(57)【要約】  生体へ安全に適用可能な、ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素生成を効果的に調節するための新規な一酸化窒素生成調節剤を提供することを課題とし、下記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素を有効成分とする一酸化窒素生成調節剤を提供することにより解決する。【化１】  一般式１2012014805.tif 000023（一般式１においてＲは分岐を有することある炭素数が２乃至４のアルキル基を表し、Ｘ−は適宜の対アニオンを表す。）
2012014805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分である一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素とともに、製剤学的に許容される１種又は２種以上の他の成分を含んでなる一酸化窒素生成調節剤。
【化１】
2012014805.tif 000017
（一般式１においてＲは分岐を有することある炭素数が２乃至４のアルキル基を表し、Ｘ−は適宜の対アニオンを表す。）
【請求項２】
一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素において対アニオンが、ヨウ素アニオン又は塩素アニオンである請求の範囲第１項記載の一酸化窒素生成調節剤。
【請求項３】
一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素が、化学式１乃至５のいずれかである請求の範囲第２項記載の一酸化窒素生成調節剤。
【化２】
2012014805.tif 000018
【化３】
2012014805.tif 000019
【化４】
2012014805.tif 000020
【化５】
2012014805.tif 000021
【化６】
2012014805.tif 000022
【請求項４】
用時に溶解して用いる形態の製剤である請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の一酸化窒素生成調節剤。
【請求項５】
経口投与又は注射投与形態である請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の一酸化窒素生成調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三核型ペンタメチン系シアニン色素の用途に関わるものであり、詳細には、三核型ペンタメチン系シアニン色素とともに、製剤学的に許容される１種又は２種以上の他の成分を含んでなる一酸化窒素生成調節剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素（ＮＯ）は、生体内の種々の生理学的反応において重要な役割を果たしていることが知られている（例えば、国際公開ＷＯ９５／０３１９８７号パンフレット参照）。具体的には、例えば、血管の平滑筋系に対する弛緩作用による血圧調整に関わる機能、血小板凝集阻害作用により血液凝固を抑制する作用などである。他にも炎症過程および活性化されたマクロファージの細胞毒性活性の因子としても重要な役割を担っている。生体内の一酸化窒素バランスの異常は重篤な疾患や障害を生ずる。すなわち敗血症性または出血性ショックでの過剰な一酸化窒素生成は病理学上の大きな血圧低下を惹起させる。さらに、一酸化窒素の濃度低下により直接または間接的に惹起される疾患の例としては動脈性高血圧症、鬱血性疾患、心臓疾患がある。【０００３】
上記以外にも生体内の一酸化窒素のバランス異常が関与する疾患や障害としては、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、潰瘍性大腸炎、臓器移植後の組織障害、移植拒絶反応、ウイルス感染などによる心筋炎および心筋症、糸球体腎炎をはじめとする腎炎、膵炎、老化などの炎症性疾患、動脈硬化症、虚血後の心臓などの血管内皮（微小血管内皮を含む）損傷などが知られている。【０００４】
一酸化窒素の生体における役割が明らかになり、その局所或いは全身におけるバランスの異常と各種疾患との関係が明らかになるにつれ、生体内の一酸化窒素の生成を抑制し、一酸化窒素のバランス異常に起因する上記のような疾患を予防、治療するために、プテリジン誘導体（国際公開ＷＯ９５／０３１９８７号パンフレット、特表平１０−５０４０２３号公報）、縮合ピペリジン化合物（特表平１１−１７１８６６号公報）、シクロアルケン誘導体（特開２００５−２３２１６８号公報）、ロキソプロフェン（特開２００７−２８４４２４号公報）等の化合物やモモタマナ処理物（特開２００５−５３８６４号公報）のような植物由来の成分などを有効成分とする、一酸化窒素のバランス異常が関与する疾患や障害の予防剤や治療剤が種々提案されている。しかしながら、これらの化合物の多くは未だ実用化されていないのが現状である。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、生体へ安全に適用可能な、ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素生成を効果的に調節するための新規な一酸化窒素生成調節剤を提供することを課題とする。
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために、ポリメチン系シアニン色素に着目し、鋭意研究し、検索したところ、下記一般式１で表されるキノリン骨格を有する三核型ペンタメチン系シアニン色素が、ミクログリア細胞からの一酸化窒素生成を調節する作用を有することを見いだし、しかも、斯かるシアニン色素は生体へ直接適用しても毒性や重篤な副作用を示さないことを確認し本発明を完成した。すなわち、本発明は、下記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素を有効成分とする一酸化窒素生成調節剤を主な構成とする。
【０００７】
【化１】
2012014805.tif 000003
（一般式１においてＲは分岐を有することある炭素数が２乃至４のアルキル基を表し、Ｘ−は適宜の対アニオンを表す。）
【０００８】
前記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素を有効成分とする本発明の一酸化窒素生成調節剤は、非経口或いは経口投与することにより、ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素生成を調節し、一酸化窒素のバランス異常を整えることができる。しかも、有効成分である一般式１で表される色素の安全性は極めて高い。さらに、本発明の一酸化窒素生成調節剤は、一酸化窒素生成のバランス異常により引き起こされる病理学上の血圧低下、心筋炎等の炎症をはじめとする種々の重篤な炎症性疾患や心臓などの血管組織（微小血管内皮を含む）などの組織や細胞の障害、動脈性高血圧症、鬱血性疾患などの予防乃至治療に有用と推定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
上記のとおり本発明は上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素を有効成分とする一酸化窒素生成調節剤に関するものである。三核型ペンタメチン系シアニン色素自体は、公知の物質で（例えば、特開平１１−３２２６０３号公報及び特開２００３−１３７７８４号公報参照）、創傷治癒や細胞の賦活などの作用があることが知られている（例えば、速水正明監修、『感光色素』、１９９７年１０月１７日、産業図書株式会社発行、２４乃至３０頁及び１３８乃至１５４頁参照）。しかしながら、これらの文献には、三核型ペンタメチン系シアニン色素が、ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素生成を調節する作用があることを教示したり示唆する記載は存在せず、一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素を有効成分として含有する一酸化窒素生成調節剤は、本発明者により初めて見出されたものである。【００１０】
