(57)【要約】  セレウス、カンピロバクター、大腸菌、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオのうちの二種類以上の食中毒菌の核酸を特異的に増幅する。これにより、これらの食中毒菌を同時に特異的に検出可能とする。  セレウス検出用の配列番号１及び２、配列番号３及び４のプライマーセット、カンピロバクター検出用の配列番号５及び６のプライマーセット、大腸菌検出用の配列番号７及び８のプライマーセット、リステリア検出用の配列番号９及び１０のプライマーセット、サルモネラ検出用の配列番号１１及び１２のプライマーセット、黄色ブドウ球菌検出用の配列番号１３及び１４のプライマーセット、腸炎ビブリオ検出用の配列番号１５及び１６のプライマーセットのうち二以上のプライマーセットからなるＰＣＲ用プライマーセットを用いてＰＣＲ法により食中毒菌の核酸を増幅する。
2011129091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ法によって核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
セレウス（Bacillus  cereus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第一のプライマーセットと、
セレウス（Bacillus  cereus）のＤＮＡを増幅するための配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第二のプライマーセットと、
カンピロバクター（Campylobacter属）のＤＮＡを増幅するための配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第三のプライマーセットと、
大腸菌（Escherichia  coli）のＤＮＡを増幅するための配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第四のプライマーセットと、
リステリア（Listeria属）のＤＮＡを増幅するための配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第五のプライマーセットと、
サルモネラ（Salmonella属）のＤＮＡを増幅するための配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第六のプライマーセットと、
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１４に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第七のプライマーセットと、
腸炎ビブリオ（Vibrio  parahaemolyticus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１６に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第八のプライマーセットと、からなる群のうち、二以上のプライマーセットを混合してなる
ことを特徴とするＰＣＲ用プライマーセット。
【請求項２】
前記第一から第八の全てのプライマーセットを混合してなることを特徴とする請求項１記載のＰＣＲ用プライマーセット。
【請求項３】
前記第一から第八のプライマーセットにおけるプライマーが、以下の（Ａ）又は（Ｂ）であることを特徴とする請求項１又は２記載のＰＣＲ用プライマーセット。
（Ａ）配列番号１〜１６に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー。
（Ｂ）配列番号１〜１６に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＰＣＲ用プライマーセットに対して、相補的な塩基配列を有するプライマーからなることを特徴とするＰＣＲ用プライマーセット。
【請求項５】
ＰＣＲ法によって核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
セレウス（Bacillus  cereus）のゲノムＤＮＡに含まれる溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子（ｎｈｅ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、
セレウス（Bacillus  cereus）のゲノムＤＮＡに含まれるセレウリド合成酵素遺伝子（ｃｅｓＢ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、
カンピロバクター（Campylobacter属）のゲノムＤＮＡに含まれるリボソーム遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、
大腸菌（Escherichia  coli）のゲノムＤＮＡに含まれるウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（ｐｙｒＨ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、
リステリア（Listeria属）のゲノムＤＮＡに含まれるヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、
サルモネラ（Salmonella属）のゲノムＤＮＡに含まれる侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）のゲノムＤＮＡに含まれるヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、
腸炎ビブリオ（Vibrio  parahaemolyticus）のゲノムＤＮＡに含まれる耐熱性溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、からなる群のうち、二以上のプライマーセットを混合してなる
ことを特徴とするＰＣＲ用プライマーセット。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＰＣＲ用プライマーセットを含有することを特徴とするＰＣＲ用反応液。
【請求項７】
セレウス（Bacillus  cereus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第一のプライマーセットと、
セレウス（Bacillus  cereus）のＤＮＡを増幅するための配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第二のプライマーセットと、
カンピロバクター（Campylobacter属）のＤＮＡを増幅するための配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第三のプライマーセットと、
大腸菌（Escherichia  coli）のＤＮＡを増幅するための配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第四のプライマーセットと、
リステリア（Listeria属）のＤＮＡを増幅するための配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第五のプライマーセットと、
サルモネラ（Salmonella属）のＤＮＡを増幅するための配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第六のプライマーセットと、
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１４に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第七のプライマーセットと、
腸炎ビブリオ（Vibrio  parahaemolyticus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１６に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第八のプライマーセットと、からなる群のうち、二以上のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法による増幅対象の試料中にこれらのプライマーセットに対応する一又は二以上の食中毒菌の核酸が含まれている場合、当該核酸を特異的に増幅し、得られた増幅産物にもとづき食中毒菌を検出する
ことを特徴とする食中毒菌の検出方法。
【請求項８】
前記第一から第八の全てのプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法による増幅対象の試料中にこれらのプライマーセットに対応する一又は二以上の食中毒菌の核酸が含まれている場合、当該核酸を特異的に増幅することを特徴とする請求項７記載の食中毒菌の検出方法。
