(57)【要約】  本発明の酵母は、高い耐塩性を有し、さらに高いエタノール生産性、耐熱性、エタノール耐性、凝集沈降性を有し、具体的には、（ａ）２．０ＭのＫＣｌを含有するＹＰＤ培地で生育可能であり、（ｂ）糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度４０℃で７〜１０％（ｖ/ｖ）のエタノールを生産し、（ｃ）グルコース５％含有ＹＰＤ培地にて３５℃で１２時間攪拌培養後、攪拌を停止してから１分以内に凝集沈降することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）２．０ＭのＫＣｌを含有するＹＰＤ培地で生育可能であり、
（ｂ）糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度４０℃で７〜１０％（ｖ/ｖ）のエタノールを生産し、
（ｃ）グルコース５％含有ＹＰＤ培地にて３５℃で１２時間攪拌培養後、攪拌を停止してから１分以内に凝集沈降する
ことを特徴とする酵母。
【請求項２】
糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度３８℃で８回以上の繰り返し回分培養が可能であることを特徴とする請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度４０℃で４回以上の繰り返し回分培養が可能であることを特徴とする請求項１または２に記載の酵母。
【請求項４】
サッカロミセス  セレビシエに属することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の酵母。
【請求項５】
サッカロミセス  セレビシエＢＡ１１株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７９３）またはサッカロミセス  セレビシエＢＡ１６株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７９４）である請求項４に記載の酵母。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の酵母を用いることを特徴とするエタノール製造方法。
【請求項７】
廃糖蜜を含有する原料を用いることを特徴とする請求項６に記載のエタノール製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐塩性、耐熱性、エタノール耐性、凝集沈降性に優れたエタノール発酵性酵母、および当該酵母を使用するエタノール製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エタノールの発酵生産において、その製造コストを下げるためには、安価な発酵原料、発酵収率の向上、冷却水の低減、蒸留エネルギーの低減などが重要である（非特許文献１、２）。このうち、発酵効率の向上と冷却水の低減、蒸留エネルギーの低減は、発酵に使用する酵母の特性に大きく依存する。これまでに発酵効率の向上については、高いエタノール生産性、耐熱性、耐酸性（特許文献１、４）、耐糖性、エタノール耐性（特許文献２）、耐塩性（特許文献３）、凝集沈降性（特許文献４、５）などの観点から酵母の開発がなされている。また冷却水の低減、蒸留エネルギーの低減については、高温条件で発酵可能な酵母（特許文献４、５）の開発が知られている。【０００３】
エタノール発酵に好適に使用される安価な原料として、廃糖蜜が知られている。廃糖蜜は、サトウキビなどの原料糖から粗糖を搾り出した後の粘状黒褐色の液体である。廃糖蜜にはカリウム、カルシウム、マグネシウムなどの各種塩類が含まれており、その量は原料の産地や、粗糖を搾り出す回数によって異なるが、その濃度は一般に１．５〜４．５Ｍである。このため、廃糖蜜を原料とするエタノールの発酵生産においては、塩耐性を有することが必須であり、さらに上記の高いエタノール生産性、耐熱性、耐酸性、耐糖性、エタノール耐性、凝集沈降性を有する酵母の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１７１９１２号公報
【特許文献２】特開平１０−２６２６５２号公報
【特許文献３】特公平７−３２７０１号公報
【特許文献４】特開平５−２３６９４２号公報
【特許文献５】特開昭５９−１３５８９６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】図解バイオエタノール製造技術  社団法人アルコール協会編  工業調査会（株）発行（２００７年）
