(57)【要約】  本発明は、簡便かつ有用な標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブの製造方法、塩基配列の情報処理方法、塩基配列の情報処理装置、塩基配列の情報処理システム、及び標的塩基の検出方法を提供することを課題とする。  本発明は、塩基数が７〜１４であり、Ｔｍ値が２５〜４０℃であり、かつ、標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、部分塩基配列を生成するステップを含む塩基配列の情報処理方法を提供する。本発明の方法は、研究者の経験や勘に基づくことなく、簡便にかつ効率よく標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブを製造するために有用であり、遺伝子工学分野のみならず、医療の研究分野においても極めて有用である。
2012014988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基配列の情報処理装置により実行される塩基配列の情報処理方法であって、
標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力するステップと、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成するステップと、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む塩基配列及びその相補的な塩基配列において、上記塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基をＲＮＡに変換してなる塩基配列を生成するステップと、
上記ＲＮＡに変換してなる塩基配列とその相補的な塩基配列とから、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列を生成するステップとを含むことを特徴とする塩基配列の情報処理方法。
【請求項２】
塩基配列の情報処理装置により実行される塩基配列の情報処理方法であって、
標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力するステップと、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成するステップと、
上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とから、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列を生成するステップと、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列において、上記塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基をＲＮＡに変換してなる部分塩基配列を生成するステップとを含むことを特徴とする塩基配列の情報処理方法。
【請求項３】
塩基配列の情報処理装置により実行される塩基配列の情報処理方法であって、
標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力するステップと、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成するステップと、
上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とに対して、
（ａ）標的塩基がプリン塩基であるか否かの判断と、
（ｂ）標的塩基の３’隣接塩基がプリン塩基であるか否かの判断と、
（ｃ）標的塩基の５’隣接塩基がプリン塩基であるか否かとの判断と
のうちの少なくとも１つの判断を行うことにより、上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とから、プリン塩基である１塩基をＲＮＡ位置として決定して、ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列を出力するステップと、
上記出力されるＲＮＡ位置情報を含む塩基配列から、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）上記ＲＮＡ位置で示された１塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
ＲＮＡ位置情報を含む部分塩基配列を生成するステップと、
上記ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列、又は上記ＲＮＡ位置情報を含む部分塩基配列において、ＲＮＡ位置として決定した塩基をＲＮＡに変換してなる部分塩基配列を生成するステップとを含むことを特徴とする塩基配列の情報処理方法。
【請求項４】
上記ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列を出力するステップは、上記標的塩基と上記決定されたＲＮＡ位置との位置関係に基づいて、上記生成されたＲＮＡに変換してなる部分塩基配列から標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブとして優れた部分塩基配列を選択するための優先順位を決定して、上記決定された優先順位を含む塩基配列又は部分塩基配列を出力することを含む請求項３記載の塩基配列の情報処理方法。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか１つに記載の塩基配列の情報処理方法の各ステップを含み、コンピュータにより実行されるプログラム。
【請求項６】
請求項５記載のプログラムを格納したことを特徴とする、コンピュータにより読取可能な記録媒体。
【請求項７】
標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力する手段と、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成する手段と、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む塩基配列及びその相補的な塩基配列において、上記塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基をＲＮＡに変換してなる塩基配列を生成する手段と
上記ＲＮＡに変換してなる塩基配列とその相補的な塩基配列とから、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列を生成する手段とを備えたことを特徴とする塩基配列の情報処理装置。
【請求項８】
標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力する手段と、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成する手段と、
上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とから、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列を生成する手段と、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列において、上記塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基をＲＮＡに変換してなる部分塩基配列を生成する手段とを備えたことを特徴とする塩基配列の情報処理装置。
【請求項９】
標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力する手段と、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成する手段と、
上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とに対して、
（ａ）標的塩基がプリン塩基であるか否かの判断と、
（ｂ）標的塩基の３’隣接塩基がプリン塩基であるか否かの判断と、
（ｃ）標的塩基の５’隣接塩基がプリン塩基であるか否かとの判断と
のうちの少なくとも１つの判断を行うことにより、上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とから、プリン塩基である１塩基をＲＮＡ位置として決定して、ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列を出力する手段と、
上記出力されるＲＮＡ位置情報を含む塩基配列から、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）上記ＲＮＡ位置で示された１塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
ＲＮＡ位置情報を含む部分塩基配列を生成する手段と、
上記ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列、又は上記ＲＮＡ位置情報を含む部分塩基配列において、ＲＮＡ位置として決定した塩基をＲＮＡに変換してなる部分塩基配列を生成する手段とを備えたことを特徴とする塩基配列の情報処理装置。
【請求項１０】
上記ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列を出力する手段は、上記標的塩基と上記決定されたＲＮＡ位置との位置関係に基づいて、上記生成されたＲＮＡに変換してなる部分塩基配列から標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブとして優れた部分塩基配列を選択するための優先順位を決定して、上記決定された優先順位を含む塩基配列又は部分塩基配列を出力することを特徴とする請求項９記載の塩基配列の情報処理装置。
【請求項１１】
請求項７〜１０のうちのいずれか１つに記載の塩基配列の情報処理装置と、クライアント装置とがネットワークを介して接続してなる塩基配列の情報処理システムであって、
上記クライアント装置は、上記入力される塩基配列を含む情報を上記ネットワークを介して上記塩基配列の情報処理装置に送信する送信手段を備え、
上記塩基配列の情報処理装置は、上記送信された塩基配列を含む情報に基づいて、上記生成されたＲＮＡに変換してなる部分塩基配列を生成して出力する手段とを備えたことを特徴とする塩基配列の情報処理システム。
【請求項１２】
請求項１〜４の塩基配列の情報処理方法により生成されたＲＮＡに変換してなる部分塩基配列と同一の配列からなるＲＮＡおよびＤＮＡ含有核酸断片を作成する工程を含む、標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブの製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法により製造された標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブを、試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程、上記ハイブリダイズ工程の後の上記標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブにリボヌクレアーゼＨを作用させる工程、及び上記リボヌクレアーゼＨによる上記標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブの切断の有無を検出する工程を含む、標的塩基の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
第一の態様において、本発明は、塩基配列の情報処理方法、塩基配列の情報処理装置、塩基配列の情報処理システム、標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブの製造方法、および標的塩基の検出方法に関する。
第二の態様において、本発明は、標的核酸の検出に有用なＲＮＡ含有プローブの設計方法、当該設計のための塩基配列処理方法、当該塩基配列処理方法をコンピュータに実行させるプログラム及び記録媒体に関する。また、当該塩基配列処理方法のため装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を増幅、あるいは検出する技術は、遺伝子工学、分子生物学における実験手段だけでなく、疾病の診断、遺伝子組換え食品の検査、微生物、ウイルスや病原菌の検出など、医薬、薬学、農林水産、食品分野において必要不可欠な技術となっている。【０００３】
生物種に関わらず、類似する機能を有する物質や酵素などは、それらがコードされる遺伝子において高い相同性を有する遺伝子群が存在することが知られている。また、同一種に属する生物個体のゲノムは完全に同一ではなく、多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）と呼ばれる塩基配列上の差異が存在することが知られている。多型には１〜数十塩基の欠失や挿入、特定の塩基配列が重複するものなどが知られている。１個の塩基が他の塩基に置換さているものは一塩基置換多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ、本願明細書においては一塩基置換と記載する場合がある）とよばれ、疾病に関連する遺伝子の探索、疾病へのかかりやすさや、薬に対する感受性（作用、副作用）の違いを知るための指標として注目されており、その検出方法についても研究が進められている。【０００４】
高い相同性を有する遺伝子群から特定の遺伝子の検出方法やＳＮＰの検出方法として、ＲＮＡ含有プローブと標的ＤＮＡとがハイブリダイズして形成されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドをリボヌクレアーゼで切断する方法がある（例えば、特許文献１）。プローブと標的ＤＮＡとの間にミスマッチがある場合にはリボヌクレアーゼによる切断が起こらないようにＲＮＡ含有プローブを設計することにより、標的ＤＮＡにおける特定の塩基の有無や塩基置換の有無を確認できる。【０００５】
通常の遺伝子検出用のプローブは、標的核酸の塩基配列をもとに、形成されるハイブリッドのＴｍ値やプローブの自己相補性等を指標として、標的核酸との間に特異的なハイブリダイゼーションが起こるような塩基配列を選択することにより設計されてきた。また、適切なプローブを設計するためのソフトウエアも種々提供されている。【０００６】
