(57)【要約】高分子ヒアルロン酸及びその塩と不純物とを含むヒアルロン酸溶液を、限外ろ過膜にて透析処理する工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法が開示される。本発明の方法によれば、タンパク質、核酸、乳酸、金属などの除去された高品質なヒアルロン酸及び／又はその塩を簡便、高収率かつ工業的規模で製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子量のヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸溶液を、限外ろ過膜にて透析処理することにより不純物を除去する工程を含む、ヒアルロン酸及びその塩の精製方法。
【請求項２】
前記不純物が、菌体、タンパク質、核酸、低分子化合物、又はエンドトキシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸及び／又はその塩の分子量が１５０万〜４００万Ｄａである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸類溶液中のヒアルロン酸及び／又はその塩の濃度が１〜１０ｇ／Ｌである、請求項１ないし３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
処理時のヒアルロン酸溶液の温度が０〜８０℃である請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、化粧品の保湿剤の他、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品として用いられている。ヒアルロン酸は、動物組織、例えば、鶏の鶏冠、牛の眼の硝子体等からの抽出物により製造することができるが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸等が混入したり、組織内に含まれるヒアルロニダーゼ等によって低分子量化されやすいため、ヒアルロン酸生産能を有する微生物を培養し、培養液からヒアルロン酸を製造すること（発酵法）も行なわれている（非特許文献１及び特許文献１）。【０００３】
抽出法や発酵法によって製造されるヒアルロン酸には、タンパク質や発熱性物質等が不純物として存在するため、これらを分離除去して高純度の製品を得る方法が検討されている。特に製造の初期段階での不純物の除去は、以降の精製工程の負荷の軽減を可能とし、医薬品としても使用可能な高純度な製品を得る方法としての開発が期待されている。ヒアルロン酸を高純度に精製する方法として、例えばタンパク質、核酸等の副生物及び、培地由来の無機塩類を除去するためにヒアルロン酸及びその塩と不純物とを含むヒアルロン酸溶液を、正に帯電したフィルターに通した後に水溶性有機溶剤を添加し、ヒアルロン酸ナトリウムを析出・沈降させ、上澄み液を抜き取ることにより精製する方法が知られている（非特許文献２）。【０００４】
【非特許文献１】Journal of General Microbiology, 85, 372-375, 1976
【特許文献１】特公平４−１２９６０号公報
【特許文献２】特開平９−３２４００１公報
【発明の概要】
【０００５】
しかしながら、工業的規模で医薬品として使用できる高純度のヒアルロン酸類を得るには、上記の方法においても、ヒアルロン酸の回収率が低いなどの課題が残っていた。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、簡便かつ高収率で高純度のヒアルロン酸類を工業的規模で精製するための方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、上記目的を解決するために、ヒアルロン酸及びその塩と不純物とを含むヒアルロン酸溶液から不純物を効率よく分離除去し、高純度のヒアルロン酸類を簡便にかつ効率よく精製する方法について種々検討した結果、ヒアルロン酸類溶液を酸性側のｐＨに調製した後、限外ろ過膜にて透析処理することにより、核酸、発熱性物質、タンパク質、乳酸、無機塩類などを効果的に除去できることを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、ヒアルロン酸及びその塩と不純物とを含むヒアルロン酸溶液を酸性側のｐＨに調製した後、限外ろ過膜にて透析処理する工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法が提供される。この製造方法によると、不純物を効果的に除去することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
〔用語の説明〕
本明細書における「ヒアルロン酸及び／又はその塩」と「ヒアルロン酸類」は同義であって、交換可能に使用され、遊離のヒアルロン酸、及び、本発明の目的を損なわない範囲で使用可能な任意のヒアルロン酸塩（これに限定されるものではないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩などの金属塩や、塩酸塩、リン酸塩、クエン酸塩などの酸付加物など）や水和物、それらの混合物を意味する。ここで、ヒアルロン酸とは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸とが結合した２糖単位がくりかえし連鎖してなる高分子量の多糖類をいい、各種塩は主にグルクロン酸部分が塩の形となったものをいう。ヒアルロン酸は、折り畳み可能な鎖部分と、Ｄ−グルクロン酸部分のカルボキシル基の負電荷の相互作用によって、空間に展開しやすく、これにより大量の水と結合してゲルを形成することができる。また、低濃度であっても、分子間力が強いため、比較的高い粘性を有する。このような作用から、例えば、関節の湿潤作用、皮膚の柔軟作用などを有し、生理的にもそれらの役割を担っている。
