(57)【要約】  未だヒト生体内で存在が確認されていないヒトＳＡＡ３の抗体を作製してヒトＳＡＡ３の存在をヒト生体内で明らかにすると共に、ヒトＳＡＡ３と疾患との関連を明らかとし、その疾患の治療方法を提供することを目的とし、特に、ヒト血清アミロイドＡ３に対するヒト血清アミロイドＡ３抗体、前記抗体を用いたヒト血清アミロイドＡ３の検出・測定キット、癌治療剤、癌治療方法、診断方法等への利用を目的とする。
2011040133.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清アミロイドＡ３に対するヒト血清アミロイドＡ３抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体である請求項１記載のヒト血清アミロイドＡ３抗体。
【請求項３】
部分アミノ酸配列として、配列番号１で示されるヒト血清アミロイドＡ３のアミノ酸配列の４９〜６０番目を含むペプチドと生体高分子化合物とを結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取することにより得られたものである請求項１記載のヒト血清アミロイドＡ３抗体。
【請求項４】
生体高分子と結合させるペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３８〜６０番目のアミノ酸配列である請求項３記載のヒト血清アミロイドＡ３抗体。
【請求項５】
配列番号１で示されるヒト血清アミロイドＡ３のアミノ酸配列の４９〜６０番目からなるペプチドを認識するものである請求項１記載のヒト血清アミロイドＡ３抗体。
【請求項６】
配列番号１で示されるヒト血清アミロイドＡ３のアミノ酸配列の３８〜４８番目からなるペプチドを認識するものである請求項１記載のヒト血清アミロイドＡ３抗体。
【請求項７】
キメラ抗体である請求項１記載のヒト血清アミロイドＡ３抗体。
【請求項８】
ヒト化抗体である請求項１記載のヒト血清アミロイドＡ３抗体。
【請求項９】
完全ヒト抗体である請求項１記載のヒト血清アミロイドＡ３抗体。
【請求項１０】
抗体断片である請求項１記載のヒト血清アミロイドＡ３抗体。
【請求項１１】
部分アミノ酸配列として、配列番号１で示されるヒト血清アミロイドＡ３のアミノ酸配列の４８〜６０番目を含むペプチドと生体高分子化合物とを結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取することを特徴とするヒト血清アミロイドＡ３抗体の製造方法。
【請求項１２】
生体高分子化合物と結合させるペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３８〜６０番目のアミノ酸配列である請求項１１記載のヒト血清アミロイドＡ３抗体の製造方法。
【請求項１３】
ヒト検体に、ヒト血清アミロイドＡ３抗体を作用させ、ヒト検体中のヒト血清アミロイドＡ３を検出・測定することを特徴とするヒト血清アミロイドＡ３の検出・測定方法。
【請求項１４】
ヒト検体に、ヒト血清アミロイドＡ３抗体を作用させ、ヒト検体中のヒト血清アミロイドＡ３を検出・測定することを特徴とする癌診断方法。
【請求項１５】
癌の転移を含む癌の浸潤を診断するものである請求項１４記載の癌診断方法。
【請求項１６】
ヒト血清アミロイドＡ３抗体を含有することを特徴とするヒト血清アミロイドＡ３の検出・測定キット。
【請求項１７】
癌の診断用である請求項１６記載のヒト血清アミロイドＡ３の検出・測定キット。
【請求項１８】
癌の転移を含む癌の浸潤診断用である請求項１６記載のヒト血清アミロイドＡ３の検出・測定キット。
【請求項１９】
ヒト血清アミロイドＡ３抗体を有効成分として含有することを特徴とする癌治療剤。
【請求項２０】
癌の転移を含む癌の浸潤抑制用である請求項１９記載の癌治療剤。
【請求項２１】
癌患者に、ヒト血清アミロイドＡ３抗体を投与し、生体内のヒト血清アミロイドＡ３と前記抗体とを結合させることを特徴とする癌治療方法。
【請求項２２】
