(57)【要約】  本発明の目的は、乳癌と間質性肺炎とを区別することのできる乳癌の悪性度、並びに進展度のマーカー、及び治療効果のモニタリングマーカーを提供することにある。  前記課題は、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するメインプローブと、被検試料とを接触させる工程、を含むことを特徴とする、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１を分析する方法によって解決することができる。
2011138955.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するメインプローブと、被検試料とを接触させる工程、
を含むことを特徴とする、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１を分析する方法。
【請求項２】
Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するメインプローブと、被検試料とを接触させる工程；及び
Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１と前記メインプローブとの結合体を検出する工程；
を含む請求項１に記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法。
【請求項３】
前記分析方法が、
Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するメインプローブと、被検試料とを接触させる工程；
Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合するサブプローブと、被検試料とを接触させる工程；及び
Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１と前記メインプローブとの結合体を検出する工程；
を含むサンドイッチ法である請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記メインプローブが、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの混合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒを持つムチン１を分析する方法。
【請求項５】
前記メインプローブが、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖に特異的に結合する抗体、若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの混合物であり；
前記サブプローブが、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、ムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの２つ以上の混合物である、請求項３に記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１を分析する方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析方法により、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の量を分析することを特徴とする、乳癌の検出又はモニタリング方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析方法により、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の量を分析することを特徴とする、乳癌と間質性肺炎との鑑別方法。
【請求項８】
Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するメインプローブを含むことを特徴とする、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット。
【請求項９】
Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合するサブプローブを更に含む、請求項８に記載のＳｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット。
【請求項１０】
前記メインプローブが、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖に特異的に結合する抗体、若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの混合物である、請求項８又は９に記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒを持つムチン１の分析キット。
【請求項１１】
前記サブプローブが、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、ムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの２つ以上の混合物である、請求項９又は１０に記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒを持つムチン１の分析キット。
【請求項１２】
Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１を更に含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット。
【請求項１３】
Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１。
【請求項１４】
前記Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖が、Ｎｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）及び／又はＮｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）である、請求項１３に記載のムチン１。
【請求項１５】
Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント。
【請求項１６】
生体由来の試料中のα２，８シアル酸転移酵素の発現を分析することを特徴とする、乳癌の検出方法。
【請求項１７】
α２，８シアル酸転移酵素のｍＲＮＡの発現量を分析する、請求項１６に記載の乳癌の検出方法。
【請求項１８】
α２，８シアル酸転移酵素に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする、請求項１６に記載の乳癌の検出方法。
【請求項１９】
α２，８シアル酸転移酵素のｍＲＮＡの塩基配列に特異的なプライマーセット及び／又はプローブを含むことを特徴とする、乳癌の検出用キット。
【請求項２０】
α２，８シアル酸転移酵素に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、乳癌の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖（以下、α２，８ジシアリル糖鎖と称することがある）を持つムチン１を分析する方法、その方法を用いた乳癌の検出若しくはモニタリング方法又は乳癌と間質性肺炎との鑑別方法、及びα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析キットに関する。また、本発明は、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１及びα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査項目のＣＡ１５−３は、乳癌のマーカーとして用いられており、乳癌の悪性度、並びに進展度の指標、及び治療効果のモニタリングとして有用である。ＣＡ１５−３は、ヒト乳汁脂肪球膜上の糖タンパク質であるＭＡＭ−６に対するモノクローナル抗体（１１５Ｄ８）及び乳癌肝転移組織に対するモノクローナル抗体（ＤＦ３）を用いる免疫測定法（サンドイッチ法）によって検出されている。このＣＡ１５−３の免疫測定法によって検出されている抗原は、上皮細胞由来のムチン１の細胞外ドメインである。【０００３】
一方、臨床検査項目のＫＬ−６は、間質性肺炎の診断に有用であることが知られている。ＫＬ−６は、ヒト肺腺癌由来細胞株（ＶＭＲＣ−ＬＣＲ）を免疫して作製されたモノクローナル抗体であるＫＬ−６抗体を用いたサンドイッチ法によって検出される（非特許文献１）。前記ＫＬ−６抗体は、ムチン１のアミノ酸配列ＰＤＴＲＰＡＰ及びスレオニンに結合しているシアル化糖鎖であるＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα糖鎖を認識するモノクローナル抗体である（非特許文献２）。従って、ＫＬ−６のサンドイッチ法によって検出されている抗原も、ムチン１の一部である遊離型ムチン１である。【０００４】
前記のように、乳癌のマーカーのＣＡ１５−３及び間質性肺炎のマーカーのＫＬ−６は、いずれもムチン１を検出している。非特許文献３は、ＫＬ−６が乳癌の腫瘍マーカーとして、転移及び再発の診断、並びに治療効果の判定に有用であることを開示している。すなわち、ＣＡ１５−３及びＫＬ−６は、乳癌のマーカー及び間質性肺炎のマーカーとしても有用である。
一方、乳癌の治療の過程において、しばしば間質性肺炎の発症がみられる。ＣＡ１５−３は、乳癌の治療効果のモニタリングに使用されているが、乳癌の治療中に間質性肺炎が発症した場合、ＣＡ１５−３の測定値が上昇し、乳癌と間質性肺炎とが鑑別できないという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「ラボラトリー・クリニカル・プラクティス（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（日本）２００３年、第２１巻、ｐ．７５−７９
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）」（米国）２００９年、第１３１巻、ｐ．１７１０２−１７１０９
【非特許文献３】「日本臨床外科学会雑誌」（日本）２００８年、第６９巻、ｐ．１２９３−１３０２
【非特許文献４】「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（米国）２０００年、第２７５巻、ｐ．１５４２２−１５４３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、乳癌と間質性肺炎とを区別することのできる乳癌の悪性度、並びに進展度のマーカー、及び治療効果のモニタリングマーカーを提供することである。具体的には、間質性肺炎の患者には存在せず、乳癌患者に存在する腫瘍マーカーを提供することである。
