(57)【要約】  本発明は、任意の抗体と結合する物質の同定処理方法であって、抗体との反応性に関し、その分子量と関連づけて検出する方法の提供を目的とする。また、該方法を実施するための装置の提供を目的とする。  本発明は、任意の抗体と結合する物質の同定処理方法であって、（ａ）目的物質の分子量情報と、分子量情報取得時間を取得する工程、（ｂ）該物質と抗体との結合情報と、抗体結合情報取得時間を取得する工程、（ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）で得られた情報から該物質の分子量情報と抗体結合情報とを関連付ける工程、（ｄ）工程（ｃ）で関連付けられた分子量情報と抗体結合情報を表示する工程、を含む同定処理方法、及び該方法を実施するための装置である。
2011135692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の抗体と結合する物質の同定処理方法であって、
（ａ）目的物質の分子量情報と、分子量情報取得時間を取得する工程、
（ｂ）該物質と抗体との結合情報と、抗体結合情報取得時間を取得する工程、
（ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）で得られた情報から該物質の分子量情報と抗体結合情報とを関連付ける工程、
（ｄ）工程（ｃ）で関連付けられた分子量情報と抗体結合情報を表示する工程、
を含む同定処理方法。
【請求項２】
前記物質の抗体結合情報が、水晶振動子を使用した方法で取得されることを特徴とする請求項１に記載の物質の同定処理方法。
【請求項３】
前記物質の抗体結合情報が、表面プラズモン共鳴を使用した方法で取得されることを特徴とする請求項１に記載の物質の同定処理方法。
【請求項４】
前記物質の抗体結合情報が、電気化学的測定手法を使用した方法で取得されることを特徴とする請求項１に記載の物質の同定処理方法。
【請求項５】
前記分子量情報が、目的物質をゲルろ過カラムクロマトグラフィーで分離し、該カラムクロマトグラフィーにより作成されたクロマトデータにおける目的物質のピーク位置に基づいて取得されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の同定処理方法。
【請求項６】
前記分子量情報が、目的物質を電気泳動で分離し、該電気泳動パターンにおける目的物質の位置に基づいて取得されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の同定処理方法。
【請求項７】
前記物質がタンパク質であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の同定処理方法。
【請求項８】
試料中の物質を分子量に基づいて分離し、該物質の分子量情報及び任意の抗体との結合情報を関連付けて検出するために使用される装置であって、
（ａ）分離された各物質の分子量情報と、試料導入から各分子量情報を取得するまでの時間を取得する手段、
（ｂ）分離された各物質の抗体との結合情報と、試料導入から各抗体結合情報を取得するまでの時間を取得する手段、
（ｃ）手段（ａ）と手段（ｂ）により得られた情報から各物質の分子量情報と抗体結合情報とを関連付ける手段、
（ｄ）手段（ｃ）で関連付けられた分子量情報と抗体結合情報を表示する手段、
を備える装置。
【請求項９】
前記物質の抗体結合情報の取得手段が、水晶振動子を使用した手段であることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記物質の抗体結合情報の取得手段が、表面プラズモン共鳴を使用した手段であることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
前記物質の抗体結合情報の取得手段が、電気化学的測定手法を使用した手段であることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１２】
前記分子量情報の取得手段が、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーであり、カラムクロマトグラフィーにより作成されたクロマトデータにおける物質のピーク位置に基づいて分子量情報を取得することを特徴とする請求項８乃至１１のいずれかに記載の装置。