癌の転移を含む癌の浸潤を抑制するものである請求項２１記載の癌治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血清アミロイドＡ３抗体およびその利用に関し、更に詳細には、ヒト血清アミロイドＡ３抗体、前記抗体の製造方法、前記抗体を利用したヒト血清アミロイドＡ３の検出・測定方法、癌治療方法、癌診断方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）は、続発性アミロイドーシスで組織に沈着するアミロイドＡタンパクの血中の前駆体として知られている。【０００３】
このＳＡＡは、マウス、ウサギ、ウマ等においてＳＡＡ１、ＳＡＡ２、ＳＡＡ３およびＳＡＡ４という４種類のアイソタイプが知られている。【０００４】
これらＳＡＡのうち、ＳＡＡ１およびＳＡＡ２がインターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等の炎症性サイトカインに応答する急性相反応物質であり、ＳＡＡ４は高比重リポタンパク（ＨＤＬ）の構成タンパクである。【０００５】
一方、ＳＡＡ３はトール様受容体４（ＴＬＲ４）に認識され、核因子κＢ（ＮＦκＢ）を介した免疫応答シグナルを活性化する結果、癌の転移が促進されることが知られており、さらに、癌細胞を皮下移植した担癌マウスに抗ＳＡＡ３抗体を投与すると、この一連のシグナル経路（Ｓ１００Ａ８−ＳＡＡ３−ＴＬＲ４）が遮断され、癌の転移が抑制されることが確認されている。ＴＬＲ４は自然免疫系の受容体としてリポポリサッカライド（ＬＰＳ）などの毒素を認識し、感染からの防御を担っている。このことは、本来は感染防御を担う自然免疫系により形成された炎症様の環境が癌細胞の遊走を促進していることを示唆している（非特許文献１）。このようにマウスにおいては、ＳＡＡ３が癌の転移に関連することが示唆されている。【０００６】
ところで、ヒトのＳＡＡ３は、マウス等のＳＡＡ３のアミノ酸配列との相同性等から、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるものと推測されている（特許文献１）。しかしながら、現実的にはヒトＳＡＡ３の存在はｍＲＮＡレベルで確認されているだけであり、実際にヒト生体内でのタンパク発現は確認されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００６−５１６１９４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sachie  Hiratsuka,  Akira  Watanabe,  Yoshiko  Sakurai,  Sachiko  Akashi-Takamura,  Sachie  Ishibashi,  Kensuke  Miyake,  Masabumi  Shibuya,  Shizuo  Akira,  Hiroyuki  Aburatani  and  Yoshiro  Maru.  Nature  Cell  Bioll10  1349-1355(2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の課題は、未だヒト生体内で存在が確認されていないヒトＳＡＡ３の抗体を作製してヒトＳＡＡ３の存在をヒト生体内で明らかにすると共に、ヒトＳＡＡ３と疾患との関連を明らかとし、その疾患の治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記知見に基づき、常法に従い、大腸菌にヒトＳＡＡ３の組換えタンパクを発現させ、それを抗原として抗体を作製し、ヒト検体中からヒトＳＡＡ３を検出することにより、ヒトＳＡＡ３の存在を明らかにしようとした。しかしながら、ヒトＳＡＡ３の組換えタンパクは発現量がごく少量であり、これを抗原として免疫することはできなかった。また、本発明者らは、抗体作製の常法に従い、ヒトＳＡＡ３の特徴的なアミノ酸配列（配列番号１で示されるヒトＳＡＡ３のアミノ酸配列の４９〜６０番目）からなるペプチドと生体高分子との結合物を抗原とした場合には数ヶ月免疫をしても抗体価がほとんど上がらず満足できる抗体は得られなかった。【００１１】
