(57)【要約】本発明は、リンパ球などの免疫担当細胞・血球系細胞において、選択的に、強力に発現を誘導するプロモーター等のウイルス性のプロモーターのエンハンサーを提供することを課題とする。本発明において、予想外にも、イントロンにそのようなエンハンサー活性があることを見出したことによって解決した。すなわち、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）（特に、ＨＨＶ−６Ｂ）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のイントロン配列またはそのフラグメントを含む、プロモーターのエンハンサーに強力なプロモーター活性を有することを見出したことによって上記課題を解決した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）（以下、「６ＭＩＥ」という。）のイントロン配列またはそのフラグメントを含むプロモーターのエンハンサー。
【請求項２】
前記イントロン配列は、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−１２〜＋１２９２の配列（配列番号２）またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載のプロモーターのエンハンサー。
【請求項３】
前記配列は、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１２〜＋２６２の配列（配列番号３）を含む、請求項１に記載のプロモーターのエンハンサー。
【請求項４】
前記配列は、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１２〜＋２６２の配列（配列番号３）である、請求項１に記載のプロモーターのエンハンサー。
【請求項５】
前記プロモーターは、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−３８２〜−９８３の配列（配列番号４）またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載のプロモーターのエンハンサー。
【請求項６】
ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のイントロン配列またはそのフラグメントと、プロモーターとを含む、活性が改善されたプロモーター。
【請求項７】
前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−１２〜＋１２９２の配列（配列番号２）またはそのフラグメントと、ＭＩＥプロモーターとを含む、請求項６に記載の活性が改善されたプロモーター。
【請求項８】
前記ＭＩＥプロモーターは、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−３８２〜−９８３の配列（配列番号４）またはそのフラグメントを含む、請求項７に記載の活性が改善されたプロモーター。
【請求項９】
ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のイントロン配列またはそのフラグメントと、プロモーターとを含む、細胞における遺伝子の発現を高めるための構築物。
【請求項１０】
前記構築物は、６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−１２〜＋１２９２（配列番号２）の配列またはそのフラグメントと、ＭＩＥプロモーターとを含む、請求項９に記載の構築物。
【請求項１１】
前記細胞は、Ｔ細胞系または付着系の細胞である、請求項９に記載の構築物。
【請求項１２】
前記細胞は、Ｍｏｌｔ−３、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＲＣ−５、ＭｅＷｏ、ＳｕｐＴ１、およびＵ３７３からなる群より選択される、請求項９に記載の構築物。
【請求項１３】
細胞における遺伝子の発現を高める方法であって、
１）請求項１に記載のプロモーターのエンハンサーと、プロモーターとを含む、配列に作動可能に連結されるように該遺伝子を配置した構築物を生成する工程；
２）該構築物を該細胞に導入する工程；および
３）該細胞を該遺伝子が発現する条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−１２〜＋１２９２の配列（配列番号２）またはそのフラグメントの、プロモーターのエンハンサーとして使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロモーターのエンハンサーおよびその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ球細胞を標的とする種々の疾患、例えば、白血病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の治療のために、リンパ球細胞に対して遺伝子治療を行うための技術の確立が望まれており、本発明者らは、リンパ球細胞に所望の遺伝子を導入するためのプロモーターとしてヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）の１種であるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）からＨＨＶ−６ＢのＭＩＥプロモーターを見出し、これを出願した（特許文献１）。【０００３】
このようなウイルスのプロモーターは、単独で使用することもできるが、その作用を増強すべく、エンハンサーと組み合わせることが望まれる。【０００４】
この点、真核生物のプロモーターについては、種々のイントロンがエンハンサー機能を有するが知られているが、ヘルペスウイルスなどのウイルスのプロモーターについては、イントロンのエンハンサー機能についてはそれほど知られていない。【０００５】
ＣＭＶプロモーターはリンパ系細胞で活性が弱いことが知られており、特許文献２のエンハンサーを用いたとしても、ＣＨＯ以外の細胞で活性が上昇するかは不明である。
【特許文献１】国際公開第２００７／０２９７１２号パンフレット
【特許文献２】特表２００８−５３６５０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、リンパ球などの免疫担当細胞・血球系細胞において、選択的に、強力に発現を誘導するプロモーター等のウイルス性のプロモーターのエンハンサーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題は、本発明において、予想外にも、ＨＨＶ−６Ｂの主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のイントロンにそのようなエンハンサー活性があることをみいだしたことによって解決した。【０００８】
これは、イントロンがすべて発現増強効果を有しているわけではなく、そのような効果があるイントロンが新規に見つかったということにおいて顕著であると考えられる。また、これまでの研究の多くは真核生物についての研究であり、今回本発明者らが提示したのは、ＨＨＶ−６のイントロン（少なくともＨＨＶ−６、特にＨＨＶ−６Ｂでは初）であり、その効果が顕著であることから、その点においても顕著であると考えられる。【０００９】
ＣＭＶプロモーターはリンパ系細胞で活性が弱いことが知られており、特許文献２のエンハンサーを用いたとしても、ＣＨＯ以外の細胞で活性が上昇するかは不明であり、仮にリンパ系細胞において活性を増強するにしても、もともとの活性が低いのであまり期待はできない。その点、６ＭＩＥプロモーターはプロモーター単独でも、Ｍｏｌｔ−３、ＪｕｒｋａｔおよびＳｕｐＴ１などのＴ細胞系培養細胞において、ＣＭＶプロモーターよりも活性が高く、この６ＭＩＥプロモーターに本エンハンサーの組み合わせにより、さらに活性が高められ、少なくともＣＭＶプロモーターの５倍以上のプロモーター活性を有してい
ることが見いだされ、リンパ系細胞により特異的、効率的に外来遺伝子を導入できると期待される。【００１０】
したがって、本明細書は、以下の項目を提供する。
（１）ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）（以下、「６ＭＩＥ」という。）のイントロン配列またはそのフラグメントを含む、プロモーターのエンハンサー。
（２）前記イントロン配列は、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−１２〜＋１２９２の配列（配列番号２）またはそのフラグメントを含む、項目１に記載のプロモーターのエンハンサー。
（３）前記配列は、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１２〜＋２６２の配列（配列番号３）を含む、項目１〜２のいずれかに記載のプロモーターのエンハンサー。
（４）前記配列は、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１２〜＋２６２の配列（配列番号３）である、項目１〜３のいずれかに記載のプロモーターのエンハンサー。
（５）前記プロモーターは、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−３８２〜−９８３の配列（配列番号４）またはそのフラグメントを含む、項目１〜４のいずれかに記載のプロモーターのエンハンサー。
（６）ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のイントロン配列またはそのフラグメントと、プロモーターとを含む、活性が改善されたプロモーター。
（７）前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−１２〜＋１２９２の配列（配列番号２）またはそのフラグメントと、ＭＩＥプロモーターとを含む、項目６に記載の活性が改善されたプロモーター。
（８）前記ＭＩＥプロモーターは、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−３８２〜−９８３の配列（配列番号４）またはそのフラグメントを含む、項目７に記載の活性が改善されたプロモーター。
（９）ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のイントロン配列またはそのフラグメントと、プロモーターとを含む、細胞における遺伝子の発現を高めるための構築物。
（１０）前記構築物は、６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−１２〜＋１２９２（配列番号２）の配列またはそのフラグメントと、ＭＩＥプロモーターとを含む、項目９に記載の構築物。
（１１）前記細胞は、Ｔ細胞系または付着系の細胞である、項目９または１０に記載の構築物。
（１２）前記細胞は、Ｍｏｌｔ−３、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＲＣ−５、ＭｅＷｏ、ＳｕｐＴ１、およびＵ３７３からなる群より選択される、項目９、１０または１１に記載の構築物。（１３）細胞における遺伝子の発現を高める方法であって、
１）該遺伝子を、項目１〜５のいずれかに記載のプロモーターのエンハンサーと、プロモーターとを含む、配列に作動可能に連結されるように配置した構築物を生成する工程；
２）該構築物を、該細胞に導入する工程；および
３）該細胞を、該遺伝子が発現する条件下で培養する工程、
を包含する、方法。
（１４）６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−１２〜＋１２９２の配列（配列番号２）またはそのフラグメントの、プロモーターのエンハンサーとして使用。【００１１】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作
