(57)【要約】【課題】本発明は、幹細胞から組織細胞への分化誘導方法を提供することを課題とし、得られた組織細胞を含むバイオ人工臓器を提供することを課題とする。さらには、作製されたバイオ人工臓器を含む医療用材料を提供することを課題とする。【解決手段】増殖能、自己複製能、分化能を有する幹細胞を用いてハンギングドロップ法により培養することで、三次元的に胚様体の細胞塊が構築され、前記細胞塊をＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７及びＥＧＦの存在下で培養することで、組織細胞に分化しうる。また、組織細胞に分化した細胞を用いてバイオ人工臓器を作製することができ、さらには医療用材料を提供することができる。【選択図】図１２【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を、基本培地に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成因子７（ＢＭＰ７）及び上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を含む培養液中で、三次元スキャホールドの存在下で三次元培養することを特徴とする、幹細胞の組織細胞への分化誘導方法。
【請求項２】
請求項１に記載の分化誘導方法であって、
前記三次元培養が、前記幹細胞を、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ及びｂ−ＦＧＦを含む培養液中で培養する第一の工程と、第一の工程の培養開始から０〜１０日経過後、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７、及びＥＧＦを含む培養液中で培養する第二の工程とを含むことを特徴とする分化誘導方法。
【請求項３】
培養液中のＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ及びＢＭＰ７は、各々独立して１００〜５００ｎｇ／ｍｌより選択される濃度で含まれ、ＥＧＦは、３００〜７００ｎｇ／ｍｌより選択される濃度で含まれる条件下で培養する請求項１または２に記載の分化誘導方法。
【請求項４】
前記培養液中にさらに血清を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
【請求項５】
前記血清がＦＣＳである請求項１〜４のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
【請求項６】
前記幹細胞が、腎臓の幹細胞であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
【請求項７】
以下の工程を含む幹細胞の組織細胞への分化誘導方法：
１）幹細胞から三次元の細胞塊を形成させる工程；及び
２）前記細胞塊をＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液中で、三次元スキャホールドの存在下で三次元培養する工程。
【請求項８】
請求項７に記載の分化誘導方法であって、
前記工程２）が、三次元スキャホールドの存在下、前記細胞塊を、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦを含む培養液中で三次元培養する第一の工程と、第一の工程の培養開始から０〜１０日経過後、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液中で三次元培養する第二の工程とを含む分化誘導方法。
【請求項９】
培養液中のＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ及びＢＭＰ７は、各々独立して１００〜５００ｎｇ／ｍｌより選択される濃度で含まれ、ＥＧＦは、３００〜７００ｎｇ／ｍｌより選択される濃度で含まれる条件下で培養する請求項７または８に記載の分化誘導方法。
【請求項１０】
前記工程２）における培養液中にさらに血清を含む請求項７〜９のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
【請求項１１】
前記工程１）において、前記細胞塊がハンギングドロップ法により形成される請求項７〜１０のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分化誘導方法により誘導されて形成される組織細胞。
【請求項１３】
分化誘導方法により誘導されて形成される組織細胞が、腎組織細胞である請求項１２に記載の組織細胞。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の組織細胞を含むバイオ人工臓器。
【請求項１５】
請求項１４に記載のバイオ人工臓器を含む医療用材料。
【請求項１６】
以下の工程を含むバイオ人工臓器の製造方法：
１）幹細胞の細胞塊を形成する工程；
２）得られた細胞塊をスキャホールドに播種する工程；および
３）スキャホールド上で、前記細胞塊をＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液中で培養する工程。
【請求項１７】
バイオ人工臓器が、バイオ人工腎臓である請求項１６に記載のバイオ人工臓器の製造方法。
【請求項１８】
以下の工程を含む幹細胞の多発性嚢胞腎様形態を有する組織細胞への分化誘導方法：
１）幹細胞から三次元の細胞塊を形成させる工程；及び
２）得られた幹細胞の三次元細胞塊を、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含み、かつ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、またはＨＧＦの少なくとも一つを含まない培養液中で、三次元スキャホールドの存在下で三次元培養する工程。
【請求項１９】
前記工程２）における培養液が、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含み、かつ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、またはＨＧＦのいずれも含まないことを特徴とする請求項１８に記載の分化誘導方法。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の分化誘導方法により誘導されて形成される、多発性嚢胞腎様形態を有する組織細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞を用いた幹細胞の組織細胞への分化誘導方法に関する。また、分化誘導された組織細胞を含むバイオ人工臓器の作製方法に関し、さらには得られたバイオ人工臓器を含む医療用材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾患や事故等の理由により失われたり機能が低下した臓器や組織について、機能を回復させたり、臓器や組織そのものを再生しようとする組織工学（ティッシュエンジニアリング）が注目されている。この組織工学分野では、幹細胞や未分化な細胞を、目的とする細胞へ増殖、分化させるための培養条件や因子が研究されている。組織工学は、一般的には細胞、成長因子及び細胞が生着しうる足場の三要素を必要とする。足場の上で細胞を培養し、成長因子を付加して再生組織を構築する試みがなされている。【０００３】
