(57)【要約】  充分に機能的であり、大量供給が可能で安全な肝実質細胞を得るｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法を提供すること。（ａ）ｉＰＳ細胞を浮遊培養し、胚様体（embryoid body）を形成する工程、（ｂ）被覆剤としてゼラチンを使用したプレートへ胚様体を１ウェルあたり１０〜１５個として接着させ培養することにより、胚体内胚葉を誘導する工程、および（ｃ）ＨＧＦおよびＤＭＳＯを添加し、基底膜基質上にて胚体内胚葉を培養することにより肝実質細胞分化を誘導する工程を含む、ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法。
2011016485.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法であって、
（ａ）ｉＰＳ細胞を浮遊培養し、胚様体を形成する工程、
（ｂ）被覆剤としてゼラチンを使用したプレートへ胚様体を１ウェルあたり１０〜１５個として接着させ培養することにより、胚体内胚葉を誘導する工程、および
（ｃ）ＨＧＦおよびＤＭＳＯを添加し、基底膜基質上にて胚体内胚葉を培養することにより肝実質細胞分化を誘導する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記（ａ）の浮遊培養期間が５日間である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記基底膜基質が肺胞ＩＩ型上皮細胞または肝実質細胞由来である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記（ｃ）の分化誘導がさらに肝臓の非実質細胞との共培養によって行われる請求項１記載の方法。
【請求項５】
肝臓の非実質細胞が肝類洞内皮細胞である請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１の方法により誘導される肝実質細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹（induced pluripotent stem）細胞）から機能的な肝実質細胞への分化誘導方法およびそれにより分化された肝実質細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の技術として、胚性幹（embryonic stem：ＥＳ）細胞から肝実質細胞を分化誘導する方法についてはいくつかの報告がなされている。【０００３】
たとえば、ＥＳ細胞での肝実質細胞分化誘導に関する既報告では、胚葉体の形成期間を２〜２．５日間とするものが主流である（非特許文献１〜３）。【０００４】
一方、ｉＰＳ細胞から肝実質細胞を分化誘導する具体的な技術は現在のところ報告されていない。【０００５】
ＥＳ細胞は多能性を有し、三胚葉系のいずれの細胞にも分化しうる。また、ＥＳ細胞は、実験系において無限の増殖能を有する。したがって、ＥＳ細胞から多数の幹細胞を分化誘導し、バイオ人工肝臓の素材として用いることにより、肝疾患患者の治療が可能となる。しかし、ＥＳ細胞由来の肝実質細胞で細胞治療を行う際には、長期的な免疫抑制剤の使用が不可欠であり、感染症などの合併症をきたしうる。またＥＳ細胞を得るには受精卵の胚を必要とするため、ＥＳ細胞の樹立および運用には倫理的な問題が伴う。【０００６】
ｉＰＳ細胞では、受精卵の胚を必要とせず、さらには患者自身の体細胞を使用することが可能であるため、倫理的な問題および拒絶反応の両面において有望な細胞ソースとなり得ると期待されている。【０００７】
しかしながら、ｉＰＳ細胞の分化誘導に関する研究の現状はまだ充分なものではない。また、ｉＰＳ細胞の分化誘導においては、培養時の細胞密度と培養液の選択が難しいことや、ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞に比し肝実質細胞の前駆組織である胚体内胚葉（definitive endoderm）への分化効率が低いこと、さらには、得られる肝実質細胞の機能が充分でないといった問題がある。【０００８】
したがって、ｉＰＳ細胞から機能的な肝実質細胞を分化誘導する技術の開発が切望されている。【０００９】
一方、基底膜は、上皮組織の内側下面である基底面（basal surface）直下に存在する、ラミニン、エンタクチン、ＩＶ型コラーゲンなどのタンパク質およびプロテオグリカンなどの細胞外基質（ＥＣＭ）からなり、細胞を含まない５０〜１００ｎｍの構造体であり、未成熟な上皮細胞が増殖し、成熟した細胞に分化して、本来の形態や、機能を発現するのに必須なものと考えられている。基底膜については、これまで、線維芽細胞を包埋したコラーゲンマトリックス上で上皮細胞を培養する方法や、マトリゲル（Matrigel（登録商標）、ベクトンデッキンソン）を加えたコラーゲン線維基質上で上皮細胞を培養する方法などインビトロでの作製方法が開発され、培養基材としての使用や、人工組織の作製への使用などの例が報告されている（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−９３０５３号公報
【特許文献２】特開２００３−１６９８４６号公報
【特許文献３】特開２００３−９３０５０号公報
【特許文献４】再表２００４−０８５６０６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Basma H, Soto-Gutieerrez A, Yannam GR, Liu L, Ito R, Yamamoto T, Ellis E, Carson SD, Sato S, Chen Y, Muirhead D, Navarro-Alvarez N, Wong RJ, Roy-Chowdhury J, Platt JL, Mercer DF, Miller JD, Strom SC, Kobayashi N, Fox IJ. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology 2009;136:990-999.
【非特許文献２】Rambhatla L, Chiu CP, Kundu P, Peng Y, Carpenter MK. Generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells. Cell Transplant 2003;12:1-11.
