(57)【要約】  本発明の課題は、ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療のための脂肪細胞の調製に際し、外来遺伝子の導入に適した細胞集団かどうかを判定する方法を提供することである。その解決手段としての本発明は、ＣＤ５４の発現の程度を指標にしてその発現程度が低いほど適していると判定するものである。外来遺伝子の導入に適した脂肪細胞の細胞集団としては、蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率が３％未満および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比が２未満である細胞集団が挙げられる。
2011090091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞の調製に際し、外来遺伝子の導入に適した細胞集団かどうかを判定する方法であって、ＣＤ５４の発現の程度を指標にしてその発現程度が低いほど適していると判定する方法。
【請求項２】
蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率が３％未満および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比が２未満である細胞集団を適していると判定する請求項１記載の方法。
【請求項３】
ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞を調製する方法であって、蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率が３％未満および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比が２未満である細胞集団に対してウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入する方法。
【請求項４】
ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞の調製のための、蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率が３％未満および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比が２未満である細胞集団を取得する方法であって、脂肪細胞を天井培養法にて６〜８日間培養する方法。
【請求項５】
ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞の調製のための、蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率が３％未満および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比が２未満である細胞集団。
【請求項６】
ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞であって、蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率が３％未満および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比が２未満である細胞集団に対してウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療のための脂肪細胞の調製に際し、外来遺伝子の導入に適した細胞集団かどうかを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内において所望の生理的機能を発揮するタンパク質やペプチドをコードする遺伝子（外来遺伝子）を生体外で細胞に導入し、外来遺伝子を導入した細胞を生体に移植して行われる遺伝子治療は、一部の疾患に対しては既に実用化され、その有効性が確認されているが、より治療効果に優れるとともに安全な技術の確立が必要とされている。遺伝子治療に利用する外来遺伝子を導入した細胞の調製方法はこれまでにも各種提案されているが、中でも脂肪細胞を用いた方法は、脂肪細胞の機能性、採取や培養の容易性などの点において利点を有することが期待されている（特許文献１）。脂肪組織から採取した脂肪細胞の培養（初代培養）は、Ｓｕｇｉｈａｒａらによって報告されている、培養フラスコの天井面に細胞を付着させて行う天井培養法がよく知られており（非特許文献１）、特許文献１においてもこの方法が採用されている。特許文献１によれば、その培養期間は１０〜１４日間が好ましいとされ、以来、この方法が外来遺伝子を導入する脂肪細胞の取得方法として一般化されている。本発明者らも、特許文献１を参考にして、脂肪細胞を用いてレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）欠損症の遺伝子治療用細胞を調製する方法を提案しているが（特許文献２）、脂肪細胞の取得方法は特許文献１に記載の方法に準じている。【０００３】
