(57)【要約】  本発明により、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を含む、開花誘導剤が提供される。（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質、（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質。この開花誘導剤は、植物体外から植物体内に投与することができる。
2011059051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を含む、開花誘導剤。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、請求項１記載の開花誘導剤。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含む、開花誘導剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項４】
前記（ｃ）のDNAが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAである、請求項３記載の開花誘導剤。
【請求項５】
配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、請求項１記載の開花誘導剤。
【請求項６】
配列番号３記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含む、請求項３記載の開花誘導剤。
【請求項７】
果樹の開花誘導に用いられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の開花誘導剤。
【請求項８】
果樹がカンキツである、請求項７記載の開花誘導剤。
【請求項９】
カンキツがウンシュウミカンである、請求項８記載の開花誘導剤。
【請求項１０】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
【請求項１１】
前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項１３】
前記（ｃ）のDNAが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて植物を処理する、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
配列番号３記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理する、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が、果樹の開花誘導に用いられる、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
果樹がカンキツである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
カンキツがウンシュウミカンである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
植物が、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物である、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質を投与した植物を、開花誘導の目的の植物の隣に配置することを含む、請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、開花誘導剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
カンキツなどの果樹は、発芽後一定の年数を経過しないと花を着けない。花などの生殖器官に対し、葉や茎のことを栄養器官というが、花を着けない期間に、果樹は、栄養器官のみを茂らせる栄養成長を続ける。この栄養成長を続ける期間のことを幼若期という。カンキツ交雑実生では、幼若期は8〜12年に及ぶ。幼若期の後に、成熟期に入る。この成熟期間では、果樹は、生殖生長（栄養生長に対する言葉で、開花・結実など生殖に関係する生育過程を生殖生長という。）を行い、開花がおこる。【０００３】
果樹栽培では、しばしば接木を行う。接ぎ木を行う理由の一つは、果樹は幼若期が長いという問題を克服するためである(非特許文献１：Nobuhito Mitani, Ryoji Matsumoto, Terutaka Yoshioka, and Takeshi Kuniga (2008) “Citrus hybrid seedlings reduce initial time to flower when grafted onto shiikuwasha rootstock” Scientia Horticulturae 116, 452-455.)。カンキツの１つであるウンシュウミカンの場合、カラタチの台木に、成熟期のウンシュウミカンの穂木を、接木することがしばしば行われる。この場合、穂木は、成熟期にある。したがって、穂木は、本来、花芽形成能をもつ。しかしながら、穂木は、接木後しばらくは栄養生長のみを行い、花芽形成がおこらない。この穂木の部分（接ぎ木苗の部分）の栄養生長期間を、栄養的成熟期という。栄養的成熟期は４年程度続くことが一般的である。しかし、栽培経費の削減、投入した経費の早期回収及び品種改良の効率化の観点から、栄養的成熟期を短くする方法の開発が求められていた。【０００４】
ここで、開花に関連する遺伝子として、「開花遺伝子座Ｔ（Flowering Locus T）」の遺伝子（以下、「FT遺伝子」という）が知られている。このFT遺伝子がコードしているタンパク質を、FTタンパク質と呼ぶ。図１のように、FTタンパク質は、日長などの環境の変化に応じて葉で合成された後、芽に移行し、花芽形成を誘導することが既にわかっている（非特許文献２：Laurent Corbesier, Coral Vincent, Seonghoe Jang, Fabio Fornara, Qingzhi Fan, Iain Searle, Antonis Giakountis, Sara Farrona, Lionel Gissot, Colin Turnbull, and George Coupland (2007) “FT Protein Movement Contributes to Long-Distance Signaling in Floral Induction of Arabidopsis” Science 316, 1030 - 1033.）。このように、葉で合成された後、芽に移行し、花芽形成を誘導する物質のことを花成ホルモンというが、FTタンパク質はこの花成ホルモンの本体であると考えられている。【０００５】
シロイヌナズナのFT遺伝子を用いて、シロイヌナズナの開花の時期を早める研究が進んでいる。例えば、特許文献１（特表2002-511270号公報）に記載の方法では、FTタンパク質を植物体で高発現させるために、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの後ろにFT遺伝子をつないだものを含むDNA断片をシロイヌナズナに導入し、遺伝子組換えシロイヌナズナを作っている。結果として、開花の時期が早まった遺伝子組換えシロイヌナズナが得られている。【０００６】
同様の研究は、カンキツでも行われている（非特許文献３：Tomoko Endo, Takehiko Shimada, Hiroshi Fujii, Yasushi Kobayashi, Takashi Araki, and Mitsuo Omura (2005) “Ectopic expression of an FThomolog from citrus confers an early flowering phenotype on trifoliate orange (Poncirus trifoliata L. Raf.)”Transgenic Research 14, 703-712.）。この研究ではシロイヌナズナのFT遺伝子と高い相同性があるウンシュウミカン（Citrus unshiu Marc.）由来のCiFT遺伝子を用いている。この方法では、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの後ろにCiFT遺伝子をつないだものを含むDNA断片をカラタチ（Poncirus trifoliata）に導入し、遺伝子組換えカラタチを作っている。結果として、カラタチの開花の時期が早まっている。より詳細には、上胚軸が現れてから、最小半年程度で開花が見られている。【０００７】
これら従来技術は、いずれも遺伝子組換え植物を用いて、FTタンパク質（上記のCiFTタンパク質のような、シロイヌナズナのFTタンパク質と高い相同性を有するタンパク質も、本明細書では、単に「FTタンパク質」という場合がある。）を植物体で高発現させている。しかし、遺伝子組換え植物を用いる方法には、いくつかの留意事項がある。【０００８】
一つは、この開花が早い植物が遺伝子組換え植物であるという点である。遺伝子組換え植物には法的な制約が多いので、圃場で遺伝子組換え植物を栽培できるようになるまでには、時間を要する。また、遺伝子組換え植物に対する消費者の理解が進んでいないという現状がある。【０００９】
もう一つは、きわめて若い植物で、花芽が形成される場合があることである（非特許文献３：Tomoko Endo, Takehiko Shimada, Hiroshi Fujii, Yasushi Kobayashi, Takashi Araki, and Mitsuo Omura (2005) “Ectopic expression of an FT homolog from citrus confers an early flowering phenotype on trifoliate orange (Poncirus trifoliata L. Raf.)” Transgenic Research 14, 703-712.）。果実ができると、葉の生育、ひいては植物体の生育が阻害を受ける。そのため、早すぎる花芽形成は、若い植物体にとって大きな負担となるため、植物の生育にとっても果実の生産にとっても望ましいものではない場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表2002-511270号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Nobuhito Mitani, Ryoji Matsumoto, Terutaka Yoshioka, and Takeshi Kuniga (2008) “Citrus hybrid seedlings reduce initial time to flower when grafted onto shiikuwasha rootstock” Scientia Horticulturae 116, 452-455.
【非特許文献２】Laurent Corbesier, Coral Vincent, Seonghoe Jang, Fabio Fornara, Qingzhi Fan, Iain Searle, Antonis Giakountis, Sara Farrona, Lionel Gissot, Colin Turnbull, and George Coupland (2007) “FT Protein Movement Contributes to Long-Distance Signaling in Floral Induction of Arabidopsis” Science 316, 1030 - 1033.
