(57)【要約】この発明は、分泌シグナル配列に連結された変異型タウ蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分として含むタウオパチーの予防または治療用ワクチンであって、被験者において変異型タウ蛋白質の直接投与と比べてより持続的にタウ蛋白質（リン酸化されていてもよい。）に対する抗体を誘導することができるワクチンに関する。
2011083881.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌シグナル配列に連結された変異型タウ蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分として含むタウオパチーの予防または治療用ワクチンであって、該変異型タウ蛋白質が、タウ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の２５７位、２６０位、２６６位、２７２位、２７９位、２８０位、２８４位、２９６位、３０１位、３０３位、３０５位、３１５位、３１７位、３２０位、３３５位、３３６位、３３７位、３４２位、３５２位、３６９位、３８９位および４０６位からなる群から選択される少なくとも１つの位置に相当する位置のアミノ酸残基の変異を含むものであり、および、該ベクターが被験者において変異型タウ蛋白質の直接投与と比べてより持続的にタウ蛋白質に対する抗体を誘導することができる、前記ワクチン。
【請求項２】
前記変異が、Ｋ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｌ２６６Ｖ、Ｇ２７２Ｖ、Ｎ２７９Ｋ、Ｋ２８０Δ、Ｌ２８４Ｌ、Ｎ２９６Δ、Ｎ２９６Ｈ、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｇ３０３Ｖ、Ｓ３０５Ｎ、Ｌ３１５Ｒ、Ｋ３１７Ｍ、Ｓ３２０Ｆ、Ｇ３３５Ｓ、Ｇ３３５Ｖ、Ｑ３３６Ｒ、Ｖ３３７Ｍ、Ｅ３４２Ｖ、Ｓ３５２Ｌ、Ｋ３６９Ｉ、Ｇ３８９ＲおよびＲ４０６Ｗ（ここでΔは欠失である。）からなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
前記変異が、少なくともＰ３０１Ｌ、Ｐ３０１ＳまたはＰ３０１Ｔの変異を含む、請求項１または２記載のワクチン。
【請求項４】
前記分泌シグナル配列が、アミロイド前駆蛋白質シグナル配列またはＣＤ５９シグナル配列である、請求項１〜３のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項５】
前記ベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項１〜４のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項６】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項１〜４のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項７】
鼻腔内投与用に製剤化されている、請求項１〜６のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項８】
タウオパチー型認知症の改善作用を有する、請求項１〜７のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項９】
被験者において社会的行動異常、不安様行動異常および記憶障害の少なくとも１つの症状の改善作用を有する、請求項１〜８のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項１０】
ワクチンが被験者の脳内のミクログリアを活性化し、これによって変異型タウ蛋白質の蓄積を抑制する作用を有する、請求項１〜９のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項１１】
タウ蛋白質はリン酸化されている、請求項１〜１０のいずれか１項記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タウオパチー（ｔａｕｏｐａｔｈｙ）の予防または治療のために用いることが可能な変異型タウ蛋白質を発現するベクターおよびその医薬品としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タウ（ｔａｕ）蛋白質は正常脳内では細胞内の微小管に結合した状態で存在する可溶性のリン酸化蛋白質で、微小管の重合促進と安定化に寄与し、微小管との結合と乖離を繰り返しながら平衡状態を保っている。この平衡状態がリン酸化・脱リン酸化酵素異常などにより崩れると、細胞質中の遊離タウ蛋白質が増加し、凝集や線維化がみられるようになる。アルツハイマー病や前頭側頭型認知症をはじめとする高齢者の認知症の大多数において、アミロイドの蓄積を必ずしも伴わず、タウ蛋白質凝集体の蓄積が特徴的病変として認められる神経変性疾患については、タウオパチーと総称されている（非特許文献１）。
わが国では６５歳以上の高齢者の約７％に認知症がみられ、軽度認知症を加えると約１０％に達する。その７割がタウオパチー型認知症といわれており、患者数は約２００万人である。認知症に関する研究開発はこれまでアミロイドβ（Ａβ）蛋白質に対する研究が先行しており、アミロイドβのペプチド免疫による臨床治験が行われているが、治験の途中で接種患者の６％に髄膜脳炎が発生したため治験中止となっている（非特許文献２）。この治験は中止になったが、ワクチン接種後脳炎を起こし快復した後、別の疾患で死亡した患者についての症例報告により、ワクチン接種により老人斑や神経変性突起の消失効果があったことが確認された（非特許文献３）。また、ワクチン接種患者のその後のｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ調査により、このワクチン投与により、剖検で老人斑の消失が確認された患者も病気は進行することが確認され、このワクチンは病気の進行予防効果がないことが示唆された（非特許文献４）。
また、アミロイドβに対する抗体による受動免疫が有効であることもこれまでの研究で明らかになっているが、病気の進行を抑える効果については明らかになっていない（非特許文献５）。
さらにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにアミロイドβを搭載した経口ワクチンの効果も検証されている。マウスの実験において、このＡＡＶベクターの経口投与により腸管粘膜を介するアミロイドβに対する抗体産生効果、学習機能改善効果が認められたが（非特許文献６）、その後のサルの実験では老人斑の減少は認められたものの、明確な病状進行抑制効果は確認できていない。
これに対して、タウ蛋白質については、これまでアルツハイマー病などの治療の標的としてあまり重視されていなかったが、近年、タウ蛋白質はアミロイドβに代わるアルツハイマーの治療薬の標的として、タウ蛋白質過剰蓄積を伴うタウオパチーの治療およびワクチンの標的となりつつある（非特許文献７）。
本発明と関連する治療剤として、アミロイドβをコードする遺伝子をアデノ随伴ウイルスに搭載したアルツハイマー治療剤（特許文献１、２、非特許文献８）、タウ蛋白質の接種によるアルツハイマーおよびタウオパチーの治療法（特許文献３、非特許文献９）などが報告されているが、タウ蛋白接種タウオパチーモデルマウスにおいて協調運動・運動学習の改善効果は認められたものの社交性の欠如、記銘力低下という認知症患者において特徴的に見られる症状の改善効果は認められていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００８−５３６４７６
【特許文献２】特開２００５−０２１１４９
【特許文献３】ＵＳ２００８／００５０３８３Ａ
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】斉藤裕子，臨床検査，Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．１０，ｐ．１１２１−１１２９（２００６）（日本）
【非特許文献２】Ｏｒｇｏｇｏｚｏ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，６１：４６−５４（２００３）
【非特許文献３】Ｎｉｃｏｌｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９：４４８−４５２（２００３）
【非特許文献４】Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３７２：２１６−２２３（２００８）
【非特許文献５】松岡康治，実験医学，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．１６，ｐ．２５７２−２５７６（２００８）（日本）
【非特許文献６】田平武，老年精神医学雑誌第２０巻増刊号，ｐ．６８−７４（２００９）（日本）
【非特許文献７】Ｍａｒｔｉｎ−Ｊｏｎｅｓ，Ｚ  ａｎｄ  Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓ，Ｃ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ，２２（２）：１１１（２００８）
【非特許文献８】Ｍｏｕｒｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２１：２１３５−２１４８（２００７）
【非特許文献９】Ａｓｕｎｉ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２７：９１１５−９１２９（２００７）
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、タウオパチー、とりわけタウオパチー型認知症、の予防または治療用ワクチンを提供することである。
本発明者らは、タウオパチーモデルマウスを用いた試験で、変異型タウ蛋白質をコードする核酸を含むベクターが、該蛋白質と比べて長い持続的抗体誘導作用を有することを確認し、さらに該ベクターがタウオパチー、とりわけタウオパチー型認知症の有意な改善作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
したがって、本発明は、要約すると、以下の特徴を包含する。
本発明は、その第１の態様において、分泌シグナル配列に連結された変異型タウ蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分として含むタウオパチーの予防または治療用ワクチンであって、該変異型タウ蛋白質が、タウ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の２５７位、２６０位、２６６位、２７２位、２７９位、２８０位、２８４位、２９６位、３０１位、３０３位、３０５位、３１５位、３１７位、３２０位、３３５位、３３６位、３３７位、３４２位、３５２位、３６９位、３８９位および４０６位からなる群から選択される少なくとも１つの位置に相当する位置のアミノ酸残基の変異を含むものであり、および、該ベクターが被験者において変異型タウ蛋白質の直接投与と比べてより持続的にタウ蛋白質（リン酸化されていてもよい。）に対する抗体を誘導することができる、前記ワクチンを提供する。
その実施形態において、前記変異が、Ｋ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｌ２６６Ｖ、Ｇ２７２Ｖ、Ｎ２７９Ｋ、Ｋ２８０Δ、Ｌ２８４Ｌ、Ｎ２９６Δ、Ｎ２９６Ｈ、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｐ３０１Ｔ、Ｇ３０３Ｖ、Ｓ３０５Ｎ、Ｌ３１５Ｒ、Ｋ３１７Ｍ、Ｓ３２０Ｆ、Ｇ３３５Ｓ、Ｇ３３５Ｖ、Ｑ３３６Ｒ、Ｖ３３７Ｍ、Ｅ３４２Ｖ、Ｓ３５２Ｌ、Ｋ３６９Ｉ、Ｇ３８９ＲおよびＲ４０６Ｗ（ここでΔは欠失である。）からなる群から選択される少なくとも１つの変異である。
別の実施形態において、前記変異が、少なくともＰ３０１Ｌ、Ｐ３０１ＳまたはＰ３０１Ｔの変異を含む変異である。
別の実施形態において、前記分泌シグナル配列が、アミロイド前駆蛋白質シグナル配列またはＣＤ５９分泌シグナル配列である。
別の実施形態において、前記ベクターがセンダイウイルスベクターである。
別の実施形態において、前記ベクターがプラスミドベクターである。
別の実施形態において、前記ワクチンが鼻腔内投与用に製剤化されている。
別の実施形態において、前記ワクチンがタウオパチー型認知症の改善作用を有する。
別の実施形態において、前記ワクチンが被験者において記銘力低下および／または社会的行動異常、不安様行動異常および記憶障害の少なくとも１つの症状の改善作用を有する。
別の実施形態において、前記ワクチンが被験者の脳内のミクログリアを活性化し、これによって変異型タウ蛋白質の蓄積を抑制する作用を有するものである。
別の実施形態において、タウ蛋白質（変異型タウ蛋白質を含む。）はリン酸化されていてもよい。