本発明の一酸化窒素生成調節剤は、上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素を有効成分とする。一般式１におけるＲで表されるアルキル基は炭素数が２乃至４であり、具体的には、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基である。ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素生成を調節する作用の強さの点では、一般式１におけるＲで表されるアルキル基の炭素数が２、又は、アルキル基が直鎖状でありその炭素数が３の三核型ペンタメチン系シアニン色素がより好ましく、アルキル基（Ｒ）の炭素数が２の色素が特に好ましい。ちなみに、後述する実験に示すとおり、アルキル基（Ｒ）の炭素数が１または６の三核型ペンチメチン系シアニン色素は、ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素生成に対し有意な調節作用を示さない。【００１１】
一般式１におけるＸ−は適宜の対アニオンを表し、通常、例えば、弗素アニオン、塩素アニオン、臭素アニオン、沃素アニオン、過塩素酸アニオン、過沃素酸アニオン、六弗化燐酸アニオン、六弗化アンチモン酸アニオン、六弗化錫酸アニオン、燐酸アニオン、硼弗化水素アニオン、四弗硼素酸アニオンなどの無機酸アニオンや、チオシアン酸アニオン、ベンゼンスルホン酸アニオン、ナフタレンスルホン酸アニオン、ナフタレンジスルホン酸アニオン、ｐ−トルエンスルホン酸アニオン、アルキルスルホン酸アニオン、ベンゼンカルボン酸アニオン、アルキルカルボン酸アニオン、トリハロアルキルカルボン酸アニオン、アルキル硫酸アニオン、トリハロアルキル硫酸アニオン、ニコチン酸アニオン、アスパラギン酸アニオンなどの有機酸アニオンから選択される。本発明の一酸化窒素調節剤によるミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素生成を調節する作用は、基本的には、有効成分である一般式１で表されるアルキル基（Ｒ）の炭素数が２乃至４の三核型ペンタメチン系シアニン色素のカチオン部分に依存するので、その対アニオンは生体に直接適用できるものであれば特に制限はないが、その作用の強さの点でより好ましいのはヨウ素アニオン及び塩素アニオンであり、ヨウ素アニオンが特に好ましい。一般式１で表されるアルキル基（Ｒ）の炭素数が２乃至４の三核型ペンタメチン系シアニン色素の場合、対アニオンが塩素アニオンの色素はヨウ素アニオンの色素と比較すると、水性媒体への溶解性に優れているので、経口投与の形態で用いる場合、生体内への吸収性、吸収速度の点で優れている。【００１２】
本発明の一酸化窒素生成調節剤の有効成分としては、具体的には、下記化学式１乃至８で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素を例示することができる。また、化学式４及び５で表される色素とカチオン部分が同一で、対アニオンをヨウ素アニオンから塩素アニオンに置換した化合物であってもよい。ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素生成を調節する作用の強さの点では、化学式１又は２で表される色素が好ましく、化学式１で表される色素が特に好ましい。【００１３】
【化２】
2012014805.tif 000004
【００１４】
【化３】
2012014805.tif 000005
【００１５】
【化４】
2012014805.tif 000006
【００１６】
【化５】
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【００１７】
【化６】
2012014805.tif 000008
【００１８】
【化７】
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【００１９】
【化８】
2012014805.tif 000010
【００２０】
【化９】
2012014805.tif 000011
【００２１】
本発明でいう一酸化窒素生成調節とは、ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素の生成が亢進し局所或いは全身の一酸化窒素のバランス異常が生じた場合、一酸化窒素の生成を抑制し一酸化窒素量を正常レベルにまで低下させること、又は、ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素の生成が低下し局所或いは全身の一酸化窒素のバランス異常が生じた場合、一酸化窒素の生成を亢進し一酸化窒素量を正常レベルにまで上昇させることを意味する。【００２２】
次に、この発明による一酸化窒素生成調節剤の用途について説明するに、既述のとおり、本発明の有効成分である三核型ペンタメチン系シアニン色素は、ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素の生成を調節する性質を具備し、生体へ直接適用しても毒性や重篤な副作用を示さないことから、生体に直接適用し、ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素の生成の調節に用いることができる。本発明の一酸化窒素生成調節剤は、生体に適用すると、一酸化窒素の生成を調節し、そのバランス異常を整えることができるので、一酸化窒素のバランス異常により引き起こされるとされる諸種の疾患や障害の予防乃至治療に有効と推定される。【００２３】
本発明でいう生体内の一酸化窒素のバランス異常により引き起こされるとされる諸種の疾患や障害とは、具体的には、例えば、敗血症または出血性ショック、サイトカインによる悪性新生物の治療または肝硬変などによる病理学上の血圧低下症、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、潰瘍性大腸炎、臓器移植後の組織障害、移植拒絶反応、動脈硬化症、ウイルス感染などによる心筋炎および心筋症、糸球体腎炎をはじめとする腎炎、膵炎、火傷などの炎症性疾患、ウイルス感染、細胞障害性因子や炎症反応などによる血管内皮（微小血管内皮を含む）などの組織損傷や細胞障害（細胞死）、動脈性高血圧症、鬱血性疾患、心臓疾患などを挙げることができる。【００２４】
本発明の一酸化窒素生成調節剤は、生体内の一酸化窒素のバランス異常の程度に応じ、毎日乃至一日以上の間隔をおいて、一日に一回乃至複数回に分け、一日あたりの所定量を投与すればよい。一日当たりの投与量は、本発明の所期の作用効果が得られる量であれば特に制限はなく、通常、静脈内投与（点滴を含む）、皮下、皮内乃至腹腔内投与の場合、上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素を合計で、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日以上が望ましく、０．１乃至２０ｍｇ／ｋｇ体重／日がより望ましく、０．５乃至５ｍｇ／ｋｇ体重／日が特に望ましい。０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日より少ない投与量では、所期の効果が認められない場合がある。また、２０ｍｇ／ｋｇ体重／日以上投与しても、その投与量に見合うほどの効果の増強は認められない場合がある。経口投与の場合、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日以上が望ましく、０．５乃至１００ｍｇ／ｋｇ体重／日がより望ましく、０．５乃至５０ｍｇ／ｋｇ体重／日が特に望ましい。なお、本発明の一酸化窒素生成調節剤を経口用剤の形態で用いる場合、本発明の所期の効果を得るためには、本発明で用いる三核型ペンタメチン系シアニン色素が皮下や腹腔内投与に比較し生体内への吸収性が低いことを考慮し、前記皮下や腹腔内への投与量よりも投与量を増やす必要がある。さらに、経口用剤の場合、一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素の対アニオンが塩素アニオンの色素とヨウ素アニオンの色素の場合とでは、生体内への吸収性やミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素の生成の調節作用の強さに差があることを勘案し、その投与量を調節すればよい。また、本発明の一酸化窒素生成調節剤の投与期間は、一酸化窒素のバランス異常の程度に応じ調整すればよく、急性の場合、生体内の一酸化窒素のレベルが低下するまで、或いは、一酸化窒素のバランス異常が原因と推定される症状が改善乃至消失するまで投与すればよく、慢性的な場合は斯かる改善乃至消失が認められた場合でも、投与を継続することが望ましい。なお、生体内の一酸化窒素のバランス異常は、一酸化窒素のバランス異常が原因と推定される疾患乃至その症状から推測することもできるが、可能な限り、生体内の一酸化窒素のレベルを直接確認することが望ましい。生体内の一酸化窒素レベルを確認するための一酸化窒素の定量法としては、例えば、常法により採取した血液や他の組織からの生体液を硝酸還元酵素で処理した後、２，３−ジアミノナフタレンにより亜硝酸アニオンを発色（蛍光）させ定量する方法を挙げることができる。また、市販の酸化窒素分析システム（例えば、エイコムス社製、商品名『ＮＯ  ｓｙｓｔｅｍ（ＥＮＯ−２０）』）などを用い定量することも随意である。【００２５】
