(57)【要約】  高感度であり、かつ、多色発色の可能なイムノクロマトグラフキット、及び該キットの要素として好適な有機着色微粒子の提供。平均粒径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍであり、かつ、発色強度が１．０〜５．０であることを特徴とする有機着色微粒子を、セルロースを出発原料として調製した。かかる有機着色微粒子をイムノクロマトグラフキットにおける標識として使用したところ、従来技術と比較して高感度なイムノクロマトグラフキットとなることが判明した。本発明に係るイムノクロマトグラフキットは、多色発色も可能であり、迅速な診断にとって有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍであり、かつ、発色強度が１．０〜５．０であることを特徴とする有機着色微粒子。
【請求項２】
前記有機着色微粒子の重量の１０ｗｔ％〜８０ｗｔ％が着色成分である、請求項１に記載の有機着色微粒子。
【請求項３】
前記着色成分が染料である、請求項２に記載の有機着色微粒子。
【請求項４】
前記有機着色微粒子の重量の２０ｗｔ％〜９０ｗｔ％がセルロース由来である、請求項１に記載の有機着色微粒子。
【請求項５】
物理吸着によりリガンドが結合された、請求項１に記載の有機着色微粒子。
【請求項６】
反応性活性基を有する、請求項１に記載の有機着色微粒子。
【請求項７】
前記反応性活性基が原子数３以上のスペーサー構造を有する、請求項６に記載の有機着色微粒子。
【請求項８】
共有結合により前記反応性活性基にリガンドが結合された、請求項６に記載の有機着色微粒子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の有機着色微粒子を含む診断薬キット。
【請求項１０】
イムノクロマトグラフキットである、請求項９に記載の診断薬キット。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の有機着色微粒子を使用する工程を含むインビトロ診断方法。
【請求項１２】
イムノクロマトグラフ方法である、請求項１１に記載のインビトロ診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機高分子由来の有機着色微粒子並びにそれを用いた診断薬キット及びインビトロ診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高分子からなる微粒子は、粒径、機械的強度、粒径の分布、形状、凝集程度の制御のし易さから、様々な分野に利用されており、例えば、トナー、包装材のブロッキング防止材、絶縁フィラー、結晶核剤、クロマトグラフィー用充填剤、研磨剤等が挙げられる。近年では、免疫診断試薬用担体、液晶ディスプレーのスペーサー、分析機器の校正用標準粒子、多孔膜の検定用標準粒子等の用途にも応用されている。【０００３】
高分子からなる微粒子は、とりわけ免疫診断薬用担体用途において使用量が増大しており、中でもイムノクロマトグラフ方法を用いた診断（以下、「イムノクロマト」ともいう。）への使用量が増大している。妊娠検査薬の様に、医薬部外品として医療関係者以外の一般人も利用できるキットが多数発売されたことがまず要因として挙げられるが、それ以外でもアデノ、ロタ、ノロ等の各種ウイルス、B型、C型各種の肝炎検査、O-157等の病原性菌群といった様々な検査のPOCT（point−of−care−testing：患者近傍で医師又は他の医療担当者が検査を実施し迅速に結果を得ること）の手段として需要が高まっていることが背景としてある。近年のインフルエンザの流行で、今後、イムノクロマトの使用量は急増すると推定される。また免疫診断薬以外にも、生化学的な分析、遺伝学的な分析等、任意の分析反応など様々な分野でイムノクロマトは利用されている。【０００４】
イムノクロマトは、例えば、金属コロイドやポリスチレン由来の着色ラテックスからなる発色微粒子で標識した抗体又は抗原（リガンド）を、クロマト基材上で検査対象物質と選択的に反応させ、複合体を形成させつつ展開させる。次いで、予めクロマト基材上の所定の検出位置に抗原又は抗体（前記リガントと特異的に結合するもの）を固定しておき、展開した複合体を捕捉することにより顕色させる手法をいう。これまで種々の検討がなされ、簡便な検査方法として確立しているが、医療現場ではPOCTにおける医療従事者の負担を減少させる必要から、イムノクロマトキットのさらなる高感度化、診断迅速化が望まれている。【０００５】
インフルエンザの診断では、感染初期の段階ではイムノクロマトで陽性にならず、翌日検査すると陽性になる場合もある。この問題を解決するために検査の更なる高感度化が求められている。また、イムノクロマト１キットでのＡ型抗原とＢ型抗原の両者の同時診断が一般的になりつつある。このように検体が複数存在する場合、一回の検査で複数の検査対象物質を同時に検査できると診断迅速化につながるが、誤診を防ぐため、視認性を向上させる必要がある。したがって、検査対象物質検出時の発色を検査対象毎に色分け（多色発色化）することが好ましい。各種ウイルスの感染症診断や、食品安全性診断でも１キットによる複数被診断物の同時診断が望まれており、同様の色分けが有効と考えられる。【０００６】
イムノクロマトの発色は、標識に用いる物質に由来する。金属コロイドの場合は、その金属種に応じたプラズモン効果に因る発色となるため、一色のみに限定される。例えば、以下の特許文献１記載されているような、金コロイドを使用する場合には赤色のみの発色となる。複数項目の同時検査を想定する際、検出位置の工夫である程度の効果は期待できるものの、視認性、誤診防止の観点からは、好適とはいえない。
また、金属コロイドの場合、リガンドの結合方法は物理吸着と呼ばれる原理が一般的である。リガンドの結合方法としては、物理吸着、化学結合（共有結合）、イオン結合、包括法、などが一般的に挙げられる。物理吸着とは基材（例えば、発色微粒子）と結合する材料（例えば、リガンド）との間に働く疎水性相互作用を利用した結合方法である。実際には疎水性相互作用だけでなく、靜電的作用、分子間力、その他、様々なメカニズムが働いていると考えられる。物理吸着はその他の結合方法に対し操作が容易であることから、簡便性やコストの面で有利になる。しかしながら物理吸着の場合は、リガンドの結合部位が一定にならなかったり、界面活性剤の存在下で吸着が阻害されてしまったり、などの問題が起こる場合もあり得る。また十分な量のリガンドを結合できない場合もあり得る。【０００７】
