(57)【要約】【課題】新規な耐熱性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ及びその生産方法を提供する。【解決手段】配列番号１、２又は３に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼ。配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が６０〜７５℃の範囲であるか、または７０℃の温度においてＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有するか、または７０〜８０℃の温度で５分間の熱処理後の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が、未熱処理の場合のＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の８０％以上の耐熱性を有する。配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が４５〜５５℃の範囲であるか、５５℃の温度においてＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有するか、又は５５〜６０℃の温度で５分間の熱処理後の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が、未熱処理の場合のＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の８０％以上の耐熱性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項２】
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が６０〜７５℃の範囲である鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項３】
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつ７０℃の温度においてもＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項４】
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、７０〜８０℃の温度で５分間の熱処理後の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が、未熱処理の場合のＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の８０％以上の耐熱性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項５】
ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が６０〜７５℃の範囲である請求項４に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項６】
７０℃の温度においてＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する請求項４に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項７】
鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大となるpHが8.0以上である請求項２〜６のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項８】
配列番号１又は２に示したアミノ酸配列が、少なくとも生物学的に許容される一つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含む、請求項２〜７のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項９】
１〜１０個のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含む請求項８に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項１０】
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項１１】
配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が４５〜５５℃の範囲である鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項１２】
配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつ５５℃の温度においてもＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項１３】
配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、５５〜６０℃の温度で５分間の熱処理後の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が、未熱処理の場合のＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の８０％以上の耐熱性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項１４】
ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が４５〜５５℃の範囲である請求項１３に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項１５】
５５℃の温度においてＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する請求項１３に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項１６】
DNAポリメラーゼ活性および鎖置換型活性が最大となるpHが8.0以上である請求項１１〜１５のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項１７】
配列番号３に示したアミノ酸配列が、少なくとも生物学的に許容される一つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含む、請求項１１〜１６のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項１８】
１〜１０個のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含む請求項１７に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項１９】
LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) 法における核酸合成に用いられる請求項１〜１８のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載のDNAポリメラーゼをコードする遺伝子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の遺伝子をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするDNAポリメラーゼを蓄積し、蓄積したDNAポリメラーゼを収集することを含む、鎖置換型DNAポリメラーゼの生産方法。
【請求項２２】
収集されたDNAポリメラーゼが請求項１〜１８のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼを含む請求項２０に記載の生産方法。
【請求項２３】
リーダー配列との共発現法を利用した大腸菌発現ベクターを用いる請求項２０または２１に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００９年１１月６日出願の日本特願２００９−２５４５２９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、耐熱性鎖置換型DNAポリメラーゼ及び該DNAポリメラーゼの生産法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
SDA(Strand Displacement Amplification)法やLAMP法などの鎖置換型DNA増幅が、DNAの増幅法として近年注目され、かつ多用されるようになってきている。【０００４】
鎖置換型DNA増幅を行うには、鎖置換型活性を有するDNAポリメラーゼが用いられる。鎖置換型活性を有するDNAポリメラーゼとしては、例えば、Geobacillus stearothermophilus由来のBst DNAポリメラーゼや、Bacillus pallidus由来のBpa DNAポリメラーゼ[特許文献1]等が報告されている。また、大腸菌と同じようにタンパク質のN末端側の5'-3'エキソヌクレアーゼドメインを含まないKlenow型酵素も知られている[特許文献2]。Bacillus属由来のDNAポリメラーゼは、中程度の高温域 (60℃付近の温度)で生育するものであり、耐熱性で鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有している。【０００５】
また耐熱性は有していないが、Bacillus subtilisに感染するPhi29ファージのDNAポリメラーゼはT4 DNAポリメラーゼと同様に3'-5'エキソヌクレアーゼ活性が強く、また鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有している。最近では、超高速並列DNAシーケンサーを用いた大規模シーケンシングにおけるサンプル調製及び塩基配列の解読にこれらの鎖置換型DNAポリメラーゼが利用されており、その有用性は高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許5,736,373
【特許文献２】米国特許5,814,506