用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、Ｔリンパ球などの免疫担当細胞においてタンパク質の発現を選択的に誘導するプロモーターのエンハンサーが提供された。本発明のプロモーターのエンハンサーを利用して、先天性免疫不全症候群などの免疫疾患を効果的に予防または治療するための方法および医薬が提供された。本発明はまた、効率よく遺伝子治療を行うための技術を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＨＨＶ−６Ｂのゲノムの遺伝子地図。三角でオープンリーディングフレーム領域を示した。ＩＥ１領域周辺の拡大図を示し、ＰＣＲで増幅したＭＩＥプロモーター及びＭＩＥプロモーターバリアントの領域を矢印で示した。上段から、ＭＩＥプロモーターおよび５’末端欠損バリアント群、中段にこれらをイントロン１まで延長したプロモーターバリアント群、下段に５’末端４３１ｂｐ欠損ＭＩＥプロモーター（６ＭＩＥｐ−ｄ２）のイントロン１からイントロン４まで延長したプロモーターバリアント群を示した。矢印の数字は、ＩＥ１の転写開始点を＋１とし、上流を負の値、下流を正の値で相対的な位置を示した。なお、各イントロンの位置は以下のとおり、イントロン１：＋６３〜＋２２０、イントロン２：＋３６１〜＋１１６３、イントロン３：＋１２９７〜＋１３８３、イントロン４：＋１５９５〜＋１７０５。
【図２】ＩＥ１のイントロン１からイントロン４まで延長したＭＩＥプロモーターバリアントにおけるプロモーター活性の比較。各ＭＩＥプロモーターバリアントをｐＧＬ３プラスミドにクローニングし、レポータープラスミドを作製した。レポータープラスミドを各種細胞にトランスフェクションし、２４時間後細胞を回収、ルシフェラーゼによる発光を測定し、相対値をグラフ化した。使用した培養細胞（上段左から、ＭＲＣ−５、ＭｅＷｏ、Ｕ３７３；下段左からＭｏｌｔ−３、ＪｕｒｋａｔおよびＳｕｐＴ１）を各グラフの上部に記載した。
【図３】ＭＩＥプロモーターならびに５‘欠損ＭＩＥプロモーターバリアントにおけるイントロン１付加の有無によるプロモーター活性の比較。ＣＭＶプロモーター、および各ＭＩＥプロモーターバリアントをｐＧＬ３プラスミドにクローニングし、レポータープラスミドを作製した。レポータープラスミドを各種細胞にトランスフェクションし、２４時間後細胞を回収、ルシフェラーゼによる発光を測定し、相対値をグラフ化した。使用した培養細胞（上段左から、ＭＲＣ−５、ＭｅＷｏ、Ｕ３７３；下段左からＭｏｌｔ−３、ＪｕｒｋａｔおよびＳｕｐＴ１）を各グラフの上部に記載した。
【図４】ＨＨＶ−６Ｂのゲノムの遺伝子地図。ＩＥ領域の拡大図を示し、ＭＩＥプロモーター（第１イントロンを含む）、Ｕ９０のｐｏｌｙＡ付加配列、およびＵ９５のｐｏｌｙ  Ａ付加配列領域を示した。（  ）内の数字は、各領域のＨＨＶ−６Ｂ  ＨＳＴ  株における塩基番号を示す＜Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＢ０２１５０６のＤＮＡ配列の塩基番号を示す。＞。
【図５】ＭＩＥプロモーターを含むＤｓＲｅｄ発現カセットの模式図。ＭＩＥプロモーター（第１イントロン含む）下流に赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ２をコードする遺伝子をつなぎ、さらにその下流にＵ９０またはＵ１００のｐｏｌｙ  Ａ付加配列を含む領域をつないだ発現カセットを作製し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミドに挿入した。（  ）内の数字は、実際に発現カセットに挿入したｐｏｌｙＡ配列を含む領域のＨＨＶ−６Ｂ  ＨＳＴ株における塩基番号を示す＜Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＢ０２１５０６のＤＮＡ配列の塩基番号を示す。＞。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明の好ましい形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、
単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１５】
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１６】
本明細書において使用される「ＨＨＶ」とは、ヒトヘルペスウイルス（ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）をいい、そのタイプによって、１型、２型、３型、４型、５型、６型、７型、８型などが存在する。
【００１７】
本明細書において使用される場合、用語「ヘルペスウイルス」とは、ＨＨＶ−６Ａ、ＨＨＶ−６Ｂ、およびＨＨＶ−７の全てを包含し、かつ、特に言及されない限り、これらウイルスの野生型、組換え型のいずれをも含む。また、本明細書において使用される場合、用語「ＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウイルス６）」は、ＨＨＶ−６ＡおよびＨＨＶ−６Ｂを包含し、かつ、特に言及されない限り、これらウイルスの野生型、組換え型のいずれをも含む。ＨＨＶ−６は、サイトメガロウイルスＨＨＶ−５と同じくβ亜科に属し、ＨＨＶ−６Ｂは突発性発疹の原因ウイルスであり、日本ではほぼ全員が２歳までに感染するといわれている。
【００１８】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。
【００１９】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００２０】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する領域を調節エレメントという。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書において遺伝子の「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、遺伝子の塩基配列を３塩基ずつに区切った時の３通りの枠組の１つであって、開始コドンを有し、そして途中に終止コドンが出現せずある程度の長さを持ち、実際にタンパク質をコードする可能性のある読み枠をいう。ヘルペスウイルスゲノムは、その全塩基配列が決定されており、少なくとも１０１個の遺伝子が同定されており、その遺伝子の各々がオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有することが公知である。
【００２１】
本明細書において「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
【００２２】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００２３】
本明細書において「対応する」アミノ酸および核酸とは、それぞれあるポリペプチドおよび核酸分子において、比較の基準となるポリペプチドおよび核酸分子における所定のアミノ酸および核酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸および核酸をいい、例えば、ユビキチンにおいては、リジンとの連結を担う配列（例えば、Ｃ末端のグリシン）と同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸およびそれをコードする核酸をいう。例えば、核酸配列であれば、その核酸配列またはそれがコードする特定の部分と同様の機能を発揮する部分であり得る。
【００２４】
本明細書において「対応する」遺伝子、プロモーター、イントロンとは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヘルペスウイルス６Ｂ型の配列、癌抗原などの遺伝子に対応する遺伝子は、他の生物（ヘルペスウイルス７型など）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ヘルペスウイルス−６ＡのＭＩＥプロモーター配列、イントロン配列など）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヘルペスウイルス６Ｂ）の配列データベースを検索することによって、またはウェットの実験でライブラリーをスクリーニングすることによって見出すことができる。
【００２５】
本明細書において「単離された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞内）の他の物質（好ましくは、生物学的因子）（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００２６】
本明細書において「精製された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものを
いう。したがって、通常、精製された物質におけるその物質の純度は、その物質が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００２７】
本明細書において「精製された」および「単離された」とは、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の物質が存在することを意味する。
【００２８】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００２９】
本明細書において「ストリンジェントなハイブリダイズ条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ
クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３０】
本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９  （２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００３１】
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用されるプロモーターとしては、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応する配列も含まれるべきであることが意図される。
【００３２】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００３３】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
【００３４】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１の配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、６００、７００、８００、９００、１０００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００３５】
本発明において使用されるポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上（例えば、１または数個）のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および／または欠失していてもよい。
【００３６】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別
される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００３７】
本明細書において「機能的改変体」とは、基準となる配列が担う生物学的活性（特に、プロモーター活性）を保持する改変体をいう。
【００３８】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。核酸においては、保存的置換は、例えば、プロモーター活性を測定しながら確認することができる。
【００３９】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドをコードする遺伝子を作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００４０】
