(57)【要約】  本発明は、AIMの機能を制御する化合物を簡便に見出す方法を提供することを課題とする。本発明は、(i)脂肪前駆細胞を、脂肪細胞に分化する条件で培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、(ii)前記脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を評価する工程と、(iii)AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも分化の誘導効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択し、誘導効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択する工程と、を含む、AIMの機能を制御する化合物を選択するためのスクリーニング方法等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
AIMが脂肪前駆細胞又は脂肪細胞に生じさせる表現型の変化を指標とし、前記候補化合物とAIMの存在下で脂肪前駆細胞又は脂肪細胞を培養して、該表現型の変化が亢進する場合は該候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、該表現型の変化が抑制される場合は該候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する、方法。
【請求項２】
前記表現型の変化が、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化抑制、脂肪細胞における脂肪滴融解促進、及び脂肪細胞肥大化の抑制からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
(i)  脂肪前駆細胞を、脂肪細胞に分化する条件で培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(ii)  前記脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を評価する工程と、
(iii)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも分化の誘導効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択し、誘導効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択する工程と、
を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程(ii)は、脂肪細胞内の脂肪滴の生成を観察する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程(ii)は、脂肪細胞特異的に発現する脂肪細胞マーカー、脂肪前駆細胞特異的に発現する脂肪前駆細胞マーカー、及び間葉系幹細胞特異的に発現する間葉系幹細胞マーカーのいずれかの発現を測定する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
(a)  脂肪細胞を培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(b)  前記脂肪細胞中の脂肪滴融解を評価する工程と、
(c)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも脂肪滴融解効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択し、脂肪滴融解効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択する工程と、
を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記工程(b)は、培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸量を測定する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程(b)は、脂肪滴形成関連遺伝子の発現を測定する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記脂肪滴形成関連遺伝子は、FSP27、Perilipin、及びAdipophilinからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
(1)  脂肪細胞を培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(2)  前記脂肪細胞の大きさを評価する工程と、
(3)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも脂肪細胞が大きくなっている場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択し、脂肪細胞が小さくなっている場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択する工程と、
を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
前記候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMを培地に加えて脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養する工程と、
前記細胞へのAIMの取り込みを評価する工程と、
AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも取り込み効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、取り込み効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する工程と、
を含む方法。
【請求項１２】
候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
前記候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMを培地に加えて脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養する工程と、
前記細胞中でのAIMとFASの結合を評価する工程と、
AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりもAIMとFASの結合が増加している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、結合が減少している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する工程と、
を含む方法。
【請求項１３】
候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
前記候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMを培地に加えて脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養する工程と、
前記細胞中でのFASの活性を評価する工程と、
AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりもFASの活性が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、FASの活性が亢進している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する、方法。
【請求項１４】
AIMとして、AIMの機能ドメイン及び保存領域を含むAIMフラグメントを用いる、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
候補化合物の中からAIM様化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養し、培地に候補化合物を加える工程と、
前記脂肪細胞又は脂肪前駆細胞中での前記候補化合物とFASの結合、及びFASの活性を評価する工程と、
前記候補化合物がFASと結合し、FASの活性を低下させている場合、前記候補化合物をAIM様化合物として選択する工程と、
を含む方法。
【請求項１６】
候補化合物の中から、AIMの発現を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
マクロファージと脂肪前駆細胞を、脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化する条件で、候補化合物の存在下又は非存在下で共培養する工程と、
前記脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を評価する工程と、
候補化合物の存在下で、候補化合物の非存在下よりも、分化の誘導効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの発現を抑制する化合物として選択し、分化の誘導効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの発現を亢進する化合物として選択する工程と、
を含む方法。
【請求項１７】
AIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するスクリーニングのためのキットであって、以下のツールのうち少なくとも一つを含むキット：
AIM又はそのフラグメント；
検出可能に標識したAIM若しくはAIMフラグメント；
抗AIM抗体又はそのフラグメント；
検出可能に標識した抗AIM抗体若しくはそのフラグメント；
AIM遺伝子の一部に相補的な配列からなる核酸、又は当該核酸と当該核酸に相補的な配列からなる二本鎖核酸；
AIM遺伝子の一部を認識するリボザイム；
マクロファージ；
脂肪細胞若しくは脂肪前駆細胞；
CD36；
FAS若しくはそのドメイン；
AIM高発現トランスジェニックマウス、AIMノックアウトマウス若しくはAIMノックダウンマウス；又は
AIM高発現トランスジェニックマウス、AIMノックアウトマウス若しくはAIMノックダウンマウス由来細胞。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、候補化合物の中から、Apoptosis Inhibitor of Macrophage（AIM）の機能を制御する化合物を選択するためのスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
AIMは、本発明者らが組織マクロファージから発見した可溶性タンパク質であり、スカベンジャー受容体システインリッチ（Scavenger Receptor Cysteine-Rich; SRCR）スーパーファミリーのメンバーである。AIMは当初、様々なアポトーシス誘導因子からマクロファージを守るアポトーシスインヒビターとして見出された（非特許文献1参照）。
AIMは、SRCRドメインを3つ有する構造がCD5の細胞外ドメインに似ていることから、CD5L（CD5-like）とも呼ばれている。【０００３】
本発明者らは、AIMについてさらに研究を進めていく中で、アテローム性動脈硬化病巣においては脂質を取り込んだマクロファージがAIMを産生すること、また、産生されたAIMは、病巣におけるマクロファージのアポトーシス抵抗性をサポートすることによってアテローム性動脈硬化の発生にも関与することを見出した。
さらに、AIM欠損マウスを作製し、AIM欠損が動脈硬化を著しく軽減させることを確認した（非特許文献2参照）。
従って、生体内においてAIMの機能を抑制する化合物が得られれば、動脈硬化の治療剤等として有用であると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Miyazaki, T. et al., J. Exp. Med. 189, 413-422 (1999)
【非特許文献２】Arai, S. et al., Cell Metab. 1, 201-213 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、また、AIM自体が抗肥満薬として作用し得ることも見出した。従って、生体内においてAIMの機能を亢進する化合物も抗肥満薬等として有用であると考えられる。
そこで、本発明は、AIMの機能を亢進又は抑制する化合物を簡便に見出すスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、AIMの機能をさらに探索する中で、肥満脂肪組織に浸潤するマクロファージにおいてもAIMが発現していることを見出した。そして、AIM存在下では、脂肪前駆細胞の成熟脂肪細胞への分化が抑制されること；AIM存在下では、成熟脂肪細胞において脂肪滴の融解（lipolysis）が誘導されること；AIM存在下では、脂肪細胞の大きさが小さくなる傾向があること；従って、脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化、成熟脂肪細胞における脂肪滴の融解、又は脂肪細胞の大きさを指標として、AIMの機能を亢進又は抑制する化合物をスクリーニングできることを見出した。
また、脂肪組織において産生されたAIMは、細胞表面のCD36に結合し、エンドサイトーシスによって脂肪細胞中に取り込まれること；細胞内において脂肪酸合成酵素（Fatty Acid Synthase; FAS）に結合し、FASの活性を抑制すること；従って、脂肪細胞へのAIMの取り込み、AIMとFASの結合、又はFASの活性等を指標としても、AIMの機能を亢進又は抑制する化合物をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
AIMが脂肪前駆細胞又は脂肪細胞に生じさせる表現型の変化を指標とし、前記候補化合物とAIMの存在下で脂肪前駆細胞又は脂肪細胞を培養して、該表現型の変化が亢進する場合は該候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、該表現型の変化が抑制される場合は該候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する、方法；
〔２〕前記表現型の変化が、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化抑制、脂肪細胞における脂肪滴融解促進、及び脂肪細胞肥大化の抑制からなる群より選択される、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕(i)  脂肪前駆細胞を、脂肪細胞に分化する条件で培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(ii)  前記脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を評価する工程と、
(iii)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも分化の誘導効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択し、誘導効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択する工程と、
を含む上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記工程(ii)は、脂肪細胞内の脂肪滴の生成を観察する工程を含む、上記〔３〕に記載の方法；
〔５〕前記脂肪細胞の脂肪滴の生成を観察する工程は、脂肪滴をoil-red-Oで染色する工程を含む、上記〔４〕に記載の方法；
〔６〕前記工程(ii)は、脂肪細胞特異的に発現する脂肪細胞マーカー、脂肪前駆細胞特異的に発現する脂肪前駆細胞マーカー、及び間葉系幹細胞特異的に発現する間葉系幹細胞マーカーのいずれかの発現を測定する工程を含む、上記〔３〕に記載の方法；
〔７〕前記脂肪細胞マーカーは、PPARγ1、PPARγ2、C/EBPα、CD36及びGlut-4からなる群より選択される少なくとも1つである、上記〔６〕に記載の方法；
〔８〕前記脂肪前駆細胞マーカーは、PREF-1である、上記〔６〕に記載の方法；
〔９〕前記間葉系幹細胞マーカーは、CD105である、上記〔６〕に記載の方法；
〔１０〕(a)  脂肪細胞を培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(b)  前記脂肪細胞中の脂肪滴融解を評価する工程と、
