(57)【要約】  本発明は、ヒトＴｒｏｐ−２細胞外領域に特異的に結合するヒトＴｒｏｐ−２に対するモノクローナル抗体または該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いる抗体または抗体断片の製造方法または該抗体断片を用いる治療薬または診断薬に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域のうち、少なくともドメインＩに結合するヒトＴｒｏｐ−２に対するモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３４番目〜７２番目の少なくとも１つのアミノ酸に結合する請求項１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項３】
抗体の抗原に対する解離定数（ＫＤ）が５×１０−１０Ｍ以下である請求項１または２に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項４】
高いＡＤＣＣ活性および抗腫瘍活性を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項５】
ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１３〜１５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１６〜１８で表されるアミノ酸配列である抗体のＬ鎖を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項６】
配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨを含み、かつ配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体が結合するＴｒｏｐ−２の細胞外領域に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項７】
請求項５または６に記載の抗体と競合してＴｒｏｐ−２の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項８】
遺伝子組換え抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項９】
ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項８に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項１０】
ヒト化抗体であって、以下の（ａ）ＶＨおよび（ｂ）ＶＬの少なくとも一方を含む請求項９に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
（ａ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列、または配列番号２４で表されるアミノ酸配列の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を行ったアミノ酸配列含むＶＨ。
（ｂ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列、または配列番号２６で表されるアミノ酸配列の１５番目のＬｅｕをＡｌａに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を行ったアミノ酸配列を含むＶＬ。
【請求項１１】
以下の（１）〜（５）から選ばれる請求項１０に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
（１）配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
（２）配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
（３）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
（４）配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
（５）配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
【請求項１２】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項１６】
請求項１４に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を精製蓄積させ、培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を含むヒトＴｒｏｐ−２の検出または測定用試薬。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を有効成分として含有するヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の診断薬。
【請求項１９】
ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患が癌である、請求項１８に記載の診断薬。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を有効成分として含有するヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の治療薬。
【請求項２１】
ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患が癌である、請求項２０に記載の治療薬。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いてヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞を検出または測定することを含む、ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いてヒトＴｒｏｐ−２を検出または測定することを含む、ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
【請求項２４】
ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患が癌である、請求項２２または２３に記載の診断方法。
【請求項２５】
ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の診断薬を製造するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
【請求項２６】
ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患が癌である、請求項２５に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
【請求項２７】
ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の治療薬を製造するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
【請求項２８】
ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患が癌である、請求項２７に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高いアフィニティーでヒトＴｒｏｐ−２細胞外領域に結合し、かつ高い抗体依存的細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下ＡＤＣＣ活性と記す）、高い抗腫瘍活性を発揮するモノクローナル抗体またはその抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法、抗体または該抗体断片を用いる治療薬および診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｒｏｐ−２は別名Ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ２（ＴＡＣＳＴＤ２）、ＧＡ７３３−１、ｇｐ５０、Ｔ１６としても知られる、３２３アミノ酸から成るＩ型膜タンパク質である。Ｔｒｏｐ−２は、ヒト栄養芽細胞に反応するモノクローナル抗体１６２−２５．３、１６２−４６．２の認識タンパク質として見出された（非特許文献１）。【０００３】
Ｔｒｏｐ−２の遺伝子は、１９８９年にクローニングされている（非特許文献２）。Ｔｒｏｐ−２のＤＮＡ配列、アミノ酸配列および立体構造は、公的データベース上に公開されており、例えば、ＮＰ＿００２３４４、ＮＭ＿００２３５３（ＮＣＢＩ）等のアクセッション番号から参照可能である。Ｔｒｏｐ−２のアミノ酸配列は、Ｎ末端２６アミノ酸から成るシグナル配列、２４８アミノ酸から成る細胞外ドメイン、２３アミノ酸から成る膜貫通ドメイン、２６アミノ酸から成る細胞内ドメインで構成されている。Ｔｒｏｐ−２の分子量の理論計算値は３５キロダルトンであるが、糖鎖付加を受け、１０キロダルトン前後増加することが知られている。【０００４】
Ｔｒｏｐ−２は、ファミリー分子であるＥｐＣＡＭ（別名Ｔｒｏｐ−１）と、同一のシステイン残基の数および位置を有することから、構造が類似することが推定されている（非特許文献２）。ＥｐＣＡＭの細胞外領域は、システイン残基に富むＮ末端側の二つのドメインと、システイン残基の少ないＣ末端側のドメインの、３つのドメインから成る（非特許文献１５）。ＥｐＣＡＭにおいては、Ｎ末端側の第一のドメインは細胞間のＥｐＣＡＭ同士の接着に、第二のドメインは同一細胞膜上のＥｐＣＡＭ同士の相互作用に関与することが知られている（非特許文献１５）。【０００５】
Ｔｒｏｐ−２は多くの癌で発現が認められており、発現と予後不良との相関も報告されている（非特許文献３−９）。また、大腸癌において、足場非依存性増殖への関与が報告されている（非特許文献１０）。正常組織におけるＴｒｏｐ−２の発現は、いくつかの組織の上皮細胞に限られていると報告されている。【０００６】
１６２−２５．３、１６２−４６．２が報告されて以降、Ｔｒｏｐ−２に対するモノクローナル抗体は複数樹立されている（非特許文献１１−１３、特許文献１−３）。７７２２０など、試薬として市販されている抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体もある。これら、樹立された抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体のいくつかは癌治療への利用が検討されている。【０００７】
抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体の一つであるＢＲ１１０（特許文献１）は細胞表面のＴｒｏｐ−２に結合後、細胞内にインターナリゼーションすることから、抗細胞薬剤とのコンジュゲートの検討例が報告されている。本コンジュゲートはＨ２９８７、Ｈ３３９６、Ｈ３６１９、ＭＣＦ−７といった癌細胞に対して細胞傷害活性を示すことが開示されている。【０００８】
抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体の一つであるＲＳ７（特許文献２、非特許文献１１、１４、１６）は細胞表面のＴｒｏｐ−２に結合後、細胞内にインターナリゼーションすることから、抗細胞薬剤とのコンジュゲートの検討例が報告されている。該抗体のヒト化抗体ｈＲＳ７と放射性同位元素（１３１Ｉ、１３１Ｉ−ＩＭＲ−Ｒ４）とのコンジュゲートは、乳癌細胞株を用いたヒト癌細胞異所移植モデルで抗腫瘍活性を示すことが開示されている。【０００９】
抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体の一つであるＡＲ４７Ａ６．４．２（特許文献３）およびＡＲ５２Ａ３０１．５（特許文献４）は、標的細胞であるＴｒｏｐ−２発現癌細胞を特異的に傷害することにより薬効を発揮する抗体である。特許文献３および４には、これらの抗体が癌細胞を直接的に殺傷することが開示されている。【００１０】
また、ＡＲ４７Ａ６．４．２のヒト化抗体ｈｕＡＲ４７Ａ６．４．２（特許文献５）は細胞内のＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ−ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ（ＥＲＫ）の活性化を抑制することが開示されている。さらに、特許文献５には、補体依存性細胞傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下ＣＤＣ活性と表記する）については、ｈｕＡＲ４７Ａ６．４．２は、補体価の高いウサギ血清を用いた場合に、Ｔｒｏｐ−２陽性のヒト細胞株に対してＣＤＣ活性を示すことが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９７／１４７９６号
【特許文献２】国際公開第２００３／０７４５６６号
【特許文献３】国際公開第２００７／０９５７４８号
【特許文献４】国際公開第２００７／０９５７４９号
【特許文献５】国際公開第２００８／１４４８９１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８，５１４７（１９８１）
【非特許文献２】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６２，６１０（１９９５）
【非特許文献３】Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．，２１，１８６（２００８）
【非特許文献４】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１２，３０５７（２００６）
【非特許文献５】Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９９，１２９０（２００８）
【非特許文献６】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，６２，１５２（２００９）
【非特許文献７】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４６，９４４（２０１０）
【非特許文献８】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２，５３２５（２００２）
【非特許文献９】Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４，３２０（２００４）
【非特許文献１０】Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，７，２８０（２００８）
【非特許文献１１】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９，２９７（１９８７）
【非特許文献１２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５０，１３３０（１９９０）
【非特許文献１３】Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１１，５３９（１９９２）
【非特許文献１４】Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，８４，１７３，（２００４）
【非特許文献１５】Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２１，２５７０（２００１）
【非特許文献１６】Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１７，３１５７(２０１１)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、特許文献１に記載のＢＲ１１０は、抗細胞薬剤を結合していない場合には細胞傷害活性を持たない。また、特許文献２、非特許文献１１、１４および１６に記載のＲＳ７は、抗細胞薬剤を結合していない場合には細胞傷害活性を示さない。また、特許文献５に記載のｈｕＡＲ４７Ａ６．４．２のＡＤＣＣ活性については報告がない。【００１４】
さらに、ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域に高いアフィニティーで結合する抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体については報告がない。ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域に高いアフィニティーで結合する抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体は、ヒトＴｒｏｐ−２陽性のヒト細胞株に対して高いＡＤＣＣ活性および抗腫瘍活性を示すと考えられる。【００１５】
したがって、本発明は、高いアフィニティーでヒトＴｒｏｐ−２細胞外領域に結合するヒトＴｒｏｐ−２に対するモノクローナル抗体または該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いる抗体または抗体断片の製造方法または該抗体断片を用いる治療薬または診断薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域のうち、少なくともドメインＩに結合するヒトＴｒｏｐ−２に対するモノクローナル抗体または該抗体断片。
２．配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、３４番目〜７２番目の少なくとも１つのアミノ酸に結合する前項１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
３．抗体の抗原に対する解離定数（ＫＤ）が５×１０−１０Ｍ以下である前項１または２に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
４．高いＡＤＣＣ活性および抗腫瘍活性を有する前項１〜３のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
５．相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１〜３がそれぞれ配列番号１３〜１５で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１６〜１８で表されるアミノ酸配列である抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含む、前項１〜４のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
６．配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）を含み、かつ配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）を含む抗体が結合するＴｒｏｐ−２の細胞外領域に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
７．前項５または６に記載の抗体と競合してＴｒｏｐ−２の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
８．遺伝子組換え抗体である、前項１〜７のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
９．ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、前項８に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
１０．ヒト化抗体であって、以下の（ａ）ＶＨおよび（ｂ）ＶＬを含む前項９に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
（ａ）配列番号２４で表されるアミノ酸配列、または配列番号２４で表されるアミノ酸配列の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を行ったアミノ酸配列含むＶＨ。
（ｂ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列、または配列番号２６で表されるアミノ酸配列の１５番目のＬｅｕをＡｌａに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を行ったアミノ酸配列を含むＶＬ。
１１．以下の（１）〜（５）から選ばれる前項１０に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
（１）配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
（２）配列番号３０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
（３）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
（４）配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号３６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
（５）配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
１２．Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である、前項１〜１１のいずれか１に記載の抗体断片。
１３．前項１〜１２のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
１４．前項１３に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
１５．前項１４に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
１６．前項１４に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に前項１〜１２のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を精製蓄積させ、培養物から該抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする前項１〜１２のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の製造方法。
１７．前項１〜１２のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を含むヒトＴｒｏｐ−２の検出または測定用試薬。
１８．前項１〜１２のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を有効成分として含有するヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の診断薬。
１９．ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患が癌である、前項１８に記載の診断薬。
２０．前項１〜１２のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を有効成分として含有するヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の治療薬。
２１．ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患が癌である、前項２０に記載の治療薬。
２２．前項１〜１２のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いてヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞を検出または測定することを含む、ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
２３．前項１〜１２のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いてヒトＴｒｏｐ−２を検出または測定することを含む、ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
２４．ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患が癌である、前項２２または２３に記載の診断方法。
２５．ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の診断薬を製造するための、前項１〜１２のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
２６．ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患が癌である、前項２５に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
２７．ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の治療薬を製造するための、前項１〜１２のいずれか１に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
２８．ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患が癌である、前項２７に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の使用。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のヒトＴｒｏｐ−２に対するモノクローナル抗体または該抗体断片は、ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域のうち少なくともドメインＩを特異的に認識し、該細胞外領域に高いアフィニティーで結合することができる。これにより、本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片は、ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞に対し、高いＡＤＣＣ活性および抗腫瘍活性を有することができる。したがって、本発明のヒトＴｒｏｐ−２に対するモノクローナル抗体または該抗体断片は、ヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の治療および診断等に非常に有用である。【００１８】
また、本発明は、前記抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法、抗体または該抗体断片を用いる治療薬および診断薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１（ａ）は、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３に対するＫＭ４０９７の反応性をＦＣＭにより解析した結果を示す。図１（ｂ）は、ヒト卵巣癌細胞株ＣａＯＶ−３に対するＫＭ４０９７の反応性をＦＣＭにより解析した結果を示す。図１（ｃ）は、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７に対するＫＭ４０９７の反応性をＦＣＭにより解析した結果を示す。図１（ｄ）は、ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５に対するＫＭ４０９７の反応性をＦＣＭにより解析した結果を示す。図１（ａ）〜（ｄ）において、黒部分はＫＭ４０９７を１０μｇ／ｍＬ添加した時のヒストグラムを、白部分は陰性対照抗体でのヒストグラムを示す。
【図２】図２は、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３へのｃＡＲ４７Ａ６．４．２の結合に対する、抗Ｔｒｏｐ−２マウスモノクローナル抗体の拮抗作用を、ＦＣＭにより解析した結果を示す。横軸には各抗体の濃度を、縦軸にはｃＡＲ４７Ａ６．４．２の結合を表すＭＦＩ値を示す。●はＫＭ４０９７を、□は７７２２０を共存させた場合のＭＦＩ値を示す。
【図３】図３は、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３への各抗Ｔｒｏｐ−２マウスモノクローナル抗体の結合に対する、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２の拮抗作用を、ＦＣＭにより解析した結果を示す。横軸にはｃＡＲ４７Ａ６．４．２の濃度を、縦軸には各競合抗体の結合を表すＭＦＩ値を示す。●はＫＭ４０９７を、□は７７２２０を共存させた場合のＭＦＩ値を示す。