遺伝子治療用細胞を調製するに際しては、外来遺伝子の導入陽性率（全処理細胞中の外来遺伝子が導入された細胞の割合）が高く、かつ平均導入コピー数（細胞の染色体に組み込まれた外来遺伝子の平均数）が低いことが望ましいとされる（前者が低いと治療効果に劣る一方、後者が高いと染色体の機能異常が懸念されるため）。外来遺伝子の導入細胞として脂肪細胞を用いる場合においても、この要求を満たすことが求められるが、特許文献１にはウイルスベクターの感染多重度（ＭＯＩ）についての記載はあるものの、外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性の好適化に関しては何ら言及されていない。本発明者らは、特許文献２において、脂肪細胞が外来遺伝子の平均導入コピー数が高くても長期にわたってがん化しないという特性を有することを報告しているが、外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性の好適化についてはこれまで検討したことがない。従って、特許文献１に記載の上記の方法が、外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性の点において、外来遺伝子の導入に適した脂肪細胞を取得する方法として最善であるのかどうかは不明であり、このことは、外来遺伝子の導入に適した細胞集団かどうかを、外来遺伝子を導入する前に判定する方法がこれまで存在しなかったことにも起因する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１３１９４１号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／１０８３４４号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｕｇｉｈａｒａら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，３１：４２−４９，１９８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療のための脂肪細胞の調製に際し、外来遺伝子の導入に適した細胞集団かどうかを判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、脂肪組織から採取した脂肪細胞を天井培養する期間の相違によって、取得される脂肪細胞の外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性が大きく異なることを見出した。そして、外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性が異なる２種類の細胞集団のプロファイルを詳細に検討したところ、全く意外にも細胞表面抗原の１つであるＣＤ５４の発現の程度が外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性の良し悪しを判定する上での優れた指標となることを知見した。【０００８】
上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞の調製に際し、外来遺伝子の導入に適した細胞集団かどうかを判定する方法であって、ＣＤ５４の発現の程度を指標にしてその発現程度が低いほど適していると判定するものである。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率が３％未満および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比が２未満である細胞集団を適していると判定するものである。
また、本発明は、請求項３記載の通り、ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞を調製する方法であって、蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率が３％未満および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比が２未満である細胞集団に対してウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入するものである。
また、本発明は、請求項４記載の通り、ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞の調製のための、蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率が３％未満および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比が２未満である細胞集団を取得する方法であって、脂肪細胞を天井培養法にて６〜８日間培養するものである。
また、本発明は、請求項５記載の通り、ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞の調製のための、蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率が３％未満および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比が２未満である細胞集団である。
また、本発明は、請求項６記載の通り、ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞であって、蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率が３％未満および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比が２未満である細胞集団に対してウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療のための脂肪細胞の調製に際し、外来遺伝子の導入に適した細胞集団かどうかを判定する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例の実験Ａにおける、ＣＦ７とＣＦ１４のそれぞれに、天井培養終了後１日目に外来遺伝子としてヒトＬＣＡＴ遺伝子を導入した際の導入陽性率と平均導入コピー数を示すグラフである。
