(57)【要約】    【課題】本発明は、抗原性が高いＧＬＰ−１アナログを改良し、その血糖値抑制活性を低下させることなく、抗原性を低下させたＧＬＰ−１アナログを提供することを課題とする。    【解決手段】本発明は、抗原性ＧＬＰ−１アナログの少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換され、ＧＬＰ−１活性を有する、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原性ＧＬＰ−１アナログの少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換され、ＧＬＰ−１活性を有する、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ又は糖鎖付加Ｃｙｓである、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が４個以上の糖からなる糖鎖である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が２本鎖複合型糖鎖である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項６】
請求項５に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖、及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項７】
請求項５に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が、
【化１】
2011052523.tif 000031
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【化２】
2011052523.tif 000032
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記抗原性ＧＬＰ−１アナログがエキセンディン−４である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項９】
請求項８に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖付加アミノ酸で置換された部位が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における３０位である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項１０】
請求項８に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、３０位のＧｌｙが糖鎖付加Ｃｙｓに置換されており、
前記糖鎖が、下記式で示されるジシアロ糖鎖
【化３】
2011052523.tif 000033
であり、
前記糖鎖付加Ｃｙｓにおいて、前記糖鎖と前記Ｃｙｓとがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記抗原性ＧＬＰ−１アナログがリラグルチドである、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された部位が、配列番号：３に記載のアミノ酸配列における３０位である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項１３】
請求項１１に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、
配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、３０位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓに置換されており、
前記糖鎖が、下記式で表わされるジシアロ糖鎖、又は、
【化４】
2011052523.tif 000034
下記式で表わされるアシアロ糖鎖
【化５】
2011052523.tif 000035
であり、
前記糖鎖付加Ｃｙｓにおいて、前記糖鎖と前記Ｃｙｓとがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が実質的に均一である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が９９％以上均一である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖を付加していない抗原性ＧＬＰ−１アナログに比較して抗原性が２分の１以下である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖を付加していない抗原性ＧＬＰ−１アナログより抗原性が低下し、天然型ＧＬＰ−１よりＧＬＰ−１活性が上昇している、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の医薬組成物であって、ＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の医薬組成物であって、前記ＧＬＰ−１に関連する疾患が糖尿病である医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体の有効量を投与することを特徴とする、ＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＬＰ−１アナログにのうち抗原性の高いものに糖鎖を付加した抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１：ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）は、糖のホメオスタシスの制御に深く関与する腸起源のペプチドである。ＧＬＰ−１は、グルカゴン前駆体のプレプログルカゴンの組織特異的な翻訳後プロセシングにより腸のＬ細胞において合成され、食事に反応して循環中へ放出される。このペプチドは、腸島軸（ｅｎｔｅｒｏｉｎｓｕｌａｒ  ａｘｉｓ）の主要メディエーターであり、特定の受容体に結合することによって作用する。【０００３】
ＧＬＰ−１は、主として膵臓に作用し、β細胞によるインスリン放出をグルコース濃度依存的に促進することが知られている。また、グルカゴンの分泌を抑制し、胃の空洞化を遅らせ、末梢のグルコース処理を高める可能性が示唆されている。【０００４】
ＧＬＰ−１の投与によりインスリン非依存型糖尿病患者において食後のグルコースレベルが正常化され得ることから、ＧＬＰ−１の治療薬としての可能性が示唆されている。また、ＧＬＰ−１はインスリン依存型糖尿病患者において血糖コントロールを改善する作用も有している。さらに、ＧＬＰ−１のインスリン放出促進作用は血漿グルコース濃度に依存しているため、低い血漿グルコース濃度ではＧＬＰ−１介在性のインスリン放出が低く、重篤な低血糖症を招かないメリットがある。従って、必要に応じ、血中ＧＬＰ−１量をコントロールすることによって、安全性の高い糖尿病治療が可能になると考えられる。しかしながら、ＧＬＰ−１の血中の半減期は、２〜６分と極めて短く、その治療剤としての可能性が限定されるという問題がある。【０００５】
このような問題を解決する手段として、ＧＬＰ−１を改変する試みがなされている。例えば、特許文献１には、少なくとも１個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子に共役的に結合したＧＬＰ−１化合物を含むペグ化ＧＬＰ−１化合物が開示されている。当該ペグ化ＧＬＰ−１化合物では、各ＰＥＧがＧＬＰ−１化合物に、Ｃｙｓ又はＬｙｓアミノ酸にて、もしくはカルボキシ末端アミノ酸にて結合している。当該ペグ化ＧＬＰ−１化合物は、少なくとも１時間の排出半減期を有する。【０００６】
特許文献１によれば、非ペグ化（ｕｎＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ペプチドと比べて、半減期が延長され、クリアランスが遅延化された生理活性ペプチドが得られる。また、これらのペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＧＬＰ−１化合物及び組成物は、糖尿病、肥満、過敏性腸症候群、ならびに血糖を低下させること、胃及び／又は腸運動性を抑制すること、及び、胃及び／又は腸内容排出を抑制すること、又は食物摂取を抑制すること等、健康状態の治療に有用であることが開示されている（例えば、非特許文献１）。【０００７】
しかしながら、ＰＥＧは、生体内で代謝されない化合物であるため、ペグ化ＧＬＰ−１化合物の投与を続けると、ＰＥＧが生体内に蓄積され、生体に薬害を与える危険性がある（非特許文献１）。【０００８】
また、半減期を延長するために、ＧＬＰ−１やその改変体に糖鎖を付加する方法も提案されている（例えば、特許文献２及び３）。一方、特許文献２には、分子量２００ＫＤａ程度のヒアルロン酸修飾物をＧＬＰ−１アナログに結合させる方法が記載されている。しかしながら、このように巨大なヒアルロン酸分子を大量に製造する場合、長さや構造を均一にするのは困難であり、実際には各ヒアルロン酸の構造や長さにはかなりばらつきが生じているものと考えられる。医薬品として用いる場合には、長さや構造が均一な糖鎖付加ペプチドが必要とされる。一方、特許文献３には、ＧＬＰ−１の２６位、３４位、及び／又は３７位に糖鎖付加アミノ酸を導入する方法等が記載されているが、糖鎖の種類や糖鎖を付加する位置が、必ずしも最適化されているとはいえない。
また、本発明者らも糖鎖の種類や付加位置を変更し、血中半減期が長く、活性の高い糖鎖付加ＧＬＰ−１を開発している（例えば、特許文献４）。【０００９】
ところで、ＧＬＰ−１に類似した構造で、同様の活性を有し、かつ、血中安定性の高い化合物として、トカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ）の唾液から発見されたエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）（非特許文献２）が米国で上市されている。しかしながら、エキセンディン−４は非ヒト型配列であるため、他のＧＬＰ−１アナログより抗原性が高く、長期投与による中和抗体の出現やそれに伴う薬効の減弱が懸念される（非特許文献３〜５）。【００１０】
また、ＧＬＰ−１に脂肪酸を結合させたリラグルチドもＧＬＰ−１アナログの一つとして開発されている（例えば非特許文献６乃至８を参照）。脂肪酸を結合させると、アルブミンとの親和性が高められる。アルブミンと結合したリラグルチドは、血中に徐々に放出されるので、半減期が約１０時間となり長時間の作用が期待される。１日１回の皮下注射で足りるので利便性も高い。また、併用のみでなく単独療法も可能とされている。
しかしながら、天然型と異なる構造を有するので、エキセンディン−４と同様に抗原性が懸念されている。特に、リラグルチドは、投与された量の約９９％がアルブミンと結合するために投与量が多くなるので、その点でも化合物の抗原性を極力低下させておく必要がある。
【特許文献１】特表２００６−５２０８１８号公報
【特許文献２】再表２００６−０９５７７５号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０６３９０７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００８／１５５９００号パンフレット
【非特許文献１】Ｂｅｎｄｅｌｅ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．：Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，４２：１５２−１５７
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２，２６７：７４０２−７４０５
【非特許文献３】Ｓｃｈｎａｂｅｌ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｒｉｓｋ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，２００６，２：６９−７７
【非特許文献４】Ａｍｏｒｉ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２００７，２９８：１９４−２０６
【非特許文献５】Ｗａｊｃｈｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．Ｌ．：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００７，２８：１８７−２１８
【非特許文献６】Ｍａｒｒｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００９，２６（３）：２６８−２７８
【非特許文献７】Ｄｅａｃｏｎ，Ｃ．Ｆ．：Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｒｉｓｋ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，２００９，５：１９９−２１１
【非特許文献８】Ｌａｒｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００１，５０：２５３０−２５３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、抗原性が高いＧＬＰ−１アナログを改良し、その血糖値抑制活性を低下させることなく、抗原性を低下させたＧＬＰ−１アナログを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、エキセンディン−４等の抗原性を有するＧＬＰ−１アナログに糖鎖を付加することによって、血糖値抑制活性を低下させることなく、抗原性を低下させることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕抗原性ＧＬＰ−１アナログの少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換され、ＧＬＰ−１活性を有する、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔２〕上記〔１〕に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ又は糖鎖付加Ｃｙｓである、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔３〕上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が４個以上の糖からなる糖鎖である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が２本鎖複合型糖鎖である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔６〕上記〔５〕に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖、及びジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔７〕上記〔５〕に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が、
【化１】
2011052523.tif 000002
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【化２】
2011052523.tif 000003
を示す。Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔８〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記抗原性ＧＬＰ−１アナログがエキセンディン−４である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔９〕上記〔８〕に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖付加アミノ酸で置換された部位が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における、３０位である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔１０〕上記〔８〕に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、３０位のＧｌｙが糖鎖付加Ｃｙｓに置換されており、
前記糖鎖が、下記式で示されるジシアロ糖鎖
【化３】
2011052523.tif 000004
であり、
