(57)【要約】  自己免疫疾患、特に１型糖尿病と関節リウマチの新規な治療剤を提供する。  新規な抗ＣＤ９８抗体を作製し、これを用いることにより、自己免疫疾患（１型糖尿病や関節リウマチ）の新しい作用機序による新規な治療剤を提供できるようになった。この新規な抗ＣＤ９８抗体はＣＤ９８のアミノ酸輸送を阻害せず、また、公知の抗ＣＤ９８抗体と異なり、更に、Ｔリンパ球活性化抑制作用、フィブロネクチン介在の細胞接着抑制作用を有すると共に、ＯＶＡ感作モデルにおいてＯＶＡ抗体の産生を抑制する等の作用を有するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲ１として配列番号１９の配列を、ＣＤＲ２として配列番号２０の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号２１の配列を有する重鎖を含む、抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項２】
ＣＤＲ１として配列番号２２の配列を、ＣＤＲ２として配列番号２３の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号２４の配列を有する軽鎖を含む、抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項３】
重鎖のＣＤＲ１として配列番号１９の配列を、ＣＤＲ２として配列番号２０の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号２１の配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１として配列番号２２の配列を、ＣＤＲ２として配列番号２３の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号２４の配列を有する、抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項４】
配列番号６および８の２配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域としてそれぞれ有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項５】
抗ＣＤ９８抗体が、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１００７由来のものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項６】
抗体重鎖定常領域のクラスがＩｇＧである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項７】
前記機能的断片が、抗体の重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項８】
ＣＤＲ１として配列番号１３の配列を、ＣＤＲ２として配列番号１４の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号１５の配列を有する重鎖を含む、抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項９】
ＣＤＲ１として配列番号１６の配列を、ＣＤＲ２として配列番号１７の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号１８の配列を有する軽鎖を含む、抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項１０】
重鎖のＣＤＲ１として配列番号１３の配列を、ＣＤＲ２として配列番号１４の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号１５の配列を有し、且つ、軽鎖のＣＤＲ１として配列番号１６の配列を、ＣＤＲ２として配列番号１７の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号１８の配列を有する、請求項８または９に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項１１】
配列番号２および４の２配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域としてそれぞれ有する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項１２】
抗体重鎖定常領域のクラスがＩｇＧである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項１３】
前記機能的断片が、抗体の重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項１４】
抗ＣＤ９８抗体が、ＮＩＴＥ  ＢＰ−９６４由来のものである、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片を発現する、細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片を有効成分として含んでなる、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片を有効成分とする、自己免疫疾患治療剤。
【請求項１８】
自己免疫疾患が、１型糖尿病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、乾癬、クローン病、全身性エリテマトーデス、またはバセドウ病である、請求項１７記載の自己免疫疾患治療剤。
【請求項１９】
自己免疫疾患が１型糖尿病または関節リウマチである、請求項１７または１８に記載の自己免疫疾患治療剤。
【請求項２０】
該抗ＣＤ９８抗体が、
ａ）ＣＤ９８の重鎖に結合部位を有し、
ｂ）ＣＤ９８のアミノ酸取り込みに影響を与えず、且つ
ｃ）Ｔリンパ球活性化抑制作用を有する
ことを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の自己免疫疾患治療剤。
【請求項２１】
配列番号１および３の２配列を含む発現ベクターを宿主に導入して該宿主を培養し、培養物から該抗体を取得することを特徴とする、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片の製造方法。
【請求項２２】
配列番号５および７の２配列を含む発現ベクターを宿主に導入して該宿主を培養し、培養物から該抗体を取得することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片の製造方法。
【請求項２３】
宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、植物および哺乳動物（ヒトを除く）からなる群から選択される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
治療上有効量の請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片を対象に投与することを含む、自己免疫疾患の予防または治療方法。
【請求項２５】
自己免疫疾患の予防または治療の為の、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ＣＤ９８抗体に関するものであり、更には新たな抗ＣＤ９８抗体を用いた自己免疫疾患治療剤に関するものである。更に詳しくは、糖尿病治療剤（特に１型糖尿病）や関節リウマチ治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ９８とは、細胞膜上に幅広く発現している約１２０ｋＤａのヘテロ２量体の糖タンパク質であり、アミノ酸輸送、増加した細胞膜発現とインテグリンが仲介する接着に付随する細胞融合に関連すると考えられている。ＣＤ９８の構造は、約８０ｋＤａのＩＩ型膜貫通型タンパク質ＣＤ９８ｈｃ（重鎖：４Ｆ２ｈｃ、ＳＬＣ３Ａ２）と６種類ある約４０ｋＤａの軽鎖（ＬＡＴ１，ＬＡＴ２，ｙ＋ＬＡＴ１，ｙ＋ＬＡＴ２，ｘＣＴ，ａｓｃ）の１つとジスルフィド結合によるヘテロ２量体を構成し、アミノ酸トランスポーターとして機能している。ＣＤ９８の重鎖（ＣＤ９８ｈｃ）は細胞膜に２量体を移動させる役割を持ち、軽鎖（ｌｃ）がトランスポーターの機能を持つと考えられている。
ＣＤ９８ｈｃは、最初、Ｔ細胞活性化抗原として発見されたものであり、様々な機能を持った糖タンパク質である。その機能としては、増殖中リンパ球、腫瘍細胞、その他の増殖能の高い細胞で高発現し、腫瘍形成を促進するインテグリン依存性シグナルに重要な役割を果たしている。【０００３】
ＣＤ９８が関与するアミノ酸輸送システムは、基質となるアミノ酸分子の多様性を反映して６種類のトランスポーター（約４０ｋＤａの軽鎖）の一つから構成されており、その輸送基質選択性とＮａ＋依存性により種々の輸送系に分類されている。例えば、中性アミノ酸輸送系Ｌ、小型中性アミノ酸輸送系ａｓｃ、中性および塩基性アミノ酸輸送系ｙ＋Ｌ、シスチン、塩基性および中性アミノ酸輸送系ｘ−ｃに相当する特定のトランスポーター（ＬＡＴ１，ＬＡＴ２，ｙ＋ＬＡＴ１，ｙ＋ＬＡＴ２，ｘＣＴ，ａｓｃ）とジスルフィド結合している。そして、ＣＤ９８重鎖は、上皮細胞の血管側の細胞膜に存在し、上記のトランスポーターを上皮細胞の血管側の細胞膜へ移送する働きをしている。【０００４】
また、ＣＤ９８は、多種の癌細胞で高発現していることが知られている。その理由として、癌細胞は細胞増殖を促進させるために、増殖に必要な必須アミノ酸を積極的に取り込む必要があり、そこで中性アミノ酸トランスポーターが過剰発現していると考えられる。例えば、癌細胞に特異的に高く発現しているアミノ酸トランスポーターとして、L-type amino acid transporter 1（ＬＡＴ１）がクローニングされている（Kanai et al., J. Biol. Chem. (1998), 273, 23629-23632）。ＬＡＴ１は、ＣＤ９８重鎖と複合体を形成し、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ヒスチジン等の大型の側鎖を持つ中性アミノ酸をナトリウムイオン非依存的に輸送する機能を有している。このＬＡＴ１は、脳、胎盤、骨髄、精巣を除く殆どの正常組織において、その発現が低いか、あるいは認められないものであるが、大腸癌、胃癌、乳癌、膵癌、腎癌、喉頭癌、食道癌、肺癌等のヒト悪性腫瘍組織では、ＣＤ９８と共に発現が亢進していることが知られている（非特許文献１）。【０００５】
そこで、ＣＤ９８重鎖や軽鎖（ＬＡＴ１）の発現を低下させ、アミノ酸取り込みを抑制すると、腫瘍の増殖が抑えられることが考えられた。即ち、軽鎖（ＬＡＴ１）の発現を低下させると、腫瘍の増殖抑制が起きることが癌移植マウスモデルで報告されている（特許文献１）。そこで、ＬＡＴ１の活性を抑えることは癌の治療法に有望であると考えられた。
また、ＣＤ９８（重鎖と軽鎖の複合体）のアミノ酸輸送を抑制するため、抗ＣＤ９８抗体を用いた癌細胞の抑制効果が癌移植マウスモデルで報告されている（特許文献２、３）。このように、抗ＣＤ９８抗体を使用して、抗癌剤として使用する試みについては、色々取り組みが行われている。しかし、抗癌剤以外の用途に関する取り組みは、ほとんど行われていない状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１５７２８６号公報
【特許文献２】特開２００９−１８９３７６号公報
【特許文献３】ＷＯ２００７／１１４４９６号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yanagida et al., Biochem. Biophys. Acta, (2001), 1514, 291-302
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新たな抗ＣＤ９８抗体および該抗体による自己免疫疾患の治療薬の提供を目的とする。特に、抗ＣＤ９８抗体による１型糖尿病や関節リウマチに対する治療薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＣＤ９８ノックアウトマウスが胎生早期に死亡することから、ＣＤ９８がアミノ酸輸送に関して重要な役割を果たしていると考えられている。そこで、本発明者は、糖尿病疾患において、細胞への糖の取り込みと消費を促進させるため、細胞へのアミノ酸の取り込みを阻害することを検討した。