【非特許文献３】Soto-Gutieerrez A, Kobayashi N, Rivas-Carrillo JD, Navarro-Alvarez N, Zhao D, Okitsu T, Noguchi H, Basma H, Tabata Y, Chen Y, Tanaka K, Narushima M, Miki A, Ueda T, Jun HS, Yoon JW, Lebkowski J, Tanaka N, Fox IJ. Reversal of mouse hepatic failure using an implanted liver-assist device containing ES cell-derived hepatocytes. Nat Biotechnol 2006;24:1412-1419.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ｉＰＳ細胞から効率的に機能的に優れた肝実質細胞を分化誘導する方法を提供すること、そして、倫理的問題を引き起こすことなく、バイオ人工肝臓の素材としての機能的肝実質細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこでわれわれは、以下の点を工夫し、組み合わせることによりｉＰＳ細胞から肝実質細胞を分化誘導することに成功した。【００１４】
本発明は、ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法であって、
（ａ）ｉＰＳ細胞を浮遊培養し、胚様体（embryoid body）を形成する工程、
（ｂ）被覆剤としてゼラチンを使用したプレートへ胚様体を１ウェルあたり１０〜１５個として接着させ培養することにより、胚体内胚葉を誘導する工程、および
（ｃ）ＨＧＦおよびＤＭＳＯを添加し、基底膜基質上にて胚体内胚葉を培養することにより肝実質細胞分化を誘導する工程
を含む方法に関する。【００１５】
本発明の方法において、（ａ）工程の浮遊培養期間は５日間が好ましい。【００１６】
また、基底膜基質は、肺胞ＩＩ型上皮細胞または肝実質細胞由来のものが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の分化誘導方法によれば、機能的に優れた肝実質細胞を得ることができる。また、安定的に胚体内胚葉を得ることができ、効率よく肝実質細胞への分化誘導が可能となる。本発明の分化肝実質細胞は、ｉＰＳ細胞に基づく肝実質細胞であるため、ＥＳ細胞の樹立および運用に伴う倫理的問題を回避することができる。さらに個体由来のｉＰＳ細胞を用いることにより、免疫抑制剤が不要な個体特異的肝実質細胞を得ることができる。したがって、本発明のｉＰＳ細胞から分化誘導された肝実質細胞は、バイオ人工肝臓の素材としてより好適なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化過程を示す図である。Ａは、日数経過と分化過程を示すスキームである。Ｂ〜ＥはそれぞれｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化過程における、（Ｂ）ｉＰＳ細胞、（Ｃ）胚様体（ＥＢ）、（Ｄ）胚体内胚葉（ＤＥ）、および（Ｅ〜Ｇ）ｉＰＳ細胞由来肝実質細胞（ｉＰＳ−Ｈｅｐｓ）の位相差顕微鏡写真である。（Ｅ）は比較例１、（Ｆ）は実施例１および（Ｇ）は実施例２のｉＰＳ−Ｈｅｐｓを示す。
【図２】アルブミンの発現を免疫組織染色により示す顕微鏡像である。実施例４、比較例１、未分化ｉＰＳ細胞および対照としてＴ３−Ａｌｂ７−ｓＢＭ基質のみの試料を用いた。顕微鏡像Ａｌｂは、ラビット抗マウスアルブミン抗体（カタログ番号64560、MP biomedicals製）を一次抗体とし、DyLight54標識ヒツジ抗ラビット抗体（カタログ番号STAR36D549、MorphoSys UK製）を二次抗体とし、発現したアルブミン（Ａｌｂ）を染色したものを示す。顕微鏡像ＤＡＰＩは、細胞の核をＤＡＰＩ（カタログ番号H-1200、Vector Laboratories Inc,製）で免疫染色したものを示す。また、ＭＥＲＧＥはＡｌｂおよびＤＡＰＩの２つの顕微鏡像を重ね合わせたものを示す。
【図３】本発明のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞のアンモニア除去率を示すグラフである。
【図４】本発明のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞の尿素産生量を示すグラフである。
【図５】本発明のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞のアルブミン産生量を示すグラフである。
【図６】比較例１によりｉＰＳ細胞より分化誘導した肝実質細胞の位相差顕微鏡写真（Ａ〜Ｃ）および電子顕微鏡写真（Ｄ〜Ｆ）である。位相差顕微鏡観察の強拡大像（図６Ｂ）では、類円形の核および細胞質内に豊富な顆粒をもつ多角形の細胞が明瞭に観察される。ＰＡＳ染色陽性であり、細胞内顆粒がグリコーゲンであることを示す（図６Ｃ）。また電子顕微鏡観察ではグリコーゲンの集簇した部位であるグリコーゲン野（図６Ｅ）や、微絨毛を伴う管腔形成像（図６Ｆ）も認め、肝実質細胞に一致した細胞構造を示している。
【図７Ａ】比較例１の分化誘導過程の各段階の細胞における各種遺伝子の発現を示す図である。調べた遺伝子は、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（Ａｌｂ）、トランスフェリン（Ｔｒｆ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）、カルバミル燐酸シンテターゼ（ＣＰＳ）、性決定遺伝子ボックス１７（Sex determining region Y, Box 17）（Ｓｏｘ１７）およびβ−アクチンの遺伝子である。レーン１〜４は、それぞれｉＰＳ細胞、胚様体、胚体内胚葉およびｉＰＳ−Ｈｅｐｓを示す。
【図７Ｂ】アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン遺伝子（Ａｌｂ）、トランスフェリン（Ｔｒｆ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシナーゼ１（ＰＣＫ１）、カルバミル燐酸シンテターゼ（ＣＰＳ）の比較例１の各分化過程における相対的ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ｉＰＳ細胞を機能的肝実質細胞へ分化誘導する方法に関する。
【００２０】
本発明のｉＰＳ細胞から肝実質細胞を分化誘導する方法は、（ａ）ｉＰＳ細胞を浮遊培養し、胚様体を形成する工程、（ｂ）被覆剤としてゼラチンを使用したプレートへ胚様体を１ウェルあたり１０〜１５個として接着させ培養することにより、胚体内胚葉を誘導する工程、および（ｃ）ＨＧＦおよびＤＭＳＯを添加し、基底膜基質上にて胚体内胚葉を培養することにより肝実質細胞分化を誘導する工程を含む。
【００２１】
本明細書において、「１ウェルあたり」と記載する場合、１２ウェル培養プレートの１ウェルを指し、１ウェルの底面積は３．６ｃｍ2を意味する。
【００２２】
次に、本発明の分化誘導方法の一実施態様を示す。
【００２３】
１）  ｉＰＳ細胞を好ましくは５日間浮遊培養し、胚様体を形成した。ＥＳ細胞での肝実質細胞分化誘導に関する既報告では、胚葉体の形成期間を２〜２．５日間とするものが主流である。しかしｉＰＳ細胞はＥＳ細胞に比し肝実質細胞の前駆組織である胚体内胚葉への分化効率が低く、２〜２．５日間の胚葉体形成では、充分な胚体内胚葉が得られない傾向がある。そこで胚様体の形成には５日間浮遊培養することが、胚体内胚葉への分化効率を高めるうえで好ましい。
