(57)【要約】  経口用ＤＮＡ損傷修復促進剤及び経口用エラスターゼ活性抑制剤の提供。  ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有する経口用ＤＮＡ損傷修復促進剤及び経口用エラスターゼ活性抑制剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有する経口用ＤＮＡ損傷修復促進剤。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベである請求項１に記載のＤＮＡ損傷修復促進剤。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  ４０６５又はビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２である請求項１又は２に記載のＤＮＡ損傷修復促進剤。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム属細菌を、１×１０３ＣＦＵ以上を１日量として含有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ損傷修復促進剤。
【請求項５】
ＤＮＡ損傷修復が、紫外線暴露によって引き起こされる皮膚中のＤＮＡ損傷に対する修復である請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡ損傷修復促進剤。
【請求項６】
少なくとも紫外線暴露前に経口投与するものである請求項５に記載のＤＮＡ損傷修復促進剤。
【請求項７】
ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有する経口用シクロブタンピリミジンダイマー量低下促進剤。
【請求項８】
ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有する経口用エラスターゼ活性抑制剤。
【請求項９】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベである請求項８に記載のエラスターゼ活性抑制剤。
【請求項１０】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  ４０６５又はビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２である請求項８又は９に記載のエラスターゼ活性抑制剤。
【請求項１１】
ビフィドバクテリウム属細菌を、１×１０３ＣＦＵ以上を１日量として含有する請求項８〜１０のいずれか１項に記載のエラスターゼ活性抑制剤。
【請求項１２】
紫外線暴露により亢進した皮膚中のエラスターゼ活性を抑制するものである請求項１１に記載のエラスターゼ活性抑制剤。
【請求項１３】
少なくとも紫外線暴露前に経口投与するものである請求項１２に記載のエラスターゼ活性抑制剤。
【請求項１４】
皮膚老化防止・改善剤である、請求項８〜１３のいずれか１項に記載のエラスターゼ活性抑制剤。
【請求項１５】
ビフィドバクテリウム属細菌を経口投与することを特徴とするＤＮＡ損傷修復促進方法。
【請求項１６】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  ４０６５又はビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２である請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
ビフィドバクテリウム属細菌を、１×１０３ＣＦＵ以上を１日量として経口投与する請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ損傷修復が、紫外線暴露によって引き起こされる皮膚中のＤＮＡ損傷に対する修復である請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも紫外線暴露前に経口投与するものである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ビフィドバクテリウム属細菌を経口投与することを特徴とするシクロブタンピリミジンダイマー量低下促進方法。
【請求項２２】
ビフィドバクテリウム属細菌を経口投与することを特徴とするエラスターゼ活性抑制方法。
【請求項２３】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  ４０６５又はビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２である請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
ビフィドバクテリウム属細菌を、１×１０３ＣＦＵ以上を１日量として経口投与する請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
紫外線暴露により亢進した皮膚中のエラスターゼ活性を抑制するものである請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも紫外線暴露前に経口投与するものである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
皮膚老化防止・改善方法である請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
経口投与によりＤＮＡの損傷の修復を促進するために用いるビフィドバクテリウム属細菌。
【請求項３０】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベである請求項２９に記載の細菌。
【請求項３１】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  ４０６５又はビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２である請求項２９又は３０に記載の細菌。
【請求項３２】
ビフィドバクテリウム属細菌を、１×１０３ＣＦＵ以上を１日量として経口投与するためのものである請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項３３】
ＤＮＡ損傷修復が、紫外線暴露によって引き起こされる皮膚中のＤＮＡ損傷に対する修復である請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項３４】
少なくとも紫外線暴露前に経口投与するためのものである請求項３３に記載の細菌。
【請求項３５】
経口投与によりシクロブタンピリミジンダイマー量の低下を促進するために用いるビフィドバクテリウム属細菌。
【請求項３６】
経口投与によりエラスターゼ活性を抑制するために用いるビフィドバクテリウム属細菌。
