(57)【要約】本発明は、心筋組織の機能を効率良く再生することができ、実際の移植手術にも使用可能な、培養によって生産され得る人工組織を提供することを課題とする。本発明は、脂肪細胞を含有する細胞シートを含む、心筋疾患治療用移植材料に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養支持体から単離された脂肪細胞含有細胞シートを含む、心臓疾患治療用移植材料。
【請求項２】
前記細胞シートの厚さが５０μｍ以上である、請求項１に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項３】
前記細胞シートのアディポネクチン分泌能が１日当たり３×１０−１４ｇ／ｃｅｌｌ以上である、請求項１または２のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項４】
前記細胞シートが線維化抑制機能、血管新生機能、アトポーシス抑制機能、および抗炎症機能からなる群より選択される少なくとも１種の機能を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項５】
前記脂肪細胞が脂肪組織由来線維芽細胞を分化誘導したものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項６】
複数層の細胞シートを積層した状態で含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項７】
前記細胞シートのうち少なくとも一層が筋芽細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択される少なくとも１種の細胞をさらに含むものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項８】
前記筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、請求項７に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項９】
前記間葉系幹細胞が脂肪組織由来のものである、請求項７または８のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項１０】
スキャフォルドを含まない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項１１】
脂肪細胞が由来する個体に対して適用される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項１２】
さらにサイトカインまたは増殖因子を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項１３】
前記心臓疾患が、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも1種の疾患または障害である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
【請求項１４】
脂肪細胞を含有する細胞シートを含む心臓疾患治療用移植材料を製造する方法であって、スキャフォルドを用いず、かつ
ａ）水に対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が０〜８０℃である温度応答性高分子が被覆された細胞培養支持体上で、脂肪細胞を含有する細胞群を培養液中で培養する工程；
ｂ）培養液の温度を、該上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とする工程；および
ｃ）細胞群を、細胞培養支持体から細胞シートとして剥離する工程
を含む方法。
【請求項１５】
工程ｃ）の前に、
ｄ）培養液にアスコルビン酸またはその誘導体を加える工程
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質分解酵素で処理する工程を含まない、請求項１４または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記温度応答性高分子が、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓に適用可能な脂肪細胞シート及びその三次元構造体に関し、詳細には、成体の脂肪細胞を含む、心臓に適用可能な、医学、生物、創薬、薬学等の分野において有用な細胞シート、製造方法及びその利用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞は、不可逆的損傷である（非特許文献１）。虚血性心疾患は、すべての心血管系の死の５０％の原因であり、鬱血性心不全の主要な原因である。鬱血性心不全と診断された患者に関して、慢性心疾患の結果、１年死亡率は、２０％である（非特許文献２）。現在臨床医が利用可能な治療の多くは、急性心筋梗塞に罹患した患者の予後を有意に改善し得る。血管形成術および血栓崩壊剤は、この急性心筋梗塞の原因を除去し得るが、閉塞発症から再灌流までの時間が、不可逆的心筋損傷の程度を決定する（非特許文献３）。臨床的に使用されるどの薬剤も処置も、機能性収縮組織で心筋瘢痕を置換することにおいて、効力を示していない。正常な心筋細胞を再生するための新規な治療についての需要が存在する。【０００３】
心筋形成術が、鬱血性心不全に罹患した患者における左心室（ＬＶ）機能を改善するための外科的方法として提唱されているが、心機能に対する効果は、不明のままである（非特許文献４および５）。近年、生分解性足場を使用する生体操作した心臓移植片移植が、別の新規なストラテジーとして提唱されたが、これは、心筋層にほとんど付着しないのが原因で、心機能の改善において最小限の利点しか示していない(非特許文献６および７)。生体操作した心臓組織が、障害心筋層の再生についてレシピエント心臓と組織学的電気的統合を示し得ることが、要点であり得る。【０００４】
古くから、臓器（例えば、心臓、血管など）の移植において、同種異系移植片（または同種移植片、ａｌｌｏｇｒａｆｔ）と異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）等の外来性組織を使用した場合、免疫拒絶反応が起こることが報告されている。(非特許文献８および９)。動脈移植片の拒絶反応は、病理学的には移植片の拡張（破裂に至る）または閉塞のいずれかを招く。前者の場合、細胞外マトリクスの分解により生じ、一方、後者は血管内細胞の増殖により起こる(非特許文献１０)。【０００５】
最近、生体物質を利用した治療法として細胞移植が注目されている。しかし、梗塞心臓におけるヒト筋芽細胞移植は、１．移植細胞の傷害損失、２．レシピエント心の注入時の組織傷害、３．レシピエント心への組織供給効率、４．不整脈の発生、５．梗塞部位全体への治療の困難などの欠点を有する。従って、細胞の移植方法については更なる改善が必要不可欠である。【０００６】
アディポネクチンは抗アポトーシス、抗炎症、血管新生、抗線維化、抗心筋肥大作用によって傷害後の心筋を保護し、心機能の増悪を抑制する可能性があるということで最近、注目されている（非特許文献１１および１２、）。しかしながら、その効果を確認するには長期にわたりアディポネクチンを投与し続けなければならない。心筋組織へ繰り返し注入することは侵襲が大きく現実的には困難である。また、全身投与の場合、莫大なタンパク量が必要であること、血中にタンパクを投与した場合は分解を受けやすく、目的の組織に到達する量は僅かであることから、現実的ではない（非特許文献１３）。また、ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ等の薬剤やカロリー制限により血中アディポネクチン濃度を上昇させる方法は心不全患者に対して必ずしも容易ではない。こうした場合の対応策の一つとして、従来技術としてドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が挙げられるが、既存のＤＤＳでは、初期バーストやタンパク質の安定性により、活性を維持したタンパク質を適当濃度で長期にわたり徐放することが困難である。また、薬剤の担体によっては炎症を惹起する可能性があった。【０００７】
このような背景のもと、特許文献１には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃であるポリマーで基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が記載されている。また、特許文献２には、この温度応答性細胞培養基材を利用して心筋細胞を上限臨界溶解温度以下或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度以下にすることにより培養心筋細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。温度応答性細胞培養基材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開をはかれるようになってきた。特許文献３では、その技術をさらに発展させ、心臓組織以外の筋芽細胞を細胞シートとすることで、従来技術では困難であった心機能を長期にわたり改善させられることが分かってきた。さらに、特許文献４では、間葉系幹細胞を細胞シートとすることで、心機能を改善させられることも分かってきた。これらの細胞シートの機能が向上されれば、さらなる治療効果が期待でき、さらなる開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平０２−２１１８６５号公報
【特許文献２】再表２００２−０８３８７号公報
【特許文献３】再表２００５−０１１５２４号公報
【特許文献４】再表２００６−０８０４３４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ho KK, Anderson KM, Kannel WB, Grossman W, Levy D., Circulation.1993;88: 107-115
【非特許文献２】American Heart Association., Dallas, Tex: American Heart Association; 2001
【非特許文献３】RyanTJ, Antman EM, Brooks NH, Califf RM, Hillis LD, HiratzkaLF, Rapaport E, RiegelB, Russell RO, Smith EE III, Weaver WD, Gibbons RJ, Alpert JS, Eagle KA,Gardner TJ, Garson A Jr, Gregoratos G, Ryan TJ, Smith SC Jr., J Am Coll Cardiol.1999; 34: 890-911
【非特許文献４】Corin WJ, George DT, Sink JD et al., J Thorac Cardiovasc Surg 1992;104:1662-71；Kratz JM, Johnson WS, Mukherjee R et al., J Thorac Cardiovasc Surg 1994;107:868-78；Carpentier A, Chachques JC., Lancet.1985;8840:1267
【非特許文献５】Hagege AA, Desnos M, Chachques JCら、Preliminary report: follow-up after dynamic cardiomyoplasty. Lancet.1990;335:1122-4
【非特許文献６】Leor J, Etzion SA, Dar A et al., Circulation 2000;102[suppl III]III-56-III-61
【非特許文献７】Li RK, Jia ZQ, Weisel RD et al., Circulation 1999;100[suppl II]:II-63-II-69
【非特許文献８】Carrel A.,1907, J Exp Med 9:226-8；Carrel A., 1912., J Exp Med 9:389-92；Calne RY., 1970,Transplant Proc 2:550
【非特許文献９】Auchincloss 1988, Transplantation 46: 1
【非特許文献１０】Uretsky BF, Mulari S, Reddy S, et al., 1987, Circulation 76:827-34
【非特許文献１１】Shibata, R., N.  Ouchi, and T. Murohara, Adiponectin and cardiovascular disease. Circ J, 2009. 73(4): p. 608-14.