一方、以下の特許文献２に開示されているように、ポリスチレン等のラテックス粒子を用いる場合は、分散染料や油溶染料、顔料からなる発色団を微粒子に含ませて用いることにより、色分けが可能である。また、一般的にリガンドの結合方法としては物理吸着、化学結合など任意の方法を選択できる。そのため前記物理吸着の問題を回避することも可能である。しかしながら、特許文献２の実施例によれば、粒子への染着量が６ｗｔ％程度と低く、発色の強度が弱いものとなっていた。そのため、イムノクロマトに用いる場合は、明瞭な発色結果が得られず、信頼性に欠けるものになっている。
以下の特許文献３には、セルロースを染色した微粒子が開示されているが、セルロース微粒子量に対する染料仕込み量が２０ｗｔ％程度であるため、得られる染色微粒子は淡いものとなる。これを以下の特許文献４にあるように、物理吸着あるいは化学結合により抗体を付与してイムノクロマトに用いたが、抗体の結合量が十分でなく、また微粒子自体の発色が弱い為、明瞭な発色結果が得られない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特公平７−６０１５９号公報
【特許文献２】特許第２９５５４０５号明細書
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００８／０８４８５４パンフレット
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００９／１２３１４８パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記現状に鑑み、発色性が高く、かつ、色分けが可能な有機着色微粒子を得、それにリガンドを結合させ、診断薬、特にイムノクロマトへ適用することにより、イムノクロマトキットの高感度化を達成することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討し、実験を重ねた結果、セルロースを出発原料にして、濃色に染色した微粒子を得ることに成功した。更に驚くべきことに、セルロースを濃色に染色することで物理吸着によるリガンドの結合が可能になり、さらには必要に応じて反応性活性基を導入することで共有結合によってもリガンドを結合することが可能であることを見出した。そしてそれを診断薬用担体としてイムノクロマトに適用したところ、イムノクロマトキットの高感度化を実現出来ることを見出し、本発明に至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。【００１１】
［１］平均粒径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍであり、かつ、発色強度が１．０〜５．０であることを特徴とする有機着色微粒子。【００１２】
［２］前記有機着色微粒子の重量の１０ｗｔ％〜８０ｗｔ％が着色成分である、前記［１］に記載の有機着色微粒子。
［３］前記着色成分が染料である、前記［２］に記載の有機着色微粒子。【００１３】
［４］前記有機着色微粒子の重量の２０ｗｔ％〜９０ｗｔ％がセルロース由来である、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の有機着色微粒子。【００１４】
［５］物理吸着によりリガンドが結合された、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の有機着色微粒子。【００１５】
［６］反応性活性基を有する、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の有機着色微粒子。【００１６】
［７］前記反応性活性基が原子数３以上のスペーサー構造を有する、前記［６］に記載の有機着色微粒子。【００１７】
［８］共有結合により前記反応性活性基にリガンドが結合された、前記［６］又は［７］に記載の有機着色微粒子。【００１８】
［９］前記［１］〜［８］のいずれかに記載の有機着色微粒子を含む診断薬キット。【００１９】
［１０］イムノクロマトグラフキットである、前記［９］に記載の診断薬キット。【００２０】
［１１］前記［１］〜［８］のいずれかに記載の有機着色微粒子を使用する工程を含むインビトロ診断方法。【００２１】
［１２］イムノクロマトグラフ方法である、前記［１１］に記載のインビトロ診断方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る有機着色微粒子は、従来技術のラテックス粒子の発色性に比較して格別顕著に優れた発色性を有しており、かつ抗体等のリガンドを吸着することが可能なため、イムノクロマトに適用でき、選択的かつ特異的な反応で捕捉された場合の発色が、より顕在化することで、高感度なイムノクロマトキットを提供することが可能となり、さらには、発色を多色にすることが可能であるため、複数の検査対象の同時測定に有用である。また、本発明の有機着色微粒子は、リガンドとの結合方法として染料に由来する物理吸着以外にも、化学結合など任意の方法を選ぶことができるため、様々な検査対象物質に対し応用できる。したがって本発明は、誤診の少ない早期診断を可能にし、検査の迅速化に大きく寄与し、イムノクロマトの適用範囲を大きく広げることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
＜平均粒径＞
以下、本願発明について詳細に説明する。
本発明における有機着色微粒子とは、平均粒径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍであり、かつ、発色強度が１．０〜５．０である有機着色微粒子をいう。平均粒径の好ましい範囲は、１００ｎｍ〜９００ｎｍであり、より好ましくは２００ｎｍ〜８００ｎｍである。平均粒径が１０００ｎｍを超えると、イムノクロマトキットに用いた際に展開が遅く、評価の迅速化に繋がらず、また展開膜上に捕捉されやすくなり、バックグラウンド自体が発色してしまうことで期待する検出箇所での発色が不明瞭になる傾向にある。特に検出箇所においては、補足試薬の塗布に起因して、展開膜のポアサイズが小さく変化している場合が多い。そのためそこでは標識が捕捉され易い傾向があり、すなわち擬陽性が出易い。もはや検査キットとして信頼できないものとなってしまう。