更に、本発明の目的は、乳癌と間質性肺炎とを区別することのできる乳癌の悪性度、並びに進展度、及び治療効果のモニタリングに用いることのできる分析キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、乳癌と間質性肺炎とを区別することのできる腫瘍マーカーについて、鋭意研究した結果、驚くべきことに、乳癌患者のムチン１が、糖鎖抗原であるＳｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖（α２，８ジシアリル糖鎖）を有していることを見出した。本願発明者らは、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を認識することのできるプローブを用い、乳癌患者のムチン１を特異的に検出することのできる分析方法を見出した。そして、本発明の分析方法を用いることにより、ＣＡ１５−３高値乳癌患者血清全例が陽性であり、間質性肺炎患者血清全例が陰性であることを見出した。従って、本発明の分析方法により、乳癌の悪性度及び進展度と間質性肺炎の発症とが、血清診断により区別することが可能になる。
本発明は、こうした知見に基づくものである。【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するメインプローブと、被検試料とを接触させる工程、を含むことを特徴とする、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１を分析する方法、
［２］Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するメインプローブと、被検試料とを接触させる工程；及びＳｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１と前記メインプローブとの結合体を検出する工程；を含む［１］に記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法、
［３］前記分析方法が、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するメインプローブと、被検試料とを接触させる工程；Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合するサブプローブと、被検試料とを接触させる工程；及びＳｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１と前記メインプローブとの結合体を検出する工程；を含むサンドイッチ法である［１］又は［２］に記載の分析方法、
［４］前記メインプローブが、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの混合物である、［１］〜［３］のいずれかに記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒを持つムチン１を分析する方法、
［５］前記メインプローブが、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖に特異的に結合する抗体、若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの混合物であり；前記サブプローブが、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、ムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの２つ以上の混合物である、［３］に記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１を分析する方法、
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載の分析方法により、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の量を分析することを特徴とする、乳癌の検出又はモニタリング方法、
［７］［１］〜［５］のいずれかに記載の分析方法により、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の量を分析することを特徴とする、乳癌と間質性肺炎との鑑別方法、
［８］Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するメインプローブを含むことを特徴とする、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット、
［９］Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合するサブプローブを更に含む、［８］に記載のＳｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット、
［１０］前記メインプローブが、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖に特異的に結合する抗体、若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの混合物である、［８］又は［９］に記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒを持つムチン１の分析キット、
［１１］前記サブプローブが、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、ムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択される抗体である、［９］又は［１０］に記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒを持つムチン１の分析キット、
［１２］Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１を更に含む、［８］〜［１１］のいずれかに記載の、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット、
［１３］Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１、
［１４］Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、
［１５］生体由来の試料中のα２，８シアル酸転移酵素の発現を分析することを特徴とする、乳癌の検出方法、
［１６］α２，８シアル酸転移酵素のｍＲＮＡの発現量を分析する、［１５］に記載の乳癌の検出方法、
［１７］α２，８シアル酸転移酵素に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする、［１５］に記載の乳癌の検出方法、
［１８］α２，８シアル酸転移酵素のｍＲＮＡの塩基配列に特異的なプライマーセット及び／又はプローブを含むことを特徴とする、乳癌の検出用キット、及び
［１９］α２，８シアル酸転移酵素に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、乳癌の検出用キット、
に関する。
なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＳｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法によれば、乳癌の悪性度及び進展度と間質性肺炎の発症とを鑑別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１のサンドイッチ法による測定における検量腺を示したグラフである。
【図２】乳癌細胞株（ＹＭＢ−１及びＭＣＦ−７）、胃癌細胞株（ＮＵＧＣ−４）、及び肺癌細胞株（ＡＢＣ−１）におけるα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の発現を測定したグラフである。
【図３】乳癌患者、健常人、間質性肺炎患者の血清中におけるα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１、ＣＡ１５−３、又はＫＬ−６を測定した結果を示すグラフである。
【図４】乳癌患者のＭＵＣ１が有する主要なＳｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を示した図である。
【図５】乳癌患者の組織においてα２，８シアル酸転移酵素ＶＩの発現が、亢進していることを示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［１］Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１
ムチン１は、約３００ＫＤａ以上の分子量を有する高度にグリコシル化されたＩ型膜糖タンパク質であり、短いＮ末端領域、中央領域、膜貫通領域、及びＣ末端の細胞質内領域からなる。前記中央領域は２０個のアミノ酸（ＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡ）からなる固有の繰り返し配列（ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）を含んでいる。ムチン１の遺伝子は多様性があり、前記繰り返し配列をコードする部分の数がおよそ２５から１２５まで変化している。また、ムチン１の遺伝子は、繰り返し配列の数以外にも、アミノ酸の欠失、挿入、及び置換が存在し、多様性が高い。前記中央領域における繰り返し配列の数が変化する領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ）は、ＶＮＴＲ領域と称され、Ｏ型グリカンを多く含んでいる。一方、中央領域の繰り返し配列以外の膜に近いペプチド部分には、Ｎ型グリカン及びＯ型グリカンが存在している。
【００１２】
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は新規化合物であり、α２，８ジシアリル糖鎖及び２０個のアミノ酸（ＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡ）からなる固有の繰り返し配列を有する限り、限定されるものではない。α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１において、α２，８ジシアリル糖鎖は、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１のＶＮＴＲ領域のＯ型グリカンに多く含まれている。
Ｎ末端領域、中央領域、膜貫通領域、及びＣ末端の細胞質内領域を含むムチン１タンパク質のアミノ酸配列の１例を配列番号１に示すが、ムチン１は多様性を有しているため、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列に限定されるものでない。前記繰り返し配列の数は限定されるものではないが、好ましくは１〜２００であり、より好ましくは５〜１５０であり、より好ましくは２０〜１３０であり、最も好ましくは２５〜１２５である。また、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１のＮ末端領域のアミノ酸配列、中央領域の繰り返しのアミノ酸配列及び繰り返し以外のアミノ酸配列、膜貫通領域のアミノ酸配列、並びにＣ末端の細胞質内領域のアミノ酸配列において、本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は、変異を含むことができる。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜１００個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列でもよい。