【請求項３７】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベである請求項３６に記載の細菌。
【請求項３８】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  ４０６５又はビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２である請求項３６又は３７に記載の細菌。
【請求項３９】
ビフィドバクテリウム属細菌を、１×１０３ＣＦＵ以上を１日量として経口投与するためのものである請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項４０】
紫外線暴露により亢進した皮膚中のエラスターゼ活性を抑制するものである請求項３９に記載の細菌。
【請求項４１】
少なくとも紫外線暴露前に経口投与するためのものである請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項４２】
皮膚老化を防止・改善するために用いるものである、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口用のＤＮＡ損傷修復促進剤及びエラスターゼ活性抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの損傷は、さまざまな外的又は内的要因によって引き起こされるものであり、日常的に絶え間なく発生している。しかしながら、ＤＮＡ損傷の放置は、複製や転写などの重要な機能を阻害するだけでなく、突然変異が引き起こされることによって、癌や老化等の原因となり得るものである。
したがって、生体はＤＮＡ損傷の種類に対応する種々の修復機構によって、普遍的にＤＮＡの損傷を修復し、ゲノム情報及びその機能を維持している。この修復機構の代表例としては、ＤＮＡの二本鎖切断に対する相同的組み換え修復機構、活性酸素種による酸化的塩基損傷に対する塩基除去修復機構、紫外線によって生成するピリミジン二量体に対するヌクレオチド除去修復機構、複製エラーに対するミスマッチ修復機構などがある。【０００３】
しかしながら、何らかの原因により、修復機構の異常や機能低下、或いは修復能力を超えた損傷が生じる場合がある。このような場合には、細胞はアポトーシスを起こして死にやすくなり、また、突然変異が誘発されることによって、長期的な癌化や老化等のプロセスが促進することになる。【０００４】
これに対し、損傷要因を軽減する素材が開発されている。具体的には、発がん性物質に起因する大腸・肝臓中のＤＮＡ損傷抑制に関するものとして、ラクトバチルス  ガセリ（Ｐ７９）、ラクトバチルス  コンフサス（ＤＳＭ２０１９６）、ストレプトコッカス  サーモフィルス（ＮＣＩＭ５００８３）、ビフィドバクテリウム  ブレーベ又はビフィドバクテリウム  ロンガムが、大腸内においてＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンに起因するＤＮＡ損傷を抑制すること（非特許文献１）、ビフィドバクテリウム  アニマリス  ＤＮ−１７３  ０１０又はストレプトコッカス  サーモフィルスＤＮ−００１  １５８で発酵したミルクが、大腸内において複素環芳香族アミンに起因するＤＮＡ損傷を抑制すること（非特許文献２）、及びラクトバチルス  ブルガリカス  ２９１、ストレプトコッカス  サーモフィルス  Ｆ４、ストレプトコッカス  サーモフィルス  Ｖ３又はビフィドバクテリウム  ロンガム  ＢＢ５３６が、大腸や肝臓において複素環芳香族アミンに起因するＤＮＡ損傷を抑制すること（非特許文献３）が、報告されている。
しかしながら、ＤＮＡ損傷抑制とＤＮＡ損傷修復とは異なるものであり、上記のような発がん性物質に起因するＤＮＡ損傷抑制は、経口摂取した細菌を消化管の表面に吸着させることによって、或いは発がん性物質を細菌菌体へ吸着させ排出することによって、経口投与した種々の発がん性物質の生体への接触・吸収を抑えるものであることから、ＤＮＡ損傷の修復を促進するものではないと考えられている。【０００５】
一方、紫外線に起因するＤＮＡ損傷は、皮膚細胞中でのシクロブタンピリミジンダイマーや６−４型光産物などが紫外線暴露により形成されることによって生じるものであり、近年のオゾン層破壊による紫外線量の増加の影響に伴い、当該ＤＮＡ損傷の予防・抑制についての開発が進められている。【０００６】
当該ＤＮＡ損傷の予防方法としては、サンスクリーン剤等により紫外線を吸収又は散乱する方法が知られているが、この方法では、紫外線による皮膚障害の軽減ができるのみであり、紫外線暴露によりＤＮＡが損傷した場合にその損傷の修復を促進することはできない。また、紫外線暴露に起因するＤＮＡ損傷を抑制する化粧組成物として、ビフィドバクテリウム属細菌の不活性化培養物からなる第一の成分と、糖タンパク質、炭水化物ポリマー及びアラビノガラクタンタンパク質からなる植物細胞外マトリックスの抽出物である第二の成分とを含む、ＵＶ照射誘発性の皮膚損傷に対抗するための局所適用の化粧組成物が知られている（特許文献１）。【０００７】
ところで、紫外線の暴露は、ＤＮＡの損傷だけでなく、シワの形成や弾力性の低下などの皮膚の光老化を引き起こすものである。この光老化現象のメカニズムは、完全には解明されていないが、真皮細胞外マトリックス成分の変化が重要な因子の１つであると考えられている。当該真皮細胞外マトリックス成分には、コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカン等があり、このうちエラスチンは弾性線維の主要蛋白質である。【０００８】
そして、紫外線に暴露した皮膚では、エラスチン分解酵素である好中球エラスターゼや線維芽細胞エラスターゼ活性が亢進していることが報告されており、これらエラスターゼによるエラスチンの量的質的変性が、シワ形成や弾力性低下に寄与していると考えられている。
これに対し、皮膚老化の防止・改善を目的とした種々のエラスターゼ活性阻害剤が提案されており、例えば、美容効果を目的とした、シソ葉の発酵物（特許文献２）、パセリの発酵物（特許文献３）又はピーマンの発酵物（特許文献４）を含有するエラスターゼ活性阻害剤が知られている。
しかしながら、上記発酵物のエラスターゼ活性阻害は、ヒト好中球由来エラスターゼや豚膵臓由来エラスターゼ溶液に被験物質を添加して行うｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により評価されたものであり、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験でエラスターゼ活性阻害が確認されたものではない。実際に皮膚に塗布した物質がエラスターゼ活性抑制作用を発揮するためには、有効成分が角層と表皮を透過して真皮層に到達する必要があるため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの当該作用が確認されたエラスターゼ活性抑制剤が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−２５５７７７号公報