前記糖鎖付加Ｃｙｓにおいて、前記糖鎖と前記Ｃｙｓとがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔１１〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記抗原性ＧＬＰ−１アナログがリラグルチドである、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔１２〕上記〔１１〕に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された部位が、配列番号：３に記載のアミノ酸配列における３０位である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔１３〕上記〔１１〕に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、
配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、３０位のＡｒｇが糖鎖付加Ｃｙｓに置換されており、
前記糖鎖が、下記式で表わされるジシアロ糖鎖、又は、
【化４】
2011052523.tif 000005
下記式で表わされるアシアロ糖鎖
【化５】
2011052523.tif 000006
であり、
前記糖鎖付加Ｃｙｓにおいて、前記糖鎖と前記Ｃｙｓとがリンカーを介して結合している、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔１４〕上記〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が実質的に均一である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔１５〕上記〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、前記糖鎖が９９％以上均一である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔１６〕上記〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖を付加していない抗原性ＧＬＰ−１アナログに比較して抗原性が２分の１以下である、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔１７〕上記〔１〕〜〔１６〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体であって、糖鎖を付加していない抗原性ＧＬＰ−１アナログより抗原性が低下し、天然型ＧＬＰ−１よりＧＬＰ−１活性が上昇している、抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体；
〔１８〕上記〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体を有効成分として含む医薬組成物；
〔１９〕上記〔１８〕に記載の医薬組成物であって、ＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防のための医薬組成物；
〔２０〕上記〔１９〕に記載の医薬組成物であって、前記ＧＬＰ−１に関連する疾患が糖尿病である医薬組成物；
〔２１〕上記〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体の有効量を投与することを特徴とする、ＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防方法、に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体は、糖鎖を付加することにより、血糖値抑制活性を低下させることなく、抗原性を低下させることができる。従って、血中安定性が高く血糖値抑制活性も高いというエキセンディン−４の優位性や、徐放性により投与回数を少なくすることができるというリラグルチドの優位性が維持された、安全な医薬品を提供することができる。
付加される糖鎖も生体内で容易に分解されるので、その蓄積により生体に薬害を与えることはない。
また、本発明で用いられる糖鎖には、比較的短いものが多いので、複雑な製造工程を経ずに、均一な構造のものを得ることができる。従って、大規模かつ安定に医薬品レベルの高品質な抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】３０位Ｃｙｓ−アシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：８）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】実施例４における、リラグルチドの３０位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチド（配列番号：１４）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３】３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：９）のＨＰＬＣによる精製クロマトグラムを示す。
【図４】糖鎖付加によるエキセンディン−４の抗原性低下作用を評価した結果を示す。糖鎖付加及び非糖鎖付加エキセンディン−４でマウスを感作すると、糖鎖付加エキセンディン−４の抗体価は非糖鎖付加エキセンディン−４に比較して約４分の１であった。
【図５】糖鎖付加エキセンディン−４の経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）の結果を示す。糖鎖付加エキセンディン−４は、非糖鎖付加エキセンディン−４と同等の血糖値上昇抑制作用を示した。
【図６】ｄｂ／ｄｂマウスを使用して、糖鎖付加エキセンディン−４の血糖値低下作用を評価した結果を示す。糖鎖付加エキセンディン−４は、非糖鎖付加エキセンディン−４と同等の強い血糖値低下作用を示した。
【図７】糖鎖付加リラグルチドの経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）の結果を示す。糖鎖付加リラグルチドは、非糖鎖付加リラグルチドよりもさらに高い血糖値上昇抑制作用を示した。
【図８】ｄｂ／ｄｂマウスを使用して、糖鎖付加リラグルチドの血糖値低下作用を評価した結果を示す。糖鎖付加リラグルチドは、非糖鎖付加リラグルチドと同等の血糖値低下作用と持続性を示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書において「ＧＬＰ−１」とは、グルカゴン様ペプチド−１（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）を示し、ＧＬＰ−１（７−３７）を指す。【００１６】
ＧＬＰ−１（７−３７）は、下記のアミノ酸配列を有する。
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：１）【００１７】
本明細書において、「ＧＬＰ−１アナログ」とは、ＧＬＰ−１と構造上類似したペプチド及び／又はＧＬＰ−１と重複した構造を有するペプチド、例えば：ＧＬＰ−１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；ＧＬＰ−１のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；ＧＬＰ−１改変体；ＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１のフラグメント；ＧＬＰ−１活性を有する伸長ＧＬＰ−１等をいう。【００１８】
本明細書において、「抗原性ＧＬＰ−１アナログ」とは、ＧＬＰ−１アナログのうち抗原性を有するものをいう。抗原性は、当該抗原性ＧＬＰ−１アナログが投与される個体における抗原性を意味し、その程度は問わない。抗原性は、当業者が公知の方法又はそれに準ずる方法で評価することができ、かかる方法としては、例えば、マウスを抗原性ＧＬＰ−１アナログで感作し、当該マウスの血中の抗ＧＬＰ−１アナログ抗体価を測定する方法が挙げられる。
抗原性ＧＬＰ−１アナログとしては、例えば、エキセンディン−４（以下、「Ｅｘ−４」と記載する場合もある。）、リラグルチド、タスポグルチド（別名ＢＩＭ−５１０７７、Ｇｉａｎｎｏｕｋａｋｉｓ，Ｎ．：Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，２００７，８：８４２−８４８）、及びＺＰ−１０Ａ（Ｔｈｏｒｋｉｌｄｓｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２００３，３０７：４９０−４９６）等が挙げられるがこれらに限定されない。【００１９】
本明細書において、「エキセンディン−４」とは、特に断りがない限り、配列番号：２に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドに加え、当該ペプチドと構造上類似したペプチド及び／又は当該ペプチドと重複した構造を有するペプチド、例えば：当該ペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；当該ペプチドのアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；当該ペプチドの改変体；エキセンディン−４と同等の活性を有する当該ペプチドのフラグメント；エキセンディン−４と同等の活性を有する当該ペプチドを伸長したペプチド、等であって、上記ＧＬＰ−１アナログに該当するものを含む。【００２０】
また、本明細書において、「リラグルチド」とは、特に断りがない限り、配列番号：３に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドに加え、当該ペプチドと構造上類似したペプチド及び／又は当該ペプチドと重複した構造を有するペプチド、例えば：当該ペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；当該ペプチドのアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；当該ペプチドの改変体；リラグルチドと同等の活性を有する当該ペプチドのフラグメント；リラグルチドと同等の活性を有する当該ペプチドを伸長したペプチド、等であって、上記ＧＬＰ−１アナログに該当するものを含む。【００２１】
本明細書において、「ＢＩＭ−５１０７７」とは、特に断りがない限り、配列番号：１８に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドに加え、当該ペプチドと構造上類似したペプチド及び／又は当該ペプチドと重複した構造を有するペプチド、例えば：当該ペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；当該ペプチドのアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；当該ペプチドの改変体；リラグルチドと同等の活性を有する当該ペプチドのフラグメント；リラグルチドと同等の活性を有する当該ペプチドを伸長したペプチド、等であって、上記ＧＬＰ−１アナログに該当するものを含む。【００２２】
本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。抗原性ＧＬＰ−１アナログのいくつかは、非天然アミノ酸を含むことが知られる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。【００２３】
本明細書において、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」という場合、置換等されるアミノ酸の個数は、本発明の抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体がＧＬＰ−１活性を保持する限り特に限定されないが、１〜９個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個程度であるかあるいは全体の長さの２０％以内、好ましくは１０％以内である。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸又はアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。【００２４】
本明細書において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、ＧＬＰ−１活性の明らかな低下又は消失を生じない置換をいう。【００２５】
本明細書において、ＧＬＰ−１、Ｅｘ−４及びリラグルチド（以下、まとめて「ＧＬＰ−１等」という。）の「改変体」とは、ＧＬＰ−１等を天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、ＧＬＰ−１等の１又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。例えば、Ｃ末端がアミド化されたペプチドも含まれる。【００２６】
本明細書において、「ＧＬＰ−１活性を有するＧＬＰ−１等のフラグメント」とは、元のＧＬＰ−１等のＮ末端及び／又はＣ末端から１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失し、かつＧＬＰ−１活性を維持したＧＬＰ−１等である。【００２７】
本明細書において、「ＧＬＰ−１活性を有する伸長したペプチド」とは、元のＧＬＰ−１等のＮ末端及び／又はＣ末端に１個又はそれ以上のアミノ酸が付加され、かつＧＬＰ−１活性を維持したペプチドである（例えば、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２５，３１０９−１４（１９８９）を参照）。【００２８】
本明細書において、「抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体」は、抗原性ＧＬＰ−１アナログにおいて、少なくとも１個のアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする。なお、以下において「抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加体」を「糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１」ということもある。【００２９】
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは、その塩も含む。本明細書において、塩は、酸付加塩又は塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩を形成するために通常用いられる酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸及びｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等の有機酸である。塩基付加塩としては、水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等の無機塩基から誘導された塩が挙げられる。特に、薬学的に許容される塩が好ましい。【００３０】
本明細書において、「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸であり、ここで糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
糖鎖が結合するアミノ酸の種類に特に限定はなく、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれを用いることもできる。糖鎖付加アミノ酸が生体内に糖ペプチド（糖たんぱく質）として存在するものと同一又は類似の構造を有するという観点からは、糖鎖付加アミノ酸は、Ｎ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Ａｓｎ、Ｏ−結合型糖鎖のような糖鎖付加Ｓｅｒ及び糖鎖付加Ｔｈｒが好ましく、特に糖鎖付加Ａｓｎが好ましい。【００３１】
また、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖付加アミノ酸のアミノ酸は、アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２つ以上のカルボキシル基を持つアミノ酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上のアミノ基を持つアミノ酸、セリン、スレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸、システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸、アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸、が好ましい。特に、反応性の観点からは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンが好ましく、特にシステイン及びリシンが好ましい。【００３２】