なお、本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は、シアリダーゼ処理を行うことにより、後述のα２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体と反応しなくなる。
【００１３】
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分子量も、限定されるものではないが、例えば２０ｋＤ〜１００００ｋＤである。α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は、細胞膜に結合した膜結合型α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１でもよく、分泌型α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１でもよく、更にそれらの部分ペプチドでもよい。従って、乳癌患者の体液は、膜結合型α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１、分泌型α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１、及びそれらの部分ペプチドを含むことができる。
【００１４】
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の発現している細胞又は組織は、限定されるものではないが、例えば乳癌細胞、乳癌組織又は乳癌由来細胞株である。一方、生体の細胞において発現しているムチン１がＳｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つという報告はない。例えば、後述の実施例に示すように、間質性肺炎において血液中に増加するムチン１は、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持たないムチン１である。更に、ムチン１は、多くの癌細胞においても発現しているが、後述の実施例に示すように、胃癌細胞であるＮＵＧＣ−４細胞、及び肺癌細胞であるＡＢＣ−１細胞に発現しているムチン１も、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持たない。
【００１５】
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は、例えば試料から分離されるものである。具体的には、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を含む生体由来の試料（例えば、血清若しくは血漿などの血液、又は乳癌組織）、又は乳癌由来の継代細胞、若しくはその培養上清などから分離することができる。例えば、前記試料を硫安塩析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を用いて精製することができる。具体的には、α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体、又はα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体を用いて、アフィニティーカラムを作成し、アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【００１６】
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は、後述のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法において、標準物質として使用することができる。また、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析キットは、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を標準物質として含むことができる。
【００１７】
本明細書において、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖（α２，８ジシアリル糖鎖）は、より具体的にはＮｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌを意味する。ムチン１が有するα２，８ジシアリル糖鎖を含む糖鎖は、限定されるものではないが、（Ａ）「Ｎｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）」（以下、「α２，８ジシアリル糖鎖（Ａ）」と称する）又は（Ｂ）「Ｎｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）」（以下、「α２，８ジシアリル糖鎖（Ｂ）」と称する）を挙げることができる。
前記α２，８ジシアリル糖鎖（Ａ）及びα２，８ジシアリル糖鎖（Ｂ）は、間質性肺炎患者のムチン１には、ほとんど存在しておらず、乳癌患者のムチン１に発現しているものである。
また、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１におけるα２，８ジシアリル糖鎖（Ａ）の含量は、乳癌患者によって異なり、特に限定されるものではないが、例えば０．１〜９９重量％であり、１〜５０重量％でもよく、３〜３０重量％でもよく、５〜１５重量％でもよい。α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１におけるα２，８ジシアリル糖鎖（Ｂ）の含量も、乳癌患者によって異なり、特に限定されるものではないが、例えば０．０１〜９９重量％であり、０．１〜１０重量％でもよく、０．３〜５重量％でもよく、０．５〜３重量％でもよい。
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１には、α２，８ジシアリル糖鎖（Ａ）のみを有するムチン１、α２，８ジシアリル糖鎖（Ｂ）のみを有するムチン１、並びにα２，８ジシアリル糖鎖（Ａ）及びα２，８ジシアリル糖鎖（Ｂ）の両方を有するムチン１が含まれる。
【００１８】
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は、α２，８ジシアリル糖鎖（Ａ）及びα２，８ジシアリル糖鎖（Ｂ）以外の糖鎖を有しており、例えば「Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα糖鎖」、「Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃβ→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）」、及び「Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６）ＧａｌＮＡｃβ→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）」を挙げることができる。
【００１９】
［２］Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析方法
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法は、（ａ）Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するメインプローブと、被検試料とを接触させる工程（以下、接触工程（ａ）と称することがある）を含むことを特徴とする。
また、本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法は、前記接触工程（ａ）に、更にＳｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１と前記メインプローブとの結合体を検出する工程（以下、検出工程と称することがある）を含むことができる。
更に、本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法は、前記接触工程（ａ）及び検出工程に加え、（ｂ）Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１に結合するサブプローブと、被検試料とを接触させる工程（以下、接触工程（ｂ）と称することがある）を含むことができる。
【００２０】
前記接触工程（ａ）において用いるメインプローブとしては、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するα２，８ムチンプローブを用いることができる。
α２，８ムチンプローブとしては、具体的には、α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合するα２，８ジシアリルプローブ（例えば、α２，８ジシアリル糖鎖にアフィニティーを有するレクチン、又はα２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント）、又はα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体、若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメントを挙げることができる。
【００２１】
前記接触工程（ｂ）において用いるサブプローブとしては、前記α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するα２，８ムチンプローブ、及びα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１及びα２，８ジシアリル糖鎖を持たないムチン１に結合する汎用ムチンプローブを用いることができる。
汎用ムチンプローブとしては、α２，８シアリル糖鎖以外のムチン１が持つ糖鎖にアフィニティーを有するレクチン、又はムチン１に特異的に結合する抗体、若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメントを挙げることができる。
以下、詳細にα２，８ムチンプローブ及び汎用ムチンプローブについて説明する。
【００２２】
《α２，８ムチンプローブ》
（α２，８ジシアリル糖鎖にアフィニティーを有するレクチン）
α２，８ジシアリル糖鎖にアフィニティーを有するレクチンは、α２，８ジシアリル糖鎖に結合することのできるレクチンであれば、限定されるものではないが、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖にアフィニティーを有するレクチン、Ｓｉａα２−８Ｓｉａ糖鎖にアフィニティーを有するレクチンを挙げることができる。
