(57)【要約】  幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞へ選択的に分化誘導しうる分化誘導剤を提供することを課題とし、さらに幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への分化誘導方法を提供する。以下の一般式(I)で表される化合物を含む分化誘導剤による。2011062013.tif 000031（式中、R1は酸素原子、H2、又はフェニル基で置換されているC1-C9のアルキル基であり、R2は水素原子、-OH又はC1-C9のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、R3とR4は結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成するか、又はR3とR4は各々独立して水素原子、-O又はC1-C9のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、並びに、R5とR6は、結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成するか、各々独立して水素原子又はC1-C9のアルキル基であってもよい；ここで、環状アルキル、環状アルケニル、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は任意にそれぞれ独立して、水素原子、-OH、脂肪族エステル、脂肪族ジカルボン酸エステル及びハロゲンから選択される１個以上の置換基によって置換されていてもよい。）
2011062013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソキノリン骨格を有する化合物を有効成分とする、幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への分化誘導剤。
【請求項２】
イソキノリン骨格を有する化合物が、以下の一般式(I)で表される化合物である請求項１に記載の分化誘導剤。
【化１】
2011062013.tif 000022
（式中、R1は酸素原子、H2、又はフェニル基で置換されているC1-C9のアルキル基であり、R2は水素原子、-OH又はC1-C9のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、R3とR4は結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成するか、又はR3とR4は各々独立して水素原子、-O又はC1-C9のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、並びに、R5とR6は、結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成するか、各々独立して水素原子又はC1-C9のアルキル基であってもよい；ここで、環状アルキル、環状アルケニル、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は任意にそれぞれ独立して、水素原子、-OH、脂肪族エステル、脂肪族ジカルボン酸エステル及びハロゲンから選択される１個以上の置換基によって置換されていてもよい。）
【請求項３】
イソキノリン骨格を有する化合物が、以下の一般式(II)で表される化合物である請求項１に記載の分化誘導剤。
【化２】
2011062013.tif 000023
（式中、R1は酸素原子、H2、又はフェニル基で置換されているC1-C9のアルキル基であり、R2、R7〜R12は、各々独立して水素原子、-OH又はC1-C9のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、R2とR8、又はR2とR12は、結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成していてもよく、並びに、R5とR6は、結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成するか、各々独立して水素原子又はC1-C9のアルキル基であってもよい；ここで、環状アルキル、環状アルケニル、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は任意にそれぞれ独立して、水素原子、-OH、脂肪族エステル、脂肪族ジカルボン酸エステル及びハロゲンから選択される１個以上の置換基によって置換されていてもよい；ここで、Ａ環は任意の位置に二重結合を有していてもよい。）
【請求項４】
イソキノリン骨格を有する化合物のうち、一般式(II)で表される化合物のうち、R10が-OHである請求項３に記載の分化誘導剤。
【請求項５】
イソキノリン骨格を有する化合物のうち、一般式(II)で表される化合物のうち、R12が水素原子である請求項３又は４に記載の分化誘導剤。
【請求項６】
イソキノリン骨格を有する化合物が、以下の式(III)〜(IX)のいずれかで表される化合物である請求項１〜３のいずれか１に記載の分化誘導剤。
【化３】
2011062013.tif 000024
【化４】
2011062013.tif 000025
【化５】
2011062013.tif 000026
【化６】
2011062013.tif 000027
【化７】
2011062013.tif 000028
【化８】
2011062013.tif 000029
【化９】
2011062013.tif 000030
【請求項７】
幹細胞が、ES細胞、iPS細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１〜６のいずれか１に記載の分化誘導剤。
【請求項８】
幹細胞培養系に、請求項１〜７のいずれか１に記載の分化誘導剤を添加することを特徴とする、幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への分化誘導方法。
【請求項９】
以下の工程を含む、請求項８に記載の分化誘導方法：
１）幹細胞を浮遊培養し、胚様体を形成させる工程；
２）上記形成された胚様体の培養系に、請求項１〜７のいずれか１に記載の分化誘導剤を添加し、培養を行なう工程。
【請求項１０】
幹細胞が、ES細胞、iPS細胞又は間葉系幹細胞である、請求項８又は９に記載の分化誘導方法。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１に記載の分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を含む、再生医療用材料。
【請求項１３】
請求項１１に記載の神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を用いる、神経疾患改善剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への選択的分化誘導剤に関し、さらに幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への分化誘導方法に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２００９−２６２５４２号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞は、多分化能と自己複製能を有する未分化細胞である。幹細胞の種類としては、胚性幹細胞（(Embryonic Stem Cells：ES細胞）、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）や人工多能性幹細胞であるiPS細胞等が挙げられる。また、成体幹細胞、胚生殖細胞等も挙げられる。例えば、骨髄に存在し、赤血球、白血球、血小板をつくり出すもとになっている造血幹細胞のように、分化の方向性が決定されている幹細胞もある。【０００４】