【特許文献３】日本特許第4086783号公報
【特許文献４】日本特許第4086235号公報
【特許文献５】日本特開2001-321181号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sidhu, M. K., et al. BioTechniques., 21: 44 (1998)
【非特許文献２】Kiefer, J. R., et al. Structure., 5: 95 (1997)
【非特許文献３】Sommer, R., Tautz, D. Nucl. Acids. Res., 17: 6749 (1989)
【非特許文献４】Collins, F. S., and Weissman, S. M. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 81: 6812 (1984)
【非特許文献５】Triglia, T., Peterson, M. G., and Kemp, D. J. Nucl. Acids. Res., 16: 8186 (1988)
【非特許文献６】Xu, S. Y., Xiao, J. P., Posfai, J., Maunus, R. E., Benner, J. S. Nucl. Acids. Res., 25: 3991 (1988)
【０００８】
特許文献１〜５及び非特許文献１〜６の全記載は、ここに特に開示として援用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
GC含量が高いDNA配列には、PCR法による増幅が極めて困難なDNA配列が存在する。このような場合には、水素結合に影響を与える溶媒(例えばDMSO、ベタイン、ホルムアミド)を添加することにより増幅が可能となる方法がある[例えば、非特許文献１]。しかし、鎖置換型DNA増幅においては、上記のようなGC含量が高いDNA配列であっても増幅は容易である。従って、今後の遺伝子解析、検査、診断分野において鎖置換型DNA増幅は有望な技術である。【００１０】
しかしながら、これまでに報告されている鎖置換型DNAポリメラーゼはPCR法で汎用されているTaq DNAポリメラーゼやPfu DNAポリメラーゼ等と比べて耐熱性が低い。遺伝子解析、検査、診断において正確な結果を得るためには、よりタンパク質の安定性に優れ、阻害物質に対する耐性が高いなどの、新しい機能を有するDNAポリメラーゼが要望されている。【００１１】
そこで本発明の目的は、新規な耐熱性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼを提供すること、及びその生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、有機廃棄物を85℃以上の温度で発酵させて得られた堆肥中に存在する微生物に由来のDNAポリメラーゼについて調査検討し、その結果、上記目的を達成する新規な耐熱性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼを見出して本発明を完成させた。【００１３】
本発明は、以下のとおりである。
[１]
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[２]
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が６０〜７５℃の範囲である鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[３]
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつ７０℃の温度においてもＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[４]
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、７０〜８０℃の温度で５分間の熱処理後の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が、未熱処理の場合のＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の８０％以上の耐熱性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[５]
ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が６０〜７５℃の範囲である[４]に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[６]
７０℃の温度においてＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する[４]に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[７]
鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大となるpHが8.0以上である[２]〜[６]のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[８]
配列番号１又は２に示したアミノ酸配列が、少なくとも生物学的に許容される一つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含む、[２]〜[７]のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[９]
１〜１０個のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含む[８]に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[１０]
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[１１]
配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が４５〜５５℃の範囲である鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[１２]
配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつ５５℃の温度においてもＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[１３]
配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、５５〜６０℃の温度で５分間の熱処理後の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が、未熱処理の場合のＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の８０％以上の耐熱性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[１４]
ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が４５〜５５℃の範囲である[１３]に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[１５]
５５℃の温度においてＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する[１３]に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[１６]
DNAポリメラーゼ活性および鎖置換型活性が最大となるpHが8.0以上である[１１]〜[１５]のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[１７]
配列番号３に示したアミノ酸配列が、少なくとも生物学的に許容される一つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含む、[１１]〜[１６]のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[１８]
１〜１０個のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含む[１７]に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[１９]
LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法における核酸合成に用いられる[１]〜[１８]のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。
[２０]
[１]〜[１８]のいずれかに記載のDNAポリメラーゼをコードする遺伝子。
[２１]
[２０]に記載の遺伝子をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするDNAポリメラーゼを蓄積し、蓄積したDNAポリメラーゼを収集することを含む、鎖置換型DNAポリメラーゼの生産方法。
[２２]
収集されたDNAポリメラーゼが[１]〜[１８]のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼを含む[２０]に記載の生産方法。
[２３]
