(57)【要約】標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端のリン酸基にアリールもしくはヘテロアリール化合物が結合している２本鎖ポリヌクレオチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端のリン酸基に、下記の式Ｘで示される置換基が結合してリン酸ジエステル構造を形成している、２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩：
Ｘは、
（ａ）  式（Ｉ）
【化１】
2011052715.tif 000031
式中、Ａは、窒素原子またはＣ−Ｒ３を示し、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、
水素原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、
置換基を有していてもよい炭素数３から６の環状アルキル基、
ハロゲン原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基、
置換基を有していてもよいフェニル基、
置換基を有していてもよいフェニルオキシ基、
置換基を有していてもよい、窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群の複素原子から選らばれる１から３の複素原子を含有し、飽和でも不飽和でもよい、５員環もしくは６員環の複素環基、
フェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキル基、
フェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキルオキシ基、
炭素数１から６のアルキルスルホニル基、
水酸基、
炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基
炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換したヒドロキシアルキルカルボニルアミノ基、
炭素数１から８のアルキル基を有するＮ−アルキルカルバモイル基、
炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換したＮ−（ヒドロキシアルキル）カルバモイル基、
炭素数１から８のアルキル基を有し、１から４の炭素原子を含むアルキレン基で芳香環と結合する、Ｎ−アルキルカルバモイルアルキレン基、
炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換した、１から４の炭素原子を含むアルキレン基で芳香環と結合する、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）カルバモイルアルキレン基、
カルボキシ基、もしくは、
式：−（ＣＨ２）ｋ−ＣＯＮＲ４Ｒ５
式中、Ｒ４及びＲ５は、各々独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１から６のアルキル基、またはフェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、ｋは０から３の整数を示す、
で示される基、
であるか、または、
Ｒ１とＲ２とは一体化して、Ｒ１とＲ２とが結合している芳香環とで、置換基を有していてもよい、二環性または三環性の環状構造を形成してもよく、該環状構造は、飽和でも不飽和でもよく、さらに該環状構造には１または１以上の複素原子を環の構成原子として含んでいてもよく、オキソ基を有していてもよい。
で示される置換基を示し、
Ｒ３は、
ハロゲン原子、
炭素数１から６のアルキル基、
炭素数１から６のアルコキシ基、
ハロゲノメチル基、
水酸基、もしくは
水素原子を示す。
であるか、あるいは
（ｂ）  アミノ基上に置換基を有していてもよい、フェニル基上の水酸基が結合部位であるチロシン残基を示す。
【請求項２】
式（Ｉ）において、Ａが、Ｃ−Ｒ３である請求項１に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項３】
Ｒ３が、水素原子である、請求項２に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項４】
センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（γ−β）９−γ−λｍ−３’（ＩＩ）
５’−Ｘ−β−（γ−β）９−υｎ−３’（ＩＩＩ）
（ａ）γはＲＮＡ、βは２’−ＯＭｅＲＮＡ、λ及びυはＤＮＡを示す；
（ｂ）ｍ及びｎは同一又は異なって、０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（γ−β）９−γは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＩ）における（γ−β）９−γと式（ＩＩＩ）におけるβ―（γ−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる：
【請求項５】
センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＶ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（Ｖ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（α−β）９−αｐ−λｍ−３’（ＩＶ）
５’−Ｘ−δｓ−（α−β）９−υｎ−３’（Ｖ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｍはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｎは０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＶ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（α−β）９−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＶ）における（α−β）９と式（Ｖ）における（α−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【請求項６】
センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩：
５’−β−（α−β）８−αｐ−λｍ−３’（ＶＩ）
５’−Ｘ−δｓ−（α−β）８−（α―β）−υｎ−３’（ＶＩＩ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｍはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｎは０〜５のいずれかの整数を示す；
（ｃ）式（ＶＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β−（α−β）８−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＶＩ）における（α−β）８と式（ＶＩＩ）における（α−β）８は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる。
【請求項７】
αがＤＮＡ、βが２’−ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、請求項５又は６に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項８】
λｍ及びυｎが同一又は異なってチミン塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有するＤＮＡ、又は、ウラシル塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有する２’−ＯＭｅＲＮＡのいずれかであることを特徴とする、請求項４乃至７のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項９】
ｍが０、ｎが２であることを特徴とする、請求項４乃至８のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１０】
ｐ及びｍが０、ｓが１、ｎが２であることを特徴とする、請求項５乃至９のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１１】
ｐ及びｍが０、ｓが０又は１、ｎが２であり、υ２がＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、請求項５乃至９のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１２】
２’−ＯＭｅＲＮＡの任意の１〜４残基がＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、請求項４乃至１１のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１３】
ＤＮＡの任意の１〜４残基がＲＮＡ、ＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、請求項４乃至１２のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１４】
各ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合で結合していることを特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項１６】
請求項１乃至１５から選択される２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩を哺乳動物に投与することによる、標的遺伝子の発現抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する２本鎖ポリヌクレオチド、該２本鎖ポリヌクレオチドの使用、該２本鎖ポリヌクレオチドを用いた遺伝子発現抑制方法、該２本鎖ポリヌクレオチドを含有する医薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、組織、あるいは個体内の標的遺伝子の発現を阻害する方法として、当該細胞、組織、あるいは個体内に２本鎖ＲＮＡを導入する手法がある。２本鎖ＲＮＡの導入によって、その配列に相同性を持つｍＲＮＡが分解され、標的遺伝子の発現が阻害される。この効果は「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」と呼ばれている。ＲＮＡ干渉は最初に線虫で報告され（例えば、非特許文献１参照。）、その後に植物でも報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。【０００３】
３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれ２１ヌクレオチドからなる２本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）は、脊椎動物の培養細胞において、ＲＮＡ干渉作用を有することが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。ｓｉＲＮＡは遺伝子機能の同定、有用物質生産に適した細胞株のスクリーニング、疾患に関与する遺伝子の制御等に有用であるとされているが、ＲＮＡ分解酵素によって容易に分解されるという性質を有する（例えば、非特許文献４参照。）。【０００４】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖の５’末端の修飾に関しては、いくつの報告がある。センス鎖、または、アンチセンス鎖の５’末端に６−アミノヘキシルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性があると報告されている（例えば、非特許文献５参照。）。一方、アンチセンス鎖の５’末端に同じ６−アミノヘキシルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性がないと報告されている（例えば、非特許文献６参照。）。また、センス鎖の５’末端に３−アミノプロピルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡ発現抑制活性があるが、アンチセンス鎖の５’末端に３−アミノプロピルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性がないと報告されている（例えば、非特許文献７参照。）。アンチセンス鎖の５’末端に同様の６−アミノヘキシルリン酸基または３−アミノプロピルリン酸基を有するｓｉＲＮＡは、未修飾ｓｉＲＮＡと比較し、標的ｍＲＮＡ発現抑制活性の低下が見られるが完全に活性が失われるものでないと報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。【０００５】
センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端にフルオレセインを有するｓｉＲＮＡにおいても標的ｍＲＮＡ発現抑制活性を有すると報告されている（例えば、非特許文献９参照。）。センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端にステロイドまたは脂質の構造を有するｓｉＲＮＡにおいて、センス鎖の５’末端にステロイドまたは脂質の構造を有するｓｉＲＮＡでは、標的ｍＲＮＡの発現を抑制する活性を有すると報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。ＵＶ照射により脱離することができるオルトニトロベンジル誘導体をアンチセンス鎖の５’末端に有する場合、ＵＶ照射を用いて標的ｍＲＮＡ発現抑制する活性を制御できると報告している（例えば、非特許文献１０参照。）。【０００６】
本発明者らは、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有するポリヌクレオチドを取得すべく、鋭意研究を行ったところ、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する２本鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に芳香族置換基（本明細書では「Ａｒ」と略することがある。）が結合している２本鎖ポリヌクレオチドを見出し、本発明を完成させた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、第３９１巻、ｐ．８０６−８１１
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、第２８６巻、ｐ．９５０−９５２
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４−４９８
【非特許文献４】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年、第４８巻、ｐ．１６４７−１６５３
【非特許文献５】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、２００２年、第１０巻、ｐ．５３７−５４８
【非特許文献６】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、第３１巻、ｐ．２７０５−２７１６
【非特許文献７】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、２００２年、第１０巻、ｐ．５４９−５６１
【非特許文献８】Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００７年、第１７６巻、ｐ．３５−４３
【非特許文献９】Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００３年、第１３巻、ｐ．８３−１０５
【非特許文献１０】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、２００６年、第１７５８巻、ｐ．  ３９４−４０３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一つの課題は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する２本鎖ポリヌクレオチドを提供することである。【０００９】
本発明の一つの課題は、ＲＮＡ分解酵素に安定なＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する２本鎖ポリヌクレオチドを提供することである。【００１０】
本発明の他の一つの課題は上記２本鎖ポリヌクレオチドによって遺伝子発現を抑制する方法を提供することである。【００１１】
本発明の他の一つの課題は上記２本鎖ポリヌクレオチドを含有する医薬品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端のリン酸基に、下記の式Ｘで示される置換基が結合してリン酸ジエステル構造を形成している、２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩：
Ｘは、
（ａ）  式（Ｉ）【００１３】
【化１】
2011052715.tif 000002
【００１４】
式中、Ａは、窒素原子またはＣ−Ｒ３を示し、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、
水素原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、
置換基を有していてもよい炭素数３から６の環状アルキル基、
ハロゲン原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基、
置換基を有していてもよいフェニル基、
置換基を有していてもよいフェニルオキシ基、
置換基を有していてもよい、窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群の複素原子から選らばれる１から３の複素原子を含有し、飽和でも不飽和でもよい、５員環もしくは６員環の複素環基、
フェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキル基、
フェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキルオキシ基、
炭素数１から６のアルキルスルホニル基、
水酸基、
炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基
炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換したヒドロキシアルキルカルボニルアミノ基、
炭素数１から８のアルキル基を有するＮ−アルキルカルバモイル基、
炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換したＮ−（ヒドロキシアルキル）カルバモイル基、
炭素数１から８のアルキル基を有し、１から４の炭素原子を含むアルキレン基で芳香環と結合する、Ｎ−アルキルカルバモイルアルキレン基、
炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換した、１から４の炭素原子を含むアルキレン基で芳香環と結合する、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）カルバモイルアルキレン基、
カルボキシ基、もしくは、
式：−（ＣＨ２）ｋ−ＣＯＮＲ４Ｒ５
式中、Ｒ４及びＲ５は、各々独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１から６のアルキル基、またはフェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、ｋは０から３の整数を示す、
で示される基、
であるか、または、
Ｒ１とＲ２とは一体化して、Ｒ１とＲ２とが結合している芳香環とで、置換基を有していてもよい、二環性または三環性の環状構造を形成してもよく、該環状構造は、飽和でも不飽和でもよく、さらに該環状構造には１または１以上の複素原子を環の構成原子として含んでいてもよく、オキソ基を有していてもよい。
で示される置換基を示し、
Ｒ３は、
ハロゲン原子、
炭素数１から６のアルキル基、
炭素数１から６のアルコキシ基、
ハロゲノメチル基、
水酸基、もしくは
水素原子を示す。
であるか、あるいは
（ｂ）  アミノ基上に置換基を有していてもよい、フェニル基上の水酸基が結合部位であるチロシン残基を示す。
（２）式（Ｉ）において、Ａが、Ｃ−Ｒ３である（１）に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
（３）Ｒ３が、水素原子である、（２）に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
（４）センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）乃至（３）のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（γ−β）９−γ−λｍ−３’（ＩＩ）
５’−Ｘ−β−（γ−β）９−υｎ−３’（ＩＩＩ）
（ａ）γはＲＮＡ、βは２’−ＯＭｅＲＮＡ、λ及びυはＤＮＡを示す；
（ｂ）ｍ及びｎは同一又は異なって、０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（γ−β）９−γは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＩ）における（γ−β）９−γと式（ＩＩＩ）におけるβ―（γ−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる：
（５）センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＶ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（Ｖ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）乃至（３）のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（α−β）９−αｐ−λｍ−３’（ＩＶ）
５’−Ｘ−δｓ−（α−β）９−υｎ−３’（Ｖ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｍはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｎは０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＶ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（α−β）９−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＶ）における（α−β）９と式（Ｖ）における（α−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
（６）センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）乃至（３）のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩：
５’−β−（α−β）８−αｐ−λｍ−３’（ＶＩ）
５’−Ｘ−δｓ−（α−β）８−（α―β）−υｎ−３’（ＶＩＩ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｍはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｎは０〜５のいずれかの整数を示す；
（ｃ）式（ＶＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β−（α−β）８−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＶＩ）における（α−β）８と式（ＶＩＩ）における（α−β）８は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
（７）αがＤＮＡ、βが２’−ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、（５）又は（６）に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
（８）λｍ及びυｎが同一又は異なってチミン塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有するＤＮＡ、又は、ウラシル塩基、アデニン塩基又はグアニン塩基を有する２’−ＯＭｅＲＮＡのいずれかであることを特徴とする、（４）乃至（７）のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
（９）ｍが０、ｎが２であることを特徴とする、（４）乃至（８）のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
（１０）ｐ及びｍが０、ｓが１、ｎが２であることを特徴とする、（５）乃至（９）のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
（１１）ｐ及びｍが０、ｓが０又は１、ｎが２であり、υ２がＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡであることを特徴とする、（５）乃至（９）のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
（１２）２’−ＯＭｅＲＮＡの任意の１〜４残基がＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、（４）乃至（１１）のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
（１３）ＤＮＡの任意の１〜４残基がＲＮＡ、ＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されていることを特徴とする、（４）乃至（１２）のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
（１４）各ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合又はホスホロチオエート結合で結合していることを特徴とする、（１）乃至（１３）のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩、
（１５）（１）乃至（１４）のいずれか１項に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩を有効成分として含有する医薬、
（１６）（１）乃至（１５）から選択される２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩を哺乳動物に投与することによる、標的遺伝子の発現抑制方法、
からなる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する２本鎖ポリヌクレオチドが提供された。また、本発明により、ＲＮＡ分解酵素、ホスファターゼ、及びエキソヌクレアーゼから選択される少なくともいずれか一つに対して安定なＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する２本鎖ポリヌクレオチドが提供された。また本発明により、ＲＮＡ分解酵素、ホスファターゼ、及びエキソヌクレアーゼに対して安定なＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する２本鎖ポリヌクレオチドが提供された。該ポリヌクレオチドを用いて各種遺伝子の機能解析が可能になり、また、該２本鎖ポリヌクレオチドを含む医薬品が提供される。【００１６】
該ポリヌクレオチドを用いて各種遺伝子の機能解析が可能になり、また、該２本鎖ポリヌクレオチドを含む医薬品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。（以下、各図中、センス鎖、アンチセンス鎖の実施例のポリヌクレオチドの組み合わせを示す。シンボルのうち、白四角（□）はＲＮＡ、黒丸（●）はＤＮＡ、白丸（○）は２’−Ｏ−メチルＲＮＡを示す。白ダイヤモンド（◇）はＥＮＡを示す。図中のｐはリン酸基を示す。ｓは、リン酸基またはリン酸ジエステル結合がそれぞれチオリン酸基またはホスホロチオエート結合であることを示す。以下の図でも同じである。）
【図２】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。配列中のＸの構造も示す。以下の図においても同様である。
【図３】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。図中で「ＣＴ００１／ＣＴ００５」と表記されているのは「ＣＴ−００１／ＣＴ−００５」を意味し、このように２本鎖ポリヌクレオチドの表記において、「ハイフン：−」を省略することがある。アンチセンス鎖の５‘末端に結合している化合物の構造も示す。以下の図においても同様である。
【図４】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図５】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図６】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図７】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図８】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図９】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図１０】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図１１】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図１２】ＣＴ−２０３に対する脱リン酸化酵素（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の作用及び、ＣＴ−２０３の液体クロマトグラム（Ａ）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ処理後のクロマトグラム（Ｂ）、ＣＴ−３２８のクロマトグラム（Ｃ）を示す図。
【図１３】ＣＴ−２９２に対する脱リン酸化酵素（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の作用及び、ＣＴ−２９２の液体クロマトグラム（Ａ）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ処理後のクロマトグラム（Ｂ）、ＣＴ−３２８のクロマトグラム（Ｃ）を示す図。
【図１４】ＣＴ−２０３に対する５’−３’エキソヌクレアーゼ（５’−３’−ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）の作用を示す図。Ａは反応時間０分、Ｂは１５分、Ｃは３０分、Ｄは４５分後のサンプルの液体クロマトグラムを示す。
【図１５】ＣＴ−２９２に対する５’−３’エキソヌクレアーゼ（５’−３’−ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）の作用を示す図。Ａは反応時間０分、Ｂは１５分、Ｃは３０分、Ｄは４５分後のサンプルの液体クロマトグラムを示す。
【図１６】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図１７】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図１８】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図１９】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図２０】Ａ法の概要を示す図。
【図２１】Ｂ法の概要を示す図。
【図２２】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図２３】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図２４】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図２５】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図２６】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図２７】ＭＣＬ１遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図２８】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図２９】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図３０】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるＭｙｅｌｏｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １（ＭＣＬ１）遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＭＣＬ１はＭＣＬ１タンパク質の発現を示し、ＣＴＮＮＢ１はコントロールとして用いたＣＴＮＮＢ１タンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどＭＣＬ１遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図３１】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図３２】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図３３】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図３４】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図３５】各種２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性の強さをウエスタンブロット解析の結果で示す図。ＣＴＮＮＢ１はヒトβ−カテニンタンパク質の発現を示し、Ａｃｔｉｎはコントロールとして用いたβ−アクチンタンパク質の発現を示す。数字は添加した２本鎖ポリヌクレオチドの濃度を示す。バンドが薄いほどヒトβ−カテニン遺伝子の発現抑制活性が強いことを示す。