【図２】同、ＣＦ７に対するＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子の導入時期の相違による導入陽性率と平均導入コピー数の相違を示すグラフである。
【図３】実施例の実験Ｂにおける、ＣＦ７とＣＦ１４のＣＤ５４の発現陽性率を示すグラフである。
【図４】同、ＣＦ７とＣＦ１４のＣＤ５４の平均蛍光強度比を示すグラフである。
【図５】実施例の実験Ｃにおける、ヒトＬＣＡＴ遺伝子の平均導入コピー数とＬＣＡＴ蛋白分泌との相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療用脂肪細胞の調製に際し、外来遺伝子の導入に適した細胞集団かどうかを判定する方法であって、ＣＤ５４の発現の程度を指標にしてその発現程度が低いほど適していると判定するものである。本発明において、脂肪細胞のＣＤ５４の発現の程度は、例えば、蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法によって測定されるＣＤ５４の発現陽性率および／またはＣＤ５４の平均蛍光強度比に基づいて評価することができる。ＣＤ５４の発現陽性率は、全測定細胞中のＣＤ５４の発現が検出される細胞の割合を意味し、ＣＤ５４の平均蛍光強度比は、コントロール抗体であるＣＤ５４に非特異的な蛍光抗体による平均蛍光強度に対するＣＤ５４に特異的な蛍光抗体による平均蛍光強度の比率（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅａｎ比）を意味する。外来遺伝子の導入陽性率が高く、かつ平均導入コピー数が低い、外来遺伝子の導入に適した細胞集団であると判定するためには、ＣＤ５４の発現陽性率は３％未満であることが望ましく、ＣＤ５４の平均蛍光強度比は２未満であることが望ましい。
【００１２】
今般、本発明者らの研究により、例えば、ヒトの脂肪組織から採取した脂肪細胞を特許文献１に記載の方法に従って天井培養法にて１４日間培養することで取得される細胞集団と、培養期間をその半分の７日間とした細胞集団のそれぞれに対し、レトロウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入した場合、外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性が両者間で大きく異なることが明らかになった。加えて、２種類の細胞集団の間には、ＣＤ５４の発現の程度の明確な相違が存在し、前者は発現の程度が高く、後者は発現の程度が低いことが判明した。外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性の相違を、ＣＤ５４の発現の程度の相違がなぜ反映するのかは必ずしも明らかではないが、外来遺伝子を導入する前に、ＣＤ５４の発現の程度を指標として外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性の良し悪しを判定することができることは、より治療効果に優れるとともに安全な脂肪細胞を用いた遺伝子治療技術の確立に大いに寄与する。
【００１３】
例えば、脂肪組織から採取した脂肪細胞を天井培養法にて６〜８日間培養することで取得される、本発明の方法によって外来遺伝子の導入に適していると判定された脂肪細胞の細胞集団に対する外来遺伝子の導入は、レトロウイルスベクターやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いた自体公知の方法によって行うことができる（例えば特許文献１を参照のこと）。なお、本発明において天井培養を行って外来遺伝子を導入する対象となる脂肪細胞は、ヒトをはじめとする哺乳動物の皮下、副睾丸、腸間膜などに存在する脂肪組織から採取される増殖型の脂肪細胞であれば、成熟脂肪細胞（ｍａｔｕｒｅ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）であってもよいし前脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）であってもよい。外来遺伝子は、ウイルスベクターを用いて脂肪細胞に導入することができ、投与された生体内において所望の生理的機能を発揮するタンパク質やペプチドをコードする遺伝子であれば特段制限されるものではなく、例えば前出のＬＣＡＴ欠損症の治療のためのＬＣＡＴをコードする遺伝子の他、糖尿病の治療のためのインスリンやグルカゴン、糖尿病や肥満の治療のためのレプチンやアデイポネクチン、血友病の治療のための血液凝固第ＩＸ因子、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）欠損症の治療のためのＬＰＬ、低ＨＤＬ血症の治療のためのアポＡ１、高血圧や心不全の治療のための心房性ナトリウムペプチド（ＡＮＰ）、血管新生阻害のためのアンジオスタチン、骨粗鬆症の治療のためのカルシトニン、悪性腫瘍の治療のためのインターフェロンやインターロイキン、創傷の治癒のための顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、各種の免疫疾患の治療のための病態中和抗体などのタンパク質やペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、例えば既知の塩基配列を持つヒト由来のものであってもよいし、ヒト由来の遺伝子の塩基配列に対して１以上の塩基が置換・欠失・付加・挿入され、かつ、ヒト由来の遺伝子がコードするタンパク質やペプチドが有する生理的機能が保持や増強されたタンパク質やペプチドをコードするものであってもよい。外来遺伝子を導入した遺伝子治療用脂肪細胞の患者への投与（移植）は自体公知の方法によって行えばよい（例えば特許文献１を参照のこと）。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。【００１５】
