(57)【要約】本発明は、血管新生抑制作用及び／又は腫瘍増殖抑制作用を有する抗腫瘍剤又は腫瘍増殖抑制方法を提供することを目的とする。  本発明は、ガラクトシルセラミド発現因子−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち、少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチドを含有する抗腫瘍剤であって、血管新生抑制作用及び／又は腫瘍増殖抑制作用を有することを特徴とする、前記抗腫瘍剤を提供する。
2011162419.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトシルセラミド発現因子−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち、少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチドを含有する腫瘍増殖抑制剤。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む、腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチド
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む、腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチド
【請求項４】
前記（ａ）に記載のポリペプチドが、配列番号４４〜６５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むものである、請求項３に記載の腫瘍増殖抑制剤。
【請求項５】
ガラクトシルセラミド発現因子−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち、少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、腫瘍増殖抑制剤。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチド
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチド
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含む、腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号７、９若しくは１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号７、９若しくは１１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項９】
ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現抑制物質を含有する腫瘍増殖抑制剤。
【請求項１０】
ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現抑制物質が、ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである請求項９に記載の腫瘍増殖抑制剤。
【請求項１１】
ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むものである、請求項１０に記載の腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖作用を有するポリペプチド
【請求項１２】
ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含むものである、請求項１０に記載の腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腫瘍増殖作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項１３】
ガラクトシルセラミド発現因子−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち、少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチドを含有する血管新生抑制剤。
【請求項１４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチド
【請求項１５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチド
【請求項１６】
前記（ａ）に記載のポリペプチドが、配列番号４４〜６５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１５に記載の血管新生抑制剤。
【請求項１７】
ガラクトシルセラミド発現因子−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち、少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、血管新生抑制剤。
【請求項１８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチド
【請求項１９】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチド
【請求項２０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含む、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号７、９若しくは１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号７、９若しくは１１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項２１】
ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現抑制物質を含有する血管新生抑制剤。
【請求項２２】
ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現抑制物質が、ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである請求項２１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項２３】
ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むものである、請求項２２に記載の血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生誘導作用を有するポリペプチド
【請求項２４】
ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含むものである、請求項２２に記載の血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血管新生誘導作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項２５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む、癌細胞特性消失剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ癌細胞特性消失作用を有するポリペプチド
【請求項２６】
癌細胞に接触阻害能を獲得させるものである、請求項２５に記載の癌細胞特性消失剤。
【請求項２７】
ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現を抑制することを特徴とする、腫瘍増殖抑制方法。
【請求項２８】
ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現を抑制することを特徴とする、血管新生抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトシルセラミド発現因子−１を標的とする抗腫瘍剤及び腫瘍増殖抑制方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）は、ガラクトース１残基とセラミド１残基からなる最小のスフィンゴ糖脂質であり、ミエリンのオリゴデンドロサイトや腎上皮細胞に特異的に大量発現し、絶縁機能、高塩濃度耐性機能を有する糖脂質である。
ガラクトシルセラミド発現因子−１（ＧａｌＣｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ−１（ＧＥＦ−１））は、ガラクトシルセラミドの発現因子であり（Ｏｇｕｒａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７１，１８２７−１８３６，１９９８）、ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ配列（ＦＹＶＥ）を持つ領域（Ｚ）、高プロリン領域（Ｐ）、コイルド−コイル配列領域（Ｃ）、高プロリン２／高グルタミン領域（Ｑ）の４つの領域から構成されるタンパク質である。また、ラットＧＥＦ−１は、マウスＨｒｓ（ＨＧＦ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）のラットオルソログであり（Ｋｏｍａｄａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１５，６２１３−６２２１，１９９５）、小胞輸送および細胞内シグナル伝達に関連することが知られている。
本発明者らは、ＧＥＦ−１／ＨｒｓがＭＤＣＫ細胞に対して線維芽細胞様の形態変化を示すことを既に見出し、さらにＧＥＦ−１／Ｈｒｓが細胞の遊走性に関与していることを見出した（特開２００５−２４７７３５号公報）。しかしながら、ＧＥＦ−１／Ｈｒｓ及びそのＱ領域欠損変異体は、腫瘍増殖抑制作用を示さなかった（特開２００５−２４７７３５号公報）。
ところで、腫瘍は、その増殖過程において酸素及び栄養不足を補うため、ＶＥＧＦやＴＧＦ−β等の血管新生誘導因子を放出し、腫瘍への血管新生を誘導することが知られている。従って、腫瘍増殖を抑制するために、当該腫瘍性血管新生を抑制する戦略が考えられている。しかしながら、ＧＥＦ−１／Ｈｒｓと血管新生との関係については、これまで明らかとなっていなかった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、血管新生抑制作用及び／又は腫瘍増殖抑制作用を有する抗腫瘍剤又は腫瘍増殖抑制方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＧＥＦ−１が血管新生及び腫瘍増殖に関与していることを見出した。そして、ＧＥＦ−１の発現を抑制することにより血管新生及び腫瘍増殖を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ガラクトシルセラミド発現因子−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち、少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチドを含有する腫瘍増殖抑制剤。
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む、腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチド
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む、腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチド
（４）前記（ａ）に記載のポリペプチドが、配列番号４４〜６５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むものである、上記（３）に記載の腫瘍増殖抑制剤。
（５）ガラクトシルセラミド発現因子−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち、少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、腫瘍増殖抑制剤。
（６）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチド
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチド
（８）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含む、腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号７、９若しくは１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号７、９若しくは１１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（９）ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現抑制物質を含有する腫瘍増殖抑制剤。
（１０）ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現抑制物質が、ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである上記（９）に記載の腫瘍増殖抑制剤。
（１１）ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むものである、上記（１０）に記載の腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖作用を有するポリペプチド
（１２）ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含むものである、上記（１０）に記載の腫瘍増殖抑制剤。
（ａ）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ腫瘍増殖作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（１３）ガラクトシルセラミド発現因子−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち、少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチドを含有する血管新生抑制剤。
（１４）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチド
（１５）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチド
（１６）前記（ａ）に記載のポリペプチドが、配列番号４４〜６５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むものである、上記（１５）に記載の血管新生抑制剤。
（１７）ガラクトシルセラミド発現因子−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち、少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する、血管新生抑制剤。
（１８）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチド
（１９）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチド
（２０）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含む、血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号７、９若しくは１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号７、９若しくは１１で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血管新生抑制作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（２１）ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現抑制物質を含有する血管新生抑制剤。
