(57)【要約】  一般に用いられているマトリックスにも適用可能で、測定対象分子のイオン生成量やイオン化効率を向上でき、試料が極めて微量であっても、イオン化効率や測定の再現性を向上させることによって、信頼性の高い化学構造についての情報を得ることができる質量分析法を提供することを課題とし、プレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成し、該起点に接する領域に、測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置し、又は測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置し、該マトリックス溶液を乾燥させて、該起点から該起点に接する領域に結晶を析出させた後、該起点の周辺部分からシグナルを得ることを特徴とする質量分析法によって、上記課題を解決した。
2011027819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成し、該起点に接する領域に、測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置し、又は測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置し、該マトリックス溶液を乾燥させて、該起点から該起点に接する領域に結晶を析出させた後、該起点の周辺部分からシグナルを得ることを特徴とする質量分析法。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析法において、測定対象分子を含む試料を載せた後、誘導体化剤を載せて該測定対象分子と反応させ、次いでマトリックス溶液を載置する請求項１に記載の質量分析法。
【請求項３】
上記マトリックス結晶の析出が始まる起点が、該マトリックス溶液を通過させない区切り上の点である請求項１又は請求項２に記載の質量分析法。
【請求項４】
上記マトリックス溶液を通過させない区切りが、該マトリックス溶液が実質的に流れ込まない不侵入領域との区切りである請求項３に記載の質量分析法。
【請求項５】
上記不侵入領域の表面の誘電率が、上記起点に接する領域の表面の誘電率と異なる請求項４に記載の質量分析法。
【請求項６】
上記マトリックス溶液を通過させない区切りが、高さの異なる区切りである請求項３又は請求項４に記載の質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は質量分析法に関し、更に詳しくは、特定のプレートに特定の方法で調製された測定試料を質量分析装置に供する質量分析法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
「質量分析法（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」（以下、「ＭＳ」と略記することがある）とは、測定対象分子を含む試料をイオン化し、測定対象分子由来のイオンを質量電荷比（質量／電荷（ｍ／ｚ））によって分離し検出することによって、その測定対象分子の化学構造に関する情報を得る方法である。【０００３】
ＭＳにおいて、試料のイオン化は、分析の可否や得られるスペクトルの質を左右する重要な過程であり、試料を効率よくイオンにするためにこれまで多くのイオン化法が開発されてきた。現在のところ、生体高分子のイオン化には、ソフトイオン化であるマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（以下、「ＭＡＬＤＩ」と略記することがある）法やエレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（以下、「ＥＳＩ」と略記することがある）法が主に用いられている。これらのイオン化法を用いた質量分析計は、ＮＭＲ等に比べて測定試料量が少なくても測定が可能であることから、バイオ分野でも広く用いられている。【０００４】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いた特に例えば糖類等の分析は、ペプチドやタンパク質等に比べて困難であると考えられている。その根本的な理由のひとつに、糖類のイオン化の効率がペプチド等に比べて著しく悪く、高感度分析が困難であることが挙げられる。【０００５】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおける試料のイオン化効率は、用いるマトリックスの種類、マトリックスへの添加剤、溶媒等の様々な要因により異なってくることが報告されており、感度良く測定するために特殊なマトリックスが開発されている（特許文献１、２、３、非特許文献１、２）。【０００６】
また、試料の性質そのものにも影響されるため、試料分子を誘導体化することでイオン化効率を向上させることも知られており、糖鎖の水酸基をメチル化する手法や、糖鎖の還元末端やシアル酸を誘導体化する手法が知られている（例えば、特許文献４、５）。【０００７】
また、試料分子を含有するマトリックスの結晶を微細で均一な状態で析出させることによって感度を向上させようとした技術も提案されている（例えば、特許文献５、６）。【０００８】
しかしながら、未だ、ＭＡＬＤＩのイオン化メカニズムは完全に解明されていないため、測定に用いるマトリックスの選択、試料の調製方法等は、経験的な知見に基づく場合が多い。一般に、マトリックスと試料は良く混ざり、混合結晶となる必要があると考えられている。しかし、固体結晶となるため不均一となり、更に、結晶が生成した場所すべてから測定対象分子由来のイオンが得られるわけでもなく、生成した結晶のごく一部分にレーザーを照射した場合のみ測定対象分子由来のイオンが得られる。【０００９】
この部分は、「スイートスポット（ｓｗｅｅｔ  ｓｐｏｔ）」と呼ばれ、ＭＡＬＤＩにおける測定の際は、まずスイートスポットを探し出すことが質の高いマススペクトルを得るために必要となるが、スイートスポットが結晶のどの部分であるかは経験によって探す他はない。また、スイートスポットを探し出し、そこにレーザー照射を行ったとしても、従来の試料の調製方法で調製したサンプルでは、イオン生成量が低く、結局は特殊なマトリックスを用いて測定するしかなく、また、たとえそうしても優れたスイートスポットが探し出せない場合があった。【００１０】
一方、分子量及び組成が同一の異性体が複数存在する化合物の場合、測定対象分子由来のイオンをプリカーサイオンとして選択し断片化し、更に生じたイオンをプリカーサイオンとして選択し断片化することを繰り返すＭＳｎ（２≦ｎ）解析が必須である。一般に、ＭＳ／ＭＳ（ＭＳ２）測定により得られるイオンのシグナル強度は前段階のイオンの約１／１０に減少する。従って、多段階ＭＳ（ＭＳｎ（２≦ｎ））測定を行うことによって化学構造に関する情報は極めて多くはなるが、検出感度は低下していくので、ますますイオン化効率の向上の必要性が増すこととなる。【００１１】
このように、極めて微量の測定対象分子を含む試料に対し、高感度で効率よく測定対象分子を質量分析する方法が強く望まれているが未だ十分な方法はなかった。特に、微量試料の感度向上のために、様々な濃縮を目的としたプレートが開発され市販されている。これらのいくつかを試したが、糖鎖や糖ペプチド解析には有用なものはなかった。すなわち、濃縮されることによってより、小さい面積のマトリックスの結晶が生成するので、ＭＳの感度は向上するが、構造同定に必須である２段階以降の多段階ＭＳ（ＭＳｎ（２≦ｎ））測定に十分な量の結晶が存在しなかった。【００１２】
更に、測定対象分子以外の夾雑分子も同時に濃縮されるので、必ずしも質の良いマススペクトルが得られる訳ではなかった。また、濃縮以外を目的として、測定対象分子を含む試料を載せる前のプレート表面の態様とプレート表面での測定試料の調製方法の両方に同時に着目し、優れたスイートスポットを得る方法は殆どなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００８−２６１８２４号公報
【特許文献２】特開２００８−２６１８２５号公報
【特許文献３】特開２００１−０１３１１０号公報
【特許文献４】特開２００８−０５１７９０号公報
【特許文献５】ＷＯ２００６／１０９４８５号公報
【特許文献６】特開２００６−１８９３９１号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Snovida,S.I. et al.，J.Am.Soc. Mass spectrom.19 (2008) 1138-1146.
