(57)【要約】  新たな特性を有する改変ＰＣ１２細胞を提供し、合わせて、当該改変ＰＣ１２細胞が有する特性を備えた新規細胞を作出することができる技術を提供することを課題とする。  以下の性質（ａ）及び（ｂ）を有する改変ＰＣ１２細胞が提供される。（ａ）神経成長因子を作用させても神経分化が誘導されない、（ｂ）神経成長因子を作用させてもＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない、変異ホスホイノシチド−３キナーゼを発現する。Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼを発現する変異細胞を作出する細胞の作出方法、当該細胞の作出方法によって得られる細胞、当該変異ホスホイノシチド−３キナーゼをコードする遺伝子、及び当該遺伝子がコードする変異ホスホイノシチド−３キナーゼも提供される。
2011111595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における６６０番目に相当する位置のアミノ酸がリジンであるホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβを発現する親細胞に対して、前記リジンを欠失又は他のアミノ酸に置換させる遺伝子の変異を導入することにより、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼを発現する変異細胞を作出することを特徴とする細胞の作出方法。
【請求項２】
他のアミノ酸が、アルギニンであることを特徴とする請求項１に記載の細胞の作出方法。
【請求項３】
前記親細胞が、幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、又は上皮細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞の作出方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞の作出方法によって得られる細胞。
【請求項５】
以下の性質（ａ）及び（ｂ）を有することを特徴とする改変ＰＣ１２細胞。
（ａ）神経成長因子を作用させても神経分化が誘導されない、
（ｂ）神経成長因子を作用させてもＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない、変異ホスホイノシチド−３キナーゼを発現する。
【請求項６】
ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβをコードする遺伝子に変異が導入されていることを特徴とする請求項５に記載の改変ＰＣ１２細胞。
【請求項７】
前記変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列における６６０番目に相当する位置のリジンを欠失又は他のアミノ酸に置換するものであることを特徴とする請求項６に記載の改変ＰＣ１２細胞。
【請求項８】
他のアミノ酸が、アルギニンであることを特徴とする請求項７に記載の改変ＰＣ１２細胞。
【請求項９】
Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼをコードする、単離された遺伝子。
【請求項１０】
前記変異ホスホイノシチド−３キナーゼが、下記（i）〜（iii）のいずれかであることを特徴とする請求項９に記載の遺伝子。
（i）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ii）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼの活性を有する蛋白質、
（iii）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼの活性を有する蛋白質。
【請求項１１】
下記（iv）又は（v）の核酸であることを特徴とする請求項９に記載の遺伝子。
（iv）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸、
（v）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼの活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに記載の遺伝子によってコードされる、単離された変異ホスホイノシチド−３キナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の作出方法、細胞、改変ＰＣ１２細胞、遺伝子、並びに、変異ホスホイノシチド−３キナーゼに関し、さらに詳細には、親細胞のホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）遺伝子に変異を導入して新規細胞を作出する細胞の作出方法、当該作出方法によって得られる細胞、神経成長因子（ＮＧＦ）を作用させてもＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼを発現する改変ＰＣ１２細胞、当該変異ホスホイノシチド−３キナーゼをコードする遺伝子、並びに、当該遺伝子がコードする変異ホスホイノシチド−３キナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞分化のモデル細胞として、ラット副腎髄質褐色細胞腫から単離されたＰＣ１２細胞（非特許文献１）が広く用いられている。ＰＣ１２細胞に神経成長因子（ＮＧＦ）を作用させると、長い神経繊維を伸張させ、交感神経節ニューロン様に分化する。このことから、ＰＣ１２細胞はＮＧＦによる末梢神経系のニューロン分化モデルとして多用されている。その他、ＮＧＦによるｐ１４０trkAチロシンキナーゼ経由の細胞内シグナル伝達経路の解析にも多用されている（非特許文献２）。【０００３】