【図４】図４は、組換えＴｒｏｐ−２へのＫＭ４０９７の結合に対する、抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体の拮抗作用を、バインディングＥＬＩＳＡで解析した結果を示す。横軸には各抗体の濃度を、縦軸にはＫＭ４０９７の結合率（％）を示す。■はｃＡＲ４７Ａ６．４．２を、□は７７２２０を共存させた場合のＫＭ４０９７の結合率（％）を示す。
【図５】図５は、組換えＴｒｏｐ−２への７７２２０の結合に対する、抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体の拮抗作用をバインディングＥＬＩＳＡで解析した結果を示す。横軸には各抗体の濃度を、縦軸には７７２２０の結合率（％）を示す。●はＫＭ４０９７を、■はｃＡＲ４７Ａ６．４．２を、△はＭＯｖ１６を共存させた場合の７７２２０の結合率（％）を示す。
【図６】図６（ａ）および（ｂ）は、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７細胞に対する抗Ｔｒｏｐ−２抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。図６（ａ）はドナー１、図６（ｂ）はドナー２の結果である。横軸に各抗体の濃度を、縦軸に細胞傷害活性率（％）を示す。●はＫＭ４５９０を、◇はｃＡＲ４７Ａ６．４．２をそれぞれ表す。結果を３ウェルの平均値±標準誤差で表す。＊はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔの結果、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２と比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）ことを示す。
【図７】図７（ａ）および（ｂ）は、ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５細胞に対する抗Ｔｒｏｐ−２抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。図７（ａ）はドナー１、図７（ｂ）はドナー２の結果である。横軸に各抗体の濃度を、縦軸に細胞傷害活性率（％）を示す。●はＫＭ４５９０を、◇はｃＡＲ４７Ａ６．４．２をそれぞれ表す。結果を３ウェルの平均値±標準誤差で表す。＊はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔの結果、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２と比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）ことを示す。
【図８】図８（ａ）および（ｂ）は、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７細胞に対する抗Ｔｒｏｐ−２抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。図８（ａ）はドナー１、図８（ｂ）はドナー２の結果である。横軸に抗体の濃度を、縦軸に細胞傷害活性率（％）を示す。●はＫＭ４５９０を、○はＫＭ４５９１をそれぞれ表す。結果を３ウェルの平均値±標準誤差で表す。
【図９】図９（ａ）および（ｂ）は、ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５細胞に対する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を示す。図９（ａ）はドナー１、図９（ｂ）はドナー２の結果である。横軸に各抗体の濃度を、縦軸に細胞傷害活性率（％）を示す。●はＫＭ４５９０を、○はＫＭ４５９１をそれぞれ表す。結果を３ウェルの平均値±標準誤差で表す。
【図１０】図１０は、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３異所移植マウスにおける抗Ｔｒｏｐ−２キメラ抗体の抗腫瘍結果を示す。縦軸が腫瘍体積、横軸が細胞株移植後の経過日数を示す。○はＰＢＳ投与群、■はｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐ投与群、●はＫＭ４５９１投与群を示す。結果を６個体の平均値±標準誤差で表す。＊はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔの結果、ＫＭ４５９１投与群がＰＢＳ投与群と比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）ことを示す。＃はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔの結果、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐ投与群がＰＢＳ投与群と比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）ことを示す。
【図１１】図１１は、ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５異所移植マウスにおける抗Ｔｒｏｐ−２キメラ抗体の抗腫瘍結果を示す。縦軸が腫瘍体積、横軸が細胞株を移植後の経過日数を示す。○はＰＢＳ投与群、■はｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐ投与群、●はＫＭ４５９１投与群を示す。結果を５個体の平均値±標準誤差で表す。＊、＊＊、＊＊＊はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔの結果、ＫＭ４５９１投与群がＰＢＳ投与群と比較して有意に異なる（それぞれ、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）ことを示す。＃はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔの結果、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐ投与群がＰＢＳ投与群と比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）ことを示す。
【図１２】図１２は、設計したＫＭ４０９７ヒト化抗体のＨ鎖可変領域ＨＶ０、ＨＶ２、ＨＶ３ａ、ＨＶ３ｂ、ＨＶ４、ＨＶ５ａ、ＨＶ５ｂ、ＨＶ５ｃ、ＨＶ６、ＨＶ８、ＨＶ９、ＨＶ１０のアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３は、設計したＫＭ４０９７ヒト化抗体のＬ鎖可変領域ＬＶ０、ＬＶ２、ＬＶ３ａ、ＬＶ３ｂ、ＬＶ４のアミノ酸配列を示す。
【図１４】図１４（ａ）〜（ｆ）は、各種抗Ｔｒｏｐ−２マウスモノクローナル抗体の組換えＴｒｏｐ−２への結合に対する、ＫＭ４５９０またはｃＡＲ４７Ａ６．４．２の拮抗作用をバインディングＥＬＩＳＡで解析した結果を示す。横軸には各キメラ抗体の濃度を、縦軸には各マウスモノクローナル抗体の結合率（％）を示す。●はｃＡＲ４７Ａ６．４．２を、○はＫＭ４５９０を共存させた場合のマウスモノクローナル抗体の結合率（％）を示す。
【図１５】図１５はＴｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃ、Ｍｕｔａｎｔ  Ａ、Ｍｕｔａｎｔ  Ｂ、Ｍｕｔａｎｔ  Ｃの構造の模式図を示す。
【図１６】図１６（ａ）〜（ｃ）は、Ｔｒｏｐ−２細胞外領域蛋白質またはそのドメイン欠失体に対してウェスタンブロットでＫＭ４５９０［図１６（ａ）］、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２［図１６（ｂ）］または抗ヒトＩｇＧ（Ａｎｔｉ−Ｆｃ）［図１６（ｃ）］を反応させた結果を示す。レーン１、２、３、４はそれぞれ、Ｔｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃ、Ｍｕｔａｎｔ  Ａ、Ｍｕｔａｎｔ  Ｂ、Ｍｕｔａｎｔ  Ｃを示す。
【図１７】図１７（ａ）および（ｂ）は、ウェスタンブロットにおけるＫＭ４５９０またはｃＡＲ４７Ａ６．４．２のＴｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃに対する反応性を、還元処理の有無で比較した結果を示す。図１７（ａ）は、非還元状態および還元状態のＴｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／ＦｃへＫＭ４５９０またはｃＡＲ４７Ａ６．４．２を反応させた結果を示す。図１７（ｂ）は、図１７（ａ）の各ＰＤＶＦ膜より抗体を剥離し、抗ヒトＩｇＧ（Ａｎｔｉ−Ｆｃ）を反応させた結果を示す。いずれもレーン１、２はそれぞれ、非還元状態、還元状態のＴｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃを示す。
【図１８】図１８は、各ＰＤＶＦ膜における３種類のバンド（非還元状態の上下のバンドおよび還元状態のバンド）のシグナルの強さを定量し、ＫＭ４５９０またはｃＡＲ４７Ａ６．４．２を反応させた場合とＡｎｔｉ−Ｆｃを反応させた場合との比を算出した結果を示す。
【図１９】図１９（ａ）および（ｂ）は、ヒトＴｒｏｐ−２発現ＣＨＯ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す。横軸に各抗体の濃度を、縦軸に細胞傷害活性率（％）を示す。図１９（ａ）はドナー１、図１９（ｂ）はドナー２の結果である。◇はＨＶ３ａＬＶ０を、●はＨＶ４ＬＶ０を、□はＫＭ４５９１をそれぞれ表す。結果を３ウェルの平均値±標準誤差で表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域に特異的に結合する、ヒトＴｒｏｐ−２に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と略記する。）または該抗体断片に関する。本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域に高いアフィニティーで結合することにより、高いＡＤＣＣ活性および抗腫瘍活性を有する。
【００２１】
本発明におけるヒトＴｒｏｐ−２としては、配列番号１またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２３４４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２３４４で示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列から成り、かつＴｒｏｐ−２の機能を有するポリペプチド、ならびに配列番号１またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２３４４で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するポリペプチド、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつＴｒｏｐ−２の機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。
【００２２】
配列番号１またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２３４４で示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）］などを用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
【００２３】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。
【００２４】
ヒトＴｒｏｐ−２をコードする遺伝子としては、配列番号２またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２３５３で示される塩基配列が挙げられる。配列番号２またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２３５３で示される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列から成り、かつＴｒｏｐ−２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号２またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２３５３で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列から成り、かつＴｒｏｐ−２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、ならびに配列番号２またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２３５３で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡから成り、かつＴｒｏｐ−２の機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子なども、本発明におけるＴｒｏｐ−２をコードする遺伝子に包含される。
【００２５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号２またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２３５３で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
【００２６】
具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物若しくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，（１９９５）］を行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００２７】
前記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２３５３で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００２８】
真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明におけるＴｒｏｐ−２をコードする遺伝子に包含される。
【００２９】
本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，７，６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
【００３０】
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ）が１、−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ  ｂｌａｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎ  の場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）が１５および−Ｚ（ｆｉｎａｌ  Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎ  の場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。
【００３１】
配列番号１またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２３４４で示されるアミノ酸配列の部分配列から成るポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作成することができ、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。
【００３２】
また、上記の方法で作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号１またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２３４４で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
【００３３】
さらに、配列番号１またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２３４４で示されるアミノ酸配列の部分配列から成るポリペプチド、または配列番号１またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２３４４で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
【００３４】
本発明におけるヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域としては、例えば配列番号１で示される該ポリペプチドのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｐ．ｎｕａｐ．ｎａｇｏｙａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ＳＯＳＵＩ／ＳＯＳＵＩ＿ｓｕｂｍｉｔ．）、ＴＭＨＭＭ  ｖｅｒ．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）またはＥｘＰＡＳｙ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／Ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）などを用いて予測された領域などが挙げられる。具体的には、ＳＯＳＵＩにおいて予測される細胞外ドメインであるＮ末より２７４番目までが挙げられる。
【００３５】
本発明におけるヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域としては、配列番号１またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２３４４で示されるアミノ酸配列を有するＴｒｏｐ−２の細胞外領域が天然状態でとりうる構造と同等の構造を有していればいずれの構造でもよい。Ｔｒｏｐ−２の細胞外領域が天然状態でとりうる構造とは、細胞膜上に発現しているＴｒｏｐ−２の天然型の立体構造のことをいう。
【００３６】
本発明において、ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域は３つに分類され、Ｎ末側より順にドメインをＩ、ＩＩ、ＩＩＩと表される。すなわち、ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域のうち、ＥｐＣＡＭの細胞外領域のシステイン残基に富んだ２つのドメインに相同なドメインを、Ｎ末側より順に各々ドメインＩ、ドメインＩＩと表し、システイン残基の少ないＣ末側のドメインを、ドメインＩＩＩと表す。具体的には、配列番号１で表されるヒトＴｒｏｐ−２のアミノ酸配列のうち、３４番目から７２番目をドメインＩ、７３番目から１４５番目をドメインＩＩ、１４６番目から２７４番目をドメインＩＩＩと表す。本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片は、ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域のうち、少なくともドメインＩに結合する。
【００３７】
本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片が、Ｔｒｏｐ−２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合することは、固相サンドイッチ法などを用いたラジオイムノアッセイ、または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いたＴｒｏｐ−２を発現した細胞に対する公知の免疫学的検出法、好ましくは蛍光細胞染色法などの特定の抗原を発現した細胞と特定抗原に対する抗体の結合性を調べることができる。
【００３８】
例えば、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステムズ社製）などを用いる蛍光抗体染色法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］、フローサイトメトリーを用いる蛍光細胞染色法、またはＢｉａｃｏｒｅシステム（ジーイーヘルスケア社製）などを用いた表面プラズモン共鳴などの方法が挙げられる。
【００３９】
また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
【００４０】
ヒトＴｒｏｐ−２を発現した細胞としては、該Ｔｒｏｐ−２を発現していればいずれの細胞でもよく、例えばヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株、または遺伝子組換え技術により得られた細胞などが挙げられる。
【００４１】
ヒト体内に天然に存在する細胞としては、癌患者体内において該ポリペプチドが発現している細胞が挙げられ、例えば、バイオプシーなどで得られた腫瘍細胞のうちで該Ｔｒｏｐ−２が発現している細胞などが挙げられる。
【００４２】
ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株としては、上記の癌患者から得られた該Ｔｒｏｐ−２が発現している細胞を株化して得られた細胞株のうち、該Ｔｒｏｐ−２を発現している細胞株が挙げられる。例えば、ヒトから樹立された細胞株であるヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６８７）、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−２２）などが挙げられる。
【００４３】
遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、具体的には、該Ｔｒｏｐ−２をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを昆虫細胞または動物細胞などに導入することにより得られる、該Ｔｒｏｐ−２を発現した細胞などが挙げられる。
【００４４】
本発明のモノクローナル抗体は、Ｔｒｏｐ−２に高いアフィニティーで結合する抗体であることが好ましい。Ｔｒｏｐ−２に高いアフィニティーで結合する抗体とは、治療用抗体として十分なアフィニティーを有する抗体であり、抗体のＴｒｏｐ−２に対する解離定数（以下、ＫＤと記す）が１×１０−９Ｍ以下であることが好ましく、７×１０−１０Ｍ以下であることがより好ましく、５×１０−１０Ｍ以下であることが更に好ましく、１×１０−１０Ｍ以下であることが特に好ましい。
【００４５】
ＫＤを１×１０−９Ｍ以下とすることにより、治療用抗体として十分なアフィニティーでヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域に結合することができ、かつ高いＡＤＣＣ活性および抗腫瘍活性を有することができる。抗体のＴｒｏｐ−２に対する解離定数ＫＤは、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ジーイーヘルスケア社製）などを用いて算出することができ、具体的には、実施例において後述する方法により測定することができる。本発明のモノクローナル抗体は、当該測定法を用いた場合に、抗Ｔｒｏｐ−２抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２と比べて、より低い値を示す。
【００４６】
アフィニティーとは、反応速度論的な解析により測定されるものであり、例えばＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ジーイーヘルスケア社製）などを用いて測定することができる。
【００４７】
本発明において、解離が遅いとは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００において算出される抗体の解離速度定数ｋｄの値が、より小さな値を示すことである。解離速度定数ｋｄは、例えばＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いて測定され、付属ソフトウェアＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ジーイーヘルスケア社製）により算出することができる。
【００４８】
また、本発明のモノクローナル抗体は、高いＡＤＣＣ活性および抗腫瘍活性を有することが好ましく、さらにＣＤＣ活性を有することがより好ましい。
【００４９】
本発明において、「高いＡＤＣＣ活性を有する」とは、Ｔｒｏｐ−２発現細胞に対して、公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］を用いて、同時に複数の抗体のＡＤＣＣ活性を測定した場合に、抗Ｔｒｏｐ−２抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２と比べて、より高いＡＤＣＣ活性を示すことをいう。
【００５０】
本発明において、「高い抗腫瘍活性を有する」とは、Ｔｒｏｐ−２を発現する癌細胞株の担癌動物モデルにおいて、同時に複数の抗体の抗腫瘍活性を測定した場合、抗Ｔｒｏｐ−２抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２と比べて、より高い抗腫瘍活性を示すことをいう。抗腫瘍活性は、実施例において後述する方法により測定する。
【００５１】
本発明においてモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、または抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
【００５２】
モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次配列）が均一である。
【００５３】
エピトープとは、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列から成る立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列および糖鎖が結合したアミノ酸配列から成る立体構造などが挙げられる。
【００５４】
本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープは、Ｔｒｏｐ−２の一部のドメインを欠失または他のタンパク質由来のドメインと置換させた変異体を用いて抗体の結合実験を行うことにより決定することができる。
【００５５】
本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープとは、抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２が認識するエピトープとは異なるアミノ酸配列または立体構造である。ＡＲ４７Ａ６．４．２は、１７９番目から１８７番目のアミノ酸配列および、２５２番目から２６０番目までの配列をエピトープとして認識し結合することが開示されている（国際公開第２００８／１４４８９１号）。
【００５６】
本発明のモノクローナル抗体としては、ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域のうち、抗Ｔｒｏｐ−２抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２および７７２２０が結合するエピトープとは別の部位に結合するモノクローナル抗体および該抗体断片が挙げられる。
【００５７】
本発明のモノクローナル抗体としては、具体的には、ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１３〜１５で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１６〜１８で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）を含むモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５８】
また、本発明のモノクローナル抗体として、より具体的には、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体が挙げられる。
【００５９】
更に、本発明のモノクローナル抗体としては、前記モノクローナル抗体ならびに前記モノクローナル抗体と競合しＴｒｏｐ−２の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体が結合する、Ｔｒｏｐ−２の細胞外領域上に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体を挙げることができる。具体的には、ヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域のうち、少なくともドメインＩを認識する抗体および該抗体断片が挙げられる。
【００６０】
