(57)【要約】  本発明は、ＮＡＦＬＤ、特にＮＡＳＨに対して有効である脂肪性肝疾患の予防または治療剤を提供することを目的とする。本発明は、イブジラストを有効成分として含有することを特徴とする脂肪性肝疾患の予防または治療剤に関する。
2012020821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イブジラストを有効成分として含有する脂肪性肝疾患の予防または治療剤。
【請求項２】
脂肪性肝疾患が非アルコール性脂肪性肝疾患である請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項３】
非アルコール性脂肪性肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎である請求項２記載の予防または治療剤。
【請求項４】
非アルコール性脂肪性肝疾患が単純性脂肪肝である請求項２記載の予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイブジラストを有効成分として含有する非アルコール性脂肪性肝疾患、特に非アルコール性脂肪肝炎の予防または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
非飲酒者に発生するアルコール性肝障害に類似した脂肪肝を包括する全ての脂肪性肝疾患は非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）と称される。ＮＡＦＬＤの患者の肝の脂肪酸合成は常に活性化している。この肝の脂肪酸合成の活性化はメタボリックシンドロームに起因する脂肪肝形成の１つの重要な因子であると考えられている（非特許文献１）。【０００３】
また、マウスにおいて、肝の脂肪酸合成の鍵となる転写因子であるＳＲＥＢＰ−１を肝に過剰発現させると脂肪肝になり（非特許文献２）、逆に、脂肪肝のマウスのＳＲＥＢＰ−１を遺伝子欠損させると脂肪肝が改善することが知られている（非特許文献３）。【０００４】
ＮＡＦＬＤは一般に予後良好と考えられている単純性脂肪肝と、単純性脂肪肝に更に炎症や線維化を伴い予後不良と考えられている非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）に大別され、ＮＡＳＨはＮＡＦＬＤの重症型と考えられている（非特許文献４−７）。【０００５】
ＮＡＳＨの発症・発展機序として現在のところＴｗｏ  ｈｉｔ  ｔｈｅｏｒｙが支持されている（非特許文献４）。Ｔｗｏ  ｈｉｔ  ｔｈｅｏｒｙとは、生活習慣や遺伝的な要因などをＦｉｒｓｔ  ｈｉｔとして単純性脂肪肝が発症して、この状態に脂肪肝に由来する酸化ストレスや炎症性サイトカインなどがＳｅｃｏｎｄ  ｈｉｔとして作用することでＮＡＳＨが発症・進展するという説である（非特許文献８および９）。【０００６】
ＮＡＳＨの疾患背景としてのメタボリックシンドロームの治療が重要であることから、この面でインスリン抵抗性改善薬、抗酸化剤、高脂血症治療薬、肝庇護薬およびアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬が使用されている（非特許文献４）。【０００７】
しかしながら、ＮＡＳＨの治療方針に、現時点で推奨に足るエビデンスを有する薬物はないとされている。例えば、インスリン抵抗性改善薬のピオグリタゾンはＮＡＳＨ治療薬として期待されていたが、フェーズＩＩＩ（ＰＩＶＥＮＳ）の結果によると、線維化に対して改善効果が無く、当初のクライテリアをクリアすることができていない（非特許文献１０）。また、ピオグリタゾンは、骨折リスク、体重増加、心不全の悪化または発症などの副作用が懸念されている（非特許文献１１）。【０００８】
一方、イブジラストは、脳血管障害改善剤、気管支喘息治療剤およびアレルギー性結膜炎治療剤として臨床の現場で広く用いられており、安全性が確認されている。イブジラストの作用としては、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）の脳血管弛緩作用の増強作用（非特許文献１２）、血小板凝集抑制作用の増強作用（非特許文献１３）、気道収縮抑制作用、ロイコトリエン拮抗作用、ロイコトリエン遊離抑制作用（非特許文献１４）、ＰＤＥ阻害作用（特許文献１）および遊走阻止因子（ＭＩＦ）の活性抑制作用（非特許文献１５）などの多彩な作用が知られているが、脂肪性肝疾患、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ及び脂肪肝に対する作用は全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００４／０５００９１号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｊｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１１３９−１１４２
【非特許文献２】Ｓｈｉｍａｎｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１５７５−１５８４．
【非特許文献３】Ｙａｈａｇｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１９３５３−１９３５７．