【非特許文献２】図解バイオエタノール最前線  大聖泰弘、三井物産（株）編  工業調査会（株)発行（２００４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、高い耐塩性を有し、さらに高いエタノール生産性、耐熱性、エタノール耐性、凝集沈降性を有する酵母を提供するとともに、当該酵母を用いるエタノール製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するために以下の発明を包含する。
［１］（ａ）２．０ＭのＫＣｌを含有するＹＰＤ培地で生育可能であり、（ｂ）糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度４０℃で７〜１０％（ｖ/ｖ）のエタノールを生産し、（ｃ）グルコース５％含有ＹＰＤ培地にて３５℃で１２時間攪拌培養後、攪拌を停止してから１分以内に凝集沈降することを特徴とする酵母。
［２］糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度３８℃で８回以上の繰り返し回分培養が可能であることを特徴とする前記［１］に記載の酵母。
［３］糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度４０℃で４回以上の繰り返し回分培養が可能であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の酵母。
［４］サッカロミセス  セレビシエに属することを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載の酵母。
［５］サッカロミセス  セレビシエＢＡ１１株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７９３）またはサッカロミセス  セレビシエＢＡ１６株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７９４）である前記［４］に記載の酵母。
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の酵母を用いることを特徴とするエタノール製造方法。
［７］廃糖蜜を含有する原料を用いることを特徴とする前記［６］に記載のエタノール製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、高い耐塩性、高いエタノール生産性、耐熱性、エタノール耐性、凝集沈降性を有する酵母、および当該酵母を用いるエタノール製造方法を提供することができる。本発明の酵母を用いれば、発酵収率が向上するとともに冷却水の低減や蒸留エネルギーを低減することができ、さらに酵母の遠心分離工程を省略できるので、バイオエタノールの製造コストを大幅に低減することが可能となる。また、塩含有量の高い廃糖蜜等を原料として効率よくエタノールを生産することができるので、原料コストを大幅に低減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】２．０ＭのＫＣｌを含むＹＰＤ寒天培地における各種酵母の生育を検討した結果を示す図である。
【図２】ＫＣｌを含まないＹＰＤ寒天培地における各種酵母の生育を検討した結果を示す図である。
【図３】ＢＡ１１株の凝集沈降性を検討した結果を示す図である。
【図４】ＢＡ１１株およびＢＡ１６株の凝集沈降性を検討した結果を示す図である。
【図５】ＢＡ１１株と従来株Ａの発酵性能を比較した結果を示す図である。
【図６】ＢＡ１１株の４０℃における繰り返し発酵性能を検討した結果を示す図である。
【図７】ＢＡ１１株およびＢＡ１６株の発酵性能を検討した結果を示す図である。
【図８】ＢＡ１１株の耐熱性を検討した結果を示す図である。
【図９】ＢＡ１１株およびＢＡ１６株の耐熱性を検討した結果を示す図であり、（Ａ）は３８℃、（Ｂ）は４３℃における生育を確認した結果を示す図である。
【図１０】ＢＡ１１株およびＢＡ１６株の倍数性を解析した結果を示す図である。
【図１１】（Ａ）は酵母のｒＤＮＡ領域を示す図であり、（Ｂ）はＢＡ１１株およびＢＡ１６株のｒＤＮＡ領域の塩基配列を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔酵母〕
