(57)【要約】  本発明は、微生物由来の酵素ニトリルヒドラターゼの作用によりアクリロニトリルからアクリルアミドをより効率的に製造する方法を提供する。より具体的には、本発明によって、ニトリルヒドラターゼを有する生体触媒を用いて、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法において、アクリロニトリルが30℃未満となるように冷却しつつ保管する工程を含む、前記方法が提供される。また、本発明によって、ニトリルヒドラターゼを有する生体触媒を用いて、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する製造装置も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼを有する生体触媒を用いて、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法において、
アクリロニトリルが30℃未満となるように冷却しつつ保管する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ニトリルヒドラターゼを有する生体触媒を用いて、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する製造装置において、アクリロニトリルの温度を３０℃未満に維持するための温度調節機構を備えたアクリルアミド製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物由来の酵素ニトリルヒドラターゼの作用によりアクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法に関する。より詳細には、本発明は、ニトリルヒドラターゼの作用によって、３０℃未満の温度で保管されたアクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクリルアミドは産業上重要な物質として広範な分野で使用されている。例えば、アクリルアミドの重合体は廃水処理用凝集剤、紙力増強剤、石油回収剤等に広く用いられている。アクリルアミドは、従来、還元状態の銅を触媒として対応するアクリロニトリルを水和することにより工業的に製造されているが、近年、銅触媒に代えて生体触媒（微生物触媒）を用いる方法が開発され、その一部は実用化されている。生体触媒法は、その反応条件が温和で副生成物も殆ど無く、極めてシンプルなプロセスが組めることから工業的製法として有力視されており、これまでにアクリロニトリルを水和してアクリルアミドに変換する触媒能を有する酵素ニトリルヒドラターゼを有する多くの微生物が見出されている。【０００３】
微生物触媒を使用したアクリルアミドの製造方法としては、特許文献１〜３に記載の方法があげられ、反応方法としては特許文献４に記載の方法等があげられる。
効率的な反応方法についても、多く検討されている（特許文献５〜９）。
また、より効率的に高性能なアクリルアミドを製造するために、アクリロニトリルの処理もしくは不純物の少ないアクリロニトリルを使用することも種々検討されている（特許文献１０〜１５）。【０００４】
しかしながら、アクリロニトリルを保存または貯蔵する時の温度に関しては、一般的なMSDS(Material Safety Date Sheet)等で冷暗所に保管することが記載されているが（例えば、非特許文献１）、アクリロニトリル保存温度のアクリルアミド水和反応に対する影響に関しては、これまで検討されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平11-123098号
【特許文献２】特開平7-265091号
【特許文献３】特公昭56-38118号
【特許文献４】特開平11-89575号
【特許文献５】特表2004-524047号
【特許文献６】中国特許出願公開1482250号
【特許文献７】国際公開第2007/097292号
【特許文献８】国際公開第2007/132601号
【特許文献９】国際公開第03/000914号
【特許文献１０】特開平9-227478号
【特許文献１１】特開2000-016978号
【特許文献１２】特開平11-123098号
【特許文献１３】特開2001-288156号
【特許文献１４】国際公開第2007/043466号
【特許文献１５】国際公開第2004/090148号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】製品安全データシート  アクリロニトリル  ダイヤニトリックス株式会社作成
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、高濃度のアクリルアミドを製造する方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、アクリロニトリルの保存温度と、当該アクリロニトリルを原料として用いたアクリルアミドの生成反応の効率との関係について、３０℃未満の温度で保管されたアクリロニトリルを使用すると、より少ない触媒量でより高濃度のアクリルアミドを製造することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ニトリルヒドラターゼを有する生体触媒を用いて、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法において、