オリジナルのＰＣ１２細胞（非特許文献１）に変異処理を施すことにより、新たな特性を備えた変異ＰＣ１２細胞を得ることも行われている。例えば、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ）経路に作用するＮＧＦには反応しないが、ｐ３８経路に働く薬剤や物理刺激によって細胞死ではなく神経分化を起こす、ＭＡＰキナーゼ経路に変異をきたした変異ＰＣ１２細胞（「ＰＣ１２ｍ３細胞」と称する）が取得されている（非特許文献３）。ＰＣ１２ｍ３細胞は薬剤や様々な物理刺激に鋭敏に反応するので、例えば、新規医薬のスクリーニングや、リハビリテーション医学における治療効果の検証を行うのに有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】グリーン（Greene）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA），１９７６年，第７３巻，第７号，ｐ．２４２４−２４２８
【非特許文献２】「生化学辞典」第４版，東京化学同人社，２００７年１２月，ｐ．１０５７
【非特許文献３】加納（Kano）ら、ブレイン・リサーチ（Brain Research），２００４年，１０２６号，ｐ．３０２−３０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記した新規医薬のスクリーニング等をより効果的に、或いは別の角度から行うために、新たな特性を有する変異ＰＣ１２細胞を取得することが望まれている。また、新たに取得した変異ＰＣ１２細胞の機能解析を進めることで、遺伝子治療や再生医療といった先端医療分野や、植物・家畜等の農学分野に有用な新たな技術を開発できる可能性が広がる。【０００６】
上記現状に鑑み、本発明の目的は、新たな特性を有する改変ＰＣ１２細胞を提供し、合わせて、当該改変ＰＣ１２細胞が有する特性を備えた新規細胞を作出することができる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における６６０番目に相当する位置のアミノ酸がリジンであるホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβを発現する親細胞に対して、前記リジンを欠失又は他のアミノ酸に置換させる遺伝子の変異を導入することにより、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼを発現する変異細胞を作出することを特徴とする細胞の作出方法である。【０００８】
本様相は細胞の作出方法に係るものであり、ホスホイノシチド−３キナーゼ（以下、「ＰＩ３Ｋ」と略記することがある）のｐ８５調節サブユニットβ（以下、「ｐ８５β」と略記することがある）遺伝子に対して特定の変異を導入することにより、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）（以下、「Ａｋｔ」と略記することがある）を活性化しない変異ＰＩ３Ｋを発現する変異細胞を作出することを特徴とするものである。本様相の細胞の作出方法によれば、変異ｐ８５βを発現する種々の細胞を作出することができる。例えば、ストレス耐性が付与された新規細胞を作出することができる。【０００９】
ここで「配列番号２で表されるアミノ酸配列における６６０番目に『相当する』位置のアミノ酸」は、実際のＮ末端からちょうど６６０番目の位置にあるとは限らない。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部にアミノ酸の欠失又は挿入があるｐ８５βの場合には、当該アミノ酸の位置は、Ｎ末端から６６１番目以上又は６５９番目以下の位置になり得る。また本発明においては、親細胞のｐ８５βが、配列番号２と完全一致するアミノ酸配列を有するものである必要もない。
なお配列番号２は、後述するオリジナルのＰＣ１２細胞におけるｐ８５βのアミノ酸配列であり、既に知られているものである。【００１０】
好ましくは、他のアミノ酸がアルギニンである。【００１１】
好ましくは、前記親細胞が、幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、又は上皮細胞である。かかる構成により、細胞医療や再生医療等に有用な新規細胞を作出することが可能となる。【００１２】
本発明の他の様相は、上記の細胞の作出方法によって得られる細胞である。【００１３】
本様相は細胞に係るものであり、上記の細胞の作出方法によって得られるものである。本様相の細胞は、例えば、細胞医療や再生医療等に有用である。【００１４】
本発明の他の様相は、以下の性質（ａ）及び（ｂ）を有することを特徴とする改変ＰＣ１２細胞である。
（ａ）神経成長因子を作用させても神経分化が誘導されない、