ハイブリドーマは、例えば上記のＴｒｏｐ−２を発現した細胞などを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、または該ハイブリドーマを動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体を取得することができる。
【００６１】
抗原を免疫する動物としてはハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、例えば、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリまたはラビットが挙げられる。このような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明のモノクローナル抗体に包含される。
【００６２】
本発明において遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体または抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。遺伝子組換え抗体は、例えば上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものが挙げられる。
【００６３】
ヒト型キメラ抗体とは、非ヒト動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと記す）および軽鎖定常領域（以下、ＣＬと記す）とから成る抗体をいう。本発明のヒト型キメラ抗体は、Ｔｒｏｐ−２を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにぞれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００６４】
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
【００６５】
本発明のキメラ抗体として具体的には、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。
【００６６】
更に、本発明のキメラ抗体としては、前記キメラ抗体と競合して、Ｔｒｏｐ−２の細胞外領域に結合するキメラ抗体および前記キメラ抗体が結合するＴｒｏｐ−２の細胞外領域上に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するキメラ抗体を挙げることができる。
【００６７】
ヒト化抗体とは、ヒト型相補鎖決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体を包含する。
【００６８】
本発明のヒト化抗体とは、非ヒト動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト化抗体は、非ヒト動物由来のハイブリドーマが産生しＴｒｏｐ−２に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＦＲと表記する）に各々移植して可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）のアミノ酸配列を設計し、さらに、Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００６９】
ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）などに記載の、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列などが挙げられる。
【００７０】
本発明のヒト化抗体としては、ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号１６〜１８のアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体が挙げられる。
【００７１】
本発明のヒト化抗体として、具体的には、以下の（ａ）ＶＨおよび（ｂ）ＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体などが挙げられるが、導入される改変の数に制限はない。
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４のアミノ酸配列の９番目のＡｌａ、１２番目のＬｙｓ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、９５番目のＴｙｒ、および１１２番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＨ
（ｂ）が配列番号２６のアミノ酸配列、または配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕ、１９番目のＡｌａ、２１番目のＩｌｅ、および８４番目のＬｅｕから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ  
【００７２】
更に、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＨとしては、以下の（１）〜（１１）が好ましい。
（１）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａ、１２番目のＬｙｓ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、９５番目のＴｙｒ、および１１２番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（２）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａ、１２番目のＬｙｓ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、および９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（３）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、および９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（４）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａ、３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、および９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（５）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、および９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（６）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａ、３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、および９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（７）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、および９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（８）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａ、３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、および９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（９）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａ、６７番目のＡｒｇ、および９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（１０）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、および９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（１１）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇ、および４８番目のＭｅｔが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
【００７３】
前記ＶＨのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２４のアミノ酸配列中の、９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、または１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００７４】
１０個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号２４のアミノ酸配列中の、９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列が挙げられる。
【００７５】
９個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１０）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２４のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【００７６】
８個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２４のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号２４のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
【００７７】
７個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（８）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２４のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
【００７８】
６個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１３）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号２４のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
【００７９】
５個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（５）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２４のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【００８０】
４個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（５）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２４のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【００８１】
３個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１２）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号２４のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
【００８２】
２個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１８）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２４のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号２４のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号２４のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、および４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号２４のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号２４のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号２４のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、および７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号２４のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号２４のアミノ酸配列中の６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号２４のアミノ酸配列中の６８番目のＶａｌをＡｌａに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号２４のアミノ酸配列中の７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【００８３】
１個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１０）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２４のアミノ酸配列中の９番目のＡｌａをＰｒｏに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２４のアミノ酸配列中の１２番目のＬｙｓをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２４のアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２４のアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号２４のアミノ酸配列中の４８番目のＭｅｔをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号２４のアミノ酸配列中の６７番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号２４のアミノ酸配列中の６８番目のＶａｌをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号２４のアミノ酸配列中の７０番目のＩｌｅをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号２４のアミノ酸配列中の９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号２４のアミノ酸配列中の１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
【００８４】
また、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＬとしては、以下の（１）〜（４）が好ましい。
（１）配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕ、１９番目のＡｌａ、２１番目のＩｌｅ、および８４番目のＬｅｕが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（２）配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕ、１９番目のＡｌａ、および８４番目のＬｅｕが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（３）配列番号２６のアミノ酸配列中の１９番目のＡｌａ、２１番目のＩｌｅ、および８４番目のＬｅｕが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（４）配列番号２６のアミノ酸配列中の１９番目のＡｌａ、および８４番目のＬｅｕが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
【００８５】
前記ＶＬのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＡｌａに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００８６】
４個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＡｌａに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列が挙げられる。
【００８７】
３個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（４）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２６のアミノ酸配列中の１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＡｌａに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＡｌａに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＡｌａに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、および２１番目のＩｌｅをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
【００８８】
２個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＡｌａに、および１９番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＡｌａに、および２１番目のＩｌｅをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＡｌａに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２６のアミノ酸配列中の１９番目のＡｌａをＶａｌに、および２１番目のＩｌｅをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号２６のアミノ酸配列中の１９番目のＡｌａをＶａｌに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号２６のアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
【００８９】
１個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（４）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号２６のアミノ酸配列中の１５番目のＬｅｕをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号２６のアミノ酸配列中の１９番目のＡｌａをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号２６のアミノ酸配列中の２１番目のＩｌｅをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号２６のアミノ酸配列中の８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
が挙げられる。
【００９０】
また、本発明のヒト化抗体の具体例としては、以下の（１）〜（３）のヒト化抗体が挙げられる。
（１）配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
（２）配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび図１３で示されるいずれかのアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
（３）図１２で示されるいずれかのアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号２６のアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
【００９１】
更に、本発明のヒト化抗体としては、前記ヒト化抗体と競合してＴｒｏｐ−２に反応するヒト化抗体、および前記ヒト化抗体が反応するエピトープと同じエピトープに結合するヒト化抗体も包含される。
【００９２】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
【００９３】
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球にＥＢウイルスなどを感染させて不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養し、該培養上清中より該抗体を精製することにより取得することができる。
【００９４】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００９５】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、個体を発生させることにより、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。
【００９６】
上述の抗体または抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつ上述の抗体またはその抗体断片と同様な活性を有するモノクローナル抗体またはその抗体断片も、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片に包含される。
【００９７】
欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。例えば、好ましくは１〜数十個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。
【００９８】
上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、次のことを示す。即ち、同一配列中の任意、かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
【００９９】
天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、またはＬ−システインなどが挙げられる。
【０１００】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【０１０１】
本発明において、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【０１０２】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素であるパパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１０３】
本発明のＦａｂは、本発明のモノクローナル抗体をパパインで処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。
【０１０４】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を蛋白質分解酵素であるペプシンで分解して得られる、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有する断片である。
【０１０５】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明のモノクローナル抗体をペプシンで処理して得ることができる。また、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合させ、作製することもできる。
【０１０６】
Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断して得られる、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、本発明のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより、Ｆａｂ’を発現させ製造することもできる。
【０１０７】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬまたはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドであり、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１０８】
本発明のｓｃＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより、発現させ、製造することができる。
【０１０９】
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片であり、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより、発現させ、製造することができる。
【０１１０】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。ｄｓＦｖは、システイン残基に置換するアミノ酸残基は既知の方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【０１１１】
本発明のｄｓＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより、発現させ、製造することができる。
【０１１２】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【０１１３】
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより、発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
【０１１４】
本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片に、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質、または抗体医薬などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
【０１１５】
本発明における抗体の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片のＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端側またはＣ末端側、抗体またはその抗体断片中の適当な置換基または側鎖、さらにはモノクローナル抗体またはその抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、蛋白質または抗体医薬などを化学的手法［抗体工学入門，地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
【０１１６】
また、本発明における抗体の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質または抗体医薬をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
【０１１７】
放射性同位元素としては、例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、または２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
【０１１８】
低分子の薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤、またはキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学，癌と化学療法社（１９９６）］、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、またはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法，医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