【００２３】
（α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体）
前記α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体としては、α２，８ジシアリル糖鎖に結合することのできる抗体であれば、限定されるものではないが、例えばＳｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖に特異的に結合する抗体、又はＳｉａα２−８Ｓｉａ糖鎖に特異的に結合する抗体を挙げることができる。前記α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体は、α２，８ジシアリル糖鎖のみと結合することができるため、α２，８ジシアリル糖鎖を持つ糖タンパク質、又は糖脂質と結合することができる。
α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体は、免疫抗原としてα２，８ジシアリル糖鎖、又はα２，８ジシアリル糖鎖を持つ糖タンパク質を用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７、１９７５）に従って、作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、α２，８ジシアリル糖鎖、又はα２，８ジシアリル糖鎖を持つ糖タンパク質を単独もしくはＢＳＡ又はＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
具体的には、α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体として、非特許文献４に記載のＳ２−５６６モノクローナル抗体、及び１Ｅ６モノクローナル抗体を挙げることができる。前記Ｓ２−５６６モノクローナル抗体はヒトＳＫ−ＭＥＬ−２８メラノーマ細胞株を免疫抗原として用いて得られたものであり、Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖（Ｎｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌ）に特異的に結合する。また、１Ｅ６モノクローナル抗体は、Ｓｉａα２−８Ｓｉａ糖鎖に特異的に結合する抗体である。
【００２４】
（α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体）
α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体は、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に結合し、α２，８ジシアリル糖鎖を持たないムチン１に結合せず、そしてα２，８ジシアリル糖鎖のみには結合しない抗体である。すなわち、α２，８ジシアリル糖鎖及びムチン１のペプチドを認識する抗体である。α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は新規化合物であり、従って、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体も新規な抗体である。
α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体は、免疫抗原としてα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７、１９７５）に従って、作製することができ、ハイブリドーマのスクリーニングにおいて、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に結合し、α２，８ジシアリル糖鎖を持たないムチン１に結合せず、そしてα２，８ジシアリル糖鎖のみに結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体を取得することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を単独もしくはＢＳＡ又はＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、α２，８ジシアリル糖鎖を持たないムチン１に結合する抗体、及びα２，８ジシアリル糖鎖に結合する抗体を、アフィニティーカラムなどで吸収することによって、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するポリクローナル抗体を取得することができる。
【００２５】
《汎用ムチンプローブ》
（α２，８シアリル糖鎖以外のムチン１が持つ糖鎖にアフィニティーを有するレクチン）
前記α２，８シアリル糖鎖以外のムチン１が持つ糖鎖にアフィニティーを有するレクチンは、α２，８ジシアリル糖鎖以外のシアリル糖鎖を持つムチン１が持つ糖鎖にアフィニティーを有するレクチンに結合することのできるレクチンであれば、限定されるものではない。例えば、後述のＫＬ−６モノクローナル抗体が認識するシアル化糖鎖であるＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα糖鎖を認識するレクチン（例えば、Ｊａｃａｌｉｎ）を挙げることができる。
【００２６】
（ムチン１に特異的に結合する抗体）
ムチン１に特異的に結合する抗体は、α２，８ジシアリル糖鎖を持たないムチン１及びα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に結合することができる限り、限定されるものではないが、例えばα２，８ジシアリル糖鎖を持たないムチン１及びα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に結合し、且つα２，８ジシアリル糖鎖のみには結合しない抗体を挙げることができる。具体的には、従来のムチン１に結合する抗体が、ムチン１に特異的に結合する抗体に含まれる。
前記ムチン１に特異的に結合する抗体は、免疫抗原としてムチン１を用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能である。例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７、１９７５）に従って、作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、ムチン１を単独もしくはＢＳＡ又はＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
具体的には、ムチン１に特異的に結合する抗体として、非特許文献２に記載のＫＬ−６モノクローナル抗体を挙げることができる。前記ＫＬ−６モノクローナル抗体は、ヒト肺腺癌由来細胞株（ＶＭＲＣ−ＬＣＲ）を免疫抗原として用いて得られたものであり、ムチン１に特異的に結合する。ＫＬ−６モノクローナル抗体は、ムチン１のアミノ酸配列ＰＤＴＲＰＡＰ及びスレオニンに結合しているシアル化糖鎖であるＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα糖鎖を認識するモノクローナル抗体である。
また、ＫＬ−６モノクローナル抗体以外に、多くの抗ムチン１抗体が市販されており、例えばａｂｃａｍ社、又はＣＴＳ社から販売されている抗ムチン１ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を、ムチン１に特異的に結合する抗体として、用いることもできる。
【００２７】
《本発明の検出方法の実施態様》
本発明の検出方法として、限定されるものではないが、具体的には以下の態様を挙げることができる。
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法の第１の実施態様は、前記接触工程（ａ）、接触工程（ｂ）、及び検出工程を含むものである。前記接触工程（ａ）、及び接触工程（ｂ）は、接触工程（ａ）、又は接触工程（ｂ）の何れを先に行ってもよい。従って、接触工程（ａ）、接触工程（ｂ）及び検出工程を実施する順番として、以下の２つの実施態様がある。
（１）接触工程（ａ）を実施し、接触工程（ｂ）を実施し、そして検出工程を実施する。
（２）接触工程（ｂ）を実施し、接触工程（ａ）を実施し、そして検出工程を実施する。
【００２８】
例えば、プローブとして抗体を用い、サンドイッチ法により本発明の分析方法を行う場合、以下の２つの実施態様を挙げることができる。
（１）α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの混合物と、被検試料とを接触させる工程（ａ）；α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、ムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの２つ以上の混合物と、被検試料とを接触させる工程（ｂ）；及びα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１と抗体との結合体を検出する工程；をこの順番で行うサンドイッチ法（以下、サンドイッチ法（１）と称する）。
（２）α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に結合するα２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、ムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの２つ以上の混合物と、被検試料とを接触させる工程（ｂ）；α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの混合物と、被検試料とを接触させる工程（ａ）；及びα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１と前記メインプローブとの結合体を検出する工程；をこの順番で行うサンドイッチ法（以下、サンドイッチ法（２）と称する）。
【００２９】
前記サンドイッチ法は、例えば以下のように行うことが可能である。
（ｉ）一次反応工程
マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、捕捉抗体（一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体（一次抗体）が固相化された不溶性担体（マイクロプレート又はビーズ）に、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１が含まれる被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体（一次抗体）とα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を接触させ、結合させる。その後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。
（ii）二次反応工程
