(57)【要約】対象において網膜変性症、例えば、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および緑内障を処置するための方法が、本明細書に記載されている。網膜神経節細胞などの細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法もまた、本明細書に提供されている。かかる方法は、単一のコンパクトなアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされた、双方向Ｈ１プロモーターと網膜変性症関連遺伝子に方向付けられたｇＲＮＡとを含むクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムなどの修飾ヌクレアーゼシステムを利用することを含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において網膜変性症を処置するための方法であって、
（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、前記対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、前記ＤＮＡ分子は、前記細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；および
ｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを提供するステップであって、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ；ならびに
（ｂ）治療有効量の前記システムを、前記対象の網膜領域に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記システムがＣＲＩＳＰＲである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記システムが、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記システムが、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プロモーターが双方向プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記双方向プロモーターがＨ１である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｈ１プロモーターが、
ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメント
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロモーターが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している、請求項６から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記網膜領域が網膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が網膜光受容体細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が網膜神経節細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記網膜変性症が、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および緑内障からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記網膜変性症が、ＬＣＡ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記網膜変性症がＬＣＡ１０である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的配列が、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子中にある、請求項１６から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的配列が、前記ＣＥＰ２９０遺伝子中の突然変異である、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的配列が、配列番号１〜１０９、１６４〜３５６、７３５〜７３８もしくは７８８〜１３９７に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的配列が、作動可能に連結した配列番号１、２、３および４を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクターが、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記網膜変性症が、常染色体優性形態の網膜色素変性症（ＡＤＲＰ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つまたは複数の遺伝子産物がロドプシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的配列が、前記ロドプシン遺伝子中の突然変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的配列が、前記ロドプシン遺伝子のＲ１３５における突然変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ１３５における前記突然変異が、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３５Ｗ、Ｒ１３５Ｌからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的配列が、配列番号１１１〜１２６に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号１２７〜１４２に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記網膜変性症が緑内障である、請求項１５に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、性決定領域Ｙ（ＳＲＹ）−ボックス１１（ＳＯＸ１１）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＳＯＸ１１もしくはＰＵＭＡ、またはそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、ＤＬＫ／ＬＺＫ、ＭＫＫ４／７、ＪＮＫ１／２／３またはＳＯＸ１１／ＡＴＦ２／ＪＵＮ／ＭＥＦ２Ａ経路のメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的配列が、配列番号１４３〜１６３に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象に投与するステップが、移植、注射またはウイルスによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象に投与するステップが、網膜下注射によって行われる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、前記方法は、
ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、前記ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、プロモーター；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、前記細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを前記細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ
を含む、方法。
【請求項３８】
前記システムがＣＲＩＳＰＲである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記システムが、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、請求項３６から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記システムが、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記プロモーターがＨ１プロモーターである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｈ１プロモーターが双方向性である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｈ１プロモーターが、
ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメント
を含む、請求項４２から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記プロモーターが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞が、真核生物細胞または非真核生物細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が網膜光受容体細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が網膜神経節細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的配列が、配列番号１〜１０９、１６４〜３５６、７３５〜７３８に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的配列が、作動可能に連結した配列番号１、２、３および４を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ベクターが、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５６】
前記１つまたは複数の遺伝子産物がロドプシンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的配列が、前記ロドプシン遺伝子中の突然変異である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５８】
前記標的配列が、前記ロドプシン遺伝子のＲ１３５における突然変異である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
Ｒ１３５における前記突然変異が、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３５Ｗ、Ｒ１３５Ｌからなる群から選択される、請求項５７から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記標的配列が、配列番号１１１〜１２６に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５７から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号１２７〜１４２に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６２】
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、性決定領域Ｙ（ＳＲＹ）−ボックス１１（ＳＯＸ１１）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＳＯＸ１１もしくはＰＵＭＡ、またはそれらの組合せである、請求項３７に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、ＤＬＫ／ＬＺＫ、ＭＫＫ４／７、ＪＮＫ１／２／３またはＳＯＸ１１／ＡＴＦ２／ＪＵＮ／ＭＥＦ２Ａ経路のメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項６４】
前記標的配列が、配列番号１４３〜１６３に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項６５】
前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現が減少する、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１６年７月５日に出願された米国仮出願番号第６２／３５８，３３７号の利益を主張しており、この仮出願の全体は、参考として本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
網膜変性症は、とりわけ、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および緑内障を含む一群の障害である。ＬＣＡは、生後数ヶ月の間の重症網膜機能不全および重症視力障害によって特徴付けられる網膜変性症の遺伝性形態である。ＬＣＡは、希少疾患（２００，０００人よりも少ないアメリカ人が罹患する疾患）であるが、ＬＣＡの合わせて１８のサブタイプが、遺伝性失明の最も一般的な原因である。ＬＣＡ１０と命名されたサブタイプは、全てのＬＣＡ症例の＞２０％を占める最も一般的なサブタイプである。ＬＣＡの一部の形態は、欠損細胞性遺伝子の機能的コピーを送達するように操作された組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による処置に適している。２００８年には、ＲＰＥ６５中の突然変異を補完した導入遺伝子が、第Ｉ相臨床試験においてＡＡＶをＬＣＡ２患者に首尾よく送達した（Maguire  AMら、N  Engl  J  Med.  ２００８年；３５８巻（２１号）：２２４０〜２２４８頁）。一部の応答が注目されたが、導入遺伝子発現は最終的には喪失するので、これらは耐久性がない（Schimmer  Jら、Hum  Gene  Ther  Clin  Dev.  ２０１５年；２６巻（４号）：２０８〜２１０頁；Azvolinsky  A.  Nat  Biotechnol.  ２０１５年；３３巻（７号）：６７８〜６７８頁）。さらに、異なるＬＣＡサブタイプを引き起こす遺伝子の一部は単に、ＡＡＶ送達には大きすぎる。したがって、ＬＣＡのこれらのサブタイプは、処置不能のままである。
【０００３】
ＡＤＲＰは、ＲＰの全ての症例のおよそ３０〜４０％を構成し、ＡＤＲＰ患者の中で最も一般的に突然変異したＲＰ関連遺伝子は、桿体視色素ロドプシンをコードする遺伝子である（Dryja,  T.  P.ら、The  New  England  journal  of  medicine  ３２３巻、１３０２〜１３０７頁（１９９０年）；Dryja,  T.  P.ら、Nature  ３４３巻、３６４〜３６６頁（１９９０年））。現在、ＡＤＲＰ患者のためのＦＤＡ承認された処置は存在しない；しかし、いくつかの手法が開発中である。これらの手法のほとんどは、「抑制および置き換え」というテーマの変形形態である。この手法では、変性を担う遺伝子の発現をノックダウンする、例えば、リボザイムまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ方法論の両方が探索されている）によってロドプシンＲＮＡのレベルをノックダウンし、次いで、リボザイムまたはＲＮＡｉ剤によるノックダウンに対して感受性でない「硬くなった」遺伝子によって、内因性対立遺伝子の発現を置き換える。おそらくはクリニックに最も近いこのテーマのバリアントは、Ｇｅｎａｂｌｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄによって開発中のＲｈｏＮｏｖａ薬剤である。ＲｈｏＮｏｖａは、ｓｉＲＮＡノックダウンに対して感受性でない、修飾されているが機能的なロドプシンをコードするＡＡＶ送達されるｃＤＮＡと組み合わせて、内因性ロドプシン発現（突然変異体および野生型の両方）をノックダウンするためにｓｉＲＮＡを使用する（http://www.genable.net）。
世界中で不可逆的失明の主要原因である緑内障（Levkovitch-Verbin  Hら、iovsorg  ４４巻、３３８８〜３３９３頁（２００３年））は、視神経乳頭の篩骨篩板（lamina  cribosa）における網膜神経節細胞（ＲＧＣ）軸索の進行性の損傷が軸索変性および細胞死をもたらす視神経症である（Howell  GRら、J  Cell  Biol  １７９巻、１５２３〜１５３７頁（２００７年））。現在、眼内圧（ＩＯＰ）を低下させ、視神経乳頭における傷害を低減させるのは、点眼薬、レーザーまたは切開手術のいずれかによる処置のみである。残念ながら、これは一部の患者では困難であり、他の患者では、この疾患は積極的なＩＯＰ低下にもかかわらず、悪化し続け得る。残存する軸索傷害に対するＲＧＣ応答を軽減することによってＩＯＰ低下を補完する代替的治療戦略が、この分野で長く必要とされてきた。さらに、ＮＥＩは、そのＡｕｄａｃｉｏｕｓ  Ｇｏａｌｓにおいて視神経再生を列挙しており、任意の再生治療が、軸索切断されたＲＧＣの生存の問題に取り組む必要がある。この目的のために、ＲＧＣ軸索変性および／または軸索傷害関連細胞死の活性な遺伝的プログラムに直接干渉し得る神経保護薬を開発することが大いに必要とされている（Adalbert  Rら、Science（２０１２年）、doi:10.1126/science.1223899；Yang  Jら、Cell  １６０巻、１６１〜１７６頁（２０１５年）；Welsbie  DSら、Proc  Nat  Acad  Sci  USA  １１０巻、４０４５〜４０５０頁（２０１３年）；Watkins  TAら、Proc  Nat  Acad  Sci  USA  １１０巻、４０３９〜４０４４頁（２０１３年））。
【０００４】
したがって、ＬＣＡ、ＡＤＲＰおよび緑内障などの網膜変性症を処置するための新規かつ改善された治療が大いに必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Maguire  AMら、N  Engl  J  Med.  ２００８年；３５８巻（２１号）：２２４０〜２２４８頁
【非特許文献２】Schimmer  Jら、Hum  Gene  Ther  Clin  Dev.  ２０１５年；２６巻（４号）：２０８〜２１０頁
【非特許文献３】Azvolinsky  A.  Nat  Biotechnol.  ２０１５年；３３巻（７号）：６７８〜６７８頁
【非特許文献４】Dryja,  T.  P.ら、The  New  England  journal  of  medicine  ３２３巻、１３０２〜１３０７頁（１９９０年）
【非特許文献５】Dryja,  T.  P.ら、Nature  ３４３巻、３６４〜３６６頁（１９９０年）
【非特許文献６】Levkovitch-Verbin  Hら、iovsorg  ４４巻、３３８８〜３３９３頁（２００３年）
【非特許文献７】Howell  GRら、J  Cell  Biol  １７９巻、１５２３〜１５３７頁（２００７年）
【非特許文献８】Adalbert  Rら、Science（２０１２年）、doi:10.1126/science.1223899
【非特許文献９】Yang  Jら、Cell  １６０巻、１６１〜１７６頁（２０１５年）
【非特許文献１０】Welsbie  DSら、Proc  Nat  Acad  Sci  USA  １１０巻、４０４５〜４０５０頁（２０１３年）
【非特許文献１１】Watkins  TAら、Proc  Nat  Acad  Sci  USA  １１０巻、４０３９〜４０４４頁（２０１３年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本発明の実施は、典型的には、特に示さない限り、当業者の技術範囲内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）技術、免疫学およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の従来の技術を使用する。ある特定のこれらの技術の非限定的な記載は、以下の刊行物中に見出される：Ausubel,  F.ら（編）、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Current  Protocols  in  Immunology、Current  Protocols  in  Protein  ScienceおよびCurrent  Protocols  in  Cell  Biology、全てJohn  Wiley  &  Sons、N.Y.、２００８年１２月時点の版；Sambrook、RussellおよびSambrook、Molecular  Cloning.  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、２００１年；Harlow,  E.およびLane,  D.、Antibodies-A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、１９８８年；Freshney,  R.  I.、「Culture  of  Animal  Cells,  A  Manual  of  Basic  Technique」、第５版、John  Wiley  &  Sons、Hoboken、N.J.、２００５年。治療剤およびヒト疾患に関する非限定的な情報は、GoodmanおよびGilmanのThe  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、第１１版、McGraw  Hill、２００５年、Katzung,  B.（編）Basic  and  Clinical  Pharmacology、McGraw-Hill/Appleton  &  Lange  第１０版（２００６年）または第１１版（２００９年７月）中に見出される。遺伝子および遺伝障害に関する非限定的な情報は、McKusick,  V.  A.：Mendelian  Inheritance  in  Man.  A  Catalog  of  Human  Genes  and  Genetic  Disorders.  Baltimore：Johns  Hopkins  University  Press、１９９８年（第１２版）またはより最近のオンラインデータベース：ワールドワイドウェブ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/上で入手可能な、２０１０年５月１日時点のOnline  Mendelian  Inheritance  in  Man、OMIM（商標）.  McKusick-Nathans  Institute  of  Genetic  Medicine、Johns  Hopkins  University（Baltimore、Md.）およびNational  Center  for  Biotechnology  Information、National  Library  of  Medicine（Bethesda、Md.）、ならびにワールドワイドウェブ：http://omia.angis.org.au/contact.shtml上で入手可能な、動物種（ヒトおよびマウス以外）における遺伝子、遺伝性障害および形質のデータベースであるOnline  Mendelian  Inheritance  in  Animals（ＯＭＩＡ）中に見出される。本明細書で言及されている全ての特許、特許出願および他の刊行物（例えば、科学論文、書籍、ウェブサイトおよびデータベース）は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書と組み込まれた参考文献のいずれかとの間に矛盾がある場合、本明細書（組み込まれた参考文献に基づき得るその任意の補正を含む）が支配するものとする。特に示さない限り、用語の標準的な当該分野で受容された意味が本明細書で使用される。種々の用語の標準的な略号が本明細書で使用される。
【０００７】
網膜変性症、例えば、レーバー先天性黒内障（Leper's  congenital  amaurosis）（例えば、レーバー先天性黒内障１０  ＣＥＰ２９０突然変異（ＬＣＡ））、網膜色素変性症（例えば、ロドプシンＲ１３５突然変異）または緑内障を含む視神経症を処置するための方法が、本明細書に記載されている。これらの方法は、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡをカットおよび／または修復するための、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、非Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステム、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ−１システムなど）などの修飾ヌクレアーゼシステム（例えば、Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２システム）を使用する。ＣＲＩＳＰＲシステムベースの遺伝子編集は、視神経症および網膜変性症を引き起こす遺伝子突然変異（例えば、ＬＣＡおよびロドプシン突然変異）を不活性化または修正し、それによって、これらの群の疾患のための遺伝子治療手法を提供するために使用され得る。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲシステムは、網膜変性症（例えば、緑内障）を引き起こす正常遺伝子（例えば、ＤＬＫおよび／またはＬＺＫ）を不活性化する突然変異を導入するために使用される。これらの遺伝子は、損傷感知および細胞生存において役割を果たすので、得られる効果は細胞生存である。緑内障をもたらし得る遺伝的突然変異が同様に存在し、これらは網膜変性症と同じであるので、「神経保護的」手法は、相互に排他的な手法ではない。一部の実施形態では、緑内障の突然変異標的には、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＴＭＣＯ１、ＰＭＭ２、ＧＭＤＳ、ＧＡＳ７、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＴＸＮＲＤ２、ＡＴＸＮ２、ＣＡＶ１／ＣＡＶ２、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＳＩＸ６、ＡＢＣＡ１、ＡＦＡＰ１およびＣＤＫＮ２Ｂ−ＡＳが含まれるがこれらに限定されない。
【０００８】
したがって、本発明の一態様は、対象の網膜領域が罹患する障害（例えば、網膜変性症）を処置するための方法であって、ゲノム標的化ヌクレアーゼと少なくとも１つの標的化されたゲノム配列を含むガイドＤＮＡとを含むヌクレアーゼシステムの治療有効量を、対象の網膜領域に投与するステップを含む方法に関する。
【０００９】
本発明の別の態様は、ＷＯ２０１５／１９５６２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載された天然に存在しないＣＲＩＳＰＲシステムの修飾を含む組成物を利用する、網膜変性症を処置するための方法を提供する。かかる修飾は、例えばＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子、ロドプシン、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、ＭＥＦ２Ａ、ＳＯＸ１１またはＰＵＭＡであるがこれらに限定されない網膜変性症（retinal  degneration）関連遺伝子を標的化するある特定のｇＲＮＡを使用する。一部の実施形態では、この組成物は、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、双方向Ｈ１プロモーター）であって、このｇＲＮＡは、対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）を含み、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。一部の実施形態では、このプロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。
【００１０】
本発明の別の態様は、真核生物細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、ＷＯ２０１５／１９５６２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載された修飾された天然に存在しないＣＲＩＳＰＲシステムを細胞中に導入するステップを含む方法を提供する。かかる修飾は、例えば、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子、ロドプシン、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、ＭＥＦ２Ａ、ＳＯＸ１１またはＰＵＭＡであるがこれらに限定されない網膜変性症関連遺伝子を標的化するある特定のｇＲＮＡを使用する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、双方向Ｈ１プロモーター）であって、このｇＲＮＡは、対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）を含む組成物を細胞中に導入するステップを含み、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。一部の実施形態では、このプロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。
【００１１】
本発明の一態様は、それを必要とする対象において網膜変性症を処置するための方法であって、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、このｇＲＮＡは、対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを提供するステップであって、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ；ならびに（ｂ）治療有効量のこのシステムを、対象の網膜領域に投与するステップを含む、方法に関する。
【００１２】
一部の実施形態では、このシステムはＣＲＩＳＰＲである。
【００１３】
一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。
【００１４】
一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。
【００１５】
一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。
【００１６】
一部の実施形態では、このプロモーターは、双方向プロモーターを含む。一部の実施形態では、このプロモーターは、配列番号７３９〜７８７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このプロモーターは、配列番号７３９〜７８７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、この双方向プロモーターはＨ１（配列番号７８７）である。このＨ１プロモーターは、ｐｏｌ  ＩＩおよびｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの両方である。一部の実施形態では、このプロモーターは、Ｈ１プロモーターに対してオルソロガスである。
【００１８】
一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、真獣類哺乳動物に由来する。
【００１９】
一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、ａｉｌｕｒｏｐｏｄａ  ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ、ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ、ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ、ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｓａｂａｅｕｓ、ｃｈｏｌｏｅｐｕｓ  ｈｏｆｆｍａｎｎｉ、ｄａｓｙｐｕｓ  ｎｏｖｅｍｃｉｎｃｔｕｓ、ｄｉｐｏｄｏｍｙｓ  ｏｒｄｉｉ、ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ、ｅｒｉｎａｃｅｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ、ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ、ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ｉｃｔｉｄｏｍｙｓ  ｔｒｉｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｕｓ、ｌｏｘｏｄｏｎｔａ  ａｆｒｉｃａｎａ、ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ｍｕｓｔｅｌａ  ｐｕｔｏｒｉｕｓ  ｆｕｒｏ、ｍｙｏｔｉｓ  ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、ｎｏｍａｓｃｕｓ  ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ、ｏｃｈｏｔｏｎａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ、ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、ｏｔｏｌｅｍｕｒ  ｇａｒｎｅｔｔｉｉ、ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ、ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ、ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ、ｐｒｏｃａｖｉａ  ｃａｐｅｎｓｉｓ、ｐｔｅｒｏｐｕｓ  ｖａｍｐｙｒｕｓ、ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、ｔａｒｓｉｕｓ  ｓｙｒｉｃｈｔａ、ｔｕｐａｉａ  ｂｅｌａｎｇｅｒｉ、ｔｕｒｓｉｏｐｓ  ｔｒｕｎｃａｔｕｓ、ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓに由来する。
【００２０】
一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、マウスまたはラットに由来する。
【００２１】
一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、配列番号７５２〜７８６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、配列番号７５２〜７８６からなる群に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。
【００２４】
一部の実施形態では、このゲノム標的化ヌクレアーゼはＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【００２５】
一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。
【００２６】
一部の実施形態では、この網膜領域は網膜である。
【００２７】
一部の実施形態では、この細胞は網膜光受容体細胞である。
【００２８】
一部の実施形態では、この細胞は網膜神経節細胞である。
【００２９】
一部の実施形態では、この網膜変性症は、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および緑内障からなる群から選択される。
【００３０】
一部の実施形態では、この網膜変性症は、ＬＣＡ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８である。
【００３１】
一部の実施形態では、この網膜変性症はＬＣＡ１０である。
【００３２】
一部の実施形態では、この標的配列は、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子中にある。
【００３３】
一部の実施形態では、この標的配列は、ＣＥＰ２９０遺伝子中の突然変異である。
【００３４】
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１〜１０９、１６４〜３５６、７３５〜７３８に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３５】
一部の実施形態では、この標的配列は、作動可能に連結した配列番号１、２、３および４を含む。
【００３６】
一部の実施形態では、このベクターは、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
一部の実施形態では、この網膜変性症は、常染色体優性形態の網膜色素変性症（ＡＤＲＰ）である。
【００３８】
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物はロドプシンである。
【００３９】
一部の実施形態では、この標的配列は、ロドプシン遺伝子中の突然変異である。
【００４０】
一部の実施形態では、この標的配列は、ロドプシン遺伝子のＲ１３５における突然変異である。
【００４１】
一部の実施形態では、Ｒ１３５における突然変異は、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３５Ｗ、Ｒ１３５Ｌからなる群から選択される。
【００４２】
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１１１〜１２６に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４３】
一部の実施形態では、このｇＲＮＡ配列は、配列番号１２７〜１４２に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４４】
一部の実施形態では、この網膜変性症は緑内障である。
【００４５】
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物は、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、性決定領域Ｙ（ＳＲＹ）−ボックス１１（ＳＯＸ１１）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＳＯＸ１１もしくはＰＵＭＡ、またはそれらの組合せである。
【００４６】
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物は、ＤＬＫ／ＬＺＫ、ＭＫＫ４／７、ＪＮＫ１／２／３またはＳＯＸ１１／ＡＴＦ２／ＪＵＮ／ＭＥＦ２Ａ経路のメンバーである。
【００４７】
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１４３〜１６３に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４８】
一部の実施形態では、対象に投与するステップは、移植、注射またはウイルスによって行われる。
【００４９】
一部の実施形態では、対象に投与するステップは、網膜下注射によって行われる。
【００５０】
一部の実施形態では、この対象はヒトである。
【００５１】
本発明の別の態様は、細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、このｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、プロモーター；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更するステップを含む方法に関する。
【００５２】
一部の実施形態では、このシステムはＣＲＩＳＰＲである。
【００５３】
一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。
【００５４】
一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。
【００５５】
一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。
【００５６】
一部の実施形態では、このプロモーターは双方向プロモーターである。
【００５７】
一部の実施形態では、この双方向プロモーターはＨ１である。このＨ１プロモーターは、ｐｏｌ  ＩＩおよびｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの両方である。
【００５８】
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。
【００５９】
一部の実施形態では、このゲノム標的化ヌクレアーゼはＣａｓ９である。
【００６０】
一部の実施形態では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【００６１】
一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。
【００６２】
一部の実施形態では、この細胞は、真核生物細胞または非真核生物細胞である。
【００６３】
一部の実施形態では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。
【００６４】
一部の実施形態では、この細胞は網膜光受容体細胞である。
【００６５】
一部の実施形態では、この細胞は網膜神経節細胞である。
【００６６】
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物は、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０である。
【００６７】
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１〜１０９、１６４〜３５６、７３５〜７３８に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【００６８】
一部の実施形態では、この標的配列は、作動可能に連結した配列番号１、２、３および４を含む。
【００６９】
一部の実施形態では、このベクターは、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物はロドプシンである。
【００７１】
一部の実施形態では、この標的配列は、ロドプシン遺伝子中の突然変異である。
【００７２】
一部の実施形態では、この標的配列は、ロドプシン遺伝子のＲ１３５における突然変異である。
【００７３】
一部の実施形態では、Ｒ１３５における突然変異は、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３５Ｗ、Ｒ１３５Ｌからなる群から選択される。
【００７４】
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１１１〜１２６に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【００７５】
一部の実施形態では、このｇＲＮＡ配列は、配列番号１２７〜１４２に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【００７６】
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物は、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、性決定領域Ｙ（ＳＲＹ）−ボックス１１（ＳＯＸ１１）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＳＯＸ１１もしくはＰＵＭＡ、またはそれらの組合せである。
【００７７】
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物は、ＤＬＫ／ＬＺＫ、ＭＫＫ４／７、ＪＮＫ１／２／３またはＳＯＸ１１／ＡＴＦ２／ＪＵＮ／ＭＥＦ２Ａ経路のメンバーである。
【００７８】
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１４３〜１６３に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【００７９】
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
【００８０】
本開示の主題によって全体的にまたは部分的に扱われる本開示の主題のある特定の態様が本明細書で上記されているが、他の態様は、以下に本明細書に最良に記載されている添付の実施例および図面と関連して解釈すると、説明が進むにつれて明らかになる。
【００８１】
このように本開示の主題を一般に述べたところで、必ずしも一定の縮尺で描かれたものではない添付の図面を参照する：
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、プラットフォーム技術を示す図である。ｐｏｌ  ＩＩ転写物が青色で示され、ｐｏｌ  ＩＩＩ転写物がオレンジ色で示されたＨ１双方向プロモーターのゲノム配列（左側）。ｓｐＣａｓ９およびｇＲＮＡの単一のＡＡＶベクターへのパッケージング（右側）。
【００８３】
【図２】図２は、ＡＡＶ−Ｈ１−ＣＲＩＳＰＲのマウス網膜への送達を示す図である。Ｃａｓ９の代わりにＧＦＰを発現するように操作されたウイルスでは、網膜下注射後に、外顆粒層（ＯＮＬ）のマウス光受容体の効率的かつ特異的な形質導入が実証される。これらは、ＬＣＡ突然変異による影響を受ける細胞である。
【００８４】
【図３】図３は、反対の鎖上に２つの近接する向かい合った標的部位（ＬおよびＲ）を必要とするＣａｓ９ニッカーゼ手法の図解である。
【００８５】
【図４】図４は、ＬＣＡ１０突然変異を示す図である。約１ｋｂの欠失をもたらし、それにより隠れたエクソンＸをＣＥＰ２９０から除去する４つの同定されたｇＲＮＡ部位。
【００８６】
【図５】図５は、４５５０ｂｐで２種のｇＲＮＡを送達する現行のＳａＣａｓ９手法（左側）と、それに対して、４３３５ｂｐを使用して４種のｇＲＮＡを送達する小型のＨ１系（右側）を示す図である。ＡＡＶパッケージング容量が点線で示されている。
【００８７】
【図６】図６は、全てのＳａＣａｓ９部位（ＣＥＰ２９０突然変異の１ｋｂ上流および１ｋｂ下流）を示す図である。
【００８８】
【図７】図７は、標的化に利用可能なＳａＣａｓ９部位（全て５’Ｇで開始する）を示す図である。
【００８９】
【図８】図８は、はるかに安全なＳａＣａｓ９ニッカーゼ手法を示す図である。
【００９０】
【図９】図９は、ＳａＣａｓ９ニッカーゼ欠失（１０７８ｂｐ）を示す図である。
【００９１】
【図１０】図１０は、潜在的なＳｐＣａｓ９部位を示す図である。
【００９２】
【図１１】図１１は、ＣＥＰ２９０（ＬＣＡ１０）標的化領域内の５’ヌクレオチドによるＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９のＣＲＩＳＰＲ部位の数を示すグラフである。
【００９３】
【図１２】図１２は、４種のｇＲＮＡを有する、クローニングされた約４．２ｋｂのＳａＣａｓ９構築物を示す図である。
【００９４】
【図１３】図１３は、ロドプシン遺伝子構造を示す図である。
【００９５】
【図１４】図１４は、世界的なＲＨＯ遺伝子の突然変異スペクトルを示す図である（http://www.hindawi.com/journals/bmri/2014/302487/より）
【００９６】
【図１５】図１５は、ロドプシンＡｒｇ１３５突然変異を示す図である。
【００９７】
【図１６】図１６は、２つのフランス人家族のＲ１３５Ｗ系図である（Audo  Iら、Invest  Ophthalmol  Vis  Sci.（２０１０年）７月；５１巻（７号）：３６８７〜７００頁より）。
【００９８】
【図１７】図１７は、５世代のシチリア人系図からのＲ１３５Ｗを示す図である（Pannarale  MRら、Ophthalmology.（１９９６年）９月；１０３巻（９号）：１４４３〜５２頁より）。
【００９９】
【図１８】図１８は、Ｒ１３５Ｌを有する６世代のスウェーデン人家族を示す図である（Andreasson  Sら、Ophthalmic  Paediatr  Genet.（１９９２年）９月；１３巻（３号）：１４５〜５３頁より）。
【０１００】
【図１９】図１９は、感度が増したカイノームスクリーンでＬＺＫがＤＬＫと協同してＲＧＣ細胞死を促進することが同定されることを示す図である。
【０１０１】
【図２０】図２０は、全ゲノムｓｉＲＮＡスクリーンでＲＧＣ細胞死のメディエーターとしてＡＴＦ２、ＳＯＸ１１、およびＭＥＦ２Ａが同定されることを示す図である。
【０１０２】
【図２１】図２１は、ＬＺＫ／ＤＬＫ依存性ＲＧＣ細胞死の下流のメディエーターを示すグラフである。
【０１０３】
【図２２】図２２は、ＬＺＫ内のカルシウム感知モチーフは毒性に必ずしも必要でないことを示すグラフである。
【０１０４】
【図２３】図２３は、標的化可能なｓｐＣａｓ９部位の数を増加させるためのハンマーヘッド型リボザイム−ｓｇＲＮＡ融合物を示す図である。
【０１０５】
【図２４】図２４は、ネットワークに基づくｓｉＲＮＡおよびｓｉＰＯＯＬスクリーニングが、改善された感度および特異度を有することを示す図である。
【０１０６】
【図２５】図２５は、Ｈ１プロモーターにより、Ｐｏｌ  ＩＩおよびＰｏｌ  ＩＩＩ転写物の双方向発現が可能になることを示す図である。
【０１０７】
【図２６】図２６は、ＲＧＣのフローサイトメトリーに基づく数量化を示す図である。
【０１０８】
【図２７−１】図２７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＤＬＫエクソン１（Ａ）およびエクソン２（Ｂ）のＣＲＩＳＰＲによる標的化を示す図である。ＤＬＫのエクソン１およびエクソン２の標的部位が青色で示され、Ｔ７Ｅ１プライマーが緑色で示されている。
【図２７−２】同上。
【０１０９】
【図２８】図２８は、２つのパネル、ＡおよびＢを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＤＬＫのＣＲＩＳＰＲによる標的化を示す図である。図２８Ａは、ｇＲＮＡの、マウス由来のＤＬＫ遺伝子を標的にするそれらの能力についてのスクリーニングを示す。標的部位の命名法は、http://crispr.technologyに従う。図２８Ｂは、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを発現させるために双方向プロモーターを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける切断では、ＤＬＫ遺伝子座の効率的な標的化が実証されることを示す。対照は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡについての標準の２プラスミドトランスフェクションである。図２８Ｂは、Ｈ１双方向プロモーターからＣａｓ９およびｇＲＮＡの両方を駆動できることを試験する実験を示す。培養物中の細胞に、標準の２つのプラスミド（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）または単一のプラスミドのいずれかを、Ｈ１双方向プロモーターを使用してトランスフェクトした。Ｔ７ＥＩアッセイでは、いずれの系を使用しても同等のレベルのカットが示される。
【０１１０】
【図２９】図２９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＡＡＶによるＤＬＫ標的化を示す図である。
【０１１１】
【図３０】図３０は、３つのパネル、Ａ、Ｂ、およびＣを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＲＧＣにおける双方向発現を示す図である。図３０Ａは、ＡＡＶ中にパッケージングされた構築物を示す。図３０Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＦＰの細胞型発現が、使用されるＡＡＶ血清型の影響を受けることを示す。上は、光受容体における優先的な発現を示し、下のパネルは、ＲＧＣにおける優先的な発現を示す。Ｈ１プロモーターは、ＡＡＶ５により送達される光受容体細胞において、またはＡＡＶ２による網膜神経節細胞において（対照）のいずれにおいてもＧＦＰを明白に発現させる。どちらのウイルスも、Ｐ０．５日マウスへの網膜下注射によって送達された。どちらも、図３０Ａに示されているレポーターの網膜下注射によって送達された。図３０Ｃは、レポーター構築物のＡＡＶ２による硝子体内送達の１５日後のフラットマウントによるＧＦＰ発現を示す。
【０１１２】
【図３１Ａ−１】図３１は、３つのパネル、Ａ、Ｂ、およびＣを含み、自己相補的ＡＡＶウイルスを使用した双方向標的化を示す図である。図３１Ａは、双方向プロモーターから核ｍＣｈｅｒｒｙおよびｇＲＮＡを発現する自己相補的ＡＡＶ構築物を示す。この図は、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）を使用してｇＲＮＡおよび蛍光レポータータンパク質（Ｈ２Ｂ−ｍＣｈｅｒｒｙ）を送達できることを試験する実験をさらに示す。細胞をＣａｓ９マウスから回収し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入した。ｓｃＡＡＶの利点は、発現が数週間ではなく数日で起こるので構築物をはるかに速く試験できることである。図３１Ａは、ｇＲＮＡ（黒色で示されている）とｍＣｈｅｒｒｙを同時に発現させるためにＨ１プロモーターを使用して生成した構築物を示す。ｇＲＮＡは、不活化すると、網膜神経節細胞生存の増強をもたらす遺伝子であるＤＬＫマウス遺伝子を標的にする。構築物をパッケージングして自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）を産生した。網膜神経節細胞をＣａｓ９トランスジェニックマウス（ＧＦＰを同時発現する）から回収し、ｓｃＡＡＶウイルスを用いて形質導入した；ｍＣｈｅｒｒｙ発現はＧＦＰを発現する全ての細胞において明白であり、これにより、構築物による高度に効率的な形質導入および発現が示される。図３１Ａは、また、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）を使用してｇＲＮＡおよび蛍光レポータータンパク質（Ｈ２Ｂ−ｍＣｈｅｒｒｙ）を送達できることの試験も示す。細胞をＣａｓ９マウスから回収し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入した。ｓｃＡＡＶの利点は、発現が数週間ではなく数日で起こるので構築物をはるかに速く試験できることである。図３１Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＲＧＣに形質導入したｓｃＡＡＶレポーターのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発現を示す；ＧＦＰ発現はＣａｓ９マウスからのものである。図３１Ｃは、ＢｇｌＩＩアッセイによって検出された高度に効率的な標的化（基本的に）１００％を示す。ｇＲＮＡ（ｍｍ０７９）はｓｓＡＡＶによって送達したものであり、Ｃａｓ９はマウス由来で存在するものであった。