この検討の中で、本発明者は、アミノ酸輸送活性を有するＣＤ９８（重鎖と軽鎖の複合体）がＴ細胞の活性化を正に制御する機能を持つことを明らかにした。そこで、更に研究を進めるため、ＣＤ９８の重鎖に特異的結合能を有する抗ＣＤ９８抗体を作製した。本発明の抗ＣＤ９８抗体は特許文献２の抗ＣＤ９８抗体とは異なり、アミノ酸輸送に全く影響を与えないが、膵臓β細胞を破壊するＴリンパ球の活性化を顕著に抑制するという特徴を持っていた。更に、本発明の抗ＣＤ９８抗体はフィブロネクチン介在の細胞接着を抑制すると言う特徴を持っていた。フィブロネクチンは、Ｔ細胞が他の細胞に接着して機能を発揮するために必要な接着因子であり、本発明の抗ＣＤ９８抗体がフィブロネクチン介在の細胞接着を抑制することから、Ｔ細胞が膵臓β細胞に接着することが抑制され、結果としてＴ細胞による膵臓β細胞の破壊が抑制できることになると考えられた。
更に、本発明の抗ＣＤ９８抗体の効果を見出すため、各種の動物モデル実験を行なったところ、本抗体が１型糖尿病の進行を抑制するだけでなく、治療できることを見出した。即ち、これまでインスリンの補充療法以外に適切な治療方法のなかった膵臓β細胞のアポトーシスに基づく１型糖尿病に対して、本抗体が非常に有効であることが示された。
また、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、関節リウマチの進行を抑制できることも分かった。これらの知見から、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、自己免疫疾患の治療薬として有用であることが示された。本発明者は、以上の知見に基づいて本発明を完成した。【００１０】
すなわち本発明は以下のとおりである。【００１１】
［１］ＣＤＲ１として配列番号１９の配列を、ＣＤＲ２として配列番号２０の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号２１の配列を有する重鎖を含む、抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［２］ＣＤＲ１として配列番号２２の配列を、ＣＤＲ２として配列番号２３の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号２４の配列を有する軽鎖を含む、抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［３］重鎖のＣＤＲ１として配列番号１９の配列を、ＣＤＲ２として配列番号２０の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号２１の配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１として配列番号２２の配列を、ＣＤＲ２として配列番号２３の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号２４の配列を有する、抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［４］配列番号６および８の２配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域としてそれぞれ有する、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［５］抗ＣＤ９８抗体が、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１００７由来のものである、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［６］抗体重鎖定常領域のクラスがＩｇＧである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［７］前記機能的断片が、抗体の重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。【００１２】
［８］ＣＤＲ１として配列番号１３の配列を、ＣＤＲ２として配列番号１４の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号１５の配列を有する重鎖を含む、抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［９］ＣＤＲ１として配列番号１６の配列を、ＣＤＲ２として配列番号１７の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号１８の配列を有する軽鎖を含む、抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［１０］重鎖のＣＤＲ１として配列番号１３の配列を、ＣＤＲ２として配列番号１４の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号１５の配列を有し、且つ、軽鎖のＣＤＲ１として配列番号１６の配列を、ＣＤＲ２として配列番号１７の配列を、およびＣＤＲ３として配列番号１８の配列を有する、上記［８］または［９］に記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［１１］配列番号２および４の２配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域としてそれぞれ有する、上記［８］〜［１０］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［１２］抗体重鎖定常領域のクラスがＩｇＧである、上記［８］〜［１１］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［１３］前記機能的断片が、抗体の重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、上記［８］〜［１２］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［１４］抗ＣＤ９８抗体が、ＮＩＴＥ  ＢＰ−９６４由来のものである、上記［８］〜［１３］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
［１５］上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片を発現する、細胞。
［１６］上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片を有効成分として含んでなる、医薬組成物。
［１７］上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片を有効成分とする、自己免疫疾患治療剤。
［１８］自己免疫疾患が、１型糖尿病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、乾癬、クローン病、全身性エリテマトーデス、またはバセドウ病である、上記［１７］記載の自己免疫疾患治療剤。
［１９］自己免疫疾患が１型糖尿病または関節リウマチである、上記［１７］または［１８］に記載の自己免疫疾患治療剤。
［２０］該抗ＣＤ９８抗体が、
ａ）ＣＤ９８の重鎖に結合部位を有し、
ｂ）ＣＤ９８のアミノ酸取り込みに影響を与えず、且つ
ｃ）Ｔリンパ球活性化抑制作用を有する
ことを特徴とする、上記［１７］〜［１９］のいずれかに記載の自己免疫疾患治療剤。【００１３】
［２１］配列番号１および３の２配列を含む発現ベクターを宿主に導入して該宿主を培養し、培養物から該抗体を取得することを特徴とする、上記［８］〜［１４］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片の製造方法。
［２２］配列番号５および７の２配列を含む発現ベクターを宿主に導入して該宿主を培養し、培養物から該抗体を取得することを特徴とする、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片の製造方法。
［２３］宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、植物および哺乳動物（ヒトを除く）からなる群から選択される、上記［２１］または［２２］に記載の方法。
［２４］治療上有効量の上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片を対象に投与することを含む、自己免疫疾患の予防または治療方法。
［２５］自己免疫疾患の予防または治療の為の、上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、新規な抗ＣＤ９８抗体と、この抗ＣＤ９８抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤である。本発明の抗ＣＤ９８抗体は、特に、これまで効果的な治療方法のなかった、１型糖尿病と関節リウマチに有効である。更に、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、効果的なＴ細胞活性化抑制を示すが、ＣＤ９８のアミノ酸取り込みには影響を与えないことから、エネルギー代謝に影響の少ない、副作用の少ない抗体であることが示されている。本発明の抗ＣＤ９８抗体の機能の特徴により、自己免疫疾患の治療に本発明の抗ＣＤ９８抗体を使用すれば、例えば糖尿病治療の場合に使用すれば、膵臓β細胞の疲弊・枯渇を抑制すると共に、特に１型糖尿病の進行を抑制し、１型糖尿病の予防と治療が可能である。また、自己免疫疾患として例えば関節リウマチの場合に、本発明の抗ＣＤ９８抗体を使用すれば、関節炎の発症と進展が抑制でき、関節リウマチの予防と治療が可能である。以上のことから、特に適切な治療方法のなかった自己免疫疾患（例えば１型糖尿病や関節リウマチ）の治療について、本発明の抗ＣＤ９８抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤は、極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の抗ＣＤ９８抗体が反応する認識分子を単離し、電気泳動で分子量を評価した結果を表わす図である。抗マウスＣＤ９８抗体（ｍＣＤ９８Ａｂ）とマウス脾臓細胞をＮＰ４０を用いて可溶化した溶液に添加し、２時間、４℃で静置した。その後、プロテインＧアガロースを添加しさらに２時間、４℃で振とう培養した。フリーの抗ＣＤ９８抗体を洗浄して除去した後に、サンプルバッファーを添加して、９８℃３分処理し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動したゲルを銀染色したところ、ＣＤ９８重鎖の分子量である約７５ｋＤａのところに銀染色の呈色が見られた。
【図２】本発明のｍＣＤ９８ＡｂがマウスＣＤ９８を発現するＣＨＯ細胞を認識して反応することを示した図（右図）である。ＣＨＯ細胞にｐｃＤＮＡ３．１に組み込んだマウスＣＤ９８遺伝子およびｐｃＤＮＡ３．１のみを電気穿孔法で遺伝子導入した。ＣＨＯ細胞のゲノムにＣＤ９８遺伝子が組み込まれた細胞を選択するために、Ｇ４１８で薬剤選択し、薬剤耐性細胞を単離した。その細胞をラットイムノグロブリンＧあるいはｍＣＤ９８Ａｂを用いて染色し、フリーの抗体を洗浄した後にＰＥ標識抗ラットＩｇＧで染色した。その結果、ｍＣＤ９８ＡｂはＣＤ９８遺伝子を導入されなかった細胞には反応せず、ＣＤ９８遺伝子を導入された細胞には反応することが示された。なお、左図は、ｐｃＤＮＡ３．１のみを遺伝子導入した細胞との反応結果を表わし、右図はマウスＣＤ９８遺伝子を導入し発現させた細胞との反応結果を表わしている。
【図３】本発明のｍＣＤ９８Ａｂが、ＯＶＡ感作によるマウスの血中の抗原特異抗体価を著減させることを示した図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に完全フロイントアジュバントとＯｖａｌｂｕｍｉｎの懸濁液で免疫し、１０日後に血清を採取した。当該マウスの免疫感作の初日を０として、２、４、６、８日目にコントロール抗体あるいは抗ＣＤ９８抗体、各２００μｇをマウス腹腔内に投与した。９６穴プレートに、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎを５０μｇ／ｍｌの濃度で固相化した後に、採取した血清で反応させた。Ｏｖａｌｂｕｍｉｎに反応した抗Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ抗体は、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体によって検出した。本図は基質を加えた後のＯＤ値を測定した結果を表わしている。