α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１と結合する抗体に西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素を標識した標識抗体（２次抗体）を添加し、捕捉されたα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に標識抗体を結合させる。この反応により、捕捉抗体−α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１−標識抗体の免疫複合体が不溶性担体（マイクロプレート又はビーズ）上に形成される。
また、２次抗体として酵素を標識した「標識抗体」に代えて、ビオチンを結合させた「ビオチン標識抗体」又は「非標識抗体」を用いることも可能である。
（iii）検出工程
不溶性担体（マイクロプレート又はビーズ等）を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。
また、２次抗体を直接標識せずに、非標識抗体を用いた場合は、２次抗体に結合する抗体を標識し、シグナルを検出することも可能である。更に、前記ビオチン標識抗体を用いた場合は、酵素標識アビジンを用いて、シグナルを検出することも可能である。
【００３０】
前記サンドイッチ法（１）の場合、捕捉抗体（一次抗体）として、α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの混合物を用い、標識抗体（２次抗体）として、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、ムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又は２つ以上のそれらの混合物を用いる。また前記サンドイッチ法（２）の場合、捕捉抗体（一次抗体）として、α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、ムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの２つ以上の混合物を用い、標識抗体（２次抗体）として、α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの混合物を用いる。
前記サンドイッチ法においては、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１が繰り返し配列を有しているために、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の１分子中に同じエピトープを複数有していることがある。従って、そのようなエピトープに対する抗体を用いる場合は、捕捉抗体（一次抗体）及び標識抗体（２次抗体）に同じエピトープを認識する抗体を用いることができる。具体的には、α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体（例えば、Ｓ２−５６６モノクローナル抗体）を、捕捉抗体（一次抗体）及び標識抗体（２次抗体）として用いることができる。また、Ｓｉａα２−８Ｓｉａ糖鎖に特異的に結合する抗体（例えば、１Ｅ６モノクローナル抗体）を、捕捉抗体（一次抗体）及び標識抗体（２次抗体）として用いることができる。
【００３１】
前記サンドイッチ法は、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、又は放射免疫測定法、によって行うことができる。従って、抗体を標識する酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に合わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。更に、本発明における標識抗体として、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体を使用することができる。
【００３２】
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法の第２の実施態様は、前記接触工程（ａ）、及び検出工程を含み、前記接触工程（ｂ）を含まないものである。
具体的には、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するα２，８ムチンプローブと、被検試料とを接触させる工程（ａ）を行い、次にα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１と前記α２，８ムチンプローブとの結合体を検出する工程を行う。α２，８ムチンプローブとしては、α２，８ジシアリル糖鎖にアフィニティーを有するレクチン、α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体、又はα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体等を用いることができる。
【００３３】
α２，８ムチンプローブとして抗体を用いる場合、第２の実施態様は、例えばラテックス凝集免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロットなどによって行うことができる。α２，８ムチンプローブとしてレクチンを用いた場合、第２の実施態様は、レクチンブロットによって行うことができる。
【００３４】
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法の第３の実施態様は、接触工程（ａ）を含み、前記接触工程（ｂ）及び検出工程を含まないものである。具体的には、α２，８ムチンプローブに、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を結合させ、それをα２，８ムチンプローブから解離させて、回収する方法を挙げることができる。α２，８ムチンプローブとして、α２，８ジシアリル糖鎖にアフィニティーを有するレクチンを用いた場合はレクチンアフィニティーカラムを、α２，８ムチンプローブとして、α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体又はα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体を用いた場合は、抗体アフィニティーカラムを用いる。
【００３５】
前記のレクチンアフィニティーカラム又は抗体アフィニティーカラムを用いて試料中のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を結合させ、そして溶出することによって、試料中のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１のみを回収する。回収したα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は、一般的なタンパク検出法（例えば、ゲル電気泳動後のタンパク質の染色、ＵＶメーターによるタンパク質の検出）、又はムチン１特異的な検出法（例えば、ＫＬ−６、又はＣＡ１５−３の酵素免疫測定法による検出）により、検出することができる。
【００３６】
（被検試料）
本発明の分析方法に用いる被検試料としては、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を含む可能性のある生体由来試料を挙げることができる。例えば、尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調整物（例えば、生検標本、特には、乳癌患者の生検標本）等を挙げることができ、血液、血清、血漿、又は乳腺の生検標本が好ましく、特には血液、血清、又は血漿が好ましい。健常人及び間質性肺炎患者の血液、血清、又は血漿中には、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は、ほとんど存在しておらず、乳癌患者においては、血液中に放出されるために、乳癌を検出するための被検試料として適当であるからである。
【００３７】
前記尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液などの液性の試料は、前記分析方法において、それぞれの分析方法に応じて適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、又は器官などの固形の試料は、固形の試料の体積の２〜１０倍程度の適当な緩衝液で溶解して、懸濁液又はその上清を、前記分析方法において、そのまま、又は更に希釈して使用することができる。
【００３８】
本明細書において「α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を含む可能性のある生体由来試料」とは、ムチン１を含む被検試料及びムチン１を含む可能性のある被検試料を含む。この理由は、乳癌の疑いのある患者由来の被検試料を分析に用いることがあるからである。
【００３９】
［３］乳癌の検出若しくはモニタリング方法、又は乳癌と間質性肺炎との鑑別方法
前記α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法により、乳癌の検出若しくはモニタリング、又は乳癌と間質性肺炎との鑑別を行うことができる。
前記α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法により、対象（患者）の試料中のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の量を測定し、健常人試料中のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の量と比較することにより、前記対象（患者）が乳癌であるか否かを検出又は診断することができる。
また、前記α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法により、治療を行っている乳癌患者の試料中のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の量を測定することにより、乳癌患者のモニタリング（例えば、乳癌の悪性度、乳癌の進展度、乳癌の転移、及び乳癌の再発のモニタリング）を行うことができる。
更に、前記α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法により、対象（患者）の試料中のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の量を測定し、間質性肺炎患者試料中のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の量と比較することにより、前記対象（患者）が乳癌であるか、又は間質性肺炎であるかを鑑別することができる。
【００４０】
［４］Ｓｉａα２−８Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ−Ｒ糖鎖を持つムチン１の分析キット
