(57)【要約】  （１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールについて、安定性の高い結晶及びその製造方法を提供する。具体的には、以下の物性を有するエタノール溶媒和物と、エタノール溶媒和物から変動された他の複数の結晶形である；（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）で、２θ＝５．９度、１７．１度、１７．６度及び２１．５度にピークを有する；（ｂ）赤外吸収スペクトルにおいて、特性吸収帯が３５３８ｃｍ-1、３３５７ｃｍ-1、２９６４ｃｍ-1、１６７３ｃｍ-1、１６３４ｃｍ-1及び１５０５ｃｍ-1にある；及び（ｃ）融点が１１１℃付近である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールのエタノール溶媒和物の結晶。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．９度、１７．１度、１７．６度及び２１．５度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトルにおいて、特性吸収帯が３５３８ｃｍ-1、３３５７ｃｍ-1、２９６４ｃｍ-1、１６７３ｃｍ-1、１６３４ｃｍ-1及び１５０５ｃｍ-1にある；並びに
（ｃ）融点が１１１℃付近である。
【請求項２】
エタノール又はエタノールと混和する性質を有する有機溶媒とエタノールとの混合液に、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールを溶解させた後、０〜８０℃で結晶化させ、得られた結晶を５０℃以下で乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶の製造方法。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．９度、１７．１度、１７．６度及び２１．５度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトルにおいて、特性吸収帯が３５３８ｃｍ-1、３３５７ｃｍ-1、２９６４ｃｍ-1、１６７３ｃｍ-1、１６３４ｃｍ-1及び１５０５ｃｍ-1にある；並びに
（ｃ）融点が１１１℃付近である。
【請求項３】
下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールの結晶。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝６．１度、１３．７度、１８．０度及び１８．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１１０℃付近である。
【請求項４】
水又はリン酸塩緩衝液に、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールのエタノール溶媒和物を懸濁させた後、得られた結晶を３５℃以下で乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する結晶の製造方法。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝６．１度、１３．７度、１８．０度及び１８．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１１０℃付近である。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールの結晶。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝６．４度、１０．９度、１６．９度及び１８．１度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１１５℃付近である。
【請求項６】
イソプロピルエーテルと混和する性質を有する有機溶媒（エタノールを除く）とイソプロピルエーテルとの混合液又はヘキサンあるいはヘプタンと混和する性質を有する有機溶媒（エタノールを除く）とヘキサンあるいはヘプタンとの混合液に、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールのエタノール溶媒和物を懸濁させた後、得られた結晶を室温〜１００℃で乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する結晶の製造方法。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝６．４度、１０．９度、１６．９度及び１８．１度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１１５℃付近である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病治療薬の有効成分として有用な４−イソプロピルフェニル  グルシトールの結晶形及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖値はメタボリックシンドロームのバイオマーカーの一つとなっており、空腹時血糖が１２６ｍｇ／ｄＬ以上を示すと糖尿病と診断される。また、空腹時血糖が正常であっても、食後２時間血糖値が１４０〜２００ｍｇ／ｄＬの場合には、耐糖能異常（又は食後高血糖）と診断される。近年の疫学的研究によれば、耐糖能異常が心血管障害のリスクを高めると報告されている(非特許文献１及び２参照)。さらに、運動療法や薬物治療を施すことで耐糖能異常から２型糖尿病への移行を抑制し、高血圧の発症も有意に抑制することが報告されている(非特許文献３参照)。【０００３】
以上のことから、食後高血糖を抑制することが糖尿病やメタボリックシンドロームの発症抑制に重要であると考えられ、食後高血糖をコントロールする薬剤の需要が高まりつつある。【０００４】
従来、食後高血糖改善薬としては、糖類の加水分解酵素を阻害し、小腸からの糖の吸収を遅延させるα−グルコシダ−ゼ阻害剤が汎用されてきたが、新しい作用機序を有する食後高血糖改善薬の開発も行われている。【０００５】
哺乳動物の小腸上皮には高い頻度でナトリウム依存性グルコ−ス共輸送体１（ＳＧＬＴ１）が発現している。このＳＧＬＴ１は小腸において、ナトリウムに依存し、グルコ−ス及びガラクト−スの能動輸送を司ることが知られている。そこで、ＳＧＬＴ１活性を阻害することによって、食事由来のグルコ−ス吸収を抑制し、食後高血糖の予防又は治療に用いることができる、ピラゾ−ル誘導体が報告されている（特許文献１〜６参照）。一方で、腎臓には高頻度にナトリウム依存性グルコ−ス共輸送体２（ＳＧＬＴ２）が発現しており、糸球体で一旦濾過されたグルコ−スはＳＧＬＴ２を介して再吸収される（非特許文献４参照）。そして、ＳＧＬＴ２活性を阻害することによって、尿への糖排泄が促進され、血糖低下作用を示すことが報告されている（非特許文献５参照）。ＳＧＬＴ２阻害剤の特徴として、随時血糖を低下させる作用が優れているが、ＳＧＬＴ１阻害剤の様に食後高血糖を是正する作用は低い。また、ＳＧＬＴ１活性に加えて、ＳＧＬＴ２活性も同時に阻害するＣ−フェニル  グルシトール誘導体についての報告もある（特許文献７参照）。【０００６】
一方、食後高血糖改善薬のような持続投与が必要な薬剤にとっては、薬効量と、毒性、副作用の発現量との間の安全域が広いことが重要である。特に、体内残留性薬物の場合は、治療に必要な投与量をコントロールすることが難しく、体内に残留している薬物が加算されて過剰量の薬物の効果が発現されることになり、予期せぬ毒性及び副作用につながる。例えば、分子内に３級アミンの様な親水性基と芳香環の様な疎水性基をもつ、陽イオン性薬物は、リン脂質と疎水結合し、ライソゾーム内に取り込まれ全身の器官に蓄積されることがあることが知られている。代表例として、クロロキンでは網膜障害、パーヘキシリンでは肺や小脳に変化があり神経障害が問題となった（非特許文献６参照）。【０００７】
したがって、薬物は、薬効を示した後に体内から速やかに排泄されることが望ましく、特に、持続投与が必須の食後高血糖改善薬では、体内残留性の問題のない薬物が望まれる。【０００８】
また、医薬品としては、工業的規模における取扱い易さと、製品の保存安定性に優れた物理的特性が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００２／０９８８９３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００４／０１４９３２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００４／０１８４９１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００４／０１９９５８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第ＷＯ２００５／１２１１６１号パンフレット
【特許文献６】国際公開第ＷＯ２００４／０５０１２２号パンフレット
【特許文献７】国際公開第ＷＯ２００７／１３６１１６号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Pan XR, et al. Diabetes Care, 第20巻, 537頁, 1997年
【非特許文献２】M Tominaga, et al. Diabetes Care, 第22巻, 920頁, 1999年
【非特許文献３】J.−L. Chiasson, et al. Lancent, 第359巻, 2072頁, 2002年
【非特許文献４】E. M. Wright, Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 第280巻, F10頁, 2001年
【非特許文献５】G. Toggenburger, et al. Biochim. Biophys. Acta, 第688巻, 557頁, 1982年