【請求項９】
前記第一から第八のプライマーセットにおけるプライマーが、以下の（Ａ）又は（Ｂ）であることを特徴とする請求項７又は８記載の食中毒菌の検出方法。
（Ａ）配列番号１〜１６に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプライマー。
（Ｂ）配列番号１〜１６に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の食中毒菌の検出方法において用いられるプライマーセットに対して、相補的な塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法による増幅対象の試料中にこれらのプライマーセットに対応する一又は二以上の食中毒菌の核酸が含まれている場合、当該核酸を特異的に増幅することを特徴とする食中毒菌の検出方法。
【請求項１１】
前記増幅産物を電気泳動し、一又は二以上の食中毒菌を同時に検出することを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の食中毒菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒菌を検出するためのＰＣＲ用プライマーセットに関し、特に複数の食中毒菌を特異的に検出可能なＰＣＲ用プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、食中毒菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、食品検査や環境検査、臨床試験、家畜衛生などにおいて、食中毒菌の存否の検査が行われている。このような検査では、近年ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により検査試料中に含まれるＤＮＡ（デオキシリボ核酸）を増幅し、得られた増幅産物にもとづき対象菌を判定することが行われている。
このようなＰＣＲを行うにあたっては、対象菌を特異的に増幅することが可能なプライマーを設計することが重要である。【０００３】
ここで、特許文献１には、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ、カンピロバクター、リステリア、及び黄色ブドウ球菌群の五種類の食中毒菌を検出することが可能なプライマーセットが開示されている。
また、特許文献２には、ＬＡＭＰ法（Loop-Mediated  Isothermal  Amplification）を用いて、サルモネラＯ４群のＤＮＡを増幅するためのプライマーセットが開示されている。【０００４】
【特許文献１】特開２００７−２７４９３４号公報
【特許文献２】特開２００８−７２９５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これらの方法では、その他の食中毒菌を検出することはできない。細菌性食中毒には、他にもセレウスや腸炎ビブリオによる場合が多くあり、大腸菌、リステリア、サルモネラ、カンピロバクター、黄色ブドウ球菌の五種類にこれらを含めた七種類の食中毒菌が、細菌性食中毒を原因とする疾病の９０％以上を占めている。
したがって、これら七種類の食中毒菌が、食品や環境などにおいて存在しているか否かを同時かつそれぞれ特異的に検出することができれば、大変有用である。【０００６】
ここで、複数の食中毒菌が存在する場合に、これらをそれぞれ特異的に検出するためには、その複数の食中毒菌のＤＮＡの一部を同時に増幅可能なプライマーセットを設計する必要がある。このとき、対象領域の異なるプライマーセットのプライマーの組み合わせにより、非対象領域が増幅されることがないようにする必要がある。また、対象領域の異なるプライマーセットが複数存在する場合、プライマーの長さや融解温度などが近いと競合する場合があるため、単独の場合よりも一層特異性の高い増幅を行うことが可能なプライマーの設計が求められる。
このように複数の食中毒菌を、それぞれ特異的に検出することは非常に難しく、これまでは五種類の食中毒菌の特異的検出が限界であり、それ以上の種類数の特異的検出は無理であるとされてきた。【０００７】
そこで、本発明者らは鋭意研究し、数多くの実験を繰り返し行った結果、上記七菌種における八領域の毒素領域遺伝子又は生体内必須遺伝子を対象とし、これらをそれぞれ特異的に増幅することができるマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを開発することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、セレウス（Bacillus  cereus）、カンピロバクター（Campylobacter属）、大腸菌（Escherichia  coli）、リステリア（Listeria属  ）、サルモネラ（Salmonella属）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）のうちの二種類以上の食中毒菌を特異的に増幅し得るＰＣＲ用プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、食中毒菌の検出方法、及びプライマーの設計方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のＰＣＲ用プライマーセットは、ＰＣＲ法によって核酸を増幅するためのプライマーセットであって、セレウス（Bacillus  cereus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第一のプライマーセットと、セレウス（Bacillus  cereus）のＤＮＡを増幅するための配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第二のプライマーセットと、カンピロバクター（Campylobacter属）のＤＮＡを増幅するための配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第三のプライマーセットと、大腸菌（Escherichia  coli）のＤＮＡを増幅するための配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第四のプライマーセットと、リステリア（Listeria属）のＤＮＡを増幅するための配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第五のプライマーセットと、サルモネラ（Salmonella属）のＤＮＡを増幅するための配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第六のプライマーセットと、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１４に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第七のプライマーセットと、腸炎ビブリオ（Vibrio  parahaemolyticus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１６に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第八のプライマーセットと、からなる群のうち、二以上のプライマーセットを混合してなる構成としてある。【０００９】
また、本発明のＰＣＲ用プライマーセットは、ＰＣＲ法によって核酸を増幅するためのプライマーセットであって、セレウス（Bacillus  cereus）のゲノムＤＮＡに含まれる溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子（ｎｈｅ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、セレウス（Bacillus  cereus）のゲノムＤＮＡに含まれるセレウリド合成酵素遺伝子（ｃｅｓＢ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、カンピロバクター（Campylobacter属）のゲノムＤＮＡに含まれるリボソーム遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、大腸菌（Escherichia  coli）のゲノムＤＮＡに含まれるウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（ｐｙｒＨ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、リステリア（Listeria属）のゲノムＤＮＡに含まれるヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、サルモネラ（Salmonella属）のゲノムＤＮＡに含まれる侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のゲノムＤＮＡに含まれるヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）のゲノムＤＮＡに含まれる耐熱性溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ）を増幅対象領域とするプライマーセットと、からなる群のうち、二以上のプライマーセットを混合してなる構成としてある。【００１０】