なお、本発明の任意の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログについて、糖鎖構造、糖鎖以外の構造、糖鎖の付加部位及び糖鎖の付加数が同一である場合に、糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ（リンカーを介さない）の場合と糖鎖付加Ｃｙｓ（リンカーを介する）の場合で、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの血糖値上昇抑制活性に大きな違いはみられない。【００３３】
糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができるが、例えば、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ２−（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）、Ｃ１−１０ポリメチレン、−ＣＨ２−Ｒ−（ここで、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）、−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−（ＣＯ）−（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）等を挙げることができる。【００３４】
糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合している場合、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合と比較して、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの抗原性は低くなり得る。糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合している場合と比較して、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの血中安定性が高くなり得る。【００３５】
なお、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは、その記載（例えば、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ」という記載）によって何ら製造方法が限定されるものではなく、後述のＡ法〜Ｃ法のいずれの方法で製造した糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログであっても、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ」に含まれる。また、例えば、アミノ酸の結合していない糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸に直接又はリンカーを介して結合させた糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ；糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログにおいて、付加した糖鎖にさらに糖又は糖鎖を付加することですでに付加された糖鎖を伸長させた糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ；糖鎖付加アミノ酸のアミノ基及び／又はカルボキシル基に１又は数個のアミノ酸を結合させ、さらにこれを１又は複数のＧＬＰ−１アナログのフラグメントと連結させた糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ、なども最終的な構造が一致している限り、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログに含まれる。【００３６】
抗原性ＧＬＰ−１アナログのアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する数は、血中安定性や血糖値抑制活性等の生理活性、最終的な糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログに存在するアミノ酸の個数や糖鎖付加前後の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの分子量、等により適宜調節すればよい。例えば、１〜５個置換することが好ましく、１〜３個置換することがより好ましい。簡便性の観点からは、１個の置換で所望の活性が得られるのであれば、１個の置換を選択することが好ましいであろう。一般に、抗原性ＧＬＰ−１アナログの１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１個以上をさらに糖鎖付加アミノ酸で置換した場合、血中安定性は増大し、血糖値抑制活性は減少する傾向がある（但し、血中安定性が増大することで、減少した血糖値抑制活性を補償することが可能である）。【００３７】
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログにおいて、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は特に限定されないが、当業者は、抗原性を低下させる活性を付与し、且つ、血中安定性や血糖値抑制活性がＧＬＰ−１より低下しない部位を適宜選択することができる。【００３８】
本発明の一態様において、抗原性ＧＬＰ−１アナログのアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、所望の活性に応じて抗原性ＧＬＰ−１アナログの任意の部位を選択することができる。例えば抗原性ＧＬＰ−１アナログにおいて、配列番号：１に記載のＧＬＰ−１ペプチドのアミノ酸配列の１２、１４、１６、２０、２４、２８、３０及び３２位（＝３１位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位に相当する部位であり、好ましくは、１２、２０、２４、２８及び３０位から選択される１以上の部位に相当する部位であり、特に２４及び３０位から選択される１以上の部位に相当する部位である。【００３９】
ここで、「抗原性ＧＬＰ−１アナログにおいて、配列番号：１に記載のＧＬＰ−１ペプチドのアミノ酸配列のＸ位に相当する位置」とは、種々の抗原性ＧＬＰ−１アナログのアミノ酸配列において、配列番号：１に記載のＧＬＰ−１ペプチドのアミノ酸配列のＸ位に対応する位置を意味し、かかる位置は、当業者がそれぞれの周辺のアミノ酸配列等に基づいて容易に決定することができる。【００４０】
例えば、抗原性ＧＬＰ−１アナログであるＥｘ−４及びリラグルチドのアミノ酸配列と、配列番号：１に記載のＧＬＰペプチドのアミノ酸配列は、以下のように対応している。
【表１】
2011052523.tif 000007
【００４１】
Ｅｘ−４やリラグルチドが、そのアミノ酸配列に付加、置換、欠失がないものであれば、上表で縦に並んだアミノ酸が「相当する位置」にあるアミノ酸である。付加、置換、欠失がある場合、当業者はそれぞれの周辺のアミノ酸配列に基づいて、「相当する位置」を決定することができる。【００４２】
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの抗原性を低下させるという観点からは、例えば、抗原性ＧＬＰ−１アナログにおける抗原認識部位の周辺とすることが好ましい。また、例えば、配列番号：１に記載のＧＬＰ−１ペプチドの３０位に相当する部位に糖鎖を付加することが有効である。【００４３】
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの血中安定性という観点からは、例えば、配列番号：１に記載のＧＬＰ−１ペプチドの３、４、５、６、８、１０、１２、１３、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２６、２８、３０及び３２位（＝３１位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位に相当する部位であり、好ましくは３、４、５、６、８及び２２位から選択される１以上の部位であり、特に好ましくは３、４、５及び６から選択される１以上の部位に相当する部位である。特にＧＬＰ−１のＮ末端に近い部位のアミノ酸の置換も好ましい。特に、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位の例として、例えば１２位と３０位、２０位と２８位、１６位と２４位、１６位と３０位、２４位と３０位に、それぞれ相当する部位などを挙げることができる。【００４４】
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの血糖値抑制作用という観点からは、例えば、配列番号：１に記載のＧＬＰ−１ペプチドの１２、１４、１６、２０、２４、２８、３０及び３２位（＝３１位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位に相当する部位であり、好ましくは１２、２０、２４、２８及び３０位から選択される１以上の部位に相当する部位であり、特に２４及び３０位から選択され１以上の部位に相当する部位である。２以上のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位の例として、例えば、１２位と３０位、２０位と２８位、１６位と２４位、１６位と３０位、２４位と３０位にそれぞれ相当する部位などを挙げることができる。【００４５】
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログのＧＬＰ−１活性のうち、ｃＡＭＰ合成能に関する観点からは、例えば、配列番号：１に記載のＧＬＰ−１ペプチドの１６、２０、２１、２４、２８、３０及び３２位（＝３１位のアミノ酸に糖鎖付加アミノ酸を付加）から選択される１以上の部位に相当する部位であり、好ましくは１６、２０、２４、２８、３０及び３２位から選択される１以上の部位に相当する部位である。【００４６】
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるＧＬＰ−１の２、３及び６位以外の部位から選択される１以上の部位である。
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、ＧＬＰ−１の１、４、７、９、１３、１５及び２３位以外の部位から選択される１以上の部位、特に、１、４及び９位以外の部位から選択される１以上の部位である。【００４７】
本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、ＧＬＰ−１のＧＬＰ−１受容体への結合部位からも、決定することができる。【００４８】
本発明の一態様において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されている場合に、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、上記のいずれの組み合わせも採用することができるがこれに限定されない。例えば、１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位が抗原性ＧＬＰ−１アナログの任意の部位から選択される組み合わせ；１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位が抗原性ＧＬＰ−１アナログのＣ末端にさらに付加された１若しくは数個のアミノ酸の任意の部位から選択される組み合わせ等もまた、本発明の好ましい一態様に含まれる。【００４９】
本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が生ずる部位は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるＧＬＰ−１の１、４、７、９、１３、１５、２２及び２３位以外の部位から選択される１以上の部位、例えば、１、４、９及び２２位以外の部位から選択される１以上の部位であることが好ましい（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｌ，ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  Ｖｏｌ．２６９，Ｎｏ．９，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｍａｒｃｈ  ４，ｐｐ．  ６２７６−６２７８．１９９４）。【００５０】
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログとしては、例えば、以下のアミノ酸配列を有するエキセンディン−４に糖鎖を付加したものを挙げることができる。
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＮＨ２（配列番号：２）
糖鎖付加エキセンディン−４は、例えば、以下の一般式（１）で表わされる。
一般式（１）
Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１２−Ｇｌｎ−Ｘａａ１４−Ｇｌｕ−Ｘａａ１６−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｘａａ２０−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｘａａ２８−Ｇｌｙ−Ｘａａ３０−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＮＨ２
［式中、Ｘａａ１２は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１４は、Ｍｅｔ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１６は、Ｇｌｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２０は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２４は、Ｇｌｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２８は、Ａｓｎ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３０は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１２、Ｘａａ１４、Ｘａａ１６、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２８及びＸａａ３０の少なくとも１つは糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付加Ａｓｎである。］（配列番号：４）
中でも、Ｘａａ２４が糖鎖付加Ｃｙｓであることが好ましい。【００５１】
なお、エキセンディン−４のように、本来Ｃ末端がアミド化されているペプチドについては、当該Ｃ末端のアミノ酸に糖鎖を付加した糖鎖付加アミノ酸を合成する場合、Ｃ末端をアミド化しない場合もある。【００５２】
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログとしては、例えば、以下のアミノ酸配列を有するリラグルチドに糖鎖を付加したものを挙げることができる。
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ２０−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：３）
ここで、Ｌｙｓ２０には、下記式で示されるように、グルタミン酸を介してパルミトイル基が結合している。
【化６】
2011052523.tif 000008
糖鎖付加リラグルチドは、例えば、以下の一般式（２）で表わされる。
一般式（２）
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１２−Ｔｙｒ−Ｘａａ１４−Ｇｌｕ−Ｘａａ１６−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ２０−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ２４−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ２８−Ｇｌｙ−Ｘａａ３０−Ｇｌｙ