アクリロニトリルが30℃未満となるように冷却しつつ保管する工程を含む、前記方法。
（２）ニトリルヒドラターゼを有する生体触媒を用いて、アクリロニトリルからアクリルアミドを製造する製造装置において、アクリロニトリルの温度を３０℃未満に維持するための温度調節機構を備えたアクリルアミド製造装置。
【発明の効果】
【０００９】
３０℃未満で保存されたアクリロニトリルを使用すると、より少ない触媒量でより高濃度の高品質なアクリルアミドを製造することができる。すなわち、本発明の製造方法においては、従来の製造方法と比較して、単位触媒量当たりの化合物の生成量（すなわち、触媒の生産効率（以後、単に「生産性」ともいう））が顕著に増加する。
そして、生体触媒あるいはそれを懸濁した液から持ち込まれる、あるいは抽出される種々の有機系不純物（糖類やたんぱく質）及び／又は無機系不純物（ミネラル類）を減らすことができ、より高純度なアクリルアミドが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のアクリルアミド製造装置に用いられるアクリロニトリル冷却機構を備えた貯蔵装置の説明斜視図である。
【図２】アクリロニトリル貯蔵装置を備えたアクリルアミド製造装置の概略を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための単なる例示であって、本発明をこの実施形態にのみ限定することは意図されない。本発明は、その趣旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することが可能である。
本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2010-106562号明細書（出願日：2010年5月6日）の内容を包含する。本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、その全体が本明細書において参考として組み込まれる。
【００１２】
生体触媒を用いたアクリルアミドの製造方法は、連続反応により行う方法（連続的にアクリルアミドを生成させる方法）であってもよいし、バッチ反応により行う方法（非連続的にアクリルアミドを生成させる方法）であってもよく、限定はされないが、連続反応により行う方法が好ましい。
【００１３】
ここで、連続反応により行う方法とは、反応原料（生体触媒及びアクリロニトリルを含む）の連続的又は間歇的な供給と、反応混合物（生成したアクリルアミドを含む）の連続的又は間歇的な取り出しを行いながら、反応器内の反応混合物の全量を抜き出すことなく連続的にアクリルアミドを製造する方法を意味する。
【００１４】
反応中のアクリロニトリル濃度は、用いる生体触媒の種類、形態によっても異なるが、０．５〜１５．０重量％程度であることが好ましい。
本発明の製造方法を連続反応により行う場合、反応器中から反応混合物を取り出す際の流体速度は、反応器内の反応混合物を全量抜き出すことなく連続的に製造できるように、アクリロニトリル及び生体触媒の導入速度に合わせて決定すればよい。
【００１５】
本発明で使用される生体触媒には、目的とする反応を触媒する酵素（すなわち、ニトリルヒドラターゼ）を含有する動物細胞、植物細胞、細胞小器官、菌体（生菌体または死菌体）またはその処理物が包含される。処理物としては、細胞から抽出された粗酵素または精製酵素、さらに動物細胞、植物細胞、細胞小器官、菌体（生菌体または死菌体）または酵素自体を包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したものが包含される。好ましくは、ニトリルヒドラターゼを有する生体触媒とは、ニトリルヒドラターゼ活性を有する酵素を含有する菌体もしくはその処理物または菌体もしくは酵素自体を包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したものである。ここで包括法としては菌体または酵素を高分子ゲルの微細な格子の中に包み込むか、半透膜性の高分子の皮膜によって被覆する方法が挙げられ、架橋法としては酵素を２個またはそれ以上の官能基を持った試薬（多官能性架橋剤）で架橋する方法が挙げられ、担体結合法としては水不溶性の担体に酵素を結合させる方法が挙げられる。固定化担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、寒天、ゼラチン等がある。
菌体を固定化する方法の内、包括固定化法は菌体濃度の高い固定化菌体が得られるため、工業的に多く用いられている。例えば、アクリルアミドおよび／またはアクリルアミドの誘導体を包括固定化用モノマーとして用いられている例が、特公昭５８−３５０７８や特開平７−２０３９６４に示されている。
【００１６】
