(57)【要約】酸化還元反応性がない金属イオンを介して生体高分子と錯体を形成し、該生体高分子と会合するときにだけ選択的に発光することができ、洗浄を行わなくても非特異的な背景蛍光が生じない、蛍光色素化合物を、既存のさまざまな蛍光特性を有する蛍光色素に普遍的に適用できる原理に基づいて開発すること。本発明は生体高分子の選択的蛍光標識剤を提供する。本発明の標識剤は、シグナル発信原子団Ｐと原子団Ｘとを含む第１化合物と、シグナル吸収原子団Ｑと原子団Ｙとを含む第２化合物とからなり、前記原子団Ｘは前記原子団Ｙの特異的結合パートナーであって、前記原子団Ｘと前記原子団Ｙとが非共有結合によって連結して第１化合物と第２化合物とが会合するとき、前記原子団Ｑは前記原子団Ｐが発するシグナルを吸収する。本発明は、第１化合物がＨｉｓＺｉＦｉＴで、第２化合物がＢＨＱ２−Ｈｉｓ6又はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6か、あるいは、第１化合物がＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡで、第２化合物がＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6かを含むタンパク質の選択的標識剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル発信原子団Ｐと原子団Ｘとを含む第１化合物と、シグナル吸収原子団Ｑと原子団Ｙとを含む第２化合物とからなる標的生体高分子の選択的蛍光標識剤であって、前記原子団Ｘは前記原子団Ｙの特異的結合パートナーであって、前記原子団Ｘと前記原子団Ｙとが非共有結合によって連結して第１化合物と第２化合物とが会合するとき、前記原子団Ｑは前記原子団Ｐが発するシグナルを吸収し、前記標的生体高分子は前記原子団Ｘと前記原子団Ｙとの連結を競合阻害し、前記標的生体高分子が前記原子団Ｘを介して第１化合物と連結するとき、前記原子団Ｑは前記原子団Ｐが発するシグナルを吸収できないことを特徴とする、標的生体高分子の選択的標識剤。
【請求項２】
前記原子団Ｘ及び前記原子団Ｙは、それぞれ、
金属配位性オリゴペプチドと金属イオンを介して錯体を形成しうるレセプター原子団と、前記金属配位性オリゴペプチドとであるか、
レクチンと、該レクチンに特異的に結合する糖鎖とであるか、
アビジンと、ビオチンとであるか、
タンパク質又はその断片と、該タンパク質又はその断片と特異的に結合するタンパク質又はその断片とであるか、
１本鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的な１本鎖オリゴヌクレオチドとであるか、
抗体又はその抗原結合断片と、該抗体が特異的に結合する抗原決定基とのうちの一方と他方とであるか、あるいは、
１本鎖又は２本鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと特異的に結合するタンパク質又はその断片とのうちの一方と他方とであるかであることを特徴とする、請求項１に記載の標識剤。
【請求項３】
前記原子団Ｙは、Ｒ1又はＲ2であって、
Ｒ1は、
−ＣＯＮＨ−（Ａａａ1）h−（Ａａａ2）i−（Ａａａ3）j−（Ａａａ4）k−ＣＯＯＨで、
Ｒ2は、
ＮＨ2−（Ａａａ5）l−（Ａａａ6）m−（Ａａａ7）n−（Ａａａ8）o−ＣＯＮＨ−で、
Ａａａ1、Ａａａ3、Ａａａ5及びＡａａ7は、それぞれ独立に、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−アスパラギン酸以外の天然アミノ酸１８種類のうちのいずれかのアミノ酸残基であり、
Ａａａ2、Ａａａ4、Ａａａ6及びＡａａ8は、それぞれ独立に、Ｌ−ヒスチジン又はＬ−アスパラギン酸のアミノ酸残基であり、
ｈ、ｊ、ｌ及びｎは、それぞれ独立に、０、１又は２であり、ｉ、ｋ、ｍ及びｏは、それぞれ独立に、２ないし２０のうちのいずれかの整数であることを特徴とする請求項１又は２に記載の標識剤。
【請求項４】
前記シグナル発信原子団Ｐ及び前記シグナル吸収原子団Ｑは、それぞれ、
蛍光色素と、該蛍光色素に特異的な消光剤とであるか、
ＭＲＩ造影剤として検出可能な核種の元素を含む原子団と、該元素に対するＭＲＩ消光剤とであることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の標識剤。
【請求項５】
（１）前記シグナル発信原子団Ｐは、ピレン、７−メトキシクマリン、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ３５０、７アミニオクマリン−Ｘ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ジメチルアミノクマリン、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＩ−Ｘ、ＤＴＡＦ、６−ＦＡＭ、Ｄａｎｓｙｌ−Ｘ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８、ｄＴ−ＦＡＭ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ、ＴＥＴ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４３０、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＩ  Ｂｒ２、６−ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５３２及びＨＥＸからなるグループから選択され、前記シグナル吸収原子団Ｑは、ＢＨＱ１又はＤＡＢＣＹＬであるか、
（２）前記シグナル発信原子団Ｐは、Ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ６Ｇ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５５５、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、Ｃｙ３、ＢＯＤＰＹ  ＴＡＭＲＡ−Ｘ、ＰｙＭＰＯ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５４６、ＴＡＭＲＡ−Ｘ／ｄＴ−ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５６８、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ−Ｘ、Ｃｙ３，５、Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  （ＲＯＸ）、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−Ｘ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４、ＨｉｓＺｉＦｉＴ及びＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡからなるグループから選択され、前記シグナル吸収原子団Ｑは、ＢＨＱ２又はＤＡＢＣＹＬであるか、
（３）前記シグナル発信原子団Ｐは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７、Ｃｙ５、カルボキシナフトフルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６６０、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６８０及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ７００からなるグループから選択され、前記シグナル吸収原子団Ｑは、ＢＨＱ３又はＤＡＢＣＹＬであるか、
（４）前記シグナル発信原子団Ｐは19Ｆ核種を含む原子団で、前記シグナル吸収原子団ＱはＧｄ3+錯体を含む原子団であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の標識剤。
【請求項６】
第１化合物と第２化合物との複合体を含むことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の標識剤。
【請求項７】
第１化合物は、ＨｉｓＺｉＦｉＴで、第２化合物はＢＨＱ２−Ｈｉｓ6又はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6か、あるいは、第１化合物はＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡで、第２化合物がＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6かであることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の標識剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１つに記載の標識剤と、該標識剤の前記原子団Ｘと前記原子団Ｙとの連結を競合阻害する原子団を含む生体高分子とを用意するステップと、
前記標識剤を前記生体高分子に接触させるステップとを含むことを特徴とする、生体高分子の標識方法。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか１つに記載の標識剤の第１化合物及び第２化合物と、前記原子団Ｘと前記原子団Ｙとの連結を競合阻害する原子団を含む生体高分子とを用意するステップを含み、
さらに、第１化合物及び第２化合物を同時に前記生体高分子に接触させるステップか、あるいは、第１化合物又は第２化合物のうちいずれか一方を先に前記生体高分子に接触させた後、他方を前記生体高分子に接触させるステップかを含むことを特徴とする、生体高分子の標識方法。
【請求項１０】