【図４】本発明の抗マウスＣＤ９８抗体（３−１４２抗体）が、マウス脾臓細胞の辺縁帯Ｂ細胞を消失させることを示した図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスにコントロールとしてラットＩｇＧ（２００μｇ）を、あるいはｍＣＤ９８Ａｂ（２００μｇ）を一回、静脈内投与した。その１日後に脾臓を採取して、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ２１抗体で染色した。図はＣＤ１９陽性細胞中のＣＤ２３とＣＤ２１の発現パターンを示したものである。ｍＣＤ９８Ａｂを投与した群ではコントロールと比較して、ＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３ｌｏｗの辺縁帯Ｂ細胞がほぼ消失していることが表わされている。
【図５】本発明のｍＣＤ９８Ａｂが、Ｔリンパ球活性化抑制効果を示すことを表した図である。本発明のｍＣＤ９８Ａｂの機能を評価するため、以下のＴリンパ球刺激系を用いて検討した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を分離し、塩化アンモニウム溶液を用いて溶血した。その後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ溶液で４５分間培養して、ＤＮＡ合成を止める作業を行った。その後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞とＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を３日間混合培養した。培養終了の６時間前に［３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを添加し、培養終了後に液体シンチレーションカウンターでその取り込みを検証した。
【図６】本発明のｍＣＤ９８Ａｂが、１型糖尿病モデルマウスにおいて発症を劇的に抑制したことを表わした図である。■は、抗ＣＤ９８抗体投与群を表わし、●はコントロール群を表わしている。
【図７】本発明のｍＣＤ９８Ａｂが投与された１型糖尿病モデルマウスとコントロールの１型糖尿病モデルマウスにおいて、膵臓の組織標本を比較対比した図（写真）である。ｍＣＤ９８Ａｂ投与群の膵臓では、β細胞の破壊はなく、細胞浸潤もコントロール群の膵臓と比較して顕著に抑制されていた。
【００１６】
【図８】糖尿病モデルマウスにおいて、１型糖尿病発症後に、抗マウスＣＤ９８抗体を投与することにより血糖値が顕著に改善されることを表わした図である。本発明の抗ＣＤ９８抗体の投与により、１型糖尿病の治療が可能であることが示されている。
【図９】本発明の抗ヒトＣＤ９８抗体と抗マウスＣＤ９８抗体が、フィブロネクチン介在の細胞接着を阻害する作用を示すことを表わした図である。抗体の濃度に依存して、細胞接着阻害効果が向上することが示されている。
【図１０】コラーゲン誘発性の関節炎モデルマウスにおいて、関節炎の発症前に抗マウスＣＤ９８抗体を投与することによって、関節炎の発症、進展が抑制されることを表わした図である。
【図１１】コラーゲン誘発性の関節炎を発症したマウスにおいて、抗マウスＣＤ９８抗体投与群と非投与群（ラットＩｇＧ投与群）における、関節炎の進行状況の相違を表わした図である。本発明の抗ＣＤ９８抗体は、一旦発症した関節炎に関しても、関節炎の進行をよく抑制することを示している。
【図１２】コラーゲン誘発性の関節炎を起こしたマウス（ラットＩｇＧ投与群または抗マウスＣＤ９８抗体投与群）から脾細胞を摘出採取し、コラーゲンＩＩ処理した後の［３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取り込み率の増減を表わした図である。コラーゲンＩＩ未処理の脾臓細胞の［３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取り込み率を１として、それを基準にした増加率で表記している。
【図１３】細胞の３Ｈ−ロイシンの取り込みに対して、抗マウスＣＤ９８抗体および抗ヒトＣＤ９８抗体が及ぼす影響の評価を表わした図である。ａ）の図は、細胞としてＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用して、抗マウスＣＤ９８抗体によるロイシンの取り込み阻害効果を評価した結果を表わしている。ｂ）の図は、細胞として２９３Ｔ細胞を使用して、抗ヒトＣＤ９８抗体によるロイシンの取り込み阻害効果を評価した結果を表わしている。いずれの抗ＣＤ９８抗体も、細胞に対するロイシンの取り込みを阻害することはなかった。
【図１４】本発明の抗マウスＣＤ９８抗体（３−１４２抗体）と従来の抗ＣＤ９８抗体（特許文献３のＫ３、１−４０−１、３−６９−６、Ｃ２ＩｇＧ１の４種の抗体）に関する可変領域核酸配列の系統樹を示した図である。
【図１５】本発明の抗ＣＤ９８抗体と従来の抗ＣＤ９８抗体との、可変領域アミノ酸配列（重鎖）を比較した結果を示す模式図である。重鎖のＣＤＲ１〜３については、既存抗体の可変領域(Rat (hybridoma YTH906) immunoglobulin variable region (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M87783.1))の配列を参考にして、その位置を決定した。また、併せて、従来の抗ＣＤ９８抗体である、特許文献３に記載のＣ２ＩｇＧ１重鎖の配列を参考にした。
【図１６】本発明の抗ＣＤ９８抗体と従来の抗ＣＤ９８抗体との、可変領域アミノ酸配列（軽鎖）を比較した結果を示す模式図である。軽鎖のＣＤＲ１〜３については、既存抗体の可変領域(Rattus norvegicus (hybridoma 53R-4) immunoglobulin rearranged kappa-chain mRNA variable (V) region, partial ds (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L07407.1))の配列を参考にして、その位置を決定した。また、併せて、従来の抗ＣＤ９８抗体である特許文献３に記載のＣ２ＩｇＧ１の軽鎖の配列を参考にした。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性（ここでは、後述する抗ＣＤ９８抗体としての活性）を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、抗体変異体、低分子化抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等、如何なる抗体も含まれる。
【００１８】
本発明の「抗ＣＤ９８抗体」とは、ＣＤ９８重鎖とＣＤ９８軽鎖（アミノ酸輸送活性を有する）とのジスルフィド結合体のＣＤ９８に特異的結合能を有する抗体である。本発明の抗ＣＤ９８抗体は、配列番号２および４の２配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域として有する。さらに、別の態様によれば、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、配列番号６および８の２配列を、重鎖可変領域および軽鎖可変領域として有する。
【００１９】
本発明の別の好ましい態様によれば、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、重鎖可変領域ＣＤＲ１として配列番号１３のアミノ酸配列を、重鎖可変領域ＣＤＲ２として配列番号１４のアミノ酸配列を、および重鎖可変領域ＣＤＲ３として配列番号１５のアミノ酸配列を有する。さらに別の態様によれば、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ１として配列番号１６のアミノ酸配列を、軽鎖可変領域ＣＤＲ２として配列番号１７のアミノ酸配列を、および軽鎖可変領域ＣＤＲ３として配列番号１８のアミノ酸配列を有する。
例えば、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、重鎖のＣＤＲ１として配列番号１３のアミノ酸配列を、重鎖のＣＤＲ２として配列番号１４のアミノ酸配列を、および重鎖のＣＤＲ３として配列番号１５のアミノ酸配列を有し、且つ、軽鎖のＣＤＲ１として配列番号１６のアミノ酸配列を、軽鎖のＣＤＲ２として配列番号１７のアミノ酸配列を、および軽鎖のＣＤＲ３として配列番号１８のアミノ酸配列を有する。
【００２０】
本発明のさらに別の好ましい態様によれば、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、重鎖可変領域ＣＤＲ１として配列番号１９のアミノ酸配列を、重鎖可変領域ＣＤＲ２として配列番号２０のアミノ酸配列を、および重鎖可変領域ＣＤＲ３として配列番号２１のアミノ酸配列を有する。さらに別の態様によれば、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ１として配列番号２２のアミノ酸配列を、軽鎖可変領域ＣＤＲ２として配列番号２３のアミノ酸配列を、および軽鎖可変領域ＣＤＲ３として配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
例えば、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、重鎖のＣＤＲ１として配列番号１９のアミノ酸配列を、重鎖のＣＤＲ２として配列番号２０のアミノ酸配列を、および重鎖のＣＤＲ３として配列番号２１のアミノ酸配列を有し、且つ、軽鎖のＣＤＲ１として配列番号２２のアミノ酸配列を、軽鎖のＣＤＲ２として配列番号２３のアミノ酸配列を、および軽鎖のＣＤＲ３として配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
そして、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、少なくとも、ａ）ＣＤ９８の重鎖に結合部位を有し、ｂ）ＣＤ９８のアミノ酸取り込みに影響を与えず、ｃ）Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の活性化を抑制することを特徴とする。好ましくは、上記ａ）〜ｃ）の特徴に加え、さらにｄ）フィブロネクチン介在の細胞接着を抑制する特徴を有している。
本発明の抗ＣＤ９８抗体は、Ｔリンパ球の活性化を抑制することから、結果としてＯＶＡ感作モデルにおいてＯＶＡ抗体の産生を抑制する。従って、本発明の抗ＣＤ９８抗体のより好ましい態様は、上記ａ）〜ｄ）の特徴に加え、ｅ）ＯＶＡ感作モデルにおいてＯＶＡ抗体の産生を抑制する、という特徴を具備する。本発明の抗ＣＤ９８抗体の特に好ましい態様は、以下のａ）〜ｅ）の特徴；
ａ）ＣＤ９８の重鎖に結合部位を有する、
ｂ）ＣＤ９８のアミノ酸取り込みに影響を与えない、
ｃ）Ｔリンパ球活性化抑制作用を有する、
ｄ）フィブロネクチン介在の細胞接着を抑制する、および
ｅ）ＯＶＡ感作モデルにおいてＯＶＡ抗体の産生を抑制する
を有する。
【００２２】
本発明の抗ＣＤ９８抗体として好ましいものは、マウス型（抗マウスＣＤ９８抗体）とヒト型（抗ヒトＣＤ９８抗体）の抗ＣＤ９８抗体である。
本発明の抗ＣＤ９８抗体は、特許文献２等の公知の方法に準じて作製することができる。例えば、ヒトＣＤ９８発現細胞株（天然に発現している細胞および形質転換体のいずれをも含む）をマウス等の非ヒト哺乳動物に免疫することにより、抗ヒトＣＤ９８抗体（マウスモノクローナル抗体）が作製されている（Haynes B. F et al., J. Immunol., (1981), 126, 1409-1414、 Masuko T. et al., Cancer Res., (1986), 46, 1478-1484、およびFreidman AW. et al., Cell. Immunol., (1994), 154, 253-263）。
本発明の抗マウスＣＤ９８抗体は、上記方法などの公知方法で得られた抗マウスＣＤ９８抗体産生細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−９６４）から得ることができる。同様に本発明の抗ヒトＣＤ９８抗体も、例えば抗ヒトＣＤ９８抗体産生細胞（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１００７）から得ることができる。
【００２３】
