(57)【要約】  本発明は、これまでの腎疾患に対する様々な検査手段では検出することができなかった腎疾患についても、正確にかつ被験者（被検試料の提供者）への負担が少なく、腎疾患を判定することのできる方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ブラインドＧＦＲエリアの少ない腎疾患マーカー物質に着目した、早期腎疾患を判定することのできる方法を提供することを目的とする。また、本発明は、これまでに着目されていなかった新たな腎疾患マーカー物質に着目した新規な腎疾患予防・治療剤を効率よくスクリーニングすることができる新たな腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。本発明は、これらの目的を達成するために、被検血液試料中に存在する、１種又は２種以上の本件腎疾患マーカー物質を検出又は定量する工程を利用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検血液試料中に存在するシス−アコニット酸（cis-aconitate）を検出又は定量する工程を有することを特徴とする腎疾患の判定方法。
【請求項２】
被検血液試料中に存在するシス−アコニット酸の検出結果又は定量結果をコントロールと比較することにより、被検血液試料の提供者が腎疾患であるかどうか、又は、該提供者の腎疾患の症状の程度を評価する工程をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の腎疾患の判定方法。
【請求項３】
被検血液試料中に存在するシス−アコニット酸の濃度がコントロールよりも高い場合に、被検血液試料の提供者が腎疾患であると評価し、又は、被検血液試料中に存在するシス−アコニット酸の濃度がコントロールよりも高い程度を、該提供者の腎疾患の症状の重さの程度であると評価することを特徴とする請求項２記載の腎疾患の判定方法。
【請求項４】
腎疾患が、腎不全であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の腎疾患の判定方法。
【請求項５】
被検血液試料中に存在するシス−アコニット酸を検出又は定量する工程を有することを特徴とする早期腎疾患の判定方法。
【請求項６】
腎疾患が、腎不全であることを特徴とする請求項５に記載の早期腎疾患の判定方法。
【請求項７】
以下の工程Ａ〜Ｄを有することを特徴とする腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法。腎機能が低下した非ヒト動物に被検物質を投与する工程Ａ；
該非ヒト動物から血液試料を採取する工程Ｂ；
該血液試料中に存在するシス−アコニット酸を検出又は定量する工程Ｃ：
血液試料中に存在するシス−アコニット酸の検出結果又は定量結果をコントロールと比較することにより、前記非ヒト動物の腎機能を評価する工程Ｄ；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおける新たな腎疾患マーカー物質を利用した腎疾患の判定方法や、かかる腎疾患マーカー物質を利用した腎疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎不全患者等の腎疾患を有する患者、特に腎透析を受ける患者の数は年々増加の一途を辿っており、現在２０万人の患者が維持透析治療を行っており、さらに毎年３万人以上が新たに透析導入に至っている。透析療法には、一人あたり年間約５００万円の費用がかかるため、２０万人に対して約１兆円の医療費が恒常的に必要となっている。また、近年、慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease：ＣＫＤ）という疾患概念が提唱され、その予防・治療の重要性に対する認識が高まりを見せている。ＣＫＤはCommon Diseaseであり、糸球体濾過量（glomerular filtration rate:ＧＦＲ）６０未満の人口が１９２６万人にも上ることから、ＣＫＤ対策が急務の課題となっている。以上のような状況下において、腎不全やＣＫＤ等の腎疾患の症状の予防法や、そのような症状を緩和し、透析導入を遅らせる治療法が開発されれば、患者のＱＯＬ（クオリティオブライフ）に資するだけでなく、医療費の大幅な削減が可能となり社会に大きく貢献することが出来る。【０００３】
腎不全に罹患すると、健常の場合では腎臓より排泄される様々な物質が体内に蓄積する。これらの物質は、腎不全の病態を診断するマーカー物質として利用されることもある。例えば、尿中に排泄されるアルブミン等の腎疾患マーカータンパク質の増加を指標として腎疾患の検出・診断する方法等が一般的に用いられている。この他の方法として、例えば、腎疾患患者の血液中でヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の濃度が上昇することを利用した腎疾患の検出方法（特許文献１参照）や、腎不全等の患者の血液中や尿中でＥＮＤＯ１８０受容体ポリペプチドの濃度が上昇することを利用した腎症の診断方法（特許文献２参照）が知られている。【０００４】
また、腎不全に罹患すると体内に蓄積する前述の物質の中でも、生体に毒性を有する物質は、いわゆる腎不全物質と呼ばれ、腎不全の病態自体を悪化させる物質として報告されてきた。しかしながら現在使用されているクレアチニン（creatinine）などの腎不全マーカー物質は腎機能の一部である糸球体濾過量（ＧＦＲ）を反映した物質がほとんどであり、尿細管機能などの他の腎機能を反映したものは少ない。また、クレアチニンの場合、腎機能を反映しないクレアチニンブラインドＧＦＲエリア（腎機能が悪化してきても、クレアチニンの上昇がまだ認められない時期）があるため、腎不全マーカー物質として十分ではなかった。さらに既存のマーカー物質では、腎不全の多彩な症状を一元的に評価する事は困難である。また、腎不全の悪化に関与する物質が何であるか、及び、腎不全悪化のメカニズムには不明な点が多かった。【０００５】
一方、キャピラリー電気泳動質量分析計（capillary electrophoresis mass spectrometry:ＣＥ−ＭＳ）は近年開発され、少量のサンプルから５００種類以上の物質を同時測定できる新たなシステムである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１４６９８０号公報
【特許文献２】特表２００７−５１９３９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、これまでの腎疾患に対する様々な検査手段では検出することができなかった腎疾患についても、正確にかつ被験者（被検試料の提供者）への負担が少なく、腎疾患を判定することのできる方法を提供することにある。また、本発明の別の課題は、ブラインドＧＦＲエリアの少ない腎疾患マーカー物質に着目した、早期腎疾患を判定することのできる方法を提供することにある。また、本発明の別の課題は、これまでに着目されていなかった新たな腎疾患マーカー物質に着目した新規な腎疾患予防・治療剤を効率よくスクリーニングすることができる新たな腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、腎疾患患者の血漿中の物質（陽イオン物質及び陰イオン物質）をＣＥ−ＭＳを用いて網羅的に解析し、推定糸球体濾過量（estimated glomerular filtration rate:ｅＧＦＲ）との間に正又は負の相関が有意に認められる物質を同定した。本発明者らは、これらの物質の中に、腎疾患との関連がこれまで知られていなかった物質や、ｅＧＦＲとの相関式が一次式に近似する物質が存在していることを見い出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、（１）被検血液試料中に存在するシス−アコニット酸（cis-aconitate）を検出又は定量する工程を有することを特徴とする腎疾患の判定方法や、（２）被検血液試料中に存在するシス−アコニット酸の検出結果又は定量結果をコントロールと比較することにより、被検血液試料の提供者が腎疾患であるかどうか、又は、該提供者の腎疾患の症状の程度を評価する工程をさらに有することを特徴とする上記（１）に記載の腎疾患の判定方法や、（３）被検血液試料中に存在するシス−アコニット酸の濃度がコントロールよりも高い場合に、被検血液試料の提供者が腎疾患であると評価し、又は、被検血液試料中に存在するシス−アコニット酸の濃度がコントロールよりも高い程度を、該提供者の腎疾患の症状の重さの程度であると評価することを特徴とする上記（２）記載の腎疾患の判定方法や、（４）腎疾患が、腎不全であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の腎疾患の判定方法や、（５）被検血液試料中に存在するシス−アコニット酸を検出又は定量する工程を有することを特徴とする早期腎疾患の判定方法や、（６）腎疾患が、腎不全であることを特徴とする上記（５）に記載の早期腎疾患の判定方法に関する。【００１０】
