(57)【要約】従来のものよりも高い治療効果を示す血管新生抑制剤及びそれを利用する血管新生抑制方法を提供する。ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類を含有する血管新生抑制剤。
2011024918.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含有する、血管新生抑制剤。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡ類が、ＶＥ−カドヘリンをコードするｍＲＮＡの配列番号１に示される塩基配列の領域に結合することによりｍｉＲＮＡ活性を示すものである、請求項１記載の血管新生抑制剤。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分が、配列番号２に示される塩基配列を含んでなるものである、請求項２記載の血管新生抑制剤。
【請求項４】
前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分が、下記（Ａ）又は（Ｂ）を配列番号２に示される塩基配列の３’末端側に連結させてなる塩基配列を含んでなるものである請求項３記載の血管新生抑制剤：
（Ａ）配列番号３に示される塩基配列；又は
（Ｂ）配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分の塩基数が１９〜２５である、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項６】
炎症疾患の治療剤として用いられる、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項７】
加齢性黄斑変性症の治療剤として用いられる、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項８】
癌転移又は癌浸潤抑制剤として用いられる、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項９】
ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含有する、成熟血管の破綻剤。
【請求項１０】
固形癌又は慢性炎症性疾患の治療剤として用いられる、請求項９に記載の成熟血管の破綻剤。
【請求項１１】
血管新生に起因して発症又は悪化する疾患の患者に対して、請求項１に記載の血管新生抑制剤を治療有効量投与する工程を含む、当該疾患における血管新生を抑制する方法。
【請求項１２】
癌転移又は癌浸潤の抑制が求められる癌患者に対して、請求項１に記載の血管新生抑制剤を治療有効量投与する工程を含む、癌転移又は癌浸潤を抑制する方法。
【請求項１３】
成熟血管が形成されている病巣を持つ患者に対して、請求項９に記載の成熟血管の破綻剤を治療有効量投与する工程を含む、当該病巣に形成された成熟血管を破綻する方法。
【請求項１４】
血管新生抑制剤の製造のための、ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの使用。
【請求項１５】
成熟血管の破綻剤の製造のための、ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生抑制剤及び血管新生抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は種々の疾病へ関与しているとされる。腫瘍組織の形成、慢性関節リウマチその他の慢性炎症性疾患における病変組織の形成、及び糖尿病性網膜症の主因である過剰血管形成等に関わっていることが今までに報告されている。そして近年、血管新生に関わる因子（以下、「血管新生因子」ということがある。）の単離とその機能解析が進んでいる。【０００３】
これらの知見を利用して、種々の疾病を改善することを目的とする血管新生抑制剤の開発が進められている。これらの血管新生抑制剤は、その多くが血管新生因子の活性を抑制する作用を有するものである。現在までに、臨床例としては血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の中和抗体であるＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）が一定の効果を示すこと、末期大腸癌患者の平均余命を延長させること、糖尿病性網膜症に対して有効であること等が報告されてきた（非特許文献１）。【０００４】
しかしながら、今までの血管新生抑制剤及びそれを利用する血管新生抑制方法は治療効果の点で不十分なものであった。特に、従来の血管新生抑制剤は、腫瘍の中心領域の血管を破綻させることが可能であるが、腫瘍周囲に存在する血管はそのほとんどが成熟しており（非特許文献２）、従来の血管新生抑制剤ではこれらの成熟した血管を破綻できていないのが現状である。血管新生剤投与後に、腫瘍の周辺部位からがんが再発（非特許文献３）或いは浸潤・転移（非特許文献４及び５）する報告が相次いでおり、このことは血管新生抑制剤投与後に耐性を示す腫瘍周囲の成熟血管の周囲に、がん細胞が残存して、これらが再発・浸潤・転移の原因となっていると考えられる。がん細胞の中で最も悪性度の高く、癌の再発や転移の原因とされるがん幹細胞は、血管領域を生態学的な適所として増殖することが判明してきており、特に腫瘍周囲の血管領域にがん幹細胞が集合している（非特許文献６）。近年、VEGFなどに対する治療薬では、血管の成熟化を促すことが指摘されてきており（非特許文献７）、がん幹細胞の温床の形成を高める懸念がなされるところである。よって、血管形成を標的にした治療においては、従来の血管新生抑制剤による、未熟な血管の破綻に加え、成熟した血管を破綻させる治療薬が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ferrara N, Hillan KJ, Novotny W. Bevacizumab (Avastin), a humanized anti-VEGF monoclonal antibody for cancer therapy. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Jul 29;333(2):289-91.
【非特許文献２】Satoh N, Yamada Y, Kinugasa Y and Takakura N. Angiopoietin-1 alters tumor growth by stabilizing blood vessels or by promoting angiogenesis. Cancer Sci. 99:2373-2379, 2008.
【非特許文献３】Tozer GM, Kanthou C, Baguley BC. Disrupting tumour blood vessels. Nat. Rev Cancer, 5: 423-435
【非特許文献４】Paez-Ribes M, Allen E, Hudock J, Takeda T, Okuyama H, Vinals F, Inoue M, Bergers G, Hanahan D, Casanovas O: Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis. Cancer Cell 15:220-231, 2009.
【非特許文献５】Ellis LM, Reardon DA: Cancer: The nuances of therapy. Nature 458:290-292, 2009.
【非特許文献６】Nagahama Y, Ueno M, Miyamoto S, Morii E, Minami T, Mochizuki N, Saya H, Takakura N. 1282796487078_0.Pubmed_RVDocSum&ordinalpos=1 Cancer Res 70, 1215-1224, 2010.