（２２）ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現抑制物質が、ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドに対するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである上記（２１）に記載の血管新生抑制剤。
（２３）ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列を含むものである、上記（２２）に記載の血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生誘導作用を有するポリペプチド
（２４）ガラクトシルセラミド発現因子−１をコードするポリヌクレオチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含むものである、上記（２２）に記載の血管新生抑制剤。
（ａ）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、３若しくは５で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血管新生誘導作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（２５）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含む、癌細胞特性消失剤。
（ａ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ癌細胞特性消失作用を有するポリペプチド
（２６）癌細胞に接触阻害能を獲得させるものである、上記（２５）に記載の癌細胞特性消失剤。
（２７）ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現を抑制することを特徴とする、腫瘍増殖抑制方法。
（２８）ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現を抑制することを特徴とする、血管新生抑制方法。
本発明により、ガラクトシルセラミド発現因子−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチドを含有する抗腫瘍剤を提供することができる。また、本発明により、ガラクトシルセラミド発現因子−１の発現抑制物質を含有する抗腫瘍剤を提供することができる。本発明は、癌転移抑制作用に加え、血管新生抑制作用及び／又は腫瘍増殖抑制作用を有することから、抗腫瘍剤として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＧＥＦ−１の構造を示す模式図である。
図２Ａは、Ｂ１６細胞、Ｂ１６／ｂｓｒ細胞、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／Ｃ細胞及びＢ１６／ｓｈＲＮＡ細胞のコロニー形態を示す図である。
図２Ｂは、Ｂ１６細胞、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／Ｃ細胞及びＢ１６／ｓｈＲＮＡ細胞の投与後２１日目における肺転移像を示す図である。図中の「ＨＥ」はＨＥ染色像を意味する。
図２Ｃは、Ｂ１６細胞、Ｂ１６／ｂｓｒ細胞、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／Ｃ細胞及びＢ１６／ｓｈＲＮＡ細胞の投与後のマウスの生存日数を示す図である。
図３は、管腔形成試験の結果を示す図である。Ａ）ＫＯＰ細胞及びＫＯＰ／Ｃ細胞の管腔形成結果を示す。Ｂ）ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞、ＭＤＣＫ細胞及びＭＤＣＫ／Ｃ細胞の管腔形成結果を示す。
図４は、マウス背部皮下（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における血管新生の誘導及び抑制の結果を示す図である。上パネルは血管新生の様子を示し、下パネルは血管長及び血管面積の測定結果を示す。
図５は、Ｂ１６／Ｃ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖能を測定した結果を示す図である。
図６は、Ｂ１６／Ｃ細胞の細胞密度と細胞周期を測定した結果を示す図である。
図７は、転写因子活性及びプロモーター活性の測定に用いたベクターの構造を示す模式図である。
図８は、ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞及びＭＤＣＫ／Ｃ細胞のＳＭＡＤ転写活性に対するＨＧＦ及びＴＧＦ−βの影響を測定した結果を示す図である。
図９は、ＭＤＣＫ細胞／ＧＥＦ−１細胞及びＭＤＣＫ／Ｃ細胞における各種転写因子の活性を測定した結果を示す図である。
図１０は、Ｂ１６細胞／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞及びＢ１６／Ｃ細胞における各種転写因子の活性を測定した結果を示す図である。
図１１は、Ｂ１６／ｂｓｒ細胞、Ｂ１６細胞／ＧＥＦ−１細胞及びＢ１６／Ｃ細胞におけるＴＧＦ−β−ＳＭＡＤシグナル誘導性のＰＡＩ−１プロモーター活性を測定した結果を示す図である。
図１２は、培地中に含まれるＴＧＦ−βの変化量を測定した結果を示す図である。
図１３Ａは、Ｂ１６細胞／ＧＥＦ−１細胞及びＢ１６／Ｃ細胞の軟寒天培地内増殖能を測定した結果を示す図である。上パネルはコロニー形成の様子を示し、下パネルはコロニー数の相対値を測定した結果を示す。
図１３Ｂは、ＬＬＣ／Ｃ細胞の軟寒天培地内増殖能を測定した結果を示す図である。上パネルはコロニー形成の様子を示し、下パネルはコロニー数の相対値を測定した結果を示す図である。
図１３Ｃは、ＭＤＣＫ細胞及びＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞の軟寒天培地内における増殖形態を示す図である。
図１４Ａは、Ｂ１６細胞／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞及びＢ１６／Ｃ細胞のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける腫瘍形成／増殖能を測定した結果を示す図である。
図１４Ｂは、ＭＤＣＫ細胞及びＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞のヌードマウスにおける腫瘍形成／増殖能を測定した結果を示す図である。
図１５は、ＧＥＦ−１  ｓｉＲＮＡの管腔形成阻害効果を検討した結果を示す図である。上パネルはｓｉＲＮＡ導入細胞の管腔形成の様子を示し、下パネルは管腔形成率の相対値を測定した結果を示す。
図１６は、ＧＥＦ−１  ｓｉＲＮＡ  ＃３のｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果を検討した結果を示す図である。左パネルは腫瘍体積及び腫瘍重量の測定結果を示し、右パネルはヌードマウスに形成された腫瘍の外観を示す。
図１７は、ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの模式図である。
図１８Ａは、Ｂ１６細胞のＳＭＡＤ転写活性に対するＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの効果を測定した結果を示す図である。
図１８Ｂは、ＣＯＬＯ２０５細胞のＳＭＡＤ転写活性に対するＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの効果を測定した結果を示す図である。
図１９は、ＫＯＰ細胞の管腔形成に対するＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの効果を測定した結果を示す図である。
図２０Ａは、Ｂ１６細胞の軟寒天培地内増殖に対するＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの効果を測定した結果を示す図である。
図２０Ｂは、ＨｅＬａ細胞の軟寒天培地内増殖に対するＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの効果を測定した結果を示す図である。
図２０Ｃは、ＣＯＬＯ２０５細胞の軟寒天培地内増殖に対するＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの効果を測定した結果を示す図である。
図２０Ｄは、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞の軟寒天培地内増殖に対するＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの効果を測定した結果を示す図である。
図２１Ａは、Ａ５４９細胞の軟寒天培地内増殖に対するＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの効果を測定した結果を示す図である。
図２１Ｂは、ＰＴ４５細胞の軟寒天培地内増殖に対するＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの効果を測定した結果を示す図である。
図２２は、Ｂ１６細胞を用いて、ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果を検討した結果を示す図である。左パネルは腫瘍体積及び腫瘍重量の測定結果を示し、右パネルはヌードマウスに形成された腫瘍の外観を示す。
図２３は、ＣＯＬＯ２０５細胞を用いて、ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果を検討した結果を示す図である。左パネルは腫瘍体積及び腫瘍重量の測定結果を示し、右パネルはヌードマウスに形成された腫瘍の外観を示す。
図２４は、Ａ５４９細胞を用いて、ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果を検討した結果を示す図である。左パネルは腫瘍体積及び腫瘍重量の測定結果を示し、右パネルはヌードマウスに形成された腫瘍の外観を示す。
図２５は、ＥＬ４／Ｃ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖能を測定した結果を示す図である。
図２６は、ＰＴ４５／Ｃ細胞の軟寒天培地内増殖能を測定した結果を示す図である。上パネルはコロニー形成の様子を示し、下パネルはコロニー数の相対値を測定した結果を示す。
図２７は、ＣＯＬＯ２０５／Ｃ細胞の軟寒天培地内増殖能を測定した結果を示す図である。上パネルはコロニー形成の様子を示し、下パネルはコロニー数の相対値を測定した結果を示す。
図２８は、ＣＯＬＯ２０５細胞を用いて、細胞膜透過ペプチドが結合したＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチド（ｒ９−ＯＰ１０−１１）のｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果を検討した結果を示す図である。左パネルは腫瘍体積変化及び腫瘍湿重量の測定結果を示し、右パネルはヌードマウスに形成された腫瘍の外観を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる２０１０年６月２５日に出願された日本国特許出願（特願２０１０−１４４７６３号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．概要
ガラクトシルセラミド発現因子−１（ＧａｌＣｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ−１（ＧＥＦ−１））は、ガラクトシルセラミドの発現を誘導する因子である（Ｏｇｕｒａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７１，１８２７−１８３６，１９９８）。本発明者らは以前、ＧＥＦ−１のＣ領域を含み、かつＱ領域を含まないポリペプチドを発現させることにより、癌細胞の転移能を抑制することに成功した（特開２００５−２４７７３５号公報）。その一方、当該ポリペプチドは、腫瘍増殖を有意には抑制しなかった（同号公報）。
しかしながら、本発明者らが改めてＧＥＦ−１の腫瘍増殖に対する効果を検討した結果、ＧＥＦ−１は腫瘍増殖を亢進することが明らかとなった。さらに、ＧＥＦ−１の血管新生に対する効果を検討した結果、ＧＥＦ−１は血管新生も亢進することが明らかとなった。そこで、ＧＥＦ−１のＣ領域の効果について検討した結果、ＧＥＦ−１のＣ領域又はその構成オリゴペプチドを発現させることにより、腫瘍増殖及び血管新生を抑制できることを見出した。また、ＧＥＦ−１の発現抑制物質を用いてＧＥＦ−１の発現を抑制することにより、腫瘍増殖及び血管新生を抑制できることを見出した。これらの結果から、ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチド、その構成オリゴペプチド及びＧＥＦ−１の発現抑制物質は、癌細胞転移抑制、血管新生抑制及び腫瘍増殖抑制という３つの効果を併せ持つものであり、抗腫瘍剤として極めて有用であることが示された。また、本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍血管新生を抑制することにより間接的に癌細胞の転移及び腫瘍増殖を抑制するだけではなく、癌細胞自体の遊走性を抑制することにより直接癌転移を抑制し、さらには癌細胞の腫瘍増殖に関与する転写因子の発現を抑制することにより直接腫瘍増殖を抑制することが示された。従って、本発明の抗腫瘍剤は、上記３つの効果の相乗効果を発揮することができるため、癌又は腫瘍の治療に極めて有用である。
２．ガラクトシルセラミド発現因子−１
（１）ガラクトシルセラミド発現因子−１の機能
ＧＥＦ−１は、上皮細胞由来ＭＤＣＫ細胞において、ＧａｌＣｅｒ及びその硫酸化誘導体サルファタイドを高発現させる機能を有する。また、ＭＤＣＫ細胞に上皮細胞−間葉系細胞変異（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（ＥＭＴ））を誘導し、線維芽細胞様の形態へと変化させる機能を有する。上皮細胞−間葉系細胞変異（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（ＥＭＴ））とは、Ｗｎｔ等のシグナルにより誘導される胎児形態形成初期における必須の過程であり、がん細胞転移における浸潤及び血管内移行にも大きく関与している過程である（Ｂｅａｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８２６−８２９，１９９７）。実際、ＧＥＦ−１は、癌細胞であるマウスメラノーマＢ１６細胞に発現させると、癌細胞の転移を促進することが明らかとなっている。また、ＧＥＦ−１は、血管新生誘導作用及び腫瘍増殖作用を有する。
（２）ＧＥＦ−１ポリペプチド
本発明に使用されるＧＥＦ−１ポリペプチドは、限定されるものではなく、ラット由来、ヒト由来、マウス由来のいずれであってもよい。ラットＧＥＦ−１は、マウス又はヒトＨＧＦ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（以下、「Ｈｒｓ」又は「Ｈｇｓ」と称する）のホモログである。ラットＧＥＦ−１とマウスＨｒｓ、ラットＧＥＦ−１とヒトＨｒｓ、マウスＨｒｓとヒトＨｒｓのアミノ酸配列相同性は以下の通りである。
（ａ）ラットＧＥＦ−１とマウスＨｒｓのアミノ酸配列相同性は９７％
（ｂ）ラットＧＥＦ−１とヒトＨｒｓのアミノ酸配列相同性は９３％
（ｃ）マウスＨｒｓとヒトＨｒｓのアミノ酸配列相同性は９３％
従って、本発明において使用されるＧＥＦ−１ポリペプチドには、ラット由来ＧＥＦ−１ポリペプチド、ヒト由来Ｈｒｓポリペプチド、マウス由来Ｈｒｓポリペプチドが含まれる。
ラット由来、ヒト由来、マウス由来のＧＥＦ−１（Ｈｒｓ）ポリペプチドのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２、４、６で表す。また、ラット由来、ヒト由来、マウス由来のＧＥＦ−１をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を、それぞれ配列番号１、３、５で表す。上記塩基配列及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。各種ＧＥＦ−１（Ｈｒｓ）の塩基配列及びアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を以下に示す。
ラットＧＥＦ−１（配列番号１、２）：ＡＢ００２８１１
ヒトＨｒｓ（配列番号３、４）：Ｕ４３８９５
マウスＨｒｓ（配列番号５、６）：Ｄ５００５０