(c)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも脂肪滴融解効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択し、脂肪滴融解効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択する工程と、
を含む上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔１１〕前記工程(b)は、培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸量を測定する工程を含む、上記〔１０〕に記載の方法；
〔１２〕前記工程(b)は、脂肪滴形成関連遺伝子の発現を測定する工程を含む、上記〔１０〕に記載の方法；
〔１３〕前記脂肪滴形成関連遺伝子は、FSP27、Perilipin、及びAdipophilinからなる群より選択される少なくとも1つである、上記〔１２〕に記載の方法；
〔１４〕(1)  脂肪細胞を培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(2)  前記脂肪細胞の大きさを評価する工程と、
(3)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも脂肪細胞が大きくなっている場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択し、脂肪細胞が小さくなっている場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択する工程と、
を含む上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔１５〕前記工程(2)は、細胞をヘマトキシリン−エオシン染色する工程を含む、上記〔１４〕に記載の方法；
〔１６〕候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
前記候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMを培地に加えて脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養する工程と、
前記細胞へのAIMの取り込みを評価する工程と、
AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも取り込み効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、取り込み効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する工程と、
を含む方法；
〔１７〕前記細胞へのAIMの取り込みを評価する工程は、
培養後に固定し透過性を付与した前記細胞と、検出可能に標識した抗AIM抗体とをインキュベートする工程と、
前記細胞中のAIMに結合した抗AIM抗体を検出する工程と、
を含む上記〔１６〕に記載の方法；
〔１８〕前記培養工程において、検出可能に標識したAIMを培地に加え、
前記細胞へのAIMの取り込みを評価する工程は、培養後、細胞中のAIMを検出する工程と、
を含む上記〔１６〕に記載の方法；
〔１９〕候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
前記候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMを培地に加えて脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養する工程と、
前記細胞中でのAIMとFASの結合を評価する工程と、
AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりもAIMとFASの結合が増加している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、結合が減少している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する工程と、
を含む方法；
〔２０〕前記細胞中でのAIMとFASの結合を評価する工程は、
前記細胞のライゼートを調製し、抗AIM抗体を用いて免疫沈降を行う工程と、
得られた沈降物中に含まれるFASを、抗FAS抗体を用いたイムノブロッティングによって検出する工程と、
を含む、上記〔１９〕に記載の方法；
〔２１〕候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
前記候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMを培地に加えて脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養する工程と、
前記細胞中でのFASの活性を評価する工程と、
AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりもFASの活性が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、FASの活性が亢進している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する、方法；
〔２２〕前記細胞中でのFASの活性を評価する工程は、
前記細胞のライゼートをアセチルCoA又はNADPHと混合し、マロニルCoAを加えて酵素反応を開始させる工程と、
前記酵素反応の開始の前後にわたって、前記細胞のライゼートのODを測定し、測定結果に基づいて酸化されたNADPHを算出し、FASの酵素活性を評価する工程と、
を含む上記〔２１〕に記載の方法；
〔２３〕AIMとしてAIMフラグメントを用いる、上記〔１〕から〔２２〕のいずれか１項に記載の方法；
〔２４〕前記AIMフラグメントは、AIMの機能ドメイン及び保存領域を含むフラグメントから選択される、上記〔２３〕に記載の方法；
〔２５〕候補化合物の中からAIMの機能を抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
非ヒト肥満モデル動物に候補化合物を投与する工程と、
前記非ヒト肥満モデル動物における体重、脂肪の量、脂肪前駆細胞マーカー発現、及び脂肪滴形成関連遺伝子発現からなる群より選択される少なくとも一つの指標を評価する工程と、
前記評価工程と並行して、前記非ヒト肥満モデル動物における血中AIM濃度の変化を測定する工程と、
を含む方法；
〔２６〕候補化合物の中からAIM様化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
AIMをノックアウトした非ヒト肥満モデル動物に候補化合物を投与する工程と、
前記非ヒト肥満モデル動物における体重、脂肪の量、脂肪前駆細胞マーカー発現、及び脂肪滴形成関連遺伝子発現からなる群より選択される少なくとも一つの指標を評価する工程と、
前記評価工程と並行して、前記非ヒト肥満モデル動物における血中AIM濃度の変化を測定する工程と、
を含む方法；
〔２７〕AIMの機能を亢進又は抑制する化合物のスクリーニングに用いるためのAIM遺伝子ノックアウト非ヒト動物またはAIM遺伝子ノックアウト非ヒト動物由来の細胞を作製するための、AIM遺伝子をノックアウトしたES細胞クローンの使用方法；
〔２８〕AIMの機能を亢進又は抑制する化合物のスクリーニングに用いるためのAIM遺伝子トランスジェニック非ヒト動物またはAIM遺伝子トランスジェニック非ヒト動物由来の細胞を作製するための、AIM遺伝子を導入したES細胞クローンの使用方法；
〔２９〕AIMの機能を亢進又は抑制する化合物のスクリーニングに用いるためのAIM遺伝子ノックアウト非ヒト動物またはAIM遺伝子ノックアウト非ヒト動物由来の細胞を作製するために使用する、AIM遺伝子をノックアウトした動物に由来する胚の使用方法；
〔３０〕AIMの機能を亢進又は抑制する化合物のスクリーニングに用いるためのAIM遺伝子トランスジェニック非ヒト動物またはAIM遺伝子トランスジェニック非ヒト動物由来の細胞を作製するために使用する、AIM遺伝子を導入した動物に由来する胚の使用方法；
〔３１〕AIM遺伝子をノックアウトした、又はAIM遺伝子に変異を加えたES細胞を分化させて作製したマクロファージ；
〔３２〕AIM遺伝子をノックアウトしたES細胞を分化させて作製した脂肪細胞；
〔３３〕候補化合物の中からAIM様化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養し、培地に候補化合物を加える工程と、
前記脂肪細胞又は脂肪前駆細胞中での前記候補化合物とFASの結合、及びFASの活性を評価する工程と、
前記候補化合物がFASと結合し、FASの活性を低下させている場合、前記候補化合物をAIM様化合物として選択する工程と、
を含む方法；
〔３４〕前記候補化合物とFASの結合を評価する工程は、
前記細胞のライゼートを調製し、候補化合物に対する抗体を用いて免疫沈降を行う工程と、
得られた沈降物中に含まれるFASを、抗FAS抗体を用いたイムノブロッティングによって検出する工程と、
を含む、上記〔３３〕に記載の方法；
〔３５〕前記細胞中でのFASの活性を評価する工程は、
前記細胞のライゼートをアセチルCoA又はNADPHと混合し、マロニルCoAを加えて酵素反応を開始させる工程と、
前記酵素反応の開始の前後にわたって、前記細胞のライゼートのODを測定し、測定結果に基づいて酸化されたNADPHを算出し、FASの酵素活性を評価する工程と、
を含む上記〔３３〕又は〔３４〕に記載の方法；
〔３６〕候補化合物の中からAIM様化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
前記候補化合物の中から、抗AIM抗体、CD36及びFASからなる群より選択される少なくとも一つと結合するものを選択する工程と、
選択された候補化合物の中から、FAS活性を抑制するものを選択する工程と、を含む方法；
〔３７〕前記選択工程において、候補化合物の中から、FASのDH、ER、TE及びCCからなる群より選択される少なくとも一つのドメインと結合するものを選択する、上記〔３６〕に記載の方法；
〔３８〕候補化合物の中からAIMの機能を抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、
AIMと、CD36又はFASタンパク質との結合及び／又は相互作用を阻害する化合物を選択する、方法；
〔３９〕前記AIMと、CD36又はFASとの結合及び／又は相互作用を阻害する化合物を選択する工程は、
前記候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMとCD36又はFASとを反応させ、候補化合物によるAIMとCD36又はFASとの結合及び／又は相互作用への影響を評価する工程を含む、上記〔３８〕に記載の方法；
〔４０〕前記評価工程において、FASとして、DH、ER、TE及びCCからなる群より選択される少なくとも一つのFASのドメインを用いる、上記〔３８〕又は〔３９〕に記載の方法；
〔４１〕前記AIMとして、AIMフラグメントを用いる、上記〔３８〕から〔４０〕のいずれか１項に記載の方法；
〔４２〕前記AIMフラグメントは、AIMの機能ドメイン及び保存領域を含むフラグメントから選択される、上記〔４１〕に記載の方法；
〔４３〕候補化合物の中から、AIMの発現を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
マクロファージと脂肪前駆細胞を、脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化する条件で、候補化合物の存在下又は非存在下で共培養する工程と、
前記脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を評価する工程と、
候補化合物の存在下で、候補化合物の非存在下よりも、分化の誘導効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの発現を抑制する化合物として選択し、分化の誘導効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの発現を亢進する化合物として選択する工程と、
を含む方法；
〔４４〕前記候補化合物が、AIM遺伝子の一部に相補的な配列からなる核酸、当該核酸と当該核酸に相補的な配列からなる二本鎖核酸、及びAIM遺伝子の一部を認識するリボザイムからなる群より選択される、上記〔４３〕に記載の方法；
〔４５〕AIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するスクリーニングのための、以下のツールの使用方法：
AIM又はそのフラグメント；
検出可能に標識したAIM若しくはAIMフラグメント；
抗AIM抗体又はそのフラグメント；
検出可能に標識した抗AIM抗体若しくはそのフラグメント；
AIM遺伝子の一部に相補的な配列からなる核酸、又は当該核酸と当該核酸に相補的な配列からなる二本鎖核酸；
AIM遺伝子の一部を認識するリボザイム；
マクロファージ；
脂肪細胞若しくは脂肪前駆細胞；
CD36；
FAS若しくはそのドメイン；
AIM高発現トランスジェニックマウス、AIMノックアウトマウス若しくはAIMノックダウンマウス；又は
AIM高発現トランスジェニックマウス、AIMノックアウトマウス若しくはAIMノックダウンマウス由来細胞；
〔４６〕AIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するスクリーニングのためのキットであって、以下のツールのうち少なくとも一つを含むキット：
AIM又はそのフラグメント；
検出可能に標識したAIM若しくはAIMフラグメント；
抗AIM抗体又はそのフラグメント；
検出可能に標識した抗AIM抗体若しくはそのフラグメント；
AIM遺伝子の一部に相補的な配列からなる核酸、又は当該核酸と当該核酸に相補的な配列からなる二本鎖核酸；
AIM遺伝子の一部を認識するリボザイム；
マクロファージ；
脂肪細胞若しくは脂肪前駆細胞；
CD36；
FAS若しくはそのドメイン；
AIM高発現トランスジェニックマウス、AIMノックアウトマウス若しくはAIMノックダウンマウス；又は
AIM高発現トランスジェニックマウス、AIMノックアウトマウス若しくはAIMノックダウンマウス由来細胞；
〔４７〕上記〔１〕から〔２４〕のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって選択される、AIMの機能を亢進又は抑制する化合物；
〔４８〕上記〔２５〕及び〔３８〕から〔４２〕のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって選択される、AIMの機能を抑制する化合物；
〔４９〕上記〔２６〕及び〔３３〕から〔３７〕のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって選択される、AIM様化合物；及び
〔５０〕上記〔４３〕又は〔４４〕に記載のスクリーニング方法によって選択される、AIMの発現を調節する化合物、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係るスクリーニング方法によれば、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化、脂肪細胞における脂肪滴の融解、脂肪細胞の大きさ、脂肪細胞へのAIMの取り込み、AIMとCD36又はFASとの結合といった、検出が容易な変化を指標として、候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を簡便に効率よく選択することができる。
本発明のスクリーニング方法で得られるAIMの機能を亢進する化合物は、抗肥満薬等として用いることができ、AIMの機能を抑制する化合物は、動脈硬化の治療剤等として用いることができる極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、正常マウス（高脂肪食負荷を行っていないマウス）及び肥満マウスの内臓脂肪組織から作製した切片を、抗マクロファージモノクローナル抗体、抗マウスAIMポリクローナル抗体、及び抗IL-6抗体で染色した結果を示す。
【図２】図２は、3T3-L1細胞の培養におけるrAIM負荷のスケジュールを示す。
【図３】図３は、図２に示すスケジュールのday 12において、細胞をoil-red-Oで染色した結果を示す。
【図４】図４は、図２に示すスケジュールのday 12において、定量的リアルタイムPCRによって脂肪細胞マーカーの発現を測定した結果を示す。
【図５】図５Ａは、成熟脂肪細胞にrAIM負荷を行い、oil-red-O染色した結果を示す。図５Ｂは脂肪滴のサイズ、図５Ｃは単位面積当たりの脂肪滴含有細胞の数を示す。