本発明の酵母は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の特性を有するものであればよい。
（ａ）２．０ＭのＫＣｌを含有するＹＰＤ培地で生育できる。
（ｂ）糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度４０℃で７〜１０％（ｖ/ｖ）のエタノールを生産する。
（ｃ）グルコース５％含有ＹＰＤ培地にて３５℃で１２時間攪拌培養後、攪拌を停止してから１分以内に凝集沈降する。
【００１１】
本発明の酵母は、さらに以下の（ｄ）、（ｅ）の特性を有することが好ましい。
（ｄ）糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度３８℃で８回以上の繰り返し回分培養が可能である。
（ｅ）糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度４０℃で４回以上の繰り返し回分培養が可能である。
【００１２】
上記（ａ）の特性を有することは、例えば、２．０ＭのＫＣｌを含有するＹＰＤ寒天培地に酵母を接種し、約３５℃で約２４時間培養することで確認できる。具体的には、２．０ＭとなるようにＫＣｌを添加したＹＰＤ寒天培地（酵母エキス１％（ｗ/ｖ）、ペプトン２％（ｗ/ｖ）、グルコース２％（ｗ/ｖ）、寒天１．５〜２％（ｗ/ｖ））を作製し、これに酵母を接種して約３５℃に設定した恒温器中で約２４時間静置した後に、酵母の増殖の有無を確認すればよい。
【００１３】
上記（ｂ）の特性を有することは、糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液に酵母を加えて培養温度４０℃で培養し、培養液中のエタノール濃度を測定することで確認できる。ここで、廃糖蜜はサトウキビなどの原料糖から粗糖を搾り出した後の粘状黒褐色の液体であり、廃糖蜜を水で希釈することにより廃糖蜜希釈液を調製することができる。糖分および灰分は、公知の方法により測定することができる。糖分の測定方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー法が挙げられ、灰分の測定方法としては、例えば、廃糖蜜を約６００℃で加熱して灰化させ、その重量を測定する方法が挙げられる。エタノール濃度は、例えば、ガスクロマトグラフィー法等の公知の方法で測定することができる。
【００１４】
培養温度が４０℃であること以外の培養条件は限定されない。以下に、培養方法の一例を示すが、限定されるものではない。
（１）前培養；５００ｍｌバッフル付三角フラスコを用いて、５％グルコースを含むＹＰＤ培地１００ｍＬに凍結保存酵母株（例えば、１５％グリセロール中で−８０℃保存した酵母株）を２白金耳分植菌し、３８℃、１７０ｒｐｍで２４時間振盪培養する。続いて、５％グルコース含有ＹＰＤ培地３Ｌを入れた５Ｌジャーファーメンターに、培養液の全量を投入し、３８℃、２００ｒｐｍ撹拌、０．５ＶＶＭ通気の条件で２４時間培養する。
(２)本培養；１００Ｌ酒母槽に、糖分１０％（ｗ/ｗ）となるように水で希釈した廃糖蜜希釈液（最終濃度０．８％の硫安添加したもの）６０Ｌを入れ、その中に前培養液３Ｌを投入し、３８℃、２０ＨＺ撹拌、０．５ＶＶＭ通気の条件下で２４時間培養する。
（３）発酵；１０,０００Ｌ発酵槽に糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）となるように水で希釈した廃糖蜜（最終濃度０．８％の硫安添加したもの）４２７５Ｌを入れ、その中に２１４Ｌの上記培養菌体液を投入し、４０℃、緩速撹拌（１５０ｒｐｍ）、通気循環量１５ｍ３/ｈｒ条件下で１７時間培養する。
【００１５】
上記（ｃ）の特性を有することは、グルコース５％含有ＹＰＤ培地に酵母を接種し、３５℃で１２時間攪拌培養を行った後に攪拌を停止することで確認することができる。具体的には、２００ｍＬのフラスコに１００ｍＬのグルコース５％含有ＹＰＤ培地（酵母エキス１％（ｗ/ｖ）、ペプトン２％（ｗ/ｖ）、グルコース５％（ｗ/ｖ））を入れ、酵母を接種（約０．５白金字耳）して３５℃、１５０ｒｐｍで撹拌培養を行い、培養開始１２時間経過後に撹拌を停止する。ビーカー、メスシリンダー等の適当な容器に培養物を移して静置し、その１分後に、凝集沈降した菌体層と濁りのない液層とが分離していることを確認すればよい。
【００１６】
