(57)【要約】【課題】パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）の発生を、紫外線照射によって位置的・時間的に制御することが可能なニトロベンゼン誘導体、並びに、それを用いた高反応性ＲＯＳ発生剤及び高反応性ＲＯＳの発生方法を提供することである。【解決手段】本発明は下記構造式で示されるニトロベンゼン誘導体である。この化合物は光照射によってＮＯラジカルを発生させることができ、さらにスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）を発生させる機能を有する置換基が導入されており、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）を発生させることができる。2011058905.tif 000011【選択図】図１
2011058905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）で示されるニトロベンゼン誘導体（ただし、Ｒ１及びＲ２は同じ又は異なっていてもよいアルキル基又はハロゲンを示し、Ｒ３及びＲ４は同じ又は異なってもよいアルキル基を示し、ｎは１以上の整数を示す。）。
【化１】
2011058905.tif 000010
【請求項２】
前記ｎは１であることを特徴とする請求項１記載のニトロベンゼン誘導体。
【請求項３】
前記Ｒ１及びＲ２はともにメチル基であることを特徴とする請求項１又は２記載のニトロベンゼン誘導体。
【請求項４】
前記Ｒ３及びＲ４はともにｔｅｒｔ−ブチル基であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載のニトロベンゼン誘導体。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかのニトロベンゼン誘導体からなることを特徴とする高反応性ＲＯＳ発生剤。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかのニトロベンゼン誘導体に光を照射することによって高反応性ＲＯＳを発生させることを特徴とする高反応性ＲＯＳの発生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光の照射によって高反応性ＲＯＳを放出するニトロベンゼン誘導体、並びに、それを用いた高反応性ＲＯＳ発生剤及び高反応性ＲＯＳの発生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素（reactive oxygen species：以下「ＲＯＳ」という）とは、酸素が化学的に活性になった化学種である。具体的には、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、過酸化水素（ＨＯＯＨ）、一重項酸素（１Ｏ２）、一酸化窒素（ＮＯまたはＮＯラジカル）、二酸化窒素（ＮＯ２）、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）、オゾン（Ｏ３）、過酸化脂質等が挙げられる。【０００３】
ＲＯＳは生体内におけるミトコンドリアの電子伝達系やある種の酸化酵素において、酸素を起源として発生し、生体内で重要な役割を担っている。また、ＲＯＳの中でも特に活性の高いパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）やヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）等の高反応性ＲＯＳ（ｈＲＯＳともいう）は、癌治療への応用が期待されている。【０００４】
こうしたことから、生体内におけるＲＯＳの挙動を調べたり、癌の治療等の医薬品研究を行ったりするために、ＲＯＳの発生剤（特に高反応性ＲＯＳの発生剤）の開発が望まれている。【０００５】
従来、ＲＯＳ発生剤として過酸化水素や酸化チタンが知られているが、過酸化水素は、それ自体が生物に対して活性を有するＲＯＳの一種であり、細胞に対する毒性も有するため、研究用のＲＯＳ発生剤としては適当ではない。また、酸化チタンは固体物質であり、投与困難であるため、研究用や医薬用としては利用し難い。【０００６】
研究用の高反応性ＲＯＳ発生剤としては、ＳＩＮ−１（同仁化学研究所製）（下記化１参照）が知られている。この化合物は、水に溶解させるとＮＯラジカルとスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）とが１：１で発生し、それらがさらに反応してパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）が生成する（下記化１参照）。しかし、この化合物は水に溶解させると同時にパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）が生成するため、発生を位置的あるいは時間的に制御することが難しいという問題がある。【０００７】
【化１】
2011058905.tif 000003
【０００８】
また、医薬品として使用されているＲＯＳ発生剤としては、ポルフィリン誘導体（例えばレザフィリン（明治製菓  登録商標））がある。レザフィリンは、ポルフィリン骨格を有する化合物であり、レーザー光の照射によって一重項酸素を主としたＲＯＳが発生する。このため、レーザーによってＲＯＳ発生の位置的・時間的制御が可能であり、癌細胞の存在する箇所にレーザーからの光を照射することによって、癌細胞を壊死に導くことができる（光線力学療法）。【０００９】
一方、本発明者らは、紫外線の照射によってＮＯラジカルを発生する一連のニトロベンゼン誘導体１０１〜１１４（下記化２参照）を見出し、既に論文で発表している（非特許文献１）。【００１０】
【化２】
2011058905.tif 000004
【００１１】
これらのニトロベンゼン誘導体は、紫外線を照射されることによりＲＯＳの一種であるＮＯラジカルが発生するため、ＲＯＳ発生の位置的・時間的制御が可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Journal of the American Chemical Society, 2005, 127, 11720-11726
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、上記非特許文献１のＲＯＳ発生剤では、紫外線を照射することにより、ＲＯＳの一種であるＮＯラジカルを発生させることはできるものの、高反応性ＲＯＳの一種であるパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）を発生させることはできなかった。このため、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）の作用等を調べるための実験に用いることはできなかった。
この点、上記ＳＩＮ−１であればパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）を発生させることはできるが、水に溶解させると同時にパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）が生成し、その半減期も短いため、紫外線等によって発生を位置的・時間的に制御することはできなかった。【００１４】
本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであって、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）の発生を、紫外線照射によって位置的・時間的に制御することが可能なニトロベンゼン誘導体、並びに、それを用いた高反応性ＲＯＳ発生剤及び高反応性ＲＯＳの発生方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上述のように、紫外線照射によってＮＯラジカルを発生するニトロベンゼン誘導体を開発している（非特許文献１）。また、ＮＯラジカルとスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）とが１：１で瞬時に反応し、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）を生成することが知られている。