【特許文献２】特開２００６−６１０９１号公報
【特許文献３】特開２００６−７５０８５号公報
【特許文献４】特開２００６−７６９２６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐｏｏｌ−Ｚｏｂｅｌ  ＢＬ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｔｒ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２６，  ３６５−８０，  １９９６
【非特許文献２】Ｔａｖａｎ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．，  ２３，  ４７７−８３，  ２００２
【非特許文献３】Ｚｓｉｖｋｏｖｉｔｓ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．，  ２４，  １９１３−１９１８，  ２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、これまで、ビフィドバクテリウム属細菌を経口投与することにより、ＤＮＡ損傷の修復を促進できることや、エラスターゼ活性を抑制できることは知られていなかった。
本発明の課題は、経口用ＤＮＡ損傷修復促進剤及び経口用エラスターゼ活性抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ＤＮＡ損傷の修復促進、エラスターゼ活性の抑制について検討したところ、意外にも、ビフィドバクテリウム属細菌を経口摂取することにより、ＤＮＡ損傷の修復を促進できること及びエラスターゼの活性が抑制できることを見出した。【００１３】
ｉ）すなわち、本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有する経口用ＤＮＡ損傷修復促進剤を提供するものである。
ｉｉ）また、本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有する経口用シクロブタンピリミジンダイマー量低下促進剤を提供するものである。
ｉｉｉ）更に、本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有する経口用エラスターゼ活性抑制剤を提供するものである。
ｉｖ）更に、本発明は、皮膚老化防止・改善剤である、上記ｉｉｉ）に記載のエラスターゼ活性抑制剤を提供するものである。【００１４】
ｖ）更に、本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌を経口投与することを特徴とするＤＮＡ損傷修復促進方法を提供するものである。
ｖｉ）更に、本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌を経口投与することを特徴とするシクロブタンピリミジンダイマー量低下促進方法を提供するものである。
ｖｉｉ）更に、本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌を経口投与することを特徴とするエラスターゼ活性抑制方法を提供するものである。
ｖｉｉｉ）更に、本発明は、皮膚老化防止・改善方法である、上記ｖｉｉ）に記載の方法を提供するものである。【００１５】
ｉｘ）更に、本発明は、経口投与によりＤＮＡの損傷を修復促進するために用いるビフィドバクテリウム属細菌を提供するものである。
ｘ）更に、本発明は、経口投与によりシクロブタンピリミジンダイマー量の低下を促進するために用いるビフィドバクテリウム属細菌を提供するものである。
ｘｉ）更に、本発明は、経口投与によりエラスターゼ活性を抑制するために用いるビフィドバクテリウム属細菌を提供するものである。
ｘｉｉ）更に、本発明は、皮膚老化を防止・改善するために用いるものである、上記ｘｉ）に記載の細菌を提供するものである。【００１６】
ｘｉｉｉ）更に、本発明は、経口用ＤＮＡ損傷修復促進剤製造のためのビフィドバクテリウム属細菌の使用を提供するものである。
ｘｉｖ）更に、本発明は、経口用シクロブタンピリミジンダイマー量低下促進剤製造のためのビフィドバクテリウム属細菌の使用を提供するものである。
ｘｖ）更に、本発明は、経口用エラスターゼ活性抑制剤製造のためのビフィドバクテリウム属細菌の使用を提供するものである。
ｘｖｉ）更に、本発明は、皮膚老化防止・改善剤製造のためのものである、上記ｘｖ）に記載の使用を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、経口投与することにより、ＤＮＡ損傷の修復を促進することができる。したがって、本発明の経口用ＤＮＡ損傷修復促進剤は、ＤＮＡ損傷の修復を促進するための医薬品、飲食品等として有用である。
また、本発明によれば、経口投与することにより、エラスターゼの活性を抑制することができる。したがって、本発明の経口用エラスターゼ活性抑制剤は、皮膚の老化を防止・改善するための医薬品、飲食品等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】菌体の経口投与によりＤＮＡ損傷の修復を促進できることを示す図である。
【図２】菌体の経口投与によりＤＮＡ損傷の修復を促進できることを示す図である。
【図３】菌体の経口投与によりエラスターゼ活性を抑制できることを示す図である。
【図４】菌体の経口投与によりエラスターゼ活性を抑制できることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の経口用ＤＮＡ損傷修復促進剤（以下、ＤＮＡ損傷修復促進剤ともいう）及び経口用エラスターゼ活性抑制剤（以下、エラスターゼ活性抑制剤ともいう）の有効成分は、ビフィドバクテリウム属細菌である。斯かるビフィドバクテリウム属細菌について、まず説明する。
【００２０】
上記ビフィドバクテリウム属細菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）等が挙げられ、これら菌種の１種又は２種以上であってもよい。これらの中でも、ＤＮＡ損傷修復促進作用及びエラスターゼ活性抑制作用の点から、ビフィドバクテリウム・ブレーベが好ましい。
【００２１】
