(57)【要約】  疎水性クロマトグラフィ−と強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィーとを組み合わせることにより、アクレモニウム・セルロリティカスより、疎水性の高い新規なβ-グルコシダーゼを同定することに成功した。さらに、同定したβ-グルコシダーゼに対応する遺伝子を単離し、その塩基配列について多くの改変を加えることにより、該遺伝子をトリコデルマ・ビリデにおいて高発現させ、かつ、発現産物に高いβ-グルコシダーゼ活性を発揮させることに成功した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、下記（i）から（vi）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（i）配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ii）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（iii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（iv）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（v）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（vi）（i）から（v）に記載のポリヌクレオチドから、シグナル配列をコードする塩基配列が除去されたポリヌクレオチド
【請求項２】
糸状菌由来である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカスである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、下記（i）または（ii）に記載のポリヌクレオチド。
（i）配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ii）配列番号：４に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
【請求項５】
配列番号：４に記載の塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードし、かつ、トリコデルマ・ビリデにおいて発現させることができるポリヌクレオチド。
【請求項６】
トリコデルマ・ビリデにおいて発現させた場合の形質転換体におけるβ-グルコシダーゼ活性を、トリコデルマ・ビリデの親株におけるβ-グルコシダーゼ活性と比較して、5倍以上に向上させることができる、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４から６のいずれかに記載のポリヌクレオチドから、シグナル配列をコードする塩基配列が除去されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
【請求項１１】
組み換えタンパク質である、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
請求項９に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞および／またはその培養物から発現させたタンパク質を採取する工程を含む、請求項１１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載のタンパク質を含む、セルラーゼ調製物。
【請求項１４】
請求項１０に記載のタンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物で、セルロース材料を処理する工程を含む、セルロース材料を分解または変換する方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載のタンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物で、セルロース材料を処理し、セルロース材料分解物を回収する工程を含む、分解または変換されたセルロース材料の製造方法。
【請求項１６】
セルロース材料分解物が糖である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載のタンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物を含んでなる洗剤組成物。
【請求項１８】
請求項１０に記載のタンパク質、請求項１３に記載のセルラーゼ調製物、または請求項１７に記載の洗剤組成物とセルロース含有繊維とを接触させる工程を含む、セルロース含有繊維の処理方法。
【請求項１９】
古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、請求項１０に記載のタンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
【請求項２０】
請求項１０に記載のタンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物で紙パルプを処理する工程を含む、ろ水性が改善された紙パルプの製造方法。
【請求項２１】
請求項１０に記載のタンパク質または請求項１３に記載のセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含む、消化能が改善された動物試料の製造方法。
【請求項２２】
請求項２に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現が抑制された糸状菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β-グルコシダーゼ活性を有する新規タンパク質およびその用途に関し、詳しくは、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）由来のβ-グルコシダーゼ活性を有する新規タンパク質、その類似体および改変体、これらタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびに、これらタンパク質の製造方法および用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、高等植物細胞の主要な構成成分であり、広く天然に存在する。セルロースは、グルコースがβ-1,4-グルコシド結合により重合した高分子多糖であり、天然にはセルロースが結晶状あるいは非結晶状態で存在しており、さらには他の成分、リグニン、ヘミセルロース類、ペクチン類などとも複雑に結合して植物組織を構築している。【０００３】
セルラーゼはセルロースを分解する酵素の総称であり、一般に微生物の生産するセルラーゼは多種類のセルラーゼ成分からなる。セルラーゼ成分は、その基質特異性から、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシターゼの3種類に分類され、セルラーゼを産生する糸状菌であるアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の場合には、最大4種類のセロビオヒドロラーゼ、15種類のエンドグルカナーゼ、15種類のβ-グルコシターゼが産生されると考えられている。これらの種々の作用様式を示す複数の酵素が互いに補い合い、相乗効果を発現することにより、植物細胞壁の主成分であるセルロースを分解するものと考えられている。β-グルコシダーゼは、セロオリゴ糖、セロビオースまたはアグリコンとβ-D-グルコピラノシル結合をする配糖体からグルコースを遊離させる反応を触媒すると考えられ、セルロースの糖化系の最終段階および配糖体からのグルコースの遊離において重要な酵素である。【０００４】