本明細書において発現されるべきポリペプチドの核酸形態は、そのポリペプチドのタンパク質形態を発現し得る核酸分子をいう。この核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【００４１】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【００４２】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００４３】
（プロモーター）
本明細書において「プロモーター」（またはプロモーター配列）とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することができる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【００４４】
本明細書において、「ＭＩＥ」（遺伝子）とは、主要前初期（ｍａｊｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のことをいい、ウイルス感染後，宿主由来またはビリオン由来の転写因子によって直ちに転写される遺伝子をいう。
【００４５】
本明細書において、「ＭＩＥプロモーター」または「ＭＩＥｐ」とは、主要前初期プロモーター（ｍａｊｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）をいい、ウイルス感染後，宿主由来またはビリオン由来の転写因子によって直ちに転写される遺伝子のプロモーターをいう。ＭＩＥ遺伝子は、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理感染細胞から抽出したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによって同定することができる。
【００４６】
本明細書において、「６ＭＩＥ」（遺伝子）とは、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）（特に、ＨＨＶ−６Ｂ）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）をいう。本明細書において「６ＭＩＥのＩＥ１」とはＨＨＶ−６の主要前初期遺伝子によりコードされるタンパク質のうちＩＥ１タンパクをコードする遺伝子をいう。６ＭＩＥのＩＥ１（配列番号４１）の転写開始点は、図１において＋１として示されている。
【００４７】
本明細書において、「６ＭＩＥプロモーター」または「６ＭＩＥｐ」とは、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）（特に、ＨＨＶ−６Ｂ）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のプロモーターをいう。
【００４８】
本発明において、プロモーターの同定方法は、以下の通りである。すなわち、構造遺伝子の周辺の配列をいくつかスクリーニングし（例えば、実施例に記載されるような発現カセットを用いる）、遺伝子発現促進活性を持つ配列をマッピングする。これによって、有意な促進活性を有する配列を同定することができる。通常は、上流に配置されていること
がおおいが、それに限定されない。
【００４９】
本明細書において「ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥプロモーター」は、配列番号１におけるプロモーター活性を有する任意の配列をいう。好ましくは、配列番号１における転写開始点より−７７０位〜−１位を有する。そのような配列は、配列番号１またはそれに対応する配列などが挙げられるがそれらに限定されない。ＨＨＶ−６Ｂ遺伝子の発現制御には、転写開始点から上流−５３０〜−３８３の領域、好ましくは−１００７〜−３８３の領域があることが好ましく、その塩基配列としては、配列番号５および配列番号６に示される配列などが挙げられる。その中でも、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１のモチーフ（転写開始点を起点とすれば−５４１〜−５３４がＮＦ−κＢモチーフ配列であり、−４２６〜−４１６、および−１９６〜−１８６がＡＰ−１のモチーフ配列である）がモチーフとなることが、塩基配列置換の実験から明らかになった。従って、好ましくは、本発明のＨＨＶ−６ＢのＭＩＥプロモーターは、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはそれに対応する塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはそれに対応する塩基配列の対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、生物学的活性を有するポリヌクレオチド；または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリヌクレオチド、を含む。
【００５０】
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ）であるとは、生物のすべての組織において、その生物の発生のいずれの段階にあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の条件でノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。
【００５１】
本明細書において「エンハンサー」または「プロモーターのエンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。イントロン中またはプロモーター中のプロモーター活性を強める領域も、遺伝子の発現効率を高める活性がある場合は、エンハンサーと呼ばれることがある。
【００５２】
本明細書において「イントロン」とは、ＤＮＡ中に存在する介在配列で、一次転写産物には含まれるが最終の機能的な成熟ＲＮＡには含まれず、スプライシングにより取り除かれる遺伝子領域をいう。
【００５３】
本明細書において使用する場合、「作動可能に連結された（る）」（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｌｉｎｋｅｄ）とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００５４】
（核酸構築物）
本明細書において、「核酸構築物」または「遺伝子カセット」とは、交換可能に用いら
れ、遺伝子をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）と、これに必要に応じて作動可能に（すなわち、その核酸の発現を制御し得るように）連結された制御配列（例えば、プロモーター）とを含む核酸配列、ならびに、必要に応じて制御配列（例えば、プロモーター）と、これに作動可能に（すなわち、インフレームに）連結された異種遺伝子とを含む核酸分子をいう。このカセットまたは構築物は、必要に応じて他の調節エレメントと組み合わせて使用することもまた、本発明の範囲に含まれる。好ましい発現カセットは、特定の制限酵素で切断され、容易に回収され得る遺伝子カセットまたは核酸構築物である。
【００５５】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、原核生物細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書では、例えば、ＢＡＣベクターを用いることができる。ＢＡＣベクターとは、大腸菌のＦプラスミドをもとにして作製されたプラスミドで、約３００ｋｂ以上の巨大なサイズのＤＮＡ断片をも大腸菌などの細菌内で安定に保持し増殖させることが可能なベクターである。ＢＡＣベクターは、少なくともＢＡＣベクターの複製に必須の領域を含む。その複製に必須の領域としては、例えば、Ｆプラスミドの複製開始点であるｏｒｉＳまたはその改変体が挙げられる。
【００５６】
本明細書において使用する場合、「選択マーカー」とは、核酸構築物、ベクターを含む宿主細胞を選択する指標として機能する遺伝子をいう。選択マーカーとしては、蛍光マーカー、発光マーカー、および薬剤選択マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。「蛍光マーカー」としては、緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）、青色蛍光プロテイン（ＣＦＰ）、黄色蛍光プロテイン（ＹＦＰ）および赤色蛍光プロテイン（ｄｓＲｅｄ）のような蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。「発光マーカー」としては、ルシフェラーゼのような発光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。「薬剤選択マーカー」としてはヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、メタロチオネイン（ＭＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１，２）、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＵＭＰシンターゼ、Ｐ−グリコプロテイン、アスパラギンシンテターゼ、およびオルニチンデカルボキシラーゼ。これら薬剤選択マーカーと使用される薬剤との組み合わせは、例えば、以下のとおりである：ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）とメソトレキセート（ＭＴＸ）との組み合わせ、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子とメチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）との組み合わせ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）遺伝子とＮ−ホスホンアセチル−Ｌ−アスパラギン酸（Ｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｎａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）（ＰＡＬＡ）との組み合わせ、ＭＴ遺伝子とカドミウム（Ｃｄ２＋）との組み合わせ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子とアデノシン、アラノシン、２’−デオキシコホルマイシンとの組み合わせ、アデノシンデアミナーゼ（ＡＭＰＤ１，２）遺伝子とアデニン、アザセリン、コホルマイシンとの組み合わせ、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子と、マイコフェノール酸との組み合わせ、ＵＭＰシンターゼ遺伝子と６−アザウリジン、ピラゾフラン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒａｎ）との組み合わせ、Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ，ＭＤＲ）遺伝子と多剤薬剤との組み合わせ、アスパラギンシンテターゼ（ＡＳ）遺伝子とβ−アスパルチルヒドロキサム酸またはアルビジイン（ａｌｂｉｚｚｉｉｎｎ）との組み合わせ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子とα−ジフルオロメチル−オルニチン（ＤＦＭＯ）などのタンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書において使用する場合、「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本明細書において使用する場合、「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【００５８】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、ＡＡＴＡＡＡを含む配列などが挙げられるが、これに限定されない。
