(57)【要約】  本発明は、過酸化チタンを含む基体粒子に、標的物を特異的に認識する分子が結合してなる、放射線照射により活性酸素を発生する複合体粒子を含む、放射線治療剤に関するものである。また本発明の放射線治療剤は、標的物を特異的に認識する分子を含むため、標的物に集積する機能を有する。本発明の放射線治療剤は、放射線治療の効果を増大することが可能であり、生体に対する副作用を低減させて、効率良く標的物を攻撃することが可能である。
2011102407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
過酸化チタンを含む基体粒子に、標的物を特異的に認識する分子が結合してなる、放射線照射により標的物に障害を与える活性酸素を発生する複合体粒子を含む、放射線治療剤。
【請求項２】
前記活性酸素がヒドロキシラジカルである請求項１に記載の放射線治療剤。
【請求項３】
前記基体粒子の過酸化チタンが主として基体粒子表面に分布していることを特徴とする請求項１または２に記載の放射線治療剤。
【請求項４】
基体粒子が、さらに二酸化チタンを含むものである、請求項１〜３のいずれか１に記載の放射線治療剤。
【請求項５】
基体粒子の平均分散粒径が、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下である、請求項１〜４のいずれか１に記載の放射線治療剤。
【請求項６】
標的物を特異的に認識する分子が、抗体である、請求項１〜５のいずれか１に記載の放射線治療剤。
【請求項７】
前記複合体粒子が、基体粒子の表面の少なくとも一部が高分子被膜により被覆されており、標的物を特異的に認識する分子が、当該高分子被膜を介して基体粒子に結合してなる、請求項１〜６のいずれか１に記載の放射線治療剤。
【請求項８】
放射線がＸ線である、請求項１〜７のいずれか１に記載の放射線治療剤。
【請求項９】
水、ｐＨ緩衝液、輸液、又は生理食塩水の中に複合体粒子が自主分散しており、当該複合体粒子が、過酸化チタンを含む基体粒子に、標的物を特異的に認識する分子が結合してなる、放射線照射により標的物に障害を与える活性酸素を発生する複合体粒子である、分散液。
【請求項１０】
前記複合体粒子の表面電位が＋２０ｍＶ以上である、請求項９に記載の分散液。
【請求項１１】
請求項９または１０の分散液である、放射線治療剤。
【請求項１２】
標的物を特異的に認識する分子が、腫瘍細胞を特異的に認識し得る抗体である、請求項１〜８および１１のいずれか１に記載の放射線治療剤を含む、抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
過酸化チタンを含む基体粒子に、標的物を特異的に認識する分子が結合してなる複合体粒子を含み、当該複合体粒子が放射線照射によりヒドロキシラジカルを発生する、放射線治療剤に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2010-032055号の優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
癌治療の１つとして、放射線治療が行われている。放射線治療はＸ線やγ線などを照射することにより癌細胞の増殖を抑えたり殺傷したりする治療法である。放射線治療は一般的に局所治療であり、全身への侵襲が小さいため、患者に対しても負担が少なく緩和医療の重要な手段と考えられている。 【０００４】
放射線治療のうち、外部照射法は体外から病巣をねらって照射する方法であり、Ｘ線、γ線、電子線、粒子線などが使用される。外部照射法では、腫瘍に十分な放射線量が到達し、かつ腫瘍周辺の正常組織に放射線があまりあたらないように、放射線照射の方向を検討することを要する。放射線は、一方向からの照射する場合もあれば、多数の方向から照射する場合もある。体内深部にある腫瘍を治療する場合は、強い放射線を照射する必要があり、副作用の問題がある。【０００５】
放射線治療による正常組織への副作用は、基本的には照射された領域に生じる。正常組織の反応としては、照射中に起こる粘膜・上皮細胞の障害や、治療が終了してから６ヶ月〜数年経過後に生じる間質細胞・血管内皮細胞の障害などがある。放射線治療の副作用は、照射線量、照射部位、患者の年齢、全身状態などによって様々である。副作用を低減させつつ、効果的に癌細胞を殺傷可能なような放射線治療が望まれる。【０００６】
近年、二酸化チタンなどの光触媒作用が種々の分野で利用されており、注目されている。光触媒作用とは、二酸化チタンなどに３８０ｎｍ以下の短波長の光を照射することにより生成される活性酸素種の酸化力に基づくものである。光触媒作用は、環境ホルモンなどの有害化学物質の分解処理、有害微生物の殺菌・抗菌に利用されており、さらに癌治療への応用研究が進められている（非特許文献１〜４）。【０００７】