【非特許文献３】Tomoko Endo, Takehiko Shimada, Hiroshi Fujii, Yasushi Kobayashi, Takashi Araki, and Mitsuo Omura (2005) “Ectopic expression of an FThomolog from citrus confers an early flowering phenotype on trifoliate orange (Poncirus trifoliata L. Raf.)”Transgenic Research 14, 703-712.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記状況において、遺伝子組換えによらずに開花を誘導できる技術、すなわち、植物体外から植物体内に投与することができる開花誘導剤などが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、所定のFTタンパク質を植物体外から植物体内に投与することで、遺伝子組換え植物の作出を行わないで、投与した植物体、および、投与した植物体に隣接する植物体の開花時期を早めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は、以下に示す、開花誘導剤、開花誘導方法などを提供する。
[１]  以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を含む、開花誘導剤。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
[２]  前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、上記[１]記載の開花誘導剤。
[３]  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含む、開花誘導剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
[４]  前記（ｃ）のDNAが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAである、上記[３]記載の開花誘導剤。
[５]  配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、上記[１]記載の開花誘導剤。
[６]  配列番号３記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含む、上記[３]記載の開花誘導剤。
[７]  果樹の開花誘導に用いられる、上記[１]〜[６]のいずれか１項に記載の開花誘導剤。
[８]  果樹がカンキツである、上記[７]記載の開花誘導剤。
[９]  カンキツがウンシュウミカンである、上記[８]記載の開花誘導剤。
[１０]  以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
[１１]  前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、上記[１０]記載の方法。
[１２]  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNA
[１３]  前記（ｃ）のDNAが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAである、上記[１２]記載の方法。
[１４]  配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて植物を処理する、上記[１０]記載の方法。
[１５]  配列番号３記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理する、上記[１２]記載の方法。
[１６]  前記タンパク質が、果樹の開花誘導に用いられる、上記[１０]〜[１５]のいずれか１項に記載の方法。
[１７]  果樹がカンキツである、上記[１６]記載の方法。
[１８]  カンキツがウンシュウミカンである、上記[１７]記載の方法。
[１９]  植物が、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物である、上記[１０]〜[１８]のいずれか１項に記載の方法。
[２０]  前記タンパク質を投与した植物を、開花誘導の目的の植物の隣に配置することを含む、上記[１０]〜[１９]のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、植物体外から植物体内に投与することができる開花誘導剤を提供する。本発明の好ましい態様の開花誘導剤は、果樹の外から果樹内に投与することで開花までの期間を短くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】FTタンパク質が花芽形成を誘導する過程を説明するための図である。
【図２】PCR産物のプラスミドpET-28b(+)へのクローニングの過程を説明するための図である。
【図３】各植物のFTタンパク質間のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。
【図４】本発明のタンパク質が精製されたことを示す図である。
【図５】一年生苗木を示す写真である（2009年4月撮影）。
【図６】本発明の開花誘導剤の注入方法の一例を示す写真である。
【図７】本発明の開花誘導剤の注入方法の別の例を示す写真である。
【図８】表１のNo.3の植物が着花している様子を示す写真である。
【図９】表２のNo.21の植物が着花している様子を示す写真である。
【図１０】表３のNo.24の植物が着花している様子を示す写真である。
【図１１】注入方法2で処理した植物から2.9 m離れた植物に着花が見られない様子を示す写真である。
【図１２】花成フェロモンにより開花が誘導されるという仮説を説明する図である。
【図１３】珠心胚実生高接ぎの開花への影響を示すグラフである。cont-1〜cont-3はFT処理区から2.9 m離れたものの結果であり、それぞれ表4のNo.37, No.36及びNo.35の植物に対応する。図中のNS（nucellar seedling、珠心胚実生）の後のSep、Oct、NovはFT処理した月を指す。括弧内の数値は珠心胚実生の幹経を指す。Leafy flowersは有葉花（着花枝）、leafless flowersは直花、vegetative shootsは発育枝（無着花枝）を指す。
【図１４】珠心胚実生の幹経と着花数の関係を示すグラフである(r＝−0.659 (n＝10))。
【図１５】珠心胚実生の高さと着花数の関係を示すグラフである(r＝−0.3407 (n＝10))。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願2009-260847号(2009年11月16日出願)の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を包含する。
【００１８】
（１）本発明の概要
本発明は、FTタンパク質（以下、本発明のタンパク質と呼ぶ場合がある。）を有効成分として含有する開花誘導剤である。本発明の開花誘導剤は、植物体外から植物体内に投与することができる。これまでのところ、植物体外から植物体内にFTタンパク質を投与することで、植物体の開花時期を早めることができたという報告はない。
【００１９】
本発明者らは、ウンシュウミカンの葉から抽出したRNAを鋳型として、シロイヌナズナのFT遺伝子と高い相同性を有するCiFT2遺伝子のcDNAを単離した。CiFT2遺伝子のcDNAをプラスミドpET-28b(+)へクローニングし、CiFT2遺伝子を挿入したプラスミドを構築した。このプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し形質転換体を得た。得られた形質転換体を用いてCiFT2タンパク質を生産した。
【００２０】
生産したCiFT2タンパク質を、一年生苗木に投与した。この一年生苗木は、カラタチを台木とし、これにウンシュウミカンを穂木として接木し、12ヵ月経過したものである。この一年生苗木の接ぎ木部上部の主幹にCiFT2タンパク質を投与した。その結果、CiFT2タンパク質投与群では、投与から5〜13ヵ月後の4月〜5月にかけて、有葉花の着花が多く見られた。また、CiFT2タンパク質投与群の隣に配置したCiFT2タンパク質未投与群においても、有葉花の着花が多く見られた。有葉花は、葉を伴った花であり、花だけの花芽である直花と比較して、結実率が高く、また、そこから生じる果実も品質の良いことが多い。
【００２１】
（２）本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列を含むものである。配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質は、例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００２２】
また、本発明のタンパク質は、前記のものに限定されることはなく、配列番号２記載のアミノ酸配列の全部または一部を含むタンパク質であって、かつ開花誘導活性を有するタンパク質を含むものである。
【００２３】
ここで、「開花誘導活性」とは、植物の開花の時期を通常の開花時期よりも早める活性、植物の開花を促進する活性などを意味する。
【００２４】
また、本発明のタンパク質には、配列番号２記載のアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、さらに特に好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質も含まれる。
【００２５】
上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列の同一性は、BLAST（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。BLASTを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２６】
さらに、配列番号２記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。
【００２７】
