(57)【要約】  本発明は、ABCトランスポーターを構成する蛋白質をコードする遺伝子群を含んでなる2つの遺伝子クラスターの少なくとも一方、好ましくは両方をゲノム中に有し、かつ該ABCトランスポーターにより細胞内に輸送される糖類から酢酸塩を生成する能力を有する腸内常在菌の生細胞を有効成分とする、腸管バリア機能改善剤を提供する。また、ゲノム中の該遺伝子クラスターの有無を指標とする、腸管バリア機能改善作用を有する微生物のスクリーニング方法も提供される。
2011027875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および／または（ｂ）の遺伝子クラスター：
（ａ）配列番号１、３、５および７に示される各ヌクレオチド配列からなる、ABCトランスポーターを構成する蛋白質をコードする遺伝子、または該遺伝子の各オルソログを含んでなる遺伝子クラスター
（ｂ）配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９に示される各ヌクレオチド配列からなる、ABCトランスポーターを構成する蛋白質をコードする遺伝子、または該遺伝子の各オルソログを含んでなる遺伝子クラスター
をゲノム中に有し、かつ該ABCトランスポーターにより細胞内に輸送される糖類から酢酸塩を生成する能力を有する、哺乳動物の腸内に常在し得る微生物の生細胞を有効成分とする、腸管バリア機能改善剤。
【請求項２】
前記微生物が、ビフィドバクテリウム (Bifidobacterium) 属またはラクトバチルス(Lactobacillus) 属に属する細菌である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
前記糖類がフルクトースである、請求項１または２記載の剤。
【請求項４】
フルクトースもしくはそれを構成糖とするオリゴ糖を組み合わせてなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
【請求項５】
機能性食品である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の剤。
【請求項６】
腸管バリア機能の低下が関与する疾患の予防および／または治療用である、、請求項１〜４のいずれか１項に記載の剤。
【請求項７】
前記疾患が病原性微生物、毒素もしくはアレルゲンの腸管バリア透過に起因するものである、請求項６記載の剤。
【請求項８】
以下の（１）および（２）の工程を含む、腸管バリア機能改善作用を有する微生物のスクリーニング方法。
（１）哺乳動物の腸内に常在し得る微生物を含有する被験試料において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に示される各ヌクレオチド配列からなる、ABCトランスポーターを構成する蛋白質をコードする遺伝子、または該遺伝子の各オルソログからなる群より選択される１以上の遺伝子、あるいはその発現産物を検出する工程
（２）該遺伝子またはその発現産物が検出された場合に、該被験試料は腸管バリア機能改善作用を有する微生物を含有すると判定する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝子クラスターを有する微生物を含有してなる腸管バリア機能改善剤、該バリア機能の低下が関与する疾患の予防および／または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物経由の人畜共通病原体である腸管出血性大腸菌 (EHEC) は、軽い下痢から出血性大腸炎や溶血性尿毒症症候群といった重篤な疾患まで広範にわたる病気を引き起こす。志賀毒素産生大腸菌 (STEC) O157:H7は、世界規模の公衆衛生問題を引き起こす重要なEHEC血清型である。【０００３】
ノトバイオートマウスは、O157の感染メカニズムを解析するのに適したモデル系であり、このモデル系を用いた研究により、O157によって産生される志賀毒素 (Stx) が感染死に決定的な因子であること、並びにビフィズス菌を含むある特定のプロバイオティクス株がこの感染死を予防することが報告されている (非特許文献１，２)。これらのプロバイオティクス株の多くはO157の増殖および／または毒素産生を阻害するらしいが、かかる予防効果の正確なメカニズムは未解明のままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Asahara, T. et al., Infect. Immun., 72, 2240-7 (2004)
【非特許文献２】Gagnon, M. et al., Int. J. Food Microbiol., 111, 26-33 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、O157感染死の予防に有効なプロバイオティクス株を提供するとともに、該予防効果のメカニズムを解明し、該メカニズムに基づく該プロバイオティクス株の他の医薬用途への利用や、該メカニズムを指標とした新規なプロバイオティクス株の探索手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、ノトバイオートマウスモデルと統合オミクス技術とを組み合わせて、O157感染死を予防し得るビフィズス菌株 (予防性株) と予防できないビフィズス菌株 (非予防性株) との間の遺伝子発現や代謝産物における差違を検討した。その結果、非予防性株が定着したマウス (O157感染死非予防マウス) では、予防性株が定着したマウス (O157感染死予防マウス) と比較して、結腸上皮における炎症と細胞のアポトーシス死が顕著に認められ、血中Stx2濃度が上昇していたことから、結腸上皮における炎症およびアポトーシスにより腸管バリア機能が低下して血中Stx2濃度が増加することがO157感染死の直接的な要因であることが示唆された。さらに、糞中代謝物の比較分析から、予防性株によるO157感染死の予防効果は、糖消費による酢酸塩濃度の上昇が抗炎症および／または抗アポトーシス作用を誘導することによって、腸管のバリア機能を改善し、Stx2の血中への吸収を阻止することに基づくことが示唆された。
そこで、本発明者らは、予防性株の糖消費・酢酸塩大量生成能のメカニズムを解明すべく、予防性株と非予防性株の全ゲノム配列を決定し、比較したところ、予防性株のゲノムに存在する2つの遺伝子座が非予防性株のゲノムでは完全に欠失しており、これらの遺伝子座は、フルクトース特異的な糖結合蛋白質を含む、ATP結合カセット (ABC) 型の糖トランスポーターの成分蛋白質をコードしていることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいて、予防性株は、糖、特にフルクトースの能動輸送システムを有することにより、それを有しない非予防性株よりも優れた糖消費および酢酸塩生成能を発揮し、その結果、O157により惹起される結腸上皮における炎症およびアポトーシスが抑制されて、腸管バリア機能の低下を阻止しているとの結論に達し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］以下の（ａ）および／または（ｂ）の遺伝子クラスター：
（ａ）配列番号１、３、５および７に示される各ヌクレオチド配列からなる、ABCトランスポーターを構成する蛋白質をコードする遺伝子、または該遺伝子の各オルソログを含んでなる遺伝子クラスター
（ｂ）配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９に示される各ヌクレオチド配列からなる、ABCトランスポーターを構成する蛋白質をコードする遺伝子、または該遺伝子の各オルソログを含んでなる遺伝子クラスター
をゲノム中に有し、かつ該ABCトランスポーターにより細胞内に輸送される糖類から酢酸塩を生成する能力を有する、哺乳動物の腸内に常在し得る微生物の生細胞を有効成分とする、腸管バリア機能改善剤。
［２］前記微生物が、ビフィドバクテリウム (Bifidobacterium) 属またはラクトバチルス(Lactobacillus) 属に属する細菌である、上記［１］記載の剤。
［３］前記糖類がフルクトースである、上記［１］または［２］記載の剤。
［４］フルクトースもしくはそれを構成糖とするオリゴ糖を組み合わせてなる、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の剤。
［５］機能性食品である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の剤。