【請求項１３】
前記分子量情報の取得手段が、電気泳動であり、電気泳動パターンにおける目的物質の位置に基づいて分子量情報を取得することを特徴とする請求項８乃至１１のいずれかに記載に記載の装置。
【請求項１４】
前記試料中の物質にタンパク質が含まれることを特徴とする請求項８乃至１３のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質の微量分析方法及び微量分析装置に関する。より具体的には、本発明は、生体物質、特にタンパク質の微量分析方法及び微量分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、脂質、あるいは、糖などの生体物質の中には、極微量でも必須の役割を担っている物質が少なからず存在しており、これらの微量物質の生体内における動態が生体に影響を与えることがある。特に、タンパク質は、様々な機能を営んでいることが知られている。例えば、従来、タンパク質と言えば三大栄養素のひとつとして生体組織材料の補給源という認識が強かったが、近年では分解物のペプチドやアミノ酸を含め、血圧降下作用、内分泌、免疫および神経系への作用、抗酸化作用など生理活性機能面の重要性が増している。他方、タンパク質やその分解物は癌、高血圧、痴呆症などの原因のひとつに挙げられ、さらにアレルギーの原因物質にもなることから、健康・医療の分野においても注目されている。これらのタンパク質の多くは微量で作用するため、研究開発や臨床検査における検体に含まれる量もごくわずかとなることが多い。そのため、これらの分析には高度な専門技術と特別の装置が必要となる。今後、微量タンパク質成分に関する研究や検査の重要度は高まる一方であり、微量タンパク質を精度よく簡便に検出できる分析技術や自動化装置が必要とされている。【０００３】
バイオテクノロジー分野において、ゲノム、タンパク質、細胞それぞれの機能やその量的変化を測定する基本原理はほぼ確立されている。２１世紀に入りゲノム関連の測定機器分野(例えば、ＤＮＡシークエンサー、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイなど）では大量サンプルの高速自動測定が可能で、かつ比較的安価な機器が市場に登場している。これらの機器は、研究の生産性効率化を促すとともに、これまでにはないバイオ技術を用いた医療、産業分野での応用を可能にしている。一方、タンパク質関連の汎用測定機器分野では、大量サンプルの高速自動測定を可能にする機器はまだ少ないのが現状である。
現在行われているタンパク質の微量分析技術のひとつにウエスタンブロッティング法がある。この方法は電気泳動法によって分離したタンパク質を、検出感度の高い抗原抗体反応を利用して検出するものである。この方法は単に検出するだけでなく、タンパク質の結合状態や修飾状態なども判別できるため、生命科学分野で特に重宝されている。しかし、ウエスタンブロッティング法にも、操作の煩雑さ、測定時間、定量データの互換性などいくつか課題が残されている。ウエスタンブロッティング法では、タンパク質の分離に電気泳動法を用い、分離タンパク質の検出に免疫染色法を用いている。電気泳動法はタンパク質の分解能に優れているが、免疫染色ではタンパク質である抗体を使用するため、ゲル内で抗原と目的タンパク質とを反応させて発色させるのが難しく、一度薄膜上に転写する必要がある。このように、従来のウエスタンブロティング法においては、タンパク質を抗体で検出する場合、最終的な検出結果を確認するまでに、半日から１日程度の時間と生化学的実験に関する相当の経験と知識が必要となる。さらに従来法では、定量性や再現性に課題があり、ウエスタンブロティング法と同等の情報を有する迅速かつ簡易な技術が求められている。【０００４】