【図６】図６は、成熟脂肪細胞にrAIM負荷を行い、培養上清中のグリセロール及び遊離脂肪酸を測定した結果を示す。
【図７】図７は、成熟脂肪細胞のrAIM負荷を行い、定量的リアルタイムPCRによって脂肪滴形成関連遺伝子の発現を測定した結果を示す。
【図８】図８は、AIM+/+マウスとAIM-/-マウスに、HFDを20日間与えた後、脂肪組織の切片をHE染色した結果を示す。
【図９】図９Ａは、分化した、又は未文化の3T3-L1細胞にrAIM負荷を行い、AIM、PPARγ2、及びDAPIを染色した結果を示す。図９Ｂは、図９Ａの結果に基づいて、PPARγ2の発現量ごとに細胞を分類し、各細胞100個当たりのrAIM含有細胞の数を計測した結果を示す。図９Ｃは、3T3-L1細胞にrAIM負荷を行い、AIMとエンドソーム、又はAIMとリソソームを染色した結果を示す。
【図１０】図１０は、図９と同様のサンプルを使用して、AIMを金微粒子で標識し、電子顕微鏡で観察した結果を示す。
【図１１】図１１は、3T3-L1細胞をCD36中和抗体で処理し、rAIMのエンドサイトーシスへの効果を調べた結果である。
【図１２】図１２は、CD36+/+マウスとCD36-/-マウスにrAIMを静注し、脂肪組織から調製した切片においてAIMとマクロファージを染色した結果を示す。
【図１３】図１３は、AIM-/-マウスの脂肪組織に、HAタグを付けたrAIMを直接注射投与し、脂肪組織を用いて抗HA抗体を用いて共免疫沈降を行い、ウエスタンブロッティングで沈降物中のFASを検出した結果を示す。
【図１４】図１４は、HEK 293T細胞内において、HAタグを付けたrAIMと、FLAGタグを付けたFASとの結合を、抗Flag抗体又は抗HA抗体を用いて共免疫沈降によって確認した結果である。
【図１５】図１５は、FASの各ドメインをFlagタグで標識し、AIM-HAを安定的に発現するHEK 293T細胞内で発現させ、抗Flag抗体又は抗HA抗体を用いた共免疫沈降で、FASとAIMの結合を確認した結果である。
【図１６】図１６は、rAIM（5μg/ml）の存在下、非存在下、及びC75（25μM）存在下で6日間処理した3T3-L1細胞におけるFAS活性を測定した結果である。
【図１７】図１７は、AIM+/+マウス及びAIM-/-マウスの脂肪組織におけるFAS活性を測定した結果である。
【図１８】図１８は、脂肪内局所注射によってrAIM又はBSAを3時間前に投与したAIM-/-マウスの脂肪組織におけるFAS活性を測定した結果である。
【図１９】図１９は、ヒトAIMとマウスAIMのアミノ酸配列とコンセンサスを示す。
【図２０】図２０は、FASの構造を示す概念図である。
【図２１】図２１は、HFDを12週間与えたAIM+/+マウスと、AIM-/-マウスにおける内臓脂肪量及び皮下脂肪量の変化を測定した結果を示す。
【図２２】図２２は、AIM-/-マウスに、5週間、HFDを与えながらrAIM又はBSAを週2回投与し、体重の変化を測定した結果を示す。
【図２３】図２３、AIM-/-マウスに、5週間、HFDを与えながらrAIM又はBSAを週2回投与し、内臓脂肪量及び皮下脂肪量の変化を測定した結果を示す。
【図２４】図２４は、図２２及び２３に示す実験の後、AIM-/-マウスの内臓脂肪における、脂肪細胞マーカー等のmRNAレベルを測定した結果を示す。
【図２５】図２５は、イヌ、ネコ及びマウス血清中のAIMタンパク質をウエスタンブロッティングによって検出した結果を示す。
【図２６】図２６は、本発明のスクリーニング方法によって得られた低分子化合物によるAIM抑制活性をFSP27の発現で評価した結果である。
【図２７】図２７は、本発明のスクリーニング方法によって得られた低分子化合物によるAIM抑制活性をFSP27の発現で評価した結果である。
【図２８】図２７は、本発明のスクリーニング方法によって得られた抗AIM抗体によるAIMに対する中和活性をFSP27の発現で評価した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（AIMの機能を制御する化合物のスクリーニング方法）
スクリーニング方法の第一の態様は、候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するための方法であって、AIMが脂肪前駆細胞又は脂肪細胞に生じさせる表現型の変化を指標とし、候補化合物とAIMの存在下で脂肪前駆細胞又は脂肪細胞ｇを培養して、表現型の変化が亢進する場合は候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、表現型の変化が抑制される場合は候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択することを特徴とする。
【００１０】
本明細書において、「AIM」とは、上述のとおり、SRCRスーパーファミリーのメンバーである可溶性タンパク質であり、どのような種に由来するものであってもよい。例として、ヒトAIMとマウスAIMのアミノ酸配列を図１９に示すが、これらのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたタンパク質であっても、AIMの機能を有する限り、本発明におけるAIMに該当する。
他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、サル）又は鳥類におけるAIMの相同タンパク質も本発明のAIMに該当する。当業者は、他の哺乳動物又は鳥類において、あるタンパク質がAIMの相同タンパク質であるか否か、配列類似性の高さや機能解析により判断することができる。
例えば、マウスAIMとヒトAIMとではアミノ酸配列の相同性が80％程度と高い。また、マウスAIMとヒトAIMとでは、SRCRドメインにおけるコンセンサスなシーケンス（CD5、CD6など、SRCRドメインを有する他の分子においても保存されているアミノ酸配列）が完全に一致している。
例として、ヒト、チンパンジー、イヌ、マウス、及びラットのAIMのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：１、２２、２３、２４及び２５に示す。
また、AIMは、生体内で産生されたものであっても、遺伝子組み換え技術によって作製した組換えAIMであってもよい。
【００１１】
本明細書において「AIMの機能」とは、AIMが生体内で発揮する分子レベル又は個体レベルのあらゆる機能を意味する。
例えば、動脈硬化巣マクロファージにおいてマクロファージのアポトーシスを抑制する機能、動脈硬化を維持又は促進する機能、脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を抑制する機能、脂肪細胞における脂肪滴の融解を促進する機能、脂肪細胞を縮小する機能、CD36と結合する機能、エンドサイトーシスによって脂肪細胞に取り込まれる機能、FASと結合する機能、FASの酵素活性を抑制する機能、及び抗肥満機能等が挙げられる。
【００１２】
本明細書において「AIMの機能を亢進又は抑制する化合物」とは、AIMの機能の全部又は一部を亢進又は抑制する化合物を意味し、候補化合物の中から選択される。AIMの機能を亢進又は抑制する化合物及び候補化合物のいずれも、低分子化合物、高分子化合物、ペプチド、タンパク質（例えば抗体）、核酸等どのような物質であってもよい。
また、候補化合物として、例えば、AIMフラグメントを用いてもよい。AIMフラグメントとは、AIMの一部からなるペプチド、又は当該ペプチドから１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたペプチドであって、各スクリーニングにおいてAIMに代わる機能を有するものが含まれる。AIMフラグメントは、例えば、5〜150アミノ酸、、5〜100アミノ酸、5〜30アミノ酸程度とすることができる。
AIMフラグメントは、例えば、AIMの機能ドメインや保存領域を含むペプチドから選択することができる。ここで、AIMの保存領域とは、SRCRを形成するのに必要な領域を意味する。
【００１３】
本明細書においてAIMが脂肪前駆細胞又は脂肪細胞に生じさせる表現型の変化とは、AIMの機能に基づいて脂肪前駆細胞又は脂肪細胞にもたらされ、且つ検出可能な表現型の変化であれば特に限定されないが、例えば、後述する脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化の抑制、脂肪細胞における脂肪滴融解、脂肪細胞肥大化の抑制等が挙げられる。
スクリーニング方法の第一の態様では、候補化合物の添加によって、AIMによってもたらされる表現型の変化が促進される場合、当該候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、当該変化が抑制される場合、当該候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択する。
スクリーニング方法の第一の態様の例を以下に示すが、第一の態様はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００１４】
スクリーニング方法の第一の態様の第一の例は、
(i)  脂肪前駆細胞を、脂肪細胞に分化する条件で培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(ii)  脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を評価する工程と、
(iii)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも分化の誘導効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択し、誘導効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択する工程と、を含む。
【００１５】
まず工程(i)について説明する。
本明細書において「脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化する条件」は、細胞培養のための基本培地に各種の成分を適宜添加して設定することができる。基本培地としては、たとえば、イーグル培地（Eagle's medium）、BME（basal medium Eagle's）、MEM（minimum essential medium）、DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）、RPMI1630培地、RPMI1640培地、ハムF10培地、ハムF12培地、199培地及びこれらを混合した培地が挙げられる。基本培地に添加する成分としては、ウシ胎児血清等の血清、細胞成長因子（EGF、FGF、IGF、TGF、NGF、BDNF、VEGF、G-CSF、GM-CSF、EPO、TPO、HGF、LIF、インターロイキン類等）、細胞接着因子（コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等）、ホルモン（インスリン、グルカゴン、プロラクチン、サイロキシン、成長ホルモン、FSH、LH、エストラジオール、グルココルチコイド等）、結合タンパク質（アルブミン、セルロプラスミン、トランスフェリン、リポタンパク質等）、脂質（プロスタグランディン、リン脂質、不飽和脂肪酸等）が挙げられる。
【００１６】
また、脂肪前駆細胞を効率よく脂肪細胞に分化させるために、培地にインスリン、デキサメタゾン（DEX）、イソブチルメチルキサンチン（IBMX）、IGF-1、インドメタシン、PPARγアゴニスト等を加えて刺激することも好ましく、特に、インスリン、DEX、及びIBMXを加えることが好ましい。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法に用いられる脂肪前駆細胞は、皮下又は内臓由来の脂肪組織から常法に従って調製してもよく、既存の株細胞（3T3-L1細胞等）を利用してもよい。また、脂肪細胞は間葉系幹細胞から脂肪前駆細胞を経て分化するので、例えばヒト骨髄由来の間葉系幹細胞やヒト骨髄ストローマ細胞を培養して得られた脂肪前駆細胞を用いてもよい。
【００１８】
脂肪前駆細胞は、上記の培地を用いて、任意の培養容器において培養することができる。培養は、例えば、37℃〜40℃で、5％CO2の条件下で行うことができ、培地を1〜数日に1回交換することが好ましい。
【００１９】
本発明に係るスクリーニング方法は、脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化する条件下で培養する際、培地にAIMのみ、又はAIMと候補化合物を加える。
AIMを添加する時期及び濃度は特に限定されないが、例えば、濃度が0.1〜50μg/ml、好ましくは1〜10μg/mlとなるように培地に加えることが好ましい。また、インスリン、DEX、IBMX等を加えて分化誘導を刺激する場合は、刺激期間と同時期にAIMを添加することが好ましい。
【００２０】
次に工程(ii)について説明する。工程(ii)では、AIMのみを培地に加えた場合と、AIMと候補化合物とを加えた場合のそれぞれにおける脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化の程度を定量的に調べ、比較する。
脂肪細胞への分化を定量的に調べる方法は、特に限定されず、公知の方法又はそれに準ずる方法に従って簡単に行うことができる。
例えば、脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化すると、細胞内に脂肪滴が生成されるので、この形態の変化を観察することにより、分化誘導の効率を簡便に評価することができる。形態変化の観察は、肉眼、顕微鏡、Time-lapseビデオ等で行うことができる。
また、脂肪滴の生成を観察する場合、oil-red-Oにより染色することも好ましい。oil-red-Oは脂溶性色素であり、脂肪細胞内の脂肪滴を赤く染色する。従って、細胞が赤く染色される程度が強いほど分化が進んだことを示す。
【００２１】
工程(ii)の別の態様として、脂肪細胞特異的に発現する脂肪細胞マーカー、脂肪前駆細胞特異的に発現する脂肪前駆細胞マーカー、及び間葉系幹細胞特異的に発現する間葉系幹細胞マーカーのいずれかの発現を測定することも好ましい。
本明細書において「発現」は、DNAを鋳型としてmRNAが産生される転写と、mRNAがもつ情報に従ってタンパク質が生成される翻訳の両方を含む用語として用いられる。
本明細書において「脂肪細胞特異的」とは、分化した脂肪細胞では発現し、脂肪前駆細胞及び間葉系幹細胞では発現しないことを意味する。「脂肪前駆細胞特異的」及び「間葉系幹細胞特異的」は、脂肪前駆細胞又は間葉系幹細胞では発現し、分化した脂肪細胞では発現しないことを意味する。
脂肪細胞マーカー、即ち分化に伴って発現が上方制御されるマーカーとしては、PPARγ1、PPARγ2、C/EBPα、CD36、Glucose transporter 4 (GLUT-4)、aP2等が挙げられる。PPARγ1、PPARγ2、及びC/EBPαは、脂質生成のマスター調節遺伝子であり（Rosen, E.D. et al., Mol. Cell, 1999, 4:611-617; Wu, Z. et al., Cell Biol., 1999, 11:689-694; Farmer, S.R., Cell Metab., 2006, 4:263-73）、CD36及びGLUT-4は、脂肪細胞に特有の下流遺伝子である。
脂肪前駆細胞マーカー、即ち分化に伴って発現が下方制御されるマーカーとしては、例えばPREF-1が挙げられる。
間葉系幹細胞マーカー、即ち分化に伴って発現が下方制御されるマーカーとしては、例えばCD105が挙げられる。
マーカーの発現をmRNAレベルで測定する場合は、例えば、定量的RT-PCR、定量的リアルタイムPCR、ノーザンブロッティング、RNaseプロテクションアッセイ等を用いることができる。また、タンパク質レベルで測定する場合には、ELISA法等によって行うことができる。
【００２２】
脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を評価する工程のさらに別な態様として、アディポネクチン、レプチン、レジスチン等、脂肪細胞のみが産生するアディポサイトカインを測定することも好ましい。アディポサイトカインは、例えばELISA法等で検出することができ、多く産生されているほど、分化が進んでいると評価することができる。
【００２３】
脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を評価する工程のさらに別な態様として、細胞質のトリグリセリドの定量、脂肪合成活性（GPDH）の測定が挙げられる。これらの指標はいずれも増加するほど分化が進んでいると評価することができる。
【００２４】