上記（ｄ）の特性を有することは、糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液に酵母を添加して培養温度３８℃で回分培養し、これを８回以上繰り返すことで確認することができる。一回の培養ごとに新たな培地を準備し、培養終了まで培地を加えない培養方法を回分培養という。繰り返し回分培養は、酵母の凝集沈降性を利用して、培養終了後に遠心分離を行うことなく酵母と上清（もろみ）とを分離し、分離した酵母に新たな培地を添加して次の培養を行う培養方法である。「８回以上の繰り返し回分培養が可能である」とは、８回以上の繰り返し回分培養を行ってもエタノール生産性が低下しない状態を維持できることをいう。「エタノール生産性が低下しない状態」とは、その回のエタノール生産量が、前回以前における最もエタノール生産量が高い回の７０％以上であることを基準とする。具体的には、廃糖蜜を水で希釈することにより、規定の糖分および灰分を含有する廃糖蜜希釈液を調製し、適当な培養容器を用いて酵母を添加して３８℃で培養する。培養終了後酵母を凝集沈降させて上清（もろみ）を回収し、分離した酵母に新たに廃糖蜜希釈液を添加して２回目の培養を開始する。これを８回以上繰り返し、各回の回収した上清中のエタノール濃度を測定して、エタノール生産性が低下しない状態を維持していることを確認する。
【００１７】
上記（ｅ）の特性を有することは、糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液に酵母を添加して培養温度４０℃で回分培養し、これを４回以上繰り返すことで確認することができる。具体的には、上記（ｄ）の特性を確認する方法において、培養温度を４０℃に変更し、繰り返し回数を４回以上に変更すればよい。
【００１８】
本発明の酵母としては、例えば、子嚢菌門のSaccharomyces属、Candida属、Torulopsis属、Zygosaccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Pichia属、Yarrowia属、Hansenula属、Kluyveromyces属、Debaryomyces属、Geotrichum属、Wickerhamia属、Fellomyces属、Sporobolomyces属に属するものが挙げられ、なかでもSaccharomyces（サッカロミセス）属に属するものが好ましく、特に好ましくはSaccharomyces cerevisiae（サッカロミセス  セレビシエ）である。
【００１９】
本発明の酵母は、天然の酵母または公知の育種方法（例えば、突然変異誘導法、細胞融合法、性的接合法など）によって作出した酵母についてスクリーニングを行い、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の特性を有するものを選択することにより取得することができる。このような酵母として、本発明者が突然変異誘導法により作出したサッカロミセス  セレビシエＢＡ１１株、および、細胞融合法により作出したサッカロミセス  セレビシエＢＡ１６株が挙げられる。サッカロミセス  セレビシエＢＡ１１株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７９３）、および、サッカロミセス  セレビシエＢＡ１６株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７９４）は、それぞれ独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に国際寄託済みである（受託日：２００９年８月１１日）。
【００２０】
〔エタノール製造方法〕
本発明のエタノール製造方法は、上記本発明の酵母を用いるものであればよい。したがって、エタノール製造における個々の具体的な工程は特に限定されない。例えば、非特許文献１、非特許文献２等に記載された公知のバイオエタノールの製造方法から使用する原料等に応じて適宜選択し、使用することができる。
【００２１】