組織工学における臓器や組織の形態的再構築のために、細胞の増殖の足場として、ポリマーなどの化学合成品が用いられており、スキャホールドともいう。目的の細胞をこのスキャホールド上に播種し、これを生体外の適当な環境下で培養することにより要求される細胞へ増殖、分化させたりすることや、再生させようとする臓器や組織の欠損部にスキャホールドを移植し、生体内において目的の細胞を要求する細胞へ増殖、分化させることで、細胞を三次元的構造で増殖させ、所望の臓器を再生させる方法が数多く報告されている（特許文献１、２）。しかしながら、このような足場がなければ、細胞を三次元的構造により増殖させることは極めて困難である。また、化学合成によって作製されたスキャホールドを用いて、生体が本来備えている三次元的構築を模することができても、臓器や組織を再現することができない等の欠点がある。スキャホールドを用いてバイオ人工臓器を構築しても、臓器の機能が十分に発揮しえなかったり、スキャホールドの有無に関わらずバイオ人工臓器そのものの構築が困難であるのが現状である。【０００４】
胚性幹細胞（embryonic stem cell、以下単に「ＥＳ細胞」ともいう。）は、胚盤胞とよばれる初期胚から誘導される未分化の細胞であり、自己複製能と分化における全能性を有する細胞である。ＥＳ細胞は、インビトロにおいて集合塊として培養するだけで生殖細胞を含む全ての細胞に分化することが可能である。ＥＳ細胞から細胞療法などの再生医療に必要とされる機能細胞を分化させる場合、まず三次構造を有する胚様体を形成させる必要がある。胚様体形成のためのＥＳ細胞培養方法として、ハンギングドロップ方法（非特許文献１）、浮遊培養、メチルセルロースなどを含む半固形培地による培養、これらを組み合わせた方法、などが挙げられる。【０００５】
近年、慢性腎不全の患者数が増加している。慢性腎不全は、腎臓における疾病又は腎臓以外の器官における疾病が原因で生じた腎臓障害が進行した病態であり、血液中に含有される尿毒素を除去する機能、内分泌機能、調節機能など、正常の腎臓が有する機能が廃絶する。慢性腎不全が進行すると、正常の腎臓が有する機能が廃絶するために、体内の各臓器に影響が及び、尿毒症となる。具体的には、中枢神経障害、末梢神経障害、心・循環器障害、消化器障害、視力・眼障害、血液・凝固障害、免疫障害、内分泌障害、皮膚障害、骨・関節障害、電解質障害、酸塩基平衡障害などになる。慢性腎不全は、進行性であり且つ治癒が不可能である。そのため、治療としては腎臓の機能が廃絶する速度を遅らせる保存的加療に主眼がおかれており、最終的には人工透析や腎臓移植など、腎臓の機能を代替するための治療が必要となる（例えば、特許文献３）。【０００６】
しかしながら、腎臓移植は、提供される腎臓の数が絶対的に不足しているために、実施が困難である。人工透析は、主に血液透析と腹膜透析との２つに分類され、血液透析では、血液中の尿毒素は除去されるものの、内分泌機能、調節機能などの代替となる治療を行うことができない。また、血液透析は週に３回程度行う必要など、患者にとって負担が大きい。腹膜透析では自己管理ができるために、患者は通院回数を減らすことができるが、代謝障害を受け易いことや、腹膜への負担が大きくなることなどの問題が生じる。【０００７】
腎臓に関し、ラットの腎臓から、高い増殖能を有する腎臓幹細胞／前駆細胞を分離し、株化したｒＫＳ（Rat Kidney Stem cell line)５６細胞を取得したことが開示されている（特許文献４）。特許文献４では、ｒＫＳ５６細胞は自己増殖能を有すること、支持細胞（フィーダー細胞）培養液を含む系で培養したときに血管内皮細胞マーカーが検出され、血管内皮細胞に分化する可能性があることが開示されており、ヘンレ係蹄細胞、近位細尿管細胞、集合管（ＣＤ）細胞へ分化しうることも開示されている。しかしながら、ｒＫＳ５６細胞に関し、支持細胞（フィーダー細胞）を含まない系で分化させる方法については報告がない。また、前記分化した細胞を用いて三次元構造からなるバイオ人工臓器を作製したという報告もない。なお、特許文献４（特開2004-275079号公報）の開示は、参照により本願明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2008-049146号公報
【特許文献２】特開2009-039401号公報
【特許文献３】特開平6-142193号公報
【特許文献４】特開2004-275079号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J Cell Biol. 126(3), 701-711 (1994)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、幹細胞から組織細胞への分化誘導方法を提供することを課題とし、得られたた組織細胞を含むバイオ人工臓器を提供することを課題とする。さらには、作製されたバイオ人工臓器を含む医療用材料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者等は、上述の課題を達成するために鋭意検討を重ねた結果、幹細胞を、基本培地にウシ胎児血清、肝細胞増殖因子、神経栄養因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、骨形成因子７及び上皮細胞増殖因子を含む培養液中で、三次元スキャホールドの存在下で培養することで、組織細胞に分化しうることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
即ち本発明は、幹細胞の組織細胞への分化誘導方法に関するものであり、前記分化誘導方法は、幹細胞を、基本培地に肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成因子７（ＢＭＰ７）及び上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を含む培養液中で、三次元スキャホールドの存在下で三次元培養することを特徴とする。【００１３】
