(57)【要約】  本発明は、収率が高く、安定性に優れ、細胞毒性が低減された核酸多糖複合体を提供する。すなわち、本発明は、多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖との核酸多糖複合体であって、ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されている複合体（但し、アンチセンスDNAとポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート化されている場合を除く）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、多糖であるβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との核酸多糖複合体であって、ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されている複合体、
但し、アンチセンスDNAとポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート化されている場合を除く。
【請求項２】
前記β-1,3-グルカン骨格を有する多糖がシゾフィランである、請求項１に記載の核酸多糖複合体。
【請求項３】
ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の少なくとも20%がホスホロチオエート化されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸多糖複合体。
【請求項４】
ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の25〜90%がホスホロチオエート化されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸多糖複合体。
【請求項５】
標的遺伝子の発現抑制のために使用される、請求項１〜４のいずれかに記載される核酸多糖複合体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の核酸多糖複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項７】
多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖とを、多糖結合部位を介して結合させる工程を含む核酸多糖複合体の製造方法、
ここで、前記核酸多糖複合体は、多糖結合部位のホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されているが、アンチセンスDNAとポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート化されているものではない。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の核酸多糖複合体を、標的細胞に接触させる工程を含む、核酸多糖複合体を標的細胞に導入する方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の核酸多糖複合体を、標的遺伝子を有する細胞に接触させる工程を含む、標的遺伝子の発現抑制方法。
【請求項１０】
多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖とを、多糖結合部位を介して結合させる工程を含む、核酸多糖複合体の安定化方法、
ここで、前記ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち20〜90%がホスホロチオエート化されているものである。
【請求項１１】
多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖とを、多糖結合部位を介して結合させる工程を含む、核酸多糖複合体の細胞毒性を低減する方法、
ここで、前記ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち20〜90%がホスホロチオエート化されているものである。
【請求項１２】
標的遺伝子の発現抑制剤の製造のための、核酸多糖複合体の使用であって、
前記核酸多糖複合体が、多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、多糖であるβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体であって、ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されているが、アンチセンスDNAとポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート化されているものではない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定性に優れた低細胞毒性の核酸多糖複合体、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンス療法のコンセプトは、1970年代にZamecnikとStephensonによって提案された。彼らは、標的mRNAの特定部分に対する相補的なオリゴヌクレオチドの短配列が対応するタンパク質の発現を阻害し得ることを初めて見出した（非特許文献１を参照）。そのような生体機能を有するオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）として使用され、現在多数のASOがHIV/AIDS及び癌の領域において前臨床及び臨床試験の段階にある。過去の研究により、ASOの細胞移入の乏しさ、ヌクレアーゼに対する脆弱性は、in vivoでの活性を著しく低下させることが知られている。また、In vivo試験では、十分な生物学的効果を達成するため、動物モデルに対して10mg/kg以上もの過剰投与試験が行われることがあった。しかしながら、過剰なASOは毒性及び副作用を引き起こす可能性があり、そもそも商業的及び医学的観点からは実用的とは言えなかった。このような欠点を克服するため、核酸アナログと標的輸送（target delivery）の主に２つのアプローチが提案された。【０００３】
