(57)【要約】  遺伝子の発現を抑制可能な新たな核酸分子であって、容易かつ効率良く製造することが可能な核酸分子を提供する。  標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域および前記３’側領域の少なくともいずれかが、前記発現抑制配列を含むことを特徴とする分子とする。この一本鎖核酸分子によれば、前記標的遺伝子の発現を抑制できる。
2012005368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことを特徴とする一本鎖核酸分子。
【請求項２】
前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とが連結している、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３】
前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが連結している、請求項１または２記載の一本鎖核酸分子。
【請求項４】
前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とが連結し、
前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが連結している、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項５】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記式（１）および（２）の条件を満たす、請求項１から４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ      ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【請求項６】
前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす、請求項１から５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
【請求項７】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差が、下記条件を満たす、請求項６記載の一本鎖核酸分子。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１、２または３  ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１、２または３  ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１８）
【請求項８】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）が、１９塩基以上である、請求項１から７のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項９】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）が、１９塩基〜３０塩基である、請求項８記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１０】
前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜１１塩基である、請求項１から９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１１】
前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜７塩基である、請求項１０記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１２】
前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜３塩基である、請求項１０記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１３】
前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜１１塩基である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１４】
前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜７塩基である、請求項１３記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１５】
前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜３塩基である、請求項１３記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１６】
少なくとも１つの修飾された残基を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１７】
標識物質を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１８】
安定同位体を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１９】
ＲＮＡ分子である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２０】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）が、
ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基の少なくとも一つから構成される、請求項２から１９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２１】
前記ヌクレオチド残基が、非修飾ヌクレオチド残基および／または修飾ヌクレオチド残基である、請求項２０記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２２】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）が、下記（１）〜（７）のいずれかの残基で構成される、請求項２０または２１記載の一本鎖核酸分子。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【請求項２３】
前記一本鎖核酸分子において、塩基数の合計が、５０塩基以上である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２４】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２５】
前記一本鎖核酸分子の塩基配列が、
配列番号２、７、８、１３、１４、２９−３５、３７、４３、４４、４７、４８および５１−８０のいずれかの塩基配列である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２６】
標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１から２５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。
【請求項２７】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項２８】
炎症治療用である、請求項２７記載の薬学組成物。
【請求項２９】
標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から２５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項３０】
前記一本鎖核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項２９記載の発現抑制方法。
【請求項３１】
前記一本鎖核酸分子を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与する、請求項３０記載の発現抑制方法。
【請求項３２】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項３３】
標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、
請求項１から２５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現誘導方法。
【請求項３４】
疾患の治療方法であって、
請求項１から２５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を、患者に投与する工程を含み、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする治療方法。
【請求項３５】
標的遺伝子の発現抑制のための、請求項１から２５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
【請求項３６】
ＲＮＡ干渉の誘導のための、請求項１から２５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
【請求項３７】
疾患の治療に使用するための核酸分子であって、
前記核酸分子は、請求項１から２５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子であり、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現を抑制する一本鎖核酸分子、それを含む組成物およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている（非特許文献１）。ＲＮＡ干渉による遺伝子の発現抑制は、例えば、短い二本鎖のＲＮＡ分子を、細胞等に投与することによって、実施されるのが一般的である。前記二本鎖のＲＮＡ分子は、通常、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる。この他に、環状のＲＮＡ分子であり、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成したＲＮＡ分子によっても、遺伝子の発現が抑制できることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、これらの手法では、遺伝子の発現抑制を誘導するＲＮＡ分子は、以下のような問題がある。【０００３】
まず、前記ｓｉＲＮＡを製造する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖を別々に合成した上で、最後にこれらの鎖をハイブリダイズする工程が必要である。このため、製造効率が悪いという問題がある。また、前記ｓｉＲＮＡを細胞に投与する際、一本鎖ＲＮＡへの解離を抑制した状態で、細胞に投与する必要があるため、その取り扱い条件の設定にも労力を要する。つぎに、環状のＲＮＡ分子の場合、その合成が困難という問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２７８７８４
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ファイアら（Ｆｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  第３９１巻、ｐ．８０６−８１１、１９９８年
【発明の概要】
【０００６】
そこで、本発明は、遺伝子の発現を抑制可能な新たな核酸分子であって、容易かつ効率良く製造することが可能な核酸分子の提供することを目的とする。
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の一本鎖核酸分子は、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明の組成物は、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の組成物は、薬学的組成物であって、前記本発明の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の発現抑制方法は、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする。
【００１１】
本発明の疾患の治療方法は、前記本発明の一本鎖核酸分子を、患者に投与する工程を含み、前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。
【００１２】
本発明の一本鎖核酸分子によれば、遺伝子の発現抑制が可能であり、かつ、環状ではないため、その合成が容易であり、また、一本鎖であるため、二本鎖のアニール工程が無く、効率良く製造可能である。
【００１３】
なお、本発明の一本鎖核酸分子の構造が、遺伝子の発現を抑制可能であることを見出したのは、本発明者が初めてである。本発明の一本鎖核酸分子の遺伝子の発現抑制効果は、ＲＮＡ干渉と同様の現象によるものと推測されるが、本発明における遺伝子発現抑制は、ＲＮＡ干渉に制限および限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の一本鎖核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例におけるＡ５４９細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例における２９３細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例における各投与群における単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１遺伝子発現量を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例における各投与群におけるＢＡＦＬサンプル中の細胞数を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例における各投与群におけるＢＡＬＦサンプル中の好中球の細胞数を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例におけるＢＡＬＦサンプル中の細胞のギムザ染色の結果を示す写真であり、（Ａ）は、ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４の結果であり、（Ｂ）は、ＬＰＳ（＋）／ネガティブコントロールＮＫ−００３５（＋）の投与群６の結果であり、（Ｃ）は、ＬＰＳ（＋）／ＮＫ−００３３（＋）の実施例投与群５の結果を示す。
【図１３】図１３は、本発明の実施例における肺組織のＨＥ染色の結果を示す写真であり、（Ａ）は、ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４の結果であり、（Ｂ）は、ＬＰＳ（＋）／ネガティブコントロールＮＫ−００３５（＋）の投与群６の結果であり、（Ｃ）は、ＬＰＳ（＋）／ＮＫ−００３３（＋）の実施例投与群５の結果を示す。
【図１４】図１４（Ａ）は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子の発現量を示す結果であり、図１４（Ｂ）は、本発明の実施例におけるＩＦＮ−α遺伝子の発現量を示す結果であり、図１４（Ｃ）は、本発明の実施例におけるＩＦＮ−β遺伝子の発現量を示す結果である。
【図１５】図１５は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１７】図１７は、本発明の実施例における各投与群における単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１発現量を示すグラフである。
【図１８】図１８（Ａ）は、本発明の実施例における各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＴＮＦ−α量を示すグラフであり、図１８（Ｂ）は、本発明の実施例における各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＩＦＮ−β量を示すグラフである。
【図１９】図１９は、本発明の実施例における２９３細胞のＬＡＭＡ遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図２０】図２０は、本発明の実施例におけるＡ５４９細胞のＬＭＮＡ遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図２１】図２１は、本発明の実施例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図２２】図２２は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図２３】図２３は、本発明の実施例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図２４】図２４は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図２５】図２５は、本発明の実施例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図２６】図２６は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図２７】図２７は、本発明の実施例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図２８】図２８は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図２９】図２９は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図３０】図３０は、本発明の実施例におけるＨＣＴ１１６細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図３１】図３１は、本発明の実施例におけるリボヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。
【図３２】図３２は、本発明の実施例におけるＳ７ヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１６】
１．ｓｓＮｃ分子
本発明の一本鎖核酸分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明において、「標的遺伝子の発現抑制」は、例えば、前記標的遺伝子の発現を阻害することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングでもよい。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質があげられる。
【００１８】
本発明の一本鎖核酸分子は、以下、本発明の「ｓｓＮｃ分子」ともいう。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現抑制に使用できることから、「標的遺伝子の発現抑制用ｓｓＮｃ分子」または「標的遺伝子の発現抑制剤」ともいう。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉により、前記標的遺伝子の発現を抑制できることから、「ＲＮＡ干渉用ｓｓＮｃ分子」、「ＲＮＡ干渉誘導分子」、「ＲＮＡ干渉剤」または「ＲＮＡ干渉誘導剤」ともいう。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、インターフェロン誘導等の副作用を抑制できる。
【００１９】
本発明のｓｓＮｃ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）において、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が、直接的に連結されている。
【００２０】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的である。このため、５’側において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能であり、また、３’側において、前記領域（Ｙｃ）が前記領域（Ｙ）に向かって折り返し、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。本発明のｓｓＮｃ分子は、このように、分子内で二重鎖を形成可能であり、例えば、従来のＲＮＡ干渉に使用するｓｉＲＮＡのように、分離した２本の一本鎖ＲＮＡがアニーリングによって二本鎖ＲＮＡを形成するものとは、明らかに異なる構造である。
【００２１】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、前記標的遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。前記発現抑制配列は、特に制限されず、目的の標的遺伝子の種類に応じて、適宜設定できる。前記発現抑制配列は、例えば、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉に関与する配列を適宜適用できる。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９〜２１塩基対程度の二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、前記ｍＲＮＡを分解することにより、前記ｍＲＮＡの翻訳を抑制する現象である。前記標的ｍＲＮＡに結合する前記ｓｉＲＮＡにおける一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡの配列を、前記発現抑制配列として使用できる。
【００２２】
なお、本発明は、前記標的遺伝子に対する前記発現抑制配列の配列情報がポイントではなく、前記発現抑制配列による前記標的遺伝子の発現抑制活性を、例えば、細胞内で機能させるための核酸分子の構造に関する。したがって、本発明においては、例えば、出願時において公知となっている前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡ配列の他、将来的に明らかとなる配列に関しても、前記発現抑制配列として利用できる。
【００２３】
前記発現抑制配列は、例えば、前記標的遺伝子の所定領域に対して、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。このような相補性を満たすことにより、例えば、オフターゲットを十分に軽減できる。
【００２４】
具体例として、標的遺伝子がＧＡＰＤＨ遺伝子の場合、前記発現抑制配列は、例えば、配列番号１に示す１９塩基長の配列が使用でき、標的遺伝子がＴＧＦ−β１の場合、前記発現抑制配列は、例えば、配列番号１６に示す２１塩基長の配列が使用でき、標的遺伝子がＬＡＭＡ１遺伝子の場合、前記発現抑制配列は、例えば、配列番号５に示す１９塩基長の配列が使用でき、標的遺伝子がＬＭＮＡ遺伝子の場合、例えば、配列番号６に示す１９塩基長の配列が使用できる。
5’-ＧＵＵＧＵＣＡＵＡＣＵＵＣＵＣＡＵＧＧ-3’（配列番号１）
5’-ＡＡＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＵＵ-3’（配列番号１６）
5’-ＡＵＵＧＵＡＡＣＧＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣ-3’（配列番号５）
5’-ＵＵＧＣＧＣＵＵＵＵＵＧＧＵＧＡＣＧＣ-3’（配列番号６）
【００２５】
本発明のｓｓＮｃ分子による前記標的遺伝子の発現の抑制は、例えば、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つに前記発現抑制配列を配置した構造をとることで、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡ干渉に類似する現象（ＲＮＡ干渉様の現象）が生じることによると推測される。なお、本発明は、このメカニズムにより限定されない。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本鎖の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、前記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。このため、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉様の機能を有するということもできる。
【００２６】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記発現抑制配列は、前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つに含まれる。本発明のｓｓＮｃ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００２７】
後者の場合、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、同じ標的遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。本発明のｓｓＮｃ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。本発明のｓｓＮｃ分子が、異なる標的遺伝子に対する前記発現抑制配列を２つ以上有する場合、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子によって、２種類以上の異なる標的遺伝子の発現を抑制可能である。
【００２８】
前記内部領域（Ｚ）は、前述のように、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｘｃ）との配列関係を示すために、「前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成される」と表わすものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記３’側領域（Ｘｃ）とが、例えば、前記ｓｓＮｃ分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【００２９】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前記内部５’側領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、具体的には、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前記内部３’側領域（Ｙ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を有していればよく、具体的には、例えば、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００３０】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが連結している形態があげられる。
【００３１】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態があげられる。
【００３２】
本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有してもよいし、いずれか一方を有してもよい。後者の場合、例えば、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有さない、つまり、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが直接連結された形態があげられる。また、後者の場合、例えば、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有さない、つまり、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが直接連結された形態があげられる。
【００３３】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、それぞれ、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【００３４】
本発明のｓｓＮｃ分子について、前記リンカー領域を有さないｓｓＮｃ分子の一例を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）は、前記ｓｓＮｃ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図１（Ｂ）は、前記ｓｓＮｃ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図１（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＮｃ分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）が折り返し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間で二重鎖が形成され、前記３’側領域（Ｙｃ）が折り返し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間で二重鎖が形成される。図１は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
【００３５】
本発明のｓｓＮｃ分子について、前記リンカー領域を有するｓｓＮｃ分子の一例を、図２の模式図に示す。図２（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＮｃ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、前記ｓｓＮｃ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図２（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＮｃ分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域および前記Ｌｙ領域が、ループ構造をとる。図２は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
【００３６】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）、前記内部５’側領域（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されず、例えば、以下の通りである。本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。
【００３７】
前記５’側領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００３８】
