(57)【要約】  タンパク質の動的結合容量が高く、圧力特性に優れた多孔質粒子を含む、タンパク質精製に有用なアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を提供する。本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体、あるいは水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体、を含むビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子、前記多孔質粒子に結合したリガンド、ならびに開環エポキシ基を有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体、あるいは水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体、を含むビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子、
前記多孔質粒子に結合したリガンド、ならびに
開環エポキシ基を有することを特徴とする、
アフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
前記リガンドが、プロテインＡ、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン、または、その変異体を少なくとも１個含むタンパク質である、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
前記ビニル単量体が、
（Ｘ−１）水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体２０〜９０質量部、
（Ｘ−２）水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体０〜４０質量部、
（Ｍ−１）エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体１〜４０質量部、および
（Ｍ−２）エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体０〜７０質量部
から構成される（但し、（Ｘ−１）、（Ｘ−２）、（Ｍ−１）および（Ｍ−２）の合計は１００質量部である。）、請求項１または２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項４】
前記開環エポキシ基は、前記重合体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる、請求項１〜３のいずれか１つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項５】
前記多孔質粒子が、
前記ビニル単量体１００質量部と、
（Ｐ−１）炭素数７〜１４である直鎖状、分岐鎖状および環状のアルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、エステル、炭素数８〜１０のアルキルベンゼンから選ばれる少なくとも１つのポロジェン（但し、ポロジェンの合計量は１００〜４００質量部であり、（Ｐ−１）はポロジェンの合計量１００質量％中に１０質量％以上である。）を必須成分とする水系混合物と、
を懸濁重合して得られる、請求項１〜４のいずれか１つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
水銀ポロシメータで孔径１０〜５０００ｎｍの範囲に相当する細孔を測定したときの前記多孔質粒子の細孔容積が１．００〜１．９０ｍｌ／ｇである、請求項１〜５のいずれか１つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
前記多孔質粒子の粒子径が３５〜１００μｍである、請求項１〜６のいずれか１つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を用いて、前記充填剤にイムノグロブリンを吸着させる工程、および
前記イムノグロブリンを溶出させる工程
を含む、イムノグロブリンを単離する方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤が充填された、アフィニティークロマトグラフィー用充填カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤に関する。特に、タンパク質の動的結合容量が高く、しかも圧力特性に優れた多孔質粒子を含む、タンパク質精製に有用なアフィニティークロマトグラフィー用充填剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフィニティークロマトグラフィーは、モノクローナル抗体を含めたタンパク質の研究、開発および製造において重要な役割を担っている。アフィニティークロマトグラフィー用充填剤は一般的に、標的分子と選択的に結合するリガンドを有する固相担体を含む。アフィニティークロマトグラフィーは、固相担体上のリガンドが標的分子に対して高い選択性を有するために、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィーに比べて、優れた収率および高速で経済的な精製が可能となる。【０００３】
アフィニティークロマトグラフィー用充填剤の固相担体は、主としてアガロース粒子が使用されている（特許文献１、２）。アガロース粒子は、その高い親水性のため、リガンドの活性が高く、標的分子に対する動的結合容量が高い。【０００４】
他のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤の固相担体としては、スチレン−ジビニルベンゼンの重合体からなる多孔質粒子が使用される場合がある（特許文献３、４）。スチレン−ジビニルベンゼンのようなビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子は、一般に弾性率が高く、圧力特性に優れる。【０００５】
また、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤における高い動的結合容量と圧力特性の両立のために、ビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子の細孔にアガロースのような糖鎖を結合した粒子も提案されている（特許文献５）。【０００６】
一方、水酸基含有架橋性ビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子をクロマトグラフィーに用いる例はあったものの、これらはいずれも分析を目的としたゲル濾過クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーのみに適合するものである（特許文献６〜８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００８−５２３１４０号公報
【特許文献２】特表２００９−５２２５８０号公報
【特許文献３】特開平８−２７８２９９号公報
【特許文献４】特表平１０−５０１１７３号公報
【特許文献５】特開２００８−２３２７６４号公報
【特許文献６】特開２００２−２３９３８０号公報
【特許文献７】特開２００３−１７６３６３号公報
【特許文献８】特開２０００−１８７０２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、アガロース粒子は、一般に弾性率が低いため、高速で媒体を流したときにカラムの圧力が高くなるという欠点を有しており、圧力特性に劣る。また、アガロース粒子は、一般に、天然の海草から長く複雑な工程を経て製造されるために、一定の品質のものを得るのが困難であるという欠点がある。一方、スチレン−ジビニルベンゼンのようなビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子は、親水性が低いために、リガンドの活性が低く、標的分子に対する動的結合容量が低いという欠点を有する。また、ビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子の細孔にアガロースのような糖鎖を結合した粒子は、アガロース粒子同様、長く複雑な工程を経て製造されるために、アフィニティークロマトグラフィーとして使用できるような品質のものは高価であったり、一定の品質のものが得られにくいという欠点を有する。さらに、従来のようなゲル濾過クロマトグラフィーや逆相液体クロマトグラフィーに用いられていた水酸基含有架橋性ビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子は、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤としての高い動的結合容量と圧力特性の両立を達成できるものではない。【０００９】
そこで、本発明は、タンパク質の動的結合容量が高く、圧力特性にも優れる、タンパク質精製に有用なアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、
水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体、あるいは水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体、を含むビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子、
前記多孔質粒子に結合したリガンド、ならびに
開環エポキシ基を有することを特徴とする。【００１１】
上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、前記リガンドが、プロテインＡ、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン、または、その変異体を少なくとも１個含むタンパク質であることができる。【００１２】
上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、前記ビニル単量体が、
（Ｘ−１）水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体２０〜９０質量部、
（Ｘ−２）水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体０〜４０質量部、
（Ｍ−１）エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体１〜４０質量部、および
（Ｍ−２）エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体０〜７０質量部
から構成される（但し、（Ｘ−１）、（Ｘ−２）、（Ｍ−１）および（Ｍ−２）の合計は１００質量部である。）ことができる。【００１３】
上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、前記開環エポキシ基は、前記重合体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得ることができる。【００１４】
上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、前記多孔質粒子が、
前記ビニル単量体１００質量部と、
（Ｐ−１）炭素数７〜１４である直鎖状、分岐鎖状および環状のアルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、エステル、炭素数８〜１０のアルキルベンゼンから選ばれる少なくとも１つのポロジェン（但し、ポロジェンの合計量は１００〜４００質量部であり、（Ｐ−１）はポロジェンの合計量１００質量％中に１０質量％以上である。）を必須成分とする水系混合物と、
を懸濁重合して得ることができる。【００１５】
上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、水銀ポロシメータで孔径１０〜５０００ｎｍの範囲に相当する細孔を測定したときの前記多孔質粒子の細孔容積が１．００〜１．９０ｍｌ／ｇであってもよい。【００１６】
上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、前記多孔質粒子の粒子径が３５〜１００μｍであってもよい。【００１７】
本発明の別の一態様に係るイムノグロブリンを単離する方法は、
上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を用いて、前記充填剤にイムノグロブリンを吸着させる工程、および
前記イムノグロブリンを溶出させる工程
を含む。【００１８】
本発明の別の一態様に係るカラムは、上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤が充填されたアフィニティークロマトグラフィー用充填カラムである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤によれば、タンパク質の動的結合容量が高く、しかも圧力特性に優れた、タンパク質精製に有用なアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の実施例１で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰ４Ｚ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、発現ベクター（ｐＥＴＭ−１１）に挿入された、本発明の実施例１に係るイムノグロブリン結合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントの構成を説明する図である。
【図３】図３は、本発明の実施例２で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＴＫ）のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】図４は、発現ベクター（ｐＥＴＭ−１１）に挿入された、本発明の実施例２に係るイムノグロブリン結合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントの構成を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤について、具体的に説明する。
【００２２】
１．アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体、あるいは水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体、を含むビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子、