第１化合物及び第２化合物を同時に前記生体高分子に接触させるステップか、あるいは、第１化合物又は第２化合物のうちいずれか一方を先に前記生体高分子に接触させた後、他方を前記生体高分子に接触させるステップかの後で、前記生体高分子と会合しなかった第１化合物を除去しないで、第１化合物が会合した前記生体高分子が発信するシグナルを検出するステップを含むことを特徴とする、請求項９に記載の標識方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の標識剤と、ヒスチジン残基が４ないし１０個連続するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる融合タンパク質とを用意するステップと、
金属２価イオンＭ2+存在下で、前記標識剤の第１化合物と、第２化合物とを会合させるステップと、
前記第１化合物と第２化合物との複合体を精製するステップと、前記複合体を前記融合タンパク質に接触させるステップとを含むことを特徴とする、タンパク質の標識方法。
【請求項１２】
前記複合体を前記融合タンパク質に接触させるステップの後で、前記融合タンパク質と会合しなかった前記複合体を除去しないで、前記複合体が会合した前記融合タンパク質が発信するシグナルを検出するステップを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の標識方法。
【請求項１３】
前記融合タンパク質を用意することは、前記融合タンパク質を発現する遺伝子コンストラクトを細胞に導入することを含むことを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の標識方法。
【請求項１４】
前記複合体を前記融合タンパク質に接触させるステップは、前記複合体を前記細胞内に注入することを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の標識方法。
【請求項１５】
第１合物はＨｉｓＺｉＦｉＴであり、第２化合物はＢＨＱ２−Ｈｉｓ6又はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6であり、金属２価イオンＭ2+はＺｎ2+であることを特徴とする、請求項１１ないし１４のいずれか１つに記載の標識方法。
【請求項１６】
第１化合物はＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡであり、第２化合物はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6であり、金属２価イオンＭ2+はＮｉ2+であることを特徴とする、請求項１１ないし１４のいずれか１つに記載の標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的生体高分子の選択的標識剤に関し、より具体的には、単一アミノ酸繰り返し配列を含む標的融合タンパク質と結合するときにのみ選択的に発光する蛍光標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生きた細胞内で所望のタンパク質を標識する技術の開発は、さまざまなタンパク質の機能を網羅的に解明するうえで重要な課題である。これまでは所望のタンパク質を緑色蛍光タンパク質のような蛍光発光タンパク質との融合タンパク質として発現させて標識タンパク質を得ていた（非特許文献１）。しかし、緑色蛍光タンパク質は２２０個以上のアミノ酸を含むため、融合タンパク質の高次構造やダイナミクスに影響を与えるので、前記所望のタンパク質の機能を反映しない場合がある。【０００３】
そこで、任意のアミノ酸２個をはさんでシステイン２個が繰り返す特定のタグ配列を所望のタンパク質と融合させたタンパク質を発現させ、これを特定の蛍光有機ヒ素化合物と接触させて標識する方法が開発された（非特許文献２、３）。しかしこの方法は、システイン残基が完全に還元された状態でのみ有効なので、細胞質又は核に局在するタンパク質にしか適さない。また、ヒ素の毒性を軽減するために悪臭の１，２−ジチオールが必要である。【０００４】
つぎに、ヒスチジンのヘキサマーペプチド配列を所望のタンパク質と融合させたタンパク質を発現させ、これをＮｉイオン存在下でニトリロ三酢酸と接触させて標識する方法が開発された（非特許文献４）。【０００５】
さらに、ヒスチジンのヘキサマーペプチドの融合タンパク質とＺｎ2+イオン存在下で錯体を形成する配位子と蛍光色素とが連結した蛍光色素化合物（化学式：２’，７’−ビス（ピリジル−２−スルホンアミド）−４’，５’−ジメチルフルオレセイン、以下、「ＨｉｓＺｉＦｉＴ」という。）も開発された（非特許文献５、特許文献１）。【０００６】
しかし、これらの標識方法の蛍光色素化合物は標的タンパク質との錯体形成の有無に関わらず蛍光を発するため、非特異的な背景蛍光によって標的タンパク質の蛍光観察が妨げられる。特に、細胞内で発現している標的タンパク質を標識する場合には、前記蛍光色素化合物を細胞内に注入するため、洗浄による除去が困難であり、非特異的な背景蛍光という課題を解決する必要性が高い。【０００７】
そこで、ヒスチジンのヘキサマーペプチドの融合タンパク質と会合した状態で選択的に発光する蛍光色素化合物が開発された（特許文献２）。前記蛍光色素化合物は、遊離状態では配位子と蛍光色素の発色団とが金属イオンと錯体を形成して蛍光を発することはできない。しかし、前記蛍光色素化合物がヒスチジンのヘキサマーペプチドの融合タンパク質と会合した状態では、前記発色団が前記金属イオンの影響を脱するので、蛍光を発することができる。【０００８】
しかし、特許文献２に説明される蛍光色素化合物が錯体を形成する金属イオンのうちＣｏイオン及びＣｕイオンは酸化還元反応性があるので、生体高分子の機能に影響を与える可能性がある。したがって、これらのイオンを必要とする生体高分子の標識技術は好ましいものとはいえない。また、特許文献２に説明される蛍光色素化合物は、発色原子団自体が金属イオンとの錯体形成に関与しているため、利用可能な蛍光色素が限定される。【０００９】
さらに、生体内及びベシクル内の標的物質を標識する場合には、蛍光色素化合物を十分に洗浄することができないために、前記生体内及びベシクル内に非特異的な背景蛍光が生じる場合があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６９３３３８４号公報
【特許文献２】特開２００７−２３１１２４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｇｉｅｐｍａｎｓ，Ｂ．Ｎ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２：２１７−２２４（２００６）
【非特許文献２】Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｂ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１：２６９−２７２（１９９８）
【非特許文献３】Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２４：６０６３−６０７６（２００２）
【非特許文献４】Ｋａｐａｎｉｄｉｓ、Ａ．Ｎ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３：１２１２３−１２１２５（２００１）
【非特許文献５】Ｈａｕｓｅｒ，Ｃ．Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０４：３６９３−３６９７（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、酸化還元反応性がない金属イオンを介して生体高分子と錯体を形成し、該生体高分子と会合するときにだけ選択的に発光することができ、洗浄を行わなくても非特異的な背景蛍光が生じない、蛍光色素化合物を、既存のさまざまな蛍光特性を有する蛍光色素に普遍的に適用できる原理に基づいて開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は標的生体高分子の選択的蛍光標識剤を提供する。本発明の標識剤は、シグナル発信原子団Ｐと原子団Ｘとを含む第１化合物と、シグナル吸収原子団Ｑと原子団Ｙとを含む第２化合物とからなり、前記原子団Ｘは前記原子団Ｙの特異的結合パートナーであって、前記原子団Ｘと前記原子団Ｙとが非共有結合によって連結して第１化合物と第２化合物とが会合するとき、前記原子団Ｑは前記原子団Ｐが発するシグナルを吸収し、前記標的生体高分子は前記原子団Ｘと前記原子団Ｙとの連結を競合阻害し、前記標的生体高分子が前記原子団Ｘを介して第１化合物と連結するとき、前記原子団Ｑは前記原子団Ｐが発するシグナルを吸収できない。【００１４】
本発明の標識剤において、前記原子団Ｘ及び前記原子団Ｙは、それぞれ、金属配位性オリゴペプチドと金属イオンを介して錯体を形成しうるレセプター原子団と、前記金属配位性オリゴペプチドとであるか、レクチンと、該レクチンに特異的に結合する糖鎖とであるか、アビジンと、ビオチンとであるか、タンパク質又はその断片と、該タンパク質又はその断片と特異的に結合するタンパク質又はその断片とであるか、１本鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的な１本鎖オリゴヌクレオチドとであるか、抗体又はその抗原結合断片と、該抗体が特異的に結合する抗原決定基とのうちの一方と他方とであるか、あるいは、１本鎖又は２本鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと特異的に結合するタンパク質又はその断片とのうちの一方と他方とであるかの場合がある。【００１５】
本発明の標識剤において、前記原子団Ｙは、Ｒ1又はＲ2であって、
Ｒ1は、
−ＣＯＮＨ−（Ａａａ1）h−（Ａａａ2）i−（Ａａａ3）j−（Ａａａ4）k−ＣＯＯＨで、
Ｒ2は、
ＮＨ2−（Ａａａ5）l−（Ａａａ6）m−（Ａａａ7）n−（Ａａａ8）o−ＣＯＮＨ−で、