［式中、Ｘａａ１２は、Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１４は、Ｌｅｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１６は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２４は、Ａｌａ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２８は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３０は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１２、Ｘａａ１４、Ｘａａ１６、Ｘａａ２４、Ｘａａ２８及びＸａａ３０の少なくとも１つは糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付加Ａｓｎである。］（配列番号：５）
中でも、Ｘａａ２４及び／又はＸａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓ又は糖鎖付加Ａｓｎであることが好ましく、特に、Ｘａａ３０が糖鎖付加Ｃｙｓであることが好ましい。【００５３】
また、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログとしては、例えば、以下のアミノ酸配列を有するＢＩＭ５１０７７に糖鎖を付加したものを挙げることができる。
Ｈｉｓ−Ｒ２−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｒ２−Ａｒｇ−ＮＨ２
［式中、Ｒ２は、α−メチルアラニン（アミノイソブタン酸、Ａｉｂとも呼ぶ）を示す。］（配列番号１８）
糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７は、例えば、以下の一般式（３）で表わされる。
一般式（３）
Ｈｉｓ−Ｒ２−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｔｙｒ−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘａａ２６−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ３４−Ｒ２−Ｘａａ３６−ＮＨ２
［式中、Ｒ２は、α−メチルアラニンを示し、
Ｘａａ１８は、Ｓｅｒ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２０は、Ｌｅｕ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２２は、Ｇｌｙ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ２６は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３０は、Ａｌａ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ３４は、Ｌｙｓ、糖鎖付加Ｃｙｓ、糖鎖付加Ａｓｎ、又は糖鎖付加Ｌｙｓを示す。
Ｘａａ３６は、Ａｒｇ、糖鎖付加Ｃｙｓ、又は糖鎖付加Ａｓｎを示す。
Ｘａａ１８、Ｘａａ２０、Ｘａａ２２、Ｘａａ２６、Ｘａａ３０、Ｘａａ３４及びＸａａ３６のすくなくとも１つは糖鎖付加Ｃｙｓまたは糖鎖付化Ａｓｎである。］（配列番号１９）【００５４】
本明細書において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。【００５５】
また、本明細書において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。【００５６】
本発明において、好ましい糖鎖は、抗原性ＧＬＰ−１アナログに付加された場合（糖鎖付加アミノ酸の形で抗原性ＧＬＰ−１アナログのアミノ酸と置換された場合）に、抗原性ＧＬＰ−１アナログの抗原性を低下させ、好ましくは血中安定性を増大させ、かつ、より好ましくは血糖値抑制活性を消失させない糖鎖である。但し、抗原性を低下させる限り、血中安定性及び／又は血糖値抑制活性は、抗原性ＧＬＰ−１アナログと同等であればよい。【００５７】
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログにおける糖鎖は特に限定されず、生体内で複合糖質（糖ペプチド（又は糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよいし、生体内では複合糖質として存在しない糖鎖であってもよい。【００５８】
生体内で複合糖質として存在する糖鎖は、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログが生体に投与されるという観点から好ましい。かかる糖鎖としては、生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）としてペプチド（又はタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等が挙げられる。好ましくは、Ｎ−結合型糖鎖が用いられる。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。【００５９】
本発明で使用する好ましい複合型糖鎖としては、例えば、下記一般式
【化７】
2011052523.tif 000009
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、
【化８】
2011052523.tif 000010
を示す。Ａｃはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。【００６０】
尚、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログにおいては、糖鎖が生体内で複合糖質として存在する糖鎖であっても、Ｏ−結合型及びＮ−結合型以外の方法で抗原性ＧＬＰ−１アナログに結合していてもよい。例えば、上述のとおり、糖鎖がリンカーを介してＣｙｓ等に結合しているものも、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログに含まれる。【００６１】
本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログにおける糖鎖は、４個以上、例えば５個以上、７個以上、特に９個以上、１１個以上の糖からなる糖鎖であることが好ましい。【００６２】
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログにおける糖鎖は、５〜１１個、９〜１１個、９個、１１個の糖からなる糖鎖である。【００６３】
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログにおける糖鎖は、２本鎖の複合型糖鎖である。複合型糖鎖とは、２種類以上の単糖を含み、以下に示す基本構造と、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃで示されるラクトサミン構造を有することを特徴とする。
【化９】
2011052523.tif 000011
２本鎖複合型糖鎖とは、基本構造の末端の２つのマンノースに、それぞれ０〜３糖からなる１本鎖の糖鎖が結合しているものをいう。２本鎖複合型糖鎖としては、例えば、以下に示すジシアロ糖鎖、
【化１０】
2011052523.tif 000012
モノシアロ糖鎖、
【化１１】
2011052523.tif 000013
アシアロ糖鎖、
【化１２】
2011052523.tif 000014
ジグルクナック糖鎖、
【化１３】
2011052523.tif 000015
ジマンノース糖鎖、
【化１４】
2011052523.tif 000016
等が好ましく、より好ましくはジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖である。
また、本明細書において「ジシアロ糖鎖」、「モノシアロ糖鎖」、「アシアロ糖鎖」、「ジグルクナック糖鎖」、「ジマンノース糖鎖」には、上記化学式で示したもののほか、化学式で示した例と結合様式の異なるものも含まれ、かかる糖鎖も本発明の糖鎖として好ましく用いられる。かかる糖鎖としては、例えば、ジシアロ糖鎖又はアシアロ糖鎖においてシアル酸とガラクトースが（α２→３）結合で結合しているもの等が挙げられる。【００６４】
また、本発明で用いられる高マンノース型糖鎖は、上述した複合型糖鎖の基本構造に、さらにマンノースが２個以上結合している糖鎖である。高マンノース型糖鎖は嵩高いので、ペプチドに高マンノース型糖鎖を結合させることにより血中安定性がより高くなりうる。哺乳類の高マンノース型糖鎖のように、５〜９個のマンノースを含む糖鎖が好ましいが、酵母の高マンノース型糖鎖のように、より多くのマンノースを含む糖鎖であってもよい。本発明に好ましく用いられる高マンノース型糖鎖としては、例えば、
ハイマンノース−５（Ｍ−５）
【化１５】
2011052523.tif 000017
ハイマンノース−９（Ｍ−９）
【化１６】
2011052523.tif 000018
等を挙げることができる。【００６５】
本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖（例えば、「ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ  Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂ．１９７５」に記載の糖鎖）と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖である、下記表２〜５に記載の糖鎖を挙げることができる。【００６６】
【表２】
2011052523.tif 000019
【００６７】
【表３】
2011052523.tif 000020
【００６８】
【表４】
2011052523.tif 000021
【００６９】
【表５】
2011052523.tif 000022
【００７０】
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖ペプチドにおける糖鎖の構造は、均一である。本明細書において、糖ペプチドにおける糖鎖の構造が均一であるとは、糖ペプチド間で比較した場合に、ペプチド中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が同一であることをいい、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖鎖の構造が均一であることを言う。糖鎖が均一である糖ペプチドは、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。【００７１】
本発明において、好ましい糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは、例えば、後述の実施例１〜４において製造した糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログである。
具体的には、
（ａ１）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるエキセンディン−４において、３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ（実施例１）（配列番号：６）；
（ａ２）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるエキセンディン−４において、３０位のＧｌｙがハイマンノース−５型糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ（実施例２）（配列番号：７）；
（ａ３）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるリラグルチドにおいて、３０位のＡｒｇがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ（実施例３）（配列番号：８）；
（ａ４）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるリラグルチドにおいて、３０位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ（実施例４）（配列番号：９）
（ａ５）配列番号：１８に記載のアミノ酸配列からなるＢＩＭ−５０１７７において、２０位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ（実施例５）（配列番号：２１）【００７２】
（製造方法）
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは、当業者に公知のペプチド合成方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加に際しては、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素の逆反応を利用する方法も用いることができるが、この場合、付加する糖鎖が大量に必要になる、最終工程後の精製が煩雑になる、糖鎖の付加位置及び付加可能な糖鎖が制限される、等の問題があるため、アッセイ用等の少量の合成には用いることが可能でも、医薬品製造等の大規模な製造には実用的な方法とは言えないことがある。【００７３】
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの簡便な製造方法であって、かつ、糖鎖の構造が均一である糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの安定した製造方法の具体例として、以下、糖鎖付加アミノ酸として糖鎖付加Ａｓｎを使用し、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを製造する方法（Ａ法）、抗原性ＧＬＰ−１アナログの任意のアミノ酸をＣｙｓで置換したペプチドを公知のペプチド合成方法に従って製造し、その後、Ｃｙｓに化学合成により糖鎖を付加し、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを製造する方法（Ｂ法）、を例示する。さらに、糖鎖付加Ａｓｎにリンカーの一端を結合した後、リンカーの他端にＮ−ヒドロキシコハク酸イミジル基を結合させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミジル基を抗原性ＧＬＰ−１アナログのＬｙｓ残基の側鎖アミノ基と反応させて、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを製造する方法（Ｃ法）を示す。これらの製造方法を参考に、当業者であれば様々な糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを製造することが可能であり、得られる糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ及びその製造方法は、特に医薬品製造の分野において、非常に有用である。【００７４】
また、これらのＡ法〜Ｃ法は、２つを組み合わせて用いることも可能である。アッセイなどに用いる少量の合成であれば、さらに、上記の方法に、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。なお、Ａ法は、国際公開第ＷＯ２００４／００５３３０号パンフレット（ＵＳ２００５２２２３８２（Ａ１））に、Ｂ法は、国際公開第ＷＯ２００５／０１００５３号パンフレット（ＵＳ２００７０６０５４３（Ａ１））に、それぞれ記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。また、Ａ法〜Ｃ法において用いられる糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、第ＷＯ０３／００８４３１号パンフレット（ＵＳ２００４１８１０５４（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０５８９８４号パンフレット（ＵＳ２００６２２８７８４（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０５８８２４号パンフレット（ＵＳ２００６００９４２１（Ａ１））、第ＷＯ２００４／０７００４６号パンフレット（ＵＳ２００６２０５０３９（Ａ１））、第ＷＯ２００７／０１１０５５号パンフレット等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。【００７５】
糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを製造する方法（Ａ法）
糖鎖付加抗原ＧＬＰ−１アナログは、例えば、以下に概略を示す糖鎖付加アスパラギンを用いた固相合成によって製造することができる。
（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基が反応してエステル化が起こる。
（２）得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させる。
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）最後に、酸でレジンを切断することにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。
ここで、（１）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加アスパラギンを用い、当該アスパラギン部分のカルボキシル基とレジンの水酸基とを反応させれば、Ｃ末端に糖鎖付加アスパラギンを有するペプチドを得ることができる。
また、（２）の後、又は、（３）と（４）を１回以上の任意の回数繰り返した後、（３）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加アスパラギンを用いれば、任意の箇所に糖鎖を付加することができる。
また、（１）及び（３）のいずれかの工程で、２回以上、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加アスパラギンを用いれば、任意の２ヶ所以上に糖鎖が付加されたペプチドを得ることができる。
糖鎖付加アミノ酸を結合させた後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、その直後に工程（６）を行えば、Ｎ末端に糖鎖付加アスパラギンを有するペプチドを得ることができる。【００７６】
水酸基を有する樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する水酸基を有する樹脂（レジン）であればよく、例えば、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。
また、Ｅｘ−４のようにＣ末端をアミド化する場合には、Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）を用いることが好ましい。このレジンとペプチドを酸で切断することにより、ペプチドのＣ末端アミノ酸をアミド化することができる。【００７７】
アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。【００７８】
脂溶性保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系又はアミド系の保護基等を挙げることができる。アミノ酸に脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。【００７９】
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−ＡＩａ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを挙げることができる。【００８０】
エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。【００８１】
エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。【００８２】
この時固相上の未反応の水酸基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。【００８３】
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。【００８４】
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。【００８５】
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウム（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。【００８６】
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが好ましい。【００８７】
溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。【００８８】
樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。【００８９】
このようにして、所望の位置を糖鎖付加アスパラギンで置換した糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを得ることができる。【００９０】
糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを製造する方法（Ｂ法）
糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは、まずペプチド鎖を合成し、後で糖鎖を付加する方法によっても製造することができる。具体的には、糖鎖を付加したい位置にＣｙｓを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞により合成する方法、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。
次に、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体を上記で得たＣｙｓを含むペプチドと反応させることにより、糖鎖をペプチドに結合させる。上記反応は、通常０〜８０℃、好ましくは、１０〜６０℃、更に好ましくは１５〜３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常３０分〜５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））で精製するのが良い。【００９１】
ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体は、例えば、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、−ＮＨ−（ＣＯ）−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ２Ｘ（Ｘはハロゲン原子、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０〜４の整数を示す。）で置換した化合物である。【００９２】
具体的には、ハロアセタミド化複合型糖鎖誘導体とＣｙｓ含有ペプチドとをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより糖鎖付加Ｃｙｓで置換した糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを得ることができる。【００９３】
なお、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログとして、糖鎖付加リラグルチドを製造する場合、Ｌｙｓ残基に脂肪酸を付加する工程が行われる。当該工程は、例えばＰａｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）−ＯＳｕを、Ｌｙｓを含むペプチドと反応させることによって行うことができる。脂肪酸付加工程は、糖鎖付加工程の前に行っても後に行ってもよい。【００９４】
糖鎖付加ＧＬＰ−１ペプチドを製造する方法（Ｃ法）
本方法は、糖鎖を付加する抗原性ＧＬＰ−１アナログにＬｙｓ残基が含まれる場合に有用である。
先ず、Ｌｙｓを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞による合成、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。
次に、糖鎖付加アミノ酸に、グルタル酸を結合させる。例えば、糖鎖付加アミノ酸をＤＭＳＯ溶液に溶解させ、この溶液に、グルタル酸−ＥＤＣ混合のＤＭＳＯ溶液を加え、室温で１日撹拌する。反応混合物を適宜希釈した後、分子量排除ゲルクロマトグラフィー等で分画することにより、α−アミノ基にグルタル酸を結合させた糖鎖付加アミノ酸を得ることができる。
次いで、グルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＤＭＳＯ溶液に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドのＤＭＳＯ溶液およびＥＤＣのＤＭＳＯ溶液を加え、室温で６時間撹拌した後、ＥＤＣを不活化することにより、グルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミジルエステルを合成することができる。
続いて、抗原性ＧＬＰ−１アナログのＤＭＳＯ溶液に、ＤＩＰＥＡ及びグルタル酸結合糖鎖付加アミノ酸のＮ−ヒドロキシコハク酸イミジルエステルを加え、室温で２時間撹拌した後、グリシン水溶液を加えて反応を停止し、適宜精製することにより、抗原性ＧＬＰ−１アナログのＬｙｓ残基にグルタル酸リンカーを介して糖鎖付加アミノ酸を結合させることができる。
抗原性ＧＬＰ−１アナログの所望の部位のアミノ酸をＬｙｓに置換したり、抗原性ＧＬＰ−１の野生型に含まれるＬｙｓ残基を他のアミノ酸で置換したりすることにより、所望の部位に糖鎖付加アミノ酸を結合させた糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを得ることが可能である。また、Ｃ法によれば、野生型抗原性ＧＬＰ−１アナログに含まれるＬｙｓに糖鎖付加する場合、ペプチド骨格が野生型と同一の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを得ることができる。【００９５】
（活性）
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは、ＧＬＰ−１活性を有する。本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは、好ましくは天然型ＧＬＰ−１と同等又はそれ以上のＧＬＰ−１活性を有し、さらに好ましくは、糖鎖を付加していない抗原性ＧＬＰ−１アナログ（以下、「非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ」という場合もある。）と比較して同等又はそれ以上のＧＬＰ−１活性を有する。【００９６】
本明細書において、「ＧＬＰ−１活性」とは、ＧＬＰ−１について公知の生理活性の一部又は全部をいう。ＧＬＰ−１は、血糖値抑制作用のほか、例えば、膵島作用として、ｃＡＭＰ合成誘導に伴うインスリン分泌、膵島保護（アポトーシス抑制）、膵島増殖、膵外作用として、食欲抑制、消化管運動抑制、カルシトニン分泌促進、虚血時の心保護作用等を有することが知られる。従って、ＧＬＰ−１活性とは、これらの作用に関連する生理活性の全部又は一部を指し、それぞれ、当業者に公知の手法を用いて測定することができる。【００９７】
例えば、ＧＬＰ−１活性のうち、血糖値抑制活性は、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂマウス）における血糖値低下作用の測定や、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ：Ｏｒａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ）における血糖値上昇抑制作用の測定などを用いて測定することができる。なお、本明細書において、「血糖値抑制」とは、血糖値の上昇を抑制すること及び血糖値を低下させることのいずれの概念も含む。特に、本明細書において、ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖値抑制作用を「血糖値低下作用」、ＯＧＴＴにおける血糖値抑制作用を「血糖値上昇抑制作用」ということがある。【００９８】
ＯＧＴＴによる血糖値抑制活性は、マウスに強制的に糖を飲ませた際の血糖値上昇の抑制の測定によって判断することができる。例えば、まず、被験化合物を一晩絶食させたマウスに投与し、その３０分後にグルコース溶液を経口投与する。グルコース投与によりマウス血糖値は上昇し、投与後約３０分後に最大となり徐々に減少する。グルコース投与後３０分の血糖値を測定し、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ投与の場合の血糖値と比較することで、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの血糖値抑制作用を評価することができる。【００９９】
一方、ＯＧＴＴにおいて同程度の血糖値上昇抑制作用が確認されるときの投与量を比較することで、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの血糖値抑制活性の強さを評価することができる。例えば、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを１０投与した場合と、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを１投与した場合で同じ血糖値抑制作用が得られる場合、該糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの血糖値抑制活性は、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの１０倍である。【０１００】
ｄｂ／ｄｂマウスを用いた血糖値抑制活性は、糖尿病マウスに被験化合物を投与後の血糖値の測定によって判断することができる。被験化合物投与後の血糖値を経時的に測定し、例えば投与後１２０分の血糖値が投与時より低下していれば、血糖値低下作用を確認することができる。また、例えば投与後３００分の血糖値を測定することで、血糖値低下作用の持続性も判断することができる。【０１０１】
なお、血糖値抑制活性が非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログと比較して低い場合あっても、血中安定性が増大することで、この活性の低さを補償することができる。【０１０２】
例えば、ＧＬＰ−１活性のうち、インスリン分泌活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｃＡＭＰ合成能試験などを用いて測定することができる。ＧＬＰ−１はＧＬＰ−１受容体と結合することにより細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させ、インシュリン分泌を促進させる。従って、例えば、マウスＧＬＰ−１受容体発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログで刺激し、細胞内で合成されるｃＡＭＰ量を測定し、ＥＣ５０値を非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログと比較することで、糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログのインスリン分泌活性を評価することができる。【０１０３】
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの血中安定性は、好ましくは天然型のＧＬＰ−１と同等又はそれ以上であり、さらに好ましくは非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログと同等又はそれ以上である。血中安定性は当業者に公知の手法を用いて測定することができ、例えば、血漿中における安定性や、ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）に対する耐性を測定し、半減期、ＡＵＣ（薬物血中濃度−時間曲線下面積）等を指標に判断することができる。また、腎クリアランスの増大も血中安定性の増大に寄与する。【０１０４】
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの血漿中における安定性は、好ましくは天然型ＧＬＰ−１と同等又はそれ以上であり、さらに好ましくは非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログと同等又はそれ以上である。【０１０５】
