(57)【要約】  肝細胞癌の発症又は再発に関与するゲノムＤＮＡのメチル化領域を特定し、より簡単な操作で検出することが可能な、ＨＣＣの発症又は再発のマーカーを提供することを課題とした。  解決手段として、Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出してＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域メチル化率を検出し、非癌部においては上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが逆の相関関係にあること、癌部においては上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが正の相関関係にあることを指標として肝細胞癌の再発リスクを予測する。また、肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域メチル化率を検出し、肝細胞癌を診断する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする肝細胞癌の発症リスクを予測する方法。
（ａ）被検者より採取された肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；
（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の発症リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記被検者における肝細胞癌の発症リスクを予測する工程；
【請求項２】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスクを予測する方法。
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された非癌部肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；
（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが逆の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における肝細胞癌の再発リスクを予測する工程；
【請求項３】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスクを予測する方法。
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された癌部肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；
（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における再発リスクを予測する工程；
【請求項４】
転写制御領域が、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−７２３ｂｐから、下流の＋５００ｂｐまでの領域であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
転写制御領域が、以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される１以上の領域であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
（ｉ）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より下流の＋１８３ｂｐから＋３０９ｂｐまでのＭＳＰ１領域；
（ii）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋７１ｂｐまでのＭＳＰ２領域；
（iii）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋５７ｂｐまでのＭＳＰ３領域；
（iv）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−２６８ｂｐから−１７３ｂｐまでのＭＳＰ４領域；
（ｖ）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−４３３ｂｐから−３３０ｂｐまでのＭＳＰ５領域；
【請求項６】
以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される１以上のプライマーセットとプローブとの組合せを用いて、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ｉ）配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号７に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ii）配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１０に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（iii）配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１３に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（iv）配列番号１４及び１５に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１６に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｖ）配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１９に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
【請求項７】
ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えることを特徴とする肝細胞癌の発症リスク予測用のキット。
【請求項８】
ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスク予測用のキット。
【請求項９】
プライマーセットとプローブとが、以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される１以上のプライマーセットとプローブとの組合せであることを特徴とする請求項７又は８のいずれかに記載のキット。
（ｉ）配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号７に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ii）配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１０に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（iii）配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１３に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（iv）配列番号１４及び１５に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１６に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｖ）配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１９に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌の発症又は再発リスクを予測する方法や、肝細胞癌の発症又は再発リスクを予測するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma；以下、「ＨＣＣ」ということもある）は、世界中で最も頻出の高い固形癌のひとつであり、癌による死亡原因の中で三番目である（非特許文献１）。ＨＣＣは、その殆どがウイルス感染に起因する慢性肝炎や、慢性肝炎から進行した肝硬変を背景として発症することが知られており、ＨＣＣ患者の中で、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に陽性である人の割合は約７０％、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に陽性である人の割合は約２０％にのぼる（非特許文献２）。これらの肝炎ウイルスがＨＣＣを引き起こすメカニズムの詳細は明らかにされていないが、ウイルスの持続感染が慢性肝炎や肝硬変等を引き起こす過程で、肝細胞の癌化が起こると考えられている。【０００３】