【００５９】
本明細書において「外来遺伝子」とは、ある生物において、その生物には天然には存在しない遺伝子をいう。そのような外来遺伝子は、その生物に天然に存在する遺伝子を改変したものであってもよく、天然において他の生物に存在する遺伝子（例えば、ＡＤＡ遺伝子）であってもよく、人工的に合成した遺伝子であってもよく、それらの複合体（例えば、融合体）であってもよい。そのような外来遺伝子を含む生物は、天然では発現しない遺伝子産物を発現し得る。例えば、欠損される劣性遺伝子（例えば、ＡＤＡ遺伝子、ＰＮＰ遺伝子、γｃ鎖遺伝子、ＴＡＰ遺伝子、ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子、Ｘ連鎖ＷＡＳＰ、ＣＤ４０リガンド、ＰＩ３Ｋ類似遺伝子、ＤＮＡヘリカーゼ）を外来遺伝子として使用することができる。
【００６０】
本発明においては、外来遺伝子はサイトカインであっても良い。本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。本明細書において用いられる「増殖因子」とは、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。
【００６１】
本発明において、発現されるべき外来遺伝子は、上述の天然型の外来遺伝子と相同性のあるものが使用され得る。そのような相同性を有する外来遺伝子としては、例えば、Ｂｌａｓｔのデフォルトパラメータを用いて比較した場合に、比較対照の外来遺伝子に対して
、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の同一性または類似性を有する核酸配列を含む核酸分子または少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド分子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６２】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００６３】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
【００６４】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
【００６５】
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。
【００６６】
本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、Ｃｒｅ酵素の一過的発現、染色体上でのＤＮＡマッピングなどは、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ「ＦＩＳＨ実験プロトコール  ヒト・ゲノム解析から染色体・遺伝子診断まで」松原謙一、吉川  寛  監修  秀潤社（東京）などに記載されるように、当該分野において周知である。
【００６７】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体
法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【００６８】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【００６９】
本発明において使用する場合、用語「形質転換」、「形質導入」および「トランスフェクション」は、特に言及しない限り互換可能に使用され、宿主細胞への核酸の導入を意味する。形質転換方法としては、宿主細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法などの種々の周知の技術が挙げられる。
【００７０】
「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
【００７１】
原核細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐ
ｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０などが例示される。
【００７２】
動物細胞としては、臍帯血単核球、末梢血単核球、およびＳｕｐ−Ｔ１細胞などを挙げることができる。
【００７３】
本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物および無脊椎動物を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７４】
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、臓器（器官）の一部であり得る。臓器（器官）内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。
【００７５】
本明細書において、「器官（臓器）」とは、１つ独立した形態をもち、１種以上の組織が組み合わさって特定の機能を営む構造体を形成したものをいう。動物では、胃、肝臓、腸、膵臓、肺、気管、鼻、心臓、動脈、静脈、リンパ節（リンパ管系）、胸腺、卵巣、眼、耳、舌、皮膚等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００７６】
本明細書において、「トランスジェニック」とは、特定の遺伝子をある生物に組み込むことまたはそのような遺伝子が組み込まれた生物（例えば、植物または動物（マウスなど）を含む）をいう。トランスジェニック生物のうち、ある遺伝子が欠失または抑制されているものをノックアウト生物という。
【００７７】
本発明の生物が、動物の場合、トランスジェニック生物は、マイクロインジェクション法（微量注入法）、ウィルスベクター法、ＥＳ細胞法（胚性幹細胞法）、精子ベクター法、染色体断片を導入する方法（トランスゾミック法）、エピゾーム法などを利用したトランスジェニック動物の作製技術を使用して作製することができる。そのようなトランスジェニック動物の作成技術は当該分野において周知である。
【００７８】
本明細書において使用される場合、「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ物質、あるいは宿主細胞またはウイルスなどを、特定の操作および／または評価方法で多数の候補から選抜することをいう。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られたウイルスもまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。
【００７９】
本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。チップとしては、例えば、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、細胞チップなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８０】
本発明のヘルペスウイルスのプロモーターは、リンパ系または血液系の疾患、免疫系疾患、感染症の処置、予防、および／または治療のための薬学的組成物の成分としても使用することが可能である。
【００８１】
本明細書において薬剤の「有効量」とは、その薬剤が目的とする薬効を発揮することができる量をいう。本明細書において、そのような有効量のうち、最小の濃度を最小有効量ということがある。そのような最小有効量は、当該分野において周知であり、通常、薬剤の最小有効量は当業者によって決定されているか、または当業者は適宜決定することができる。そのような有効量の決定には、実際の投与のほか、動物モデルなどを用いることも可能である。本発明はまた、このような有効量を決定する際に有用である。
【００８２】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバント。
【００８３】
本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。
【００８４】
本明細書において「指示書」は、本発明の治療方法などを医師、患者など投与を行う人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の医薬などを例えば、放射線治療直後または直前（例えば、２４時間以内など）に投与することを指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００８５】
必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用され得る。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。
【００８６】
本発明で使用される培養方法は、例えば、動物培養細胞マニュアル、瀬野ら編著、共立出版、１９９３年などに記載され支持されており、本明細書においてこのすべての記載を援用する。
【００８７】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタン
パク質は治療効果を媒介する。
【００８８】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
【００８９】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【００９０】
（治療活性または予防活性の証明）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【００９１】
（治療／予防のための投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明のプロモーターのエンハンサーを含む成分または薬学的組成物の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、プロモーターのエンハンサーを含む成分は実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【００９２】
本発明の核酸分子またはポリペプチドが医薬として使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
【００９３】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、単離された多能性幹細胞、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【００９４】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９５】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【００９６】
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
【００９７】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版、その追補またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
【００９８】
本発明の処置方法において使用される糖鎖組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日〜数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回〜１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間〜１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【００９９】