試料中に微量に存在する物質を抗体によりできるだけ迅速かつ簡易に検出する方法として、水晶振動子を使用する方法（例えば、特許文献１〜特許文献６）、表面プラズモン共鳴を使用する方法（例えば、特許文献７、特許文献８）、電気化学的測定手法（例えば、特許文献１３、１４）などが知られている。水晶振動子は、水晶の圧電効果により高周波数精度の発振を起こす受動素子である。水晶振動子を用いた物質の測定方法は、振動子表面へ物質が吸着すると、その重量に比例して周波数が変化するため、この周波数変化を利用して微量成分を検出するものである。水晶振動子表面に固定された抗体が抗原と反応すると、振動子の周波数変化によって、抗原抗体反応感知することができるため、水晶振動子を使用した検出方法は、使用する抗体を予め標識する必要がなく、従来の免疫染色的な方法に比較して簡易、迅速、かつ安価に行うことができる。また、水晶振動子を高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどと組み合わせて、物質の測定又は検出を短時間で行う方法も報告されており（例えば、特許文献９〜特許文献１２）、水晶振動子を利用した検出方法や装置の開発は急速な進展を遂げている。
しかしながら、生体物質、特にタンパク質を抗体で検出する方法の中でも、生体物質の分子量と関連づけて抗体との反応性を検出する方法、例えば、ウエスタンブロッティングのような方法については、以前として従来法に頼っているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−１１８３５
【特許文献２】特開昭６４−３５２６９
【特許文献３】特開平３−７７０６１
【特許文献４】特開平６−１３８１２５
【特許文献５】特開平１０−２７４６５４
【特許文献６】ＷＯ２００３／１００３８６
【特許文献７】特開平１０−９０２７１
【特許文献８】特開２００９−２５０９６０
【特許文献９】特開２００４−２４５６１３
【特許文献１０】ＵＳ２００６／０１７９９１８
【特許文献１１】ＵＳ２００６／０１８３１６５
【特許文献１２】ＵＳ６，７２７，１０４
【特許文献１３】特開２００８−１０１９４９
【特許文献１４】特開平５−２４０８２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、任意の抗体と結合する生体物質を、その分子量と関連づけて検出する、より簡易、迅速、かつ、安価な方法の開発を目標として鋭意研究を行った結果完成されたものである。
従って、本発明は、任意の抗体と結合する物質の同定処理方法であって、抗体との反応性に関し、その分子量と関連づけて検出する方法の提供を目的とする。
また、本発明は、任意の抗体と結合する物質の同定処理方法であって、抗体との反応性に関し、その分子量と関連づけて検出する装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これまでに、水晶振動子や表面プラズモン共鳴を利用して抗原抗体反応を検出する方法及び装置、水晶振動子とクロマトグラフィーなどを組み合わせた物質の測定方法及び装置などが従来技術として報告されている。しかしながら、検出物質の抗体との反応性を分子量と関連づけて検出する方法及び装置については、これまでに知られてはいなかった。本発明者らは、物質の分子量を決定する手段としてゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用い、抗原抗体反応の検出手段として、例えば、水晶振動子を使用したＱＣＭ（quartz crystal microbalance）装置を用い、さらに、分子量と抗体との反応性を関連づける手段を導入し、本発明を完成させた。従来法において、物質の抗体との反応性をその分子量と関連づけて１連の工程で検出する方法は報告されておらず、また、このような方法を実現する装置も知られていない。【０００８】
すなわち、本発明は、任意の抗体と結合する物質の同定処理方法であって、
（ａ）目的物質の分子量情報と、分子量情報取得時間を取得する工程、
（ｂ）該物質と抗体との結合情報と、抗体結合情報取得時間を取得する工程、
（ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）で得られた情報から該物質の分子量情報と抗体結合情報とを関連付ける工程、
（ｄ）工程（ｃ）で関連付けられた分子量情報と抗体結合情報を表示する工程、
を含む同定処理方法である。
さらに、試料中の物質を分子量に基づいて分離し、該物質の分子量情報及び任意の抗体との結合情報を関連付けて検出するために使用される装置であって、
（ａ）分離された各物質の分子量情報と、試料導入から各分子量情報を取得するまでの時間を取得する手段、
（ｂ）分離された各物質の抗体との結合情報と、試料導入から各抗体結合情報を取得するまでの時間を取得する手段、
（ｃ）手段（ａ）と手段（ｂ）により得られた情報から各物質の分子量情報と抗体結合情報とを関連付ける手段、