配列番号２記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸に欠失、置換および／または付加の変異が生じたアミノ酸配列としては、例えば（i）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号２記載のアミノ酸配列の１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（iii）配列番号２記載のアミノ酸配列に１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iv）配列番号２記載のアミノ酸配列に１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（v）上記（i）〜（iv）を組み合わせたアミノ酸配列が挙げられる。
【００２８】
さらに、後述の本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。
【００２９】
本発明のタンパク質はさらに精製のためのペプチド配列および／または分泌シグナルペプチドを含んでいてもよい。精製のためのペプチド配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、例えば、ヒスチジン残基が４残基以上、好ましくは６残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、Ｔ７タグ配列、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列またはプロテインＡのアミノ酸配列などがあげられる。分泌シグナルペプチドとは、当該分泌シグナルペプチドに結合されたタンパク質を、細胞膜透過させる役割を担うペプチド領域を意味する。このような分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、当技術分野において周知であり、報告されている（例えばvon Heijine G (1988) Biochim. Biohys. Acra 947: 307-333、von Heijine G (1990) J. Membr. Biol. 115: 195-201など参照）。分泌シグナルペプチドとしては、より具体的には、例えば、大腸菌の外膜タンパク質A由来の分泌シグナルペプチド（ompA）（Ghrayeb, J. et al. (1984) EMBO J. 3:2437-2442）、コレラ菌由来コレラトキシン由来の分泌シグナルペプチドなどがあげられる。
【００３０】
本発明のタンパク質はさらに切断のためのペプチド配列を含んでいてもよい。切断のためのペプチド配列は、目的タンパク質から、精製のためのペプチド配列および／または分泌シグナルペプチドを切り離すための配列であり、例えば、トロンビン認識配列などが挙げられる。
【００３１】
本発明の一つの態様のタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号４に示す。このタンパク質は、配列番号２記載のアミノ酸配列の後方に、トロンビン認識部位、T7タグおよびヒスチジンタグが順に融合されたタンパク質である。
【００３２】
本発明のタンパク質の取得方法については特に制限はない。本発明のタンパク質としては、化学合成により合成したポリペプチドでもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質であってもよい。本発明のタンパク質を化学合成する場合には、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等により合成することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。本発明のタンパク質を遺伝子組換え技術により作製する場合には、通常の遺伝子組換え手法により作製することができる。より具体的には、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を作製することができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現系での発現などについては、後記する。
【００３３】
（３）本発明の遺伝子
本発明の遺伝子は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子である。本発明のタンパク質は前述のとおりである。本発明の遺伝子は、例えば、配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAを含むものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の遺伝子には、配列番号１記載の塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、さらに特に好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列であって、開花誘導活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
【００３５】
上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、塩基配列の同一性は、BLAST（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。BLASTを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００３６】
また、本発明の遺伝子には、上記のDNAのほか、配列番号１記載の塩基配列において、１個または数個の塩基に欠失、置換および／または付加の変異が生じた塩基配列であって、開花誘導活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAが含まれる。
【００３７】
また、本発明の遺伝子には、配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。これらの遺伝子などは本発明の遺伝子に含まれる。
【００３８】
ストリンジェントな条件としては、例えば、DNAを固定したナイロン膜を、６×SSC（１×SSCは塩化ナトリウム8.76g 、クエン酸ナトリウム4.41g を１リットルの水に溶かしたもの）、１％ SDS、100μg／mlサケ精子DNA、0.1％ ウシ血清アルブミン、0.1％ ポリビニルピロリドン、0.1％ フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件をあげることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。
【００３９】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）等を参照することができる。
【００４０】
以下に、ハイブリダイゼーションにより本発明の遺伝子を得る方法の一例を示すが、これに限定されるわけではない。
まず、適当な遺伝子源から得たDNAを常法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してDNAライブラリーを作製する。このライブラリーを適当な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培養し、生育したコロニーまたはプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理の後にDNAを膜に固定する。この膜をあらかじめ32Ｐ等で標識したプローブを含む上記の組成の溶液中、上記のストリンジェントな条件で保温し、ハイブリダイゼーションを行う。プローブとしては、配列番号２記載のアミノ酸配列の全部または一部をコードするポリヌクレオチドを含有していればよく、たとえば配列番号１記載の塩基配列の全部または一部からなるポリヌクレオチドまたはそれを含むポリヌクレオチドを使用することができる。
【００４１】
ハイブリダイゼーションの終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成クローンを単離できるまで繰り返す。
【００４２】
こうして得られたクローンの中には、目的の開花誘導活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が保持されている。そして、クローンから目的の遺伝子を得るには、アルカリ-SDS法などの公知のポリヌクレオチド抽出方法を使用する。
【００４３】
また、配列番号１記載の塩基配列において１個または数個の塩基に欠失、置換および／または付加の変異が生じた塩基配列としては、例えば（i）配列番号１記載の塩基配列において、１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が欠失した塩基配列、（ii）配列番号１記載の塩基配列の１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、（iii）配列番号１記載の塩基配列に１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が付加した塩基配列、（iv）配列番号１記載の塩基配列に１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が挿入された塩基配列、（v）上記（i）〜（iv）を組み合わせた塩基配列が挙げられる。
【００４４】
このように種々のDNAが本発明の遺伝子の範囲内に含まれるのは、以下の理由によるものである。即ち、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、あるアミノ酸配列をコードする遺伝子は多数存在することができる。
【００４５】
遺伝子は自然界において必ずしも安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異によっては、コードされるアミノ酸配列に変化を与えない変異（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。
【００４６】
さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
【００４７】
例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている。
【００４８】