【図３６】参考例２２〜参考例３３、参考例３６、参考例４０〜参考例４２に記載の化合物の構造を示す図。
【図３７】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図３８】リアルタイムＰＣＲ解析による２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性を示す図。
【図３９】ヒトβ−カテニン遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを示す図。
【図４０】リアルタイムＰＣＲ解析による２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．用語の説明
本明細書において、「標的遺伝子」とは、これを導入する細胞、組織、あるいは固体（以下これを「被導入体」と称することがある。）においてｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を産生するように翻訳され得るものであれば特に制限されない。具体的には、導入する被導入体に内在性のものでも、遺伝子導入等の手法によって導入される外来性のものでもよい。また、染色体上に存在する遺伝子でも、染色体外のものでもよい。外来性の遺伝子としては、例えば、被導入体に感染可能なウイルス、バクテリア、真菌または原生動物由来のものが挙げられるがこれらに制限されない。遺伝子の機能については既知のものでも未知のものでもよい。
【００１９】
そのような標的遺伝子の例としては、特定の疾患を有する患者において特異的に発現が上昇している及び／又は特異的に変異している遺伝子を挙げることができ、疾患としては、中枢疾患（例えば、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、炎症性疾患（例えば、アレルギー、リュウマチ、変形性関節症、エリテマトーデスなど）、循環器疾患（例えば、高血圧症、心肥大、狭心症、動脈硬化症等）、癌（例えば、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌等）、呼吸器疾患（例えば、肺炎、気管支炎、喘息、肺繊維症など）、糖尿病、免疫系疾患（例えば、クローン病、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患、免疫不全、白血病等）、肝臓・胆のう疾患（例えば、肝硬変、肝炎、肝不全、胆汁うっ滞症、結石等）、消化管疾患（例えば、潰瘍、腸炎、吸収不良等）、感染症、肥満を挙げることができ、これらの疾患の原因遺伝子としては、例えば、ｋｉｎｅｓｉｎ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＫＳＰ）、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，  （ＶＥＧＦ）、ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  （ＴＴＲ）、ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｎ／ｋｅｘｉｎ  ｔｙｐｅ  ９（ＰＣＳＫ９）、ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＰＬＫ）、ＡｐｏＢ−１００、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｍ２  ｓｕｂｕｎｉｔ  （ＲＲＭ２）、ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２７（Ｈｓｐ２７）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−４Ｅ  （ｅＩＦ−４Ｅ）、ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １（ＩＣＡＭ−１）、ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＩＬ−４Ｒ−ａｌｐｈａ）、Ｆａｃｔｏｒ  ＸＩ、  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ、Ｎ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘＬ、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３、Ｈｅｒ−４、ＭＤＲ−１、ヒトβ−カテニン遺伝子、ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  （Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）  ｂｏｘ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ３，  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ）、Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １（ＭＣＬ１）遺伝子を挙げることが出来るがこれらに限定されない。
【００２０】
本明細書において、「天然型のヌクレオシド」とは、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシシチジン、２’−デオキシ−５−メチルシチジン、チミジン等の２’−デオキシヌクレオシド、アデノシン、グアノシン、シチジン、５−メチルシチジン、ウリジン等のリボヌクレオシドをいう。また、「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルを形成している化合物から構成されるオリゴヌクレオチドのことをいう。
【００２１】
本明細書においては２’−デオキシアデノシンをＡｔ、２’−デオキシグアノシンをＧｔ、２’−デオキシシチジンをＣｔ、２’−デオキシ−５−メチルシチジンを５ｍｅＣｔ、チミジンをＴｔ、２’−デオキシウリジンをＵｔ、アデノシンをＡｒｔ、グアノシンをＧｒｔ、シチジンをＣｒｔ、５−メチルシチジンを５ｍｅＣｒｔ、ウリジンをＵｒｔと表すこともある。また、本明細書中においては、２’−デオキシアデノシンヌクレオチドをＡｐ、２’−デオキシグアノシンヌクレオチドをＧｐ、２’−デオキシシチジンヌクレオチドをＣｐ、２’−デオキシ−５−メチルシチジンヌクレオチドを５ｍｅＣｐ、チミジンヌクレオチドをＴｐ、２’−デオキシウリジンヌクレオチドをＵｐ、アデノシンヌクレオチドをＡｒｐ、グアノシンヌクレオチドをＧｒｐ、シチジンヌクレオチドをＣｒｐ、５−メチルシチジンヌクレオチドを５ｍｅＣｒｐ、ウラシルヌクレオチドをＵｒｐと表すこともある。
【００２２】
本明細書においてはヌクレオチドのリン酸エステルの代わりにホスホロチオエートエステルとなっているホスホロチオエートエステルについて、Ａｐに対応するものとしてＡｓ、Ｇｐに対応するものとしてＧｓ、Ｃｐに対応するものとしてＣｓ、５ｍｅＣｐに対応するものとして５ｍｅＣｓ、Ｔｐに対応するものとしてＴｓ、Ｕｐに対応するものとしてＵｓ、Ａｒｐに対応するものとしてＡｒｓ、Ｇｒｐに対応するものとしてＧｒｓ、Ｃｒｐに対応するものとしてＣｒｓ、５ｍｅＣｒｐに対応するものとして５ｍｅＣｒｓ、Ｕｒｐに対応するものとしてＵｒｓと表すこともある。
【００２３】
本明細書における、「糖修飾ヌクレオシド」とは、ヌクレオシドの糖部分が修飾されているヌクレオシドをいう。
【００２４】
このうち、２’−Ｏ−メチル修飾の例としては、Ａｒｔに対応するものとしてＡｍ１ｔ、Ｇｒｔに対応するものとしてＧｍ１ｔ、Ｃｒｔに対応するものとしてＣｍ１ｔ、５ｍｅＣｒｔに対応するものとして５ｍｅＣｍ１ｔ、Ｕｒｔに対応するものとしてＵｍ１ｔ、Ａｒｐに対応するものとしてＡｍ１ｐ、Ｇｒｐに対応するものとしてＧｍ１ｐ、Ｃｒｐに対応するものとしてＣｍ１ｐ、５ｍｅＣｒｐに対応するものとして５ｍｅＣｍ１ｐ、Ｕｒｐに対応するものとしてＵｍ１ｐ、Ａｒｓに対応するものとしてＡｍ１ｓ、Ｇｒｓに対応するものとしてＧｍ１ｓ、Ｃｒｓに対応するものとしてＣｍ１ｓ、５ｍｅＣｓに対応するものとして５ｍｅＣｍ１ｓ、Ｕｒｓに対応するものとしてＵｍ１ｓと表すこともある。
【００２５】
本明細書において２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオチド  ユニット及び「ＥＮＡユニット」とは上記の各ヌクレオシド、各ヌクレオチドにおいてＥＮＡを有するものをいい、Ａｔに対応するものとしてＡ２ｔ、Ａｐに対応するものとしてＡｅ２ｐ、Ａｓに対してはＡｅ２ｓ、Ｇｔに対応するものとしてＧ２ｔ、Ｇｐに対応するものとしてＧｅ２ｐ、Ｇｓに対してはＧｅ２ｓ、５ｍｅＣｔに対応するものとしてＣ２ｔ、５ｍｅＣｐに対応するものとしてＣｅ２ｐ、５ｍｅＣｓに対してはＣｅ２ｓ、Ｔｔに対応するものとしてＴ２ｔ、Ｔｐに対応するものとしてＴｅ２ｐ、Ｔｓに対してはＴｅ２ｓというようにＥＮＡユニットを有するヌクレオシド及びヌクレオチドを表わすこともある。
【００２６】
本明細書において２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンヌクレオチド  ユニット及び「２’、４’−ＢＮＡ／ＬＮＡユニット」とは上記の各ヌクレオシド、各ヌクレオチドにおいて２’、４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを有するものをいい、Ａｔに対応するものとしてＡ１ｔ、Ａｐに対応するものとしてＡｅ１ｐ、Ａｓに対してはＡｅ１ｓ、Ｇｔに対応するものとしてＧ１ｔ、Ｇｐに対応するものとしてＧｅ１ｐ、Ｇｓに対してはＧｅ１ｓ、５ｍｅＣｔに対応するものとしてＣ１ｔ、５ｍｅＣｐに対応するものとしてＣｅ１ｐ、５ｍｅＣｓに対してはＣｅ１ｓ、Ｔｔに対応するものとしてＴ１ｔ、Ｔｐに対応するものとしてＴｅ１ｐ、Ｔｓに対してはＴｅ１ｓというように２’、４’−ＢＮＡ／ＬＮＡユニットを有するヌクレオシド及びヌクレオチドを表わすこともある。
【００２７】
以下に各ヌクレオチドの構造式を示す。
【００２８】
【化２】
2011052715.tif 000003
【００２９】
【化３】
2011052715.tif 000004
【００３０】
【化４】
2011052715.tif 000005
【００３１】
【化５】
2011052715.tif 000006
【００３２】
【化６】
2011052715.tif 000007
【００３３】
【化７】
2011052715.tif 000008
【００３４】
本明細書中における、アンチセンス鎖の５’末端がフェニルリン酸で修飾された２本鎖ポリヌクレオチドは、２本鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端のリン酸に下記の芳香族性の置換基Ｘがリン酸ジエステル結合を形成して結合しており、すなわち、Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−５’−オリゴヌクレオチドの構造を形成している。
【００３５】
ここでＸは、ヘテロアリールであってもよい芳香族性の基からなり、その環上の水酸基部分が結合部位となっており、具体的には以下の通りである。
（ａ）  式（Ｉ）
【００３６】
【化８】
2011052715.tif 000009
【００３７】
式中、Ａは、窒素原子またはＣ−Ｒ３を示し、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立に、
水素原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基、
置換基を有していてもよい炭素数３から６の環状アルキル基、
ハロゲン原子、
置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基、
置換基を有していてもよいフェニル基、
置換基を有していてもよいフェニルオキシ基、
置換基を有していてもよい、窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群の複素原子から選らばれる１から３の複素原子を含有し、飽和でも不飽和でもよい、５員環もしくは６員環の複素環基、
フェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキル基、
フェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキルオキシ基、
炭素数１から６のアルキルスルホニル基、
水酸基、
炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基
炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換したヒドロキシアルキルカルボニルアミノ基、
炭素数１から８のアルキル基を有するＮ−アルキルカルバモイル基、
炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換したＮ−（ヒドロキシアルキル）カルバモイル基、
炭素数１から８のアルキル基を有し、１から４の炭素原子を含むアルキレン基で芳香環と結合する、Ｎ−アルキルカルバモイルアルキレン基、
炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換した、１から４の炭素原子を含むアルキレン基で芳香環と結合する、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）カルバモイルアルキレン基、
カルボキシ基、もしくは、
式：−（ＣＨ２）ｋ−ＣＯＮＲ４Ｒ５
式中、Ｒ４及びＲ５は、各々独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１から６のアルキル基、またはフェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、ｋは０から３の整数を示す、
で示される基、
であるか、または、
Ｒ１とＲ２とは一体化して、Ｒ１とＲ２とが結合している芳香環とで、置換基を有していてもよい、二環性または三環性の環状構造を形成してもよく、該環状構造は、飽和でも不飽和でもよく、さらに該環状構造には１または１以上の複素原子を環の構成原子として含んでいてもよく、オキソ基を有していてもよい。
で示される置換基を示し、
Ｒ３は、
ハロゲン原子、
炭素数１から６のアルキル基、
炭素数１から６のアルコキシ基、
ハロゲノメチル基、
水酸基、もしくは
水素原子を示す。
であるか、あるいは
（ｂ）  アミノ基上に置換基を有していてもよい、フェニル基上の水酸基が結合部位であるチロシン残基を示す。
で示される置換基を示す。
【００３８】
Ｘは、上記のとおり、（ａ）または（ｂ）の態様を示す。Ｘが、（ａ）の態様であるとき、Ａ部分は、部分構造Ｃ−Ｒ３であるか、または窒素原子を示す。ＡがＣ−Ｒ３であるときは次式（Ｉａ）：
【００３９】
【化９】
2011052715.tif 000010
【００４０】
で示される構造のフェニル基含有置換基であり、Ａが窒素原子であるときは次式（Ｉｂ）：
【００４１】
【化１０】
2011052715.tif 000011
【００４２】
で示されるピリジニル基含有置換基である。
【００４３】
式（Ｉ）における置換基Ｒ１及びＲ２について説明する。
【００４４】
Ｒ１及びＲ２が、置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基であるとき、アルキル基としては、直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等を挙げることができる。アルキル基が置換基を有するとき、置換基としては、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルコキシ基、カルボキシ基、炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基からなる群の基から選ばれる基１または１以上の基を置換基として有していてもよい。置換基が１以上の場合は、同一であっても異なっていてもいずれでもよい。水酸基またはアミノ基がアルキル基の置換基のとき、これらはアルキル基の末端の炭素原子上に置換したものがより好ましい。水酸基を有するアルキル基としてヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基が好ましい。ハロゲン原子をアルキル基の置換基として有する場合、アルキル基は、炭素数１から６の直鎖状または分枝状のいずれでもよいが、より好ましくはメチル基またはエチル基上にハロゲン原子を有するものであり、特にメチル基が好ましい。ハロゲン原子がアルキル基の置換基であるとき、ハロゲン原子としてはフッ素原子が好ましい。フッ素原子の数は、モノ置換からパーフルオロ置換までのいずれでもよい。モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、及び２，２，２−トリフルオロエチル基を例示することができる。モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、及びトリフルオロメチル基が好ましい。炭素数１から６のアルキルチオ基及び炭素数１から６のアルコキシ基としては、直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基等を挙げることができる。カルボキシ基または炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基がアルキル基の置換基のとき、これらはアルキル基の末端の炭素原子上に置換したものがより好ましい。炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基のアルキル基は、直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基等を挙げることができる。
【００４５】
Ｒ１及びＲ２が、置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルコキシ基であるとき、このアルコキシ基は上記に示したアルキル基と酸素原子とから構成されたアルコキシ基であればよい。
【００４６】
Ｒ１及びＲ２が、置換基を有していてもよい炭素数３から６のシクロアルキル基のとき、シクロアルキル基としてはシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基のいずれかである。これらが置換基を有するとき、置換基としては上記のアルキル基またはアルコキシ基と同様の置換基を有していればよい。
【００４７】
Ｒ１及びＲ２が、ハロゲン原子であるときは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子である。
【００４８】
Ｒ１及びＲ２が、置換基を有していてもよい炭素数１から８のアルキル基を含むアルキルカルボニル基（脂肪族アシル基）であるとき、このアルキル部分は上記で示した炭素数１から８のアルキル基であればよく、アルキルカルボニル基はこのようなアルキル基とカルボニル基とから構成されるものであればよい。
【００４９】
Ｒ１及びＲ２が、置換基を有していてもよいフェニル基であるとき、置換基としては水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルコキシ基、カルボキシ基、炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基からなる群の基から選ばれる基１または１以上の基を置換基として有していてもよい。置換基が１以上の場合は、同一であっても異なっていてもいずれでもよい。置換基の数は、１から３までであればよい。
【００５０】
Ｒ１及びＲ２が、置換基を有していてもよいフェニルオキシ基であるとき、このフェニルオキシ基は上記のフェニル基と酸素原子とから構成されたフェニルオキシ基であればよい。
【００５１】
Ｒ１及びＲ２が、置換基を有していてもよい複素環基であるとき、これらは５員環または６員環であればよい。複素原子としては窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群の複素原子から選らばれる１から３の複素原子であればよい。これらのうちでは、窒素原子である場合が好ましく、さらに窒素原子１個または２個含むものが好ましい。この他に、酸素原子あるいは硫黄原子を含む複素環置換基でもよい。これらの複素環基は飽和でも不飽和のいずれでもよい。
【００５２】
Ｒ１及びＲ２が、フェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキル基であるとき、フェニル基部分は上記に示したフェニル基であればよい。このフェニル基に結合するアルキレン基はメチレン基または炭素数２から４のポリメチレン基であればよく、さらにこれらの上には炭素数１から６のアルキル基が置換していてもよい。この様なアラルキル基としてはベンジル基、α−メチルベンジル基を挙げることができる。フェニル基部分の置換基としては水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルコキシ基、カルボキシ基、炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基からなる群の基から選ばれる基１または１以上の基を置換基として有していてもよい。置換基が１以上の場合は、同一であっても異なっていてもいずれでもよい。置換基の数は、１から３までであればよい。
【００５３】
Ｒ１及びＲ２が、フェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキルオキシ基であるとき、このアラルキルオキシ基は上記のアラルキル基と酸素原子から構成されたアラルキルオキシ基であればよい。
【００５４】
Ｒ１及びＲ２が、炭素数１から６のアルキルスルホニル基［Ａｌｋｙｌ−ＳＯ２−］であるとき、炭素数１から６のアルキル基は直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を挙げることができる。また、直鎖状だけでなく環状のアルキル基であってもよい。なお、先に述べた炭素数１から８のアルキル基が炭素数１から６になった他は、これと同じでよい。
【００５５】
Ｒ１及びＲ２が、炭素数１から９のアルキル基を有するアルキルカルボニルアミノ基［Ａｌｋｙｌ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−］であるとき、アルキル基部分は先に述べた炭素数８までのアルキル基を含む炭素数９までのアルキル基でよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基を挙げることができる。
【００５６】
Ｒ１及びＲ２が、炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換した、ヒドロキシアルキルカルボニルアミノ基［ＨＯ−Ａｌｋｙｌ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−］であるとき、アルキル基部分は直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよい。先に述べた炭素数８までのアルキル基を含んだ炭素数９までのアルキル基であればよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等を挙げることができる。水酸基はこのアルキル基の末端の炭素原子上に置換する。
【００５７】
Ｒ１及びＲ２が、炭素数１から８のアルキル基を有するＮ−アルキルカルバモイル基［Ａｌｋｙｌ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−］であるとき、この基は、カルバモイル基の窒素原子上にアルキル基が置換した構造である。このアルキル基部分は既に述べた、直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等を挙げることができる。
【００５８】
Ｒ１及びＲ２が、炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換した、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）カルバモイル基［ＨＯ−Ａｌｋｙｌ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−］であるとき、この基は、カルバモイル基の窒素原子上にヒドロキシアルキル基が置換した構造である。このヒドロキシアルキル基部分は既に述べた、アルキル基の末端の炭素原子に水素原子が置換したヒドロキシアルキル基であればよい。
【００５９】
Ｒ１及びＲ２が、炭素数１から８のアルキル基を有し、１から４の炭素原子を含むアルキレン基で芳香環と結合する、Ｎ−アルキルカルバモイルアルキレン基［Ａｌｋｙｌ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｉ−；ｉは、１から４の整数である］であるとき、この基は、Ｎ−アルキルカルバモイル基が、アルキレン基を介して芳香環と結合した構造である。Ｎ−アルキルカルバモイル基は上記と同じでよい。結合部分のアルキレン基は、炭素数１から４であればよく、炭素数２のものがよい。
【００６０】
Ｒ１及びＲ２が、炭素数１から９のアルキル基を有し、該アルキル基の末端の炭素原子に水酸基が置換した、１から４の炭素原子を含むアルキレン基で芳香環と結合する、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）カルバモイルアルキレン基［ＨＯ−Ａｌｋｙｌ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｊ−；ｊは、１から４の整数である］であるとき、この基は、Ｎ−ヒドロキシアルキルカルバモイル基が、アルキレン基を介して芳香環と結合した構造を有している。Ｎ−ヒドロキシアルキルカルバモイル基、及び結合部分のアルキレン基は、いずれも先に述べたものでよい。
【００６１】
Ｒ１及びＲ２が、式：−（ＣＨ２）ｋ−ＣＯＮＲ４Ｒ５で示される基であるとき、Ｒ４及びＲ５は、各々独立に、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１から６のアルキル基、またはフェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキル基を示すが、置換基を有していてもよい炭素数１から６のアルキル基、またはフェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキル基の場合は、Ｒ１またはＲ２において定義されたものと同一でよい。Ｒ４及びＲ５としては水素原子、及び／またはフェニル基部分に置換基を有していてもよいアラルキル基が好ましい。また、ｋは０から３の整数であればよいが、ｋが０のとき、Ｒ４及びＲ５は水素原子の組み合わせが好ましく、ｋが１以上のとき、特にｋが２であるとき、Ｒ４及びＲ５は水素原子及びベンジル基である組み合わせが好ましい。
【００６２】
一方、Ｒ１とＲ２とは一体化して、置換基を有していてもよい、二環性または三環性の環状構造を形成してもよい。このようにして形成される環状構造は、飽和でも不飽和でもよい。さらに、この環状構造には１または１以上の複素原子を環の構成原子として含んでいてもよい。
【００６３】
Ｒ１とＲ２とが一体化して二環性の環状構造となるとき、Ｒ１とＲ２とは例えば炭素数３から４のポリメチレン鎖であることができる。すなわち、飽和の脂環式化合物がベンゼン環に縮合した構造を採ることができる。また、二環性の構造として芳香族のナフタレン基であることもできる。したがって、二環性の構造としては、６−５、または６−６の縮合環形式となることができる。この二環性の環状構造の置換基としては、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルコキシ基、カルボキシ基、炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基、オキソ基からなる群の基から選ばれる基１または１以上の基を置換基として有していてもよい。置換基が１以上の場合は、同一であっても異なっていてもいずれでもよい。置換基の数は、１から３までであればよい。複素原子としては、窒素原子、酸素原子または硫黄原子から選ばれる１または１以上の複素原子であればよく、その数は１から４までである。
【００６４】
Ｒ１とＲ２とが一体化して三環性の環状構造となるときは、二環性のときと同様にして環状構造を形成すればよく、例えば、６−５−６、６−６−５、６−６−６などの縮合環構造を形成すればよい。
【００６５】
これらの二環性または三環性の環状構造の置換基としては、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルコキシ基、カルボキシ基、炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基、オキソ基からなる群の基から選ばれる基１または１以上の基を置換基として有していてもよい。置換基が１以上の場合は、同一であっても異なっていてもいずれでもよい。置換基の数は、１から３までであればよい。複素原子としては、窒素原子、酸素原子または硫黄原子から選ばれる１または１以上の複素原子であればよく、その数は１から４までである。例えばアントラセニル基、フルオレニル基、ジベンゾフラニル基を挙げることができる。
【００６６】
式（Ｉ）における置換基Ｒ３について説明する。
【００６７】
Ｒ３が、ハロゲン原子であるとき、ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子等を挙げることができる。
【００６８】
Ｒ３が、炭素数１から６のアルキル基であるとき、アルキル基としては直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を挙げることができる。
【００６９】
Ｒ３が、炭素数１から６のアルコキシル基であるときは、アルコキシカルボニル基のアルキル基は、直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基等を挙げることができる。
【００７０】
Ｒ３が、ハロゲノメチル基であるときのハロゲンとしては、フッ素等を挙げることができる。これの置換基はＲ１とＲ２で例示されたものであればよい。
【００７１】
Ｒ３が、水素原子以外の基であるときは、Ｒ１及びＲ２は、水素原子、ハロゲン原子、メチル基、及び水酸基から選ばれる基であることが好ましい。さらに好ましくは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３がいずれもハロゲン原子の場合である。
【００７２】
Ｒ３が、水素原子であるときは、Ｒ１及びＲ２は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、ハロゲノアルコキシ基、アシル基、フェニル基から選ばれる基であることが好ましい。ハロゲノアルコキシ基としては、トリフルオロメトキシ基でよく，アシル基としてはアセチル基でよい。
【００７３】
Ｘは、上記（ｂ）の態様であるところの、フェニル基上の水酸基が結合部位であるチロシン残基であってもよい。このチロシン残基はアミノ基上に置換基を有していてもよい。アミノ基に置換基を有していないときのＸとしてのチロシン残基を次に示す。
【００７４】
【化１１】
2011052715.tif 000012
【００７５】
2011052715.tif 000013
【００７６】
チロシン残基は光学活性であっても、光学活性でなくとも、いずれでもよい。
【００７７】
アミノ基上の置換基としては、炭素数１から６のアルキル基、アリールカルボニル基、ヘテロアリールカルボニル基、またはアラルキルオキシカルボニル基を挙げることができる。
【００７８】
アミノ基上の置換基が炭素数１から６のアルキル基のときこのアルキル基は、直鎖状または分枝鎖状のいずれであってもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第二級ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等を挙げることができる。
【００７９】
アミノ基上の置換基がアリールカルボニル基であるとき、アリール基はフェニル基であればよく、このフェニル基は置換基を有していてもよい。置換基としては水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルコキシ基、カルボキシ基、炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基からなる群の基から選ばれる基１または１以上の基を置換基として有していてもよい。置換基が１以上の場合は、同一であっても異なっていてもいずれでもよい。置換基の数は、１から３までであればよい。
【００８０】
アミノ基上の置換基がヘテロアリールカルボニル基であるとき、ヘテロアリール基としては５員環または６員環で、複素原子としては、窒素原子、酸素原子または硫黄原子から選ばれる１または１以上の複素原子であればよく、その数は１から２までである。例えばピリジル基、フリル基、チエニル基を挙げることができる。
【００８１】
アミノ基上の置換基がアラルキルオキシカルボニル基であるとき、このアラルキルオキシカルボニル基は、置換基を有するフェニル基部分とメチレン基または炭素数２から４のポリメチレン基であるアルキレン基から構成されるアラルキル基と酸素原子で構成されたアラルキルオキシ基が結合したカルボニル基であればよい。アラルキル基としてはベンジル基、α−メチルベンジル基を挙げることができる。フェニル基部分の置換基としては水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルコキシ基、カルボキシ基、炭素数１から６のアルコキシ基を含有するアルコキシカルボニル基からなる群の基から選ばれる基１または１以上の基を置換基として有していてもよい。置換基が１以上の場合は、同一であっても異なっていてもいずれでもよい。置換基の数は、１から３までであればよい。
【００８２】
本明細書中においては、上記Ｘで示される置換基がアンチセンス鎖の５’末端に付加している、アンチセンス鎖を有する２本鎖ポリヌクレオチドを「５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチド」ともいう。
【００８３】
Ｘに示される置換基の具体例としては、以下の化学式で示される化合物を挙げることができる