（ｄ）手段（ｃ）で関連付けられた分子量情報と抗体結合情報を表示する手段、
を備える装置である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、生体物質と抗体との結合を、分子量と関連づけて検出する場合、従来法と比較して、より簡易、迅速、かつ、安価に行うことが可能となる。【００１０】
本発明により、従来型のウエスタンブロッティング法に比べて、より簡易、迅速、かつ安価にタンパク質などの生体物質の検出が可能となる。すなわち、目的物質を検出するにあたり、物質の分離、抗体との反応のための薄膜への転写など、煩雑な工程を自動化することが可能である。また、目的物質の検出に使用する抗体の蛍光あるいは酵素標識等する必要がないため、検出にかかるコストを軽減することができる。【００１１】
本発明にかかる方法は、その工程を自動化することができるため、再現性が高い試験結果を得ることができる。また、自動化された機器は、臨床検査における試験プロトコールの標準化に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】バーチャルウエスタンブロッティングシステムの解析アルゴリズムを示す。
【図２】バーチャルウエスタンブロッティングシステムの計測アルゴリズムと装置構成を示す。
【図３】バーチャルウエスタンブロッティングシステムでの計測事例。
【図４】バーチャルウエスタンブロッティングシステムによる目的物質のバンド表示例。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施形態の１つは、任意の抗体と結合する物質の同定処理方法であって、
（ａ）目的物質の分子量情報と、分子量情報取得時間を取得する工程、
（ｂ）該物質と抗体との結合情報と、抗体結合情報取得時間を取得する工程、
（ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）で得られた情報から該物質の分子量情報と抗体結合情報とを関連付ける工程、
（ｄ）工程（ｃ）で関連付けられた分子量情報と抗体結合情報を表示する工程、
を含む同定処理方法である。
本実施形態に示される方法は、任意の抗体と結合する物質をその分子量と関連づけて同定処理するものであり、工程（ａ）〜（ｄ）までを、一連の工程で自動的に行うことが望ましい。本方法が適用される物質は、分子量による分離方法が確立されており、抗体との反応性を有するものであれば、特に限定はしないが、例えば、タンパク質、脂質、糖などの生体物質への適用が効果的であり、特に、タンパク質が好ましい。本発明の方法を適用する目的物質は、他の夾雑物を含まない単一な状態であっても、あるいは、他の多くの物質と混合された状態であってもよい。目的物質の分子量情報とは、ゲルろ過法や電気泳動法などにより決定される分子量に相当する数値のことで、変性又は非変性いずれの状態における分子量であってもよい。
なお、「関連づける」の意味は、特に、特別なことを意味するものではなく、一般に使用される意味として捉えてよい。例えば、「分子量情報と抗体結合情報を関連づける」とは、目的物質の分子量情報と該物質の抗体結合情報を対応付けることで、その結果は、グラフや表等、適当な方法で表示してもよく、又は、適当な関数列などとして保存しておいてもよい。
【００１４】
分子量情報を取得する方法は、特に限定はされず、例えば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー法、電気泳動法（キャピラリー電気泳動、二次元電気泳動、等電点電気泳動）、などを挙げることができ、好ましくは、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー法である。例えば、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを使用する場合、カラムを通過してきた目的物質のピーク位置から分子量情報を求めることができる。例えば、目的物質の吸光度（例えば２８０ｎｍあるいは２２０ｎｍの波長の吸光度）の時系列上のピーク位置から分子量情報を求めることができる。直接的に紫外線吸収が検出できない微量な目的物質は、予め分子量が既知の紫外線吸収が検出可能なタンパク質標準物質、あるいは蛍光標識した標準物質と目的物質を混合してもよい。