バイオマスからのエタノール変換は、入手が容易である可能性があること、材料の燃焼または地中充填を回避できること、およびエタノール燃料がクリーンであるという利点がある。木材、農業残留物、草本性作物および都市の固体状廃棄物は、エタノール製造用バイオマスとして注目されている。これらの材料は、主としてセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンからなる。いったんセルロースがグルコースに転化されると、グルコースは酵母によりエタノールに容易に発酵される。その一方、セロビオースは、酵母によりエタノールに容易に発酵されず、残留するセロビオースが、エタノール収量の低下を引き起こす。さらに重要なことは、セロビオースが、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼに対する強力なインヒビターであることである。このため加水分解中のセロビオースの蓄積は、エタノール製造のために望ましくない。セルラーゼ産生微生物は、一般に、β-グルコシダーゼをほとんど産生することができないため、酵素的加水分解において生じるセロビオースの蓄積が、主要な問題となっている。【０００５】
セロビオースからグルコースへの転化を促進させるために、宿主中でβ-グルコシダーゼを過剰発現させて、β-グルコシダーゼの収量を増加させることは、バイオマスからグルコースへの糖化促進に有効な手段である。このため、セルラーゼ産生微生物に導入して発現させるための、新規なβ-グルコシダーゼ遺伝子の単離が望まれてきた。【０００６】
一方、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスに関しては、糖化力の強いセルラーゼを生産し（非特許文献１）、飼料用途やサイレージ用途で、高い有用性を持つことが報告されている（特許文献１−３）。また、含有されているセルラーゼ成分（特許文献４−１０）に関しても詳細な検討がなされており、その他の糸状菌と同様に多種類のセルラーゼ成分が分泌されていることが明らかにされている。特に、セルラーゼ中のβ-グルコシダーゼ活性に関しては、トリコデルマ・レーゼイ（Trichoderma reesei）等のセルラーゼに比べて著しく活性が高いことなどが報告されている（特許文献１１）。このような特性から、β-グルコシダーゼ遺伝子の単離の対象として、アクレモニウム・セルロリティカスが注目されてきた。【０００７】
しかしながら、これまでにアクレモニウム・セルロリティカスから単離された遺伝子はわずかであり（特許文献９、１０）、しかも、単離された遺伝子については、いまだに、アクレモニウム・セルロリティカス以外の糸状菌における発現に成功していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平７−２６４９９４号公報
【特許文献２】特許第２５３１５９５号明細書
【特許文献３】特開平７−２３６４３１号公報
【特許文献４】特開２００１−１７１８０号公報
【特許文献５】国際公開９７／３３９８２号パンフレット
【特許文献６】国際公開９９／０１１７６７号パンフレット
【特許文献７】特開２０００／６９９７８号公報
【特許文献８】特開平１０−０６６５６９号公報
【特許文献９】特開２００２／１０１８７６号公報
【特許文献１０】国際公開２００２／０２６９７９号パンフレット
【特許文献１１】特公昭６０−４３９５４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural  and  Biological  Chemistry）」，（日本），1987年，第51巻，p65
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、アクレモニウム・セルロリティカスから、新規なβ-グルコシダーゼ遺伝子を単離することにある。さらなる本発明の目的は、単離したβ-グルコシダーゼ遺伝子を宿主中で高発現させ、宿主からのβ-グルコシダーゼの収量を増加させることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ-グルコシダーゼの分離・精製の手法について鋭意検討を重ねた結果、遂に、アクレモニウム・セルロリティカスにおいて、これまで知られていたβ-グルコシダーゼとは異なる新規なβ-グルコシダーゼを同定することに成功した。さらに、同定したβ-グルコシダーゼをコードする遺伝子の単離にも成功した。アクレモニウム・セルロリティカスからのβ-グルコシダーゼ遺伝子の単離については、長年に渡り試みられてきたにもかかわらず、本発明者らが見出した遺伝子が単離されてこなかったのは、この遺伝子がコードするタンパク質の疎水性の高さ故、その分離・精製が困難であったことに起因するものと考えられた。【００１２】
さらに、本発明者らは、単離したアクレモニウム・セルロリティカス由来のβ-グルコシダーゼ遺伝子を宿主において高発現させ、宿主に優れた活性を持つβ-グルコシダーゼを生産させる手法について鋭意検討を行った結果、β-グルコシダーゼ遺伝子において、複数の塩基の改変を加えることにより、世界で初めて、アクレモニウム・セルロリティカス以外の糸状菌内で、β-グルコシダーゼ遺伝子を高発現させ、かつ、発現産物に高いβ-グルコシダーゼ活性を発揮させることに成功した。これにより、宿主中で、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ-グルコシダーゼを高発現させ、β-グルコシダーゼの生産量を増加させることが可能となる。本発明者らは、こうして作製した形質転換体から取得したβ-グルコシダーゼあるいはセルラーゼ調製物を利用すれば、バイオマスからグルコースへの糖化や、セルロース系基質の種々の処理や改変を、効率的に行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
即ち、本発明は、アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ-グルコシダーゼ活性を有する新規タンパク質、その類似体および改変体、これらタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびに、これらタンパク質の製造方法および用途に関し、より詳しくは、下記を提供するものである。
（１）  β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、下記（i）から（vi）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（i）配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ii）配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（iii）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（iv）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（v）配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（vi）（i）から（v）に記載のポリヌクレオチドから、シグナル配列をコードする塩基配列が除去されたポリヌクレオチド
（２）  糸状菌由来である、（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）  糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカスである、（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）  β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、下記（i）または（ii）に記載のポリヌクレオチド。
（i）配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ii）配列番号：４に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
