(57)【要約】  ＮＧＦに対する結合活性を有する、より良質なアプタマーの提供。  以下の（１）および（２）を満たすＮＧＦに結合するアプタマー：（１）ＵＧＡＡＡＲＡＡＡＣＣ（配列番号６４）またはＣＧＡＡＭＲＡＡＡＣＵ（配列番号６５）で表される配列を含む。（２）塩基長が７３以下である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）および（２）を満たすＮＧＦに結合するアプタマー：
（１）ＵＧＡＡＡＲＡＡＡＣＣ（配列番号６４）またはＣＧＡＡＭＲＡＡＡＣＵ（配列番号６５）で表される配列を含む。
（２）塩基長が７３以下である。
【請求項２】
ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害する、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性または細胞増殖活性を阻害する、請求項１または２に記載のアプタマー。
【請求項４】
５０％阻害濃度が１０ｎＭ以下である、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項５】
ＮＴ−３に結合しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項６】
ＢＤＮＦ、ＮＴ−３又はＮＴ−４／５の細胞増殖活性を阻害しない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項７】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のアプタマー：
（ａ）配列番号１〜５４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号１〜５４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド；又は
（ｃ）配列番号１〜５４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
【請求項８】
少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項９】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールで修飾されている、請求項８に記載のアプタマー。
【請求項１０】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端または３’末端に結合している、請求項９に記載のアプタマー。
【請求項１１】
各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１２】
各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１３】
配列番号１〜５４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含み、塩基長が７３以下である核酸。
【請求項１４】
少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールで修飾されている請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端または３’末端に結合している、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１８】
各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１９】
ＮＧＦに結合する、疎水性物質付加アプタマー。
【請求項２０】
ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害する、請求項１９に記載のアプタマー。
【請求項２１】
ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性または細胞増殖活性を阻害する、請求項２０に記載のアプタマー。
【請求項２２】
５０％阻害濃度が１０ｎＭ以下である、請求項２１に記載のアプタマー。
【請求項２３】
以下の（ａ’）、（ｂ’）又は（ｃ’）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１９または２０に記載のアプタマー：
（ａ’）配列番号５５〜６３のいずれかから選択されるヌクレオチド（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ’）配列番号５５〜６３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ’）配列番号５５〜６３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
【請求項２４】
疎水性物質がアプタマーの５’末端に結合している、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項２５】
疎水性物質がコレステロールである、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項２６】
少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項２７】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴで修飾されている、請求項２６に記載のアプタマー。
【請求項２８】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴが、アプタマーの３’末端に結合している、請求項２７に記載のアプタマー。
【請求項２９】
各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項３０】
各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項３１】
請求項１〜１２、１９〜３０のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の核酸、及び機能性物質を含む複合体。
【請求項３２】
機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、請求項３１に記載の複合体。
【請求項３３】
請求項１〜１２、１９〜３０のいずれか一項に記載のアプタマー、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の核酸、あるいは請求項３１又は３２に記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項３４】
請求項１〜１２、１９〜３０のいずれか一項に記載のアプタマー、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の核酸、あるいは請求項３１又は３２に記載の複合体を含む抗疼痛剤。
【請求項３５】
請求項１〜１２、１９〜３０のいずれか一項に記載のアプタマー、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の核酸、あるいは請求項３１又は３２に記載の複合体を含む抗炎症剤。
【請求項３６】
請求項１〜１２、１８〜３０のいずれか一項に記載のアプタマー、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の核酸、あるいは請求項３１又は３２に記載の複合体を、それを必要とする対象に投与することを特徴とする、疼痛又は炎症を伴う疾患を治療又は予防する方法。
【請求項３７】
疼痛又は炎症を伴う疾患の治療又は予防のための、請求項１〜１２、１８〜３０のいずれか一項に記載のアプタマー、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の核酸、あるいは請求項３１又は３２に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＧＦに対するアプタマー及びその利用方法などに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
神経成長因子ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）は１９５１年に同定された最初のニューロトロフィンであり、末梢および中枢ニューロンの発達・生存に係わる重要な分泌タンパク質である。１１８個のアミノ酸からなり、分子量は１３ｋＤａで、分子内に３ヶ所のＳ−Ｓ結合を有する。ファミリータンパク質にＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５が存在し、これらは構造上よく保存されており、非共有結合によるホモ二量体を形成する。３つの別方向を向いたβシート構造を持ち、この部分で二量体化していると考えられている。またファミリー間でホモロジーの低い４つのループ構造をもち、この部分が受容体に対する特異性を規定していると考えられている。【０００３】
ＮＧＦの受容体には高親和性のチロシンキナーゼ型受容体ＴｒｋＡと低親和性の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属するｐ７５が知られている。これらの受容体はホモ二量体もしくはヘテロ二量体として作用し神経系の発生と維持に深く係わっている。ＴｒｋＡは一回膜貫通型受容体で細胞内ドメインにチロシンキナーゼ構造を持つ。ＮＧＦが結合するとチロシンリン酸化が起こり、下流にシグナルが伝わり、その細胞の分化促進や生存維持に働く。
ＴｒｋＡのファミリー受容体としてＴｒｋＢとＴｒｋＣが知られている。ＴｒｋＢはＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５と結合し、ＴｒｋＣはＮＴ−３と結合する。ｐ７５はＴｒｋＡに比べてリガンド特異性が低く、ＮＧＦ以外にもＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５と結合する。ｐ７５は一回膜貫通型受容体であるが、細胞質側にチロシンキナーゼドメインはない。ＴｒｋＡ同様、神経細胞だけでなく非神経細胞にも発現している。この受容体は細胞の分化促進や生存維持に関与しているほか、アポトーシスの誘導や細胞遊走とも関係していることが知られている。結晶構造解析の結果から、ホモ二量体のＮＧＦはＴｒｋＡと２：２で結合するが、ｐ７５とは２：１で結合することが示唆された。ホモ二量体のＮＧＦがＴｒｋＡとｐ７５のヘテロ二量体に結合することもある。【０００４】
ＮＧＦはシュワン細胞、角化細胞、気管支上皮細胞、線維芽細胞、Ｔリンパ球、マクロファージ、肥満細胞、Ｂリンパ球、ケラチノサイト、平滑筋細胞、腎糸球体細胞、骨格筋細胞などにより産生される。一方、ＴｒｋＡは神経細胞のほか、神経細胞以外の単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、肥満細胞にも発現していることが知られている。ｐ７５も同様に神経細胞だけでなく非神経細胞にも発現している。【０００５】
ＮＧＦは神経系において重要な役割を担っていることはよく知られている。コリン作動性ニューロンの生存を維持する作用を有することが明らかにされており、アルツハイマー病と何らかの関連があると考えられている。また、老齢ラットの脳内にＮＧＦを投与すると、記憶障害の改善が認められることから、老人性痴呆の治療薬としても期待されている。【０００６】
ＮＧＦは神経系以外の組織や細胞にも作用し、生体防御や組織修復過程に関与していることがわかっている。例えば、ＮＧＦを動物に投与すると、血管透過性の増大、Ｔ細胞やＢ細胞の免疫応答の増強、リンパ球の分化誘導、肥満細胞の増殖誘導、肥満細胞からの各種サイトカインの放出誘導などが起こることが知られている。【０００７】
ＮＧＦは炎症と関連があり、炎症性疾患の患者や炎症性動物モデルでＮＧＦの発現上昇が観察されている。例えば、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、関節炎、間質性膀胱炎、喘息などがそれに当たる。関節リウマチの患者の滑液中のＮＧＦの濃度が上昇していることが報告されている。また、関節リウマチモデルラットのＮＧＦの発現の向上、関節炎モデルマウスで肥満細胞の増加とＮＧＦの発現の向上が報告されている。【０００８】
ＮＧＦは痛みと深く関わる。ヒトにＮＧＦを皮下投与すると、筋肉痛のような深部痛が数日続き、注入部位の痛覚過敏が生じる。ＮＧＦノックアウトマウスとＴｒｋＡノックアウトマウスは無髄神経が欠損し痛みを感じなくなる。成熟ラットに１ｍｇ／ｋｇのＮＧＦを腹腔内投与すると、侵害性熱や機械刺激に対する痛覚過敏が生じる。ＮＧＦのトランスジェニックマウスは炎症症状を伴わない痛覚過敏を示す。また、先天性無痛無汗症（ＣＩＰＡ）の患者のＴｒｋＡ遺伝子に異常があること、ＮＧＦの遺伝子に異常があると痛覚が低下することが知られている。【０００９】
以上より、ＮＧＦ阻害剤は侵害受容性疼痛、炎症性疼痛、神経因性疼痛、癌性疼痛、線維筋痛などの疼痛の治療薬として利用可能である。ＮＧＦ抗体とＮＳＡＩＤの併用療法（特許文献１）、ＮＧＦ抗体とオピオイド鎮痛剤の併用療法（特許文献２）、ＮＧＦ抗体を用いた手術後の疼痛の治療法（特許文献３、特許文献４）、ＮＧＦ抗体を用いた骨癌の疼痛治療法（特許文献５）、ＮＧＦ抗体を用いた変形性関節炎の疼痛治療法（特許文献６）が報告されている。
Ｔａｎｅｚｕｍａｂ（ＰＦ−４３８３１１９またはＲＮ６２４）はＮＧＦに対する抗体で、変形性関節炎モデル動物を用いた疼痛モデル実験で効果を示し、現在臨床試験が行われている。また、ＮＧＦとＮＧＦ受容体の阻害活性の有無は不明であるが、ＮＧＦに結合する天然のＲＮＡに関する報告がある（非特許文献１）。【００１０】
ところで、近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階あるいは実用化段階に入っている。２００４年１２月には世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて作製することができる（特許文献７〜９）。ＳＥＬＥＸとは、１０１４個程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別してくる方法である。使用されるＲＮＡは４０残基程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみ回収する。回収したＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる場合がある。【００１１】
アプタマー医薬は抗体医薬と同様に細胞外因子を標的にすることができるが、既に公表されている多くの学術論文等を参考にすると、いくつかの点で抗体医薬を上回る可能性がある。例えば、アプタマーは抗体よりも結合力と特異性が高い場合が多々ある。また、免疫排除を受けにくく、抗体特有の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などの副作用は起こらない。デリバリーの観点では、アプタマーは抗体の１／１０程度のサイズであるので、目的の部位まで薬物を送達させることはより容易である。アプタマーは化学合成により生産されるので、各種修飾を容易に入れることができ、大量生産によるコストダウンが可能である。一方で、一般にアプタマーの血中半減期は抗体よりも短い。しかし、この点も毒性を考慮した場合はメリットとなる場合がある。以上の点より、同じ分子を標的にした医薬品であっても、アプタマー医薬は抗体医薬に勝る可能性がある。【００１２】
本発明者らは、ＰＣＴ／ＪＰ０９／０６６４５７において、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマーを製造し、これがＮＧＦによる神経突起伸長活性を阻害することを見出した。一方、特許文献１０には、自動化されたＳＥＬＥＸによって得られたＮＧＦに対するアプタマーが記載されており、また特許文献１１には、特許文献１０で得られたアプタマーの改変体および修飾体が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０４／０７３６５３号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ０４／０９６１２２号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ０４／０３２８７０号パンフレット
【特許文献４】国際公開ＷＯ０５／０００１９４号パンフレット
【特許文献５】国際公開ＷＯ０５／１１１０７７号パンフレット
【特許文献６】国際公開ＷＯ０６／１１０８８３号パンフレット
【特許文献７】国際公開ＷＯ９１／１９８１３号パンフレット
【特許文献８】国際公開ＷＯ９４／０８０５０号パンフレット
【特許文献９】国際公開ＷＯ９５／０７３６４号パンフレット