本発明の一酸化窒素生成調節剤は、通常、非経口投与用の液剤、用時溶解型粉末剤などの形態で提供される。さらに、本発明の一酸化窒素生成調節剤は経口用剤の形態で提供される。経口用剤の剤形としては、粉末、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シラップ、液剤などを挙げることができる。【００２６】
本発明の一酸化窒素生成調節剤は、注射剤、経口用剤以外にも、ハップ剤や経肺用の吸飲噴霧剤等の形態で用いることもでき、皮下等の体内に埋め込む徐放製剤の形態で用いることもできる。【００２７】
さらに、本発明の一酸化窒素生成調節剤は、投薬単位形態の薬剤をも包含する。斯かる投薬形態の薬剤とは、本発明の有効成分である上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素の、例えば、１日あたりの用量又はその整数倍（４倍まで）又は約数（１／４まで）に相当する量を含有し、投与に適する物理的に分離可能な剤形を意味する。【００２８】
本発明の一酸化窒素生成調節剤は、家畜、家禽、ペットをはじめとするヒト以外の動物のミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などからの一酸化窒素生成の調節にも用いることができる。【００２９】
次に、本発明の一酸化窒素生成調節剤の製造方法について説明するに、本発明の一酸化窒素生成調節剤の有効成分である上記一般式で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素は、その由来や製法に制限はなく、公知の方法によるか、あるいは、公知の方法に準じ所望量を得ることができる。例えば、速水正明監修、『感光色素』、１９９７年１０月１７日、産業図書株式会社発行、の２４乃至３０頁に記載された方法か、あるいは、それらの方法に準じ所望量を得ることができる。斯かる色素の市販品がある場合には、必要に応じ、それを適宜精製したうえで用いればよく、上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素であって、その対アニオンがヨウ素アニオンの色素の市販品としては、『ＮＫ−４』（一般式１におけるアルキル基（Ｒ）の炭素数が２の色素：上記化学式１で表される色素）、『ＮＫ−２３４』（一般式１におけるアルキル基（Ｒ）が直鎖状でその炭素数が３の色素；上記化学式２で表される色素）及び『ＮＫ−２６』（一般式１におけるアルキル基（Ｒ）が直鎖状でその炭素数が４の色素；上記化学式３で表される色素）（いずれも、株式会社林原生物化学研究所製造）がある。また、一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素であって、その対アニオンが塩素アニオンの色素の市販品としては、『ＮＫ−９』（一般式１におけるアルキル基（Ｒ）の炭素数が２の色素；上記化学式６で表される色素）、『ＮＫ−２３５』（一般式１におけるアルキル基（Ｒ）が直鎖状でその炭素数が３の色素；上記化学式７で表される色素）及び『ＮＫ−４６』（一般式１におけるアルキル基（Ｒ）が直鎖状でその炭素数が４の色素；上記化学式８で表される色素）（いずれも、株式会社林原生物化学研究所製造）などを挙げることができる。【００３０】
本発明の一酸化窒素生成調節剤はその有効成分である三核型ペンタメチン系シアニン色素を単独で用いてもよいが、通常、本発明の範囲を逸脱しない範囲で、製剤学的に許容される医薬品分野、医薬部外品分野或いは食品分野や化粧品分野で用いることのできる成分の１種又は２種以上を配合した製剤の形態で提供される。【００３１】
製剤学的に許容される成分としては、例えば、医薬品、医薬部外品用などの添加剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、界面活性剤、防腐剤（抗菌剤）、香料、増粘剤、抗酸化剤、キレート剤、ビタミン類、アミノ酸類、水性媒体、糖質、水溶性高分子、ｐＨ調整剤、発泡剤、医薬用や医薬部外品用の有効成分、化粧品原料などを例示することができ、これらの成分の１種又は２種以上を適宜組み合わせて配合し、目的とする剤型に応じ、常法により製造すればよい。【００３２】
また、本発明の一酸化窒素生成調節剤は、本発明で用いる三核型ペンタメチン系シアニン色素以外の化合物を有効成分とする一酸化窒素生成調節剤や、本発明の一酸化窒素生成調節剤が適用できると推定される諸疾患や障害の予防剤、治療剤との併用も有利に実施できる。これらの薬剤は、本発明の有効成分と混合剤の形態で投与してもよいし、個々の製剤を別々に投与することもできる。【００３３】
本発明で用いる色素は、対象とする製剤の組成やその使用目的を勘案し、原料の段階から製品が完成するまでの工程で本発明の一酸化窒素生成調節剤に配合すればよい。その方法としては、例えば、混和、混捏、溶解、融解、分散、懸濁、乳化、逆ミセル化、浸透、晶出、散布、塗布、付着、噴霧、被覆（コーティング）、注入、浸漬、固化、担持などの１種又は２種以上の方法が適宜に選ばれる。【００３４】
本発明の一酸化窒素生成調節剤は、注射用製剤などの非経口用剤の場合、通常、パイロジェンを含まない水性媒体に溶解し、皮内、皮下、筋肉内、体腔内（胸腔内、腹腔内など）、血管内などの組織や臓器へ投与されるので、製剤の形態としては、乾燥製剤であってもよく、液剤であってもよい。乾燥製剤の場合は、用時に、注射用の精製水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖液などの水性媒体に溶解し用いればよい。粉末成分と水性媒体とを、別々に封入でき、その間のシール部分を開通すれば、両者を混合できる形態のプラスチック製容器などにそれぞれを収納し、用時に２成分を混合、溶解し用いることもできる。液剤の場合は、そのまま投与してもよく、輸液、灌流液、腹膜透析液などに添加し用いてもよい。また、徐放性の製剤を調製する場合や親油性の成分を配合する場合は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの両親媒性溶媒、油性基材や、ツイーン８０などの乳化剤等を用いることも随意である。また、リポソームなどに封入し投与することも随意である。【００３５】
本発明でいう水性媒体とは、水を必須の要素とし、必要に応じ、これに、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどのアルコール類、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と略記する場合がある。）などの含硫化合物をはじめとする親水性有機溶剤の１種又は２種以上を配合してなる水性媒体一般を意味する。本発明による液剤における水性溶剤としては、注射用精製水、生理食塩水、リンゲル液等を単独で用いればよく、注射用精製水と、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ジエチルエーテル、ＤＭＳＯなどの生理学的に許容される親水性有機溶剤との混液を用いることも随意である。また、乳酸、塩酸、スルホン酸、メチルスルホン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウムやリン酸緩衝液などのｐＨ調整剤を添加し、製剤化する色素の最も溶解度や安定性の高いｐＨ６．５乃至８．０、より好ましくは６．８乃至７．４に調整することも随意である。なお、本発明の一酸化窒素生成調節剤の有効成分である上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素は、対アニオンの種類などにより、水性媒体に対する安定性が低い場合があるので、用時溶解型の製剤の形態が望ましく、さらに、対アニオンがヨウ素アニオンの色素が望ましい。【００３６】