ES細胞とは、多分化能と自己複製能を有する未分化細胞であり、組織損傷後の組織修復力を有することが示唆されている。このためES細胞は、各種疾患の治療用物質のスクリーニングや再生医療分野において有用であるとして、さかんに研究されている。ES細胞は、胚盤胞(blastocyst)期胚の内部にある内部細胞塊(inner cell mass)と呼ばれる細胞集塊をin vitro培養に移し、細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより、未分化幹細胞集団として単離できる。さらにES細胞は、試験管内培養においても、多種多様な細胞種に分化誘導することができる。分化誘導方法は詳細には個々の条件は異なるが、ES細胞を浮遊培養により凝集させ、擬似胚状態の細胞塊、いわゆる胚様体(Embryoid Body)を形成させることによって分化を誘導する方法が一般的に用いられる。この様な方法により、胎児期の内胚葉や外胚葉、中胚葉の性質を有した細胞や、例えば血球細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイト、脂肪細胞等の分化細胞を作製することができる。【０００５】
また、iPS細胞(Induced Pluripotent Stem Cells)は、線維芽細胞などの体細胞に、特定の転写因子、例えばOct3/4、Sox2、Klf-4、c-Myc等を導入することにより、体細胞を脱分化して作製された人工多能性幹細胞である。分化万能性を持った細胞は理論上、神経細胞等を含む全ての組織や臓器に分化誘導することが可能であり、上記ES細胞と同様に、各種疾患の治療用物質のスクリーニング、再生医療分野において有用であるとして、さかんに研究されている。【０００６】
未分化の細胞から神経系（外胚葉系）への分化誘導物質として、レチノイン酸を用いることが報告されている（特許文献１、非特許文献１）。しかしレチノイン酸をES細胞に直接作用させると、神経系以外の系譜の細胞も分化誘導されるため、選択的ではなく、優れた分化誘導剤とはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2007-535957号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E. & Gottlieb, D. I. Dev Biol. 168, 342-357 (1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞へ選択的に分化誘導しうる分化誘導剤を提供することを課題とし、さらに幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への分化誘導方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために、幹細胞の分化を引き起こす様々な培養条件を鋭意検討した結果、以下の一般式(I)で示されるイソキノリン誘導体で幹細胞を処理すると、当該処理した幹細胞について、外胚葉系細胞への分化誘導の指標となるネスチン(Nestin)の発現を確認した。また、細胞の形態学的な観察から、神経様突起を有する細胞集団が確認された。これにより、イソキノリン誘導体は、神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への選択的分化誘導剤となることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
即ち本発明は、以下よりなる。
１．イソキノリン骨格を有する化合物を有効成分とする、幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への分化誘導剤。
２．イソキノリン骨格を有する化合物が、以下の一般式(I)で表される化合物である前項１に記載の分化誘導剤。
【化１】
2011062013.tif 000003
（式中、R1は酸素原子、H2、又はフェニル基で置換されているC1-C9のアルキル基であり、R2は水素原子、-OH又はC1-C9のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、R3とR4は結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成するか、又はR3とR4は各々独立して水素原子、-O又はC1-C9のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、並びに、R5とR6は、結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成するか、各々独立して水素原子又はC1-C9のアルキル基であってもよい；ここで、環状アルキル、環状アルケニル、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は任意にそれぞれ独立して、水素原子、-OH、脂肪族エステル、脂肪族ジカルボン酸エステル及びハロゲンから選択される１個以上の置換基によって置換されていてもよい。）
３．イソキノリン骨格を有する化合物が、以下の一般式(II)で表される化合物である前項１に記載の分化誘導剤。
【化２】
2011062013.tif 000004
（式中、R1は酸素原子、H2、又はフェニル基で置換されているC1-C9のアルキル基であり、R2、R7〜R12は、各々独立して水素原子、-OH又はC1-C9のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、R2とR8、又はR2とR12は、結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成していてもよく、並びに、R5とR6は、結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成するか、各々独立して水素原子又はC1-C9のアルキル基であってもよい；ここで、環状アルキル、環状アルケニル、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は任意にそれぞれ独立して、水素原子、-OH、脂肪族エステル、脂肪族ジカルボン酸エステル及びハロゲンから選択される１個以上の置換基によって置換されていてもよい；ここで、Ａ環は任意の位置に二重結合を有していてもよい。）
４．イソキノリン骨格を有する化合物のうち、一般式(II)で表される化合物のうち、R10が-OHである前項３に記載の分化誘導剤。
５．イソキノリン骨格を有する化合物のうち、一般式(II)で表される化合物のうち、R12が水素原子である前項３又は４に記載の分化誘導剤。
６．イソキノリン骨格を有する化合物が、以下の式(III)〜(IX)のいずれかで表される化合物である前項１〜３のいずれか１に記載の分化誘導剤。
【化３】
2011062013.tif 000005
【化４】
2011062013.tif 000006
【化５】
2011062013.tif 000007
【化６】
2011062013.tif 000008
【化７】
2011062013.tif 000009
【化８】
2011062013.tif 000010
【化９】
2011062013.tif 000011
７．幹細胞が、ES細胞、iPS細胞又は間葉系幹細胞である、前項１〜６のいずれか１に記載の分化誘導剤。