また、本発明のＰＣＲ用反応液は、上記ＰＣＲ用プライマーセットを含有するものとしてある。【００１１】
また、本発明の食中毒菌の検出方法は、セレウス（Bacillus  cereus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第一のプライマーセットと、セレウス（Bacillus  cereus）のＤＮＡを増幅するための配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第二のプライマーセットと、カンピロバクター（Campylobacter属）のＤＮＡを増幅するための配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第三のプライマーセットと、大腸菌（Escherichia  coli）のＤＮＡを増幅するための配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第四のプライマーセットと、リステリア（Listeria属）のＤＮＡを増幅するための配列番号９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第五のプライマーセットと、サルモネラ（Salmonella属）のＤＮＡを増幅するための配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第六のプライマーセットと、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１４に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第七のプライマーセットと、腸炎ビブリオ（Vibrio  parahaemolyticus）のＤＮＡを増幅するための配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１６に示す塩基配列からなるプライマーを備えた第八のプライマーセットと、からなる群のうち、二以上のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法による増幅対象の試料中にこれらのプライマーセットに対応する一又は二以上の食中毒菌の核酸が含まれている場合、当該核酸を特異的に増幅し、得られた増幅産物にもとづき食中毒菌を検出する方法としてある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、セレウス、カンピロバクター、大腸菌、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオのうちの二種類以上の食中毒菌を特異的に増幅することができる。このため、これらの食中毒菌をそれぞれ特異的に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態における新規プライマーセットに対応する配列番号、フォワード、リバースの区別、対象食中毒菌、増幅対象領域、及び増幅産物の長さを示す図である。
【図２】本発明の実施形態における新規プライマーセットの増幅対象領域と配列の対応を示す図である。
【図３】試験１のセレウスのゲノムＤＮＡに含まれる溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子（Bacillus  cereus／nhe）の増幅結果を示す図である。
【図４】試験２のセレウスのゲノムＤＮＡに含まれるセレウリド合成酵素遺伝子（Bacillus  cereus／cesB）の増幅結果を示す図である。
【図５】試験３のカンピロバクターのゲノムＤＮＡに含まれるリボソーム遺伝子（Campylobacter／１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の増幅結果を示す図である。
【図６】試験４の大腸菌のゲノムＤＮＡに含まれるウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（Escherichia  coli／ｐｙｒＨ）の増幅結果を示す図である。
【図７】試験５のリステリアのゲノムＤＮＡに含まれるヒートショックタンパク遺伝子（Listeria  monocytogenes／ｄｎａＪ）の増幅結果を示す図である。
【図８】試験６のサルモネラのゲノムＤＮＡに含まれる侵入性因子関連遺伝子（Salmonella  enterica／ｉｎｖＡ）の増幅結果を示す図である。
【図９】試験７の黄色ブドウ球菌のゲノムＤＮＡに含まれるヒートショックタンパク遺伝子（Staphylococcus  aureus／ｄｎａＪ）の増幅結果を示す図である。
【図１０】試験８の腸炎ビブリオのゲノムＤＮＡに含まれる耐熱性溶血毒素遺伝子（Vibrio  parahaemolyticus／ｔｄｈ）の増幅結果を示す図である。
【図１１】実施例１の八セット全てのプライマーにより七種類の食中毒菌のゲノムＤＮＡの一部を個別にそれぞれ増幅した結果を示す図である。
【図１２】実施例２の八セット全てのプライマーにより七種類の食中毒菌のゲノムＤＮＡの一部を一括して増幅した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
［ＰＣＲ用プライマーセット］
まず、図１及び図２を参照して本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットについて説明する。
ＰＣＲ用プライマーセットは、ＰＣＲ法により試料中のゲノムＤＮＡの一部を増幅するために用いられ、フォワードプライマー及びリバースプライマーの二種類のプライマーにより特定される領域を増幅する。ＰＣＲ用プライマーセットは、ＰＣＲ反応液に含有される。ＰＣＲ反応液には、その他に核酸合成基質、核酸合成酵素、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液などが含有される。そして、このＰＣＲ反応液を用いてサーマルサイクラーなどの核酸増幅装置により、試料中のゲノムＤＮＡの一部が増幅される。すなわち、ＰＣＲ用プライマーセットによる増幅対象領域を有するゲノムＤＮＡが試料中に存在している場合、その対象領域が増幅される。本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットは、一般的なＰＣＲ法において使用することができる。
【００１５】
図１において、配列番号は、配列表に示される塩基配列の配列番号を示している。Ｆ／Ｒは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの区別を示しており、Ｆがフォワードプライマー、Ｒがリバースプライマーを示している。増幅対象食中毒菌（学名）は、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットにより増幅する対象の食中毒菌の名称を表している。対象領域は、その食中毒菌における本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットにより増幅される対象領域に存在する遺伝子の名称を示している。増幅産物は、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットを用いて、対応する対象領域を増幅した場合の増幅産物の塩基配列の長さを示している。また、図２において、食中毒菌の増幅対象領域ごとに対応するＰＣＲ用プライマーセットの塩基配列を示している。
【００１６】
配列番号１及び２は、セレウス（Bacillus  cereus）のゲノムＤＮＡに含まれる溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子（ｎｈｅ）を増幅するためのプライマーセットの塩基配列を示しており、増幅産物は１９５ｂｐ（ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）である。
配列番号３及び４は、セレウス（Bacillus  cereus）のゲノムＤＮＡに含まれるセレウリド合成酵素遺伝子（ｃｅｓＢ）を増幅するためのプライマーセットの塩基配列を示しており、増幅産物は２３８ｂｐである。