【非特許文献２】Fukuyama,Y. et al.，Anal.Chem. 80 (2008) 2172-2179.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、一般に用いられているＭＡＬＤＩ法用のマトリックスにも適用可能で、レーザー照射時の測定対象分子を含む試料のイオン生成量やイオン化効率を、従来法と比べて向上できる質量分析法を提供することにある。【００１６】
更に、具体的には、スイートスポットを現出させ易い、又はスイートスポットを多く若しくは広く現出させる測定試料をプレート上に調製し、多段階ＭＳ（ＭＳｎ（２≦ｎ））測定をも可能にする、それを用いた質量分析法を提供することにあり、それによって、測定対象分子を含む試料が極めて微量であっても、イオン化効率や測定の再現性を向上させることによって、信頼性の高い化学構造についての情報を得ることができる質量分析法を提供することにある。【００１７】
また、特に、糖、糖タンパク質、糖ペプチド等の微量な「生体由来の分子又は生体試料中の分子」に適用して、その機能解明や病態の解明に有用な情報を好適に得ることができる質量分析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、測定プレート上に測定試料を調製するときに、プレート上に、まずマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成し、次いで、該起点に接する領域に試料やマトリックス溶液を載置し、該マトリックス溶液を乾燥させることによって、該起点から結晶を析出させることができ、その起点の周辺部分が、イオン化効率に優れたスイートスポットとなることを見いだした。この時に、より小さい面積にマトリックス結晶を作成するよりも、むしろ、広がりをもって結晶化させた方が有用であることを発見した。【００１９】
また、測定対象分子を含む試料を載せた後に、上記起点に接する領域に誘導体化剤を載せて測定対象分子と反応させ、次いで、マトリックス溶液を載置すれば、更に、その起点の周辺部分が、イオン化効率に極めて優れたスイートスポットとなることを見いだして本発明を完成するに至った。【００２０】
すなわち、本発明は、プレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成し、該起点に接する領域に、測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置し、又は測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置し、該マトリックス溶液を乾燥させて、該起点から該起点に接する領域に結晶を析出させた後、該起点の周辺部分からシグナルを得ることを特徴とする質量分析法を提供するものである。【００２１】
また、本発明は、上記の質量分析法において、測定対象分子を含む試料を載せた後、該起点に接する領域に誘導体化剤を載せて該測定対象分子と反応させ、次いでマトリックス溶液を載置する質量分析法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、前記問題点を解消し上記課題を解決し、ＭＡＬＤＩ法用に一般に用いられているマトリックスにも適用可能で、測定対象分子を含む試料のイオン生成量やイオン化効率を向上できる質量分析法を提供することができる。すなわち、優れたスイートスポットが存在する測定試料を用いた質量分析法を提供することができる。【００２３】
更に具体的には、試料を載せる前のプレートの態様と該プレート上での測定試料の調製方法を特定することによって、良好なスイートスポットを現出させ易い、又は良好なスイートスポットを多く若しくは広く現出させる質量分析法を提供することができる。その結果、通常の測定試料の調製方法では、分析可能な量未満になってしまうような微量試料しかない場合でも、質量分析が可能となり、また、量が十分あったときでも、より信頼性の高い化学構造情報を容易に確実に得ることができるようになる。【００２４】
また、本発明は微量な生体試料由来の分子や生体試料中の分子に適用できるので、例えば、糖、タンパク質（ペプチドを含む）、糖タンパク質（糖ペプチドを含む）、核酸、糖脂質等の分子の、化学構造解析はもちろん機能解明や病態の解明にも有用な情報をより好適に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例３において、測定対象分子を含むマトリックス結晶の析出の状態を示す光学顕微鏡写真（上の図）と、質量分析計のラスタースキャンによって、マトリックス結晶のどの位置から測定対象分子のシグナルが検出されるかについて調べた結果（下の図）である。
【図２】実施例１において、測定対象分子を含むマトリックス結晶の析出の状態を示す光学顕微鏡写真の図である。    左：［Ａｕの内径］＝０．９ｍｍ    右：[Ａｕの内径］＝０．６ｍｍ
【図３】実施例１において、質量分析計のラスタースキャンによって、マトリックス結晶のどの位置から測定対象分子のシグナルが検出されるかについて調べた結果である。    左：［Ａｕの内径］＝０．９ｍｍ    右：[Ａｕの内径］＝０．６ｍｍ
【図４】実施例２における、５ｆｍｏｌの試料での質量分析スペクトルを示す図である。
【図５】実施例２、比較例１及び参考例１の測定対象分子のシグナルと、参考例１の光学顕微鏡写真の図である。    ａ：実施例２において、［Ａｕの内径］＝１．４ｍｍの正円のとき、どの位置から測定対象分子のシグナルが検出されるかを示す図である。  ｂ：参考例１においてマトリックス溶液をスプレーしたとき、どの位置から測定対象分子のシグナルが検出されるかを示す図である。  ｃ：比較例１において、（「起点に接する領域」にマトリックス溶液を載置して乾燥することをせず）、起点から「起点に接する領域」に結晶を析出させなかったとき、どの位置から測定対象分子のシグナルが検出されるかを示す図である。  ｄ：参考例１において、測定対象分子を含むマトリックス結晶の析出の状態を示す光学顕微鏡写真の図である。
【図６】比較例１における、１０ｆｍｏｌの試料での質量分析スペクトルを示す図である。
【図７】比較例１における、マトリックス結晶の析出の状態を示す光学顕微鏡写真の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明について説明するが、本発明は以下の実施の具体的態様に限定されるものではなく、任意に変形して実施することができる。
【００２７】
本発明は、以下の工程（１）ないし（４）を必須工程として有することを特徴とする質量分析法である。工程（２）では、下記（２ａ）又は（２ｂ）の何れか一方が行われる。なお、本発明は、下記のそれぞれの工程の間に別の工程を挿入してもよく、また、下記の１つの工程の中であっても、下記されていない操作を付加させることもできる。
（１）プレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成し、
（２）該起点に接する領域に、
（２ａ）測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置し、又は