【非特許文献６】日薬理誌  Folia Pharmacol. Jpn. 第113巻, 19頁, 1999年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、薬効量と毒性、副作用の発現量との間の安全域が広いＳＧＬＴ１阻害作用を示し、かつ上記物理的特性に優れた新規な化合物の結晶を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトール（以下、化合物（Ａ）と参照することもある）が、薬効量と毒性、副作用の発現量との間の安全域が広いＳＧＬＴ１阻害作用を示し、また、そのエタノール溶媒和にすることで、上記物理的特性に優れた新規な化合物の結晶を提供することができること、また、上記エタノール溶媒和物は、他の結晶形へ容易に変動することを可能にすることを発見し、本発明を完成するに至った。【００１３】
本発明の１つの態様は、下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールのエタノール溶媒和物の結晶である。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．９度、１７．１度、１７．６度及び２１．５度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトルにおいて、特性吸収帯が３５３８ｃｍ-1、３３５７ｃｍ-1、２９６４ｃｍ-1、１６７３ｃｍ-1、１６３４ｃｍ-1及び１５０５ｃｍ-1にある；並びに
（ｃ）融点が１１１℃付近である。【００１４】
本発明の他の態様は、エタノール又はエタノールと混和する性質を有する有機溶媒とエタノールとの混合液に（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールを溶解させた後、０〜８０℃で結晶化させ、得られた結晶を５０℃以下で乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｃ）の物性を有する結晶の製造方法である。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．９度、１７．１度、１７．６度及び２１．５度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトルにおいて、特性吸収帯が３５３８ｃｍ-1、３３５７ｃｍ-1、２９６４ｃｍ-1、１６７３ｃｍ-1、１６３４ｃｍ-1及び１５０５ｃｍ-1にある；並びに
（ｃ）融点が１１１℃付近である。【００１５】
本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールの結晶（Ａ形結晶）である。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝６．１度、１３．７度、１８．０度及び１８．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１１０℃付近である。【００１６】
本発明の他の態様は、水又はリン酸緩衝溶液に（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールのエタノール溶媒和物を懸濁させた後、３５℃以下で乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する結晶（Ａ形結晶）の製造方法である。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝６．１度、１３．７度、１８．０度及び１８．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１１０℃付近である。【００１７】
本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールの結晶（Ｂ形結晶）である。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝６．４度、１０．９度、１６．９度及び１８．１度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１１５℃付近である。【００１８】
本発明の他の態様は、イソプロピルエーテルと混和する性質を有する有機溶媒（エタノールを除く）とイソプロピルエーテルとの混合液又はヘキサンあるいはヘプタンと混和する性質を有する有機溶媒（エタノールを除く ）とヘキサンあるいはヘプタンとの混合液に、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールのエタノール溶媒和物を懸濁させた後、室温〜１００℃で乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する結晶（Ｂ形結晶）の製造方法である。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝６．４度、１０．９度、１６．９度及び１８．１度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１１５℃付近である。【００１９】
本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールの結晶（Ｃ形結晶）である。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１０．７度、１７．９度及び１９．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１２７℃付近である。【００２０】
本発明の他の態様は、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールの結晶（Ａ形結晶）を減圧条件下、室温〜１５０℃まで昇温させた後、ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒で懸濁させた後、３５℃以下で乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する結晶（Ｃ形結晶）の製造方法である。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１０．７度、１７．９度及び１９．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１２７℃付近である。【００２１】
本発明の他の態様は、下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールの結晶（二水和物の結晶）である。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１７．２度、１７．８度及び２０．９度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１２１℃付近である。
本発明の他の態様は、イソプロピルエーテルとメタノールとの混合液に、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールのエタノール溶媒和物を懸濁させた後、室温で乾燥させることを特徴とする下記（ａ）〜（ｂ）の物性を有する結晶（二水和物の結晶）の製造方法である。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１７．２度、１７．８度及び２０．９度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１２１℃付近である。
【発明の効果】
【００２２】
（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールのエタノール溶媒和物は室温付近の温度で安定な結晶形であり、保存安定性に優れている。また、簡便な方法により高純度に精製可能なため、工業的生産に優れている。さらに、上記エタノール溶媒和物は、目的に応じて、他の結晶形へ容易に変動することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】エタノール溶媒和物の粉末Ｘ線回折パターンを示す。
【図２】エタノール溶媒和物の赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示す。
【図３】エタノール溶媒和物の示差熱分析／熱質量測定カーブを示す。
【図４】Ａ形結晶の粉末Ｘ線回折パターンを示す。
【図５】Ａ形結晶の示差熱分析／熱質量測定カーブを示す。
【図６】Ｂ形結晶の粉末Ｘ線回折パターンを示す。
【図７】Ｂ形結晶の示差熱分析／熱質量測定カーブを示す。
【図８】Ｃ形結晶の粉末Ｘ線回折パターンを示す。
【図９】Ｃ形結晶の示差熱分析／熱質量測定カーブを示す。
【図１０】二水和物の結晶の粉末Ｘ線回折パターンを示す。
【図１１】二水和物の結晶の示差熱分析／熱質量測定カーブを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を実施するための形態を具体的に説明する。
【００２５】
本発明の化合物である（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトール（以下、化合物（Ａ）ということがある）は、下記に示す化学構造式を有している。
【００２６】
【化１】
2012023598.tif 000002
【００２７】
化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物（以下、「本発明結晶」ということがある）は、一定の品質を有する単一の結晶として再現性良く得られ、医薬品の製造に用いられる原薬の結晶として安定的に供給されることが可能で、保存安定性に優れたものである。また、本発明結晶は、水や有機溶媒（エタノールを除く）に懸濁させることで、他の結晶形へ容易に変動することができる。これらの結晶形の相違は、特に、粉末Ｘ線回折及び示差熱分析／熱質量測定カーブによって区別される。なお、「本発明結晶」とは、エタノール溶媒和物と無水物結晶との混合物、及びエタノール溶媒和物と無水物結晶との混晶をも含む概念を意味する。
【００２８】
化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物は次の（ａ）〜（ｃ）の物性を有する。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝５．９度、１７．１度、１７．６度及び２１．５度にピークを有する；