リーダー配列との共発現法を利用した大腸菌発現ベクターを用いる[２０]または[２１]に記載の生産方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、新規な耐熱性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼを提供すること、及びその生産方法を提供することにある。さらに、本発明の鎖置換型DNAポリメラーゼは、塩基性条件下においても良好な鎖置換型DNAポリメラーゼを有すること、さらに、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の保存安定性も優れたものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】Caldothrix satsumae YMO81由来の耐熱性DNAポリメラーゼ(fYMO81 DNAポリメラーゼ)とGeobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼ(GenBank Accession No. AAB52611)とのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図１−２】Caldothrix satsumae YMO81由来の耐熱性DNAポリメラーゼ(fYMO81 DNAポリメラーゼ)とGeobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼ(GenBank Accession No. AAB52611)とのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図２−１】Caldothrix satsumae YMO81由来の耐熱性DNAポリメラーゼ(tYMO81 DNAポリメラーゼ)とGeobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼ(GenBank Accession No. AAB52611)とのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図２−２】Caldothrix satsumae YMO81由来の耐熱性DNAポリメラーゼ(tYMO81 DNAポリメラーゼ)とGeobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼ(GenBank Accession No. AAB52611)とのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図３−１】未同定微生物96-7由来の耐熱性DNAポリメラーゼ(t96-7 DNAポリメラーゼ)とGeobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼ(GenBank Accession No. AAB52611)とのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図３−２】未同定微生物96-7由来の耐熱性DNAポリメラーゼ(t96-7 DNAポリメラーゼ)とGeobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼ(GenBank Accession No. AAB52611)とのアミノ酸配列の比較を示す説明図である。
【図４】fYMO81 DNAポリメラーゼ及びtYMO81 DNAポリメラーゼの大腸菌での発現を示すゲル電気泳動写真である。
【図５】t96-7 DNAポリメラーゼの大腸菌での発現を示すゲル電気泳動写真である。
【図６】fYMO81 DNAポリメラーゼ及びtYMO81 DNAポリメラーゼのDNAポリメラーゼ活性を示すゲル電気泳動写真である。
【図７】t96-7 DNAポリメラーゼのDNAポリメラーゼ活性を示すゲル電気泳動写真である。
【図８】fYMO81 DNAポリメラーゼ及びtYMO81 DNAポリメラーゼのRCA法における至適反応温度を示すゲル電気泳動写真並びにt96-7 DNAポリメラーゼのRCA法における至適反応温度を示すゲル電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［鎖置換型DNAポリメラーゼ］
本発明は、鎖置換型DNAポリメラーゼであって、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼ（本発明の第１の態様の鎖置換型DNAポリメラーゼ）及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼ（本発明の第２の態様の鎖置換型DNAポリメラーゼ）に関する。
【００１７】
前述のように、本発明者らは、有機廃棄物を85℃以上の温度で発酵させて得られた堆肥中に存在する微生物に由来のDNAポリメラーゼについて調査検討した結果、上記本発明の第１の態様及び第２の態様の鎖置換型DNAポリメラーゼを見出した。
【００１８】
中程度の高温で生育するGeobacillus stearothermophilusは好熱性好気性菌として一般的であるが、分類が非常にあいまいであり、これまで複数のGeobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼが報告されている[非特許文献２]。また、同じGeobacillus属であるが、報告されているstearothermophilus、caldotenaxと極めて構造の類似したDNAポリメラーゼが発見されている。これは、中程度高温菌であるGeobacillus属がまだまだ多様性が広いことを示しており、新しいDNAポリメラーゼを探索する微生物として魅力ある微生物である
【００１９】
Bacillus属、Geobacillus属に属する中温性好気性芽胞菌は従来から堆肥の生産に用いられて来た。堆肥とは、微生物を用い家畜糞、屎尿、汚泥、都市ごみ等の有機物を発酵させて得られる肥料であり、従来、この発酵の過程には好熱性の微生物が用いられていた。しかしながら、発酵熱による発酵温度は80℃程度が上限であり、芽胞形成性雑菌などを完全に除去することが出来なかった。
【００２０】
この問題を解決するために、霧島火山地帯の土壌から得られた85℃以上の温度で生育する細菌培養物を生汚泥に加えて混合し、通気発酵させて85℃以上の発酵温度で汚泥中に存在する雑菌、種子等を死滅させ、汚泥を清浄化し、有用な菌体のみを多数含有する汚泥発酵物を得る方法が見出された [特許文献３、４]。
【００２１】
この汚泥発酵物は堆肥として利用され、従来の堆肥中において芽胞形成性雑菌等に比べると占有率が低く、見落とされていたであろう新規のBacillus属、Geobacillus属に属する中温性好気性芽胞菌、高温性好気性芽胞菌、好熱菌等が多数見出されている[特許文献３、４]。
【００２２】
本発明者らは、有機廃棄物を85℃以上の温度で発酵させて得られた前述の堆肥に着目し、この堆肥から本発明が目的とする耐熱性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼが得られないか試みた。その結果、前記堆肥から単離された好熱菌Caldothrix satsumae YMO81（FERM BP-8233）由来のDNAポリメラーゼ遺伝子を単離した。前述のGeobacillus stearothermophilusは芽胞形成能を有するグラム陽性桿菌であるが、Caldothrix satsumae YMO81はグラム陰性細菌であり、芽胞形成能を持たない。そして、得られたCaldothrix satsumae YMO81由来のDNAポリメラーゼに関しては塩基配列、アミノ酸配列の報告が無かったため、大腸菌に組換えタンパク質を発現させてその活性の検証を試み、本発明の第１の態様の鎖置換型DNAポリメラーゼに至った。
【００２３】
さらに、上記堆肥中に存在する微生物群のメタゲノムからも、DNAポリメラーゼ遺伝子を直接単離した。ここで得られた微生物を96-7と命名し、96-7由来のDNAポリメラーゼに関しては塩基配列、アミノ酸配列の報告が無かったため、大腸菌に組換えタンパク質を発現させてその活性の検証を試み、本発明の第２の態様の鎖置換型DNAポリメラーゼに至った。前記微生物96-7の分類は未同定であるが、96-7由来のDNAポリメラーゼは塩基配列、アミノ酸配列の報告が無く、96-7由来のDNAポリメラーゼも新規なDNAポリメラーゼである。
【００２４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼは、実施例１〜３及び試験例１に示すように、８９０のアミノ酸からなり、ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が６０〜７５℃の範囲であり、７０℃の温度においてもＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、７０〜８０℃の温度で５分間の熱処理後の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が、未熱処理の場合の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の８０％以上の耐熱性を有し、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大となるpHが8.0以上である。
【００２５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼは、実施例１〜３及び試験例１に示すように、６０８のアミノ酸からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼと同様に、ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が６０〜７５℃の範囲であり、７０℃の温度においてもＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、７０〜８０℃の温度で５分間の熱処理後の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が、未熱処理の場合の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の８０％以上の耐熱性を有し、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大となるpHが8.0以上である。
【００２６】
本発明の第１の態様の鎖置換型DNAポリメラーゼは、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼに加えて、以下の鎖置換型DNAポリメラーゼを包含する。
（１）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が６０〜７５℃の範囲である鎖置換型DNAポリメラーゼ。ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が好ましくは６０〜７０℃の範囲である。