以上のことから、本発明者らは、ＮＯラジカルを生成するニトロベンゼン誘導体に、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）を発生させる置換基を導入すれば、ＮＯラジカルとスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）とが１：１の割合で発生し、ＮＯラジカルやスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）が残存することなく、定量的にパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）となるのではないかと考えた。そして、鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。【００１６】
すなわち、本発明のニトロベンゼン誘導体は、下記構造式（１）で示されることを特徴とする（ただし、Ｒ１及びＲ２は同じ又は異なっていてもよいアルキル基又はハロゲンを示し、Ｒ３及びＲ４は同じ又は異なってもよいアルキル基を示し、ｎは１以上の整数を示す。）。【００１７】
【化３】
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【００１８】
本発明者らの試験結果によれば、上記本発明のニトロベンゼン誘導体（１）に紫外線を照射すると、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）が生成する。このため、紫外線を照射した箇所で、位置選択的にパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）を発生させることができる。また、必要な時に紫外線を照射することにより、任意の時にパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）を発生させることができる。すなわち、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）の発生を、紫外線照射によって位置的・時間的に制御することができる。このため、研究用のＲＯＳ発生剤や光線力学療法として好適に用いることができる。【００１９】
また、本発明のニトロベンゼン誘導体は、紫外線の照射によって一分子当たり、ＮＯラジカルとスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）とが１つづつ発生し、それらが瞬時に反応してパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）（７）となる。このため、ＮＯラジカル（２）やスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）が残存することはなく、ＮＯラジカルやスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）の影響を受けることなく、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）に基づく反応の研究を行うことができるという利点を有している。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１のＥＳＲスペクトルである。
【図２】実施例１にグルタチオンを添加した、ＥＳＲスペクトルである。
【図３】実施例１のＴＢＡＲＳスペクトルである。
【図４】ニトロベンゼン誘導体(E)に紫外線を照射した後の反応液のＨＰＬＣチャートである。
【図５】ニトロベンゼン誘導体(E)をＦｅ２＋及びＭＧＤの存在下でアルゴン雰囲気下で光照射した場合のＥＳＲ測定結果を示す。
【図６】ニトロベンゼン誘導体(E)をＦｅ２＋及びＭＧＤの存在下でアルゴン雰囲気下、大気存在下、及び（大気+ＳＯＤ）存在下で光照射した場合のＥＳＲ測定結果を示す。
【図７】ＤＭＰＯを用いたＥＳＲ測定によるヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）発生確認の原理を示す図である。
【図８】ａ）〜ｄ）の溶液についてＥＳＲ測定を行った結果を示すグラフである。
【図９】ＨＰＦを用いた蛍光測定による高反応性ＲＯＳ発生確認の原理を示す図である。
【図１０】ｅ）〜ｈ）の溶液について蛍光測定を行った結果を示すグラフである。
【図１１】ニトロベンゼン誘導体(E)を用いたDNA鎖切断の原理を示す模式図である。
【図１２】ニトロベンゼン誘導体(E)を用いたDNA鎖切断能の確認試験の結果を示す電気泳動グラフである。
【図１３】パーオキシナイトライトナトリウム塩溶液を用いたDNA鎖切断能の確認試験の結果を示す電気泳動グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のニトロベンゼン誘導体（１）からパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）が生成する反応機構については、下記化４に示す反応経路が推定される。
【００２２】
【化４】
2011058905.tif 000006
【００２３】
すなわち、まずニトロベンゼン誘導体（１）に紫外線が照射されると、ニトロ基（ＮＯ２基）が転移して（−Ｏ−Ｎ＝Ｏ）となり、さらに（−Ｏ−Ｎ＝Ｏ）からＮＯラジカル（２）が脱離してラジカル（３）となる。さらにラジカル（３）のフェノール性水酸基からＨ＋が解離してアニオンラジカル（４）となる。そして、さらに分子状の酸素がアニオンラジカル（４）から電子を受け取って、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）（５）となり、アニオンラジカル（４）は電子の移動にともなってキノン型化合物（６）となる。そして、以上の反応によって生じたＮＯラジカルとスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）とが１：１で瞬時に反応し、高反応性ＲＯＳであるパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）（７）となる。なお、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）（７）は水素イオンの存在下では水素イオンと反応し、ＮＯ２ラジカルとヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）に分解する。
【００２４】
以上の反応機構によれば、本発明のニトロベンゼン誘導体は紫外線の照射によって、一分子当たり、ＮＯラジカル（２）とスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）（５）とが１つづつ発生し、それらが瞬時に反応してパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）（７）となる。このため、ＮＯラジカル（２）やスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）（５）が残存することなく、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）（７）が生成する。このため、ＮＯラジカル（２）やスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）（５）の影響を受けることなく、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ-）（７）に基づく反応を研究することができるという利点を有している。
【００２５】
本発明のニトロベンゼン誘導体（１）は、以下の１）〜３）を要件とする。
１）ニトロ基の隣の２つのオルト位にアルキル基及び／又はハロゲンが置換基として結合していること。
２）フェノール性水酸基のオルト位に２つのアルキル基が結合していること。
３）ニトロベンゼン誘導体（１）に存在する２つのベンゼン環がＣ＝Ｃ二重結合で結合してπ電子共役系を形成していること。
【００２６】
上記１）が要件とされるのは、次の理由による。
すなわち、本発明のニトロベンゼン誘導体（１）に紫外線が照射されると、ニトロ基（ＮＯ２基）が転移して（−Ｏ−Ｎ＝Ｏ）となるが（化４）、この転位は、ニトロ基とベンゼン環に、ある程度ねじれがある場合に生じ易い。ニトロ基の隣の２つのオルト位に置換基が結合していると、このねじれが生じる。発明者らは、ニトロ基（ＮＯ２基）の隣にアルキル基及び／又はハロゲンが存在する場合に、この転位が生じることを確認している。
ここで、置換基Ｒ１、Ｒ２として具体的には、メチル基、エチル基等が挙げられる。また、置換基Ｒ１、Ｒ２は電子求引性を有するハロゲンであることも好ましい。そうであれば、ニトロ基（ＮＯ２基）が転移して亜硝酸エステル基（ＯＮＯ基）となる反応はスムーズに進行する。ハロゲンとして、例えばＦやＣｌが挙げられる。
【００２７】
また、上記２）が要件とされるのは、次の理由による。