次に、工程(iii)について説明する。工程(iii)では、工程(ii)の評価の結果に基づいて、候補化合物の中から、AIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択する。
具体的には、工程(ii)においてAIMのみを培地に加えた場合と、AIMと候補化合物とを加えた場合のそれぞれにおける脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化の程度を定量的に調べて比較した結果、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも分化の誘導効率が上昇している場合には、その候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する。
【００２５】
後述する実施例に示されるとおり、AIMは脂肪細胞の分化を抑制する。従って、脂肪細胞への分化誘導の効率を上昇させる候補化合物は、AIMの機能の全部又は一部を抑制することによって、AIMによる脂肪細胞の分化抑制を抑制しているものと考えられる。
一方、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも分化の誘導効率が低下している場合には、その候補化合物をAIMの機能を亢進させる化合物として選択する。脂肪細胞への分化誘導の効率を低下させる候補化合物は、AIMの機能の全又は一部を亢進させることによって、AIMによる脂肪細胞の分化抑制を促進しているものと考えられる。
【００２６】
AIMの機能を亢進させる化合物は、上述したAIMの機能のうち生体に好ましい機能（例えば、脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を抑制する機能、脂肪細胞における脂肪滴の融解を促進する機能、脂肪細胞を縮小する機能、抗肥満機能等）を亢進させるために好適に用いられ、例えば抗肥満薬として有用である。
また、AIMの機能を抑制する化合物は、上述したAIMの機能のうち生体に好ましくない機能（例えば、動脈硬化巣においてマクロファージのアポトーシスを抑制する機能、動脈硬化を維持又は促進する機能）を抑制するために好適に用いられ、例えば抗動脈硬化薬として有用である。
【００２７】
スクリーニング方法の第一の態様の第二の例は、
(a)  脂肪細胞を培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(b)  前記脂肪細胞中の脂肪滴融解を評価する工程と、
(c)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも脂肪滴融解効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択し、脂肪滴融解効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択する工程と、を含む。
【００２８】
工程(a)における脂肪細胞は、既存の株細胞を使用することもできるし、上記工程(i)の従って脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させて使用することもできる。脂肪細胞の培地は、上述した細胞培養のための基本培地に、各種の成分を添加して適宜調製することができる。
AIM、又はAIMと候補化合物の添加も、上記工程(i)の説明に従って行うことができる。
【００２９】
次に、工程(b)について説明する。工程(b)では、AIMのみを培地に加えた場合と、AIMと候補化合物とを加えた場合のそれぞれにおける脂肪滴融解の程度を定量的に調べ、比較する。
脂肪滴融解を定量的に調べる方法は、特に限定されず、公知の方法又はそれに準ずる方法に従って簡単に行うことができる。
例えば、脂肪滴融解が起こると、脂肪細胞の培養上清中にグリセロール又は遊離脂肪酸が放出されるので、培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸を定量することにより、脂肪滴融解の程度を簡便に評価することができる。グリセロール又は遊離脂肪酸の定量は、市販のキットを使用して行うことができる。培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸の濃度が高くなっているほど、脂肪滴融解の効率が上昇していることを示す。
【００３０】
また、工程(b)の別の態様として、脂肪滴形成関連遺伝子の発現を測定することも好ましい。脂肪滴形成関連遺伝子とは、その発現量が、脂肪滴の形成と正の相関性を示す遺伝子であり、例えば、FSP27、Perilipin、Adipophilinが挙げられる。これらの遺伝子の発現量が低下しているほど、脂肪滴融解の効率が上昇していることを示す。
脂肪滴形成関連遺伝子のmRNAレベルの発現は、定量的RT-PCR、定量的リアルタイムPCR、ノーザンブロッティング、RNaseプロテクションアッセイ等で測定することができ、タンパク質レベルの発現はELISA法等で測定することができる。
【００３１】
工程(b)のさらに別の態様として、oil-red-Oにより染色し、顕微鏡で観察する方法も簡便で好ましい。染色される脂肪滴が少ないほど、脂肪滴融解の効率が上昇していることを示す。
【００３２】
スクリーニング方法の第一の態様の第三の例は、
(1)  脂肪細胞を培養し、培地にAIMのみ、又は、AIMと候補化合物を加える工程と、
(2)  前記脂肪細胞の大きさを評価する工程と、
(3)  AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも脂肪細胞が大きくなっている場合には、前記候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択し、脂肪細胞が小さくなっている場合には、前記候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択する工程と、を含む。
工程(1)は、上記工程(a)と同様に行うことができる。工程(2)は、例えば、細胞を常法に従ってヘマトキシリン−エオシン（HE）染色し、顕微鏡で観察して行うことができる。
【００３３】
工程(3)においては、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも脂肪細胞が大きくなっている場合には、その候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する。後述する実施例に示されるとおり、AIM+/+マウス及びAIM-/-マウスに高脂肪食を与えると、AIM+/+マウスの脂肪細胞のサイズは、AIM-/-マウスの脂肪細胞のサイズに比較して有意に小さくなる。従って、脂肪細胞のサイズを大きくする候補化合物は、AIMの機能の全部又は一部を抑制することによって、AIMによる脂肪細胞の縮小機能を抑制しているものと考えられる。
【００３４】
一方、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも脂肪細胞が小さくなっている場合には、その候補化合物をAIMの機能を亢進させる化合物として選択する。
脂肪細胞のサイズを小さくする候補化合物は、AIMの機能の全部または一部を亢進させることによって、AIMによる脂肪細胞の縮小機能を促進しているものと考えられる。
【００３５】
スクリーニング方法の第二の態様は、候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMを培地に加えて脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養する工程と、細胞へのAIMの取り込みを評価する工程と、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりも取り込み効率が上昇している場合には、候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、取り込み効率が低下している場合には、候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する工程と、を含むことを特徴とする。
培養工程は、上記工程(i)又は工程(a)の説明に従って行うことができる。AIMを添加する時期及び濃度は特に限定されないが、例えば、濃度が0.1〜100μg/ml、好ましくは1〜50μg/mlとなるように培地に加えることが好ましい。候補化合物を添加する時期及び濃度も特に限定されず、候補化合物の種類に応じて当業者が容易に決定することができる。候補化合物の濃度を変えて、複数回実験を行うことも好ましい。
【００３６】
「細胞へのAIMの取り込みを評価する工程」は、特定のタンパク質の細胞内への取り込みを検出する各種方法を用いて行うことができる。例えば、AIM自体に予め検出可能な物質を結合させ、当該物質を検出して細胞内のAIM量を評価してもよい。また、組換えAIMを使用する場合、検出可能なタンパク質との融合タンパク質として発現させ、当該検出可能なタンパク質を検出することによって細胞内のAIMを定量することもできる。
【００３７】
また、細胞へのAIMの取り込みを評価する工程は、検出可能に標識した抗AIM抗体をAIMに結合させて、細胞内のAIM量を評価することも好ましい。具体的には、培養工程後に細胞をパラホルムアルデヒド等で固定し、透過性を付与して、検出可能に標識した抗AIM抗体とともにインキュベートする。当該工程により、抗AIM抗体は細胞内のAIMに結合するので、抗AIM抗体の標識を検出することにより、細胞内のAIMの量を測定することができる。
検出可能に標識した抗AIM抗体とは、抗AIM抗体に検出可能な物質を直接又は間接的に結合させた抗体を意味する。検出可能な物質としては、例えば、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等）、補欠分子族（ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン等）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等）、発光物質（ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン）、放射性物質（125I、131I、35S、3H）、金微粒子や量子ドット等が挙げられる。
抗AIM抗体は、公知のもの又は新規に作製したものを使用できる。
検出可能に標識した抗AIM抗体を、各標識に適した方法で検出することにより、脂肪細胞内に取り込まれたAIMを定量的に評価することができる。
【００３８】
なお、検出可能に標識したAIMも、検出可能に標識した抗AIM抗体と同様の検出可能な物質を用いて作製することができる。標識物質がタンパク質である場合、当該標識物質とAIMとの融合タンパク質として発現させてもよい。
【００３９】
上述の方法でAIMの細胞への取り込みを評価し、候補化合物の存在下又は非存在下で培養を行った場合に細胞内に取り込まれたAIMの量を比較する。候補化合物を投与した場合に、取り込み効率が低下すれば、当該候補化合物は、細胞へのAIMの取り込みを阻害することによってAIMの機能を抑制するものと考えられ、AIMの機能を抑制する化合物として選択される。一方、当該候補化合物が、細胞へのAIMの取り込みを亢進させた場合、その化合物は、AIMの機能を亢進する化合物として選択される。
【００４０】
スクリーニング方法の第三の態様は、候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMを培地に加えて脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養する工程と、細胞中でのAIMとFASの結合を評価する工程と、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりもAIMとFASの結合が増加している場合には、候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、結合が減少している場合には、候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する工程と、を含むことを特徴とする。
【００４１】
培養工程は、上記工程(i)又は工程(a)の説明に従って行うことができる。AIMを添加する時期及び濃度は特に限定されないが、例えば、濃度が0.1〜100μg/ml、好ましくは1〜50μg/mlとなるように培地に加えることが好ましい。候補化合物を添加する時期及び濃度も特に限定されず、化合物の種類に応じて当業者が容易に決定することができる。候補化合物の濃度を変えて、複数回実験を行うことも好ましい。
【００４２】
「細胞中でのAIMとFASの結合を評価する工程」は、細胞内でタンパク質が複合体を形成することを確認するためのあらゆる方法を用いて行うことができ、例えば、免疫沈降法とイムノブロッティングを組み合わせて行うことが好ましい。具体的には、まず細胞のライゼートを調製し、常法に従って抗AIM抗体を用いた免疫沈降を行う。AIMがFASと複合体を形成していれば、免疫沈降における沈降物にもFASが含まれるので、抗FAS抗体を用いたイムノブロッティングで当該FASを検出する。FASの検出量は、FASとAIMの複合体の量に比例する。
【００４３】
次に、候補化合物の存在下と非存在下で培養を行った場合における、AIMとFASの複合体の量を比較する。AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりもAIMとFASの結合が増加している場合には、候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、結合が減少している場合には、候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する。
【００４４】
スクリーニング方法の第四の態様は、候補化合物の中からAIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、候補化合物の存在下又は非存在下で、AIMを培地に加えて脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養する工程と、細胞中でのFASの活性を評価する工程と、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりもFASの活性が低下している場合には、候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、FASの活性が亢進している場合には、候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択することを特徴とする。
【００４５】
培養工程は、上記工程(i)又は工程(a)の説明に従って行うことができる。AIMを添加する時期及び濃度は特に限定されないが、例えば、濃度が0.1〜100μg/ml、好ましくは1〜50μg/mlとなるように培地に加えることが好ましい。選択化合物を添加する時期及び濃度も特に限定されず、化合物の種類に応じて当業者が容易に決定することができる。選択化合物の濃度を変えて、複数回実験を行うことも好ましい。
【００４６】
「細胞中でのFASの活性を評価する工程」は、FASの活性を測定できるあらゆる方法を用いて行うことができ、たとえば、Kellyらの方法（Kelley et al., Biochem. J. 235, 87-90, 1986）又はこれに修正を加えた方法を用いることが好ましい。
具体的には、細胞のライゼートをアセチルCoA又はNADPHと混合し、マロニルCoAを加えて酵素反応を開始させる工程と、酵素反応の開始の前後にわたって、細胞のライゼートのODを測定し、測定結果に基づいて酸化されたNADPHを算出し、FASの酵素活性を評価する工程と、を含む方法とすることができる。
【００４７】
次に、候補化合物の存在下と非存在下で培養を行った場合における、FASの活性を比較する。AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときよりもFASの活性が低下している場合には、候補化合物をAIMの機能を亢進する化合物として選択し、FASの活性が亢進している場合には、候補化合物をAIMの機能を抑制する化合物として選択する。
【００４８】
スクリーニング方法の第五の態様は、候補化合物の中からAIMの機能を抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、非ヒト肥満モデル動物に候補化合物を投与する工程と、前記非ヒト肥満モデル動物における体重、脂肪の量、脂肪前駆細胞マーカー発現、及び脂肪滴形成関連遺伝子発現からなる群より選択される少なくとも一つの指標を評価する工程と、前記評価工程と並行して、前記非ヒト肥満モデル動物における血中AIM濃度の変化を測定する工程と、を含むことを特徴とする。