本発明でいうニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物としては、好ましくは、バチルス（Bacillus)属、バクテリジューム（Bacteridium)属、ミクロコッカス（Micrococcus)属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium)属〔特公昭62-21519号〕、コリネバクテリウム（Corynebacterium)属、ノカルジア（Nocardia)属〔特公昭56-17918号〕、シュードモナス（Pseudomonas)属〔特公昭59-37951号〕、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属〔特公平4-4873号〕、ロドコッカス（Rhodococcus)属〔特公平4-4873号、特公平6-55148号、特公平7-40948号〕、アクロモバクター(Achromobacter)属〔特開平6-225780〕、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属〔特開平9-275978号〕に属する微生物が挙げられるが、これらに限定されない。ロドコッカス（Rhodococcus)属細菌がより好ましい。より好ましい菌体としては、ロドコッカス・ロドクロウス J1株（FERM BP-1478）が挙げられる。
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス・ロドクロウス  Rodococcus rhodochrous J1株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、受託番号：FERM BP-1478として1987年9月18日に国際寄託されている。
なお、寄託者についての情報は以下の通りである。
名称：山田 秀明
あて名：京都府京都市左京区松ヶ崎木ノ本町１９番地の１
【００１７】
また、前記した微生物由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を取得し、そのまま又は人為的に改良し、任意の宿主に該遺伝子を導入した形質転換体を使用しても良い。
前記形質転換体としては、アクロモバクター(Achromobacter)属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌MT10770（FERM P-14756）(特開平8-266277号)、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌MT10822（FERM BP-5785）(特開平9-275978号)またはロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous)種のニトリルヒドラターゼ（特開平4-211379号）で形質転換した微生物を例示することができる。さらに、上記文献に記載の方法又は他の公知方法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons (1987-1997)）に従って、所望の形質転換体を作製することも可能である。本発明の方法においては、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現する限り、任意の形質転換体を生体触媒として使用することができる。
【００１８】
生体触媒の使用量は、用いる生体触媒の種類および／または形態によっても異なるが、反応器中に導入する生体触媒の活性が、反応温度10℃で乾燥菌体１ｍｇ当たり５０〜２００Ｕ程度となるように調整することが好ましい。ただし、前記単位Ｕ（ユニット）とは、１分間にアクリロニトリルからアクリルアミドを１マイクロモル生成させることを意味し、製造に用いるアクリロニトリルを用いて測定した値である。本発明の製造方法においては、３０℃以上で保管されたアクリロニトリルを使用したアクリルアミドの製造方法において使用される生体触媒の量と比較して少ない量で反応を行う、あるいは同量の生体触媒の量でより多くのアクリルアミドを製造することが可能である。
【００１９】
本発明において、原料アクリロニトリルを保管するとは、例えば、アクリルアミド製造設備に付随するアクリルアミド保管貯蔵設備において、アクリロニトリルを一定期間以上（例えば、１日以上、好ましくは3日以上、より好ましくは７日以上）保管することを意味する。保管貯蔵設備としては、アクリロニトリルを含むドラムを保管する設備およびアクリロニトリルを貯蔵するタンク等があるが、工業的にアクリルアミドを製造する場合には通常アクリロニトリル貯蔵タンクが好ましい。
【００２０】
アクリロニトリルの貯蔵設備は、遮光性、酸素遮断性、防火性、除電性、防振性などを有することが好ましく、さらに貯蔵環境を密閉でき、かつ場合により排気／換気可能とする機構を備えることが望ましい。貯蔵形態は、アクリロニトリルの安定性が確保される限り特に制限されないが、アクリロニトリルの安定性を高めるために、任意に安定剤を添加できるようにしてもよい。
３０℃未満となるように冷却しつつ保管するとは、夏場や高温地域でのアクリロニトリル貯蔵において、内部のアクリロニトリルの温度が３０℃以上とならないように、冷却しつつ保管することである。
【００２１】
本発明は、アクリロニトリルを冷却しつつ保管するための冷却装置が設けられたアクリルアミド製造装置（設備）も提供する。内部温度上昇を防ぐ冷却装置としては、冷却用流体を用いてアクリロニトリルを冷却できるものであれば特に制限しない。冷却用流体は特に制限されないが、気体よりも熱容量の大きな液体を用いることでより効率よくアクリロニトリルを冷却することができる。
特に冷却用液体の中でも低コストで取り扱いの容易な水を用いることが好ましい。