【００８４】
【化１２】
2011052715.tif 000014
【００８５】
【化１３】
2011052715.tif 000015
【００８６】
【化１４】
2011052715.tif 000016
【００８７】
【化１５】
2011052715.tif 000017
【００８８】
【化１６】
2011052715.tif 000018
【００８９】
【化１７】
2011052715.tif 000019
【００９０】
本明細書中における、「相補的なヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの塩基部分が相補するヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分がアデニンとチミン、グアニンとシトシン、グアニンと５−メチルシトシン及びアデニンとウラシルであるヌクレオチドは互いに相補的なヌクレオチドである。
【００９１】
本明細書中における、「相補的なヌクレオチド配列」とは、対象となるヌクレオチド配列に対して、全てが相補的なヌクレオチドからなるヌクレオチド配列に加え、１又は数個のヌクレオチドが相補的なヌクレオチドではないが、オリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド同士が塩基対を形成するヌクレオチド配列も含む。
【００９２】
本明細書中における５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドは相補的なヌクレオチド同士がワトソン−クリック塩基対を形成し、２本鎖となっているポリヌクレオチドであるが、全てのポリヌクレオチドがワトソン−クリック塩基対を形成していなくてもよい。
【００９３】
本明細書中における５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドの鎖長とは、センス鎖又はアンチセンス鎖を構成するポリヌクレオチドのヌクレオチド数を示す。
【００９４】
本明細書中では、５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドを構成するポリヌクレオチドのうち、標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列を含むものをパッセンジャー鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）又はセンス鎖と呼び、標的遺伝子と相補的なヌクレオチド配列を含むものをガイド鎖（ｇｕｉｄｅ  ｓｔｒａｎｄ）又はアンチセンス鎖と呼ぶ。
【００９５】
本明細書中において、「標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる」とは、標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と同一の配列からなることをいうが、完全に同一の配列に加え、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて、実質的に同一な配列も含む。また、標的遺伝子にＳＮＰｓ等が知られている場合、それらの変異を有する配列も同一のヌクレオチド配列に含まれる。本明細書中において、標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列を含み標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する２本鎖ポリヌクレオチドを標的遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドという。
【００９６】
標的遺伝子に対する５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限りにおいて特に制限されないが、例えば、コンピュータソフトウエア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）：ＧＥＮＥＴＹＸ  ＣＯＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等。）を用いて標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用を有すると予想された配列に基づいて決定することもできるし、更に選択された配列に基づいて作製した５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を確認することによって決定することもできる。
【００９７】
本明細書中において遺伝子発現抑制作用とは、遺伝子の発現を完全に抑制する作用の他に、コントロールに比して遺伝子の発現を減少させる作用も含まれる。また、本明細書においては、遺伝子発現抑制作用と遺伝子発現抑制活性を同じ意味に用いている。
【００９８】
ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用は、当業者が通常行う方法で確認することができるが、例えば、標的遺伝子が発現している細胞に標的遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチドを投与して一定時間経過後の標的遺伝子の翻訳産物であるタンパク質をウエスタンブロット解析によって定量しタンパク質の発現量をコントロールと比較することによって確認することが出来る。また、リアルタイムＰＣＲの手法により標的遺伝子に対する２本鎖ポリヌクレオチド投与後の標的遺伝子の発現量をリアルタイムで測定することによっても確認することができる。
【００９９】
標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と同一又は実質的に同一な配列を有するポリヌクレオチドとは、標的遺伝子のヌクレオチド配列のうち、いずれの部分でもよい１８ヌクレオチド以上の配列と同一又は実質的に同一な配列からなるポリヌクレオチドである。ここで、「実質的に同一な配列」とは、標的遺伝子のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する配列のことをいう。ヌクレオチド配列の相同性はＢＬＡＳＴ（登録商標）等の公知の遺伝子解析ソフトウエアを用いて計算することが出来る。
【０１００】
本明細書に添付する配列表において、各配列の＜２２３＞の項目中で“ｃｍ”は２’−Ｏ−メチルシチジン（２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）を示し、“ｕｍ”は２’−Ｏ−メチルウリジン（２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ）を示し、“ｇｍ”は２’−Ｏ−メチルグアノシン（２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ）を示す。
【０１０１】
２．５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチド
本発明における５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドの鎖長は、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する限り、１８ヌクレオチドから、標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までのいかなる長さでもよい。センス鎖としては、１８〜２１の鎖長のものが好ましく、１８〜１９の鎖長のものが更に好ましい。アンチセンス鎖としては、１９〜２１の鎖長のものが好ましく、２１鎖長のものが更に好ましい。５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドはその全体が２本鎖である必要はなく５’及び／又は３’末端が一部突出したものも含み、その突出末端は１〜５ヌクレオチド、好ましくは１〜３ヌクレオチド、さらに好ましくは２ヌクレオチドである。また、最も好ましい例としては、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドの３’末端が２ヌクレオチド突出している（オーバーハング構造）構造を有するものが挙げられる。
【０１０２】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドは、下記の（ａ）〜（ｈ）から選択される少なくともいずれか一つの性質を有する。
（ａ）標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｂ）ＲＮＡ分解酵素に安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｃ）ホスファターゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｄ）エキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｅ）ＲＮＡ分解酵素、ホスファターゼ及びエキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｆ）アンチセンス鎖がホスファターゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｇ）アンチセンス鎖がエキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する；
（ｈ）アンチセンス鎖が５’−３’エキソヌクレアーゼに対して安定で、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する。
【０１０３】
２−１．
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドの一例としては、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖ポリヌクレオチド、及び該センス鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドを有する２本鎖ポリヌクレオチドであって、該アンチセンス鎖ポリヌクレオチドの５’末端のリン酸基に本明細書中の式（Ｉ）に示される置換基Ｘが付加した２本鎖ポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１０４】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドの他の一例としては、１９乃至２３塩基長のからなり、単離された二本鎖ＲＮＡ分子であって、各ＲＮＡ鎖が１９〜２３塩基長を有し、少なくとも１つの鎖が１〜３塩基からなる３’突出部を有するものであり、該ＲＮＡ分子は標的特異的なＲＮＡ干渉が可能なものであり、３’突出部を除く該ＲＮＡ分子の１つの鎖が、予め決定したｍＲＮＡ標的分子に対して１００％の同一性を有する配列からなり、かつ、該ｍＲＮＡ標的分子が細胞または生物中に存在するものである、上記ＲＮＡ分子であり、アンチセンス鎖側の５’末端のリン酸基に本明細書中の式（Ｉ）に示される置換基Ｘが付加した２本鎖ポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１０５】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（γ−β）９−γ−λｍ−３’（ＩＩ）
５’−Ｘ−β−（γ−β）９−υｎ−３’（ＩＩＩ）
（ａ）γはＲＮＡ、βは２’−ＯＭｅＲＮＡ、λ及びυはＤＮＡを示す；
（ｂ）ｍ及びｎは同一又は異なって、０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＩＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（γ−β）９−γは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＩ）における（γ−β）９−γと式（ＩＩＩ）におけるβ―（γ−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる：
を挙げることができる。
【０１０６】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＩＶ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（Ｖ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩：
５’−（α−β）９−αｐ−λｍ−３’（ＩＶ）
５’−Ｘ−δｓ−（α−β）９−υｎ−３’（Ｖ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｍはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｎは０〜５のいずれかの整数を示す。；
（ｃ）式（ＩＶ）で示されるポリヌクレオチドのうち、（α−β）９−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＩＶ）における（α−β）９と式（Ｖ）における（α−β）９は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
を挙げることができる。
【０１０７】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドの他の一例としては、センス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドが以下の式（ＶＩＩ）に示すポリヌクレオチドからなり、更に、以下の（ａ）乃至（ｄ）に示される特徴を有する、（１）に記載の２本鎖ポリヌクレオチド又はその塩：
５’β−（α−β）８−αｐ−λｍ−３’（ＶＩ）
５’−Ｘ−δｓ−（α−β）８−（α―β）−υｎ−３’（ＶＩＩ）
（ａ）α及びβは異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、δ及びλは同一又は異なってＤＮＡ又は２’−ＯＭｅＲＮＡ、υは同一又は異なってはＤＮＡ、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡから選択されるいずれかのヌクレオチドを示す；
（ｂ）ｐは０又は１の整数を示し、ｍはｐが０のときは０であり、ｐが１のときは０〜５のいずれかの整数を示す。ｓは０又は１の整数を示し、ｎは０〜５のいずれかの整数を示す；
（ｃ）式（ＶＩ）で示されるポリヌクレオチドのうち、β−（α−β）８−αｐは標的遺伝子と同一のヌクレオチド配列からなる；
（ｄ）式（ＶＩ）における（α−β）８と式（ＶＩＩ）における（α−β）８は互いに相補的なヌクレオチド配列からなる、
を挙げることができる。
【０１０８】
糖修飾ヌクレオチドには、本発明の属する技術分野で知られている糖修飾の全ての様式を含む。糖修飾ヌクレオチドは、あらゆる複素環塩基部位及びインターヌクレオシド結合を保持することができ、さらに前記糖修飾とは独立したグループを含む。糖修飾ヌクレオチドのグループは、２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド及び二環式糖修飾ヌクレオシドを含む。
【０１０９】
２’−修飾ヌクレオチドの例としては、ハロ、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）であり、各ＲｍとＲｎが個別にＨ、アミノ保護基、または置換あるいは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。好ましい２’−修飾は−Ｆ、−ＯＣＨ３、又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３である。さらに好ましくは−ＯＣＨ３である。
【０１１０】
４’−チオ修飾ヌクレオシドの例としては、４’−酸素原子が硫黄原子で置換されたβ−Ｄ−リボヌクレオシドを挙げることができる（Ｈｏｓｈｉｋａ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９，ｐ．３１１５−３１１８，（２００５）；  Ｄａｎｄｅ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９，  ｐ．１６２４−１６３４（２００６）；Ｈｏｓｈｉｋａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．  ８，  ｐ．２１３３−２１３８，（２００７））。
【０１１１】
４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドの例としては、２’−Ｈ、または、２’−Ｏ−メチルを保持する４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドを挙げることができ（Ｍａｔｓｕｇａｍｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６，  １８０５  （２００８））。
【０１１２】
二環式糖修飾ヌクレオシドの例としては、リボース環の２原子を架橋することによって形成された第二の環を保持するヌクレオシドを挙げることができ、そのようなヌクレオシドの例としては、２’−酸素原子と４’−炭素原子をメチレン鎖で架橋した２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ／ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）（Ｏｂｉｋａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３８，  ｐ．８７３５−  （１９９７）．；  Ｏｂｉｋａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３９，  ｐ．５４０１−  （１９９８）．；  Ａ．  Ａ．  Ｋｏｓｈｋｉｎ，  Ａ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５４，  ｐ．３６０７（１９９８）．；  Ｏｂｉｋａ，  Ｓ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ９，ｐ．１００１（２００１）．）、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡのメチレン鎖を一炭素延ばしたエチレン鎖で架橋したＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）を挙げることができる（Ｍｏｒｉｔａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １２，  ｐ．７３（２００２）．；  Ｍｏｒｉｔａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １１，ｐ．２２１１（２００３）．）。
【０１１３】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチド中の２’−ＯＭｅＲＮＡの任意の１〜４残基が糖修飾ヌクレオチドで置換されている場合に、より好ましい糖修飾ヌクレオチドは上記の糖修飾ヌクレオチドのうち、同一又は異なってＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡである。
【０１１４】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチド中のＤＮＡの１〜４残基が同一又は異なって、ＲＮＡ、ＥＮＡ又は２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに置換されている２本鎖ポリヌクレオチドも含まれる。
【０１１５】
２−２  ５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドセンス鎖の合成方法
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドを構成するセンス鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては所望のポリヌクレオチドが合成できる限り特に制限はないが、既知の化学合成法（リン酸トリエステル法、ホスホロアミダイト法、又は、Ｈ−ホスホネート法等）を用いることができる。例えば、市販の核酸合成機を用いて、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成に使われる試薬を用いて合成することが出来る。
【０１１６】
２−３  ５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチド５’フェニルリン酸修飾アンチセンス鎖の合成方法
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドを構成する５’フェニルリン酸修飾アンチセンス鎖ポリヌクレオチドは５’フェニルリン酸修飾アンチセンス鎖を合成できる限り特に制限されないが、例えば、以下に示すＡ法（図２０）又はＢ法（図２１）により合成することができる。
【０１１７】
２−３−１  Ａ法
２−３−１−１  Ａ−１工程
本工程は、所望のヌクレオシドが結合した市販のＣＰＧ（１）（コントロールド  ポアグラス、Ａ法中、Ｙ−ＣＰＧと表す。）を用いて、所望のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド類縁体である化合物２を製造する工程である（Ａ法中、ＨＯ−Ｗ−Ｙ−ＣＰＧ）と表す。）。
【０１１８】
化合物２を製造するのに必要なホスホロアミダイト試薬等を使用して、ＤＮＡ自動合成機を用いた通常のホスホロアミダイト法により、化合物（２）を製造する。所望のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチド類縁体は、ＤＮＡ合成機、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２，  ４５３９（１９８４））記載の方法に準じて合成することが出来る。
【０１１９】
また所望により、オリゴヌクレオチド類縁体をチオエート化する場合は、硫黄のほかテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステムズ社）、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬、フェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液（Ｒａｖｉｋｕｍａｒ，  Ｖ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００６）  １６，ｐ．２５１３−２５１７）等の試薬を用い、文献（Ｔｅｔａｒｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３２，  ３００５（１９９１）、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１２，  １２５３（１９９０））記載の方法に準じてチオエート誘導体を得る事ができる。
【０１２０】
２−３−２  Ａ−２工程
本工程は、不活性溶剤中、上記Ａ−１工程で製造される化合物（２）に、トリス−（１，２，４−トリアゾリル）ホスファイト、或いは、２−Ｃｈｌｏｒｏ−４Ｈ−１，３，２−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｎ−４−ｏｎｅを反応した後、水を加えて、Ｈ−ホスホネート化して、化合物（３）を製造する工程である。
【０１２１】
使用される溶剤としては、反応に影響を与えないものであれば、特に限定はないが、好適には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサンのようなエーテル類；メチレンクロリド、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類を挙げることができる。
【０１２２】
２−Ｃｈｌｏｒｏ−４Ｈ−１，３，２−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｎ−４−ｏｎｅを用いる場合には、脱酸剤が使用され、その場合に、使用される脱酸剤としては、ピリジン、ジメチルアミノピリジンのような複素環アミン類、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミンのような脂肪族アミン類があげられるが、好適には、脂肪族アミン類（特にトリエチルアミン）である。
【０１２３】
反応温度は、特に限定はないが、通常−２０乃至１００℃であり、好適には、１０乃至４０℃である。
【０１２４】
反応時間は、使用する原料、試薬、温度等により異なるが、通常、５分から３０時間であり、好適には、室温で反応した場合、３０分である。
【０１２５】
反応終了後、濾過により反応液とＣＰＧを分離することができる。ピリジン、アセトニトリル等の有機溶媒で洗浄後、トリエチルアミン炭酸塩／水溶液を加え、再度アセトニトリルで洗浄し、乾燥することによって化合物（３）が得られる。
【０１２６】
２−３−３  Ａ−３工程
本工程は上記Ａ−２工程で製造される化合物（３）と水酸基を有する化合物（Ａ法中、Ｘ−Ｈと表す。）を、例えばピバロイルクロリドのような縮合剤と脱酸剤の存在下に縮合させてＨ−ホスホン酸ジエステル結合を形成させ、化合物（４）を製造する工程である。
【０１２７】
本工程に用いられる溶媒としては反応を阻害しないものであれば特に限定はないが、好適には無水アセトニトリル、無水ピリジン、またはそれらの混液が使用される。
【０１２８】
縮合剤として使用される試薬としては、カルボン酸やリン酸の酸塩化物を挙げることができるが好適にはピバロイルクロリド又はアダマンタン酸クロリドが使用される。
【０１２９】
使用される脱酸剤としては、ピリジン、ジメチルアミノピリジンのような複素環アミン類、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンのような脂肪族アミン類が挙げられるが好適には脂肪族アミン類（特にトリエチルアミン）である。
【０１３０】
反応温度は、特に限定はないが、通常−５０乃至５０℃であり、好適には室温である。
【０１３１】
反応時間は、使用する原料、試薬、温度等により異なるが、通常、５分から３０時間であり、好適には、室温で反応した場合、３０分である。
【０１３２】
反応終了後、濾過により反応液とＣＰＧを分離することができる。ピリジン、アセトニトリル等の有機溶媒で洗浄後、乾燥するによって化合物（４）が得られる。
【０１３３】
２−３−４  Ａ−４工程
本工程は、酸化剤を用いて上記Ａ−３工程で製造される化合物（４）のＨ−ホスホン酸結合をリン酸ジエステル結合に変換し、化合物（５）を製造する工程である。
【０１３４】
Ｈ−ホスホン酸結合を酸化する酸化剤としては、通常、酸化反応に使用されるものであれば特に限定はなく、過マンガン酸カリウム、二酸化マンガンのような酸化マンガン類；四酸化ルテニウムのような酸化ルテニウム類；二酸化ゼレンのようなゼレン化合物；塩化鉄のような鉄化合物；四酸化オスミウムのようなオスミウム化合物；酸化銀のような銀化合物；酢酸水銀のような水銀化合物、酸化鉛、四酸化鉛のような酸化鉛化合物；クロム酸カリウム、クロム酸−硫酸錯体、クロム酸−ピリジン錯体のようなクロム酸化合物、セリウムアンモニウムナイトレイト（ＣＡＮ）のようなセリウム化合物等の無機金属酸化剤；塩素分子、臭素分子、沃素分子のようなハロゲン分子；過沃素酸ナトリウムのような過沃素酸類；オゾン；過酸化水素水；亜硝酸のような亜硝酸化合物；亜塩素酸カリウム、亜塩素酸ナトリウムのような亜塩素酸化合物；過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウムのような過硫酸化合物等の無機酸化剤；ＤＭＳＯ酸化に使用される試薬類（ジメチルスルホキシドとジシクロヘキシルカルボジイミド、オキザリルクロリド、無水酢酸若しくは五酸化燐との錯体又はピリジン−無水酢酸の錯体）；ｔ−ブチルヒドロパーオキシドのようなパーオキシド類；トリフェニルメチルカチオンのような安定なカチオン類；Ｎ−ブロモコハク酸イミドのようなコハク酸イミド類、次亜塩素酸ｔ−ブチルのような次亜塩素酸化合物；アゾジカルボン酸メチルのようなアゾジカルボン酸化合物；ジメチルジスルフィド、ジフェニルジスルフィド、ジピリジルジスルフィドのようなジスルフィド類とトリフェニルホスフィン；亜硝酸メチルのような亜硝酸エステル類；四臭化メタンのようなテトラハロゲン化炭素、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（ＤＤＱ）のようなキノン化合物等の有機酸化剤を挙げることができ、好適にはよう素分子である。
【０１３５】
使用される脱酸剤としては、ピリジン、ジメチルアミノピリジンのような複素環アミン類、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンのような脂肪族アミン類があげられるが好適にはピリジンである。
【０１３６】
反応温度は、特に限定はないが、通常−５０乃至５０℃であり、好適には室温である。
【０１３７】
反応時間は、使用する原料、試薬、温度等により異なるが、通常、５分から３０時間であり、好適には、室温で反応した場合、３０分である。
【０１３８】
反応終了後、濾過により反応液とＣＰＧを分離することができる。ピリジン、アセトニトリル等の有機溶媒で洗浄後、乾燥するによって化合物（５）は得られる。
【０１３９】
２−３−５  Ａ−５工程
本工程は、上記Ａ−４工程で製造される化合物（５）のＣＰＧ  より切り出し、および、保護基の除去を行い、最終化合物（６）を製造する工程である（Ａ、Ｂ法中、―Ｗ’−Ｙ’−は、５’  ―水酸基、及び、３’―水酸基を除いたオリゴヌクレオチドの構造を表す。）。
【０１４０】
用いる塩基としては、濃アンモニア水、メタノール性アンモニア、エタノール性アンモニア、濃アンモニア水―エタノール（３：１Ｖ／Ｖ）混液を挙げることができ、好適には濃アンモニア水、濃アンモニア水―エタノール混液（３：１Ｖ／Ｖ）である。
【０１４１】
反応温度は、特に限定はないが、通常−５０乃至８０℃であり、好適には室温乃至６０℃である。
【０１４２】
反応時間は、使用する原料、試薬、温度等により異なるが、通常、５分から３０時間であり、好適には、６０℃で反応した場合、５時間である。このようにして得られる化合物（６）を含む反応混合物を、逆相およびイオン交換クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィーを含む。）等の各種クロマトグラフィーなど、通常の核酸の精製に用いられる精製操作で精製することにより、化合物（６）を得ることができる。
【０１４３】
Ａ法の概要を図２０に示す。
【０１４４】
２−４  Ｂ工程
２−４−１  Ｂ−１工程
本工程は、不活性溶剤中、水酸基をする化合物（Ｂ法中、Ｘ−Ｈと表す。）に、アミダイト化に通常用いるモノ置換−クロロ（アルコキシ）ホスフィン類又はジ置換−アルコキシホスフィン類を反応して、化合物（７）を製造する工程である。
【０１４５】
使用される溶剤としては、反応に影響を与えないものであれば、特に限定はないが、好適には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジオキサンのようなエーテル類；メチレンクロリド、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンのようなハロゲン化炭化水素類が挙げられる。
【０１４６】
Ｂ法中のＲ１は、シアノエチル基、メチル基、メタンスルホニルエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基をあげることができ、好適には、シアノエチル基、メチル基である。
【０１４７】
使用されるモノ置換−クロロ（アルコキシ）ホスフィン類としては、例えば、クロロ（モルホリノ）メトキシホスフィン、クロロ（モルホリノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジメチルアミノ）メトキシホスフィン、クロロ（ジメチルアミノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンのようなホスフィン類があげられ、好適には、クロロ（モルホリノ）メトキシホスフィン、クロロ（モルホリノ）シアノエトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン、クロロ（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである。
【０１４８】
モノ置換−クロロ（アルコキシ）ホスフィン類を用いる場合には、脱酸剤が使用され、その場合に、使用される脱酸剤としては、ピリジン、ジメチルアミノピリジンのような複素環アミン類、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンのような脂肪族アミン類があげられるが、好適には、脂肪族アミン類（特にジイソプロピルエチルアミン）である。
【０１４９】
使用されるジ置換−アルコキシホスフィン類としては、例えば、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィン、ビス（ジエチルアミノ）メタンスルホニルエトキシホスフィン、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２，２，２−トリクロロエトキシ）ホスフィン、ビス（ジイソプロピルアミノ）（４−クロロフェニルメトキシ）ホスフィンのようなホスフィン類をあげることができ、好適には、ビス（ジイソプロピルアミノ）シアノエトキシホスフィンである。
【０１５０】
ジ置換−アルコキシホスフィン類を用いる場合には、酸が使用され、その場合に、使用される酸としては、好適には、テトラゾール、酢酸又はｐ−トルエンスルホン酸である。
【０１５１】
反応温度は、特に限定はないが、通常０乃至８０℃であり、好適には、室温である。
【０１５２】
反応時間は、使用する原料、試薬、温度等により異なるが、通常、５分乃至３０時間であり、好適には、室温で反応した場合、３０分乃至１０時間である。
【０１５３】
反応終了後、本反応の目的化合物（７）は、例えば、反応混合物を適宜中和し、又、不溶物が存在する場合には、濾過により除去した後、水と酢酸エチルのような混和しない有機溶媒を加え、水洗後、目的化合物を含む有機層を分離し、無水硫酸マグネシウム等で乾燥後、溶剤を留去することによって得られる。
【０１５４】
得られた目的化合物は必要ならば、常法、例えば、再結晶、再沈殿又はクロマトグラフィ−等によって更に精製できる。
【０１５５】
２−４−２  Ｂ−２工程
本工程は、Ａ−１で製造される化合物（２）にＢ−１で製造される化合物（７）のホスホロアミダイト体を、ＤＮＡ自動合成機を用いた通常のホスホロアミダイト法により化合物（８）を製造する工程である。