本発明のワクチンは、タウオパチーをもつ被験者において、認知症の記銘力低下および／または社会的行動異常および／または不安様行動異常および／または記憶障害の有意な改善効果を有し、とりわけ従来のワクチンでは有効でなかった、タウオパチーの症状の進行を抑制する（若しくは遅延させる）作用を有する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１０−３４２４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、ＧＦＰ搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ＧＦＰ）の経鼻投与によるタウオパチーモデルマウス（Ｐ３０１Ｓ  Ｔａｕ  トランスジェニックマウス）における感染効率の検討結果を示す。Ｓｅｖ−ＧＦＰ接種マウスの脳のＧＦＰの発現を多目的顕微鏡（ＢＺ−９０００，Ｋｅｙｅｎｃｅ）にて蛍光像（Ａ）と明視野像（Ｂ）の撮影を行って解析した。
図２は、タウオパチーモデルマウスにタウ蛋白質搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ）を接種しリン酸化タウ蛋白質発現抑制効果に関する解析を行った結果を示す。コントロールとしてＳｅｖ−ＧＦＰ（ここで、ＧＦＰは緑色蛍光蛋白質をコードする核酸を表す。）を用いた。接種後５カ月目にマウス海馬冠状断面において抗リン酸化タウタンパク抗体（ＡＴ８，Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）による免疫染色を行った。矢頭はタウ病変を示す。免疫染色後、海馬ＣＡ３領域において蓄積した領域の面積を多目的顕微鏡（ＢＺ−９０００，Ｋｅｙｅｎｃｅ）付属解析ソフトで測定した。Ｓｅｖ−ＧＦＰ接種群、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種群について、それぞれ平均値±標準誤差、統計学的解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。
図３は、（Ａ）に、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１ＳまたはＳｅｖ−ＧＦＰを野生型マウス（Ｎｏｎ−Ｔｇ）またはタウオパチーモデルマウス（Ｔｇ）に経鼻接種し、接種５か月後の海馬全体におけるリン酸化タウタンパク質（ｐＴＡＵ）の蓄積をウエスタンブロット法にて評価した結果を示す。さらにタンパク量は、バンドの信号強度を画像解析ソフト（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ，Ｖｅｒ．１．６３，ＮＩＨ，ＵＳ）で測定し、内部コントロールタンパクであるβ−ａｃｔｉｎと信号強度の比をとって定量化した結果を（Ｂ）に示す。Ｓｅｖ−ＧＦＰ接種群、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種群について、それぞれ平均値±標準誤差、統計学的解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。試験に用いたマウス群及び対照は次のとおりである。
Ｎｏｎ−Ｔｇ／Ｓｅｖ−ＧＦＰ：野生型マウスにＳｅｖ−ＧＦＰを経鼻接種したグループ、Ｎｏｎ−Ｔｇ／Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ：野生型マウスにＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを経鼻接種したグループ、Ｔｇ／Ｓｅｖ−ＧＦＰ：タウオパチーモデルマウスにＳｅｖ−ＧＦＰを経鼻接種したグループ、Ｔｇ／Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ：タウオパチーモデルマウスにＳｅｖ−ｔａｕＰ３０１Ｓを経鼻接種したグループ、−：陰性対照（野生型マウスから抽出したタンパク）、＋：陽性対照（なにも投与していないタウオパチーモデルマウス海馬から抽出したタンパク）。
図４は、（ａ）：Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓをタウオパチーモデルマウスまたは野生型マウスに接種後、血清を採取し組織のタウに反応する血清中抗体価を、それぞれのマウスの海馬組織（白いボックス部分）における反応性で評価した結果を示す。
Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを投与したマウスの血清をそれぞれ３０倍、１００倍、３００倍、１０００倍、３０００倍に希釈し、４℃で一晩反応させ、２次抗体としてＡｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体を室温、１時間反応させた。
（ｂ）：コントロールとしてタウオパチーモデルマウスに抗体を反応せずに免疫染色を行った結果を示す。
（ｃ）：Ｓｅｖ−ＧＦＰ、またはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種したタウオパチーモデルマウスの血清中抗体価を、組織との反応がみられた最大希釈倍率で評価した結果を示す。
Ｓｅｖ−ＧＦＰ接種群、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種群それぞれ平均値＋／−標準誤差、統計学的解析をＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定より行った。
図５は、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種による脳内のミクログリアの活性化を解析した結果を示す。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種し、投与５カ月後接種マウスの海馬の組織における活性化ミクログリアを認識する抗Ｉｂａ１抗体を用いて免疫染色を行った（Ａ）。コントロールとしてＳｅｖ−ＧＦＰを接種した（Ｂ）。矢印はＩｇＧと共在しないミクログリアを示す。
図６は、野生型マウスまたはタウオパチーモデルマウスへのＳｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓの接種による血清中の抗リン酸化タウ抗体の産生及び脳脊髄液中リン酸化タウ蛋白質の産生について解析した結果を示す。抗体産生の解析については、Ｓｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種したマウスの血清を用いて、リコンビナント変異型タウ蛋白質（ＴＡＵＰ３０１Ｓ）を抗原としたＥＬＩＳＡを行った。
リン酸化タウ蛋白質の産生については、Ｓｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種したマウスの脳脊髄液を用いて、抗リン酸化タウ抗体（ＡＴ８抗体）との結合によるＥＬＩＳＡを行った。
（ａ）：Ｓｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種後５カ月目の血清中のヒトＰ３０１Ｓ変異タウタンパクに対する抗体価を示す。
（ｂ）：Ｓｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種後５カ月目のＣＳＦ中のリン酸化タウの量を示す。
図７は、（Ａ）野生型マウスまたはタウオパチーモデルマウスへＳｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種し、社会的行動測定テスト（Ｓｏｃｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）を行った結果を示す。タウオパチー患者では社会的行動の異常が多く認められることから、社会的行動に関する「Ｓｏｃｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ（社会的行動測定テスト）」（箱にマウスを２匹入れて、１０分間の間の接触時間を測定）を行った。（Ｂ）さらにＣｒａｗｌｅｙ’ｓ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ（記銘力および社会的行動測定テスト）により、はじめて会ったマウスに対しどれだけ興味をもって近づこうとするか、ケージの近傍付近での滞在時間を測定した。
図８は、野生型マウスまたはタウオパチーモデルマウスへＳｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種し、高架式十字迷路テスト（不安様行動のテスト）を行った結果を示す。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓまたは、Ｓｅｖ−ＧＦＰ接種マウスにおいて、迷路中心から各４方向への総エントリー回数（Ａ）、柵のない方向へのエントリー回数の割合（Ｂ）、マウスの総移動距離（Ｃ）、柵のない場所への滞在時間の割合（Ｄ）を１０分間観察し、Ｉｍａｇｅ  ＥＰソフトウェアを用いて自動的に計測した。統計学的解析はＯｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡ，ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔはＦｉｓｈｅｒのＰｒｏｔｅｃｔｅｄ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｃｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＬＳＤ）法にて行った。
図９は、野生型マウスまたはタウオパチーモデルマウスへリコンビナントタウ蛋白質を接種しオープンフィールド試験（活動量や情動性を測定するためのテスト）を行った結果を示す。リコンビナントタウ蛋白質（ＴＡＵＰ３０１Ｓ）を接種し、接種後１カ月目にオープンフィールド試験を行った。接種マウスの移動距離（Ａ）、背伸びの回数（Ｂ）、フィールド中央での滞在時間（Ｃ）、常同性行動（Ｄ）について１２０分間の自由行動を観察し評価した。
図１０は、野生型マウスまたはタウオパチーモデルマウスへリコンビナントタウ蛋白を接種し高架式十字迷路テスト（不安様行動のテスト）を行った結果を示す。リコンビナントタウ蛋白質（ＴＡＵＰ３０１Ｓ）１００μｇ／匹／回、２週間毎に計３回皮下投与接種したタウオパチーモデルマウス及び野生型マウスを、それぞれ迷路中心の正方形の部分（５×５ｃｍ）に、クローズドアームの方を向くように置いて、１０分間行動を記録した。コントロールとしては、Ｓｅｖ−ＧＦＰを接種した。迷路中央から各４方向への総エントリー回数（Ａ）、柵のない方向へのエントリー回数の割合（Ｂ）、マウスの総移動距離（Ｃ）、柵のない場所への滞在時間の割合（Ｄ）をＩｍａｇｅ  ＥＰソフトウェアを用いて自動的に計測した。統計学的解析はＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ，ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔはＦｉｓｈｅｒのＰｒｏｔｅｃｔｅｄ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｃｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＬＳＤ）法にて行った。
図１１は、野生型マウスまたはタウオパチーモデルマウスへｐｃＤＮＡ３．１−ＣＤ５９−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓ（ＡＴＧ−）（以下ｃＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓ）を接種し、オープンフィールド試験を行った結果を示す。ｃＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓを接種し、接種後１カ月目にオープンフィールド試験を行った。接種マウスの移動距離（Ａ）、背伸びの回数（Ｂ）、フィールド中央での滞在時間（Ｃ）、常同性行動（Ｄ）について１２０分間の自由行動を観察し評価した。
図１２は、野生型マウスまたはタウオパチーモデルマウスへｃＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓを接種し社会的行動測定テスト（Ｓｏｃｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）の結果を示す。タウオパチー患者では社会的行動の異常が多く認められることから、社会的行動に関する「Ｓｏｃｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ（社会的行動測定テスト）」（箱にマウスを２匹入れて、１０分間の間の接触時間を測定）を行った。
図１３は、ｃＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓの構造と挿入配列（配列番号１２）を示す。
図１４は、（ａ）：Ｐ３０１Ｓについてタウタンパクの最長アイソフォームでの配列番号３０１番目のアミノ酸における変異を示す。Ｓｅｖ／△ＦはセンダイウイルスのＦ遺伝子が欠損したものを示す。（ｂ）：アミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）シグナル配列はヒト変異型タウ蛋白質（Ｐ３０１Ｓ，アイソフォーム１Ｎ４Ｒ）のＮ末端からメチオニンを欠失させた部位に接続させた。ｃ：ｐｃＤＮＡ３−ＡＰＰ−ＴａｕＰ３０１Ｓにおける挿入配列（配列番号１３）を示す。ここで用いた、ＡＰＰシグナル配列はＮＴ＿０１１５１２．１１，ＮＷ＿００１８３８７０６．１、ＮＭ＿２０１４１４．１，ＮＭ＿２０１４１３．１，ＮＭ＿０００４８４．２，ＮＭ＿００１１３６１３０．１，ＮＭ＿００１１３６１２９．１のａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号でＧｅｎＢａｎｋに登録されている。およびＰ３０１Ｓ  Ｔａｕの配列はＮＭ＿００１１２３０６７．２のａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号でＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列を基に変異を加えた。