様々な核酸アナログのうち、ホスホジエステル結合部分にホスホロチオエート化（S化）が施されたASOはヌクレアーゼ耐性と細胞取り込みの点で優れていることが知られている。ホスホロチオエート化ASOは、ホスホジエステル（PO）基の酸素原子が、硫黄原子で置換されたものである。【０００４】
一方、標的輸送に使用される天然型多糖であるシゾフィラン（SPG）は、抗原提示細胞のdectin-1によって認識され、輸送担体として使用できることが知られている。SPGは、β-1,3-グルカンファミリーに属し、中性水溶液中で右回りの３重螺旋構造をとり、アルカリ溶液（0.25N 以上の水酸化ナトリウム水溶液）中で１本鎖の構造をとることが知られている。SPGのアルカリ溶液がpH7〜8に中和されると、一本鎖は疎水性及び親水性の結合相互作用により本来の３重螺旋構造を再生する。中和工程において特定のポリヌクレオチド（例えば、ポリデオキシアデニン等の核酸ホモポリマー）が存在すれば、２本のSPGと１本のポリヌクレオチドが複合体を形成する。このような技術を基礎として、SPG等のβ-1,3-グルカンを利用する技術が精力的に検討されている。例えば、これまでに、機能性核酸と、SPG等のβ-1,3-グルカンとの複合体の形成が可能になるように、ポリデオキシアデニン等の核酸ホモポリマーを機能性核酸に付加させる技術が報告されている（例えば、特許文献１参照）。また、SPG等のβ-1,3-グルカンの上記特性を利用することにより、β-1,3-グルカンを遺伝子キャリアーとして使用する技術についても報告されている（例えば、特許文献２参照）。更に、SPG等のβ-1,3-グルカンと核酸との親和性を高めるために、β-1,3-グルカンの1,6グルコピラノシド分岐の少なくとも一部に、カチオン性官能基、ステロイド官能基、アミノ酸性官能基、インターカレーター性官能基等の核酸結合性官能基を付加する技術も報告されている（例えば、特許文献３参照）。【０００５】
一方、ポリデオキシアデニン鎖を付加したASOは、短いヘテロ配列（例えばアンチセンスDNA等の様なランダムに塩基が配列しているようなポリヌクレオチド）部分には、通常SPGと複合体を形成しない。特に長いポリデオキシアデニン鎖は安定な複合体を形成するからである。これまでに、本発明者らは、ホスホロチオエート化されたASOにホスホロチオエート化されたポリデオキシアデニンを付加したものは安定なSPG複合体（PS複合体）を形成することを確認している（非特許文献２を参照）。しかしながら、PS複合体を使用する場合、ホスホロチオエートに起因する副作用（細胞毒性）が引き起こされることが懸念されている。このような副作用を抑制するための技術については、未だ解決策が見出されていないのが現状である。【０００６】
このような背景から、SPGとアンチセンスDNAの安定な複合体を効率よく得るための方法、ならびにPS複合体の副作用抑制するための技術の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】P.S.Zamecnik et al., Proc Natl Acad Sci USA 75(1978) 280-4
【非特許文献２】Bull. Chem. Soc. Jpn., 77, 1101-1110 (2004)
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第2007/058323号パンフレット
【特許文献２】国際公開第01/34207号パンフレット
【特許文献３】国際公開第02/072152号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、安定性に優れ、細胞毒性が低減されたアンチセンスDNAとβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との核酸多糖複合体を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、核酸多糖複合体における多糖結合部位（すなわちポリデオキシアデニン部分）のS化（ホスホロチオエート化）の程度を調節することにより、安定性に優れ、標的遺伝子の発現抑制に十分なアンチセンス活性を有する核酸多糖複合体が効率よく得られることを見出した。さらに、本発明者らは、このような核酸多糖複合体は、細胞毒性が低減されることも見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
即ち、本発明は、下記の態様の発明を提供する。
項１．  多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、多糖であるβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との核酸多糖複合体であって、ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されている複合体、
但し、アンチセンスDNAとポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート化されている場合を除く。
項２．  前記β-1,3-グルカン骨格を有する多糖がシゾフィランである、項１に記載の核酸多糖複合体。
項３．  ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の少なくとも20%がホスホロチオエート化されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸多糖複合体。
項４．  ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の25〜90%がホスホロチオエート化されていることを特徴とする、項１〜３のいずれかに記載の核酸多糖複合体。
項５．  標的遺伝子の発現抑制のために使用される、項１〜４のいずれかに記載される核酸多糖複合体。
項６．  項１〜５のいずれかに記載の核酸多糖複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