【非特許文献７】Jain RK: Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med 9:685-693, 2003.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来のものよりも高い治療効果を示す血管新生抑制剤及びそれを利用する血管新生抑制方法を提供することを課題とする。更に、本発明は、成熟血管を破綻させる成熟血管破綻剤及びそれを利用する成熟血管破綻方法をも提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、血管新生抑制剤の作用点及び作用機序に着目した。すなわち、従来の血管新生抑制剤はまずその標的となる血管新生因子すなわち作用点に問題があり、また同時にその抑制手段すなわち作用機序にも問題があったために十分な治療効果が得られなかったのだと仮定し、詳細に検討した。【０００８】
まず作用点については次のように考えられた。例えばＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）はＶＥＧＦを標的としているが、ＶＥＧＦのみをいくら抑制したとしても他の血管新生因子が代償的に発現誘導されてしまうため、血管新生を完全に抑制することができないと考えられた。そこで、本発明者らは、他の血管新生因子では代償できないような血管新生因子を標的とすることを着想した。それに加えて本発明者らは、さらに血管新生因子のうち管腔形成過程に関与するものに特に着目することにした。そのような血管新生因子としてはＶＥ−カドヘリン、Claudin-5等いくつかが考えられた。【０００９】
さらに作用機序については次のように考えられた。例えばＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）は血管新生因子の活性を抑制することで作用するが、タンパク質発現の段階で標的を抑制できればより高い効果を得られるのではないかと考えられた。そこで、本発明者らは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用することを着想した。【００１０】
しかしながら、これまでに、血管新生因子を抑制するｍｉＲＮＡの報告は多くない。しかも予め標的タンパク質を設定しておき、これに対して抑制作用を示すｍｉＲＮＡを探索するという手順を踏むと通常その探索は困難を極める。多大な試行錯誤を経て本発明者らはｍｉＲＮＡのうちｍｉＲＮＡ１２５ｂ（ｍｉＲ１２５ｂ）がＶＥ−カドヘリンの発現を抑制することにより血管新生を抑制するということを偶然見出した。本発明者らはさらにこのｍｉＲ１２５ｂを利用することで実際に血管新生抑制効果、ひいては癌転移抑制効果が得られることを明らかにした。さらに、本発明者らは、ｍｉＲ１２５ｂは、癌組織等の成熟血管が形成された病巣部位において、成熟血管を破綻させて当該病巣部位に対する酸素運搬を抑制でき、当該病巣の治癒に有効であることを明らかにした。本発明は、これらの知見に基づいて、検討を重ねることにより完成したものである。【００１１】
すなわち、本発明は次の通りである：
項１．ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含有する、血管新生抑制剤。
項２．前記ｍｉＲＮＡ類が、ＶＥ−カドヘリンをコードするｍＲＮＡの配列番号１に示される塩基配列の領域に結合することによりｍｉＲＮＡ活性を示すものである、項１記載の血管新生抑制剤。
項３．前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分が、配列番号２に示される塩基配列を含んでなるものである、項２記載の血管新生抑制剤。
項４．前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分が、下記（Ａ）又は（Ｂ）を配列番号２に示される塩基配列の３’末端側に連結させてなる塩基配列を含んでなるものである項３記載の血管新生抑制剤：
（Ａ）配列番号３に示される塩基配列；又は
（Ｂ）配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列。
項５．前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分の塩基数が１９〜２５である、項１に記載の血管新生抑制剤。
項６．炎症疾患の治療剤として用いられる、項１に記載の血管新生抑制剤。
項７．加齢性黄斑変性症の治療剤として用いられる、項１に記載の血管新生抑制剤。
項８．癌転移又は癌浸潤抑制剤として用いられる、項１に記載の血管新生抑制剤。
項９．ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含有する、成熟血管の破綻剤。
項１０．固形癌又は慢性炎症性疾患の治療剤として用いられる、項９に記載の成熟血管の破綻剤。
項１１．血管新生に起因して発症又は悪化する疾患の患者に対して、項１に記載の血管新生抑制剤を治療有効量投与する工程を含む、当該疾患における血管新生を抑制する方法。
項１２．癌転移又は癌浸潤の抑制が求められる癌患者に対して、請求項１に記載の血管新生抑制剤を治療有効量投与する工程を含む、癌転移又は癌浸潤を抑制する方法。
項１３．成熟血管が形成されている病巣を持つ患者に対して、項９に記載の成熟血管の破綻剤を治療有効量投与する工程を含む、当該病巣に形成された成熟血管を破綻する方法。
項１４．血管新生抑制剤の製造のための、ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの使用。
項１５．成熟血管の破綻剤の製造のための、ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの使用。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の血管新生抑制剤は、血管新生抑制効果を奏する。特に、（ｉ）内皮細胞の増殖に対する抑制効果、（ｉｉ）内皮細胞による管腔形成に対する抑制効果、及び（ｉｉｉ）内皮細胞の運動に対する抑制効果を奏する。【００１３】
また、本発明の血管新生抑制剤は、血管新生抑制効果を奏することにより、ひいては癌転移および浸潤抑制効果をも奏する。さらに、本発明の血管新生抑制剤は、血管新生抑制効果に基づいて、炎症疾患や加齢黄斑変成症に対しても有効な治療効果を奏することができる。【００１４】
また、本発明の成熟血管破綻剤は、癌組織等の成熟血管が形成された病巣部位において、成熟血管を破綻させることができるので、当該病巣部位に対する酸素運搬を抑制して、当該病巣を治癒させることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】上はｍｉＲ１２５ｂのステム−ループ配列、下に成熟配列（ｍａｔｕｒｅ配列）を示す。成熟配列における下線部分は本ｍｉＲ１２５ｂの機能領域のシード配列となる。
【図２】血管新生が生じている内皮細胞におけるｍｉＲ１２５ｂの発現量をＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲによって調べた結果を示すグラフである。
【図３】ＶＥＧＦ刺激を受けた内皮細胞におけるｍｉＲ１２５ｂの発現量をＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲによって調べた結果を示すグラフである。
【図４】脱メチル化を受けた内皮細胞におけるｍｉＲ１２５ｂの発現量をＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲによって調べた結果を示すグラフである。
【図５】ｍｉＲ１２５ｂをトランスフェクションした血管内皮細胞の細胞増殖速度を調べた結果を示すグラフである。
【図６】コントロール細胞（非トランスフェクション血管内皮細胞）、及びｍｉＲ１２５ｂをトランスフェクションした血管内皮細胞の管腔形成の様子を撮影した、図面に代わる写真である。
【図７】コントロール細胞（非トランスフェクション血管内皮細胞）、及びｍｉＲ１２５ｂをトランスフェクションした血管内皮細胞の細胞運動能を示す、図面に代わる写真である。
【図８】ｍｉＲ１２５ｂをトランスフェクションすることによるＶＥ−カドヘリン及びｃｌａｕｄｉｎ５のｍＲＮＡの発現量変化をｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｍｅｔｈｏｄで測定した結果を示すグラフである。
【図９】ｍｉＲ１２５ｂをトランスフェクションすることによるＶＥ−カドヘリン及びｃｌａｕｄｉｎ５の発現量変化を抗体染色によって評価した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図１０】がんマウスにおけるｍｉＲ１２５ｂの機能を解析した際のマウスの写真を示す。左がトランスフェクション試薬のみを注入したコントロール、中心がｍｉＲ１２５ｂをトランスフェクションしたマウス、右がｍｉＲ１２５ｂと相補鎖であるａｎｔｉ−ｍｉＲをトランスフェクションしたマウスにおける腫瘍像である。
【図１１】トランスフェクション試薬のみを注入したコントロール、ｍｉＲ１２５ｂをトランスフェクションしたマウス、及びｍｉＲ１２５ｂと相補鎖であるａｎｔｉ−ｍｉＲをトランスフェクションしたマウスにおける腫瘍増殖の抑制効果を示すグラフである。
