(57)【要約】固相化工程と洗浄工程とを必要としない、液相において迅速かつ簡便に目的の物質の定量的な測定を可能とし、かつ、抗原を可視化することが可能な免疫測定法を提供することを課題とした。かかる課題を、（ａ）液相中で、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと、蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを、被検物質中の抗原に接触させる工程；又は液相中で、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと、蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを、被検物質中の抗原に接触させる工程；（ｂ）前記蛍光色素の蛍光強度を測定する工程；（ｃ）液相中の抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、被検物質に含まれる抗原量を算出する工程；を順次行い、被検物質中に存在する目的とする抗原の濃度を測定することにより解決した。
2011061944.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備え、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方が蛍光色素により標識されたキットであって、液相中の抗原濃度と上記蛍光色素の蛍光強度とが正の相関関係にあることを指標として、抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とすることを特徴とする抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項２】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとが結合した一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１記載の抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項３】
蛍光色素が、ローダミン系蛍光色素又はオキサジン系蛍光色素であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項４】
蛍光色素が、ＣＲ１１０、ＴＡＭＲＡ、又はＡＴＴＯ６５５であることを特徴とする請求項３記載の抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項５】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項６】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項７】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする抗原濃度測定・検出方法。
（ａ）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチド、又は、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを、
（ａ１）液相中で、被検物質中の抗原に接触させる工程；又は
（ａ２）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチド、又は、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを投与した被検非ヒト動物対象中の抗原に接触させる工程；又は
（ａ３）インビトロで、被検対象中の抗原に接触させる工程；
（ｂ）前記（ａ１）の場合には、蛍光色素の蛍光強度を測定し、
前記（ａ２）及び（ａ３）の場合には、前記蛍光色素の蛍光を検出する工程；
（ｃ）液相中の抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、前記（ａ１）の場合には、被検物質に含まれる抗原量を算出し、前記（ａ２）及び（ａ３）の場合には、被検対象に含まれる抗原を可視化する工程；
【請求項８】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとが結合した一本鎖抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗原濃度測定・検出方法。
【請求項９】
蛍光色素が、ローダミン系蛍光色素又はオキサジン系蛍光色素であることを特徴とする請求項７又は８記載の抗原濃度測定・検出方法。
【請求項１０】
蛍光色素が、ＣＲ１１０、ＴＡＭＲＡ、又はＡＴＴＯ６５５であることを特徴とする請求項９記載の抗原濃度測定・検出方法。
【請求項１１】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出方法。
【請求項１２】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相化工程及び洗浄工程を必要としない新規の抗原濃度測定方法や、かかる抗原濃度測定方法を行うためのキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原や抗体の濃度を測定する方法のうち、臨床診断、基礎研究や環境調査などに最も広く用いられている測定方法は、同一の抗原の異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を使用する、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（あるいはサンドイッチＲＩＡ法）と呼ばれる免疫測定法である。サンドイッチ法の詳細は以下に述べる通りである。第一段階として一次抗体と呼ばれるモノ／ポリクローナル抗体を測定用プレートに固定化し、そこに抗原を含む検体を注ぎ、一定時間反応させて抗体と抗原を結合させる。次に、第二段階として、抗体に結合した夾雑物や、プレートに非特異的に結合した抗原を洗浄液で洗浄して取り除く。第三段階として、予め酵素、蛍光色素あるいはラジオアイソトープなどのレポーター分子を結合させた標識二次抗体溶液を注ぎ、一定時間反応させ、一次抗体によって補足された抗原にさらに標識二次抗体を結合させる。反応後に、洗浄液で余分の標識抗体を取り除き、測定用プレートに結合したレポーター分子の量を酵素活性、蛍光あるいはラジオアイソトープなどで測定することにより検体中の抗原量を測定する。【０００３】
前述のように、通常のサンドイッチＥＬＩＳＡ法では、エピトープの異なる２種類の抗体が必要となるが、例えば、低分子化合物などを抗原とする場合には、異なるエピトープを認識する複数の抗体を作製することは困難である。このため、上田らは、１種類の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを用いた、オープンサンドイッチ法と呼ばれる、精度の高い低分子化合物の免疫測定法を確立した（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）。この方法は、抗原を特異的に認識する抗体のＶＨ領域ポリペプチド及びＶＬ領域ポリペプチドを調製し、一方のポリペプチドをレポーター分子で標識して標識化ポリペプチドとし、他方のポリペプチドを固相に固定して固定化ポリペプチドとし、抗原含有試料及び標識化ポリペプチドを固定化ポリペプチドに接触させ、固定化ポリペプチドに結合した標識化ポリペプチドのレポーター分子の量を測定する抗原濃度測定方法である。また、低分子化合物を測定するための測定法としては、免疫測定法の他にも液体クロマトグラフ法等があるが、高精度な測定機器が必要な上、被検体の必要量も多く、測定時間もかかり、しかも汎用性が低い。【０００４】
また、蛍光色素標識した抗体を用いて抗原の濃度を測定する免疫測定方法としては、抗体と抗原とをそれぞれ異なる蛍光色素により標識し、蛍光色素間で起こる蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の効率の変化を指標とした免疫測定法や（非特許文献３及び４）、蛍光標識した抗体にあらかじめ消光物質を混合することにより消光されていた抗体の蛍光が、目的検出物質の導入により増大する現象を用いるクエンチングによる効率の変化を指標とした免疫測定法や、蛍光色素で標識した抗体を用いて、標識抗体と測定対象物が凝集することにより起こる蛍光強度の減少を測定する蛍光免疫測定方法（特許文献３）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−７８４３６号公報
【特許文献２】特許第３７８４１１１号公報
【特許文献３】特開平１０−２８２０９８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】上田宏，薬学雑誌 27：71-80(2007)
【非特許文献２】Lim SL, et al., Anal Chem. 79(16): 6193-200(2007)
【非特許文献３】Iijima I. and Hohsaka T., Chembiochem. 17;10(6): 999-1006 (2009)
【非特許文献４】Kajihara D, et al., Nat Methods. 3(11): 923(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在までに知られている免疫測定法は、上述したように、いずれも抗体又は抗原を固相化する工程と、非特異的な標識化合物の吸着を除去するための洗浄工程とを必要とするものであった。これらの工程は作業が煩雑で時間が掛かる上に、結果のばらつきの原因となることから、固相化工程や洗浄工程を必要としない液相系免疫測定方法の開発が求められていた。本願発明の課題は、固相化工程と洗浄工程とを必要としない、液相において迅速かつ簡便に目的の物質の定量的な測定を可能とし、かつ、抗原を可視化することが可能な免疫測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはまず、異なる蛍光色素により標識された抗体ＶＨ及びＶＬを用いて、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）効率を指標とした抗体／抗原結合活性評価系の確立を試みた。ＦＲＥＴ測定には、蛍光色素ＣＲ１１０により標識した抗ＢＧＰ抗体軽鎖領域（ＣＲ１１０−ＶＬ）と、蛍光色素ＴＡＭＲＡにより標識した抗ＢＧＰ抗体重鎖領域（ＴＡＭＲＡ−ＶＨ）とを用い、抗原が存在しない場合はＣＲ１１０からＴＡＭＡＲへＦＲＥＴが生じないのに対して、抗原が存在する場合には、ＶＨとＶＬは抗原を介して三者複合体を形成し、ＣＲ１１０からＴＡＭＲＡへのＦＲＥＴが引き起こされると予想して、ＣＲ１１０−ＶＬと、ＴＡＭＲＡ−ＶＨ又は標識していないＶＨとを、異なる濃度のＢＧＰ抗原ペプチドとともにインキュベートし、ＣＲ１１０の蛍光強度の変化を蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により解析した。その結果、ＣＲ１１０−ＶＬとＴＡＭＲＡ−ＶＨとを反応させた場合には、ＣＲ１１０の蛍光強度はＢＧＰ抗原ペプチドの濃度依存的に低下したことから、ＣＲ１１０−ＶＬ及びＴＡＭＲＡ−ＶＨが、抗原ペプチドを介して結合して複合体を形成し、予想されたようなＣＲ１１０からＴＡＭＲＡへのＦＲＥＴが引き起こされることが確認された。【０００９】
一方、意外なことに、ＣＲ１１０−ＶＬと標識していないＶＨとを反応させた場合には、ＣＲ１１０の蛍光強度はＢＧＰ抗原ペプチドの濃度依存的に増加した。本発明者らは、同様の現象が標識したＶＨを用いた場合にも認められるかどうかを確認する目的で、ＴＡＭＲＡ−ＶＨと、ＣＲ１１０−ＶＬ又は標識していないＶＬとを、異なる濃度のＢＧＰ抗原ペプチドとともにインキュベートし、ＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化を解析した。その結果、ＴＡＭＲＡ−ＶＨと標識していないＶＬとを反応させた場合にも、ＴＡＭＲＡ−ＶＨの蛍光強度はＢＧＰ抗原ペプチドの濃度依存的に増加することが明らかとなった。これらの結果は全く予想外のものであり、ＶＬ及びＶＨが蛍光色素（ＣＲ１１０、ＴＡＭＲＡ）に対してクエンチャーとして作用しており、ＶＨ及びＶＬが抗原ペプチドを介して複合体を形成したときのみ、このクエンチが解消されて蛍光強度が増加するのではないかとの仮説を立てた。【００１０】
上記の仮説を基に、本発明者らは、クエンチング現象を利用した新たな測定方法（以後、「均一系蛍光免疫測定法(homogenous fluorescent based immunoassay)」と称することもある）の確立を試み、ＴＡＭＲＡ−ＶＨと異なる濃度のＢＧＰペプチドとを、標識されていないＶＬの存在又は非存在下で反応させ、蛍光強度を測定した。その結果、ＶＬの存在下では、ＴＡＭＲＡ−ＶＨの蛍光強度はＢＧＰペプチドの濃度依存的に増加し、ＶＬの存在／非存在下におけるＴＡＭＲＡ−ＶＨの蛍光強度の比（＋ＶＬ／−ＶＬ）を解析した結果から、高感度の均一系蛍光免疫測定法が構築できることを見い出した。さらに、発明者らは、蛍光色素としてＡＴＴＯ６５５を使用すること、スペーサーを介して蛍光色素をＶＨに標識することにより、上記「均一系蛍光免疫測定法」の感度が増加することを確認した。【００１１】
さらに、本発明者らは、ＶＨに存在する４つのトリプトファン（以下、Ｔｒｐ又はＷと表記することもある）をそれぞれフェニルアラニン（以下、Ｐｈｅ又はＦと表記することもある）に変異させた変異ＶＨを用いてクエンチ効果を確認する実験を行い、ＶＨのアミノ酸配列における第３６番目、第４７番目、第１０６番目（Kabatの番号付け系においては第１０３番目に対応）のトリプトファンが蛍光色素のクエンチャーとして作用していることを明らかにした。これらのトリプトファンは、マウス抗体ＶＨにおいて高度に保存されていることから、本発明の「均一系蛍光免疫測定法」を適用することにより、様々な抗体を用いた抗原の測定を行うことが可能であることがわかった。
本発明は、以上の知見に基づき完成するに至ったものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、液相において迅速かつ簡便に目的物質の定量的な測定が可能な免疫測定方法や、該測定方法による抗原の測定を行うためのキットを提供することができる。本発明の測定方法は、抗原と、抗体ＶＬ及びＶＨとの結合を、上記抗体ＶＬ又はＶＨに標識した蛍光色素の蛍光強度を指標として検出／測定する方法であって、上記抗体ＶＬとＶＨとが結合していない時、上記蛍光色素はクエンチされた状態にあり、上記抗体ＶＬ及びＶＨが抗原を介して結合した時、上記蛍光色素のクエンチが解消される、という新たな知見に基づいたものであって、従来の免疫測定法では不可欠であった固相化工程と洗浄工程とを必要としないため、ばらつきが少なく精度の高い測定結果を短時間で得ることができる。【００１３】