【０１５６】
所望の化合物（８）は、ＤＮＡ合成機、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２，  ４５３９（１９８４））記載の方法に準じて合成することが出来る。
【０１５７】
また所望により、チオエート化する場合は、硫黄のほかテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ、アプライドバイオシステムズ社）、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬、フェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液（Ｒａｖｉｋｕｍａｒ，  Ｖ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２００６）  １６，ｐ．２５１３−２５１７）等の試薬を用い、文献（Ｔｅｔａｒｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３２，  ３００５（１９９１）、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１２，  １２５３（１９９０））記載の方法に準じてチオエート誘導体を得る事ができる。
【０１５８】
２−４−３  Ｂ−３工程
本工程は、上記Ｂ−２工程で製造される化合物（８）のＣＰＧ  よりの切り出し、および、保護基の除去を行い、最終化合物（６）を製造する工程である。
【０１５９】
本工程は、Ａ−５工程と同様の方法で行うことができる。
【０１６０】
Ｂ法の概要を図２１に示す。
【０１６１】
２−５  ２本鎖ポリヌクレオチドの作製
相補性を有するセンス鎖、アンチセンス鎖の各１本鎖ポリヌクレオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより２本鎖とすることが出来る。会合の方法としては具体的には例えば、合成した１本鎖ポリヌクレオチドを好ましくは少なくとも約３：７のモル比で、より好ましくは約４：６のモル比で、最も好ましくは等モル量（５：５のモル比）で混合し、２本鎖が解離する温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した２本鎖ポリヌクレオチドは、必要に応じてそれ自体公知の通常用いられる方法により精製される。精製方法としては、例えばアガロースゲル等を用いて会合を確認し、残存する１本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する方法を用いることができる。本方法により、５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチド及び５’末端のリン酸が修飾されていない２本鎖ポリヌクレオチドを取得することができる。
【０１６２】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドには、５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドにコレステロールユニット、脂質ユニットまたは、ビタミンＥユニットを導入したもの（例えば、Ｌｏｒｅｎｚ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，１４，ｐ．４９７５−４９７７（２００４）；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，４３２，ｐ．１７３−１７８，  （２００４）；  Ｗｏｌｆｒｕｍ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２５，ｐ．１１４９−１１５７，（２００７））Ｋｕｂｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １７，  ｐ．１−２０，（２００７）；  Ｋｕｂｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ３６５，ｐ．５４−６１，（２００８）；  Ｎｉｓｈｉｎａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １６，ｐ．７３４−７４０，（２００８）参照。）、及び５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドの末端に、タンパク質に結合する核酸分子であるアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を結合したものも含む。
【０１６３】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドには、５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドとモノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）や、タンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）が結合したものも含む（例えば、Ｓｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３，ｐ．７０９−７１７（２００５）；  Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ２４，ｐ．２３０９−２３１６（２００７）、Ｋｕｍａｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐ．３９−４３（２００７）参照。）。
【０１６４】
また、５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドには、５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドにカチオニックポリマーを加えることで、正電荷を帯びた複合体としたものも含む（臓器及び細胞への分布を達成することができた例として、Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｅｄ．  ７，ｐ．９７７−９８６（２００５），Ｂａｉｇｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２，ｐ．２３７−２４１，  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．（２００７），Ｙａｄａｖａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １７，ｐ．２１３−２２２（２００７）参照）。
【０１６５】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドには、上記５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドのあらゆる薬学的に許容可能な塩類、エステル、またはそのようなエステルの塩類を含む。
【０１６６】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩類としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリ−ルスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマ−ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
【０１６７】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドを含有する組成物は、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所的または取り込み、分配および／または吸収を補助するための他の処方として、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合される、封入される、共役される。
【０１６８】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドを、疾患の予防薬又は治療薬として使用する場合には、前記ポリヌクレオチド、又は、その薬理学上許容される塩を、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、又は、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。
【０１６９】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【０１７０】
３．２本鎖ポリヌクレオチドの細胞、組織あるいは個体への導入、及び標的遺伝子の発現調節
上記のように調製された５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳され得るものであれば、特に制限されない。被導入体としては細胞、組織、あるいは個体を意味する。
【０１７１】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドが用いられる細胞としては、生殖系列細胞、体性細胞、分化全能性細胞、多分化能細胞、分割細胞、非分割細胞、実質組織細胞、上皮細胞、不滅化細胞、形質転換細胞、神経細胞又は免疫細胞のいずれのものであってもよい。
【０１７２】
組織としては単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚、胎児組織等を含む。また、上記分化細胞としては、例えば、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌線または外分泌腺の細胞等が挙げられる。このような細胞の例としては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）、ショウジョウバエＳ２細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈ．，  ２７，ｐ．３５３−３６５（１９７２）、ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）、あるいは、ヒトＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等が好ましく用いられる。
【０１７３】
さらに５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドの被導入体として用いられる個体として、具体的には、植物、動物、原生動物、ウイルス、バクテリア、または真菌類に属するもの等が挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってもよい。脊椎動物としてはマウス、ラット、サル、イヌ及びヒトを含む哺乳類が好ましい。
【０１７４】
被導入体への５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドの導入方法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウイルス感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、皮下、筋肉内及び静脈内投与、非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、経膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウイルス感染等が用いられる。経口導入の方法としては、２本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合する方法を使うこともできる。
【０１７５】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドを患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。
【０１７６】
コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。
【０１７７】
コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，ｐ．６８２−；Ｂｌｕｍｅ  ａｎｄ  Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，ｐ．９１−；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，１９９４，２３，ｐ．１１９−；Ｃｈｏｎｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，ｐ．６９８−）。
【０１７８】
０．２−０．４μｍのサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，ｐ．７７−）。
【０１７９】
リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。
【０１８０】
リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。
【０１８１】
特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８の炭素原子、特に１６−１８の炭素原子を含有し、飽和している（１４−１８の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。
【０１８２】
代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【０１８３】
リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的又は能動的のいずれかであってもよい。
【０１８４】
受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。
【０１８５】
一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスのタンパク質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，ｐ．８４７４−）、モノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又はタンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げることができる。
【０１８６】
標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。
【０１８７】
リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。
脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。
【０１８８】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメント、又は（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ；Ｆ（ａｂ’）２）、であり得る。
２種又はそれ以上の生物活性剤は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。
【０１８９】
内容物の細胞内安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【０１９０】
５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチド又はその薬理学上許容される塩の使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１ｍｇ（好適には、３０ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１５００ｍｇ）を、静脈内投与の場合には、１回当り下限０．５ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限５００ｍｇ（好適には、２５０ｍｇ）を成人に対して、１日当り１乃至６回症状に応じて投与することが望ましい。
【０１９１】
局所的投与に対する薬学的組成物および処方は、経皮的パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、飴、坐薬、スプレー、液体および粉末を含む。
【実施例】
【０１９２】
以下、実施例、参考例及び試験例にて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。実施例で合成された各ポリヌクレオチドのＸの構造式、質量分析計で測定された各ポリヌクレオチドの分子量の測定値、を表１に示した。【０１９３】
（実施例１）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号１）（ＣＴ−１６９）の合成
核酸自動合成機（パーキンエルマー社製  ＡＢＩ  ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用い、０．２μｍｏｌスケールのＲＮＡ合成プログラムに従って行った。各合成サイクルにおける溶媒、試薬、ホスホロアミダイトの濃度は天然オリゴデオキシヌクレオチド合成の場合と同じものを用いた。【０１９４】
デオキシヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトをＰｒｏｌｉｇｏ社より購入し適宜調整し用いた。【０１９５】
２’−Ｏ−メチルヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−イソブチリル−２’−Ｏ−メチルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトをＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈより購入し適宜調製し用いた。【０１９６】
リボヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｎ−ジメチルホルムアミジン−２’  −Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）グアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−アセチル−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）シチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトをＰｒｏｌｉｇｏ社より購入し適宜調製し用いた。
２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドホスホロアミダイトを用いる場合は、特許３４２０９８４号の実施例１４（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例２７（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−２−Ｎ−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例２２（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例９（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、の化合物を適宜調製し用いた。【０１９７】
５’−末端にリン酸基部分がある場合は、フォスファリンク（ＡＢＩ製）を適宜調製し用いた。【０１９８】
ホスホロアミダイトは、適宜核酸自動合成機に取り付け、所望の配列を有するポリヌクレオチドを合成した。固相担体として、所望のヌクレオシドが結合したＣＰＧ（コントロールド  ポア  グラス；アプライドバイオシステム製、または、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）０．５μｍｏｌを用い、表記のポリヌクレオチドを合成した。核酸自動合成機の最終工程で、酸処理をしなかった（ジメトキシトリチル基がオリゴヌクレオチド上に結合している）。本ポリヌクレオチドにおいては、アンモニア水で処理した後、逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製ＬＣ−１０ＶＰ、カラム（Ｍｅｒｃｋ，  Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ  （４．６×１００ｍｍ））、Ａ溶液：５％アセトニトリル、０．１Ｍ  酢酸トリエチルアミン水溶液（ＴＥＡＡ），  ｐＨ７．０、Ｂ溶液：アセトニトリル、Ｂ％：１０％→６０％（１０ｍｉｎ，  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；２ｍｌ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）にて精製し、ジメトキシトリチル基を有する目的物のピークを集めた。水を加え、減圧下留去することで、ＴＥＡＡを除いた。ジメトキシトリチル基が結合している場合は、８０％酢酸水溶液（２ｍＬ）を加え、２０分放置することで、ジメトキシトリチル基の脱保護を行った。溶媒を留去したのち、残渣を５００μｌの水に溶解し、酢酸エチルで洗浄し、凍結乾燥後、目的とするオリゴヌクレオチドを得た。また必要に応じて、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１ｘ  ＴＢＥ、６００Ｖ、４時間）で精製した。電気泳動後、ＵＶランプを用いてバンドを可視化し、ナイフを使ってバンドを切り出し、１ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）の溶液を加えて、一晩放置し、ポリヌクレオチドをゲル片から溶出させた。エタノールを加え、オリゴヌクレオチドを沈殿させ、遠心し回収した。本ポリヌクレオチドの分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析により同定した。
分子量：計算値：５７６７．８６、測定値：５７６７．７８
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５６の配列を含む。【０１９９】
（実施例２）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２５９）の合成
実施例１と同様にＣＴ−２５９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、核酸自動合成機の最終工程で酸処理をし、Ｘ部分をマニュアルにて縮合した。即ち、核酸部分が結合したＣＰＧを核酸自動合成機から取り外し、そのＣＰＧに対して、２−Ｃｈｌｏｒｏ−４Ｈ−１，３，２−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｎ−４−ｏｎｅ  （２０．２ｍｇ、  １００μｍｏｌ）をＴＨＦ１ｍＬ、トリエチルアミン１０μＬ溶液に溶解し、その１／６量を加え、室温で３０分反応させた。ＣＰＧをアセトニトリル  ２ｍＬ、５０ｍＭトリエチルアミン炭酸塩／水溶液  ２ｍＬで洗浄し、再度アセトニトリルで洗浄し、乾燥した。Ｎ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（２ｍｇ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５９；  ９；  １９９４；  ２３０４  −  ２３１３）、ピバロイルクロリド（５μＬ、４０μｍｏｌ）をピリジン：アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ、１５０μＬ）に溶解し、ＣＰＧに室温で３０分反応させた。アセトニトリルで洗浄後、核酸合成機用試薬のヨウ素溶液（プロリゴ社製）を３０秒、核酸合成機を用いて送液し、５分間放置した。再度アセトニトリルで洗浄し、乾燥し、実施例１と同様に脱保護、精製を行った。
分子量：計算値：６６８７．２０、測定値：６６８６．２２
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５６に相補的な配列を含む。【０２００】
（実施例３）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２６０）の合成
実施例２と同様にＣＴ−２６０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ｍｅｔｈｙｌ  ２−（２−ｆｕｒｙｌｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ  （Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；  １６；  １９７３；  ２８１）を最終工程で縮合した。【０２０１】
（実施例４）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２６１）の合成
実施例２と同様にＣＴ−２６１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ｍｅｔｈｙｌ  （Ｓ）−３−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｈｅｎｙｌ）−２−［（ｐｙｒｉｄｉｎｅ−２−ｃａｒｂｏｎｙｌ）−ａｍｉｎｏ］−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ；    １１；  １１；  ２００１；  １４４１  −  １４４４）を最終工程で縮合した。【０２０２】
（実施例５）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２６３）の合成
実施例２と同様にＣＴ−２６３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、４−プロピルフェノールを最終工程で縮合した。【０２０３】
（実施例６）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２６８）の合成
実施例１と同様にＣＴ−２６８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分に以下のように調製したアミダイト試薬を縮合した。ｐ―クレゾール（２０ｍｇ）をアセトニトリル：塩化メチレン（１：１ｖ／ｖ）２ｍＬに溶解し、２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  ｔｅｔｒａｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅ  （７４μＬ、０．２３ｍｍｏｌ）、１Ｈ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｅ  ０．４５Ｍアセトニトリル溶液３６０μＬを加え２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認後、フィルターろ過を行い、アミダイト試薬を調製した。【０２０４】
（実施例７）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２６９）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２６９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−エチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２０５】
（実施例８）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２７０）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２７０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−イソプロピルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２０６】
（実施例９）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２７１）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２７１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−ｓｅｃ−ブチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２０７】
（実施例１０）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２７２）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２７２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−ブチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２０８】
（実施例１１）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２７３）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２７３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−アミルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２０９】
（実施例１２）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２７４）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２７４を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−オクチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２１０】
（実施例１３）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２７５）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２７５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−シクロヘキシルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２１１】
（実施例１４）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２７６）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２７６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフトール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２１２】
（実施例１５）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２７７）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２７７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、５−ヒドロキシインダン（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２１３】
（実施例１６）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２９０）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２９０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−エチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２１４】
（実施例１７）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２９２）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２９２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−フェニルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２１５】
（実施例１８）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２９３）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２９３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−フェニルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２１６】
（実施例１９）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２９５）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２９５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−（ベンジルオキシ）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２１７】
（実施例２０）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２９６）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２９６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−（ベンジルオキシ）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２１８】