また、本発明は、（７）以下の工程Ａ〜Ｄを有することを特徴とする腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法；腎機能が低下した非ヒト動物に被検物質を投与する工程Ａ；該非ヒト動物から血液試料を採取する工程Ｂ；該血液試料中に存在するシス−アコニット酸を検出又は定量する工程Ｃ；血液試料中に存在するシス−アコニット酸の検出結果又は定量結果をコントロールと比較することにより、前記非ヒト動物の腎機能を評価する工程Ｄ；に関する。
なお、本明細書における「被験者」、「被検試料の提供者」、「腎疾患非罹患者」、「健常者」は、便宜上、ヒトだけでなく、他の非ヒト動物含むが、ヒト及び非ヒト哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の腎疾患の判定方法によれば、これまでの腎疾患に対する様々な検査手段では検出することができなかった腎疾患についても、正確にかつ被験者（被検試料の提供者）への負担が少なく、腎疾患を判定することができる。また、本発明により初めて見い出された腎疾患マーカー物質についてさらに研究が進めば、腎疾患の様々な病態や症状に対応した腎疾患マーカー物質となり得ると考えられる。また、本発明の早期腎疾患の判定方法によれば、従来の腎疾患マーカー物質では十分になし得なかった、早期腎疾患の判定が可能となる。また、本発明の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法によれば、これまでに着目されていなかった新たな腎疾患マーカー物質に着目した新規な腎疾患予防・治療剤を効率よくスクリーニングすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】腎疾患患者（慢性腎臓患者）４１人の患者背景を示す図である。
【図２】血漿中において、ｅＧＦＲと正又は負の相関が見い出されたカチオンを示す図である。左側の表は、スピアマンの相関係数によりｅＧＦＲと有意な負の相関が見い出されたカチオンを表し、右側の表は、ｅＧＦＲと有意な正の相関が見い出されたカチオンを表す。なお、物質名の背景が灰色の物質は、ｅＧＦＲとの相関が有意であり、かつ、その相関が新規に見い出された物質である。
【図３】血漿中において、ｅＧＦＲと正又は負の相関が見い出されたアニオンを示す図である。左側の表は、ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンを表し、右側の表は、ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたアニオンを表す。なお、物質名の背景が灰色の物質は、ｅＧＦＲとの相関が新規に見い出された物質である。ところで、ｅＧＦＲと負の相関がある物質とは、腎機能の改善に伴って、濃度が低下する物質であり、すなわち、腎機能の悪化に伴って、濃度が上昇する物質である。また、ｅＧＦＲと正の相関がある物質とは、腎機能の改善に伴って、濃度が上昇する物質であり、すなわち、腎機能の悪化に伴って、濃度が低下する物質である。
【図４】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。
【図５】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図６】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図７】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。
【図８】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。
【図９】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。
【図１０】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。
【図１１】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図１２】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。
【図１３】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。
【図１４】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図１５】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。
【図１６】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図１７】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図１８】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図１９】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。
【図２０】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。
【図２１】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。
【図２２】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。
【図２３】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図２４】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。
【図２５】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図２６】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、
【図２７】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図２８】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。
【図２９】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図３０】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。
【図３１】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。
【図３２】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたカチオンについて、そのカチオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。
【図３３】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図３４】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図３５】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図３６】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図３７】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図３８】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図３９】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図４０】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図４１】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図４２】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図４３】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図４４】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図４５】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。