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析キットは、前記α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析方法に用いるキットである。本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析キットは、乳癌の検出若しくはモニタリング用キット、又は乳癌と間質性肺炎との鑑別キットとして用いることもできる。
【００４１】
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分析キットは、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するメインプローブを含む。
メインプローブとしては、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するα２，８ムチンプローブを用いることができる。α２，８ムチンプローブとしては、具体的には、α２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合するα２，８ジシアリルプローブ（例えば、α２，８ジシアリル糖鎖にアフィニティーを有するレクチン、又はα２，８ジシアリル糖鎖に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント）、又はα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合する抗体、若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はそれらの２つ以上の混合物を挙げることができる。
【００４２】
本発明の分析キットは、更にα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に結合するサブプローブを含んでもよい。サブプローブとしては、前記α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１に特異的に結合するα２，８ムチンプローブ、又はα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１及びα２，８ジシアリル糖鎖を持たないムチン１に結合する汎用ムチンプローブを用いることができる。汎用ムチンプローブとしては、α２，８シアリル糖鎖以外のムチン１が持つ糖鎖にアフィニティーを有するレクチン、又はムチン１に特異的に結合する抗体、若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメントを挙げることができる。
【００４３】
前記メインプローブ及びサブプローブは、分析キットの測定方法に従って、担体に結合させてもよく、緩衝液に溶解させてもよい。例えば、担体としてはセファロース、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、スチレンとジビニルベンゼンのコポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン及びポリスチレン・コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、コラーゲン、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、シリカ、ジルコニア、アルミナ、チタニア、セラミックスを挙げることができる。担体の形状も特に限定されるものではないが、粒子状のビーズ、プレート及びゲルなどの形状の担体を用いることができる。
【００４４】
また、前記分析方法が、標識化抗体を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法）の場合には、メインプローブ及びサブプローブは、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないため、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。
【００４５】
本発明の分析キットは、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を、標準物質として含むことができる。更に、本発明のキットは、乳癌の検出若しくはモニタリング用、乳癌と間質性肺炎との鑑別用である旨を明記した使用説明書を含むことができる。乳癌の検出若しくはモニタリング用、乳癌と間質性肺炎との鑑別用である旨の記載は、分析キットの容器に付されていてもよい。
【００４６】
［４］糖転移酵素の分析による乳癌の検出方法
後述の実施例５に示すように、乳癌患者のムチン１におけるα２，８ジシアリル糖鎖の増加には、α２，８シアル酸転移酵素Ｉ〜ＶＩ、特にはα２，８シアル酸転移酵素ＩＩＩ又はＶＩ（以下、それぞれＳＴ８−ＩＩＩ、又はＳＴ８−ＶＩと称することがある）の乳癌における発現の増加が強く関与している。従って、乳癌患者由来の試料のα２，８シアル酸転移酵素を分析することによって、乳癌患者と、正常人とを鑑別することが可能である。以下に、α２，８シアル酸転移酵素の例として、ＳＴ８−ＶＩを用いる本発明の乳癌の検出法について説明するが、ＳＴ８−ＶＩに限られるものではない。
【００４７】
本発明の検出方法において、ＳＴ８−ＶＩを分析する方法としては、ＳＴ８−ＶＩを定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいはＳＴ８−ＶＩの存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、ＳＴ８−ＶＩのｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的分析方法（例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法等）、ＳＴ８−ＶＩに対する抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）、又は生化学的手法（例えば、酵素学的測定法）などを挙げることができる。
【００４８】
《分子生物学的分析方法》
ＳＴ８−ＶＩの分子生物学的分析方法としては、試料中の遺伝子、例えばｍＲＮＡ又はそれから得られたｃＤＮＡなどと、それらのヌクレオチドにハイブリダイズすることのできるプライマーやプローブとを用い、ハイブリダイズの原理を用いた方法で分析するものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法を挙げることができ、好ましくはリバーストランスクリプション−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）であり、特にはリアルタイムＰＣＲ法を好適に用いることができる。
【００４９】
リアルタイムＰＣＲ法としては、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセットを用い、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する化合物であるインターカレーター、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩをＰＣＲの反応系に加えるインターカレーター法、並びに前記プライマーセットと、５’末端をレポーター色素で、３’末端をクエンチャー色素で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）とをＰＣＲの反応系に加えるＴａｑＭａｎ法等を挙げることができる。このようなリアルタイムＰＣＲ法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、前記プライマーセット、又はプライマーセット及びプローブを合成すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができる。
【００５０】
前記フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブは、ＳＴ８−ＶＩをコードするヌクレオチドの塩基配列に基づいて作成することができる。具体的には、ＳＴ８−ＶＩのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブは、配列番号２で表されるＳＴ８−ＶＩをコードするｃＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．３３８５９６）から、適当な塩基配列を選択し、作製することができ、例えば、フォワードプライマーとして５’−ＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＡ−３’（配列番号３）を、リバースプライマーとして５’−ＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴ−３’（配列番号４）を挙げることができる。
プライマーの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであり、より好ましくは、１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、最も好ましくは、１９ｍｅｒ〜２５ｍｅｒである。プローブの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、１２ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、より好ましくは、１３ｍｅｒ〜２９ｍｅｒであり、最も好ましくは、１４ｍｅｒ〜１８ｍｅｒである。
【００５１】
前記ＲＴ−ＰＣＲ法（特にはリアルタイムＰＣＲ法）は、
（１）生体由来の試料からｍＲＮＡを抽出する工程、
（２）抽出されたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する工程、
（３）プライマーセット、又はプライマーセット及びプローブを用いてＤＮＡを増幅する工程、及び
（４）増幅されたＤＮＡを検出する工程、
を含むことができる。
【００５２】
乳癌が疑われる患者の生体由来の試料中におけるＳＴ８−ＶＩのｍＲＮＡの発現量を、測定し、健常者生体由来試料中のＳＴ８−ＶＩの発現量と比較することにより、前記患者が乳癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のＳＴ８−ＶＩの発現量と比べて、前記患者のＳＴ８−ＶＩの発現量が有意に多い場合に前記患者は乳癌であると判定することができる。
例えば、後述の実施例におけるリアルタイムＰＣＲの場合、ＳＴ８−ＶＩの健常者の平均値を求め、標準偏差（ＳＤ）を求める。癌患者の検出のためのカットオフ値は、乳癌を検出することのできる値であれば、限定されない。例えば、平均値を超える検体を陽性と判定することも可能であるし、平均値±ＳＤ、平均値±２ＳＤ、又は平均値±３ＳＤをカットオフ値とすることもできる。
【００５３】
《免疫学的分析方法》
ＳＴ８−ＶＩの分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、ＳＴ８−ＶＩに結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることができる。