ここで、本発明の分化誘導方法の一実施態様においては、三次元培養が、前記幹細胞を、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ及びｂ−ＦＧＦを含む培養液中で培養する第一の工程と、第一の工程の培養開始から０〜１０日経過後、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７、及びＥＧＦを含む培養液中で培養する第二の工程とを含むことが好ましい。【００１４】
また、本発明の分化誘導方法の一実施態様においては、培養液中のＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ及びＢＭＰ７が、各々独立して１００〜５００ｎｇ／ｍｌより選択される濃度で含まれ、ＥＧＦは、３００〜７００ｎｇ／ｍｌより選択される濃度で含まれる条件下で培養することが好ましい。また、本発明の分化誘導方法の一実施態様においては、培養液中にさらに血清を含むことが好ましい。また、本発明の分化誘導方法は、幹細胞が、腎臓の幹細胞であることが好ましい。【００１５】
本発明の分化誘導方法の一実施態様は、
１）幹細胞から三次元の細胞塊を形成させる工程；及び
２）前記細胞塊をＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液中で、三次元スキャホールドの存在下で三次元培養する工程
とを含む分化誘導方法である。【００１６】
ここで、上記工程２）は、三次元スキャホールドの存在下、前記細胞塊を、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦを含む培養液中で三次元培養する第一の工程（工程２Ａ）と、第一の工程の培養開始から０〜１０日経過後、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液中で三次元培養する第二の工程（工程２Ｂ）とを含むことができる。【００１７】
また、上記工程１）においては、前記細胞塊がハンギングドロップ法により形成されることが好ましい。【００１８】
また、本発明の別の実施態様によれば、本発明は、上記分化誘導方法により誘導されて形成される組織細胞に関するものである。【００１９】
ここで、本発明の分化誘導方法により誘導されて形成される組織細胞は、一実施態様において、腎組織細胞とすることができる。【００２０】
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、上記組織細胞を含むバイオ人工臓器に関するものである。【００２１】
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、バイオ人工臓器を含む医療用材料に関するものである。【００２２】
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、バイオ人工臓器の製造方法に関するものであり、前記製造方法は、
１）幹細胞の細胞塊を形成する工程；
２）得られた細胞塊をスキャホールドに播種する工程；および
３）スキャホールド上で、前記細胞塊をＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液中で培養する工程を含むことを特徴とする。【００２３】
ここで、本発明のバイオ人工臓器は、一実施態様において、バイオ人工腎臓とすることができる。【００２４】
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、幹細胞から多発性嚢胞腎様形態を有する組織細胞への分化誘導方法に関するものであり、前記分化誘導方法は、
１）幹細胞から三次元の細胞塊を形成させる工程；及び
２）得られた幹細胞の三次元細胞塊を、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含み、かつ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、またはＨＧＦの少なくとも一つを含まない培養液中で、三次元スキャホールドの存在下で三次元培養する工程を含むことを特徴とする。【００２５】
また、本発明の多発性嚢胞腎様形態を有する組織細胞への分化誘導方法は、一実施態様において、工程２）における培養液が、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含み、かつ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、またはＨＧＦのいずれも含まないとすることが好ましい。【００２６】
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、上記多発性嚢胞腎様形態を有する組織細胞への分化誘導方法により誘導されて形成される、多発性嚢胞腎様形態を有する組織細胞に関するものである。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の幹細胞の組織細胞への分化誘導方法により、未分化の細胞を組織細胞へ分化誘導させることができ、さらには三次元的な構造を構築することができた。具体的には、本発明の方法により腎臓幹細胞／前駆細胞から腎臓の遠位尿細管細胞、糸球体細胞、近位尿細管細胞などに分化させることができ、さらにはin vitroで腎臓様構造を再構築することができた。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】腎臓の構造を示す模式図である。
【図２】本発明の分化誘導方法を示す概略図である。（実施例１）
【図３】三次元培養２１日後の培養形態を示す写真図である。ａは、ｒＫＳ細胞の細胞塊の三次元培養２１日目の形態を示し、ｂは、後腎発生間葉系幹細胞（metanephric mesenchymak細胞）三次元培養２１日目の形態を示し、ｃは、尿細芽細胞の三次元培養２１日目の形態を示す写真図である。（実施例１、実施例２）
【図４】ｒＫＳ細胞の三次元培養２１日後の培養形態を示す写真図である。Ａは、管腔構造が認められない状態を示し、Ｂは、集合する腎杯様構造が認められず、糸球体様構造＋尿管様構造を有する状態を示し、Ｃは、糸球体陽構造、尿管様構造、腎杯様構造の全てが認められる状態を示す。（実施例３）
【図５】ｒＫＳ細胞の三次元培養２１日後の培養形態に関し、ｒＫＳ細胞塊を作製する際の細胞数による各種形態の割合を示す図である。Ａ、Ｂ及びＣは、図４の説明と同様である。（実施例３）
【図６】ｒＫＳ細胞塊を作製する際の、各種細胞数を変えたときのｒＫＳ細胞の三次元培養１日目、７日目並びに２１日目の培養形態を示す写真図である（実施例３）。
【図７】各培養条件における、ｒＫＳ細胞の三次元培養２１日後の培養形態を示す写真図である。なお、ｍの条件は、三次元培養４日後の培養形態を示す写真図である（実施例４）。
【図８】ｒＫＳ細胞の三次元培養４日目の培養形態を示す写真図である（実施例５）。