【非特許文献１２】Eren  P., Camus S., Matrone G., et al., Adiponectinemia controls pro-angiogenic cell therapy. 2009, Stem Cells 27(11): p. 2712-21
【非特許文献１３】Hwang H., Kloner RA. Improving regenerationg potential of the heart after myocardial infarction: Factor-based approach. 2010, Life Sciences 86: ｐ. 461-472
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、移植手術に耐え得る、実際の手術に使用可能な、培養によって生産され得る人工組織またはシートを提供することを課題とする。本発明はまた、細胞治療に代わる新たな治療法を提供することを課題とする。特に、脂肪細胞を材料として移植手術に耐え得る人工組織を作製することを目的とする。従来、脂肪細胞のような終末分化した培養細胞を利用しようとしても、それを回収する際に、一般的に用いられている酵素処理による方法では細胞生存率を維持することが困難であった。本発明では、得られた脂肪細胞を温度応答性培養器材上に播種し酵素処理なくシート状に回収することで、脂肪細胞の生存率を維持したまま、低侵襲かつ高効率に患部へ移植させられるようになった。これにより、患部に脂肪細胞が生着し、長期にわたるアディポネクチンの局所的かつ持続的供給が可能となった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、脂肪細胞を含む細胞シート及びその三次元構造体を利用することで、予想外に移植部の組織化が進展し、かつ、培養皿から剥離し易いという性質をもつ人工組織を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。【００１２】
すなわち、本発明は、心臓疾患に適用するため少なくとも脂肪細胞を含む細胞シート及びその三次元構造体を提供するものである。また、本発明は、この細胞シート及びその三次元構造体を温度応答性ポリマーが被覆された基材表面で作製する方法を提供するものである。本発明は、心臓疾患に適用するため少なくとも脂肪細胞を含む細胞シートという世界に類のない新規な発想による細胞構造物を使ってはじめて実現する極めて重要な発明と考えている。【００１３】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
項１．脂肪細胞を含有する細胞シートを含む、心臓疾患治療用移植材料。
項２．前記細胞シートの厚さが５０μｍ以上である、項１記載の心臓疾患治療用移植材料。
項３．前記脂肪細胞シートのアディポネクチン分泌能が１日当たり３×１０−１４ｇ／ｃｅｌｌ以上である、項１または２のいずれか１項記載の心臓疾患治療用移植材料。
項４．前記細胞シートが線維化抑制機能、血管新生機能、アトポーシス抑制機能、および抗炎症機能からなる群より選択される少なくとも１種の機能を有する、項１〜３のいずれか1項記載の心臓疾患治療用移植材料。
項５．前記細胞が脂肪組織由来線維芽細胞を分化誘導したものである、項１〜４のいずれか１項記載の心臓疾患治療用移植材料。
項６．細胞シートを三次元構造体の状態で含む、項１〜５のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項７．複数層の細胞シートを積層した状態で含む、項１〜６のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項８．前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を５０％以上含むものである、項１〜７のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項９．前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を６０％以上含むものである、項１〜７のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項１０．前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を７０％以上含むものである、項１〜７のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項１１．前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を８０％以上含むものである、項１〜７のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項１２．前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を９０％以上含むものである、項１〜７のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項１３．前記細胞シートのうち少なくとも一層が脂肪細胞を９５％以上含むものである、項１〜７のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項１４．前記細胞シートのうち少なくとも一層が筋芽細胞および間葉系幹細胞からなる群より選択される少なくとも１種の細胞をさらに含むものである、項１〜１３のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項１５．前記筋芽細胞が骨格筋芽細胞である、項１４記載の心臓疾患治療用移植材料。
項１６．前記間葉系幹細胞が脂肪組織由来のものである、項１４または１５のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項１７．スキャフォルドを含まない、項１〜１６のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項１８．脂肪細胞が由来する個体に対して適用される、項１〜１７のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項１９．さらにサイトカインまたは増殖因子を含む、項１〜１８のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項２０．前記心臓疾患が、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも1種の疾患または障害である、項１〜１９のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項２１．前記細胞シートが、細胞培養支持体から単離されたものである、項１〜２０のいずれか１項に記載の心臓疾患治療用移植材料。
項２２．脂肪細胞を含有する細胞シートを含む心臓疾患治療用移植材料を製造する方法であって、スキャフォルドを用いず、かつ
ａ）水に対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が０〜８０℃である温度応答性高分子が被覆された細胞培養支持体上で、脂肪細胞を含有する細胞群を培養液中で培養する工程；
ｂ）培養液の温度を、該上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とする工程；および
ｃ）細胞群を、細胞培養支持体から細胞シートとして剥離する工程
を含む方法。
項２３．工程ｃ）の前に、
ｄ）培養液にアスコルビン酸またはその誘導体を加える工程
をさらに含む、項２２記載の方法。
項２４．タンパク質分解酵素で処理する工程を含まない、項２２または２３のいずれか１項に記載の方法。
項２５．前記温度応答性高分子が、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に示される脂肪細胞を含む細胞シート及びその三次元構造体を用いれば、従来技術である筋芽細胞、或いは間葉系幹細胞だけからなる細胞シートを使用したときに比べ顕著に心機能を改善させられるようになる。また、細胞シートそのものの強度も向上し移植操作も改善させられるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１の脂肪細胞シートの組織学的検討を行った結果を示す図である。（１）Ｉｎ  ＶｉｔｒｏＡ．培養および分化誘導後の脂肪細胞。オイルレッドＯ染色にて脂肪細胞へ分化していることを確認した。図中の球形状のものが油滴である。Ｂ．温度応答性培養皿を用いて脂肪細胞をシート状に回収した。Ｃ．ＡＳのオイルレッドＯで染色。多数の陽性細胞を認めた。図中の球形状のものが油滴である。Ｄ．ＡＳのアディポネクチン免疫染色。アディポネクチンの発現を認めた。図中の色の薄い部分がアディポネクチンである。（２）Ｉｎ  ＶｉｖｏＥ．心筋梗塞急性期モデルラットに対するＡＳ移植後２８日の摘出心組織。脂肪細胞シート様組織の付着を認めた。Ｆ．心筋梗塞急性期モデルラットに対するＡＳ移植後２８日のオイルレッドＯ染色。心外膜側にオイルレッドＯ陽性細胞層の生着を認めた。図中の色の薄い部分が油滴である。Ｇ．Ｆと同一切片のアディポネクチン免疫染色像。心外膜側および心筋梗塞部においてアディポネクチンの発現を認めた。図中の色の薄い部分がアディポネクチンである。Ｈ．Ｆと同一切片のヘマトキシリン・エオジン染色像。