【００２４】
２）  胚様体をゼラチン被覆プレートに移したのち、アクチビンＡ  １００ｎｇ／ｍｌおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）１００ｎｇ／ｍｌ、低濃度の血清代替物（serum replacement）を添加のうえ３日間培養し、胚体内胚葉を誘導した。５日間かけて形成した胚様体は、２〜２．５日かけて形成したものに比し、プレートへの接着能が低下しているため、被覆剤なしではプレートへ接着し分化を開始することができない。そこでわれわれはゼラチンを被覆剤として使用することで良好な接着性を得た。
【００２５】
３）  胚様体の培養は１２ウェルのゼラチン被覆プレートで行い、１ウェルあたりの胚様体は１０〜１５個として、胚体内胚葉の誘導を開始した。分化誘導過程において、胚様体周囲より細胞増殖が開始し、これらが肝実質細胞へと分化するため、胚様体を適切な密度でプレートに移すことが重要である。胚様体の密度が低い場合（たとえば１ウェルあたり１０個より少ない場合）、分化誘導の終了時点で得られる肝実質細胞が少なくなる。一方、胚様体の密度が高い場合（たとえば１ウェルあたり１５個より多い場合）には、心筋細胞への分化が誘導されやすくなるため、得られる肝実質細胞の純度が低下する。また培地不足による細胞の死滅をきたしやすい。したがって１ウェルあたりの胚様体を１０〜１５個として胚体内胚葉の誘導を開始することが重要であった。
【００２６】
４）  一連の分化誘導過程において、無血清培地、すなわちノックアウトＤＭＥＭおよびノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を使用した。従来、ＥＳ細胞の分化誘導過程では血清培地が用いられてきたが、ｉＰＳ細胞の培養および分化誘導においては、無血清培地の方が血清培地に比し高い細胞増殖能を示したため、肝実質細胞の分化誘導において上記の組み合わせを用い、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、基底膜基質上にて胚体内胚葉を培養することにより、アンモニアを代謝し、尿素を産生することができる機能的な肝実質細胞の分化誘導に成功した。
【００２７】
以上、１）ｉＰＳ細胞を好ましくは５日間浮遊培養し、胚様体を形成する、２）ゼラチンを被覆剤として使用し、胚様体をプレートへ接着させる、３）１ウェルあたりの胚様体は１０〜１５個として胚体内胚葉の誘導を開始する、４）好ましくは無血清培地、すなわちノックアウトＤＭＥＭおよびＫＳＲを使用し、ＨＧＦとＤＭＳＯを添加し、基底膜基質上にて胚体内胚葉を培養することにより肝実質細胞への分化を始める、上記１）〜４）の工程、およびその組み合わせが本願発明の特徴である。
【００２８】
本発明により、効果的かつ安定的にｉＰＳ細胞から肝実質細胞を誘導することができる。
【００２９】
ｉＰＳ細胞としては、哺乳類由来のものが好ましく、哺乳類としては、ヒト、カニクイザルなどの霊長類、マウスなどが挙げられる。
【００３０】
ｉＰＳ細胞の作製方法としては、Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S., Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007; 448: 313-317 などを参照することができる。また、たとえばマウスｉＰＳ細胞は、理研細胞バンクより入手可能である。
【００３１】
本発明においては、必要に応じて、ｉＰＳ細胞を分化しない条件下に継代、維持、増殖させ（以下、この工程を調製工程という場合がある）、必要に応じてその一部を使用して肝実質細胞に分化誘導する。
【００３２】
調製工程において、ｉＰＳ細胞の培養を行う容器としては、増殖能の点からフィーダー細胞でコートされたものを使用するのが好ましい。フィーダー細胞としては、γ線で照射処理したマウス胚性繊維芽細胞が挙げられる。マウス由来のｉＰＳ細胞の場合、フィーダー細胞でコートした培養容器を使用することが好ましい。
【００３３】
調製工程における培養条件としては、通常のＥＳ細胞と同様の条件を採用することができる。調製工程の要点は、２４時間おきに培地を交換して栄養の枯渇を防ぐこと、細胞密度が増加しコロニー同士が接着する前に継代することなどが挙げられる。培養温度は、３６〜３７℃の範囲が好ましく、ｐＨは７．３〜７．４の範囲が好ましい。マウスｉＰＳ細胞の調製工程では、一般に分化を抑制するために白血病抑制因子（ＬＩＦ）を使用する。
【００３４】
本発明の方法によりｉＰＳ細胞より分化誘導された肝実質細胞は、形態学的特徴の観察および逆転写ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で確認できる。
【００３５】
形態学的な確認方法としては、位相差型顕微鏡で観察される複数の核を有する細胞および電子顕微鏡で観察される細胞質内に豊富な顆粒、特にグリコーゲン顆粒の存在といった、肝実質細胞に特異的な形態学的特徴を確認することが挙げられる。
【００３６】
また、ＲＴ−ＰＣＲにより、誘導された肝実質細胞の形質発現を遺伝子の発現から評価することもできる。アルブミン遺伝子が発現していることと、未分化な遺伝子であるα−フェトプロテインが発現していないことがＲＴ−ＰＣＲなどで確認できれば、分化が誘導されているということができる。また、肝実質細胞としての成熟度を表わす指標として、アルブミン、尿素合成に関する酵素のカルバミルリン酸シンテターゼ（ＣＰＳ）、糖新生を調節する酵素のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）、トランスフェリン（Ｔｒｆ）などの遺伝子発現が認められるのが好ましい。
【００３７】
さらには、実際に肝実質細胞として機能できるか否かは、培地中にアンモニア、リドカイン、ジアゼパムなどを添加して代謝できるか否かが大きな点となる。また、培地中にアルブミン、尿素が産生されていれば、充分に機能的な肝実質細胞へと分化しているということができる。
【００３８】
本発明に用いる基底膜基質としては、様々なものを使用することができ、特に限定されるものではない。たとえば得られた肝実質細胞の機能が充分に確認されたという点から、特開２００３−９３０５３号公報などに記載のマトリゲル存在下に基底膜形成能を有する細胞を培養することにより得られる基底膜基質や、特開２００３−９３０５０号公報などに記載の糖鎖β-GlcNAcを結合したＭＡＳＴポリマー（maleic anhydride-styrene copolymer）をコートしたコラーゲン線維上に基底膜形成能を有する細胞を培養することにより得られる基底膜基質が好ましい。ここで、マトリゲルとは、Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍マトリックスから抽出された基底膜調製物であり（J. Exp. Med. 145, 204-220, 1977）、細胞外基質合成に影響を及ぼす可能性のある種々のサイトカインの他に、ラミニン−１１１、エンタクチン、ＩＶ型コラーゲン、パールカンなどを含んでいる（Exp. Cell Res. 202, 1-8, 1992）。
【００３９】