斯かる液剤の場合、本発明で用いる三核型ペンタメチン系シアニン色素は、溶存酸素などにより不安定になる場合があるので、その場合は、例えば、斯かる色素溶液の溶存酸素濃度を低減させればよい。このような液状組成物は、通常、斯かる色素を水性媒体に溶解する工程と、該水性媒体をしてその常温常圧の大気環境下における酸素濃度を下回らせる工程とを経由する方法により調製することができる。これらの色素を水性媒体に溶解するには、例えば、所定の量の色素を適量の水性媒体へ添加し、必要に応じて、加熱・攪拌しながら溶解させた後、必要に応じ、色素の濃度が所定のレベルになるまで水性媒体を追加すればよい。また、予め、斯かる色素を親水性有機溶剤に溶解した後、色素の濃度が所定のレベルになるまで水性媒体を加えて希釈してもよい。【００３７】
水性媒体の溶存酸素濃度を、常温常圧の大気環境下における濃度より低くするには、例えば、本発明で用いる三核型ペンタメチン系シアニン色素の溶液を減圧下で調製し、保存するか、斯かる色素溶液に溶存する酸素を別の気体で置換するか、あるいは、斯かる色素溶液を脱酸素剤へ接触させる方法が好適である。液状組成物に溶解する酸素を別の気体で置換するには、液状組成物中で、例えば、窒素などの比較的不活性な気体か、あるいは、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンなどの希ガスをバブリングさせればよい。脱酸素剤を用いて酸素濃度を下げるには、液状組成物へ、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、アルファチオグリセリン、エデト酸ナトリウム、塩酸システイン、クエン酸、レシチン、チオグリコール酸ナトウム、チオリンゴ酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール、ブドウ糖や麦芽糖などの還元性糖質などを適量添加すればよい。これらの方法は、色素溶液に適用しても、色素を溶解する前の水性媒体へ適用してもよい。この場合の水性媒体に溶存する酸素の濃度は、通常、０．４ｐｐｍ以下、望ましくは、０．１ｐｐｍ以下とすればよい。【００３８】
また、トコフェロール、カロチン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、システイン、ドーパ、チオタウリン、ヒポタウリン、ビリルビン、コレステロール、キノリン、ケルセチン、ルチンやその糖質誘導体、ヘスペリジンやその糖質誘導体、カテキン、アントシアニン、チアミンなどのような一重項酸素消去活性を有する成分や、アルキルセルロース、カルボキビニルポリマー、プルランなどの増粘剤、トリトンＸ、ツイーン８０、デオキシコール酸又はその塩、コール酸又はその塩などの界面活性剤を、本発明で用いる三核型ペンタメチン系シアニン色素の安定化のため適量添加し、製剤を調製することも有利に実施できる。【００３９】
斯くして得られた上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素の溶液は、酸素を遮断し得る、用途に応じた適宜の容器へ封入した状態で保存すればよい。容器の材質としては、原理上、液状組成物を保持することができ、かつ、酸素を実質的に遮断し得るものであるかぎり、特に制限がないが、褐色ビンや褐色のアンプル、プラスチック容器のような遮光性の容器が望ましい。用途にもよるけれども、通常、ガラスアンプル、バイアル瓶、プラスチック容器などの容器へ液状組成物を分注前に濾過滅菌などの滅菌を行うか、ガラスアンプル、バイアル瓶の場合は分注し容器を封止した後、高圧滅菌などにより滅菌する。【００４０】
斯くして製造される本発明の一酸化窒素生成調節剤は、長期間連用しても重篤な副作用もなく安全な製剤である。【００４１】
以下、実験により本発明をさらに詳細に説明する。【００４２】
＜実験１：三核型ペンタメチン系シアニン色素の一酸化窒素生成に及ぼす影響＞
生体内における一酸化窒素の生成に及ぼす三核型ペンタメチン系シアニン色素の影響を、ヒトの一酸化窒素生成のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして汎用されているラット胎児脳細胞の初代培養により調製したミクログリア細胞を用い、以下に示す方法により評価した。一酸化窒素の誘発剤として、炎症状態や敗血症の誘発モデル物質として汎用されているリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を用いた。なお、以下の実験において、三核型ペンタメチン系シアニン色素は、いずれも株式会社林原生物化学研究所で合成し、純度９９質量％以上に精製し用いた。【００４３】
＜被験試料＞
上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素の対アニオン（Ｘ−）がヨウ素アニオンで、且つ、アルキル基（Ｒ）の炭素数が、１の色素（以下、「化合物１」という。）、２の色素（上記化学式１で表される色素；以下、「化合物２」という。）、及び、アルキル基（Ｒ）がいずれも直鎖状でその炭素数が３の色素（上記化学式２で表される色素；以下、「化合物３」という。）、４の色素（上記化学式３で表される色素；以下、「化合物４」という。）及び６の色素（以下、「化合物５」という。）を、各々ＤＭＳＯ（シグマ社販売、商品番号「Ｄ８４１８」）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、膜濾過（ミリポア社販売、商品名「マイレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）−ＬＧ  ＳＬＬＧ０２５ＳＳ」、ＤＭＳＯ耐性膜使用）した。この溶液を、用いる直前に１０容積％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）加ダルベッコのＭＥＭ培地（日水製薬株式会社販売、ＤＭＥＭ培地）（２０ｍＭグルコース，１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５０単位（Ｕ）／ｍｌペニシリン含有）（以下、「１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ培地」と略記する。）を用い、化合物の最終濃度が表１に示す濃度となるように希釈し被験試料とし、試験に供した。なお、ＤＭＳＯに溶解した試験標品を、１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ培地で試験に用いる濃度に希釈した場合、それに含まれる濃度のＤＭＳＯは、以下の試験系に影響しないことを予め確認した。【００４４】
＜ミクログリア細胞の調製＞
妊娠１６乃至１８日目のウイスター系ラット（株式会社日本チャールスリバー社販売、１０週齢、雌）をエーテル麻酔下で解剖し、子宮を摘出し７０容積％エタノール溶液に浸漬後、直ちに氷冷した滅菌ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）に浸漬し、胎児を摘出した。摘出した胎児を新鮮な氷冷した滅菌ＨＢＳＳに浸漬し、実体顕微鏡下で、胎児から大脳を摘出し、その皮質部分を切り出し、髄膜を取り除いて細断した。この大脳皮質の細断片を回収し、１仔から摘出した大脳皮質あたり、０．３ｍｇ／ｍｌのＬ−システイン塩酸塩で活性化させた０．０１質量％ＤＮａｓｅＩ（ウォーシントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）社製）を含む２０単位（Ｕ）／ｍｌパパイン溶液（ウォーシントン社製）１ｍｌを加え、３７℃、３０分間処理し、細胞を分散させた。１仔から摘出した大脳皮質あたり０．５ｍｌのウマ血清（セルカルチャーテック（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈ）社製）を添加し酵素反応を停止後、細胞懸濁液を遠心分離用チューブに回収し、室温で８００ｒｐｍ、３分間遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、細胞のペレットに、ニューロベーサル  メディウム（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製；２５μＭグルタミン酸、０．