高脂肪食（HFD）を与えると、AIMノックアウトマウスは、正常マウスに比較して、内臓脂肪及び皮下脂肪の増加が速く、また、HFDを与えて肥満したAIMノックアウトマウスにAIMタンパク質を投与すると、体重及び脂肪組織量の増加が抑制される。
従って、AIMをノックアウトしていない非ヒト肥満モデル動物に候補化合物を投与したときに、体重及び／又は脂肪量が増加する場合又は増加が抑制されない場合、脂肪前駆細胞マーカー発現が増加する場合、脂肪滴形成関連遺伝子発現が増加する場合は、当該候補化合物はAIMの機能を抑制する化合物として選択される。
また、これらの指標の測定と並行して、当該非ヒト肥満モデル動物における血中AIM濃度の変化を測定することにより、候補化合物が直接的又は間接的にAIMに作用することによってこれらの指標の変化を生じさせていることを確認することができる。
仮に、血中AIM濃度に変化が見られなければ、当該候補化合物は、AIMの機能を調節する化合物ではなく、他の作用機序によって、上記指標を変化させているものと判断される。
【００４９】
第五の態様に用いられる非ヒト肥満モデル動物は、通常の方法、例えばHDFを与えることによって作製することができる。また、非ヒト肥満モデル動物への候補化合物の投与は、例えば、静脈注射により行うことができる。脂肪量の増減を指標とする場合、脂肪組織に局所注射してもよい。投与は、例えば数日から数週間継続的に、又は非継続的に繰り返し行うことが好ましい。
【００５０】
スクリーニング方法の第六の態様は、候補化合物の中からAIMの機能を抑制する化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、AIMと、CD36又はFASタンパク質との結合及び／又は相互作用を阻害する化合物を選択することを特徴とする。
AIMと、CD36又はFASタンパク質との結合及び／又は相互作用を阻害する化合物を選択する工程は、タンパク質同士の結合を検出するあらゆる方法を用いて行うことができるが、例えば、候補化合物の存在下又は非存在下で、検出可能に標識したAIMとCD36又はFASとを反応させ、AIMの標識を検出することにより、候補化合物によってAIMとCD36又はFASとの結合及び／又は相互作用が増減するか評価する工程を含む。
例えば、CD36（又はCD36を発現する細胞）又はFASをマイクロタイタープレートやマイクロアレイに固定し、ここに検出可能に標識したAIMと候補化合物を加えてインキュベートした後、一旦洗浄し、CD36又はFASに結合したAIMを定量する。
一方で、コントロールとして、CD36又はFASをマイクロタイタープレートやマイクロアレイに固定し、ここに検出可能に標識したAIMを加えてインキュベートした後、一旦洗浄し、CD36又はFASに結合したAIMを定量する。
AIMの結合量を比較することによって、候補化合物が、AIMとCD36又はFASとの結合にどのように影響するかを調べることができる。
かかる方法は、大量の候補化合物の中からAIMとCD36又はFASを効率よく選択するハイスループットなスクリーニング方法として有用である。
なお、本態様においても、FASは、FAS分子全体を用いてもよく、FASの一部のドメインを用いてもよく、DH、ER、TE及びCCからなる群より選択される少なくとも一つのドメインが好ましい。
【００５１】
上述したスクリーニング方法において、AIMは、AIM分子全体を用いてもよく、またAIMフラグメントを用いてもよい。
【００５２】
上述した本発明に係るスクリーニング方法は、多くの候補化合物の中からAIMの機能又は発現を調節する化合物を探索するために有効である。
また、本発明に係るスクリーニング方法は、候補化合物として、特定の医薬を用い、当該医薬がAIMの機能又は発現を亢進させるのか抑制するのか確認するためにも有用である。上述のとおり、AIMは生体内において好ましい機能と好ましくない機能を併せ持つことから、ある医薬を患者に投与する前に、当該医薬がAIMにどのように作用するのか確認することは有用である。
（AIMの発現を調節する化合物のスクリーニング方法）
AIMの発現を調節する化合物を選択するためのスクリーニング方法は、
(I)  マクロファージと脂肪前駆細胞を、脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化する条件で、候補化合物の存在下又は非存在下で共培養する工程と、
(II)  前記脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を評価する工程と、
(III)  候補化合物の存在下で、候補化合物の非存在下よりも、分化の誘導効率が上昇している場合には、前記候補化合物をAIMの発現を抑制する化合物として選択し、分化の誘導効率が低下している場合には、前記候補化合物をAIMの発現を亢進する化合物として選択する工程と、を含む。
【００５３】
工程(I)のマクロファージと脂肪前駆細胞との共培養は常法を用いて行うことができ、例えば、上述した工程(i)の脂肪前駆細胞の培地にマクロファージを加えることによって行うことができる。
工程(II)の脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を評価する工程は、工程(ii)と同様に行うことができる。
【００５４】
上述のとおりAIMは、マクロファージに産生され、脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を抑制する。従って、候補化合物がAIMの発現を亢進させる場合、マクロファージがAIMを過剰発現し、これが脂肪前駆細胞に作用して脂肪細胞への分化の誘導効率を低下させる。一方、候補化合物がAIMの発現を抑制する場合、マクロファージによるAIMの産生量が減少するので、脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化の誘導効率は上昇する。
そこで、工程(III)では、候補化合物の存在下で、候補化合物の非存在下よりも、分化の誘導効率が上昇している場合には、その候補化合物をAIMの発現を抑制する化合物として選択し、分化の誘導効率が低下している場合には、その候補化合物をAIMの発現を亢進する化合物として選択する。
【００５５】
AIMの発現を調節する化合物を選択するためのスクリーニング方法においては、候補化合物として、例えば、AIM遺伝子の一部に相補的な配列からなる核酸、当該核酸と当該核酸に相補的な配列からなる二本鎖核酸、及びAIM遺伝子の一部を認識するリボザイムからなる群より選択されるものを用いることができる。
【００５６】
AIM遺伝子の一部に相補的な配列からなる核酸は、アンチセンス核酸としてAIMの発現を抑制しうる。アンチセンス核酸は、標的遺伝子（基本的には転写産物であるmRNA）に相補的な塩基配列を有し、一般的には10塩基長〜100塩基長、好ましくは15塩基長〜30塩基長の一本鎖核酸である。アンチセンス核酸を細胞内に導入し、標的遺伝子にハイブリダイズさせることによって遺伝子の発現が阻害される。アンチセンス核酸は、標的遺伝子の発現阻害効果が得られる限り、標的遺伝子と完全に相補的でなくてもよい。アンチセンス核酸は、公知のソフトウエア等を用いて当業者が適宜設計することができる。アンチセンス核酸は、DNA、RNA、DNA-RNAキメラのいずれであってもよく、また修飾されていてもよい。
【００５７】
AIM遺伝子の一部に相補的な配列からなる核酸と当該核酸に相補的な配列からなる二本鎖核酸は、AIM遺伝子に対してRNAi効果を有しうる。
RNAi効果は、二本鎖核酸によって誘導される配列特異的な遺伝子発現抑制機構である。標的特異性が非常に高く、生体内にもともと存在する遺伝子発現抑制メカニズムを利用する方法なので安全性が高い。
RNAi効果を有する二本鎖核酸としては、例えば、siRNAが挙げられる。siRNAは、哺乳動物細胞に用いられる場合、通常19〜30塩基程度、好ましくは21塩基〜25塩基程度の二本鎖RNAである。但し、細胞内で酵素（Dicer）により切断されてsiRNAとなり得るより長い二本鎖RNAであってもよい。RNAi効果を有する二本鎖核酸は、一般に、その一方が標的核酸の一部と相補的な塩基配列を有し、他方がこれに相補的な配列を有する。RNAi効果を有する二本鎖核酸は、互いに3’末端に2塩基の突出塩基（オーバーハング）を有していることが一般的であるが、オーバーハングを有しないブラントエンド型であってもよい。例えば、25塩基のブラントエンドRNAは、インターフェロン応答遺伝子の活性化を最小にし、センス鎖由来のオフターゲット効果を防ぎ、血清中で安定性が非常に高いという利点を有し、in vivoでの使用にも適している。
RNAi効果を有する二本鎖核酸は、標的遺伝子の塩基配列に基づき、公知の方法に従って設計することができる。また、RNAi効果を有する二本鎖核酸は、二本鎖RNAであってもよいし、DNA-RNAキメラ型二本鎖核酸であってもよく、人工核酸や各種の修飾が施された核酸であってもよい。
AIM遺伝子の一部に相補的な配列からなる核酸と当該核酸に相補的な配列からなる二本鎖核酸を含む限り、ショートヘアピンRNA（shRNA）であってもよいし、micro RNA（miRNA）であってもよい。
【００５８】
リボザイムは、標的RNAを触媒的に加水分解する核酸分子であり、標的RNAと相補的な配列を有するアンチセンス領域と、切断反応を担う触媒中心領域から構成されている。リボザイムは当業者が公知の方法に従って適宜設計することができる。リボザイムは一般的にはRNA分子であるが、DNA-RNAキメラ型分子を用いることもできる。
【００５９】
（AIM遺伝子をノックアウトしたES細胞クローン等）
本発明は、AIM遺伝子をノックアウトしたES細胞クローン、AIM遺伝子を導入したES細胞クローン、AIM遺伝子をノックアウトした動物に由来する胚、及びAIM遺伝子を導入した動物に由来する胚の新規な用途、即ちAIM活性調節剤のスクリーニングのための用途も提供する。
具体的には、
AIMの機能を亢進又は抑制する化合物のスクリーニングに用いるためのAIM遺伝子ノックアウト非ヒト動物またはAIM遺伝子ノックアウト非ヒト動物由来の細胞を作製するための、AIM遺伝子をノックアウトしたES細胞クローンの使用方法；
AIMの機能を亢進又は抑制する化合物のスクリーニングに用いるためのAIM遺伝子トランスジェニック非ヒト動物またはAIM遺伝子トランスジェニック非ヒト動物由来の細胞を作製するための、AIM遺伝子を導入したES細胞クローンの使用方法；
AIMの機能を亢進又は抑制する化合物のスクリーニングに用いるためのAIM遺伝子ノックアウト非ヒト動物またはAIM遺伝子ノックアウト非ヒト動物由来の細胞を作製するために使用する、AIM遺伝子をノックアウトした動物に由来する胚の使用方法；及び
AIMの機能を亢進又は抑制する化合物のスクリーニングに用いるためのAIM遺伝子トランスジェニック非ヒト動物またはAIM遺伝子トランスジェニック非ヒト動物由来の細胞を作製するために使用する、AIM遺伝子を導入した動物に由来する胚の使用方法、である。
非ヒト動物は、もともとAIMを発現する動物であれば特に限定されないが、例えば、マウス、ラット等が好ましい。
【００６０】
また、本発明は、AIM遺伝子をノックアウトしたES細胞、又はAIM遺伝子に変異を加えたES細胞を分化させて作製したマクロファージも包含する。
AIM遺伝子をノックアウトしたES細胞、及びAIM遺伝子に変異を加えたES細胞は、公知の方法に従って作製することができる。また、これらのES細胞をマクロファージに分化させる方法も公知の方法又はそれに準ずる方法に従って行うことができる。
こうして得られたマクロファージを、AIMノックアウトマウスやマクロファージが欠損しているM-CSFノックアウトマウス等に導入し、肥満等への影響しらべることができる。
ES細胞は、通常利用される129系マウスやB6マウスのみならず、C3H、Balb/c、野生型マウス等、他の系統のマウスを用いてもよい。
【００６１】
また、本発明は、AIM遺伝子をノックアウトしたES細胞を分化させて作製した脂肪細胞も包含する。
かかる脂肪細胞は、どのような条件でもAIMを発現することがない。従って、当該脂肪組織から得た細胞は、AIMの機能を亢進又は抑制する化合物のスクリーニングにも用いることができる。
【００６２】
（AIM様化合物を選択するためのスクリーニング方法）
本発明は、AIM様化合物を選択するためのスクリーニング方法も包含する。
本発明に係るAIM様化合物を選択するためのスクリーニング方法は、
脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養し、培地に候補化合物を加える工程と、
前記脂肪細胞又は脂肪前駆細胞中での前記候補化合物とFASの結合、及びFASの活性を評価する工程と、
前記候補化合物がFASと結合し、FASの活性を低下させている場合、前記候補化合物をAIM様化合物として選択する工程と、
を含む。
【００６３】
本明細書において「AIM様化合物」とは、標的細胞に取り込まれ、細胞内でFASに結合してその活性を低下させる化合物を意味する。標的細胞に取り込まれ、細胞内でFASに結合してその活性を低下させる化合物は、これまでAIM以外に報告がない。従って、候補化合物が細胞内でFASに結合すること、及びFASの活性を低下させることを確認することにより、当該化合物がAIM様化合物であるか判定することができる。
【００６４】
脂肪細胞又は脂肪前駆細胞を培養し、培地に候補化合物を加える工程は、上述した工程(i)又は工程(a)に準じて行うことができる。
なお、AIM様化合物を選択するためのスクリーニング方法において「候補化合物」は、低分子化合物、高分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸等どのような物質であってもよいが、タンパク質が好ましい。
【００６５】
細胞中で候補化合物とFASの結合を評価する工程は、候補化合物の種類に応じて当業者が適宜行うことができる。
例えば、候補化合物に対する抗体及び抗FAS抗体を用い、まず細胞のライゼートを調製し、いずれか一方の抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降物についてもう一方の抗体を用いてイムノブロッティングを行うことにより、沈降物中に候補化合物とFASの複合体が存在するか否かを検出することができる。
【００６６】
細胞中でFASの酵素活性を評価する工程は、FASの活性を測定できるあらゆる方法を用いて行うことができ、たとえば、Kellyらの方法（Kelley et al., Biochem. J. 235, 87-90, 1986）又はこれに修正を加えた方法を用いることが好ましい。
具体的には、細胞のライゼートをアセチルCoA又はNADPHと混合し、マロニルCoAを加えて酵素反応を開始させる工程と、酵素反応の開始の前後にわたって、細胞のライゼートのODを測定し、測定結果に基づいて酸化されたNADPHを算出し、FASの酵素活性を評価する工程と、を含む方法とすることができる。
【００６７】
また、候補化合物の中からAIM様化合物を選択するためのスクリーニング方法の別の態様は、化合物の中からAIM様化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、候補化合物の中から、抗AIM抗体、CD36及びFASからなる群より選択される少なくとも一つと結合するものを選択する工程と、選択された候補化合物の中から、FAS活性を抑制するものを選択する工程と、を含むことを特徴とする。
抗AIM抗体、CD36及びFASのいずれかと結合し、且つFAS活性を抑制する場合、候補化合物はAIMと同様の機能を有するものと考えることができる。
候補化合物とFASの結合の有無は、候補化合物と、FASにおけるAIMとの結合ドメインであるDH、ER、TE及びCCからなる群より選択される少なくとも一つのドメインとの結合の有無によって確認してもよい。
【００６８】
また、AIM様化合物を、in vivoのスクリーニングによって選択することもできる。
当該スクリーニング方法は、候補化合物の中からAIM様化合物を選択するためのスクリーニング方法であって、AIMをノックアウトした非ヒト肥満モデル動物に候補化合物を投与する工程と、前記非ヒト肥満モデル動物における体重、脂肪の量、脂肪前駆細胞マーカー発現、及び脂肪滴形成関連遺伝子発現からなる群より選択される少なくとも一つの指標を評価する工程と、前記評価工程と並行して、前記非ヒト肥満モデル動物における血中AIM濃度の変化を測定する工程と、を含むことを特徴とする。
【００６９】
高脂肪食（HFD）を与えると、AIMノックアウトマウスは、正常マウスに比較して、内臓脂肪及び皮下脂肪の増加が速く、また、HFDを与えて肥満したAIMノックアウトマウスにAIMタンパク質を投与すると、体重及び脂肪組織量の増加が抑制される。
従って、AIMをノックアウトした非ヒト肥満モデル動物に候補化合物を投与したときに、体重及び／又は脂肪量が減少する場合又は増加が抑制される場合、脂肪前駆細胞マーカー発現が減少する場合、脂肪滴形成関連遺伝子発現が減少する場合は、当該候補化合物は、モデル動物の生体内においてAIM様の機能を有する化合物として選択される。