本発明において使用されるＧＥＦ−１ポリペプチドには、上記の配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号２、４若しくは６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生誘導作用若しくは腫瘍増殖作用を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
本発明において、「血管新生誘導作用」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて管腔形成を誘導する作用又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血管新生を誘導する作用を意味する。また、「腫瘍増殖作用」とは、癌細胞の増殖を促進する作用を意味する。
また、「血管新生誘導作用又は腫瘍増殖作用を有する」とは、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの血管新生誘導作用又は腫瘍増殖作用を１００としたときと比較して、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、好ましくは９０％以上の活性を有することを意味する。
血管新生誘導作用は、公知の方法、例えばＭＤＣＫ細胞に変異ポリペプチドを発現させ、対照ＭＤＣＫ細胞と比較して管腔形成能が亢進しているか否かを試験することにより確認することができる。また、マウス背部皮下での血管新生誘導試験（ＤＡＳ法）を用いて、血管長又は血管面積を測定することにより、血管新生誘導作用を測定することができる。また、腫瘍増殖作用は、任意の癌細胞に変異ポリペプチドを発現させ、公知の手法を用いて腫瘍の増殖量を測定することにより、測定することができる。
上記の変異を有するポリペプチドを調製するためにポリヌクレオチドに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２、Ｋｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−６７、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
また、本発明において使用されるＧＥＦ−１ポリペプチドには、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列のほか、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９３％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ血管新生誘導作用又は腫瘍増殖作用を有するもの（配列番号２、４、６で表されるアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列）も含まれる。相同性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）において、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ等の相同性検索を利用できる。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において、ＢＬＡＳＴを用いた検索を行うこともできる。
（３）ＧＥＦ−１をコードするポリヌクレオチド
上記の通り、ラットＧＥＦ−１はマウス又はヒトＨｒｓのホモログである。従って、本発明のＧＥＦ−１をコードするポリヌクレオチドには、Ｈｒｓをコードするポリヌクレオチド、例えば、ヒト及びマウスのＨｒｓをコードするポリヌクレオチド（配列番号３及び５）、さらに、配列番号４及び６で表されるアミノ酸配列からなるヒト及びマウスＨｒｓのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。また、ラットＨｒｓをコードするポリヌクレオチドも含まれる。
本発明において、ＧＥＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、３又は５で表される塩基配列のほか、前記ＧＥＦ−１ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。例えば、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのほか、配列番号２、４又は６で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドであって、血管新生誘導作用又は腫瘍増殖作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明において使用することができる。
ここで、「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指し、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。また、天然以外の人工塩基を必要に応じて含むポリヌクレオチドも包含する。
本発明のＧＥＦ−１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または該塩基配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、血管新生誘導作用又は腫瘍増殖作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１、３又は５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒトのｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
本発明におけるハイブリダイゼーション条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２５℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２５℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６８℃」等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のＧＥＦ−１遺伝子をコードするポリヌクレオチドを得るための条件を設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３−６．４）等を参照することができる。
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、慣用の配列決定法により確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサー（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（アプライドバイオシステムズ社））を利用して配列を解析することも可能である。
３．ＧＥＦ−１のＣ領域及びＱ領域
（１）ＧＥＦ−１のＣ領域及びＱ領域の機能
ＧＥＦ−１タンパク質は、図１に示すように、アミノ末端側から順にｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ配列（ＦＹＶＥ）を持つ領域（Ｚ）、高プロリン領域（Ｐ）、コイルド−コイル配列領域（Ｃ）及び高プロリン２／高グルタミン領域（Ｑ）の４つの領域（ドメイン）から構成されているタンパク質である。
ＧＥＦ−１のＣ−Ｑ領域を少なくとも含むポリペプチドはＥＭＴ誘導能を有しており、Ｑ領域を含まずかつＣ領域を含むポリペプチド（例えば、ＺＰＣ、ＰＣ、Ｃ）は、ＥＭＴ誘導阻害活性を有している。また、トランスウェルチャンバーを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞遊走実験において、全長のＧＥＦ−１（ＺＰＣＱ）を発現する細胞は遊走性が上昇するが、一方、Ｑ領域を欠損し、かつＣ領域を含むＧＥＦ−１変異体（ＺＰＣ、ＰＣ、Ｃ）では顕著にその遊走性が低下し、特にＣ領域を発現する細胞は遊走性の低下が顕著である（特開２００５−２４７７３５号公報）。
さらに、後述する実施例に記載の通り、ＧＥＦ−１のＣ領域のポリペプチドは、癌細胞の転移を抑制する。
従って、ＧＥＦ−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち少なくともＣ領域を含むポリペプチド、すなわち、ＧＥＦ−１のＺＰＣ領域、好ましくはＰＣ領域、より好ましくはＣ領域のポリペプチドは、癌細胞転移抑制作用を有する。また、ＧＥＦ−１のＣ領域のポリペプチドは、血管形成抑制作用及び腫瘍増殖抑制作用を有する。
（２）ＧＥＦ−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち少なくともＣ領域を含むポリペプチド
本発明において、「ガラクトシルセラミド発現因子−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち少なくともＣ領域を含むポリペプチド」は、ＧＥＦ−１のＱ領域を含まず、かつＣ領域を含むポリペプチドを意味する。このようなポリペプチドとしては、ＧＥＦ−１のＣ領域のポリペプチド（ＧＥＦ−１／Ｃ）のほか、Ｃ領域のアミノ末端側にＰ領域の全長又は一部を含むポリペプチド（ＧＥＦ−１／ＰＣ）、ＰＣ領域のアミノ末端側にＺ領域の全長又は一部を含むポリペプチド（ＧＥＦ−１／ＺＰＣ）が挙げられるが、好ましくはＣ領域のポリペプチド（ＧＥＦ−１／Ｃ）である。
ＧＥＦ−１／ＺＰＣ、ＧＥＦ−１／ＰＣ及びＧＥＦ−１／Ｃの各ポリペプチド及びその変異体は、当業者であれば下記の表１及び上記変異体の作製方法に基づいて、容易に作製することができる。配列番号２、配列番号４及び配列番号６で表されるアミノ酸配列におけるＺ、Ｐ、Ｃ及びＱ領域の位置を以下の表１に示す。
【表１】
2011162419.tif 000003
（３）ＧＥＦ−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち少なくともＣ領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
上記（２）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、上記ＧＥＦ−１／Ｃ、ＧＥＦ−１／ＰＣ、ＧＥＦ−１／ＺＰＣをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。これらのポリヌクレオチド及びその変異体は、当業者であれば下記の表２及び上記のハイブリダイゼーション方法に基づいて容易に作製することができる。配列番号１（ラットＧＥＦ−１）、配列番号３（ヒトＨｒｓ）及び配列番号５（マウスＨｒｓ）の塩基配列におけるＺ、Ｐ、Ｃ及びＱ領域の位置を以下の表２に示す。
【表２】
2011162419.tif 000004
４．ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチド
（１）ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチド（ＧＥＦ−１／Ｃ）
本発明において、ＧＥＦ−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち少なくともＣ領域を含むポリペプチドには、ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドが含まれる。
ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドは、癌細胞の転移抑制作用、血管新生抑制作用及び腫瘍増殖抑制作用を有する。
ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドとしては、配列番号８（ラットＧＥＦ−１／Ｃ）、配列番号１０（ヒトＨｒｓ／Ｃ）又は配列番号１２（マウスＨｒｓ／Ｃ）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
また、ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドとしては、上記の配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生誘導作用若しくは腫瘍増殖作用を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
（ｉ）配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
本発明における血管新生誘導作用及び腫瘍増殖作用に関する説明及び測定方法は、上記と同様である。また、上記の変異を有するポリペプチドを調製するためのポリヌクレオチドへの変異導入方法も上記と同様である。
ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドには、配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列のほか、配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ血管新生抑制作用又は腫瘍増殖抑制作用を有するもの（配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列）も含まれる。相同性の検索方法は上記と同様である。
（２）ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチド（ＧＥＦ−１／Ｃ）をコードするポリヌクレオチド
本発明において、ＧＥＦ−１／Ｃをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７、９又は１１で表される塩基配列のほか、前記ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。例えば、配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのほか、配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドであって、血管新生誘導作用又は腫瘍増殖作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明において使用することができる。
本発明のＧＥＦ−１／Ｃをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７、９又は１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または該塩基配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、血管新生抑制作用又は腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは、配列番号７、９又は１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに基づいて公知の方法により取得することができる。また、上記ハイブリダイゼーションの条件及び塩基配列の確認方法については、上記と同様である。
５．ＧＥＦ−１のＣ領域の構成オリゴペプチド（ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチド）
ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドは、癌細胞の転移抑制作用、血管新生抑制作用及び腫瘍増殖抑制作用を有することから、その一部のポリペプチドも同様の作用を有することが考えられる。実際、後述する実施例に記載のとおり、ＧＥＦ−１のＣ領域の構成オリゴペプチドは、癌細胞の転移抑制作用、血管新生抑制作用及び腫瘍増殖抑制作用を有する。
従って、本発明に使用されるポリペプチドには、ＧＥＦ−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチドが含まれる。ここで、「その一部」とは、Ｃ領域の一部を意味し、そのアミノ酸配列の長さは特に限定されない。また、本発明における「ポリペプチド」には、アミノ酸残基の数が２〜２０であるオリゴペプチドも含まれる。
Ｃ領域の一部を含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基以上、好ましくは８アミノ酸残基以上、より好ましくは１０アミノ酸残基以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドが挙げられる。より具体的には、配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列のうち連続する６〜１４０アミノ酸残基、好ましくは８〜３０アミノ酸残基、より好ましくは８〜２０アミノ酸残基、さらに好ましくは１０アミノ酸残基を含むポリペプチドが挙げられる。