本発明のエタノール製造方法に使用する酵母は、高いエタノール生産性を有するので、どのような原料を用いても効率よくエタノールを生産することができる。例えば、サトウキビ、テンサイ、サトウキビ由来の廃糖蜜等の糖質原料；トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、イネ、ムギ類等のデンプン質原料；セルロース系バイオマスなどを好適に用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明のエタノール製造方法に使用する酵母は、高い耐塩性を有するので、塩濃度の高い原料を好適に用いることができる。塩濃度の高い原料としては、サトウキビ由来の廃糖蜜が挙げられる。サトウキビ由来の廃糖蜜中の塩濃度は、産地、粗糖の回収状態等によって異なるが、例えば本発明者が使用した沖縄産サトウキビから粗糖を３回回収した後の廃糖蜜の分析結果によれば、マグネシウムイオン濃度が０．７〜１．１％（ｗ/ｗ）、カリウムイオン濃度が５．６〜９．４％（ｗ/ｗ）、カルシウム濃度が１．１〜１．８％（ｗ/ｗ）であり、灰分濃度として約１５〜２０％（ｗ/ｗ）を含有しているものであった。本発明のエタノール製造方法によれば、本来エタノール発酵用としては利用価値の低いサトウキビ由来の廃糖蜜を原料として利用できるので、原料コストを低減することが可能となる。
【００２２】
本発明のエタノール製造方法に使用する酵母は、優れた耐熱性を有するので、発酵工程を３８〜４０℃程度の高温で行うことができる。従来株は耐熱性が低いため３０〜３３℃で発酵工程を行う必要があり、そのため、冷却施設（チラー）を用いて発酵槽を冷却することが必須であった。本発明のエタノール製造方法によれば、夏季においても地下水等で冷却するだけで十分であるため、冷却のための電力コストを大幅に節約することが可能となる。冷却コストの削減は熱帯亜熱帯地域でのエタノール生産に特に顕著である。さらに、セルロース原料をセルラーゼによって糖化する場合、温度が高いほどセルラーゼの活性が高いので、本発明の酵母は、糖化とエタノール発酵を同時に行わせるエタノール製造方法に好適に使用することができる。
【００２３】
本発明のエタノール製造方法に使用する酵母は、優れたエタノール耐性、凝集沈降性を有するので、本発明のエタノール製造方法において繰り返し回分培養法（「繰り返し回分発酵法」ともいう。）を好適に採用することができる。繰り返し回分培養法を採用することにより、酵母の遠心分離工程を省略でき、もろみを抜き取り、原料を追加するだけで、直ちに次の発酵サイクルを開始することができる。更に毎回酒母を作る必要がないので、製造コストを大幅に低減することが可能となる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００２５】
〔実施例１：サッカロミセス  セレビシエＢＡ１１株の作製〕
バイオアカデミア株式会社保存株のうちアルコール耐性、高温耐性、凝集沈降性に優れたサッカロミセス  セレビシエＢＡ６株に対して、公知の突然変異誘導法（大嶋泰治編、酵母の分子遺伝学実験法、学会出版センター、1996年）に従い、ＥＭＳ（エチルメタンスルフォネート）処理を加え、菌体を０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、高耐塩性、耐熱性を有する株を選択する目的で１．２Ｍ ＫＣｌを含むＹＰＤ培地（酵母エキス１０ｇ、ポリペプトン２０ｇ、グルコース２０ｇ、水１０００ｍＬ）中、４２℃の培養温度で液体培地および寒天培地でスクリーニングした。最終的にグルコース２０％と１．２Ｍ ＫＣｌを含むＹＰＤ培地で培養し、エタノール発酵性（発酵速度および残糖）、凝集沈降性（沈降速度の目視）を指標にしてＢＡ１１株を選択した。沖縄産廃糖蜜（サトウキビから３回砂糖を回収した廃糖蜜）を水で希釈して糖分を約１５％（ｗ/ｗ）含有するように調整した培養液中でＢＡ６株およびＢＡ１１株を４０℃で培養したところ、エタノール発酵性および凝集沈降性においてＢＡ１１株がＢＡ６株より優れていることを確認した。サッカロミセス  セレビシエＢＡ１１株は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７９３として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に国際寄託済みである（受託日：２００９年８月１１日）。【００２６】
〔実施例２：サッカロミセス  セレビシエＢＡ１６株の作製〕