（５）  配列番号：４に記載の塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードし、かつ、トリコデルマ・ビリデにおいて発現させることができるポリヌクレオチド。
（６）  トリコデルマ・ビリデにおいて発現させた場合の形質転換体におけるβ-グルコシダーゼ活性を、トリコデルマ・ビリデの親株におけるβ-グルコシダーゼ活性と比較して、5倍以上に向上させることができる、（５）に記載のポリヌクレオチド。
（７）  （４）から（６）のいずれかに記載のポリヌクレオチドから、シグナル配列をコードする塩基配列が除去されたポリヌクレオチド。
（８）  （１）から（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
（９）  （８）に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
（１０）  （１）から（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
（１１）  組み換えタンパク質である、（１０）に記載のタンパク質。
（１２）  （９）に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞および／またはその培養物から発現させたタンパク質を採取する工程を含む、（１１）に記載のタンパク質の製造方法。
（１３）  （１１）に記載のタンパク質を含む、セルラーゼ調製物。
（１４）  （１０）に記載のタンパク質または（１３）に記載のセルラーゼ調製物で、セルロース材料を処理する工程を含む、セルロース材料を分解または変換する方法。
（１５）  （１０）に記載のタンパク質または（１３）に記載のセルラーゼ調製物で、セルロース材料を処理し、セルロース材料分解物を回収する工程を含む、分解または変換されたセルロース材料の製造方法。
（１６）  セルロース材料分解物が糖である、（１５）に記載の方法。
（１７）  （１０）に記載のタンパク質または（１３）に記載のセルラーゼ調製物を含んでなる洗剤組成物。
（１８）  （１０）に記載のタンパク質、（１３）に記載のセルラーゼ調製物、または（１７）に記載の洗剤組成物とセルロース含有繊維とを接触させる工程を含む、セルロース含有繊維の処理方法。
（１９）  古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、（１０）に記載のタンパク質または（１３）に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
（２０）  （１０）に記載のタンパク質または（１３）に記載のセルラーゼ調製物で紙パルプを処理する工程を含む、ろ水性が改善された紙パルプの製造方法。
（２１）  （１０）に記載のタンパク質または（１３）に記載のセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含む、消化能が改善された動物試料の製造方法。
（２２）  （２）に記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現が抑制された糸状菌。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、アクレモニウム・セルロリティカスに由来する新規なβ-グルコシターゼ遺伝子、および、宿主内でβ-グルコシターゼを効率良く発現させるための、その類似体および改変体が提供された。さらに、該β-グルコシターゼを高発現し、優れたβ-グルコシターゼ活性を示す宿主が提供された。これによりアクレモニウム・セルロリティカスに由来するβ-グルコシダーゼを、精製タンパク質として、あるいはセルラーゼ調製物として、高い収量で取得することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】プラスミドpBGLBの制限酵素地図を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
β-グルコシターゼ活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明は、新規なβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明において「β-グルコシターゼ」とは、β-グルコシダーゼ活性を示す酵素、すなわち、β-D-Glucoside  glucohydrolase  EC3.2.1.21を意味する。「β-グルコシダーゼ活性」とは、セロオリゴ糖、セロビオース、またはアグリコンとβ-D-グルコピラノシル結合をする配糖体を、エキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する活性を意味する。
【００１７】
本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする「ポリヌクレオチド」には、例えば、DNAもしくはRNA、またはそれらの修飾体もしくはキメラ体が含まれるが、好ましくはDNAである。DNAには、cDNA、ゲノムDNA、および化学合成DNAが含まれる。本発明者らにより単離されたアクレモニウム・セルロリティカスに由来する新規なβ-グルコシターゼ（以下、「acBGLB」と称する）をコードするｃDNAの塩基配列を配列番号：１に、ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：２に示す。また、これらDNAがコードするacBGLBのアミノ酸配列を配列番号：３に示す。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドの好ましい態様は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるacBGLBをコードするポリヌクレオチドであり、例えば、配列番号：１または２に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１９】
本発明は、また、acBGLBと機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、acBGLBの変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが挙げられる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質がβ-グルコシダーゼ活性を有することを意味する。好ましくはacBGLBと比較して、70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上のβ-グルコシダーゼ活性を有するものである。対象となるタンパク質およびacBGLBのβ-グルコシダーゼ活性は、文献（Methods  in  ENZYMOLOGY,  vol.160,  Biomass  Part  A  Cellulose  and  Hemicellulose,  Willis  A.  Wood編  p109-110）記載の方法で測定した場合における、1分間にp-ニトロフェニル-β-グルコシドから1μmolのp-ニトロフェノールを生成する活性として評価することができる。
【００２０】
acBGLBと機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一つの態様は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、１つもしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００２１】
改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは1〜40個、より好ましくは1〜20個、更に好ましくは1〜8個、最も好ましくは1〜4個である。アミノ酸の改変としては、保存的置換が好ましい。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように１もしくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に、当業者に公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００２２】