しかしながら、上記の標的核酸検出用のＲＮＡ含有プローブは特定の塩基の有無や塩基置換が生じている、もしくはその可能性がある特定の塩基を包含する領域でしか設計できないため、通常のプローブ設計に比べて領域選択の余地が小さい。更に、当該プローブに含有されるＲＮＡ部分のリボヌクレアーゼＨに対する感受性が特定の塩基やＳＮＰの存在／非存在により大きく変化する必要がある。これらの制約のため、これまでは研究者がその経験や試行錯誤に基づいてＲＮＡ含有プローブの設計を行うしかなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，６６０，９８８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、第一の態様において、簡便かつ有用な標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブの製造方法、塩基配列の情報処理方法、塩基配列の情報処理装置、及び塩基配列の情報処理システム、及び標的塩基の検出方法を提供することにある。
第二の態様において、本発明の目的は、簡便かつ有用な標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブの設計方法、塩基配列処理方法、塩基配列処理装置、並びに塩基配列処理システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、これまで研究者が検出しようとする標的核酸中の特定の塩基や一塩基置換毎に試行錯誤を経て行っていた標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブの設計について鋭意研究を重ねた。そして膨大な条件の組合せを１つ１つ検討した結果、特定の条件を満たす配列に、設計したＲＮＡ含有プローブをリボヌクレアーゼＨと組み合わせて用いた場合、効率よく特定の塩基やＳＮＰを検出できることを見出し、本発明を完成させた。また、このＲＮＡ含有プローブの設計を行うための塩基配列処理方法、当該処理方法をコンピュータに実行させるプログラム、塩基配列処理装置、更には、塩基配列処理装置とネットワークを介して通信可能な状態で接続されたクライアント装置より、標的核酸の塩基配列情報を入力するだけで、標的核酸検出用のＲＮＡ含有プローブの設計、更には特定の塩基や一塩基置換が効率よく検出できるプライマー対情報も得られる塩基配列処理システムを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明を概説すれば、第一の態様において、本発明は、
［１］塩基配列の情報処理装置により実行される塩基配列の情報処理方法であって、
標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力するステップと、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成するステップと、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む塩基配列及びその相補的な塩基配列において、上記塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基をＲＮＡに変換してなる塩基配列を生成するステップと、
上記ＲＮＡに変換してなる塩基配列とその相補的な塩基配列とから、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列を生成するステップとを含むことを特徴とする塩基配列の情報処理方法、
［２］塩基配列の情報処理装置により実行される塩基配列の情報処理方法であって、
標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力するステップと、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成するステップと、
上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とから、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列を生成するステップと、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列において、上記塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基をＲＮＡに変換してなる部分塩基配列を生成するステップとを含むことを特徴とする塩基配列の情報処理方法、
［３］塩基配列の情報処理装置により実行される塩基配列の情報処理方法であって、
標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力するステップと、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成するステップと、
上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とに対して、
（ａ）標的塩基がプリン塩基であるか否かの判断と、
（ｂ）標的塩基の３’隣接塩基がプリン塩基であるか否かの判断と、
（ｃ）標的塩基の５’隣接塩基がプリン塩基であるか否かとの判断と
のうちの少なくとも１つの判断を行うことにより、上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とから、プリン塩基である１塩基をＲＮＡ位置として決定して、ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列を出力するステップと、
上記出力されるＲＮＡ位置情報を含む塩基配列から、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）上記ＲＮＡ位置で示された１塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
ＲＮＡ位置情報を含む部分塩基配列を生成するステップと、
上記ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列、又は上記ＲＮＡ位置情報を含む部分塩基配列において、ＲＮＡ位置として決定した塩基をＲＮＡに変換してなる部分塩基配列を生成するステップとを含むことを特徴とする塩基配列の情報処理方法、
［４］上記ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列を出力するステップは、上記標的塩基と上記決定されたＲＮＡ位置との位置関係に基づいて、上記生成されたＲＮＡに変換してなる部分塩基配列から標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブとして優れた部分塩基配列を選択するための優先順位を決定して、上記決定された優先順位を含む塩基配列又は部分塩基配列を出力することを含む［３］記載の塩基配列の情報処理方法、
［５］［１］〜［４］のうちのいずれか１つに記載の塩基配列の情報処理方法の各ステップを含み、コンピュータにより実行されるプログラム、
［６］［５］記載のプログラムを格納したことを特徴とする、コンピュータにより読取可能な記録媒体、
［７］標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力する手段と、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成する手段と、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む塩基配列及びその相補的な塩基配列において、上記塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基をＲＮＡに変換してなる塩基配列を生成する手段と
上記ＲＮＡに変換してなる塩基配列とその相補的な塩基配列とから、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列を生成する手段とを備えたことを特徴とする塩基配列の情報処理装置、
［８］標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力する手段と、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成する手段と、
上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とから、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列を生成する手段と、
上記標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基の位置情報を含む部分塩基配列において、上記塩基配列の標的塩基又は上記標的塩基に隣接する塩基をＲＮＡに変換してなる部分塩基配列を生成する手段とを備えたことを特徴とする塩基配列の情報処理装置、
［９］標的塩基と、上記標的塩基の５’側に隣接する塩基と、上記標的塩基の３’側に隣接する塩基とを含む入力される塩基配列に、上記標的塩基の位置情報を入力して、当該入力された標的塩基の位置情報を含む塩基配列を出力する手段と、
上記出力される標的塩基の位置情報を含む塩基配列に対する、標的塩基の位置情報を含む相補的な塩基配列を生成する手段と、
上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とに対して、
（ａ）標的塩基がプリン塩基であるか否かの判断と、
（ｂ）標的塩基の３’隣接塩基がプリン塩基であるか否かの判断と、
（ｃ）標的塩基の５’隣接塩基がプリン塩基であるか否かとの判断と
のうちの少なくとも１つの判断を行うことにより、上記出力された塩基配列と、上記生成された相補的な塩基配列とから、プリン塩基である１塩基をＲＮＡ位置として決定して、ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列を出力する手段と、
上記出力されるＲＮＡ位置情報を含む塩基配列から、
（ｄ）部分塩基配列の塩基数が７〜１４であり、
（ｅ）部分塩基配列のTm値が２５〜４０℃であり、
（ｆ）上記ＲＮＡ位置で示された１塩基が、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目に位置する、
ＲＮＡ位置情報を含む部分塩基配列を生成する手段と、
上記ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列、又は上記ＲＮＡ位置情報を含む部分塩基配列において、ＲＮＡ位置として決定した塩基をＲＮＡに変換してなる部分塩基配列を生成する手段とを備えたことを特徴とする塩基配列の情報処理装置、
［１０］上記ＲＮＡ位置情報を含む塩基配列を出力する手段は、上記標的塩基と上記決定されたＲＮＡ位置との位置関係に基づいて、上記生成されたＲＮＡに変換してなる部分塩基配列から標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブとして優れた部分塩基配列を選択するための優先順位を決定して、上記決定された優先順位を含む塩基配列又は部分塩基配列を出力することを特徴とする［９］記載の塩基配列の情報処理装置、
［１１］［７］〜［１０］のうちのいずれか１つに記載の塩基配列の情報処理装置と、クライアント装置とがネットワークを介して接続してなる塩基配列の情報処理システムであって、
上記クライアント装置は、上記入力される塩基配列を含む情報を上記ネットワークを介して上記塩基配列の情報処理装置に送信する送信手段を備え、
上記塩基配列の情報処理装置は、上記送信された塩基配列を含む情報に基づいて、上記生成されたＲＮＡに変換してなる部分塩基配列を生成して出力する手段とを備えたことを特徴とする塩基配列の情報処理システム、
［１２］［１］〜［４］の塩基配列の情報処理方法により生成されたＲＮＡに変換してなる部分塩基配列と同一の配列からなるＲＮＡおよびＤＮＡ含有核酸断片を作成する工程を含む、標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブの製造方法、及び
［１３］［１２］に記載の方法により製造された標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブを、試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程、上記ハイブリダイズ工程の後の上記標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブにリボヌクレアーゼＨを作用させる工程、及び上記リボヌクレアーゼＨによる上記標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブの切断の有無を検出する工程を含む、標的塩基の検出方法
に関する。
また、第二の態様において、本発明は、
［１］下記（ａ）〜（ｄ）の条件を満たす塩基配列を創成する工程を包含する、標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブの設計方法、
（ａ）１つのプリン塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｂ）検出しようとする標的核酸又はその相補鎖に由来する塩基配列が７〜１４の塩基数を有する。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端より３〜５塩基目、あるいは、５’末端より３〜５塩基目に位置する。
（ｄ）Ｔｍ値が２５〜４０℃の範囲にある。
［２］工程（ａ）のＲＮＡが、標的核酸中の一塩基置換が起こり得る塩基、その３’側に隣接する塩基、標的核酸中の一塩基置換が起こり得る塩基の相補鎖の塩基、及び当該相補鎖の塩基の３’側に隣接する塩基から選択される１つの塩基に対応する塩基である、［１］の設計方法、
［３］［１］又は［２］に記載の設計方法により標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブを設計する工程、当該プローブを合成する工程、合成されたＲＮＡ含有プローブを試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程、及びリボヌクレアーゼＨを作用させ、プローブの切断の有無を調べる工程、を含む標的核酸の検出方法、