【００２４】
＜発色強度＞
本発明における発色強度とは、有機着色微粒子の分散液を光路長１０ｍｍとして、４００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲で積分球を用いた可視吸光度測定を行い、分散媒のバックグラウンド成分を差し引くことで、分散基質自体の吸光度曲線を得、その最大値（ＡＢＳ）を分散基質の重量パーセントで割り返し、０．０１ｗｔ％当りで算出した値として定義する。積分球を用いることで、粒子の散乱光の影響を低減させることができるため、得られた値は微粒子の発色度合いの指標足り得、この数値が大きいほど発色が明瞭であると判断できる。本発明の微粒子の発色強度は１．０以上であるが、大きい程好ましい。発色強度を増大させるには、分散する染料や顔料として発色が高いものを用いるか、染色回数を増やすなどの手段を選択することができる。しかしながら、発色強度を５．０以上にするには、一般的な染料を用いた数回の染色では到達できないため、経済性を考慮すれば発色強度は１．０〜５．０であり、より好ましくは１．５〜５．０であり、さらに好ましくは２．０〜５．０である。発色強度が１．０より小さい場合は、発色が弱いため、イムノクロマトキットに用いた際に検出部位の視認性に劣り、検査結果の信頼性を損ねてしまう。
【００２５】
＜有機着色微粒子の素材（材料）＞
本発明における有機着色微粒子の素材は、発色強度が高く、安定分散したものであれば特に限定されない。染料や顔料を用いて濃色化可能な素材が適用できるが、濃染化し、かつ強固な染着を実現したほうが、イムノクロマトによる検査時や、キットの長期保管の品質安定化に寄与するので好ましい。強固な染着を達成するには、例えば、共有結合性の反応染料を用いることが出来、反応染料で染色できるものとして、セルロース由来のものが挙げられる。セルロース由来のものからなる微粒子は大量の水酸基を有するため、多くの反応性染料を共有結合により保持することができるだけでなく、濃染化した後も水などへの安定分散性を保持することができる。それゆえ、有機着色微粒子の素材としては、セルロースを用いると好適であるが、その種類は特に限定されない。再生セルロース、精製セルロース、天然セルロース等を用いることができる。一部誘導体化されたセルロースを用いてもよい。好ましくは、有機着色微粒子の重量の２０〜９０ｗｔ％はセルロース由来である。より好ましくは、有機着色微粒子の重量の２０〜８０ｗｔ％はセルロース由来である。さらに好ましくは２０〜７０ｗｔ％である。
【００２６】
＜有機着色微粒子の素材の製造方法＞
本発明における有機着色微粒子の素材の製造方法は特に限定されない。湿式粉砕等による力学的な手法を用いて、分級して所望の平均粒径の微粒子を得てもよいが、本発明ではセルロースをその良溶媒に溶解し、水、有機溶媒、アンモニア等を混合した凝固液を用いることでセルロース微粒子を調製している。この方法を用いることにより得られるセルロース微粒子の粒径を凝固液の組成によって調整することが可能となる。本発明の有機着色微粒子の素材の製造方法を限定することを意図しないが、以下、具体例によって、より詳細に説明する。
まず、セルロースリンターをセルロースの良溶媒に溶解させる。本発明では良溶媒には公知の方法で調製した銅アンモニア溶液を用いる。そして凝固液としては有機溶媒＋水＋アンモニア混合系を主に用いる。この凝固液を攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロース溶液を加えて凝固を行う。さらに硫酸を加え中和、再生を行うことで、目的のセルロース微粒子を含有したスラリーを得ることができる。このスラリーを希釈、精製、乾燥させることで、セルロース微粒子分散液やセルロース微粒子を得ることができる。
【００２７】
＜着色方法＞
本発明における有機着色微粒子の素材の着色方法も特に限定されるものではなく、染料を用いる方法、顔料を用いる方法など様々なものを用いることができる。中でも発色強度を高くできる点で染料を用いる方法が好ましく、直接染料、含金染料、酸性染料、反応染料、塩基性染料、分散染料、硫化染料、植物染料、ナフトール染料等、各種の染色剤を用いることができる。
本発明において有機着色微粒子としてセルロース微粒子を用いる場合、セルロース微粒子の表面積は、繊維の表面積に比べて著しく大きいため、染着量を極めて大きくすることができ、有機着色微粒子のうち１０ｗｔ％以上が着色成分である微粒子を得ることもできる。しかしながら、発色性と経済性の観点から、着色成分は、有機着色微粒子の１０ｗｔ％〜８０ｗｔ％が好ましく、より好ましくは２０ｗｔ％〜８０ｗｔ％であり、さらに好ましくは３０ｗｔ％〜８０ｗｔ％である。さらに、本発明においては、セルロース微粒子を濃色に染めることができ、かつ長期間安定すなわち湿潤堅牢度に優れたものとするため、共有結合にて染着させるのが望ましいという観点から、反応染料を選択することが好ましい。
【００２８】
本発明における有機着色微粒子に対する着色成分の割合は、着色前後の重量変化から算出できる。本発明においては着色の方法として染色を用い、その過程で、遠心分離を用いるため、全ての粒子を回収できない場合もあるが、この場合は回収できた粒子の重量と染色前の粒子の重量から着色成分の割合を算出するものとする。例えば１．０ｇのセルロース微粒子を染色し２．０ｇの有機着色微粒子が得られた場合は５０ｗｔ％となる。また、必要に応じて、有機着色微粒子と着色成分を分離する操作、例えば、酸やアルカリ処理による共有結合の切断や、微粒子を膨潤させる、その他最適な洗浄操作などにより有機微粒子と着色成分を分離して算出することも可能である。
【００２９】
＜リガンド＞
本発明におけるリガンドとは、特定の検査対象物質に選択的かつ特異的に結合する性質を持つ物質である。その種類は特に限定されるものではないが、例えば、抗体、抗原、酵素、遺伝子、ホルモン、細胞、核酸、ペプチド、タンパク質などが挙げられる。
【００３０】
＜染色によるリガンドの物理吸着＞