前記多孔質粒子に結合したリガンド、ならびに
開環エポキシ基を有する。
【００２３】
１．１．多孔質粒子の構成
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する多孔質粒子は、水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体を必須成分とするビニル単量体の共重合体、あるいは水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体のみを必須成分とするビニル単量体の単独重合体からなる担体粒子である。該重合体にはエポキシ基が含まれることから、該重合体からなるリガンド結合前における多孔質粒子はエポキシ基を含む。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量は、０．０５〜４．０ｍｍｏｌ／ｇである。
【００２４】
１．１．１．水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体
水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体は、１分子中に、２個以上の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）と、１個以上の水酸基とを有し、かつエポキシ基を有さない架橋性の単量体である。水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体を用いて、多孔質粒子を親水化し、適切な弾性率に制御することにより、タンパク質の動的結合容量が高く、しかも圧力特性に優れたアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を得ることが出来る。
【００２５】
水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体としては、好ましくは脂肪族ポリビニル単量体であり、さらに好ましくは多価アルコールの（メタ）アクリレートである。水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体としては、具体的には、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。その他、各種糖類の２置換以上の（メタ）アクリレート、例えば、グルコースジ（メタ）アクリレート、グルコーストリ（メタ）アクリレート、グルコーステトラ（メタ）アクリレート、マンニトールジ（メタ）アクリレート、マンニトールトリ（メタ）アクリレート、マンニトールテトラ（メタ）アクリレート、マンニトールペンタ（メタ）アクリレートなども挙げられる。さらに、ジアミノプロパノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グルコサミンなどの多価アミノアルコールと（メタ）アクリル酸との脱水縮合反応物と同様の構造を有する水酸基含有架橋性ビニル単量体なども挙げられる。水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体として、特に好ましくは、グリセリンジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレートであり、最も好ましくは、グリセリンジ（メタ）アクリレートである。耐アルカリ性を考慮すると、メタクリレート類、アクリルアミド類、メタクリルアミド類が好ましい。耐アルカリ性を考慮した場合、特に好ましい水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体は、グリセリンジメタクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、イノシトールトリメタクリレートであり、最も好ましくは、グリセリンジメタクリレートである。
【００２６】
１．１．２．エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体
エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体は、１分子中に、１個の重合性ビニル基と、１個以上のエポキシ基とを有する非架橋性の単量体である。エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体が有するエポキシ基の数は、１分子中に１〜３個が好ましく、１個がより好ましい。エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体は、水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体を含むビニル単量体の共重合体から得られる多孔質粒子のリガンド結合前に、適切な量のエポキシ基を導入するための必須成分である。
【００２７】
エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体としては、１分子中に、１個の重合性ビニル基と、１個のエポキシ基とを有する非架橋性の単量体が工業的に容易に入手できる。このようなエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体としては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール等の（メタ）アクリル酸エステル類；ビニルベンジルグリシジルエーテル等の芳香族ビニル化合物；アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等が挙げられ、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテルが特に好ましい。
【００２８】
そのほか、ビニル単量体として、水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体のかわりに、水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体を単独で使用できる。水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体としては、例えば、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、イノシトールジ（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、イノシトールトリ（メタ）アクリレートグリシジルエーテルなどを例示できる。なお、水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体を、上記水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体とともに用いてもよい。
【００２９】
１．１．３．好ましいビニル単量体
ビニル単量体は、
（Ｘ−１）水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体２０〜９０質量部、
（Ｘ−２）水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体０〜４０質量部、
（Ｍ−１）エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体１〜４０質量部、および
（Ｍ−２）エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体０〜７０質量部
から構成される（但し、（Ｘ−１）、（Ｘ−２）、（Ｍ−１）および（Ｍ−２）の合計は１００質量部）であることが好ましい。
【００３０】
（Ｘ−１）水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体の具体例、好適な例は、上記１．１．１．水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体で、述べたとおりである。（Ｘ−１）は、好ましくは２０〜９０質量部、より好ましくは２５〜８５質量部、最も好ましくは３０〜８０質量部である。（Ｘ−１）水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体が２０質量部以上９０質量部以下であると、タンパク質の動的結合容量に優れる。
【００３１】
（Ｘ−２）水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体は、１分子中に、２個以上の重合性ビニル基を有し、水酸基もエポキシ基も有さない架橋性の単量体である。（Ｘ−２）水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体は、（Ｘ−１）水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体を補って使用し、適切な弾性率に制御することにより、圧力特性を向上することが出来る場合がある。（Ｘ−２）水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体としては、芳香族ポリビニル単量体、脂肪族ポリビニル単量体が好適であり、芳香族ポリビニル単量体としては、ジビニルベンゼンが好ましく、脂肪族ポリビニル単量体としては多価（メタ）アクリレート化合物が好ましい。多価（メタ）アクリレート化合物としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレートなどが挙げられ、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレートが特に好ましい。（Ｘ−２）水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体は、好ましくは０〜４０質量部であり、より好ましくは０〜２０質量部である。（Ｘ−２）が４０質量部を超えると、タンパク質の動的結合量が低くなる場合がある。
【００３２】
（Ｘ−１）水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体と（Ｘ−２）水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体とは、混合物として工業的に供給されることがあり、本発明の範囲内で、これらをそのまま使用することもできる。
【００３３】
（Ｍ−１）エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体の具体例、好適な例は、上記１．１．２．エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体で、述べたとおりである。（Ｍ−１）エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体は、好ましくは１〜４０質量部、より好ましくは２〜３０質量部、最も好ましくは３〜１５質量部である。（Ｍ−１）エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体が１質量部以上４０質量部以下であると、得られる重合体からなる多孔質粒子に含まれるエポキシ基含有量が適切な量となる。
【００３４】
（Ｍ−２）エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体としては、親水性ビニル単量体が好ましく、水酸基含有非架橋性ビニル単量体がさらに好ましい。（Ｍ−２）エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体として、親水性モノマーを用いた場合には、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤の親水性を補い、高い標的分子の動的結合容量を発現できることがある。親水性ビニル単量体のうち、水酸基非含有非架橋性の親水性ビニル単量体としては、例えば、ジメチルアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ダイアセトン（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドンなどが挙げられる。水酸基含有非架橋性ビニル単量体としては、例えば、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドなどが挙げられ、グリセロールモノメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール（メタ）アクリルエステルが好ましく、グリセロールモノメタクリレートが最も好ましい。（Ｍ−２）エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体は、好ましくは０〜７０質量部であり、より好ましくは０質量部を超え４０質量部以下である。（Ｍ−２）が７０質量部を超えると、圧力特性に劣る場合がある。
【００３５】
好ましいビニル単量体における好適な量比の具体例としては、
（Ｘ−１）水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体２５〜８５質量部、
（Ｘ−２）水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体０〜２０質量部、
（Ｍ−１）エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体２〜３０質量部、および
（Ｍ−２）エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体０〜７０質量部
から構成されるビニル単量体、
又は、
（Ｘ−１）水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体３０〜８０質量部、
（Ｘ−２）水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体０〜２０質量部、
（Ｍ−１）エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体３〜１５質量部、および
（Ｍ−２）エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体０質量部を超え４０質量部以下
から構成されるビニル単量体が挙げられる。但し、いずれのビニル単量体の具体例においても、（Ｘ−１）、（Ｘ−２）、（Ｍ−１）および（Ｍ−２）の合計は１００質量部である。
【００３６】
１．１．４．多孔質粒子の製造
多孔質粒子は、公知のシード重合、懸濁重合などにより製造することができる。シード重合法として、特公昭５７−２４３６９号公報記載の二段膨潤重合法も好適に用いられる。重合に際しては、上記単量体の他、水、ポロジェンを必須成分とし、重合開始剤、高分子分散剤、界面活性剤、塩、シード粒子、水溶性重合禁止剤などを必要に応じて使用する。