すなわち本発明は、（１）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備え、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方が蛍光色素により標識されたキットであって、液相中の抗原濃度と上記蛍光色素の蛍光強度とが正の相関関係にあることを指標として、抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とすることを特徴とする抗原濃度測定・検出用キットや、（２）抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとが結合した一本鎖抗体であることを特徴とする上記（１）記載の抗原濃度測定・検出用キットに関する。【００１４】
また本発明は、（３）蛍光色素が、ローダミン系蛍光色素又はオキサジン系蛍光色素であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の抗原濃度測定・検出用キットや、（４）蛍光色素が、ＣＲ１１０、ＴＡＭＲＡ、又はＡＴＴＯ６５５であることを特徴とする上記（３）記載の抗原濃度測定・検出用キットや、（５）抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出用キットや、（６）抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出用キットに関する。【００１５】
さらに本発明は、（７）（ａ）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチド、又は、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを、（ａ１）液相中で、被検物質中の抗原に接触させる工程；又は、（ａ２）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチド、又は、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを投与した被検非ヒト動物対象中の抗原に接触させる工程；又は（ａ３）インビトロで、被検対象中の抗原に接触させる工程；（ｂ）前記（ａ１）の場合には、蛍光色素の蛍光強度を測定し、前記（ａ２）及び（ａ３）の場合には、前記蛍光色素の蛍光を検出する工程；（ｃ）液相中の抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、前記（ａ１）の場合には、被検物質に含まれる抗原量を算出し、前記（ａ２）及び（ａ３）の場合には、被検対象に含まれる抗原を可視化する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする抗原濃度測定・検出方法に関する。【００１６】
また本発明は、（８）抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとが結合した一本鎖抗体であることを特徴とする上記（７）記載の抗原濃度測定・検出方法や、（９）蛍光色素が、ローダミン系蛍光色素又はオキサジン系蛍光色素であることを特徴とする上記（７）又は（８）記載の抗原濃度測定・検出方法や、（１０）蛍光色素が、ＣＲ１１０、ＴＡＭＲＡ、又はＡＴＴＯ６５５であることを特徴とする上記（９）記載の抗原濃度測定・検出方法や、（１１）抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出方法や、（１２）抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のＣＲ１１０標識抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチド（ＣＲ１１０−ＶＬ）、ＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチド（ＴＡＭＲＡ−ＶＨ）、及び、それらの複合体（ＣＲ１１０−ＶＬ／ＴＡＭＲＡ−ＶＨ）を模式的に示した図である。
【図２】異なる濃度のＢＧＰペプチドの存在下で、ＣＲ１１０−ＶＬ及びＴＡＭＲＡ−ＶＨを反応させて、４９０ｎｍの励起光を用いて蛍光スペクトルを測定した結果を示す図である。
【図３】異なる濃度のＢＧＰペプチドの存在下で、ＣＲ１１０−ＶＬ及びＴＡＭＲＡ−ＶＨを反応させて、５２５ｎｍ（Ｆ５２５）及び５７５ｎｍ（Ｆ５７５）の蛍光強度の変化を測定した結果を示す図である。
【図４】異なる濃度のＢＧＰペプチドの存在下で、ＣＲ１１０−ＶＬ及びＴＡＭＲＡ−ＶＨを反応させて５２５ｎｍ及び５７５ｎｍの蛍光強度を測定し、蛍光強度の比（Ｆ５７５／Ｆ５２５）の変化を解析した結果を示す図である。
【図５】本発明のＣＲ１１０標識抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチド、及び、ＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチドを、異なる濃度のＢＧＰペプチド存在下で反応させ、４８８ｎｍレーザーと５１０〜５６０ｎｍ蛍光フィルターを用いて蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により解析した結果を示す図である。図中、ＣＲ１１０−ＶＬはＣＲ１１０標識抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを、ＴＡＭＲＡ−ＶＨはＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチドを、ｗ．ｔ．−ＶＨは標識されていない抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチドをそれぞれ示す。
【図６】本発明のＣＲ１１０標識抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチド、及び、ＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチドを、異なる濃度のＢＧＰペプチド存在下で反応させ、５４３ｎｍレーザーと５６０〜６２０ｎｍ蛍光フィルターを用いて蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により解析した結果を示す図である。図中、ＣＲ１１０−ＶＬはＣＲ１１０標識抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを、ＴＡＭＲＡ−ＶＨはＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチドを、ｗ．ｔ．−ＶＬは標識されていない抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを示す。
【図７】本発明のＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチドと、異なる濃度のＢＧＰペプチドとを、標識されていない抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドの存在又は非存在下で反応させ、５４３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを用いて蛍光強度を測定した結果を示す図である。図中、＋ＶＬは標識されていない抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドの存在下で反応させた結果を、−ＶＬは標識されていない抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドの非存在下で反応させ蛍光強度を測定した結果をそれぞれ示す。
【図８】本発明のＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチドと、異なる濃度のＢＧＰペプチドとを、標識されていない抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドの存在又は非存在下で反応させ、蛍光強度の比（＋ＶＬ／−ＶＬ）を解析した結果を示す図である。
【図９】本発明の抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチド中に存在するトリプトファン残基について示した図である。抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとの複合体（ＶＨ／ＶＬ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、及び単独の抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチド（ＶＨ）の３次元構造予測モデルにおけるトリプトファン残基（Ｗ３３、Ｗ３６、Ｗ４７、Ｗ１０６）の位置を示す図である。なお、これらのトリプトファン残基の位置は、カバット（Kabat）の番号付け系ではそれぞれＶＨの第３３番目、第３６番目、第４７番目、第１０３番目のアミノ酸に対応する。
【図１０】野生型（ＷＴ）又は変異型抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチド（Ｗ３３Ｆ、Ｗ３６Ｆ、Ｗ４７Ｆ、Ｗ１０６Ｆ）と抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを、異なる濃度のＢＧＰペプチド存在下で反応させ、５４３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを用いて蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【図１１】野生型（ＷＴ）又は変異型抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチド（Ｗ３３Ｆ、Ｗ３６Ｆ、Ｗ４７Ｆ、Ｗ１０６Ｆ）と抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを、異なる濃度のＢＧＰペプチド存在下で反応させ、蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy；ＦＣＳ)により拡散時間（diffusion time）の変化を解析した結果を示す図である。
【図１２】スペーサー付加蛍光標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチド（Fluorescentlabeled ＢＧＰ−ＶＨ）と、抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチド（ＢＧＰ−ＶＬ）との複合体（Fluorescentlabeled ＢＧＰ−ＶＨ／ＶＬ）の３次元構造予測モデルを示す図である。
【図１３】スペーサー（ＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号４）を含む又は含まないＡＴＴＯ６５５標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチドと、抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを、異なる濃度のＢＧＰペプチド存在下で反応させ、蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【図１４】スペーサー（ＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号４）を含む又は含まないＡＴＴＯ６５５標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチドと、抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを、異なる濃度のＢＧＰペプチド存在下で反応させ、測定した蛍光強度の比を示す図である。
【図１５】本発明の蛍光標識抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを結合させた蛍光標識一本鎖抗体の３次元構造予測モデルを示す図である。
【図１６】本発明の蛍光標識抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを結合させた蛍光標識一本鎖抗体の１次元構造の模式図を示す図である。
【図１７】スペーサーを含む又は含まないＡＴＴＯ６５５標識抗ＢＧＰ一本鎖抗体と異なる濃度のＢＧＰペプチドとを反応させ、蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【図１８】スペーサーを含む又は含まないＡＴＴＯ６５５標識抗ＢＧＰ一本鎖抗体と異なる濃度のＢＧＰペプチドとを反応させ、測定した蛍光強度の比を示す図である。
【図１９】本発明のＡＴＴＯ６５５標識抗ＢＧＰ一本鎖抗体と異なる濃度のＢＧＰペプチドとを反応させ、蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ−III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）を用いて蛍光を検出した結果を示す図である。図中、ＦＬ９２は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるスペーサー配列を、２ＴＡＧはＭＸ（Ｘは蛍光標識アミノ酸）からなるスペーサー配列をそれぞれ示す。
【図２０】スペーサーを含む又は含まない蛍光標識抗ＢＧＰ一本鎖抗体と異なる濃度のＢＧＰペプチドとを反応させ、蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ−III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）を用いて蛍光を定量した結果を示す図である。図中、ＦＬ９２は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるスペーサー配列を、２ＴＡＧはＭＸ（Ｘは蛍光標識アミノ酸）からなるスペーサー配列をそれぞれ示す。
【図２１】スペーサーを含む又は含まない蛍光標識抗ＢＧＰ一本鎖抗体と異なる濃度のＢＧＰペプチドとを反応させ、蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ−III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）を用いて蛍光を検出した結果を示す図である。図中、ＦＬ９２は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるスペーサー配列を、２ＴＡＧはＭＸ（Ｘは蛍光標識アミノ酸）からなるスペーサー配列をそれぞれ示す。