【特許文献１０】国際公開ＷＯ０２／０７７２６２号パンフレット
【特許文献１１】国際公開ＷＯ０３／０７０９８４号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂｉｎｋｌｅｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２３，  ３１９８−３２０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ＮＧＦに対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。特に、医薬品用途に適した短鎖長のアプタマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、ＮＧＦに対するより良質なアプタマーを作製することに成功し、もって本発明を完成するに至った。【００１７】
即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである：
［１］以下の（１）および（２）を満たすＮＧＦに結合するアプタマー：
（１）ＵＧＡＡＡＲＡＡＡＣＣ（配列番号６４）またはＣＧＡＡＭＲＡＡＡＣＵ（配列番号６５）で表される配列を含む。
（２）塩基長が７３以下である。
［２］ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害する、［１］に記載のアプタマー。
［３］ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性または細胞増殖活性を阻害する、［１］または［２］に記載のアプタマー。
［４］５０％阻害濃度が１０ｎＭ以下である、［３］に記載のアプタマー。
［５］ＮＴ−３に結合しない、［１］〜［４］のいずれか一に記載のアプタマー。
［６］ＢＤＮＦ、ＮＴ−３又はＮＴ−４／５の細胞増殖活性を阻害しない、［１］〜［５］のいずれか一に記載のアプタマー。
［７］以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、［１］または［２］に記載のアプタマー：
（ａ）配列番号１〜５４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号１〜５４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ）配列番号１〜５４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
［８］少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、［１］〜［７］のいずれか一に記載のアプタマー。
［９］ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールで修飾されている、［８］に記載のアプタマー。
［１０］ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端または３’末端に結合している、［９］に記載のアプタマー。
［１１］各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、［８］〜［１０］のいずれか一に記載のアプタマー。
［１２］各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、［８］〜［１０］のいずれか一に記載のアプタマー。
［１３］配列番号１〜５４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含み、塩基長が７３以下である核酸。
［１４］少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、［１３］に記載の核酸。
［１５］ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールで修飾されている、［１４］に記載の核酸。
［１６］ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端または３’末端に結合している、［１５］に記載の核酸。
［１７］各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、［１４］〜［１６］のいずれか一に記載の核酸。
［１８］各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、［１４］〜［１６］のいずれか一に記載の核酸。
［１９］ＮＧＦに結合する、疎水性物質付加アプタマー。
［２０］ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害する、［１９］に記載のアプタマー。
［２１］ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性または細胞増殖活性を阻害する、［２０］に記載のアプタマー。
［２２］５０％阻害濃度が１０ｎＭ以下である、［２１］に記載のアプタマー。
［２３］以下の（ａ’）、（ｂ’）又は（ｃ’）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、［１９］または［２０］に記載のアプタマー：
（ａ’）配列番号５５〜６３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ’）配列番号５５〜６３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ’）配列番号５５〜６３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
［２４］疎水性物質がアプタマーの５’末端に結合している、［１９］〜［２３］のいずれか一に記載のアプタマー。
［２５］疎水性物質がコレステロールである、［１９］〜［２４］のいずれか一に記載のアプタマー。
［２６］少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、［１９］〜［２５］のいずれか一に記載のアプタマー。
［２７］ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴで修飾されている、［２６］に記載のアプタマー。
［２８］ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴが、アプタマーの３’末端に結合している、［２７］に記載のアプタマー。
［２９］各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、［２６］〜［２８］のいずれか一に記載のアプタマー。
［３０］各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、［２６］〜［２８］のいずれか一に記載のアプタマー。
［３１］［１］〜［１２］、［１９］〜［３０］のいずれか一に記載のアプタマーまたは［１３］〜［１８］のいずれか一に記載の核酸、及び機能性物質を含む複合体。
［３２］機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、［３１］に記載の複合体。
［３３］［１］〜［１２］、［１９］〜［３０］のいずれか一に記載のアプタマー、［１３］〜［１８］のいずれか一に記載の核酸、あるいは［３１］又は［３２］に記載の複合体を含む医薬組成物。
［３４］［１］〜［１２］、［１９］〜［３０］のいずれか一に記載のアプタマー、［１３］〜［１８］のいずれか一に記載の核酸、あるいは［３１］又は［３２］に記載の複合体を含む抗疼痛剤。
［３５］［１］〜［１２］、［１９］〜［３０］のいずれか一に記載のアプタマー、［１３］〜［１８］のいずれか一に記載の核酸、あるいは［３１］又は［３２］に記載の複合体を含む抗炎症剤。
［３６］［１］〜［１２］、［１９］〜［３０］のいずれか一に記載のアプタマー、［１３］〜［１８］のいずれか一に記載の核酸、あるいは［３１］又は［３２］に記載の複合体を、それを必要とする対象に投与することを特徴とする、疼痛又は炎症を伴う疾患を治療又は予防する方法。
［３７］疼痛又は炎症を伴う疾患の治療又は予防のための、［１］〜［１２］、［１９］〜［３０］のいずれか一に記載のアプタマー、［１３］〜［１８］のいずれか一に記載の核酸、あるいは［３１］又は［３２］に記載の複合体。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のアプタマー、疎水性物質付加アプタマー及びそれらの複合体は、疼痛や炎症性疾患などの疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、ＮＧＦの精製及び濃縮、並びにＮＧＦの検出及び定量に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】アプタマーＩＤ：２６、４８、５７で表されるアプタマー（Ａｐｔ）がヒトＮＧＦに結合することを示すセンサーグラムである。アプタマーＩＤ：２６（−）は、アプタマーＩＤ：２６で表わされるアプタマーの一カ所に変異を導入し（ｇ１９→ｇ（Ｍ））、結合活性を消失させたアプタマーを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ＵＧＡＡＡＲＡＡＡＣＣ（配列番号６４）またはＣＧＡＡＭＲＡＡＡＣＵ（配列番号６５）で表される配列を含み、かつ塩基長が７３以下であることを特徴とする、ＮＧＦに結合するアプタマー（以下、「本発明のアプタマー」と記載する）を提供する。
これらの配列は、後述する修飾を受けていてもよい。
【００２１】
本発明で提供されるアプタマーは、ＮＧＦに対して結合活性を有するアプタマーである。好ましい態様によれば、本発明のアプタマーはＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することによって、ＮＧＦの活性を阻害し得る。
【００２２】
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物などの核酸であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態の核酸であり得る。
すなわち以下において、本発明のアプタマーは、「本発明の核酸」と読み替えて表される場合もあり得る。
【００２３】
本願明細書において「配列番号」で特定される配列とは、各アプタマー又は核酸のヌクレオチド配列を意味し、例えば「配列番号１の配列を含む核酸」とは、配列番号１の配列を含む天然の核酸、修飾核酸またはその両方で構成される核酸を意味する。配列表に各アプタマーの配列番号の塩基配列を記載している。
【００２４】
ＮＧＦは公知のニューロトロフィンであり、末梢および中枢ニューロンの発達・生存に係わる重要な分泌タンパク質である。本発明において、ＮＧＦは、特にβタイプのＮＧＦを意味する。ヒトβ−ＮＧＦのアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ００２４９７、Ｐ０１１３８、ＡＡＩ２６１５１、ＡＡＩ２６１４９、ＣＡＢ７５６２５で表されるものであるが、変異の入ったものや、そのドメイン、ペプチドであってもよい。また、モノマーだけでなくダイマーや多量体であってもよい。
【００２５】
本発明のアプタマーは、生理的な緩衝液（例えば溶液Ａ：実施例２参照）中で、ＮＧＦへ結合する。本発明のアプタマーは、例えば以下の試験により検出可能な程度の強度で、ＮＧＦへ結合する。
測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いる。センサーチップにアプタマーを固定化する。固定化量は１０００ＲＵとする。０．３ＭのＮａＣｌを含有する生理的な緩衝液（溶液Ａ：実施例２参照）によりＮＧＦ溶液（０．５μＭ）を調製する。このＮＧＦ溶液を２０μＬ注入し、ＮＧＦのアプタマーへの結合を検出する。４０ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチドを含むＲＮＡをネガティブコントロールとし、該コントロールＲＮＡと比較してＮＧＦが有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはＮＧＦへの結合能を有すると判定する。
【００２６】
本発明のアプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することによって、ＮＧＦの活性を阻害する。本明細書中、「ＮＧＦに対する阻害活性」とはＮＧＦが保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。例えば、ＮＧＦがＮＧＦ受容体に結合することを阻害する活性である。
また、他の「ＮＧＦに対する阻害活性」としては、ＮＧＦがＮＧＦ受容体に結合することによって生じる、ＮＧＦ受容体の下流のシグナル伝達（Ｒａｓ−ＭＡＰキナーゼ経路、ＰＩ３キナーゼ経路）の阻害、ＴＲＰＶ１、ＳＰ、ＢＤＮＦなどの発現上昇の阻害、肥満細胞などから放出されるＨＡ、ＢＫ、ＰＧ、ＮＧＦ、その他サイトカインの発現の阻害活性などが挙げられる。
更に、ＮＧＦにより誘導される神経細胞の分化、生存、神経突起伸長、血管透過性の増大、Ｔ細胞やＢ細胞の免疫応答の増強、リンパ球の分化、肥満細胞や赤白血病細胞、癌細胞など各種細胞の増殖などの阻害、疼痛、痛覚過敏の軽減などが挙げられる。
本発明のアプタマーが有する好ましい「ＮＧＦに対する阻害活性」は、ＮＧＦがＮＧＦ受容体に結合することを阻害する活性であり、ＮＧＦにより誘導される神経突起伸長活性を阻害する活性、ＮＧＦにより誘導される細胞増殖活性を阻害する活性などである。
【００２７】
本明細書中、「ＮＧＦ受容体」とはＮＧＦが結合する細胞表面タンパク質を意味する。ＮＧＦ受容体としては、ＴｒｋＡとｐ７５が知られている。本発明でいうＮＧＦ受容体とは、天然のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいし、その変異体であってもよい。ここで「その変異体」とは、「ＮＧＦ受容体」のアミノ酸が数個置換されたものやその一部分のアミノ酸配列であって、ＮＧＦに対して結合活性を有し、かつＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するタンパク質またはペプチドを意味する。
【００２８】
本発明のアプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマーである。ＮＧＦのＮＧＦ受容体への結合をアプタマーが阻害するか否かは、例えば以下の試験により評価することができる。
測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いる。ＣＭ５センサーチップにＮＧＦ受容体とＦｃとの融合タンパク質（例えば、Ｔｒｋ  Ａ−Ｆｃ（１７５−ＴＫ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）又はｐ７５−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を固定化する。固定化量は５００〜７００ＲＵとする。生理的な緩衝液（溶液Ａ：後述する実施例２参照）中でＮＧＦ（０．１μＭ）とアプタマー（０．２μＭ）を混合し、３０分かけてサンプルとなる混合液を調製する。この混合液をＢＩＡｃｏｒｅ２０００に注入し、ＮＧＦのＮＧＦ受容体への結合を検出する。
阻害活性％が９０％以上だった場合、該アプタマーはＮＧＦのＮＧＦ受容体への結合を阻害すると判定する。阻害活性％は、アプタマーを含まないＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合量を０、ＮＧＦを含まない溶液をインジェクションした場合の結合量を１００として計算される。ここで結合量は、ＢＩＡｃｏｒｅのセンサーグラムのピークトップでのＲＵ値（ＮＧＦのインジェクション終了直後のＲＵ値）を意味する。
【００２９】
一態様において、本発明のアプタマーは、ＮＧＦとＴｒｋＡとの結合およびＮＧＦとｐ７５との結合を両方阻害し得る。
【００３０】
本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物に由来するＮＧＦに対する阻害活性を有し得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。
【００３１】
本発明のアプタマーは、ＮＧＦの任意の部分に結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害し得るものである限り特に限定されない。
【００３２】