上記ビフィドバクテリウム・ブレーベとしては、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ４０６３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８２３）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  ４０６４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８２４）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  ４０６５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２３    （独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  旧名：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）（住所：〒３０５  日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成８年２月２９日に寄託））、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１３２０    独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成２２年２月１６日に寄託）、これらビフィドバクテリウム・ブレーベを親株とする子孫株が好ましい。これらの中でも、ＤＮＡ損傷修復促進作用及びエラスターゼ活性抑制作用の点から、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  ４０６５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２が特に好ましい。なお、本発明において「子孫株」とは、自然変異株、変異処理による変異株、遺伝子操作による変異株等を含む概念である。
【００２２】
また、上記ビフィドバクテリウム属細菌は、細菌菌体（生菌）及び当該細菌菌体の処理物のいずれでもよい。該処理物は、常法の処理によって得られるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、加熱菌体（死菌体）、その凍結乾燥物、これらを含有する培養物、細菌の超音波等による破砕液、細菌の酵素処理液、これらを濾過や遠心分離等の固液分離手段によって分離した固体残渣等；細胞壁を酵素若しくは機械的手段により除去した処理液、当該処理液の濃縮物、それらの希釈物、それらの乾燥物等；細菌を界面活性剤等によって溶解した後、エタノール等によって沈殿させて得られる核酸含有画分；前記細菌の超音波等による破砕液や細胞の酵素処理液等に対し、各種クロマトグラフィー等による分離などの分離・精製処理を行ったもの等が挙げられる。
上記ビフィドバクテリウム属細菌としては、細菌菌体（生菌）；加熱菌体（死菌体）、その凍結乾燥物、細菌の超音波等による破砕液、細菌の酵素処理液が好ましい。この中でも、ＤＮＡ損傷修復促進作用及びエラスターゼ活性抑制作用の点から、細菌菌体（生菌）、上記の凍結乾燥物が特に好ましい。
なお、前記死菌体は、例えば、加熱処理、抗生物質等の薬物による処理、ホルマリン等の化学物質による処理、紫外線による処理、γ線等の放射線による処理により得ることができる。
【００２３】
次に、本発明の「ＤＮＡ損傷修復促進剤」について、詳細に説明する。
本発明において、「ＤＮＡ損傷修復促進」とは、損傷したＤＮＡ分子の修復を促進することを意味する。本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、後記実施例に示すように、経口投与によりシクロブタンピリミジンダイマー（以下、ＣＰＤともいう）量の低下を促進するため、ＤＮＡ損傷に対する優れた修復促進作用を有する。
したがって、ビフィドバクテリウム属細菌は、ＤＮＡ損傷修復促進剤として使用することができ、また、ＤＮＡ損傷修復促進剤を製造するために使用することができる。
そして、ＤＮＡ損傷の修復を促進することによって、癌及び老化を予防・治療できることから、ビフィドバクテリウム属細菌は、癌又は老化の予防・治療剤ともなり得、上記ＤＮＡ損傷修復促進剤は、癌や老化を予防・治療するための、ヒト又は動物用の医薬品、医薬部外品、飲食品、ペットフード等として有用である。
また、本発明のＤＮＡ損傷修復促進剤は、紫外線暴露によって生じたＤＮＡ損傷の修復を促進できることから、ビフィドバクテリウム属細菌は、皮膚癌又は皮膚老化の予防・治療剤ともなり得る。
【００２４】
また、前述のとおり、本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、ＣＰＤ量低下促進作用を有する。したがって、ビフィドバクテリウム属細菌は、ＣＰＤ量低下促進剤として使用することができ、また、ＣＰＤ量低下促進剤を製造するために使用することができる。
本発明のＣＰＤ量低下促進剤は、ＤＮＡ損傷の指標であるＣＰＤ量を低下させることから、ビフィドバクテリウム属細菌は、癌又は老化の予防・治療剤ともなり得、ＣＰＤは紫外線暴露によって生じるものであることから、本発明のＣＰＤ量低下促進剤は、特に皮膚癌又は皮膚老化の予防・治療剤として有用である。
【００２５】
次に、本発明の「エラスターゼ活性抑制剤」について、詳細に説明する。
本発明のビフィドバクテリウム属細菌は、後記実施例に示すように、経口投与することにより、紫外線暴露により亢進した皮膚中のエラスターゼの活性を抑制する作用を有する。したがって、ビフィドバクテリウム属細菌は、エラスターゼ活性抑制剤として使用することができ、また、エラスターゼ活性抑制剤を製造するために使用することができる。
そして、エラスターゼ活性を抑制することは、皮膚の老化を防止・改善することから、ビフィドバクテリウム属細菌は、皮膚老化防止・改善剤ともなり得、上記エラスターゼ活性抑制剤は、皮膚老化を防止・改善するための、ヒト又は動物用の医薬品、医薬部外品、飲食品、ペットフード等として有用である。なお、「皮膚老化防止・改善」とは、皮膚のシワ予防・改善、たるみ防止、弾力性改善、抗老化を含むものである。
【００２６】
次に、上記ＤＮＡ損傷修復促進剤、エラスターゼ活性抑制剤及び皮膚老化防止・改善剤の使用態様等について説明する。
ＤＮＡ損傷修復促進剤、エラスターゼ活性抑制剤及び皮膚老化防止・改善剤の投与形態は、経口投与である。当該投与は、紫外線暴露前、紫外線暴露中、紫外線暴露後のいずれにおこなってもよい。中でも、ＤＮＡ損傷修復促進作用、エラスターゼ活性抑制作用及び皮膚老化防止・改善作用の点から、少なくとも紫外線暴露前に投与するのが好ましく、紫外線暴露前及び紫外線暴露中に投与するのがより好ましい。また、紫外線暴露前から投与する場合、当該暴露前の投与期間は、ＤＮＡ損傷修復促進作用、エラスターゼ活性抑制作用及び皮膚老化防止・改善作用の点から、５日間以上が好ましく、５〜１０日間がより好ましい。なお、１０日間以上長期に投与しても、ＤＮＡ損傷修復促進作用、エラスターゼ活性抑制作用及び皮膚老化防止・改善作用は期待できる。
【００２７】