【図３１Ａ−２】同上。
【図３１Ｂ】同上。
【図３１Ｃ】同上。
【０１１３】
【図３２−１】図３２は、５つのパネル、Ａ〜Ｅを含む、自己相補的ＡＡＶウイルスを使用した双方向標的化を示す図である。ＷＴ  ＲＧＣまたはＣａｓ９マウスに由来するＲＧＣのいずれかに形質導入するｓｃＡＡＶウイルスの力価測定。図３２Ｃは、ＲＧＣにおいてＣａｓ９が存在する場合にゲノム編集が起こることを示す。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、非常に高いレベル（約１００％）のカットが実証される。このアッセイでは、制限酵素部位の消失によるカットについてアッセイする。ＷＴ動物では、ＰＣＲ産物はＢｇｌＩＩによって完全に消化されるが、ＡＡＶを用いて形質導入したＣａｓ９マウスでは、高濃度で、ＢｇｌＩＩによるカットは基本的に検出不可能であり、これにより、ＣＲＩＳＰＲによるカットが約１００％であることが示される。図３２Ｄおよび３２Ｅは、処置された眼における、視神経挫滅後のｉｎ  ｖｉｖｏでの網膜神経節細胞のレスキューを示す。ｇＲＮＡ（黒色で示されている）とｍＣｈｅｒｒｙを同時に発現させるためにＨ１プロモーターを使用して構築物を生成した。ｇＲＮＡは、不活化すると、網膜神経節細胞生存の増強をもたらす遺伝子であるＤＬＫマウス遺伝子を標的にする。構築物をパッケージングして自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）を産生した。ウイルスを、Ｃａｓ９トランスジェニック、または対照としてＷＴマウスに硝子体内投与した。視神経挫滅の１４日後に網膜神経節細胞生存を定量化し、ＣＲＩＳＰＲ送達により、処置したマウスでは対照と比較してＲＧＣ生存がもたらされることが示された。（どちらのマウスもＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡを受けるが、マウス間の差異は、ゲノム編集に必要なＣａｓ９の存在である）。
【図３２−２】同上。
【図３２−３】同上。
【０１１４】
【図３３】図３３は、３つのパネル、Ａ、Ｂ、およびＣを含む、ＤＬＫのＣＲＩＳＰＲによる標的化により、ＲＧＣ生存がもたらされることを示す図である。Ｃａｓ９マウス由来のＲＧＣへのレンチウイルスによる形質導入により、ＢｇｌＩＩアッセイによって測定して約１００％のカットがもたらされる。ＤＬＫの破壊により、ＲＧＣ生存の有意な増大がもたらされ、これにより、ＤＬＫ標的化の視神経症における治療標的としての潜在性が実証される。
【０１１５】
【図３４Ａ】図３４は、２つのパネル、ＡおよびＢを含み、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＬＺＫのＣＲＩＳＰＲによる標的化を示す図である。図３４Ａは、ＬＺＫのエクソン１を示し、標的部位が青色で示され、Ｔ７Ｅ１プライマーが緑色で示されている。図３４Ｂは、ＬＺＫのエクソン２を示し、標的部位が青色で示され、Ｔ７Ｅ１プライマーが緑色で示されている。
【図３４Ｂ】同上。
【０１１６】
【図３５−１】図３５は、７つのパネル、Ａ〜Ｈを含み、カイノームの感度が増したｓｉＲＮＡスクリーニングでｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＲＧＣ細胞死のメディエーターとしてＬＺＫが同定されることを示す図である。図３５Ａは、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスを用いて形質導入し、トザセルチブ（１μＭ）またはビヒクル対照の存在下で培養したＤｌｋｆｌ／ｆｌ  ＲＧＣの生存を示す。図３５Ｂは、カイノームライブラリー内の全１，８６９種のｓｉＲＮＡ（Ｄｌｋ  ｓｉＲＮＡの存在下でトランスフェクトした）についての正規化された生存のヒストグラムを示す。矢印は、Ｌｚｋに対する３種のｓｉＲＮＡのそれぞれについての生存を示す。図３５Ｃは、対照またはＤｌｋ  ｓｉＲＮＡを４種の独立したＬｚｋ  ｓｉＲＮＡのうちの１種または非標的化対照と組み合わせてトランスフェクトしたＷＴ  ＲＧＣの生存を示す図である。図３５Ｄは、対照、Ｄｌｋ  ｓｉＰＯＯＬ、Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬまたはＤｌｋ  ｓｉＰＯＯＬとＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬの両方をトランスフェクトした後のＷＴ  ＲＧＣのキャピラリーに基づくイムノアッセイを示す。図３５Ｅは、漸増量の対照、Ｄｌｋ  ｓｉＰＯＯＬ、Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬまたはＤｌｋ  ｓｉＰＯＯＬとＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬの両方をトランスフェクトしたＷＴ  ＲＧＣの生存を示す。図３５Ｆは、Ｄｌｋ  ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡまたはキナーゼの混合系列キナーゼファミリーの他のメンバーを標的にする４種の独立したｓｉＲＮＡのうちの１種のいずれかをトランスフェクトしたＷＴ  ＲＧＣの生存を示す。図３５Ｇは、対照、Ｄｌｋ  ｓｉＰＯＯＬ、Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬまたはＤｌｋ  ｓｉＰＯＯＬとＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬの両方をトランスフェクトし、漸増用量のトザセルチブの存在下で培養したＷＴ  ＲＧＣの生存を示す。図３５Ｈは、コルヒチン（１μＭ）添加の２日後に、ニューロトロフィン（ＮＴ、５０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、５ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦ）の存在下または不在下でｓｉＰＯＯＬをトランスフェクトしたＷＴ  ＲＧＣの生存（±ＳＤ）を示す。＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーのＵ検定。Ｄ／Ｌ、Ｄｌｋ／Ｌｚｋ。
【図３５−２】同上。
【０１１７】
【図３６】図３６は、６つのパネル、ＡおよびＦを含む、ＤｌｋおよびＬｚｋの標的化欠失を有するＲＧＣが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて軸索傷害により誘導される細胞死に対して高度に抵抗性であることを示す図である。図３６Ａは、構成的およびコンディショナルＬｚｋノックアウトマウスを生成するために使用した手法の図を示す。挿入図は、ヘテロ接合性動物における単一の標的化構築物の存在を確認するサザンブロットを示す。図３６Ｂは、イムノパニング傷害の０時間後または２４時間後の、ＷＴから単離されたＲＧＣと、それに対して、Ｌｚｋ−／−マウスから単離されたＲＧＣのキャピラリーに基づくイムノアッセイ（上）および数量化（下）を示す。図３６Ｃは、視神経挫滅の２週間後または偽対照の、傷害を受けていない対照に対して正規化した、生存ＲＧＣの数のフローサイトメトリーに基づく数量化を示す。ＮＳ、有意でない、マン・ホイットニーのＵ検定。図３６Ｄは、ＷＴまたはＬｚｋｆｌ／ｆｌマウスから単離され、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスを用いて形質導入したＲＧＣのキャピラリーに基づくイムノアッセイ（上）および数量化（下）を示す。図３６Ｅは、漸増量の、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスのいずれかを用いて形質導入したＷＴ、Ｄｌｋｆｌ／ｆｌ、Ｌｚｋｆｌ／ｆｌまたはＤｌｋｆｌ／ｆｌＬｚｋｆｌ／ｆｌ  ＲＧＣの生存を示す。図３６Ｆは、視神経挫滅の２週間後または偽対照の、傷害を受けていない対照に対して正規化した、生存ＲＧＣの数のフローサイトメトリーに基づく数量化を示す。外科手術の２週間後に、全ての眼に１０９ｖｇのＡＡＶ２−Ｃｒｅを注射した。＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーのＵ検定。
【０１１８】
【図３７】図３７は、５つのパネル、Ａ〜Ｅを含み、ＬＺＫキナーゼシグナル伝達により、ＭＫＫ４／７およびＪＮＫ１〜３キナーゼカスケードを介してＲＧＣ細胞死が誘発されることを示す図である。図３７Ａは、Ｄｌｋ／Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬをトランスフェクトし、次いで、ＷＴまたは突然変異型ｓｉＰＯＯＬ抵抗性ヒトＬＺＫ  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルスを用いて形質導入することによりＬＺＫシグナル伝達を再構成したＷＴ  ＲＧＣの生存を示す。図３７Ｂ〜Ｃは、漸増量の、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスを用いて形質導入したＷＴ  ＲＧＣ（Ｂ〜Ｃ）、Ｊｎｋ１ｆｌ／ｆｌＪｎｋ２−／−Ｊｎｋ３−／−ＲＧＣ（Ｂ）またはＭｋｋ４ｆｌ／ｆｌＭｋｋ７ｆｌ／ｆｌＲＧＣ（Ｃ）の生存を示す。図３７Ｄ〜Ｅは、Ｄｌｋ／Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬをトランスフェクトし、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスを用いて形質導入し、次いで、２日後に、ヒトＬＺＫ  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスを用いて形質導入することによってＬＺＫシグナル伝達を再構成したＷＴ  ＲＧＣ（Ｄ〜Ｅ）、Ｊｎｋ１ｆｌ／ｆｌＪｎｋ２−／−Ｊｎｋ３−／−ＲＧＣ（Ｄ）またはＭｋｋ４ｆｌ／ｆｌＭｋｋ７ｆｌ／ｆｌＲＧＣ（Ｅ）の生存を示す。
【０１１９】
【図３８】図３８は、３つのパネル、Ａ〜Ｃを含み、全ゲノムｓｉＲＮＡスクリーンでＲＧＣ細胞死のメディエーターとしてＡＴＦ２、ＰＵＭＡおよびＭＥＦ２Ａが同定されることを示す図である。図３８Ａは、全ゲノムライブラリー内の１７，５７５種の遺伝子のそれぞれを標的とする、生存期間中央値増進性ｓｉＲＮＡについての正規化された、シード調整された生存を示すヒストグラムを示す。矢印は、Ａｔｆ２、ＰｕｍａおよびＭｅｆ２ａを標的にする生存期間中央値増進性ｓｉＲＮＡについての生存を示す。図３８Ｂは、Ａｔｆ２、ＰｕｍａもしくはＭｅｆ２ａを標的にする４種の独立したｓｉＲＮＡのうちの１種または非標的化対照をトランスフェクトしたＷＴ  ＲＧＣの生存を示す。破線は、陰性対照よりも３ＳＤ大きい生存の閾値を示す。図３８Ｃは、漸増量の、対照およびＡｔｆ２  ｓｉＰＯＯＬ（左側）、Ｐｕｍａ  ｓｉＰＯＯＬ（中央）またはＭｅｆ２ａ  ｓｉＰＯＯＬ（右側）のいずれかをトランスフェクトしたＷＴ  ＲＧＣの生存を示す。
【０１２０】
【図３９】図３９は、７つのパネル、Ａ〜Ｇを含み、ＡＴＦ２およびＭＥＦ２Ａの転写調節ドメインの標的化破壊を有するＲＧＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、軸索傷害により誘導される細胞死に対して部分的に抵抗性であることを示す図である。図３９Ａは、Ｄｌｋ／ＬｚｋまたはＰｕｍａ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、ＷＴまたはＫＤヒトＬＺＫを用いて形質導入したＷＴ  ＲＧＣの生存を示す。図３９Ｂは、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスを用いて形質導入したＭｅｆ２ａｆｌ／ｆｌＲＧＣのキャピラリーに基づくイムノアッセイを示す。図３９Ｃは、漸増量の、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスを用いて形質導入したＷＴまたはＭｅｆ２ａｆｌ／ｆｌＲＧＣの生存を示す。図３９Ｄは、Ｍｅｆ２ａｆｌ／ｆｌＲＧＣと、それに対してＭｅｆ２ａｆｌ／ｆｌＭｅｆ２ｃｆｌ／ｆｌＭｅｆ２ｄｆｌ／ｆｌＲＧＣの、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスを用いた形質導入による生存の倍率変化を示す。図３９Ｅは、視神経挫滅の２週間後または偽対照の、傷害を受けていない対照に対して正規化した、生存ＲＧＣの数のフローサイトメトリーに基づく数量化を示す。外科手術の２週間前に、全ての眼に１０９ｖｇのＡＡＶ２−Ｃｒｅを注射した。＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーのＵ検定。図３９Ｆは、視神経挫滅の２日後または偽対照の、全体に対するパーセンテージとして表した、ＴＵＢＢ３／Ｐ−Ｓ４０８  ＭＥＦ２Ａの数のフローサイトメトリーに基づく数量化を示す。図３９Ｇは、漸増量の、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスを用いて形質導入したＷＴまたはＡｔｆ２ｆｌ／ｆｌ  ＲＧＣの生存を示す。
【０１２１】
【図４０−１】図４０は、６つのパネル、Ａ〜Ｇを含み、感度が増した全ゲノムｓｉＲＮＡスクリーンでＲＧＣ細胞死のメディエーターとしてＪＵＮおよびＳＯＸ１１が同定されることを示す図である。図４０Ａは、全ゲノムライブラリー内の遺伝子のそれぞれを標的にするｓｉＲＮＡミニプールについての正規化された生存を示すヒストグラムを示す（Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬの存在下でトランスフェクトした）。矢印は、Ｄｌｋを標的にする上位のｓｉＲＮＡミニプールについての生存を示す。図４０Ｂは、イムノパニング傷害および対照ｓｉＰＯＯＬまたはＤｌｋ／ＬｚｋまたはＳｏｘ１１に対するｓｉＰＯＯＬのいずれかのトランスフェクト後の示されている時間での、ＷＴ  ＲＧＣにおけるＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した、Ｓｏｘ１１  ｍＲＮＡについての定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを示す。図４０Ｃは、漸増量のＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬおよび／またはＳｏｘ１１  ｓｉＰＯＯＬをトランスフェクトしたＷＴ  ＲＧＣの生存を示す。図４０Ｄは、Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬまたはＬｚｋ／Ｓｏｘ１１  ｓｉＰＯＯＬをトランスフェクトし、対照またはヒトＳＯＸ１１  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルスを形質導入することによってＳＯＸ１１シグナル伝達を再構成したＷＴ  ＲＧＣの生存を示す。図４０Ｅは、漸増量の、Ｃｒｅを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスを用いて形質導入したＷＴまたはＳｏｘ１１ｆｌ／ｆｌ  ＲＧＣの生存を示す。図４０Ｆは、視神経挫滅の２週間後または偽対照の、傷害を受けていない対照に対して正規化した、生存ＲＧＣの数のフローサイトメトリーに基づく数量化を示す。外科手術の２週間前に、全ての眼に１０９ｖｇのＡＡＶ２−Ｃｒｅを注射した。＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーのＵ検定。図４０Ｇは、アデノウイルスを用いて形質導入したＳｏｘ１１ｆｌ／ｆｌ  ＲＧＣにおける、ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化した、Ｓｏｘ１１  ｍＲＮＡのＱＰＣＲアッセイを示す。
【図４０−２】同上。
【０１２２】
【図４１−１】図４１は、７つのパネル、Ａ〜Ｈを含み、ＤＬＫ／ＬＺＫ依存性細胞死が４種の転写因子：ＪＵＮ、ＡＴＦ２、ＳＯＸ１１およびＭＥＦ２Ａのセットによって媒介されることを示す図である。図４１Ａは、示されているｓｉＰＯＯＬをトランスフェクトしたＷＴ  ＲＧＣの生存を示す。図４１Ｂは、Ｄｌｋ／Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬおよび対照またはＪｕｎ／Ａｔｆ２／Ｓｏｘ１１／Ｍｅｆ２ａ  ｓｉＰＯＯＬのいずれかをトランスフェクトし、次いで、ｓｉＰＯＯＬ抵抗性、ヒトＬＺＫ  ｃＤＮＡを発現するアデノウイルスまたは対照アデノウイルスを用いて形質導入することによってＬＺＫシグナル伝達を再構成したＷＴ  ＲＧＣの生存を示す。図４１Ｃは、Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはＤｌｋを標的にするｓｇＲＮＡのいずれかをトランスフェクトしたＷＴまたはＳｐＣａｓ９ノックインＲＧＣの生存を示す。図４１Ｄは、Ｄｌｋ  ｓｉＰＯＯＬおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはＬｚｋを標的にするｓｇＲＮＡのいずれかをトランスフェクトしたＷＴまたはＳｐＣａｓ９ノックインＲＧＣの生存を示す。図４１Ｅは、個々のｓｇＲＮＡまたはＤｌｋを標的にするｓｇＲＮＡおよび／またはＬｚｋのプールをトランスフェクトしたＷＴまたはＳｐＣａｓ９ノックインＲＧＣの生存を示す。図４１Ｆは、漸増量の、４種の転写因子（Ｊｕｎ、Ａｔｆ２、Ｓｏｘ１１、Ｍｅｆ２ａ）のそれぞれを標的にするｓｇＲＮＡを単独でまたは組み合わせてトランスフェクトすることによって付与し、陰性対照であるｔｒａｃｒＲＮＡまたは陽性対照である、Ｄｌｋ／Ｌｚｋを標的にするｓｇＲＮＡでのトランスフェクションと比較した、正規化された生存（ＳｐＣａｓ９−ＷＴ）を示す。図４１Ｈは、ＬＺＫシグナル伝達を活性化するためのアデノウイルスによる形質導入の２日後の、ｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたＳｐＣａｓ９  ＲＧＣの生存（±ＳＤ）を示す。＊Ｐ＜０．０５、Ｄｌｋ／Ｌｚｋと転写因子ｓｇＲＮＡを比較したマン・ホイットニーのＵ検定。図４１Ｇは、軸索傷害後のＲＧＣ細胞死について提唱された経路を示す図を示す。
【図４１−２】同上。
【０１２３】
【図４２】図４２（図６１と関連する）は、６つのパネル、Ａ〜Ｆを含有し、ＬＺＫが一次ＲＧＣにおける細胞死のメディエーターであることを示す図である。
【０１２４】
【図４３】図４３（図６２と関連する）は、５つのパネル、Ａ〜Ｅを含有し、ＲＧＣ生存を数量化するためのフローサイトメトリーに基づくアッセイの展開を示す図である。
【０１２５】
【図４４−１】図４４（図６３と関連する）は、４つのパネル、Ａ〜Ｄを含有し、全ゲノムｓｉＲＮＡスクリーン結果を示す図である。
【図４４−２】同上。
【図４４−３】同上。
【０１２６】
【図４５−１】図４５（図６４および６５と関連する）は、８つのパネル、Ａ〜Ｈを含有し、Ｍｅｆ２ａ、ＰｕｍａおよびＡｔｆ２のノックダウンならびに視神経損傷により、ＤＬＫ依存性ＭＥＦ２Ａリン酸化が導かれることを示す。
【図４５−２】同上。
【図４５−３】同上。
【０１２７】
【図４６−１】図４６（図６６と関連する）は、５つのパネル、Ａ〜Ｅを含有し、全ゲノムの、感度が増したｓｉＲＮＡスクリーン結果を示す図である。
【図４６−２】同上。
【図４６−３】同上。
【０１２８】
【図４７−１】図４７（図６８と関連する）は、２つのパネル、Ａ〜Ｂを含有し、一次ＲＧＣにおけるＤｌｋのＣＲＩＳＰＲノックアウトを示す。
【図４７−２】同上。
【０１２９】
【図４８−１】図４８は、２つのパネル、Ａ〜Ｂを含有し、生存グラフを示す図である。
【図４８−２】同上。
【０１３０】
【図４９】図４９は、トレーサーＲＮＡ、ｍｍ１９０、ｍｍ２０４、ｍｍ０９４、ｍｍ０７９、ｍｍ９３６、ｍｍ９２６、ｍｍ３７５、ｍｍ７７５、ｍｍ８７８、およびｍｍ９４２の表を示す図である。
【０１３１】
【図５０】図５０は、ＣＥＰ２０を標的化するためのＡＡＶ２構築物サイズを示す図である。構築物サイズは４，７８１ｂｐである。プロモーターは、Ｈ１双方向プロモーター（マウス）である。Ｐｏｌ  ＩＩターミネーターはＳＰＡであり、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。
【０１３２】
【図５１】図５１は、ＬＣＡ１０がＣＥＰ２９０のイントロン突然変異によって引き起こされることを示す図である。ＣＥＰ２９０遺伝子が示されている。ＩＶＳ２６  ｃ．２９９１＋１６５５  Ａ＞Ｇ突然変異により、異常なスプライシングおよび１２８ｂｐの隠れたエクソンＸの包含（下）が生じる。
【０１３３】
【図５２】図５２は、Ｈ１ＲＮＡおよびＰＡＲＰ−２遺伝子座のゲノム組織化を示す図である。上に示されているのは、一定の縮尺で描かれた、右に向かって転写されるＰＡＲＰ−２遺伝子（青色）および左側に転写されるＨ１ＲＮＡ遺伝子（オレンジ色）の描写である。下は、両方の遺伝子のプロモーター領域を拡大した領域である。
【０１３４】
【図５３】図５３は、ＳｐＣａｓ９標的部位およびＬＣＡ１０突然変異を示す図である。Ａ＞Ｇ突然変異の場所が、エクソンＸの３’末端（オレンジ色）、およびＳｐＣａｓ９標的部位（青色）との関連で示されている。ＳｐＣａｓ９カット部位が２つの矢印で示され、スプライシングのために重要なヌクレオチドが四角で囲まれている。
【０１３５】
【図５４】図５４は、高忠実度／高特異性ＳｐＣａｓ９バリアントを示す図である。ｅＳｐＣａｓ９点突然変異が青色で示され、ｓｐＣａｓ９−ＨＦ  １  点突然変異がオレンジ色で示されている。
【０１３６】
【図５５】図５５は、Ｃａｓ９ニッカーゼ手法を示す図である。ニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ切断（下）を生成するために、反対の鎖上の２つの近接する向かい合った標的部位（ＬおよびＲ；上）を必要とする。
【０１３７】
【図５６】図５６は、３つのパネル、Ａ〜Ｃを含み、ＬＣＡ１０  ＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶ治療薬を示す図である。図５６Ａは、ＡＡＶウイルスの略画およびパッケージング容量を示す。図５６Ｂは、ＳＡ１からのｅＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦバリアントを含むＳｐＣａｓ９標的化構築物の図を示す。図５６Ｃは、ＳＡ２に記載されている４種のｇＲＮＡを伴うＳａＣａｓ９ニッカーゼの図を示す。
【０１３８】
【図５７−１】図５７は、８つのパネル、Ａ〜Ｈを含有する図である。図５７Ａおよび５７Ｂは、示されている深部イントロンＬＣＡ１０突然変異（Ａ→Ｇ）の場所を有するＣＥＰ２９０のゲノム遺伝子座を示す。この突然変異により、隠れたエクソン（エクソンＸ）のｍＲＮＡへの包含が引き起こされ、それにより、短縮されたタンパク質が生じる。Ａ→Ｇ突然変異は、突然変異配列にわたって位置するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９部位によって標的にすることができる。スプライス部位の周囲で形成されるインデルによりこの偽性エクソンのスプライシングが損なわれる可能性があるので、このｇＲＮＡの標的になることにより、正確なスプライシングがもたらされることが予想される。下は、正常なＣＥＰ２９０発現を回復させるための、イントロン領域に対するｄｓＤＮＡ切断の標的化の一般的な戦略を示す。図５７Ｃは、正常なＣＥＰ２９０遺伝子（エクソン２５〜２８）を示す。図５７Ｄは、隠れたエクソンのＣＥＰ２９０への包含を生じさせる点突然変異を示す。図５７Ｅおよび５７Ｆは、ＳａＣａｓ９を使用して（ＡＡＶ中に収まるのに十分に小さいので）点突然変異配列の除去を試みる報告された戦略を示す。この戦略は、イントロンの大きな切片を除去して点突然変異配列を除去しようとするものである。点突然変異の付近にはＳａＣａｓ９部位がないので、これが最も可能性が高い。ＳａＣａｓ９を使用するこの戦略は、２つの結果を受ける可能性が高い：（１）１つではなく２つのＤＮＡカットが必要になるので効率が低いこと；（２）染色体移行または再編成、および挿入性突然変異誘発が起こる潜在性などの安全性に関する問題、ならびに（３）オフターゲットがより多くなる潜在性。逆に、双方向戦略を使用すると、Ｃａｓ９（またはＣａｓ９バリアント、またはＣｐｆ１、またはＣｐｆ１バリアント）をＡＡＶによって送達することができ、これにより、さらに多くの標的化部位、およびＣＥＰ２９０の正常なスプライシングを回復させるための戦略の可能性が開ける。図５７Ｇおよび５７Ｈは、プラスミドのトランスフェクション、またはＡＡＶウイルスによる形質導入後のＢｍｒＩ切断に対する抵抗性によって測定されるＣＥＰ２９０標的化部位の切断を示す。
【図５７−２】同上。
【図５７−３】同上。
【図５７−４】同上。
【図５７−５】同上。
【０１３９】
【図５８】図５８は、ｉｎ  ｖｉｖｏでロドプシンを標的化するためのＡＡＶ５構築物サイズを示す図である。構築物サイズは４，９９６ｂｐである。プロモーターはＨ１双方向（ヒト）である。Ｐｏｌ  ＩＩターミネーターはＳＶ４０である。ＡＡＶ血清型はＡＡＶ５である。
【０１４０】
【図５９Ａ】図５９は、５つのパネル、Ａ〜Ｅを含有し、硝子体内注射後のｉｎ  ｖｉｖｏにおける双方向発現を示す図である。図５９Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨ１−双方向プロモーター構築物の検証を示す。図５９Ａに示されている通り、Ｈ１プロモーターを使用して生成した構築物を使用してＲＮＡ（ｇＲＮＡが黒色で示されている）およびＧＦＰを同時に発現させた。ＧＦＰは、Ｈ１プロモーターによるｐｏｌ  ＩＩ発現の視覚による読み取りをもたらすために使用した。次いで、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列が隣接する構築物を、網膜神経節細胞への形質導入を好むＡＡＶ２＊（Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ三重カプシド突然変異が＊によって示される）を使用してウイルス中にパッケージングした。ウイルスを硝子体内注射によって送達した；ビヒクルを単独で使用した対照注射を対照眼に送達した。注入の１４日後、マウスに鎮静剤を投与し、Ｍｉｃｒｏ  ＩＩＩ網膜イメージング顕微鏡を使用してＧＦＰ発現を可視化した。左側のパネルに示されている通り、生きているマウスから散在性のＧＦＰ発現を検出することができる。図５９Ｃは、ＧＰＦ発現がないことを示す。マウスを安楽死させ、網膜フラットマウントからＧＦＰ発現を可視化し、ＡＡＶ２＊血清型を使用して予測される通り、網膜神経節細胞層におけるＧＦＰ発現が示された。図５９Ｃは、Ｈ１双方向プロモーターを使用してＧＦＰ（および空のｇＲＮＡ）を発現させ、ＡＡＶ２ウイルスまたはＡＡＶ５ウイルスのいずれかにパッケージングしたことを示す。この実験は、異なる細胞型におけるＨ１発現を試験し、細胞型トロピズムを検証するためのものである。図５９Ｄは、血清型およびトロピズムの意味を示す略画による図解を示す。血清型は、ＡＡＶの異なる「株」を指し、トロピズムは、所与の株が感染し得る細胞の型を指す。この性質により、所望の細胞型を標的にするために特定の血清型を使用することができるので、追加的な安全性の層がもたらされる。例えば、網膜では、ＡＡＶ血清型はよく特徴付けられており、ある特定の細胞に、多くの異なる細胞型で囲まれているにもかかわらず、優先的に感染させるために使用することができる。特に、ＡＡＶ５は光受容体特異性を示す。
【図５９Ｂ】同上。
【図５９Ｃ】同上。
【図５９Ｄ】同上。
【図５９Ｅ】同上。
【０１４１】
【図６０Ａ】図６０は、２つのパネル、Ａ〜Ｂを含有し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＲＩＳＰＲによる網膜ゲノム編集およびＳＮＰを使用して優性対立遺伝子を標的にするための戦略を示す図である。この実施例は、ロドプシンのＰ２３Ｈ突然変異の標的化に関するものである。図６０Ｂは、対立遺伝子特異性およびシス不活化のためのＳＮＰの使用、ならびに、Ｐ２３Ｈを標的にするための、工学的に操作されたＣａｓ９バリアントの使用を示す、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける優性突然変異のＣＲＩＳＰＲによる標的化（ＲＨＯ  Ｐ２３Ｈ）を示す。左側には、野生型近交系マウス系統ＣＡＳＴ／ＥｉＪと交配したＣ５７ＢＬ系統のＰ２３Ｈホモ接合性マウスを使用した育種スキームを示す。ＣＡＳＴ系統は、配列決定によって示される通り、他の系統が有さない非同義ＳＮＰを有する。このＳＮＰはＷＴロドプシンタンパク質配列を変化させず、ＷＴロドプシン配列とＰ２３Ｈ配列を識別するために使用することができる。Ｐ２３Ｈ点突然変異（Ｃ→Ａ）は、Ｃａｓ９  ＰＡＭ配列に由来するＮＧＧのＮに位置し、したがって、ｇＲＮＡはＷＴおよびＰ２３Ｈ配列の両方を同等に標的にする。ＣＡＳＴ配列は、ｇＲＮＡにより突然変異を標的にし、ＷＴ配列は標的にしないことを可能にする追加的な塩基変化を有する。
【図６０Ｂ】同上。
【０１４２】
【図６１】図６１（図４２と関連する）は、１１のパネル、Ａ〜Ｋを含有し、ＬＺＫが一次ＲＧＣにおける細胞死のメディエーターであることを示す図である。図６１Ａは、ＲＧＣのプレーティング時のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ数量化（「生存（ＲＬＵ）」）とセロミクスに基づく数量化（「生存可能なＲＧＣ」）の比較を示す。図６１Ｂ〜Ｃは、ｓｉＲＮＡ（Ｂ）またはｓｉＰＯＯＬ（Ｃ）のトランスフェクション後のＲＧＣにおけるＬＺＫのキャピラリーに基づくイムノアッセイ（上）および数量化（下）を示す。図６１Ｄは、コルヒチンの４８時間後にＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬ±Ｄｌｋ  ｓｉＰＯＯＬをトランスフェクトしたＲＧＣのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ数量化（「生存（ＲＬＵ）」）とセロミクスに基づく数量化（「生存可能なＲＧＣ」）の比較を示す。ＮＳ、マン・ホイットニーのＵ検定により、有意でない。図６１Ｅは、自動蛍光顕微鏡によって数量化した、生存可能なＲＧＣ（カルセインＡＭ染色／エチジウムホモ二量体を除いて；±ＳＤ）を示す。図６１Ｆは、対照またはＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬのトランスフェクションおよびマウスｓｉＲＮＡ抵抗性、ヒトＬＺＫ  ｃＤＮＡまたはＧＦＰ対照を発現するアデノウイルスを用いた形質導入の１日後のＲＧＣにおけるＬＺＫのキャピラリーに基づくイムノアッセイ（上）および数量化（下）を示す。図６１Ｇは、マウスｓｉＲＮＡ抵抗性、ヒトＬＺＫ  ｃＤＮＡまたはＧＦＰ対照を発現するアデノウイルスを用いたＬＺＫシグナル伝達の再構成の２日後の、Ｄｌｋ／Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬをトランスフェクトしたＷＴ  ＲＧＣの生存（±ＳＤ）を示す（「ＬＺＫ再構成アッセイ」）。図６１Ｈ〜Ｉは、イムノパニング傷害の３日後にｓｉＰＯＯＬをトランスフェクトし、カルセインＡＭで染色したＲＧＣの神経突起の長さ（ニューロンごとの平均）の代表的な顕微鏡写真（Ｈ）および数量化（Ｉ）を示す。図６１Ｊは、コルヒチン攻撃誘発の２日後にアデノウイルスを用いて形質導入したＷＴ  ＲＧＣの生存（±ＳＤ）を示す。図６１Ｋは、イムノパニング傷害の１日後のＷＴ  ＲＧＣの免疫共沈降アッセイを示す。
【０１４３】
【図６２】図６２（図４３と関連する）は、６つのパネル、Ａ〜Ｆを含有し、ＲＧＣ生存を数量化するためのフローサイトメトリーに基づくアッセイの展開を示す図である。図６２Ａは、傷害を受けていない野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の代表的な網膜フラットマウントの免疫蛍光染色を示す。図６２Ｂは、イムノパニングの直後にＦＣによって分析した、イムノパニングしたＰ０〜３マウスＲＧＣの２Ｄプロットを示す。図６２Ｃ〜Ｄは、ＦＣによって分析した、傷害を受けていない網膜（Ｃ）またはＯＮＣの２週間後（Ｄ）の代表的な２Ｄプロットを示す。それぞれ、技法の特異度および感度を推定するために、（Ｃ）のゲーティングを使用して、Ｔｈｙ１．２／ＮｅｕＮについて２重陽性であるＴＵＢＢ３／ＳＮＣＧ２重陽性細胞のパーセンテージを示した、またはその逆を行った。平均が下に示されている。図６２Ｅは、ＯＮＣまたは偽の後の種々の時点（括弧内のｎ）での生存ＲＧＣ（±ＳＤ）のＦＣに基づく数量化を示す。図６２Ｆは、生存ＲＧＣ（±ＳＤ）のＦＣに基づく数量化と免疫染色されたフラットマウントの手動での計数の比較を示す。どちらの場合でも、ＳＮＣＧ／ＴＵＢＢ３  ２重染色によってＲＧＣを同定する。ＮＳ、有意でない、マン・ホイットニーのＵ検定。
【０１４４】
【図６３】図６３（図４４と関連する）は、４つのパネル、Ａ〜Ｄを含有する図である。全ゲノムｓｉＲＮＡスクリーン結果。図６３Ａ〜Ｂは、シード配列による寄与を補正した後のＺ−スコアによって並べた上位の４８種の遺伝子の順位序列（Ａ）またはＨａｙｓｔａｃｋ分析によって決定された上位の１４種の遺伝子の順位序列（Ｂ）を示す。検証された遺伝子が赤色で示されている。図６３Ｃ〜Ｄは、ＲＧＣに、シード補正分析（Ｃ）またはＨａｙｓｔａｃｋ分析（Ｄ）によって指定された上位の遺伝子を標的にする４種の独立したｓｉＲＮＡをトランスフェクトした二次スクリーニングの結果を示す。破線は、陰性対照よりも３ＳＤ大きい生存の閾値を示す。
【０１４５】
【図６４】図６４（図４５と関連する）は、５つのパネル、Ａ〜Ｅを含有し、Ｍｅｆ２ａ、ＰｕｍａおよびＡｔｆ２のノックダウンを示す図である。図６４Ａ〜Ｂは、個々のｓｉＲＮＡ（Ａ）またはｓｉＰＯＯＬ（Ｂ）をトランスフェクトしたＲＧＣに対して実施した、関連する数量化（上、中央）またはｑＰＣＲ（下）を伴う、キャピラリーに基づくイムノアッセイを示す。図６４Ｃは、３日間アデノウイルスを用いて形質導入したＡｔｆ２ｆｌ／ｆｌ  ＲＧＣ由来のＡＴＦ２のキャピラリーに基づくイムノアッセイを示す。図６４Ｄは、コルヒチン攻撃誘発の２日後にアデノウイルスを用いて形質導入したＲＧＣの生存（±ＳＤ）を示す。図６４Ｅは、ＯＮＣまたは偽外科手術の２週間後の、傷害を受けていない対照に対して正規化した（±ＳＤ）、生存ＲＧＣのＦＣに基づく数量化を示す。外科手術の２週間前に、全ての眼に１０９ｖｇのＡＡＶ２−Ｃｒｅを注射した。＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーのＵ検定。
【０１４６】
【図６５】図６５（図４５と関連する）は、２つのパネル、ＡおよびＢを含有し、視神経損傷により、ＤＬＫ依存性ＭＥＦ２Ａリン酸化が導かれることを示す図である。図６５Ａは、ＯＮＣまたは偽外科手術の２日後の代表的な網膜節の合成免疫蛍光染色を示す。図６５Ｂは、ＯＮＣまたは偽外科手術の２日後にＦＣによって分析した代表的なＷＴまたはＤｌｋｆｌ／ｆｌ網膜の２Ｄプロットを示す。
【０１４７】
【図６６】図６６（図４６と関連する）、は、５つのパネル、Ａ〜Ｅを含有し、全ゲノム、感度が増したｓｉＲＮＡスクリーン結果を示す図である。図６６Ａは、シード配列による寄与を補正した後にＺ−スコアによって並べた上位の４８種の候補遺伝子配列順位序列を示す。以前検証された遺伝子が赤色で示されている。図６６Ｂは、全ゲノムライブラリー内の各ミニプールについてのシード補正された活性を示す散布図を示す。以前検証された遺伝子が赤色で示されている。図６６Ｃは、ＲＧＣに、シード補正分析によって指定された上位の遺伝子を標的にする４種の独立したｓｉＲＮＡをトランスフェクトした二次スクリーニングの結果を示す。破線は、陰性対照よりも３ＳＤ大きい生存の閾値を示す。図６６Ｄは、Ｈａｙｓｔａｃｋ分析によって決定された上位の遺伝子の順位序列を示す。図６６Ｅは、ＲＧＣに、Ｈａｙｓｔａｃｋ分析によって指定された上位の遺伝子を標的にする４種の独立したｓｉＲＮＡをトランスフェクトした二次スクリーニングの結果を示す。破線は、陰性対照よりも３ＳＤ大きい生存の閾値を示す。
【０１４８】
【図６７】図６７は、神経突起伸長に対する転写因子の影響を示す図である。イムノパニング傷害の３日後にｓｉＰＯＯＬをトランスフェクトし、カルセインＡＭで染色したＲＧＣにおける神経突起の長さ（ニューロンごとの平均；±ＳＤ）の数量化。＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーのＵ検定。
【０１４９】
【図６８】図６８（図４７と関連する）は、４つのパネル、Ａ〜Ｄを含有し、一次ＲＧＣにおけるＤｌｋのＣＲＩＳＰＲノックアウトを示す図である。図６８Ａは、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはＤｌｋ  ｇＲＮＡ  ＃４でのトランスフェクションの３日後にＳｐＣａｓ９  ＲＧＣゲノムＤＮＡから増幅し、選択を回避するためにＤＬＫ／ＬＺＫ阻害剤の存在下で維持したＰＣＲ産物のＢｇｌＩＩ消化を示す。ＰＣＲ領域にはＤｌｋ  ｇＲＮＡ  ＃４標的部位またはhttp://crispr.mit.eduによって予測された上位の１４のオフターゲット（それらの全てがＢｇｌＩＩ部位を維持する）を含めた。図６８Ｂは、サブクローニング後のＤｌｋ  ＃４  ＰＣＲ産物の配列決定結果を示す。図６８Ｃは、コルヒチン攻撃誘発の２日後に、ニューロトロフィン（ＮＴ、５０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、５ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、５ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦ）の不在または存在下で、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはＤｌｋおよびＬｚｋを標的にするｓｇＲＮＡをトランスフェクトした、ＷＴ  ＲＧＣの生存と、それに対してＳｐＣａｓ９を発現するＲＧＣの生存を示す（±ＳＤ）。＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーのＵ検定。図６８Ｄは、４種の転写因子のそれぞれを標的にする第２のｓｇＲＮＡのセットを、単独でまたは組み合わせてトランスフェクトし、陰性対照であるｔｒａｃｒＲＮＡと比較することによって付与される生存の差異（ＳｐＣａｓ９−ＷＴ；±ＳＤ）を示す。
【０１５０】
【図６９】図６９は、ヒトＥＳＣ由来ＲＧＣの生存を促進する、ＦＤＡに認可された小分子阻害剤であるスニチニブによるものを含めた、ＤＬＫおよびＬＺＫの薬理的阻害を示す図である。図６９Ａは、ＤＬＫ／ＬＺＫ阻害剤トザセルチブ（１μＭ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ阻害剤１２３（０．１μＭ）またはビヒクル対照の存在下、ビヒクルまたはコルヒチン（１μＭ）で攻撃誘発した２日後のｈＥＳＣ由来ＲＧＣの生存（±ＳＤ）を示す。図６９Ｂは漸増用量のスニチニブの存在下、コルヒチン（１μＭ）で攻撃誘発した２日後の、ｈＥＳＣ由来ＲＧＣの生存（±ＳＤ）を示す。
【０１５１】
【図７０】図７０は、ロドプシンを標的にする構築物の一実施形態を使用したｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集を示す図である。
【０１５２】
【図７１】図７１は、ロドプシンを標的にする構築物の一実施形態を使用したｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集を示す図である。全網膜からの細胞を使用してカットについてアッセイし（精製された光受容体ではなく）、１４日目にわずかなレベルのカットが検出可能であり、これは２８日目には上昇する。
【０１５３】
【図７２】図７２は、転写調節をモジュレートするためにＣａｓ９のヌクレアーゼデッドバージョンを使用した融合構築物を示す図である。これらの構築物は、Ｈ１双方向プロモーターを使用してＡＡＶによって送達することができる。
【０１５４】
【図７３】図７３は、ロドプシンプロモーターおよびプロモーター領域内のタンパク質結合部位の概略図を示す図である。これらの相互作用を破壊することにより、その対立遺伝子のシスでの転写を抑圧することができ、また、プロモーター領域においてＳＮＰを利用することにより、ＡＤＲＰを処置するためにＣａｓ９の非カットバージョンを送達することができる。
【０１５５】
【図７４】図７４は、ロドプシンプロモーターおよびＲＥＲ領域の概略図を示す図である（上）。中央のパネルは、Ｓａｎｇｅｒ配列決定された、３種の異なるマウス細胞／系統からのＰＣＲ産物を示す。同定されたＳＮＰＳが示されているが、下の図上に線が引かれている。我々は、これらの配列変形形態を、ロドプシンのシスでの発現をモジュレートするために活用することを可能にするいくつかの領域を同定した。
【０１５６】
【図７５】図７５は、ＣＲＩＳＰＲによる標的化部位のための、ロドプシンプロモーター領域内の約２ｋｂの領域（ＲＥＲから転写開始まで）のスキャンを示す図である。ＲＥＲ付近の６部位および近位プロモーター領域付近の６部位を選択し、それらをカットについてアッセイした（高い結合効率を可能にする利用可能な領域を同定するための代理としてカット効率を使用した）。我々は、ＲＥＲ／近位プロモーター領域の間のクロマチンループの単純な破壊を通じて、またはｄＣａｓ９融合物（アクチベーター／リプレッサードメイン）の使用を通じてのいずれかでｄＣａｓ９によるモジュレーションを可能にすることができるいくつかの候補配列を同定した。
【０１５７】
【図７６】図７６は、部分的なヒト配列に対するカットおよび非カット方法を試験するためのＲｈｏ−ＧＦＰマウスを示す図である。下は、Ｒｈｏ−ＧＦＰマウスから精製された光受容体を使用し、ＣＲＩＳＰＲによる標的化によるＧＦＰの消失を探すｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである。
【０１５８】
【図７７】図７７は、アクチベータードメインまたはリプレッサードメインのいずれかと融合したヌクレアーゼ−デッドＣａｓ９構築物を試験するためのレポーターアッセイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１５９】
詳細な説明
ここで、本開示の主題は、本開示の主題の一部であるが全てではない実施形態が示される添付の図面を参照して、以下により完全に記載される。あらゆる場所で、同様の番号は同様の要素を指す。本開示の主題は、多くの異なる形態で具体化され得、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈すべきではない；むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満足するように提供される。実際、本明細書に示される本開示の主題の多くの修飾および他の実施形態は、前述の説明および添付の図面に示される教示の利益を有する、本開示の主題が関連する分野の当業者に想起される。したがって、本開示の主題が、開示されている具体的な実施形態に限定されないこと、ならびに修飾および他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる意図であることを理解すべきである。
【０１６０】
ゲノム編集技術、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（PorteusおよびBaltimore（２００３年）Science  ３００巻：７６３頁；Millerら（２００７年）Nat.  Biotechnol.  ２５巻：７７８〜７８５頁；Sanderら（２０１１年）Nature  Methods  ８巻：６７〜６９頁；Woodら（２０１１年）Science  ３３３巻：３０７頁）および転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（Woodら（２０１１年）Science  ３３３巻：３０７頁；Bochら（２００９年）Science  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁；MoscouおよびBogdanove（２００９年）Science  ３２６巻：１５０１頁；Christianら（２０１０年）Genetics  １８６巻：７５７〜７６１頁；Millerら（２０１１年）Nat.  Biotechnol.  ２９巻：１４３〜１４８頁；Zhangら（２０１１年）Nat.  Biotechnol.  ２９巻：１４９〜１５３頁；Reyonら（２０１２年）Nat.  Biotechnol.  ３０巻：４６０〜４６５頁）は、標的化されたゲノム修飾を生成する能力を与え、疾患突然変異を正確に修正する能力を提供する。有効ではあるが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ対は共に、所与のＤＮＡ標的部位のために大きい独自の認識タンパク質を合成することを必要とするので、これらの技術は、実務上の制限によって妨げられる。いくつかのグループが、これらの重要な制限を回避する操作されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を介した高効率ゲノム編集を最近報告している（Congら（２０１３年）Science  ３３９巻：８１９〜８２３頁；Jinekら（２０１３年）eLife  ２巻：ｅ００４７１頁；Maliら（２０１３年）Science  ３３９巻：８２３〜８２６頁；Choら（２０１３年）Nat.  Biotechnol.  ３１巻：２３０〜２３２頁；Hwangら（２０１３年）Nat.  Biotechnol.  ３１巻：２２７〜２２９頁）。比較的時間がかかり作製が困難であるＺＦＮおよびＴＡＬＥＮとは異なり、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とカップリングされたＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性に依存するＣＲＩＳＰＲ構築物は、合成が単純かつ迅速であり、多重化され得る。しかし、それらの合成が比較的容易であるにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲは、Ｃａｓ９自体の特性およびそのｇＲＮＡの合成の両方の関数である、標的化可能なゲノム空間へのアクセスに関する技術的制限を有する。
【０１６１】
ＣＲＩＳＰＲシステムによる切断は、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列へのｇＲＮＡの相補的塩基対合および標的部位に対して３’側に見出される短いヌクレオチドモチーフである必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とする（Jinekら（２０１２年）Science  ３３７巻：８１６〜８２１頁）。理論上は、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用してゲノム中の任意の独自のＮ２０−ＰＡＭ配列を標的化することができる。使用される特定のＣａｓ９の起源の種に依存して変動するＰＡＭ配列のＤＮＡ結合特異性は、制約を与える。現在、制限が最小であり最も一般的に使用されるＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来であり、これは、配列ＮＧＧを認識し、したがって、ゲノム中の、２つのグアノシンヌクレオチドが後に続く任意の独自の２１ヌクレオチド配列（Ｎ２０ＮＧＧ）が標的化され得る。タンパク質構成要素によって課される利用可能な標的化空間の増大は、変更されたＰＡＭ要件を有する新規Ｃａｓ９タンパク質の発見および使用に制限され（Congら（２０１３年）Science  ３３９巻：８１９〜８２３頁；Houら（２０１３年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、１１０巻（３９号）：１５６４４〜９頁）、または突然変異誘発もしくは定向進化を介した新規Ｃａｓ９バリアントの生成を待っている。ＣＲＩＳＰＲシステムの第２の技術的制約は、５’グアノシンヌクレオチドにおけるｇＲＮＡ発現の開始から生じる。ＩＩＩ型クラスのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの使用は、ｇＲＮＡ発現のために特に受け入れられてきたが、それは、これらの短い非コード転写物が十分に規定された末端を有し、１＋ヌクレオチドを除く転写に必要な全てのエレメントが上流プロモーター領域中に含有されるからである。しかし、一般的に使用されるＵ６プロモーターは、転写を開始するためにグアノシンヌクレオチドを必要とするので、Ｕ６プロモーターの使用は、ゲノム標的化部位をＧＮ１９ＮＧＧへとさらに制約している（Maliら（２０１３年）Science  ３３９巻：８２３〜８２６頁；Dingら（２０１３年）Cell  Stem  Cell  １２巻：３９３〜３９４頁）。代替的手法、例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写もまた、開始グアノシンヌクレオチド（複数可）を必要とする（Adhyaら（１９８１年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  ７８巻：１４７〜１５１頁；Meltonら（１９８４年）Nucleic  Acids  Res.  １２巻：７０３５〜７０５６頁；Pleissら（１９９８年）RNA  ４巻：１３１３〜１３１７頁）。
【０１６２】
本開示の主題は、例えば、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子、ロドプシン、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、ＭＥＦ２Ａ、ＳＯＸ１１またはＰＵＭＡであるがこれらに限定されない網膜変性症関連遺伝子を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１９５６１）を発現させるためにＨ１プロモーターを使用する、網膜変性症を標的化するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの修飾に関する。かかる修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、より高い有効性、安全性および正確さで、これらの網膜変性症における病原性突然変異を正確に標的化できる。さらに、ｇＲＮＡを含むこの修飾は、既存のＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガー技術を超えた、網膜変性症のより高解像度の標的化を可能にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  Ｈ１プロモーターシステムのコンパクトな性質を保持する。
Ｉ．Ｈ１プロモーターを使用して網膜変性症を標的化するＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの発現
Ａ．組成物
【０１６３】
一部の実施形態では、網膜変性症を処置するための本明細書に開示されている方法は、ＷＯ２０１５／１９５６２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載された天然に存在しないＣＲＩＳＰＲシステムの修飾を含む組成物を利用する。かかる修飾は、例えばＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子、ロドプシン、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、ＭＥＦ２Ａ、ＳＯＸ１１またはＰＵＭＡであるがこれらに限定されない網膜変性症関連遺伝子を標的化するある特定のｇＲＮＡを使用する。一部の実施形態では、この組成物は、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、双方向Ｈ１プロモーター）であって、このｇＲＮＡは、対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）を含み、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。一部の実施形態では、このアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、５１のヒトアデノウイルス血清型のいずれか（例えば、血清型２、５または３５）を含み得る。一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。一部の実施形態では、このプロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。一部の実施形態では、この標的配列は、ＣＥＰ２９０遺伝子（例えば、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子）中の突然変異である。一部の実施形態では、ＣＥＰ２９０についての標的配列は、配列番号１〜１０９、１６４〜３５６、７３５〜７３８に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この標的配列は、作動可能に連結した配列番号１、２、３および４を含む。一部の実施形態では、このベクターは、配列番号��１０に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物はロドプシンである。一部の実施形態では、この標的配列は、ロドプシン遺伝子中の突然変異である。一部の実施形態では、この標的配列は、ロドプシン遺伝子のＲ１３５における突然変異（例えば、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３５Ｗ、Ｒ１３５Ｌ）である。一部の実施形態では、ロドプシンＲ１３５についての標的配列は、配列番号１１１〜１２６に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ロドプシンＲ１３５についてのｇＲＮＡ配列は、配列番号１２７〜１４２に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物は、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、ＭＥＦ２Ａ、ＳＯＸ１１もしくはＰＵＭＡ、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、緑内障の突然変異標的には、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＴＭＣＯ１、ＰＭＭ２、ＧＭＤＳ、ＧＡＳ７、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＴＸＮＲＤ２、ＡＴＸＮ２、ＣＡＶ１／ＣＡＶ２、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＳＩＸ６、ＡＢＣＡ１、ＡＦＡＰ１およびＣＤＫＮ２Ｂ−ＡＳが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、緑内障についての標的配列は、配列番号１４３〜１６３に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１６４】
一部の実施形態では、網膜変性症を処置するための本明細書に開示されている方法は、ａ）ＣＲＩＳＰＲシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲシステムを含む組成物であって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する組成物を利用する。