また、「Ｃ領域の一部」として選択されるアミノ酸配列の範囲は、配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列の範囲内であれば限定されるものではないが、例えば、配列番号１０で表されるアミノ酸配列の場合、好ましくは第３３番目（メチオニン）〜第１７２番目（アラニン）のアミノ酸配列であり、より好ましくは第８３番目（リジン）〜第１５２番目（グルタミン酸）のアミノ酸配列である。また、配列番号８又は１２で表されるアミノ酸配列についても、これらに相当する範囲のアミノ酸配列をＣ領域の一部として選択することができる。
さらに、Ｃ領域の一部のアミノ酸配列としては、例えば以下のアミノ酸配列のいずれかを含むものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
2011162419.tif 000005
2011162419.tif 000006
また、前記Ｃ領域の一部を含むポリペプチドには、配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも連続する６〜１０アミノ酸残基を含むアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつ血管新生抑制作用若しくは腫瘍増殖抑制作用を有するポリペプチドが含まれる。ここで、「数個」とは、１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）を意味するが、前記ポリペプチドに含まれるアミノ酸残基の総数が２０個前後のときは、１〜５個を意味し、前記ポリペプチドに含まれるアミノ酸残基の総数が１０個前後のときは、１〜３個を意味する。
さらに、前記Ｃ領域の一部を含むポリペプチドには、Ｃ領域の一部のアミノ酸配列からなるペプチド又はその変異体に細胞膜透過性ペプチドを付加（結合）したものが含まれる。
細胞膜透過性ペプチドは、リジン残基やアルギニン残基を高い割合で含む塩基性ペプチドであり、ＨＩＶ−１ウイルス由来のＴＡＴタンパク質（Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などが知られている。細胞膜透過性ペプチドに含まれる塩基性アミノ酸残基の割合は、例えば、３０％〜１００％であり、好ましくは１００％である。人工的合成細胞膜透過ペプチドとしては、７残基から１１残基のアルギニン残基を連ねた細胞膜透過性ペプチドが知られている。また、細胞膜透過性ペプチドに含まれるアルギニン残基はＤ体であることが好ましい。
細胞膜透過性ペプチドは任意の物質に付加することができ、当該ペプチドを付加された物質は細胞膜を透過し、細胞内に移行することができる。
本発明においては、例えば、細胞膜透過性ペプチドを前記Ｃ領域の一部のアミノ酸配列からなるペプチドに付加することにより、当該Ｃ領域の一部のアミノ酸配列からなるペプチドを標的細胞内に移行させることができる。
例えば、９個のＤ体アルギニン残基を含む細胞膜透過性ペプチド（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＰＧ（配列番号６６））を、前記Ｃ領域の一部のアミノ酸配列からなるペプチドＯＰ１０−１１（ＥＹＬＥＶＱＲＱＬＡ）に付加したポリペプチド（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＰＧＥＹＬＥＶＱＲＱＬＡ（配列番号６７））を作製し、当該ポリペプチドと標的細胞とを接触させることにより、ＯＰ１０−１１を標的細胞内に導入することができる。
Ｃ領域の一部を含むポリペプチドの血管新生誘導作用及び腫瘍増殖作用に関する説明及び測定方法は、上記と同様である。また、上記の変異を有するポリペプチドを調製するためのポリヌクレオチドへの変異導入方法も上記と同様である。
また、上記Ｃ領域の一部を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上記Ｃ領域の一部を含むポリペプチドのアミノ酸配列情報及び／又は上記Ｃ領域ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報等に基づいて、当業者であれば公知の手法により容易に作製することができる。
６．ポリペプチドの作製
ＧＥＦ−１のＱ領域を除くポリペプチドのうち少なくともＣ領域又はその一部を含むポリペプチド（以下「本発明のポリペプチド」という）は、公知の手法を用いて作製することができるが、具体的には以下の通りである。
（１）発現ベクターの作製
本発明のポリペプチドを発現するベクターは、発現させる宿主細胞に保持されるものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージ等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＭＥ１８Ｓ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が挙げられるが、大腸菌由来、枯草菌由来、酵母由来等の他のプラスミドでもよい。ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、）等が挙げられる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをベクターに組み込む手法は、適当な制限酵素で切断した後にリガーゼを作用させて連結する手法などが採用される（上記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ等を参照）。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばＺ、Ｐ、Ｃの各領域毎にそれぞれのポリヌクレオチドを増幅させるプライマーを設計し、ＰＣＲ法等を用いて当該領域を増幅した後、制限酵素やリガーゼを用いて所望の部分のみをベクターに連結させることができる。また、標的部分を増幅させるプライマーを設計しＰＣＲ法で増幅し、ベクターに連結させることもできる。
（２）形質転換
本発明において使用される宿主は、ＧＥＦ−１のＣ領域等を含むポリペプチドをコードする遺伝子が導入された後にＧＥＦ−１のＣ領域等を含むポリペプチドを発現するものであればよい。例えば、哺乳動物細胞、ビフィズス菌、乳酸菌、大腸菌等の細菌類、昆虫細胞、酵母、カビ等を挙げることができるがこれらに限定されない。
宿主への組換えＤＮＡの導入は、公知の方法により行うことができる。上記のベクターを宿主に導入する方法として、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気穿孔法、カチオン性脂質法等を挙げることができる。
また、ＤＮＡが導入されたことの確認は、選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ブラストシジン耐性遺伝子等）を用いて行われる。
（３）ポリペプチドの産生
本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその変異体を含む上記形質転換体を培養し、その培養物からポリペプチドを採取することにより得ることができる。
「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
プロモーターとして誘導型転写プロモーターを用いた発現ベクターを導入した組換え体を培養する場合は、必要に応じて誘導剤を培地に添加してもよい。誘導剤にＩＰＴＧを用いる場合のＩＰＴＧの添加量は、０．１〜１．０ｍＭであり、培養開始後２〜１２時間後に添加し、添加後さらに１〜１２時間追加培養する。
培養後、本発明のポリペプチドが菌体内又は細胞内に蓄積される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより、目的のポリペプチドを採取する。本発明のポリペプチドが菌体外又は細胞外に産生される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、硫安沈殿操作等により前記培養液中からポリペプチドを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製する。
また、本発明においては、生細胞を全く使用することなく無細胞タンパク質合成系を採用して、本発明のポリペプチドを産生することが可能である。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系であり、例えばｍＲＮＡの情報を読み取って、リボソーム上でタンパク質を合成するというものである。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されないものであってもよい。
本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭＳｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
無細胞タンパク質合成によって得られる本発明のポリペプチドは、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。また、本発明のポリペプチドが単離精製されたことの確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により行うことが可能である。
また、本発明のポリペプチドは、全長のＧＥＦ−１等から臭化シアンやペプチダーゼ等で切断することによって得ることもできる。ペプチダーゼは、当該ポリペプチドを切断することができれば限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ等を挙げることができる。
（４）ペプチド合成
本発明のポリペプチドは化学合成により得ることができる。ペプチド合成は、既知の方法により、Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所）等の合成装置で行うことができる。また、本発明のポリペプチドは、林化成株式会社などのペプチド合成受託会社にペプチド合成を依頼し、購入することによって得ることもできる。細胞膜透過性ペプチドを付加したポリペプチドについても同様である。
７．ＧＥＦ−１の発現抑制物質
（１）ＧＥＦ−１の発現抑制物質
ＧＥＦ−１は、癌転移を促進し、血管新生を誘導しかつ腫瘍増殖を促進することから、当該ＧＥＦ−１の発現を抑制することにより、これらの作用を抑制することができる。
ＧＥＦ−１の発現抑制物質としては、例えば、ＲＮＡ干渉に利用される核酸（マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、アンチセンス核酸、デコイ核酸、又はアプタマーなどが挙げられる。これらの発現抑制物質により、ＧＥＦ−１の発現を抑制することが可能である。抑制の対象となるＧＥＦ−１遺伝子の塩基配列は上記の通り公知であり、それぞれ配列情報を入手することができる。本発明において、ＧＥＦ−１遺伝子の塩基配列は配列番号１、３又は５に示すものであるが、ＧＥＦ−１のコード領域のみならず、非コード領域を対象として使用することも可能である。
（２）ＲＮＡ干渉
本発明においては、ＧＥＦ−１遺伝子に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用して発現を抑制することができる。このようなＲＮＡｉに用いられる核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びｓｈＲＮＡが挙げられる。
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）分子は、標的となるＧＥＦ−１遺伝子に対応する種々のＲＮＡである。そのようなＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、ＧＥＦ−１遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ等が挙げられる。
一般に、ｍＲＮＡ上の標的配列は、ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列から選択することができる。但し、本発明においてはこの領域に限定されるものではない。
ｓｉＲＮＡ分子は、当分野において周知の基準に基づいて設計できる。例えば、標的ｍＲＮＡの標的セグメントは、好ましくはＡＡ、ＴＡ、ＧＡ又はＣＡで始まる連続する１５〜３０塩基、好ましくは１９〜２５塩基のセグメントを選択することができる。ｓｉＲＮＡ分子のＧＣ比は、３０〜７０％、好ましくは３５〜５５％である。
ｓｉＲＮＡは、２本鎖部分を生成するために自身の核酸上で折り畳む一本鎖ヘアピンＲＮＡ分子として生成することができる。ｓｉＲＮＡ分子は、通常の化学合成により得ることができるが、発現ベクターを用いて生物学的に生成することも可能である。
ｓｉＲＮＡを細胞に導入するには、合成したｓｉＲＮＡをプラスミドＤＮＡに連結してこれを細胞に導入する方法、２本鎖ＲＮＡをアニールする方法などを採用することができる。
また、本発明においては、ｓｉＲＮＡとして、ＳｔｅａｌｔｈＴＭ  ＲＮＡｉ、ＳｔｅａｌｔｈＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＲＮＡｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）など、市販のｓｉＲＮＡを使用することもできる。
また、本発明は、ＲＮＡｉ効果をもたらすためにｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡとは、ショートヘアピンＲＮＡと呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Ａとし、配列Ａに対する相補鎖を配列Ｂとすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順でこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するように連結し、全体で４５〜６０塩基の長さとなるように設計する。スペーサーの長さも特に限定されるものではない。配列Ａは、標的となるＧＥＦ−１遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１９〜２５塩基、好ましくは１９〜２１塩基である。
このようにして設計したｓｈＲＮＡは、例えば、ｓｈＲＮＡの鋳型となるポリヌクレオチドをＰＣＲ法により増幅し、当該ポリヌクレオチドをｐＳｕｐｅｒｉｏｒ．ｎｅｏ．ｇｆｐベクター（ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ社）等の適当なｓｈＲＮＡ発現用ベクターに導入し、当該ｓｈＲＮＡ発現ベクターを対象となる細胞に遺伝子導入することにより、産生させることができる。
さらに、本発明は、マイクロＲＮＡを用いてＧＥＦ−１の発現を抑制することができる。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、細胞内に存在する長さ２０〜２５塩基ほどの１本鎖ＲＮＡであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているｎｃＲＮＡ（ｎｏｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）の一種である。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡに転写された際にプロセシングを受けて生じ、標的配列の発現を抑制するヘアピン構造を形成する核酸として存在する。
ｍｉＲＮＡも、ＲＮＡｉに基づく核酸であるため、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡに準じて設計し合成することができる。
（３）アンチセンス核酸
本発明の別の態様において、ＧＥＦ−１の発現を抑制するためにアンチセンス核酸を使用することができる。アンチセンス核酸は、ＧＥＦ−１遺伝子のｍＲＮＡ又はＤＮＡ配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）である。アンチセンス核酸配列の長さは、少なくとも１４ヌクレオチドであり、好ましくは１４〜１００ヌクレオチドである。アンチセンス核酸は、上記遺伝子配列に結合して二重鎖を形成し、ＧＥＦ−１遺伝子の転写又は翻訳を抑制する。
アンチセンス核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、一般的に用いられるＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。アンチセンス核酸は、例えば、各種ＤＮＡトランスフェクション又はエレクトロポレーション等の遺伝子導入方法によりＧＥＦ−１を発現する癌細胞に導入される。
（４）デコイ核酸
本発明の別の態様では、デコイ核酸と呼ばれるおとり核酸を使用することにより、ＧＥＦ−１の発現を抑制することができる。