項７．  多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖とを、多糖結合部位を介して結合させる工程を含む核酸多糖複合体の製造方法
ここで、前記核酸多糖複合体は、多糖結合部位のホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されているが、アンチセンスDNAとポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート化されているものではない。
項８．  項１〜５のいずれかに記載の核酸多糖複合体を、標的細胞に接触させる工程を含む、核酸多糖複合体を標的細胞に導入する方法。
項９．  項１〜５のいずれかに記載の核酸多糖複合体を、標的遺伝子を有する細胞に接触させる工程を含む、標的遺伝子の発現抑制方法。
項１０．  多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖とを、多糖結合部位を介して結合させる工程を含む、核酸多糖複合体の安定化方法、
ここで、前記ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち20〜90%がホスホロチオエート化されているものである。
項１１．  多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖とを、多糖結合部位を介して結合させる工程を含む、核酸多糖複合体の細胞毒性を低減する方法、
ここで、前記ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち20〜90%がホスホロチオエート化されているものである。
項１２．  標的遺伝子の発現抑制剤の製造のための、核酸多糖複合体の使用であって、
前記核酸多糖複合体が、多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、多糖であるβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体であって、ポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート化されているが、アンチセンスDNAとポリデオキシアデニンのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオエート化されているものではない。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖とアンチセンスDNAにより構成される核酸多糖複合体は、安定性に優れ、細胞毒性が低減されていることから、アンチセンス療法においても安全に使用することができる。また、本発明の核酸多糖複合体は、優れたアンチセンス効果を発揮し得るものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】(A)は、複合体(c)、ネイキッド(n)(dA)20、(dA)30、(dA)40試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動の移動パターンを示す。(B)は、AS-(dA)20、AS-(dA)30、AS-(dA)40試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動の移動パターンを示す。なお、ネイキッド(n)(dA)20とはSPGと複合体を形成していないdAを意味する。
【図２】(A)は、複合体(c)及び、異なるPS含量のネイキッド(n)(dA)40試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動の移動パターンを示す。(B)は、PSとSPG及びAS-ODNからなる複合体、並びにPOとSPG及びAS-ODNからなる複合体のゲル浸透クロマトグラムを示す。クロマトグラムは260nmにおける紫外吸光度を検出した。
【図３−１】20℃にて計測されたネイキッド(dA)40（図中(A)）及び(dA)40複合体（図中(B)）のCDスペクトラムのPS含量依存性を示す。
【図３−２】(C)は、282nmにおける複合体のCDスペクトラムの温度依存性を示す。(D)は、異なるPS含量の(dA)40のTmを示す。
【図４】SPG及び異なるPS含量のASO-(dA)40からなる複合体のゲル電気泳動の移動パターンの比較を示す。図中n及びcは、それぞれ、ネイキッドASO及びSPGとの複合体を表す。
【図５】ASO/SPG複合体による処置後のLPS誘導TNF-α分泌の比較を示す。結果は、mean ± SD (n=3)で示される*P<0.05, **P<0.01
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の核酸多糖複合体は、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖の２本鎖と標的配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンスDNAの１本鎖によって構成される三重螺旋構造を有している。具体的には、３重螺旋構造の多糖であるβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖を、一度有機溶媒やアルカリ性の水溶液に溶解して単一鎖の溶液にし、この溶媒を元の中性の水に戻す過程において、ある長さ以上のpoly(dA)が存在すると核酸１塩基に対して多糖の主鎖１グルコースの長さの割合でポリヌクレオチド１本に対し多糖２本の複合体を形成する。
【００１４】