また、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、５’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【００３９】
前記３’側領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００４０】
また、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補であることが好ましい。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、３’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【００４１】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記式（１）および（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ      ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【００４２】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の長さの関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たしてもよい。
Ｘ＝Ｙ  ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ  ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ  ・・・（２１）
【００４３】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
【００４４】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３      ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３      ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２          ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２          ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１８）
【００４５】
前記（ａ）〜（ｄ）のｓｓＮｃ分子について、それぞれの構造の一例を、図３の模式図に示す。図３は、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を含むｓｓＮｃであり、（Ａ）は、前記（ａ）のｓｓＮｃ分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）のｓｓＮｃ分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）のｓｓＮｃ分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）のｓｓＮｃ分子の例である。図３において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図３のｓｓＮｃ分子は、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」として表わすが、これには制限されず、前述のように、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図３は、あくまでも、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）との関係、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状等は、これには制限されず、また、リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）の有無も、これには制限されない。
【００４６】
前記（ａ）〜（ｃ）のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）、および、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントできない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントできない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図３において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【００４７】
他方、前記(ｄ)のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）のｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の５’末端と前記３’側領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【００４８】
本発明のｓｓＮｃ分子について、各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。本発明において、例えば、塩基数の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００４９】
前記５’側領域（Ｘｃ）、前記３’側領域（Ｙｃ）、および前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数（Ｆ）およびその位置に応じて、適宜決定できる。
【００５０】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または、３０塩基である。
【００５１】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基である。
【００５２】
前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００５３】
前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記５’側領域（Ｘｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００５４】
前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００５５】
前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記３’側領域（Ｙｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００５６】
前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、または、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２または３である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基の領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【００５７】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位が塩基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）のそれぞれの塩基数は、同じであっても異なってもよく、また、その塩基配列も、同じであっても異なってもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【００５８】
本発明のｓｓＮｃ分子の全長は、特に制限されない。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【００５９】
本発明のｓｓＮｃ分子の構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基の詳細は、後述する。
【００６０】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【００６１】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【００６２】
本発明のｓｓＮｃ分子が、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有する場合、例えば、両方の構成単位が同じでもよいし、異なってもよい。具体例として、例えば、両方のリンカー領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基である形態、両方のリンカー領域の構成単位が前記非ヌクレオチド残基である形態、一方の領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基であり、他方のリンカー領域の構成単位が非ヌクレオチド残基である形態等があげられる。
【００６３】
本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基および前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記ｓｓＮｃ分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明のｓｓＮｃ分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜８個、１〜６個、１〜４個、１、２または３個である。
【００６４】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。この場合、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、「ＲＮＡ分子」または「ｓｓＲＮＡ分子」ともいう。前記ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基および前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
【００６５】
前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【００６６】
本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
【００６７】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前述のように、前記標的遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明のｓｓＮｃ分子が、例えば、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を含む場合、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【００６８】
本発明のｓｓＮｃ分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＮｃ分子を投与すればよい。
【００６９】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【００７０】
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定できる。そして、前述のように、前記標的遺伝子の種類に応じて、前記発現抑制配列を適宜設計すればよい。
【００７１】
本発明のｓｓＮｃ分子の具体例を以下に示すが、本発明は、これには何ら制限されない。前記ｓｓＮｃ分子の塩基配列は、例えば、配列番号２、７、８、１３、１４、２９−３５、３７、４３、４４、４７、４８および５１−８０の塩基配列が例示でき、また、前記塩基配列において、例えば、１もしくは数個の欠失、置換および／または付加された塩基配列でもよい。前記標的遺伝子がＧＡＰＤＨ遺伝子の場合、例えば、配列番号２、７、８、１３、３７および５１−８０の塩基配列があげられ、標的遺伝子がＴＧＦ−β１の場合、例えば、配列番号１４および２９−３５の塩基配列があげられ、前記標的遺伝子がＬＡＭＡ１遺伝子の場合、例えば、配列番号４３および４４の塩基配列があげられ、前記標的遺伝子がＬＭＮＡ遺伝子の場合、例えば、配列番号４７および４８の塩基配列があげられる。
【００７２】
本発明のｓｓＮｃ分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
【００７３】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【００７４】
２．ヌクレオチド残基
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
【００７５】
前記ヌクレオチド残基は、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【００７６】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい
【００７７】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾があげられる。
【００７８】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等のハロゲンに置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【００７９】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【００８０】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も隣接するリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合酸素における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【００８１】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【００８２】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換でき。前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子の５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【００８３】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【００８４】
本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【００８５】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子の検出等に利用できる。
【００８６】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【００８７】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３または６が好ましい。
【００８８】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【００８９】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【００９０】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【００９１】
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ  ジェー  アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【００９２】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【００９３】
３．非ヌクレオチド残基
前記非ヌクレオチド残基は、特に制限されない。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記非ヌクレオチド残基として、ピロリジン骨格またはピペリジン骨格を含む非ヌクレオチド構造を有してもよい。前記非ヌクレオチド残基は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の少なくとも一方に有することが好ましい。前記非ヌクレオチド残基は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）に有してもよいし、前記リンカー領域（Ｌｙ）に有してもよいし、両方の前記リンカー領域に有してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。
【００９４】
前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素、または硫黄で置換されてもよい。前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合、または、炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素基が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記５員環のいずれか一個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記５員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。前記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられる。前記プロリン骨格およびプロリノール骨格等は、例えば、生体内物質およびその還元体であるため、安全性にも優れる。
【００９５】
前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素、または硫黄で置換されてもよい。前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合、または、炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素基が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピペリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記６員環のいずれか一個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記６員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。前記リンカー領域（Ｌｙ）についても同様である。
【００９６】
前記リンカー領域は、例えば、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とを含んでもよい。
【００９７】
前記リンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
【化１】
2012005368.tif 000003
【００９８】
前記式（Ｉ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
前記置換基は、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）であり；
Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよく；
Ｒ４およびＲ５は、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよく；
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨもしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、または硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合、または、炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）が前記式（１）で表わされる場合、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合する。また、前記リンカー領域（Ｌｙ）が前記式（１）で表わされる場合、前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
【００９９】
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【０１００】
前記式（Ｉ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
【０１０１】
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【０１０２】
前記式（Ｉ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。前記置換基は、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。Ｒ４およびＲ５は、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。
【０１０３】
前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。
【０１０４】
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J．  F．  W．  McOmie，  「Protecting  Groups  in  Organic  Chemistry」Prenum  Press，  London  and  New  York，  1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル（ＡＣＥ）基、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）基、１−（２−シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基およびトリルスルフォニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、後述するシリル含有基等もあげられる。以下、同様である。
【０１０５】
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨもしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【０１０６】
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【０１０７】
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
【０１０８】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基があげられる。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
【０１０９】
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【０１１０】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前記式（Ｉ）で表わされる場合、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ)の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。また、前記リンカー領域（Ｌｙ）が、前記式（Ｉ）で表わされる場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）、前記領域（Ｙ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）について、前記リンカー領域（Ｌｘ）の説明を援用できる。
【０１１１】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）、ならびに、前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）と、前記−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（４）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【０１１２】
前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ−１）〜式（Ｉ−９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（Ｉ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
【化２】
2012005368.tif 000004
【０１１３】
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４または８、前記（Ｉ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（Ｉ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（Ｉ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（Ｉ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（Ｉ−４ａ）に、前記式（Ｉ−６）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（Ｉ−６ａ）に示す。
【化３】
2012005368.tif 000005
【０１１４】
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜６または１〜４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ-ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
【０１１５】
本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等があげられる。
【０１１６】
本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個または複数の二重結合を有してもよい。
【０１１７】
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチル等のナフチル等があげられる。
【０１１８】
本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例：１−テトラゾリル、２−テトラゾリル、５−テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル）、フラザニル（例：３−フラザニル）、ピラジニル（例：２−ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、ベンゾフリル（例：２−ベンゾ［ｂ］フリル、−ベンゾ［ｂ］フリル、４−ベンゾ［ｂ］フリル、５−ベンゾ［ｂ］フリル、６−ベンゾ［ｂ］フリル、７−ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、４−ベンゾ［ｂ］チエニル、５−ベンゾ［ｂ］チエニル、６−ベンゾ［ｂ］チエニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンズイミダゾリル（例：１−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリル（例：２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル）、シンノリニル（例：３−シンノリニル、４−シンノリニル、５−シンノリニル、６−シンノリニル、７−シンノリニル、８−シンノリニル）、キナゾリル（例：２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニル、８−キナゾリニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、６−キノリル、７−キノリル、８−キノリル）、フタラジニル（例：１−フタラジニル、５−フタラジニル、６−フタラジニル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、６−イソキノリル、７−イソキノリル、８−イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２−プテリジニル、４−プテリジニル、６−プテリジニル、７−プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニル、４−アクリジニル、９−アクリジニル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、４−インドリル、５−インドリル、６−インドリル、７−インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１−フェナジニル、２−フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１−フェノチアジニル、２−フェノチアジニル、３−フェノチアジニル、４−フェノチアジニル）等があげられる。
【０１１９】
本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３〜１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
【０１２０】
本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルおよびビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アダマンチル、２−アダマンチル等があげられる。
【０１２１】
本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
【０１２２】
本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を包み、炭素数は、例えば、３〜７個である。前記基は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
【０１２３】
本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２−フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、ヒドロキシメチルおよび２−ヒドロキシエチル等があげられる。
【０１２４】