【図４６】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図４７】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図４８】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図４９】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図５０】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図５１】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図５２】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図５３】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図５４】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図５５】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図５６】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。
【図５７】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図５８】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図５９】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図６０】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図６１】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図６２】ｅＧＦＲと負の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。
【図６３】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図６４】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図６５】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図６６】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、一次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図６７】ｅＧＦＲと正の相関が見い出されたアニオンについて、そのアニオンの濃度とｅＧＦＲとの相関関係を示し、二次式で近似した図である。なお、「＊」は、ｅＧＦＲとの負の相関が新規に発見されたものであることを示す。
【図６８】ｅＧＦＲとの相関について、本件早期腎疾患マーカー物質と、シスタチンＣとを比較した結果を示す図である。
【図６９】ｅＧＦＲとの相関について、本件早期腎疾患マーカー物質と、１−メチルアデノシンとを比較した結果を示す図である。
【図７０】ｅＧＦＲとの相関について、本件早期腎疾患マーカー物質と、Ｎ−アセチルグルコサミンとを比較した結果を示す図である。
【図７１】ｅＧＦＲとの相関について、本件早期腎疾患マーカー物質と、γ−ブチロベタインとを比較した結果を示す図である。
【図７２】ｅＧＦＲとの相関について、本件早期腎疾患マーカー物質と、セバシン酸とを比較した結果を示す図である。
【図７３】ｅＧＦＲとの相関について、本件早期腎疾患マーカー物質と、シス−アコニット酸とを比較した結果を示す図である。
【図７４】ｅＧＦＲとの相関について、本件早期腎疾患マーカー物質と、ホモバニリン酸とを比較した結果を示す図である。
【図７５】血漿サンプル中の本件早期腎疾患マーカー物質（γ−ブチロベタイン、Ｎ−アセチルグルコサミン）の濃度を、ｅＧＦＲ値に応じたグループ毎に示した図である。
【図７６】血漿サンプル中の本件早期腎疾患マーカー物質（Ｎ−アセチルグルコサミン、１−メチルアデノシン）の濃度を、ｅＧＦＲ値に応じたグループ毎に示した図である。
【図７７】血漿サンプル中の本件早期腎疾患マーカー物質（シス−アコニット酸、セバシン酸）の濃度を、ｅＧＦＲ値に応じたグループ毎に示した図である。
【図７８】血漿サンプル中の本件早期腎疾患マーカー物質（ホモバニリン酸）の濃度を、ｅＧＦＲ値に応じたグループ毎に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の腎疾患の判定方法（本発明の第１の発明）
本発明の腎疾患の判定方法としては、被検血液試料中に存在する、以下の腎疾患マーカー物質（以下、「本件腎疾患マーカー物質」とも表示する。）から選ばれる１種又は２種以上の腎疾患マーカー物質を検出又は定量する工程を有する方法であれば特に制限されない。
（ｅＧＦＲとの負の相関を持つカチオンである腎疾患マーカー物質）：Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）、γ−ブチロベタイン（γ-butyrobetaine）、オフタルム酸（ophthalmate）、Ｎ−ε−アセチルリジン（N-epsilon-acetyllysine）、シトシン（cytosine）、ヒポタウリン（hypotaurine）、７−メチルグアニン（7-methylguanine）、メチオニンスルホキシド（methionine sulfoxide）、アスパラギン（Ａｓｎ）；
（ｅＧＦＲとの正の相関を持つカチオンである腎疾患マーカー物質）：２−アミノ酪酸（2-aminobutyrate）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；
（ｅＧＦＲとの負の相関を持つアニオンである腎疾患マーカー物質）：イセチオン酸（isethionate）、グルコン酸（gluconate）、トランス−アコニット酸（trans-aconitate）、ピメリン酸（pimelate）、イソクエン酸（isocitrate）、Ｎ−アセチル−β−アラニン（N-acetyl-beta-alanine）、Ｎ−アセチルグルタミン酸（N-acetylglutamate）、セバシン酸（sebacate）、４−オキソペンタン酸（4-oxopentanoate）、シス−アコニット酸（cis-aconitate）、ホモバニリン酸（homovanillate）、アジピン酸（adipate）、シトラマレイン酸（citramalate）、２−イソプロピルマレイン酸（2-isopropylmalate）、トレオン酸（threonate）、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（N-acetylaspartate）、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸（4-hydroxy-3-methoxymandelate）、オキサミン酸（oxamate）、グルタル酸（glutarate）、アゼテート（azetate）、フタル酸（phthalate）、マロン酸（malonate）、シトラコン酸（citraconate）、キナ酸（quinate）、コハク酸（succinate）、システイン−Ｓ−硫酸（cysteine S-sulfate）、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸（4-hydroxy-3-methoxybenzoate）；
（ｅＧＦＲとの正の相関を持つアニオンである腎疾患マーカー物質）：４−メチル−２−オキソペンタン酸（4-methyl-2-oxopentanoate）、２−オキソイソペンタン酸（2-oxoisopentanoate）、乳酸（lactate）、オクタン酸（octanoate）、２−オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）。なお、本発明の腎疾患の判定方法の精度をより高める観点からは、２種以上の本件腎疾患マーカー物質を併用する方法もある。