実験Ａ．外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性とヒト脂肪細胞の取得方法の関係の検討
（１）外来遺伝子を導入するヒト脂肪細胞の取得
非特許文献１に記載の方法に従って行った。具体的には、まず、ボランティア（Ｎｏ．Ｃ００９）より得た脂肪組織を、２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼを含むＨａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社）で、３７℃において１時間処理した（５０ｍＬのコニカルチューブ内で脂肪組織１ｇに対してコラゲナーゼ溶液３ｍＬを添加して行った）。次に、２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＨＡＭ（ＤＭＥＭ−ＨＡＭ／２０％ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社）を１０ｍＬ加えて攪拌した後、４００ｇで１分間遠心した。遠心後、コニカルチューブ内の間質・血管系画分（Ｓｔｒｏｍａｌ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＳＶＦ）を含む溶液を除去した。さらに、ＤＭＥＭ−ＨＡＭ／２０％ＦＢＳを１０ｍＬ加えて攪拌した後、４００ｇで１分間遠心し、ＳＶＦを含む溶液を除去する操作を４回行い、脂肪細胞（増殖型成熟脂肪細胞）を含む上清画分を得た。５００μｍメッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を用いて脂肪細胞を含む上清画分をろ過した後、１０ｍＬのＤＭＥＭ−ＨＡＭ／２０％ＦＢＳでメッシュ上に残った組織を洗浄した。得られたろ液を、培地としてＤＭＥＭ−ＨＡＭ／２０％ＦＢＳを充填し、予め３７℃に保温しておいたＴ１５０またはＴ２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に加え、さらに気泡がフラスコ内にできるだけ残らないようにＤＭＥＭ−ＨＡＭ／２０％ＦＢＳを追加した。その後、フラスコの側面が培養面（天井面）となるようにフラスコを横にし、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で天井培養した。７日間または１４日間の培養の後、フラスコ内の培地を除去し、培養面に増殖した脂肪細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＴｒｙｐＺｅａｎ（Ｓｉｇｍａ社）を用いて処理することで回収した。回収した脂肪細胞は、ＤＭＥＭ−ＨＡＭ／２０％ＦＢＳを培地として用いて通常の方法で培養した（継代培養を週２回実施）。【００１６】
（２）ヒト脂肪細胞への外来遺伝子の導入
ウイルスベクターとしてヒトＬＣＡＴ遺伝子搭載レトロウイルスベクターとＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子搭載レトロウイルスベクターを使用した。これらのウイルスベクターは、自体公知の方法により、タカラバイオ社のｐＤＯＮ−ＡＩベクターにヒトＬＣＡＴ遺伝子のｃＤＮＡまたはＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子のｃＤＮＡを挿入して構築したプラスミドを、パッケージング細胞株であるＧＰ＋Ｅ８６にトランスフェクトした後、その培養上清をＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２に感染させることで作製した（必要であればＢｅｓｔｗｉｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５４０４（１９８８）やＫｏｚａｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３５００（１９９０）などを参照のこと）。ウイルスベクター含有遺伝子導入溶液には最終濃度が２０％となるようにＦＢＳを加えた。遺伝子導入は、脂肪細胞の培養液から培地であるＤＭＥＭ−ＨＡＭ／２０％ＦＢＳをピペットで除去し、ウイルスベクター含有遺伝子導入溶液に置換した後、一晩ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で培養することにより行った（２．５×１０５個の細胞を播種して接着させたＴ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に２ｍＬのウイルスベクター含有遺伝子導入溶液を添加）。なお、遺伝子導入補助試薬として硫酸プロタミン（持田製薬社）を最終濃度８μｇ／ｍＬで使用した。遺伝子導入後の脂肪細胞は、ＤＭＥＭ−ＨＡＭ／２０％ＦＢＳを培地として用いて通常の方法で培養した（継代培養を週２回実施）。【００１７】
（３）遺伝子の導入陽性率の測定