【図１２】トランスフェクション試薬のみを注入したコントロール、及びｍｉＲ１２５ｂをトランスフェクションしたマウスの血管内皮細胞におけるＶＥ−カドヘリンの発現を抗体染色によって評価した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図１３】トランスフェクション試薬のみを注入したコントロール、及びｍｉＲ１２５ｂをトランスフェクションしたマウスにおけるＣＤ３１陽性の血管内皮細胞の存在、及びその低酸素状態を評価した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図１４】（A）マトリゲルに形成された血管をCD31抗体で染色したものを示す。緑が血管。(B)マトリゲル内に形成された血管数を計算したデータを示す。データ数値（Y軸）は、VEGF、bFGF、vehicleによって誘導された血管数を１とした際に、ｍｉＲ１２５ｂによって誘導された血管数を相対的に計算した値である。
【図１５】（A）加齢性黄斑変性症モデルにおいて、ｐｒｅｍｉｃｒｏＲＮＡ１２５ｂ、又はコントロールｐｒｅｍｉｃｒｏＲＮＡを投与し、脈絡膜を観察した結果を示す。網膜に新しく形成された血管新生領域を破線で示す。血管はデキストランで染色されている。(B)網膜に形成された血管領域（ＣＮＶ ａｒｅａ）を計測した結果である。
【図１６】ｍｉＲ１２５ｂの作用の模式図。血管は、内皮細胞が集合しさく状（ｃｏｒｄ）構造を呈し、内皮細胞同士が、ＶＥ−カドヘリンで接着しあって、管腔（ｔｕｂｅ）が形成される。ｍｉＲ１２５ｂはＶＥ−カドヘリンの蛋白翻訳を抑制して、管腔形成を抑制する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ａ．血管新生抑制剤
本発明の血管新生抑制剤は、ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードする遺伝子を含む組換えベクターを含有することを特徴とするものである。
【００１７】
１．ｍｉＲＮＡ類
ｍｉＲＮＡとは、タンパク質として翻訳されない、内因性の短い一本鎖のＲＮＡであり、特定のｍＲＮＡを標的とし、この標的ｍＲＮＡからのタンパク質翻訳を阻害したり、標的ｍＲＮＡを不安定化したりするものである。自らの塩基配列と相補的な標的ｍＲＮＡ中の塩基配列に結合することにより作用する。
【００１８】
ｍｉＲＮＡとしては２２塩基の鎖長のものが最も多く知られているが、本発明では、例えば１９〜２５塩基の鎖長のｍｉＲＮＡを用いることができる。特に、２０〜２４塩基の鎖長のｍｉＲＮＡを好ましく用いることができる。さらに２１〜２３塩基の鎖長のｍｉＲＮＡをより好ましく用いることができる。
【００１９】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとは、ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｍｉＲＮＡの略称である。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡの前駆体である。二本鎖のＲＮＡであり、ｍｉＲＮＡ配列をステム部分に含んだステム−ループ構造を有する。Ｄｉｃｅｒと呼ばれる酵素によりこのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡからｍｉＲＮＡ配列が切り出される。
【００２０】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとしては約７０塩基の鎖長のものが最も多く知られているが、本発明では、例えば６０〜８００塩基の鎖長のｍｉＲＮＡを用いることができる。特に、７０〜２００塩基の鎖長のｍｉＲＮＡを好ましく用いることができる。さらに８０〜１００塩基の鎖長のｍｉＲＮＡをより好ましく用いることができる。
【００２１】
ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとは、ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉＲＮＡの略称である。ゲノムから転写される一次転写産物である。二本鎖のＲＮＡであり、キャップ構造及びｐｏｌｙ（Ａ）テール、並びにｍｉＲＮＡ配列をステム部分に含んだステム−ループ構造を有する。Ｄｒｏｓｈａと呼ばれる酵素がこのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの一部を切断することによりｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを生じる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとしては、数百〜数千塩基の鎖長のものが知られている。
【００２２】
ｍｉＲＮＡ類としては、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのうちいずれかを単独で、又は二種以上を組み合わせて使用できる。
【００２３】
２．ＶＥ−カドヘリンに対するｍｉＲＮＡ活性
ｍｉＲＮＡ活性とは、ｍｉＲＮＡ類が標的ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を阻害する活性をいう。より詳細には、ｍｉＲＮＡ類がｍｉＲＮＡである場合には、そのｍｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡに対して作用することにより標的ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を阻害する活性をいう。ｍｉＲＮＡ類がｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡである場合には、それらから生じるｍｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡに対して作用することにより標的ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を阻害する活性をいう。
【００２４】
あるｍｉＲＮＡ類がＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すものであるか否かは、そのｍｉＲＮＡ類を導入したヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ＨＵＶＥＣｓ）におけるＶＥ−カドヘリンの発現が抑制されているか否かを検討し、抑制されていればｍｉＲＮＡ活性を示すと判断し、抑制されていなければ当該活性を示さないと判断する。ｍｉＲＮＡ類を導入する具体的方法は、試験例２の記載に準じて十分量のｍｉＲＮＡ類が導入される条件で行う。
【００２５】
３．ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ類
ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ類としては、例えば、ＶＥ−カドヘリンをコードするｍＲＮＡの３’領域の非翻訳領域に存在する塩基配列に結合することによりｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡを用いることができる。より具体的には、例えばＶＥ−カドヘリンをコードするｍＲＮＡの部分配列である配列番号１に示される塩基配列の領域に結合することによりｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡを用いることができる。また、当該ｍｉＲＮＡを産生するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを用いることができる。
【００２６】
配列番号１に示される塩基配列は、ＶＥ−カドヘリンをコードするｍＲＮＡの３’領域の非翻訳領域に存在する塩基配列である。
【００２７】
配列番号１に示される塩基配列に結合することによりｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ類としては、例えば、配列番号２に示される塩基配列を含むｍｉＲＮＡ、又は当該ｍｉＲＮＡを産生するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ若しくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを用いることができる。当該ｍｉＲＮＡを産生するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ若しくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ若しくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの塩基配列のうちステム構造を構成する部分、すなわちｍｉＲＮＡを構成する部分が、配列番号２に示される塩基配列を含んでなるものである。
【００２８】
配列番号２に示される塩基配列は、配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列である。
【００２９】
配列番号１に示される塩基配列に結合することによりｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ類としては、好ましくは、配列番号２に示される塩基配列を５’末端側に含むｍｉＲＮＡ、又は当該ｍｉＲＮＡを産生するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ若しくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを用いることができる。
【００３０】