そこで本発明者らはヒトＳＡＡ３の特徴的なアミノ酸配列よりも少し長いヒトＳＡＡ３の部分アミノ酸配列を含むペプチドと生体高分子との結合物を抗原とすることにより免疫をした動物の抗体産生能が高くなることを見出し、ヒトＳＡＡ３に対する抗体を初めて得た。【００１２】
そしてこのヒトＳＡＡ３抗体を用い、健常者と癌患者の検体でウエスタンブロットを行ったところ、癌患者のサンプルだけにヒトＳＡＡ３抗体との反応物が検出された。また、前記反応物のゲル上の位置が上記ヒトＳＡＡ３の組換えタンパクとヒトＳＡＡ３抗体との反応物と同位置であったことから、ヒト生体内にヒトＳＡＡ３が存在することが明らかとなった。【００１３】
このことから、ヒトＳＡＡ３が確かにヒト生体内に存在し、それをヒトＳＡＡ３に対する抗体で検出できることおよびヒトＳＡＡ３が癌と関連することを見出し、本発明を完成させた。【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
（１）ヒト血清アミロイドＡ３に対するヒト血清アミロイドＡ３抗体。
（２）部分アミノ酸配列として、配列番号１で示されるヒト血清アミロイドＡ３のアミノ酸配列の４８〜６０番目を含むペプチドと生体高分子化合物とを結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取することを特徴とするヒト血清アミロイドＡ３抗体の製造方法。
（３）ヒト検体に、ヒト血清アミロイドＡ３抗体を作用させ、ヒト検体中のヒト血清アミロイドＡ３を検出・測定することを特徴とするヒト血清アミロイドＡ３の検出・測定方法。
（４）ヒト検体に、ヒト血清アミロイドＡ３抗体を作用させ、ヒト検体中のヒト血清アミロイドＡ３を検出・測定することを特徴とする癌診断方法。
（５）ヒト血清アミロイドＡ３抗体を含有することを特徴とするヒト血清アミロイドＡ３の検出・測定キット。
（６）ヒト血清アミロイドＡ３抗体を有効成分として含有することを特徴とする癌治療剤。
（７）癌患者に、ヒト血清アミロイドＡ３抗体を投与し、生体内のヒト血清アミロイドＡ３と前記抗体とを結合させることを特徴とする癌治療方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のヒトＳＡＡ３抗体は、これまでヒトでは発現が確認されていなかったヒトＳＡＡ３に結合するため、ヒトＳＡＡ３がヒト成体内においてどのような役割を果たしているのかを研究するのに利用することができる。【００１６】
また、マウスＳＡＡ３が癌の転移に関連していることが示唆されていることから、本発明のヒトＳＡＡ３抗体は癌の転移抑制等の治療や診断等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１はヒトＳＡＡ３モノクローナル抗体（ｈ−ＳＡＡ３−３−１抗体）を用いたウエスタンブロット法による癌患者血清中のヒトＳＡＡ３の存在を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のヒトＳＡＡ３抗体は、ヒトＳＡＡ３に結合することができる抗体であれば特に制限されない。また、これらの抗体の作製方法も特に制限されず、例えば、ヒトＳＡＡ３を抗原とする以外は、抗体作製の常法（G.Kohler  and  C.Milstein,  Continuous  cultures  of  fused  cells  secreting  antibody  of  predefined  specificity,  Nature  256  495-497(1975).）に準じて作製することができる。
【００１９】
本発明においては、上記したヒトＳＡＡ３抗体の中でも、ヒトＳＡＡ３に特異的に結合するモノクローナル抗体が好ましい。ここで特異的とは、ヒトＳＡＡ３に反応し、ヒトＳＡＡ１、ヒトＳＡＡ２、ヒトＳＡＡ４に反応しないこと、好ましくはヒトＳＡＡ３のみに反応することをいう。
【００２０】
このようなヒトＳＡＡ３モノクローナル抗体は、例えば、部分アミノ酸配列として、配列番号１で示されるヒトＳＡＡ３のアミノ酸配列の４９〜６０番目を含むペプチドと生体高分子化合物とを結合させ、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取することにより得られる。