（本明細書において用いられる一般的技術）
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分
野の技術範囲内にある、糖鎖科学、マイクロフルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
【０１００】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１  ５  Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１０１】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ  ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１０２】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本
発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【０１０３】
（プロモーターのエンハンサー）
１つの局面において、本発明は、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のイントロン配列またはそのフラグメントを含む、プロモーターのエンハンサーを提供する。特に、このエンハンサーは、ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥプロモーターなどのウイルス性プロモーターを、予想外に、その能力を高めていたことが見出された。
【０１０４】
このＨＨＶ−６ＢのＭＩＥプロモーターは、ＨＨＶ−７のＭＩＥプロモーターおよびＨＨＶ−７のＵ９５プロモーターなどとともに、予想外に、ＨＣＭＶのＩＥプロモーターよりも、リンパ球への選択性が高まっていたことが見出されている。本発明のエンハンサーはこのような選択性をさらに高めることができることが理解される。また、付着性細胞（２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞など）では、ＨＣＭＶのＩＥプロモーターの１００分の１程度の活性しかＭＩＥプロモーターは示さなかったのに対して、ＳｕｐＴ１、Ｕ９３７などのリンパ球系細胞では、数倍高い発現効率が得られたことも見出されている。このような選択性、特異性の高さは、ＤＮＡワクチン、遺伝子治療として特にリンパ球をターゲットとした医薬の開発に応用できることを明らかにされている。この点でも、本発明のエンハンサーはこのような効果をさらに高めることができることが理解される。また、インビボにおける発現系では、メチレースの作用によってＣＭＶプロモーターなどの強力な活性を持つものでも活性が減弱されることから、血球系・リンパ球系細胞でのインビボでの発現量の確保のために、本発明のプロモーターのエンハンサーを用いることができることが理解される。遺伝病、がんの遺伝子治療などにおいて、レトロウイルスベクターが一般的に使用されているが、プロモーターとしてのＬＴＲの活性はあまり強くないことから、発現させようとする遺伝子の上流に本発明のプロモーターのエンハンサーを導入することによって、血球系細胞において強い発現を得ることができる。白血病などの血液細胞の疾患をターゲットにした遺伝子治療において本発明は有用である。さらに、遺伝子発現をノックアウトする方法としてＲＮＡｉを用いて、ヘアピン型ＲＮＡ発現ベクターのプロモーターのエンハンサーとして本発明のプロモーターのエンハンサーを用いることによって、血球系の発現抑制効果をより効率よいものにすることができる。生体の末梢血よりマクロファージまたは樹状細胞などをフローサイトメトリーによって分離精製し、これらの細胞に本発明のプロモーターのエンハンサー制御下で癌特異的抗原および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子などを発現させるように構築したプラスミドをトランスフェクトし、がん抗原の発現を確認した後に元の生体に戻すことによって、クラスＩ−ＨＬＡを介した癌抗原特異的ＣＴＬを効率的に活性化させて癌の遺伝子治療を実現することができる。
【０１０５】
１つの実施形態において、本発明で使用されるプロモーターは、配列番号１に示す配列のうち、少なくとも８の連続するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、本発明のプロモーターは、配列番号１に示す配列のうち、少なくともＲ３領域またはその機能的改変体を含む。さらに好ましくは、本発明のプロモーターは、配列番号１に示す配列のうち、転写開始点を起点として少なくとも−５７４〜−４２７の配列、さらにより好ましくは、転写開始点を起点として少なくとも−１０５１〜−４２７の配列を含む。
【０１０６】
１つの実施形態において、本発明のイントロン配列は、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−１２〜＋１２９２の配列（配列番号２）またはそのフラグメントを含む。このような本発明のイントロン配列が、エンハンサー効果を有することは、従来知られておらず、ウイルス性のプロモーターとしても従来知られていなかったことであり、まったく予想外のものである。
【０１０７】
好ましい実施形態では、本発明のイントロン配列は、前記６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１２〜＋２６２の配列（配列番号３）を含む。より好ましくは、本発明のイントロン配列は、６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１２〜＋２６２の配列（配列番号３）からなる。このような配列については、エンハンサー効果を有する限り、１または数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有していてもよいことが理解される。
【０１０８】
１つの実施形態では、本発明のエンハンサーが対象とするプロモーターは、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはそれに対応する塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくはそれに対応する塩基配列の対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、生物学的活性を有するポリヌクレオチド；または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリヌクレオチド、を含む。ここで、この生物学的活性は、プロモーター活性および／またはエンハンサー活性であり得るがそれに限定されない。プロモーター活性およびエンハンサー活性は、当該分野において周知の技法を用いて測定することができ、そのような技法は、本明細書においても記載されており、実施例において例示されている。
【０１０９】
１つの好ましい実施形態において、本発明のエンハンサーが対象とするプロモーターは、上記（ａ）〜（ｄ）において置換、付加または欠失を含んでいてもよい。このような置換、付加および欠失の数は、限定され得、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥプロモーターと類似するかまたは実質的に同一の活性を有する）限り、多い数であってもよい。
【０１１０】
好ましい実施形態において、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約８０％であり得、より好ましくは少なくとも約９０％であり得、さらに好ましくは少なくとも約９８％であり得、もっとも好ましくは少なくとも約９９％であり得る。
【０１１１】
別の好ましい実施形態では、本発明が対象とするプロモーターは、６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−３８２〜−９８３の配列またはそのフラグメントを含む。理論に束縛されることを望まないが、本発明のエンハンサー効果が顕著な配列がこの領域に見出されるからである。また、このようなエンハンサー効果が見出される領域は、これに限定されるものではないことも理解される。
【０１１２】
（プロモーター）
別の局面において、本発明は、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）（特に、ＨＨＶ−６Ｂ）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のイントロン配列またはそのフラグメントと、プロモーターとを含む、活性が改善されたプロモーターを提供する。
【０１１３】
本明細書において、本発明の「活性が改善されたプロモーター」とは、プロモーター単独で用いるよりもプロモーター活性が改善された任意のものをいうことが理解される。
【０１１４】
１つの実施形態において、本発明の活性が改善されたプロモーターに用いられるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のイントロン配列またはそのフラグメントは、上記（プロモーターのエンハンサー）において説明される任意の実
施形態を採用することができることが理解される。
【０１１５】
また、１つの実施形態において、本発明の活性が改善されたプロモーターに用いられるプロモーターもまた、上記（プロモーターのエンハンサー）において説明される任意の実施形態を採用することができることが理解される。
【０１１６】
好ましい実施形態では、本発明の活性が改善されたプロモーターは、６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の少なくとも−１２〜＋１２９２の配列（配列番号２）またはそのフラグメントと、ＭＩＥプロモーターとを含む。理論に束縛されることを望まないが、この組み合わせを用いることによって、従来のＭＩＥプロモーターよりも顕著にプロモーター効果が改善されたプロモーターが提供されるからである。
【０１１７】
ここで、好ましくは、本発明において利用されるＭＩＥプロモーターは、６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−３８２〜−９８３の配列（配列番号４）またはそのフラグメントを含む。
【０１１８】
（遺伝子構築物）
別の局面において、本発明は、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）（特に、ＨＨＶ−６Ｂ）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のイントロン配列またはそのフラグメントと、プロモーターとを含む、細胞における遺伝子の発現を高めるための構築物を提供する。
【０１１９】
１つの実施形態において、本発明の構築物に用いられるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）の主要前初期遺伝子（ＭＩＥ）のイントロン配列またはそのフラグメントは、上記（プロモーターのエンハンサー）において説明される任意の実施形態を採用することができることが理解される。
【０１２０】
また、１つの実施形態において、本発明の構築物に用いられるプロモーターもまた、上記（プロモーターのエンハンサー）において説明される任意の実施形態を採用することができることが理解される。
【０１２１】
好ましい実施形態では、本発明の構築物は、細胞における遺伝子の発現を高めるための構築物であって、６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−１２〜＋１２９２の配列（配列番号２）またはそのフラグメントと、ＭＩＥプロモーターとを含む。理論に束縛されることを望まないが、この組み合わせを用いることによって、従来のＭＩＥプロモーターを用いる構築物よりも顕著にプロモーター効果が改善された構築物が提供されるからである。
【０１２２】