本発明においては染料を用いてセルロースを濃色に染色するだけでリガンドの物理吸着が可能である。染色だけでは物理吸着性能が不十分な場合は、必要に応じてセルロースの誘導体化と組み合わせることで親水疎水バランスを調整してもかまわない。セルロースを濃色に染色するだけでリガンドの物理吸着が可能になる理由は明らかになっていないが、染色によりセルロースが疎水化されたためと考えられる。一般的に、フィルムなどでは接触角を測定することで親水疎水の程度を知ることができるが、ナノ微粒子では接触角を測定することは困難である。そこでモデル的に平坦なセルロースであるセロハン（登録商標）を濃色に染色し接触角を測定したところ、未染色のセルロースの接触角が２０〜３０度程度であるのに対し、十分に染色したセロハン（登録商標）では、染料の染着量に比例して４０〜１００度にも達することが確認できた。一般的な染料は、ベンゼン、ナフタレン、アントラキノン、アゾなど疎水性が強い構造を持つ。本発明においては、繊維の染色条件では通常考えられないような大量の染料をセルロースに結合させた結果、抗体が物理吸着できるほどの疎水化が達成できたと予想される。タンパク質定量法で一般的なローリー法を用いて、結合しているマウスＩｇＧ抗体を定量したところ、本発明における有機着色微粒子の様に、十分に染色されている場合は、抗体の結合を確認することができた。一方、染色強度が低すぎると、未染色粒子との差が認められず、抗体結合量は低い傾向にあった。
【００３１】
＜反応性活性基によるリガンドの化学結合＞
本発明においてはリガンドの結合方法として物理吸着だけでなく化学結合を選択することもできる。一般的には物理吸着は操作が簡便でありコストが安いというメリットがあるが以下のような問題が発生する可能性も指摘されている。例えば、リガンドの結合部位が一定にならず反応の選択性が失われてしまう、界面活性剤の存在化で結合していたリガンドが外れてしまう、などである。そこでそれらの問題を解決するために、状況に応じてリガンドと共有結合を形成する化学結合方式をとる場合もある。また化学結合方式ではリガンドの結合量を物理吸着より更に多くすることができる場合もある。
【００３２】
＜反応性活性基＞
本発明における反応性活性基はリガンドを共有結合させるために用いる。反応性活性基の代表的な例としてはカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、エポキシ基、水酸基などが挙げられる。種類は特に限定されないが、カルボキシル基、及びアミノ基が好ましい。カルボキシル基の場合は、カルボジイミドを用いてリガンドのアミノ基と共有結合を形成することができる。反応性活性基を導入するタイミングは染色前に予め導入しておいてもかまわないし、染色後に導入してもよい。導入する部位は有機微粒子でもかまわないし染料部分に導入してもよい。また、染料の構造の一部を反応性活性基としておいてもかまわない。
【００３３】
本発明における反応性活性基の導入は赤外分光分析装置によって確認することができる。例えば、カルボキシル基の場合、遊離酸型であれば１７３０ｃｍ−１前後の吸収で確認できる。またアミノ基の場合、１級アミノ基であれば１６００ｃｍ−１前後の吸収で確認できる。ただし反応性活性基の導入量を定量することは非常に困難である。これは大量の染料成分が存在するためであり、一般的な定量方法では定量することができない。本発明では赤外分光分析装置で導入の可否のみを判断した。
【００３４】
＜スペーサー構造＞
本発明における反応性活性基は原子数３以上のスペーサー構造を有することが好ましい。本願発明者らは、高度に濃色化された有機着色微粒子に反応性活性基を導入しリガンドを化学結合させイムノクロマトに用いる際に、原子数３以上のスペーサー構造を有すると感度がより向上することを見出した。この理由は明らかになってはいないが、例えば、大量に存在する染料の立体障害や電荷の影響により、リガンドと検査対象物質の選択的反応が妨害される可能性があると考えられる。
【００３５】
スペーサー構造とは反応性活性基と有機着色微粒子との間に存在する原子を指す。また、スペーサー構造が分岐している場合は主鎖の原子数を指すものとする。例えば、一般的に知られているカルボキシメチルセルロースはセルロースの水酸基の一部がカルボキシメチル基に置換したものである。この場合の反応性活性基はカルボキシル基であり、スペーサー構造は-CH2-、すなわち原子数１のスペーサー構造となる。本発明の実施例では以下の４種類の方法でスペーサー構造を持つ反応性活性基を導入した。化合物１〜４の構造を、それぞれ、化１〜４に示す。本来は水酸基の一部に染料も結合しているが染料は省略する。
【００３６】
＜化合物１＞
【化１】
2011062157.tif 000002
染色セルロース微粒子と5-ヘキセン酸を反応させカルボキシル基を導入した。主鎖の原子数、すなわちスペーサー構造の原子数は５となる。
【００３７】
＜化合物２＞
【化２】
2011062157.tif 000003
染色セルロース微粒子と１６ヘプタデセン酸を反応させカルボキシル基を導入した。主鎖の原子数、すなわちスペーサー構造の原子数は１６となる。
【００３８】
＜化合物３＞
【化３】
2011062157.tif 000004
染色セルロース微粒子とエピクロルヒドリンを反応させエポキシ基を導入し、更に6-アミノヘキサン酸と反応させることでカルボキシル基を導入した。主鎖の原子数、すなわちスペーサー構造の原子数は９となる。
【００３９】
＜化合物４＞
【化４】
2011062157.tif 000005
染色セルロース微粒子とエピクロルヒドリンを反応させエポキシ基を導入し、更にアンモニアと反応させることで１級アミノ基を導入した。主鎖の原子数、すなわちスペーサー構造の原子数は３となる。
【００４０】
前記のスペーサー構造は最大で原子数１６であるが、より長いスペーサー構造でもかまわない。より長いスペーサー構造は染色セルロース微粒子と反応させる化合物を変えることで達成できるし、導入した反応性活性基を用いて再延長しても得ることができる。原理的には非常に長いスペーサー構造も導入可能ではあるが、導入の容易さ、コストの観点から考えると好ましくは原子数３〜１００であり、より好ましくは３〜５０、さらに好ましくは３〜２０である。
【００４１】
＜有機着色微粒子の分散方法＞
上記の着色方法にて得られた有機着色微粒子、すなわち染色セルロース微粒子は、分散液のままの状態でネバードライのまま用いることも可能であるが、各種の試薬、界面活性剤、緩衝剤を添加し分散液の安定化を図ってもよい。また必要に応じて乾燥を行うことで微粒子単体に又は各種濃度の分散液に調製することも可能である。本発明においては、染色微粒子を分散させる液体の種類は、微粒子を溶解又は膨潤させないものであれば特に限定されない。水や各種無機化合物水溶液、アルコール類、エーテル類、アルデヒド類、ケトン類、脂肪酸類、アミン類、その他有機溶媒を用いることができる。各種の化合物を任意の割合で混合した溶媒を用いてもよく、さらにはそれらの溶媒と相溶性のある疎水性溶媒と混合して用いることも可能である。