【図２２】ＦＬ９２スペーサー（配列番号３）を含む蛍光標識抗ＢＧＰ一本鎖抗体と異なる濃度のＢＧＰペプチドとを反応させ、蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ−III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）及びＭＦ２０／ＦｌｕｏｒｏＰｏｉｎｔ−Ｌｉｇｈｔ（オリンパス社製）を用いて測定した蛍光強度の比を示す図である。
【図２３】スペーサーを含む又は含まないＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ一本鎖抗体と異なる濃度のＢＧＰペプチドとを反応させ、蛍光を検出した結果を示す図である。Ｇ３Ｓ（１）はＧＧＧＳを、Ｇ３Ｓ（２）はＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４）を、Ｇ３Ｓ（３）はＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１０）のスペーサー（リンカー）の配列をそれぞれ含むことを示す。
【図２４】ＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ一本鎖抗体タンパク質と、異なる濃度のＢＧＰとを、ＰＢＳＴ緩衝液および終濃度５０％ヒト血漿存在下で反応させ、蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【図２５】本発明のＡＴＴＯ６５５標識抗ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び異なる濃度のＢＰＡを、標識されていない抗ＢＰＡ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドの存在又は非存在下で反応させ、蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【図２６】ＡＴＴＯ６５５標識抗ＢＰＡ抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び異なる濃度のＢＰＡを、標識されていない抗ＢＰＡ抗体軽鎖可変領域ポリペプチドの存在又は非存在下で反応させ、測定した蛍光強度の比を示す図である。
【図２７】スペーサーを含む又は含まないＴＡＭＲＡ標識抗ＢＰＡ一本鎖抗体と異なる濃度のＢＰＡペプチドとを反応させ、蛍光を検出した結果を示す図である。Ｇ３Ｓ（２）はＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４）を、Ｇ３Ｓ（３）はＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１０）を、Ｇ３Ｓ（５）はＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１１）ののスペーサー（リンカー）の配列をそれぞれ含むことを示す。
【図２８】ＴＡＭＲＡ標識抗ＨＥＬ一本鎖抗体と異なる濃度のＨＥＬタンパク質とを反応させ、蛍光を検出した結果を示す図である。
【図２９】ＴＡＭＲＡ標識抗エストラジオール一本鎖抗体と異なる濃度のエストラジオールとを反応させ、蛍光を検出した結果を示す図である。
【図３０】ＴＡＭＲＡ標識抗ＳＡ一本鎖抗体と、異なる濃度のＢＳＡ又はＨＳＡとを反応させ、蛍光を検出した結果を示す図である。
【図３１】マウス抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列において、カバット（Kabat）の番号付け系で第３６番目、第４７番目、又は第１０３番目のトリプトファンが保存されていることを示す図である。Ａ）抗ＢＧＰマウス抗体重鎖可変領域の３次元構造予測モデル、及び、該抗ＢＧＰマウス抗体重鎖可変領域に含まれるトリプトファン残基のうちＷ３６、Ｗ４７、Ｗ１０６が特にクエンチングに関与している可能性を示す図である。
【図３２】多くの種類のマウス抗体重鎖可変領域において、Ｗ３３が高度に保存されていることを示す図である。
【図３３】多くの種類のマウス抗体重鎖可変領域において、Ｗ３６が高度に保存されていることを示す図である。
【図３４】多くの種類のマウス抗体重鎖可変領域において、Ｗ４７が高度に保存されていることを示す図である。
【図３５】多くの種類のマウス抗体重鎖可変領域において、Ｗ１０６が高度に保存されていることを示す図である。なお、上記のＶＨのアミノ酸配列におけるＴｒｐ１０６は、カバット（Kabat）の番号付け系においては第１０３番目の位置に対応するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の抗原濃度測定・検出用キットとしては、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備え、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方が蛍光色素により標識されたキットであって、液相中の抗原濃度と上記蛍光色素の蛍光強度とが正の相関関係にあることを指標として、抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とすることを特徴とする抗原濃度測定・検出用キット、すなわち、（１）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと、蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備えたキットであって、液相中の抗原濃度と上記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として抗原濃度を測定することができる抗原濃度測定用キットや、（２）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと、蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備えたキットであって、被検対象中の抗原量と上記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として抗原を可視化することができる抗原検出用キットや、（３）抗体重鎖可変領域ポリペプチドと、蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを備えたキットであって、液相中の抗原濃度と上記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として抗原濃度を測定することができる抗原濃度測定用キットや、（４）抗体重鎖可変領域ポリペプチドと、蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを備えたキットであって、被検対象中の抗原量と上記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として抗原を可視化することができる抗原検出用キットであれば特に制限されず、上記抗体軽鎖可変領域ポリペプチド及び上記抗体重鎖可変領域ポリペプチドは、同一の抗原分子を介して複合体を形成することが可能であれば、それぞれ独立した２つポリペプチド断片として調製されたものであってもよいし、リンカー等を介して融合した一本鎖抗体として調製されたであってもよい。また、上記抗原としては、上記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び上記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドにより特異的に認識される抗原であれば特に制限されず、例えば、タンパク質、ペプチド、糖質、脂質、糖脂質、低分子化合物等を挙げることができる。
【００１９】
本発明の抗原濃度測定・検出方法としては、（ａ）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチド、又は、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを、（ａ１）液相中で、被検物質中の抗原に接触させる工程；又は（ａ２）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチド、又は、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを投与した被検非ヒト動物対象中の抗原に接触させる工程；又は（ａ３）インビトロで、被検対象中の抗原に接触させる工程；（ｂ）前記（ａ１）の場合には、蛍光色素の蛍光強度を測定し、前記（ａ２）及び（ａ３）の場合には、前記蛍光色素の蛍光を検出する工程；（ｃ）液相中の抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、前記（ａ１）の場合には、被検物質に含まれる抗原量を算出し、前記（ａ２）及び（ａ３）の場合には、被検対象に含まれる抗原を可視化する工程；の（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする抗原濃度測定・検出方法、すなわち、液相中で、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと、蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを、被検物質中の抗原に接触させる工程（ａ１−１）；前記蛍光色素の蛍光強度を測定する工程（ｂ）；被検物質に含まれる抗原量を算出する工程、すなわち液相中の抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、被検物質に含まれる抗原量を算出する工程（ｃ）；を順次備えることを特徴とする抗原濃度測定方法（以下、「測定方法［Ｉ］」ということがある）や、液相中で、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと、蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを、被検物質中の抗原に接触させる工程（ａ１−２）；前記蛍光色素の蛍光強度を測定する工程（ｂ）；被検物質に含まれる抗原量を算出する工程、すなわち液相中の抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、被検物質に含まれる抗原量を算出する工程（ｃ）；を順次備えることを特徴とする抗原濃度測定方法（以下、「測定方法［II］」ということがある）や、抗体軽鎖可変領域ポリペプチド及び蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドを投与した被検非ヒト動物対象中の抗原に接触させる工程（ａ２−１）；（ｂ）前記蛍光色素の蛍光を検出する工程；（ｃ）被検非ヒト動物対象中の抗原量と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、被検対象に含まれる抗原を可視化する工程；を順次備えることを特徴とする抗原検出方法（以下、「非ヒト動物検出方法［Ｉ］」ということがある）や、抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを投与した被検非ヒト動物対象中の抗原に接触させる工程（ａ２−２）；前記蛍光色素の蛍光を検出する工程（ｂ）；被検非ヒト動物対象中の抗原量と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、被検対象に含まれる抗原を可視化する工程（ｃ）；を順次備えることを特徴とする抗原検出方法（以下、「非ヒト���物検出方法［II］」ということがある）や、インビトロで、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと、蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを、被検対象中の抗原に接触させる工程（ａ３−１）；前記蛍光色素の蛍光を検出する工程（ｂ）；被検対象中の抗原量と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、被検対象に含まれる抗原を可視化する工程（ｃ）；を順次備えることを特徴とする抗原検出方法（以下、「インビトロ検出方法［Ｉ］」ということがある）や、インビトロで、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと、蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを、被検対象中の抗原に接触させる工程（ａ３−２）；前記蛍光色素の蛍光を検出する工程（ｂ）；被検対象中の抗原量と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、被検対象に含まれる抗原を可視化する工程（ｃ）；を順次備えることを特徴とする抗原検出方法（以下、「インビトロ検出方法［II］」ということがある）であれば特に制限されず、上記抗体軽鎖可変領域ポリペプチド及び上記抗体重鎖可変領域ポリペプチドは、同一の抗原分子を介して複合体を形成することが可能であれば、それぞれ独立した２つポリペプチド断片として調製されたものであってもよいし、リンカー等を介して融合した一本鎖抗体として調製されたものであってもよい。また、上記抗原としては、上記抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び上記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドにより特異的に認識される抗原であれば特に制限されず、例えば、タンパク質、ペプチド、糖質、脂質、糖脂質、低分子化合物等を挙げることができる。
【００２０】
上記抗体重鎖可変領域ポリペプチドとしては、抗体重鎖遺伝子のＶ領域、Ｄ領域、及びＪ領域のエクソンによりコードされる抗体重鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列を含むものであれば特に制限されるものではなく、上記抗体重鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端側に、さらに任意のアミノ酸配列が付加されたものであってもよい。また、上記抗体重鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列としては、カバット（Kabat）の番号付け系で第３６番目、第４７番目、又は第１０３番目のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列であることが好ましく、具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列や、配列番号６に示されるアミノ酸配列を好適に例示することができる。