（ｂ）赤外線吸収スペクトルにおいて、特性吸収帯が３５３８ｃｍ-1、３３５７ｃｍ-1、２９６４ｃｍ-1、１６７３ｃｍ-1、１６３４ｃｍ-1及び１５０５ｃｍ-1にある；並びに
（ｃ）融点が１１１℃付近であり、好ましくは１０８℃〜１１４℃である。
【００２９】
化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物の粉末Ｘ線回折パターンは図１に、赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ法）は図２に、示差熱分析／熱質量測定カーブは図３に示した通りである。
【００３０】
化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物は、化合物（Ａ）がエタノール又はエタノールと混和する性質を有する有機溶媒とエタノールとの混合液に溶解している溶液からの結晶化により得られる。
【００３１】
再結晶前の原料の化合物（Ａ）は、非晶質である。
【００３２】
該溶液からの再結晶によりエタノール溶媒和物を得る際の、化合物（Ａ）の該溶液への溶解及び該溶液からの結晶化は通常の方法で行えばよい。例えば、エタノールと混和する性質を有する有機溶媒とエタノールからなる混合液に、非晶質の化合物（Ａ）を加熱溶解させた後、冷却する方法が用いられる。
【００３３】
エタノールと混和する性質を有する有機溶媒としては、ヘプタン等のハイドロカーボン、ｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチルなどが挙げられる。
【００３４】
化合物（Ａ）を溶解させる濃度は０．５〜７０質量％、好ましくは５〜５０質量％である。ここで質量％とは、溶液中または懸濁液中の化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物の質量パーセントである。
【００３５】
エタノールと混和する性質を有する有機溶媒とエタノールとの混合溶媒における混合比は適宜に変更することができる。
【００３６】
エタノール溶媒和物の結晶化は、０〜８０℃で行う。
【００３７】
析出したエタノール溶媒和物の結晶は、溶液からろ過、遠心分離などにより溶媒と分離した後に５０℃以下で乾燥する。
【００３８】
化合物（Ａ）のＡ形結晶は次の（ａ）〜（ｂ）の物性を有する。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝６．１度、１３．７度、１８．０度及び１８．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１１０℃付近であり、好ましくは１０７℃〜１１３℃である。
【００３９】
化合物（Ａ）のＡ形結晶の粉末Ｘ線回折パターンは図４に、示差熱分析／熱質量測定カーブは図５に示した通りである。
【００４０】
化合物（Ａ）のＡ形結晶は、化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物の水又はリン酸緩衝溶液からの懸濁により得られる。
【００４１】
リン酸緩衝液に用いることができるリン酸としては、リン酸、リン酸二水素ナトリウム及びその水和物（例えば、２水和物）、リン酸水素二ナトリウム及びその水和物（例えば、１２水和物）、リン酸二水素カリウム及びその水和物、リン酸水素二カリウム及びその水和物などが挙げられる。
【００４２】
化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物を懸濁する濃度は懸濁液に対し、０．５〜３０質量％、好ましくは１〜２０質量％である。
【００４３】
懸濁温度は、３５℃以下であり、通常２５℃である。
【００４４】
懸濁する時間は、溶媒の種類、温度、その他の条件により必ずしも一定しない。懸濁温度が２５℃の場合は、懸濁時間は、２４時間以上であり、通常２４時間である。懸濁する条件は、化合物（Ａ）の懸濁状態を損なわなければ良く、加温することにより、Ａ型結晶への変換の時間を短縮することも可能である。Ａ形結晶への変換の終点は懸濁液より一部結晶をろ取し、この結晶の粉末Ｘ線回折パターンなどを測定することにより確認することができる。
【００４５】
以上のようにして得られたＡ形結晶は、分散（懸濁）液中からろ過、遠心分離などにより溶媒と分離した後に３５℃以下で、通常室温（２５℃）で乾燥する。
【００４６】
前記何れの方法によるも、乾燥する時間は、乾燥温度、使用原料の結晶形、粒子径、その他の条件により必ずしも一定しないが、結晶形の変化の終点は一部乾燥結晶を取り、この結晶の粉末Ｘ線回折パターンなどを測定することにより確認することができる。
【００４７】
化合物（Ａ）のＢ形結晶は次の（ａ）〜（ｂ）の物性を有する。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝６．４度、１０．９度、１６．９度及び１８．１度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１１５℃付近であり、好ましくは１１２℃〜１１８℃である。
【００４８】
化合物（Ａ）のＢ形結晶の粉末Ｘ線回折パターンは図６に、示差熱分析／熱質量測定カーブは図７に示した通りである。
【００４９】
化合物（Ａ）のＢ形結晶は、化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物のイソプロピルエーテルと混和する性質を有する有機溶媒（エタノールを除く）とイソプロピルエーテルとの混合液又はヘキサンあるいはヘプタンと混和する性質を有する有機溶媒（エタノールを除く ）とヘキサンあるいはヘプタンとの混合液からの懸濁により得られる。
【００５０】
イソプロピルエーテルと混和する性質を有する有機溶媒（エタノールを除く）としては、メタノール、イソプロピルアルコール、ｔ−ブチルメチルエーテルなどが挙げられる。
【００５１】
ヘキサンあるいはヘプタンと混和する性質を有する有機溶媒（エタノールを除く）としては、酢酸エチル、アセトン、ｔ−ブチルメチルエーテルなどが挙げられる。
【００５２】
化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物を懸濁する濃度は懸濁液に対し、０．５〜３０質量％、好ましくは１〜２０質量％である。
【００５３】
懸濁温度は、３５℃以下であり、通常２５℃である。
【００５４】
懸濁する時間は、溶媒の種類、温度、その他の条件により必ずしも一定しない。懸濁温度が２５℃の場合は、懸濁時間は、１週間以上であり、通常１週間である。懸濁する条件は、化合物（Ａ）の懸濁状態を損なわなければ良く、加温することにより、Ｂ型結晶への変換の時間を短縮することも可能である。Ｂ形結晶への変換の終点は懸濁液より一部結晶をろ取し、この結晶の粉末Ｘ線回折パターンなどを測定することにより確認することができる。
【００５５】
以上のようにして得られたＢ形結晶は、分散（懸濁）液中からろ過、遠心分離などにより溶媒と分離した後に室温〜１００℃で乾燥する。
【００５６】
室温で乾燥するときの湿度は、２０％以下であり、通常１１％以下である。
【００５７】
前記何れの方法によるも、乾燥する時間は、乾燥温度、使用原料の結晶形、粒子径、その他の条件により必ずしも一定しないが、結晶形の変化の終点は一部乾燥結晶を取り、この結晶の粉末Ｘ線回折パターンなどを測定することにより確認することができる。
【００５８】
１例としては、化合物（Ａ）のＢ形結晶は、化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物を、上記溶媒の懸濁液から分離後、２５℃、湿度１１％の状態にさらすことにより得られる。
【００５９】
他の例としては、化合物（Ａ）のＢ形結晶は、化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物を、上記溶媒の懸濁液から分離後、６０℃、湿度０％の状態にさらすことにより得られる。
【００６０】
他の例としては、化合物（Ａ）のＢ形結晶は、化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物を、上記溶媒の懸濁液から分離後、１００℃の条件にさらすことにより得られる。
【００６１】
化合物（Ａ）のＣ形結晶は次の（ａ）〜（ｂ）の物性を有する。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１０．７度、１７．９度及び１９．７度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１２７℃付近であり、好ましくは１２４℃〜１３０℃である。
【００６２】
化合物（Ａ）のＣ形結晶は、化合物（Ａ）のＡ形結晶を減圧条件下、室温〜１５０℃まで、昇温させた後、ヘキサンと酢酸エチルとの混合液からの懸濁により得られる。
【００６３】
化合物（Ａ）のＡ形結晶を減圧条件下、昇温させる温度は、室温〜１５０℃、好ましくは室温〜１２０℃、より好ましくは、１２０℃である。
【００６４】
化合物（Ａ）のＡ形結晶を減圧条件下昇温させた後、ヘキサンと酢酸エチルとの混合液にて懸濁する濃度は懸濁液に対し、０．５〜３０質量％、好ましくは１〜２０質量％である。
【００６５】
懸濁温度は、５５〜７５℃であり、通常６５℃である。
【００６６】
懸濁する時間は、溶媒の種類、温度、その他の条件により必ずしも一定しない。６５℃の場合は、懸濁時間は、８時間以上であり、通常８時間である。Ｃ形結晶への変換の終点は懸濁液より一部結晶をろ取し、この結晶の粉末Ｘ線回折パターンなどを測定することにより確認することができる。
【００６７】
以上のようにして得られたＣ形結晶は、溶媒をロータリーエバポレーターで留去することや分散（懸濁）液中からろ過、遠心分離などにより溶媒と分離した後に３５℃以下で、通常室温で乾燥する。
【００６８】
前記何れの方法によるも、乾燥する時間は、乾燥温度、使用原料の結晶形、粒子径、その他の条件により必ずしも一定しないが、結晶形の変化の終点は一部乾燥結晶を取り、この結晶の粉末Ｘ線回折パターンなどを測定することにより確認することができる。
【００６９】
化合物（Ａ）の二水和物の結晶は次の（ａ）〜（ｂ）の物性を有する。
（ａ）粉末Ｘ線回折（Ｃｕ−Ｋα）において、２θ＝１７．２度、１７．８度及び２０．９度にピークを有する；並びに