ＤＮＡ損傷修復促進剤、エラスターゼ活性抑制剤及び皮膚老化防止・改善剤を医薬品として使用する場合における経口投与製剤の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、糖衣錠、丸剤、細粒剤、散剤、粉剤、徐放性製剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、凍結乾燥剤、液剤、エリキシル剤等が挙げられる。
【００２８】
また、上記製剤は、常法によって製造でき、また、ビフィドバクテリウム属細菌を単独で使用してもよく、薬学的に許容される担体と組み合わせて使用してもよい。該担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料、希釈剤、殺菌剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定化剤、吸収助剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、湿潤剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、等張化剤、無痛化剤、矯臭剤等が挙げられる。
【００２９】
上記結合剤としては、例えば、デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。
【００３０】
上記崩壊剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００３１】
上記界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が挙げられる。
上記滑沢剤としては、例えば、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
上記流動性促進剤としては、例えば、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
【００３２】
上記希釈剤としては、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００３３】
また、本発明のＤＮＡ損傷修復促進剤、エラスターゼ活性抑制剤及び皮膚老化防止・改善剤は、上記のような医薬品として用いるだけでなく、飲食品、医薬部外品、ペットフード等として用いることもできる。この場合には、上記ビフィドバクテリウム属細菌をそのまま、又は種々の栄養成分を加えて、上記飲食品等に含有せしめればよい。この飲食品は、癌や老化の予防・治療に有用な保健用食品又は食品素材、或いは皮膚老化の防止・改善に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品等又はその容器には、前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。
【００３４】
ＤＮＡ損傷修復促進剤、エラスターゼ活性抑制剤及び皮膚老化防止・改善剤を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品；パン、菓子、バター、粉乳、発酵飲食品に添加して使用し、又は水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。これら飲食品の中でも、有効成分であるビフィドバクテリウム属細菌を含有する発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液等の発酵製品が好ましい。
また、これら発酵飲食品の製造は常法にしたがって製造することができる。例えば発酵乳は、殺菌した乳培地にビフィドバクテリウム属細菌を接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、さらにフレーバーを添加して最終製品とすることができる。このようにして得られる発酵乳は、プレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。
【００３５】
次に、ビフィドバクテリウム属細菌の投与量等について説明する。
本発明のＤＮＡ損傷修復促進剤、エラスターゼ活性抑制剤及び皮膚老化防止・改善剤の有効成分であるビフィドバクテリウム属細菌を使用する際の投与量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましいが、ＤＮＡ損傷修復促進作用、エラスターゼ活性抑制作用及び皮膚老化防止・改善作用の点から、ビフィドバクテリウム属細菌の菌数を、１×１０３ＣＦＵ以上を１日量として含有する量が好ましく、１×１０３〜１×１０１３ＣＦＵを１日量として含有する量がより好ましく、１×１０６〜１×１０１０ＣＦＵを１日量として含有する量が特に好ましい。
【００３６】
なお、上記紫外線の波長は、特に限定されないが、２８０〜４００ｎｍの波長の紫外線は、ＤＮＡ損傷を生じさせる割合が高いため、皮膚癌や皮膚老化の原因になりやすく、また、エラスターゼの活性をより亢進するため、皮膚老化の原因となりやすいものであるから、本発明のＤＮＡ損傷修復促進剤、エラスターゼ活性抑制剤及び皮膚老化防止・改善剤は、２８０〜４００ｎｍの波長の紫外線暴露によって生じた、ＤＮＡ損傷の修復促進剤、エラスターゼ活性の亢進の抑制剤及び皮膚老化防止・改善剤として好適に用いられる。また、紫外線量は、特に限定されないが、１日あたり２０ｍＪ／ｃｍ２以上、特に４０ｍＪ／ｃｍ２以上である場合に、本発明のＤＮＡ損傷の修復促進剤、エラスターゼ活性抑制剤及び皮膚老化防止・改善剤が好適に用いられる。
【００３７】
また、本発明のＤＮＡ損傷修復促進剤及びシクロブタンピリミジンダイマー量低下促進剤は、食経験が豊富なビフィドバクテリウム属細菌を経口で使用するものであるから、従来の静注等で使用され深刻な副作用を伴うものであった癌化学療法剤と比較して、その安全性は極めて高く、対象者への負担を著しく軽減させることができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を示し、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下実施例において、％は、特に断りがない限り、全てｍａｓｓ／ｖｏｌ％を意味する。【００３９】
実施例１  （菌体溶液の調製）
Ｒｏｇｏｓａらの培地（Ｅｆｔｙｍｉｏｕ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  ｉｎｆｅｃｔ  ｄｉｓ．，  １１０，  ２５８−２６７，  １９６２）を改変した下記の組成の培地を１２１℃、１５分間加熱殺菌した。この培地にビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  ４０６５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２３）を１ｖ／ｖ％接種し、３７℃でおよそ２０時間嫌気的に培養して培養液を得た。この培養液を３５００×Ｇで遠心分離し、ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を集菌した。この菌体を１．０×１０１０ＣＦＵ／ｍＬになるように生理食塩水に懸濁させ、菌体溶液を得た。【００４０】