上記反応経路（化４）では、上記化合物（１）は紫外線照射によってニトロ基が転位した後、ＮＯラジカルが生じる必要がある。ところが、化合物（１）における置換基Ｒ３、Ｒ４が水素のような小さな置換基であった場合、フェノール性水酸基に水和に対する立体障害がないため、水和が容易に起こり、フェノール性水酸基の酸素上の電子がベンゼン環およびニトロベンゼン部分に非局在化した安定な状態となる。この状態ではニトロ基のＣ−Ｎ結合の二重結合性が増し、転位反応が起こりにくくなる。このため、ＮＯラジカルが発生せず、上記反応経路（化４）の反応が起こらないからである。このため、置換基Ｒ１、Ｒ２は嵩高いアルキル基が好ましく、特に好ましいのは、ｔｅｒｔ−ブチル基である。
【００２８】
また、上記３）が要件とされるのは、次の理由による。
すなわち、上記反応経路（化４）において、アニオンラジカル（４）からキノン型化合物（６）が生成するためには、分子状の酸素への電子の移動に伴い、π電子共役系への電子移動によるキノン型化合物（６）の形成が必要となる。ニトロベンゼン誘導体（１）に存在する２つのベンゼン環がＣ＝Ｃ二重結合で結合してπ電子共役系を形成していれば、このような電子の移動が可能となる。
また、非特許文献１において、ベンゼン環がＣ＝Ｃ二重結合で結合しているニトロベンゼン誘導体１０４〜１１４（上記化２参照）において、ＮＯラジカルが発生することが記載されていることからも、ニトロベンゼン誘導体（１）に存在する２つのベンゼン環がＣ＝Ｃ二重結合で結合してπ電子共役系を形成することの必要性を支持される。また、ｎは1より大きくてもよいことは、ニトロベンゼン誘導体１０８、１０９及び１１４のように、ｎ＝２に相当する化合物であっても、ＮＯラジカルが発生することから、支持される。
なお、ｎは１以上の整数であれば良い。発明者らはｎ＝１である化合物について、紫外線を照射することにより、確実にパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）が水素イオンの存在により分解して発生したヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）が生成することを確認している。
【００２９】
以下、本発明をさらに具体化した実施例１について、詳述する。
（実施例１）
実施例１では、下記化５の合成経路に従ってニトロベンゼン誘導体(E)を合成した。以下詳細について述べる。
【００３０】
【化５】
2011058905.tif 000007
【００３１】
（ステップ１）
３，５−ジメチル−４−ニトロ安息香酸（Ａ−２）の合成
三酸化クロム (20.0329 g, 200.349 mmol, 3.2当量) を酢酸 (220 mL) に懸濁させた後、酢酸 (30 mL) に溶解させた１，３，５−トリメチルニトロベンゼン（Ａ−１）(10.2003 g, 61.749 mmol) を加えて、室温にて12.5時間攪拌した。続いて、目的化合物である３，５―ジメチル―４―ニトロ安息香酸を沈殿させるため、混合溶液に氷水を加えた。白色固形物をろ別し、クロロホルムに溶解した。クロロホルム層は２規定の水酸化ナトリウムを用いて洗浄し、水層は濃塩酸を用いて酸性にした後、クロロホルムを用いて抽出した。クロロホルム層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて脱水した。ろ過した後、エバポレーションで溶媒留去し、化合物（Ａ−２）(4.0326 g, 33.5 %)を白色固体として得た。得られた化合物（Ａ−２）の1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 7.90 (2H, s), 2.38 (6H, s)
【００３２】
（ステップ２）
３，５−ジメチル−４−ニトロベンジルアルコール（Ａ−３）の合成
水素化ホウ素ナトリウム (2.3577 g, 62.324 mmol, 3.0当量) をテトラヒドロフラン (40  mL) に懸濁させた後、ステップ１で合成した化合物（Ａ−２）(4.0332 g, 20.665 mmol) のテトラヒドロフラン (30 mL) 溶液と、三フッ化ホウ素エチルエーテル (2.26 g, 15.923 mmol, 0.77当量) を加え、室温で8時間攪拌した。続いて、混合溶液に氷水を加えて、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて脱水した。ろ過した後、エバポレーションで溶媒留去し、化合物（Ａ−３）(3.0792 g, 82.3 %) を黄色固体として得た。得られた化合物（Ａ−３）の1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 7.12 (2H, s), 4.69 (2H, s), 2.32 (6H, s)
【００３３】
（ステップ３）
５−（ブロモメチル）−１，３−ジメチル−２−ニトロベンゼン（Ａ−４）の合成
三臭化リン (14.4 g, 53.197 mmol, 3.1当量) とステップ２で合成した化合物（Ａ−３）の混合物を室温で２時間攪拌した。続いて、混合溶液に氷水を加えて、クロロホルムで抽出した。クロロホルム層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて脱水した。ろ過した後、エバポレーションで溶媒留去し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/ヘキサン = 1:6) で精製し、化合物（Ａ−４）(3.2903 g, 80.6 %) を黄色固体として得た。得られた化合物（Ａ−４）の1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 7.15 (2H, s), 4.41 (2H, s), 2.31 (6H, s)
【００３４】
（ステップ４）
（３，５―ジメチル―４―ニトロベンジル）ホスホン酸ジエチル（Ａ−５）の合成
テトラブチルアンモニウムヨージド (413.4 mg, 1.19 mmol, 0.08当量) と亜リン酸トリエチル (2.9760 g, 17.910 mmol, 1.3 eq) の混合物に、ステップ４で合成した化合物（Ａ−４）(3.2903 g, 13.710 mmol) を加えて、１２０℃で4.5時間攪拌した。室温に冷却した後、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/ｎ−ヘキサン = 9:1) で精製し、化合物（Ａ−５）(3.3094 g, 80.1 %) を黄色油状物として得た。得られた化合物（Ａ−５）の1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 7.06 (2H, s), 4.09-4.03 (4H, m), 3.09 (2H, d, J = 21.9 Hz), 2.30 (6H, s), 1.28 (6H, t, J = 7.3 Hz)
【００３５】
（ステップ５）
３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（メトキシメトキシ）ベンズアルデヒド（Ｂ−１）の合成
アセトン (150 mL) に溶解した３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンズアルデヒド (5.0258 g, 20.6543 mmol) に、炭酸カルシウム (5.9597 g, 43.1206 mmol, 2.1 当量) を加え、室温で20分攪拌した。更に、反応混合物にクロロメチルメチルエーテル (2.5902 g, 32.1720 mmol, 1.6 当量) をゆっくり加え、完全に加え終えた後昇温し、4.5時間加熱還流した。反応混合物を室温まで冷却し、過剰な炭酸カルシウムをろ過して、溶液を水へ注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水した。ろ過した後、エバポレーションで溶媒留去し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/ｎ−ヘキサン = 1:40) で精製し、化合物（Ｂ−１）(398.1 mg, 6.9 %) を黄色油状物として得た。得られた化合物（Ｂ−１）の1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 9.93 (1H, s), 7.84 (2H, s), 4.92 (2H, s), 3.57 (3H, s), 1.43 (18H, s)
【００３６】
（ステップ６）
5-{(E)-2-[3,5-di-tert-butyl-4-(methoxymethoxy)phenyl]vinyl}-1,3-dimethyl-2-nitrobenzene（Ｂ−３）の合成