本発明において、「アルコキシ」は、前記アルキル−Ｏ−基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ−ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２−アミノエチル等があげられる。
【０１２５】
本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、ピロリジノン、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、ピペラジノン、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
【０１２６】
本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２−ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン−３−イルメチル等があげられる。
【０１２７】
本発明において、「シリル」は、式Ｒ３Ｓｉ−で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
【０１２８】
本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
【０１２９】
本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、スルファモイル、オキソ等があげられる。
【０１３０】
４．本発明のｓｓＮｃ分子の合成方法
本発明のｓｓＮｃ分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。
【０１３１】
５．組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であり、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【０１３２】
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
【０１３３】
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
【０１３４】
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１３５】
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設定すればよい。
【０１３６】
具体例として、前記標的遺伝子を前記ＴＧＦ−β１遺伝子に設定し、前記遺伝子に対する発現抑制配列を前記ｓｓＮｃ分子に配置すれば、例えば、炎症性疾患、具体的には、急性肺傷害等の治療に使用できる。
【０１３７】
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＮｃ分子を投与すればよい。
【０１３８】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１３９】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。
【０１４０】
本発明の組成物は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１４１】
本発明の組成物において、前記ｓｓＮｃ分子は、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体形成により、例えば、前記ｓｓＮｃ分子を効率よくデリバリーすることができる。前記ｓｓＮｃ分子と前記複合化剤との結合は、特に制限されず、例えば、非共有結合があげられる。前記複合体は、例えば、包接複合体があげられる。
【０１４２】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
【０１４３】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤等があげられる。
【０１４４】
前記担体は、例えば、高分子が好ましく、より好ましくは、生体高分子である。前記担体は、例えば、生分解性が好ましい。前記担体は、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、グロブリン等のタンパク質；例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸等の糖質；脂質等があげられる。前記担体は、例えば、合成ポリアミノ酸等の合成ポリマーも使用できる。前記ポリアミノ酸は、例えば、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ)等があげられる。
【０１４５】
前記結合物質は、例えば、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ネプロキシン（Ｎｅｐｒｏｘｉｎ)、ＲＧＤペプチド、ＲＤＧペプチド擬似体等があげられる。
【０１４６】
前記融合剤および縮合剤は、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のポリアミノ鎖等があげられる。ＰＥＩは、例えば、直鎖状および分岐状のいずれでもよく、また、合成物および天然物のいずれでもよい。前記ＰＥＩは、例えば、アルキル置換されてもよいし、脂質置換されてもよい。また、前記融合剤は、この他に、例えば、ポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メリチン、ポリアセタール物質（例えば、カチオン性ポリアセタール等）等が使用できる。前記融合剤は、例えば、αらせん構造を有してもよい。前記融合剤は、例えば、メリチン等の膜崩壊剤でもよい。
【０１４７】
本発明の組成物は、例えば、前記複合体の形成等について、米国特許第６，５０９，３２３号、米国特許公報第２００３／０００８８１８号、ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号等を援用できる。
【０１４８】
前記添加剤は、この他に、例えば、両親媒性分子があげられる。前記両親媒性分子は、例えば、疎水性領域および親水性領域を有する分子である。前記分子は、例えば、ポリマーが好ましい。前記ポリマーは、例えば、二次構造を有するポリマーであり、反復性の二次構造を有するポリマーが好ましい。具体例としては、例えば、ポリペプチドが好ましく、より好ましくは、αらせん状ポリペプチド等である。
【０１４９】
前記両親媒性ポリマーは、例えば、２つ以上の両親媒性サブユニットを有するポリマーでもよい。前記サブユニットは、例えば、少なくとも１つの親水性基および１つの疎水性基を有する環状構造を有するサブユニットがあげられる。前記サブユニットは、例えば、コール酸等のステロイド、芳香族構造等を有してもよい。前記ポリマーは、例えば、芳香族サブユニット等の環状構造サブユニットとアミノ酸の両方を有してもよい。
【０１５０】
６．発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１５１】
本発明の発現抑制方法において、前記遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡ干渉様の現象による発現抑制があげられる。ここで、本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であり、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することを特徴とする発現誘導方法ともいえる。
【０１５２】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記ｓｓＮｃ分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記ｓｓＮｃ分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１５３】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記ｓｓＮｃ分子を単独で投与してもよいし、前記ｓｓＮｃ分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１５４】
７．治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明のｓｓＮｃ分子を、患者に投与する工程を含み、前記ｓｓＮｃ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１５５】
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。
【０１５６】
８．ｓｓＮｃ分子の使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明のｓｓＮｃ分子の使用である。また、本発明の使用は、ＲＮＡ干渉の誘導のための、前記本発明のｓｓＮｃ分子の使用である。
【０１５７】
本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子は、前記本発明のｓｓＮｃ分子であり、前記ｓｓＮｃ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。
【０１５８】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１５９】
（実施例Ａ１）ＲＮＡの合成
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、以下に示すｓｓＲＮＡ（ＮＫ−００１６）を合成した。前記ＮＫ−００１６は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を抑制する１９塩基長の発現抑制配列（配列番号１）を有する。ＮＫ−００１６の配列において、領域（Ｘｃ）と領域（Ｘ）との間が、リンカー領域（Ｌｘ）であり、領域（Ｙ）と領域（Ｙｃ）との間が、リンカー領域（Ｌｙ）である（以下、同様）。配列において、５’領域（Ｘｃ）および３’領域（Ｙｃ）は、それぞれ小文字で表わす（以下、同様）。
ＧＡＰＤＨ遺伝子発現抑制配列（配列番号１）
5’-ＧＵＵＧＵＣＡＵＡＣＵＵＣＵＣＡＵＧＧ-3’ 
【化４】
2012005368.tif 000006
【０１６０】
比較例のＲＮＡとして、以下に示す、ＲＮＡｉポジティブコントロール（Ｐｃ）のｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００１１）を合成した。ＮＩ−００１１は、各一本鎖の３’末端に２塩基のオバーハングを有し、配列番号４の一本鎖が、前記ＮＫ−００１６と同様に、前記１９塩基長の発現抑制配列を有している。【０１６１】
【化５】
2012005368.tif 000007
【０１６２】
前記ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）  ８９０９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムス）により合成した。前記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）を用いた（以下、同様）。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成したＲＮＡは、ＨＰＬＣにより精製した。精製後のＲＮＡは、それぞれ凍結乾燥した。以下の実施例において、ＲＮＡの合成は、特に示さない限り、本実施例と同様に行った。【０１６３】
凍結乾燥したＲＮＡは、注射用蒸留水（大塚製薬、以下同様）を用いて、所望の濃度となるよう溶解した。【０１６４】
（実施例Ａ２）ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果
本発明のｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。【０１６５】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ａ１のｓｓＲＮＡ（ＮＫ−００１６）を使用した。
【化６】
2012005368.tif 000008
【０１６６】
前記ＲＮＡを、所望の濃度となるように、注射用蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。細胞は、ＨＣＴ１１６細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用し、培地は、１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を使用し、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。【０１６７】
まず、ＨＣＴ１１６細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、２×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、前記ＲＮＡを、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、５ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ／Ｌ、２０ｎｍｏｌ／Ｌ、４０ｎｍｏｌ／Ｌとした。【０１６８】
【表１】
2012005368.tif 000009
【０１６９】
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を４８時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商品名、Ｑｉａｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量は、前記β−アクチン遺伝子の発現量により補正した。【０１７０】
前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＤＸ４００（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様。）。前記ＧＡＰＤＨ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセット
5’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3’（配列番号９）
5’-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3’（配列番号１０）
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’（配列番号１１）
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’（配列番号１２）【０１７１】
なお、コントロール１として、前記（Ｂ）１００μＬのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（−）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。【０１７２】
補正後のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量について、コントロール（−）の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。【０１７３】
（２）結果
これらの結果を、図４に示す。図４は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図４に示すように、前記ＮＫ−００１６は、ＲＮＡ未添加のコントロール（−）よりも低い発現量であり、ＧＡＰＨＤ遺伝子の発現を抑制したことがわかった。また、図４に示すように、投与量依存的に遺伝子発現抑制効果を示すことがわかった。【０１７４】
（実施例Ａ３）ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果
本発明のｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。【０１７５】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ａ１のｓｓＲＮＡ（ＮＫ−００１６）を使用した。比較例のＲＮＡとして、ＲＮＡｉポジティブコントロール（Ｐｃ）の前記ｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００１１）を使用した。前記ＲＮＡを、４０μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。【０１７６】
前記ＲＮＡ溶液を使用した以外は、前記実施例Ａ２と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を確認した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、４０ｎｍｏｌ／Ｌとした。【０１７７】
（２）結果
これらの結果を、図５に示す。図５は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、縦軸は、相対遺伝子発現量である。図５に示すように、前記実施例のＮＫ−００１６は、比較例のＮＩ−００１１と比較して、極めて強い遺伝子発現抑制活性を示した。【０１７８】
（実施例Ａ４）Ａ５４９細胞および２９３細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果
本発明のｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。【０１７９】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ａ１のＮＫ−００１６および以下のＥｘ−ｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００４）を使用した。前記ＰＫ−０００４において、リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）は、ＸｃとＸとの間、ＹｃとＹとの間を、実施例Ｂに示すスキーム３の化合物１０（Ｌ−プロリンジアミドアミダイト）を用いて結合させた。前記両リンカーの化学式を以下に示す。前記ＮＫ−００１６と前記ＰＫ−０００４は、ＸｃとＸとの間のリンカー領域（Ｌｘ）、およびＹｃとＹとの間のリンカー領域（Ｌｙ）が異なる以外は、同じ配列とした。
【化７】
2012005368.tif 000010
【０１８０】
前記ＲＮＡを、２０μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。細胞は、Ａ５４９細胞および２９３細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用した。前者の培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、後者の培地は、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。【０１８１】
まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、５×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、前記ＲＮＡをトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、Ａ５４９細胞および２９３細胞に対して、それぞれ、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（Ｃ）は、２０μｍｏｌ／Ｌ  前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて９８．５μＬまたは９９μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌ、３ｎｍｏｌ／Ｌ、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【表２】
2012005368.tif 000011
【０１８２】
トランスフェクション後、前記細胞を４８時間培養し、前記実施例Ａ２と同様にして、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の相対的発現量を測定した。【０１８３】
（２）結果
これらの結果を、図６および７に示す。図６は、Ａ５４９細胞の結果であり、図７は、２９３細胞の結果である。図６および７は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図６および７に示すように、実施例のＮＫ−００１６およびＰＫ−０００４は、強い遺伝子発現抑制活性を示し、濃度依存的に効果を示すことがわかった。【０１８４】
（実施例Ａ５）Ｈｅｐａ１−６細胞におけるＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果
本発明のｓｓＲＮＡについて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果を確認した。【０１８５】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、以下に示すｓｓＲＮＡ（ＮＫ−００３３）を使用した。前記ＮＫ−００３３は、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制する２１塩基長の下記配列を有している。この配列は、Ｃｈｅｎｇらが用いたｓｉＲＮＡ（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，２００９，６，７７２−７７９）に基づいて、設計した。
ＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制配列（配列番号１６）
５’−ＡＡＡＧＵＣＡＡＵＧＵＡＣＡＧＣＵＧＣＵＵ−３’【０１８６】
比較例のＲＮＡとして、以下に示す、ＲＮＡｉネガティブコントロール（Ｎｃ）のｓｓＲＮＡ（ＮＫ−００３５）を使用した。ＮＫ−００３５は、前記発現抑制配列ではなく、発現抑制に関与しないスクランブル配列を組み込んだ。
【化８】
2012005368.tif 000012
【０１８７】
前記ＲＮＡを、注射用蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。細胞は、Ｈｅｐａ１−６細胞（理化学研究所バイオリソースセンター）を使用し、培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を使用し、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。【０１８８】
まず、Ｈｅｐａ１−６細胞を前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、３×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を、２４時間培養した後、前記ｓｓＲＮＡをトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（Ｃ）は、２０μｍｏｌ／Ｌ  前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて９８．５μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、１０ｎｍｏｌ／Ｌ、２５ｎｍｏｌ／Ｌ、５０ｎｍｏｌ／Ｌおよび１００ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【表３】
2012005368.tif 000013
【０１８９】
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を４８時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商品名、Ｑｉａｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、下記ＴＧＦ−β１遺伝子用ＰＣＲプライマーセットおよびβ−アクチン遺伝子用プライマーセットを使用した以外は、前記実施例Ａ２と同様にして、ＰＣＲを行い、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＴＧＦ−β１遺伝子の発現量は、前記β−アクチン遺伝子の発現量により補正した。
ＴＧＦ−β１遺伝子用プライマーセット
5’-CCATTGCTGTCCCGTGCAGAGCTG-3’（配列番号１７）
5’-ATGGTAGCCCTTGGGCTCGTGGATC-3’（配列番号１８）
β−アクチン遺伝子増幅用プライマーセット
5’-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3’（配列番号１９）
5’-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3’（配列番号２０）【０１９０】
また、前記実施例Ａ２と同様にして、コントロール（−）およびコントロール（ｍｏｃｋ）について、遺伝子発現量を測定した。そして、補正後のＴＧＦ−β１遺伝子発現量について、コントロール（−）の細胞の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。【０１９１】
（２）結果
これらの結果を、図８に示す。図８は、ＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図８に示すように、前記実施例のＮＫ−００３３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制した。他方、ネガティブコントロールのＮＫ−００３５は、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制しなかった。【０１９２】
（実施例Ａ６）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果および急性肺傷害抑制効果
本発明のｓｓＲＮＡについて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現抑制および急性肺傷害抑制の効果を確認した。前記効果の確認は、Ｔａｋａｇｉら（Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ  ２００９；７：２０５３−２０６３）に記載の方法に従って行った。【０１９３】
（１）材料および方法
（１．１）急性肺傷害マウスへのｓｓＲＮＡの投与
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）は、前記実施例Ａ５のｓｓＲＮＡ（ＮＫ−００３３）を使用した。比較例のＲＮＡは、前記実施例Ａ５に示す、ＲＮＡｉネガティブコントロール（Ｎｃ）のｓｓＲＮＡ（ＮＫ−００３５）を使用した。【０１９４】
前記ＲＮＡ  １００μｇを滅菌生理食塩水（日本化薬、以下、同様）８０μＬに溶解して、ＲＮＡ溶液を調製した。他方、１００μｇのリポ多糖（ＬＰＳ）を、滅菌生理食塩水５０μＬに溶解して、ＬＰＳ溶液を調製した。【０１９５】
まず、前記ＲＮＡ溶液８０μＬを、マウスの気管内に滴下した。滴下から１時間後に、前記マウスの気管内に、前記ＬＰＳ溶液５０μＬを滴下して、肺傷害を誘発した。【０１９６】
前記ＬＰＳに対するネガティブコントロールとして、前記ＬＰＳ溶液に代えて、ＬＰＳ未添加の滅菌生理食塩水５０μＬを用いた。また、前記ＲＮＡ溶液に対するネガティブコントロールとして、滅菌生理食塩水８０μＬを用いた。【０１９７】
以下に、各投与群を示す。各投与群において、４〜６匹のマウスを使用した。
・投与群１
滅菌生理食塩水８０μＬの投与から１時間後、滅菌生理食塩水５０μＬを投与
・投与群２
ＲＮＡ溶液（ＮＫ−００３３）８０μＬの投与から１時間後、滅菌生理食塩水５０μＬを投与
・投与群３
ＲＮＡ溶液（ＮＫ−００３５）８０μＬの投与から１時間後、滅菌生理食塩水５０μＬを投与
・投与群４
滅菌生理食塩水８０μＬの投与から１時間後、前記ＬＰＳ溶液５０μＬを投与
・投与群５
ＲＮＡ溶液（ＮＫ−００３３）８０μＬの投与から１時間後、前記ＬＰＳ溶液５０μＬを投与
・投与群６
ＲＮＡ溶液（ＮＫ−００３５）８０μＬの投与から１時間後、前記ＬＰＳ溶液５０μＬを投与【０１９８】
（１．２）気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）のサンプリング
前記ＬＰＳ溶液を滴下してから２４時間後、前記マウスの腹腔に、過剰量のペントバルビタールを投与して安楽死させ、生化学的解析および組織学的解析のサンプルとした。ネガティブコントロールは、前記ＬＰＳ溶液に代えて、滅菌生理食塩水を添加した。【０１９９】
前記マウスの心臓に穿刺して、血液サンプルを回収し、３．８％クエン酸ナトリウム水溶液を含む試験管に添加した。前記クエン酸ナトリウム水溶液の量（体積）は、前記血液サンプルの１／１０とした。この混合液から、Ｙａｓｕｉら（Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００１：１６３：１６６０−８）の記載にしたがって、ＢＡＬＦサンプルを回収した。そして、前記ＢＡＬＦサンプル中の総細胞数を、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（商品名、ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｄ社）を用いて測定した。【０２００】
また、前記ＢＡＬＦサンプルを遠心分離に供して、前記ＢＡＬＦサンプルの上清を回収し、生化学的分析を行うまで、−８０℃で保存した。また、前記ＢＡＬＦサンプルに含まれる異なる種類の細胞を計数するために、前記ＢＡＬＦサンプルを、サイトスピンを用いて遠心分離し、分離した細胞を、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ（商品名、Ｍｅｒｃｋ）を用いてギムザ染色した。また、前記マウスから肺組織を採取して、ＨＥ染色を行った。【０２０１】
（２）結果
（２．１）肺におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現の抑制
前記マウスの肺サンプルについて、ＴＧＦ−β１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ（商品名、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１発現量を測定した。【０２０２】
その結果を、図９に示す。図９は、各投与群における単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１遺伝子発現量を示すグラフである。ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４は、ＬＰＳ（−）／ＲＮＡ（−）の投与群１と比較して、ＬＰＳ処理の結果、前記遺伝子の発現量が増加した。そして、ＬＰＳ（＋）／ＮＫ−００３３（＋）の実施例投与群５は、ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４と比較して、前記遺伝子の発現量の上昇が抑制された。この抑制効果は、ＬＰＳ（＋）／ネガティブコントロールＮＫ−００３５（＋）の投与群６では観察されなかった。この結果から、前記実施例のＮＫ−００３３により、効果的にＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制できることがわかった。【０２０３】