５ｍＭグルタミン、１質量％Ｂ２７サプリメント（インビトロジェン社製）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び５０単位（Ｕ）／ｍｌペニシリン含有）を加え、１０ｍｌメスピペットを用い、泡立てないようゆっくりとピペッティングすることにより細胞を懸濁した後、室温、８００ｒｐｍ、３分間遠心分離した。上清を除去後、再度ニューロベーサル  メディウムを加え、１ｍｌ可変式ピペットを用い、泡立てないようゆっくりペレットをピペッティングすることにより細胞を懸濁した後、孔径０．４μｍのメッシュ（セルストレイナー、ベクトンディッキンソン社製）を通し大脳皮質細胞画分とした。さらに、この大脳皮質細胞画分を、１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ培地に懸濁し、１５０ｃｍ２培養フラスコ（ベクトンディッキンソン社製）に３×１０７個／４０ｍｌ／フラスコで播種し、同じ培地で培地交換しながら約１ヶ月培養した後、フラスコを軽く振とうすることにより、グリア層上面に出現し浮遊した細胞を培養上清とともに回収し、ミクログリア細胞を調製した。【００４５】
＜ミクログリア細胞からのＬＰＳ誘導性一酸化窒素生成量の測定＞
上記ミクログリア細胞を、１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ培地で３×１０５個／ｍｌに懸濁し、組織培養用９６ウエルマイクロプレートに、１００μｌ／ウエル播種した。１日培養後、上清を除去し、１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ培地で希釈した被験試料のいずれかを５０μｌ／ウエルとなるように添加し、さらに、１時間後に１０％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ培地に溶解した大腸菌由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ、Ｄｉｆｃｏ社製）を、予め被験試料を添加したウエルに５０μｌ／ウエル（ＬＰＳの最終濃度３０ｎｇ／ｍｌ）添加した。ＬＰＳ添加２４時間後に培養上清中に放出された一酸化窒素量を、培養上清にＧｒｉｅｓｓ試薬を５０μｌ／ウエル加え、反応、発色させた後、マルチプレートリーダーを用い５４０ｎｍの吸光度により測定した。培地にＬＰＳのみを添加し培養した時の一酸化窒素生成量を１００とし、ＬＰＳ添加前に被験試料のいずれかを添加したときの一酸化窒素生成量の相対値を各々求め、一酸化窒素生成率（％）として表１に示す。表１において一酸化窒素生成率が低いほど一酸化窒素生成抑制作用が強いことを意味する。なお、本実験系において、ミクログリア細胞調製時に、培養フラスコに付着したグリア層から剥離しミクログリア細胞中に微量混入すると推定されるアストロサイトは、３０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ共存下で２４時間培養しても一酸化窒素産生は誘導されなかったので、本実験で確認された一酸化窒素はミクログリア細胞が産生したと判断した。【００４６】
【表１】
2012014805.tif 000012
【００４７】
表１の結果から明らかなように、上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）の炭素数が１（化合物１）及び６（化合物５）であり、対アニオンがヨウ素アニオンの色素は、この試験に用いた濃度では、ＬＰＳにより誘導されるミクログリア細胞からの一酸化窒素生成率が９５乃至１００％となり、有意の一酸化窒素の生成調節作用を示さなかった。これに対し、一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）の炭素数が２乃至４であり、対アニオンがヨウ素アニオンの色素（化合物２乃至４）は、化合物２の色素の場合、０．０８μｇ／ｍｌ以上の濃度で、濃度依存的に、ＬＰＳにより誘導されるミクログリア細胞からの一酸化窒素の有意な生成調節作用を示し、２５μｇ／ｍｌの濃度では生成率が３５％にまで低下した。化合物３及び化合物４の色素の場合、２μｇ／ｍｌ以上の濃度で、濃度依存的に、ＬＰＳにより誘導されるミクログリア細胞からの一酸化窒素の生成調節作用を示し、２５μｇ／ｍｌの濃度では生成率が、それぞれ４７％及び６１％に低下した。一酸化窒素生成調節の程度は、その生成率が５０％に低下する各化合物の濃度で比較すると、化合物２（アルキル基（Ｒ）の炭素数が２の色素）及び化合物３（アルキル基（Ｒ）が直鎖状でその炭素数が３の色素）が低濃度でも顕著な作用を示し、化合物２で特に顕著であった。この結果は、一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）の炭素数が２乃至４で、その対アニオンがヨウ素アニオンの色素、とりわけ、アルキル基（Ｒ）が直鎖状でその炭素数が２又は３の色素、特にはアルキル基（Ｒ）の炭素数が２の色素が生体内の一酸化窒素生成調節剤として有効であることを示している。【００４８】
＜実験２：三核型ペンタメチン系シアニン色素の投与の生体内一酸化窒素レベルに及ぼす影響＞
感染や免疫異常などによる生体内での炎症反応などの亢進に伴い、ミクログリア細胞を含むマクロファージ系細胞や血管内皮細胞などから一酸化窒素が生成すると、すみやかに、亜硝酸、硝酸へと代謝され血中の窒素酸化物（ＮＯｘ）濃度が上昇する。そこで、実験１で用いた化合物１乃至５につき、これらの化合物を生体に直接投与した場合の生体内一酸化窒素レベルに及ぼす影響を調べた。すなわち、実験１で用いたと同じ化合物１乃至５を、各々ＤＭＳＯ（シグマ社販売、商品番号「Ｄ８４１８」）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、膜濾過（ミリポア社販売、商品名「マイレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）−ＬＧ  ＳＬＬＧ０２５ＳＳ」）した。この溶液を、マウスへ投与する直前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５０μｇ／ｍｌになるよう希釈し、被験試料とした。対照として、被験試料と同じ濃度となるようにＰＢＳで希釈しＤＭＳＯ溶液を用いた。【００４９】
＜試験方法＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー社販売、６週齢、雌）３６匹を、体重測定（平均体重２０ｇ）後、無作為に６匹ずつ６群に分けた。５群各６匹のマウスには、化合物１乃至５のいずれかを含む被験試料を、化合物の投与量が５００μｇ／ｋｇ体重となるよう尾静脈内投与した（略２００μｌ／匹）投与した。残りの１群６匹には、ＤＭＳＯの溶液（対照）を２００μｌ／匹尾静脈内投与した。被験試料又は対照投与１５分後に、６群３６匹全てのマウスに、実験１で用いたＬＰＳをＰＢＳに溶解し、１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように腹腔内に投与した（略４００μｌ／匹）。ＬＰＳ投与６時間後に各マウスの心臓から採血し、市販の酸化窒素分析システム（エイコムス社製、商品名『ＮＯ  ｓｙｓｔｅｍ（ＥＮＯ−２０）』）により、血液中の硝酸アニオンと亜硝酸アニオンの合計濃度を測定し、対照を投与したときの血中濃度を１００とし、被験試料を投与した血中濃度の相対値を求め、一酸化窒素生成率（％）として表２に示す。表２において、一酸化窒素生成率（％）が低い程、一酸化窒素生成調節作用が強いことを意味する。ちなみに、生体内で一酸化窒素が生成されると、速やかに亜硝酸、硝酸に代謝されるので、本実験では血液中の硝酸アニオンと亜硝酸アニオンの合計の濃度をもって一酸化窒素生成量とした。【００５０】
【表２】
2012014805.tif 000013
【００５１】