【００３７】
多孔質粒子の製造における好ましい重合法は、
上述のビニル単量体１００質量部と、
（Ｐ−１）炭素数７〜１４である直鎖状、分岐鎖状および環状のアルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、エステル、炭素数８〜１０のアルキルベンゼンから選ばれる少なくとも１つのポロジェンと、を必須成分とする水系混合物の懸濁重合法である。
【００３８】
このとき、さらに（Ｐ−２）として（Ｐ−１）以外のポロジェンを併用してもよい。ポロジェンの使用量は、好ましくはモノマー１００質量部に対して合計で１００〜４００質量部である。（Ｐ−１）の使用量は、ポロジェンの合計量１００質量％中に１０質量％以上であることが好ましい。
【００３９】
（Ｐ−１）のポロジェンを具体的に例示すると、
アルコールとして、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、４−ヘプタノール、２，４−ジメチル−３−ペンタノール、５−メチル−２−ヘキサノール、２−エチル−１−ヘキサノール、２−オクタノール、３−オクタノール、５−メチル−３−ヘプタノール、１−ノナノール、３，５，５−トリメチルヘキサノール；
エーテルとして、ヘキシルメチルエーテル、ジブチルエーテル、シネオール；
アルデヒドとして、ヘプタナール、オクタナール、２−エチル−１−ヘキサナール、ノナナール、３，５，５−トリメチルヘキサナール、１−デカナール、ドデカナール；
ケトンとして、２−ヘプタノン、３−ヘプタノン、４−ヘプタノン、２，４−ジメチル−３−ペンタノン、４，４−ジメチル−２−ペンタノン、５−メチル−２−ヘキサノン、２−オクタノン、３−オクタノン、５−メチル−３−ヘプタノン、２，６−ジメチル−４−ヘプタノン、２−ノナノン、３−ノナノン、４−ノナノン、３，３，５−トリメチルシクロヘキサノン、２−デカノン、３−デカノン、２−ウンデカノン、４−ｔ−ペンチルシクロヘキサノン、２−ヘキシルシクロペンタノン、２−ヘプチルシクロペンタノン、ジシクロヘキシルケトン；
エステルとして、蟻酸ヘキシル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソブチル、酪酸プロピル、酪酸イソプロピル、イソ酪酸プロピル、イソ酪酸イソプロピル、吉草酸エチル、イソ吉草酸エチル、ピバル酸エチル、ヘキサン酸メチル、酢酸ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸−２−エチルブチル、プロピオン酸イソペンチル、酪酸ブチル、イソ酪酸ブチル、酪酸イソブチル、イソ酪酸イソブチル、吉草酸プロピル、イソ吉草酸プロピル、ヘキサン酸エチル、ヘプタン酸メチル、酢酸ヘプチル、プロピオン酸ヘキシル、酪酸ペンチル、酪酸イソペンチル、イソ酪酸ペンチル、イソ酪酸イソペンチル、吉草酸イソブチル、ヘキサン酸プロピル、ヘキサン酸イソプロピル、ヘプタン酸エチル、オクタン酸メチル、酢酸オクチル、酢酸イソオクチル、酢酸−２−エチルヘキシル、酪酸ヘキシル、酪酸シクロヘキシル、吉草酸ペンチル、イソ吉草酸イソペンチル、ヘキサン酸ブチル、ヘキサン酸イソブチル、オクタン酸エチル、ノナン酸メチル、酢酸ノニル、ヘキサン酸ペンチル、ノナン酸エチル、２−エチルヘキサン酸プロピル、３，５，５−トリメチルヘキサン酸エチル、デカン酸メチル、δ−ドデカノラクトン、酢酸デシル、デカン酸エチル、酢酸シトロネリル、ドデカン酸メチル、酢酸ドデシル、ドデカン酸エチル；
アルキルベンゼンとして、キシレン、エチルベンゼン、クメン、ｎ−プロピルベンゼン、ｎ−ブチルベンゼン、ｔ−ブチルベンゼン、ｓｅｃ−ブチルベンゼン、ｉｓｏ−ブチルベンゼン、エチルトルエン、シメン、メシチレンなどが挙げられる。
【００４０】
（Ｐ−１）のポロジェンとしては、親水性を阻害せず、リガンドの活性を高く維持できることから、アルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、エステルが好ましく、ケトン、エステルがさらに好ましく、炭素数７〜１０のケトン、エステルが最も好ましい。
【００４１】
（Ｐ−２）は（Ｐ−１）以外のポロジェンであり、多孔質粒子の細孔容積を調整するために加えても良い成分である。２０℃における（Ｐ−２）の水への溶解度は２０％以下であることが好ましい。
【００４２】
ポロジェンの構成として、（Ｐ−２）のポロジェン、すなわち炭素数７未満の直鎖および分岐のアルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、エステル、炭素数８未満のアルキルベンゼンを主成分とすると、タンパク質分離などに適した大きな細孔径とはならず、また、細孔容積が小さくなる場合がある。また、炭素数１４を超えるアルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、エステル、または、炭素数１０を超えるアルキルベンゼンを主成分とすると、細孔容積が小さくなるか、あるいは、多孔質でない微小な粒子が形成される場合がある。
【００４３】
（Ｐ−１）を含むポロジェンの合計量は、上記単量体全量１００質量部に対し、通常１００〜４００質量部であり、好ましくは１５０〜３００質量部である。ポロジェンの合計量が１００質量部未満であると、タンパク質分離などに適した大きな細孔径とはならず、また、細孔容積が小さくなる。ポロジェンの合計量が４００質量部を超えると、細孔容積が過大になるか、あるいは、多孔質でない微小な粒子が形成される。
【００４４】
（Ｐ−１）はポロジェンの合計量に対して１０質量％以上であることが好ましく、２０質量％以上であることが好ましい。（Ｐ−１）がポロジェンの合計量中に１０質量％以下であると、細孔容積が小さくなることがある。
【００４５】
懸濁重合における重合溶媒は、水である。水には、本発明の効果を損なわない範囲で、アルコール等の有機溶媒等が含まれていてもよい。水の量は、単量体全量１００質量部に対し、好ましくは２００〜１００００質量部、より好ましくは５００〜５０００質量部である。水の量が上記の範囲内であると重合中の粒子同士の合一が抑制され、粒子径の制御が容易であり、生産性に優れる。
【００４６】
重合開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩、過酸化水素、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシマレイン酸、コハク酸パーオキサイド、２，２’−アゾビス〔２−Ｎ−ベンジルアミジノ〕プロパン塩酸塩などの水溶性開始剤；ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、クメンハイドロパーオキサイド、ジイソプロピルパーオキシジカーボネート、クミルパーオキシネオデカノエート、クミルパーオキシオクタノエート、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソバレロニトリルなどの油溶性開始剤；有機パーオキサイドと亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、アスコルビン酸ナトリウムなどの還元剤を併用したレドックス系開始剤などが使用でき、好ましくは油溶性開始剤または油溶性のレドックス開始剤であり、生産性の点からより好ましくは油溶性開始剤である。開始剤の量は、単量体全量１００質量部に対し、好ましくは０．０１〜１０質量部、より好ましくは０．０５〜５質量部である。これら重合開始剤は、水、単量体混合物あるいはポロジェンに溶解して重合系に供してもよいし、室温および加熱中の重合系に単独で添加してもよい。過硫酸塩など、重合中に酸性または塩基性を示す開始剤を使用し、かつ、エポキシ基の加水分解を防止する必要がある場合は、ｐＨを中性付近に維持する緩衝溶液中で懸濁重合することが好ましい。紫外線、電子線などを照射することにより開始剤を使用せずに懸濁重合することも可能であり、公知の光ラジカル開始剤を使用することも可能である。
【００４７】
高分子分散剤としては、ケン化度８０〜９５％のポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性ポリマーを使用することができる。
【００４８】
界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテル硫酸エステル塩などのアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテルなどの非イオン性界面活性剤などを使用することができる。
【００４９】
塩としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウムなどが好適に使用できる。
【００５０】
シード粒子としては、重量平均分子量１，０００〜１００，０００程度のポリスチレン粒子、ポリアルキル（メタ）アクリレート粒子などを使用することができる。
【００５１】
水溶性重合禁止剤としては、ヨウ化カリウムなどのヨウ化物塩、亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩、チオ硫酸ナトリウムなどのチオ硫酸塩、スルホン化ナフトヒドロキノンアンモニウム塩などの水溶性キノン化合物などが好適に使用できる。
【００５２】
シード重合では、シード粒子の大きさと量、単量体の量、ポロジェンの量を調整することにより、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤として必要な粒子径を有する多孔質粒子を得ることができる。懸濁重合では、高分子分散剤および界面活性剤の種類と量、攪拌速度、攪拌翼および重合容器の形状と大きさを調整することにより、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤として必要な粒子径を有する多孔質粒子を得ることができる。
【００５３】
多孔質粒子の細孔容積は、単量体とポロジェンとの比を変えることで調節することが公知である。他に、重合時に使用する塩や重合禁止剤の種類と量、重合温度などによっても多孔質粒子の細孔容積を調節することができる。アフィニティークロマトグラフィー用充填剤としての多孔質粒子の細孔容積は、リガンド結合前の多孔質粒子の細孔容積と、結合するリガンドの量によって調節することができる。
【００５４】
重合の温度および時間は、レドックス系開始剤以外の開始剤を使用する場合、好ましくは４０〜１００℃で３０分〜２４時間、より好ましくは６０〜９０℃で１〜１０時間である。
【００５５】
重合完結後、シード粒子および／またはポロジェンの良溶媒を用いて洗浄することが、後述のリガンドの結合が容易となる点から、好ましい。洗浄溶媒としては、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコールなどが好適に使用できる。また、必要に応じて、洗浄の前後に、超音波分散機などを用いて、多孔質粒子を分散しても良い。さらに、デカンテーション、ろ過などの方法により、小粒子や粗大粒子を除去することが、圧力特性の向上やタンパク質などの動的結合容量の向上の点から好ましい。
【００５６】
１．１．５．エポキシ基含有量
リガンド結合前の多孔質粒子に含まれるエポキシ基は、リガンドを結合するための官能基であり、また、さらに開環後にアフィニティークロマトグラフィー用充填剤としての親水性向上の元となる官能基である。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量は、０．０５〜４．０ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．０８〜２．５ｍｍｏｌ／ｇであり、最も好ましくは０．１０〜１．５ｍｍｏｌ／ｇである。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量が０．０５ｍｍｏｌ／ｇ以上であるとリガンドの結合量が適度であり、タンパク質の動的結合容量の低下が抑制される。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量が４．０ｍｍｏｌ／ｇ以下であると、保存中におけるリガンドの活性の低下が抑制され、タンパク質の動的結合容量の低下も抑制される。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量は、多孔質粒子に塩酸を過剰に添加して塩酸を付加反応することによりエポキシ基を開環し、残余の塩酸を過剰量の水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、残余の水酸化ナトリウムを塩酸で逆滴定することにより定量することが出来る。リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量は、エポキシ基含ビニル単量体の量、重合温度、重合時間、重合液のｐＨ、さらには、重合後の開環処理などによって、調整することが出来る。
【００５７】
１．２．アフィニティークロマトグラフィー用充填剤の構成
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、前記多孔質粒子、前記多孔質粒子に結合したリガンド、および開環エポキシ基を含む。
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤の一実施形態としては、上記特定の重合体からなる多孔質粒子にリガンドを結合し、該重合体に含まれるエポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子を含む。
【００５８】
前記リガンド結合多孔質粒子の体積平均粒子径は３５〜１００μｍであることが好ましく、かつ、水銀ポロシメータで孔径１０〜５０００ｎｍの範囲に相当する細孔を測定したときの細孔容積が１．００〜１．９０ｍｌ／ｇであることが好ましい。
【００５９】
１．２．１．リガンド
リガンドは、標的物に対して適度なアフィニティーを有するものであれば、その種類は特に限定されないが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物を用いることができる。上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
【００６０】
イムノグロブリンの分離または精製に好適なリガンドとしては、例えばプロテインＡおよびプロテインＧであり、さらに好ましくはプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインであり、最も好ましくはプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの末端に、４個以上の連続するヒスチジン単位を含むペプチドを付加したタンパク質であり、このようなタンパク質としては、例えば、後述する一般式（１）または一般式（２）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質が挙げられる。
【００６１】