本発明の核酸多糖複合体を構成するアンチセンスDNAは、ポリデオキシアデニン（dA）テイルを末端に有している。アンチセンスDNAとは、標的遺伝子のmRNAへの転写を抑制することにより標的遺伝子の発現を抑制できる一本鎖DNAである。アンチセンスDNAを構成する塩基数については特に限定されるものではないが、通常10〜35個、好ましくは15〜30個、更に好ましくは16〜24個が挙げられる。アンチセンスDNAの発現抑制対象となる標的遺伝子の種類は特に限定されるものではなく、治療目的等に応じて適宜決定することができる。また、アンチセンスDNAの塩基配列については、標的遺伝子の種類等に応じて、従来公知の手法で設計することができる。また、本発明の核酸多糖複合体を構成するdAテイルは多糖結合部位として機能する。dAテイルを構成するデオキシアデニンの数としては、後述するβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖との複合体形成が可能であることを限度として、特に限定されるものではないが、例えば、10〜100個、好ましくは20〜100個、より好ましくは20〜80個、更に好ましくは40〜60個が挙げられる。
【００１５】
アンチセンスDNAにdAテイルを修飾することにより、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖と良好な複合体を形成し、このようにして得られる核酸多糖複合体は高い分解酵素耐性を有する。
【００１６】
アンチセンスDNA鎖の5’末端にdAテイルを直接結合させるには、具体的には、アンチセンスDNA鎖の5’末端のリボヌクレオチドの5’の炭素原子と、dAテイルの3’末端の3’の炭素原子とエステル結合したリン酸残基とをエステル結合させればよい。また、アンチセンスDNA鎖の3’末端に、dAテイルを直接結合させるにはアンチセンスDNA鎖の3’末端のリボヌクレオチドに結合したリン酸残基と、dAテイルの5’端とをエステル結合させればよい。
また、アンチセンスDNAは、通常用いられる方法によって種々の修飾を加えたものであってもよい。例えば、安定化のために、ホスホロチオエート化（S化）したS-オリゴや、糖の2’位にフッ素やヒドロキシメチル基等で修飾した核酸を使用することも可能である。ただし、本発明においては、dAテイルとアンチセンスDNAの全てのホスホジエステル結合部分をS化したものは含まないものとする。なお、アンチセンス部分のS化の程度は目的とする治療によって異なり、適宜調整することが可能である。例えば、ヌクレアーゼに対する酵素耐性が必要とされる場合のS化率は100％に近いものが好ましく、S化による副反応が懸念される場合は天然型（すなわちS化率0％）に近い方が好ましい。
【００１７】
本発明においては、多糖結合部位のポリデオキシアデニン（dA）のホスホジエステル結合を、所定の範囲でホスホロチオエート化（S化）することにより、本発明の核酸多糖複合体の収率や安定性を高め、細胞毒性を低減させることができる。
【００１８】
ポリデオキシアデニンのS化は、従来公知の方法に従って行うことができる。dAテイル部分におけるS化の分布は特に限定されず、任意の位置に所望のS化を行えばよい。ここで、核酸多糖複合体の収率を高めることを目的とする場合、S化率が20〜90％程度、好ましくは30〜70％程度、より好ましくは50〜70％程度である。なお、本明細書において、dAテイル部分のS化率とは、dAテイル中のホスホジエステル結合の総数に対して、S化されているホスホジエステル結合の割合（％）を示す。また、S化されているホスホジエステル結合とは、ホスホジエステル結合のリン酸残基の酸素原子の一つが硫黄原子に置換されている結合構造である。
【００１９】
また、核酸多糖複合体の安定性を高めることを目的とする場合、dAテイルの全長を100%として、S化率が20〜90％程度、好ましくは30〜70％程度、より好ましくは50〜70％程度である。
【００２０】
さらに、核酸多糖複合体の細胞毒性を低減することを目的とする場合、dAテイルの全長を100%として、S化率が20〜90％程度、好ましくは30〜70％程度である。
【００２１】
本発明においては、高収率、安定性、細胞毒性低減の全ての効果を奏するために、ポリデオキシアデニンのS化率を少なくとも20％以上、好ましくは25〜90％程度、より好ましくは30〜70％程度とすることが望ましい。
【００２２】
本発明の核酸多糖複合体には、アンチセンス効果以外の所望の機能を担う部分として、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖を含む。β-1,3-グルカン骨格を有する多糖は、前述の細胞表面に存在する受容体、Dctin-1と結合することによって誘導されるシグナルを通じ、細部内に送達される。
【００２３】
β-1,3-グルカンとは、グルコースがβ1→3グルコシド結合により結合された多糖であり、主鎖のグルコース残基数に対する側鎖のグルコース残基数の割合（以下、側鎖率と略記する）の異なる各種のものが知られている。本発明に使用される多糖類については、前記1本鎖ポリデオキシアデニンとの複合化を容易ならしめ、本発明の核酸多糖複合体の細胞内導入率をより一層向上させるという観点から、側鎖率の比較的高いβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖が好適である。
本発明において使用されるβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖（以下、単に『前記多糖』と略記することがある）として、具体的には、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリフォラン、スクレログルカン等が例示される。これらの中でも、シゾフィランは、細胞内導入性及び酵素分解耐性の向上を一層顕著ならしめることができるので、本発明において好適な多糖である。また、前記多糖としてシゾフィランを用いる場合、シゾフィランの側鎖のグルコース残基を化学変換することにより、細胞のレセプターに親和性を有する官能基（アミノ基、アミノ酸基、ペプチド基、コレステロール基等）を導入することが可能である。
【００２４】
本発明の核酸多糖複合体に使用される前記多糖の分子量については、特に制限されず、使用する多糖の種類、前述のdAテイルの鎖長等に応じて適宜設定すればよい。具体的には、該多糖の分子量として、通常25,000〜2500,000、好ましくは25,000〜150,000が例示される。
また、前記多糖には、直接又はリンカーを介して機能性分子が結合していてもよい。このように機能性分子が結合した前記多糖（修飾型のβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖）を使用することによって、本発明の核酸多糖複合体に、該機能性分子に基づく有用機能を備えさせることが可能になる。リンカーは、従来公知のものを利用することができ、例えばPEG等が挙げられる。