【００２１】
上記配列番号１で示されるヒトＳＡＡ３のアミノ酸配列の４９〜６０番目を含むペプチドとしては、例えば、配列番号１で示されるヒトＳＡＡ３のアミノ酸配列の１９〜６０番目からなるペプチド、より好ましくは３０〜６０番目のアミノ酸配列からなるペプチド、特に好ましくは３８〜６０番目のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。このようなペプチドを用いれば、配列番号１で示されるヒト血清アミロイドＡ３のアミノ酸配列の４９〜６０番目からなるペプチドや３８〜４８番目を認識するヒトＳＡＡ３モノクローナル抗体を得ることができる。また、これらのペプチドとしては大腸菌等に発現させたものでも合成ペプチドの何れでも良いが、糖鎖等の問題から合成ペプチドが好ましい。
【００２２】
上記ペプチドと結合される生体高分子化合物としては、例えば、牛血清アルブミン、スカシガイ由来ヘモシアニン、卵白アルブミン等が挙げられる。
【００２３】
上記ペプチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、カルボジイミド法、マレイミド法等の公知の結合方法で行うことができる。
【００２４】
上記のようにして得られる上記ペプチドと生体高分子化合物との結合物は生理食塩水等の溶媒に溶解後、ポリビニルピロリドンを添加して攪拌後、コンプリートフロイントアジュバントと混合し、アジュバントとする。
【００２５】
このアジュバントを常法に従って、ウサギ、マウス等の動物に皮下投与等で、１回ないし複数回、２〜３週間隔で投与し、数ヶ月間免疫する。免疫後に動物の抗体価が２５〜１０程度になったら免疫を終了する。
【００２６】
上記のようにして免疫を終了した動物から、常法に従って、血液を採取して、血清を分離し、抗体画分を精製すればヒトＳＡＡ３抗体を得ることができる。
【００２７】
また、常法に従い、前記結合物でマウスを免疫して得られた脾臓細胞と、ミエローマ細胞とを、ポリエチレングリコールで融合させてハイブリドーマを作製し、そのハイブリドーマをスクリーニングすることによってヒトＳＡＡ３モノクローナル抗体を得ることもできる。
【００２８】
このハイブリドーマを、ヒトＳＡＡ３やその部分ペプチドからなるペプチド等を用い、常法に従って、スクリーニングすればよい。スクリーニングに用いられる部分ペプチドとしては、ヒトＳＡＡ３に特異的な配列（配列番号１で示されるヒトＳＡＡ３のアミノ酸配列の４９〜６０番目）が挙げられる。
【００２９】
上記のようにして得られる、ヒトＳＡＡ３モノクローナル抗体のうち、特に配列番号１で示されるヒトＳＡＡ３のアミノ酸配列の４９〜６０番目からなるペプチドを認識するヒトＳＡＡ３モノクローナル抗体（以下、「ｈ−ＳＡＡ３−３−１抗体」という）を産生するハイブリドーマをｈ−ＳＡＡ３−３−１と名付けて２００９年８月２８日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６：郵便番号３０５−８５６６）に国際寄託（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１７６）した。
【００３０】
斯くして得られる本発明のヒトＳＡＡ３抗体は、ヒトＳＡＡ３に結合する。そのため、ヒトの血液、血清、尿、組織等のヒト検体に、本発明のヒトＳＡＡ３抗体を作用させることにより、ヒト検体中のヒトＳＡＡ３を検出・測定することができる。また、本発明のヒトＳＡＡ３抗体として特にｈ−ＳＡＡ３−３−１抗体を用いた場合には、ヒト検体中のヒトＳＡＡ３と特異的に結合するため、精度よい検出・測定ができる。
【００３１】
ヒト検体中のヒトＳＡＡ３を検出・測定する方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、凝集法等の通常の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法を用いることができる。これらの方法において本発明のヒトＳＡＡ３抗体とヒトＳＡＡ３の結合手段としては、直接吸着法、サンドイッチ法、競合法を利用できる。