（２）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつ７０℃の温度においてもＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。好ましくは７５℃の温度、より好ましくは８０℃の温度においてもＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する。
（３）配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、７０〜８０℃の温度で５分間の熱処理後の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が、未熱処理の場合のＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の８０％以上の耐熱性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。好ましくは未熱処理の場合のＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の９０％以上、より好ましくは９５％以上の耐熱性を有する。
（４）ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が６０〜７５℃の範囲である（３）に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が好ましくは６０〜７０℃の範囲である。
（５）７０℃の温度においてＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する（３）に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。好ましくは７５℃の温度、より好ましくは８０℃の温度においてもＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する。
（６）鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大となるpHが8.0以上である塩基性での活性が高い（１）〜（５）のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。好ましくはpHが8.0〜10.0の範囲で鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大となる。
（７）上記（１）〜（６）の鎖置換型DNAポリメラーゼにおいては、配列番号１又は２に示したアミノ酸配列が、少なくとも生物学的に許容される一つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含むことができ、好ましくは、１〜１０個のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含む。
【００２７】
上記（１）〜（７）においては、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と好ましく９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにまた好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることが、鎖置換型DNAポリメラーゼの高温で活性が高く、かつ鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の耐熱性が高く、塩基性での活性も高いという観点から適当である。
【００２８】
本発明の第２の態様の鎖置換型DNAポリメラーゼは、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる鎖置換型DNAポリメラーゼに加えて、以下の鎖置換型DNAポリメラーゼを包含する。
（８）配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が４５〜５５℃の範囲である鎖置換型DNAポリメラーゼ。ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が好ましくは５０〜５５℃の範囲である。
（９）配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、かつ６０℃の温度においてＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。
（１０）配列番号３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有し、５５〜６０℃の温度で５分間の熱処理後の鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が、未熱処理の場合のＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の８０％以上の耐熱性を有する鎖置換型DNAポリメラーゼ。好ましくは未熱処理の場合のＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の９０％以上、より好ましくは９５％以上の耐熱性を有する。
（１１）ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が４５〜５５℃の範囲である（１０）に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。ＲＣＡ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大になる温度が好ましくは５０〜５５℃の範囲である。
（１２）５５℃の温度においてＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する（１０）に記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。好ましくは６０℃の温度においてもＬＡＭＰ法による鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を有する。
（１３）鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大となるpHが8.0以上である塩基性での活性が高い（８）〜（１２）のいずれかに記載の鎖置換型DNAポリメラーゼ。好ましくはpHが8.0〜9.0の範囲で鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が最大となる。
（１４）上記（８）〜（１３）の鎖置換型DNAポリメラーゼにおいては、配列番号３に示したアミノ酸配列が、少なくとも生物学的に許容される一つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含むことができ、好ましくは、１〜１０個のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び／又はアミノ酸挿入を含む。
【００２９】
上記（８）〜（１４）においては、配列番号３に記載のアミノ酸配列と好ましく９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにまた好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることが、鎖置換型DNAポリメラーゼの高温で活性が高く、かつ鎖置換型DNAポリメラーゼ活性の耐熱性が高く、塩基性での活性も高いという観点から適当である。
【００３０】
本発明の鎖置換型DNAポリメラーゼは、鎖置換型DNAポリメラーゼ活性が適用される様々な核酸合成に用いることができ、好ましくはLAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法における核酸合成に用いられる。
【００３１】
本発明は、上記本発明の鎖置換型DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を包含する。本発明の遺伝子の代表例を配列番号４〜６に示す。
【００３２】
本発明の鎖置換型DNAポリメラーゼの取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。組み換えタンパク質を作製する場合には、後述するように当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質（鎖置換型DNAポリメラーゼ）を産生することができる。
【００３３】
本発明の鎖置換型DNAポリメラーゼは、上記本発明の鎖置換型DNAポリメラーゼをコードする遺伝子をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするDNAポリメラーゼを蓄積し、蓄積したDNAポリメラーゼを収集することを含む、生産方法により調製することができる。
【００３４】
本発明の鎖置換型DNAポリメラーゼをコードする遺伝子の取得方法は特に限定されない。本発明の鎖置換型DNAポリメラーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号１〜３に記載のアミノ酸配列および配列番号４〜６に記載した塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００３５】
例えば、配列表の配列番号４〜６に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons(1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３６】
本明細書中の配列表の配列番号１または２に記載したアミノ酸配列または配列番号４または５に示す塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてCaldothrix satsumae YMO81のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、Caldothrix satsumae YMO81から常法により作製することができる。
【００３７】