【０１１９】
抗癌剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３（Ｆｌｔ３）阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｏｔｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、イレッサ、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール−トランスレチノイン酸、サリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ−ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケトコナゾール、ア���ノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート、マイタンシノイド、またはその誘導体、などが挙げられる。
【０１２０】
低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、または水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
【０１２１】
高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、またはヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。
【０１２２】
これらの高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的または生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失または抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品，廣川書店（１９９３）］。
【０１２３】
ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、例えば、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品，廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１−１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６−２３５８７号公報）、またはアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２−１１７９２０号公報）などが挙げられる。
【０１２４】
免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、またはαガラクトシルセラミドなどが挙げられる。
【０１２５】
蛋白質としては、ＮＫ細胞、マクロファージ、または好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカイン若しくは増殖因子、または毒素蛋白質などが挙げられる。
【０１２６】
サイトカインまたは増殖因子としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＮＦと記す）−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）などが挙げられる。
【０１２７】
毒素蛋白質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシン、またはＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
【０１２８】
抗体医薬としては、例えば、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗原、病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体が挙げられる。
【０１２９】
抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）−Ｃｌａｓｓ  ＩＩ、またはＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）などが挙げられる。
【０１３０】
腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗体の抗原としては、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、またはＢ７−Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、またはＢＴＬＡ）、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、またはＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、またはＴＲＡＩＬ−Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ  Ｂ  ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体４、サイトカイン［ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）β、またはＴＮＦαなど］、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ−３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、またはＣＴＡＣＫなど）、またはこれらのケモカインの受容体が挙げられる。
【０１３１】
病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、例えば、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ＥＧＦ、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ−８、Ｅｐｈｉｌｉｎ、ＳＤＦ−１、またはこれらの受容体などが挙げられる。
【０１３２】
蛋白質または抗体医薬との融合抗体は、モノクローナル抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させることにより、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより、融合抗体を発現させ製造することができる。
【０１３３】
検出方法、定量方法、検出用試薬、定量用試薬または診断薬として上記抗体の誘導体を使用する場合に、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片に結合させる薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体が挙げられる。
【０１３４】
標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステルおよびロフィンなどの発光物質、並びにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
【０１３５】
また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含有するＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の治療薬に関する。
【０１３６】
Ｔｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患としては、例えば、Ｔｒｏｐ−２が発現している細胞が関与する疾患であればいかなるものでもよく、例えば癌が挙げられる。
【０１３７】
癌としては、例えば、血液癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌または膵臓癌などが挙げられ、好ましくは血液癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌または前立腺癌が挙げられる。
【０１３８】
本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【０１３９】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内または静脈内などの非経口投与が挙げられる。中でも、静脈内投与が好ましい。
【０１４０】
投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、またはテープ剤などが挙げられる。
【０１４１】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、および体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１４２】
さらに、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を有効成分として含有する、Ｔｒｏｐ−２の免疫学的検出または測定方法、Ｔｒｏｐ−２の免疫学的検出用または測定用試薬、Ｔｒｏｐ−２が発現する細胞の免疫学的検出または測定方法、およびＴｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の診断薬に関する。
【０１４３】
本発明においてＴｒｏｐ−２の量を検出または測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出または測定方法などが挙げられる。
【０１４４】
免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
【０１４５】
本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いてＴｒｏｐ−２が発現した細胞を検出または測定することにより、Ｔｒｏｐ−２が関連する疾患を診断することができる。
【０１４６】
該ポリペプチドが発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、例えば、免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法、または蛍光抗体染色法などが、好ましく挙げられる。また、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などの蛍光抗体染色法なども挙げられる。
【０１４７】
本発明においてＴｒｏｐ−２を検出または測定する対象となる生体試料としては、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液、または培養液など、Ｔｒｏｐ−２が発現した細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
【０１４８】
本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、例えば、緩衝剤、塩などが挙げられる。
【０１４９】
検出用試薬としては、例えば、該モノクローナル抗体若しくはその抗体断片、またはこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、または標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬が挙げられる。
【０１５０】
以下に、本発明のモノクローナル抗体の製造方法、疾患の治療方法、および疾患の診断方法について、具体的に説明する。
【０１５１】
１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
抗原となるＴｒｏｐ−２またはＴｒｏｐ−２を発現させた細胞は、Ｔｒｏｐ−２全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、Ｔｒｏｐ−２を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト組織などからＴｒｏｐ−２を精製し、得ることができる。また、該腫瘍培養細胞、または該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＴｒｏｐ−２の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
【０１５２】
本発明で用いられるＴｒｏｐ−２は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該Ｔｒｏｐ−２をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
【０１５３】
まず、Ｔｒｏｐ−２をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
【０１５４】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体上への組込みが可能であり、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものであれば、いずれも用いることができる。
【０１５５】
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、または動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
【０１５６】
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、Ｔｒｏｐ−２をコードする部分を含むＤＮＡ、および転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
【０１５７】
該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【０１５８】
また、該Ｔｒｏｐ−２をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＴｒｏｐ−２の生産率を向上させることができる。
【０１５９】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３―２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、またはｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。
【０１６０】
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、またはＴ７プロモーターなどの、大腸菌やファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、またはｌｅｔ  Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
【０１６１】
宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、または大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
【０１６２】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）］が挙げられる。
【０１６３】
動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７  ［日本国特開平３−２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、またはｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。
【０１６４】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、またはモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０１６５】
宿主細胞としては、例えば、ヒトバーキットリンパ腫細胞Ｎａｍａｌｗａ、サル腎臓細胞ＣＯＳ、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）；  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０  ，１２７５（１９６８）；  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）；  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）；  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）；  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）；  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６０，１２７５（１９６８）；  Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，ＩＩ（ｐｐ．８８３−９００）；）、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ  ＃  １１６１９）、Ｐｒｏ−３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫまたはヒト白血病細胞ＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３−０００２９９号公報）、などが挙げられる。
【０１６６】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などが挙げられる。
【０１６７】
以上のようにして得られるＴｒｏｐ−２をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する、微生物または動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該Ｔｒｏｐ−２を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、Ｔｒｏｐ−２を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１６８】
真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたＴｒｏｐ−２を得ることができる。
【０１６９】
誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを、培地に添加してもよい。
【０１７０】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、またはこれらの培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１７１】
Ｔｒｏｐ−２をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産または融合蛋白質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を用いることができる。
【０１７２】
Ｔｒｏｐ−２の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるＴｒｏｐ−２の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
【０１７３】
Ｔｒｏｐ−２が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５−３３６９６３号公報、または国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、Ｔｒｏｐ−２を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１７４】
また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２−２２７０７５号公報）を利用してＴｒｏｐ−２の生産量を上昇させることもできる。
【０１７５】
得られたＴｒｏｐ−２は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
【０１７６】
Ｔｒｏｐ−２が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、またはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【０１７７】
前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【０１７８】
Ｔｒｏｐ−２が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該Ｔｒｏｐ−２の不溶体を回収する。回収した該Ｔｒｏｐ−２の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該Ｔｒｏｐ−２を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【０１７９】
Ｔｒｏｐ−２またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該Ｔｒｏｐ−２またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【０１８０】
また、本発明において用いられるＴｒｏｐ−２は、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル−ベガ社製、パーセプチブ社製、または島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【０１８１】
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、Ｔｒｏｐ−２ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
【０１８２】
免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、またはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
【０１８３】
抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
【０１８４】
抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
【０１８５】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）］、またはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］などが挙げられる。
【０１８６】
該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、および８−アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【０１８７】
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
【０１８８】
沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
【０１８９】
培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、Ｔｒｏｐ−２を含む抗原に反応し、Ｔｒｏｐ−２を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
【０１９０】
（５）精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行い、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
【０１９１】
また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％濃度のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ培地に懸濁し、３〜７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ−カラムまたはプロテインＧ−カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ培地には５％濃度のダイゴＧＦ２１を添加することもできる。
【０１９２】
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法または２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【０１９３】
（６）モノクローナル抗体の選択
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、およびＢｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析により行う。これらの方法以外に、公知の方法（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６７，１１６３（２００７））により、抗体の標的抗原を同定することで選択することもできる。
【０１９４】
（６−ａ）バインディングアッセイ
抗原としては、（１）で得られるＴｒｏｐ−２をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、またはヒト組織から得た精製ポリペプチドまたは部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡまたはＫＬＨなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
【０１９５】
抗原を９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、固相化した後、一次抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。ＰＢＳまたはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎなどで、よく洗浄した後、二次抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質または放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、二次抗体の標識物質に応じた反応を行い、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
【０１９６】
また、本発明のモノクローナル抗体と競合してＴｒｏｐ−２に結合するモノクローナル抗体は、上述のバインディングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、Ｔｒｏｐ−２の細胞外領域への結合において、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。
【０１９７】
更に、本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインディングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、またはエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
【０１９８】
（６−ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅによるカイネティクス解析
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用い、抗原と被験物の間の結合におけるカイネティクスを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、更に濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合および解離を測定する。
【０１９９】
得られたデータを元に、機器付属のソフトウエアを用いて、１：１バインディングモデルによりカイネティクス解析を行い、各種パラメータを取得する。または、ヒトＴｒｏｐ−２をセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流し、結合および解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、バイバレントバインディングモデルによるカイネティクス解析を行い、各種パラメータを取得する。
【０２００】
２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製方法を示す。