上述したようなタンクを備えた冷却設備は、様々な方法でアクリロニトリルを冷却することができる。アクリロニトリルの貯蔵タンクの冷却機構としては、例えば、タンクの表面に水もしくは冷却水を散水する機構、タンク壁に設けられた冷却用ジャケット機構、またはタンク壁もしくはタンク内部にコイルを設置してコイル内部に冷却水やエチレングリコール水溶液などの冷却用溶液（冷媒）を流通させる機構などをあげることができる。冷却水又は冷媒は、循環して繰返し使用することができるが、安価で環境負荷のない水を散水する場合は、繰り返さずにそのまま廃水とすることもできる。
【００２２】
以下に、散水設備を備えたアクリロニトリルの貯蔵装置について図１を用いてさらに詳しく説明する。なお、図１に示したようなアクリロニトリルの貯蔵装置はあくまで一例であり、アクリロニトリルの冷却方法は以下の説明に限定されるものではない。
【００２３】
図１に示すように、アクリロニトリルの貯蔵装置２は、アクリルアミドの製造装置３０（図２参照）に組み込むことができるように構成されており、アクリロニトリルを貯蔵するための貯蔵タンク４、このタンク４に収容されたアクリロニトリルを例えば３０℃未満に冷却するための冷却機構１０を備える。
貯蔵タンク４は金属などの熱伝導度の高い材料によって形成され、タンク表面には、水などによって腐食されないように耐食加工が施されている。
貯蔵タンク４の冷却機構としては、内部コイル式またはジャケット式を用いることができるが、ランニングコストなどの低さなどから冷却機構は散水方式を用いることが好ましい。散水方式の冷却機構１０は、温度検知部１２、冷却水弁１６、などを備える。外気温や天気などの気候条件でアクリロニトリルの温度が経験的に推察される場合は、温度検知部１２を使用しなくてもよい。
温度検知部１２を有した冷却機構１０を使用する場合は、温度検知部１２から入力される温度情報に基づいてアクリロニトリルの温度をフィードバック制御しており、温度情報に基づいて温度調節部１４が冷却水弁１６の開閉を制御してアクリロニトリルの温度を調節する。冷却水源から供給される冷却水は、例えば、５℃〜２０℃に調温された冷却された水又はエチレングリコール水溶液を用いるか、あるいは工業用水などを安価に入手できる場合は、工業用水をそのまま用いる。工業用水を用いる場合は、散水した水を回収することなく、排水とすることができる。
貯蔵タンク４の上部には冷却水を散水するための、例えばリング状に形成された散水リング４ａが設けられ、冷却水供給管２０を通して冷却水源から散水リング４ａに冷却水が供給される。散水リングには、水を貯蔵タンク４の表面を満遍なく濡らすことができるように、小さな散水孔１８が外円周上に穿たれている。散水孔１８を介して散水リング４ａから散水された冷却水は、例えば貯蔵タンク４表面を流下しつつタンク表面を冷却し、これにより貯蔵タンク４内のアクリロニトリルが冷却される。散水リング４aの大きさや散水孔１８のサイズは貯蔵タンク４を冷却できる限り特に制限されないが、例えば、散水リング４aを直径４０ｍｍとして、この散水リング４aに直径３．５ｍｍの散水孔１８を７５ｍｍ間隔で設けてもよい。
冷却水弁１６の駆動態様としては、例えば、温度検知部１２が検知したアクリロニトリルの温度が閾値（例えば、２５℃）を超えた場合に冷却水弁１６が開き貯蔵タンク４側に冷却水が供給され、検知されたアクリロニトリルの温度が閾値以下の場合に冷却水弁１６が閉止する態様などがあげられる。
このように冷却水弁１６を開いて冷却水を貯蔵タンク４側に供給することにより、貯蔵タンク４内に貯蔵されたアクリロニトリルを３０℃未満で維持することができる。
【００２４】
次に、アクリロニトリルの貯槽装置を備えたアクリルアミドの製造装置について図２を用いて説明する。なお、アクリロニトリルの貯蔵装置に関し、図１に例示した貯蔵装置と同一な部分に関しては同じ符号を付して概略的な説明にとどめその詳細な説明については省略する。
図２に示すように、アクリルアミドの製造装置３０は、アクリロニトリルの貯蔵装置２、反応器３６、分離器３９、アクリルアミド貯留タンク４３、冷却水供給部４５などを備える。
冷却水供給部４５は、冷却水路を介して反応器３６に冷却水を供給し、反応器３６は供給される冷却水によって冷却可能となっている。反応器３６から排出された冷却水は冷却水路を介して冷却水供給部４５に戻される。
製造装置３０では、アクリロニトリルの貯蔵タンク２から反応器３６に供給ライン４７を介してアクリロニトリルが供給され、反応器３６に供給されたアクリロニトリルは例えば撹拌翼３６ａによって生体触媒と混合され、ニトリルヒドラターゼ反応によってアクリルアミドが生成される。反応器３６からはアクリルアミドが混合した反応混合液が排出され、排出された反応混合液は例えば遠心分離機などに代表さる分離器３９に供給される。
分離器３９に供給された反応混合液からアクリルアミドが分離され、分離されたアクリルアミドはアクリルアミドの貯留タンク４３に貯留され、分離された生体触媒は廃触媒として廃棄される。
タンク４内のアクリロニトリルの温度は、例えば２５℃以下に制御されており、このように調温されたアクリロニトリルを反応器３６に供給することにより、アクリルアミドを効率よく生産することができ、また、高品質なアクリルアミドを提供することができる。
【００２５】