現在のところ、ＨＣＣ治療法としては外科的な摘除手術が有効であるとされているが、術後の再発率はきわめて高く、予後不良であることが知られている（非特許文献３）。癌部切除後の残肝におけるＨＣＣの再発は、初発ＨＣＣと同様のメカニズムであると考えられるが、その詳細については不明である（非特許文献４）。以上のように、ＨＣＣの治療には、高い再発の危険性が伴っており、外科手術後の再発を予測するためのバイオマーカーの開発は、ＨＣＣ患者のＱＯＬ（quality of life）の観点から非常に重要である。【０００４】
最近、マイクロアレイ解析等の網羅的解析方法を用いて、癌細胞における遺伝子発現解析が盛んに行われ、癌と関わりのある遺伝子が多数同定されており、ＨＣＣについても、ＨＣＣ特異的な遺伝子発現プロファイルの解析結果に基づいて、様々な早期検出・分類・予後予測方法が開発されている（特許文献１及び非特許文献５〜１０）。しかし、これらの早期検出・分類・予後予測方法は、いずれもｍＲＮＡの発現を指標としたものであり、ＲＮＡの不安定性から実際に臨床に応用するのは困難であると考えられている。また、上記の従来技術においては、非常に多数の遺伝子発現を組み合わせて指標としているため、複雑な計算式を用いて診断する必要がある。このため、より簡単な操作で検出が可能な、ＤＮＡを用いたマーカーの開発が求められている。【０００５】
ATP-binding cassetteトランスポーター（ＡＢＣトランスポーター）は、物質のＡＴＰに依存する細胞外輸送に関与するタンパク質である。特許文献２は、ＡＢＣＢ６遺伝子発現と他の遺伝子発現とを組み合わせて指標とするＨＣＣの予後判定方法を開示している。また、特許文献３は、ＡＢＣトランスポーター及びＢＣＬ１２ファミリー遺伝子の増加を指標とする癌の薬剤耐性検出方法を開示している。しかし、ＡＢＣトランスポーター遺伝子のメチル化と癌との関連についてはこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１７１５０号パンフレット
【特許文献２】特表２００９−５１７０６４号公報
【特許文献３】ＵＳ２００９／０１４３２３６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bosch FX. et al., Semin Liver Dis 19, 271-85 (1999)
【非特許文献２】Kiyosawa K. et al., Gastroenterology 127, S17-26 (2004)
【非特許文献３】Makuuchi M. et al., Hepatogastroenterology 45, S1267-1274 (1998)
【非特許文献４】Poon RT. et al., Cancer 89, 500-507 (2000)
【非特許文献５】Chen et al., Mol Biol Cell. 13(6): 1929-1939 (2002)
【非特許文献６】Qin et al., J Cancer Res Clin Oncol. 130(9): 497-513 (2004)
【非特許文献７】Ye et al., Nat Med. Apr,9(4): 416-23 (2003)
【非特許文献８】Kurokawa et al., J Hepatol. 41(2): 284-291 (2004)
【非特許文献９】Lizuka et al., Lancet. 15, 361(9361): 923-929 (2003)
【非特許文献１０】Lee et al., Hepatology. 40(3): 667-76 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症又は再発に関与するゲノムＤＮＡのメチル化領域を特定し、より簡単な操作で検出することが可能な、ＨＣＣの発症又は再発のマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＨＣＣ患者より切除された癌部及び／又は非癌部肝臓組織における遺伝子発現を網羅的に解析し、１年以内に再発が認められた患者由来の肝臓組織（再発有り肝臓組織）におけるＡＢＣＢ６ｍＲＮＡ発現量が、１年以内に再発が認められた患者由来の肝臓組織（再発無し肝臓組織）と比較して有意に高いことを見い出した（図９）。一般的に遺伝子発現は、プロモータ領域のＤＮＡメチル化により抑制されることが知られていることから、発明者らは、再発有り肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子の発現の増加に、プロモータ領域の低メチル化が関与している可能性があると考え、ＡＢＣＢ６遺伝子に関するメチル化解析を行った。本発明者らは、ＡＢＣＢ６遺伝子近傍のＤＮＡ配列を解析してＡＢＣＢ６遺伝子のプロモータ領域にＣｐＧアイランドの存在することを明らかにし、該ＣｐＧアイランドにおけるメチル化率を調べた。また、非癌部においてはＡＢＣＢ６ｍＲＮＡ発現とメチル化率との相関は見られなかったが、癌部においてはｍＲＮＡ発現とメチル化率との間に逆相関関係が見られた（図４）。しかしながら、再発の有無に基づいて解析を行った結果は予想外なことに、Ｃ型肝炎ウイルスキャリア由来の再発有り肝臓組織の癌部においてはメチル化率が高いことが明らかとなった。さらに、該ＣｐＧアイランドのメチル化率は、Ｃ型肝炎ウイルスキャリア由来の再発無し肝臓組織の非癌部においては低いこと、Ｂ型肝炎ウイルスキャリア由来の肝臓組織においては癌部及び非癌部のいずれのメチル化率も、再発の有無との関連が認められないことを見い出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は（１）（ａ）被検者より採取された肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の発症リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記被検者における肝細胞癌の発症リスクを予測する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする肝細胞癌の発症リスクを予測する方法や、（２）（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された非癌部肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが逆の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における肝細胞癌の再発リスクを予測する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスクを予測する方法や、（３）（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された癌部肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における再発リスクを予測する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスクを予測する方法や、（４）転写制御領域が、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−７２３ｂｐから、下流の＋５００ｂｐまでの領域であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法や、（５）転写制御領域が、（ｉ）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より下流の＋１８３ｂｐから＋３０９ｂｐまでのＭＳＰ１領域；（ii）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋７１ｂｐまでのＭＳＰ２領域；（iii）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋５７ｂｐまでのＭＳＰ３領域；（iv）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−２６８ｂｐから−１７３ｂｐまでのＭＳＰ４領域；（ｖ）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−４３３ｂｐから−３３０ｂｐまでのＭＳＰ５領域；の（ｉ）〜（ｖ）から選択される１以