８．幹細胞培養系に、前項１〜７のいずれか１に記載の分化誘導剤を添加することを特徴とする、幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への分化誘導方法。
９．以下の工程を含む、前項８に記載の分化誘導方法：
１）幹細胞を浮遊培養し、胚様体を形成させる工程；
２）上記形成された胚様体の培養系に、前項１〜７のいずれか１に記載の分化誘導剤を添加し、培養を行なう工程。
１０．幹細胞が、ES細胞、iPS細胞又は間葉系幹細胞である、前項８又は９に記載の分化誘導方法。
１１．前項８〜１０のいずれか１に記載の分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞。
１２．前項１１に記載の神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を含む、再生医療用材料。
１３．前項１１に記載の神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を用いる、神経疾患改善剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の有効成分としてのイソキノリン骨格を有する化合物を含む系で、幹細胞を培養すると、選択的に神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞へ分化誘導される。本発明の分化誘導剤は、幹細胞であるES細胞に直接作用し、比較的短期間に神経幹細胞へ誘導され、神経系前駆細胞へと誘導される。従来ES細胞のような幹細胞から神経系（外胚葉系）への分化誘導物質は、レチノイン酸が一般的に使用されていた。しかし、レチノイン酸をES細胞に直接作用させると、神経系以外の系譜の細胞も分化誘導されるため、神経細胞選択的に分化誘導されるとはいえなかった。しかしながら、本発明の分化誘導剤は、神経細胞選択的に分化誘導能を有し、他の系譜の細胞を誘導しない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ES細胞からの胚様体形成プロトコール及び胚様体の形成経過を示す図である。（実施例１）
【図２】ES細胞をリコリンで処理したときの形態学的な分化誘導確認試験結果を示す図である。神経様突起を有する細胞集団が観察された。（実験例１−１）
【図３】ES細胞をレチノイン酸（陽性コントロール）で処理したときの形態学的な分化誘導確認試験結果を示す写真図である。神経様突起を有する細胞のほか、突起を有さない他系譜の細胞集団が観察された。（実験例１−１）
【図４】ES細胞を培地のみで培養したとき（陰性コントロール）の形態学的な分化誘導確認試験結果を示す写真図である。（実験例１−１）
【図５】ネスチンを指標とした分化誘導確認試験結果を示す図である。リコリンで処理した場合に、レチノイン酸（陽性コントロール）で処理した場合に比べて２倍以上のネスチンの発現が観察された。（実験例１−２）
【図６】ES細胞を各用量のリコリンで処理したときの形態学的な分化誘導確認試験結果を示す写真図である。（実験例１−３）
【図７】神経細胞接着分子(N-CAM)の発現を指標とした分化誘導確認試験結果を示す写真図である。神経細胞接着分子の発現を確認することで、神経系前駆細胞への分化誘導が確認される。（実験例１−４）
【図８】マウスES細胞由来胚様体に各種化合物で処理したときの分化誘導能をネスチンを指標として確認した写真図である。（実施例２、実験例２−１）
【図９】ヒトiPS細胞由来胚様体に化合物(No.146)で処理したときの分化誘導能をPSA-NCAMを指標として確認した写真図である。（実験例３−１）
【図１０】ヒトiPS細胞由来胚様体に化合物(No.146)で処理したときの分化誘導能をPSA-NCAMを指標として確認した写真図である。（実験例３−１）
【図１１】ヒトiPS細胞由来胚様体に化合物(No.150)で処理したときの分化誘導能をPSA-NCAMを指標として確認した写真図である。（実験例３−１）
【図１２】ヒトiPS細胞由来胚様体に化合物(No.150)で処理したときの分化誘導能をPSA-NCAMを指標として確認した写真図である。（実験例３−１）
【図１３】ヒトiPS細胞由来胚様体に化合物(No.146)で処理したときの分化誘導能をPSA-NCAMを指標として確認した写真図である。（実験例３−１）
【図１４】ヒトiPS細胞由来胚様体に化合物(No.150)で処理したときの分化誘導能をPSA-NCAMを指標として確認した写真図である。（実験例３−１）
【図１５】マウスES細胞及びヒトiPS細胞に各化合物(No.146又はNo.150)で処理したときの分化誘導能を確認した写真図である。（実験例３−２）
【図１６】化合物（No.146）による神経幹細胞／神経系前駆細胞分化実験に用いたSandhoff病モデルマウス（SDマウス）骨髄由来間葉系幹細胞の性質を示した写真図である。（実施例４）
【図１７】SDマウス骨髄由来間葉系幹細胞に化合物（No.146）で処理したときの分化能をネスチンを指標として確認した写真図である。（実験例４）
【図１８】SDマウス骨髄由来間葉系幹細胞に化合物（No.146）を各濃度で処理したときのネスチン陽性細胞の相対数を示した表である。（実験例４）
【図１９】SDマウス骨髄由来間葉系幹細胞に化合物（No.146）を各濃度で処理したときの突起伸長を示した表である。（実験例４）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞に分化誘導しうる分化誘導剤に関し、さらには幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への分化誘導方法に関する。本発明の分化誘導剤は、イソキノリン骨格を有する化合物を有効成分とし、当該イソキノリン骨格を有する化合物は以下の一般式(I)で表される。
【化１】
2011062013.tif 000012
（式中、R1は酸素原子、H2、又はフェニル基で置換されているC1-C9のアルキル基であり、R2は水素原子、-OH又はC1-C9のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、R3とR4は結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成するか、又はR3とR4は各々独立して水素原子、-O又はC1-C9のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、並びに、R5とR6は、結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成するか、各々独立して水素原子又はC1-C9のアルキル基であってもよい；ここで、環状アルキル、環状アルケニル、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は任意にそれぞれ独立して、水素原子、-OH、脂肪族エステル、脂肪族ジカルボン酸エステル及びハロゲンから選択される１個以上の置換基によって置換されていてもよい。）
【００１５】
イソキノリン骨格を有する化合物は、好適には以下の一般式(II)で表される化合物が挙げられる。
【化２】
2011062013.tif 000013
（式中、R1は酸素原子、H2、又はフェニル基で置換されているC1-C9のアルキル基であり、R2、R7〜R12は、各々独立して水素原子、-OH又はC1-C9のアルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基であり、R2とR8、又はR2とR12は、結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成していてもよく、並びに、R5とR6は、結合して環状アルキル若しくは環状アルケニルを形成するか、各々独立して水素原子又はC1-C9のアルキル基であってもよい；ここで、環状アルキル、環状アルケニル、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基は任意にそれぞれ独立して、水素原子、-OH、脂肪族エステル、脂肪族ジカルボン酸エステル及びハロゲンから選択される１個以上の置換基によって置換されていてもよい；ここで、Ａ環は任意の位置に二重結合を有していてもよい。二重結合の数及び位置については、R8〜R12の置換基によって適宜決定される。）