【００２５】
機能性分子としては、具体的には、ペプチド、タンパク質、糖、アミノ酸、DNA、RNA、低分子有機・無機材料、コレステロール、デンドリマー、脂質、高分子材料等が例示される。
【００２６】
前記ペプチドとしては、例えば、3〜40個、好ましくは6〜30個、更に好ましくは8〜25個のアミノ酸から構成されるペプチドが挙げられる。具体的には、細胞膜透過ペプチド（オクタアルギニン（R8）、ペネトラチン等）、核局在化シグナルペプチド配列(HIV-1 Tat、SV40 T抗原等)、核外移行性シグナルペプチド(HIV-1 Rev、MAPKK等)、細胞膜融合ペプチド（gp41、バイアルフュージョンペプチド等）が挙げられる。中でも、本発明において、R8は好適に使用される。R8は細胞内への導入を促進する作用があり、R8が結合した多糖を使用すれば、核酸多糖複合体を細胞内に一層効率的に導入できるという利点が得られる。
【００２７】
前記タンパク質としては、生体内に存在するタンパク質、薬理作用を有するタンパク質、分子認識作用を有するタンパク質等を使用でき、該タンパク質の一例として、エクスポーチン/インポーチン・タンパク質、フェブロネクチン、アビジン、抗体等を挙げることができる。
【００２８】
前記糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、グルコサミン、ガラクトサミン等の単糖、これらを任意に組み合わせたオリゴ糖又は多糖等が挙げられる。
【００２９】
前記低分子有機・無機材料としては、例えば、スペルミン、スペルミジン等のカチオン性分子；FITC、Alexa、Cy3、Cy5等の蛍光物質；ビオチン；量子ドット；金微粒子等が挙げられる。
【００３０】
前記デンドリマーとしては、例えば、ポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
【００３１】
前記脂質としては、例えば、リノール酸、DOPE（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）等が挙げられる。
【００３２】
前記高分子材料としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン等が挙げられる。
【００３３】
前記機能性分子の中でも、好ましくはペプチド、カチオン性分子、ポリエチレングリコールであり、更に好ましくはペプチドである。また、前記機能性分子の中でも、細胞膜透過性を有する分子（細胞膜透過性分子）、及びアンチセンスDNAに対して分解酵素耐性を付与できる分子が好適である。上記機能性分子の内、細胞膜透過性分子としてはペプチド等が挙げられ、アンチセンスDNAに対して分解酵素耐性を付与できる分子としてはポリエチレングリコールが挙げられる。このような修飾型の多糖も本発明におけるβ-1,3-グルカン骨格を有する多糖に包含されるものとする。
【００３４】
本発明の核酸多糖複合体は、前述のdAテイルを有するアンチセンスDNAと前記多糖が複合化することによって形成されている。アンチセンスDNAと前記多糖との複合化構造については、特に制限されないが、通常、１本鎖アンチセンスDNAに対して２本鎖の前記多糖を複合化させた３重鎖螺旋構造が好適である。このような３重鎖螺旋構造の形成は、具体的には以下の方法に従って実施できる。前記多糖は、天然若しくは水中では、３重螺旋構造をとっている。この多糖を、DMSO（ジメチルスルホオキシド）等の極性溶媒に溶解して１本鎖にした後、dAテイルを有するアンチセンスDNAを加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、アンチセンスDNA１本鎖部分と２つの前記多糖からなる、３重螺旋型に複合化された構造（会合構造）が形成される。このようなポリヌクレオチドと多糖の複合化は、主に、水素結合と疎水性相互作用を介して形成されると考えられる。
【００３５】
このような構造を有する本発明の核酸多糖複合体は、公知の方法に従って調製することができる。具体的には、以下の(1)〜(3)の工程で製造する方法が例示される：(1)ポリデオキシアデニンが結合したポリヌクレオチド結合アンチセンスDNAを公知の方法に従って調製する、(2)別途、前記多糖を用意する、或いは機能性分子が直接又はリンカーを介して結合している前記多糖を調製する、(3)次いで、アンチセンスDNAに結合したポリデオキシアデニンと前記多糖とを用いて複合体を形成させる。
【００３６】
すなわち、本発明は、多糖結合部位としてポリデオキシアデニン（dA）を有するアンチセンスDNAと、β-1,3-グルカン骨格を有する多糖とを、多糖結合部位を介して結合させる核酸多糖複合体の製造方法をも提供するものである。ここで、ポリデオキシアデニン部分（dAテイル部分）の少なくとも一部はS化されており、そのS化率は前述の通りである。
【００３７】
前記方法の(3)の工程で形成させる複合体において、dAテイルを有するアンチセンスDNAとβ-1,3-グルカンの分子数比については、アンチセンス鎖の塩基数とそれに付加するdAテイルのアデニンの数、及びβ-1,3-グルカンの分子量等に応じて適宜設定され、一意的に好ましい分子数比を限定することができないが、通常、β-1,3-グルカンに対するdAテイルを有するアンチセンスDNAの分子数比（モル）は1:2〜1:30程度である。β-1,3-グルカン1分子に対して多くのアンチセンス鎖が複合化されていることにより効果が一層有効に発揮できる場合は分子量が数万以上のβ-1,3-グルカンと複合化することが好ましく、分子数比（モル）で1:8〜1:20がより好ましい。逆に、上記複合体が小さい粒子の方が効果がある場合は、分子数比（モル）で1:2から1:5がより好ましい。このようなモル比で、前記アンチセンスDNAと、シゾフィランを複合体形成条件下に晒すことにより、両者を効率的に相互作用させることが可能になり、本発明の核酸多糖複合体の製造効率を向上させることができる。
【００３８】