また、これらの指標の測定と並行して、当該非ヒト肥満モデル動物における血中AIM濃度の変化を測定することにより、候補化合物が直接的又は間接的にAIMに作用することによってこれらの指標の変化を生じさせていることを確認することができる。
仮に、血中AIM濃度に変化が見られなければ、当該候補化合物は、AIMの機能を調節する化合物ではなく、他の作用機序によって、上記指標を変化させているものと判断される。
【００７０】
AIMをノックアウトした非ヒト肥満モデル動物は、通常の方法、例えばAIMノックアウトマウスにHDFを与えることによって作製することができる。また、非ヒト肥満モデル動物への候補化合物の投与は、例えば、静脈注射により行うことができる。脂肪量の増減を指標とする場合、脂肪組織に局所注射してもよい。投与は、例えば数日から数週間継続的に、又は非継続的に繰り返し行うことが好ましい。
【００７１】
（スクリーニングのためのツールの使用方法）
本発明は、AIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するスクリーニングのための、以下のツールの使用方法も包含する。これらのツールを、AIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するためのスクリーニングに使用することは新規な知見である。
AIM又はそのフラグメント；
検出可能に標識したAIM若しくはAIMフラグメント；
抗AIM抗体又はそのフラグメント；
検出可能に標識した抗AIM抗体若しくはそのフラグメント；
AIM遺伝子の一部に相補的な配列からなる核酸、又は当該核酸と当該核酸に相補的な配列からなる二本鎖核酸；
AIM遺伝子の一部を認識するリボザイム；
マクロファージ；
脂肪細胞若しくは脂肪前駆細胞；
CD36；
FAS若しくはそのドメイン；
AIM高発現トランスジェニックマウス、AIMノックアウトマウス若しくはAIMノックダウンマウス；又は
AIM高発現トランスジェニックマウス、AIMノックアウトマウス若しくはAIMノックダウンマウス由来細胞。
（スクリーニング用キット）
また、本発明は、AIMの機能を亢進又は抑制する化合物を選択するスクリーニングのためのキットであって、以下のツールのうちの少なくとも一つを含むキットを包含する。
AIM又はそのフラグメント；
検出可能に標識したAIM若しくはAIMフラグメント；
抗AIM抗体又はそのフラグメント；
検出可能に標識した抗AIM抗体若しくはそのフラグメント；
AIM遺伝子の一部に相補的な配列からなる核酸、又は当該核酸と当該核酸に相補的な配列からなる二本鎖核酸；
AIM遺伝子の一部を認識するリボザイム；
マクロファージ；
脂肪細胞若しくは脂肪前駆細胞；
CD36；
FAS若しくはそのドメイン；
AIM高発現トランスジェニックマウス、AIMノックアウトマウス若しくはAIMノックダウンマウス；又は
AIM高発現トランスジェニックマウス、AIMノックアウトマウス若しくはAIMノックダウンマウス由来細胞。
【００７２】
スクリーニング用キットの一例は、AIMタンパク質又はそのフラグメントと、脂肪前駆細胞又は脂肪細胞と、脂肪前駆細胞又は脂肪細胞用の培地とを含み、スクリーニング方法で評価する指標によって、当該指標を検出するのに好適な構成要素をさらに含むことができる。
【００７３】
例えば、本発明に係るスクリーニング方法の第一の態様の第一の例ためのキットは、AIMタンパク質と、脂肪前駆細胞と、脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させるための培地とを含み、分化を評価する方法によって、oil-red-O；細胞固定液；脂肪細胞マーカー、脂肪前駆細胞マーカー、及び／又は間葉系幹細胞マーカーの遺伝子検出用プライマーをさらに含むことができる。
【００７４】
また、本発明に係るスクリーニング方法の第一の態様の第二の例ためのキットは、AIMタンパク質と、脂肪細胞と、脂肪細胞用の培地とを含み、脂肪滴の融解を評価する方法によって、培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸量を測定するための試薬、脂肪滴形成関連遺伝子検出用プライマー等をさらに含むことができる。脂肪細胞と脂肪細胞用の培地に代えて、脂肪前駆細胞と、脂肪前駆細胞を分化させるための培地を含むことも好ましい。
【００７５】
また、本発明に係るスクリーニング方法の第一の態様の第三の例のためのキットは、AIMタンパク質と、脂肪細胞と、脂肪細胞用の培地とを含み、脂肪細胞の大きさを評価する方法によって、ヘマトキシリン−エオシン染色に必要な試薬等をさらに含むことができる。脂肪細胞と脂肪細胞用の培地に代えて、脂肪前駆細胞と、脂肪前駆細胞を分化させるための培地を含むことも好ましい。
【００７６】
本発明に係るスクリーニング用キットは、さらに、AIMの作用機序を確認する方法に必要な試薬を含むことも好ましい。例えば、AIMの取り込みを検出するための検出可能に標識した抗AIM抗体、AIMとFASの結合を検出するための抗AIM抗体及び抗FAS抗体、FAS活性を測定するための試薬（例えば、アセチルCoA、NADPH、マロニルCoA）等を含むことができる。
また、本発明に係るスクリーニング用キットは、細胞培養容器その他の実験器具や、取り扱い説明書等を含むことも好ましい。
【００７７】
以下、本発明に係るスクリーニング方法の一態様をより具体的に説明する。
脂肪前駆細胞として3T3-L1細胞の分化をMadsenらの方法（Madsen, L. et al., Biochem. J. 375, 539-549, 2003）に従って行う。培養のスケジュールを図２に示す。
コンフルエント後2日（day 2）の3T3-L1脂肪前駆細胞を分化用培地（例えば、1μg/mlインスリン、1μM DEX、0.5mM IVMX、10％FBSを含むDMEM培地）で2日間（day 2からday 4）培養する。この際、培地にAIM（例えば5μg/mlの組換えAIM）のみ、又はAIMと候補化合物を加える。
細胞を、維持培地（例えば、10％FBS及び1μg/mlインスリンを含むDMEM培地）でさらに2日間（day 4からday 6）培養した後、培地がインスリンを含む場合インスリンを除去する。培地は2日に一度交換し、day 12に細胞を回収して、形態及び遺伝子発現の分析を行う。形態学的分析は、脂肪細胞中の脂肪滴をoil-red-Oで染色して行う。また、脂肪細胞の分化に伴って著しく上方制御される脂肪細胞マーカー（例えば、PPARγ1、PPARγ2、C/EBPα、CD36、Glut-4）のmRNAレベルを、定量的RT-PCR（QPCR）で測定する。
AIMのみを加えた場合と、AIMと候補化合物を加えた場合の形態学的分析及び死亡細胞マーカーの発現解析の結果を比較する。形態学適分析において、候補化合物を加えた場合に脂肪滴がより多ければ、当該候補化合物は抗AIM化合物として選択される。また、発現解析において、候補化合物を加えた場合に脂肪細胞マーカーの発現がより多ければ、当該候補化合物は抗AIM化合物として選択される。
【００７８】
続いて、選択された抗AIM化合物がCD36を介したAIMの取り込みを阻害するか否か評価するために、様々な濃度の抗AIM化合物の存在下又は非存在下でAIM（例えば、10μg/ml）を3T3-L1細胞の培地に添加する。3時間経過後、細胞をパラホルムアルデヒド（4% in PBS）で固定し透過性を付与して、抗AIM抗体（例えば、SA-1（Arai, S. et al., 2005, Cell Metab., 2005, 1:201-213）を使用してAIMを染色する。サンプルを共焦点顕微鏡で観察し、当該抗AIM化合物が、脂肪細胞へのAIMの取り込みを低下させるか否か分析する。抗AIM化合物の存在下で、脂肪細胞へのAIMの取り込みが低下する場合、当該抗AIM化合物は、細胞へのAIMの取り込みを阻害することによって、AIMの機能を抑制していると考えられる。一方、脂肪細胞によるrAIMの取り込みに影響を与えない化合物は、FASに関する分析に供する。
【００７９】
抗AIM化合物が、AIMとFASとの結合を阻害するか否か評価するため、3T3-L1細胞の培地に様々な濃度の候補化合物の加えて、又は加えないで、3T3-L1細胞（例えば、図２において、インスリン、DEX及びIBMXで刺激したday 4以降の細胞）をAIM（例えば、10μg/ml）とインキュベートする。6時間インキュベートした後、細胞のライゼートを調製し、取り込まれたAIMを抗AIM抗体（例えば、SA-1抗体）で沈降させる。次いで、抗FAS抗体を用いたイムノブロッティングにより沈降物中のFASを測定する。抗AIM化合物を加えた場合に、AIMとFASの複合体が減少していれば、当該抗AIM化合物はAIMとFASの結合を阻害することによって、AIMの機能を抑制していると考えられる。
【００８０】
一方、細胞内におけるFASの活性を評価するため、3T3-L1細胞の培地に様々な濃度の候補化合物の加えて、又は加えないで、3T3-L1細胞（例えば、図２において、インスリン、DEX及びIBMXで刺激したday 4以降の細胞）をAIM（例えば、10μg/ml）とインキュベートする。6時間インキュベートした後、細胞のライゼートを調製し、0.4mM EDTAを含む0.2Mリン酸カルシウム緩衝液（pH 7.0）中でアセチルCoA及びNADPHと混合し、30℃に調整した分光光度計のキュベットに投入する。マロニルCoA溶液（0.2mM）を20μl加えて酵素反応を開始させ、ODの減少を2cm/minのチャートスピードで追跡する。結果に基づいて、FASの酵素活性は、ε＝6,220 M-1 cm-1として酸化されたNADPHを算出して評価することができる。
抗AIM化合物を加えた場合に、FASの活性が低下していれば、当該抗AIM化合物はAIMとFASの結合を阻害することによって、AIMの機能を抑制していると考えられる。
【００８１】
本発明は、本発明に係るスクリーニング方法により選択される化合物も包含する。
本発明に係るスクリーニング方法により選択された化合物は、AIMに関連する疾患に対する医薬として用いられる可能性が高く、例えば、動脈硬化の治療剤としてヒト又はヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、サル）、鳥類等に有効量投与することができる。
【００８２】
（AIM阻害剤）
後述する実施例8に示されるとおり、本発明者らは、本発明に係るスクリーニング方法により、AIMの機能を抑制する以下の化合物を見出した。これらの化合物も本発明に包含される。
【化１】
2011145722.tif 000002
【化２】
2011145722.tif 000003
【化３】
2011145722.tif 000004
【化４】
2011145722.tif 000005
これらの化合物は、本来AIMの添加によって誘導されるFSP27 ｍRNA発現の著しい減少を有意に抑制し、AIMの機能を阻害することが確認された。
また、後述する実施例9で得られた中和抗体（クローン11、12及び17）も、本来AIMの添加によって誘導されるFSP27 ｍRNA発現の著しい減少を有意に抑制し、AIMの機能を阻害することが確認された。
【実施例】
【００８３】
以下に示す実施例は、単なる例示であって、上述した実施形態と共に本発明を詳細に説明することのみを意図しており、本発明を限定するものではない。
実施例1.  脂肪組織中のマクロファージにおけるAIMの発現
野生型B6マウスに通常の餌を与えた痩せ型マウス（lean）と、高脂肪食（High Fat Diet：HFD、fat calorie 60%）を20週間与えた肥満マウス（obese）から、内臓脂肪組織を採取し、この脂肪組織から作製したパラフィン切片を抗マクロファージモノクローナル抗体（F4/80）、抗マウスAIMポリクローナル抗体（SA-1）、または抗IL-6抗体（MP520F3, R & D systems）にて二重染色した。【００８４】
図１に、染色された切片を蛍光顕微鏡で観察した結果の一例を示す。
抗マクロファージ抗体で染色された肥満マウスの脂肪組織中のマクロファージは、AIM特異的な抗体によっても染色された（obese 左レーン）。AIM陽性マクロファージは、IL-6も陽性であったことから（obese 右レーン）、炎症性マクロファージ（M1）であるものと考えられた。
一方、痩せ型マウスから採取した脂肪組織内のマクロファージは、AIM、IL-6のいずれも陰性であった。
また、脂肪細胞でAIMが発現されていないことを確かめるため、肥満マウス由来の脂肪組織（内臓組織の代表として精巣上体脂肪組織を使用）をコラゲナーゼ処理後に分画し、RT-PCRでAIMの発現を調べたが、精製された脂肪細胞においてAIMの発現は見られなかった。さらに、3T3-L1細胞をインスリン、DEX及びIBMXで処理した後、AIMの発現を調べたが、やはり発現は見られなかった。
以上の結果から、脂肪組織に浸潤したマクロファージがAIMを強く発現していることが確認された。【００８５】
実施例2.  AIMによる脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化の抑制機能
［脂肪滴形成による評価］
脂肪組織に浸潤したマクロファージが産生するAIMが周辺の脂肪細胞に対してどのような働きをしているのかを調べるため、3T3-L1脂肪前駆細胞（preadipocyte）を成熟脂肪細胞に分化させる培養過程でAIMを負荷する実験を行った。
図２に示すように、４つのスケジュールA〜Dにて3T3-L1細胞の培養を行った。（A）はAIMを負荷せず、（B）は分化誘導刺激開始から10日間（day2-day12）AIMを負荷し、（C）は分化誘導刺激の初期のみ（day2-day4）AIMを負荷し、（D）は分化誘導前の増殖（clonal expansion）期間のみ（day(-2)-day2）AIMを負荷した。【００８６】
AIMとしては、マウスの組換えAIMタンパク質（rAIM）を用いた。rAIMは、マウスAIMを発現するベクター（pCAGGS-mAIM-HAプラスミド）をトランスフェクションしたヒト由来HEK293T細胞を無血清培地（FreeStyleTM 293 Expression Medium; Invitrogen）で培養し、その培養上清から抗HA抗体カラムで単離精製することにより調製した。なお、以下に示す他の実施例においても、AIMとしては同様のrAIMタンパクを使用した。AIMの負荷は、培養液に5μg/mlの濃度でAIMを添加することにより行った。【００８７】
また、3T3-L1細胞の分化誘導は、図２に示すように、まず3T3-L1細胞を4日間（day(-2)-day2）培養して増殖させ、その後、インスリン、デキサメタゾン（DEX）、イソブチルメチルキサンチン（IBMX）を含有する培養液で2日間（day2-day4）培養することで分化誘導刺激を開始し、さらにインスリンを含有する培養液で2日間（day4-day6）培養することにより行った。【００８８】
分化誘導刺激期間（day2-day6）後は、これら分化誘導刺激因子を含有しない培養液にて培養を継続した。そして、分化誘導刺激開始から10日目（day12）の細胞をoil-red-Oにて染色し、3T3-L1細胞から成熟脂肪細胞への分化の状況を観察した。【００８９】
図３に、4つのスケジュールA〜Dのそれぞれについて、染色後の細胞の顕微鏡写真を示す。【００９０】
図３に示すように、スケジュールCにてAIMを分化誘導刺激の初期のみ（day2-day4）負荷した場合には、脂肪滴を有する細胞はほとんど観察されず、3T3-L1細胞の分化はほぼ完全に抑制されていた。すなわち、AIMは、上述の分化誘導因子の存在下で、3T3-L1細胞の分化を抑制した。【００９１】
なお、分化誘導因子とAIMとを含有する培養液を調製後、当該培養液から精製カラムを用いてAIMを除去した場合であっても、当該分化誘導因子による3T3-L1細胞を分化させる能力は失われなかった（data not shown）。したがって、分化誘導因子とAIMとの間では実質的に化学的な相互作用はないと考えられた。【００９２】
また、スケジュールBにてAIMを分化誘導刺激開始から10日間（day2-day12）負荷した場合も、脂肪滴を有する細胞はほとんど観察されず、3T3-L1細胞の分化はほぼ完全に抑制されていた。また、このようなAIMによる分化抑制効果は、AIMの濃度に依存することも確認された（data not shown）。3T3-L1細胞に負荷するAIMの濃度を1μg/ml、0.1μg/mlと減少させると、AIMによる分化抑制効果も低減された。【００９３】
また、AIMの負荷による死細胞数の増加は認められなかった。したがって、AIMによる分化抑制は、細胞死を誘導することなく、成熟脂肪細胞に分化する3T3-L1細胞の数を減少させることによるものと考えられた。【００９４】
一方、スケジュールDにてAIMを分化誘導前にのみ（day(-2)-day2）負荷した場合には、スケジュールAにてAIMを負荷しなかった場合と同様、ほとんどの細胞が脂肪滴を有しており、ほとんどの3T3-L1細胞が成熟脂肪細胞に分化していることが確認された。すなわち、AIMを分化誘導前のみに負荷しても、3T3-L1細胞の成熟脂肪細胞への分化は抑制されなかった。ただし、AIMを分化誘導前から分化誘導期間を経てその後も継続的に（day(-2)-day12）負荷した場合には、3T3-L1細胞の脂肪細胞への分化は完全に抑制された（data not shown）。【００９５】