【００１６】
一般式(II)で表される化合物のうち、R8〜R12において、-OHの数が多いほど、強い活性が期待でき、特にR10が-OHであるのが好適である。また、同様にR12が水素原子であるのが好適である。同様に、R1は酸素原子又はH2が好適である。さらに同様にR2とR8において、R2は水素原子、R8は-OHであってもよく、あるいはR2とR8は脂肪族炭化水素基を介して互いに連結して五員環を形成していてもよい。
【００１７】
より具体的には、イソキノリン骨格を有する化合物は、以下の式(III)〜(IX)のいずれか又はその薬理学的に許容しうる塩で表される化合物が挙げられる。本発明において、上記いずれかで表される化合物には、水素原子又は-OHの向きが異なる異性体（エピマー）が存在する。これらいずれかの異性体及びその任意の混合物はすべて本発明に属するものとする。
【化３】
2011062013.tif 000014
【化４】
2011062013.tif 000015
【化５】
2011062013.tif 000016
【化６】
2011062013.tif 000017
【化７】
2011062013.tif 000018
【化８】
2011062013.tif 000019
【化９】
2011062013.tif 000020
【００１８】
上記式(IV)で表される化合物は、リコリン(Lycorine)ともいい、ヒガンバナ科植物に含まれるヒガンバナ科アルカロイド(Amaryllidaceae alkaloids)の一つとして公知である。リコリンについては、タンパク質合成阻害作用、抗ウイルス作用、免疫抑制作用等を有することが知られている。またリコリンを含む生薬セキサンの脳下垂体を介した抗炎症作用について記載した文献や、リコリンのアポトーシス阻害作用について開示する特許公報などがあるが、未分化細胞に対する分化誘導作用については、全く報告されていない。
【００１９】
本発明において一般式(I)〜(IX)のいずれかで表される化合物は、さらに、薬学的に許容される塩であってもよい。薬理的に許容し得る塩は、その分子内塩、付加物、錯体、溶媒和物あるいは水和物などをいずれも含む。
【００２０】
本発明において、薬学的に許容される塩とは、薬理学的及び製剤学的に許容される一般的な塩が挙げられる。そのような塩として、具体的には以下が例示される。塩基性付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；例えばアンモニウム塩；例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩；ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩；たとえばＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；例えばピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩；例えばテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩；リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００２１】
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等を挙げることができる。
【００２２】
本発明の分化誘導剤は、上述の化合物又はその薬学的の許容される塩を有効成分として含有することができる。本発明の分化誘導剤には、その他薬学的に許容しうる担体を含んでいても良い。本明細書における薬学的に許容しうる担体としては、通常必要により用いられる補助剤、芳香剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤、噴射剤、粘着剤や防腐剤等を適宜選択して含むことができる。
【００２３】
本発明において、幹細胞とはin vitroの系において培養することが可能であり、かつ、生体を構成するすべての細胞に分化しうる多分化能を有する細胞をいい、例えばES細胞、iPS細胞や間葉系幹細胞のように多分化能と自己複製能を有する未分化細胞をいう。ES細胞、iPS細胞や間葉系幹細胞の由来は、特に限定されないが、例えば哺乳動物が挙げられる。
【００２４】
本発明の分化誘導剤で幹細胞を処理することで、幹細胞から外胚葉細胞を介して神経幹細胞へ誘導され、さらには神経系前駆細胞へ分化誘導することができる。幹細胞の処理の際、胚様体を処理するのが好適である。ここで胚様体とは、液体培養中の幹細胞の成長により形成された球状コロニーをいう。胚様体及びそれらを形成する方法は当該技術分野において公知である。外胚葉細胞とは、神経系細胞や表皮系細胞に分化しうる能力を有した細胞から構成される胚葉細胞を包含する。
【００２５】
本発明において、神経幹細胞とは、神経細胞(neuron)、アストロサイト(astrocyte)又はオリゴデンドロサイト(oligodendrocyte)に分化しうる能力を有し、かつ自己複製能力を有する細胞として定義される。胚性幹細胞のようにすべての細胞に分化する多分化能は有していないが、脳内において神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを供給する機能を有している。また、本発明において神経系前駆細胞とは、神経細胞やグリア細胞（アストロサイト又はオリゴデンドロサイト等）の前駆細胞をいう。
【００２６】
本明細書において神経細胞とは、他の神経細胞または刺激受容細胞からの刺激を受け、別の神経細胞、筋または腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞を意味する。神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類されるが、本発明においては神経伝達物質の種類については特に限定しない。神経伝達物質としては、ペプチド性、非ペプチド性のいずれも包含される。非ペプチド性の神経伝達物質のうち代表的な物質としては、ドーパミン、アセチルコリン、γアミノ酪酸等が挙げられる。より詳しくは、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン、セロトニン、アセチルコリン、γアミノ酪酸、グルタミン酸があげられる。ペプチド性の神経伝達物質のうち代表的な物質としては、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、α−エンドルフィン、β−エンドルフィン、γ−エンドルフィン、バソプレッシン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明は、ES細胞、iPS細胞や間葉系幹細胞などの幹細胞培養系に、本発明の分化誘導剤を添加することを特徴とする、幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への分化誘導方法にも及ぶ。幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への分化誘導方法としては、以下の工程が含まれる。
１）幹細胞を浮遊培養し、胚様体を形成させる工程；