すなわち、ゲルろ過法により作製されるクロマトグラムデータ内での目的物質の溶出位置は、ゲルろ過に使用した粒子径、カラム長、流速に依存し、予め分子量が既知の標準物質の紫外線吸収あるいは蛍光強度の時系列上のピーク位置と分子量との関係から、目的物質の分子量情報を換算することができる。また、電気泳動を使用する場合、分子量によって分離された目的物質の移動度などの電気泳動パターンにおける該物質の位置から、分子量情報を求めることができる。電気泳動は、泳動対象が変性状態でも非変性状態でもよく、あらかじめ、分子量の既知の標準物質により泳動パターンと分子量との関係を決定しておくことで、未知の物質であっても容易に分子量情報を取得することができる。
【００１５】
目的物質と抗体との結合情報とは、目的物質と任意の抗体との結合の有無、結合が確認される場合には、結合量のことである。結合情報の取得は、表面プラズモン共鳴法を使用する方法、水晶振動子を使用する方法、電気化学的測定手法などを挙げることができる。例えば、水晶振動子を使用する場合、抗体を固定した水晶振動子に、目的物質を接触させ、目的物質が抗体と結合すると、水晶振動子上において質量変化が生じ、周波数が低下する。この周波数の低下を検出し、低下の程度を数値化すれば、抗体と結合した目的物質の量を算定することが可能となる。このような水晶振動子を利用した抗原抗体反応の検出技術は、公知の技術としても多く報告されており（例えば、特許文献１〜６などを参照のこと）、当業者であれば容易に利用することができる。また、場合によっては、市販の水晶振動子装置（ＱＣＭ装置）を使用することもできる。
表面プラズモン共鳴を使用した方法は、任意の抗体を固定したセンサーチップと目的物質を接触させ、抗体に目的物質が結合すると表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が変化することを利用したものである。この変化に基づいて、目的物質の有無や存在量を測定する。表面プラズモン共鳴を使用した抗原抗体反応の検出技術も、多くの公知技術（例えば、特許文献７、８など）が存在するため、当業者であれば当該技術を容易に使用することができる。また、場合によっては、市販の表面プラズモン共鳴装置を使用することもできる。
電気化学的測定は検出抗体（タンパク質）を微小電極に吸着させ、目的物質の結合に伴うインピーダンス変化を測定することを利用したものである。この変化に基づいて、目的物質の有無や存在量を測定する（例えば、特許文献１３、１４）。
水晶振動子、表面プラズモン共鳴又は電気化学的手法のセンサーチップに対し、抗体を介さない非特異的な吸着が生じることを防ぐために、抗体が結合してない振動子又はチップ上の領域を適当な物質で予めブロックしておくことが望ましい。このブロックに使用可能な物質は、ウエスタンブロッティング法などでブロッキングに使用される、例えば、各種動物由来のアルブミン、スキムミルク、オブアルブミン、などが利用可能である。
【００１６】
工程（ｂ）は、異なる複数の抗体ごとに行うことができ、工程（ａ）の処理後に、複数の工程（ｂ）を１つの処理工程において行ってもよい。工程（ａ）の分子量情報取得時間、工程（ｂ）の抗体との結合情報取得時間とは、各々、上記分子量情報、上記結合情報を取得した時間のことで、例えば、本発明の処理方法を開始してからの経過時間として特定することができる。本発明の処理方法において、例えば、分子量情報の取得のためにゲルろ過カラムクロマトグラフィーを行い、目的物質がゲルろ過カラムを通過した後、目的物質のピークをＵＶ値として検出する場合、本方法の処理開始からＵＶ値の検出までの時間を分子量情報取得時間として採用することができる。また、本発明の処理方法において、抗体との結合情報の取得のために、例えば、水晶振動子装置（ＱＣＭ装置）を使用する場合、目的物質が振動子上の抗体と結合した後の振動子の周波数変化（ＱＣＭ値と記す）を抗体との結合情報として検出してもよい。また、表面プラズモン共鳴装置を使用する場合には、ＳＰＲ値の変化を結合情報とし、電気化学的測定装置を使用する場合には、インピーダンス変化を結合情報として検出してもよい。この場合、本方法の処理開始からＱＣＭ値、ＳＰＲ値又はインピーダンスの変化量の検出までの時間を、抗体との結合情報取得時間として採用することができる。
【００１７】
