(57)【要約】  本発明は、特別な機器を必要とせず、迅速かつ確実に微生物を検出するための微生物検出用試薬に用いられる化合物、微生物検出用試薬および微生物の検出方法を提供することを課題とする。上記課題は、下記一般式（Ｉ）2011132480.tif 000014［式中の記号は、明細書の定義を参照のこと］で示されるテトラゾリウム化合物、テトラゾリウム化合物を含む微生物検出用発色試薬、またはその発色試薬を用いた微生物の検出方法により解決される。
2011132480.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）
【化１】
2011132480.tif 000013
（式（I）中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に水素またはＣ1-6アルコキシル（ただし、Ｒ１およびＲ２は同時に水素ではない）、Ｒ３は水素またはニトロ、Ｒ４は水素、ニトロまたはＣ1-6アルコキシル、Ｘ−は陰イオン）で表されるテトラゾリウム化合物。
【請求項２】
式（I）中、Ｒ１およびＲ２のいずれか一方はＣ1-6アルコキシルで他方は水素である請求項１に記載のテトラゾリウム化合物。
【請求項３】
式（I）中、Ｒ１はメトキシ、Ｒ２は水素、そしてＲ３およびＲ４の少なくともいずれか一方がニトロである請求項２に記載のテトラゾリウム化合物。
【請求項４】
テトラゾリウム化合物が、２-(２-メトキシフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウム塩、２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウム塩、２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３,５ジフェニル-テトラゾリウム塩、２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３-(４−メトキシフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウム塩または２-(３-メトキシフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウム塩である請求項１に記載のテトラゾリウム化合物。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれかに記載のテトラゾリウム化合物を含む微生物検出用発色試薬。
【請求項６】
テトラゾリウム化合物の還元により生じるホルマザン色素の吸収波長域が４００ｎｍ〜４２０ｎｍである請求項５に記載の微生物検出用発色試薬。
【請求項７】
微生物を含む検体と、請求項５または請求項６のいずれかに記載の発色試薬との接触によりテトラゾリウム化合物から生じるホルマザン色素の発色シグナルにより微生物を検出する検出方法。
【請求項８】
酵素的サイクリング反応により発色シグナルを増感する請求項７に記載の微生物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テトラゾリウム化合物、その化合物を含む微生物検出用試薬および微生物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の微生物検査は、例えば以下のように行われる。まず、粉末寒天培地を溶解、滅菌した後、一定の温度に保っておく。その寒天培地の一定量を、予め食品の懸濁液などの検査試料の一定量を入れた滅菌ペトリ皿などに分注して混釈する。混釈後の寒天を固化し、通常２４〜４８時間ほど培養した後、生じた微生物のコロニー数を計数する。このように従来の一般生菌検査方法は、前もって培地を調製、滅菌した後、培地が固化しない温度に保っておく必要があるなど、非常に手間と時間がかかる方法である。【０００３】
また、培地調製の手間を省いたスタンプタイプ（例えば、特許文献１参照）、フィルタータイプ、フィルム（シート）タイプ（例えば、特許文献２〜４参照）、微生物の移動を抑制して培養器材表面にコロニーを形成させるタイプ（例えば、特許文献５参照）、試験紙タイプなど、それぞれの目的にあわせ使いやすいように作られた簡易培地が生産されている。しかしながら、検査時間は上記の寒天培地を用いた場合と変わらず、２４〜４８時間、またはそれ以上を要するものである。【０００４】
一方、検査時間を短縮した方法の例として、捕集した菌を短時間培養した後、界面活性剤や有機溶媒などで菌由来のアデノシン−三リン酸を細胞より抽出し、ルシフェラーゼの存在下にルシフェリンと反応させて発光させ、その発光輝点をイメージアナライザーで検出して生菌数を測定する方法がある（例えば、特許文献６参照）。しかし、この方法は特別な測定機器を必要とし、通常は固形物を含まない液体試料の検査にしか適用できない。【０００５】