ステップ４で合成した化合物（Ａ−５）(289.4 mg, 0.9605 mmol) をテトラヒドロフラン (3 mL) に溶解させ、水素化ナトリウム (48.0 mg, 2.0000 mmol, 2.1 当量) を加えて、室温で20分攪拌した。続いて、反応混合物にステップ５で合成したＥ−２ (269.0 mg, 0.9663 mmol) のテトラヒドロフラン(4 mL) に溶液を加え、室温にて5時間攪拌した。反応溶液を水へ注ぎ、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水した。ろ過した後、エバポレーションで溶媒留去し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/ｎ−ヘキサン = 1:40) で精製し、化合物（Ｂ−３）(342.0 mg, 83.2 %) を黄色固体として得た。化合物（Ｂ−３）の1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 7.53 (2H, s), 7.51 (2H, s), 7.36 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.15 (1H, d, J = 16.4 Hz), 4.86 (2H, s), 3.56 (3H, s), 2.28 (6H, s), 1.43 (18H, s)
【００３７】
（ステップ７）
ニトロベンゼン誘導体(E)の合成
ステップ６で合成した化合物（Ｂ−３）(397.5 mg, 0.9341 mmol) を酢酸エチル (5 mL) に溶解させ、塩化水素を４規程の濃度で溶解させた酢酸エチル(10 mL) を加えて、室温で2.5時間攪拌した。反応溶液を水へ注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水した。ろ過した後、エバポレーションで溶媒留去し、ニトロベンゼン誘導体(E)(326.7 mg, 91.7 %) を黄色固体として得た。更に、再結晶（酢酸エチル /ｎ−ヘキサン）を行い、実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)(295.3 mg, 90.4 %) を黄色固体として得た。ニトロベンゼン誘導体(E)の1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, δ; ppm) 7.35 (2H, s), 7.23 (2H, s), 7.10 (1H, d, J = 16.4 Hz), 6.85 (1H, d, J = 16.1 Hz), 5.35 (1H, s), 2.34 (6H, s), 1.48 (18H, s)
【００３８】
＜キノン型化合物（Ｑ）の合成＞
前述した反応機構（化４参照）の妥当性を調べるため、その反応機構に基づきニトロベンゼン誘導体(E)から得られるであろうキノン型化合物（Ｑ）を以下のステップに従って合成した。
【００３９】
【化６】
2011058905.tif 000008
【００４０】
（ステップ１）
4-(methoxymethoxy)-2,6-dimethyliodobenzeneの合成
4-ヨード-2,6-ジメチルフェノール (1.662 g, 6.701 mmol) をアセトン (15 mL) に溶かし、その溶液に炭酸カリウム(1.868 g, 13.513 mmol, 2.0 eq) を加えた。その混合溶液を室温で15分間攪拌し、その後、クロロメチルメチルエーテル(1.078 g, 12.675 mmol, 1.9 eq) を加え、5.5時間、還流させながら攪拌した。反応溶液を室温まで冷やし、過剰な炭酸カリウムを濾取した。その濾液に水を加えて、酢酸エチルで抽出した。その有機層を飽和塩化ナトリウム溶液で洗い、硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過した後、有機溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン:酢酸エチル=1:20)で精製し、4-(methoxymethoxy)-2,6-dimethyliodobenzeneを、無色のオイルとして771mg(収率39.4%)得た。4-(methoxymethoxy)-2,6-dimethyliodobenzeneの1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm) 7.35 (2H, s), 4.93 (2H, s), 3.59 (3H, s), 2.24 (6H, s).
【００４１】
（ステップ２）
3,5-di-tert-butyl-4-(methoxymethoxy)ethenylbenzeneの合成
メチルトリフェニルホスフィンブロミド (1.787 g, 5.005 mmol, 1.0 eq) に乾燥テトラヒドロフラン (10 mL) を加えた溶液を、水素化ナトリウムの乾燥テトラヒドロフラン(10 mL)の懸濁溶液に加えた。その反応溶液に3,5-di-tert-butyl-4-(methoxymethoxy)benzaldehyde (1.393 g, 5.003 mmol,) の乾燥テトラヒドロフラン(10 mL)溶液を加え、室温で2時間攪拌した。その後、冷やしながら水を加え、その溶液をクロロホルムで抽出した。その有機層を飽和塩化ナトリウム溶液で洗い、硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過した後、有機溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン:酢酸エチル=1:40)で精製し、3,5-di-tert-butyl-4-(methoxymethoxy)ethenylbenzeneを黄色のオイルとして、506 mg(収率36.6%)得た。3,5-di-tert-butyl-4-(methoxymethoxy)ethenylbenzeneの1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm) 7.31 (2H, s), 6.67 (1H, dd, J = 11.0 Hz, 17.7 Hz), 5.63 (1H, dd, J = 0.6 Hz, 17.7 Hz), 5.17 (1H, dd, J = 0.8 Hz, 10.8 Hz), 4.89 (2H, s), 3.64 (3H, s), 1.45 (18H, s).
【００４２】
（ステップ３）
4-{(E)-2-[3,5-di-tert-butyl-4-(methoxymethoxy)phenyl]ethenyl}-2,6-dimethyl-4-(methoxymethoxy)benzeneの合成
（ステップ２）の化合物(506 mg, 1.830 mmol) と、（ステップ１）の化合物(590 mg, 2.020 mmol, 1.1 eq) と、酢酸パラジウム (44 mg, 0.196 mmol, 0.1 eq) と、トリフェニルホスフィン (103 mg, 0.393 mmol, 0.2 eq) と、トリエチルアミン (185 mg, 1.830 mmol, 1.0 eq) と、硝酸銀 (355 mg, 2.090 mmol, 1.1 eq) をアセトニトリル (15 mL) に混ぜ、その混合溶液を室温で1.5時間攪拌した。その後還流させながら3時間、攪拌した。その反応溶液を濾過し、濾過した溶液に水を加え、クロロホルムで抽出した。その有機層を飽和塩化ナトリウム溶液で洗い、硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過した後、有機溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン:トルエン=6:1)で精製し、4-{(E)-2-[3,5-di-tert-butyl-4-(methoxymethoxy)phenyl]ethenyl}-2,6-dimethyl-4-(methoxymethoxy)benzeneを褐色の固体として、636 mg (収率 78.9 %)得た。4-{(E)-2-[3,5-di-tert-butyl-4-(methoxymethoxy)phenyl]ethenyl}-2,6-dimethyl-4-(methoxymethoxy)benzeneの1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm) 7.39 (2H, s), 7.18 (2H, s), 6.97 (1H, d, J = 16.1 Hz), 6.88 (1H, d, J = 16.1 Hz), 4.97 (2H, s), 4.91 (2H, s), 3.65 (3H, s), 3.62 (3H, s), 2.31 (6H, s), 1.47 (18H, s).