【００１４】
本発明の腎疾患の判定方法によれば、被検血液試料の提供者が腎疾患であるかどうかや、該提供者の腎疾患の症状の程度を判定することができる。
【００１５】
前述の本件腎疾患マーカー物質の中でも、推定糸球体濾過量（estimated glomerular filtration rate:ｅＧＦＲ）との相関係数がより高い点で、Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、Ｎ−ε−アセチルリジン、シトシン、オキサミン酸；２−アミノ酪酸、グルタミン酸；イセチオン酸、グルコン酸、トランス−アコニット酸、ピメリン酸、イソクエン酸、Ｎ−アセチル−β−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、セバシン酸、４−オキソペンタン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラマレイン酸、２−イソプロピルマレイン酸、トレオン酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸；４−メチル−２−オキソペンタン酸、２−オキソイソペンタン酸；を好適に例示することができる。
【００１６】
また、クレアチニンをはじめとする現在使用されている腎不全マーカー物質は、主に糸球体濾過率を指標としたマーカーである点、ｅＧＦＲを計算しなければならない点など不十分な点が多い。しかし、本件腎疾患マーカー物質の中でも、Ｎ−アセチルグルコサミン（図５）、γ−ブチロベタイン（図６）、Ｎ−ε−アセチルリジン（図１１）、ヒポタウリン（図１４）、７−メチルグアニン（図１６）、メチオニンスルホキシド（図１７）、アスパラギン（図１８）、２−アミノ酪酸（図２７）、グルタミン酸（図２９）、セバシン酸（図３３）、シス−アコニット酸（図３４）、ホモバニリン酸（図３５）、アジピン酸（図３６）、シトラマレイン酸（図３７）、２−イソプロピルマレイン酸（図３８）、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（図３９）、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸（図４０）、オキサミン酸（図４１）、グルタル酸（図４２）、アゼテート（図４３）、フタル酸（図４４）、マロン酸（図４６）、シトラコン酸（図４７）、キナ酸（図４８）、コハク酸（図４９）、システイン−Ｓ−硫酸（図５０）、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸（図５１）、４−メチル−２−オキソペンタン酸（図６３）、２−オキソイソペンタン酸（図６４）、乳酸（図６５）、オクタン酸（図６６）の３１種類の腎疾患マーカー物質は、ｅＧＦＲとの相関式が一次式に近似しており、被験者（被検血液試料の提供者）のｅＧＦＲの複雑な計算式を必要とせずに、腎疾患の判定に用いることができるため、より簡便な腎疾患マーカー物質として好適に用いることができる。また、上記の３１種類の腎疾患マーカー物質は、早期の腎疾患の判定・検出に好適に用い得ると考えられる。
【００１７】
なお、上記の本件腎疾患マーカー物質のうち、腎機能の悪化に伴って濃度が上昇する本件腎疾患マーカー物質（ｅＧＦＲの低下と共に血液中に有意に蓄積する物質）としては、Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、オフタルム酸、Ｎ−ε−アセチルリジン、シトシン、ヒポタウリン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギンからなる陽イオン群や、イセチオン酸、グルコン酸、トランス−アコニット酸、ピメリン酸、イソクエン酸、Ｎ−アセチル−β−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、セバシン酸、４−オキソペンタン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラマレイン酸、２−イソプロピルマレイン酸、トレオン酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼテート、フタル酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸からなる陰イオン群を例示することができ、腎機能の悪化に伴って濃度が低下する本件腎疾患マーカー物質（ｅＧＦＲの低下と共に血液中に有意に減少する物質）としては、２−アミノ酪酸、グルタミン酸からなる陽イオン群や、４−メチル−２−オキソペンタン酸、２−オキソイソペンタン酸、乳酸、オクタン酸、２−オキソグルタル酸からなる陰イオン群を例示することができる。
【００１８】
また、本件腎疾患マーカー物質のうち、１−メチルアデノシン、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸は、ｅＧＦＲが少し低下したグループ（ｅＧＦＲ３０−５９）においても、健常者における濃度と有意差が見られたため、早期腎疾患の判定・検出や、腎疾患の高感度での判定・検出に特に好適に用いることができ、中でも、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、中でも特にシス−アコニット酸は、健常者における濃度がかなり低いため、早期腎疾患の判定・検出や、腎疾患の高感度での判定・検出のために、とりわけ優れた腎疾患マーカーとなる。
【００１９】
また、上記の被検血液試料としては、被験者（被検血液試料の提供者）の血液に由来する試料である限り特に制限されず、血液試料そのものであってもよいし、その血液試料から得られた血清試料や血漿試料であってもよいが、検出や定量のより高い精度を得る観点から、血漿試料を好適に例示することができる。
【００２０】
上記の本件腎疾患マーカー物質の検出又は定量方法としては、本件腎疾患マーカー物質を検出又は定量し得る限り、物理化学的方法であっても生物学的方法であってもよいが、検出感度の点で物理化学的方法を好適に例示することができ、中でも、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）やキャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ−ＭＳ）等の質量分析計（ＭＳ）を用いた方法をより好適に例示することができ、少量のサンプルから数百種類以上の物質を同時測定できることから、ＣＥ−ＭＳを用いた方法を特に好適に例示することができる。
【００２１】
本発明の腎疾患の判定方法においては、本件腎疾患マーカー物質の検出結果又は定量結果をコントロールと比較することにより、被検血液試料の提供者が腎疾患であるかどうか、又は、該提供者の腎疾患の症状の程度を評価する工程をさらに有することが好ましい。上記のコントロールとしては、腎疾患非罹患者（好ましくは健常者）の血液試料（より好適には、被検血液試料と同種の血液試料）中の本件マーカー物質の検出結果又は定量結果（好ましくは、後述の「基準値」）を好適に例示することができる。例えば、上記方法にて定量した被検血液試料中の本件腎疾患マーカー物質を濃度換算し、その濃度を、腎疾患非罹患者の血液試料中の本件腎疾患マーカー物質濃度より設定した基準値と比較することによって、被検血液試料の提供者が腎疾患であるかどうかを評価することができる。ここで、「基準値」とは、陽性又は陰性を判定するための値をいう。この基準値は、例えば、腎機能の悪化に伴って濃度が上昇する本件腎疾患マーカー物質の場合は、「腎疾患非罹患者の血液試料中の特定の本件腎疾患マーカー物質の濃度の平均値」＋（α×標準偏差（ＳＤ）という数式において、αとして、０．５、１、２又は５を用いることによって、設定することができ、腎機能の悪化に伴って濃度が低下する本件腎疾患マーカー物質の場合は、「腎疾患非罹患者の血液試料中の特定の本件腎疾患マーカー物質の濃度の平均値」−（α×標準偏差（ＳＤ）という数式において、αとして０．５、１、２又は５を用いることによって、設定することができる。なお、濃度の分布が正規分布である集団では、いずれの数式においても、αとして２を用いることが多い。
【００２２】