２）上記形成された胚様体の培養系に本発明のイソキノリン骨格を有する化合物を有効成分とする分化誘導剤を添加し、培養を行なう工程。
【００２８】
上記において、幹細胞から胚様体を形成させる工程は、当該研究分野において実施されている自体公知の方法、あるいは今後開発されるあらゆる方法により行うことができる。胚様体の形成は、浮遊培養系により好適に形成することができる。本発明の分化誘導剤は、上記形成された胚様体を含む培養系に本発明の分化誘導剤を添加することで、神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞へ分化誘導させることができる。本発明において、本発明の分化誘導剤に含有される有効成分としてのイソキノリン骨格を有する化合物は、各種化合物の構造によっても異なるが、100μM〜6μM未満であれば培養系に添加することができる。100μM以上では、細胞毒性を示す場合が多く、低濃度で分化誘導能を示す化合物の場合には、6μMであっても細胞毒性を示す場合がある。従って、最適な濃度は、適宜決定することができるが、有効成分としてのイソキノリン骨格を有する化合物を0.01〜100μM、好ましくは0.1〜70μM、より好ましくは0.1〜50μM添加することができる。
【００２９】
神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞への分化誘導の際は、培養液の使用については、自体公知の方法によることができる。本発明の方法に用いることができる培地としては、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地（例えば、Iscove（IMDM）、RPMI、DMEM、Fischer培地、α培地、Leibovitz培地、L-15培地、NCTC培地、F-12培地、MEM、MoCy培地）に、増殖因子として塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮増殖因子(EGF)又は白血球遊走阻止因子(LIF)の少なくともいずれか１種を添加した培地が用いられ、好ましくはこれらの増殖因子の全てが含有されたものを使用することができる。また、増殖速度を増大させるために、インスリン、プロゲステロン、プラレッシン、トランスフェリン、セレナイトの添加物、あるいは神経細胞培養用添加物が含まれているB27添加物やN2添加物と、必要に応じて、ヘパリンやヘパラン硫酸又はこれらの脱硫酸化グリコサミノグリカンを含有していてもよい。また、必要に応じて、抗生物質を含有してもよい。 
【００３０】
一方、上記分化誘導用培地には、血清は含まれないことが好ましい。血清には未知の分化誘導剤が含まれており、本発明の選択的分化誘導を阻害し得るからである。血清の存在によりGABA(Gamma-Amino Butyric Acid)作動性ニューロンの誘導割合が高くなり得るため、GABA作動性ニューロン以外のニューロンを優先的に誘導したい場合には、むしろ血清は存在しないことが好ましい。上記のような組成を有する培地での培養時間は特に限定しないが、少なくとも一夜以上、好ましくは一昼夜以上、より好ましくは2日間程度培養されていることが好ましい。さらに、幹細胞を1〜8日間無血清培養後、有効成分としてのイソキノリン骨格を有する化合物を0.01〜100μM、好ましくは0.1〜70μM、より好ましくは0.1〜50μMの濃度で約2〜7日程度培養することで、選択的に神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を誘導し、他の系譜の細胞を誘導しない。一定条件下でさらにこの神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を継続して培養すると、成熟神経細胞にまで分化誘導が可能である。
【００３１】
神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞であることは、細胞の形態学的観察により確認することもできる。さらには、例えば、神経系前駆細胞での発現が確認されている細胞骨格タンパク質ネスチンや神経細胞接着分子(N-CAM)を指標として検出することができる。具体的には、これらの物質を抗体を用いて検出することができる。例えば、抗原抗体反応により、細胞を直接染色したり、培養液中に認められる上記物質を、ELISA法等により検出することができる。
【００３２】
本発明は、上述の分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞にも及び、さらには前記分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を含む再生医療用材料にも及ぶ。さらには、前記分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を用いる、神経疾患改善剤のスクリーニング方法にも及ぶ。例えば、前記再生医療用材料は、事故等による神経障害に対して使用することができるほか、外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患の治療用材料として用いることができる。外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患としては、神経系細胞の障害に基づく疾患があげられ、神経系細胞の障害に基づく疾患としては、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、虚血性脳疾患、てんかん、脳外傷、背堆損傷、運動神経疾患、神経変性疾患、網膜色素変性症、内耳性難聴、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患などが挙げられる。本発明の分化誘導剤や、あるいは本発明の分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を用いることで、各種要因により障害を受けた神経細胞を修復することができる。さらに、本発明の分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞をin vitroの系において培養したり、in vivoの系に移植し、神経疾患改善剤の候補となりうる物質と相互作用させることで、神経疾患改善剤のスクリーニングを行なうことができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例の範囲に限定されることはない。【００３４】
（実施例１）ES細胞から神経芽細胞への分化誘導
本実施例では、マウスES細胞から神経芽細胞への分化誘導について説明する。【００３５】
１）マウスES細胞から胚様体(Embryoid Body: EBs)の形成
胚様体の形成のために、ES培地(ES cell medium: ESM)及びNP培地(NPM)を用いた。ここで、ES培地は、DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 培地に、20 v/v% ウシ胎児血清(FBS)、 1 w/v% ES細胞用ヌクレオシド溶液(ES Cell Qualified Nucleosides、Gibco製)、1 w/v% 非必須アミノ酸 (Non Essential Amino Acids、Gibco製)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(2-ME)、1000 U/mL LIF (leukemia inhibitory factor)を添加した培地からなり、NP培地は、DMEM/F12 (DMEM:Ham's F12 =1:1)混合培地に、25 μg/mL インスリン(insulin)、50μg/mL トランスフェリン(transferrin)、20 mMプロゲステロン(progesterone)、100μM プトレシン(putrescine)、30 nM 亜セレン酸ナトリウム(sodium selenite)、1μg/mL ラミニン(laminin)及び10 ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む培地からなる。また、分化誘導用培地としてDifferentiation培地を用いた。Differentiation培地は、DMEM培地に、10 v/v% FBS、1 w/v% ES細胞用ヌクレオシド溶液及び1 w/v% 非必須アミノ酸を添加した培地からなる。【００３６】