【０１６５】
一部の実施形態では、網膜変性症を処置するための本明細書に開示されている方法は、ａ）ＣＲＩＳＰＲシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、真核生物細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、真核生物細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、真核生物細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲシステムを含む組成物であって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、それによって、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質はＤＮＡ分子を切断し、それによって、１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更される組成物を利用する。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。さらに別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
【０１６６】
一部の実施形態では、網膜変性症を処置するための本明細書に開示されている方法は、双方向Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲシステムを含む組成物であって、この双方向Ｈ１プロモーターは、ａ）ＣＲＩＳＰＲシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメントであって、このｇＲＮＡは、真核生物細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、真核生物細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、制御エレメント；およびｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントであって、それによって、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質はＤＮＡ分子を切断し、それによって、１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更される、制御エレメントを含む、組成物を利用する。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。さらに別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
【０１６７】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞（例えば、真核生物細胞）の核中の検出可能な量でのＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積を駆動するのに十分な強度の、１つまたは複数の核局在化配列を含む。理論に束縛されることは望まないが、核局在化配列は、真核生物におけるＣＲＩＳＰＲ複合体活性には必要ないが、かかる配列を含むことは、特に、核において核酸分子を標的化することについて、このシステムの活性を増強すると考えられている。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム酵素である。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素である。一部の実施形態では、このＣａｓ９酵素は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９であり、これらの生物に由来する突然変異したＣａｓ９を含み得る。この酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。
【０１６８】
一般に、本明細書を通じて、用語「ベクター」とは、それが連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターには、一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖である核酸分子；１つまたは複数の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端を含まない核酸分子（例えば、環状）；ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方を含む核酸分子；および当該分野で公知のポリヌクレオチドの他の変種が含まれるがこれらに限定されない。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが標準的な分子クローニング技術などによってその中に挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、ウイルスに由来するＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためにベクター中に存在する、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、宿主細胞中へのトランスフェクションのためにウイルスによって運搬されるポリヌクレオチドもまた含む。
【０１６９】
ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動的に連結した遺伝子の発現を方向付けることが可能である。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。
【０１７０】
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で本開示の主題の核酸を含み得、これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動的に連結した、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され得る１つまたは複数の調節エレメントを含むことを意味する。
【０１７１】
組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結した」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおける、またはベクターが宿主細胞中に導入される場合には宿主細胞における）を可能にする様式で、調節エレメント（複数可）に連結したことを意味する意図である。
【０１７２】
用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列）を含む意図である。かかる調節エレメントは、例えば、Goeddel（１９９０年）Gene  Expression  Technology:  Methods  in  Enzymology  １８５巻、Academic  Press、San  Diego、Calif.に記載されている。調節エレメントには、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるエレメント、およびある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるエレメント（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、目的の所望の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えば、リンパ球）における発現を主に方向付け得る。調節エレメントはまた、時間依存的様式、例えば、細胞周期依存的様式または発生段階依存的様式で発現を方向付け得、これは、組織特異的または細胞型特異的であってもなくてもよい。
【０１７３】
一部の実施形態では、ベクターは、１つもしくは複数のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、１つもしくは複数のｐｏｌ  ＩＩプロモーター、１つもしくは複数のｐｏｌ  Ｉプロモーター、またはそれらの組合せを含む。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例には、Ｕ６およびＨ１プロモーターが含まれるがこれらに限定されない。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例には、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えば、Boshartら（１９８５年）Cell  ４１巻：５２１〜５３０頁）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【０１７４】
エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲ中のＲ−Ｕ５’セグメント（Takebeら（１９８８年）Mol.  Cell.  Biol.８巻：４６６〜４７２頁）；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβ−グロビンのエクソン２とエクソン３との間のイントロン配列（O'Hareら（１９８１年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  ７８巻（３号）：１５２７〜３１頁）もまた、用語「調節エレメント」によって包含される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望される発現のレベルなどの因子に依存し得ることが、当業者に理解される。ベクターは、宿主細胞中に導入され得、それによって、本明細書に記載されている核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチド（例えば、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異体形態、それらの融合タンパク質など）を含む転写物、タンパク質またはペプチドを産生する。有利なベクターには、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれ、かかるベクターの型は、特定の型の細胞を標的化するためにも選択され得る。
【０１７５】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖分析から規定された遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド構成要素が割り込み得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾され得る。
【０１７６】
本開示の主題の態様では、用語「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一のガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」は、互換的に使用され、ガイド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」とは、標的部位を特定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐの配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換的に使用され得る。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、用語「野生型」とは、当業者が理解する当該分野の用語であり、突然変異体またはバリアント形態から識別されて天然に存在する、生物、系統、遺伝子または特徴の典型的な型を意味する。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、天然に存在するものから外れたパターンを有する質の提示を意味すると解釈すべきである。
【０１７９】
用語「天然に存在しない」または「操作された」は、互換的に使用され、人の手の関与を示す。これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合、その核酸分子またはポリペプチドが、それらが自然界で天然に関連するおよび自然界で見出される少なくとも１つの他の構成要素を、少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【０１８０】
「相補性」とは、伝統的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型または他の非伝統的な型のいずれかによって、核酸が別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合）し得る、核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の連続する残基が全て、第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれよりも多くのヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である相補性の程度を指す、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションについて「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対する相補性を有する核酸がその標的配列と優勢にハイブリダイズし、非標的配列には実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は一般に、配列依存的であり、いくつかの因子に依存して変動する。一般に、配列が長くなるほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Tijssen（１９９３年）、Laboratory  Techniques  In  Biochemistry  And  Molecular  Biology-Hybridization  With  Nucleic  Acid  Probes  第１部、第２章「Overview  of  principles  of  hybridization  and  the  strategy  of  nucleic  acid  probe  assay」、Elsevier、N.Y.に詳細に記載されている。
【０１８２】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対合、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合によって、または任意の他の配列特異的様式で生じ得る。この複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、複数本鎖の複合体を形成する３つもしくはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より詳細なプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断におけるステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズすることが可能な配列は、その所与の配列の「相補体」と呼ばれる。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へと）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが引き続いてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、「遺伝子産物」と集合的に呼ばれ得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【０１８４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用されて、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。このポリマーは、直鎖または分岐鎖であり得、修飾アミノ酸を含み得、このポリマーには、非アミノ酸が割り込み得る。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識構成要素とのコンジュゲーションもまた包含する。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異性体、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む、天然のおよび／または非天然もしくは合成のアミノ酸を含む。
【０１８６】
本開示の主題の実施は、特に示さない限り、当業者の技術範囲内の、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技術を使用する（Sambrook、FritschおよびManiatis（１９８９年）Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第２版；Ausubelら編（１９８７年）Current  Protocols  in  Molecular  Biology）；MacPhersonら編（１９９５年）Methods  in  Enzymology  （Academic  Press,  Inc.）:  PCR  2:  A  Practical  Approach）；HarlowおよびLane編（１９８８年）Antibodies,  A  Laboratory  Manual；Freshney編（１９８７年）Animal  Cell  Culture）。
【０１８７】
本開示の主題のいくつかの態様は、１つもしくは複数のベクターを含むベクターシステム、またはそのようなベクターに関する。ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質または酵素）の発現のために設計され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Goeddel（１９９０年）Gene  Expression  Technology:  Methods  in  Enzymology  １８５巻、Academic  Press、San  Diego、Calif.でさらに議論されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳され得る。
【０１８８】
ベクターは、原核生物中に導入され、そこで繁殖され得る。一部の実施形態では、原核生物は、真核生物細胞中に導入されるベクターのコピーを増幅するため、または真核生物細胞中に導入されるベクターの産生（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅する）における中間体ベクターとして、使用される。一部の実施形態では、原核生物は、例えば、宿主細胞または宿主生物への送達のための１つまたは複数のタンパク質の源を提供するために、ベクターのコピーを増幅し、１つまたは複数の核酸を発現させるために使用される。原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を方向付ける構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて実施される場合が最も多い。
【０１８９】
融合ベクターは、それらがコードするタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させるため；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させるため；および（ｉｉｉ）親和性精製における配位子として作用することによって組換えタンパク質の精製を補助するためなどの、１つまたは複数の目的を果たし得る。しばしば、融合発現ベクター中には、タンパク質分解性切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との接合部において導入されて、融合タンパク質の精製に引き続く、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。かかる酵素、およびそれらの同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例には、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；SmithおよびJohnson（１９８８年）Gene  ６７巻：３１〜４０頁）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が含まれる。
【０１９０】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Amrannら（１９８８年）Gene  ６９巻：３０１〜３１５頁）およびｐＥＴ  １１ｄ（Studierら（１９９０年）Gene  Expression  Technology:  Methods  in  Enzymology  １８５巻、Academic  Press、San  Diego、Calif.）が含まれる。
【０１９１】
一部の実施形態では、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldariら（１９８７年）EMBO  J.  ６巻：２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（KuijanおよびHerskowitz（１９８２年）Cell  ３０巻：９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（Schultzら（１９８７年）Gene  ５４巻：１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。
【０１９２】
一部の実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞における１つまたは複数の配列の発現を駆動することが可能である。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Seed（１９８７年）Nature  ３２９巻：８４０頁）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufmanら（１９８７年）EMBO  J.  ６巻：１８７〜１９５頁）が含まれる。哺乳動物細胞で使用する場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には、１つまたは複数の調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、サルウイルス４０、ならびに本明細書で開示されるおよび当該分野で公知の他のウイルスに由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方に適切な他の発現システムについては、例えば、Sambrookら（１９８９年）Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual.第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１９３】
一部の実施形態では、この組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に、核酸の発現を方向付けることが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントが、核酸を発現させるために使用される）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkertら（１９８７年）Genes  Dev.  １巻：２６８〜２７７頁）、リンパ系特異的プロモーター（CalameおよびEaton（１９８８年）Adv.  Immunol.  ４３巻：２３５〜２７５頁）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（WinotoおよびBaltimore（１９８９年）EMBO  J.  ８巻：７２９〜７３３頁）および免疫グロブリンのプロモーター（Baneijiら（１９８３年）Cell  ３３巻：７２９〜７４０頁；QueenおよびBaltimore（１９８３年）Cell  ３３巻：７４１〜７４８頁）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ByrneおよびRuddle（１９８９年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８６巻：５４７３〜５４７７頁）、膵臓特異的プロモーター（Edlundら（１９８５年）Science  ２３０巻：９１２〜９１６頁）ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が含まれる。発生的に調節されるプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（KesselおよびGruss（１９９０年）Science  ２４９巻：３７４〜３７９頁）およびα−フェトプロテインプロモーター（CampesおよびTilghman（１９８９年）Genes  Dev.  ３巻：５３７〜５４６頁）もまた包含される。
【０１９４】
一部の実施形態では、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントの発現を駆動するように、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントに作動可能に連結している。一般に、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート（SPacer  Interspersed  Direct  Repeat））としても公知のＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート）は、特定の細菌種に対して通常特異的なＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。このＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて認識された別個のクラスの散在型の短い配列リピート（ＳＳＲ）（Ishinoら（１９８７年）J.  Bacteriol.、１６９巻：５４２９〜５４３３頁；およびNakataら（１９８９年）J.  Bacteriol.、１７１巻：３５５３〜３５５６頁）、および関連遺伝子を含む。類似の散在型ＳＳＲは、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ＡｎａｂａｅｎａおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおいて同定されている（Groenenら（１９９３年）Mol.  Microbiol.、１０巻：１０５７〜１０６５頁；Hoeら（１９９９年）Emerg.  Infect.  Dis.、５巻：２５４〜２６３頁；Masepohlら（１９９６年）Biochim.  Biophys.  Acta  １３０７巻：２６〜３０頁；およびMojicaら（１９９５年）Mol.  Microbiol.、１７巻：８５〜９３頁）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には、短鎖規則的間隔リピート（short  regularly  spaced  repeat）（ＳＲＳＲ）と名付けられたリピートの構造によって、他のＳＳＲとは異なる（Janssenら（２００２年）OMICS  J.  Integ.  Biol.、６巻：２３〜３３頁；およびMojicaら（２０００年）Mol.  Microbiol.、３６巻：２４４〜２４６頁）。一般に、これらのリピートは、実質的に一定の長さの独自の介在配列によって規則的に間隔があいたクラスターで存在する短いエレメントである（Mojicaら（２０００年）Mol.  Microbiol.、３６巻：２４４〜２４６頁）。リピート配列は系統間で高度に保存されているが、散在型リピートの数およびスペーサー領域の配列は、典型的には、系統によって異なる（van  Embdenら（２０００年）J.  Bacteriol.、１８２巻：２３９３〜２４０１頁）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ、Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａｑｕｉｆｒｘ、Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚａｒｃｕｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅ���ｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａが含まれるがこれらに限定されない、４０を上回る原核生物において同定されている（例えば、Jansenら（２００２年）Mol.  Microbiol.、４３巻：１５６５〜１５７５頁；およびMojicaら（２００５年）J.  Mol.  Evol.  ６０巻：１７４〜８２頁）。
【０１９５】
一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するもしくはその活性を方向付ける転写物および他のエレメント、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムとの関連では、「スペーサー」とも呼ばれる）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列および転写物を、集合的に指す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓなどの、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムとの関連では、プロトスペーサーとも呼ばれる）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。
【０１９６】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成との関連では、「標的配列」とは、ガイド配列がそれに対する相補性を有するように設計される配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在する限り、完全な相補性は必ずしも必要ではない。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質中に位置する。一部の実施形態では、この標的配列は、真核生物細胞のオルガネラ、例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体内にあり得る。標的配列を含む標的化される遺伝子座中への組換えに使用され得る配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と呼ばれる。本開示の主題の態様では、外因性鋳型ポリヌクレオチドは、編集鋳型と呼ばれ得る。本開示の主題のある態様では、この組換えは相同組換えである。
【０１９７】
一部の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの挿入部位）が、１つまたは複数のベクターの１つまたは複数の配列エレメントの上流および／または下流に位置する。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物が、細胞内の複数の異なる対応する標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するために使用され得る。例えば、単一のベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれよりも多くのガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのかかるガイド配列含有ベクターが提供され得、任意選択で細胞に送達され得る。
【０１９８】
一部の実施形態では、ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結した調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１３ａ、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、それらのホモログ、またはそれらの修飾バージョンが含まれる。これらの酵素は公知である；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、受託番号Ｑ９９ＺＷ２の下でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて見出され得る。一部の実施形態では、未修飾のＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＣａｓ９であり得る。
【０１９９】
一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置における、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補体内での、一方または両方の鎖の切断を方向付ける。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００またはそれよりも多くの塩基対以内での、一方または両方の鎖の切断を方向付ける。一部の実施形態では、突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、ベクターは、対応する野生型酵素に関して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。
【０２００】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核生物細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化されている。この真核生物細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌもしくは非ヒト霊長類が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物などの特定の生物のものであり得るまたはそれに由来し得る。一般に、コドン最適化とは、ネイティブ配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０またはそれよりも多くのコドン）を、ネイティブアミノ酸配列を維持したままその宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞における増強された発現のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の差異）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関する場合が多く、これは次に、とりわけ、翻訳されているコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。コドン使用表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適応され得る。Nakamuraら（２０００年）Nucl.  Acids  Res.  ２８巻：２９２頁を参照のこと。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムもまた入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、Ｐａ．）もまた入手可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列中の１つまたは複数のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０もしくはそれよりも多くの、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンと対応する。
【０２０１】
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を方向付けるのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する、任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインした場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれよりも高い。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムの使用によって決定され得、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（soap.genomics.org.cnにおいて入手可能）およびＭａｑ（maq.sourceforge.netにおいて入手可能）が含まれる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５またはそれよりも多くのヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２もしくはそれよりも少ないヌクレオチド長未満である。
【０２０２】
標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を方向付けるガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって調査され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、その後、例えば、本明細書に記載されているＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって、標的配列内の優先的な切断が調査される。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験されるガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素を提供すること、ならびに試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応との間で、標的配列における結合、または切断の速度を比較することによって、試験管中で評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者に明らかである。
【０２０３】
ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するために選択され得る。一部の実施形態では、この標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列には、標的ゲノム中で独自である配列が含まれる。例えば、一部の実施形態では、ＬＣＡの標的配列は、配列番号１、２、３、４、５および６；またはそれらの組合せからなる群から選択される。配列番号１、２、３、４、５および６；またはそれらの組合せは、ＣＥＰ２９０から隠れたエクソンＤを除去する約１ｋｂの欠失を生じ得る。配列番号１、２、３、４、５および６を、修飾形態のＣａｓ９、例えばＤ１０Ａニッカーゼと組み合わせることは、安全で有効な治療手法を提供し得る。４つのｇＲＮＡを有する例示的なｓａＣａｓ９構築物は、配列番号１１０に示される。ＬＣＡのさらなる標的配列は、配列番号７〜１０９に示されるヌクレオチド配列から選択され得る。一部の実施形態では、ＡＤＲＰの標的配列は、配列番号１１１〜１２６、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＤＲＰのｇＲＮＡ配列は、配列番号１２７〜１４２、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、緑内障の突然変異標的には、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＴＭＣＯ１、ＰＭＭ２、ＧＭＤＳ、ＧＡＳ７、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＴＸＮＲＤ２、ＡＴＸＮ２、ＣＡＶ１／ＣＡＶ２、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＳＩＸ６、ＡＢＣＡ１、ＡＦＡＰ１およびＣＤＫＮ２Ｂ−ＡＳが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、緑内障の標的配列は、配列番号１４３〜１６３、またはそれらの組合せからなる群から選択される。緑内障を処置する方法についての一部の実施形態では、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲシステムは、例えば、Ｄｌｋ、Ｌｚｋ、または本明細書で提供されるスクリーニング方法を使用して同定されたＲＧＣ生存経路の他の上流もしくは下流の構成要素に方向付けられた少なくとも１つのｇＲＮＡと組み合わせて、Ｐｏｌ  ＩＩ方向でｍＣｈｅｒｒｙ−ヒストン２ｂ融合物を発現させるためのＨ１プロモーターを含む。
【０２０４】
一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１〜７３８または７８８〜１３９７に示されるヌクレオチド配列に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％相同であり得る。
【０２０５】
用語「相同な」とは、「％相同性」を指し、本明細書で、本明細書の用語「％同一性」と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用してアラインした場合の、核酸配列同一性のレベルに関する。
【０２０６】
例えば、本明細書で使用される場合、８０％相同性とは、規定されたアルゴリズムによって決定された８０％配列同一性と同じことを意味し、したがって、所与の配列のホモログは、所与の配列の長さにわたって、８０％よりも高い配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルには、配列番号１〜１４００に示されるヌクレオチド配列に対する約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％またはそれよりも高い配列同一性が含まれるがこれらに限定されない。
【０２０７】
一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたは複数の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列、および任意選択で、任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合し得るタンパク質ドメインの例には、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および以下の活性のうち１つまたは複数を有するタンパク質ドメインが含まれるがこれらに限定されない：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性。エピトープタグの非限定的な例には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれる。レポーター遺伝子の例には、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物が含まれるがこれらに限定されない、ＤＮＡ分子を結合するまたは他の細胞性分子を結合するタンパク質またはタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合し得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１００５９５０２に記載されている。一部の実施形態では、タグ化されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置を同定するために使用される。
【０２０８】
本開示の主題のある態様では、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれるがこれらに限定されないレポーター遺伝子は、遺伝子産物の発現の変更または修飾を測定するためのマーカーとして機能する遺伝子産物をコードするために、細胞中に導入され得る。本開示の主題のさらなる実施形態では、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子は、ベクターを介して細胞中に導入され得る。本開示の主題の好ましい実施形態では、この遺伝子産物はルシフェラーゼである。本開示の主題のさらなる実施形態では、この遺伝子産物の発現は減少する。
【０２０９】
一般に、本開示の主題のプロモーター実施形態は、以下を含む：１）ＴＡＴＡボックス、近位配列エレメント（ＰＳＥ）および遠位配列エレメント（ＤＳＥ）を含む、完全なＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター；ならびに２）リバース配向でＤＳＥの５’末端に融合したＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター。そのヌクレオチド配列にちなんで名付けられたＴＡＴＡボックスは、Ｐｏｌ  ＩＩＩ特異性の主要な決定因子である。これは通常、転写される配列に対してヌクレオチド−２３と−３０との間の位置に位置し、転写される配列の開始の主要な決定因子である。ＰＳＥは通常、ヌクレオチド−４５と−６６との間に位置する。ＤＳＥは、基本的Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの活性を増強する。Ｈ１プロモーター中には、ＰＳＥとＤＳＥとの間にギャップは存在しない。
【０２１０】
双方向プロモーターは、以下からなる：１）３つの外部制御エレメント：ＤＳＥ、ＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含有する、完全な従来の一方向Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター；ならびに２）リバース配向でＤＳＥの５’末端に融合したＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター。ＴＡＴＡ結合タンパク質によって認識されるＴＡＴＡボックスは、プロモーター領域にＰｏｌ  ＩＩＩを動員するために重要である。ＴＡＴＡボックスへのＴＡＴＡ結合タンパク質の結合は、ＳＮＡＰｃとＰＳＥとの相互作用によって安定化される。合わせると、これらのエレメントは、Ｐｏｌ  ＩＩＩが発現される配列を転写できるように、Ｐｏｌ  ＩＩＩを正確に位置付ける。ＤＳＥはまた、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの完全な活性に重要である（Murphyら（１９９２年）Mol.  Cell  Biol.  １２巻：３２４７〜３２６１頁；Mittalら（１９９６年）Mol.  Cell  Biol.  １６巻：１９５５〜１９６５頁；FordおよびHernandez（１９９７年）J.Biol.Chem.、２７２巻：１６０４８〜１６０５５頁；Fordら（１９９８年）Genes,  Dev.、１２巻：３５２８〜３５４０頁；Hovdeら（２００２年）Genes  Dev.  １６巻：２７７２〜２７７７頁）。転写は、転写因子Ｏｃｔ−１および／またはＳＢＦ／Ｓｔａｆと、ＤＳＥ内のそれらのモチーフとの相互作用によって、最大１００倍増強される（KunkelおよびHixon（１９９８年）Nucl.  Acid  Res.、２６巻：１５３６〜１５４３頁）。フォワードおよびリバース配向の基本的プロモーターは、二本鎖ＤＮＡ鋳型の対向する鎖上の配列の転写を方向付けるので、リバース配向の基本的プロモーターのプラス鎖は、ＤＳＥのマイナス鎖の５’末端に付け加えられる。Ｈ１プロモーターの制御下で発現された転写物は、４Ｔまたは５Ｔの連続した配列によって終結される。
【０２１１】
Ｈ１プロモーター中では、ＤＳＥは、ＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスに隣接する（Myslinskiら（２００１年）Nucl.  Acid  Res.  ２９巻：２５０２〜２５０９頁）。配列反復を最小化するために、リバース方向での転写がＵ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付け加えることによって制御されるハイブリッドプロモーターを創出することによって、このプロモーターを双方向性にした。双方向Ｈ１プロモーターの構築を促進するために、小さいスペーサー配列もまた、リバース配向の基本的プロモーターとＤＳＥとの間に挿入され得る。
【０２１２】
一部の実施形態では、双方向プロモーターには、Ｈ１、ＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（ヒト）、ＳＲＰ−ＲＰＳ２９、７ｓｋ１−ＧＳＴＡ４、ＳＮＡＲ−Ｇ−１−ＣＧＢ１、ＳＮＡＲ−ＣＧＢ２、ＲＭＲＰ−ＣＣＤＣ１０７、ｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）−ＡＬＯＸＥ３、ＲＮＵ６−９−ＭＥＤ１６：ｔＲＮＡ（Ｇｌｙ）−ＤＰＰ９、ＲＮＵ６−２−ＴＨＥＭ２５９またはＳＮＯＲＤ１３−Ｃ８ｏｒｆ４１が含まれるがこれらに限定されない。
【０２１３】
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、配列番号７８７に示されるヌクレオチド配列を含む。
Ｈ１＿ｗｔ：
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCC（配列番号７８７）
【０２１４】
一部の実施形態では、オルソロガスな双方向プロモーターには、ＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（マウス）もしくはＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（ラット）、またはａｉｌｕｒｏｐｏｄａ  ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ、ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ、ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ、ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｓａｂａｅｕｓ、ｃｈｏｌｏｅｐｕｓ  ｈｏｆｆｍａｎｎｉ、ｄａｓｙｐｕｓ  ｎｏｖｅｍｃｉｎｃｔｕｓ、ｄｉｐｏｄｏｍｙｓ  ｏｒｄｉｉ、ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ、ｅｒｉｎａｃｅｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ、ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ、ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ｉｃｔｉｄｏｍｙｓ  ｔｒｉｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｕｓ、ｌｏｘｏｄｏｎｔａ  ａｆｒｉｃａｎａ、ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ｍｕｓｔｅｌａ  ｐｕｔｏｒｉｕｓ  ｆｕｒｏ、ｍｙｏｔｉｓ  ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、ｎｏｍａｓｃｕｓ  ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ、ｏｃｈｏｔｏｎａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ、ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、ｏｔｏｌｅｍｕｒ  ｇａｒｎｅｔｔｉｉ、ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ、ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ、ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ、ｐｒｏｃａｖｉａ  ｃａｐｅｎｓｉｓ、ｐｔｅｒｏｐｕｓ  ｖａｍｐｙｒｕｓ、ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、ｔａｒｓｉｕｓ  ｓｙｒｉｃｈｔａ、ｔｕｐａｉａ  ｂｅｌａｎｇｅｒｉ、ｔｕｒｓｉｏｐｓ  ｔｒｕｎｃａｔｕｓ、ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓに由来するプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【表１−１】
2019520391.tif 000002
【表１−２】
2019520391.tif 000003
ＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（ヒト）：
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCC（配列番号７３９）
ＳＲＰ−ＲＰＳ２９：
CTTGCTCTCAGCAGTGCAACGAGGTAAAAGGAAGAAGCTGGCCCACGCATGCGCTCTTCAAATTTTTGAGACAGTTTACCCAGAATGCAGTGCTCAAAGGAAACGCGTGCGCAGTGTGGTCAGGTTGTTTCGCTGGGTGAGTAAAATGAAATCTTAGAGGCGTTGTGGGCTGGCCCAGTTGATGACGTCACCATACCACAGCTTCTAGTGCTATTCTGCGCCGGTATCCGACC（配列番号７４０）
７ｓｋ１−ＧＳＴＡ４：
AGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTC（配列番号７４１）
ＳＮＡＲ−Ｇ−１−ＣＧＢ１：