【００３２】
具体的に、ヒト検体中のヒトＳＡＡ３を本発明のヒトＳＡＡ３抗体で検出・測定する方法を説明する。まず、常法に従い作製したヒトＳＡＡ３のポリクローナル（ウサギ等のポリクローナル抗体、マウス以外の抗体）抗体を、プレートまたはマイクロパーティクルに固相し、次いで、ヒト検体を固相のヒトＳＡＡ３抗体に反応させる。洗浄後、２次抗体であるヒトＳＡＡ３抗体を固相のヒトＳＡＡ３と反応させる。２次抗体にはＨＲＰ、ＡＬＰ、ＲＩ等を直接標識して用いるか、標識せずそのまま使用して、その後、更に、抗マウスＩｇＧ等の３次抗体をＨＲＰ、ＡＬＰ、ＲＩ等で標識して測定する。測定方法はそれぞれの感度によりＲＩ法、発色法、蛍光法、発光法、金コロイド法等を適宜選択すればよい。
【００３３】
また、上記検出・測定ができるように、本発明のヒトＳＡＡ３抗体をプレートまたはマイクロパーティクル等に常法に従って、標識化、固相化等することによりヒトＳＡＡ３の検出・測定キットとすることができる。
【００３４】
具体的なヒトＳＡＡ３の検出・測定キットとしては、抗体固相プレートまたはマイクロパーティクル、洗浄用容液、本発明のヒトＳＡＡ３抗体、抗マウスＩｇＧ標識抗体、発色剤、反応停止液を含有するものが挙げられる。
【００３５】
これらヒトＳＡＡ３を検出・測定方法やキットを利用することにより、ヒト検体中のヒトＳＡＡ３濃度を０.１〜１０ｎｇ／ｍＬの感度で検出・測定することができる。
【００３６】
更に、ヒトＳＡＡ３の発現が癌患者、特に脳、肝、肺等に転移した癌患者特有であったことから、上記ヒトＳＡＡ３の検出・測定方法やキットで、ヒト検体中のヒトＳＡＡ３を検出・測定することにより、癌や癌の転移の診断をすることができる。
【００３７】
具体的に癌の診断は、健常者（癌と診断されていない癌患者を含む）の血清、尿等のヒト検体中に、ヒトＳＡＡ３が検出されることより行われる。また、癌の転移の診断も、癌患者の血清、尿等のヒト検体中に、ヒトＳＡＡ３が検出されることにより行われる。なお、癌が肺に転移した癌患者のヒトＳＡＡ３濃度は、癌が肺以外の部位に転移した癌患者よりもかなり高くなっていた。そのため、癌患者のヒトＳＡＡ３濃度を上記ヒトＳＡＡ３の検出・測定方法やキットで定期的にモニターしておき、その濃度が高くなってきたとき、癌の肺への転移の予兆があるまたは癌が肺に転移したと診断することができる。
【００３８】
また更に、マウスＳＡＡ３抗体が癌の転移を抑制することが知られている（非特許文献１）。そのため、本発明のヒトＳＡＡ３抗体も、癌患者に投与し、血液、血清、組織等の生体内のヒトＳＡＡ３と前記抗体と結合させることにより、ヒトＳＡＡ３のＴＬＲ４に対する効果を阻害することができるため、ヒトの癌の転移を含む癌の浸潤抑制剤等の癌治療剤や癌治療方法に用いることができる。ここで癌の転移を含む癌の浸潤とは、癌自体の周辺組織への拡がり、癌の転移、癌の転移が既に見つかっている場合に次から次へと起きる癌の転移の進行をいう。なお、上記したように、癌が肺に転移した癌患者のヒトＳＡＡ３濃度は、癌が肺以外の部位に転移した癌患者よりもかなり高くなることから、本発明のヒトＳＡＡ３抗体は特に癌の肺への転移を抑制することができる。
【００３９】
上記した癌治療剤や治療方法に用いる本発明のヒトＳＡＡ３抗体として特にｈ−ＳＡＡ３−３−１抗体を用いた場合には、ヒト検体中またはヒト生体内のヒトＳＡＡ３と特異的に結合するため、効率のよい癌治療剤や治療方法を提供できる。
【００４０】
本発明のヒトＳＡＡ３抗体を、ヒトの癌の転移を含む癌の浸潤抑制等の癌の治療剤に用いる場合には、上記のようにしてヒト以外の動物から得られる抗体を遺伝子工学的に改変してキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体およびそれらの抗体断片として用いることが好ましい。
【００４１】
ここでキメラ抗体とは、上記動物の抗体の定常領域をヒトの抗体の定常領域に代えたものである。このキメラ抗体は、例えば、コー等の文献（Co  MS  and  Queen  C,  Humanized  antibodies  for  therapy,  Nature  351.501(1991)）に記載の方法に基づいて作製することができる。