本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、トリコデルマ・ビリデにおいて発現させる場合には、特に、配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：４に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド）であることが好ましい。配列番号：４に記載の塩基配列は、acBGLBをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（配列番号：１）と比較して、13.2％以上の塩基が変更されている。しかも、そのコードするアミノ酸配列においては、20種類あるアミノ酸のうち16種類のアミノ酸について、コードする塩基配列の変更がなされており、各アミノ酸に対応するコドンの決定においては、宿主におけるコドンの使用頻度分布が考慮されている。これにより、トリコデルマ・ビリデにおいて発現させることを可能にすると供に、発現産物に高いβ-グルコシダーゼ活性を発揮させることに成功した。一旦、このような好適化配列が得られれば、当業者であれば、この配列を基盤として、さらに塩基配列を改変して、配列番号：４に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドと同様に、トリコデルマにおいて発現させることが可能なポリヌクレオチドを取得することが可能である。従って、本発明は、配列番号：４に記載の塩基配列において、１もしくは複数個（好ましくは30塩基以内、さらに好ましくは20塩基以内、さらに好ましくは10塩基以内、さらに好ましくは5塩基以内）の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードし、かつ、トリコデルマ・ビリデにおいて発現させることができるポリヌクレオチドを提供するものである。このようなポリヌクレオチドの好ましい態様は、トリコデルマ・ビリデにおいて発現させた場合の形質転換体におけるβ-グルコシダーゼ活性を、トリコデルマ・ビリデの親株（ウラシル生合成遺伝子が欠損されていない元のトリコデルマ・ビリデ株）におけるβ-グルコシダーゼ活性（実施例５を参照）と比較して、5倍以上（好ましくは、7倍以上）に向上させることができるポリヌクレオチドである。
【００２３】
本発明における、acBGLBと機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの他の態様は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。ここで「同一性（identity）」とは、当業者に公知の相同性検索プログラムであるFASTA3［Science，227，1435-1441(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,2444-2448(1988)、http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html］においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。前記同一性としては、好ましくは95％以上の同一性、さらに好ましくは98％以上の同一性、特に好ましくは99％以上の同一性であることができる。
【００２４】
本発明における、acBGLBと機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの他の態様は、配列番号：１または２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、2×SSC濃度（1×SSC:15mmol/Lクエン酸3ナトリウム、150mmol/L塩化ナトリウム）、0.5％SDS溶液中で、60℃、20分間の洗浄条件を意味する。
【００２５】
本発明は、また、acBGLBまたはそれと機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチドから、シグナル配列をコードする塩基配列が除去されたポリヌクレオチドを提供する。acBGLBのシグナル配列は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列においては、-18位〜-1位のアミノ酸配列である。
【００２６】
本発明のタンパク質は、成熟タンパク質部分に対応する各アミノ酸配列のN末端および／またはC末端に、β-グルコシダーゼ活性に影響を与えない範囲で、任意のポリペプチド配列を付与することができる。このようなポリペプチド配列としては、例えば、シグナル配列、検出用マーカー（例えば、FLAGタグ）、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)］を挙げることができる。
【００２７】
本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするゲノムDNAの調製においては、例えば、まず、アクレモニウム・セルロリティカスなどの目的の微生物から慣行法によりゲノムDNAを抽出する。このゲノムDNAを適当な制限酵素にて消化後、適当なベクターと連結することにより、アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムDNAライブラリーを作製する。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、BACベクター等、多様なものが使用できる。次に、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号：２）に基づいて適当なプローブを作成し、ゲノムDNAライブラリーからハイブリダイゼーションによって所望のゲノムDNAを単離することができる。また、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号：２）に基づいてプライマーを作成し、アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムDNAを鋳型としてPCRを実施し、増幅したDNA断片を適当なベクターと連結することにより所望のゲノムDNAを単離することができる。また、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするｃDNAの調製においては、例えば、まず、アクレモニウム・セルロリティカスなどの目的の微生物から抽出したmRNAを基にcDNAを合成する。このcDNAを適当な制限酵素にて消化後、適当なベクターと連結することにより、アクレモニウム・セルロリティカスのcDNAライブラリーを作製する。次に、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号：１）に基づいて適当なプローブを作成し、cDNAライブラリーからハイブリダイゼーションによって所望のcDNAを単離することができる。また、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号：１）に基づいてプライマーを作成し、アクレモニウム・セルロリティカスのcDNAを鋳型としてPCRを実施し、増幅したDNA断片を適当なベクターと連結することにより所望のcDNAを単離することができる。また、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、人工的に化学合成することも可能である。
【００２８】