【非特許文献４】西原利治編「ＮＡＳＨ診療  ｂｅｓｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ」中外医学社、２００８年１２月５日
【非特許文献５】Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．１９８６．Ｐｒｏｇ．Ｌｉｖｅｒ．Ｄｉｓ．８：２８３−２９８．
【非特許文献６】Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ−Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．３７：１２０２−１２１９．
【非特許文献７】Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．５０：Ｓ４１２−４１６．
【非特許文献８】Ｄａｙ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１４：８４２−８４５．
【非特許文献９】Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４：１４７−１５２
【非特許文献１０】Ｓａｎｙａｌ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６２：１６７５−１６８５．
【非特許文献１１】Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．５１：３６６−３６９．
【非特許文献１２】Ｏｈａｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．１９８６．Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．Ｔｈｅｒ．２８０：２１６−２２９．
【非特許文献１３】Ｏｈａｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．１９８６．Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．Ｔｈｅｒ．２８３：３２１−３３４．
【非特許文献１４】大橋光雄  １９８９．喘息．２：１０３−１０７．
【非特許文献１５】Ｃｈｏ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０７：１１３１３−１１３１８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＮＡＦＬＤ、特にＮＡＳＨに対して有効である脂肪性肝疾患の予防または治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らはイブジラストがＮＡＳＨの主たる病態である脂肪肝、肝炎症および肝線維化の全てを改善することを見出し、本発明を完成した。【００１３】
即ち、本発明は以下の通りである。
１．イブジラストを有効成分として含有する脂肪性肝疾患の予防または治療剤。
２．脂肪性肝疾患が非アルコール性脂肪性肝疾患である前項１記載の予防または治療剤。
３．非アルコール性脂肪性肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎である前項２記載の予防または治療剤。
４．非アルコール性脂肪性肝疾患が単純性脂肪肝である前項２記載の予防または治療剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の脂肪性肝疾患の予防または治療剤は、イブジラストを含有することにより、肝での脂肪酸合成、脂肪肝、肝炎症および肝線維化の全てを抑制することができ、ＮＡＦＬＤ、特にＮＡＳＨを有効に予防または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、肝脂肪酸合成に対するイブジラスト（１０および１００ｍｇ／ｋｇ，１日２回投与）の効果を示す。数値は平均値±標準誤差である（ｎ＝５−６，＊ｐ＜０．０５ｖｓ．溶媒）。
【図２】図２は、肝トリグリセリド含量に対するイブジラスト（１０および１００ｍｇ／ｋｇ，１日２回投与）の効果を示す。数値は平均値±標準誤差である（ｎ＝５−６，＊ｐ＜０．０５ｖｓ．溶媒）。
【図３】図３は、肝トリグリセリド含量に対するイブジラスト（１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇ，１日２回投与）の効果を示す。数値は平均値±標準誤差である（ｎ＝６，＊ｐ＜０．０５ｖｓ．溶媒）。
【図４】図４は、肝ＴＮＦαｍＲＮＡ発現量に対するイブジラスト（１０，３０および１００ｍｇ／ｋｇ，１日２回投与）の効果を示す。数値は平均値±標準誤差である（ｎ＝９−１０，＊ｐ＜０．０５ｖｓ．溶媒）。
【図５】図５は、肝ＭＣＰ−１ｍＲＮＡ発現量に対するイブジラスト（１０，３０および１００ｍｇ／ｋｇ，１日２回投与）の効果を示す。数値は平均値±標準誤差である（ｎ＝９−１０，＊ｐ＜０．０５ｖｓ．溶媒）。
【図６】図６は、肝ＩＬ−１βｍＲＮＡ発現量に対するイブジラスト（１０，３０および１００ｍｇ／ｋｇ，１日２回投与）の効果を示す。数値は平均値±標準誤差である（ｎ＝９−１０，＊ｐ＜０．０５ｖｓ．溶媒）。