【００４２】
＜粒度分布＞
本発明の有機着色微粒子の粒度分布は、以下の式（１）：
ＣＶ値＝（粒度分布測定装置より求めた体積粒度分布における標準偏差）／（粒度分布測定装置より求めた体積平均メジアン径）×１００      式（１）
で求められる。特に限定するものでないが、前述した通り、粒径が大きすぎると、イムノクロマトキットにおいて、バックグラウンドの発色や、擬陽性が見られる傾向があるため、粒度分布は小さいほうが好適であり、７０％以下が好ましい。ＣＶ値を小さくしたいときは微粒子製造条件によって調整は可能だが、染色前、染色後の各段階において濾過、遠心分離などの操作により粒子を分級してもよい。本発明においては、好適なＣＶ値の範囲は、経済性も鑑みて１０％〜７０％であるが、より好ましくは１０％〜６０％、さらに好ましくは１０％〜５０％である。
【００４３】
＜イムノクロマト＞
本発明の有機着色微粒子はイムノクロマトグラフ方法による免疫測定法に好適に用いられる。
以下、イムノクロマトグラフ方法の代表例を説明するが、これに限るものでなく、サンドイッチアッセイ全般に適用できる。イムノクロマトグラフ方法は、概して、被検出物資である抗原又は抗体と特異的に結合する抗体又は抗原に、金属コロイドやポリスチレン由来の着色ラテックスからなる発色微粒子を標識として予め結合させる。他方、クロマト基材上の所定箇所に、抗原又は抗体に特異的に反応する抗体又は抗原をライン状に塗布する。検査時において、前記の標識−抗体又は抗原を、被検出物質である抗原又は抗体と接触させることにより、複合体を形成させ、これをクロマト基材上で展開させるが、この複合体は、ライン状に塗布した１次抗体により捕捉が可能である（サンドイッチアッセイ）。このとき標識物質も捕捉されるため、所定箇所での顕色が起こることになる。目視による被検出物質の有無が判定できることから、簡便な検査方法として、近年、広く普及している。また抗原又は抗体を用いる免疫反応だけでなく、被検出物質と特異的な反応を起こすリガンドを用いることにより様々な検査が可能になる。免疫診断薬以外にも、生化学的な分析、遺伝学的な分析等、任意の分析反応など様々な分野でイムノクロマトは利用されている。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
まず、本発明における有機着色微粒子又は着色微粒子分散体の測定法について詳細に説明する。
特に記載のない限り全ての操作は２５℃の環境下で実施した。【００４５】
（１）粒度（粒径）分布：日機装社製ナノトラック粒度分布測定装置ＵＰＡ−ＥＸ１５０を用いてセルロース微粒子分散体を測定した。特に記載のない限り、セルロース微粒子を分散させる液体として水を用い、セルロース微粒子濃度は約０．１ｗｔ％で測定し、積算回数は３０回とした。またＣＶ値は３０回の積算によって得られた体積粒度分布における標準偏差を体積平均メジアン径で割ったものを算出した。【００４６】
（２）発色強度：日本分光製ＪＡＳＣＯ・Ｖ−６５０に積分球ユニットＩＳＶ−７２２付加して用いて、セルロース微粒子、及び比較例となる着色ポリスチレンラテックス及び金コロイドの吸光度を測定した。微粒子濃度は０．０１ｗｔ％〜０．１ｗｔ％で測定した。次いで、４００ｎｍ〜８００ｎｍの可視光範囲での吸光度ピークの最大値（ＡＢＳ）を、微粒子の重量パーセントで割り返し、０．０１ｗｔ％辺りで算出した値を求めた。【００４７】
（３）反応性活性基の導入可否の確認：反応性活性基を導入した微粒子分散液を乾燥し、反応性活性基を導入した微粒子を得た。パーキンエルマー製赤外分光分析装置Ｓｐｅｃｔｒｕｍ１００を用い反射法にて赤外吸収スペクトルを測定し、導入前後の吸収スペクトルを比較する。カルボキシル基の場合、遊離酸型の１７３０ｃｍ-1前後の吸収で確認し、アミノ基の場合、１級アミノ基の１６００ｃｍ-1前後の吸収で確認した。
また、セルロース微粒子分散体、染色セルロース微粒子分散体の凝集をときほぐすため、マイクロフルイディックス社製油圧式超高圧ホモジナイザーＭ−１１０−Ｅ／Ｈを用いた。その際の処理圧力は５０ＭＰａであり、高圧部であるチャンバーを１０回通す操作を行った。【００４８】
［実施例１］
＜微粒子の調製＞
セルロースリンターを銅アンモニア溶液に溶解させ、次いで水及びアンモニアで希釈して、セルロース濃度０.３７ｗｔ％の銅アンモニアセルロース溶液を調製した。その溶液の銅濃度は０．１３ｗｔ％であり、アンモニア濃度は１．００ｗｔ％であった。次いで、テトラヒドロフラン濃度９０ｗｔ％、水濃度１０ｗｔ％の凝固液を調製した。マグネティックスターラーを用い凝固液５０００ｇをゆっくり攪拌しながら、予め調製しておいたセルロース濃度０．３７ｗｔ％の銅アンモニアセルロース溶液５００ｇを添加した。５秒程度攪拌を継続したのちに１０ｗｔ％の硫酸１０００ｇを加え中和、再生を行い、目的のセルロース微粒子を含有したスラリー２６５００ｇを得た。得られたスラリーを１００００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、脱イオン水を注入して攪拌し、再び遠心分離した。ｐＨが６．０〜７．０になるまでこの操作を数回繰り返し、その後高圧ホモジナイザーによる分散処理を行い、セルロース微粒子分散体１５０ｇを得た。なお全ての操作は２５℃の環境下で行った。【００４９】
＜微粒子の染色＞
次に、前記のようにして調製したセルロース微粒子の染色を行った。微粒子濃度を１．０ｗｔ％に調整したセルロース微粒子分散体１００ｇに対し、硫酸ナトリウム３０ｇ、反応性染料としてダイスター株式会社製Levafix Navy CA Gr.（登録商標）（以下、青系Ａともいう。）１ｇ、を加え攪拌させながら恒温槽を用いて６０℃まで昇温した。６０℃に昇温後に炭酸ナトリウム４ｇを加え、２時間染色を行った。続いて得られた粗染色微粒子を水酸化ナトリウム５ｗｔ％水溶液で洗浄し、遠心分離で回収、純水にて水洗した後遠心分離で回収するという一連の操作を１サイクルとし、同様の操作を計３サイクルまで実施し、染色微粒子を得た。染料成分の割合は、有機着色微粒子の重量の４９％であった。
染色前後の平均粒径と、発色強度を測定した結果を、以下の表１に示す。【００５０】
［実施例２］
実施例１で得た未染色セルロース微粒子を、同様の操作で染色するが、計１０サイクルまで実施し、染色微粒子を得た。染色前後の平均粒径と発色強度を測定した結果を、以下の表１に示す。【００５１】