本発明の方法により検出された目的物質の分子量情報を換算するための、例えば、ＵＶ値と分子量取得時間、並びに、任意の抗体と目的物質との結合情報を換算するための、例えば、ＱＣＭ値と抗体との結合情報取得時間は、適当なデータ処理装置（例えば、パーソナルコンピュータ）に、各々、ＵＶ値−時間関数、ＱＣＭ値−時間関数の数列（あるいは、ＳＰＲ値−時間関数の数例もしくはインピーダンス変化量−時間関数の数例）（例えば、ＣＳＶ形式などのファイルとして）として保存してもよい。保存されたＵＶ値−時間関数列から、既知の分子量データ等に基づいて、分子量−時間関数列を求める。このようにして求められた、分子量−時間関数列とＱＣＭ値−時間関数列（あるいは、ＳＰＲ値−時間関数例もしくはインピーダンス変化量−時間関数例）を利用して、ＱＣＭ値−分子量関数（あるいは、ＳＰＲ値−分子量関数もしくはインピーダンス変化量−分子量関数）を求め、適当な表示方法（例えば、図４を参照）で表示することができる。このとき、分子量情報取得時間（分子量−時間関数）と抗体結合情報取得時間（ＱＣＭ値−時間関数、ＳＰＲ値−時間関数又はインピーダンス変化量−時間関数）のズレを適当な方法により補正を行ってもよい。ＱＣＭ値−分子量関数を求める方法は、図１に示すような解析アルゴリズムを用いて、当業者であれば容易に実施することが可能である。
【００１８】
本発明の他の実施形態は、試料中の物質を分子量に基づいて分離し、該物質の分子量情報及び任意の抗体との結合情報を関連付けて検出するために使用される装置であって、
（ａ）分離された各物質の分子量情報と、試料導入から各分子量情報を取得するまでの時間を取得する手段、
（ｂ）分離された各物質の抗体との結合情報と、試料導入から各抗体結合情報を取得するまでの時間を取得する手段、
（ｃ）手段（ａ）と手段（ｂ）により得られた情報から各物質の分子量情報と抗体結合情報とを関連付ける手段、
（ｄ）手段（ｃ）で関連付けられた分子量情報と抗体結合情報を表示する手段、
を備える装置である。
本実施形態は、上述の本発明の処理同定方法を実施するための装置であり、目的物質の他、共雑物質を多く含む試料の中から、任意の抗体との結合の有無、結合量などを結合情報として、目的物質の分子量と関連付けて提示する装置である。試料の分離手段及び分離された各物質の分子量情報の取得手段として、上述のゲルろ過カラムクロマトグラフィー、電気泳動装置を、分離された各物質の吸光度等をＵＶ値などとして検出する検出器を組み合わせて使用することができる。ＵＶ値等は、その取得時間と共に取得し、これらのデータをデータ処理装置（例えば、パーソナルコンピュータ）へ送り、データ処理装置において、適当なソフトトウェアを使用して分離された物質のＵＶ値−時間関数列として保存してもよい。さらに、分子量既知の物質から求められるＵＶ値−時間関数に基づいて、分離された物質の分子量−時間関数を適当なソフトウェアを使用して求めることができる。
また、試料中の各物質と抗体との結合情報は、上述の水晶振動子装置、表面プラズモン共鳴装置又は電気化学的測定装置などを取得手段として使用し、各々、ＱＣＭ値、ＳＰＲ値又はインピーダンス変化量などとして取得することができる。ＱＣＭ値、ＳＰＲ値又はインピーダンス変化量は、その取得時間と共に取得し、これらのデータをデータ処理装置（例えば、パーソナルコンピュータ）へ送りＱＣＭ値−時間関数列、ＳＰＲ値−時間関数列又はインピーダンス変化量−時間関数列として保存してもよい。ここで、保存されるＱＣＭ値−時間関数列、ＳＰＲ値−時間関数列又はインピーダンス変化量−時間関数列は、データ処理装置と適当なソフトウェアにより、上記分子量（分離された各物質の）−時間関数から、ＱＣＭ値−分子量関数、ＳＰＲ値−時間関数又はインピーダンス変化量−時間関数に換算し、その結果を適当な表示形式で提示部（例えば、パーソナルコンピュータに付属したディスプレイなど）において提示することができる。
【００１９】
さらに本発明の装置には、試料を導入する導入部を具備しており、試料の導入を行うにあたり、導入口を適宜開閉できるようなレバーなどを備えていてもよく。該レバーにより導入口の開閉を信号としてデータ処理装置に送り、該信号の検出時を試料導入時として、分子量情報や抗体との結合情報の取得時間を特定してもよい。