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０２０１】
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
【０２０２】
動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，１７３（１９９０）］、またはｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，７９（１９９３）］などを用いる。
【０２０３】
動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）〕、または免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］などを用いる。
【０２０４】
遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］を用いるが、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、例えば、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号公報）、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９（１９９８）］などを用いる。
【０２０５】
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【０２０６】
前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
【０２０７】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、またはラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
【０２０８】
ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）］、またはＲＮＡ  ｅａｓｙ  ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
【０２０９】
全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、またはＯｌｉｇｏ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。
【０２１０】
また、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、またはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
【０２１１】
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）、またはＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
【０２１２】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］、またはｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］などを用いる。
【０２１３】
ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］、またはＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］などを用いる。
【０２１４】
ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープまたは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］などを用いる。
【０２１５】
また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］を行うことよりＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
【０２１６】
選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］などの反応を行った後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）またはＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
【０２１７】
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
【０２１８】
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
【０２１９】
また、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴまたはＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
【０２２０】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２２１】
非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。
【０２２２】
作製されたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
【０２２３】
また、非ヒト抗体ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
【０２２４】
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
【０２２５】
非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するための、ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
【０２２６】
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などを用いる。
【０２２７】
抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
【０２２８】
次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
【０２２９】
設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＶＨ、ＶＬ各々について各６本の合成ＤＮＡを設計する。さらに、両端に位置する合成ＤＮＡの各５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
【０２３０】
ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【０２３１】
または、設計したＤＮＡ配列に基づき、ＶＨ全長およびＶＬ全長を各々１本の長鎖ＤＮＡとして合成したものを、上記ＰＣＲ増幅産物に代えて用いることもできる。さらに、合成長鎖ＤＮＡの両端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
【０２３２】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。
【０２３３】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
【０２３４】
抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７）］またはコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築および解析を行うことができる。
【０２３５】
また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト型ＣＤＲ移植抗体を取得できる。
【０２３６】
ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【０２３７】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２３８】
例えば、（４）および（５）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
【０２３９】
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）および（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
【０２４０】
発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ−７細胞［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＲＬ１６５１］を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］。
【０２４１】
ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ（１９９１）］、またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などを用いる。
【０２４２】
発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
【０２４３】
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
（３）および（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
【０２４４】
宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２−２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］などを用いる。
【０２４５】
遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ  ＃  １１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２、またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］などを用いる。
【０２４６】
また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素などの蛋白質またはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質、または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、例えばα１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５（１９８６）］などを用いることもできる。
【０２４７】
発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２−２５７８９１号公報）。
【０２４８】
動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。
【０２４９】
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系（日本国特開平２−２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換株の産生する遺伝子組換え抗体の発現量を向上させることができる。
【０２５０】
遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ−カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  −  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わせることもできる。
【０２５１】
精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］、またはウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  −  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。
【０２５２】
３．精製モノクローナル抗体またはその抗体断片の活性評価
精製した本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。Ｔｒｏｐ−２発現細胞株に対する結合活性は、前述の１−（６ａ）記載のバインディングアッセイおよび（６ｂ）記載のＢｉａｃｏｒｅシステムなどを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて測定する。
【０２５３】
また、該結合活性は、蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］などを用いて測定できる。抗原陽性培養細胞株に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］により測定することができる。
【０２５４】
４．抗体のエフェクター活性を制御する方法
本発明のモノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体の定常領域（Ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、以下、Ｆｃ領域と表記する）の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα−１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）や、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明のモノクローナル抗体にはいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。
【０２５５】
エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性傷害活性（ＣＤＣ活性）や、マクロファージや樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，ＡＤＰ活性）などが知られている。
【０２５６】
Ｆｃ領域上のＮ−結合型複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンに付加するフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加または低下させることができる。抗体のＦｃ領域に結合しているＮ結合複合型糖鎖に付加するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現することで、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。
【０２５７】
一方、抗体のＦｃ領域に結合しているＮ−結合複合型糖鎖に付加するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。
【０２５８】
また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性を増加または低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書または米国特許第７，３１７，０９１号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。
【０２５９】
更に、上述の方法を組み合わせて、一つの抗体に使用することにより、抗体のエフェクター活性が制御された抗体を取得することができる。
【０２６０】
５．本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、Ｔｒｏｐ−２陽性細胞が関与する疾患の治療に用いることができる。
【０２６１】
本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
【０２６２】
投与経路としては、例えば、経口投与、並びに口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏およびテープ剤などが挙げられる。
【０２６３】
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、または顆粒剤などが挙げられる。
【０２６４】
乳剤またはシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトールまたは果糖などの糖類、ポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油または大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、またはストロベリーフレーバーまたはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
【０２６５】
カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖またはマンニトールなどの賦形剤、デンプンまたはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースまたはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤またはグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
【０２６６】
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤または噴霧剤などが挙げられる。
【０２６７】
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
【０２６８】
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造する。
【０２６９】
噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖またはグリセリンなどを用いる。また、エアロゾルまたはドライパウダーとして製造することもできる。
【０２７０】
さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０２７１】
６．本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いた疾患の診断方法
本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いて、Ｔｒｏｐ−２またはＴｒｏｐ−２が発現した細胞を検出または測定することにより、Ｔｒｏｐ−２が関連する疾患を診断することができる。
【０２７２】
Ｔｒｏｐ−２が関連する疾患の一つである癌の診断は、例えば、以下のようにＴｒｏｐ−２の検出または測定して行うことができる。患者体内の癌細胞に発現しているＴｒｏｐ−２をフローサイトメトリーなどの免疫学的手法を用いて検出することにより診断を行うことができる。
【０２７３】
免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法または物理化学的手法などを用いる。
【０２７４】
放射免疫測定法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
【０２７５】
酵素免疫測定法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法，医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、またはビオチン標識などを用いる。
【０２７６】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体または抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、またはビオチンなどで標識しておく。
【０２７７】
上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、または眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。
【０２７８】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片との組み合わせでもよい。
【０２７９】
蛍光免疫測定法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知［蛍光抗体法，ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣ、またはＲＩＴＣなどを用いる。
【０２８０】
発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光  臨床検査４２，廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステル、ロフィンなどを用いる。
【０２８１】
ウェスタンブロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル）［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、またはビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。
【０２８２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１〜３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１〜１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。
【０２８３】
ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５〜０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
【０２８４】
物理化学的手法は、例えば、抗原であるＴｒｏｐ−２と本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法またはラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要，金原出版（１９９８）］などを用いることもできる。
【０２８５】
ラテックス免疫比濁法は、抗体または抗原を感作させた粒径０．１〜１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
【０２８６】
一方、Ｔｒｏｐ−２が発現している細胞の検出または測定は、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、好ましくは免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などを用いる。
【０２８７】
免疫沈降法は、Ｔｒｏｐ−２を発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる。または以下のような方法によっても行なうことができる。ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに上述した本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ−ＰＢＳによりブロッキングする。
【０２８８】
抗体が、例えばハイブリドーマ培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリン、抗ラットイムノグロブリン、プロテイン−Ａまたはプロテイン−ＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化し、ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を分注して結合させる。次に、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、Ｔｒｏｐ−２を発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。
【０２８９】
免疫細胞染色法または免疫組織染色法は、抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明のモノクローナル抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体またはその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。
【０２９０】
また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ−サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  −  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］により検出を行うことができる。特に、Ｔｒｏｐ−２の細胞外領域に結合する、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片は、蛍光抗体染色法により天然型の立体構造を保持して発現している細胞の検出ができる。
【０２９１】
また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体−抗原複合体と、抗体−抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定できる。
【実施例】
【０２９２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【０２９３】
［実施例１］
抗Ｔｒｏｐ−２マウスモノクローナル抗体の取得
（１）免疫原の調製
ヒト前立腺癌より癌細胞株Ｐｃ１を樹立し、免疫原として用いた。【０２９４】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
１×１０６個のＰｃ１細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに２週間間隔で５回投与し、最終投与の３日後に脾臓を摘出した。脾臓をＲＰＭＩ１６４０（以下、ＲＰＭＩ培地と表記する）中で裁断し、すりつぶして遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６）を添加し、３７℃で１分間処理することにより赤血球を除去した。さらに、沈殿画分（細胞画分）をＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。【０２９５】
（３）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）を１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン社）にて培養し、細胞融合の親株として用いた。【０２９６】
（４）アデノウィルスベクターの調製
ＩｇＧへの結合性を有するｐｒｏｔｅｉｎ  ＡのＺ３３モチーフをＨＩループ中に持つ、改変型のタイプ５アデノウィルスに、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入したＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３［Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１２，３８０３（２００６）］を、ハイブリドーマへの導入に用いた。【０２９７】
（５）ハイブリドーマの作製
実施例１（２）で得られたマウス脾細胞と実施例１（３）で得られた骨髄腫細胞を５：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した。得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、ポリエチレングリコール−４０００（ＰＥＧ−４０００）１ｍＬを約１分かけて徐々に加え、その後該細胞液に１分毎にＲＰＭＩ培地１ｍＬを数回加えた後、ＲＰＭＩ培地を加えて全量を５０ｍＬとした。該細胞懸濁液を遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）し、得られた沈殿画分の細胞をゆるやかにほぐした後、ＨＡＴ培地［１０％ウシ胎児血清およびＨＡＴ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを加えたＭＩ１６４０培地］１００ｍＬ中にゆるやかに懸濁した。該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００μＬ／ウェルずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で、５０％コンフルエントとなるまで培養した。【０２９８】
