
以上の結果から、ヒトの胆管嚢胞性腫瘍（ＭＰＢＴ−ｃｏｌｕｍｎａｒ）の嚢胞内液サンプルや肝外胆管癌から得られた胆汁サンプルにおいても、一部に不一致はあるものの、ＭＳＥ法によるメチル化解析が有用である可能性が示された。
【実施例１０】
【００１６】
ホルマリン固定時間及びパラフィン包埋時間によるＤＮＡメチル化への影響に関するＭＳＥ法による評価
本実施例では、ホルマリン固定時間及びパラフィン包埋時間によるＤＮＡメチル化への影響が、ＭＳＥ法にて詳細に解明できることを示す。
ホルマリン固定パラフィン包埋病理標本は保存性に優れ、過去の症例についての遺伝子検索も可能であるため、ホルマリン固定パラフィン包埋病理標本のマイクロディセクション標本等を用いた遺伝子解析も盛んに行われるようになってきている。しかしながら、ホルマリン固定時間やパラフィン包埋により、ＤＮＡメチル化に変化が起きてしまわないか否かの検討は十分にはなされていない。
そこで、ホルマリン固定時間及びパラフィン包埋時間によるＤＮＡメチル化への影響をＭＳＥ法およびＭＳＰ法により解析を行った。これまでの分析でムチンに関し、発現状況とＤＮＡメチル化の解析結果のデータの蓄積があるヒト大腸の正常粘膜組織をサンプルとして用い、各ムチン（ＭＵＣ１、ＭＵＣ２及びＭＵＣ４）の遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析を実施例１〜３と同様にＭＳＥ法にて行った。
ＭＵＣ１に関するＭＳＰ法は、ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ：ＭＳＰ−ＵＬ（ＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＡＴＡＡＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴ：配列番号１７）；ＭＳＰ−ＵＲ（ＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡ：配列番号１８）；ＭＳＰ−ＭＬ（ＧＡＴＣＧＧＴＡＴＡＡＡＧＣＧＧＴＡＧＧＣ：配列番号１９）；及びＭＳＰ−ＭＲ（ＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＧ：配列番号２０）を用いて、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｙｕｋａｒｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｔｏｍｏｆｕｍｉ  Ｈａｍａｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００８）ＭＵＣ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３−Ｋ９  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８（８）：２７０８−１６）を参照して行った。
ＭＵＣ２に関するＭＳＰ法は、ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ：ＭＳＰ−ＵＬ（ＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧ：配列番号２１）；ＭＳＰ−ＵＲ（ＴＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣＣＡＡＡ：配列番号２２）；ＭＳＰ−ＭＬ（ＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＣ：配列番号２３）；及びＭＳＰ−ＭＲ（ＣＧＡＴＡＴＡＡＡＴＴＡＣＧＣＣＣＧＡＡ：配列番号２４）を用いて、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｔｏｍｏｆｕｍｉ  Ｈａｍａｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００６）ＭＵＣ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１９（８）：１８５０−７）を参照して行った。
さらに、ＭＵＣ４に関するＭＳＰ法は、ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ：ＭＳＰ−ＵＬ（ＧＧＴＧＡＴＴＡＧＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧ：配列番号２５）；ＭＳＰ−ＵＲ（ＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＣＴＣＣＡＡ：配列番号２６）；ＭＳＰ−ＭＬ（ＧＧＴＧＡＴＴＡＧＣＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣ：配列番号２７）；及びＭＳＰ−ＭＲ（ＣＧＡＡＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＴＴＣＴＣＣＧ：配列番号２８）を用いて、論文（Ｎｏｒｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，Ｙｕｋａｒｉ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｔｓｕｔｓｕｍｉｄａ，Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｈｉｙｏ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍｉｔｓｕｈａｒｕ  Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｓｕｇｕｒｕ  Ｙｏｎｅｚａｗａ（２００９）Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ＣｐＧ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＵＣ４．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１００（２）：３４４−５１）を参照して行った。