上の領域であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法や、（６）（ｉ）配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号７に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；（ii）配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１０に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；（iii）配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１３に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；（iv）配列番号１４及び１５に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１６に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；（ｖ）配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるプライマーセッ���と、配列番号１９に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；の（ｉ）〜（ｖ）から選択される１以上のプライマーセットとプローブとの組合せを用いて、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法や、（７）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えることを特徴とする肝細胞癌の発症リスク予測用のキットや、（８）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスク予測用のキットや、（９）プライマーセットとプローブとが、（ｉ）配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号７に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；（ii）配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１０に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；（iii）配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１３に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；（iv）配列番号１４及び１５に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１６に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；（ｖ）配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１９に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；の（ｉ）〜（ｖ）から選択される１以上のプライマーセットとプローブとの組合せであることを特徴とする上記（７）又は（８）のいずれかに記載のキットに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアのＨＣＣ患者より採取された肝臓組織を用いて、ＨＣＣの再発リスクを予測することが可能となり、術後の治療方針を決定する上で有用な情報を提供することができる。また、本発明によると、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアの被検者より採取された肝臓組織を用いて、ＨＣＣ発症リスクを予測することができ、該被検者におけるＨＣＣの予防及び早期発見のために有用な情報を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域における、ＣｐＧアイランド領域、及びＣｐＧ配列の位置を示す図である。
【図２】６種の肝癌細胞株（ＨＬＥ、ＳＫ−ＨＥＰ−１、Ｈｅｐ  ３Ｂ、ＨｕＨ−６、ＨｕＨ−７、Ｈｅｐ  Ｇ２）におけるＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域のメチル化の程度について調べた結果を示す図である。細胞株名下の括弧表記は、脱メチル化剤処理による発現上昇の程度である。
【図３】ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域における、５箇所のメチル化解析領域（ＭＳＰ１〜５）の位置を示す図である。
【図４】癌患者から採取した肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子ｍＲＮＡ発現量、及びＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるメチル化率を解析した結果を示す図である。
【図５】癌患者から採取した肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子ｍＲＮＡ発現量（左側）、又はＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率（右側）を指標とした、癌の１年以内の再発予測診断能についてReceiver operating characteristic（ＲＯＣ）曲線解析の結果を示す図である。ｍＲＮＡ発現量については、非癌部肝臓組織における発現量を基準として、癌部肝臓組織における発現量を示した。また、メチル化率については、ＭＳＰ５に対するＭＳＰ２及びＭＳＰ３のメチル化率の比を求め、非癌部肝臓組織におけるメチル化率と癌部肝臓組織におけるメチル化率の差を示した。
【図６】非癌部肝臓組織における、ＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率を指標とした１年以内の再発予測診断能についてのReceiver operating characteristic（ＲＯＣ）曲線におけるArea Under the Curve（ＡＵＣ）の比較を示す図である。
【図７】癌部肝臓組織における、ＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率を指標とした１年以内の再発予測診断能についてのReceiver operating characteristic（ＲＯＣ）曲線におけるArea Under the Curve（ＡＵＣ）の比較を示す図である。
【図８】非癌部肝臓組織及び癌部肝臓組織における、ＡＢＣＢ６遺伝子ｍＲＮＡ発現量またはメチル化率の組合せを指標とした１年以内の再発予測診断能についてのReceiver operating characteristic（ＲＯＣ）曲線におけるArea Under the Curve（ＡＵＣ）の比較を示す図である。
【図９】癌患者から採取した肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子ｍＲＮＡ発現量（上段）、又はＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率（下段）を、再発無しの群と、再発有りの群でそれぞれ解析した結果を示す図である。メチル化率は、ＭＳＰ５に対するＭＳＰ２及びＭＳＰ３のメチル化率の比を求めて示した。箱ひげ図（box and whiskers plot）の箱の中の線は中央値(median)を表す。
【図１０】癌患者から採取した肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子ｍＲＮＡ発現量、又はＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率を、１年以内の再発無しの群（白いカラム）と、１年以内の再発有りの群（黒いカラム）でそれぞれ解析した結果を示す図である。左上図及び左下図はＡＢＣＢ６遺伝子ｍＲＮＡ発現量を、右上図及び右下図はＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率をそれぞれ示す。