【００４２】
また、ヒト化抗体とは、上記動物の抗体のヒトＳＡＡ３の結合領域をヒトの抗体の結合領域に代えたものである。このヒト化抗体は、例えば、ライヒマン等の文献（L.  Riechmann,  M.  Clark,  H.  Waldmann,  G.  Winter,  Reshaping  human  antibodies  for  therapy.  Nature  332.  323(1998)）に記載の方法に基づいて作製することができる。
【００４３】
更に、完全ヒト抗体とは、ヒトが産生する抗体と同様の抗体である。この完全ヒト抗体は、例えば、グリーン等の文献（Green  LL,  Hardy  MC,  Maynard-Currie  CE  et  al,  Antigen-specific  human  monoclonal  antibodies  from  mice  engineered  with  human  Ig  heavy  and  light  chain  YACs,  Nature  Genetics  7.  13(1994)）に記載の方法に基づいて作製することができる。
【００４４】
また更に、抗体断片とは、上記抗体を酵素等で断片化したものであり、例えば、Ｆｖ、ＦａｂやＦ（ａｂ'）２等のヒトＳＡＡ３の結合領域は保持したものが挙げられる。
【００４５】
なお、上記したキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体およびそれらの抗体断片については、各種会社より受託サービスが提供されているのでこちらを利用することもできる。
【００４６】
上記の各種抗体は、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化すればよい。この癌治療剤の剤形としては、注射剤等の非経口の剤形が挙げられる。この癌治療剤は、静脈内投与等で投与することが好ましい。製剤化にあたっては、上記剤形に適した公知の医薬用の担体、添加剤等を用いることができる。
【００４７】
上記癌治療剤として本発明のヒトＳＡＡ３抗体を用いる場合に、その投与量は癌患者の癌の種類、年齢、体格、性別等や、抗体の性質等により一概にはいえないが、本発明のヒトＳＡＡ３抗体、例えば、１日あたり５〜１００ｍｇ／ヒト、好ましくは２〜１０ｍｇ／ヒトである。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明をするが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００４９】
実  施  例  １
ヒトＳＡＡ３モノクローナル抗体の作製：
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒトＳＡＡ３の３８〜６０番目の合成ペプチド（オペロン社より入手）（以下、このペプチドを「２３−ＳＡＡ３」という）にキャリアタンパクとして卵白アルブミン（ＯＶＡ）をＥＭＣＳ（マレイミド法）によりコンジュゲーションして、ＯＶＡ合成ペプチドを得た。【００５０】
このＯＶＡ合成ペプチド２ｍｇを０.３ｍｌの生理食塩水に溶解後、５０％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）０.６ｍｌを加え、攪拌後、コンプリートフロイントアジュバント１.１ｍｌを加え、オムニミキサー（OmniMixer：５０,０００回転）で軟膏状のアジュバントを得た（A.  Arimura,  H.  Sato,  T.  Kumasaka,  et  al.,  Production  of  Antiserum  to  LH-RH-Releasing  Hormone(LH-RH)Associated  with  Conadal  Atrophy  in  Rabbits:  Development  of  Radio-immunoassays  for  LH-RH,  Endocrinology.  93  1092(1973)）。【００５１】