マウスES細胞（B6-2細胞株）を、胚様体(EBs)形成のための培養1日前に上述のES培地にて培養し、次に培養した前記マウスES細胞を、ES培地及びNP培地を各々1:1で配合した培地に懸濁し、1×106 cells/5 mLの細胞を径60mmの非コーティング細胞培養用ディッシュに播種し、37±0.5℃で１日間培養した。トランスファーピペットで培地を吹き付けることにより、細胞を剥がし、同じ細胞培養用ディッシュに再度播種した。さらに２日間培養し、胚様体の形成を確認した。【００３７】
胚様体形成プロトコール及び胚様体の形成経過を、図１に示した。培養３日目で、再現性良く、均一な胚様体の形成が観察された。【００３８】
２）化合物による胚様体(EBs)からの分化誘導実験
上記培養後、浮遊している細胞塊（胚様体）を回収し、500rpmで5分間遠心処理した。培地を除去した後、細胞塊を10 mLのNP培地で懸濁し、I型コラーゲン(collagen type I)でコートした96ウェルのプレートに、浮遊細胞塊が20 sphere/ウェル程度の密度となるように100μLずつ添加した。さらに1日培養後、NP培地を除去し、以下の式(IVa)に示す化合物（リコリン）を含む培地(Differentiation 培地及びNP培地を各々1:1で混合した培地)を200μL加え、4日間培養し、分化誘導処理を行った。陽性コントロールとして、レチノイン酸を加え、陰性コントロールは培地のみとした。【００３９】
【化４ａ】
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【００４０】
（実験例１−１）形態学的な分化誘導確認試験１
実施例１の分化誘導実験において、本発明の分化誘導剤として4μM リコリン、陽性コントロールとして1μM レチノイン酸を含む系で分化誘導処理を行った。各細胞について、各ウェルの細胞から培地を除去し、4% パラホルムアルデヒドで固定し、常法にてヘマトキシリン（HE）染色を行い、光学顕微鏡にて細胞の形態変化を観察した。【００４１】
その結果、リコリンを含む系で作用させた場合には、神経様突起を有する細胞集団のみが選択的に誘導されることが観察された（図２）。一方、神経系細胞誘導剤として用いられるレチノイン酸（陽性コントロール）では、突起を持たない他系譜の細胞集団も誘導されることが観察された（図３）。【００４２】
（実験例１−２）ネスチンを指標とした分化誘導確認試験
実施例１において、分化誘導処理を行った各細胞について、ネスチンを指標として、分化誘導能を確認した。ネスチンの検出は、以下のELISA法に従った。
実験例１−１と同様に4% パラホルムアルデヒドでO/N細胞固定を行なった後、パラホルムアルデヒドを除去し、PBSを用いて4回洗浄した。200μL/ウェルの0.6% H2O2を加え、室温で1時間放置した後、PBSを用いて4回洗浄した。各ウェルに、ヤギ血清(Goat Serum) 5 v/v%/ウシ血清アルブミン (BSA) 1 v/v%を75μL加えて室温にて1時間置き、ブロッキング処理を行なった。次に、1次抗体溶液として2000倍希釈した抗ネスチン・マウスIgG（American Research Products製）溶液を50μL/ウェル加えて4℃で固定した。その後、1次抗体溶液を除去し、PBS-0.05% Tween20で5回洗浄した。さらに2次抗体溶液として、2500倍希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体（Thermo SCIENTIFIC製）溶液を200μL/ウェル加え、室温で１時間反応させた。その後2次抗体溶液を除去し、PBS-0.5% Tween20で5回洗浄した。ペルオキシダーゼ発色キット（住友ベークライト製）を用い、室温にて30分間発色させた後、停止液を加え、450nmで吸光度を測定し、ネスチンを定量した。【００４３】
その結果、リコリンは陽性コントロールのレチノイン酸に比べて、2倍以上のネスチンを誘導し、その至適濃度は4μMであることが確認された（図５）。【００４４】
（実験例１−３）形態学的な分化誘導確認試験２
本発明の分化誘導剤として1〜5μM リコリンを含む系で分化誘導処理を行った以外は、実験例１−１と同手法にて細胞を固定し、HE染色を行い、光学顕微鏡にて細胞の形態変化を観察した。【００４５】
その結果、5μM リコリン処理でも神経様突起を有する細胞集団のみが選択的に誘導されることが観察され、リコリンの用量依存的に神経様突起を有する細胞の誘導が観察された（図６）。【００４６】
（実験例１−４）神経細胞接着分子(N-CAM)の発現を指標とした分化誘導確認試験
実施例１において、分化誘導処理を行った各細胞について、抗PolySialic Acid-NCAM(PSA-NCAM)・マウスIgGを用いた間接蛍光抗体法により、神経細胞接着分子の発現を定性的に確認した。神経細胞接着分子の発現により、神経系前駆細胞へ分化誘導されていることを確認することができる。【００４７】
その結果、リコリン添加により誘導された神経様突起細胞をもつ細胞の殆どが、抗PSA-NCAM抗体に対し陽性を示し、神経系前駆細胞の分化形質を発現していることが確認された（図７参照）。【００４８】
（実施例２）ES細胞から神経前駆細胞への誘導
本実施例では、マウスES細胞から形成させた胚様体(EBs)に対する各種化応物の神経前駆細胞誘導について説明する。【００４９】
１）マウスES細胞から胚様体の形成
胚様体の形成のための培地は、実施例１と同手法により手配した。マウスES細胞（AB2-2細胞株）は、Sanger Institute (Cambridge, UK)より入手した。【００５０】
マウスES細胞（AB2-2細胞株）を、実施例１と同手法により胚様体形成のための培養1日前に上述のES培地にて培養し、次に培養した前記マウスES細胞を、ES培地及びNP培地を各々1:1で配合した培地に懸濁し、1×106 cells/5 mLの細胞を径60mmの非コーティング細胞培養用ディッシュに播種し、37±0.5℃で1日間培養した。トランスファーピペットで培地を吹き付けることにより、細胞を剥がし、同じ細胞培養用ディッシュに再度播種した。さらに1日間培養し、胚様体の形成を確認した。培養3日目で、再現性良く、均一な胚様体の形成が観察された。【００５１】
２）化合物による胚様体からの分化誘導実験
誘導3日目の胚様体を、15 mLチューブに回収した。1×PBSを5 mL加えて洗浄し、500rpmで5分間遠心処理を行った。培地を除去し、NP培地を11mL加えた。よく混和したのち、I型コラーゲン(collagen type I)でコートした96ウェルのプレートに、上記胚様体を含むNP培地を100μLずつ添加した。37±0.5℃、5% CO2の条件で一夜培養し、96ウェルプレートへ10% FBS含有Differentiation培地を適量加えた。図８に示す式(IIIa)〜(IXa)の各化合物を使用条件の濃度になるように加え、37±0.5℃、5% CO2の条件で5日間培養した。ここで、図８に示す化合物は、No.150（式IIIa）、No.146（式IVa）、No.152（式Va）、No.147（式VIa）、No.153（式VIIa）、AS070531（式VIIIa）、No.149（式IXa）で特定される。以下の実施例においても同様である。【００５２】