本発明の抗ＣＤ９８抗体の機能的断片とは、本発明の抗ＣＤ９８抗体が特異的に結合する抗原に対して、特異的に結合する抗体の断片を意味し、より具体的には抗体の重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ＦＶ（ｓｄＦｖ）、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  ＦＶ（ｓｃＦＶ）およびこれらの重合体等が挙げられる(D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd)。このような抗体断片は慣用法、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、あるいは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
本発明の抗体の機能的断片は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
【００２４】
本発明の抗ＣＤ９８抗体には、抗体を構成する重鎖および／または軽鎖の各々のアミノ酸配列において一若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖および／または軽鎖からなるモノクローナル抗体も包含される。本発明の抗ＣＤ９８抗体のアミノ酸配列中への、このようなアミノ酸の部分的改変（欠失、置換、挿入、付加）は、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができる。この塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法（Site specific mutagenesis）を用いて常法により導入することができる（Proc Natl Acsd Sci USA., 1984 Vol. 81 5662-5666; Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual(1989) Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００２５】
本発明の抗ＣＤ９８抗体には、いずれのイムノグロブリンクラスおよびサブクラスを有する抗体も包含されるが、本発明の好ましい態様によれば、マウスイムノグロブリンクラスおよびサブクラス、並びにヒトイムノグロブリンクラスおよびサブクラスを有する抗体であり、好ましくはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）である。
【００２６】
本発明の抗ＣＤ９８抗体は、例えば、以下に述べる方法によって製造することができる。
ＣＤ９８若しくはその一部、あるいは抗原の抗原性を高めるための適当な物質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンやウシ血清アルブミン等）との結合物、またはＣＤ９８を細胞表面に多量に発現している細胞を、必要に応じて免疫賦活剤(フロイントアジュバント等）とともに、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する、またはＣＤ９８を組み込んだ発現ベクターを非ヒト哺乳動物に投与することにより免疫感作を行う。本発明のＣＤ９８抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって取得することができる。
【００２７】
以下にさらに具体的に本発明による抗体の作製法について詳述するが、抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマを使用することもできる。
【００２８】
抗原としては、ＣＤ９８若しくはその一部、及び天然にＣＤ９８を発現している細胞に加え、ＣＤ９８をコードするＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに組み込み、該発現ベクターを動物細胞に導入し、取得した形質転換株そのものを使用できる。
【００２９】
動物細胞用発現ベクターとしては例えばｐＥＧＦ−Ｎ１（ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンス・クロンテック社製）などのベクターを用いることができ、適当な制限酵素で挿入部位を開裂し、同一酵素で開裂されたＣＤ９８をコードするＤＮＡを連結することにより、目的遺伝子導入用ベクターが調製できる。そして、調製した発現ベクターを例えばＬ９２９細胞（American Type Culture Collection No.CCL-1）といった細胞を宿主として導入することにより、ＣＤ９８を高発現した細胞を作製できる。
宿主への遺伝子の導入方法は公知であり、任意の方法（例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等）が挙げられる。
【００３０】
こうして作製した形質転換細胞はＣＤ９８抗体を作製するための免疫原とすることができる。さらに、発現ベクターそのものを免疫原とすることもできる。
【００３１】
ＣＤ９８は、公知の塩基配列またはアミノ酸配列に基づいて、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような技術的分野において知られる方法を適宜用いることにより製造することができる。そしてこのようにして得られたＣＤ９８タンパクを抗原として抗ＣＤ９８抗体を作製することも可能である。ＣＤ９８の部分配列は、後述する技術的分野において知られる方法に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造することもできるし、またＣＤ９８をタンパク分解酵素等を用いて適切に切断することにより製造することができる。
【００３２】
上述のようにして得た抗原を、以下のように免疫する。すなわち、作製した抗原を、抗原性を高めるための適当な物質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンやウシ血清アルブミン等）、および必要に応じて免疫賦活剤（フロイントの完全若しくは不完全アジュバント等）とともに混合し、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する。免疫動物は、３〜１０日間隔で複数回免疫される。例えば抗原として細胞を用いる場合には、１回の免疫に用いられる細胞の数は、任意である。通常、１０３〜１０８、たとえば１０６の細胞が免疫される。又、抗原として蛋白質やペプチドを用いる場合には、一般に１〜１００μｇが免疫される。複数回の免疫を経た免疫動物から免疫担当細胞を回収し、目的とする抗体を産生する細胞をクローニングすることにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。免疫担当細胞とは、免疫動物において抗体産生能を有する細胞を言う。
【００３３】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature., 1975 Vol.256:495-497）およびそれに準じて行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄または扁桃等、好ましくはリンパ節または脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞とを、細胞融合させることにより調製される。細胞融合は例えば、ポリエチレングリコール（例えば分子量１５００〜６０００）等の高濃度ポリマー溶液中、通常約３０〜４０℃、約１〜１０分間、抗体産生細胞とミエローマ細胞を混合することによって行うことができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェル中の培養上清の免疫抗原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法などの免疫学的方法を用いて測定することにより行なうことができる。
【００３４】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養して培養上清から単離することができる。また、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹水中等でのインビボで培養し、腹水から単離することもできる。また、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換型抗体を調製することができる（P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY、 P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W. Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS）。さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的および培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持および保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地または既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
【００３５】
産生されたモノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法、例えばプロテインＡカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
【００３６】
さらに本発明の抗ＣＤ９８抗体は、その可変領域の塩基配列情報に基づいて遺伝子工学的に製造することもできる。例えば、配列番号１および３の２配列、あるいは配列番号５および７の２配列を含む発現ベクターを宿主に導入して該宿主を培養し、培養物から該抗体を取得することができる。ここで配列番号１および３は同一の発現ベクター中に導入されていてもよいし、別個の発現ベクター中に導入されていてもよい。同様に配列番号５および７は同一の発現ベクター中に導入されていてもよいし、別個の発現ベクター中に導入されていてもよい。発現ベクターや宿主は、上記したものと同様のものが用いられる。
【００３７】
当該抗ＣＤ９８抗体を発現すべく構築された発現ベクターを用いて、本発明の抗ＣＤ９８抗体またはその機能的断片を発現する細胞を調製することができる。具体的には、目的とする抗体をコードするＤＮＡを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
【００３８】
ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などを用いることができる。
【００３９】
抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546;FASEB J. (1992) 6, 2422-2427、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ａｒａＢプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（QIAGEN社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
【００４０】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００４１】
又、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（GIBCO BRL社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）等を用いることができる。
【００４２】
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＣＡＧプロモーター（Gene. (1991) 108, 193、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、形質転換細胞を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
【００４３】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【００４４】