【図９】ｒＫＳ細胞の三次元培養４日目の培養細胞の表面マーカーを示す写真図である（実施例１）。
【図１０】ｒＫＳ細胞の三次元培養２週間後の形態を示す写真図である（実施例６）。
【図１１】ｒＫＳ細胞の三次元培養３週間後の形態を示す写真図である（実施例６）。
【図１２】ｒＫＳ細胞の三次元培養３週間後の形態を示す写真図である（実施例６）。
【図１３】ｒＫＳ細胞の三次元培養３週間後の遠位尿細管の形態を示す顕微鏡写真図である。図中の矢印は、priｍary cillaを示す（実施例６）。
【図１４】ｒＫＳ細胞の三次元培養３週間後の糸球体の形態を示す顕微鏡写真図である（実施例２）。
【図１５】ｒＫＳ細胞の三次元培養２週間後の近位尿細管の形態を示す顕微鏡写真図である（実施例６）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、幹細胞の臓器細胞への分化誘導方法に関する。本発明において、幹細胞とはある細胞に変化するようにという指示を受けると特定の細胞に分化する能力を有する細胞をいう。幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、成体幹細胞、胚生殖細胞等に分類されるが、本発明の幹細胞は何れの細胞であっても良い。取り扱いの容易さから考えると、成体幹細胞又は胚生殖細胞を用いるのが好適である。
【００３０】
成体幹細胞とは生体内の組織より採り出される分化する前の状態の細胞をいう。組織には、すでに分化した成熟細胞と共に、未分化細胞、すなわち幹細胞も含まれる。成体幹細胞は、自らと同じ細胞を複製し、製造する能力を持つとともに、分化によってそれが存在していた組織内のあらゆる個別細胞を作製することができる。本発明において使用可能な幹細胞としては、生体内の組織より従来周知の方法によって単離される幹細胞または前駆細胞を使用することができ、具体的には、例えば特許文献４に記載の腎臓幹細胞／前駆細胞が挙げられる。本願の明細書及びクレームにおいて、「幹細胞」との記載は、広義に解釈され、幹細胞のみならず前駆細胞をも含む概念である。このような広義の「幹細胞」概念を意味して、適宜、「幹細胞／前駆細胞」との記載が用いられる。
【００３１】
本発明の幹細胞の組織細胞への分化誘導方法に用いられる三次元培養用の培養液は、基本培地にウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ］）、肝細胞増殖因子（以下「ＨＧＦ」）、神経栄養因子（以下「ＧＤＮＦ」、塩基性線維芽細胞増殖因子（以下「ｂ−ＦＧＦ」）、骨形成因子７（以下「ＢＭＰ７」）及び上皮細胞増殖因子（以下「ＥＧＦ」）を含むことを特徴とする。培養液に含まれるＦＣＳは、約１０ｖ／ｖ％とすることができる。また、ＨＧＦは、１００〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２００〜４００ｎｇ／ｍｌより選択される濃度で含まれ、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌ含まれる。また、ＧＤＮＦは、１００〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２００〜４００ｎｇ／ｍｌより選択される濃度で含まれ、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌ含まれる。また、ｂ−ＦＧＦは、１００〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２００〜４００ｎｇ／ｍｌより選択される濃度で含まれ、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌ含まれる。また、ＢＭＰ７は、１００〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２００〜４００ｎｇ／ｍｌより選択される濃度で含まれ、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌ含まれる。また、ＥＧＦは、３００〜７００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは４００〜６００ｎｇ／ｍｌより選択される濃度で含まれ、より好ましくは５００ｎｇ／ｍｌ含まれる。
【００３２】
上述のとおり、実施態様において、本発明の分化誘導方法を、
１）幹細胞から三次元の細胞塊を形成させる工程；及び
２）前記細胞塊をＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液中で、三次元スキャホールドの存在下で三次元培養する工程
とを含む分化誘導方法とする場合において、上記工程２）が、三次元スキャホールドの存在下、前記細胞塊を、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦを含む培養液中で三次元培養する第一の工程（工程２Ａ）と、第一の工程の培養開始から０〜１０日経過後、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液中で三次元培養する第二の工程（工程２Ｂ）とを含むものとする場合、例えば、以下のように、第一の工程と第二の工程の培養液中の各成分の好ましい濃度を設定することができる。すなわち、上記各好ましい濃度を実現するようにＦＣＳ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦを配合することにより第一の工程の培養液を調製する。また、第一の工程の培養液にＢＭＰ７およびＦＧＦを上記好ましい終濃度となるように添加することで第二の工程の培養液を調製することができる。
【００３３】
ここで、培養液の基本培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用することが好ましい。しかしながら、基本培地はこれに限定されず、当分野に周知の基本培地も使用することができる。培養液には、さらにペニシリンやステレプトマイシン等の抗生物質を必要に応じて適宜添加することができる。
【００３４】
本発明の幹細胞の組織細胞への分化誘導は、上記培養液を用いて三次元スキャホールドの存在下で三次元培養により達成することができる。三次元培養を行なうに際して、まず幹細胞から三次元の細胞塊を形成させる工程を含むのが好適である。
より具体的には、以下の工程を含む方法による。
１）幹細胞から三次元の細胞塊を形成させる工程；及び
２）得られた細胞塊をＦＣＳ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液中で、三次元スキャホールドの存在下で三次元培養する工程。
【００３５】