配列番号１に示される塩基配列に結合することによりｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ類としては、より好ましくは、配列番号３に示される塩基配列を配列番号２に示される塩基配列の３’末端側に連結させてなる塩基配列を含むｍｉＲＮＡ、又は当該ｍｉＲＮＡを産生するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ若しくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを用いることができる。配列番号３に示される塩基配列を配列番号２に示される塩基配列の３’末端側に連結させてなる塩基配列を含むｍｉＲＮＡとしては、より好ましくは配列番号３に示される塩基配列を配列番号２に示される塩基配列の３’末端側に連結させた塩基外列からなるｍｉＲＮＡである、ｍｉＲＮＡ１２５ｂ（ｍｉＲ１２５ｂ）を用いることができる。
【００３１】
これまでに、ｍｉＲ１２５ｂによって血管新生が抑制されることを報告した例はない。
【００３２】
また、配列番号１に示される塩基配列に結合することによりｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ類としては、好ましくは、配列番号３に示される塩基配列において１若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列を配列番号２に示される塩基配列の３’末端側に連結させてなる塩基配列を含んでなり、かつｍｉＲＮＡ活性を有するもの、又は当該塩基配列からなるＲＮＡを産生するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ若しくはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを用いることができる。
【００３３】
「数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列」としては、１〜９個のヌクレオチドが欠失等された塩基配列が好ましく、１〜７個のヌクレオチドが欠失等された塩基配列がより好ましく、１〜５個のヌクレオチドが欠失等された塩基配列がさらに好ましく、１〜４個のヌクレオチドが欠失等された塩基配列が特に好ましく、１〜４個、特に１〜３個、とりわけ１又は２個のヌクレオチドが欠失等された塩基配列がさらに特に好ましい。
【００３４】
４．ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ類をコードする遺伝子を含む組換えベクター
ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ類をコードする遺伝子を含む組換えベクター（以下、「ｍｉＲＮＡ類組換えベクター」ということがある。）とは、細胞において当該ｍｉＲＮＡ類を発現させることにより、当該ｍｉＲＮＡ類について上で説明したのと同様のｍｉＲＮＡ活性を示す組換えベクターである。
【００３５】
当該組換えベクターは、適当な発現ベクターに当該ｍｉＲＮＡ類をコードするＤＮＡを挿入することにより作製できる。
【００３６】
当該組換えベクターは、当該ｍｉＲＮＡ類をコードするＤＮＡの他にその発現を制御する塩基配列を含んでいる。そのような塩基配列としては、当該ｍｉＲＮＡ類をコードするＤＮＡの上流に配置されるプロモーター配列等が挙げられる。
【００３７】
プロモーター配列としては、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ１・等を用いることができる。
【００３８】
その他には、例えば、目的のｍｉＲＮＡの５’及び３’側にｍｉＲＮＡを挟んで、Ｆｌａｎｋｉｎｇ領域を配置させること等が挙げられる。
【００３９】
発現ベクターとしては、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又は非レンチウイルス非アデノウイルスベクター等を用いることができる。
【００４０】
当該ＤＮＡを挿入する方法としては、公知の方法を利用できる。例えば、発現ベクターを単一又は複数の制限酵素で切断してから、その切断箇所に挿入することができる。必要に応じて当該ＤＮＡを同一又は異なる制限酵素で切断してから挿入してもよい。またリンカーを介して挿入してもよい。さらに、必要に応じて制限酵素処理により生じた突出末端部分を平滑化してから挿入してもよい。
【００４１】
５．血管新生抑制剤の投与方法
本発明の血管新生抑制剤の投与形態は、遺伝子やオリゴヌクレオチドを導入（トランスフェクション）する方法として一般に用いられている方法に従って行うことができ、適用対象患部等に応じて適宜設定される。全身的投与であってもよいし、局所的投与であってもよい。全身的投与としては、経口投与又は非経口投与が挙げられる。さらに非経口投与としては、静脈内注射、皮下注射、及び筋肉内注射等が挙げられる。局所的投与としては、皮膚、粘膜、気道、腹腔内、鼻内、眼内、脳内等に対する投与を挙げることができる。
【００４２】
本発明の血管新生抑制剤の剤型は、投与形態等に応じて適宜設定される。例えば、錠剤、顆粒、散剤、坐剤、及びカプセル剤等の固形状；クリーム剤、ゲル剤、及び軟膏剤等の半固形状；並びに液剤、及びローション剤等の液状等が挙げられる。
【００４３】
本発明の血管新生抑制剤の投与量及び投与頻度は、投与形態及び剤型の他、被投与者の状態、ｍｉＲＮＡ類のｍｉＲＮＡ活性の程度、並びに組換えベクターの発現効率等に応じて適宜設定される。一回あたりの投与量は治療有効量であればよい。例えば、１日当たりの投与量の平均としては、ｍｉＲＮＡ換算で体重あたり０．００００１〜２００ｍｇ／ｋｇであれば好ましく、０．２〜１５ｍｇ／ｋｇであればより好ましく、１〜２．５ｍｇ／ｋｇであればさらに好ましい。
【００４４】
なお、血管新生抑制剤が有効成分としてｍｉＲＮＡ類を含むものである場合において、ｍｉＲＮＡ換算とは、ｍｉＲＮＡ類がｍｉＲＮＡであるときは当該量のｍｉＲＮＡを含む血管新生抑制剤を意味し、ｍｉＲＮＡ類がｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡであるときは当該量のｍｉＲＮＡを産生することができるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを含む血管新生抑制剤を意味する。また、血管新生抑制剤が有効成分としてｍｉＲＮＡ類組換えベクターを含むものである場合において、ｍｉＲＮＡ換算とは、ｍｉＲＮＡ類がｍｉＲＮＡであるときは当該量のｍｉＲＮＡを発現しうる組換えベクターを含む血管新生抑制剤を意味し、ｍｉＲＮＡ類がｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡであるときは当該量のｍｉＲＮＡを産生することができるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを発現しうる組換えベクターを含む血管新生抑制剤を意味する。また、本発明の血管新生抑制剤は、例えば、１日当たり１回の頻度で若しくは２又は３回程度に分割して投与してもよく、また、２日〜１週間分の投与量を一度にまとめて投与してもよい。
【００４５】
本発明のｍｉＲＮＡ類を含む血管新生抑制剤におけるｍｉＲＮＡ類又はｍｉＲＮＡ類組換えベクターの含有割合は、投与形態、剤型、投与量、及び投与頻度等に応じて決められる。
【００４６】
本発明の血管新生抑制剤は、有効成分（ｍｉＲＮＡ類又はｍｉＲＮＡ類組換えベクター）に加えて必要に応じてさらに薬学的に許容される担体、及び／又は他の薬効成分を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体としては、トランスフェクション用試薬、剤型に応じて製剤化のために必要となる製剤成分、保存安定のために必要となる保存安定成分等が挙げられる。これらの担体の中でも、トランスフェクション用試薬は、投与対象部位において上記有効成分（ｍｉＲＮＡ類又はｍｉＲＮＡ類組換えベクター）の細胞内送達を効率的に行う上で好適に使用される。トランスフェクション用試薬としては、例えば、陽イオン性の水溶性高分子、又は陽イオン性脂質を主有効成分として含むものを用いることができる。また、トランスフェクション用試薬には、ウイルス粒子を含むものも用いることができる。また、その他の薬効成分としては、例えば、抗炎症剤及び抗菌剤等が挙げられる。
【００４７】
６．血管新生抑制剤の投与対象
本発明の血管新生抑制剤は、血管新生に起因して発症又は悪化する疾患の患者に対して投与することにより、当該疾患を治療することができる。
【００４８】
血管新生に起因して発症する疾患としては、例えば、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症、未熟児網膜症、緑内障、動静脈奇形、及び血管腫等が挙げられる（1:Pandya NM, Dhalla NS, Santani DD. Angiogenesis--a new target for future therapy. Vascul Pharmacol. 2006 May;44(5):265-74. Epub 2006 Mar 20.）。
【００４９】