本発明は、本願発明で開示された抗体（上記した抗ＣＤ９８抗体）が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体及びその自己免疫疾患治療剤としての用途もまた提供する。当該エピトープは、配列データの解析や立体構造の解析といったバイオインフォマティスク的手法により予測することができる。また、同じエピトープに結合するか否かは、エピトープに対する両抗体の競合関係の有無を確認することによって判定することができる。
【００４５】
本発明に使用する抗体は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、化学的修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における抗体にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される（D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681，すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００４６】
本発明の「自己免疫疾患」とは、免疫系が内因性抗原に対する自己抗体産生を起こすことで起こる疾患であり、例えば１型糖尿病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、乾癬、クローン病、全身性エリテマトーデス、バセドウ病等を挙げることができる。いずれの自己免疫疾患も、Ｔ細胞の異常な過剰活性化がその原因となっていることがこれまでの研究から明らかになっている。特に、ＣＤ４陽性あるいはＣＤ８陽性のＴリンパ球（Ｔ細胞）が過剰に活性化し、自己抗体の産生を促したり、組織破壊を引き起こしたりすることが病状の進展に大きな影響を与えることは広く知られている事実である。従って、本発明の抗ＣＤ９８抗体がＴリンパ球（Ｔ細胞）の活性化を抑制することから、本発明の抗ＣＤ９８抗体を用いて、上記の自己免疫疾患の治療を行なうことができる。例えば、図６〜図８に示されるように、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、１型糖尿病の治療に有効であり、また、図１０〜図１２に示されるように、関節リウマチの治療に有効である。このように、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、例えば１型糖尿病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、乾癬、クローン病、全身性エリテマトーデス、バセドウ病等の自己免疫疾患の治療に使用することができる。以上のように、本発明の抗ＣＤ９８抗体の好ましい用途としては、１型糖尿病、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、乾癬、クローン病、全身性エリテマトーデス、バセドウ病の治療であり、特に好ましい用途として、１型糖尿病あるいは関節リウマチの治療を挙げることができる。
本発明の「関節リウマチ」とは、関節や骨、筋肉、じん帯、腱などが痛む自己免疫疾患のことを言い、きわめて慢性の経過をたどり治療に難渋することが多いもっとも頻度の高い自己免疫疾患である。関節リウマチは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が過剰に活性化し、様々なサイトカインを産生することに加えて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が関節組織を破壊することによって病状が進展することが知られている。そのため、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）の活性化抑制作用を持つ、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、関節リウマチの治療に好適なものである。
本発明の「１型糖尿病」とは、主に自己免疫により膵β細胞が破壊され、インスリンの産生が枯渇して、インスリン不足に陥る疾患を言う。また、糖尿病が重症化し、インスリン抵抗性が亢進し、膵臓β細胞が疲弊し、アポトーシスが起こり始めると、２型糖尿病から結果として、１型糖尿病に推移して来ることになる。１型糖尿病の発症にはＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれもが寄与し、最終的にＣＤ８陽性Ｔ細胞が膵臓β細胞を破壊することによりインスリンの欠乏が惹起される。従って、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）の活性化抑制作用を持つ、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、１型糖尿病の予防と治療に好適なものである。
【００４７】
本発明による抗ＣＤ９８抗体を含有する自己免疫疾患治療剤は、医薬組成物として提供されることが好ましい。このような医薬組成物には、治療上有効量の当該抗体が含まれ、非経口投与用の種々の形態に製剤化される。ここで、治療上有効量とは、所与の症状や投与計画について治療効果を与える量をいう。
本発明の医薬組成物は、抗体に加えて、薬学的に許容される担体が含まれてもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、結合剤等を挙げることができる。これら担体のうち１種または複数を含むことができる。
【００４８】
本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
【００４９】
また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。
【００５０】
本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸等の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
【００５１】
また、本発明の医薬組成物は、抗体に加えて、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
【００５２】
本発明においてアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩（好ましくは、塩酸塩、リン酸塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場合、好ましいｐＨ値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添加により調整される。この場合、リン酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有しない場合あるいは対応する陰イオン（リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましいアミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオルニチンである。さらに、酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸、及びその塩の形（好ましくはナトリウム塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、メチオニン、システイン、またはアラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体のＮ−アセチルトリプトファンを使用することもできる。
【００５３】
本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
【００５４】
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
【００５５】
本発明の医薬組成物を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液と混合することができる、また該水溶液は、適当な溶解補助剤（例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等）と併用してもよい。所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
【００５６】
本発明において、含硫還元剤としては、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等を挙げることができる。
【００５７】
また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
【００５８】
また、必要に応じ、マイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（“Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition“,Oslo Ed.,1980等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る（Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15:167-277；Langer, Chem. Tech. 1982, 12:98-105；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開（ＥＰ）第５８，４８１号；Sidman et al., Biopolymers 1983, 22:547-556；ＥＰ第１３３，９８８号）。
【００５９】
製剤の形態としては、凍結乾燥製剤（この場合上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用可能である。）、徐放製剤、腸溶性製剤、注射剤または点滴剤などを含む製剤を、治療目的、治療計画に応じて選択可能である。
【００６０】
投与経路は、適宜決定されてよいが、例えば経口投与、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内注射等の非経口投与が考えられる。あるいは、患者の患部に直接、本発明の抗ＣＤ９８抗体を接触させる方法も可能である。
【００６１】
投与量は、動物を用いた試験、臨床試験の実施により適宜決定されるが、一般に患者の状態若しくは重篤度、年齢、体重、性別などが考慮されるべきである。通常、経口投与では、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、これらを１回または数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
本発明は、本発明による抗体または医薬組成物を用いた上記疾患の予防または治療法をも包含し、さらに本発明は本発明の抗体の上記疾患の予防または治療剤の製造への使用をも包含する。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、水またはそれ以外の薬理学的に許容し得る溶液に溶解した無菌性溶液または懸濁液のアンプルとして使用に供される。また、無菌粉末製剤（本発明の抗体を凍結乾燥するのが好ましい）をアンプルに充填しておき、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈してもよい。
【００６２】
また、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、併用することが有用である他の薬剤との混合物とすることもできる。他の薬剤として、具体的には本発明の抗ＣＤ９８抗体以外の抗体や、自己免疫疾患治療剤、糖尿病治療剤等が挙げられる。本発明の抗ＣＤ９８抗体と併用して使用されるこれらの薬剤を併用薬剤とも称する。
本発明の抗ＣＤ９８抗体以外の抗体としては、例えば特許文献１および２で提供される抗体が挙げられる。
自己免疫疾患治療剤としては、慢性関節リウマチ治療剤等が挙げられる。
糖尿病治療剤としては、インスリン製剤、α−グルコシダーゼ阻害剤、ビグアナイド剤、インスリン分泌促進剤、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、β３アゴニスト等が挙げられる。
【００６３】
上記併用薬剤は、２種以上を適宜の割合で組み合せて用いてもよい。
【実施例】
【００６４】