ＤＰＰ−ＩＶに対する耐性は、例えば、ＤＰＰ−ＩＶ溶液中における半減期の測定により判断することができる。本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログと比較して、ＤＰＰ−ＩＶに対する耐性は同等又はそれ以上である。【０１０６】
また、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも３、５、７、１０、１５、２０時間及びさらに好ましくは少なくとも２４時間の血中半減期を有する。【０１０７】
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログと比較して、その抗原性が低下している。抗原性の低下は、例えば、マウスを糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ又は非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログで感作し、それぞれのマウスの血中の抗ＧＬＰ−１アナログ抗体価を測定して比較することにより、評価することができる。
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの抗原性は、非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログと比較して、好ましくは約２分の１以下、より好ましくは約３分の１以下、さらに好ましくは約４分の１程度に低下している。【０１０８】
（医薬組成物）
次に、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを有効成分として含有する医薬組成物について説明する。
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを有効成分として含有する医薬組成物は、ＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防に有効である。上述の通り、ＧＬＰ−１には種々の作用が知られており、これらの作用に関連する疾患も様々である。例えば、ＧＬＰ−１が、インスリン放出を刺激することにより、細胞によるグルコース取り込み及び血糖値の低下を引き起こすことが見出されている。また、胃及び／又は腸運動性を抑制すること、胃及び／又は腸内容排出を抑制すること並びに食物摂取を抑制することも見出されている。従って、ＧＬＰ−１に関連する疾患には、例えば、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、インスリン依存性糖尿病、脳卒中（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ００／１６７９７号パンフレットを参照）、心筋梗塞（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９８／０８５３１号パンフレットを参照）、肥満（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９８／１９６９８号パンフレットを参照）、機能性消化不良、過敏性腸症候群（Ｅｆｅｎｄｉｃによる国際公開公報第ＷＯ９９／６４０６０号パンフレットを参照）、膵島移植が含まれる。本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを有効成分として含有する医薬組成物は、特に糖尿病の治療又は予防に有効であり、より特定すれば、１型糖尿病の予防、２型糖尿病の治療に有効である。【０１０９】
上記医薬組成物は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤したものである。
このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等が挙げられる。【０１１０】
医薬組成物中に含有される本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択することができるが、通常、医薬組成物中に本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを１〜７０重量％含有させるのが好ましい。【０１１１】
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに異なる１以上の本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを有効成分として含有することもできるし、異なる１以上の本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログを有効成分として含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。【０１１２】
本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。【０１１３】
上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、通常、体重１ｋｇに対して本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログが０．１〜９００ｎｍｏｌ、好ましくは１〜９０ｎｍｏｌとなる投与量である。本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは非糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログに比べ、抗原性が低いので投与量を増やしても比較的安全性が高い。【０１１４】
上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月など）も選択しうる。好ましくは、上記医薬組成物の投与回数は、１回以下／１日である。【０１１５】
本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログに付加された糖鎖は、体内の代謝系で容易に分解される。また、本発明の一態様において、該糖鎖は生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）として結合して存在する構造を有する。従って、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログ及び該ペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、生体内に投与しても副作用や抗原性を示すことがなく、アレルギー反応や、抗体産生により薬効が得られなくなる心配が少ないなどの利点を有する。【０１１６】
さらに、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログは安定して簡便に大量に供給することが可能であり、品質の安定した、高品質の医薬品の提供という観点からも、非常に有用である。
本発明はまた、本発明の糖鎖付加抗原性ＧＬＰ−１アナログの有効量を投与することを特徴とする、ＧＬＰ−１に関連する疾患の治療又は予防方法も提供する。【０１１７】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。【０１１８】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。【０１１９】
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。【０１２０】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【０１２１】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが何らこれらに限定されるものではない。【０１２２】
実施例１  ３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加エキセンディン−４（配列番号：６）の合成法
後述する合成例１により合成したＥｘ−４（配列番号：１０；配列番号：２に示すＥｘ−４のアミノ酸配列の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチド）１２．０ｍｇと、下記式（ａ）で示すブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（大塚化学株式会社製）３６ｍｇを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、５ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン  １ｍＬ中、３７℃で１時間反応させた。
【化１７】
2011052523.tif 000023
そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  ８ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→５０％  ２０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、エキセンディン−４の３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加エキセンディン−４を１０．６ｍｇ得た。（Ｍ：Ｃ２７１Ｈ４２２Ｎ５８Ｏ１２３Ｓ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ＋Ｈ］＋６４９３．６３，ｆｏｕｎｄ  ６４９４．３３）【０１２３】
実施例２  ３０位Ｃｙｓ−ハイマンノース−５型糖鎖付加エキセンディン−４（配列番号：７）の合成法
後述する合成例１により合成したＥｘ−４（配列番号：１０；配列番号：２に示すＥｘ−４のアミノ酸配列の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチド）１．２ｍｇと、後述する合成例２で合成したブロモアセチル化した下記式（ｂ）で示すＭ５糖鎖３．９ｍｇを、３５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、１ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン  ０．１７ｍＬ中、３７℃で３時間反応させた。
【化１８】
2011052523.tif 000024
そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→５０％  ２０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、エキセンディン−４の３０位のＧｌｙが高マンノース型Ｍ５糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加エキセンディン−４を０．５ｍｇ得た。（Ｍ：Ｃ２３３Ｈ３６２Ｎ５４Ｏ９７Ｓ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋５５０４．７４，ｆｏｕｎｄ  ５５０６．８５）
実施例３  ３０位Ｃｙｓ−アシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：８）の合成
（１）２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ  ＧＬＰ−１（配列番号：１１）の合成
Ｆｍｏｃ法によるによるペプチド固相合成法にて合成し、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  ８ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液２０→９５％  ２０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製した。
（２）２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ−アシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１（配列番号：１２）の合成
合成した２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ  ＧＬＰ−１（７−３７）２１．９ｍｇと下記式に示すアシアロブロモアセチル糖鎖４０．３ｍｇ，水１．３ｍＬを１００ｍＭ  ＴＣＥＰ  ６０μＬ，２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ  ７．５  ７００μＬ中、３７℃で７時間反応させた。
【化１９】
2011052523.tif 000025
そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  ８ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液２０→９５％  ２０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ−アシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１（７−３７）を２０．８ｍｇ得た。
（３）３０位Ｃｙｓ−アシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：８）の合成
（２）で合成した２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ−アシアロ糖鎖付加ＧＬＰ−１（７−３７）７．０ｍｇとＰａｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）−ＯＳｕ（特表２００２−５１２１７５号公報、例３３参照）５．０ｍｇをＤＩＰＥＡ４．６μＬ，ＮＭＰ３００μＬ、水２００μＬ中で５分反応させた。Ｇｌｙ水溶液（Ｇｌｙ  ６ｍｇ，水１００μＬ，ＥｔＯＨ  １００μＬ）を加え、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  １．０ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液４０→５５％  １５ｍｉｎ  ６５℃  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、凍結乾燥した（４．３ｍｇ）。
得られた凍結乾燥品の中から１．１ｍｇをＴＦＡ処理した後、再度ＨＰＬＣ同条件で精製し（図１）、リラグルチドの３０位のＡｒｇがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された３０Ｃｙｓアシアロ糖鎖付加リラグルチドを０．８ｍｇ得た。（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋５３７９．６８，ｆｏｕｎｄ  ５３７８．４２）
実施例４  ３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：９）の合成
（１）２８位Ａｒｇ，３０位Ｃｙｓ（ａｃｍ）ＧＬＰ−１（配列番号：１３）の合成
Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて合成し、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  ８ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液２０→９５％  ２０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製した。
（２）３０位Ｃｙｓリラグルチドの合成
（１）で得られたペプチド１０．４ｍｇとＰａｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）−ＯＳｕ（特表２００２−５１２１７５号公報、例３３参照）９．０ｍｇをＤＩＰＥＡ１０．９μＬ，ＮＭＰ  ６００μＬ、水３００μＬ中で１０分反応させた。Ｇｌｙ水溶液（Ｇｌｙ  ２９ｍｇ，  水４００μＬ，ＥｔＯＨ  ２００μＬ）を加え、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  １．０ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液４８−５５（７ｍｉｎ）−６５（８ｍｉｎ）−１００（９ｍｉｎ），１５ｍｉｎ  ６５℃  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、凍結乾燥した。
得られたペプチド８．２ｍｇのうち５．２ｍｇをＴＦＡ処理した後、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  １．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液４５−４７（１ｍｉｎ）−５０（７ｍｉｎ）−９５（８ｍｉｎ），１４ｍｉｎ  ６５℃  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、凍結乾燥した（３．２ｍｇ）。