【図２】実施例1の心筋梗塞急性期に対する脂肪細胞シート移植処置後４週における心機能に及ぼす影響に関する検討を行った結果を示す図である。Ａ．左室収縮末期断面積（ＬＶＥＳＡ）。ＡＳ移植により左室拡大の抑制傾向を認めた。Ｂ．左室拡張末期断面積（ＬＶＥＤＡ）。ＡＳ移植により左室拡大の抑制傾向を認めた。Ｃ．左室断面積変化率（ＦＡＣ）。ＡＳ移植により有意な左室収縮能の増悪抑制を認めた。Ｄ．左室最大陽性ｄＰ／ｄｔ（ｄＰ／ｄｔｍａｘ）。ＡＳ移植により有意な収縮力増悪抑制を認めた。Ｅ．左室収縮期末エラスタンス（Ｅｅｓ）。ＡＳ移植により有意な収縮力増悪抑制を認めた。Ｆ．左室最大陰性ｄＰ／ｄｔ（ｄＰ／ｄｔｍｉｎ）。ＡＳ移植により有意な拡張力増悪抑制を認めた。Ｇ．左室等容弛緩時間（τ）。ＡＳ移植により拡張力増悪抑制傾向を認めた。
【図３】実施例1の心筋梗塞急性期に対する脂肪細胞シート移植処置後４週における心筋組織に及ぼす影響に関する検討を行った結果を示す図である。Ａ．Ｃ群のマクロ像。Ｂ．Ａ群のマクロ像。C群と比して左室前壁菲薄化の抑制を認めた。Ｃ．Ｃ群およびＡ群の左室前壁厚を定量した。ＡＳ移植により有意な左室菲薄化抑制を認めた。Ｄ．Ｃ群における梗塞―正常部境界領域の強拡大像。Ｅ．Ａ群における梗塞―正常部境界領域の強拡大像。Ｃ群と比して線維化の緩和を認めた。Ｆ．Ｃ群およびＡ群の梗塞―正常部境界領域における線維化率を測定した。ＡＳ移植により有意な線維化抑制を認めた。
【図４】実施例1の脂肪細胞シート移植処置後２日における心筋保護効果に関する検討を行った結果を示す図である。Ａ．Ｃ群のヘマトキシリン・エオジン染色マクロ像。Ｂ．Ａ群のヘマトキシリン・エオジン染色マクロ像。Ｃ群と比して梗塞範囲の縮小を認めた。Ｃ．Ｃ群およびA群における梗塞率（左室全周に対する梗塞部の距離割合）。ＡＳ移植により有意な梗塞範囲の縮小を認めた。Ｄ．Ｃ群の梗塞―正常部境界領域におけるＴＵＮＥＬ染色像。Ｅ．Ａ群の梗塞―正常部境界領域におけるＴＵＮＥＬ染色像。Ｃ群と比してＴＵＮＥＬ陽性細胞の減少を認めた。図中の色の薄い部分がＴＵＮＥＬ陽性細胞である。Ｆ．Ｃ群およびＡ群におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞数を定量した。脂肪細胞シート移植により有意なアポトーシス細胞数の減少を認めた。
【図５】実施例1の脂肪細胞シート移植による抗炎症効果に関する検討を行った結果を示す図である。Ａ．Ｃ群の梗塞―正常部境界領域におけるＣＤ１１ｂ免疫染色像。Ｂ．Ａ群の梗塞―正常部境界領域におけるＣＤ１１ｂ免疫染色像。Ｃ群と比してＣＤ１１ｂ陽性細胞の減少を認めた。図中の色の薄い部分がＣＤ１１ｂ陽性細胞である。Ｃ．Ｃ群およびＡ群におけるＣＤ１１ｂ陽性細胞数を定量した。ＡＳ移植により有意な浸潤マクロファージ数の減少を認めた。Ｄ．梗塞領域および梗塞―正常部境界領域におけるＴＮＦ−αの転写量を定量化した。ＡＳ移植によりＴｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ（ＴＮＦ−α）の転写の抑制を認めた。Ｅ．梗塞領域および梗塞―正常部境界領域におけるＭｏｎｏｃｙｔｅ  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＭＣＰ−１）の転写量を定量化した。ＡＳ移植によりＭＣＰ−１の転写の抑制を認めた。
【図６】実施例２の脂肪細胞シートの組織学的検討を行った結果を示す図である。Ａ．培養および分化誘導後の脂肪細胞。脂肪細胞へ分化していることを確認した。Ｂ．温度応答性培養皿を用いて脂肪細胞をシート状に回収した。脂肪細胞シートの直径は約７ｍｍ程度であった。Ｃ．脂肪細胞シートのヘマトキシリン・エオジン染色像。厚さは約１００μｍ程度であった。Ｄ．脂肪細胞シートのアディポネクチン免疫染色。野生型マウス由来（ＷＴ）脂肪細胞シート（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｓｈｅｅｔ）におけるアディポネクチンの発現を認めた（図中の色の薄い部分がアディポネクチンである。）。野生型（ＷＴ）脂肪前駆細胞シート（ＳＶＦ  ｃｅｌｌ  ｓｈｅｅｔ）、アディポネクチンノックアウトマウス（ＫＯ）由来脂肪細胞シートおよび脂肪前駆細胞シートにおいて、アディポネクチンの発現を認めなかった。Ｅ．細胞シート培養上清におけるアディポネクチン含量。野生型マウス由来脂肪細胞シート（ＷＴ−ＡＳ）の培養上清において、アディポネクチンを検出した。培養培地（ｍｅｄｉｕｍ）、野生型マウス由来脂肪前駆細胞シート（ＷＴ−ＳＶＦ  ｃｅｌｌ  ｓｈｅｅｔ）、アディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シート（ＫＯ−ＡＳ）の培養上清において、アディポネクチンは検出されなかった。
【図７】実施例２の心筋梗塞急性期に対する脂肪細胞シート移植処置後４週におけるにおける心機能に及ぼす影響に関する検討を行った結果を示す図である。Ａ．左室収縮末期断径（ＬＶＤｄ）。野生型マウス由来脂肪細胞シート移植群（Ｗ）において、アディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シート移植群（Ｋ）および無治療群（Ｃ）と比して左室拡大の抑制傾向を認めた。左室拡張末期径（ＬＶＤｓ）。Ｗ群において、Ｃ群と比して有意な左室拡大の抑制を認めた。また、Ｋ群と比して有意ではないものの、左室拡大抑制傾向を認めた。左室駆出率（ＥＦ）。Ｗ群において、Ｃ群と比して有意な左室駆出率の上昇を認めた。また、Ｋ群と比して有意ではないものの、左室駆出率上昇傾向を認めた。Ｂ．生命予後。Ｗ群において、Ｋ群およびＣ群と比して有意な平均余命の延長を認めた。
【図８】実施例２の心筋梗塞急性期に対する脂肪細胞シート移植処置後４週における心筋組織に及ぼす影響に関する検討を行った結果を示す図である。Ａ．Ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）染色の代表的な組織像。心筋梗塞遠隔部を顕鏡したところ、Ｃ群において、心筋細胞肥大を認めた。Ｋ群において、Ｃ群と同様の左室肥大を認めた。Ｗ群において、他の２群と比して、心筋細胞肥大が軽減されていた。図中の色の濃い部分が心筋細胞膜である。Ｂ．各実験群の心筋梗塞遠隔部における心筋細胞径を定量した。Ｗ群において、他の２群と比して有意な心筋細胞肥大抑制を認めた。Ｃ．マッソン・トリクロム染色の代表的な組織像。心筋梗塞と正常部境界領域を顕鏡したところ、Ｃ群において、適度な線維化を認めた。Ｋ群において、Ｃ群と同様の線維化を認めた。Ｗ群において、他の２群と比して、線維化が軽減されていた。Ｄ．各実験群の心筋梗塞と正常部の境界領域の線維化レベルを定量した。Ｗ群において、他の２群と比して有意な線維化抑制を認めた。
【図９】実施例２の脂肪細胞シート移植処置後２日における心筋保護効果に関する検討を行った結果を示す図である。Ａ．左室短軸切片の２，３，５−Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ）染色の代表的な組織像。Ｗ群において、他の２群と比して梗塞領域が少なかった。Ｂ．各実験群の左室全体の面積に対する梗塞領域の割合を定量した。Ｗ群は他の２群と比して有意な梗塞範囲の縮小を認めた。Ｃ．梗塞領域おけるＴｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ（ＴＮＦ−α）の転写量を定量化した。Ｗ群において、Ｃ群と比して有意なＴＮＦ−αの転写の抑制を認めた。Ｋ群はＣ群と有意な差を認めなかった。Ｄ．各実験群の心筋梗塞と正常部の境界領域におけるＣＤ１１ｂ陽性細胞数を定量した。Ｗ群およびＫ群において、Ｃ群と比して、ＣＤ１１ｂ陽性細胞の浸潤が軽減されていた。
【図１０】実施例２の脂肪細胞シートからのアディポネクチンの持続的産生能を示す図である。Ａ．野生型マウス由来脂肪細胞シートをアディポネクチンノックアウトマウスの左室に移植し、１時間後の組織をアディポネクチンで免疫染色した結果である。図中の色の薄い部分がアディポネクチンである。Ｂ．予め赤色の蛍光色素で標識した野生型マウス由来脂肪細胞シートを、アディポネクチンノックアウトマウスの左室に移植し、４週間後の組織をアディポネクチンで免疫染色した結果である。細胞シートは心臓表面に生着していた。脂肪細胞シートおよび脂肪細胞シートと接した心筋の周囲において、アディポネクチンの発現を認めた。図中左上の色の薄い領域が脂肪細胞シートであり、その下の色の薄い領域がアディポネクチンである。Ｃ．予め赤色の蛍光色素で標識したアディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シートをアディポネクチンノックアウトマウスの左室に移植し、４週間後の組織をアディポネクチンで免疫染色した結果である。細胞シートは心臓表面に生着していた。脂肪細胞シートおよび脂肪細胞シートと接した心筋の周囲において、アディポネクチンの発現を認めなかった。図中左上の色の薄い領域が脂肪細胞シートであり、その下の色の薄い領域がアディポネクチンである。Ｄ．Ａの連続切片をヘマトキシレン・エオジン染色したのもである。細胞シートはｖｉｔｒｏにおける形態と同様に細胞質に脂肪滴を蓄積した脂肪細胞から構成され、厚さはほぼ均一で１００μｍ程度であった。Ｅ．Ｂの連続切片をヘマトキシレン・エオジン染色したものである。細胞シートは移植後１時間の場合と比して肥厚し、約６００μｍ程度であった。細胞シートには細胞質に油滴を蓄積した脂肪細胞の他、結合組織や肉芽が混在していた。Ｆ．Ｃの連続切片をヘマトキシレン・エオジン染色したものである。アディポネクチンノックアウトマウス由来細胞シートは移植後４週の野生型マウス由来脂肪細胞シートと同様の形態で、厚さ６００μｍ程度、細胞シートには細胞質に油滴を蓄積した脂肪細胞の他、結合組織や肉芽が混在していた。Ｇ．脂肪細胞シート移植による血中アディポネクチン濃度に対する影響を示す。野生型マウス由来およびアディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シートをアディポネクチンノックアウトマウスの左室全壁に移植し、４週間後、血漿のアディポネクチン含量を測定した。アディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シート移植群（Ｋ）において、アディポネクチンは検出限界以下であったのに対し、野生型マウス由来脂肪細胞シート移植群（Ｗ）は０．３７±０．０９８ｎｇ／ｍｌのアディポネクチンが検出された。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