上記で得られたアジュバントを、マウス（３匹）に０.２ｍｌずつ皮下投与した。投与は１、３および５週目と行い、３回投与後にマウスの尾より少量採血し、抗体価の測定を行った。抗体価の上昇がみられたマウスを再び免疫し（ブースター）、免疫後３日で脾臓を摘出した。摘出した脾臓細胞とミエローマ細胞（P3X63Ag8・U1(P3U1)）とをポリエチレングリコールで融合させた。その後、ＨＡＴ培地２００ｍｌに細胞を分散し、９６ウェルマイクロプレート１０枚にそれぞれ１００μｌずつ分注した。融合後、１０および１５日目に２３−ＳＡＡ３固相によるＥＬＩＳＡ法によってアッセイを行った。【００５２】
その結果、２３−ＳＡＡ３に明らかな陽性であったものは１５個であった。そのハイブリドーマ細胞を２４ウェルプレートにそれぞれ移し、２回目のアッセイを行った。最終的に強い抗体価を示す５個の細胞を選抜した。【００５３】
次に、これら５個のハイブリドーマ細胞をメチルセルロース培地下でリクローニングし、モノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞を得た。【００５４】
上記で得た５個のハイブリドーマ細胞をＲＰＭＩ１６４０培地ＦＣＳ１０％加で培養してヒトＳＡＡ３モノクローナル抗体を５種産生させた。固相（マイクロプレート１０ｎｇ／ｗｅｌｌ）に２３−ＳＡＡ３、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒトＳＡＡ３の４９〜６０番目の合成ペプチド（オペロン社より入手）（以下、このペプチドを「１２−ＳＡＡ３」という）、マウスＳＡＡ１の合成ペプチド（以下、このペプチドを「合成ペプチド」という）を結合させたものを用いて５種のヒトＳＡＡ３モノクローナル抗体の反応性を調べた。固相のブロッキングには、ＴＢＳ−Ｔ（１０％ＨＳ含有）溶液で行い、二次抗体の希釈はＴＢＳ−Ｔ（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）溶液で行った。また、陽性コントロールとしては、マウス血清を５０倍に希釈したものを用いた。更に、測定装置としてはサーモフィッシャー社マルチスキャンＪＸを用いた。これらの結果を表１に示した。また、これらの抗体のサブクラスを  マウスモノクローナルアイソタイピングテストキット（HyCult  biotechnology）で決定した。この結果を表２に示した。【００５５】
【表１】
2011040133.tif 000003
【００５６】
【表２】
2011040133.tif 000004
【００５７】
この結果より、抗体Ｎｏ.１、３、６および７は、ヒトＳＡＡ３のＮ末端領域の１２−ＳＡＡ３を特異的に認識するモノクローナル抗体であることがわかった。一方、抗体Ｎｏ.９は１２−ＳＡＡ３を認識せずに２３−ＳＡＡ３を認識することから、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒトＳＡＡ３の３８〜４８番目を特異的に認識するモノクローナル抗体であることがわかった。また、全ての抗体のサブクラスがＩｇＧであることがわかった。【００５８】
比  較  例  １
ヒトＳＡＡ３モノクローナル抗体の作製：
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒトＳＡＡ３の４９〜６０番目の合成ペプチド（オペロン社より入手）（以下、このペプチドを「１２−ＳＡＡ３」という）にキャリアタンパクとして卵白アルブミン（ＯＶＡ）をＥＭＣＳ（マレイミド法）によりコンジュゲーションして、ＯＶＡ合成ペプチドを得た。このＯＶＡ合成ペプチド２ｍｇを０.３ｍｌの生理食塩水に溶解後、５０％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）０.６ｍｌを加え、攪拌後、コンプリートフロイントアジュバント１.１ｍｌを加え、オムニミキサー（OmniMixer：５０,０００回転）で軟膏状のアジュバントを得た。上記で得られたアジュバントを、マウス（３匹）に０.２ｍｌずつ皮下投与した。投与は２〜３週間の間隔で６〜８ヶ月にわたり行ったが、わずかな抗体価の上昇がみられただけであった。また数種類のアジュバントTiterMax  Gold  (CytRx  Corporation)等に変えてみたが効果は見られなかった。長期間にわたる免疫感作のため、細胞融合時には脾臓に繊維化がみられ、良好な細胞が少なく陽性のハイブリドーマを得ることができなかった。【００５９】