配列番号５及び６は、カンピロバクター（Campylobacter属）のゲノムＤＮＡに含まれるリボソーム遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）を増幅するためのプライマーセットの塩基配列を示しており、増幅産物は２６３ｂｐである。
配列番号７及び８は、大腸菌（Escherichia  coli）のゲノムＤＮＡに含まれるウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（ｐｙｒＨ）を増幅するためのプライマーセットの塩基配列を示しており、増幅産物は１５７ｂｐである。
【００１７】
配列番号９及び１０は、リステリア（Listeria属）のゲノムＤＮＡに含まれるヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を増幅するためのプライマーセットの塩基配列を示しており、増幅産物は１７６ｂｐである。
配列番号１１及び１２は、サルモネラ（Salmonella属）のゲノムＤＮＡに含まれる侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）を増幅するためのプライマーセットの塩基配列を示しており、増幅産物は１８０ｂｐである。
配列番号１３及び１４は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）のゲノムＤＮＡに含まれるヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を増幅するためのプライマーセットの塩基配列を示しており、増幅産物は２３６ｂｐである。
配列番号１５及び１６は、腸炎ビブリオ（Vibrio  parahaemolyticus）のゲノムＤＮＡに含まれる耐熱性溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ）を増幅するためのプライマーセットの塩基配列を示しており、増幅産物は３８０ｂｐである。
これらの配列番号に示される塩基配列は、５’末端から３’末端方向の配列を示している。
【００１８】
また、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットにおける各プライマーは、上記の塩基配列に限定されるものではなく、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものを用いることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるものを用いることもできる。
【００１９】
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１〜１６で表される配列からなるＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１〜１６で表される配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００２０】
さらに、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットに対して、相補的な塩基配列を有するプライマーからなるＰＣＲ用プライマーセットを用いることもできる。
すなわち、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットにおけるプライマーとそれぞれ相補的な配列を有し、かつ５’末端から３’末端の配列の方向を逆向きにしたプライマーセットを用いることもできる。
【００２１】
上記八種類のＰＣＲ用プライマーセットをＰＣＲ反応液に含有させてＰＣＲ法による増幅反応を行った場合、ＰＣＲ反応液に含有される試料中に、上記増幅対象の食中毒菌のゲノムＤＮＡのいずれかが含まれていれば、その増幅対象領域を特異的に増幅することができる。
また、試料中に、上記増幅対象の食中毒菌のゲノムＤＮＡが二種類以上含まれている場合、それぞれのゲノムＤＮＡの増幅対象領域を同時かつ特異的に増幅することができる。試料中に、七種類の増幅対象の食中毒菌のゲノムＤＮＡにおける八領域の遺伝子が全て含まれている場合でも、各ゲノムＤＮＡの増幅対象領域を同時かつ特異的に増幅することが可能である。
【００２２】
すなわち、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットによれば、それぞれ対象の食中毒菌以外のゲノムＤＮＡによる競合が行われない。また、複数のＰＣＲ用プライマーセットを同時に使用しても、異なるプライマーセットにおけるプライマーの組み合わせによる非特異的な増幅も行われない。
このため、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットをＰＣＲ反応液に加えることで、試料に増幅対象領域をもつ食中毒菌のゲノムＤＮＡが含まれている場合には、その領域を特異的に増幅することが可能である。
また、試料に増幅対象の食中毒菌が複数種類含まれている場合でも、それぞれの増幅対象領域を同時かつ特異的に増幅することが可能である。
【００２３】
勿論、ＰＣＲ反応液に、上記八種類のＰＣＲ用プライマーセットの全てではなく、このうち一種類から七種類のＰＣＲ用プライマーセットが含まれている場合であっても、そのＰＣＲ用プライマーセットの増幅対象領域をもつ食中毒菌のゲノムＤＮＡがＰＣＲ反応液に含まれている場合には、その対象領域を特異的に増幅することが可能である。
【００２４】
［ＰＣＲ用反応液］
本実施形態のＰＣＲ反応液は、少なくとも上記八種類のＰＣＲ用プライマーセットのいずれかを含有し、好ましくはその二種類以上を含有し、より好ましくは、八種類全てのＰＣＲ用プライマーセットを含有するものである。ＰＣＲ反応液におけるそれ以外の成分は、一般的なものを用いることができる。
具体的には、例えば以下の組成からなるものを用いることができるが、これに限定されるものではない。特に、プライマー、試料のＤＮＡ、及び滅菌水の容量は、増幅対象とする食中毒菌の種類数によって相違する。
【００２５】
・緩衝液（１０容量％）
・核酸合成基質（８容量％）
・フォワードプライマー（１０ｎｇ／μｌ、２容量％〜１６容量％）
・リバースプライマー（１０ｎｇ／μｌ、２容量％〜１６容量％）
・核酸合成酵素（０．５容量％）
・試料のＤＮＡ（５容量％〜３５容量％）
・水（７２．５容量％〜１４．５容量％）
【００２６】
［食中毒菌の検出方法］
次に、本実施形態の食中毒菌の検出方法について説明する。
まず、本実施形態のＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲ法により試料中に含まれるゲノムを増幅する。
なお、実用上は、食中毒菌の検出を行う場合、食品や環境などからサンプルを採取して、そのサンプル中に含まれる菌の培養を行う。そして、培養された菌からゲノムＤＮＡを抽出し、この抽出されたゲノムＤＮＡを、上記ＰＣＲ反応液における試料として使用する。したがって、実用上は、試料中に増幅対象の食中毒菌が存在するか否かは不明であり、存在する場合に、これを検出することを可能にしている。また、このときＰＣＲ反応液に上記八種類のＰＣＲ用プライマーセットを全て含有させておけば、試料に上記七菌種八領域の遺伝子の少なくともいずれかが存在していれば、その増幅対象領域をそれぞれ特異的に増幅することが可能である。
【００２７】
ＰＣＲ法による遺伝子の増幅には、核酸増幅装置を使用する。この核酸増幅装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。ＰＣＲの反応条件は、例えば以下のようにすることができるが、これに限定されるものではない。
（１）９５℃  ２分
（２）９５℃  １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃  ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃  ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃  ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
【００２８】
次に増幅産物を用いて電気泳動を行い、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットによる増幅産物が得られているか否かを確認する。
電気泳動は、アガロースゲル電気泳動やアクリルアミド電気泳動やマイクロチップ電気泳動など一般的な方法により行うことができる。
【００２９】
［プライマーの設計方法］
次に、本実施形態のプライマーの設計方法について説明する。
背景技術において説明した通り、複数の食中毒菌を、それぞれ特異的に同時に検出するためには、その複数の食中毒菌のＤＮＡを同時に増幅可能なプライマーを設計する必要がある。しかしながら、種類の異なるプライマーセットが複数存在する場合は、プライマーの長さや融解温度などが近いと競合する場合があるため、単独の場合よりも一層特異性の高い増幅を行うことが可能なプライマーの設計が求められる。