（実験例２−１）ネスチンを指標とした分化誘導確認試験
実施例２において、分化誘導処理を行った各細胞について、ネスチンを指標として、分化誘導能を確認した。ネスチンの検出は、以下のELISA法に従った。
実験例１と同様に4% パラホルムアルデヒドでO/N細胞固定を行なった後、パラホルムアルデヒドを除去し、PBSを200μL/ウェルになるように加え、3分間放置し、洗浄した（10回）。各ウェルに、ヤギ血清 5 v/v% /BSA 1 v/v% を100μL加えて室温にて1時間置き、ブロッキング処理を行なった。次に、1次抗体溶液として500倍希釈した抗ネスチン・マウスIgG（American Research Products製）溶液を50μL/ウェル加えて4℃で固定した。その後、1次抗体溶液を除去し、PBS-0.05% Tween20を加え、3分間放置して洗浄した（5回）。Biotin標識抗マウスIgG(1000倍希釈液）を50μL/ウェル加え、室温で60分間放置した。PBS-0.05% Tween20を加え、3分間放置して洗浄した（5回）。0.26% DABCO/PBSを100μL/ウェルになるように加え、IN Cell Analyzerで写真撮影した。PBSを200μL/ウェルになるように加え、洗浄した。マイヤー・ヘマトキシリンを80μL/ウェル加え、室温で6分間放置した。PBSを200μL/ウェルになるように加え、洗浄した（3回）。PBSを100μL/ウェルになるように加え、顕微鏡にて写真撮影を行った。【００５３】
その結果を図８に示した。各化合物について、ネスチンの発現が認められ、分化誘導されていることが確認された。【００５４】
（実施例３）ヒトiPS細胞から神経前駆細胞への誘導
本実施例では、ヒトiPS細胞から形成させた胚様体に対する各種化応物の神経前駆細胞誘導について説明する。【００５５】
ヒトiPS細胞株（hPS0001201B7 lot3）は、理研から購入した。培地は、4ng/mL human basic FGFを含むPrimate ES Cell Culture Medium（リプロセル）を用いた。胚様体の形成のためのES培地及びNP培地、並びに分化誘導用のDifferentiation培地の組成は実施例１に記載と同様であり、ES培地は、DMEM、20% FBS、ES細胞用ヌクレオシド、非必須アミノ酸、2-Mercaptoethanol (ME)及びLeukemia inhibitory factor (LIF)を含み、NP培地にはDMEM/F12、25μg/mL インスリン(Imsulin)、50μg/mL トランスフェリン(Transferrin)、20mM プロゲステロン(Progesterone)、100μM プトレシン (Putrescine)、30nM セレン酸ナトリウム(Sodium selenate)、1μg/mL ラミニン(Laminin)、10ng/mL bFGFを含み、Differentiation培地には、DMEM、10% FBS、ES細胞用ヌクレオシド、非必須アミノ酸を含む。【００５６】
１）胚様体の形成
SNL線維芽細胞フィーダー上に播種したヒトiPS細胞（100mm×2枚）を、コンフルエントになるまで培養したのち、PBS 5 mLで洗浄した（3回）。その後、霊長類ES細胞用剥離液（リプロセル）を、0.5 mL加え、1 分間放置した。PBS 5 mLを加え、フィーダーを剥離し、アスピレーターで吸引した。さらに、PBS 5 mLで洗浄したのち、霊長類ES細胞用剥離液を0.5 mL加え、5分間放置した。DMEM 10% FBSを5 mL加え、洗浄し、15 mLチューブに回収した。1000rpmで5分間遠心処理したのち、上清を除き、NP培地及びES培地をそれぞれ2 mL加え、懸濁したのちに、60 mmペトリ皿に播種した。37±0.5℃、5% CO2で2日間培養したのち、細胞塊を回収した。500rpmで5分間遠心処理したのち、上清を除き、NP培地及びES培地をそれぞれ2 mL加え、懸濁したのちに、60 mmペトリ皿に播種した。37±0.5℃、5% CO2で2日間培養したのち、細胞塊を回収した。500rpmで5分間遠心処理したのち、上清を除き、NP培地及びES培地をそれぞれ2 mL加え、懸濁したのちに、60 mmペトリ皿に播種した。37±0.5℃、5% CO2で2日間培養したのち、細胞塊を回収した。【００５７】
２）化合物による胚様体からの分化誘導実験
上記培養後、形成した胚様体を回収し、500rpmで5分間遠心処理し、上清を除き、NP培地を加え、I型コラーゲン(collagen type I)でコートした96ウェルのプレートに、20-30細胞塊（100μL）/ウェルとなるように添加した。37±0.5℃、5% CO2で1日培養後、Differentiation培地で各濃度に希釈した化合物（No.146, No.150）を含む溶液を100μL/ウェル加え、37±0.5℃、5% CO2で4日培養した。【００５８】
（実験例３−１）PSA-NCAMを指標とした分化誘導確認試験１
実施例３において、分化誘導処理を行った各細胞について、PSA-NCAMを指標として、分化誘導能を確認した。PSA-NCAMの検出は、以下のELISA法に従った。【００５９】
実施例３の分化誘導処理を行った各細胞について、各ウェルから培地を除去し、4% パラホルムアルデヒドを100μL/ウェル加えた。各ウェルに、ヤギ血清 5v/v% /BSA 1v/v% /PBSを150μL加えて室温にて3時間置き、ブロッキング処理を行なった。次に、1次抗体溶液としてヤギ血清 5v/v% /BSA 1v/v% /PBSで1000倍希釈した抗PSA-NCAM抗体（Millipore製）を50μL/ウェル加えて4℃で一晩おいた。抗PSA-NCAM抗体を用いることで、神経系前駆細胞の分化形質を発現しうる指標となるPSA-NCAMを検出することができる。【００６０】
その後、１次抗体溶液を除去し、PBS-0.05% Tween20を加え、3分間放置し、洗浄した（5回）。ヤギ血清 5v/v% /BSA 1v/v% /PBSで1000倍希釈した抗マウスIgG（1000倍希釈液）を50μL/ウェル加え、室温で60分間放置した。2次抗体溶液を除去し、PBS-0.05% Tween20を加え、洗浄した（5回）。ヤギ血清 5v/v% /BSA 1v/v% /PBSで1000倍希釈したFITC標識ストレプトアビジン及び500倍希釈した核染色剤(Hoechst 33258)を50μL/ウェル加え、室温で1時間放置した。3次プローブを除去し、PBS-0.05% Tween20を加え、洗浄した（5回）。0.26% DABCO/PBSを100μL/ウェルになるように加え、IN Cell Analyzerで写真撮影した。PBSを200μL/ウェルになるように加え洗浄した。マイヤー・ヘマトキシリンを80μL/ウェル加え、室温で6分間放置した。PBSを200μL/ウェルになるように加え、洗浄した（3回）。PBSを100μL/ウェルになるように加え、顕微鏡にて写真撮影を行った。【００６１】
その結果を、図９〜１４に示した。なお、図９及び図１１では、マウスES細胞に対するリコリン及びジヒドロリコリシジン作用のときの培地を、NP培地: Differentiation培地＝1:1とし、図１０及び図１２ではNP培地のみとした。図１３及び図１４ではヒトiPS細胞に対するリコリン及びジヒドロリコリシジン作用のときの培地を、NP培地: Differentiation培地＝1:1とした。【００６２】
（実験例３−２）マウスES細胞及びヒトiPS細胞に対する分化誘導能の比較