このように、特定のアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子は人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。したがって、本発明中に開示された塩基配列と同一の遺伝子ではなくても、開花誘導活性を示すタンパク質をコードするDNAである限り、本発明の遺伝子に含まれるものである。
【００４９】
また、遺伝子に変異を導入することによって、１個または数個のアミノ酸に欠失、置換および／または付加の変異を導入することもできる。アミノ酸配列と遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社）等を用いることができる。
【００５０】
本発明において、DNAの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００５１】
塩基配列の決定は、プラスミドベクターを用いて作製された形質転換体の場合、宿主が大腸菌（エシェリヒア・コリ）であれば試験管等で培養を行い、常法に従ってプラスミドを調製する。得られたプラスミドをそのまま鋳型とするか、あるいは挿入断片を取り出してM13ファージベクター等にサブクローニングした後に、ジデオキシ法等により塩基配列を決定する。ファージベクターで作製された形質転換体の場合も基本的に同様な操作により塩基配列を決定することができる。これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば、T.ManiatisらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual等に記載されている。また、市販のシークエンサー（Applied Biosystems 3130 ジェネェテェックアナライザ（ライフテクノロジーズ社製）、ABI PRISM 3100 DNAアナライザ（ライフテクノロジーズ社製）など）により、配列を自動決定することもできる。
【００５２】
得られた遺伝子が目的のタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかの確認は、決定された塩基配列を配列番号１記載の塩基配列と比較して行うことができる。あるいは決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号２記載のアミノ酸配列と比較して行うことができる。
【００５３】
本発明の遺伝子は、精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、DNA）および／または分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、DNA）を含んでいてもよい。精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどがあげられる。分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、当記述分野において知られている分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。分泌シグナルペプチドとしては、前記したものなどがあげられる。
【００５４】
本発明の遺伝子はさらに切断のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、DNA）を含んでいてもよい。切断のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている切断のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。切断のためのペプチド配列としては、前記したものなどがあげられる。
【００５５】
本発明の一つの態様の遺伝子に含まれるDNAの塩基配列を、配列番号３に示す。このDNAは、配列番号１記載の塩基配列からなるDNAの後方に、トロンビン認識部位をコードするDNA、Ｔ７タグをコードするDNAおよびヒスチジンタグをコードするDNAが順に融合されたDNAである。
【００５６】
（４）本発明のタンパク質の製造方法
本発明のタンパク質を製造するには、まず本発明のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターを作製する。そして、この組換えベクターで形質転換された形質転換体を作製し、これを培養して、培養物中より開花誘導活性を有するタンパク質を採取することにより本発明のタンパク質を製造することができる。
【００５７】
本発明の遺伝子を含む組換えベクターは、本発明の範囲に含まれる。
【００５８】
本発明の組換えベクターは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび／またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターおよび／またはターミネーターを利用して、その間に当該タンパク質をコードする遺伝子を挿入すればよい。なお、ターミネーターを必ずしも必要としない場合がある。
【００５９】
本明細書において、プロモーターは、例えば、trcプロモーター、lacプロモーター、T7プロモーターなどをあげることができるが、これに限定されるわけではない。
【００６０】
本明細書において、ターミネーターは、例えば、trpオペロンターミネータ、T7ターミネーターをあげることができるが、これに限定されるわけではない。
【００６１】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法、相同組換えを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、SD配列やKozak配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
【００６２】
本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、pET-28 b (+)（Merck社）、pTrc99A（GEヘルスケアバイオサイエンス）、pACYC184（ニッポンジーン）、pMW118（ニッポンジーン）などを挙げることができる。また、必要に応じて、これらのベクターを改変したものを用いることもできる。
【００６３】
本発明の組換えベクターを宿主に導入することで、本発明の形質転換体を作製することができる。当該形質転換体も本発明の範囲に含まれる。
【００６４】
本発明において使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的のタンパク質を発現することができる限り、特に限定されるものではない。宿主としては、例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、枯草菌（バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis））、ロドコッカス菌（Rhodococcus）、放線菌などの細菌、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、カビ、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。本発明において、宿主は好ましくは大腸菌である。
【００６５】
本発明において、大腸菌は、例えば、大腸菌K12株やB株、あるいはそれらの野生株由来の派生株である、JM109株、XL1-Blue株（例えば、XL1-Blue MRF’）、K802株、C600株、Origami B(DE3)株などを挙げることができる。
【００６６】
宿主への組換えベクターの導入方法としては、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではなく、当業者であれば公知技術から適宜選択することができる。このような方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００６７】
本発明の形質転換体を培養して、培養物から開花誘導活性を有するタンパク質を採取することにより、本発明のタンパク質を製造することができる。
【００６８】
本発明において「培養物」とは、菌体、培養液、無細胞抽出液、細胞膜などの培養により得られるものを意味する。無細胞抽出液は、培養後の菌体を、例えばリン酸ナトリウム緩衝液を加えてホモジナイザーなどで物理的に破砕した後、遠心し、破砕できない菌体（細胞）が存在しないように上清を回収して得ることができる。細胞膜は、上記遠心で得られたペレットとして得ることができ、また、ペレットを溶解バッファーで懸濁することにより得ることもできる。
【００６９】
本発明のタンパク質は、培養物をそのまま用いてもよいし、透析や硫安沈殿などの公知の方法、あるいはゲルろ過、イオン交換、アフィニティー等の各種クロマトグラフィーなどの公知の方法を単独または適宜組み合わせることによって、培養物から濃縮、精製したものを用いてもよい。この場合、分子量、等電点などを指標に濃縮、精製することができる（例えば、SDS-PAGE）。
【００７０】
用いる発現系によっては、形質転換体中で発現された本発明のタンパク質が不溶物［封入体（inclusion body）］として蓄積される場合がある。この場合にはこの不溶物を回収し、穏和な変性条件、たとえば尿素等の変性剤存在下で可溶化した後に変性剤を除くことによって活性型のタンパク質を得ることができる。さらにクロマトグラフィー操作などを行って目的とする開花誘導活性を有するタンパク質を精製することができる。
【００７１】
また、上記で得られた遺伝子をプローブとしてストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行えば、得られた遺伝子（例えば、配列番号１記載の塩基配列からなるDNAを含む遺伝子）と配列は少し異なるが、同様な開花誘導活性を持つタンパク質をコードする遺伝子を得ることができ、これも本発明の範囲内のものである。
【００７２】
得られた遺伝子が目的のタンパク質をコードする領域の全てを含まない場合には、得られた遺伝子の塩基配列をもとにしてプライマーを合成し、これを用いたPCRによって不足する領域を増幅したり、あるいは得られた遺伝子の断片をプローブとしてDNAライブラリーのスクリーニングを繰り返すことにより、全コード領域を得ることができる。
【００７３】