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６５】
（実施例１）抗マウスＣＤ９８抗体の作製
ＢＡＬＢ／ｃマウスから骨髄細胞を分離し、その骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦ存在下で８日間培養した。その後に、その細胞（１ｘ１０７個）を８週齢のＷｉｓｔａｒラットの腹腔に免疫した。一回免疫後の２週間後に再度免疫を繰り返した。その後、２週間後に再度免疫し、その３日後にラットから脾臓を取り出した。脾臓細胞とＳＰ２細胞（ミエローマ細胞）を用いて、常法に従って細胞融合を行いＨＡＴ培地で選択をした。その後、フローサイトメーターを用いて樹状細胞に応答する抗体を選択した。選択された抗体については限界希釈法を用いて、単一クローンを採取した。０．５個／ｗｅｌｌの条件で限界希釈法を三度行っていることから、単一のクローンであると考えられる。以上の方法で、４０種類以上の抗体を単離することに成功した。
得られた抗体を、Ｔ細胞培養系（ＢＡＬＢ／ｃマウスのＴ細胞と、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞を混合した混合リンパ球反応）に添加し、Ｔ細胞の増殖を抑制する抗体を選別した。そのような抗体は１０種類選択された。そのうちの一つの抗体（ｍＣＤ９８Ａｂ）が認識する分子を同定するために、ＮＰ４０を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を可溶化し、その可溶化されたタンパク分子混合体に抗体を添加した。プロテインＧを用いて抗体・タンパク複合体を単離した後に、ＳＤＳゲルを使って分離した。分離されたタンパクを銀染色により可視化した。図１に示されるように、特異的に反応している７５ｋＤのバンドを切りだし、質量分析器（ＬＣ−ＭＡＳ）を用いて同定したところ、認識している分子はＣＤ９８重鎖であることが明らかになった。
なお、当該抗体は、ウェスタンブロットでは反応せず、高次構造を認識している抗体であることが分かった。当該抗体を産出する抗マウスＣＤ９８抗体産生細胞は、２０１０年７月８日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に国内寄託（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６４）され、２０１１年２月７日にブダペスト条約下での国際寄託に移管されて受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ-９６４が付与されている（原寄託日：２０１０年７月８日）。ＮＩＴＥ  ＢＰ−９６４により産出される抗体は、３−１４２抗体とも表示される。【００６６】
（実施例２）本発明の抗マウスＣＤ９８抗体（ｍＣＤ９８Ａｂ）の反応性
本発明のｍＣＤ９８Ａｂの反応性を見るため、マウスＣＤ９８遺伝子(ｍＣＤ９８，ＧｅｎＢａｎｋ/ＥＭＢＬ/ＤＤＢＪ accession no. Ｕ２５７０８)を導入しＣＤ９８を発現するＣＨＯ細胞（２９３Ｔ／ＣＤ９８）を作製した。即ち、ＣＨＯ細胞にｐｃＤＮＡ３．１に組み込んだマウスＣＤ９８遺伝子およびｐｃＤＮＡ３．１のみを、電気穿孔法で遺伝子導入した。ＣＨＯ細胞のゲノムにＣＤ９８遺伝子が組み込まれた細胞を選択するために、Ｇ４１８で薬剤選択し、薬剤耐性細胞を単離した。その細胞をラットイムノグロブリンＧ（コントロール抗体）あるいはｍＣＤ９８Ａｂを用いて染色し、フリーの抗体を洗浄・除去した後にＰＥ標識抗ラットＩｇＧで染色した。その結果を図２に示す。本発明のｍＣＤ９８ＡｂはＣＤ９８遺伝子を導入されなかった細胞には反応せず、ＣＤ９８遺伝子が導入された細胞に反応することが示された。左図は、ｐｃＤＮＡ３．１のみを遺伝子導入した細胞、右図はマウスＣＤ９８遺伝子を導入した細胞である。
以上の結果から、本発明のｍＣＤ９８ＡｂはＣＨＯ細胞に発現したマウスＣＤ９８を特異的に認識していることが示された。【００６７】
（実施例３）本発明の抗マウスＣＤ９８抗体（ｍＣＤ９８Ａｂ）の抗炎症作用
本発明のｍＣＤ９８Ａｂの機能を評価するため、ＯＶＡ感作モデルを作製した。即ち、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＯＶＡ（卵白アルブミン）プロテインと完全フロイトアジュバントを混合した複合体をマウスの皮下に注射し免疫感作した。当該マウスの免疫感作の初日を０として、２，４，６，８日目にコントロール抗体あるいは抗ＣＤ９８抗体を各２００μｇ、マウスの腹腔内に投与した。１０日目にマウスから血清を分離しその中にあるＯＶＡ特異的なＩｇＭとＩｇＧをＥＬＩＳＡ法で測定した。即ち、９６穴プレートに、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎを５０μｇ／ｍｌの濃度で固相化した後に、採取した血清を反応させた。Ｏｖａｌｂｕｍｉｎに反応した抗Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ抗体は、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧによって検出した。
その結果を図３に示す。図３に示されるように、本発明の抗マウスＣＤ９８抗体投与群ではＯＶＡ抗体の産生が顕著に低下していることが観察された。これまで既知の抗ＣＤ９８抗体では、血中の抗原特異抗体価を顕著に低減させるような作用は観察されていないことから、本発明の抗ＣＤ９８抗体の特性であると考えられた。【００６８】
（実施例４）本発明の抗マウスＣＤ９８抗体（ｍＣＤ９８Ａｂ）の辺縁帯Ｂ細胞への効果
本発明のｍＣＤ９８Ａｂの機能を評価するため、辺縁帯Ｂ細胞への効果を確認した。まず、コントロール抗体および抗ＣＤ９８抗体の各２００μｇをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与した。投与２日後にマウス脾臓細胞を分離し、マウス抗ＣＤ２３抗体およびマウス抗ＣＤ２１抗体で染色してフローサイトメーターで検討した。
その結果を図４に示す。ＣＤ２１ｈｉｇｈＣＤ２３ｌｏｗの分画が抗マウスＣＤ９８抗体投与群で消失していることが観察された。この分画は辺縁帯Ｂ細胞と呼ばれる細胞集団である。これまで既知の抗ＣＤ９８抗体ではこのような作用（辺縁帯Ｂ細胞の消失）は観察されていない。【００６９】
（実施例５）本発明の抗マウスＣＤ９８抗体（ｍＣＤ９８Ａｂ）のＴリンパ球活性化抑制効果
本発明のｍＣＤ９８Ａｂの機能を評価するため、以下のＴリンパ球刺激系を用いて検討した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を分離し、塩化アンモニウム溶液を用いて溶血した。その後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞は５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ溶液で４５分間培養して、ＤＮＡ合成を止める作業を行った。その後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞とＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞を３日間混合培養した。培養終了の６時間前に［３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを添加し、培養終了後に液体シンチレーションカウンターでその取り込みを検証した。［３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの添加と同時にコントロールＩｇＧまたはｍＣＤ９８Ａｂを、それぞれ２０μｇ/ｍｌ加えた。
その結果を、図５に示す。本発明のｍＣＤ９８ＡｂはＴリンパ球の刺激活性を抑制することが示された。【００７０】
（実施例６）本発明の抗マウスＣＤ９８抗体の１型糖尿病モデルマウスへの治療効果
本発明のｍＣＤ９８Ａｂの機能を評価するため、以下の１型糖尿病モデルマウスを作製し、本発明の抗マウスＣＤ９８抗体を投与して効果を確認した。
１型糖尿病モデルとは、ＮＯＤマウス（雌、１０週齢）にサイクロフォスファマイド（ＣＰＭ）を２週間間隔で腹腔内に二回投与して糖尿病を発症させる系である。空腹時血糖が２回連続２５０ｍｇ／ｄｌ以上のとき、糖尿病と診断する。なお、ＮＯＤマウスは古くから知られている１型糖尿病のモデルマウスであり、自然発症をすることも知られているが、ＣＰＭを投与することで早期に誘導が可能である。そこで、今回はこのモデルを使用した。
（１）抗マウスＣＤ９８抗体による１型糖尿病の発症予防効果：
先ず、抗マウスＣＤ９８抗体２００μｇ／匹を一回目のＣＰＭ投与と同日に投与し、３日毎に６回腹腔内投与する。コントロールとして、抗マウスＣＤ９８抗体の代わりにラットＩｇＧ抗体２００μｇ／匹を使用し、同様に３日毎に６回腹腔内投与した。その結果を図６に示す。■は、抗マウスＣＤ９８抗体投与群を表わし、●はコントロール群を表わしている。図６に示されるように、抗マウスＣＤ９８抗体の投与により、顕著に糖尿病の発症が抑制された。
更に、抗マウスＣＤ９８抗体投与群とコントロール群の各マウスの膵臓を摘出し、ホルマリン固定を行った後に、パラフィン切片を作製した。薄層切片を切り出した後にＨＥ染色を行った。その顕微鏡写真の結果を図７に示す。コントロール群の膵臓では、図７の左図に示されるようにβ細胞に壊死脱落が見られた。しかし、抗マウスＣＤ９８抗体投与群では、図７の右図に示されるようにβ細胞に大きな変化はなかった。
（２）抗マウスＣＤ９８抗体による１型糖尿病の発症後の治療効果：
ＮＯＤマウスを１５週齢から尿糖および血糖を観察し、尿糖が陽性で随時血糖が２００ｍｇ／ｄｌを超えたマウスを糖尿病を発症したと判断した。糖尿病を発症したマウスに、抗マウスＣＤ９８抗体２００μｇを発症時と６日後に腹腔内に投与した。血糖は１日おきに測定し、糖尿病の発症が抑制されるかどうかを検討した。図８に示すように、二回の抗体投与によって、血糖値は顕著に低下する傾向にあった。このことから、本発明の抗ＣＤ９８抗体は、一旦発症した１型糖尿病でも有効な治療効果を有することが明らかになった。【００７１】
(実施例７)抗ヒトＣＤ９８抗体の作製
本発明の抗ヒトＣＤ９８抗体を以下のようにして作製した。まず、ヒトＣＤ９８遺伝子(ｈＣＤ９８，ＧｅｎＢａｎｋ/ＥＭＢＬ/ＤＤＢＪ accession no. ＡＢ０１８０１０)をＣＨＯ細胞に電気穿孔法で導入した。ヒトＣＤ９８遺伝子が組み込まれているプラスミドにはネオマイシン耐性遺伝子が入っているため、ネオマイシン耐性のＣＨＯ細胞を選別した。その結果、ヒトＣＤ９８が恒常的に発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｈＣＤ９８）を樹立することができた。上記ＣＨＯ−ｈＣＤ９８をＷｉｓｔａｒラットに投与し免疫感作（２週間間隔で三回）させた。感作ラットの脾臓細胞とＳＰ２細胞を定法に従って融合させてハイブリドーマを作成した。ハイブリドーマは、フローサイトメーターを使って、ＣＨＯ−ｈＣＤ９８に反応するがＣＨＯ細胞には反応しない抗体を選別した。その結果、合計で９個のヒトＣＤ９８を認識すると思われる抗体を樹立できた。
なお、その内の一つの抗ヒトＣＤ９８抗体は、実施例８で示されるように、実施例１の抗マウスＣＤ９８抗体と同様の細胞接着阻害活性を示した。
なお、当該抗体を産出する抗ヒトＣＤ９８抗体産生細胞は、２０１０年１１月３０日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に国内寄託（ＮＩＴＥ  Ｐ−１００７）され、２０１１年２月７日にブダペスト条約下での国際寄託に移管されて受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１００７が付与されている（原寄託日：２０１０年１１月３０日）。ＮＩＴＥ  ＢＰ−１００７により産出される抗体は、ｈＣＤ９８−３１４抗体とも表示される。【００７２】
(実施例８)本発明の抗ヒトＣＤ９８抗体と抗マウスＣＤ９８抗体の細胞接着阻害効果試験
実施例７の方法に準じて、マウスＣＤ９８遺伝子あるいはヒトＣＤ９８遺伝子をＣＨＯ細胞に導入し、薬剤選択によりマウスＣＤ９８あるいはヒトＣＤ９８を恒常的に発現するＣＨＯ細胞株を樹立した。樹立された細胞を各種濃度の実施例１の抗マウスＣＤ９８抗体あるいは実施例７の抗ヒトＣＤ９８抗体と４℃で３０分反応させた後、細胞を洗浄した。フィブロネクチンを固相化した２４ｗｅｌｌプレートに上記細胞を入れ、ｓｐｒｅａｄｉｎｇする細胞数を移入後４時間でカウントした。抗体で処理しない群のｓｐｒｅａｄｉｎｇした細胞数を１００％として、抗体で処理した場合のｓｐｒｅａｄｉｎｇ阻害の割合を評価した。