（２ｂ）測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置し、
（３）該マトリックス溶液を乾燥させて、該起点から該起点に接する領域に結晶を析出させた後、
（４）該起点の周辺部分からシグナルを得る。
【００２８】
＜工程（１）＞
本発明の質量分析法では、プレート上に、まずマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成することが必須である。
【００２９】
上記した「マトリックス結晶の析出が始まる起点」としては、例えば、以下のものが挙げられる。
（ａ）基板上の、素材の同一、相違によらず、微小な、きず、溝、穴、突起物等の部分上の点
（ｂ）試薬溶液や溶媒等が乾いた跡の部分上の点
（ｃ）誘電率の異なる領域の区切り上の点
（ｄ）素材の同一、相違によらず、基板上の段差部分を「区切り」とし、その区切り上の点。この場合。上記「起点に接する領域」は、段差の高い方にあっても、低い方にあってもよい。
（ｅ）基板上の段差部分の高い部分が膜で作られていて、膜の有り無しの区切り上の点。この場合、上記「起点に接する領域」が、膜の方であっても膜でない方であってもよい。また、膜はプレートの中部分にあって、膜上が上記「起点に接する領域」であっても、膜の中心部分がくり抜いてあって、くり抜かれた膜の無い部分が上記「起点に接する領域」であってもよい。
【００３０】
上記した「マトリックス結晶の析出が始まる起点」は、上記（ａ）及び（ｂ）のような部分上の点でもよいが、例えば、上記（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のような「該マトリックス溶液を通過させない区切り」上の点であることも好ましい。該マトリックス溶液を自由に通過させてしまうと、結晶化の起点が少なくなり、スイートスポットが多く存在するマトリックス結晶が析出し難くなる場合がある。上記マトリックス溶液を通過させない区切りが、該マトリックス溶液が実質的に流れ込まない不侵入領域との区切りであることが好ましい。本発明では、「起点に接する領域」の外部であって、マトリックス溶液が実質的に流れ込まない領域を「不侵入領域」という。
【００３１】
該「区切り」の形状は特に限定はなく、直線でも曲線でもよい。また、「区切り」が形作る形状も特に限定はないが、実質的に閉じた形状であることが好ましい。本発明においては、マトリックス溶液を乾燥させて、起点から「該起点に接する領域」に結晶を析出させた後、該起点の周辺部分からシグナルを得る。その際、「区切り」が実質的に閉じた形状であれば、その形状の内側、すなわち「該起点に接する領域」側に結晶を析出させる。「区切り」が実質的に閉じた形状であれば、その形状の外側が上記「不侵入領域」となる。
【００３２】
上記「実質的に閉じた形状」は、正円、楕円、雲型図形等の角のない図形でも、多角形、星型図形、ギザギザの周囲を有する図形等の角のある図形でも、何れでもよい。角のない図形の方が、マトリックス溶液を乾燥させたときに、該区切り上の点を起点として良好な結晶が析出し、スイートスポットが多くなる点で好ましい。特に好ましくは正円である。
【００３３】
上記区切り上の点が、マトリックス溶液を乾燥させた際にマトリックス結晶化の起点となる。すべてのマトリックス結晶が、上記区切り上の点を起点として析出する必要はないが、少なくとも、マトリックス結晶の幾つかは、かかる区切り上の点を起点として析出する。本発明は、かかる区切り上の点を起点として析出させたマトリックス結晶の中に、すなわち区切り上の点である起点の周辺部分に、優れたスイートスポットが多く存在することを見出してなされたものである。
【００３４】
上記した「起点の周辺部分」とは、マトリックス結晶が成長し始めた根元、すなわち起点から３００μｍ以内の部分をいう。好ましくは起点から２００μｍ以内に、特に好ましくは起点から１００μｍ以内に、優れたスイートスポットが多く存在する。起点から離れ過ぎると、優れたスイートスポットが存在しなくなったり、スイートスポットの数が少なくなったりする場合がある。特に、濃縮効果を目的としたプレートは、区切りから離れたところにマトリックス結晶が成長することが多い。また、上記した区切りがある場合には、マトリックス溶液は該起点に接する領域に載置するので、該起点から載置した方とは逆方向になると、そもそもマトリックス溶液が載置されていない場合（流れ込んでいない場合）がある。
【００３５】
本発明においては、プレート上に測定対象分子を含む試料を載せる前に、まずプレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成させる。かかる起点は、上記特性を有していることが好ましい。特に限定はないが、かかる特性を有する起点の具体的種類、及びかかる特性を有する起点の具体的作り方に関して以下に説明する。
【００３６】
＜＜（ｃ）について＞＞
本発明における「起点」が存在する「区切り」は、上記特性を有していれば特に限定はないが、具体的には例えば、誘電率が異なる区切りが挙げられる。更に、上記「区切り」の外側の上記不侵入領域の表面における誘電率が、上記該起点に接する領域の表面における誘電率より小さいことが特に好ましい。
【００３７】
上記不侵入領域の表面における誘電率を、その内側の表面（該起点に接する領域の表面）における誘電率より小さくして、マトリックス溶液が該区切りを通過させないようにすることによって、該マトリックス溶液が乾燥していく際、該区切り上の点を起点として、その周辺（特に該区切りの内部の周辺）に、極めて優れたスイートスポットを有する結晶を析出させることができる。
【００３８】
その点で、上記不侵入領域の表面における誘電率を、区切りの内側の領域における誘電率より小さくして、区切りの内側（区切り上の点である該起点に接する領域）に載置されたマトリックス溶液を、区切りの内側に閉じ込めることによって、区切り周辺で凹となるメニスカスはできず、該マトリックス溶液が乾燥していく際、該区切り上の点を起点として、極めて優れたスイートスポットを有する結晶を析出させることができる。
【００３９】
このような区切りを有するプレートとして、該区切りで囲まれた領域の表面が金属であり、上記不侵入領域の表面が有機基で修飾されているものが特に好ましい。以下に、その作製方法について説明する。ただし、このような区切りを有するプレートの作製方法としては、以下の具体的作製方法に限定される訳ではない。
【００４０】
プレート表面の有機基による修飾は、例えば、Ｍｉｃｒｏ・Ｃｏｎｔａｃｔ・Ｐｒｉｎｔｉｎｇ法（Ｈａｒｖａｒｄ大、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ・Ｖｏｌ．１０．１４９８〜１５１１（１９９４）に従って行うことができる。例えば、このようなポリジメチルシロキサン製の版材を準備し、この版材を、オクタデシルメルカプタンのエタノール希釈液に所定時間浸して風乾する。次いで、この版材を別途準備した金（Ａｕ）基板の表面に３秒間スタンプする。
【００４１】
このようにすれば、版材の上に存在する上記化合物のメルカプト基が金表面と反応してＡｕ−Ｓ結合を生じ、金表面にドーナツ型の自己組織化単分子膜（ＳＡＭｓ）を形成する。最後に、金基板をエタノールで洗浄、乾燥し、表面が有機基で修飾されたプレートを得ることができる。