【図７】図７は、肝ＴＧＦβｍＲＮＡ発現量に対するイブジラスト（１０，３０および１００ｍｇ／ｋｇ，１日２回投与）の効果を示す。数値は平均値±標準誤差である（ｎ＝９−１０，＊ｐ＜０．０５ｖｓ．溶媒）。
【図８】図８は、肝ｃｏｌ１ａ１ｍＲＮＡ発現量に対するイブジラスト（１０，３０および１００ｍｇ／ｋｇ，１日２回投与）の効果を示す。数値は平均値±標準誤差である（ｎ＝９−１０，＊ｐ＜０．０５ｖｓ．溶媒）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
本発明の脂肪性肝疾患の予防または治療剤は、イブジラストを有効成分として含有する。
【００１８】
イブジラストは、次式（１）で表される公知化合物であり、公知の製造方法（例えば、日本国特公昭５２−２９３１８号公報）に従い製造できる。
【００１９】
【化１】
2012020821.tif 000003
【００２０】
本発明において、「脂肪性肝疾患」とは、肝細胞に中性脂肪が沈着して肝障害をきたす疾患の総称を表し、アルコール性肝障害及び非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）が含まれる。
【００２１】
本発明において、「非アルコール性脂肪性肝疾患」とは、非アルコール性脂肪肝及び非アルコール性肝脂肪症と同義である。非アルコール性脂肪性肝疾患には、非アルコール性脂肪肝炎（非アルコール性脂肪性肝炎、ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）及び単純性脂肪肝が含まれる。
【００２２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、例えば、明らかな飲酒歴がないにもかかわらず、肝組織所見はアルコール性肝障害に類似した主に大滴性の肝脂肪沈着を特徴とする肝障害であり、予後良好な単純性脂肪肝と進行性のＮＡＳＨを含む疾患概念と定義される［「ＮＡＳＨ・ＮＡＦＬＤの診療ガイド」（日本肝臓学会編、文光堂、２００６年８月）］。
【００２３】
また、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の特徴としては、以下のような特徴が挙げられる。
１．明らかな飲酒歴がない（アルコール量：２０ｇ以下／日）。
２．ウイルス性（ＨＣＶ、ＨＢＶ）、自己免疫性のような成因の明らかな慢性肝疾患は認めない。
３．メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧、高尿酸血症、睡眠時無呼吸症候群などはリスクファクターである。マルチプルリスクファクターを有す例では単純性脂肪肝＜ＮＡＳＨの可能性が高くなる。
４．脂質代謝やミトコンドリア機能の異常をきたす種々の疾患や薬剤も成因となる。
【００２４】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）は、例えば、以下のように定義される［「ＮＡＳＨ・ＮＡＦＬＤの診療ガイド」（日本肝臓学会編、文光堂、２００６年８月）］。
１．Ｍａｔｔｅｏｎｉ（Ｍａｔｔｅｏｎｉ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１６：１４１３−１４１９）はＮＡＦＬＤを４型に分類。１型：単純性脂肪肝、２型：脂肪性肝炎、３型：脂肪性肝壊死（風船様変性を伴う）、４型：マロリー体ないしは線維化を伴う肝細胞壊死（風船様変性を伴う）。長期予後の検討から肝硬変への進展や肝関連死の頻度が有意に高い３型、４型を非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）とする。
２．米国肝臓学会のＳｉｎｇｌｅ  Ｔｏｐｉｃ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ２００２（Ｎｅｕｓｃｈｗａｎｄｅｒ−Ｔｅｔｒｉ，Ｂ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．３７：１２０２−１２１９．）ではＮＡＳＨの必須所見として脂肪化（大滴性＞小滴性、小葉中心部に多い）、小葉内炎症（軽度、好中球や単核球浸潤）、肝細胞の風船様変性（脂肪化周辺、小葉中心部に多い）を挙げ、ＮＡＦＬＤの３型、４型（Ｍａｔｔｅｏｎｉ分類）をＮＡＳＨとしている。
３．Ｂｒｕｎｔ（Ｂｒｕｎｔ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９４：２４６７−２４７４）はＮＡＳＨの進展経過を線維化の程度により４段階に分類。ｓｔａｇｅ  １：小葉中心部（Ｚｏｎｅ  ３）、ｓｔａｇｅ  ２：１＋門脈域、ｓｔａｇｅ  ３：架橋形成、ｓｔａｇｅ  ４：肝硬変。
【００２５】
本発明において、「単純性脂肪肝」とは、脂肪性肝疾患のうち肝細胞の脂肪沈着のみが認められ、肝細胞の壊死・炎症や線維化を伴わない症例を表す。
【００２６】
本発明の予防または治療剤を適用する脂肪性肝疾患としては、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が好ましく、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）または単純性脂肪肝がより好ましく、非アルコール性脂肪肝炎が特に好ましい。