（実施例２１）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２９９）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２９９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、２−ナフトール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２１９】
（実施例２２）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３００）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３００を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−エチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０２２０】
（実施例２３）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３１２）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３１２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−フェニルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２２１】
（実施例２４）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３１３）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３１３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−フェノキシフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２２２】
（実施例２５）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３１４）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３１４を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−メトキシフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２２３】
（実施例２６）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３１５）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３１５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−（トリフルオロメトキシ）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２２４】
（実施例２７）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３１６）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３１６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−（トリフルオロメチル）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２２５】
（実施例２８）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３１７）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３１７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−フルオロフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２２６】
（実施例２９）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３１８）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３１８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−クロロフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。
分子量：計算値：６８２０．２８、測定値：６８２０．６７
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０２２７】
（実施例３０）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３１９）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３１９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−アセチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２２８】
（実施例３１）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３２１）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３２１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−（メチルスルホニル）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２２９】
（実施例３２）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３２５）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３２５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−メチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２３０】
（実施例３３）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３３１）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３３１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、２−ナフトール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２３１】
（実施例３４）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３３６）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３３６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、２−ヒドロキシ−９−フルオレノン（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２３２】
（実施例３５）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３３７）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３３７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−フェニルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２３３】
（実施例３６）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３３８）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３３８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、２−ヒドロキシジベンゾフラン（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２３４】
（実施例３７）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｔ−Ｈ（配列表の配列番号４）（ＣＴ−３３９）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３３９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−フェニルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。本ポリヌクレオチドにおいては、目的配列を有する保護されたポリヌクレオチド類縁体をアンモニア水：エタノール溶液（３：１ｖ／ｖ）２  ｍＬで５５℃、１６時間処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン酸基の保護基のシアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。ＣＰＧをろ過して除き、エタノールで洗浄し、ろ液と洗液と合わせて、溶媒を減圧下留去した。残った残渣に、Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  ｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅを０．３ｍＬ加え、室温で１９時間放置した。Ｈ２Ｏ  ６０μＬ、ｎ−ブタノール３ｍＬを加え、−２０℃で１時間放置後、遠心して沈殿を回収した。得られた沈殿を２００μＬのＨ２Ｏに溶解し、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１ｘ  ＴＢＥ、６００Ｖ、４時間）で精製した。電気泳動後、ＵＶランプを用いてバンドを可視化し、ナイフを使ってバンドを切り出し、１ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）の溶液を加えて、一晩放置し、ポリヌクレオチドをゲル片から溶出させた。エタノールを加え、オリゴヌクレオチドを沈殿させ、遠心し回収した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０２３５】
（実施例３８）
ＨＯ−Ｇｓ−Ｃｍ１ｓ−Ａｓ−Ｃｍ１ｓ−Ａｓ−Ａｍ１ｓ−Ｇｓ−Ａｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｇｓ−Ｇｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号５）（ＣＴ−３１０）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３１０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５６の配列を含む。【０２３６】
（実施例３９）
Ｘ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｓ−Ｔｓ−Ｇｍ１ｓ−Ｔｓ−Ｇｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｃｓ−Ｃｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｔｓ−Ｃｍ１ｓ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｇｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｇｓ−Ｃｍ１ｓ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号６）（ＣＴ−３３０）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３３０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。また、本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−フェニルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０２３７】
（実施例４０）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３２０）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３２０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、４−ヒドロキシベンズアミドを最終工程で縮合した。【０２３８】
（実施例４１）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３２２）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３２２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、４−（イミダゾール−１−イル）フェノールを最終工程で縮合した。【０２３９】
（実施例４２）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３２３）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３２３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、４−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）フェノールを最終工程で縮合した。【０２４０】
（実施例４３）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３３２）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３３２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、６−ヒドロキシキノリンを最終工程で縮合した。【０２４１】
（実施例４４）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３３５）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３３５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、３，４−ＤＩＨＹＤＲＯ−６−ＨＹＤＲＯＸＹ−２（１Ｈ）−ＱＵＩＮＯＬＩＮＯＮＥを最終工程で縮合した。【０２４２】
（実施例４５）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３５２）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３５２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−ヒドロキシ−４’−メトキシビフェニル（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２４３】
（実施例４６）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３５３）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３５３を合成する。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−フルオロ−４’−ヒドロキシビフェニル（２０ｍｇ）を用いて調製した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０２４４】
（実施例４７）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３５４）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３５４を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−ベンジルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２４５】
（実施例４８）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３５５）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３５５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−α−クミルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２４６】
（実施例４９）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３５９）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３５９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−Ｎ−ｂｅｎｚｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２４７】
（実施例５０）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３６０）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３６０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−ヒドロキシフェニル  ベンゾエート（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２４８】
（実施例５１）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３６５）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３６５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−フルオロフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０２４９】
（実施例５２）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３６６）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３６６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−クロロフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５０】
（実施例５３）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３６７）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３６７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−（トリフルオロメチル）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５１】
（実施例５４）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３６８）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３６８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−アセチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５２】
（実施例５５）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３６９）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３６９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３、４−ジフルオロフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５３】
（実施例５６）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３７０）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３７０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−フルオロ−４−クロロフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５４】
（実施例５７）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３７１）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３７１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−（トリフルオロメチル）−４−フルオロフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５５】
（実施例５８）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３７３）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３７３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３、５−ジクロロフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５６】
（実施例５９）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３７４）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３７４を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−フルオロ−４−アセチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５７】
（実施例６０）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３７５）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３７５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３，４，５−トリフルオロフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５８】
（実施例６１）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号８）（ＣＴ−３７７）の合成
実施例３７と同様にＣＴ−３７７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−（トリフルオロメトキシ）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２５９】
（実施例６２）
ＨＯ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号１３）（ＣＴ−１６５）の合成
実施例３７と同様にＣＴ−１６５を合成した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号２１３７−２１５５の配列を含む。【０２６０】
（実施例６３）
ＨＯ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号１４）（ＣＴ−２７８）の合成
実施例１と同様にＣＴ−２７８を合成した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号２１３７−２１５４の配列を含む。【０２６１】
（実施例６４）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号１５）（ＣＴ−３７８）の合成
実施例３７と同様にＣＴ−３７８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−（トリフルオロメトキシ）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号２１３７−２１５５に相補的な配列を含む。【０２６２】
（実施例６５）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号１６）（ＣＴ−３７９）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３７９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−（トリフルオロメトキシ）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２６３】
（実施例６６）
ＨＯ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号１７）（ＭＣ−００６）の合成
実施例３７と同様にＭＣ−００６を合成した。
塩基配列：Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  １（ＭＣＬ１）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２１９６０）のヌクレオチド番号１５４４−１５６２の配列を含む。【０２６４】
（実施例６７）
ＨＯ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号１８）（ＭＣ−００８）の合成
実施例１と同様にＭＣ−００８を合成した。
塩基配列：ＭＣＬ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２１９６０）のヌクレオチド番号１５４４−１５６１の配列を含む。【０２６５】
（実施例６８）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号１９）（ＭＣ−０１５）の合成
実施例３７と同様にＭＣ−０１５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−（トリフルオロメトキシ）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。
塩基配列：ＭＣＬ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２１９６０）のヌクレオチド番号１５４４−１５６２に相補的な配列を含む。【０２６６】
（実施例６９）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２０）（ＭＣ−０１６）の合成
実施例６と同様にＭＣ−０１６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−（トリフルオロメトキシ）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２６７】
（実施例７０）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２１）（ＣＴ−３８０）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３８０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−ｎ−オクチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０２６８】
（実施例７１）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２１）（ＣＴ−３８１）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３８１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−ｎ−オクチルオキシフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２６９】
（実施例７２）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２１）（ＣＴ−３８２）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３８２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４’−ヒドロキシオクタフェノン（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２７０】
（実施例７３）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２１）（ＣＴ−３８３）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３８３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４’−ヒドロキシバレロフェノン（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２７１】
（実施例７４）
ＨＯ−Ｇｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ｃｍ１ｓ−Ａｓ−Ａｍ１ｓ−Ｇｓ−Ａｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｇｓ−Ｇｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２２）（ＣＴ−３４２）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３４２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５６の配列を含む。【０２７２】
（実施例７５）
ＨＯ−Ｇｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ａｍ１ｓ−Ｇｓ−Ａｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｇｓ−Ｇｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２３）（ＣＴ−３４３）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３４３を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。【０２７３】
（実施例７６）
ＨＯ−Ｇｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ａｅ２ｓ−Ｇｓ−Ａｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｇｓ−Ｇｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２４）（ＣＴ−３４４）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３４４を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。【０２７４】
（実施例７７）
ＨＯ−Ｇｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ａｅ２ｓ−Ｇｓ−Ａｅ２ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｇｓ−Ｇｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２５）（ＣＴ−３４５）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３４５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。【０２７５】
（実施例７８）
ＨＯ−Ｇｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ａｅ２ｓ−Ｇｓ−Ａｅ２ｓ−Ａｓ−Ｕｅ２ｓ−Ｇｓ−Ｇｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２６）（ＣＴ−３４６）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３４６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。【０２７６】
（実施例７９）
ＨＯ−Ｇｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ａｅ２ｓ−Ｇｓ−Ａｅ２ｓ−Ａｓ−Ｕｅ２ｓ−Ｇｓ−Ｇｅ２ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２７）（ＣＴ−３４７）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３４７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。【０２７７】
（実施例８０）
ＨＯ−Ｇｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ａｅ２ｓ−Ｇｓ−Ａｅ２ｓ−Ａｓ−Ｕｅ２ｓ−Ｇｓ−Ｇｅ２ｓ−Ａｓ−Ｕｅ２ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２８）（ＣＴ−３４８）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３４８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。【０２７８】