［４］標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブを設計するための標的核酸の塩基配列の処理方法であって、
検出しようとする標的核酸の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得工程、
上記標的核酸の塩基配列中の１塩基、その３’側に隣接する塩基、上記１塩基に対応する標的核酸の相補鎖の塩基配列中の塩基、及び当該相補鎖の塩基配列中の塩基の３’側に隣接する塩基から選択される塩基の１つがプリン塩基であるか否かを判定する塩基判定工程、
上記プリン塩基の１つをＲＮＡとし、他はＤＮＡとする塩基情報作成工程、
検出しようとする標的核酸又はその相補鎖に由来する塩基配列の塩基数を７〜１４とし、部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成工程、
上記部分塩基配列情報から、前記ＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目、あるいは５’末端より３〜５塩基目の位置である塩基配列を選択する塩基配列選択工程、
上記塩基配列選択工程で得られた塩基配列のＴｍ値が２５〜４０℃の範囲である特定の塩基含有配列を選択する特定塩基含有配列選択工程、
を包含する塩基配列処理方法、
［５］更に、設計されたＲＮＡ含有プローブに対応する領域を含む標的核酸の断片を増幅するためのプライマー対を標的核酸の塩基配列情報より設計する標的核酸増幅用プライマー設計工程を含む［４］記載の塩基配列処理方法、
［６］上記塩基配列情報中の１塩基が、一塩基置換が起こり得る塩基である、［４］記載の塩基配列処理方法、
［７］［４］又は［５］に記載の塩基配列処理方法をコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム、
［８］［７］記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能記録媒体、
［９］標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブを設計するための標的核酸の処理装置であって、
検出しようとする標的核酸の塩基配列情報を取得する塩基配列情報取得手段、
上記標的核酸の塩基配列中の１塩基、その３’側に隣接する塩基、上記１塩基に対応する標的核酸の相補鎖の塩基配列中の塩基、及び当該相補鎖の塩基配列中の塩基の３’側に隣接する塩基から選択される塩基の１つがプリン塩基であるか否かを判定する塩基判定手段、
上記プリン塩基の１つをＲＮＡとし、他はＤＮＡとする塩基情報作成手段、
検出しようとする標的核酸又はその相補鎖に由来する塩基配列の塩基数を７〜１４とし、部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成手段、
上記部分塩基配列情報から、前記ＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目、あるいは５’末端より３〜５塩基目の位置である塩基配列を選択する塩基配列選択手段、
上記塩基配列選択工程で得られた塩基配列のＴｍ値が２５〜４０℃の範囲である特定の塩基含有配列を選択する特定塩基含有配列選択手段、
を備えたことを特徴とする塩基配列処理装置、
［１０］更に、設計されたＲＮＡ含有プローブに対応する領域を含む標的核酸の断片を増幅するためのプライマー対を標的核酸の塩基配列情報より設計する標的核酸増幅用プライマー設計手段を備えた［９］記載の塩基配列処理装置、
［１１］上記塩基配列情報中の１塩基が、一塩基置換が起こり得る塩基である、［９］記載の塩基配列処理装置、
［１２］［９］又は［１０］記載の塩基配列処理装置とネットワークを介して通信可能な状態で接続されたクライアント装置からなる塩基配列処理システムであって、
当該クライアント装置は、標的核酸の塩基配列情報を上記塩基配列処理装置に送信する手段と、上記塩基配列処理装置より送信された標的核酸中の標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブ情報又は当該プローブ情報及び標的核酸増幅用プライマー情報を取得する手段を備えたことを特徴とする塩基配列処理システム、
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、これまで研究者の経験や勘に基づいて行っていた標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブの設計を簡便に行うことができ、効率よく標的核酸、並びに標的核酸中の特定の塩基（本明細書において、この塩基は標的塩基と称されることもある）やＳＮＰを検出することが可能となる。更に標的核酸中の特定の塩基や一塩基置換が効率よく検出できるプライマー対情報も得られることから、標的核酸の検出の経験が少ない又は経験がない研究者であっても、標的核酸を検出するためのＲＮＡ含有プローブを容易に設計することが可能であり、かつ効率よく目的とする標的核酸中の特定の塩基やＳＮＰを検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の塩基配列処理方法の工程を示す図である。
【図２】本発明の塩基配列処理方法の工程の一例を示す図である。
【図３】本発明の塩基配列処理方法の工程の一例を示す図である。
【図４】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図５】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図６】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図７】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図８】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図９】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図１０】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図１１】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図１２】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図１３】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図１４】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図１５】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図１６】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図１７】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図１８】本発明の方法で設計したＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による特異性の結果の一例を示す図である。
【図１９】本発明の装置のブロック図の一例を示す図である。
【図２０】データメモリ２３の内部構造を示す図面である。
【図２１】本発明の塩基配列処理方法のフローチャートの一例を示す図である。
【図２２】ＳＴ３のフローチャートを示す図である。
【図２３】ＳＴ４のフローチャートを示す図である。
【図２４】ＳＴ３１のフローチャートを示す図である。
【図２５】ＳＴ３２のフローチャートを示す図である。
【図２６】ＳＴ１〜ＳＴ４において入力または作成されるデータの形式をまとめたテーブルである。
【図２７】ＳＴ２の処理において参照されるテーブルである。
【図２８】ＳＴ１８〜ＳＴ２５の処理において作成される文字列Ｎを示すテーブルである。
【図２９】ＳＴ１１〜ＳＴ１７の判断において参照されるテーブルである。
【図３０】ＳＴ３３の処理において参照されるテーブルである。
【図３１】ＳＴ５の判定において参照されるテーブルである。
【図３２】ＳＴ１０の処理において出力されるデータのテーブルである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明を具体的に説明する。
【００１４】
本発明は、標的核酸とハイブリダイズさせた後にリボヌクレアーゼＨによる切断の有無に基づいて標的核酸を検出する方法に使用されるＲＮＡ含有プローブを提供する。以下、本発明により設計されるＲＮＡ含有プローブの特徴について、標的核酸中の特定の位置における塩基Ｘの検出のためのＲＮＡ含有プローブを例として説明する。ここで、前記の塩基Ｘは標的核酸中の任意の塩基であってよいが、例えば一塩基置換の結果として通常の塩基から置換した塩基であってもよく、あるいは他の塩基に置換している可能性のある通常見出される塩基であってもよい。前記の塩基Ｘは、本明細書において、標的塩基と称されることもある。
【００１５】
本発明のＲＮＡ含有プローブは標的核酸中の上記の塩基Ｘを含む領域又は当該領域に相補的な領域にハイブリダイズ可能な配列を有する。従って、当該プローブは標的核酸又はその相補鎖より選択される塩基配列の一部であって、かつ塩基Ｘ又は標的核酸の相補鎖中の塩基Ｘに相補的な塩基（Ｙとする）を包含する領域にハイブリダイズする配列である。その鎖長は特に限定はないが、好ましくは７〜１４塩基である。塩基Ｘ、塩基Ｙ、又はそれらの３’側に隣接する塩基の少なくとも１つはプリン塩基（アデニン又はグアニン）であることから、本発明のＲＮＡ含有プローブの設計では前記プリン塩基のいずれかを選択して当該塩基のみをＲＮＡとし、他の塩基はＤＮＡとする。すなわち、塩基Ｘ及びその３’側に隣接する塩基がピリミジン塩基（シトシン又はチミン）である場合には、標的核酸の相補鎖の配列よりＲＮＡ含有プローブを設計する（塩基Ｙ又はその３’側に隣接する塩基をＲＮＡとする）ことでこの条件を満たすことができる。ＤＮＡにはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの他、例えば、ｄＵＴＰ、イノシン、７−ＤＥＡＺＡ−ＧＴＰ、７−ＤＥＡＺＡ−ＡＴＰ、ＬＮＡ修飾したＤＮＡを使用することができる。前記ＲＮＡは当該プローブの３’末端、５’末端のいずれかより３〜５塩基目に位置している。好ましい態様では、プローブの３’末端、５’末端のいずれかより３又は４塩基目にＲＮＡが位置している。プローブのＴｍ値は２５〜４０℃の範囲、好ましくは２５〜３２℃の範囲にある。ここで、Ｔｍ値は、ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ法を用いて、更にＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３６巻、第３４号、１０５８１〜１０５９４頁（１９９７年）に記載の方法で、ＤＮＡ濃度５００ｎＭ、塩濃度５０ｍＭとして計算される。
【００１６】
以上の条件を満たすＲＮＡ含有プローブは、塩基Ｘを有する標的核酸（ＤＮＡ）又はその相補鎖とハイブリダイズさせてリボヌクレアーゼＨを作用させた場合に、上記条件のいずれかを満たしていないＲＮＡ含有プローブと比較して効率よくリボヌクレアーゼＨの切断を受ける。すなわち、標的核酸中の塩基Ｘの存在を高感度に検出できる。
【００１７】
本発明の標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブの設計方法では、まず、標的核酸の塩基配列情報を取得する。ここで「標的核酸の塩基配列情報」とは、標的核酸の塩基配列及び当該塩基配列中の１塩基の位置を示す。ここで、「１塩基の位置」とは、検出したい標的核酸中の１塩基の位置を示す。標的核酸が高い相同性を有する遺伝子群から特定の遺伝子を検出するためのＲＮＡ含有プローブを設計する場合、常法に従いこれら遺伝子群の塩基配列の相同性解析を行い、保存されている領域又は相同性の高い領域中で、標的である遺伝子と他の遺伝子とで相同性の低い塩基、もしくは異なる塩基を見つけ出し、その位置を当該１塩基の位置としてもよい。ＳＮＰを検出するためのＲＮＡ含有プローブを設計する場合、ゲノム解析などでＳＮＰが起こり得る塩基であると推定された塩基や公開されている公的データベースに記載されているＳＮＰの位置を前記の１塩基としてＲＮＡ含有プローブの設計を行ってもよい。塩基配列としては、核酸配列であれば特に限定されないが、ＤＮＡ配列が好ましい。また、当該塩基配列中の塩基の位置は１つでも複数個でもよい。複数個の場合、本発明の標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブの設計方法では、それぞれ１つの位置を１塩基の位置として個別に設計を行う。更に、標的核酸の塩基配列情報は、任意の塩基配列及び当該塩基配列の１塩基の位置、もしくは各種公開されているデータベースより取得した塩基配列及び当該塩基配列の１塩基の位置でもよい。
【００１８】
前記標的核酸の塩基配列情報に基づき、以下の条件をみたす配列の集合を作成する。
（ａ）１つのプリン塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｂ）検出しようとする標的核酸又はその相補鎖に由来する塩基配列の塩基数が７〜１４である。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端より３〜５塩基目に位置する。あるいは、５’末端より３〜５塩基目に位置する。
（ｄ）Ｔｍ値が２５〜４０℃の範囲にある。
塩基の位置が複数個ある場合、個々の塩基の位置に対してそれぞれ集合を作成する。
【００１９】
上記配列の集合を作成する際、更に、次の条件を追加することが好ましい。
（ｅ）（ａ）において、ＲＮＡとしたプリン塩基から５’側に２塩基までの配列（計３塩基）に相補する配列、又はＲＮＡとしたプリン塩基の５’側の１塩基から３’側の１塩基までの配列（計３塩基）に相補する配列が同一プローブ内に存在する場合は、上記配列の集合から除く。
（ｆ）相補部分が４塩基以上の逆方向反復塩基配列（パリンドローム配列）が含まれる配列は、上記配列の集合から除く。
【００２０】
また、上記配列の集合を作成する際、上記条件の内、（ａ）及び（ｃ）が以下のいずれであるかによって、次の基準に従ってプローブの順位付けを行うことが好ましい。以下の優先順位１〜６において、数値が低いことは、優先順位が高いことを意味する。また、以下に記載の「標的核酸中の１塩基」は標的塩基を示し、以下の優先順位において「当該１塩基」とも称する。