【図１１】癌患者から採取した非癌部の肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率を、癌の１年以内（上段）又は２年以内（下段）の再発無しの群と、再発有りの群でそれぞれ解析した結果を示す図である。メチル化率は、ＲＰＰＨ１遺伝子領域のＤＮＡのメチル化率に対するＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率（ＭＳＰ５）の比を示した。全サンプルの群（左側）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）キャリアの群（中央）と、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアではない群（右側）でそれぞれ解析した結果を示す。箱ひげ図（box and whiskers plot）の箱の中の線は中央値（median）を表す。
【図１２】癌患者から採取した癌部の肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率を、癌の１年以内（上段）又は２年以内（下段）の再発無しの群と、再発有りの群でそれぞれ解析した結果を示す図である。メチル化率は、ＲＰＰＨ１遺伝子領域のＤＮＡのメチル化率に対するＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率（ＭＳＰ５）の比を示した。全サンプルの群（左側）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）キャリアの群（中央）と、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアではない群（右側）の結果を示す。箱ひげ図（box and whiskers plot）の箱の中の線は中央値（median）を表す。
【図１３】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）キャリア群（左側）と、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアではない群（右側）の癌患者から採取した非癌部の肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率を指標とした、癌の１年以内（上段）又は２年以内（下段）の再発予測診断能について示す図である。メチル化率は、ＲＰＰＨ１遺伝子領域のＤＮＡのメチル化率に対するＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率（ＭＳＰ５）の比を示した。
【図１４】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）キャリア群（左側）と、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアではない群（右側）の癌患者から採取した肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子ｍＲＮＡ発現量とＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率を組合せてマーカーとした、癌の１年以内（上段）又は２年以内（下段）の再発予測診断能についてReceiver operating characteristic（ＲＯＣ）曲線解析の結果を示す図である。ｍＲＮＡ発現量については、非癌部肝臓組織における発現量を基準として、癌部肝臓組織における発現量を示した。また、メチル化率については、非癌部肝臓組織におけるＲＰＰＨ１遺伝子領域のＤＮＡのメチル化率に対するＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率（ＭＳＰ５）の比を求め、メチル化率とした。
【図１５】癌患者から採取した癌部及び非癌部の肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率（上段）、ＡＬＵ配列のＤＮＡメチル化率（中段）、又はＡＬＵ配列のＤＮＡメチル化率に対するＭＳＰ５領域のＤＮＡメチル化率の比（下段）を、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）キャリアの群（左側）と、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアではない群（右側）でそれぞれ解析した結果を示す図である。
【図１６】全ての癌患者群（左側）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）キャリア群（中央）と、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアではない群（右側）の癌患者から採取した癌部の肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率を指標とした、癌の診断マーカーとしての性能を示す図である。メチル化率は、ＭＳＰ５領域のＤＮＡメチル化率（上段）、ＡＬＵ配列のＤＮＡメチル化率（中段）、又はＡＬＵ配列のＤＮＡメチル化率に対するＭＳＰ５領域のＤＮＡメチル化率の比（下段）を指標とした結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の肝細胞癌の発症リスクを予測する方法としては、（ａ）被検者より採取された肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の発症リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記被検者における肝細胞癌の発症リスクを予測する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備える方法（以下、「発症リスク予測方法」ということもある）であれば特に制限されず、また、本発明の肝細胞癌の再発リスクを予測する方法としては、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された非癌部肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが逆の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における肝細胞癌の再発リスクを予測する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備える方法（以下、「再発リスク予測方法（Ｉ）」ということもある）や、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された癌部肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における再発リスクを予測する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備える肝細胞癌の再発リスクを予測する方法（以下、「再発リスク予測方法（II）」ということもある）であれば特に制限されず、ここで、「発症」とは、癌化していない肝細胞、若しくは前癌状態にある肝細胞が癌化して癌組織を形成することを意味し、「再発」とは、治療のために癌部を除去した後の非癌部肝臓組織において、癌化していない肝細胞、若しくは前癌状態にある肝細胞が新たに癌化することや、癌部より転移した癌細胞が非癌部肝臓組織中で増殖して新たに癌組織が形成されることを意味する。
【００１４】
本発明の発症リスク予測方法の工程（ａ）における「Ｃ型肝炎ウイルスに感染している被検者」としては、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染しているＨＣＶキャリアであれば特に制限されず、肝炎の臨床的症状のない持続的なＨＣＶウイルスキャリアであっても、ＨＣＶによる慢性肝炎及び／又は肝硬変を発症しているＨＣＶウイルスキャリアであってもよい。また、本発明の再発リスク予測方法（Ｉ）の工程（ｂ）、及び再発リスク予測方法（II）の工程（ｂ）における「Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者」としては、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染しているＨＣＶキャリアであって、且つ、肝細胞癌を発症している肝細胞癌患者であれば特に制限されないが、ＨＣＶによる慢性肝炎及び／又は肝硬変を発症しているＨＣＶウイルスキャリアであることが特に好適である。
【００１５】