（ｂ）融点が１２１℃付近であり、好ましくは１１８℃〜１２４℃である。
【００７０】
化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物のイソプロピルエーテルとメタノールとの混合液からの懸濁により得られる。
【００７１】
化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物を懸濁する濃度は懸濁液に対し、０．５〜２０％質量％、好ましくは０．５〜１０質量％である。
【００７２】
懸濁温度は、３５℃以下であり、通常２５℃である。
【００７３】
懸濁する時間は、溶媒の種類、温度、その他の条件により必ずしも一定しない。懸濁温度が２５℃の場合は、懸濁時間は、６日間以上であり、通常６日間である。懸濁する条件は、化合物（Ａ）の懸濁状態を損なわなければ良く、加温することにより、二水和物の結晶への変換の時間を短縮することも可能である。二水和物の結晶への変換の終点は懸濁液より一部結晶をろ取し、この結晶の粉末Ｘ線回折パターンなどを測定することにより確認することができる。
【００７４】
以上のようにして得られた二水和物の結晶は、分散（懸濁）液中からろ過、遠心分離などにより溶媒と分離した後に室温で乾燥する。
【００７５】
室温で乾燥するときの湿度は、４０％〜８５％である。二水和物の結晶は、湿度４０％以上の条件でＢ型結晶から転移することを、また湿度８５％以上で潮解することを確認している。
【００７６】
前記何れの方法によるも、乾燥する時間は、乾燥温度、使用原料の結晶形、粒子径、その他の条件により必ずしも一定しないが、結晶形の変化の終点は一部乾燥結晶を取り、この結晶の粉末Ｘ線回折パターンなどを測定することにより確認することができる。
【実施例】
【００７７】
次に、参考例、実施例及び試験例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。【００７８】
ＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトルは、室温にて、２００ＭＨｚ（ＧＥＭＩＮＩ２０００／２００，Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、  ３００ＭＨｚ（ＩＮＯＶＡ  ３００，Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＥＣＰ３００，日本電子、ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＥＣＸ３００，日本電子）６００ＭＨｚ（ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＥＣＡ６００，日本電子）にて測定した。本明細書中の化学シフト値は、内部標準物質（テトラメチルシラン）に対するｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ（δ）値で示した。【００７９】
質量スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＧＣＴ（ＥＩ：電子イオン化法）、ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ−ＬＣ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＥＳＩ：電子スプレーイオン化法）又は島津ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ  （ＥＳＩ：電子スプレーイオン化法／ＡＰＣＩ：大気圧イオン化法  Ｄｕａｌ）  にて測定した。【００８０】
元素分析は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ２４００Ｚ  にて測定した。【００８１】
粉末Ｘ線は、Ｒｉｇａｋｕ  ＲＩＮＴ２２００ＵｌｔｉｍａＩＩＩにて測定した。【００８２】
示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）は、Ｒｉｇａｋｕ  Ｔｈｅｒｍｏ  ｐｌｕｓ  ＥｖｏＴＧ８１２０  にて測定した。【００８３】
シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、関東化学「シリカゲル６０」もしくは「シリカゲル６０Ｎ」を使用した。【００８４】
室温は２５℃を指す。
参考例１  中間体（Ｂ）の製造【００８５】
【化２】
2012023598.tif 000003
【００８６】
参考例１−１  化合物（Ｂ１）【００８７】
【化３】
2012023598.tif 000004
【００８８】
３−イソプロピルフェノール（２５ｇ，０．１８４ｍｏｌ）の酢酸（２００ｍＬ）溶液にヨウ素酸カリウム（７．８８ｇ，０．０３６８ｍｏｌ）の水懸濁溶液（７５ｍＬ）とヨウ素（１８．７ｇ，０．０７３６ｍｏｌ）を加え、この反応溶液を室温で２０時間攪拌した。ジエチルエーテル（４００ｍＬ）と水（３００ｍＬ）を加えた後に、有機層を分離した。その有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去し得られた残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=９５：５)にて精製し、無色油状の化合物（Ｂ１）（２７．６ｇ，５７％）を得た。
1H NMR (200 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.16 - 1.25 (m, 6 H) 2.64 - 2.98 (m, 1 H) 5.21 (s, 1 H) 6.57 (dd, J=8.13, 2.20 Hz, 1 H) 6.88 (d, J=2.20 Hz, 1 H) 7.54 (d, J=8.13 Hz, 1 H).
参考例１−２  化合物（Ｂ２）【００８９】
【化４】
2012023598.tif 000005
【００９０】
化合物（Ｂ１）（２７．４ｇ，０．１０４ｍｏｌ）と炭酸カリウム（２１．７ｇ，０．１５６ｍｏｌ）のアセトニトリル懸濁液（２００ｍＬ）にヨウ化メチル（９．８ｍＬ，０．１５６ｍｏｌ）を加え４０℃で２．５時間攪拌した。ヨウ化メチル（３．５ｍＬ，０．０５２ｍｏｌ）を更に加え、同温で１時間攪拌した。不溶物をろ過し、ろ液を酢酸エチルで希釈した。有機層を水、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン→ヘキサン：酢酸エチル＝９５：５)にて精製し、淡黄色油状の化合物（Ｂ２）（２４．５ｇ，８５％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.24 (d, J=6.84 Hz, 6 H) 2.87 (quin, J=6.92 Hz, 1 H) 3.88 (s, 3 H) 6.58 - 6.65 (m, 1 H) 6.70 (d, J=1.87 Hz, 1 H) 7.65 (d, J=8.08 Hz, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 277[M+H]+.
参考例１−３  化合物（Ｂ３）【００９１】
【化５】
2012023598.tif 000006
【００９２】
化合物（Ｂ２）（２４．５ｇ，８８．６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液に窒素雰囲気下、−７８℃にて２．６Ｍ  ｎ−ブチルリチウムへキサン溶液（３４ｍＬ、８８．６ｍｍｏｌ）を滴下し、同温にて５分間攪拌した。次いで２，３，４，６−テトラ−Ｏ−トリメチルシリル−Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン（３７．６ｇ、８０．５ｍｍoｌ）のＴＨＦ（６０ｍL）溶液を２５分かけて滴下し、同温にて１０分間攪拌した。反応液に氷と水を加え、混合物を室温まで温めた後に、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去した。【００９３】
得られた残渣を、メタンスルホン酸（１．５５ｇ，１６．１ｍｍｏｌ）を含むメタノール（３８０ｍＬ）溶液に溶解し、室温で２時間攪拌した。トリエチルアミン（１１．２ｍＬ，８０．５ｍｍｏｌ）で中和し、反応混合物を濃縮した。【００９４】
得られた残渣（３０．２ｇ）をピリジン（１００ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（１００ｍＬ）を加え、室温で１４時間攪拌した。氷水（４００ｍＬ）を加え、混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で２回抽出した。合わせた有機層を１Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去し得られた残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン→ヘキサン：酢酸エチル＝６：４）にて精製し、淡黄色油状の化合物（Ｂ３）（３２．８ｇ，８０％；３工程）を得た。
1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.23 (d, 6 H) 1.84 (s, 3 H) 1.97 (s, 3 H) 2.06 (s, 3 H) 2.10 (s, 3 H) 2.87 (dt, J=13.83, 6.92 Hz, 1 H) 3.32 (s, 3 H) 3.87 (s, 3 H) 4.04 (ddd, J=10.26, 4.74, 2.41 Hz, 1 H) 4.17 - 4.23 (m, 1 H) 4.28 - 4.36 (m, 1 H) 5.25 (dd, J=10.18, 9.40 Hz, 1 H) 5.36 (d, J=10.10 Hz, 1 H) 5.60 (dd, J=10.03, 9.40 Hz, 1 H) 6.74 (d, J=1.55 Hz, 1 H) 6.79 (dd, J=8.08, 1.24 Hz, 1 H) 7.26 - 7.33 (m, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 533[M+Na]+.