凍結乾燥品３．２ｍｇを２．５ｍＭ９０％酢酸銀水溶液（１６０μＬ）に溶解させ、室温にて２時間撹拌した。ジチオスレイトール（３．８ｍｇ）を加え、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  １．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液４５−４８（１ｍｉｎ）−５０（７ｍｉｎ）−９５（８ｍｉｎ），１４ｍｉｎ，６５℃  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し（図２）、凍結乾燥し、リラグルチドの３０位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたペプチド（配列番号：１４）を２．９ｍｇ得た。
（３）３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチド（配列番号：９）の合成
（２）で得られた３０位Ｃｙｓリラグルチド１．６ｍｇ、下記式で示されるジシアロブロモアセチル糖鎖２０．０ｍｇ、水  ２５０μＬを１００ｍＭ  ＴＣＥＰ  ４０μＬ，２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５  ４８０μＬ中、３７℃で６時間反応させた。
【化２０】
2011052523.tif 000026
９時間後、そのままＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  １．０  ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液４２−４３（３ｍｉｎ）−５２（４ｍｉｎ）−６１（７ｍｉｎ）−９５（８ｍｉｎ），１４ｍｉｎ，６５℃  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し（図３）、下記式に示す、リラグルチドの３０位Ａｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチド２．３ｍｇを得た。（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋５９６２．１９，ｆｏｕｎｄ  ５９６３．０４）
【化２１】
2011052523.tif 000027
親油性置換基のＬｙｓ（Ｋ２０）への結合部位は、下記のとおりである。
【化２２】
2011052523.tif 000028
【０１２４】
実施例５  ２０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７（配列番号：２１）の合成
合成例３にて合成したＢＩＭ５１０７７の２０位のＬｙｓがＣｙｓで置換された３０残基のペプチド（配列番号：２０）（２．４ｍｇ，０．７２μｍｏｌ）およびグアニジン（２１６ｍｇ）を蒸留水（２４０μＬ）に溶解し、順次ＴＣＥＰ水溶液（１００ｍＭ、１００μＬ）、下記式（ａ）で示すブロモアセチル化したジシアロ糖鎖（１０ｍｇ／ｍＬ，１００μＬ，４．２６μｍｏｌ）ならびに、５００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４，１００μＬ）を加えた。
【化２３】
2011052523.tif 000029
３７℃で２時間反応させた後、そのままＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  ０．７ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％  ２０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＢＩＭ５１０７７の２０位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換された糖鎖付加ＢＩＭ５１０７７ペプチド（配列番号：２１）を１．９ｍｇ得た。（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋５５７８．７２，ｆｏｕｎｄ  ５５７８．７４）【０１２５】
比較例１  エキセンディン−４（配列番号：２）の合成
固相合成用カラムにＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｏｍｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＳｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３９残基ペプチドを得た（配列番号：１５）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＵＧ−１２０（Ｃ１８  ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％  ２０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｅｘ−４の３９残基のペプチド（配列番号：２）が得られた。【０１２６】
比較例２  ＧＬＰ−１（配列番号：１）の合成
固相合成用カラムにＡｍｉｎｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（１００μｍｏｌ）を入れ、ＤＣＭ、ＤＭＦで十分に洗浄した後、ＤＭＦで十分に膨潤させた。４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ酪酸（ＨＭＰＢ）（０．２５ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（０．２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−エチルモルホリン（０．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させてカラムに入れ、室温で４時間攪拌した。樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄し、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎを得、固相合成の固相として用いた。【０１２７】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（０．５０ｍｍｏｌ）とＭＳＮＴ（０．５０ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（０．３７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解させて、固相合成用カラムに入れ、２５℃で３時間攪拌した。【０１２８】
攪拌後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄した。Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄後、その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１２９】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸をＮＭＰ（１ｍｌ）に溶解させ、０．４５ＭＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（０．４ｍｍｏｌ）を加えた後に，固相合成用カラムに加え、続いて０．９ＭＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（０．８ｍｍｏｌ）を固相合成用カラムに加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を使用しアミノ酸を順次縮合させた。【０１３０】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂にＧｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３１残基ペプチドを得た（配列番号：１６）。【０１３１】
ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄した後、３１残基のペプチド５μｍｏｌ相当の樹脂をエッペンチューブに移した。【０１３２】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ（Ｃａｄｅｎｚａ  ｃｏｌｕｍｎ  Ｃ１８  １００×１０ｍｍ  展開溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液  Ｂ：０．１％ＴＦＡ  アセトニトリル：水＝９０：１０  グラジエントＡ：Ｂ＝９５：５→５：９５  １５分  流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ）で精製し、ＧＬＰ−１（配列番号：１）を得た。【０１３３】
比較例３  リラグルチド（配列番号：３）の合成
リラグルチドの調製は特表ＪＰ２００２−５１２１７５  例３４の方法に従い下記の手順にて実施した。
Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて合成し、ＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  ８ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液２０→９５％  ２０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］にて精製した。
得られたペプチド１０．４ｍｇとＰａｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）−ＯＳｕ（９．０ｍｇ）をＤＩＰＥＡ１０．９μＬ，ＮＭＰ  ６００μＬ、水３００μＬ中で１０分反応させた。Ｇｌｙ水溶液（Ｇｌｙ  ２９ｍｇ，水４００μＬ，ＥｔＯＨ  ２００μＬ）を加え、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  １．０ｍｌ／ｍｉｎ；Ｂ液４８−５５（７ｍｉｎ）−６５（８ｍｉｎ）−１００（９ｍｉｎ），１５ｍｉｎ  ６５℃］で精製した後、凍結乾燥した。
得られた保護脂質化ペプチドをＴＦＡ処理した後、ＨＰＬＣ［カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−ＣＮ、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  １．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液４５−４７（１ｍｉｎ）−５０（７ｍｉｎ）−９５（８ｍｉｎ），１４ｍｉｎ，６５℃］で精製した後、凍結乾燥することにより、リラグルチド（配列番号：３）を得た。（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋３７４９．９５，ｆｏｕｎｄ  ３７５０．９７）【０１３４】
合成例１  エキセンディン−４の３０位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
固相合成用カラムにＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｏｍｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、
固相樹脂にＳｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）
の３９残基ペプチドを得た（配列番号：１７）。
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＵＧ−１２０（Ｃ１８  ５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％  ２０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、Ｅｘ−４の３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換された３９残基のペプチドが得られた。（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ［Ｍ＋Ｈ］＋４２３０．６０，ｆｏｕｎｄ  ４２３１．２７）（配列番号：１０）【０１３５】
合成例２  ブロモアセチル化したＭ５糖鎖の合成法
大豆パウダー１００ｇを、５００ｍｌのアセトンで２回、５００ｍｌのメタノールで２回洗浄し脱脂大豆パウダー６１．４ｇを得た。
得られた脱脂大豆パウダー４３．０ｇに水４３０ｍｌ、液化酵素Ｔ（ＨＢＩ社製）４．３ｇを加え、撹拌しながら７０℃で１９時間反応させた。反応液を遠心分離（１００００Ｇ、１０分）して上清と沈殿物に分け、上清８００ｍｌを得た。さらに沈殿物に水４３０ｍｌ、液化酵素Ｔ４．３ｇを加えて再度７０℃で１９時間反応させ、反応液を遠心分離（１００００Ｇ、１０分）して上清と沈殿物に分け、上清６００ｍｌを得た。
得られた上清を合わせ（計１４００ｍｌ）、５００ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０を１００ｍｌ、オリエンターゼＯＮＳ（ＨＢＩ社製）３．０ｇを加え、撹拌しながら５０℃で１９時間反応を行った。反応後の液をろ過して不溶物を除き、ロータリーエバポレーターにて液量が４００ｍｌになるまで濃縮した。得られた液を分画分子量１Ｋの限外ろ過膜（Ｍｉｎｉｍａｔｅ  ＴＦＦ  Ｃａｐｓｕｌｅ  １Ｋ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ポール社製）を用いて限外ろ過を行った。
６時間の処理の後、膜を透過しなかった液２３０ｍｌを回収した。回収した液に１Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０を２０ｍｌ、アジ化ナトリウム２５０ｍｇ、アクチナーゼＥ（科研製薬社製）４２３．５ｍｇを加え３７℃で８２時間反応させた。反応液をろ過して不溶物を除いた後、ロータリーエバポレーターにて液量が１００ｍｌになるまで濃縮した。濃縮液を半分ずつ２回にわけてＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（φ２５ｍｍ×１００ｍｍ）カラムにて分画し、糖鎖含有画分のみを集めて濃縮し２．２２ｇを得た。
得られた糖鎖含有画分に蒸留水２１．０ｍｌ、エタノール１４．９ｍｌを加えて溶かし、炭酸水素ナトリウム１．１３ｇ、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ  ２．０２ｇを加え室温で１６時間反応させた。反応後アセトン２５０ｍｌを加え沈殿物をメンブレンフィルター（φ４７ｍｍ、保持粒子経０．５μｍ  アドバンテック東洋社製）でろ過した。膜上に残った不溶物を蒸留水に溶かして回収し、ロータリーエバポレーターにて液量が１０ｍｌ以下になるまで濃縮した。濃縮液をＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５（φ２５ｍｍ×１００ｍｍ）カラムにて分画し、糖鎖含有画分を集めて濃縮し１．３７ｇを得た。
これをさらに蒸留水４ｍｌに溶かしてＯＤＳカラム（ワコーゲル１００Ｃ１８、φ２５ｍｍ×１５０ｍｍ）にて分画し、糖鎖含有画分のみを集めて濃縮し、粗精製糖鎖４８．６ｍｇを得た。粗精製糖鎖をＨＰＬＣ［カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−ＡＭ  φ２０×２５０ｍｍ、溶離液：アセトニトリル／２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液＝８２／１８、流速：８．０ｍｌ／ｍｉｎ］にて精製し、ハイマンノース型Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖鎖（Ｍ５糖鎖）１３．０ｍｇを得た。
得られたＭ５糖鎖１１．０ｍｇに水１６５μｌを加えて溶かした。この溶液に炭酸水素アンモニウム２００ｍｇを加え室温で４１時間処理した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥品に炭酸水素ナトリウム１２．５ｍｇ、水１１０μｌを加え、予め１０μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた無水ブロモ酢酸（アルドリッチ社製）１９．９ｍｇを加え、氷冷しながら１時間反応させた。１時間後、反応系を室温に戻しさらに１時間反応させた後、ゲルろ過にて精製を行い、以下に示すブロモアセチル化Ｍ５糖鎖（ｂ）７．９ｍｇを得た。
【化２４】