血管新生に起因して悪化する疾患としては、例えば、固形癌、感染症、動脈硬化、慢性関節リウマチ・強皮症など各種の自己免疫疾患、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症、未熟児網膜症、緑内障、動静脈奇形、血管腫、変形性関節症、ケロイド、乾癬、アレルギー性皮膚炎、肥満、肺高血圧、喘息、肺気腫、慢性気管支炎、肝硬変、及び腹水症等が挙げられる（Pandya NM, Dhalla NS, Santani DD. Angiogenesis--a new target for future therapy. Vascul Pharmacol. 2006 May;44(5):265-74. Epub 2006 Mar 20.,  Buysschaert I, Schmidt T, Roncal C, Carmeliet P, Lambrechts D. Genetics, epigenetics and pharmaco-(epi)genomics in angiogenesis. J Cell Mol Med. 2008 Dec;12(6B):2533-51, Carmeliet P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 2005 Dec 15;438(7070):932-6.）。
【００５０】
これらの疾患に対しては血管新生抑制剤の投与が有効であると考えられており、実際に血管新生剤が投与され有効性も報告されている（癌についてFerrara N, Hillan KJ, Novotny W. Bevacizumab (Avastin), a humanized anti-VEGF monoclonal antibody for cancer therapy. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Jul 29;333(2):289-91.；網膜症についてJardeleza MS, Miller JW. Review of anti-VEGF therapy in proliferative diabetic retinopathy. Semin Ophthalmol. 2009 Mar-Apr;24(2):87-92）。
【００５１】
これらの疾患の中でも、とりわけ加齢性黄斑変性症については、本発明の血管新生抑制剤によって優れた治療効果が認められるので、適用対象疾患として好適である。更に、本発明の血管新生抑制剤を癌に適用する場合、好適な適用対象の癌の一例として、肺癌が挙げられる。
【００５２】
更に、本発明の血管新生抑制剤は、炎症により誘導される血管新生を効果的に抑制できるので、アレルギー性皮膚炎、慢性気管支炎等の炎症性疾患の治療にも好適に使用される。
【００５３】
７．癌転移抑又は浸潤制剤
本発明の血管新生抑制剤の作用機序は、血管内皮細胞の管腔形成において必須の役割を担っているＶＥ−カドヘリンの発現を負に制御することにより血管新生を阻害するというものである。
【００５４】
癌治療においては癌細胞の転移や浸潤がしばしば問題となる。癌細胞の転移には血管新生が不可欠であるとされる。本発明の血管新生抑制剤を癌細胞の転移又は癌の浸潤が懸念される部位に投与することによってその場における血管新生が抑制されるので、その結果として癌細胞の転移又は癌の浸潤を抑制することもできる。そのため、本発明の血管新生抑制剤は、癌転移又は浸潤抑制剤としても用いることができる。
【００５５】
癌転移又は浸潤抑制剤として使用する場合、その投与形態、剤型、投与量、及び投与頻度等は血管新生抑制剤と同様である。
【００５６】
Ｂ．成熟血管の破綻剤
ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類は、病巣部位における成熟血管を破綻させ、当該病巣部位に対する酸素運搬を抑制して、当該病巣を治癒させることができる。したがって、本発明は、更に、ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードする遺伝子を含む組換えベクターを含有することを特徴とする、成熟血管の破綻剤をも提供する。
【００５７】
本成熟血管の破綻剤は、固形癌、関節リウマチなどの慢性炎症性疾患等の病巣部位で形成された成熟血管を破綻させるのに有効であり、当該病巣を治癒させるために使用することができる。
【００５８】
本成熟血管の破綻剤について、その投与形態、剤型、投与量、及び投与頻度等は、前記血管新生抑制剤の場合と同様である。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を試験例及び実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。【００６０】
試験例１．血管新生時に発現亢進するｍｉＲＮＡの探索
本発明者らは、血管内皮細胞には血管新生を抑制する働きを担うｍｉＲＮＡが存在するという仮説を立てた。特に血管新生が活発化している細胞においてそのようなｍｉＲＮＡの発現が上昇していると仮定した。そしてこの仮説を次の通り検証した。【００６１】
まず、血管新生が旺盛に生じている腫瘍組織から血管内皮細胞を回収し、正常組織の血管内皮細胞と比較することにより、前者において発現が増幅しているｍｉＲＮＡをプロファイリングした。得られたｍｉＲＮＡの数は全部で１８種類であった。【００６２】
そして、スクリーニングの結果、次の試験例２〜６に示す通りｍｉＲ１２５ｂが（ｉ）内皮細胞の増殖に対する抑制作用、（ｉｉ）内皮細胞による管腔形成に対する抑制作用、及び（ｉｉｉ）内皮細胞の運動に対する抑制作用という、血管新生抑制に必要な作用を持ち合わせていることを見出した。当該スクリーニングで得られた他のｍｉＲＮＡに関しては、発現が安定していないために以後の検討では対象外とした。【００６３】
腫瘍中の血管新生を営む血管内皮細胞では、正常皮下組織の内皮細胞にくらべ約３倍のｍｉＲ１２５ｂの発現亢進が生じていることが判明した。結果を図２に示す。なお実験操作は次の通り行った。【００６４】
［実験方法］
血管新生のモデルの一つとして、腫瘍細胞をマウス皮下に移植して形成される腫瘍内に侵入して、血管を構築するモデルがある。Ｌｅｕｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞をマウスに移植して形成された腫瘍からＣＤ４５（血液マーカー）陰性、ＣＤ３１（血管内皮細胞マーカー）陽性の血管内皮細胞を回収して、ｍｉＲ１２５ｂの発現を解析した。回収した内皮細胞をＰＢＳで洗浄後、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｋ１５７０−０１）の説明書に従ってｍｉＲＮＡを回収した。回収したｍｉＲＮＡは−８０℃で保存した。その後、ＮＣｏｄｅ  ｍｉＲＮＡ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＭＩＲＣ−５０）の説明書に従って、ｍｉＲＮＡの逆転写反応をさせた。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ  ＥＲ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｒｅＭｉｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  １１７６２−１００）を用いて行った。ｍｉＲ１２５ｂ用のｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＣＣＣ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＴＧＡ−３’、ＲＮＵ６用のｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＡＣ−３’、５’−ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＣＧＡ−３’を用いた。ｍｉＲＮＡ量の解析は、ＲＮＵ６  ｍｉＲＮＡを内在性コントロールとして各ｍｉＲＮＡ量を標準化し、ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｍｅｔｈｏｄで行った。【００６５】
また、内皮細胞ではＶＥＧＦ刺激により、ｍｉＲ１２５ｂの発現が誘導されることが確認された。結果を図３に示す。なお実験操作は次の通り行った。【００６６】
［実験方法］
６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２×１０５  ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ＨＵＶＥＣｓ）を播種し、Ｈｕｍｅｄｉａ  ＥＧ２に２０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ−Ａ１６５  （ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社)を添加して３７℃  ＣＯ２インキュベーターで培養した。２４時間後、４８時間後、ＨＵＶＥＣｓをＰＢＳで洗い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の説明書に従ってｍｉＲＮＡを回収した。図２と同様ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲにて解析した。【００６７】
さらに内皮細胞では脱メチル化により、ｍｉＲ１２５ｂの発現が誘導されることが確認された。結果を図４に示す。なお実験操作は次の通り行った。【００６８】
［実験方法］
５−Ａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）をＰＢＳで可溶化させ、１０ｍＭ  ５−Ａｚａ−ｄＣ溶液を調整した。６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２×１０５ＨＵＶＥＣｓをまき、Ｈｕｍｅｄｉａ  ＥＧ２に０．２μＭ、２μＭ、２０μＭ、２００μＭとなるように１０ｍＭ  ５−Ａｚａ−ｄＣ溶液を加え、３７℃ ＣＯ２インキュベーター内で培養した。２４時間後、ＨＵＶＥＣをＰＢＳで洗い、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の説明書に従ってｍｉＲＮＡを回収した。図２と同様ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲにて解析した。【００６９】