【００１０】
ヒアルロン酸類の中でも、分子量約２００万Ｄａのヒアルロン酸ナトリウムは、分子量約８０万Ｄａのものに比べて医薬品として、変形性膝関節症、肩関節周囲炎、慢性関節リウマチ等の治療に優れた効果を発揮することが知られている（薬理と治療、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．９、２８９（１９９４）；薬理と治療、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．９、３１９（１９９４））。また、その他に、外科手術後の癒着防止用として、さらに皮膚科領域、眼科領域においても医薬品としての効果が知られており、一部は臨床的に一般に使用されている。医薬品として用いる場合には、平均分子量が１００万以上のヒアルロン酸類を用いることが望ましい。さらに、入手や取り扱いの容易さを勘案すると、平均分子量１００万〜５００万Ｄａのヒアルロン酸類が医薬品としては望ましく、平均分子量１５０万〜４００万Ｄａのヒアルロン酸類が特に望ましい。また、このような高分子量のヒアルロン酸類は、化粧品用途として使用した際にも、その高い保湿力から優れた効果を発揮する。
本明細書における「平均分子量」について、特記しない限り、ヒアルロン酸類の平均分子量を示す際は、粘度平均分子量のことをいう。粘度平均分子量は、当業者が通常行う方法により求めることができる。好ましくは、各国の薬局方等で一般的に用いられている測定方法により求めることができ、より好ましくは、日本薬局方で用いられている測定方法により求めることができる。一例としては、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムが本願発明に近い平均分子量（１５０万〜３９０万）を有すると期待される場合、これに限定されるものではないが、その平均分子量は、極限粘度［η］を用いて、次式により求めることができる。
【式１】
【００１１】
2011114475.tif 000002
【００１２】
医薬品として、ヒアルロン酸類を溶解する注射用溶解液としては、注射用水、生理食塩水等に、酸、アルカリ、リン酸塩のような緩衝剤を含むｐＨ調整剤等を加えた一般に用いられる注射用溶解液（例えば、各国薬局方で認められているもの）を適宜使用することができる。
【００１３】
これらのヒアルロン酸類は、動物組織から抽出する抽出法により製造したものでも、ヒアルロン酸生産微生物菌株を用いて発酵させて得る発酵法で製造したものでもよい。しかしながら、動物組織から抽出したものには、他のムコ多糖などの不純物が比較的多く、ヒアルロン酸類の分子量も小さいため、発酵法で得られるものを用いることが望ましい。本発明に適した発酵法の一例では、例えばストレプトコッカス属の微生物を使用して既知の方法でヒアルロン酸類を得ることができる。
発酵法により得られた発酵液を本発明の方法等に用いる場合には、既知の方法、例えば、遠心分離やろ過処理等で除菌した液を使用することが望ましい。場合によっては、アルコール等の水溶性有機溶媒を添加してヒアルロン酸を析出精製したものを使用してもよい。また、アルミナ等で処理したものを用いてもよい。
【００１４】
本明細書における「ストレプトコッカス」には、ヒアルロン酸を生産することのできるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の任意の細菌・その変異株が含まれる。特に、特許文献２に記載されたストレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）、特開平２−２３４６８９号公報に記載されたストレプトコッカス・エキＦＭ−３００（微工研菌寄第２３１９号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株を用いることが望ましい。ヒアルロン酸の生産に適したストレプトコッカス属の細菌の例としては、他に、これに限定されるものではないが、例えば、ストレプトコッカス・エキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・エキシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びこれらの変異株などが挙げられる。
【００１５】
本明細書における「限外ろ過膜」とは、孔径が０．００１〜０．０１μｍのろ過膜及び／又は分画分子量が１０００〜３０００００程度のろ過膜を意味する。限外ろ過膜の材質は、無機膜と有機膜に大別され、さらに疎水性と親水性に分けられる。疎水性の有機膜として、これに限定されるものではないが、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリエーテル、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。親水性の有機膜として、これに限定されるものではないが、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリイミド、酢酸セルロースなどが挙げられる。その濾材形状としては、平膜、管状膜、スパイラル膜、ホロファイバー（中空糸）膜等、あらゆるモジュール形式が含まれる。
【００１６】