本発明においては、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、宿主微生物内で複製可能で、かつ、そのポリヌクレオチド配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含む発現ベクターが提供される。本発明の発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発明の発現ベクターは、宿主微生物に導入された場合、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明の発現ベクターの構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００２９】
本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入してβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質を発現させるために、上記本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の他に、その発現を制御するポリヌクレオチド配列や微生物を選択するための遺伝子マーカーなどを含んでいることが望ましい。発現を制御するポリヌクレオチド配列としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、またはシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、が挙げられる。プロモーターは、宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種微生物由来のものであっても、異種微生物由来のものであってもよい。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種微生物由来のものであっても、異種微生物由来のものであってもよい。また、遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択することができ、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００３０】
さらに、本発明は、この発現ベクターによって形質転換された微生物を提供する。本発明において用いられる宿主微生物としては、特に限定されず、例えば、糸状菌、酵母、大腸菌、放線菌などが挙げられる。酵母細胞としては、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、またはピキア（Pichia）属に属するものが挙げられ、好ましい酵母細胞の一例は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。また、糸状菌としては、例えば、フミコーラ（Humicola）属、アスペルギルス（Aspergillus）属またはトリコデルマ（Trichoderma）属、フザリウム（Fusarium）属、またはアクレモニウム（Acremonium）属に属するものが挙げられ、好ましい糸状菌の例は、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）もしくはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、またはトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、フザリウム・オキシスポーラム（Fusarium oxysporum）、またはアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）である。本発明の発現ベクターによる、これら微生物の形質転換は、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
【００３１】
本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質（または後述する本発明のセルラーゼ調製物）は、こうして調製した形質転換体を、適当な培地で培養し、その培養物（例えば、培養細胞、培養上清）から回収することができる。形質転換体の培養およびその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。例えば、形質転換体の培養終了後、培養物を遠心分離等により除去して得た上清液を粗酵素として用いることもできる。さらに、この上清液を、限外濾過法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とすることもできる。さらに、濃縮後、スプレードライ法などによって粉末酵素とすることもできる。本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質（または本発明のセルラーゼ調製物）は、これら濃縮酵素または粉末酵素を、必要に応じて、部分精製または高度に精製して得ることができる。精製方法としては、常法、例えば、硫酸アンモニウムなどによる塩析法、アルコールなどによる有機溶媒沈殿法、膜分離法、あるいはイオン交換体、疎水クロマトグラフ用担体、またはゲル濾過用担体などを用いるクロマト分離法を、単独または適宜組み合わせて用いることができる。本発明は、こうした本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質（または本発明のセルラーゼ調製物）の製造方法をも提供するものである。
セルラーゼ調製物
本発明は、上記の本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質を含むセルラーゼ調製物を提供する。本発明のセルラーゼ調製物は、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質以外に、他のタンパク質が含まれていてもよい。他のタンパク質としては、例えば、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質以外のβ-グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α-グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼを含んでなることができる。本発明のセルラーゼ調製物に含まれる、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質以外のタンパク質は、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質を発現させた形質転換体に由来してもよく、また、別途、添加したものであってもよい。
【００３２】
本発明のセルラーゼ調製物は、一般的に含まれる担体もしくは媒体、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等と混合して、製造されてもよい。また、本発明のセルラーゼ調製物は、適当な形状、例えば、粉末または液体状にて調製することができる。
β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質またはセルラーゼ調製物の用途
本発明は、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質または本発明のセルラーゼ調製物で、セルロース材料を処理することを含む、セルロース材料を分解または変換する方法を提供する。さらに、本発明は、セルロース材料を処理した後、セルロース材料分解物を回収することを含む、分解または変換されたセルロース材料の製造方法を提供する。セルロース材料は、典型的には、バイオマスであり、その例としては、稲わら、バガス、コーンストーバー、椰子の実などの果実の絞りかす、廃木材、およびこれらに適切な前処理を施した材料が挙げられるが、これらに限定されない。セルロース材料の処理に用いる、β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質またはセルラーゼ調製物は、細胞を除去した形態、または、除去しない粗製発酵ブロスの形態であってもよく、半精製または精製した調製物の形態であってもよい。本発明の形質転換体は、バイオマスを使用する発酵プロセスにおいて、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質を生産させる源として使用することができる。形質転換体は、各種セルラーゼ遺伝子や、バイオマスのプロセシングにおいて有効な他の酵素をコードする遺伝子が導入されていてもよい。本発明の方法は、例えば、バイオマスから化学的または発酵フィードストックとして糖（例えば、単糖類、二糖類、多糖類）を製造するために、利用することができる。こうして得られた糖は、例えば、エタノール、プラスチック、他の生成物または中間体を製造するための原料となる。