図１５は、（Ａ）：Ｓｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種した野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスにおけるバーンス迷路試験（空間記憶）の結果を示す。筒に入れてマウスに目隠しをして所定の位置にセット、筒をとって自由に歩かせ、正解の穴に暗箱をとりつけ、暗箱のある場所を覚えさせた（トレーニング）。（Ｂ）：トレーニング後、暗箱をはずした穴（ターゲット）の周囲の滞在時間を記録した（プローブ試験）。
トレーニング期間におけるターゲットに到達するまでの時間、プローブ試験におけるターゲットに到達するまでの時間、各穴の周辺で滞在する時間を測定した。
図１６は、Ｓｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種した野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスにおける恐怖条件付け試験（文脈記憶）の結果を示す。箱に音と電気ショックを組み合わせてマウスに提示し、マウスに条件付けを行い、再び同じ箱にいれることにより引き起こされるフリージング（すくみ行動）の出現割合により評価した。
図１７は、Ｓｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種した野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスの身体測定（体重（Ａ）、体温（Ｂ）、握力（Ｃ）、ワイアハングテスト（Ｄ））の結果を示す。
図１８は、Ｓｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種した野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスにおける社会的行動測定テスト（接触の総持続時間（Ａ）、接触回数（Ｂ）、活発な接触の総持続時間（Ｃ）、接触の持続時間の平均値（Ｄ）、総移動距離（Ｅ））の結果を示す。
図１９は、Ｓｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種した野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスにおけるプレパルス抑制試験（驚愕反応（Ａ）、プレパルスによる驚愕反応の抑制効果（Ｂ））の結果を示す。先に弱い音を聞かせることで、その後大きい音を聞かせた際の驚愕反応の抑制効果を比較することで評価した。
図２０は、Ｓｅｖ−ＧＦＰまたはＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種した野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスにおけるオープンフィールドテストの結果を示す。（Ａ）は総移動距離、（Ｂ）は垂直方向の活動量、（Ｃ）は中心部での滞在時間、（Ｄ）は常同行動回数を示す。
図２１は、野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスにおけるオープンフィールドテストの結果を示す。（Ａ）は総移動距離、（Ｂ）は垂直方向の活動量、（Ｃ）は中心部での滞在時間、（Ｄ）は常同行動回数を示す。
図２２は、野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスにおける高架式十字型迷路テストの結果を示したものである。（Ａ）はオープンアームに侵入した数、（Ｂ）はオープンアームに侵入した割合、（Ｃ）は移動距離、（Ｄ）はオープンアームに滞在した時間を示す。
図２３は、野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスにおけるプレパルス抑制試験の結果を示す。（Ａ）：音の違いによる驚愕反応の違い、（Ｂ）：プレパルス抑制の割合（事前に小さな音をならし、その後大きな音を鳴らした際の驚愕反応の抑制効果の有無の割合）を示す。
図２４は、（Ａ）〜（Ｄ）：４カ月齢のタウオパチーモデルマウス、（Ｅ）〜（Ｈ）：４カ月齢の野生型マウス、（Ａ），（Ｅ）：外側淡蒼球、（Ｂ），（Ｆ）：大脳皮質扁桃核、（Ｃ），（Ｇ）：聴覚皮質、（ＣＡ３；Ｄ，Ｈ）：腹側海馬。行動学的解析後の６カ月齢のマウスにおける解析、（Ｉ，Ｌ）：帯状回皮質、（Ｊ，Ｍ）：大脳皮質扁桃核、（ＣＡ３；Ｋ，Ｎ）：海馬。
赤い染色部位はリン酸化タウを示し、青い染色部位は細胞核を示す。
矢頭はリン酸化タウ蛋白質の蓄積を示し、丸印は血管に対する抗マウスＩｇＧ抗体の非特異反応を示す。
図２５は、１３週齢の野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスにおける一般的身体測定の結果を示す。（Ａ）は体重、（Ｂ）は直腸温、（Ｃ）は握力、（Ｄ）はワイアハングテストの結果を示す。
図２６は、社会行動測定テストの結果を示す。（Ａ）は接触の継続時間、（Ｂ）は接触回数、（Ｃ）は活発な接触の持続時間、（Ｄ）は接触毎の平均持続時間、（Ｅ）はテスト中の総移動距離を示す。
図２７は、野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスにおける恐怖条件付け試験（文脈記憶）の結果を示す。
図２８は、野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスにおけるバーンス迷路試験（空間記憶）の結果を示す。（Ａ）〜（Ｃ）はトレーニング期間における解析結果を示し、（Ｄ）はトレーニング後のプローブ試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、タウオパチーの予防または治療の有効成分として変異型タウ蛋白質をコードする核酸を含むベクターをワクチンとして使用することを特徴とする。
本明細書で使用する「タウオパチー」とは、中枢神経系にリン酸化されたタウ蛋白質が異常に蓄積し、神経障害（神経変性、等）と関連する疾患群を指す。
本明細書で使用する「核酸」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
本明細書で使用する「被験者」とは、哺乳動物、好ましくは霊長類、さらに好ましくはヒトを意味する。
＜変異型タウ蛋白質＞
タウ蛋白質は、微小管関連結合蛋白質の１つであってＭＡＰＴ（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｕ）とも称され、タウ遺伝子の選択的スプライシングにより生じる６つのアイソフォームが存在し、Ｃ末端側の微小管結合部位の反復回数により、３回リピート型タウと４回リピート型タウに分類される（斉藤裕子，臨床検査，Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．１０，ｐ．１１２１−１１２９（２００６）（日本））。ヒトＭＡＰＴは、１７番染色体上に存在し（ＮＧ＿００７３９８．１）、例えば転写変異体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ）１〜６はそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（米国）に登録番号ＮＭ＿０１６８３５．３、ＮＭ＿００５９１０．４、ＮＭ＿０１６８３４．３、ＮＭ＿０１６８４１．３、ＮＭ＿００１１２３０６７．２、ＮＭ＿００１１２３０６６．２として登録されている。タウ蛋白質は、３回リピート型タウ、４回リピート型タウのいずれでもよく、とりわけ４回リピート型タウはヒト脳で最も多く発現するアイソフォームであることが知られている。「タウ蛋白質」は、好ましくはヒトタウ蛋白質である。
本発明の変異型タウ蛋白質は、タウ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１（ＮＭ＿００５９１０．４；アイソフォーム２Ｎ４Ｒ型）の２５７位、２６０位、２６６位、２７２位、２７９位、２８０位、２８４位、２９６位、３０１位、３０３位、３０５位、３１５位、３１７位、３２０位、３３５位、３３６位、３３７位、３４２位、３５２位、３６９位、３８９位および４０６位からなる群から選択される少なくとも１つの位置に相当する位置のアミノ酸残基の変異を含むものである。好ましい変異位置は、タウ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の２５７位、２６０位、２７２位、２７９位、２９６位、３０１位、３０３位、３０５位、３３５位、３３７位、３４２位、３６９位、３８９位または４０６位に相当する位置であり、より好ましい変異位置は、タウ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の少なくとも３０１位に相当する位置である。このことは、変異位置が、配列番号１の３０１位に相当する位置のみであってもよいし、或いは、配列番号１の３０１位に相当する位置に加えて、上に特定した配列番号１の２５７位、２６０位、２６６位、２７２位、２７９位、２８０位、２８４位、２９６位、３０３位、３０５位、３１５位、３１７位、３２０位、３３５位、３３６位、３３７位、３４２位、３５２位、３６９位、３８９位および４０６位からなる群から選択される少なくとも１つの位置に相当する位置のアミノ酸残基の変異を含んでもよいことを意味する。
前記変異は、置換または欠失である。置換の場合、タウ蛋白質の前記位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基、好ましくは自然変異体で認められたアミノ酸残基、に置換された変異であり、そのような置換の例は、配列番号１のアミノ酸配列においてＫ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｌ２６６Ｖ、Ｇ２７２Ｖ、Ｎ２７９Ｋ、Ｌ２８４Ｌ、Ｎ２９６Ｈ、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｇ３０３Ｖ、Ｓ３０５Ｎ、Ｌ３１５Ｒ、Ｋ３１７Ｍ、Ｓ３２０Ｆ、Ｇ３３５Ｓ、Ｇ３３５Ｖ、Ｑ３３６Ｒ、Ｖ３３７Ｍ、Ｅ３４２Ｖ、Ｓ３５２Ｌ、Ｋ３６９Ｉ、Ｇ３８９ＲまたはＲ４０６Ｗのアミノ酸置換である。また、欠失の場合、自然変異体で認められたような欠失、例えば配列番号１の２８０位のＫまたは２９６位のＮの欠失である。本発明では、前記変異は、前記位置のうち１個もしくは複数個（例えば、数個（例えば２〜１０の整数））の変異からなる。
本発明で好ましい変異は、前記３０１位のアミノ酸残基の置換であり、例えばＰ３０１Ｓ、Ｐ３０１ＬまたはＰ３０１Ｔのアミノ酸置換である。
本明細書で使用するアミノ酸置換に関する、例えば「Ｐ３０１Ｓ」という記載は、配列番号１のアミノ酸配列の３０１位のプロリン残基（Ｐ）がセリン残基（Ｓ）に置換されることを意味する。
３０１位の変異に関して、前頭側頭型痴呆の患者の発症年齢が比較的若く、発症すると進行が早いこと（Ｓｐｅｒｆｅｌｄ  ＡＤ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．１９９９  Ｎｏｖ；４６（５）：７０８−７１５；Ｙａｓｕｄａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５５：１２２４−１２２７，２０００）などが知られているため、この３０１位の変異に起因する若年年齢での発症や（一旦発症すると）進行が早いタウオパチーの治療や予防のターゲットとして３０１位の変異は重要であり、本発明のワクチンはそのようなタウオパチーに対し有効である。
＜ベクター＞
本発明のベクターは、上で説明した変異型タウ蛋白質をコードする核酸を含む。該変異型タウ蛋白質のＮ末端側には分泌シグナル配列が連結されており、これによって、細胞内に取り込まれたベクターが該核酸を発現し、細胞内の翻訳機構を利用して変異型タウ蛋白質前駆体に翻訳されたのち、細胞膜に移行され、シグナルペプチダーゼによりシグナル配列が切断され、該変異型タウ蛋白質が細胞外に分泌される。
分泌シグナル配列に連結された変異型タウ蛋白質をコードするＤＮＡは、慣用の遺伝子組換え技術を用いて合成することができる。このような技術は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ（２００２）などに記載されている。
変異型タウ蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、タウ蛋白質遺伝子によってコードされるｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを適当なプラスミドベクターに組み込み、得られたベクターを鋳型にし、かつ、目的の変異を導入したプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って該変異を含むタウ蛋白質コード配列部分を増幅し、制限酵素処理して該配列部分を含むフラグメントを取得し、同じ制限酵素で処理した該プラスミドベクターに該フラグメントを組み入れたのち、これを鋳型にし、タウ蛋白質コード配列全長の増幅を可能にするプライマーを用いて同様にＰＣＲを行い増幅することによって作製することができる。