（実施例８１）
ＨＯ−Ｇｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ａｅ２ｓ−Ｇｓ−Ａｅ２ｓ−Ａｓ−Ｕｅ２ｓ−Ｇｓ−Ｇｅ２ｓ−Ａｓ−Ｕｅ２ｓ−Ｃｓ−Ａｅ２ｓ−Ｃｓ−Ａｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２９）（ＣＴ−３４９）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３４９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。【０２７９】
（実施例８２）
ＨＯ−Ｇｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ｃｅ２ｓ−Ａｓ−Ａｅ２ｓ−Ｇｓ−Ａｅ２ｓ−Ａｓ−Ｕｅ２ｓ−Ｇｓ−Ｇｅ２ｓ−Ａｓ−Ｕｅ２ｓ−Ｃｓ−Ａｅ２ｓ−Ｃｓ−Ａｅ２ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３０）（ＣＴ−３５０）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３５０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。【０２８０】
（実施例８３）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３８７）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３８７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４’−ヒドロキシアセトアニリド（２０ｍｇ）を用いて調製した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０２８１】
（実施例８４）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３８８）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３８８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−ヒドロキシ安息香酸メチル（２０ｍｇ）を用いて調製した
（実施例８５）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３８９）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３８９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８２】
（実施例８６）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３９０）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３９０を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、レソルシノール・モノアセタート（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８３】
（実施例８７）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３９１）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３９１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−ブロモフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８４】
（実施例８８）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３９２）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３９２を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−ヨードフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８５】
（実施例８９）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−４３８）の合成
実施例６と同様にＣＴ−４３８を合成した。但し、最終工程で酸処理を行った。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例２２（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８６】
（実施例９０）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−４３９）の合成
実施例６と同様にＣＴ−４３９を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−ヒドロキシピリジン（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８７】
（実施例９１）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−４５７）の合成
実施例６と同様にＣＴ−４５７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、参考例３４（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８８】
（実施例９２）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−４５８）の合成
実施例６と同様にＣＴ−４５８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、メチル  ５−ヒドロキシ−３−ピリジンカルボキシレート（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０２８９】
【表１】
2011052715.tif 000020
【０２９０】
【表１−２】
2011052715.tif 000021
【０２９１】
【表１−３】
2011052715.tif 000022
【０２９２】
【表１−４】
2011052715.tif 000023
【０２９３】
【表１−５】
2011052715.tif 000024
【０２９４】
【表１−６】
2011052715.tif 000025
同様に参考例で合成された各ポリヌクレオチドのＸの構造式、質量分析計で測定された各ポリヌクレオチドの分子量の測定値、を表２に示した。【０２９５】
（参考例１）
ＨＯ−Ｇｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ｃｒｐ−Ａｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号７）（ＣＴ−００１）の合成
実施例１と同様にＣＴ−００１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、目的配列を有する保護されたポリヌクレオチド類縁体をアンモニア水：エタノール溶液（３：１ｖ／ｖ）２  ｍＬで５５℃、１６時間処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン酸基の保護基のシアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。ＣＰＧをろ過して除き、エタノールで洗浄し、ろ液と洗液と合わせて、溶媒を減圧下留去した。残った残渣に、Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  ｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅを０．３ｍＬ加え、室温で１９時間放置した。Ｈ２Ｏ  ６０μＬ、ｎ−ブタノール３ｍＬを加え、−２０℃で１時間放置後、遠心して沈殿を回収した。得られた沈殿を２００μＬのＨ２Ｏに溶解し、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１ｘ  ＴＢＥ、６００Ｖ、４時間）で精製した。電気泳動後、ＵＶランプを用いてバンドを可視化し、ナイフを使ってバンドを切り出し、１ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）の溶液を加えて、一晩放置し、ポリヌクレオチドをゲル片から溶出させた。エタノールを加え、オリゴヌクレオチドを沈殿させ、遠心し回収した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７の配列を含む。【０２９６】
（参考例２）
ＨＯ−Ｕｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｕｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｒｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号８）（ＣＴ−００５）の合成
参考例１と同様にＣＴ−００５を合成した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０２９７】
（参考例３）
ＨＯ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｔ−Ｈ（配列表の配列番号９）（ＣＴ−１０６）の合成
参考例１と同様にＣＴ−１０６を合成した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７の配列を含む。【０２９８】
（参考例４）
ＨＯ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｔ−Ｈ（配列表の配列番号１０）（ＣＴ−０４１）の合成
参考例１と同様にＣＴ−０４１を合成した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０２９９】
（参考例５）
ＨＯ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号１１）（ＣＴ−１５７）の合成
実施例１と同様にＣＴ−１５７を合成した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０３００】
（参考例６）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）  −Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２２５）の合成
実施例２と同様にＣＴ−２２５を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｍｅｔｈｙｌ  ３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅを最終工程で縮合した。【０３０１】
（参考例７）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２９１）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２９１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、２−エチルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３０２】
（参考例８）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２９４）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２９４を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、２−フェニルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３０３】
（参考例９）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２９７）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２９７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、２−（ベンジルオキシ）フェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３０４】
（参考例１０）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号２）（ＣＴ−２９８）の合成
実施例６と同様にＣＴ−２９８を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、１−ナフトール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３０５】
（参考例１１）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−１８６）の合成
実施例６と同様にＣＴ−１８６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分は、特開平１１−２４６５９２  実施例８ａの化合物を用いて調製した。【０３０６】
（参考例１２）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３２７）の合成
実施例６と同様にＣＴ−３２７を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−メチルフェネニルアルコール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３０７】
（参考例１３）
ＨＯ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｓ−Ｔｓ−Ｇｍ１ｓ−Ｔｓ−Ｇｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｃｓ−Ｃｍ１ｓ−Ａｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｔｓ−Ｃｍ１ｓ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｇｓ−Ｕｍ１ｓ−Ｇｓ−Ｃｍ１ｓ−Ｔｓ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号６）（ＣＴ−３１１）の合成
実施例１と同様にＣＴ−３１１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、ホスホロチオエート結合部分は、０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド／ピリジン−アセトニトリル（１：１  ｖ／ｖ）溶液３分間処理することで調製した。【０３０８】
（参考例１４）
ＨＯ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）  −Ｏ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号１２）（ＣＴ−２０３）の合成
実施例１と同様にＣＴ−２０３を合成した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５６に相補的な配列を含む。【０３０９】
（参考例１５）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３５１）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３５１を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、３−ペンタデシルフェノール（２０ｍｇ）を用いて調製した。【０３１０】
（参考例１６）
Ｘ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ａｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３）（ＣＴ−３２６）の合成
実施例２と同様にＣＴ−３２６を合成した。本ポリヌクレオチドにおいては、Ｘ部分のアミダイト試薬は、４−メチルベンジルアルコールを用いて調製した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号３１３９−３１５７に相補的な配列を含む。【０３１１】
（参考例１７）
ＨＯ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ａｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｃｒｐ−Ｔｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号３１）（ＣＴ−１６６）の合成
実施例３７と同様にＣＴ−１６６を合成した。
塩基配列：ヒトβ−カテニン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１９０４．３）のヌクレオチド番号２１３７−２１５５に相補的な配列を含む。【０３１２】
（参考例１８）
ＨＯ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｔｐ−Ｔｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｃｐ−Ａｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３２）（ＣＴ−２８０）の合成
実施例１と同様にＣＴ−２８０を合成した。
分子量：計算値：６６２９．２６、測定値：６６２９．５１
（参考例１９）
ＨＯ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｇｒｐ−Ａｒｐ−Ａｒｐ−Ｕｒｐ−Ｕｒｐ−Ｃｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ｃｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｒｐ−Ｇｐ−Ｔｔ−Ｈ（配列表の配列番号３３）（ＭＣ−００７）の合成
実施例３７と同様にＭＣ−００７を合成した。
塩基配列：ＭＣＬ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２１９６０）のヌクレオチド番号１５４４−１５６２に相補的な配列を含む。【０３１３】
（参考例２０）
ＨＯ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ａｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｇｍ１ｐ−Ａｐ−Ａｍ１ｐ−Ｔｐ−Ｕｍ１ｐ−Ｃｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｃｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｇｍ１ｐ−Ｇｐ−Ｕｍ１ｔ−Ｈ（配列表の配列番号３４）（ＭＣ−００９）の合成
実施例１と同様にＭＣ−００９を合成した。【０３１４】
（参考例２２）
６−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（７２２  ｍｇ，  １．６７  ｍｍｏｌ，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９５，  ６０，  ３３５８-３３６４）をメチレンクロリド２ｍＬに溶解し、４−アミノフェノール（２００  ｍｇ、１．８４  ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２８８  ｍｇ、２．５  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（２２５  ｍｇ，  ２．５  ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２６０μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、メチレンクロリド、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相を飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（３０ｇ、２％メタノール／メチレンクロリド）で精製し、アモルファス状の参考例２２の化合物を得た（６４９ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４３−６．７５（１７Ｈ，ｍ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．０５（２Ｈ，ｍ），２．３０（２Ｈ，ｍ），  １．７３−１．５９（４Ｈ，ｍ），  １．４９−１．３８（２Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５２５  Ｍ＋
（参考例２３）
８−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  （１００ｍｇ，  ０．５９  ｍｍｏｌ）をピリジン１．５ｍＬに溶解し、４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  （２３７ｍｇ，  ０．７  ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、メチレンクロリド、水で分液し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（４ｇ、メチレンクロリド）で精製し、アモルファス状の８−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄを得た（３４８ｍｇ）。得られた８−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｏｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄをメチレンクロリド１ｍＬに溶解し、４−アミノフェノール（７０．９  ｍｇ、０．６４  ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１０１．６  ｍｇ、０．８８  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（７９  ｍｇ，  ０．８８６  ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９２  μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、シリカゲルカラム（５  ｇ、３０％→５０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の参考例２３の化合物を得た（１４８ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．５９（１７Ｈ，ｍ），  ３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．０５−３．０１（２Ｈ，ｍ），２．２８（２Ｈ，ｍ），  １．７１−１．５８（４Ｈ，ｍ），  １．３５−１．２４（６Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ＋ＫＩ）：  ５９２  （Ｍ＋Ｋ）＋
（参考例２４）
１０−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（０．７０７  ｇ，  １．１９  ｍｍｏｌ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １９９４，  ３５，  ２３５３−２３５６）を  メチレンクロリド２ｍＬに溶解し、４−アミノフェノール（１４１．８  ｍｇ、１．２８  ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２０３  ｍｇ、１．７６  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１５８  ｍｇ，  １．７６  ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１８３μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、シリカゲルカラム（７．５  ｇ、３０％→５０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の参考例２４の化合物を得た（４８５ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．５９（１７Ｈ，ｍ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．０２（２Ｈ，ｍ），２．３１（２Ｈ，ｍ），  １．７４−１．５６（４Ｈ，ｍ），  １．３３−１．２４（１０Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５８０  （Ｍ−Ｈ）＋
（参考例２５）
４−アミノ−１−ブタノール（１６０．４５  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）に対して、ＥＤＣ（３８３  ｍｇ、２  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（６７．５  ｍｇ，  ０．５  ｍｍｏｌ）がメチレンクロリド３  ｍＬに溶解した溶液を加え、さらにトリエチルアミン（２６０  μＬ）を加え、一晩振とうした。反応の終結をＴＬＣで確認後、シリカゲルカラム（５  ｇ、メチレンクロリド→酢酸エチルで溶出）で精製し、オイル状のアミド化合物を得た（０．２０  ｇ）。これをピリジン１．５  ｍＬに溶解し、４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  （５００  ｍｇ，  １．５  ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、メタノール０．５  ｍＬを加え、酢酸エチル、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相の溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（１０ｇ、４０％→５０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の参考例２５の化合物を得た（３２５ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．７０−６．７８（１７Ｈ，ｍ），  ６．１１（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ５．６９（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．４２（２Ｈ，ｍ），  ３．１１（２Ｈ，ｍ），  １．６９（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５１１  Ｍ＋
（参考例２６）
６−アミノ−１−ヘキサノール（２１０．９４  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例２５と同様に合成し、アモルファス状の参考例２６の化合物を得た（４４５ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．６７−６．７９（１７Ｈ，ｍ），  ５．９７（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ５．５６（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．４３−３．３８（２Ｈ，ｍ），  ３．０６−３．０２（２Ｈ，ｍ），  １．６３−１．５５（４Ｈ，ｍ），  １．４５−１．３４（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５３９  Ｍ＋
（参考例２７）
８−アミノ−１−オクタノール（２６１．４３  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例２５と同様に合成し、アモルファス状の参考例２７の化合物を得た（４８６ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．６８−６．８０（１７Ｈ，ｍ），  ５．９８（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ５．５４（１Ｈ，  ｓ），  ３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．４４−３．３９（２Ｈ，ｍ），  ３．０３（２Ｈ，ｍ），  １．６２−１．５５（４Ｈ，ｍ），  １．３４−１．２４（８Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５６７  Ｍ＋
（参考例２８）
４−アミノ−１−ブタノール（１６０．４５  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例２５と同様に合成し、アモルファス状の参考例２８の化合物を得た（５６６ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．７９（１７Ｈ，ｍ），  ６．２５（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ６．０６（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．４７−３．４２（２Ｈ，ｍ），  ３．１３（２Ｈ，ｍ），  １．７２−１．６６（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５１１  Ｍ＋
（参考例２９）
６−アミノ−１−ヘキサノール（２１０．９４  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例２５と同様に合成し、アモルファス状の参考例２９の化合物を得た（５８０ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．８０（１７Ｈ，ｍ），  ６．０８（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ６．０４（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．４５−３．４０（２Ｈ，ｍ），  ３．０６−３．０３（２Ｈ，ｍ），  １．６５−１．５６（４Ｈ，ｍ），  １．４５−１．３４（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５３９  Ｍ＋
（参考例３０）
８−アミノ−１−オクタノール（２６１．４３  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシ安息香酸（２０７．１８  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例２５と同様に合成し、アモルファス状の参考例３０の化合物を得た（６７５ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．８０（１７Ｈ，ｍ），  ６．２１（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ６．１１（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．４６−３．４１（２Ｈ，ｍ），  ３．０４−３．０１（２Ｈ，ｍ），  １．６３−１．５８（４Ｈ，ｍ），  １．３９−１．３３（８Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５６６  （Ｍ−Ｈ）＋
（参考例３１）
４−アミノ−１−ブタノール（１６０．４５  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸
（２４９．２６  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例２５と同様に合成し、アモルファス状の参考例３１の化合物を得た（５４０ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．６８（１７Ｈ，ｍ），  ５．３７（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ４．８７（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．１８（２Ｈ，ｍ），  ３．０４（２Ｈ，ｍ），  ２．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  ２．３５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  １．５４−１．４８（４Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５４０  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例３２）