GTCTCTCTCTTAGCGGGATATCTTCCGCAAGCACTGGGAATGTGGACATGGAAAGTAAATTGAGTCTCCGTGGGGGAGTGAGACAGGGAGTGAGGGGTGTTGGACGCGGCACGGGAACCTGGCCAGAGTCAGCGGACCCAATTGGCTGCTCTCTCTCAGATGCAGTTCCCCTTCCTCCCTCCAGGGGGCGCCACGGAACGCAGGGCCCTCACTGGCCCTGGGGACTGGGTGACGTCAGGGATGAGCCTCTTGTGATTGGCTCCATCACCCTGCGTAAGATCAAAGGGAAGAAAGGATGGGCCCGACAA（配列番号７４２）
ＳＮＡＲ−ＣＧＢ２：
GTCTCTCTCTTAGCGGGATATCTTCCGCAAGCACTGGGGATGTGGACATGGAAAGTAAATTGAGTCTCCGTGGGGGAGTGAGACAGGGAGTGAGGGGTGTTGGACGCGGCACGGGAACCCGGCCGGAGTCAGCGGACCCAATTGGCTGCTCTCTCTCAGATACAGTTCCCCTTCCTCCCTCCAGGGGGCGCCACGGAACGCAGGGCCCTCACTGGCCCTGGGGACTGGGTGACGTCAGGGGTGAGCCTCTCCTGATTGGCTCCATCACCCTGCGTAAGGTCAAAAGGAAGAAAGGAGATCCCCGACAC（配列番号７４３）
ＲＭＲＰ−ＣＣＤＣ１０７：
TGCCGGCCCACGGGTGGAGGGATCGGGCGGGCGGTGCCGAAGCGGTCCGGCATTGGCCGGCCGCCCCAACGCGCACGCGCACGCGAGCAGGCCGGCCGGCTCCGGGGAGGCCACGCCCACTCCCCGTAGGGCGGGGCCAGACCATATTTGCATAAGATAGTGTCATTCTAGCTTTCCTGTATTTGTTCATTTCGTGTCTATTAGCTATTCTGCTAGCCACAATGCCTCTGAAAGCCTATAGTCTTAGAAAGTTATGCCCGAAAACGGTTTTTTTAATCTCACGCCACCAACTTTCTCACCCTAATCATAAAACACAATTTCTTTAGGGCTATAAAATACTACTCTGTGAAGCTGAGGACGT（配列番号７４４）
ｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）−ＡＬＯＸＥ３：
TCTTTCCGCTCCAGGACCGCCCTGGGCCTGCAGGATCCTGGGCGGGAGCCCAGGTGTCCGGGATCTGGGCCACTAGGGACTGGGGAGGAACCTCTCAGAGAAGCCCATAGCCCGCAGCGGCCCCGCGCGGCCGGTTCCGGCGCCGCACTGTTCCAGCCTCTACTATGGTACAGTCCCTGCGTCGCAGCCTCGGCGGGGGCTCTAAGAACGGGAGGCAGAAAAAGCTCAATCAGCAGCAGGCGAGCTTCACCCGCTGCTTCCAAATCTGTGCCAAAATATTCTATGCTGCACAGATAAAATCCTCTGTCGGTTCTACAAGCCTGGCTTTTCCTATAGAGAACCCTCTTATAAGCAAAAAGTAAAGCTCTCGTGAAGA（配列番号７４５）
ＲＮＵ６−９−ＭＥＤ１６：
GAGGGCAGTCACCAGCTCCTGGCCCGTGCGCCAAGCTCAGCGGGCGTCCGCGGTGCGATCTTCCCTAGCGCCTCGGGTCTGGCGCCGCCATCTTCCTCGGTAACAACCAGTCGCCTGAGGCGTGGGGCCGCCTCCCAAAGACTTCTGGGAGGGCGGTGCGGCTCAGGCTCTGCCCCGCCTCCGGGGCTATTTGCATACGACCATTTCCAGTAATTCCCAGCAGCCACCGTAGCTATATTTGGTAGAACAACGAGCACTTTCTCAACTCCAGTCAATAACTACGTTAGTTGCATTACACATTGGGCTAATATAAATAGAGGTTAAATCTCTAGGTCATTTAAGAGAAGTCGGCCTATGTGTACAGACATTTGTTCCAGGGGCTTTAAATAGCTGGTGGTGGAACTCAATATTC（配列番号７４６）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｙ）−ＤＰＰ９：
TAACCGCTCAGCTGACCTCAGGAGGGCAGGGGTGCCTTCTAAAGGGTCCAGAGAGCCTCCATTCCAGCTGCAGGCGTGGGACACAGACCGGGACGTGGGGCGGCGGCCGGACTGGGCAGGTCGTCCCGGGTCCAGCGGCGCCTCACGGTCGCGGCTCCATGCCCGGGACTGCGACCCCGGAAGTGGCGGGAGCGGGGGACGACAGCCGCGGCGGACACAGGGGACCCGCCGGCTCAGGCACCTTTGACCCGGAAGTTGAGCGACCCAGGCGGCGGCCTGGGATTGGACACCACCAGGCACGTACCAAGGCGTCCGCGGCGCTTGGGGGGGAGCCCGCGGCGCGGCGGCCTAAGGTGCGTAACGCCCCATGAACGACATCTTCCGGTGGGTTAGGGAGAGACACCCCCCTGTGACTTGGTATCACTCAGTCAAACCCATGATCCCCCACTATTAAGGATATCCGGAGAGGATGCTACCTATCAGG（配列番号７４７）
ＳＮＯＲＤ１３−Ｃ８ｏｒｆ４１：
TCCTGACTGCAGCACCAGAAGGCTGGTCTCTCCCACAGAACGAGGATGGAGGCGGGGAGGGATCCGTTGAAGAGGGAAGGAGCGATCACCCAAAGAGAACTAAAATCAAATAAAATAAAACAGAGAGATGTCTTGGAGGAGGGGGCGAGTCTGACCGGGATAAGAATAAAGAGAAAGGGTGAACCCGGGAGGCGGAGTTTGCAGTGAGCCGAGATCGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGTGAGACTCCGTCTCAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATAAAGAGGAAAGGACGCAAGAAAGGGAAAGGGGACTCTCAGGGAGTAAAAGAGTCTTACACTTTTAACAGTGACGTTAAAAGACTACTGTTGCCTTTCTGAAGACTAAAAAGAAAAAAAACTTAAAAATTTAAAGAAATAAACTTCTGAGCCATGTCACCAACTTAACCACCCCCAGGTACCTGCAACGGCTCGCGCCCGCCGGTGTCTAACAGGATCCGGACCTAGCTCATATTGCTGCCGCAAAACGCAAGGCTAGCTTCCGCCAGTACTGCCGCAACACCTTCTTATTTCACGACGTATGGTCGTAAAGCAATAAAGATCCAGGCTCGGGAAAATGACGGAGAGGTGGAACTATAGAGAATAAATTTGCATATATAATAATCCGCTCGCTAATTGTGTTTCTGTTTTCCTTTGCTAAGGTAGAAACAAAAGAATAATCACAGAATCTCAGTGGGACTTTGAAAATATCCAGGATTTTATACGTGAAGAATGGATGTATCGCATTACGGTAGTCACCCTATGTGTAAATTAGTGGCACATACTTGGCACTCCTTAATGTCAACTATAAGATG（配列番号７４８）
ＲＮＵ６−２−ＴＨＥＭ２５９；
GCCTCCCAGCGTCGCGCCCTAACGACCCGCAAGTGTCCGAGGGCGCCTCCCGGCCGCCATCGGCCGCCCTCGCAGCCGCCGCTCTCCTCACGGCCTCCCGGCCGCCGCCGCCATCTTCCGCTTTCTCGTCCGGCTGCGGCGCTGCTGACGCTAGCGAGTCGCCACGCCGGGCAAGAGCGGCCCCCCTGCGCCCGCAGAGAACGCTGGGATGCCAGCGGCGCCCGCGGAGGCCTCACCCCCTACCTCGGCCGCTCCAGGGGGCGGGCCTGCATCTGGGCCACCTCTTTTGCATATTGGCACCCACAATCCACCGCGGCTATGAGGCCAGTATAAGGCGGTAAAATTACGATAAGATATGGGATTTTACGTGATCGAAGACATCAAAGTAAGCGTAAGCACGAAAGTTGTTCTGCAACATACCACTGTAGGAAATTATGCTAAATATGAAACCGACCATAAGTTATCCTAACCAAAAGATGATTTGATTGAAGGGCTTAAAATAGGTGTGACAGTAACCCTTGAGTC（配列番号７４９）
【表６】
2019520391.tif 000004
ＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（マウス）：
CGCTCTTGAAGGACGACGTCATCATCCCTTGCCCGGATGCGCGGGCTTCTTGTCTAGCACAGGAGCCTGGGGTAGAGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCC（配列番号７５０）
ＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（ラット）：
GGCTGATGAGCTTCCCCCGCCCACTAGGAGTGTGAAGACCTGCCGCCATAATAAGACTCCAAAAGACAGTGAATTTAACACTTACGGTGACTTCCCACAAAGCACAGCGTGTAATTTGCATGCGCTCTAGCCCAGGCTCCAGCTCCGGACCAGAAGCCCGCGCATCCCGGCAAAGGGTGATGACGTCGTCCTTCAAGCGCT（配列番号７５１）
表７：オルソロガスなＨ１配列の例
ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ
TTCAGGATGTAGACCGGCCGCCACTATAAGGCTCGAAAGAGGAATAAATTTTTCGTTTAGGGTGATTTCCCACAAAGCACAGCGCGTAATTTGCATGCGCTCTACCCCAGGCTCCTGTGCTAGACAAGAAGCCCGCGCATCCGGGCAAGGGATGATGACGTCGTCCTTCAAGAGCG（配列番号７５２）
ｒａｔｔｕｓ＿ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ
AGGAGTGTGAAGACCTGCCGCCATAATAAGACTCCAAAAGACAGTGAATTTAACACTTACGGTGACTTCCCACAAAGCACAGCGTGTAATTTGCATGCGCTCTAGCCCAGGCTCCAGCTCCGGACCAGAAGCCCGCGCATCCCGGCAAAGGGTGATGACGTCGTCCTTCAAGCGCT（配列番号７５３）
ｄｉｐｏｄｏｍｙｓ＿ｏｒｄｉｉ
AGGAAAGACTTCGCTGAGGCAGACTTTATAAGGCTCCCGCGCAGAAAGAAACTTTATAGTTATGGTGATTTCCCACAAGCCACTGCGTCATGCAAATAAAGCAGGGTACGGCTTCCATGTACCTTAAGGTTTTTTTCTAGGCCGCGTACGCTCTGCGTATTCAGCCACGTGACCCTGAGCCAGTGGTTGTTGGGAGCACGTTGTGGACCTCTGCGTTTGGATTCC（配列番号７５４）
ｉｃｔｉｄｏｍｙｓ＿ｔｒｉｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｕｓ
GAAAGGGACTCCGCACAAGCAGAGTTTATAAGGCTCCCATCTGTACAGCCATTTCTCGGTCATGGTAACTACCCACAACACACAGCGATATGCAAATATAGCAGAGCGTGTCTTCCCGCGCGCGCCTGGTCGTCTCGGCGCCGGCGCGCTGCGTGGGGCGGAACTGTGACAGAGACCCTGCGATTCCTGGGAGCTGGCTGATGACATCAGTGTCTAACCTCC（配列番号７５５）
ｃａｖｉａ＿ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ
GAGAAAGAAAGGCTCAAACCTAGCCTTATAAGGCTCCCAAATGTCGGTATATTTTTTGGTTATGGTGACTTCCCACAATGCATAGCGATATGTAGATATTGCCAGGAGTACCTCCCACTTCTGGTCCTGTCAGCTCTTTTCTAGGACGCGCGCGCTGCAGGTTTCCAGCCTGTGATTGGGCCAGCAATTCCGGGAATGAATTGATGACGTCAGCGTTTGAATTCC（配列番号７５６）
ｏｃｈｏｔｏｎａ＿ｐｒｉｎｃｅｐｓ
GGGGGAAGCTGGGCTCGATCAGCCTTTATAAAGCTCCAAAAACTCAAGACATTTTTCTGTTACGGTGGCTTCCCACAGTACACAGCGACATGCAAATAGCTTGCCAATGAATTCGCGGACCGCTTCCCGCCCCGGCGCAGGCGCGCGGACGCTGTCTCCCCTGGACGCGCGCTCGCGGTTCCCGGGAGCTGGCTGATGACGTTCGGTCTCC（配列番号７５７）
ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ＿ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ
GGGGAGAGGTGGATCCGAACAGACTTTATAAAGCTCCGAAAGCCCAAGGCATCTTTCCCTTACGGTAGCTTCCCACAAGACATAGCGACATGCAAATTTCTTGAAGTATGCTTCAGACGCGCTTCTCGCCACAGCGCAAGCGCGCTGTGTGCTGACGCGGGAACGGGCCAGGGCGCGGTTCCCGGGAGCGGGTTGATGACGTTAGATCTCC（配列番号７５８）
ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ＿ｊａｃｃｈｕｓ
GAGGAAAAGTAGTCCCACAGACAACTTATAAGATTCCCATACCCTAAGACATTTCACGATTATGGTGACTTCCCAGAAGACACAGCGACATGCAAATATTGCAGGTCGTGTTTCGCCTGTCCCTCACAGTCGTCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTTTCCCGCCAACTGACGCTGGGCTCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTTGAATTCC（配列番号７５９）
ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ＿ｓａｂａｅｕｓ
GGGGAAGGGTGGTCCCTTACAGAACTTATAAGATTCCCAAACTCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGACTTCCCAGAAGACATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGTCACACCCCTCTCCCTCACAGTCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCTCGCGTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号７６０）
ｍａｃａｃａ＿ｍｕｌａｔｔａ
GGGGAAGGGTGGTCCCACACAGAACTTATAAGATTCCCATACTCAAAGACATTTCTCGTTTATGGTGACTTCCCAGAAGACACAGCGACATGCAAATATTGTAGGGCGTCACACCCCTGTCCCTCACAGTCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCGTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号７６１）
ｐａｐｉｏ＿ａｎｕｂｉｓ
GGGGAAAGGTGGTACCATACAGAACTTATAAGATTCCCATACTCAAAGACATTTCACGATTATGGTGACTTCCCAGAAGACACAGCGACATGCAAATATTGTAGGGCGTCACACCCCCTGTCCCTCACAGTCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCGTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号７６２）
ｇｏｒｉｌｌａ＿ｇｏｒｉｌｌａ
GGGAAAGGGTGGTCCCACACAGAACTTATAAGACTCCCATATCCAAAGACATTTCACGGTTATGGTGATTTCCCAGAACACATAGCGACATGTAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCAGTCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号７６３）
ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ
GGGAAAAAGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCCAAATCCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGATTTCCCAGAACACATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCTGTCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号７６４）
ｐａｎ＿ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ
GGGAAAGGGTGGTGCCACACAGAACTTATAAGATTCCCATATGCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGATTTCCCAGAACACATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCTGTCCCTCACTGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号７６５）
ｐｏｎｇｏ＿ａｂｅｌｉｉ
GAGAAAGGGTGGTCCCGTCCAGAACTTATAAGATTCCCATACCCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGACTTCCCAGAATGCATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGTCACTCCCCTGTCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCCCGCGCGCTGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTGGGCCCACGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGCTCGTATTCC（配列番号７６６）
ｎｏｍａｓｃｕｓ＿ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ
GGGGAAAAGTAGTAGACCTTATAAGATTCCCAAACCCAAAGACATTTCTCGTTTATGGTGACTTCCCAGAAGACATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCTGTCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTCGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号７６７）
ｔａｒｓｉｕｓ＿ｓｙｒｉｃｈｔａ
GCGAGAGGGTGGGTCCACACAGAGCTTATAAGGTTCACAAGTAAAGATATTTCACGGTGACGGTGACTTCCCACAATACACTGCGACATGCAAATATAGCCGGGCGTGCCTCCCCGATCCCGGAAGAGCGACTCCTAGCCAGTGCGCACGCGCGCTGCGTGTTCGCGTCCTAGGTCGCTGGGCCCGCGGTTCCTGGGAGCGGGTGGTGACGTCAGCGGCCCAGCTTC（配列番号７６８）
ｏｔｏｌｅｍｕｒ＿ｇａｒｎｅｔｔｉｉ
GCCTAAAAGGGCGCTTGCACAGAATTTATAAGGTTCCCAAACAGAGACACATTTCATTATTATGGTGACTTCCCACAATGCACAGCGCCATGCAAATATGCTAGGACGCCTCCCCCCGCTACCTTAAGGTCGTCAACTAACCAGTGCGCGCGCGCACTGCGCGTTTCCCGCCGGTGACTCAATGCCCGCGTTTGGTGGGAGCTAGTTGGTGACCTCAGTTCTGGAGGCTC（配列番号７６９）
ｔｕｐａｉａ＿ｂｅｌａｎｇｅｒｉ
GGGGGAAGCTGGGTCCACTGAGTTCTTATAAGGTTTCCAGTCCTAGAGCGATTTTACCATTGCGGTGATTTCCCAGCATCCGTAGCTACATGCAAATAGCGCGGGGCGCGTCTCTCAGGTCCCTCCCCGCCCTCTCACTGTACGTACCCGCGTCCTAGGGACGCCGCGCCCGGGGTTCCCGGACGTCAGCGTTCCGACGCA（配列番号１０２）
ａｉｌｕｒｏｐｏｄａ＿ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ
AGGGAAAGCCGCGCCTGGGGCGGATTTATAAGGCTTCCATATCTAAAGGCATTTCACAGTCATGGTGACTTCCCACAATACATAGCAACATGCAAATATCGCGGGGAGAACCTCCCCTGTCCCTTGTACGCGGCTTCTAAAGACGCACGCGCGCTCTGTGTTCCCGCCCTGTGACTCTAGGCGGGCAATTCCTGGGACAGTGTTCTGACGGGAACGTTCAGGCTCC（配列番号７７０）
ｍｕｓｔｅｌａ＿ｐｕｔｏｒｉｕｓ＿ｆｕｒｏ
GGGAAAGGGTGGACCCACCGAGCATTTATAAGGCTCCCGCATCTAAAGACATTTTACAGTTATGGTGACTTCCCACAACGCGTAGCAACATGCAAATATCGTGGAGAGTACCGCCCCTGTCCCATGCACGCGTCTTCTCAGCAGCACGCACGCGCGCTGTGTTCCCGCCCTGTGACTCCAGGCGGGTATTTCCAGGGGCGGGTTGCTGACAGGAACGTTCAGGCTTC（配列番号７７１）
ｃａｎｉｓ＿ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ
GCAGCGCAGCCCTCTCGCCGCTTATAAAGTGCCGCCCGCACGGCCCTTCTCGCTCACGGCGACTTCCCATAACACACAGCAGCATGCAAATACCGCGGGGAGCCCCGCCCCGCCCCGGCCCCCGCACCGCCTCGGGACGCATGCGCCGGCTCTCCGTTCCCGCCTTGGGCCGGCGGCGGGCGGGCGGGCGAGCGGGCGGGAGCGGCTCCGGCGGGGACGAGCGGGCGCC（配列番号７７２）
ｆｅｌｉｓ＿ｃａｔｕｓ
GGGAAAGGGTGGCCCCGCCGAGCATTTATAAGACTCCCATACCTAAAGACATTTCTCAGTTATGGTGATTTCCCACAACACACAGCAACATGCAAATATCGAGGGGTGTACCGCCCCTGTCCTTTGTAGACGTCTTCTCTCCAGGACGCACGCGCGCTGTATTCCCGCCTTGTGACTCTAGGCGGGCGATTCCTGGGAGAGGGTTGATGACGTCCAAGTTCTGGCTTC（配列番号７７３）
ｅｑｕｕｓ＿ｃａｂａｌｌｕｓ
GGGGGAAAACAGCCCATGGCTGCATTTATAAGACTCACAGATCTAAAGCCATTTCACGAATAGGGTGACTTCCCACAATACACAGCGACATGCAAACATAGCGGGGCGTGCCTTTCCTGTACCCTGTGGGCATCTCTCCTGGACGCACGCGCGCCGGGTGTTCCCGCGCTGTGACTCTAGGCAAGCGCTTCCTGGGAGAGAGTTGATGACGGCAGCATTCGGGCTCC（配列番号７７４）
ｍｙｏｔｉｓ＿ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ
GGGAGAAGGAGGCGTAGAGGATATATAAGGCCCCCTTATGTGTAGTCCTTTTACGGTTAGGGTGACTTCCCACAACGCATAGCGACATGCAAATTTGACGGGCGTGCCTCCTCTGTCCCTGCGGGCAACTTCTCTCCTGGACGCGCGCGCGCTGCGTGTTCCCGCCTTTTGACTCCAGCCGAGCGAATCCTGGGAGAGGGCAGGTGACGTCAACAGTCAGGCTCG（配列番号７７５）
ｐｔｅｒｏｐｕｓ＿ｖａｍｐｙｒｕｓ
GCGAGAAAAATTCTTCACGCAGAATATATAAGGATCCCATATCTGAAGACATTTTACGATTACGGCGATTTCCCACAACACATAGCGACATGTAAATGTAGTGGGGCATGCCTCCCCTGTCCCTTGTGGGCAGCTTCTCGCCAGAACGCACGCGCGGTGCGTGTTCCCGCCTTGTGACTAAGTTGGCGAGTCAGGGAGGAGATTGATGACGTCAGCTCACCCGCTCC（配列番号７７６）
ｂｏｓ＿ｔａｕｒｕｓ
GGCAAACACCGCACGCAAATAGCACTTATAATGTGCTCATACCTAGAGCCACTTTTCGGTTACGGTGACTTCTCAAAAAGACAGTGGAACATGCAAATATTACAGTGCGTCCCGCCCCTGGTAGGTCTACGCTAGGACGCACGCGCACTACGGTTCCCGCCTATAGACTGCGCTGGCGATTCCTGGGAGCGGACTGATGACGTCAGCGTTCGGGATCC（配列番号７７７）
ｏｖｉｓ＿ａｒｉｅｓ
GGCGAACAATGCGCGCAAACAGCATTTATAATGAGCTCATACCTAAAGCCACTTTACGGTTACGGTGACTTCCCACAAGACATTGCGGCATGCAAATATTTTAGTGCGTCCCGCCCCTGGTAGTTCCACGCTAGGACGCACACGCACTACGGTTCCCGCCTTTAGACTGCGCTGGCGATTCCAGGAGCGGACTGATGACGTCAGCGTTGGGGCTCC（配列番号７７８）
ｔｕｒｓｉｏｐｓ＿ｔｒｕｎｃａｔｕｓ
GCCGAAAACCAGGCTCAAGCCACATTTATAAGGCTCCCAAATCTAAGTACATTTGTCGGTTATGGTGACTTCCCGCACCACATTGCGACATGCAAATACTGCGGAGCGTCCCTCCCCTGGCAACTCCTCGCTGGGACGCACGCGCGCTACGTGCTCCCGCCTTTTGACTGCGCCGGCGATACTTGGGAGAGGGTTGATGACGTCAGCGTTCTGGCTCC（配列番号７７９）
ｖｉｃｕｇｎａ＿ｐａｃｏｓ
GGGAAAGGGTGGGCTCACGCAGCCTTTATAAGACTCCCAAACTTAAAGACATTTCTCGGTTATGGCGACTTCCCACAAGACATAGCGACATGCAAATACTGCAGGGCGCCGACCCGGTCCTGTGCAGCCATCTTTCGGCTGGGACGCACGCGCGCTGCGTGTTCCCGCCCTGTGACTGCGCCGGCGATTACTGGGAGAGGATTGATGACGTCAACGTTCGGGTTCC（配列番号７８０）
ｓｕｓ＿ｓｃｒｏｆａ
GTAGGAAAACTGCTTCTGTGAGCACTTATAAAACTCCCATAAGTAGAGAGATTTCATAGTTATGGTGATTTCCCATAAGACATTGCGACATGCAAATATTGTGGCGCGTTCGTCCCCGTCCGGTGCAGGCAGCTTCGCTCCAGGACGCACGCGCAATACATGTTCCCGCCTTGAGACTGCGCCGGCAGATTCCTAGGAAGTGGTTGATGACGTCGATGTTAGGGATCC（配列番号７８１）
ｅｒｉｎａｃｅｕｓ＿ｅｕｒｏｐａｅｕｓ
GCCTAAACCGGCTCTTTCGACAGACTTATAAGGACCTCTTATCTTAGGACATTTTTTTGTTAGGGTAACTTCCCACGATGCATAGCGATATGTAAATATGGCGCCGCGAGTCTCTCCTAGGCGTCTCCCCAGGACGCAGGCGCACTGCTTGTTCCCGCGTTAACATTGCTGATTCTGGGAGACTGCTGATGACGTCAGCGTCCAGTCTAC（配列番号７８２）
ｃｈｏｌｏｅｐｕｓ＿ｈｏｆｆｍａｎｎｉ
AGAAAAAAATAGTTTATGCTGGATTTATAAGATTCCCAAATCTAAAGCCATTTCACAGTTACGGTGATTCCCCACTACACACGGCGATATGCAAATATAGCGGAAGTGTTCCTGAGGCGTGGTAAAGCGCGCGCGCGCTGAGAGTTCCCGCCCTGTGGTGCTGGGCTGGAGATGCCTGAGAACTGGCTGATGACGGCAACGTTCGGGCTCC（配列番号７８３）
ｄａｓｙｐｕｓ＿ｎｏｖｅｍｃｉｎｃｔｕｓ
AAAGCGATAGTTTTTTAAACTGGACTTATAAGGCACCCATATCTACGTATATTTCATGGTTAGGGTGATTTCCCACAACACATAGCGAAATGCAAATATTGGAGGGCGCTGAGGCGTGGTCGGGCGCAAGCGCGCTGCGACTTCCCGCCTTTCGGCCCTAGGCCCCAGATTCCTGGGAGCTGGATGATGACGTTGACGTTCGGATACC（配列番号７８４）
ｌｏｘｏｄｏｎｔａ＿ａｆｒｉｃａｎａ
GGGAAGGAACAAATTCGTCAGGATTTATAAGACTCTCAGAGCTGTAGACATTTCACAGTTAGGGCGATGTCCCACAATACATAGCAACATGCAAATATTCTAGGAGGCCAGCCTCCCCGTCCGCGTGGTCATCTTCTCGCTAGGGCGCACGCCCGCTGCGTGTTCCCGCTCTGTGACCAGGCAGGCGATTCCTGAGAACCGCTTGGTGACGTCAGTGTTCTGGCTCC（配列番号７８５）
ｐｒｏｃａｖｉａ＿ｃａｐｅｎｓｉｓ
AGGGTAAATCGGCGCTGCTCAGCATTTAAAAGAATCCCAAATGTGTCGCCATTTTACGCTTAGGGTGATATCCCACAAGACACAGCGACATGCAAATATCGTGAGTCTCTGTTTCCCTGTCCACGAGGGCGTCCTCTCGCTGGGGCGCACGCGCGGTGTGTGTGCCCCCGTTGTGTGTTCCCGCGATTCCAAAGAACTGGTTGATAACGTTAGACTTCCGGCTGC（配列番号７８６）
Ｂ．方法
【０２１５】
一部の実施形態では、本開示の主題は、真核生物細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、ＷＯ２０１５／１９５６２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載された修飾された天然に存在しないＣＲＩＳＰＲシステムを細胞中に導入するステップを含む方法もまた提供する。かかる修飾は、例えば、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子、ロドプシン、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、ＭＥＦ２Ａ、ＳＯＸ１１またはＰＵＭＡであるがこれらに限定されない網膜変性症（retinal  degenration）関連遺伝子を標的化するある特定のｇＲＮＡを使用する。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、双方向Ｈ１プロモーター）であって、このｇＲＮＡは、対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）を含む組成物を細胞中に導入するステップを含み、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。一部の実施形態では、このアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、５１のヒトアデノウイルス血清型のいずれか（例えば、血清型２、５または３５）を含み得る。一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。一部の実施形態では、このプロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結される。一部の実施形態では、この標的配列は、ＣＥＰ２９０遺伝子（例えば、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子）中の突然変異である。一部の実施形態では、ＣＥＰ２９０についての標的配列は、配列番号１〜１０９、１６４〜３５６、７３５〜７３８に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この標的配列は、作動可能に連結した配列番号１、２、３および４を含む。一部の実施形態では、このベクターは、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物はロドプシンである。一部の実施形態では、この標的配列は、ロドプシン遺伝子中の突然変異である。一部の実施形態では、この標的配列は、ロドプシン遺伝子のＲ１３５における突然変異（例えば、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３５Ｗ、Ｒ１３５Ｌ）である。一部の実施形態では、ロドプシンＲ１３５についての標的配列は、配列番号１１１〜１２６に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ロドプシンＲ１３５についてのｇＲＮＡ配列は、配列番号１２７〜１４２に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物は、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、ＭＥＦ２Ａ、ＳＯＸ１１もしくはＰＵＭＡ、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、緑内障の突然変異標的には、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＴＭＣＯ１、ＰＭＭ２、ＧＭＤＳ、ＧＡＳ７、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＴＸＮＲＤ２、ＡＴＸＮ２、ＣＡＶ１／ＣＡＶ２、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＳＩＸ６、ＡＢＣＡ１、ＡＦＡＰ１およびＣＤＫＮ２Ｂ−ＡＳが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、緑内障についての標的配列は、配列番号１４３〜１６３に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
【０２１６】
一部の実施形態では、本開示の主題は、細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、ａ）ＣＲＩＳＰＲシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲシステムを細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更するステップを含む方法もまた提供する。
【０２１７】
一部の実施形態では、本開示の主題は、真核生物細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、ａ）ＣＲＩＳＰＲシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、真核生物細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲシステムを細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、それによって、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断し、それによって、１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更されるステップを含む方法もまた提供する。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらに別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
【０２１８】
本開示の主題は、真核生物細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、双方向Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲシステムを細胞中に導入するステップであって、この双方向Ｈ１プロモーターは、ａ）ＣＲＩＳＰＲシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメントであって、このｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメント；およびｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントであって、それによって、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断し、それによって、１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更される、制御エレメントを含むステップを含む方法もまた提供する。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらに別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
【０２１９】
一部の態様では、本開示の主題は、１つまたは複数のポリヌクレオチド、例えばまたは本明細書に記載されている１つもしくは複数のベクター、１つもしくは複数のその転写物、および／またはそれから転写された１つもしくは複数のタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、本開示の主題は、かかる方法によって産生された細胞、およびかかる細胞を含むまたはかかる細胞から産生される生物（例えば、動物、植物または真菌）をさらに提供する。一部の実施形態では、ガイド配列と組み合わせた（任意選択でガイド配列と複合体化した）ＣＲＩＳＰＲ酵素が、細胞に送達される。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法が、哺乳動物細胞または標的組織中に核酸を導入するために使用され得る。かかる方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素をコードする核酸を、培養物中または宿主生物中の細胞に投与するために使用され得る。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されているベクターの転写物）、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソーム性のゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子治療手順のレビューについては、Anderson（１９９２年）Science  ２５６巻：８０８〜８１３頁；NabelおよびFelgner（１９９３年）TIBTECH  １１巻：２１１〜２１７頁；MitaniおよびCaskey（１９９３年）TIBTECH  １１巻：１６２〜１６６頁；Dillon（１９９３年）TIBTECH  １１巻：１６７〜１７５頁；Miller（１９９２年）Nature  ３５７巻：４５５〜４６０頁；Van  Brunt（１９９８年）Biotechnology  ６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁；Vigne（１９９５年）Restorative  Neurology  and  Neuroscience  ８巻：３５〜３６頁；KremerおよびPerricaudet（１９９５年）British  Medical  Bulletin  ５１巻（１号）：３１〜４４頁；Haddadaら（１９９５年）Current  Topics  in  Microbiology  and  Immunology.  DoerflerおよびBohm（編）；ならびにYuら（１９９４年）Gene  Therapy  １巻：１３〜２６頁を参照のこと。
【０２２０】
核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により増強されるＤＮＡ取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適切なカチオン性および中性の脂質には、Felgner、ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４の脂質が含まれる。送達は、細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ投与）または標的組織（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）への送達であり得る。
【０２２１】
標的化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体、例えば、イムノリピド（immunolipid）複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal（１９９５年）Science  ２７０巻：４０４〜４１０頁；Blaeseら（１９９５年）Cancer  Gene  Ther.  ２巻：２９１〜２９７頁：Behrら（１９９４年）Bioconjugate  Chem.  ５巻：３８２〜３８９頁；Remyら（１９９４年）Bioconjugate  Chem.  ５巻：６４７〜６５４頁；Gaoら（１９９５年）Gene  Therapy  ２巻：７１０〜７２２頁；Ahmadら（１９９２年）Cancer  Res.  ５２巻：４８１７〜４８２０頁；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号および同第４，９４６，７８７号）。
【０２２２】
核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、身体中の特異的細胞にウイルスを標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための、高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与され得（ｉｎ  ｖｉｖｏ）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を処置するために使用され得、修飾された細胞は、患者に任意選択で投与され得る（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。従来のウイルスベースのシステムは、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。宿主ゲノムにおける組み込みは、挿入された導入遺伝子の長期発現を生じる場合が多い、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法を用いて可能である。さらに、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
【０２２３】
レトロウイルスのトロピズムは、外来エンベロープタンパク質を取り込み、標的細胞の潜在的標的集団を増大させることによって変更され得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させ、典型的には高いウイルス力価を生じることができるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子移入システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列をパッケージングする能力を有するシス作用性の長末端リピートで構成される。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これらのベクターは次いで、恒久的な導入遺伝子発現を提供するために、標的細胞中に治療遺伝子を組み込むために使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくベクターが含まれる（例えば、Buchscherら（１９９２年）J.  Virol.  ６６巻：２７３１〜２７３９頁；Johannら（１９９２年）J.  Virol.  ６６巻：１６３５〜１６４０頁；Sommnerfeltら（１９９０年）J.  Virol.  １７６巻：５８〜５９頁；Wilsonら（１９８９年）J.  Virol.  ６３巻：２３７４〜２３７８頁；Millerら（１９９１年）J.  Virol.  ６５巻：２２２０〜２２２４頁；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００）。一過的な発現が好まれる適用では、アデノウイルスベースのシステムが使用され得る。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高い力価およびレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に産生できる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療手順のために、細胞を標的核酸で形質導入するためにも使用され得る（例えば、Westら（１９８７年）Virology  １６０巻：３８〜４７頁；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Kotin（１９９４年）Human  Gene  Therapy  ５巻：７９３〜８０１頁；Muzyczka（１９９４年）J.  Clin.  Invest.  ９４巻：１３５１頁）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschinら（１９８５年）Mol.  Cell.  Biol.  ５巻：３２５１〜３２６０頁；Tratschinら（１９８４年）Mol.  Cell.  Biol.  ４巻：２０７２〜２０８１頁；HermonatおよびMuzyczka（１９８４年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  ８１巻：６４６６〜６４７０頁；ならびにSamulskiら（１９８９年）J.  Virol.  ６３巻：０３８２２〜３８２８頁を含むいくつかの刊行物中に記載されている。
【０２２４】
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞系を産生することによって生成される。これらのベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主中への引き続く組み込みに必要な最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるポリヌクレオチド（複数可）のための発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノム中への組み込みに必要な、ＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを保有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系においてパッケージングされる。この細胞系には、ヘルパーとしてのアデノウイルスもまた感染し得る。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、顕著な量ではパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理によって低減され得る。細胞への核酸の送達のためのさらなる方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００３００８７８１７を参照のこと。
【０２２５】
一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載されている１つまたは複数のベクターで一過的または非一過的にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、対象中に天然に存在しながらトランスフェクトされる。一部の実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、対象から採取される。一部の実施形態では、この細胞は、対象から採取された細胞、例えば細胞系に由来する。組織培養のための広範な種々の細胞株が、当該分野で公知である。細胞株の例には、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｅｌ、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨｅＬａ  Ｂ、ＨｅＬａ  Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３  Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ  ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ  Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ  Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−ＭｅＩ  １−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ  ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ  ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞系、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、およびそれらのトランスジェニック変種が含まれるがこれらに限定されない。細胞株は、当業者に公知の種々の源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ、Ｖａ．）を参照のこと）。一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つまたは複数のベクターでトランスフェクトされた細胞は、１つまたは複数のベクター由来配列を含む新たな細胞系を樹立するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素で一過的にトランスフェクトされ（例えば、１つもしくは複数のベクターの一過的なトランスフェクション、またはＲＮＡによるトランスフェクションによって）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を介して修飾された細胞は、修飾を含有するが任意の他の外因性配列を欠く細胞を含む新たな細胞系を樹立するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つもしくは複数のベクターで一過的もしくは非一過的にトランスフェクトされた細胞、またはかかる細胞に由来する細胞株は、１つまたは複数の試験化合物を調査する際に使用される。
【０２２６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つまたは複数のベクターは、非ヒトトランスジェニック動物を産生するために使用される。一部の実施形態では、このトランスジェニック動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラットまたはウサギである。ある特定の実施形態では、生物または対象は植物である。トランスジェニック動物を産生するための方法は、当該分野で公知であり、一般に、本明細書に記載されているような細胞トランスフェクションの方法で始まる。
【０２２７】
一態様では、本開示の主題は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏであり得る、真核生物細胞において標的ポリヌクレオチドを修飾する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ヒトまたは非ヒト動物から細胞または細胞の集団を試料採取するステップ、および細胞（単数または複数）を修飾するステップを含む。培養するステップは、任意の段階でｅｘ  ｖｉｖｏで行われ得る。細胞（単数または複数）はさらに、非ヒト動物中に再導入され得る。
【０２２８】
一態様では、本開示の主題は、真核生物細胞において標的ポリヌクレオチドを修飾する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、標的ポリヌクレオチドの切断をもたらすために標的ポリヌクレオチドにＣＲＩＳＰＲ複合体を結合させ、それによって、標的ポリヌクレオチドを修飾するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体化したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
【０２２９】
一態様では、本開示の主題は、真核生物細胞におけるポリヌクレオチドの発現を修飾する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、結合がポリヌクレオチドの発現の増加または減少を生じるように、ポリヌクレオチドにＣＲＩＳＰＲ複合体を結合させるステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体化したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
【０２３０】