１．標的核酸中の１塩基がプリン塩基であって、その３’側及び５’側に隣接する塩基がともにプリン塩基である場合；
優先順位１：  （ａ）当該１塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端より３〜５塩基目に位置する。
優先順位２：  （ａ）当該１塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端より３〜５塩基目に位置する。
優先順位３：  （ａ）当該１塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端より３〜５塩基目に位置する。
優先順位４：  （ａ）当該１塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端より３〜５塩基目に位置する。
【００２１】
２．標的核酸中の１塩基がプリン塩基であって、その３’側に隣接する塩基がプリン塩基であり、５’側に隣接する塩基がピリミジン塩基である場合；
優先順位１：  （ａ）当該１塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端より３〜５塩基目に位置する。
優先順位２：  （ａ）当該１塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
：  （ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端より３〜５塩基目に位置する。
優先順位３：  （ａ）当該１塩基の相補鎖（アンチセンス鎖）の塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端より３〜５塩基目に位置する。
優先順位４：  （ａ）当該１塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端より３〜５塩基目に位置する。
優先順位５：  （ａ）当該１塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端より３〜５塩基目に位置する。
優先順位６：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
【００２２】
３．標的核酸中の１塩基がプリン塩基であって、その３’側に隣接する塩基がピリミジン塩基であり、５’側に隣接する塩基がプリン塩基である場合；
優先順位１：  （ａ）当該１塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位２：  （ａ）当該１塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
【００２３】
４．標的核酸中の１塩基がプリン塩基であって、その３’側及び５’側に隣接する塩基がともにピリミジン塩基である場合；
優先順位１：  （ａ）当該１塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位２：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位３：  （ａ）当該１塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位４：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
【００２４】
５．標的核酸中の１塩基がピリミジン塩基であって、その３’側及び５’側に隣接する塩基がともにプリン塩基である場合；
優先順位１：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位２：  （ａ）当該１塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位３：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位４：  （ａ）当該１塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
【００２５】
６．標的核酸中の１塩基がピリミジン塩基であって、その３’側に隣接する塩基がプリン塩基であり、５’側に隣接する塩基がピリミジン塩基である場合；
優先順位１：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位２：  （ａ）当該１塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位３：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位４：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位５：  （ａ）当該１塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位６：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
【００２６】
７．標的核酸中の１塩基がピリミジン塩基であって、その３’側に隣接する塩基がピリミジン塩基であり、５’側に隣接する塩基がプリン塩基である場合；
優先順位１：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位２：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
【００２７】
８．標的核酸中の１塩基がピリミジン塩基であって、その３’側及び５’側に隣接する塩基がともにピリミジン塩基である場合；
優先順位１：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位２：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位３：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
優先順位４：  （ａ）当該１塩基のアンチセンス鎖の塩基の３’側に隣接する塩基がＲＮＡであり、他はＤＮＡである。
（ｃ）（ａ）のＲＮＡが５’末端から３〜５塩基目に位置する。
【００２８】
上記の設計方法により得られたＲＮＡ含有プローブを用いて、標的核酸の検出を行う方法も本願に含まれる。例えば、上記方法で設計された優先順位の高いＲＮＡ含有プローブ配列を公知の方法により合成する。合成されたＲＮＡ含有プローブを試料中の核酸にハイブリダイズさせた後、リボヌクレアーゼＨを作用させ、当該プローブの切断の有無を調べることにより、試料中の標的核酸の検出を行うことができる。プローブの切断の有無を調べる手段には特に限定はなく、公知の核酸分析手法を利用することができる。例えば、電気泳動法や高速液体クロマトグラフィー法により、当該プローブの鎖長の変化から切断を検出することができる。特に好適な態様としては、例えばＲＮＡ含有プローブを蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質の両者で、プローブ内のＲＮＡをはさんだ位置に適当な間隔をとって標識したものが包含される。このようなＲＮＡ含有プローブはインタクトな状態ではほとんど蛍光を発することはないが、切断されて蛍光物質と消光物質との距離が離れた場合には蛍光を発するようになる。このようなＲＮＡ含有プローブとすることで、反応中の反応液が発する蛍光を観察することにより標的核酸の検出を行うことができる。蛍光物質や消光物質には多種のものが知られており、すでに多くのものが市販されている。なお、本発明で設計されたＲＮＡ含有プローブを使用した標的核酸の検出は、特定の塩基の検出やこれら特定の塩基の有無の検出、特に一塩基置換が生じた結果として標的核酸中に存在することとなった塩基の存在の検出、あるいは一塩基置換が生じた場合には、他の塩基に置換されている通常見出される塩基の非存在の検出の方法として実施することができる。
【００２９】
本発明の塩基配列処理方法は、上記の標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブの設計方法に基づいて、まず、標的核酸の塩基配列情報を取得する工程（Ｓ１）、取得した塩基配列情報をチェックする工程（Ｓ２）、ＲＮＡ含有プローブを設計する工程（Ｓ３）を含むものである（図１）。当該プローブを設計する工程（Ｓ３）は、上記（ａ）〜（ｄ）の条件を順次処理する工程を含むものである。更に、上記（ｅ）及び（ｆ）の条件を処理する工程を含むことが好ましい。
ＲＮＡ含有プローブを設計する工程を、更に詳細に説明すると、上記塩基配列情報より、塩基配列情報中の１塩基、その３’側に隣接する塩基、上記塩基配列情報中の１塩基の相補鎖の塩基、及び当該相補鎖の塩基の３’側に隣接する塩基から選択される塩基の１つがプリン塩基であるか否かを判定する塩基判定工程、
上記プリン塩基の１つをＲＮＡとし、他はＤＮＡとする塩基情報作成工程、
検出しようとする標的核酸又はその相補鎖に由来する塩基配列の塩基数を７〜１４とし、部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成工程、
上記部分塩基配列情報から、前記ＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目、あるいは５’末端より３〜５塩基目の位置である塩基配列を選択する塩基配列選択工程、
上記塩基配列選択工程で得られた塩基配列のＴｍ値が２５〜４０℃の範囲である特定の塩基含有配列を選択する特定塩基含有配列選択工程、からなる。
【００３０】
標的核酸の塩基配列情報を取得する工程において、取得した塩基配列情報をもとにして、公開されている公的データベースから、更に詳細な情報を取得する工程を追加してもよい。また、取得した塩基配列情報のチェック工程において、取得した塩基配列情報と公開されている公的データベースの情報を比較チェックする工程を追加してもよい。
【００３１】
また、本発明により設計されたＲＮＡ含有プローブがハイブリダイズする標的核酸上の領域を増幅できるプライマー対を設計する工程（Ｓ４）を加えることができる（図２又は図３）。更に、上記工程で提供されるＲＮＡ含有プローブと当該プローブに対して設計されたプライマー対とのセットリストを作成する工程（Ｓ５）を加えることもできる。当該プライマー対を設計する工程におけるプライマー対の設計方法については、特に限定はなく、標的核酸中のＲＮＡ含有プローブ配列がハイブリダイズする領域を増幅できるようなプライマー対を公知の方法を用いて設計すればよい。また、当該プライマー対は公知の核酸増幅法、例えばＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法等に使用可能なものであればよい。こうして設計されたプライマーによる試料中の標的核酸由来のＤＮＡ断片の増幅と本発明の標的核酸の検出方法を組み合わせることにより、微量の試料から高感度で目的とする遺伝子中の特定の塩基や一塩基置換の有無を検出することができる。
【００３２】
更に、本発明においては、既に設計されている公知の核酸増幅法に使用可能なプライマー対により増幅されるＤＮＡ配列中に、ＲＮＡ含有プローブを設計することも可能である。この場合、上記増幅されるＤＮＡ配列中の１塩基を本発明の「１塩基」とし、本発明の方法でＲＮＡ含有プローブを設計することにより、当該プローブを用いて高感度に増幅配列を検出することが可能である。
【００３３】
本発明の塩基配列処理方法をコンピュータに実行させるプログラムとしては、上記の塩基配列処理方法の各工程を実行することが可能なプログラムであればよく、例えば、Ｒｕｂｙ、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）等により記述されたプログラムが挙げられる。
【００３４】
上記プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能記録媒体としては、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）等の光ディスク、フラッシュメモリやハードディスク等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、コンピュータで読み取り可能な記録媒体であれよい。
【００３５】
本発明の塩基配列処理装置は、上記の標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブの設計方法に基づいて、まず、検出しようとする標的核酸の塩基配列情報を取得する手段、取得した塩基配列情報をチェックする手段、ＲＮＡ含有プローブを設計する手段を含むものである。当該プローブを設計する手段は、上記（ａ）〜（ｄ）の条件を順次処理する手段を含むものである。更に、上記（ｅ）及び（ｆ）の条件を処理する手段を含むことが好ましい。
ＲＮＡ含有プローブを設計する手段を、更に詳細に説明すると、上記塩基配列情報より、標的核酸の塩基配列中の１塩基、その３’側に隣接する塩基、上記１塩基に対応する標的核酸の相補鎖の塩基配列中の塩基、及び当該相補鎖の塩基配列中の塩基の３’側に隣接する塩基の少なくとも１つがプリン塩基であるか否かを判定する塩基判定手段、
上記プリン塩基の１つをＲＮＡとし、他はＤＮＡとする塩基情報作成手段、
検出しようとする標的核酸又はその相補鎖に由来する塩基配列の塩基数を７〜１４とし、部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成手段、
上記部分塩基配列情報から、前記ＲＮＡが３’末端から３〜５塩基目、あるいは５’末端より３〜５塩基目の位置である塩基配列を選択する塩基配列選択手段、
上記塩基配列選択手段で得られた塩基配列のＴｍ値が２５〜４０℃の範囲である特定の塩基含有配列を選択する特定塩基含有配列選択手段、からなる。
【００３６】
標的核酸の塩基配列情報を取得する手段において、取得した塩基配列情報をもとにして、公開されている公的データベースから、更に詳細な情報を取得する手段を追加してもよい。また、取得した塩基配列情報のチェック手段において、取得した塩基配列情報と公開されている公的データベースの塩基配列情報を比較チェックする手段を追加してもよい。また前記手段において、設計されるＲＮＡ含有プローブの非標的核酸へのハイブリダイズの可能性の評価を行う手段を追加してもよい。
【００３７】