一方で９６ウェルプレートにて培養したＰｃ１細胞より培養液を除去し、上記のハイブリドーマの培養上清を添加した。４℃で１時間インキュベートした後、培養上清を除いて細胞をＰＢＳで２回洗浄し、実施例１（４）にて作製したＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を多重感染度（ＭＯＩ）１０００となるよう添加した。さらに４℃で１時間インキュベートした後、ウィルス液を除いて細胞をＰＢＳで２回洗浄した。【０２９９】
β−Ｇａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ，ｃｈｅｍｉｌｉｍｉｎｅｓｃｅｎｔキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてβ−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを行い、β−ガラクトシダーゼ活性の高いウェルを選択した。選択したウェルの細胞について限界希釈法によるクローニングを２回繰り返すことにより、Ｐｃ１細胞に反応する抗体を産生するハイブリドーマを単離した［Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６７，１１６３（２００７）］。【０３００】
（６）抗体の標的抗原の決定
実施例１（５）にて確立したハイブリドーマの標的抗原を公知の方法［Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ，６７，１１６３（２００７）］にて決定し、ハイブリドーマからＴｒｏｐ−２を認識する抗体ＫＭ４０９７を見出した。Ｉｓｏ  Ｓｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュ・アプライドサイエンス社）により、本抗体のアイソタイプはＩｇＧ１およびκと決定された。【０３０１】
［実施例２］
抗Ｔｒｏｐ−２マウス抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２のＩｇＧ１型キメラ抗体およびデフコース型抗体の作製
（１）ＡＲ４７Ａ６．４．２由来ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本発明の抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体の活性と比較するために、既存の抗Ｔｒｏｐ−２マウスモノクローナル抗体ＡＲ４７Ａ６．４．２の可変領域と、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とのキメラ抗体（以下、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２と略記する）を作製した。【０３０２】
米国特許第７４２００４０号明細書に開示されている配列情報に基づき、ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子として、配列番号３のＤＮＡおよび配列番号４のＤＮＡをおのおのｐＺＥｒＯ−２ベクターに組み込んだプラスミドをカスタム合成した（ＩＤＴ社）。【０３０３】
ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＨが組み込まれたプラスミドに対し、ＡｐａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）およびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて制限酵素処理を行い、ＶＨを含むＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片を取得した。また、ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＬが組み込まれたプラスミドに対し、ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）およびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて制限酵素処理を行い、ＶＬを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を取得した。【０３０４】
一方、抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３に対し、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩ、またはＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩの２通りの組み合わせで制限酵素処理を行った。ＶＨを含むＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片およびｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片、ならびに、ＶＬを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片およびｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片の２種類の組み合わせを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて連結した。【０３０５】
得られた該連結反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）の形質転換を行った。形質転換クローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡが各々クローニングされたｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを取得した。【０３０６】
ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＨまたはＶＬが組み込まれた各々のｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターに対し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて制限酵素処理を行い、ＶＬの組み込まれたＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片、およびＶＨの組み込まれたＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片を取得した。得られた２種類の断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて連結した。【０３０７】
得られた該連結反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）の形質転換を行った。形質転換クローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＡＲ４７Ａ６．４．２のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する、抗Ｔｒｏｐ−２ヒト型キメラ抗体発現ベクターを取得した。【０３０８】
（２）動物細胞を用いたＡＲ４７Ａ６．４．２由来ヒト型キメラ抗体の発現
実施例２（１）で得た抗体発現ベクターを、常法［Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）］により動物細胞株へ導入し、抗Ｔｒｏｐ−２ヒト型キメラ抗体を産生する形質転換株を取得した。宿主動物細胞株としては、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株、およびα１，６−フコース転移酵素（ＦＵＴ８）遺伝子をノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株（以下、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株と表記する）を用いた。【０３０９】
（３）ＡＲ４７Ａ６．４．２精製キメラ抗体の取得
実施例（２）で得られた各形質転換株の細胞懸濁液に対し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で２０分間の遠心分離を行うことにより、培養上清を回収し、さらに０．２２μｍ孔径ＭｉｌｌｅｘＧＶフィルター（ミリポア社）により濾過滅菌した。得られた培養上清より、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙレジン（ミリポア社）カラムを用いて、各抗Ｔｒｏｐ−２ヒト型キメラ抗体を精製した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株およびＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株由来の各形質転換株より得た抗体を、それぞれｃＡＲ４７Ａ６．４．２およびｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐと称す。【０３１０】
（４）ＡＲ４７Ａ６．４．２キメラ抗体のフコース含量測定
国際公開第２００２／３１１４０号に記載の方法に従い、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２およびｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐに存在するＮ結合複合型糖鎖のうち、フコースが結合していない糖鎖の割合を調べた。その結果を表１に示す。【０３１１】
【表１】
2011155579.tif 000002
【０３１２】
表１に示す結果から、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐにはフコースが付加していないことが確認された。【０３１３】
［実施例３］
抗Ｔｒｏｐ−２マウスモノクローナル抗体ＫＭ４０９７の抗原結合活性評価
（１）フローサイトメトリー（以下、ＦＣＭと表記する）を用いたヒトＴｒｏｐ−２陽性細胞株に対するＫＭ４０９７の反応性
１〜２×１０５個のヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７、卵巣癌細胞株ＣａＯＶ−３および大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５を、ＢＳＡ（インビトロジェン社）を１％加えたＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）中に懸濁して細胞をブロッキングした。【０３１４】
その後、抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体ＫＭ４０９７をＢＳＡ−ＰＢＳで適宜希釈して添加し、全量を１００μＬとした。これらの細胞懸濁液を氷上で６０分間反応させた後、ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて細胞を洗浄した。該細胞に、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈調製したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ダコ・ジャパン社）を１００μＬ添加し、氷上で３０分間反応させた。ＢＳＡ−ＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＰＢＳに懸濁して、フローサイトメーター（ベックマン・コールター社）を用いて、蛍光強度を測定した。【０３１５】
図１（ａ）〜（ｄ）および表２に、ＫＭ４０９７を１０μｇ／ｍＬで反応させた場合のヒストグラムおよび平均蛍光強度（ＭＦＩ値）を示す。【０３１６】
【表２】
2011155579.tif 000003
【０３１７】
図１（ａ）〜（ｄ）および表２に示す結果から、ＫＭ４０９７はいずれも抗体濃度依存的にＴｒｏｐ−２陽性細胞株へ結合することが確認された。【０３１８】
（２）Ｂｉａｃｏｒｅを用いた組換えヒトＴｒｏｐ−２に対するＫＭ４０９７の結合活性
組換えヒトＴｒｏｐ−２に対する各抗Ｔｒｏｐ−２マウスモノクローナル抗体の結合活性を反応速度論的に解析するため、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いて結合活性測定を行った。尚、既存の抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体である７７２２０（Ｒ＆Ｄ社）およびＭＯｖ１６（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）についても解析を行い、比較対照とした。【０３１９】
以下の操作は全てＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて行った。Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、Ｔｅｔｒａ−Ｈｉｓ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社）を１２０００ＲＵ（レゾナンス  ユニット）になるように、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）上に固相化した。センサーチップに組換えＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ社）を捕捉させた後、５０００ｎｇ／ｍＬから５段階に希釈した抗Ｔｒｏｐ−２抗体を３０μＬ／ｍｉｎの速度で流し、各濃度におけるセンサーグラムを取得した。【０３２０】
装置添付の解析ソフトにより、Ｂｉｖａｌｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｅモデルを用いて解析し、各抗体の組換えヒトＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓ融合タンパク質に対する結合速度定数および解離速度定数を算出した。【０３２１】
各抗体の結合速度定数（以下、ｋａと記す）、解離速度定数（以下、ｋｄと記す）および解離定数ＫＤ（ｋｄ／ｋａ）を表３に示す（２回の実験の平均値）。【０３２２】
【表３】
2011155579.tif 000004
【０３２３】
表３に示すように、ＫＭ４０９７は既存抗体よりも高いアフィニティーを示した。【０３２４】
（３）ＦＣＭを用いた抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体間の競合活性評価
１〜２×１０５個のヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ−３を、ＢＳＡ−ＰＢＳ中に懸濁して細胞をブロッキングした。一方、ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２を０．３μｇ／ｍＬの濃度とすると共に、ＫＭ４０９７または７７２２０を段階的に希釈した。調製した各抗体溶液を細胞懸濁液へ添加して全量を１００μＬとした。【０３２５】
これらの細胞懸濁液を氷上で６０分間反応させた後、ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて細胞を洗浄した。該細胞に、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈調製したＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１００μＬ添加し、氷上で３０分間反応させた。ＢＳＡ−ＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＰＢＳに懸濁して、フローサイトメーター（ベックマン・コールター社）用いて、蛍光強度を測定した。【０３２６】
図２に、ＫＭ４０９７または７７２２０の濃度を変化させた場合の、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２のＢｘＰＣ−３細胞への結合を表す平均蛍光強度（ＭＦＩ値）を示す。７７２２０は濃度依存的にｃＡＲ４７Ａ６．４．２の細胞への結合を阻害する一方で、ＫＭ４０９７はｃＡＲ４７Ａ６．４．２の細胞への結合を阻害しないことが確認された。【０３２７】
次に、上記と同様にして、ＢｘＰＣ−３細胞をＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした。一方、ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて、ＫＭ４０９７または７７２２０を１μｇ／ｍＬの濃度とすると共に、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２を段階的に希釈した。調製した抗体溶液を細胞懸濁液へ添加し、全量を１００μＬとした。【０３２８】
これらの細胞懸濁液を氷上で６０分間反応させた後、ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて細胞を洗浄した。該細胞に、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈調製したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ダコ・ジャパン社）を１００μＬ添加し、氷上で３０分間反応させた。ＢＳＡ−ＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＰＢＳに懸濁して、フローサイトメーター（ベックマン・コールター社）を用いて、蛍光強度を測定した。【０３２９】
図３に、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２の濃度を変化させた場合の、ＫＭ４０９７および７７２２０のＢｘＰＣ−３細胞への結合を表す平均蛍光強度（ＭＦＩ値）を示す。図３に示すように、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２はＫＭ４０９７のＢｘＰＣ−３細胞への結合を阻害しないことが確認された。【０３３０】
以上の結果から、ＫＭ４０９７はｃＡＲ４７Ａ６．４．２とは異なるエピトープを認識することが示された。【０３３１】
（４）Ｔｒｏｐ−２バインディングＥＬＩＳＡを用いた抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体間の競合活性評価
２μｇ／ｍＬ組換えヒトＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ社）を９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社）へ５０μＬ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩静置して固相化した。該プレートをＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ加え、室温で１時間静置することによりブロッキングを行った。【０３３２】
該プレートよりＢＳＡ−ＰＢＳを除去した後、一次抗体として、０．３μｇ／ｍＬ濃度のＫＭ４０９７（サブクラスはマウスＩｇＧ１）のＢＳＡ−ＰＢＳ希釈溶液、および競合抗体（マウスＩｇＧ１以外のサブクラスの抗体）のＢＳＡ−ＰＢＳ段階希釈溶液を、総量５０μＬ／ウェルとなるように分注し、２時間静置した。【０３３３】
該プレートを０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［（ＩＣＩ社商標Ｔｗｅｅｎ  ２０相当品：和光純薬工業社）］／ＰＢＳ（以下Ｔｗｅｅｎ‐ＰＢＳと表記）で洗浄した後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ１抗体（ＺＹＭＥＤ社）を５０μＬ／ウェルずつ加えて１時間室温で静置した。【０３３４】
該プレートをＴｗｅｅｎ‐ＰＢＳで洗浄した後、ＡＢＴＳ〔２．２‐アジノビス（３‐エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム〕基質液〔１ｍｍｏＬ／Ｌ  ＡＢＴＳ、０．１ｍｏＬ／Ｌ  クエン酸バッファー（ｐＨ４．２）、０．１％Ｈ２Ｏ２〕を５０μＬ／ウェルずつ添加して発色し、さらに５％ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｕｒｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ）溶液を５０μＬ／ウェルずつ添加して発色反応を停止した。ＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて測定した。【０３３５】
図４に、７７２２０の濃度を変化させた場合の、ＫＭ４０９７のＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓ融合タンパク質への結合を示す。図４に示すように、７７２２０はＫＭ４０９７のＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓ融合タンパク質への結合を阻害しないことが確認された。【０３３６】
次に、上記の実験と同様に、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレートに組換えヒトＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓ融合タンパク質を固相化し、ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした。該プレートに、一次抗体として、０．３μｇ／ｍＬ濃度の７７２２０（サブクラスはマウスＩｇＧ２ａ）のＢＳＡ−ＰＢＳ希釈溶液、および競合抗体（マウスＩｇＧ２ａ以外のサブクラスの抗体）のＢＳＡ−ＰＢＳ段階希釈溶液を、総量５０μＬ／ウェルとなるように分注して、２時間静置した。【０３３７】
該プレートをＴｗｅｅｎ‐ＰＢＳで洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（ＺＹＭＥＤ社）を５０μＬ／ウェルずつ加えて１時間室温で静置した。該プレートをＴｗｅｅｎ‐ＰＢＳで洗浄し、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェル添加して発色し、さらに５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェルずつ添加して発色反応を停止した。ＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて測定した。【０３３８】
図５に、ＫＭ４０９７、ＭＯｖ１６の濃度を変化させた場合の７７２２０のＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓキメラタンパク質への結合を示す。図５に示すように、ＭＯｖ１６は７７２２０のＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓキメラタンパク質への結合を阻害する一方で、ＫＭ４０９７は７７２２０のＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓキメラタンパク質への結合を阻害しないことが確認された。【０３３９】
以上の結果から、ＫＭ４０９７は７７２２０およびＭＯｖ１６と異なるエピトープに結合することが明らかとなった。【０３４０】
［実施例４］
抗Ｔｒｏｐ−２マウスモノクローナル抗体ＫＭ４０９７の可変領域をコードするｃＤＮＡの単離
（１）ＫＭ４０９７産生ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
実施例１で取得したハイブリドーマ細胞５×１０７〜１×１０８個より、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）およびＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて、ＫＭ４０９７のｍＲＮＡを調製した。【０３４１】
（２）ＫＭ４０９７のＨ鎖可変領域遺伝子およびＬ鎖可変領域遺伝子のクローニング
実施例４（１）で取得したＫＭ４０９７のｍＲＮＡから、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｃＤＮＡを取得した。取得したｃＤＮＡを鋳型として、ユニバーサルプライマーＡｍｉｘ（上記キットに添付）と、マウスＩｇＧ１に特異的なプライマー（配列番号５、６）を用いて、それぞれＰＣＲを行い、各抗体のＶＨのｃＤＮＡ断片を増幅した。また、抗体の各サブクラス特異的プライマーの代わりにマウスＩｇ（κ）特異的プライマー（配列番号７、８）を用いてＰＣＲを行い、各抗体のＶＬのｃＤＮＡ断片を増幅した。いずれのＰＣＲとも、ＰＴＣ−２００  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて、９４℃で２分間加熱後、９４℃で１５秒間、６８℃で１分間から成る反応サイクルを３０回行った。【０３４２】
取得したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にて展開し、ＶＨを含むＤＮＡ断片およびＶＬを含むＤＮＡ断片を取得した。次に、ＴＡｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ  Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、得られた各ＤＮＡ断片の両端にデオキシアデニンを付加した後、ｐＴＡ２ベクターへ各々組み込んだ。こうして得られたベクターを用いて大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）の形質転換を行い、得られた形質転換クローンよりプラスミドを抽出した。クローニングした各ＰＣＲ産物の塩基配列の解析は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥバイオシステムズ社）および同社のシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００を用いて実施した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する、ＶＨの完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドおよびＶＬの完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドを各々取得したことが確認された。【０３４３】
（３）ＫＭ４０９７可変領域の遺伝子配列の解析
実施例４（２）で得られたプラスミドが有する、ＫＭ４０９７のＶＨの全塩基配列を配列番号９に、該配列から推定されるシグナル配列を含んだＶＨの全アミノ酸配列を配列番号１０に、また、ＶＬの全塩基配列を配列番号１１に、該配列から推定されるシグナル配列を含んだＶＬの全アミノ酸配列を配列番号１２にそれぞれ示した。【０３４４】
既知のマウス抗体の配列データ［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］との比較から、単離した各ｃＤＮＡは、ＫＭ４０９７の分泌シグナル配列を含む可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）をコードする完全長ｃＤＮＡであり、さらに、ＫＭ４０９７のＨ鎖については配列番号１０に記載のアミノ酸配列の１から１９番目が、ＫＭ４０９７のＬ鎖については配列番号１２に記載のアミノ酸配列の１から２０番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。【０３４５】
次に、ＫＭ４０９７のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の新規性について解析した。配列解析システムとしてＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社）を用い、既存のタンパク質のアミノ酸配列データベースをＢＬＡＳＴＰ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）］により検索した。その結果、ＶＨ、ＶＬともに完全に一致するアミノ酸配列がデータベース内に認められなかったことから、ＫＭ４０９７のＶＨおよびＶＬは新規のアミノ酸配列を有していることが確認された。【０３４６】
また、ＫＭ４０９７のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。ＫＭ４０９７のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１３、１４および１５に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１６、１７および１８にそれぞれ示した。【０３４７】
［実施例５］
ＫＭ４０９７ヒト型キメラ抗体の作製