具体的には、腎疾患非罹患者の集団を対象として、その血液試料中の本件腎疾患マーカー物質を定量して、上記の式により基準値を設定し、その本件腎疾患マーカー物質が腎機能の悪化に伴って濃度が上昇するもの（Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、オフタルム酸、Ｎ−ε−アセチルリジン、シトシン、ヒポタウリン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギン、イセチオン酸、グルコン酸、トランス−アコニット酸、ピメリン酸、イソクエン酸、Ｎ−アセチル−β−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、セバシン酸、４−オキソペンタン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラマレイン酸、２−イソプロピルマレイン酸、トレオン酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼテート、フタル酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸）である場合は、被検血液試料中のその本件腎疾患マーカー物質の濃度が、コントロール（好ましくは基準値）より高い値を示した場合に、被検血液試料の提供者を陽性（腎疾患に罹患）と評価することができ、また、前述の被検血液試料中のその本件腎疾患マーカー物質の濃度がコントロールよりも高い程度を、該提供者の腎疾患の症状の重さの程度であると評価することができる。
【００２３】
一方、用いる本件腎疾患マーカー物質が腎機能の悪化に伴って濃度が低下するもの（２−アミノ酪酸、グルタミン酸、４−メチル−２−オキソペンタン酸、２−オキソイソペンタン酸、乳酸、オクタン酸、２−オキソグルタル酸）である場合は、被検血液試料中のその本件腎疾患マーカー物質の濃度がコントロール（好ましくは基準値）より低い値を示した場合に、被検血液試料の提供者を陽性（腎疾患に罹患）と評価することができ、また、前述の被検血液試料中のその本件腎疾患マーカー物質の濃度がコントロールよりも低い程度を、該提供者の腎疾患の症状の重さの程度であると評価することができる。なお、基準値は、被検血液試料中の本件腎疾患マーカー物質を検出する度に毎回算出する必要はなく、例えば、様々な種類の血液試料についてあらかじめ基準値を測定しておき、血液試料の種類毎に検量線を作成しておけば、被検血液試料と同種の血液試料の基準値を検索するなどしてすぐに用いることができる。なお、本件腎疾患マーカー物質が検出できない場合は濃度０として扱えばよい。
【００２４】
また、本件腎疾患マーカー物質は、腎疾患の病態の管理に利用することもできる。腎疾患の病態を管理するには、例えば、上記方法にて定量した被検血液試料中の本件腎疾患マーカー物質を濃度換算し、その濃度からｅＧＦＲを評価すること等によって行なうことができる。本明細書において病態の管理とは、病状の重篤度の把握及び予後の観察をいう。
【００２５】
本発明の腎疾患の判定方法により判定することができ、又は、病態の管理を行なうことのできる腎疾患としては、慢性腎不全、急性腎不全、糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、腎硬化症、免疫複合体腎症、ループス腎炎、糖尿病性腎症、薬剤性腎障害、高血圧性腎障害、多発性嚢胞腎、ＩｇＡ腎症などを好適に例示することができ、中でも、慢性腎不全、急性腎不全、糖尿病性腎症などをより好適に例示することができる。
【００２６】
本発明の早期腎疾患の判定方法（本発明の第２の発明）
現在一般的に使用されている公知の腎疾患マーカー物質としては、クレアチニンやシスタチンＣが挙げられる。これらの公知の腎疾患マーカー物質の尿中の濃度は、ＧＦＲの低下と共に徐々に上昇するものの、特に末期の腎疾患では急激に上昇する二次曲線に近い上昇カーブを描く（図６８〜７４参照）。また、上記の公知の腎疾患マーカー物質は、早期の腎疾患ではその濃度の上昇が緩やかであることから、早期の腎疾患を検出するには不向きであった。また、上記の公知の腎疾患マーカー物質の濃度からｅＧＦＲを算出する際にも複雑な計算式を必要とした。そこで、本発明者らは、ｅＧＦＲと有意な相関がある６４種類の腎疾患マーカー物質に関して、ｅＧＦＲとの関係をより詳細に検討し、ｅＧＦＲとの相関が一次式に近似する早期腎疾患マーカー物質を見い出した。
【００２７】
本発明の早期腎疾患の判定方法としては、被検血液試料中に存在する、以下の早期腎疾患マーカー物質から選ばれる１種又は２種以上の腎疾患マーカー物質（以下、「本件早期腎疾患マーカー物質」とも表示する。）を検出又は定量する工程を有することを特徴とする判定方法であれば特に制限されない。
（ｅＧＦＲとの負の相関を持つカチオンである早期腎疾患マーカー物質）：１−メチルアデノシン、Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、アシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ−ε−アセチルリジン、キヌレニン、インドール−３−酢酸、ヒポタウリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギン；
（ｅＧＦＲとの正の相関を持つカチオンである早期腎疾患マーカー物質）：バリン、２−アミノ酪酸、グアニド酢酸、グルタミン酸、ロイシン；
（ｅＧＦＲとの負の相関を持つアニオンである早期腎疾患マーカー物質）：セバシン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラマレイン酸、２−イソプロピルマレイン酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼテート、フタル酸、クエン酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸；
（ｅＧＦＲとの正の相関を持つアニオンである早期腎疾患マーカー物質）：４−メチル−２−オキソペンタン酸、２−オキソイソペンタン酸、乳酸、オクタン酸；
なお、本発明の早期腎疾患の判定方法の精度をより高める観点からは、２種以上の本件早期腎疾患マーカー物質を併用する方法もある。
【００２８】
また、本件早期腎疾患マーカー物質のうち、１−メチルアデノシン、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸は、ｅＧＦＲが少し低下したグループ（ｅＧＦＲ３０−５９）においても、健常者における濃度と有意差が見られたため、早期腎疾患の判定・検出や、腎疾患の高感度での判定・検出に特に好適に用いることができ、中でも、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、中でも特にシス−アコニット酸は、健常者における濃度がかなり低いため、早期腎疾患の判定・検出や、腎疾患の高感度での判定・検出のために、とりわけ優れた腎疾患マーカーとなる。
【００２９】
本発明の早期腎疾患の判定方法によれば、被検血液試料の提供者が早期腎疾患であるかどうかや、該提供者の早期腎疾患の症状の程度を判定することができる。
【００３０】
前述の本件早期腎疾患マーカー物質のうち、１−メチルアデノシン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、アシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、キヌレニン、インドール−３−酢酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、バリン、グアニド酢酸、ロイシン、クエン酸は、腎疾患との関連は知られていたが、ｅＧＦＲとの相関式が一次式に近似する事、すなわち、早期腎疾患マーカー物質として用い得ることは本発明者らが初めて明らかにしたものである。
【００３１】
本発明の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法（本発明の第３の発明）