上記において、三次元の細胞塊の作製方法は特に限定されないが、例えばハンギングドロップ法により作製することができる。ハンギングドロップ法とは、例えば以下に示す三次元の細胞塊作製溶液を用いて、本発明の幹細胞を含む細胞浮遊液を調製したものを、培養容器の蓋等に載せ、載せた細胞浮遊液がぶら下がるように逆さにして培養することによる方法が挙げられる。具体的には、細胞塊作製溶液５０μｌに対して１×１０４〜１×１０６個、好ましくは５×１０４〜５×１０５個、より好ましくは１×１０５〜２×１０５個の細胞を含む細胞浮遊液を調製することができる。細胞塊を形成させるための培養時間は、約６〜１０時間程度が好適である。培養時間が６時間より短い時間では、十分な細胞塊を得ることはできず、１０時間より多い場合は、形成した細胞塊が崩れるため、３７℃で６〜１０時間培養することが好ましい。ハンギングドロップ法により作製された細胞塊は、幹細胞がＥＳ細胞の場合は胚様体（embryoid body：ＥＢ体）となりうる。ここで、胚様体とはＥＳ細胞を様々な組織に分化誘導するために形成される胚をいう。ＥＢ体の形成はin vitroでのＥＳ細胞の分化誘導におけるファーストステップとなる。三次元の細胞塊を形成させることで、細胞分化に関する細胞間のシグナルが働き、より幹細胞がより分化されやすくなるものと考えられる。
【００３６】
上記において、三次元の細胞塊を作製する際には、例えば基本培地にＦＣＳ、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、デキサメタゾン、ＨＧＦ及びｂ−ＦＧＦを含む溶液を用いることが好ましい。ここで、基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用することが好ましい。しかしながら、基本培地はこれに限定されず、当分野に周知の基本培地も使用することができる。また、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを含有する溶液として、市販のＩＴＳ−ｍｉｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）を使用することができる。溶液に含まれる血清（例えばＦＣＳ）は、約１０ｖ／ｖ％とすることができる。また、インスリンは、１〜１０ｇ／ｍｌ、より好ましくは約５ｇ／ｍｌ含まれる。また、トランスフェリンは、１〜５ｇ／ｍｌ、より好ましくは約２．７５ｇ／ｍｌ含まれる。また、セレニウム（Sodium Selenite）は、１〜５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３．３５ｎｇ／ｍｌ含まれる。また、デキサメタゾンは、１〜１０×１０−８Ｍ、より好ましくは５×１０−８Ｍ含まれる。また、ＨＧＦは、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌ含まれる。また、ｂ−ＦＧＦは、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２５ｎｇ／ｍｌ含まれる。本溶液にも、さらにペニシリンやステレプトマイシン等の抗生物質を必要に応じて適宜添加することができる。
【００３７】
本発明の幹細胞の組織細胞への分化誘導方法では、幹細胞を、上述の三次元培養用の培養液中で、三次元スキャホールドの存在下、培養することができる。より好ましくは、上記の幹細胞から形成させた三次元の細胞塊を上述の三次元培養用の培養液を用いて培養することができる。
【００３８】
三次元培養を行なうための培養は、上述の幹細胞の培養液、即ちＦＣＳ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ及びｂ−ＦＧＦ、並びにＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液で培養することもできるし、また、三次元培養を二段階に分け、予め上記各濃度のＦＣＳ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ及びｂ−ＦＧＦを含む培養液で培養し、さらに０〜１０日経過後に、ＦＣＳ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦを含む培養液に上記各濃度のＢＭＰ７及びＥＧＦを含む条件下で培養することもできる。三次元培養を二段階に分ける場合には、第一の工程（工程２Ａ）であるＦＣＳ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦを含む培養液による培養の開始から、好ましくは１〜８日経過後に、より好ましくは４〜７日経過後に、第二の工程（工程２Ｂ）であるＦＣＳ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦ、ＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液で培養することができる。第一の工程から第二の工程への培養液の変更を、上記好ましい期間とすることで分化誘導率を向上させることができる。ＢＭＰ７及びＥＧＦは、最終的に上記に示す濃度になるように、濃度勾配をかけて徐々に添加濃度を増加させてゆくことも可能である。例えば培養用ダブルチャンバーの下部にＨＧＦ、ＧＤＮＦ及びｂ−ＦＧＦを含む培養液を加え、上部にＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液を加え、下部の培養液中で上述の幹細胞を培養しつつ、徐々に上部のＢＭＰ７及びＥＧＦを含む培養液を下部に移動させることで、ＢＭＰ７及びＥＧＦの濃度勾配をつくる方法等が挙げられる。
【００３９】
なお、本明細書中において、幹細胞の組織細胞への分化誘導方法に用いられる培養液に含まれる血清として主に、ＦＣＳを記載しているが、基本培地に使用する血清はＦＣＳに限定されず、その他のウシ血清やヒト血清等、所望の役割を果たし得る、当分野で周知の血清を使用することができる。
【００４０】
本発明に用いられる三次元スキャホールドの材料としては、当該分野で公知のものであれば特に限定されず、例えばコラーゲンベースの材料やポリカプロラクトンやポリグリコール酸等のポリマー系の材料、又はそれらの複合体を使用することができる。また、その形態についても特に限定されないが、例えばスポンジ状構造物などが挙げられる。また、三次元スキャホールドは、生体由来の試料を材料（例えば細胞外マトリックスや基底膜など）とするものであってもよい。具体的には、マトリゲルTM（ベクトン・ディッキンソン社）、typeIコラーゲンゲル、typeIＶコラーゲンゲルなどを挙げることができる。
【００４１】