（ｂ）神経成長因子を作用させてもＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない、変異ホスホイノシチド−３キナーゼを発現する。【００１５】
本様相は改変されたＰＣ１２細胞（改変ＰＣ１２細胞）に係るものであり、上記（ａ）及び（ｂ）に示す特異な性質を有している。本様相の改変ＰＣ１２細胞によれば、新しい作用機序からなる新規医薬のスクリーニング等を行うことができる。さらに、本様相の改変ＰＣ１２細胞の機能解析を詳細に行うことにより、先端医療等に応用可能な新たな技術開発を可能にする知見を得ることができる。【００１６】
ここで、（ａ）における「神経分化が誘導されない」とは、神経分化の誘導が全く観察されない場合の他、オリジナルのＰＣ１２細胞と比較して神経分化の誘導が極めて弱く、神経分化は実質的に誘導されていないと判断される場合も含む。（ｂ）における「Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない」についても同様であり、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）の活性化が全く観察されない場合の他、オリジナルのＰＣ１２細胞と比較してＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）の活性化が極めて弱く、活性化は実質的に起こっていないと判断される場合も含む。【００１７】
好ましくは、ホスホイノシチド−３キナーゼのｐ８５調節サブユニットβをコードする遺伝子に変異が導入されている。【００１８】
好ましくは、前記変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列における６６０番目に相当する位置のリジンを欠失又は他のアミノ酸に置換するものである。【００１９】
ここで「配列番号２で表されるアミノ酸配列における６６０番目に『相当する』位置のリジン」は、実際のＮ末端からちょうど６６０番目の位置にあるとは限らない。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部にアミノ酸の欠失又は挿入があるｐ８５βの場合には、当該リジンの位置は、Ｎ末端から６６１番目以上又は６５９番目以下の位置になり得る。また本発明においては、変異前のｐ８５βが、配列番号２と完全一致するアミノ酸配列を有するものである必要もない。【００２０】
好ましくは、他のアミノ酸がアルギニンである。【００２１】
本発明の他の様相は、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼをコードする、単離された遺伝子である。【００２２】
好ましくは、前記変異ホスホイノシチド−３キナーゼが、以下（i）〜（iii）のいずれかである。
（i）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ii）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼの活性を有する蛋白質、
（iii）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼの活性を有する蛋白質。【００２３】
好ましくは、以下の（iv）又は（v）の核酸である。
（iv）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸、
（v）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼの活性を有する蛋白質をコードする核酸。【００２４】
本発明の他の様相は、上記の遺伝子によってコードされる、単離された変異ホスホイノシチド−３キナーゼである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の細胞の作出方法によれば、細胞医療や再生医療等に有用な新規細胞を作出することができる。【００２６】
本発明の細胞についても同様であり、細胞医療や再生医療等に有用な新規細胞を提供することができる。【００２７】
本発明の改変ＰＣ１２細胞によれば、新しい作用機序からなる新規医薬のスクリーニング等を行うことができる。さらに、本発明の改変ＰＣ１２細胞の機能解析を詳細に行うことにより、先端医療等に応用可能な新たな技術開発を可能にする知見を得ることができる。【００２８】
本発明の遺伝子によれば、細胞医療や再生医療等に有用な新規細胞を作出することができる。【００２９】
本発明の変異ホスホイノシチド−３キナーゼは、新規医薬のスクリーニングや、改変ＰＣ１２細胞の機能解析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】（ａ）〜（ｄ）はいずれもＡｋｔ活性化の有無を示すウエスタンブロット解析の結果を表す写真である。
【図２】Ａｋｔ活性化の有無を示す別のウエスタンブロット解析の結果を表す写真である。
【図３】Ｆｏｘｏ蛋白質活性化の有無を示すウエスタンブロット解析の結果を表す写真である。
【図４】ｐ８５αとドッキング蛋白質との結合の有無を示すウエスタンブロット解析の結果を表す写真である。
【図５】（ａ），（ｂ）はいずれも熱抵抗性の評価結果を示すグラフである。