本発明の腎疾患予防・治療剤のスクリーニング方法としては、腎機能が低下した非ヒト動物に被検物質を投与する工程Ａ；該非ヒト動物から血液試料を採取する工程Ｂ；該血液試料中に存在する、腎疾患マーカー物質（Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、オフタルム酸、Ｎ−ε−アセチルリジン、シトシン、ヒポタウリン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギン、２−アミノ酪酸、グルタミン酸、イセチオン酸、グルコン酸、トランス−アコニット酸、ピメリン酸、イソクエン酸、Ｎ−アセチル−β−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、セバシン酸、４−オキソペンタン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラマレイン酸、２−イソプロピルマレイン酸、トレオン酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼテート、フタル酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、４−メチル−２−オキソペンタン酸、２−オキソイソペンタン酸、乳酸、オクタン酸、２−オキソグルタル酸）から選ばれる１種又は２種以上の腎疾患マーカー物質を検出又は定量する工程Ｃ；血液試料中に存在する腎疾患マーカー物質の検出結果又は定量結果をコントロールと比較することにより、前記非ヒト動物の腎機能を評価する工程Ｄ；を有している限り特に制限されないが、前記工程Ｄとしては、腎機能の悪化に伴って濃度が上昇する本件腎疾患マーカー物質の濃度が、コントロールよりも低い場合、又は、腎機能の悪化に伴って濃度が低下する本件腎疾患マーカー物質の濃度が、コントロールよりも高い場合に、前述の被検物質を腎疾患の予防・治療剤と評価する工程Ｄ’を好適に例示することができる。
【００３２】
上記非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物を好適に例示することができ、中でも、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができる。
【実施例１】
【００３３】
［腎疾患患者の背景］
東北大学病院受診中の慢性腎臓病患者４１人から、後述のＣＥ−ＭＳ解析の対象となる血漿サンプルを採取した。なお、本研究計画は東北大学倫理委員会にて予め承認を受けており、患者個人各々に情報提供した後、患者各々から承認を得て血漿サンプルの採取を行った。これらの患者の背景は、平均年齢が６２．９±１４．６歳であり、４１人中２６人が男性、１５人が女性であった。これらの患者の推定糸球体濾過量（estimated glomerular filtration rate:ｅＧＦＲ）を、日本腎臓学会により推奨される推定式を用いて算出したところ、平均で２４．４±１３．９ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２であり、また、全ての患者がＣＫＤ（慢性腎不全）の基準である６０ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以下に分類されていた。なお、ｅＧＦＲを算出するための上記推定式は男性の場合は、「ｅＧＦＲ＝１９４×［年齢］−０．２８７×［血中クレアチニン（ｍｇ／ｄｌ）］−１．０９４」であり、女性の場合は、「ｅＧＦＲ＝１９４×［年齢］−０．２８７×［血中クレアチニン（ｍｇ／ｄｌ）］−１．０９４×［０．７３９］」である。これらの慢性腎臓患者４１人の患者背景を図１に示す。【００３４】
図１に示されているように、これらの患者の慢性腎臓病の原因（原疾患）としては、アルポート症候群が１人（２．４％）、アレルギー性腎症が１人（２．４％）、ＡＮＣＡ関連腎症が１人（２．４％）、大動脈炎症候群が１人（２．４％）、両側腎梗塞が１人（２．４％）、糖尿病性腎症が８人（１９．５％）、巣状糸球体硬化症が３人（７．３％）、糸球体硬化症が４人（９．７％）、水腎症が１人（２．４％）、ＩｇＡ腎症が９人（２１．９％）、リポ蛋白糸球体症が１人（２．４％）、ループス腎症が２人（４．８％）、膜性増殖性糸球体炎が１人（２．４％）、膜性腎症が２人（４．８％）、多発嚢胞腎が１人（２．４％）、原発性腎症が２人（４．８％）、腎結核が１人（２．４％）、サルコイドーシスが１人（２．４％）であった。また、これらの患者の基礎疾患としては、１０人が心血管病、１２人が糖尿病、４０人が高血圧を罹患していた。さらに、これらの患者４１人中１１人が喫煙者であった。これらの患者が内服している薬剤の種類としては、アロプリノールが１２人（２９．２％）、アンジオテンシン受容体拮抗薬が３０人（７３．１％）、ＡＳＴ−１２０が５人（１２．１％）、エリスロポエチンが６人（１４．６％）、スタチンが８人（１９．５％）であった。
【実施例２】
【００３５】
［腎疾患患者の血漿中の物質の解析］
本発明者らは、実施例１で採取した腎疾患患者全員の血漿サンプルについて、ＣＥ−ＭＳを用いて網羅的解析を行い、これら血漿サンプルに含まれる物質の分析を行なった。具体的には以下のような方法で行なった。【００３６】
内標準物質を調整したメタノール溶液を、実施例１で得られた各血漿サンプルに添加して撹拌し、さらにクロロホルムを加えて撹拌し、４６００ｇで５分間遠心分離した後、上清を限外ろ過フィルター（分画分子量５０００）にとり、４℃、９１００ｇで２時間遠心分離した後、ろ液を遠心濃縮してＣＥ−ＴＯＦＭＳにて測定を行った。その際、３１２種類の陽イオンと１９３種類の陰イオンを網羅的に同時測定した。その結果、６６種類の陽イオンと５０種類の陰イオンが、慢性腎不全患者の血漿中より検出された。検出された物質（以下、「検出物質」と表示する。）の分子量は７３．０ｍ／ｚから４６０．１ｍ／ｚの間であった。検出物質のうち、腎不全時に蓄積する物質を検索するために、本発明者らは、検出物質とｅＧＦＲの相関を、スピアマン順位相関検定を用いて解析した。検出物質のうち陽イオン（Ｃａｔｉｏｎ）の結果を図２に示し、陰イオン（Ａｎｉｏｎ）の結果を図３に示す。なお、図２及び図３はそれぞれ相関係数の高い順に上から表示している。これらの検出物質のうち、相関関係についてのＰ値が０．０５以下であった物質を、ｅＧＦＲと有意な相関があると見なした。そしてさらに解析を進め、ｅＧＦＲと有意な相関がある陰イオン、陽イオンの中でも、ｅＧＦＲの低下とともに有意に蓄積する物質３０種類と、ｅＧＦＲ低下とともに有意に減少する物質３５種類の合計６５種類の物質が同定された。【００３７】
図２に示すように、陽イオンでｅＧＦＲの低下とともに有意に蓄積する物質として、クレアチニン（creatinine）、シンメトリックジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、グアジニノコハク酸（guanidino succinate）、シトルリン（citrulline）、１−メチルアデノシン（1-methyladenosine）、Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetylgulusosamine）、γ−ブチロベタイン（γ-butyrobetaine）、オフタルム酸（ophthalmate）、３−メチルヒスチジン（3-methylhistidine）、ヒドロキシプロリン（hydroxyproline）、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（trimethylamine N-oxide）、アラントイン（allantoin）、アシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ−ε−アセチルリジン（N-epsilon-acetyllysine）、キヌレニン（kynurenine）、シトシン（cytosine）、インドール−３−酢酸（indole-3-acetate）、ヒポタウリン（hypotaurine）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（n,n-dimethylglycine）、７−メチルグアニン（7-methylguanine）、メチオニンスルホキシド（methionine sulfoxide）、アスパラギン（Ａｓｎ）が同定された。また、図２に示すように、陽イオンでｅＧＦＲの低下とともに有意に減少する物質として、トリプトファン（Ｔｒｐ）、バリン（Ｖａｌ）、チロシン（Ｔｙｒ）、２−アミノ酪酸（2-aminobutyrate）、グアニド酢酸（guanidoacetate）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、ロイシン（Ｌｅｕ）が同定された。【００３８】