図１７に示すように、ヒト大腸の正常粘膜組織を、ホルマリン固定の時間を区切って最長１４０時間まで行った。一方、ホルマリン固定を２４時間あるいは４８時間行った後、パラフィン包埋を行い、全てのサンプルについてＭＳＥ法及びＭＳＰ法により解析を行った。結果を図１７に示す。ＭＳＥ法において、ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける左側から右側方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。「Ｕ」は非メチル化を示し、「Ｍ」はメチル化を示す。また、ＭＳＰのパネルにおいて「Ｕ」は非メチル化を示し、「Ｍ」はメチル化を示す。
（１）ホルマリン固定時間によるＤＮＡメチル化への影響
ＭＳＥ法による解析において、ＭＵＣ１及びＭＵＣ４遺伝子の標的領域に対しては、１４０時間までのホルマリン固定による影響は示されなかった。一方、ＭＵＣ２遺伝子の標的領域に対しては、１１６時間までのホルマリン固定では影響は認められなかったが、１４０時間のホルマリン固定後のサンプルにおいて、「低メチル化」を呈すバンドの消失が示された。
ＭＳＰ法による解析においては、ＭＳＥ法で示されたような詳細なホルマリン固定パラフィン包埋の影響を解析することが出来なかった。
この結果より、ホルマリン固定後のサンプルにおいてＤＮＡメチル化解析を行う場合には、標的領域の処理時間における影響の検討が必要であることが示された。
（２）ホルマリン固定後パラフィン包埋によるＤＮＡメチル化への影響
２４時間あるいは４８時間にわたりホルマリン固定後パラフィンに包埋したサンプルにおける、各ムチンの遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析を行った。パラフィン包埋後直ちに脱パラフィンを行いＤＮＡの精製を行ったサンプルに限っては、標的領域にメチル化の変化は生じていなかった。
しかし、パラフィン包埋後１１６時間あるいは１４０時間にわたり室温にて放置したパラフィンブロックから得られたサンプルにおけるＭＳＥ法による解析で、ＭＵＣ１及びＭＵＣ４遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域では「高メチル化」を呈すバンドの消失を確認でき、また、ＭＵＣ２遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域では、「低メチル化」を呈すバンドの消失を確認することができた。
同様の解析をＭＳＰ法で行った場合、安定した結果を得られず、ＭＳＥ法で示されたような詳細なホルマリン固定パラフィン包埋の影響を解析することが出来なかった。
この結果より、ホルマリン固定後パラフィン包埋したサンプルにおいても、メチル化の解析を行う場合には、標的領域への経時変化の影響の検討が必要であることが示された。
以上の結果は、安易に、長期保存されているホルマリン固定パラフィン包埋標本を用いてＤＮＡメチル化解析を行うことへの警鐘となる。
以上の実施例５〜９に示す結果より、ＭＳＥ法は、ヒト由来の手術摘出サンプルや膵液・胆汁のような体液にも応用できることを示すものであり、実際に、ヒト癌の早期診断に役立つ可能性があると考えられる。また、実施例１０に示すように、ＭＳＥ法は、従来のＭＳＰ法等ではその実態が分からなかったサンプルのホルマリン固定やパラフィン包埋によるＤＮＡメチル化への影響をも明らかにできる。
【実施例１１】
【００１７】
ＭＳＥ法を用いたムチンコアタンパク質５ＡＣ（ＭＵＣ５ＡＣ）遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化解析
本実施例では、ＭＳＥ法を使用して、ヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域のメチル化を解析した。図１８は、ヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域の配列（配列番号２９；ただし、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列であり、且つ非メチル化シトシンから変換されたウラシルをチミンで表示する）を示す。図１８において、四角で囲まれた太字のＴＧはヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子プロモーターの発現に重要なＣｐＧ部位を示し、四角で囲まれたＴＧはそれ以外のＣｐＧ部位を示す。また、斜体のＴは、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理によりＣがＴに変換されたものを示す。
１１−１．サンプル作製及び方法
実施例１と同様にして、各細胞株（ＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＮＣＩ−Ｈ２９２、Ａ４２７、ＢｘＰＣ３、ＨＰＡＦ  ＩＩ、ＰＡＮＣ１、ＬＳ１７４Ｔ、及びＣａｃｏ２）からＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して抽出した後、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用して、抽出したＤＮＡをＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理に供した。
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡを、以下のプライマーを使用したＰＣＲに供した。
プライマーセット（小文字の塩基配列はＧＣ  ｃｌａｍｐである）：
2011132798.tif 000016
2011132798.tif 000017
各ＰＣＲは図１８に示すように、１ｓｔＰＣＲは上記Ｐｒｉｍｅｒ  ５−１とＰｒｉｍｅｒ  ５−２を用いて、２ｎｄＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）は上記Ｐｒｉｍｅｒ  ５−３とＰｒｉｍｅｒ  ５−４を用いて行った。ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用した。さらに、ＰＣＲ条件及び温度設定を下記表７に示す。
【表７】
2011132798.tif 000018
次いで、下記表８に示すＤＧＧＥゲル条件下の変性剤濃度勾配ゲルを使用し、２ｎｄＰＣＲ後の反応液をＤＧＧＥに供した。なお、電気泳動条件は、泳動槽温度：６０℃、定電圧：２３０Ｖ、泳動時間：３００分であった。電気泳動槽は、Ｄｃｏｄｅシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用した。