【００２１】
上記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとしては、抗体軽鎖遺伝子のＶ領域及びＪ領域のエクソンによりコードされる抗体軽鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列を含むものであれば特に制限されるものではなく、上記抗体軽鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端側に、さらに任意のアミノ酸配列が付加されたものであってもよい。また、上記抗体軽鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列としては、カバット（Kabat）の番号付け系で第３５番目のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列であることが好ましく、具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列や、配列番号７に示されるアミノ酸配列を好適に例示することができる。
【００２２】
抗体軽鎖可変領域ポリペプチド、抗体軽鎖可変領域ポリペプチド、及び、抗体軽鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域の両方を含む一本鎖抗体ポリペプチドは、公知の化学合成法、遺伝子組換え技術、抗体分子のタンパク質分解酵素による分解方法等を用いて調製することができるが、中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術により調製することが好ましい。遺伝子組換え技術により上記ポリペプチドを調製する場合には、抗体軽鎖可変領域又は抗体軽鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを好適なベクターに導入して発現ベクターを作製し、バクテリア、酵母、昆虫、動植物細胞などを宿主として用いた発現系や、無細胞翻訳系により目的のポリペプチドを発現させることができる。無細胞翻訳系においてポリペプチドの発現を行う場合は、例えば、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球等の無細胞抽出液に、ヌクレオチド３リン酸や各種アミノ酸を加えた反応液中で、ポリペプチドを発現させることができる。
【００２３】
上記蛍光色素としては、抗体重鎖可変領域ポリペプチド又は抗体軽鎖可変領域ポリペプチドに標識された状態でクエンチ（消光）されるものであれば特に制限されず、ローダミン、クマリン、Ｃｙ、ＥｖｏＢｌｕｅ、オキサジン、Carbopyronin、naphthalene、biphenyl、anthracene、phenenthrene、pyrene、carbazole等を基本骨格として有する蛍光色素やその蛍光色素の誘導体を例示することができ、具体的には、ＣＲ１１０：carboxyrhodamine 110：Rhodamine Green(商標名)、ＴＡＭＲＡ: carbocytetremethlrhodamine：TMR、ＡＴＴＯ６５５(商標名)、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ(商標名)：4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３(商標名)：4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-8-propionicacid、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ(商標名)：4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８(商標名)：4,4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０(商標名)：4,4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９(商標名)：4,4-difluoro-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１(商標名)：4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、Ｃｙ３(商標名)、Ｃｙ３Ｂ(商標名)、Ｃｙ３．５(商標名)、Ｃｙ５(商標名)、Ｃｙ５．５(商標名)、ＥｖｏＢｌｕｅ１０(商標名)、ＥｖｏＢｌｕｅ３０(商標名)、ＭＲ１２１、ＡＴＴＯ  ３９０（商標名）、ＡＴＴＯ  ４２５（商標名）、ＡＴＴＯ  ４６５（商標名）、ＡＴＴＯ  ４８８（商標名）、ＡＴＴＯ  ４９５（商標名）、ＡＴＴＯ  ５２０（商標名）、ＡＴＴＯ  ５３２（商標名）、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ（商標名）、ＡＴＴＯ  ５５０（商標名）、ＡＴＴＯ  ５６５（商標名）、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ（商標名）、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１（商標名）、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２（商標名）、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２（商標名）、ＡＴＴＯ  ６１０（商標名）、ＡＴＴＯ  ６１１Ｘ（商標名）、ＡＴＴＯ  ６２０（商標名）、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４（商標名）、ＡＴＴＯ  ６３３（商標名）、ＡＴＴＯ  ６４７（商標名）、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ（商標名）、ＡＴＴＯ  ６５５（商標名）、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２（商標名）、ＡＴＴＯ  ７００（商標名）、ＡＴＴＯ  ７２５（商標名）、ＡＴＴＯ  ７４０（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（商標名）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０（商標名）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−Ｘ（商標名）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ（商標名）、５（６）−ＴＡＭＲＡ−Ｘ（商標名）、５ＴＡＭＲＡ（商標名）、ＳＦＸ（商標名)を挙げることができるが、中でも、ローダミン系蛍光色素であるＣＲ１１０やＴＡＭＲＡ、及びオキサジン系蛍光色素であるＡＴＴＯ６５５を特に好適に挙げることができる。
【００２４】
蛍光色素により、抗体軽鎖可変領域ポリペプチド及び抗体重鎖可変領域ポリペプチドを標識する方法としては特に制限されず、ポリペプチドの両端又は側鎖の官能基を利用して直接又は架橋剤を介して間接的に標識する方法や、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を利用してポリペプチドを合成しながら部位特異的に標識する手法等を用いることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を利用して標識する方法としては、アンバーサプレッション法（Ellman J et al.(1991)Methods Enzymol.202:301-36）、Ｃ末端標識法（特開２０００−１３９４６８号公報）、Ｎ末端標識法（米国特許第５，６４３，７２２号公報、Olejnik et al.(2005)Methods 36:252-260）等が知られており、アンバーサプレッション法では、標識のターゲット部位のアミノ酸をコードするコドンを、終止コドンの一つであるアンバーコドンに置き換えたＤＮＡ又はｍＲＮＡを作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて該ＤＮＡ又はｍＲＮＡからタンパク質を合成する。その際、タンパク質合成反応液に標識された非天然アミノ酸を結合させたサプレッサーｔＲＮＡを添加することで、アンバーコドンに置換した部位に標識アミノ酸が導入されたタンパク質を合成することができる。また、Ｃ末端標識法では、標識したピューロマイシンを最適濃度で添加したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系において、ＤＮＡ又はｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を行うことにより、Ｃ末端特異的に標識が導入されたタンパク質を合成することができる。
【００２５】
上記本発明の抗原濃度測定・検出用キットは、緩衝液、測定用のチューブ又はプレート、標準物質として使用できる抗原等、通常この種の免疫測定キットに用いられる試薬や器具を含んでいてもよい。かかる本発明の抗原濃度測定・検出用キットは、本発明の抗原濃度測定・検出方法に好適に用いることができる。
【００２６】
上記本発明の測定方法［Ｉ］における工程（ａ１−１）においては、緩衝液や生理食塩水等の溶液に、抗体軽鎖可変領域ポリペプチド及び蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドをそれぞれ加えた後に、被検物質を加えてインキュベートし、溶液中で抗体軽鎖可変領域ポリペプチド／蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチド／抗体により特異的に認識される抗原からなる三者複合体を形成させる。また、上記測定方法［II］における工程（ａ１−２）においては、緩衝液や生理食塩水等の溶液に、抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを、それぞれ加えた後に、被検物質を加えてインキュベートし、溶液中で抗体重鎖可変領域ポリペプチド／蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチド／抗体により特異的に認識される抗原からなる三者複合体を形成させる。上記被検物質としては、測定対象となるターゲット抗原を含む可能性がある血清、血漿、唾液、尿等の体液、培養上清、細胞抽出液、菌体抽出液、工業廃水を挙げることができる。また、上記インキュベート条件としては、抗体抗原反応に一般的に用いることのできる条件であれば特に制限されず、温度条件は、例えば１〜３０℃、好ましくは１８〜２５℃、反応時間は、例えば、５〜１８０分、好ましくは６０〜１２０分とすることができる。インキュベート終了後の溶液は、洗浄などの工程を経ることなく、そのまま以下の工程（ｂ）に供することができる。このことが本発明の抗原濃度測定・検出方法の大きな特徴の一つである。
【００２７】
上記本発明の測定方法［Ｉ］や測定方法［II］における工程（ｂ）においては、上記工程（ａ１−１）又は（ａ１−２）により調製された溶液に励起光を照射して溶液中の蛍光色素の蛍光強度を測定することができる。測定に用いる蛍光測定装置は特に制限されないが、例えば、ＭＦ２０／ＦｌｕｏｒｏＰｏｉｎｔ−Ｌｉｇｈｔ（オリンパス社製）やＦＭＢＩＯ−III（日立ソフトウエアエンジニアリング社製）等を好適に挙げることができる。また、測定の際には、上記工程（ａ１−１）により調製された溶液のネガティブコントロールとして、１）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを含まない、蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドのみを含む溶液、２）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを含まない、蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドと被検物質のみを含む溶液、３）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドを含み、被検物質を含まない溶液、４）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと標識されていない抗体重鎖可変領域ポリペプチドと被検物質を含む溶液、等を測定することが好ましく、上記工程（ａ１−２）により調製された溶液のネガティブコントロールとして、１）抗体重鎖可変領域ポリペプチドを含まない、蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドのみを含む溶液、２）抗体重鎖可変領域ポリペプチドを含まない、蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと被検物質のみを含む溶液、３）抗体重鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを含み、被検物質を含まない溶液、４）抗体重鎖可変領域ポリペプチドと標識されていない抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと被検物質を含む溶液、等を測定することが好ましい。
【００２８】
上記本発明の測定方法［Ｉ］や測定方法［II］における工程（ｃ）においては、上記工程（ｂ）により得られた蛍光強度の測定値から、被検物質に含まれる抗原量を算出することができる。すなわち、上記工程（ａ１−１）又は（ａ１−２）により調製された溶液中の抗原濃度と、工程（ｂ）により測定された蛍光強度とは正の相関関係にあるので、濃度既知の抗原を含む被検物質を用いたときの蛍光強度を測定して抗原濃度と蛍光強度との関係を示す標準曲線を作成し、この標準曲線から濃度未知の抗原を含む被検物質を用いたときの蛍光強度の測定値に対応する抗原濃度を算出することにより、被検物質に含まれる抗原量を求めることができる。また、工程（ｃ）における「抗原量を算出する」には、標準曲線に基づいてあらかじめ設定された変換式等により自動的に抗原量が算出される場合も含まれる。
【００２９】