参考例１−４  化合物（Ｂ４）【００９５】
【化６】
2012023598.tif 000007
【００９６】
化合物（Ｂ３）（３２．８ｇ，６４．０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１５０ｍＬ）とアセトニトリル（１５０ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下４℃にてＥｔ3ＳｉＨ（２１ｍＬ、１２８ｍｍｏｌ）とＢＦ3・ＯＥｔ2（４９ｍＬ、３８５ｍｍｏｌ）を加え、同温で１時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）にて精製し、淡黄色ガム状の化合物（Ｂ４）（２２．９ｇ，７４％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.22 (d, J=6.99 Hz, 6 H) 1.77 (s, 3 H) 2.01 (s, 3 H) 2.05 (s, 3 H) 2.07 (s, 3 H) 2.87 (dt, J=13.76, 6.96 Hz, 1 H) 3.80 - 3.87 (m, 1 H) 3.84 (s, 3 H) 4.09 - 4.16 (m, 1 H) 4.22 - 4.29 (m, 1 H) 4.88 - 4.95 (m, 1 H) 5.18 - 5.27 (m, 1 H) 5.32 - 5.38 (m, 2 H) 6.71 (d, J=1.55 Hz, 1 H) 6.83 (dd, J=7.93, 1.55 Hz, 1 H) 7.23 - 7.30 (m, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 503[M+Na]+.
MS ESI/APCI Dual nega : 515[M+Cl]-.
参考例１−５  化合物（Ｂ５）【００９７】
【化７】
2012023598.tif 000008
【００９８】
化合物（Ｂ４）（２２．９ｇ，４７．７ｍｍｏｌ）の酢酸（９０ｍＬ）溶液に、臭素（２．４ｍＬ，４７．６ｍｍｏｌ）を室温にて滴下した。反応混合液を１時間攪拌し、反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（４００ｍＬ）に加えた。この混合物を酢酸エチルで２回抽出し、合わせた有機層を１０％食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）にて精製し、淡黄色非晶質の化合物（Ｂ５）（２５．５ｇ，９６％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.20 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 1.23 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 1.80 (s, 3 H) 2.01 (s, 3 H) 2.05 (s, 3 H) 2.09 (s, 3 H) 3.31 (quin, J=6.84 Hz, 1 H) 3.77 - 3.82 (m, 1 H) 3.83 (s, 3 H) 4.10 - 4.17 (m, 1 H) 4.22 - 4.30 (m, 1 H) 4.83 (d, J=9.48 Hz, 1 H) 5.17 - 5.38 (m, 3 H) 6.75 (s, 1 H) 7.49 (s, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 581[M+Na]+, 583[M+2+Na]+.
参考例１−６  化合物（Ｂ６）【００９９】
【化８】
2012023598.tif 000009
【０１００】
化合物（Ｂ５）（２５．５ｇ，４５．６ｍｍｏｌ）のメタノール（２５０ｍＬ）懸濁液に、２５ｗｔ％ナトリウムメトキシド・メタノール溶液（１ｍＬ，４．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応溶液にドライアイスを入れた後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１３５ｍＬ）に溶解し、氷冷下にてトリエチルアミン（４５ｍＬ）とクロロトリメチルシラン（３５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温にて２時間攪拌し、氷水を加えた。この混合物をトルエンで２回抽出し、合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去し、茶色油状の化合物（Ｂ６）（３０．３ｇ）を得た。これを精製せずに次の反応に用いた。
1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm -0.32 (s, 9 H) 0.09 (s, 9 H) 0.18 (s, 9 H) 0.20 (s, 9 H) 1.19 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 1.23 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 3.26 - 3.44 (m, 3 H) 3.52 - 3.58 (m, 2 H) 3.65 - 3.75 (m, 3 H) 3.76 - 3.83 (m, 1 H) 3.80 (s, 3 H) 4.60 (d, J=8.55 Hz, 1 H) 6.72 (s, 1 H) 7.51 (s, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 701[M+Na]+, 703[M+2+Na]+.
参考例１−７  化合物（Ｂ７）【０１０１】
【化９】
2012023598.tif 000010
【０１０２】
化合物（Ｂ６）（８．７ｇ，１２．９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍＬ）溶液にアルゴン雰囲気下、−７８℃にて２．７Ｍ  ｎ−ブチルリチウムへキサン溶液（４．７ｍＬ，１２．９ｍｍｏｌ）を滴下し、同温にて１０分間攪拌した。次いで４−ブロモベンズアルデヒド（２．６ｇ，１４．２ｍｍoｌ）のＴＨＦ（２５ｍL）溶液を１５分かけて滴下し、同温にて３０分間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、この混合物を室温まで温めた後に、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去した。【０１０３】
得られた残渣を、メタンスルホン酸（０．２ｇ）を含むメタノール（６５ｍＬ）溶液に溶解し、室温で１４時間攪拌した。トリエチルアミン（１．８ｍＬ）で中和し、反応混合物を濃縮した。得られた残渣を酸性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝９：１）で精製し、無色非晶質の化合物（Ｂ７）（２．９ｇ，４５％）を得た。
1H NMR (300 MHz, METHANOL- d4) δ ppm 1.00 - 1.11 (m, 6 H) 3.10 - 3.27 (m, 2 H) 3.34 - 3.40 (m, 5H) 3.43 - 3.70 (m, 4H) 3.84 (s, 4 H) 4.66 (d, J=9.64 Hz, 1 H) 5.47 (s, 1 H) 6.89 (d, J=1.24 Hz, 1 H) 7.20 (d, J=2.18 Hz, 1 H) 7.22 (d, J=2.18 Hz, 1 H) 7.37 - 7.47 (m, 3 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 479[M-H2O+H]+
参考例１−８  中間体（Ｂ）の製造【０１０４】
【化１０】
2012023598.tif 000011
【０１０５】
化合物（Ｂ７）（２．９ｇ，５．８ｍｍｏｌ）をピリジン（１８ｍＬ）に溶解した。この溶液に無水酢酸（９ｍＬ）を加え、室温で５時間攪拌した。氷水を加え、混合物を酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を３Ｎ塩酸、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去し粗生成物（３．３ｇ）を得た。【０１０６】
この粗生成物（３．３ｇ）のクロロホルム（２５ｍＬ）とアセトニトリル（２５ｍＬ）溶液にＥｔ3ＳｉＨ（１．１ｍＬ，７．１ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下氷冷した。氷冷下、ＢＦ3・ＯＥｔ2（０．９ｍＬ，７．１ｍｍｏｌ）を１０分かけて滴下し、同温で３０分間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を酸性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝９：１→６：４）で精製し、無色油状物として中間体（Ｂ）（２．９ｇ，７６％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.04 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 1.09 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 1.76 (s, 3 H) 2.01 (s, 3 H) 2.05 (s, 3 H) 2.06 (s, 3 H) 2.91 - 3.06 (m, 1 H) 3.80 - 3.88 (m, 4 H) 3.91 (d, J=5.13 Hz, 2 H) 4.06 - 4.18 (m, 1 H) 4.20 - 4.31 (m, 1 H) 4.82 - 4.93 (m, 1 H) 5.15 - 5.43 (m, 3 H) 6.77 (s, 1 H) 6.92 (d, J=8.55 Hz, 2 H) 7.11 (s, 1 H) 7.36 (d, J=8.55 Hz, 2 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 671[M+Na]+, 666[M+NH4]+
参考例２  中間体（Ｃ）の製造【０１０７】
【化１１】
2012023598.tif 000012
【０１０８】
参考例２−１  化合物（Ｃ１）【０１０９】
【化１２】
2012023598.tif 000013
【０１１０】
２，２−ジメチル−３−ブテノイックアシッド（J. Org. Chem., 第65巻, 8402頁，2000年）（５．４２ｇ，４７．５ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２５０ｍＬ）溶液に窒素雰囲気下、塩化オキサリル（４．４３ｍＬ，４９．９ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３滴）を加え、室温で１．５時間攪拌した。その後反応液を氷冷し、トリエチルアミン（１９．９ｍＬ，１４３ｍｍｏｌ）とα−アミノイソブチリックアシッドメチルエステル塩酸塩（１０．９ｇ，７１．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出後、有機層を３Ｍ塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン→ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）にて精製し、無色粉末の化合物（Ｃ１）（９．３８ｇ，９３％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.27 (s, 6 H) 1.51 (s, 6 H) 3.73 (s, 3 H) 5.17 - 5.32 (m, 2 H) 6.02 (dd, J=17.56, 10.57 Hz, 1 H) 6.25 (br. s., 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 214[M+H]+.