本発明のアプタマーは、ＵＧＡＡＡＲＡＡＡＣＣ（配列番号６４）またはＣＧＡＡＭＲＡＡＡＣＵ（配列番号６５）で表される配列を含むアプタマーである。配列番号６５におけるＭは、アデノシンまたはシチジンを意味し、配列番号６４および６５におけるＲは、グアノシンまたはアデノシンを意味する。配列番号６４に示される配列としては、ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号６６）またはＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号６７）が例示される。また配列番号６５に示される配列としては、ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣＵ（配列番号６８）又はＣＧＡＡＡＧＡＡＡＣＵ（配列番号６９）が例示される。
これらの配列は、後述する修飾を受けていてもよい。
【００３３】
また本発明のアプタマーは、塩基長が７３以下であることを特徴とする。
７４ヌクレオチド以上のアプタマーは、鎖長が長いことから医薬品用途として適用することが困難である場合が多い。換言すると、総ヌクレオチド数が７３以下であれば、アプタマーの化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾が容易であり、生体内安定性を向上させやすく、毒性が低いと考えられる。
医薬品用途への適用の観点では、本発明のアプタマーは７３ヌクレオチドよりもさらに短い塩基長であることがより望ましく、好ましくは７０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは５０ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは４５ヌクレオチド以下であり得る。なお一方で、「核酸」部分の総ヌクレオチド数が少なすぎると、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することができなくなる可能性がある。適切な最小ヌクレオチド数は、当業者であれば目的に応じて適宜決定することが可能である。
【００３４】
また本発明のアプタマーは、ＮＧＦに結合し、そして／あるいはＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することによって、ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性またはＮＧＦの細胞増殖活性を阻害するアプタマーであり得る。ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性を本発明のアプタマーが阻害するか否かは、実施例３に記載の試験により評価することができる。またＮＧＦの細胞増殖活性を本発明のアプタマーが阻害するか否かは、実施例４に記載の試験により評価することができる。
【００３５】
また、ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性またはＮＧＦの細胞増殖活性が５０％となる際の、本発明のアプタマー濃度（ＩＣ５０；５０％阻害濃度）は、好ましくは１０ｎＭ以下であり、より好ましくは１ｎＭ以下である。
【００３６】
本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基で置き換えられているヌクレオチドであり得る。このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＨＯ基）、アミノ基（例、−ＮＨ２基）で置き換えられているヌクレオチドが挙げられる。以下にリボースの２’位において、ヒドロキシル基が水素原子、フッ素原子、−Ｏ−Ｍｅ基で置き換えられた場合をそれぞれ示す。
【００３７】
【化１】
2011118682.tif 000002
【００３８】
【化２】
2011118682.tif 000003
【００３９】
【化３】
2011118682.tif 000004
【００４０】
本発明のアプタマーはまた、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含むヌクレオチドであり得る。
【００４１】
本発明のアプタマーはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、フッ素原子で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されているヌクレオチドであり得る。
【００４２】
本発明のアプタマーはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、ヒドロキシル基で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子または基で置換されるヌクレオチドであり得る。
【００４３】
本発明のアプタマーはまた、全てのヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる同一の基を含むヌクレオチドであり得る。
【００４４】
尚、本明細書においては、アプタマーを構成するヌクレオチドをＲＮＡと仮定して（すなわち糖基をリボースと仮定して）、ヌクレオチド中の糖基への修飾の態様を説明するが、これは、アプタマーを構成するヌクレオチドからＤＮＡが除外されることを意味するものではなく、適宜ＤＮＡへの修飾として読み替えられる。例えば、アプタマーを構成するヌクレオチドがＤＮＡである場合、リボースの２’位のヒドロキシル基のＸへの置き換えは、デオキシリボースの２’位の一方の水素原子のＸへの置き換えとして読み替えられる。
なお本発明のアプタマーにおいて、ウラシルをチミンに置換することによって、ＮＧＦに対する結合性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害活性、ＮＧＦの神経細胞突起伸長阻害活性、ＮＧＦの細胞増殖阻害活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めることが可能である。
【００４５】
あるいは、本発明のアプタマーは、ニューロトロフィン３（以下ＮＴ−３と記載する）への結合活性を有さないことを特徴とする。ここでＮＴ−３への結合活性を有さないとは、種々の結合アッセイにおいて、それぞれのタンパク質と本発明のアプタマーとの結合が検出限界以下であることを意味する。具体的には、例えば、表面プラズモン共鳴のセンサーグラムにおいて、レスポンスが得られないことを意味し、実施例７に記載の方法で測定することができる。
【００４６】
あるいは、本発明のアプタマーは、ＮＧＦ以外の他のニューロトロフィン、具体的には、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：以下ＢＤＮＦと記載する）、ＮＴ−３およびニューロトロフィン４／５（以下ＮＴ−４／５と記載する）の細胞増殖活性を阻害しないことを特徴とする。ここで他のニューロトロフィン（ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５）の細胞増殖活性を阻害するか否かは、実施例７に記載の試験により評価することができる。ＢＤＮＦ、ＮＴ−３又はＮＴ−４／５の細胞増殖活性を阻害しないとは、例えば、本発明のアプタマーが各ニューロトロフィンの細胞増殖を５０％阻害するために必要な本発明のアプタマー濃度（ＩＣ５０；５０％阻害濃度）が、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３については１００ｎＭ以上、好ましくは３００ｎＭ以上、より好ましくは１０００ｎＭ以上であることをいい、ＮＴ−４／５については１００ｎＭ以上、好ましくは３００ｎＭ以上であることをいう。
【００４７】
本発明のアプタマーのさらに好ましい態様として、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３及びＮＴ−４／５の細胞増殖活性を阻害しないアプタマーを挙げることが出来る。
【００４８】
本明細書においてＢＤＮＦ、ＮＴ−３及びＮＴ−４／５の用語は、それぞれヒトを含む、全哺乳類種のＢＤＮＦ、ＮＴ−３及びＮＴ−４／５を意味する。
【００４９】
本発明のアプタマーはまた、
（ａ）配列番号１〜５４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマー；
（ｂ）配列番号１〜５４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；
（ｃ）配列番号１〜５４のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を含むアプタマー；或いは
（ｄ）上記（ａ）の複数の連結物、上記（ｂ）の複数の連結物、上記（ｃ）の複数の連結物、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物であり得る。
【００５０】
上記（ｂ）〜（ｄ）のアプタマーは、ＮＧＦに結合し且つ／又はＮＧＦの活性（ＮＧＦ受容体との結合活性等）を阻害し得る。
また好ましくは、上記（ｂ）〜（ｄ）のアプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマー、および／またはＮＧＦに結合し、ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性または細胞増殖活性を阻害するアプタマーである。
さらに好ましくは、上記（ｂ）〜（ｄ）のアプタマーは、ＮＧＦの神経細胞突起伸長または細胞増殖活性の阻害濃度が１０ｎＭ以下であるアプタマーであり、より好ましくは、ＮＧＦの神経細胞突起伸長または細胞増殖活性の阻害濃度が１ｎＭ以下であるアプタマーである。
【００５１】
上記（ｂ）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、アプタマーがＮＧＦに結合し、ＮＧＦの活性（ＮＧＦ受容体との結合活性等）を阻害し得、またアプタマー自体のヌクレオチド数が７３を超えない限り特に限定されないが、例えば約３０個以下、好ましくは約２０個以下、より好ましくは約１０個以下、さらにより好ましくは５個以下、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個であり得る。
【００５２】
上記（ｃ）において、「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのヌクレオチド配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（％）を意味する。
ヌクレオチド配列における同一性は、例えば相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ−２（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５ペナルティ；ギャップエクステンション＝２ペナルティ；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）にて２つのヌクレオチド配列をアラインすることにより、計算することができる。
【００５３】
上記（ｄ）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。上記（ａ）〜（ｄ）における各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置き換えられているヌクレオチドであり得る。
【００５４】
本発明のアプタマーは、ＮＧＦに対する結合性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害活性、ＮＧＦの神経細胞突起伸長阻害活性、ＮＧＦの細胞増殖阻害活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化（例、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ２）が挙げられる。他にも、４’位の酸素を硫黄に置き換えた４’−ＳＲＮＡ、２’位と４’位とをメチレンを介して架橋したＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、３’位の水酸基をアミノ基に置き換えた３’−Ｎ−ホスホロアミデート核酸などを例として挙げることができる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２，５１３８−５１４５参照）。
【００５５】
本発明のアプタマーはまた、ＮＧＦに対する結合性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害活性、ＮＧＦの神経細胞突起伸長阻害活性、ＮＧＦの細胞増殖阻害活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６および／または８位プリン改変（Ｏ−メチル修飾など）、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、アプタマーのホスフェート部分が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）、Ｐ（Ｏ）ＢＨ３（ボラノホスフェート）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置き換えられていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
連結基としては、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。
【００５６】
改変はさらに、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」と記載する場合がある）、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照のこと。
【００５７】
特に、改変がＰＥＧの末端付加によって行われる場合、ＰＥＧの分子量は特に限定されないが、好ましくは１０００〜１０００００、より好ましくは３００００〜９００００である。ＰＥＧは、直鎖状であってもよいし、二つ以上の鎖に分岐したもの（マルチアームＰＥＧ）であってもよい。
このようなＰＥＧとしては特に限定されず、当業者であれば市販あるいは公知のＰＥＧを適宜選択して用いることができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｇ−ｄｒｕｇ．ｃｏｍ／ｐｅｇ＿ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂｒａｎｃｈｅｄ．ｈｔｍｌを参照のこと）が、本発明のアプタマーに適用するＰＥＧの好適例として具体的には、分子量４００００の２分岐ＧＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２  日油製）、分子量４００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＴＳ  日油製）、分子量４００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−４００ＴＳ  日油製）、分子量８００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−８００ＴＳ  日油製）、または分子量８００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−８００ＴＳ  日油製）などが挙げられる。
【００５８】
この場合、本発明のアプタマーは、ＰＥＧが末端に直接付加されていてもよいが、その末端にＰＥＧと結合可能な基を有するリンカーなどが付加され、それを介してＰＥＧを本発明のアプタマーに付加することがより好ましい。
【００５９】
ＰＥＧと本発明のアプタマーのリンカーとしては特に限定されず、炭素鎖数や官能基などを結合部位やＰＥＧの種類などに応じて適宜選択することができる。このようなリンカーとしては、例えばアミノ基を有するリンカーが挙げられ、具体的には、５’末端に付加する場合は、ｓｓＨ  Ｌｉｎｋｅｒ（ＳＡＦＣ）またはＤＭＳ（Ｏ）ＭＴ−ＡＭＩＮＯ−ＭＯＤＩＦＩＥＲ（ＧＬＥＮＲＥＳＥＲＣＨ）が、３’末端に付加する場合は、ＴＦＡ  Ａｍｉｎｏ  Ｃ−６  ｌｃａａ  ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）などが例示される。このリンカーを選択した場合、ＰＥＧには、例えばＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの活性基を付加した上で、これをリンカー側のアミノ基と反応させることで、本発明のアプタマーとＰＥＧとをリンカーを介して結合することができる。
【００６０】
なおＰＥＧやリンカーとしては、市販のものを好ましく用いることができる。またＰＥＧ、リンカーおよび本発明のアプタマーの結合に関する反応条件などは、当業者であれば適宜設定することが可能である。
【００６１】