なお、上記では冷却時の閾値について一例として２５℃を例示したが、閾値はこれに限らず、ニトリルヒドラターゼ反応に使用される生体触媒の性質や反応時の温度に応じて適宜変更してよい。特に微生物のニトリルヒドラターゼ活性レベルは様々な条件によって変動する場合があり、このような場合ではその条件に基づいて反応温度を決定し、アクリロニトリル冷却時の閾値の設定を柔軟に変更することが望ましい。
【００２６】
以上のように、本発明のアクリルアミド製造装置は、アクリロニトリルを、当該装置が設置される外的環境の温度（周囲温度）に影響されることなく、３０℃未満の温度で維持することができる。例えば、冷却水を用いる冷却機構を備える製造装置では、当該装置の周囲温度が、アクリルアミドの生産に好適な温度より高い場合、より積極的に冷却水を使用することができる。この際、アクリロニトリルの温度をモニターしておくことが好ましいが、モニターは行わずに気温および／または日差しにより判断して冷却機構を稼動させてもよい。また、冷却水の供給を制御する弁もしくはポンプを省き３０℃未満の一定温度の冷却水をアクリロニトリルの貯蔵タンク内で常時循環させるなどしてアクリロニトリルを３０℃未満に維持してもよい。このような構造にしてもアクリルアミドを効率よく生産することができる。
【実施例】
【００２７】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００２８】
［実施例１および２］：20℃又は28℃で保管したアクリロニトリルを用いたアクリルアミドの製造
（アクリロニトリルの保管）
アクリロニトリル（ダイヤニトリックス社製）を、５００ｍLのガラス瓶に入れ２０℃および２８℃に調整した恒温槽でそれぞれ７日間保管した。【００２９】
（生体触媒の調整）
ニトリルヒドラターゼ活性を有するRhodococcus rhodochrous J1(FERM BP-1478)を、グルコース２％、尿素１％、ペプトン０．５％酵母エキス０．３％、塩化コバルト０．０５％（何れも重量％）を含む培地（ｐＨ７．０）により３０゜Cで好気的に培養した。これを遠心分離機を用いて５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄して菌体懸濁液（乾燥菌体１５重量％）を得た。【００３０】
（アクリロニトリルからアクリルアミドへの反応）
１Ｌのジャケット付きセパラブルフラスコに、脱イオン水を６６４ｇ入れ水温を１８℃に制御した。30分後、先に得た菌体懸濁液を０．８ｇ添加し、１８０ｒｐｍ撹拌下、アクリロニトリル濃度が常に２％となるように連続的にアクリロニトリルを添加して、アクリルアミドの製造を開始した。
その結果、２０℃又は２８℃のいずれの温度で保管したアクリロニトリルを用いた場合でも、アクリロニトリルの添加開始から２５時間で生成したアクリルアミド濃度が目的の４５％となった。【００３１】
〔比較例１〕
３５℃で保管したアクリロニトリルを用いたこと以外は、実施例１と同様に実施したところ２５時間ではアクリルアミド濃度は４２％にしかならなかった。そのため、添加する菌体量を０．９ｇとしたところ２５時間で４５％となった。
以上から、３０℃未満の温度で保管されたアクリロニトリルを使用すると、３０℃以上で保管されたアクリロニトリルを使用する場合と比較して少ない生体触媒量でアクリルアミドを製造できることが示された。【００３２】
［実施例３］：ロドコッカス ロドクロウス M8株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
（１）ロドコッカス ロドクロウス M8株（以下、Ｍ８株という。）からの染色体ＤＮＡ調製
Ｍ８株(SU1731814)は、ロシア菌株センターIBFM（VKPM S-926）から入手することができる。
Ｍ８株を100mlのMYK（0.5％ ポリペプトン、0.3％ バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4）培地(pH7.0)中、30℃にて７２時間振盪培養した。培養液を遠心分離し、集菌した菌体をSaline-EDTA溶液（0.1M EDTA、0.15M NaCl(pH8.0)）4mlに懸濁した。懸濁液にリゾチーム8mgを加えて37℃で1〜2時間振盪した後、−20℃で凍結した。
次に、当該懸濁液に10ｍｌのTris-SDS液（１％SDS、0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl(pH9.0)）を穏やかに振盪しながら加えた。さらに、当該懸濁液にプロテイナーゼＫ（メルク社）（終濃度0.1mg）を加え37℃で１時間振盪した。次に、等量のＴＥ飽和フェノールを加え攪拌後（TE：10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0)）遠心した。上層を採取し、2倍量のエタノールを加えて、ガラス棒でDNAを巻きとった。その後、これを順次90％、80％、70％のエタノールで遠心分離しフェノールを取り除いた。
次に、DNAを3mlのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（100℃、15分間の加熱処理済）を10μg/mlになるよう加え37℃で30分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫ（メルク社）を加え37℃で30分間振盪した。これに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。