【００４２】
金基板の表面を有機基で修飾する方法は、上記スタンプ法に限られず、スピンコート、ロールコート、スクリーン印刷等の各種塗布方法を採用することもできる。
【００４３】
ここで使用する基板の金属材料としては、チオールが吸着可能な金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム又はこれらの合金が使用可能である。これらの中でも、大気中で表面酸化が進行しない、安定に作製可能な金が実用上好ましい。
【００４４】
修飾に用いる上記有機基は、ブチル基、オクチル基、ドデシル基、ステアリル基等の任意の炭素数のアルキル基またはフッ素置換したアルキル基；フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基等の単環式のアリール基；ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、ベンゾチアゾリル基等の縮合多環式のアリール基等が挙げられる。また、一種類の有機基のみでなく、複数種類の有機基をプレート表面に導入することもできる。また、上記アルキル基にはアリール基が置換基として結合していてもよく、上記アリール基にはアルキル基が置換基として結合していてもよい。また、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＮ等の官能基が結合していてもよい。
【００４５】
マトリックス溶液の溶媒が水溶液である場合には、上記起点に接する領域の表面は親水性で、上記不侵入領域の表面は疎水性であることが、マトリックス溶液を区切りの内側に閉じ込める等のために好ましい。すなわち、区切りで囲まれた領域の表面の誘電率が、不侵入領域の表面の誘電率より大きいことが、上記状態を作り出せる点で好ましい。
【００４６】
具体的には、上記マトリックス溶液が水溶液であり、上記区切りで囲まれた領域（該起点に接する領域）の表面が金で修飾され、上記不侵入領域の表面がアルキル基又はアリール基で修飾されているプレートを用いることが特に好ましい。「金で修飾」とは、金めっきでもよいし、金属金自体であってもよい。また、「アルキル基又はアリール基」は、上記したような置換基が結合したものも含まれる。不侵入領域の表面の誘電率を調節できる点、マトリックス溶液を通過させないようにし易い点等から、特に好ましくは上記不侵入領域の表面がアルキル基で修飾されているプレートである。また、金表面を、区切りで囲まれた領域（起点に接する領域）としてそのまま残し、その外側をアルキル基又はアリール基（より好ましくはアルキル基）で修飾したプレートが特に好ましい。
【００４７】
＜＜（ｄ）について＞＞
上記したマトリックス溶液を通過させない区切りが、高さの異なる区切りであることも特に好ましい。すなわち、上記区切りで囲まれた領域と上記不侵入領域の高さが異なり、どちらかが高くなっていて、その高さの違いが区切りを形成していることも好ましい。高さの値や「高さの違いを形成する土手又は壁の角度」は特に限定されない。
【００４８】
＜＜（ｅ）について＞＞
上記マトリックス溶液を通過させない区切りが膜の有り無しであることも好ましい。かかる膜としては、特に限定はないが、プレートとは誘電率が異なる材質が好ましい。具体的には、シロキサン類、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、シリコーン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリレート、ポリメチルペンテン、１，３−シクロヘキサジエン系重合体等の膜が挙げられる。
【００４９】
基板上の段差部分の高い部分が膜で作られていて、膜の有り無しが区切りであって、その区切り上の点が、マトリックス結晶の析出が始まる起点となる。この場合、結晶が析出する上記「起点に接する領域」が、膜の方であっても膜でない方であってもよい。また、膜はプレートの中部分にあって、膜の表面が、結晶が析出する「起点に接する領域」であっても、膜の中心部分がくり抜いてあって、膜の無い表面部分が、上記「起点に接する領域」であってもよい。
【００５０】
＜＜プレート＞＞
本発明においては、試料やマトリックス等をプレート上に載せる前に、まずプレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成することは必須であるが、該プレート表面の材質に関しては、該起点に接する領域（結晶を析出させる領域）でも、それ以外の領域でも、特に限定はない。例えば、金、銀、白金、パラジウム、ステンレス等の金属若しくは合金；カーボン等が挙げられ、これらの表面は、有機物、無機物等で、分子レベルで修飾されていてもよい。
【００５１】
上記マトリックス結晶の析出が始まる起点は、０．０５ｍｍ〜１０ｍｍの外周上の点であることが好ましい。言い換えると、区切りの長さが０．０５ｍｍ〜１０ｍｍであり、その区切り上の点を起点とすることが好ましい。より好ましくは０．３ｍｍ〜９ｍｍであり、特に好ましくは３ｍｍ〜７ｍｍである。この範囲外だと、実施例にも示した通り、スイートスポットを有する良好な結晶が該起点の周辺部分に集中せず、結果として良好な測定試料が得られない場合がある。
【００５２】
＜工程（２）＞
次に、本発明の質量分析法の測定試料の調製方法を以下に説明する。すなわち、まず、
（２）該起点に接する領域に、
（２ａ）測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置し、又は
（２ｂ）測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置する。
上記工程（２）では、下記（２ａ）又は（２ｂ）の何れか一方が行われる。工程（２ａ）の中には、例えば、誘導体化剤を載せて該測定対象分子と反応させる、又はその後、更にこの誘導体化剤を洗浄する等、他の操作を挿入することもできる。
【００５３】
＜＜（２ａ）の方法＞＞
上記（２ａ）の方法では、測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置する。測定対象分子を含む試料は、単身で載せてもよいし溶液にして載せてもよい。溶液で載せた場合は、溶媒を蒸発させて除いてもよいし、溶媒を除かずにその上からマトリックス溶液を載置してもよい。測定対象分子を溶解する溶媒は、測定対象分子又は「測定対象分子を含む試料」を溶解するものならば特に限定はないが、水等が好ましい。
【００５４】
測定対象分子を含む試料は、プレート上の少なくとも上記起点に接する領域に載せればよく、上記起点に接する領域の外に載せてもよい。
【００５５】
（２ａ）の方法は、別の容器でマトリックス溶液と混合しその一部をプレートに滴下する必要がなく、測定対象分子を含む試料が極めて微量である場合に、その微量試料のほとんど全量を分析に供することができるため特に有用である。測定対象分子を含む試料が１００００ｆｍｏｌ（１０ｐｍｏｌ）以下の場合により有用であり、１０００ｆｍｏｌ（１ｐｍｏｌ）以下の場合により有用であり、１００ｆｍｏｌ（０．１ｐｍｏｌ）以下の場合に特に有用である。
【００５６】