こうして得られた本発明の遺伝子を含有する形質転換体を作製して該遺伝子によりコードされる本発明のタンパク質を発現させ、さらに発現させたタンパク質を精製することができる。形質転換体の作製、タンパク質の発現および精製はいずれも上記と同様の方法で行うことができる。こうして得られたタンパク質も本発明に含まれる。
【００７４】
また、本発明においては、本発明の遺伝子または本発明のベクターから、本発明のタンパク質を製造することも可能である。すなわち、本発明においては、いわゆる無細胞タンパク質合成系を採用して、本発明のタンパク質を産生することが可能である。
【００７５】
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
【００７６】
ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来または原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。
【００７７】
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（PEG）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTMSystem（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
【００７８】
上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる本発明のタンパク質は、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、濃縮、精製することができる。
【００７９】
（５）本発明の開花誘導剤および開花誘導剤方法
本発明の開花誘導剤は、本発明のタンパク質を有効成分として含むものであり、当該開花誘導剤を植物体に投与することにより、植物体の開花を誘導することができる。また、上記開花誘導剤を製造するため、本発明のタンパク質を使用することができる。
【００８０】
本発明の開花誘導剤の投与対象の植物は、花を着ける植物であれば特に限定されず、果樹、マツ・スギ・ヒノキ等の樹木、ツツジ・ツバキ・サザンカ等の花木（観賞樹木）、ニンジン・キュウリ・ダイコン・カボチャ・ナス・トマト・キャベツ・ジャガイモ・ハクサイ・シュンギク・コマツナ・ピーマン・ネギ・タマネギ・レタス・ショウガ・ ニンニク・イチゴなどの野菜、イネ・コムギ・トウモロコシなどの穀物、キク・チューリップ・バラなどの花卉、ダイズ・エンドウなどの豆類、モデル植物のシロイヌナズナ等が挙げられる。投与対象の植物は、好ましくは、発芽〜着花までの期間である幼若期が比較的長い（１０年以上、９年以上、８年以上、７年以上、６年以上、５年以上、４年以上または３年以上の）植物であり、例えば、果樹である。果樹は、木本性であること、他の農作物と比較して栽培本数が少ないことなどから、本発明の開花誘導剤の投与が比較的容易である。果樹として、カンキツ、キンカン、リンゴ、ウメ、モモ、ブドウ、ナシ、ビワ、カキ、イチジク等があげられる。
【００８１】
投与対象の植物は、より好ましくは、カンキツである。カンキツは、マンダリン類（例、ウンシュウミカン、ポンカン、タチバナ、紀州ミカン、キング、クレメンテイン、カラ等）、オレンジ類（例、バレンシアオレンジ、ネーブルオレンジ、ブラッドオレンジ、ハムリンオレンジ等）、グレープフルーツ（例、グレープフルーツ、スウィーティ、オロブランコ等）、香酸カンキツ類（例、ユズ、ダイダイ、カボス、スダチ、レモン、シイクワシャー、ライム、シトロン、ヘベス、ユコウ等）、雑柑（例、ナツミカン、川野ナツダイダイ（甘夏）、ハッサク、ヒュウガナツ、ジャバラ、河内晩柑、三宝柑、ナルト、キンコウジ等）、タンゴール（イヨカン、清見、はるみ、タンカン、マーコット、オータニーク等）、ダンゼロ（例、セミノール、ヤラハ、ミネオラ、オーランド等）、ブンタン類（例、カオファン、晩白柚、江上ブンタン、平戸ブンタン、麻豆ブンタン等）、カラタチ類（カラタチ、ヒリュウ、ルビドー等）、キンカン類（ニンポーキンカン、丸キンカン、長キンカン等）等が挙げられる。投与対象の植物は、さらに好ましくは、ウンシュウミカンである。
【００８２】
本発明のいくつかの好ましい態様では、投与対象の植物は、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物である。穂木は、上記した開花誘導剤の投与対象の植物を挙げることができ、好ましくは、上記の果樹であり、より好ましくは、上記のカンキツであり、さらに好ましくは、ウンシュウミカンである。また、台木としては、公知の台木を用いることができ、例えば、上記した開花誘導剤の投与対象の植物を挙げることができ、好ましくは、上記の果樹であり、より好ましくは、上記のカンキツであり、さらに好ましくは、カラタチである。
例えば、カンキツ交雑実生では、幼若期は８〜１２年に及ぶ。本発明の好ましい態様の開花誘導剤により、成熟相にある穂木を接ぎ木したカンキツを処理することで開花までの期間を少なくとも２年以内に短縮でき、結果として、早期にカンキツの果実を収穫できるようになる。
【００８３】
本発明の開花誘導剤は、本発明のタンパク質を有効成分として含有するものであり、本発明のタンパク質以外にも、通常用いられている担体、乳化剤、分散剤、展着剤、湿展剤、固着剤、崩壊剤などの補助剤を含有させることができる。
【００８４】
担体としては、例えば、水；エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；酢酸エチルなどのエステル類、並びに、固体担体、例えば、タルク、ベントナイト、クレー、カオリン、ケイソウ土、ホワイトカーボン、バーミキュライト、消石灰、ケイ砂、硫安、尿素などが例示される。
【００８５】
乳化剤または分散剤としては、通常、界面活性剤が用いられ、例えば高級アルコール硫酸ナトリウムなどの陰イオン系界面活性剤、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドなどの陽イオン系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどの非イオン系界面活性剤、などが例示される。
【００８６】
本発明の開花誘導剤の剤形は特に限定されず、乳剤、懸濁剤、粉剤、水和剤、水溶剤、粒剤、ペースト剤、エアゾール剤などが挙げられる。
【００８７】
本発明の開花誘導剤の使用時期および使用方法は、植物の種類などによって適宜選択することができるが、植物、例えば、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物に対して、注入する、吸収させる、などの方法が挙げられる。「注入する方法」では、植物体の茎、葉、根などから、スポイト、本発明の開花誘導剤を染み込ませた脱脂綿などを用いて、植物体に注入することができる。「吸収させる方法」では、本発明の開花誘導剤を植物体の茎、葉、根などに、直接、塗布する。この際、界面活性剤、展着剤等を共に用いても良い。また、別の「吸収させる方法」では、水耕栽培の際、養液中に本発明の開花誘導剤を加える方法がある。
【００８８】
本発明の開花誘導剤中の本発明のタンパク質の含有量及び本発明の開花誘導剤の投与量は、植物の種類、剤形、使用方法、使用時期などによって異なる。例えば、本発明の開花誘導剤をカンキツに水溶剤として注入する場合、本発明のタンパク質が20〜10000ppm、好ましくは50〜10000ppm、より好ましくは100〜10000ppmの濃度になる範囲で調整し、カンキツの生理的花芽分化期に、0.1〜5.0ml、好ましくは0.2〜2.0ml、より好ましくは0.5〜1.0mlの量で、カンキツに注入する。
【００８９】
また、本発明は、本発明のタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法を提供する。「本発明のタンパク質を用いて植物を処理する」ことには、本発明のタンパク質を目的の植物に投与すること、本発明のタンパク質を投与した植物を目的の植物の隣に配置することなどが含まれる。「隣に配置」することには、本発明のタンパク質を投与した植物の主幹（主幹は植物体のほぼ中心に位置する）からその隣に配置した植物の主幹までの距離にして、例えば、２ｍ以内、１．９ｍ以内、１．８ｍ以内、１．７ｍ以内、１．６ｍ以内、１．５ｍ以内、１．４ｍ以内、１．３ｍ以内、１．２ｍ以内、１．１ｍ以内、１ｍ以内、０．９ｍ以内、または０．８ｍ以内に配置することが含まれる。本発明の開花誘導方法において、投与対象の植物、補助剤、使用時期、使用方法、本発明のタンパク質の含有量、本発明の開花誘導剤の投与量等は、前記開花誘導剤で説明したのと同様である。
【００９０】
本発明の好ましい態様の開花誘導剤または開花誘導方法は、（a）結実の時期が早まることから結実までの栽培経費の削減ができること、(b) 結実の時期が早まることから開園時に投入した経費の早期回収につながること、および(c)早期に花が咲くことにより品種改良を効率化できること、からなる群から選択される少なくとも１つの効果を奏する。
【００９１】
本発明のさらに好ましい態様の開花誘導剤または開花誘導方法は、カンキツ、特にはウンシュウミカンの隔年結果を防止することができる。
【００９２】
また、本発明のいくつかの態様の開花誘導剤または開花誘導方法では、他の開花誘導方法として、遺伝子組換え植物を用いない。
【００９３】
尚、発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。
【実施例１】
【００９４】
１．CiFT2遺伝子のPCR
ウンシュウミカンの葉から抽出したRNAを鋳型として、FTの相補的DNAと高い相同性を示す相補的DNAをRT-PCR法で得た。具体的には、以下の方法で行った。RT-PCR法で使うプライマーは、ウンシュウミカンのCiFTのcDNA配列（アクセションナンバーAB027456、配列番号５）およびこれとDNA配列が99%一致するウンシュウミカンのCiFT2（アクセションナンバーAB301934、配列番号７）（Fumie Nishikawa, Tomoko Endo, Takehiko Shimada, Hiroshi Fujii, Tokurou Shimizu, Mitsuo Omura, and Yoshinori Ikoma  (2007) “Increased CiFT abundance in the stem correlates with floral induction by low temperature in Satsuma mandarin (Citrus unshiu Marc.).”J. Exp. Bot. 58, 3915-3927）のcDNA配列を元に設計した。尚、配列番号５および７の塩基配列から予測されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６および８に示す。【００９５】
