(57)【要約】  全血検体を用いた場合でも、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴを正確に測定することのできる分析方法を提供する。  前記分析方法では、全血検体の採取から６時間以内に前記検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを分析する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血検体の採取から６時間以内に前記検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを分析することを特徴とする、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴの分析方法。
【請求項２】
全血検体の採取から４時間以内に前記検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを分析する、請求項１に記載のヒトｓＣＤ１４−ＳＴの分析方法。
【請求項３】
全血検体のまま分析を実施する、請求項１又は２に記載のヒトｓＣＤ１４−ＳＴの分析方法。
【請求項４】
全血検体の採取を、ヘパリン採血管又はＥＤＴＡ採血管を使用して実施する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒトｓＣＤ１４−ＳＴの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敗血症診断のマーカーとして知られているヒトｓＣＤ１４−ＳＴの分析方法に関する。
なお、本明細書における「分析」には、分析対象物質であるヒトｓＣＤ１４−ＳＴの存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ１４分子は、単核球細胞の膜表面上に発現している糖タンパク質を認識する一群の抗体により同定されるタンパク質として１９８６年に第３回Leukocyte Typing Conferenceにて、命名された。１９９０年、WrightらはこのＣＤ１４分子が、エンドトキシンであるＬＰＳのレセプターであることを明らかにした（非特許文献１）。このＣＤ１４分子は分子量５３〜５５ｋＤａの糖タンパク質で、ｍＲＮＡは約１．４ｋｂのサイズで３５６個のアミノ酸からなることがｃＤＮＡの解析から明らかにされた（非特許文献２）。【０００３】
ヒトＣＤ１４分子には、膜結合型ＣＤ１４のほかに可溶型ＣＤ１４があり、血中には分子量の異なる複数の可溶型ＣＤ１４が存在することが知られている。このような可溶型ＣＤ１４としては、約５５ｋＤａと４９ｋＤａの２種類の可溶型ＣＤ１４（可溶型高分子量ＣＤ１４）、約１３ｋＤａの可溶型低分子量ＣＤ１４サブタイプ（以下、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴと称する）が知られており、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴが敗血症の診断マーカーとして臨床上、有用である（特許文献１）。【０００４】
このヒトｓＣＤ１４−ＳＴに関して、特許文献１には、血清検体の凍結融解を繰り返したり、長時間室温で放置した場合に、血清検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴが分解し、測定できなくなる場合が想定されること、あるいは、血清検体中の高分子量ＣＤ１４が、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴ若しくはそれに近い構造に分解され、測定結果を誤る場合が想定されることが開示されている（段落［０１５１］）。一方、特許文献１には、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴが、エラスターゼ等のプロテアーゼにより全長のＣＤ１４が分解して生じること、生じたヒトｓＣＤ１４−ＳＴは、少なくとも生体内（血清中）に検出できる程度には安定して存在していることも開示されている（段落［０１２６］）。
このように、特許文献１には、血清検体の凍結融解や長時間室温放置で測定結果を誤る場合を想定しているが、一般的な検体保管条件に関する内容であって特段な取り扱いを喚起する記載はない。特許文献１は、むしろ、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴが生体内血清中で安定であることを開示するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「サイエンス（Science）」（米国）、1990年、第249巻、p.1431−1433
【非特許文献２】「ヌクレイック  アシッド  リサーチ（Nucleic Acids Research）」（英国）、1988年、第16巻、p.4173
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４０４０６６６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴが血清中で比較的安定に存在することが知られていたが、血漿検体あるいは全血検体を含め、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴのより正確な分析方法を鋭意開発する中で、本発明者は、意外にも、全血検体を用いた場合において、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴの測定値に影響を及ぼすことを見出した。