本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により化学合成することができる。アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合および水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング結合など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換または削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。
【００６２】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ及びその改良法（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２；Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用したりすることで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させたりすることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸにはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。
【００６３】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であり、そのことは標的物質の活性部位に結合することを意味しない。従って、ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは必ずしも標的物質の機能に作用するとは限らない。ＮＧＦは塩基性タンパク質であり、核酸が非特異的に結合しやすいと考えられる。活性部位に結合しないアプタマーはその標的物質の活性に影響を及ぼさない。実際、コントロールで用いたＲＮＡはＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合を阻害しなかった。
【００６４】
このようにして選ばれた活性のあるアプタマーに基づき、より高い活性を有するアプタマーを獲得するために取得されたアプタマーの配列を基にしたＳＥＬＥＸを行うことが出来る。具体的な方法とは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。
【００６５】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる７３ヌクレオチド以下、好ましくは７０ヌクレオチド以下、より好ましくは６０ヌクレオチド以下、さらに好ましくは５０ヌクレオチド以下、最も好ましくは４５ヌクレオチド以下の長さまで短くする必要がある。ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、ＳＥＬＥＸによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。本発明では４３ヌクレオチドでも活性を保持しているアプタマーを得ることができた。
【００６６】
アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測したりすることで、どのヌクレオチドを置換または欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうか既存のアッセイ系により確認することができる。
【００６７】
得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。そしてこのような新しい配列の長さは特に限定されるものではない。
特に、前述したＵＧＡＡＡＲＡＡＡＣＣ（配列番号６４）またはＣＧＡＡＭＲＡＡＡＣＵ（配列番号６５）で表される配列は、本発明のアプタマーがＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害する上で重要な部分であるが、これらの配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。またこれらの配列は、前記修飾を受けていてもよい。
【００６８】
修飾に関しても配列と同様に高度に設計又は改変可能である。
【００６９】
以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能であるアプタマーの製造方法を提供する。
【００７０】
例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：
【００７１】
【化４】
2011118682.tif 000005
【００７２】
〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約５０個、より好ましくは１〜約３０個、さらにより好ましくは１〜約２０個又は１〜約１０個であり得る。〕で表されるヌクレオチドからなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。
【００７３】
本発明のアプタマーとして好ましくは、配列番号２６で表される配列を含み、かつ塩基長が７３以下であることを特徴とする、ＮＧＦに結合するアプタマーである。
配列番号２６で表される配列は本発明のアプタマーがＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するなど、本発明のアプタマーとして機能する上で重要な部分であるが、これらの配列の両端に新しい配列を付加しても本発明のアプタマーとしての機能が損なわれることはない。またこれらの配列は、前記した糖残基の修飾・核酸塩基やリン酸基の改変などを受けていてもよい。
【００７４】
すなわち本発明のアプタマーとして、
配列番号２６で表される配列を含み、かつ塩基長が７３以下であることを特徴とする、ＮＧＦに結合するアプタマーであって、
（ｉ）少なくとも１種のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基またはアミノ基で置き換えられている、アプタマー；
（ｉｉ）ＰＥＧ、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質またはビオチンが末端に付加されている、アプタマー；
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の要件を満足するアプタマー；
などを、好ましい具体例として挙げることができる。
【００７５】
また本発明は、ＮＧＦに結合する、疎水性物質付加アプタマー（以下、「本発明の疎水性物質付加アプタマー」と記載する）を提供する。
【００７６】
本明細書中、疎水性物質付加アプタマーとは、アプタマーが疎水性物質と結合したものをいう。すなわち、本発明の疎水性物質付加アプタマーとは、「アプタマー」部分と、「疎水性物質」部分とが結合した物質のことをいう。「アプタマー」部分と「疎水性物質」部分とは、「リンカー」部分で結合していてもよい。
【００７７】
本発明の疎水性物質付加アプタマーの「アプタマー」部分は、先の「本発明のアプタマー」において説明したとおりである。したがって、アプタマー部分を構成するヌクレオチドの種類は、疎水性物質付加アプタマーがＮＧＦに結合する限り特に限定されない。すなわち先の条件を満足する限り、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの自体公知のヌクレオチド、修飾核酸またはそれらの混合物のいずれであってもよく、また二本鎖であっても一本鎖であってもよい。また、ヌクレオチドの配列自体も特に限定されない。なお上記「修飾核酸」とは、特に示されない限り、下記で示される「置換可能な位置で置換（修飾）されているヌクレオチド」のことをいう。
【００７８】
あるいは本発明の疎水性物質付加アプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害する疎水性物質付加アプタマーであり得る。本発明の疎水性物質付加アプタマーがＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するか否かは、先の「本発明のアプタマー」における試験あるいは実施例２に記載の試験により評価することができる。
【００７９】
また本発明の疎水性物質付加アプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性またはＮＧＦの細胞増殖活性を阻害する疎水性物質付加アプタマーであり得る。ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性を本発明の疎水性物質付加アプタマーが阻害するか否かは、先の「本発明のアプタマー」における試験あるいは実施例３に記載の試験により評価することができる。またＮＧＦの細胞増殖活性を本発明の疎水性物質付加アプタマーが阻害するか否かは、先の「本発明のアプタマー」における試験あるいは実施例４に記載の試験により評価することができる。
【００８０】
また、ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性またはＮＧＦの細胞増殖活性が５０％となる際の本発明の疎水性物質付加アプタマー濃度（ＩＣ５０；５０％阻害濃度）は、好ましくは１０ｎＭ以下であり、より好ましくは３ｎＭ以下である。
【００８１】
本発明の疎水性物質付加アプタマーに含まれる各ヌクレオチドは、本発明のアプタマーと同様に、リボースの２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基で置き換えられているヌクレオチドであり得る。このような任意の原子又は基としては、本発明のアプタマーについて挙げられた原子又は基と同様の原子又は基が挙げられる。
【００８２】
本発明の疎水性物質付加アプタマーの「アプタマー」部分の塩基長としては、疎水性物質付加アプタマーがＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害する限り特に限定されないが、７３ヌクレオチド以下（なお５’末端または３’末端をｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴで修飾する場合、これは塩基長にカウントしない）であることが望ましい。
７４ヌクレオチド以上の疎水性物質付加アプタマーは、鎖長が長いことから医薬品用途として適用することが困難である場合が多い。換言すると、総ヌクレオチド数が７３以下であれば、アプタマーの化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾が容易であり、生体内安定性を向上させやすく、毒性が低いと考えられる。
医薬品用途への適用の観点では、本発明の疎水性物質付加アプタマーは７３ヌクレオチドよりもさらに短い塩基長であることがより望ましく、好ましくは７０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは５０ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは４５ヌクレオチド以下であり得る。なお一方で、「核酸」部分の総ヌクレオチド数が少なすぎると、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することができなくなる可能性がある。適切な最小ヌクレオチド数は、当業者であれば目的に応じて適宜決定することが可能である。
【００８３】
「アプタマー」部分を構成する各ヌクレオチドは、疎水性物質付加アプタマーがＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害する限り、置換可能な位置でどのように置換（修飾）されているヌクレオチドであってもよい。また全く置換（修飾）されていないヌクレオチドであってもよい。置換（修飾）される場合、当業者であれば、「置換可能な位置」は明らかであるし、また置換基についても、自体公知の置換基を選択することが可能である。
【００８４】
「アプタマー」部分を構成するヌクレオチドのうち、置換可能な位置で置換（修飾）されているヌクレオチド（本明細書中、修飾核酸と記載する場合がある）としては、好ましくは、各ヌクレオチドが、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位がヒドロキシル基であるヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、同一又は異なって、任意の原子又は置換基で置き換えられているヌクレオチドである。
上記原子又は置換基としては、例えば、水素原子、ハロゲン原子（例、フッ素原子）、−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＨＯ基）、アミノ基（例、−ＮＨ２基）などが挙げられる。
【００８５】
尚、本明細書においては、疎水性物質付加アプタマーを構成するヌクレオチドをＲＮＡと仮定して（すなわち糖基をリボースと仮定して）、ヌクレオチド中の糖基への修飾の態様を説明するが、これは、疎水性物質付加アプタマーを構成するヌクレオチドからＤＮＡが除外されることを意味するものではなく、適宜ＤＮＡへの修飾として読み替えられる。例えば、アプタマーを構成するヌクレオチドがＤＮＡである場合、リボースの２’位のヒドロキシル基のＸへの置き換えは、デオキシリボースの２’位の一方の水素原子のＸへの置き換えとして読み替えられる。
なお本発明の疎水性物質付加アプタマーにおいて、ウラシルをチミンに置換することによって、ＮＧＦに対する結合性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害活性、ＮＧＦの神経細胞突起伸長阻害活性、ＮＧＦの細胞増殖阻害活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めることが可能である。
【００８６】
本発明の疎水性物質付加アプタマーはまた、
（ａ’）配列番号５５〜６３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含む疎水性物質付加アプタマー；
（ｂ’）配列番号５５〜６３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド配列を含む疎水性物質付加アプタマー；
（ｃ’）配列番号５５〜６３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を含む疎水性物質付加アプタマー；或いは
（ｄ’）上記（ａ’）の複数の連結物、上記（ｂ’）の複数の連結物、上記（ｃ’）の複数の連結物、上記（ａ’）、（ｂ’）及び（ｃ’）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物であり得る。
【００８７】
上記（ｂ’）〜（ｄ’）のアプタマーまたは連結物は、ＮＧＦに結合し且つ／又はＮＧＦの活性（ＮＧＦ受容体との結合活性等）を阻害し得る。
また好ましくは、上記（ｂ’）〜（ｄ’）のアプタマーまたは連結物は、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマー、および／またはＮＧＦに結合し、ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性を阻害するアプタマーである。
さらに好ましくは、上記（ｂ’）〜（ｄ’）のアプタマーまたは連結物は、ＮＧＦの神経細胞突起伸長または細胞増殖活性の阻害濃度が１０ｎＭ以下であるアプタマーであり、より好ましくは、ＮＧＦの神経細胞突起伸長または細胞増殖活性の阻害濃度が３ｎＭ以下であるアプタマーまたは連結物である。
【００８８】
上記（ｂ’）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、アプタマーがＮＧＦに結合し、ＮＧＦの活性（ＮＧＦ受容体との結合活性等）を阻害し得、またアプタマー自体のヌクレオチド数が７３を超えない限り特に限定されないが、例えば約３０個以下、好ましくは約２０個以下、より好ましくは約１０個以下、さらにより好ましくは５個以下、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個であり得る。
【００８９】
上記（ｄ’）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。上記（ａ’）〜（ｄ’）における各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置き換えられているヌクレオチドであり得る。
【００９０】
本発明の疎水性物質付加アプタマーにおける、「糖残基」部分、「核酸塩基」部分および「リン酸基」部分、ならびにこれらの置換（修飾）・改変等については、本発明のアプタマーにおける「糖残基」部分、「核酸塩基」部分および「リン酸基」部分、ならびにこれらの置換（修飾）・改変等について説明したものと同様である。
【００９１】