上記本発明の発症リスク予測方法の工程（ｂ）、再発リスク予測方法（Ｉ）の工程（ｂ）、及び再発リスク予測方法（II）の工程（ｂ）において、ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する方法としては、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域の全部又は一部に含まれるＣｐＧ配列のシトシンのうち、メチル化されているシトシンを定量又は半定量的に検出する方法であれば特に制限されず、上記転写制御領域としては、例えば、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の７２３ｂｐ（−７２３ｂｐ）から、下流の５００ｂｐ（＋５００ｂｐ）までの領域を好適に例示することができるが、なかでも、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より下流の＋１８３ｂｐから＋３０９ｂｐまでのＭＳＰ１領域や、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋７１ｂｐまでのＭＳＰ２領域や、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋５７ｂｐまでのＭＳＰ３領域や、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−２６８ｂｐから−１７３ｂｐまでのＭＳＰ４領域や、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−４３３ｂｐから−３３０ｂｐまでのＭＳＰ５領域等であることが好ましく、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋７１ｂｐまでのＭＳＰ２領域や、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋５７ｂｐまでのＭＳＰ３領域であることがさらに好ましい。また、上記シトシンのメチル化の程度の検出方法としては、定量的又は半定量的なメチル化検出方法であれば特に制限されず、具体的には、Methylight法、バイサルファイトシーケンス法、メチル化特異的ＰＣＲ法（ＭＳＰ法）、Combined bisulfite restriction assay（ＣＯＢＲＡ）法、High Resolution Melting（ＨＲＭ）法等を例として好適に挙げることができるが、なかでも、Methylight法を特に好適に挙げることができる。上記本発明の方法において、Methylight法を用いてＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する場合には、例えば、（ｉ）配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号７に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、（ii）配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１０に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、（iii）配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１３に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、（iv）配列番号１４及び１５に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１６に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、（ｖ）配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１９に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ等を用いることができる。
【００１６】
本発明の肝細胞癌の発症リスク予測用のキットとしては、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えるものであれば特に制限されず、また、本発明の肝細胞癌の再発リスク予測用のキットとしては、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えるものであれば特に制限されず、上記ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域としては、上記転写制御領域としては、例えば、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の７２３ｂｐ（−７２３ｂｐ）から、下流の５００ｂｐ（＋５００ｂｐ）までの領域の全部又は一部を好適に例示することができるが、なかでも、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より下流の＋１８３ｂｐから＋３０９ｂｐまでのＭＳＰ１領域や、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋７１ｂｐまでのＭＳＰ２領域や、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋５７ｂｐまでのＭＳＰ３領域や、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−２６８ｂｐから−１７３ｂｐまでのＭＳＰ４領域や、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−４３３ｂｐから−３３０ｂｐまでのＭＳＰ５領域等であることが好ましく、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋７１ｂｐまでのＭＳＰ２領域や、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋５７ｂｐまでのＭＳＰ３領域であることがさらに好ましい。また、上記プライマーセットとプローブとしては、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域のシトシンのメチル化の程度を検出するためのものであれば特に制限されないが、具体的には、（ｉ）配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号７に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、（ii）配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１０に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、（iii）配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１３に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、（iv）配列番号１４及び１５に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１６に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ、（ｖ）配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１９に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ等を例として好適に挙げることができる。また、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備えるキットを、肝細胞癌の発症リスクの予測又は肝細胞癌の再発リスクの予測に使用する方法も本発明の実施の変形とすることができる。
【００１７】