本発明は、このような状況下に鑑みてなされたものであり、全血検体を用いた場合でも、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴを正確に測定することのできる分析方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題は、本発明による、全血検体の採取から６時間以内に前記検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを分析することを特徴とする、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴの分析方法により解決することができる。【０００９】
本明細書において「ヒトｓＣＤ１４−ＳＴ」（別称としてプレセプシン（登録商標）ともいう）とは、特許第４０４０６６６号明細書に記載の「第１の態様の可溶性ＣＤ１４抗原」を意味し、より具体的には、下記の１）〜３）の性質を有する可溶性ＣＤ１４抗原である。
１）非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
２）Ｎ末端配列に配列番号１のアミノ酸配列を有する、及び
３）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する。【００１０】
配列番号１：
Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu 
1               5                   10      
配列番号２：
Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys 
1               5                   10                  15      
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、血清検体又は血漿検体中では安定であっても、全血検体中では時間経過により測定値が変動するヒトｓＣＤ１４−ＳＴを、血清検体又は血漿検体を調製することなく、全血検体を用いて正確な分析を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヘパリン採血管を使用して調製した全血検体及び血漿検体（検体１）を室温で所定時間（０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間）静置保存した後、各検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを測定した結果を示すグラフである。
【図２】ヘパリン採血管を使用して調製した全血検体及び血漿検体（検体２）を室温で所定時間（０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間）静置保存した後、各検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを測定した結果を示すグラフである。
【図３】ヘパリン採血管を使用して調製した全血検体及び血漿検体（検体３）を室温で所定時間（０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間）静置保存した後、各検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを測定した結果を示すグラフである。
【図４】ＥＤＴＡ採血管を使用して調製した全血検体及び血漿検体（検体１）を室温で所定時間（０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間）静置保存した後、各検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを測定した結果を示すグラフである。
【図５】ＥＤＴＡ採血管を使用して調製した全血検体及び血漿検体（検体２）を室温で所定時間（０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間）静置保存した後、各検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを測定した結果を示すグラフである。
【図６】ＥＤＴＡ採血管を使用して調製した全血検体及び血漿検体（検体３）を室温で所定時間（０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間）静置保存した後、各検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを測定した結果を示すグラフである。
【図７】血清検体（検体１〜検体３）を室温で所定時間（０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間）静置保存した後、各検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを測定した結果を示すグラフである。
【図８】全血検体の不安定性の要因を検討するために、各種条件（条件１〜条件３）で静置保存した各検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを測定した結果を示すグラフである。
【図９】ヘパリン採血管を使用して調製した全血検体（検体１〜検体３）を室温で所定時間（０時間、２時間、４時間、８時間）静置保存した後、各検体中のＣＲＰを測定した結果を示すグラフである。
【図１０】ＥＤＴＡ採血管を使用して調製した全血検体（検体１〜検体３）を室温で所定時間（０時間、２時間、４時間、８時間）静置保存した後、各検体中のＣＲＰを測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の分析方法は、被検試料として全血検体を使用し、その採取から６時間以内にその分析を行うこと以外は、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴの公知の分析方法をそのまま適用することができる。