【００４３】
（ステップ４）
4-[(E)-2-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)ethenyl]- 2,6-dimethylphenolの合成
（ステップ３）の化合物(636 mg, 1.444 mmol) の酢酸エチル (5 mL) 溶液に4規定塩酸-酢酸エチル溶液 (5 mL) を加え、その溶液を室温で1時間攪拌した。その反応溶液に水を加え、抽出した。その有機層を飽和塩化ナトリウム溶液で洗い、硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。硫酸ナトリウムを濾過した後、4-[(E)-2-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)ethenyl]- 2,6-dimethylphenolを褐色の固体として、295 mg (収率 58.0 %)得た。4-[(E)-2-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)ethenyl]- 2,6-dimethylphenolの1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz, d; ppm) 7.31 (2H, s), 7.15 (2H, s), 6.92 (1H, d, J = 16.1 Hz), 6.83 (1H, d, J = 16.1 Hz), 5.23 (1H, s), 4.60 (1H, s), 2.27 (6H, s), 1.47 (18H, s).
【００４４】
（ステップ５）
キノン型化合物（Ｑ）の合成
（ステップ４）の化合物（295 mg, 0.837 mmol）をトルエン10 mlに溶解し、これにDDQ（199 mg, 0.877 mmol）を加えた。これを室温で1.5時間撹拌した。その後溶媒を減圧下に溜去し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（n-ヘキサン：酢酸エチル＝6:1）で生成し、キノン型化合物（Ｑ）を229 mg（78.2%）の赤色個体として得た。キノン型化合物（Ｑ）のの1H-NMRデータを以下に示す。
1H-NMR (DMSO, 500 MHz, δ; ppm) 7.98 (1H, s), 7.89 (1H, d, J=13.4 Hz), 7.80 (1H, d, J=17.4 Hz), 7.70 (1H, s), 7.43 (1H, s), 7.29 (1H, s), 2.02 (3H, s), 1.98 (3H, s), 1.31 (9H, s), 1,28 (9H, s)
【００４５】
＜評  価＞
上記のようにして合成した実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)について、光照射による高反応性ＲＯＳの発生を確認するため、様々な条件下でのＥＳＲ測定、ＴＢＡＲＳ測定、及び蛍光試薬存在下での蛍光測定を行なった。さらには、実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)によるＤＮＡ鎖切断能の確認試験を行った。
尚、本明細書では、本実施例において用いた試薬について、以下の略号を用いることがある。
ＤＭＰＯ：５，５−ジメチル−１−ピロリン‐Ｎ−オキサイド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＭＴＰＡ：ジエチレントリアミン５酢酸
ＴＢＡ：チオバルビツール酸
ＭＧＤ：（N-(ジチオカルボキシ)-N-メチル-D-グルカミンのナトリウム塩）
ＳＯＤ：スーパーオキシドディスムターゼ
ＨＰＦ：ハイドロキシフェニルフルオレッセイン
【００４６】
（ＥＳＲ測定によるヒドロキシルラジカル発生の確認）
合成した実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)について、ＥＳＲ測定によるヒドロキシルラジカル発生の確認を行うため、以下に示すＡ〜Ｃ液を調製した。
（Ａ液の調製）
ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 2.60 mgにDMSO 682 μLを加え、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 10mM溶液とした。この溶液を40μL取って、MilliQ-水960μLを加え、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 400μM (DMSO4%)溶液(Ａ液)とした。
（Ｂ液の調製）
DMPO 111 μLにMilliQ-水を加え、DMPO 1M溶液とした。この溶液を400μL取って、Milli-Q水 600μLを加え、DMPO 400mM溶液(Ｂ液)とした。
（Ｃ液の調製）
Tris-HCl 1M (pH=7.5)緩衝溶液を400μLとり、MilliQ-水600μLを加え、Tris-HCl 400mM (pH=7.5)緩衝溶液(Ｃ液)とした。
【００４７】
Ａ〜Ｃ液を用いて、ＥＳＲ測定を行った。以下に詳細を述べる。
１）上記で調製した、Ａ〜Ｃ液とMilliQ-水を50μLずつ混ぜ、最終濃度がニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 100μM、DMPO 100mM、Tris-HCl 100mM(pH=7.5)、DMSO1%となるように調製したものをサンプルとした。
２）調製したサンプル200μLをキュベットに入れ、蛍光顕微鏡(Olympus BX60/BX-FLA)の100W 水銀ランプにWUフィルター(λ=330〜380nm)を付け、WUフィルター透過光照射を、減光フィルターを付けずに15分間行った。
３）光照射後のサンプルをＥＳＲ測定用の偏平セルに移し、ＥＳＲ測定を行った。ＥＳＲ測定における各パラメータは以下のとおりである
microwave power, 10mW; frequency, 9.4200 GHz; field, 336.5 mT;
sweep width, 7.5 mT; sweep time, 1 min; modulation width, 0.100 mT;
gain, 790.00; time constant; 0.10 s.
【００４８】
ＥＳＲ測定の結果を図１に示す。図中の左右端に表れている２つのシグナルは、標準物質（Ｍｎ2+）のシグナルである。矢印で示された４本のシグナルが明瞭に観測された。この４本のシグナルは、実施例１のニトロベンゼン誘導体（Ｅ）から発生するヒドロキシルラジカルと検出試薬であるＤＭＰＯとが反応して生じる、ラジカルニトロベンゼン誘導体（Ｅ）に基づくシグナルである。
【００４９】
以上の結果から、実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)は、紫外線を照射すると、高反応性ＲＯＳであるヒドロキシルラジカルが発生することが分かる。
【００５０】
また、グルタチオン（ＧＳＨ）存在下におけるＥＳＲ測定も測定した。
グルタチオンを添加すると、ＤＭＰＯとヒドロキシルラジカルとから生じた、ＤＭＰＯラジカル(E)の分解を防止できるため、ヒドロキシルラジカル発生の感度を上げることができる。
結果、図２に示す。矢印で示す４本のシグナルは、図１と比較して、強度が増していることが分かる。このことから、矢印で示す４本のシグナルは、ヒドロキシルラジカルに基づくことが、さらに明らかとなった。
【００５１】