一方、図３に示すように、陰イオンでｅＧＦＲの低下とともに有意に蓄積する物質として、イセチオン酸（isethionate）、グルコン酸（gluconate）、トランス−アコニット酸（trans-aconitate）、ピメリン酸（pimelate）、３−インドキシル硫酸（3-indoxylsulfate）、イソクエン酸（isocitrate）、Ｎ−アセチル−β−アラニン（N-acetyl-beta-alanine）、Ｎ−アセチルグルタミン酸（N-acetylglutamate）、セバシン酸（sebacate）、４−オキソペンタン酸（4-oxopentanoate）、シス−アコニット酸（cis-aconitate）、ホモバニリン酸（homovanillate）、アジピン酸（adipate）、シトラマレイン酸（citramalate）、２−イソプロピルマレイン酸（2-isopropylmalate）、トレオン酸（threonate）、馬尿酸（hippurate）、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（N-acetylaspartate）、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸（4-hydroxy-3-methoxymandelate）、オキサミン酸（oxamate）、グルタル酸（glutarate）、アゼテート（azetate）、フタル酸（phthalate）、クエン酸（citrate）、マロン酸（malonate）、シトラコン酸（citraconate）、キナ酸（quinate）、コハク酸（succinate）、システイン−Ｓ−硫酸（cysteine S-sulfate）、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸（4-hydroxy-3-methoxybenzoate）が同定された。
また、図３に示すように、陰イオンでｅＧＦＲの低下とともに有意に減少する物質として、４−メチル−２−オキソペンタン酸（4-methyl-2-oxopentanoate）、２−オキソイソペンタン酸（2-oxoisopentanoate）、乳酸（lactate）、オクタン酸（octanoate）、ピルビン酸（pyruvate）、２−オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）が同定された。【００３９】
ｅＧＦＲと有意な相関が認められたこれらの６４種類の物質（陽イオン及び陰イオン）のうち、クレアチニン（creatinine）を始めとするいくつかの物質は、これまでに腎不全との相関が報告されている物質であった。これらの６４種類の物質のうち、ｅＧＦＲとの有意な相関関係が新規に見い出された合計４３種類（１１種類の陽イオン、３２種類の陰イオン）の物質については、図２又は３において、物質名の背景を灰色とした。例えば、陽イオンでｅＧＦＲの低下とともに有意に蓄積する物質の中でも、Ｎ−アセチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）、γ−ブチロベタイン（γ-butyrobetaine）、オフタルム酸（ophthalmate）、Ｎ−ε−アセチルリジン（N-epsilon-acetyllysine）、シトシン（cytosine）、ヒポタウリン（hypotaurine）、７−メチルグアニン（7-methylguanine）、メチオニンスルホキシド（methionine sulfoxide）、アスパラギン（Ａｓｎ）は、今回の研究で、腎不全との相関が初めて見い出された物質であった。【００４０】
また、陽イオンでｅＧＦＲの低下とともに有意に減少する物質の中でも、２−アミノ酪酸（2-aminobutyrate）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）は、今回の研究で、腎不全との相関が初めて見い出された物質であった。【００４１】
一方、陰イオンでｅＧＦＲの低下とともに有意に蓄積する物質に関しては、その大部分が今回新たに腎不全との相関が発見された物質であった。具体的には、イセチオン酸（isethionate）、グルコン酸（gluconate）、トランス−アコニット酸（trans-aconitate）、ピメリン酸（pimelate）、イソクエン酸（isocitrate）、Ｎ−アセチル−β−アラニン（N-acetyl-beta-alanine）、Ｎ−アセチルグルタミン酸（N-acetylglutamate）、セバシン酸（sebacate）、４−オキソペンタン酸（4-oxopentanoate）、シス−アコニット酸（cis-aconitate）、ホモバニリン酸（homovanillate）、アジピン酸（adipate）、シトラマレイン酸（citramalate）、２−イソプロピルマレイン酸（2-isopropylmalate）、トレオン酸（threonate）、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（N-acetylaspartate）、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸（4-hydroxy-3-methoxymandelate）、オキサミン酸（oxamate）、グルタル酸（glutarate）、アゼテート（azetate）、フタル酸（phthalate）、マロン酸（malonate）、シトラコン酸（citraconate）、キナ酸（quinate）、コハク酸（succinate）、システイン−Ｓ−硫酸（cysteine S-sulfate）、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸（4-hydroxy-3-methoxybenzoate）が、今回の研究で、腎不全との相関が初めて見い出された物質であった。【００４２】
また、陰イオンでｅＧＦＲの低下とともに有意に減少する物質の中では、４−メチル−２−オキソペンタン酸（4-methyl-2-oxopentanoate）、２−オキソイソペンタン酸（2-oxoisopentanoate）、乳酸（lactate）、オクタン酸（octanoate）、２−オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）が、今回の研究で、腎不全との相関が初めて見い出された物質であった。【００４３】
以上のように、ｅＧＦＲの低下と有意に相関のある合計４３種類のこれらの物質は、腎疾患マーカー物質として使用し得ることが新たに示された。
【実施例３】
【００４４】
［早期腎疾患マーカー物質の検索］
現在一般的に使用されている公知の腎疾患マーカー物質としては、クレアチニンやシスタチンＣが挙げられる。これらの公知の腎疾患マーカー物質の尿中の濃度は、ＧＦＲの低下と共に徐々に上昇するものの、特に末期の腎疾患では急激に上昇する二次曲線に近い上昇カーブを描く。また、上記の公知の腎疾患マーカー物質は、早期の腎疾患ではその濃度の上昇が緩やかであることから、早期の腎疾患を検出するには不向きであった。また、上記の公知の腎疾患マーカー物質の濃度からｅＧＦＲを算出する際にも複雑な計算式を必要とした。そこで、本発明者らは、上記実施例２でｅＧＦＲと有意な相関があると認められた６４種類の腎疾患マーカー物質に関して、ｅＧＦＲとの関係をより詳細に検討し、より早期に腎不全等の腎疾患を検出し得る腎疾患マーカー物質や、ｅＧＦＲをより簡単に算出し得る腎疾患マーカー物質の選抜を試みた。【００４５】
具体的には、実施例２で見い出された６４種類の腎疾患マーカー物質のそれぞれについて、横軸をｅＧＦＲの値とし、縦軸をその腎疾患マーカー物質の血漿中濃度としたグラフを作成し（図４〜６７）、その腎疾患マーカー物質の血漿中濃度とｅＧＦＲとの間のスピアマンの相関係数が高く、かつ、その相関式一次式に近似して増減する物質を選抜した。なお、一次式に近似する変化を示す腎疾患マーカー物質の場合、ｅＧＦＲとの関係は、その腎疾患マーカー物質の血漿中濃度をＩｎ（Ｃｐ）で表した際に、Ｉｎ（Ｃｐ）＝β１（ｅＧＦＲ）＋αと示される。一方、クレアチニンやシスタチンＣのように二次式に近似する物質の場合、血漿中濃度はＩｎ（Ｃｐ）＝β１（ｅＧＦＲ）２＋β２（ｅＧＦＲ）＋αとして示される。ここで、（ｅＧＦＲ）２を独立の変数として扱い、その際の対数尤度比（log likelihood ratio）を計算する事によって、相関式が一次式あるいは二次式のどちらにより近似するかを評価した。この結果、陽イオンでｅＧＦＲが低下するとともに体内に有意に蓄積する２２種類の物質（図４〜２５）の中でも、１−メチルアデノシン、Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、アシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ−ε−アセチルリジン、キヌレニン、インドール−３−酢酸、ヒポタウリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギンは、ｅＧＦＲとの相関式が一次式に近似する事が分かった。また、陽イオンでｅＧＦＲが低下するとともに有意に減少する７種類の物質（図２６〜３２）の中でも、バリン、２−アミノ酪酸、グアニド酢酸、グルタミン酸、ロイシンはｅＧＦＲとの相関式が一次式に近似する事が分かった。一方、陰イオンでｅＧＦＲが低下するとともに有意に蓄積する３０種類の物質（図３３〜６２）の中でも、セバシン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラマレイン酸、２−イソプロピルマレイン酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼテート、フタル酸、クエン酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸は、ｅＧＦＲとの相関式が一次式に近似する事が分かった。さらに、陰イオンでｅＧＦＲが低下するとともに有意に減少する５種類の物質（図６３〜６７）のなかでも、４−メチル−２−オキソペンタン酸、２−オキソイソペンタン酸、乳酸、オクタン酸は、ｅＧＦＲとの相関式が一次式に近似する事が分かった。【００４６】