アディポネクチンは脂肪組織により分泌されるサイトカインで、生活習慣病の制御に寄与している他、抗アポトーシス、抗線維化、血管新生促進、心筋肥大抑制、細胞増殖促進といった効果を有する。アディポネクチンは心不全や動脈硬化といった循環器疾患においても有益に作用する。左室心筋梗塞に対する脂肪細胞移植においても、傷害部位局所においてアディポネクチンが分泌されることにより、早期に、傷害程度が軽減し、炎症反応が緩和される。また、移植後中・長期において、患部に生着した脂肪細胞はアディポネクチンを分泌し続けることで、左室前壁の菲薄化および梗塞部周縁の線維化といったリモデリングを抑制することで機能的回復を助長する。本発明では生体由来の材料である脂肪細胞を用いてＤＤＳを構築した。本発明によれば生体適合性に関する懸念がなく、また、移植材料自体が傷害部位で生着するため、活性の高いアディポネクチンが長期にわたり局所で供給されることが予想される。また、既存の心不全治療の為の細胞シートは骨格筋筋芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞といった組織幹細胞を用いて作製されているが、脂肪細胞はこれらと比して採取が容易かつ低侵襲で大量調整が可能であることから、より広い患者に適応可能であると考えている。
【００１７】
本発明は、心臓疾患に適用するために細胞培養支持体から単離された、少なくとも脂肪細胞を含む、細胞シート及びその三次元構造体であり、この脂肪細胞を含む細胞シート及びその三次元構造体が心筋梗塞後の心不全治療に極めて有用であることが判明したことにより完成したものである。本発明における脂肪細胞とは脂肪細胞として分化したものを指し、その種類は全く限定されないが、その細胞が例えば成熟脂肪細胞であっても良い。また、本発明における脂肪細胞の由来は何ら限定されるものではないが、脂肪組織、皮下脂肪組織、心外膜由来脂肪組織などが挙げられる。それらの組織から脂肪細胞を得る方法としては特に限定されるものではないが採取が容易な簡便な脂肪組織から脂肪細胞そのものを採取する方法、或いは脂肪組織から得られる脂肪細胞、脂肪幹細胞、線維芽細胞等を採取し常法に従って分化誘導させる方法等が挙げられる。その脂肪組織からの脂肪細胞の分離方法は、特に限定されるものではないが、例えば、天井培養法、新鮮な脂肪組織をそのまま使用する方法などが挙げられる。本発明における脂肪細胞には、未分化の状態を保ったまま増殖した間葉系幹細胞に加え、間葉系幹細胞が分化した線維芽細胞、間質細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、平滑筋細胞、ＳＰ細胞および心筋細胞などの他の細胞や、間葉系幹細胞を採取する際に混入した間質細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、平滑筋細胞、ＳＰ細胞及び心筋細胞等の細胞が含まれていても良い。本発明の細胞シートは、脂肪細胞を５０％、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上含むものであれば好ましい。本発明の細胞シートを含む心臓疾患治療用移植材料は、細胞シートの少なくとも一層が脂肪細胞を５０％、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上含むものであれば好ましい。また、本発明の細胞シートを含む心臓疾患治療用移植材料は、全ての細胞シートに含まれる細胞のうち脂肪細胞が５０％、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上含まれていれば好ましい。さらに、本発明の細胞シートを含む心臓疾患治療用移植材料は、細胞シートの全てが脂肪細胞を５０％、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上含むものであれば好ましい。
【００１８】
本発明では、上記脂肪細胞に加え、筋芽細胞、間葉系幹細胞、もしくはその両方を併用しても良い。特に、筋芽細胞とはその種類、採取する組織の由来は特に限定されるものではないが、例えば骨格筋組織の骨格筋芽細胞が生体内に豊富に存在に比較的容易な操作で採取できる点で好ましい。また、その骨格筋芽細胞は、従来技術において心臓に対する移植可能性が示されたことから、実際の医療に使用できるものである。本発明においては、その筋芽細胞を採取する際、未分化の状態を保ったまま増殖した間葉系幹細胞に加え、線維芽細胞、間質細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、及び平滑筋細胞等の他の細胞や、間葉系幹細胞を採取する際に混入した間質細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、平滑筋細胞、ＳＰ細胞及び心筋細胞などの細胞が含まれていても良い。本発明においては間葉性幹細胞においては、その由来は何ら限定されるものではないが、採取が容易な簡便な骨髄または脂肪組織が好ましい。細胞源としては、自己成長する性質を有し、かつ心筋細胞および血管内皮細胞に分化しうる体性幹細胞が望ましいが特に限定されるものではない。また、間葉系幹細胞は、従来技術において心臓に対する移植可能性が示されたことから、実際の医療に使用できるものである。さらに、移植の際の組織適合性および感染のリスクの観点から、患者の自己体性幹細胞が特に望ましいがこれについても特に限定されるものではない。間葉系幹細胞とは、未分化の状態を保ったまま増殖した間葉系幹細胞に加え、間葉系幹細胞が分化した線維芽細胞、間質細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、平滑筋細胞、ＳＰ細胞および心筋細胞などの他の細胞や、間葉系幹細胞を採取する際に混入した間質細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、平滑筋細胞、ＳＰ細胞及び心筋細胞等の細胞が含まれていても良い。また、これらの細胞の併用する方法については特に限定されるものではないが、同一培養面上で共培養する方法、セルインサートのような多孔膜の培養面を介して異種の細胞を培養する方法、さらには後述するように異種の細胞シートを積層化する方法、或いはこれら方法の組み合わせた方法等が挙げられる。
【００１９】
本発明は、脂肪細胞が産生するアディポネクチンが近傍の細胞に対して抗アポトーシス効果、増殖促進効果を示すという知見にも基づいている。近傍の細胞とは、傷害された組織の細胞だけではなく、脂肪細胞シートに混在している他の細胞に対しても作用を及ぼすと考えられる。本発明は、少なくとも脂肪細胞が必要であるが、その他の細胞として、例えば筋芽細胞と間葉系幹細胞の中に混在していても良く、何ら限定されるものではない。
【００２０】
本発明では、脂肪細胞を培養する必要がある。その際に使用する培地は脂肪細胞が培養できる一般的な培地でよく特に限定されるものではない。具体的には、培地中に１０〜１５％の自己血清または牛胎児血清（ＦＢＳ）、２００μＭのアスコルビン酸、０．５〜２．０μＭのインスリン、及び抗生物質を補充したα−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２培地、或いはこれらの混合物を用いることができる。必要に応じて線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）やアドレノメデユリンなどの成長因子を加えることがある。培養は、哺乳動物の細胞の培養に適する任意の条件で実施することができるが、一般的には３７℃、５％ ＣＯ２で数日間培養し、必要に応じて培地を交換する。
【００２１】