複合体の化学量論比は、β-1,3-グルカン骨格の繰り返し単であるグルコース糖のモル数と、ポリデオキシアデニンの塩基のモル数の比で2:1である。通常、多糖やポリデオキシアデニンは高分子であるため、多糖とポリデオキシアデニンとのモル数で複合体の化学量論比を規定することはできない。実験的には、反応させる糖と核酸の重量比や、分子数比で議論することが便利である。このように、複合体の化学量論比は、2:1であるが、核酸を強固に守る必要がある場合は糖を多く、アンチセンス核酸の効果を強く出すためには、核酸を多く入れることができる。
【００３９】
本発明の核酸多糖複合体は、細胞内に導入されることにより、細胞内での標的遺伝子の発現を抑制することができるので、標的遺伝子の発現抑制を目的とした医薬組成物として使用できる。当該医薬組成物は、有効成分として本発明の核酸多糖複合体に薬学的に許容される担体を適宜組み合わせて調製することができる。このような担体としては、精製水、糖含有水溶液、緩衝液、生理食塩水、RNase free水等の水性担体；賦形剤等が挙げられる。
【００４０】
本発明の核酸多糖複合体の投与量は、所望の遺伝子抑制作用を発揮し得る限り特に限定されないが、体重1kg当たりに一回で投与する核酸量として、0.001mg〜10mgとすることが望ましく、投与対象の症状、投与経路等に応じて適宜設定することができる。
【００４１】
また、当該医薬組成物の剤形、投与方法等は、医薬品として公知の形態を適用可能であり、アンチセンスDNAの種類や用途、疾患部位等に応じて適宜設定することができる。
【００４２】
さらに、本発明は、核酸多糖複合体を標的細胞に導入する方法を提供する。本発明の核酸多糖複合体の細胞内への導入量や方法は、従来のアンチセンスDNAの場合と同様であり、標的遺伝子の発現抑制に有効な量の核酸多糖複合体を、標的遺伝子を有する細胞に接触させ、当該細胞内に当該核酸多糖複合体を取り込ませればよい。なお、本発明の核酸多糖複合体は、単独でも優れた細胞内移行能を示すので、アンチセンスDNAの細胞内への導入に使用されている従来の遺伝子導入試薬を用いずに、或いは従来の遺伝子導入試薬の使用量を低減して、細胞内に導入することも可能である。なお、本発明の核酸多糖複合体の標的遺伝子の発現抑制は、in vivoで行ってもよく、またin vitro又はex vivoで行うこともできる。
【００４３】
さらに、上述のようにポリデオキシアデニン（dA）テイル部分のS化を調節することにより、安定性が高い核酸多糖複合体、細胞毒性が低減された核酸多糖複合体を得ることができる。すなわち、本発明は、dAテイル部分のホスホジエステル結合を20〜90％、好ましくは30〜70％、より好ましくは50〜70％ホスホロチオエート化することを特徴とする核酸多糖複合体の安定化方法、ならびにdAテイル部分のホスホジエステル結合を20〜90％、好ましくは30〜70％ホスホロチオエート化することを特徴とする核酸多糖複合体の細胞毒性を低減する方法を提供する。
【００４４】
また、本発明は、細胞内で標的遺伝子の発現を抑制するための、上記核酸多糖複合体の使用をも提供する。更に、本発明は、上記核酸多糖複合体を利用した標的遺伝子の発現抑制方法を提供する。これらの使用及び方法において、核酸多糖複合体、その使用方法等については上述の通りである。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、本実施例において、シゾフィランを、「SPG」、ポリデオキシアデニンを「(dA)x」と表記することがある。また、本実施例において、アンチセンスDNAを「AS」と表記することがある。【００４６】
1.試験材料と試験方法
(1.1)試験材料
Schizophyllum  commune由来SPG（Mw＝1.5×105；多角光散乱解析とゲル浸透クロマトグラフィーを併用して測定）は、三井製糖株式会社からの提供されたものである。ホスホロチオエート化アンチセンスDNA試料は株式会社ファスマックにおいて合成され、高速液体クロマトグラフィーにより精製された。【００４７】
(1.2)SPGとのホスホロチオエート化アンチセンスDNA複合体の調製
SPGの三重らせんを解離して1本鎖にするため、0.25N NaOH水溶液に2日以上かけて溶解した。適量のSPG溶液、オリゴヌクレオチド（水中）及びリン酸緩衝溶液（330mM NaH2PO4,  pH=4.7）を混合した。その後、混合物（オリゴヌクレオチド 60μM, pH=7.4）を4℃で一晩置いた。SPGとオリゴヌクレオチド（ODN）の分子数比で表したモル比（[SPG]/[ODN]）を0.27に調整した。【００４８】
(1.3)ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）
オリゴヌクレオチド（20ng）又はオリゴヌクレオチドとSPGとの複合体を、15%アクリルアミドゲルを用いて100Vで1時間かけて分離した。ゲルをSYBR Gold（Invitrogen社製）で染色した後、PharosFX（Bio-Rad社製）を用いて蛍光画像を得た。【００４９】
(1.4)ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）
GPCは、昭和電工DU-H2130ポンプ装置を用い、OHpak SB802.5及びOHpak 806カラムで流速0.8ml/minにて実施した。0.5M KCL含有0.1Mリン酸緩衝溶液（pH7.4）を移動相に使用した。溶出物を多角光散乱（LS）検出器（DAWN-HELEOS, Wyatt Technology社製）、UV検出器（SPD-10A, 株式会社島津製作所製）及び屈折率（RI）検出器（RI-71S,昭和電工株式会社）により検出した。DAWN-HELEOSの取扱説明書に従って、RI及びLS信号を重量平均分子量（Mw）の計算に用いた。屈折率増分（dn/dc値）は0.157ml/gであった。【００５０】
(1.5)円偏光二色性分光法（circular  dichroism  spectroscopy）
240〜320nm領域における円偏光を、Jasco  J-802円二色性分散計（日本分光株式会社製）で、20〜80℃にて、恒温槽つきの1cm石英セルを用いて計測した。【００５１】
(1.6)動物試験