１つの実施形態では、本発明の構築物が対象とする細胞は、血球系細胞、特にＴ細胞系の細胞、および付着系の細胞である。たとえば、Ｔ細胞系の細胞としては、Ｍｏｌｔ−３、Ｊｕｒｋａｔ、およびＳｕｐＴ１を挙げることができ、付着系の細胞としては、ＭＲＣ−５、ＭｅＷｏおよびＵ３７３を挙げることができる。
【０１２３】
１つの実施形態において、本発明の核酸構築物は、本発明で使用されるプロモーターおよびそのエンハンサーとは異なる由来の外来遺伝子をコードする配列を、本発明で使用されるプロモーターの配列に対して作動可能に連結されて、含む。
【０１２４】
このような外来遺伝子としては、例えば、ＲＮＡｉ分子、薬剤、欠損される劣性遺伝子、選択マーカーをコードするものが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２５】
好ましくは、本発明において使用される選択マーカーは、本発明の核酸構築物が導入される宿主の培地での選択を可能にするものが好ましく、例えば、この選択マーカーは、前記核酸構築物が導入される宿主での視覚での選択を可能にするものであってもよく、例示的には、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）、または緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）、青色蛍光プロテイン（ＣＦＰ）、黄色蛍光プロテイン（ＹＦＰ）および赤色蛍光プロテイン（ｄｓＲｅｄ）などを挙げることができる。
【０１２６】
本発明の核酸構築物において含まれる選択マーカーは、好ましくは、本発明の核酸構築物が導入される宿主に対して実質的に毒性を示さないものであることが有利である。治療、予防目的で本発明を用いる場合、有害作用は皆無であることが好ましいからである。
【０１２７】
本発明の核酸構築物において含まれるものとしては、例えば、欠損される劣性遺伝子がある。ここで欠損される劣性遺伝子とは、欠損されると疾患状態を呈示する任意の劣性遺伝子をいい、例えば、ＡＤＡ遺伝子（重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）に関連する）、ＰＮＰ遺伝子（重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）に関連する）、γｃ鎖遺伝子（重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）に関連する）、ＴＡＰ遺伝子（ＭＨＣ  Ｉ欠損症に関連する）、ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子（ＭＨＣ  ＩＩ欠損症に関連する）、Ｘ連鎖ＷＡＳＰ（Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群に関連する）、ＣＤ４０リガンド（Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群に関連する）、ＰＩ３Ｋ類似遺伝子（毛細血管拡張性失調症に関連する）、ＤＮＡヘリカーゼ（Ｂｌｏｏｍ’ｓ症候群が関連する）などを挙げることができる。
【０１２８】
好ましい実施形態では、本発明の核酸構築物において含まれる薬剤は、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質ホルモン、ペプチドホルモン（ＩＦＮ−α，ＩＦＮ−γ，ＩＬ−２，ＩＬ−１２，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ）等のタンパク質性の薬剤であり得る。
【０１２９】
他の局面において、本発明は、本発明の核酸構築物を含む発現ベクターを提供する。このような発現ベクターには、本発明の核酸構築物に存在していないかもしれない、発現に必須のエレメント、例えば、ターミネーター、本発明以外のエンハンサー配列などをいずれも作動可能に連結された状態で含み、宿主での発現を可能にする。別の好ましい実施形態では、選択マーカーは、不死化遺伝子（例えば、ｂｃｌ−２）であり得る。あるいは、選択マーカーは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、毒性産物をコードする遺伝子、自殺基質と組合せて条件により活性な毒性遺伝子産物（例えば、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）と組合せた単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ））であり得る。
【０１３０】
別の局面において、本発明は、本発明の構築物を含む、細胞を提供する。このような細胞は、リンパ球である場合、外来遺伝子にコードされたタンパク質の発現が亢進されている。
【０１３１】
好ましくは、本発明の細胞は、本発明で使用されるプロモーター配列とは異種の細胞であることが有利である。異種であってもプロモーター活性を有することは驚くべき効果のひとつといってもよい。本発明の核酸分子を細胞に導入する方法は、当該分野において周知であり、本明細書において上記節において詳述されている。あるいは、そのような細胞は、細胞を含むサンプル中において、その核酸分子を含む細胞をスクリーニングすることによって、同定することができる。本発明の核酸分子を含む細胞は、好ましくは、未分化状態であり得る。本発明の核酸分子が発現している細胞は、通常未分化状態である。したがって、そのような核酸分子が制御可能に発現されるように導入された細胞は、その未分化状態を制御することができる。あるいは、そのような細胞を用いて、本発明の核酸分子を大量に生産することができる。そのような生産方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載された文献に記載されている。
【０１３２】
別の局面において、本発明は、本発明の構築物を含む、組織を提供する。そのような核酸配列は、制御配列に作動可能に連結されることが好ましい。そのような組織は、動物組織であってもよく、他の生物（例えば、植物）の組織であってもよい。あるいは、そのような組織を用いて、本発明の核酸分子を大量に生産することができる。そのような生産方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載された文献に記載されている。
【０１３３】
他の局面において、本発明は、本発明の構築物を含む、臓器を提供する。そのような核酸配列は、制御配列に作動可能に連結されることが好ましい。そのような臓器または器官は、動物臓器または器官であってもよく、他の生物（例えば、植物）の臓器または器官であってもよい。あるいは、そのような臓器または器官を用いて、本発明の核酸分子を大量に生産することができる。そのような生産方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載された文献に記載されている。
【０１３４】
なお他の局面において、本発明は、本発明の構築物を含む、生物を提供する。そのような生物は、動物であってもよく、他の生物（例えば、植物）であってもよい。あるいは、そのような生物を用いて、本発明の核酸分子を大量に生産することができる。そのような生産方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載された文献に記載されている。
【０１３５】
（細胞における遺伝子の発現を高める方法）
別の局面において、本発明は、細胞における遺伝子の発現を高める方法であって、
１）該遺伝子を、本発明のプロモーターのエンハンサーと、プロモーターとを含む、配列に作動可能に連結されるように配置した構築物を生成する工程；
２）該構築物を、該細胞に導入する工程；および
３）該細胞を、該遺伝子が発現する条件下で培養する工程、
を包含する、方法を提供する。
【０１３６】
あるいは、本発明は、細胞における遺伝子の発現を高めるためのキットであって、
１）該遺伝子を、本発明のプロモーターのエンハンサーと、プロモーターとを含む、配列に作動可能に連結されるように配置した構築物；
２）該構築物を、該細胞に導入するための試薬；および
３）該細胞を、該遺伝子が発現する条件下で培養するための手段、
を包含する、方法を提供する。ここで使用されるプロモーターのエンハンサー、プロモーター、構築物、細胞等は、（プロモーターのエンハンサー）、（プロモーター）、（構築物）において記載される任意の形態を採用することができることが理解される。構築物の細胞導入試薬は、当該分野で公知であり、任意のものを使用することができる。培養手段もまた、公知であり、任意のものを使用することができる。
【０１３７】
（使用）
別の局面において、本発明は、６ＭＩＥ配列に含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として少なくとも−１２〜＋１２９２の配列（配列番号２）またはそのフラグメントの、プロモーターのエンハンサーとして使用を提供する。ここで、プロモーターのエンハンサーとしては、（プロモーターのエンハンサー）に記載される任意の形態を採用することができることが理解される。
【０１３８】
１つの局面では、このような使用の形態として医薬がある。
【０１３９】
したがって、別の局面において、本発明は、本発明のプロモーターのエンハンサー、プロモーターおよび抗原をコードする配列を含む、薬学的組成物を提供する。ここで、抗原としては、宿主に免疫反応を惹起することが所望される任意のタンパク質を使用することができる。そのような抗原としては、例えば、がん抗原などを挙げることができるがそれらに限定されない。従って、本発明の薬学的組成物は、好ましくはＤＮＡワクチンであり得る。
【０１４０】
他の局面において、本発明のプロモーターのエンハンサーは、リンパ球特異的な処置が所望される疾患、障害または状態を処置するための薬学的組成物であって、本発明のプロモーターのエンハンサー、プロモーターおよび該処置のための核酸配列を含む、薬学的組成物を提供する。ここで、この薬学的組成物のターゲットとしては、リンパ球特異的な処置が所望される任意の疾患、障害、状態などが適切であり、例えば、先天性免疫不全症候群を例示することができる。先天性免疫不全症候群としては、例えば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ＭＨＣ  Ｉ欠損症、ＭＨＣ  ＩＩ欠損症、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群、毛細血管拡張性失調症、Ｂｌｏｏｍ’ｓ症候群などを挙げることができるがそれらに限定されない。理論に束縛されないが、線先生免疫不全症候群は、何らかの劣性遺伝子の欠損によっておこる（ここでは、欠損される劣性遺伝子ともいう）。患者から採取した骨髄細胞にこの欠損遺伝子を導入して再び患者に戻してやる体細胞遺伝子治療（ｓｏｍａｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）を実施することが可能である。この際、本発明のプロモーターのエンハンサーが対象としうるＨＨＶ−６Ｂ  ＭＩＥプロモーターを利用して、Ｔ細胞、マクロファージなどに分化した細胞での遺伝子発現効率の上昇が見込める。このような遺伝子構築物の導入は、例えば、レトロウイルスなどによって行うことができる。
【０１４１】
好ましい実施形態では、本発明において使用されるべき処置のための核酸配列は、サイトカインをコードする核酸配列、ケモカインをコードする核酸配列、増殖因子をコードする核酸配列、タンパク質ホルモンをコードする核酸配列、ペプチドホルモンをコードする核酸配列、リボザイム、ＲＮＡｉを含む。
【０１４２】
別の局面において、本発明は、本発明のプロモーターのエンハンサーの、疾患、障害または状態を処置するための薬学的組成物の製造における使用を提供する。
【０１４３】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１４４】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１４５】
以下の実施例で用いた動物の取り扱いは、大阪大学において規定される基準を遵守した。【０１４６】
（実施例１）
これまでにヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）の主要前初期（ＭＩＥ）プロモーター（６ＭＩＥｐ）が、Ｔ細胞においてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥプロモーター（配列番号３５）よりも高い活性を有していることを確認した。本実施例では、ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥプロモーターの３’末端を延長したプロモーターを作製し、ＩＥ１のイントロンについても同様の効果が得られるのか否かを検討した。【０１４７】
（材料および方法）
ＨＨＶ−６Ｂ  ＨＳＴ株のＭＩＥ遺伝子の上流域を、以下に示す種々のプライマーを用いたＰＣＲにて増幅させた（図１）。
ｆｕｌｌ            Ｆｗプライマー：５’−ＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴＣＡＧＣＧＧＧＴＡＣ−３’（配列番号７）；
−ｄ１              Ｆｗプライマー：５’−ＡＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＧＣＧＡＡＴＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＣ−３’（配列番号８）；
−ｄ２              Ｆｗプライマー：５’−ＡＧＴＣＧＧＴＡＣＣＴＡＣＴＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＣＴＡＣ−３’（配列番号９）；
−ｄ３              Ｆｗプライマー：５’−ＡＧＴＣＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴＧＴＡＧＣ−３’（配列番号１０）；
−ｄ４              Ｆｗプライマー：５’−ＡＧＴＣＧＧＴＡＣＣＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＡＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１１）；
−ｄ５              Ｆｗプライマー：５’−ＡＧＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＣＴＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＣＣＡＴＡＴＴＴＧＴＣ−３’（配列番号１２）；
−ｄ６              Ｆｗプライマー：５’−ＡＧＴＣＧＧＴＡＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＴＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣ−３’（配列番号１３）；
６ＭＩＥｐ          Ｒｖプライマー：５’−ＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＴＧＴＡＡＣＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１４）；
６ＭＩＥｐ−ｉｎ１  Ｒｖプライマー：５’−ＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＴＣＣＡＡＴＡＡＴＴＧＡＴＧ−３’（配列番号１５）；
６ＭＩＥｐ−ｉｎ２  Ｒｖプライマー：５’−ＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＡＣＧＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＧＡＴ−３’（配列番号１６）；
６ＭＩＥｐ−ｉｎ３  Ｒｖプライマー：５’−ＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡ−３’（配列番号１７）；
６ＭＩＥｐ−ｉｎ４  Ｒｖプライマー：５’−ＣＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＣＡＡＣＧ−３’（配列番号１８）。【０１４８】
得られた様々なプロモーターのバリアントをｐＧＬ３  ｂａｓｉｃに挿入しレポータープラスミドを構築した。構築したレポータープラスミドを各種培養細胞（Ｍｏｌｔ−３、ＭＲＣ−５、Ｊｕｒｋａｔ、ＭｅＷｏ、ＳｕｐＴ１およびＵ３７３）にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１４９】
具体的には、付着系細胞はトランスフェクション前日に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。浮遊系細胞はトランスフェクション直前に４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した。構築した各種レポータープラスミドもしくは空ベクター１μｇをトランスフェクション効率補正用のウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）０．２５μｇとともにリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いて、各種培養細胞（Ｍｏｌｔ−３、ＭＲＣ−５、Ｊｕｒｋａｔ、ＭｅＷｏ、ＳｕｐＴ１およびＵ３７３）にトランスフェクションを行った。トランスフェクションの２４時間後、細胞を回収した。Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いて、細胞を溶解し、細胞溶解液中のホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼによる発光量を測定した。なお、測定にはマルチモードマイクロプレートリーダーＬＢ９４１（ベルトールド）を用いた。測定により得られたホタルルシフェラーゼによる発光量をウミシイタケルシフェラーゼによる発光量で除し、トランスフェクション効率を補正した。さらに、得られた値を空ベクターの発光量で除し、空ベクターに対するプロモーター活性の相対値を求めた。【０１５０】
（結果）
ルシフェラーゼによるレポーターアッセイの結果、イントロン１まで延長したプロモーターはいずれの細胞においても活性上昇が見られた。しかしながら、イントロン２〜４まで延長した場合は逆に活性の低下が認められた（図２）。イントロン１付加によるプロモーター活性の増強はいずれのプロモーター欠損変異においても認められた（図３）。【０１５１】
（考察）
プロモーターのレポーターアッセイの結果より、イントロン１付加により活性の上昇が認められ、Ｔ細胞系ではＣＭＶＩＥプロモーターよりも高い活性が見られ、ＭｅＷｏ細胞やＭＲＣ−５細胞など一部の付着系細胞においてもＣＭＶＩＥプロモーターと同等の活性まで上昇が認められ、外来遺伝子発現に有用であると考えられた。【０１５２】
（実施例２）
（ヘルペスウイルス由来ｐｏｌｙＡ付加配列の検討）
ｍＲＮＡの３’末端にはｐｏｌｙＡ  ｔａｉｌが付加されている。ｐｏｌｙＡ  ｔａｉｌはｍＲＮＡを安定化すると考えられており、タンパク質発現を促進する。ｐｏｌｙＡ  ｔａｉｌはｍＲＮＡの３’領域に存在するＡＡＵＡＡＡという配列をターゲットとして、ポリＡポリメラーゼによって付加される。ヘルペスウイルス由来のポリＡ付加配列を含む領域を目的タンパク質をコードする遺伝子の下流に挿入し、タンパク質発現を試みた。【０１５３】
（材料および方法）
以下に示すＨＨＶ−６Ｂ  Ｕ９０およびＵ１００由来のｐｏｌｙＡ付加配列と考えられる部分を含む領域をＰＣＲによって増幅し、これらをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ（−）−ＤｓＲｅｄ２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＤｓＲｅｄ２遺伝子の下流に挿入し、プロモーターとして、６ＭＩＥを用いて、プラスミドｐＢｌｅｕＳｃｒｉｐｔＳＫ（−）−６ＭＩＥ−ＤｓＲｅｄ２−Ｕ９０ｐＡ（配列番号３９）および、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ（−）−６ＭＩＥ−ＤｓＲｅｄ２−Ｕ１００ｐＡ（配列番号４０）を構築した。【０１５４】
クローニングしたＵ９０ｐＡ配列（ＨＨＶ−６Ｂ  ＨＳＴゲノムの１３４４７４〜１３４６７９の相補鎖、下線部がｐｏｌｙＡ付加配列と想定される）は以下のとおりである：５’−ＴＴＡＧＡＡＡＴＴＡＣＡＴＡＡＧＣＡＡＡＴＧＴＡＡＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＡＧＣＡＡＡＣＡＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＡＣＣＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＧＴＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＴＧＴＡＣＡＴＡＡＡＣＴＧＡＣＴＴＡＴＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣＡＴＡＡＧＴＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＴＴ−３’（配列番号３７）
クローニングしたＵ１００ｐＡ配列（ＨＨＶ−６Ｂ  ＨＳＴゲノムの１４８１５０〜１４８３０１の相補鎖、下線部がｐｏｌｙＡ付加配列と想定される）は以下のとおりである：
５’−ＣＣＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＡＣＧＴＴＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＴＡＴＧＧＣＡＡＣＧＧＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＧＴＣＡＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＣＡＣＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴＣＣＣＴＡＴＣＡＣＡＡＴＡＣ−３’（配列番号３８）
得られたプラスミドを各種培養細胞（２９３Ｔ、ＭｅＷｏ、ＭＲＣ５、ＨｅＬａ）内にトランスフェクションし、蛍光顕微鏡下でＤｓＲｅｄの発現を確認する。【０１５５】
具体的には、トランスフェクション前日に各種培養細胞（２９３Ｔ、ＭｅＷｏ、ＭＲＣ５、ＨｅＬａ）を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。上記発現カセットを挿入したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミド１μｇをリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いてトランスフェクションを行う。３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した後、蛍光顕微鏡を用いてＤｓＲｅｄ発現を確認する。【０１５６】
（実施例３：特異的欠失システムの構築）
血球系細胞における遺伝子発現のノックアウトを本発明のプロモーターのエンハンサーとともに、ＩＥプロモーターおよびＲＮＡｉ法を使用して実施する。ＩＥプロモーターは血球系細胞で発現量が非常に多いため、解析に有利である。【０１５７】
１）細胞の調製（マクロファージの場合〉
健常人末梢血を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ・Ｈｙｐａｑｕｅを使用した密度勾配によりＰＢＭＣを分離精製する。ＡＩＭ  Ｖ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１００Ｕ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えて上記ＰＢＭＣを培養する。培地は、３日ごとに交換し、培養６または７日後のマクロファージを実験に使用する。【０１５８】