上層をさらに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。この操作を再度繰り返した。その後、上層に同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加えて遠心分離し、上層を回収した。次いで、上層に２倍量のエタノールを加えガラス棒でDNAを巻きとって回収し、染色体DNAを得た。【００３３】
（２）ＰＣＲを用いたＭ８株染色体ＤＮＡからのニトリルヒドラターゼ遺伝子の調製
Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼはVeiko,V.P.et al, Cloning,nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8, Biotekhnologiia (Mosc.) 5, 3-5 (1995)に記載されており、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターの配列を表１に示す。
【表１】
2011138966.tif 000002
上記配列情報に基づいて、プライマーM8-1およびM8-2を合成し、（１）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
＜プライマー＞
M8-1：GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC（配列番号７）
M8-2：CCCCTGCAGGTCAGTCGATGATGGCCATCGATTC （配列番号８）
＜PCR反応溶液組成＞
鋳型DNA（染色体DNA） 200ng
PrimeSTAR Max Premix（宝酒造社製） 25μl
プライマーM8-1  10pmol
プライマーM8-2   10pmol
＜反応条件＞
（98℃  10秒、55℃  5秒、72℃で30秒）×30サイクル【００３４】
PCR終了後、反応液5μlを0.7％アガロースゲル（同仁化学社製アガロースＩ使用；アガロース濃度０．７重量％）電気泳動に供し、1.6kbの増幅断片の検出を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅ(プロメガ株式会社)を用いて精製した。
回収したPCR産物はLigation Kit(宝酒造)を用いてベクター（pUC118/HincII部位）に連結し、反応液により大腸菌JM109のコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体コロニーより数クローンをLB-Amp培地1.5mlに接種し、37℃で12時間振盪培養した。培養後、この培養物を遠心分離により集菌した。QIAprep Spin Miniprep Kit (アマシャムバイオサイエンス社)を用いることにより、集菌した菌体からプラスミドDNAを抽出した。得られたプラスミドDNAに対し、シークエンシングキットとオートシークエンサーCEQ 8000（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。【００３５】
次に、得られたプラスミドDNAを制限酵素XbaIとSse8387Iで切断後、0.7％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子断片（1.6kb）を回収し、プラスミドpSJ042のXbaI-Sse8387Iサイトに導入した。得られたプラスミドをpSJ-N01Aと命名した。【００３６】
尚、ｐSJ042はロドコッカス菌においてＪ１株ニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドとして特開２００８−１５４５５２号公報に示す方法で作製されたものであり、ｐＳＪ０４２の作製に使用したpSJ023は形質転換体ATCC12674/pSJ023（FERM BP-6232）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成9年3月4日付けで寄託されている。
なお、寄託者についての情報は以下の通りである。
名称：三菱レイヨン株式会社
あて名：東京都港区港南１丁目６番地４１【００３７】
（３）コンピテントセルの作製
ロドコッカス・ロドクロウスATCC 12674株（以下、ATCC 12674株）をMYK培地で対数増殖期前期まで培養し、細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁し、コンピテントセルを作製した。【００３８】
（４）Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
得られたプラスミドpSJ-N01A0.1μgとATCC12674株のコンピテントセルの菌体懸濁液各20μｌとを混合し、各々氷冷した。キュベットに各混合液を入れ、遺伝子導入装置 Gene Pulser（BIO RAD）により20 KV/cm、200 OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下10分静置し、37℃で10分間ヒートショックを行った。その後、キュベットにMYK培地500μlを加え、30 ℃、5時間静置した後、50μg/mlカナマイシン入りMYK寒天培地に塗布し、30℃、3日間培養した。