そこで、本発明者らは、このようなプライマーの特異性を向上させ得るプライマーの設計方法を検討し、以下の基準に従えば、プライマーの特異性を向上させ得ることを見いだした。
【００３０】
（１）融解温度
プライマーの融解温度を７０℃以上とする。
従来のプライマーでは、融解温度が５５℃〜６０℃のものが一般的に使用されている。これに対し、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットでは、融解温度の高いプライマーを設計することで、ＰＣＲにおける増幅反応時の自由エネルギーを増大させ、非特異的な増幅反応を減少させることができているものと推定される。
【００３１】
（２）ＧＣ含量
プライマーの塩基配列におけるＧＣ含量を６０％以上とする。
従来のプライマーでは、ＧＣ含量が４０％〜６０％のものが一般的に使用されている。これに対し、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットでは、ＡＴに比較してより高い結合力を有するＧＣの含量が多いプライマーを設計することで、アニーリング工程における特異的結合を向上させることが可能になっているものと推定される。
【００３２】
（３）プライマーの長さ
プライマーの塩基配列の長さを２３mer〜４１mer程度とする。より好ましくは２６mer〜３４mer程度であり、２８mer〜３２mer程度とすることがさらに好ましい。
従来のプライマーでは、塩基配列の長さが１８mer〜２５mer程度のものが一般的に使用されている。これに対し、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットでは、より長いプライマーを使用することで、非特異的な増幅を排除するようにしている。
このように（１）〜（３）の少なくともいずれかの基準を用いてプライマー設計を行うことで、従来のプライマーよりもその特異性、すなわち増幅対象の遺伝子領域を特異的に増幅させる性質を、より向上させることが可能になっている。
本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットは、これら全ての基準に適合するＰＣＲ用プライマーセットを設計することで、七種類八領域を特異的に増幅することが可能な優れたものとなっている。
【００３３】
（４）検出対象領域
また、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットは、図１を用いて上述した通り、各食中毒菌の特定の領域を対象として、プライマーを設計している。
すなわち、これらの食中毒菌の毒素領域の遺伝子、及び／又は、生体内必須領域の遺伝子を対象としている。
【００３４】
具体的には、増幅対象領域として、セレウスについては溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子（ｎｈｅ）、及びセレウリド合成酵素遺伝子（ｃｅｓＢ）を、カンピロバクターについてはリボソーム遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）を、大腸菌についてはウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（ｐｙｒＨ）を、リステリアについてはヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を、サルモネラについては侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）を、黄色ブドウ球菌についてはヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を、腸炎ビブリオについては耐熱性溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ）を、それぞれ選択している。
本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットは、それぞれこれらの領域を増幅対象として選択することにより、プライマーの特異性をより向上させることが可能となっている。
【００３５】
以上説明した通り、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセット、ＰＣＲ用反応液、食中毒菌の検出方法によれば、セレウス、カンピロバクター、大腸菌、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオの七種類の食中毒菌における八領域について、同時に特異的に増幅することができる。このため、本実施形態によれば、これらの食中毒菌を同時にそれぞれ特異的に検出することが可能となる。
また、本実施形態のプライマーの設計方法によれば、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットのような特異性の高いプライマーを設計することが可能である。
【実施例】
【００３６】
まず、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットが、増幅対象領域を正しく増幅できるかを確認するための検証試験を行った。
試験方法は、上記実施形態の方法により、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いてＰＣＲ法により増幅反応を行い、増幅産物を電気泳動することで、正しい増幅産物が得られることを確認した。具体的には、八種類のＰＣＲ用プライマーセットごとに、以下の試験１〜８において説明する。【００３７】
（試験１）
まず、ＰＣＲ用プライマーセットとして、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものを用いた。増幅対象領域は、セレウスのゲノムＤＮＡの毒素領域における溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子（ｎｈｅ）であり、増幅産物は１９５ｂｐである。
ＰＣＲ反応液としては、以下の組成のものを使用した。プライマーはライフテクノロジージャパン株式会社より合成した。それ以外は、タカラバイオ株式会社製である。
・緩衝液  10×Ex  Taq  buffer(20mM  Mg  2＋  plus)  2.0μl
・核酸合成基質  dNTP  Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)  1.6μl
・primerF(10ng/μl、final  conc.4ng)  0.4μl
・primerR(10ng/μl、final  conc.4ng)  0.4μl
・核酸合成酵素  EX  Taq(5U/μl)  0.1μl
・試料のＤＮＡ  1.0μl
・滅菌水  14.5μl
（全量  20μl）【００３８】
また、試料のＤＮＡは、次の１〜１１に示す食中毒菌の供試菌株のゲノムＤＮＡをそれぞれ別個に含有させ、個別にＰＣＲを行った。
１．Bacillus  cereus  NBRC  15305
２．Bacillus  cereus  TIFT  114011
３．Campylobacter  coli  ATCC  43478
４．Campylobacter  jejuni  ATCC  33560
５．Escherichia  coli  NBRC  102203
６．Listeria  monocytogenes  ATCC  15313
７．Salmonella  enterica  ATCC  9270
８．Staphylococcus  aureus  NBRC  100910
９．Vibrio  parahaemolyticus  GTC  2055
１０．Vibrio  parahaemolyticus  ATCC  17802
１１．Yersinia  enterocolitica  ATCC  9610
１２．Negative  Cont.【００３９】
これらの食中毒菌の菌株は、次の機関から分譲されたものである。
・NBRC  独立行政法人製品評価基盤機構
・TIFT  東洋食品研究所
・ATCC  American  type  culture  collection
・GTC  岐阜大学大学院医学系研究科病原体制御分野【００４０】
なお、供試菌株１１のエルシニア（Yersinia  enterocolitica  ATCC  9610）を含有するＰＣＲ反応液を用いた試験は、本実施形態の各ＰＣＲ用プライマーセットについての偽陽性反応を確認するために行った。また、１２の試験は、試料のＤＮＡに代えて同量の滅菌水をＰＣＲ反応液に加えたものである。【００４１】