TRIZOL（Invitrogen社）を用いて、添付の説明書に従って、ウンシュウミカンの葉からRNAを抽出した。抽出したRNAを鋳型とし、DNA配列がCAAATTAAGCATGTATGG（配列番号９）であるプライマーにより、Piero Carninci, Yoko Nishiyama, Arthur Westover, Masayoshi Itoh, Sumiharu Nagaoka, Nobuya Sasaki, Yasushi Okazaki, Masami Muramatsu, and Yoshihide Hayashizaki (1998) “Thermostabilization and thermoactivation of thermolabile enzymes by trehalose and its application for the synthesis of full length cDNA”Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 520-524.記載の条件に従って、SuperScript II（Invitrogen社）酵素により逆転写反応を行い、相補的DNAを得た。【００９６】
次に、この相補的DNAを鋳型にして、nested PCRを行うこととした。一回目のPCR反応には、DNA配列が以下の配列であるプライマーを用いた。
プライマー：CAAATTAAGCATGTATGG（配列番号１０）
プライマー：GTGCTTAGTGTTGTTGAG（配列番号１１）
そして、PCR反応を、上記プライマーを用い、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社）を用いて、添付の説明書に従って行った。反応は、98℃10秒、55℃15秒、68℃1分を1サイクルとして20回繰り返した。【００９７】
二回目のPCR反応には、DNA配列が以下の配列であるプライマーを用いた。
プライマー：AGGAGATATACCATGTCTAGCAGGGAGAGAGA（配列番号１２）
プライマー：CACCAGGCCGCTGCTTCGTCTGACAGGCCTTCCGC（配列番号１３）
そして、PCR反応を、上記プライマーを用い、PrimeSTAR GXL DNA Polymeraseを用いて、添付の説明書に従って行った。反応は、98℃10秒、55℃15秒、68℃1分を1サイクルとして20回繰り返した。【００９８】
三回目のPCR反応には、DNA配列が以下の配列であるプライマーを用いた。
プライマー：AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATG（配列番号１４）
プライマー：GCCATATGGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCGCTGCT（配列番号１５）
そして、PCR反応を、上記プライマーを用い、PrimeSTAR GXL DNA Polymeraseを用いて、添付の説明書に従って行った。反応は、98℃10秒、55℃15秒、68℃1分を1サイクルとして40回繰り返した。【００９９】
なお、この二回目および三回目のPCR反応のプライマー配列には、プラスミドpET-28b(+)（Merck社）と相同な配列をPCR産物に付加するための配列が含まれる。【０１００】
２．PCR産物のプラスミドpET-28b(+)へのクローニング
PCR産物のプラスミドへのクローニングは酵母相同組換え法で行った（Ei’ichi Iizasa, and Yukio Nagano (2006) “Highly efficient yeast-based in vivo DNA cloning of multiple DNA fragments and the simultaneous construction of yeast/ Escherichia coli shuttle vectors” BioTechniques 40, 79-83.）。図２のように、プラスミドpET-28b(+)を制限酵素NcoIとClaIで切断したもの、プラスミドpYES2/CT（Invitrogen社）を制限酵素HindIIIとXhoIで切断したもの、および上記PCR産物を、同時に酵母に形質転換した。すると、酵母細胞内の相同組換え反応によって、pET-28b(+)が酵母の複製起点および酵母の選択マーカーURA3を持つようになると同時に、PCR産物がpET-28b(+)にクローニングされる。この実験は、Ei’ichi Iizasa, and Yukio Nagano (2006) BioTechniques 40, 79-83.に従って行った。得られたプラスミドにより、FTタンパク質の後方に、トロンビン認識部位、エピトープタグであるT7タグ、および精製のためのタグであるヒスタグが順に融合されたタンパク質の発現が可能になる。形質転換された酵母コロニーの集団を回収し、この集団からプラスミドDNAを精製した。次に、精製したプラスミドDNAを大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌コロニーの一つからプラスミドDNAを精製し、PCR産物が挿入された部分のDNA配列を決定した。【０１０１】
得られたDNA配列を配列番号１に示す。また、このDNA配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。このDNAの配列は、ウンシュウミカンのCiFT2のものと同じであった。このCiFT2がコードしているものがCiFT2タンパク質である。【０１０２】
３．CiFT2タンパク質のアミノ酸配列の比較
図３は、いくつかの植物由来FTタンパク質間のアミノ酸配列の比較を示す。CiFT2タンパク質は、ウンシュウミカン由来のCiFTタンパク質およびウンシュウミカン由来のCiFT3タンパク質と、それぞれ、99%および95%のアミノ酸配列の一致を示す。また、CiFT2タンパク質は、カラタチ、リンゴ、ウメ、モモ、およびブドウ由来のFTタンパク質とそれぞれ99%、84%、83%、82%および81%のアミノ酸配列の一致を示す。一方、CiFT2タンパク質はシロイヌナズナ由来のFTタンパク質と75%のアミノ酸配列の一致を示す。このように、CiFT2タンパク質は、シロイヌナズナ由来のFTタンパク質よりも果樹由来のFTタンパク質と相対的にアミノ酸配列が類似している。【０１０３】
４．大腸菌形質転換体によるCiFT2タンパク質の生産
次にCiFT2タンパク質を大腸菌で生産させた。構築したプラスミドを大腸菌Origami B (DE3)（Merck社）に形質転換した。この大腸菌を100 μg/mlのアンピシリンを含むTerrific培地（1リットルの水あたりYeast Extract 24 g、Peptone 12 g、リン酸水素二カリウム 9.4 g、リン酸二水素カリウム 2.2 g、グリセロール4 ml）250ml中で37℃の条件下、600 nmの吸光度が0.7程度になるまで培養した。次に1 mM になるようにIPTGを加えて、15℃で二日間培養した。【０１０４】
培養した大腸菌を集菌し、リン酸緩衝生理食塩水（塩化ナトリウム 8 g、塩化カリウム 0.2 g、リン酸水素二ナトリウム 1.44 g、 リン酸二水素カリウム 0.24 gを800 ml水にとかし、pHを7.4にした後、水で1リットルにした緩衝液）40 mlに懸濁した。この懸濁液にフッ化フェニルメチルスルホニル（タンパク質分解酵素の阻害剤）を1 mMになるように、デオキシリボヌクレアーゼ（DNA加水分解酵素）を10 μg/mlになるように、リゾチーム（最近の細胞壁を溶解する酵素）を100 μg/mlになるように加えて、30度で15分間反応させた。【０１０５】
次に、フレンチプレスを用いて、この反応液を約150メガパスカルの圧力条件下で破砕した。細胞破砕液から不溶性画分を除くために、20,000gで10分の遠心を2回行った。この上清を、ニッケルイオンでチャージした10 mlのChelating Sepharose Fast Flow（GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社）に通した。次に、100 mlの洗浄バッファー１（50 mM  リン酸バッファー（pH 7.0）、0.5 M 塩化ナトリウム、1% Triton X-100）で洗浄し、次に20 mlの洗浄バッファー２（50 mM  リン酸バッファー（pH 7.0）、0.5 M 塩化ナトリウム）で洗浄し、最後に20 mlの洗浄バッファー３（50 mM  リン酸バッファー（pH 7.0）、0.5 M 塩化ナトリウム、100 mMイミダゾール）で洗浄した。【０１０６】
次に、5 mlの溶出バッファー（50 mM  リン酸バッファー（pH 7.0）、0.5 M 塩化ナトリウム、200 mMイミダゾール）で計6回（計30 ml）、組換えタンパク質の溶出を行った。溶出液の3番目から6番目に多くの組換えタンパク質が含まれていたので、この分画を透析にかけて、イミダゾールを除いた。透析は、25倍のリン酸緩衝生理食塩水で計5回行った。得られたタンパク質の濃度はBIO-RAD社のプロテインアッセイ（ブラッドフォード法）で添付の説明書に従って行った。【０１０７】
図４は、精製したタンパク質の一部を14%のSDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、クーマシーブリリアントブルーで染色したものである。比較的高純度で精製されたことがわかる。組換えタンパク質の相対分子量は、予測値とほぼ一致した。なお、CiFT2タンパク質の後方に、トロンビン認識部位、エピトープタグであるT7タグ、および精製のためのタグであるヒスチジンタグが順に融合されているが、この余分な配列の除去は行わず、以降の実施例に用いた。【０１０８】
ここで得られた組換えタンパク質をコードするDNAの塩基配列を配列番号３に示す。また、その塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。【０１０９】
５．開花誘導剤の投与及びその結果(No. 1)
５．１．開花誘導剤の投与
次に、上記で得られた組換えCiFT2タンパク質を含む開花誘導剤をウンシュウミカンに注入した。用いた植物は、カラタチを台木とし、これにウンシュウミカン（品種は青島温州）を穂木として接木し、12ヶ月経過したもの（2008年4月の時点）、すなわち一年生苗木といわれるものである。ウンシュウミカンへの開花誘導剤の注入は以下の二通りの方法で行った。参考までに、2009年4月に撮影した一年生苗木の写真を図５に示す。【０１１０】