【００３３】
本発明は、また、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質または本発明のセルラーゼ調製物を含んでなる洗剤組成物を提供する。本発明の洗剤組成物は、界面活性剤（アニオン性、ノニオン性、カチオン性、両性又は双性イオン性あるいはそれらの混合物であり得る）をも含有し得る。また、前記洗剤組成物は、当分野で既知の他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素（プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼなど）、酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、及び／又は発泡促進剤等をも含有しうる。
【００３４】
本発明は、また、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質、本発明のセルラーゼ調製物、または該洗剤組成物を、セルロース含有繊維に接触させる工程を含む、セルロース含有繊維の処理方法を提供する。本発明の処理方法により改善されうる、セルロース含有繊維の性質としては、例えば、(１)減量による繊維の肌触り及び外観の改善、(２)着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化の付与、すなわち、着色セルロース含有繊維、代表的にはジーンズへのストーンウォッシュ様の外観及び風合いの付与、(３)着色セルロース含有繊維の色の澄明化、(４)柔軟化（ごわつき始める速度の低減、ごわつきの低減）、(５)毛羽の除去（毛羽立ち始める速度の低減、毛羽立ちの低減）が挙げられる。
【００３５】
本発明は、また、古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質または本発明のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法を提供する。
【００３６】
本発明は、また、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質または本発明のセルラーゼ調製物で紙パルプを処理する工程を含む、ろ水性が改善された紙パルプの製造方法を提供する。本発明によれば、紙パルプのろ水性を、強度の著しい低下を伴うことなく改善することができる。処理の対象となる紙パルプの例としては、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプまたは加工熱処理および他の高収率パルプが挙げられるが、これらに制限されない。
【００３７】
本発明は、また、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質または本発明のセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含む、消化能を改善された動物飼料の製造方法を提供する。本発明の方法によれば、例えば、動物体内における、飼料中のグルカンの消化能を改善することができる。
β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質の発現が抑制された糸状菌
本発明は、本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質の発現が抑制された糸状菌を提供する。糸状菌は、好ましくは、アクレモニウム（Acremonium）属に属する糸状菌であり、最も好ましくはアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）である。糸状菌における本発明のβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質（内因性タンパク質）の発現の抑制は、例えば、RNA干渉法、アンチセンスRNA・DNA法、相同組換えなどの汎用技術を利用して行うことができる。これら技術に用いられるポリヌクレオチド分子（例えば、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、同組み換えのための標的DNAと相同な配列を含むポリヌクレオチドなど）の作成、これらポリヌクレオチドを含むベクターの作成、およびベクターの宿主への導入の手法は、当業者に公知である。こうして作製された糸状菌を利用して、植物などに広く分布するセルロースの分解を行った場合、その分解過程において最終的な分解物であるグルコースが生成されず、グルコース二分子がβ-1,4結合で結合したセロビオースを選択的に製造される。セロビオースは、甘味がある一方、ヒト体内では分解されないことから、健康食品や糖尿病患者用食品の甘味料、化粧品原料、あるいは医薬品原料として有用である。本発明の糸状菌を利用すれば、このような製品の原料を安価に提供することが可能となる。
【実施例】
【００３８】
本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に限定されるものではない。【００３９】
[実施例１]  アクレモニウム・セルロリティカスのβ-グルコシダーゼの精製
アクレモニウム・セルロリティカスから、スプレードライしたセルラーゼの粉末酵素を調製し、0.5Mの(NH4)2SO4を含むTris-HCl緩衝液(0.05M、pH7.0)に溶解し、不純物を高速冷却遠心分離により除去した。得られた上清を酵素精製の出発材料として以下に示した方法で精製した。
(a)疎水性クロマトグラフィ−（その１）
上清に含まれるタンパク質を、0.5Mの(NH4)2SO4を含むTris-HCl緩衝液(0.05M、pH7.0)中で、HiTrap  Butyl  FF(GE  Healthcar社製)に吸着させ、次いで、(NH4)2SO4を0.5Mから0Mを含むTris-HCl緩衝液(0.05M、pH7.0)中で、吸着させたタンパク質のリニアグラジェント溶出を行い、β-グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
(b)疎水性クロマトグラフィ−（その２）
上記(a)で得た画分中のタンパク質を再度、HiTrap  Butyl  FF(GE  Healthcare社製)に吸着させ、次いで、(a)と同様の方法で、吸着させたタンパク質のリニアグラジェント溶出を行ない、β-グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
(c)強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー
上記(b)で得た画分中のタンパク質をTris-HCl緩衝液(0.05M、pH7.0)中で、MonoQ(GE  Healthcare社製)に吸着させ、NaClを0Mから1Mを含むTris-HCl緩衝液(0.05M、pH7.0)中で、吸着させたタンパク質のリニアグラジェント溶出を行い、β-グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
[実施例２]  精製したβ-グルコシダーゼの部分アミノ酸配列決定