６−アミノ−１−ヘキサノール（２１０．９４  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（２４９．２６  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例２５と同様に合成し、アモルファス状の参考例３２の化合物を得た（５５９ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４４−６．７０（１７Ｈ，ｍ），  ５．２１（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ５．０３（１Ｈ，  ｓ），  ３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．１５（２Ｈ，ｍ），  ３．０３（２Ｈ，ｍ），  ２．８７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３３Ｈｚ），  ２．３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  １．５９−１．１３（８Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５６８  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例３３）
８−アミノ−１−オクタノール（２６１．４３  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（２４９．２６  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）を用いて参考例２５と同様に合成し、あめ状の参考例３３の化合物を得た（７２０ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．７１（１７Ｈ，ｍ），  ５．２６（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ５．１０（１Ｈ，  ｓ），  ３．７８（６Ｈ，ｓ），  ３．１８（２Ｈ，ｍ），  ３．０３（２Ｈ，ｍ），  ２．８８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  ２．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ），  １．６２−１．１７（１２Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ５９４  （Ｍ−Ｈ）＋
（参考例３４）
Ｎ−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ
Ｌ−チロシン  エチル（４１８ｍｇ，  ２ｍｍｏｌ）をピリジン５  ｍＬに溶解し、４−ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  （７４１  ｍｇ，  ２．４  ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、酢酸エチル、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、有溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（３０ｇ、３０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の参考例３４の化合物を得た（６８７ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４２−６．７２（１８Ｈ，ｍ），  ４．６９（１Ｈ，  ｓ），  ３．７６（３Ｈ，ｓ），  ３．５３−３．３３（３Ｈ，ｍ），  ２．９４−２．８１（２Ｈ，ｍ），  ２．５８（１Ｈ，  ｄ），  ０．８４（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ４８２  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例３５）
３−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｏｘｙ）−２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  （Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−ＯＨ）
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−セリン（１．７７５ｇ，  １２ｍｍｏｌ）をピリジン２０  ｍＬに溶解し、４−ｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  （４．１ｇ，  １３．２  ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応の終結をＴＬＣで確認後、酢酸エチル、５％炭酸水素ナトリウム水溶液で分液し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（１２０ｇ、３０％アセトン／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の参考例３５の化合物を得た（３．９３ｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４１−６．８１（１４Ｈ，ｍ），  ６．１５（１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝７．３３Ｈｚ），  ４．７０−４．６６（１Ｈ，  ｍ），  ３．７８（３Ｈ，ｓ），  ３．７５−３．７４（１Ｈ，ｍ），  ３．４２−３．３８（１Ｈ，ｍ），  ２．０２（３Ｈ，  ｓ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ４１９  Ｍ＋
（参考例３６）
Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
参考例３５の化合物（６２９  ｍｇ，  １．５  ｍｍｏｌ  Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−ＯＨ）をメチレンクロリド３ｍＬに溶解し、Ｌ−チロシン  エチル（３３４ｍｇ，  １．６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３８３  ｍｇ、２  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（６７．５  ｍｇ，  ０．５  ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２６０μＬ）を加え、４時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラム（１５ｇ、４０％→５０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン）で精製し、アモルファス状の参考例３６の化合物を得た（４６０ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．５２−６．６１（１８Ｈ，ｍ），  ６．０８（１Ｈ，  ｍ），  ４．８７−４．７７（１Ｈ，ｍ），  ４．５２（１Ｈ，ｍ），  ４．１９−４．０５（２Ｈ，  ｍ），  ３．７９（３Ｈ，ｓ），  ３．７０−３．５９（１Ｈ，ｍ），  ３．１９−２．９６（３Ｈ，ｍ），  １．９３，１．９１  （１Ｈ，  ｄｓ），  １．２８−１．２２（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６１１  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例３７）
ｔ−Ｂｏｃ−βＡｌａ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−β−Ａｌａｎｉｎｅ（２８３ｍｇ，  １．５ｍｍｏｌ，  ｔ−Ｂｏｃ−βＡｌａ−ＯＨ）、Ｌ−チロシン  エチル（３７６  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ，  Ｈ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ）を用いて参考例３６と同様に合成し、アモルファス状の参考例３７の化合物を得た（４９７ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）６．９７−６．７４（４Ｈ，ｍ），  ６．０３（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ５．１１（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ４．８０（１Ｈ，ｑ，  Ｊ＝６．７２Ｈｚ），  ４．２２−４．１５（２Ｈ，ｍ），  ３．３６（２Ｈ，ｍ），  ３．１０−３．０１（２Ｈ，ｍ），  ２．３８（２Ｈ，ｍ），  １．４１（９Ｈ，ｓ），  １．２９−１．２３（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ３８１  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例３８）
ｔ−Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ａｌａｎｉｎｅ（２８３ｍｇ，  １．５ｍｍｏｌ，  ｔ−Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ）、Ｌ−チロシン  エチル（３７６  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例３６と同様に合成し、アモルファス状の参考例３８の化合物を得た（４９０ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）６．９８−６．７１（４Ｈ，ｍ），  ６．４９（１Ｈ，  ｄ），  ５．１６（１Ｈ，  ｓ），  ４．９５−４．７６（１Ｈ，ｍ），  ４．２０−４．１３（３Ｈ，ｍ），  ３．０５（２Ｈ，ｍ），  １．４１（９Ｈ，ｓ），  １．３３，１．３１（３Ｈ，ｄｓ），  １．２８−１．２１（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ３８１  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例３９）
ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙｃｉｎｅ（２６３  ｍｇ、１．５  ｍｍｏｌ）、Ｌ−チロシン  エチル（３７６  ｍｇ、１．８  ｍｍｏｌ）を用いて参考例３６と同様に合成し、アモルファス状の参考例３９の化合物を得た（４３４ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）６．９８−６．７２（４Ｈ，ｍ），  ６．４６（１Ｈ，  ｄ），  ５．０６（１Ｈ，  ｂｒｓ），  ４．８２（１Ｈ，ｍ），  ４．２１−４．１３（２Ｈ，ｍ），  ３．８５−３．７２（２Ｈ，ｍ），  ３．０５（２Ｈ，ｍ），  １．４１（９Ｈ，ｓ），  １．２９−１．２４（３Ｈ，ｍ），  １．２８−１．２１（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ３６７  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例４０）
Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−βＡｌａ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
参考例３７の化合物（４９０ｍｇ，  １．２９ｍｍｏｌ）をメチレンクロリド４ｍＬに溶解し、ＴＦＡ４ｍＬを加え、室温で１５分放置後、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をメチレンクロリド３ｍＬ、トリエチルアミン（２６０μＬ）に溶解し、参考例３５の化合物（５４４ｍｇ，  １．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３８３  ｍｇ、２  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（６７．５  ｍｇ，  ０．５  ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２６０μＬ）を加え、一晩撹拌した。反応液をシリカゲルカラム（２０ｇ、８０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサン→酢酸エチル）で精製し、アモルファス状の参考例４０の化合物を得た（４６９ｍｇ）。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４１−６．７１（１８Ｈ，ｍ），  ４．８１−４．７５（１Ｈ，ｍ），  ４．５４−４．４４（１Ｈ，ｍ），  ４．２６−４．１５（２Ｈ，ｍ），  ３．７８（３Ｈ，ｓ），  ３．４６−２．２０（８Ｈ，ｍ），  ２．０２，１．９８（３Ｈ，ｄｓ），  １．３４−１．２４（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６８２  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例４１）
Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
参考例３８の化合物（４８５ｍｇ，  １．２６ｍｍｏｌ）、参考例３５の化合物（５４４ｍｇ，  １．３ｍｍｏｌ）を用いて、参考例４０と同様に合成し、白色固体の参考例４１の化合物を得た（４４８ｍｇ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．４１−６．４９（１８Ｈ，ｍ），  ４．７９（１Ｈ，ｍ），  ４．５４−４．４４（２Ｈ，ｍ），  ４．２０−４．１５（２Ｈ，ｍ），  ３．７８（３Ｈ，ｓ），  ３．４６−２．８５（４Ｈ，ｍ），  ２．０１，１．９４（３Ｈ，ｄｓ），  １．３７−１．１７（６Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６８２  （Ｍ＋Ｈ）＋
（参考例４２）
Ａｃ−Ｓｅｒ（ＭＭＴｒ）−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ
参考例３９の化合物（４３０ｍｇ，  １．１７ｍｍｏｌ）、参考例３５の化合物（５４４ｍｇ，  １．３ｍｍｏｌ）を用いて、参考例４０と同様に合成し、白色固体の参考例４２の化合物を得た（４８６ｍｇ）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）９．２２（１Ｈ，ｓ），  ８．４１−８．３４（１Ｈ，ｍ），  ８．２３（１Ｈ，ｍ），  ８．０８−８．０５（１Ｈ，ｍ），  ７．３８−６．６３（１８Ｈ，ｍ），  ４．６０（１Ｈ，  ｍ），  ４．３６（１Ｈ，  ｍ），  ４．０４−３．９７（２Ｈ，ｍ），  ３．９２−３．６１（２Ｈ，ｍ），  ３．７４（３Ｈ，ｓ），  ３．０９（１Ｈ，ｍ），  ２．８３（１Ｈ，ｍ），  １．８５（３Ｈ，ｓ），  １．１１−１．０６（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ−ＭＡＳ（ｍＮＢＡ）：  ６６８  （Ｍ＋Ｈ）＋
参考例２２〜３３、３６及び４０〜４２に記載の化合物の構造を図３６に示す。【０３１５】
【表２】
2011052715.tif 000026
【０３１６】
（実施例９３）２本鎖ポリヌクレオチド形成のためのアニーリング
上記、実施例及び参考例において合成したポリヌクレオチドを表３〜表６に示す組み合わせで、センス鎖及びアンチセンス鎖を３００ｐｍｏｌずつ１つのチューブに入れて、減圧下乾燥し、３０μＬのｓｉＲＮＡ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）を加え、６５℃、１分間加温した後、室温に５分間放置し、センス鎖及びアンチセンス鎖をアニーリングさせ、１０μＭの２本鎖ポリヌクレオチド溶液を得た。【０３１７】
２本鎖ポリヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖の組み合わせのみで表すこともある。すなわち、例えば、ＣＴ−００１／ＣＴ−０００５の組み合わせからなる２本鎖ポリヌクレオチドは、単に、「ＣＴ−００１／ＣＴ−００５」とも表す。）
本方法により、表３〜８に示す、２本鎖ポリヌクレオチド及びアンチセンス鎖の５’リン酸に芳香族置換基が付加している５’−Ａｒ−２本鎖ポリヌクレオチドを取得することができる。【０３１８】
【表３】
2011052715.tif 000027
【０３１９】
【表４】
2011052715.tif 000028
【０３２０】
【表５】
2011052715.tif 000029
【０３２１】
【表６】
2011052715.tif 000030
【０３２２】
（試験例１）
（１）トランスフェクション
ヒト大腸癌ＳＷ４８０細胞株（ヒト大腸腺癌由来）を、１０％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。１０００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるように、ＳＷ４８０の培養液を１２穴プレートに播種し、一晩培養した。次に各ウェルにリポフェクション試薬ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を最終濃度０．５％、２本鎖ポリヌクレオチド溶液を最終濃度が、３０、３、０．３、および０．０３ｎＭ（または、３、１、０．３、０．１、および０．０３ｎＭ等、図内に表示）となるよう添加して、更に３日間培養を継続した。その後、培地を除いてＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で細胞を洗浄後、５％  ２−メルカプトエタノール含有Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １００μＬを直接添加して細胞を溶解させた。細胞溶解液をチューブに回収後、１００℃で５分間加熱して蛋白質を変性させた。２本鎖ポリヌクレオチドの構造及びそのヌクレオチド配列は図１、図２、図４、図６、図８、図１０、図１６、図１８、図１９、図２４、図２６、図２７、図２９、図３１、図３２、図３４、図３７及び図３９に示している。【０３２３】
（２）ウエスタンブロット解析
各サンプル（蛋白質量として１μｇ分）をポリアクリルアミドゲル電気泳動（５−２０％  グラジエントゲル）によって分離し、ニトロセルロース膜に電気的に転写した。５％スキムミルク液でブロッキング後、一次抗体としてウサギ抗β−カテニン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてβ−カテニン蛋白質を検出した。陰性対象としてβ−アクチン蛋白質を抗β−アクチンモノクローナル抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。各蛋白質の検出は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を基質として使用した時に生じた化学発光によってＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｆｉｌｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を感光させることで可視化して実施した。【０３２４】
（３）ウエスタンブロット解析結果
（ａ）参考例として合成した２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性
２本鎖ポリヌクレオチドの全てのヌクレオチドがＲＮＡからなるＣＴ−１０６／ＣＴ−０４１の組み合わせからなる２本鎖ポリヌクレオチド（以下、２本鎖ポリヌクレオチドは、センス鎖、アンチセンス鎖の組み合わせのみで表すこともある。すなわち、例えば、ＣＴ−１０６／ＣＴ−０４１の組み合わせからなる２本鎖ポリヌクレオチドは、単に、「ＣＴ−１０６／ＣＴ−０４１」とも表す。）及び、ＲＮＡを１つおきに２’−Ｏ−メチルＲＮＡに置き換え、ｏｖｅｒｈａｎｇ部分はＤＮＡとしたＣＴ−００１／ＣＴ−００５について実験を行った。これらの２本鎖ポリヌクレオチドの構造は図１に示している。ＣＴ−００１／ＣＴ−００５は、全てのヌクレオチドがＲＮＡからなるＣＴ−１０６／ＣＴ−０４１と同程度にヒトβ−カテニン遺伝子の発現を抑制していた（図１）。以後の実験では、ＣＴ−００１／ＣＴ−００５またはＣＴ−１０６／ＣＴ−０４１を、対照として利用した。【０３２５】
（ｂ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析１
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端に、４−エチルフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−３００、及び、２−ヒドロキシエチルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−１８６（構造は図２参照。）の遺伝子発現抑制活性を調べた。図３に示すように、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３００は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同程度にヒトβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。しかし、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１８６では、ヒトβ−カテニン遺伝子発現の抑制は見られなかった。また、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−２０３のアンチセンス鎖５’末端に、４−エチルフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−２６９、及び、４−フェニルフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−２９２（図２参照。）の遺伝子発現抑制活性を調べた。図３に示すように、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６９、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９２は、ヒトβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルリン酸基が結合した２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３２６】
（ｃ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析２
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−２０３のアンチセンス鎖５’末端に、置換基を有するフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−２６３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６８、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７４、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７６、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７７（構造は図４参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３２７】
図５に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−２６３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６８、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７４、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７６、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２７７は、β−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルリン酸基を有している２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３２８】
（ｄ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析３
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−２０３のアンチセンス鎖５’末端に、置換基を有するフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−２６９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９４、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９６、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９７、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９８、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９９（構造は図６参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３２９】
図７に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−２６９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９６、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９９は、β−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。それらと比較して、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９４、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９７、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２９８は、β−カテニン遺伝子発現抑制活性が低かった。このことは、アンチセンス鎖５’末端のフェニルリン酸基上の置換位置としてオルト位よりもメタ位、或いはパラ位が好ましく、エチル基、フェニル基、或いはベンジルオキシ基を有している２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３３０】
（ｅ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析４
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−２０３のアンチセンス鎖５’末端に、置換を有するフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−２２５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２５９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６１、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６３（構造は図８参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。
図９に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−２５９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６１、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６３は、β−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。それらと比較して、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２２５は、β−カテニン遺伝子発現抑制活性が低かった。アンチセンス鎖５’末端に４−プロピルフェニルリン酸基を有している２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−２６３は強い遺伝子の発現抑制活性を有するが、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６３に対してカルボン酸を導入したＣＴ−１６９／ＣＴ−２２５は、β−カテニン遺伝子発現抑制活性が低下した。しかし、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２５９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２６１のように、ＣＴ−１６９／ＣＴ−２２５にさらに置換基を導入した場合は、強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示めしている。【０３３１】
（ｆ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析５
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端に、置換を有するフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−３１２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１４、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１６、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１７、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１８、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１９（構造は図１０参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３３２】
図１１に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−３１２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１４、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１６、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１７、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１８、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１９は、ＣＴ−００１／ＣＴ−００５及びＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同程度にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。【０３３３】
（ｇ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析６
天然型２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１０６／ＣＴ−０４１のアンチセンス鎖５’末端に、３−フェニルフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１０６／ＣＴ−３３９（構造は図１６参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３３４】
図１７に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１０６／ＣＴ−３３９は、天然型２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１０６／ＣＴ−０４１と同程度にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルリン酸基を有している天然型２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３３５】
（ｈ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析７
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端に、置換を有するフェニルリン酸基またはが４−メチルフェネニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−３２１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３２５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３２７、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３６、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３７、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３８（構造は図１６参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３３６】