ＰＣＲ法により本発明の鎖置換型DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を取得することもできる。上記Caldothrix satsumae YMO81のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号４または５に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００３８】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３９】
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌のlac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
【００４１】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００４２】
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の遺伝子を含む組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。本発明の遺伝子を含む組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００４３】
本発明の遺伝子を含む組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００４４】
本発明の遺伝子を含む組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明の遺伝子を含む組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００４５】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００４６】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００４７】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００４８】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
【００４９】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００５０】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明の鎖置換型DNAポリメラーゼを精製標品として得ることができる。
【００５１】
上記組換えタンパク質の発現には大腸菌の組換えタンパク質発現ベクターを利用でき、大腸菌の組換えタンパク質発現ベクターを利用する場合、リーダー配列との共発現を利用したExpression Vector pLEAD5 DNA (ニッポンジーン社製) [特許文献５]を用いることが、GC或いはAT含有率に偏りがある異種遺伝子を大腸菌で発現させるのに最適化されたベクターであるという観点から好ましい。一般的に、好熱菌や放線菌に由来するGC含有率の高い遺伝子は大腸菌で発現させることが困難である場合が多く、その原因は翻訳効率の低さにあると考えられている。Expression Vector pLEAD5は、GC含有率の高い遺伝子からのタンパク質発現効率が良い発現用ベクターのスクリーニングの結果に基づいて構築されており、AT含有率の高い遺伝子の発現に対しても有効であることが示されている。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５３】
実施例１
［Caldothrix satsumae YMO81由来のDNAポリメラーゼIのクローニング］
DNAポリメラーゼIにおいて、異種生物間において特に保存性の高いDNAポリメラーゼドメインのアミノ酸配列から縮重プライマーを設計し、既に取得済みであるCaldothrix satsumae YMO81ゲノムDNAを鋳型DNAとしたPCR法により、遺伝子の一部を取得した[非特許文献３（Sommer, R., Tautz, D. Nucleic Acids Research, 17: 6749 (1989)）]。得られたDNA断片の配列はサンガー法により解析し、DNAポリメラーゼIとの相同性を確認した。【００５４】
次にCaldothrix satsumae YMO81ゲノムDNAを任意の制限酵素で消化し、DNA断片をセルフライゲーションにより環状化した。これを鋳型DNAとしたinverse PCR法により、得られたDNA断片の前後の配列を順次単離した [非特許文献４（Collins, F. S., and Weissman, S. M. Proc Natl Acad Sci USA. 81: 6812 (1984)）、非特許文献５（Triglia, T., Peterson, M. G., and Kemp, D. J. Nucleic Acids Reseach, 16: 8186 (1988)）、非特許文献６（Xu, S. Y., Xiao, J. P., Posfai, J., Maunus, R. E., Benner, J. S. Nucleic Acids Research, 25: 3991 (1988)）]。このinverse PCR法を繰り返すことにより、DNAポリメラーゼI遺伝子の全長を単離し、配列を決定した。【００５５】
単離したDNAポリメラーゼI遺伝子と予想される配列は2,673 bpであり、890アミノ酸から構成されるタンパク質をコードすると推定された。得られたアミノ酸配列とGeobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼI(GenBank Accession No. AAB52611)のアミノ酸配列（配列番号２３）との比較を図１に示し、5'-3'エキソヌクレアーゼドメインと推定されるドメインを除去して得られたアミノ酸配列とGeobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼI(GenBank Accession No. AAB52611)とのアミノ酸配列（配列番号２３）との比較を図２に示した。【００５６】
推定アミノ酸配列の比較において、Caldothrix satsumae YMO81由来のDNAポリメラーゼIとDNA Geobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼIのアミノ酸レベルにおける相同性は58%であった。【００５７】
実施例２
［Caldothrix satsumae YMO81由来のDNAポリメラーゼ発現ベクターの構築]
Caldothrix satsumae YMO81由来のDNAポリメラーゼ遺伝子の全長に相当する、890アミノ酸残基、2,670 bpの遺伝子をタンパク質発現ベクターExpression Vector pLEAD5 DNAに導入するためにPCRプライマー(fYMO81_N: 5'-GTG ATG GAG AAG CTG GTC CT-3'、tYMO81_C_SacI: 5'-GCT GAG CTC TAT TTC GCG TCG TAC CAC-3') を設計した。なお、設計されたプライマー(fYMO81_N、tYMO81_C_SacI)の塩基配列は、配列番号７、８に示した。【００５８】
図４は、Caldothrix satsumae YMO81由来のDNAポリメラーゼの大腸菌での発現を示すアクリルアミドゲル電気泳動写真である。図４において、レーン2はクローン化したDNAポリメラーゼの全長遺伝子からの組換えタンパク質の発現を確認したものである。最初に、94℃にて2分間の熱処理を行った後、94℃に15秒間、55℃に30秒間、68℃に3分間を1サイクルとして合計35サイクルを行うPCR法により目的のDNA断片を増幅した。なお、PCR法による増幅が困難である領域を含むため、5%ホルムアミド存在下でのPCR法により、DNA断片を取得した。DNA断片の5’末端はT4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、一方の末端をさらにSacIにより消化した後、目的のDNA断片のみをアガロースゲルより切り出して、Expression Vector pLEAD5 DNA, pre-digested(株式会社ニッポンジーン)に連結した。このDNAにより大腸菌JM109を形質転換し、形質転換体におけるタンパク質の発現を確認したところ、約113 kDaの予想分子量の組換え型のタンパク質が発現していることが確認された(図４、レーン2)。このタンパク質をコードする890アミノ酸の配列を後述する配列番号１に示した。【００５９】
また、レーン5は5'-3'エキソヌクレアーゼドメインを除去したDNAポリメラーゼの発現を確認したものである。即ち、5'-3'エキソヌクレアーゼドメインを除去するため、284番目のアミノ酸をロイシンからメチオニンに置き換えた、608アミノ酸残基、1,824 bpの遺伝子を導入するためにPCRプライマー (tYMO81_N: 5'-GTG ATG CCC CAT GTG CCG-3'、tYMO81_C_SacI)を設計し、94℃にて2分間の熱処理を行った後、94℃に15秒間、55℃に30秒間、68℃に2分間を1サイクルとして合計35サイクルを行うPCR法により目的のDNA断片を増幅した。DNA断片の5’末端はT4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、一方の末端をさらにSacIにより消化した後、目的のDNA断片のみをアガロースゲルより切り出して、Expression Vector pLEAD5 DNA, pre-digested (株式会社ニッポンジーン)に連結した。なお、設計されたプライマー(tYMO81_N)の塩基配列は、配列番号９に示した。このDNAにより大腸菌 JM109を形質転換し、形質転換体の発現を確認したところ、約77 kDaの予想分子量の組換え型のタンパク質が発現していることが確認された (図４、レーン5)。このタンパク質をコードする608アミノ酸の配列を後述する配列番号２に示した。【００６０】