また、本発明により設計されたＲＮＡ含有プローブがハイブリダイズする標的核酸上の領域を増幅できるプライマー対を設計する手段を加えることができる。更に、上記の手段で提供されるＲＮＡ含有プローブと当該プローブ配列に対して設計されたプライマー対とのセットリストを作成する手段を加えることもできる。ここで、プライマーは公知の核酸増幅法、例えばＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法等に使用可能なものであればよい。こうして設計されたプライマーによる試料中の標的核酸由来のＤＮＡ断片の増幅と本発明の標的核酸の検出方法を組み合わせることにより、微量の試料から高感度で目的とする遺伝子中の特定の塩基や一塩基置換の有無を検出することができる。
【００３８】
本発明の塩基配列処理装置は単独で処理を行う装置であってもよく、また、当該塩基配列処理装置とネットワークを介して通信可能な状態で接続されたクライアント装置間で情報をやりとりする塩基配列処理システムであってもよい。前者の場合、例えば、本発明のプログラムをコンピュータのハードディスクに動作可能な状態で記録又はインストールし、当該コンピュータを本発明の塩基配列処理装置とすることができる。また、本発明のプログラムを光ディスクやフラッシュメモリ等の外部媒体に動作可能な状態で記録又はインストールし、当該外部媒体をコンピュータに接続し、コンピュータのハードディスクに本発明のプログラムを記録又はインストールすることなく、本発明の塩基配列処理を行える装置とすることができる。後者の場合、例えば、パソコン通信、イントラネットやインターネット等のネットワークを介して、クライアント装置より標的核酸の塩基配列情報を本発明の塩基配列処理装置に送信し、当該塩基配列処理装置より得られた標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブ情報、プライマー対設計情報をクライアント装置から受け取ることができる。又は、クライアント装置の要求に応じてこれら情報を選択して受け取ることができる。当該システムであれば、塩基配列処理装置の設置場所等に関係なく、本発明の塩基配列処理装置を使用することができ有用である。また、当該塩基配列処理装置をクライアント装置から簡便に利用可能にするため、Ｗｅｂ画面上で情報の送受信ができるようにするのは、当然のことである。
【００３９】
本発明により設計されるＲＮＡ含有プローブ並びにリボヌクレアーゼＨを核酸増幅反応液に添加することにより、標的核酸の増幅と検出を一つの反応で実施することが可能となる。本発明により設計されたＲＮＡ含有プローブは、特にＰＣＲによる標的核酸断片の増幅反応と耐熱性リボヌクレアーゼＨによるプローブの切断反応とを同時に行う検出系に好適である。また、前記のように切断に伴ってシグナル、例えば蛍光が発生するように標識されたＲＮＡ含有プローブはこのような態様に好適であり、シグナル検出系を備えた核酸増幅装置と組み合わせて標的核酸や一塩基置換の迅速検出系を構築することができる。
本発明によれば、標的核酸の検出や標的核酸上のＳＮＰの検出に有用なＲＮＡ含有プローブを作製することができ、さらに、当該プローブと組み合わせることができる標的核酸断片増幅用のプライマー対も提供される。これらのＲＮＡ含有プローブ、プライマーは標的核酸やＳＮＰを感度よく検出するための試薬、キットのコンポーネントとすることができる。すなわち、本発明により高感度な標的核酸、一塩基置換の検出系も提供される。
【００４０】
以下、図１９〜図３２に基づき、本発明の具体的な実施態様を説明する。
【００４１】
図１９は、本発明の塩基配列処理装置１０である。塩基配列処理装置１０は、
（ａ）当該塩基配列処理装置１０の動作及び処理を演算及び制御するコンピュータのＣＰＵ（中央演算処理装置）２０と、
（ｂ）オペレーションプログラムなどの基本プログラム及びそれを実行するために必要なデータを格納するＲＯＭ（読み出し専用メモリ）２１と、
（ｃ）ＣＰＵ２０のワーキングメモリとして動作し、画像処理で必要なパラメータやデータを一時的に格納するＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）２２と、
（ｄ）例えばハードディスクメモリで構成され、図２０に示すように各種のデータを格納するデータメモリ２３と、
（ｅ）例えばハードディスクメモリで構成され、ＣＤ−ＲＯＭドライブ装置４５を用いて読みこんだ図２１〜図２５の処理のプログラムを格納するプログラムメモリ２４と、
（ｆ）通信端末装置４６と接続され、インターネット５０を介して遺伝子データベースサーバ装置６０と、遺伝子データベースのデータを送受信する通信インターフェース３６と、
（ｇ）所定のデータや指示コマンドを入力するためのキーボード４１に接続され、キーボード４１から入力されたデータや指示コマンドを受信して所定の信号変換などのインターフェース処理を行ってＣＰＵ２０に伝送するキーボードインターフェース３１と、
（ｈ）ＣＲＴディスプレイ４３上で指示コマンドを入力するためのマウス４２に接続され、マウス４２から入力されたデータや指示コマンドを受信して所定の信号変換などのインターフェース処理を行ってＣＰＵ２０に伝送するマウスインターフェース３２と、
（ｉ）ＣＰＵ２０によって処理された出力データや設定指示画面などを表示するＣＲＴディスプレイ４３に接続され、表示すべき画像データをＣＲＴディスプレイ４３用の画像信号に変換してＣＲＴディスプレイ４３に出力して表示するディスプレイインターフェース３３と、
（ｊ）ＣＰＵ２０によって処理された出力データなどを印字するプリンタ４４に接続され、印字すべき印字データの所定の信号変換などを行ってプリンタ４４に出力して印字するプリンタインターフェース３４と、
（ｋ）上記処理のプログラムが記憶されたＣＤ−ＲＯＭ４５ａから当該プログラムのプログラムデータを読み出すＣＤ−ＲＯＭドライブ装置４５に接続され、読み出された画像処理プログラムのプログラムデータを所定の信号変換などを行ってプログラムメモリ２４に転送するドライブ装置インターフェース３５とを備え、
これらの回路２０〜２４、３１〜３６はバス３０を介して接続される。
【００４２】
図２０は図１９のデータメモリ２３の内部構成を示すブロック図である。図２０に示すように、データメモリ２３は以下のテーブルを格納する。
（１）相補的塩基配列作成処理における参照テーブル７１。
（２）ＲＮＡ位置決定における参照テーブル７２。
（３）プリン塩基の判断における参照テーブル７３。
（４）優先順位決定における参照テーブル７４〜７６。
（５）２５℃≦Ｔｍ値≦４０℃か否かの判定処理における参照テーブル７７。
（６）部分塩基配列およびプライマー配列の出力情報テーブル７８。
テーブル７１〜７８を、図２７〜３２に示す。
【００４３】
図１９の装置は、図２１のフローチャートに示される処理を行う。図２１のＳＴ１は、標的核酸の塩基配列、および標的塩基を表す情報を入力する処理である。入力される文字列は、文字列Ｋ（数ｘ，文字列Ｊ，記号ｉ）である（図２６のテーブル７０参照）。文字列Ｊは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれかの文字によって構成される一次元の文字列である。文字列Ｊは、標的核酸の塩基配列に対応する。文字列Ｊの左側が塩基配列の５’側であり、右側が塩基配列の３’側である。数ｘは、自然数である。数ｘは、標的塩基を表す。文字列Ｊの左からｘ番目に存在する文字が、標的塩基である。記号ｉは、文字列Ｋが入力された塩基配列であることを示す。記号ｉは、ＳＴ２で作成される塩基配列と区別するためのものである。
【００４４】
ＳＴ２は、標的核酸の相補的な塩基配列を作成する処理である。ＳＴ２により、文字列Ｍ（数ｘ，文字列Ｌ，記号ｃ）が作成される（図２６のテーブル７０参照）。数ｘは、文字列Ｋにおける数ｘと同一である。文字列Ｌは、図２７のテーブル７１にもとづき、文字列Ｊから作成される。文字列Ｌを構成する文字は、文字列Ｊを右側から読み左側から並べて得られた文字列を構成する文字と、それぞれ、図２７のテーブル７１の対応関係をもつ。記号ｃは、文字列Ｌが相補的塩基配列であることを示す。
【００４５】
ＳＴ３は、ＲＮＡ位置、および優先順位を決定する処理である。ＳＴ３は、図２２のフローチャートにしたがって行われる。図２２のフローチャートは、ＳＴ１１〜ＳＴ１７の判断処理、およびＳＴ１８〜ＳＴ２５の情報作成処理からなる。
【００４６】
ＳＴ１１〜ＳＴ１７の判断処理は、図２９のテーブル７３にしたがっておこなわれる。ＳＴ１１において、文字列Ｊにおける左側からｘ番目の文字がＡまたはＧである場合には、Ｙｅｓとの判断がなされる。同文字がＴまたはＣである場合には、Ｎｏとの判断がなされる。ＳＴ１２およびＳＴ１３においては、同様の判断が、文字列Ｊにおける左側から（ｘ＋１）番目の文字について行われる。ＳＴ１４〜ＳＴ１７においては、同様の判断が、文字列Ｊにおける左側から（ｘ−１）番目の文字について行われる。
【００４７】
ＳＴ１８〜ＳＴ２５の処理は、ＳＴ１１〜ＳＴ１７の判断結果に応じて行われる。ＳＴ１８〜ＳＴ２５の処理においては、３つの文字からなる文字列Ｎ（記号ｉまたは記号ｃ，数ｙ，記号ｚ）が作成される（図２６のテーブル７０参照）。具体的には、ＳＴ１８〜ＳＴ２６のそれぞれの処理ｈ１〜ｈ８に応じて、図２８のテーブル７２に示される文字列Ｎが作成される。
【００４８】
文字列Ｎの左から１文字目である記号ｉまたは記号ｃは、ＲＮＡ位置が存在する塩基配列を示す記号である。記号ｉは、ＲＮＡ位置がＳＴ１において入力された塩基配列上に存在することを示す。記号ｃは、同位置がＳＴ２において作成された塩基配列上に存在することを示す。
【００４９】
文字列Ｎの左から２文字目である数ｙは、数ｘまたは数（ｘ＋１）であり、ＲＮＡ位置を特定するための数である。数ｙは、左からｙ番目がＲＮＡ位置であることを示す。
【００５０】
文字列Ｎの左から３文字目である記号ｚは、α、βおよびγからなる群から選ばれる。記号ｚは、優先順位を示すための文字である。αが優先順位として最も高く、これにβ、γが順に続く。作成された文字列Ｎは、データメモリ２３に一時的に格納される。
【００５１】
ＳＴ４は、末端から３〜５塩基目がＲＮＡ位置である塩基数７〜１４の部分塩基配列を表す情報を作成する処理である。処理は、図２３のフローチャートにしたがって行われる。
【００５２】
図２３のフローチャートは、処理ＳＴ３１、処理ＳＴ３２、および処理ＳＴ３３からなる。
【００５３】
処理ＳＴ３１は、５’末端から３〜５塩基目がＲＮＡ位置である部分塩基配列をあらわす情報を作成する処理である。処理ＳＴ３１は、図２４のフローチャートにしたがって行われる。
【００５４】
図２４のフローチャートのＳＴ４１は、文字列Ｋ、文字列Ｍ、および文字列Ｎを読み出す処理である。
ＳＴ４２、ＳＴ４３、ＳＴ４５、ＳＴ４６、ＳＴ４７、およびＳＴ４８において、プローブ５’末端位置、プローブサイズ、およびＲＮＡ位置は、自然数である。ＲＮＡ位置は、文字列Ｎ中の数ｙである。プローブ５’末端位置を数ａとし、プローブサイズを数ｂとする。
【００５５】
ＳＴ４４は、文字列Ｐ（文字列Ｏ，数ｙ，記号ｚ，記号ＳＴ３１）を作成する処理である。ＳＴ４４の作成処理においては、まず、ＳＴ４２で参照された数ｙが由来する文字列Ｎの左から一文字目が参照される。１文字目が記号ｉである場合には、左端から数えてａ番目の文字から、（ａ＋ｂ−１）番目の文字まで、文字列Ｊ中の文字が読み出される。読み出された文字列が左側から並べられることによって作成された文字列が、文字列Ｏである。文字列Ｎの左から１文字目が記号ｃである場合には、文字列Ｊの代わりに文字列Ｌを用いることを除き、同様の処理が行われる。文字列Ｐ中の数ｙおよび記号ｚは、参照された文字列Ｎ中の数ｙおよび記号ｚと同一である。文字列Ｐ中の記号ＳＴ３１は、後のＳＴ３３の優先順位を作成する処理のためのものである。作成された文字列Ｐは、データメモリ２３に一時的に格納される。
【００５６】
図２３のフローチャートの処理ＳＴ３２は、３’末端から３〜５塩基目がＲＮＡ位置である部分塩基配列をあらわす情報を作成する処理である。処理ＳＴ３２は、図２５におけるフローチャートにしたがって行われる。図２５のフローチャートは、プローブ３’末端位置という数が用いられることを除き、図２４と同様である。処理ＳＴ３２によって、処理ＳＴ３１と同様に、文字列Ｑ（文字列Ｏ，数ｙ，記号ｚ，記号ＳＴ３２）が作成される（図２６のテーブル７０参照）。文字列Ｑ中の記号ＳＴ３２は、後の処理ＳＴ３３において優先順位の情報を作成するためのものである。
【００５７】
図２３のフローチャートの処理ＳＴ３３は、部分塩基配列の優先順位の情報を作成する処理である。まず、ＳＴ３１およびＳＴ３２によりデータメモリ２３に一時的に格納された文字列Ｐ（文字列Ｏ，数ｙ，記号ｚ，記号ＳＴ３１）および文字列Ｑ（文字列Ｏ，数ｙ，記号ｚ，記号ＳＴ３２）が読み出される。読み出された文字列Ｐおよび文字列Ｑのうち、記号ｚおよび記号ＳＴ３１または記号ＳＴ３２にもとづき、図３０のテーブル７４〜７６に則り、記号ｒが求められる。すなわち、記号ｚがα、βまたはγのいずれであるか、および記号がＳＴ３１であるかＳＴ３２であるかにもとづき、図３０のテーブル７４〜７６に示される数１〜６のいずれかの数が記号ｒとして作成される。記号ｒは、作成された部分塩基配列についての優先順位を示す記号である。記号ｒは、１〜６のいずれか１の自然数である。１が優先順位として最も高いことを意味し、順に２、３、４、５、６が低い。記号ｒおよび読み出された文字列Ｐおよび文字列Ｑを用いて、文字列Ｒ（文字列Ｏ，数ｙ，記号ｒ）が作成される（図２６のテーブル７０参照）。作成された文字列Ｒは、データメモリ２３に一時的に格納される。
【００５８】
ＳＴ５は、Ｔｍ値に基づく判定処理である。データメモリ２３に一時的に格納された全ての文字列Ｒにつき、Ｔｍ値がそれぞれ計算される。ここで、Ｔｍ値は、ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ法を用いて、更にＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３６巻、第３４号、１０５８１〜１０５９４頁（１９９７年）に記載の方法で、ＤＮＡ濃度５００ｎＭ、塩濃度５０ｍＭとして計算される。計算されたＴｍ値をもとに、図３１のテーブル７７に基づく判断が行われる。Ｎｏであるとの判断がなされた場合、データメモリ２３に一時格納されたその文字列Ｒが削除される。
【００５９】
ＳＴ６は、ＳＴ４によって作成された文字列に同一の配列が含まれる場合、その文字列Ｏを含む文字列Ｒを、データメモリ２３から削除する処理である。文字列Ｏのうちの左側から（ｙ−２）番目からｙ番目までの文字列、および文字列Ｏのうちの左側から（ｙ−１）番目から（ｙ＋１）番目までの文字列が読み出され、これらの読み出された文字列が、文字列Ｏの中に含まれるか否かが検索される。含まれる場合には、その文字列Ｏを含む文字列Ｒがデータメモリ２３から削除される。