特別な測定機器を必要としない方法として、培養した微生物、あるいは生体試料を色素原と接触させ、色素原の発色または蛍光シグナルにより微生物の存在を確認する方法が開示されている（例えば、特許文献７〜９参照）。このような方法が、例えば食品における微生物、血清、全血などの生体試料中の成分の測定に用いられた場合、対象となる微生物、成分の容易かつ確実な検出が困難になり得る。これは、色素原を発色させるために必要な酵素反応が速やかに進行しなかったり、あるいは色素原により生じた色素の色が、食品、生体試料などの色と類似してしまう場合があるためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平４−１１７２９９号公報
【特許文献２】特公平２−４９７０５号公報
【特許文献３】特開平３−１５３７９号公報
【特許文献４】国際公開第２００１／４４４３７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第１９９７／２４４３２号パンフレット
【特許文献６】特開平４−３０７９８号公報
【特許文献７】特開２００５−１１０６３８号公報
【特許文献８】特開２００５−２８７４５２号公報
【特許文献９】特開２００９−７２１３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような状況において、特別な機器を必要とせず、迅速かつ確実に微生物を検出するための微生物検出用試薬に用いられる化合物および微生物検出用試薬、微生物の検出方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下のように、テトラゾリウム化合物、テトラゾリウム化合物を含む微生物検出用試薬および微生物の検出方法を提供する。【０００９】
＜１＞下記式（I）
【化１】
2011132480.tif 000003
上記式（I）において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に水素またはＣ1-6アルコキシルを示し（ただし同時に水素であることはない）、Ｒ３は水素またはニトロ、Ｒ４は水素、ニトロまたはＣ1-6アルコキシル、Ｘ−は陰イオンであるテトラゾリウム化合物。
＜２＞  上記式（I）中、Ｒ１およびＲ２のいずれか一方はＣ1-6アルコキシルで他方は水素である上記＜１＞に記載のテトラゾリウム化合物。
＜３＞  上記式（I）中、Ｒ１はメトキシ、Ｒ２は水素、そしてＲ３およびＲ４の少なくともいずれか一方がニトロである上記＜２＞に記載のテトラゾリウム化合物。
＜４＞  ２-(２-メトキシフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウム塩、２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウム塩、２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３,５ジフェニル-テトラゾリウム塩または２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３-(４−メトキシフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウム塩または２-(３-メトキシフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウム塩である上記＜１＞に記載のテトラゾリウム化合物。
＜５＞  上記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のテトラゾリウム化合物を含む微生物検出用発色試薬。
＜６＞  テトラゾリウム化合物の還元により生じるホルマザン色素の吸収波長域が４００ｎｍ〜４２０ｎｍである、上記＜５＞に記載の微生物検出用発色試薬。
＜７＞  微生物を含む検体と、上記＜５＞または＜６＞のいずれかに記載の発色試薬との接触によりテトラゾリウム化合物から生じるホルマザン色素の発色シグナルにより微生物を検出する検出方法。
＜８＞  酵素的サイクリング反応により発色シグナルを増感する上記＜７＞に記載の微生物の検出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明においては、微生物等との接触により、確実に検出可能な発色シグナルを速やかに発生させるテトラゾリウム化合物が実現される。そしてこのようなテトラゾリウム化合物を用いることにより、特別な機器なしに迅速かつ確実に微生物を検出可能な発色試薬および検出方法もまた実現される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１の発色試薬により検出された生育菌数と比較例の発色試薬により検出された生育菌数との関係を示すグラフである。
【図２】実施例２の発色試薬により検出された生育菌数と比較例の発色試薬により検出された生育菌数との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．テトラゾリウム化合物
本発明のテトラゾリウム化合物は、上記式（I）で示される構造を有する。
【００１３】
１Ａ．置換基Ｒ１およびＲ２