（ＴＢＡＲＳ測定）
実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)から生成するヒドロキシルラジカルを定量的に観測するため、デオキシリボースを基質としたＴＢＡＲＳ測定を行った。
まず、以下に示すＤ〜Ｈ液を調製した。
（Ｄ液の調製）
実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)1.09 mg にDMSO 286μLを加え、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 10mM溶液とした。この溶液を40μL取って、MilliQ-水を960μL加え、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 400μM(DMSO4%)溶液(Ｄ液)とした。
（Ｅ液の調製）
DTPA 3.86 mgに1N NaOHを981 μL加え、DTPA 10mM溶液とした。この溶液を40μL取って、MilliQ-水を920μL加え、1N-HClを40μL加え、DTPA 400μM(Ｅ液)とした。
（Ｆ液の調製）
デオキシリボース4.34 mgにMilliQ-水 324 μLを加え、デオキシリボース100mM溶液とした。この溶液を40μL取って、MilliQ-水を960μL加え、デオキシリボース4mM溶液(Ｆ液)とした。
（Ｇ液の調製）
Tris-HCl 1M (pH=7.5)緩衝溶液を400μLとり、MilliQ-水600μLを加え、Tris-HCl 400mM (pH=7.5)緩衝溶液(Ｇ液)とした。
（Ｈ液の調製）
チオバルビツール酸52 mgに硫酸50mM溶液を10.4 mL加え、TBA溶液(Ｈ液)とした。
【００５２】
以上のようにして調製したＤ〜Ｈ液を用いて、蛍光スペクトル測定を行った。以下に詳細を述べる。
１）Ｄ液及びＥ液を250μLずつ計りとって混合し、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 100μM、DTPA 100μM、デオキシリボース 1mM、Tris-HCl 100mM(pH=7.5)、DMSO1%となるように調製したも混合液とする。
２）上記混合液1mLをキュベットに入れ、蛍光顕微鏡(Olympus BX60/BX-FLA)の100W 水銀ランプにWUフィルター(λ=330〜380nm)を付け、WUフィルター透過光照射を、減光フィルターを付けずに15分間行った。
３）光照射が終わったサンプルを試験管に移し、TBA溶液(Ｈ液)を1 mL加え、温浴(100℃)で20分間加熱した。
４）加熱し終わったサンプルを氷水で冷やし、励起波長５１５ｎｍ、測定蛍光の波長５３０〜６００ｎｍで蛍光測定を行った。
【００５３】
ＴＢＡＲＳ測定の結果を図３に示す。図中の「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、紫外線を照射しない場合の結果を示す。この図から、実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)に紫外線を照射した場合、紫外線を照射しなかった場合と比べて、５４５ｎｍ付近の蛍光が大きくなった。この蛍光はヒドロキシルラジカルによって生じるＴＢＡ付加物に基づくものであり、紫外線照射によりヒドロキシルラジカルの発生が増大することが分かった。
【００５４】
以上のように、実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)に紫外線を照射した場合、ヒドロキシルラジカルが生成することが分かった。また、前述した化合物１０４〜１１４（化２）に紫外線を照射した場合、ＮＯが発生することが分かっていることから、同様の骨格構造を有するニトロベンゼン誘導体(E)に紫外線を照射した場合も、ＮＯが発生すると考えられる。さらには、ニトロベンゼン誘導体(E)に紫外線を照射した後の反応液をＨＰＬＣ分析した結果、図４に示すように、紫外線照射の強度を強くするに従って、ニトロベンゼン誘導体(E)のピークが小さくなり、前述した（化６）に示すキノン型化合物（Ｑ）のピークが大きくなったことから、ニトロベンゼン誘導体(E)への紫外線照射によってキノン型化合物（Ｑ）へ変化することが分かった。なお、キノン型化合物（Ｑ）の同定は、上記化６に示す合成ルートに従って合成したキノン型化合物（Ｑ）のＨＰＬＣにおける保持時間との比較により確認した。
以上の事実から、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）が発生し、その分解によってヒドロキシルラジカルが生成するという、上記（化４）に示す反応機構は妥当であるといえる。
【００５５】
（ＥＳＲによるＮＯラジカル発生の確認試験）
合成したニトロベンゼン誘導体(E)について、ＥＳＲ測定によるＮＯラジカル発生の確認及び酸素の影響を調べるために、以下に示すようにアルゴン雰囲気下および酸素存在下での光照射試験を行った。
【００５６】
１）ESRによるNOラジカルの測定（アルゴン雰囲気下で光照射）
ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 100 mM、FeSO4 1.5 mM、MGD（N-(ジチオカルボキシ)-N-メチル-D-グルカミンのナトリウム塩）6 mMを含むTris-HCl緩衝液 (100 mM, pH = 7.4) 200 μL (共溶媒としてDMSO 1 %含む) を調製した（この溶液は、NOラジカルと反応してＮＯ−Ｆｅ−ＭＧＤ錯体を生成し、ＥＳＲにおいて所定の磁場強度において3本の吸収を示す。）。その溶液をキュベットに入れ、蛍光顕微鏡 (Olympus BX60/BX-FLA) のWUフィルター (λ = 330〜380 nm) をつけた100W 水銀ランプから、減光フィルターを付けずに、アルゴン雰囲気下、光照射を15分間行った。光照射をした溶液をESR測定用扁平セルに入れ、JES-RE2X spectrometerによりESR測定を行った。測定条件：microwave power 10 mW；  frequency, 9.4200 GHz; field, 330 mT; sweep width, 7.5 mT; sweep time, 4 min; modulation width, 0.125 mT; time constant; 0.10 s.
【００５７】
２）ESRによるNOラジカルの測定（酸素存在下で光照射）
ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 100 mM、FeSO4 1.5 mM、MGD 6 mMを含むTris-HCl緩衝液 (100 mM, pH = 7.4) 200 μL (共溶媒としてDMSO 1 %含む) を調製した。その溶液をキュベットに入れ、蛍光顕微鏡 (Olympus BX60/BX-FLA) のWUフィルター (λ = 330〜380 nm) をつけた100W 水銀ランプから、減光フィルターを付けずに、光照射を15分間行った。光照射をした溶液をESR測定用扁平セルに入れ、JES-RE2X spectrometerによりESR測定を行った。測定条件：microwave power 10 mW；  frequency, 9.4200 GHz; field, 330 mT; sweep width, 7.5 mT; sweep time, 4 min; modulation width, 0.125 mT; time constant; 0.10 s.