ＰＣＲ法による遺伝子の増幅には、ｅｐグラジエント（エッペンドルフ株式会社製）を使用した。また、ＰＣＲの反応条件は、実施形態で説明したものと同一の次の条件で行った。
（１）９５℃  ２分
（２）９５℃  １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃  ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃  ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃  ２分
（２）〜（４）を４０サイクル【００４２】
次に、ＰＣＲ法による産物を、アガロースゲル電気泳動により増幅対象領域ごとに泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。電気泳動は、MultiNA(株式会社島津製作所製)を用いて行った。その結果を図３に示す。【００４３】
同図において、１〜１２のバンドは、それぞれ対応する番号の試料のＤＮＡ等を含有するＰＣＲ反応液を用いて行ったＰＣＲの産物を、それぞれ電気泳動した結果を示している。また、グラフは、増幅産物の長さを示すものである。グラフには、当該ＰＣＲ用プライマーセットの増幅対象である目的の増幅産物が得られたバンドについて、その増幅産物のピークが示されている。これらは、以下の試験２〜８においても同様である。【００４４】
ここで、ＰＣＲによる増幅産物を電気泳動した場合、MultiNA(株式会社島津製作所製)に用いる試薬などの影響から、理論上の増幅産物の塩基配列と完全には一致せず、近似する値の結果が得られる。【００４５】
試験１のＰＣＲ用プライマーセットは、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものであり、増幅対象領域はセレウスの溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子（ｎｈｅ）、増幅産物は１９５ｂｐである。
図３では、試料のＤＮＡとしてセレウスのゲノムを使用した供試菌株１，２において、２００ｂｐ付近にバンドが見られ、その他の供試菌株３〜１２には、同付近にバンドが見られない。また、下欄のグラフは、供試菌株１についてのものであり、１９５ｂｐのピークが示されている。
なお、電気泳動結果における２５ｂｐや７５ｂｐ付近等のその他のバンドは、プライマーやプライマーにより形成されたダイマーを示すものであると推定される。これは、以下の試験２〜８でも同様である。【００４６】
以上のことから、試料のＤＮＡとしてセレウスのゲノムＤＮＡを使用した供試菌株１，２では、試験１のＰＣＲ用プライマーセットにより、セレウスの溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子（ｎｈｅ）が正しく増幅されていると判断できる。
一方、試料のＤＮＡとしてその他のゲノムを使用した供試菌株３−１１のバンドを参照すると、プライマーにより形成されたダイマーを示すと考えられるバンドは見られるが、溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子（ｎｈｅ）が増幅されたものと誤認してしまうような、非対象領域の増幅は見られなかった。
これにより、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーを備えたＰＣＲ用プライマーセットを用いることで、セレウスの溶血活性を示さないエンテロトキシン分泌遺伝子（ｎｈｅ）を特異的に増幅できることが確認された。【００４７】
（試験２）
ＰＣＲ用プライマーセットとして、配列番号３及び４に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものを用いた点以外は、試験１と同様にして実験を行った。その結果を図４に示す。
試験２のＰＣＲ用プライマーセットの増幅対象領域は、セレウスのゲノムＤＮＡの毒素領域におけるセレウリド合成酵素遺伝子（ｃｅｓＢ）であり、増幅産物は２３８ｂｐである。【００４８】
図４では、試料のＤＮＡとして、セレウリド合成酵素遺伝子（ｃｅｓＢ）を有する供試菌株２のゲノム（Bacillus  cereus  TIFT  114011）のＤＮＡを使用したものにおいて、２５０ｂｐ付近にバンドが見られ、その他の供試菌株１，３−１２には、２５０ｂｐ付近にバンドが見られない。また、下欄のグラフは、供試菌株２についてのものであり、２５１ｂｐのピークが示されている。【００４９】
したがって、試料のＤＮＡとして、セレウリド合成酵素遺伝子（ｃｅｓＢ）を有するゲノムＤＮＡを用いた供試菌株２については、試験２のＰＣＲ用プライマーセットにより、増幅対象領域が正しく増幅されていると判断できる。
一方、試料のＤＮＡとしてその他のゲノムＤＮＡを使用した供試菌株１，３〜１１のバンドを参照すると、セレウリド合成酵素遺伝子（ｃｅｓＢ）が増幅されたものと誤認してしまうような、非対象領域の増幅は見られなかった。
これにより、配列番号３及び４に示す塩基配列からなるプライマーを備えたＰＣＲ用プライマーセットを用いることで、セレウスのセレウリド合成酵素遺伝子（ｃｅｓＢ）を特異的に増幅できることが確認された。【００５０】
（試験３）
ＰＣＲ用プライマーセットとして、配列番号５及び６に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものを用いた点以外は、試験１と同様にして実験を行った。その結果を図５に示す。
試験３のＰＣＲ用プライマーセットの増幅対象領域は、カンピロバクターのゲノムＤＮＡの生体内必須領域におけるリボソーム遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）であり、増幅産物は２６３ｂｐである。【００５１】
図５では、試料のＤＮＡとして、カンピロバクターのリボソーム遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）を有する供試菌株３，４のゲノムのＤＮＡを使用したものにおいて、２７５ｂｐ付近にバンドが見られ、その他の供試菌株１，２，５〜１２には、同付近にバンドは見られない。また、下欄のグラフは、供試菌株３についてのものであり、２６８ｂｐのピークが示されている。【００５２】
したがって、試料のＤＮＡとして、カンピロバクターのリボソーム遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）を有するゲノムＤＮＡを用いた供試菌株３，４については、試験３のＰＣＲ用プライマーセットにより、増幅対象領域が正しく増幅されていると判断できる。
一方、試料のＤＮＡとしてその他のゲノムＤＮＡを使用した供試菌株１，２，５〜１１のバンドを参照すると、カンピロバクターのリボソーム遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）が増幅されたものと誤認してしまうような、非対象領域の増幅は見られなかった。
これにより、配列番号５及び６に示す塩基配列からなるプライマーを備えたＰＣＲ用プライマーセットを用いることで、カンピロバクターのリボソーム遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）を特異的に増幅できることが確認された。【００５３】
（試験４）
ＰＣＲ用プライマーセットとして、配列番号７及び８に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものを用いた点以外は、試験１と同様にして実験を行った。その結果を図６に示す。
試験４のＰＣＲ用プライマーセットの増幅対象領域は、大腸菌のゲノムＤＮＡの生体内必須領域におけるウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（ｐｙｒＨ）であり、増幅産物は１５７ｂｐである。【００５４】
図６では、試料のＤＮＡとして、大腸菌のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（ｐｙｒＨ）を有する供試菌株５のゲノムのＤＮＡを使用したものにおいて、１６０ｂｐ付近にバンドが見られ、その他の供試菌株１〜４，６〜１２には、同付近にバンドは見られない。また、下欄のグラフは、供試菌株５についてのものであり、１５９ｂｐのピークが示されている。【００５５】
したがって、試料のＤＮＡとして、大腸菌のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（ｐｙｒＨ）を有するゲノムＤＮＡを用いた供試菌株５については、試験４のＰＣＲ用プライマーセットにより、増幅対象領域が正しく増幅されていると判断できる。
一方、試料のＤＮＡとしてその他のゲノムＤＮＡを使用した供試菌株１〜４，６〜１１のバンドを参照すると、大腸菌のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（ｐｙｒＨ）が増幅されたものと誤認してしまうような、非対象領域の増幅は見られなかった。