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ水素またはＣ1-6アルコキシルであり、同時に水素であることはない。すなわちＲ１およびＲ２は、いずれか一方がＣ1-6アルコキシルであって他方が水素であるか、あるいは、いずれもＣ1-6アルコキシルである。好ましくは、Ｒ１およびＲ２のいずれか一方がＣ1-6アルコキシル、他方が水素であり、より好ましくは、Ｒ１およびＲ２のいずれか一方がＣ1-3アルコキシルである。また、Ｃ1-3アルコキシルは、さらに好ましくはメトキシである。Ｃ1-6（Ｃ1-3）アルコキシルは、例えばヒドロキシ、ハロゲンなどの置換基を有していても、有していなくてもよい。また、Ｃ1-6（Ｃ1-3）アルコキシルは、分岐していても、分岐していなくてもよい。
【００１４】
１Ｂ．置換基Ｒ３およびＲ４
Ｒ３は水素またはニトロであり、Ｒ４は水素、ニトロまたはＣ1-6アルコキシルである。好ましくは、Ｒ３は水素またはニトロであり、Ｒ４は水素、ニトロまたはＣ1-3アルコキシルである。より好ましくは、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ水素またはニトロであり、Ｒ３およびＲ４の少なくともいずれか一方はニトロである。
【００１５】
１Ｃ．陰イオン
Ｘ−は陰イオンであり、好ましくは、塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲンイオンである。ただし、例えば四弗化ホウ素イオン等、他の陰イオンであってもよい。
【００１６】
上述のテトラゾリウム化合物は、より複雑な構造を有するテトラゾリウム化合物、例えばＮＢＴ（nitro blue tetrazolium）などに比べ、微生物の細胞中に取り込まれやすい。このため、微生物検出用の発色試薬として上述のテトラゾリウム化合物を用いると、酵素によるテトラゾリウム化合物の還元反応が速やかに進行してホルマザン色素が生じ、微生物を速やかに検出することができる。より具体的には、本発明のテトラゾリウム化合物として、２-(２-メトキシフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウムクロライド（下記式（II）参照）、２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウムクロライド（下記式（III）参照）、２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３,５ジフェニル-テトラゾリウムクロライド（下記式（IV）参照）、２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３-(４−メトキシフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウムクロライド（下記式（V）参照）または２-(３-メトキシフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウムクロライド（下記式（VI）参照）を微生物の検出に用いることが好ましい。特に、２−フェニル環において少なくとも置換基Ｒ１（オルト位）がメトキシであるもの、例えば、２−フェニル環における置換基Ｒ３（メタ位）が水素、３−フェニル環における置換基Ｒ４がニトロである２-(２-メトキシフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウム塩（下記式（II）参照）、さらに２−フェニル環の置換基Ｒ３としてニトロを有する２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウム塩（下記式（III）参照）等が好ましい。
【００１７】
【化２】
2011132480.tif 000004
【００１８】
【化３】
2011132480.tif 000005
【００１９】
【化４】
2011132480.tif 000006
【００２０】
【化５】
2011132480.tif 000007
【００２１】
【化６】
2011132480.tif 000008
【００２２】
１Ｄ．テトラゾリウム化合物の合成方法
本発明のテトラゾリウム化合物は、下記のいずれかの反応ルートによって合成することができる。
【化７】
2011132480.tif 000009
反応式（Ａ）において、Ｒ１〜Ｒ４およびＸ−は、前記式（Ｉ）において定義された置換基あるいはイオンである。この反応式（Ａ）で表される反応ルートでは、まず、置換基Ｒ１〜Ｒ３を有するフェニルヒドラジン塩酸塩（１）とベンズアルデヒド（２）を反応させ、中間体（３）を生成する。この中間体（３）と置換基Ｒ４を有するフェニルジアゾニウム化合物（４）との反応により、テトラゾリウム前駆体（５）を生成する。そしてテトラゾリウム前駆体（５）にハロゲン化チオニルを反応させ、上記式（Ｉ）で表されるテトラゾリウム化合物（６）を得る。
【００２３】
【化８】
2011132480.tif 000010
反応式（Ｂ）においても、Ｒ１〜Ｒ４およびＸ−は、前記式（Ｉ）において定義された置換基あるいはイオンである。この反応式（Ｂ）で表される反応ルートでは、まず、置換基Ｒ４を有するフェニルヒドラジン塩酸塩（７）とベンズアルデヒド（２）を反応させ、中間体（８）を生成する。この中間体（８）と置換基Ｒ１〜Ｒ３を有するアニリン誘導体（９）との反応により、テトラゾリウム前駆体（１０）を生成する。そしてテトラゾリウム前駆体（１０）にハロゲン化チオニルを反応させ、上記式（Ｉ）で表されるテトラゾリウム化合物（６）を得る。これらの反応ルートは、目的とするテトラゾリウム化合物の構造、必要とされる材料物質の入手容易性等に応じて、適宜選択可能である。