上記本発明の非ヒト動物検出方法［Ｉ］における工程（ａ２−１）においては、抗体軽鎖可変領域ポリペプチド及び蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドを、被検非ヒト動物対象に投与し、被検非ヒト動物対象中で抗体軽鎖可変領域ポリペプチド／蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチド／抗体により特異的に認識される抗原からなる三者複合体を形成させる。また、上記非ヒト動物検出方法［II］における工程（ａ２−２）においては、抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを、全身又は局所的に被検非ヒト動物対象に投与し、被検非ヒト動物対象中で抗体重鎖可変領域ポリペプチド／蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチド／抗体により特異的に認識される抗原からなる三者複合体を形成させる。上記被検非ヒト動物対象としては、ヒト以外の動物であれば特に制限されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、サル、ブタ等を好適に挙げることができる。また、上記「投与」方法としては筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、埋込み、塗布等の非経口的な局所投与方法や、経口的な投与方法の中から適宜選択することができる。
【００３０】
上記本発明の非ヒト動物検出方法［Ｉ］や非ヒト動物検出方法［II］における工程（ｂ）においては、上記工程（ａ２−１）又は（ａ２−２）において、いずれか一方が蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチド及び抗体重鎖可変領域ポリペプチドを投与された被検非ヒト動物対象中の蛍光色素の蛍光を個体のまま非侵襲的に検出したり、上記被検非ヒト動物対象から採取した組織又は細胞中の蛍光色素の蛍光を検出する。上記「検出する」方法としては、被検非ヒト動物対象の個体、組織、又は細胞に励起光を照射して、蛍光色素の蛍光を２次元又は３次元的に検出できる方法であれば特に制限されるものではない。また、検出の際には、内視鏡、Ｘ線、ＣＴ、ＭＲＩ、超音波、顕微鏡等を用いて、被検非ヒト動物対象の個体、組織、又は細胞の構造を示す画像を同時に作成することが好ましい。
【００３１】
上記本発明の非ヒト動物検出方法［Ｉ］や非ヒト動物検出方法［II］における工程（ｃ）においては、上記工程（ｂ）により得られた蛍光色素の蛍光を検出した結果から、被検非ヒト動物対象における抗原を可視化する。すなわち、被検非ヒト動物対象における抗原量と、工程（ｂ）により検出された蛍光の蛍光強度とは正の相関関係にあるので、被検非ヒト動物対象の個体、組織、又は細胞の構造を示す画像データと、工程（ｂ）により検出された蛍光の２次元又は３次元的画像とを比較することにより、抗原の局在（位置）を知ることができる。例えば、内視鏡を用いて検出する場合には、被検非ヒト動物対象の組織に可視光線を照射して観察可能な可視光画像を作成するとともに、該組織にどちらか一方が標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチド及び抗体重鎖可変領域ポリペプチドを塗布等により接触させた後に、標識された蛍光色素に対する励起光を照射して蛍光画像を作成し、上記化視光画像と蛍光画像とを比較することにより、組織中の抗原の局在を知ることができる。
【００３２】
上記本発明のインビトロ検出方法［Ｉ］における工程（ａ３−１）においては、インビトロで、抗体軽鎖可変領域ポリペプチド及び蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチドと、被検対象中の抗原とをインキュベートし、抗体軽鎖可変領域ポリペプチド／蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチド／抗体により特異的に認識される抗原からなる三者複合体を形成させる。また、上記インビトロ検出方法［II］における工程（ａ３−２）においては、インビトロで、抗体重鎖可変領域ポリペプチド及び蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと、被検対象中の抗原とをインキュベートし、抗体重鎖可変領域ポリペプチド／蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチド／抗体により特異的に認識される抗原からなる三者複合体を形成させる。上記被検対象としては、測定対象となるターゲット抗原を含む可能性がある培養細胞、組織切片、生体より採取された組織又は細胞等の他、ニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜等にブロットされた細胞抽出液等を挙げることができる。また、上記インキュベート条件としては、抗体抗原反応に一般的に用いるこのとのできる条件であれば特に制限されず、温度条件は、例えば１〜３０℃、好ましくは１８〜２５℃、反応時間は、例えば、５〜１８０分、好ましくは６０〜１２０分とすることができる。インキュベート終了後の溶液は、洗浄などの工程を経ることなく、そのまま以下の工程（ｂ）に供することができる。このことが本発明の抗原濃度測定・検出方法の大きな特徴の一つである。
【００３３】
上記インビトロ検出方法［Ｉ］やインビトロ検出方法［II］における工程（ｂ）においては、上記工程（ａ３−１）又は（ａ３−２）において、いずれか一方が蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチド及び抗体重鎖可変領域ポリペプチドとインキュベートさせた被検対象における蛍光色素の蛍光を２次元又は３次元的に検出する。上記「検出する」方法としては、蛍光顕微鏡や蛍光イメージアナライザー等を挙げることができる。
【００３４】
上記インビトロ検出方法［Ｉ］やインビトロ検出方法［II］における工程（ｃ）においては、上記工程（ｂ）により得られた蛍光色素の蛍光を検出した結果から、被検対象における抗原を可視化することができる。すなわち、被検対象における抗原量と、工程（ｂ）により検出された蛍光の蛍光強度とは正の相関関係にあるので、工程（ｂ）により検出された蛍光の２次元又は３次元的画像に基づいて、抗原の局在（位置）を知ることができる。
【００３５】
以下に示す実施例において、本発明を具体的且つ更に詳細に説明する。下記実施例は本発明の説明のためのものであり、これらの実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
１．抗ＢＧＰ抗体由来のＶＨ及びＶＬを用いた均一系蛍光免疫測定法の確立
（抗ＢＧＰ抗体Ｖ領域遺伝子発現ベクターの構築）
ヒトオステオカルシン（human Bone Gla Protein；ＢＧＰ）に対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号１）又は軽鎖可変領域（ＶＬ：配列番号２）領域をコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にａｍｂｅｒコドンを含むＰｒｏＸＴＭｔａｇ（ＭＳＫＱＩＥＶＮＸＳＮＥＴ（Ｘは蛍光標識アミノ酸）；配列番号３）のＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、ｐＩＶＥＸ２．３ｄベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）のＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIサイトへ組み込んだ。この構築した発現ベクターは、挿入したＶＨ又はＶＬのＮ末端にＰｒｏＸＴＭｔａｇ（ＭＳＫＱＩＥＶＮＸＳＮＥＴ（Ｘは蛍光標識アミノ酸）；配列番号３）が、Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇが、それぞれ付加されるよう設計されている。図１に、ＣＲ１１０標識抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチド（ＣＲ１１０−ＶＬ）、ＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチド（ＴＡＭＲＡ−ＶＨ）、及び、それらの複合体（ＣＲ１１０−ＶＬ／ＴＡＭＲＡ−ＶＨ）を模式的に示す。同様にして、ＴＡＧコドンをＴＴＴコドンに置換し、蛍光標識アミノ酸残基をフェニルアラニン残基に置換した野生型ＶＨ及びＶＬ発現ベクターを作製した。【００３７】
さらに、上記ＶＨ遺伝子に含まれる４つのトリプトファンコドン（ＴＧＧ；Ｔｒｐ３３，Ｔｒｐ３６，Ｔｒｐ４７，Ｔｒｐ１０６）をそれぞれフェニルアラニンコドン（ＴＴＴ）に置換した変異ＶＬ（Ｗ３３Ｆ、Ｗ３６Ｆ、Ｗ４７Ｆ、Ｗ１０６Ｆ）発現ベクター、ＰｒｏＸｔａｇとＶＨ遺伝子のＮ末端との間にスペーサー（ＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号４）を付加したスペーサー付加ＶＨ発現ベクター、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子とをリンカー（ＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号５、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号９）により結合させた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）発現ベクター、ＰｒｏＸＴＭｔａｇとｓｃＦｖのＮ末端との間にスペーサー（ＧＧＧＳ、ＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号４又はＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号１０）配列を有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）発現ベクター、ＭＸ（Ｘは蛍光標識アミノ酸）をＮ末端に有するｓｃＦｖの発現ベクターもあわせて作製した。【００３８】
（標識抗ＢＧＰ抗体Ｖ領域タンパク質の作製）
RTS100 E.coli Disulfide Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、無細胞翻訳系によるＶ領域タンパク質Ｎ末端領域への蛍光標識アミノ酸の導入を行った。反応液（５０μＬ）は、７μＬのamino acid mix、１μＬのMethionine、７μＬのReactionmix、２５μＬのactivated E-coli Lysate、５μＬのplasmid DNA（５００ｎｇ）、５μＬの蛍光標識アミノアシル−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ（０．８ｎｍｏｌ）を加えた。蛍光標識タンパク質を作製するための蛍光標識アミノアシル−ｔＲＮＡ（ＴＡＭＲＡ−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ，ＣＲ１１０−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ，及びＡＴＴＯ６５５−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ）は、CloverDirectTM tRNA Reagents for Site-Derected Protein Functionalization（プロテインエクスプレス社製）を用いた。反応液は、２０℃，６００ｒｐｍ，２ｈで反応させた後、さらに、４℃、１６ｈの反応を行った。反応終了後、反応液１μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）を行い、蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ−III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）でタンパク質発現を観察した。さらに、Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、目的のタンパク質が合成されていることを確認した。【００３９】
合成したＶ領域タンパク質は、His-Spin Trap Column（ＧＥヘルスケア社製）により精製を行った。上記反応液（５０μＬ）に、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Phosphatebuffer（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ ＮａＣｌ／６０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／０．１％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）を加えて４００μＬとし、His-Spin Trap Columnへアプライした。室温で１５分間インキュベートした後にＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄を行った。次に２００ｕＬのＥｌｕｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Phosphate buffer（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／０．１％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）で２回溶出させた。さらに溶出液は、UltraFree-0.5 centrifugaldevices（ミリポア社製）を使用し、ＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）でバッファー交換、濃縮を行った。精製後のサンプルの濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＦＣＳ（ＭＦ２０；オリンパス社製）を用いて測定した。
【実施例２】
【００４０】
(蛍光スペクトル測定)