本発明は、幹細胞の組織細胞への分化誘導方法により得られた組織細胞にも及び、当該組織細胞より形成されるバイオ人工臓器にも及ぶ。例えば、用いた幹細胞が腎臓幹細胞／前駆細胞の場合は、得られる組織細胞は腎臓細胞であり、該組織細胞から形成されるバイオ人工臓器は、バイオ人工腎臓である。腎臓幹細胞／前駆細胞の取得方法は、特に限定されないが、例えば特許文献４に記載する方法に従うことができる。本発明は、このようにして作製されたバイオ人工臓器を含む医療用材料にも及ぶ。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明の理解を深めるために実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。【００４３】
腎臓はヒトでは腹腔の背側に２個存在しており、それぞれ膀胱まで伸びた尿管を有しており、ホルモンを生成して分泌したり、尿を生成する臓器であり、主に排泄機能、内分泌機能、調節機能を有する。腎臓には、ネフロンと呼ばれる基本構造が約１００万個存在し、血液から老廃物を含む水分を濾過し、原尿を生成する糸球体を備えている。糸球体で生成された原尿は、近位尿細管、ヘンレのループ、遠位尿細管、集合管を通過して尿管へ運ばれる。近位尿細管（Ｓ１：分節１、Ｓ２：分節２、Ｓ３：分節３）、ヘンレ係蹄、遠位尿細管では、ナトリウムや水分などを再吸収し、エリスロポイエチンや、ビタミンＤ３を活性化する。また、ネフロンの周囲には間質細胞などがある。原尿は、尿管へ運ばれるまでに約１００倍に濃縮された後、尿管を通過して膀胱まで運ばれ、膀胱から体外へ排泄される（図１参照）。【００４４】
腎臓は中間中胚葉から発生し、前腎、中腎、後腎の３段階を経て形成される。哺乳動物では、前腎及び中腎のほとんどが後に退行変性し、主に後腎から腎臓が生じる。後腎は、中腎の最も尾側に発生する尿管芽と呼ばれる突起の周りに間葉系細胞が集合して生じる。そして、尿管芽と間葉系細胞とが相互作用し、間葉系細胞が上皮化してＳ字体と呼ばれる状態を経ることによって、糸球体、近位尿細管、ヘンレ係蹄、遠位尿細管が発生する。また、集合管及び尿管上皮細胞などは、尿管芽より分化する。【００４５】
（実施例１）腎臓幹細胞／前駆細胞を用いた三次元培養
腎臓幹細胞／前駆細胞をハンギングドロップ法により培養し、得られた細胞塊をマトリゲルからなるスキャホールド内で培養し、三次元培養を行なった（図２参照）。【００４６】
１）腎臓幹細胞／前駆細胞
特許文献４に記載の方法により近位尿細管のＳ３領域より分離し、得られた高増殖能細胞をリポフェクション法によりＳＶ４０遺伝子を組み込み、細胞株化した。得られた株化細胞は、本実施例の腎臓幹細胞／前駆細胞であり、以下ｒＫＳ５６細胞という。【００４７】
２）ｒＫＳ５６細胞の細胞塊の作製
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にＦＣＳ（終濃度：１０ｖ／ｖ％）、ＩＴＳ−ｍｉｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）（２００μｌ）、デキサメタゾン（終濃度：５×１０−８Ｍ）、ＨＧＦ（終濃度：５ｎｇ／ｍｌ）、ｂ−ＦＧＦ（終濃度：２５ｎｇ／ｍｌ）からなる溶液を調製した。上記溶液５０μｌに、ｒＫＳ５６細胞を約１×１０５程度含む細胞浮遊液を調製し、９６穴マイクロプレートのふたの内側に前記細胞浮遊液を載せ、元に戻してハンギングドロップを行なった。３７℃で６〜１０時間培養を行い、ｒＫＳ５６細胞の細胞塊を作製した（図３参照）。【００４８】
３）ｒＫＳ５６細胞の三次元培養
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及びマトリゲルTM（ベクトン・ディッキンソン社）を１：１で混合した溶液に、ＦＣＳ（終濃度：１０ｖ／ｖ％）、ＨＧＦ（終濃度：２５０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＤＮＦ（終濃度：２５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂ−ＦＧＦ（終濃度：２５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた培養液を調製した。まず、三次元培養工程の第一の工程(工程２Ａ)として、スキャホールドとしてのマトリゲルTMを含む前記培養液を用い、上記２）で作製した細胞塊を２４穴のトランスウェル（コーニング（Corning）社、Cat#3470）に対して１ウェルあたり１個播種し、５〜７日間３７℃で培養した。その後、三次元培養の第二の工程（工程２Ｂ）として、ＦＣＳ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦを含む前記培養液にＢＭＰ７（終濃度：２５０ｎｇ／ｍｌ）及びＥＧＦ（終濃度：５００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培養液内で約４週間、３７℃で培養した。一実施例として、第一の工程(工程２Ａ)から第二の工程（工程２Ｂ）への培養液の変更は、ＦＣＳ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ｂ−ＦＧＦを含む前記培養液を２４穴のトランスウェルの１ウェルごとに４００μｌ添加した状態に対し、５０μｇ／ｍｌＢＭＰ７高濃度溶液を２μｌ、１００μｇ／ｍｌＥＧＦ高濃度溶液を２μｌ添加することにより行った。三次元培養２１日目の培養形態を図３ａに示した。【００４９】
（実施例２）腎臓幹細胞／前駆細胞を用いた三次元培養
ｒＫＳ５６細胞の代わりに、後腎発生間葉系幹細胞（metanephric mesenchymak）又は尿細芽細胞を用いて培養したほかは、実施例１と同手法にて培養を行なった。各々についての三次元培養２１日目の培養形態を図３ｂ及びｃに示した。【００５０】
（実施例３）ｒＫＳ５６細胞の細胞塊作製の細胞数による培養細胞形態について
ｒＫＳ５６細胞を用いて細胞塊を作製する際に使用する細胞数を、各種変化させた他は、実施例１と同手法にて細胞を培養した。そのときの、各種細胞形態の出現頻度を確認した。図４において、Ａは、管腔構造が認められない状態を示し、Ｂは、集合する腎杯様構造が認められず、糸球体様構造＋尿管様構造を有する状態を示し、Ｃは、糸球体陽構造、尿管様構造、腎杯様構造の全てが認められる状態を示す。
上記の結果、図５に示すように、ｒＫＳ５６細胞の細胞塊作製の細胞数が低い場合は、腎組織への十分な分化誘導頻度が低いのに対し、細胞数が高くなるにつれて、腎組織への十分な分化誘導能が確認された。
具体的には、図６に示す細胞の培養形態が確認された。図６において、ｒＫＳ５６細胞塊を作る際の細胞数は、ａ）ｇ）及びｍ）では６．２５×１０３個、ｂ）ｈ）及びｎ）では１．２５×１０４個、ｃ）ｉ）及びｏ）では２．５×１０４個、ｄ）ｊ）及びｐ）では５．０×１０４個、ｅ）ｋ）及びｑ）では１．０×１０５個、並びにｆ）ｌ）及びｒ）では２．０×１０５個であった。また、培養１日目の形態をａ）ｂ）ｃ）ｄ）ｅ）及びｆ）に示し、培養７日目の形態をｇ）ｈ）ｉ）ｊ）ｋ）及びｌ）に示し、並びに培養２１日目の形態をｍ）ｎ）ｏ）ｐ）ｑ）及びｒ）に示した。【００５１】