【図６】免疫沈降法におけるｐ８５αとＩＲＳ−１との結合性のパルスアンドチェイス実験の結果を表す写真である。
【図７】免疫沈降法におけるｐ８５βとＴｒｋＡレセプター蛋白質との結合性のパルスアンドチェイス実験の結果を表す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の実施するための形態について具体例を挙げながら説明する。なお、以下の記述において、オリジナルのＰＣ１２細胞（非特許文献１）を、「正常型ＰＣ１２細胞」又は単に「ＰＣ１２細胞」を呼ぶことがある。さらに、本発明の改変ＰＣ１２細胞を、単に「改変ＰＣ１２細胞」又は「変異ＰＣ１２細胞」と呼ぶことがある。
【００３２】
本発明の改変ＰＣ１２細胞は、下記（ａ）及び（ｂ）の性質：
（ａ）神経成長因子を作用させても神経分化が誘導されない、
（ｂ）神経成長因子を作用させてもＡｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない、変異ホスホイノシチド−３キナーゼを発現する、
を有するものである。
【００３３】
ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、イノシトールリン脂質のイノシトール環３位のヒドロキシル基をリン酸化する酵素である。細胞膜の構成成分の１つであるイノシトールリン脂質は、ＰＩ３Ｋ等のキナーゼの作用によってリン酸化され、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化する（ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路）。すなわち、ＰＩ３ＫはＡｋｔを活性化する作用を有する。
ＰＩ３Ｋはｐ１１０触媒サブユニット（α、β、δ）とｐ８５調節サブユニット（α、β）から構成されている。ｐ８５調節サブユニットのうち、αサブユニットについてはこれまでに詳細な研究がなされているが、βサブユニット（以下、「ｐ８５β」と略記することがある）については不明な点が多い。
ＰＣ１２細胞にＮＧＦを作用させると、その受容体であるＴｒｋに作用し、結果的にＰＩ３Ｋが活性化され、Ａｋｔが活性化される。
そして、本発明の改変ＰＣ１２細胞は、ＮＧＦを作用させてもＡｋｔを活性化しない、変異ＰＩ３Ｋを発現するものである。さらに本発明の改変ＰＣ１２細胞は、ＮＧＦを作用させても神経分化が誘導されない特性を有する。
【００３４】
本発明の改変ＰＣ１２細胞を製造する方法としては、例えば、オリジナルのＰＣ１２細胞に対して、ＰＩ３Ｋのｐ８５β遺伝子に変異を導入する方法が挙げられる。なお、オリジナルのＰＣ１２細胞は広く市販されており、例えば、American type culture collection （ＡＴＣＣ）から入手できる。
配列番号１にオリジナルのＰＣ１２細胞におけるｐ８５β遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列及びそれに対応するアミノ酸配列を、配列番号２にアミノ酸配列のみを、それぞれ示す。本発明の改変ＰＣ１２細胞を作製するには、例えば、配列番号２の６６０番目のリジンをアルギニンに置換するような変異を、オリジナルのＰＣ１２細胞に導入することが挙げられる。より具体的には、配列番号１の塩基番号１９７８〜１９８０（６６０番目のリジンに対応する３塩基）の「ａａｇ」を、アルギニンに対応するコドンである「ｃｇｔ」、「ｃｇｃ」、「ｃｇａ」、「ｃｇｇ」、「ａｇａ」、又は「ａｇｇ」に置換する突然変異（塩基置換）を導入すればよい。なお、本発明において、前記変異は「ＮＧＦを作用させてもＡｋｔを活性化しない変異ＰＩ３Ｋ」を発現可能にする変異であればリジンからアルギニンへの置換に限定されるものではなく、例えば、置換後のアミノ酸はアルギニン以外でもよいし、さらに、他アミノ酸への置換ではなくリジンの欠失であってもよい。
【００３５】
ｐ８５β遺伝子に塩基置換を導入する方法としては、公知の方法をそのまま採用することができ、例えば、相同組換え、部位特異的変異導入、発現ベクター組換え変異ｐ８５β遺伝子の導入等の手法を用いて行うことができる。
【００３６】
本発明の改変ＰＣ１２細胞の培養方法としては、オリジナルのＰＣ１２細胞の培養方法をそのまま適用することができる。例えば、馬血清と牛胎児血清を含有するＤＭＥ培地を用い、５％ＣＯ2、３７℃の条件で培養することができる。必要に応じて、抗生物質等の他の物質を培地に添加してもよい。
【００３７】
本発明の改変ＰＣ１２細胞は、「ＮＧＦを作用させてもＡｋｔを活性化しない変異ＰＩ３Ｋ」を発現するものであるが、ＮＧＦ以外の成長因子等によるＡｋｔ活性化の有無は問わない。例えば後述の実施例で示すような、ＮＧＦと同じく上皮成長因子（ＥＧＦ）や線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を作用させてもＡｋｔは活性化されず、一方、インシュリンやインシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）を作用させるとＡｋｔが活性化される変異ＰＣ１２細胞は、本発明の改変ＰＣ１２細胞に含まれる。
【００３８】