実施例１で作製したＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体ＶＨタンパク質及びＣＲ１１０標識抗ＢＧＰ抗体ＶＬタンパク質（それぞれ１μｇ／ｍＬ、３０μＬ）と、抗原となる７残基のＢＧＰのＣ末端ペプチド（ＲＲＦＹＧＰＶ；配列番号８）とを、ＰＢＳ（＋０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で計２００μＬになるように調製した。２５℃、９０分間放置した後に、蛍光分光光度計（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−４；ホリバ・ジョバンイボン社製）を用いて蛍光スペクトル測定を行った。励起波長は、ＣＲ１１０−ＶＬとＴＡＭＲＡ−ＶＨの混合物に対しては４９０ｎｍ、ＴＡＭＲＡ−ＶＨに対しては５５０ｎｍにセットした。ＣＲ１１０−ＶＬとＴＡＭＲＡ−ＶＨの混合物に対しては蛍光強度比ＩＡ／ＩＤを算出した。ＩＡとＩＤは、それぞれ５７５ｎｍと５２５ｎｍでの蛍光強度とした。解離定数（Ｋｄ）値は、蛍光強度比（ＩＡ／ＩＤ）もしくは最大蛍光波長の蛍光強度のカーブフィッテングにて算出した。その際、統計解析ソフトとしてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ社製）のsigmoidal dose-response modelを使用した。異なる濃度のＢＧＰペプチドの存在下で、ＣＲ１１０−ＶＬ及びＴＡＭＲＡ−ＶＨを反応させて、４９０ｎｍの励起光を用いて蛍光スペクトルを測定した結果を図２に、５２５ｎｍ及び５７５ｎｍの蛍光強度の変化を測定した結果を図３に、５２５ｎｍ及び５７５ｎｍの蛍光強度の比（Ｆ５７５／Ｆ５２５）の変化を解析した結果を図４にそれぞれ示す。スペーサーを含む又は含まないＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体ｓｃＦｖタンパク質（２μｇ／ｍＬ、２５μＬ）と、抗原であるＢＧＰペプチドとを、計２００μＬのＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％ＢＳＡ）となるようにサンプルを調製した。その後、サンプルを２５℃、７０分間放置した後に、蛍光分光光度計（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−４；ホリバ・ジョバンイボン社製）を用いて蛍光スペクトル測定を行い、蛍光強度をカーブフィッテングにて算出した。その際、統計解析ソフトとしてＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ(http://rsbweb.nih.gov/ij/)のsigmoidal dose-response modelを使用した。励起波長は５５０ｎｍ、測定波長は５８０ｎｍで測定を行った。
【００４１】
（蛍光強度分布解析法）
実施例１で作製した蛍光標識ＶＨタンパク質及び蛍光標識ＶＬタンパク質（それぞれ１μｇ／ｍＬ、７．５μＬ）、又は、蛍光標識ｓｃＦｖ（１μｇ／ｍＬ、７．５μＬ）を、ＢＧＰペプチドともにＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５０μＬになるように調製し、384-well Glass Bottom Microplate（オリンパス社製）に加え、２５℃で９０間インキュベートした。蛍光強度分布解析法（Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis；ＦＩＤＡ）による測定は、２５℃でＭＦ２０／ＦｌｕｏｒｏＰｏｉｎｔ−Ｌｉｇｈｔ（オリンパス社製）を用いて測定した。ＴＡＭＲＡとＡＴＴＯ６５５は、それぞれ５４３ｎｍと６３３ｎｍのレーザーで励起した。１測定で１０秒間データを取得し、１サンプルに対して１０回測定を行った。この測定値より平均値及び標準偏差を算出した。
【実施例３】
【００４２】
(ＴＡＭＲＡ−ＶＨ及びＣＲ１１０−ＶＬのＢＧＰペプチドへの結合活性評価)
まず、蛍光共鳴エネルギー転移法（ＦＲＥＴ）を利用した抗体／抗原結合活性評価系の確立を試みた。ＦＲＥＴ測定には、ＣＲ１１０とＴＡＭＲＡをそれぞれドナー、アクセプターとして使用した。ドナー（ＣＲ１１０）の蛍光とアクセプター（ＴＡＭＲＡ）の吸収は、十分な重なりを持っておりＦＲＥＴペアとして用いることができる。配向因子（κ２）を２／３とした際フェルスター距離（Ｒ０）は６２Åと計算され、この値はタンパク質の分子間相互作用を検出するのに適している。抗原が存在しない場合、ＶＬとＶＨ間の相互作用は弱いため、ＣＲ１１０からＴＡＭＡＲへＦＲＥＴは起きないのに対して、抗原が存在する場合には、ＶＨとＶＬは抗原と三者複合体を形成し、その結果、ＣＲ１１０からＴＡＭＲＡへのＦＲＥＴが引き起こされると予測される。【００４３】
抗原を介してＣＲ１１０−ＶＬとＴＡＭＲＡ−ＶＨとが結合することにより、ＣＲ１１０からＴＡＭＲＡへのＦＲＥＴが検出されるかどうかを確認する目的で、以下の実験を行った。ＣＲ１１０−ＶＬと、ＴＡＭＲＡ−ＶＨ又は標識されていないＶＨとを、異なる濃度のＢＧＰ抗原ペプチド（１〜１０，０００ｎｇ）とともにインキュベートし、ＣＲ１１０の蛍光強度の変化を蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により解析した。測定は、励起光として４８８ｎｍレーザーを用い、５１０〜５６０ｎｍ蛍光フィルターを用いて検出を行った。結果を図５に示す。ＣＲ１１０−ＶＬとＴＡＭＲＡ−ＶＨとを反応させた場合には、ＣＲ１１０の蛍光強度はＢＧＰ抗原ペプチドの濃度依存的に低下した。この結果から、ＣＲ１１０−ＶＬ及びＴＡＭＲＡ−ＶＨが、抗原ペプチドを介して結合して複合体を形成することにより、予想されたようなＣＲ１１０からＴＡＭＲＡへのＦＲＥＴが引き起こされることが確認された。一方、意外なことに、ＣＲ１１０−ＶＬと標識していないＶＨとを反応させた場合には、ＣＲ１１０の蛍光強度はＢＧＰ抗原ペプチドの濃度依存的に増加した。この結果から、ＶＬがＣＲ１１０に対してクエンチャーとして作用しており、ＣＲ１１０−ＶＬが単独で存在する場合にはＣＲ１１０の蛍光はＶＬによりクエンチされているが、ＣＲ１１０−ＶＬとＶＨ及び抗原ペプチドが三者複合体を形成した場合にはこのクエンチ効果が解消される可能性が推測された。【００４４】
このようなＶＬによるクエンチ効果が、ＶＨにおいても認められるかどうかを確認する目的で以下の実験を行った。ＴＡＭＲＡ−ＶＨと、ＣＲ１１０−ＶＬ又は標識していないＶＬとを、異なる濃度のＢＧＰ抗原ペプチド（１〜１０，０００ｎｇ）とともにインキュベートし、ＴＡＭＲＡの蛍光強度の変化を蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）により解析した。測定は、励起光として５４３ｎｍレーザーを用い、５６０〜６２０ｎｍ蛍光フィルターを用いて検出を行った。結果を図６に示す。ＴＡＭＲＡ−ＶＨとＣＲ１１０−ＶＬとを反応させた場合には、ＴＡＭＲＡの蛍光強度はＢＧＰ抗原ペプチドの濃度依存的に増加した。また同様に、ＴＡＭＲＡ−ＶＨと標識していないＶＬとを反応させた場合にも、ＴＡＭＲＡ−ＶＨの蛍光強度はＢＧＰ抗原ペプチドの濃度依存的に増加した。これらの結果から、ＶＬと同様に、ＶＨもＴＡＭＲＡに対してクエンチャーとして作用しており、ＴＡＭＲＡ−ＶＨが単独で存在する場合にはＴＡＭＲＡの蛍光はクエンチされているが、ＴＡＭＲＡ−ＶＨとＶＬ及び抗原ペプチドが三者複合体を形成した場合にはこのクエンチ効果が解消される可能性が推測された。以上の結果から、ＶＨ及びＶＬが蛍光色素に対してクエンチ効果を有すること、さらに、その効果はＶＨ／ＶＬ／抗原の三者複合体の形成に伴い解消されることが示唆された（図９）。
【実施例４】
【００４５】
（クエンチング現象を利用した抗原濃度の均一系蛍光免疫測定法の確立）
発明者らは、実施例３で明らかとなったクエンチ現象を利用することにより、新たな免疫測定法を確立することができるのではないかと考え、以下の実験を行った。ＴＡＭＲＡ−ＶＨと異なる濃度のＢＧＰペプチドとを、標識されていないＶＬの存在又は非存在下で反応させ、５４３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを用いて蛍光強度を測定した結果を図７に示す。ＶＬの存在下では、ＴＡＭＲＡ−ＶＨの蛍光強度はＢＧＰペプチドの濃度依存的に増加した。一方、ＶＬの非存在下では、ＴＡＭＲＡ−ＶＨの蛍光強度はいずれの濃度のＢＧＰペプチドを反応させた場合にも低いままであった。また、ＶＬの存在／非存在下におけるＴＡＭＲＡ−ＶＨの蛍光強度の比（＋ＶＬ／−ＶＬ）を解析した結果、解離定数Ｋｄ＝１．２ｘ１０−７［Ｍ］であった（図８）。以上の結果から、ＶＨ及びＶＬタンパク質によるクエンチ現象を利用した、全く新しい均一系蛍光免疫測定法が確立できたことが示された。
【実施例５】
【００４６】
(ＶＨ中のＴｒｐによるクエンチ効果の検討)
実施例３の結果から、抗原の滴定に対してＣＲ１１０の蛍光減少量よりもＴＡＭＲＡの蛍光増加量が高いことが明らかとなった。ＴＡＭＲＡはローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）系色素であり、これまでの研究によりローダミン系色素はトリプトファン（Ｔｒｐ）等のアミノ酸によりクエンチ（消光）されることが報告されている。そこで、発明者らは、ＶＨ中に存在するＴｒｐ残基がＴＡＭＲＡのクエンチングに関与していると推測し、ＴＡＭＲＡ−ＶＨが単独で存在する場合には、ＴＡＭＲＡの蛍光はその近傍に存在するＴｒｐ残基によりクエンチされているが、ＴＡＭＲＡ−ＶＨがＶＬ及び抗原と複合体を形成することにより、ＴＡＭＲＡ／Ｔｒｐ間の相互位置を変化させてクエンチを解消しているとの仮説を立てた。図９に示すように、ＶＨは４つのＴｒｐ残基（Ｔｒｐ３３、Ｔｒｐ３６、Ｔｒｐ４７、Ｔｒｐ１０６）を持つ。予想分子モデルによる解析では、Ｔｒｐ３３、Ｔｒｐ３６及びＴｒｐ１０６はＶＬとの疎水相互作用に関与しており、Ｔｒｐ３３はＢＧＰペプチドとの相互作用に関与していると予想された。これらのＴｒｐ残基がクエンチに影響を及ぼすかを検討する目的で、ＴｒｐをＰｈｅに置換した４種の変異型ＶＨを用いて以下の実験を行った。【００４７】
野生型又は変異型抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチド（Ｗ３３Ｆ、Ｗ３６Ｆ、Ｗ４７Ｆ、Ｗ１０６Ｆ）とＶＬとを、異なる濃度のＢＧＰペプチド存在下で反応させ、５４３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを用いて蛍光強度を測定した。結果を図１０及び表１に示す。変異体の蛍光標識ＶＨ単独の蛍光強度を測定した結果、野生型（ＷＴ）に比べＷ１０６ＦとＷ３６Ｆはそれぞれ３１％と２９％の蛍光の増加を示した。Ｗ４７Ｆは１１％の蛍光の増加を示した。一方でＷ３３Ｆは９％の減少を示した。これらの結果より、ＴＡＭＲＡの蛍光クエンチングに、主にＴｒｐ３６、Ｔｒｐ４７、及びＴｒｐ１０６が関与していることが明らかとなった。また、Ｗ３３Ｆ、Ｗ３６Ｆ、Ｗ１０６Ｆは、ＶＬ及びＢＧＰペプチドとともに反応させることにより、１．５倍、１．３倍、１．５倍の抗原濃度依存的な蛍光の増加をそれぞれ示した。ＴｒｐからＰｈｅへの変異により、抗原依存的なクエンチの解消が減少したというこれらの結果は、Ｔｒｐ３３、Ｔｒｐ３６、及びＴｒｐ１０６が部分的にクエンチに関与していることを示唆している。一方、Ｗ４７ＦはＢＧＰペプチド及びＶＬと反応させた場合にも全く蛍光の増加が認められなかった。ＦＣＳ測定による拡散時間（diffusion time）の解析結果（図１１）は、Ｔｒｐ４７の変異により抗体の結合活性が消失することを示していることから、ＶＨのＴｒｐ４７は抗体と抗原の結合に必須であることが示された。【００４８】
以上の結果から、Ｔｒｐ３３及びＴｒｐ１０６は、蛍光標識ＶＨ単独の蛍光の増加及び抗原濃度依存的な蛍光の増加量の減少の２つの点から、クエンチに重要なＴｒｐであることが確認できた。また、Ｔｒｐ４７は抗原濃度依存的なクエンチへの関与は不明であるが、抗原を介したＶＨ及びＶＬの複合体形成には非常に重要な部位であることが明らかとなった。なお、上記のＶＨのアミノ酸配列におけるＴｒｐ１０６は、カバット（Kabat）の番号付け系においては第１０３番目の位置に対応するものである。（Kabat, E. et al.,"Sequences of proteins of immunological interest, 5th edn.," U. S. Department of Health and Human Service, Public Service, National Institute of Health, Washington, DC, 1991.）【００４９】
【表１】
2011061944.tif 000003
【実施例６】
【００５０】
(オキサジン系蛍光色素及びスペーサー付加によるクエンチング効果の検討)
均一系蛍光免疫測定法の感度に及ぼす蛍光色素及びスペーサーの影響について検討した。クエンチングの効率は蛍光色素の種類に依存して大きく変化し、ローダミン系の色素よりも、オキサジン（Ｏｘａｚｉｎ）系の色素は効果的にクエンチされることが報告されている。そこで、発明者らは、オキサジン系蛍光色素であるＡＴＴＯ６５５を標識物質として使用したＡＴＴＯ６５５−ＶＨを作製して実施例４と同様の実験を行った。さらに、ＡＴＴＯ６５５とＶＨとの間にＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４）をスペーサーとして付加したＡＴＴＯ６５５−ＶＨ（＋ｓｐａｃｅｒ）を作製し、スペーサーの有無がクエンチ効果に及ぼす影響について検討した。図１２にスペーサー付加蛍光標識抗ＢＧＰ抗体重鎖可変領域ポリペプチド（Fluorescent labeled ＢＧＰ−ＶＨ）と、抗ＢＧＰ抗体軽鎖可変領域ポリペプチド（ＢＧＰ−ＶＬ）との複合体（Fluorescent labeled ＢＧＰ−ＶＨ／ＶＬ）の３次元構造予測モデルを示す。【００５１】
スペーサーを付加又は付加していないＡＴＴＯ６５５−ＶＨを用いて、実施例４と同様の実験を行った結果（図１３）、いずれの場合でもＡＴＴＯ６５５−ＶＨの蛍光強度はＢＧＰペプチドの濃度依存的に増加した。また、スペーサーを付加していないＡＴＴＯ６５５−ＶＨにより得られた蛍光強度は、ＴＡＭＲＡ−ＶＨを使用した時と比較して３倍であった。さらに、スペーサーの付加することにより、スペーサーを付加しないものと比較して蛍光強度が２倍程度増加することが明らかとなった。ＧＧＧＳスペーサーを付加することによりクエンチャーであるＴｒｐと蛍光色素間の距離が近づいたことが、このような蛍光強度の増加に影響したと考えられる。
また、ＶＬの存在／非存在下におけるＡＴＴＯ６５５−ＶＨの蛍光強度の比（＋ＶＬ／−ＶＬ）を解析した結果（図１４）、スペーサーを付加しない場合は解離定数Ｋｄ＝８．４ｘ１０−８［Ｍ］、スペーサーを付加した場合は解離定数Ｋｄ＝１．８ｘ１０−７［Ｍ］であった。解離定数が高いほど測定系の感度は高いと考えられるので、以上の結果は、蛍光色素とＶＨの間にスペーサーを設けることにより、より感度の高い測定系が確立できたことを意味している。
【実施例７】
【００５２】
（一本鎖抗体を用いた均一系蛍光免疫測定法の確立）
ＶＨとＶＬとを配列番号５又は配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるリンカーにより結合させた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を用いた均一系蛍光免疫測定法を確立する目的で以下の実験を行った。本発明の蛍光標識抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを結合させた蛍光標識一本鎖抗体の３次元構造予測モデルを図１５に、１次元構造を図１６に示す。ＶＨ及びＶＬのそれぞれのペプチド断片を用いた場合と同様に、蛍光標識ｓｃＦｖを用いた場合にも、ＢＧＰペプチドの濃度依存的な蛍光強度の増加が認められた。配列番号５のリンカーにより結合させたＡＴＴＯ６５５標識抗ＢＧＰ抗体ｓｃＦｖの結果を図１７〜２２に、配列番号９のリンカーにより結合させたＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体ｓｃＦｖの結果を図２３に示す。