ＰＣＲは、変性、アニーリングおよび増幅からなる３つのステップを１サイクルとし、これを約２０〜４５サイクル行うことを含む。変性は、二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするステップであり、９２〜９８℃の温度で約３０秒〜２分間熱処理する。アニーリングは、一本鎖ＤＮＡにプライマーを結合するステップであり、５０〜６５℃の温度で約１０秒〜６０秒間処理する。増幅は、プライマーが結合した一本鎖ＤＮＡを鋳型にして相補鎖を合成するステップであり、約７２℃の温度で約１０秒〜７分間処理する。サイクルを開始する前に約９４℃で約３０秒〜５分熱処理、またサイクルの終了後に、約７２℃で約１分〜１０分の増幅反応をそれぞれ行うことができる。反応は、ＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行う。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなどの市販のポリメラーゼを使用できる。ＰＣＲを自動で行うためのサーマルサイクラーなどの市販のＰＣＲ装置（宝酒造、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄなど）を使用すると便利である。
分泌シグナル配列は、ヒト細胞内に存在するシグナルペプチダーゼによって切断可能な任意のシグナル配列である。そのようなシグナル配列には、細胞特異的なものも包含される。分泌シグナル配列の例は、非限定的に、アミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）のシグナル配列をコードするＤＮＡ（ＮＴ＿０１１５１２．１１、ＮＷ＿００１８３８７０６．１、ＮＭ＿２０１４１４．１，ＮＭ＿２０１４１３．１，ＮＭ＿０００４８４．２，ＮＭ＿００１１３６１３０．１，ＮＭ＿００１１３６１２９．１）：５’−ｇｇｔｃｔａｇａａｔｇｃｔｇｃｃｃｇｇｔｔｔｇｇｃａｃｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔｇｇｃｃｇｃｃｔｇｇａｃｇｇｃｔｃｇｇｇｃｇｃｔｔ−３’（配列番号２）（ここで、実際のＡＰＰシグナル配列は開始コドンａｔｇ（下線）から始まる。また、その５’側のｔｃｔａｇａ配列は制限酵素サイトである。）、ＣＤ５９のシグナル配列をコードするＤＮＡ（ＮＭ＿００１１２７２２７．１、ＮＭ＿００１１２７２２６．１、ＮＭ＿０００６１１．５、ＮＭ＿２０３３３１．２、ＮＭ＿００１１２７２２５．１、ＮＭ＿２０３３２９．２、ＮＭ＿２０３３３０．２、ＮＭ＿００１１２７２２３．１）：５’−ａｔｇｇｇａａｔｃｃａａｇｇａｇｇｇｔｃｔｇｔｃｃｔｇｔｔｃｇｇｇｃｔｇｃｔｇｃｔｃｇｔｃｃｔｇｇｃｔｇｔｃｔｔｃｔｇｃｃａｔｔｃａｇｇｔｃａｔａｇｃ−３’（配列番号３）などである。
分泌シグナル配列をコードするＤＮＡと変異型タウ蛋白質をコードするＤＮＡを５’側からこの順に連結し、この連結体を鋳型にしてＰＣＲ増幅し、適当な制限酵素で消化したのちプラスミドベクターにサブクローニングする。
上記手法で使用可能なプラスミドベクターは、クローニング用ベクターのいずれでもよい。そのようなベクターの例は、非限定的にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＥＴ系などである。
上記のようにして得られた分泌シグナルが連結された変異型タウ蛋白質をコードする核酸を搭載するためのベクターは、ヒト細胞等の哺乳動物細胞内で該核酸の発現を可能にするものであればいずれのものでもよく、例えば遺伝子治療用のプラスミド、ウイルスベクターなどが包含される。
遺伝子治療用プラスミドには、非限定的に、例えばｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロジェン社、ストラタジーン社）、ｐＣＡＧＧＳ（ジーンブリッジ社）などが含まれる。
遺伝子治療用ウイルスベクターには、非限定的に、例えばセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、複製欠損レトロウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、狂犬病ウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクター、ワクシニアウイルスベクター、シンドビスウイルスベクターなどが含まれる。それらの複製欠陥型などの安全性の高いベクターが好ましい。
本発明では、上記のいずれのベクターも使用できるが、好ましく使用しうるベクターは、プラスミドベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり、そのうち特に好ましいウイルスベクターは、センダイウイルスベクターである。
ベクターには、外来ＤＮＡの発現に必要な真核生物細胞内で作動可能なプロモーター、例えばＣＭＶ  ＩＥ、デクチン−１、デクチン−２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＭＨＣクラスＩＩなどの各プロモーターが挿入されてもよい。このエレメントの他に、エンハンサー、複製開始点、リボソーム結合部位、ターミネーター、ポリアデニル化部位などの調節配列、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーなどが、ベクターに含まれうる。
また、前記ベクターは、目的核酸が恒常的に、自律的に、または誘導的に発現可能であるいずれのベクターでもよいが、安全性の面で核酸が自律的に発現されるベクターが好ましい。
センダイウイルスベクターは、遺伝子発現率が比較的高いうえに、染色体挿入変異による発癌リスクがないという高い安全性を有している。このベクターは、細胞核内に入らず細胞質内で複製し外来蛋白質の高いレベルでの発現を可能にする。
センダイウイルスにおいて自律的複製に関与する遺伝子は、ＮＰ、Ｐ／ＣおよびＬ遺伝子であり、また伝播性に関与する遺伝子は、Ｍ、ＦおよびＨＮ遺伝子であることが知られている。このウイルスをベクターとして利用する場合には、前記の遺伝子類が備わっていてもよいし、その一部の遺伝子、例えばＦ遺伝子、Ｍ遺伝子、ＨＮ遺伝子などが欠損していてもよい（蛋白質・核酸・酵素  Ｖｏｌ．５１，２７−３７，２００６）。特に宿主細胞への侵入に関与する膜融合蛋白質であるＦ蛋白質の遺伝子を欠損することによって高い安全性が確保される（特開２００９−２６８４７１、特表２００８−５３６４７６、ＷＯ  ００／７００７０）。
センダイウイルスの前記遺伝子のヌクレオチド配列は、以下のとおりＧｅｎＢａｎｋ等に登録されている（特表２００８−５３６４７６）。
ＮＰ遺伝子について、Ｍ２９３４３、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ５１３３１、Ｍ５５５６５、Ｍ６９０４６、Ｘ１７２１８など。
Ｐ遺伝子について、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ５５５６５、Ｍ６９０４６、Ｘ００５８３、Ｘ１７００７、Ｘ１７００８など。
Ｌ遺伝子について、Ｄ０００５３、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４０、Ｘ００５８７、Ｘ５８８８６など。
Ｍ遺伝子について、Ｄ１１４４６、Ｋ０２７４２、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４６、Ｕ３１９５６、Ｘ００５８４、Ｘ５３０５６など。
Ｆ遺伝子について、Ｄ００１５２、Ｄ１１４４６、Ｄ１７３３４、Ｄ１７３３５、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４６、Ｘ００１５２、Ｘ０２１３１など。
ＨＮ遺伝子について、Ｄ２６４７５、Ｍ１２３９７、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４６、Ｘ００５８６、Ｘ０２８０８、Ｘ５６１３１など。
また、センダイウイルスゲノムｃＤＮＡは、例えばＹｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ２：４５７−４６６，１９９７、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７などに記載の方法に従って構築することができる。さらに、該ｃＤＮＡからのウイルスの再構成は、ＷＯ  ９７／１６５３９；ＷＯ  ９７／１６５３８；ＷＯ  ００／７００５５；ＷＯ  ００／７００７０；ＷＯ  ０１／１８２２３；ＷＯ  ０３／０２５５７０；特表２００８−５３６４７６；Ｔｏｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．８６：３３−３８（２００２）；Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：６５６４−６５６９（２０００）などに記載された方法に従って行うことができる。ウイルスベクターを再構成するために使用できる宿主細胞として、例えばサル腎臓由来のＬＬＣ−ＭＫ２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７）およびＣＶ−１細胞（例えばＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）、ハムスター腎臓由来のＢＨＫ細胞（例えばＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）などの培養細胞、ヒト由来の２９３Ｔ細胞などが知られており、さらに大量のウイルスベクターを得るために、上記の宿主細胞から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させて増幅し、精製することができる（特表２００８−５３６４７６、ＷＯ  ００／７００５５、ＷＯ  ００／７００７０）。回収されたウイルスの力価は、例えばＣＩＵ（Ｃｅｌｌ−Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｕｎｉｔ）または赤血球凝集活性（ＨＡ）を測定することにより決定することができる（ＷＯ  ００／７００７０）。
Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターの再構成についても、ＷＯ  ００／７００５５、ＷＯ  ００／７００７０、特表２００８−５３６４７６などに記載された方法に従って行うことができる。このとき、センダイウイルスＦ蛋白質を発現するヘルパー細胞株を樹立し、これを用いてＦ遺伝子欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収する。
後述の実施例によれば、上記の方法を参考にしながら、Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（Ｚ株）のｃＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、分泌シグナル配列（例えば、ＡＰＰシグナル配列またはＣＤ５９シグナル配列）と変異型タウ蛋白質（ＴＡＵ（Ｐ３０１Ｓ））の結合フラグメントをセンダイウイルスヌクレオカプシド（ＮＰ）蛋白質遺伝子の転写開始配列と翻訳領域（ＯＲＦ）の間の非翻訳領域に挿入することで、変異型タウ遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ）を構築する。実際に構築したセンダイウイルスベクター再構成用プラスミドは、ｐｃＤＮＡ３−ＡＰＰ−ＴａｕＰ３０１Ｓ（図１４）であり、分泌シグナル配列の５’末端には開始コドン（ａｔｇ）を結合し、さらに開始コドンの前にコザック（ｋｏｚａｋ）のコンセンサス配列（例えばｇｃｃａｃｃまたはｃｃａｃｃ）を連結してもよい。ベクターの再構成のために、センダイウイルスＦ蛋白質を発現するヘルパー細胞株を使用する（ＷＯ  ００／７００７０）。
アデノウイルスベクターの場合には、Ｅ１領域欠失型アデノウイルスベクターを使用することができる。Ｅ１領域に加えてＥ３領域も欠損されてよいが、Ｅ３領域の欠損はかならずしも必須ではない。アデノウイルスベクターに関しては、特開２００８−０１７８４９、特開２０００−１６６５８１、特表２００３−５１８９１５、Ｈｉｔｔ，Ｍ．ら，「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．ｅｄ．），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２００５）、Ｈｉｔｔ，Ｍ．ら，「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ａｄｏｌｐｈ，Ｋ．Ｗ．ｅｄ．），Ｖｏｌ．７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などに記載されている。
その他のウイルスベクターについても、遺伝子治療用に改良されたベクターが文献に記載されているので、本発明のために利用しうる。