【００６０】
ＳＴ７は、文字列Ｏに、４文字以上の逆方向反復塩基配列（パリンドローム配列）が含まれる場合、その文字列Ｏを含む文字列Ｒを、データメモリ２３から削除する処理である。パリンドローム配列が含まれていることの判定は、以下のように行われる。まず、プローブ配列がｓｅｑと、プローブ鎖長がｎと定義される。塩基は５’末端から３’末端へ０、１、２、．．．、（ｎ−１）と数える。この定義のもと、以下のような方法がおこなわれる。すなわち、部分配列の開始位置ｉを０番目から（ｎ−１）−（最小対象部サイズｘ２−１）番目まで変化させてゆき、部分配列サイズが最小対象部サイズ４ｂｐから（ｎ−ｉ）／２（小数点以下切り捨て）の部分配列の相補配列が作成される。作成された相補配列が、部分配列開始位置ｉから（ｉ＋部分配列サイズ）の位置までの配列と一致するとき、パリンドロームとの判定がなされる。以下は、この方法をプログラムとして表現した一例である。
MIN_SIZE = 4
n = seq.size
0.upto((n-1) - MIN_SIZE*2-1) do |i|
MIN_SIZE.upto(((n-i)/2).floor) do |len|
bases = seq[i, len].reverse_complement
result_pos = seq.index(bases, i+len)
if result_pos == (i+len)
# パリンドローム
End
end
end
以上の判定によりパリンドロームであると判定された場合には、そのような文字列Ｏを含む文字列Ｒがデータメモリ２３から削除される。
【００６１】
ＳＴ８は、部分塩基配列を抽出する処理である。以上の処理を経て削除されずにデータメモリ２３に格納されている全ての文字列Ｒがデータメモリ２３から読み出される。読み出された文字列Ｒのうち、優先順位を表す記号ｒの数が最も小さい１または複数の文字列Ｒが抽出される。
【００６２】
ＳＴ９は、プライマー配列設計処理である。ＳＴ８において選択されたプローブの配列に適合するプライマーが作成される。当該プライマー対を設計する工程におけるプライマー対の設計方法については、特に限定はなく、標的核酸中のＲＮＡ含有プローブ配列がハイブリダイズする領域を増幅できるようなプライマー対を公知の方法を用いて設計すればよい。
【００６３】
ＳＴ１０は、出力処理である。ＳＴ１０の処理において、ＳＴ８において抽出された文字列Ｒにもとづき、図３２のテーブル７８の情報がＣＲＴディスプレイ４３に出力される。左からｙ番目の文字に（）が付された文字列Ｏが出力される。（）は、その文字の位置がＲＮＡであることを示す。
【００６４】
次に、本願発明に包含される他の態様を、図２１のフローチャートをもとに説明する。
【００６５】
ＳＴ１において、文字列Ｋの入力は、図１９のキーボード４１またはマウス４２を用いておこなわれてもよい。また、文字列Ｋの入力は、インターネット５０を介して遺伝子データベースサーバ装置６０から取得したものを入力することによっておこなわれてもよい。さらに、ＳＴ１において、標的核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を表す情報の入力がおこなわれてもよい。すなわち、ＳＴ２により作成される文字列Ｍは、ＳＴ１において入力されてもよい。その場合、ＳＴ２は省略される。
【００６６】
ＳＴ３において作成される文字列Ｎのうち、優先順位を表す記号ｚは、作成が省略されてもよい。ＳＴ４のうち、図２２のＳＴ３３の優先順位作成処理は、省略されてもよい。ＳＴ６およびＳＴ７の処理も省略されてよい。
ＳＴ９のプライマー設計処理も省略されてよい。この場合、プローブ配列のみが出力される。
ＳＴ５〜ＳＴ７の処理は、この順番で行われなくてもよい。これらの処理は、適宜交換されてよい。ＳＴ５〜ＳＴ７の処理の１または複数が、ＳＴ４処理と同時に行われてもよい。ＳＴ５〜ＳＴ７の処理においてデータメモリ２３に格納された文字列Ｒを削除する代わりに、無効フラグを立てる方法がとられてもよい。この場合、ＳＴ８の抽出方法もこれに合わせた方法に代えられる。
ＳＴ９の処理は、ＳＴ８の処理ののちにおこなわれてもよいが、ＳＴ３〜ＳＴ７のいずれかの処理ののちに行われることもある。
【００６７】
以上の実施形態に則して具体的に説明されたように、本発明の塩基配列処理方法は、３’末端から３〜５塩基目、または５’末端から３〜５塩基目がＲＮＡ位置である塩基数７〜１４の部分塩基配列を作成する処理、および部分塩基配列のＴｍ値が２５〜４０℃であるか否かを判定する処理を含むことを特徴とする。
【００６８】
より好ましい実施態様において、本発明の塩基配列処理方法は、標的核酸中の標的塩基、これの３’側に隣接する塩基、およびこれの５’側に隣接する塩基がプリン塩基であるか否かを判定する処理を含む。
【００６９】
また、より好ましい実施態様において、本発明の塩基配列処理方法は、
標的核酸の塩基配列中の標的塩基、
標的核酸の塩基配列において標的塩基の３’側に隣接する塩基、
標的核酸の塩基配列に相補鎖な塩基配列において標的塩基に相補的な塩基、および
標的核酸の塩基配列に相補鎖な塩基配列において標的塩基に相補的な塩基の３’側に隣接する塩基
から選択される塩基の位置を、ＲＮＡ位置として決定する処理を含む。さらにより好ましい実施態様において、本発明の塩基配列処理方法は、ＲＮＡ位置として決定する処理は、上のプリン塩基であるか否かの判定結果に基づいて行われる。
【００７０】
さらにより好ましい実施態様において、本発明の塩基配列処理方法における標的塩基は、１塩基置換が起こりうる塩基である。
【００７１】
また、好ましい実施態様において、本発明の塩基配列処理方法は、ＲＮＡ位置にもとづく優先順位による選択を含む。より好ましい実施態様において、ＲＮＡ位置にもとづく優先順位は、
標的核酸の塩基配列中の標的塩基、
標的核酸の塩基配列において標的塩基の３’側に隣接する塩基、
標的核酸の塩基配列に相補鎖な塩基配列において標的塩基に相補的な塩基の３’側に隣接する塩基
の順に高い。また、より好ましい実施態様において、ＲＮＡ位置にもとづく優先順位は、
標的核酸の塩基配列に相補鎖な塩基配列において標的塩基に相補的な塩基、
標的核酸の塩基配列において標的塩基の３’側に隣接する塩基、
標的核酸の塩基配列に相補鎖な塩基配列において標的塩基に相補的な塩基の３’側に隣接する塩基
の順に高い。
【００７２】
また、好ましい実施態様において、本発明の塩基配列処理方法は、末端とＲＮＡ位置の位置関係にもとづく優先順位による選択を含む。より好ましい実施態様において、末端とＲＮＡ位置の位置関係に基づく優先順位は、ＲＮＡ位置が３’末端から３〜５塩基目である場合、ＲＮＡ位置が５’末端から３〜５塩基目である場合の順に高い。
【００７３】
また、好ましい実施態様において、本発明の塩基配列処理方法は、塩基配列において、ＲＮＡ位置を含む塩基配列に相補する配列が存在するか否かを判定する処理を含む。より好ましい実施態様において、存在するか否か判定される配列は、ＲＮＡ位置から５’側に２塩基までの配列に相補する配列、又はＲＮＡ位置から５’側の１塩基から３’側の１塩基までの配列に相補する配列である。
【００７４】
また、好ましい実施態様において、本発明の塩基配列処理方法は、塩基配列において、パリンドローム配列が存在するか否かを判定する処理を含む。より好ましい実施態様において、判定されるパリンドローム配列は、４塩基以上である。
【００７５】
また、好ましい実施態様において、本発明の塩基配列処理方法は、作成するプローブの部分塩基配列の情報にもとづくプライマーの塩基配列決定処理を含む。
【００７６】
以上のような本発明の塩基配列処理方法は、このような方法を実行させるためのプログラム、およびハードウェアを用いて行われても良い。ここで、このような方法を実行させるためのプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されていてもよい。また、本発明の塩基配列処理方法は、このような塩基配列処理方法を行うための処理装置を用いて行われても良い。なお、好ましい態様において、本発明の処理装置は、本発明の塩基配列処理方法を行うための手段を有し、かつ、本発明の塩基配列処理方法を行うに際して参照されるテーブルがデータメモリに格納されている。しかしながら、本発明の塩基配列処理方法は、これらの方法によるものに限られず、たとえば、ヒトの操作による塩基配列の処理も含む。
【００７７】
また、以上のような本発明の塩基配列処理方法は、本発明の塩基配列処理方法を実行するための塩基配列処理装置、および該装置とネットワークを介して通信可能な状態で接続されたクライアント装置からなる塩基配列処理システムにおいて行われてもよい。好ましい実施態様において、該クライアント装置は、標的核酸の塩基配列情報を上記塩基配列処理装置に送信する手段、および上記塩基配列処理装置より送信された標的核酸中の標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブ情報を取得する手段を備える。より好ましい実施態様において、該クライアント装置は、上記塩基配列処理装置より送信された標的核酸中の標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブ情報、および標的核酸増幅用プライマー情報を取得する手段を備える。
【００７８】
異なる側面において、本発明は、本発明の塩基配列処理方法を含む、標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブの塩基配列の決定方法を提供する。
【００７９】
また、異なる側面において、本発明は、本発明の塩基配列処理方法を含む、標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブの製造方法を提供する。より好ましい実施態様において、本発明のプローブの製造方法は、塩基配列が本発明の塩基配列処理方法によって決定された塩基配列と同一であるＲＮＡおよびＤＮＡ含有核酸断片を作成する工程を含む。
【００８０】
また、異なる側面において、本発明は、本発明の製造方法により製造された標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブを用いる工程を含む標的塩基の検出方法を提供する。より好ましい実施態様において、本発明の標的塩基の検出方法は、本発明の製造方法により製造された標的塩基検出用ＲＮＡ含有プローブを、試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程、リボヌクレアーゼＨを作用させる工程、及びプローブの切断の有無を検出する工程を含む。
【実施例】
【００８１】
以下に実施例をもって本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに何ら限定されるものではない。【００８２】
実施例１
標的核酸を検出するためのプローブ内において、検出したい標的核酸中の１塩基の位置とＲＮＡの位置の違いによる反応の特異性の違いの確認を行った。まず、標的核酸として、配列表の配列番号１に記載の配列をｔｅｍｐｌａｔｅ  １として設定した。次に、ｔｅｍｐｌａｔｅ  １にハイブリダイズするプローブとして、すなわち、ｔｅｍｐｌｅｔｅ  １を検出するプローブとして、
５’末端から７塩基目（すなわち、３’末端から６塩基目）がＲＮＡであるプローブ（以下、ｐｒｏｂｅ  ｃｅｎｔｒａｌと称することもある。配列番号２）、
５’末端から４塩基目（すなわち、３’末端から９塩基目）がＲＮＡであるプローブ（以下、ｐｒｏｂｅ  ５’−４ｍｅｒと称することもある。配列番号３）、
５’末端から３塩基目（すなわち、３’末端から１０塩基目）がＲＮＡであるプローブ（以下、ｐｒｏｂｅ  ５’−３ｍｅｒと称することもある。配列番号４）、
３’末端から４塩基目（すなわち、５’末端から９塩基目）がＲＮＡであるプローブ（以下、ｐｒｏｂｅ  ３’−４ｍｅｒと称することもある。配列番号５）、
３’末端から３塩基目（すなわち、５’末端から１０塩基目）がＲＮＡであるプローブ（以下、ｐｒｏｂｅ  ３’−３ｍｅｒと称することもある。配列番号６）
を設定し、以下の実験に用いた。【００８３】
（１）プローブ内のＲＮＡの位置の違いによる特異性の違いの確認：
ｔｅｍｐｌａｔｅ  １内の検出したい１塩基を、５’末端から１０塩基目に設定した。この塩基に対応するプローブ中の塩基をＲＮＡとし、プローブ内のＲＮＡの位置の違いによる特異性の違いの確認を行うため、表１に示すような各プローブの塩基配列中のｍｒｍ塩基とｔｅｍｐｌａｔｅ  １の塩基配列中のｎｎｎ塩基を設定し、ｔｅｍｐｌａｔｅ  １とＲＮＡ含有プローブを全て合成した。合成した各プローブには、５’末端をＥｃｌｉｐｓｅ標識、３’末端をＦＡＭ標識した。表中の配列について、カッコは、カッコ内の塩基がＲＮＡであることを示す。【００８４】
【表１】
2012014988.tif 000003
【００８５】
次に、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ（登録商標）  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）中のポリメラーゼ以外の試薬を用い、１反応につき、ｔｅｍｐｌａｔｅ  １を１μＭ、プローブを０．３μＭ、Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  ＩＩを０．００４Ｕとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）により、サイクリングプローブ反応を行った。反応条件は、５５℃、３０秒、５５℃、３０秒で４０サイクル行った。また、蛍光値の測定は、反応スタート時の蛍光値と最大蛍光値を測定し、その最大蛍光値に達する時のサイクル数もカウントした。その結果を表２に示す。表中の配列について、カッコは、カッコ内の塩基がＲＮＡであることを示す。また、表中の数値は、それぞれのｔｅｍｐｌａｔｅ  １に完全にマッチするＲＮＡ含有プローブを用いた場合の〔（最大蛍光値−反応スタート時の蛍光値）／最大蛍光値時のサイクル数〕を１００％とし、ミスマッチになるＲＮＡ含有プローブを用いた場合の上記式で計算された蛍光値の割合（％）として算出された数値である。蛍光値の割合がマイナスになる場合には、０％と表示される。更に、完全マッチのＲＮＡ含有プローブでも蛍光の変動がみられなかったため数値化できなかった場合には、“−”と表示される。【００８６】
【表２】
2012014988.tif 000004
【００８７】