得られた形質転換体コロニーに含まれるプラスミドDNAを確認し、この組換え菌をＭ８株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（ATCC12674／pSJ-N01A）とした。【００３９】
（５）ロドコッカス属組換え菌の調整
実施例１と同様に培養し、組換菌体懸濁液（乾燥菌体６重量％）を得た。【００４０】
（６）組換菌によるアクリロニトリルからアクリルアミドへの反応
１Ｌのジャケット付きセパラブルフラスコに、脱イオン水を６００ｇ入れ水温を２５℃に制御した。30分後、先に得た組換え菌（ATCC12674／pSJ-N01A）菌体懸濁液５ｇを添加し、１８０ｒｐｍ撹拌下、室温（25度以下）で保管しておいたアクリロニトリルを８４ｇ／ｈの添加速度で連続的に添加して、アクリルアミドの製造を開始した。
４時間後アクリルアミド濃度が目的の４０％となった。この反応の生産性は、約９００であった。【００４１】
｛比較例２｝
３５℃で保管したアクリロニトリルを用いたこと以外は、実施例２と同様に実施したところ４時間後アクリルアミド濃度は３８％であり、その後もアクリロニトリル濃度が上昇するばかりで目的の４０％とならなかった。【００４２】
［実施例４］：シュードノカルディア・サーモフィラJCM3095株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
（１）ＰＣＲを用いたpPT-DB1プラスミドＤＮＡからのニトリルヒドラターゼ遺伝子の調製
pPT-DB1は、特開平９−２７５９７８で得られたシュードノカルディア・サーモフィラJCM3095株（以下、JCM3095株と言う。）由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドである。
JCM3095株は特開平９−２７５９７８に記載されており、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターの配列を表２に示す。
【表２】
2011138966.tif 000003
上記配列情報に基づいて、プライマーPSN-1およびPSN-1を合成し、pPT-DB1プラスミドDNAを鋳型としてＰＣＲを行った。
＜プライマー＞
PSN-1：GGTCTAGAATGAACGGCGTGTACGACGTCGGC（配列番号１５）
PSN-2：ccCCTGCAGGTCAGGACCGCACGGCCGGGTGGAC（配列番号１６）
＜PCR反応溶液組成＞
鋳型DNA（pPT-DB1）200ng
PrimeSTAR Max Premix（宝酒造社製） 25μl
プライマーPSN-1  10pmol
プライマーPSN-2   10pmol
＜反応条件＞
（98℃  10秒、55℃  5秒、72℃で30秒）×30サイクル
得られたPCR産物は、実施例１（２）と同様の方法でプラスミドを作製し、pSJ-N02Aと命名した。【００４３】
（２）JCM3095株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
実施例  （４）と同様の手法により、JCM3095株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（ATCC12674／pSJ-N02A）を作製した。【００４４】
（３）ロドコッカス属組換え菌の調整
実施例１と同様に培養し、組換菌体懸濁液（乾燥菌体５重量％）を得た。【００４５】
（４）組換菌によるアクリロニトリルからアクリルアミドへの反応
１Ｌのジャケット付きセパラブルフラスコに、脱イオン水を７００ｇ入れ水温を２５℃に制御した。30分後、先に得た菌体懸濁液１２ｇを添加し、１８０ｒｐｍ撹拌下、室温（25度以下）で保管しておいたアクリロニトリルを８４ｇ／ｈの添加速度で連続的に添加して、アクリルアミドの製造を開始した。
２時間後アクリルアミド濃度が目的の２０％となった。【００４６】
｛比較例３｝
３５℃で保管したアクリロニトリルを用いたこと以外は、実施例５と同様に実施したところ２時間後アクリルアミド濃度は１８％であり、その後もアクリロニトリル濃度が上昇するばかりで目的の２０％とならなかった。
以上から、生体触媒として形質転換体を使用した場合でも、３０℃未満の温度で保管されたアクリロニトリルを使用すると、３０℃以上で保管されたアクリロニトリルを使用する場合と比較して効率よくアクリルアミドを製造できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の方法によって、より効率的にアクリルアミド製造を行うことが可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号１５：合成DNA
配列番号１６：合成DNA
【図１】
2011138966.tif 000004
【図２】
2011138966.tif 000005
【配列表】
2011138966000001.app
【国際調査報告】
2011138966.tif 000006
2011138966.tif 000007
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