【００２４】
２．微生物検出用発色試薬
本発明の微生物検出用発色試薬は、上述のテトラゾリウム化合物のいずれかを発色基質として含んでいるため、微生物を速やかに検出できる。さらにこの場合、特別な測定機器は不要であり、目視でも微生物を確実に検出できる。このように、本発明の微生物検出用発色試薬を用いると、簡便な手法で確実に微生物を検出できる。
【００２５】
本発明の微生物検出用発色試薬においては、好ましくは、テトラゾリウム化合物の還元により生じるホルマザン色素の吸収波長域は３８０ｎｍ〜４８０ｎｍ、より好ましくは４００ｎｍ〜４３０ｎｍ、特に好ましくは４００ｎｍ〜４２０ｎｍである。この場合、ホルマザン色素は、青色、青紫色の発色シグナルを生じる。このような寒色系の発色シグナルを生じさせるテトラゾリウム化合物を発色基質として用いると、肉類等の暖色系のものを対象とした場合に、明らかに異なる色の発色シグナルにより微生物をより確実に検出できる。一般的に、微生物の検出対象である食品には肉類等の暖色系のものが数多く含まれるため、上述の微生物検出用発色試薬は、従来の暖色系の発色シグナルを生じるものに比べ、微生物をより確実に検出可能にする。
【００２６】
３．微生物の検出方法
本発明における微生物の検出方法では、上述の微生物検出用発色試薬が用いられる。そして、微生物を含む検体と上述の発色試薬とが接触すると、微生物の細胞内代謝系反応によりテトラゾリウム化合物が還元され、ホルマザン色素が生じる。この発色ホルマザンにより発色シグナルが生じる。
【００２７】
３Ａ．酵素的サイクリング反応
発色シグナルは、例えば酵素的サイクリング反応により、増感されることが好ましい。酵素的サイクリング反応においては、微生物内に比較的多く存在する成分、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化型（以下「ＮＡＤ」と略す）およびその還元型（以下「ＮＡＤＨ」と略す）、あるいはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の酸化型（以下「ＮＡＤＰ」と略す）およびその還元型（以下「ＮＡＤＰＨ」と略す）が用いられる。ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨは、生体含量の多い補酵素であり、水素の授受を介して可逆的に変化することによって多くの脱水素酵素の酸化還元反応に関与している。したがって、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨの酸化反応または還元反応に伴って生じる、テトラゾリウム化合物由来のホルマザン色素の発色または蛍光シグナルを、酵素的サイクリング反応によって増感させ、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨの存在を高感度に検出することができる。この場合、脱水素酵素、脱水素酵素の基質、およびジアホラーゼを反応系に加えることが必要である。
【００２８】
脱水素酵素およびその基質の組み合わせとしては、アルコール脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．１］とメタノール、エタノールまたはプロパノール、グリセロール脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．６］とグリセリン、グリセロール３−リン酸脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．８］とグリセロール３−リン酸、アルデヒド脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．２１］とアセトアルデヒド、乳酸脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．２７］と乳酸、リンゴ酸脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．３７］とリンゴ酸、グルコース脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．４７］とグルコース、グルコース６−リン酸脱水素酵素［ＥＣ１．１．１．４９］とグルコース６−リン酸、蟻酸脱水素酵素［ＥＣ１．２．１．２］と蟻酸、アルデヒド脱水素酵素［ＥＣ１．２．１．３］とアセトアルデヒド、コレステロール脱水素酵素［ＥＣ１．３．１．２２］とコレステロール、酵素番号が［ＥＣ１．４．１．１から２０］で表される各種アミノ酸脱水素酵素と各種アミノ酸などが用いられる。
【００２９】