（２．２）急性肺傷害抑制効果
急性肺傷害における炎症は、好中球等の細胞が肺に浸潤することによって生じる。このため、肺に対する好中球等の細胞の浸潤を抑制する薬物は、急性肺傷害における炎症の治療薬となる。そこで、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の細胞数を、肺へ浸潤した細胞数の指標として、本発明のｓｓＲＮＡの薬理効果を確認した。【０２０４】
前記ＢＡＬＦサンプル中の細胞数の測定結果を、図１０に示す。図１０は、各投与群におけるＢＡＦＬサンプル中の細胞数を示すグラフである。ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４は、ＬＰＳ（−）／ＲＮＡ（−）の投与群１と比較して、ＬＰＳ処理の結果、前記ＢＡＬＦサンプル中の細胞数が増加した。これは、ＬＰＳによって炎症作用が誘導され、その結果、細胞が肺に浸潤したことを示す。そして、ＬＰＳ（＋）／ＮＫ−００３３（＋）の実施例投与群５は、ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４と比較して、細胞数の上昇が抑制された。これは、前記ＮＫ−００３３によって、急性肺傷害における炎症が抑制されたことを示す。この抑制効果は、ＬＰＳ（＋）／ネガティブコントロールＮＫ−００３５（＋）の投与群６では観察されなかった。この結果から、前記実施例のＮＫ−００３３により、効果的に急性肺傷害における炎症を抑制できることがわかった。【０２０５】
前記ＢＡＬＦサンプル中の好中球数の測定結果を、図１１に示す。図１１は、各投与群におけるＢＡＬＦサンプル中の好中球の細胞数を示すグラフでる。ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４は、ＬＰＳ（−）／ＲＮＡ（−）の投与群１と比較して、ＬＰＳ処理の結果、前記ＢＡＬＦサンプル中の好中球数が増加した。これは、ＬＰＳによって炎症作用が誘導され、その結果、好中球が肺に浸潤したことを示す。そして、ＬＰＳ（＋）／ＮＫ−００３３（＋）の実施例投与群５は、ＬＰＳ（＋）／ｓｓＲＮＡ（−）の投与群４と比較して、前記ＢＡＬＦサンプル中の好中球数の上昇が抑制された。これは、前記ＮＫ−００３３によって、急性肺傷害における炎症を抑制されたことを示す。この抑制効果は、ＬＰＳ（＋）／ネガティブコントロールＮＫ−００３５（＋）の投与群６では観察されなかった。この結果から、前記実施例のＮＫ−００３３により、効果的に急性肺傷害における炎症が抑制できることがわかった。【０２０６】
（２．３）組織学的観察：ギムザ染色
ギムザ染色の結果を、図１２に示す。図１２は、前記ＢＡＬＦサンプル中の細胞のギムザ染色の結果を示す写真である（倍率１００倍）。図１２において、（Ａ）は、ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４の結果であり、（Ｂ）は、ＬＰＳ（＋）／ネガティブコントロールＮＫ−００３５（＋）の投与群６の結果であり、（Ｃ）は、ＬＰＳ（＋）／ＮＫ−００３３（＋）の実施例投与群５の結果を示す。【０２０７】
図１２に示すように、ＬＰＳ（＋）／ＮＫ−００３３（＋）の実施例投与群５（Ｃ）は、ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４（Ａ）およびＬＰＳ（＋）／ネガティブコントロールＮＫ−００３５（＋）の投与群６（Ｂ）と比較して、肺に浸潤した細胞数が顕著に少なかった。この組織学的観察は、前述したＢＡＬＦサンプル中の細胞数の結果と一致する。【０２０８】
（２．４）組織学的観察：ＨＥ染色
ＨＥ染色の結果を、図１３に示す。図１３は、前記肺組織のＨＥ染色の結果を示す写真である（倍率１０倍）。図１３において、（Ａ）は、ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４の結果であり、（Ｂ）は、ＬＰＳ（＋）／ネガティブコントロールＮＫ−００３５（＋）の投与群６の結果であり、（Ｃ）は、ＬＰＳ（＋）／ＮＫ−００３３（＋）の実施例投与群５の結果を示す。図１３から、血管周囲、肺胞腔内、肺胞壁および気管支周辺への、好中球等の細胞の浸潤が減少し、肺組織の傷害性が低減していることがわかった。【０２０９】
（実施例Ａ７）インターフェロン誘導を指標とする副作用の評価
従来法のｉＲＮＡ剤は、副作用としてインターフェロンを配列非依存的に誘導することが知られており、この副作用が問題視されている。そこで、本発明のｓｓＲＮＡについて、インターフェロン誘導の副作用を評価した。【０２１０】
（１）材料および方法
前記実施例Ａ６と同じ方法および条件により、急性肺傷害マウスへのｓｓＲＮＡの投与を行った。そして、前記実施例Ａ６と同様にして、前記ＬＰＳ溶液または滅菌生理食塩水（ＬＰＳに対するネガティブコントロール）を滴下してから２４時間後、マウスを安楽死させ、肺組織を採取した。【０２１１】
【表４】
2012005368.tif 000014
【０２１２】
前記肺組織から、各遺伝子の発現量測定のために、ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。次に、逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＴＧＦ−β１遺伝子、ＩＦＮ−α遺伝子、ＩＦＮ−β遺伝子の発現量を測定した。【０２１３】
前記ＰＣＲは、試薬としてＧｏｌｄ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、米国）、測定機器としてＡＢ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ７６００（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いた。ＴＧＦ−β１遺伝子、ＩＦＮ−α遺伝子、ＩＦＮ−β遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセット
5’-CCCTTATTGACCTCAACTACATGGT-3’（配列番号２１）
5’-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3’（配列番号２２）
ＴＧＦ−β１遺伝子用プライマーセット
5’-ACTCCACGTGGAAATCAACGG-3’（配列番号２３）
5’-TAGTAGACGATGGGCAGTGG-3’（配列番号２４）
ＩＦＮ−α遺伝子用プライマーセット
5’-ATGGCTAGRCTCTGTGCTTCCT-3’（配列番号２５）
5’-AGGGCTCTCCAGAYTTCTGCTCTG-3’（配列番号２６）
ＩＦＮ−β遺伝子用プライマーセット
5’-CATCAACTATAAGCAGCTCCA-3’（配列番号２７）
5’-TTCAAGTGGAGAGCAGTTCAG-3（配列番号２８）【０２１４】
そして、得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動した。また、電気泳動後のアガロースについて、ＮＩＨ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて密度解析を行い、各遺伝子の発現量を確認した。前記ＴＧＦ−β１遺伝子、前記ＩＦＮ−α遺伝子および前記ＩＦＮ−β遺伝子の発現量は、それぞれ、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を標準とし、相対的に評価した。具体的には、前記ＧＡＰＤＨ遺伝子用プライマーセットを用いたＰＣＲ産物の測定強度を標準１として、各遺伝子用プライマーセットを用いたＰＣＲ産物の測定強度の相対値を求め、評価した。【０２１５】
（２）結果および考察
前記ＴＧＦ−β１遺伝子、ＩＦＮ−α遺伝子およびＩＦＮ−β遺伝子の発現量に関する定量的解析結果を、それぞれ、図１４（Ａ）〜（Ｃ）のグラフに示す。各投与群は、前記実施例Ａ６と同様に以下の通りである。【０２１６】
図１４（Ａ）は、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現量の結果である。図１４（Ａ）に示すように、前記ＮＫ−００３３を投与した実施例投与群５は、ＲＮＡ（−）の投与群４と比較して、ＬＰＳで誘導されるＴＧＦ−β１遺伝子発現の上昇を抑制した。この結果は、前記実施例Ａ５の図８で示したＴＧＦ−β１発現量の測定結果と相関する。【０２１７】
図１４（Ｂ）は、ＩＦＮ−α遺伝子の発現量、図１４（Ｃ）は、ＩＦＮ−β遺伝子の発現量を示す結果である。図１４（Ｂ）および図１４（Ｃ）に示すように、ＬＰＳ未添加の場合、ＲＮＡ（−）の投与群１と、ＲＮＡ（＋）の投与群２とを比較した結果、ｓｓＲＮＡ添加による、Ｉ型インターフェロンであるＩＦＮ−α遺伝子およびＩＦＮ−β遺伝子の発現誘導は生じなかった。また、図１４（Ｂ）および図１４（Ｃ）に示すように、ＬＰＳ添加の場合、ＲＮＡ（−）の投与群４と、ＮＫ−００３３（＋）の投与群５とを比較した結果、同様に、ｓｓＲＮＡの添加による、ＩＦＮ−α遺伝子およびＩＦＮ−β遺伝子の発現誘導は生じなかった。【０２１８】
この結果は、Ｉ型インターフェロンの誘導という副作用が生じるという従来のｓｉＲＮＡの結果とは、対照的である。すなわち、本発明のｓｓＲＮＡは、予想外にも、従来法のｓｉＲＮＡで問題となっていたインターフェロン誘導という副作用を生じないことが実証された。【０２１９】
（実施例Ａ８）Ｈｅｐａ１−６細胞におけるＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果
本発明のｓｓＲＮＡについて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果を確認した。【０２２０】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ａ５のＮＫ−００３３、以下に示すＮＫ−００６１、ＮＫ−００５５、ＮＫ−００６２を使用した。下記配列において、「＊」は、フリー塩基を示す。
【化９】
2012005368.tif 000015
【０２２１】
また、実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、下記ＰＫ−０００７、ＰＫ−００２６、ＰＫ−００２７、ＰＫ−００２８を使用した。これらのｓｓＲＮＡにおいて、リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）は、ＸｃとＸとの間、ＹｃとＹとの間を、実施例Ｂに示すスキーム３の化合物１０（Ｌ−プロリンジアミドアミダイト）を用いて結合させた。
【化１０】
2012005368.tif 000016
【０２２２】
ＮＫ−００３３、ＮＫ−００６１、ＮＫ−００５５およびＮＫ−００６２と、ＰＫ−０００７、ＰＫ−００２６、ＰＫ−００２７およびＰＫ−００２８とは、前記第１リンカー（Ｌ１）および第２リンカー（Ｌ２）が異なる以外は、同じ配列であり、いずれもＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制する配列（配列番号１６）を有する。【０２２３】
（１．２）遺伝子の発現抑制
凍結保存した前記ＲＮＡを、２０μｍｏｌ／Ｌとなるように、注射用蒸留水に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。そして、前記ＲＮＡ溶液を使用した以外は、前記実施例Ａ５と同様にして、Ｈｅｐａｌ−６細胞への前記ｓｓＲＮＡのトランスフェクション、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い。ＴＧＦ−β１遺伝子の相対的発現量を測定した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌとした。【０２２４】
（２）結果
これらの結果を、図１５および１６に示す。図１５および図１６は、それぞれ、ＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図１５は、ＮＫ−００３３、ＮＫ−００６１、ＮＫ−００５５およびＮＫ−００６２を使用した結果であり、図１６は、ＰＫ−０００７、ＰＫ−００２６、ＰＫ−００２７およびＰＫ−００２８を使用した結果である。図１５および図１６に示すように、いずれのｓｓＲＮＡも、強い遺伝子発現抑制活性を示した。【０２２５】
（実施例Ａ９）
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制効果および急性肺傷害抑制効果【０２２６】
（Ａ９−１）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果
本発明のｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制効果を確認した。【０２２７】
（１）材料および方法
急性肺傷害マウスへのＲＮＡの投与は、特に示さない限り、前記実施例Ａ６と同様にして行った。【０２２８】
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、前記実施例Ａ８におけＰＫ−０００７およびＮＫ００３３を使用した。また、比較例のＲＮＡとして、以下に示す、ＲＮＡｉネガティブコントロール（Ｎｃ）のＰＫ−０００８およびＮＫ−００３５、ＲＮＡｉポジティブコントロール（Ｐｃ）のｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００３０）およびＲＮＡｉネガティブコントロール（Ｎｃ）のｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００３１）を使用した。ネガティブコントロールのＰＫ−０００８は、ＰＫ−０００７と同じ、前記アミダイト（スキーム３の前記化合物１０：Ｌ−プロリンジアミドアミダイト）由来のリンカーＬｘおよびＬｙを有する。【０２２９】
【化１１】
2012005368.tif 000017
【０２３０】
前記ＲＮＡ  １００μｇを滅菌生理食塩水７５μＬに溶解して、ＲＮＡ溶液を調製した。他方、１００μｇのリポ多糖（ＬＰＳ）を、滅菌生理食塩水５０μＬに溶解して、ＬＰＳ溶液を調製した。【０２３１】
以下に、各投与群を示す。特に示さない限りは、前記実施例Ａ６と同様に投与を行った。各投与群において、４〜６匹のマウスを使用した。
・投与群１
滅菌生理食塩水７５μＬの投与から５分後、滅菌生理食塩水５０μＬを投与
・投与群２
滅菌生理食塩水７５μＬの投与から５分後、ＬＰＳ溶液５０μＬを投与
・投与群３
ＲＮＡ溶液（ＰＫ−０００７）７５μＬの投与から５分後、ＬＰＳ溶液５０μＬを投与
・投与群４
ＲＮＡ溶液（ＰＫ−０００８）７５μＬの投与から５分後、ＬＰＳ溶液５０μＬを投与
・投与群５
ＲＮＡ溶液（ＮＫ−００３３）７５μＬの投与から５分後、ＬＰＳ溶液５０μＬを投与
・投与群６
ＲＮＡ溶液（ＮＫ−００３５）７５μＬの投与から５分後、ＬＰＳ溶液５０μＬを投与
・投与群７
ＲＮＡ溶液（ＮＩ−００３０）７５μＬの投与から５分後、ＬＰＳ溶液５０μＬを投与
・投与群８
ＲＮＡ溶液（ＮＩ−００３１）５０μＬの投与から５分後、ＬＰＳ溶液５０μＬを投与【０２３２】
そして、前記実施例Ａ６と同様にして、肺サンプルを調製し、単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１発現量を測定した。【０２３３】
その結果を、図１７に示す。図１７は、各投与群における単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１発現量を示すグラフである。ＬＰＳ（＋）／ＰＫ−０００７（＋）の投与群３およびＬＰＳ（＋）／ＮＫ−００３３（＋）の投与群５は、それぞれ、ＬＰＳ（＋）／ｓｓＲＮＡ（−）の投与群２と比較して、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現量が抑制された。この抑制効果は、ＬＰＳ（＋）／ポジティブコントロールＮＩ−００３０の投与群７よりも、強いことが明らかとなった。特に、ＬＰＳ（＋）／ＰＫ−０００７（＋）の投与群３は、著しい抑制効果を示した。なお、ネガティブコントロールのＲＮＡを投与した投与群４（ＰＫ−０００８）、投与群６（ＮＫ−００３５）、投与群８（ＮＩ−００３１）では、抑制効果は確認されなかった。【０２３４】
（Ａ９−２）ｉｎ  ｖｉｖｏでのオフターゲット効果
本発明のｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのオフターゲット効果を確認し、副作用を評価した。【０２３５】
実施例のＲＮＡは、前記実施例Ａ８のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００７）を使用した。比較例のＲＮＡは、前記実施例Ａ９−１に示す、ＲＮＡｉネガティブコントロール（Ｎｃ）のｓｓＲＮＡ（ＰＫ−０００８）、ＲＮＡｉポジティブコントロール（Ｐｃ）のｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００３０）およびＲＮＡｉネガティブコントロールのｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００３１）を使用した。そして、前記ＲＮＡ  １００μｇを滅菌生理食塩水７５μＬに溶解して、ＲＮＡ溶液を調製した。【０２３６】
以下に、各投与群を示す。各投与群において、２〜４匹のマウスを使用した。
・投与群１
滅菌生理食塩水７５μＬを投与
・投与群２
ＲＮＡ溶液（ＰＫ−０００７）７５μＬを投与
・投与群３
ＲＮＡ溶液（ＰＫ−０００８）７５μＬを投与【０２３７】
そして、投与から２４時間後、前記実施例Ａ６と同様にして、マウスからＢＡＬＦサンプルを回収し、前記ＢＡＬＦサンプルの上清を得た。前記上清について、ＴＮＦ−α量およびＩＦＮ−β量を測定した。前記ＴＮＦ−α量は、商品名Ｍｏｕｓｅ  ＴＮＦ  ｓｅｔ  ＩＩ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、その使用説明書に従って定量した。また、前記ＩＦＮ−β量は、商品名Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎβ（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）および商品名Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所）を用いて作製したＥＬＩＳＡプレートを用いて、それらの使用説明書にしたがって定量した。【０２３８】
これらの結果を、図１８に示す。図１８（Ａ）は、各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＴＮＦ−α量を示すグラフであり、図１８（Ｂ）は、各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＩＦＮ−β量を示すグラフである。図１８において、横軸は、それぞれの量を示す。前記ＰＫ−０００７（＋）の投与群２は、ＲＮＡ（−）の投与群１と比較して、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βの発現が惹起されなかった。【０２３９】
（実施例Ａ１０）２９３細胞におけるＬＡＭＡ１遺伝子の発現抑制効果
本発明のｓｓＲＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＬＡＭＡ１遺伝子の発現抑制を確認した。【０２４０】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、以下に示すＮＫ−００４３、ＮＫ−００６４を使用した。下記配列において、「＊」は、フリー塩基を示す（以下、同様）。
【化１２】
2012005368.tif 000018
【０２４１】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ａ４と同様にして、２９３細胞へのトランスフェクションを行い、前記細胞を４８時間培養した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。そして、プライマーとして、以下のＬＡＭＡ１遺伝子用プライマーセットを使用した以外は、前記実施例Ａ２と同様にして、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＬＡＭＡ１遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＬＡＭＡ１遺伝子の発現量は、内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量により補正した。
ＬＡＭＡ１遺伝子用プライマーセット
5’-AAAGCTGCCAATGCCCCTCGACC-3’（配列番号４５）
5’-TAGGTGGGTGGCCCTCGTCTTG-3’（配列番号４６）【０２４２】
また、前記実施例Ａ２と同様にして、コントロール１（−）およびコントロール２（ｍｏｃｋ）に関しても、発現量を測定した。そして、補正後のＬＡＭＡ１遺伝子発現量について、コントロール（−）の細胞の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。【０２４３】
（２）結果
これらの結果を、図１９に示す。図１９は、２９３細胞におけるＬＡＭＡ１遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。図１９に示すように、実施例のＮＫ−００４３およびＮＫ−００６４は、強い遺伝子発現抑制活性を示すことがわかった。【０２４４】
（実施例Ａ１１）Ａ５４９細胞におけるＬＭＮＡ遺伝子の発現抑制効果
本発明のｓｓＲＮＡを用いて、ＲＮＡ干渉効果による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＬＭＮＡ遺伝子の発現抑制を確認した。【０２４５】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、以下に示すＮＫ−００６３、ＮＫ−００６６を使用した。下記配列において、「＊」は、フリー塩基を示す。
【化１３】
2012005368.tif 000019
【０２４６】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ａ４と同様にして、Ａ５４９細胞へのトランスフェクションを行い、前記細胞を４８時間培養した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、３ｎｍｏｌ／Ｌとした。そして、プライマーとして、以下のＬＭＮＡ遺伝子用プライマーセットを使用した以外は、前記実施例Ａ２と同様にして、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＬＭＮＡ遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＬＭＮＡ遺伝子の発現量は、内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量により補正した。
ＬＭＮＡ遺伝子用プライマーセット
5’-CTGGACATCAAGCTGGCCCTGGAC-3’（配列番号４９）
5’-CACCAGCTTGCGCATGGCCACTTC-3’（配列番号５０）【０２４７】
また、前記実施例Ａ２と同様にして、コントロール１（−）およびコントロール２（ｍｏｃｋ）に関しても、発現量を測定した。そして、補正後のＬＭＮＡ遺伝子発現量について、コントロール（−）の細胞の発現量を１として、各ＲＮＡを導入した細胞の発現量の相対値を求めた。【０２４８】
（２）結果
これらの結果を、図２０に示す。図２０は、Ａ５４９細胞におけるＬＭＮＡ遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。図２０に示すように、実施例のＮＫ−００６３およびＮＫ−００６６は、強い遺伝子発現抑制活性を示すことがわかった。【０２４９】
（実施例Ａ１２）ＸｃとＹｃの長さ
本発明のｓｓＲＮＡについて、前記内部５’側領域（Ｘ）に相補的な前記５’側領域（Ｘｃ）の長さ、および、前記内部３’側領域（Ｙ）に相補的な前記３’側領域（Ｙｃ）の長さを変化させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。【０２５０】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡとして、図２１に示すｓｓＲＮＡを使用した。図２１において、右端の番号は、配列番号を示す。図２１において、５’側から、小文字下線の領域は、前記領域（Ｘｃ）、大文字下線の領域は、前記内部領域（Ｚ）、小文字下線の領域は、前記領域（Ｙｃ）を示す。前記Ｘｃと前記Ｚとの間が、リンカー領域（Ｌｘ）であり、前記Ｚと前記Ｙｃとの間が、リンカー領域（Ｌｙ）である。また、「Ｘｃ／Ｙｃ」は、前記領域（Ｘｃ）の塩基長（Ｘｃ）と、前記領域（Ｙｃ）の塩基長（Ｙｃ）との比を示す。図２１において、「＊」は、フリー塩基を示す。【０２５１】
各ｓｓＲＮＡは、いずれも、内部領域（Ｚ）の塩基長を２６塩基、リンカー領域（Ｌｘ）の塩基長を７塩基、リンカー領域（Ｌｙ）の塩基長を４塩基とした。また、ＮＫ−００３６およびＮＫ−００４０は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｙｃ）との合計塩基数（Ｘｃ＋Ｙｃ）を２６塩基とし、それ以外は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｙｃ）との合計塩基数（Ｘｃ＋Ｙｃ）を２５塩基とした。そして、この条件の下、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基長を変化させた。これによって、ＮＫ−００３６およびＮＫ−００４０は、フリー塩基を有さない分子とした。また、これら以外の各ｓｓＲＮＡは、前記内部領域（Ｚ）における、二重鎖を形成しないフリー塩基を全て１塩基とし、且つ、前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基の位置を３’側から５’側に変動させた。【０２５２】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ａ２と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の相対的発現量を測定した。トランスフェクション時のＲＮＡ濃度は、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。【０２５３】
（２）結果および考察
これらの結果を、図２２に示す。図２２は、終濃度１０ｎｍｏｌ／ＬのＲＮＡを使用した場合におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図２２に示すように、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の長さを変化させたいずれのｓｓＲＮＡについても、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制が確認できた。【０２５４】
特に、前記領域（Ｘｃ）の塩基長と前記領域（Ｙｃ）の塩基長の差が大きくなるに従って、相対的に遺伝子の発現量が低下し、発現抑制活性が増加したことが確認された。すなわち、前記内部領域（Ｚ）におけるフリー塩基の位置を、前記内部領域の中央よりも、５’側または３’側に配置するほど、前記発現抑制活性を向上できることがわかった。【０２５５】
前記実施例Ａ２において、ＮＫ−００１６は、極めて強い発現抑制活性が確認されている。本実施例において、ＮＫ−００２５およびＮＫ−００３７は、前記ＮＫ−００１６をさらに上回る活性が認められた。【０２５６】
なお、フリー塩基の位置に関しては、例えば、本実施例とは異なる遺伝子を対象とする実施例Ａ８（ＴＧＦ−β１遺伝子）、実施例Ａ１０（ＬＡＭＡ１遺伝子）、実施例Ａ１１（ＬＭＮＡ遺伝子）においても、同様の効果が得られている。【０２５７】
すなわち、前記実施例Ａ８では、前述の配列に示すように、ＮＫ−００３３とＮＫ−００５５は、ともに１塩基のフリー塩基を有し、前者は、内部領域（Ｚ）の３’末端から４番目に位置し、後者は、内部領域（Ｚ）の３’末端から２番目に位置する。そして、前述の図１５に示すように、フリー塩基が、より３’末端側に位置するＮＫ−００５５が、高い発現抑制を示した。フリー塩基が２塩基であるＮＫ−００６１とＮＫ−００６２との間においても、同様の結果であった。また、実施例Ａ９および実施例１０においても、前記実施例８と同様の条件で、フリー塩基の位置を変化させたが、同様に、フリー塩基が、より３’末端側に位置するｓｓＲＮＡが、高い発現抑制を示した。【０２５８】
これらの結果からも、標的遺伝子の種類ならびにそれに対する発現抑制配列にかかわらず、同様の挙動を示すことは明らかである。このため、本発明のｓｓＲＮＡは、標的遺伝子の種類に関わらず適用可能なツールといえる。【０２５９】
（実施例Ａ１３）Ｘ、Ｘｃ、ＹおよびＹｃの長さ
本発明のｓｓＲＮＡについて、前記内部５’側領域（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の各長さを変化させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。【０２６０】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡとして、図２３に示すｓｓＲＮＡを使用した。図２３において、右端の番号は、配列番号を示す。図２３において、５’側から、小文字下線の領域は、前記領域（Ｘｃ）、大文字下線の領域は、前記内部領域（Ｚ）、小文字下線の領域は、前記領域（Ｙｃ）を示す。また、「Ｘｃ＋Ｙｃ／Ｘ＋Ｙ」は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基長の合計と、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基長の合計との比を示す。図２３において、「＊」は、フリー塩基を示す。【０２６１】
各ｓｓＲＮＡは、いずれも、リンカー領域（Ｌｘ）の塩基長を７塩基、リンカー領域（Ｌｙ）の塩基長を４塩基、前記領域（Ｙｃ）の塩基長を１塩基とし、前記内部領域（Ｚ）の３’側から２番目の塩基を、フリー塩基とした。そして、前記内部領域（Ｚ）の塩基長と前記領域（Ｘｃ）の塩基長を変動させた。【０２６２】
特に示さない限りは、前記実施例Ａ２と同様にして、前記ＲＮＡについて、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。前記トランスフェクションの条件は、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定した。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（Ｃ）は、２０μｍｏｌ／Ｌ  前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて９８．５μＬ添加した。前記ウェルにおいて、前記ＲＮＡの最終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌとした。内部標準による補正、発現量の相対値の算出も、前記実施例Ａ２と同様に行った。
【表５】
2012005368.tif 000020
【０２６３】
（２）結果および考察
これらの結果を、図２４に示す。図２４は、終濃度１ｎｍｏｌ／ＬのＲＮＡを使用した場合におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図２４に示すように、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の長さを変化させたいずれのｓｓＲＮＡについても、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制が確認できた。また、前記実施例Ａ２において、ＮＫ−００１６は、極めて強い発現抑制活性が確認されている。本実施例において、ＮＫ−００１６以外のｓｓＲＮＡは、全てＮＫ−００１６をさらに上回る活性が認められた。【０２６４】