本発明の疎水性物質付加アプタマーにおいて、改変はさらに、ＰＥＧ、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。上記の改変については、本発明のアプタマーと同様に取り扱うことができる。
【００９２】
本発明の疎水性物質付加アプタマーの「疎水性物質」部分を構成する物質は、疎水性物質付加アプタマーがＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害する限り、置換可能な位置でどのように置換（修飾）されている物質であってもよい。当業者であれば、「置換可能な位置」は明らかであるし、また置換基についても、自体公知の置換基を選択することが可能である。
これらの「疎水性物質」をアプタマーに結合させることによって、ＮＧＦに対する結合性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害活性、ＮＧＦの神経細胞突起伸長阻害活性、ＮＧＦの細胞増殖阻害活性、アプタマーの安定性、薬物送達性、血液中での安定性等を高めることができる。
【００９３】
なお、本明細書で「疎水性物質」として具体的には、後述するステロイド類やビタミン類が挙げられ、好ましくはステロール類が挙げられ、より好ましくはコレステロール類が挙げられる。
本明細書で「ステロイド類」とは、シクロペンタフェナントレン骨格またはそれから１つ以上の環結合の切断、環拡大、環縮小の結果の骨格を基本骨格として有する化合物であって、その全部または一部が水素化されている化合物を意味する。ステロイド類として具体的にはストロファンチジン、コレスタノール、ステロイドホルモン（テストステロン、エストラジオール、プロゲステロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチコステロンなど）などが挙げられる。また公知のビタミン類、具体的にはビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫなどであってもよい。
本明細書で「ステロール類」とは、ステロイド類のシクロペンタフェナントレン骨格におけるＡ環のＣ−３位がヒドロキシル化またはカルボニル化された化合物を意味する。ステロール類として具体的にはステロイドホルモン、カンプエステロール、シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロールなどが挙げられる。
本明細書で「コレステロール類」とは動物由来のステロールを意味し、コレステロールだけでなくコレステロールに水素添加したものやエステル反応により誘導体化したものも含まれる。このようなコレステロール誘導体としては、水素添加したジヒドロコレステロール、低級または高級脂肪酸とのエステル体が挙げられる。ヒドロキシステアリン酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、イソステアリン酸コレステリル、ラノリン脂肪酸コレステリル、マカデミアナッツ油脂肪酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、酪酸コレステリルなどが市販されている。
【００９４】
本発明の疎水性物質付加アプタマーは、「アプタマー」部分と「疎水性物質」部分とが直接結合してなるものであってもよいし、「アプタマー」部分と「疎水性物質」部分とを「リンカー」部分で結合してなるものであってもよい。「アプタマー」部分と「疎水性物質」部分とは、当業者に公知の方法で結合することが可能である。
【００９５】
本発明の疎水性物質付加アプタマーの、「アプタマー」部分と「疎水性物質」部分とを結合しうる「リンカー」部分としては、疎水性物質付加アプタマーがＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害する限り特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。
このようなリンカーとしては、例えば、飽和炭化水素鎖（例、炭素数１２の飽和炭化水素鎖）、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、ペプチドを含むリンカー（例、−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−）、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー（例、−（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−）、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー（例、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−）、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー（例、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−）、ポリエチレングリコールリンカー（例、ヘキサエチレングリコールリンカー））などが挙げられる（各リンカーにおけるｍおよびｎは、任意の整数を示す）。
リンカー部分は、上記で例示したリンカーを枝分かれさせて、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）や蛍光物質などの機能性分子を付加したものであってもよい（これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある）。更に、トロンビン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチドであってもよいし、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。
【００９６】
上記「飽和炭化水素鎖」としては、例えば、炭素数が３、６、１２、１８、２４個のものが考えられる。また、枝分かれしたものであってもよい。
【００９７】
上記「ヌクレオチド鎖」としては、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置き換えられている（修飾されている）ヌクレオチドが挙げられる。
【００９８】
「リンカー」部分と「疎水性物質」部分との結合は、特に限定されず、両部分は当業者に公知の方法で結合することが可能である。
また、「リンカー」部分と「アプタマー」部分との結合も、特に限定されず、両部分は当業者に公知の方法で結合することが可能である。
【００９９】
本発明の疎水性物質付加アプタマーの「リンカー」部分および「疎水性物質」部分は、「アプタマー」部分の５’末端側に結合していてもよいし、３’末端側に結合していてもよい。また、「アプタマー」部分の５’末端および３’末端の両方に結合していてもよい。また、「アプタマー」部分の途中の配列の核酸塩基またはリボース、リン酸部分に結合してもよい。
【０１００】
本発明の疎水性物質付加アプタマーの「アプタマー」部分は、先に記載した本発明のアプタマーの製造方法と同様の方法により製造することができる。そして本発明の疎水性物質付加アプタマーは、当該技術分野における自体公知の方法により化学合成することができる。例えば、市販のコレステロールＴＥＧホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて、合成したアプタマーの５’末端にコレステロールを付加することができる。この場合、市販のアミダイト体であるＳｐａｃｅｒ１８（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）などを同時に用いることで、アプタマーとコレステロールとの間に任意のリンカーを加えることもできる。
また、市販の３’−コレステロールＴＥＧ−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いることで、アプタマーの３’末端にコレステロールを付加することができる。上記と同様に、市販のアミダイト体であるＳｐａｃｅｒ１８（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）などを同時に用いることで、アプタマーとコレステロールとの間に任意のリンカーを加えることができる。
同様の手法を用いることで、途中の配列の核酸塩基やリボース、リン酸部分にコレステロールを付加することもできる。
【０１０１】
さらに、アプタマーの末端または途中にアミノ基を付加することで、合成機を用いた核酸合成の後に、コレステロールをカップリング反応により付加することが可能である。
アプタマーの５’末端にアミノ基を付加するには、市販の５’−ａｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｒＣ６−ＴＦＡ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）などを用いることができる。
また、アプタマーの３’末端にアミノ基を付加するには、市販の３’−ａｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｒＣ７−ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）などを用いることができる。
アプタマーの途中にコレステロールを付加するには、核酸塩基中のアミノ基を利用したり、ピリミジンの５位やプリンの６位などにアミノ基を導入することで行うことができる。また、リボースの２’位やリン酸部分にアミノ基を導入してもよい。
コレステロールとアミノ基とのカップリング反応は、コレステロールに活性基を付加することで容易に行うことができる。これにより、本発明の疎水性物質付加アプタマーを製造することができる。
【０１０２】
本発明はまた、本発明のアプタマー（以下、疎水性物質付加アプタマーを含む）及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質は、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミドまたはダカルバジンなどのアルキル化剤、メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。
【０１０３】
本発明のアプタマー及び複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬、飲料水や食品の添加剤、増強剤、緩和剤として使用され得る。
【０１０４】
本発明のアプタマー及び複合体は、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することによって、ＮＧＦの機能を阻害する活性を有し得る。上述のように、ＮＧＦは疼痛や炎症と深く関わっている。従って、本発明のアプタマー（疎水性物質付加アプタマー）及び複合体は、疼痛や炎症を伴う疾患を治療又は予防するための医薬（抗疼痛剤、抗炎症剤等）として有用である。
【０１０５】
ここで疼痛としては侵害受容性疼痛（筋肉痛、背部痛、上肢痛、鞭打ち損傷、関節痛、変形性関節症、痛風、慢性関節リウマチ、頭痛、片頭痛、緊張型頭痛、群発頭痛、二次性頭痛、口腔顔面痛、歯痛、抜歯後カウザルギー、幻歯痛、内臓痛、心臓痛、腹痛、中間痛、月経困難、陣痛、腎臓痛、尿管痛、膀胱痛など）、炎症性疼痛、神経因性疼痛（糖尿病性ニューロパチー、中毒性ニューロパチー、術後痛、幻肢痛、断端部痛、反射性交感神経性ジストロフィー、カウザルギー、帯状疱疹後痛、三叉神経痛、中枢性疼痛）、癌性疼痛（内臓器官への癌浸潤による痛み、癌組織の血管浸潤による血管閉塞で生じる痛み、骨転移の痛み、脳内転移に伴う痛み、癌組織の末梢神経浸潤による痛み）、線維筋痛などが挙げられる。
【０１０６】
ここで炎症に伴う疾患としては、特に限定されるものではないが、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、変形性関節症、慢性関節リウマチ、間質性膀胱炎、喘息などが挙げられる。
【０１０７】
上記癌としては、特に限定されるものではないが、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、ニューロブラストーマ、グリオブラストーマ、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、ウィルムス腫瘍、前立腺癌などが挙げられる。
【０１０８】
ＮＧＦはその受容体ＴｒｋＡに結合するとＴｒｋＡのチロシンリン酸化およびＴｒｋＡ下流のＲａｓ−ＭＡＰＫ、ＰＬＣ−γ、ＰＩ３Ｋなどを活性化させ、神経細胞の生存や分化といった生理的作用を発揮する。一方、ｐ７５受容体を介するシグナル経路では細胞死を誘導する。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、これらのシグナル伝達経路の活性化に関係した疾患の医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。これらのシグナル伝達経路の活性化に関係した疾患としては、上記疼痛や炎症性疾患、癌が挙げられる。
【０１０９】
本発明のアプタマー及び複合体が医薬、診断薬、検査薬、試薬などとして用いられる場合、それが投与される対象としては特に限定されないが、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。
【０１１０】
本発明のアプタマー及び複合体は、ＮＧＦに特異的に結合し得る。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、ＮＧＦ検出用プローブとして有用である。該プローブは、ＮＧＦのインビボイメージング、血中濃度測定、組織染色、ＥＬＩＳＡ等に有用である。また、該プローブは、ＮＧＦが関与する疾患（疼痛や炎症を伴う疾患等）の診断薬、検査薬、試薬等として有用である。
【０１１１】
また、そのＮＧＦへの特異的結合に基づき、本発明のアプタマー及び複合体はＮＧＦの分離精製用リガンドとして使用され得る。
【０１１２】
また、本発明のアプタマー及び複合体は、恋愛などの精神的状態を調べるための検査薬や精神状態を調整するための医薬、調整剤、増強剤、緩和剤として使用され得る。
【０１１３】
また、本発明のアプタマー及び複合体は、薬物送達剤として使用され得る。
【０１１４】
本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１１５】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【０１１６】
また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）および色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。徐放の基材としては、例えば、リポソーム、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、ＰＬＧＡなどが挙げられる。
【０１１７】
非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。また、徐放製剤も好適な製剤として挙げることができる。徐放製剤としては、人工骨や生体分解性もしくは非分解性スポンジ、バッグ、薬剤ポンプ、浸透圧ポンプなど、体内に埋め込まれた担体もしくは容器からの徐放形態、あるいは体外から継続的もしくは断続的に体内もしくは局所に送達されるデバイス等が挙げられる。生体分解性の基材としては、リポソーム、カチオニックリポソーム、Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ）ａｃｉｄ（ＰＬＧＡ）、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、多糖シゾフィランなどが挙げられる。更に注射液剤や徐放製剤以外にも、吸入剤、軟膏剤も可能である。吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて従来使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリンまたはその誘導体等を適宜配合することができる。
【０１１８】
ここで界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名スパン８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名スパン８０）、ソルビタンモノラウレート（商品名スパン２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名ツイーン２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名ツイーン８０）、天然資源由来のレシチン（商品名エピクロン）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名ブリジ３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ゲナポル０−０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名シンペロニック）等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分と混合し製剤化し使用する。