２）ｓｉＲＮＡ発現レトロウイルスベクターの作製
・ヘアピン型ＲＮＡを発現させるために「センス鎖標的配列」、「ループ配列」、「アンチセンス鎖標的配列」および「ターミネーター配列」を含む合成オリゴＤＮＡを作製する。このようなセンス鎖標的配列、ループ配列、アンチセンス標的配列、ターミネーター配列は、当該分野において周知の技術を用いて実現することができる。当業者は、実際に使用する場合は、その状況に応じて適切な配列を採用することができることが理解され得る。【０１５９】
ＩＥ配列下流に上記オリゴＤＮＡを繋ぎ、レトロウイルスの複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを欠失させ、ＮｅｏＲ遺伝子を含んだプラスミドベクターに制限酵素配列等を利用して上記ＤＮＡを組み込む。作製したプラスミドベクター１０μｌを１００μｌのコンピテントセルに加え形質転換し、ＬＢＡｍｐプレートにまき３７℃で１６時間培養する。形質転換により得られたコロニーをＬＢＡｍｐ液体培地で３７℃で１６時間培養し、培養液より常法にてプラスミドを抽出精製する。【０１６０】
ｇａｇ、ｐｏ１およびｅｎｖを発現しているレトロウイルスパッケージング細胞を直径１０ｃｍのシャーレに播き、トランスフェクション試薬を開いて、１０μｇの上記プラスミドをトランスフェクションする。２４〜４８時間後、細胞をＧ４１８含有培地（５００μｇ／ｍｌ）に段階希釈後、継代する。【０１６１】
３〜４日ごとにＧ４１８培地を交換し約２週間培養する。コロニーを回収し、６ウエルプレートにコンフルエントに生育したところで、（Ｇ４１８を含まない培地に交換し、２４時間後、上清を回収する。また、細胞はストックする。【０１６２】
上清中に含まれるレトロウイルスベクターを段階希釈し、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に感染させ、生育したコロニーをカウントすることにより、感染価を算出する。【０１６３】
３）レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入実験
１）で調製したマクロファージ等血球系細胞にレトロウイルスベクターを感染させる。洗浄後ただちに、０．５〜２．５×１０４細胞／ｃｍ２となるようにプレートに播く。感染後２４時間でＧ４１８含有培地と交換し、３〜４日ごとに培地を交換する。約２週間後、遺伝子導入細胞を得る。この細胞を使用し、目的ノックアウト遺伝子の発現量を確認する。【０１６４】
これらの実験を行うことによって、遺伝子導入後、実際に本発明で使用されるプロモーターでのリンパ球特異的外来遺伝子発現がノックアウトされることが確認される。【０１６５】
（実施例４：特異的発現）
実施例３におけるＲＮＡｉに代えて発現が所望される遺伝子（例えば、ＴＧＦβなどのサイトカイン）をコードする核酸分子を導入する。【０１６６】
その結果、実施例３と同様の実験を行うことによって、遺伝子導入後、実際に本発明のプロモーターのエンハンサーによりプロモーター活性が増強された様式でが特異的外来遺伝子発現を誘導することが確認される。【０１６７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１６８】
本発明によって、ウイルス性のプロモーターのエンハンサーが提供された。本発明のプロモーターのエンハンサーは、先天性免疫不全症候群などの免疫疾患を効果的に予防または治療するための方法および医薬において有用である。本発明はまた、効率よく遺伝子治療を行うための技術においても有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６９】
配列番号１は、ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥプロモーターの配列である。
配列番号２は、ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１２〜＋１２９２の配列である。
配列番号３は、ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１２〜＋２６２の配列である。
配列番号４は、ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−３８２〜−９８３の配列である。
配列番号５は、ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−５３０〜＋３８３の配列である。
配列番号６は、ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１００７〜＋３８３の配列である。
配列番号７は、実施例１で使用されたｆｕｌｌ  Ｆｗプライマーの配列である。
配列番号８は、実施例１で使用された−ｄ１  Ｆｗプライマーの配列である。
配列番号９は、実施例１で使用された−ｄ２  Ｆｗプライマーの配列である。
配列番号１０は、実施例１で使用された−ｄ３  Ｆｗプライマーの配列である。
配列番号１１は、実施例１で使用された−ｄ４  Ｆｗプライマーの配列である。
配列番号１２は、実施例１で使用された−ｄ５  Ｆｗプライマーの配列である。
配列番号１３は、実施例１で使用された−ｄ６  Ｆｗプライマーの配列である。
配列番号１４は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ  Ｒｖプライマーの配列である。
配列番号１５は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｉｎ１  Ｒｖプライマーの配列である。
配列番号１６は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｉｎ２  Ｒｖプライマーの配列である。
配列番号１７は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｉｎ３  Ｒｖプライマーの配列である。
配列番号１８は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｉｎ４  Ｒｖプライマーの配列であ
る。
配列番号１９は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１３〜−９８３；９７１ｂｐ）の配列である。
配列番号２０は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ１（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１３〜−７３２；７２０ｂｐ）の配列である。
配列番号２１は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ２（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１３〜−５５２；５４０ｂｐ）の配列である。
配列番号２２は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ３（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１３〜−３８１；３６９ｂｐ）の配列である。
配列番号２３は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ４（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１３〜−２１４；２０２ｂｐ）の配列である。
配列番号２４は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ５（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１３〜−１６５；１５３ｂｐ）の配列である。
配列番号２５は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ６（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として−１３〜−１０２；９０ｂｐ）の配列である。
配列番号２６は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｉｎ１（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として＋２６２〜−９８３；１２４５ｂｐ）の配列である。
配列番号２７は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ１ｉｎ１（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として＋２６２〜−７３２；９９４ｂｐ）の配列である。
配列番号２８は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ２ｉｎ１（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として＋２６２〜−５５２；８１４ｂｐ）の配列である。
配列番号２９は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ３ｉｎ１（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として＋２６２〜−３８１；６４３ｂｐ）の配列である。
配列番号３０は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ４ｉｎ１（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として＋２６２〜−２１４；４７６ｂｐ）の配列である。
配列番号３１は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ５ｉｎ１（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として＋２６２〜−１６５；４２７ｂｐ）の配列である。
配列番号３２は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ６ｉｎ１（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として＋２６２〜−１０２；３６４ｂｐ）の配列である。
配列番号３３は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ２ｉｎ２（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として＋１２９２〜−５５２；１８４４ｂｐ）の配列である。
配列番号３４は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ２ｉｎ３（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として＋１５９２〜−５５２；２１４４ｂｐ）の配列である。
配列番号３５は、実施例１で使用された６ＭＩＥｐ−ｄ２ｉｎ４（ＨＨＶ−６ＢのＭＩＥに含まれるＩＥ１の転写開始点を基準として＋１７３２〜−５５２；２２８４ｂｐ）の配列である。
配列番号３６は、実施例１で使用されたＣＭＶＩＥプロモーターの配列である。
配列番号３７は、実施例２でクローニングしたＵ９０ｐＡ配列の配列である。
配列番号３８は、実施例２でクローニングしたＵ１００ｐＡ配列の配列である。
配列番号３９は、実施例２で構築したプラスミドｐＢｌｅｕＳｃｒｉｐｔＳＫ（−）−６ＭＩＥ−ＤｓＲｅｄ２−Ｕ９０ｐＡの配列である。
配列番号４０は、実施例２で構築したプラスミドｐＢｌｅｕＳｃｒｉｐｔＳＫ（−）−６ＭＩＥ−ＤｓＲｅｄ２−Ｕ１００ｐＡの配列である。
配列番号４１は、ＨＨＶ−６のＩＥ１の配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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