また、ジアホラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス、クロストリジウム・クルイベリその他の微生物由来のものや、ブタ心臓由来のものが用いられる。さらに、保存安定性に優れているバチルス・ステアロサーモフィルス由来のジアホラーゼＩ［ＥＣ１．６．４．３］およびジアホラーゼII［ＥＣ１．６．９９．−］がより好ましい。また、ジアホラーゼの代わりに、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）やメルドラーブルーなどの電子伝達物質を用いてもよい。
【００３０】
３Ｂ．微生物検出方法の対象および適用範囲
本発明における微生物の検出方法の対象となる検体は、特に限定されず、食品、化粧品、実験用器具等が挙げられる。また、検出可能な微生物も特に限定されない。培地は、液状培地でも固体培地でもよい。固体培地としては、例えば、シート状（フィルム状）培地、シャーレ状乾式培地、寒天培地、試験紙等を挙げることができる。なお、脱水素酵素とその基質、検出対象および培地については、特開２００５−１１０６３８号公報、特開２００５−２８７４５２号公報などを引用することができる。
【００３１】
また、微生物を培養する時間は、テトラゾリウム化合物を含む発色試薬の添加によりコロニー等を色素産生させることで肉眼でも観察できるようになる程度で十分である。なお、この場合の「肉眼での観察」にはルーペを用いての観察も含まれる。所定時間としては、好ましくは４８時間以内、より好ましくは２４時間以内である。なお培養温度は、検出対象の微生物に応じて適宜決定できる。
【００３２】
次に、実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
テトラゾリウム化合物の合成方法
実施例１）２-(２-メトキシフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウムクロリド
２-(２-メトキシフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウムクロリド（以下、テトラゾリウム化合物Ａ・上記式（II）参照）を、以下のように合成した（下記式（VII）参照）。まず、２−メトキシフェニルヒドラジン塩酸塩８ｇを水１５０ｍｌに溶解し、室温で撹拌下、ベンズアルデヒド６ｇをエタノール７５ｍｌに混合した溶液を滴下して１時間撹拌した。析出した沈殿を水２００ｍｌで洗浄し、減圧下５０℃で乾燥し、１０ｇの淡黄色固体を得た。この淡黄色固体をピリジン６００ｍｌに溶解し、氷冷下で撹拌した。次に４−ニトロベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボレイト１２ｇを水５００ｍｌに溶解してピリジン溶液に滴下し、氷浴上で２時間撹拌した。析出した沈殿物を濾別し、水２００ｍｌで洗浄した。これを減圧下５０℃で乾燥し、濃藍色固体８．６３ｇを得た。これをトルエン２５０ｍｌに溶解し、塩化チオニル２ｇを加えて９０℃で２時間、加熱撹拌した。そして冷却後に水２５０ｍｌ加え、水溶成分を抽出した。水層に酢酸エチル２５０ｍｌを加えて洗浄した後に、水層を凍結乾燥し、５．４ｇの黄色固体として２-(２-メトキシフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウムクロリドを得た。
【００３３】
【化９】
2011132480.tif 000011
【００３４】
実施例２）２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウムクロライド
２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウムクロライド（以下、テトラゾリウム化合物Ｂ・上記式（III）参照）を、以下のように合成した（下記式（VIII）参照）。まず、４−ニトロフェニルヒドラジン３ｇを濃塩酸１０ｍｌと水５０ｍｌの混合溶液に溶解し、室温で撹拌下、フェニルアルデヒド２．５ｇをエタノール２０ｍｌに混合した溶液を滴下して１時間撹拌した。析出した沈殿を水２００ｍｌで洗浄し、減圧下５０℃で乾燥し、５ｇの淡黄色固体を得た。これをピリジン５０ｍｌに溶解し、氷冷下で撹拌した。次に、２−アミノ−５−ニトロアニソール５ｇを、濃塩酸２０ｍｌと水４０ｍｌの混合溶液に加え、氷浴下、撹拌した。そこへ亜硝酸ナトリウム７ｇを水２０mlに溶解した水溶液を滴下し、氷浴下で1時間撹拌した。この水溶液を、上述のピリジン溶液に滴下し、氷浴下で1時間撹拌した。析出した沈殿物を濾別し、水２００ｍｌで洗浄した。これを減圧下５０℃で乾燥し、赤褐色固体４．７６ｇを得た。この赤褐色固体をトルエン１５０ｍｌに溶解し、塩化チオニル２ｇを加えて９０℃で２時間、加熱撹拌した。そして冷却後に水１５０ｍｌを加え、水溶成分を抽出した。水層に酢酸エチル１５０ｍｌを加え、洗浄した。水層を凍結乾燥し、２．５４ｇの黄色固体として、２-(２-メトキシ-４-ニトロフェニル)-３-(４−ニトロフェニル)-５-フェニル-テトラゾリウムクロライドを得た。
【００３５】
【化１０】
2011132480.tif 000012
【００３６】
上記式（VII）、あるいは式（VIII）の合成方法を応用することにより、テトラゾリウム化合物ＡおよびＢ以外の上述のテトラゾリウム化合物も合成することができる。
【００３７】