ろ過方式としては、全量ろ過方式とクロスフロー方式が含まれる。全量ろ過方式は膜に供給される水の全量をろ過する方式のことをいう。これに対して、クロスフロー方式は膜面に対し平行な流れを作ることで膜に供給される水に含まれる懸濁物質やコロイドが膜面に堆積する現象を抑制しながらろ過を行う方式のことをいう。クロスフロー方式には、これに限定されるものではないが、ワンパス方式、バックフラッシュ方式及びリバース方式が含まれる。ワンパス方式とは、図１のＡに示すように、限外ろ過膜からの透過液を再利用せずにろ過を行う方式のことをいう。バックフラッシュ方式とは、図１のＢに示すように、限外ろ過膜からの透過液を透過液タンクに貯蔵し、透過液タンクから限外ろ過膜へ移送し、ろ過膜表面に付着したヒアルロン酸類を洗い流す工程を含むろ過方式のことをいう。リバース方式とは、図１のＣに示すように、限外ろ過膜からの透過液を、透過液バルブを閉めて逆流させることにより、ろ過膜表面に付着したヒアルロン酸類を洗い流す工程を含むろ過方式のことをいう。
【００１７】
本明細書における「不純物」とは、ヒアルロン酸類、水その他の溶媒成分、無機塩以外の物質、特に、最終製品としてのヒアルロン酸類を用いる際に不利益を与え得る物質（発熱性物質など）のことをいう。主な不純物源としては、ヒアルロン酸類の生産段階での組織、微生物又は培養液（培地）由来のもの、あるいは、その後の精製段階等で混入したものが挙げられる。本明細書における不純物の例としては、これに限られるものではないが、組織又は菌体、タンパク質、核酸、多糖類、低分子化合物、あるいはエンドトキシンなどが挙げられる。不純物としての組織又は菌体には、これに限られるものではないが、それぞれ、抽出法で用いた抽出原料としての組織由来の組織片などや、発酵法で用いた微生物の菌体あるいは菌体片などが含まれる。不純物としてのタンパク質には、これに限られるものではないが、上記組織、菌由来のタンパク質や、生産後の工程で混入したタンパク質などが含まれる。不純物としてのエンドトキシンには、これに限られるものではないが、上記菌由来のリポ多糖類などが含まれる。
【００１８】
本明細書における「低分子化合物」とは、ヒアルロン酸類と比較して、分子量の比較的小さな化合物のことをいい、例えば、これに限られるものではないが、分子量２０００Ｄａ以下、あるいは、分子量１０００Ｄａ、あるいは分子量５００Ｄａ以下の化合物のことをいう。このような低分子化合物には、各種アミノ酸、有機酸（例えば、乳酸）、糖（例えば、グルコース）などが含まれる。
【００１９】
本明細書における「除去」には、対象の物質を完全に除き去ることに加え、部分的に除き去る（その物質の量を減少させる）ことも含まれる。本明細書における「精製」には、任意の又は特定の不純物を除去することが含まれる。
【００２０】
本明細書におけるそれぞれの数値範囲については、「〜」で示された上限値及び下限値をそれぞれ含むものとする。
【００２１】
〔実施の形態〕
本発明は、これに限られるものではないが、例えば、以下の実施態様に関する。
【００２２】
実施態様１．
ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸溶液を酸性側のｐＨに調製した後、限外ろ過膜にて透析処理することにより不純物を除去する工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【００２３】
実施態様２．
限外ろ過膜の分画分子量と限外ろ過膜による透析処理時のｐＨとが以下の式
ｐＨ≦−５×１０−５×（分画分子量）＋４．４９７８
を満たす条件下で限外ろ過膜による透析処理が行われる、実施態様１に記載の方法。
【００２４】
実施態様３．
限外ろ過膜の分画分子量が２５０００〜３５０００であり、透析処理時のｐＨが３．３以下である、実施態様１又は２に記載の方法。
【００２５】
前記限外ろ過膜の分画分子量が１２０００〜１４０００であり、透析処理時のｐＨが３．９以下である、実施態様１又は２に記載の方法。
【００２６】
実施態様４．
前記限外ろ過膜の分画分子量が９０００〜１１０００であり、透析処理時のｐＨが４．１以下である、実施態様１又は２に記載の方法。
【００２７】
実施態様５．
前記限外ろ過膜の分画分子量が６０００〜８０００であり、透析処理時のｐＨが４．２以下である、実施態様１又は２に記載の方法。
【００２８】
実施態様６．
前記限外ろ過膜の分画分子量が４０００〜５０００であり、透析処理時のｐＨが４．３以下である、実施態様１又は２に記載の方法。
【００２９】
実施態様７．
前記限外ろ過膜が疎水性有機膜である、実施態様１ないし６の何れか一項に記載の方法。
【００３０】
実施態様８．
前記処理のろ過方式がリバース方式である、実施態様１ないし７の何れか一項に記載の方法。
【００３１】
実施態様９．
前記処理時の透過流速が、２０〜５０Ｌ／ｍ２・ｈｒである、実施態様１ないし８の何れか一項に記載の方法。
【００３２】
実施態様１０．
前記不純物が、菌体、タンパク質、核酸、低分子化合物、又はエンドトキシンを含む、実施態様１ないし９の何れか一項に記載の方法。
【００３３】
実施態様１１．
精製後の上記ヒアルロン酸及び／又はその塩の平均分子量が３５０万〜７００万Ｄａである、実施態様１ないし１０の何れか一項に記載の方法。
【００３４】
実施態様１２．
前記ヒアルロン酸類溶液中のヒアルロン酸及び／又はその塩の濃度が１〜５ｇ／Ｌである、実施態様１ないし１１の何れか一項に記載の方法。
【００３５】
以下、本発明の態様について説明する。
【００３６】
本発明の態様（例えば、実施態様１）は、ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸類溶液を酸性側のｐＨに調製した後、限外ろ過膜にて透析処理することにより不純物を除去する工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法である。この精製方法によると、酸性側のｐＨに調製することにより限外ろ過膜によるろ過におけるヒアルロン酸類の損失が減少し、不純物を効率よく除去することができる。
【００３７】