【実施例８】
【００５３】
（ヒト血漿中での蛍光免疫測定）
ＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体ｓｃＦｖタンパク質（２μｇ／ｍＬ、６．２５μＬ）と、抗原であるＢＧＰペプチドを、５０％ヒト血漿を含むサンプルとなるよう、ＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％ＢＳＡ）で計５０ｕＬに調製した。その後、２５℃、９０分間放置した後に、蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ−III；日立ソフトウエアエンジニアリング社製）で観察した。励起波長は５３２ｎｍ、測定波長は５８０ｎｍで測定を行った。結果を図２４に示す。５０％のヒト血漿を含むサンプル中でもＢＧＰペプチドの濃度依存的な蛍光強度の増加が認められた。
【実施例９】
【００５４】
２．抗ＢＰＡ抗体由来のＶＨ及びＶＬを用いた均一系蛍光免疫測定法の確立
（抗ＢＰＡ抗体由のＶ領域遺伝子発現ベクターの構築）
抗ビスフェノールＡ（ＢＰＡ）抗体のＶＨ（配列番号６）をコードする遺伝子に、Ｎ末端にａｍｂｅｒコドンを含むＰｒｏＸＴＭｔａｇ（ＭＳＫＱＩＥＶＮＸＳＮＥＴ（Ｘは蛍光標識アミノ酸）；配列番号３）のＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、ｐＩＶＥＸ２．３ｄベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）のＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIサイトへ組み込んだ。この構築した発現ベクターは、挿入したＶＨのＮ末端にａｍｂｅｒコドンを含むＰｒｏＸＴＭｔａｇ（ＭＳＫＱＩＥＶＮＸＳＮＥＴ（Ｘは蛍光標識アミノ酸）；配列番号３）が、Ｃ末端にＨｉｓ-ｔａｇが、それぞれ付加されるよう設計されている。また、同様にして抗ＢＰＡ抗体のＶＬ（配列番号７）をコードする遺伝子に、Ｎ末端ＰｒｏＸＴＭｔａｇのアミノ酸ＸがＦに置換されたＤＮＡ配列を付与し、ｐＩＶＥＸ２．３ｄベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）のＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIサイトへ組み込まれた。この構築した発現ベクターは、挿入したＶＬのＮ末端ＰｒｏＸＴＭｔａｇのアミノ酸ＸがＦに置換された配列が、Ｃ末端にＨｉｓ-ｔａｇが、付加されるよう設計されている。さらに、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子とをリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号９）により結合させた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）発現ベクター、ＰｒｏＸＴＭｔａｇとｓｃＦｖのＮ末端との間にスペーサー（ＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号４、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号１０又はＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号１１）を有する３種類の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）発現ベクターもあわせて作製した。【００５５】
（無細胞翻訳系による蛍光標識タンパク質の作製）
RTS100 E.coli Disulfide Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、無細胞翻訳系によるＶ領域タンパク質のＮ末端領域への蛍光標識アミノ酸の導入を行った。反応液（５０μＬ）は、７μＬのamino acid mix、１μＬのMethionine、７μＬのReaction mix、２５μＬのactivated E-coli Lysate、５μＬのplasmid DNA（５００ｎｇ）、５μＬのＡＴＴＯ６５５−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡamber（０．８ｎｍｏｌ）を加えた。蛍光標識タンパク質を作製するためのＡＴＴＯ６５５−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡamberは、CloverDirectTM tRNA Reagents for Site-Derected Protein Functionalization（プロテインエクスプレス社製）を用いた。反応液は、２０℃、６００ｒｐｍ、２ｈで反応を行い、その後４℃、１６ｈ反応を行った。反応終了後、反応液１μＬを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）を行い、蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ−III；日立ソフトウエアエンジニアリング社製）でタンパク質発現を観察した。さらにＨｉｓ-ｔａｇ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、目的のタンパク質が合成されていることを確認した。【００５６】
次に、His Spin Trap Column（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、合成したＶ領域タンパク質の精製を行った。上記反応液（５０μＬ）に、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Phosphate buffer（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／６０  ｍＭ  imidazole／０．１％  Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）を加えて４００μＬにし、His-Spin Trap Columnへアプライした。室温で１５分間インキュベートした後、Wash bufferで３回洗浄を行った。続いて、２００μＬのＥｌｕｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Phosphate buffer（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．５Ｍ  imidazole／０．１％  Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）で２回溶出させた。さらに、UltraFree-0.5 centrifugal devices（ミリポア社製）を使用して、溶出液のバッファーをＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）に交換するとともに濃縮を行った。サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＦＣＳ（ＭＦ２０；オリンパス社製）を用いて濃度測定を行った。
【実施例１０】
【００５７】
（蛍光スペクトル測定）
実施例９で作製したＡＴＴＯ６５５標識抗ＢＰＡ抗体ＶＨタンパク質及び標識されていない抗ＢＰＡ抗体ＶＬタンパク質（それぞれ１μｇ／ｍＬ、７．５μＬ）と、抗原であるＢＰＡとを、Ｔｏｔａｌ  ５０ｕＬの１０％ＭｅＯＨ  ｉｎ  ＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）となるように調製し、２５℃、９０分間放置した後に、蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ−III；日立ソフトウエアエンジニアリング社製）で観察した。励起波長は６３５ｎｍ、測定波長は６７０ｎｍで測定を行った。解離定数（Ｋｄ）値は、蛍光測定値のカーブフィッテングにて算出した。その際、統計解析ソフトとしてＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ社製）のsigmoidal dose-response modelを使用した。
スペーサーを含む又は含まないＴＡＭＲＡ標識抗ＢＰＡ抗体ｓｃＦｖタンパク質（２μｇ／ｍＬ、２５μＬ）と、抗原であるＢＰＡとを、計２００μＬのＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％ＢＳＡ、１％ＭｅＯＨ）となるようにサンプルを調製した。その後、サンプルを２５℃、１０分間放置した後に、蛍光分光光度計（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−４；ホリバ・ジョバンイボン社製）を用いて蛍光スペクトル測定を行い、蛍光強度をカーブフィッテングにて算出した。その際、統計解析ソフトとしてＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ(http://rsbweb.nih.gov/ij/)のsigmoidal dose-response modelを使用した。励起波長は５５０ｎｍ、測定波長は５８０ｎｍで測定を行った。
【実施例１１】
【００５８】
（標識抗ＢＰＡ抗体由Ｖ領域タンパク質を用いた均一系蛍光免疫測定法の確立）
ＡＴＴＯ６５５−ＶＨ及び蛍光標識されていないＶＬを用いた均一系蛍光免疫測定法の確立を目的として以下の実験を行った。ＡＴＴＯ６５５−ＶＨと異なる濃度のＢＰＡとを、標識されていないＶＬの存在下又は非存在下で反応させ、蛍光強度を測定した（図２５）。ＶＬの存在下では、ＡＴＴＯ６５５−ＶＨの蛍光強度はＢＰＡの濃度依存的に増加した。一方、ＶＬの非存在下では、ＡＴＴＯ６５５−ＶＨの蛍光強度はいずれの濃度のＢＰＡを反応させた場合にも低いままであった。また、ＶＬの存在／非存在下におけるＡＴＴＯ６５５−ＶＨの蛍光強度の比（＋ＶＬ／−ＶＬ）を解析した結果、解離定数（Ｋｄ）は２．４ｘ１０−８［Ｍ］であった（図２６）。また、実施例７と同様に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を用いた蛍光免疫測定法の確立を目的として以下の実験を行った。ＴＡＭＲＡ標識抗ＢＰＡ抗体ｓｃＦｖを用いた場合も、ＶＨ及びＶＬのそれぞれのペプチド断片を用いた場合と同様に、ＢＰＡの濃度依存的な蛍光強度の増加が認められた（図２７）。
【実施例１２】
【００５９】
３．様々な抗体由来の一本鎖抗体を用いた均一系蛍光免疫測定法の確立
（抗ＨＥＬ抗体、抗エストラジオール抗体、抗ＳＡ抗体由のＶ領域遺伝子発現ベクターの構築）
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のＤＮＡ配列のＮ末端にａｍｂｅｒコドンを含むＰｒｏＸＴＭｔａｇ（ＭＳＫＱＩＥＶＮＸＳＮＥＴ（Ｘは蛍光標識アミノ酸）；配列番号３）を、Ｃ末端にＨｉｓ-ｔａｇを有し、ＰｒｏＸＴＭｔａｇとｓｃＦｖのＮ末端との間にスペーサー（ＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号４）を有するＤＮＡ配列を、ｐＩＶＥＸ２．３ｄベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）のＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIサイトへ組み込み、発現ベクターを構築した。各一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）のＤＮＡ配列は、以下のとおりである；抗鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）抗体ｓｃＦｖは、抗ＨＥＬ抗体のＶＨ（配列番号１２）とＶＬ（配列番号１３）を順次リンカー配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号９）で結合した配列；エストラジオール（estradiol）抗体ｓｃＦｖは、抗エストラジオール抗体のＶＨ（配列番号１４）とＶＬ（配列番号１５）を順次リンカー配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号９）で結合した配列；ＳＡ（Serum Albumin）抗体ｓｃＦｖは、抗ＳＡ抗体のＶＨ（配列番号１６）とＶＬ（配列番号１７）を順次リンカー配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号９）で結合した配列。【００６０】
（蛍光標識抗ＨＥＬ抗体、抗エストラジオール抗体、抗ＳＡ抗体Ｖ領域タンパク質の作製）
RTS100 E.coli Disulfide Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、無細胞翻訳系によるＶ領域タンパク質Ｎ末端領域への蛍光標識アミノ酸の導入を行った。反応液（５０μＬ）は、７μＬのamino acid mix、１μＬのMethionine、７μＬのReactionmix、２５μＬのactivated E-coli Lysate、５μＬのplasmid DNA（５００ｎｇ）、５μＬの蛍光標識アミノアシル−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ（０．８ｎｍｏｌ）を加えた。蛍光標識タンパク質を作製するための蛍光標識アミノアシル−ｔＲＮＡ（ＴＡＭＲＡ−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ）は、CloverDirectTM tRNA Reagents for Site-Derected Protein Functionalization（プロテインエクスプレス社製）を用いた。反応液は、２０℃，６００ｒｐｍ，２ｈで反応させた後、さらに、４℃、１６ｈの反応を行った。反応終了後、反応液１μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）を行い、蛍光イメージアナライザー（ＦＭＢＩＯ−III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）でタンパク質発現を観察した。さらに、Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、目的のタンパク質が合成されていることを確認した。【００６１】