本発明の細胞の作出方法は、配列番号２で表されるアミノ酸配列（正常型ＰＣ１２細胞におけるｐ８５βのアミノ酸配列）における６６０番目に相当する位置のアミノ酸がリジンであるｐ８５βを発現する親細胞に対して、前記リジンを欠失又は他のアミノ酸に置換させる遺伝子の変異を導入することにより、Ａｋｔを活性化しない変異ＰＩ３Ｋを発現する変異細胞を新たに作出するものである。変異導入の対象となる親細胞の種類としては特に限定されず、各種の細胞を採用することができる。例えば、幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、上皮細胞等を親細胞として採用することができる。幹細胞の例としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞等が挙げられる。もちろん正常型ＰＣ１２細胞やＰＣ１２ｍ３細胞（非特許文献３）も対象とすることができ、この場合には、上記した改変ＰＣ１２細胞を作出することができる。
【００３９】
遺伝子変異を導入する方法としては、上記と同じく公知の方法をそのまま採用することができ、例えば、相同組換え、部位特異的変異導入、発現ベクター組換え変異ｐ８５β遺伝子の導入等の手法を用いて行うことができる。
【００４０】
本発明の改変ＰＣ１２細胞、細胞の作出方法、及び細胞は、種々の用途に応用することができる。例えば、本発明の改変ＰＣ１２細胞を用いることで、化合物の新たなスクリーニング系を構築できる可能性がある。また、ＮＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ等の増殖因子存在下でＡｋｔ活性を抑制する化合物は制がん剤になりうるので、変異ＰＣ１２細胞と同じような形質を示す物質を選抜することにより、新たな制がん剤やがんの予防薬を開発できる可能性がある。
本発明の細胞の作出方法をｉＰＳ細胞に適用すると、ストレス耐性の高い高寿命の臓器を作製できる可能性がある。当該臓器は移植分野において有用である。また本発明の細胞の作出方法によって、がん化抑制型臓器に分化するより完全なｉＰＳ細胞を作製できる可能性がある。さらに、本発明の細胞の作出方法を植物細胞に適用することにより、熱や塩分に強い植物を作出でき、砂漠の緑化や環境対策に使用できる可能性がある。
【００４１】
また本発明は、「Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼ」をコードする単離された遺伝子（核酸分子）を提供することができる。当該遺伝子の例としては、「（i）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質」をコードする遺伝子が挙げられる。配列番号４は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、６６０番目のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列に相当する。
さらに、当該遺伝子の例として、以下の（ii）又は（iii）の蛋白質をコードする遺伝子が挙げられる。
（ii）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ「Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼ」の活性を有する蛋白質、
（iii）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ「Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼ」の活性を有する蛋白質。
【００４２】
上記（ii）において、欠失等されたアミノ酸の数は、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個である。また上記（iii）において、アミノ酸配列の相同性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
【００４３】
さらに、下記（iv）又は（v）の核酸である遺伝子も、前記遺伝子の例として挙げられる。
（iv）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸、
（v）配列番号３で表される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ『Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない変異ホスホイノシチド−３キナーゼ』の活性を有する蛋白質をコードする核酸。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、０．１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム、からなる）、１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、６５℃、２４時間の条件をいう。なお配列番号３は、配列番号１において、２８５番目の塩基「ｇ」が「ａ」に、１９７９番目の塩基「ａ」が「ｇ」に、それぞれ置換された塩基配列に相当する。
【００４４】
本発明は、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）を活性化しない、単離された変異ホスホイノシチド−３キナーゼを提供することができる。本発明の変異ホスホイノシチド−３キナーゼは、例えば、前記した本発明の遺伝子を発現させることにより、得ることができる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４６】