また、ヒトrAIMを用いてAIM負荷をいったところ、同様にマウス由来3T3-L1細胞の分化を抑制した。これにより、ヒトとマウスの間で、AIMの機能について互換性のあることが示された。【００９６】
［脂肪細胞マーカーの発現による評価］
図２に示すスケジュールA〜Dにて培養された細胞を分化誘導刺激開始から10日目（day12）に回収し、脂肪細胞マーカー（C/EBPα, PPARγ1, PPARγ2, CD36, Glut4）のmRNAレベルの発現を、7500 Fast Real-Time PCR system （Invitrogen; CA, USA）を用いてΔΔCT法により測定した。使用したプライマーを表１に示す。
【表１】
2011145722.tif 000006
結果を図４に示す。スケジュールA及びDでは脂肪細胞マーカーが発現し、脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化していることが示された。一方、分化誘導刺激と同時にAIMを投与したスケジュールB及びDでは、脂肪細胞マーカーの発現が抑制されており、脂肪細胞への分化が抑制されていることが示唆された。この結果は、スケジュールA及びDでは脂肪滴が形成され、スケジュールB及びDでは形成されなかったことと一致する。【００９７】
以上のとおり、AIMは脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化を抑制する。また、分化の程度は、脂肪滴の生成の観察、又は、脂肪細胞マーカー、脂肪前駆細胞マーカー、間葉系幹細胞マーカーの検出によって、容易に調べることができる。
従って、脂肪滴の生成やマーカーの検出の結果、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときに比較して、分化の誘導効率が上昇している場合には、当該候補化合物はAIMの機能を抑制する化合物であり、分化の誘導効率が低下している場合には、当該候補化合物はAIMの機能を亢進させる化合物であると評価することができる。【００９８】
実施例3.  AIMによる脂肪細胞の脂肪滴の融解機能
［oil-red-Oによる評価］
分化した3T3-L1細胞に、図２のEに示すスケジュールでrAIM負荷（5μg/ml）を行った。rAIM負荷の前後でoil-red-O染色を行った。代表的な写真を図５Ａに示す。細胞内の脂肪滴は、rAIM負荷を行って6日間培養した後、著しく減少した（rAIM(+)）。
また、脂肪滴の相対サイズ（Relative droplet size）は、50個の脂肪滴の直径の平均から求めた。エラーバーは、標準誤差を示す。単位面積当たりの脂肪滴含有細胞の数は、5つの異なる視野において計測し、平均を求めた。それぞれの結果を図５Ｂ、Ｃに示す。
脂肪滴の相対サイズ、脂肪滴含有細胞の数のいずれも有意に減少した。
この結果は、rAIMが脂肪滴融解を引き起こし、脂肪滴に含まれるグリセロールや遊離脂肪酸が上清中に放出されたことを示唆する。【００９９】
［培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸量による評価］
3T3-L1脂肪細胞にrAIM負荷（5μg/ml）を開始した後、2日目、4日目、及び6日目における培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸の放出量を測定した。rAIM負荷後、PBSで2回洗浄し、無血清培地（FreeStyleTM293 Expression Medium; Invitrogen）中で5時間インキュベートした。バッファーを回収し、グリセロールアッセイキット、脂肪酸アッセイキット（いずれもBio Vision Inc.）を使用して、取扱説明書に従って測定した。
結果を図６に示す。rAIMを加えて培養すると、培養上清中のグリセロール及び遊離脂肪酸のいずれの量も有意に増加した。
この結果は、rAIMが脂肪滴融解を引き起こし、脂肪滴に含まれるグリセロールや遊離脂肪酸が上清中に放出されたことを示唆する。【０１００】
［脂肪滴形成関連遺伝子の発現による評価］
3T3-L1脂肪細胞にrAIM負荷（5μg/ml）を開始した後、2日目、4日目、及び6日目における脂肪滴形成関連遺伝子（FSP27、Perilipin、及びAdipophilin）のmRNAを、7500 Fast Real-Time PCR system （Invitrogen; CA, USA）を用いてΔΔCT法により測定した（それぞれにつきn=3）。
また、同様に、脂肪前駆細胞マーカーのPREF-1のmRNAも測定した。測定値はGAPDHで標準化した。使用したプライマーを表２に示す。
【表２】
2011145722.tif 000007
結果を図７に示す。0日目を1.0として相対的発現量を求めた。エラーバーは標準誤差を示す。
脂肪滴形成関連遺伝子の発現は、rAIM処理後2日目ですでに著しく低下していた。一方、脂肪前駆細胞マーカーの発現はrAIM処理の間増加しなかった。このことは、AIMが成熟脂肪細胞を脱分化させるものではないことを示唆する。【０１０１】
以上のとおり、AIMは成熟脂肪細胞において脂肪滴を融解させる。また、脂肪滴の融解の程度は、顕微鏡による観察、培養上清中のグリセロール又は遊離脂肪酸量の測定、脂肪滴形成関連遺伝子の発現の測定等によって、容易に調べることができる。
従って、培養上清中のグリセロール等を検出した結果、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときに比較して、脂肪滴融解の効率が低下している場合には、当該候補化合物はAIMの機能を抑制する化合物であり、脂肪滴融解の効率が上昇している場合には、当該化合物はAIMの機能を亢進させる化合物であると評価することができる。【０１０２】
実施例4.  AIMによる脂肪細胞の縮小機能
［HE染色による評価］
AIM+/+マウス(+/+)とAIM-/-マウス（-/-）（非特許文献１参照）に、高脂肪食（High Fat Diet; HFD）を20日間与え、脂肪組織の切片をHE染色した。顕微鏡の様々な視野において、50個の脂肪細胞の距離を測定し、平均±標準誤差を求めた。結果を図８Ａに示し、代表的な写真を図８Ｂに示す。AIM-/-マウスの内臓脂肪細胞は、AIM+/+マウスと比較して有意に大きかった。【０１０３】
以上のとおり、AIMは脂肪細胞の大きさを縮小する。縮小の程度は、顕微鏡によって容易に調べることができる。
従って、脂肪細胞の大きさを測定した結果、AIMと候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときに比較して、細胞の大きさが大きくなっている場合には、当該化合物はAIMの機能を抑制する化合物であり、細胞の大きさが小さくなっている場合には、当該化合物は、AIMの機能を亢進させる化合物であると評価することができる。【０１０４】
実施例5.  細胞表面のCD36を介した脂肪細胞へのAIMの取り込み
分化した3T3-L1細胞（ins/DEX/IBMX stimulation (+)）と、未分化の3T3-L1細胞（ins/DEX/IBMX stimulation (−)）を、rAIM（5μg/ml）と共に3時間インキュベートし、AIM、PPARγ2、及びDAPIを染色した。PPARγ2の染色にはウサギ抗PPARγ2ポリクローナル抗体（Abcam社）を用いた。結果を図９Ａに示す。
上段にAIMとDAPIで核を染色した結果を、中段にAIMとPPARγ2を染色した結果を、下段にAIM、PPARγ2、DAPIを染色した結果の位相コントラスト像を示す。AIMが脂肪細胞の細胞質に散在していることが観察された。
下段からわかるように、PPARγ2が高発現している細胞は、多くの脂肪滴を含んでいる。PPARγ2を高発現している細胞、十分に分化した成熟脂肪細胞である。”pre”と表記された右のレーンは、分化誘導刺激を行っていない未分化の3T3-L1脂肪前駆細胞である。
また図９Ｂに、PPARγ2の発現量ごとに細胞を分類し、各細胞100個当たりのrAIMが含まれる細胞数を示す。図示されたとおり、PPARγ2が高発現している成熟脂肪細胞ではrAIMが効率よく取り込まれ、PPARγ2の発現が低く十分に分化していない細胞ではrAIMの取り込み効率が著しく低いことがわかった。分化誘導刺激を行わなかった脂肪前駆細胞（pre）は、rAIMを取り込まなかった。【０１０５】
また、3T3-L1脂肪細胞をrAIMで3時間処理し、AIMとエンドソーム（FM 1-43FX, Invitrogen社を使用）、AIMとリソソーム（Lyso Tracker Red DND-99, Invitrogen社を使用）を染色し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図９Ｃに示す。
脂肪細胞内に取り込まれたrAIMは、エンドソームと共局在化しており、リソソームとの共局在化は見られなかった。【０１０６】
同じサンプルを使って、AIMを金微粒子で標識し、電子顕微鏡で観察した。具体的には、正常ヤギ血清で30分前処理した細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、SA-1ウサギ抗AIMポリクローナル抗体（1：600希釈）と共に一晩インキュベートした。続いて、1nm金微粒子（1:200; Nanoprobes社）を共有結合させたヤギ抗ウサギIgGと反応させた。HQ silver（Nanoprobes社）を使用して銀増感を行い、osmificateし、脱水し、Epon（Nisshin EM社）に直接埋め込んだ。極薄切片を調製し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、電子顕微鏡（H-7100; Hitachi Inc.）で観察した。
結果を図１０に示す。Eはエンドソーム、Pはファゴソーム又はファゴリソソーム、Mはミトコンドリア、Nは核、LDは脂肪滴を示す。
金粒子で標識されたrAIMはエンドソーム様の構造をとり、その限界膜付近に特に集積していた（上段左）。細胞膜においては、rAIMのエンドサイトーシスが観察された（上段中央）。rAIMを含むいくつかの粒子は核付近に見られ、後期エンドソームと考えられた（上段右）。後期エンドソームは変性し、これに伴ってrAIMが細胞質に放出され得る。
大きな径を有する不規則な形状のファゴソーム及びファゴリソソーム、ミトコンドリア、脂肪滴では、AIMは検出されなかった（下段）。
以上の結果を総合すると、AIMは、エンドサイトーシスによって脂肪細胞内に取り込まれ、細胞内で機能を発揮することが示唆された。【０１０７】
次に、AIMの取り込みに関与する細胞表面分子を特定した。リポタンパク質や脂肪酸等の取り込みを促進すること、及び、AIMの機能のターゲットとなる脂肪細胞とマクロファージの双方で発現していることから、CD36に注目した。
CD36中和抗体（Abcam社；Clone JC63.1 マウスIgA）で3T3-L1脂肪細胞を処理し、rAIMのエンドサイトーシスを阻害した。図１１に、中和抗体で処理した場合と処理しなかった場合の代表的な写真と、細胞100個当たりのrAIMを取り込んだ細胞数を示す。
図示されるとおり、CD36中和抗体で処理することにより、rAIMの取り込みは著しく抑制された。【０１０８】
次に、CD36+/+マウス（野生型）とCD36-/-マウス（Febbraio et al., J. Biol. Chem., 1999, 274:19055-19062）にrAIM（300μg/mouse in PBS）を静注し、16時間後に犠牲死させ、脂肪組織から切片を調製した。切片におけるAIM、マクロファージF4/80を染色した。結果を図１２に示す。
図示されるとおり、AIMのシグナルはCD36-/-脂肪細胞において著しく低下しており、CD36-/-脂肪細胞ではrAIM取り込み能が失われることが示された。
これらの結果は、CD36がrAIMの取り込みの原因となっていることを強く示唆する。【０１０９】
以上のとおり、AIMは細胞表面のCD36を介して、脂肪細胞に取り込まれる。脂肪細胞によるAIMの取り込みの程度は、例えば、検出可能に標識した抗AIM抗体を用いて細胞内のAIMを可視化することによって、容易に調べることができる。
従って、この方法を用いれば、AIMの機能を抑制する候補化合物の作用機序を明らかにし、当該化合物の効果を検証することができる。
例えば、AIMとAIMの機能を抑制する候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときと比較して、細胞内へのAIMの取り込みが低下している場合には、当該化合物は、細胞内へのAIMの取り込みを阻害することによってAIMの機能を抑制していると考えられる。【０１１０】
実施例6.  AIMとFASの結合
［免疫沈降による評価］
AIM-/-マウスの脂肪組織に、HAタグを付けたrAIMを直接注射した（数箇所に計100μg）。3時間後、rAIM-HAと内因性FASの結合を確認するため、脂肪組織を用いて抗HA抗体による共免疫沈降を行った。沈降物中のFASの存在を、ウエスタンブロッティングによって解析した（WB）。
結果を図１３に示す。図示されるとおり、FASとrAIMは共沈し、取り込まれたAIMと細胞質のFASが結合することが確認された。【０１１１】
HEK 293T細胞内において、HAタグを付けたrAIMと、FLAGタグを付けたFASを共発現させ、rAIMとFASとの結合を抗Flag抗体又は抗HA抗体を用いた共免疫沈降によって確認した。
結果を図１４に示す。rAIMとFASは共沈し、FASに対するAIMの結合能が示された。【０１１２】
次に、FASにおけるAIMの結合領域を調べた。FASは、ケトアシルシンターゼ（KS）、マロニル／アセチルトランスフェラーゼ（MAT）、デヒドラーゼ（DH）、セントラルコア（CC）、エノイルレダクターゼ（ER）、ケトレダクターゼ（KR）、アシルキャリアタンパク質（ACP）、チオエステラーゼ（TE）の8つのドメインを含む。
FASの構造を図２０に示す。
FASの各ドメインのN末端をFlag配列で標識し、AIM-HAを安定的に発現するHEK293T細胞内で発現させた。AIM-HAとFASの各ドメインとの結合を、抗Flag抗体又は抗HA抗体を使った共免疫沈降で確認した。
結果を図１５に示す。AIMと結合するドメインは、ER、DH、TE及びCCであることがわかった。
なお、FLAGタグを付けた全長FAS cDNA（ヌクレオチド：+1〜7515）をコードする配列は、Dr. Ohara（かずさDNA研究所）から提供を受けたcDNAクローンの一部と、RT-PCRでクローニングしたいくつかのフラグメントと、pFLAG-CMV2ベクター（Sigma社）を使用して構築した。
KS、MAT、DH、CC、ER、KR、ACP、又はTEをコードするcDNAフラグメントは、全長FAS cDNAをテンプレートとし、pFLAG-CMV2ベクターにサブクローニングして作製した。【０１１３】
［AIMによるFAS酵素活性の抑制］
脂肪細胞または脂肪組織のFAS活性に対するAIMの影響を調べた。FASの活性の測定は、Kelleyらの方法（Kelley et al., Biochem. J., 1986, 235:87-90）にわずかに修正を加えて行った。3T3-L1脂肪細胞、又は肥満マウスの脂肪組織のライゼートを、アセチル−CoA及びNADPH（0.4mM EDTAを含む0.2M リン酸カルシウムバッファー[pH 7.0]中）と混合し、分光光度計のキュベットに入れて、30℃に維持した。20μlのマロニル−CoA溶液（0.2mM）を加えて酵素反応を開始させ、ODの減少をチャートスピード2cm/minで測定した。その結果に基づき、酸化NADPHのモル吸光係数を6220としてFASの酵素活性を評価した。【０１１４】
まず、rAIM（5μg/ml）の存在下、非存在下、及びC75（25μM）存在下で6日間処理した3T3-L1細胞におけるFAS活性を測定した。結果を図１６に示す。また、AIM+/+マウス及びAIM-/-マウスの脂肪組織におけるFAS活性、及び、脂肪内局所注射によってrAIM又はBSAを3時間前に投与したAIM-/-マウスの脂肪組織におけるFAS活性を、それぞれ図１７及び１８に示す。
すべてのマウスにはHFDを20週間与えた。サンプルは溶解（lyse）させてFAS活性を測定した。データは、同じサンプルを用いて行ったWBの結果に基づき、FASタンパク質当たりに換算した。各グループn=6とし、エラーバーは標準誤差を示す。
図１６に示されるとおり、rAIM処理によって、3T3-L1脂肪細胞におけるFAS活性は著しく抑制された。抑制の程度は、FASを特異的に阻害するC75と同程度であった。
in vivoにおいては、AIM+/+マウスに比較して、AIM-/-マウスでは、脂肪組織が有意に増加していた（図１７）。また、AIM-/-マウスの脂肪組織にrAIMを直接投与するとFAS活性は低下した。【０１１５】
以上のとおり、AIMはFASと結合し、その活性を抑制する。