バイオアカデミア株式会社保存株のうち凝集沈降性とアルコール耐性において優れたサッカロミセス  セレビシエＢＡ５株と上記ＢＡ１１株を細胞融合し、ＢＡ１１株の特徴を維持しつつ凝集沈降性およびエタノール発酵能が向上した酵母株の作出を試みた。細胞融合は両菌株に別々の遺伝的マーカーをつけて、ポリエチレングリコールによって融合させ、遺伝的マーカーを相補する融合株を選択する公知の方法（大嶋泰治編、酵母の分子遺伝学実験法、学会出版センター、1996年）に従って行った。融合株を１．２Ｍ ＫＣｌを含むＹＰＤ培地で４２℃にて培養し、続いて同じ組成のＹＰＤ平板培地でコロニーを形成させ、生育の良いコロニーを選択した。選択したコロニーを、沖縄産廃糖蜜（サトウキビから３回砂糖を回収した廃糖蜜）を水で希釈して糖分を約１５％（ｗ/ｗ）含有するように調整した培養液を用いて４０℃で培養し、最もエタノール発酵性に優れたＢＡ１６株を選択した。ＢＡ１６株は、ＢＡ１１株の特徴を維持するとともに、高温でのエタノール生産能力と凝集沈降性においてＢＡ１１株より優れていることを確認した。サッカロミセス  セレビシエＢＡ１６株は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−７９４として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に国際寄託済みである（受託日：２００９年８月１１日）。【００２７】
〔実施例３：耐塩性の検討〕
ＫＣｌを含まないＹＰＤ寒天培地および２．０ＭのＫＣｌを含むＹＰＤ寒天培地に、ＢＡ１１株、ＢＡ１６株、ＢＡ６株およびＳ２８８Ｃ株（出芽酵母遺伝学研究用の標準株）の４種類の酵母をそれぞれ接種し、３５℃で２４時間培養した。
２．０ＭのＫＣｌを含むＹＰＤ寒天培地の結果を図１に、ＫＣｌを含まないＹＰＤ寒天培地の結果を図２に示した。図１および図２から明らかなように、ＫＣｌを含まないＹＰＤ寒天培地ではすべての菌株が生育できたが、２．０ＭのＫＣｌを含むＹＰＤ寒天培地では、ＢＡ６株およびＳ２８８Ｃ株は生育できなった。この結果は、ＢＡ１１株およびＢＡ１６株が非常に優れた耐塩性を有していることを示すものである。【００２８】
〔実施例４：ＢＡ１１株の４０℃における発酵性能の検討〕
沖縄産廃糖蜜（サトウキビから３回砂糖を回収した廃糖蜜）を水で約３倍に希釈して糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有するように調整し、この廃糖蜜希釈液を原料として、ＢＡ１１株の発酵性能を検討した（培養方法の詳細は実施例６を参照）。結果を表１に示した。
【表１】
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表１から明らかなように、ＢＡ１１株は、糖分１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度４０℃で７％（ｖ／ｖ）を超えるエタノールを生産した。この結果は、ＢＡ１１株が耐熱性および高温におけるエタノール生産性に優れていることを示すものである。【００２９】
〔実施例５：凝集沈降性の検討（１）〕
ＢＡ１１株を、グルコース５％含有ＹＰＤ培地１００ｍＬを入れた２００ｍＬの三角フラスコ中で、恒温振とう培養機を用いて３５℃、回転数１５０ｒｐｍの条件下で１２時間攪拌培養した。攪拌を停止して１００ｍＬビーカーに移し１分後の状態を図３に示した。図３から明らかなように、ＢＡ１１株は攪拌停止から１分以内に凝集沈降して液層の濁りがなくなった。【００３０】
〔実施例６：凝集沈降性の検討（２）〕
ＢＡ１１株、ＢＡ１６株およびＳ２８８Ｃ株（出芽酵母遺伝学研究用の標準株）を、グルコース５％含有ＹＰＤ培地を入れた三角フラスコ中で、恒温振とう培養機を用いて３５℃、回転数１５０ｒｐｍの条件下で１２時間攪拌培養した。各酵母の培養液を十分混和して同時にメスシリンダーに移して静置した。静置直後（スタート）および１分経過後に写真を撮影し、沈降性を比較した。
結果を図４に示した。図４から明らかなように、Ｓ２８８Ｃ株は全く沈降性が認められなかった。１分間の静置により、ＢＡ１１株およびＢＡ１６株とも液層の濁りが目視で認められなくなり、液層と菌体層に分離した。ＢＡ１６株の方がＢＡ１１株より優れた沈降性を示した。【００３１】
〔実施例７：ＢＡ１１株と従来株Ａの発酵性能の比較〕
沖縄産廃糖蜜（サトウキビから３回砂糖を回収した廃糖蜜）を水で約３倍に希釈して糖分約１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有するように調整した廃糖蜜希釈液を原料とした。従来株Ａは３３℃で培養し、ＢＡ１１株は３８℃で培養してエタノール生産性と糖の減少を測定した。具体的には、ＢＡ１１株は以下の方法で培養を行った。