以上のことから、１−メチルアデノシン、Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、アシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ−ε−アセチルリジン、キヌレニン、インドール−３−酢酸、ヒポタウリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギン、バリン、２−アミノ酪酸、グアニド酢酸、グルタミン酸、ロイシン、セバシン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラマレイン酸、２−イソプロピルマレイン酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼテート、フタル酸、クエン酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、４−メチル−２−オキソペンタン酸、２−オキソイソペンタン酸、乳酸、オクタン酸は、ｅＧＦＲとの相関式が一次式に近似する腎疾患マーカー物質であることが示された。腎疾患マーカー物質の中でも、腎疾患の初期から濃度が変化し、腎疾患が進行するにつれて、一次式に近い形で直線的に濃度が上昇する上記の４３種類の腎疾患マーカー物質は、早期腎疾患の判定・検出に好適に用い得る早期腎疾患マーカー物質と考えられる。なお、早期腎疾患マーカー物質のうち、１−メチルアデノシン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、アシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、キヌレニン、インドール−３−酢酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、バリン、グアニド酢酸、ロイシン、クエン酸は、腎疾患との関連は知られていたが、ｅＧＦＲとの相関式が一次式に近似する事、すなわち、早期腎疾患マーカー物質として用い得ることは本発明者らが初めて明らかにしたものである。また、かかる４３種類の早期腎疾患マーカー物質は、被験者（被検血液試料の提供者）のｅＧＦＲの複雑な計算式を必要とせずに、腎疾患の判定に用いることができるため、より簡便な腎疾患マーカー物質として好適に用いることができると考えられる。
【実施例４】
【００４７】
［シスタチンＣとの比較］
現在一般的に使用されている公知の腎疾患マーカー物質のうち、クレアチニンについては既に図１９において、ｅＧＦＲとの相関式が二次式に近似することを示した。そこで、現在、クレアチニンに代わる腎不全マーカー物質と言われているシスタチンＣについても、ｅＧＦＲとの相関式を調べることとした。具体的には、実施例１で採取した腎疾患患者全員の血漿サンプルについて、実施例２と同様にＣＥ−ＭＳを用いて、これら血漿サンプルに含まれるシスタチンＣの分析を行った。次いで、この分析結果を利用して、ｅＧＦＲとシスタチンＣとの相関関係を調べた。その結果を図６８に示す。この結果から分かるように、シスタチンＣもまた、ｅＧＦＲの低下と共に徐々に血中濃度が上昇するものの、特に末期の腎疾患では急激に上昇する二次曲線に近い上昇カーブを描いた。したがって、クレアチニンだけでなく、シスタチンＣもまた、本件早期腎疾患マーカー物質のようには、早期腎疾患の判定には不向きであることが示された。なお、参考のため、図６９〜７４に、ｅＧＦＲとの相関について、本件早期腎疾患マーカー物質と、公知の腎疾患マーカー物質（クレアチニン及びシスタチンＣ）とを比較した図を６つ示す。これらの図に示されるように、本件早期腎疾患マーカー物質は、ｅＧＦＲの落ち込みに対して、クレアチニンやシスタチンＣよりも敏感な濃度変化を示した。以上の結果から、本件早期腎疾患マーカー物質は、従来の腎疾患マーカー物質と比較して、早期腎疾患の判定において、特に優れていることが示された。
【実施例５】
【００４８】
［腎疾患患者の血漿中の腎疾患マーカー物質濃度と、健常者の血漿中のかかる濃度との比較］
前述の実施例２や３において、腎疾患患者の血漿中の腎疾患マーカー物質の濃度や、かかる患者のｅＧＦＲの解析を行った。この解析結果を、健常者場合と比較するために、健常者の血漿中の腎疾患マーカー物質の濃度を測定することとした。【００４９】
まず、健常者１８人から、前述のＣＥ−ＭＳ解析の対象となる血漿サンプルを採取した。これらの健常者の背景は、平均年齢が５５歳であり、全員が男性であった。これらの健常者のｅＧＦＲを、日本腎臓学会により推奨される前述の推定式を用いて算出したところ、全ての健常者が正常の基準である６０ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以上に分類されていた。【００５０】
これらの健常者から採取した血漿サンプルについて、前述の実施例２記載の方法と同じ方法でＣＥ−ＭＳ解析を行い、γ−ブチロベタイン、Ｎ−アセチルグルコサミン、１−メチルアデノシン、シス−アコニット酸、セバシン酸、ホモバニリン酸の計６種類の物質の濃度を測定した。次いで、これらの各物質の濃度の平均値を算出した。また、前述の実施例２で腎疾患患者の血漿サンプル中の濃度を測定した物質のうち、前述の６種類の各物質の濃度について、腎疾患患者のｅＧＦＲ値に応じた３つのグループ（ｅＧＦＲ３０−５９、ｅＧＦＲ１５−２９、ｅＧＦＲ１５＞）毎に平均値を算出した。前述の６種類の各物質について、健常者のグループ（ｎｏｍａｌ）、ｅＧＦＲが３０−５９の腎疾患患者のグループ（ｅＧＦＲ３０−５９）、ｅＧＦＲが１５−２９の腎疾患患者のグループ（ｅＧＦＲ１５−２９）、ｅＧＦＲが１５以下の腎疾患患者のグループ（ｅＧＦＲ１５＞）ごとに表示した結果を図７５〜７８に示す。なお、図７５の下段において、健常者のうちの２人のＮ−アセチルグルコサミン濃度が他の全員の該濃度と極端に離れていたため、この２人のＮ−アセチルグルコサミン濃度を異常値として除外したものを図７６の上段に示している。また、図７５〜７８の左側のパネルは、測定濃度を個別にドットとして表したものであり、右側のパネルは、グループ毎に平均した棒グラフを表したものである。【００５１】
図７５〜７８の結果から分かるように、６種類の物質のうち、１−メチルアデノシン、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸は、ｅＧＦＲが低下するにつれて物質濃度が上昇する傾向が見られた上に、ｅＧＦＲが少し低下したグループ（ｅＧＦＲ３０−５９）においても、健常者における濃度と有意差が見られ、中でも、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、中でも特にシス−アコニット酸は、健常者における濃度がかなり低いかったため（図７７及び７８）、特に優れた腎疾患マーカーとなることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、腎疾患の判定の分野や、腎疾患の予防・治療剤のスクリーニングの分野に好適に利用することができる。
【図１】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
2011027573.tif 000038
【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【国際調査報告】
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