＜ワクチン＞
本発明のワクチンは、タウオパチーの予防または治療のために使用することができる。該ワクチンは、被験者において変異型タウ蛋白質の直接投与と比べてより持続的にタウ蛋白質（リン酸化されていてもよい。）に対する抗体を誘導することができる（図４、図６参照）。
本発明のワクチンは、被験者の脳内のミクログリアを活性化し、これによって変異型タウ蛋白質を貪食する。タウオパチーの原因物質である変異型タウ蛋白質がミクログリアによってクリアランスされることによって、該蛋白質の蓄積が阻害され、タウオパチーの症状の進行が抑制される。
本発明のワクチンは、タウオパチーモデルマウス（Ｐ３０１Ｓ  Ｔａｕトランスジェニックマウス）でのｉｎ  ｖｉｖｏ試験によって、タウオパチー、とりわけタウオパチー型認知症の改善作用を有することが明らかになった。すなわち、認知症で認められる記銘力低下や社交性の欠如が、本発明のワクチンを接種することによって改善されたが、この改善効果は組換え変異型タウ蛋白質を接種したときには認められなかったので、本発明のワクチンの優位性が確認された。また、本発明のワクチンは、組換え変異型タウ蛋白質と同様に、認知症でよく見られる多動（落ち着きのなさ）に対する改善効果が認められた。このように、本発明のワクチンは、認知症で認められる記銘力低下および／または社会的行動異常および／または不安様行動異常および／または記憶障害の改善効果を有する。
本発明のワクチンは、上記の効能を有するために、タウオパチー、とりわけアルツハイマー病、ＦＴＤＰ−１７（第１７番染色体に関連したパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症）、ダウン症候群、ピック病、パーキンソン認知症複合、神経原線維変化優位型認知症、ボクサー認知症、進行性核上性麻痺、嗜銀顆粒性認知症、大脳皮質基底核変性症、脳炎後パーキンソニズム、亜急性硬化性全脳炎、筋緊張性ジストロフィー、福山型筋ジストロフィー、グアム島筋萎縮性側策硬化症・パーキンソニズム複合、紀伊半島の神経原線維変化を伴う筋萎縮性側策硬化症などの疾患の予防または治療のために使用できる。
本発明のワクチンは、必要に応じて、薬学上許容される担体および添加剤、例えば生理食塩水、リンゲル液、緩衝液、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、保存剤などを含むことができる。また、免疫原性を高めるためのアジュバントをワクチンに添加してもよい。アジュバントとして、例えばアルミニウム塩（ａｌｕｍ）、サポニン類、ムラミル（ジ）ペプチド、サイトカイン類（ＩＬ−２，４，６、等）、コレラ毒素、サルモネラ毒素などの免疫促進剤が含まれる。
本発明のワクチンの接種は、皮下、皮内、鼻腔内、筋内、静脈内、腹腔内などの投与経路で行うことができる。好ましい製剤は、注射剤、吸入剤などである。吸入剤は、用量を量りとって吸入可能にする吸入装置内に封入されうる。投与量は、被験者（哺乳動物、好ましくは、ヒト）の症状、重症度、年齢、性別、体重などに応じて臨床医が適宜判断すべきであるが、ワクチンの形態や投与方法などにより変動し得るが、非限定的に、ウイルスベクターの場合、例えば１０４〜１０１４ｐｆｕ（プラーク形成単位）、好ましくは１０５〜１０１３ｐｆｕ、より好ましくは１０６〜１０１１ｐｆｕであるか、あるいは、１０５〜１０９ＣＩＵ（細胞感染単位）であるし、また、プラスミドベクターの場合、例えば約１μｇ〜５００μｇであり、いずれにしてもワクチン効果が発揮されるのであれば上記の範囲外であってもよい。
また、細胞膜の透過を促進するためにリポソームを利用することも可能である。リポソームとして好ましいものがカチオン性リポソームである。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡの細胞内送達を媒介することが示されている（Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：３８７（１９８９））。カチオン性リポソームはまた、膜透過性ペプチドを結合することによって細胞内送達を容易にすることができる。リポソームについては、例えばＢｒｉｇｈａｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８（１９８９）、Ｏｓａｋａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８５（６）：６１２−６１８（１９９６）、Ｓａｎら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４：７８１−７８８（１９９３）、Ｓｅｎｉｏｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１０７０：１７３−１７９（１９９１）、Ｋａｂａｎｏｖ  ａｎｄ  Ｋａｂａｎｏｖ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９５；６：７−２０、Ｒｅｍｙら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，５：６４７−６５４（１９９４）；Ｂｅｈｒ，Ｊ−Ｐ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，５：３８２−３８９（１９９４）、Ｗｙｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６：３００８−３０１７（１９９７）などの文献を参照することができる。
【実施例】
【０００８】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はそれらの実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］
変異型タウ遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターの構築
１）分泌シグナルシークエンスとタウ蛋白を発現するセンダイウイルスベクターの構築
分泌型シグナルシークエンスはアミロイド前駆蛋白（ＡＰＰ，Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＴ＿０１１５１２．１１，ＮＷ＿００１８３８７０６．１、ＮＭ＿２０１４１４．１，ＮＭ＿２０１４１３．１，ＮＭ＿０００４８４．２，ＮＭ＿００１１３６１３０．１，ＮＭ＿００１１３６１２９．１）を基に、以下の配列を用いた。
2011083881.tif 000003
変異型タウ蛋白（ＴａｕＰ３０１Ｓ）のｃＤＮＡはヒト１Ｎ４Ｒ型タウ蛋白（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００１１２３０６７．２）の塩基配列に変異が入ったもの［ＮＭ＿００１１２３０６７．２に記載のアミノ酸配列の２７２位（配列番号１の３０１位に相当する位置）のプロリン（Ｐ）のコドンからセリン（Ｓ）のコドンへの変異；配列番号１３の８８４〜８８６位のセリンコドン（ｔｃｇ）］を鋳型とし、以下のプライマーを用いＰＣＲにて増幅した。
2011083881.tif 000004
ＡＰＰ分泌シグナルとＰＣＲで増幅したタウ蛋白のｃＤＮＡを結合し、これを鋳型として以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
2011083881.tif 000005
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、次いでｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。
変異型タウ遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターの構築は、Ｌｉらの報告（Ｌｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７４．６５６４−６５６９（２０００）；ＷＯ  ００／７００７０）に記載の方法に準じて行った。Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（Ｚ株）のｃＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、分泌シグナルシークエンスと変異型タウ蛋白の結合フラグメントをセンダイウイルスヌクレオカプシド（ＮＰ）蛋白遺伝子の転写開始配列と翻訳領域の間の非翻訳領域に挿入することで、変異型タウ遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターを構築した。
なおコントロールとして用いる、ＥＧＦＰを発現するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターもｐＴＲＥＳ２−ＥＧＦＰ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）のＥＧＦＰ部分を用いて構築した。
２）変異型タウ遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターの再構成と増幅
Ｆ遺伝子を欠失したセンダイウイルスベクターの再構成は前出のＬｉらの報告（Ｌｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７４．６５６４−６５６９（２０００）；ＷＯ  ００／７００７０）を参考に実施した。該センダイウイルスベクターはＦ遺伝子欠失型であるため、Ｆ蛋白を発現するパッケージング細胞を使用し、変異型タウ遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（以下、「Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ」という。）及びＥＧＦＰ遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（以下、「Ｓｅｖ−ＧＦＰ」という。）を作製した。
［実施例２］
変異型タウ遺伝子を搭載したプラスミドベクターの構築
１）分泌シグナルシークエンスとタウ蛋白を発現するプラスミドベクターの構築
分泌シグナルシークエンスはＣＤ５９蛋白（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００１１２７２２７．１、ＮＭ＿００１１２７２２６．１、ＮＭ＿０００６１１．５、ＮＭ＿２０３３３１．２、ＮＭ＿００１１２７２２５．１、ＮＭ＿２０３３２９．２、ＮＭ＿２０３３３０．２、ＮＭ＿００１１２７２２３．１）の塩基配列のうち、以下の配列を用いた。
2011083881.tif 000006
変異型タウ蛋白（ＴａｕＰ３０１Ｓ）のｃＤＮＡはヒト１Ｎ４Ｒ型タウ蛋白（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００１１２３０６７．２）の配列に変異が入ったもの［ＮＭ＿００１１２３０６７．２に記載のアミノ酸配列の２７２位（配列番号１の３０１位に相当する位置）のプロリン（Ｐ）のコドンからセリン（Ｓ）のコドンへの変異；配列番号１２の８９８〜９００位のセリンコドン（ａｇｔ）］を鋳型とし、以下のプライマーを用いＰＣＲにて増幅した。なお、本プラスミドベクターに搭載した変異型タウは、センダイウイルスベクターに搭載した変異型タウと区別するために、異なったセリンコドンの配列を有するようにした。
2011083881.tif 000007
ＣＤ５９分泌シグナルとＰＣＲで増幅したとタウ蛋白のｃＤＮＡを結合し、これを鋳型として以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
2011083881.tif 000008
2011083881.tif 000009
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し、次いでｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチプルクローニングサイトを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し、それぞれの切断部位間に挿入した。
２）変異型タウ遺伝子搭載プラスミドベクターの増幅
プラスミドベクターの増幅はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社発行のｐｃＤＮＡ３．１製品取り扱い説明書を基に以下の要領で行った。大腸菌ＤＨ５α株をプラスミドベクターでトランスフォーメーションした。次にＬＢ−アンピシリン培地に播種し、単一クローン毎に少量培養を行って純粋化した。Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄプラスミド精製キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）にてプラスミドを抽出し、シークエンスを行い正しく複製されているかを確認し、有効なクローンを選択した。マウスに接種するプラスミドベクターの増幅は、選択したクローンの大量培養にて行い、プラスミドの抽出にはエンドトキシンフリーグレードのＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄプラスミド精製キットを用いた。
［実施例３］