表２に示されるように、ｐｒｏｂｅ  ｃｅｎｔｒａｌが用いられた場合においては、ｎｎｎとｍｒｍが相補的でない場合においても、比較的高い蛍光値の割合（％）が測定されたのに対し、ｐｒｏｂｅ  ５’−４ｍｅｒ、ｐｒｏｂｅ  ５’−３ｍｅｒ、ｐｒｏｂｅ  ３’−４ｍｅｒ、およびｐｒｏｂｅ  ３’−３ｍｅｒが用いられた場合には、ｎｎｎとｍｒｍが相補的でない場合には、比較的低い蛍光値の割合（％）しか測定されなかった。これらの結果から、プローブ内のＲＮＡの位置は、プローブの中央もしくは５’末端から７塩基目や３’末端から６塩基目よりも、プローブの５’末端から３塩基目及び４塩基目、又はプローブの３’末端から３塩基目及び４塩基目にすることにより、特異的に効率よく目的とする塩基を検出できることが明らかとなった。【００８８】
（２）検出したい塩基と該塩基に対応するプローブ内のＲＮＡの位置の違いによる特異性の違いの確認：
標的核酸中の検出したい１塩基に対応するプローブ中の塩基の位置以外をＲＮＡとした場合の特異性を確認するため、次の実験を行った。まず、ｔｅｍｐｌａｔｅ  １内の検出したい１塩基を、５’末端から１１塩基目に設定した。この塩基に対応するプローブ中の塩基の３’側に隣接する塩基をＲＮＡとなるように、表３に示すような各プローブの塩基配列中のｍｒｍ塩基とｔｅｍｐｌａｔｅ  １の塩基配列中のｎｎｎ塩基を設定し、ｔｅｍｐｌａｔｅ  １とＲＮＡ含有プローブを全て合成した。また、合成した各プローブは、５’末端をＥｃｌｉｐｓｅ標識、３’末端をＦＡＭ標識した。表中の配列について、カッコは、カッコ内の塩基がＲＮＡであることを示す。【００８９】
【表３】
2012014988.tif 000005
【００９０】
次に、実施例１−（１）と同様の条件でサイクリングプローブ反応を行った。その結果を表４に示す。表中の配列について、カッコ内の塩基はＲＮＡを示す。また、表中の数値は表２と同様の計算方法で算出した蛍光値の割合を示す。【００９１】
【表４】
2012014988.tif 000006
【００９２】
また、ｔｅｍｐｌａｔｅ  １内の検出したい１塩基を、５’末端から９塩基目に設定した。この塩基に対応するプローブ中の塩基の５’側に隣接する塩基をＲＮＡとなるように、表５に示すような各プローブの塩基配列中のｍｒｍ塩基とｔｅｍｐｌａｔｅ  １の塩基配列中のｎｎｎ塩基を設定し、ｔｅｍｐｌａｔｅ  １とＲＮＡ含有プローブを全て合成した。また、合成した各プローブは、５’末端をＥｃｌｉｐｓｅ標識、３’末端をＦＡＭ標識した。表中の配列について、カッコは、カッコ内の塩基がＲＮＡであることを示す。【００９３】
【表５】
2012014988.tif 000007
【００９４】
次に、実施例１−（１）と同様の条件でサイクリングプローブ反応を行った。その結果を表６に示す。表中の配列について、カッコは、カッコ内の塩基がＲＮＡであることを示す。また、表中の数値は表２と同様の計算方法で算出した蛍光値の割合を示す。【００９５】
【表６】
2012014988.tif 000008
【００９６】
表４及び表６の結果から、標的核酸中の検出したい１塩基に対応するプローブ中の塩基の３’側に隣接する塩基をＲＮＡとした場合でも、検出したい１塩基に対応するプローブ中の塩基をＲＮＡとした場合と同様に、特異的に効率よく目的とする塩基を検出できることが明らかとなった。これに対して、５’側に隣接する塩基をＲＮＡとした場合、特異性が弱くなることが明らかとなった。【００９７】
実施例２
標的核酸を検出するためのＲＮＡ含有プローブのＴｍ値の違いによる反応の特異性の確認を行った。まず、ＮＣＢＩに登録されているＳＮＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／）である、ｒｓ５４４３、ｒｓ１６５４４１６及びｒｓ１７９９８２１について、それぞれのＳＮＰを含み、かつＴｍ値が２５〜３２℃と３５〜４０℃となるようなプローブをそれぞれ設計した。なお、ｒｓ５４４３については、ゲノム配列に対して正鎖（センス鎖）で設計し、かつゲノム配列に対するＳＮＰ位置に隣接する３’側をＲＮＡとし、当該ＲＮＡがプローブの５’末端から３塩基目及び４塩基目であるプローブ、並びにゲノム配列に対してアンチセンス鎖で設計し、かつゲノム配列に対するＳＮＰ位置の相補鎖の塩基をＲＮＡとし、当該ＲＮＡがプローブの３’末端から３塩基目であるプローブ（配列番号７及び８）を設計した。ｒｓ１６５４４１６については、ゲノム配列に対してアンチセンス鎖で設計し、かつゲノム配列に対するＳＮＰ位置の相補鎖の塩基をＲＮＡとし、当該ＲＮＡがプローブの３’末端から３塩基目であるプローブ（配列番号９〜１２）を設計した。更に、ｒｓ１７９９８２１については、ゲノム配列に対してセンス鎖で設計し、かつゲノム配列に対するＳＮＰ位置をＲＮＡとし、当該ＲＮＡがプローブの５’末端から３塩基目とするプローブ（配列番号１３）、３’末端から３塩基目とするプローブ（配列番号１４及び１５）を設計した。設計した各プローブの配列、Ｔｍ値及び各合成時のＲＮＡ含有プローブの蛍光標識の種類を表７に示す。表中の配列について、カッコは、カッコ内の塩基がＲＮＡであることを示す。【００９８】
【表７】
2012014988.tif 000009
【００９９】
上記ＲＮＡ含有プローブに対して、Ｃｙｃｌｅａｖｅ  ＰＣＲが行えるように、ｒｓ５４４３から設計したＲＮＡ含有プローブのうち、ｒｓ５４４３  Ｃ  ｐｒｏｂｅ及びｒｓ５４４３  Ｔ  ｐｒｏｂｅに対しては、ｒｓ５４４３  Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ及びｒｓ５４４３  Ｒ  ｐｒｉｍｅｒのプライマー対を設計した（配列番号１６及び１７）。ｒｓ５４４３  Ｃ  ｐｒｏｂｅ２及びｒｓ５４４３  Ｔ  ｐｒｏｂｅ２に対しては、ｒｓ５４４３  Ｆ２  ｐｒｉｍｅｒ及びｒｓ５４４３  Ｒ２  ｐｒｉｍｅｒのプライマー対を設計した（配列番号１８及び１９）。ｒｓ１６５４４１６から設計したＲＮＡ含有プローブに対しては、ｒｓ１６５４４１６  Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ及びｒｓ１６５４４１６  Ｒ  ｐｒｉｍｅｒを設計した（配列番号２０及び２１）。ｒｓ１７９９８２１から設計したＲＮＡ含有プローブに対しては、ｒｓ１７９９８２１  Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ及びｒｓ１７９９８２１  Ｒ  ｐｒｉｍｅｒのプライマー対を設計した（配列番号２２及び２３）。【０１００】
上記記載のＲＮＡ含有プローブ及びプライマー対をそれぞれ合成し、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ（登録商標）  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、当該Ｋｉｔの取扱説明書に従い、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）により、Ｃｙｃｌｅａｖｅ  ＰＣＲ反応を行った。鋳型ＤＮＡは、次のように作製し、１反応につき１０５コピー相当量を用いた。まず、各プローブのＤＮＡ配列を含むプライマー増幅領域からなる配列を個別に人工的に作製した。その後、プラスミドベクターＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ）（タカラバイオ社製）のＥｃｏ  ＲＶ  Ｔ−Ｃｌｏｎｉｎｇサイトに上記作製した人工的に合成した配列を常法に従い挿入したものを鋳型ＤＮＡとした。反応は、表８に示すＲＮＡ含有プローブとプライマー対の組合せで行い、ＦＡＭのシグナルとＲＯＸのシグナルをＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）の取扱説明書に従い検出を行った。表中、反応１、３、５は、Ｔｍ値が２５〜３２℃となるように設計したＲＮＡ含有プローブ、反応２、４、６は、Ｔｍ値が３５〜４０℃となるように設計したＲＮＡ含有プローブを示す。【０１０１】
【表８】
2012014988.tif 000010
【０１０２】
各反応の結果を図４〜９に示す。各図中、上段はＦＡＭシグナルの検出、下段はＲＯＸシグナルの検出を示す。また、縦軸はＦＡＭ及びＲＯＸの蛍光値を示し、横軸は反応のサイクル数を示す。実線はＷｉｌｄ型、点線はＭｕｔａｎｔ型の鋳型を用いた結果を示す。ｒｓ５４４３の検出結果である図４及び図５中のＷｉｌｄ型はゲノム配列に対してＳＮＰ位置の塩基がＣの場合、Ｍｕｔａｎｔ型はＳＮＰ位置の塩基がＴの場合を示す。ｒｓ１６５４４１６の検出結果である図６及び図７中のＷｉｌｄ型はゲノム配列に対するＳＮＰ位置の塩基がＴの場合、Ｍｕｔａｎｔ型はＳＮＰ位置の塩基がＣの場合を示す。ｒｓ１７９９８２１の検出結果である図８及び図９中のＷｉｌｄ型はゲノム配列に対するＳＮＰ位置の塩基がＧの場合、Ｍｕｔａｎｔ型はＳＮＰ位置がＡの場合を示す。【０１０３】
これらの結果から、ｒｓ５４４３のＳＮＰ検出に関して、Ｔｍ値を２５〜３２℃になるように設計したＲＮＡ含有プローブのうち、Ｗｉｌｄ型を検出するｒｓ５４４３  Ｃ  ｐｒｏｂｅはＷｉｌｄ型のみを検出した（図４の上段のＦＡＭ）。Ｍｕｔａｎｔ型を検出するｒｓ５４４３  Ｔ  ｐｒｏｂｅは、Ｍｕｔａｎｔ型のみを特異的に検出した（図４の下段のＲＯＸ）。Ｔｍ値を３５〜４０℃になるように設計したＲＮＡ含有プローブのうち、Ｗｉｌｄ型を検出するためのｒｓ５４４３  Ｃ  ｐｒｏｂｅ２は、Ｗｉｌｄ型を検出するが、Ｍｕｔａｎｔ型をも弱いシグナルではあるが検出した（図５の上段のＦＡＭ）。Ｍｕｔａｎｔ型を検出するｒｓ５４４３  Ｃ  ｐｒｏｂｅ２は、Ｍｕｔａｎｔ型を検出するが、Ｗｉｌｄ型をもの弱いシグナルではあるが検出した（図５の下段のＲＯＸ）。ｒｓ１６５４４１６に対する設計したＲＮＡ含有プローブでも同様の結果となった（図６及び図７）。ｒｓ１７９９８２１に対する設計したＲＮＡ含有プローブでは、全てそれぞれのプローブでＷｉｌｄ型及びＭｕｔａｎｔ型をそれぞれ特異的に検出した（図８及び図９）。図４〜９の結果から、Ｔｍ値を２５〜４０℃の範囲でＲＮＡ含有プローブを設計することにより、ＳＮＰを特異的に検出することが可能であることが明らかになった。【０１０４】
実施例３
標的核酸を検出するためのＲＮＡ含有プローブのＴｍ値による反応の特異性の更なる確認、および反応液中のＲＮａｓｅ  Ｈの添加量による特異性の確認を行った。まず、実施例２に記載のＳＮＰ（ｒｓ５４４３、ｒｓ１６５４４１６、ｒｓ１７９９８２１）を含み、かつＴｍ値が４０℃以上となるようなプローブを設計した。なお、ｒｓ５４４３は、ゲノム配列に対してアンチセンス鎖で設計し、かつゲノム配列に対するＳＮＰ位置の相補鎖の塩基をＲＮＡとし、当該ＲＮＡがプローブの３’末端から４塩基目と３塩基目であるプローブ（配列番号２４及び２５）を設計した。ｒｓ１６５４４１６は、ゲノム配列に対してアンチセンス鎖で設計し、かつゲノム配列に対するＳＮＰ位置の相補鎖の塩基をＲＮＡとし、当該ＲＮＡがプローブの３’末端から４塩基目であるプローブ（配列番号２６）と５’末端から４塩基目であるプローブ（配列番号２７）を設計した。ｒｓ１７９９８２１は、ゲノム配列に対してアンチセンス鎖で設計し、かつゲノム配列に対するＳＮＰ位置の相補鎖の塩基に隣接する３’側をＲＮＡとし、当該ＲＮＡがプローブの５’末端から３塩基目であるプローブ（配列番号２８）と３’末端から４塩基目であるプローブ（配列番号２９）を設計した。設計した各プローブ配列、Ｔｍ値及び各合成時のＲＮＡ含有プローブの蛍光標識の種類を表９に示す。表中の配列について、カッコ内の塩基はＲＮＡを示す。【０１０５】
【表９】
2012014988.tif 000011
【０１０６】
上記ＲＮＡ含有プローブに対して、Ｃｙｃｌｅａｖｅ  ＰＣＲが行えるように、ｒｓ５４４３から設計したＲＮＡ含有プローブに対しては、ｒｓ５４４３  Ｆ３  ｐｒｉｍｅｒ及びｒｓ５４４３  Ｒ３  ｐｒｉｍｅｒのプライマー対を設計した（配列番号３０及び３１）。ｒｓ１６５４４１６から設計したＲＮＡ含有プローブに対しては、ｒｓ１６５４４１６  Ｆ３  ｐｒｉｍｅｒ及びｒｓ１６５４４１６  Ｒ３  ｐｒｉｍｅｒのプライマー対を設計した（配列番号３２及び３３）。ｒｓ１７９９８２１から設計したＲＮＡ含有プローブに対しては、ｒｓ１７９９８２１  Ｆ３  ｐｒｉｍｅｒ及びｒｓ１７９９８２１  Ｒ３  ｐｒｉｍｅｒのプライマー対を設計した（配列番号３４及び３５）。【０１０７】
上記記載のＲＮＡ含有プローブ及びプライマー対をそれぞれ合成し、実施例２と同様にＣｙｃｌｅａｖｅ  ＰＣＲ反応を行った。但し、同Ｋｉｔに添付のＴｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  ＩＩを添付のｂｕｆｆｅｒを用いて、反応液への添加量が１００Ｕ（通常の添加量）、１０Ｕ、５Ｕとなるように調製し、それぞれのプローブに対して使用した。【０１０８】
ｒｓ５４４３の結果を図１０（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈの添加量１００Ｕ）、図１１（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈの添加量１０Ｕ）及び図１２（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈの添加量５Ｕ）に示す。ｒｓ１６５４４１６の結果を図１３（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈの添加量１００Ｕ）、図１４（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈの添加量１０Ｕ）及び図１５（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈの添加量５Ｕ）に示す。ｒｓ１７９９８２１の結果を図１６（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈの添加量１００Ｕ）、図１７（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈの添加量１０Ｕ）及び図１８（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈの添加量５Ｕ）に示す。各図中、上段はＦＡＭシグナルの検出、下段はＲＯＸシグナルの検出を示す。また、縦軸はＦＡＭ及びＲＯＸの蛍光値を示し、横軸は反応のサイクル数を示す。実線はＷｉｌｄ型、点線はＭｕｔａｎｔ型の鋳型を用いた結果を示す。【０１０９】