遺伝子導入後、１週間以上継代培養した脂肪細胞について測定した。ヒトＬＣＡＴ遺伝子の導入陽性率は、免疫染色法によって測定した。具体的には、コラーゲンコートされた８ｗｅｌｌカルチャースライドに５，０００個／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種して接着させた後、ＰＢＳで細胞を洗浄してから４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）・リン酸緩衝液を固定液として添加して細胞を固定し、一次抗体としてＥｐｉｔｏｍｉｃｓ社の抗ヒトＬＣＡＴウサギモノクローナル抗体、二次抗体としてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ抗体を用いた免疫染色を行った。染色操作終了後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で細胞の核を染色し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒによる赤色蛍光とＤＡＰＩによる青色蛍光を蛍光顕微鏡で観察することで、ＤＡＰＩによって染色された細胞数に対するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒによって染色された細胞数の比率（％）を算出し、導入陽性率とした。ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子の導入陽性率は、ＺｓＧｒｅｅｎタンパク質が緑色の蛍光タンパク質であることから、フローサイトメトリー法によって測定した（ベクトン・ディッキンソン社のＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを使用し、５，０００個の細胞について２回測定した）。【００１８】
（４）遺伝子の平均導入コピー数の算出
遺伝子導入後、１週間以上継代培養した脂肪細胞について測定した。経代操作時に１×１０５〜２×１０５個の細胞を１．５ｍＬのプラスチックチューブに回収し、４℃において３，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳに懸濁した。得られた細胞懸濁液は、そのままＤＮＡ抽出操作に供するか、もしくはＤＮＡ抽出操作を行うまで−２０℃に凍結保存した。Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡの抽出は、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行った。遺伝子の導入コピー数は、レトロウイルスベクターのパッケージングシグナル領域に特異的なプライマー（タカラバイオ社）を用い、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ（タカラバイオ社）を用いたＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法により定量した（アプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ７５００を使用）。検量線用のＤＮＡは、（２）でタカラバイオ社のｐＤＯＮ−ＡＩベクターにヒトＬＣＡＴ遺伝子のｃＤＮＡを挿入して構築したプラスミドを使用した。こうして測定された定量値から、ヒトにおいては１個の細胞あたり６ｐｇの染色体ＤＮＡを有するという報告（Ｖｌａｄｉｍｉｒ  Ａ  Ｒｏｇａｃｈｅｖら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００６，６：２３）を元に、遺伝子の平均導入コピー数を算出した。【００１９】
（５）結果
天井培養を７日間行って取得した脂肪細胞（以下、「ＣＦ７」と略称する）と１４日間行って取得した脂肪細胞（以下、「ＣＦ１４」と略称する）のそれぞれに、天井培養終了後１日目に外来遺伝子としてヒトＬＣＡＴ遺伝子を導入した際の導入陽性率と平均導入コピー数を図１に示す。図１から明らかなように、特許文献１に記載の方法によって取得したＣＦ１４よりもＣＦ７の方が、同一条件下では外来遺伝子の導入陽性率が高く、かつ平均導入コピー数が低く、脂肪組織から採取した脂肪細胞を天井培養する期間の相違によって、取得される脂肪細胞の外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性が異なることがわかった（図１において、導入日は天井培養終了後に通常の方法で培養を開始してから遺伝子導入を行うまでの日数を示す。Ｔｏｔａｌ  ｄｏｓｅはウイルスベクターのＭＯＩ（ＲＮＡゲノムコピー数／標的細胞数）の合計値を表し、導入日が複数の場合はこの合計値を均等に分割して感染させた）。この相違は、外来遺伝子としてＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子を導入した場合でも同様であり、ＣＦ７を用いた場合、天井培養を終了してから時間をおかずにすぐに遺伝子導入を行った時の方が、時間をおいてから遺伝子導入を行った時よりも、外来遺伝子の導入陽性率が同等でありながら、平均導入コピー数がより低くなることがわかった（図２：ＣＦ７（８）とＣＦ７（１５）はそれぞれ天井培養開始後８日目と１５日目、即ち、天井培養終了後１日目と８日目に遺伝子導入を行った時の結果を示す。従って、遺伝子導入は天井培養終了後３日目以内に行うのが望ましく、２日目以内に行うのがより望ましく、１日目以内に行うのがさらに望ましい）。【００２０】
実験Ｂ．ヒト脂肪細胞の取得方法とＣＤ５４の発現の程度の関係の検討
（検討方法）