［実施例３］
実施例１で得た未染色セルロース微粒子を、反応染料としてダイスター株式会社製Levafix Rubine CA Gr.（登録商標）（以下、赤系Ｂともいう。）１ｇを用いること以外は、実施例１と同様の方法でセルロース微粒子、及び染色セルロース微粒子を得た。染色前後の平均粒径と発色強度を測定した結果を、以下の表１に示す。【００５２】
［実施例４］
凝固に用いる凝固液が、テトラヒドロフラン濃度９５ｗｔ％、水濃度５ｗｔ％であること以外は実施例１と同じ方法で、セルロース微粒子、及び染色セルロース微粒子を得た。染色前後の平均粒径と発色強度を測定した結果を、以下の表１に示す。【００５３】
［実施例５］
実施例４で得た未染色セルロース微粒子を、反応染料としてダイスター株式会社製Levafix Rubine CA Gr.（登録商標）（赤系Ｂ）１ｇを用いること以外は、実施例１と同様の方法でセルロース微粒子、及び染色セルロース微粒子を得た。染色前後の平均粒径と発色強度を測定した結果を、以下の表１に示す。【００５４】
［実施例６］
凝固に用いる凝固液が、アセトン濃度２６．５ｗｔ％、アンモニア濃度０．２０ｗｔ％、水濃度７３．３ｗｔ％であること以外は実施例１と同じ方法で、セルロース微粒子、及び染色セルロース微粒子を得た。染色前後の平均粒径と発色強度を測定した結果を、以下の表１に示す。【００５５】
［比較例１］
凝固に用いる凝固液が、テトラヒドロフラン濃度９７ｗｔ％、水濃度３ｗｔ％であること以外は実施例１と同じ方法で、セルロース微粒子、及び染色セルロース微粒子を得た。染色前後の平均粒径と発色強度を測定した結果を、以下の表１に示す。【００５６】
［実施例７］
比較例１で得た染色セルロース微粒子を日本ミリポア株式会社製のポアサイズ０．８μのニトロセルロース由来のろ過膜を用いて、ろ過し、ろ液を採取した。平均粒径と発色強度を測定した結果を、以下の表１に示す。【００５７】
［実施例８］
実施例１で得た未染色セルロース微粒子を、実施例１と同様の操作で染色したが、１サイクルのみの染色を行い、染色微粒子を得た。染色前後の平均粒径と発色強度を測定した結果を、以下の表１に示す。【００５８】
［実施例９］
実施例１で得た未染色セルロース微粒子を、硫酸ナトリウム１５ｇ、反応染料としてダイスター株式会社製Levafix Rubine CA Gr.（登録商標）（赤系Ｂ）０．５ｇとした以外は実施例１と同様の操作で染色したが、１サイクルのみの染色を行い、染色微粒子を得た。染色前後の平均粒径と発色強度を測定した結果を、以下の表１に示す。【００５９】
［比較例２］
実施例１で得た未染色セルロース微粒子を、硫酸ナトリウム６ｇ、反応性染料としてダイスター株式会社製Levafix Navy CA Gr.（登録商標）（青系Ａ）０．２ｇとした以外は、実施例８と同様の操作を行い、染色微粒子を得た。染色後の平均粒径と発色強度を測定した結果を、以下の表１に示す。【００６０】
［比較例３］
実施例６で得た未染色セルロース微粒子を、硫酸ナトリウム６ｇ、反応性染料としてダイスター株式会社製Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｂｌａｃｋ  Ｂ  ＨＩ−ＧＲＡＮ．１５０（登録商標）（以下、青系Ｃともいう）を０．２ｇとした以外は、実施例８と同様な操作を行い、染色微粒子を得た。染色前後の平均粒径と発色強度を測定した結果を以下の表１に示す。【００６１】
［比較例４］
染色ポリスチレンラテックス粒子として、ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＤＳ０２Ｂ（ＰｒｉｍａｒｙＢｌｕｅ（登録商標）、平均粒径０．４７μｍ）の発色強度を測定した。結果を、以下の表１に示す。【００６２】
［比較例５］
平均粒径が０．０４μｍの金コロイド粒子の発色強度を測定した結果を以下の表１に示す。【００６３】
【表１】
2011062157.tif 000006
【００６４】
＜性能評価1＞
実施例１〜比較例５の染色、着色又は発色粒子を用いて、イムノクロマトグラフ用のキットを作製し、性能評価を実施した。
＜物理吸着による抗体結合染色微粒子の調製＞
実施例１〜比較例４で得られた染色又は着色微粒子をリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という。）により、固形分濃度が１重量％となるように希釈調整し、得られた１重量染色粒子リン酸緩衝液懸濁液１ｍｌと、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下「ｈＣＧ」という）に対するマウス由来のモノクローナル抗体（ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製＃５０１４抗ｈＣＧ抗体）をＰＢＳで１００μｇ／ｍｌに希釈して得られた抗体希釈液１ｍｌとをエッペンドルフ遠沈管に採り、室温で２時間振とうして、染色粒子にモノクローナル抗体を結合させ、次いで０．１重量％の濃度で牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡという。）を含有するＰＢＳを用いて３回、遠心洗浄し、最終的に２ｍｌとなるように再分散させることにより、抗体結合染色微粒子分散液を得た。【００６５】
＜抗体結合金コロイドの調製＞
濃度０．０１重量％の塩化金水溶液２００ｍｌを沸騰させ、これに濃度１重量％のクエン酸ナトリウム水溶液を加え、溶液の色が薄い黄色から紫色〜赤色に変わるまで加熱沸騰を行って、比較例５に示す平均粒径が０．０４μｍの金コロイド粒子の分散液を調製した。次いで得られた金コロイド分散液に５０ｍＭりん酸二水素カリウム溶液を加えてｐＨを８に調整し、これにｈＣＧに対するモノクローナル抗体を、金コロイド粒子分散液１ｍｌ当り１０μｇとなる割合で加え、その１０ｍｌに濃度３０重量％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を０．１ｍｌ加え、遠心沈降処理して、上澄液を除去し、ＢＳＡを濃度０．１重量％で含有するＰＢＳを用いて３回遠心沈降処理により洗浄し、再分散させることにより、抗体結合金コロイド粒子分散液を得た。【００６６】
＜クロマトグラフ基材（メンブレン）の調製＞