基底膜形成能を有する細胞としては、上皮細胞、血管内皮細胞、グリアなど種々のものを使用することができる。肝臓への分化誘導という点からは、例えば、肺胞ＩＩ型上皮細胞などの肺由来の細胞や、肝実質細胞などの肝臓由来の細胞、あるいは、２９３細胞を遺伝子改変してｈＬＮ−５１１を安定発現し、細胞外に大量分泌するｒＬＮ−１０細胞を用いることが好ましく、さらには肝実質細胞が最も好ましい。安定した質の基底膜基質が大量に得られることから株化した細胞（癌化および不死化細胞株）を使用することが好ましく、また安全面を鑑みると不死化した細胞系を使用することがより好ましい。
【００４０】
基底膜の主要糖タンパク質であるラミニンは、α、β、γの３種類のサブユニットからなる複合体で、種々のアイソフォーム、ラミニン−１１１（α１β１γ１）やラミニン−５１１（α５β１γ１）などが存在する。
【００４１】
このような基底膜基質の作製方法としては、たとえば、特開２００３−９３０５０号公報または特開２００３−９３０５３号公報などに記載の技術を使用することができる。
【００４２】
また、基底膜基質上で胚体内胚葉と共に各種の細胞を共培養することで、得られる肝実質細胞の機能を向上させることができる。共培養には、肝類洞内皮細胞や胆管上皮細胞、肝星細胞などを用いることができるが、ヒト肝類洞内皮細胞株などが望ましい。
【００４３】
よって、本発明の好ましい一実施態様は、ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法であって、（ａ）ｉＰＳ細胞を浮遊培養し、胚様体を形成する工程、（ｂ）被覆剤としてゼラチンを使用したプレートへ胚様体を１ウェルあたり１０〜１５個として接着させ培養することにより、胚体内胚葉を誘導する工程、および（ｃ）ＨＧＦおよびＤＭＳＯを添加し、基底膜基質上にて胚体内胚葉を肝類洞内皮細胞と共培養することにより肝実質細胞分化を誘導する工程を含む方法に関する。
【００４４】
本発明においては、ｉＰＳ細胞を胚体内胚葉に分化させ必要細胞数までプールしたのち、必要に応じて肝実質細胞に分化させることにより、倫理的問題を生ずることなく、安全な肝実質細胞が大量に供給できる。これをバイオ人工肝臓の細胞源とすることで万人が恩恵を受けることができるバイオ人工肝臓の開発が大いに期待できる。
【００４５】
よって、本発明のもう１つの態様は、ｉＰＳ細胞から分化誘導させた肝実質細胞の用途に関する。これらの肝実質細胞は、バイオ人工肝臓の細胞源に使用することができる。
【００４６】
バイオ人工肝臓とは、肝実質細胞を担体に組み込んで固定しリアクター化した生体内の肝臓を模倣した人工肝臓装置であり、患者の血液を当該装置内に導き、肝実質細胞の代謝能を利用して血液中のトキシンの除去と肝臓細胞に由来する凝固因子などの生理活性物質の供給とを行うことができる装置である。
【００４７】
このようなバイオ人工肝臓としては、中空糸型のリアクター（デバイス）と分離・培養細胞を組み合わせたバイブリッド型の人工肝臓などが挙げられる。バイオ人工肝臓は、体外に装着して血管に接続するもの、体内に留置して血管に接続するもの、または血管に接続せずに腹腔内に留置するものの三つの形態がある。本発明の肝実質細胞は、いずれの形態のバイオ人工肝臓にも使用可能であるが、細胞移入などに伴う危険性を回避するという点から体外型であることが好ましい。
【００４８】
バイオ人工肝臓に用いられるバイオリアクターとしては、サーシ  バイオメディカル社（Circe Biomedical Inc.）（レキシントン、マサチューセッツ州、米国）の支援下でシダーズサイナイ医療センター（Cedars-Sinai Medical Center）（ロサンジェルス、カリフォルニア州、米国）のディメトリュー（Demetriou）らを中心としたブタ肝実質細胞を用いたバイオ人工肝臓治療用のヘパトアシスト（HepatAssist）（Hui T, Rozga J, Demetriou AA. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2001; 8: 1-15.）や、ブタ肝実質細胞を使用したドイツのGerlachらのＭＥＬＳ（モジュラー体外肝臓システム（Modular Extracorporeal Liver System））など、様々なタイプが知られている。これらのリアクターは、肝実質細胞が付着するための足場が無いため、細胞はただ単に、中空糸内スペースか、中空糸外スペースに充填されるのみで浮遊した状態となる傾向がある。肝実質細胞は、浮遊状態では、分化機能が充分に発現されない傾向があり、さらに周りの細胞と衝突し、ストレス刺激を受けやすい。したがって、肝実質細胞に足場が提供できるよう、中空糸と不織布からなるリアクターがより好ましく使用されている（小林直哉、他「ハイブリッド人工肝臓」、肝胆膵、２００３年、４６巻、ｐ３８１−３９３）。
【００４９】
さらに、本発明の方法によりｉＰＳ細胞から分化誘導された肝実質細胞、特にヒト肝実質細胞は、薬剤の代謝試験用細胞として有用である。すなわち、新薬開発や安全性試験、毒性試験などにおける試験用細胞として有用である。
【００５０】
肝実質細胞は様々な薬物代謝の中心となっており、薬物の毒性や安全性を検定するためには、肝実質細胞に薬物を投与して代謝のされ方を調べることが必要である。そして、物質代謝においては、ヒトと実験動物とでは大きな違いがあるので、最終的なテストはヒト肝実質細胞を使用した試験が不可欠である。この点において、均一な品質のヒト肝実質細胞を大量に提供できる本発明は有用である。このような代謝試験に用いる装置としては、前記のバイオ人工肝臓と同様な構造のものなどが使用できる。
【００５１】
さらに、本発明の方法によりｉＰＳ細胞から分化誘導された肝実質細胞、特にヒト肝実質細胞は、生理活性物質の産生に使用できる。このような生理活性物質としては、アルブミン、各種血液凝固因子などが挙げられる。このような生理活性物質の製造装置としては、前記のバイオ人工肝臓と同様な構造のものなどが使用できる。
【００５２】
以下、本発明をマウス由来のｉＰＳ細胞を用いた実施例をあげて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
実施例１〜４
ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導
（１）  未分化ｉＰＳ細胞の培養
文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを介して理研バイオリソースセンターより入手したマウスｉＰＳ細胞（Cell no. APS0001, Cell name iPS-MEF-Ng-20D-17, Lot no. 006）を用いた。マウスｉＰＳ細胞は、マイトマイシンＣ（カタログ番号ＧＲ−３１１、バイオモル（Biomol）、エンゾライフサイエンスインターナショナル（Enzo Life Sciences International））により不活化したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）（大日本住友製薬）をフィーダー細胞とし、ゼラチン（カタログ番号ＥＳ−００６−Ｂ、スペシャルティメディア（Specialtymedia）、ケミコンインターナショナル（Chemicon international））被覆プレート上にて３７℃、ＣＯ2濃度５％の条件下で培養した。培地はComplete ES cell medium（カタログ番号ＳＦ００１−５００Ｐ、ミリポア（Millipore）、ケミコンインターナショナル）を用い、白血病抑制因子（recombinant leukemia inhibitory factor:ＬＩＦ、カタログ番号ＬＩＦ２０１０、ミリポア、ケミコンインターナショナル）１０００Ｕ／ｍｌを添加した。継代数５〜２０のマウスｉＰＳ細胞（図１（Ｂ））を分化誘導実験に使用した。【００５４】