実験Ａの（１）において天井培養終了後に回収した脂肪細胞を３００ｇで５分間遠心した後、ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）で２回洗浄した。次いで、ヨウ化プロピジウムで細胞の核を染色した後、細胞計数装置（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社のＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ）で細胞数を測定し、４．５×１０４個の細胞を用いて実験を行った。ＣＤ５４の染色のための蛍光抗体にはＣＤ５４−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＣａｔ＃ＩＭ０７２６）を用い、アイソタイプコントロール（コントロール抗体）にはＩｇＧ１−ＦＩＴＣ（同、Ｃａｔ＃Ａ０７７９５）を用いた。脂肪細胞に抗体を添加し、遮光して室温で３０分間静置した後、ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを用いて３００ｇで５分間の遠心洗浄を３回行った。次いで、２００μＬの１％ＰＦＡ／２％ＦＢＳ／ＰＢＳを加えて抗体を細胞に固定した後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いてＣＤ５４の発現の程度を解析した。【００２１】
（検討結果）
２名のボランティア（Ｎｏ．Ｃ００９とＮｏ．Ｃ０１０）より得た脂肪組織から取得したＣＦ７とＣＦ１４のＣＤ５４の発現陽性率を図３に、平均蛍光強度比（ＧｅｏＭｅａｎ比）を図４に示す。図３から明らかなように、いずれのボランティアから取得したＣＦ７も、ＣＦ１４よりもＣＤ５４の発現陽性率が非常に低く、３％未満であった（Ｃ００９では２．７８％、Ｃ０１０では１．９６％）。また、図４から明らかなように、いずれのボランティアから取得したＣＦ７も、ＣＦ１４よりもＣＤ５４の平均蛍光強度比が非常に低く、２未満であった（Ｃ００９では１．２３、Ｃ０１０では１．４１）。表１に、２名のボランティアから取得したＣＦ７とＣＦ１４の、ＣＤ５４を含めた種々の細胞表面抗原の発現陽性率と平均蛍光強度比を示す。表１から明らかなように、ＣＦ７とＣＦ１４の間において認められる外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性の相違を反映する、ＣＦ７とＣＦ１４の間において認められる発現陽性率と平均蛍光強度比の特性の相違を有する細胞表面抗原としては、発現陽性率と平均蛍光強度比がともにＣＦ１４の数値よりもＣＦ７の数値が小さいＣＤ２９、ＣＤ３６、ＣＤ５４、ＣＤ５５があるが、発現陽性率と平均蛍光強度比の数値がともにＣＦ７とＣＦ１４の間で大きな違いがあるのはＣＤ５４のみであった（例えばＣＦ７の数値がＣＦ１４の数値の１／２未満）。従って、ＣＤ５４の発現の程度は、外来遺伝子の導入対象となる脂肪細胞の細胞集団の外来遺伝子の導入陽性率と平均導入コピー数の特性の良し悪しを判定する上での優れた指標となり、発現程度が低いほど適していると判定できることがわかった。なお、脂肪細胞の天井培養期間を６日間にした場合と８日間にした場合も、程度に違いはあるものの、７日間にした場合の上記の結果と同様の結果となった。【００２２】
【表１】
2011090091.tif 000003
【００２３】
実験Ｃ．ヒトＬＣＡＴ遺伝子の平均導入コピー数とＬＣＡＴ蛋白分泌との相関の検討
（１）ＬＣＡＴ蛋白解析用脂肪細胞の培養上清の調製
実験Ａと同様にして、ボランティア（Ｎｏ．Ｃ０１３）より得た脂肪組織から取得したＣＦ７に、種々の外来遺伝子導入条件（ＭＯＩおよび導入日数）で外来遺伝子としてヒトＬＣＡＴ遺伝子を導入したそれぞれの細胞を、増殖用培地（ＭｅｓｅｎＰＲＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁させて１×１０５個／ｍＬに調整した。この細胞懸濁液を１２ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり１ｍＬずつ播種し、ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。翌日、培養液を新鮮な培地０．６ｍＬに交換し、ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。培養後の培養液をプラスチックチューブに回収し、４℃において３００ｇで５分間遠心することで得られた上清を以下のＬＣＡＴ蛋白解析に使用した（使用時まで−３０℃のフリーザーにて保存）。【００２４】
（２）ＬＣＡＴ蛋白の免疫沈降・ウェスタンブロット法による検出
（１）で調製した２０μＬの培養上清を、０．２％ＮＰ−４０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−ＮＰ４０）を用いて５００μＬに希釈した後、免疫沈降用抗体として２．５μＬの抗ヒトＬＣＡＴウサギモノクローナル抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ社）を添加し、４℃で一晩転倒混和した。次に、二次抗体として２０μＬのＴｒｕｅ  Ｂｌｏｔ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＩＰ  Ｂｅａｄｓ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を反応液に添加し、４℃で２時間転倒混和した後、４℃において５，０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清を除去した後、マトリックスをＰＢＳ−ＮＰ４０で５回洗浄してから、２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を１０μＬ添加し、１００℃で５分間加熱した。