【００５８】
上記アルゴン雰囲気下および酸素存在下での光照射試験の結果、アルゴン雰囲気下で光照射を行なった場合では、図５に示すように、ＮＯ−Ｆｅ−ＭＧＤ錯体に特有な3本の吸収が認められた。この結果から、実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)をアルゴン雰囲気下で光照射を行なうと、ＮＯラジカルが発生することが分かった。
これに対して、酸素存在下で光照射を行なった場合には、このような3本の吸収は認められなかった。
【００５９】
以上の事実は、実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)への光照射を酸素存在下で行なった場合、下記化７に示す反応機構で反応が進行することを示唆するものである。
【００６０】
【化７】
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【００６１】
すなわち、ニトロベンゼン誘導体(E)を酸素の存在下で光照射した場合、ニトロ基（ＮＯ２基）が転移して（−Ｏ−Ｎ＝Ｏ）となり、さらに（−Ｏ−Ｎ＝Ｏ）からＮＯラジカルが脱離してラジカル（F）となる。さらにラジカル（F）のフェノール性水酸基からＨ＋が解離してアニオンラジカル（G）となる。そして、さらに分子状の酸素がアニオンラジカル（G）から電子を受け取って、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）となり、アニオンラジカル（G）は電子の移動にともなってキノン型の化合物（Ｑ）となる。そして、以上の反応によって生じたＮＯラジカルとスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）とが１：１で瞬時に反応し、高反応性ＲＯＳであるパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）となる。このため、酸素存在下では、ＮＯラジカルがＥＳＲで検出されないのである。
【００６２】
（ＥＳＲ測定によるスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）発生の確認試験）
合成した実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)について、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）の発生の証拠を得るため、以下に示すように、ＳＯＤおよび酸素の存在下での光照射試験を行った。
【００６３】
・ＥＳＲによるＮＯラジカルの測定（ＳＯＤおよび酸素の存在下で光照射）
ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 100 mM、FeSO4 1.5 mM、MGD 6 mM、SOD 1 kunit/mLを含むTris-HCl緩衝液 (100 mM, pH = 7.4) 200 μL (共溶媒としてDMSO 1 %含む) を調製した。その溶液をキュベットに入れ、蛍光顕微鏡 (Olympus BX60/BX-FLA) のWUフィルター (λ = 330〜380 nm) をつけた100W 水銀ランプから、減光フィルターを付けずに、光照射を15分間行った。光照射をした溶液をESR測定用扁平セルに入れ、JES-RE2X spectrometerによりESR測定を行った。測定条件：microwave power 10 mW；  frequency, 9.4200 GHz; field, 330 mT; sweep width, 7.5 mT; sweep time, 4 min; modulation width, 0.125 mT; time constant; 0.10 s.
【００６４】
結果を図６に示す。この図から、アルゴン雰囲気下であって、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ）にＦｅ（II）イオンとＭＧＤとが存在する条件下（図６の左側）では、ＮＯ−Ｆｅ−ＭＧＯ錯体が生じて３本の吸収が認められ、ＮＯラジカルの存在が確認された。これに対し、酸素存在下における同様の測定では、ＮＯラジカルの存在が確認されなかった（図６の中）。さらに、酸素存在下において、ＳＯＤを存在させた場合は、僅かに３本の吸収が認められた。
【００６５】
以上の結果は、次のように説明することができる。
すなわち、アルゴン雰囲気下における光照射では、まず上記化７における第１段階の反応である、ニトロベンゼン誘導体(E)からＮＯラジカルが発生し、化合物(F)となり、さらに水素イオンの脱離によってラジカルアニオン(G)となる。しかしながら、酸素のない状態であるので、上記化７の最後の段階である酸素によるラジカルアニオン(G)のキノン型の化合物（H）への酸素酸化反応は起こらず、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）は発生しない。このため、ＮＯラジカルはスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）によって消費されることなく、ＮＯ−Ｆｅ−ＭＧＤ錯体を生成し、これに基づく3本の吸収がＥＳＲ測定で認められたのである（図６左側のスペクトル）。
【００６６】
これに対して、酸素の存在する条件下では、上記化７の最後の段階である酸素によるラジカルアニオン(G)のキノン型の化合物（H）への酸素酸化反応が起こり、これに伴いスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）が発生する。このため、ＮＯラジカルはスーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）と出会った途端に瞬時に反応しパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）となる。このため、ＮＯラジカルはＦｅ−ＭＧＤ錯体を生成することはなく、それに基づくＥＳＲシグナルは検出されなかったのである（図６中央）。
【００６７】
ところが、酸素存在下においても、スーパーオキシデスムターゼ（ＳＯＤ）存在下では、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）の一部を分解するため、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２-）と１：１の個数割合で発生したＮＯラジカルの一部が残り、ＮＯ−Ｆｅ−ＭＧＤ錯体を生成し、これに基づく3本の吸収がＥＳＲ測定で認められたのである（図６右側）。
【００６８】
（ＥＳＲ測定によるヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）発生の確認試験）
上記化７の反応機構に示したように、ニトロベンゼン誘導体(E)の酸素存在下における光照射によって発生したパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）は、さらに水素イオンによって不均一分解反応が生じ、ＮＯ２ラジカルとヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）とが発生する。このため、ニトロベンゼン誘導体(E)の酸素存在下における光照射においてヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）が検出されれば、その事実はパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）存在の間接的証明になる。このため、ニトロベンゼン誘導体(E)の酸素存在下における光照射において、ＥＳＲによるヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）検出を試みた
【００６９】
すなわち、まず以下に示すａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）の４種類の溶液をそれぞれ200 μLずつ (共溶媒としてDMF 1%含む) 調製した。
ａ）ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 100 μM、DMPO 100 mMを含むリン酸カリ
ウム緩衝液 (100mM、pH = 7.5)
ｂ）ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 100 μM、DMPO 100 mM、マンニトール 
1 mMを含むリン酸カリウム緩衝液 (100mM、pH = 7.5)
ｃ）DMPO 100 mMを含むリン酸カリウム緩衝液 (100mM、pH = 7.5)
ｄ）DMPO 100 mM、マンニトール 1 mMを含むリン酸カリウム緩衝液 
(100mM、pH = 7.5)
そして、それらの溶液をキュベットに入れ、蛍光顕微鏡 (Olympus BX60/BX-FLA) のWUフィルター (λ = 330〜380 nm) をつけた100W 水銀ランプから、減光フィルターを付けずに、光照射を15分間行った。光照射をした溶液をESR測定用扁平セルに入れ、JES-RE2X spectrometerによりESR測定を行った。測定条件：microwave power, 10mW; frequency, 9.4200 GHz; field, 336.5 mT; sweep width, 7.5 mT; sweep time, 1 min; modulation width, 0.100 mT; gain, 790.00; time constant; 0.10 s.