【００５４】
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、免疫抗原としてＳＴ８−ＶＩを用いること以外は、公知の方法によって作成することが可能であり、例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って、作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、ＳＴ８−ＶＩのタンパク質を単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、単純あるいはフロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
【００５５】
免疫学的分析方法として、酵素免疫測定方法、特にはサンドイッチ法を用いる場合には、以下のように行うことが可能である。
まず、マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、ＳＴ８−ＶＩに結合する抗体（捕捉抗体、又は一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体が固相化されたプレートやビーズに、ＳＴ８−ＶＩが含まれる被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体とＳＴ８−ＶＩを接触させ、結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたβ４ＧＡＬＮＴ４と結合する抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素とが結合した標識抗体（２次抗体）を添加し、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体−ＳＴ８−ＶＩ−標識抗体の免疫複合体がマイクロプレート等の担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。また、２次抗体を直接標識せずに、２次抗体に結合する抗体を標識し、シグナルを検出することも可能である。
抗体を標識する酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に合わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。更に、本発明における標識抗体は、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体も含むことができる。
【００５６】
更に被検試料として乳腺の生検試料を用いる場合には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色法により、乳腺組織でのＳＴ８−ＶＩの発現を確認することにより、乳癌であるか否かを判定することができる。
【００５７】
また、被検試料として血液等を用いる場合、乳癌の疑いのある患者から血液を採取し、全血のままか、あるいは血清又は血漿とし、その中のＳＴ８−ＶＩの量を測定し、健常者から採取した血液等中のＳＴ８−ＶＩの量と比較することにより、前記患者が乳癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のＳＴ８−ＶＩの量と比べて、前記患者のＳＴ８−ＶＩの量が有意に多い場合に前記患者は乳癌であると判定することができる。
例えば、サンドイッチ法によるＥＬＩＳＡの場合、ＳＴ８−ＶＩの健常者の平均値を求め、標準偏差（ＳＤ）を求める。乳癌患者の検出のためのカットオフ値は、乳癌患者を検出することのできる値であれば、限定されない。例えば、平均値を超える検体を陽性と判定することも可能であるし、平均値±ＳＤ、平均値±２ＳＤ、又は平均値±３ＳＤをカットオフ値とすることもできる。
【００５８】
本発明の糖転移酵素の分析による乳癌の検出方法において、ＳＴ８−ＶＩの分析に用いる被検試料としては、ＳＴ８−ＶＩを含有する可能性のある生体試料又は生体由来試料を挙げることができ、例えば、尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液等の体液試料、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調整物（例えば、生検標本、特には、乳腺の生検標本）等を挙げることができ、血液、血清、血漿、又は乳腺の生検標本が好ましく、特には血液、血清、又は血漿（以下、血液等と称することがある）が好ましい。健常者の組織、血液、血清、又は血漿中には、ＳＴ８−ＶＩは、ほとんど存在しておらず、乳癌を検出するための被検試料として適当であるからである。
【００５９】
［５］糖転移酵素の分析による乳癌の検出キット
本発明の分子生物学的分析による乳癌の検出用キットは、α２，８シアル酸転移酵素Ｉ〜ＶＩ（特には、ＳＴ８−ＶＩ）をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプライマーセット、又はプライマーセット及びプローブを含むことができる。本発明の検出用キットにおいてフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブは、混合物として含まれてもよく、個別の試薬として含まれてもよい。また、本発明のキットは、プライマー及びプローブの他に、リアルタイムＰＣＲ法を行うのに必要な試薬及び／又は酵素を更に含むこともできる。更に、本発明のキットは、乳癌の検出又は測定用、乳癌と健常人との鑑別用であることを明記した使用説明書を含むことができる。また、これらの記載は、容器に付されていてもよい。
【００６０】
本発明の免疫学的分析による乳癌の検出用キットは、用いる免疫学的手法に応じて、所望の形態でα２，８シアル酸転移酵素Ｉ〜ＶＩ（特には、ＳＴ８−ＶＩ）に特異的に結合する抗体、またはその断片を含むことができる。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる。前記抗体断片としては、例えばＳＴ８−ＶＩへの特異的結合能を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。
更に、本発明のキットは、乳癌の検出又は測定用、乳癌と健常人との鑑別用であることを明記した使用説明書を含むことができる。また、これらの記載は、容器に付されていてもよい。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００６２】
《実施例１：α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分離》
本実施例では、乳癌細胞株からα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の分離及び精製を行った。
乳癌由来の細胞株ＹＭＢ−１（１×１０７）を、遠心分離により回収した。回収した細胞に、抽出液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０，１．０％ＮＰ−４０）１ｍＬを加え、激しく攪拌することによって細胞を溶解した。溶解液を遠心分離（１５，０００ｘｇ、１５分）し、上清を回収した。得られた上清１ｍＬを、抽出液で平衡化したＫＬ−６抗体のアフィニティーカラムにアプライし、３０分保持した。２０倍容量の抽出液でカラムを洗浄したのち、更に１０倍量のＰＢＳで洗浄した。溶出緩衝液（１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，３Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ２．５）３ｍＬで溶出し、ＹＭＢ−１ムチン１溶液を得た。
なお、ＫＬ−６抗体のアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、メーカーの推奨する添付のプロトコールに従い、作製した。【００６３】
《実施例２：α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の測定系の構築》
本実施例では、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１のサンドイッチ法による免疫学的分析方法の構築を行った。
ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したＳ２−５６６モノクローナル抗体（生化学工業）５０μＬを、９６ｗｅｌｌ  ｂｌａｃｋ、ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｌａｔｅｓ  （コーニング社）に加え、４℃、１６時間で固相化した。表面を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで、２５℃１時間、ブロッキングした。ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）に１％ＢＳＡを添加した希釈液で、標準物質として、実施例１で得たα２，８ジシアリル糖鎖を持つＹＭＢ−１ムチン１溶液を１０〜６０００倍に希釈し、５０μＬ加え、２５℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、１０００倍希釈したＫＬ−６抗体５０μＬを加え、２５℃、１．５時間インキュベートした。各ウエルをＰＢＳ−Ｔで、４回洗浄し、１００μＬのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ピアス社）を加え、Ｐｌａｔｅ  ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ  Ｖ（ハイデックス社）で、化学発光を測定した。
得られた標準直線を図１に示す。なお、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の量は、前記ＹＭＢ−１ムチン１溶液を、ＫＬ−６の測定キット（エイテストＫＬ−６：エーザイ株式会社）により測定し、得られたユニット数を基準として算出した。【００６４】
《実施例３：癌細胞株からの抽出物の測定》
本実施例では、乳癌以外の癌細胞株におけるα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の発現を検討した。
乳癌由来の細胞株ＹＭＢ−１に加えて、乳癌由来細胞株ＭＣＦ−７、胃癌由来細胞株ＮＵＧＣ−４、及び肺癌由来細胞株ＡＢＣ−１を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返して、ＭＣＦ−７ムチン１溶液、ＮｕＧＣ−４ムチン１溶液、及びＡＢＣ−１ムチン１溶液を得た。そして、これらのムチン１溶液中のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を、実施例２に記載のサンドイッチ法によって、測定した。
結果を図２に示す。乳癌由来細胞株ＹＭＢ−１及び乳癌由来細胞株ＭＣＦ−７のムチン１溶液中には、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１が検出されたが、胃癌由来細胞株ＮＵＧＣ−４のムチン１溶液、及び肺癌由来細胞株ＡＢＣ−１のムチン１溶液中には、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は検出されなかった。【００６５】