参考例２−２  中間体（Ｃ）【０１１１】
【化１３】
2012023598.tif 000014
【０１１２】
化合物（Ｃ１）（９．３８ｇ，４３．９ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ｍＬ）溶液に４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１６．５ｍＬ，６６．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。その後、反応混合物を濃縮した。得られた残渣を水に溶解し、３Ｍ塩酸を加えて中和した。この混合物を酢酸エチルで２回抽出し、合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去し、無色粉末の中間体（Ｃ）（８．１９ｇ，９４％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.29 (s, 6 H) 1.54 (s, 6 H) 5.16 - 5.36 (m, 2 H) 6.01 (dd, J=17.49, 10.65 Hz, 1 H) 6.14 (s, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 200[M+H]+, 222[M+Na]+.
MS ESI/APCI Dual nega : 198[M-H]-.
参考例３  化合物Ｄの製造【０１１３】
【化１４】
2012023598.tif 000015
【０１１４】
アルゴン雰囲気下、中間体（Ｂ）（１．２ｇ，１．８５ｍｍｏｌ）、中間体（Ｃ）（２．５９ｇ，１３．０ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（ＩＩ）（４４ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）、トリ-ｏ-トリルホスフィン（１１２ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．３ｍＬ，９．２５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３６ｍｌ）懸濁液を、マイクロウェーブ照射下１２０℃で３０分間攪拌した。反応液をセライト（登録商標）を用いてろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝９：１）にて精製し、粗精製物として化合物（Ｄ）（１．５ｇ）を得た。得られた化合物（Ｄ）（１．５ｇ）を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝７：３→２：８）にてさらに精製し、淡黄色非晶質の化合物（Ｄ）（８５４ｍｇ，６０％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.08 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 1.12 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 1.38 (s, 6 H) 1.53 (s, 6 H) 1.77 (s, 3 H) 2.00 (s, 3 H) 2.05 (s, 6 H) 3.06 (quin, J=6.64 Hz, 1 H) 3.78 - 3.83 (m, 1 H) 3.84 (s, 3 H) 3.97 (s, 2 H) 4.07 - 4.18 (m, 1 H) 4.17 - 4.27 (m, 1 H) 4.87 (dd, J=6.76, 2.88 Hz, 1 H) 5.16 - 5.25 (m, 1 H) 5.27 - 5.40 (m, 2 H) 6.18 - 6.33 (m, 2 H) 6.54 (d, J=16.48 Hz, 1 H) 6.77 (s, 1 H) 7.03 (d, J=8.08 Hz, 2 H) 7.10 (s, 1 H) 7.29 (d, J=8.08 Hz, 2 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 768[M+H]+, 790[M+Na]+.
MS ESI/APCI Dual nega : 766[M-H]-.
参考例４  化合物（Ｅ）の製造【０１１５】
【化１５】
2012023598.tif 000016
【０１１６】
化合物（Ｄ）（１００ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル一水和物（ＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ）（３０ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（４２μＬ，０．３９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１．５ｍＬ）／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）溶液にＮ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ−ＨＣｌ）（３７ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。反応液を水にあけ、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝７：３→２：８）で精製し、無色非晶質の化合物（Ｅ）（１０３ｍｇ，９４％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CHLOROFORM-d) δ ppm 1.05 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 1.10 (d, J=6.84 Hz, 3 H) 1.38 (s, 6 H) 1.49 (s, 6 H) 1.77 (s, 3 H) 2.00 (s, 3 H) 2.05 (s, 3 H) 2.06 (s, 3 H) 2.46 (s, 6 H) 2.64 - 2.78 (m, 2 H) 3.04 (quin, J=6.80 Hz, 1 H) 3.38 - 3.49 (m, 2 H) 3.78 - 3.83 (m, 1 H) 3.85 (s, 3 H) 3.87 - 4.04 (m, 2 H) 4.08 - 4.18 (m, 1 H) 4.18 - 4.30 (m, 1 H) 4.87 (d, J=9.48 Hz, 1 H) 5.16 - 5.27 (m, 1 H) 5.28 - 5.44 (m, 2 H) 6.35 (s, 1 H) 6.40 - 6.57 (m, 2 H) 6.77 (s, 1 H) 7.01 (d, J=8.24 Hz, 2 H) 7.13 (s, 1 H) 7.32 (d, J=8.24 Hz, 2 H) 7.40 (s, 1 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 838[M+H]+.  
MS ESI/APCI Dual nega : 872[M+Cl]-.
参考例５  化合物（Ａ）の製造【０１１７】
【化１６】
2012023598.tif 000017
【０１１８】
化合物（Ｅ）（１０３ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）にトリエチルアミン／水／メタノール（１／１／５，２．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で１７時間攪拌し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝８：２）で精製し、無色非晶質の化合物（Ａ）（６２．１ｍｇ，７５％）を得た。
1H NMR (600 MHz, METHANOL- d4) δ ppm 1.07 (d, J=5.04 Hz, 3 H) 1.09 (d, J=5.04 Hz, 3 H) 1.36 (s, 6 H) 1.44 (s, 6 H) 2.23 (s, 6 H) 2.41 (t, J=6.88 Hz, 2 H) 3.10 (quin, J=6.76 Hz, 1 H) 3.26 - 3.30 (m, 2 H) 3.38 (d, J=5.96 Hz, 2 H) 3.45 - 3.52 (m, 1 H) 3.54 - 3.60 (m, 1 H) 3.62 - 3.69 (m, 1 H) 3.79 - 3.89 (m, 4 H) 3.99 (s, 2 H) 4.65 (d, J=9.63 Hz, 1 H) 6.39 (d, J=16.51 Hz, 1 H) 6.52 (d, J=16.51 Hz, 1 H) 6.88 (s, 1 H) 7.07 (d, J=8.25 Hz, 2 H) 7.23 (s, 1 H) 7.31 (d, J=8.25 Hz, 2 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 670[M+H]+.