デコイ核酸は、ＧＥＦ−１遺伝子に結合してプロモーター活性を抑制することにより、ＧＥＦ−１遺伝子発現を抑制する核酸であって、転写因子の結合部位を含む短いおとり核酸を意味する。この核酸が細胞内に導入されると、転写因子がこの核酸に結合する。これにより、転写因子のゲノム結合部位への結合が競合的に阻害され、その結果、転写因子の発現が抑制される。
本発明の好ましいデコイ核酸としては、例えばＧＥＦ−１遺伝子のプロモーターに結合する核酸、あるいはＧＥＦ−１のｍＲＮＡやＧＥＦ−１の上流に存在する因子のプロモーターに結合する核酸などが挙げられる。デコイ核酸は、ＧＥＦ−１遺伝子のプロモーター配列をもとに、１本鎖又は２本鎖として設計することができる。デコイ核酸の長さは特に限定されるものではなく、１５〜６０塩基、好ましくは２０〜３０塩基である。
デコイ核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、修飾された核酸が含まれていてもよい。
本発明で用いられるデコイ核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術に一般的に用いられるＤＮＡ合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、ＰＣＲ法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。さらに、細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、塩基等にアルキル化、アシル化等の化学修飾を付加することができる。
なお、デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、一般的に行なわれるルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ等を採用することができる。これらのアッセイを行なうためのキットも市販されている（例えばｐｒｏｍｅｇａ  ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）。
（５）アプタマー
さらに、本発明は、アプタマーを用いてＧＥＦ−１の発現を抑制することができる。
アプタマーとは、特異的に標的物質に結合する能力を持つ合成ＤＮＡ又はＲＮＡ分子及びペプチド性分子であり、試験管内において化学的に短時間で合成することができる。従って、配列番号１、３又は５で表される塩基配列を基準にして、あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法又はＳＥＬＥＸ法として知られている進化工学的手法により得ることができる。
核酸アプタマーは、血流中ではヌクレアーゼにより速やかに分解及び除去されるため、必要に応じてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などによる分子修飾を行って半減期を伸ばしておくことが好ましい。
８．抗腫瘍剤
本発明のポリペプチド、当該ポリペプチドを発現するベクター並びに本発明において作製されたｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡは、癌転移抑制作用、血管新生抑制作用及び／又は腫瘍増殖抑制作用を有する。従って、これらを含む組成物は、抗腫瘍剤として使用することができる。
本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍血管新生を抑制することにより間接的に癌の転移及び腫瘍増殖を抑制するだけではなく、癌細胞の遊走性を抑制することにより癌の転移を抑制し、さらに腫瘍増殖に関与する転写因子の発現を抑制することにより腫瘍増殖を抑制することができる。従って、本発明の抗腫瘍剤は、癌の転移、血管新生及び腫瘍増殖の３つをそれぞれ直接的に抑制でき、さらにその相乗効果によって腫瘍を治療できる点で、公知の抗腫瘍剤と比較して癌の治療に極めて有用である。
本発明における「癌」又は「腫瘍」としては、例えば、固形癌としては、脳腫瘍、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸や十二指腸の癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫など）、メラノーマなどが挙げられ、血液腫瘍としては、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ））、リンパ腫、多発性骨髄腫（ＭＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明における「血管新生」とは、生理的血管新生及び病的血管新生の双方を含むが、好ましくは病的血管新生である。生理的血管新生は、限られた部位及び時期に観察される血管新生であり、通常は抑制されている。他方、病的血管新生は、生体制御機構の支配下になく、無秩序に行われる血管新生であり、癌又は腫瘍、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、尋常性乾癬、粥状動脈硬化症などで観察される血管新生である。
本発明における病的血管新生としては、好ましくは腫瘍血管新生である。
「転移」は、癌細胞が血液やリンパ系を介して、あるいは手術の際に、原発巣から離れた他の部位に運ばれて、そこに新しい増殖巣をつくることを意味する。あるいは、「転移」は「癌細胞が伝播し、非連続部位で新たな増殖巣を形成する（すなわち転移を形成する）能力」を指す（Ｈｉｌｌ，Ｒ．Ｐ，“Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”，Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｔａｎｎｏｃｋら編、１７８−１９５（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）。
本発明の抗腫瘍剤は、本発明のポリペプチド、当該ポリペプチドを発現するベクター、本発明において作製されたｓｈＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡのほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、抗腫瘍剤としての使用に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、着香料、又は甘味料を指す。
本発明の抗腫瘍剤は、注射剤、凍結乾燥品、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、シロップ剤、坐剤、バップ剤、軟膏剤、クリーム剤、点眼剤等の剤型をとることができる。
本発明の抗腫瘍剤は、当業者に既知である任意の手段によって局所的又は全身に投与される。投与量は、患者の年齢、体重、健康状態、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型などの要因に応じて変化し、具体的な投与手順は当業者により設定することができる。例えば、成人には、本発明の抗腫瘍剤を錠剤として投与する場合に０．１μｇ〜１０ｇ、好ましくは１μｇ〜１ｇ、より好ましくは１０μｇ〜１００ｍｇを一日に１〜５回投与することができる。
さらに、本発明の抗腫瘍剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の抗腫瘍剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
また、本発明の抗腫瘍剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。脳等に局所投与することもできる。例えば、成人に上記の抗腫瘍剤を投与する場合は、一日あたり０．１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは一日あたり１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇを投与することができる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを目的の組織又は器官に導入するためには、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
さらに、本発明のポリペプチドを発現するベクターをビフィズス菌、乳酸菌、酵母、糸状菌等の宿主に形質転換し、当該形質転換体を抗腫瘍剤として用いることができる。ビフィズス菌としてはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ等が挙げられる。乳酸菌としては、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）等が挙げられる。これらの形質転換体は、そのまま使用できるほか、上記の剤形に適宜製剤化し、本発明の抗腫瘍剤として用いることができる。
９．血管新生抑制剤及び腫瘍増殖抑制剤
本発明のポリペプチド、当該ポリペプチドを発現するベクター並びに本発明において作製されたｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡは、血管新生抑制作用及び腫瘍増殖抑制作用を有する。従って、これらを含む組成物は、血管新生抑制剤及び腫瘍増殖抑制剤として使用することができる。本発明における血管新生についての説明は、上記「８．抗腫瘍剤」に記載した通りである。
本発明の血管新生抑制剤及び腫瘍増殖抑制剤は、試薬として、あるいは哺乳動物の治療に用いることができ、その投与形態、添加物、投与経路、投与対象、投与量などは、上記「８．抗腫瘍剤」の記載に準じて適宜選択することができる。
１０．癌細胞特性消失剤
本発明のポリペプチド、当該ポリペプチドを発現するベクターは、癌細胞特性を消失させる作用を有する。従って、これらを含む組成物は、癌細胞特性消失剤として使用することができる。本発明において、「癌細胞特性」としては、例えば、遊走性、転移性、血管新生誘導性、接触阻害が生じることなく増殖する特性、軟寒天培地における増殖性（足場非依存的に増殖する特性）等が挙げられる。
本発明の癌細胞特性消失剤は、癌細胞に投与することにより、癌細胞に接触阻害能を獲得させることができる。ここで、「接触阻害」とは、正常細胞が増殖する上で、物理的障害物との接触や細胞同士の接触により増殖が一定レベルで停止することを意味する。例えば、動物細胞を培養皿上で培養すると、物理的障害物や細胞同士の接触によって細胞膜を介して細胞骨格に変化を生じ、細胞運動の方向を変えたり、運動が減少する。また、正常繊維芽細胞や正常上皮細胞は、癌細胞と異なり、培養皿一面に播種すると増殖を停止する。すなわち、正常細胞は、細胞密度依存的に増殖が阻害され、コンフルエントに達すると増殖が停止する。そして、細胞密度が低い状態で再播種すると、再度増殖することができる。これに対し、癌細胞は、細胞の細胞密度がコンフルエントに達しても、増殖を続け、酸素又は栄養が不足するまで増殖を続ける。すなわち、接触阻害は、正常細胞に認められる現象であり、癌細胞には認められないものである。従って、接触阻害が生じたということは、癌細胞の特性を消失したことを示す。接触阻害には、接触増殖阻害及び接触阻止も含まれる。
本願発明のポリペプチド（例えば、配列番号８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド等）及びその変異体の癌細胞特性消失作用は、公知の方法、例えば、癌細胞に本願発明のポリペプチド又は発現ベクターを導入し、形質導入された癌細胞が培養皿において細胞密度依存的に増殖が阻害されるかどうかを測定することにより、評価することができる。
本発明の癌細胞特性消失剤は、試薬として、あるいは哺乳動物の治療に用いることができ、その投与形態、添加物、投与経路、投与対象、投与量などは、上記「８．抗腫瘍剤」の記載に準じて適宜選択することができる。
１１．血管新生抑制方法及び腫瘍増殖抑制方法
本発明のポリペプチド、当該ポリペプチドを発現するベクター並びに本発明において作製されたｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡを、哺乳動物又は哺乳動物由来の細胞に投与し、ＧＥＦ−１の発現を抑制することにより、血管新生及び腫瘍増殖を抑制することができる。従って、本発明により、血管新生抑制方法及び腫瘍増殖抑制方法が提供される。
本発明の方法に用いられる本発明のポリペプチド等の投与形態、添加物、投与経路、投与対象、投与量などは、上記「８．抗腫瘍剤」の記載に準じて適宜選択することができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
ＧＥＦ−１変異細胞の作製及び転移性の検討
１．細胞株
本実施例に用いたマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６及びルイス肺がん（ＬＬＣ）細胞は、東北大学加齢医学研究所  医用細胞資源センターから取得し、ヒト大腸がん由来細胞株ＣＯＬＯ２０５、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９、ヒト胃がん由来細胞株ＫＡＴＯＩＩＩ及びヒト子宮頸がん細胞株ＨｅＬａ細胞は、独立行政法人  理化学研究所  バイオリソースセンター（理研ＢＲＣ）から取得した。
ヒト膵がん由来細胞としては、ＰＴ４５細胞（Ｅｇａｗａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．１９９６  ４２９：５９−６８）を用い、マウス血管内皮細胞としては、ＫＯＰ２．１６細胞（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４  １１１：１１１−６）を用いた。
イヌ腎上皮由来細胞株ＭＤＣＫ細胞及びマウスリンパ腫由来ＥＬ４細胞は、独立行政法人  医薬基盤研究所から取得した。
各細胞は、ペニシリン・ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社）含有ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中、３７℃  ５％ＣＯ２条件下で培養した。
２．ＧＥＦ−１変異細胞の作製
（１）ＧＥＦ−１及び欠損変異体の各発現ベクターの作製
ＧＥＦ−１及び各欠損変異体の制限酵素ＥｃｏＲＩサイト及びＦＬＡＧエピトープ配列を含むセンス鎖プライマーと、制限酵素ＮｏｔＩサイトを含むアンチセンス鎖プライマーとを用いてＧＥＦ−１を鋳型としてＰＣＲを行い、各変異体ｃＤＮＡを作製した。ＧＥＦ−１はラット由来のものを用いた。
ＰＣＲは変性９４℃３０秒、アニーリング６０℃３０秒、伸長反応７２℃９０秒から３００秒の条件で２０サイクル行った。プライマーとして、以下のセンスプライマー、アンチセンスプライマーを用いた。
Ｚセンスプライマー：
2011162419.tif 000007
Ｐセンスプライマー：
2011162419.tif 000008
Ｃセンスプライマー：
2011162419.tif 000009
Ｑセンスプライマー：
2011162419.tif 000010
Ｚ−アンチセンスプライマー：
2011162419.tif 000011
Ｐ−アンチセンスプライマー：
2011162419.tif 000012
Ｃ−アンチセンスプライマー：
2011162419.tif 000013
Ｑ−アンチセンスプライマー：
2011162419.tif 000014
増幅産物の各配列を確認した後に、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩによる切断フラグメントをｐｃＤＮＡ３動物細胞発現ベクター（インビトロジェン社）のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイトに導入し、ＧＥＦ−１及びＱ領域欠損変異体の各発現ベクターを作製した。
（２）ＧＥＦ−１発現細胞及びＱ領域欠損変異体発現細胞の作製
以下の細胞を公知の方法に従って作製した（Ｐａｔｋｉ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９４，４３３−４３４，１９９８）。具体的には、上記で作製したＧＥＦ−１（ＺＰＣＱ）又はＱ領域欠損変異体（ＺＰＣ、ＰＣ、Ｃ領域）の各発現ベクターとブラストシジン選択遺伝子発現ベクター（ｐＳＶ２ｂｓｒベクター）（フナコシ社）とを各種細胞に同時に導入し、ブラストシジン（フナコシ社）で選択（２ｍｇ／Ｌ）後、安定発現細胞を得て、限界希釈法を用いて各発現細胞をクローニングした。
ａ）ＧＥＦ−１（ＺＰＣＱ領域）発現ＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞）
ｂ）ＧＥＦ−１（ＺＰＣＱ領域）発現Ｂ１６細胞（Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞）
ｃ）Ｑ領域欠損変異体（ＺＰＣ、ＰＣ又はＣ領域）発現ＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ／ＺＰＣ細胞、ＭＤＣＫ／ＰＣ細胞、ＭＤＣＫ／Ｃ細胞）