試験例２．内皮細胞の増殖に対するｍｉＲ１２５ｂによる抑制作用
ｍｉＲ１２５ｂの血管新生への関わりについて、血管内皮細胞の増殖への影響を観察した。【００７０】
ＨＵＶＥＣは基礎培地 Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２にＨｕＭｅｄｉａ−ＭｖＧ増殖添加剤セットを加えた完全培地で培養した。４〜７回継代以内のＨＵＶＥＣをプレートに播種し、翌日プレート上でＨＵＶＥＣが３０〜５０％コンフルエントな状態になっているのを確認したのち、完全培地からａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｆｒｅｅ培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２＋２％ＦＢＳ）へと変えて３７℃  ＣＯ２インキュベーターで１時間培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の説明書に従い、終濃度３３ｍＭになるようにｍｉＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒをトランスフェクションした。トランスフェクション試薬はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社）を用いた。ｍｉＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒは Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ＃１（ＡＭ１７１１０）、Ｐｒｅ−ｍｉＲ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ （ＰＭ１０１４８）、Ａｎｔｉ−ｍｉＲ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＡＭ１０１４８）をＡｐｐｉｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社より購入した。ＨＵＶＥＣ、基礎培地 Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＢ２およびＨｕＭｅｄｉａ−ＭｖＧ増殖添加剤セットはクラボウより購入した。ｍｉＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒをトランスフェクションしたＨＵＶＥＣを、翌日９６ｗｅｌｌプレートに１×１０４個/１００μｌ となるようにまき直し、２４時間後および４８時間後に細胞をトリプシン処理して回収し、血球計算盤を用いて細胞数をカウントした。
その結果、図５に示すようにｍｉＲ１２５ｂは血管内皮細胞の細胞増殖を抑制することが解明された。【００７１】
試験例３．内皮細胞の管腔形成に対するｍｉＲ１２５ｂによる抑制作用
４８ｗｅｌｌプレートに１５０μｌのＧｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）をのせ、３７℃  ＣＯ２インキュベーター内に３０分置きＭａｔｒｉｇｅｌを固めた。その後、図３に示したようにｍｉＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒをトランスフェクションしたＨＵＶＥＣをトリプシン処理して回収し、固まったＭａｔｒｉｇｅｌ上に各ｗｅｌｌあたり１×１０５ｃｅｌｌｓ／１５０μｌ完全培地となるように細胞をまき、３７℃  ＣＯ２インキュベーター内におき５時間後に撮影した。その結果、図６に示すように、コントロールの内皮細胞では管腔様構造を呈したが、ｍｉＲ１２５ｂを導入された内皮細胞では管腔形成が抑制された。【００７２】
試験例４．内皮細胞の運動に対するｍｉＲ１２５ｂによる抑制作用
６ｗｅｌｌプレート上で図３に示した方法でｍｉＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒをトランスフェクションしたＨＵＶＥＣが、翌日コンフルエントになったのを確認した後、ピペットマンのチップの先端でプレートの底をスクラッチした。スクラッチ直後、５時間後、１０時間後にスクラッチした細胞領域を撮影した。その結果、図７に示すとおりｍｉＲ１２５ｂを導入された内皮細胞では、細胞運動能が著しく低下することが判明した。【００７３】
試験例５．ｍｉＲ１２５ｂによるＶＥ−カドヘリン及びｃｌａｕｄｉｎ５のｍＲＮＡ発現制御
以上の結果からｍｉＲ１２５ｂは細胞接着性に影響を与える可能性が示唆された。血管内皮細胞による管腔の形成には、内皮細胞同士の接着を司るＶＥ−カドヘリンやｃｌａｕｄｉｎ５の発現が重要であることから、これら遺伝子および蛋白の発現に影響を与える可能性につき検討した。まず、遺伝子の発現につきＰＣＲを用いて解析を行った。【００７４】
図４で示したようにｍｉＲ１２５ｂを導入した内皮細胞とコントロールの内皮細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）の説明書に従ってｍＲＮＡを回収した。回収したｍＲＮＡは−２０℃で保存した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）の説明書に従って、逆転写反応をした。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＥＲ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｒｅＭｉｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１７６２−１００）を用いて行った。ヒトＶＥ−カドヘリン用のｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＡＴＣ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＣＧＴ  ＣＣ−３’および５’−ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＣＡ−３’、Ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ−５用のｐｒｉｍｅｒ配列は５’−ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＴＣＧ  ＴＧＡ  Ｃ−３’および５’−ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  Ｇ−３’、Ｈｕｍａｎ  ＧＡＰＤＨ用のｐｒｉｍｅｒ配列は５‘−ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＧ  ＡＧＴ  Ｃ−３’および５’−ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＡＴＴ  ＴＣ−３’を用いた。ｍＲＮＡ量の解析は、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを内在性コントロールとして各ｍＲＮＡ量を標準化し、ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｍｅｔｈｏｄで行った。【００７５】
その結果、図８に示すとおりｍｉＲ１２５ｂはＶＥ−カドヘリンおよびｃｌａｕｄｉｎ５のｍＲＮＡの発現を抑制することはないことが判明した。【００７６】
試験例６．ｍｉＲ１２５ｂによるＶＥ−カドヘリン及びｃｌａｕｄｉｎ５のタンパク質発現制御
図４で示したようにｍｉＲ１２５ｂを導入した内皮細胞とコントロールの内皮細胞を培養中の液体培地を捨て、ＨＵＶＥＣをＰＢＳで一回洗浄ののち、可溶化バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ−４０、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１／１００ ｖｏｌｕｍｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  （ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）を加え１０分間、氷上で可溶化した。可溶化液はエッペンチューブに移し、４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心した後、上清を回収した。一次抗体はＭｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｃｌａｕｄｉｎ−５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ１４４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ 社）、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ （Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社）、ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＧＡＰＤＨ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）を用いた。二次抗体はＰｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ社）、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ (Ｄａｋｏ社)、Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇ’ｓ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）、Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇ’ｓ  ＨＲＰ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）を用いた。化学発光の検出はＬＡ−３０００ ｍｉｎｉ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社)を用いた。ｍｉＲ１２５ｂはＶＥ−カドヘリンおよびｃｌａｕｄｉｎ５ のｍＲＮＡの発現には影響を示さなかったが、図９に示すとおりこれらの蛋白発現を抑制することが判明した。【００７７】