（２）  第１段階：胚様体（ＥＢ）の形成（第０日〜第４日）
フィーダー細胞上で培養したｉＰＳ細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ（カタログ番号Ｔ４０４９、シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）  ジャパン）を用いてプレートより分離したのち、８００ｒｐｍで３分間遠心分離しペレットとして収集した。その後ノックアウト血清代替因子（Knockout serum replacement:ＫＳＲ、カタログ番号１０８２８、ギブコ（GIBCO）、インビトロジェン（Invitrogen））１５％、非必須アミノ酸（カタログ番号１６８１０４９、ＭＰ  バイオメディカルズ（biomedicals））１％、２−メルカプトエタノール（カタログ番号２１９８５−０２３、ギブコ、インビトロジェン）１％、ペニシリン／ストレプトマイシン（カタログ番号ＥＳ−１０１−Ｂ、スペシャルティメディア、ケミコンインターナショナル）１％、Ｌ−グルタミン（カタログ番号ＤＳＭ２０２、ＤＳファーマバイオメディカル（DS pharma biomedical））１％を添加したノックアウトＤＭＥＭ（カタログ番号１０８２９、ギブコ、インビトロジェン）にて懸濁した。この細胞懸濁液を低接着性の６ウェルプレート（カタログ番号３４７１、コスター（Costar）、コーニング（Corning））へ移し、２×１０5ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ウェルの密度で浮遊培養し、胚様体の形成を開始した。培地は毎日半分の量を交換した。【００５５】
胚様体の形成開始後、細胞が集合し始め、１日後には球形の細胞集塊を形成した。これらの細胞集塊はその後もさらに結合し、５日後には地図状の形態をなす集塊となった（図１（Ｃ））。【００５６】
（３）第２段階：胚体内胚葉（ＤＥ）の誘導（第５日〜第７日）
第５日に胚様体を含む培地を１ウェルから回収し、１，０００ｒｐｍで３分間遠心分離しペレットとして胚様体を収集した。胚様体をその後、ペニシリン／ストレプトマイシン １％、Ｌ−グルタミン １％、アクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ、Ｒ＆Ｄシステムズ）１００ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ（カタログ番号１００−１８Ｂ、ぺプロテック（Peprotech））１００ｎｇ／ｍｌを添加したノックアウトＤＭＥＭ １２ｍｌに懸濁した。その後、ゼラチン被覆した１２ウェルプレート（カタログ番号３５３５０３、日本ベクトン・ディッキンソン）を用意し、１ウェルにつき胚様体を１０〜１５個ずつ移した。胚体内胚葉の形成のため、さらに３日間培養した。ＫＳＲは第６日に０．２％、第７日に２％となるよう添加した。培地は毎日半分の量を交換した。【００５７】
ゼラチン被覆プレートに移された後、胚様体はプレートに接着し、胚様体の周囲より細胞増殖が開始された（図１（Ｄ））。【００５８】
（４）基底膜基質の作製
ａ）ｍＬＮ−１１１アイソフォーム型基底膜（ｍＬＮ１１１−ｓＢＭ）基質の作製
ラット不死化肺胞ＩＩ型上皮細胞（ＳＶ４０−Ｔ２細胞：Dr. A. Clement, Hopital Armand Trousseau, Paris (参考文献６参照)から供与された肺胞ＩＩ型上皮細胞（ＳＶ４０−ラージＴ抗原遺伝子をトランスフェクトしたラットから採取））を参考文献７記載の方法に準じてマトリゲル（カタログ番号３５６２３４、日本ベクトン・デッキンソン）の存在下で培養することにより、１２ウェル培養プレート用インサート（カタログ番号３５３４９４、日本ベクトン・デッキンソン）上にｍＬＮ−１１１アイソフォーム型基底膜（ｍＬＮ１１１−ｓＢＭ）構造体を作製し、タンパク質分解酵素阻害剤の混合液（ＰＩＣ、ペプチド研究所社製）を添加した等張のリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；ＰＢＳ（−））中で、０．１％のトリトンＸ−１００（界面活性剤）２ｍｌを用いて、上皮細胞の脂質成分を溶解・溶出すると同時に、共存する５０ｍＭ ＮＨ3で、基底膜構造体表面に残存するタンパク質を溶解する操作を２回（基底膜構造体のタンパク質までは溶かしてはならない）繰り返した後、再度ＰＩＣを含むＰＢＳ（−）溶液で基底膜構造体から界面活性剤とアルカリとを洗浄することによって、肺胞ＩＩ型上皮細胞層を剥離して基底膜構造体が露出したｍＬＮ−１１１アイソフォーム型基底膜（ｍＬＮ１１１−ｓＢＭ）基質を作製した。【００５９】
ｂ）Ｔ３−Ａｌｂ７アイソフォーム型基底膜（Ｔ３−Ａｌｂ７−ｓＢＭ）基質の作製
ヒト不死化肝実質細胞（Ｔ３−Ａｌｂ７細胞、薬剤誘導性Ｃｒｅ組み換え酵素発現不死化ヒト肝細胞株  ＴＴＮＴ−１６−Ｔ３（寄託機関：ＩＰＯＤ  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１５年１０月１日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０１、Totsugawa T, et al., Survival of liver failure pigs by transplantation of reversibly immortalized human hepatocytes with Tamoxifen-mediated self-recombination. J. Hepatol. 47： 74-82, 2007 参照、万人が使用できる））を、特開２００３−９３０５０号公報記載の方法に準じて糖鎖β-GlcNAcを結合したＭＡＳＴポリマー（maleic anhydride-styrene copolymer：特許文献４参照）をコートしたコラーゲン線維上に播種し、約２週間培養することで基底膜構造体を形成させた。基底膜構造体形成後、５０ｍＭ ＮＨ3、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び、プロテアーゼインヒビターカクテル（ＰＩＣ、ペプチド研究所社製）を含むＤ−ＰＢＳ（−）溶液でＴ３−Ａｌｂ７細胞を処理することで細胞のみを除去し、Ｔ３−Ａｌｂ７細胞が形成した基底膜構造体を傷つけることなく露出させることで、Ｔ３−Ａｌｂ７アイソフォーム型基底膜（Ｔ３−Ａｌｂ７−ｓＢＭ）基質を作製した。【００６０】
（５）第３段階：ｉＰＳ細胞由来肝実質細胞（iPS-Heps）への分化（第８日〜第１６日）
第８日に、胚体内胚葉をトリプシン−ＥＤＴＡ（カタログ番号Ｔ４０４９、シグマ−アルドリッチジャパン）を用いてプレートより分離したのち、８００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ペレットとして収集した。ＫＳＲ １０％、非必須アミノ酸 １％、Ｌ−グルタミン １％、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、カタログ番号Ｄ４５４０−１００ＭＬ、シグマ−アルドリッチ）１％、ＨＧＦ（カタログ番号１００−３９、ぺプロテック）１００ｎｇ／ｍｌを添加したノックアウトＤＭＥＭを培地として用意し、１ウェルから収集したペレットに対して０．５ｍｌの培地で懸濁した。この懸濁液を、前記（４）で作製したｍＬＮ１１１−ｓＢＭ基質またはＴ３−Ａｌｂ７−ｓＢＭ基質を含むインサート内に滴下した。【００６１】