培地の組成
Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ：１％、  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ：０．５％、  Ｔｒｙｐｔｏｓｅ：０．３％、  リン酸（Ｉ）カリウム：０．３％、  リン酸（ＩＩ）カリウム：０．３９％、  クエン酸アンモニウム：０．２％、  乳糖：１％、  Ｌ−システイン塩酸塩：０．０３％、  Ｔｗｅｅｎ８０：０．１％、  塩溶液０．５％（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：１１．５ｇ、  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．６８ｇ、  ＭｎＳＯ４・２Ｈ２Ｏ：２．４ｇを１００ｍＬの水に溶解したもの）【００４１】
試験例１  （ＣＰＤ量測定試験）
上記菌体溶液について、ＣＰＤ量を測定することによりＤＮＡ修復促進効果を検討した。
ヘアレスマウスＨｏｓ：ＨＲ−１（６週齢）を、搬入後１週間馴化させた後、６匹ずつ計８群に分け、それぞれ第１群〜第８群とした。
上記マウス群のうち第１群、第３群、第５群及び第７群（以下、対照群ともいう）には生理食塩水を、第２群、第４群、第６群及び第８群（以下、菌体群ともいう）には実施例１で調製した菌体溶液を、それぞれ９日間０．１ｍＬ／ｄａｙ経口投与した。
また、上記第１群及び第２群については紫外線を照射せず、第３群〜第８群については投与開始から６日目以降４日間、前記投与と共に紫外線照射装置（東芝ＳＥ−ＦＬ−２０）により、２８０〜４００ｎｍを含む紫外線を１日あたり４０ｍＪ／ｃｍ２照射した。
そして、第１群及び第２群については最後の投与から２４時間後、第３群及び第４群については最後の照射から６時間後、第５群及び第６群については最後の照射から１２時間後、第７群及び第８群については最後の照射から２４時間後に、それぞれ背部皮膚を採取した。
なお、下記表１において、ＵＶ＋は紫外線照射したこと、ＵＶ−は紫外線照射していないことを示す。【００４２】
【表１】
2011083738.tif 000002
【００４３】
上記の採取した各背部皮膚からゲノムＤＮＡを精製し（ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ）、一定量を９６穴プレートにコートし、シクロブタンピリミジンダイマー抗体（ＴＤＭ−２）を結合させた後、ビオチン標識２次抗体及び酵素標識ストレプトアビジンでシグナルを増幅させ、最後に基質を加えて着色させ４９２ｎｍの吸光度を測定した（ＥＬＩＳＡ法）。測定結果を図１に示す。【００４４】
図１に示すとおり、最後の紫外線照射から６時間後の皮膚中のＣＰＤ量を測定した場合には、対照群（第３群）と菌体群（第４群）において同程度のＣＰＤが認められていたが、２４時間後に採取した皮膚中のＣＰＤ量を測定すると菌体群（第８群）では対照群（第７群）と比較して有意にＣＰＤ量が低下した。したがって、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  ４０６５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２３）の投与により、紫外線に起因するＤＮＡ損傷の修復を促進できることが認められた。【００４５】
実施例２  （菌体試料の調製）
ミネラル液（１ｗ／ｖ％）、酵母エキス（１ｗ／ｖ％）、乳糖（３ｗ／ｖ％）及び乳蛋白質（５ｗ／ｖ％）を用いて調製した培地を２Ｌコルベンに１．５Ｌ作製し、１２１℃で１５分間加熱殺菌した。この培地にビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１３２０）を１ｖ／ｖ％接種し、水酸化ナトリウムでｐＨを５．５に保持しながら３６℃でおよそ２０時間嫌気的に培養して培養液を得た。この培養液を１５，０００×Ｇで遠心分離し、ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を集菌した。なお、前記ミネラル液の組成は、リン酸（Ｉ）カリウム（１０ｗ／ｖ％）、リン酸（ＩＩ）カリウム（２０ｗ／ｖ％）、酢酸ナトリウム（３０ｗ／ｖ％）及び硫酸アンモニウム（３０ｗ／ｖ％）である。
一方、乳蛋白質８ｗ／ｖ％及び糖質４ｗ／ｖ％を分散させた分散液を１００ｍＬ調製し、１２１℃で１５分間加熱殺菌した。この分散液に、上記集菌したビフィドバクテリウム属細菌の菌体を湿重量当り１５％分散させ、その後凍結乾燥して、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１３２０）の凍結乾燥菌体を得た。この凍結乾燥菌体を４×１０９ＣＦＵ／ｍＬとなるように生理食塩水１０ｍＬに懸濁し、菌体試料を得た。【００４６】
試験例２  （ＣＰＤ量測定試験）
ヘアレスマウスＨｏｓ：ＨＲ−１（６週齢）を、搬入後１週間馴化させた後、３匹ずつ合計３群に分け、それぞれ第１群〜第３群とした。
上記マウス群のうち、第１群及び第２群には生理食塩水を、第３群には実施例２で調製した菌体試料を、それぞれ９日間０．１ｍＬ／ｄａｙ経口投与した。
また、上記第１群については紫外線照射をせず、第２群及び第３群については、投与開始から６日目以降４日間、前記投与と共に紫外線照射装置（東芝ＳＥ−ＦＬ−２０）により、２８０〜４００ｎｍを含む紫外線を１日あたり５０ｍＪ／ｃｍ２照射し、その後、背部皮膚を採取した。
なお、上記マウス群のうち、生理食塩水を投与し、紫外線照射していないマウス群をｂｌａｎｋ群とし、生理食塩水を投与し、紫外線照射したマウス群を対照群とし、菌体試料を投与し、紫外線照射したマウス群を菌体群とした（表２）。下記表２において、ＵＶ＋は紫外線照射したこと、ＵＶ−は紫外線照射していないことを示す。【００４７】
【表２】
2011083738.tif 000003
【００４８】
上記採取した各背部皮膚からゲノムＤＮＡを精製し（ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ）、一定量を９６穴プレートにコートし、シクロブタンピリミジンダイマー抗体（ＴＤＭ−２）を結合させた後、ビオチン標識２次抗体及び酵素標識ストレプトアビジンでシグナルを増幅させ、最後に基質を加えて着色させ４９２ｎｍの吸光度を測定した（ＥＬＩＳＡ法）。測定結果を図２に示す。【００４９】
図２に示すとおり、対照群では、ｂｌａｎｋ群と比較して、紫外線照射によって著しいＣＰＤの増加が認められたが、菌体群では、この対照群と比較して、ＣＰＤ量が低下していた。したがって、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１３２０）の投与により紫外線に起因するＤＮＡ損傷の修復を促進できることが認められた。【００５０】