一態様では、本開示の主題は、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントを使用するための方法を提供する。本開示の主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを修飾するための有効な手段を提供する。本開示の主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、多様な細胞型において標的ポリヌクレオチドを修飾（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）することを含む広範な種々の有用性を有する。このように、本開示の主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子治療、薬物スクリーニング、疾患診断および予後判定において、広範な適用を有する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体化したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
【０２３１】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核生物細胞にとって内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、この標的ポリヌクレオチドは、真核生物細胞の核中に存在するポリヌクレオチドであり得る。この標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。理論に束縛されることは望まないが、標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）；すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列と会合すべきであると考えられる。ＰＡＭについての正確な配列および長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素に依存して異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２〜５塩基対の配列である。ＰＡＭ配列の例は、以下の実施例のセクションで与えられ、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素との使用のためのさらなるＰＡＭ配列を同定することができる。
【０２３２】
標的ポリヌクレオチドの例には、生化学的シグナル伝達経路と関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが含まれる。標的ポリヌクレオチドの例には、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが含まれる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドとは、非疾患対照の組織または細胞と比較して、疾患罹患組織に由来する細胞において異常なレベルまたは異常な形態で転写または翻訳産物を生じている、任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルで発現される遺伝子であり得る；これは、異常に低いレベルで発現される遺伝子であり得、ここで、変更された発現は、疾患の出現および／または進行と相関する。疾患関連遺伝子は、疾患の原因を直接担うまたは疾患の原因を担う遺伝子（複数可）と連鎖不平衡である、突然変異（複数可）または遺伝的変異を保有する遺伝子もまた指す。転写されたまたは翻訳された産物は、既知または未知であり得、正常または異常なレベルであり得る。
【０２３３】
本開示の主題の実施形態は、遺伝子をノックアウトすること、遺伝子を増幅すること、および網膜障害と関連する特定の突然変異を修復することに関する方法および組成物にも関する（Robert  D.  Wells、Tetsuo  Ashizawa、Genetic  Instabilities  and  Neurological  Diseases、第２版、Academic  Press、２０１１年１０月１３日-Medical）。タンデムリピート配列の特定の態様は、２０よりも多いヒト疾患を担うことが見出されている（McIvorら（２０１０年）RNA  Biol.  ７巻（５号）：５５１〜８頁）。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ゲノム不安定性のこれらの欠損を修正するために利用され得る。
【０２３４】
本開示の主題のさらに別の態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Traboulsi編（２０１２年）Genetic  Diseases  of  the  Eye、第２版、Oxford  University  Pressにさらに記載されているいくつかの遺伝的突然変異から生じる網膜欠損を修正するために使用され得る。
ＩＩ．網膜変性症を処置するための方法
【０２３５】
本開示の主題は、網膜変性症、例えば、ＬＣＡ、ＡＤＲＰまたは緑内障を処置するための方法もまた提供する。一部の実施形態では、本開示の主題は、それを必要とする対象（例えば、ヒト）において網膜変性症を処置するための方法を提供する。この方法は、（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、双方向Ｈ１プロモーター）であって、このｇＲＮＡは、対象の細胞（例えば、網膜光受容体または神経節細胞）においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）を提供するステップであって、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つもしくは複数の遺伝子産物の発現を変更する、またはこの１つもしくは複数の遺伝子産物を不活性化する、ステップ；ならびに（ｂ）治療有効量のこのシステムを、対象の網膜領域に投与するステップを含む。一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子（例えば、ＡＡＶ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９など）中にパッケージングされる。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。一部の実施形態では、この網膜変性症は、ＬＣＡ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択される。一部の実施形態では、この網膜変性症はＬＣＡ１０である。ＬＣＡを処置する一部の実施形態では、この標的配列は、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子から選択される。ＬＣＡを処置する一部の実施形態では、この標的配列は、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子中に位置し、配列番号１〜１０９、１６４〜３５６、７３５〜７３８に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せ（例えば、作動可能に連結した配列番号１、２、３および４）からなる群から選択される。ＬＣＡを処置する一部の実施形態では、このベクターは、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、この網膜変性症は、ＡＤＲＰである。ＡＤＲＰを処置する一部の実施形態では、この標的配列は、ロドプシン遺伝子中の突然変異である。ＡＤＲＰを処置す��一部の実施形態では、この標的配列は、ロドプシン遺伝子のＲ１３５における突然変異である。一部の実施形態では、Ｒ１３５における突然変異は、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３５Ｗ、Ｒ１３５Ｌからなる群から選択される。ＡＤＲＰを処置する一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１１１〜１２６に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。ＡＤＲＰを処置する一部の実施形態では、このｇＲＮＡ配列は、配列番号１２７〜１４２に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、この網膜変性症は緑内障である。緑内障を処置する一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物は、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４およびＭＫＫ７、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、ＭＥＦ２Ａ、ＳＯＸ１１もしくはＰＵＭＡ、またはそれらの組合せである。緑内障を処置する一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物は、以下の実施例４に記載されているＲＮＡベースのスクリーニングを使用して同定される。一部の実施形態では、緑内障の突然変異標的には、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＴＭＣＯ１、ＰＭＭ２、ＧＭＤＳ、ＧＡＳ７、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＴＸＮＲＤ２、ＡＴＸＮ２、ＣＡＶ１／ＣＡＶ２、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＳＩＸ６、ＡＢＣＡ１、ＡＦＡＰ１およびＣＤＫＮ２Ｂ−ＡＳが含まれるがこれらに限定されない。緑内障を処置する一部の実施形態では、この標的配列は、配列番号１４３〜１６３に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、対象に投与するステップは、移植、注射（例えば、網膜下）またはウイルスによって行われる。
【０２３６】
このＣＲＩＳＰＲシステムは、ヒト細胞などの哺乳動物細胞を含む真核生物細胞における標的化ゲノム編集を促進するために使用され得る。ゲノム編集を促進するために、修飾される細胞に、ガイドＲＮＡ分子自体、またはガイドＲＮＡ分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターと一緒に、Ｃａｓ９をコードする発現ベクター、またはＣａｓ９タンパク質、ＤＮＡもしくはＲＮＡ自体を同時トランスフェクトする。例えば、ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９の導入は、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡとしてのＣａｓ９、またはＣａｓ９をコードする核酸を含む発現ベクターをトランスフェクトすることによって実施され得る。ある特定の実施形態では、ガイドＤＮＡはそれ自体、ＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）、ＤＮＡ分子として、またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む発現ベクターとして、直接投与され得る。
【０２３７】
「網膜変性症」とは、ニューロンまたは他の神経細胞、例えば、網膜神経節または光受容体細胞の変性または機能不全と関連する疾患、障害または状態（視神経症を含む）を意味する。網膜変性症は、ニューロンの減少した機能もしくは機能不全、またはニューロンもしくは他の神経細胞の喪失が生じ得る、任意の疾患、障害または状態であり得る。
【０２３８】
かかる疾患、障害または状態には、緑内障、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄性筋萎縮症、遺伝性筋萎縮症、無脊椎動物椎間板症候群（invertebrate  disk  syndrome）、頚椎症、神経叢障害、胸郭出口破壊症候群（thoracic  outlet  destruction  syndrome）、末梢神経障害、ポルフィリン症（prophyria）、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病（Parkinson's-plus  disease）、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉型認知症、脱髄性疾患、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー・マリー・トゥース病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ピック病、てんかんおよびＡＩＤＳ認知症複合（AIDS  demential  complex）が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３９】
他の疾患、障害または状態には、アレキサンダー病、アルパース病、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病（シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病（Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten  disease）としても公知）、カナバン病、コケイン症候群、糖尿病性ニューロパチー、前頭側頭葉変性症、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病（脊髄小脳失調症３型）、ウェット型またはドライ型黄斑変性症、ニーマン・ピック病、ペリツェウス・メルツバッハ病、光受容体変性疾患、例えば、網膜色素変性症および関連疾患、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する脊髄の亜急性連合変性症、シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病（バッテン病としても公知）、脊髄小脳失調症（変動する特徴を有する複数の型）、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄ろう、格子状ジストロフィー、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、ウェット型またはドライ型ＡＭＤと関連する光受容体変性、他の網膜変性症、例えば、網膜色素変性症（ＲＰ）、視神経ドルーゼン、視神経症、および視神経炎、例えば、多発性硬化症から生じる視神経炎が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４０】
本開示の主題に従って予防または処置され得る異なる型の緑内障の非限定的な例には、原発性緑内障（原発性開放隅角緑内障、慢性開放隅角緑内障、慢性単純緑内障および単性緑内障としても公知）、低眼圧緑内障、原発性閉塞隅角（angle-closure）緑内障（原発性閉塞隅角（closed-angle）緑内障、狭隅角緑内障、瞳孔ブロック緑内障および急性うっ血性緑内障としても公知）、急性閉塞隅角緑内障、慢性閉塞隅角緑内障、間欠性閉塞隅角緑内障、慢性開放閉塞隅角（open-angle  closure）緑内障、色素性緑内障、落屑緑内障（偽落屑緑内障または嚢性緑内障としても公知）、発達緑内障（例えば、原発性先天性緑内障および乳児緑内障）、続発性緑内障（例えば、炎症性緑内障（例えば、ブドウ膜炎およびフックス虹彩異色性毛様体炎（Fuchs  heterochromic  iridocyclitis）））、水晶体起因性（phacogenic）緑内障（例えば、成熟白内障を伴う閉塞隅角緑内障、水晶体嚢の破裂に続発する水晶体過敏性（phacoanaphylactic）緑内障、水晶体毒性網目構造遮断（phacotoxic  meshwork  blockage）に起因する水晶体融解性緑内障、および水晶体の亜脱臼）、眼内出血に続発する緑内障（例えば、前房出血、および溶血緑内障としても公知の溶血性緑内障（hemolytic  glaucoma））、外傷性緑内障（例えば、隅角後退緑内障、外傷性前房隅角後退（traumatic  recession  on  anterior  chamber  angle）、術後緑内障、無水晶体瞳孔ブロック（aphakic  pupillary  block）および毛様体ブロック緑内障）、血管新生緑内障、薬物誘導性緑内障（例えば、コルチコステロイド誘導性緑内障およびアルファ−キモトリプシン緑内障）、中毒性緑内障（toxic  glaucoma）、ならびに眼内腫瘍、網膜剥離、眼の重症化学熱傷および虹彩萎縮症と関連する緑内障が含まれる。ある特定の実施形態では、神経変性疾患、障害または状態は、過剰な血管新生と関連しない疾患、障害または状態、例えば、血管新生緑内障ではない緑内障である。一部の実施形態では、緑内障の突然変異標的には、ＯＰＴＮ、ＴＢＫ１、ＴＭＣＯ１、ＰＭＭ２、ＧＭＤＳ、ＧＡＳ７、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＴＸＮＲＤ２、ＡＴＸＮ２、ＣＡＶ１／ＣＡＶ２、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＳＩＸ６、ＡＢＣＡ１、ＡＦＡＰ１およびＣＤＫＮ２Ｂ−ＡＳが含まれるがこれらに限定されない。
【０２４１】
本明細書で使用される場合、用語「障害」とは一般に、同定された標的もしくは経路のうち１つに対する化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量によって処置され得る任意の疾患、障害または状態を含む、同定された標的または経路のうち１つに対する化合物による処置から利益を得る任意の状態を指す。
【０２４２】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」は、かかる用語が適用される疾患、障害もしくは状態（例えば、網膜神経節または光受容体細胞の機能不全および／または死を引き起こす疾患または障害）、またはかかる疾患、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状もしくは所見の進行を逆転、緩和、阻害すること、それらを予防すること、もしくはその可能性を低減させることを含み得る。一部の実施形態では、処置は、網膜神経節または光受容体細胞の機能不全および／または死を低減させる。例えば、処置は、処置を受ける前の対象または処置を受けない対象における網膜神経節または光受容体細胞の機能不全および／または死と比較して、網膜神経節または光受容体細胞の機能不全および／または死を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６６％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きく低減させ得る。一部の実施形態では、処置は、対象における網膜光受容体または神経節細胞の機能不全および／または死を完全に阻害する。本明細書で使用される場合、「網膜神経節または光受容体細胞」は、光伝達が可能な、網膜中で見出される専門化した型のニューロンである。一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子産物はロドプシンである。
【０２４３】
一部の実施形態では、このシステムは、対象に投与するステップの前に、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。一部の実施形態では、対象に投与するステップは、網膜下注射によって行われる。処置、投与または治療は、継続的または間欠性であり得る。継続的な処置、投与または治療とは、１または複数日の処置の中断を伴わない、少なくとも毎日の処置を指す。間欠性の処置もしくは投与、または間欠性様式での処置もしくは投与とは、継続的ではなく事実上周期性の処置を指す。本明細書に開示されている方法に従う処置は、疾患、障害もしくは状態の完全な解放もしくは治癒、または疾患、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の部分的寛解を生じ得、一時的または恒久的であり得る。用語「処置」は、予防、治療および治癒も包含する意図である。
【０２４４】
用語「有効量」または「治療有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、対象および処置されている疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などのうち１つまたは複数に依存して変動し得、これらは、当業者によって容易に決定され得る。この用語は、本明細書に記載されているイメージング方法のいずれか１つによって検出のためのイメージを提供する用量にも適用される。具体的な用量は、選択される特定の薬剤、従うべき投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、イメージングされる組織、それが運搬される物理的送達システムのうち１つまたは複数に依存して変動し得る。
【０２４５】
用語「阻害する（inhibit）」または「阻害する（inhibits）」とは、未処置の対照対象、細胞、生物経路もしくは生物活性と比較して、または対象が処置される前の対象における標的と比較して、疾患、障害もしくは状態の発達もしくは進行、生物経路の活性、または生物活性を、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％またはさらには１００％減少、抑制、減弱、減退、停止または安定化することを意味する。用語「減少」とは、網膜疾患、障害または状態の症状を阻害、抑制、減弱、減退、停止または安定化することを意味する。除外されるわけではないが、疾患、障害または状態を処置することは、疾患、障害、状態またはそれらと関連する症状が完全に排除されることを必要としないことが理解されるであろう。
【０２４６】
語句「薬学的に許容される担体」とは、本明細書で使用される場合、１つの臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部へと対象化合物を運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒カプセル化材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者にとって傷害性でないという意味で「許容される」べきである。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例には、以下が含まれる：（１）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）トラガント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックス；（９）油、例えば、ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；ならびに（２２）医薬製剤において使用される他の非毒性の適合性物質。
【０２４７】
「薬学的に許容される塩」とは、化合物の比較的非毒性の無機および有機の酸付加塩を指す。
【０２４８】
用語「予防する（prevent）」、「予防する（preventing）」、「予防（prevention）」、「予防的（prophylactic）処置」などは、疾患、障害もしくは状態を有してはいないが、疾患、障害もしくは状態を発達させるリスクがあるまたはそれに対して感受性の対象において、疾患、障害もしくは状態を発達させる確率を低減させることを指す。
【０２４９】
用語「対象」および「患者」は、本明細書で互換的に使用される。その多くの実施形態において本明細書に開示されている方法によって処置される対象は、望ましくはヒト対象であるが、本明細書に記載されている方法は、用語「対象」に含まれることが意図される全ての脊椎動物種に関して有効であることを理解すべきである。したがって、「対象」は、医学的目的、例えば、既存の状態もしくは疾患の処置、または状態もしくは疾患の発症を予防するための予防的処置のためにはヒト対象、あるいは医学的、獣医学的目的のため、または開発目的のためには動物対象を含み得る。適切な動物対象には、霊長類、例えば、ヒト、サル、類人猿など；ウシ（bovine）、例えば、ウシ（cattle）、雄ウシ（oxen）など；ヒツジ（ovine）、例えば、ヒツジ（sheep）など；ヤギ（caprine）、例えば、ヤギ（goat）など；ブタ（porcine）、例えば、ブタ（pig）、雄ブタ（hog）など；ウマ（equine）、例えば、ウマ（horse）、ロバ、シマウマなど；ヤマネコおよびイエネコを含むネコ（feline）；イヌ（dog）を含むイヌ（canine）；ウサギ、ノウサギなどを含むウサギ類；ならびにマウス、ラットなどを含むげっ歯類が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物が含まれる。動物は、トランスジェニック動物であり得る。一部の実施形態では、この対象は、胎児、新生児、乳児、若年および成人対象が含まれるがこれらに限定されないヒトである。さらに、「対象」は、状態もしくは疾患に罹患しているまたは状態もしくは疾患に罹患していることが疑われる患者を含み得る。
【０２５０】
用語「治療効果」とは、薬理学的に活性な物質によって引き起こされる、動物、特に哺乳動物、より特にはヒトにおける局所的または全身的効果を指す。
【０２５１】
用語「治療有効量」および「有効量」とは、本明細書で使用される場合、任意の医学的処置に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で、動物中の細胞の少なくとも下位集団においていくらかの所望の治療効果を生じるのに有効な、本発明の組成物の量を意味する。
ＩＩＩ．一般的定義
【０２５２】
本明細書で具体的な用語が使用されているが、これらは、一般的で記述的な意味でのみ使用され、限定目的で使用されるのではない。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示の主題が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０２５３】
長年の特許法の慣習に従い、用語「１つの（a）」、「１つの（an）」および「この（the）」とは、特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、「１つまたは複数」を指す。したがって、例えば、「１つの（a）対象」に対する言及は、文脈が明らかに逆（例えば、複数の対象）を指さない限り、複数の対象を含む、などである。
【０２５４】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」および「含む（comprising）」は、文脈上他のものを要求しない限り、非排他的な意味で使用される。同様に、用語「含む（include）」およびその文法的変化形は、リスト中の項目の列挙が、列挙された項目を置換し得るまたは列挙された項目に追加され得る他の同様の項目の排除にならないように、非限定的であることを意図する。
【０２５５】
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のために、特に示さない限り、量、サイズ、寸法、割合、形状、処方、パラメーター、パーセンテージ、パラメーター、数量、特徴を表す全ての数字、ならびに本明細書および特許請求の範囲において使用される他の数値は、用語「約」がその値、量または範囲と共に明示的に出現していない場合であっても、全ての場合において用語「約」によって修飾されると理解すべきである。したがって、逆が示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数的パラメーターは、正確ではなく正確である必要もないが、許容範囲、変換係数、四捨五入、測定誤差など、および本開示の主題によって得ることが求められる所望の特性に依存する当業者に公知の他の因子を反映して、おおよそ、および／または所望よりも大きいもしくは小さくてもよい。例えば、用語「約」は、値に言及する場合、特定された量から、一部の実施形態では±１００％、一部の実施形態では±５０％、一部の実施形態では±２０％、一部の実施形態では±１０％、一部の実施形態では±５％、一部の実施形態では±１％、一部の実施形態では±０．５％、および一部の実施形態では±０．１％の変動を包含することを意味し得、したがって、変動は、開示されている方法を実施するためまたは開示されている組成物を使用するために適切である。
【０２５６】
さらに、用語「約」は、１つまたは複数の数字または数的範囲と合わせて使用される場合、ある範囲内の全ての数字を含む全てのかかる数字を指し、示された数値の上および下の境界を拡張することによってその範囲を修飾すると理解すべきである。終点による数的範囲の列挙は、その範囲内に含まれる全ての数、例えば、それらの分数を含む全整数（例えば、１〜５の列挙は、１、２、３、４および５、ならびにそれらの分数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１などを含む）、およびその範囲内の任意の範囲を含む。
【実施例】
【０２５７】
以下の実施例は、当業者に本開示の主題の代表的な実施形態を実施するための手引きを提供するために含めたものである。本開示および当業者の一般的なレベルに照らして、当業者には、以下の実施例が単に例示的なものであること、ならびに、本開示の主題の範囲から逸脱することなく多数の変化、修飾、および変更を使用することができることが理解されよう。総合的な説明およびそれに従う特定の実施例は、単に例証するためのものであり、本開示の化合物を他の方法によって作製することをいかなる様式でも限定すると解釈されるものではない。
方法
【０２５８】
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３Ｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２で維持した。
【０２５９】
ロドプシンを標的にするｇＲＮＡ（Ranganathan,  VおよびZack,  DJ.  grID:  A  CRISPR  guide  RNA  Database  and  Resource  for  Gene-Editing.  Submitted（２０１５年）を参照）を、アニーリングし、二段階増幅Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｆｌａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してＰＣＲによって増幅し、その後、Ｚｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒカラムを使用して精製したオリゴをオーバーラップさせることによって生成した。次いで、精製されたＰＣＲ産物をＨ２Ｏに再懸濁させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。ｇＲＮＡ発現構築物を、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をわずかな修飾を伴って使用して生成した（Gibsonら、Nature  Methods、６巻：３４３〜３４５頁（２００９年））。総反応体積を２０μｌから２μｌに低下させた。クローンをＳａｎｇｅｒ配列決定によって検証した。
【０２６０】
ＨＥＫ２９３細胞に、Ｃａｓ９（無修飾、または細胞周期調節バージョン）およびロドプシンを標的にするｇＲＮＡ構築物を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ゲノムＤＮＡを回収し、付録に列挙されているプライマーに従って標的カット部位の周囲の配列を増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を精製し、定量化した後、Ｔ７  Ｅｎｄｏ  Ｉアッセイを実施した。簡単に述べると、ＰＣＲ産物２００ｎｇを変性させ、次いで、ゆっくりと再アニーリングさせてヘテロ二本鎖を形成させ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩをＰＣＲ産物に添加し、３７℃で２５分間インキュベートしてヘテロ二本鎖を切断し、反応をローディング色素中でクエンチし、最後に、反応物を６％ＴＢＥ  ＰＡＧＥゲルに流して産物を分解した。ゲルをＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄで染色し、可視化し、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。ＮＨＥＪ頻度を、二項方程式を使用して算出した：
【数１】
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（式中、「ａ」および「ｂ」の値は、バックグラウンド除去後の切断された断片の積分面積と等しく、「ｃ」は、バックグラウンド除去後の切断されていないＰＣＲ産物の積分面積と等しい）。
（実施例１）
【０２６１】
ＣＲＩＳＰＲ系は、まだ初期のうちに、ゲノム編集技術を改革し、生物学的研究を変換し、遺伝子薬の新時代の先触れとなった。ヒトゲノム内の配列を対象として、ＣＲＩＳＰＲに基づく編集系は、任意の遺伝子または調節エレメントが破壊されるように、またはゲノムＤＮＡ配列が高度に特異的に欠失するおよび置き換えられるようにカスタマイズすることができる。また、世界中の多数の試験により、疾患突然変異をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて効率的に標的にできることが実証されているにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のためのＣＲＩＳＰＲに基づく治療薬の開発は、送達の制約によって著しく妨害されている。
【０２６２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、遺伝子療法において最も頻繁に使用されているウイルスベクターであり、いくつかの魅力的な特徴を有する：このウイルスは非病原性であり、分裂細胞および非分裂細胞のどちらにも感染し、発現を長期間持続させることができ、ならびに、臨床試験における安全性、有効性、および、全般的に毒性がないことの注目すべき履歴がある。さらに、バリアントＡＡＶ血清型の組合せは、特定の細胞型を標的にすることに関して有効である。ＡＡＶベクターは、治療用ＣＲＩＳＰＲ構成成分を送達する安全な手段をもたらすものであるが、そのサイズが、ＡＡＶベクターの有用性を限定する１つの主要な技術的障害になっている。野生型ＡＡＶゲノムは、長さが約４．７ｋｂであり、組換えウイルスには、最大５．０ｋｂまでをパッケージングすることができる。このパッケージング容量により、単一のウイルスベクターに対して使用することができるＤＮＡの上限が規定される。
【０２６３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系はヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）と、ヌクレアーゼをゲノム内の特定の領域に方向付ける働きをするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とで構成される。最も一般的に使用されるＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するもの（ＳｐＣａｓ９）であり、これは、４１０４ｂｐのオープンリーディングフレームによりコードされる。ＳｐＣａｓ９のサイズが大きいことに起因して、発現に必要なプロモーターおよびターミネーター配列を含め、両方のＣＲＩＳＰＲ構成成分の送達はＡＡＶパッケージング容量によって限定されると仮定されている。標準のプロモーターエレメントが所定の位置にあると、ＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡカセットはＡＡＶのパッケージング容量を著しい程度で超える。
【０２６４】
パッケージング容量問題の解決法は、ＷＯ２０１５／１９５６２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示され、これにより、治療用ＣＲＩＳＰＲの潜在的な適用範囲が著しく拡大される。ＣＲＩＳＰＲ送達のためのこの新しい手法の根底には、ヒト細胞において高度に活性である小型の双方向プロモーターがある。Ｈ１プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌ  ＩＩおよびＰｏｌ  ＩＩＩによって認識される著しく独特の遺伝子エレメントである。ＡＡＶベクターに導入されると、Ｈ１プロモーターは、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの両方を効率的に発現し得る。最適化されたＨ１プロモーターの長さはたった約２３０ｂｐであるので、このカセットの使用により、ＳｐＣａｓ９および多数のハイブリッドｇＲＮＡを単一の組換えＡＡＶ中にパッケージングすることが可能になる。
【０２６５】
ＳｐＣａｓ９、短いポリＡ（ＳＰＡ）配列、２つの別々にカスタマイズ可能なｇＲＮＡ足場およびＨ１プロモーターエレメントを含む完全な「オールインワン」ＡＡＶベクターは、約４６４０ｋｂである。これは、ほぼ野生型ＡＡＶゲノムのサイズであり、それでも最大パッケージング容量である５．２ｋｂを十分に下回る。Ｃａｓ９遺伝子のいずれもこの基本構造に組み入れることができる。したがって、このプラットフォームにより、あらゆる既存の技術よりも、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてさらに多くのゲノム部位および突然変異を標的にする能力がもたらされる（図１）。
【０２６６】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）によって強調される臨床的送達のための別の実行可能な手法は、ＡＡＶベクター中にパッケージングすることができるより小さなＣａｓ９オルソログの使用である。代替のＣａｓ９タンパク質は、代替の標的特異性を有し、ＳｐＣａｓ９タンパク質よりも限定的である可能性が高いが、より小さなｓａＣａｓ９タンパク質をＨ１系と組み合わせて使用することにより、既存の手法と比較して著しい利点がもたらされる。
【０２６７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ｄｓＤＮＡ切断を誘導することによって機能するが、Ｃａｓ９の単一の点突然変異により、ｓｓＤＮＡ「ニッカーゼ」を生成することができる。ニッカーゼの使用では、ｄｓＤＮＡ切断を生じさせるために２倍のｇＲＮＡの使用が必要になるが、これは、より安全であるとして普遍的に認められている。重要なことに、ＡＡＶ−Ｈ１−ＣＲＩＳＰＲプラットフォームは、ＳａＣａｓ９および４種を超えるｇＲＮＡに適応させることができ、したがって、オフターゲット突然変異を伴わずにＤＮＡ切断を安全に生じさせることができる。現行の送達手法はこの能力を欠く。
【０２６８】
レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）は、人生の最初の数カ月の間の重症の網膜機能障害および重症の視力障害、または失明を特徴とする早期発症型小児期網膜変性症の群で構成される。奇病であるＬＣＡは、全ての公知の遺伝性網膜変性疾患の５％と同程度を構成する遺伝性失明の最も一般的な原因である。具体的には、ＦＤＡに認可された療法が存在しない疾患であるＬＣＡ１０は、ＣＥＰ２９０遺伝子のイントロン突然変異によって引き起こされる。このＡからＧへの突然変異の結果、新規の強力なスプライシングドナー部位の創出および隠れたエクソン（エクソンＸ）のＣＥＰ２９０  ｍＲＮＡへの包含およびその後の光受容体または神経節変性が生じる。この突然変異は、治療標的として特に魅力的である。
【０２６９】
原型のＡＡＶ−Ｈ１−ＣＲＩＳＰＲにより、ヒト細胞においてＣａｓ９およびｇＲＮＡの両方が頑強に発現し、それにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて遺伝子標的化を効率的に導くことができることが首尾よく実証された。網膜疾患のマウスモデルを使用することにより、Ｈ１−ＡＡＶ−ＣＲＩＳＰＲを使用して、網膜下送達によりｉｎ  ｖｉｖｏにおいて病原性突然変異を正確に標的にできることが実証された（図２）。
【０２７０】
Ｅｄｉｔａｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより、ＣＲＩＳＰＲを用いてＬＣＡ１０の根本原因を処置するためのＡＡＶに基づく戦略が臨床使用のために現在開発中である。ＡＡＶパッケージング容量問題を解決するための彼らの手法は、約３．２ｋｂの転写物によりコードされるＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のより小さなＣａｓ９オルソログ（ＳａＣａｓ９）を使用することである。小型のＳａＣａｓ９遺伝子は、単一のＡＡＶベクター中に２つのｇＲＮＡカセットと一緒にパッケージングすることが可能であるが、我々のＡＡＶ技術では、追加的なｇＲＮＡを使用することができるさらなる余地がもたらされる。
【０２７１】
ＣＲＩＳＰＲに基づく治療薬の安全性に関する懸念に関して、最も重要なのは、確実に、オフターゲット突然変異誘発である。これは、Ｃａｓ９によりＤＮＡが意図されたものではない場所で切断された場合に生じ得る。幸運にも、このリスクは、１本のＤＮＡ鎖のみを切断する、修飾された形態のＣａｓ９（Ｄ１０Ａニッカーゼとして公知）を使用することによってほぼ排除することができる。２種のｇＲＮＡを別々に連結して反対の鎖上の２つの近接する向かい合ったニックを生成することにより、Ｃａｓ９ニッカーゼは二本鎖切断を効率的に生じさせることができる。しかし、オフターゲット切断は２種のｇＲＮＡにより、ゲノム内の他の場所の極めて近傍かつ反対の鎖上に存在するオフターゲットが認識された場合にのみニッカーゼにより生じ、この出現率は統計学的に起こりそうにないものであり（Church  G.  Nature、２０１５年１２月３日；５２８巻（７５８０号）：Ｓ７頁）、したがって、観察されない；ニックが生じたＤＮＡは、効率的に修復されるが、正常な細胞タンパク質である。この理由で、ＣＥＰ２９０突然変異を補正するためにＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）を４種のｇＲＮＡ（標的にされた突然変異を欠失させるために各側に１対）と共に導入することは、規制当局も含め、普遍的かつ明確に最も安全な手法とみなされている（Shenら、Nature  Methods、１１巻、３９９〜４０２頁（２０１４年））。Ｈ１エレメントにより、この可能性を使用する余地が一意的に付与される。
【０２７２】
しかし、現行の系（すなわち、非Ｈ１系を用いるＥｄｉｔａｓ：ｓａＣａｓ９）ではサイズ限定があるので、ＣＥＰ２９０突然変異の補正にはおよそ１ｋｂのイントロンＤＮＡの脱落が必要であり、より安全なニッカーゼ手法によって行うことができない。４種のｇＲＮＡにより、より安全な治療薬を診療所に送達することが可能であることが同定された：
ｈｓ０７５７１７９９［Ｓａ］：GATCTTATTCTACTCCTGTGAAAGGAT（配列番号１）
ｈｓ０７５７１７９６［Ｓａ］：AACGTTGTTCTGAGTAGCTTTCAGGAT（配列番号２）
ｈｓ０７５７１７８３［Ｓａ］：GATCATTCTTGTGGCAGTAAGGAGGAT（配列番号３）
ｈｓ０７５７１７７８［Ｓａ］：TCAAAAGCTACCGGTTACCTGAAGGGT（配列番号４）
【０２７３】
しかし、Ｅｄｉｔａｓは、Ｕ６プロモーターに起因してそれらの標的部位を５’Ｇ標的化部位に制約している（Friedlandら、Genome  Biology、１６巻、２５７頁（２０１５年））。
【０２７４】
ＡからＧへの突然変異と重複するｓｐＣａｓ９標的化部位が存在する。以前に開示されたＨ１系およびｓｐＣａｓ９を使用すると、大きな欠失を生じさせる必要なくＣＥＰ２９０突然変異を直接標的にできる。この方法はまた、現行のＥｄｉｔａｓ系よりも安全であると予測される。
ＷＴ
ｈｓ０２８８９３１０８；GAGATATTCACAATTACAACTGG（配列番号５）
ＬＣＡ１０
ｈｓ０２８８９３１０８＊；GAGATACTCACAATTACAACTGG（配列番号６）
【０２７５】
５’Ｇ開始要件からの部位の減少により、ｇＲＮＡを発現させるためにＨ１を使用することのＵ６を超える有用性が例示される。さらに、コンピュータにより予測したところ、標的化部位の総数から、ｓｐＣａｓ９がｓａＣａｓ９に数で勝ることが示される（Ranganathanら、Nat  Commun、２０１４年８月８日；５巻：４５１６頁）。
【表２】
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【表３】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
2019520391.tif 000013
【表４−７】
2019520391.tif 000014
【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表５】
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【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
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【表８−７】
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【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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構築物配列
ｓａＣａｓ９＿４ｘ−ｇＲＮＡ（ｈｓ０７５７１７９９［Ｓａ］；ｈｓ０７５７１７９６［Ｓａ］；ｈｓ０７５７１７８３［Ｓａ］；ｈｓ０７５７１７７８［Ｓａ］）
CCATGGGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCCTGAAGATCATTCTTGTGGCAGTAAGGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTGTTAACGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCCTGAATCAAAAGCTACCGGTTACCTGGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTAGACACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTAGGCTGATCAGCGAGCTCTAGGAATTCTTAGGATCCCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCCTTTTTCGTGGCCGCCGGCCTTTTGCCCTTTTTGATGATCTGAGGGTGCTTCTTAGATTTCACTTCATACAGGTTGCCCAGAATGTCTGTGCTGTACTTCTTAATGCTCTGGGTCTTGGAGGCGATTGTCTTAATGATCCTGGGGGGCCTCTTGTCGTTCATGTTTTCCAGGTACTCGCGGTAGGTGATGTCGATCATGTTCACTTCGATCCGGTTCAGCAGGTCGTTGTTCACGCCGATCACTCTATACAGCTCGCCGTTGATCTTGATCAGATCGTTGTTGTAGAAGGAGGCGATAAACTCGGCCTGGTTGCTGATCTTCTTCAGCTTCTTAGCTTCCTCATAGCACTTGCTATTCACTTCGTAGTAGTTTTCTTTTTTGATCACATCCAGATTCTTCACGGTCACGAACTTGTACACGCCATTGTCCAGGTACACGTCGAATCTGTAGGGCTTCAGGGACAGCTTCACGACCTTGTTTCTGCTGTTGGGGTAGTCGTCGGTGATGTCCAGATGGGCGTTCAGTTTGTTGCCGTAATACTTAATCTTCTTGATCACGGGGCCGTTGTCCTTTTTGGAGTACTTGGTCAGGTAGTTCCCGGTTTCCTCGTAGTACTTGTACAGGGGATTCTTCTCGTCGCCGTACTGTTCCATAATCAGCTTCAGTTTCTGGTAGGTCTGGGGGTCGTGGTGGTACATCAGCAGCTTTTCGGGGCTCTTGTTGATCAGCTTTTTCAGCTTGTCATTGTCCTTGTCGTACAGGCCGTTCAGATTGTTCACGATCAGGGTGTTGCCCTTGTCGTCCTTCCGGGTGGAGTACAGGGTGTCGTTAATCAGCTCTCTATTAGGCTTCTTGTCCACCCGGTGGCTGTACTTGTAGTCCTTGAAGTCCTTAATGTGCTTGATCTGGTGGGGGGTGATGAAGATCTCTTTGTACTCCTGCTCGGTTTCGATCTCGGGCATGCTCTCGGCCTGCTTTTCCTCGAACATCTGGTTTTCCATCACTTTTTTGGCCTTGTCCAGTTTCTTCCACTCTTTGAAGATGAAATCGGCGTTGGCAATGATCAGGGCGTCCTCGGCGTGGTGCTTGTACCCCTTGTTCCGCTCTTTCTTAAACTTCCACTTCCGCCGCAGAAAGCTGGTGAAGCCGCCATTGATGGACTTCACTTTCACGTCCAGGTTGTTCACTCTGAAGTAGCTCCGCAGCAGGTTCATCAGGCCTCTGGTGGCGTATCTGGTATCCACCAGGTTCCGGTTGATGAAGTCTTTCTGCACGGAGAACCTGTTGATGTCCCGTTCTTCCAGCAGATACTCTTTCTTGGTCTTGCTGATTCTGCCCTTGCCCTTGGCCAGATTCAGGATGTGCTTCTTGAAGGTTTCGTAGCTGATCTTGCTGTCGCTGCTGCTCAGGTACTGGAATGGGGTCCGGTTGCCCTTCTTGCTGTTTTCTTCCTGCTTCACGAGCACCTTGTTGTTGAAGCTGTTGTCGAAGGACACGCTTCTGGGGATGATGTGGTCCACCTCATAGTTGAAGGGGTTGTTCAGCAGATCTTCCAGAGGGATGGCTTCCAGGCTGTACAGGCACTTGCCTTCCTGCATGTCGTGCAGCTTGATCTTCTCGATCAGGTACTTGGCGTTCTCTTTGCCGGTGGTCCGGATGATTTCCTCGATCCGCTCGTTGGTCTGCCGGTTCCGCTTCTGCATCTCGTTGATCATTTTCTGGGCGTCCTTGGAGTTCTTCTCGCGGGCCAGCTCGATAATGATGTCGTTGGGCAGGCCGTACTTCTTGATGATGGCGTTGATCACTTTGATGCTCTGGATGAAGCTTCTCTTCACGACGGGGCTCAGGATGAAGTCGTCCACCAGGGTGGTGGGGATCTCTTTCTGCTGGGACAGGTCCACCTTCTTGGGCACCAGCTTCAGCCGGTTGAAGATAGCGATCTGGTTGTCGTTGGTGTGCCACAGCTCGTCCAGGATCAGGTTGATGGCCTTCAGGCTCAGGTTGTGGGTGCCGGTATAGCCCTTCAGATTAGAGATCTGCTCGATCTCTTCCTGGGTCAGCTCGGAGTTCAGATTGGTCAGTTCTTCCTGGATGTCCTCGCTGCTCTGGTAGATGGTCAGGATCTTGGCAATCTGATCCAGCAGCTCGGCGTTCTCAATAATCTCTTTCCGGGCGGTAATGTCCTTGATGTCGTGGTACACCTTCAGGTTGGTGAACTCGGGCTTGCCGGTGCTGGTCACTCTGTAGCCCTTAATATCCTCTTCGTTCACGAGGATTTCTTTGGCGATCTGCTTCAGGGTGGGCTTCTTCTTCTGCTTGAACACGTTCTCGATGATCTGGAACTTCTCGTAATATTCCAGCTTCTCGTTCTCGTCCCTGGTGATCACGAGATTGTTCAGGTCGTTCAGGGCGTTGTACAGGTCGGCGTTGTAGGCGTACTTCACGCTCCGCAGTTCCTCGGGGAAGTAGGTGCAGTGGCCCATCAGCATCTCGTACCATTCTTTGATGTCCTTCCAGCCGAAGGGGCTGCCCTCGCCAGGTCCCTCATAGTAGGTCCGCCGGGTTTCCAGCAGGTCGATGTAGGTGTCGATGAAGCTCTGGTCCAGCTGGTGGTAGGCCTTCTGCACCTTCAGCAGCTGTTTGGCTTCTTTCACGTAGTCGCTGGTCTTGAATCTGTTGATGCTGCCCCGCACTTCGCCGTCTTTCTTCAGCCGTTCCAGCTGCAGTTCGGCCACGTATTTCTCTTCCAGGGCCTTGCTGTTCCGGCTGATCTGCTCTTTGGTGGACAGCTCGTTGCCGGTGTCCTCTTCCACCTCGTTCACGTTGTGCACGCCTCTTCTCTTGGCCAGGTGCAGCAGGGCGGCAGAGAACTCTTCCTCGCTCAGCTTCTGGCTCAGGCCCTTCACTCTGGCCTCGTAGGGGTTGATGCCGCTCAGCTCGCTGTGGTCGGTCAGCAGGTTGTAGTCGAACAGCAGCTTCTTCACTCTCTGGATTCTATGCCGCCTCCGCCGCTTCAGCCTTCTGGCGCCTCTCTTGCTCCGCCTGCCCTCGTTGTTTTCCACGTTGGCCTCTTTGAACAGCCGCACGCCGGCATCGATCACGTCCCGTGTCTCGTAGTCGATGATGCCGTAGCCCACGCTGGTGATGCCGATGTCCAGGCCCAGGATGTAGTTCCGCTTGGCTGCTGGGACTCCGTGGATACCGACCTTCCGCTTCTTCTTTGGGGCCATGTGGCGGCTCTTGAAGGACGACGTCATCATCCCTTGCCCGGATGCGCGGGCTTCTTGTCTAGCACAGGAGCCTGGGGTAGAGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCCTGAAGATCTTATTCTACTCCTGTGAGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTGATATCGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCCTGAAAACGTTGTTCTGAGTAGCTTTGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTCTCGAGGCGGCCGC（配列番号１１０）
自己相補的ＡＡＶベクター
ｐｓｃＡＡＶ＿ＤＬＫ（ｍｍ０７９）
AAAGCTTCCCGGGGGGATCTGGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGGGGTGGAGTCGTGACCTAGGGCGGCCGCTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGATTTACTTATGTAGCTCGTCCATGCCGCCGGTGGAGTGGCGGCCCTCGGCGCGTTCGTACTGTTCCACGATGGTGTAGTCCTCGTTGTGGGAGGTGATGTCCAACTTGATGTTGACGTTGTAGGCGCCGGGCAGCTGCACGGGCTTCTTGGCCTTGTAGGTGGTCTTGACCTCAGCGTCGTAGTGGCCGCCGTCCTTCAGCTTCAGCCTCTGCTTGATCTCGCCCTTCAGGGCGCCGTCCTCGGGGTACATCCGCTCGGAGGAGGCCTCCCAGCCCATGGTCTTCTTCTGCATTACGGGGCCGTCGGAGGGGAAGTTGGTGCCGCGCAGCTTCACCTTGTAGATGAACTCGCCGTCCTGCAGGGAGGAGTCCTGGGTCACGGTCACCACGCCGCCGTCCTCGAAGTTCATCACGCGCTCCCACTTGAAGCCCTCGGGGAAGGACAGCTTCAAGTAGTCGGGGATGTCGGCGGGGTGCTTCACGTAGGCCTTGGAGCCGTACATGAACTGAGGGGACAGGATGTCCCAGGCGAAGGGCAGGGGGCCACCCTTGGTCACCTTCAGCTTGGCGGTCTGGGTGCCCTCGTAGGGGCGGCCCTCGCCCTCGCCCTCGATCTCGAACTCGTGGCCGTTCACGGAGCCCTCCATGTGCACCTTGAAGCGCATGAACTCCTTGATGATGGCCATGTTATCCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTGGATCCTTAGAGCTAGTGTACTTGGTAACTGCCTTAGTGCCCTCGGACACAGCATGCTTAGCCAGCTCCCCAGGCAGCAGCAGGCGCACAGCCGTCTGAATCTCCCTGGAGGTGATGGTCGAGCGCTTATTGTAGTGAGCCAGGCGAGAAGCCTCGCCCGCGATGCGCTCGAAGATGTCGTTGACGAAGGAGTTCATGATCCCCATGGCCTTGGATGAGATGCCGGTGTCGGGGTGGACCTGCTTCAGAACCTTGTACACATAGATAGAATAGCTCTCCTTGCGGCTGCGCTTACGCTTCTTACCATCCTTCTTCTGCGCCTTAGTGATAGCCTTCTTAGAACCCTTTTTAGGGGCTGGAGCAGACTTAGAGGGTTCAGGCATGGTGGCGGCCGCTCTTGAAGGACGACGTCATCATCCCTTGCCCGGATGCGCGGGCTTCTTGTCTAGCACAGGAGCCTGGGGTAGAGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCCTGAAGAAGAAGGTTCGAGATCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCGGCCGCACTAGTCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCGGGCCCGCATGCGTCGACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTCGAGATCTAG（配列番号１３９８）
ｐｓｃＡＡＶ＿ＬＺＫ（ＧＦＰ）
AAAGCTTCCCGGGGGGATCTGGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGGGGTGGAGTCGTGACCTAGGGCGGCCGCTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGATTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTGGATCCTTAGAGCTAGTGTACTTGGTAACTGCCTTAGTGCCCTCGGACACAGCATGCTTAGCCAGCTCCCCAGGCAGCAGCAGGCGCACAGCCGTCTGAATCTCCCTGGAGGTGATGGTCGAGCGCTTATTGTAGTGAGCCAGGCGAGAAGCCTCGCCCGCGATGCGCTCGAAGATGTCGTTGACGAAGGAGTTCATGATCCCCATGGCCTTGGATGAGATGCCGGTGTCGGGGTGGACCTGCTTCAGAACCTTGTACACATAGATAGAATAGCTCTCCTTGCGGCTGCGCTTACGCTTCTTACCATCCTTCTTCTGCGCCTTAGTGATAGCCTTCTTAGAACCCTTTTTAGGGGCTGGAGCAGACTTAGAGGGTTCAGGCATGGTGGCGGCCGCTCTTGAAGGACGACGTCATCATCCCTTGCCCGGATGCGCGGGCTTCTTGTCTAGCACAGGAGCCTGGGGTAGAGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCCTGAAGCCGACACCCCAAATGATGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCGGCCGCACTAGTCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCGGGCCCGCATGCGTCGACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTCGAGATCTAG（配列番号１３９９）
ｐｓｃＡＡＶ＿ｄｕａｌ（ＤＬＫ＋ＬＺＫ）
AAAGCTTCCCGGGGGGATCTGGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGAGGGGTGGAGTCGTGACCTAGGGCGGCCGCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAGTCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCCGCCGACACCCCAAATGATGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGATTTACTTATGTAGCTCGTCCATGCCGCCGGTGGAGTGGCGGCCCTCGGCGCGTTCGTACTGTTCCACGATGGTGTAGTCCTCGTTGTGGGAGGTGATGTCCAACTTGATGTTGACGTTGTAGGCGCCGGGCAGCTGCACGGGCTTCTTGGCCTTGTAGGTGGTCTTGACCTCAGCGTCGTAGTGGCCGCCGTCCTTCAGCTTCAGCCTCTGCTTGATCTCGCCCTTCAGGGCGCCGTCCTCGGGGTACATCCGCTCGGAGGAGGCCTCCCAGCCCATGGTCTTCTTCTGCATTACGGGGCCGTCGGAGGGGAAGTTGGTGCCGCGCAGCTTCACCTTGTAGATGAACTCGCCGTCCTGCAGGGAGGAGTCCTGGGTCACGGTCACCACGCCGCCGTCCTCGAAGTTCATCACGCGCTCCCACTTGAAGCCCTCGGGGAAGGACAGCTTCAAGTAGTCGGGGATGTCGGCGGGGTGCTTCACGTAGGCCTTGGAGCCGTACATGAACTGAGGGGACAGGATGTCCCAGGCGAAGGGCAGGGGGCCACCCTTGGTCACCTTCAGCTTGGCGGTCTGGGTGCCCTCGTAGGGGCGGCCCTCGCCCTCGCCCTCGATCTCGAACTCGTGGCCGTTCACGGAGCCCTCCATGTGCACCTTGAAGCGCATGAACTCCTTGATGATGGCCATGTTATCCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTGGATCCTTAGAGCTAGTGTACTTGGTAACTGCCTTAGTGCCCTCGGACACAGCATGCTTAGCCAGCTCCCCAGGCAGCAGCAGGCGCACAGCCGTCTGAATCTCCCTGGAGGTGATGGTCGAGCGCTTATTGTAGTGAGCCAGGCGAGAAGCCTCGCCCGCGATGCGCTCGAAGATGTCGTTGACGAAGGAGTTCATGATCCCCATGGCCTTGGATGAGATGCCGGTGTCGGGGTGGACCTGCTTCAGAACCTTGTACACATAGATAGAATAGCTCTCCTTGCGGCTGCGCTTACGCTTCTTACCATCCTTCTTCTGCGCCTTAGTGATAGCCTTCTTAGAACCCTTTTTAGGGGCTGGAGCAGACTTAGAGGGTTCAGGCATGGTGGCGGCCGCTCTTGAAGGACGACGTCATCATCCCTTGCCCGGATGCGCGGGCTTCTTGTCTAGCACAGGAGCCTGGGGTAGAGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCCTGAAGAAGAAGGTTCGAGATCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCGGCCGCACTAGTCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGACAGATCCGGGCCCGCATGCGTCGACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTCGAGATCTAG（配列番号１４００）
（実施例２）
【０２７６】
ＬＣＡを処置するためのＡＡＶに基づく手法が本明細書に提示される。遺伝子移入を伴う処置とは対照的に、当該手法では、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集技術を使用する。ＣＲＩＳＰＲは近年開発され、生物学的研究を非常に急速に改革し、遺伝子薬の新時代の先触れとなった（４、５）。ＣＲＩＳＰＲは、細菌エンドヌクレアーゼと、このヌクレアーゼをゲノム内の特定の切断部位にガイドする短いＲＮＡとで構成される。カスタマイズされたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用い、任意のヒト遺伝子もしくは調節エレメントが破壊されるように、またはゲノムＤＮＡ配列が高度に特異的に欠失するおよび置き換えられるようにＣＲＩＳＰＲをプログラミングすることができる。ＬＣＡに対するＣＲＩＳＰＲ手法により、変性のリスクがある細胞から突然変異を恒久的に排除し、したがって、疾患を治癒させることが容易になる。
【０２７７】
ＡＡＶをＣＲＩＳＰＲ適用に使用することに関して、それらのサイズが１つの主要な技術的障害である。ＡＡＶは、最大５．２ｋｂまでのＤＮＡをパッケージングすることができる小さなウイルスである。標準のＣＲＩＳＰＲは、このパッケージング容量を著しい程度で超える。ＣＲＩＳＰＲは、細菌エンドヌクレアーゼＣａｓ９と少なくとも１種のｇＲＮＡとで構成される。最も一般的に使用されるＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のものであり、４．１ｋｂの遺伝子により単独でコードされる。ＣＲＩＳＰＲ構成成分の両方を標準の発現に必要なプロモーターおよびターミネーター配列と共に単一のウイルス中にパッケージングすることは不可能である。
【０２７８】
参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５１９５６２１には、パッケージング容量問題に対する解決法が開示されている。ＣＲＩＳＰＲ送達のためのこの新しい手法の根底には、Ｈ１として公知の小型の双方向プロモーターがある。単一のＨ１プロモーターは、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの両方を効率的に発現し得る。この独特の遺伝子エレメントにより、ＡＡＶ−Ｈ１−ＣＲＩＳＰＲと称される、単一の組換えＡＡＶ中にパッケージングされる任意のＣａｓ９遺伝子と、多数、最適には４種のｇＲＮＡとで構成されるアセンブリが可能になる（図１）。ｇＲＮＡを付加できることにより、ＡＡＶ−Ｈ１−ＣＲＩＳＰＲによりアンマッチ部位特異的に二本鎖切断を生じさせることが可能になり、したがって、周知のオフターゲット突然変異誘発のリスクが最小化される（６、７）。
【０２７９】
ＡＡＶ−Ｈ１−ＣＲＩＳＰＲ治療薬を単独で投与することによるＬＣＡ１０に対する安全かつ長続きする処置が本明細書に提示される。ＬＣＡ１０は、遺伝子ＣＥＰ２９０の突然変異によって引き起こされる。このＬＣＡのサブタイプは、西欧諸国において約２，０００名の個体に影響を及ぼしている。この治療薬は、Ｅｄｉｔａｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより開発された現行の技術とは対照をなす。パッケージング容量問題に対する彼らの解決法は、より小さなＣａｓ９遺伝子を使用することである。しかし、彼らのベクター構成では、関与させることができるゲノム標的が我々のものよりも少なく、また、以下の決定的な特徴を欠く：重要な安全性に関する問題であるオフターゲット突然変異誘発を防止することが示されている（６、７）、優れた標的化感度をもたらすための４種のｇＲＮＡの使用（上記の通り）。ＡＡＶ−Ｈ１−ＣＲＩＳＰＲは、この決定的な特徴を保持する。我々のＬＣＡ１０ベクターによって引き起こされるオフターゲット突然変異の率は、無視できるものであると予測される。
【０２８０】
１．ウイルス構築物のアセンブリ。民間研究所の場での、モジュラー構成成分からのウイルスベクターの迅速なアセンブリを容易にするために、その後の標的に対して再使用可能な合成モジュラーカセットを合成する。ＬＣＡ１０に対するベクターをこれらの一般的なモジュールおよび４種のＣＥＰ２９０特異的Ｈ１−ｇＲＮＡモジュールからアセンブルする。最終的なアセンブリは、制限マッピング、次いで完全な配列決定によって検証される。最終産物は、内毒素および配列エラーを含まない１ｍｇのトランスフェクショングレードのＣＥＰ２９０特異的ＡＡＶシャトルプラスミドＤＮＡのアセンブルされたウイルス構築物としてもたらされる。
【０２８１】
２．ＡＡＶ−Ｈ１−ＣＲＩＳＰＲストックの調製および分析。ウイルス構築物のパッケージング、ウイルス粒子の精製ならびにウイルス力価純度および感染力の分子調査は、ｃＧＭＰ認定コア施設により、業界標準に従って実施される（１０）。前臨床試験に定性的かつ定量的に適するウイルスストックの産生。０．９ＩＵ／ウイルスゲノムである最小の感染力、ウイルスゲノム１０１２個／ｍｌである最小の力価および１０１４感染単位である最小の収率を伴う、ｃＧＭＰにより調製および精製した、滅菌された内毒素を含まないＡＡＶのストック。
【０２８２】
３．ＡＡＶ−Ｈ１−ＣＲＩＳＰＲゲノム標的およびオフターゲット部位の定量的特徴付け。機能的検証を、ＬＣＡ１０標的部位を有する不死化網膜色素上皮細胞系ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥ１を使用して行う。感染細胞集団におけるオンターゲットおよび予測されるオフターゲット部位を深く配列決定する。修飾／無修飾対立遺伝子比により、効率の定量的測定基準がもたらされる；オンターゲット／オフターゲット修飾比が特異性の最終的な測定基準になる。ウイルスを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、操作されたマウスおよびヒト生検試料を使用して試験する。標的関与の定量的分析。培養物中、＜０．１％のオフターゲット効果でＣＥＰ２９０対立遺伝子の＞５％において欠失を創出することができるウイルス（５％の閾値によりｉｎ  ｖｉｖｏにおける視覚的改善がもたらされると考えられる）。
【化１】
2019520391.tif 000043
（実施例３）
【０２８３】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをカスタマイズ可能な小さなガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と併せて使用して、突然変異型ロドプシン対立遺伝子を標的にし、切断し、それにより、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を通じて、正常な対立遺伝子に影響を及ぼすことなく突然変異型対立遺伝子の発現を特異的にノックアウトするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術の開発によってＡＤＲＰを処置するための代替の手法が本明細書に提示される（Doudna,  J.  A.ら、Science、３４６巻、１２５８０９６頁（２０１４年）；Hsu,  PD.ら、Cell、１５７巻、１２６２〜１２７８頁（２０１４年））。この手法でもたらされ得る発現は野生型レベルのロドプシンのたった５０％であるが、動物データから、これは、臨床的に有用なロッド機能をもたらすために十分なはずであることが示唆される（Liang,  Y.ら、The  Journal  of  biological  chemistry、２７９巻：４８１８９〜４８１９６頁（２００４年））。
【０２８４】
ロドプシンのＲ１３５突然変異により、最も侵攻性かつ急速に進行する形態の網膜色素変性症（ＲＰ）が生じる。影響を受けた個体は、小児期に夜盲症を有し、１０代になる前に視野喪失する。疾患の進行は異常に高く、ベースラインＥＲＧ振幅および視野面積が１年当たり平均５０％低下する。３０代になる前に、黄斑機能が重度に損なわれる（OMIM:http://www.omim.org/entry/180380）。
【０２８５】
いくつかの推定により、Ｒ１３５突然変異は、世界的に２番目に多いロドプシン突然変異を占める。Ｒ１３５突然変異は、中途停止コドンにより、ナンセンス媒介性減衰による転写物の分解がもたらされる可能性が高く、それにより、この突然変異のドミナントネガティブ効果が軽減されるので、ＮＨＥＪによる補正を特に受けやすい。最も一般的な突然変異であるＰ３４７は、ロドプシンのエクソン５において生じ、これにより、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集による補正の追加的な挑戦が示される。遺伝子の最後のエクソンにおける中途停止コドンは、ナンセンス媒介性減衰を受けにくい。
【化２】
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【化３−１】
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【化３−２】
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【化３−３】
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（実施例４）
【０２８６】
世界中で不可逆的失明の主要原因である緑内障（１）は、視神経乳頭の篩骨篩板における網膜神経節細胞（ＲＧＣ）軸索の進行性の損傷が軸索変性および細胞死をもたらす視神経症である（２）。現在、眼内圧（ＩＯＰ）を低下させ、視神経乳頭における傷害を低減させるのは、点眼薬、レーザーまたは切開手術のいずれかによる処置のみである。残念ながら、これは一部の患者では困難であり、他の患者では、この疾患は積極的なＩＯＰ低下にもかかわらず、悪化し続け得る。残存する軸索傷害に対するＲＧＣ応答を軽減することによってＩＯＰ低下を補完する代替的治療戦略が、この分野で長く必要とされてきた。さらに、ＮＥＩは、そのＡｕｄａｃｉｏｕｓ  Ｇｏａｌｓにおいて視神経再生を列挙しており、任意の再生治療が、軸索切断されたＲＧＣの生存の問題に取り組む必要がある。この目的のために、ＲＧＣ軸索変性および／または軸索傷害関連細胞死の活性な遺伝的プログラムに直接干渉し得る神経保護薬を開発することが大いに必要とされている（３〜６）。
【０２８７】
包括的かつ不偏的に、神経保護緑内障療法のための新規の薬物標的として機能し得る遺伝子を同定するために、マウスカイノーム全体（ドラッガブルゲノムのサブセット）を、その阻害によりＲＧＣ生存が促進されるキナーゼについてスクリーニングした。このスクリーンのために、雄および雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス由来の一次ＲＧＣにおいて、低分子干渉ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を用いて遺伝子発現をノックダウンするためにハイスループットな方法を開発し（７）、それをＲＧＣ生存の定量的アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）（５）とカップリングした。この手法を使用し、イムノパニング（必ず細胞を軸索切断する）の３日後のＲＧＣ生存を増大させる能力について、１８６９種のｓｉＲＮＡのアレイライブラリーをスクリーニングし、６２３種のキナーゼを標的にした。上位２つのヒットは、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ／ＭＡＰ３Ｋ１２）およびその唯一の既知の基質であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ７（ＭＫＫ７）であった。雄および雌のｆｌｏｘｅｄ  Ｄｌｋマウス（８）およびＣｒｅを発現するカプシド修飾（９、１０）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ２）の硝子体内注射を使用して、マウス視神経挫滅モデルにおいて、Ｄｌｋの標的化破壊により、ＲＧＣが軸索傷害により誘導される細胞死に対して高度に抵抗性になることが示された（５）。
【０２８８】
さらに、一般には１つまたは複数の上流ＭＡＰ３Ｋによって活性化されるＪＵＮ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）１〜３がＲＧＣ細胞死において中心的な役割を果たすことが示されているので（１１、１２）、ＤＬＫ（ＭＡＰ３Ｋ１２）が関連性のある上流の誘発因子であるかどうかを試験した。実際に、ＡＡＶ２−Ｃｒｅを硝子体内注射した野生型マウスは、ＲＧＣ細胞体および軸索におけるＪＮＫシグナル伝達の頑強な上方制御を伴って視神経損傷に応答したが、ｆｌｏｘｅｄ  Ｄｌｋマウスでは、当該経路の活性化が低下した（５）。最後に、公開されたキナーゼ阻害剤のプロファイリングデータ（１３、１４）を使用して、プロテインキナーゼ阻害剤であるトザセルチブをＤＬＫの阻害剤として同定し、また、トザセルチブにより、ラット視神経切断および緑内障モデルのどちらにおいてもＲＧＣが保護されることが示された（５）。一部の実施形態では、ＤＬＫ／ＭＡＰ３Ｋ１２の標的配列は、配列番号７８８〜１０２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
【０２８９】
トザセルチブにより、一貫して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＲＧＣ生存がＤＬＫノックダウンまたはノックアウト単独よりも大きく改善されたことが認められた（５）。これにより、トザセルチブの１種または複数種の追加的なキナーゼ標的（１５０種よりも多く存在する）がＤＬＫと協同して細胞死を促進し得ること、および両方の同時阻害により最大ＲＧＣ生存が促進されることが示唆された。これらの他の標的を同定するために、カイノームスクリーンを、Ｄｌｋ  ｓｉＲＮＡを全てのウェルに含め、それを、ＤＬＫノックダウンと協同してＲＧＣ生存をさらに増大させたライブラリーｓｉＲＮＡに対して感度が増すように改変した（図１９Ａ）。他の改変は、４８時間、現存のタンパク質をターンオーバーさせた後、軸索傷害をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてモデリングするために使用されてきた微小管不安定化剤であるコルヒチン（１５、１６）を用いてイムノパニング傷害を増悪させるものであった。予測通り、Ｄｌｋ  ｓｉＲＮＡはすでに至る所に存在していたので、ライブラリー（最初のカイノームスクリーンにおいて最も効果的であったもの）に由来するＤｌｋ  ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのいずれによっても、生存はベースラインよりも改善されなかった。その代わりに、この改変された「相乗作用」プロトコールにおける上位の遺伝子は、密接に関連する混合系統キナーゼであるロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ／ＭＡＰ３Ｋ１３）であった。最初のスクリーンでは使用されなかった配列を有する４種の追加的なＬｚｋ  ｓｉＲＮＡにより、ＬＺＫノックダウン（図１９Ｂ、挿入図）が、一次ＲＧＣ生存の促進に関して、それだけでわずかな活性を有するが、ＤＬＫノックダウンと高度に相乗的であることが確認された（図１Ｂ）。さらに、混合系統キナーゼファミリーの他のメンバー（すなわち、ＭＬＫ１〜３）はいずれも、生存に対していかなる効果も有さなかったので（データは示していない）、この相乗作用はＬＺＫに特異的であった。トザセルチブはＤＬＫに加えてＬＺＫも阻害するので（１３、１４）、ＬＺＫが実際に「他の」重要な標的であるかどうかを考察した。この仮説と一致して、ＬＺＫまたはＤＬＫのいずれかの個々のノックダウンは、部分的に神経保護性であり、低用量のトザセルチブに対する細胞の感度が増した（重要な薬物標的がすでに遺伝的に破壊されている場合に予想される通り）。さらに、ＤＬＫおよびＬＺＫの両方のノックダウンの組合せにより、薬物により生じる生存が総括され、トザセルチブのさらなる添加には効果がなかった（全ての重要な薬物標的がすでに遺伝的に破壊されている場合に予想される通り）（図１９Ｃ）。一部の実施形態では、ＤＬＫ／ＭＡＰ３Ｋ１３の標的配列は、配列番号１０２４〜１３９７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
【０２９０】
ＬＺＫがＲＧＣ細胞死の重要なメディエーターであることの証拠は実質的なものである一方で、個々のｓｉＲＮＡに完全に基づくものであった。任意の所与のｓｉＲＮＡによって生じる表現型は、全２１ヌクレオチドによって媒介される標準的な「オンターゲット」サイレンシングと６〜７ヌクレオチドのシード配列によって媒介されるプロミスキャスな「オフターゲット」サイレンシングの生物学的総和である（１７、１８）ことに留意することが重要である。後者により、数百の標的がサイレンシングされ、残念ながら、それにより表現型およびｓｉＲＮＡスクリーン結果が支配される可能性がある（１９）。したがって、ＬＺＫ所見を検証するために２つの相補的手法、ｓｉＰＯＯＬおよびクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）により媒介される遺伝子ノックアウトを選択した。ｓｉＰＯＯＬは、共通の遺伝子を標的にする３０種のｓｉＲＮＡのプールである。３０種の構成成分ｓｉＲＮＡはそれぞれ異なるオフターゲットセットを有するが共通のオンターゲットを共有するので、ｓｉＰＯＯＬでは、オフターゲットサイレンシングに対してオンターゲットサイレンシングの３０倍の濃縮がもたらされる（２０）。予測通り、Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬでは一次ＲＧＣ生存が最小にしか改善されないが、Ｄｌｋ  ｓｉＰＯＯＬとＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬの組合せは、生存（図１９Ｄ）およびＪＮＫシグナル伝達の抑制（図１９Ｅ）のどちらに関しても高度に相乗的であった。生存能力に関する従来の染色を用いても同様の結果が得られたので、この表現型はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイのアーチファクトではなかった（図１９Ｆ）。
【０２９１】
ＣＲＩＳＰＲを用いたノックアウト手法に関しては、一次ＲＧＣプラットフォームが低分子ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ）の送達を中心にして築かれたという事実を活用した。Ｒｏｓａ２６遺伝子座においてＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）を発現するマウス（２１）からＲＧＣを単離し、その代わりに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトすることにより、Ｃａｓ９を所与の標的遺伝子でのカットのための標的にできる。次いで、細胞により、このカット部位が非相同末端結合で修復され、それにより、下流のタンパク質をフレームシフトさせる可能性がある小さな（約１〜２０ｂｐ）の挿入／欠失（インデル）が生じる。当該手法を検証するために、Ｄｌｋに対する一連のｓｇＲＮＡを合成し、これらがＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬと協同して生存を増大させること（図１９Ｇ）およびこれらにより、検出可能なオフターゲット効果を伴わずに標的特異的なインデルが生じること（図１９Ｈ）が示された。相互的手法、すなわち、Ｄｌｋ  ｓｉＰＯＯＬおよびＬｚｋ  ｓｇＲＮＡにより、ｓｇＲＮＡのみ、すなわち、Ｄｌｋ  ｓｇＲＮＡおよびＬｚｋ  ｓｇＲＮＡを使用した結果（図１９Ｊ）と同様の結果がもたらされた（図１９Ｉ）。ｆｌｏｘｅｄＬｚｋマウスが最近生成され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてノックアウトが検証された（図１９Ｋ）。ホモ接合性Ｄｌｋｆｌ／ｆｌＬｚｋｆｌ／ｆｌマウスを育種し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＬｚｋとＤｌｋの組合せ標的化破壊により視神経損傷後のＲＧＣ生存およびＪＮＫ経路の抑制の増強が導かれるかどうかを確かめるために試験した。しかし、少なくとも一次ＲＧＣでは、ＤＬＫが非機能性である場合、ＬＺＫは傷害シグナル伝達を媒介し得、最大の神経保護のためにはＤＬＫとＬＺＫの同時阻害が必要であることが明らかである。
【０２９２】
次に、傷害シグナル伝達経路の非キナーゼメンバーを同定することを試み、したがって、１６，８７７種のｓｉＲＮＡミニプール（遺伝子当たり４種）の全ゲノムライブラリーをスクリーニングするために、我々のプラットフォームを拡大した。アッセイのシグナル対ノイズを改善し、全ゲノム規模でのスクリーニングを容易にするために、ＬＺＫ阻害によるベースライン生存の改善はわずかであるが、細胞がさらなるＤＬＫ阻害に対して高度に感度が増すという事実を活用した。したがって、標準のライブラリーｓｉＲＮＡミニプールに加えて、各ウェルは、Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬも受けた。結果を分析するために、ゲノム規模のスクリーンでは、すべての可能性のあるシード組合せを有するｓｉＲＮＡが多数回サンプリングされるという事実を利用し、したがって、広汎性のオフターゲット効果に取り組むために、２つの別個のバイオインフォマティクス手法が可能になる。第１に、所与のシードの生存効果を、それがライブラリー全体を通して多数回出現した時に追跡することができる。次いで、これを使用して、表現型に対するオフターゲット寄与を差引き、オンターゲットによって媒介される構成成分を明らかにするために役立つ補正因子を生成することができる（１９）。第２に、各シードによってもたらされる生存／毒性を知ることに加えて、その可能性のあるオフターゲット全てを予測することもできる。次いで、一般に標的化される遺伝子を同様に挙動するシードによって検索するためにＨａｙｓｔａｃｋ分析を使用し、オフターゲット効果をデコンボリューションし、オフターゲットサイレンシングが生存に影響を及ぼす遺伝子を同定することを実際に試みることができる（２２）。
【０２９３】
第１の方法を使用した結果（シード補正された、オンターゲット）を分析したところ、ＤＬＫが全１６，８７７種の遺伝子の中で上位の遺伝子であることが見いだされた（図２０Ａ）。さらに、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３は全て上位１％に順位付けされた（データは示していない）。スクリーンにより、２種の公知のＪＮＫ依存性転写因子、ＪＵＮおよびＡＴＦ２も同定された。前者は、視神経損傷の齧歯類モデルにおいてＲＧＣ細胞死の重要なメディエーターとして以前検証されている（２３）。後者の役割を試験するために、一次ＲＧＣを、野生型と、それに対してｆｌｏｘｅｄＡｔｆ２マウス（２４）とから単離し、それらに、Ｃｒｅ発現アデノウイルスと、それに対してＧＦＰ発現アデノウイルスとを形質導入した。予測通り、Ａｔｆ２の標的化欠失により、Ｄｌｋ欠失によってもたらされるものと同等に生存が増大した（図２０Ｂ）。総合して、これらの結果から、スクリーンにより公知のＤＬＫ／ＪＮＫ経路メンバーを同定することができるという信用がもたらされた。次に、ＤＬＫまたはＪＮＫと以前に関連付けられていない新規の遺伝子を検証することを試みた。Ｈａｙｓｔａｃｋ分析を使用した上位のヒットは、性決定領域Ｙ（ＳＲＹ）−ボックス１１（ＳＯＸ１１）転写因子であった。ＳＯＸ４と一緒に、ＳＯＸ１１は、発生の間のＲＧＣ生存および分化にとって重要であることが以前示されている（２５）。ＳＯＸ１１がＲＧＣ細胞死において逆説的な役割を果たすことを検証するために、まずＳｏｘ１１  ｓｉＰＯＯＬを試験し、Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬ（図２０Ｃ）またはＤｌｋ  ｓｉＰＯＯＬ（データは示していない）のいずれかと実際に協同して一次ＲＧＣ生存を増大させることが見出された。２つのノックアウトモデル：Ｃｒｅ発現アデノウイルスを用いてＳｏｘ１１  ｆｌ／ｆｌ  ＲＧＣを形質導入したもの（２６）と、それに対してＧＦＰ発現アデノウイルスを用いてＳｏｘ１１  ｆｌ／ｆｌ  ＲＧＣを形質導入したものと（図２０Ｄ）を調査し、単一のＳｏｘ１１エクソンを標的にするｓｇＲＮＡを有するｓｐＣａｓ９−ノックインＲＧＣにトランスフェクトした（図２０Ｅ）。どちらの場合でも、Ｓｏｘ１１の標的化破壊によりＲＧＣ生存が改善された。この発生生存遺伝子が成体における傷害シグナル伝達において役割を果たし得るという事実は、ＳＯＸ１１が、視神経挫滅に応答して、ほぼ完全にＤＬＫ依存的に、最も高度に上方制御される遺伝子であることが示されたマイクロアレイ試験によって裏付けられる（６）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生存表現型を検証するためにＳｏｘ１１  ｆｌ／ｆｌマウスが現在使用されている。スクリーンがＤＬＫ経路阻害に応答するように過度に感度が増すことが原因で潜在的なＲＧＣ細胞死経路メンバーが見落とされないことを確実にするために、異なる全ゲノムｓｉＲＮＡライブラリーをＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬの不在下でスクリーニングした。一次ＲＧＣに、１７，５７５種の遺伝子を標的にする５２，７２５種のｓｉＲＮＡのアレイライブラリーをトランスフェクトした。再度、上位のヒットには、ＤＬＫ、ＪＵＮ、ＡＴＦ２、ＭＫＫ４およびＭＫＫ７のような公知の遺伝子が含まれた。しかし、今回は、別の転写因子、ニ���ーロンの生存および分化において突出した役割を有する筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）（２７〜２９）も同定された。他の候補と同様に、ＭＥＦ２Ａを、ｓｉＰＯＯＬを用いて（データは示していない）、ｓｇＲＮＡを用いて（データは示していない）、およびコンディショナルノックアウト（Ｍｅｆ２ａｆｌ／ｆ）マウス（３０）からＲＧＣを単離し、ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅと、それに対してａｄｅｎｏ−ＧＦＰを用いて形質導入することによって（図２０Ｆ）検証した。さらに、マウス視神経挫滅モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＥＦ２ＡのノックアウトによりＲＧＣが保護されることが実証された（図２０Ｇ）。最後に、Ｄｌｋ  ｆｌ／ｆｌマウスを使用することにより、ＭＥＦ２Ａが、軸索傷害に応答して、ＤＬＫ依存的にリン酸化されることが示された（図２０Ｈ）。
【０２９４】
この時点までに、４種の異なる転写因子（すなわち、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、ＳＯＸ１１、ＭＥＦ２Ａ）が同定され、そのそれぞれが、破壊された際に部分的な保護効果を有した。ＤＬＫおよびＬＺＫからの重複性の教訓を考慮すると、最大の神経保護のために、これらの４種の転写因子を同時に阻害する必要があり得る可能性が考慮された。したがって、野生型ＲＧＣに、Ｍｅｆ２ａ、Ｊｕｎ、Ｓｏｘ１１またはＡｔｆ２  ｓｉＰＯＯＬを、単独でまたは組み合わせてトランスフェクトし、９６時間後に生存を測定した。結果から、４種の転写因子の阻害が高度に相乗的であり、生存が同時ＤＬＫ／ＬＺＫ阻害と同程度に増大することが示された（図２１Ａ）。これらの４種の転写因子がＤＬＫに対して遺伝子下流にあるかどうかを決定するために、野生型ＲＧＣに、Ｄｌｋ／Ｌｚｋ  ｓｉＰＯＯＬを、４種の転写因子を標的にするｓｉＰＯＯＬを伴ってまたは伴わずにトランスフェクトした。２日後、ＤＬＫシグナル伝達を、アデノウイルス（マウスｓｉＲＮＡ非感度、ラットＤＬＫを発現する）を用いて再構成した。さらに２日後に生存を測定した。４種の転写因子の存在下ではＤＬＫ過剰発現によってＲＧＣの８０〜９０％が死滅したが、ＭＥＦ２Ａ、ＳＯＸ１１、ＪＵＮおよびＡＴＦ２が同時ノックダウンされることにより、細胞死は完全に消失した（図２１Ｂ）。最後に、ＪＮＫ１〜３およびＭＫＫ４／７ノックアウトとＤＬＫ過剰発現（データは示していない）またはＬＺＫ過剰発現（図２１Ｃ）の組合せを使用し、ＤＬＫ／ＬＺＫが、インタクトなＭＫＫ／ＪＮＫ経路の不在下では毒作用を有さないことが実証された。総合すると、機能的ゲノムスクリーニングは、軸索傷害によりＤＬＫ／ＬＺＫ、ＭＫＫ４／７およびＪＮＫ１〜３のキナーゼシグナル伝達カスケードが誘発され、それにより、４種の転写因子、ＭＥＦ２Ａ、ＳＯＸ１１、ＪＵＮおよびＡＴＦ２の活性化、ならびに最終的に細胞死が導かれるモデルによって要約することができる。
【０２９５】
ＤＬＫを緑内障に対する神経保護戦略として標的にすることには、魅力的な特徴がいくつかある。上記の通り、ＤＬＫは、頑強な、進化的に保存された表現型を有し（５、３１）、不偏の方法を使用して同定されたものであり、また、小分子阻害剤を用いて容易にドラッガブルである。さらに、これは独立して検証されており、また、ＤＬＫ阻害により、単に細胞死が遅延するのではなく、総じて防止されると思われる（６）。さらに、ＤＬＫ阻害で生存し続ける細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて電気生理学的に活性なままであり（５）、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、それらの以前の傷害にもかかわらず、比較的健康な遺伝子発現パターンを保持する（６）。最後に、全て（３２）ではないが一部（４、６、８）のデータから、ＤＬＫが軸索傷害によって誘発される軸索変性プログラムにおいて役割を果たすことが示唆される。他方では、ＤＬＫ阻害により、軸索再生が遅延し（６）、これは、神経再生戦略の生成に関する潜在的な限定である（３３〜３５）。これにより、軸索再生に関与する経路メンバーから細胞死の決定に関与する経路メンバーを詳細に分析する必要性が強調される。さらに、細胞死（および再生）におけるそれらの中心的役割にもかかわらず、ＤＬＫおよびＬＺＫが軸索傷害に応答して活性化される機構ならびにＤＬＫおよびＬＺＫにより下流の転写因子が活性化される機構はまだ解明されていない。
【０２９６】
本明細書に開示されている通り、ＤＬＫ／ＬＺＫ細胞死経路をさらに探索し、実行可能な遺伝子療法ベクターを用いて種々の候補神経保護標的の活性をシームレスに妨げるために、機能的ゲノムスクリーニングをＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶ治療用プラットフォームと統合することができる。
【０２９７】
一部の実施形態では、まだ同定されていない上流活性化因子（複数可）および細胞死と再生を切り離し得る標的を含めた新規のＤＬＫ／ＬＺＫ経路メンバーを同定するために、ｓｇＲＮＡおよびｓｉＲＮＡのネットワークを使用するＲＮＡに基づくスクリーニングの模範の増強されたセットを使用する。一部の実施形態では、視神経症の齧歯類モデルにおいてＳＡ１からのヒットを迅速に検証することを可能にするＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶベクターを開発する。遺伝子療法適用に適する、これらの神経保護性ウイルスのバリアントを創出し、それにより、非ドラッガブル遺伝子産物およびさらには遺伝子のネットワークが含まれるように潜在的な標的の余地を拡大する。一部の実施形態では、プロテオミクスと機能喪失／機能獲得実験の組合せを使用して、ＤＬＫにより下流のメディエーターであるＭＥＦ２Ａが調節される機構を探索し、ＭＥＦ２Ａ阻害が再生を妨げることなくＲＧＣ生存を促進するための治療戦略としての機能を果たし得るかどうかを決定する。
【０２９８】
機構の観点から考えると、スクリーニングプラットフォームにより、疾患と関連性のある一次ニューロン（すなわち、ＲＧＣ）と、数週間で完了することができるアレイされた全ゲノム規模のＲＮＡに基づくスクリーンを一意的に組み合わせて、ＲＧＣ細胞死シグナル伝達をよりよく理解するための不偏かつ包括的なツールをもたらす。実際に、ＲＧＣ発生に重要なＳＯＸ１１は、かかる手法によりどのように細胞死に関与する遺伝子に関する新規かつ予想外の発見をなすことができるかの完全な例である。以下に提唱される修飾（すなわち、遺伝子ネットワークをスクリーニングすることおよびＣＲＩＳＰＲ技術を使用すること）により、同定することができる潜在的な神経保護標的に対する余地が広がる。
【０２９９】
治療的観点から考えると、ＲＧＣにおけるＣＲＩＳＰＲ編集を利用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲ治療薬を開発する。一部の実施形態では、２つの別々のシストロン（すなわち、一方はｇＲＮＡを発現し、他方はｓｐＣａｓ９を発現する）を単一のＡＡＶ粒子中にパッケージングするＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲにより、遺伝子療法のためのＣＲＩＳＰＲの使用における主要な限定を克服する。これにより、スループットが劇的に改善された我々のスクリーンからのヒットを検証するため、および、小分子を用いて容易にドラッガブルなものではないものを含めた、これらの経路メンバーを治療的に標的にすることを可能にするための、遺伝子療法に基づく手法の潜在性が創出される。全体として、ＤＬＫ標的経路自体ならびに手法の両方が、緑内障および視神経疾患の他の形態に対する新規の神経保護療法を開発するための革新的戦略を構成する。
【０３００】
増強されたＲＮＡに基づくスクリーンを一次ＲＧＣにおいて使用して、まだ同定されていない上流活性化因子を含めた新規のＤＬＫ／ＬＺＫ経路メンバーを同定する。
【０３０１】
視神経損傷に応答してＤＬＫおよびＬＺＫが活性化される機構は、まだ決定されていない。Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓでは、Ｅ３リガーゼ（それぞれｈｉｇｈｗｉｒｅおよびＲＰＭ−１と称される）により、ＤＬＫホモログ（それぞれＷａｌｌｅｎｄａおよびＤＬＫ−１と称される）の基礎タンパク質レベルが抑制される。軸索傷害に対する応答では、この抑制は緩和され、それにより、ＤＬＫ蓄積および細胞死が導かれる。
【０３０２】
興味深いことに、マウスにおけるＨｉｇｈｗｉｒｅ／ＲＰＭ−１ホモログ、ＰＨＲ１の役割は不明確である。予測される通り、後根神経節細胞では、Ｐｈｒ１の破壊によりＤＬＫのレベルが上昇するが（３６、３７）、ＲＧＣでは、ＰＨＲ１のノックダウンは、ＤＬＫレベルまたは生存に影響を及ぼさず（データは示していない）、コンディショナルＰｈｒ１ノックアウトマウスは正常なＲＧＣ生存を有する（３８、３９）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＤＬＫ−１に関して記載されている内因性カルシウム感知モチーフ（４０）は、内在性マウスＬＺＫ（当該モチーフを含有する唯一のマウスＤＬＫ−１ホモログ）を野生型ヒトＬＺＫまたはヘキサペプチドモチーフを欠く突然変異体のいずれかで置き換えることにより、同等の細胞死が導かれるので、機能的に保存されていないと思われる（図４）。最後に、脊椎動物では、公知のＤＬＫキナーゼ（すなわち、ＪＮＫおよびＤＬＫ）によって調節されないと思われる、Ｓ６４３、Ｓ３０２、Ｓ２９５、Ｓ３０２、Ｔ３０６およびＳ６４３を含めたいくつかのＤＬＫリン酸化部位が存在し、これにより、新規の上流調節キナーゼの可能性が示唆される（３７）。上記のカイノームおよびゲノムスクリーンは、ＤＬＫ経路メンバーを探すための感度が増したが、ＤＬＫ／ＬＺＫの上流のいかなる遺伝子も同定されていない。注目すべきことに、これらのスクリーンには２つの固有の限定があった。第１に、いくつかの遺伝子の表現型を得るためには、ノックアウトではなくノックダウンでは不十分な可能性がある。この観念を支持して、ノックダウンに基づくスクリーンにより、ノックアウトに基づくスクリーンと直接比較した場合に、別個のヒットが得られる可能性があることが示されている（４１）。第２に、ＤＬＫ／ＬＺＫ、ＭＫＫ４／７、ＪＮＫ１／２／３およびＳＯＸ１１／ＡＴＦ２／ＪＵＮ／ＭＥＦ２Ａを用いた場合と同様に、頑強な表現型を生じさせるために、所与の層の多数のメンバーを同時に阻害する必要があり得る。これらの潜在的な限定に取り組むために、我々のスクリーニング戦略に２つの重要な変化を行う。我々の最初の再スクリーンに関しては、カイノームに、その比較的小さなサイズ、生物活性およびドラッガビリティを考慮して、焦点を当てる。
【０３０３】
１．標的化破壊によりＲＧＣ生存が改善される遺伝子を同定するために、マウスカイノームを標的にするアレイされたｓｇＲＮＡライブラリーをスクリーニングする。
【０３０４】
上記の第１の限定に取り組むために、ｉＣＲＩＳＰＲ系（４２）といくらか類似した、ＣＲＩＳＰＲに基づくスクリーニングを実施する。ｓｐＣａｓ９を発現するマウスのコロニーを拡大し、ＲＧＣをこれらのマウスから単離し、それらに、ｓｉＲＮＡの代わりにｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたところ、頑強な生存が実証された（図１９Ｇ〜Ｊ）。実際に、Ｚ’は、０．３〜０．５（０．５を含む）であり、陽性対照ｓｇＲＮＡ（すなわち、Ｄｌｋを標的にする）でトランスフェクトされたスクリーン中の細胞は、対照ｔｒａｃｒＲＮＡ（それを特定の遺伝子に方向付ける２０ヌクレオチドのプロトスペーサー配列を欠く）をトランスフェクトした細胞よりも、１２標準偏差を超えて高い生存を有することを示した。図１９ＧおよびＪに示されている通り、同じ遺伝子を標的にする異なるｓｇＲＮＡの中での変動性は、幾分小さく、遺伝子当たり３種のｓｇＲＮＡが十分なカバレッジなはずである。ＤＬＫおよびＬＺＫを用いて行ったのと同様に、Ｔ７−転写およびｓｐＣａｓ９、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に適合させるために、配列ＧＮ１９ＮＧＧを有する標的部位を選択する。オンターゲットカットがより多く、オフターゲットカットがより少ないことがバイオインフォマティクスで予測される部位に優先順位が与えられる（４３〜４５）。さらに、遺伝子の５’側半分において、および、可能であれば、重要なドメインにおいて標的部位を選択する。前者により、インデルによって生じるフレームシフト突然変異がタンパク質の残りの半分よりも多くに影響を及ぼすことが確実になり、一方、後者では、インフレームに留まるインデルの３分の１がなおタンパク質機能を破壊することが可能になる。過去の研究との直接比較を可能にするために、ライブラリーは、ＳｉｇｍａカイノームｓｉＲＮＡライブラリーに存在するのと同じ６２３種のキナーゼを標的にする。ハイスループットな合成のために、各ｓｇＲＮＡの転写のための鋳型は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含有する共通の８０−ｍｅｒとアニーリングした、遺伝子特異的な６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドである（４６）。
【０３０５】
スクリーンのために、ＲＧＣをｓｐＣａｓ９ノックインマウスからイムノパニングし、３８４ウェルプレートにウェル当たり細胞１，０００個で播種する。ｓｇＲＮＡのライブラリーを、ＮｅｕｒｏＭａｇ（Ｏｚ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、２連で、ウェル当たり３０ｎｇで逆トランスフェクトする。１ｎＭのＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬは、全ゲノムｓｉＲＮＡライブラリーのＤＬＫ阻害に対する感度が増すように十分に機能するので、このスクリーンの全てのウェルに同じ試薬を添加する。各プレートは、品質管理および正規化標準物質（プレート間の比較を可能にするため）としての機能を果たす陰性対照ｓｇＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）および陽性対照ｓｇＲＮＡ（Ｄｌｋ）を含有する。４８時間後、各ウェルを、１μＭのコルヒチンを用いて処理して、ＤＬＫ／ＬＫＺａＪＮＫシグナル伝達および低バックグラウンド生存を促進させる（１５、４７）。最後に、さらに４８時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを使用して生存を測定し、各プレートについて陰性対照ウェルの中央値に対して正規化する。遺伝子をスコア化し、３種のｓｇＲＮＡについて活性の平均値および中央値に基づいて順位付けする。活性ｓｇＲＮＡをｓｐＣａｓ９および野生型ＲＧＣにおいて再試験して、活性がｓｐＣａｓ９依存性であることを確実にする。ｓｉＲＮＡと同様に、最初のスクリーンで試験されていない配列を有する新しいｓｇＲＮＡを合成することによって二次スクリーニングを実施する。
【０３０６】
一次ＲＧＣにＲＮＡをトランスフェクトし、生存を測定するプラットフォームは広範囲にわたって試験されてきたことを考慮すると、スクリーン自体に伴ういかなる問題も予測されない。さらに、ＤＬＫ阻害に対する系の感度を増すためにＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬを使用し、１６，８７７遺伝子の中で上位のヒットとしてＤｌｋ  ｓｉＲＮＡミニプールが得られた全ゲノムｓｉＲＮＡスクリーンからの結果を考慮すると、この戦略により、ＤＬＫ経路メンバーを同定することが可能になる。主要な問題は、ｓｇＲＮＡライブラリーの合成に伴う労力である。鋳型をプールし、３種のｓｇＲＮＡのプールをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写することがさらに考えられている。同じ遺伝子を標的にする多数のｓｇＲＮＡにより、全てのインデルが偶然に３の倍数のヌクレオチド数になることによって所与の遺伝子座が標的化を免れる機会が減るはずである。しかし、少なくともＬＺＫおよびＤＬＫを伴うと、プール戦略を用いた有効性の増大は観察されておらず（図１９Ｊ）、これは、おそらくインデル頻度がすでに高いことが原因である（図１９Ｈ）。一部のより小さなキナーゼが有する許容されるｓｐＣａｓ９標的が少なすぎることを回避するために、ｓｉＴＯＯＬＳ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して、ハンマーヘッド型リボザイムとの５’融合を伴うｓｇＲＮＡを試験し（図２３）、それにより、ｓｇＲＮＡがグアニンで開始される必要性を排除し（Ｔ７転写がリボザイムで開始されるので）、標的の数を４倍に増加させる。この系は、正確な切断生成物が生成することが示されており、また、この様式で作製されたｓｇＲＮＡの有効性が現在試験中である（図２３）。最後に、マウスｓｇＲＮＡライブラリーは、必要であれば現在Ｄｈａｒｍａｃｏｎから商業的に入手可能である。Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、遺伝子特異的ｃｒＲＮＡおよび共通のｔｒａｃｒＲＮＡの同時トランスフェクションを含め、上で使用したキメラｓｇＲＮＡの活性の５０％しか有さなかった（データは示していない）。上首尾であれば、次のステップを設計し、全ゲノムｓｇＲＮＡライブラリーをスクリーニングする。
【０３０７】
２．それがノックダウンされることによりＲＧＣ生存が改善される遺伝子を同定するために、ｓｉＲＮＡライブラリーをスクリーニングし、標的キナーゼネットワークに群分けする。
【０３０８】
キナーゼがＲＧＣ細胞死において重要な役割を果たすとしても、阻害された場合には、その表現型は重複している／代償的なキナーゼによって遮蔽される可能性がある。感度を増したスクリーンがこの限定を回避するための１つの手法であったが、重複している対の既知の１種のメンバー（例えば、ゲノムワイドなスクリーンにおけるＬＺＫ）に依拠するものであった。代替として、より不偏的な手法、ウェル毎に、重複しているシグナル伝達ネットワークの一部であり得ることに起因して群分けされた多数のキナーゼを同時に標的にするｓｉＲＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。ＳｉｇｍａカイノームｓｉＲＮＡライブラリーを最初に利用し、６２３種のミニプール（遺伝子当たり３種のｓｉＲＮＡ）に凝縮し、次いで、ミニプールを新規の組合せに組み合わせる。全ての対キナーゼの組合せを試すことは実行可能ではないので（６２３２）、３つの別個のバイオインフォマティクス手法を利用してミニプールのプールを創出する。第１に、および概念的に最も単純に、相同性の程度が最も高いキナーゼ（例えば、ＪＮＫ１、２および３）を標的にするｓｉＲＮＡを一緒に群分けする。ＥＮＳＥＭＢＬデータベースに基づいて、ＳｉｇｍａカイノームｓｉＲＮＡライブラリー内の４８８種の遺伝子は、別のメンバーと有意な相同性を共有し、１６２６対が導かれた（所与の遺伝子は１種よりも多くの他のメンバーと相同であり得るので）。数をより管理しやすくするために、これらの対を、群当たり４種のメンバーの中央値で１１１群にさらにクラスター化した。第２に、基質のスペクトルが重複するキナーゼは、重複する可能性がある。４，１９１種の独特の全長ヒトタンパク質で構成されるタンパク質マイクロアレイ上で２８９種のヒトキナーゼを用いたリン酸化反応を実施し、３，６５６種のキナーゼ−基質関係が同定された（４８）。分析に含めたＳｉｇｍａカイノームｓｉＲＮＡライブラリー内の１９８種の遺伝子のうち、２，０８９対が、それらの基質スペクトルが有意に重複した。キナーゼは１種よりも多くの他のキナーゼと重複するスペクトルを有する可能性があるので、これにより、群当たり１１種の遺伝子の中央値で、３，３８６種の潜在的な群がもたらされた。最後に、包括的なエピスタシスマップ（Ｅ−ＭＡＰ）を生成するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける１２１種のキナーゼ全て、およびそれらの対の組合せの全てが遺伝的相互作用についてアッセイされたという事実を利用した（４９）。これらの対遺伝的相互作用の一部がマウスにおいて保存されている可能性があることは理にかなっており、一部の場合では、重複している／代償的な経路メンバー（合成致死性相互作用の遺伝的基質）が示される。酵母ホモログを有するＳｉｇｍａライブラリー内の２２３種のキナーゼの中で１，６７４種の対キナーゼ相互作用が同定され、２種の遺伝子のサイズ中央値で１，００３群が生じた。全部で、４，５００のｓｉＲＮＡ群があり、最も大きな群は１９種のキナーゼを含有した。最後に、パイロット実験を実施して、その大部分が不活性である可能性が高い、最も多く標的を有する（例えば、１９種のキナーゼ）プールにより活性な対が希釈されないことを確実にした。ＤｌｋおよびＬｚｋ  ｓｉＲＮＡミニプールをトランスフェクトしたＲＧＣでは、不活性ｓｉＲＮＡで６４倍に希釈された場合であっても検出可能な表現型が生じたことが認められたことにより再保証された（図２４Ａ）。スクリーン自体を２連で行い、各プレートは、相乗作用に関しておよび正規化標準物質として陰性対照（Ｌｚｋ／Ｌｚｋ）および陽性対照（Ｄｌｋ／Ｌｚｋ）を含有する。生存データを、すでに生成しておいたシード補正因子を用いて調整し、多数の生存促進性ウェルに出現する組合せを探すことに注意を払う。次いで、これらのプールをデコンボリューションして、活性なメディエーターを同定する。最後に、二次的な確認には、Ｓｉｇｍａライブラリーで試験されていない配列を有する独立したｓｉＲＮＡの使用を伴う。