なお、本発明において、「タンパク質」とは、ペプチド構造単位を有するあらゆる分子をいい、例えば、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変した変異体を含む概念である。また、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位を表し、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、かつ、「イムノグロブリン結合ドメイン」を含むタンパク質を表す。「イムノグロブリン結合」とはイムノグロブリン分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域、特にＦｃフラグメントに結合することを表す。本発明において、アフィニティークロマトグラフィーに関連して使用される用語「リガンド」とは、アフィニティークロマトグラフィーの標的物質と結合する部分のことを表す。
【００６２】
１．２．２．イムノグロブリン結合ドメイン
プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、天然型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよいし、または、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよい。プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、およびＺドメインから選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインのアミノ酸配列は例えば、Ｍｏｋｓ  Ｔ，  Ａｂｒａｈｍｓ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８６，  １５６，  ６３７−６４３のＦｉｇ．１に記載されている。該文献はこの参照により開示に含まれる。また、上記文献に記載された各ドメインのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは９０％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も、本発明におけるプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとして使用することができる。
【００６３】
組換え型のイムノグロブリン結合ドメインは、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合ドメインと同等のものとして扱うことができ、例えば、天然型のプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは９０％以上）の相同性を保持することが好ましい。具体例としては、ニルソン・ビー（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｂ．）他、プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、１９８７年、第１巻、２号、１０７−１１３頁に記載されているＺドメイン（配列番号１）、Ｈｏｂｅｒ  Ｓらによる米国特許出願２００６／０１９４９５５Ａ１に記載されているアルカリ耐性を有するＺドメインの変異体（ｍｕｔａｎｔ）が挙げられる。
【００６４】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤に用いられるリガンドは、複数の同一または異なる種類のイムノグロブリン結合ドメインを有していてもよい。
【００６５】
例えば、上記リガンドは、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとして、（Ｄドメイン−Ａドメイン）ｎ（ここで、ｎは１以上の整数（好ましくは１〜６）を示し、ＤドメインとＡドメインとの間には任意のアミノ酸配列が存在していてもよい。）、すなわち、ＡドメインおよびＤドメインを含む繰り返し単位を含むものであってもよい。また、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は使用時にアルカリ水溶液に接触する機会を有するため、上記リガンドは、プロテインＡのＺドメインを含む繰り返し単位を含むものであってもよい。
【００６６】
また、本発明において、リガンドは、上記各ドメイン、またはそのフラグメントもしくは変異体を、単独でまたは組み合わせて２個以上含むことができる。
【００６７】
本発明において、イムノグロブリン結合ドメインのフラグメントとは、当該ドメインのアミノ酸配列の一部を有するものであり、且つイムノグロブリン結合活性を有するものをいう。好ましくは、イムノグロブリン結合ドメインのフラグメントとは、当該ドメインのアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有し、且つイムノグロブリン結合活性を有するものをいう。また本発明において、イムノグロブリン結合ドメインの変異体とは、好ましくは当該ドメインのアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有し、且つイムノグロブリン結合活性を有するものをいう。
【００６８】
イムノグロブリン結合ドメインは、例えばＺドメイン、またはそのフラグメントもしくは変異体から選ばれる少なくとも１個を含むことができる。Ｚドメインについては、ニルソン・ビー（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｂ．）他、プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、１９８７年、第１巻、２号、１０７−１１３頁）に記載されている。
【００６９】
また、本発明において、リガンドは、Ｚドメイン、またはそのフラグメントもしくは変異体を単独でまたは組み合わせて２個以上（好ましくは４〜１０個）含むことができる。
【００７０】
Ｚドメインの変異体としては、例えば、特許第４３９１８３０号に記載された配列を有するタンパク質が挙げられる。例えば、特許第４３９１８３０号の請求項１には、配列番号１で規定される２以上の反復単位（Ｚドメイン）を含み、２３位のアミノ酸残基がスレオニンであるタンパク質が記載されている。
【００７１】
また、Ｚドメインのフラグメント（Ｚフラグメント）とは、Ｚドメインのアミノ酸配列の一部を有するものであり、例えば、Ｚドメインのアミノ酸配列の９０％以上を有するものであることが好ましく、９５％以上を有するものであることがより好ましく、且つイムノグロブリン結合活性を有するものをいう。また、Ｚドメインの変異体とは、例えば、Ｚドメインのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものであり、９５％以上の相同性を有するものであるのが好ましく、且つイムノグロブリン結合活性を有するものをいう。Ｚドメインの変異体は、Ｚドメインと比較してアルカリ耐性が改良されたものであることが好ましい。この場合、Ｚドメインの変異体がＺドメインと比較してアルカリ耐性が改良されているかどうかは、後述する実施例記載の方法にて確認することができる。
【００７２】
１．２．３．イムノグロブリン結合タンパク質１
好ましいリガンドの一例であるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質１」ともいう。）は、下記一般式（１）で表される。
【００７３】
Ｒ−Ｒ２  ・・・・・（１）
（式中、Ｒは４〜２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４〜３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０〜５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインのＣ末端またはＮ末端である。）。）
【００７４】
上記一般式（１）において、Ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は８〜１００個であることが好ましく、Ｒに含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４〜８個であることが好ましい。また、上記一般式（１）において、Ｒ２で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１２０〜４８０個であることが好ましい。
【００７５】
上記一般式（１）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むことが好ましい。この場合、上記アミノ酸配列中に同一または異なるドメインｔが複数含まれていてもよい。
【００７６】
また、上記一般式（１）において、Ｒ−は下記一般式（２）で表される基であることが好ましい。
【００７７】
Ｒ１−ｒ−  ・・・・・（２）
（式中、Ｒ１は４〜２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒは７〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
【００７８】
上記一般式（２）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は４〜２５個であることが好ましく、Ｒ１に含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４〜８個であることが好ましく、ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１０〜５０個であることが好ましい。
【００７９】
また、上記一般式（２）に示されるｒで表されるアミノ酸配列中には、ＴＥＶドメインが含まれていてもよい。ｒで表されるアミノ酸配列中にＴＥＶドメインが含まれていることにより、ＴＥＶプロテアーゼによる切断によってＲとＲ２との分離が可能になるうえ、ＴＥＶドメインは、担体への固定化量が多く、かつ、当該担体のイムノグロブリン保持能力を高めるという効果を実現するために好ましい配列である。また、ｒで表されるアミノ酸配列中に、ＴＥＶドメインの変異体（Ｍｕｔａｎｔ）（該ＴＥＶプロテアーゼで切断できるか否かと関係なく、ＴＥＶドメインのアミノ配列と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する。）が含まれていてもよい。
【００８０】
本発明で用いるタンパク質１を構成するアミノ酸の総個数は、好ましくは５４〜８００であり、粒子に結合させる用途に使用する場合、８０〜６００であるのがより好ましい。
【００８１】
１．２．４．イムノグロブリン結合タンパク質２
リガンドは、耐アルカリ性のイムノグロブリン結合性タンパク質であってもよい。耐アルカリ性のイムノグロブリン結合性タンパク質として、好ましいリガンドの他の一例であるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質２」ともいう。）は、下記一般式（３）で表される。
【００８２】
Ｒ−Ｒ２  ・・・・・（３）
（式中、Ｒは４〜２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４〜３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はＺドメイン、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む５０〜５００個のアミノ酸からなる、イムノグロブリンと結合可能なアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインのＣ末端またはＮ末端である。）。）
【００８３】
上記一般式（３）において、Ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は８〜１００個であることが好ましく、Ｒに含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４〜８個であることが好ましい。また、上記一般式（１）において、Ｒ２で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１２０〜４８０個であることが好ましい。
【００８４】
また、上記一般式（３）において、Ｒ−は下記一般式（４）で表される基であることが好ましい。
【００８５】
Ｒ１−ｒ−  ・・・・・（４）
（式中、Ｒ１は４〜２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４〜１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒは７〜２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
【００８６】
また、上記一般式（２）と同様に、上記一般式（４）におけるｒで表されるアミノ酸配列中には、ＴＥＶドメインが含まれていてもよい。ｒで表されるアミノ酸配列中にＴＥＶドメインが含まれていることにより、ＴＥＶプロテアーゼによる切断によってＲとＲ２との分離が可能になるうえ、ＴＥＶドメインは、本発明の効果（担体への固定化量が多く、かつ、当該担体のイムノグロブリン保持能力を高めること）を実現するために好ましい配列である。また、ｒで表されるアミノ酸配列中に、ＴＥＶドメインの変異体（Ｍｕｔａｎｔ）（該ＴＥＶプロテアーゼで切断できるか否かと関係なく、ＴＥＶドメインのアミノ配列と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する。）が含まれていてもよい。
【００８７】
上記一般式（４）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は４〜２５個であることが好ましく、Ｒ１に含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４〜８個であることが好ましく、ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１０〜５０個であることが好ましい。
【００８８】
上記一般式（３）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１〜５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むことが好ましい。この場合、上記アミノ酸配列中に同一または異なるドメインｔが複数含まれていてもよい。
【００８９】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、リガンドとしてタンパク質２を用いた場合、アルカリ性条件下での洗浄（例えば水酸化ナトリウム等のアルカリ性液を用いた洗浄）に対して高い耐性を有する。その理由としては、ヒスチジンが連続した部位をＺドメインに付加したことにより、多孔質粒子とＺドメインの結合位置がヒスチジン連続部位のない場合とは異なること、および固定化後のＺドメインに何らかの構造変化が起こり、アルカリ耐性が高くなったことなどが考えられる。実際の理由を実験により確認することはできていないが、耐アルカリ性の実験結果は、ヒスチジン連続部位を付加することによる作用効果があることを示している。