限外ろ過膜の分画分子量と限外ろ過膜による透析処理時のｐＨとが以下の式
ｐＨ≦−５×１０−５×（分画分子量）＋４．４９７８
を満たす条件下で限外ろ過膜による透析処理が行うことにより、実質的にヒアルロン酸類を損失することなく精製することができる。上記の式を満たす限外ろ過膜の分画分子量と限外ろ過膜による透析処理時のｐＨとして、例えば分画分子量３５０００の限外ろ過膜ではｐＨ２．７、分画分子量３００００の限外ろ過膜ではｐＨ３．０、分画分子量２５０００の限外ろ過膜ではｐＨ３．３、分画分子量２００００の限外ろ過膜ではｐＨ３．５、分画分子量１４０００の限外ろ過膜ではｐＨ３．８、分画分子量１３０００の限外ろ過膜ではｐＨ３．９、分画分子量１２０００の限外ろ過膜ではｐＨ３．９、分画分子量１１０００の限外ろ過膜ではｐＨ４．０、分画分子量１００００の限外ろ過膜ではｐＨ４．０、分画分子量９０００の限外ろ過膜ではｐＨ４．１、分画分子量８０００の限外ろ過膜ではｐＨ４．１、分画分子量７０００の限外ろ過膜ではｐＨ４．２、分画分子量６０００の限外ろ過膜ではｐＨ４．２、分画分子量５０００の限外ろ過膜ではｐＨ４．３、分画分子量４０００の限外ろ過膜ではｐＨ４．３が挙げられる。
ここで、「実質的にヒアルロン酸類を損失することなく」とは、ヒアルロン酸類の損失率が３％以下（回収率が９７％以上）となることをいう。
【００３８】
分画分子量の高い膜を使用するとヒアルロン酸類が限外ろ過膜を透過して損失が起こるリスクが高くなる一方、分画分子量の低い膜を使用するとタンパク質等の比較的高分子の不純物の除去効率が低下する。上記実施形態の方法によると、分画分子量の高い膜を使用しても、分画分子量の低い膜を使用しても、膜の分画分子量に適したｐＨに調整することでヒアルロン酸類を損失せずに不純物を除去できることから、上記態様の方法において用いる限外ろ過膜の分画分子量は、特に限定されるものではない。例えば２５０００〜３５０００の分画分子量を有する限外ろ過膜を用いる場合、ｐＨを３．３以下に調整することでヒアルロン酸類を損失せずに精製することができる。１２０００〜１４０００の分画分子量を有する限外ろ過膜を用いる場合、ｐＨを３．９以下に調整することでヒアルロン酸類を損失せずに精製することができる。９０００〜１１０００の分画分子量を有する限外ろ過膜を用いる場合、ｐＨを４．１以下に調整することでヒアルロン酸類を損失せずに精製することができる。６０００〜８０００の分画分子量を有する限外ろ過膜を用いる場合、ｐＨを４．２以下に調整することでヒアルロン酸類を損失せずに精製することができる。４０００〜５０００の分画分子量を有する限外ろ過膜を用いる場合、ｐＨを４．３以下に調整することでヒアルロン酸類を損失せずに精製することができる。
【００３９】
ここで、限外ろ過膜の分画分子量は、表１に示したような指標物質を用いてろ過を行い、それぞれの阻止率が９０％に相当する分子量を調べることにより決定することができる。
【表１】
2011114475.tif 000003
【００４０】
上記態様の方法において用いる限外ろ過膜の材質は、特に限定されるものではないが、不純物の除去の観点からは、疎水性有機膜が望ましく、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリエーテル、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリプロピレンがさらに望ましい。
【００４１】
上記態様の方法において用いる限外ろ過膜として、例えば、ＰＭ−１０、ＰＭ−５０、ＰＭ−１００（Ｋｏｃｈ社製）、ＮＴＵ−３０５０（日東電工社製）、ＩＲＩＳ３０６５（ローヌ・プラン社製）、ＦＳ−１０（旭化成社製）、ＭＵ−６３０３（クラレ社製）、ＤＵＳＯ４００（ダイセル化学工業社製）、ＳＬＰ−３０５３（旭化成ケミカルズ社製）等が使用できるが、これらに制限されるものではない。
【００４２】
上記態様の方法におけるろ過方式は、特に限定されるものではないが、水の膜透過流速が安定化しやすいこと、ろ過膜の寿命が延長することなどから、クロスフロー方式が望ましく、中でもリバース方式が特に望ましい。
【００４３】
上記態様の方法において、ヒアルロン酸類溶液の限外ろ過膜処理時における透過流速は、ヒアルロン酸類溶液の性状や限外ろ過膜の種類により異なり一律に規定する事ができないが、例えば、工業的規模でのヒアルロン酸類の精製においては２０Ｌ／ｍ２・ｈｒ以上であることが望ましく、２５Ｌ／ｍ２・ｈｒ以上であることがさらに望ましく、３０Ｌ／ｍ２・ｈｒ以上であることが特に望ましい。ヒアルロン酸類がせん断され、分子量の低下が起こることから、ヒアルロン酸類溶液のろ過における透過流速は、１００Ｌ／ｍ２・ｈｒ以下であることが望ましく、５０Ｌ／ｍ２・ｈｒ以下であることがさらに望ましい。
【００４４】
上記態様の方法において、送液のための圧力についての限定はないが、一般に加圧にてろ過膜を通過させることが好ましい。特に加圧はポンプなどで送る方法が好ましい。送液時にポンプで圧力をかけるにあたり、ろ過膜を破損したり目詰まりさせたりして性能を劣化させない限り、特に限定されない。ろ過膜にかかる圧力としては、０．０１ＭＰａ以上０．３０ＭＰａが好ましく、さらに０．０３ＭＰａ以上０．２０ＭＰａが好ましく、０．０５ＭＰａ以上０．１０ＭＰａが特に好ましい。
【００４５】
さらに、上記態様の方法によると、精製時におけるヒアルロン酸類の分子量の低下を低減させることができ、特に、高分子量（例えば、精製後の平均分子量が３５０万〜７００万Ｄａ）のヒアルロン酸類の精製において、優れた効果を発揮する。また、従来は処理が困難であった比較的高濃度（例えば、０．１〜２０ｇ／Ｌ、０．５〜１５ｇ／Ｌ、１〜１０ｇ／Ｌ）のヒアルロン酸類溶液についても、効率的に処理することができる。
【００４６】