表２の結果から明らかなように、上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）の炭素数が１（化合物１）及び６（化合物５）であり、その対アニオンがヨウ素アニオンの色素は、この試験で投与した量では、ＬＰＳにより誘導されるマウスの一酸化窒素生成率が１００％となり、対照と比較し有意の一酸化窒素の生成調節作用を示さなかった。これに対し、一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）の炭素数が２乃至４であり、その対アニオンがヨウ素アニオンの色素（化合物２乃至４）を投与した場合、一酸化窒素生成率が、各々５８％、７４％、８６％となり、いずれの化合物も一酸化窒素の生成の調節作用を有することが確認された。この調節作用は、化合物２が最も強く、化合物３がこれに次ぐ強さを示した。この結果は、実験１におけるＬＰＳにより誘導されるミクログリア細胞からの一酸化窒素生成に対するこれらの化合物の調節作用の有無および強弱の点でよく整合している。さらに、この結果は、化合物２乃至４は、生体に投与した場合に、一酸化窒素生成調節剤として有効であることを示している。【００５２】
＜実験３：三核型ペンタメチン系シアニン色素の対アニオンの違いが経口投与時の生体内への吸収性に及ぼす影響＞
化合物２乃至４などの三核型ペンタメチン系シアニン色素は疎水性が高いため、経口投与の場合生体内への吸収性が低く、本発明の所期の効果が期待できるに充分な血中濃度、治療の標的組織への移行が達成できない場合が想定されたので、これらの化合物と三核型ペンタメチン系シアニン色素の中でも比較的水性媒体に対する溶解性が高いとされる対アニオンが塩素アニオンの色素とで、経口投与時の生体内への吸収性に差があるかどうかを確認する試験を以下の様に行った。すなわち、実験１及び実験２において、一酸化窒素生成調節作用が特に強いことが判明した化合物２（上記一般式１におけるアルキル基（Ｒ）の炭素数が２で、対アニオンがヨウ素アニオンの三核型ペンタメチン系シアニン色素；上記化学式１で表される色素）又は上記一般式１におけるアルキル基（Ｒ）の炭素数が２で、対アニオンが塩素アニオンの三核型ペンタメチン系シアニン色素（上記化学式６で表される色素；以下、「化合物６という」）を、それぞれ経口投与し、下記評価方法により生体内への吸収性、組織への移行性を評価した。なお、評価対象の臓器は、斯かる色素の吸収、分解、排出に最も関与すると想定される血液、肝臓、腎臓、及び、血液脳関門（ＢＢＢ）の存在により移行が困難な可能性が高い脳を選択した。【００５３】
＜被験試料＞
化合物２及び化合物６を、各々、プルランの１０質量／容積％（株式会社林原生物化学研究所販売、商品名『日本薬局方プルラン』）溶液に９．２ｍｇ／ｍｌとなるよう懸濁或いは溶解し、被験試料とした。
＜試験方法＞
ｄｄＹマウス（日本ＳＬＣ社販売、８週齢、雄、平均体重３７ｇ）２４匹を無作為に１２匹ずつ２群に分けた。被験試料投与１６時間前から絶食させ、飲水は自由摂取とし、１群１２匹のマウスには化合物２を含む被験試料を０．４ｍｌ／匹、胃ゾンデを用い経口投与した。残りの１群１２匹には化合物６を含む被験試料を０．４ｍｌ／匹、胃ゾンデを用い経口投与した。被験試料投与後１、２、８及び２４時間で、化合物２又は化合物６を含む被験試料を投与したマウス各３匹を無作為に選択し、エーテル麻酔下で、腹部大静脈より血液を採取するとともに、血液凝固阻止剤としてＥＤＴＡを添加した。採取した血液は、７０容積％になるようにアセトニトリルを添加、混合し遠心分離した上清を各々、減圧濃縮後、乾固し、７０容積％アセトニトリル溶液で再溶解した後、再度遠心分離し上清を回収した。この上清を、下記条件による高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供し、測定波長７７６ｎｍ及び２５４ｎｍの吸光度計によるクロマトグラムに出現したピークの面積から、化合物２又は化合物６量を求めた。採血後のマウスは、各々リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（‐））１５ｍｌを用いることにより心灌流を行い、脱血した後、嗅球を含む全脳（脳実質）、肝臓及び腎臓を摘出した。摘出した全脳は、湿質量を測定後、質量の２倍量の蒸留水を加え、ホモジネート後７０容積％となるようアセトニトリルを添加、混合し、１２，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清の全量を減圧濃縮後、乾固し、７０容積％アセトニトリル溶液で再溶解した後、再度遠心分離して上清を回収し、血液と同様にＨＰＬＣ法により化合物２又は化合物６量を求めた。肝臓および腎臓は、湿質量を測定後、−８０℃で凍結保存した。凍結した肝臓及び腎臓は、氷冷上で解凍し、質量の２倍量のＰＢＳ（−）を添加しホモジネートした後、７０容積％となるようアセトニトリルを添加、混合し、遠心分離した上清を回収し、血液と同様にＨＰＬＣにより化合物２又は化合物６量を求めた。いずれの臓器の場合も、ホモジネート以降の操作は、氷冷、遮光下で行った。結果を表３に示す。
＜化合物２および６の定量方法＞
標準品として、化合物２及び６を、各々７０容積％アセトニトリル溶液で２５〜１，０００ｎｇ／ｍｌに希釈したものを用い下記条件のＨＰＬＣに供した。
システム：ＨＩＴＡＣＨＩ社製（商品名『Ｌａ  Ｃｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ』）
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  Ｃ８（ナカライテスク社製、φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ガードカラム無）
移動相：７０容積％アセトニトリル、０．２容積％トリエチルアミン、０．２容積％酢酸
流速：０．８ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
サンプルクーラー：５℃
サンプルの注入量：０．１ｍｌ
分析時間：２５分
測定波長：７７６ｎｍ、２５４ｎｍ【００５４】
【表３】
2012014805.tif 000014
【００５５】
表３の結果から明らかなように、化合物２を含む被験試料を経口投与した場合の化合物２の血中濃度は投与後２時間でピークとなり、そのときの濃度は１３．２ｎｇ／ｍｌで、その後減少し、投与８時間と２４ではほぼ一定値を示した。これに対し、化合物６を含む被験試料を経口投与した場合の化合物６の血中濃度は投与後１時間で既にピークに達し、そのとき濃度は２０６ｎｇ／ｍｌで、化合物２を投与した場合のピーク濃度の１５倍以上に達した。投与８時間と２４時間ではほぼ一定値を示したものの、その濃度は化合物２を投与した場合の約３分の１に迄減少した。さらに、全脳、腎臓及び肝臓のいずれの臓器においても、化合物６を含む被験試料を経口投与した場合の方が化合物２を含む被験試料を経口投与した場合よりも短時間での移行が確認された。化合物２を含む被験試料を経口投与した場合、化合物６を含む被験試料を投与した場合よりも各臓器への移行量は少ないものの、投与２４時間でも移行量は増加傾向を示した。この結果は、斯かる化合物を経口或いは経消化管投与した場合、対アニオンの違いが、生体内への吸収量、吸収速度に顕著な影響を及ぼすことを示している。さらに、この結果は、斯かる化合物を経口投与する場合、血液中のピーク時の化合物の濃度及びピークに達するまでの時間で比較すると、上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素は、そのアルキル基（Ｒ）の炭素数が同一の場合、対アニオンが塩素アニオンの色素の方が、ヨウ素アニオンの色素に比べ、生体への吸収性及び吸収速度、すなわち、バイオアベイラビリティに優れていることを示している。また、腎臓や肝臓と比較すると量的な差異は認められたものの、脳内でも投与した化合物が検出されたので、上記一般式１で表され、そのアルキル基（Ｒ）の炭素数が２乃至４で、対アニオンがヨウ素アニオン又は塩素アニオンの三核型ペンタメチン系シアニン色素は、いずれも、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができると推測される。【００５６】
＜実験４：一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素における対アニオンの違いによる水性溶媒に対する溶解度の差＞