【００９０】
なお、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を用いてイムノグロブリンを単離する場合、例えば、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を用いて、前記充填剤にイムノグロブリンを吸着させる工程（第一の工程）、および前記イムノグロブリンを溶出させる工程（第二の工程）により、イムノグロブリンを単離することができ、さらに前記充填剤をアルカリ性液でＣＩＰ洗浄する工程（第三の工程）を経るのが好ましい。
【００９１】
第一の工程では、上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を充填したカラム等にイムノグロブリンを含有する溶液を、該充填剤のリガンドにイムノグロブリンが吸着する条件にて流す。ここで、上記イムノグロブリンを含有する溶液とは、イムノグロブリンを含有する任意の溶液であればよく、例えば、血清等の生体由来の検体、ハイブリドーマ培地の上清等が挙げられる。上記イムノグロブリンが吸着する条件としては、例えば、イムノグロブリン濃度０．１〜１０ｇ／Ｌ、溶液のｐＨ５〜９、カラム中の滞留時間０．５〜５０分、温度０〜４０℃が挙げられる。
【００９２】
この第一の工程では、溶液中のイムノグロブリン以外の物質のほとんどは吸着されずカラムを通過する。通常、一部の弱く保持された物質を除去するため、充填剤をＮａＣｌなどの塩を含む中性の緩衝液、例えば、リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム溶液、クエン酸／リン酸水素二ナトリウム溶液、塩酸／トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン溶液、ＨＥＰＥＳ／水酸化ナトリウム溶液等、で洗浄する。第二の工程では、ｐＨ２〜５の適切な緩衝液、例えば、例えば、クエン酸／クエン酸ナトリウム溶液、酢酸／酢酸ナトリウム溶液、塩酸／グリシン溶液等、を流しイムノグロブリンを溶出させる。第三の工程では、アルカリ性液で充填剤を洗浄（ＣＩＰ洗浄）する。
【００９３】
ここで使用されるアルカリ性液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、トリエチルアミン、水酸化テトラブチルアンモニウム等が挙げられる。
【００９４】
１．２．５．タンパク質１および２の製造
本発明で用いるタンパク質１および２を製造するための標準技術としては、例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  ＡｕｓｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙやＳａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。例えば、本発明で用いるタンパク質１または２は、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されている遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。すなわち、目的の改変タンパク質（タンパク質１または２）をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、当該細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、本発明で用いるタンパク質１または２を大量かつ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、細菌内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した細菌を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。
【００９５】
具体的には、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを数十塩基からなる合成オリゴヌクレオチドに分割して合成し、それらをＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応によって繋げてプラスミドに挿入することにより、目的の発現ベクターを取得することができる。その際に、当該タンパク質を大腸菌で効率良く発現させる目的で、大腸菌の至適コドンを用いた核酸配列を採用することは、当業者によって一般的に行われる方法である。また、後述する本発明の実施例に示されるようにＳｔｒａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡからＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）技術を用いて所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を構築することが可能である。
【００９６】
例えば、上記製造方法で用いる核酸は、イムノグロブリン結合タンパク質（タンパク質１または２）あるいはその等機能変異体をコードし得る。本発明において、イムノグロブリン結合タンパク質の「等機能変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）」とは、部分的なアミノ酸の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質であって、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を保持し、かつ、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質と同等のものとして扱うことができるものを意味する。すなわち、上記核酸としては、本明細書におけるタンパク質１または２をコードする核酸が含まれる。
【００９７】
また、上述したように、本発明で用いるタンパク質１および２は、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上（好ましくは２〜１２個、より好ましくは４〜１０個）を含むタンパク質であってもよい。この様なタンパク質をコードするｃＤＮＡは、１個のイムノグロブリン結合ドメインをコードするｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を所定の個数、直列に連結することにより、容易に作成することができる。こうして作成したｃＤＮＡを適切な発現プラスミドに挿入して利用することにより、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上含むタンパク質を容易に製造することができる。
【００９８】
例えば、後述する実施例において示される配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質（ＳＰＡＴＫ）や配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質（ＳＰ４Ｚ）、配列番号２または配列番号４において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合活性を有するタンパク質は、本発明で用いるイムノグロブリン結合タンパク質として好適である。
【００９９】
１．２．６．リガンドの結合
上記担体と上記リガンドの結合方法としては、多孔質粒子に含まれるエポキシ基をそのままリガンドとの結合部位として利用することが、プロセスとして簡便であり、好ましい。その他に、多孔質粒子に含まれるエポキシ基を開環して生成するアルコール性水酸基をトシル基などで活性化してから、リガンドを結合する方法や、多孔質粒子に含まれるエポキシ基または、当該エポキシ基の開環により生成する基からさらにリンカーを伸ばしてから、当該リンカーを介して多孔質粒子にリガンドを結合しても良い。
【０１００】
リガンドの結合条件は、リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量、リガンドの種類により異なるが、当業者にとっての公知の方法を採用することができる。リガンドがタンパク質である場合は、タンパク質のＮ末端のアミノ基、タンパク質に含まれるリジン、システインがエポキシとの反応点になりうる。タンパク質を結合する場合、例えば、タンパク質の等電点に近いバッファー類の水溶液を用い、必要により塩化ナトリウムや硫酸ナトリウムなどの塩を添加し、タンパク質と多孔質粒子を混合しながら、０〜４０℃で１〜２４時間反応させて、リガンドであるタンパク質を結合することができる。
【０１０１】
リガンドの結合量は、リガンドの種類、標的分子の種類などによって、適宜調節されるが、プロテインＡのような抗体結合性タンパク質をリガンドとして結合する場合、多孔質粒子１ｇ当たり、好ましくは１０〜２００ｍｇ、より好ましくは２５〜１００ｍｇである。プロテインＡのような抗体結合性タンパク質をリガンドとして結合する場合、多孔質粒子１ｇ当たりのリガンドの結合量が１０ｍｇ以上であると動的結合容量に優れ、２００ｍｇ以下であると、結合した抗体の溶出のための溶出液の量が適量となる。
【０１０２】
１．２．７．開環エポキシ基
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成するリガンド結合多孔質粒子は、開環エポキシ基を有する。この開環エポキシ基は、上記特定の重合体からなる多孔質粒子にリガンドを結合した後に、該重合体に含まれるエポキシ基、すなわち、リガンドと結合したエポキシ基以外の残余のエポキシ基を開環させて得られる。これは、多孔質粒子をアフィニティークロマトグラフィー用充填剤として使用する前に、多孔質粒子の表面のエポキシ基が実質的に全て開環していることを意味する。
【０１０３】
なお、多孔質粒子の表面のエポキシ基が実質的に全て開環しているとは、開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子に残留するエポキシ基が、具体的には、好ましくは０．０４ｍｍｏｌ／ｇ未満、さらに好ましくは０．０２ｍｍｏｌ／ｇ未満であることを意味し、エポキシ基が残留していないことが最も好ましい。開環エポキシ基の残留量が０．０４ｍｍｏｌ／ｇ未満であると、保存安定性に優れる。
【０１０４】
エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基であるアルコール性水酸基は、粒子表面を親水化し、タンパク質などの非特異吸着を防止すると共に、水中で粒子の靱性を向上させ、高流速下の粒子の破壊を防止する役割を果たす。多孔質粒子中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸またはアルカリにより、加熱または室温で攪拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノール、チオグリセロールなどのメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミンなどのアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させても良い。最も好ましい開環エポキシ基は、多孔質粒子に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる開環エポキシ基である。チオグリセロールは、原料としてメルカプトエタノールなどよりも毒性が低く、チオグリセロールが付加したエポキシ開環基は、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が低い上に、動的結合量が高くなるといった利点を有する。
【０１０５】
１．２．８．粒子径、細孔容積
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子の粒子径は、３５〜１００μｍであることが好ましく、より好ましくは３８〜７５μｍである。粒子径が３５μｍ以上であると、圧力特性に優れる。１００μｍ以下であると、動的結合容量が高い充填剤が得られる。開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子の粒子径は、上述の通り、多孔質粒子を重合する際の条件で調整することができる。なお、本発明における「粒子径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒子径である。
【０１０６】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子は、水銀ポロシメータで孔径１０〜５０００ｎｍの範囲に相当する細孔を測定したときに、好ましくは１．００〜１．９０ｍｌ／ｇ、より好ましくは１．０５〜１．８５ｍｌ／ｇの細孔容積を有する。細孔容積が上記範囲内であると、タンパク質の動的結合容量が高い充填剤が得られる。また、細孔容積が１．９０ｍｌ／ｇ以下であると、圧力特性に優れる。
【０１０７】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子は、好ましくは８０〜１５０ｍ２／ｇ、より好ましくは１００〜１４０ｍ２／ｇの比表面積を有する。ここで、比表面積が８０ｍ２／ｇ以上であると、動的結合容量高い充填剤が得られる。一方、１５０ｍ２／ｇ以下であると、充填剤の強度に優れ、高流速下での充填剤の破壊が抑制され、カラム圧力の上昇が抑制される。本発明における「比表面積」とは、水銀ポロシメータにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥質量で除した値である。
【０１０８】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子は、好ましくは７５〜３００ｎｍ、より好ましくは８０〜２５０ｎｍの体積平均細孔径を有する。ここで、体積平均細孔径が７５ｎｍ以上であると、高流速下の動的結合容量低下が抑制される。一方、３００ｎｍ以下であると、流速にかかわらず動的結合容量に優れた充填剤が得られる。本発明における「体積平均細孔径」とは、水銀ポロシメータにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の体積平均細孔径である。