（２ａ）の方法における「測定対象分子を含む試料溶液中における測定対象分子の濃度」は特に限定はないが、１ａｍｏｌ／μＬ〜１μｍｏｌ／μＬが好ましく、１００ａｍｏｌ／μＬ〜１ｎｍｏｌ／μＬが特に好ましい。溶媒を蒸発させた後（乾燥後）に、プレート上に存在する測定対象分子を含有する層の厚さは特に限定はないが、５μｍ以下が好ましく、１μｍ以下が特に好ましい。かかる層の厚さが厚すぎると、マトリックス溶液を滴下した場合にマトリックス分子とうまく混和しない可能性があり、シグナルが低下する場合がある。
【００５７】
（２ａ）の方法においては、測定対象分子を含む試料を載せた後に、マトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を上記プレートに滴下して乾燥する。「測定対象分子を含む試料を載せた後に」の意味は、「測定対象分子を含む試料を載せた直後に」には限定されず、他の工程が挿入されていてもよい。例えば、後述するように、測定対象分子を含む試料を載せた後に、上記起点に接する領域に誘導体化剤を載せて該測定対象分子と反応させ、ある場合には、更に過剰の誘導体化剤を洗浄し、その後にマトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を上記プレートに滴下して乾燥してもよい。
【００５８】
（２ａ）の方法においては、マトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を上記プレートに滴下して乾燥する。マトリックスとしては特に限定はなく、公知のものが使用可能であり、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（以下、「ＤＨＢＡ」と略記する）、１，５−ジアミノナフタレン、ｎｏｒｈａｒｍａｎ（９Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール）、ピレン誘導体等が挙げられる。
【００５９】
上記溶媒は、用いるマトリックスを溶解するものであれば特に限定はないが、例えば、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、それらの混合物等が挙げられる。ここでの溶媒は、マトリックスのみならず、測定対象分子も少なくともその一部は溶解するものが好ましく、用いた溶媒で測定対象分子の大部分を溶解できるものであることが特に好ましい。測定対象分子とマトリックスの何れをも溶解できる溶媒を用いることによって、下層の測定対象分子がマトリックス分子と共に溶媒に溶解し、下層の測定対象分子が測定試料の表面に移動し、そこが優れたスイートスポットになる。
【００６０】
本発明では、プレート状の上記起点に接する領域にマトリックス溶液を載置することが必須であるが、上記「区切り」で囲まれた領域のみにマトリックス溶液を載置することが好ましい。特に好ましい態様は、該起点に接する領域の一部に、該マトリックス溶液を滴下することによって、該マトリックス溶液が上記「区切り」で囲まれた領域全体に広がり、その結果、上記「区切り」で囲まれた領域のみにマトリックス溶液を載置されることである。こうすることによって、該マトリックス溶液を乾燥させたとき、該区切り上の点を起点として結晶が析出し易くなり、該起点の周辺部分がスイートスポットになる。
【００６１】
上記「区切り」で囲まれた領域のみにマトリックス溶液を載置する場合のマトリックス溶液の体積は、上記「区切り」で囲まれた領域の面積に応じて調整することが好ましいが、例えば、該上記「区切り」で囲まれた領域が直径１．４ｍｍの正円であるならば、０．２μＬ〜２０μＬが好ましく、０．３μＬ〜２μＬがより好ましく、０．５μＬ〜１μＬが特に好ましい。該上記「区切り」で囲まれた領域の面積が上記面積から増減した場合は、その面積に比例して、載置するマトリックス溶液の体積を増減することが好ましい。
【００６２】
上記マトリックス溶液の濃度は特に限定はないが、０．１〜１０００ｍｇ／ｍＬが好ましく、１〜３００ｍｇ／ｍＬがより好ましく、１０〜１００ｍｇ／ｍＬが特に好ましい。上記したように、載置するマトリックス溶液の体積は上記「区切り」で囲まれた領域の面積に応じて調整し、その上で、マトリックス溶液の濃度は上記「区切り」で囲まれた領域の周囲の長さ（すなわち、上記「区切り」の長さ）に比例して、増減させて決定することが好ましい。そうすることによって、起点の周辺部分に存在するマトリックスの絶対量を調節できる。
【００６３】
＜＜＜（２ａ）の方法中で誘導体化剤を使用した（２ａ’）の方法＞＞＞
更に、本発明は、上記工程（２）で（２ａ）の方法を採用し、かつ、工程（２ａ）において、測定対象分子を含む試料を載せた後であり、マトリックス溶液を載置する前に、上記「区切り」で囲まれた領域に誘導体化剤を載せて該測定対象分子と反応させることが、測定対象分子を含む試料のイオン生成量やイオン化効率を向上できるために好ましい。
【００６４】
すなわち、本発明においては、以下の工程を有する質量分析法が好ましい。
（１）プレート上にマトリックス結晶化の起点となる閉じた区切りを形成し、
（２）該区切りで囲まれた領域に、
（２ａ’）測定対象分子を含む試料を載せた後、該区切りで囲まれた領域に誘導体化剤を載せて測定対象分子と反応させ、次いでマトリックス溶液を載置し、
（３）該マトリックス溶液を乾燥させて該区切り上の点を起点として結晶を析出させた後、
（４）該起点の周辺部分からシグナルを得ることを特徴とする質量分析法。
【００６５】
また、上記工程（２ａ’）は、誘導体化剤を載せて測定対象分子と反応させた後であってマトリックス溶液を載置する前に、誘導体化剤を洗浄する工程を含んでもよい。
【００６６】
誘導体化剤を、予め測定対象分子と反応させてからプレートに供給すると、試料のロスに繋がる場合がある。従って、糖、糖タンパク質、糖ペプチド等の微量な「生体由来の分子又は生体試料中の分子」に質量分析法を適用する場合、（２ａ’）の方法、すなわち、測定対象分子を含む試料を載せた後であり、マトリックス溶液を載置する前に、上記区切りで囲まれた領域に誘導体化剤を載せて測定対象分子と反応させることが好ましい。
【００６７】
誘導体化剤は、誘導体化された測定対象分子すなわち質量分析に供される分子と反応して、イオン化効率を高めるものであれば特に限定はない。レーザー脱離イオン化法においてイオン化効率を高めるものであっても、エレクトロスプレーイオン化法においてイオン化効率を高めるものであってもよい。
【００６８】
かかる誘導体化剤の化学構造は上記効果を奏するものであれば特に限定はないが、その分子内にナフタレン、アントラセン、ピレン等の縮合多環を有する縮合多環化合物等が上記効果を好適に奏するので特に好ましい。ここで「縮合多環化合物」とは、窒素、硫黄又は酸素分子を含む複素環を一部に含んでいてもよい縮合多環部分と、測定対象分子とを結合することが可能である反応性官能基と、要すれば、該縮合多環部分と該反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物をいう。
【００６９】
誘導体化剤は、測定対象分子と反応することによって、誘導体化された分子すなわち質量分析に供される分子の、イオン化切断位置を制御できるようにするものであることが特に好ましい。
【００７０】