実施例２及び３の手法において、各化合物（No.146, No.150）により分化誘導させたときの分化誘導効果を、マウスES細胞についてはネスチンを指標とし、ヒトiPS細胞についてはPSA-NCAMを指標として確認した。その結果を図１５に示した。【００６３】
（実施例４）Sandhoff病モデルマウス骨髄由来間葉系幹細胞から神経前駆細胞への誘導
本実施例では、Sandhoff病モデルマウス（SDマウス）骨髄由来間葉系幹細胞に対する各種化応物の神経前駆細胞誘導について説明する。【００６４】
16週齢のSDマウス（雌）の骨髄を大腿骨から単離した後、DMEM 10% FBSで培養を行い、接着性の細胞を獲得した。この細胞に対し、トリプシンを用いて継代培養を繰り返し、クローン化を行った後、各抗体を用いた間接蛍光抗体法及び既存の各分化誘導法による間葉系細胞分化実験を行った。図１６はその結果を示しており、CD90、CD29、CD54が陽性、ネスチンが弱陽性、MAP2及びGFAPが陰性の性質を示し、既存の各分化誘導法により、脂肪細胞・軟骨細胞・骨芽細胞へと分化する能力を有することから間葉系幹細胞の性質を有することを確認した。これらをSDマウス骨髄由来間葉系幹細胞とした。【００６５】
SDマウス骨髄由来間葉系幹細胞をI型コラーゲン(collagen type I)でコートした96ウェルのプレートに、5×103個/ウェルとなるように播種した。37±0.5℃、5% CO2で1日培養後、NP培地で各濃度（1-10μM）に希釈した化合物（No.146）を200μL/ウェル加え、37±0.5℃、5% CO2で4日培養した。【００６６】
（実験例４）ネスチンを指標とした分化誘導確認試験
実施例４の手法により分化誘導処理を行った各細胞について、各ウェルから培地を除去し、4% パラホルムアルデヒドを100μL/ウェル加えた。各ウェルに、ヤギ血清 5v/v% /BSA 1v/v% /PBSを150μL加えて室温にて3時間置き、ブロッキング処理を行なった。次に、1次抗体溶液としてヤギ血清 5v/v% /BSA 1v/v% /PBSで500倍希釈した抗ネスチン抗体（SIGMA製）を50μL/ウェル加えて4℃で一晩おいた。抗ネスチン抗体を用いることで、神経幹細胞／神経系前駆細胞の分化形質の指標となるネスチンを検出することができる。その後、1次抗体溶液を除去し、PBS-0.05% Tween20を加え、3分間放置し、洗浄した（5回）。ヤギ血清 5v/v% /BSA 1v/v% /PBSで1000倍希釈した抗マウスIgG（1000倍希釈液）を50μL/ウェル加え、室温で60分間放置した。2次抗体溶液を除去し、PBS-0.05% Tween20を加え、洗浄した（5回）。ヤギ血清 5v/v% /BSA 1v/v% /PBSで1000倍希釈したFITC標識ストレプトアビジン及び500倍希釈した核染色剤(Hoechst 33258)を50μL/ウェル加え、室温で1時間放置した。3次プローブを除去し、PBS-0.05% Tween20を加え、洗浄した（5回）。0.26% DABCO/PBSを100μL/ウェルになるように加え、IN Cell Analyzerで写真撮影し、その結果を図１７に示した。化合物（No.146）処理により、扁平な細胞形態が細長い突起を有した双極性の細胞形態へと変化し、弱陽性だったネスチンの発現が顕著に強くなった。【００６７】
上記分化誘導処理を行った各細胞について、ネスチンの発現強度を指標として、IN Cell Analyzerの解析ソフトウェア Investigator Workstation（GEヘルスケア製）の解析ツールObjectで解析を行った。SDマウス骨髄由来間葉系幹細胞に化合物（No.146）を各濃度で処理したときのネスチン陽性細胞の相対数を図１８に示した。また、同様にIN Cell Analyzerの解析ソフトウェア Investigator Workstation（GEヘルスケア製）の解析ツールNeurite Outgrowthで解析を行った。SDマウス骨髄由来間葉系幹細胞に化合物（No.146）を各濃度で処理したときの突起伸長を図１９に示した。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上詳述したように、本発明の有効成分としてのイソキノリン骨格を有する化合物を含む系で、ES細胞やiPS細胞などの幹細胞を培養すると、選択的に神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞へ誘導され、神経系前駆細胞へと誘導される。本発明の分化誘導剤は、ES細胞に直接作用し、比較的短期間に選択的に神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を誘導しうる。従来ES細胞から神経系（外胚葉系）への分化誘導物質は、レチノイン酸が一般的に使用されていた。しかし、レチノイン酸をES細胞に直接作用させると、神経系以外の系譜の細胞も分化誘導されるため、神経細胞選択的に分化誘導されるとはいえなかった。しかしながら、本発明の分化誘導剤は、神経細胞選択的に分化誘導能を有し、他の系譜の細胞を誘導しない。【００６９】
さらに、幹細胞を8日間無血清培養後、有効成分としてのイソキノリン骨格を有する化合物を0.01〜100μM、好ましくは0.1〜70μM、より好ましくは0.1〜50μMの濃度で約7日程度培養することで、選択的に神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を誘導し、他の系譜の細胞を誘導しない。一定条件下でさらにこの神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を継続して培養すると、成熟神経細胞にまで分化しうる。【００７０】
本発明の分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞は、神経細胞に関連する再生医療用材料として利用することができる。さらには、前記分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を用いる、神経疾患改善剤のスクリーニング方法にも利用することができる。例えば、前記分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を含む再生医療用材料は、事故等による神経障害に対して使用することができるほか、外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患の治療用材料として用いることができる。外胚葉由来の細胞の障害に基づく疾患としては、神経系細胞の障害に基づく疾患があげられ、神経系細胞の障害に基づく疾患としては、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、虚血性脳疾患、てんかん、脳外傷、背堆損傷、運動神経疾患、神経変性疾患、網膜色素変性症、内耳性難聴、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患などが挙げられる。本発明の分化誘導剤や、あるいは本発明の分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞を用いることで、各種要因により障害を受けた神経細胞を修復することができる。さらに、本発明の分化誘導方法により作製された神経幹細胞及び／又は神経系前駆細胞をin vitroの系において培養したり、in vitroの系に移植し、神経疾患改善剤の候補となりうる物質と相互作用させることで、神経疾患改善剤のスクリーニングを行なうことができる。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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