MS ESI/APCI Dual nega : 704[M+Cl]-.
Anal. Calcd for C37H55N3O8・1.0H2O : C, 64.6; H, 8.36; N, 6.11. Found : C, 64.5; H, 8.31; N, 6.02.
参考例６  化合物（Ａ）の精製
無色非晶質の化合物（Ａ）（９．８８ｇ，純度９６．０％）を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝７：３→１：１）にて精製し、無色非晶質の化合物（Ａ）（６．２４ｇ，回収率６３％，純度９９．５％）を得た。更に、無色非晶質の化合物（Ａ）（６．２４ｇ，純度９９．５％）を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝７：３→３：７）にて精製し、無色非晶質の化合物（Ａ）（３．３１ｇ，回収率５３％，純度９９．９％）を得た。
実施例１
無色非晶質の化合物（Ａ）（純度９９．９％）２５ｍｇをエタノール０．０８ｍＬに室温にて溶解させた後、１日間室温で撹拌させ結晶を得た。本結晶を室温で減圧乾燥し、無色の結晶２７ｍｇ（回収率１００％）を得た。この結晶の粉末Ｘ線回折パターン及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物の結晶であった。
実施例２
無色非晶質の化合物（Ａ）（純度９６．０％）５６ｇをエタノール１３５ｍＬに６６℃で溶解した後、撹拌しながらヘプタン１３５ｍＬを加えて冷却し、４５℃付近で、実施例１で得られた化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物の結晶を入れた後、１℃まで温度を下げた。析出した結晶をろ取した後に、４０℃で減圧乾燥し、無色の結晶４６ｇ（回収率８２％，純度９９．１％）を得た。この結晶の粉末Ｘ線回折パターン、示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）及び赤外吸収スペクトルを測定したところ、化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物の結晶であった。
1H NMR (600 MHz, METHANOL- d4) δ ppm 1.06 (d, J=5.04 Hz, 3 H) 1.07 (d, J=5.50 Hz, 3 H) 1.15 (t, J=6.88 Hz, 3 H) 1.34 (s, 6 H) 1.43 (s, 6 H) 2.20 (s, 6 H) 2.37 (t, J=6.88 Hz, 2 H) 3.08 (quin, J=6.88 Hz, 1 H) 3.26 (t, J=6.88 Hz, 2 H) 3.28-3.30 (m, 4 H) 3.34 - 3.38 (m, 2 H) 3.43 - 3.49 (m, 1 H) 3.55 (t, J=9.17 Hz, 1 H) 3.58 (q, J=6.88 Hz, 2 H) 3.62 - 3.66 (m, 1 H) 3.78 - 3.85 (m, 4 H) 3.96 (s, 2 H) 4.63 (d, J=9.62 Hz, 1 H) 6.37 (d, J=16.50 Hz, 1 H) 6.50 (d, J=16.50 Hz, 1 H) 6.86 (s, 1 H) 7.05 (d, J=7.80 Hz, 2 H) 7.22 (s, 1 H) 7.29 (d, J=7.79 Hz, 2 H).
MS ESI/APCI Dual posi : 670[M+H]+.
MS ESI/APCI Dual nega : 704[M+Cl]-.
Anal. Calcd for C39H61N3O9・0.6H2O : C, 64.94; H, 8.61; N, 5.83. Found: C, 64.75; H, 8.46; N, 5.82.
実施例３
化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物０．１０ｇにリン酸塩緩衝液（リン酸二水素ナトリウム・２水和物とリン酸水素二ナトリウム・１２水和物との混合液）（ｐＨ６．８）６００μＬを加え，２５℃で２４時間懸濁した。遠心分離（３０００ｒｐｍ，２５℃，１０分）後，上清を取り除き、室温で乾燥し、無色の結晶を得た。この結晶の粉末Ｘ線回折パターン及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、Ａ形結晶であった。
実施例４
化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物０．１０ｇにイソプロピルエーテル／メタノール（９／１）を２ｍＬ加え、懸濁させ、２５℃で１週間懸濁した。遠心分離（３０００ｒｐｍ，２５℃，１０分）後，上清を取り除き、室温で乾燥して無色の結晶を得た。この結晶の粉末Ｘ線回折パターン及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、Ｂ形結晶であった。
実施例５
化合物（Ａ）のＡ形結晶１．００ｇを減圧状態で１２０℃まで昇温させた後、０．５ｇを採取し、ヘキサン／酢酸エチル（２／１）を１０ｍＬ加え、懸濁させ、６５℃で８時間懸濁した。懸濁液の溶媒を留去後、室温で乾燥して無色の結晶を得た。この結晶の粉末Ｘ線回折パターン及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、Ｃ形結晶であった。
実施例６
化合物（Ａ）のエタノール溶媒和物０．４０ｇにイソプロピルエーテル／メタノール（９／１）を１０ｍＬ加え、懸濁させ、２５℃で３日間懸濁した。さらにイソプロピルエーテル／メタノール（９／１）を５０ｍＬ追加後、２５℃で６日間懸濁した。遠心分離（３０００ｒｐｍ，２５℃，１０分）後，上清を取り除き、室温で乾燥して無色の結晶を得た。この結晶の粉末Ｘ線回折パターン及び示差熱分析／熱質量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）を測定したところ、二水和物の結晶であった。
試験例１
（１）ヒトＳＧＬＴ１を安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の作製
ヒトＳＧＬＴ１蛋白質を発現するプラスミドベクターを、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションした。ＳＧＬＴ１発現細胞は、５００μｇ／ｍＬの濃度のジェネティシンの存在下で培養し耐性株を選択し、下記に示す系により糖取り込み能を指標に取得した。
（２）ヒトＳＧＬＴ２を安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の作製
方法Ａ（ＷＯ２００７／１３６１１６に記載の方法）：ヒトＳＧＬＴ２カルボキシ末端の最終残基にＬｅｕＧｌｕＳｅｒＡｒｇＧｌｙＰｒｏＶａｌが付加された蛋白質を発現するプラスミドベクターを、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションした。ＳＧＬＴ２発現細胞は、５００μｇ／ｍＬの濃度のハイグロマイシンＢの存在下で培養し耐性株を選択し、下記に示す系により糖取り込み能を指標に取得した。本安定発現細胞を用いて算出された結果を表１に方法Ａとして示した。【０１１９】
方法Ｂ：ヒトＳＧＬＴ２蛋白質を発現するプラスミドベクターを、リポフェクトアミンＬＴＸ（インビトロジェン社）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションした。ＳＧＬＴ２発現細胞は、１０００μｇ／ｍＬの濃度のジェネティシンの存在下で培養し耐性株を選択し、下記に示す系により糖取り込み能を指標に取得した。本安定発現細胞を用いて算出された結果を表１に方法Ｂとして示した。
（３）安定発現細胞におけるナトリウム依存的糖取り込み阻害試験
上記で調製した安定発現細胞を用いて下記試験を行った。【０１２０】