動物試験は、九州工業大学動物実験委員会によるガイドラインに従って実施した。チオグリコレート誘発マクロファージを、標準的な手順に従ってC57BL/6マウス（九動株式会社より入手）から単離した。簡潔には、マウスに3mLの3%チオグリコレート培地を腹腔内注射し、3日後にRPMI 1640（6mL）で腹腔内洗浄を行い、腹腔内マクロファージを採取した。洗浄液を貯留し、100×gで5分間遠心分離を行った。初代マクロファージを10% FCS、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン添加RPMI 1640培地中で、37℃、5%CO2条件下で培養した。【００５２】
(1.7)サイトカインアッセイ
上記(1.6)で得たマクロファージを94ウェルプレートに5×104cell/wellの濃度で播種し、24時間置いた。細胞にODN/SPG複合体又はODN（0.5μM）を添加し、37℃で30分インキュベーションを行い、LPS（10ng/ml）含有新鮮培地で37℃にて5時間インキュベーションを行った。上清中に放出されたTNF-αレベルについては、げっ歯類TNF-α ELISA Developmentキット（Pepro Tech社製）を用いて計測した。【００５３】
2.結果及び考察
(2.1)SPG及び(dA)x間の複合体形成
図1Aは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって検出される、ホスホロチオエート化(dA)x（PS-(dA)x）の複合体形成における配列の長さ依存性を示す。dAxにおいてx>30では、SPGとの複合体形成後にフリーの(dA)xは検出されなかった。一方、X=20ではわずかにフリーの(dA)20が検出された。図1Aと1Bの第2レーンを比較すると理解できるように、20merのアンチセンスTNF-αのような生物学的に実在するヘテロ配列が(dA)20に結合した場合、その収率は(dA)20そのものよりも少なくなることが示された。また、末端が長くなるに従って、AS-(dA)30及びAS-(dA)40はほとんどフリーの(dA)xを示さなくなった。これらの結果は、長いdA末端が高い収率に貢献しており、結合されたヘテロ配列が収率を低下させることを示している。この収率における末端長の効果は、共同的な高分子効果に起因する複合体の安定化によるものであると理解される。【００５４】
本発明者らは、異なるPS含量（S化率）を有する6種の(dA)40試料（PS含量：0/39PS, 8/39PS, 13/39PS, 20/39PS,  26/39PS,  39/39,PS）を調製した。この6種の(dA)40試料は下表1に示される。なお、(dA)40試料は、アンチセンスTNF-α（aTNF）の3’末端に各種のdAテイルを直接結合させたものである。【００５５】
【表１】
2012008465.tif 000002
【００５６】
これらの複合体は、前記『1.試験材料と試験方法』の記載に従って調製されたものである。図2AのPAGE画像に示されるように、13/39、20/39、26/39及び39/39PS複合体ではいずれもフリー(dA)xは観察されなかったが、8/39PS複合体ではいくらかのフリー(dA)xが認められた。収率は8/39PSでは90%、0/39PSでは70％であった。図2Bは、39/39PS及び0/39PSがそれぞれ複合体形成した後のゲル浸透クロマトグラム（UV 260nm）を比較したものである。複合体のピーク領域（16〜20分あたり）とフリー(dA)x（20〜25分あたり）より、収率は39/39PSが90%、0/39PSが60%と測定され、PAGEの結果と合致した。上記結果は、ほぼ30%のホスホロチオエート化は100%の収率を与え、またPO（ホスホジエステル）よりもPS（ホスホロチオエート）の方がより安定した複合体を形成することが確認できた。【００５７】
リン酸化と複合体安定性の関係は興味深く、複合体の分子構造に関連していることが推測された。計算化学により、SPG主鎖グルコースと塩基領域間の水素結合が複合体形成の原動力であり、特にSPG主鎖グルコースに沿って共同的に配置された水素結合が複合体を安定化することが示唆される（K. Miyoshi, et al., Biomacromolecules 6(2005) 1540-6）。リン酸ジエステル領域が隣接する2つのリボースに結合し、隣接する2つの(dA)40環の可変角度及びスタッキング特性を決定することから、PSはそのような水素結合を形成するためにPOよりも好ましい立体配置を提供する可能性がある。隣接する2つのdA環の空間的関係は、円偏光二色性（CD）に詳細に反映される。【００５８】
(2.2)複合体の熱安定性
図3-1のAは、20℃での全てのPS(dA)40及びPO(dA)40試料の240〜320nm領域におけるCDスペクトルを示す。スペクトルの全体的な形状は全ての試料で共通しているが、PS含量が増加すると248nmでの負ピークの強度がわずかに減弱した。この波長領域は塩基領域間での増加したCDに関連することから、CDスペクトルの類似は、全ての(dA)40が同じ構造を有することを意味している。【００５９】
SPG複合体形成において、CDスペクトルは図3-1のBに示されるように大幅に変化する。図3-1のBにおいては、PO-(dA)40のSPG複合体と、ネイキッドPO-(dA)40とを比較しており、既に報告されているように、dAがSPG複合体を形成するために新たな構造をとることが示されている（J. Kurreck, Eur  J Biochem 270 (2003) 1628-44及びS.M. Boye et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev 12 (2002) 95-102）。複合化されたスペクトルを比較すると、0/39PSから20/39PS/SPGの4種の複合体は、ほぼ同じスペクトルを示した。一方、S含量が39/39にまで増加すると、他の複合体とは異なるスペクトルを示した。39/39PSの負ピークは、248nmで減少し、264nmで増加した。【００６０】