（実施例Ａ１４）Ｘｃの長さ
本発明のｓｓＲＮＡについて、前記内部５’側領域（Ｘ）に相補的な前記５’側領域（Ｘｃ）の長さを変化させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。【０２６５】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡとして、図２５に示すｓｓＲＮＡを使用した。図２５において、５’側から、小文字下線の領域は、前記領域（Ｘｃ）、大文字下線の領域は、前記内部５’領域（Ｘ）、小文字下線の領域は、前記領域（Ｙｃ）を示す。また、「Ｘｃ／Ｙｃ」は、前記領域（Ｘｃ）の塩基長（Ｘｃ）と、前記領域（Ｘ）の塩基長（Ｘ）との比を示す。図２５において、「＊」は、フリー塩基を示す。下記ＲＮＡの配列は、配列番号７４〜７６に示す。【０２６６】
各ｓｓＲＮＡは、いずれも、内部領域（Ｚ）の塩基長を２６塩基、前記領域（Ｘ）を２５塩基、前記領域（Ｙ）を１塩基、前記領域（Ｙｃ）を１塩基、リンカー領域（Ｌｘ）の塩基長を７塩基、リンカー領域（Ｌｙ）の塩基長を４塩基とした。そして、この条件の下、前記領域（Ｘｃ）の塩基長を変化させた。これによって、各ｓｓＲＮＡは、前記内部領域（Ｚ）における、二重鎖を形成しないフリー塩基の有無および数を変化させた。なお、ＮＫ−０００１は、フリー塩基を有さない。【０２６７】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ａ１３と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。内部標準による補正、発現量の相対値の算出も、前記実施例Ａ１３と同様に行った。【０２６８】
（２）結果および考察
これらの結果を、図２６に示す。図２６は、終濃度１ｎｍｏｌ／ＬのＲＮＡを使用した場合におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図２６に示すように、前記５’側領域（Ｘｃ）の長さを変化させたいずれのｓｓＲＮＡについても、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制が確認できた。特に、フリー塩基を有する場合、その数が少ない程、前記発現抑制活性を向上できると考えられる。また、前記実施例Ａ２において、ＮＫ−００１６は、極めて強い発現抑制活性が確認されている。本実施例において、ＮＫ−００１６以外のｓｓＲＮＡは、全てＮＫ−００１６をさらに上回る活性が認められた。【０２６９】
なお、フリー塩基の個数に関しては、例えば、本実施例とは異なる遺伝子を対象とする実施例Ａ８（ＴＧＦ−β１遺伝子）においても、同様の効果が得られている。すなわち、前記実施例Ａ８では、前述の配列に示すように、ＮＫ−００３３とＮＫ−００６１のフリー塩基は、前者が、１塩基であり、後者が２塩基である。そして、前述した図１５に示すように、フリー塩基が少ないＮＫ−００３３が、高い発現抑制を示した。また、ＮＫ−００５５とＮＫ−００６２は、前記ＮＫ−００３３および前記ＮＫ−００６１よりも、フリー塩基の位置を内部領域（Ｚ）の３’側に変動させることで、実施例Ａ１２で述べたように、高い発現抑制を示した。これらの結果からも、標的遺伝子およびそれに対する発現抑制配列の種類にかかわらず、同様の挙動を示すことは明らかである。このため、本発明のｓｓＲＮＡは、標的遺伝子の種類に関わらず適用可能なツールといえる。【０２７０】
（実施例Ａ１５）リンカーの互換性
本発明のｓｓＲＮＡについて、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）との間のリンカー領域（Ｌｘ）および前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との間のリンカー領域（Ｌｙ）を変化させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制を確認した。【０２７１】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡとして、図２７に示すｓｓＲＮＡを使用した。図２７において、５’側から、小文字下線の領域は、前記５’側領域（Ｘｃ）、大文字下線の領域は、前記内部領域（Ｚ）、小文字下線の領域は、前記３’側領域（Ｙｃ）を示す。前記Ｘと前記Ｘｃとの間の配列が、リンカー領域（Ｌｘ）であり、前記Ｙと前記Ｙｃとの間の配列が、リンカー領域（Ｌｙ）である。また、各ＲＮＡについて、リンカー領域（Ｌｘ）の塩基長（Ｌｘ）と、リンカー領域（Ｌｙ）の塩基長（Ｌｙ）との比（Ｌｘ／Ｌｙ）を示す。図２７において、「＊」は、フリー塩基を示す。【０２７２】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ａ１３と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。内部標準による補正、発現量の相対値の算出も、前記実施例Ａ１３と同様に行った。【０２７３】
（２）結果および考察
これらの結果を、図２８に示す。図２８は、終濃度１ｎｍｏｌ／ＬのＲＮＡを使用した場合におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図２８に示すように、前記リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）の条件、すなわち、長さ、両者間の長さの比、配列等を変化させたいずれのｓｓＲＮＡについても、同様に、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制が確認できた。この結果から、前記リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）の条件は、特に制限されず、様々な長さ、配列等に設計可能であることがわかった。【０２７４】
（実施例Ａ１６）ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果
プロリンまたはプロリノールを有するリンカーで置換したｓｓＲＮＡを用いて、ＨＣＴ１１６細胞でのＧＡＰＤＨ発現抑制効果を確認した。【０２７５】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、以下に示すＲＮＡ（Ｅｘ  ｓｓＲＮＡ）を合成した。また、比較例のＲＮＡとして、以下に示す、ＲＮＡｉのネガティブコントロール（Ｎｃ）のＮｃ  ｓｓＲＮＡを合成した。下記式において、リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）は、ＸｃＸとの間、および、ＹｃＹとの間を、プロリンまたはプロリノールを有する下記表のアミダイト（実施例Ｂ参照）を用いて結合させた。
【化１４】
2012005368.tif 000021
【０２７６】
【表６】
2012005368.tif 000022
【０２７７】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ａ１３と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。内部標準による補正、発現量の相対値の算出も、前記実施例Ａ１３と同様に行った。【０２７８】
（２）結果
これらの結果を、図２９に示す。図２９は、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図２９に示すように、リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）としてプロリンまたはプロリノールを含むＥｘ  ｓｓＲＮＡは、いずれも、強い遺伝子発現抑制活性が確認でき、濃度依存的に効果を示すことがわかった。他方、ネガティブコントロールのｓｓＲＮＡは、抑制効果が観察されなかった。【０２７９】
（実施例Ａ１７）ＨＣＴ１１６細胞におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現抑制効果
プロリンを有するリンカーで置換したｓｓＲＮＡを用いて、ＨＣＴ１１６細胞でのＧＡＰＤＨ発現抑制効果を確認した。【０２８０】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、以下に示すＲＮＡ（Ｅｘ  ｓｓＲＮＡ）を合成した。また、比較例のＲＮＡとして、以下に示す、ＲＮＡｉのネガティブコントロール（Ｎｃ）のＮｃ  ｓｓＲＮＡを合成した。下記式において、リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）は、ＸｃとＸとの間、および、ＹｃＹとの間を、プロリンまたはプロリノールを有する下記表のアミダイト（実施例Ｂ参照）を用いて結合させた。
【化１５】
2012005368.tif 000023
【０２８１】
【表７】
2012005368.tif 000024
【０２８２】
前記ＲＮＡを使用した以外は、前記実施例Ａ１３と同様にして、ＨＣＴ１１６細胞へのトランスフェクション、培養、ＲＮＡ回収、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定した。内部標準による補正、発現量の相対値の算出も、前記実施例Ａ１３と同様に行った。【０２８３】
（２）結果
これらの結果を、図３０に示す。図３０は、ＨＣＴ１１６細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。図３０に示すように、リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）としてプロリンを含むＥｘ  ｓｓＲＮＡは、強い遺伝子発現抑制活性を示し、濃度依存的に効果を示すことがわかった。他方、ネガティブコントロールのｓｓＲＮＡは、抑制効果が観察されなかった。【０２８４】
（実施例Ａ１８）リボヌクレアーゼ耐性
本発明のｓｓＲＮＡについて、リボヌクレアーゼ耐性を確認した。【０２８５】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡ（Ｅｘ）として、実施例Ａ５におけるＮＫ−００３３および実施例Ａ８におけるＰＫ−０００７を使用した。また、比較例のＲＮＡとして、実施例Ａ９におけるポジティブコントロール（Ｐｃ）のｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００３０）を使用した。【０２８６】
まず、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に、６０ｐｍｏｌの前記ＲＮＡ、５×１０−５ユニットのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｒｏｃｈｅ）および５×１０−５ユニットのＲＮａｓｅ  Ｔ１（Ｒｏｃｈｅ）を混合し、３７℃にてインキュベートした。インキュベート開始から１０分、２０分、３０分後に、定法に従ってＲＮａｓeの反応を停止させた。そして、前記反応液を１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（Ｌｏｎｚａ、スイス）で染色し、Ｅ−ＢＯＸ−ＶＸ２（エムエス機器、東京）を用いて分析した。【０２８７】
（２）結果
この結果を図３１に示す。図３１は、リボヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。図３１において、レーン「Ｍ」は、分子量マーカーであり、ｍｉｎは、インキュベート時間を示す。【０２８８】
図３１に示すように、比較例のＮＩ−００３０は、インキュベート１０分後において、ほぼ全てが分解された。これに対して、実施例のＮＫ−００３３およびＰＫ−０００７）は、インキュベート１０分後においても、残存していた。この結果から、本発明のｓｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡよりもリボヌクレアーゼ耐性に優れることがわかった。【０２８９】
（実施例Ａ１９）ヌクレアーゼ耐性
本発明のｓｓＲＮＡについて、ヌクレアーゼ耐性を確認した。【０２９０】
（１）材料および方法
前記実施例Ａ１８と同じＲＮＡを使用した。まず、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に、６０ｐｍｏｌの前記ＲＮＡ、０．５ユニットのＳ７ヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を混合し、３７℃にてインキュベートした。インキュベート開始（０ｈ）から０．５時間後に、定法に従ってＳ７ヌクレアーゼの反応を停止させた。そして、そして、前記反応液を定法に従い、７Ｍ尿素−１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（商品名、Ｌｏｎｚａ）で染色し、Ｅ−ＢＯＸ−ＶＸ２（商品名、エムエス機器）を用いて分析した。【０２９１】
（２）結果
この結果を図３２に示す。図３２は、Ｓ７ヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。図３２において、レーン「Ｍ」は、分子量マーカーである。また、ｈは、インキュベート時間を示す。【０２９２】
図３２に示すように、比較例のＮＩ−００３０は、インキュベート０．５時間後において、ほぼ全てが分解された。これに対して、実施例のＮＫ−００３３およびＰＫ−０００７は、インキュベート０．５時間後においても、残存していた。この結果から、本発明のｓｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡよりもＳ７ヌクレアーゼ耐性に優れることがわかった。【０２９３】
前記実施例Ａの各結果から、本発明のｓｓＲＮＡは、例えば、標的遺伝子の種類に依存することなく、構築可能であることがわかった。具体的に、前記ｓｓＲＮＡは、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）により形成される二重鎖の長さおよび前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）により形成される二重鎖の長さ、前記内部領域（Ｚ）において、二重鎖を形成しないフリー塩基の有無、個数および位置、ならびに、リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）の有無、種類および長さ等は、改変可能であることがわかった。このことから、本発明のｓｓＲＮＡは、遺伝子の発現抑制において、標的遺伝子の種類に依存することなく使用できる、汎用性の高い新たなツールであるといえる。【０２９４】
（実施例Ｂ１）
１．プロリノールの合成
下記式に示すスキーム１に従い、ジメトキシトリチル基で保護されたプロリノールを合成した。【０２９５】
【化１６】
2012005368.tif 000025
【０２９６】
（１）Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリノール（化合物２）
Ｌ−プロリノール（化合物１）（０．６１ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を、純水７０ｍＬに溶解し、Ｌ−プロリノール水溶液を調製した。Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニロキシ）スクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（２．０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ１０ｍＬに溶解した。このＴＨＦ溶液を、前記Ｌ−プロリノール水溶液に加え、１時間撹拌して、両者を反応させた。この反応液を、液体画分と沈殿画分とに分離し、それぞれの画分を酢酸エチルで抽出し、それぞれ有機層を回収した。そして、それぞれの有機層を合わせた後、無水硫酸ナトリウムを添加して、水分を吸収させた（以下、乾燥という）。前記有機層をろ過して、ろ液を回収し、前記ろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により精製し、化合物２を得た（１．４ｇ、収率７４％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）:  δ７．７７(２Ｈ，ｄ，Ｊ=７．７Ｈｚ，Ａｒ-Ｈ)，７．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），７．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），７．３１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．４０−４．５０（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），４．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ａｒ−ＣＨ），３．２０−３．８０（５Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−６），１．７５（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．４０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）．【０２９７】
（２）Ｆｍｏｃ−ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物３）
前記Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリノール（化合物２）（１．４ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を、ピリジン２０ｍＬに溶解して、３回共沸した。得られた残留物を、ピリジン２０ｍＬに溶解した。この溶液を、アルゴン下、氷浴中で、撹拌しながら、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒ−Ｃｌ）（１．８ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を添加した。この反応液について、クロロホルム／メタノールのＴＬＣにより反応を追跡し、Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリノールのスポットが消えるまで、４時間反応させた。そして、過剰のＤＭＴｒ−Ｃｌをクエンチするために、前記反応液に、メタノール３ｍＬを加えて１０分撹拌した。前記反応液に、さらに、クロロホルムを加えた後、有機層を回収した。回収した前記有機層に、飽和食塩水による洗浄、５％炭酸水素ナトリウム水溶液による洗浄を行い、もう一度、飽和食塩水による洗浄を行った。洗浄後の有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  クロロホルム、１％ピリジン）により精製し、化合物３を得た（２．０ｇ、収率７４％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），７．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），７．４０−７．１８（１３Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８９（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．２０−４．４０（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），４．０２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ａｒ−ＣＨ），３．８０−３．１０（５Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−６），３．７３（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），１．８４（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．５８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）．【０２９８】
（３）ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物４）
前記Ｆｍｏｃ−ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物３）（２．０ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を、２０％ピペリジンを含むＤＭＦ溶液２５ｍＬに溶解し、１２時間撹拌した。この溶液を減圧濃縮し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８５：１５、１％ピリジン含有）で精製し、化合物４を得た（１．０ｇ、収率７８％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．３１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），  ３．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−６），２．９０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５），１．８４（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．４０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）．【０２９９】
２．アミダイト誘導体の合成
つぎに、下記式に示すスキーム２に従い、プロリノールを有するアミダイト誘導体を合成した。以下、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を、「ＥＤＣ」、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（４−ジメチルアミノピリジン）を「ＤＭＡＰ」という。【０３００】
【化１７】
2012005368.tif 000026
【０３０１】
（１）ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリノール（化合物５）
前記ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物４）（０．８０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（０．４６ｇ、２．４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．２９ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン２０ｍＬに溶解して撹拌した。この溶液に、１０−ヒドロキシデカン酸（０．４５ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌した。この反応液について、酢酸エチルのＴＬＣにより反応を追跡し、ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノールのスポットが消えるまで、２０時間反応させた。そして、前記反応液に、ジクロロメタンを加えた後、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル、１％ピリジン含有）により精製し、化合物５を得た（０．７１ｇ，収率６２％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），  ６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．６８−２．９３（７Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．２７−１．７２（６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．５８（４Ｈ，ｓ，アルキル），１．３０（１０Ｈ，ｓ，アルキル）．【０３０２】
（２）ＤＭＴｒ−アルキル−Ｌ−プロリノール（化合物６）
前記ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物４）（０．８０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、メタノール１５ｍＬに溶解し、５−ヒドロキシペンタナール（０．３１ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。この溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．２５ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を加え、さらに撹拌した。この反応液について、酢酸エチル／ヘキサンのＴＬＣにより反応を追跡し、ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノールのスポットが消えるまで、２４時間反応させた。そして、前記反応液に、酢酸エチルを加え、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、１％ピリジン含有）により精製し、化合物６を得た（０．６２ｇ、収率６３％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．７０−２．８６（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＯＨ，Ｈ−６），２．０６−１．７９（５Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−２，Ｈ−５），１．７４−１．４９（６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．４５−１．２７（４Ｈ，ｍ，アルキル）．【０３０３】
（３）ＤＭＴｒ−ウレタン−Ｌ−プロリノール（化合物７）
１，４−ブタンジオール（０．９０ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン３０ｍＬに溶解し、さらに、カルボニルジイミダゾール（１．４ｇ、８．６ｍｍｏｌ）を加え、３時間撹拌した。この反応液の有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）により精製した。これによって、１，４−ブタンジオールの一方の末端がカルボニルジイミダゾールで活性化された化合物を得た（０．２５ｇ，１．５ｍｍｏｌ）。この化合物をジクロロメタン１５ｍＬに溶解し、前記ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物４）（０．６ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加し、２４時間撹拌した。この混合液に、さらに、酢酸エチルを加え、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、１％ピリジン含有）により精製し、化合物７を得た（０．６１ｇ、収率７７％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．２４−３．９４（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．７２−２．９６（７Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．１０−１．３０（８Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４）．【０３０４】
（４）ＤＭＴｒ−ウレイド−L−プロリノール（化合物８）
前記ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物４）（０．５０ｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびトリホスゲン（０．１２ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン８ｍＬに溶解し、アルゴン下、氷浴中で、撹拌した。そして、前記溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３１ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌した。さらに、前記溶液に、８−アミノ−１−オクタノール（０．１７ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を添加し、同様にして氷浴中で３０分撹拌した後、室温で２０時間撹拌した。前記溶液に、ジクロロメタンを加え、有機層を回収した。回収した前記有機層を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１、１％トリエチルアミン含有）により精製し、化合物８を得た（０．４４ｇ、収率６２％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．６８−３．２５（９Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＮＨ，ＣＨ２ＯＨ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），１．７４−１．１８（１６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４）．【０３０５】
（５）プロリノールを有するアミダイト誘導体（化合物９〜１２）
前記修飾プロリノール（化合物５〜８）を、それぞれ原料として、以下に示す方法により、化合物９〜１２を合成した。前記修飾プロリノールおよび５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾールを、アセトニトリル３ｍＬに溶解した。前記修飾プロリノールの使用量は、化合物５の場合、０．６９ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、化合物６の場合、０．６０ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、化合物７の場合、０．６０ｇ（１．２ｍｍｏｌ）、化合物８の場合、０．２５ｇ（０．４３ｍｍｏｌ）とした。また、５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾールの使用量は、化合物５〜７に対しては、０．１５ｇ（０．７８ｍｍｏｌ）、化合物８に対しては、５４ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）とした。前記溶液に、アルゴン下、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを添加し、２時間撹拌した。前記２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトの添加量は、前記化合物５〜７を使用した系では、０．５４ｇ（１．８ｍｍｏｌ）とし、前記化合物８を使用した系では、０．１９ｇ（０．６４ｍｍｏｌ）とした。そして、前記溶液に、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、さらに、ジクロロメタンで抽出し、有機層を回収した。回収した前記有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、１％トリエチルアミン含有）により精製し、化合物９〜１２を得た。以下に、各化合物のＮＭＲの結果を示す。【０３０６】
ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリノールアミダイト（化合物９、０．６０ｇ、収率５５％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．６８−２．９３（１１Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．２７−１．７２（６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．５８（４Ｈ，ｓ，アルキル），１．３０（２２Ｈ，ｓ，アルキル，ＣＨＣＨ３）．【０３０７】
ＤＭＴｒ−アルキル−Ｌ−プロリノールアミダイト（化合物１０、０．７１ｇ、収率６０％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．７０−２．８６（８Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−６），２．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．０６−１．７９（５Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−２，Ｈ−５），１．７４−１．４９（６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．３７−１．１０（１６Ｈ，ｍ，アルキル，ＣＨＣＨ３）．【０３０８】
ＤＭＴｒ−ウレタン−Ｌ−プロリノールアミダイト（化合物１１、０．６７ｇ、収率５２％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．２４−３．９４（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．７２−２．９６（１１Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．１０−１．４６（８Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．３４−１．１０（１２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ３）．【０３０９】
ＤＭＴｒ−ウレイド−Ｌ−プロリノールアミダイト（化合物１２、０．２０ｇ、収率６１％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．６５−３．２５（１３Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−２，ＣＨ２ＮＨ，ＣＨ２ＯＨ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．７３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．１０−１．４８（１６Ｈ，ｍ，アルキル，Ｈ−３，Ｈ−４），１．３５−１．１０（１２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ３）．【０３１０】
（実施例Ｂ２）
つぎに、下記式に示すスキーム３に従い、Ｌ−プロリンを有するアミダイト誘導体を合成した。【０３１１】
【化１８】
2012005368.tif 000027
【０３１２】
（１）ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドアミノ−Ｌ−プロリン（化合物１１）
ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（１．００ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）および５−ヒドロキシペンタナール（０．３３ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）を含むエタノール溶液（７ｍＬ）に、氷冷下、酢酸緩衝液（７ｍＬ）を加えた。この混合液を、氷冷下、２０分撹拌した後、シアノ化ホウ素ナトリウム（０．７７ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）を加え、さらに、室温下、７時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した後、さらに飽和食塩水で洗浄した。そして、前記有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９８：２、０．０５％ピリジン含有）に供した。ついで、得られた生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９８：２、０．０５％ピリジン含有）に供し、さらに、得られた生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ジクロロメタン：アセトン＝７：３、０．０５％ピリジン含有）に供した。これによって、無色シロップ状の化合物１１を得た（０．４９ｇ、収率４１％）。
Ｍｓ  （ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ５７５  （Ｍ＋）、３０３  （ＤＭＴｒ＋）【０３１３】
（２）ＤＭＴｒ−アミドアミノ−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物１２）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドアミノ−Ｌ−プロリン（化合物１１）（０．５０ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１７８ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３１３ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で、順次洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：アセトン＝７：３、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１２（０．５７ｇ、純度９３％、収率７９％）を得た。前記純度は、ＨＰＬＣにより測定した（以下、同様）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４３  （ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２８−７．３２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２５−７．２７（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１８−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８４（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、３．７３−３．８４（ｍ，１Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４７−３．６４（ｍ，３Ｈ）、３．１２−３．２６（ｍ，２Ｈ）、３．０５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．９８−２．０２（ｍ，２Ｈ）、２．６１（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．５５−２．６３（ｍ，２Ｈ）、２．２７−２．４２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．４０−１．９０（ｍ，８Ｈ）、１．２３−１．３３（ｍ，５Ｈ）、１．１４−１．２０（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ３）；
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ１４６．９１；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ７７４（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．【０３１４】
（３）ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドカルバモイル−Ｌ−プロリン（化合物１３）
ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（１．００ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）を溶解した無水アセトニトリル溶液（１０ｍＬ）に、１−イミダゾカルボニルオキシ−８−ヒドロキシオクタン（１．１２ｇ，４．９２ｍｍｏｌ）を溶解した無水アセトニトリル溶液（２０ｍＬ）を、アルゴン雰囲気下、室温で加えた。この混合液を、４０〜５０℃で２日間加熱した後、５日間室温で放置した。前記混合液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ジクロロメタン：アセトン＝４：１、０．０５％ピリジン含有）に供した。これによって、無色シロップ状の化合物１３を得た（０．６８ｇ、収率５０％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．４２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，６Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．７９−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．２３−４．３０（ｍ，１Ｈ）、４．０５−４．１０（ｍ，２Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６０−３．６５（ｍ，２Ｈ）、３．３２−３．５５（ｍ，２Ｈ）、３．１６−３．２９（ｍ，２Ｈ），３．０１−３．０７（ｍ，２Ｈ）、２．３８−２．４０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８３−１．９０（ｍ，２Ｈ）、１．５７−１．６９（ｍ，８Ｈ）、１．２６−１．３６（ｍ，２Ｈ）；
Ｍｓ  （ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ６０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．【０３１５】
（４）ＤＭＴｒ−アミドカルバモイル−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物１４）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドカルバモイル−Ｌ−プロリン（化合物１３）（０．６３ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２０６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下に脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２８２ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカを用いたカラムクロマト（展開溶媒  ヘキサン：アセトン＝７：３、０．５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１４（０．７４ｇ、純度１００％、収率８７％）を得た。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
Ｐ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ１４７．１９；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８６０（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．【０３１６】
（５）ＤＭＴｒ−ｔ−ブチルジメチルシロキシアミドウレイド−Ｌ−プロリン（化合物１５）
トリホスゲン（１．２２ｇ、４．１０ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気および氷冷下、無水テトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）を加えた。この混合液に、アルゴン雰囲気および氷冷下、ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（１．００ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（９．８０ｇ、７５．８ｍｍｏｌ）を溶解した無水テトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）を、３０分間で滴下し、その後、室温で１時間撹拌した。前記混合液に、アルゴン雰囲気および氷冷下、１０−アミノ−１−ｔ−ブチルジメチルシロキシデカン（２．６６ｇ、１０．２５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３．２０ｇ、２４．７６ｍｍｏｌ）を溶解した無水テトラヒドロフラン溶液（２０ｍＬ）を、４５分間で滴下した。そして、前記混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で一晩撹拌した。この混合液を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、有機層を回収した。前記有機層を、飽和重曹水で洗浄した後、さらに、飽和食塩水で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ジクロロメタン：アセトン＝４：１、０．０５％ピリジン含有）に供した。これによって、無色シロップ状の化合物１５を得た（０．８７ｇ、収率５５％）。【０３１７】
（６）ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドウレイド−Ｌ−プロリン（１６）
得られた前記ＤＭＴｒ−ｔ−ブチルジメチルシロキシアミドウレイド−Ｌ−プロリン（１５）（０．８７ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気下、無水テトラヒドロフランジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）を室温で加えた。前記混合液に、アルゴン雰囲気下、１ｍｏｌ／Ｌテトラブチルアンモニウムフルオリド含有テトラヒドロフラン溶液(４．６９ｍＬ、東京化成）を加え、室温で３日間撹拌した。前記混合液をジクロロメタン（１５０ｍＬ）で希釈し、水で洗浄した後、さらに飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ジクロロメタン：アセトン＝１：１、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１６を得た（０．６８ｇ、収率９２％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１９−７．２６（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１９−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８３（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．３４（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．６１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．３４−３．３７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．１６−３．２７（ｍ，５Ｈ），３．０４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３８−２．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８３−２．０５（ｍ，３Ｈ）、１．４５−１．６４（ｍ，８Ｈ）、１．２５−１．３８（ｍ，７Ｈ）．【０３１８】
（７）ＤＭＴｒ−アミドウレイド−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物１７）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシアミドウレイド−Ｌ−プロリン（化合物１６）（０．６２ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１９２ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合液に対し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２８２ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で、順次洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカを用いたカラムクロマト（展開溶媒  ヘキサン：アセトン＝１：１、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１７を得た（０．７７ｇ、純度８８％、収率８４％）。以下に、化合物のＮＭＲの結果を示す。
Ｐ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ１４７．２７；
Ｍｓ  （ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８６０（Ｍ＋＋１）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．【０３１９】
（実施例Ｂ３）プロリンジアミドアミダイトの合成
プロリン骨格を有するリンカーを含む本発明の核酸分子を生成するため、前記スキーム３により、Ｌ−プロリンジアミドアミダイトおよびＤ−プロリンジアミドアミダイトを合成した。【０３２０】
（Ｂ３−１）Ｌ−プロリンジアミドアミダイト
（１）Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物４）
前記スキーム３の化合物２（Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリン）を開始原料とした。前記化合物２（１０．００ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１−ブタノール（３．１８ｇ、３５．５６ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０．９０ｇ、７０．７２ｍｍｏｌ）を混合し、前記混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（１４０ｍＬ）を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．３４ｇ、３５．５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７０ｍＬ）を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水（２００ｍＬ）で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状の化合物４（１０．３４ｇ、収率８４％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．７６−７．８３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．５０−７．６３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３８−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２８−７．３３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．４０−４．４６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．１５−４．３１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．６７−３．７３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．３５−３．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．１８−３．３０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．２０−２．５０（ｍ，４Ｈ）、１．８１−２．０３（ｍ，３Ｈ）、１．４７−１．５４（ｍ，２Ｈ）；
Ｍｓ  （ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ４０９（Ｍ＋Ｈ＋）．【０３２１】
（２）ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物４）（７．８０ｇ、１９．０９ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍＬ）と混合し、室温で２回共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８．２０ｇ、２４．２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（３９ｍＬ）を加えた。この混合物を、室温で１時間撹拌した後、メタノール（７．８ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（１５０ｍＬ）で洗浄後、有機層を分離した。前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド（３９ｍＬ）およびピペリジン（１８．７ｍＬ、１８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、前記混合液について、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（商品名Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００、展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１、０．０５％ピリジン含有に供し、淡黄色油状の化合物６（９．１１ｇ、収率９８％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．３９−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７，２１（ｔｔ，１Ｈ，４．９，１．３Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ）、６．８１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．７１（ｄｄ，Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，５．４Ｈｚ，ＣＨ）、３．２１（２Ｈ，１２．９，６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．０５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．８５−２．９１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０８−２．１７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８５−２．００（ｍ，３Ｈ）、１．５５−１．６５（ｍ，５Ｈ）：
Ｍｓ  （ＦＡＢ＋）；  ｍ／ｚ  ４８９（Ｍ＋Ｈ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．【０３２２】
（３）ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（化合物８）
得られた前記ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（６．０１ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．８３ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．９８ｇ、２９．４７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．４７ｇ、４４．２１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１２０ｍＬ）を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、６−ヒドロキシヘキサン酸（１．９５ｇ、１４．４７ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、１時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタン（６００ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（８００ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を回収し、前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色泡状の前記化合物８（６．２９ｇ、収率８５％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１９−７．２６（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．７９−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．５０−３．５５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．３６−３．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．１５−３．２４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３８−２．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，６．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．４８−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；
Ｍｓ  （ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ６０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．【０３２３】
（４）ＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物１０）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（化合物８）（８．５５ｇ、１４．１８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で３回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２．９１ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１０ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５．１３ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水（２００ｍＬ）で３回洗浄した後、飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝１：３、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１０（１０．２５ｇ、純度９２％、収率８３％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．４２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２９−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２５−７．２７（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７５−３．９３（ｍ，４Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４５−３．６０（ｍ，４Ｈ）、３．３５−３．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．２０−３．２９（ｍ，１Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．６２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．４０−２．４４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．０２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７０−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５１−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．１８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）、１．１６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）；
Ｐ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  Ｍｓδ１４７．１７；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．【０３２４】