その結果を図９に示す。図９に示されるように、本発明の抗マウスＣＤ９８抗体あるいは抗ヒトＣＤ９８抗体はいずれもＣＨＯ細胞のｓｐｒｅａｄｉｎｇを阻害することがわかった。つまり両抗体共に細胞の接着を阻害する同等の能力を持っていることが示された。【００７３】
(実施例９)本発明の抗マウスＣＤ９８抗体による、リウマチ関節炎モデルマウスへの治療効果
マウスの誘導型関節炎モデルを公知文献に準じて作成した（Kijima M.等, J Immunol. 2009 Mar 15;182(6):3566-72.）。まず、ＤＢＡ／１Ｊマウス（７週齢の雄、１０匹）に、牛コラーゲンＩＩと完全アジュバントを混合乳化させたエマルジョンを２回投与し、免疫感作させて、関節炎を誘発させた。その結果、関節の腫脹、発赤を主体とする関節炎が発症したモデルマウスを作成することができた。
（１）抗マウスＣＤ９８抗体による関節炎の発症予防効果：
ＤＢＡ／１Ｊマウス（７週齢の雄、１０匹）のそれぞれ２群を抗体投与群と非投与群に分け、牛コラーゲンＩＩと完全アジュバントを混合乳化させたエマルジョン投与の２日前に、投与群には抗マウスＣＤ９８抗体（２００μｇ／一匹）を投与し、非投与群にはラットＩｇＧ（１００μｇ／一匹）を投与した。最初の牛コラーゲンＩＩの投与後、２日目、４日目、６日目に、上記と同様に、投与群には抗マウスＣＤ９８抗体（２００μｇ／一匹）を投与し、非投与群にはラットＩｇＧ（１００μｇ／一匹）を投与した。更に、２６日目に２回目の牛コラーゲンＩＩを投与し、関節炎の発症を観察評価した。
その結果を図１０に示す。図１０では、その臨床スコアの平均±標準偏差で表している。横軸は二回目のコラーゲン免疫後からの日数を表している。この結果に示されるように、抗マウスＣＤ９８抗体投与群は、非投与群と対比して、コラーゲン誘導性の関節炎の発症が顕著に抑制されており、抗マウスＣＤ９８抗体は関節炎の発症予防効果を持つことが示された。
（２）抗マウスＣＤ９８抗体による関節炎の発症後の治療効果：
前項と同様に、ＤＢＡ／１Ｊマウス（７週齢の雄、１０匹）のそれぞれ２群を抗体投与群と非投与群に分け、同様に牛コラーゲンＩＩを投与後、２６日目に再度牛コラーゲンＩＩを投与し、関節炎の発症を待った。２回目の牛コラーゲンＩＩを投与後の３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目に、投与群として抗マウスＣＤ９８抗体（４００μｇ／一匹）を投与し、非投与群としてラットＩｇＧ（１００μｇ／一匹）を投与した。
その結果を図１１に示す。図１１では、横軸は関節炎発症後からの日数を表している。また、臨床スコアの平均±標準偏差で表している。この結果に示されるように、抗マウスＣＤ９８抗体投与群は、非投与群と対比して、一度発症した関節炎に対しても、良好な抑制効果が示されている。このように、抗マウスＣＤ９８抗体は関節炎の治療に有効であることが示された。【００７４】
(実施例１０)本発明の抗マウスＣＤ９８抗体による、リウマチ関節炎モデルマウスにおける脾臓細胞のＴ細胞活性化抑制効果
実施例９（２）の関節炎モデル治療実験を実施した後、２回目の牛コラーゲンＩＩを投与後２０日目に投与群、非投与群のマウスからそれぞれ脾臓を摘出した。摘出したマウス脾臓細胞に牛コラーゲンＩＩを５０μｇ／ｍｌの濃度で添加し７２時間培養した。培養終了の８時間前に［３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを１マイクロキューリー（μＣｉ）添加し、培養終了後、脾臓細胞への［３Ｈ］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの取り込みを液体シンチレーションカウンターでカウントした。
その結果を図１２に示す。図１２では、コラーゲン（ＣＩＩ）を添加しない群を１としてコラーゲンを添加した場合の増加率を表している。この結果から、本発明の抗マウスＣＤ９８抗体を投与することで、Ｔ細胞の活性化そのものが顕著に抑制されていることが分かった。【００７５】
(実施例１１)細胞のアミノ酸取り込みに対する抗マウスＣＤ９８抗体および抗ヒトＣＤ９８抗体の阻害効果
（１）抗マウスＣＤ９８抗体の阻害効果：
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて、実施例１で作製された抗マウスＣＤ９８抗体を終濃度３０μｇ／ｍｌとして、上記細胞を３７℃で３０分間処理する。処理後に洗浄し、１μＣｉの［３Ｈ］−ロイシンを加えて、１０分間３７℃で保温した。当該細胞を洗浄後、１００μｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、当該細胞を溶解した。溶解液の上清を採取し、上清の単位タンパク量当たりの放射線量を求めた。
その結果を図１３のａ）に示す。本図から明らかなように、コントロールのＩｇＧを加えた試験結果と対比して、抗マウスＣＤ９８抗体は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のアミノ酸取り込みを全く阻害しないことが示された。
（２）抗ヒトＣＤ９８抗体の阻害効果：
２９３Ｔ細胞を用いて、実施例７で作製された抗ヒトＣＤ９８抗体を使用して、上記（１）と同じ操作を行なった。
その結果を図１３のｂ）に示す。本図から明らかなように、コントロールのＩｇＧを加えた試験結果と対比して、抗ヒトＣＤ９８抗体は、２９３Ｔ細胞のアミノ酸取り込みを全く阻害しないことが示された。【００７６】
（実施例１２）抗マウスＣＤ９８抗体および抗ヒトＣＤ９８抗体をコードする遺伝子の解析
（１）抗マウスＣＤ９８抗体の解析
実施例１で得られた３−１４２抗体を産生するハイブリドーマを１０％ＦＢＳが入ったＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、約１ｘ１０７個の細胞からRNAiso Plus（Takara）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出方法は試薬の添付書類に従った。total RNAをNuclease-free water（Ambion）に溶解した後、RNase-free DNase I（Takara）を用いて、添付書類に従ってＤＮＡ分解処理を行った。total RNAからｃＤＮＡを得るため、オリゴｄＴプライマーとPrimeScript RT-PCR Kit（Takara）を用いて逆転写反応を行った。ｃＤＮＡを鋳型にしてPrimeSTAR HS DNA polymerase（Takara）を用いて抗体の可変領域を増幅した。
使用したプライマーは、γ鎖用は５’−CGG AAT TCA GGT (GC) (AC) A (AG) CTG CAG (GC) AGT−３’（配列番号９）と５’−GCG GAT CCG GAC AGG GCT CCA GAG TTC CA−３’（配列番号１０）、κ鎖用は５’−GCG AAT TCG ACA (CT) (CT) (AGC) (AT) G (AC) TGA C (ACT) C AGT CTC−３’（配列番号１１）と５’−CGC GAA GCT TTC AGT AAC ACT GT (CT) CAG GAC A−３’（配列番号１２）である（Patrik Wernhoff et. al., Int. Immunol., 13(7) pp909-919, 2001）。
ＰＣＲはγ鎖用には９８℃で２分間加熱後に９８℃で１０秒、５７℃で５秒、７２℃で２分間の３ステップを４０サイクル行った。κ鎖のＰＣＲは９８℃で２分間加熱後に９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で２分間の３ステップを４０サイクル行った。
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、γ鎖のＰＣＲでは約７００ｂｐのところに、κ鎖のＰＣＲでは約５５０ｂｐのところにシングルバンドが見られることを確認した後、これらのバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いて精製した。精製産物をBig Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用いてダイレクトシークエンスを行い、3100-Avant Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いてシークエンスの解析を行った。
３−１４２抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むＤＮＡ配列、並びに重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列は、それぞれ以下の配列番号の配列であった。【００７７】
＜３−１４２抗体の重鎖可変領域核酸配列＞
ATGGACACCAGGCTCAGCTTGGTTTTCCTTGTCCTTTTCATAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTTATGAGGGTAGTAGTATTTACTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGAGTCACTATCTCCAGAGATAATGCAAAAAGCACCCTATACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGCAAGACGGGGATACTATGGATATAAGCCCTTCGATTACTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACAGTCTCCTCAGCCCAAACAACAGCCCCATCTGTCTATCCACTGGCTCCTGGATGTGGTGATACAACCAGCTCCACGGTGACTCTGGGATGCCTGGTCAAGG（配列番号１）【００７８】
＜３−１４２抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列＞
MDTRLSLVFLVLFIKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPKKGLEWVASISYEGSSIYYGDSVKGRVTISRDNAKSTLYLQMNSLRSEDTATYYCARRGYYGYKPFDYWGQGVMVTVSSAQTTAPSVYPLAPGCGDTTSSTVTLGCLVK（配列番号２）【００７９】
＜３−１４２抗体の軽鎖可変領域核酸配列＞
GTCACCATCGAATGTCGAGCAAGTGAAGACATTTACAATGGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATAATATAGATAACTTGCATACTGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACACAGTATTCTCTCAAGATAAACAGCCTACAATCGGAGGATGTCGCAAGTTATTTCTGTCAGCAGTATTACACTTATGCGTACACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCATGGAACAGTTAACATCTGGAGGTGCCACAGTCGTGTGCTTCGTGAACAACTTCTATCCCAGAGACATCAGTGTCAAGTGGAAA（配列番号３）【００８０】
＜３−１４２抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列＞
VTIECRASEDIYNGLAWYQQKPGKSPQLLIYNIDNLHTGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVASYFCQQYYTYAYTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSMEQLTSGGATVVCFVNNFYPRDISVKWK（配列番号４）【００８１】
（２）抗ヒトＣＤ９８抗体の解析
上記（１）抗マウスＣＤ９８抗体の解析と同様にして、実施例７で得られたｈＣＤ９８−３１４抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むＤＮＡ配列、並びに重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むアミノ酸配列を調べた。それぞれ以下の配列番号の配列であった。【００８２】
＜ｈＣＤ９８−３１４抗体の重鎖可変領域核酸配列＞