Ａａａ1、Ａａａ3、Ａａａ5及びＡａａ7は、それぞれ独立に、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−アスパラギン酸以外の天然アミノ酸１８種類のうちのいずれかのアミノ酸残基であり、Ａａａ2、Ａａａ4、Ａａａ6及びＡａａ8は、それぞれ独立に、Ｌ−ヒスチジン又はＬ−アスパラギン酸のアミノ酸残基であり、ｈ、ｊ、ｌ及びｎは、それぞれ独立に、０、１又は２であり、ｉ、ｋ、ｍ及びｏは、それぞれ独立に、２ないし２０のうちのいずれかの整数の場合がある。【００１６】
本発明の標識剤において、前記シグナル発信原子団Ｐ及び前記シグナル吸収原子団Ｑは、それぞれ、蛍光色素と、該蛍光色素に特異的な消光剤とであるか、ＭＲＩ造影剤として検出可能な核種の元素を含む原子団と、該元素に対するＭＲＩ消光剤とであるかの場合がある。【００１７】
本発明の標識剤において、
（１）前記シグナル発信原子団Ｐは、ピレン、７−メトキシクマリン、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ３５０、７アミニオクマリン−Ｘ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ジメチルアミノクマリン、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＩ−Ｘ、ＤＴＡＦ、６−ＦＡＭ、Ｄａｎｓｙｌ−Ｘ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８、ｄＴ−ＦＡＭ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ、ＴＥＴ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４３０、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＩ  Ｂｒ２、６−ＪＯＥ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５３２及びＨＥＸからなるグループから選択され、前記シグナル吸収原子団Ｑは、ＢＨＱ１又はＤＡＢＣＹＬであるか、
（２）前記シグナル発信原子団Ｐは、Ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ６Ｇ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５５５、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、Ｃｙ３、ＢＯＤＰＹ  ＴＡＭＲＡ−Ｘ、ＰｙＭＰＯ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５４６、ＴＡＭＲＡ−Ｘ／ｄＴ−ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５６８、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ−Ｘ、Ｃｙ３，５、Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  （ＲＯＸ）、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−Ｘ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４、ニトリロ三酢酸、ＨｉｓＺｉＦｉＴ及びＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡからなるグループから選択され、前記シグナル吸収原子団Ｑは、ＢＨＱ２又はＤＡＢＣＹＬであるか、
（３）前記シグナル発信原子団Ｐは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７、Ｃｙ５、カルボキシナフトフルオレセイン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６６０、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６８０及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ７００からなるグループから選択され、前記シグナル吸収原子団Ｑは、ＢＨＱ３又はＤＡＢＣＹＬであるか、あるいは、
（４）前記シグナル発信原子団Ｐは19Ｆ核種を含む原子団で、前記シグナル吸収原子団ＱはＧｄ3+錯体を含む原子団であるかの場合がある。【００１８】
本発明の標識剤は、第１化合物と第２化合物との複合体を含むか、該複合体からなる場合がある。【００１９】
本発明の標識剤は、第１化合物と第２化合物とに特異的に錯体を形成する金属イオンを含む場合がある。【００２０】
本発明の標識剤において、第１化合物は、ＨｉｓＺｉＦｉＴで、第２化合物はＢＨＱ２−Ｈｉｓ6又はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6か、あるいは、第１化合物はＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡで、第２化合物がＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6かの場合がある。【００２１】
本発明の標識剤に含まれる金属イオンは、第１化合物がＨｉｓＺｉＦｉＴで、第２化合物がＢＨＱ２−Ｈｉｓ6又はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6のとき、Ｚｎ2+の場合があり、第１化合物がＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡで、第２化合物がＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6のとき、Ｎｉ2+の場合がある。【００２２】
本発明は生体高分子の標識方法を提供する。本発明の標識方法は、本発明のいずれかの標識剤と、該標識剤の前記原子団Ｘと前記原子団Ｙとの連結を競合阻害する原子団を含む生体高分子とを用意するステップと、前記標識剤を前記生体高分子に接触させるステップとを含む。【００２３】
本発明の生体高分子の標識方法は、前記標識剤を前記生体高分子に接触させるステップの後で、前記生体高分子と会合しなかった前記標識剤を除去しないで、前記標識剤が会合した前記生体高分子が発信するシグナルを検出するステップを含む場合がある。【００２４】
本発明の生体高分子の標識方法は、前記標識剤の第１化合物及び第２化合物と、前記原子団Ｘと前記原子団Ｙとの連結を競合阻害する原子団を含む生体高分子とを用意するステップを含み、さらに、第１化合物及び第２化合物を同時に前記生体高分子に接触させるステップか、あるいは、第１化合物又は第２化合物のうちいずれか一方を先に前記生体高分子に接触させた後、他方を前記生体高分子に接触させるステップかを含む場合がある。【００２５】
本発明の生体高分子の標識方法は、第１化合物及び第２化合物を同時に前記生体高分子に接触させるステップか、あるいは、第１化合物又は第２化合物のうちいずれか一方を先に前記生体高分子に接触させた後、他方を前記生体高分子に接触させるステップかの後で、前記生体高分子と会合しなかった第１化合物を除去しないで、第１化合物が会合した前記生体高分子が発信するシグナルを検出するステップを含む場合がある。【００２６】
本発明はタンパク質の標識方法を提供する。本発明のタンパク質の標識方法は、第１化合物と、第２化合物と、ヒスチジン残基が４ないし１０個連続するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなる融合タンパク質とを用意するステップと、金属２価イオンＭ2+存在下で、第１化合物と、第２化合物とを会合させるステップと、前記第１化合物と第２化合物との複合体を精製するステップと、前記複合体を前記融合タンパク質に接触させるステップとを含み、第１化合物は、ＨｉｓＺｉＦｉＴで、第２化合物はＢＨＱ２−Ｈｉｓ6又はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6か、あるいは、第１化合物はＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡで、第２化合物がＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6かである。【００２７】
本発明のタンパク質の標識方法は、前記複合体を前記融合タンパク質に接触させるステップの後で、前記融合タンパク質と会合しなかった前記複合体を除去しないで、前記複合体が会合した前記融合タンパク質が発信するシグナルを検出するステップを含む場合がある。【００２８】
本発明のタンパク質の標識方法において、前記融合タンパク質を用意することは、前記融合タンパク質を発現する遺伝子コンストラクトを細胞に導入することを含む場合がある。【００２９】
本発明のタンパク質の標識方法において、前記複合体を前記融合タンパク質に接触させるステップは、前記複合体を前記細胞内に注入することを含む場合がある。【００３０】
本発明のタンパク質の標識方法において、第１化合物はＨｉｓＺｉＦｉＴであり、第２化合物はＢＨＱ２−Ｈｉｓ6又はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6であり、金属２価イオンＭ2+はＺｎ2+の場合がある。【００３１】
本発明のタンパク質の標識方法において、第１化合物はＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡであり、第２化合物はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6であり、金属２価イオンＭ2+はＮｉ2+の場合がある。【００３２】