実施例１の強塩基性陰イオン交換クロマトグラフィーで分取したβ-グルコシダーゼ活性を有する画分を、12％  Gel  SDS-PAGE  mini(テフコ社製)を用いて電気泳動による分離を行い、アクレモニウム・セルロリティカスのβ-グルコシダーゼB(acBGLB)を同定した。acBGLBのバンドを切り出した後、還元カルボキシメチル化し、次いでリシルエンドペプチダーゼで処理した。この分解産物を12％  Gel  SDS-PAGE  mini(テフコ社製)を用いて電気泳動による分離を行ない、PVDF膜（ミリポア社製）上にブロットした。得られたペプチド断片のバンドを切り出し、プロテインシークエンサーModel  492（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ペプチド断片のN末端アミノ酸配列を決定した。決定したacBGLBの部分アミノ酸配列（「BGLB-LE-1」、「BGLB-LE-2」）を、それぞれ配列番号：6と7に示す。
[実施例３]  acBGLB遺伝子のクローニング
（1）ゲノムDNAの単離
アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株を、（s）培地（2％ブイヨン、0.5％イーストエキスおよび2％グルコース）で32℃にて2日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体より、堀内らの方法（H.Horiuchi  et.  al.,  J.Bacteriol.,  170,  272-278,  (1988)）に従い、ゲノムDNAを単離した。
（2）acBGLB遺伝子断片の取得
acBGLBの部分アミノ酸配列を基に以下のプライマーを作製した。
BGLB-F：CCNTTYGTNGGNAAYACNGCNGCNCC（配列番号：8）
BGLB-R：CATDATRTANCCNGGRAANCC（配列番号：9）
BGLB-FおよびBGLB-Rをプライマーとして使用し、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRはLA  taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。PCRは、「94℃で30秒、53℃で30秒、72℃で2分間」を35サイクルで実施した。増幅された650bpのDNA断片を、TOPO  TAクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いて、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミド「TOPO-pBGLB-partial」を得た。【００４０】
プラスミド「TOPO-pBGLB-partial」にクローニングされた挿入DNA断片のシークエンスは、BigDye  Terminator  v3.1  Cycle  Sequebcing  Kit（アプライドバイオシステムズ社製）とABI  PRISMジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って、決定した。得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳し、そのアミノ酸配列をホモロジー検索した結果、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のβ-グルコシダーゼ（XP_001216552）と72％の、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffei）由来のβ-グルコシダーゼ（XP_002149046.1）と88％の相同性を示しため、本DNA断片が、β-グルコシダーゼ（Glycoside  Hydrolase  family  3）遺伝子の一部であると判断した。
（3）インバースPCR法によるacBGLB遺伝子全長の取得
インバースPCR法は、Trigliaらの方法（T  Triglia  et.  al.,  Nucleic  Acids  Research,  16,  8186,  (1988)）に従って実施した。アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムDNAをScaＩで一晩消化し、消化断片から、Mighty  Mix（タカラバイオ社製）を用いて、環状DNAを作製した。本環状DNAをテンプレートに、acBGLB遺伝子断片の塩基配列情報を基に作製した下記プライマーを用いて、PCRを実施し、acBGLB遺伝子の5’上流領域ならびに3’下流領域を取得した。
BGLB-inv-F：TAGGCGTTCGTTATGCGAAC（配列番号：10）
BGLB-inv-R：AAACGAGATTCCAGATGGCG（配列番号：11）
上記5’上流領域ならびに3’下流領域を実施例3-(2)に記載の方法により解析し、BGLB遺伝子の全長塩基配列を決定した。【００４１】
インバースPCR法により得た塩基配列を基に以下のプライマーを作製し、ゲノムDNAをテンプレートにPCRを実施し、BGLB遺伝子を増幅した。
pBGLB-F：CTGGACCTATATTCCCCGAT（配列番号：12）
pBGLB-R：TGGTTTGTCCATACTGCGTC（配列番号：13）
増幅されたDNAをTOPO  TAクローニングキット（インビトロジェン社製）によりpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミド「pBGLB」を得た。得られたプラスミド「pBGLB」で大腸菌（Escherichia coli）TOP10株（インビトロジェン社製）を形質転換することにより「Escherichia  coli  TOP10株/pBGLB」を得た。
（4）acBGLB  cDNAの作製、およびacBGLB  ゲノムDNAのイントロン解析
アクレモニウム・セルロリティカスACCP-5-1株をセルラーゼ誘導培地で32℃にて2日間培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用いて磨砕した。この磨砕した菌体からISOGEN（ニッポンジーン社）により、添付のプロトコールに従い全RNAを単離した。さらに、全RNAから、mRNA  Purification  Kit（ファルマシア社）により、添付のプロトコールに従い、mRNAを精製した。【００４２】
こうして得られたmRNAから、TimeSaver  cDNA  Synthesis  Kit（ファルマシア社）により、添付のプロトコールに従い、cDNAを合成した。acBGLB遺伝子配列から開始コドンならびに終始コドンを含む下記のプライマーを作製し、cDNAをテンプレートにPCRを実施した。
BGLB-N：ATGTATTCCGCATTTCTTTTGCTGC（配列番号：14）
BGLB-C：CTATTGTAGGCATTGAGAATACCAT（配列番号：15）
増幅されたcDNAの塩基配列（配列番号：1）を、実施例3-(2)に記載の方法により解析し、pBGLB  ゲノムDNAの塩基配列と比較することで、ゲノムDNA中のイントロンの位置を決定した。
（5）acBGLBのアミノ酸配列の推定
上記の方法により単離されたacBGLB  ゲノムDNAのエクソンおよびイントロンは、配列番号：2に記載の塩基配列の218〜2847位に示された2630bpからなっていた。また、acBGLB  ゲノムDNAは、配列番号：2に記載の塩基配列の734〜792番、1665〜1717番、および2523〜2601番に示される3つのイントロンを含んでいた。オープンリーディングフレーム（ORF）から予測されるacBGLBのアミノ酸配列は、配列番号：3に示される通りであった。このORFから予測されるアミノ酸配列の一部は、実施例2において決定したacBGLBの内部配列と一致した。この事実から、単離したゲノムDNAが、acBGLBをコードしていることが明らかとなった。なお、シグナル配列予測ソフトSignalP  3.0によりacBGLBの-18〜-1アミノ酸残基までをシグナル配列と推定した。
[実施例４]  acBGLB遺伝子のトリコデルマ・ビリデでの発現
（1）トリコデルマ・ビリデでの発現に適したacBGLB遺伝子コドンの改変