ｄ）Ｑ領域欠損変異体（ＺＰＣ、ＰＣ又はＣ領域）発現Ｂ１６細胞（Ｂ１６／ＺＰＣ細胞、Ｂ１６／ＰＣ細胞、Ｂ１６／Ｃ細胞）
ｅ）Ｃ領域発現ＬＬＣ細胞（ＬＬＣ／Ｃ細胞）
ｆ）Ｃ領域発現ＫＯＰ２．１６細胞（ＫＯＰ／Ｃ細胞）
ｇ）Ｃ領域発現ＰＴ４５細胞（ＰＴ４５／Ｃ細胞）
ｈ）Ｃ領域発現ＣＯＬＯ２０５細胞（ＣＯＬＯ２０５／Ｃ細胞）
ｉ）Ｃ領域発現ＥＬ４細胞（ＥＬ４／Ｃ細胞）
また、コントロールとして、空ベクターとｐＳＶ２ｂｓｒベクターとを同時に導入した対照ＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ／ｂｓｒ細胞）及び対照Ｂ１６細胞（Ｂ１６／ｂｓｒ細胞）を作製した。
（３）ＧＥＦ−１遺伝子に対するｓｈＲＮＡを発現するＢ１６細胞の作製
ｉ）ｓｈＲＮＡ発現ベクターの作製
３種類のｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−７４、ｓｈＲＮＡ−１５７、ｓｈＲＮＡ−２０７）発現ベクターを、以下の方法により作製した。なお、「７４」、「１５７」及び「２０７」は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中の塩基配列番号であり、各ｓｈＲＮＡの５’側の塩基配列番号を示す。例えば、ｓｈＲＮＡ−７４の場合、Ｈｇｓ７４テンプレートの５’末端から３番目のグアニン（Ｇ）が、ＧＥＦ−１遺伝子のＯＲＦにおける第７４番目の塩基に相当する。ｓｈＲＮＡ発現ベクターの作製において、ＧＥＦ−１（Ｈｒｓ／Ｈｇｓ）遺伝子はマウス由来のものを用いた。
ｐＳｕｐｅｒｉｏｒ．ｎｅｏ．ｇｆｐベクター（ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ社）を制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断し、ＢＡＰ処理をした。
他方、ｐＳｕｐｅｒｉｏｒ．ｎｅｏ．ｇｆｐベクターに導入するための３種類のフラグメントは、ＰＣＲにより取得した。ＰＣＲは、Ｈｇｓテンプレート（２００ｐｍｏｌ）、Ｈｇｓセンスプライマー（４００ｐｍｏｌ）、Ｈｇｓアンチセンスプライマー（４００ｐｍｏｌ）、専用の１ｘ  ｂｕｆｆｅｒ、ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）２．５Ｕ、ｄＮＴＰ濃度０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２濃度１ｍＭを含む反応溶液を用いて、［９５℃  ３０秒−５５℃  ３０秒−６８℃  ３０秒］ｘ２４サイクル＋［９５℃３０秒−５５℃  ３０秒−６８℃  ７分］ｘ１サイクルの温度条件にて行った。ＰＣＲに用いた各種Ｈｇｓテンプレート、Ｈｇｓセンスプライマー及びＨｇｓアンチセンスプライマーを以下に示す。
Ｈｇｓ７４センスプライマー：
2011162419.tif 000015
Ｈｇｓ７４アンチセンスプライマー：
2011162419.tif 000016
Ｈｇｓ７４テンプレート：
2011162419.tif 000017
Ｈｇｓ１５７センスプライマー：
2011162419.tif 000018
ＨｇＳ１５７アンチセンスプライマー：
2011162419.tif 000019
Ｈｇｓ１５７テンプレート：
2011162419.tif 000020
Ｈｇｓ２０７センスプライマー：
2011162419.tif 000021
Ｈｇｓ２０７アンチセンスプライマー：
2011162419.tif 000022
Ｈｇｓ２０７テンプレート：
2011162419.tif 000023
上記ＰＣＲにより得られた３種類のフラグメントを精製後、それぞれ制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断し、ＢＡＰ処理をしたｐＳｕｐｅｒｉｏｒ．ｎｅｏ．ｇｆｐベクターに導入した。
ｉｉ）ｓｈＲＮＡ発現Ｂ１６細胞の作製
上記ｉ）で作製した各種ｓｈＲＮＡ発現ベクターを、Ｂ１６細胞に遺伝子導入し、Ｇ４１８薬剤（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて薬剤選択を行った。最終的に各種ｓｈＲＮＡを発現するＢ１６細胞（Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ−７４細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ−１５７細胞及びＢ１６／ｓｈＲＮＡ−２０７細胞）は、クローニングすることにより得た。各細胞のＧＥＦ−１発現量をウエスタンブロティング法により確認し、ボイエントチャンバーを用いて細胞遊走能を調べた。
その結果、３種の細胞は、共にＨｇｓ発現も細胞遊走能も８０％以上抑制していた。Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ−１５７細胞は、Ｈｇｓ発現も細胞遊走能も９５％抑制しており、３種の細胞の中では最も高い抑制率を示した。そこで、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ−１５７細胞をＢ１６／ｓｈＲＮＡ細胞として、以下の実験に用いた。
上記（２）及び（３）で作製した細胞のうち、Ｂ１６／ｂｓｒ細胞、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／Ｃ細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞及び親株であるＢ１６細胞の形態を図２Ａに示す。
図２Ａに示すとおり、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞は、親株のＢ１６細胞やＢ１６／ｂｓｒ細胞よりも線維芽細胞様形態を示し、細胞−細胞間接触が少なくなっていた。一方、Ｂ１６／Ｃ細胞及びＢ１６／ｓｈＲＮＡ細胞では、細胞−細胞間接触の多い形態を示した。
この結果から、ＧＥＦ−１の発現はＢ１６細胞の遊走性を亢進し、ＧＥＦ−１のＣ領域及びｓｈＲＮＡの発現はＢ１６細胞の遊走性を抑制することが示された。
さらに、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／Ｃ細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞及びＢ１６細胞の転移能について検討を行った。具体的には、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／Ｃ細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞、Ｂ１６細胞（１×１０６／０．２ｍＬ  ＰＢＳ）をＣ５７ＢＬ６マウス尾静脈より投与し、投与後２１日目の肺における転移を観察した。また、ＨＥ染色も行った。さらに、細胞投与から個体死までの日数を計測し、５０％致死日数を測定した。
その結果、投与から２１日後のマウスにおいて、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞は肺への転移が亢進したのに対し、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ及びＢ１６／Ｃ細胞は肺への転移が抑制されていることが示された。特に、Ｂ１６／Ｃ細胞の肺への転移は顕著に抑制されていることが示された（図２Ｂ）。
また、Ｂ１６細胞、Ｂ１６／ｂｓｒ細胞では５０％生存日数が４２日であったのに対し、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞では２５日であり、５０％生存日数が大幅に減少した。これに対し、Ｂ１６／Ｃ細胞では、５０％生存日数は８７日であり、Ｂ１６細胞及びＢ１６／ｂｓｒ細胞の２倍以上増加した。また、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞でも、５０％生存日数はＢ１６細胞及びＢ１６／ｂｓｒ細胞と比較して大幅に増加した（図２Ｃ）。
これらの結果から、ＧＥＦ−１の発現は癌細胞の転移を亢進し、ＧＥＦ−１のＣ領域及びｓｈＲＮＡの発現は癌細胞の転移を顕著に抑制することが示された。
【実施例２】
【０００７】
ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドの血管新生に対する効果の検討
１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける管腔形成試験
血管内皮細胞としてＫＯＰ２．１６細胞を用い、ＧＥＦ−１のＣ領域を安定発現させたＫＯＰ２．１６細胞（ＫＯＰ／Ｃ細胞）の管腔形成能を測定した。
具体的には、上記ＫＯＰ２．１６細胞とＫＯＰ／Ｃ細胞をそれぞれ一定の細胞数となるように調整し、マイクロプレートのマトリゲル上に播種した。１８〜４８時間培養後、倒立顕微鏡下で細胞を写真撮影した。その画像から測定ソフトを用いて管腔形成の状態をスコア化し、管腔形成能を測定した。
その結果、マウス血管内皮細胞（ＫＯＰ２．１６）は細胞が集合した管腔形態を形成したのに対し、ＫＯＰ／Ｃ細胞では管腔形成能が消失していた（図３Ａ）。
また、ＭＤＣＫ細胞は腎上皮由来細胞であり、血管内皮由来細胞でないが、わずかな管腔形成能を示すことから、ＭＤＣＫ細胞を用いてＫＯＰ細胞と同様の管腔形成試験を行った。
その結果、ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞では、管腔形成能が顕著に亢進していた。一方、ＭＤＣＫ／Ｃ細胞では、管腔形成能が完全に消失していた（図３Ｂ）。
これらの結果から、ＧＥＦ−１のＣ領域を含むポリペプチドは、血管新生における管腔形成を阻害することが示された。
２．ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管新生誘導試験
ｉｎ  ｖｉｖｏ系の背部皮下空気嚢（ドーサル・サック・アッセイ、ＤＡＳ）法を用いて、Ｂ１６細胞の血管新生誘導能を検討した。ＤＡＳ法は、腫瘍血管新生などの病的血管新生の検討に用いられる方法である。
各種細胞（Ｂ１６細胞、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／Ｃ細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞）を注入したチャンバーをマウスの背部皮下に移植し、７日後にチャンバーを摘出した後、背部皮下を実体顕微鏡で撮影した。撮影した画像から、腫瘍細胞によって誘発された新生血管の数と面積を、測定ソフトを用いてスコア化し、管腔形成能を測定した。
その結果、Ｂ１６細胞と比較して、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞では、血管新生誘導能は亢進していた。一方、Ｂ１６／Ｃ細胞とＢ１６／ｓｈＲＮＡ細胞では、血管新生誘導能は低下していた（図４）。
これらの結果により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両者において、ＧＥＦ−１の発現が癌細胞誘導性血管新生（病的血管新生）や血管内皮細胞の血管新生を誘導したことが示された。
また、本発明におけるポリペプチド（ＧＥＦ−１のＣ領域を含むポリペプチド）及び抑制物質（ＧＥＦ−１をコードするポリヌクレオチドに対するｓｈＲＮＡ）が、癌細胞誘導性血管新生や血管内皮細胞の血管新生を抑制したことが示された。
【実施例３】
【０００８】
１．ＧＥＦ−１  Ｃ領域ポリペプチドの腫瘍増殖に対する効果の検討
（１）Ｂ１６／Ｃ細胞及びＥＬ４／Ｃ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖
ＧＥＦ−１発現と腫瘍増殖の関連性を、Ｂ１６細胞及びＥＬ４細胞のＧＥＦ−１変異細胞株を用いて検討した。
各種細胞（Ｂ１６細胞、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／Ｃ細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞、ＥＬ４細胞、ＥＬ４／Ｃ細胞）は、ＰＢＳで洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて細胞を分離し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に再懸濁した。その懸濁液の細胞数は、カウンテス（登録商標）を用いて測定した。
その結果、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞は、親株のＢ１６細胞と同様な増殖パターンを示した。これらの細胞は細胞密度が約３ｘ１０６／ｃｍ２に達すると死滅した。
一方、Ｂ１６／Ｃ細胞は細胞密度が５ｘ１０５／ｃｍ２に達するとコンフルエントとなり、細胞の増殖が停止した（図５）。そのＢ１６／Ｃ細胞を低細胞密度で再播種した場合、以前と同様な増殖能を示した。また、ＥＬ４細胞は細胞密度が約９ｘ１０５／ｃｍ２に達すると死滅した。一方、ＥＬ４／Ｃ細胞は細胞密度が６ｘ１０５／ｃｍ２に達するとコンフルエントとなり、細胞の増殖が停止した。ＥＬ４／Ｃ細胞も細胞密度依存的な細胞増殖停止が認められた（図２５）。
これらの結果から、ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドを発現するＢ１６／Ｃ細胞及びＥＬ４／Ｃ細胞は、正常細胞に認められる細胞密度依存的な接触増殖阻害能を有し、癌細胞特性を消失していることが示された。
（２）Ｂ１６／Ｃ細胞の細胞増殖と細胞周期
ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドの細胞周期に対する影響を検討するため、Ｂ１６／Ｃ細胞の細胞周期をＦＡＣＳ法により分析した。具体的には、サイクルテスト（登録商標）プラス  キット（ベクトン・ディッキンソン社（以下ＢＤ社））を用いて調製した細胞をＦＡＣＳｃａｒｉｖｅｒ（ＢＤ社）により分析した。
その結果、Ｂ１６／Ｃ細胞は、細胞密度の低い増殖期では、Ｇ１期：Ｓ期：Ｇ２／Ｍ期＝４１：５１：８であったが、コンフルエント時には７２：２１：７となり、その４週間後では、９０：２：８となっていた（図６）。
この結果から、Ｂ１６／Ｃ細胞は、細胞密度依存的にＧ１期に停止し、Ｇ１アレストとなり、増殖能が著しく低下し、癌細胞特性が消失していることが示された。
２．ＤＮＡマイクロアレイ分析及びプロファイリング解析
Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞、Ｂ１６／Ｃ細胞、及びＢ１６細胞の細胞特性を明らかにするため、それぞれの細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＤＮＡマイクロアレイ（アジレント社）分析を行った。さらに、解析ソフトＫｅｙＭｏｌｎｅｔ（医薬設計研究所）を用いて、それらのデータについてプロファイリングを行った。
その結果を以下の表に示す。
2011162419.tif 000024
この結果から、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞及びＢ１６／Ｃ細胞は、親株Ｂ１６細胞と比較して、ＳＭＡＤ経路とＲｂ／Ｅ２Ｆ経路の下流のタンパク質発現が大きく変化していることが示された。
また、この結果から、細胞内ＧＥＦ−１発現量の変化が、ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達経路とＲｂ／Ｅ２Ｆ情報伝達経路を介して、当該経路の下流のタンパク質発現に影響を与えていることが示された。ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達経路は、細胞増殖、分化、アポトーシスに大きく関与している。また、Ｒｂは、ｐ５３同様に最も主要な癌抑制遺伝子産物である。また、ＲｂはＥ２Ｆとの結合を介して細胞周期を制御する機能を有する。
従って、上記結果により、ＧＥＦ−１の発現量を調節することにより、ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達経路とＲｂ／Ｅ２Ｆ情報伝達経路を調節することが可能であり、さらには腫瘍細胞の増殖を制御又は抑制できることが示唆された。
なお、ＭＤＣＫ細胞を用いた実験においては、ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞ではＳＭＡＤ７及びＲｂの発現が低下していたのに対し、ＭＤＣＫ／Ｃ細胞では、Ｒｂ発現が増加し、ＣｙｃｌｉｎＡ，Ｄ、Ｅ、ｐ５３、ｃ−Ｓｋｉ、ＣＴＧＦ（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＨＤＡＣ４、ＡＴＭの発現が低下していた。また、ＭＤＣＫ／ｓｈＲＮＡ細胞では、ｃ−Ｍｙｃ及びｃ−Ｆｏｓの発現が増加し、Ｃｙｃｌｉｎ  Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ及びＡｕｒｏｒａ  Ｂの発現が低下していた。