これらの結果から、通常のＴｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈの添加量１００ＵにおけるＴｍ値を４０℃以上で設計した標的核酸を検出するためのＲＮＡ含有プローブでは、いずれの場合でもＷｉｌｄ型のみを特異的に検出すべきＦＡＭ標識プローブで、Ｍｕｔａｎｔ型も検出された。また、Ｍｕｔａｎｔ型のみを特異的に検出すべきＲＯＸ標識プローブで、Ｗｉｌｄ型も検出された。従って、Ｔｍ値を４０℃以上で設計した標的核酸を検出するためのＲＮＡ含有プローブは、特異的な検出ができないことが明らかとなった。【０１１０】
更に、Ｔｍ値を４０℃以上で設計した標的核酸を検出するためのＲＮＡ含有プローブを用いた場合のＲＮａｓｅ  Ｈの添加量による特異性の確認の結果から、ｓ１７９９８２１  Ｇ  ｐｒｏｂｅ３においては、Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈの添加量を５Ｕにすることで特異性の改善が見られたが、それ以外においては、多少改善傾向にあるが、増幅曲線の形状がなだらかで、Ｃｔ値が遅れていることから、反応性が低下していることが明らかとなった。このことから、Ｔｍ値を４０℃以上で設計した標的核酸を検出するためのＲＮＡ含有プローブを用いた場合、大部分のプローブにおいて、特異的な検出ができないことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明により、研究者の経験や勘に基づくことなく、簡便にかつ効率よく標的核酸を検出することが可能な標的核酸検出用ＲＮＡ含有プローブの設計方法が提供される。また、塩基配列処理方法及び塩基配列処理装置が提供され、標的核酸の検出の経験が少ない又は経験がない当該分野の研究者であっても、標的核酸を検出するためのＲＮＡ含有プローブを容易に設計することが可能となり、遺伝子工学分野のみならず、医療の研究分野においても極めて有用である。
【符号の説明】
【０１１２】
ＳＴ１…標的核酸の塩基配列、および標的塩基を表す情報を入力する処理、
ＳＴ２…標的核酸の相補的な塩基配列を作成する処理、
ＳＴ３…ＲＮＡ位置、および優先順位を決定する処理、
ＳＴ４…部分塩基配列を表す情報を作成する処理、
ＳＴ５…Ｔｍ値に基づく判定処理、
ＳＴ６…文字列Ｒをデータメモリ２３から削除する処理、
ＳＴ７…文字列Ｒをデータメモリ２３から削除する処理、
ＳＴ８…部分塩基配列を抽出する処理、
ＳＴ９…プライマー配列設計処理、
ＳＴ１０…出力処理、
ＳＴ１１〜ＳＴ１７…判断処理、
ＳＴ１８〜ＳＴ２５…情報作成処理、
ＳＴ３１…部分塩基配列をあらわす情報を作成する処理、
ＳＴ３２…部分塩基配列をあらわす情報を作成する処理、
ＳＴ３３…部分塩基配列の優先順位の情報を作成する処理、
ＳＴ４１…文字列Ｋ、文字列Ｍ、および文字列Ｎを読み出す処理、
ＳＴ４４…文字列Ｐ（文字列Ｏ，数ｙ，記号ｚ，記号ＳＴ３１）を作成する処理、
１０…塩基配列処理装置、
２０…ＣＰＵ、
２１…ＲＯＭ、
２２…ＲＡＭ、
２３…データメモリ、
２４…プログラムメモリ、
４１…キーボード、
４２…マウス、
４３…ＣＲＴディスプレイ、
４５…ＣＤ−ＲＯＭドライブ装置、
４５ａ…ＣＤ−ＲＯＭ、
５０…インターネット、
６０…遺伝子データベースサーバ装置、
７０…ＳＴ１〜ＳＴ４において入力または作成されるデータの形式をまとめたテーブル、
７１…相補的塩基配列作成処理における参照テーブル、
７２…ＲＮＡ位置決定における参照テーブル、
７３…プリン塩基の判断における参照テーブル、
７４…優先順位決定における参照テーブル、
７５…優先順位決定における参照テーブル、
７６…優先順位決定における参照テーブル、
７７…２５℃≦Ｔｍ値≦４０℃か否かの判定処理における参照テーブル、
７８…部分塩基配列およびプライマー配列の出力情報テーブル。
【配列表フリーテキスト】
【０１１３】
SEQ ID NO:1 ; Target nucleic acid template 1.
SEQ ID NO:2 ; Chimeric oligonucleotide probe central to detect the template 1. The 7th base from 5' end is RNA.
SEQ ID NO:3 ; Chimeric oligonucleotide probe 5'-4mer to detect the template 1. The 4th base from 5' end is RNA.
SEQ ID NO:4 ; Chimeric oligonucleotide probe 5'-3mer to detect the template 1. The 3rd base from 5' end is RNA.
SEQ ID NO:5 ; Chimeric oligonucleotide probe 3'-4mer to detect the template 1. The 4th base from 3' end is RNA.
SEQ ID NO:6 ; Chimeric oligonucleotide probe 3'-3mer to detect the template 1. The 3rd base from 3' end is RNA.
SEQ ID NO:7 ; Chimeric oligonucleotide rs5443 C probe2 to detect the SNP of rs5443. The third base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:8 ; Chimeric oligonucleotide rs5443 T probe to detect the SNP of rs5443. The third base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:9 ; Chimeric oligonucleotide rs1654416 C probe to detect the SNP of rs1654416. The third base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:10 ; Chimeric oligonucleotide rs1654416 T probe to detect the SNP of rs1654416. The third base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:11 ; Chimeric oligonucleotide rs1654416 C probe2 to detect the SNP of rs1654416. The third base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:12 ; Chimeric oligonucleotide rs1654416 T probe2 to detect the SNP of rs1654416. The third base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:13 ; Chimeric oligonucleotide rs1799821 A probe to detect the SNP of rs1799821. The third base from the 5' end is RNA.
SEQ ID NO:14 ; Chimeric oligonucleotide rs1799821 A probe2 to detect the SNP of rs1799821. The third base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:15 ; Chimeric oligonucleotide rs1799821 G probe2 to detect the SNP of rs1799821. The third base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:16 ; rs5443 F primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe or rs5443 T probe.
SEQ ID NO:17 ; rs5443 R primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe or rs5443 T probe.
SEQ ID NO:18 ; rs5443 F2 primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe2 or rs5443 T probe2.
SEQ ID NO:19 ; rs5443 R2 primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe2 or rs5443 T probe2.
SEQ ID NO:20 ; rs1654416 F primer to amplify the DNA region including rs1654416 C probe, rs1654416 T probe, rs1654416 C probe2 or rs1654416 T probe2.
SEQ ID NO:21 ; rs1654416 R primer to amplify the DNA region including rs1654416 C probe, rs1654416 T probe, rs1654416 C probe2 or rs1654416 T probe2.
SEQ ID NO:22 ; rs1799821 F primer to amplify the DNA region including rs1799821 A probe, rs1799821 G probe, rs1799821 A probe2 or rs1799821 G probe2.
SEQ ID NO:23 ; rs1799821 R primer to amplify the DNA region including rs1799821 A probe, rs1799821 G probe, rs1799821 A probe2 or rs1799821 G probe2.
SEQ ID NO:24 ; Chimeric oligonucleotide rs5443 C probe3 to detect the SNP of rs5443. The 4th base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:25 ; Chimeric oligonucleotide rs5443 T probe3 to detect the SNP of rs5443. The 3rd base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:26 ; Chimeric oligonucleotide rs1654416 C probe3 to detect the SNP of rs1654416. The 4th base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:27 ; Chimeric oligonucleotide rs1654416 T probe3 to detect the SNP of rs1654416. The 4th base from the 5' end is RNA.
SEQ ID NO:28 ; Chimeric oligonucleotide rs1799821 A probe3 to detect the SNP of rs1799821. The 3rd base from the 5' end is RNA.
SEQ ID NO:29 ; Chimeric oligonucleotide rs1799821 G probe3 to detect the SNP of rs1799821. The 4th base from the 3' end is RNA.
SEQ ID NO:30 ; rs5443 F3 primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe3 or rs5443 T probe3.
SEQ ID NO:31 ; rs5443 R3 primer to amplify the DNA region including rs5443 C probe3 or rs5443 T probe3.
SEQ ID NO:32 ; rs1654416 F3 primer to amplify the DNA region including rs1654416 C probe3 or rs1654416 T probe3.
SEQ ID NO:33 ; rs1654416 R3 primer to amplify the DNA region including rs1654416 C probe3 or rs1654416 T probe3.
SEQ ID NO:34 ; rs1799821 F3 primer to amplify the DNA region including rs1799821 A probe3 or rs1799821 G probe3.
SEQ ID NO:35 ; rs1799821 R3 primer to amplify the DNA region including rs1799821 A probe3 or rs1799821 G probe3.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2012014988.tif 000018
【図８】
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【図９】
2012014988.tif 000020
【図１０】
2012014988.tif 000021
【図１１】
2012014988.tif 000022
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2012014988.tif 000027
【図１７】
2012014988.tif 000028
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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