（１）前培養；−８０℃の冷凍庫に１５％グリセロール中で保存されていたＢＡ１１株を、５００ｍｌバッフル付三角フラスコに１００ｍｌの５％グルコースを含むＹＰＤ培地に２白金耳分を植菌し３８℃、１７０ｒｐｍで２４時間振とう培養した。５Ｌジャーファーメンターに５％グルコース含有ＹＰＤ培地３Ｌを入れ、その中に培養液全量を投入し３８℃、２００ｒｐｍ撹拌、０．５ＶＶＭ通気の条件下で２４時間培養した。
（２）本培養；１００Ｌ酒母槽に水で糖分が約１０％になるように希釈した廃糖蜜（最終濃度０．８％硫安添加）６０Ｌを入れその中に前培養液３Ｌを投入し、３８℃、２０Ｈｚ撹拌、０．５ＶＶＭ通気の条件下で２４時間培養した。１０００Ｌ培養槽に同組成の希釈廃糖蜜６００Ｌを入れ、その中にこの培養菌体液３０Ｌを投入し、３８℃、２０Ｈｚ撹拌、０．５ＶＶＭ通気の条件下で２４時間培養した。
（３）発酵；１０,０００Ｌ発酵槽に、糖分約１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）になるように希釈した廃糖蜜（最終濃度０．８％硫安添加）４２７５Ｌを入れ、その中に２１４Ｌの上記培養菌体液を投入し、３８℃、緩速撹拌（１５０ｒｐｍ）、通気循環量１５ｍ３/ｈｒ条件下で１７時間培養した。発酵終了後撹拌および通気を停止し約２時間清置することによって、菌体を凝集沈降させて固液を分離し、上清のもろみを抜き出した。
（４）繰り返し回分発酵（回分培養）；発酵槽中の沈降菌体液７２０Ｌに廃糖蜜希釈液（糖分約１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）、最終濃度０．８％硫安添加）４５００Ｌを加え、（３）と同様の条件下で発酵させた。この操作を繰り返した。【００３２】
結果を図５に示した。ＢＡ１１株、従来株Ａ（図中、従来酵母）とも、糖を約５０％エタノールに変換し、ほぼ理論値の限界のエタノール生成収率を得た。しかし、データを示していないが、従来株Ａは３４℃では生成収率が減少し３８℃では全くエタノールを生産できないので、温度耐性（耐熱性）においてＢＡ１１株は従来株Ａを大きく凌いでいた。本実施例ではＢＡ１１株を用いて３８℃で８回の繰り返し回分培養が可能であることが確認できた。この結果はＢＡ１１株がエタノール耐性に顕著に優れていることを示している。なお、比較に用いた従来株Ａでは３３℃において４回の繰り返し回分培養を確認できた。【００３３】
〔実施例８：ＢＡ１１株の４０℃における繰り返し発酵性能〕
沖縄産廃糖蜜（サトウキビから３回砂糖を回収した廃糖蜜）を水で約３倍に希釈して糖分約１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有するように調整した廃糖蜜希釈液を原料として、ＢＡ１１株の４０℃における繰り返し発酵性能を検討した（培養方法の詳細は実施例６を参照）。
結果を図６に示した。この結果から、ＢＡ１１株を用いて４０℃で４回の繰り返し回分培養が可能であることが確認できた。なお、各バッチの生産性は１バッチ目が２．３３ｇ／ｈ・Ｌ、２バッチ目が２．３５ｇ／ｈ・Ｌ、３バッチ目が２．１１ｇ／ｈ・Ｌ、４バッチ目が１．６７ｇ／ｈ・Ｌであった。【００３４】
〔実施例９：ＢＡ１１株およびＢＡ１６株の発酵性能〕
沖縄産廃糖蜜（サトウキビから３回砂糖を回収した廃糖蜜）を水で約３倍に希釈して糖分約１５％（ｗ/ｗ）、灰分５〜６％（ｗ/ｗ）を含有するように調整した廃糖蜜希釈液を原料として、ＢＡ１１株およびＢＡ１６株の発酵性能を検討した（培養方法の詳細は実施例６を参照）。１回目は３０℃で２１時間培養し、攪拌を止めて６時間静置して凝集沈降させた。上清を回収して新たに原料を添加し、２回目は３８℃で１６時間培養し、攪拌を止めて７時間静置した。
結果を図７に示した。ＢＡ１１株は１コロニー（菱形）ＢＡ１６株は３コロニー（丸、三角、四角）を使用した。図７から明らかなように、ＢＡ１６株は、ＢＡ１１株と同等以上の発酵性能を有しており、特に高温（３８℃）での発酵性能はＢＡ１１株より優れていることが確認できた。【００３５】
〔実施例１０：耐熱性の検討（１）〕
約３倍希釈した廃糖蜜を含むＹＰＤ寒天培地にＢＡ１１株を接種し、種々の温度で２４時間培養して耐熱性を検討した。対照として清酒酵母Ｋ７株（日本醸造協会）を使用した。結果を図８に示した。図８から明らかなように、ＢＡ１１株は４３℃でも生育可能であった。【００３６】
〔実施例１１：耐熱性の検討（２）〕
ＹＰＤ寒天培地にＢＡ１１株およびＢＡ１６株を接種し、３８℃または４３℃で１２時間培養して耐熱性を検討した。対照としてＳ２８８Ｃ株（出芽酵母遺伝学研究用の標準株）を使用した。結果を図９に示した。図９から明らかのようにＢＡ１１株およびＢＡ１６株は４３℃でも生育可能であった。【００３７】