【０１０９】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子の湿潤状態の１個の粒子を微小硬度計で測定したときの弾性率は、好ましくは３．０〜１０．０ＭＰａ、さらに好ましくは５．０〜８．０ＭＰａである。３．０ＭＰａ以上であると、圧力特性に優れる。１０．０ＭＰａ以下であると、タンパク質の動的結合容量に優れた充填剤が得られる。本発明における弾性率は、水スラリー状態のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子の１滴を微小硬度計のステージに乗せ、湿潤状態の１個の粒子について、微小硬度計のプローブを粒子の真上から当てて粒子を直径の５％変形させたときに測定される応力（単位Ｎ）を粒子径と同じ直径の円の面積（単位ｍ２）で除した値である。
【実施例】
【０１１０】
２．実施例
以下、本実施形態にかかるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。【０１１１】
２．１．評価方法
２．１．１．エポキシ基含有量
リガンド結合前の多孔質粒子のエポキシ基含有量は、重合で使用したエポキシ基含有モノマー量より計算されるエポキシ基モル数が２．００ｍｍｏｌとなるように、質量濃度約１０％で正確な質量濃度がわかっている多孔質粒子水分散体をポリエチレンボトルに質量で測り取り、これに濃度３８％の塩化カルシウム水溶液２５ｍＬおよび２規定の塩酸２．００ｍＬを加えて、７５℃で２時間３０分攪拌することによりエポキシ基を開環し、冷却後、２規定の水酸化ナトリウム水溶液２．５０ｍＬで中和し、さらにｐＨメーターでｐＨをモニターしながら０．１規定の塩酸で逆滴定することにより定量した。【０１１２】
２．１．２．粒子径
レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製  ＬＳ１３３２０）により、粒子の体積平均粒子径を測定した。【０１１３】
２．１．３．細孔容積、比表面積、体積平均細孔径
４０℃で２４時間真空乾燥させて乾燥粒子を得、水銀ポロシメータ（島津製作所社製  オートポアＩＶ９５２０）にて乾燥粒子の細孔容積、比表面積、および体積平均細孔径（細孔径）を求めた。測定範囲は細孔径範囲で１０〜５０００ｎｍとした。【０１１４】
２．１．４．弾性率
水スラリー状態の開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子の１滴を微小硬度計（フィッシャー・インストルメンツ社製ＨＭ２０００）のステージに乗せ、湿潤状態の１個の粒子について、微小硬度計のプローブを粒子の真上から当てて粒子を直径の５％変形させたときに測定される応力（単位Ｎ）を記録した。また、プローブの位置と応力のグラフから応力＝０となるプローブの位置を最小自乗法で算出し、これを対象粒子の直径とした。記録した応力を対象粒子の直径の円の面積（単位ｍ２）で除した値を測定した１粒子の弾性率とした。測定は任意に選んだ５個の粒子について実施し、個々の弾性率の平均値を求めて、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を構成する開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子の弾性率とした。【０１１５】
２．１．５．タンパク質の動的結合容量
ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体）の動的結合容量を測定した。カラム容量は４ｍＬ（５ｍｍΦ×２００ｍｍ長）、ヒトＩｇＧ抗体（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社製  ＨＧＧ−１０００）は２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で５ｍｇ／ｍＬに希釈したものを使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのヒトＩｇＧ抗体吸着量とカラム充填体積から動的結合容量を求めた。以下、動的結合容量はＤＢＣと記載することがある。【０１１６】
２．１．６．圧力特性
測定する開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなる充填剤を内径１６ｍｍ、充填高さ１００ｍｍとなるようにカラムに充填し、このカラムをＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡｐｉｌｏｔに接続し、純水を線流速で５０ｃｍ／ｈｒずつ段階的に上げながら流したときに、一定線流速で流している１分間に０．０５ＭＰａを超える経時的な圧力増加が見られたときの線流速を圧密流速として記録した。３０００ｃｍ／ｈｒでもこのような圧力増加が見られない場合、測定を中止し、＞３０００ｃｍ／ｈｒと記録した。また、カラムの絶対圧力が１．９ＭＰａに達した場合、このような圧力増加が見られない場合でも測定を中止し、１．９ＭＰａに達したときの線流速を記録した。圧密流速は、９００ｃｍ／ｈｒ以上が好ましく、１２００ｃｍ／ｈｒ以上がより好ましく、１８００ｃｍ／ｈｒ以上がさらに好ましく、２７００ｃｍ／ｈｒ以上が最も好ましい。【０１１７】
２．１．７．プロテインＡ結合量
多孔質粒子に結合したリガンドであるプロテインＡ（ＳＰＡ）の結合量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬を用いた試薬セットで定量した。具体的には、固形分換算で１ｍｇの充填剤をテストチューブに採取し、これをＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（旧ＰＩＥＲＣＥ社）のＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔで定量した。反応は、３７℃で３０分間、転倒混和することによって行った。検量線は、多孔質粒子に結合させたプロテインＡと同一のロットのものを用いて作成した。【０１１８】
２．２．実験例
２．２．１．実施例１
（ｉ）多孔質粒子の懸濁重合
４０９１ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）８．５２ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）２．１３ｇおよび炭酸ナトリウム４．２６ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液（Ｓ−１−１）を調製した。さらに重合当日、（Ｓ−１−１）の３０ｇを別に抜き取り、残りの（Ｓ−１−１）に亜硝酸ナトリウム２．１３ｇを溶解して、水溶液（Ｓ−２−１）を調製した。【０１１９】
次に、グリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）１２５ｇ、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１７．９ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日本油脂社製）３５．９ｇを２−オクタノン（東洋合成社製）８６．４ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）２５３ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。なお、単量体の全質量を１００質量部としたときの、各単量体の部数は、グリセリンジメタクリレート７０質量部、グリシジルメタクリレート１０質量部、グリセロールモノメタクリレート２０質量部である。【０１２０】
（Ｓ−１−１）３０ｇに２、２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）２．２ｇを添加して分散し、開始剤分散液とした。【０１２１】
次いで、準備した水溶液（Ｓ−２−１）および単量体溶液をバッフル付きの７Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼、および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、２２０ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、内温が８５℃に到達したところで、開始剤分散液を添加し、８５℃に温度を保持しつつ、５時間攪拌を行った。【０１２２】
次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液をヌッチェでろ過し、純水とイソプロピルアルコールで洗浄した。洗浄した粒子をポリビンに移し、水に分散してデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。以上の操作により水に分散した１２．５質量％の多孔質粒子１（粒子乾燥質量１２３ｇ）を得た。多孔質粒子１のエポキシ基含有量は、０．４７ｍｍｏｌ／ｇであった。【０１２３】
（ｉｉ）リガンドの作製
２．２．１．１．ＳＰ４Ｚ発現ベクターの構築
イムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰ４Ｚ）発現ベクターを下記のステップで構築した。図２は、ＳＰ４Ｚベクターの構築方法を説明する図である。【０１２４】
（１）ステップ１
単量体ＺドメインをコードするＤＮＡを出発物質として、ＮｃｏＩ切断部位およびＥｃｏＲＩ切断部位を有する単量体Ｚドメインベクター（Ａ−ｐＥＴＭ１１）（ＳＰ１Ｚ）を構築した。【０１２５】
（２）ステップ２
次に、Ａ−ｐＥＴＭ１１ベクターにもう一個Ｚドメインを付加して、ＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位を有する２量体Ｚドメインベクター（ＡＢ−ｐＥＴＭ１１）（ＳＰ２Ｚ）を構築した。【０１２６】
（３）ステップ３
次いで、ＡＢ−ｐＥＴＭ１１ベクターに更にもう一個Ｚドメインを付加して、ＳａｃＩ切断部位およびＨｉｎｄ  ＩＩＩ切断部位を有する３量体Ｚドメインベクター（ＡＢＣ−ｐＥＴＭ１１）（ＳＰ３Ｚ）を構築した。【０１２７】
（４）ステップ４
最後に、ＡＢＣ−ｐＥＴＭ１１ベクターに４個目のＺドメインを付加して、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位を有するｐＥＴＭ１１−ＳＰ４Ｚのベクターを構築した。【０１２８】
２．２．１．２．ＳＰ１Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン有りの単量体Ｚドメインベクター）の構築
ＳＰＺＫ  ＤＮＡ（配列番号３）をテンプレートとし、フォワードプライマーとしてプライマー１５３（配列番号５）およびリバースプライマーとしてプライマー１５６（配列番号８）を用いてＰＣＲを実施した。プライマー１５３およびプライマー１５６にはそれぞれ、ＮｃｏＩ切断部位およびＳａｃＩの制限酵素切断部位が含まれる。ＰＣＲの条件は以下の通りである。【０１２９】
段階１：９４℃１分間１サイクル、段階２：９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２．５分間（２５サイクル）、段階３：７２℃１０分間１サイクル、その後４℃で保持した。【０１３０】
ＰＣＲ生成物はＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製生成キットでＰＣＲ精製した。次に、ＮｃｏＩ制限酵素およびＳａｃＩ制限酵素を用いて切断されたｐＥＴＭ１１ベクターとＰＣＲ生成物とのライゲーションを行った。制限酵素による消化反応は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製ＮｃｏＩ制限酵素およびＳａｃＩ制限酵素を用いて３７℃１時間行い、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製生成キットでＰＣＲ精製した。【０１３１】
ライゲーション反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で室温にて終夜行った。ライゲーションで得られたベクターをＤＨ５ａ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｍｅｄａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）で形質転換させ、得られた形質転換体を、カナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃終夜培養し陽性Ｃｏｌｏｎｙからプラスミドを抽出し、挿入されたＤＮＡフラグメントの配列が正しいことを３７３０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で確認した。【０１３２】
２．２．１．３．Ａ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン無しの単量体Ｚドメインベクター）の構築
プライマー１５３，１５６の代わりに、フォワードプライマーとしてプライマー１５３およびリバースプライマーとしてプライマー１５４（配列番号６）を用いて、実験２．２．１．２．と同様にＡ−ｐＥＴＭ１１ベクターを構築した。なお、ＤＮＡフラグメントの挿入は、ｐＥＴＭ１１のＮｃｏＩ切断部位およびＥｃｏＲＩ切断部位を利用している。【０１３３】
２．２．１．４．ＳＰ２Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン有りの２量体Ｚドメインベクター）の構築
フォワードプライマーとしてプライマー１５５（配列番号７）およびリバースプライマーとしてプライマー１５６を用いて、ＰＣＲでＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位を有する単量体ＺドメインのＤＮＡを調製し、Ａ−ｐＥＴＭ１１のＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位に挿入して構築した。実験は実験２．２．１．２．と同様の条件で行った。【０１３４】
２．２．１．５．ＡＢ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドンなしの２量体Ｚドメインベクター）の構築
フォワードプライマーとしてプライマー１５５およびリバースプライマーとしてプライマー１５７（配列番号９）を用いて、ＰＣＲでＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位を有する終止コドンなしの単量体ＺドメインのＤＮＡを調製し、Ａ−ｐＥＴＭ１１のＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位に挿入して、ＡＢ−ｐＥＴＭ１１ベクターを構築した。実験は実験２．２．１．２．と同様の条件で行った。【０１３５】
２．２．１．６．ＳＰ３Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン有りの３量体Ｚドメインベクター）の構築
フォワードプライマーとしてプライマー１５８（配列番号１０）およびリバースプライマーとしてプライマー１６１（配列番号１３）を用いて、ＰＣＲでＳａｃＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位を有する単量体ＺドメインのＤＮＡを調製し、ＡＢ−ｐＥＴＭ１１のＥｃｏＲＩ切断部位およびＳａｃＩ切断部位に挿入して構築した。実験は実験２．２．１．２．と同様の条件で行った。【０１３６】