（実施例４）三次元培養における培地の条件を変えたときの培養細胞形態について
実施例１に記載の細胞塊の作製法と同手法にて作製したｒＫＳ５６細胞の細胞塊を、二次元培養した場合、又は各種培養液の組成を変えて三次元培養したときの各種細胞形態を確認した。
培養は、以下のａ）〜ｐ）の条件で行なった。各培養液には、１％のペニシリン及びストレプトマイシンを添加した。また、本実施例では、ａ）の培養液で培養した際、スキャホールドを用いず、二次元培養を行なった。その他の組成の培養液で培養したときは、三次元培養を行なった。また、細胞塊の二次元培養および三次元培養は、二段階に分けることなく、培養開始時から各種組成を全て含む培養液で培養を行った。【００５２】
１）各培養液
ａ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ＧＤＮＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）＋ｂ−ＦＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）＋ＨＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）＋ＥＧＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ７（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｂ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ
ｃ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ＧＤＮＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｄ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ｂ−ＦＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｅ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ＨＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｆ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ＧＤＮＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）＋ｂ−ＦＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）＋ＨＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｇ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ＥＧＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）での変化
ｈ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ＢＭＰ７（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ＥＧＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ７（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｊ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ＧＤＮＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）＋ｂ−ＦＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）＋ＨＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）＋ＥＧＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ７（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｋ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋アクチビン（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｌ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋フォリスタチン（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｍ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ＥＧＦ（１０００ｎｇ／ｍｌ）＋ＢＭＰ７（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｎ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ＨＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）＋アクチビン（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｏ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ＬＩＦｓＲα（２５０ｎｇ／ｍｌ）
ｐ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ＋ｎｅｐｈｒｏｎｅｃｔｉｎ（２５０ｎｇ／ｍｌ）【００５３】
２）２１日培養後の培養形態結果
各条件で、２１日培養した後の観察結果を以下に示した（図７参照）。なお、ｍ）の条件については、ロジスティクスの関係上、培養４日目の観察結果を示す。
ａ）の培養条件では、三次元培養をしないと形態形成をしないことが示された（細胞の形態は変化しており、分化していることが示唆される）。
ｂ）の培養条件では、成長因子をいれないと形態形成しないことが確認された。
ｃ）の培養条件では、ＧＤＮＦのみでは数個の長い管腔構造ができることが確認された。
ｄ）の培養条件では、ｂ−ＦＧＦのみで、太い管腔構造ができることが確認された。