本発明とは、かくして培養された脂肪細胞を含めた細胞をシート状に回収し、心筋組織の再生に利用しようとするものである。その培養した細胞をシート状に回収する方法は特に限定されないが、例えば後述するような温度応答性細胞培養器材上で培養する方法、希薄なタンパク質分解酵素水溶液を使用する方法、特殊なタンパク質分解酵素水溶液を使用する方法、ＥＤＴＡ水溶液だけを使って剥離する方法、さらにはスクレーパー等を使い物理的に剥離する方法等が挙げられる。本発明においては、かくして得られた細胞シートを重ね合わせ、積層化させることで三次元構造体としても良い。その際、各細胞シートに筋芽細胞と間葉系幹細胞が混在されたものでも良く、各細胞シートが筋芽細胞と間葉系幹細胞のそれぞれの細胞からなり重ね合わせることで共培養する形となっていても良く、その状態は何ら限定されるものではない。また、本発明においては、細胞シートが積層化される際の細胞シートの収縮程度は特に限定さるものではなく、その他の積層化条件も何ら制約されるものではない。その積層化枚数は特に限定されるものではないが、積層回数は１０回以下が良く、好ましくは８回以下、さらに好ましくは４回以下が良い。細胞シートを積層化するとシート単面積当たりの細胞密度が向上し、細胞シートとしての機能も向上し好ましい。さらに、その三次元構造体を作製する際、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン等の1種以上からなるゲルやマトリゲル等のその他のスキャフォルドを用いても良く、本発明においては何ら制約されるものではないが、これらのものは移植後、生体内でさまざまな影響を与え、好ましくは使用しない方が良い。
【００２２】
本発明で培養器材表面から剥離された脂肪細胞シート及びその三次元構造体の厚さは５０μｍ以上となる。このとき脂肪細胞シート及びその三次元構造体の厚さは５０μｍ以上が良く、好ましくは７０μｍ以上が良く、さらに好ましくは８０μｍ以上が良く、最も好ましいものは１００μｍ以上が良い。脂肪細胞シート及びその三次元構造体の厚さが５０μｍ以下であると細胞シートの取り扱いが悪くなり、本発明として好ましくない。
【００２３】
本発明である脂肪細胞シート及びその三次元構造体からのアディポネクチン分泌能は１日当たり３×１０−１４ｇ／ｃｅｌｌ以上である必要がある。本発明におけるアディポネクチン分泌能は、１日当たり９×１０−１４ｇ／ｃｅｌｌ以上が良く、好ましくは１．２×１０−１３ｇ／ｃｅｌｌ以上が良く、さらに好ましくは１．６×１０−１３ｇ／ｃｅｌｌ以上が良く、最も好ましくは２×１０−１３ｇ／ｃｅｌｌ以上が良い。アディポネクチン分泌能が１日当たり３×１０−１４ｇ／ｃｅｌｌ以下であると移植された細胞シートの心筋組織再生機能が十分でなく好ましくない。
【００２４】
本発明で用いられる細胞は、生体組織から直接採取した細胞、直接採取し培養系等で分化させた細胞、或いは細胞株が挙げられるがその種類は、何ら制約されるものではない。これらの細胞の由来は特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、或いはラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられるが、本発明の細胞シート及びその三次元構造体をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタ、チンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。本発明における細胞培養のための培地は培養される細胞に対し通常用いられるものを用いれば特に制約されるものではない。
【００２５】
本発明において、培養時に播種する細胞数は使用細胞の動物種によって異なるが、一般的に３０００〜２００００個／ｃｍ２が良く、好ましくは５０００〜１５０００個／ｃｍ２が良く、さらに好ましくは６０００〜１００００個／ｃｍ２が良い。播種濃度が３０００個／ｃｍ２以上の場合、脂肪細胞分化頻度が低く、得られる細胞シートのアディポネクチン分泌程度が悪化し、本発明を実施する点において好ましくない。播種後分化誘導までの培養期間は使用細胞の動物種によって異なるが、一般的に５〜１０日が良く、好ましくは７〜８日が良い。これより短いと脂肪細胞分化頻度が低く、得られる細胞シートのアディポネクチン分泌程度が悪化し、本発明を実施する点において好ましくない。本発明では、成熟脂肪細胞を培養する必要がある。その際に使用する培地は成熟脂肪細胞が培養できる一般的な培地でよく特に限定されるものではない。具体的には、１０〜１５％の自己血清または牛胎児血清（ＦＢＳ）、０．５〜２．０μＭのインスリン、０．１〜１．０μＭのデキサメタゾン、０．２〜２ｍＭのイソブチルメルキサンチンを補充したα-ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２培地、或いはこれらの混合物を用いることができる。好ましくは、５μＭのピオグリタゾン、２００μＭのアスコルビン酸、および抗生物質、必要に応じて線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）やアドレノメデユリンなどの成長因子を加えることがある。分化誘導時間は一般的に３６〜６０時間が良く、好ましくは４５〜５１時間が良い。これより短いと脂肪細胞分化頻度が低く、長いと死細胞が出現するため、本発明を実施する点において好ましくない。分化誘導後移植までの培養期間は一般に５〜１４日間が良く、好ましくは７〜１０日間が良い。これより短いと脂肪細胞の成熟程度が低く、アディポネクチン分泌量が少ないため、本発明を実施する点においては好ましくない。
【００２６】
かくして得られた細胞シート及びその三次元構造体は、良好な抗炎症効果、線維化抑制効果、血管新生効果、アトポーシス抑制を示すものであり、心筋組織の再生に好都合である。また、本発明で得られる細胞シート及びその三次元構造体からは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）も発現し、心筋組織の再生に有用である。しかもこれらの効果、並びにＨＧＦ、ＶＥＧＦの産生量は筋芽細胞、間葉系幹細胞が単独で存在する場合より顕著に増加していることが判明した。
【００２７】
本発明において、上述した細胞シート及びその三次元構造体は、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で培養すると容易に得られる。すなわち、上記細胞を０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養される。その温度とは通常、細胞を培養する温度である３７℃が好ましい。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。
【００２８】
本発明で用いられる、上述の各ポリマーの基材表面への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、１．１〜２．３μｇ／ｃｍ２の範囲が良く、好ましくは１．４〜１．９μｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは１．５〜１．８μｇ／ｃｍ２である。１．１μｇ／ｃｍ２より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．３μｇ／ｃｍ２以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。このような場合、温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆すれば、基材表面の温度応答性ポリマー被覆量は２．３μｇ／ｃｍ２以上であっても良く、その際の温度応答性ポリマーの被覆量は９．０μｇ／ｃｍ２以下が良く、好ましくは８．０μｇ／ｃｍ２以下が良く、７．０μｇ／ｃｍ２以下が好都合である。温度応答性ポリマーの被覆量が９．０μｇ／ｃｍ２以上であると温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆しても細胞が付着し難くなり好ましくない。そのような細胞接着性タンパク質の種類は何ら限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物が挙げられる。また、これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を基材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法がとられている。本発明は、温度応答性培養皿を利用したなるべく細胞シートそのものを利用しようとする技術である。従って、温度応答性ポリマー層上の細胞接着性タンパク質の被覆量が極度に多くなっては好ましくない。温度応答性ポリマーの被覆量、並びに細胞接着性タンパク質の被覆量の測定は常法に従えば良く、例えばＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲを用いて細胞付着部を直接測る方法、あらかじめラベル化したポリマーを同様な方法で固定化し細胞付着部に固定化されたラベル化ポリマー量より推測する方法などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。
【００２９】
本発明の方法において、培養した細胞シートを温度応答性基材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養基材の温度を培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。さらに、細胞培養時に細胞が細胞外マトリックスを十分に産生させる目的でアスコルビン酸またはその誘導体を培地中に加えても良い。