実験３において、上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素の対アニオンの違いにより、生体への吸収性に顕著な差が認められた。その原因として、対アニオンの違いによる消化管内での両化合物の溶解性の違いが予測されたので、消化管内の環境を考慮し、水性溶媒を用い、これらの色素の溶解度に差のあることを確認する試験をおこなった。すなわち、日本薬局方の溶解度試験法に準じ、実験１で用いたと同じ化合物２乃至４、実験３で用いたと同じ化合物６、及び、アルキル基（Ｒ）が直鎖状でその炭素数が３であり、対アニオンが塩素アニオンの色素（上記化学式７で表される色素；以下、「化合物７」という。）、アルキル基（Ｒ）が直鎖状でその炭素数が４であり、対アニオンが塩素アニオンの色素（上記化学式８で表される色素；以下、「化合物８」という。）を、各々、予め乳鉢を用い微粉化した。予め検討した各々の化合物の蒸留水に対する溶解性の試験に基づき、各々の化合物約２．５乃至２０ｍｇを精秤量し、１５或いは５０ｍｌ容の透明スピッツ管に入れ、各々の色素の溶解性に合わせ、蒸留水を少量ずつ添加し、ミキサーで５分間撹拌し、精製水を加えてから３０分以内に不溶物（沈殿）が残存しているかどうかを目視により確認した。不溶物が認められた場合、さらに、蒸留水を少量加え、ミキサーで５分間撹拌し蒸留水を加えてから３０分以内に不溶物（沈殿）が確認できるかどうかを目視により確認し、不溶物が確認できなくなるまでこの操作を繰り返すことにより、不溶物が認められなくなる蒸留水の最少添加量を決定した。試験に用いた各化合物質量を蒸留水の最少添加質量で除し、溶解度とした。結果を表４に示す。また、上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）が直鎖状でその炭素数が６の色素についても、対アニオンがヨウ素アニオンの色素（化合物５）及び塩素アニオンの色素（以下、「化合物９」という。）を用い同様の試験を行った。結果を表４に併せて示す。実験は各色素につき３回実施し、その平均値を求めた。【００５７】
【表４】
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【００５８】
表４の結果から明らかなように上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）の炭素数が２乃至４の色素（化合物２乃至４）の蒸留水への溶解性は、その対アニオンがヨウ素アニオンの色素よりも塩素アニオンの色素の方が、いずれの場合も高かった。なかでも、一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）が直鎖状でその炭素数が３の色素（化合物３および７）では、その対アニオンの違いによる水への溶解性の差が顕著であった。これに対し、一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）が直鎖状でその炭素数が６の色素では、その対アニオンが塩素アニオンの色素（化合物９）は、対アニオンがヨウ素アニオンの色素（化合物５）と同様に、水への溶解性は低く、対アニオンの差による溶解性の差異は認められなかった。この結果は、一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）の炭素数が２の色素の場合、その対アニオンがヨウ素アニオンよりも塩素アニオンの色素を用いた場合の方が、経口的に投与した場合の生体内への吸収性に優れているという実験３の結果とよく整合する。さらに、一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）の炭素数が３又は４の色素の場合、その対アニオンがヨウ素アニオンよりも塩素アニオンの色素を用いた場合の方が、経口的に投与した場合の生体内への吸収性に優れていると推定される。また、一般式１で表される色素のアルキル基（Ｒ）の炭素数６以上の色素では、斯かる化合物を経口投与した場合、アルキル基（Ｒ）の炭素数が２乃至４の色素の場合とは異なり、対アニオンの差によるバイオアベイラビリティの差は、それほど大きくないと推定される。【００５９】
＜実験５：三核型ペンタメチン系シアニン色素の安全性＞
上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）の炭素数が２乃至４であり、その対アニオンがヨウ素アニオン又は塩素アニオンの６種の化合物につき、生体に投与した場合の安全性を確認する試験を以下のようにおこなった。【００６０】
（１）経口、単回投与試験
＜被験試料＞
実験４で用いたと同じ化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７及び化合物８を、各々、１質量／容積％のカルボキシメチルセルロース溶液に９０ｍｇ／ｍｌになるよう溶解乃至懸濁し、被験試料とした（被験試料１乃至６）。対照として１質量／容積％のカルボキシメチルセルロース溶液を用いた。
＜評価方法＞
医薬品毒性試験ガイドラインに基づき、齧歯類を用いた試験の限界量とされる２，０００ｍｇ／ｋｇ体重の１用量を設定した。ＣＤ１（ＩＣＲ系）マウス（日本チャールスリバー社販売、６週齢、雄）３５匹を無作為に、５匹ずつ７群に分けた。全てのマウスを、固形飼料（オリエンタル酵母社販売、商品名『ＮＭＦ』）で６日間馴化飼育した。飲水は、給水瓶を用い、水道水を自由摂取とした。馴化飼育後１日絶食したマウスの体重を測定し、被験試料１乃至６のいずれかを、化合物の投与量が２，０００ｍｇ／ｋｇ体重となるように各々１群５匹に、胃ゾンデを用い強制的に経口投与した（略０．５ｍｌ／匹）。残りの１群５匹には、１質量／容積％のカルボキシメチルセルロース溶液（対照）を、胃ゾンデを用い強制的に経口投与した（０．５ｍｌ／匹）。さらに、ＣＤ１（ＩＣＲ系）マウス（日本チャールスリバー社販売、６週齢、雌）３５匹を用い、雄を用いた場合と同じ試験を実施した。
＜観察項目＞
被験試料投与後、毎日１回１４日間、マウスの状態を肉眼観察した。投与直前、投与後１、３、８、６、８、１０、１３及び１４日目に、体重を測定し、併せて、摂餌量、摂水量を測定した。投与１４日目の観察、体重測定後、全個体をエーテル麻酔し、放血させた後、解剖し、肉眼観察により臓器の異常の有無を確認し、これら観察結果に基づき最小致死用量を求めた。結果を表５に示す。なお、試験結果に雌雄による差は認められなかったので雌雄の結果を併せて表５に示す。【００６１】
（２）皮下、２８日間連続投与試験
＜被験試料＞
化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７及び化合物８を、各々、ＤＭＳＯ（シグマ社販売）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、膜濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社販売、商品名「Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ  ＳＬＬＧ０２５ＳＳ」、ＤＭＳＯ耐性膜使用）した。各化合物溶液を、マウスに投与する直前に、略０．１ｍｌ／匹投与したとき５０ｍｇ／ｋｇ体重となるように各々ＰＢＳで希釈し、被験試料とした（被験試料１乃至６）。
＜評価方法＞
ＣＤ１（ＩＣＲ系）マウス（日本チャールスリバー社販売、６週齢）雄３５匹を無作為に、５匹ずつ７群に分けた。全てのマウスを、固形飼料（オリエンタル酵母社販売、商品名『ＮＭＦ』）で６日間馴化飼育した。飲水は、給水瓶を用い、水道水を自由摂取とした。馴化飼育後１日絶食したマウスの体重を測定し、被験試料１乃至６のいずれかを、化合物の投与量が５０ｍｇ／ｋｇ体重となるように各々１群５匹に、注射器を用い皮下投与した。残りの１群５匹には、ＰＢＳ（対照）を、皮下投与した。
＜観察項目＞
被験試料投与開始日から、毎日１回４２日間、マウスの状態を肉眼観察した。投与直前、投与開始日から２乃至３日間隔で、体重を測定し、併せて、摂餌量、摂水量を測定した。投与開始日から４２日目の観察、体重測定後、全個体をエーテル麻酔し、放血させた後、解剖し、肉眼観察により臓器の異常の有無を確認し、これら観察結果に基づき最小致死用量を求めた。結果を表５に示す。【００６２】
（３）腹腔内、２７０日間連続投与
＜被験試料＞
化合物２、化合物３、化合物４、化合物６、化合物７及び化合物８を、各々、ＤＭＳＯ（シグマ社販売）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、膜濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社販売、商品名「Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ  ＳＬＬＧ０２５ＳＳ」、ＤＭＳＯ耐性膜使用）した。各化合物溶液を、使用時に、マウスに略０．２ｍｌ／匹投与したとき被験試料の投与量が０．５ｍｇ／ｋｇ体重となるようにＰＢＳで希釈し、被験試料とした（被験試料１乃至６）。