インサート対応１２ウェル培養プレート（カタログ番号３５３５０３、日本ベクトン・ディッキンソン）の１ウェルに培地１．５ｍｌを加え、これに胚体内胚葉、ｍＬＮ１１１−ｓＢＭ基質および培地０．５ｍｌを含むインサートを載せ培養し、これを実施例１とした。また、インサート対応１２ウェル培養プレートのプレート底面に、あらかじめ５．０×１０5個のヒト不死化肝類洞内皮細胞株  ＴＭＮＴ−１（寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、寄託日：平成１４年４月１６日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０１７、参考文献５参照、万人が使用できる）を播種し、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）ならびに１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した、４．５ｇ／Ｌ濃度のグルコースを含むＤＭＥＭ（DMEM high glucose）中、１日以上培養しておき、このウェルに培地１．５ｍｌを加え、胚体内胚葉、ｍＬＮ１１１−ｓＢＭ基質および培地０．５ｍｌを含むインサートを載せ培養し、これを実施例２とした。それぞれ第１０日にＨＧＦを含まない培地、すなわちＫＳＲ １０％、非必須アミノ酸 １％、Ｌ−グルタミン １％、ＤＭＳＯ １％を添加したノックアウトＤＭＥＭに交換し、以後は２日おきに全量の培地を交換した。分化誘導は第１６日に終了した。基底膜基質を用いない比較例１と比べ、実施例１および２では多数のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞が得られた（図１（Ｅ〜Ｇ））。【００６２】
インサート対応１２ウェル培養プレートの１ウェルに培地１．５ｍｌを加え、これに胚体内胚葉、Ｔ３−Ａｌｂ７−ｓＢＭ基質および培地０．５ｍｌを含むインサートを載せ培養し、これを実施例３とした。インサート対応１２ウェル培養プレートのプレート底面に、あらかじめ５．０×１０5個のＴＭＮＫ−１を播種し１日以上培養しておき、このウェルに培地１．５ｍｌを加え、胚体内胚葉、Ｔ３−Ａｌｂ７−ｓＢＭ基質および培地０．５ｍｌを含むインサートを載せ培養し、これを実施例４とした。それぞれ第１０日にＨＧＦを含まない培地、すなわちＫＳＲ １％、非必須アミノ酸 １％、Ｌ−グルタミン １％、ＤＭＳＯ １％を添加したノックアウトＤＭＥＭに交換し、以後は２日おきに全量の培地を交換した。分化誘導は第１６日に終了した。基底膜基質を用いない比較例１と比べ、実施例３および４では多数のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞が得られた（図２および５）。【００６３】
試験例１
ｉＰＳ細胞由来肝実質細胞の機能評価
（Ａ）アンモニア代謝能
未分化ｉＰＳ細胞ならびに実施例１および実施例２の方法にしたがって分化誘導したｉＰＳ細胞由来肝実質細胞および後述の比較例１の方法にしたがって分化誘導したｉＰＳ細胞由来肝実質細胞に０．５６ｍＭ濃度のアンモニア硫酸塩（カタログ番号０２６１９−１５、シグマ−アルドリッチ製）をそれぞれ添加し、２４時間後に培養上清を回収してアンモニア代謝能を測定した。アンモニア濃度はアンモニアテスト−ワコー（カタログ番号２７７−１４４０１、和光純薬製）を用いて測定した。【００６４】
結果を図３に示す。未分化ｉＰＳ細胞ではアンモニア濃度はむしろ増加し、除去率は−４２．９±１０．４％であった。本発明のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞は、実施例１では培養液中に添加されたアンモニアの６３．７±７．３％を代謝し、実施例２では３１．９±５．３％を代謝した。これは比較例１のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞の１８．１±５．９％と比較して優れた代謝能を示した。【００６５】
（Ｂ）尿素の産生
未分化ｉＰＳ細胞ならびに実施例１および実施例２の方法にしたがって分化誘導したｉＰＳ細胞由来肝実質細胞および後述の比較例１の方法にしたがって分化誘導したｉＰＳ細胞由来肝実質細胞それぞれの尿素産生能を評価するため、培地交換より２４時間後に培養液を採取し、尿素の産生量を測定(SRL社に委託)した。結果を図４に示す。未分化ｉＰＳ細胞は尿素産生能を示さなかった。本発明のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞は、実施例１では１ウェルあたり１３３±１５３ｎｇの尿素産生能を、実施例２では１ウェルあたり１６７±１５３ｎｇの尿素産生能を示した。これは比較例１のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞の３３．３±５７．７ｎｇと比較して尿素産生量が多い傾向を示した。【００６６】
（Ｃ）アルブミンの産生
未分化ｉＰＳ細胞ならびに実施例２〜４の方法にしたがって分化誘導したｉＰＳ細胞由来肝実質細胞および後述の比較例１の方法にしたがって分化誘導したｉＰＳ細胞由来肝実質細胞それぞれのアルブミン産生量を評価するため、培地交換より２４時間後に培養液を採取し、AssayMaxマウスアルブミンELISAキット(カタログ番号EMA3201-1、Gentaur製)を用いてアルブミン量を測定した。結果を図５に示す。未分化ｉＰＳ細胞はアルブミン産生能を示さなかった。比較例１のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞は５３±３８ｐｇのアルブミン産生能を示した。実施例１ではアルブミン産生量を示さず、実施例２では５１４±８９０ｐｇのアルブミン産生がみられた。これらに比べ、実施例３では２３２０±６４ｐｇ、実施例４では２６３５±１１１ｐｇと有意に高いアルブミン産生がみられた。【００６７】
（Ｄ）アルブミン発現の陽性率
未分化ｉＰＳ細胞、実施例４の方法にしたがって分化誘導したｉＰＳ細胞由来肝実質細胞、および後述の比較例１の方法にしたがって分化誘導したｉＰＳ細胞由来肝実質細胞のそれぞれのアルブミン発現の陽性率を評価するためラビット抗マウスアルブミン抗体（カタログ番号64560、MP biomedicals製）を一次抗体とし、DyLight54標識ヒツジ抗ラビット抗体（カタログ番号STAR36D549、MorphoSys UK製）を二次抗体とし、発現したアルブミン（Ａｌｂ）を染色した。また、細胞の核をＤＡＰＩ（カタログ番号H-1200、Vector Laboratories Inc,製）で免疫染色することにより総細胞数とＡｌｂ発現細胞数を測定し、Ａｌｂ陽性細胞／ＤＡＰＩで染色された核の数としてＡｌｂ発現の陽性率を算出した。結果を図２に示す。未分化ｉＰＳ細胞および対照のＴ３−Ａｌｂ７−ｓＢＭ基質のみの試料ではＡｌｂ陽性率は０％であった。比較例１のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞は２０．６％のＡｌｂ陽性率を示した。一方、実施例４では３１．８％と有意に高いＡｌｂ陽性率がみられた。【００６８】
比較例１
実施例１の（１）〜（３）までを同様に行ない胚体内胚葉を得た。【００６９】
（４ａ）第３段階：ｉＰＳ細胞由来肝実質細胞（iPS-Heps）への分化（第８日〜第１６日）