２．２．１．７．ＡＢＣ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン無しの３量体Ｚドメインベクター）の構築
フォワードプライマーとしてプライマー１５８およびリバースプライマーとしてプライマー１５９（配列番号１１）を用いて、ＰＣＲでＳａｃＩ切断部位およびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を有する終止コドン無しの単量体ＺドメインのＤＮＡを調製し、ＡＢ−ｐＥＴＭ１１のＳａｃＩ切断部位およびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入して、ＡＢＣ−ｐＥＴＭ１１ベクターを構築した。実験は実験２．２．１．２．と同様の条件で行った。【０１３７】
２．２．１．８．ＳＰ４Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクター（終止コドン有りの４量体Ｚドメインベクター）の構築
プライマー１６０（配列番号１２）およびプライマー１６１を用いて、ＰＣＲでＨｉｎｄＩＩＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位を有する単量体ＺドメインのＤＮＡを調製し、ＡＢＣ−ｐＥＴＭ１１のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位に挿入して、ＳＰ４Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクターを構築した。実験は実験２．２．１．２．と同様の条件で行った。【０１３８】
２．２．１．９．ＳＰ４Ｚの発現および精製
得られたＳＰ４Ｚ−ｐＥＴＭ１１ベクターをＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）に導入し、１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間インキュベートして、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰ４Ｚ）を発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した。【０１３９】
得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰ４Ｚ）は、Ｎｉアフィニティクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）粒子、キアゲン社製）によって精製された。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質は陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥバイオサイエンス社製）によって、さらに精製された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されたイムノグロブリン結合タンパク質の純度は９６％であった。【０１４０】
また、得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰ４Ｚ）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析により、それぞれアミノ酸配列が一致したことにより、図１に示すアミノ酸配列（配列番号２）を有することが確認された。【０１４１】
なお、図１において、ＲおよびＲ２は上記一般式（１）及び（３）におけるＲおよびＲ２に対応し、Ｒ１およびｒは上記一般式（２）及び（４）におけるＲ１およびｒに対応する。ｒ中の下線部はＴＥＶドメイン（ＴＥＶプロテアーゼ（ペプチド結合加水分解合成酵素）切断部位）を示す。【０１４２】
（ｉｉｉ）多孔質粒子とリガンドとの結合
粒子乾燥質量換算で１ｇの多孔質粒子１、０．１ｇのＳＰ４Ｚが２５ｍＬの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）に分散した混合液を調製し、１０℃で２４時間転倒混和し、ＳＰ４Ｚを多孔質粒子１に結合させた。生成した粒子を濾過した後、１Ｍチオグリセロール２５ｍＬと混合し３０℃で４時間反応させ、残余のエポキシ基を開環し、ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、ＰＢＳで洗浄し、開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤１（Ａ−１）を得た。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔで定量測定を行ったところ、前記粒子に結合したＳＰ４Ｚの量は４１ｍｇ／ｇ粒子であった。結果を表２に示す。【０１４３】
（ｉｖ）評価
（Ａ−１）の粒子径は５４μｍ、細孔容積は１．２６ｍＬ／ｇ、比表面積は１１１ｍ２／ｇ、体積平均細孔径は１０１ｎｍであった。弾性率は５．６ＭＰａであった。タンパク質（ヒトＩｇＧ抗体）の動的結合容量は４０ｍｇ／ｍＬ、圧力流速は２７００ｃｍ／ｈｒであった。【０１４４】
２．２．２．実施例２
実施例１の懸濁重合で、攪拌回転数を３００ｒｐｍとした以外は、同様にして多孔質粒子２を得て、開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤２（Ａ−２）を製造、評価した。結果を表２に示す。多孔質粒子２のエポキシ基含有量は、０．４５ｍｍｏｌ／ｇであった。（Ａ−２）の粒子径は３１μｍ、細孔容積は１．４３８ｍＬ／ｇ、比表面積は１３２ｍ２／ｇ、体積平均細孔径は１１０ｎｍであった。弾性率は６．４ＭＰａであった。タンパク質（ヒトＩｇＧ抗体）の動的結合容量は４０ｍｇ／ｍＬ、圧力流速は１１００ｃｍ／ｈｒであった。【０１４５】
２．２．３．実施例３
（ｉ）多孔質粒子の懸濁重合
３００ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）０．６００ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）０．０３０ｇおよび硫酸ナトリウム１．５０ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液（Ｓ−１−２）を調製した。さらに重合当日、（Ｓ−１−２）の５ｇを別に抜き取り、残りの（Ｓ−１−２）に亜硝酸ナトリウム０．１５０ｇを溶解して、水溶液（Ｓ−２−２）を調製した。【０１４６】
次に、グリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）８．１９ｇ、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）３．５１ｇを２−オクタノン（東洋合成社製）６．２５ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）１８．３ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。なお、単量体の全質量を１００質量部としたときの、各単量体の部数は、グリセリンジメタクリレート７０質量部、グリシジルメタクリレート３０質量部である。【０１４７】
（Ｓ−１−２）５ｇに２、２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．１４９ｇを添加して分散し、開始剤分散液とした。【０１４８】
次いで、得られた水溶液（Ｓ−２−２）および単量体溶液をバッフル付きの０．５Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼、および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、６８０ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、内温が８５℃に到達したところで、開始剤分散液を添加し、８５℃に温度を保持しつつ、５時間攪拌を行った。【０１４９】
次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液をヌッチェでろ過し、純水とイソプロピルアルコールで洗浄した。洗浄した粒子をポリビンに移し、水に分散してデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。以上の操作により水に分散した１２．５質量％の多孔質粒子３（粒子乾燥質量８．７ｇ）を得た。多孔質粒子３のエポキシ基含有量は、１．７ｍｍｏｌ／ｇであった。【０１５０】
（ｉｉ）リガンドの作製
後述する調製例（１）〜（５）により、図３に示されるアミノ酸配列を有するイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＴＫ（配列番号４））を調製した。【０１５１】
（１）ステップ１
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、制限酵素ＮｃｏＩサイトを有するプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ１１）、及び制限酵素ＢａｍＨ１とＨｉｎｄＩＩＩサイトを有するプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ１２）を用いてＰＣＲでＤ−ＡドメンをコードするＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＥＴＭ１１にライゲーションしてＳＰＡＫプラスミドを構築した。【０１５２】
（２）ステップ２
次に、上記に得られたＳＰＡＫプラスミドをテンプレートとして制限酵素ＢａｍＨＩサイトを有するプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ１３）と制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを有するプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ１４）を用いてＰＣＲで新たなＤ−ＡドメンをコードするＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断された上記に得られたＳＰＡＫプラスミドにライゲーションしてＳＰＡＴＫプラスミドを構築した。【０１５３】
（３）ＳＰＡＫプラスミドの構築
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、Ｐｒｉｍｅｒ１１とＰｒｉｍｅｒ１２を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
段階１：９４℃１分間１サイクル、段階２：９４℃３０秒間、５３℃３０秒間、７２℃２．５分間（２５サイクル）、段階３：７２℃１０分間１サイクル、その後４℃で保持した。【０１５４】
ＰＣＲ生成物はＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製の精製キットで精製した。次に、ＮｃｏＩ制限酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて切断した。ｐＥＴＭ１１ベクターについて同じくＮｃｏＩ制限酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断した。制限酵素による消化反応は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製ＮｃｏＩ制限酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて行い、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製精製キットで精製した。ライゲーション反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で室温にて終夜行った。ライゲーションで得られたベクターをＤＨ５ａ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｍｅｄａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に形質転換させ、陽性ｃｏｌｏｎｙのプラスミド（ＳＰＡＫプラスミド）の配列が正しいことを３７３０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で確認した。【０１５５】
（４）ＳＰＡＴＫプラスミドの構築の構築
ＳＰＡＫプラスミドをテンプレートとしてＰｒｉｍｅｒ１３とＰｒｉｍｅｒ１４を用いてＰＣＲで新たなＤ−ＡドメンをコードするＤＮＡを得た。ＰＣＲの条件は段階１：９４℃１分間１サイクル、段階２：９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２．５分間（２５サイクル）、段階３：７２℃１０分間１サイクル、その後４℃で保持した。ＰＣＲ生成物はＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製の精製キットで精製した。次に、ＢａｍＨＩ制限酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素用いてこのＤＮＡを切断した。ＳＰＡＫプラスミドについても同じくＢａｍＨＩ制限酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断した。制限酵素による消化反応は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製ＢａｍＨＩ制限酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用い、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製精製キットで精製した。ライゲーション反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で室温にて終夜行った。ライゲーションで得られたベクターをＤＨ５ａ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｍｅｄａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に形質転換させ、陽性ｃｏｌｏｎｙのプラスミド（ＳＰＡＴＫプラスミド）の配列が正しいことを３７３０  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で確認した。【０１５６】
（５）ＳＰＡＴＫの発現および精製
得られたＳＰＡＴＫプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）に形質転換した。１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間インキュベートして、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＴＫ）を発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した。【０１５７】
得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＴＫ）は、Ｎｉアフィニティクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）粒子、キアゲン社製）によって精製された。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質は陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥバイオサイエンス社製）によって、さらに精製された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されたイムノグロブリン結合タンパク質の純度は９６％であった。【０１５８】
また、得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＴＫ）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル分析により、それぞれアミノ酸配列が一致したことにより、図３に示すアミノ酸配列を有することが確認された。【０１５９】
【表１】
2011125673.tif 000002
【０１６０】
（ｉｉｉ）多孔質粒子とリガンドとの結合
粒子乾燥質量換算で１ｇの多孔質粒子３、０．１ｇのＳＰＡＴＫが２５ｍＬの０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）に分散した混合液を調製し、１０℃で２４時間転倒混和し、ＳＰＡＴＫを多孔質粒子３に結合させた。生成した粒子を濾過した後、１Ｍチオグリセロール２５ｍＬと混合し３０℃で４時間反応させ、残余のエポキシ基を開環し、ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、ＰＢＳで洗浄し、開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤３（Ａ−３）を得た。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔで定量測定を行ったところ、前記粒子に結合したＳＰＡＴＫの量は４４ｍｇ／ｇ粒子であった。結果を表２に示す。【０１６１】
（ｉｖ）評価
（Ａ−３）の粒子径は５０μｍ、細孔容積は１．０７ｍＬ／ｇ、比表面積は１０４ｍ２／ｇ、体積平均細孔径は６８ｎｍであった。弾性率は６．６ＭＰａであった。タンパク質（ヒトＩｇＧ抗体）の動的結合容量は３９ｍｇ／ｍＬ、圧力流速は＞３０００であった。【０１６２】
２．２．４．実施例４〜６
実施例３において、単量体の全質量を１００質量部としたときの、各単量体の部数を、表２の通りとした以外は、同様にして開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤４〜６（Ａ−４〜６）を得、評価した。結果を表２に示す。【０１６３】
２．２．５．実施例７
実施例３において、硫酸ナトリウムを使用せず、亜硝酸ナトリウム１．５０ｇとし、単量体の全質量を１００質量部としたときの各単量体の部数を、表２の通りとした以外は、同様にして開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤７（Ａ−７）を得、評価した。結果を表２に示す。【０１６４】
２．２．６．比較例１〜２
実施例３において、単量体の全質量を１００質量部としたときの、各単量体の部数を、表３の通りとした以外は、同様にして比較アフィニティークロマトグラフィー用充填剤１〜２（Ｂ−１〜２）を得、評価した。結果を表３に示す。【０１６５】
２．２．７．実施例８
（ｉ）多孔質粒子の懸濁重合
４２５７ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）８．５１ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）０．４２５ｇおよび硫酸ナトリウム２１．３ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液（Ｓ−１−６）を調製した。さらに重合当日、（Ｓ−１−６）の２０ｇを別に抜き取り、残りの（Ｓ−１−６）にヨウ化カリウム２．１３ｇを溶解して、水溶液（Ｓ−２−６）を調製した。【０１６６】
次に、ペンタエリスリトールトリアクリレート６０質量％およびペンタエリスリトールテトラアクリレート４０質量％からなる単量体（新中村化学工業社製商品名「ＮＫエステルＡ−ＴＭＭ−３ＬＭ−Ｎ」）１０４ｇ、４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル（日本化成社製）２０．７ｇ、ヒドロキシエチルアクリルアミド（興人社製）８２．９ｇを２−オクタノン（東洋合成社製）１３４ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）１６９ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。なお、単量体の全質量を１００質量部としたときの、各単量体の部数は、ペンタエリスリトールトリアクリレート３０部、ペンタエリスリトールテトラアクリレート２０部、４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル１０部、ヒドロキシエチルアクリルアミド４０部である。【０１６７】
（Ｓ−１−６）２０ｇに２、２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．９２ｇを添加して分散し、開始剤分散液とした。【０１６８】
次いで、準備した水溶液（Ｓ−２−６）および単量体溶液をバッフル付きの７Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼、および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、３００ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、内温が８０℃に到達したところで、開始剤分散液を添加し、８０℃に温度を保持しつつ、５時間攪拌を行った。【０１６９】
次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液をヌッチェでろ過し、純水とイソプロピルアルコールで洗浄した。洗浄した粒子をポリビンに移し、水に分散してデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。以上の操作により水に分散した１２．５質量％の多孔質粒子８（粒子乾燥質量１０７ｇ）を得た。多孔質粒子８のエポキシ基含有量は、０．２９ｍｍｏｌ／ｇであった。【０１７０】
（ｉｉ）リガンドの作製、（ｉｉｉ）多孔質粒子とリガンドとの結合、（ｉｖ）評価
実施例１と同様にして、作製、評価した。結果を表４に示す。【０１７１】
２．２．８．実施例９
実施例８において、ペンタエリスリトールトリアクリレート６０質量％およびペンタエリスリトールテトラアクリレート４０質量％からなる単量体（新中村化学工業社製商品名「ＮＫエステルＡ−ＴＭＭ−３ＬＭ−Ｎ」）９６．７ｇ、４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル（日本化成社製）１９．３ｇ、ヒドロキシエチルアクリルアミド（興人社製）７７．３ｇを２−オクタノン（東洋合成社製）１３９ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）１７５ｇに溶解させ、単量体溶液を調製し、２、２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）の質量を２．６９ｇとした以外は、同様にして開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤９（Ａ−９）を得、評価した。結果を表４に示す。【０１７２】
２．２．９．実施例１０
実施例９において、内温が８５℃に到達したところで、開始剤分散液を添加し、８５〜９０℃に温度を保持しつつ、５時間攪拌を行った以外は、同様にして開環エポキシ基を有するリガンド結合多孔質粒子からなるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤１０（Ａ−１０）を得、評価した。結果を表４に示す。【０１７３】
【表２】
2011125673.tif 000003
【０１７４】
【表３】
2011125673.tif 000004
【０１７５】
【表４】
2011125673.tif 000005
【０１７６】
表２〜４によれば、実施例１〜１０の充填剤を用いた場合、比較例１〜２の充填剤を用いた場合と比較して、リガンドの保持量が多く、圧力特性に優れていることが理解できる。【０１７７】
２．２．１０．比較例３
実施例１の懸濁重合で、グリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）１２５ｇ、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１７．９ｇの代わりに、グリシジルメタクリレート１４２．９ｇを使用した以外は、同様にして、単量体溶液を調製、重合を実施した。なお、単量体の全質量を１００質量部としたときの、各単量体の部数は、グリシジルメタクリレート８０質量部、グリセロールメタクリレート２０質量部である。次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液をヌッチェでろ過し、純水とイソプロピルアルコールで洗浄しようとしたが、ろ過の途中で溶剤を含んだ白色塊状物となり、詰まりが生じて次の工程に進むことができなかった。【０１７８】
本実施形態に係る説明は以上である。本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらなる種々の変形が可能である。また本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【産業上の利用可能性】
【０１７９】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、従来の担体と比較してイムノグロブリン結合タンパク質の保持量が多く、かつ、当該タンパク質の保持能に優れている。これにより、目的タンパク質の捕捉量を高めることができるため、目的タンパク質（抗体）の結合容量を増大させることができる。その結果、純度の高い目的タンパク質を効率良く、低コストでかつ大量に精製することができる。
【図１】
2011125673.tif 000006
【図２】
2011125673.tif 000007
【図３】
2011125673.tif 000008
【図４】
2011125673.tif 000009
【配列表】
2011125673000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月23日(2013.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有非架橋性ビニル単量体、あるいは水酸基とエポキシ基とを含有する架橋性ビニル単量体、を含むビニル単量体の重合体からなる多孔質粒子、
前記多孔質粒子に結合したリガンド、ならびに
前記重合体に含まれるエポキシ基をメルカプト基又はアミノ基を有するブロッキング剤により開環させて得られ、かつ前記多孔質粒子表面に存在する開環エポキシ基を有することを特徴とする、
アフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
前記リガンドが、プロテインＡ、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン、または、その変異体を少なくとも１個含むイムノグロブリン結合性タンパク質である、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
前記ビニル単量体が、
（Ｘ−１）水酸基を含有しエポキシ基を含有しない架橋性ビニル単量体２０〜９０質量部、
（Ｘ−２）水酸基もエポキシ基も含有しない架橋性ビニル単量体０〜４０質量部、
（Ｍ−１）エポキシ基含有非架橋性ビニル単量体１〜４０質量部、および
（Ｍ−２）エポキシ基を含有しない非架橋性ビニル単量体０〜７０質量部
から構成される（但し、（Ｘ−１）、（Ｘ−２）、（Ｍ−１）および（Ｍ−２）の合計は１００質量部である。）、請求項１または２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項４】
前記開環エポキシ基は、前記重合体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる、請求項１〜３のいずれか１つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項５】
前記多孔質粒子が、
前記ビニル単量体１００質量部と、
（Ｐ−１）炭素数７〜１４である直鎖状、分岐鎖状および環状のアルコール、エーテル、アルデヒド、ケトン、エステル、炭素数８〜１０のアルキルベンゼンから選ばれる少なくとも１つのポロジェン（但し、ポロジェンの合計量は１００〜４００質量部であり、（Ｐ−１）はポロジェンの合計量１００質量％中に１０質量％以上である。）を必須成分とする水系混合物と、
を懸濁重合して得られる、請求項１〜４のいずれか１つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
水銀ポロシメータで孔径１０〜５０００ｎｍの範囲に相当する細孔を測定したときの前記多孔質粒子の細孔容積が１．００〜１．９０ｍｌ／ｇである、請求項１〜５のいずれか１つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
前記多孔質粒子の粒子径が３５〜１００μｍである、請求項１〜６のいずれか１つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を用いて、前記充填剤にイムノグロブリンを吸着させる工程、および
前記イムノグロブリンを溶出させる工程
を含む、イムノグロブリンを単離する方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤が充填された、アフィニティークロマトグラフィー用充填カラム。
【国際調査報告】
2011125673.tif 000010
2011125673.tif 000011
2011125673.tif 000012
2011125673.tif 000013