変異型タウ遺伝子搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターによるインビボ試験
１）ＧＦＰ発現Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターのマウスへの経鼻投与
３か月齢のタウオパチーモデルマウス（Ｐ３０１Ｓ  Ｔａｕトランスジェニックマウス）（Ｙｏｓｈｉｙａｍａ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ  ５３，３３７−３５１（２００７）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｄｒ．Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉより供与）を用い、本発明のＧＦＰ搭載Ｆ遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（以下、「Ｓｅｖ−ＧＦＰ」という。）の経鼻投与を行い、感染効率の検討を行った。
マウス１匹あたり、Ｓｅｖ−ＧＦＰ  ５ｘ１０６ＣＩＵを投与し、１週間後鼻粘膜におけるＧＦＰの発現を多目的顕微鏡（ＢＺ−９０００，Ｋｅｙｅｎｃｅ）にて蛍光像と明視野像の撮影を行って解析した。
解析の結果、鼻粘膜の広い範囲にＧＦＰの発現が認められ、センダイウイルスベクターの経鼻投与が有効であることが確認された（図１）。
２）Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種によるリン酸化タウ蛋白発現抑制効果（その１）
Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ  ５×１０６ＣＩＵ／匹を３か月齢のタウオパチーモデルマウスに経鼻（鼻腔内）投与し、投与５カ月後で解剖し、海馬冠状の組織切片を調製した。コントロールワクチンとしてＳｅｖ−ＧＦＰを用いた。なお上記２つのグループでは、それぞれ１３頭、１１頭のタウオパチーモデルマウスへの接種を行った。
リン酸化タウの発現レベルを測定するために、海馬の組織切片において免疫染色を行った。マウス海馬冠状断面において抗リン酸化タウタンパク抗体（ＡＴ８，Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）を反応させ、洗浄後、２次抗体としてビオチン標識ウマ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いた免疫染色を行った。免疫染色後、海馬ＣＡ３領域において蓄積した領域の面積を多目的顕微鏡（ＢＺ−９０００，Ｋｅｙｅｎｃｅ）付属解析ソフトで測定した。Ｓｅｖ−ＧＦＰ群、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ群それぞれ平均値±標準誤差、統計学的解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。その結果、Ｓｅｖ−ＧＦＰ投与群に比べ、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ投与群では、海馬におけるリン酸化タウの発現の抑制が示唆された（図２）。
３）Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種によるリン酸化タウ蛋白発現抑制効果（その２）
Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ、もしくはＳｅｖ−ＧＦＰ接種によるタウ蛋白の発現抑制効果を、海馬由来の蛋白質を用いてウエスタンブロット法により解析を行った。
ウエスタンブロット法の方法は以下の通りである。ＲＡＢ−ＨＳバッファーにて海馬組織をホモジナイズ後、４℃，５０，０００×ｇ，４０分で遠心し、上清をＳＤＳ処理し、１サンプルあたり１５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動した。泳動後ＰＶＤＦ膜に転写し、抗リン酸化タウタンパク抗体（ＡＴ８，Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）を反応させ、洗浄後２次抗体としてＨＲＰ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、ＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による化学発光にて検出した。リン酸化タウ蛋白の評価後、Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｎａｋａｌａｉ）で抗体を剥離後、抗β−ａｃｔｉｎ抗体（ＳＩＧＭＡ）を用いて再度同様の方法で検出した。
蓄積したリン酸化タウタンパク量は、バンドの信号強度を画像解析ソフト（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ，Ｖｅｒ．１．６３，ＮＩＨ，ＵＳ）で測定し、内部コントロールタンパクであるβ−ａｃｔｉｎと信号強度の比をとって定量化した。コントロールワクチン（Ｓｅｖ−ＧＦＰ）接種群、タウワクチン（Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ）接種群それぞれ平均値±標準誤差、統計学的解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。その結果、Ｓｅｖ−ＧＦＰ接種群に比べ、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種群では、海馬におけるリン酸化タウの発現が抑制されていることが明らかになった（図３）。
４）海馬におけるリン酸化タウに反応する抗体の誘導
組織のタウに反応する血清中抗体価はＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを投与していないタウオパチーモデルマウス海馬組織に対する反応性で評価した。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１ＳまたはＳｅｖ−ＧＦＰ（各５×１０６ＣＩＵ／匹）を投与したマウスの血清をそれぞれ３０倍、１００倍、３００倍、１０００倍、３０００倍に希釈して４℃で一晩、タウオパチーモデルマウス海馬組織切片に反応させた後、Ａｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温、１時間で反応させて検出した。各マウスの抗体価は組織との反応が見られた最大希釈倍率で評価した。Ｓｅｖ−ＧＦＰ接種群、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種群それぞれ平均値±標準誤差、統計学的解析はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定で行った。
その結果、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種マウス由来の血清を反応させた場合、Ｓｅｖ−ＧＦＰを投与したマウス由来の血清と比べて海馬で反応する抗体価は有意に高かった。以上の結果から、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種することにより血清中に産生される抗体がリン酸化タウを発現する海馬に反応することが確認された（図４ａ，４ｃ）。
５）Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種による脳内のミクログリアの活性化
Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種による脳内の神経免疫担当細胞であるミクログリアの変化について確認するために実験を行った。
Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ  ５×１０６ＣＩＵ／匹を３カ月齢のタウオパチーモデルマウスに接種し、接種５カ月後脳組織を取り出し、海馬の組織切片を作成し、免疫染色を以下のように行った。
マウス海馬冠状断面において抗Ｉｂａ１抗体（ＷＡＫＯ）を４℃、一晩反応させ、洗浄後、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、また組織中マウスＩｇＧ検出のため、Ａｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を合わせて室温、１時間で反応させ、蛍光２重免疫染色で検出した。免疫染色後、海馬ＣＡ３領域を多目的顕微鏡（ＢＺ−９０００，Ｋｅｙｅｎｃｅ）にて蛍光像を撮影した。その結果、コントロールであるＳｅｖ−ＧＦＰ投与群に比べＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ投与群では、海馬においてＩｂａ１陽性細胞が数多く認められ、それらの陽性細胞の多くは抗マウスＩｇＧ抗体と共染色されていた。このＩｂａ１（Ｉｏｎｉｚｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｄａｐｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １）はミクログリアの活性化に伴いその発現量が増加することから、Ｉｂａ１はミクログリアの活性化に係る分子であることが報告されており（Ｉｔｏ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５７．１−９，１９９８）、さらにマウスＩｇＧが組織中のＴａｕＰ３０１Ｓを認識していると考えられることから、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓの接種にてミクログリアのＴａｕＰ３０１Ｓに対する反応が活性化したものと考えられた（図５）。
タウワクチン接種によるミクログリアの活性化上昇については、１）末梢血中においてマクロファージが抗原提示を受けて活性化し、血液脳関門を通過して脳に集まり活性化ミクログリアとなり、変異タウタンパク質を貪食している、あるいは２）変異タウタンパク質が血液脳関門を通過し、脳においてミクログリアが直接抗原提示を受けて活性化し、変異タウタンパク質を貪食している、可能性が示唆された。
６）リコンビナントリン酸化タウ蛋白を抗原としたＥＬＩＳＡ
Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種した結果、血清中に産生される抗体がリン酸化タウ特異的な抗体であるかを確認するために、リコンビナント変異型タウタンパク（ＴＡＵＰ３０１Ｓ）を抗原としたＥＬＩＳＡを行った。
リコンビナント変異型タウタンパクの作製は、坂上ら（Ｓａｋａｕｅ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０．３１５２２−３１５２９，２００５）の方法に基づき行った。具体的には、ＴａｕＰ３０１Ｓ（１Ｎ４Ｒ型）を組み込んだｐＲＫ１７２ベクターを大腸菌（ＢＬ２１−ＤＥ３株）に発現させ、菌体からホスホセルロースカラム（Ｐ１１）、５０％硫酸アンモニウム沈殿、熱処理、さらに逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥し４℃で保存した。
血清中の抗リン酸化タウ抗体の産生については、以下のＥＬＩＳＡ法により解析した。前述の方法で作製したリコンビナントＴＡＵＰ３０１Ｓタンパク（１μｇ／ｍｌ／ｗｅｌｌ）を９６ｗｅｌｌプレートに４℃、一晩で固相化させた。
血清は、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ、またはＳｅｖ−ＧＦＰを接種する直前、及び接種後１ヶ月目において、接種マウスから採取したものを５０倍希釈したものを用い、室温で２時間プレートに入れて反応させた。反応後、洗浄を経て、ＨＲＰ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、室温で１時間反応させた。反応後洗浄し、Ｏｐｔｉ−ＥＩＡＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ（ＢＤ）で発色させ、４５０ｎｍの波長での吸光度測定により定量化した。測定の陽性対照血清にはリコンビナントＴＡＵＰ３０１Ｓタンパクを皮下接種したマウス血清を用いて段階希釈し、血清原液での抗体力価を１，０００単位として作成した吸光度−単位間での検量線を用いて吸光度を単位へと変換した。このようにして求めたそれぞれのマウスの接種後の単位量により抗体価の上昇を評価した。このＥＬＩＳＡの結果、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種することにより血清中に抗リン酸化タウ抗体が多く産生されることが確認できた（図６ａ）。
リコンビナントタンパクを接種したマウスにおいてタウ特異的な抗体産生が顕著なのは接種してから間もない時期における血中に存在する変異型タウタンパク質の量が多く、変異型タウタンパク質に曝露される抗原提示細胞の数が多いためと考えられた。
また脳脊髄液中のリン酸化タウ蛋白の量は、以下の方法により測定した。