【００３０】
以上のことを温度応答性ポリマーとしてポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞、もしくは細胞シートも冷却するだけで剥離させられることになる。
【００３１】
被覆を施される基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外のポリマー化合物、セラミックス類など全て用いることができる。
【００３２】
本発明における培養基材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサート、ビーズ、ファイバーのような形態のもの、平膜状のもの、さらには多孔膜等が挙げられ、特に限定されるものではない。
【００３３】
本発明における細胞シート及びその三次元構造体は、培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けていないものである。そのため、基材から剥離された細胞シート及びその三次元構造体は接着性蛋白質を有し、細胞シート及びその三次元構造体をシート状に剥離させた際には細胞−細胞間のデスモソーム構造がある程度保持されたものとなる。このことにより、移植時において患部組織と良好に接着することができ、効率良い移植を実施することができるようになる。一般に蛋白質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞−細胞間のデスモソーム構造については１０〜４０％保持した状態で剥離させることができることで知られているが、細胞−基材間の基底膜様蛋白質等を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞シートは強度の弱いものとなる。これに対して、本発明の細胞シート及びその三次元構造体は、デスモソーム構造、基底膜様蛋白質共に６０％以上残存された状態のものであり、上述したような種々の効果を得ることができるものである。
【００３４】
本発明における三次元構造体を作製する方法についても特に限定されるものではないが、例えば、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させることで得られる。その際、培地の温度は、培養基材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。また、積層化する細胞シートの細胞種についても特に限定されるものではないが、脂肪細胞シート同士を重ね合わせていく積層化方法、脂肪細胞シートと筋芽細胞シートを重ね合わせていく積層化方法、脂肪細胞と筋芽細胞とを共培養させた細胞シートを重ね合わせていく積層化方法、もしくはこれらの積層化方法の組み合わせた積層化方法等が挙げられる。ここで、積層化する細胞が異種の場合、その積層化される順番については特に限定されるものでない。使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。また、使用される培養細胞移動治具は剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば特に限定されるわけではなく、例えば多孔膜や紙、ゴム等の膜類や板類、スポンジ類等が挙げられ、積層化作業を行い易くするために柄の付いた治具に多孔膜や紙、ゴム等の膜類や板類、スポンジ類等を取り付けたものを利用しても良い。
【００３５】
本発明においては、温度応答性細胞培養基材から剥離させた細胞シート及びその三次元構造体を密着させるためにキャリアを用いても良い。本発明の細胞シート及びその三次元構造体の形態を保持するものとしては、例えば高分子膜または高分子膜から成型された構造物、金属性治具などを使用することができる。例えば、キャリアの材質として高分子を使用する場合、その具体的な材質としてはポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリプロピレン、ポリエチレン、セルロース及びその誘導体、紙類、キチン、キトサン、コラーゲン、ウレタン、ゼラチン等を挙げることができる。キャリアの形状は、特に限定されるものではない。
【００３６】
本発明で得られた細胞シート及びその三次元構造体を生体内の所定部位に移植することができる。その移植部位は心筋組織のいずれの場所でも良く特に限定されないが、その他の方法として、特に大網は血管が豊富に存在し、かつ移植行為が容易な点で好ましい。そして、体網に移植した細胞シート及びその三次元構造体を、血管をつなげたまま心筋組織へ移植することでも良い。その移植部位はあらかじめ血管誘導を施されていても、施されていなくても良く、特に限定されるものではない。ここで、血管誘導を施す方法も特に限定されるものではないが、例えば、血管増殖因子であるＦＧＦをミクロスフィアに包埋し、このミクロスフィアの組成、大きさ、注入範囲を変えながら生体に８〜１０日間作用させる方法、ポリエチレンテレフタレートメッシュを任意の大きさに切り、袋状のものを作製し、そのバッグの内側に、高濃度アガロース溶液に溶解させたＦＧＦを入れ、８〜１０日間後、そのバッグを除去することにより、血管誘導された空間を作製する方法などが挙げられる。
【００３７】
ヒトに対し、本発明で示すところの本発明の細胞シート及びその三次元構造体を利用すれば、移植された細胞シート及びその三次元構造体はヒトの生体内で機能を長期間発現することとなる。そして、剥離された細胞シート及びその三次元構造体の大きさや形状、もしくは両者で機能の発現量を制御できる。このような細胞シート及びその三次元構造体は、例えば心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴う各疾患の治療を目的に使用されるが、特に限定されるものではない。
【００３８】
動物に対し、本発明で示すところの細胞シート及びその三次元構造体が移植されれば、医薬品評価用動物となる。そして、剥離された細胞シート及びその三次元構造体の大きさや形状で機能の発現量を制御できる。ここで使用される動物はラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ブタ、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられるが特に限定されるものではない。このような移植動物は、例えば、被検物質をこの動物に投与し、当該被検物質の心機能への影響を判定する心機能評価システム等を目的に使用されるが、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００４０】
本実施例において、動物の取り扱いは、大阪大学において規定される基準を遵守し、動物愛護精神に則って実験を行った。
【実施例１】
【００４１】
（脂肪由来線維芽細胞の調整）
３週令雄性ＬＥＷ／Ｓｅａラットの両鼡径部から皮下脂肪組織を採取した。脂肪組織を鋏で細かく刻み、０．１％のタイプIIコラゲナーゼ溶液中に懸濁し、３７度温浴槽で１時間震盪した。２５０μｍのメッシュフィルターで濾過し、毎分１８００回転５分間遠心分離した。沈渣を培養培地（１０％ウシ胎児血清、２００μＭアスコルビン酸、および抗生物質含有Ｄ−ＭＥＭ）に懸濁し、２５μｍのメッシュフィルターで濾過し、毎分１８００回転５分間遠心分離した。沈渣を培養培地で懸濁し、これを培養皿に移して５％二酸化炭素、３７度の湿潤環境で培養した。培養開始後２４時間で培養皿に接着したものを脂肪由来線維芽細胞（Ｓｔｒｏｍａｌ−Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ：  ＳＶＦ  ｃｅｌｌ）とした。【００４２】
（脂肪細胞分化誘導および脂肪細胞シートの調整）
培養開始後３日で細胞をトリプシン処理により細胞浮遊液とし、直径３５ｍｍの温度応答性培養皿に密度７０００個／ｃｍ２になるように播種した。培養開始１０日後、温度応答性培養皿上でコンフルエントとなった脂肪由来線維芽細胞に、分化誘導培地（１０％ウシ胎児血清、２００μＭアスコルビン酸、０．８７μＭインスリン、０．２５μＭデキサメタゾン、５００μＭイソブチルメチルキサンチン、５μＭピオグリタゾン、抗生物質含有Ｄ−ＭＥＭ）を４８時間添加し、脂肪細胞へ分化誘導を行った。分化誘導終了後はメンテナンス培地（１０％ウシ胎児血清、２００μＭアスコルビン酸、０．８７μＭインスリン、抗生物質含有Ｄ−ＭＥＭ）で培養し、細胞質内に油滴が蓄積され、脂肪細胞に分化したことを確認した。培養開始１９〜２５日後、温度応答性培養皿を２０度で培養した。４０分以内に脂肪細胞は自然にはがれ、脂肪細胞シートとして培養液中に浮遊した。【００４３】
（脂肪細胞シートにおけるアディポネクチンの分泌）
脂肪細胞シートを２４時間培養した培養培地を採取し、酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により培養液中のアディポネクチンを測定した。【００４４】
（脂肪細胞シートの組織学的検討）
脂肪細胞シートの凍結切片を作製し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、オイルレッドO染色およびアディポネクチン免疫染色を施行した。【００４５】
（心不全モデルおよび脂肪細胞シート移植）