【０３０９】
キナーゼの組合せを生成するための我々の３つの手法により、少なくとも１種の公知の相互作用性キナーゼ（例えば、リン酸ネットワーク−ＪＮＫ１／２／３およびＭＫＫ４／７；ホモログ−ＪＮＫ１／２／３、ＭＫＫ４／７、およびＤＬＫ／ＬＺＫ；酵母Ｅ−ＭＡＰ−ＤＬＫ／ＬＺＫ）を含むリストが得られたことを確認した。また、スクリーンは数週間のうちに行うことができ、プロセスは反復することができ、スクリーンの結果から群分けアルゴリズムの改変が導かれる。実際のライブラリーの構築は、ピペットチップを使用せずに数時間のうちに全４，５００群をアセンブルすることができるＬａｂｃｙｔｅ  Ｅｃｈｏ  ５５０超音波液体ハンドラーを利用できることを考えると、比較的容易なはずである。単一のウェル中の非常に多くのｓｉＲＮＡの組合せにより多数のオフターゲット相互作用が導かれる可能性があることが１つの障害になり得る。相補的なまたは代替の戦略として、ｓｉＴＯＯＬＳ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して、ｓｉＰＯＯＬを使用したマウスカイノームライブラリーを築くことができる。これには、オンターゲット効果が３０倍に濃縮されるという利点があると思われる。実際に、Ａ４３９細胞に、キナーゼを標的にするｓｉＲＮＡと、それに対してｓｉＰＯＯＬとをトランスフェクトし、生存についてアッセイし、同じ遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡのＲ２はたった０．１９であった（図２４Ｂ）。対照的に、同じ遺伝子を標的にする独立したｓｉＰＯＯＬのＲ２は０．７１であった。
【０３１０】
３．上の節１または２からの検証されたヒットがＤＬＫ／ＬＺＫシグナル伝達に影響を及ぼすかどうかを決定する。
【０３１１】
ＤＬＫおよびＬＺＫを用いて行ったものと同様に（図１９Ｅ）、ＲＧＣを、検証されたキナーゼを標的にするｓｉＲＮＡ、ｓｉＰＯＯＬまたはｓｇＲＮＡ（上の節１および２からのもの）単独で、またはＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬ（細胞の経路阻害への感度を増すため）と組み合わせてトランスフェクトし、２４〜４８時間の時点でリン酸化ＭＫＫ４、ＭＫＫ７（ＤＬＫ／ＬＺＫの直接基質）、ＪＮＫおよびＪＵＮについて免疫ブロットする。それがノックダウンまたはノックアウトされることによりＪＮＫ経路シグナル伝達が抑制されるキナーゼを潜在的なＤＬＫ／ＬＺＫの上流活性化因子とみなす。ＭＫＫ／ＪＮＫリン酸化に影響を及ぼすことなく生存を促進するものは、それがＲＧＣ細胞死を誘発するために十分であるので、ＤＬＫに対する感度を低下しているに違いない。
【０３１２】
選択されていない集団全体においてｓｉＲＮＡの効果を検出することは容易であるが、ｓｇＲＮＡは、細胞の１００％ではノックアウトが生じないので、より難しい。この問題に取り組むために、ＲＧＣをｓｇＲＮＡでトランスフェクトし、強力な選択圧力をもたらし、ノックアウト細胞を濃縮するためにコルヒチンを用いた標準の９６時間プロトコールに供す。次いで、残りの細胞数に応じて、ＪＮＫ経路の状態を、ＪＮＫリン酸化についての免疫ブロッティングまたはリン酸化ＪＵＮに対する抗体を使用した免疫蛍光法によって測定する。
【０３１３】
４．節１または２からの検証されたヒットがＤＬＫおよびＬＺＫの上流または下流で遺伝的に機能するかどうかを決定する。
【０３１４】
ＲＧＣを節３におけるものと同様にトランスフェクトし、次いで、十分な選択時間の後、残りの細胞を、野生型ラットＤＬＫまたはヒトＬＺＫを過剰発現するアデノウイルスで攻撃する。ＤＬＫ／ＬＺＫの上流にある遺伝子は、それらのノックダウン／ノックアウト表現型がＤＬＫ／ＬＺＫ過剰発現で逆転しているはずである。相補的手法として、候補キナーゼ（キナーゼを構成的に活性なものにする任意の公知の突然変異体を含む）のｃＤＮＡを過剰発現するアデノウイルスを産生し、それらの過剰発現によりＲＧＣ細胞死が促進されるかどうか、およびそれがＤＬＫ／ＬＺＫ阻害剤および／またはＤｌｋ／Ｌｚｋ  ｓｉＲＮＡによって遮断され得るかどうか（ＤＬＫ／ＬＺＫの上流で機能する場合に予測される）を試験する。
【０３１５】
我々の容易に利用可能な野生型ラットＤＬＫ発現アデノウイルスおよび真に構成的に活性というわけではない突然変異体を用いた生存表現型の逆転を実施することができる。生存表現型を逆転させることができる場合、活性が増大していると考えられるＤＬＫ突然変異体（Ｓ５８４Ａ／Ｔ６５９Ａ）をサブクローニングし、発現させる（５０）。最後に、上の節１の主要な目的は、ＤＬＫおよびＬＺＫの上流活性化因子を同定することであるが、ＤＬＫ／ＬＺＫの下流で／それらとは独立して機能すると思われるキナーゼを探求する。
【０３１６】
５．節１または２からの検証されたヒットにより、軸索再生が影響を受けることなく生存が促進されるかどうかを決定する。
【０３１７】
ＲＧＣを、検証されたキナーゼを標的にするｓｉＲＮＡ、ｓｉＰＯＯＬまたはｓｇＲＮＡ（節１および２からのもの）単独で、またはＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬ（細胞の経路阻害への感度を増すため）と組み合わせてトランスフェクトし、７２時間後、カルセインＡＭを用いて染色した。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ自動顕微鏡を使用して、細胞をイメージングし、全体的な神経突起の長さを算出する。理想的には、その阻害により、神経突起伸長が影響を受けることなく生存が促進される遺伝子を同定する。
【０３１８】
神経突起伸長アッセイによりｉｎ  ｖｉｖｏにおける再生を予測できることを確認するために、我々は、ＤＬＫ／ＬＺＫ阻害剤および／またはｓｉＲＮＡで処理した一次ＲＧＣでは、対照で処理した細胞と比較して、神経突起の長さが劇的に減少したことを以前に示した（図２４Ｃ）。さらに、節２の相補的実験を使用して、我々の発見のｉｎ  ｖｉｖｏ関連性を検証することができる。
【０３１９】
６．ＲＧＣにおける標的遺伝子機能をｉｎ  ｖｉｖｏでノックアウトするための、ＡＡＶ送達に適合するＣＲＩＳＰＲ系の開発。
【０３２０】
スクリーニング研究により、ＲＧＣにおける多数の神経保護標的が以前同定され、節１および２に概説されている手法により、候補の一覧がさらに拡大される。追加的なステップは、これらのヒットを視神経症の齧歯類モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで検証すること、検証されたヒットに優先順位を付けること、および、その後、優先順位が付けられた標的の特異的な阻害剤を開発することを含む。潜在的に理想的な手法は、ヒットを直ちに検証すること（すなわち、ノックアウトマウスを創出／入手する必要なくｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子をノックアウトすること）、および、後にそれ自体を治療薬として機能させることの両方が可能な、遺伝子療法に基づく戦略である。図１９Ｇ〜Ｊにおいて実証されている通り、ＣＲＩＳＰＲに基づく系をＲＧＣにおいて使用して、遺伝子機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで頑強に破壊することができる。ＲＧＣのｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集において、ＡＡＶ２のＲＧＣに有効に形質導入する能力を利用して、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用する（９、１０）。残念ながら、ＡＡＶカプシドのパッケージング容量が約４．８ｋｂであり、それにより、ｓｐＣａｓ９発現カセット（約４．８ｋｂ）とｇＲＮＡ発現カセット（約０．４ｋｂ）の両方を単一のウイルス中で送達することは妨げられてきた。ＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲ系はｉｎ  ｖｉｖｏで使用されているが、１）遺伝子療法として最適以下である、２種の異なるＡＡＶの使用（５１）、または；２）より限定的なＰＡＭを有し、また、潜在的な標的部位の数が４分の１である、より小さなＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）の使用（５２）に依拠しなければならなかった。この問題は、ｇＲＮＡが、一般には、グアニンから開始し、標的部位をＧＮ１９ＮＧＧ（ｓｐＣａｓ９）またはＧＮ１９ＮＮＧＲＲＴ（ｓａＣａｓ９）に限定するＵ６プロモーターから離れて発現するという事実によって悪化する。最近、アデニンまたはグアニンのいずれかから開始し得るＨ１プロモーターでは潜在的なＣａｓ９標的の数が倍増することが示された（５３）。天然には、Ｈ１プロモーターは、その標準的なＰｏｌ  ＩＩＩ転写物であるＨ１ＲＮＡの転写を一方の方向に駆動し、他方の方向に、Ｐａｒｐ２と称される遍在的に発現するＰｏｌ  ＩＩ転写物の転写を駆動する（５４、５５）（図２８Ａ）。この小型の（約０．２ｋｂ）双方向Ｈ１アーキテクチャにより、ｓｐＣａｓ９およびｇＲＮＡを単一のプロモーターから発現させること、および単一のＡＡＶベクター中にパッケージングすることが可能になる。
【０３２１】
この系を試験するために、Ｈ１プロモーターを使用してｍＣｈｅｒｒｙ−ヒストン２Ｂ融合物をＰｏｌ  ＩＩ方向に発現させ、ＢｇｌＩＩ部位を好都合に標的にする（図１９Ｇおよび１Ｈ）Ｄｌｋ＃４  ｇＲＮＡ（５’ＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＴＮＮＮＧＧ３’（配列番号１６３））をＰｏｌ  ＩＩＩ方向に発現させるＡＡＶ構築物を生成した（Ｄｌｋ  ｇＲＮＡ：Ｈ１：Ｈ２Ｂ−ｍＣｈｅｒｒｙ）。総サイズが２．４ｋｂを下回るので、末端逆位配列の一方を突然変異させて、遺伝子発現を増大および促進することが公知である自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶを生成した（５６）。ウイルス粒子を生成し、ｓｐＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ＧＦＰノックインマウスから単離した一次ＲＧＣへの形質導入に使用した。トザセルチブの存在下で（細胞死を防止し、選択を回避するため）、わずか５日後に、ほぼ１００％の形質導入（図２５Ｂ、左側）および９０％を超えるＢｇｌＩＩ部位の消失、すなわち遺伝子編集（図２５Ｂ、右側）を伴う頑強なレポーター発現が観察された。別々に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ｓｐＣａｓ９およびｇＲＮＡを単一のＨ１プロモーターから発現させるプラスミド（非ウイルス）をトランスフェクトし、それにより、従来の２ベクター系と同等の頑強なカットが導かれることが示された（図２５Ｃ）。総合して、これらの試験により、ｓｃＡＡＶ系（節８、９、および１５で利用される）および双方向Ｈ１プロモーターのＰｏｌ  ＩＩ／ＩＩＩ−コンピテンスが検証される。下記の通り、ｓｐＣａｓ９およびｇＲＮＡの両方を発現する単一のＡＡＶ送達系を生成した。一部の実施形態では、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶの配列は、配列番号１３９８〜１４００からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
【０３２２】
形質導入後のＲＧＣの分析を補助するために、フローサイトメトリーを、マウスＲＧＣを数量化し、特徴付けるための方法に基づいて開発した。網膜を単離し、解離させ、アセトンで固定し（核酸の品質を保存するため）、次いで、ＲＧＣ抗原であるγ−シヌクレイン（ＳＮＣＧ）およびβ−ＩＩＩ−チューブリン（ＴＵＪ１）に対する抗体を用いて染色した。ＳＮＣＧ＋／ＴＵＪ１＋２重陽性細胞は、追加的なＲＧＣマーカーであるＴｈｙ１．２およびＮｅｕＮに関しても染色される（図２６Ａ）、それらの生存が視神経挫滅後に低減する（図２６Ｂおよび２５Ｃ）、ならびに精製された一次ＲＧＣが同様のプロファイルを有する（図２６Ｂ）という所見によって確認される通り、ＲＧＣを表す。しかし、Ｔｈｙ１．２およびＮｅｕＮとは異なり、ＳＮＣＧおよびＴＵＪ１の発現は軸索傷害によって下方制御されず（データは示していない）、したがって、これらは、視神経症のモデルにおいて有用なマーカーのままである。最後に、当該方法は、細胞選別に適合し、選別された細胞が、イムノパニングされたＲＧＣ、およびインタクトなＲＮＡ／ＤＮＡと非常に類似したプロテオミクスプロファイルを有することが示された（データは示していない）。
【０３２３】
７．ｓｐＣａｓ９ノックインマウスにおいて、ｓｃＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲに基づく手法を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子を標的にできることの原理証明としてＤｌｋをノックアウトする。
【０３２４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで検証されたウイルスを使用し（図２５Ｂ）、ウイルス力価をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて最適化する。ｓｐＣａｓ９−２Ａ−ＧＦＰを発現するマウスに、ウイルスを、１μＬ当たりウイルス粒子１０１０個、１０９個、１０８個または１０７個で片側硝子体内注射（約１μＬ）する（群当たりマウス４匹）。ＡＡＶ生活環が完了するのに十分な時間がもたらされる２週間後、ＲＧＣを上記の通り数量化し、選別する。
【０３２５】
最後に、ゲノムＤＮＡを精製し、最適な力価（すなわち、ＲＧＣ毒性を引き起こすことなく最大量のカット）を決定するために、ＢｇｌＩＩ消化の消失によって測定されるＤｌｋの破壊についてアッセイする。最終的なステップにおいて、ｓｐＣａｓ９を発現するマウスの一方の眼に、最適用量のｓｃＡＡＶ２−Ｄｌｋ  ｇＲＮＡ：Ｈ１：Ｈ２Ｂ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはＤｌｋ  ｇＲＮＡの代わりに非標的化ｇＲＮＡを発現する対照ウイルスを硝子体内注射する。２週間後、眼に、３秒の視神経挫滅（脈管構造が損なわれないように）または偽対照手順を行い、さらに２週間後に、４群（群当たりｎ＝１０の網膜）における生存をＳＮＣＧ／ＴＵＪ１フローサイトメトリーによって測定する。以後に、この系が適合するものであるかを、ＲＧＣが有効に形質導入されることが示されている手法であるＡＡＶ９ベクターの静脈内投与を用いて試験する（５７、５８）。
【０３２６】
すでに記載されているｆｌｏｘｅｄ  Ｄｌｋマウス実験に基づいて、Ｄｌｋの標的化破壊によりＲＧＣ生存が改善されることが分かっている（５）。さらに、ＣＲＩＳＰＲに基づくノックアウトがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて機能することが分かっている。したがって、Ｄｌｋ  ｇＲＮＡを用いて形質導入したＲＧＣにおいて生存の増大が検出される可能性が非常に高いと思われる。＞５０％のカットまたは生存表現型が見られない場合、ｍＣｈｅｒｒｙを発現するＡＡＶ形質導入された細胞を分析する。これは、フローサイトメトリー技法は現在４チャネルと同程度に機能しているので、容易に実現可能なはずである（図２６Ａ）。
【０３２７】
８．ＳＡ１で同定されたヒットが、マウス視神経挫滅モデルにおけるＲＧＣ細胞死のメディエーターであることを検証するために、ｓｃＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲ系を使用する。
【０３２８】
それがノックダウンまたはノックアウトされることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＲＧＣ生存が改善されることが同定された遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｇＲＮＡを用いて標的にし、節７でＤＬＫについて記載されている通り試験する。ＤＬＫの上流で機能すると思われる、または再生に影響を及ぼさないと思われるこれらの遺伝子に優先順位を付ける。ＤＬＫを用いて行ったものと同様に、各標的遺伝子に対する多数のｇＲＮＡを一次ＲＧＣにおいて試験して、ＡＡＶ系に進めるのに最も効果的なものを同定する。最後に、ＤＬＫの上流にあると仮定された標的を、網膜フラットマウントをリン酸化ＪＵＮおよびＤＬＫについて免疫染色することによって検証して、それらにより経路がｉｎ  ｖｉｖｏで抑制されるかどうかを決定する（５）。
【０３２９】
節１で得られた遺伝子は、スクリーンにより活性なｇＲＮＡが同定されるので、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験しやすいはずである。しかし、スクリーンはＬｚｋ  ｓｉＰＯＯＬを用いて感度を増したので、ｉｎ  ｖｉｖｏでの表現型にはＬＺＫまたはＤＬＫ阻害が必要であることが考えられる。幸運にも、Ｌｚｋコンディショナルノックアウトを作製した際、最初にヌル対立遺伝子を生じさせる戦略を使用した。さらに、Ｄｌｋ−ヌルマウスを用いた状況とは異なり（５９）、Ｌｚｋ−ヌルマウスは、生存可能であり、繁殖性であった。したがって、Ｌｚｋ−ヌルマウスをｓｐＣａｓ９ノックイン系統と交配させて、節１のヒットを確認するためにより適した系統であるＲｏｓａ２６Ｃａｓ９／Ｃａｓ９Ｌｚｋ−／−マウスを産生した。
【０３３０】
節２で同定された遺伝子は、多数の遺伝子を同時に破壊することを必要とする可能性があるので、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて検証することがより困難であり得る。これらのためには、小さなサイズの構築物、および、別のｇＲＮＡの追加的なＨ１駆動性発現を適応させることができ、それでも同じｓｃＡＡＶ設計が保持されるという事実を利用する。これにより、１つのウイルスベクターを用いて２種の遺伝子をノックアウトすることが可能になる（節１１でさらに考察する）。今後の取り組みでは、遺伝子のネットワークを標的にするために、２種よりも多くのｇＲＮＡを使用すること（ｍＣｈｅｒｒｙの代わりにまたは一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ設計において）試みることができる。
【０３３１】
９．節５で同定されたヒットが再生に影響を及ぼさないことを検証するために、改変ｓｃＡＡＶ２／ＣＲＩＳＰＲ手法を使用する。
【０３３２】
視神経挫滅後のＲＧＣ再生の基礎レベルは極めて低いが、ＰＴＥＮを阻害することによって増強することができ、しかし、ＰＴＥＮおよびＤＬＫを同時に阻害した場合には増強されない（６）。節５で同定された候補の阻害により、再生に影響を及ぼすことなく（ＤＬＫとは異なり）ＲＧＣ生存が促進されるかどうかを試験するための１つの手法として、各候補遺伝子についてノックアウトマウスを得、それらをＰｔｅｎｆｌ／ｆｌバックグラウンドで育種した−これは、時間および労力が法外なものである。その代わりに、ｉｎ  ｖｉｖｏノックアウト手法を使用して、目的の遺伝子を標的にするｇＲＮＡを標準の双方向Ｈ１プロモーターからＰｏｌ  ＩＩＩ方向に発現し、Ｈ２Ｂ融合を伴わないｍＣｈｅｒｒｙ（軸索を可視化するため）をＰｏｌ  ＩＩ方向に発現するｓｃＡＡＶを生成する。第２のＨ１プロモーターによりＰｔｅｎ  ｇＲＮＡを発現させる。ｓｐＣａｓ９を発現するマウスの一方の眼に、最適用量のｓｃＡＡＶ２−Ｘ  ｇＲＮＡ：Ｈ１：ｍＣｈｅｒｒｙ；Ｈ１：Ｐｔｅｎ  ｇＲＮＡ（Ｘは非標的化ｇＲＮＡ（再生の防止についての陰性対照）、Ｄｌｋ＃４  ｇＲＮＡ（再生の防止についての陽性対照）または節５からの候補を標的にするｇＲＮＡのいずれかである）を硝子体内注射する。２週間後、眼に、３秒の視神経挫滅（脈管構造が損なわれないように）を行う。最後に、さらに２週間後、３群からの視神経（群当たりｎ＝１０の視神経）を回収し、縦方向に切開し、挫滅部位を越えて伸長しているｍＣｈｅｒｒｙ陽性軸索の数を数量化する。
【０３３３】
Ｐｔｅｎ欠失の再生表現型が不十分な場合には、Ｓｏｃｓ３を用いた効果を強化することができる（３３、３５、６０）。再生におけるＤＬＫの役割に関する後世に影響を与える研究ではＰｔｅｎ（組み合わせたＰｔｅｎ／Ｓｏｃｓ３ではなく）欠失が使用されたので、これらの実験は代替として提唱される（６）。複対立遺伝子破壊は、意欲的なものであり、低頻度で起こり得る。幸運にも、小型のＨ１プロモーターには、２つのＨ１プロモーターおよびｓｃＡＡＶ設計を用いたとしても、ほぼ１ｋｂのパッケージングの余地が残り、これにより、蛍光タンパク質に基づくレポーターをＣＲＩＳＰＲ編集のために操作することが可能になる（６１）。
【０３３４】
１０．治療上適切なｓｓＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲに基づく手法を使用して、野生型マウスにおける遺伝子を標的にできることの原理証明としてＤｌｋをノックアウトする。
【０３３５】
節７および８に概説されている実験では、ｓｃＡＡＶの頑強性を活用し、生物学的性質の迅速な検証が可能になるが、ｓｐＣａｓ９ノックインマウスに依拠するので、治療上有用ではない。相補的手法として、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの発現を駆動するためにＨ１プロモーターの双方向特徴を使用し、それにより、両方のカセットを単一のウイルスベクター中にパッケージングすることを可能にする。当該戦略では、野生型ＡＡＶと同等のサイズの挿入断片が可能になるが、ｓｃＡＡＶには大きすぎる。したがって、ｓｓＡＡＶ２−Ｄｌｋ  ｇＲＮＡ：Ｈ１：ｓｐＣａｓ９粒子を、動物がｓｐＣａｓ９を発現しないこと（ここではウイルスによってもたらされるので）以外は節７に記載されている通り調製し、試験する。ウイルスを緑内障モデルにおいて試験し、視覚の機能的測定基準を含める。重要なことに、ＤｌｋおよびＲＧＣが焦点とされてきたが、これらのデータは、さらにいっそう広範に広がる影響を有すると思われる−ゲノムを修飾し、病態に対する抵抗性を増大させるための、単一のＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲウイルスの使用。
【０３３６】
二対立遺伝子破壊を受けている細胞のパーセンテージは、視神経挫滅モデルにおける生存の増大を確実に検出するためには不十分であり得る。現在まで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用してほぼ２０カ所のＤｌｋ標的部位がサンプリングされており、＃４（節６で使用）よりもはるかに良く機能する部位は見出されていない。Ｄｌｋの単一対立遺伝子破壊であっても、二対立遺伝子破壊によって付与される頑強な保護よりも小さくはあるが、生存が増大し得る（３７）。この単一対立遺伝子Ｄｌｋ破壊に対する細胞の感度を増すために、Ｌｚｋ−ヌルマウスを使用して実験を繰り返すことができる。相補的戦略により視神経挫滅からＲＧＣ数量化までの時間が延長される。実験は一般には２週間で停止される（ＲＧＣの約７５〜８０％が死滅した時）が、次の１〜２週間で持続的な消失が起こり、最終的に約９０〜９５％細胞死のプラトーに達する。細胞の５％しかＤｌｋの二対立遺伝子破壊を有さなくても、１カ月の時点で生存細胞の数の５０〜１００％の相対的増加が生じ得る（２週間の時点での２０〜２５％の増加と比較して）。最後に、Ｄｌｋ  ＃４標的部位が好ましいが（ＢｇｌＩＩ部位が理由で）、マウスおよびヒトにおいて正確に同じ配列を有し、したがって、動物モデルでヒト治療薬を試験することが可能になる＃５を用いて実験を繰り返すことができる。
【０３３７】
１１．節１０で開発されたＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲ治療薬によって生じるオフターゲットを測定する。ｓｐＣａｓ９がＰＡＭより遠位にあるプロトスペーサーのポーションではよりよくミスマッチを許容することが十分に確立されており（６２、６３）、したがって、最も可能性が高いオフターゲットは、保存された３’配列および５’末端の１〜２つのミスマッチを有する。
【０３３８】
ＢｇｌＩＩ部位はカット部位（３’）の近くに位置するので、＃４  ｇＲＮＡについての可能性が高いオフターゲットほぼ全てがＢｇｌＩＩ部位を保持する。節１０で得られたゲノムＤＮＡおよび図１９Ｈに記載されているＢｇｌＩＩアッセイを使用して、最も可能性が高いオフターゲット部位におけるカットを数量化することができる。
【０３３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける特異性（図１９Ｈ）が有望であるので、オフターゲットカットが問題になり得る。その場合、最近記載された突然変異の２つのセット（ｓｐＣａｓ９−ＨＦ１−Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ｅＳｐＣａｓ９−Ｋ８１０Ａ  Ｋ１０３Ａ、Ｒ１０６０Ａ）のうちの１つをｓｐＣａｓ９に使用することができ、それにより、特異性が改善される（６４、６５）。代替は、別のｇＲＮＡ配列を試験することであるが、オンターゲットカットおよびオフターゲットカットの測定は、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイおよび配列決定のようなより労力を要する方法で行われることになる。この観念の変形形態は、＃４  ｇＲＮＡの５’末端の１〜３ヌクレオチドを短縮することであり、これは、特異性が改善されることが示されている技法である（６６）。幸運にも、＃４  ｇＲＮＡはＧＡＡＧから開始し、したがって、これらの短縮はいずれも、Ｈ１プロモーター（ＡまたはＧから開始する）になお適合する。最後に、Ｈ１により発現されたｇＲＮＡで生じるオフターゲットカット率は低い可能性があることに言及する価値がある（５３）。
【０３４０】
１２．Ｃａｓ９および２種のｇＲＮＡを単一ベクターで送達するＡＡＶ／ＣＲＩＳＰＲ治療薬を開発する。
【０３４１】
Ｈ１プロモーターを使用することにより、Ｄｌｋ  ｇＲＮＡ：Ｈ１：ｓｐＣａｓ９のサイズは４．５ｋｂになり、野生型ウイルスの４．７〜４．８ｋｂのサイズおよびＡＡＶパッケージング限界の５．２ｋｂを十分に下回る。これにより、節１０において提唱された構築物を追加的なＨ１−ｇＲＮＡカセット（約０．２ｋｂ）で修飾する機会がもたらされる。２種のｇＲＮＡを単一のウイルスから発現させること（ｓｐＣａｓ９に加えて）により、より特異的な「ニッカーゼ」突然変異型ｓｐＣａｓ９の使用（６７）、単一の遺伝子における大きな欠失の生成、および、我々の研究のテーマに関連して、２種の代償的な遺伝子を同時に標的にすることを含めた、いくつかの可能性が広がる。これを試験するために、Ｈ１：Ｌｚｋ  ｇＲＮＡ  ＃１を節１０に記載されている構築物に対して発現カセットに追加し、ｓｓＡＡＶ２−Ｄｌｋ  ｇＲＮＡ４：Ｈ１：ｓｐＣａｓ９；Ｈ１：Ｌｚｋ  ｇＲＮＡ５ウイルス粒子を生成する。これらを節１０に記載されている通り試験し、今回はＤｌｋを単独で、またはＬｚｋと組み合わせて標的にするウイルスと比較する（群当たりｎ＝１０の網膜）。
【０３４２】
この構築物のサイズはＡＡＶのパッケージング容量の限界を超える（野生型ウイルスを０．１ｋｂ未満上回るに留まるが）。これが問題になる場合、より低分子のマウスＨ１プロモーター（同じく双方向的に機能する）、または、ｓｐＣａｓ９よりもほぼ１ｋｂ小さいｓａＣａｓ９を使用することができる（５２）。後者の手法では、＃４部位と＃５部位はいずれもｓａＣａｓ９  ＰＡＭ要件に適合しないので、異なる標的部位が必要になる。
【０３４３】
１３．ＤＬＫによりＭＥＦ２Ａが調節されてＲＧＣ細胞死が促進される機構を探究する。
【０３４４】
ＭＥＦ２Ａは、筋肉の分化および心血管生理機能において、十分に試験された役割を有する（６８）。ニューロンでは、ＭＥＦ２Ａは、生存の促進において決定的な役割を果たすことが示されており（２７）、また、Ｍｅｆ２ａの脳特異的コンディショナルノックアウトは全体のニューロン生存には影響を及ぼさないが、Ｍｅｆ２ａ／ｃ／ｄの組合せノックアウトでは、ニューロンアポトーシスの明らかな増大が示され、生後初期の致死性が導かれる（３０）。興奮毒性刺激に応答して、皮質ニューロンは、ＭＥＦ２Ａシグナル伝達を阻害し、アポトーシスを促進するために２つの機構を利用する：ドミナントネガティブな活性がもたらされる、ＭＥＦ２Ａのカスパーゼにより触媒される切断（６９）およびトランス活性化ドメインの不活化を導くＭＥＦ２ＡのＳ４０８のサイクリン依存性キナーゼ５（ＣＤＫ５）リン酸化（７０）、または、特に樹状／シナプス生理機能の場合では、その後のＫ４０３におけるＳＵＭＯ化および転写抑圧された形態のＭＥＦ２Ａの形成（２９、７１）。これらの場合のそれぞれにおいて、ＭＥＦ２Ａによりニューロン生存が促進され、ＭＥＦ２Ａの阻害により、細胞死が導かれる。対照的に、ＭＥＦ２Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＲＧＣ細胞死のメディエーターとして同定された（図２０Ｆおよび２０Ｇ）。ｆｌｏｘｅｄＭｅｆ２ａ  ＲＧＣの生存をｆｌｏｘｅｄＭｅｆ２ａ／ｃ／ｄ  ＲＧＣと比較したところ（３０）、差異は見られず（データは示していない）、これにより、ＭＥＦ２ＡがＲＧＣ細胞死を促進するためにＭＥＦ２Ｃ／Ｄに干渉しなかったことが示唆される。最後に、頑強なＤＬＫ依存性のＭＥＦ２Ａ  Ｓ４０８リン酸化が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて視神経損傷に応答して、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてイムノパニングに応答して検出されたが、リン酸化可能でないＳ４０８Ａ突然変異体は活性に干渉しない（図２０Ｉ）。総合して、これらの結果から、ＤＬＫ活性化により、細胞死に関与する新規のＭＥＦ２Ａ変更が導かれることが示唆される。
【０３４５】
１４．プロテオミクス手法を使用して、ＭＥＦ２ＡにおけるＤＬＫ依存性翻訳後修飾を同定する。
【０３４６】
ＤＬＫ／ＬＺＫによりＭＥＦ２Ａが調節される機構を同定するために、ＭＥＦ２Ａを、ａｄｅｎｏ−Ｃｒｅ（ＤＬＫ／ＬＺＫシグナル伝達を除去するため）、ａｄｅｎｏ−ＧＦＰ（活性なＤＬＫ／ＬＺＫシグナル伝達を有する）、野生型ラットＤＬＫ（経路を超活性化する）またはｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄラットＤＬＫ（ドミナントネガティブとして機能する）を用いて形質導入したｆｌｏｘｅｄ  Ｄｌｋ／Ｌｚｋ一次ＲＧＣから精製した。リン酸化残基およびこれらの部位のそれぞれにおけるリン酸化の相対的存在量は、タンデム質量タグ（ＴＭＴ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）数量化および我々のグループが利用可能ないくつかのＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１つでの液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析によって決定される。この手法により、ＭＥＦ２Ａシグナル伝達において役割を果たすことがすでに分かっているＳＵＭＯ化およびアセチル化のような他の翻訳後修飾を分析することも可能になる（２９、７１）。ＤＬＫ／ＬＺＫの存在に依存して現れる変化、特に経路の超活性化に伴って増大するものを節１５で追跡する。
【０３４７】
ＭＥＦ２Ａ翻訳後修飾を我々の疾患関連、一次細胞系に関してアッセイすることを考慮すると、最も大きな難題は出発材料の量であり得る。この問題を回避するために、３〜５，０００，０００個のＲＧＣを常套的に単離することができ、これは、ＩＰの複雑さが少ない（すなわち、１種のタンパク質についてのみ調べる）ことを考慮すると十二分である。十分なＭＥＦ２Ａタンパク質を得ることができない場合、エピトープタグを付けたＭＥＦ２Ａの過剰発現を使用することができる。第２に、既知および未知の両方の潜在的なＭＥＦ２Ａリン酸化部位を標的にする多重反応モニタリング（ＭＲＭ）手法を介して、これらの種についてのＭＲＭアッセイの第１の最適化後に、ＭＳ分析の感度および正確度を増大させることができる（７２、７３）。多数の同時の部位におけるリン酸化が、ＤＬＫ／ＬＺＫによるＭＥＦ２Ａ調節にとって重要である場合、インタクトなトリプシン処理していないＭＥＦ２Ａに対してトップダウン型プロテオミクス手法を使用して、リン酸化の多重性を決定することができる。
【０３４８】
１５．突然変異と機能獲得／機能喪失実験の組合せを使用して、プロテオミクスにより同定された翻訳後修飾を検証する。
【０３４９】
節１４で同定された翻訳後修飾を一次ＲＧＣ系で試験する。残基のそれぞれの突然変異体（例えば、Ｓ４０８Ａ）をマウスＭｅｆ２ａ  ｃＤＮＡ中に工学的に作製し、上に多数回記載されている通りアデノウイルスベクター中にシャトルする。次いで、ＲＧＣをｆｌｏｘｅｄＭｅｆ２ａマウスから単離し、生存を促進し、内在性ＭＥＦ２Ａを除去するためにアデノウイルス−Ｃｒｅ（ＭＯＩ  １０００）を用いて形質導入する。４８時間後に、アデノウイルスを使用して野生型ＭＥＦ２Ａまたは修飾できない突然変異体を再導入する。ＭＥＦ２Ａ依存性死滅のために翻訳後修飾が必要な場合、突然変異体は機能喪失型であることが予想される。さらに、野生型ＤＬＫ（経路を超活性化し、ＲＧＣ細胞死を加速する）の過剰発現を突然変異体と組み合わせて使用して、これらがドミナントネガティブな活性を有するかどうか（すなわち、修飾がＤＬＫシグナル伝達によりＭＥＦ２Ａが活性化される機構の一部であるかどうか予測される通り）を判断する。最後に、少なくともｐｈｏｓｐｈｏｓｉｔｅの場合では、リン酸化模倣突然変異（例えば、Ｓ４０８Ｅ）を工学的に作製し、これらが、組合せＤＬＫ／ＬＺＫ阻害（ｓｉＲＮＡを使用する）の状況であっても、構成的活性を獲得し、細胞死を促進するかどうかを試験する。
【０３５０】
１６．ＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶ戦略を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭｅｆ２ａの標的化破壊によりＲＧＣ生存が促進されるか、および軸索再生への影響が伴わないかを試験する。
【０３５１】
ＤＬＫは、細胞死および軸索再生のどちらにおいても重要な役割を果たすが、細胞死シグナルを媒介する４種の下流の転写因子を同定した。それらのうちの少なくとも２種（すなわち、ＳＯＸ１１およびＪＵＮ）は再生における役割が分かっているが、ＭＥＦ２Ａの役割は分かっていない。したがって、ＭＥＦ２Ａは、生存と再生を分離する潜在的な神経保護標的であり得る。実際に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＭＥＦ２Ａノックダウンは、神経突起伸長に大きく影響を及ぼさないと思われる（データは示していない）。通常、転写因子であるＭＥＦ２Ａは容易にドラッガブルなものではないので、この一連の調査の有用性は限られたものになる。しかし、節１０に概説されている戦略により、ＭＥＦ２Ａのような遺伝子を治療標的にすることが可能になる。さらに、多数の遺伝子をノックアウトし、さらには活性なＣＲＩＳＰＲ編集を有する細胞を選択的に標識する、節９に記載されている手法により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＥＦ２Ａの生物学的性質を容易に試験する機会がもたらされる。したがって、ｓｐＣａｓ９−２Ａ−ＧＦＰノックインマウスに、Ｍｅｆ２ａ、Ｄｌｋ（再生の防止についての陽性対照）を標的にするように修飾された、または非標的化対照（再生の防止についての陰性対照）の、節９に記載されているウイルスを用いて形質導入し、節９に記載されている通りアッセイする。
結論
【０３５２】
要約すると、ＤＬＫおよびＬＺＫによりＲＧＣ細胞死が促進される上流および下流の機構をさらに探索することを目的とする実験のセットが本明細書に記載されている。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶ治療薬を使用することで、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける迅速な検証、および、最も重要なことに、高度に特異的な遺伝子療法に基づく治療薬へのシームレスな移行を可能にするプラットフォームが開発されてきた。実際に、ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲに基づく治療薬に関する極めて大きな興奮が存在するが、この分野は、ｓｐＣａｓ９とｇＲＮＡを同時に単一のウイルスベクター中にパッケージングすることができないという事実によって限定される。Ｈ１プロモーターを使用することで、この障害が克服されている。例として、ＤＬＫを使用することで、ゲノム修飾を視神経症において治療的に使用することができる。
標的：
DLK
エクソン1:
mm048414154:  AGGTCCAGGATTTCCTCAAAGGG  (配列番号143)
mm048414155:  ATCTAGAGTTCGAGCTGATGAGG  (配列番号144)
mm048414202:  GTGGGCGTCAGGTCTTTCTCGGG  (配列番号145)
エクソン2
mm048414070:  ACTTGAAAGTGATGATGTTGGGG  (配列番号146)
mm048414079:  GAAGAAGGTTCGAGATCTCAAGG  (配列番号147)
mm048414081:  GGAGGAGGTAGCTGTGAAGAAGG  (配列番号148)
mm048414082:  GGGACGCTTCCACGGGGAGGAGG  (配列番号149)
mm048414086:  GTTTTCCTGGGACGCTTCCACGG  (配列番号150)
mm048414094:  AGGTCCAGGATTTCCTCAAAGGG  (配列番号151)
LZK
エクソン1:
mm049598783:  ACGAAATGAGCTTGCAGCTATGG  (配列番号152)
mm049598824:  GTGGATGGAGAGAACACGAACGG  (配列番号153)
mm049598832:  GGCAGCGGCGGGTTTCTCGAAGG  (配列番号154)
mm049598833:  GGGTTTCTCGAAGGACTGTTTGG  (配列番号155)
エクソン2
mm049599350:  AGGAAATCTCAGAGCTGCAATGG  (配列番号156)
mm049599375:  GCAAGTGCCGACCTACTTGAAGG  (配列番号157)
mm049599764:  GACCTCGTACAGCTGTCCGTGGG  (配列番号158)
mm049599772:  GCAGCCGGGGCGTGATCTTCCGG  (配列番号159)
mm049599878:  GGATGGCACCAGAGGTGATCCGG  (配列番号160)
mm049599881:  GATCCGGAATGAGCCTGTCTCGG  (配列番号161)
mm049599884:  GGCTCATTCCGGATCACCTCTGG  (配列番号162)
（実施例５）
プロトコール
【０３５３】
ＨＥＫ２９３細胞をＴ２５フラスコに播種し、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を補充したＤＭＥＭ中で半集密になるまで成長させた。プレーティングの２日後、１つのフラスコ中の細胞に、プラスミドｐＡＡＶ−ＣＥＰ２９０をトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡ  ４ｕｇ、リポフェクタミン３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０ｕｌおよびＰ３０００試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０ｕｌを、添加剤を含まないＯｐｔｉＭＥＭ培地合計５００ｕｌ中に含有するトランスフェクション混合物を細胞培養培地に添加した。第２のフラスコ中の細胞を、パッケージングおよび精製されたＡＡＶ２−ＣＥＰ２９０のストック１００ｕｌに感染させた（２．０６ｅ１０＾１１ウイルスゲノム）。第３のＴ２５フラスコは処理せず、これは、対照としての機能を果たした。トランスフェクションまたは感染の４８時間後に細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ中に回収し、遠心分離によってペレット化した。各試料について、細胞ペレットをＰＢＳ２００ｕｌに再懸濁させ、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉキットを用いて製造者のプロトコールの通り処理した。ゲノムＤＮＡを水２００ｕｌ中に溶出させた。
【０３５４】
Ｔ７  ＥｎｄｏＩ分析のために、ゲノムＤＮＡを、細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に再懸濁させ、６５℃で２０分間インキュベートし、次いで、９８℃で２０分間インキュベートすることによって抽出した。抽出溶液を直接使用するかまたはＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して清澄化し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  ３０  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。ＣＲＩＳＰＲ標的部位の周囲のゲノム領域を、約１００ｎｇのゲノムＤＮＡからＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して増幅した。多数の独立したＰＣＲ反応をプールし、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して精製した。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ中１５０ｎｇのＰＣＲ産物を含有する２５μｌ体積を変性させ、ゆっくりと再アニーリングさせて、ヘテロ二本鎖を形成させた：９５℃で１０分、毎秒−１．０℃の勾配で９５℃から８５℃へ、８５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で８５℃から７５℃へ、７５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で７５℃から６５℃へ、６５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で６５℃から５５℃へ、５５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で５５℃から４５℃へ、４５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で４５℃から３５℃へ、３５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で３５℃から２５℃へ、次いで、４℃で保持。Ｔ７  ＥｎｄｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１μｌを各反応に添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、すぐに氷上に置いた。ゲル分析のために、反応３μｌを２×ローディング色素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）３μｌと混合し、６％ＴＢＥ−ＰＡＧＥゲルにローディングし、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（１：１０，０００）を用いて約１５分にわたって染色した後、可視化した。ゲルをＧｅｌ  Ｌｏｇｉｃ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｏｄａｋ、１５Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）で可視化し、ＩｍａｇｅＪ  ｖ．１．４６を使用して定量化した。ＮＨＥＪ頻度を、二項方程式を使用して算出した：
％遺伝子修飾＝１００＊（１−（ＳＱＲＴ（１−（（ａ＋ｂ）／（ａ＋ｂ＋ｃ）））））
（式中、「ａ」および「ｂ」の値は、バックグラウンド除去後の切断された断片の積分面積と等しく、「ｃ」は、バックグラウンド除去後の切断されていないＰＣＲ産物の積分面積と等しい）。
【０３５５】
制限分析のために、ゲノムＤＮＡを、細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に再懸濁させ、６５℃で２０分間インキュベートし、次いで、９８℃で２０分間インキュベートすることによって抽出した。抽出溶液を直接使用するかまたはＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して清澄化し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  ３０  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。ＣＲＩＳＰＲ標的部位の周囲のゲノム領域を、約１００ｎｇのゲノムＤＮＡからＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して増幅した。多数の独立したＰＣＲ反応をプールし、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して精製した。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ中１５０ｎｇのＰＣＲ産物を含有する２５μｌ体積を３７℃で１時間にわたって消化した。ゲル分析のために、反応３μｌを２×ローディング色素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）３μｌと混合し、６％ＴＢＥ−ＰＡＧＥゲルにローディングし、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（１：１０，０００）を用いて約１５分にわたって染色した後、可視化した。ゲルをＧｅｌ  Ｌｏｇｉｃ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｏｄａｋ、１５Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）で可視化し、ＩｍａｇｅＪ  ｖ．１．４６を使用して定量化した。ＮＨＥＪ頻度を、方程式を使用して算出した：
％遺伝子修飾＝（（ａ＋ｂ）／（ａ＋ｂ＋ｃ））＊１００
（式中、「ａ」および「ｂ」の値は、バックグラウンド除去後の切断された断片の積分面積と等しく、「ｃ」は、バックグラウンド除去後の切断されていないＰＣＲ産物の積分面積と等しい）。
【０３５６】
レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）は、人生の最初の数カ月の間の重症の網膜機能障害および重症の視力障害、または失明を特徴とする早期発症型小児期網膜ジストロフィーの群で構成される。奇病であるＬＣＡは、全ての公知の遺伝性網膜変性疾患の５％と同程度を構成する遺伝性失明の最も一般的な原因である。ＦＤＡに認可された療法が存在しない疾患であるＬＣＡ１０の最も一般的な原因は、ＣＥＰ２９０遺伝子の深部イントロン突然変異である（den  Hollander,  A.  I.ら、（２００６年）、American  journal  of  human  genetics、７９巻、５５６〜５６１頁）（図５１）。ＩＶＳ２６  ｃ．２９９１＋１６５５  Ａ＞Ｇ突然変異の結果、新規の強力なスプライシングドナー部位およびその後の隠れたエクソン（エクソンＸ）のＣＥＰ２９０  ｍＲＮＡへの包含が生じる。中心体タンパク質であるＣＥＰ２９０は、光受容体の結合繊毛に位置し、毛様体形成および毛様体輸送において役割を果たす（Drivas,  T.  G.ら、（２０１３年）、The  Journal  of  clinical  investigation、１２３巻、４５２５〜４５３９頁；Craige,  B.ら、（２０１０年）、The  Journal  of  cell  biology、１９０巻、９２７〜９４０頁；Tsang,  W.  Y.ら、（２００８年）、Developmental  cell、１５巻、１８７〜１９７頁）。中途停止コドンを含有するエクソンＸの包含の結果、短縮された形態のＣＥＰ２９０および最終的な光受容体変性が生じる。
【０３５７】
ＬＣＡの一部の形態は、欠陥のある細胞遺伝子の機能的コピーを送達するために工学的に作製された組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による処置に潜在的に適する。２００８年に、第Ｉ相臨床試験において、ＬＣＡ２患者にＲＰＥ６５の突然変異を補完する導入遺伝子がＡＡＶにより首尾よく送達された（Maguire,  A.  M.ら、（２００８年）、The  New  England  journal  of  medicine３５８巻、２２４０〜２２４８頁）。いくらかの応答が認められたが、残念ながら、導入遺伝子発現が消失することに潜在的に起因して、効果は長続きしなかった（Azvolinsky,  A.、（２０１５年）、Nat  Biotechnol、３３巻、６７８頁；Schimmer,  J.ら、（２０１５年）、Human  gene  therapy.  Clinical  development２６巻、２０８〜２１０頁）。さらに、ＣＥＰ２９０などの、異なるＬＣＡサブタイプを引き起こす一部の遺伝子の突然変異は、単純にＡＡＶ送達には大き過ぎ、したがって、遺伝子療法手法では処置不能なままである。さらに、光受容体はタンパク質レベルに対する感度が高く（Olsson,  J.  E.ら、（１９９２年）、Neuron９巻、８１５〜８３０頁；Tan,  E.ら、（２００１年）、Investigative  ophthalmology  &  visual  science、４２巻、５８９〜６００頁；Seo,  S.ら、（２０１３年）、Investigative  ophthalmology  &  visual  science、５４巻）、トランスジェニック実験により、ＣＥＰ２９０過剰発現による光受容体毒性が実証された（Burnight,  E.  R.ら、（２０１４年）、Gene  therapy、２１巻、６６２〜６７２頁）。以下の性質を考慮すると、我々は、ＣＥＰ２９０突然変異はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術の治療標的として特に魅力的であると考える。
【０３５８】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術の開発により、遺伝子編集の分野が改革され、遺伝子疾患を処置するための極めて大きく新しい手法がもたらされた。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを配列特異的に標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で構成される。ＣＲＩＳＰＲ系による切断には、ｇＲＮＡのＤＮＡ配列に対する相補的な塩基対合、および標的部位の３’側に見出される短いヌクレオチドモチーフである必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が必要である（Doudna,  J.  A.ら、（２０１４年）、Science、３４６巻、１２５８０９６頁；Hsu,  P.  D.ら、（２０１４年）、Cell１５７巻、１２６２〜１２７８頁）。現在、制限が最小であり最も一般的に使用されるＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来であり、これは、配列ＮＧＧを認識し、したがって、ＣＲＩＳＰＲが標的にする配列は、Ｎ２０ＮＧＧである。多数の試験により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて疾患突然変異を効率的に標的にできることが示されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に基づく治療薬の開発は、安全性に関する懸念および送達に関する制約によって妨害されている。
【０３５９】
疾患突然変異のＣＲＩＳＰＲによる標的化は、多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏの状況において有効であること、ならびにマウスおよび他の動物試験を通じてｉｎ  ｖｉｖｏにおいても有効であることが示されているが、現行の手法は全て、主に送達に関する制約に起因して、まだ臨床使用にはほど遠い。ＡＡＶベクターは、眼への遺伝子療法注射に最も頻繁にかつ首尾よく使用されているウイルスベクターである（Dalkara,  D.ら、（２０１４年）、Comptes  rendus  biologies、３３７巻、１８５〜１９２頁；Day,  T.  P.ら、（２０１４年）、Advances  in  experimental  medicine  and  biology、８０１巻、６８７〜６９３頁；Willett,  K.ら、（２０１３年）、Frontiers  in  immunology、４巻、２６１頁；Dinculescu,  A.ら、（２００５年）、Human  gene  therapy１６巻、６４９〜６６３頁）。いくつかの特徴により、ＡＡＶが最も魅力的な選択になっている：このウイルスは非病原性であり、分裂細胞および非分裂細胞のどちらにも感染し、発現を長期間持続させることができ、また、その臨床試験における安全性、有効性、および、全般的に毒性がないことの履歴に特に注目すべきである。さらに、特定のＡＡＶ血清型は、網膜下注射後に光受容体細胞を標的にすることに関して有効である。ＡＡＶベクターは、治療用ＣＲＩＳＰＲ構成成分を送達する安全な手段をもたらすものであるが、そのサイズが、ＡＡＶベクターの有用性を限定する１つの主要な技術的障害になっている。野生型ＡＡＶゲノムは、長さが約４．７ｋｂであり、組換えウイルスは、最大約５．０ｋｂまでをパッケージングすることができる（Dong,  B.ら、（２０１０年）、Molecular  therapy:  the  journal  of  the  American  Society  of  Gene  Therapy１８巻、８７〜９２頁；Wu,  Z.ら、（２０１０年）、Molecular  therapy:  the  journal  of  the  American  Society  of  Gene  Therapy１８巻、８０〜８６頁）。このパッケージング容量により、単一のウイルスベクターに対して使用することができるＤＮＡの上限が規定される。
【０３６０】
従来の方法によってＣａｓ９およびｇＲＮＡを発現させるために必要なＤＮＡは、５．２ｋｂを超える：Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター（約０．５ｋｂ）、ＳｐＣａｓ９（約４．１ｋｂ）、Ｐｏｌ  ＩＩターミネーター（約０．２ｋｂ）、Ｕ６プロモーター（約０．３ｋｂ）、およびｇＲＮＡ（約０．１ｋｂ）。ＡＡＶ送達の難題に対する１つの手法は、２ベクター手法である：Ｃａｓ９を送達するための１つのＡＡＶベクター、およびｇＲＮＡのための別のＡＡＶベクター（Swiech,  L.ら、（２０１５年）、Nat  Biotechnol３３巻、１０２〜１０６頁）。しかし、２重ＡＡＶ手法では、杆体を重要な例外として（Song,  C.ら、（２０１４年）、Epigenetics  &  chromatin、７巻、１７頁；Jain,  D.ら、（２０１０年）、Pediatric  neurology４３巻、３５〜４０頁）、網膜細胞において発現することが見出されている遺伝子である低分子マウスＭｅｃｐ２プロモーターを利用し、これにより、ウイルスによる送達の負荷量が増加することに起因する潜在的な毒性に加えて、共送達手法では、推測的に、ＬＣＡ突然変異の大部分を標的にできない可能性が高いことが示唆される。これは、他の遺伝子療法により媒介されるゲノム編集のために潜在的に実行可能な手法であるが、我々は、その代わりに、網膜の遺伝子編集のために、効率が上昇し、光受容体が特異的に標的にされ、かつ、ウイルス負荷送達による潜在的な毒性が低減されるはずである、単一ベクター手法を提案する。