CACAGACTACTCACCATGGACATCAGGCTCAGCTTGGCTTTCCTTGTCCTTTTCATAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGACGGTCCATGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAACGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTGCTGGTGGTGTTAACAATTACTATCGAGACTCCATGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAGATAATGCAAAAAGCACCCTATACCTGCAAATGGACGGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGCACGACTTGTGAATAATTTAGGTACAAACGTGTTTCCTGACTGGGGCCAAGGCACTCTGGTCACTGTCTCTTTAGCCCAAACAACAGCCCCATCTGTCTATCCACTGGCTCCTGGATGTGGTGATACAACCAGCTCCACGGTGACTCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAG（配列番号５）【００８３】
＜ｈＣＤ９８−３１４抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列＞
HRLLTMDIRLSLAFLVLFIKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSMKLSCAASGFTFSNYYMAWVRQAPTKGLEWVASISAGGVNNYYRDSMKGRFTISRDNAKSTLYLQMDGLRSEDTATYYCARLVNNLGTNVFPDWGQGTLVTVSLAQTTAPSVYPLAPGCGDTTSSTVTLGCLVKGYFPE（配列番号６）【００８４】
＜ｈＣＤ９８−３１４抗体の軽鎖可変領域核酸配列＞
GCTGTGTCAGCGGGAGAGGCGGTCACTATAAACTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTTTTATCCAGTGGAAACCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCTACTAGGCAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGACTTCACTCTGACCATCAGCGGTGTGCAGGCAGAAGATCTGGCAGTT TATTACTGTCAGCAGTATAAGGAAATTCCGCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAACTGGAGATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCATGGAACAGTTAACATCTGGAGGTGCCACAGTCGTGTGCTTCGTGAACAACTTCTATCCCAGAGACATCAGT GTCAAGTGGAAGATTGATGGCAG（配列番号７）【００８５】
＜ｈＣＤ９８−３１４抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列＞
AVSAGEAVTINCKSSQSLLSSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRQSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISGVQAEDLAVYYCQQYKEIPLTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSMEQLTSGGATVVCFVNNFYPRDISVKWKIDG（配列番号８）【００８６】
（３）抗ＣＤ９８抗体の系統樹の作成
本発明の抗ＣＤ９８抗体と、従来の抗ＣＤ９８抗体との可変領域のＤＮＡ配列を比較し、系統樹を作成した。従来の抗ＣＤ９８抗体の可変領域のＤＮＡ配列は、特許文献３で報告されているＫ３、３−６９−６、Ｃ２ＩｇＧ１、および１−４０−１のものを用いた。
ＣＬＵＳＴＡＬＷ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．８３(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)を起動して、上記（１）で得られた３−１４２抗体の重鎖および軽鎖可変領域核酸配列、Ｋ３、１−４０−１、３−６９−６、Ｃ２ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖可変領域核酸配列をそれぞれ入力し、解析結果を得た。次にＭＥＧＡ４．０．２(http://www.megasoftware.net/mega4/mega.html)を起動して、ＣＬＵＳＴＡＬＷで得たデータを開け、系統樹を作成した。結果を図１４に示す。【００８７】
（４）抗ＣＤ９８抗体の相補性領域の決定
上記（１）〜（３）で得られた配列情報に基づいて、本発明の抗ＣＤ９８抗体の相補性領域（ＣＤＲ）１〜３を決定した。具体的には、従来の抗ＣＤ９８抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列または軽鎖可変領域アミノ酸配列と比較することによって決定した。重鎖のＣＤＲ１〜３については、既存抗体の可変領域(Rat (hybridoma YTH906) immunoglobulin variable region (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M87783.1))の配列（配列番号２５）を参考にして、その位置を決定した。また、併せて、従来の抗ＣＤ９８抗体である、特許文献３に記載のＣ２ＩｇＧ１重鎖（特許文献３の配列番号４３；本願明細書では配列番号２６）を用い、ABG:Directory of 3D structures of antibodies(http://www.ibt.unam.mx/vir/structure/structures.html)とblast for Ig sequence(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast)等を利用して決定した（図１５）。
軽鎖のＣＤＲ１〜３については、既存抗体の可変領域(Rattus norvegicus (hybridoma 53R-4) immunoglobulin rearranged kappa-chain mRNA variable (V) region, partial ds (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L07407.1))（配列番号２７）を参考にして、その位置を決定した。また、併せて、従来の抗ＣＤ９８抗体である特許文献３に記載のＣ２ＩｇＧ１の軽鎖（特許文献３の配列番号８３；本願明細書では配列番号２８）を用い、重鎖と同様にして決定した（図１６）。
３−１４２抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３、並びにｈＣＤ９８−３１４抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含むアミノ酸配列は、それぞれ以下の配列番号の配列であった。【００８８】
＜３−１４２抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ１＞
DYYMA（配列番号１３）【００８９】
＜３−１４２抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ２＞
SISYEGSSIYYGDSVKG（配列番号１４）【００９０】
＜３−１４２抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ３＞
RGYYGYKPFDY（配列番号１５）【００９１】
＜３−１４２抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲ１＞
RASEDIYNGLA（配列番号１６）【００９２】
＜３−１４２抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲ２＞
NIDNLHT（配列番号１７）【００９３】
＜３−１４２抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲ３＞
QQYYTYAYT（配列番号１８）【００９４】
＜ｈＣＤ９８−３１４抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ１＞
NYYMA（配列番号１９）【００９５】
＜ｈＣＤ９８−３１４抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ２＞
SISAGGVNNYYRDSMKG（配列番号２０）【００９６】
＜ｈＣＤ９８−３１４抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ３＞
LVNNLGTNVFPD（配列番号２１）【００９７】
＜ｈＣＤ９８−３１４抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲ１＞
KSSQSLLSSGNQKNYLA（配列番号２２）【００９８】
＜ｈＣＤ９８−３１４抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲ２＞
WASTRQS（配列番号２３）【００９９】
＜ｈＣＤ９８−３１４抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲ３＞
QQYKEIPLT（配列番号２４）【０１００】
［配列表フリーテキスト］
配列番号９：プライマー（γ鎖）
配列番号１０：プライマー（γ鎖）
配列番号１１：プライマー（κ鎖）
配列番号１２：プライマー（κ鎖）
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の抗ＣＤ９８抗体とそれを用いた自己免疫疾患治療剤によって、例えば糖尿病（特に１型糖尿病）治療の場合、膵臓β細胞の壊死・枯渇を抑制することができ、糖尿病の新たな抗体療法が可能となった。更に、例えばリウマチ関節炎等の治療の場合にも、関節炎の発症と進展が抑制でき、リウマチの新たな抗体療法が可能となった。このように、従来適切な治療方法のなかった自己免疫疾患に対して、本発明の抗ＣＤ９８抗体を含有する自己免疫疾患治療剤は、エネルギー代謝に影響を与えない、副作用の少ない治療薬として非常に有用性の高いものとなっている。【０１０２】
本出願は日本で出願された特願２０１０−７２９６６、特願２０１０−２００５９９、および特願２０１０−２７３４５５を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含される。また、本明細書で引用した特許文献および非特許文献は、引用したことによってその内容の全てが開示されたと同程度に本明細書中に組み込まれるものである。
【図２】
2011118804.tif 000002
【図３】
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【図４】
2011118804.tif 000004
【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2011118804.tif 000008
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2011118804.tif 000011
【図１４】
2011118804.tif 000012
【図１５】
2011118804.tif 000013
【図１６】
2011118804.tif 000014
【図１】
2011118804.tif 000015
【図６】
2011118804.tif 000016
【図７】
2011118804.tif 000017
【配列表】
2011118804000001.app
【国際調査報告】
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2011118804.tif 000019
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