誘導体化剤は、アミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基、スクシニミジルエステル基、塩化スルホニル基、ヨード基（−Ｉ）等の反応性官能基を有することが好ましい。特に好ましい誘導体化剤としては、具体的には、ナフタレン環、アントラセン環、ピレン環等の縮合多環に、上記基が直接若しくは他の基（スペーサ部分）を介して結合した縮合多環誘導体化合物；ヨウ化メチル；ジアゾメタン；トリメチルシリルジアゾメタン等が挙げられる。
【００７１】
このうち、誘導体化された分子すなわち質量分析に供される分子のイオン化効率を高めたり、イオン化切断位置を制御できるようにしたりする点等で、ピレン環化合物が特に好ましい。ここで「ピレン環化合物」とは、ピレン環と、「測定対象分子」に結合することが可能である反応性官能基と、要すれば該ピレン環と該反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物をいう。
【００７２】
具体的には、１−ピレンブタン酸ヒドラジド（1-pyrenebutanoic acid, hydrazide）（以下、「ＰＢＨ」と略記する）、１−ピレン酢酸ヒドラジド（1-pyreneacetic acid, hydrazide）、１−ピレンプロピオン酸ヒドラジド（1-pyrenepropionic acid, hydrazide）、１−ピレン酢酸スクシニミジルエステル（1-pyreneacetic acid, succinimidyl ester）、１−ピレンプロピオン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester）、１−ピレンブタン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester）、Ｎ−（１−ピレンブタノイル）システイン酸スクシニミジルエステル（N-(1-pyrenebutanoyl)cysteic acid, succinimidyl ester）、Ｎ−（１−ピレン）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrene) iodoacetamide）、Ｎ−（１−ピレン）ヨードマレイミド（N-(1-pyrene) maleimide）、Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrenemethyl) iodoacetamide）、１−ピレンメチルヨードアセテート（1-pyrenemethyl iodoacetate）、アミノピレン（aminopyrene）、１−ピレンメチルアミン（1-pyrenemethyl amine）、１−ピレンプロピルアミン（3-(1-pyrenyl)propylamine）、１−ピレンブチルアミン（4-(1-pyrenyl)butylamine）、１−ピレンスルホン酸クロリド（1-pyrenesμＬfonyl  chloride）、１−ピレニルジアゾメタン（1-pyrenyldiazomethane）（以下、「ＰＤＡＭ」と略記する）、１−ピレンカルバルデヒド  ヒドラゾン（1-pyrenecarbaldehyde hydrazone）、１−ピレニルチオシアネート（1-pyrenylthiocyanate）、１−ピレニルイソチオシアネート（1-pyrenylisothiocyanate）等が好ましいものとして挙げられる。このうち最も好ましくはＰＢＨ又はＰＤＡＭである。
【００７３】
誘導体化剤としては、上記具体的化合物において、ピレン環を、ナフタレン環又はアントラセン環に代えたものも好ましいものとして挙げられる。また、ヨウ化メチル、ジアゾメタン又はトリメチルシリルジアゾメタンも好ましい。
【００７４】
好ましい「測定対象分子と誘導体化剤との組み合わせ」としては、測定対象分子がアルデヒド基、還元性水酸基等を含有する糖鎖を有する分子であり、誘導体化剤がアミノ基又はヒドラジド基等を有するものである場合が挙げられる。また、好ましい組み合わせとしては、測定対象分子が、カルボキシル基、アミノ基又はメルカプト基を有するタンパク質若しくは糖タンパク質であり、誘導体化剤が、アミノ基、ヒドラジド基又はジアゾメチル基等を有するものである場合が挙げられ、更に、測定対象分子が、カルボキシル基を有するタンパク質若しくは糖タンパク質であり、誘導体化剤がヨウ化メチル又はトリメチルシリルジアゾメタンである場合が挙げられる。これらの組み合わせは、測定対象分子及び誘導体化剤を、容易にプレート上で反応させることができる点、イオン化を阻害しない点、反応が選択的である点、一般に微量での分析の必要性が高いので、前記効果を奏し易い点等から好ましい。
【００７５】
測定対象分子と誘導体化剤の反応温度は特に限定はないが、４０〜１００℃で反応させることが好ましく、６０〜９０℃で反応させることが特に好ましい。室温より高い温度で反応させることによって、反応速度が増加するだけでなく、溶媒が乾く速度を高めることによって、区切りに接して反応生成物が残るようになるからである。この反応混合物の残存が区切り上に重なることによって、区切り上の点からマトリックスの結晶を析出させ、区切り上の点を起点とすることがより確実になる。
【００７６】
＜＜（２ｂ）の方法＞＞
工程（２）では、上記した（２ａ）の方法に代えて、（２ｂ）測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置してもよい。（２ｂ）の方法では、「Ｄｒｉｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ法」として知られている方法も可能である。
【００７７】
（２ｂ）の方法における溶媒としては特に限定はないが、例えば、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、それらの混合溶媒等が挙げられる。
【００７８】
（２ｂ）の方法における溶液の、測定対象分子の濃度及びマトリックスの濃度は特に限定はなく、それぞれ（２ａ）で上記した濃度で同時に含む溶液を用いればよい。
【００７９】
＜工程（３）＞
本発明においては、該マトリックス溶液を乾燥させて、該起点から該起点に接する領域に結晶を析出させる。工程（２）の後、（３）該マトリックス溶液を乾燥させて、上記区切り上の点を起点として結晶を析出させることが好ましい。乾燥方法は特に限定されないが、加温する、冷却する、風を送る、減圧する等によって乾燥を促進することが効果的な場合がある。この時に、界面張力を変化させるような分子が微量存在するとよい。例えば、区切りに存在するピレン標識されたペプチドや、洗浄後に微量に残っているピレン誘導体化剤等がよい。また、垂直に立てて乾燥させて、上記区切り上の点を起点として結晶を析出させることも、下方が結晶の起点を規定するので好ましい（実施例３参照）。
【００８０】
図２に特に好ましい態様の一例の光学顕微鏡写真を示すが、該区切り（図２の場合は正円）を起点として、結晶が上記区切り（正円）で囲まれた領域内に、特に該正円のほぼ中心に向かって成長しており、該区切り上の点を起点として結晶が析出していることが分かる。プレート上で、測定対象分子とマトリックスを含む溶液ができるが、その溶液が乾燥し始めて最初に析出しだした結晶表面に、意外にもスイートスポットが多い。本発明は、マトリックス結晶が析出し始めた場所に特異的にスイートスポットが多いことを見出してなされたものである。