また、上記態様の方法によると、ヒアルロン酸類の消失は低く抑えながらも、不純物として、一般的に限外ろ過膜により除去可能とされる低分子化合物（例えば、アミノ酸、糖、有機酸）のみならず、高分子化合物（例えば、核酸、エンドトキシン、タンパク質）までも効率的に分離・除去することが可能であった。また、上記態様の方法は、核酸、エンドトキシン及び／又はタンパク質の除去にも優れた効果を発揮する。
【００４７】
上記態様の方法を用いる際のヒアルロン酸類溶液のヒアルロン酸類濃度は、溶液粘度の高さに起因する取り扱いの困難さ及びヒアルロン酸類の溶解度の観点からは、これに限定されるものではないが、０．１〜２０ｇ／Ｌが望ましく、１〜１０ｇ／Ｌが最も望ましい。
【００４８】
また、上記態様の方法において、ヒアルロン酸類溶液の粘度を下げる目的で、ヒアルロン酸類溶液に塩化ナトリウム等の塩類を共存させることもできる。この場合、精製効果が損なわれないように、高濃度の塩の共存は避けることが望ましい。このような塩の共存の具体例としては、０．１〜５重量％の塩化ナトリウムをヒアルロン酸類溶液に添加することが挙げられる。
【００４９】
上記態様の方法を用いる際のヒアルロン酸類溶液の温度は、これに限定されるものではないが、０〜８０℃であることが望ましい。温度が８０℃以下であれば、処理中のヒアルロン酸類の分解及び分子量の低下を、強く抑えることができる。
【００５０】
また、限外ろ過透祈処理を行うにあたり、膜前処理として、２％以下のアルカリ(例えば、水酸化ナトリウム水溶液)、過酸化物(例えば、次亜塩素酸ナトリウム水溶液)、界面活性剤、クエン酸、クエン酸アンモニウム・酵素洗剤等の薬剤で膜を洗浄処理する化学的方法や、フラッシング、スポンジボール、空気インジェクション法等の物理的方法により行うことが望ましい。
【００５１】
本発明の更なる態様は、上記第一の態様において、上述の工程とは別に、ヒアルロン酸類溶液を無機吸着剤、有機吸着剤及び／又は活性炭と接触させる工程をさらに含んでもよい。
【００５２】
また、その後に必要となる分離・精製工程等を考慮すると、追加の精製工程を必要とする成分の混入を避けることが望ましい。すなわち、新たな不純物の混入を避けるための、本発明の他の態様は、上記第一の態様において、ヒアルロン酸類溶液の限外ろ過後に無機吸着剤又は有機吸着剤と接触させる工程を含まない精製方法である。本発明の更なる態様では、上記第一の態様において、ヒアルロン酸類溶液を、無機吸着剤又は有機吸着剤と接触させる工程を含まない。本発明においては、限外ろ過でも十分な精製効果を奏することが可能であるため、新たな不純物の混入を避けることを重視する場合には、限外ろ過単独で処理することが望ましい。もちろん、この場合も、限外ろ過とは別に、他の精製処理等の工程を行うことはできる。
【００５３】
また、本発明の更なる態様では、上記態様において、ヒアルロン酸類がストレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研条寄第９０２７号）あるいはストレプトコッカス・エキＦＭ−３００（微工研条寄第２３１９号）により生産される。これらの微生物により生産されたヒアルロン酸類を精製対象として用いることで、より不純物が少なく、高分子量のヒアルロン酸類精製物を得ることができ、特に医薬として用いる際には優れた効果を発揮する。
【００５４】
上記態様の精製方法を用いることで、ヒアルロン酸類の分離・精製工程の負荷を軽減することができるため、上記態様に関する精製方法は、製造の工業的なプロセスの比較的初期段階で用いることが特に有効的である。
【００５５】
なお、上記実施態様、態様により説明される精製方法等は、本発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
【００５６】
例えば、上記精製方法は、更なる他の工程を含むか、あるいは、上記精製方法に引き続いて更なる他の工程・方法が実施され、ヒアルロン酸類等を製造する方法であってもよい。そのような工程・方法としては、例えば、ヒアルロン酸生産微生物菌株を培養する工程、ヒアルロン酸産生微生物菌株培養液から培養濾液を製造する工程、精製対象液を遠心分離する工程、対象液を中和する工程、精製対象液を精密ろ過する工程、対象液を透析処理する工程、精製対象液に芳香族系吸着樹脂を加えて攪拌及びろ過する工程、対象液をクロマトグラフィーで精製する工程、活性炭を対象液から分離する工程、活性炭を対象液から除去する工程、有機溶媒を加えてヒアルロン酸類を沈殿させる工程、ヒアルロン酸類を結晶化する工程、ヒアルロン酸類を乾燥させる工程などが挙げられる。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５８】
実施例１
ストレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研寄第９０２７号）を用いて培養した培養液４５Ｌを純水で８０Ｌに希釈し（ヒアルロン酸ナトリウム濃度２．０ｇ／１）、遠心分離で菌体を除いた。得られた粗製ヒアルロン酸をｐＨ２．９に調整した後、分画分子量３００００材質ポリスルフォンの限外ろ過膜（Ｋｏｃｈ社製・ＰＭ−１００）２ｍ２にて透過流速３０Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍希釈操作を繰り返し透析回数１０回、リバース方式で処理した。得られた液８０Ｌに食塩２．４ｋｇを溶解し、ｐＨ７に調整後エタノール２４０Ｌで析出、エタノール８Ｌで洗浄し、４０℃で真空乾燥してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表２に示す。【００５９】
実施例２