実施例３  （菌体試料の調製）
ミネラル液（１ｗ／ｖ％）、酵母エキス（１ｗ／ｖ％）、乳糖（３ｗ／ｖ％）及び乳蛋白質（５ｗ／ｖ％）を用いて調製した培地を２Ｌコルベンに１．５Ｌ作製し、１２１℃で１５分間加熱殺菌した。この培地にビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  ４０６５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２３）を１ｖ／ｖ％接種し、水酸化ナトリウムでｐＨを５．５に保持しながら３６℃でおよそ２０時間嫌気的に培養して培養液を得た。この培養液を１５，０００×Ｇで遠心分離し、ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を集菌した。なお、前記ミネラル液の組成は、リン酸（Ｉ）カリウム（１０ｗ／ｖ％）、リン酸（ＩＩ）カリウム（２０ｗ／ｖ％）、酢酸ナトリウム（３０ｗ／ｖ％）及び硫酸アンモニウム（３０ｗ／ｖ％）である。
一方、乳蛋白質８ｗ／ｖ％及び糖質４ｗ／ｖ％を分散させた分散液を１００ｍＬ調製し、１２１℃で１５分間加熱殺菌した。この分散液に、上記集菌したビフィドバクテリウム属細菌の菌体を湿重量当り１５％分散させ、その後凍結乾燥して、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  ４０６５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２３）の凍結乾燥菌体を得た。この凍結乾燥菌体を１．０×１０１０ＣＦＵ／ｍＬとなるように生理食塩水１０ｍＬに懸濁し、菌体試料を得た。【００５１】
試験例３  （エラスターゼ活性抑制試験）
ヘアレスマウスＨｏｓ：ＨＲ−１（６週齢）を、搬入後１週間馴化させた後、５匹ずつ合計３群に分け、それぞれ第１群〜第３群とした。
上記マウス群のうち、第１群及び第２群には生理食塩水を、第３群には実施例３で調製した菌体試料を、それぞれ９日間０．１ｍＬ／ｄａｙ経口投与した。
また、上記第１群については紫外線照射をせず、第２群及び第３群については、投与開始から６日目以降４日間、前記投与と共に紫外線照射装置（東芝ＳＥ−ＦＬ−２０）により、２８０〜４００ｎｍを含む紫外線を１日あたり４０ｍＪ／ｃｍ２照射し、その後、背部皮膚を採取した。
なお、上記マウス群のうち、生理食塩水を投与し、紫外線照射していないマウス群をｂｌａｎｋ群とし、生理食塩水を投与し、紫外線照射したマウス群を対照群とし、菌体試料を投与し、紫外線照射したマウス群を菌体群とした（表３）。下記表３において、ＵＶ＋は紫外線照射したこと、ＵＶ−は紫外線照射していないことを示す。【００５２】
【表３】
2011083738.tif 000004
【００５３】
上記の採取した各背部皮膚に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えてＰｏｌｙｔｒｏｎでホモジネートし、１４，０００×Ｇで遠心した後、上清を９６穴プレートに１００μＬずつ分注し、エラスチンに代わる人工基質として合成基質であるスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロアニリド６．２５ｍＭを２０μＬ添加し、３７℃で２４時間インキュベーションした。その後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。スタンダードにはｐ−ニトロアニリンを使用して、皮膚ホモジネート中のエラスターゼ活性を表した。結果を図３に示す。【００５４】
図３に示すとおり、ｂｌａｎｋ群と対照群を比較すると、紫外線照射によってエラスターゼ活性の著しい増加が認められたが、菌体群では対照群と比較して、エラスターゼ活性が抑制されることがわかった。【００５５】
実施例４  （菌体試料の調製）
ミネラル液（１ｗ／ｖ％）、酵母エキス（１ｗ／ｖ％）、乳糖（３ｗ／ｖ％）及び乳蛋白質（５ｗ／ｖ％）を用いて調製した培地を２Ｌコルベンに１．５Ｌ作製し、１２１℃で１５分間加熱殺菌した。この培地にビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１３２０）を１ｖ／ｖ％接種し、水酸化ナトリウムでｐＨを５．５に保持しながら３６℃でおよそ２０時間嫌気的に培養して培養液を得た。この培養液を１５，０００×Ｇで遠心分離し、ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を集菌した。なお、前記ミネラル液の組成は、リン酸（Ｉ）カリウム（１０ｗ／ｖ％）、リン酸（ＩＩ）カリウム（２０ｗ／ｖ％）、酢酸ナトリウム（３０ｗ／ｖ％）及び硫酸アンモニウム（３０ｗ／ｖ％）である。
一方、乳蛋白質８ｗ／ｖ％及び糖質４ｗ／ｖ％を分散させた分散液を１００ｍＬ調製し、１２１℃で１５分間加熱殺菌した。この分散液に、上記集菌したビフィドバクテリウム属細菌の菌体を湿重量当り１５％分散させ、その後凍結乾燥して、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１３２０）の凍結乾燥菌体を得た。この凍結乾燥菌体を４×１０９ＣＦＵ／ｍＬとなるように生理食塩水１０ｍＬに懸濁し、菌体試料を得た。【００５６】
試験例４  （エラスターゼ活性抑制試験）
ヘアレスマウスＨｏｓ：ＨＲ−１（６週齢）を、搬入後１週間馴化させた後、６匹ずつ合計３群に分け、それぞれ第１群〜第３群とした。
上記マウス群のうち、第１群及び第２群には生理食塩水を、第３群には実施例４で調製した菌体試料を、それぞれ９日間０．１ｍＬ／ｄａｙ経口投与した。
また、上記第１群については紫外線照射をせず、第２群及び第３群については、投与開始から６日目以降４日間、前記投与と共に紫外線照射装置（東芝ＳＥ−ＦＬ−２０）により、２８０〜４００ｎｍを含む紫外線を１日あたり５０ｍＪ／ｃｍ２照射し、その後、背部皮膚を採取した。
なお、上記マウス群のうち、生理食塩水を投与し、紫外線照射していないマウス群をｂｌａｎｋ群とし、生理食塩水を投与し、紫外線照射したマウス群を対照群とし、菌体試料を投与し、紫外線照射したマウス群を菌体群とした（表４）。下記表４において、ＵＶ＋は紫外線照射したこと、ＵＶ−は紫外線照射していないことを示す。【００５７】
【表４】
2011083738.tif 000005
【００５８】
上記採取した各背部皮膚にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を加えてＰｏｌｙｔｒｏｎでホモジネートし、１４，０００×Ｇで遠心した後、上清を９６穴プレートに１００μＬずつ分注し、エラスチンに代わる人工基質として合成基質であるスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロアニリド６．２５ｍＭを２０μＬ添加し、３７℃で２４時間インキュベーションした。その後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。スタンダードにはｐ−ニトロアニリンを使用して、皮膚ホモジネート中のエラスターゼ活性を表した。結果を図４に示す。【００５９】