３．転写調節因子活性分析
上記ＤＮＡアレイ分析の結果から、ＧＥＦ−１発現量の変化が、ＳＭＡＤ転写因子やＲｂ転写因子の活性に影響を与えている可能性が示唆されたので、以下、ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞とＭＤＣＫ／Ｃ細胞における各種転写因子の活性等について検討した。
（１）ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞とＭＤＣＫ／Ｃ細胞におけるＨＧＦ及びＴＧＦ−βのＳＭＡＤ転写活性への影響
ＳＭＡＤ転写活性の測定には、ｐＳｍａｄ  ＲＥ−ＴＫ  ｈＲｌｕｃ（Ｆ）及びｐｈＲＬ−ＴＫ（共に理研ＢＲＣ））を用いた。ｐＳｍａｄ  ＲＥ−ＴＫ  ｈＲｌｕｃ（Ｆ）は、ＴＡＴＡ様プロモーターの上流に各応答エレメント（シス作用ＤＮＡ配列）、下流にレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を持つベクターである。当該ベクターの模式図を図７に示す。
ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞とＭＤＣＫ／Ｃ細胞を、それぞれ４８ウエルプレートの各ウエルに５．０ｘ１０４個播種した。２４時間後に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地で細胞を洗浄し、ｐＳｍａｄ−ＲＥ−ＴＫ−ｈＲｌｕｃ（Ｆ）０．５μｇとｐＧＬ４．１３（プロメガ社）０．０５μｇとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．５μｌとを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地混合液（１００μｌ）を細胞に加え、遺伝子を導入した。ＣＯ２インキュベーターで４時間培養後、０．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を加えた。遺伝子導入から２４時間後に、ＨＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ）又はＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍｌ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に交換した。遺伝子導入から４８時間後に細胞をＰＢＳ洗浄し、ルシフェラーゼ活性をデュアル−ルシフェラーゼ定量システムにより測定した。
その結果、ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞のＳＭＡＤ転写活性は、ＭＤＣＫ細胞に比較して、約５７０倍の亢進が認められた。
ＭＤＣＫ細胞のＳＭＡＤ転写活性は、ＨＧＦ刺激を加えると約２倍強の亢進が認められたのに対し、ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞ではさらなる亢進は認められなかった。また、ＳＭＡＤ転写活性は、ＴＧＦ−β刺激を加えると、ＭＤＣＫ細胞では約１１倍の亢進が認められ、ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞では約６．４倍の亢進が認められた。
一方、ＭＤＣＫ／Ｃ細胞のＳＭＡＤ転写活性は、ＭＤＣＫ細胞のＳＭＡＤ転写活性よりも抑制されていた。さらに、ＨＧＦ刺激やＴＧＦ−β刺激を加えてもＭＤＣＫ／Ｃ細胞では全くＳＭＡＤ転写活性の亢進は認められなかった（図８）。
この結果から、ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドを発現させると、ＭＤＣＫ細胞はＳＭＡＤ転写活性が抑制され、かつＨＧＦ刺激やＴＧＦ−β刺激の影響も受けなくなることが示された。
（２）ＭＤＣＫ変異細胞の転写因子活性
上記の検討において、ＳＭＡＤ転写活性は、ＭＤＣＫ細胞と比較して、ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞では亢進し、ＭＤＣＫ／Ｃ細胞では抑制されていた。そこで、ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞とＭＤＣＫ／Ｃ細胞における種々の情報伝達経路に関与する転写因子活性を測定した。
Ｒｂやｐ５３等の各種転写因子の転写活性の測定には、ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ社）とＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ４（ＢＤ社）を用いた。
その結果、各細胞において、ＳＭＡＤより下流のタンパク質の発現に亢進と抑制の制御がなされていることが示された。特に、ＭＤＣＫ／Ｃ細胞ではｐ５３転写活性が亢進し、Ｒｂ転写活性が抑制されていた（図９）。Ｒｂ転写活性の低下は、Ｅ２Ｆ／Ｒｂ複合体の増加を示している。
（３）Ｂ１６変異細胞の転写因子活性
上記ＭＤＣＫ細胞と同様の方法を用いて、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞とＢ１６／Ｃ細胞における種々の情報伝達経路に関与する転写因子活性を測定した。
その結果、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞ではＳＭＡＤ転写活性が増強していたのに対し、Ｂ１６／Ｃ細胞ではＳＭＡＤ転写活性とＲｂ転写活性が抑制され、ｐ５３転写活性が増強されていた（図１０）。Ｒｂ転写活性の低下はＥ２Ｆ／Ｒｂ複合体の増加を示している。
上記のとおり、ＭＤＣＫ／Ｃ細胞とＢ１６／Ｃ細胞の両者において、Ｒｂの転写活性が低下し、ｐ５３の転写活性が亢進していた。Ｒｂ転写活性の低下は、Ｒｂ／Ｅ２Ｆ複合体形成の増加を示し、Ｇ１期での細胞周期停滞を進める。また、ｐ５３の転写活性の亢進は、ｐ２１発現を誘導し、ｐ２１によりＲｂのリン酸化が阻害され、細胞周期がＧ１期で停止する。
従って、上記の結果により、ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドを発現させると、Ｅ２Ｆ／Ｒｂ複合体の形成及びｐ５３の発現が亢進し、これにより細胞周期はＧ１期で停止し、細胞増殖が抑制されることが示された。
（４）Ｂ１６変異細胞のＰＡＩ−１プロモーター活性
μＰｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１（ＰＡＩ−１）はＳＭＡＤ転写因子により発現が誘導されることが知られている。そこで、ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞とＭＤＣＫ／Ｃ細胞におけるＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達量を、ＰＡＩ−１のプロモーター活性を測定することにより測定した。ＰＡＩ−１のプロモーター活性は、上記（１）と同様の方法を用いて、ルシフェラーゼ活性をデュアル−ルシフェラーゼ定量システムにより測定した。ＰＡＩ−１のプロモーターを有するベクターの模式図を図７に示す。
その結果、ＰＡＩ−１プロモーター活性は、Ｂ１６細胞と比較して、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞では約４倍に増加し、Ｂ１６／Ｃ細胞では３／４に減少していた（図１１）。
この結果により、ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達は、Ｂ１６細胞に比較して、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞では約４倍亢進し、Ｂ１６／Ｃ細胞では３／４に抑制されていることが示された。
４．ＴＧＦ−β発現量の測定
ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報は細胞外ＴＧＦ−βが細胞表層にあるそのリセプターを介して、細胞内のＳＭＡＤ分子へ伝達される。そして、核内へ移行したＳＭＡＤ分子がＤＮＡと結合し、ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達に対応するタンパク質の転写活性を亢進する。また、ＴＧＦ−β分子自身もＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達により発現誘導されるタンパク質であり、ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達の亢進により、そのタンパク質合成、細胞外放出が亢進する。従って、細胞培養液中のＴＧＦ−β量は、細胞のＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達量に比例する。
そこで、細胞培養液中のＴＧＦ−β発現量を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＴＧＦ−β  ＥＬＩＳＡ測定キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて測定し、分析した。
その結果、Ｂ１６細胞及びＢ１６／ＧＥＦ−１細胞培地では、ＴＧＦ−βのタンパク質量が増加し、Ｂ１６／Ｃ細胞及びＢ１６／ｓｈＲＮＡ細胞培地では、減少していた（図１２）。
したがって、Ｂ１６細胞及びＢ１６／ＧＥＦ−１細胞では、ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達が亢進し、Ｂ１６／Ｃ細胞では、抑制されていたと考えられる。Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞の培地におけるＴＧＦ−β量は、Ｂ１６細胞の培地の約２倍であったことから、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞のＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達量は、Ｂ１６細胞の約２倍に亢進していると考えられた。
５．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟寒天内細胞増殖能の測定
足場非依存性増殖能は癌細胞の特性の一つである。正常（非癌）細胞は足場依存性増殖しかできないため、軟寒天培地中では増殖できない。一方、癌細胞は軟寒天培地中で増殖し、コロニーを形成できる。そこで、各種細胞の軟寒天培地における増殖能を測定した。
アガロース（低ゲル化温度製品）を０．５％（ｗ／ｖ）濃度に溶解させた細胞培養液１．５ｍｌを３５ｍｍシャーレディッシュに加え、冷却し、ゲル化した。その上に、５．０ｘ１０３個の細胞を含む、０．３３％アガロース／細胞培養培地１．５ｍｌを加えた。ゲル化した後、ＣＯ２インキュベーター中で２週間培養した。０．００５％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレット水溶液０．５ｍｌをゲル上に加え、一晩インキュベートし、細胞を染色した。３５ｍｍシャーレディッシュをスキャナーで撮影し、画像解析ソフトを用いて画像からコロニー数を測定した。
その結果、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞の軟寒天培地内増殖能はＢ１６細胞の約２倍に亢進し、Ｂ１６／Ｃ細胞ではＢ１６細胞の５％以下に低下していた（図１３Ａ）。
同様の方法を用いて、マウス肺がん由来ＬＬＣ細胞のＧＥＦ−１／Ｃタンパク質安定発現細胞株（ＬＬＣ／Ｃ細胞）、ヒト膵がん由来細胞株ＰＴ４５細胞のＧＥＦ−１／Ｃ蛋白安定発現細胞株（ＰＴ４５／Ｃ細胞）、及びヒト大腸がん由来細胞株ＣＯＬＯ２０５細胞のＧＥＦ−１／Ｃ蛋白安定発現細胞株（ＣＯＬＯ２０５／Ｃ細胞）の軟寒天培地内増殖能について測定した。
その結果、各種細胞の軟寒天培地内増殖能は、ＬＬＣ／Ｃ細胞では、親ＬＬＣ細胞と比較して２０％以下に低下し（図１３Ｂ）。また、ＰＴ４５／Ｃ細胞では、親ＰＴ４５細胞と比較して５％以下に低下し（図２６）、ＣＯＬＯ２０５／Ｃ細胞では、親ＣＯＬＯ２０５細胞と比較して１％以下に低下していた（図２７）。
次に、ＭＤＣＫ細胞について軟寒天培地内増殖能を測定した。ＭＤＣＫ細胞は、イヌ腎上皮細胞由来細胞であり、癌化しておらず、正常細胞様形態を維持している。したがって、軟寒天培地中で増殖し得ない。しかし、ＭＤＣＫ細胞のＧＥＦ−１タンパク質安定発現細胞株（ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞）は、軟寒天培地内増殖能を獲得していた（図１３Ｃ）。
これらの結果から、ＧＥＦ−１を癌細胞であるＢ１６細胞及びＬＬＣ細胞で発現させると軟寒天培地内増殖能が亢進し、癌細胞ではないＭＤＣＫ細胞で発現させると、本来有さないはずの軟寒天培地内増殖能を獲得することが示された。一方、ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドをＢ１６細胞、ＬＬＣ細胞、ＰＴ４５／Ｃ細胞及びＣＯＬＯ２０５／Ｃ細胞で発現させると、軟寒天培地内における腫瘍増殖能が顕著に低下することが示された。
すなわち、ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドをＢ１６細胞、ＬＬＣ細胞、ＰＴ４５／Ｃ細胞及びＣＯＬＯ２０５／Ｃ細胞で発現させることにより、これらの細胞は癌細胞の特性である足場非依存性増殖能を消失したことが示された。
６．Ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能試験
各種細胞（Ｂ１６細胞、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞、Ｂ１６／Ｃ細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞）を、それぞれＣ５７ＢＬ／６マウス皮下に移植し、１週間ごとに腫瘍体積を測定した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの毛を刈り、各種細胞（２．０ｘ１０６細胞／０．２ｍｌ  ＰＢＳ）を皮下に接種した。１週間毎に腫瘍の長径と短径を測定し、腫瘍体積（＝長径ｘ（短径）２ｘπ／６）を算出した。
その結果、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞では、Ｂ１６細胞と比較して、Ｃ５７ＢＬ／６マウス皮下での腫瘍形成能が約２倍亢進していた。一方、Ｂ１６／Ｃ細胞、Ｂ１６／ｓｈＲＮＡ細胞は共に腫瘍形成能が低下していた（図１４Ａ）。
この結果から、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞は、Ｂ１６細胞と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成能が高いことが示された。一方、Ｂ１６／Ｃ細胞及びＢ１６／ｓｈＲＮＡ細胞は共に腫瘍形成能が抑制されていることが示された。
さらに、ＭＤＣＫ細胞及びＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成能を測定するため、これらの細胞（１．０ｘ１０６細胞／０．２ｍｌ  ＰＢＳ）をヌードマウス皮下に移植した。移植から４週間後に炭酸ガスでマウスを安楽死させた後、腫瘍を摘出し、湿重量を測定した。
その結果、ＭＤＣＫ細胞は癌化しておらず、正常細胞様形態を維持しているため、ヌードマウス皮下で腫瘍は形成しなかった。一方、ＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞はヌードマウス皮下で腫瘍を形成した（図１４Ｂ）。
上記ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成能試験において、Ｂ１６／ＧＥＦ−１細胞及びＭＤＣＫ／ＧＥＦ−１細胞では、腫瘍増殖能の亢進が認められた。また、Ｂ１６／Ｃ細胞やＢ１６／ｓｈＲＮＡ細胞では、腫瘍増殖能の低下が認められた。これらの結果から、細胞内のＧＥＦ−１タンパク質量の増加により腫瘍増殖能が亢進し、逆にＧＥＦ−１タンパク質量を抑制することにより腫瘍増殖能が抑制されることが示された。従って、ＧＥＦ−１の発現及び機能を制御することにより、癌細胞の腫瘍増殖能を制御できることが示された。
また、ＧＥＦ−１のＣ領域ポリペプチドの発現により、Ｂ１６細胞やＬＬＣ細胞の腫瘍増殖能が低下することから、本発明のポリペプチドは腫瘍の増殖を抑制することが示された。
【実施例４】
【０００９】
ＧＥＦ−１関連低分子の作製
上記実施例３の結果から、ＧＥＦ−１の発現量を抑制するか、または、ＧＥＦ−１／Ｃタンパク質を発現させ、ＧＥＦ−１の機能を抑制することにより、腫瘍増殖を抑制できることが明らかとなった。
前述のＢ１６／ｓｈＲＮＡ細胞は、Ｂ１６細胞に干渉誘導ベクターを導入し、ＲＮＡ干渉効果によりＧＥＦ−１発現量を抑制した細胞である。また、Ｂ１６／Ｃ細胞は、Ｂ１６細胞にＧＥＦ−１／Ｃタンパク質発現ベクターを導入し、ＧＥＦ−１／Ｃタンパク質の発現を誘導した細胞である。ＲＮＡ干渉誘導ベクターもＧＥＦ−１／Ｃタンパク質発現ベクターも高分子であることから、人体内の癌細胞への導入は難しく、臨床への応用は容易ではない。