８週令雌性ＬＥＷ／Ｓｅａラットを用いた。心筋梗塞モデルは左冠動脈前下降枝結紮術により作製した。イソフルランの吸入麻酔人工呼吸下（１．５％イソフルラン、換気量４ｍｌ、１００サイクル／分）に全身麻酔をした後、左開胸を行い、心臓を露出した。左冠動脈起始部から２−３ｍｍの部位を８−０プロリン糸で結紮した。【００４６】
冠動脈結紮術１５分後、脂肪細胞シートをＰＢＳで穏やかに洗浄し、先曲ピンセット上に載せて左室前壁の梗塞部位に滑らせ、静置した。移植２０分後に閉胸した。無治療群に対しては、移植操作なしで同様の処置を行った。【００４７】
（動物実験プロトコル）
冠動脈結紮術１５分後、ラットを２群に分けて以下の処置を行った。すなわち、脂肪細胞シート２枚を左室前壁に移植した群（Ａ群；ｎ＝１５）、および移植を行わない未治療の群（Ｃ群；ｎ＝１５）である。手術後３日に組織学的評価、分子学的評価を行った。手術後４週間後に心臓超音波検査、心臓カテーテル検査、および組織学的評価を行った。【００４８】
（心臓超音波検査）
イソフルランの吸入麻酔により抑制状態を得たのち、収縮末期血圧および心拍数のモニタリング下で、１４ＭＨｚトランスデューサーを備えた心臓超音波システムを用いて、乳頭筋レベルの左室短軸像を得た。左室の拡張末期断面積（ＬＶＥＤＡ）および収縮末期断面積（ＬＶＥＳＡ）を測定した。測定は３回以上繰り返し、平均値を求めた。左室断面積変化率（ＦＡＣ）は以下の式から算出した。
ＦＡＣ（％）＝（ＬＶＥＤＡ―ＬＶＥＳＡ）／ＬＶＥＤＡ×１００【００４９】
（心臓カテーテル検査）
イソフルランの吸入麻酔人工呼吸下（１．５％イソフルラン、換気量４ｍｌ、１００サイクル／分）に全身麻酔をした後、正中開胸を行い、心臓を露出した。下大静脈に１−０絹糸をかけた。左室心尖部からコンダクタンスカテーテル、左室前壁から圧カテーテルをそれぞれ左室内腔に挿入した。ＰＶ−ｌｏｏｐを描出した後、下大静脈を絞って負荷をかけた。データはＩｎｔｅｇｒａｌ３ソフトウェア（ユニークメディカル）を用いて解析した。【００５０】
（組織学的評価）
手術後３日および２８日において、カリウム投与により心臓を拡張期で停止させた後摘出した。左室を短軸方向にスライスしてコンパウンドに包埋後、液体窒素中で凍結し、組織切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色、マッソン・トリクロム染色、オイルレッドO染色、アディポネクチン免疫染色、ＣＤ１１ｂ免疫染色、ＴＵＮＥＬ染色を施行した。線維化率をマッソン・トリクロム染色像の画像解析により求めた。梗塞サイズはヘマトキシリン・エオジン染色のマクロ像の画像解析により求めた。ＣＤ１１ｂおよびＴＵＮＥＬ染色は、１視野あたりの陽性細胞数を計測し、検体あたり５視野の平均値を算出した。【００５１】
（分子生物学的検討）
手術後３日において、摘出した心臓サンプルを梗塞部（ｓｃａｒ）、梗塞と正常の境界部（ｂｏｒｄｅｒ）、非梗塞部（ｎｏｒｍａｌ）に分けて、それぞれＲＮＡ抽出をした。ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。定量ＰＣＲ法により腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）および単球走化活性因子（ＭＣＰ−１）転写量を定量し、内在性コントロールであるリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）転写量で除算した値を、各検体のｎｏｒｍａｌの値との比であらわした。【００５２】
（統計学的分析）
データは平均値±標準誤差であらわした。群間の比較はｔ検定にて行い、Ｐ値が０．０５未満を有意差ありとした。生存率解析は、カプラン・マイヤー法により生存率を算出し、各実験群について、ログランク検定で有意差を求めた。【００５３】
（脂肪細胞シート作製）
ラット脂肪由来線維芽細胞に対して脂肪細胞へ分化誘導をしたところ、分化誘導後７日でオイルレッドＯ陽性の脂肪細胞が多数出現した（図１．Ａ）。直径３５ｍｍの温度応答性培養皿で培養した脂肪細胞は、２０℃でインキュベートすることにより１０ｍｍ程度のシート状に回収された（図１．Ｂ）。１枚のシートを構成する細胞数は２×１０６個程度であった。脂肪細胞シートは１００μｍ程度の厚さで、オイルレッドＯ陽性脂肪細胞を多数含み、細胞質にアディポネクチンの発現を認めた（図１．Ｃ，Ｄ）。脂肪細胞シートを２４時間培養した培養液に、０．９８±０．２０μｇ／ｍｌのアディポネクチン分泌を認めた。一方、細胞培養液自体や分化誘導処理をしていない脂肪由来線維芽細胞シートの培養液においてアディポネクチンは検出限界以下の濃度であった。【００５４】
（心筋梗塞部における脂肪細胞シートの生着）
心筋梗塞急性期に左室前壁に移植された脂肪細胞シートは、移植後２８日の左室前壁瘢痕領域に良好に生着していた（図１．Ｅ）。脂肪細胞シートは移植部位でもオイルレッドＯ陽性、アディポネクチン陽性であった（図１．Ｆ−Ｈ）。【００５５】
（脂肪細胞シートが心機能に及ぼす影響）
心筋梗塞急性期に対するシート移植後２８日の心機能評価を図２．Ａ−Ｇに示す。心臓超音波検査より、Ａ群におけるＬＶＥＤＡおよびＬＶＥＳＡの値がＣ群と比して小さかったことから、左室拡大が抑制されていると考えられる（図２．Ａ，Ｂ）。またＦＡＣはＣ群と比して有意に大きく、シート移植により心機能の増悪が抑制されていると考えられる（図２．Ｃ）。心臓カテーテル検査においても、収縮能の指標である左室最大陽性ｄＰ／ｄｔ（ｄＰ／ｄｔｍａｘ）および左室収縮期末エラスタンス（Ｅｅｓ）の上昇、拡張能  の指標である左室最大陰性ｄＰ／ｄｔ（ｄＰ／ｄｔｍｉｎ）および左室等容弛緩時間（τ）の低下を認めたことから、脂肪細胞シート移植が心筋梗塞急性期において治療効果を有することが示唆された。【００５６】
（脂肪細胞シートが心筋組織に及ぼす影響）
心筋梗塞急性期に対するシート移植２８日後、組織学的解析を施行した。無治療であるＣ群は強度の左室前壁菲薄化を認めたが、Ａ群はＣ群と比して左室前壁が厚く、左室前壁組織が維持されていることが示唆された（図３．Ａ−Ｃ）。さらにマッソン・トリクロム染色により、梗塞部周縁の線維化を評価したところ、Ａ群はＣ群と比して有意に線維化が抑制されていた（図３．Ｄ−Ｆ）。【００５７】
（脂肪細胞シートの心筋保護効果）
心筋梗塞急性期に対する脂肪細胞シート移植３日後、組織学的解析を施行した。梗塞サイズを定量したところ、Ａ群における梗塞サイズはＣ群と比して有意に小さかった（図４．Ａ−Ｃ）。さらに心筋梗塞部周縁におけるアポトーシス細胞をＴＵＮＮＥＬ染色により検出したところ、Ａ群におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞数はＣ群と比して有意に少なかった（図４．Ｄ−Ｆ）。以上より、脂肪細胞シート移植によりアポトーシスの抑制を介して梗塞サイズが限局されている可能性が示唆された。【００５８】
（脂肪細胞シートの抗炎症効果）
脂肪細胞シート移植後３日の心筋組織における抗炎症効果に関する検討を図５に示す。心筋梗塞周縁における炎症細胞の浸潤を炎症細胞マーカーであるＣＤ１１ｂの免疫染色により評価した。Ａ群における梗塞部周縁のＣＤ１１ｂ陽性細胞はＣ群と比して有意に少なかった（図５．Ａ−Ｃ）。さらに、梗塞部および梗塞部周縁の炎症性サイトカイン転写程度を評価したところ、Ａ群はＣ群と比して梗塞部、梗塞部周縁ともに、ＴＮＦ−αおよびＭＣＰ−１の転写量が有意に低かった（図５．Ｄ，Ｅ）。以上より、脂肪細胞シート移植により、心筋梗塞後の炎症細胞の浸潤を含む炎症反応が緩和されている可能性が示唆された。
【実施例２】
【００５９】
（脂肪由来線維芽細胞の調整）
２０週令雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（野生型マウス）およびアディポネクチンノックアウト遺伝子改変マウスの両鼡径部から皮下脂肪組織を採取した。脂肪組織を鋏で細かく刻み、０．１％のタイプIIコラゲナーゼ溶液中に懸濁し、３７度温浴槽で１時間震盪した。１００μｍのメッシュフィルターで濾過し、毎分１８００回転５分間遠心分離した。沈渣を培養培地（１０％ウシ胎児血清、２００μＭアスコルビン酸、および抗生物質含有Ｄ−ＭＥＭ）に懸濁し、７０μｍのメッシュフィルターで濾過し、毎分１８００回転５分間遠心分離した。沈渣を培養培地で懸濁し、これを培養皿に移して５％二酸化炭素、３７度の湿潤環境で培養した。培養開始後２４時間で培養皿に接着したものを脂肪由来線維芽細胞（Ｓｔｒｏｍａｌ−Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ：  ＳＶＦ  ｃｅｌｌ）とした。【００６０】
（脂肪細胞分化誘導および脂肪細胞シートの調整）
培養開始後３日で細胞をトリプシン処理により細胞浮遊液とし、２４穴（直径１５．５ｍｍ）の温度応答性培養皿に密度７０００個／ｃｍ２になるように播種した。培養開始１０日後、温度応答性培養皿上でコンフルエントとなった脂肪由来線維芽細胞に、分化誘導培地（１０％ウシ胎児血清、２００μＭアスコルビン酸、０．８７μＭインスリン、０．２５μＭデキサメタゾン、５００μＭイソブチルメチルキサンチン、５μＭピオグリタゾン、抗生物質含有Ｄ−ＭＥＭ）を４８時間添加し、脂肪細胞へ分化誘導を行った。分化誘導終了後はメンテナンス培地（１０％ウシ胎児血清、２００μＭアスコルビン酸、０．８７μＭインスリン、抗生物質含有Ｄ−ＭＥＭ）で培養し、細胞質内に油滴が蓄積され、脂肪細胞に分化したことを確認した。培養開始１９〜２５日後、温度応答性培養皿を２０度で培養した。４０分以内に脂肪細胞は自然にはがれ、脂肪細胞シートとして培養液中に浮遊した。【００６１】