合成したＶ領域タンパク質は、His-Spin Trap Column（ＧＥヘルスケア社製）により精製を行った。上記反応液（５０μＬ）に、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Phosphatebuffer（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ ＮａＣｌ／６０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／０．１％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）を加えて４００μＬとし、His-Spin Trap Columnへアプライした。室温で１５分間インキュベートした後にＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄を行った。次に２００ｕＬのＥｌｕｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Phosphate buffer（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／０．１％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）で２回溶出させた。さらに溶出液は、UltraFree-0.5 centrifugaldevices（ミリポア社製）を使用し、ＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）でバッファー交換、濃縮を行った。精製後のサンプルの濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＦＣＳ（ＭＦ２０；オリンパス社製）を用いて測定した。
【実施例１３】
【００６２】
（蛍光スペクトル測定）
ＴＡＭＲＡ標識抗ＨＥＬ抗体ｓｃＦｖタンパク質（２μｇ／ｍＬ、２５μＬ）と、抗原であるＨＥＬタンパク質とを、計２００μＬのＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ）となるようにサンプルを調製した。ＴＡＭＲＡ標識抗エストラジオール抗体ｓｃＦｖタンパク質（２μｇ／ｍＬ、２５μＬ）と、抗原であるエストラジオールとを、計２００μＬのＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ）となるようにサンプルを調製した。ＴＡＭＲＡ標識抗ＳＡ抗体ｓｃＦｖタンパク質（２μｇ／ｍＬ、２５μＬ）と、抗原であるＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）又はＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）とを、計２００μＬのＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．２％ゼラチン）となるようにサンプルを調製した。その後、サンプルを２５℃、５分間放置した後に、蛍光分光光度計（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−４；ホリバ・ジョバンイボン社製）を用いて蛍光スペクトル測定を行い、蛍光強度をカーブフィッテングにて算出した。その際、統計解析ソフトとしてＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ(http://rsbweb.nih.gov/ij/)のsigmoidal dose-response modelを使用した。励起波長は５５０ｎｍ、測定波長は５８０ｎｍで測定を行ったところ、抗原の濃度依存的な蛍光強度の増加が認められた（図２８〜３０）。以上のように、様々な種類の抗体の蛍光標識一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を用いて、蛍光免疫測定法を行うことができることが示された。
【実施例１４】
【００６３】
４．マウス抗体ＶＨにおけるＴｒｐ残基の保存
実施例４、図９、及び表１に示すように、抗ＢＧＰ抗体において標識された蛍光色素のクエンチングには、ＶＨのアミノ酸配列においカバット（Kabat）の番号付け系で第３３番目、第３６番目及び第１０６番目のＴｒｐが重要な役割を果たしていること、また、第４７番目のＴｒｐは抗体（ＶＨ及びＶＬ）と抗原の結合に必須であることが明らかとなった（なお、上記のＶＨのアミノ酸配列におけるＴｒｐ１０６は、カバット（Kabat）の番号付け系においては第１０３番目の位置に対応するものである）。そこで、抗ＢＧＰ抗体以外のマウス抗体ＶＨ領域においても、これらのトリプトファン残基が保存されているかどうかを確認した。マウス抗体のアミノ酸残基分布の解析にはＡｂｙｓｉｓデータベース（Dr. Andrew C.R. Martin's Group；http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)を用いた。また、上記データベースにおける、各抗体残基のKabat配列表記による残基番号についても、ＡｂＣｈｅｃｋ（Dr. Andrew C.R. Martin's Group；Martin, A.C.R. Accessingthe Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133；http://www.bioinf.org.uk/abs/seqtest.html)により調べた。図３１〜３５に結果を示すように、マウス抗体のＶＨ領域における４つのＴｒｐ残基の保存率は、Ｔｒｐ３３は４０％、Ｔｒｐ３６は９８％、Ｔｒｐ４７は９４％、Ｔｒｐ１０３は９５％であった。これらの結果は、均一系蛍光免疫測定法を行う際に重要なＶＨの４つのＴｒｐ残基が多くのマウス抗体ＶＨで保存されていることを示している。【００６４】
上記実施例において用いた抗ＢＧＰ抗体のＶＨ（配列番号１）及びＶＬ（配列番号２）、抗ＢＰＡ抗体のＶＨ（配列番号６）及びＶＬ（配列番号７）に含まれるトリプトファン残基の位置を、カバット（Kabat）配列表記法により番号付けした結果を表２に、抗ＢＧＰ抗体ｓｃＦｖ、抗ＢＰＡ抗体ｓｃＦｖ、抗ＨＥＬ抗体ｓｃＦｖ、抗ＳＡ抗体ｓｃＦｖ、抗エストラジオール抗体ｓｃＦｖに含まれるトリプトファン残基の位置を、カバット（Kabat）配列表記法により番号付けした結果を表３に示す。【００６５】
【表２】
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【００６６】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によれば、蛍光色素により標識された抗体（断片）を用いて、該蛍光色素のクエンチの解消を指標とした均一系蛍光免疫測定法を提供することができる。本発明の均一系蛍光免疫測定法は、抗体又は抗原の固定化や洗浄の必要がなく、抗体と被検物質とを混合させた混合液の蛍光強度を直接モニターすることにより目的の物質の濃度を測定することができるため、より簡便で迅速な低分子化合物の検出が可能になると予想される。また、クエンチに影響している抗体ＶＨ領域のＴｒｐ残基は多くの種類の抗体において保存されていることから、本発明の均一系蛍光免疫測定法は様々の抗原濃度の測定に利用できる。
【図３】
2011061944.tif 000006
【図４】
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【図７】
2011061944.tif 000008
【図８】
2011061944.tif 000009
【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
2011061944.tif 000013
【図１７】
2011061944.tif 000014
【図１８】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２８】
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【図２９】
2011061944.tif 000020
【図３０】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２７】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年6月14日(2012.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドとを備え、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方が蛍光色素により標識されたキットであって、液相中の抗原濃度と上記蛍光色素の蛍光強度とが正の相関関係にあることを指標として、抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とすることを特徴とする抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項２】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとが結合した一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１記載の抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項３】
蛍光色素が、ローダミン系蛍光色素又はオキサジン系蛍光色素であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項４】
蛍光色素が、カルボキシローダミン１１０、カルボキシテトラメチルローダミン、又はＡＴＴＯ６５５（商標名）であることを特徴とする請求項３記載の抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項５】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項６】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出用キット。
【請求項７】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする抗原濃度測定・検出方法。
（ａ）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチド、又は、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを、
（ａ１）液相中で、被検物質中の抗原に接触させる工程；又は
（ａ２）抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体重鎖可変領域ポリペプチド、又は、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域ポリペプチドを投与した被検非ヒト動物対象中の抗原に接触させる工程；又は
（ａ３）インビトロで、被検対象中の抗原に接触させる工程；
（ｂ）前記（ａ１）の場合には、蛍光色素の蛍光強度を測定し、
前記（ａ２）及び（ａ３）の場合には、前記蛍光色素の蛍光を検出する工程；
（ｃ）液相中の抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、前記（ａ１）の場合には、被検物質に含まれる抗原量を算出し、前記（ａ２）及び（ａ３）の場合には、被検対象に含まれる抗原を可視化する工程；
【請求項８】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとが結合した一本鎖抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗原濃度測定・検出方法。
【請求項９】
蛍光色素が、ローダミン系蛍光色素又はオキサジン系蛍光色素であることを特徴とする請求項７又は８記載の抗原濃度測定・検出方法。
【請求項１０】
蛍光色素が、カルボキシローダミン１１０、カルボキシテトラメチルローダミン、又はＡＴＴＯ６５５（商標名）であることを特徴とする請求項９記載の抗原濃度測定・検出方法。
【請求項１１】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出方法。
【請求項１２】
抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
また本発明は、（３）蛍光色素が、ローダミン系蛍光色素又はオキサジン系蛍光色素であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の抗原濃度測定・検出用キットや、（４）蛍光色素が、カルボキシローダミン１１０、カルボキシテトラメチルローダミン、又はＡＴＴＯ６５５（商標名）であることを特徴とする上記（３）記載の抗原濃度測定・検出用キットや、（５）抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出用キットや、（６）抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出用キットに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
また本発明は、（８）抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとが結合した一本鎖抗体であることを特徴とする上記（７）記載の抗原濃度測定・検出方法や、（９）蛍光色素が、ローダミン系蛍光色素又はオキサジン系蛍光色素であることを特徴とする上記（７）又は（８）記載の抗原濃度測定・検出方法や、（１０）蛍光色素が、カルボキシローダミン１１０、カルボキシテトラメチルローダミン、又はＡＴＴＯ６５５（商標名）であることを特徴とする上記（９）記載の抗原濃度測定・検出方法や、（１１）抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出方法や、（１２）抗体重鎖可変領域ポリペプチドが配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、抗体軽鎖可変領域ポリペプチドが配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の抗原濃度測定・検出方法に関する。
【国際調査報告】
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2011061944.tif 000042
2011061944.tif 000043
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