これらの約113 kDa(fYMO81 DNAポリメラーゼと呼称する)と約77 kDa(tYMO81 DNAポリメラーゼと呼称する)のタンパク質を精製し、RCA(Rolling Circle Amplification)法によりDNAポリメラーゼ活性を調べた。鋳型として、大腸菌ファージ由来の環状型一本鎖DNAを用い、このDNAにプライマーを添加して、DNAポリメラーゼ活性と鎖置換活性の有無を検証した。酵素のコントロールとしては、Geobacillus stearothermophilus由来の5'-3'エキソヌクレアーゼ欠損型DNA ポリメラーゼを用いた(Bst DNA Polymerase, Large Fragment； New England Biolabs社製)。【００６１】
具体的には、M13mp18 single strand DNA 20 ng、Universal primer(5'-GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG TA-3') 50 nM、0.25 mM each dNTPs、20 mM Tris-HCl(pH 8.8 at 25℃)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、2 mM MgSO4、0.1% Tween 20、及びDNAポリメラーゼを含んだ全量20 μlを60℃で0分間から30分間反応した後にアガロースゲル電気泳動を行った結果、反応時間依存的にDNAのバンドが高分子側にシフトしたため、fYMO81 DNAポリメラーゼ及びtYMO81 DNAポリメラーゼは鎖置換型のDNAポリメラーゼ活性を有していることが示唆された(図６)。Universal primerの塩基配列は、配列番号１０に示した。【００６２】
実施例３
［Caldothrix satsumae YMO81由来の組換え型DNAポリメラーゼの精製］
実施例２で得た大腸菌を培養し、集菌する。大腸菌をSonication Buffer (200 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM Dithiothreitol、0.1 mM Benzamidine、10 μg/ml Bacitracin、30 μg/ml Phenylmethylsulfonyl fluoride、20mM Tris-HCl(pH 7.5 at 25 ℃))で懸濁し、氷上で温度を下げながら超音波処理によりゲノムDNAを分解する。この懸濁液を55℃の湯浴中にて20分間、加熱する。直ちに氷上で温度を下げ、遠心し上清を集める。【００６３】
上清を陰イオン交換カラム (HiTrap Q HP; GEヘルスケアバイオサイエンス社製) に添加し、十分洗浄した後、NaClの直線濃度勾配により分離した。【００６４】
RCA法及びSDS-PAGEを行い、DNAポリメラーゼを含む分画を確認した。目的の分画を集めてヘパリンアフィニティカラム(HiTrap Heparin HP; GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に添加し、十分洗浄した後、NaClの直線濃度勾配により分離した。【００６５】
SDS-PAGEを行い、DNAポリメラーゼを含む分画を確認した(図４、レーン3及びレーン6)。集めた分画は、保存緩衝液(0.1 mM EDTA、1 mM Dithiothreitol、10mM Tris-HCl(pH 7.5 at 25 ℃)、0.1% Tween 20、50% Glycerol)に対して十分透析したものを用いて試験例１における解析を行った。【００６６】
実施例４
［96-7由来のDNAポリメラーゼIのクローニング］
一般的に天然界においては多くの細菌等の生物が共生関係にあり、特定の細菌の純粋培養は困難な場合が多い。そこで本発明者らは、細菌の培養を経ずに、発酵中のコンポストからメタゲノムDNAを抽出し、PCR法によりDNAポリメラーゼI遺伝子を単離する方法を試みた。【００６７】
まず、本発明者らは、霧島火山地帯の土壌から得られた85℃以上の温度で生育する細菌培養物を含み、下水汚泥を主な原料として発酵中のコンポストから90℃前後の高温部分を取り出し、QIAamp DNA Stool Mini Kit(株式会社キアゲン)を用いてDNAを抽出した。【００６８】
DNAポリメラーゼIにおいて、異種生物間において特に保存性の高いDNAポリメラーゼドメインのアミノ酸配列から縮重プライマーを設計し、得られたメタゲノムDNAを鋳型DNAとしたPCR法により、遺伝子の一部を取得した。得られたDNA断片の配列はサンガー法により解析し、DNAポリメラーゼIとの相同性を確認した。このDNA断片をゲノムDNA中に有すると推定される微生物を96-7と命名した。尚、この微生物96-7の分類は未同定である。【００６９】
次に、メタゲノムDNAを任意の制限酵素で消化し、DNA断片をセルフライゲーションにより環状化した。これを鋳型DNAとしたinverse PCR法により、得られたDNA断片の前後の配列を順次単離した。このinverse PCR法を繰り返すことにより、DNAポリメラーゼI遺伝子の5'-3'エキソヌクレアーゼドメインをコードすると推定される配列を除いた領域の配列を決定した。【００７０】
単離したDNAポリメラーゼI遺伝子と予想される配列は1,785 bpであり、594アミノ酸から構成されるタンパク質をコードすると推定された。得られたアミノ酸配列とGeobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼI(GenBank Accession No. AAB52611)のアミノ酸配列（配列番号２３）との比較を図３に示した。【００７１】
推定アミノ酸配列の比較において、96-7由来のDNAポリメラーゼIの5’-3’エキソヌクレアーゼドメインと推定されるドメインを含まない領域部分のアミノ酸配列とGeobacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼIのアミノ酸レベルにおける相同性は66%であった。【００７２】
実施例５
［96-7由来のDNAポリメラーゼ発現ベクターの構築］
96-7由来のDNAポリメラーゼ遺伝子をタンパク質発現ベクターExpression Vector pLEAD5 DNAに導入するためにPCRプライマー(t967_N: 5'-GTG ATG TCC GGA CAA AAG GAT G-3'、t967_C_SacI: 5'-GAG GAG CTC TAT TTT GCA TCG AAC CAG-3')を設計した。なお、設計されたプライマー(t967_N、t967_C_SacI)の塩基配列は、配列番号１１、１２に示した。【００７３】
図５は、96-7由来のDNAポリメラーゼの大腸菌での発現を示すアクリルアミドゲル電気泳動写真である。図５において、レーン2は5'-3'エキソヌクレアーゼドメインを除去したDNAポリメラーゼの発現を確認したものである。即ち、5'-3'エキソヌクレアーゼドメインを除去するため、285番目のアミノ酸をイソロイシンからメチオニンに置き換えた、595アミノ酸残基、1,785 bpの遺伝子を導入するために前述のプライマー(t967_N、t967_C_SacI)を設計し、94℃にて2分間の熱処理を行った後、94℃に15秒間、50℃に30秒間、68℃に2分間を1サイクルとして合計35サイクルを行うPCR法により目的のDNA断片を増幅した。DNA断片の5’末端はT4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、一方の末端をさらにSacIにより消化した後、目的のDNA断片のみをアガロースゲルより切り出して、Expression Vector pLEAD5 DNA, pre-digested(株式会社ニッポンジーン)に連結した。このDNAにより大腸菌JM109を形質転換し、形質転換体におけるタンパク質の発現を確認したところ、約75 kDaの予想分子量の組換え型のタンパク質が発現していることが確認された (図５、レーン2)。このタンパク質をコードする595アミノ酸の配列を後述する配列番号３に示した。【００７４】
この約75 kDa(t96-7 DNAポリメラーゼと呼称する)のタンパク質を精製し、RCA(Rolling Circle Amplification)法によりDNAポリメラーゼ活性を調べた。鋳型として、大腸菌ファージ由来の環状型一本鎖DNAを用い、このDNAにプライマーを添加して、DNAポリメラーゼ活性と鎖置換活性の有無を検証した。酵素のコントロールとしては、Geobacillus stearothermophilus由来の5'-3'エキソヌクレアーゼ欠損型DNA ポリメラーゼを用いた (Bst DNA Polymerase, Large Fragment； New England Biolabs社製)。【００７５】
具体的には、M13mp18 single strand DNA 20 ng、Universal primer(5'-GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG TA-3')50 nM、0.25 mM each dNTPs、20 mM Tris-HCl(pH 8.8 at 25℃)、10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、2 mM MgSO4、0.1% Tween 20、及びDNAポリメラーゼを含んだ全量20 μlを60℃で0分間から30分間反応した後にアガロースゲル電気泳動を行った結果、反応時間依存的にDNAのバンドが高分子側にシフトしたため、t96-7 DNAポリメラーゼは鎖置換型のDNAポリメラーゼ活性を有していることが示唆された(図７)。【００７６】
実施例６
［96-7由来の組換え型DNAポリメラーゼの精製］
実施例５で得た大腸菌を培養し、集菌する。大腸菌をSonication Buffer(200 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM Dithiothreitol、0.1 mM Benzamidine、10 μg/ml Bacitracin、30 μg/ml Phenylmethylsulfonyl fluoride、20mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25 ℃))で懸濁し、氷上で温度を下げながら超音波処理によりゲノムDNAを分解する。この懸濁液を55℃の湯浴中にて20分間、加熱する。直ちに氷上で温度を下げ、遠心し上清を集める。【００７７】
上清を陰イオン交換カラム(HiTrap Q HP; GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に添加し、十分洗浄した後、NaClの直線濃度勾配により分離した。【００７８】