【００２７】
上述したように、ＮＡＳＨの発症・発展機序として、Ｔｗｏ  ｈｉｔ  ｔｈｅｏｒｙが支持されている（西原利治編「ＮＡＳＨ診療  ｂｅｓｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ」中外医学社、２００８年１２月５日）。
【００２８】
Ｔｗｏ  ｈｉｔ  ｔｈｅｏｒｙとは、次のような発症・発展機序によりＮＡＳＨが発症・進展するという説である。まず、Ｆｉｒｓｔ  ｈｉｔとして肝脂肪の蓄積（脂肪肝）が起こる。さらにＳｅｃｏｎｄ  ｈｉｔとして脂肪肝に由来する酸化ストレスや炎症性サイトカインなどにより肝炎症および肝線維化が発症することにより、ＮＡＳＨが発症・進展する。ＮＡＳＨが発症・進展することにより、肝硬変および肝癌が発症・進展することとなる。
【００２９】
イブジラストは、Ｆｉｒｓｔ  ｈｉｔに対して、肝脂肪合成活性と肝トリグリセリド含量を抑制することにより肝脂肪の蓄積を抑制し、まず脂肪肝を抑える。さらに、イブジラストは、Ｓｅｃｏｎｄ  ｈｉｔに対して、肝臓における脂肪滴と炎症細胞の浸潤を抑制し、酸化ストレスおよび炎症性サイトカイン量を抑えるとともに、肝炎症関連遺伝子および肝線維化関連遺伝子の発現を抑制することにより肝炎症および肝線維化を抑える。このような機構により、イブジラストは、ＮＡＳＨの発症・発展機序を効果的に阻害することができると考えられる。
【００３０】
本発明の脂肪性肝疾患の予防または治療剤は、イブジラストを含み、必要に応じて、薬理学的に許容される公知の添加剤を配合することができる。任意に配合することのできる添加剤としては、剤形や、投与形態等に応じて変動するが、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、着香剤、着色剤または甘味剤などを使用してもよい。
【００３１】
また、本発明の脂肪性肝疾患の予防または治療剤は、薬理学的に許容される各種の形態で使用することができる。このような形態としては、例えば、カプセル剤、散在、錠剤、細粒剤、顆粒剤、注射剤、液剤、軟膏剤または貼付剤等の形態が好適に列挙できる。
【００３２】
従って、本発明の脂肪性肝疾患の予防または治療剤は、経口投与や、非経口投与の形態で患者に投与することができる。なかでも、患者が用い易いことを考慮し、経口剤が好ましい。
【００３３】
本発明の脂肪性肝疾患の予防または治療剤におけるイブジラストの配合量は、患者の年齢や、体重、症状、投与経路などによって適宜変更することが可能である。
【００３４】
例えば、成人（約６０ｋｇ）に対する経口投与では、一般に、１回当たり１０ｍｇ〜２００ｍｇを用いることが好ましく、１回当たり１０ｍｇ〜６０ｍｇを１日２回〜３回用いることがより好ましい。
【００３５】
また、例えば、成人（約６０ｋｇ）に対する注射形態では、一般に、１回当たり１０ｍｇ〜２００ｍｇを用いることが好ましく、１回当たり１０ｍｇ〜６０ｍｇを１日２回〜３回用いることがより好ましい。
【実施例】
【００３６】
次に本発明を具体例によって説明するが、これらの例によって本発明が限定されるものではない。【００３７】
［実施例１］  
イブジラストの脂肪肝抑制作用（脂肪肝モデルを用いた評価）
ＮＡＦＬＤにおいて、肝脂肪酸合成の活性化が脂肪肝形成の１つの重要な因子であると考えられている（Ｓｈｉｎｊｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：１１３９−１１４２）。そこで、Ｄｅｌｚｅｎｎｅら（Ｄｅｌｚｅｎｎｅ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２６：８８０−８８５．）及びＴｓｕｃｈｉｄａら（Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３０８１７−３０８２２）の方法を参考にして、肝の脂肪酸合成を増大させた再摂食マウスを用いてイブジラストの脂肪肝に対する効果を検討した。【００３８】
８週齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（日本クレア株式会社）を４８時間絶食させた後に４時間再摂食させた。比較対照とする溶媒群には２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０水添ヒマシ油（ＮＩＫＫＯＬ  ＨＣＯ−６０，日光ケミカルズ株式会社）、イブジラスト群には２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０水添ヒマシ油に溶解させたイブジラスト１０又は１００ｍｇ／ｋｇを絶食前並びに絶食１２、２４、３６および４８時間後に経口投与した。【００３９】
絶食４８時間後の経口投与３０分後から標準食（ＣＥ−２，日本クレア株式会社）を再摂食させ、再摂食４時間後に解剖した。採取した肝臓におけるトリグリセリド含量と脂肪酸合成を測定した。【００４０】