acBGLB遺伝子をトリコデルマ・ビリデにおいて、活性あるタンパク質として高発現させるために、acBGLB遺伝子の改変を行った。試行錯誤の結果、acBGLB遺伝子から13.2％以上の塩基の変更を伴う、配列番号：4に記載の塩基配列からなるDNAを見出した。この改変acBGLB遺伝子は、20種類のアミノ酸のうち16種類のアミノ酸について、コードする塩基配列の変更を行うと供に、トリコデルマ・ビリデにおけるコドンの使用頻度分布を考慮してデザインしたものである。この改変acBGLB遺伝子を、株式会社ジーンデザインで、人工的に合成した。人工合成の際、開始コドンの上流の配列にXbaＩとSnaBＩを、終始コドンの下流にSalＩとXbaＩを含むように設計した。pUC19のXbaＩに、コドン改変acBGLB遺伝子が挿入されたプラスミド「pBGLBkai」を得た。
（2）コドン改変BGLB発現プラスミドBGLBkai−pCB1の構築
プラスミド「pBGLBkai」をSnaBＩおよびSalＩ切断し、約2.7kbpの遺伝子断片「BGLBkai-N」を得た。一方、pCB1-Eg3X(国際公開98/11239号パンフレット)からハイグロマイシンB耐性カセットを削除するため、制限酵素XbaＩで切断した後、TaKaRa  DNA  Ligation  Kit  Mighty  Mix(宝酒造社製)を用いて再び環状にし、得られたプラスミドを「pCB1-Eg3X-hphless」とした。「pCB1-Eg3X-hphless」をStuＩおよびXhoＩで切断し、約７kbpの断片を回収した。これに約2.7kbpの遺伝子断片「BGLBkai-N」をTaKaRa  DNA  Ligation  Kit  Mighty  Mix(宝酒造社製)を用いて連結し、プラスミド「BGLBkai−pCB1」を作成した。酵素などの反応条件についてはキットに添付の説明書の条件に従った。プラスミド「BGLBkai−pCB1」は、宿主のトリコデルマ・ビリデ内にて、自身の開始コドンを用いて改変acBGLBを発現するように構築した。
（3）プラスミド「BGLBkai−pCB1」によるトリコデルマ・ビリデの形質転換体の作製
実施例4-(2)で得られたプラスミド「BGLBkai−pCB1」によるトリコデルマ・ビリデの形質転換は、国際公開第2005/056787号パンフレットに記載の方法に従い、実施した。ウラシル生合成遺伝子（pyr4）欠損株であるトリコデルマ・ビリデ  strain2株を宿主とし、選択マーカーとしてニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)のpyr4遺伝子を用いたコートランスフォーメーション法により形質転換を実施した。トリコデルマ・ビリデ  strain2株を50mLの菌体形成培地(1％  イーストエキス、1％  モルトエキス、2％  ポリペプトン、2.5％  グルコース、0.1％  リン酸水素2カリウム、0.05％  硫酸マグネシウム7水和物、0.0001％  ウリジン(pH7.0))において、28℃で24時間培養し、3000rpmで10分間遠心分離し、集菌した。得られた菌体を0.5mol/L  シュークロースで洗浄し、綿で濾過したプロトプラスト化酵素溶液（1mg/mL  β-グルクロニダーゼ、0.3mg/mL  キチナーゼ、0.3mg/mL  ザイモリエース、0.5mol/L  シュークロース）に懸濁した。30℃で60分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、2500rpmで10分間遠心分離してプロトプラストを回収し、SUTC緩衝液(0.5mol/L  シュークロース、10mmol/L  塩化カルシウム、10mmol/L  トリス塩酸(pH7.5))で洗浄した。【００４３】
このプロトプラストを100μLのSUTC緩衝液に懸濁し、そこに10μg分のプラスミド「BGLBkai−pCB1」が入ったDNA溶液10μLとpyr4遺伝子が入ったDNA溶液10μLを加え、氷中に5分間静置した。次に400μLのPEG溶液(60％  PEG4000、10mmol/L  塩化カルシウム、10mmol/L  トリス塩酸(pH7.5))を加え、氷中に20分間静置した後、10mLのSUTC緩衝液を加え、2500rpmで10分間遠心分離した。集めたプロトプラストを1mLのSUTC緩衝液に懸濁し、200μLずつ0.5mol/L  シュークロースを含む最少培地に軟寒天とともに重層し、28℃で5日間培養後、生育したコロニーを再度最少培地に移植し、ここで形成したコロニーを形質転換体とした。
（4）「BGLBkai−pCB1」の形質転換体の培養および同定
プラスミド「BGLBkai−pCB1」を導入し最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第98/11239号パンフレットに準じて培養した。得られた培養上清液を12％  Gel  SDS-PAGE  mini(テフコ社製)を用いて電気泳動分離を行い、実施例2で同定したacBGLBと同じ泳動距離のバンドが良好に検出される培養上清を選抜した。
（5）組換え改変acBGLBの部分アミノ酸配列の同定
実施例4-(4)で大量発現したタンパク質が改変acBGLBであることを確認するために、部分アミノ酸配列を決定した。まず、培養上清中のタンパク質について12％  Gel  SDS-PAGE  mini(テフコ社製)を用いて電気泳動による分離を行い、実施例2の方法に従って分離したacBGLBのバンドをリシルエンドペプチダーゼで処理した。この分解産物を12％  Gel  SDS-PAGE  mini(テフコ社製)を用いて電気泳動によって分離し、PVDF膜（ミリポア社製）上にブロットした。得られたペプチド断片のバンドを切り出し、プロテインシークエンサーModel  492（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ペプチド断片のN末端アミノ酸配列を決定した。その結果、acBGLBの部分アミノ酸配列（配列番号：6）と一致した。
[実施例５]  トリコデルマ・ビリデ形質転換体における酵素活性の測定
実施例4-(4)で得られた「BGLBkai−pCB1」形質転換体の培養上清を用いてβ-グルコシダーゼ活性を測定した。測定法は、文献（Methods  in  ENZYMOLOGY,  vol.160,  Biomass  Part  A  Cellulose  and  Hemicellulose,  Willis  A.  Wood編  p109-110）に記載の方法に準じた。なお、β-グルコシダーゼ活性は、1分間にp-ニトロフェニル-β-グルコシドから1μmolのp-ニトロフェノールを生成する活性と定義し、培養上清1mL当りの活性(U/mL)として表した。その結果は、表１の通りである。表１から明らかなように、形質転換体は親株（ウラシル生合成遺伝子が欠損されていない元のトリコデルマ・ビリデ株）の約7.5倍の活性を示した。【００４４】
【表１】
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【００４５】
これにより、β-グルコシダーゼ活性が低いセルラーゼ産生微生物に、アクレモニウム・セルロリティカスに由来するβ-グルコシダーゼを過剰発現させ、該微生物におけるβ-グルコシダーゼ活性を増強させることが可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
以上、説明したように、本発明により、アクレモニウム・セルロリティカスに由来するβ-グルコシダーゼを、精製タンパク質として、あるいはセルラーゼ調製物として、高い収量で得ることが可能となった。こうして取得したβ-グルコシダーゼやセルラーゼ調製物を用いることにより、バイオマスからグルコースへの糖化の促進や、セルロース系基質の処理や改変の効率化を図ることが可能となる。また、これらβ-グルコシダーゼやセルラーゼ調製物の利用を安価で行うことが可能となる。また、本発明のβ-グルコシダーゼの発現が抑制された糸状菌を利用すれば、甘味料、化粧品原料、あるいは医薬品原料として有用なセロビオースを効率的に生産することが可能となる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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