本発明において、「ある原子団が、蛍光色素、ビオチンその他の化合物か、レクチン、抗体その他のタンパク質又はその断片か、オリゴヌクレオチドかである。」という説明は、当該原子団は、前記化合物、前記タンパク質又はその断片及び前記オリゴヌクレオチドの分子を構成するいずれかの原子との共有結合が可能な誘導体基であって、前記化合物か、前記タンパク質又はその断片か、前記オリゴヌクレオチドかの機能を実質的に阻害しないものである、という意味である。同様に、本発明において、「ある原子団が、蛍光色素、ビオチンその他の化合物か、レクチン、抗体その他のタンパク質又はその断片か、オリゴヌクレオチドかを含む。」という説明は、当該原子団は、前記化合物、前記タンパク質又はその断片及び前記オリゴヌクレオチドの分子を構成するいずれかの原子との共有結合が可能な誘導体基であって、前記化合物か、前記タンパク質又はその断片か、前記オリゴヌクレオチドかの機能を実質的に阻害しないものを含む、という意味である。【００３３】
本発明において、標的生体高分子が前記原子団Ｘと前記原子団Ｙとの連結を競合阻害するのは、該標的生体高分子が、前記原子団Ｙか、前記原子団Ｙと同一ではない原子団Ｚかを含み、該原子団Ｚが前記原子団Ｘと連結して、前記原子団Ｙと原子団Ｘとの連結を競合阻害するためである。より具体的には、前記原子団Ｚは、前記原子団Ｙと同じ構造か、前記原子団Ｙを含む構造か、以下に列挙される構造を有するかの場合がある。すなわち、前記原子団Ｘ及び前記原子団Ｙが、それぞれ、金属配位性オリゴペプチドと金属イオンを介して錯体を形成しうるレセプター原子団と、前記金属配位性オリゴペプチドとのとき、前記原子団Ｚは、前記原子団Ｙのオリゴペプチドのアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記原子団Ｘと前記原子団Ｙとの錯体形成に関与するのと同じ金属イオンを介して前記原子団Ｘと錯体形成する金属配位性オリゴペプチドを含む場合がある。前記原子団Ｘ及び前記原子団Ｙが、それぞれ、レクチンと、該レクチンに特異的に結合する糖鎖とのとき、前記原子団Ｚは、前記原子団Ｙの誘導体又は類縁体の構造を含む原子団であって、前記原子団Ｘ及び原子団Ｙとの結合の解離定数と同じ解離定数か、より低い解離定数かで前記原子団Ｘのレクチンと結合する原子団を含む場合がある。前記原子団Ｘ及び前記原子団Ｙが、それぞれ、アビジンと、ビオチンとのとき、前記原子団Ｚは、ビオチンと同程度か又はより強くアビジンと結合するビオチンの誘導体又は類縁体の構造を含む場合がある。前記原子団Ｘ及び前記原子団Ｙが、それぞれ、タンパク質又はその断片と、該タンパク質又はその断片と特異的に結合するタンパク質又はその断片とのとき、前記原子団Ｚは、原子団Ｙのタンパク質又はその断片のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、原子団Ｙのタンパク質又はその断片と同程度か又はより強く原子団Ｘのタンパク質又はその断片と結合するタンパク質又はその断片の場合がある。前記原子団Ｘ及び前記原子団Ｙが、それぞれ、１本鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと相補的な１本鎖オリゴヌクレオチドとのとき、前記原子団Ｚは、原子団Ｙの１本鎖オリゴヌクレオチドヌクレオチド酸配列に１個又は数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列を有し、原子団Ｙの１本鎖オリゴヌクレオチドと同程度か又はより強く原子団Ｘの１本鎖オリゴヌクレオチドと結合する１本鎖オリゴヌクレオチドの場合がある。前記原子団Ｘ及び前記原子団Ｙが、それぞれ、抗体又はその抗原結合断片と、該抗体が特異的に結合する抗原決定基とのうちの一方と他方とのとき、前記原子団Ｚは、前記抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有するか、前記抗原決定基の原子団の誘導体又は類縁体の原子団を含むかであって、原子団Ｙと同程度か又はより強く結合する原子団の場合がある。前記原子団Ｘ及び前記原子団Ｙが、それぞれ、１本鎖又は２本鎖オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドと特異的に結合するタンパク質又はその断片とのうちの一方と他方とのとき、前記原子団Ｚは、前記１本鎖又は２本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に１個又は数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列を有するか、前記タンパク質又はその断片のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有するかであって、原子団Ｙと同程度か又はより強く結合する原子団の場合がある。【００３４】
本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列は、該融合タンパク質の機能を実質的に阻害しないことを条件として、ヒスチジン残基が４ないし１０個連続するアミノ酸配列をアミノ末端からカルボキシル末端までのいずれの位置に含んでもかまわない。前記ヒスチジン残基が４ないし１０個連続するアミノ酸配列は、前記融合タンパク質の立体構造において、本発明の標識剤がアクセスする際に立体的障害が生じない位置に配置されることが好ましく、アミノ末端又はカルボキシル末端に配置されることが好ましい。【００３５】
本発明の融合タンパク質を用意する際には、固相法その他の周知の人工合成法によって化学的に合成されてもよいし、組換えＤＮＡ技術によって、無細胞的に、あるいは、宿主細胞内で産生されてもよい。本発明の融合タンパク質を用意する際には、単離精製されてもよいが、単離精製は必ずしも必要ではない。本発明の融合タンパク質を用意することは、該融合タンパク質をエンコードするＤＮＡが導入された生物に由来し、前記融合タンパク質を発現する細胞、組織、器官又は個体を用意することの場合がある。【００３６】
本発明の技術的範囲は、添付する特許請求の範囲の記載に基づいて定められる。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ｚｎ2+イオンを添加したＨｉｓＺｉＦｉＴの吸光及び発光スペクトル図。
【図２】ＢＨＱ２−Ｈｉｓ6を添加する前後のＨｉｓＺｉＦｉＴの発光スペクトル図。
【図３】ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6を添加する前後のＨｉｓＺｉＦｉＴの発光スペクトル図。
【図４】Ｈｉｓ6を添加する前後のＢＨＱ２−Ｈｉｓ6添加で消光されたＨｉｓＺｉＦｉＴの発光スペクトル図。
【図５】Ｈｉｓ6を添加する前後のＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6添加で消光されたＨｉｓＺｉＦｉＴの発光スペクトル図。
【図６】ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6を添加する前後のＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの発光スペクトル図。
【図７】Ｈｉｓ6を添加する前後のＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6添加で消光されたＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの発光スペクトル図。
【図８】ＨｉｓＺｉＦｉＴ又はＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡと消光剤との複合体に添加されたＨｉｓ6の濃度と、蛍光強度との関係を示すグラフ。
【図９Ａ】抗Ｈｉｓ６抗体で染色された細胞の蛍光顕微鏡写真。
【図９Ｂ】ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡで染色された細胞の蛍光顕微鏡写真。
【図９Ｃ】ＨｉｓＺｉＦｉＴで染色された細胞の蛍光顕微鏡写真。
【図１０Ａ】ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ単体で染色された細胞の洗浄前の蛍光顕微鏡写真。
【図１０Ｂ】ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ単体で染色された細胞の洗浄後の蛍光顕微鏡写真。
【図１０Ｃ】ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ消光剤複合体で染色された細胞の洗浄前の蛍光顕微鏡写真。
【図１０Ｄ】ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ消光剤複合体で染色された細胞の洗浄後の蛍光顕微鏡写真。
【図１１】蛍光染色された細胞の表面及び内部における洗浄前後の蛍光強度のグラフ。
【図１２Ａ】ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡで染色された細胞にＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ６が添加された時点（０ｓ）の蛍光背景の蛍光顕微鏡写真。
【図１２Ｂ】ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡで染色された細胞にＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ６が添加されてから１×１０２秒経過後の蛍光背景の蛍光顕微鏡写真。
【図１２Ｃ】ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡで染色された細胞にＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ６が添加されてから４×１０２秒経過後の蛍光背景の蛍光顕微鏡写真。