市販メンブランフィルター（ミリポア社製ＨＦ１２０、２５ｍｍ×３００ｍｍ）の一方の端（以下、この一方の端はストリップの下端となる、他の一方の端はストリップ上端となる）から７ｍｍの位置に液体噴射装置を用いて展開方向に垂直、すなわちメンブレン長辺に平行に、テストライン用の抗体を幅約１ｍｍとなるよう噴射印刷した。より詳しくはテストライン抗体として、マウス由来の抗ｈα−サブユニット抗体（ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製＃６６０１）を用い、ＰＢＳにて０．５ｍｇ／ｍｌに調整したものを、１．０μＬ／ｃｍとなるよう噴霧した。また、同様に下端から１２ｍｍの位置にはコントロールライン用の抗体を幅１ｍｍで噴射印刷した。より詳しくはコントロールラインとして、ウサギ由来の抗マウス抗体（Ｄａｃｏ社製Ｚ０２５９）を用い、ＰＢＳにて０．５ｍｇ／ｍｌに調整したものを、１．０μＬ／ｃｍとなるよう噴霧した。各々の抗体を噴霧した後、１時間乾燥させ、ついで乳性カゼインを含むホウ酸緩衝液を用いたブロッキングを行い、スクロースを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用い洗浄を行い、室温で一晩定着をさせることで、クロマト用メンブレンを調製した。【００６７】
＜クロマト評価サンプル作製＞
得られた、各実施例、比較例記載の染色粒子を用いたクロマト用メンブレンに、２０×３００ｍｍの濾紙性の吸収パッドを上端から５ｍｍの間が重なるように長辺どうしで接触させたのち、ギロチンカッターで５ｍｍ巾ごとに切断することでサンプルを作製した。単純計算で６０サンプルできることになる。【００６８】
＜クロマトグラフ評価＞
展開試験に用いる、ｈＣＧ含有試料は以下のようにして調製した。
ｈＣＧを、１重量％濃度でＢＳＡを含有するＰＢＳにより希釈して、ｈＣＧ濃度がそれぞれ１００、１０、０ｍＩＵ／ｍｌのｈＣＧを含有させた。この試料液に、上記で得られた５ｍｍ巾キットサンプルの下端から２ｍｍを浸漬して、試料液を展開させた。１０分経過後、メンブランフィルター上での反応部位（標識印刷部）における顕色を目視観察した。評価基準として、テストラインにて発色が認められない場合を（−）、発色が認められる場合を（＋）、発色がはっきりと認められる場合を（＋＋）、発色が強く認められる場合を（＋＋＋）を用いた。評価結果を、以下の表２に示す。【００６９】
【表２】
2011062157.tif 000007
【００７０】
すべての実施例、比較例において、コントロールラインの発色が認められた。ｈＣＧ濃度が１００ｍＩＵ／ｍｌでは、実施例１〜９、及び比較例１、４、５において、テストラインの発色が認められた。また、ｈＣＧ濃度が１０ｍＩＵ／ｍｌと薄い濃度においても、実施例１〜９並びに比較例１及び比較例５においてテストラインの発色が認められた。
比較例１では、特に抗原濃度が高い側で、バックグラウンドの呈色により見かけ感度が下がる現象が見られた。また試料中にｈＣＧが無くても発色する傾向、すなわち擬陽性が見られた。実施例７において、比較例１の粒子をろ過したものを用いたところ、バックグラウンドの呈色は残るものの、擬陽性は見られなくなったことから、粒径が過大であると擬陽性が発生すると考えられる。粒径が過大な場合は診断薬キットに不適である。実施例１〜９で擬陽性が見られなかったことから、実施例１〜９は、高感度であるといえる。
一方、比較例２〜４では、染料の発色強度が小さいため、ｈＣＧ濃度１０ｍＩＵ／ｍｌでは発色は検出できなかった。したがって、本発明の有機着色微粒子を用いれば、ポリスチレンラテックスと比較して高感度になることが理解できる。
また、比較例５の金コロイドとの比較においては同等又はそれ以上の感度を示すことも理解できる。すなわち本発明の有機着色微粒子を用いることで、高感度診断が青色系でも赤色系でも可能となる。【００７１】
＜反応性活性基の導入＞
続いて実施例１で得られた染色微粒子にカルボキシル基やアミノ基などの反応性活性基の導入を行なった。
［実施例１０］
実施例１で得た青色染色微粒子分散液の一部に純水、イソプロピルアルコール（和光純薬社製、試薬特級）を加え、分散媒体のイソプロピルアルコール：水の比が８５：１５となり、かつ分散媒体中の粒子濃度が０．５０ｗｔ％になるように調整した。得られた染色セルロース微粒子分散液２０ｇを回転子と共に試験管に入れ、ガラス製還流管を取り付けた。約１０℃の水道水を還流させ冷却しながら、セルロース微粒子分散液が５０℃となるようウォーターバスにて３０分間加熱した。なお加熱はマグネティックスターラーを用いて緩やかに攪拌させながら行った。その後、４０ｗｔ％の苛性ソーダ溶液７４ｍｇを攪拌しながら加え、さらに３０分間攪拌を継続し、その後クロロ酢酸ナトリウム（和光純薬社製）２１６ｍｇを加えた。３時間の間、攪拌、および還流を継続し、カルボキシル基の導入を行った。３時間経過後、ウォーターバスによる加熱を止め、ナス型フラスコを氷水で冷やし、反応後スラリーの温度が２０℃になるまで冷却した。冷却後に攪拌を継続しながら、１０ｗｔ％塩酸を１．０ｇ加えて反応後スラリーのＰＨを酸性にした。微粒子の洗浄と同様に遠心分離機を用いて、デカンテーション−脱イオン水による希釈を数回繰り返し、ＰＨを６．０〜７．０とし、さらに高圧ホモジナイザーによる分散処理を行い、カルボキシル化染色微粒子分散液を得た。得られた分散液の一部を平均粒径と発色強度を測定した結果を以下の表３に示す。【００７２】
［実施例１１］
実施例１で得た青色染色微粒子分散液の一部に純水、アセトン（和光純薬社製、試薬特級）を加え、分散媒体のアセトン：水の比が１：１となり、かつ分散媒体中の粒子濃度が１．０ｗｔ％になるように調整した。得られた染色セルロース微粒子分散液１０．０ｇを回転子と共にガラス製試験管に入れ、ガラス製還流管を取り付けた。約１０℃の水道水を還流させ冷却しながら、セルロース微粒子分散液が４０℃となるようウォーターバスにて３０分間加熱した。なお加熱はマグネティックスターラーを用いて緩やかに攪拌させながら行った。その後、５−ヘキセン酸（和光純薬社製）７０５ｍｇ、硝酸二アンモニウムセリウム（和光純薬社製）６７７ｍｇ、１ｍｏｌ／Ｌ硝酸（和光純薬社製）６１７ｍｌを加えた。３時間の間、攪拌、および還流を継続し、カルボキシル基の導入を行った。反応後の処理は実施例１０と同様にし、カルボキシル化染色微粒子分散液を得た。得られた分散液の一部を平均粒径と発色強度を測定した結果を以下の表３に示す。【００７３】
［実施例１２］
カルボキシル化のために加える反応剤が１６−ヘプタデセン酸（和光純薬社製）１６５４ｇであること以外は実施例１１と同様の方法でカルボキシル化染色微粒子分散液を得た。得られた分散液の一部を平均粒径と発色強度を測定した結果を以下の表３に示す。【００７４】