図１７に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−３２１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３２５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３１２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３６、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３７、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３８は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同程度にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。それらと比較して、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３２７は、β−カテニン遺伝子発現抑制活性が低かった。このことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルリン酸基を有している天然型２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３３７】
（ｉ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析８
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のリン酸ジエステル結合をｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ結合にした２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−３１０／ＣＴ−３１１のアンチセンス鎖５’末端に、３−フェニルフェニルチオリン酸基が結合したＣＴ−３１０／ＣＴ−３３０（構造は図１８参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３３８】
図１８に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−３１０／ＣＴ−３３０は、ＣＴ−３１０／ＣＴ−３１１と同程度にβ−カテニン遺伝子の発現を抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルチオリン酸基を有している２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３３９】
（試験例２）ホスファターゼに対する安定性試験
ポリヌクレオチド、ＣＴ−２０３及びＣＴ−２９２（図２参照。）のそれぞれ４００ｐｍｏｌを   Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０、  ５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、タカラバイオ）で総容量を４９μＬとし、１Ｕ  Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＡＰ、１μＬ、タカラバイオ）を加え、３７℃で１５分加温した。さらに６０℃で１５分加温後、逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製ＬＣ−１０ＶＰ、カラム（Ｍｅｒｃｋ，  Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ  （４．６×１００ｍｍ））、Ａ溶液：５％アセトニトリル、０．１Ｍ  酢酸トリエチルアミン水溶液（ＴＥＡＡ），  ｐＨ７．０、Ｂ溶液：アセトニトリル、Ｂ％：０％→１０％（１０ｍｉｎ、  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ、ＣＴ−２０３の場合）；６０℃；２ｍｌ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）にて分析した。但し、ＣＴ−２９２の場合は、Ｂ％：０％→３０％（１０ｍｉｎ、  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）で分析した。【０３４０】
ポリヌクレオチドＣＴ−２０３は、ＳＡＰで速やかに脱リン酸化され、脱リン酸体であるＣＴ−３２８と同じ保持時間を与えた（図１２Ａ、Ｂ、Ｃ参照）。一方、４−フェニルフェニルリン酸基を有しているポリヌクレオチドＣＴ−２９２は、ＳＡＰで処理しても脱リン酸化されることがなく、ＳＡＰに対して耐性であった（図１３Ａ、Ｂ、Ｃ参照）。【０３４１】
（試験例３）エキソヌクレアーゼに対する安定性試験
ポリヌクレオチド、ＣＴ−２０３及びＣＴ−２９２（図２参照。）のそれぞれ４００ｐｍｏｌを   ｂｕｆｆｅｒ  （５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、  ２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で総容量を１９μＬとし、１Ｕ  ５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（１μＬ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を加え、３０℃で加温した。１５、３０、４５分後に５μＬずつサンプルを停止溶液（１２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．２μＬ、Ｈ２Ｏ  ７μＬ）に加え、逆相ＨＰＬＣ（島津製作所製ＬＣ−１０ＶＰ、カラム（Ｍｅｒｃｋ，  Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ  （４．６×１００ｍｍ））、Ａ溶液：５％アセトニトリル、０．１Ｍ  酢酸トリエチルアミン水溶液（ＴＥＡＡ）、  ｐＨ７．０、Ｂ溶液：アセトニトリル、Ｂ％：０％→１０％（１０ｍｉｎ、  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ、ＣＴ−２０３の場合）；６０℃；２ｍｌ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）で反応液を分析した。但し、ＣＴ−２９２の場合は、Ｂ％：０％→３０％（１０ｍｉｎ、  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）で分析した。【０３４２】
ポリヌクレオチドＣＴ−２０３は、ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅで分解され、鎖長の短くなったものと考えられるピークが観察された（図１４参照）。一方、４−フェニルフェニルリン酸基を有しているポリヌクレオチドＣＴ−２９２は、ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅで処理してもピークの変化がなかった。このことは、ＣＴ−２９２は分解されることがなく、ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅに非常に耐性であることを示している（図１５参照）。【０３４３】
（試験例４）
試験例１と同様の方法で、以下のように２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。【０３４４】
（ａ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性解析１
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端に、置換を有するフェニルリン酸基または４−メチルベンジルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−３２０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３２２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３２３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３２６、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３２、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３５（構造は図１９参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３４５】
図２２に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−３２０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３２２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３２３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３２、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３３５は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。それらと比較して、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３２６は、β−カテニン遺伝子発現抑制活性が低かった。このことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルリン酸基を有している天然型２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３４６】
（ｂ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性解析２
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端に、置換を有するフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−３５１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３５２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３５３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３５４、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３５５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３５９、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３６０（構造は図１９参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３４７】
図２３に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−３５２、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３５３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３５４、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３５５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３５９、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３６０は、ＣＴ−１０６／ＣＴ−０４１と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。それらと比較して、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３５１は、β−カテニン遺伝子発現抑制活性が低かった。このことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルリン酸基を有している天然型２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３４８】
（ｃ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性解析３
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端に、置換を有するフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−３６５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３６６、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３６７、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３６８、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３６９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３７０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３７１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３７３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３７４、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３７５（構造は図２４参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３４９】
図２５に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−３６５、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３６６、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３６７、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３６８、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３６９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３７０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３７１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３７３、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３７４、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３７５は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルリン酸基を有している天然型２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３５０】
（ｄ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析４
ＤＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端に４−（トリフルオロメトキシ）フェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−３１５、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−００１／ＣＴ−００５のアンチセンス鎖５’末端に４−（トリフルオロメトキシ）フェニルリン酸基が結合したＣＴ−００１／ＣＴ−３７７、ＲＮＡ及びＤＮＡ２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６５／ＣＴ−１６６のアンチセンス鎖５’末端に４−（トリフルオロメトキシ）フェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６５／ＣＴ−３７８、ＤＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−２７８／ＣＴ−２８０のアンチセンス鎖５’末端に４−（トリフルオロメトキシ）フェニルリン酸基が結合したＣＴ−２７８／ＣＴ−３７９（構造は図２６参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３５１】
図２８に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−３１５は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−００１／ＣＴ−３７７は、ＣＴ−００１／ＣＴ−００５と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６５／ＣＴ−３７８は、ＣＴ−１６５／ＣＴ−１６６と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−２７８／ＣＴ−３７９は、ＣＴ−２７８／ＣＴ−２８０と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。これらのことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルリン酸基を持つＤＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチド、ＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチド、ＲＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３５２】
（試験例５）
試験例１と同様の方法で、以下のように２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。但し、ウエスタンブロット解析は以下のように行った。【０３５３】
（１）ウエスタンブロット解析
各サンプル（蛋白質量として５μｇ分）をポリアクリルアミドゲル電気泳動（５−２０％  グラジエントゲル）によって分離し、ニトロセルロース膜に電気的に転写した。５％スキムミルク液でブロッキング後、一次抗体としてウサギ抗ＭＣＬ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＭＣＬ１蛋白質を検出した。陰性対象としてβ−カテニン蛋白質を抗β−カテニン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。各蛋白質の検出は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を基質として使用した時に生じた化学発光によってＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｆｉｌｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を感光させることで可視化して実施した。【０３５４】
（２）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析１
ＲＮＡ及びＤＮＡ２本鎖ポリヌクレオチドＭＣ−００６／ＭＣ−００７のアンチセンス鎖５’末端に４−（トリフルオロメトキシ）フェニルリン酸基が結合したＭＣ−００６／ＭＣ−０１５、ＤＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチドＭＣ−００８／ＭＣ−００９のアンチセンス鎖５’末端に４−（トリフルオロメトキシ）フェニルリン酸基が結合したＭＣ−００８／ＭＣ−０１６（構造は図２７参照。）のＭＣＬ１遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３５５】
図３０に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＭＣ−００６／ＭＣ−０１５は、ＭＣ−００６／ＭＣ−００７と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。２本鎖ポリヌクレオチドＭＣ−００８／ＭＣ−０１６は、ＭＣ−００８／ＭＣ−００９と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。これらのことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルリン酸基を持つＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチド、ＤＮＡ及び２’−ＯＭｅＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３５６】
（試験例６）
試験例１と同様の方法で、以下のように２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。
（ａ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析１
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端に、置換を有するフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−３８０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３８１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３８２、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３８３（構造は図３１参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３５７】
図３３に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−３８０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３８１、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３８２、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３８３は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルリン酸基を有している２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
（ｂ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析２
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端に、置換を有するフェニルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−３８７、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３８８、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３８９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３９０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３９１、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３９２（構造は図３４参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３５８】
図３５に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−３８７、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３８８、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３８９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３９０、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３９１、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−３９２は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するフェニルリン酸基を有している２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。【０３５９】
（試験例７）
以下のように１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチドによるヒトβ−カテニン遺伝子発現抑制活性の強さを比較した。【０３６０】
（１）トランスフェクション
ヒト大腸癌ＳＷ４８０細胞株（ヒト大腸腺癌由来）を、１０％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中に１０００００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製した。そして、１２穴平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１ｍＬずつ播種し、３７℃、５．０％炭酸ガス下で１日間培養した。リポフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を７．５μＬ、１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチド溶液を最終濃度が、０．３、０．０３、および０．００３ｎＭとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地中で混合し、２０分室温で静置した。各ウェルに混合液を添加して、さらに３日間培養を継続した。【０３６１】
（２）リアルタイムＰＣＲ
トランスフェクション後、ウェルより培養上清を除いて、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）でｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡをｉＳｃｒｉｐｔＴＭｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて説明書の記載に従い０．５μｇＲＮＡよりｃＤＮＡを調製した。次に、リアルタイムＰＣＲのためにヒトβ−カテニン遺伝子ＰＣＲプライマー（ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  ＩＤ：  ＨＡ１３５６６４、タカラバイオ社製）、内部標準としてヒト−ＧＡＰＤＨ遺伝子に対するＰＣＲプライマー（ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  ＩＤ：  ＨＡ０６７８１２、タカラバイオ社製）及びＰＣＲに必要な薬剤を含むリアルタイムＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて次のようにｍＲＮＡの定量を行った。９６穴ＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）１ウェルあたり、リアルタイムＰＣＲキットに含まれる２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを２５μＬ、ＲＮａｓｅ―Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒを１８μＬ、各ＰＣＲプライマーを５μＬ（最終濃度  ０．３μＭ）、調製したｃＤＮＡ溶液を２μＬ添加して総量を５０μＬとし、Ｍｘ３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）にセットし、以下の条件でＰＣＲを実施した。
ＰＣＲ初期活性化  ９５℃、１５分間
ＰＣＲ  ９４℃、１５秒間
５６℃、３０秒
７２℃、３０秒
このＰＣＲサイクルは４０回繰り返した。検量線は、リポフェクション試薬のみで処理した細胞（＝ＮＣ）から抽出したｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡ５倍希釈列したものを用いた。検量線を元に、各トランスフェクタントのヒトβ−カテニンとヒトＧＡＰＤＨを定量し、ヒトβ−カテニン遺伝子量をヒトＧＡＰＤＨ量で割った相対量をグラフにプロットした。リアルタイムＰＣＲはＮ＝２で実施し、グラフにはその平均を示した（２本鎖ポリヌクレオチドの構造及びそのヌクレオチド配列は図３７及び図３９に示している。）
（３）リアルタイムＰＣＲ解析
（ａ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析１
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端に、置換を有するピリジルリン酸基が結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−４３９、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−４５８、また２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端に、チロシンが結合したＣＴ−１６９／ＣＴ−４５７（構造は図３７及び３９参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３６２】
図３８、４０に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−４３９、ＣＴ−１６９／ＣＴ−４５７、及び、ＣＴ−１６９／ＣＴ−４５８は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。このことは、アンチセンス鎖５’末端に置換基を有するピリジルリン酸基、または、チロシンを有している２本鎖ポリヌクレオチドが強い遺伝子の発現抑制活性を有することを示す。
（ｂ）２本鎖ポリヌクレオチドの遺伝子抑制活性解析２
２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７のアンチセンス鎖５’末端を芳香族置換基を用いて修飾した２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−４３８（構造は図３７参照。）のβ−カテニン遺伝子発現抑制活性を調べた。【０３６３】
図３８に示すように、２本鎖ポリヌクレオチドＣＴ−１６９／ＣＴ−４３８は、ＣＴ−１６９／ＣＴ−１５７と同様にβ−カテニン遺伝子の発現を強く抑制した。
【産業上の利用可能性】
【０３６４】
本発明により、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する２本鎖ポリヌクレオチドを提供することができた。また、本発明により、ＲＮＡ分解酵素に対して安定で、ＲＮＡ干渉作用及び／又は遺伝子発現抑制作用を有する２本鎖ポリヌクレオチドを提供することができた。【０３６５】
該２本鎖ポリヌクレオチドは遺伝子の機能解析、医薬品等に利用することが可能であるが、本２本鎖ポリヌクレオチドが利用できる限りにおいてその産業分野は制限されない。
【配列表フリーテキスト】
【０３６６】
配列番号１：センス鎖
配列番号２：アンチセンス鎖
配列番号３：アンチセンス鎖
配列番号４：アンチセンス鎖
配列番号５：センス鎖
配列番号６：アンチセンス鎖
配列番号７：センス鎖
配列番号８：アンチセンス鎖
配列番号９：センス鎖
配列番号１０：アンチセンス鎖
配列番号１１：アンチセンス鎖
配列番号１２：アンチセンス鎖
配列番号１３：センス鎖
配列番号１４：センス鎖
配列番号１５：アンチセンス鎖
配列番号１６：アンチセンス鎖
配列番号１７：センス鎖
配列番号１８：センス鎖
配列番号１９：アンチセンス鎖
配列番号２０：アンチセンス鎖
配列番号２１：アンチセンス鎖
配列番号２２：センス鎖
配列番号２３：センス鎖
配列番号２４：センス鎖
配列番号２５：センス鎖
配列番号２６：センス鎖
配列番号２７：センス鎖
配列番号２８：センス鎖
配列番号２９：センス鎖
配列番号３０：センス鎖
配列番号３１：アンチセンス鎖
配列番号３２：アンチセンス鎖
配列番号３３：アンチセンス鎖
配列番号３４：アンチセンス鎖
【図１】
2011052715.tif 000032
【図２】
2011052715.tif 000033
【図３】
2011052715.tif 000034
【図４】
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【図５】
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【図６】
2011052715.tif 000037
【図７】
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【図８】
2011052715.tif 000039
【図９】
2011052715.tif 000040
【図１０】
2011052715.tif 000041
【図１１】
2011052715.tif 000042
【図１２】
2011052715.tif 000043
【図１３】
2011052715.tif 000044
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2011052715.tif 000047
【図１７】
2011052715.tif 000048
【図１８】
2011052715.tif 000049
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
2011052715000001.app
【国際調査報告】
2011052715.tif 000072
2011052715.tif 000073
2011052715.tif 000074
2011052715.tif 000075
2011052715.tif 000076
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