肝臓からのトリグリセリド抽出はＦｏｌｃｈらの方法（Ｆｏｌｃｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．１９５７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：４９７−５０９．）を改良して行った。クロロホルム−メタノール混液２：１（ｖ／ｖ）を用いて組織をホモジナイズした。【００４１】
ホモジネートを１時間振盪して脂質画分を抽出し、遠心して得られた上清を乾固させた。組織の沈渣から同様の操作で２回抽出を行い、合わせて乾固させた。乾固した抽出物を４％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に溶解させてリキテックＴＧＩＩ試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いてトリグリセリド濃度を測定した。結果は平均値±標準誤差で示した。統計解析はＷｉｌｌｉａｍｓの多重比較検定を用いて、有意水準は５％未満とした。【００４２】
肝の脂肪酸合成は酢酸からの脂肪酸合成を測定した。組織を９５％（ｖ／ｖ）Ｏ２、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、０．５ｍＭ酢酸（０．２５μＣｉ／ｍＬ、［１−１４Ｃ］酢酸）、０．２％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ含有クレブスリンガー・リン酸・ヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）中で３７℃で２時間インキュベートした後に、１５％（ｗ／ｖ）水酸化カリウムを含有するエタノール溶液を添加して８５℃で２時間インキュベートしてケン化した。【００４３】
石油エーテルを加えて３０分間振盪した後に遠心して得られた上層のエーテル層を除去した。同様の操作を２回行った後に、水層を塩酸でｐＨ１に調整した。石油エーテルを加えて３０分間振盪した後に遠心して得られた上層のエーテル層を回収した。同様の操作を２回行った。回収したエーテル層を合わせた後、乾固させた抽出物をクロロホルムに溶解させ、精製水を加えて３０分間振盪した。【００４４】
遠心して得られた下層のクロロホルム層を乾固後にメタノールに溶解させ、シンチレーターを混和して放射能を液体シンチレーションカウンター（Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  １９００ＣＡ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定した。結果は平均値±標準誤差で示した。統計解析はＷｉｌｌｉａｍｓの多重比較検定を用いて、有意水準は５％未満とした。【００４５】
イブジラストはＮＡＦＬＤにおける脂肪肝形成に重要であると考えられている肝の脂肪酸合成を減少させた（図１）。さらに、脂肪肝の指標である肝のトリグリセリド含量も顕著に減少させた（図２）。これにより、イブジラストは肝での脂肪酸合成と脂肪肝の抑制作用に優れることが示された。【００４６】
[実施例２]  
イブジラストの脂肪肝抑制作用（肥満を伴う脂肪肝モデルを用いた評価）
肥満・インスリン抵抗性は、ＮＡＦＬＤにおいて主要な基礎病態として考えられている（Ｋｒｉｓｔｉｎａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．９１：  ４７５３−４７６１）。そこで、肥満・インスリン抵抗性を有し、かつ、脂肪肝を呈するＢ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂ／Ｊ（ｏｂ／ｏｂ；日本チャールス・リバー株式会社）マウスを用いてイブジラストの脂肪肝に対する効果を検討した。【００４７】
７週齢の雄性ｏｂ／ｏｂマウス（日本チャールス・リバー株式会社）を使用した。比較対照とする溶媒群には２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０水添ヒマシ油（ＮＩＫＫＯＬ  ＨＣＯ−６０，日光ケミカルズ株式会社）、イブジラスト群には２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０水添ヒマシ油に溶解させたイブジラスト１０、３０又は１００ｍｇ／ｋｇを１日２回経口投与した。【００４８】
２週間投与後、最終投与の１５から２１時間後に飽食下で解剖を行い、採取した肝臓におけるトリグリセリド含量を測定した。【００４９】
肝臓からのトリグリセリド抽出はＦｏｌｃｈらの方法（Ｆｏｌｃｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．１９５７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：４９７-５０９．）を改良して行った。クロロホルム−メタノール混液２：１（ｖ／ｖ）を用いて組織をホモジナイズした。【００５０】
ホモジネートを１時間振盪して脂質画分を抽出し、遠心して得られた上清を乾固させた。組織の沈渣から同様の操作で２回抽出を行い、合わせて乾固させた。乾固した抽出物を４％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に溶解させてリキテックＴＧＩＩ試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いてトリグリセリド濃度を測定した。結果は平均値±標準誤差で示した。統計解析はＷｉｌｌｉａｍｓの多重比較検定を用いて、有意水準は５％未満とした。【００５１】