しかし、ＲＮＡ干渉を誘導する低分子のｓｉＲＮＡやＧＥＦ−１／Ｃ領域構成オリゴペプチドであれば、人体内の癌細胞への導入や送達（ＤＤＳ）はより簡要であり、臨床への応用も期待できる。
そこで、ＧＥＦ−１を標的とするＧＥＦ−１関連低分子ｓｉＲＮＡとＧＥＦ−１／Ｃ領域構成オリゴペプチドによる腫瘍増殖抑制法を検討した。
１．ｓｉＲＮＡ
ＧＥＦ−１を標的とするｓｉＲＮＡ（ＧＥＦ−１−ｓｉＲＮＡ）として、マウスＨｇｓ（ＮＭ＿００８２４４）に対するｓｉＲＮＡ（ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ）の合成をインビトロジェン社に依頼した。６種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃１〜６）及びｓｉＲＮＡ＃３−ｓｃｒａｍｂｌｅの塩基配列を以下に示す。なお、ｓｉＲＮＡ＃３−ｓｃｒａｍｂｌｅは、ｓｉＲＮＡ＃３のスクランブルｓｉＲＮＡを意味し、ｓｉＲＮＡ＃３とは塩基配列は異なるが、塩基の構成比が等しく、使用する細胞又は個体に相同な配列が存在しないＲＮＡ二量体である。ｓｉＲＮＡ＃３−ｓｃｒａｍｂｌｅは、ｓｉＲＮＡ＃３の対照として用いた。
ｓｉＲＮＡ  ＃１
ＮＭ＿００８２４４＿ｓｔｅａｌｔｈ＿１０６４
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ｓｉＲＮＡ  ＃２
ＮＭ＿００８２４４＿ｓｔｅａｌｔｈ＿６７７
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ｓｉＲＮＡ  ＃３
ＮＭ＿００８２４４＿ｓｔｅａｌｔｈ＿９９
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ｓｉＲＮＡ  ＃３  ｓｃｒａｍｂｌｅ
ＮＭ＿００８２４４＿ｓｔｅａｌｔｈ＿ｓｃｒａｍｂｌｅ＿９９
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ｓｉＲＮＡ  ＃４
ＮＭ＿００８２４４＿ｓｔｅａｌｔｈ＿７４
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ｓｉＲＮＡ  ＃５
ＮＭ＿００８２４４＿ｓｔｅａｌｔｈ＿２５５
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ｓｉＲＮＡ  ＃６
ＮＭ＿００８２４４＿ｓｔｅａｌｔｈ＿１０２６
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２．ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチド
本実施例に用いるＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドは、林化成株式会社に合成を依頼した。
ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの模式図を図１７に示す。また、合成したオリゴペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。以下に示す合成オリゴペプチドのうち、ｒ９−ＯＰ１０−１１は、ＯＰ１０−１１に細胞膜透過性ペプチド（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＧＰＧ（ＲはＤ体アルギニンを示す）（配列番号６６））を結合したペプチドである。また、以下のＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドはマウス由来のものであるが、ヒト由来のオリゴペプチドとはＯＰ２０−２のＮ末端から１６番目（ＯＰ−２０−３及びＯＰ１０−３のＮ末端から６番目）のＴ（ヒトではＧ）が相違するのみであり、他はマウスとヒトとで共通する。
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【実施例５】
【００１０】
ＧＥＦ−１関連低分子による血管新生と腫瘍増殖の抑制
１．ｓｉＲＮＡによる血管新生及び腫瘍増殖の抑制
（１）ｓｉＲＮＡによる血管新生抑制の検討
ＧＥＦ−１−ｓｉＲＮＡによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生抑制効果を確かめるために、血管内皮ＫＯＰ２．１６細胞を用いた管腔形成阻害試験を行った。
ｓｉＲＮＡ（４０ｎｍｏｌ）とリポフェクトアミン２０００  １０μｌを混合した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地で１．０ｍｌに希釈し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地で洗浄した３５ｍｍシャーレディッシュのＫＯＰ２．１６細胞に添加した。４時間後に２０％ＦＢＳ含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地１．０ｍｌをディッシュに加えた。４８時間後に、ｓｉＲＮＡ導入細胞を回収し、細胞数を計測した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地に懸濁して、マトリジェル上に再播種した。１８〜４８時間後に細胞の管腔形成を観察した。陰性対照としては、ＰＢＳ（図１５中「Ｎｏｎｅ」）及びＳｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＧＣ  Ｄｕｐｌｅｘ（インビトロジェン社）（図１５中「ｓｉＲＮＡ−ＭＮＣ」）を用いた。
その結果、６種類のｓｉＲＮＡうちｓｉＲＮＡ＃２とｓｉＲＮＡ＃３には顕著な管腔形成阻害効果が認められた（図１５）。
この結果から、上記ｓｉＲＮＡは、ＧＥＦ−１の発現を抑制することにより、血管新生抑制効果を示すことが明らかとなった。
（２）ｓｉＲＮＡによる腫瘍増殖抑制の検討
さらに、上記（１）で管腔形成阻害効果の最も高かったｓｉＲＮＡ＃３の腫瘍増殖抑制効果を調べた。
Ｂ１６細胞をヌードマウス皮下に接種し、約一週間後に腫瘍が直径約５ｍｍ（約１００ｍ３）に達したところで、ｓｉＲＮＡ＃３／アテロコラーゲン混合液（０．２ｍｌ）を腫瘍近傍に注入した。その後、一週間おきに更に２度ｓｉＲＮＡ＃３／アテロコラーゲン混合液を腫瘍近傍に注入した。
その結果、ｓｉＲＮＡ＃３は、ＰＢＳやｓｉＲＮＡ＃３のスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＃３−ｓｃｒａｍｂｌｅ）を投与した場合と比較して、腫瘍体積及び腫瘍重量を５０％又はそれ以下に抑制することができた（図１６）。
この結果から、上記ｓｉＲＮＡは、ＧＥＦ−１の発現を抑制することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。
２．ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドによる血管新生及び腫瘍増殖の抑制
（１）ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドのＳＭＡＤ転写活性への影響
まず、ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達におけるＳＭＡＤ転写活性に対するＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの影響を検討した。ＴＧＦ−β−ＳＭＡＤ情報伝達経路は、血管新生と癌細胞転移に大きく関与している。
ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチド２．５ｎｍｏｌとペプチド・トランスポーターＷｒ−Ｔ  ０．２ｎｍｏｌを混合した後、ＰＢＳで０．１ｍｌに希釈し、ＳＭＡＤ転写活性試験用ＤＮＡ溶液０．１ｍｌと混合した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地で洗浄した４８ウエルプレートの１ウエルの各種細胞（Ｂ１６細胞及びＣＯＬＯ２０５細胞）に混合液０．２ｍｌを添加した。４時間後に２０％ＦＢＳ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地０．２ｍｌを各ウエルに加えた。４８時間後に各種細胞を溶解させ、溶解液中のルシフェラーゼ活性を測定した。
その結果、Ｂ１６細胞において、ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドＯＰ１０−７、ＯＰ１０−１１及びＯＰ１０−１２は、ＳＭＡＤ転写活性を約５０％阻害した（図１８Ａ）。
また、ヒト大腸がんＣＯＬＯ２０５細胞において、ＯＰ１０−６〜ＯＰ１０−１２はＳＭＡＤ転写活性を約３５％から７０％阻害した（図１８Ｂ）。
（２）ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドによる血管新生抑制の検討
ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける血管新生に対する抑制効果を確かめるために、血管内皮ＫＯＰ２．１６細胞を用いた管腔形成阻害試験を行った。
ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチド２．５ｎｍｏｌとペプチド・トランスポーターＷｒ−Ｔ  ０．２ｎｍｏｌを混合した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地で０．１ｍｌに希釈し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地で洗浄した４８ウエルプレートの１ウエルのＫＯＰ２．１６細胞に添加した。２時間後に１０％ＦＢＳ含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地０．４ｍｌを各ウエルに加えた。４８時間後に、ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチド導入細胞を回収し、細胞数を計測したのち、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地に懸濁した。この細胞をマトリジェル上に播種した。
その結果、ＯＰ１０−１０〜ＯＰ１０−１２は管腔形成を約５０％阻害した（図１９）。
この結果から、上記ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドは血管新生抑制効果を示すことが明らかとなった。
（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの腫瘍増殖抑制効果の検討
各種腫瘍細胞（Ｂ１６細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＬＯ２０５細胞、ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞、Ａ５４９細胞及びＰＴ４５細胞）の軟寒天培地内増殖に対するＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの抑制効果を検討した。
上記（２）と同様の方法により、ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドを各種腫瘍細胞に導入し、これらの細胞を０．３３％軟寒天培地と共に播種した。
その結果を以下、各種細胞ごとに示す。
ａ）マウスメラノーマＢ１６細胞
ＯＰ１０−６〜ＯＰ１０−１２は、Ｂ１６細胞の軟寒天培地内増殖能を約３０％以上抑制した。特にＯＰ１０−１１は約６０％抑制した（図２０Ａ）。
ｂ）ヒト子宮頸がん由来ＨｅＬａ細胞
ＯＰ１０−１１は、ＨｅＬａ細胞の軟寒天培地内増殖能を約２０％抑制した（図２０Ｂ）。
ｃ）ヒト大腸がん由来ＣＯＬＯ２０５細胞
ＯＰ１０−１０、ＯＰ１０−１１は、ＣＯＬＯ２０５細胞の軟寒天培地内増殖能を約５０％抑制した（図２０Ｃ）。
ｄ）ヒト胃がん由来ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞
ＯＰ１０−１０、ＯＰ１０−１１は、ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞の軟寒天培地内増殖能を約５０％から７０％抑制した（図２０Ｄ）。
ｅ）ヒト肺がん由来Ａ５４９細胞
ＯＰ１０−７、ＯＰ１０−１１、ＯＰ１０−１２は、Ａ５４９細胞の軟寒天培地内増殖能を約４０％から５０％抑制した（図２１Ａ）。
ｆ）ヒト膵がん由来ＰＴ４５細胞
ＯＰ１０−７、ＯＰ１０−１１、ＯＰ１０−１２は、ＰＴ４５細胞の軟寒天培地内増殖能を約３０％から６０％抑制した（図２１Ｂ）。
（４）ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの腫瘍増殖抑制効果の検討
次に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドの腫瘍増殖抑制効果を検討した。
ＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチド２５ｎｍｏｌとペプチド・トランスポーターＷｒ−Ｔ  ２ｎｍｏｌとを混合した後、ＰＢＳで０．１ｍｌに希釈した。ここに、各種細胞の５．０ｘ１０６／ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地溶液０．１ｍｌを加え、混合した。この細胞混合液をＣＯ２インキュベーターで３７℃、２時間インキュベートした後に、ヌードマウス皮下に接種した。一週間毎に腫瘍の長径と短径を測定し、腫瘍体積（＝長径ｘ（短径）２ｘπ／６）を算出した。最終的に炭酸ガスで安楽死させた後、マウスの腫瘍写真を撮影した。その後、腫瘍を摘出し、湿重量を測定した。
その結果を以下、各種腫瘍細胞ごとに示す。ＯＰ１０−１１は、上記の試験において管腔形成阻害効果や軟寒天培地内増殖能抑制効果が最も高かったことから、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験にも用いた。なお、図２３及び２４中の＃８〜１２は、それぞれＯＰ１０−８〜ＯＰ１０−１２を表す。
ａ）マウスメラノーマＢ１６細胞
ＯＰ１０−１１は、Ｂ１６細胞の腫瘍増殖を５０％以上抑制した（図２２）。
ｂ）ヒト大腸がん由来ＣＯＬＯ２０５細胞
ＯＰ１０−９及びＯＰ１０−１１は、ＣＯＬＯ２０５細胞の腫瘍増殖を約７０％以上抑制した（図２３）。
ｃ）ヒト肺がん由来Ａ５４９細胞
ＯＰ１０−９、Ｏｐ１０−１１及びＯＰ１０−１２は、Ａ５４９細胞の腫瘍増殖を腫瘍体積で約５０％から８０％、腫瘍重量で約３５％から７０％抑制した（図２４）。
また、ｒ９−ＯＰ１０−１１オリゴペプチドについて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖抑制効果を検討した。
１．０ｘ１０６のＣＯＬＯ２０５細胞をヌードマウス皮下に接種し、ＣＯＬＯ２０５細胞の腫瘍を作製した。接種１０日後、直径５〜６ｍｍ（約１００ｍｍ３）となった腫瘍の周りにｒ９−ＯＰ１０−１１（３５ｎｍｏｌ）／ＰＢＳ溶液０．１ｍｌを投与した。この投与から、７日、１４日、２１日後に同様の投与を行った。腫瘍の長径と短径を測定し、腫瘍体積（＝長径ｘ（短径）２ｘπ／６）を算出した。最終的に炭酸ガスで安楽死させた後、マウスの腫瘍写真を撮影した。その後、腫瘍を摘出し、湿重量を測定した。
その結果、ｒ９−ＯＰ１０−１１は、ヌードマウス皮下において既に形成されているヒト大腸がん由来ＣＯＬＯ２０５細胞腫瘍の増殖を腫瘍体積で約６５％、腫瘍重量で約６０％抑制した（図２８）。
この結果から、ｒ９−ＯＰ１０−１１オリゴペプチドはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。
以上より、本発明のｓｉＲＮＡはＧＥＦ−１発現を抑制することにより、またＧＥＦ−１／Ｃ構成オリゴペプチドはＧＥＦ−１機能を阻害することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍増殖を抑制できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明は、血管新生抑制作用及び／又は腫瘍増殖抑制作用を有する抗腫瘍剤として用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００１２】
配列番号１３〜４３：合成ヌクレオチド
配列番号４４〜６７：合成ペプチド
［配列表］
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図２５】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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