【０１１９】
吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、上記本発明のアプタマー及び複合体を粉末または液状にして、吸入噴射剤および／または担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー及び複合体が粉末の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。
【０１２０】
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１２１】
本発明はまた、本発明のアプタマー及び複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコーン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、ＮＧＦの精製、及びＮＧＦの検出、定量に有用であり得る。
【０１２２】
本発明のアプタマー及び複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマー（疎水性物質付加アプタマー）及び複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。
【０１２３】
本発明はまた、ＮＧＦの精製及び濃縮方法を提供する。特に本発明はＮＧＦを他のファミリータンパク質から分離することが可能である。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にＮＧＦを吸着させ、吸着したＮＧＦを溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのＮＧＦの吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、ＮＧＦを含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。ＮＧＦの溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくは約６．５〜約８．５、より好ましくは約７〜約８であり得る。中性溶液はまた、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、カリウム塩（例、ＫＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（例、ツイーン２０、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０）、グリセリンを含むものであり得る。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、ＮＧＦの吸着後、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリ、Ｔｒａｎｆｅｒ  ＲＮＡ、ＤＮＡ、ツイーン２０などの表面活性剤、ＮａＣｌなどの塩を含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。
【０１２４】
本発明はまた、ＮＧＦの検出及び定量方法を提供する。特に本発明はＮＧＦを他のファミリータンパク質と区別して検出及び定量することができる。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）ＮＧＦを測定することを含み得る。ＮＧＦの検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーをプローブとして用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。また、ＰＥＴ等の分子プローブとしても、使用することができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるＮＧＦ量の測定、ＮＧＦが関連する疾患の診断に有用であり得る。
【０１２５】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【実施例】
【０１２６】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
実施例１：ＲＮＡアプタマー
（１）ＲＮＡアプタマーの作製
ＲＮＡアプタマーの配列はＰＣＴ／ＪＰ０９／０６６４５７に記載の配列番号４０、６０、６２、６７および６８で表わされるアプタマーを基にして決定した。これらのＲＮＡアプタマーは転写酵素を用いた方法またはホスホアミダイト法による化学合成により作製した。長鎖のＲＮＡは化学合成するのが困難であるため転写酵素を利用して作製した。具体的には、アプタマーＩＤ：１〜２５、アプタマーＩＤ：２７〜５４で表わされるアプタマーは転写により、アプタマーＩＤ：２６、２６（１）〜（７２）、２９（１）とアプタマーＩＤ：５５〜６３で表わされるアプタマーは化学合成により得た。
転写は、目的のアプタマーのＤＮＡを化学合成により作製し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いることによって行った。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。転写産物はＤＮａｓｅ処理の後、フェノール・クロロホルム処理によりタンパク質を除去し、エタノール沈殿により回収した。回収されたアプタマーの純度はポリアクリルアミド電気泳動法で、量は吸光度測定法で確認した。【０１２７】
化学合成は、ホスホアミダイト法により行った。ホスホアミダイト法による化学合成は一般的に行われている方法であり、その方法はＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｖｏｌ．２）［１］Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｅｄｉｔｏｒ：Ｙｕｋｉｏ  Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｈｉｒｏｋａｗａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）などに記載のとおりである。実際にはアプライドバイオシステムズ社製の核酸合成機（ＡＢＩ３９４）等を用いて合成し、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）により精製した。最終合成物はＨＰＬＣを用いて純度決定し、８５％以上の場合合格とした。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより分子量が理論分子量と一致することを確認した。【０１２８】
ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）が５’末端または３’末端に付加されたアプタマーは次のようにして合成した。まず初めに５’末端または３’末端にアミノ基を有するリンカーが付加したアプタマーを核酸合成機を用いて合成した。５’末端の場合はｓｓＨ  Ｌｉｎｋｅｒ（ＳＡＦＣ）またはＤＭＳ（Ｏ）ＭＴ−ＡＭＩＮＯ−ＭＯＤＩＦＩＦＩＥＲ  Ｃ６  （ＧＬＥＮＲＥＳＥＲＣＨ）を、３’末端の場合はＴＦＡ  Ａｍｉｎｏ  Ｃ−６  ｌｃａａ  ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用いた。これらアミノ基が付加したアプタマーはＨＰＬＣで精製後、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで純度分析した。次にこれらのアプタマーをＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅの活性基が付加された分子量４００００の２分岐ＧＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２  日油製）、分子量４００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＴＳ  日油製）、分子量４００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−４００ＴＳ  日油製）、分子量８００００の２分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−８００ＴＳ  日油製）、又は分子量８００００の４分岐ＴＳ型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−８００ＴＳ  日油製）と混合し、室温下で反応させ、アミド結合にてＰＥＧとアプタマーを連結した。反応終了後、ＨＰＬＣで精製および純度分析を行った。【０１２９】
このようにして得られた、ＰＥＧが末端修飾された本発明のアプタマーの部分構造の例を以下に示す。
（１）２分岐ＧＳ型ＰＥＧがｓｓＨ  ｌｉｎｋｅｒ（Ｔａ）を介してアプタマーと結合した構造：【０１３０】
【化５】
2011118682.tif 000006
【０１３１】
（２）２分岐ＧＳ型ＰＥＧがＴＦＡ  Ａｍｉｎｏ  Ｃ−６（Ｔｃ）を介してアプタマーと結合した構造：【０１３２】
【化６】
2011118682.tif 000007
【０１３３】
（３）２分岐ＴＳ型ＰＥＧがｓｓＨ  ｌｉｎｋｅｒ（Ｔａ）を介してアプタマーと結合した構造：【０１３４】
【化７】
2011118682.tif 000008
【０１３５】
（４）４分岐ＴＳ型ＰＥＧがｓｓＨ  ｌｉｎｋｅｒ（Ｔａ）を介してアプタマーと結合した構造：【０１３６】
【化８】
2011118682.tif 000009
【０１３７】
（５）４分岐ＴＳ型ＰＥＧがＤＭＳ（Ｏ）ＭＴ−ＡＭＩＮＯ−ＭＯＤＩＦＩＦＩＥＲ  Ｃ６（Ｔｂ）を介してアプタマーと結合した構造：【０１３８】
【化９】
2011118682.tif 000010
【０１３９】
以下の表１に、実際に得られたアプタマーＩＤ：１〜５４で表されるアプタマーのヌクレオチドを示す。
特に記載が無い限り、ヌクレオチド間の結合はホスホジエステル結合である。小文字はＲＮＡ、大文字はＤＮＡ、ｓはホスホロチオエート結合をそれぞれ示す。ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基、ＬはＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）を表わす。例えば下記でｇ（Ｍ）と記載された場合、２’位がＯ−メチル基で修飾されたｇを意味する。ＴａはｓｓＨ  ｌｉｎｋｅｒをＰＥＧとアプタマーとの連結に用いた場合のリンカー部分を、ＴｂはＤＭＳ（Ｏ）ＭＴ−ＡＭＩＮＯ−ＭＯＤＩＦＩＦＩＥＲ  Ｃ６  をＰＥＧとアプタマーとの連結に用いた場合のリンカー部分を、ＴｃはＴＦＡ  Ａｍｉｎｏ  Ｃ−６をＰＥＧとアプタマーとの連結に用いた場合のリンカー部分を示す。ｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴを示す。ＰＥＧ４０ＧＳ２は分子量４００００の２分岐ＧＳ型（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＧＳ２  日油製）、ＰＥＧ４０ＴＳ２は分子量４００００の２分岐ＴＳ型（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＴＳ  日油製）、ＰＥＧ４０ＴＳ４は分子量４００００の４分岐ＴＳ型（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−４００ＴＳ  日油製）、ＰＥＧ８０ＴＳ２は分子量８００００の２分岐ＴＳ型（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−８００ＴＳ  日油製）、ＰＥＧ８０ＴＳ４は分子量８００００の４分岐ＴＳ型（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−８００ＴＳ  日油製）である。【０１４０】
アプタマーＩＤ：１〜３０で表わされるアプタマーは、共通配列ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号６７）を含んでいる。アプタマーＩＤ：３１〜５１で表わされるアプタマーは、共通配列ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣＵ（配列番号６８）を含んでいる。アプタマーＩＤ：５２、５３、５４で表わされるアプタマーはそれぞれ共通配列ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号６６）、ＣＧＡＡＡＧＡＡＡＣＵ（配列番号６９）を含んでいる。【０１４１】
【表１−１】
2011118682.tif 000011
【０１４２】
【表１−２】
2011118682.tif 000012
【０１４３】
【表１−３】
2011118682.tif 000013
【０１４４】
【表１−４】
2011118682.tif 000014
【０１４５】
【表１−５】
2011118682.tif 000015
【０１４６】
【表１−６】
2011118682.tif 000016
【０１４７】
【表１−７】
2011118682.tif 000017
【０１４８】
【表１−８】
2011118682.tif 000018
【０１４９】
【表１−９】
2011118682.tif 000019
【０１５０】
【表１−１０】
2011118682.tif 000020
【０１５１】
【表１−１１】
2011118682.tif 000021
【０１５２】
【表１−１２】
2011118682.tif 000022
【０１５３】
【表１−１３】
2011118682.tif 000023
【０１５４】
【表１−１４】
2011118682.tif 000024
【０１５５】
【表１−１５】
2011118682.tif 000025
【０１５６】
【表１−１６】
2011118682.tif 000026
【０１５７】
（２）コレステロール付加アプタマーの作製
ＰＣＴ／ＪＰ０９／０６６４５７に記載された配列番号３０（６）で表わされるアプタマーを基にして、５’末端にコレステロールを付加したアプタマーを作製した。コレステロール付加アプタマーは、ホスホアミダイト法で、化学合成により作製した。コレステロールはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製のコレステロールアミダイト（ＴＥＧ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ｎｏｎ−ＤＭＴ，ＣＬＰ−２７０４）を用いた。【０１５８】
得られたコレステロール付加アプタマーの構造の一例を下記に示す。【０１５９】
【化１０】
2011118682.tif 000027
【０１６０】
以下の表２に、実際に得られたアプタマーＩＤ：５５〜６３で表されるアプタマーを示す。特に記載が無い限り、ヌクレオチド間の結合はホスホジエステル結合である。小文字はＲＮＡを、大文字はＤＮＡを、ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基を表わす。ｓはホスホロチオエート結合を示す。例えば下記でｇ（Ｍ）ｓＴと記載された場合、２’位がＯ−メチル基で修飾されたｇとＴとがホスホロチオエート結合で連結していることを意味する。Ｃｈｏｌはコレステロール、ｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴを示す。アプタマーＩＤ：５５〜６３で表されるアプタマーは、５’末端にコレステロールを有することを特徴とする。【０１６１】
【表２−１】
2011118682.tif 000028
【０１６２】
【表２−２】
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【０１６３】
【表２−３】
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【０１６４】
実施例２：ＮＧＦに結合するＲＮＡアプタマー
実施例１で作成したアプタマーＩＤ：１〜６３（ただし、ＰＥＧ化されたアプタマーであるアプタマーＩＤ：２６（１６）、（１７）、（６４）〜（７２）を除く。）で表わされるアプタマーのＮＧＦに対する結合活性を、表面プラズモン共鳴法により評価した。