また、本発明は、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスに感染している被検者より採取された肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の発症リスクが正の相関関係にあることを指標として前記被検者における肝細胞癌の発症リスクを予測する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備える肝細胞癌の発症リスクを予測するためのデータを収集する方法（以下、「発症リスク予測データ収集方法」ということもある）や、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された非癌部肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクが逆の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における肝細胞癌の再発リスクを予測する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備える肝細胞癌の再発リスクを予測するためのデータを収集する方法（以下、「再発リスク予測データ収集方法（Ｉ）」ということもある）や、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された癌部肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクが正の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における再発リスクを予測する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備える肝細胞癌の再発リスクを予測するためのデータを収集する方法（以下、「再発リスク予測データ収集方法（II）」ということもある）を実施の変形として含むことがある。本発明の発症リスク予測データ収集方法、再発リスク予測データ収集方法（Ｉ）、及び再発リスク予測データ収集方法（II）を実施する際の操作は、データを収集することを除き、上記本発明の発症リスク予測、再発リスク予測方法（Ｉ）、及び再発リスク予測方法（II）を実施する際の操作と同様である。
【００１８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
[ＡＢＣＢ６遺伝子のメチル化解析]
ＡＢＣＢ６遺伝子の転写調節領域付近をコンピュータ解析した結果、ＣｐＧアイランドが存在することが明らかとなった。図１に、ＡＢＣＢ６遺伝子領域における、ＣｐＧ配列の位置、及びＣｐＧアイランド領域を示す。このＣｐＧアイランドにおけるシトシンのメチル化について、６種の肝癌細胞株（ＨＬＥ、ＳＫ−ＨＥＰ−１、Ｈｅｐ  ３Ｂ、ＨｕＨ−６、ＨｕＨ−７、Ｈｅｐ  Ｇ２）を用いて解析を行った。図２に、バイサルファイトシークエンスの結果を示す。以上の解析結果に基づいて、Methylight法による解析に用いる５箇所のメチル化解析領域（ＭＳＰ１〜５）を決定した（図３）。
【実施例２】
【００２０】
[肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子のメチル化解析]
１．サンプル
肝臓癌患者より外科的に切除して得られた肝臓組織から、非癌部及び癌部（ＨＣＣ）組織を採取した。得られた非癌部及び癌部（ＨＣＣ）サンプルは−８０℃にて保存し、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出に用いた。【００２１】
２．ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡ抽出
上記の４８例（再発なし：３５例、再発有り：１３例）のサンプルから、TRIzol Reagent（インビトロジェン社製）とPureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification Kit（インビトロジェン社製）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。また、４６例（再発なし：３５例、再発有り：１１例）のサンプルから、UltraClean Tissue DNA Spin Kit（ＭＯ ＢＩＯ社製）を用いてＤＮＡ抽出を行った。上記サンプルのうち、３３例のサンプルはＲＮＡとＤＮＡの両方の抽出に用いた。【００２２】
３．逆転写反応とＡＢＣＢ６発現レベルの算出
上記のようにして抽出されたｔｏｔａｌ ＲＮＡから、PrimeScript RT reagent Kit（タカラバイオ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲによりＡＢＣＢ６ｍＲＮＡ発現レベルを調べた。リアルタイムＰＣＲの反応は、ｃＤＮＡ（１０ｎｇのinitial ＲＮＡに相当）、プライマー（１０ｐｍｏｌ）、及び加水分解プローブ（２ｐｍｏｌ）を含む２０μＬの反応液を用い、LightCycler 480II（ロシュ社製）によって行った。ΔΔＣｑ法（ΔΔＣｔ法）により、非癌部サンプルにおけるＡＢＣＢ６ｍＲＮＡ発現量の平均値（Ｎ＝４８）を１．０として、癌部サンプルにおけるＡＢＣＢ６ｍＲＮＡ発現レベルを相対値として示した。また、リファレンス遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルを確認した。リアルタイムＰＣＲに用いたプライマー及び加水分解プローブの配列を以下に示す。
＜ＡＢＣＢ６＞
センスプライマー（配列番号１）：5'-GGACCAAGATGTGGAAAGGA-3'
アンチセンスプライマー（配列番号２）：5'-CCAAAATCTCGCCAGGTAGA-3'
プローブ：Universal Probe Library #66（Roche Diagnostics社製)
＜ＧＡＰＤＨ＞
センスプライマー（配列番号３）：5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'
アンチセンスプライマー（配列番号４）：5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'
プローブ：Universal Probe Library #60（Roche Diagnostics社製)【００２３】
４．バイサルファイト処理とＡＢＣＢ６遺伝子領域のメチル化率の算出
各サンプルにおけるＡＢＣＢ６遺伝子領域のメチル化率を検討する目的で以下の実験を行った。上記１で抽出したＤＮＡをEZ DNA Methylation-Gold Kit（ZYMO RESEARCH社製）によりバイサルファイト処理した。これによって、ゲノムＤＮＡ中のメチル化されていないシトシンはチミンへと変換され、メチル化されているシトシンは変換されずに残る。メチル化率の測定はMethylight法を若干改変し、リアルタイムＰＣＲ装置とプライマー（１０ｐｍｏｌ）及び加水分解プローブ（２ｐｍｏｌ）を用いて２０μＬ反応系でのメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）によって行った。鋳型には１００ｎｇのバイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを用いた。ＡＢＣＢ６遺伝子領域のメチル化率は、ΔΔＣｑ法（ΔΔＣｔ法）によりＭＳＰ５のメチル化率に対する相対値としてＭＳＰ１〜４について求めた。あるいは、ＡＢＣＢ６遺伝子領域のメチル化率をＲＰＰＨ１（ribonuclease P RNA component H1（NR_002312.1, X15624））又はＡＬＵ（Alu repeat（The most plentiful short interspersed nucleotide element（SINE）in human DNA））配列のメチル化率に対する相対値としてＭＳＰ５について求めた。また、全ての実験においてコントロールとして１００％メチル化コントロールＤＮＡ（QIAGEN社製）を鋳型に用いた。リアルタイムＰＣＲに用いたプライマー及び加水分解プローブの配列を以下に示す。
＜ＭＳＰ１＞
センスプライマー（配列番号５）：5'-TAAGGTATTCGGATGTTCGC-3'
アンチセンスプライマー（配列番号６）：5'-TCGACCTCGCAATAATTACC-3'
プローブ（配列番号７）：5'-FAM-AGTGTTCGTAGTTTCGGTCGGCGTTT-BHQ-3'
＜ＭＳＰ２＞
センスプライマー（配列番号８）：5'-GGGGTTATAGTCGTGGAGC-3'
アンチセンスプライマー（配列番号９）：5'-AAAACACGTACGCCGTCT-3'
プローブ（配列番号１０）：5'-FAM-GTGGGTTTGTAGTTGGTAGGAGGGTT-BHQ-3'
＜ＭＳＰ３＞
センスプライマー（配列番号１１）：5'-GGGGTTATAGTCGTGGAGC-3'
アンチセンスプライマー（配列番号１２）：5'-GTCTCAACACGACCCCG-3'
プローブ（配列番号１３）：5'-FAM-GTGGGTTTGTAGTTGGTAGGAGGGTT-BHQ-3'
＜ＭＳＰ４＞
センスプライマー（配列番号１４）：5'-GTGTTTTGTTTCGAGTTAGGATTTC-3'
アンチセンスプライマー（配列番号１５）：5'-GAAAAATCTAACGACCAAACCG-3'
プローブ（配列番号１６）：5'-FAM-TTTCGAGTTACGATTTCGTGGAGG-BHQ-3'
＜ＭＳＰ５＞
センスプライマー（配列番号１７）：5'-TAGATTTTTTGTTGTTTCGC-3'