〔実施例１２：ＢＡ１１株およびＢＡ１６株の倍数性の解析〕
比較株として、１倍体株ＳＣ２８８Ｃ（J. Biol. Chem. 246, 7817-7819. 1971)、２倍体株Ｋ１４（清酒酵母協会１４号、日本醸造協会）、４倍体株ＳＣ１３３３（別名ＮＣＹＣ１３３３、英国National Collection of Yeast Culture保存株）を用い、ＢＡ１１株およびＢＡ１６株の倍数性を解析した。具体的には、ＹＰＤ培地で３０℃、１６時間培養した対数増殖期の細胞をＯＤ６６０が約０．１になるように希釈し、蛍光色素ヨウ化プロビジウム（ＰＩ）で染色した後、フローサイトメトリー法で１細胞あたりのＤＮＡ含量と、対応する細胞数を解析した。
結果を図１０に示した。図１０において各チャートの横軸はＤＮＡ含量を表し、縦軸は細胞数を表す。図１０から明らかなように、ＢＡ１１株およびＢＡ１６株のＤＮＡ含量の分布は、比較菌株のＫ１４（２倍体）と同様であった。したがって、ＢＡ１１株およびＢＡ１６株は、いずれも２倍体であることが確認された。【００３８】
〔実施例１３：ＢＡ１１株およびＢＡ１６株のｒＤＮＡ領域の塩基配列解析〕
核のリボゾームＲＮＡをコードする領域（ｒＤＮＡ）は、酵母では細胞あたり約１５０コピーの繰り返し配列を持ち、転写後スプライスで除かれるＩＴＳ１、ＩＴＳ２（Internal Transcribed Spacer 1, 2、図１１（Ａ）参照）領域は進化の速度が速いため、同種の中での固有の菌株で異なる場合が多い。そのためＩＴＳ領域の塩基配列は菌株の識別に用いることが可能である（Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics in “PCR Protocols; A Guide to Methods and Applications”, Academic Press. 1990）。
ｒＤＮＡのＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域の塩基配列の決定法、これらの領域の塩基配列の決定およびクローニングに用いたプライマーの配列はKawahataらの文献（Kawahata M. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71,1616-1620, 2007）に従った。出芽酵母遺伝学研究用の標準株であるＳ２８８Ｃ株（１倍体）を対照とした。ＢＡ１１株、ＢＡ１６株およびＳ２８８Ｃ株からそれぞれＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法でＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域のＤＮＡを増幅した。得られたＤＮＡ断片をプラズミドにクローニングして塩基配列を解析した。【００３９】
結果を図１１（Ｂ）に示した。ＩＴＳ１の領域Ａにおいて、対照株（Ｓ２８８Ｃ株）は２８番目からＴが７個続くが、ＢＡ１１株およびＢＡ１６株ではＴが７個続く配列とＴが９個続く配列の２種類の配列が同定された。ＩＴＳ１の領域Ｂでは、ＢＡ１１株において２４２番目のＴがＣに置換された配列が１０クローン中１クローンだけに見出されたが、ＰＣＲにより生じたエラーの可能性がある。ＩＴＳ１の領域Ｃの３０１番目が対照株ではＣであるのに対しＢＡ１１株およびＢＡ１６株ではＴであった。ＩＴＳ２の領域Ｄでは対照株とＢＡ１６株ではＴが８個続く配列を有したが、ＢＡ１１株ではＴが８個続く配列と９個続く配列の２種類の配列が同定された。領域Ｅにおいて、対照株は１６３番目からＴが７個続く配列を有したが、ＢＡ１１株およびＢＡ１６株ではＴが６個続く配列であった。
ＢＡ１１株およびＢＡ１６株がヘテロな配列の領域を持つことは両株が細胞融合法で作成されたヘテロ２倍体であることと合致している。ＢＡ１１株およびＢＡ１６株がＩＴＳ領域において少なくとも４箇所の配列が対照株と異なること、並びに上記Kawahataらの文献で解析されたSaccharomyces cerevisiae ２９株のいずれとも異なるユニークな配列を有していることが判明したので、ＩＴＳ領域の塩基配列はＢＡ１１株およびＢＡ１６株の識別に極めて有効であると考えられる。【００４０】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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