（Ｂ３−２）Ｄ−プロリンジアミドアミダイト
（１）Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｄ−プロリン（化合物３）
前記スキーム３の化合物１（Ｆｍｏｃ−Ｄ−プロリン）を開始原料とした。前記化合物１（１．５ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．１ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．５ｇ、１０．６９ｍｍｏｌ）の混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（２４ｍＬ）を室温で加え、さらに、４−アミノ−１−ブタノール（０．４８ｇ、５．３４ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（６ｍＬ）添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で３回、飽和重曹水で３回洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒留去し、その残渣にジエチルエーテル（５０ｍＬ）を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、白色粉末状の化合物３を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：  δ７．７７（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）；７．５８（ｂｒ，２Ｈ）；７．４１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）；７．３２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）；  ４．２５−４．４３（ｍ，４Ｈ）；３．２５−３．６１（ｍ，６Ｈ）；１．５７−１．９２（ｍ，８Ｈ）．
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ４０９（Ｍ＋Ｈ＋）．【０３２５】
（２）ＤＭＴｒ−アミド−Ｄ−プロリン（化合物５）
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｄ−プロリン（化合物３）（１．０ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍＬ）と混合し、室温で２回共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．０５ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（３ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（５ｍＬ）を加えた。この混合物を、室温で１時間撹拌した後、メタノール（１ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄後、有機層を分離した。前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）およびピペリジン（２．４ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、前記混合液について、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（商品名Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−３００、展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１、０．０５％ピリジン含有）に供し、淡黄色油状の化合物５（１．２６ｇ、収率９６％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ７．６２（ｂｒ，１Ｈ）；７．４１−７．４４（ｍ，２Ｈ）；７．２６−７．３３（ｍ，６Ｈ）；７．１７−７．２２（ｍ，１Ｈ）；６．８０−６．８４（ｍ，４Ｈ）；３．７８（ｓ，６Ｈ）；３．７１（ｄｄ，Ｊ＝８．８，５．４Ｈｚ，１Ｈ）；３．２２  （ｑ，６．５Ｈｚ，２Ｈ）；３．０７（ｔ，  Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）；２．９７−３．０３（ｍ，１Ｈ）；２．８５−２．９１（ｍ，１Ｈ）；１．８５−２．１５（ｍ，３Ｈ）；１．５５−１．７３（ｍ，６Ｈ）．
ＭＳ  （ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ４８９  （Ｍ＋Ｈ＋），  ３０３（ＤＭＴｒ＋）．【０３２６】
（３）ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｄ−プロリン（化合物７）
得られた前記ＤＭＴｒ−アミド−Ｄ−プロリン（化合物５）（１．２ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（５６６ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（７９６ｍｇ、５．８９ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（１．２ｍＬ、８．８４ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（２４ｍＬ）を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、６−ヒドロキシヘキサン酸（３９０ｍｇ、２．９５ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で１時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で３回洗浄した。有機層を回収し、前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色油状の化合物７（１．４ｇ、収率９５％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．４３（ｍ，２Ｈ）；７．２５−７．３２（ｍ，６Ｈ）；７．１７−７．２２（ｍ，１Ｈ）；６．７９−６．８３（ｍ，４Ｈ）；３．７９（ｓ，６Ｈ）；３．５８−３．６３（ｍ，２Ｈ）；３．４９−３．５５（ｍ，１Ｈ）；３．１５−３．２６（ｍ，２Ｈ）；３．０２−３．０７（ｍ，２Ｈ）；２．３０−２．３３（ｍ，２Ｈ）；２．１１−２．２０（ｍ，１Ｈ）；１．５０−１．９９（ｍ，１３Ｈ）；１．３６−１．４３（ｍ，２Ｈ）．
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ６０２（Ｍ＋），３０３（ＤＭＴｒ＋）．【０３２７】
（４）ＤＭＴｒ−ジアミド−Ｄ−プロリンアミダイト（化合物９）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｄ−プロリン（化合物７）（１．２ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で３回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（４１０ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（２．４ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（７２２ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で３回洗浄後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝１：３）に供し、無色油状の化合物９（１．４ｇ、純度９５％、収率８３％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．４３（ｍ，２Ｈ）；７．２５−７．３２（ｍ，６Ｈ）；７．１４−７．２１（ｍ，１Ｈ）；６．８０−６．８３（ｍ，４Ｈ）；３．８０−３．８５（ｍ，２Ｈ）；３．７９（ｓ，６Ｈ）；３．４９−３．６５（ｍ，５Ｈ）；３．０２−３．０６（ｍ，２Ｈ）；２．６０−２．６３（ｍ，２Ｈ）；２．２９−２．３３（ｍ，２Ｈ）；１．７７−１．８２（ｍ，２Ｈ）；１．５６−１．６８（ｍ，８Ｈ）；１．３８−１．４３（ｍ，２Ｈ）；１．１５−１．２９（ｍ，１８Ｈ）．
３１Ｐ−ＮＭＲ  （１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：  δ１４６．９４．
ＭＳ  （ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８０２（Ｍ＋），３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．【０３２８】
（実施例Ｂ４）
プロリン骨格を有するリンカーを含む本発明の核酸分子を生成するため、下記スキーム４により、Ｌ−プロリンジアミドアミダイトタイプＢを合成した。【０３２９】
【化１９】
2012005368.tif 000028
【０３３０】
（１）Ｆｍｏｃ−ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１８）
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物４）（２．００ｇ、３０ｍｍｏｌ）、ｔ−ブチル−ジメチルシリルクロリド（１．１１ｇ、３５ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（１０．９０ｇ、７１ｍｍｏｌ）を混合した。前記混合物に対し、減圧下に脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（２０ｍＬ）を室温で加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。反応終了後、前記混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、水で３回洗浄し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９５：５）に供し、無色シロップ状の化合物１８（２．３５ｇ、収率９２％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．７６−７．７８（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．５０−７．６３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３８−７．４２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２９−７．３４（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．１０−４．４６（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２），３．４７−３．５９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２）、３．２０−３．２６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ）、１．８５−１．９５（ｍ，２Ｈ）、１．４２−１．５５（ｍ，６Ｈ）、０．９６（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）、０．０２（ｓ，６Ｈ，ＳｉＣＨ３）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ５２３（Ｍ＋Ｈ＋）．【０３３１】
（２）ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１９）
得られた前記Ｆｍｏｃ−ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１８）（１．１８ｇ、２．５ｍｍｏｌ）に対し、無水アセトニトリル（５ｍＬ）およびピペリジン（２．４ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、前記混合物にアセトニトリル（５０ｍＬ）を加え、不溶物をろ別した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１）に供し、無色シロップ状の化合物１９（０．６１ｇ、収率９０％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ３．７１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，５．２Ｈｚ，ＣＨ）、３．６１−３．６４  （ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．２２−３．２８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．９８−３．０４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．８６−２．９１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．０８−２．１７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８６−１．９３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．６６−１．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．５２−１．５７（ｍ，４Ｈ）、０．８９（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）、０．０５（ｓ，６Ｈ，ＳｉＣＨ３）：
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）；  ｍ／ｚ  ３０１  （Ｍ＋Ｈ＋）．【０３３２】
（３）ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミドヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン  （化合物２０）
得られた前記ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１９）（５５０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）、６−ヒドロキシヘキサン酸（３００ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（４３４ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６９５ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）を混合した。前記混合物に、アルゴン雰囲気下、室温で、トリエチルアミン（６８９ｍｇ、６．８ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、終夜撹拌した。前記混合液を飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、前記を硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１）に供し、無色シロップ状の化合物２０（６９６ｍｇ、収率９２％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ４．５４（ｄ，１Ｈ，ＣＨ）、３．５８−３．６７（ｍ，５Ｈ）、３．５２−３．５６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．３２−３．３９（ｍ，１Ｈ），３．２０−３．２５（ｍ，２Ｈ）、２．４０−２．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２５（ｍ，２Ｈ）、１．９３−２．０３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５０−１．７３（ｍ，８Ｈ）、１．３７−１．４６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、０．８７（ｓ，  ９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）、０．０４（ｓ，６Ｈ，ＳｉＣＨ３）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ４１５（Ｍ＋＋１）．【０３３３】
（４）ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリンタイプＢ（化合物２１）
得られた前記ｔ−ブチル−ジメチルシロキシアミドヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物２０）（６４０ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１ｍＬ）と混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（６５７ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ）および無水ピリジン（５ｍＬ）を加え、室温で４時間撹拌した後、メタノール（１ｍＬ）を加え、３０分室温で撹拌した。前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣に、無水アセトニトリル（５ｍＬ）および１ｍｏｌ／Ｌテトラブチルアンモニウムフルオリド含有テトラヒドロフラン溶液（１．４２ｍＬ、テトラブチルアンモニウムフルオリド１．４２ｍｍｏｌ）を加え、室温で終夜撹拌した。反応終了後、前記混合物に酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え、水で洗浄した後、飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９５：５、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物２１（６８０ｍｇ、収率７３％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４４（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２６−７．３３（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１８−７．２１（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８４（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｄ，６．８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６１（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ，５．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．５０−３．５４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．３６−３．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．２０−３．２６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．０５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３８−２．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５２−１．６７（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ６０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．【０３３４】
（５）ＤＭＴｒ−ジアミド−Ｌ−プロリンアミダイトタイプＢ（化合物２２）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン  タイプＢ（化合物２１）（６３７ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２０１ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３５０ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：アセトン＝７：３）に供し、無色シロップ状の化合物２２（６８０ｍｇ、純度９５％、収率７６％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２５−７．３２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８３（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７５−３．９３（ｍ，３Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４６−３．６８（ｍ，５Ｈ）、３．３４−３．４１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．１０−３．３１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．０５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．６２（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３９−２．４６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．２９（ｔ，７．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９０−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７０−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５１−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．１８（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）、１．１６（ｄ，Ｊ＝６．４  Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）；
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＨ３ＣＮ）：  δ１４６．９０；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８０３（Ｍ＋＋１）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．【０３３５】
（実施例Ｂ５）
プロリン骨格を有するリンカーを含む本発明の核酸分子を生成するため、下記スキーム５により、ＤＭＴｒ−アミドエチレンオキシエチルアミノ−Ｌ−プロリンアミダイト（以下、ＰＥＧスペーサータイプという）を合成した。【０３３６】
【化２０】
2012005368.tif 000029
【０３３７】
（１）ＤＭＴｒ−アミドヒドロキシエトキシエチルアミノ−Ｌ−プロリン（化合物２３）
ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物６）（１．００ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）、４−トルエンスルホン酸２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルエステル（３．１０ｇ、１２．３０ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（０．８５ｇ、６．１５ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド溶液（１０ｍＬ）を混合し、アルゴン雰囲気下、室温で４日間撹拌した。前記混合物について、減圧化、室温で溶媒を留去した後、ジクロロメタン（２０ｍＬ）を加え、ろ過した。ろ液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーの添加溶媒は、まず、０．０５％ピリジンを含む酢酸エチルを使用した後、０．０５％ピリジンを含むＣＨ２Ｃｌ２とＣＨ３ＯＨの混合液（ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：：１）を使用した。その結果、無色シロップ状の化合物２３（１．１５ｇ、収率９７％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４５（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，６Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．７９−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６０−３．７０（ｍ，２Ｈ）、３．３９−３．５７（ｍ，４Ｈ），３．１３−３．２７（ｍ，３Ｈ），３．０７−３．０８（ｍ，２Ｈ）、２．７１−２．８４（ｍ，１Ｈ）、２．３８−２．４６（ｍ，１Ｈ）、２．１４−２．１９（ｍ，１Ｈ）、１．８４−１．８７（ｍ，１Ｈ）、１．５７−１．７６  （ｍ，８Ｈ）．【０３３８】
（２）ＤＭＴｒ−アミドエチレンオキシエチルアミノ−Ｌ−プロリンアミダイト（化合物２４）
得られた前記ＤＭＴｒ−アミドヒドロキシエトキシエチルアミノ−Ｌ−プロリン（化合物２３）（０．６３ｇ、１．００ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと混合し、室温で共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２０６ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（２８２ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：アセトン＝７：３、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物２４（０．７４ｇ、純度１００％、収率８７％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）：  δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２８−７．３１（ｍ，６Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１８−７．２２（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８４−６．８６（ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ）、３．７３−３．８４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４７−３．６４（ｍ，７Ｈ）、３．１５−３．２３（ｍ，１Ｈ）、３．１１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．０１（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．９５−２．９９（ｍ，１Ｈ）、２．５８−２．６３（ｍ，２Ｈ）、２．３１−２．３５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．４８−１．７８（ｍ，１０Ｈ）、１．１２−１．５７（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ３）；
Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）  ：δ１４８．００；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ７７６（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）  ２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．【０３３９】
（実施例Ｂ６）
１．保護プロリノールの合成
以下に示すスキーム６に従い、ジメトキシトリチル基で保護されたプロリノール（化合物３）を合成した。【０３４０】
【化２１】
2012005368.tif 000030
【０３４１】
（１）トリフルオロアセチル−Ｌ−プロリノール(化合物１) 
Ｌ−プロリノール(２．０ｇ、２０ｍｍｏｌ)をＴＨＦ２０ｍＬに溶解した。他方、トリフルオロ酢酸エチル(３．０ｇ、２１ｍｍｏｌ)をＴＨＦ２０ｍＬに溶解した。そして、後者のＴＨＦ溶液を、前者のＬ−プロリノール含有ＴＨＦ溶液に滴下し、１２時間撹拌した。この反応液を減圧濃縮し、化合物1を得た(３．７ｇ、収率９７％)。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ４．２８−４，２３（１．０Ｈ，ｍ，ＯＨ），３．９０−３．４１（５Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６，ｍ），  ２．２７−１．７７（４Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４，ｍ）．【０３４２】
（２）トリフルオロアセチル−ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物２）
得られた前記トリフルオロアセチル−Ｌ−プロリノール（化合物１）（３．７ｇ、１９ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解して、３回、室温で共沸乾燥した。得られた残留物をピリジン１５ｍＬに溶かし、アルゴン下、氷浴中で撹拌しながら、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒ−Ｃｌ）（８．１ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加え、さらに、室温で４時間反応させた。そして、過剰のＤＭＴｒ−Ｃｌをクエンチするために、前記反応液に、さらに、メタノール１０ｍＬを加え１０分撹拌した。その後、前記反応液に、ジクロロメタンを加え飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。洗浄後の回収した有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９５：５、０．１％ピリジン含有）に供し、精製した化合物２を得た（８．５ｇ、収率８９％）。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．３９−７．１８（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．７０−３．４１（５Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６，  ｍ），２．１９−１．８５（４Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４，ｍ）．【０３４３】