【図１２Ｄ】ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡで染色された細胞にＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ６が添加されてから７×１０２秒経過後の蛍光背景の蛍光顕微鏡写真。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下に説明する本発明の実施例は、例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本明細書で言及されるすべての特許文献及び非特許文献はそれらの全体が引用によって本明細書に取り込まれる。
【実施例１】
【００３９】
消光剤ＢＨＱ２−Ｈｉｓ6の合成
常法に従いペプチドシンセサイザーを用いて、ヒスチジンのヘキサマーペプチドのアミノ末端に消光原子団ＢＨＱ２基（化学名：４’−（４−ニトロ−フェニルジアゾ）−２’−メトキシ−５’−メトキシ−アゾベンゼン−４”−（Ｎ−エチル）−Ｎ−エチル−２−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−）のカルボン酸スクシンイミジルエステル（ＢＨＱ−２０００Ｓ、バイオリサーチテクノロジージャパン）を反応させて、ＢＨＱ−２がアミノ末端に連結したヒスチジンヘキサマーペプチド（以下、「ＢＨＱ２−Ｈｉｓ6」という。）が合成された。ＢＨＱ２−Ｈｉｓ6の化学式は以下のとおりである。【００４０】
【化１】
2011021581.tif 000002
【００４１】
消光剤ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6の合成
常法に従いペプチドシンセサイザーを用いて、ヒスチジンのヘキサマーペプチドのアミノ末端に消光原子団ＤＡＢＣＹＬ基（化学名：４−（［４−（ジメチルアミノ）フェニル］アゾ）安息香酸スクシンイミジルエステル（０９２７８、シグマアルドリッジ）を反応させて、ＤＡＢＣＹＬがアミノ末端に連結したヒスチジンヘキサマーペプチド（以下、「ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6」という。）が合成された。ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6の化学式は以下のとおりである。【００４２】
【化２】
2011021581.tif 000003
【００４３】
反応産物の解析
各反応産物はＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、株式会社島津製作所）を用いて精製された。溶離条件は、Ａ液として０．０１Ｍ  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）の水溶液、Ｂ液として０．０１Ｍ  ＴＦＡのアセトニトリル溶液を用いて、流速は毎分１．０ｍＬとした。ＢＨＱ２−Ｈｉｓ6の時、Ｂ液の濃度勾配は５分間で０−２０％、１５分間で２０−５０％、５分間で５０−８０％であった。ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6の時、Ｂ液の濃度勾配は２分間で０−１０％、１０分間で１０−４０％、２分間で４０−７０％であった。精製標品の分子量を質量分析装置を用いて測定し、ＢＨＱ２−Ｈｉｓ6又はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が得られたことを確認した。
【実施例２】
【００４４】
発光剤ＨｉｓＺｉＦｉＴの合成
生体内でヒスチジンのオリゴペプチドと亜鉛イオン特異的な錯体を形成するＨｉｓＺｉＦｉＴは、Ｈａｕｓｅｒ、Ｃ．Ｔ．及びＴｓｉｅｎ、Ｒ．Ｙ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０４：３６９３−３６９７（２００７））の補足情報（Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０４／１０／３６９３／ｓｕｐｐｌ／ＤＣ１）に従って合成された。ＨｉｓＺｉＦｉＴの化学式は以下のとおりである。【００４５】
【化３】
2011021581.tif 000004
【００４６】
ＨｉｓＺｉＦｉＴ中間体１は以下の化学式で表される。【００４７】
【化４】
2011021581.tif 000005
【００４８】
ＨｉｓＺｉＦｉＴ中間体１の合成
１２−メチルレゾルシン（５．１８ｇ、０．０４２０モル）、フタル酸無水物（３．３５ｇ、０．０２１０モル）及び塩化亜鉛（３．２０ｇ、０．０２４０モル）が、乳鉢で手早く混合され、２３０℃で１．５時間加熱された。冷却後、飽和炭酸ナトリウム水溶液に溶解され、塩酸で中和（ｐＨ試験紙を用いて確認）され、析出物が濾別され、乾燥された（粗収量５．５６ｇ）。粗生成物のうち、６７０ｍｇが氷浴下で硫酸１５１ｍＬ及び硝酸３．３５ｍＬを加えて約２時間攪拌され、室温に昇温後、さらに１４時間攪拌された。反応溶液が氷に滴下され、析出物が濾別された後、メタノールで洗浄された。フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製された標品４５３ｍｇが得られた。【００４９】
前記精製標品のＮＭＲ測定値は以下の通りであった。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．５１（６Ｈ，ｓ）、７．１９−７．２２（１Ｈ，ｍ）、７．５１（２Ｈ，ｓ）、７．７４−７．８２（２Ｈ，ｍ）、８．１２−８．１５（１Ｈ，ｍ）、１１．１０（２Ｈ，ｓ）【００５０】
ＮＭＲの結果から前記精製標品がＨｉｓＺｉＦｉＴ中間体１であることが確認された。収率は５４％であった。【００５１】
ＨｉｓＺｉＦｉＴ中間体２は以下の化学式で表される。【００５２】
【化５】
2011021581.tif 000006
【００５３】
ＨｉｓＺｉＦｉＴ中間体２の合成
ＨｉｓＺｉＦｉＴ中間体１（１００ｍｇ、０．２２２モル）が１，２−ジクロロエタン−エタノール混合溶媒（５：２）５２ｍＬに溶解され、パラジウム−炭素３７０ｍｇが加えられ、水素雰囲気下で、２時間攪拌され、セライト濾過によりパラジウム−炭素が除去された後、濃縮された標品が７７ｍｇ得られた。【００５４】
前記濃縮標品のＮＭＲ測定値は以下の通りであった。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ２．３８（６Ｈ，ｓ）、６．１９（２Ｈ，ｓ）、７．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝７．０Ｈｚ，Ｊ２＝７．２Ｈｚ）、７．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１＝７．０，Ｊ２＝８．０Ｈｚ）、８．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）【００５５】
ＮＭＲの結果から前記精製標品がＨｉｓＺｉＦｉＴ中間体２であることが確認された。収率は８９％であった。【００５６】
ＨｉｓＺｉＦｉＴの合成
中間体２（９０ｍｇ、０．２３モル）がピリジン５ｍＬに溶解され、氷浴下で、２−ピリジンスルホニルクロライド（１３７ｍｇ、０．９２モル）を加えて約２時間攪拌された後、一夜放置された。反応液が１Ｍ塩酸に滴下され、析出物が濾別され、フラッシュカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／酢酸＝９／１／０．０５、ｖ／ｖ／ｖ）により精製された標品２０ｍｇが得られた。【００５７】
前記精製標品のＮＭＲ測定値は以下の通りであった。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ２．２３（６Ｈ，ｓ）、６．３４（２Ｈ，ｂｒ−ｓ）、６．９４−７．００（１Ｈ，ｍ）、７．４２−７．４８（２Ｈ，ｍ）、７．５７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．６９−７．７３（２Ｈ，ｍ）、７．７９−７．８５（２Ｈ，ｍ）、８．１２−８．２２（１Ｈ，ｍ）、８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝８．９６（２ｔ，２Ｈ，ＡｒＨ）、８．３２−８．３０（ｍ，４Ｈ，ＡｒＨ）、８．１１（ｄ，１Ｈ，ＡｒＨ）、７．９７−７．９５（ｍ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．８８（ｄｔ，１Ｈ，ＡｒＨ）、７．８１（ｄｔ，１Ｈ，ＡｒＨ）、７．４３（ｄ，１Ｈ，ＡｒＨ）、６．１４（ｓ，２Ｈ，ＡｒＨ）５．０６（ｓ，３Ｈ，ＮＨ）、２．４０（ｓ，６Ｈ，Ｍｅ）。【００５８】
ＮＭＲの結果から前記精製標品がＨｉｓＺｉＦｉＴであることが確認された。収率は１３％、純度は９５％であった。
【実施例３】
【００５９】
ＢＨＱ２−Ｈｉｓ6によるＨｉｓＺｉＦｉＴの消光
９ｍＭのＨｉｓＺｉＦｉＴを含むＤＭＳＯ溶液と、２ｍＭのＺｎＣｌ2水溶液とが用意されて、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でＨｉｓＺｉＦｉＴを１０μＭに希釈した蛍光色素液２ｍＬが調製された。前記蛍光色素液に、２ｍＭ  ＺｎＣｌ2が２０μＬ（ＨｉｓＺｉＦｉＴに対して当量比２倍）加えられた後、蛍光分光光度計（ＲＦ−５０００、島津製作所）を用いて、蛍光特性が測定された。その後、Ｚｎ2+イオンが添加された前記蛍光色素液に、２ｍＭのＢＨＱ２−Ｈｉｓ6が含まれるＤＭＳＯ溶液が２μＬずつ計１０μＬ（ＨｉｓＺｉＦｉＴに対して当量比１倍）添加されてから、再度蛍光特性が測定された。【００６０】
結果
Ｚｎ2+イオンを添加した前記蛍光色素液の吸光及び発光スペクトルを図１に示す。図１の破線は前記蛍光色素液の発光スペクトルで、図１の実線は前記蛍光色素液の吸光スペクトルである。図１に示すとおり、Ｚｎ2+イオンを添加した前記蛍光色素液の吸光スペクトルのピークは５２６ｎｍで、発光スペクトルのピークは５５３ｎｍであった。そこで、励起波長５００ｎｍでの発光スペクトルの変化が観察された。Ｚｎ2+イオンが添加された前記蛍光色素液にＢＨＱ２−Ｈｉｓ6が添加される前後の発光スペクトルを図２に示す。図２の破線はＢＨＱ２−Ｈｉｓ6が添加される前の前記蛍光色素液の発光スペクトルで、図２の実線はＢＨＱ２−Ｈｉｓが添加された後の前記蛍光色素液の発光スペクトルである。図２に示すとおり、ＢＨＱ２−Ｈｉｓ6が添加されると、発光ピーク波長である５５３ｎｍでの発光強度が６８０分の１に減少するという著しい消光現象が観測された（励起：スリット幅３ｎｍ、発光：スリット幅３ｎｍ）。