１．変異ＰＣ１２細胞の選抜
正常型ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣより入手）を、１０％ウマ血清、５％牛胎児血清、及び８０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する高グルコース型ＤＭＥ培地を用いて継代し、維持した。培養は、炭酸ガス培養器にて５％ＣＯ2、３７℃の条件で行った。３日毎に培地交換を行った。その後、非特許文献３に記載の手順に従ってＰＣ１２ｍ３細胞を選抜した。【００４７】
２５ｃｍ2のフラスコで正常型ＰＣ１２細胞又はＰＣ１２ｍ３細胞をコンフルエント状態まで培養した。このまま１０〜１４日間、非培地交換低栄養状態で培養を続けた。大半の細胞が死滅する中、生き残った細胞について、新しい培地と交換して１〜２週間培養し、コロニーを単離した。各コロニーに対して「ＮＧＦによるＡｋｔ活性」と「熱によるサバイバル」を指標としたリングアイソレーション法を行い、目的の変異ＰＣ１２細胞をクローニングした。【００４８】
２．変異ＰＣ１２細胞の解析
（１）遺伝子の変異部位の特定
正常型ＰＣ１２細胞、ＰＣ１２ｍ３細胞（非特許文献３）、及び変異ＰＣ１２細胞について、ｐ８５βの塩基配列を決定し、比較した。配列番号３に変異ＰＣ１２細胞のｐ８５β遺伝子の塩基配列及びそれに対応するアミノ酸配列を、配列番号４にアミノ酸配列のみを、それぞれ示す。すなわち、配列番号１（正常型ＰＣ１２細胞のｐ８５β遺伝子の塩基配列）と配列番号３との比較から分かるように、変異ＰＣ１２細胞では、２８５番目の塩基について「ｇ」→「ａ」（以下、「変異Ａ」と称する）、１９７９番目の塩基について「ａ」→「ｇ」（以下、「変異Ｂ」と称する）の計２箇所の点変異が導入されていた。このうち、変異Ａはコドン「ｃｃｇ」→「ｃｃａ」の置換であり、アミノ酸（９５番目のＰｒｏ）を置換するものではなかった。一方、変異Ｂはコドン「ａａｇ」→「ａｇｇ」の置換であり、６６０番目のアミノ酸をリジンからアルギニンに置換するものであった。
また、ＰＣ１２ｍ３細胞のｐ８５β遺伝子の塩基配列は、配列番号１に対して変異Ａのみが起こったものであり、アミノ酸配列は正常型ＰＣ１２細胞のものと同じであった。換言すれば、変異ＢはＰＣ１２ｍ３細胞のｐ８５β遺伝子には起こっておらず、変異ＰＣ１２細胞にのみ起こっていた。
以上より、変異Ｂは変異ＰＣ１２細胞特異的な突然変異であることが示された。【００４９】
なお、ｐ８５α（ｐ８５調節サブユニットα）遺伝子の塩基配列を比較したところ、ＰＣ１２ｍ３細胞と変異ＰＣ１２細胞に、ラット正常細胞と異なる複数の変異が導入されていた。しかし、当該変異部位は全てＰＣ１２ｍ３細胞と変異ＰＣ１２細胞とで共通しており、両者に違いはなかった。【００５０】
（２）ＮＧＦによる神経分化の誘導の有無
正常型ＰＣ１２細胞（陽性対照）、ＰＣ１２ｍ３細胞、変異ＰＣ１２細胞について、細胞１００万個を２５ｃｍ2のフラスコに蒔き、精製されたＮＧＦ１μＬを作用させて１週間培養した。その結果、正常型ＰＣ１２細胞では神経分化は誘導されたが、ＰＣ１２ｍ３細胞と変異ＰＣ１２細胞ではいずれも神経分化が誘導されなかった。【００５１】
（３）ＰＩ３ＫによるＡｋｔの活性化の有無
正常型ＰＣ１２細胞、ＰＣ１２ｍ３細胞、及び変異ＰＣ１２細胞について、ＰＩ３ＫによるＡｋｔ活性化の有無を以下の手順で調べた。
まず、培養した各細胞１００万個を２５ｃｍ2のフラスコに蒔き、５日間培養した。その後、無血清下で、ＮＧＦ、ＦＧＦ、インシュリン、若しくはＩＧＦ−１による処理（３０分）、又は熱処理（４４℃、３０分）を行い、リン酸化したＡｋｔ（ホスホＡｋｔ)の検出を行った。検出はウエスタンブロット法によった。すなわち、細胞から全蛋白質を抽出し、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分画した後、ポリビニルメンブレンにブロットした。抗ホスホＡｋｔ抗体（ＮＥＢ社）と標識２次抗体を用いて、メンブレン上のホスホＡｋｔを検出した。図１（ａ）〜（ｄ）に結果を示す。図中、「＋」は「処理あり」、「−」は「処理なし」を示す（後述の図２〜４についても同じ）。【００５２】
図１（ａ）に示すように、インシュリンによる処理では、ＰＣ１２ｍ３細胞と変異ＰＣ１２細胞のいずれにもホスホＡｋｔが検出され、両者に差異は見られなかった。一方、ＮＧＦによる処理では、ＰＣ１２ｍ３細胞のみにホスホＡｋｔが検出され、変異ＰＣ１２細胞ではホスホＡｋｔが検出されなかった。これは、変異ＰＣ１２細胞においてはＰＩ３Ｋ（特にｐ８５β）に変異が起こっており、Ａｋｔを活性化することができなかったことを示している。
なおインシュリン処理では変異ＰＣ１２細胞にもホスホＡｋｔが検出されたが、これは、インシュリンがＴｒｋに作用したときにドッキング蛋白質であるＩＲＳ−１がリン酸化し、それにＰＩ３Ｋがドッキングするが、ＩＲＳ−１のリン酸化部位が非常に多いために、ＰＩ３Ｋの変異が大きな影響を及ぼさなかったためと考えられる。
以上より、変異ＰＣ１２細胞は、ＮＧＦを作用させてもＡｋｔを活性化しない変異ＰＩ３Ｋを発現していることが明らかとなった。