（３）ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物３）
得られた前記トリフルオロアセチル−ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物２）（５ｇ、１０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１００ｍＬに溶解した。このＴＨＦ溶液に５％水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬを加え、撹拌した。この溶液に、１Ｍ  フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）溶液５ｍＬ加え、室温で１２時間撹拌した。この反応液を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。洗浄後の回収した有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、化合物３を得た（３．６ｇ、収率９０％）。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ３），３．３１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），３．０７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−６），２．９０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５），１．８４（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．４０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）．【０３４４】
２．アミダイト誘導体の合成
前記「１．」で合成した保護プロリノール（化合物３）を用いて、下記スキーム７により、結合形式が異なる、プロリノールを有するアミダイト誘導体を合成した。【０３４５】
【化２２】
2012005368.tif 000031
【０３４６】
（１）ＤＭＴｒ−ウレタン−Ｌ−プロリノール（化合物４）
１，８−オクタンジオール（９．０ｇ、６２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ９０ｍＬに溶解し、アルゴン下に置いた。他方、カルボニルジイミダゾール（２．０ｇ、１２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１０ｍＬに溶解した。後者のＴＨＦ溶液を、前者のＴＨＦ溶液に加え、室温で１時間撹拌した。この反応液を、１，８−オクタンジオールのＴＬＣスポットが消えるまで、水で洗浄した。さらに、洗浄後に回収した有機層を、飽和食塩水で洗浄し、回収した有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮した。その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９５：５）に供し、精製した化合物を得た。この化合物は、１，８−オクタンジオールの片末端がカルボニルジイミダゾールで活性化された化合物であった（２．３ｇ、収率７７％）。【０３４７】
前記化合物０．９ｇをアセトニトリル１０ｍＬで溶解し、アルゴン下においた。他方、ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物３）（１．９ｇ、４．８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル２０ｍＬに溶解した。後者のアセトニトリル溶液を、前記前者のアセトニトリル溶液に加え、室温で２４時間撹拌した。そして、この反応液を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、回収した有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮した。その残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ジクロロメタン：アセトン＝９：１、０．１％ピリジン含有）に供し、精製した化合物４（プロリノールウレタンアミダイト）を得た（１．５ｇ、収率６５％）。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．２４−３．９４（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．７２−２．９６（７Ｈ，ｍ，ａｌｋｙｌ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．１０−１．３０（１６Ｈ，ｍ，ａｌｋｙｌ，Ｈ−３，Ｈ−４）．
ＦＡＢ−ＭＳ：５７６  ［Ｍ＋Ｈ］＋．【０３４８】
（２）ＤＭＴｒ−ウレイド−Ｌ−プロリノール（化合物５）
アルゴン下、トリホスゲン（２．０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１０ｍＬに溶解し、０℃で撹拌した。他方、ＤＭＴｒ−Ｌ−プロリノール（化合物３）（１．３ｇ、３．２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６ｇ、１２４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１０ｍＬに溶解し、前記トリホスゲンのＴＨＦ溶液に滴下した。この反応液を、０℃で１時間、続いて、室温で２時間撹拌した。そして、８−アミノ−１−オクタノール（２．３ｇ、１６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５．０ｇ、３８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ３０ｍＬに溶解した。このＴＨＦ溶液に、前記撹拌後の反応液を滴下し、０℃で１時間、続いて、室温で４８時間撹拌した。この反応液を減圧濃縮し、その残渣をジクロロメタンに溶解した。この溶液を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、回収した有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮し、その残渣を、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して、精製した。この際、展開溶媒は、０．１％ピリジンを含有するアセトンと水との混合溶媒を使用し、前記アセトンと水との混合割合は、ステップワイズとし、具体的には、アセトン：水のモル比を、２：８、３：７、４：６および５：５の順に変化させた。目的の化合物５を含むフラクションを、ジクロロメタンで抽出し、この有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記有機層をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮し、化合物５（プロリノールウレイドアミダイト）を得た（０．９ｇ、収率４９％）。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．６８−３．２５（９Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＮＨ，ＣＨ２ＯＨ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），１．７４−１．１８（１６Ｈ，ｍ，ａｌｋｙｌ，Ｈ−３，Ｈ−４）．
ＦＡＢ−ＭＳ  ：５７５  ［Ｍ＋Ｈ］＋．【０３４９】
（３）プロリノールを有するアミダイト誘導体（化合物６および７）
修飾プロリノールとして、得られた前記化合物４（０．８０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶解し、室温で３回共沸乾燥した。得られた残留物をアセトニトリル１ｍＬに溶解し、アルゴン下においた。このアセトニトリル溶液に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．２４ｇ，１．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応液とした。他方、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．５０ｇ、１．７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１ｍＬに溶解した。これを、前記反応液に添加し、室温で４時間撹拌した。前記反応液に、ジクロロメタンを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した。洗浄後の回収した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、前記有機層をろ過して、得られたろ液を減圧濃縮した。その残渣を、アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒ヘキサン：アセトン＝１０：１、０．１％ピリジン含有）に供し、精製した化合物６（ＤＭＴｒ−ウレタン−Ｌ−プロリノールアミダイト）（０．９０ｇ、収率８３％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ），４．２４−３．９４（２Ｈ，ｍ，ＣＯＯＣＨ２），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．７２−２．９６（１１Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．５８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．１０−１．４６（１６Ｈ，ｍ，ａｌｋｙｌ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．３４−１．１０（１２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ３）。３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）δ  １４６．８２．
ＦＡＢ−ＭＳ：７７６  ［Ｍ＋Ｈ］＋．【０３５０】
前記修飾プロリノールとして、前記化合物４に代えて、前記化合物５を使用した以外は、同様に処理を行い、精製した化合物７（ＤＭＴｒ−ウレイド−Ｌ−プロリノールアミダイト）（０．８０ｇ、収率７４％）を得た。以下に、前記化合物のＮＭＲの結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．１４（９Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），６．８２（４Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３），３．６５−３．２５（１３Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ，ＰＯＣＨ２，ＣＨＣＨ３，Ｈ−２，ＣＨ２ＮＨ，ＣＨ２ＯＨ，Ｈ−２，Ｈ−５，Ｈ−６），２．７３（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＮ），２．１０−１．４８（１６Ｈ，ｍ，ａｌｋｙｌ，Ｈ−３，Ｈ−４），１．３５−１．１０（１２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ３）．
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ）δ  １４６．８３．
ＦＡＢ−ＭＳ：７７５  ［Ｍ＋Ｈ］＋．【０３５１】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【０３５２】
この出願は、２０１０年７月８日に出願された日本出願特願２０１０−１５６１２２、２０１０年１０月１３日に出願された日本出願特願２０１０−２３０８０８、２０１０年１２月２日に出願された日本出願特願２０１０−２６９８２４、２０１０年８月３日に出願された日本出願特願２０１０−１７４９１５、２０１０年１０月１３日に出願された日本出願特願２０１０−２３０８０６、および２０１０年１２月２日に出願された日本出願特願２０１０−２６９８２３を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０３５３】
本発明の一本鎖核酸分子によれば、遺伝子の発現抑制が可能であり、かつ、環状ではないため、その合成が容易であり、また、一本鎖であるため、二本鎖のアニール工程が無く、効率良く製造可能である。本発明のｓｓＮｃ分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月30日(2012.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ核酸分子であって、
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列のみからなり、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９塩基〜３０塩基であり、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と完全に相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と完全に相補的であり、
前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記（ａ）、（ｂ）および（ｄ）のいずれかの条件を満たし、
（ａ）下記式（３）、（４）、（１１）および（１２）の条件を満たす
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１２）
（ｂ）下記式（５）、（６）、（１３）および（１４）の条件を満たす
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１、２または３  ・・・（１４）
（ｄ）下記式（９）、（１０）、（１７）および（１８）の条件を満たす
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１８）
前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が１〜３塩基であるか、または、前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が１〜３塩基であり、
５’末端と３’末端とが未結合であることを特徴とする一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項２】
前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とが連結している、請求項１記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項３】
前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが連結している、請求項１または２記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項４】
前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とが連結し、
前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、
前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが連結している、請求項１記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項５】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記式（１）および（２）の条件を満たす、請求項１から４のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ      ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【請求項６】
少なくとも１つの修飾された残基を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項７】
標識物質を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項８】
安定同位体を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項９】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）が、
ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基の少なくとも一つから構成される、請求項２から８のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド残基が、非修飾ヌクレオチド残基および／または修飾ヌクレオチド残基である、請求項９記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１１】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）が、下記（１）〜（７）のいずれかの残基で構成される、請求項９または１０記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【請求項１２】
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子において、塩基数の合計が、５０塩基以上である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１３】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１４】
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子の塩基配列が、
配列番号２、８、１３、２９−３２、３７、４３、４４、４７、４８、５１−５３および６２−７９のいずれかの塩基配列である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１５】
標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖ＲＮＡ核酸分子であって、
前記核酸分子の塩基配列が、配列番号５４−５７、６０、６１および７のいずれかの塩基配列であることを特徴とする一本鎖ＲＮＡ核酸分子。
【請求項１６】
標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項１８】
炎症治療用である、請求項１７記載の薬学組成物。
【請求項１９】
非ヒト動物において標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項２０】
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項１９記載の発現抑制方法。
【請求項２１】
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与する、請求項１９または２０記載の発現抑制方法。
【請求項２２】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項２４】
非ヒト動物において標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする発現誘導方法。
【請求項２５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡの発現を誘導する方法であって、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を使用することを特徴とする発現誘導方法。
【請求項２６】
非ヒト動物の疾患の治療方法であって、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ核酸分子を、前記非ヒト動物に投与する工程を含み、
前記一本鎖ＲＮＡ核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする治療方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の一本鎖核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例におけるＡ５４９細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例における２９３細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例における各投与群における単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１遺伝子発現量を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例における各投与群におけるＢＡＬＦサンプル中の細胞数を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例における各投与群におけるＢＡＬＦサンプル中の好中球の細胞数を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例におけるＢＡＬＦサンプル中の細胞のギムザ染色の結果を示す写真であり、（Ａ）は、ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４の結果であり、（Ｂ）は、ＬＰＳ（＋）／ネガティブコントロールＮＫ−００３５（＋）の投与群６の結果であり、（Ｃ）は、ＬＰＳ（＋）／ＮＫ−００３３（＋）の実施例投与群５の結果を示す。
【図１３】図１３は、本発明の実施例における肺組織のＨＥ染色の結果を示す写真であり、（Ａ）は、ＬＰＳ（＋）／ＲＮＡ（−）の投与群４の結果であり、（Ｂ）は、ＬＰＳ（＋）／ネガティブコントロールＮＫ−００３５（＋）の投与群６の結果であり、（Ｃ）は、ＬＰＳ（＋）／ＮＫ−００３３（＋）の実施例投与群５の結果を示す。
【図１４】図１４（Ａ）は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子の発現量を示す結果であり、図１４（Ｂ）は、本発明の実施例におけるＩＦＮ−α遺伝子の発現量を示す結果であり、図１４（Ｃ）は、本発明の実施例におけるＩＦＮ−β遺伝子の発現量を示す結果である。
【図１５】図１５は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１７】図１７は、本発明の実施例における各投与群における単位重量の肺あたりのＴＧＦ−β１発現量を示すグラフである。
【図１８】図１８（Ａ）は、本発明の実施例における各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＴＮＦ−α量を示すグラフであり、図１８（Ｂ）は、本発明の実施例における各投与群のＢＡＬＦサンプル中のＩＦＮ−β量を示すグラフである。
【図１９】図１９は、本発明の実施例における２９３細胞のＬＡＭＡ１遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図２０】図２０は、本発明の実施例におけるＡ５４９細胞のＬＭＮＡ遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図２１】図２１は、本発明の実施例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図２２】図２２は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図２３】図２３は、本発明の実施例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図２４】図２４は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図２５】図２５は、本発明の実施例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図２６】図２６は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図２７】図２７は、本発明の実施例で使用したｓｓＲＮＡを示す図である。
【図２８】図２８は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図２９】図２９は、本発明の実施例におけるＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図３０】図３０は、本発明の実施例におけるＨＣＴ１１６細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図３１】図３１は、本発明の実施例におけるリボヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。
【図３２】図３２は、本発明の実施例におけるＳ７ヌクレアーゼ耐性を示す電気泳動写真である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
前記内部領域（Ｚ）は、前述のように、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成される」と表わすものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とが、例えば、前記ｓｓＮｃ分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、Ｃ−２の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素、または硫黄で置換されてもよい。前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合、または、炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素基が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記ピロリジン骨格のいずれの基を介して、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と結合してもよく、好ましくは、前記５員環のいずれか一個の炭素原子と窒素であり、好ましくは、前記５員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。前記ピロリジン骨格としては、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられる。前記プロリン骨格およびプロリノール骨格等は、例えば、生体内物質およびその還元体であるため、安全性にも優れる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
前記式（Ｉ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
前記置換基は、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）であり；
Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよく；
Ｒ４およびＲ５は、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよく；
Ｌ１は、ｎ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨもしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、または硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合、または、炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）が前記式（Ｉ）で表わされる場合、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合する。また、前記リンカー領域（Ｌｙ）が前記式（Ｉ）で表わされる場合、前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ)である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４または８、前記（Ｉ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（Ｉ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（Ｉ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（Ｉ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（Ｉ−４ａ）に、前記式（Ｉ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（Ｉ−６ａ）に示す。
【化３】
2012005368.tif 000064
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
比較例のＲＮＡとして、以下に示す、ＲＮＡｉポジティブコントロール（Ｐｃ）のｄｓＲＮＡ（ＮＩ−００１１）を合成した。ＮＩ−００１１は、各一本鎖の３’末端に２塩基のオーバーハングを有し、配列番号４の一本鎖が、前記ＮＫ−００１６と同様に、前記１９塩基長の発現抑制配列を有している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６５】
（１）材料および方法
実施例のＲＮＡとして、図２５に示すｓｓＲＮＡを使用した。図２５において、５’側から、小文字下線の領域は、前記領域（Ｘｃ）、大文字下線の領域は、前記内部５’領域（Ｘ）、小文字下線の領域は、前記領域（Ｙｃ）を示す。また、「Ｘｃ／Ｘ」は、前記領域（Ｘｃ）の塩基長（Ｘｃ）と、前記領域（Ｘ）の塩基長（Ｘ）との比を示す。図２５において、「＊」は、フリー塩基を示す。下記ＲＮＡの配列は、配列番号７４〜７６に示す。
【国際調査報告】
2012005368.tif 000065
2012005368.tif 000066
2012005368.tif 000067
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