９６ｗｅｌｌプレートは、あらかじめ３μｇ／ｍｌ抗リン酸化抗体（ＡＴ８抗体）にて４℃で一晩コーティング処理しておく。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ、またはＳｅｖ−ＧＦＰを接種したマウスから採取した脳脊髄液（ＣＳＦ）を５０倍希釈し、各ｗｅｌｌに加え反応させた。陽性対照として、１４カ月齢のタウオパチーモデルマウスの脳をホモジナイズし得られた液を１００〜１０２４００倍に段階希釈したものを用いた。２次抗体として、ウサギ抗ヒトタウタンパク抗体、その後ペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗ウサギＩｇＧＦ（ａｂ’）２抗体を反応させ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  Ｂｅｎｚｉｄｏｎｅ液を用いて発色させた。
４５０ｎｍの吸光度は自動プレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ  ３５３；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｊａｐａｎ）により計測した。その結果、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種したタウオパチーモデルマウスの脳脊髄液中にリン酸化タウタンパクが高濃度に認められた（図６ｂ）。
７）マウス行動解析
すべての行動実験は京都大学医学研究科動物実験委員会（京都、日本）より承認を受けた上で行った。本実験で使用したタウオパチーモデルマウス（Ｐ３０１Ｓ  Ｔａｕトランスジェニックマウス）にタウワクチンを投与することにより、認知症患者で認められる行動学的異常（記銘力低下、社交性の欠如、不安様行動、多動、活動量、空間学習、参照記憶、感覚中枢、聴力等）の改善効果を以下の方法にて評価した。
（１）タウオパチーモデルマウスへのＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種による新奇環境下での社会的行動テスト（Ｓｏｃｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）
Ｓｏｃｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔは新奇場面での行動評価に用いられるテストである。
Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種（５×１０６ＣＩＵ／匹）したタウオパチーモデルマウス、またはＳｅｖ−ＧＦＰを接種（５×１０６ＣＩＵ／匹）したタウオパチーモデルマウスを接種後３カ月目に、これまで同じケージにいたことのないマウスと１匹ずつ１つの箱（４０×４０×３０ｃｍ）の中に入れて、１０分間自由に探索させた。社会的行動はＣＣＤカメラ（Ｓｏｎｙ  ＤＸＣ−１５１Ａ）を通じてモニターされ、画像をコンピューターに取り込みＩｍａｇｅ  ＳＩソフトウェアを用いて自動的に、接触回数、１接触あたりの平均時間、移動距離を測定した。解析を行ったところ、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種したタウオパチーモデルマウスは、Ｓｅｖ−ＧＦＰが投与されたタウオパチーモデルマウスに比べ、見知らぬマウスに対し接触した時間が長かった。この解析により、社会的行動、また新たなマウスの出現に対する対応能力の改善効果が認められた（図７Ａ）。
（２）タウオパチーモデルマウスへのＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種による社会的行動測定テスト（Ｃｒａｗｌｅｙ  ｖｅｒｓｉｏｎ）
社会的行動測定テスト（Ｃｒａｗｌｅｙ’ｓ  ｓｏｃｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）は別々のマウスに対する記銘力、社会的関係の形成、社交性の評価に用いられるテストである。
装置は、パネルにより３つの空間に仕切られており、両端の空間の一隅には小さなかごがそれぞれ１つずつ設定されている。これまで同じケージにいたことのないマウスをかごの中に入れ、その後Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ（５×１０６ＣＩＵ／匹）またはＳｅｖ−ＧＦＰを（５×１０６ＣＩＵ／匹）タウオパチーモデルマウスに接種し、接種後３カ月目のマウスをかごの外におき、１０分間の間そのまま放置した。１０分後、他方のかごに別のこれまで同じケージにいたことのないマウスを入れた後、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種、あるいはＳｅｖ−ＧＦＰ接種タウオパチーモデルマウスが既に１０分間いたマウス（Ｆａｍｉｌｉａｒ  Ｓｉｄｅ）、新しくきた見知らぬマウス（Ｓｔｒａｎｇｅｒ  Ｓｉｄｅ）のどちらのマウスの近傍に長く滞在するか、滞在時間を測定することで社会的行動の評価を行った。
その結果、Ｓｅｖ−ＧＦＰ接種タウオパチーモデルマウスでは、Ｆａｍｉｌｉａｒ  Ｓｉｄｅでの滞在時間が長かったのに比べ、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種したタウオパチーモデルマウスは、Ｓｔｒａｎｇｅｒ  Ｓｉｄｅでの滞在時間が長く、社会的行動、また別々のマウスに対する記銘力の改善効果が認められた（図７Ｂ）。
（３）タウオパチーモデルマウスへのＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種による高架式十字型迷路テスト
高架式十字型迷路は不安様行動を評価するための装置であり、同じ大きさの２つのオープンアームと高さ１５ｃｍの透明な壁がついた２つのクローズドアームで構成されている。クローズドアームには高さ１５ｃｍの透明な壁が付けられている。
アームおよび中心の正方形の部分は白いプラスチック板で出来ており、床から５０ｃｍの高さに位置している。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ（５ｘ１０７ＣＩＵ／匹，１週間毎に計３回）を接種したタウオパチーモデルマウスまたは同力価のＳｅｖ−ＧＦＰをタウオパチーモデルマウスに接種し、接種後３カ月目のマウスをそれぞれ迷路中心の正方形の部分（５×５ｃｍ）に、クローズドアームの方を向くように置いて、１０分間行動を記録した。迷路中心から各４方向へのすべての出入り回数（Ａ）、柵のない方向への出入りの回数の割合（Ｂ）、マウスの総移動距離（Ｃ）、柵のない場所への滞在時間の割合（Ｄ）をＩｍａｇｅ  ＥＰソフトウェアを用いて自動的に計測した。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種したタウオパチーモデルマウスは、柵のない場所への滞在時間が有意に少なくなっており、不安様行動、また落下の危険に対する判断力の改善が認められた（図８Ｄ）。
（４）タウオパチーモデルマウスへのリコンビナントタウ蛋白接種によるオープンフィールド試験
オープンフィールド試験は、活動量や情動性を測定するためのテストである。
リコンビナントタウ蛋白（ＴＡＵＰ３０１Ｓ）１００μｇ／匹／回、２週間毎に計３回Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓアジュバント（Ｇｅｎｔａｕｒ社）とともにタウオパチーモデルマウスに皮下接種し、接種後１カ月目にオープンフィールド試験を行った。接種マウスを高さ３０ｃｍの柵がついた４０ｃｍ四方のオープンフィールド試験用装置（Ａｃｃｕｓｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にマウスを入れ、１２０分間の自由行動を５分間毎に区切って移動距離（Ａ）、背伸びの回数（Ｂ）、フィールド中央での滞在時間（Ｃ）、常同性行動（Ｄ）を評価した。ＴＡＵＰ３０１Ｓを接種したタウオパチーモデルマウスは有意に移動距離が短くなっており、多動（落ち着きのなさ）の改善効果が認められた（図９Ａ）。
（５）タウオパチーモデルマウスへのリコンビナントタウ蛋白接種による高架式十字型迷路テスト
リコンビナントタウ蛋白（ＴＡＵＰ３０１Ｓ）１００μｇ／匹／回、２週間毎に計３回Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓアジュバント（Ｇｅｎｔａｕｒ社）とともにタウオパチーモデルマウスに皮下接種し、接種後１カ月目に高架式十字型迷路の解析を行った。接種マウスを、それぞれ迷路中心の正方形の部分（５×５ｃｍ）に、クローズドアームのほうを向くように置いて、１０分間行動を記録した。中央から各４方向へのすべての出入り回数（Ａ）、柵のない方向への出入りの回数の割合（Ｂ）、マウスの総移動距離（Ｃ）、柵のない場所への滞在時間の割合（Ｄ）をＩｍａｇｅ  ＥＰソフトウェアを用いて自動的に計測した。ＴＡＵＰ３０１Ｓを接種したタウオパチーモデルマウスは、コントロール（アジュバント投与）のマウスの結果にくらべて、高架式十字型迷路解析においては大きな違いは認められなかった（図１０）。
（６）タウオパチーモデルマウスへのＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓ接種によるオープンフィールド試験
ｃＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓを１００μｇ／匹／回、毎週計６回、次いで２週間毎に計３回、合計９回、開始の時点で５ヶ月齢のタウオパチーモデルマウス左後肢大腿筋に筋肉内接種し、接種後１カ月目にオープンフィールド試験を行った。接種マウスを高さ３０ｃｍの柵がついた４０ｃｍ四方のオープンフィールド試験用装置（Ａｃｃｕｓｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にマウスを入れ、１２０分間の自由行動を５分間毎に区切って移動距離（Ａ）、背伸びの回数（Ｂ）、フィールド中央での滞在時間（Ｃ）、常同性行動（Ｄ）を評価した。ｃＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓを接種したタウオパチーモデルマウスは移動距離が短くなっていることが明らかになり、多動（落ち着きのなさ）の改善効果が認められた（図１１Ａ）。
（７）タウオパチーモデルマウスへのｃＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓ接種による新奇環境下での社会的行動テスト
ｃＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓを１００μｇ／頭／回、毎週計６回、次いで２週間毎に計３回、合計９回、開始の時点で５ヶ月齢のタウオパチーモデルマウス左後肢大腿筋に筋肉内接種し、接種後１カ月目にこれまで同じケージにいたことのないマウスと１匹ずつ１つの箱（４０×４０×３０ｃｍ）の中に入れて、１０分間自由に探索させた。社会的行動はＣＣＤカメラ（Ｓｏｎｙ  ＤＸＣ−１５１Ａ）を通じてモニターされ、画像をコンピューターに取り込みＩｍａｇｅ  ＳＩソフトウェアを用いて自動的に、接触回数、１接触あたりの平均時間、移動距離を測定した。解析を行ったところ、ｃＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓを接種したタウオパチーモデルマウスは、コントロールであるｐｃＤＮＡ３．１（ＡＴＧ−）（以下ｃＤＮＡ−Ｅｍｐｔｙ）を接種したタウオパチーモデルマウスに比べ、見知らぬマウスに対し接触した時間が有意に短く（ｐ＝０．０１６４，Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）なっていた（図１２Ａ）。また、ｃＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓを接種したタウオパチーモデルマウスは、ｃＤＮＡ−Ｅｍｐｔｙを接種したタウオパチーモデルマウスに比べ、移動距離も短くなっていた。（図１２Ｂ）。結果として、オープンフィールド試験と同様にｃＤＮＡ−Ｔａｕ  Ｐ３０１Ｓ接種により多動に対する改善が認められた。
（８）タウオパチーモデルマウスへのＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種によるバーンズ迷路試験
バーンズ迷路試験は、空間学習や参照記憶を調べるためのテストである。１枚の円状の板の上に１２個の穴があいており、そのうちの１個のみの穴の下に暗箱がおいてある。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ（５×１０６ＣＩＵ／匹）またはＳｅｖ−ＧＦＰを（５×１０６ＣＩＵ／匹）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスに接種し、接種後４カ月目において本テストを行った。まず一定期間マウスに暗箱の空間的位置を記憶させるよう訓練し（トレーニング期間）、トレーニング終了後２４時間経過後、（暗箱がおいてあった）ターゲットの穴の周辺に滞在する時間により空間学習や参照記憶を評価（プローブ試験）した。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種により、タウオパチーモデルマウスにおいて、ターゲットにたどりつくまでの時間が減少し（図１５Ｂ）、さらにターゲットの穴の周辺に滞在する時間が長くなった（図１５Ｃ）ことから、改善効果が確認された。
（９）タウオパチーマウスへのＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種による恐怖条件付け試験