2011052523.tif 000030
【０１３６】
合成例３  ＢＩＭ５１０７７の２６位がＣｙｓで置換されたペプチドの合成法
固相合成用カラムにＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｏ−ＰＥＧＡ  ｒｅｓｉｎ（メルク社製）（１００μｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄後、ペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１３７】
Ｆｍｏｃ基でアミノ基を保護したアミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を０．４５Ｍ  ＨＣＴＵ・ＨＯＢＴ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）に溶解させ、固相合成用カラムに加え、続いて０．９Ｍ  ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０分間攪拌した後、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦを用いて洗浄し、Ｆｍｏｃ基を１５分２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）を用いて脱保護した。この操作を繰り返し、アミノ酸を順次縮合させた。【０１３８】
Ｆｍｏｃ基で保護したアミノ酸にはＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），Ｆｍｏｃ−Ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ（Ａｉｂ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ，Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）を用い、固相樹脂上にＡｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｉｂ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｉｂ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）の３０残基ペプチドを得た（配列番号２２）。【０１３９】
得られたペプチドを形成した樹脂を一部固相合成用カラムにとり、トリフルオロ酢酸：水：ＴＩＰＳ（＝９５：２．５：２．５）を樹脂が十分に浸る程度に加え、３時間室温で撹拌した。樹脂をろ過して除き、反応溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣をＨＰＬＣ［カラム：ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＵＧ−１２０（Ｃ１８，５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、グラジエント：Ａ液：０．１％ＴＦＡ水、Ｂ液：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％ＡＮ  ８．０ｍｌ／ｍｉｎ、；Ｂ液３５→６０％２０ｍｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ］で精製し、ＢＩＭ５１０７７の２０位のＬｙｓがＣｙｓで置換された３０残基のペプチド１２ｍｇが得られた。（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ［Ｍ（ａｖｅｒａｇｅ）＋Ｈ］＋３３１５．６９，ｆｏｕｎｄ  ３３１４．７２）（配列番号２０）【０１４０】
試験例１  糖鎖付加によるエキセンディン−４の抗原性低下作用の確認
マウスに非糖鎖付加エキセンディン−４あるいは３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加エキセンディン−４を感作し、血中の抗エキセンディン−４抗体濃度を比較することにより、糖鎖付加がエキセンディンの抗原性に与える効果を検証した。
初回免疫として、実施例１で合成した３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加エキセンディン−４及び非糖鎖付加エキセンディン−４（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と充分に混合してエマルジョンとし、ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）に腹腔内に投与した。
１４日目に、Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と充分に混合することによりエマルジョン化した糖鎖付加エキセンディン−４又は非糖鎖付加エキセンディン−４を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、７週齢）に皮下投与し、追加免疫とした。
追加免疫から７日後にマウスから血漿を採取した。血漿中の抗エキセンディン−４抗体濃度は、市販の抗エキセンディン−４抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙｓｈｏｐ）を標準品としたＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。
５０μｇの非糖鎖付加エキセンディン−４を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃、２時間インキュベートした。プレートは０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（洗浄バッファー）で３回洗浄し、０．５％ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ含有洗浄バッファーで４℃、１晩ブロッキングした。ブロッキング後のプレートを３回洗浄した後、血漿サンプルをＰＢＳで希釈することにより作製された希釈系列を添加し、３７℃、２時間インキュベートした。洗浄バッファーを用いて３回洗浄されたプレートに５０μＬのｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧを添加し、３７℃、２時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファーを用いて３回洗浄し、１００μＬのＡＢＴＳ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加し発色させた。発色反応は２０％ＳＤＳを添加することによって停止し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。抗エキセンディン−４抗体の濃度は抗エキセンディン−４モノクローナル抗体を標準品として決定した。結果を図４に示す。
糖鎖付加の非糖鎖付加エキセンディン−４を免疫したマウスでは抗体産生が強く誘導され、その血漿中濃度は７０７±６８．２ｍｇ／ｍＬであった。これに対し、３０位−Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加エキセンディン−４を免役したマウスの血漿中抗エキセンディン−４抗体濃度は非糖鎖付加エキセンディン−４を免疫した場合に比べて約４分の１（１７８．８±２２．３ｍｇ／ｍＬ）に低下し、有意な抗原性低下作用を示した（ｐ<０．００１，Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）。【０１４１】
試験例２  糖鎖付加エキセンディン−４の経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ：Ｏｒａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ）
実施例１で合成した３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加エキセンディン−４、若しくは比較例１で合成した非糖鎖付加エキセンディン−４のＰＢＳ溶液（０．９ｎｍｏｌ／１０ｍｌ）、又は比較例２で製造したＧＬＰ−１のＰＢＳ溶液（９ｎｍｏｌ／１０ｍｌ）を、一晩絶食させたＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（１０週齢、雄）に１０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。
３０分後にグルコース溶液を１ｍｇ／ｇの投与量で経口投与した。グルコース投与前、グルコース投与３０分後、６０分後、１２０分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。同様に、非糖鎖付加リラグルチドもｄｂ／ｄｂマウスに投与し、経時的に血糖値を測定して３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチドの作用と比較した。結果を図５に示す。
３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加エキセンディン−４及び非糖鎖付加エキセンディン−４は同等の効果を示し、いずれもＶｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳのみ）及びＧＬＰ−１より高い血糖上昇抑制作用を示した。【０１４２】
試験例３  ｄｂ／ｄｂマウスを使用した糖鎖付加エキセンディン−４の血糖値低下作用の確認
実施例１で合成した３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加エキセンディン−４のＰＢＳ溶液（９ｎｍｏｌ／１０ｍＬ）を、ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊｃｌマウス（１０週齢、雄）に１０ｍＬ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。化合物投与前、３０分後、６０分後、１２０分、２４０分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。
血糖値低下作用を、比較例１で合成した非糖鎖付加エキセンディン−４と比較した。結果を図６に示す。
非糖鎖付加エキセンディン−４の血中安定性は高く、投与後３０分で強い血糖値低下作用を示し、その効果が２４０分後まで持続した。３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加エキセンディン−４は非糖鎖付加エキセンディン−４と同等の血糖値低下作用と持続性を示し、エキセンディン−４の３０位のアミノ酸への糖鎖付加の影響は検出されなかった。
試験例１、２及び３の結果から、非糖鎖付加エキセンディン−４の３０位への糖鎖付加はエキセンディン−４の薬理作用に影響を与えることなく、非糖鎖付加エキセンディン−４の抗原性を低下させる有効な方法であると考えられた。【０１４３】
試験例４  糖鎖付加リラグルチドの経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ：Ｏｒａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ）
実施例４で製造した３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチド、比較例２で製造したＧＬＰ−１若しくは比較例３で製造したリラグルチドのＰＢＳ溶液（９ｎｍｏｌ／１０ｍｌ）、又はＰＢＳ溶液を、一晩絶食させたＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（１０週齢、雄）に１０ｍｌ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。
３０分後にグルコース溶液を１ｍｇ／ｇの投与量で経口投与した。グルコース投与前、グルコース投与３０分後、６０分後、１２０分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。結果を図７に示す。
３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチド及び非糖鎖付加リラグルチドのいずれもＶｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳのみ）及びＧＬＰ−１より高い血糖上昇抑制作用を示したが、３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチドは、非糖鎖付加リラグルチドに比較して、更に高い血糖値上昇抑制作用を示した。【０１４４】
試験例５  糖鎖付加リラグルチドのｄｂ／ｄｂマウスを使用した血糖値上昇抑制作用試験
実施例４で製造した３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチドのＰＢＳ溶液（９ｎｍｏｌ／１０ｍＬ）を、ＢＫＳ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊｃｌマウス（ｄｂ／ｄｂマウス、１０週齢、雄）に１０ｍＬ／ｋｇの投与量で腹腔内に投与した。化合物投与前、３０分後、６０分後、１２０分、２４０分、４８０分、７２０分後に眼窩採血を行い、アキュチェックアビバ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて血糖値を測定した。同様に、非糖鎖付加リラグルチドもｄｂ／ｄｂマウスに投与し、経時的に血糖値を測定して３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチドの作用と比較した。結果を図８に示す。
３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチドの血中安定性は高く、投与後３０分で強い血糖値低下作用を示し、その効果が１２時間後まで持続した。３０位Ｃｙｓ−ジシアロ糖鎖付加リラグルチドは非糖鎖付加リラグルチドと同等の血糖値低下作用と持続性を示し、リラグルチドの３０位のアミノ酸への糖鎖付加の影響は検出されなかった。【０１４５】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、ＧＬＰ−１である。
配列番号：２は、エキセンディン−４である。
配列番号：３は、リラグルチドである。
配列番号：４は、糖鎖付加エキセンディン−４の一般式である。
配列番号：５は、糖鎖付加リラグルチドの一般式である。
配列番号：６は、３０位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたエキセンディン−４である。
配列番号：７は、３０位のＧｌｙがハイマンノース−５型糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたエキセンディン−４である。
配列番号：８は、３０位のＡｒｇがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたリラグルチドである。
配列番号：９は、３０位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたリラグルチドである。
配列番号：１０は、３０位のＧｌｙがＣｙｓで置換されたエキセンディン−４である。
配列番号：１１は、２８位ＬｙｓがＡｒｇで、３０位のＡｒｇがＣｙｓで置換されたＧＬＰ−１ペプチドである。
配列番号：１２は、２８位のＬｙｓがＡｒｇで、３０位のＡｒｇがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたＧＬＰ−１である。
配列番号：１３は、２８位のＬｙｓがＡｒｇで、３０位のＡｒｇがＣｙｓ（ａｃｍ）で置換されたＧＬＰ−１である。
配列番号：１４は、３０位−のＡｒｇがＣｙｓで置換されたリラグルチドである。
配列番号：１５は、比較例１で合成された保護基を有するペプチドである。
配列番号：１６は、比較例２で合成された保護基を有するペプチドである。
配列番号：１７は、合成例１で合成された保護基を有するペプチドである。
配列番号：１８は、ＢＩＭ−５１０７７である。
配列番号：１９は、糖鎖付加ＢＩＭ−５１０７７の一般式である。
配列番号：２０は、２０位のＬｙｓがＣｙｓで置換されたＢＩＭ−５１０７７である。
配列番号：２１は、２０位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓで置換されたＢＩＭ−５１０７７である。
配列番号：２２は、合成例３で合成された保護基を有するペプチドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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