【実施例４】
【００６１】
ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6によるＨｉｓＺｉＦｉＴの消光
５ｍＭのＨｉｓＺｉＦｉＴを含むＤＭＳＯ溶液と、１０ｍＭのＺｎＣｌ2水溶液とが用意され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でＨｉｓＺｉＦｉＴが５μＭに希釈された蛍光色素液２ｍＬが調製された。前記蛍光色素液に、１０ｍＭ  ＺｎＣｌ2が２μＬ（ＨｉｓＺｉＦｉＴに対して当量比２倍）加えられた後、蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ、島津製作所）を用いて、蛍光特性が測定された。その後、Ｚｎ2+イオンが添加された前記蛍光色素液に、５ｍＭのＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が含まれるＤＭＳＯ溶液が２μＬ（ＨｉｓＺｉＦｉＴに対して当量比１倍）添加されてから、再度蛍光特性が測定された（励起波長４７０ｎｍ、励起：スリット幅３ｎｍ、発光：スリット幅３ｎｍ）。【００６２】
結果
Ｚｎ2+イオンが添加された前記蛍光色素液にＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が添加される前後の発光スペクトルを図３に示す。図３の実線はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が添加される前の前記蛍光色素液の発光スペクトルで、図３の破線はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が添加された後の前記蛍光色素液の発光スペクトルである。図３に示すとおり、ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が添加されると、発光ピーク波長である５５３ｎｍでの発光強度が１％に低下するという著しい消光現象が観測された。
【実施例５】
【００６３】
ＢＨＱ２−Ｈｉｓ6で消光されたＨｉｓＺｉＦｉＴのＨｉｓ6による蛍光回復
消光剤が結合していない遊離のヒスチジンのヘキサマーペプチド（以下、「Ｈｉｓ6」という。）が５０ｍＭ含まれる水溶液４μＬ（ＨｉｓＺｉＦｉＴに対して当量比１０倍）が、Ｚｎ2+イオン及びＢＨＱ２−Ｈｉｓ6が混合した後の前記蛍光色素液に添加されて、励起波長５００ｎｍの発光スペクトルが測定された。【００６４】
結果
前記蛍光色素液にＨｉｓ6が添加される前後の発光スペクトルを図４に示す。図４の実線はＨｉｓ6が添加される前の前記蛍光色素液の発光スペクトルで、図４の破線はＨｉｓ6が添加された後の前記蛍光色素液の発光スペクトルである。図４に示すとおり、Ｈｉｓ6を添加すると、ＢＨＱ２−Ｈｉｓ6添加で低下した発光ピーク波長（５５３ｎｍ）の発光強度が５．４倍に増大するという蛍光回復が観測された（励起：スリット幅５ｎｍ、発光：スリット幅５ｎｍ）。
【実施例６】
【００６５】
ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6で消光されたＨｉｓＺｉＦｉＴのＨｉｓ6による蛍光回復
Ｈｉｓ6が５ｍＭ含まれる水溶液２μＬ（ＨｉｓＺｉＦｉＴに対して当量比１倍）が、Ｚｎ2+イオン及びＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が混合された後の前記蛍光色素液に添加され、励起波長４７０ｎｍの発光スペクトルが測定された。
結果
前記蛍光色素液にＨｉｓ6が添加される前後の発光スペクトルが図５に示される。図５の実線はＨｉｓ6が添加される前の前記蛍光色素液の発光スペクトルで、図５の破線はＨｉｓ6が添加された後の前記蛍光色素液の発光スペクトルである。図５に示すとおり、ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6添加で低下した発光ピーク波長（５５３ｎｍ）の発光強度は、Ｈｉｓ6添加後もほとんど回復がみられなかった（励起：スリット幅５ｎｍ、発光：スリット幅５ｎｍ）。
【実施例７】
【００６６】
発光剤ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの合成
生体内でヒスチジンのオリゴペプチドと錯体を形成するＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡは、Ｈｕａｎｇ，  Ｚ．ら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１７：１５９２−１６００（２００６））が報告した方法に従って合成された。【００６７】
簡潔には、ＮＨ2−ｔｒｉ−ＮＴＡ（ｔ−Ｂｕ）3（２１．０ｍｇ、１５μｍｏｌ）及び５（６）−カルボキシテトラメチルローダミンＮ−スクシンイミジルエステル（４．６ｍｇ、７μｍｏｌ）がジクロロメタン水溶液（１ｍＬ）に溶解され、さらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１０μＬ）が添加された。反応溶液は室温で一晩攪拌された後、濃縮され、ＴＭＲ−ＴｒｉＮＴＡ（ｔ−Ｂｕ）3中間体を得るためにシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（溶出液、クロロホルム／メタノール＝４０：１、ｖ／ｖ）によって精製された。精製された中間体はＴＦＡ（２ｍＬ）に溶解され、一晩中攪拌された。精製標品５．０ｍｇが濃縮、真空乾燥後に得られた。【００６８】
結果
前記精製標品のＮＭＲ測定値及びＥＳＩ−ＭＳ測定値は以下の通りであった。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ／ＤＭＳＯ）：δ＝８．６１，８．３０，８．１５，８．１０，７．６６，７．４２（ｍ，３Ｈ），７．０４（ｄ，２Ｈ），６．９２−６．８３（ｍ，６Ｈ），３．６６−３．１３（ｍ，２８Ｈ），１．８７−０．７６（ｍ，３６Ｈ）。
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝４６７．９２［Ｍ−３Ｈ+］3-。【００６９】
ＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳの結果から前記精製標品がＴＭＲ−ＴｒｉＮＴＡであることが確認された。収率は４０％、純度は９５％であった。ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの化学式は以下のとおりである。【００７０】
【化６】
2011021581.tif 000007
【実施例８】
【００７１】
ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6によるＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの消光
５ｍＭのＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡが含まれるＤＭＳＯ溶液と、１０ｍＭのＮｉＣｌ2水溶液とが用意され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡが０．３ｍＭ、ＮｉＣｌ2が３ｍＭ（ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡに対して当量比１０倍）に希釈された蛍光色素液０．５ｍＬが調製された。前記蛍光色素液はイオン交換クロマトグラフィーＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（１７−１１５３−０１，ＧＥヘルスケア）を用いて精製され、０．１６ｍＭのＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉが含まれる溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）が調製された。２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡが５μＭに希釈された蛍光色素液２ｍＬが調製され、蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ、島津製作所）を用いて、蛍光特性が測定された。その後、前記蛍光色素液に、５ｍＭのＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が含まれるＤＭＳＯ溶液が２μＬ（ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡに対して当量比１倍）添加されてから、再度蛍光特性が測定された（励起波長５００ｎｍ、励起：スリット幅５ｎｍ、発光：スリット幅５ｎｍ）。【００７２】
結果
前記蛍光色素液にＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が添加される前後の発光スペクトルを図６に示す。図６の実線はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が添加される前の前記蛍光色素液の発光スペクトルで、図６の破線はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が添加された後の前記蛍光色素液の発光スペクトルである。図６に示すとおり、ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が添加されると、発光ピーク波長である５７６ｎｍでの発光強度が８％に低下するという著しい消光現象が観測された。