（脂肪細胞シートにおけるアディポネクチンの分泌）
脂肪細胞シートを２４時間培養した培養培地を採取し、酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により培養液中のアディポネクチンを測定した。【００６２】
（脂肪細胞シートの組織学的検討）
脂肪細胞シートの凍結切片を作製し、４％パラホルムアルデヒドで固定後、ヘマトキシリン・エオジン染色およびアディポネクチン免疫染色を施行した。【００６３】
（心不全モデルおよび脂肪細胞シート移植）
雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（野生型マウス）およびアディポネクチンノックアウト遺伝子改変マウスを用いた。心筋梗塞モデルは左冠動脈前下降枝結紮術により作製した。イソフルランの吸入麻酔人工呼吸下（１．０％イソフルラン、換気量１ｍｌ、１００サイクル／分）に全身麻酔をした後、左開胸を行い、心臓を露出した。左冠動脈起始部から約１ｍｍの部位を８−０プロリン糸で結紮した。【００６４】
冠動脈結紮術１５分後、脂肪細胞シートをＰＢＳで穏やかに洗浄し、先曲ピンセット上に載せて左室前壁の梗塞部位に滑らせ、静置した。移植２０分後に閉胸した。無治療群に対しては、移植操作なしで同様の処置を行った。【００６５】
（動物実験プロトコル）
冠動脈結紮術１５分後、ラットを２群に分けて以下の処置を行った。すなわち、野生型マウス由来脂肪細胞シート２枚を左室前壁に移植した群（Ｗ群）、アディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シート２枚を左室前壁に移植した群（Ｋ群）、および移植を行わない未治療の群（Ｃ群）である。手術後２日に組織学的評価、分子学的評価を行った。手術後４週間後に心臓超音波検査および組織学的評価を行った。【００６６】
（心臓超音波検査）
イソフルランの吸入麻酔により抑制状態を得たのち、１４ＭＨｚトランスデューサーを備えた心臓超音波システムを用いて、乳頭筋レベルの左室短軸像を得た。左室の拡張末期径（ＬＶＤｄ）および収縮末期径（ＬＶＤｓ）を測定した。測定は３回以上繰り返し、平均値を求めた。左室駆出率（ＥＦ）は以下の式から算出した。
ＥＦ（％）＝（ＬＶＤｄ３―ＬＶＤｓ３）／ＬＶＤｄ３×１００【００６７】
（組織学的評価）
手術後２日および２８日において、カリウム投与により心臓を拡張期で停止させた後摘出し、左室を短軸方向にスライスした。移植後２日の検体について、常法によりＴＴＣ染色を施行した。また、コンパウンドに包埋後、液体窒素中で凍結し、組織切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色、マッソン・トリクロム染色、ＰＡＳ染色、オイルレッドO染色、アディポネクチン免疫染色、ＣＤ１１ｂ免疫染色を施行した。線維化率はマッソン・トリクロム染色像の画像解析により求めた。心筋細胞径はＰＡＳ染色像の心筋細胞径を画像解析により計測した。梗塞範囲はＴＴＣ染色像の画像解析により求めた。ＣＤ１１ｂは１視野あたりの陽性細胞数を計測した。以上の定量評価について、検体あたり５視野の平均値を算出し、各群で平均値を求めた。【００６８】
（分子生物学的検討）
手術後２日において、摘出した心臓サンプルの梗塞部よりＲＮＡ抽出をした。ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。定量ＰＣＲ法により腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）転写量を定量し、内在性コントロールであるリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）転写量で除算した。【００６９】
（脂肪細胞シート作製）
ラット脂肪由来線維芽細胞に対して脂肪細胞へ分化誘導をしたところ、分化誘導後７日で細胞質に油滴を蓄積した脂肪細胞が多数出現した（図６．Ａ）。直径１５．５ｍｍの温度応答性培養皿で培養した脂肪細胞は、２０℃でインキュベートすることにより７ｍｍ程度のシート状に回収された（図６．Ｂ）。脂肪細胞シートは、主に細胞質に油滴を蓄積した脂肪細胞から成り、約１００μｍ程度の厚さであった（図６．Ｃ）。野生型マウス由来の脂肪細胞シートは細胞質にアディポネクチンの発現を認めた。分化誘導処理をしていない野生型マウス由来脂肪由来線維芽細胞シート、アディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シートおよび脂肪由来線維芽細胞シートにおいて、アディポネクチンの発現を認めなかった（図６．Ｄ）。脂肪細胞シートを２４時間培養した培養液においてアディポネクチン分泌を認めた。一方、細胞培養液自体や野生型マウス由来脂肪由来線維芽細胞シートやアディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シートの培養液においてアディポネクチンは検出限界以下の濃度であった。【００７０】
（脂肪細胞シート由来アディポネクチンが心機能に及ぼす影響）
心筋梗塞急性期に対するシート移植後２８日の心機能評価を図７．Ａ、Ｂに示す。心臓超音波検査より、Ｗ群におけるＬＶＤｓの値が、Ｃ群と比して有意に小さかったことから、左室拡大が抑制されていると考えられる。Ｋ群はＣ群と比して、ＬＶＤｄ、ＬＶＤｓともに縮小傾向にあるものの、有意な差ではなかった。また、ＥＦは、Ｗ群においてＣ群と比して有意に高く、Ｋ群はＣ群と比して有意な差はなかった。（図７．Ａ）このことから脂肪細胞シート移植により心機能の増悪が抑制されており、その機序において、脂肪細胞シート由来のアディポネクチンが重要であると考えられる。また、各群の生存率について評価したところ、Ｗ群はＣ群と比して有意に生存率が高かった（ｐ＝０．０４２８）。Ｗ群はＫ群と比して有意ではないものの生存率改善傾向を認めた（ｐ＝０．０６１４）。以上より、心筋梗塞において、脂肪細胞シート移植による外来アディポネクチンを介して予後が改善することが示唆された。【００７１】
（脂肪細胞シート由来アディポネクチンが心筋組織に及ぼす影響）
心筋梗塞急性期に対するシート移植２８日後、組織学的解析を施行した。Ｗ群はＫ群およびＣ群と比して心筋細胞径が小さく、心筋梗塞後の心筋肥大が抑制されていることが示唆された（図８．Ａ、Ｂ）。マッソン・トリクロム染色により、梗塞部周縁の線維化を評価したところ、Ｗ群はＫ群およびＣ群と比して有意に線維化が抑制されていた（図８．Ｃ、Ｄ）。【００７２】
（脂肪細胞シート由来アディポネクチンによる心筋保護効果）
心筋梗塞急性期に対する脂肪細胞シート移植２日後、組織学的解析を施行した。ＴＴＣ染色により梗塞サイズを定量したところ、Ｗ群における梗塞サイズはＫ群およびＣ群と比して有意に小さかった（図９．Ａ、Ｂ）。梗塞部における炎症性サイトカインＴＮＦ−α転写程度を評価したところ、Ｗ群はＫ群およびＣ群と比して転写量が有意に低かった（図９．Ｃ）。また、心筋梗塞周縁における炎症細胞の浸潤を炎症細胞マーカーであるＣＤ１１ｂの免疫染色により評価した。Ｗ群およびＫ群における梗塞部周縁のＣＤ１１ｂ陽性細胞はＣ群と比して有意に少なかった（図９．Ｄ）。以上より、脂肪細胞シート移植により、アディポネクチンを介して心筋梗塞後の細胞死が抑制され、炎症細胞の浸潤を含む炎症反応が緩和されている可能性が示唆された。【００７３】
（脂肪細胞シートによるアディポネクチンの持続的産生）
脂肪細胞シート由来アディポネクチンの持続産生および移植部位の心筋組織対する浸潤を評価するため、アディポネクチンノックアウトマウスをレシピエントとして脂肪細胞シート移植を施行した。野生型マウス由来脂肪細胞シートは移植後1か月間、心筋組織に生着し、アディポネクチンを分泌していた。脂肪細胞シートと接した心筋細胞のＥＣＭにおいてアディポネクチンの発現を認めたことから、脂肪細胞シート由来アディポネクチンは近傍の心筋細胞に浸透していることが示唆された（図１０．Ｂ）。このような近傍の心筋細胞におけるアディポネクチン陽性免疫染色像は、アディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シートでは認めなかったことから、図１０．Ｂの染色像が非特異的なものである可能性は除外される（図１０．Ｃ）。さらに、脂肪細胞シート移植後1か月の血漿から、脂肪細胞シート由来アディポネクチンが検出された。アディポネクチンノックアウトマウス由来脂肪細胞シート移植マウスの血漿からはアディポネクチンは検出限界以下であった（図１０．Ｇ）。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明に示される脂肪細胞シートを用いれば、顕著に低下した心機能を改善させられるようになる。そのような細胞シート及びその三次元構造体を利用することでさらなる治療効果を期待することができる。さらに、脂肪細胞シート移植により、血中アディポネクチン濃度を上昇させることが可能となり、生活習慣病をはじめとする様々な疾患に対する治療効果を期待することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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