AIMとFASとの結合の程度は、免疫沈降等により容易に調べることができる。従って、この方法を用いれば、AIMの機能を抑制する候補化合物の作用機序を明らかにし、当該化合物の効果を検証することができる。例えば、AIMとAIMの機能を抑制する候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときと比較して、AIMとFASの結合が低下している場合には、当該化合物は、AIMとFASの結合を阻害することによって、AIMの機能を抑制していると考えられる。
また、活性抑制の程度は、FAS活性を測定する通常の方法で容易に調べることができる。従って、この方法を用いれば、AIMの機能を抑制する候補化合物の作用機序を明らかにし、当該化合物の効果を検証することができる。例えば、AIMとAIMの機能を抑制する候補化合物を加えたときに、AIMのみを加えたときと比較して、FAS活性の抑制が抑制されている場合には、当該化合物は、AIMのFAS活性抑制機能を阻害することによって、AIMの機能を抑制していると考えられる。【０１１６】
実施例7.  AIMによる体重、脂肪量の変化（in vivo）
AIM+/+マウス（n=7）と、AIM-/-マウス（n=6）にHFDを12週間与え、内蔵脂肪及び皮下脂肪量の変化を測定した。結果を図２１に示す。内臓脂肪（精巣上体脂肪）及び皮下脂肪のいずれも、AIM-/-マウスのほうが増加量が多かった。
次に、AIM-/-マウスに、5週間、HFDを与えながらrAIMを週2回腹腔内投与し（n=6; 300μg/injection/mouse）、体重及び脂肪組織量を測定した。結果を図２２及び２３に示す。rAIM投与群は、ウシ血清アルブミンを投与したコントロール（n=5; 300μg/injection/mouse）に比較して、体重、内臓脂肪、及び皮下脂肪のいずれの増加も有意に少なかった。
rAIM投与群及びBSA投与群のマウスの内臓脂肪組織から抽出したRNAにおける、脂肪細胞マーカー、脂肪前駆細胞マーカー、及び脂肪滴形成関連遺伝子のmRNAレベルをQPCRで測定した。結果を図２４に示す。測定値は、GAPDHの測定値で標準化し、BSA投与した脂肪組織に対する相対的発現量で表した。
rAIM投与群においては、内臓脂肪におけるFSP27、Perilipin、及びAdipophilinのmRNAレベルも低かった。一方、PREF-1のmRNAレベルはrAIMの投与により上昇したが、PPARγ2、C/EBPα、GLUT4のmRNAは、rAIM投与群とBSA投与群で差が見られなかった。【０１１７】
参考例1  イヌ、ネコにおけるAIMの発現
イヌ、ネコ及びマウスの血清中のAIMタンパク質を、抗AIM抗体（SA-1）を用いたウエスタンブロッティング（還元状態）によって検出した。
結果を図２５に示す。図示されるとおり、いずれの動物においてもAIMタンパク質が検出された。種間の分子量の違いは、糖鎖等の修飾によるものと考えられる。【０１１８】
実施例8.  低分子化合物のスクリーニング
材料及び方法は以下のとおりとした。
＜細胞＞
3T3-L1（DSバイオファーマ Cat No. EC86052701）
＜試薬＞
・培地
継代用
DMEM(Invitrogen Cat No. 11995-081)/ 10% CS/ PS SM
アッセイ用・・・DMEM/ 10% FBS/ ペニシリン＋ストレプトマイシン 
分化誘導用・・・DMEM/ 10% FBS/ペニシリン＋ストレプトマイシン/ 1ug/mL Insulin/ 1uM Dexamethasone/ 0.5mM IBMX 
・RT-PCR TaqMan Gene Expression Cells-to-Ct kit (Applied Biosystems Cat No. AM1729) 
・Probe mouse FSP27, mouse GAPDH(Applied Biosystems Cat No. AM1729) 
・mAIM FreeStyle CHO Expression Medium(Invitrogen Cat No. 12651-014)を用いて37℃で震盪培養しているCHO-S細胞を106 cells/mLに調製し、終濃度1.25%になるようにDMSOを添加して、37℃で3時間震盪培養した。マウスmAIMのC末端にHis6タグを付加し、CMVあるいはPGKプロモーター下流に連結したプラスミドでCHO-S細胞をトランスフェクションした。37℃で2時間震盪培養した後、29℃に移し、CMVプロモーターを用いた場合は７日間、PGKプロモーターを用いた場合は9日間培養を継続し、培養上清を回収した。回収した培養上清をHisTrap HPカラム（5mL、GEヘルスケア社製）にアプライし、20mMイミダゾールで洗浄した後、300mMイミダゾールで溶出した。回収した溶液をPBSで置換し、濃縮して精製mAIMとした。
＜被検化合物＞
・被検化合物 10 mM DMSO溶液 
＜方法＞
（１）細胞の継代
・Dishで培養中の細胞をPBS(-)で洗浄後、1/10濃度のトリプシンで処理することにより剥がし、継代用培地に懸濁し細胞数をカウントした。
・通常、10cm dishで5x105〜1x106 cells/dishで継代を行った。
・新しい10cm dishに細胞を播種する。
中一日で継代する場合は2x105  cells/dishで、 
中二日で継代する場合は1x105  cells/dishで播種した。 
（２）分化誘導
− Day 1 
・Dishで培養中の細胞をPBS(-)で洗浄後、1/10濃度のトリプシンで処理することにより剥がし、アッセイ用培地に懸濁し細胞数をカウントした。
・5x104 cells/mLに調製し、96 well plate (IWAKI)に100uL/well (5000cells/well)で播種した。
− Day 3 
・mAIM(final 400ug/mL)及び希釈した被検化合物(最終濃度10uM)を添加した分化誘導培地を調整した。
・96 well plateの培地を除去し、上記分化誘導培地100uL/wellを添加した。
− Day 5
・培地を除去し、100uL/wellの4℃に冷却したPBS(-)で洗浄した。
・25uL/wellのLysis Buffer（+1/100 DNase）を添加し、Plate Shakerで細胞を完全に溶解した（室温1分）。
・さらに室温で5分静置した。
・2.5uL/wellのStop Solutionを添加し、Plate Shakerで混合した（室温2分）。
（３）RT-PCRアッセイ
96 well PCR Plateに、下記逆転写反応溶液を調製した。
2xRT Buffer        10 
20xRT Enzyme Mix  1 
Nuclease-free water  5 
Cell lysate          4 
Total               20uL/well 
・ 逆転写反応
37℃ 60min 
95℃ 5min 
4℃ hold 
・384 well PCR Plateに、下記RT-PCR反応溶液を調製した。
TaqMan Gene Expression Master Mix      5
20x TaqMan Probe (mFSP27)              0.5
20x TaqMan Probe (mGAPDH)            0.5
Nuclease-free water                      2
cDNA sample                            2
Total                                    10uL/well 
・ABI7900HTにてRT-PCR反応を行った。
50℃ 2min 
95℃ 10min 
以下40サイクル 
95℃ 15sec 
60℃ 1min 【０１１９】
1280点で1次スクリーニング（n=1、10μM）を行い、FSP27の発現量（GAPDで標準化）が、(-)AIM＋3SD以下のヒットで、各96プレート上位2点の32点を1次ヒットとした。
再現性試験（n=3、10μM、AIM4Lot）を行い、FSP27の発現量（GAPDで標準化）が、AIMタンパク質の4Lotすべてで(+)AIM＋3×SD以上活性化したものを選択し、以下の化合物を得た。順に、DST-1、DST-2、DST-3、DST-4と呼ぶ。
【化５】
2011145722.tif 000008
【化６】
2011145722.tif 000009
【化７】
2011145722.tif 000010
【化８】
2011145722.tif 000011
DST-1〜DST-4の再現性試験の結果を図２６、２７に示す。いずれの化合物も、本来AIMの添加によって誘導されるFSP27 mRNA発現の著しい減少を有意に抑制し、AIMの機能を抑制することが確認された。
以上より、本発明のスクリーニング方法により、AIMの活性を抑制する低分子化合物が得られることが確認された。【０１２０】
実施例9.  中和抗体のスクリーニング
材料及び方法は以下のとおりとした。
＜動物感作＞
抗原としてマウスAIM（2mg/ｍｌ）を等量のTiterMaxGold（G-1フナコシ）と混合しエマルジョンを作製した。免疫動物にはＪｃｌ：Ｗｉｓｔａｒラット（日本クレア(株)）６週齢のメス2匹を用い、後ろ足底部へ50μLを投与した。2週間後に同様の投与を行い、更に2週間以上をおいて抗原溶液50μｇを足底部へ投与し3日後の細胞融合に備えた。
＜ミエローマ細胞＞
ミエローマ細胞にはマウスP3U1を用い、増殖培養には、RPMI1640（11875-119  GIBCO）にグルタミンとピルビン酸を加えFBS（S1560  BWT社）を10％になるように添加した培地を用いた。抗生物質としてはペニシリン、ストレプトマイシンを適量加えた。
＜細胞融合＞
麻酔下にて心臓採血を行ったラットから無菌的に膝窩リンパ節を摘出し、＃200メッシュ付ビーカーにのせシリコン棒で押しながら細胞浮遊液を調整した。細胞はRPMI1640にて2回の遠心洗浄を行った後、細胞数をカウントした。
対数増殖期の状態のミエローマ細胞を遠心により集め洗浄後、リンパ細胞に対して5対１となるように調整し、混合遠心を行った。
細胞融合はPEG1500（783641 ロシュ）を用いて行った。すなわち細胞ペレットへ１mLのPEG液を3分間かけて反応させ、その後段階的に希釈を行い遠心にて洗浄した後、培地を加え96ウェルプレート15枚へ200μLずつ入れ、1週間の培養を行った。培地にはミエローマ細胞用培地にHATサプリメント（21060-017 GIBCO）を加え、FBS濃度を15％にしたものを用いた。
＜マウス腹水採取＞
凍結保存された細胞を解凍し、増殖培養を行った後、１週間以上前に0.5ｍｌのプリスタン（42-002 コスモバイオ）を腹腔内投与したヌードマウス（BALB/cAJcl-nu/nu 日本クレア）の腹腔へ1×10７乗個を投与し、およそ2週間後に4〜12mlの腹水を得た。遠心処理にて固形物を除去した後、凍結保存を行った。
＜電気泳動解析＞
解凍し5μｍのフィルターにて腹水を処理した後、セルロースアセテート膜電気泳動にて腹水中に含まれるモノクローナル抗体のバンドの確認を行った。
電気泳動条件は、0.05MBarbital Na Buffer pH8.6（020-13415  和光純薬）、SELECA-V（ADVANTEC）、1mA/cm、25min で行い、固定、染色には0.1％ニグロシン（2％酢酸）を用いた。
＜抗体アッセイ＞
24個の抗マウスAIMラットモノクローナル抗体を、それぞれ200mg/mlの濃度でrAIMと室温30分間処理したのち、rAIM最終濃度5mg/mlで分化した3T3-L1脂肪細胞（分化誘導4日目）に添加し、24時間培養した。RNAを細胞より単離し、quantitative RT-PCRにて、FSP27のmRNA量を定量化した。
結果を図２８に示す。
Clone11, 12, 17の3クローンについては、本来rAIM添加により誘導されるFSP27 mRNAの著しい減少が有意に抑制された。Control rat IgGやclone15との処理では抑制されなかった。
以上の結果から、本発明のスクリーニング方法により、AIMに対する中和活性を有する抗AIM抗体が得られることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【０１２１】
配列番号：１は、ヒトAIMのアミノ酸配列である。
配列番号：２は、定量的リアルタイムPCRによるPPARγ1発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：３は、定量的リアルタイムPCRによるPPARγ1発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：４は、定量的リアルタイムPCRによるPPARγ2発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：５は、定量的リアルタイムPCRによるPPARγ2発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：６は、定量的リアルタイムPCRによるC/EBPα発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：７は、定量的リアルタイムPCRによるC/EBPα発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：８は、定量的リアルタイムPCRによるCD36発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：９は、定量的リアルタイムPCRによるCD36発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：１０は、定量的リアルタイムPCRによるGLUT4発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：１１は、定量的リアルタイムPCRによるGLUT4発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：１２は、定量的リアルタイムPCRによるFsp27発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：１３は、定量的リアルタイムPCRによるFsp27発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：１４は、定量的リアルタイムPCRによるPerilipin発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：１５は、定量的リアルタイムPCRによるPerilipin発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：１６は、定量的リアルタイムPCRによるAdipophilin発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：１７は、定量的リアルタイムPCRによるAdipophilin発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：１８は、定量的リアルタイムPCRによるGAPDH発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：１９は、定量的リアルタイムPCRによるGAPDH発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：２０は、定量的リアルタイムPCRによるPREF1発現解析に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
配列番号：２１は、定量的リアルタイムPCRによるPREF1発現解析に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
配列番号：２２は、チンパンジーAIMのアミノ酸配列である。
配列番号：２３は、イヌAIMのアミノ酸配列である。
配列番号：２４は、マウスAIMのアミノ酸配列である。
配列番号：２５は、ラットAIMのアミノ酸配列である。
【図２】
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【図４】
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【図１９】
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【図２８】
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【図１】
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【図３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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