【実施例９】
【００７３】
Ｈｉｓ6によるＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの蛍光回復
Ｈｉｓ6が５ｍＭ含まれる水溶液２μＬ（ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡに対して当量比１倍）が、ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が混合された後の前記蛍光色素液に添加され、励起波長５００ｎｍの発光スペクトルが測定された（励起：スリット幅５ｎｍ、発光：スリット幅５ｎｍ）。【００７４】
結果
前記蛍光色素液にＨｉｓ6が添加される前後の発光スペクトルを図７に示す。図７の実線はＨｉｓ6が添加される前の前記蛍光色素液の発光スペクトルで、図７の破線はＨｉｓ6が添加された後の前記蛍光色素液の発光スペクトルである。図７に示すとおり、Ｈｉｓ6が添加されると、ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6添加で低下した発光ピーク波長（５７６ｎｍ）の発光強度が５．４倍に増大するという蛍光回復が観測された。以上の結果から、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉは、会合及び解離することによって、ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6及び／又はＨｉｓ6と可逆的に反応できることが示された。
【実施例１０】
【００７５】
ＨｉｓＺｉＦｉＴ又はＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡと消光剤との複合体と、Ｈｉｓ6との競合による蛍光回復特性の比較
５ｍＭのＨｉｓＺｉＦｉＴを含むＤＭＳＯ溶液と、１０ｍＭのＺｎＣｌ2水溶液とが用意され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でＨｉｓＺｉＦｉＴが５μＭ、ＺｎＣｌ2が１０μＭに希釈された蛍光色素液０．４ｍＬが調製された。さらに、５ｍＭのＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡが含まれるＤＭＳＯ溶液と、１０ｍＭのＮｉＣｌ2水溶液とが用意され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡが０．３ｍＭ、ＮｉＣｌ2が３ｍＭ（ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡに対して当量比１０倍）に希釈された蛍光色素液０．５ｍＬが調製された。前記蛍光色素液はイオン交換クロマトグラフィーＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（１７−１１５３−０１，ＧＥヘルスケア）を用いて精製され、０．１６ｍＭのＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉが含まれる溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）が調製された。２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡが５μＭに希釈された蛍光色素液０．４ｍＬが調製された。【００７６】
前記錯体溶液のそれぞれに、１ｍＭのＤａｂｃｙｌ−Ｈｉｓ6が２μＬ添加され、それぞれの蛍光強度が測定された。さらに、ＨｉｓＺｉＦｉＴを含むサンプルに対して、Ｈｉｓ6が１ｍＭ含まれる水溶液を１μＬずつ計４μＬ，２μＬずつ計６μＬ、５ｍＭ含まれる水溶液を２μＬ（等量比０．５〜１０倍）添加された。ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡに対しては、Ｈｉｓ6が０．５ｍＭ含まれる水溶液を１μＬずつ計４μＬ，１ｍＭ含まれる水溶液を２μＬずつ計６μＬ、５ｍＭ含まれる水溶液を２．４μＬ（等量比０．２５〜１０倍）添加された。これらの溶液サンプルについて、ＨｉｓＺｉＦｉＴは、励起波長５００ｎｍ及び発光波長５５３ｎｍ、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡは励起波長５００ｎｍ及び発光波長５７６ｎｍの蛍光強度が測定された。結果は、Ｈｉｓ6を含まない溶液サンプルの蛍光強度を１とする蛍光強度の相対値を縦軸に、Ｈｉｓ6の濃度を横軸に表すグラフにプロットされた。【００７７】
結果
ＨｉｓＺｉＦｉＴ又はＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡと消光剤との複合体に添加されたＨｉｓ6の濃度と、蛍光強度との関係を示すグラフを図８に示す。図８の黒い菱形（◆）のプロットは、Ｄａｂｃｙｌ−Ｈｉｓ6との複合体形成によって消光されたＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ錯体の蛍光が、Ｈｉｓ6の競合により回復したことを示す。図８の黒い三角形（▲）のプロットは、Ｄａｂｃｙｌ−Ｈｉｓ6との複合体形成によって消光されたＨｉｓＺｉＦｉＴ−２Ｚｎ錯体の蛍光が、Ｈｉｓ6の競合によっては回復しなかったことを示す。以上の結果から、錯体との複合体形成によって、ＨｉｓＺｉＦｉＴのほうがＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡより強力に消光されるものの、標識すべきヒスチジンのヘキサマーペプチドの存在下では、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡが顕著に蛍光回復を起こすのに対して、ＨｉｓＺｉＦｉＴではほとんど蛍光回復がみられないことが明らかになった。
【実施例１１】
【００７８】
ＨｉｓＺｉＦｉＴ及びＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの単体を用いるＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質の検出
ＨｉｓＺｉＦｉＴ及びＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの単体が生細胞で標的分子を選択的に検出可能かどうかが評価された。【００７９】
細胞培養
ＣＯＳ７細胞は７ｘ１０4個となるように３５ｍｍ径の培養ディッシュに播種され、３７°Ｃ、５％  ＣＯ2及び飽和水蒸気雰囲気下で、１０％  牛胎児血清、１００μｇ／ｍＬ  ペニシリン及び１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンが添加されたダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）を用いて培養された。【００８０】
遺伝子導入
Ｈｉｓ6−ＥＧＦ−ＴＤコンストラクトは、Ｈｉｓ6及びＥＧＦドメインとＰＤＧＦ膜貫通ドメインとが融合したタンパク質（以下、「Ｈｉｓタグ融合タンパク質」という。）が哺乳類細胞で発現されるように、Ｈｉｓ6及びＥＧＦドメインをエンコードするＤＮＡ断片がｐＤｉｓｐｌａｙ（商標、インビトロジェン）ベクターにクローン化されて作製された。前記コンストラクト  ０．５μｇは、エフェクテン試薬（キアゲン）を用いてＣＯＳ７細胞にトランスフェクションされた。【００８１】
蛍光染色
Ｈｉｓ6−ＥＧＦ−ＴＤコンストラクトをトランスフェクションされたＣＯＳ７細胞は、１ないし２日間培養された後、ハンクス平衡緩衝塩溶液（以下、「ＨＢＳＳ」という。）で２回洗浄され、１μＭ  ＨｉｓＺｉＦｉＴ（１０μＭ  ＺｎＣｌ2）、１μＭ  ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ（３μＭ  ＮｉＣｌ2）又は５μｇ／ｍＬ  抗Ｈｉｓ6抗体（１１９２２４１６００１、ロシュ）を用いて室温で染色された。ＨｉｓＺｉＦｉＴ及びＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡは、２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で希釈された。前記抗Ｈｉｓ6抗体は１０％  牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ中で希釈され、陽性対照として用いられた。前記抗体が一次抗体として添加された後、前記細胞はＨＢＳＳで２回洗浄され、二次抗体として６．６７μｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６３３抗体（Ａ２１０５０、モレキュラープローブ）が添加された。その後、前記細胞はＨＢＳＳで２回洗浄され、共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００、オリンパス）で観察された。【００８２】
結果
抗Ｈｉｓ6抗体、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ及びＨｉｓＺｉＦｉＴで蛍光染色された、Ｈｉｓタグ融合タンパク質を一過性に発現するＣＯＳ７細胞の蛍光顕微鏡写真を、それぞれ図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃに示す。Ｈｉｓ6を有するタンパク質が遺伝子導入された細胞で発現され、該細胞表面に局在することが免疫染色によって示された。また、細胞表面の蛍光発光強度は、ＨｉｓＺｉＦｉＴ及びＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの添加後１分間以内にプラトーに達した。細胞染色におけるＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの蛍光強度は、ＨｉｓＺｉＦｉＴの蛍光強度と比較してより強いことが示された。以上の結果から、ＨｉｓＺｉＦｉＴ及びＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡは、生体内で標的分子を選択的に検出できることが示された。