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸をｐＨ２．９に調整した後、分画分子量３００００材質ポリエーテルスルフォンの限外ろ過膜（旭化成社製・ＦＳ−１０）５ｍ２にて透過流速３０Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透祈回数１１回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例１と同様に処理してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分折結果、及びヒアルロン酸回収率を表２に示す。【００６０】
実施倒３
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸をｐＨ３．３に調整した後、分画分子量２００００材質ポリスルフォンの限外ろ過膜（日東電工社製・ＮＴＵ−３０５０）３ｍ２にて透過流速３０Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数８回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例１と同様に処理してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸ナトリウムの回収率を表２に示す。【００６１】
実施例４
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸をｐＨ２．９に調整した後、分画分子量３００００材質ポリフッ化ビニリデンの限外ろ過膜（ローヌ・プラン社製・ＩＲＩＳ３０６５）５ｍ２にて透過流速３０Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数９回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例１と同様に処理してヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸ナトリウムの回収率を表２に示す。【００６２】
実施例５
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸をｐＨ２．７に調整した後、分画分子量４００００材質ポリエーテルスルフォンの限外ろ過膜（ダイセル化学工業社製・ＤＵＳＯ４００）５ｍ２にて透過流速３０Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例１と同様に処理し、１５０ｇのヒアルロン酸ナトリウムが得られた。分析結果、及びヒアルロン酸ナトリウムの回収率を表２に示す。【００６３】
実施例６
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸をｐＨ３．７に調整した後、分画分子量１３０００材質ポリスルフォンの限外ろ過膜（クラレ社製・ＭＵ−６３０３）５ｍ２にて透過流速３０Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例１と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸ナトリウムの回収率を表２に示す。【００６４】
実施例７
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸をｐＨ３．７に調整した後、分画分子量１００００材質ポリスルフォンの限外ろ過膜（旭化成ケミカルズ社製・ＳＬＰ−３０５３）４．５ｍ２にて透過流速３０Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例１と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸ナトリウムの回収率を表２に示す。【００６５】
比較例１
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸をｐＨ５．５に調整した後、分画分子量１００００材質ポリスルフォンの疎水性限外ろ過膜（Ｋｏｃｈ社製・ＰＭ−１０）２ｍ２にて透過流速３０Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍希釈操作を繰り返し透析回数１５回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例１と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表２に示す。【００６６】
比較例２
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸をｐＨ３．６に調整した後、分画分子量２００００材質酢酸セルロースの親水性限外ろ過膜（ＤＤＳ社製・ＣＡ６００ＰＰ）４．５ｍ２にて透過流速３０Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１０回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例１と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表２に示す。【００６７】
比較例３
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸をｐＨ３．３に調整した後、分画分子量２００００材質酢酸ポリイミドの親水性限外ろ過膜（日東電工社製・ＮＴＵ−４２２０）５ｍ２にて透過流速３０Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数９回、リバース方式で処理した。得られた液は実施例１と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表２に示す。【００６８】