［６］腸管バリア機能の低下が関与する疾患の予防および／または治療用である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の剤。
［７］前記疾患が病原性微生物、毒素もしくはアレルゲンの腸管バリア透過に起因するものである、上記［６］記載の剤。
［８］以下の（１）および（２）の工程を含む、腸管バリア機能改善作用を有する微生物のスクリーニング方法。
（１）哺乳動物の腸内に常在し得る微生物を含有する被験試料において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に示される各ヌクレオチド配列からなる、ABCトランスポーターを構成する蛋白質をコードする遺伝子、または該遺伝子の各オルソログからなる群より選択される１以上の遺伝子、あるいはその発現産物を検出する工程
（２）該遺伝子またはその発現産物が検出された場合に、該被験試料は腸管バリア機能改善作用を有する候補微生物を含有すると判定する工程
【発明の効果】
【０００８】
本発明の特定の遺伝子クラスターを有する腸内常在性微生物をプロバイオティクスとして摂取することにより、腸管、特に結腸における糖消費が亢進されて、酢酸塩濃度が上昇し、バリア機能低下の原因となる上皮細胞の炎症やアポトーシスが抑制され、O157を含む種々の病原性微生物および／またはそれらが産生する毒素、あるいはアレルゲン物質などのバリア透過を阻止することができる。また、微生物ゲノム中における該遺伝子クラスターの有無を指標として、腸管バリア機能改善に有効な微生物を探索することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１ａは、O157単独投与無菌 (GF) マウス(▲)、BL+O157定着マウス (◆) 及びBA+O157定着マウス (●) の生存率の推移を示す。図１ｂ−ｅは、O157単独投与GFマウス (O157; 以下同様)、BL+O157定着マウス (BL+O157; 以下同様) 及びBA+O157定着マウス (BA+O157; 以下同様) の腸管内における、O157の生菌数、Stx2濃度、ムチン及びIgA量、並びにpHを示す。図１ｆは、O157マウス、BL+O157マウス及びBA+O157マウスの血清中Stx2濃度を示す。**: P<0.01
【図２】図２は、マウス遠位結腸の免疫組織化学解析を示す。ａは、O157投与後5〜7日目のマウス遠位結腸のヘマトキシリン−エオシン (HE) 染色を示す。ｂは、O157投与後7日目のBL+O157マウス及びBA+O157マウスのマウス遠位結腸の免疫染色を示す。ｃは、O157投与後1日目のマウス遠位結腸のHE染色 (最上段のパネル) およびTUNEL染色 (その他のパネル) を示す。図中、スケールバーは100 μmを示す。
【図３】図３は、O157投与後1日目におけるマウス結腸上皮の遺伝子発現プロファイルを示す。ａは、トランスクリプトームデータにおける自己組織化マップ (SOM) 及び階層的クラスター解析 (HCA) を示す。ｂは、O157投与後1日目のトランスクリプトームデータにおける部分最少二乗判別分析 (PLS-DA) を示す。ｃは、O157投与後1日目における、主成分に寄与する遺伝子の定量的RT-PCR解析を示す。
【図４】図４は、Ingenuity Pathway解析から予測される、O157投与後1日目における遺伝子ネットワークを示す。
【図５】図５は、予防性及び非予防性ビフィズス菌単独定着マウスの糞便中代謝物プロファイルと結腸上皮の遺伝子発現プロファイルを示す。ａは、無菌マウス (n=5) へのビフィズス菌投与後7日目におけるマウス糞便のメタボロームデータにおける部分最少二乗判別分析 (PLS-DA) を示す。ｂは、HPLCにより測定したマウス糞便中の有機酸濃度を示す。*: p<0.05、**: p<0.01。ｃは、BL-単独定着マウス又はBA-単独定着マウス (n=3) における結腸上皮の遺伝子発現プロファイル (y軸) と糞便中の代謝物プロファイル (x軸) との間の共変動解析結果を示す。
【図６】図６は、1H-NMR及び1H、13C-NMR測定による、糖領域のシグナル強度を示す。
【図７】図７は、BL単独定着マウス結腸上皮とBA単独定着マウス結腸上皮との間の遺伝子発現プロファイルの比較を示す。
【図８】図８は、Caco-2細胞を用いたO157感染による細胞死の予防に寄与する酢酸の機能解析を示す。ａは、予防性ビフィズス菌定着マウスの結腸上皮で増加していた3つの遺伝子の定量的RT-PCR解析結果を示す。**: p<0.01。ｂは、O157感染16時間後の、Caco-2細胞の経上皮電気抵抗 (TER) を示す。ｃは、O157感染8時間後の、Caco-2細胞における死細胞の数を示す。
【図９】図９は、5つのビフィズス菌株におけるゲノムのプロファイリング及び代謝物プロファイリングを示す。ａは、配列決定されたビフィズス菌株における特異的ABC型糖トランスポーターの遺伝子を包含する領域を示す。遺伝子及びそれらの配向性を矢印で示す。灰色のバーは、オルソロガスな領域を示す。ｂは、インビトロで12時間インキュベーション後13C標識培地で培養したビフィズス菌株のメタボロームデータにおける部分最少二乗判別分析(PLS-DA) を示す。ｃは、4つのビフィズス菌株における、12時間培養後のフルクトース消費量及び酢酸生成量を示す。
【図１０】図１０ａは、BL及びBF単独定着マウスの腸管内における、予防性ビフィズス菌特異的なCOG遺伝子の発現を調べた定量的RT-PCR解析結果を示す。ｂは、4つのビフィズス菌株における、フルクトキナーゼの定量的RT-PCR解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明はプロバイオティクスを利用した腸管バリア機能改善剤を提供する。腸管上皮細胞は、食品中に含まれる各種栄養素を取り込むための吸収機能や、管腔側からの刺激を受容してその情報を基底膜側に伝達する情報伝達機能とともに、異物の透過を阻害するバリア機能を有する。上皮細胞同士を密接につなぎ合わせるタイトジャンクション (TJ) は低分子物質以外の物質の透過を物理的に阻害している。病原性微生物の感染などによる細胞死や炎症応答など、何らかの理由で腸管上皮細胞のバリア機能が低下すると、病原性微生物、毒素、アレルゲンなどの異物の侵入を招き、感染症、食中毒、食物アレルギーなどを引き起こす。
本発明において「腸管バリア機能改善」とは、腸管のバリア機能、即ち腸管上皮における物理的な物質透過阻害機能が低下した状態から、より正常に近い状態に戻すことだけでなく、外因性もしくは内因性の要因により腸管のバリア機能が低下するのを阻止または抑制する予防的な意味をも包含する。O157感染のように、バリア機能の低下による毒素の初期的侵入が致命的な症状を引き起こす場合が少なくないので、本発明の腸管バリア機能改善剤は、好ましくは予防的に使用され得る。
【００１１】
本発明のバリア機能改善剤の標的部位となる腸管は、バリア機能が低下しているかバリア機能の低下を予防する必要がある限り、特に制限はなく、例えば、小腸 (例、空腸、回腸)、大腸 (例、盲腸、結腸、直腸) が挙げられるが、例えば、病原性大腸菌、サルモネラ菌、ボツリヌス菌等の病原性微生物の多くは大腸 (例、結腸、盲腸) 内で増殖するので、これらの病原性微生物感染症の予防および／または治療を目的とする場合には、大腸 (例、結腸、盲腸) のバリア機能を改善するものであることが望ましい。
【００１２】
本発明の腸管バリア機能改善剤は、哺乳動物の腸内に常在し得る微生物（以下、「腸内常在菌」ともいう）の生細胞を有効成分とする。腸内常在性の微生物としては、例えば、細菌類、酵母などの真菌類などが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、乳酸菌と総称される乳酸発酵を行う細菌類（例、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、リューコノストック (Leuconostoc) 属、エンテロコッカス (Enterococcus) 属、ラクトコッカス (Lactococcus) 属、ペディオコッカス (Pediococcus) 属などに属する細菌等）、ストレプトコッカス (Streptococcus) 属に属する細菌、ユウバクテリウム(Eubacterium) 属に属する細菌、酵母 (例、ビール酵母等) など、より好ましくは、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、リューコノストック属に属する乳酸菌、特に好ましくはビフィドバクテリウム属に属する細菌が挙げられる。一方、ウエルシュ菌、クロストリジウム、ブドウ球菌、緑膿菌、ベイオネラ菌、大腸菌などの、腐敗物質や発がん性物質を生成するいわゆる悪玉菌は、本発明における使用に適さない。
ラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、酵母などは小腸上部から小腸下部、ビフィドバクテリウム属細菌、ユウバクテリウム属細菌などは小腸下部から大腸にかけて分布するので、バリア機能の改善が必要な腸管部位に応じて、使用する腸内常在菌を選択することもできる。
【００１３】
本発明の腸管バリア機能改善剤の有効成分である腸内常在菌は、以下の（ａ）および／または（ｂ）の遺伝子クラスター：
（ａ）配列番号１、３、５および７に示される各ヌクレオチド配列からなる、ABCトランスポーターを構成する蛋白質をコードする遺伝子、または該遺伝子の各オルソログを含んでなる遺伝子クラスター
（ｂ）配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９に示される各ヌクレオチド配列からなる、ABCトランスポーターを構成する蛋白質をコードする遺伝子、または該遺伝子の各オルソログを含んでなる遺伝子クラスターをゲノム中に有することを特徴とする。
配列番号１、３、５および７に示される各ヌクレオチド配列は、NCBIデータベースに登録されるビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム (Bifidobacterium longum subsp. longum) NCC2705 (以下、「BN」と略記する場合がある) 株のゲノム配列 (NC_004307.2) 中、それぞれBL0033 (41952〜42935位)、BL0034 (43076〜44617位)、BL0035 (44619〜45689位) およびBL0036 (45686〜46708位) のlocus tagを付された遺伝子の配列であり、約4.8kbからなる遺伝子クラスター (41952〜46708位) を形成している。BL0033はABC型の糖トランスポーターのペリプラズミック成分をコードしており、BL0034は同トランスポーターのATPase成分をコードしており、BL0035およびBL0036はいずれも同トランスポーターのパーミアーゼ成分をコードするパラログである。
配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９に示される各ヌクレオチド配列は、BN株のゲノム配列 (NC_004307.2) 中、それぞれBL1691 (2111349〜2112299位)、BL1692 (2112324〜2113190位 (相補鎖))、BL1693 (2113228〜2114397位 (相補鎖))、BL1694 (2114649〜2115806位)、BL1695 (2115907〜2117460位) およびBL1696 (2117460〜2118677位) のlocus tagを付された遺伝子の配列であり、約7.3kbからなる遺伝子クラスター (2111349〜2118677位) を形成している。BL1692およびBL1695はABC型の糖トランスポーターのATPase成分をコードするパラログであり、BL1694は同トランスポーターのペリプラズミック成分をコードしており、BL1696はパーミアーゼ成分をコードしており、BL1691およびBL1693は転写調節因子をコードしている。
【００１４】
上記（ａ）および（ｂ）の遺伝子クラスターをゲノム中に有する腸内常在菌としては、BN株の他、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム (Bifidobacteriumlongum subsp. longum) JCM 1217T (以下、「BL」と略記する場合がある) 株、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス (Bifidobacterium longum subsp. infantis)157F (以下、「BF」と略記する場合がある) 等が挙げられるが、これらに限定されない。BLおよびBF株は、BN株のBL0033〜BL0036の各遺伝子のオルソログを含む遺伝子クラスターおよびBL1691〜BL1696の各遺伝子のオルソログを含む遺伝子クラスターをゲノム中に有する。BL0033〜BL0036およびBL1691〜BL1696の各遺伝子のオルソログとしては、各遺伝子のヌクレオチド配列 (配列番号2n-1 (nは1〜10の整数))と、オーバーラップする領域に関して約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、いっそう好ましくは約90％以上、特に好ましくは約95%以上、最も好ましくは97%の相同性を有する塩基配列である。本発明における「ヌクレオチド配列の相同性」は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
より具体的には、BL0033〜BL0036およびBL1691〜BL1696の各遺伝子のオルソログとしては、配列番号2n-1 (nは1〜10の整数) に示されるヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、配列番号2n (nは1〜10の整数) に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の機能を有する蛋白質をコードする配列が挙げられる。ここで「実質的に同質の機能」とは、ABCトランスポーターのペリプラズミック成分、ATPase成分またはパーミアーゼ成分、あるいは転写調節因子としての機能を意味する。ストリンジェントな条件とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×SSC (sodium chloride/sodium citrate)／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％ SDS／50〜65℃での一回以上の洗浄等が挙げられる。
当業者であれば、後述する本発明のスクリーニング法により、公知の腸内常在菌または新たに分離された腸内常在菌の中から、容易に上記（ａ）および／または（ｂ）の遺伝子クラスターをゲノム中に有する菌株を選択することができる。
あるいは、NCBIのWebサイト上からダウンロードすることができるCOGデータベースを利用して、全ゲノム配列が決定されている腸内常在菌のゲノムを検索することにより、上記（ａ）および／または（ｂ）の遺伝子クラスターをゲノム中に有する菌株を選択することもできる。COG (Clusters of Orthologous Groups) はオルソログ(種間の相同な遺伝子) およびパラログ (同一ゲノム上の類似する遺伝子) から構成される遺伝子 (蛋白質) のセットを意味する (Science, 278(5338):631-7(1997))。NCBI COGデータベースでは、BN株のBL0033およびBL1694遺伝子はCOG family: ABC-type sugar transporter periplasmic component (COG1879) に、BL0034、BL1692およびBL1695遺伝子はCOG family: ABC-type sugar transporter ATPase component (COG1129) に、BL0035、BL0036およびBL1696遺伝子はCOG family: ABC-type sugar transporter permease component (COG1172) に、BL1691およびBL1693遺伝子はCOG family: transcriptional regulator/sugar kinase (COG1940) に、それぞれ分類されている。したがって、候補腸内常在菌のゲノム配列情報にアクセスし、そのCOGデータ一覧から上記COGに属する遺伝子の存在を調べ、さらに該遺伝子の位置情報から上記（ａ）および／または（ｂ）の遺伝子クラスターの存在を確認することにより、本発明の腸管バリア機能改善剤に用いることができる腸内常在菌を選択することができる。
【００１５】