RCA法及びSDS-PAGEを行い、DNAポリメラーゼを含む分画を確認した。目的の分画を集めてヘパリンアフィニティカラム(HiTrap Heparin HP; GEヘルスケアバイオサイエンス社製)に添加し、十分洗浄した後、NaClの直線濃度勾配により分離した。【００７９】
SDS-PAGEを行い、DNAポリメラーゼを含む分画を確認した(図５、レーン３)。集めた分画は、保存緩衝液(0.1 mM EDTA、1 mM Dithiothreitol、10mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25 ℃)、0.1% Tween 20、50% Glycerol)に対して十分透析したものを用いて試験例１における解析を行った。【００８０】
試験例１
[反応特性の検証]【００８１】
5’-3’エキソヌクレアーゼドメインを除去したtYMO81 DNAポリメラーゼ及びt96-7 DNAポリメラーゼに関して、詳細に性能を検証した。【００８２】
試験例１−１
[RCA法による至適反応温度の評価] 
RCA法により、tYMO81 DNAポリメラーゼ及びt96-7 DNAポリメラーゼの至適反応温度を評価した。即ち、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃の各温度にてRCA法を行った。30分間反応した後にアガロースゲル電気泳動を行い、DNAのバンドが高分子側にシフトすることを確認した(図８)。なお、1反応あたりBst DNA Polymerase, Large Fragmentは4 unit、fYMO81 DNAポリメラーゼ、tYMO81 DNAポリメラーゼ、t96-7 DNAポリメラーゼはそれぞれ400 ngを使用した。【００８３】
一定の時間内に高分子側にバンドがシフトする移動度によってDNAポリメラーゼ活性及び鎖置換型活性の強さを評価したところ、Bst DNA Polymerase, Large Fragmentは50〜65℃の温度域においてDNAポリメラーゼ活性及び鎖置換型活性が最大となるのに対し、tYMO81 DNAポリメラーゼは60〜75℃、t96-7 DNAポリメラーゼは45〜55℃においてその活性が最大となった。また、fYMO81 DNAポリメラーゼにおいても鎖置換型DNAポリメラーゼ活性を示唆するDNAの高分子化が認められたが、内因性の5’-3’エキソヌクレアーゼ活性によると考えられる、多量の低分子核酸の形成が認められたため、以降の反応特性に関する解析は実施しなかった。【００８４】
試験例１−２
[LAMP法による至適反応温度の評価]
LAMP法を用いたリアルタイム濁度測定により、tYMO81 DNAポリメラーゼ及びt96-7 DNAポリメラーゼの至適反応温度を評価した。具体的には、陽性コントロールプラスミドDNA、LAMPプライマーセット、0.25 mM each dNTPs、20 mM Tris-HC (pH 8.8 at 25℃)、10 mM KCl、10 mM(NH4)2SO4、2 mM MgSO4、0.1% Tween 20、及びDNAポリメラーゼを含んだ全量25 μlを、Loopamp リアルタイム濁度測定装置LA-200(テラメックス社製 で1時間保温、濁度の上昇を観察した。LAMP法を用いたリアルタイム濁度測定においては、濁度が0.1に到達した時点までに要した反応時間(Tt)を比較した。このTtの値が低い程、効率良く反応が進行している指標となる。【００８５】
ここで用いた陽性コントロールプラスミドDNAはカンキツグリーニング病の原因微生物であるCandidatus Liberibacter asiaticus或いは植物病害ウイルスの媒介昆虫であるタバココナジラミバイオタイプQに特徴的な配列を含むものとし、LAMPプライマーセットは、それぞれの配列を特異的に検出する目的で設計されたものを用いた。Candidatus Liberibacter asiaticusを特異的に検出するためのLAMPプライマーセットとして、FIPに配列番号１３、BIPに配列番号１４、F3に配列番号１５、B3に配列番号１６、LFに配列番号１７、LBに配列番号１８の各プライマーを用いる組合せを用いた。また、タバココナジラミバイオタイプQを特異的に検出するためのLAMPプライマーセットとして、FIPに配列番号１９、BIPに配列番号２０、F3に配列番号２１、B3に配列番号２２の各プライマーを用いる組合せを用いた。【００８６】
tYMO81 DNAポリメラーゼに関してはCandidatus Liberibacter asiaticusを特異的に検出するためのLAMPプライマーセットと陽性コントロールプラスミドDNAを用い、60℃、65℃、70℃の各温度にてリアルタイム濁度測定を行った。なお、1反応あたりBst DNA Polymerase, Large Fragmentは8 unit、tYMO81 DNAポリメラーゼは800 ngを使用した。【００８７】
その結果、Bst DNA Polymerase, Large Fragmentは70℃では顕著にTtが高くなるのに対し、tYMO81 DNAポリメラーゼでは70℃でも低いTtを維持していた。これは、従来よりも高温域におけるLAMPプライマーの設計を可能とすることを示唆している(表１)。【００８８】
【表１】
2011055737.tif 000002
【００８９】
t96-7 DNAポリメラーゼに関してはタバココナジラミバイオタイプQを特異的に検出するためのLAMPプライマーセットと陽性コントロールプラスミドDNAを用い、55℃、60℃の各温度にてリアルタイム濁度測定を行った。なお、1反応あたりBst DNA Polymerase, Large Fragmentは8 unit、t96-7 DNAポリメラーゼは600 ngを使用した。【００９０】
Bst DNA Polymerase, Large Fragmentは55℃では顕著にTtが低くなるのに対し、t96-7 DNAポリメラーゼでは55℃でも低いTtを維持しており、従来よりも低温域におけるLAMPプライマーの設計を可能とすることを示唆している(表２)。【００９１】
【表２】
2011055737.tif 000003
【００９２】
試験例１−３
[tYMO81 DNAポリメラーゼの耐熱性の評価] 
tYMO81 DNAポリメラーゼはBst DNA Polymerase, Large Fragmentよりも高い耐熱性を有することが示唆されたため、予め70℃、75℃、80℃、85、90℃の各温度で5分間、tYMO81 DNAポリメラーゼ及びBst DNA Polymerase, Large Fragmentを処理した後、LAMP法を用いたリアルタイム濁度測定を行い、活性が維持されているかどうかを評価した。Candidatus Liberibacter asiaticusを特異的に検出するためのLAMPプライマーセットと陽性コントロールプラスミドDNAを用い、65℃、1時間のリアルタイム濁度測定を行った。なお、1反応あたりBst DNA Polymerase, Large Fragmentは8 unit、tYMO81 DNAポリメラーゼは800 ngを使用した。【００９３】
Bst DNA Polymerase, Large Fragmentでは70℃、5分間の処理によってLAMP法における濁度の上昇が観察されなくなったため、70℃以上の高温下での処理においてはタンパク質の活性が著しく低下すると予想される。これに対し、tYMO81 DNAポリメラーゼでは80℃、5分間の処理の後でも活性を維持しており、タンパク質の耐熱性が有意に向上していた(表３)。【００９４】
【表３】
2011055737.tif 000004
【００９５】
[t96-7 DNAポリメラーゼの耐熱性の評価] 
t96-7 DNAポリメラーゼはBst DNA Polymerase, Large Fragmentよりも高い耐熱性を有することが示唆されたたため、予め65、70℃、75℃、80℃、85、90℃の各温度で5分間、t96-7 DNAポリメラーゼ及びBst DNA Polymerase, Large Fragmentを処理した後、LAMP法を用いたリアルタイム濁度測定を行い、活性が維持されているかどうかを評価した。タバココナジラミバイオタイプQを特異的に検出するためのLAMPプライマーセットと陽性コントロールプラスミドDNAを用い、60℃、1時間のリアルタイム濁度測定を行った。なお、1反応あたりBst DNA Polymerase, Large Fragmentは8 unit、t96-7 DNAポリメラーゼは600 ngを使用した。【００９６】
Bst DNA Polymerase, Large Fragmentでは70℃、5分間の処理によってLAMP法における濁度の上昇が観察されなくなったため、70℃以上の高温下での処理においてはタンパク質の活性が著しく低下すると予想される。これに対し、t96-7 DNAポリメラーゼでは65℃、5分間の処理により濁度の上昇が認められなくなっているが、熱処理を施していないt96-7 DNAポリメラーゼを用いた場合60℃、1時間のリアルタイム濁度測定は可能であり、Bst DNA Polymerase, Lage Fragmentよりも低温域で活性を維持していた結果と一致して、少なくとも55〜60℃では活性を維持していることが示唆された(表４)。【００９７】
【表４】
2011055737.tif 000005
【００９８】
試験例１−４
[LAMP法による至適反応pHの評価] 
LAMP法を用いたリアルタイム濁度測定により、tYMO81 DNAポリメラーゼ及びt96-7 DNAポリメラーゼの至適反応pHを評価した。具体的には、LAMP法に含まれるTris-HClのpHを本来の8.8から上下に変化させることによるTtの値の変化を観察した。なお、Tris-HClのpHは全て25℃の温度条件下にて調整されたものを用いた(表５)。【００９９】
【表５】
2011055737.tif 000006
【０１００】
tYMO81 DNAポリメラーゼに関してはCandidatus Liberibacter asiaticusを特異的に検出するためのLAMPプライマーセットと陽性コントロールプラスミドDNAを用いてBst DNA Polymerase, Large Fragmentと比較した。即ち、7.5、8.0、8.3、8.8、9.0、9.5、10.0の各pHにおいて65℃、1時間のリアルタイム濁度測定を行った。なお、1反応あたりBst DNA Polymerase, Large Fragmentは8 unit、tYMO81 DNAポリメラーゼは800 ngを使用した。【０１０１】