ｅ）の培養条件では、ＨＧＦのみでは管腔構造などができるが形態が不十分であることが確認された。
ｆ）の培養条件では、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ及びｂ−ＦＧＦを含む培養液では形態形成が比較的確認された。管腔の構造の太細ははっきりせず、後のＥＧＦやＢＭＰ７を含む培養液で培養した方がより正常の腎臓に近いものができやすいことが確認された。
ｇ）の培養条件では、ＥＧＦのみでは曲がった管腔構造ができやすいことが確認された。
ｈ）の培養条件では、先端に糸球体様構造が多数できていることが確認された。
ｉ）の培養条件では、塊の中に嚢胞状のものができていることが確認され、多発性嚢胞腎様形態が確認された。
ｊ）の培養条件では、腎臓形態に近い形態が確認された。
ｋ）の培養条件では、全く変化がないことが確認された。
ｌ）の培養条件では、曲がった太い管腔構造が確認された。（糸球体様構造なし）
ｍ）の培養条件では、塊の中に嚢胞状のものができていることが確認され、ｉ）の多発性嚢胞腎様形態に比べてよりはっきりした形態形成が確認された。
ｎ）の培養条件では、ＨＧＦ及びアクチビンを含む培養液で、一部に管腔構造ができることが確認された。
ｏ）の培養条件では、全く変化がないことが確認された。
ｐ）の培養条件では、全く変化がないことが確認された。
以上で、条件により、形態形成が違ってくることが確認された。特に、ｉ）およびｍ）では、多発性嚢胞腎様形態を確認することができた。これらの多発性嚢胞腎様形態を有する組織細胞は、病変モデルとして有用である。このような病変モデルは、新たな薬剤に対する腎障害等のテストを、生体内投与で試す前に、in vitroで障害部位について検討可能なバイオアッセイ系のツールとして応用することができ、例えば、多発性嚢胞腎の治療のための治療薬等に関し、新規薬剤のスクリーニング、アッセイの材料として利用可能である。【００５４】
（実施例５）培養４日目の三次元培養形態の確認及び各種マーカーの確認
実施例１と同手法にて培養する際、三次元培養における培養条件を多発性嚢胞腎様条件または腎臓様構造条件とした結果、培養４日目に尿管芽様細胞（ＵＢ）とその周囲の後腎間葉様細胞（ＭＭ）を観察することができた（図８参照）。なお、ＭＭ条件とは腎臓様構造条件のことを意味し、ＵＢ条件とは多発性嚢胞腎様条件のことを意味する。ＵＢ及びＭＭの細胞表面の各種マーカーを、ＲＴ−ＰＣＲの手法にて確認した。各種マーカーについて、ＲＴ−ＰＣＲを行なうためのプライマーを、表１に示した。【００５５】
【表１】
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【００５６】
アクアポリン（Aquaporin、ＡＱＰ）とは細胞膜に存在する細孔を持ったタンパク質であり、哺乳類が持つアクアポリンは１３種類が知られているが、その内６種類は腎臓にある。これらのうち、ＡＱＰ−１は近位尿細管のマーカーであり、ＡＱＰ−２は遠位尿細管のマーカーである。また、ネフリン(Nephrin)は糸球体上皮細胞に局在するタンパク質である。培養４日目の細胞において上記各マーカーが検出されたことから、上記培養により、ｒＫＳ５６細胞は腎臓の各種組織に分化しうることが示唆された（図９）。【００５７】
（実施例６）培養形態の観察
１）培養２週目の培養細胞
実施例１に記載の培養手順にて三次元培養２週後のバイオ人工腎臓の形態を顕微鏡にて観察した。
培養した細胞塊から尿細管様の管腔構造が多数認められ、その構造は極性を持った細胞で構築されていた。また、管腔の先端には糸球体様の球体構造が認められた（図１０）。【００５８】
２）培養３週目の培養細胞
上記培養手順にて三次元培養３週後のバイオ人工腎臓の形態を顕微鏡にて観察した。管腔構造にも変化が認められ、同じ管腔でも太さや、曲部などを伴う管腔も認められ、腎臓でいう近位尿細管のような太く、曲がった管腔からまっすぐの構造で細い、ヘンレのループや遠位尿細管のような構造が認められた（図１１）。【００５９】
３）培養３週目の培養細胞（球体様構造の観察）
上記培養手順にて三次元培養３週後のバイオ人工腎臓の形態をさらに観察してみると、条件によっては、先端に球体様構造を伴い、それに管腔構造が続き、それらが徐々にあつまり、腎杯様の構造に注ぐ腎臓用の構造が認められた。この構造は、腎臓の基本構造単位であるネフロンに近く、それらが、複数個集まっており、臓器様の構造を呈していると思われた（図１２）。【００６０】
４）培養３週目の培養細胞（遠位尿細管構造の観察）
上記培養手順にて三次元培養３週後のバイオ人工腎臓の遠位尿細管（管腔構造）の形態を電子顕微鏡にて観察した。primary  cillaをともなった管腔の細胞が認められ、極性をもち、細胞が存在していると思われ、ただ単に、細胞が管腔構造をとっているのではなく、極性をもち、お互いに位置を確認し、存在、機能していると考えられた（図１３）。【００６１】
５）培養３週目の培養細胞（ボーマン嚢様の観察）
上記培養手順にて三次元培養３週後のバイオ人工腎臓の糸球体の形態を電子顕微鏡にて観察した。管腔の先端の球体構造は、電子顕微鏡にて、外側にボーマン嚢様の細胞構築が認められ、その中に、管腔構造を伴った糸球体様構造が認められた（図１４）。【００６２】
６）培養３週目の培養細胞（近位尿細管構造の観察）
上記培養手順にて三次元培養３週後のバイオ人工腎臓の近位尿細管（管腔構造）の形態を電子顕微鏡にて観察した。
さらに同じ管腔構造も、絨毛が多数認められる近尿細管構造と同じ構造が電子顕微鏡レベルでも確認された（図１５）。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
以上詳述したように、本発明の幹細胞の組織細胞への分化誘導方法により、細胞を分化誘導させることができる。具体的には、腎臓幹細胞／前駆細胞から腎臓の遠位尿細管、糸球体、近位尿細管などに分化させることができ、in vitroで腎臓様構造の再構築が可能であった。これにより、バイオ人工臓器を作製することができ、さらにはバイオ人工臓器を含む医療用材料を提供することができる。【００６４】
バイオ人工臓器を用いることで、腎障害治療薬等の薬剤に関し、腎臓障害のどの部位（セグメント）で薬剤が有効に作用するかなどの分析や、新規薬剤のスクリーニング、アッセイを行うことができる。また、成体から幹細胞／前駆細胞を取り出すことで、そのヒト特有の自己由来バイオ人工臓器の作製が可能となる。また、本発明のバイオ人工臓器や医療用材料は、従来臓器移植でしか対応できなかった疾患に対しても、提供することが可能となり、非常に有用である。さらに、自己由来バイオ人工臓器や医療用材料は、拒絶反応の心配もなく、安全性にも優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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