本発明の腸管バリア機能改善剤の有効成分である腸内常在菌は、上記遺伝子クラスターをゲノム中に有することに加えて、該クラスター中に含まれるABCトランスポーターにより細胞内に輸送される糖類から、酢酸塩を生成する能力を有することをさらなる特徴とする。該糖類としては、例えば、フルクトース、リボース、マンノースなどが挙げられるが、好ましくはフルクトースである。本発明に用いられる腸内常在菌は、該トランスポーターにより取り込んだ糖類を代謝して酢酸塩を生成し、細胞外に放出することにより、周囲の腸管上皮細胞において抗炎症応答や抗アポトーシス作用に関与する遺伝子 (例、Apoe、C3、Pla2g2a等) の発現を誘導し、腸管バリア機能の低下を抑制すると考えられる。腸内常在菌の酢酸塩生成能は、例えば、標識した糖類 (例、フルクトース) を炭素源として含有する培地で被験菌株を一定時間 (例、3〜24時間) 培養し、該糖類の減少と酢酸塩の生成量とを検出することにより評価することができる。この際、陰性対照として上記（ａ）および（ｂ）の遺伝子クラスターを有しない腸内常在菌株、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス (Bifidobacterium longum subsp. infantis) JCM 1222T (以下「BT」と略記する場合がある) 株やビフィドバクテリウム・アドレッセンティス (Bifidobacterium adolescentis) JCM 1275T(以下、「BA」と略記する場合がある) 株を用い、該陰性対照と比較して有意に基質糖類を高消費し、かつ酢酸塩を高産生した被験菌株を、本発明の腸管バリア機能改善剤に用いることができる腸内常在菌として選択することができる。
【００１６】
上記（ａ）および／または（ｂ）の遺伝子クラスターをゲノム中に有し、かつ該クラスター中に含まれるABCトランスポーターにより細胞内に輸送される糖類から、酢酸塩を生成する能力を有する腸内常在菌は、本来、宿主である哺乳動物 (例、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、マウス、ラット等) の腸内に常在し、これと共生しているので、医薬もしくは食品 (添加物) として安全に哺乳動物に投与することができる。
本発明の腸内常在菌は腸管バリア機能を改善する作用を有するので、本発明の腸管バリア機能改善剤は、腸管バリア機能の低下が関与する疾患、好ましくは病原性微生物、毒素もしくはアレルゲン等が腸管バリアを透過して血流中などに侵入することに起因する疾患の予防および／または治療に有用である。そのような疾患としては、例えば、O157等の腸管出血性大腸菌をはじめとする病原性大腸菌、サルモネラ菌、ボツリヌス菌等の病原性微生物感染症、炎症性腸疾患、食物アレルギーなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１７】
本発明の腸内常在菌は、生きた細胞である限り、医薬上もしくは食品加工上許容されるいかなる形態でも、本発明の腸管バリア機能改善剤に含有させることができ、例えば、細胞 (菌体) 自体、その培養 (発酵) 物などの形態で用いられる。
【００１８】
本発明の腸内常在菌は、各菌株に適した培地によって培養できる。例えば、ビフィドバクテリウム属やラクトバチルス属に属する乳酸菌株の場合、乳培地または乳成分を含む培地、あるいはそれらを含まない半合成培地等の種々の培地を用いることができる。このような培地としては、脱脂乳を還元して加熱殺菌した還元脱脂乳培地を例示することができる。培養は、静置培養またはｐＨを一定にコントロールした中和培養で行うことできるが、菌が良好に生育する条件であれば特に培養法に制限はない。培養終了後、乳酸菌培養液から濾過もしくは遠心分離などにより分離回収した菌体や、乳酸菌培養液をそのまま、あるいは培地を濃縮した濃縮物として使用することもできる。菌体自体を用いる場合、生菌体、湿潤菌体、乾燥菌 (噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、ドラム乾燥などによって得られる) の形態で用いられ得る。
【００１９】
また、本発明の腸内常在菌は、それらを用いた発酵物として使用してもよい。例えば、ビフィドバクテリウム属やラクトバチルス属に属する乳酸菌株の場合、発酵物として、例えば、乳酸菌飲料、酸乳、発酵乳、ヨーグルトなどが例示される。
【００２０】
本発明の腸管バリア機能改善剤は、上記本発明の腸内常在菌の細胞 (菌体)または培養 (発酵) 物をそのまま、あるいは薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに医薬組成物として製剤化することができ、経口的または非経口的（例、経管投与、経腸投与など）に投与することができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注入剤、坐剤等が用いられる。注入剤の調製方法としては、例えば、本発明の腸内常在菌を、通常注入剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に懸濁または乳化することによって調製できる。注入用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられる。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられる。直腸投与に用いられる坐剤は、本発明の腸内常在菌を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製され得る。
【００２１】
本発明の腸管バリア機能改善剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、通常成人１日あたり、乾燥物として0.5〜10gであり、これを１日数回に分けて投与することができる。好ましくは、それぞれの株が生菌として成人一人あたり、108〜1012cfu／日投与することで本発明の目的とする効果を発揮させることが可能となる。このように投与することによって腸管内に本発明の腸内常在菌が定着し、所望の効果を発揮する。
【００２２】
本発明の腸管バリア機能改善剤は、腸内常在菌との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、本発明の腸管バリア機能改善剤は、対象疾患に応じて、他の薬剤、例えば、抗炎症薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗毒素、抗アレルギー薬などと併用してもよい。本発明の腸管バリア機能改善剤および上記薬剤は、同時または異なった時間に、対象に投与すればよい。
本発明の腸管バリア機能改善剤の好ましい併用薬の例として、該バリア機能改善剤に含有される腸内常在菌の増殖および／または代謝を促進する物質（プレバイオティクス）が挙げられる。本発明の腸内常在菌は、上記（ａ）および／または（ｂ）の遺伝子クラスターによってコードされるABCトランスポーターにより細胞内に輸送される糖類を代謝して酢酸塩を大量に生成するので、該糖類 (例、フルクトース、リボース、マンノース等)、好ましくはフルクトース、あるいは腸内で消化されて該糖類を生成するオリゴ糖、好ましくは2〜10の単糖からなるオリゴ糖、好ましくはショ糖、乳糖果糖オリゴ糖、フルクトオリゴ糖などが、本発明の腸管バリア機能改善剤に併用されるプレバイオティクスとして挙げられる。これらのプレバイオティクスは、本発明の腸内常在菌とともに本発明の腸管バリア機能改善剤に配合することもできるし、別個の製剤として、同時または異なった時間に、対象に投与してもよい。
【００２３】
本発明のバリア機能改善剤の作用機序は、本発明の腸内常在菌が生成する高濃度の酢酸塩による刺激に応答して、腸管上皮細胞において抗炎症作用および／または抗アポトーシス作用に関与する遺伝子群の発現が誘導され、腸管上皮のバリア機能低下を阻止または抑制するというものである。従って、本発明のバリア機能改善剤は、腸内常在菌が定着し得る限り、腸管以外の部位における上皮細胞のバリア機能改善にも有用である。例えば、ビフィドバクテリウム属やラクトバチルス属に属する乳酸菌は、女性の膣内にも常在することが知られているので、膣上皮のバリア機能改善にも有用であり、例えば、カンジダ症、性感染症 (例、エイズ、梅毒、淋菌感染症、クラミジア感染症、性器ヘルペス、トリコモナス症、尖形コンジローム等)、子宮がんの予防に用いることができる。膣投与に適した製剤としては、例えば、該乳酸菌に加えて、製剤技術分野において適当な担体を含むペッサリー、坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー剤として提供され得る。同様に、有効成分をコンドーム上のコーティングとしての潤滑剤と組み合わせることもできる。
【００２４】