測定装置はＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を使用し、センサーチップとしてアミノ基と反応するＣＭ５を用いた。ヒトＮＧＦは固定化溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６）に溶解し２５〜４０μｇ／ｍｌとした。タンパク質側のアミノ基とチップ側のカルボキシル基の反応にはＥｔｈｙｌ−３−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅとＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを用いた。反応後、ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ＨＣｌによるブロッキングを行った。ＮＧＦの固定化量は３，０００〜４，０００ＲＵとした。アナライト用のアプタマーは０．１５μＭ〜０．５μＭに調製した。ランニングバッファーには溶液Ａを用いた。ここで溶液Ａとは１４５ｍＭ塩化ナトリウム、５．４ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウム、０．８ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）、０．０５％  ツイーン２０の混合溶液である。再生用液として１Ｍ  ＮａＣｌと５０ｍＭ  ＮａＯＨの混合溶液を用いた。ＮＧＦはＦＣ２に固定化し、ＦＣ１の結果を引くことで最終的なセンサーグラムとした。【０１６５】
測定の結果、アプタマーＩＤ：１〜６３（ただし、ＰＥＧ化されたアプタマーであるアプタマーＩＤ：２６（１６）、２６（１７）、２６（６４）〜２６（７２）を除く。）で表されるアプタマーの全てが、有意にＮＧＦに結合することがわかった。その一例としてアプタマーＩＤ：２６、４８、５７で表されるアプタマーとＮＧＦが結合する様子を図１に示す。アプタマーＩＤ：２６（−）で表わされるアプタマーは、アプタマーＩＤ：２６で表されるアプタマーの１９番目のｇをＯ−メチル修飾されたｇにしたものである。このｇは以下で示す共通配列中のｇで修飾を加えると生理活性が大きく低下することが分かっている。以上より、アプタマーＩＤ：１〜６３で表されるアプタマーはＮＧＦに特異的に結合するアプタマーであることが示された。【０１６６】
実施例１で得られたアプタマーＩＤ：１〜８、２６（２）、３１〜３８、５２〜５６、６１、６３で表されるアプタマーがＮＧＦとＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡ）の結合を阻害するかどうか、表面プラズモン共鳴法を用いて調べた。
ＢＩＡｃｏｒｅ社のプロトコールに従って、ＣＭ５センサーチップにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（２１１８１，ＰＩＥＲＣＥ）を固定化した。そこに、ＩｇＧのＦｃ部分が融合したヒトＴｒｋＡ−Ｆｃ（１７５−ＴＫ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を約５００〜７００ＲＵ固定化した。アナライトとしてＮＧＦ（０．１μＭ）とアプタマー（０．２μＭ）を混合して３０分保持したものをインジェクションした。もしアプタマーがＮＧＦとＴｒｋＡの結合を阻害する場合はセンサーグラムのシグナルは上がらないが、もし阻害しない場合は三者複合体を形成しシグナルが上がることが予想される。また、ＮＧＦがアプタマーよりも受容体に強く結合する場合は、アプタマーがはずれて、ＮＧＦが受容体と結合する場合もある。阻害実験を開始する前にＴｒｋＡにＮＧＦが結合することを確認した。アプタマーを含まないＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合量を１００とし、アプタマーを添加した場合のＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合量を補正値として求めた。ここで結合量は、ＢＩＡｃｏｒｅのセンサーグラムのピークトップでのＲＵ値（ＮＧＦのインジェクション終了直後のＲＵ値）とした。１００からこの補正値を引いた値を阻害活性％とし、９０％以上を阻害活性ありとした。
実験の結果、アプタマーＩＤ：１〜８、２６（２）、３１〜３８、５２〜５６、６１、６３で表されるアプタマーの全てがＮＧＦとＴｒｋＡの結合を阻害することがわかった。もう一つの受容体Ｐ７５（ｐ７５−Ｆｃ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に対しても同様な実験をおこなった。その結果、実施例１で得られたアプタマーＩＤ：２６（２）、５６、６１、６３で表されるアプタマーの全てがＮＧＦとＰ７５の結合を９０％以上阻害することがわかった。【０１６７】
実施例３：アプタマーの神経突起伸長阻害活性
ＰＣ１２細胞のサブクローンであるＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１細胞を用いて、実施例１で得たアプタマーの神経突起伸長阻害活性を評価した。
コラーゲンタイプＩＶでコートした９６ウェル平底プレートに１ウェルあたり２５００個の細胞を２．５％ウマ血清と１．２５％胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で１日培養した。そこに室温もしくは３７℃にて３０分間から１時間無血清のＲＰＭＩ−１６４０培地中で予め反応させたヒトＮＧＦ（最終濃度１．１ｎＭもしくは０．３８ｎＭ）とアプタマー（最終濃度５００〜０．０１ｎＭ）の混合溶液を添加した。２日後にＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｎｅｕｒｉｔｅ  Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して細胞質と核を染色し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によって１細胞あたりの神経突起長を測定した。ＮＧＦのみの添加の際に得られた１細胞あたりの神経突起長を阻害活性０％、ＮＧＦ無添加で２日間培養して得られた１細胞あたりの神経突起長を阻害活性１００％として、ＮＧＦとアプタマーを混合添加した場合に得られた１細胞あたりの神経突起長から、アプタマーの阻害活性を算出した。阻害活性が０以下の場合は０％とした。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、５０％阻害活性を挟む上下二点の濃度より求めた。実験の結果を表３−１〜３−３に示す。
表３−１〜３−４においてＩＣ５０値を「＜Ｘ」と記載したものは、記載した濃度Ｘが測定最低濃度であった場合において阻害活性が５０％以上であったことを示し、ＩＣ５０値を「＞Ｘ」と記載したものは、記載した濃度Ｘが測定最高濃度であった場合に阻害活性が５０％以下であったことを示す。＊で示した値はＮＧＦの濃度が０．３８ｎＭの場合であり、他はＮＧＦの濃度が１．１ｎＭの場合である。カッコ内の数値はＰＣＴ／ＪＰ０９／０６６４５７に記載したＩＣ５０値である。
その結果、得られたアプタマーの多くが、ＩＣ５０が１０ｎＭ以下の高い活性を有するアプタマーであり、中にはＩＣ５０が１ｎＭ以下のアプタマー、さらにはＩＣ５０が０．３ｎＭ以下のアプタマーも存在することがわかった。特にアプタマーＩＤ：２６（１８）以降のアプタマーは、ＩＣ５０値が０．３ｎＭ以下０．３ｎＭのアプタマーであった。【０１６８】
【表３−１】
2011118682.tif 000031
【０１６９】
【表３−２】
2011118682.tif 000032
【０１７０】
【表３−３】
2011118682.tif 000033
【０１７１】
【表３−４】
2011118682.tif 000034
【０１７２】
実施例４：アプタマーの細胞増殖阻害活性（ＴＦ−１アッセイ）
ＴＦ−１細胞を用いた増殖阻害評価系により実施例１で得たアプタマーの阻害活性を評価した。
ヒト赤白血病細胞株であるＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−２００３）にレトロウイルスベクターを用いて二つのＮＧＦ受容体（ヒトＴｒｋＡおよびヒトｐ７５）遺伝子を導入し、二つの受容体を同時に安定的に高発現する細胞を作製した。この細胞を２０％の胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、白色の９６ウェル平底プレートに１ウェルあたり１０００個（５０μＬ）の細胞を播種した。そこに室温にて３０分間無血清のＲＰＭＩ−１６４０培地中で予め反応させたヒトＮＧＦ（最終濃度０．０７６ｎＭ）とアプタマー（最終濃度３０〜０．０１ｎＭ）の混合溶液５０μＬを添加し、３日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに１００μＬ添加後、マイクロプレートリーダーにより化学発光を測定し、ＮＧＦ刺激によるＴＦ−１細胞の増殖を評価した。ＮＧＦのみの添加で細胞を３日間培養して得られた１ウェルあたりの発光量を阻害活性０％、ＮＧＦ無添加で３日間培養して得られた１ウェルあたりの発光量を阻害活性１００％として、ＮＧＦとアプタマーを混合添加した場合に得られた１ウェルあたりの発光量から、アプタマーの阻害活性を算出した。阻害活性が０以下の場合は０％とした。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、５０％阻害活性を挟む上下二点の濃度より求めた。結果を表４−１〜４−３に示す。
ＩＣ５０値を「＜Ｘ」と記載したものは、記載した濃度Ｘが測定最低濃度であった場合において阻害活性が５０％以上であったことを示し、ＩＣ５０値を「＞Ｘ」と記載したものは、記載した濃度Ｘが測定最高濃度であった場合に阻害活性が５０％以下であったことを示す。  その結果、得られたアプタマーの多くが、ＩＣ５０が１０ｎＭ以下の高い活性を有するアプタマーであり、中にはＩＣ５０が１ｎＭ以下のアプタマー、さらにはＩＣ５０が０．３ｎＭ以下のアプタマーも存在することがわかった。特にアプタマーＩＤ：２６（１８）以降のアプタマーのうち、アプタマーＩＤ：２６（３６）、２６（３７）、２６（４０）以外のアプタマーが、細胞増殖阻害実験でＩＣ５０値０．３ｎＭ以下を示すので、これらのアプタマーがＮＧＦに対して高い阻害活性を有していることがわかった。【０１７３】
【表４−１】
2011118682.tif 000035
【０１７４】
【表４−２】
2011118682.tif 000036
【０１７５】
【表４−３】
2011118682.tif 000037
【０１７６】
実施例５：先行文献記載のＮＧＦアプタマーとの比較
先行文献（Ｂｉｎｋｌｅｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，  ３１９８）に記載のＮＧＦアプタマーの結合活性および神経突起伸長阻害活性の比較を行った。
先行文献記載のアプタマーは全て未修飾ＲＮＡであり、本明細書記載の配列と一致するものはない。先行文献記載のアプタマーとして結合活性が高いＨ１、Ｌ２、Ｌ６を選び、Ｔ７ポリメラーゼで転写して作製した。結合活性は実施例２と同様な方法で評価した。ＮＧＦに配列番号５７で表わされるアプタマーが結合した場合の最大ＲＵ値を分子量で割った値を１００％とし、８０％以上の場合は“＋＋”、５０％以上の場合は“＋”、５０％以下の場合は“−”とした。アプタマーの分子量の違いを考慮して、得られたＲＵ値を分子量で割って補正した。また神経突起伸長阻害活性は実施例３と同様な方法で評価した。結果を表５に示す。
実験の結果、Ｌ２とＬ６は顕著な結合を示さなかった。Ｌ２またはＬ６を固定化してＮＧＦとの結合を見た場合には結合が見られたので、ＮＧＦを固定化したことでＬ２およびＬ６のＮＧＦに対する親和性が低下したものと考えられる。一方、突起伸長阻害活性について、本発明のアプタマーは高い神経突起伸長阻害活性を有するのに対し、Ｈ１、Ｌ２、Ｌ６は５００ｎＭでも神経突起の伸長を阻害しないことがわかった。【０１７７】
【表５】
2011118682.tif 000038
【０１７８】
実施例６：ＷＯ０２／０７７２６２に記載されたＮＧＦアプタマーとの比較
ＷＯ０２／０７７２６２公報に記載されたＮＧＦアプタマーの結合活性および神経突起伸張阻害活性、細胞増殖阻害活性を測定し、本発明で特定されたアプタマーＩＤ：２６（１９）で表わされるアプタマーと比較した。ＷＯ０２／０７７２６２公報に記載されたＮＧＦアプタマーとしてＳｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．３８および４２を選んだ。これらのアプタマーの配列は以下の通りであり、実施例１で示すホスホアミダイト法により作製した。ここで、Ｔとしてブロム化ｄＵを用いた（Ｔ＝５−ＢｒｄＵ（５−ｂｒｏｍｏ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ））。
Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．３８
ＡＴＡＴＡＴＡＴＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＧＣＡＣＡＣＴＴＡＡＡＴＣＣＡＣＴＴＣＡＣＣＴＴＡＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡ
Ｓｅｑ  ＩＤ  Ｎｏ．４２
ＡＴＡＴＡＴＡＴＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＧＣＣＣＣＡＡＡＣＡＣＴＴＧＴＴＣＣＴＡＴＣＴＴＴＣＡＡＣＣＣＣＣＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡ【０１７９】
結合活性は、表面プラズモン共鳴法を用いて実施例２と同様な方法で評価した。ＮＧＦにアプタマーＩＤ：２６（１９）で表わされるアプタマーが結合した場合の最大ＲＵ値を分子量で割った値を１００％とし、８０％以上の場合は“＋＋”、７９〜５１％の場合は“＋”、５０％以下の場合は“−”とした。アプタマーの分子量の違いを考慮して、得られたＲＵ値を分子量で割って補正した。また神経突起伸長阻害活性と細胞増殖阻害活性は実施例３および４と同様な方法で評価した。結果を表６に示す。【０１８０】
実験の結果、ＷＯ０２／０７７２６２公報に記載されたＮＧＦアプタマーの結合活性は、本発明のアプタマーと比較して極めて低いことがわかった。また、神経突起伸長阻害活性と細胞増殖阻害活性については、本発明のアプタマーは高い阻害活性を示したのに対して、ＷＯ０２／０７７２６２公報に記載されたアプタマーは阻害活性を全く示さなかった。【０１８１】
【表６】
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【０１８２】
実施例７：他のニューロトロフィンとの交差反応性
ニューロトロフィンはＮＧＦ関連遺伝子ファミリーの総称であり、他にＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＮＴ−３（ニューロトロフィン−３）、ＮＴ−４／５（ニューロトロフィン−４／５）が知られている。一方、ニューロトロフィンの受容体には、低親和性受容体ｐ７５と高親和性受容体Ｔｒｋが同定されている。Ｔｒｋはまたファミリーを形成して、ＮＧＦの受容体であるＴｒｋＡ、ＢＤＮＦとＮＴ−４／５の受容体であるＴｒｋＢ、ＮＴ−３受容体であるＴｒｋＣの３種類が存在する。本発明で特定されたアプタマーはＮＧＦに対して高い結合活性および阻害活性を有しているが、他のニューロトロフィンに対する活性を調べた。【０１８３】
アプタマーＩＤ：２６（２）で表わされるアプタマーとヒトＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ヒトＮＴ−３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ヒトＮＴ−４／５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）の結合を、実施例２と同様に表面プラズモン共鳴法で評価した。
その結果、ＮＴ−３に対する結合は観察されなかった。また、ＢＤＮＦとＮＴ−４／５に対しては乖離速度が非常に速く、ＮＧＦに対する結合活性よりも明らかに低いことがわかった。【０１８４】
アプタマーＩＤ：２６（２）、５２、６３〜６５で表わされるアプタマーのＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５に対する生理阻害活性を、ＴＦ−１細胞を用いた増殖阻害アッセイで評価した。