【表８】
2011132798.tif 000019
2011132798.tif 000020
１１−２．解析結果
各細胞株における解析結果を図１９に示す。（Ａ）のパネルは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法による各細胞株のヒトＭＵＣ５ＡＣ遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域におけるメチル化の評価を示す。四角で囲んだ領域が本実施例における標的領域のＣｐＧ部位である。一方、（Ｂ）のパネルは、本実施例におけるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける上部から底部方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。
図１９に示すように、ＭＳＥ法によるメチル化の評価は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法による評価と高い相関を示した。ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子において、（Ａ）のパネルにおける左側の四角で囲んだ領域のように、−３，７００付近のかなり上流のメチル化状態と、ｍＲＮＡに相関があることを見出し、ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅとＭＳＥによりそれを確認し、全てが一致していた。なお、ヒストンの修飾も、この上流領域においてＭＵＣ５ＡＣ遺伝子発現に関与していた。
〔比較例１〕Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法とＭＳＥ法との比較
従来法であるＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法により作製したサンプルとＭＳＥ法により作製したサンプルとの比較を行った。なお、ＤＧＧＥでは、変性剤のみの濃度勾配アクリルアミドゲルを使用した。ＤＮＡメチル化評価の対象は、実施例１と同様にヒトＭＵＣ１遺伝子プロモーターの発現に関与するメチル化領域である。
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法では、サンプルは、実施例１に記載の上記プライマーセットのＰｒｉｍｅｒ  １−３とＰｒｉｍｅｒ  １−４を用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行わずに通常のＰＣＲのみを行い、作製した。ＰＣＲ反応液組成及び温度設定は、表１に記載の１ｓｔＰＣＲに準じたものである。
一方、ＭＳＥ法では、サンプルは、実施例１と同様にして作製した。
結果を図２０に示す。（Ａ）のパネルがＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法によるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。（Ｂ）のパネルがＭＳＥ法によるＤＧＧＥ後のゲルの写真である。ゲルにおける変性剤濃度勾配は、電気泳動における陰極から陽極方向へ（パネルにおける上部から底部方向へ）低濃度から高濃度へと勾配をつけている。
図２０に示すように、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法では、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理に起因する非特異的増幅や目的外領域の増幅により正確な解析が行うことができなかった。あるいは、極少量のサンプル量に起因し、ＰＣＲの増幅が十分でないためにバンドが検出できなかった。一方、ＭＳＥ法では、安定した解析結果を呈した。
また、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法とＭＳＥ法との比較として、細胞株（図２１）、組織サンプル（図２２）及び体液サンプル（図２３）について、ＤＧＧＥ後のゲルの写真におけるバンドの発光強度をＩｍａｇｅＪにより計測し、算出した。図２１〜２３において、（Ａ）のパネルがＭＳＥ法に関する結果であり、（Ｂ）のパネルがＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法に関する結果である。
また、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法とＭＳＥ法との検出力の比較結果を下記の表９に示す。表９においては、バンド発光強度の比率を、（ＭＳＥ法による発光強度／Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法による発光強度）の値として算出した。
【表９】
2011132798.tif 000021
2011132798.tif 000022
図２１〜２３及表９に示すように、ＭＳＥ法は、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法と比較して、細胞株サンプルで平均３４倍、組織サンプルで平均４７倍、体液サンプルで平均５３倍の検出力を示した。従って、ＭＳＥ法は、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法と比較して全体で平均４５倍（最高１０５倍）の検出力を示した。双方の解析方法で検出可能なバンドにおいても、ＭＳＥ法は、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＤＧＧＥ法よりも高い検出力を示した。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明によれば、微量のＤＮＡサンプルであってもＤＮＡメチル化を検出でき、またＤＮＡメチル化パターン又は連続性を検出できる。
また、本発明に係るＤＮＡメチル化検出方法は、エピジェネティクス等のライフサイエンス分野において有効に利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図１８】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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