本発明の腸管バリア機能改善剤は、医薬のみならず、特定保健用食品などの機能性食品を含む食品組成物をも包含する。このような食品組成物としては、本発明の腸内常在菌を用いて得られた発酵食品の他、該腸内常在菌を人工的に加えた加工食品も含まれる。具体的には、例えば、ビフィドバクテリウム属やラクトバチルス属に属する乳酸菌の場合、それを用いて得られた発酵食品としては、乳酸菌飲料、酸乳、発酵乳、ヨーグルトなどが挙げられる。本発明の腸内常在菌を人工的に加えた加工食品としては、例えば、牛乳やヨーグルト、チーズ、発酵乳、豆腐、おかゆ、くず湯、お茶や果汁などからなる清涼飲料水、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病人用食品、幼児用粉乳、授乳婦用粉乳等の食品 (粉ミルクなど生物学的規格を有するものを含む)、栄養食品など、各種食用素材を原料にして製造された食品が例示され、これらの食品の製造時に本発明の腸内常在菌を添加したもののみならず、経腸栄養剤等のように、各種蛋白質 (全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエー粉、ホエイ蛋白質、ホエイ蛋白質濃縮物、ホエイ蛋白質分離物、α−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆蛋白質、鶏卵蛋白質、肉蛋白質等の動植物性蛋白質やレシチン、大豆蛋白質等の植物性蛋白質など)、各種糖質 (グルコースやフルクトース等の単糖類、ショ糖などの二糖類、キシリトールやグリセリンなどの多価アルコール、デキストリン、加工澱粉 (デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等)、食物繊維などの多糖類など)、各種脂質(ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂や、大豆油、ヤシ油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂など)、各種ビタミン (ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸など) や各種ミネラル (カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなど)、有機酸 (リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸など) などの各種栄養素を任意の割合で混合し、そのまま、あるいはさらにそれらの混合物にゲル化剤を加え、嚥下しやすい程度に粘度を調製した食品組成物なども例示される。
【００２５】
本発明の腸内常在菌を含有する食品組成物は、食事 (食餌) の一品目として、あるいはその素材として食事 (給餌) の際に、また、おやつ、サプリメント、栄養補助食品等として食事の間に摂取されるのが好ましい。
【００２６】
本発明はまた、以下の（１）および（２）の工程を含む、腸管バリア機能改善作用を有する微生物のスクリーニング方法を提供する。
（１）腸内常在菌を含有する被験試料において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に示される各ヌクレオチド配列からなる、ABCトランスポーターを構成する蛋白質をコードする遺伝子、または該遺伝子の各オルソログからなる群より選択される１以上の遺伝子、あるいはその発現産物を検出する工程
（２）該遺伝子またはその発現産物が検出された場合に、該被験試料は腸管バリア機能改善作用を有する候補微生物を含有すると判定する工程
腸内常在菌を含有する被験試料は、単離された腸内常在菌株の菌体であってもよいし、腸内常在菌を含有することが既知であるかもしくは含有すると予測される未精製の試料 (例、発酵食品 (好ましくは乳酸発酵食品)、糞便など) であってもよい。
本発明のスクリーニング法は、被験試料中に含有される腸内常在菌が、本発明の腸内常在菌の特徴である、上記（ａ）および／または（ｂ）の遺伝子クラスターをゲノム上に有するか否かを判定するものである。当該判定の手法としては、該遺伝子クラスターの全体もしくは一部を直接検出する方法、あるいは該クラスターを構成する１以上の遺伝子の発現をRNAレベルもしくは蛋白質レベルで検出する方法が挙げられるが、2つのクラスター中に含まれる10遺伝子のオルソログのうちの1以上を、ゲノム上の離れた (即ち、クラスターを構成しない) 位置に有する菌株も存在すると予測されるので、好ましくは、工程（１）において、ゲノム中の該遺伝子クラスターの有無が直接検出される。例えば、該遺伝子クラスターを有する既知菌株、および同種もしくは同属の該クラスターを有しない菌株の両方で保存されている、該クラスターの上流もしくは下流に隣接するヌクレオチド配列と、該クラスター内部のヌクレオチド配列とを、それぞれ標的配列とする一対のプライマーを設計し、ゲノミックPCRを行い、予測される塩基長を有する増幅断片が検出された場合には、被験試料は腸管バリア機能改善作用を有する候補微生物を含有すると判定することができる。
【００２７】
好ましくは、上記方法により腸管バリア機能改善作用を有すると判定された候補微生物を、適当な糖類、好ましくはフルクトースを炭素源として含有する培地で培養し、フルクトースの減少および／または酢酸塩の生成を確認することにより、本発明の腸内常在菌として選択することができる。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明を何ら限定するものではない。【００２９】
実施例１  O157感染と乳酸菌投与
細菌の菌株、細胞系及び培養条件
Bifidobacterium longum subsp. longumJCM 1217T (BL)、Bifidobacteriumlongum subsp. infantis JCM 1222T (BT) 及びBifidobacterium adolescentis JCM 1275T(BA) をJapan Collection of Microorganisms (JCM)から購入した。Bifidobacterium longum subsp. infantis157F (BF) は、ヒト新生児の糞便から常法により単離した。リファンピシン耐性変異体である、大腸菌O157:H7菌株44Rfはウシ糞便より分離した。大腸菌O157:H7菌株44Rf Stx2欠損株をDatsenko及びWanner法により作製した (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-5 (2000))。RT-PCR及びELISAで、このStx2欠損株が、stx2遺伝子を発現せず、Stx2蛋白質を合成しないことを確認した。ビフィズス菌及び大腸菌O157:H7菌株44RfをBL寒天培地 (ニッスイ) 及びTS寒天培地 (BBL、Becton Dickinson) 中でそれぞれ嫌気的に培養した。
ベロ細胞はAmerican Type Culture Collection (ATCC) から購入し、10% ウシ胎仔血清及び1% ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンダルベッコ (GIBCO) を補充した変法イーグル培地 (D-MEM: GIBCO) で単層培養した。培養はプラスチックシャーレで37℃、5%CO2環境下で行った。【００３０】
動物
無菌BALB/cマウス (GFマウス) はアイソレーター内で12時間明期のサイクル下で飼育し、オートクレーブした標準のげっ歯動物食餌 (CMF, Oriental Yeast Co. Ltd, Japan) を与えた。8〜16週齢雄又は雌GFマウスに、108コロニー形成単位 (CFU) のビフィズス菌 (それぞれ、BL又はBA) を単回経口投与して定着させた。GFマウス又はビフィズス菌 (BL又はBA) 単独定着 (7日間) マウス (以下、BLマウス又はBAマウスという場合がある。他のビフィズス菌株 (BF、BN、BT) が単独で定着した場合も同じ要領で表記する。) に、104CFUの大腸菌O157:H7菌株44Rfを単回経口投与することで感染させた (以下、GFマウスにO157を投与したものをO157マウス、BLマウス、BAマウスにO157を投与したものをそれぞれBL+0157マウス、BA+O157マウスという場合がある。他のビフィズス菌株が定着したマウスにO157を投与した場合も同じ要領で表記する)。【００３１】
糞便中の細菌数の計数
糞便懸濁液に50倍量の嫌気性溶液A (4.5 g/l KH2PO4, 6 g/l Na2HPO4, 12.5 g/l L-cysteine・HCl, 0.5 g/l Tween80, 0.75 g/l Bacto Agar) を加えてホモジナイズした。10倍希釈系列を調製し、各希釈液の50 μlをTS寒天プレート (O157用) 又はBL寒天プレート (ビフィズス菌用) 上に塗布した。プレートを37℃で嫌気的にインキュベートし、CFUを計数した。【００３２】
Stx2細胞毒性についてのアッセイ