なお、正常型ＰＣ１２細胞は、インシュリンを作用させるとＡｋｔを活性化し（ＰＣ１２ｍ３細胞、変異ＰＣ１２細胞と同じ）、ＮＧＦを作用させるとＡｋｔを活性化した（ＰＣ１２ｍ３細胞と同じ）。【００５３】
図１（ｂ）に示すように、ＥＧＦによる処理では、ＮＧＦによる処理と同様に、ＰＣ１２ｍ３細胞のみにホスホＡｋｔが検出され、変異ＰＣ１２細胞ではホスホＡｋｔが検出されなかった。これは、ＮＧＦとＥＧＦではＴｒｋが同じ構造をしているが、インシュリンのＴｒｋとは異なっていることによると考えられる。
なお、正常型ＰＣ１２細胞は、ＥＧＦを作用させるとＡｋｔを活性化した（ＰＣ１２ｍ３細胞と同じ）。【００５４】
図１（ｃ）に示すように、ＩＧＦ−１による処理では、インシュリンによる処理と同様に、ＰＣ１２ｍ３細胞と変異ＰＣ１２細胞のいずれにもホスホＡｋｔが検出され、両者に差異は見られなかった。一方、ＦＧＦによる処理では、ＮＧＦやＥＧＦによる処理と同様に、ＰＣ１２ｍ３細胞のみにホスホＡｋｔが検出され、変異ＰＣ１２細胞ではホスホＡｋｔが検出されなかった。なお、インシュリン、ＩＧＦ−１、ＦＧＦによる処理において、ホスホＥｒｋ−１とホスホＥｒｋ−２の発現についてはＰＣ１２ｍ３細胞と変異ＰＣ１２細胞との間に相違はなかった。
なお、正常型ＰＣ１２細胞は、ＩＧＦ−１を作用させるとＡｋｔを活性化し（ＰＣ１２ｍ３細胞、変異ＰＣ１２細胞と同じ）、ＦＧＦを作用させるとＡｋｔを活性化した（ＰＣ１２ｍ３細胞と同じ）。【００５５】
図１（ｄ）に示すように、熱処理では、ＰＣ１２ｍ３細胞と変異ＰＣ１２細胞のいずれにもホスホＡｋｔが検出され、両者に差異は見られなかった。ただし、血清（増殖因子を含むもの）の存在下では、変異ＰＣ１２細胞の方がＰＣ１２ｍ３細胞よりもホスホＡｋｔの発現量がやや高かった。
なお、正常型ＰＣ１２細胞における、血清存在下の熱処理によるＡｋｔ活性化レベルは低かった（ＰＣ１２ｍ３細胞と同じレベル）。【００５６】
（４）変異ｐ８５β遺伝子を導入することによる新規細胞の作出
変異ｐ８５β遺伝子のｍ−ＲＮＡから作製したＰＣＲ産物をＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＰＣＲ-ＸＬ-ＴＯＰＯ、インビトロジェン社）に組み込み、増幅した。増幅産物をＥｃｏＲＩで切断後、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）のＥｃｏＲ１サイトに組み込んだ。正方向に組み込まれたものを増幅して、以下の遺伝子導入に使用した。【００５７】
正常型ＰＣ１２細胞又はＰＣ１２ｍ３細胞２００万個を２５ｃｍ2のフラスコに蒔き、５日間培養した。２．５ｍＬのＤＭＥＭで培地交換を行い、直ちに変異ｐ８５β遺伝子の導入を行った。遺伝子導入は、遺伝子導入試薬ＴｒａｎｓＩＴ-ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ社）を使用して行った。具体的には、無血清のＤＭＥＭ培地５００μＬにＴｒａｎｓＩＴ-ＴＫＯ試薬２０μＬを加えて１０分間放置後、発現ベクターに組み込んだ変異ｐ８５βＤＮＡ１０μＬ（１０μｇ）を加えた。１０分間放置後、全量（５３０μＬ）を細胞に与え、２日間の発現期間を経て１：４の希釈で継代培養を行った。培地にはＧＩＢＣＯ社のＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（ネオマイシン）を３００μｇ添加した。２週間培養を行い、遺伝子導入細胞の選択を行った。培地交換は５日毎に行った。【００５８】
遺伝子が組み込まれたコロニーについて、２週間後にリングアイソレーション法を用いて２０〜３０個クローニングし、細胞の増幅後、変異細胞と同じ形質を示すかどうかの分析（温熱によるサバイバル実験、及び、ＮＧＦ、インスリンによるＡｋｔ活性）を行い、変異の確認を行った。これにより、配列番号２で表されるアミノ酸配列の６６０番目の位置に相当するリジンをアルギニンに置換する変異がｐ８５β遺伝子に導入された、組換え型の変異ＰＣ１２細胞（以下、「組換えＰＣ１２細胞」と称する）が作製された。【００５９】
（５）組換えＰＣ１２細胞におけるＮＧＦの影響
上記（３）と同様にして、組換えＰＣ１２細胞（２クローン）におけるＮＧＦ処理の影響を調べた。図２に結果を示す。図中、「ｐ８５ｍ−１」と「ｐ８５ｍ−２」はいずれもクローン名である。すなわち、組換えＰＣ１２細胞では変異ＰＣ１２細胞と同様に、ＮＧＦ処理によってＡｋｔは活性化されなかった。なお、ベクターのみ導入したＰＣ１２ｍ３細胞（陰性対照）は、ＰＣ１２ｍ３細胞と同様にＮＧＦ処理によってＡｋｔが活性化された。
以上より、ＰＣ１２ｍ３細胞（親細胞）のｐ８５β遺伝子に変異を導入することにより、上記変異ＰＣ１２細胞と同じ特性を有する新規細胞を作出できることが示された。【００６０】
（６）Ｆｏｘｏ蛋白質の活性化の有無
寿命の延長に関係する蛋白質であるＦｏｘｏ蛋白質の活性化の有無について、抗ホスホＦｏｘｏ抗体（サンタクルズ社）を用いたウエスタンブロット法により解析した。図３に結果を示す。すなわち、インシュリンによる処理では、ＰＣ１２ｍ３細胞と変異ＰＣ１２細胞のいずれにもホスホＦｏｘｏが同程度に検出され、両者に差異は見られなかった。一方、ＮＧＦによる処理では、変異ＰＣ１２細胞におけるホスホＡｋｔ発現量が大きく低下していた。この結果は、ｐ８５βの変異が寿命の延長に働くことを示唆している。【００６１】
（７）免疫沈降法によるｐ８５調節αサブユニット（ｐ８５α）とドッキング蛋白質の結合評価