＜評価方法＞
ＣＤ１（ＩＣＲ系）マウス（日本チャールスリバー社販売、６週齢、雄）３５匹を無作為に、５匹ずつ７群に分けた。全てのマウスを、固形飼料（オリエンタル酵母社販売、商品名『ＮＭＦ』）で６日間馴化飼育した。飲水は、給水瓶を用い、水道水を自由摂取とした。馴化飼育後１日絶食したマウスの体重を測定し、被験試料１乃至６のいずれかを、化合物の投与量が０．５ｍｇ／ｋｇ体重となるように各々１群５匹に、注射器を用いて腹腔内投与した。残りの１群５匹には、ＰＢＳ（対照）を、注射器を用いて腹腔内投与した。
＜観察項目＞
被験試料投与開始日から、毎日１回２７０日間、マウスの状態を肉眼観察した。投与直前、投与開始日から２乃至３日間隔で、体重を測定し、併せて、摂餌量、摂水量を測定した。投与開始日から２７０日目の観察、体重測定後、全個体をエーテル麻酔し、放血させた後、解剖し、肉眼観察により臓器の異常の有無を確認し、これら観察結果に基づき最小致死用量を求めた。結果を表５に示す。【００６３】
【表５】
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【００６４】
上記一般式１で表される三核型ペンタメチン系シアニン色素のアルキル基（Ｒ）の炭素数が２乃至４であり、その対アニオンがヨウ素アニオン又は塩素アニオンの６種の化合物は、試験に用いた投与量、投与経路、投与期間では、いずれの場合も死亡や異常が観察されたマウスは認められず、体重、摂餌量、摂水量も対照投与群と有意の差は認められなかった。また、経口、単回投与試験ではマウスの雌雄による差異は認められなかった。さらに、いずれの試験においても、目視による臓器の異常も認められなかったので、いずれの試験の場合も正確な最小致死容量を求めることはできなかった。この結果から、本発明の有効成分である三核型ペンタメチン系シアニン色素は、いずれも生体へ非経口乃至経口的に長期間連続投与しても安全性が高い化合物であると判断した。【００６５】
以下、実施例により本発明についてさらに詳しく説明するが、本発明は何ら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６６】
＜注射用の液剤＞
注射用精製水３７０ｇにパイロジェンフリーの含水結晶α，α−トレハロース（株式会社林原製造）５０ｇ、アスコルビン酸０．５ｇ、炭酸水素ナトリウム１．２５ｇを溶解しｐＨを７．２に調整した溶液と、注射用精製水１７７ｇに、ツイーン８０（日本油脂株式会社販売、商品名『ポリソルベイト８０』）３ｇと、有効成分である化合物２乃至４及び化合物６乃至８（いずれも株式会社林原生物化学研究所製造）のいずれか１種を、各々１２０ｍｇ溶解した溶液とを混合し、濾過滅菌後、溶存する酸素の濃度が約０．１ｐｐｍになるまで無菌の窒素ガスをバブリングし、褐色アンプルに１ｍｌずつ分注し、窒素気流下でアンプルを封止した。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、一酸化窒素生成調節剤として利用できる。また、本品は、一酸化窒素のバランス異常に起因する病理学上の血圧低下、臓器移植後の組織障害、移植拒絶反応、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎をはじめとする腎炎、膵炎などの炎症性疾患、ウイルス感染，細胞障害性因子，炎症反応などによる血管内皮（微小血管内皮を含む）などの組織損傷や細胞障害（細胞死）、動脈性高血圧症、鬱血性疾患、心臓疾患などの疾患や障害の予防、治療に用いることができる。さらに、本発明の一酸化窒素生成調節剤は、ヒト以外の動物にも適用することができる。
【実施例２】
【００６７】
＜用時溶解型粉末剤＞
注射用精製水３７０ｇに注射用精製マルトース（株式会社林原製造）３０ｇ、アスコルビン酸０．５ｇ、炭酸水素ナトリウム１ｇを溶解しｐＨを７．０に調整した溶液と、注射用精製水１００ｇに、有効成分である化合物６乃至８（いずれも株式会社林原生物化学研究所製造）のいずれか１種を２００ｍｇ溶解した溶液とを、各々混合して濾過滅菌後、褐色アンプルに１０ｍｌずつ分注し、常法により凍結乾燥後、窒素気流下でアンプルを封止した。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、用時に、アンプルに注射用精製水乃至生理食塩水２乃至１０ｍｌを加えて溶解し、点滴静注、皮下投与、腹腔内投与などの方法で用いることができる。本品は、注射投与用の一酸化窒素生成調節剤として利用できる。また、本品は、一酸化窒素のバランス異常に起因する病理学上の血圧低下、臓器移植後の組織障害、移植拒絶反応、動脈硬化症、心筋炎，心筋症，糸球体腎炎をはじめとする腎炎、膵炎などの炎症性疾患、ウイルス感染、細胞障害性因子、炎症反応などによる血管内皮（微小血管内皮を含む）などの組織損傷や細胞障害（細胞死）、動脈性高血圧症、鬱血性疾患、心臓疾患などの疾患や障害の予防、治療に用いることができる。さらに、本発明の一酸化窒素生成調節剤は、ヒト以外の動物にも適用することができる。
【実施例３】
【００６８】
＜用時溶解型粉末剤＞
実施例１と同様に調製したアンプル封入前の化合物２乃至４、及び、化合物６乃至８の溶液を、各々、濾過滅菌後、凍結乾燥し、粉砕して粉末化した。各々の粉末を、２つの収容部を有し、その一方を加圧すると２つの収容部間のシールが容易に開通する構造の遮光性プラスチック容器の一方の収容部に、化合物２乃至４及び化合物６乃至８の凍結乾燥粉末のいずれかが化合物として１０ｍｇ／容器となるよう加えた後封止した。同一の容器の他方の収容部には、注射用の精製水を２５ｍｌ／容器となるように分注後封止した。本品は用時に、精製水封入部を加圧し、粉末と精製水を混合することにより溶解し、静脈内投与、点滴静注、腹腔内投与などの方法で用いる。本品は、注射投与用の一酸化窒素生成調節剤として利用できる。また、本品は、一酸化窒素のバランス異常に起因する病理学上の血圧低下、臓器移植後の組織障害、移植拒絶反応、動脈硬化症、心筋炎，心筋症，糸球体腎炎をはじめとする腎炎、膵炎などの炎症性疾患、ウイルス感染、細胞障害性因子、炎症反応などによる血管内皮（微小血管内皮を含む）などの組織損傷や細胞障害（細胞死）、動脈性高血圧症、鬱血性疾患、心臓疾患などの疾患や障害の予防、治療に用いることができる。さらに、本発明の一酸化窒素生成調節剤は、ヒト以外の動物にも適用することができる。
【実施例４】
【００６９】
＜経口用剤＞
予め乳鉢を用い微粉化した化合物２乃至４及び化合物６乃至８（いずれも株式会社林原生物化学研究所製造）のいずれか１種４質量部に対し、炭酸水素ナトリウム４．２５質量部及び含水結晶α，α−トレハロース（株式会社林原製造）１．５質量部、ステアリン酸マグネシウム０．２５質量部を均質に混合し、常法により０．５ｇずつ打錠し錠剤を調製した。本品は、経口投与用の一酸化窒素生成調節剤として利用できる。また、本品は、一酸化窒素のバランス異常に起因する病理学上の血圧低下、臓器移植後の組織障害、移植拒絶反応、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎をはじめとする腎炎、膵炎などの炎症性疾患、ウイルス感染、細胞障害性因子、炎症反応などによる血管内皮（微小血管内皮を含む）などの組織損傷や細胞障害（細胞死）、動脈性高血圧症、鬱血性疾患、心臓疾患などの疾患や障害の予防、治療に用いることもできる。さらに、本発明の一酸化窒素生成調節剤は、ヒト以外の動物にも適用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の一酸化窒素生成調節剤は、生体内の一酸化窒素のバランスを調節する作用を有し、かつ、生体に投与しても毒性や重篤な副作用のない安全な物質なので、生体内の一酸化窒素のバランス異常の調節を目的とする医薬品、医薬部外品などの製剤を製造する業界において利用することができる。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に多大の貢献をする誠に意義のある発明である。
【国際調査報告】
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