J. Clin. Microbiol., 25, 115-8 (1987) に記載の方法に従って、Stx2細胞毒性を96穴マイクロタイタープレートで測定した。ベロ細胞懸濁液 (5×103細胞/ウェル) を96穴マイクロタイタープレートに添加し、プレートを37℃、5% CO2環境下で24時間インキュベートした。マウスの血清又はマウスの糞便懸濁液の10倍希釈系列を調製し、各希釈液の5 μlを各ウェルに添加し、37℃、5% CO2環境下で24時間インキュベートした。細胞形態を位相差顕微鏡下で観察した。志賀毒素 (100 ng/ml: VTEC-RPLA 「生研」 (デンカ生研)) をスタンダードとして用いた。【００３３】
ムチンの量の測定
J. Gastroenterol. Hepatol., 19, 303-13 (2004) に記載の方法に従って、粗ムチンをマウス盲腸内容物から単離し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により解析した。凍結乾燥試料をNaCl溶液でホモジナイズし、直ちに10000×gで30分間遠心分離した。上清を別のチューブに移し、次いでエタノールを添加した。粗ムチンを-20℃で一晩放置して沈殿させ、SDS-PAGEにより分離した。電気泳動後、過ヨウ素酸シッフ試薬 (PAS) でゲルを染色し、糖（糖蛋白質）を検出した。PAS染色された範囲の強度をGelDoc XR (Bio-Rad Laboratories) を用いて解析した。【００３４】
総IgA量についてのアッセイ
J. Gastroenterol. Hepatol. (2004, 上述) に記載の方法に従って、盲腸IgAをNunc-Immunoプレート(MaxiSorb F96; Nalge Nunc International, Rochester) を用いてELISAにより測定した。96穴プレートの各ウェルに抗マウスIgAモノクローナル抗体 (C10-3 clone; BD) 溶液を添加し、4℃で一晩インキュベーションした。精製マウスIgA (553476; BD) をスタンダードとして用いた。1% ウシ血清アルブミン (BSA) 含有PBSでブロッキングした後、適当に希釈した試料又はスタンダード50 μlを各ウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。PBSで3回洗浄後、ビオチン化抗マウスIgAモノクローナル抗体 (C10-1 clone; BD) を各ウェルに添加し、プレートを室温で2時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン-HRP (Amersham) を各ウェルに添加し、プレートを室温で2時間インキュベートした。洗浄後、クエン酸−リン酸バッファ (pH 5.0) に溶解した発色基質フェニレンジアミン (Sigma) を各ウェルに添加し、吸光度をマイクロプレートリーダー(NJ-2300; System Instruments)で測定した。【００３５】
pH及び有機酸濃度の測定
蒸留水で盲腸内容物をホモジナイズした後、ホモジネートの一部を等量の蒸留水で希釈し、盲腸中pHをコンパクトpHメーター(Model C-1; 堀場製作所) で測定した。盲腸中及び糞便中の有機酸 (ギ酸、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、ｎ−酪酸、イソ吉草酸、ｎ−吉草酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸及び乳酸) 濃度の測定は、イオン交換カラム (Ionpak KC-811; 昭和電工) 及び紫外線検出器 (Model 800; 日本分光) を備えた装置を用い、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) により行った。試料にスルホサリチル酸 (最終濃度10%) を添加して蛋白質を除いた後、10000×gで10分間遠心分離した。HPLCのカラムを60℃に保ち、3 mM HClO4を移動相として流速1 ml/分で通液した。カラムからの溶出液は、1.5 ml/分で注入された、15 mM Na2HPO4中に溶解した125 mg/l ブロモチモールブルー (BTB) 溶液と混合した後、430nmにおける吸光度を計測することにより、有機酸濃度を測定した。【００３６】
結果
O157を単独投与したGFマウスは、感染後7日目までに100%死亡した。しかし、O157投与前にBLを投与した場合、その後にO157を投与してもマウスは死亡しなかった。対照的に、O157投与前にBAを投与した場合ではO157による感染死は予防できなかった (図１ａ)。BL及びO157が定着したマウス (BL+O157) 及びBA及びO157が定着したマウス(BA+O157) の腸管内において、O157の生菌数、Stx2濃度、pH、ムチン量及びIgA量に有意な差はなかった (図１ｂ−ｅ)。実際、BL及びO157のインビトロでの共培養系においては、競合阻害は観察されなかった。一方、BL+O157マウスの血清中Stx2濃度は、BA+O157マウスのそれよりも著しく低かった (図１ｆ)。これらのマウスにおいて、腸、脾臓、腎臓、及び肝臓へのO157の感染はなかった。これらのデータから、血清中でのStx2の増加がBA+O157マウスの死亡の直接的な要因であり、この増加はStx2に対する腸管上皮層のバリア機能の低下に起因するものと考えられた。【００３７】
実施例２  大腸の免疫組織学的分析
4% パラホルムアルデヒドで固定したマウス大腸の凍結切片を用い、CD4、CD11b、CD11c及びKi67の免疫染色を行った。切片を1% ヤギ血清 (Roche) と共にPBS中で30分間、室温でインキュベートし、次いで、2 μg/mlの各一次抗体又は同じ濃度のコントロールIgGと共に、一晩4℃でインキュベートした。一次抗体は、Alexa 488 (Molecular Probes) 又はCy3 (Perkin Elmer) で標識した各二次抗体 (4 μg/ml) で検出した。TdT介在dUTPニック末端標識(TUNEL) 染色は、4% パラホルムアルデヒドで固定したマウス大腸の凍結切片を、in Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche) で染色して行った。ヘマトキシリン−エオシン (HE) 染色は、10% ホルマリン(Richard-Allan Scientific) で固定したマウス大腸切片を脱パラフィン化し、再水和して行った。【００３８】
結果
大腸の免疫組織学的分析により、O157感染後5〜7日の感染死非予防マウスの遠位結腸において軽微な炎症 (図２ａに示す杯細胞の減少及び図２ｂに示す炎症細胞の浸潤として表される) が観察されたが、感染死予防マウスにおいては見られなかった。また、感染死非予防マウスでは、結腸上皮細胞のアポトーシス死が顕著に観察された (図２ｂ)。一方、O157感染後1日目には、いずれのマウスでも遠位結腸に炎症は認められなかったが、感染死非予防マウスでは、既に上皮細胞のアポトーシス死が観察された (図２ｃ)。【００３９】
実施例３  O157感染死予防マウスおよび非予防マウスにおける宿主応答の網羅的解析
宿主腸管上皮層のトランスクリプトーム解析を行い、O157感染時の、BL及びBAに対するマウスの宿主応答を網羅的に調べた。O157感染後1日目のBL+O157マウス、BA+O157マウス及びO157マウスの腸管上皮層の遺伝子発現プロファイルを比較・解析した。自己組織化マッピング (SOM) 及び階層的クラスタリング解析 (HCA) 等のクラスタリングアルゴリズムを組み合わせて用いた。【００４０】
結腸上皮の遺伝子発現プロファイリング
遠位結腸の小断片をマウス大腸から切除し、30 mM EDTA含有ハンクス液 (HBSS) に浸漬した。氷上で20分間インキュベーション後、実体顕微鏡でモニタリングしながら、細針を用いた操作で結腸上皮を単離した。各群2匹のマウス結腸上皮を混合し、Affymetrix社の提供する標準プロトコルにより全RNAを抽出した。次いで、RNAをラベル化し、Affymetrix社の提供する標準プロトコルに従って、Affymetrixマウスゲノム430 2.0アレイにハイブリダイズさせた。GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent) を用いて、得られたGeneChipデータセットを解析した。gcRMAアルゴリズムを用いてアレイデータを正規化した。特定のRefSeq及びGenBank transcriptsを標的とするA又はBに分類されるプローブセットを用いた (Bioinformatics, 23, 2934-41 (2007))。【００４１】