【００１４】
ヒトｓＣＤ１４−ＳＴの分析は、タンパク質の各種の公知分析方法、例えば、抗体を用いる免疫学的分析方法、電気泳動等の生化学的分析方法により実施することができ、臨床検査用の自動分析機を使用することもできる。
例えば、特許第４０４０６６６号明細書には、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴの測定方法、より具体的には、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチド（特許第４０４０６６６号明細書に記載のＳ６８ペプチド）を抗原として作製したポリクローナル抗体（Ｓ６８抗体）、モノクローナル抗体（Ｆ１１４６−１７−２抗体）と、抗ＣＤ１４抗原モノクローナル抗体（例えば、Ｆ１０３１−８−３抗体、Ｆ１１０６−１３−３抗体等）との組合せを用いたサンドイッチＥＩＡ系［特許第４０４０６６６号明細書の実施例７−（１）］が開示されており、本発明の分析方法に適用することができる。
また、後述の実施例では、検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴと抗ｓＣＤ１４−ＳＴマウスモノクローナル抗体（Ｆ１１０６−１３−３抗体）感作磁性ラテックス及びＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）標識抗ｓＣＤ１４−ＳＴウサギポリクローナル抗体（Ｓ６８抗体）を結合させ、過剰のＡＬＰ標識抗ｓＣＤ１４−ＳＴウサギポリクローナル抗体を除去した後、抗原抗体反応により形成された免疫複合体のＡＬＰ酵素活性を、発光基質（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ；トロピックス社製）を用いた化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ；Chemiluminescent Enzyme Immunoassay）により測定し、検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴ濃度を求める方法を使用している。
【００１５】
本発明の分析方法では、被検試料として全血検体を使用する。本明細書において「全血検体を使用する」とは、全血を採血してからその検体の分析を開始するまでの期間（以下、採血後保存期間と称する）又はそのほとんどの期間を全血のままで保存した検体を使用することを意味する。全血検体は、通常の採血操作により、すなわち、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸）を含む採血管により採取することができる。
採血管により採取した全血検体は、数回の転倒混和等で撹拌した後、そのまま測定に使用することもできるし、血漿分離して使用することもできる。血漿分離して使用するとは、遠心分離によって血漿と血球を２層に分けた状態で血漿成分を使用する場合と、さらに血漿成分のみを分注して使用する場合を含む。本発明の分析方法では、被検試料として全血検体を使用するが、採血後保存期間の終了後、血漿分離して使用する場合も、「全血検体を使用する」態様に含まれる。また、本実施例を含む本発明者の知見から、全血検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴを測定する場合、時間経過により測定値が変動することがあり、検体を調製する際や輸送する際の過度な物理的衝撃が測定値に影響を与える要因となる場合がある。
【００１６】
本発明の分析方法では、全血検体を採取してから６時間以内（好ましくは４時間以内）に分析を実施する。なお、本明細書において「６時間以内に分析を実施する」とは、６時間以内に分析を開始することを意味する。
さらに具体的には、ＥＤＴＡ採血管により全血検体を採取した場合には６時間以内に分析を実施することが好ましく、ヘパリン採血管により全血検体を採取した場合には４時間以内に分析を実施することが好ましい。
後述の実施例で具体的データを示すように、血漿検体又は血清検体においては測定値に変化が認められない、採血から６〜８時間後の測定であっても、健常人の全血検体においてヒトｓＣＤ１４−ＳＴの測定値の上昇が認められた。健常人と敗血症患者の間では、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴ測定値は５０倍の差が認められることが知られており、健常人血中におけるヒトｓＣＤ１４−ＳＴ濃度は極めて低い。このことにより、適切なカットオフ値を設定することで、高い感度および特異性で敗血症を診断することが可能となる（特許文献１の実施例１２）。しかし、全血検体において、健常人のヒトｓＣＤ１４−ＳＴ測定値が時間経過とともに上昇した場合、測定時間によって、カットオフ値より低値か高値かの判断に違いが生じてしまう可能性がある。このような状況下、本発明者らは全血検体においても検体を採取してから６時間以内（好ましくは４時間以内）であればヒトｓＣＤ１４−ＳＴの測定値が変動しないことを見出したものであり、本発明の分析方法では、全血検体の採取から６時間以内に分析を実施するため、測定値上昇の影響を受けることなく、正確なヒトｓＣＤ１４−ＳＴの測定を行うことができる。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００１８】
《実施例１：検体中のヒトｓＣＤ１４−ＳＴの測定方法》
ヒトｓＣＤ１４−ＳＴを測定するための各検体は、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴ測定用の試薬を用いて測定した。この試薬は、第１抗体溶液として抗ｓＣＤ１４−ＳＴマウスモノクローナル抗体（Ｆ１１０６−１３−３抗体；特許第４０４０６６６号明細書）感作磁性ラテックス溶液、第２抗体溶液としてＡＬＰ（アルカリフォスファターゼ）標識抗ｓＣＤ１４−ＳＴウサギポリクローナル抗体（Ｓ６８抗体）溶液、Ｂ／Ｆ分離用洗浄液、基質溶液等よりなり、後述の自動免疫発光測定装置に収載されるようにカートリッジに封入されている。