イブジラストは肥満・インスリン抵抗性を有する脂肪肝モデルであるｏｂ／ｏｂマウスにおいて、脂肪肝の指標である肝のトリグリセリド含量を顕著に減少させた（図３）。これにより、肥満・インスリン抵抗性を有する患者の脂肪肝に対してもイブジラストが優れた改善効果を有することが明確に示された。【００５２】
［実施例３］
イブジラストの肝炎症および肝線維化抑制作用
ＮＡＳＨのようなヒトの病態で認められる肝炎症および肝線維化を誘発したメチオニン−コリン欠乏食（ＭＣＤ食）負荷マウスを用いて、イブジラストの肝炎症および肝線維化に対する効果を検討した。【００５３】
１０週齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（日本クレア株式会社）に、Ｏｋｕｍｕｒａらの配合（Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．３６：２１７−２２８）に順じたＭＣＤ食（オリエンタル酵母工業株式会社）を６週間負荷した。【００５４】
ＭＣＤ食を６週間負荷した後に溶媒群には２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０水添ヒマシ油（ＮＩＫＫＯＬ  ＨＣＯ−６０，日光ケミカルズ株式会社）、イブジラスト群には２％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ−６０水添ヒマシ油に溶解させたイブジラスト１０、３０又は１００ｍｇ／ｋｇを１日２回、１４日間経口投与した。【００５５】
その後採取した肝臓を用いて、定量的リアルタイムＰＣＲ法により、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１β、ＴＧＦβおよびｃｏｌ１ａ１ｍＲＮＡ発現量を測定した。同様に定量的リアルタイムＰＣＲ法により、内部標準として１８Ｓ  ｒＲＮＡｍＲＮＡ発現量を測定した。【００５６】
肝からのＲＮＡの抽出は、ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。抽出したＲＮＡのＤＮＡａｓｅ処理は、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＲＮｅａｓｙｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。【００５７】
ＲＮＡの逆転写はＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。【００５８】
定量的リアルタイムＰＣＲはＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。【００５９】
Ｔａｑｍａｎ  プローブとプライマーはそれぞれのｍＲＮＡのアッセイセットとして入手した（ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）。具体的には、マウスのＴＮＦα（Ｍｍ００４４３２５８＿ｍ１）、ＭＣＰ−１（Ｍｍ９９９９９０５６＿ｍ１）、ＩＬ−１β（Ｍｍ００４３４２２８＿ｍ１）、ＴＧＦβ（Ｍｍ０１１７８８１９＿ｍ１）、ｃｏｌ１ａ１（Ｍｍ００８０１６６６＿ｇ１）および１８ｓ  ｒＲＮＡ（Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１）を使用した。【００６０】
なお、当該定量的リアルタイムＰＣＲ法に関連する各操作は、各試薬、キット及び装置に添付の説明書にしたがった。目的遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、１８Ｓ  ｒＲＮＡを内部標準とした相対値として表した。結果は平均値±標準誤差で示した。統計解析はＷｉｌｌｉａｍｓの多重比較検定を用いて、有意水準は５％未満とした。【００６１】
イブジラストは肝炎症の指標である肝ＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１βｍＲＮＡ発現量並びに肝線維化の指標である肝ＴＧＦβおよびｃｏｌ１ａ１ｍＲＮＡ発現量を減少させた（図４〜図８）。これにより、イブジラストが肝炎症と肝線維化を抑制することが示された。【００６２】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２０１０年８月１２日出願の日本特許出願２０１０−１８０６５６に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
上述の通り、イブジラストはＮＡＳＨの主たる病態である脂肪肝、肝炎症および肝線維化の全てを改善することが明らかとなった。したがって、イブジラストを含有する本発明の脂肪性肝疾患の予防または治療剤は、ＮＡＦＬＤ、特にＮＡＳＨの予防または治療薬として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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