自己組織化マッッピング (SOM) 及び階層的クラスター解析 (HCA)
O157マウス、BA+O157マウス又はBL+O157マウスにおいて、GFマウスと比較して、遺伝子発現量が2倍以上に増加または2分の1以下に減少した遺伝子群を選択した(約4000遺伝子)。GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent) を用いてSOM及びHCAを行った。【００４２】
部分最少二乗判別分析 (PLS-DA)
PLS-DAは、Rソフトウェアで動作する、“simpls”法を用いたpls package (ver 2.0) を使用して行った。SOM解析に供した発現遺伝子群プロファイリングデータセットをRソフトウェアにインポートし、解析した。サンプル間の差異に最も寄与する主成分をPC1軸、差異への寄与が2番目、3番目に相当する主成分をそれぞれPC2軸及びPC3軸とする3次元直交座標上に主成分(PC) スコアをプロットして、データを可視化した。【００４３】
リアルタイム定量的RT-PCR
市販のキット (RNeasy; Qiagen) を用いて、マウス結腸上皮全RNAを抽出した。1 μgの全RNAをRevaTra Ace (TOYOBO) を用いて逆転写した。得られたcDNAを鋳型とし、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa) 及び各遺伝子についての特異的プライマー (表１) を用いて、リアルタイムPCRを行った。Thermal Cycler Dice Real Time System (TaKaRa) を用いて、アッセイを3連で行った。試料間の転写レベルはGAPDHの発現レベルに対して正規化した。【００４４】
【表１】
2011027875.tif 000003
【００４５】
結果
BL+O157マウスの結腸上皮における遺伝子発現プロファイルは、BA+O157マウス及びO157マウスのそれらとは大きく異なっていた (図３ａ)。感染死非予防マウス(BA+O157及びO157) において発現量が2倍以上に増加した遺伝子群をジーンオントロジー (GO) データベースを用いて解析したところ、免疫応答及び生体防御応答にかかわる遺伝子群の発現が増加していることが明らかになった (表２及び図４)。さらに、部分最少二乗判別分析 (PLS-DA) から、8つの遺伝子レベルの上昇が、感染死予防マウス (BL+O157) と感染死非予防マウスとの間の違いに寄与していることが示唆された (図３ｂ及び表３)。定量的PCR (qPCR) によりこれらの遺伝子の発現量を検証したところ、8つの遺伝子のうちの7つが、O157による感染死非予防マウスで有意に増加していることが明らかとなった (図３ｃ)。これらの遺伝子には、炎症関連遺伝子 (ケモカインCxcl9及びCxcl10、並びにRegIIIファミリーReg3b及びReg3g) が含まれていた。前述の組織学的分析では、O157感染後1日目には明らかな炎症は認められなかったが、上皮細胞のアポトーシスが観察された (図２ｃ)。これらの結果は、O157が感染死非予防マウスの上皮細胞のアポトーシスを引き起こして大腸で炎症を生じるのに対し、感染死予防マウスでは予防性株 (BL) によりアポトーシスが抑制されていることを示唆している。【００４６】
【表２】
2011027875.tif 000004
【００４７】
【表３】
2011027875.tif 000005
【００４８】
実施例４  炎症の発症および腸管上皮細胞のアポトーシスの予防
BLマウス及びBAマウスの糞便代謝プロファイルをPLS-DAにより解析し、BLがO157により誘導される炎症及び腸管上皮細胞のアポトーシスを予防する機序を調べた。【００４９】
1H及び1H、13C NMR測定
凍結乾燥した糞便10 mgを90% 重水 (D2O) 含有100 mM KPi及び1 mM 2,2-ジメチル-2-シラペンタン-5-スルホン酸ナトリウム (DSS) で穏やかに振盪し、糞便中の代謝物を抽出した。次いで、1H NMRおよび1H, 13C NMRを用いて解析を行った。得られたデータはNMRPipeソフトウェアを用いてNMRスペクトルを解析した。【００５０】
結果
BLマウスとBAマウスとの間で糞便中代謝物の組成に著しい差異があった (図５ａ)。ローディングプロット解析及び1H、13C NMR測定の結果、BLマウスにおける糞便中の糖質の量が、BAマウスよりも有意に低いことが示唆された (図６及び表４)。これらのデータは、ビフィズス菌による糖消費の程度が、O157感染からの宿主の生存率に関連することを意味する。【００５１】
【表４】
2011027875.tif 000006
【００５２】
実施例５  短鎖脂肪酸の定量
ビフィズス菌の糖発酵の主要最終生成物である、酢酸等の短鎖脂肪酸の糞便中含量を、実施例１記載の方法にしたがって定量した。【００５３】
結果
酢酸の濃度は、BAマウスよりBLマウスで有意に高かった(図５ｂ)。他のビフィズス菌での類似観察も行ったところ、O157感染死を予防できるBFを投与したマウスでは、予防できないBTを投与したマウスよりも、糞便中の酢酸濃度は高かった (図５ｂ及び図６)。したがって、予防性BL及びBFは、非予防性BA及びBTよりも、大量の酢酸を遠位結腸において産生するとみられ、このことが最終的にO157感染による死亡の予防をもたらす可能性がある。【００５４】
実施例６  BLマウス及びBAマウスの宿主腸管上皮応答における差異
BLマウス及びBAマウスの結腸上皮における遺伝子発現プロファイルを解析した。
代謝物及び発現した遺伝子の共変動解析
位置 (i、j) における要素が、マイクロアレイデータ (BLマウスとBAマウスとの間で発現レベルに2倍以上あるいは2分の１以下の差がある24の遺伝子) と1H NMRスペクトルとのセットにおけるi番遺伝子とj番binsとの間の相関係数として定義される、二次元相関マップをマトリクスとして計算した。正 (又は負) に高い係数ほど、i番とj番とのシグナルもしくはピーク間で正 (又は負) 相関があることを意味する。【００５５】
結果
BLマウスとBAマウスとの間で発現レベルに2倍以上あるいは2分の１以下の差があった24の遺伝子を同定した (表５及び図７)。共変動解析の結果、24遺伝子のうちのいくつかの発現変動とBLマウス及びBAマウスにおける糞便中代謝物のうちのいくつかの代謝物量との間に強い相関が認められた (図５ｃ)。【００５６】
【表５】
2011027875.tif 000007
【００５７】
実施例７  酢酸量の上昇が及ぼす効果
実施例６で同定された遺伝子の中で、Apoe、C3、及びPla2g2a等の遺伝子によりコードされる蛋白質は、レチノイドX受容体α (RXRα) の下流の分子であり、この核内受容体は、細胞エネルギーの代謝及び炎症反応の転写制御において中心的役割を果たしている。そこで、これらの遺伝子と酢酸量の関係を調べるために、酢酸の存在下 (5 mM又は10 mM) および非存在下で、以下の実験を行った。【００５８】
定量的RT-PCR
予防性ビフィズス菌定着マウスの結腸上皮においてその発現量が増加していた3つの遺伝子 (Apoe、C3、及びPla2g2a) のmRNA発現量が、Caco-2細胞を用いた本実験でも同様に増加するか否かを、実施例２記載の方法にしたがってRT-PCRにより検討した。PCRに使用したプライマーを表６に示す。試料間の転写レベルはGAPDHの発現レベルに対して正規化した。尚、Caco-2細胞はAmerican Type Culture Collection (ATCC) から購入し、10% ウシ胎仔血清及び1% ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンダルベッコ (GIBCO) を補充した変法イーグル培地 (D-MEM: GIBCO) で単層培養した。培養はプラスチックシャーレで37℃、5% CO2環境下で行った。【００５９】
【表６】
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【００６０】
経上皮電気抵抗 (TER) 測定
コラーゲンコーティングしたTranswellフィルター (直径6.5 mm、孔径0.4 mm; Costar) の上部域にCaco-2細胞を播種し、EVOM抵抗計 (World Precision Instruments) を用いて経上皮電気抵抗 (TER) をモニターしながら、500 W/cm2の安定なTER値となるまで7〜12日間培養した。Transwellの上部域にO157を添加し (moi 10)、37℃、5% CO2環境下で16時間インキュベートした後に、TER値を測定した。【００６１】
死細胞数の測定