前処理用緩衝液（１４０ｍＭ  塩化コリン、２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）を２００μＬをＳＧＬＴ１安定発現細胞に、または２ｍＬを各ＳＧＬＴ２安定発現細胞に加え、２０分間インキュベーションした。前処理用緩衝液を除去し、試験化合物を含む取り込み用緩衝液（［14Ｃ］メチル  α−Ｄ−グルコピラノシドを含むメチル  α−Ｄ−グルコピラノシド（１ｍＭ）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）を７５μＬ（ＳＧＬＴ１の場合）、または２００μＬ（ＳＧＬＴ２の場合）加え、３７℃にて３０分（ＳＧＬＴ１）または６０分（ＳＧＬＴ２）取り込み反応を行った。反応後細胞を洗浄用緩衝液（１０ｍＭ  メチル  α−Ｄ−グルコピラノシド、１４０ｍＭ  塩化コリン２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）２００μＬ（ＳＧＬＴ１の場合）、または２ｍＬ（ＳＧＬＴ２の場合）で２回洗浄し、０．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液７５μＬ（ＳＧＬＴ１の場合）、または４００μＬ（ＳＧＬＴ２の場合）に溶かした。液体シンチレーター（パーキンエルマー社）を加えよく混和した後、β線測定装置を用いて放射活性を測定した。対照群として試験化合物を含まない取り込み用緩衝液を調製した。また基礎取り込み用としてＮａＣｌに代えて塩化コリンを含む取り込み用緩衝液を調製した。【０１２１】
ＩＣ50値を求めるにあたり、適当な６濃度の試験化合物を用い、対照群の糖取り込み量（１００％）に対し、糖取り込み量が５０％阻害される試験化合物濃度（ＩＣ50値）を算出した。試験結果を表１に示す。【０１２２】
【表１】
2012023598.tif 000018
表１より、化合物（Ａ）は、強いＳＧＬＴ１阻害活性を有し、また、ＳＧＬＴ２阻害活性も弱いがある程度の活性を有することが示された。【０１２３】
以下に、類似構造化合物に対する化合物（Ａ）の優位性を示す。【０１２４】
試験例２  ストレプトゾトシン糖尿病モデルラットにおける血糖値上昇抑制作用確認試験
（１）糖尿病モデルラットの作製
７週齢のＳＤ／ＩＧＳラット（日本チャールスリバー株式会社，雄性）について約１６時間の絶食後、エーテル麻酔下でストレプトゾトシン（ＳＴＺ）５０ｍｇ／ｋｇを尾静脈内投与し、糖尿病モデルラットを作製した。同様にエーテル麻酔下、１．２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸生理食塩液１ｍＬ／ｋｇを尾静脈内投与し、正常対照ラットを作製した。ＳＴＺまたは１．２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸生理食塩液投与１週後（８週齢）、経口グルコース負荷試験に供した。
（２）経口グルコース負荷試験
ラットを約１６時間の絶食後、薬物投与群には、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）水溶液に溶解した薬物（１ｍｇ／ｋｇ）を、対照群には０．５％ＣＭＣ水溶液のみ経口投与した。薬物投与５分後に、グルコース溶液（２ｇ／ｋｇ）を経口投与し、薬物投与前（０ｔｉｍｅ）、及び、経口投与０．２５、０．５、１、２時間後の計５点で採血した。【０１２５】
採血は、エーテル麻酔下でラット尾静脈よりヘパリンコート採血管を用いて行い、遠心分離後、血漿を分取した。血漿中グルコース濃度の定量は、グルコースＣIIテストワコー（和光純薬株式会社）を用いて測定した。血糖値上昇抑制作用強度は、各薬物投与群の０から1時間までの血糖値より台形法を用いて血糖値-時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、basalを差し引いた血糖増加面積（ΔＡＵＣ）として表記し、対照群のそれに対する降下の割合で表記した。【０１２６】
結果を表２及び表３に示す。【０１２７】
試験例３
（１）ＷＯ２００７／１３６１１６に開示された化合物の経口投与後１週間までの腎臓中濃度推移
７週齢のＳＤ／ＩＧＳラット（日本チャールスリバー株式会社、雄性、非絶食）に、０．５％ＣＭＣ水溶液にて調製した化合物４、１０、３３（各１ｍｇ／ｋｇ）、および化合物１１（０．３ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。薬物投与後２４、７２、１６８時間にエーテル麻酔下、後大静脈より全採血し、安楽死確認後に腎臓を摘出した。生理食塩液で組織表面を洗浄後、重量を測定し４倍量の精製水を加え氷冷下ホモジナイズした。ホモジネートに内標準物質を含むアセトニトリル／メタノール溶液を加えて除タンパクした後、上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（アプライドバイオシステムズAPI3000）に供した。ポジティブイオンモードのエレクトロスプレーイオン化法にて生成した薬物由来のイオンを選択反応モニタリングにて検出した。得られた抽出イオンクロマトグラムのピーク面積から内標準法にてホモジネート中薬物濃度を算出した。【０１２８】
ここで、化合物１０および３３の内部標準物質には、（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−エトキシベンジル）−２−メトキシ−４−メチルフェニル］−１−チオ−Ｄ−グルシトール，エチル−Ｄ5を用い、化合物４および１１の内部標準物質には、化合物１１および化合物１１重水素標識体（トリスヒドロキシメチル−Ｄ6；−Ｃ（ＣＤ2ＯＨ）3）をそれぞれ用いた。【０１２９】
実験結果を表２に示す。
（２）本発明の化合物（Ａ）の３日間反復経口投与後の腎臓中濃度
７週齢のＳＤ／ＩＧＳラット（日本チャールスリバー株式会社、雄性、非絶食）に、０．５％ＣＭＣ水溶液にて調製した化合物（Ａ）（３ｍｇ／ｋｇ）を１日１回３日間連続経口投与した。最終日の薬物投与後４８時間にイソフルラン麻酔下、後大静脈より全採血し、安楽死確認後に腎臓を摘出した。生理食塩液で組織表面を洗浄後、重量を測定し４倍量の精製水を加え氷冷下ホモジナイズした。ホモジネート中薬物濃度の測定は、上記に示した試験例３の（１）と同じ方法で、内部標準物質に上記の化合物１１を用い、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより行った。【０１３０】
実験結果を表３に示す。【０１３１】
【表２】
2012023598.tif 000019
【０１３２】
ＷＯ２００７／１３６１１６に開示の化合物４、１０、１１および３３の構造を、下記に示す。【０１３３】
【化１７】
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【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
ＷＯ２００７／１３６１１６号に開示の化合物は１ｍｇ／ｋｇ経口投与後の糖負荷試験において、強い血糖低下作用を示した。しかし、１ｍｇ／ｋｇ経口投与した後、腎臓中から化合物の消失速度が緩慢で、７日後でも化合物は排泄されず腎臓に残留する傾向が見られた（表２）。【０１３６】
一方、化合物（Ａ）は上記先行技術化合物と同様に強い血糖降下作用を有した。また、３ｍｇ／ｋｇの用量で３日間連続投与したにも関わらず、投与２日後に意外にも化合物は腎臓に残留しないという特徴を示した（表３）。【０１３７】
この相違の原因として、化合物（Ａ）は、体内に吸収された場合に腎臓に残留されずにすみやかに排泄されたと考えられる。【０１３８】
したがって、化合物（Ａ）は、体内残留性がなく、連続投与による副作用及び毒性が少ない医薬品として実用性に優れた性質を有すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明の（１Ｓ）−１，５−アンヒドロ−１−［５−（４−｛（１Ｅ）−４−［（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ］−３，３−ジメチル−４−オキソブタ−１−エン−１−イル｝ベンジル）−２−メトキシ−４−（プロパン−２−イル）フェニル］−Ｄ−グルシトールの結晶は、優れた保存安定性、その他の物性を有しており医薬品原体として有用である上、工業生産に適している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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