また、目的物質と結合する任意の抗体は、抗体結合情報を取得するための手段、例えば、ＱＣＭ装置、表面プラズモン共鳴装置又は電気化学的測定装置などに導入口を設け、かかる導入口から、抗体を該装置に導入し、目的物質の検出部位（例えば、ＱＣＭ装置の水晶振動子、表面プラズモン共鳴装置又は電気化学的測定装置のセンサーチップなど）に付着させてもよい。あるいは、試料の導入口から抗体を導入し、ＱＣＭ装置、表面プラズモン共鳴装置又は電気化学的測定装置の検出部位に付着させてもよい。
【００２０】
次に本発明を具体例によって説明するがこれらの例によって本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
図２は、自動化されたバーチャルウエスタンブロッティングシステムの要素を示す。ポンプ、サンプルアプライ、紫外線（２８０ｎｍ）の吸光度計は、Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  Ｄｕｏ  ｆｌｏｗシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いた。ゲルろ過ゲルろ過クロマトグラフィーとしては、Ｂｉｏ  Ｓｉｌｅｃｔ  ＳＥＣ２５０−５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用した。水晶振動子バイオセンシング装置ＱＣＭ９３４（セイコー・イージーアンドジー社製）をカラムークロマトグラフィィーと紫外線吸光度計の後に結合した。水晶振動子（セイコー・イージーアンドジー社製）は、金を電極分にコートした直径５ｍｍ、電極面積０．１９６ｃｍ２を使用した。目的物質と水晶振動子上の抗体との反応はフロー型セルＱＣＭ９３４−５１０を使用した。【００２２】
吸着洗浄用の溶液としては、リン酸緩衝液を用い、０．３ｍｌ／分の流速で送液した。検出用抗体は０．３ｍｇ／ｍｌで０．５ｍｌの容量で電極に吸着させた。さらにウシ血清アルブミン溶液は３ｍｇ／ｍｌで０．５ｍｌの容量で電極に吸着させたのち、リン酸緩衝液で充分洗浄した。目的物質（分子約１５０ｋＤａのＩｇＧ）最終濃度３２５μｇ／ｍｌと分子量を決定する標準物質（Ｔｈｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＩｇＧ，Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，  Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２）を  混合して最終容積を２００μｌとした。図２に示す機器に流速０．９ｍｌ／ｍｉｎで目的物質を含むサンプルをアプライした。【００２３】
混合した標準物質（Ｔｈｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＩｇＧ，Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２：Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の紫外線（２８０ｎｍ）の吸光度により、分子量を正確に溶出時間として推定することができる。本系では、反応サンプル（抗ＩｇＧ抗体）に対応する溶出時間は７．６９分（標準物質中のＩｇＧに対応）であった。図３上段は混合した標準物質の紫外線（２８０ｎｍ）の吸光度の時系列上のピークを示す。その時間と一致してＱＣＭの振動周波数の低下（ΔＨｚ）が観察された。このことは、分子量１５０ＫＤａに抗体と反応する物質（目的物質）が存在することと同質の情報を得ることができることを示している。
パーソナルコンピュータ側では、図２の計測アルゴリズムに示したように、測定開始レバーをトリガとして測定値を連続に蓄積しはじめ、測定時間が終了すると蓄積したＵＶ値とＱＣＭ値の時間関数列を保存する。測定が終了すると自動的解析アルゴリズムに移行し、それぞれのピーク時間を検出し（ＱＣＭ値の場合一度微分してから処理）、ＵＶピーク−時間関数と既知の分子量マーカの分子量データから、分子量−時間関数を求める。この関数を利用してＱＣＭピーク−時間関数をＱＣＭピーク−分子量関数に換算して、分子量軸に目的とするタンパク質をバンド状に表示することができる。従来のウエスタンブロッティング法と似た結果表示となる（図４）。また目的物質の量は、バンドの濃さとして表示することができるとともの数値データとして定量化できる。