Caco-2細胞を6ウェルプレート中で7〜12日間培養した。細胞をO157に感染させ (moi 10)、37℃、5% CO2環境下で8時間インキュベートした後に、アポトーシス細胞を0.5% トリパンブルーで染色し、位相差顕微鏡下で計数した。【００６２】
結果
ヒト結腸上皮Caco-2細胞を用いたインビトロの実験では、酢酸がApoe、C3及びPla2g2aの発現を直接誘導し(図８ａ)、O157感染による細胞死に起因する経上皮電気抵抗 (TER) の低下を防げることが明らかとなった (図８ｂ及びｃ)。これらの所見は、酢酸量の増加が、抗炎症反応及び／又は抗アポトーシス作用を誘導することによって結腸上皮のバリア機能を増強し、血液中へのStx2の浸潤を予防することを示している。【００６３】
実施例８  酢酸産生機序の解明
BL及びBFが、BT及びBAより多くの酢酸を産生し得る機序を明らかにするために、以下の方法にしたがって、BL、BF及びBTのゲノムを完全に配列決定し、また、公的に入手可能なBA及びBNを含む他のビフィズス菌のゲノム配列並びにヒト腸内細菌叢由来のゲノム配列とも比較した。【００６４】
ゲノム配列決定
BF、BT及びBLのゲノム配列を、全ゲノムショットガン法により決定した。3つのゲノムについて、それぞれ小さい挿入断片 (2 kb) 及び大きい挿入断片 (10 kb) を有するゲノムライブラリーを構築し、ABI 3730xlシーケンサー(Applied Biosystems)を用いて、それぞれゲノムクローン全体の7.8、6.3及び7.6倍をカバーする26880 (BF)、30720 (BT) 及び28416 (BL) の配列を読み取った。読み取った配列をPhred-Phrap-Consed program (Genome Res., 11, 614-25 (2001)) を用いて繋ぎ合わせ、ギャップは、ギャップをまたぐクローン又は隣接するコンティグの各末端にアニールするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅されたPCR産物の配列を直接シークエンスすることによりうめた。完成した配列の全体的な精度は、10000塩基に1つ未満のエラー率と推定された（≧40のPhrapスコア）。配列決定したビフィズス菌ゲノムの一般的特徴を表７に示す。【００６５】
【表７】
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【００６６】
予防性ビフィズス菌特異的遺伝子群のマウス腸管内発現
BLマウスまたはBFマウスの腸管内容物から細菌RNAを抽出し、実施例３に記載の方法にしたがって、定量的RT-PCRにより予防性ビフィズス菌特異的遺伝子群の腸管内発現を調べた。試料間の転写レベルは16S RNAの発現レベルに対して正規化した。使用したプライマーを表８に示す。【００６７】
【表８】
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【００６８】
結果
種々のビフィズス菌ゲノムにおける糖代謝に関与する遺伝子を比較した結果、BL、BF及びBNゲノム中には存在するが、BA及びBTゲノム中では完全に欠失している2つの遺伝子座を同定した。これら2つの遺伝子座は、NCBIのCOGデータベースにCOG1879、COG1172、及びCOG1129として登録されているABC型糖トランスポーターの遺伝子をコードしていた (図９ａ及び表９)。BNにおけるこれらのオルソログによりコードされたトランスポーターの基質は、リボース、フルクトース、マンノース等であると予想される。【００６９】
【表９】
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【００７０】
これら2つの遺伝子座に存在するABC型糖トランスポーターの遺伝子について、本実施例にて配列決定したものを含め、ゲノム配列が公知の種々のビフィズス菌株において、オルソログの存在およびアミノ酸の配列類似性を調べたところ、BN、BLおよびBF以外に、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム (Bifidobacterium longum subsp. longum) DJO10A株でもオルソログの存在が確認され、これら4菌株では、すべての遺伝子についてオルソログ間で互いにきわめて高い配列類似性が認められた(表１０)。さらに、13人のヒト腸内細菌叢由来の全ゲノム配列データ (Kurokawa, K. et al., DNA Res., 14, 169-181 (2007)) との比較の結果、8人の腸内細菌叢からこれらのABCトランスポーター遺伝子と配列類似性の高い遺伝子が検出された (表１０)。【００７１】
【表１０】
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【００７２】
これらのオルソログ及び転写調節因子等の隣接遺伝子は、BLマウス及びBFマウスの遠位結腸において発現していることが確認された (図１０ａ)。一方、ビフィズス菌における異化経路内のフルクトース代謝に関わる酵素をコードするフルクトキナーゼ遺伝子は、O157感染死に対して予防性であるか非予防性であるかにかかわらず、いずれのビフィズス菌株でも、マウス遠位結腸において高発現していた (図１０ｂ)。【００７３】
実施例９  インビトロでのビフィズス菌のフルクトース消費率及び酢酸の生成
13C標識したグルコース及びフルクトースを含有する培地 (Silantes, Co. Ltd., Munchen,  Germany) を用い、O157感染死予防性のBL及びBF株、並びに非予防性のBA及びBT株をインビトロで培養し、1H, 13C NMR測定によるメタボローム解析を行い、PLS-DA法を用いてO157感染死予防性ビフィズス菌の糖質の代謝能を解析した。【００７４】
結果
BL及びBFにおけるフルクトースの消費率及び酢酸の生成量は、BA及びBTよりも、有意に高いことが明らかになった(図９ｂ及びｃ)。13C標識培地を用いてビフィズス菌株をインビトロで12時間培養した時のメタボローム解析データをPLS-DAにより評価した結果を表１１に示す。これらのデータは、フルクトース及びビフィズス菌のABC型糖トランスポーターが、宿主結腸上皮における抗炎症及び／抗アポトーシスを惹起する酢酸の生成に大きく寄与し、それによってマウスをO157感染死から予防することを強く示唆している。【００７５】
【表１１】
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【００７６】
実施例１０  O157感染死予防性および非予防性ビフィズス菌株の糖資化性
種々の糖質を添加した培地を用い、O157感染死予防性のBN、BL及びBF株、並びに非予防性のBT及びBA株を液体培養し、増殖速度と酢酸の生成量を測定した。増殖速度はビフィズス菌株を接種後、培養液のOD値が1.0になるまでの時間を測定し、5段階でスコア化した。【００７７】
結果
いずれのO157感染死予防性株も、非予防性株に比べて顕著に増殖が速かった。また、予防性株は、増殖速度は速くないもののマンノース資化性であるのに対し、非予防性株はマンノースを炭素源として利用できなかった。酢酸の生成量は、いずれの菌株においても増殖速度と相関していた (表１２)。【００７８】
【表１２】
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【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の腸管バリア機能改善剤は、腸管、特に結腸上皮における酢酸塩濃度を上昇させることにより、上皮細胞における抗炎症作用および抗アポトーシス作用に関与する遺伝子群の発現を誘導し、腸管バリア機能低下の原因となる上皮細胞の炎症やアポトーシスを抑制することができるので、O157感染死を予防し得るのみならず、種々の病原性微生物および／またはそれらが産生する毒素、あるいはアレルゲン物質などのバリア透過を阻止することができ、それら異物の侵入により引き起こされる多様な疾患の予防および／または治療にも有用である。また、本発明のスクリーニング方法は、微生物ゲノム中における特定の遺伝子クラスターの有無を調べることにより、迅速かつ簡便に腸管バリア機能改善に有効な微生物を選択することができるので、新規かつ有用なプロバイオティクスの探索ツールとして有用である。【００８０】
本出願は、2009年9月3日付で日本国に出願された特願2009-204157を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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