比較例４
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸をｐＨ３．７に調整した後、分画分子量１３０００材質酢酸ポリスルフォンの疎水性限外ろ過膜（クラレ社製・ＭＵ−６３０３）５ｍ２にて透過流速５Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回、ワンパス方式で処理した。得られた液は実施例１と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表２に示す。【００６９】
比較例５
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸をｐＨ３．７に調整した後、分画分子量１３０００材質酢酸ポリスルフォンの疎水性限外ろ過膜（クラレ社製・ＭＵ−６３０３）５ｍ２にて透過流速１５Ｌ／ｍ２・ｈｒ、容積比２倍濃縮、等倍純水希釈を繰り返し透析回数１１回、バックフラッシュ方式で処理した。得られた液は実施例１と同様に処理し、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結果、及びヒアルロン酸回収率を表２に示す。【００７０】
【表２】
2011114475.tif 000004
【００７１】
測定方法
（１）核酸含量：０．１％ヒアルロン酸ナトリウムの２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（２）タンパク質含量：ヒアルロン酸ナトリウムを０．１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し、ローリー法で行った。
（３）乳酸：ヒアルロン酸ナトリウムを、０．１％の濃度に溶解し、Ｌ−ＬＤＨ法にて行った。
（４）金属：ヒアルロン酸ナトリウムを、０．０５％の濃度に８Ｎ硝酸に溶解し、ＩＣＰ発光分光分析を行った。
（５）極限粘度：ヒアルロン酸ナトリウムを、０．０２％の濃度に０．２Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、３０℃における極限粘度を測定した。【００７２】
【表３】
2011114475.tif 000005
【００７３】
実施例８
実施例１で用いた粗製ヒアルロン酸を、様々な分画分子量を有するポリスルフォンの疎水性限外ろ過膜を用いて以下の条件で精製し、限外ろ過時のｐＨとヒアルロン酸の回収率との関係を調べた。
ＨＡ溶液条件
ＨＡ濃度：２ｇ／Ｌ
分子量：４４０万  （極限粘度：５５ｄＬ／ｇ）
ろ過条件
線速：１ｍ／ｓ
透過流速：３０Ｌ／（ｍ２・ｈｒ）
濃縮：２倍濃縮
温度：２５℃【００７４】
限外ろ過時のｐＨとヒアルロン酸回収率との関係を示すグラフを図２に示す。また、各分画分子量の膜について、限外ろ過時のｐＨとヒアルロン酸損失率との関係を示す式１〜５が得られた。下記式１〜５を用いて、各分画分子量の限外ろ過膜におけるヒアルロン酸類の損失が実質的に起こらないｐＨを算出し、そのｐＨの範囲内（至適ｐＨ）で限外ろ過による精製を行うことで、ヒアルロン酸類を損失することなく精製することができる。
分画分子量３０，０００の限外ろ過膜を用いた場合
（式１）ヒアルロン酸類の損失率（％）＝４４．８６×（限外ろ過時のｐＨ）−１３１．７９
（至適ｐＨ≦２．９）
分画分子量１３，０００の限外ろ過膜を用いた場合
（式２）ヒアルロン酸類の損失率（％）＝４０．８４×（限外ろ過時のｐＨ）−８６．９２
（至適ｐＨ≦３．７）
分画分子量１０，０００の限外ろ過膜を用いた場合
（式３）ヒアルロン酸類の損失率（％）＝２４．３６×（限外ろ過時のｐＨ）−９７．１９
（至適ｐＨ≦４．０）
分画分子量７，０００の限外ろ過膜を用いた場合
（式４）ヒアルロン酸類の損失率（％）＝７．０９×（限外ろ過時のｐＨ）−２９．０２
（至適ｐＨ≦４．１）
分画分子量５，０００の限外ろ過膜を用いた場合
（式５）ヒアルロン酸類の損失率（％）＝０．７９×（限外ろ過時のｐＨ）−２．０１
（至適ｐＨ≦４．２）【００７５】
ヒアルロン酸類の損失率が３％以下となるｐＨと限外ろ過膜の分画分子量との関係を図３に示す。また、ヒアルロン酸類の損失率が３％以下となるｐＨと限外ろ過膜の分画分子量との関係は以下の式６を満たすことが明らかとなった。
（式６）ヒアルロン酸類の損失率が３％以下となるｐＨ＝−５×１０−５×（分画分子量）＋４．４９７８
式６を用いることで、限外ろ過膜の分画分子量に対する至適ｐＨの上限を求めることができ、至適ｐＨで限外ろ過膜による透析を行うことにより、損失率３％以下でヒアルロン酸類を精製することができる。【００７６】
以上の実験から、本発明に係る精製方法を用いると、ヒアルロン酸類溶液から、不純物を効果的に除去し、高分子量のヒアルロン酸類を精製できることが確認された。【００７７】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、クロスフロー方式に含まれる、ワンパス方式（Ａ）、バックフラッシュ方式（Ｂ）及びリバース方式（Ｃ）のろ過方式を示す図である。
【図２】図２は、限外ろ過時のｐＨとヒアルロン酸損失率との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒアルロン酸類の損失率が３％以下となるｐＨと限外ろ過膜の分画分子量との関係を示すグラフである。
【図１】
2011114475.tif 000006
【図２】
2011114475.tif 000007
【図３】