【００８１】
＜工程（４）＞
本発明においては、上記起点の周辺部分からシグナルを得る。上記工程（３）の後、（４）区切り上の点である起点の周辺部分からシグナルを得ることが好ましい。図１、図３に示したように、区切り上の点である起点の周辺部分に特異的にスイートスポットが多い。このことは、マトリックス結晶の析出が始まる起点が、０．０５ｍｍ〜１０ｍｍの外周上の点であるとき顕著であり、０．３ｍｍ〜９ｍｍの外周上の点であるときより顕著であり、３ｍｍ〜７ｍｍの外周上の点であるとき特に顕著である。また、直径０．７ｍｍ〜２ｍｍの円周上の点であるである場合に更に顕著である（図３の「０．９ｍｍ」参照）。
【００８２】
＜測定対象分子＞
「測定対象分子」は特に限定はないが、生体由来の分子又は生体試料中の分子であることが好ましく、具体的には、糖、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、糖脂質等であることが、本発明の効果をより発揮できるので好ましい。「測定対象分子」としては、天然物から調製されるもの、天然物を化学的又は酵素学的に一部改変して調製されるものの他、化学的又は酵素学的に調製されるものも好ましい。また、生体に含まれる分子の部分構造を有するものや生体に含まれる分子を模倣して作製されたものも好ましい。また、質量分析法に用いるプレート上に載せる試料、すなわち、測定対象分子を含む試料としては、「測定対象分子」そのものだけでもよいし、「測定対象分子」を含むもの、例えば、生体の組織、細胞、体液や分泌物（例えば、血液、血清、尿、精液、唾液、涙液、汗、糞便等）等でもよい。すなわち、直接生体試料を用いてもよい。また、試料をプレート上に載せ、酵素処理等を行なって、測定対象分子を調製してもよい。
【００８３】
上記した分子は、分析に供される試料が少量である場合が多く、また特に、糖、糖タンパク質、糖脂質等の複合糖質等又はそれらから化学的若しくは酵素学的に遊離させて得たものは、分子量や組成が同一の異性体が複数存在するので、本発明の質量分析法は、それら分子の化学構造解析に対して特に上記効果を奏するので好ましい。
【００８４】
前記した調製方法で調製された測定試料は前記した本発明の効果を奏する。すなわち、かかる測定試料を質量分析法に供すれば、測定対象分子を含む試料のイオン生成量やイオン化効率を向上させることができる。すなわち、かかる測定試料には優れたスイートスポットが存在するので、質量分析法における感度、精度、再現性等が向上する。
【００８５】
＜質量分析法＞
イオン化に用いられるレーザーとしては、窒素レーザー（３３７ｎｍ）、ＹＡＧレーザー３倍波（３５５ｎｍ）、ＮｄＹＡＧレーザー（２５６ｎｍ）、炭酸ガスレーザー（２９４０ｎｍ）等が挙げられるが、窒素レーザーが好ましい。イオンの分離検出方法は特に限定はなく、二重収束法、四重極集束法（四重極（Ｑ）フィルター法）、タンデム型四重極（ＱＱ）法、イオントラップ法、飛行時間（ＴＯＦ）法等を用いて、イオン化した分子を質量／電荷比（ｍ／ｚ）に従って分離し検出する。好ましくは、ＱＩＴ−ＴＯＦである。
【００８６】
糖、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、糖脂質等の分子は、分子量や組成が同じ異性体を多く含むので、イオンの生成効率を向上させ、分子のフラグメント化をｎ回繰り返す方法（以下、「ＭＳｎ法」と略記することがある）が好ましい。本発明は、測定対象分子を含む試料が極めて微量でも測定が可能であるので、前記した測定試料に対しフラグメント化をｎ回繰り返すＭＳｎ法（２≦ｎ）に適用することが特に好ましい。ＭＳｎ法により、選択した標識を含むイオンを解析することで、分子中の結合位置等を決定できる。
【実施例】
【００８７】
以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。【００８８】
実施例１
プレートの作製
Ｍｉｃｒｏ・Ｃｏｎｔａｃｔ・Ｐｒｉｎｔｉｎｇ法に従って、プレート表面をオクタデシル基で修飾を行なった。具体的には、正円状にくりぬいたポリジメチルシロキサン製の版材を準備し、オクタデシルメルカプタンのエタノール希釈液（２ｍＭ）に１０分間浸して風乾した。次いで、別途準備した金（Ａｕ）基板に３秒間スタンプした。その後、金（Ａｕ）基板をエタノールで洗浄し、乾燥した。処理されずに金が残った部分が、それぞれ０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１．０ｍｍの円形のもの５種を作製した。【００８９】
以下、プレート上の円の内部（処理されずに金が残った部分）を「Ａｕ」と略記し、プレート上の円の外部であり、処理された部分を「Ｃ１８」と略記する。「Ａｕ」の円周が、本発明における「区切り」である。
また、基板が金以外のシリコン（ケイ素）（以下「Ｓｉ」と略記する）等の場合も、プレート上の円の外部であり、上記のように処理された部分を「Ｃ１８」と略記する。【００９０】
上記のように事前にマトリックス結晶の析出が始まる区切りを形成したプレート上に、測定対象分子として糖ペプチド（５ｆｍｏｌ〜５ｐｍｏｌ）を含有する溶液０．５〜２０μＬを載せ、乾燥させた。その上に、誘導体化剤としてＰＤＡＭ５００ｐｍｏｌ含有ＤＭＳＯ溶液０．２５μＬを滴下し、約５分にわたって８０℃に加熱して乾燥させることにより、ピレン誘導体化を行った。【００９１】
マトリックス溶液は、Ａｕの内径に応じて以下に示す濃度および液量のＤＨＢＡ水溶液を滴下し乾燥させた。
Ａｕの内径：外周の長さ：マトリックス溶液の濃度，マトリックス溶液の滴下量
０．６ｍｍ：１．９ｍｍ：  １５ｍｇ／ｍＬ，  ０．２５μＬ
０．７ｍｍ：２．２ｍｍ：  １８ｍｇ／ｍＬ，  ０．２５μＬ
０．８ｍｍ：２．５ｍｍ：  ２０ｍｇ／ｍＬ，  ０．２５μＬ
０．９ｍｍ：２．８ｍｍ：  １８ｍｇ／ｍＬ，  ０．３０μＬ
１．０ｍｍ：３．１ｍｍ：  １５ｍｇ／ｍＬ，  ０．４０μＬ【００９２】
マトリックス溶液の滴下量は、該区切りで囲まれた領域（Ａｕ）の面積に応じて、それぞれ好ましい範囲に調整した。また、マトリックス溶液の濃度は、滴下量を決定した上で、それを勘案して、更に上記区切りで囲まれた領域の周囲の長さ（すなわち、閉じた区切りの長さ、外周の長さ）に比例して増減させた。【００９３】
０．６ｍｍ〜１．０ｍｍの何れの場合でも、外側のＣ１８部分の表面には、糖ペプチドとマトリックスの結晶物は何れも形成されず、Ｃ１８とＡｕの区切り上の起点の周辺部分に結晶物が生成した。すなわち、正円状に結晶物が生成した。０．６ｍｍおよび０．９ｍｍ径を用いた時の試料・マトリックス結晶物の顕微鏡像を図２に示す。【００９４】
糖ペプチドとマトリックスの結晶物を質量分析計（ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ、島津製作所社製）のラスタースキャンによって、ポジティブおよびネガティブイオンを測定した。【００９５】