恐怖条件付け試験は文脈記憶や注意能力を測定するためのテストである。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ（５×１０６ＣＩＵ／匹）またはＳｅｖ−ＧＦＰを（５×１０６ＣＩＵ／匹）タウオパチーマウス及び野生型マウスに接種し、接種後４カ月目においてテストを行った。箱に入れたマウスに対し電気ショックを加え、その電気ショックを体験した同じ箱で別の刺激（例えば音）を与え、一定の時間経過後、同じ箱にマウスをいれること、あるいは別の箱に入れて同じ音による刺激を行うことによりフリージング（すくみ行動）という現象がマウスに起きることがある。このフリージングの出現率により文脈記憶や注意能力を評価した。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種により、タウオパチーモデルマウスにおいて、フリージングの出現率が減少し、改善効果が認められた（図１６Ｃ）。
（１０）タウオパチーモデルマウスへのＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種による身体測定
Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ（５×１０６ＣＩＵ／匹）またはＳｅｖ−ＧＦＰを（５×１０６ＣＩＵ／匹）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスに接種し、接種後１カ月目において体重、体温、握力、ワイヤに掴まっている時間に関する測定を行った結果を図１７に示す。各グループにおける優位差は認められなかった。
（１１）タウオパチーモデルマウスへのＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種による社会的行動測定試験
社会的行動測定試験は被験マウス２匹を箱の中に入れて、１０分間の接触回数や接触持続時間、マウスの移動距離などを測定社会的行動を測定するテストである。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ（５×１０６ＣＩＵ／匹）またはＳｅｖ−ＧＦＰを（５×１０６ＣＩＵ／匹）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスに接種し、接種後２カ月目において本テストを行った。その結果、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種タウオパチーモデルマウスにおいて、接触回数の増加（図１８Ｂ）、活発な接触の持続時間の延長（図１８Ｃ）、及び総移動距離の増加（図１８Ｅ）において改善効果が認められた。
（１２）タウオパチーモデルマウスへのＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種によるプレパルス抑制テスト
プレパルス抑制テストは感覚中枢や聴力、（刺激に対して）跳びあがる反応などの評価を行うテストである。Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓを接種（５×１０６ＣＩＵ／匹）したタウオパチーモデルマウス及び野生型マウス、またはＳｅｖ−ＧＦＰ（５×１０６ＣＩＵ／匹）を接種したタウオパチーモデルマウス及び野生型マウスについて、接種後３カ月目にプレパルス抑制テストを行った。
その結果、Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種によるフリージング抑制効果も認められず、各グループ間で優位な差は認められなかった（図１９）。
（１３）タウオパチーモデルマウスへのＳｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ接種によるオープンフィールド試験
Ｓｅｖ−ＴａｕＰ３０１Ｓ（５×１０６ＣＩＵ／匹）またはＳｅｖ−ＧＦＰを（５×１０６ＣＩＵ／匹）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスに接種し、接種後１カ月目にオープンフィールド試験を行った。（Ａ）は総移動距離、（Ｂ）は垂直方向の活動量、（Ｃ）は中心部での滞在時間、（Ｄ）常同行動回数を示す。
各グループ間で優位な差は認められなかった（図２０）。
（１４）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスにおけるオープンフィールド試験
野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスに対し、オープンフィールドテストを行った。（Ａ）は総移動距離、（Ｂ）は垂直方向の活動量、（Ｃ）は中心部での滞在時間、（Ｄ）は常同行動回数を示す。
タウオパチーモデルマウスは、野生型マウスと比較し総移動距離が長く（Ａ）、垂直方向の運動量が多く（Ｂ）、中心部に滞在する時間（Ｃ）が長かった。常同行動回数（Ｄ）は優位な差は認められなかった（図２１）。
（１５）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスにおける高架式十字迷路テスト
タウオパチーマウス、または野生型マウスに高架式十字迷路テストを行った。
その結果、タウオパチーマウスにおいて、柵のないオープンアームに侵入した割合（Ｂ）と柵のないオープンアームに滞在する時間（Ｄ）が野生型マウスに比べ優位に高い値を示した（図２２）。
（１６）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスにおけるプレパルス抑制テスト
タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスにおけるプレパルス抑制テストを行った。タウオパチーモデルマウスは、野生型マウスに比べ、音に対する驚愕反応が低かったが（図２３Ａ）、事前に小さな音をならした後大きな音を鳴らすことで驚愕反応の抑制の割合が高い値を示した（図２３Ｂ）。
（１７）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスの脳組織におけるタウ蛋白の発現
タウオパチーモデルマウスと野生型マウスの脳組織におけるタウタンパク質の発現レベルの比較を病理組織学的に検討した。
タウの凝集像や封入は認められなかったものの、タウオパチーマウスの脳組織において野生型マウスに比べ、リン酸化タウタンパク質が顕著に認められた（図２４）。リン酸化タウが多く認められた帯状回皮質、大脳皮質扁桃核、海馬などは不安障害に関連し、海馬は記憶障害に関連するとされていることから、これらの組織にリン酸化タウが蓄積することにより、行動異常を呈するのではないかと示唆された。
（１８）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスにおける身体測定
１３週齢のタウオパチーモデルマウス及び野生型マウスにおける一般的身体測定を行った。
（Ａ）は体重、（Ｂ）は直腸温、（Ｃ）は握力、（Ｄ）はワイアハングテストの結果を示す。
タウオパチーモデルマウスと野生型マウスの間に優位な差は認められなかった（図２５）。
（１９）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスにおける社会行動測定テスト（新奇場面）
タウオパチーマウス、または野生型マウスに社会行動測定テストを行った。
社会行動測定テストの結果、タウオパチーモデルマウスと野生型マウスとの間に優位な差は認められなかった（図２６）。
（２０）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスにおける恐怖条件付け試験
野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスに対し、恐怖条件付け試験を行った。タウオパチーモデルマウスにおいてフリージングの出現率が野生型マウスに比べ低い値を示したが、全体的には大きな優位差はなかった（図２７）。
（２１）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスにおけるバーンズ迷路試験
野生型マウス及びタウオパチーモデルマウスに対し、バーンズ迷路試験を行った。図２８の（Ａ）〜（Ｃ）は訓練期間での結果を示す。図２８の（Ｄ）は訓練後２４時間経過後のプローブテストを示す。
訓練期間中では、タウオパチーモデルマウスと野生型マウスの間に優位な差は認められなかった（図２８Ａ−Ｃ）。
Ｐｒｏｂｅテストにおいて、タウオパチーモデルマウスと野生型マウスとの間にターゲットの隣の穴周辺及びターゲットの穴周辺での滞在時間がタウオパチーモデルマウスのほうが短かった（図２８Ｄ）。
（２２）タウオパチーモデルマウス及び野生型マウスの脳組織におけるタウタンパク質の発現
タウオパチーモデルマウスと野生型マウスの脳組織におけるタウタンパク質の発現レベルの比較を病理組織学的に検討した。
タウタンパク質の凝集像や封入体は認められなかったものの、野生型マウスに比べタウオパチーマウスの脳組織においてリン酸化タウタンパクが顕著に認められた（図２４）。リン酸化タウが多く認められた帯状回皮質、大脳皮質扁桃核、海馬などは不安障害に関連し、海馬は記憶障害に関連するとされていることから、これらの組織にリン酸化タウタンパク質が蓄積することにより、行動異常を呈するのではないかと示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明のワクチンは、タウ蛋白質が中枢神経系に異常に蓄積して起こる疾患（タウオパチー）の症状のなかで、とりわけタウオパチー型認知症の改善に有効であることから、医療上有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００１０】
配列番号４〜１１  プライマー
配列番号１２，１３  合成ＤＮＡ
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１４】
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【図２４】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年6月17日(2011.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌シグナル配列に連結された変異型タウ蛋白質をコードする核酸を含むベクターを有効成分として含むタウオパチー型認知症の予防または治療用ワクチンであって、該変異型タウ蛋白質が、タウ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の２５７位、２６０位、２６６位、２７２位、２７９位、２８０位、２８４位、２９６位、３０１位、３０３位、３０５位、３１５位、３１７位、３２０位、３３５位、３３６位、３３７位、３４２位、３５２位、３６９位、３８９位および４０６位からなる群から選択される少なくとも１つの位置に相当する位置のアミノ酸残基の変異を含むものであり、および、該ベクターが被験者において変異型タウ蛋白質の直接投与と比べてより持続的にタウ蛋白質に対する抗体を誘導することができる、前記ワクチン。
【請求項２】
前記変異が、Ｋ２５７Ｔ、Ｉ２６０Ｖ、Ｌ２６６Ｖ、Ｇ２７２Ｖ、Ｎ２７９Ｋ、Ｋ２８０Δ、Ｌ２８４Ｌ、Ｎ２９６Δ、Ｎ２９６Ｈ、Ｐ３０１Ｌ、Ｐ３０１Ｓ、Ｇ３０３Ｖ、Ｓ３０５Ｎ、Ｌ３１５Ｒ、Ｋ３１７Ｍ、Ｓ３２０Ｆ、Ｇ３３５Ｓ、Ｇ３３５Ｖ、Ｑ３３６Ｒ、Ｖ３３７Ｍ、Ｅ３４２Ｖ、Ｓ３５２Ｌ、Ｋ３６９Ｉ、Ｇ３８９ＲおよびＲ４０６Ｗ（ここでΔは欠失である。）からなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
前記変異が、少なくともＰ３０１Ｌ、Ｐ３０１ＳまたはＰ３０１Ｔの変異を含む、請求項１または２記載のワクチン。
【請求項４】
前記分泌シグナル配列が、アミロイド前駆蛋白質シグナル配列またはＣＤ５９シグナル配列である、請求項１〜３のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項５】
前記ベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項１〜４のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項６】
前記ベクターがプラスミドベクターである、請求項１〜４のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項７】
鼻腔内投与用に製剤化されている、請求項１〜６のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
被験者において社会的行動異常、不安様行動異常および記憶障害の少なくとも１つの症状の改善作用を有する、請求項１〜７のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項１０】
ワクチンが被験者の脳内のミクログリアを活性化し、これによって変異型タウ蛋白質の蓄積を抑制する作用を有する、請求項１〜７、９のいずれか１項記載のワクチン。
【請求項１１】
タウ蛋白質はリン酸化されている、請求項１〜７、９、１０のいずれか１項記載のワクチン。
【国際調査報告】
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