2011114475.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月7日(2013.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸及び／又はその塩と不純物とを含むヒアルロン酸溶液を酸性側のｐＨに調製した後、限外ろ過膜にて透析処理することにより不純物を除去する工程を含む、ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法。
【請求項２】
前記限外ろ過膜の分画分子量と限外ろ過膜による透析処理時のｐＨとが以下の式
ｐＨ≦−５×１０−５×（分画分子量）＋４．４９７８
を満たす条件下で限外ろ過膜による透析処理が行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記限外ろ過膜の分画分子量が２５０００〜３５０００であり、透析処理時のｐＨが３．３以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記限外ろ過膜の分画分子量が１２０００〜１４０００であり、透析処理時のｐＨが３．９以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記限外ろ過膜の分画分子量が９０００〜１１０００であり、透析処理時のｐＨが４．１以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記限外ろ過膜の分画分子量が６０００〜８０００であり、透析処理時のｐＨが４．２以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記限外ろ過膜の分画分子量が４０００〜５０００であり、透析処理時のｐＨが４．３以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記限外ろ過膜が疎水性有機膜である、請求項１ないし７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記処理のろ過方式がリバース方式である、請求項１ないし８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記処理時の透過流速が、２０〜５０Ｌ／ｍ２・ｈｒである、請求項１ないし９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記不純物が、菌体、タンパク質、核酸、低分子化合物、又はエンドトキシンを含む、請求項１ないし１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
精製後の上記ヒアルロン酸及び／又はその塩の平均分子量が３５０万〜７００万Ｄａである、請求項１ないし１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒアルロン酸類溶液中のヒアルロン酸及び／又はその塩の濃度が１〜５ｇ／Ｌである、請求項１ないし１２の何れか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
実施態様４．
前記限外ろ過膜の分画分子量が１２０００〜１４０００であり、透析処理時のｐＨが３．９以下である、実施態様１又は２に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
実施態様５．
前記限外ろ過膜の分画分子量が９０００〜１１０００であり、透析処理時のｐＨが４．１以下である、実施態様１又は２に記載の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
実施態様６．
前記限外ろ過膜の分画分子量が６０００〜８０００であり、透析処理時のｐＨが４．２以下である、実施態様１又は２に記載の方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
実施態様７．
前記限外ろ過膜の分画分子量が４０００〜５０００であり、透析処理時のｐＨが４．３以下である、実施態様１又は２に記載の方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
実施態様８．
前記限外ろ過膜が疎水性有機膜である、実施態様１ないし７の何れか一項に記載の方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
実施態様９．
前記処理のろ過方式がリバース方式である、実施態様１ないし８の何れか一項に記載の方法。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
実施態様１０．
前記処理時の透過流速が、２０〜５０Ｌ／ｍ２・ｈｒである、実施態様１ないし９の何れか一項に記載の方法。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
実施態様１１．
前記不純物が、菌体、タンパク質、核酸、低分子化合物、又はエンドトキシンを含む、実施態様１ないし１０の何れか一項に記載の方法。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
実施態様１２．
精製後の上記ヒアルロン酸及び／又はその塩の平均分子量が３５０万〜７００万Ｄａである、実施態様１ないし１１の何れか一項に記載の方法。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
実施態様１３．
前記ヒアルロン酸類溶液中のヒアルロン酸及び／又はその塩の濃度が１〜５ｇ／Ｌである、実施態様１ないし１２の何れか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2011114475.tif 000009
2011114475.tif 000010