［実施例１３］
実施例１で得た青色染色微粒子分散液の一部に純水を加え、分散媒体中の粒子濃度が１．０ｗｔ％になるように調整した。得られた染色微粒子分散液１０．０ｇを回転子と共にガラス製試験管に入れ、ガラス製還流管を取り付けた。約１０℃の水道水を還流させ冷却しながら、セルロース微粒子分散液が３５℃となるようウォーターバスにて３０分間加熱した。なお加熱はマグネティックスターラーを用いて緩やかに攪拌させながら行った。その後、エピクロルヒドリン（和光純薬社製）５７１ｇを加え、３０分の間、攪拌、および還流を継続し、エポキシ基の導入を行った。その後、ウォーターバスの温度を５０℃に昇温し、６−アミノヘキサン酸（和光純薬社製）８１０ｇを加え、１時間の間、攪拌、および還流を継続し、カルボキシル基の導入を行なった。反応後の処理は実施例１０と同様にし、カルボキシル化染色微粒子分散液を得た。得られた分散液の一部を平均粒径と発色強度を測定した結果を以下の表３に示す。【００７５】
［実施例１４］
エポキシ基の導入後に加える反応剤が２５ｗｔ％アンモニア水（和光純薬社製）８４０ｇであること以外は実施例１３と同様にし、アミノ化染色微粒子分散液を得た。得られた分散液の一部を平均粒径と発色強度を測定した結果を以下の表３に示す。【００７６】
＜赤外分光分析装置による反応性活性基の確認＞
実施例１０〜１４で得られたカルボキシル化及びアミノ化染色微粒子分散液を乾燥させ、カルボキシル化及びアミノ化染色微粒子を調整し、赤外分光分析装置により反応性活性基の導入を確認した。カルボキシル化染色微粒子は１７３０ｃｍ-1前後、アミノ化染色微粒子は１６００ｃｍ-1前後、それぞれの吸収が増加しており、反応性活性基の導入に成功したことを確認した。【００７７】
【表３】
2011062157.tif 000008
【００７８】
＜性能評価２＞
実施例１０〜１４の反応性活性基を導入した染色微粒子に抗体を化学結合させ、その後イムノクロマトグラフ用のキットを作製し、性能評価を実施した。
＜化学結合による抗体結合染色微粒子の調製１＞
２-モルホリノエタンスルホン酸（和光純薬社製）、苛性ソーダ、純水を用いてｐＨが５．２であり濃度が５０ｍＭの２-モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（以下、「ＭＥＳ」という）を調製し、更に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（和光純薬社製、以下カルボジイミドという）をＭＥＳ緩衝液に溶解させ、カルボジイミド濃度が２０ｗｔ％となるよう調整した。実施例１０〜１３で得られたカルボキシル化染色微粒子を遠心分離機を用いて沈降させた後、前記ＭＥＳ緩衝液に再分散させ固形分濃度が１重量％となるように濃度を調整し、カルボキシル化染色微粒子ＭＥＳ緩衝液分散体を得た。カルボキシル化染色微粒子ＭＥＳ緩衝液分散体１０ｇに対し、２０ｗｔ％のカルボジイミド溶液１ｇを加え、恒温振盪槽を用い２５度の環境下で１時間反応させ、反応終了後に１０，０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離を行った。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、リン酸緩衝液を加えて攪拌し、カルボジイミド活性化染色微粒子をリン酸緩衝液に分散させた。微粒子の洗浄と同様に遠心分離機を用いて、デカンテーション−リン酸緩衝液よる希釈を３回繰り返し、未反応のカルボジイミドを除去した。得られたカルボジイミド活性化染色微粒子を用い、物理吸着による抗体結合染色微粒子の調製と同様の手順で化学結合による抗体結合染色微粒子を調製した。【００７９】
＜化学結合による抗体結合染色微粒子の調製２＞
アミノ化染色微粒子分散液を遠心分離機を用いて沈降させた後、前記リン酸緩衝液に再分散させ固形分濃度が１重量％となるように濃度を調整し、アミノ化染色微粒子リン酸緩衝液分散体を得た。アミノ化染色微粒子ＰＢＳ緩衝液分散体１０ｇに対し、２５％グルタルアルデヒド溶液（和光純薬社製）１ｇを加え、恒温振盪槽を用い３７度の環境下で２時間反応させ、反応終了後に１０，０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離を行った。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、リン酸緩衝液を加えて攪拌し、グルタルアルデヒド活性化染色微粒子をリン酸緩衝液に分散させた。微粒子の洗浄と同様に遠心分離機を用いて、デカンテーション−リン酸緩衝液よる希釈を３回繰り返し、未反応のグルタルアルデヒドを除去した。得られたグルタルアルデヒド活性化染色微粒子を用い、物理吸着による抗体結合染色微粒子の調整と同様の手順で化学結合による抗体結合染色微粒子を調製した。０．１重量％の濃度で牛血清アルブミンを加える前に１ｇのグリシンを加えることで未反応のアルデヒドを除去した。【００８０】
＜クロマトグラフ評価＞
実施例１０〜１４で得られた化学結合による抗体結合染色微粒子と、実施例１から得られた物理吸着による抗体結合染色微粒子のイムノクロマト用微粒子としての評価を行った。
評価は前記と同様の手順で、ｈＣＧ濃度がそれぞれ１０、１、０ｍＩＵ／ｍｌの３水準で行った。評価結果を以下の表４に示す。【００８１】
【表４】
2011062157.tif 000009
【００８２】
実施例１１〜１４の化学結合による抗体結合微粒子はｈＣＧ濃度が１ｍＩＵ／ｍｌでも発色が認められた。これらはいずれも反応性活性基が有するスペーサーの原子数が３以上である。それに対し、実施例１の物理吸着による抗体結合染色微粒子、及び実施例９のスペーサーの原子数が１の化学結合による抗体結合微粒子はｈＣＧ濃度が１ｍＩＵ／ｍｌでは発色が認められなかった。これらの結果より本発明の有機微粒子は化学結合によるリガンド担持も可能であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の有機着色微粒子は、免疫診断、イムノクロマトグラフィー用の標識として有用であり、迅速な評価を可能にする高感度なイムノクロマトグラフキットに好適に利用可能である。
【国際調査報告】
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