これにより、配列番号７及び８に示す塩基配列からなるプライマーを備えたＰＣＲ用プライマーセットを用いることで、大腸菌のウリジンモノリン酸キナーゼ遺伝子（ｐｙｒＨ）を特異的に増幅できることが確認された。【００５６】
（試験５）
ＰＣＲ用プライマーセットとして、配列番号９及び１０に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものを用いた点以外は、試験１と同様にして実験を行った。その結果を図７に示す。
試験５のＰＣＲ用プライマーセットの増幅対象領域は、リステリアのゲノムＤＮＡの生体内必須領域におけるヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）であり、増幅産物は１７６ｂｐである。【００５７】
図７では、試料のＤＮＡとして、リステリアのヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を有する供試菌株６のゲノムのＤＮＡを使用したものにおいて、２００ｂｐ付近にバンドが見られ、その他の供試菌株１〜５，７〜１２には、同付近にバンドは見られない。また、下欄のグラフは、供試菌株６についてのものであり、１９８ｂｐのピークが示されている。【００５８】
したがって、試料のＤＮＡとして、リステリアのヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を有するゲノムＤＮＡを用いた供試菌株６については、試験５のＰＣＲ用プライマーセットにより、増幅対象領域が正しく増幅されていると判断できる。
なお、試験５では、理論上の増幅産物の長さと、現実の増幅産物の長さに、２０ｂｐ程度の差が見られる。これは、供試菌株６におけるヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）において、何らかの配列の挿入が起こったためであると推定される。【００５９】
一方、試料のＤＮＡとしてその他のゲノムＤＮＡを使用した１〜５，７〜１１に対応するバンドを参照すると、リステリアのヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）が増幅されたものと誤認してしまうような、非対象領域の増幅は見られなかった。
これにより、配列番号９及び１０に示す塩基配列からなるプライマーを備えたＰＣＲ用プライマーセットを用いることで、リステリアのヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を特異的に増幅できることが確認された。【００６０】
（試験６）
ＰＣＲ用プライマーセットとして、配列番号１１及び１２に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものを用いた点以外は、試験１と同様にして実験を行った。その結果を図８に示す。
試験６のＰＣＲ用プライマーセットの増幅対象領域は、サルモネラのゲノムＤＮＡの毒素領域における侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）であり、増幅産物は１８０ｂｐである。【００６１】
図８では、試料のＤＮＡとして、サルモネラの侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）を有する供試菌株７のゲノムＤＮＡを使用したものにおいて、１９０ｂｐ付近にバンドが見られ、その他の供試菌株１〜６，８〜１２には、同付近にバンドは見られない。また、下欄のグラフは、供試菌株７についてのものであり、１８３ｂｐのピークが示されている。【００６２】
したがって、試料のＤＮＡとして、サルモネラの侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）を有するゲノムＤＮＡを用いた供試菌株７については、試験６のＰＣＲ用プライマーセットにより、増幅対象領域が正しく増幅されていると判断できる。
一方、試料のＤＮＡとしてその他のゲノムＤＮＡを使用した供試菌株１〜６，８〜１１のバンドを参照すると、サルモネラの侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）が増幅されたものと誤認してしまうような、非対象領域の増幅は見られなかった。
これにより、配列番号１１及び１２に示す塩基配列からなるプライマーを備えたＰＣＲ用プライマーセットを用いることで、サルモネラの侵入性因子関連遺伝子（ｉｎｖＡ）を特異的に増幅できることが確認された。【００６３】
（試験７）
ＰＣＲ用プライマーセットとして、配列番号１３及び１４に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものを用いた点以外は、試験１と同様にして実験を行った。その結果を図９に示す。
試験７のＰＣＲ用プライマーセットの増幅対象領域は、黄色ブドウ球菌のゲノムＤＮＡの生体内必須領域におけるヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）であり、増幅産物は２３６ｂｐである。【００６４】
図９では、試料のＤＮＡとして、黄色ブドウ球菌のヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を有する供試菌株８のゲノムＤＮＡを使用したものにおいて、２４０ｂｐ付近にバンドが見られ、その他の供試菌株１〜７，９〜１２には、同付近にバンドは見られない。また、下欄のグラフは、供試菌株８についてのものであり、２３８ｂｐのピークが示されている。【００６５】
したがって、試料のＤＮＡとして、黄色ブドウ球菌のヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を有するゲノムＤＮＡを用いた供試菌株８については、試験７のＰＣＲ用プライマーセットにより、増幅対象領域が正しく増幅されていると判断できる。
一方、試料のＤＮＡとしてその他のゲノムＤＮＡを使用した供試菌株１〜７，９〜１１のバンドを参照すると、黄色ブドウ球菌のヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）が増幅されたものと誤認してしまうような、非対象領域の増幅は見られなかった。
これにより、配列番号１３及び１４に示す塩基配列からなるプライマーを備えたＰＣＲ用プライマーセットを用いることで、黄色ブドウ球菌のヒートショックタンパク遺伝子（ｄｎａＪ）を特異的に増幅できることが確認された。【００６６】
（試験８）
ＰＣＲ用プライマーセットとして、配列番号１５及び１６に示す塩基配列からなるプライマーを備えたものを用いた点以外は、試験１と同様にして実験を行った。その結果を図１０に示す。
試験８のＰＣＲ用プライマーセットの増幅対象領域は、腸炎ビブリオのゲノムの毒素領域における耐熱性溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ）であり、増幅産物は３８０ｂｐである。【００６７】
図１０では、試料のＤＮＡとして、腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ）を有する供試菌株９のゲノムＤＮＡを使用したものにおいて、４００ｂｐ付近にバンドが見られ、その他の供試菌株１〜８，１０〜１２には、同付近にバンドは見られない。また、下欄のグラフは、供試菌株９についてのものであり、３９０ｂｐのピークが示されている。なお、供試菌株１０のゲノム（Vibrio  parahaemolyticus  ATCC  17802）は、耐熱性溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ）を有していない腸炎ビブリオの菌株であり、増幅対象領域の増幅は見られなかった。【００６８】
したがって、試料のＤＮＡとして、腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ）を有するゲノムＤＮＡを用いた供試菌株９については、試験８のＰＣＲ用プライマーセットにより、増幅対象領域が正しく増幅されていると判断できる。
一方、試料のＤＮＡとしてその他のゲノムＤＮＡを使用した供試菌株１〜８，１０，１１のバンドを参照すると、腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ）が増幅されたものと誤認してしまうような、非対象領域の増幅は見られなかった。
これにより、配列番号１５及び１６に示す塩基配列からなるプライマーを備えたＰＣＲ用プライマーセットを用いることで、腸炎ビブリオの耐熱性溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ）を特異的に増幅できることが確認された。【００６９】
以上の通り、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットは、それぞれ単独で用いた場合には、当該プライマーセットの増幅対象ではない他の上記食中毒菌のゲノムＤＮＡに関し、偽陽性による増幅反応が起こらないことが確認された。