ヒト赤白血病細胞株であるＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＲＬ−２００３）にレトロウイルスベクターを用いて各神経栄養因子に対するヒト受容体遺伝子（ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、ｐ７５）を導入し、それらの受容体を安定的に高発現する細胞を作製した。尚、ＢＤＮＦへの阻害活性評価にはＴｒｋＢおよびｐ７５を導入したＴＦ−１細胞、ＮＴ−３に対する評価にはＴｒｋＣおよびｐ７５を導入したＴＦ−１細胞、そしてＮＴ−４／５に対する評価にはＴｒｋＢのみを導入したＴＦ−１細胞を使用した。これらの細胞を２０％の胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、白色の９６ウェル平底プレートに１ウェルあたり１０００個（５０μＬ）の細胞を播種した。そこに室温にて３０分間無血清のＲＰＭＩ−１６４０培地中で予め反応させたヒトＢＤＮＦ（最終濃度０．０７４ｎＭ）あるいはＮＴ−３（最終濃度０．０７４ｎＭ）あるいはＮＴ−４／５（最終濃度０．０７１ｎＭ）とアプタマー（最終濃度３０〜０．０１ｎＭ）の混合溶液５０μＬを添加し、３日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を各ウェルに１００μＬ添加後、マイクロプレートリーダーにより化学発光を測定した。ＢＤＮＦあるいはＮＴ−３あるいはＮＴ−４／５のみの添加で細胞を３日間培養して得られた１ウェルあたりの発光量を阻害活性０％、ＢＤＮＦあるいはＮＴ３あるいはＮＴ−４／５無添加で３日間培養して得られた１ウェルあたりの発光量を阻害活性１００％として、ＢＤＮＦあるいはＮＴ３あるいはＮＴ−４／５とアプタマーを混合添加した場合に得られた１ウェルあたりの発光量から、アプタマーの阻害活性を算出した。阻害活性が０以下の場合は０％とした。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、５０％阻害活性を挟む上下二点の濃度より求めた。結果を表７に示す。【０１８５】
ＩＣ５０値を「＞Ｘ」と記載したものは、記載した濃度Ｘが測定最高濃度であった場合に阻害活性が５０％以下であったことを示す。測定した全てのアプタマーはＢＤＮＦおよびＮＴ−３に対してＩＣ５０が１０００ｎＭ以上であった。また、ＮＴ−４／５に対してはＩＣ５０が３００ｎＭ以上であった。以上の結果から、これらのアプタマーはＮＧＦを特異的に阻害することがわかった。【０１８６】
【表７】
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【０１８７】
実施例８：ＮＧＦアプタマーによる鎮痛作用
ＮＧＦ誘発性疼痛に対するＮＧＦアプタマーの鎮痛作用を検討する為、ラット後肢へのＮＧＦ皮下投与により引き起こされる熱性痛覚過敏モデルを使用した。実験にはＪｃｌ：ＳＤ系ラット（６週齢）を使用した。熱性痛覚過敏の指標として、足底熱刺激測定装置（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ社製）からの肢底への赤外線照射に対する逃避行動の反応潜時を用いた。試験前日に評価系への馴化を行った。試験当日の投与前に逃避行動反応潜時を測定し、１０秒以上２０秒未満の個体を使用した。Ｖｅｈｉｃｌｅ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％  ＢＳＡ）にＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、終濃度５０μｇ／ｍｌ）および被験物質を混合し、室温３０分間のインキュベート後、左後肢底に１０μｌ皮下投与し、３時間後及び５時間後に逃避行動反応潜時を測定した。アプタマーＩＤ：２６（２）で表される抗ＮＧＦアプタマーを、終濃度０．５、５、１０ｍｇ／ｍｌ（ＮＧＦに対するモル比  約：１０、１００、２００倍）で投与した。コントロールとして、ＶｅｈｉｃｌｅまたはＶｅｈｉｃｌｅとＮＧＦとの混合液を同様に投与した。結果を表８に示す（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ、Ｖｅｈｉｃｌｅ群およびＮＧＦ群：ｎ＝１２、配列番号２６（２）投与群：ｎ＝９）。【０１８８】
投与３時間後及び５時間後で、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に比べてＮＧＦ群で逃避行動反応潜時が有意に小さかった。投与３時間後では、５、１０ｍｇ／ｍｌのアプタマーＩＤ：２６（２）投与群の逃避行動反応潜時がＮＧＦのみの投与群に比べて有意に大きく（ｐ＜０．０５）、投与５時間後では、０．５、５、１０ｍｇ／ｍｌアプタマーＩＤ：２６（２）投与群の逃避行動反応潜時がＮＧＦのみの投与群に比べて大きかった（ｐ＜０．０１）。このことから、抗ＮＧＦアプタマーがＮＧＦ誘発性疼痛に対する鎮痛作用を有することが示された。【０１８９】
【表８】
2011118682.tif 000041
【０１９０】
実施例９：ＮＧＦアプタマーによる術後痛モデルにおける鎮痛作用
ＮＧＦアプタマー療法の薬効検討の為、熱性痛覚過敏が引き起こされる術後痛モデルを使用した。実験にはＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系ラット（５週齢）を使用した。カテーテルの先端を大腿静脈内に留置し、もう一方の先端をラット背部から体外へ露出した。１週間後にＱｕｉｃｋ  ｃｏｎｎｅｃｔインフュージョンシステム（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社製）をラットに装着し、更に１週間後に熱性痛覚過敏を評価した。熱性痛覚過敏の指標として、足底熱刺激測定装置（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ社製）からの肢底への赤外線照射に対する逃避行動の反応潜時を用いた。試験開始３日前に評価系への馴化を行った。試験開始日に逃避行動反応潜時を測定し、１０秒以上２０秒未満の個体を使用した。生理食塩水に溶解したアプタマーＩＤ：２６（６６）で表される抗ＮＧＦアプタマーをシリンジポンプ（テルモ社製）を用いて１３．６１ｍｇ／２４０ｍｌ／ｋｇ／９６ｈｒで持続的に静脈内投与した（なお、アプタマーの質量は、ＰＥＧを含まない部分に相当する質量である）。コントロールとして、Ｖｅｈｉｃｌｅを同様に投与した。投与開始１時間後に右後肢底の皮膚および筋膜を切開後、屈筋を垂直に二分し、皮膚を縫合した。切開手術後、１、２、３、４日後に逃避行動反応潜時を測定した。結果を表９に示す（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝９）。【０１９１】
Ｖｅｈｉｃｌｅ群において、投与・切開術１、２、３、４日後の逃避行動反応潜時が投与・切開術前に比べて有意に小さかった（ｐ＜０．０１）。投与・切開術１、２、３、４日後において、アプタマーＩＤ：２６（６６）のアプタマー投与群の逃避行動反応潜時がＶｅｈｉｃｌｅ群に比べて有意に大きかった（１、２、４日後：ｐ＜０．０１、３日後：ｐ＜０．０５）。このことから抗NGFアプタマーは術後痛モデルに対する鎮痛作用を有することが示された。【０１９２】
【表９】
2011118682.tif 000042
【産業上の利用可能性】
【０１９３】
本発明のアプタマー及び複合体は、疼痛や炎症性疾患などの疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、ＮＧＦの精製及び濃縮、並びにＮＧＦの検出及び定量に有用であり得る。【０１９４】
本出願は、日本で出願された特願２０１０−０６８５４６（出願日：２０１０年３月２４日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2011118682.tif 000043
【配列表】
2011118682000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年1月26日(2012.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、塩基長が７３以下のアプタマーであって、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマー：
（ａ）配列番号２６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号２６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣで表わされる配列を除く１〜４個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド；又は
（ｃ）配列番号２６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有する（但し、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣで表わされる配列は同一である）ヌクレオチド配列。
【請求項２】
少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールで修飾されている、請求項２に記載のアプタマー。
【請求項４】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端または３’末端に結合している、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項５】
各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項６】
各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項７】
ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性または細胞増殖活性を阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項８】
５０％阻害濃度が１０ｎＭ以下である、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項９】
ＮＴ−３に結合しない、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１０】
ＢＤＮＦ、ＮＴ−３又はＮＴ−４／５の細胞増殖活性を阻害しない、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１１】
配列番号２６で表わされるヌクレオチド配列を含み、塩基長が７３以下である核酸。
【請求項１２】
配列番号２６で表わされるヌクレオチド配列からなる核酸。
【請求項１３】
少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項１１または１２に記載の核酸。
【請求項１４】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールで修飾されている請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端または３’末端に結合している、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１７】
各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸、及びそれに結合した標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物を含む複合体。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアプタマー、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸、あるいは請求項１８に記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアプタマー、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸、あるいは請求項１８に記載の複合体を含む抗疼痛剤。
【請求項２１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアプタマー、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸、あるいは請求項１８に記載の複合体を含む抗炎症剤。
【手続補正書】
【提出日】平成24年5月10日(2012.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、塩基長が７３以下のアプタマーであって、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマー：
（ａ）配列番号２６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号２６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣで表わされる配列を除く１〜４個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ）配列番号２６で表わされるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と９０％以上の同一性を有する（但し、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣで表わされる配列は同一である）ヌクレオチド配列。
【請求項２】
少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールで修飾されている、請求項２に記載のアプタマー。
【請求項４】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端または３’末端に結合している、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項５】
各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項６】
各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項７】
ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性または細胞増殖活性を阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項８】
５０％阻害濃度が１０ｎＭ以下である、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項９】
ＮＴ−３に結合しない、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１０】
ＢＤＮＦ、ＮＴ−３又はＮＴ−４／５の細胞増殖活性を阻害しない、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１１】
配列番号２６で表わされるヌクレオチド配列を含み、塩基長が７３以下である核酸。
【請求項１２】
配列番号２６で表わされるヌクレオチド配列からなる核酸。
【請求項１３】
少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項１１または１２に記載の核酸。
【請求項１４】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールで修飾されている請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ又はポリエチレングリコールが、アプタマーの５’末端または３’末端に結合している、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１７】
各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置き換えられている、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸、及びそれに結合した標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物を含む複合体。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアプタマー、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸、あるいは請求項１８に記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアプタマー、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸、あるいは請求項１８に記載の複合体を含む抗疼痛剤。
【国際調査報告】
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