アンチセンスプライマー（配列番号１８）：5'-TCTAAACGACGACCTAAACA-3'
プローブ（配列番号１９）：5'-FAM-AAGAGAAATGGGATGGGGATTTTG-BHQ-3'
＜ＲＰＰＨ１＞
センスプライマー（配列番号２０）：5'-AATGAGGTGTAGAAGGTTGATGGT-3'
アンチセンスプライマー（配列番号２１）：5'-CATAATTAAATCACTTCCCACCAAA-3'
プローブ：Universal ProbeLibrary #10（Roche diagnostics社製）
＜ＡＬＵ＞
センスプライマー（配列番号２２）：5'-GCGCGGTGGTTTACGTTT-3'
アンチセンスプライマー（配列番号２３）：5'-AACCGAACTAATCTCGAACTCCTAAC-3'
プローブ（配列番号２４）：5'-6FAM-AAATAATCCGCCCGCCTCGACCT-BHQ-3'【００２４】
５．再発・無再発診断能の評価
ＭＳＰ５に対する相対値としてＭＳＰ１〜４について求めたＡＢＣＢ６遺伝子領域のメチル化率を用いて解析した。非癌部においてはＡＢＣＢ６ｍＲＮＡ発現とメチル化率との相関は見られなかったが、癌部においてはｍＲＮＡ発現とメチル化率との間に逆相関関係が見られた（図４）。また、再発の有無に基づいて、Receiver operating characteristic（ＲＯＣ）曲線におけるArea Under the Curve（ＡＵＣ）を用いて比較した（図５〜１０）。感度・特異度はＲＯＣ曲線において最区分点の最大値での値を示した。Ｃ型肝炎ウイルスキャリア由来の１年以内再発有り肝臓組織の癌部においてはメチル化率が高いことが明らかとなった。さらに、該ＣｐＧアイランドのメチル化率は、Ｃ型肝炎ウイルスキャリア由来の１年以内再発無し肝臓組織の非癌部においては低いこと、Ｂ型肝炎ウイルスキャリア由来の肝臓組織においては癌部及び非癌部のいずれのメチル化率も、１年以内再発の有無との関連が認められないことが示された。【００２５】
次に、ＲＰＰＨ１に対する相対値としてＭＳＰ５について求めたＡＢＣＢ６遺伝子領域のメチル化率を用いて解析した結果を図１１、１２に示す。癌の２年以内の再発については、全体及びＣ型肝炎ウイルスキャリアの群で非癌部の肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子領域のメチル化率に有意差が認められた。また、非癌部の肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子領域のメチル化率からReceiver operating characteristic（ＲＯＣ）曲線を作成して再発予測性能を評価した結果により、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアの群で癌の２年以内の再発予測精度が高いことが示された（図１３）。【００２６】
さらに、癌患者から採取した肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子ｍＲＮＡ発現量をＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率で除した値を用いてReceiver operating characteristic（ＲＯＣ）曲線を作成して再発予測性能を評価した（図１４）。ＡＢＣＢ６遺伝子ｍＲＮＡ発現量とＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率を組合せてマーカーとすると、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアの群で、癌の１年以内及び２年以内の高い再発予測精度を得られることが示された。【００２７】
６．癌の診断マーカーとしての性能の解析
癌患者から採取した癌部及び非癌部の肝臓組織において、ＡＬＵ配列に対する相対値としてＭＳＰ５について求めたＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率は、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアの有無に係らず癌部において高いことが示された（図１５）。また、Receiver operating characteristic（ＲＯＣ）曲線を作成して診断マーカーとしての性能を評価した結果、ＡＬＵ配列に対する相対値としてＭＳＰ５について求めたＡＢＣＢ６遺伝子転写制御領域のＤＮＡメチル化率は、Ｃ型肝炎ウイルスキャリアの有無に係らず、高性能に診断マーカーとして用いることができることが示された（図１６）。
【図４】
2011122021.tif 000002
【図５】
2011122021.tif 000003
【図１０】
2011122021.tif 000004
【図１３】
2011122021.tif 000005
【図１４】
2011122021.tif 000006
【図１６】
2011122021.tif 000007
【図１】
2011122021.tif 000008
【図２】
2011122021.tif 000009
【図３】
2011122021.tif 000010
【図６】
2011122021.tif 000011
【図７】
2011122021.tif 000012
【図８】
2011122021.tif 000013
【図９】
2011122021.tif 000014
【図１１】
2011122021.tif 000015
【図１２】
2011122021.tif 000016
【図１５】
2011122021.tif 000017
【配列表】
2011122021000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年10月7日(2011.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする肝細胞癌の発症リスクを予測するためのデータを収集する方法。
（ａ）被検者より採取された肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；
（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の発症リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記被検者における肝細胞癌の発症リスクを予測する工程；
【請求項２】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスクを予測するためのデータを収集する方法。
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された非癌部肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；
（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが逆の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における肝細胞癌の再発リスクを予測する工程；
【請求項３】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする肝細胞癌の再発リスクを予測するためのデータを収集する方法。
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者より採取された癌部肝臓組織からゲノムＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）上記ゲノムＤＮＡのＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出する工程；
（ｃ）上記転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度と、肝細胞癌の再発リスクとが正の相関関係にあることを指標として前記肝細胞癌患者における再発リスクを予測する工程；
【請求項４】
転写制御領域が、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−７２３ｂｐから、下流の＋５００ｂｐまでの領域であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
転写制御領域が、以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される１以上の領域であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