次に、これらのＰＣＲ用プライマーセットを同時に使用した場合において、対象領域を特異的に増幅できるかを検証した。その結果を以下の実施例１及び実施例２において説明する。【００７０】
（実施例１）
まず、ＰＣＲ用プライマーセットとして、試験１〜８で使用した全てのプライマーセットを用いて、実験を行った。すなわち、実施例１のＰＣＲ反応液には、配列番号１〜１６に示す塩基配列からなる全てのプライマーを含有させた。【００７１】
実施例１のＰＣＲ反応液は、プライマー、試料のＤＮＡ、及び滅菌水以外は試験１と同様であり、以下の組成のものを使用した。
・緩衝液  10×Ex  Taq  buffer(20mM  Mg  2＋  plus)  2.0μl
・核酸合成基質  dNTP  Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)  1.6μl
・ビブリオ検出用primer  F（10ng/μl、final  conc.4ng）  0.4μl
・ビブリオ検出用primer  R（10ng/μl、final  conc.4ng）  0.4μl
・他のprimer  F（10ng/μl、final  conc.2ng）  0.2μl×7
・他のprimer  R（10ng/μl、final  conc.2ng）  0.2μl×7
・核酸合成酵素  EX  Taq(5U/μl)  0.1μl
・試料のＤＮＡ  1.0μl
・滅菌水  11.7μl【００７２】
また、試料のＤＮＡは、次の１〜７に示す食中毒菌の供試菌株のゲノムＤＮＡをそれぞれ別個に含有させ、個別にＰＣＲを行った。
１．Bacillus  cereus  TIFT  114011
２．Campylobacter  jejuni  ATCC  33560
３．Escherichia  coli  NBRC  102203
４．Listeria  monocytogenes  ATCC  15313
５．Salmonella  enterica  ATCC  9270
６．Staphylococcus  aureus  NBRC  100910
７．Vibrio  parahaemolyticus  GTC  2055【００７３】
ＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、試験１と同様に、ｅｐグラジエント（エッペンドルフ株式会社製）を使用して、以下の条件で行った。
（１）９５℃  ２分
（２）９５℃  １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃  ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃  ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃  ２分
（２）〜（４）を４０サイクル【００７４】
次に、ＰＣＲ法による産物を、電気泳動により増幅対象領域ごとに泳動させ、試料のＤＮＡごとに、その増幅対象領域が増幅された正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。その結果を図１１に示す。【００７５】
同図において、試料のＤＮＡとして、上記供試菌株１〜７のゲノムＤＮＡを用いた場合のＰＣＲ法による増幅産物ごとに、それぞれ以下のピークが示されている。
１．Bacillus  cereus  TIFT  114011        １９８ｂｐ及び２５２ｂｐ
２．Campylobacter  jejuni  ATCC  33560    ２７０ｂｐ
３．Escherichia  coli  NBRC  102203    
１５８ｂｐ
４．Listeria  monocytogenes  ATCC  15313  １９５ｂｐ
５．Salmonella  enterica  ATCC  9270  １７７ｂｐ
６．Staphylococcus  aureus  NBRC  100910  ２３８ｂｐ
７．Vibrio  parahaemolyticus  GTC  2055   ３９０ｂｐ【００７６】
これらは、それぞれの理論上の増幅産物の塩基配列の長さに近似するものであり、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットによって、それぞれ対象とする食中毒菌の増幅対象領域が特異的に増幅することができていると考えられる。
なお、供試菌株４のリステリアの増幅産物は１９５ｂｐであり、図１に示すリステリアの増幅産物１７６ｂｐに比較して２０ｂｐ近く長くなっているが、これは上述した通り、当該菌株に配列の挿入が生じていることによるものと推定される。【００７７】
（実施例２）
実施例２のＰＣＲ反応液には、試料のＤＮＡとして、実施例１における供試菌株１〜７の全ての食中毒菌のゲノムＤＮＡを含有させた。試料のＤＮＡ及び滅菌水以外は実施例１と同様であり、以下の組成のものを使用した。
・緩衝液  10×Ex  Taq  buffer(20mM  Mg  2＋  plus)  2.0μl
・核酸合成基質  dNTP  Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)  1.6μl
・ビブリオ検出用primer  F（10ng/μl、final  conc.4ng）  0.4μl
・ビブリオ検出用primer  R（10ng/μl、final  conc.4ng）  0.4μl
・他のprimer  F（10ng/μl、final  conc.2ng）  0.2μl×7
・他のprimer  R（10ng/μl、final  conc.2ng）  0.2μl×7
・核酸合成酵素  EX  Taq(5U/μl)  0.1μl
・試料のＤＮＡ  1.0μl×7
・滅菌水  5.7μl【００７８】
このＰＣＲ反応液を用いて、実施例１と同様の条件で、ＰＣＲ法により増幅対象領域の増幅を一括して行った。
次に、増幅産物の電気泳動を、ＭｕｌｔｉＮＡ（株式会社島津製作所製）を用いて行った。その結果を図１２に示す。【００７９】
同図に示すように、次の８つの増幅産物のピークが見られた。
（１）１６８ｂｐ  （２）１７２ｂｐ  （３）１８７ｂｐ  （４）２０１ｂｐ  
（５）２２４ｂｐ  （６）２４３ｂｐ  （７）２７３ｂｐ  （８）３８７ｂｐ  
実施例１の結果と照らし合わせると、これらのピークは、それぞれ以下の供試菌株の増幅産物を示していると考えられる。【００８０】
（１）供試菌株３．Escherichia  coli  NBRC  102203
（２）供試菌株５．Salmonella  enterica  ATCC  9270
（３）供試菌株４．Listeria  monocytogenes  ATCC  15313
（４）供試菌株１．Bacillus  cereus  TIFT  114011
（５）供試菌株６．Staphylococcus  aureus  NBRC  100910
（６）供試菌株１．Bacillus  cereus  TIFT  114011
（７）供試菌株２．Campylobacter  jejuni  ATCC  33560
（８）供試菌株７．Vibrio  parahaemolyticus  GTC  2055【００８１】
このように、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットによれば、セレウス、カンピロバクター、大腸菌、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオの食中毒菌を同時かつ特異的に増幅することができることがわかった。
またその結果、これらの食中毒菌を同時にそれぞれ特異的に検出することが可能であることが確認された。【００８２】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、ＰＣＲ反応液のプライマーとして、本実施形態のＰＣＲ用プライマーセットを含有させるものであれば、その他の成分については上記実施形態及び実施例と異なるものとするなど適宜変更することが可能である。また、本実施形態のプライマーの設計方法を、その他の菌のゲノムＤＮＡを増幅するためのプライマー設計に適用することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、食品や製造環境などに、セレウス、カンピロバクター、大腸菌、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオが存在しているか否かを同時かつ特異的に短期間で検査する場合などに好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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