比  較  例  ２
大腸菌を用いたヒト血清アミロイドＡ３の発現：
ヒト血清アミロイドＡ３の遺伝子配列（アクセッションナンバー：AY209188）をクローニングしてベクターｐＧＥＸ４Ｔ−１に組み込み、大腸菌で発現させた。この大腸菌をＬＢ培地で培養した。この大腸菌からヒトＳＡＡ３を精製したところ、１ｍｇというごく少量のタンパクしか得られなかった。比較例１に述べた手順でアジュバントを作り２回投与したが、抗体はできず、効率の悪さから実験を中止した。【００６０】
実  施  例  ２
ヒト血清中のヒトＳＡＡ３の検出：
実施例１で得られた抗体Ｎｏ.９のヒトＳＡＡ３モノクローナル抗体（ｈ−ＳＡＡ３−３−１抗体）と、以下のサンプルを用いて常法に従ってウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロットによる検出はＥＣＬ  ＰＬＵＳの発光法で行った。その結果を図１に示した。【００６１】
＜サンプル＞
健常者の血清：Ｂ３−２、４−２、Ｙ８−２
癌患者の血清：１５１−２＊１、１６７−２＊２、１６９−２＊３
＊１血清採取時には癌が脳へ転移していた胃癌患者
＊２血清採取時には癌が肝臓へ転移していた大腸癌患者
＊３血清採取時には癌が肺へ転移していた胃癌患者
発現タンパク（陽性コントロール）：ＳＡＡ１、ＳＡＡ２、ＳＡＡ３＊４、ＳＡＡ４
＊４比較例２で得られたもの【００６２】
ウエスタンブロットの結果より、癌患者の３サンプルにヒトＳＡＡ３の存在が確認された。また、癌が肺へ転移していた胃癌患者のサンプル（１６９−２）のヒトＳＡＡ３濃度はかなり高かった。このことから、ヒトＳＡＡ３は、肺転移が見られる癌患者においては高濃度に発現することがみられ、また（脳や肝）に転移した例ではヒトＳＡＡ３の発現が低濃度であったことから、肺転移にはヒトＳＡＡ３濃度が関係することがわかった。【００６３】
実  施  例  ３
ヒトＳＡＡ３検出・測定キット：
マイクロプレートのウェルに実施例１で得られた抗体Ｎｏ.１、３、６または７のモノクローナル抗体を固相し、ブロッキング−洗浄した。また、実施例１で得られたｈ−ＳＡＡ３−３−１抗体をＦａｂ処理後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。前記マイクロプレートおよびＨＲＰ標識抗体と、ＨＲＰの発色基質である３,３',５,５'−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）とを組み合わせてヒトＳＡＡ３検出・測定キットを作製した。【００６４】
上記で作製したヒトＳＡＡ３検出・測定キットのマイクロプレートのウェルに、リコンビナントＳＡＡ３または血清（ヒト検体）を加え、室温で１時間反応させる。ウェルを洗浄後、４μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ｈ−ＳＡＡ３−３−１抗体を加え、室温で１時間反応させる。ウェルを洗浄後、ＴＭＢを加え、室温で３０分間酵素反応を行い、反応停止後、Ａｂｓ４５０を測定する。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明のヒトＳＡＡ３抗体は、ヒトＳＡＡ３に結合するため、ヒトＳＡＡ３がヒト生体内においてどのような役割を果たしているのかを研究するのに利用することができる。【００６６】
また、マウスＳＡＡ３が癌に関連していることが示唆されていることから、本発明のヒトＳＡＡ３抗体は癌の治療や診断等に利用することができる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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