（１）ＫＭ４０９７ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本発明で作製するキメラ抗体は、実施例４（２）で得られたＫＭ４０９７の重鎖および軽鎖の各可変領域に、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の重鎖定常領域およびヒトκ型軽鎖定常領域をそれぞれ連結したキメラ抗体である。方法としては、抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と、実施例４（２）で得られたＶＨまたはＶＬを有する各ｐＴＡ２ベクターとを用いて、以下のようにしてＫＭ４０９７ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築した。【０３４８】
ＫＭ４０９７のＶＨまたはＶＬを有するｐＴＡ２ベクターを鋳型として１００ｎｇ使用し、１０×ＥｘＴａｑ緩衝液を１．５μＬ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰを１．２μＬ、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を１μＬ、１０μｍｏｌ／Ｌ濃度のＶＨまたはＶＬに特異的なプライマーを０．７５μＬ各々含む、全量１５μＬから成る溶液を用いて、ＰＣＲを行った。ＫＭ４０９７のＶＨのプライマーを配列番号１９および２０に、ＶＬのプライマーを配列番号２１および２２に示す。ＰＣＲは、９４℃で２分間加熱後、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の反応から成る反応サイクルを３０回行った後、７２℃で１０分間反応させることで行った。【０３４９】
各ＰＣＲ反応産物をアガロースゲル電気泳動にて展開し、ＶＨを含むＤＮＡ断片およびＶＬを含むＤＮＡ断片を取得した。次に、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（インビトロジェン社）用いて、各ＤＮＡ断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターへ組み込んだ。【０３５０】
ＫＭ４０９７のＶＨが組み込まれたプラスミドに対し、ＡｐａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）およびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて制限酵素処理を行い、ＶＨを含むＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片を取得した。また、ＫＭ４０９７のＶＬが組み込まれたプラスミドに対し、ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）およびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて制限酵素処理を行い、ＶＬを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を取得した。【０３５１】
一方、抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３に対し、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩ、またはＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩの２通りの組み合わせで制限酵素処理を行った。ＶＨを含むＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片およびｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片、ならびに、ＶＬを含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片およびｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片の２種類の組み合わせを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて連結した。【０３５２】
得られた該連結反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）の形質転換を行った。形質転換クローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＫＭ４０９７のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡが各々クローニングされたｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを取得した。【０３５３】
次に、ＫＭ４０９７のＶＨまたはＶＬが組み込まれた各々のｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターに対し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて制限酵素処理を行い、ＶＬの組み込まれたＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片、およびＶＨの組み込まれたＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片を取得した。得られた２種類の断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて連結した。得られた該連結反応液を用いて、大腸菌ＤＨ５α株（ＴＯＹＯＢＯ社）の形質転換を行った。形質転換クローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＫＭ４０９７のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する、抗Ｔｒｏｐ−２ヒト型キメラ抗体発現ベクターを取得した。【０３５４】
（２）動物細胞を用いたＫＭ４０９７ヒト型キメラ抗体の取得
実施例２と同様にして、実施例５（１）で得た抗Ｔｒｏｐ−２キメラ抗体発現ベクターをＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株およびＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株に導入し、得られた各形質転換株より、ヒト型キメラ抗体ＫＭ４５９０およびＫＭ４５９１を各々取得した。【０３５５】
（３）ＫＭ４０９７キメラ抗体のフコース含量測定
国際公開第２００２／３１１４０号に記載の方法に従い、ＫＭ４５９０およびＫＭ４５９１に存在するＮ−結合複合型糖鎖のうち、フコースが結合していない糖鎖の割合を調べた。その結果を表４に示す。【０３５６】
【表４】
2011155579.tif 000005
【０３５７】
表４に示す結果から、実施例５（２）で作製したヒト型キメラ抗体ＫＭ４５９１にはフコースが付加していないことが確認された。【０３５８】
［実施例６］
抗Ｔｒｏｐ−２ヒト型キメラ抗体ＫＭ４５９０およびＫＭ４５９１の活性評価
実施例５で得たＫＭ４５９０およびＫＭ４５９１、ならびに、実施例２で得たｃＡＲ４７Ａ６．４．２およびｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐの活性評価を行った。
（１）ビアコアによる抗Ｔｒｏｐ−２ヒト型キメラ抗体の組換えヒトＴｒｏｐ−２への結合活性評価
実施例３と同様にして、ＫＭ４５９１、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２−ＰのヒトＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ社）に対する親和性を評価した。各抗体のｋａ、ｋｄおよびＫＤ（ｋｄ／ｋａ）を表５に示す（２回の実験の平均値）。【０３５９】
【表５】
2011155579.tif 000006
【０３６０】
表５に示すように、ＫＭ４５９１はｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐよりも高いアフィニティーを示した。【０３６１】
（２）抗Ｔｒｏｐ−２ヒト型キメラ抗体のヒト癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性の評価
ヒト癌細胞株に対するＫＭ４５９０、およびｃＡＲ４７Ａ６．４．２−１のＡＤＣＣ活性を、以下に示す方法に従って測定した。【０３６２】
（２）−１  標的細胞懸濁液の調製
ヒト癌細胞株ＭＣＦ−７、Ｃｏｌｏ２０５をＰＢＳで洗浄後、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（インビトロジェン社）を含むフェノールレッド不含有ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）（以下、ＡＤＣＣ用培地と表記する）で洗浄し、同培地で至適の細胞密度に調製して標的細胞懸濁液とした。【０３６３】
（２）−２  エフェクター細胞懸濁液の調製
以下に示した方法により、健常人末梢血より末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）を分離した。ヘパリンナトリウム注（味の素社）を０．５ｍＬ加えたシリンジを用いて、健常人から健常人末梢血５０ｍＬを採血した。採取した末梢血に同量の生理食塩水（大塚製薬）を加えて希釈し、良く攪拌した。【０３６４】
１５ｍＬチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に４．５ｍＬずつ分注したＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社）の上に、１０ｍＬの希釈末梢血を静かに重層し、２０００ｒｐｍ、ブレーキオフ、室温の条件で２０分間遠心分離して、単核球層を分離した。こうして得られた単核球画分を、ＡＤＣＣ用培地を用いて２回洗浄し、同培地により至適の細胞密度に調製して、エフェクター細胞懸濁液とした。【０３６５】
（２）−３  ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ底プレート（ＦＡＬＣＯＮ社）の各ウェルに、各抗体を３μｇ／ｍＬから段階的に１０倍希釈した抗体溶液を５０μＬずつ分注した後、次に（２）−１で調製した標的細胞懸濁液を１×１０４個／５０μＬ／ウェルずつ分注し、最後に（２）−２で調製したエフェクター細胞懸濁液を２．５×１０５個／５０μＬ／ウェルずつ分注し、全量を１５０μＬとして、３７℃で４時間反応させた。本系でのエフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）の比は２５：１とした。反応後、ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔｅｓｔ（和光純薬社）を用いて各培養上清の発色を測定した。【０３６６】
ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。その結果を図６（ａ）および（ｂ）、図７（ａ）および（ｂ）、図８（ａ）および（ｂ）並びに図９（ａ）および（ｂ）に示す。【０３６７】
（式）
ＡＤＣＣ活性（％）＝｛（［検体の吸光度］−［標的細胞自然遊離の吸光度］−［エフェクター細胞自然遊離の吸光度］）／（［標的細胞全遊離の吸光度］−［標的細胞自然遊離の吸光度］）｝×１００【０３６８】
図６（ａ）および（ｂ）並びに図７（ａ）および（ｂ）に示すように、ＫＭ４５９０は、ヒト癌細胞株ＭＣＦ−７、Ｃｏｌｏ２０５に対してＡＤＣＣ活性を示し、その活性は既存の抗Ｔｒｏｐ−２ヒト型キメラ抗体ｃＡＲ４７Ａ６．４．２よりも高かった。さらに、図８（ａ）および（ｂ）並びに図９（ａ）および（ｂ）に示すように、ＫＭ４５９１は、ヒト癌細胞株ＭＣＦ−７、Ｃｏｌｏ２０５に対してＫＭ４５９０よりも高いＡＤＣＣ活性を有していた。【０３６９】
（３）ＢｘＰＣ−３細胞株異所移植マウスにおける抗Ｔｒｏｐ−２ヒト型キメラ抗体の抗腫瘍活性の評価
ＢｘＰＣ−３細胞をＰＢＳにて５×１０７個／ｍＬの密度に調製し、６週齢雄性ＳＣＩＤマウス（日本クレア）の右腋下に１００μＬ注入した。６日後に腫瘍径を測定し、各群の平均腫瘍体積［長径×（短径）２×０．５として計算］が１００ｍｍ３となるよう群分けした（各群６匹）。ＰＢＳまたは抗Ｔｒｏｐ−２キメラ抗体（ＫＭ４５９１またはｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐ）を週２回、４週間投与して抗腫瘍活性を評価した。【０３７０】
その結果を図１０に示す。図１０に示すように、評価の結果、ＫＭ４５９１は有意な抗腫瘍活性を示し、その活性はｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐよりも高かった。【０３７１】
（４）Ｃｏｌｏ２０５細胞株異所移植マウスにおける抗Ｔｒｏｐ−２キメラ抗体の抗腫瘍活性の評価
Ｃｏｌｏ２０５細胞をＰＢＳにて５×１０７個／ｍＬの密度に調製し、５週齢雄性ＳＣＩＤマウス（日本クレア）の右腋下に１００μＬ注入した。５日後に腫瘍径を測定し、各群の平均腫瘍体積［長径×（短径）２×０．５として計算］が１００ｍｍ３となるよう群分けした（各群５匹）。ＰＢＳまたは抗Ｔｒｏｐ−２キメラ抗体（ＫＭ４５９１またはｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐ）を週２回、４週間投与して抗腫瘍活性を評価した。【０３７２】
その結果を図１１に示す。図１１に示すように、評価の結果、ＫＭ４５９１は有意な抗腫瘍活性を示し、その活性はｃＡＲ４７Ａ６．４．２−Ｐよりも高かった。【０３７３】
［実施例７］
抗Ｔｒｏｐ−２ヒト型キメラ抗体ＫＭ４５９０のエピトープ解析
（１）Ｔｒｏｐ−２バインディングＥＬＩＳＡによる各種抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体に対する競合活性評価
９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社）へ、２μｇ／ｍＬの組換えヒトＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ社製）をプレートに５０μＬ／ウェル分注し、４℃で一晩静置して吸着させた。該プレートをＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルずつ加え、室温で１時間静置することにより活性基のブロッキングを行った。【０３７４】
その後、該プレートよりＢＳＡ−ＰＢＳを除去し、一次抗体として、０．３μｇ／ｍＬ濃度の各種マウス抗Ｔｒｏｐ−２抗体〔７７７２０（Ｒ＆Ｄ社）、ＭＯｖ１６（ＡＬＥＸＩＳ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ社）、ＭＭ０５８８−４９Ｄ６（Ａｎｇｉｏ−Ｐｒｏｔｅｏｍｉｅ社）、ＹＹ−０１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）または１６２−４６（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社）〕のＢＳＡ−ＰＢＳ希釈溶液、および競合キメラ抗体（ＫＭ４５９０またはｃＡＲ４７Ａ６．４．２）の段階希釈溶液を５０μＬ／ウェル分注し、２時間静置した。【０３７５】
該プレートをＴｗｅｅｎ‐ＰＢＳで洗浄後、２次抗体として、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社）を５０μＬ／ウェルずつ加えて１時間室温で静置した。該プレートをＴｗｅｅｎ‐ＰＢＳで洗浄し、ＡＢＴＳ〔２．２‐アジノビス（３‐エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム〕基質液〔１  ｍｍｏＬ／Ｌ  ＡＢＴＳ、０．１ｍｏＬ／Ｌ  クエン酸バッファー（ｐＨ４．２）、０．１％Ｈ２Ｏ２〕を５０μＬ／ウェル添加して発色し、５％ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｕｒｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ）溶液を５０μＬ／ウェル添加して発色反応を停止した。プレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて該プレートのＯＤ４１５ｎｍの吸光度を測定した。【０３７６】
図１４（ａ）〜（ｆ）に、ＫＭ４５９０およびｃＡＲ４７Ａ６．４．２の濃度を変化させた場合の、各種抗Ｔｒｏｐ−２マウスモノクローナル抗体のＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓキメラタンパク質への結合を示す。【０３７７】
図１４（ａ）〜（ｆ）に示すように、ＫＭ４０９７以外の抗Ｔｒｏｐ−２マウスモノクローナル抗体のＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓキメラタンパク質への結合は、ＫＭ４５９０により阻害されないことが確認された。一方、ＫＭ４０９７以外の抗Ｔｒｏｐ−２マウスモノクローナル抗体のＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓキメラタンパク質への結合は、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２により阻害されることが確認された。【０３７８】
これらの結果から、ＫＭ４０９７およびそのキメラ抗体であるＫＭ４５９０は他の抗Ｔｒｏｐ−２抗体とは異なるエピトープを認識することが示された。【０３７９】
（２）Ｔｒｏｐ−２細胞外領域蛋白質およびそのドメイン欠損体蛋白質の作製
本発明の抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体のエピトープを同定するため、Ｔｒｏｐ−２蛋白質の細胞外領域およびそのドメイン欠損体を作製した［図１５（ａ）〜（ｄ）］］。まず、ＩＮＰＥＰ４ベクター（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ社）に、ＦＬＡＧタグおよびＦｃ領域をコードするＤＮＡを５’末端側から３’末端側へ順次配置したＤＮＡ（配列番号３９）を挿入したベクターを作製した（ＩＮＰＥＰ４−ＦＬＡＧ−Ｆｃ）。【０３８０】
次に、Ｔｒｏｐ−２の細胞外領域に分泌シグナル配列を付加した蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号４０）を、ＩＮＰＥＰ４−ＦＬＡＧ−ＦｃベクターのＦＬＡＧタグ配列の５’末端側に挿入することにより、Ｔｒｏｐ−２細胞外領域とＦＬＡＧタグおよびＦｃとの融合蛋白質（Ｔｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃとする）の発現ベクターを構築した。【０３８１】
同様にして、Ｔｒｏｐ−２細胞外領域側のドメインＩのみ、ドメインＩおよびドメインＩＩ、ドメインＩおよびＩＩの全長ならびにドメインＩＩＩの一部を各々欠損した３種類の蛋白質（それぞれＭｕｔａｎｔ  Ａ、Ｍｕｔａｎｔ  Ｂ、Ｍｕｔａｎｔ  Ｃとする）をコードするＤＮＡ（配列番号４１、４２、４３）についても、ＦＬＡＧタグおよびＦｃ領域との融合蛋白質の発現ベクターを構築した。Ｔｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃ、Ｍｕｔａｎｔ  Ａ、Ｍｕｔａｎｔ  ＢおよびＭｕｔａｎｔ  Ｃのアミノ酸配列を配列番号４４−４７に示す。【０３８２】
ＨＥＫ２９３Ｆを宿主細胞とし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３  遺伝子導入システム（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、遺伝子導入および蛋白質の発現を行った。まず、発現ベクタープラスミド  ３０μｇを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合して計９００μＬとした。次に、２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）３０μＬをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉと混合して計９００μＬとし、室温で５分間静置した。【０３８３】
該２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ溶液を上記発現ベクタープラスミド溶液と混合し、室温で２０〜３０分間静置した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３  ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて、１．１×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で培養したＨＥＫ２９３Ｆ細胞３０ｍＬに対し、上記プラスミド混合液の全量を加えた後、３７℃、５％ＣＯ２、１２５ｒｐｍの設定条件下で、４日間の浮遊旋回培養を行った。【０３８４】
培養後、細胞懸濁液を３０００  ｒｐｍ、４℃の条件で２０分間の遠心分離に供して培養上清を回収し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルターを通して濾過滅菌した。【０３８５】
エコノパックカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）にＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）１  ｍＬを充填し、上記の操作で回収した培養上清をカラムに通塔した後、ＰＢＳ  １０  ｍＬで洗浄した。洗浄後、０．１  ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ  ３．４）を用いて担体に吸着した抗体の溶出を行った。【０３８６】
溶出画分を１  ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）により中和した。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により目的蛋白質の溶出が確認された画分を合一し、該画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濃縮した後、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて滅菌濾過した。上記濃縮溶液の２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ２８０  ｎｍ）を吸光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００）を用いて測定し、各精製蛋白質の濃度を算出した。【０３８７】
（３）ウェスタンブロットによるエピトープ解析
本実施例（２）で作製したＴｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃ、Ｍｕｔａｎｔ  Ａ、Ｍｕｔａｎｔ  ＢおよびＭｕｔａｎｔ  Ｃの各蛋白質を還元状態（サンプルを１０  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ存在下で９５℃、５分間処理）または非還元状態（ＤＴＴ非存在下で室温にて１０分間処理）でＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開した後、セミドライ法を用いて、２００ｍＡの電流を１時間流すことによりゲル内のタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に転写した。【０３８８】
５％ＢＳＡを含むＰＢＳにて該ＰＶＤＦ膜を室温で１時間ブロッキングした後、０．１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ［ナカライテスク社製トリス緩衝生理食塩水（１０倍濃縮）（ｐＨ  ７．４）を１０倍に希釈し、さらに０．１％濃度の０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＩＣＩ社商標Ｔｗｅｅｎ  ２０相当品：和光純薬工業社）を加えた水溶液］で調製した一次抗液に浸漬し、室温で１時間または４℃で一晩反応させた。【０３８９】
該ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで３〜４回洗浄した後、０．１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで調製したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）もしくはペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトκ鎖抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を二次抗体として、室温で１時間反応させた。該ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで３〜４回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、化学発光反応を行った。【０３９０】
発光像を、イメージングシステムＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（富士フイルム社）を用いて取得した。一方、ＰＶＤＦ膜上の各ＦＬＡＧ／Ｆｃ融合タンパク質の量を評価する目的で、一次抗体反応を行わずに、ヒトＦｃを認識するペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社）を室温で１時間反応させた後、化学発光反応を行う実験も実施した。【０３９１】
図１６（ａ）に、ウェスタンブロットにおいて、一次抗体としてＫＭ４５９０を反応させた実験結果を示す。また、図１６（ｂ）に、ウェスタンブロットにおいて、一次抗体としてｃＡＲ４７Ａ６．４．２を反応させた実験結果を示す。【０３９２】
図１６（ａ）に示すように、非還元状態および還元状態のいずれにおいても、ＫＭ４５９０は、Ｔｒｏｐ−２のドメインＩを欠損させたＭｕｔａｎｔ  ＡおよびＭｕｔａｎｔ  Ｂに対する反応性が低下した。一方、図１６（ｂ）に示すように、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２は、ドメインＩＩＩの一部まで欠損させたＭｕｔａｎｔ  Ｃに対してのみ反応性が低下した。【０３９３】
以上の結果から、キメラ抗体ＫＭ４５９０およびそのマウスモノクローナル抗体ＫＭ４０９７のエピトープはドメインＩに、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２のエピトープはドメインＩＩＩにあることが示された。【０３９４】
次に、Ｔｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃタンパク質の非還元状態と還元状態に対するＫＭ４５９０およびｃＡＲ４７Ａ６．４．２の反応性を比較した。図１７（ａ）および（ｂ）並びに図１８に実験の結果を示す。【０３９５】
ウェスタンブロットにてＫＭ４５９０およびｃＡＲ４７Ａ６．４．２を各々反応させたＰＶＤＦ膜［図１７（ａ）］より、ＲｅｓｔｏｒｅＴＭ  ＰＬＵＳ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて抗体を剥離し、前述のブロッキングを行った後にペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体を反応させることにより、ＰＶＤＦ膜上のＴｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃ蛋白質の量を評価した。【０３９６】
その結果、図１７（ｂ）に示すように、二つのＰＶＤＦ膜の間で、含まれるＴｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃ蛋白質の量に大きな差は認められなかった。また、ＫＭ４５９０は還元状態のＴｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃタンパク質への反応性は非常に弱いのに対し、ｃＡＲ４７Ａ６．４．２は還元状態への反応性が強いことが示された。【０３９７】
図１８に、画像解析ソフトＭｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  Ｖｅｒ３．０（富士フイルム社）を用いてバンドのシグナル強度を解析し数値化した結果を示す。以上より、ＫＭ４５９０はＴｒｏｐ−２タンパク質のドメインＩ内の、ジスルフィド結合を含む構造を認識していることが示された。【０３９８】
以上の結果から、ＫＭ４５９０およびそのマウス抗体ＫＭ４０９７は、Ｔｒｏｐ−２の細胞外領域のうち、既存抗体とは異なるエピトープであるドメインＩを認識する抗体であることが明らかとなった。【０３９９】
［実施例８］
抗Ｔｒｏｐ−２ヒト化抗体の作製
（１）ＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
ＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。ＫＭ４０９７ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号１３〜１５）の移植に適したヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。【０４００】
カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性からサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＩＩ）に分類し、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこで、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩ〜ＩＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列とＫＭ４０９７ＶＨのＦＲのアミノ酸配列との相同性検索を実施した。【０４０１】
相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、およびＨＳＧＩＩＩの相同性はそれぞれ７４．７％、５５．２％、５９．８％であった。従って、ＫＭ４０９７ＶＨのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。【０４０２】
以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、ＫＭ４０９７ＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号１３〜１５）を移植した。このようにして、配列番号２４で表される抗Ｔｒｏｐ−２ＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＫＭ４０９７ＨＶ０を設計した。【０４０３】
次に、ＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。ＫＭ４０９７ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号１６〜１８）を移植に適したヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を、以下のようにして選択した。【０４０４】
カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性からサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＶ）に分類し、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこで、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩ〜ＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列とＫＭ４０９７ＶＬのＦＲのアミノ酸配列との相同性検索を実施した。【０４０５】
相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、ＨＳＧＩＩＩ、およびＨＳＧＩＶの相同性はそれぞれ７８．８％、７３．８％、７２．５％、８３．８％であった。従って、ＫＭ４０９７ＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグルーＩＶと最も高い相同性を有していた。【０４０６】
以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、ＫＭ４０９７ＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号１６〜１８）を移植した。しかし、ＫＭ４０９７ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１２）中の１１０番目のＬｅｕは、カバットらが挙げるヒト抗体ＦＲのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される頻度が高いアミノ酸残基ではないが、比較的高い頻度で使用されるアミノ酸残基であるため、上記のＫＭ４０９７ＶＬのアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。【０４０７】
このようにして、抗Ｔｒｏｐ−２ＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＫＭ４０９７ＬＶ０（配列番号２６）を設計した。【０４０８】
上記で設計したＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＫＭ４０９７ＨＶ０、およびＶＬのアミノ酸配列ＫＭ４０９７ＬＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に、マウスモノクローナル抗体であるＫＭ４０９７のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。【０４０９】
しかし、一般に、ヒト化抗体を作製する場合には、単にヒト抗体のＦＲへマウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を移植するのみでは、結合活性が低下してしまうことが多い。このような結合活性の低下を回避するため、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、ヒト抗体とマウス抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を改変することが行われている。【０４１０】
そこで、本実施例においても、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定し、改変することとした。【０４１１】
まず、上記で設計したＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＫＭ４０９７ＨＶ０、およびＶＬのアミノ酸配列ＫＭ４０９７ＬＶ０より成る抗体Ｖ領域（以下、ＨＶ０ＬＶ０と表す）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製および三次元構造の表示には、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（アクセルリス社）を用いた。また、ＫＭ４０９７のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。【０４１２】
更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、ＫＭ４０９７と異なっているアミノ酸残基を選択し、ＫＭ４０９７のアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列を作製し、同様に三次元構造モデルを構築した。これら作製したＫＭ４０９７、ＨＶ０ＬＶ０および改変体の各Ｖ領域の三次元構造を比較し、抗体の結合活性に影響を与えると予測されるアミノ酸残基を同定した。【０４１３】
その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、
ＫＭ４０９７ＨＶ０では、９番目のＡｌａ、１２番目のＬｙｓ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４８番目のＭｅｔ、６７番目のＡｒｇ、６８番目のＶａｌ、７０番目のＩｌｅ、９５番目のＴｙｒ、および１１２番目のＶａｌを、ＫＭ４０９７ＬＶ０では、１５番目のＬｅｕ、１９番目のＡｌａ、２１番目のＩｌｅ、および８４番目のＬｅｕを、それぞれ選択した。【０４１４】
これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列をＫＭ４０９７の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。【０４１５】
具体的には、ＶＨについては、配列番号２４のアミノ酸配列の
９番目のＡｌａをＰｒｏに、１２番目のＬｙｓをＶａｌに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４８番目のＭｅｔをＩｌｅに、６７番目のＡｒｇをＬｙｓに、６８番目のＶａｌをＡｌａに、７０番目のＩｌｅをＬｅｕに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１２番目のＶａｌをＬｅｕに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。【０４１６】
また、ＶＬについては、配列番号２６のアミノ酸配列の
１５番目のＬｅｕをＡｌａに、１９番目のＡｌａをＶａｌに、２１番目のＩｌｅをＭｅｔに、および８４番目のＬｅｕをＶａｌに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。【０４１７】
ＨＶ０ＬＶ０のＦＲに存在する、少なくとも１つのアミノ酸残基を改変したＫＭ４０９７ヒト化抗体の抗体Ｖ領域として、
ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ２、ＨＶ０ＬＶ３ａ、ＨＶ０ＬＶ３ｂ、ＨＶ０ＬＶ４、ＨＶ２ＬＶ０、ＨＶ２ＬＶ２、ＨＶ２ＬＶ３ａ、ＨＶ２ＬＶ３ｂ、ＨＶ２ＬＶ４、ＨＶ３ａＬＶ０、ＨＶ３ａＬＶ２、ＨＶ３ａＬＶ３ａ、ＨＶ３ａＬＶ３ｂ、ＨＶ３ａＬＶ４、ＨＶ３ｂＬＶ０、ＨＶ３ｂＬＶ２、ＨＶ３ｂＬＶ３ａ、ＨＶ３ｂＬＶ３ｂ、ＨＶ３ｂＬＶ４、ＨＶ４ＬＶ０、ＨＶ４ＬＶ２、ＨＶ４ＬＶ３ａ、ＨＶ４ＬＶ３ｂ、ＨＶ４ＬＶ４、ＨＶ５ａＬＶ０、ＨＶ５ａＬＶ２、ＨＶ５ａＬＶ３ａ、ＨＶ５ａＬＶ３ｂ、ＨＶ５ａＬＶ４、ＨＶ５ｂＬＶ０、ＨＶ５ｂＬＶ２、ＨＶ５ｂＬＶ３ａ、ＨＶ５ｂＬＶ３ｂ、ＨＶ５ｂＬＶ４、ＨＶ５ｃＬＶ０、ＨＶ５ｃＬＶ２、ＨＶ５ｃＬＶ３ａ、ＨＶ５ｃＬＶ３ｂ、ＨＶ５ｃＬＶ４、ＨＶ６ＬＶ０、ＨＶ６ＬＶ２、ＨＶ６ＬＶ３ａ、ＨＶ６ＬＶ３ｂ、ＨＶ６ＬＶ４、ＨＶ８ＬＶ０、ＨＶ８ＬＶ２、ＨＶ８ＬＶ３ａ、ＨＶ８ＬＶ３ｂ、ＨＶ８ＬＶ４、ＨＶ９ＬＶ０、ＨＶ９ＬＶ２、ＨＶ９ＬＶ３ａ、ＨＶ９ＬＶ３ｂ、ＨＶ９ＬＶ４、ＨＶ１０ＬＶ０、ＨＶ１０ＬＶ２、ＨＶ１０ＬＶ３ａ、ＨＶ１０ＬＶ３ｂ、およびＨＶ１０ＬＶ４をそれぞれ設計した。【０４１８】
Ｈ鎖可変領域ＨＶ２、ＨＶ３ａ，ＨＶ３ｂ，ＨＶ４、ＨＶ５ａ、ＨＶ５ｂ，ＨＶ５ｃ、ＨＶ６、ＨＶ８、ＨＶ９、ＨＶ１０およびＬ鎖可変領域ＬＶ２、ＬＶ３ａ、ＬＶ３ｂ、ＬＶ４のアミノ酸配列をそれぞれ図１２および図１３に示す。【０４１９】
（２）ＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡ配列の設計
ＫＭ４０９７ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ＫＭ４０９７ＶＨおよびＫＭ４０９７ＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号２３、２５）で用いられているコドンを利用して設計し、アミノ酸改変を行う場合には、哺乳動物細胞で高頻度で使用されるコドンを用いて設計し、各々作製した。これらＤＮＡ配列を用いて、抗体発現ベクターの構築およびヒト化抗体の発現を行った。【０４２０】
（３）ＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
本実施例（１）で設計したＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＫＭ４０９７ＨＶ０（配列番号２４）、および本実施例（１）の方法により設計した図１２に示されるＨＶ３ａ（配列番号２８）、ＨＶ４（配列番号３０）、ＨＶ５（配列番号３２）、ＨＶ１０（配列番号３４）をコードする、各ｃＤＮＡ（配列番号２３、２７、２９、３１、３３）を全合成にて作成した。【０４２１】
（４）ＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
本実施例（１）で設計したＫＭ４０９７ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０（配列番号２６）、および本実施例（１）の方法により設計した図１３に示されるＬＶ２（配列番号３６）、ＬＶ４（配列番号３８）をコードする、各ｃＤＮＡ（配列番号２５、３５、３７）を全合成にて作成した。【０４２２】
（５）ＫＭ４０９７ヒト化抗体発現ベクターの構築
国際公開第９７／１０３５４号に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の適当な位置に、本実施例（３）および（４）で得られたＨＶ０、ＨＶ３ａ、ＨＶ４、ＨＶ５、ＨＶ１０のいずれかをコードするｃＤＮＡ、およびＬＶ０、ＬＶ２、ＬＶ４のいずれかをコードするｃＤＮＡを挿入し、各種ＫＭ４０９７ヒト化抗体発現ベクターを構築した。【０４２３】
（６）動物細胞を用いたＫＭ４０９７ヒト化抗体の発現
本実施例（５）にて構築した動物細胞用の抗体発現ベクターの遺伝子導入には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（理化学研究所セルバンク寄託番号ＲＣＢ０４０３）のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子を破壊した株（以下、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞）を使用した。【０４２４】
ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞を宿主細胞とし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の説明書に基づいて、遺伝子導入から抗体の発現を行った。３１２．５μｇの発現ベクタープラスミドを、ＯｐｔｉＰｒｏTM  ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合して計５ｍＬとした。【０４２５】
３１２．５μＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、ＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭと混合して計５ｍＬとした。発現ベクタープラスミド溶液と上記ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  溶液を混合し、室温で１０分間静置した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて１．０×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で培養したＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞  ２５０ｍＬに対し、上記ベクター溶液の全量を加えた後、３７℃、８％ＣＯ２、１３５ｒｐｍの条件下で、５日〜７日間浮遊旋回培養した。【０４２６】
培養後、細胞懸濁液を３０００  ｒｐｍ、４℃の条件で２０分間の遠心分離に供して培養上清を回収し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルターを通して濾過滅菌した。【０４２７】
（７）ＫＭ４０９７ヒト化抗体の精製
０．８ｃｍ径のカラムにＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）０．５ｍＬを充填し、精製水  ３．０ｍＬ、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ  ３．５）２．０ｍＬ、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２Ｍホウ酸ナトリウム酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）１．５ｍＬを順次通塔し、担体の平衡化を行った。次に、本実施例（６）で回収した培養上清をカラムに通塔した後、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２Ｍホウ酸ナトリウム酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）５．０ｍＬで洗浄した。洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ  ３．５）２．０ｍＬを用いて担体に吸着した抗体の溶出を行った。【０４２８】
溶出は５００μＬずつ、４画分に分けて取得した。次に、得られた精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行い、抗体の溶出が確認された画分をまとめ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ６．０）を用いて、４℃で一昼夜透析を行った。透析後、抗Ｔｒｏｐ−２ＫＭ４０９７ヒト化抗体溶液を回収し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて滅菌濾過した後に、２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ２８０  ｎｍ）を吸光光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１７００）を用いて測定し、各精製ＫＭ４０９７ヒト化抗体の濃度を算出した。【０４２９】
以上より、抗体のＶＨがＨＶ０、ＶＬがＬＶ０から成るＨＶ０ＬＶ０、抗体のＶＨがＨＶ３ａ、ＶＬがＬＶ０から成るＨＶ３ａＬＶ０、抗体のＶＨがＨＶ４、ＶＬがＬＶ０から成るＨＶ４ＬＶ０、抗体のＶＨがＨＶ５、ＶＬがＬＶ０から成るＨＶ５ＬＶ０、抗体のＶＨがＨＶ１０、ＶＬがＬＶ２からなるＨＶ１０ＬＶ２、および抗体のＶＨがＨＶ１０、ＶＬがＬＶ４から成るＨＶ１０ＬＶ４、の６種類のＫＭ４０９７ヒト化抗体を作製した。【０４３０】
（８）ＫＭ４０９７ヒト化抗体のフコース含量測定
国際公開第２００２／３１１４０号に記載の方法に従い、本実施例（７）で作製した６種類のＫＭ４０９７ヒト化抗体に存在するＮ−結合複合型糖鎖のうち、フコースが結合していない糖鎖の割合を調べた。その結果、本実施例（７）で作製した６種類のＫＭ４０９７ヒト化抗体にはフコースが付加していないことが確認された。【０４３１】
［実施例９］
ＫＭ４０９７ヒト化抗体の活性評価
実施例５で得たＫＭ４５９１ならびに、実施例８で得た６種類のＫＭ４０９７ヒト化抗体（ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ３ａＬＶ０、ＨＶ４ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０、ＨＶ１０ＬＶ２、およびＨＶ１０ＬＶ４）の活性評価を行った。【０４３２】
（１）ビアコアによる組換えヒトＴｒｏｐ−２に対するＫＭ４０９７ヒト化抗体の結合活性評価
実施例３（２）と同様にして、ＫＭ４５９１ならびに、実施例８で得た６種類のＫＭ４０９７ヒト化抗体（ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ３ａＬＶ０、ＨＶ４ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０、ＨＶ１０ＬＶ２、およびＨＶ１０ＬＶ４）の、ヒトＴｒｏｐ−２／Ｆｃ／Ｈｉｓ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ社）に対する親和性を評価した。【０４３３】
各抗体のｋａ、ｋｄおよびＫＤ（ｋｄ／ｋａ）を表６に示す（２回の実験の平均値）。【０４３４】
【表６】
2011155579.tif 000007
【０４３５】
表６に示すように、全ての抗Ｔｒｏｐ−２ＫＭ４０９７ヒト化抗体（ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ３ａＬＶ０、ＨＶ４ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０、ＨＶ１０ＬＶ２、およびＨＶ１０ＬＶ４）は、１×１０−９Ｍ以下の高いアフィニティー（ＫＤ）値を示した。うち５種類のＫＭ４０９７ヒト化抗体（ＨＶ３ａＬＶ０、ＨＶ４ＬＶ０、ＨＶ５ＬＶ０、ＨＶ１０ＬＶ２、およびＨＶ１０ＬＶ４）は、５×１０−１０Ｍ以下の高いＫＤ値を示した。【０４３６】
（２）ヒトＴｒｏｐ−２発現細胞株に対する抗Ｔｒｏｐ−２ヒト化抗体のＡＤＣＣ活性の評価
（２）−１  標的細胞懸濁液の調製
ヒトＴｒｏｐ−２のＣ末端側にｍｙｃタグおよびＨｉｓタグを付加した配列（配列番号４８）をコードするＤＮＡ（配列番号４９）をｐＫＡＮＴＥＸ９３の適当な部位に挿入することにより、タグ付加ヒトＴｒｏｐ−２発現ベクターを構築した。該発現ベクターをＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に導入して得た形質転換株を本評価の標的細胞として用いた。標的細胞をＰＢＳで洗浄後、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（インビトロジェン社）を含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）（以下、ＡＤＣＣ用培地と表記する）で洗浄し、同培地で至適の細胞密度に調製して標的細胞懸濁液とした。【０４３７】
（２）−２  エフェクター細胞懸濁液の調製
凍結状態より融解した末梢血単核球〔Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ（ＰＢＭＣ）：ＡｌｌＣｅｌｌｓ社〕を、ＤＮａｓｅ  Ｉ（ロシュアプライドサイエンス社製）および１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除いた後、細胞をＤＮａｓｅ  Ｉおよび１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートした。該懸濁液を１５００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を除き、さらに、ＡＤＣＣ用培地を用いて２回洗浄した。ＡＤＣＣ用培地により細胞を至適の密度に調製し、エフェクター細胞懸濁液とした。【０４３８】
（２）−３  ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ底プレート（ＦＡＬＣＯＮ社）の各ウェルに、３μｇ／ｍＬから段階的に１０倍希釈した各抗体溶液を５０μＬ／ウェル分注した。次に、（２）−１で調製した標的細胞懸濁液を１×１０４個／５０μＬ／ウェル分注し、さらに（２）−２で調製したエフェクター細胞懸濁液を２．５×１０５個／５０μＬ／ウェル分注して全量を１５０μＬ／ウェルとした後、３７℃で２４時間反応させた。本系でのエフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）の比は２５：１とした。反応後、ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔｅｓｔ（和光純薬社）を用いて各培養上清の発色を測定した。【０４３９】
ＡＤＣＣ活性は次式により算出した。その結果を図１９に示す。【０４４０】
（式）
ＡＤＣＣ活性（％）＝｛（［検体の吸光度］−［標的細胞自然遊離の吸光度］−［エフェクター細胞自然遊離の吸光度］）／（［標的細胞全遊離の吸光度］−［標的細胞自然遊離の吸光度］）｝×１００【０４４１】
図１９に示すように、作製したヒト化抗体ＨＶ３ａＬＶ０、ＨＶ４ＬＶ０はＫＭ４５９１と同程度のＡＤＣＣ活性を示した。【０４４２】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１０年６月１０日付で出願された米国仮出願（６１／３５３４３０）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【産業上の利用可能性】
【０４４３】
本発明によれば、高いアフィニティーでヒトＴｒｏｐ−２の細胞外領域に結合し、かつ高い抗体依存的細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下ＡＤＣＣ活性と記す）、高い抗腫瘍活性を発揮するモノクローナル抗体またはその抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法、抗体または該抗体断片を用いる治療薬および診断薬を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０４４４】
配列番号１：ヒトＴｒｏｐ−２アミノ酸配列
配列番号２：ヒトＴｒｏｐ−２塩基配列
配列番号３：ＡＲ４７Ａ６．４．２ＶＨ塩基配列
配列番号４：ＡＲ４７Ａ６．４．２ＶＬ塩基配列
配列番号５：マウスＩｇＧ１プライマーｍＧ１ａ１塩基配列
配列番号６：マウスＩｇＧ１プライマーｍＧ１ａ２塩基配列
配列番号７：マウスκ鎖プライマーＫａ１塩基配列
配列番号８：マウスκ鎖プライマーＫａ２塩基配列
配列番号９：ＫＭ４０９７ＶＨ塩基配列
配列番号１０：ＫＭ４０９７ＶＨアミノ酸配列
配列番号１１：ＫＭ４０９７ＶＬ塩基配列
配列番号１２：ＫＭ４０９７ＶＬアミノ酸配列
配列番号１３：ＫＭ４０９７ＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号１４：ＫＭ４０９７ＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号１５：ＫＭ４０９７ＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号１６：ＫＭ４０９７ＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号１７：ＫＭ４０９７ＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号１８：ＫＭ４０９７ＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号１９：ＫＭ４０９７キメラ抗体作製用ＶＨ鎖増幅フォワードプライマー塩基配列
配列番号２０：ＫＭ４０９７キメラ抗体作製用ＶＨ鎖増幅リバースプライマー塩基配列
配列番号２１：ＫＭ４０９７キメラ抗体作製用ＶＬ鎖増幅フォワードプライマー塩基配列
配列番号２２：ＫＭ４０９７キメラ抗体作製用ＶＬ鎖増幅リバースプライマー塩基配列
配列番号２３：ＫＭ４０９７  ＨＶ０可変領域塩基配列
配列番号２４：ＫＭ４０９７  ＨＶ０可変領域アミノ酸配列
配列番号２５：ＫＭ４０９７  ＬＶ０可変領域塩基配列
配列番号２６：ＫＭ４０９７  ＬＶ０可変領域アミノ酸配列
配列番号２７：ＫＭ４０９７  ＨＶ３ａ可変領域塩基配列
配列番号２８：ＫＭ４０９７  ＨＶ３ａ可変領域アミノ酸配列
配列番号２９：ＫＭ４０９７  ＨＶ４可変領域塩基配列
配列番号３０：ＫＭ４０９７  ＨＶ４可変領域アミノ酸配列
配列番号３１：ＫＭ４０９７  ＨＶ５可変領域塩基配列
配列番号３２：ＫＭ４０９７  ＨＶ５可変領域アミノ酸配列
配列番号３３：ＫＭ４０９７  ＨＶ１０可変領域塩基配列
配列番号３４：ＫＭ４０９７  ＨＶ１０可変領域アミノ酸配列
配列番号３５：ＫＭ４０９７  ＬＶ２可変領域塩基配列
配列番号３６：ＫＭ４０９７  ＬＶ２可変領域アミノ酸配列
配列番号３７：ＫＭ４０９７  ＬＶ４可変領域塩基配列
配列番号３８：ＫＭ４０９７  ＬＶ４可変領域アミノ酸配列
配列番号３９：ＦＬＡＧタグおよびＦｃの塩基配列
配列番号４０：Ｔｒｏｐ−２細胞外領域にシグナル配列を付加した塩基配列
配列番号４１：Ｍｕｔａｎｔ  ＡよりＦＬＡＧタグおよびＦｃ領域を除いた塩基配列
配列番号４２：Ｍｕｔａｎｔ  ＢよりＦＬＡＧタグおよびＦｃ領域を除いた塩基配列
配列番号４３：Ｍｕｔａｎｔ  ＣよりＦＬＡＧタグおよびＦｃ領域を除いた塩基配列
配列番号４４：Ｔｒｏｐ−２／ＦＬＡＧ／Ｆｃアミノ酸配列
配列番号４５：Ｍｕｔａｎｔ  Ａアミノ酸配列
配列番号４６：Ｍｕｔａｎｔ  Ｂアミノ酸配列
配列番号４７：Ｍｕｔａｎｔ  Ｃアミノ酸配列
配列番号４８：Ｃ末端タグ付加ヒトＴｒｏｐ−２アミノ酸配列
配列番号４９：Ｃ末端タグ付加ヒトＴｒｏｐ−２塩基配列
【図１】
2011155579.tif 000008
【図２】
2011155579.tif 000009
【図３】
2011155579.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2011155579.tif 000019
【図１３】
2011155579.tif 000020
【図１４】
2011155579.tif 000021
【図１５】
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【図１６】
2011155579.tif 000023
【図１７】
2011155579.tif 000024
【図１８】
2011155579.tif 000025
【図１９】
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【配列表】
2011155579000001.app
【国際調査報告】
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2011155579.tif 000029
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