なお、上記溶液調製に用いたDMPOはヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）と反応してＥＳＲ測定において４本の吸収シグナルを示す化合物となるため、これによりヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）の存在が証明される。また、マンニトールはヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）の消去剤としての役割を有するものである。
【００７０】
上記ＥＳＲ測定における原理を図７に示す。すなわち、ニトロベンゼン誘導体(E)に水素イオン存在下で光照射すると、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）が発生し、さらにこれがDMPOと反応してDMPO-OHとなり、ＥＳＲ測定において４本のＥＳＲシグナルが所定の位置に検出されるのである。
【００７１】
上記ａ）〜ｄ）の溶液についてＥＳＲ測定を行った結果を図８に示す。ここで、縦軸は（DMPO-OHのＥＳＲシグナル面積）／（標準サンプルとして測定した所定濃度のＭｎに基づくＥＳＲシグナル面積）で求めたＥＳＲシグナルの強度である。
【００７２】
図８から、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ）及びDMPOを含む溶液ａ）では、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ）を含みDMPOを含まない溶液ｃ）に比べて、DMPO-OHに基づくＥＳＲシグナル強度が大きなっていることが分かった。この結果から、溶液ａ）ではヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）が発生していることが分かった。さらには、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）を経てヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）が発生することが強く示唆された。なお、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ）を含まない溶液ｃ）でもシグナルが検出されたのは、光照射によってDMPOが分解されたことに起因するものであると考えられる。
【００７３】
一方、マンニトールを加えた溶液ｂ）や溶液ｄ）では、マンニトールを加えていない溶液ａ）や溶液ｃ）と比べて、シグナル強度が小さかった。これは、マンニトールがヒドロキシルラジカルのスカベンジャーとして作用し、DMPO-OHの生成を抑制したからである。
【００７４】
（ＨＰＦを用いた高反応性ＲＯＳ発生の確認試験）
合成した実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)について、高反応性ＲＯＳ発生の証拠を得るため、以下に示すように、ＨＰＦ（ハイドロキシフェニルフルオレッセイン）による蛍光測定を行った。
【００７５】
以下に示すｅ）、ｆ）、ｇ）及びｈ）の４種類の溶液をそれぞれ1 mLずつ （共溶媒としてDMF 0.2 %含む）調製した。
ｅ）ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 10 μM、HPF 10 μMを含むリン酸カリウム
緩衝液 (100 mM, pH = 7.5)
ｆ）ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 10 μM、HPF 10 μM、NAC（N-アセチルシ
ステイン）1mMを含むリン酸カリウム緩衝液 (100 mM, pH = 7.5)
ｇ）HPF 10 μMを含むリン酸カリウム緩衝液 (100 mM, pH = 7.5)
ｈ）HPF 10 μM、NAC 1mMを含むリン酸カリウム緩衝液(100 mM, pH = 7.5)
そして、それらの溶液をそれぞれ1 mLずつ (共溶媒としてDMF 0.2 %含む) を調製した。その溶液をキュベットに入れ、蛍光顕微鏡 (Olympus BX60/BX-FLA) のWUフィルター (λ = 330〜380 nm) をつけた100W 水銀ランプから、減光フィルターを付けずに、光照射を15分間行った。光照射をした溶液をHitachi F4500を用いて蛍光測定を行った。測定条件：励起波長 490 nm、測定波長 515 nm、励起スリット 2.5 nm、発光スリット 2.5 nm、光電子倍増管電圧 950 V
なお、上記溶液調製に用いたＨＰＦは、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）やパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）等の高反応性ＲＯＳと反応して強い蛍光を発する化合物となる（図９参照）。これにより高反応性ＲＯＳの存在が証明される。
また、ＮＡＣ（N-アセチルシステイン）は高反応性ＲＯＳの消去剤としての役割を有するものである。
【００７６】
上記ｅ）〜ｈ）の溶液について蛍光強度の測定を行った結果を図１０に示す。この図から、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ）及びＨＰＦを含む溶液ｅ）では、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ）を含みＨＰＦを含まない溶液ｇ）に比べて蛍光強度が著しく高く、溶液ｅ）では高反応性ＲＯＳが発生していることが分かった。さらには、高反応性ＲＯＳの消去剤であるＮＡＣを加えた溶液ｇ）や溶液ｈ）では、ＮＡＣを加えていない溶液ｅ）や溶液ｇ）と比べて、シグナル強度が小さかった。これは、ＮＡＣが高反応性ＲＯＳのスカベンジャーとして作用したからである。
【００７７】
（ニトロベンゼン誘導体(E)を用いたDNA鎖切断能の確認試験）
合成した実施例１のニトロベンゼン誘導体(E)についてのDNA鎖切断能について調べた。切断試験対象となるＤＮＡにはpBR322プラスミドを用いた。詳細について以下に示す。
【００７８】
以下に示す６種類の溶液をそれぞれ20 μLずつ調製した。
・ニトロベンゼン誘導体（Ｅ） 100 μM、pBR322プラスミドDNA 0.04 μg/mLを含むリン酸カリウム緩衝液 (10 mM、pH = 6.0、7.0、及び8.0)、
・プラスミドDNA 0.04 μg/mLを含むリン酸カリウム緩衝液 (10 mM、pH = 6.0、7.0、及び8.0)
また、比較のためにパーオキシナイトライトナトリウム塩溶液（株式会社同仁化学研究所製）を用いた、以下に示す６種類の溶液をそれぞれ20 μLずつ調製した。
・ONOO- 300 μM、pBR322プラスミドDNA 0.04 μg/mLを含むリン酸カリウム緩衝液 (10 mM、pH = 6.0、7.0及び8.0)
・プラスミドDNA 0.04 μg/mLを含むリン酸カリウム緩衝液 (10 mM、pH = 6.0、7.0、及び8.0)
上記各溶液に蛍光顕微鏡 (Olympus BX60/BX-FLA) のWUフィルター (λ = 330〜380 nm) をつけた100W 水銀ランプから、減光フィルターを付けずに、光照射を15分間行った。光照射した溶液にローディングバッファー 5 μLを加え、TBE緩衝液中 (89 mM, pH = 8.3) でアガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動は50 Vで30分、さらに100 Vで30分行った。電気泳動を行ったアガロースゲルを1 μg/mL臭化エチジウムで30分間染色し、TBE緩衝液(89 mM, pH = 8.3) で30分間洗浄した。そのゲルをUV照射下、観察した。
なお、ニトロベンゼン誘導体(E)を加えていない溶液に対しては、比較のため、光照射を行わない場合についても同様の操作を行った。
【００７９】
その結果図１２に示すように、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ）のバンドよりも上方に、別のバンドが検出されたのに対して、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ）を含まない溶液では、そのようなバンドはほとんど検出されなかった。また、パーオキシナイトライト溶液を含んだ溶液では、図１３に示すように、上記ニトロベンゼン誘導体（Ｅ）を含んだ溶液に光照射した場合と同様の位置にバンドが検出された。このことから、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ）のバンドよりも上方に検出されたバンドは、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）の発生によってプラスミドＤＮＡの1箇所が切断されたバンドであることか強く示唆された。
また、ニトロベンゼン誘導体（Ｅ）を含む溶液の光照射について、溶液のｐＨによる影響は、プラスミドＤＮＡの1箇所が切断されたバンドの蛍光強度はｐＨ６＞ｐＨ７＞ｐＨ８の順となり、低いpＨほどＤＮＡ切断能が高い傾向となった。これは、パーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）のＤＮＡ切断能依存性と同じであり、このことからもパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ―）の発生が示唆された。
【００８０】
この発明は、上記発明の実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明はＲＯＳの発生剤の研究用試薬、医薬品に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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