第８日に培地をＫＳＲ １０％、非必須アミノ酸 １％、Ｌ−グルタミン １％、ＤＭＳＯ １％、ＨＧＦ（カタログ番号１００−３９、ぺプロテック）１００ｎｇ／ｍｌを添加したノックアウトＤＭＥＭに交換した。培地は毎日半分の量を交換した。分化誘導は第１６日に終了した。形態的に、分化の最終段階でマウスｉＰＳ細胞は肝実質細胞に類似した形態を示した。すなわち細胞質内に豊富な顆粒をもつ多角形の細胞となった（図１Ｅ、図６Ａ、図６Ｂ）。【００７０】
参考例１
比較例１のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞（ｉＰＳ−Ｈｅｐｓ）の細胞形態
比較例１のｉＰＳ細胞由来肝実質細胞の細胞形態を位相差顕微鏡および電子顕微鏡を用いて観察した。位相差顕微鏡観察の強拡大像（図６Ｂ）では、類円形の核および細胞質内に豊富な顆粒をもつ多角形の細胞が明瞭に観察される。ＰＡＳ染色陽性であり、細胞内顆粒がグリコーゲンであることを示す（図６Ｃ）。また電子顕微鏡観察ではグリコーゲンの集簇した部位であるグリコーゲン野（図６Ｅ）や、微絨毛を伴う管腔形成像（図６Ｆ）も認め、肝実質細胞に一致した細胞構造を示している。【００７１】
参考例２
ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導過程における遺伝子発現
比較例１の分化誘導過程の各段階でＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＮＡはＴＲＩ ｚｏｌ（カタログ番号１５５９６−０２６、インビトロジェン）を用いて抽出した。ｃＤＮＡは２μｇのＲＮＡから、ＭｕＬＶ逆転写酵素（カタログ番号Ｎ８０８００１８、アプライド  バイオシステムズ（Applied Biosystems））およびＲＮアーゼ阻害剤（カタログ番号Ｎ８０８０１１９、アプライド  バイオシステムズ）を用い、タカラ社性サーマルサイクラーを使用して作成した。ＲＴ−ＰＣＲはＡｍｐｌｉＴａｑゴールドＤＮＡポリメラーゼ、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲゴールドバッファー、ＭｇＣｌ2溶液（カタログ番号６０６０８０、アプライド  バイオシステムズ）を用いて行った。遺伝子としては、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（Ａｌｂ）、トランスフェリン（Ｔｒｆ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）、カルバミル燐酸シンテターゼ（ＣＰＳ）、性決定遺伝子ボックス１７（Ｓｏｘ１７）および内因性コントロールであるβ−アクチンの遺伝子を調べた。ＲＴ−ＰＣＲで使用したプライマーを表１に示す。ＰＣＲ産物は２．５％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドを用いて可視化した（図７Ａ）。図７Ａ中、レーン１〜４はそれぞれ、ｉＰＳ細胞、ＥＢ、ＤＥおよびｉＰＳ−Ｈｅｐｓである。【００７２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはLight Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I（カタログ番号０３００３２３０００１、 ロッシュアプライドサイエンス（Roche Applied Science）、ＩＮ）キットを使用し、ライトサイクラー１．５（ロッシュアプライドサイエンス）を用いて実施した。遺伝子としては、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン（Ａｌｂ）、トランスフェリン（Ｔｒｆ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）、カルバミル燐酸シンテターゼ（ＣＰＳ）および内因性コントロールであるβ−アクチンの遺伝子を調べた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで使用したプライマーを表２に示す。【００７３】
ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果では、分化過程に伴って成熟肝実質細胞の指標であるアルブミンの遺伝子発現が徐々に増加した。また尿素合成に関する酵素のカルバミルリン酸シンテターゼ（ＣＰＳ）、糖新生を調節する酵素のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）、トランスフェリン（Ｔｒｆ）など、肝実質細胞で豊富にみられる遺伝子についても経時的に発現が増強していた（図７Ｂ）。【００７４】
【表１】
2011016485.tif 000003
【００７５】
【表２】
2011016485.tif 000004
【００７６】
参考例３
胚体内胚葉の分化効率に対する胚様体の形成期間の影響を調べた。【００７７】
実施例１の第１段階と同様に５日間かけて形成したＥＢを、実施例１の第２段階と同様の条件で内胚葉分化誘導を５日間かけて行った（試料１）。形成期間を２日間とした以外は実施例１の第１段階と同様に形成したＥＢを、実施例１の第２段階と同様の条件で内胚葉分化誘導を５日間かけて行った（試料２）。得られた細胞の遺伝子の発現を実施例２と同様にリアルタイムＰＣＲで分析した。調べた遺伝子は性決定遺伝子ボックス１７（Ｓｏｘ１７）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（chemokine (C-X-C motif) receptor 4）（Ｃｘｃｒ４）およびフォークヘッドボックスＡ２（forkhead box A2）（Ｆｏｘａ２）であり、使用したプライマーを表３に示す。【００７８】
試料１では、試料２と比較して、汎内胚葉マーカーであるＳｏｘ１７およびＦｏｘａ２の発現はそれぞれ１．４および２．８倍であり、また胚体内胚葉マーカーであるＣｘｃｒ４の発現は１．１倍であった。【００７９】
以上より、胚様体の形成期間は２日間よりも５日間のほうが、その後の胚体内胚葉の分化効率が良好であることが示された。【００８０】
【表３】
2011016485.tif 000005
【００８１】
［参考文献］
1) Kubo A, Shinozaki K, Shannon JM, Kouskoff V, Kennedy M, Woo S, Fehling HJ, Keller G. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development 2004;131:1651-1662.
2) Basma H, Soto-Gutieerrez A, Yannam GR, Liu L, Ito R, Yamamoto T, Ellis E, Carson SD, Sato S, Chen Y, Muirhead D, Navarro-Alvarez N, Wong RJ, Roy-Chowdhury J, Platt JL, Mercer DF, Miller JD, Strom SC, Kobayashi N, Fox IJ. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology 2009;136:990-999.