免疫沈降法により、ＰＣ１２ｍ３細胞と変異ＰＣ１２細胞について、ｐ８５αと、ＩＲＳ−１（インシュリンによって活性化するドッキング蛋白質）又はＧａｂ−１（ＮＧＦによって活性化するドッキング蛋白質）との結合性を評価した。図４に結果を示す。すなわち、インシュリンによる処理では、ＰＣ１２ｍ３細胞と変異ＰＣ１２細胞のいずれの場合でも、ｐ８５αとＩＲＳ−１が結合した。一方、ＮＧＦによる処理では、ＰＣ１２ｍ３細胞の場合はｐ８５αとＧａｂ−１が結合したが、変異ＰＣ１２細胞の場合はｐ８５αとＧａｂ−１の結合は見られなかった。この結果は、変異ＰＣ１２細胞がインシュリンには作用するが、ＮＧＦではチロシンカイネースが活性化するがＧａｂ−１を介したｐ８５αの活性化がないためにＰＩ３Ｋが働かないことを示している。【００６２】
（８）熱抵抗性の評価
ＰＣ１２ｍ３細胞と変異ＰＣ１２細胞について、４４℃の熱処理を２０分、３０分、４０分、５０分間加えた後の生存曲線を作成した。結果を図５（ａ）に示す。図中、○はＰＣ１２ｍ３細胞、●は変異ＰＣ１２細胞の場合を示す。すなわち、変異ＰＣ１２細胞の方が約４倍の熱抵抗性を示した。
また、ＰＣ１２ｍ３細胞と組換えＰＣ１２細胞について、４５℃の熱処理を１０分、２０分、３０分間加えた後の生存曲線を作成した。結果を図５（ｂ）に示す。図中、○はＰＣ１２ｍ３細胞、●は組換えＰＣ１２細胞の場合を示す。すなわち、組換えＰＣ１２細胞の方が約６倍の熱抵抗性を示した。
以上より、変異ＰＣ１２細胞と組換えＰＣ１２細胞は、いずれもＰＣ１２ｍ３細胞よりも高い熱抵抗性を有していることが示された。【００６３】
（９）標識付加した変異ｐ８５β遺伝子を導入することによる新規細胞の作出
ラット変異ｐ８５β遺伝子（配列番号３）が導入されたｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（インビトロジェン社）を鋳型とし、ＰＩ３ＫＦ（１−１８）プライマー（配列番号５）とＰＩ３Ｋ−Ｒ（２１６９−２１５２）プライマー（配列番号６）をプライマー対とし、KOD plus polymeraseを用いてＰＣＲを行った。これにより、５’側にＦＬＡＧ配列が導入された変異ｐ８５β遺伝子（ＦＬＡＧ標識変異ｐ８５β遺伝子）を含むＤＮＡ断片が得られた。当該ＤＮＡ断片は、５’末端から３’末端に向かって、EcoRIサイト、kozak配列、開始コドン（ＡＴＧ）、ＦＬＡＧ配列、変異ｐ８５β遺伝子、HindIIIサイトがこの順番に並んだ構造を有している。【００６４】
得られたＤＮＡ断片をEcoRIとHindIIIで処理し、同じ制限酵素で処理したｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターにクローニングした。ワンパスシークエンス解析によりクローニングされた領域の塩基配列を決定し、所望の配列と一致していること確認した。NucleoBond Xtra MaxiEF（MACHEREY-NAGEL社製）を用いて、このプラスミドＤＮＡのＭａｘｉ精製を行った。【００６５】
ラット正常ｐ８５β遺伝子（配列番号１）についても、同様の方法でＦＬＡＧ配列を付加し（ＦＬＡＧ標識正常ｐ８５β遺伝子）、プラスミドＤＮＡを精製した。【００６６】
上記（４）と同様にして、ＰＣ１２ｍ３細胞に、ＦＬＡＧ標識変異ｐ８５β遺伝子あるいはＦＬＡＧ標識正常ｐ８５β遺伝子を導入した。得られた多数のクローンについて、抗ＦＬＡＧ抗体（ＦＬＡＧ ＤＤＤＤＫ抗体）を用いたウエスタンブロットを行い、遺伝子導入の有無を確認した。これにより、ＦＬＡＧ標識変異ｐ８５β遺伝子が導入された変異ＰＣ１２細胞（以下、「組換えＰＣ１２細胞（ＦＬＡＧ導入）」と称する。）と、ＦＬＡＧ標識正常ｐ８５β遺伝子が導入されたＰＣ１２細胞（以下、「正常ＰＣ１２細胞（ＦＬＡＧ導入）」と称する。）が得られた。【００６７】
上記（５）と同様にして、組換えＰＣ１２細胞（ＦＬＡＧ導入）におけるＮＧＦ処理の影響を調べた。その結果、変異ＰＣ１２細胞と同様に、Ａｋｔは活性化されなかった。なお、正常ＰＣ１２細胞（ＦＬＡＧ導入）では、正常ＰＣ１２細胞と同様に、Ａｋｔが活性化された。【００６８】
上記（８）と同様にして、組換えＰＣ１２細胞（ＦＬＡＧ導入）における熱抵抗性を調べた。その結果、組換えＰＣ１２細胞と同様の高い熱抵抗性が得られた。なお、正常ＰＣ１２細胞（ＦＬＡＧ導入）は、正常ＰＣ１２細胞と同程度の熱抵抗性しか示さなかった。【００６９】
上記（７）と同様の免疫沈降法により、ＦＬＡＧ標識変異ｐ８５βとＦＬＡＧ標識正常ｐ８５βについて、ＴｒｋＡへの結合様式の違いを調べた。まず、図６に示すように、インスリン処理によるパルスアンドチェイス実験を行ったところ、組換えＰＣ１２細胞（ＦＬＡＧ導入）における、インスリンレセプターへのｐ８５αの結合様式は正常であった。一方、図７に示すように、ＮＧＦ処理によるパルスアンドチェイス実験を行ったところ、ＦＬＡＧ標識変異ｐ８５βは、ＦＬＡＧ標識正常ｐ８５βと比べてＴｒｋＡに長時間結合し、ＰＩ３ＫのＰＩへの移行を阻害していることが分かった。このことが、変異ｐ８５β遺伝子を持つＰＣ１２細胞がＮＧＦに反応できない理由と考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2011111595.tif 000011
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