Bst DNA Polymerase, Large Fragmentは8.3付近のpHにおいてTtが最も低くなるのに対し、tYMO81 DNAポリメラーゼでは、8.8から10.0までの広いpHの範囲においてTtが最も低くなっていた。一般的なDNA合成においては、反応副産物の生成及びTris系緩衝液の温度依存性によって反応液のpHが酸性側に傾き、タンパク質の溶解度が低下することによってDNAポリメラーゼの活性が著しく低下することが知られているが、tYMO81 DNAポリメラーゼでは予め高いpHの緩衝液を用いることにより、この問題を解消し、DNAポリメラーゼの活性を維持したまま、安定に反応を行うことが可能であると予想される。【０１０２】
t96-7 DNAポリメラーゼに関してはタバココナジラミバイオタイプQを特異的に検出するためのLAMPプライマーセットと陽性コントロールプラスミドDNAを用いてBst DNA Polymerase, Large Fragmentと比較した。即ち、7.5、8.0、8.3、8.8、9.0の各pHにおいて60℃、1時間のリアルタイム濁度測定を行った。なお、1反応あたりBst DNA Polymerase, Large Fragmentは8 unit、t96-7 DNAポリメラーゼは600 ngを使用した。【０１０３】
Bst DNA Polymerase, Large Fragmentは8.3付近のpHにおいてTtが最も低くなるのに対し、t96-7 DNAポリメラーゼでは、8.3から9.0までのpHの範囲においてTtが最も低くなっていた。t96-7 DNAポリメラーゼは、tYMO81 DNAポリメラーゼには及ばないが、Bst DNA Polymerase, Large Fragmentよりも塩基性側及び広範囲のpH条件下においての利用が可能であると予想される。【０１０４】
試験例１−５
[LAMP法による耐塩基性の評価] 
LAMP法などの遺伝子診断法において、増幅すべき標的となる核酸は生体試料より抽出されるが、この工程において、水酸化ナトリウム等の強塩基性溶液を用いて細胞のタンパク質を変性させる方法が知られている。しかしながら、この塩基性溶液の残存は意図しない反応溶液のpH上昇やDNAポリメラーゼ等タンパク質分子の加水分解を引き起こし、結果的にDNAポリメラーゼによるDNA合成反応を阻害するため、生体試料から核酸分子を抽出した場合、それらの阻害物質を除去するために、有機溶媒による抽出や遠心操作を用いた濃縮、分離による核酸の精製が必要とされる。そこで本発明者らは、tYMO81 DNAポリメラーゼの至適pHが8.8から10.0付近と、比較的塩基性側に偏っていることに着目し、塩基性溶液中におけるtYMO81 DNAポリメラーゼの活性の変化及び阻害の影響に関して評価を行った(表６)。【０１０５】
【表６】
2011055737.tif 000007
【０１０６】
具体的には、カンキツ葉に感染しているCandidatus Liberibacter asiaticusのゲノムDNAを抽出するプロトコルを利用した。即ち、250 mM水酸化ナトリウムによりカンキツ葉検体から核酸を抽出し、2.5 M酢酸により中和した後にイソプロパノール沈澱を行い、核酸を濃縮、精製する方法を改変して、酢酸の添加量を減じた抽出溶液を直接添加する条件下にてLAMP法を用いたリアルタイム濁度測定を行った。【０１０７】
通常は250μlの250 mM水酸化ナトリウム中にカンキツ葉を入れて煮沸処理した後、50 μlの2.5 M酢酸を添加して中和する。本発明者らは擬似的にこの水酸化ナトリウムと酢酸の混合溶液を調製し、その2μlを反応溶液に添加する条件下にて、Candidatus Liberibacter asiaticusを特異的に検出するためのLAMPプライマーセットと陽性コントロールプラスミドDNAを用いてリアルタイム濁度測定を行った。その結果、上記の混合溶液原液を使用した場合には、tYMO81 DNAポリメラーゼ、Bst DNA Polymerase, Large Fragmentともに、濁度の上昇が認められなかった。これは高濃度の水酸化ナトリウム或いは酢酸の持ち込みにより、溶液のイオン強度、pHの大幅な変動が起こり、DNAポリメラーゼ反応が阻害を受けているためであると予想される。【０１０８】
そこで本発明者らは、上記の混合溶液(希釈抽出溶液と呼称する)を滅菌蒸留水にて2倍に希釈してから添加すると、tYMO81 DNAポリメラーゼ、Bst DNA Polymerase, Large Fragmentともに、濁度の上昇が認められることを見出し、この希釈抽出溶液の総量を600μl、250 mM水酸化ナトリウムの添加量を250μlに固定した上で、酢酸添加液量を50μl、25μl、12.5μl、5μl、0μlと段階的に減じた希釈抽出溶液を添加する条件下にて、Candidatus Liberibacter asiaticusを特異的に検出するためのLAMPプライマーセットと陽性コントロールプラスミドDNAを用いて65℃、1時間のリアルタイム濁度測定を行った。なお、1反応あたりBst DNA Polymerase, Large Fragmentは8 unit、tYMO81 DNAポリメラーゼは500 ngを使用した。また、希釈抽出溶液のコントロールとして、代わりに滅菌蒸留水のみを添加する反応を加えた。【０１０９】
Bst DNA Polymerase, Large Fragmentでは、酢酸の添加量が5μl或いは0μlになると顕著にTtの上昇が認められ、塩基性溶液の中和を必須とすることが示唆されたのに対し、tYMO81 DNAポリメラーゼでは、逆に酢酸の添加量が5μl或いは0μl付近でTtが最も低くなっていた。従って、tYMO81 DNAポリメラーゼを用いる場合、強塩基溶液を用いるような核酸抽出試料を中和、濃縮、溶液除去等の操作を省略して直接核酸増幅反応に投入が可能となる点で、遺伝子解析、検査、診断分野において従来のDNAポリメラーゼよりも医療、食品、農業などよりも広範囲での応用、自動化への適応による検査方法の簡易化が期待される。興味深いのは、酢酸の添加量が12.5μl、5μl、或いは0μlの場合に、コントロールとして滅菌蒸留水のみを添加した場合と比較してTtが顕著に低下している点である。これは、tYMO81 DNAポリメラーゼの至適pHが8.8から10.0付近の塩基性側の広範囲に分布する本発明中のデータの傾向とも一致しており、tYMO81 DNAポリメラーゼは強塩基性溶液により活性阻害を受けるのではなく、むしろ活性化されると考えられ、本来、塩基性の反応条件を要求する可能性がある。【０１１０】
試験例１−６
[LAMP法によるタンパク質保存安定性の評価]
一般的な遺伝子診断、核酸の増幅において、反応の構成試薬である酵素溶液は大腸菌、或いはその他の微生物、植物、動物のいずれかに由来するタンパク質であることがほとんどであり、タンパク質はその分子のみを単離した場合に、タンパク質分解酵素や、温度変化、酸化などの要因によって不安定化することが多い。遺伝子解析、検査、診断分野において、LAMP法などの遺伝子診断法は再現性に優れている必要があり、DNAポリメラーゼの品質がどの程度安定に維持できるかは無視できない重要な性質となる。そこで本発明者らは、tYMO81 DNAポリメラーゼが80℃付近おいてもその活性を失わないことに着目し、tYMO81 DNAポリメラーゼとBst DNA Polymerase, Large Fragmentの保存安定性を比較した。具体的には、37℃の保存では24時間でtYMO81 DNAポリメラーゼ、Bst DNA Polymerase, Large Fragmentともに変化が認められなかったため、温度の負荷レベルを上昇させた条件下、例えばここでは、LAMP法で一般的に用いられる65℃の温度における残存活性の変動に関して評価を行った(表７)。表７では、全て四重測定の平均値とした。【０１１１】
【表７】
2011055737.tif 000008
【０１１２】
Bst DNA Polymerase, Large Fragmentは市販されている保存溶液、即ち、緩衝液、塩、グリセロール、及び界面活性剤を含む条件下にて保存安定性を評価した。なお、tYMO81 DNAポリメラーゼは緩衝液、塩、グリセロール、及び界面活性剤を含む条件下の場合、65℃に保存しても24時間までに活性の有意な変動が認められなかったため、tYMO81 DNAポリメラーゼに関してはさらに負荷レベルを上げ、tYMO81滅菌蒸留水中における保存安定性を評価した。酵素溶液は65℃にて、3時間、6時間、24時間それぞれ保存した後、Candidatus Liberibacter asiaticusを特異的に検出するためのLAMPプライマーセットと陽性コントロールプラスミドDNAを用いて評価した。なお、1反応あたりBst DNA Polymerase, Large Fragmentは8 unit、tYMO81 DNAポリメラーゼは500 ngを使用した。【０１１３】
Bst DNA Polymerase, Large Fragmentでは65℃、3時間の処理によってTtの著しい上昇が確認され、その後、6時間、24時間のそれぞれの経過後には段階的にTtが上昇しているが、特に最初の3時間における活性の低下が大きいと予想される。これに対し、tYMO81 DNAポリメラーゼでは65℃、3時間の処理の後でもTtの変動は極めて小さく、6時間後までの活性低下も緩やかであり、それ以降24時間までは活性の低下が見られなかった。通常、タンパク質の溶液はグリセロール、ウシ血清アルブミン、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤等で知られるタンパク質安定化剤の存在下にて、2-8℃程度の低温、或いはさらに低温域の-20℃や-80℃程度の条件にて保存されるが、滅菌蒸留水中にほぼ単一なタンパク質分子として存在させたtYMO81 DNAポリメラーゼが65℃の条件下においても活性のほとんどを失わなかったことは、タンパク質の長期保存安定性、さらには負荷条件への耐性を示唆するものであり、有用な性質である。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明は、鎖置換型DNAポリメラーゼを用いるあらゆる分野に利用可能である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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