注入方法１）
2008年の9月、10月、11月にそれぞれ開花誘導剤の注入を行った。注入は、接ぎ木部上部の主幹に対して行った。上記で得られた組換えCiFT2タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水で希釈して、500ppmの開花誘導剤を調製した。500ppm（0.5 mg/ml）の開花誘導剤1 mlをプラスチックスポイトで吸い込んだ。次に、皮部を木部に達するまで切開し、そこにプラスチックスポイトの先を挿入し、この挿入部分を接着剤（アロンアルファTM（東亜合成株式会社））で覆うことにより、開花誘導剤の液が漏れないようにした（図６）。スポイトはテープを用いて茎に固定した。なお、液はスポイトを押すことにより注入したのではなく、液が自然に吸い込まれるのを利用して注入した。【０１１１】
なお、この時期（9月、10月、11月）は、ウンシュウミカンにとって生理的花芽分化期である。前記の通り、開花を誘導する物質は葉で合成されるが、様々な時期に植物体から葉を取り除く実験から、この生理的花芽分化期にこの開花誘導物質が合成されることがわかっている。生理的花芽分化期には、顕微鏡で観察できるような形態の変化はおこらない。実際に開花がおこるのは翌4月である。【０１１２】
注入方法２）
2008年4月に接ぎ木部上部の主幹に開花誘導剤を注入した。皮部を木部に達するまでナイフで切断後、脱脂綿に約0.2mlの開花誘導剤を吸い込ませたものを切り口に被せ、その周りをテープ（接木用テープ）で巻くことによって、開花誘導剤を注入した（図７）。脱脂綿に吸い込ませた開花誘導剤の濃度は、10,000ppm、1,000ppmまたは100ppmであった。これらの各濃度の開花誘導剤は、上記で得られた組換えCiFT2タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水で希釈して調製した。【０１１３】
５．２．開花誘導剤投与の結果
処理した植物の大部分で、2009年4月の初めには、明らかなつぼみの形成を観察できた。また、4月の終わりから5月の初めにそれらは開花した。【０１１４】
下記表１は、注入方法１で行った実験の結果である。この表で、発育枝（無着花枝）とは、文字通り、着花がおこらず、発育（栄養生長）をしている枝である。また、花芽には二種類あり、葉を伴った有葉花と、花だけの花芽である直花がある。通常、直花の約９０％は落花または落果し、果実ができたとしてもその品質が不良なことが多い。一方、有葉花は結実率が高く、果実の品質がよいことが多い。【０１１５】
表１から明らかなように大部分の植物で、程度の差はあるけれども、着花が多くおこり、また、直花に比べて有葉花が多かった。なお、コントロールの植物（無処理の植物）で得られた結果については後で詳しく触れるが、一般に、ウンシュウミカンの品種の一つである青島温州の苗木は、定植後1年ではまだ栄養生長が盛んで、通常ほとんど開花しない。処理した月による明確な差はなかった。なお、10月に処理したNo. 4で着花が少なかった理由は不明である。【０１１６】
【表１】
2011059051.tif 000003
【０１１７】
上記表１中のNo.3の植物の写真を、図８に示す。図８には、白い有葉花が多数着花している様子が示されている。【０１１８】
下記表２は、注入方法２で行った実験の結果である。大部分の植物で、程度の差はあるけれども、着花が多くおこり、また、直花に比べて有葉花が多かった。処理した濃度による明確な差はなかった。【０１１９】
【表２】
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【０１２０】
上記表２中のNo.21の植物の写真を図９に示す。図９には、白い有葉花が多数着花している様子が示されている。【０１２１】
下記表３は、注入方法２で処理した植物に隣接する区画（80 cm以内）の結果である。表２と同様に、大部分の植物で、程度の差はあるけれども、着花が多くおこり、また、直花に比べて有葉花が多かった。何故、この区画で、すなわち無処理の対象区画で着花がおこったかについては、後で議論する。
ここで、注入方法２で処理した植物に隣接する区画までの距離とは、処理した植物の主幹からその隣接する区画に配置した植物の主幹までの距離のこととした。【０１２２】
【表３】
2011059051.tif 000005
【０１２３】
上記表３中のNo.24の植物の写真を図１０に示す。図１０には、白い有葉花が多数着花している様子が示されている。【０１２４】
下記表４は、注入方法２で処理した植物に隣接する区画（80 cm以内）から、さらに離れた区画の実験結果である。ここで、「距離」は注入方法２で処理した植物に隣接する区画からの距離を示す。表４には、注入方法２で処理した植物に隣接する区画からの距離を示してある。距離に応じて、着花数が減少する傾向がある。前にも触れたが、一般に、ウンシュウミカンの品種の一つである青島温州の苗木は、定植後1年では、通常ほとんど開花しない。特に、今回のように植木鉢で植えた場合より、圃場に直に植えた露地栽培の場合は、その傾向が顕著である。したがって、No. 37の状態がもっとも通常な状態に近いと言える。【０１２５】
【表４】
2011059051.tif 000006
【０１２６】
図１１は2.9 m離れた植物の写真である。なお、植物体の一部（例えば、葉の表面）に白く見える部分があるが、これは光の反射によるものであり、着花は見られない。【０１２７】
また、開花とともに別の現象もみられた。ウンシュウミカンは本来、雄性不稔性であり、ハウス栽培の加温により花粉を形成することがあるが、露地栽培での花粉形成はほとんど認められない。しかし、本実験において、着生した花の多くは、葯壁が裂開し、花粉を形成していたことが、この一連の実験でわかった。このウンシュウミカンの貴重な花粉は、交雑に利用することができる。この花粉形成により、雄性不稔性で花粉親としての利用が不可能であったカンキツの花粉親としての利用が可能となる。このことはカンキツの品種改良の効率化にもつながる。【０１２８】
さて、このように、この一連の実験では、開花誘導剤の処理樹の隣に配置した開花誘導剤の無処理樹にも着花が見られた。また、開花誘導剤の処理樹から離れるほど開花誘導剤の無処理樹の着花が少なくなった。ウンシュウミカンの品種の一つである青島温州の苗木は、定植後1年では、通常ほとんど開花しない。開花誘導剤を注入した植物の隣に位置する開花誘導剤の無処理植物で着花がおこるメカニズムの一つの可能性として、開花誘導剤を注入した植物から、「花成フェロモン」とでも言うべき、未知の開花誘導物質が放出されている可能性が考えられる（図１２）。以下、この仮説について説明するが、本発明は、開花誘導が以下の仮説のメカニズムに従って生じる場合に限定されない。【０１２９】
フェロモンは、個体が体内で生成して体外に分泌後、同種の他の個体に一定の行動や発育の変化を促す生理活性物質のことである。フェロモンによる個体間のコミュニケーションは、自然界に幅広く見られる現象である。本発明者らがみつけた現象は、このフェロモンによる個体間のコミュニケーションで説明できる。【０１３０】
ミカンを含む果樹の多くで、隔年結果（ここの「結果」は「実を結ぶこと」を意味する）という現象が知られている。果樹園全体で、一年おきに豊作不作を繰り返す現象である。しかし、隔年結果がおこる理由はよくわかっていない。隔年結果は、果樹園全体で着花が同期する現象である。この隔年結果という現象は、フェロモンによる個体間のコミュニケーションで説明できる可能性がある。【０１３１】
また、今回の実験では、投与時期や濃度を変えて処理を行ったが、着花数に明確な差がなかった。着花数に明確な差がなかったことは、フェロモンによる個体間のコミュニケーションによって説明できる。【０１３２】
1937年、旧ソ連のMikhail Chailakhyanは、葉で合成された後、芽に移行し、花芽形成を誘導する物質が存在することを示した。この物質を花成ホルモンという。この物質は長年にわたって同定することができなかったが、現在では、様々な研究から、FTタンパク質がこの花成ホルモンの本体であると考えられている。しかし、あくまでもこの仮説は様々な研究結果からの推定である。FTタンパク質が花成ホルモンであることを最終的に示すためには、FTタンパク質を植物体に注入して、開花を誘導する必要がある。この実験で、本発明者らは、FTタンパク質が花成ホルモンであることを最終的に証明した。さらに、また、本発明者らはFTタンパク質を最初に農業に応用した。加えて、我々は花成フェロモンの存在を提唱した。【０１３３】
上記実施例では、ウンシュウミカンに本発明の開花誘導剤を投与した場合を例に挙げて説明したが、以下に説明するように、本発明の開花誘導剤は、他の植物へも適用可能である。【０１３４】
まず、他のカンキツへの本発明の開花誘導剤の適用について説明する。CiFT2タンパク質はカラタチのFTタンパク質とアミノ酸配列が99%一致することから類推して、カンキツの間で、FTタンパク質のアミノ酸配列は極めてよく保存されていると推定できる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、そのカンキツ種由来のFTタンパク質を用いなくても、ウンシュウミカンに由来するCiFT2タンパク質を用いて、その他のカンキツ種の開花誘導が可能である。【０１３５】
次に、他の果樹への本発明の開花誘導剤の適用について説明する。CiFT2タンパク質は既知の果樹由来FTタンパク質とアミノ酸配列で80%以上の一致を示す。このように高い相同性を示すことから、本発明の好ましい態様によれば、ウンシュウミカンに由来するCiFT2タンパク質を他の果樹に投与することで開花誘導が可能である。本発明の別の好ましい態様によれば、投与する果樹に由来する組換えFTタンパク質を用いてもよい。本発明のさらに別の好ましい態様によれば、CiFT2タンパク質など他の植物由来FTタンパク質を用いても開花誘導ができる。なぜなら、ウンシュウミカン由来のCiFT遺伝子が高発現する遺伝子組換えシロイヌナズナで開花が早まるという報告がある（Yasushi Kobayashi, Hidetaka Kaya, Koji Goto, Masaki Iwabuchi, and Takashi Araki (1999) “A Pair of Related Genes with Antagonistic Roles in Mediating Flowering Signals” Science 286, 1960-1962.）ので、FTタンパク質の開花誘導機能にそれほど種特異性がないと考えられるからである。