《実施例４：乳癌患者血清の測定》
ＣＡ１５−３高値乳癌患者血清１０検体、健常人血清１０検体、及び間質性肺炎患者血清３０検体について、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１の測定を行った。
ＹＭＢ−１ムチン１溶液に代えて、乳癌患者血清１０検体、健常人血清１０検体、及び間質性肺炎患者血清３０検体を用いたことを除いては、実施例２の操作を繰り返した。実施例２において得られた標準直線から、それぞれの検体のユニット数を計算した。結果を図３に示す。健常人血清、及び間質性肺炎患者血清からは、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１は検出されなかった。一方、乳癌患者血清では、１０例すべての血清から、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１が検出された。【００６６】
《比較例１：ＫＬ−６及びＣＡ１５−３の測定》
本実施例では、実施例４において測定した乳癌患者血清１０検体、健常人血清１０検体、及び間質性肺炎患者血清３０検体について、従来の間質性肺炎のマーカーであるＫＬ−６の測定を行った。また、乳癌患者血清１０検体、及び健常人血清１０検体について、乳癌マーカーであるＣＡ１５−３の測定を行った。
ＫＬ−６の測定は、「エイテストＫＬ−６」（エーザイ株式会社）を用い、添付のプロトコールに従い、測定した。
ＣＡ１５−３の測定は、「Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＣＡ１５−３」（東ソー株式会社）を用い、添付のプロトコールに従い、測定した。
結果を図３に示す。乳癌患者血清１０例は、ＫＬ−６及びＣＡ１５−３共に約５０ユニット／ｍＬ〜６５０ユニット／ｍＬ程度に分布した。一方、間質性肺炎患者血清３０例のすべてにおいて、ＫＬ−６が検出された。【００６７】
乳癌患者１０例について、α２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１、ＣＡ１５−３、及びＫＬ−６の測定値を表１に示す。
【表１】
2011138955.tif 000003
【００６８】
《実施例５》
本実施例では、乳癌細胞のＭＵＣ１におけるα２，８ジシアリル糖鎖の解析を行った。乳癌細胞のＭＵＣ１の糖鎖を、β−エリミネーションで遊離し、ＮａＢ３Ｈ４で還元標識した。得られた糖鎖をｐＨ５．４の高圧濾紙電気泳動で分画した。分画した各フラクションをＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−４カラムクロマトグラフィー、各種レクチンカラムクロマトグラフィー、シアリダーゼを含むエキソグリコシダーゼ消化によって、それぞれのフラクションに含まれる糖鎖構造を決定した。【００６９】
その結果、α２，８ジシアリル糖鎖を含む糖鎖としては、「Ｎｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）」が約９モル％、そして「Ｎｅｕ５Ａｃα２→８Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ→Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）」が約１モル％含まれていた（図４）。【００７０】
《実施例６》
本実施例では、乳癌患者のムチン１にα２，８ジシアリル糖鎖を付加するα２，８シアル酸転移酵素を特定し、その転移酵素の乳癌組織における発現を確認した。【００７１】
まず、４例のヒト乳癌由来組織及び正常ヒト乳腺組織におけるα２，８シアル酸転移酵素Ｉ（ＳＴ８−Ｉ）、α２，８シアル酸転移酵素ＩＩ（ＳＴ８−ＩＩ）、α２，８シアル酸転移酵素ＩＩＩ（ＳＴ８−ＩＩＩ）、α２，８シアル酸転移酵素ＩＶ（ＳＴ８−ＩＶ）、α２，８シアル酸転移酵素Ｖ（ＳＴ８−Ｖ）、及びα２，８シアル酸転移酵素ＶＩのｍＲＮＡの発現を、リアルタイムポリメレース重合反応（以下、リアルタイムＰＣＲと称する）法によって調べた。ヒト乳癌由来組織及び正常ヒト乳腺組織から、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてトータルＲＮＡを調整し、クロロホルム・イソプロピルアルコール抽出を行った。抽出したＲＮＡは、エタノール沈殿の後、ジエチルカーボネート処理した蒸留水に溶解した。ＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（インビトロジェン社）を用い、オリゴ（ｄＴ）プライマーで逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。リアルタイムＰＣＲは、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ライフテクノロジー社）、及びそれぞれの糖転移酵素の遺伝子特異的なプライマーを用いて、Ｄｉｃｅ（登録商標）ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ＴＰ８００，タカラ）により行った。【００７２】
用いたそれぞれの糖転移酵素のプライマーは、以下のとおりである。
ＳＴ８−Ｉ：５’−ＴＴＣＡＡＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣＣＡＣＡ−３’（配列番号５）、及び５’−ＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＣＡＣＣＡＴＴ−３’（配列番号６）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．６４８９）；ＳＴ８−ＩＩ：５’−ＣＴＣＡＧＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＧ−３’（配列番号７）、及び５’−ＧＣＴＧＴＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＴ−３’（配列番号８）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．８１２８）；ＳＴ８−ＩＩＩ：５’−ＣＡＧＧＴＡＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＴＧＣ−３’（配列番号９）、及び５’−ＧＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＴＧＣＣＴＴＧＴ−３’（配列番号１０）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．５１０４６）；ＳＴ８−ＩＶ：５’−ＡＡＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＣＡＧＴ−３’（配列番号１１）、及び５’−ＴＣＴＧＡＴＴＴＡＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１２）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．７９０３）；ＳＴ８−Ｖ：５’−ＧＣＴＧＡＧＧＣＡＣＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号１３）、及び５’−ＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣ−３’（配列番号１４）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．２９９０６）；ＳＴ８−ＶＩ：５’−ＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＡ−３’（配列番号３）、及び５’−ＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴ−３’（配列番号４）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．３３８５９６）。
内部標準のプライマーとして、ＧＡＰＤＨ：５’−ＡＴＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣ−３’（配列番号１５）、及び５’−ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号１６）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＭ＿００２０４６）を用いてｍＲＮＡの発現の補正を行った。
リアルタイムＰＣＲのプログラムは、９５℃、１０秒、６０℃、４０秒を４０サイクル繰り返した。それぞれのプライマーセットにより単一のシャープなピークが得られ、特異的なＰＣＲ産物が増幅されており、プライマーダイマーも見られなかった。すべてのサンプルは、３重で試験された。【００７３】
その結果、ＳＴ８−ＩＩＩ及びＳＴ８−ＶＩが、正常ヒト乳腺組織と比較して、ヒト乳癌由来組織におけるｍＲＮＡの発現が高かった。【００７４】
次に、ＳＴ８−ＩＩＩ及びＳＴ８−ＶＩのｍＲＮＡについて、ＳＴ８−ＩＩＩのフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにＳＴ８−ＶＩのフォワードプライマー及びリバースプライマーを用い、ｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲを行った。ＰＣＲのプログラムは、９５℃、３０秒、５２．５℃、３０秒、７２℃、３０秒を５０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ産物を、電気泳動し、ＳＴ８−ＩＩＩ及びＳＴ８−ＶＩのｍＲＮＡの発現を確認した。コントロールとして、ＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲを行った。結果を図５に示す。
ＳＴ８−ＶＩのｍＲＮＡの発現は、正常ヒト乳腺組織と比較すると、ヒト乳癌由来組織において約１０倍程度増加していた。これらの結果は、ヒト乳癌患者のムチン１において、ＳＴ８−ＶＩがα２，８ジシアリル糖鎖の増加に関与していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のα２，８ジシアリル糖鎖を持つムチン１を分析する方法は、その方法を用いた乳癌の検出若しくはモニタリングに用いることができる。また、乳癌と間質性肺炎との鑑別を容易に行うことができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
2011138955.tif 000004
【図２】
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【図３】
2011138955.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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