【実施例１２】
【００８３】
ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6及びＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの複合体によるＨｉｓタグ融合タンパク質の検出
ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6及びＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの複合体（以下、「ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ消光剤複合体」という。）が生体内で標的分子を選択的に検出可能かどうかが評価された。【００８４】
細胞培養及び遺伝子導入
細胞培養及び遺伝子導入は、実施例１１で説明された方法に従って行われた。【００８５】
蛍光染色
トランスフェクションされた細胞はＨＢＳＳで２回洗浄され、１μＭ  ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ単体又はＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ消光剤複合体（ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ（終濃度１μＭ）およびＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6（終濃度１μＭ）の混合液）を用いて室温で染色された。前記ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ単体及びＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ消光剤複合体は、２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製された。前記共焦点顕微鏡が観察に用いられた。【００８６】
結果
ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ単体で蛍光染色された細胞の洗浄前及び洗浄後の蛍光顕微鏡写真をそれぞれ、図１０Ａ及び１０Ｂに示す。また、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ消光剤複合体で蛍光染色された細胞の洗浄前及び洗浄後の蛍光顕微鏡写真をそれぞれ、図１０Ｃ及び１０Ｄに示す。ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ消光剤複合体は、背景蛍光を生じることなく、細胞表面を特異的に発光させた。蛍光染色された前記細胞の表面及び内部における洗浄前後の蛍光強度（任意の単位）のグラフを図１１に示す。各実験条件の誤差棒は同一条件で６ないし９回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。またアステリスク（＊）は、対応のない両側ｔ検定でｐ値が１％未満であることを示す。洗浄前において、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ単体の蛍光強度は、細胞表面では３５００、細胞内部では４００であり、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ消光剤複合体の蛍光強度は、細胞表面では３３００、細胞内部では２００であった。洗浄後において、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ単体の蛍光強度は、細胞表面では３６００、細胞内部では５００であり、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ消光剤複合体の蛍光強度は、細胞表面では３５００、細胞内部では２００であった。以上の結果から、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ消光剤複合体から分離したＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉの蛍光強度はＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ単体の蛍光強度と同程度であり、前記ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ消光剤複合体は、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉ単体と比較して、細胞洗浄の有無にかかわらず、細胞内部の背景蛍光を統計的に有意に低下させることが示された。【００８７】
したがって、本発明の別の選択的標識剤も同様に洗浄工程なしに簡便に生体内で標的分子を選択的に検出でき、疾患解析、創薬等のための蛍光検出のスループットも向上されることが示唆された。また、さまざまな蛍光剤が本発明の選択的標識剤に使用できるため、複数の標的分子を選択的に多重検出できることが示唆された。なお、生体透過性の高い近赤外線を放出する発光剤が用いられる場合には、個体レベルのモニタリングがリアルタイムに実施できることが示唆された。
【実施例１３】
【００８８】
ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6によるＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの背景蛍光の低減
ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6単体がＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ単体の背景蛍光を低減するかどうかが評価された。【００８９】
細胞培養、遺伝子導入及び蛍光染色は、原則として実施例１１で説明された方法に従って行われた。なお、前記蛍光染色では、細胞は１μＭ  ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉで染色された後、１μＭ  ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6を用いてインキュベーションされた。【００９０】
結果
ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6が、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡ−３Ｎｉで染色された細胞に添加されてから、０秒、１×１０2秒、４×１０2秒及び７×１０2秒後の蛍光背景の経時変化の写真を、それぞれ、図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ及び１２Ｄに示す。ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6はＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの蛍光、特に、蛍光背景を経時的に低減させることが示された。以上の結果から、ＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡは、試験管内だけでなく、生体内でも会合及び解離することによって、ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6及び／又はＨｉｓ6と可逆的に反応できることが示された。【００９１】
ＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6及びＴＭＲ−ｔｒｉＮＴＡの組み合わせと同様に、ＢＨＱ２−Ｈｉｓ6又はＤＡＢＣＹＬ−Ｈｉｓ6と、ＨｉｓＺｉＦｉＴとの組み合わせはＨｉｓ6と可逆的に反応できるため、該組み合わせも生体内で非特異的な背景蛍光を生じることなく、標的分子を選択的に検出できることが示唆された。また、この特徴を利用した検出システムは、選択的標的剤が、標的分子を含む試料に浸透できない場合であっても、発光剤及び消光剤それぞれを同時に又は差次的に注入することによって前記標的分子を選択的に生体内で検出できることが示唆された。
【図１】
2011021581.tif 000008
【図２】
2011021581.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
2011021581.tif 000012
【図６】
2011021581.tif 000013
【図７】
2011021581.tif 000014
【図８】
2011021581.tif 000015
【図９Ａ】
2011021581.tif 000016
【図９Ｂ】
2011021581.tif 000017
【図９Ｃ】
2011021581.tif 000018
【図１０Ａ】
2011021581.tif 000019
【図１０Ｂ】
2011021581.tif 000020
【図１０Ｃ】
2011021581.tif 000021
【図１０Ｄ】
2011021581.tif 000022
【図１１】
2011021581.tif 000023
【図１２Ａ】
2011021581.tif 000024
【図１２Ｂ】
2011021581.tif 000025
【図１２Ｃ】
2011021581.tif 000026
【図１２Ｄ】
2011021581.tif 000027
【国際調査報告】
2011021581.tif 000028
2011021581.tif 000029
2011021581.tif 000030