氷上で冷却した後、卓上遠心機を用いて５，０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。得られた上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％）で展開し、ニトロセルロースメンブレンに転写後にＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて室温で１時間ブロッキングした。その後、ウェスタンブロット用一次抗体としてＮＯＶＵＳ社の抗ヒトＬＣＡＴウサギポリクローナル抗体（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで１，０００倍希釈）、二次抗体としてＴｒｕｅ  Ｂｌｏｔ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで５，０００倍希釈）を用いて抗原抗体反応を行った。化学発光基質はＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用い、ＬＡＳ−１０００イメージアナライザーでＬＣＡＴ蛋白を検出した。得られた画像を元に、市販の組換え型ＬＣＡＴ蛋白（Ｒｏａｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）を標準物質としてデンシトメトリー解析を行い、ヒトＬＣＡＴ遺伝子の平均導入コピー数とＬＣＡＴ蛋白量との相関を調べた。【００２５】
（３）ＬＣＡＴ蛋白活性の測定
［３Ｈ］コレステロール（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）をガラスチューブに０．２ｍＬ取り、窒素ガスにより溶媒を蒸発させた。アナソルブ（登録商標）ＬＣＡＴキット（積水メディカル社）の説明書に従って調製したＬＣＡＴ基質液５ｍＬを上記のガラスチューブに添加し、Ｖｏｒｔｅｘミキサーにより１分間混和した後、超音波発生機（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ２５０：ＢＲＡＮＳＯＮ社）により、マイクロチップを用い、氷上において、超音波出力設定４０％、パルス発振ＯＮ，ＯＦＦ各０．５秒間の条件で超音波処理を１分間行った。この超音波処理をあと５回繰り返した後（合計６回）、室温において３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、ラベル基質液とした（４℃で保存して１週間以内に使用）。ガラスチューブに反応液（（１）で調製した培養上清１００μＬ、ラベル基質液１００μＬ、１Ｍβ−メルカプトエタノール１μＬ、培地１４μＬ、アポＡ１溶液（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）５μＬ：８μｇ蛋白相当）を準備し（反応液の総量は２２０μＬ）、３７℃の恒温漕で、６０分間インキュベーションした。その後、１．６ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１）を添加し、反応を停止した。こうして得られたＬＣＡＴ反応液をＶｏｒｔｅｘミキサーにより６０秒間激しく混和した後、０．１ｍＬの蒸留水を添加し、さらに３０秒間激しく混和した。その後、室温において３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。あらかじめ１０ｍｇ／ｍＬオレイン酸コレステロール（コレステリルエステル）２μＬと１０ｍｇ／ｍＬコレステロール５μＬをスポットしておいたＴＬＣプレート（Ｗｈａｔｍａｎ社）に、上記の遠心後の下層（有機層）５０μＬを、５μＬずつ１０回に分けてスポットした。スポット後のＴＬＣプレートをヘキサン／エチルエーテル／酢酸（１４６：５０：４）で展開後、風乾してからヨウ素（ナカライテスク社）で染色した。出現したコレステリルエステルのスポットを切り取り、１０ｍＬのＣｌｅａｒ−ｓｏｌＩＩ（ナカライテスク社）中に沈めた。その後、液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。液体シンチレーションカウンターによる測定値からＬＣＡＴ活性（コレステリルエステル合成能）を算出し、ヒトＬＣＡＴ遺伝子の平均導入コピー数とＬＣＡＴ活性との相関を調べた。【００２６】
（４）結果
（２）の方法で調べたヒトＬＣＡＴ遺伝子の平均導入コピー数とＬＣＡＴ蛋白量との相関と、（３）の方法で調べたヒトＬＣＡＴ遺伝子の平均導入コピー数とＬＣＡＴ活性との相関を図５に示す。図５から明らかなように、ヒトＬＣＡＴ遺伝子の平均導入コピー数が増えるにつれて、ＬＣＡＴ蛋白量とＬＣＡＴ蛋白活性も増えたことから、ヒトＬＣＡＴ遺伝子の平均導入コピー数とＬＣＡＴ蛋白分泌は相関することがわかった（ピアソンの相関係数ｒは、ヒトＬＣＡＴ遺伝子の平均導入コピー数とＬＣＡＴ蛋白量の相関について０．９１７で、ヒトＬＣＡＴ遺伝子の平均導入コピー数とＬＣＡＴ蛋白活性の相関について０．９４５：いずれもｐ＜０．０５）。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、ウイルスベクターを用いて外来遺伝子を導入してなる遺伝子治療のための脂肪細胞の調製に際し、外来遺伝子の導入に適した細胞集団かどうかを判定する方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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