測定には、特許第３１１５５０１号公報等に開示されているものと同様の磁性粒子を用いた免疫測定を自動的に行うことのできる自動免疫発光測定装置（パスファースト；三菱化学メディエンス社製）を用いた。該装置は、液体の吸引・吐出ラインとして配設されたチップ内で磁力により効果的にＢ／Ｆ分離を行うことができ、高い洗浄効率を示す。該装置の測定ステップは下記のとおりである。
なお、基質としては、化学発光基質「ＣＤＰ−Ｓｔａｒ」（トロピックス社製）を用い、光電子増倍管（ＰＭＴ）により検出される発光カウントを測定結果とした。【００１９】
自動測定用カートリッジに、試料、試料希釈液、磁性粒子溶液（第１抗体が担持されている）、Ｂ／Ｆ分離用の洗浄液、第２抗体溶液、基質溶液等を充填し、装置にセットする。
以下、通常の運転方法に従い、各操作が行われる。
（１）希釈液を用いて任意の希釈倍率に調整された試料溶液、磁性粒子溶液、および、第２抗体溶液を混合し、抗原抗体反応を行わせて免疫複合体を生成させる。
（２）未反応の物質を除去するためにＢ／Ｆ分離を行う。まず、液体吸引ラインとしてセットされたチップを通じて反応液を吸引し、磁石をチップ外壁面に接触させて磁性粒子を捕集する。次に、磁性粒子がチップ内壁面に吸着保持された状態で溶液を吐出して分離を行った後、別の反応容器に充填されたＢ／Ｆ分離用の洗浄液を吸引・吐出して洗浄を行う。
（３）前記チップの外壁面から磁石を離脱させて磁力の影響をなくした後に、基質溶液を吸引・吐出し、チップ内壁面に吸着保持された磁性粒子を分散させ、酵素反応を行わせる。
（４）ＰＭＴにより発光量を測定する。【００２０】
《実施例２：全血検体、血漿検体、血清検体の短時間保存した場合の測定値に関する検討》
全血検体、血清検体、血漿検体について、室温で所定時間静置保存した後、実施例１の測定方法に従って、ヒトｓＣＤ１４−ＳＴの測定を実施した。
具体的には、抗凝固剤（ヘパリン又はＥＤＴＡ）を含む採血管を用いて健常人３人から採取した全血検体、血漿検体、血清検体を、室温で０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、もしくは１０時間（全血検体及び血漿検体のみ）静置保存し、その都度、測定を行うことで各検体の測定値経時変化を確認した。血清検体としては、プレイン採血管（テルモ社製）で採取した後、遠心し血清分離した試料を用いて行った。ＥＤＴＡ血漿検体はＥＤＴＡ採血管（テルモ社製）を使用し、ヘパリン血漿検体はヘパリン採血管（テルモ社製）を使用して調製した。全血検体については上記の採血管で採取した後、血漿分離せずにそのまま使用した。【００２１】
ヘパリン採血管を使用して調製した全血検体及び血漿検体の結果を図１〜図３（検体１〜検体３）に、ＥＤＴＡ採血管を使用して調製した全血検体及び血漿検体の結果を図４〜図６（検体１〜検体３）に示す。それぞれ、採取して直ぐに処理した後測定した検体の値を１００％として、それに対しての増減を％で示した。また、９０％〜１１０％以内の値を安定であるとして評価した。全血検体は採血後５〜８時間以降から測定値が上昇する傾向にあり、同条件で静置保存していた血漿検体の測定値には変化が見られなかった。また、ＥＤＴＡ採血管で調製した全血検体の測定値は、６時間までしか安定でなく、ヘパリン採血管で調整した全血検体の測定値は、４時間までしか安定でなかった。
なお、データは示さないが、全血検体に過度な物理的衝撃、例えば、撹拌操作を実施すると、顕著な測定値の上昇が認められた。
血清検体の結果を図７に示す。同条件で静置保存していた血清検体の測定値には変化が見られなかった。
また、データは示さないが、血清検体および血漿検体の測定値は、少なくとも２４時間まで室温静置した場合についても、充分な安定性を示すことを確認した。【００２２】
《実施例３：全血検体の安定性の検討》
全血検体の測定値の不安定性が何に由来しているものなのか検討した。
条件１：全血検体
条件２：全血検体を室温で各時間静置保存し、測定前に血漿分離を行った血漿
条件３：血漿検体
検体の調製方法及び測定方法は、いずれもヘパリン採血管を使用して実施例２に従った。結果を図８に示す。実施例１と同じように、全血検体（条件１）は４時間以降測定値の上昇が認められるものの、血漿検体（条件３）は８時間まで安定であった。一方、条件２で各時間保存した全血検体から分離した血漿検体は、全血検体（条件１）と同様に測定値の上昇が認められた。
以上より測定値の上昇は、血漿成分由来ではなく血球成分由来であることが示唆された。全血検体を採取後４時間以内にそのまま測定する必要があるのに加え、全血検体を採取後４時間以内に血漿分離しなければ、分離後の測定値の上昇が認められることから、正確な測定値を得るためには採取後４時間以内に血漿分離が必要であることがわかった。【００２３】
《参考例１》
健常人３人から抗凝固剤（ヘパリン又はＥＤＴＡ）を含む採血管を用いて全血検体を採取し、室温で０時間、２時間、４時間、８時間静置保存し、その都度、市販のＣＲＰ測定試薬（PATHFAST hs CRP測定試薬；三菱化学メディエンス社製）を用いて、測定値経時変化を確認した。検体の調製方法及び測定方法は、試薬がＣＲＰ測定試薬であることを除き実施例２と同様に行った。
結果を図９（ヘパリン採血管）及び図１０（ＥＤＴＡ採血管）に示す。実施例２のヒトｓＣＤ１４−ＳＴの場合のように、採血後４時間以降に測定値が上昇するような傾向はなく、ＣＲＰは全血検体中で安定であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明の分析方法は、例えば、敗血症の診断に利用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2011093459.tif 000013
2011093459.tif 000014
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