3) Soto-Gutieerrez A, Kobayashi N, Rivas-Carrillo JD, Navarro-Alvarez N, Zhao D, Okitsu T, Noguchi H, Basma H, Tabata Y, Chen Y, Tanaka K, Narushima M, Miki A, Ueda T, Jun HS, Yoon JW, Lebkowski J, Tanaka N, Fox IJ. Reversal of mouse hepatic failure using an implanted liver-assist device containing ES cell-derived hepatocytes. Nat Biotechnol 2006;24:1412-1419.
4) Yasunaga M, Tada S, Torikai-Nishikawa S, Nakano Y, Okada M, Jakt LM, Nishikawa S, Chiba T, Era T, Nishikawa S. Induction and monitoring of definitive and visceral endoderm differentiation of mouse ES cells. Nat Biotechnol 2005;23:1542-1550.
5) Matsumura, T. et al. Establishment of an immortalized human-liver endothelial cell line with SV40T and hTERT. Transplantation 77, 1357-1365 (2004).
6) Clement et al., Exp. Cell Res., 196:198-205, 1991.
7) Hosokawa T, Furuyama A, Katagiri K, Betsuyaku T, Nishimura M, and Mochitate K.   Differentiation of Tracheal Basal Cells to Ciliated Cells and Tissue Reconstruction on the Synthesized Basement Membrane Substratum In Vitro.  Connective Tissue Research 48：9-18, 2007.
8) Totsugawa T, Chen Y, Soto-Gutierrez A, Rivas-Carrillo1 JD, Navarro-Alvarez N, Noguchi H, Okitsu T, Westerman KA, Tanaka N, Leboulch P, and Kobayashi N. Survival of liver failure pigs by transplantation of 3 reversibly immortalized human hepatocytes with Tamoxifen-mediated self-recombination.  J. Hepatol. 47：74-82, 2007.
【配列表フリーテキスト】
【００８２】
配列番号１：ＡＦＰ遺伝子を検出するためのＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２：ＡＦＰ遺伝子を検出するためのＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号３：Ａｌｂ遺伝子を検出するためのＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号４：Ａｌｂ遺伝子を検出するためのＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号５：Ｔｒｆ遺伝子を検出するためのＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号６：Ｔｒｆ遺伝子を検出するためのＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号７：ＰＣＫ１遺伝子を検出するためのＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号８：ＰＣＫ１遺伝子を検出するためのＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号９：ＣＰＳ遺伝子を検出するためのＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１０：ＣＰＳ遺伝子を検出するためのＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号１１：Ｓｏｘ１７遺伝子を検出するためのＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１２：Ｓｏｘ１７遺伝子を検出するためのＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号１３：β−アクチン遺伝子を検出するためのＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１４：β−アクチン遺伝子を検出するためのＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号１５：ＡＦＰ遺伝子を検出するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１６：ＡＦＰ遺伝子を検出するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号１７：Ａｌｂ遺伝子を検出するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１８：Ａｌｂ遺伝子を検出するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号１９：Ｓｏｘ１７遺伝子を検出するためのリアルタイムＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２０：Ｓｏｘ１７遺伝子を検出するためのリアルタイムＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号２１：Ｃｘｃｒ４遺伝子を検出するためのリアルタイムＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２２：Ｃｘｃｒ４遺伝子を検出するためのリアルタイムＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号２３：Ｆｏｘａ２遺伝子を検出するためのリアルタイムＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２４：Ｆｏｘａ２遺伝子を検出するためのリアルタイムＰＣＲ用リバースプライマー
【図１】
2011016485.tif 000006
【図２】
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【図３】
2011016485.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2011016485.tif 000012
【図７Ｂ】
2011016485.tif 000013
【配列表】
2011016485000001.app
【国際調査報告】
2011016485.tif 000014
2011016485.tif 000015
2011016485.tif 000016
2011016485.tif 000017