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明は、タンパク質などに代表される生体物質を微量であっても、簡易、迅速、かつ、安価に検出することを実現ならしめるものである。現在食品検査で行われているアレルゲン（例えば卵白アルブミン）の食品中での存在を誰でも確認することができる。狂牛病の原因タンパク質であるプリオンを食肉中より同定することができる。また唾液、血液、尿中などの体液中から疾患関連タンパク質や病原性細菌あるいはウイルス由来のタンパク質を同定することができる。培養細胞や実験動物組織における疾患関連タンパク質の同定や発現変動に利用することができる。医学生物学の学問研究分野のみならず、医療、食品検査などの分野において、大いに貢献することが期待される。
【符号の説明】
【００２５】
１１  ゲル濾過カラム
１２  電気泳動用ゲル
２１  ＱＣＭ装置（水晶振動子装置）
２２  表面プラズモン共鳴装置
２３  電気化学的測定装置
【図１】
2011135692.tif 000003
【図２】
2011135692.tif 000004
【図３】
2011135692.tif 000005
【図４】
2011135692.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成25年3月25日(2013.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の抗体と結合する物質の同定処理方法であって、
（ａ）目的物質の分子量情報と、分子量情報取得時間を取得する工程、
（ｂ）該物質と抗体との結合情報を、水晶振動子、表面プラズモン共鳴、又は、電気化学的測定を使用した方法で取得し、さらに、抗体結合情報取得時間を取得する工程、
（ｃ）工程（ａ）と工程（ｂ）で得られた情報から該物質の分子量情報と抗体結合情報とを関連付ける工程、
（ｄ）工程（ｃ）で関連付けられた分子量情報と抗体結合情報を処理の開始から１０００秒以内で表示する工程、
を含む同定処理方法。
【請求項２】
前記分子量情報が、目的物質をゲルろ過カラムクロマトグラフィーで分離し、該カラムクロマトグラフィーにより作成されたクロマトデータにおける目的物質のピーク位置に基づいて取得されることを特徴とする請求項１に記載の同定処理方法。
【請求項３】
前記分子量情報が、目的物質を電気泳動で分離し、該電気泳動パターンにおける目的物質の位置に基づいて取得されることを特徴とする請求項１又は２に記載の同定処理方法。
【請求項４】
前記物質がタンパク質であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の同定処理方法。
【請求項５】
試料中の物質を分子量に基づいて分離し、該物質の分子量情報及び任意の抗体との結合情報を関連付けて検出するために使用される装置であって、
（ａ）分離された各物質の分子量情報と、試料導入から各分子量情報を取得するまでの時間を取得する手段、
（ｂ）分離された各物質の抗体との結合情報を、水晶振動子、表面プラズモン共鳴、又は、電気化学的測定を使用した方法で取得し、さらに、試料導入から各抗体結合情報を取得するまでの時間を取得する手段、
（ｃ）手段（ａ）と手段（ｂ）により得られた情報から各物質の分子量情報と抗体結合情報とを関連付ける手段、
（ｄ）手段（ｃ）で関連付けられた分子量情報と抗体結合情報を検出の開始から１０００秒以内で表示する手段、
を備える装置。
【請求項６】
前記分子量情報の取得手段が、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーであり、カラムクロマトグラフィーにより作成されたクロマトデータにおける物質のピーク位置に基づいて分子量情報を取得することを特徴とする請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記分子量情報の取得手段が、電気泳動であり、電気泳動パターンにおける目的物質の位置に基づいて分子量情報を取得することを特徴とする請求項５又は６に記載の装置。
【請求項８】
前記試料中の物質にタンパク質が含まれることを特徴とする請求項５乃至７のいずれかに記載の装置。
【国際調査報告】
2011135692.tif 000007
2011135692.tif 000008
2011135692.tif 000009
2011135692.tif 000010