実施例１．ｍｉＲ１２５ｂによる腫瘍増殖の抑制作用
以上の結果から、ｍｉＲ１２５ｂは血管内皮細胞の管腔形成に必須の役割を果たす、内皮細胞間のジャンクション蛋白の発現を負に制御して、血管形成を抑制する可能性が考えられる。そこで、腫瘍の血管形成を抑制して、腫瘍の増大を抑制する可能性があるかどうかを検討した。【００７８】
Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞（ＬＬＣ細胞）をトリプシン処理して回収し、ＰＢＳで２回洗浄後、６週齢のＣ５７ＢＬ／６  Ｃｒ  Ｓｌｃマウス（ＳＬＣ社）に対し、一匹あたり３×１０６ｃｅｌｌｓ／２００μｌ  ＰＢＳとなるように皮下にＬＬＣ細胞を注射した。２〜３日おきごとに腫瘍の大きさを測り、１０，１２，１４，１７日後にｍｉＲ１２５ｂのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを２６Ｇ シリンジで腫瘍内に注入しトランスフェクションした。トランスフェクション用試薬はｉｎ ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ （Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社)を使用した。１匹１回あたりｍｉＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒを４００ｐｍｏｌ分、ｉｎ ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩを０．３５μｌ使用し、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの説明書に従い、トランスフェクション試薬を調整した。腫瘍注入１９日後にマウスから回収した。腫瘍組織の一部を細かく裁断し、ｍｉＲＮＡ  ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ１５７０−０１）を用いてｍｉＲＮＡを回収した。残りの腫瘍組織は２つに分割して、４％  ＰＦＡ／ＰＢＳにて４℃、３時間振盪し固定した。固定終了後、４℃のＰＢＳで腫瘍組織を一晩振盪した。その後腫瘍組織を、４℃  １５％  ｓｕｃｒｏｓｅ／ＰＢＳで３時間振盪し、次に４℃  ３０％  ｓｕｃｒｏｓｅ／ＰＢＳで３時間振盪した。そしてＯ．Ｃ．Ｔ．  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  （Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ社）に包埋し、−２０℃で３時間置いたのち、−８０℃で３日以上冷凍した。【００７９】
その結果、図１０及び１１に示す通り、ｍｉＲ１２５ｂを投与したマウスにおいては、トランスフェクション試薬のみを注入したコントロールおよびｍｉＲ１２５ｂと相補鎖であるａｎｔｉ−ｍｉＲを注入したものにくらべ有意に腫瘍増殖の抑制が観察された。【００８０】
実施例２．ｍｉＲ１２５ｂによる血管新生時の内皮細胞におけるＶＥ−カドヘリンの発現の抑制作用
Ｏ．Ｃ．Ｔ．  ｃｏｍｐｏｕｎｄに包埋したＬＬＣ腫瘍組織をクライオスタット（ＬＥＩＣＡ社）で２０μｍの切片にスライスし、スライドガラス上に切片をのせドライヤーで１時間風乾させた。コリンジャーにスライドガラスをセットし、室温でＰＢＳを用いて１分洗浄を３回行い、Ｏ．Ｃ．Ｔ．  ｃｏｍｐｏｕｎｄを溶かした。ＰＢＳＴで抗原賦活化を５分間行った。そして切片の周りをＬｉｑｕｉｄ  Ｂｌｏｃｋｅｒで囲い、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５％  ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ／１％ＢＳＡ／２％ ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ／ＰＢＳ)を切片上に滴下し、室温で３０分間ブロッキングを行った。１次抗体はＰｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ１４４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５５０５４８）を４℃で一晩反応させた。ＰＢＳＴで１０分間のＷＡＳＨを３回行ったのち、二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｔ  ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を遮光して１時間、室温で反応させた。以降の操作はすべて遮光して室温にて行った。その後ＰＢＳＴで１０分間のＷＡＳＨを３回行ったのち、一次抗体Ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉ−ｒａｔ  ＣＤ３１（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を１時間反応させた。再びＰＢＳＴでｗａｓｈ１０分間を３回行い、二次抗体Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社)を１時間反応させた。ＰＢＳＴでｗａｓｈ１０分間を３回行いＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ （ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．社)を数滴落とし、カバーガラスをして、共焦点レーザー顕微鏡にて観察、撮影した。【００８１】
その結果、図１２に示す通り、コントロールの腫瘍内の血管ではほとんどにＶＥ−カドヘリンの発現が観察されたが、ｍｉＲ１２５ｂを投与した腫瘍内では、血管内皮細胞におけるＶＥ−カドヘリンの発現が抑制されていた。【００８２】
実施例３．ｍｉＲ１２５ｂによる無機能な血管形成の誘導
ｍｉＲ１２５ｂにより影響を受けた腫瘍内の血管の血流を観察するために、腫瘍の低酸素の程度を指標にして、解析を行った。図１０の腫瘍切片を用い、１次抗体はＰｕｒｉｆｉｅｄ  Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ−ＣＤ３１（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１  Ｍａｂ１  ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを４℃で遮光して一晩反応させた。以降の操作はすべて遮光し、室温で行った。ＰＢＳＴで１０分間のＷＡＳＨを３回行ったのち、二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｔ  ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を遮光して１時間、室温で反応させた。その後ＰＢＳＴで１０分間のＷＡＳＨを３回行ったのちＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．社）を数滴落とし、カバーガラスをして、共焦点レーザー顕微鏡にて観察、撮影した。【００８３】
その結果、図１３に示す通り、ｍｉＲ１２５ｂを投与された腫瘍内では、ＣＤ３１陽性の血管内皮細胞は存在していても、低酸素であることが判明し、ｍｉＲ１２５ｂは血流を有さず、成熟血管が破綻された状態で、酸素運搬のできない無機能血管を誘導することが判明した。【００８４】
実施例４．ｍｉＲ１２５ｂによる炎症部位における血管新生の抑制
ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）やＶＥＧＦは炎症部位において発現が上昇して血管新生を誘導する。この血管新生により炎症が悪化することが周知である。マトリゲルという細胞外マトリックス成分に上記ｂＦＧＦ又はＶＥＧＦを含ませてマウスに皮下移植すると、炎症で観察されるような血管新生が誘導される。そこで６週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの右脇窩に、ＢＤマトリゲルにそれぞれ、３０Ｕｎｉｔ／ｍｌの最終濃度になるようにヘパリンを加え、さらに最終濃度が５００ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ (Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ)、１５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、又はｖｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳのみ）となるようにそれぞれ加えたもの５００μｌを注射した。２日後、５日後に３．３ｐｍｏｌ  ｍｉＲ１２５ｂ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ｐｒｅ−ｍｉＲ１２５ｂ）をｉｎ ｖｉｖｏ ｊｅｔＰＥＩを用いて脇窩に注射した。７日目にマウスからマトリゲルを回収。室温にて４重量％パラホルムアルデヒド（４重量％パラホルムアルデヒド及び９６重量％ＰＢＳ）にて一晩固定し、凍結組織包埋剤（ＯＣＴコンパウンド：Tissue-tec社製）に埋め込んだ後、切片を作成して、マトリゲル内の血管をＣＤ３１抗体(ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ)および２次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｒａｔ ＩｇＧ(ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ)を用いて、免疫染色した。その結果、ｍｉＲ１２５ｂｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ｐｒｅ−ｍｉＲ１２５ｂ）を注射しなかった場合には、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦによってマトリゲル内に血管新生が誘導されていたが（図１４のＡ参照）、この血管新生の誘導が、ｍｉＲ１２５ｂにより抑制されることが判明した（図１４のＡ及びＢ参照）。以上より、ｍｉＲ１２５ｂは炎症により誘導される血管新生を抑制することが判明した。【００８５】
実施例５．ｍｉＲ１２５ｂによる加齢性黄斑変性症モデルにおける血管新生の抑制
成体マウスの網膜にレーザーを照射することにより、脈絡膜に不安定血管の増成が誘導される。この現象は、人の加齢によって生じ、原因の本体とされる加齢性黄斑変性症における血管新生のモデルとされている。そこで８週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスに対し、３０．０ ｍｇ／ｋｇペントバルビタール麻酔を腹腔下投与し、１％トロピカミド点眼により散瞳を行った。アルゴングリーンレーザーを用いて、マウス網膜視神経乳頭の周囲４箇所に０．０５秒、５０ μｍ、１００ ｍＷの条件にてレーザー照射を行い、ブルッフ膜の断裂を図った。レーザー照射後直ちに、マウス眼球に５ μｍｏｌ／ｌのｐｒｅｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２５をｉｎ ｖｉｖｏ ｊｅｔ ＰＥＩを用いて硝子体へ注射し、他方の片眼には同濃度のコントロールｐｒｅｍｉｃｒｏＲＮＡを注射し、レーザー照射後７日目にも同様の注射を行った。レーザー照射後１４日目にはマウスに分子量２ × １０６のフルオレセイン標識デキストラン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）を静注し血管をあらかじめ染色し、眼球を摘出、脈絡膜のホールマウント組織片を作成した。ホールマウント組織片は蛍光顕微鏡で観察・撮影し、盲検化された検者により脈絡膜新生血管領域の面積測定を行った。その結果を図１５に示す。コントロール群では、おびただしい血管新生が誘導されていたが、ｍｉＲ１２５ｂにより、血管新生が抑制されていることが判明した。以上より、ｍｉＲ１２５ｂは加齢性黄斑変性症などの網膜血管新生を抑制することが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年2月15日(2011.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含有する、血管新生抑制剤。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡ類が、ＶＥ−カドヘリンをコードするｍＲＮＡの配列番号１に示される塩基配列の領域に結合することによりｍｉＲＮＡ活性を示すものである、請求項１記載の血管新生抑制剤。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分が、配列番号２に示される塩基配列を含んでなるものである、請求項２記載の血管新生抑制剤。
【請求項４】
前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分が、下記（Ａ）又は（Ｂ）を配列番号２に示される塩基配列の３’末端側に連結させてなる塩基配列を含んでなるものである請求項３記載の血管新生抑制剤：
（Ａ）配列番号３に示される塩基配列；又は
（Ｂ）配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分の塩基数が１９〜２５である、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項６】
炎症疾患の治療剤として用いられる、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項７】
加齢性黄斑変性症の治療剤として用いられる、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含有する、成熟血管の破綻剤。
【請求項１０】
固形癌又は慢性炎症性疾患の治療剤として用いられる、請求項９に記載の成熟血管の破綻剤。
【請求項１１】
血管新生に起因して発症又は悪化する疾患の患者に対して、請求項１に記載の血管新生抑制剤を治療有効量投与する工程を含む、当該疾患における血管新生を抑制する方法。
【請求項１２】
癌転移又は癌浸潤の抑制が求められる癌患者に対して、請求項１に記載の血管新生抑制剤を治療有効量投与する工程を含む、癌転移又は癌浸潤を抑制する方法。
【請求項１３】
成熟血管が形成されている病巣を持つ患者に対して、請求項９に記載の成熟血管の破綻剤を治療有効量投与する工程を含む、当該病巣に形成された成熟血管を破綻する方法。
【請求項１４】
血管新生抑制剤の製造のための、ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの使用。
【請求項１５】
成熟血管の破綻剤の製造のための、ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの使用。
【手続補正書】
【提出日】平成24年1月24日(2012.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含有する、血管新生抑制剤。
【請求項２】
前記ｍｉＲＮＡ類が、ＶＥ−カドヘリンをコードするｍＲＮＡの配列番号１に示される塩基配列の領域に結合することによりｍｉＲＮＡ活性を示すものである、請求項１記載の血管新生抑制剤。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分が、配列番号２に示される塩基配列を含んでなるものである、請求項２記載の血管新生抑制剤。
【請求項４】
前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分が、下記（Ａ）又は（Ｂ）を配列番号２に示される塩基配列の３’末端側に連結させてなる塩基配列を含んでなるものである請求項３記載の血管新生抑制剤：
（Ａ）配列番号３に示される塩基配列；又は
（Ｂ）配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡ類の塩基配列のうちｍｉＲＮＡを構成する部分の塩基数が１９〜２５である、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項６】
炎症疾患の治療剤として用いられる、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項７】
加齢性黄斑変性症の治療剤として用いられる、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項８】
ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含有する、成熟血管の破綻剤。
【請求項９】
固形癌又は慢性炎症性疾患の治療剤として用いられる、請求項９に記載の成熟血管の破綻剤。
【請求項１０】
血管新生抑制剤の製造のための、ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの使用。
【請求項１１】
成熟血管の破綻剤の製造のための、ＶＥ−カドヘリンに対してｍｉＲＮＡ活性を示すｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡからなる群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ類、又は当該ｍｉＲＮＡ類をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの使用。
【国際調査報告】
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