【０３６１】
我々は最近、ｇＲＮＡ転写を導くために、より伝統的に使用されているＵ６プロモーターではなく、Ｈ１プロモーターを使用することにより、利用可能なＣＲＩＳＰＲによる遺伝子標的化用の余地をほぼ倍増させることが可能になることを報告した（Ranganathan,  V.ら、（２０１４年）、Nature  communications、５巻、４５１６頁）。注目すべきことに、オフターゲットカットの傾向がより小さいことも検出し、これにより、Ｈ１プロモーターが治療手法としてより好都合なものであることが示唆される。これらの試験中、ゲノムにおいて内在性Ｈ１ＲＮＡ遺伝子のごく近くにタンパク質コード遺伝子（ＰＡＲＰ−２）が存在することを認めた（Myslinski,  E.ら、（２００１年）、Nucleic  Acids  Res２９巻、２５０２〜２５０９頁；Baer,  M.ら、（１９９０年）、Nucleic  Acids  Res１８巻、９７〜１０３頁）。Ｈ１ＲＮＡ（ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＲＮＡ転写物）の開始とＰＡＲＰ−２遺伝子（ｐｏｌ  ＩＩ転写物）の開始の間の配列は２３０ｂｐであり（図５２）、これにより、この比較的小さな配列が小型の双方向プロモーターとして機能し得ることが示される−これは、我々の知る限りでは、ｐｏｌ  ＩＩ転写物とｐｏｌ  ＩＩＩ転写物の両方を導くことができる、哺乳動物ゲノムにおける唯一の双方向プロモーター配列である。Ｈ１プロモーターのこれらの思いがけない性質により、ＣＲＩＳＰＲ構成成分の両方を単一のＡＡＶ中にパッケージングすることのサイズに関するハードルを克服することが可能になり得ると仮定した。
【０３６２】
２つのＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶ治療薬を並行して直交性のＣａｓ９系に基づいて開発する。第１は、単一のＡＡＶベクターを通じたＳｐＣａｓ９とガイドＲＮＡの共送達によって媒介されるＬＣＡ１０治療薬の開発である。第２は、単一のＡＡＶベクターを通じたＳａＣａｓ９ニッカーゼと４種のガイドＲＮＡの共送達によって媒介されるＬＣＡ１０治療薬の開発である。どちらの戦略も最終的な臨床使用のために開発されるものであり、したがって、安全性は、最高である。最後に、新規の治療薬の特徴付けおよび開発のために、ＬＣＡ１０を含有する同質遺伝子型ヒト幹細胞株を生成する。
【０３６３】
単一のＡＡＶベクターを通じたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）とガイドＲＮＡの共送達によって媒介されるＬＣＡ１０治療薬の開発。
【０３６４】
バックグラウンドおよび理論的根拠。多数の試験により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて疾患突然変異を効率的に標的にできることが示されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するためのＳｐＣａｓ９に基づく治療薬の開発は、送達に関する制約によって妨害されている。小型の双方向プロモーター系を使用することで、単一のＡＡＶベクターを通じたＳｐＣａｓ９とｇＲＮＡの共送達のための、臨床的に実行可能なプラットフォームを実証した。ＳｐＣａｓ９により、いくつかの有利な点がもたらされる：最も一般的に使用されており、最も多用途のものであり、また、最も良く理解されているＣＲＩＳＰＲ系である。そのＰＡＭ要件（ＮＧＧ）は、他のＣａｓ９タンパク質よりも相当に低ストリンジェントであり、これが今度は、より多くの遺伝子およびより多くの突然変異を直接標的にできることを意味する。臨床的な治療手法に関して重要なことに、ＳｐＣａｓ９のタンパク質工学における最近の進歩により、検出可能なゲノムワイドなオフターゲット効果がゼロという少なさの多数の高特異性／高忠実度バリアントが開発されてきた（Kleinstiver,  B.  P.ら、（２０１６年）、Nature  doi:  10.1038/nature  16526；Slaymaker,  I.  M.ら、（２０１６年）、Science３５１巻、８４〜８８頁）。実際に、他のＣａｓ９オルソログ標的化部位とは異なり、イントロンＣＥＰ２９０突然変異はＳｐＣａｓ９部位内に入り（図５３）、これにより、ＬＣＡ１０突然変異がＳｐＣａｓ９の特に魅力的な標的になっている。
【０３６５】
ｇＲＮＡ配列をカスタマイズすることにより、ＳｐＣａｓ９（またはＳｐＣａｓ９バリアント）をＣＥＰ２９０突然変異に方向付け、スプライシングドナー部位の近くで二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすことができる。ＤＮＡ切断に対する細胞応答は、主に２つの競合する経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、または相同性配向型修復（ＨＤＲ）のうちの一方を通じて起こる。ＮＨＥＪは、ＤＮＡ修復のためのより優性の経路であり、切断点の近く、一般に＋／−約１５ｎｔのところに欠失および挿入をもたらすエラープローン経路である（Mali,  P.ら、（２０１３年）、Science３３９巻、８２３〜８２６頁）。したがって、正常なＤＮＡ修復機構の細胞を使用することにより、スプライシングドナー部位の近くの配列を破壊し、エクソンＸの包含を防止し、正常なＣＥＰ２９０スプライシングおよび機能を回復させることができる。重要なことに、このイントロン領域内の多くの突然変異は、正常なスプライシングで回復すると予測される。
【０３６６】
我々の手法は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９方法体系を改変および最適化することを伴い、したがって、必要な構成成分全てを、哺乳動物の杆体における性能が実証されているＡＡＶ血清型である単一のＡＡＶ５によって光受容体に送達することができる。我々のＨ１−ＡＡＶ系を使用してＣａｓ９をＧＦＰと交換することにより、ＡＡＶ５を使用したＧＦＰの光受容体への効率的な送達を実証することができた（図２）。ＬＣＡ１０は劣性であるので、光受容体機能には正常なＣＥＰ２９０スプライシングの５０％レスキューで十分なはずである。
【０３６７】
実験計画および方法。
【０３６８】
１．ｇＲＮＡのコンピュータによる選択および解析。構築物は、最終的に臨床使用するために開発されるので、それらを潜在的なオフターゲット活性について慎重にモニタリングすることが不可欠である（Wu,  X.ら、（２０１４年）、Quantitative  biology、２巻、５９〜７０頁）。この目的のために、いくつかの相補的手法を探求する。バイオインフォマティクス手法を取り、両鎖およびＳｐＣａｓ９標的化部位の重複する出現を検索するために書かれたカスタムパールスクリプトを使用して、ヒトゲノム内の全ての潜在的なＣＲＩＳＰＲ部位を決定した；例えば、ヒトゲノムでは、反復配列をフィルタリング除去した後、ＣＲＩＳＰＲ部位が１３７，４０９，５６２カ所存在する。各部位についてオフターゲット効果が示される傾向を、Ｂｏｗｔｉｅ（Langmead,  B.ら、（２００９年）、Genome  biology、１０巻、Ｒ２５頁）を使用してコンピュータにより決定して、各ＣＲＩＳＰＲ部位をまたゲノムに再アラインメントし、標的化配列全体を通して最大３塩基のミスマッチを許容した。ＬＣＡ１０  ＳｐＣａｓ９部位に関する我々の分析により、１３の潜在的なオフターゲット遺伝子座が同定され、これを疑似標的化について試験する：１部位は２つのミスマッチを有し、１２部位は３つのミスマッチを有する（コンピュータによるデータはhttp://crispr.technologyにおいて入手可能である）。オンターゲット部位および予測されるオフターゲット部位に隣接するＰＣＲプライマーを高忠実度ポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｐｈｕｓｉｏｎ）と共に使用して、ゲノム配列を増幅し、次いで、それをＴ７ＥＩアッセイによって試験する。これにより、我々の最適化実験について、標的化の正確度をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方においてモニタリングすることが可能になる。
【０３６９】
２．ヒト細胞株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価。単純な標的ｇＲＮＡ挿入のための独特の制限部位、およびＡＡＶ産生のために必要なＩＴＲ含有ベクターへの容易なサブクローニングを可能にするための隣接するＮｏｔＩ部位を含有する、ＳｐＣａｓ９標的化プラスミドをいくつか開発した。さらに、２つの最近報告された高忠実度Ｃａｓ９バリアント、ＳｐＣａｓ９−ＨＦおよびｅＳｐＣａｓ９２６，２７を含有する構築物を生成する（図５４）。我々はこれらのバリアント間のいかなる比較も意識しておらず、安全な治療薬を開発するためには、オフターゲット突然変異誘発を最小化することが最優先である。各部位における効率的な標的化を得ることを確実にするために、まず、ＨＥＫ２９３細胞においてＳｐＣａｓ９標的部位を切断についてアッセイする。標的部位に隣接するＰＣＲプライマーを使用し、高忠実度ポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｐｈｕｓｉｏｎ）を使用してゲノム配列を増幅し、次いで、それを、切断活性についてＴ７ＥＩアッセイによって試験する（詳細なプロトコールはhttp://crispr.technologyにおいて入手可能である）。
【０３７０】
３．オンターゲット／オフターゲット突然変異誘発についてのハイスループットな配列決定。オンターゲット部位およびオフターゲット部位の部位特異的ディープ配列決定解析を実施することを目的とする。ＣＲＩＳＰＲ標的部位および予測されるオフターゲット部位に隣接するゲノム配列を、高忠実度ポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｐｈｕｓｉｏｎ）を使用して１５サイクルにわたって増幅し、次いで、精製する（Ｚｙｍｏ、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５）。精製されたＰＣＲ産物を５サイクルにわたって増幅してＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ５アダプターおよび試料特異的バーコードを付着させ、再度精製し、次いで、ＳＹＢＲグリーン蛍光によって定量化し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分析し、最終的に等モル比でプールした後、ＭｉＳｅｑ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて配列決定する。配列決定データを解析するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒソフトウェアを使用して３００ｂｐペアエンドＭｉＳｅｑ読み取りを多重分離し、その後、未加工の読み取りのアダプターおよび品質トリミングを行う。全ての読み取りに関して野生型配列に対するアラインメントを行い、ＮＨＥＪ頻度を１００＊（インデル読み取りの数／インデル読み取りの数＋ＷＴ読み取りの数）によって算出する。
【０３７１】
４．ＡＡＶウイルス産生。高力価ＧＭＰ様前臨床ＡＡＶ５ベクターが、我々の共同研究者（Dr.  William  Hauswirth、University  of  Florida）により、彼らの独立したベクター生産施設において、彼らの研究室で開発されたヘルパーを用いないプラスミドトランスフェクション法を使用して生成される。ベクターを、イオジキサノール勾配遠心分離、その後のＱ−カラムＦＰＬＣクロマトグラフィーによって精製し、ＡＡＶベクターストックのＧＬＰ様純度を確立するために、各ベクターを、それぞれが臨床試験のＩＮＤ  ＣＭＣセクションに重要な要素である、純度、バイオバーデン、無菌性、ＤＮＡ含有粒子力価、感染力価、粒子と感染力の比および複製コンピテントＡＡＶによる潜在的なコンタミネーションの調査を含めた生理学的および生物学的アッセイの標準化バッテリーに供す。
【０３７２】
単一のＡＡＶベクターを通じたＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）ニッカーゼと４種のガイドＲＮＡの共送達によって媒介されるＬＣＡ１０治療薬の開発。
【０３７３】
バックグラウンドおよび理論的根拠。ＣＲＩＳＰＲをＡＡＶによって送達するための最近現れた別の有望な手法は、より小さな直交性Ｃａｓ９タンパク質を使用することである。
【０３７４】
約３．２ｋｂの転写物によりコードされるＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）により強調される（Ran,  F.  A.ら、（２０１５年）、Nature５２０巻、１８６〜１９１頁）。しかし、ＳａＣａｓ９の使用における１つの限定は、そのＰＡＭ要件（ＮＮＧＲＲＴ）に起因するものである。ＰＡＭ配列がより長いこと、およびＬＣＡ１０  Ａ＞Ｇ突然変異に位置するＳａＣａｓ９部位が存在しないことに起因して、独特のゲノム標的化部位の数はＳｐＣａｓ９の約４分の１である。特定の突然変異はＳｐＣａｓ９により標的にすることができず（上記の通り）、したがって、我々の手法は、欠失戦略を使用して隠れたエクソンの周囲の小さな領域を除去することである。小型のＳａＣａｓ９遺伝子は、標準のプロモーターおよびターミネーターエレメントを使用し、１種、２種、または潜在的に３種のｇＲＮＡカセットと一緒に、単一のＡＡＶベクター中にパッケージングすることが可能である、３２。ＣＲＩＳＰＲに基づく治療薬の安全性に関する懸念に関して、最も重要なのは、確実に、オフターゲット突然変異誘発である。これは、Ｃａｓ９によりＤＮＡが意図されたものではない場所で切断された場合に生じ得る。幸運にも、このリスクは、ニッカーゼとして公知のＣａｓ９の、１本のＤＮＡ鎖のみを切断する点突然変異を使用することによって数桁低減することができる。Ｃａｓ９ニッカーゼ手法では、２種のｇＲＮＡを別々に連結して反対の鎖上の２つの近接する向かい合ったニックを生成することにより、二本鎖切断を効率的に生じさせることができる（図５５）。オフターゲット効果は、２種のｇＲＮＡにより、ゲノム内の他の場所の極めて近傍かつ反対の鎖上に存在するオフターゲットが認識された場合にのみ生じ、この出現率は統計学的に起こりそうにないものである。この理由で、ＤＮＡ切断を生じさせるためにニッカーゼを使用することは、最も安全な手法である。欠失の生成に関して、この手法では、４種のｇＲＮＡが必要である（標的にされた突然変異を欠失させるために各側の対）、３３。しかし、追加的な余地をもたらすＨ１双方向系を使用すると、４種のｇＲＮＡを容易に適応させることができる。
【０３７５】
１．ｇＲＮＡのコンピュータによる選択および構築物の生成。上記の我々のバイオインフォマティクスと同様に、ゲノム内のあらゆるＳａＣａｓ９標的化部位を同定し、情報をデータベース化した（データは、http://crispr.technologyにおいて入手可能である）。ＳａＣａｓ９ニッカーゼ系を使用して欠失を標的にするために、我々のコンピュータによる解析から、ニッカーゼを使用して欠失を生成するために好都合な性質を有する４種の候補ｇＲＮＡ部位を同定した（Friedland,  A.  E.ら、（２０１５年）、Genome  biology、１６巻、２５７頁；Mali,  P.ら、（２０１３年）、Nat  Biotechnol、doi:  10.1038/nbt.2675；Ran,  F.  A.ら、（２０１３年）、Cell,  doi:  10.1016/j.cell.2013.08.021）（図４）。
【０３７６】
２．ヒト細胞株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価。ＡＡＶ産生のために必要なＩＴＲ含有ベクターへの容易なサブクローニングを可能にするための隣接するＮｏｔＩ部位を含有するＳａＣａｓ９標的化プラスミドを構築した。ＳｐＣａｓ９標的化プラスミドと同様に、これらは、特定のｇＲＮＡ配列を迅速にクローニングするための独特の制限部位を含有する。各部位における効率的な標的化を得ることを確実にするために、まず、各部位をＨＥＫ２９３細胞におけるｄｓＤＮＡカットについてアッセイする。標的部位に隣接するＰＣＲプライマーを使用し、高忠実度ポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｐｈｕｓｉｏｎ）を使用してゲノム配列を増幅し、次いで、それを、切断活性についてＴ７ＥＩアッセイによって試験する；３０〜７５％の標的化効率を常套的に同定する。これらの部位を、切断を誘導するそれらの能力について検証した後、４種のｇＲＮＡを発現させるための４種のＨ１プロモーターカセットを含有する我々が構築したＳａＣａｓ９ニッカーゼ標的化プラスミドにクローニングする。その後、ＰＣＲによる欠失分析をＨＥＫ２９３細胞において実施して、我々の標的化構築物の効率を調査する。我々のバイオインフォマティクスから予測されるオフターゲット遺伝子座を疑似突然変異誘発について調査する。
【０３７７】
３．オンターゲット／オフターゲット突然変異誘発についてのハイスループットな配列決定。上記の通り、我々のＳａＣａｓ９標的化実験について部位特異的ディープ配列決定解析も実施する。ニッカーゼ手法を使用することを考慮すると、オフターゲット突然変異誘発の検出は予想されないが、隠れたエクソンのイントロン欠失を生成することの潜在的に代替物である代替のＳａＣａｓ９標的化部位を決定した。
【０３７８】
４．ＡＡＶウイルス産生。これは上記の通り実施する。
ＬＣＡ１０幹細胞株の生成
【０３７９】
４  バックグラウンドおよび理論的根拠。マウスは、網膜変性症の優れたモデルとしての機能を果たし得るが、ＣＥＰ２９０の突然変異によって引き起こされるｒｄ１６マウスは、ＣＲＩＳＰＲ／ＡＡＶ治療薬を試験するためのａｐｔモデルではない。ヒト点突然変異とは異なり、マウス変性表現型は、大きな（８９７ｂｐ）ホモ接合性インフレーム欠失によって引き起こされる、３６。したがって、ヒト疾患をより良好に反映させるために、現在、ＬＣＡ１０細胞を生成するために２つの手法を使用している：１）ＩＶＳ２６  ｃ．２９９１＋１６５５  Ａ＞Ｇ突然変異をＨ７ヒト胚性幹細胞に由来する株に工学的に作製すること、および２）ＬＣＡ１０患者の線維芽細胞に由来する同質遺伝子型ｉＰＳ細胞株。
【０３８０】
実験計画および方法。
【０３８１】
１．遺伝子編集されたｈＥＳＣ株。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用して、約１５０塩基のオリゴドナー（約７５塩基の隣接相同性）を使用した点突然変異を工学的に作製することに成功した。Ｃａｓ９をコードするプラスミド、上記のｇＲＮＡ配列、およびドナーオリゴを電気穿孔によって導入する（Ranganathan,  V.ら、（２０１４年）、Nature  communications、５巻、４５１６頁）。トランスフェクション効率を、電気穿孔後２４時間、蛍光によってモニタリングし、全部の遺伝子標的化をＴ７ＥＩアッセイによって調査する。最後に、組換えクローンを、所望の挿入についてＰＣＲによってスクリーニングし、次いで、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって検証する。Ａ＞Ｇ突然変異を有する多数のホモ接合性およびヘテロ接合性株を単離し、オフターゲット突然変異誘発について上記のバイオインフォマティクスを使用して調査する。
【０３８２】
２．患者由来のｉＰＳＣ株。Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｗｉｌｍｅｒ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃとの共同研究において、現在、ＣＥＰ２９０突然変異を有する患者の線維芽細胞を探索している。同定されたら、ＪＨＭＩ−ＳＯＭ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄを伴う既存のＩＲＢにより承認されたプロトコールの下で、インフォームドコンセント後に皮膚生検材料を採取する。ＬＣＡ１０患者由来のｉＰＳＣを、確立されたプロトコールを使用して作製する（Galluzzi,  L.ら、（２０１２年）、Cell  deathおよびdifferentiation１９巻、１０７〜１２０頁；Yu,  J.ら、（２００７年）、Science３１８巻、１９１７〜１９２０頁；Takahashi,  K.ら、（２００６年）、Cell１２６巻、６６３〜６７６頁；Ludwig,  T.  E.ら、（２００６年）、Nat  Biotechnol２４巻、１８５〜１８７頁）。上記の技法を使用し、突然変異が補正された同質遺伝子型細胞株を並行して生成し、予測されるオフターゲット遺伝子座をＳａｎｇｅｒ配列決定して外来突然変異が存在しないことを検証する。
【０３８３】
生命倫理。ヒト胚性幹細胞系Ｈ７（ＷｉＣｅｌｌ）を使用する；提唱された実験にこれらの細胞株を使用することは、ＪＨＵ  ＩＳＣＲＯ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている（適用ＩＳＣＲＯ００００００２３）。さらに、ＪＨＵ治験審査委員会の主催の下（ＩＲＢ＃ＮＡ＿０００４７２７１）、インフォームドコンセントの下で我々の研究室で生成されたｈｉＰＳＣを使用する。ＥＳ細胞系は意図されていないが、それでも、ＪＨＵ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｖｅｒｓｉｇｈｔ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって規定されている全ての方針および規制に従う。
【０３８４】
３．遺伝子編集されたｈＥＳＣ株のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける編集および／または患者由来のｉＰＳＣ株の編集。上で開発された種々のリードウイルスベクターを徹底的に調査するために、患者由来のｉＰＳＣ株または遺伝子編集されたｈＥＳＣ株のいずれかに由来する細胞を試験する；ＷＴ  ＳｐＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９、またはＳｐＣａｓ９−ＨＦを用いてＬＣＡ１０突然変異を直接標的にする構築物、および４種のｇＲＮＡを用いるＳａＣａｓ９ニッカーゼ手法を使用する構築物（図５６）。まず、オンターゲットカット効率をＴ７ＥＩアッセイによって決定する。高分解能分析のために、ＭｉＳｅｑを使用して、オンターゲットおよびオフターゲット突然変異誘発を定量化する。ＳｐＣａｓ９による標的化は、スプライシングに重要なヌクレオチドを排除するためにエラープローンＮＨＥＪに依拠するので、この分析により、治療的潜在性が良好に示される。カット効率およびオフターゲット突然変異誘発に加えて、ｑＲＴＰＣＲを使用して、突然変異型対立遺伝子および野生型対立遺伝子の両方からのＣＥＰ２９０発現のレベルを定量化する。これにより、我々の構築物の検証の第１のステップがもたらされる。我々の研究室における既存の能力で、定量的毛様体形成アッセイ（Kim,  J.ら、（２０１０年）、Nature４６４巻、１０４８〜１０５１頁）を我々のハイコンテンツな機械を使用して実施して、我々の治療用構築物の潜在性を調査することができる。さらに、幹細胞を光受容体に分化させるためのプロトコールを開発し、それにより、関連する細胞型における表現型レスキューの調査を可能にした。ＬＣＡ１０についてのゲノム編集を調査するための良好な動物モデルがないことを考慮して、これらのアッセイが我々のウイルス構築物の真の治療的潜在性により密接に近似すると考える。
（実施例６）
【０３８５】
ＡＡＶ５をＰ０．５マウスに網膜下注射によって送達した。１４日後または２８日後、網膜を回収し、Ｔ７  Ｅｎｄｏ  Ｉアッセイを実施した（注：ＡＡＶ５は、杆体光受容体を標的にし、また、アッセイは全網膜に対して実施した）。
【０３８６】
Ｔ７  ＥｎｄｏＩ分析のために、ゲノムＤＮＡを、細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に再懸濁させ、６５℃で２０分間インキュベートし、次いで、９８℃で２０分間インキュベートすることによって抽出した。抽出溶液を直接使用するかまたはＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して清澄化し、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  ３０  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。ＣＲＩＳＰＲ標的部位の周囲のゲノム領域を、約１００ｎｇのゲノムＤＮＡからＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して増幅した。多数の独立したＰＣＲ反応をプールし、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して精製した。１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ中１５０ｎｇのＰＣＲ産物を含有する２５μｌ体積を変性させ、ゆっくりと再アニーリングさせて、ヘテロ二本鎖を形成させた：９５℃で１０分、毎秒−１．０℃の勾配で９５℃から８５℃へ、８５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で８５℃から７５℃へ、７５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で７５℃から６５℃へ、６５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で６５℃から５５℃へ、５５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で５５℃から４５℃へ、４５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で４５℃から３５℃へ、３５℃で１秒、毎秒−１．０℃の勾配で３５℃から２５℃へ、次いで、４℃で保持。Ｔ７  ＥｎｄｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１μｌを各反応に添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、すぐに氷上に置いた。ゲル分析のために、反応３μｌを２×ローディング色素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）３μｌと混合し、６％ＴＢＥ−ＰＡＧＥゲルにローディングし、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（１：１０，０００）を用いて約１５分にわたって染色した後、可視化した。ゲルをＧｅｌ  Ｌｏｇｉｃ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｏｄａｋ、１５Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）で可視化し、ＩｍａｇｅＪ  ｖ．１．４６を使用して定量化した。ＮＨＥＪ頻度を、二項方程式を使用して算出した：
％遺伝子修飾＝１００＊（１−（ＳＱＲＴ（１−（（ａ＋ｂ）／（ａ＋ｂ＋ｃ）））））
（式中、「ａ」および「ｂ」の値は、バックグラウンド除去後の切断された断片の積分面積と等しく、「ｃ」は、バックグラウンド除去後の切断されていないＰＣＲ産物の積分面積と等しい）。
【化４−１】
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【化４−２】
2019520391.tif 000049
【化４−３】
2019520391.tif 000050
参考文献
【０３８７】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示の主題が関係する分野の当業者のレベルを示すものである。全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、個々の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献のそれぞれが具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じくものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。いくつもの特許出願、特許、および他の参考文献が本明細書で言及されているが、かかる参考文献は、これらの文書のいずれも当技術分野における共通する一般的知見の一部を形成することの容認を構成するものではないことが理解されよう。
【０３８８】
前述の主題は理解を明瞭にするために図表および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内である特定の変化および修飾を行うことができることが当業者には理解されよう。
【図１】
2019520391.tif 000051
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
2019520391.tif 000078
【図２８】
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【図２９】
2019520391.tif 000080
【図３０】
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【図３１Ａ−１】
2019520391.tif 000082
【図３１Ａ−２】
2019520391.tif 000083
【図３１Ｂ】
2019520391.tif 000084
【図３１Ｃ】
2019520391.tif 000085
【図３２−１】
2019520391.tif 000086
【図３２−２】
2019520391.tif 000087
【図３２−３】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
2019520391.tif 000090
【図３４Ｂ】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４４−３】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４５−３】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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【図４６−３】
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【図４７−１】
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【図４７−２】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５７−３】
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【図５７−４】
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【図５７−５】
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【図５８】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図５９Ｃ】
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【図５９Ｄ】
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【図５９Ｅ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月6日(2019.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において網膜変性症を処置するための、天然に存在しないヌクレアーゼシステムであって、
ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、前記対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、前記ＤＮＡ分子は、前記細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードし、前記１つまたは複数の遺伝子産物は、ロドプシン、ＣＥＰ２９０、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、およびロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）からなる群から選択される、プロモーター；および
ｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含み、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子の１つまたは２つの鎖を切断して、前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更し、前記ヌクレアーゼシステムは、前記システムの治療有効量で前記対象の網膜領域に投与されることを特徴とする、ヌクレアーゼシステム。
【請求項２】
細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法において使用するための天然に存在しないヌクレアーゼシステムであって、前記細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、前記天然に存在しないヌクレアーゼシステムは、
ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、前記ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、プロモーター；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、前記細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含み、構成要素（ａ）および（ｂ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子を切断して、ロドプシン、ＣＥＰ２９０、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、およびロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）からなる群から選択される前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更し、前記ヌクレアーゼシステムは前記細胞中に導入されることを特徴とする、ヌクレアーゼシステム。
【請求項３】
前記システムがＣＲＩＳＰＲである、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項４】
前記システムが、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項５】
前記システムが、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項７】
前記プロモーターが双方向プロモーターである、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項８】
前記双方向プロモーターがＨ１である、請求項７に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項９】
前記Ｈ１プロモーターが、
ａ）前記ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；および
ｂ）前記ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメント
を含む、請求項８に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項１０】
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項１１】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１０に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項１２】
前記プロモーターが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している、請求項７から８のいずれか一項に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項１３】
前記網膜領域が網膜である、請求項１に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項１４】
前記細胞が、真核生物細胞または非真核生物細胞である、請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項１５】
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項１６】
前記細胞が網膜光受容体細胞である、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項１７】
前記細胞が網膜神経節細胞である、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項１８】
前記網膜変性症が、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および緑内障からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項１９】
前記網膜変性症が、ＬＣＡ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８である、請求項１８に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項２０】
前記標的配列が、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子中にある、請求項１９に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項２１】
前記標的配列が、配列番号１〜１０９、１６４〜３５６、７３５〜７３８もしくは７８８〜１３９７に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される前記ＣＰＥ２９０遺伝子中の突然変異である、請求項１９から２０のいずれか一項に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項２２】
前記標的配列が、作動可能に連結した配列番号１、２、３および４を含む、請求項２１に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項２３】
前記ベクターが、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項２４】
前記網膜変性症が、常染色体優性形態の網膜色素変性症（ＡＤＲＰ）である、請求項１８に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項２５】
前記標的配列が、前記ロドプシン遺伝子中の突然変異である、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項２６】
前記標的配列が、前記ロドプシン遺伝子のＲ１３５における突然変異である、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項２７】
Ｒ１３５における前記突然変異が、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３５Ｗ、Ｒ１３５Ｌからなる群から選択される、請求項２６に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項２８】
前記標的配列が、配列番号１１１〜１２６に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２５から２７のいずれか一項に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項２９】
前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号１３１〜１４２に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項３０】
前記網膜変性症が緑内障である、請求項１８に記載のヌクレアーゼシステム。
【請求項３１】
前記標的配列が、配列番号１４３〜１６３に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載のヌクレアーゼシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８８】
前述の主題は理解を明瞭にするために図表および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内である特定の変化および修飾を行うことができることが当業者には理解されよう。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
それを必要とする対象において網膜変性症を処置するための方法であって、
（ａ）ｉ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、前記対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、前記ＤＮＡ分子は、前記細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；および
ｉｉ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを提供するステップであって、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ；ならびに
（ｂ）治療有効量の前記システムを、前記対象の網膜領域に投与するステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記システムがＣＲＩＳＰＲである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記システムが、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記システムが、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記プロモーターが双方向プロモーターである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記双方向プロモーターがＨ１である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記Ｈ１プロモーターが、
ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメント
を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記プロモーターが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している、項目６から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記網膜領域が網膜である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞が網膜光受容体細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞が網膜神経節細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記網膜変性症が、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および緑内障からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記網膜変性症が、ＬＣＡ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記網膜変性症がＬＣＡ１０である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記標的配列が、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０遺伝子中にある、項目１６から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記標的配列が、前記ＣＥＰ２９０遺伝子中の突然変異である、項目１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記標的配列が、配列番号１〜１０９、１６４〜３５６、７３５〜７３８もしくは７８８〜１３９７に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記標的配列が、作動可能に連結した配列番号１、２、３および４を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ベクターが、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記網膜変性症が、常染色体優性形態の網膜色素変性症（ＡＤＲＰ）である、項目１５に記載の方法。
（項目２４）
前記１つまたは複数の遺伝子産物がロドプシンである、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記標的配列が、前記ロドプシン遺伝子中の突然変異である、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記標的配列が、前記ロドプシン遺伝子のＲ１３５における突然変異である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
Ｒ１３５における前記突然変異が、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３５Ｗ、Ｒ１３５Ｌからなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記標的配列が、配列番号１１１〜１２６に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号１２７〜１４２に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記網膜変性症が緑内障である、項目１５に記載の方法。
（項目３１）
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、性決定領域Ｙ（ＳＲＹ）−ボックス１１（ＳＯＸ１１）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＳＯＸ１１もしくはＰＵＭＡ、またはそれらの組合せである、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、ＤＬＫ／ＬＺＫ、ＭＫＫ４／７、ＪＮＫ１／２／３またはＳＯＸ１１／ＡＴＦ２／ＪＵＮ／ＭＥＦ２Ａ経路のメンバーである、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記標的配列が、配列番号１４３〜１６３に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記対象に投与するステップが、移植、注射またはウイルスによって行われる、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記対象に投与するステップが、網膜下注射によって行われる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記対象がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目３７）
細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、前記方法は、
ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、前記ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、プロモーター；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、前記細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムを前記細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ
を含む、方法。
（項目３８）
前記システムがＣＲＩＳＰＲである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記システムが、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、項目３６から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記システムが、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記プロモーターがＨ１プロモーターである、項目３７に記載の方法。
（項目４３）
前記Ｈ１プロモーターが双方向性である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記Ｈ１プロモーターが、
ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメント
を含む、項目４２から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９である、項目３７に記載の方法。
（項目４６）
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞における発現のためにコドン最適化されている、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記プロモーターが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している、項目４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記細胞が、真核生物細胞または非真核生物細胞である、項目３７に記載の方法。
（項目４９）
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記細胞が網膜光受容体細胞である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記細胞が網膜神経節細胞である、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、ＬＣＡ１０  ＣＥＰ２９０である、項目３７に記載の方法。
（項目５３）
前記標的配列が、配列番号１〜１０９、１６４〜３５６、７３５〜７３８に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目３７に記載の方法。
（項目５４）
前記標的配列が、作動可能に連結した配列番号１、２、３および４を含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ベクターが、配列番号１１０に示されるヌクレオチド配列を含む、項目３７に記載の方法。
（項目５６）
前記１つまたは複数の遺伝子産物がロドプシンである、項目３７に記載の方法。
（項目５７）
前記標的配列が、前記ロドプシン遺伝子中の突然変異である、項目３７に記載の方法。
（項目５８）
前記標的配列が、前記ロドプシン遺伝子のＲ１３５における突然変異である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
Ｒ１３５における前記突然変異が、Ｒ１３５Ｇ、Ｒ１３５Ｗ、Ｒ１３５Ｌからなる群から選択される、項目５７から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記標的配列が、配列番号１１１〜１２６に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目５７から５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記ｇＲＮＡ配列が、配列番号１２７〜１４２に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目３７に記載の方法。
（項目６２）
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、二重ロイシンジッパーキナーゼ（ＤＬＫ）、ロイシンジッパーキナーゼ（ＬＺＫ）、ＡＴＦ２、ＪＵＮ、性決定領域Ｙ（ＳＲＹ）−ボックス１１（ＳＯＸ１１）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、ＪＮＫ１〜３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、ＳＯＸ１１もしくはＰＵＭＡ、またはそれらの組合せである、項目３７に記載の方法。
（項目６３）
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、ＤＬＫ／ＬＺＫ、ＭＫＫ４／７、ＪＮＫ１／２／３またはＳＯＸ１１／ＡＴＦ２／ＪＵＮ／ＭＥＦ２Ａ経路のメンバーである、項目１に記載の方法。
（項目６４）
前記標的配列が、配列番号１４３〜１６３に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの組合せからなる群から選択される、項目３７に記載の方法。
（項目６５）
前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現が減少する、項目３７に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月28日(2019.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019520391000001.app
【国際調査報告】
2019520391.tif 000155
2019520391.tif 000156
2019520391.tif 000157