前述のように、図3-1のAにおいて、POからPSへS化率を増加させていくと、250nmあたりのCDバンドがそれに伴って減少したが、これはS化が進むと分子の形態が天然型から非天然型に移行していくことを示している。合成核酸医薬の副作用は、天然型ではない形態が原因とされている。従って、複合化前のアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、S化率の増加とともに非天然型の効果が表れる。一方、図3-1のBに示されるように、複合体ではPOからPSへS化率を増加させていくと、265nmあたりのCDバンドが変化するが、S化が26/39までの変化は極めて小さく、少なくともS化が0/39〜26/39ではほぼ同一である。すなわち、PS複合体ではS化が26/39まででは、天然型の形態が保持されており、副作用が表れにくいと考えられる。【００６１】
以上の結果は、PSがPOよりもより好ましい構造を与えるという上記推測と定性的にも一致する。しかしながら、これらはCD及びPAGEの結果で定性的に相違する。すなわち、S化率33%（13/39PS）で収率100%を達成するために十分であるのに対し、CDを変化させるためには66%（26/39PS）以上のS化が必要であった。【００６２】
図3-2のCは、温度に対する282nmにおけるCD強度をプロットしたものである。上述のように、低温では複合体のCD強度はネイキッドのものよりも強い。所定の温度領域内では複合体のCD強度は減少し、対応する(dA)40試料の強度と重なった。この推移に基づいて、解離温度Tm（融解温度）を図3-2のDにプロットした。PS含量が0/39から8/39に増加するに従い、Tmは49℃から59℃に上昇したが、さらなるPS含量の増加は大きくTmを上昇させなかった。これらの結果より、PS骨格の修飾はPO骨格よりもより安定した複合体を導き、さらに、20%の修飾（S化）のみでも100%修飾したものと同じTmの増加を与えるのに十分であることが確認された。【００６３】
(2.3)複合体による遺伝子サイレンシング
本発明者らは、PO TNF-αアンチセンス配列の3’末端に(dA)40テイルが直接結合された、異なるS含量を有する試料と、完全にホスホロチオエート化された試料の5種類のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）試料を調製した。試料の調製は上記(1.1)及び(1.2)に記載の方法に従った。各試料のS化率と収率を下記表２に示す。【００６４】
【表２】
2012008465.tif 000003
【００６５】
全ての複合体のPAGE画像を図4に示す。AS-0/39複合体については、大量のフリーのアンチセンスオリゴヌクレオチドが存在し、収率（複合体化率）は50%であった。この値は0/39PS(dA40)テイルそのものよりも小さい。S含量が増加するに従い、フリーのアンチセンスオリゴヌクレオチドのバンドは消滅し、複合体化率が上昇したことを示す。AS-13/39複合体はフリーのアンチセンスオリゴヌクレオチドのバンドは示さず、(dA)40そのものと同様の結果を示した。【００６６】
本発明者らは、上述のように調製されたASO試料を用いたTNF-α遺伝子サイレンシング効果について、以下のように試験を実施した。【００６７】
SPG複合体は、マクロファージや樹状細胞を含む様々な抗原提示細胞（APC）上のβ-1,3-グルカンを認識する主要な受容体であるdectin-1を介して細胞内に取り込まれる。チオグリコレート誘発腹腔内マクロファージ（チオマクロファージ）を調製後、ODN/SPG複合体を投与し、その後LPSで刺激してTNF-αを分泌させた。PS含量に対する分泌されたTNF-αの量を図5のグラフにプロットした。ネイキッドアンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれもTNF-αの分泌を減少させなかった。一方、SPG複合体はTNF-αのサイレンシングを示した。PS含量が増加するに従い、サイレンシング効果は徐々に増強した。これは、おそらくポリデオキシアデニンテイルにおけるS化率の高いPS複合体が培地中でより安定であり、細胞に取り込まれやすいからだと考えられる。また、アンチセンスの抑制能はPS及びPO間でほぼ同一であるか、PS複合体の方がやや効果が高かったことから、アンチセンス部分は必ずしもPS骨格でなくてもよいと考えられる。【００６８】
(2.4)以上より、ホスホロチオエート化(dA)40との複合体は、リン酸ジエステル(dA)40よりも熱安定性が高く、リン酸ジエステル領域の酸素を20〜30%置換するだけで完全にホスホロチオエート化されたものと同レベルにまで安定性が高められることが示された。解離温度が高いということは、熱力学的に安定であるということであり、生体内で本発明の核酸多糖複合体が安定に存在することを示す。PSとPO間のアンチセンス遺伝子抑制能は同程度かもしくはPSがやや上でであった。これらの知見は、β-1,3-グルカンとDNA間の相互作用について新たな理解を導き、副作用が低減された治療用PSオリゴヌクレオチド輸送に役立つ可能性がある。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１は、配列（aTNF）の3’末端にA40が結合した塩基配列である。
配列番号２は、配列（aTNF）の3’末端に(AsAAAA)8が結合した塩基配列である。
配列番号３は、配列（aTNF）の3’末端に(AsAA)13Aが結合した塩基配列である。
配列番号４は、配列（aTNF）の3’末端に(AsA)20が結合した塩基配列である。
配列番号５は、配列（aTNF）の3’末端に(AsAsA)13A.が結合した塩基配列である。
配列番号６は、配列（aTNF）の3’末端に(As)39Aが結合した塩基配列である。
【図３−２】
2012008465.tif 000004
【図１】
2012008465.tif 000005
【図２】
2012008465.tif 000006
【図３−１】
2012008465.tif 000007
【図４】
2012008465.tif 000008
【図５】
2012008465.tif 000009
【配列表】
2012008465000001.app
【国際調査報告】
2012008465.tif 000010
2012008465.tif 000011
2012008465.tif 000012
2012008465.tif 000013
2012008465.tif 000014
2012008465.tif 000015