何れの内径のものでも、通常のステンレスプレートを用いた場合（以下の比較例参照）に比較して、５〜８倍シグナル強度が上昇した。０．６ｍｍ径では面積が小さいため、より濃縮されて若干のシグナル強度の向上が認められたが、測定点が限られるので、同一試料で測定を繰り返すＭＳｎ（ｎは２以上の整数）測定には不利であった。【００９６】
試料・マトリックス結晶物のどの位置からシグナルが検出されるかについて調べた結果、図３に示したように、０．６ｍｍでも、０．９ｍｍでも良好なシグナルが検出された。ただし、０．６ｍｍ径の場合では、特に結晶物の縁（区切りの周辺部分）にシグナルが集中しているわけではなかったが、０．９ｍｍ径では結晶物の外縁にそって、極めて良好なシグナル（スイートスポット）が多数検出された。このように、糖ペプチドのシグナルが結晶物の外縁（区切り上の起点の周辺部分）に検出されるのは、０．７ｍｍ径以上であった。【００９７】
マトリックス溶液が乾く様子を顕微鏡で観察すると、溶液はＣ１８の内縁である円周いっぱいに広がった液摘となった後は、その直径を保ったまま蒸発し、その界面から最も早く結晶物が析出し始めた。このようにして最初に結晶物が析出したところは糖ペプチドのシグナルが強かった。【００９８】
実施例２
実施例１と同様にして、内径１．４ｍｍ（外周４．４ｍｍ）となるように、ＡｕおよびＣ１８を配したプレートを作製した。実施例１と同様にして、糖ペプチドを滴下、乾燥し、ピレン誘導体化した。マトリックス溶液は、２０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢＡ水溶液０．５μＬを用いた。実施例１と同様にＭＳ測定を行った。【００９９】
図４にそのマススペクトルを示したが、従来のステンレスプレートで測定した場合（以下の比較例１参照）に比較して検出感度が極めて向上し、５ｆｍｏｌの試料でも良好なスペクトルを示し、ＭＳｎ（ｎは２以上の整数）測定が可能であった。【０１００】
顕微鏡で観察したところ、結晶物は１．４ｍｍ径の正円状に析出しており、かつ図５ａに示したように、シグナルが強く観察されるところはその正円の内部であり正円の縁にそって存在した。この結果は再現性がよく、Ｃ１８とＡｕの界面が結晶物の析出の起点を決定しており、結晶物の析出し始める界面すなわちＡｕの円の縁で、糖ペプチドのシグナルが強かった。【０１０１】
実施例３
実施例２と同様にして、糖ペプチドを滴下、乾燥し、ピレン誘導体化した。マトリックス溶液１０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢＡ水溶液０．７５μＬを載せた後、プレートを垂直に立てて室温で乾燥させ結晶物を析出させた。【０１０２】
実施例１と同様にＭＳ測定を行った。その結果、図１に示したように、区切りの下方から（矢印の部分）結晶物が析出し始めたが、その部分は糖ペプチドのシグナルも強いことが分かった。【０１０３】
実施例４
実施例２と同様にして、内径１．４ｍｍ（外周４．４ｍｍ）となるように、ＡｕおよびＣ１８を配したプレート、並びに、ＳｉおよびＣ１８を配したプレートを作製した。実施例２と同様にして、糖ペプチドを滴下、乾燥し、ピレン誘導体化した。
マトリックス溶液を滴下する前に、余剰の誘導体化剤（ＰＤＡＭ）を除くため、プレートを、誘導体化剤を溶解する溶媒に浸漬した。具体的には、キシレン（ＳＩＧＭＡ社製）を満たしたビーカーに２秒間浸し引き上げ、これを３回繰り返した。また、キシレンに代えてトルエン（ＳＩＧＭＡ社製）でも同様に行った。
余剰のＰＤＡＭが除去されたプレートは、その後十分に乾燥させた。マトリックス溶液は、１０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢＡ水溶液０．７５μＬを用いた。【０１０４】
実施例１と同様にＭＳ測定を行った。その結果、ＡｕでもＳｉでも、また、キシレンでもトルエンでも、結晶物は１．４ｍｍ径の正円状に析出しており、実施例２と同様に、シグナルが強く観察されるところはその正円の内部であり正円の縁にそって存在した。更に、これまでは、低ｍ／ｚ領域に誘導体化剤に由来するクラスターピークが強く検出されていたが、適度なキシレンまたはトルエン洗浄により、これらの誘導体化剤が効率良く取り除かれたため、ノイズの少ないマススペクトルを取得することができた。【０１０５】
比較例１
磨いて濃縮効果が期待されたステンレスプレートを用いて、実施例１と同様な操作であるが、ただし、４０℃に加熱して約３０分間乾燥させることにより、ピレン誘導体化を行い、ＭＳ測定を行った。【０１０６】
図７に示したように、２ｍｍ径の外側に溝があるが、マトリックス結晶はそこまで広がらず平らな面の中で生成した。区切りはあるが、区切りに接しないでマトリックス溶液が乾いた。その結果、糖ペプチド５ｆｍｏｌでは検出することは難しく、図６に示したように１０ｆｍｏｌでかろうじて検出した。しかし、この量ではＭＳ２測定はきわめて困難である。【０１０７】
この場合、多くは結晶物の外周は歪な円形であり正円になることはなかった。この結晶物では、図５ｃに示したように、シグナルが検出される部位が外周に多いが内部にも認められた。このように、通常の起点も、起点の存在する通常の区切りもないプレートでは、シグナルが強く検出されるところが特定されず、測定に時間がかかる、感度が低い等の問題があった。【０１０８】
参考例１
実施例２と同様に、１．４ｍｍとなるように、ＡｕとＣ１８を配したプレートを用いて、糖ペプチドを滴下、乾燥し、ピレン誘導体化した。【０１０９】
マトリックス溶液として５０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢＡ、７０％アセトニトリル溶液を、エアースプレーを用いて噴霧し乾燥させた。図５ｄに示したように、大きな結晶物とならずにドット状に析出した。この結晶物をＭＳ測定すると、図５ｂに示したように、外周に偏在せずに１．４ｍｍ径の円内に分散してシグナルが検出された。このことは、ピレン誘導体化後の糖ペプチドは、１．４ｍｍ径の円内に均一に分散していることが明らかになった。【０１１０】
上記の結果から、マトリックス溶液を載置前に、測定対象分子が区切り上の起点の周辺部分に局在化しているということではなく、実施例１、２の場合は、このＡｕ内に均一に分散している糖ペプチドをマトリックス溶液が溶解し、Ｃ１８とＡｕの区切り上の起点から、糖ペプチドとマトリックスの結晶物として析出し、その部分から良好なシグナルが検出されたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明の質量分析法は、イオン化効率の良いスイートスポットを多く含む測定試料を提供でき、それによって信頼性の高い化学構造についての情報を得ることができるので、微量な生体試料由来の分子や生体試料中の分子の化学構造解析はもちろん、機能解明や病態の解明の分野にも広く利用されるものである。【０１１２】
本願は、２００９年９月２日に出願した日本の特許出願である特願２００９−２０２１９７に基づくものであり、その出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。
【図４】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【国際調査報告】
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