（ｉ）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より下流の＋１８３ｂｐから＋３０９ｂｐまでのＭＳＰ１領域；
（ｉｉ）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋７１ｂｐまでのＭＳＰ２領域；
（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−５０ｂｐから下流の＋５７ｂｐまでのＭＳＰ３領域；
（ｉｖ）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−２６８ｂｐから−１７３ｂｐまでのＭＳＰ４領域；
（ｖ）ＡＢＣＢ６遺伝子の転写開始点より上流の−４３３ｂｐから−３３０ｂｐまでのＭＳＰ５領域；
【請求項６】
以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される１以上のプライマーセットとプローブとの組合せを用いて、ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ｉ）配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号７に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｉｉ）配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１０に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｉｉｉ）配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１３に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｉｖ）配列番号１４及び１５に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１６に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｖ）配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１９に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
【請求項７】
ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備え、前記シトシンのメチル化の程度と肝細胞癌の発症リスクとが正の相関関係にあることを指標とした、肝細胞癌の発症リスク予測用のキットであって、プライマーセットとプローブとが、以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される１以上のプライマーセットとプローブとの組合せであることを特徴とするキット。
（ｉ）配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号７に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｉｉ）配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１０に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｉｉｉ）配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１３に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｉｖ）配列番号１４及び１５に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１６に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｖ）配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１９に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
【請求項８】
ＡＢＣＢ６遺伝子の転写制御領域におけるシトシンのメチル化の程度を検出するためのプライマーセットとプローブとを備え、Ｃ型肝炎ウイルスに感染している肝細胞癌患者の肝細胞癌の再発リスク予測用のキットであって、プライマーセットとプローブとが、以下の（ｉ）〜（ｖ）から選択される１以上のプライマーセットとプローブとの組合せであることを特徴とするキット。
（ｉ）配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号７に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｉｉ）配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１０に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｉｉｉ）配列番号１１及び１２に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１３に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｉｖ）配列番号１４及び１５に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１６に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
（ｖ）配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるプライマーセットと、配列番号１９に示される塩基配列を含むプローブとの組合せ；
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
非特許文献７：Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．Ａｐｒ，９（４）：４１６−２３（２００３）
非特許文献８：Ｋｕｒｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．４１（２）：２８４−２９１（２００４）
非特許文献９：Ｌｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．１５，３６１（９３６１）：９２３−９２９（２００３）
非特許文献１０：Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．４０（３）：６６７−７６（２００４）
発明の概要
発明が解決しようとする課題
［０００８］
本発明の課題は、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症又は再発に関与するゲノムＤＮＡのメチル化領域を特定し、より簡単な操作で検出することが可能な、ＨＣＣの発症又は再発のマーカーを提供することにある。
課題を解決するための手段
［０００９］
本発明者らは、ＨＣＣ患者より切除された癌部及び／又は非癌部肝臓組織における遺伝子発現を網羅的に解析し、１年以内に再発が認められた患者由来の肝臓組織（再発有り肝臓組織）におけるＡＢＣＢ６ｍＲＮＡ発現量が、１年以内に再発が認められない患者由来の肝臓組織（再発無し肝臓組織）と比較して有意に高いことを見い出した（図９）。一般的に遺伝子発現は、プロモータ領域のＤＮＡメチル化により抑制されることが知られていることから、発明者らは、再発有り肝臓組織におけるＡＢＣＢ６遺伝子の発現の増加に、プロモータ領域の低メチル化が関与している可能性があると考え、ＡＢＣＢ６遺伝子に関するメチル化解析を行った。本発明者らは、ＡＢＣＢ６遺伝子近傍のＤＮＡ配列を解析してＡＢＣＢ６遺伝子のプロモータ領域にＣｐＧアイランドの存在することを明らかにし、該ＣｐＧアイランドにおけるメチル化率を調べた。また、非癌部においてはＡＢＣＢ６ｍＲＮＡ発現とメチル化率との相関は見られなかったが、癌部においてはｍＲＮＡ発現とメチル化率との間に逆相関関係が見られた（図４）。しかしながら、再発の有無に基づいて解析を行った結果は予想外なことに、Ｃ型肝炎ウイルスキャリア由来の再発有り肝臓組織の癌部においてはメチル化率が高いことが明らかとなった。さらに、該ＣｐＧアイランドのメチル化率は、Ｃ型肝炎ウイルスキャリア由来の再発無し肝臓組織の非癌部においては低いこと、Ｂ型肝炎ウイルス
【国際調査報告】
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