図４に示すとおり、ｂｌａｎｋ群と対照群を比較すると、紫外線照射によってエラスターゼ活性の著しい増加が認められたが、菌体群では対照群と比較して、エラスターゼ活性が抑制されることがわかった。
【図１】
2011083738.tif 000006
【図２】
2011083738.tif 000007
【図３】
2011083738.tif 000008
【図４】
2011083738.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成24年9月28日(2012.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
上記ビフィドバクテリウム・ブレーベとしては、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ４０６３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８２３）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  ４０６４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８２４）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  ４０６５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２３    （独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  旧名：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）（住所：〒３０５  日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成８年２月２９日に寄託））、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０    独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成２２年２月１６日に寄託）、これらビフィドバクテリウム・ブレーベを親株とする子孫株が好ましい。これらの中でも、ＤＮＡ損傷修復促進作用及びエラスターゼ活性抑制作用の点から、ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＹＩＴ  ４０６５、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２が特に好ましい。なお、本発明において「子孫株」とは、自然変異株、変異処理による変異株、遺伝子操作による変異株等を含む概念である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
実施例２  （菌体試料の調製）
ミネラル液（１ｗ／ｖ％）、酵母エキス（１ｗ／ｖ％）、乳糖（３ｗ／ｖ％）及び乳蛋白質（５ｗ／ｖ％）を用いて調製した培地を２Ｌコルベンに１．５Ｌ作製し、１２１℃で１５分間加熱殺菌した。この培地にビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０）を１ｖ／ｖ％接種し、水酸化ナトリウムでｐＨを５．５に保持しながら３６℃でおよそ２０時間嫌気的に培養して培養液を得た。この培養液を１５，０００×Ｇで遠心分離し、ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を集菌した。なお、前記ミネラル液の組成は、リン酸（Ｉ）カリウム（１０ｗ／ｖ％）、リン酸（ＩＩ）カリウム（２０ｗ／ｖ％）、酢酸ナトリウム（３０ｗ／ｖ％）及び硫酸アンモニウム（３０ｗ／ｖ％）である。
一方、乳蛋白質８ｗ／ｖ％及び糖質４ｗ／ｖ％を分散させた分散液を１００ｍＬ調製し、１２１℃で１５分間加熱殺菌した。この分散液に、上記集菌したビフィドバクテリウム属細菌の菌体を湿重量当り１５％分散させ、その後凍結乾燥して、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０）の凍結乾燥菌体を得た。この凍結乾燥菌体を４×１０９ＣＦＵ／ｍＬとなるように生理食塩水１０ｍＬに懸濁し、菌体試料を得た。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
図２に示すとおり、対照群では、ｂｌａｎｋ群と比較して、紫外線照射によって著しいＣＰＤの増加が認められたが、菌体群では、この対照群と比較して、ＣＰＤ量が低下していた。したがって、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０）の投与により紫外線に起因するＤＮＡ損傷の修復を促進できることが認められた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
実施例４  （菌体試料の調製）
ミネラル液（１ｗ／ｖ％）、酵母エキス（１ｗ／ｖ％）、乳糖（３ｗ／ｖ％）及び乳蛋白質（５ｗ／ｖ％）を用いて調製した培地を２Ｌコルベンに１．５Ｌ作製し、１２１℃で１５分間加熱殺菌した。この培地にビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０）を１ｖ／ｖ％接種し、水酸化ナトリウムでｐＨを５．５に保持しながら３６℃でおよそ２０時間嫌気的に培養して培養液を得た。この培養液を１５，０００×Ｇで遠心分離し、ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を集菌した。なお、前記ミネラル液の組成は、リン酸（Ｉ）カリウム（１０ｗ／ｖ％）、リン酸（ＩＩ）カリウム（２０ｗ／ｖ％）、酢酸ナトリウム（３０ｗ／ｖ％）及び硫酸アンモニウム（３０ｗ／ｖ％）である。
一方、乳蛋白質８ｗ／ｖ％及び糖質４ｗ／ｖ％を分散させた分散液を１００ｍＬ調製し、１２１℃で１５分間加熱殺菌した。この分散液に、上記集菌したビフィドバクテリウム属細菌の菌体を湿重量当り１５％分散させ、その後凍結乾燥して、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ  １２２７２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０）の凍結乾燥菌体を得た。この凍結乾燥菌体を４×１０９ＣＦＵ／ｍＬとなるように生理食塩水１０ｍＬに懸濁し、菌体試料を得た。
【国際調査報告】
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