【実施例２】
【０１３６】
６．開花誘導剤の投与及びその結果（No.2）
６．１．開花誘導剤の投与
一年生の苗木（カラタチの台木に、成熟期のウンシュウミカンの穂木を、接木したもの）の先端に、ウンシュウミカンの珠心胚実生を二重に接ぎ木したものを用いて、FTタンパク質の注入実験を行った。すなわち、カラタチが台木、成熟期のウンシュウミカンが中間台木、ウンシュウミカンの珠心胚実生が穂木となる。珠心胚実生とは、受精の結果生じた胚から生じた芽ではなく、珠心胚から生じた芽を指す。珠心胚実生は、無性生殖の一つであり、親のクローンである。ちなみに、実生とは、（接ぎ木・挿し木などによらず）種子から芽を出して生長することを指す。実生は、幼若期にある。【０１３７】
ここで考え方を説明すると、穂木の部分が珠心胚由来であることは重要ではなく、穂木の部分が実生であること、すなわち、穂木の部分が幼若期にあることが重要である。【０１３８】
開花誘導剤の注入は、2008年の9月、10月、11月にそれぞれ行った。注入は、中間台木の部分である成熟期のウンシュウミカンに対して行ったものであり、穂木の部分であるウンシュウミカンの珠心胚実生に対して行ったものではない。すなわち、注入は、カラタチの台木に成熟期のウンシュウミカンの穂木を継いだ部分の上部の主幹に対して行った。実施例１で得られた組換えCiFT2タンパク質をリン酸緩生理食塩水で希釈して500ppmの開花誘導剤を調製した。500ppm（0.5 mg/ml）の開花誘導剤1 mlをプラスチックスポイトで吸い込んだ。次に、皮部を木部に達するまで切開し、そこにプラスチックスポイトの先を挿入し、この挿入部分を接着剤（アロンアルファTM(東亜合成株式会社)）で覆うことにより、開花誘導剤の液が漏れないようにした。スポイトはテープを用いて茎に固定した。なお、液はスポイトを押すことにより注入したのではなく、液が自然に吸い込まれるのを利用して注入した。
対照として、開花誘導剤処理した植物の区画(FT処理区)から2.9m離れた区画(対照区)の開花誘導剤未処理植物を用いた。【０１３９】
６．２．開花誘導剤投与の結果
上記開花誘導剤投与実験の結果を図１３に示した。また、図１３の数値データを表５にまとめた。図１３及び表５から、開花誘導剤を投与した群(NS-Sep-1〜NS-Nov-3)では、着花の数において、対照区の群(Cont-1〜3)と差がないことがわかる。【０１４０】
【表５】
2011059051.tif 000007
【０１４１】
また、開花誘導剤を投与した群(NS-Sep-1〜NS-Nov-3)について、珠心胚実生の幹経と着花数の間の相関の有無を調べたところ、珠心胚実生の幹経と着花数の間に負の相関があることがわかった（図１４）。一方、珠心胚実生の高さと着花数の間には相関がなかった（図１５）。【０１４２】
以上の結果から次のことが推測される。
1)FTタンパク質の作用を抑える物質が、珠心胚実生から出る。
2)この物質は、珠心胚実生から、中間台木に移動して、FTタンパク質の作用を抑える。
3)珠心胚実生の幹経（生育量の目安）が大きいほど、この物質の量は多い。【０１４３】
また、他の実験も行った。カワノナツダイダイ（川野夏橙）の珠心胚実生、あるいは、カワチバンカン（河内晩柑）の放任受粉した交雑実生を育て、発芽後三ヶ月の実生を得た。これに対して、FTタンパク質の注入を行ったが、一年経っても開花は見られなかった。この結果からも、実生にFTタンパク質の作用を抑える物質があることが示唆される。【０１４４】
以上のことから、栄養的成熟期のウンシュウミカンは、実生などの幼若期のものと異なり、FTタンパク質の作用を抑える物質の影響が少なく、本発明の開花誘導剤による開花誘導効果がより大きく出ることが期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４５】
［配列番号１］実施例で得られたDNAの塩基配列。
［配列番号２］配列番号１の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号３］配列番号１記載の塩基配列からなるDNAの後方に、トロンビン認識部位をコードするDNA、Ｔ７タグをコードするDNAおよびヒスチジンタグをコードするDNAが順に融合されたDNAの配列。
［配列番号４］配列番号３の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号５］ウンシュウミカンのCiFTのcDNA配列（アクセションナンバーAB027456）。
［配列番号６］配列番号５の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号７］ウンシュウミカンのCiFT2のcDNA配列（アクセションナンバーAB301934）。
［配列番号８］配列番号７の塩基配列から推定されるアミノ酸配列。
［配列番号９］プライマー
［配列番号１０］プライマー
［配列番号１１］プライマー
［配列番号１２］プライマー
［配列番号１３］プライマー
［配列番号１４］プライマー
［配列番号１５］プライマー
【図１】
2011059051.tif 000008
【図２】
2011059051.tif 000009
【図３】
2011059051.tif 000010
【図４】
2011059051.tif 000011
【図５】
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【図６】
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【図７】
2011059051.tif 000014
【図８】
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【図９】
2011059051.tif 000016
【図１０】
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【図１１】
2011059051.tif 000018
【図１２】
2011059051.tif 000019
【図１３】
2011059051.tif 000020
【図１４】
2011059051.tif 000021
【図１５】
2011059051.tif 000022
【配列表】
2011059051000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月9日(2011.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を含む、開花誘導剤。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、請求項１記載の開花誘導剤。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含む、開花誘導剤。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
前記（ｃ）のＤＮＡが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項３記載の開花誘導剤。
【請求項５】
配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、請求項１記載の開花誘導剤。
【請求項６】
配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を含む、請求項３記載の開花誘導剤。
【請求項７】
果樹の開花誘導に用いられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の開花誘導剤。
【請求項８】
果樹がカンキツである、請求項７記載の開花誘導剤。
【請求項９】
カンキツがウンシュウミカンである、請求項８記載の開花誘導剤。
【請求項１０】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質
【請求項１１】
前記（Ｃ）のタンパク質が、配列番号２記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理することを特徴とする開花誘導方法。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と６０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項１３】
前記（ｃ）のＤＮＡが、配列番号１記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ開花誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて植物を処理する、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて植物を処理する、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が、果樹の開花誘導に用いられる、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
果樹がカンキツである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
カンキツがウンシュウミカンである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
植物が、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物である、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質を用いて処理した植物を、前記タンパク質を用いて処理していない開花誘導の目的の植物の隣に配置することを含む、請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記開花誘導剤が、成熟相にある穂木を台木に接ぎ木した植物を処理するために用いられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の開花誘導剤。
【請求項２２】
前記開花誘導剤が、前記タンパク質を用いて処理した植物の隣に配置された前記タンパク質を用いて処理していない植物の開花を誘導するために用いられる、請求項１〜９及び２１のいずれか１項に記載の開花誘導剤。
【国際調査報告】
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