次に、実施例１の発色試薬と、比較例の発色試薬とによる微生物の検出比較試験の結果につき、説明する。比較試験は以下のように行った。まず、発色試薬としての実施例１のテトラゾリウム化合物Ａおよび比較例の２，３，５-トリフェニルテトラゾリウムクロリドを、それぞれ０．０３g/m3ずつ含有する一般生菌検出用シート培地を調製した。一般生菌検出用シート培地は、発色試薬が異なる他は、いずれも同一のものである。
【００３８】
そして、食肉、カット野菜、総菜など各種食品のいずれか１種類を１０ｇ、滅菌済袋に入れ、１００ｍｌの滅菌生理食塩水を加えてストマッカーでホモジナイズした。滅菌生理食塩水で１０倍希釈水を作製し、上述の２種類の一般生菌検出用シート培地のポロプロピレンフィルムを、バックーシーリングテープを接着した部分まで開き、上述の希釈液１ｍｌをそれぞれ加えた。その後、再度ポリプロピレンフィルムを被せて、一般生菌検出用シート培地とした。なお一般生菌検出用シート培地は、様々な種類の食品それぞれについて、実施例１、比較例の２つずつ調製した。
【００３９】
実施例１の発色試薬を含む一般生菌検出用シート培地は２４時間、比較の発色試薬を含む一般生菌検出用シート培地は４８時間、それぞれ３５℃で培養した。そして目視により、実施例１の発色試薬により検出された生育菌数と、比較例の発色試薬により検出された生育菌数との生育菌数をそれぞれ比較した。この結果を、図１に示す。なお、図１における各点は、いずれか同じ食品についてのコロニー数の対数の比を示している。
【００４０】
図１より明らかであるように、実施例１のテトラゾリウム化合物Ａによる発色試薬は、テトラゾリウム化合物Ａの置換基を有さない比較例の化合物による発色試薬よりも優れている。実施例１では、培養時間が半分である他は比較例と同じ条件下で培養された微生物を検出しているにも係わらず、ほぼ同等数以上のコロニー数が検出されたためである。このようにテトラゾリウム化合物Ａは、微生物検出用の発色試薬としての使用に適していることが確認された。
【００４１】
これらの結果は、主として、テトラゾリウム化合物Ａからホルマザン色素を生じさせる酵素反応の進行が速やかであったことによると考えられる。このため、上述の比較試験においては、明確な結果を得るために実施例１においても培養時間を長く設定したものの、実際に実施例１の発色試薬を使用する場合、より短い時間、例えば１６〜２４時間程度の培養で十分である。
【００４２】
次に、実施例２の発色試薬テトラゾリウム化合物Ｂと、同様の比較試験を行った。比較例の化合物は、実施例１と同じ２，３，５-トリフェニルテトラゾリウムクロリドである。この結果を、図２に示す。図２より明らかなように、テトラゾリウム化合物Ｂも、実施例１のテトラゾリウム化合物Ａと同様の結果を示している。すなわち、比較例に比べて培養時間が半分であるにも係わらず、実施例２では、比較例と同等、あるいはそれ以上のコロニー数が検出された。このため、テトラゾリウム化合物Ｂについても、比較例の化合物よりも微生物検出用の発色試薬として優れていることが確認された。
【００４３】
さらに、テトラゾリウム化合物ＡおよびＢと類似の分子構造を有する本発明のテトラゾリウム化合物（上述のＩ式等参照）についても、ＮＢＴ等のより大きくて複雑な分子構造を有するテトラゾリウム化合物よりも微生物の細胞に取り込まれ易いため、酵素によるテトラゾリウム化合物の還元反応が速やかに進行すると考えられる。
【００４４】
さらに、２−フェニル環におけるオルト位（上記式（Ｉ）における置換基Ｒ１）にメトキシを有するテトラゾリウム化合物Ａ、Ｂ（上記式（II）および（III）参照）を含む本発明のテトラゾリウム化合物による発色試薬は、他のテトラゾリウム化合物、例えば、２−フェニル環におけるパラ位（上記式（Ｉ）の置換基Ｒ３）のみにメトキシを有する化合物、あるいはメトキシを有さない化合物（以下、対照化合物）による発色試薬よりも優れていると考えられる。これは、対照化合物から生じたホルマザン色素が赤色を呈するのに対し、テトラゾリウム化合物Ａ、Ｂ等から生じたホルマザン色素の呈する色は青色から青紫色だからである。このようなホルマザン色素を生じさせる本発明の発色試薬、微視物検出方法においては、例えば肉類等の暖色系の検体における微生物のコロニーがより明確に識別可能である。具体的には、対照化合物から生じるホルマゾン色素の吸収波長のピークが約４３０ｎｍであるのに対し、テトラゾリウム化合物Ａ、Ｂから生じるホルマゾン色素の吸収波長のピークは約４１０ｎｍである。このように、４００〜４３０ｎｍの範囲、より好ましくは４００〜４２０ｎｍの範囲の吸収波長域を有するホルマゾン色素を生じさせる本発明のテトラゾリウム化合物は、特に、微生物検出用の試薬として適している。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
以上のように、本発明によれば、特別な測定機器を必要とせずに、迅速かつ確実に微生物を検出するために微生物検出用試薬に用いられる化合物、微生物検出用試薬および微生物の検出方法が提供される。すなわち本発明では、例えば食品、化粧品、環境中の微生物汚染を、迅速かつ確実に検出することができる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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