二酸化チタンを親水性高分子により修飾し、さらに目的分子に対して特異的な結合能を有する分子を固定化した二酸化チタン複合体が、癌細胞等を光触媒作用により分解する作用を有することが開示されている（特許文献１）。かかる二酸化チタン複合体は、紫外線照射により光触媒作用を発揮する。【０００８】
また二酸化チタンに超音波を照射すると、高濃度のヒドロキシルラジカルを生成することが確認されている（二酸化チタン／超音波触媒法）。二酸化チタンをポリアクリル酸で被覆して、肝細胞認識タンパク質pre/S2を二酸化チタンに結合させてなる複合体粒子の開示があり、かかる複合体粒子は、肝癌細胞を特異的にターゲッティングすることができ、超音波の照射により癌細胞を殺傷・損傷させる作用を発揮する（特許文献２）。【０００９】
光触媒作用の放射線治療への利用が望まれているものの、照射線量の問題などがあり、実用に耐え得るような光触媒材料は見出されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００４／０８７７６５号
【特許文献２】特開２００８−１９５６５３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】R,Cai, Y.Kubota, T.Shuin, et al., Cancer Res. 52 (1992) 2346-2348.
【非特許文献２】World J Gastroenterol 10 (2004) 3191-3193.
【非特許文献３】Q.Liu, X.Wang, P.Wang, et al.,  Ultrasonics 2006;45:56-60.
【非特許文献４】H.Honda, Q.L.Zhao, T.Kondo.,  Ultrasound in Med. & Biol. 28 (2002) 673-682.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、放射線照射によりヒドロキシラジカルを発生する粒子を含む、放射線治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために本発明者らは、鋭意検討した結果、過酸化チタンが放射線照射によりヒドロキシラジカルを発生することに着目し、過酸化チタンを放射線治療に用いることが可能であることを見出し、本発明を完成した。【００１４】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．過酸化チタンを含む基体粒子に、標的物を特異的に認識する分子が結合してなる、放射線照射により標的物に障害を与える活性酸素を発生する複合体粒子を含む、放射線治療剤。
２．前記活性酸素がヒドロキシラジカルである前項１に記載の放射線治療剤。
３．前記基体粒子の過酸化チタンが主として基体粒子表面に分布していることを特徴とする前項１または２に記載の放射線治療剤。
４．基体粒子が、さらに二酸化チタンを含むものである、前項１〜３のいずれか１に記載の放射線治療剤。
５．基体粒子の平均分散粒径が、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下である、前項１〜４のいずれか１に記載の放射線治療剤。
６．標的物を特異的に認識する分子が、抗体である、前項１〜５のいずれか１に記載の放射線治療剤。
７．前記複合体粒子が、基体粒子の表面の少なくとも一部が高分子被膜により被覆されており、標的物を特異的に認識する分子が、当該高分子被膜を介して基体粒子に結合してなる、前項１〜６のいずれか１に記載の放射線治療剤。
８．放射線がＸ線である、前項１〜７のいずれか１に記載の放射線治療剤。
９．水、ｐＨ緩衝液、輸液、又は生理食塩水の中に複合体粒子が自主分散しており、当該複合体粒子が、過酸化チタンを含む基体粒子に、標的物を特異的に認識する分子が結合してなる、放射線照射により標的物に障害を与える活性酸素を発生するものである、分散液。
１０．前記複合体粒子の表面電位が＋２０ｍＶ以上である、前項９に記載の分散液。
１１．前項９または１０の分散液である、放射線治療剤。
１２．標的物を特異的に認識する分子が、腫瘍細胞を特異的に認識し得る抗体である、前項１〜８および１１のいずれか１に記載の放射線治療剤を含む、抗腫瘍剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の放射線治療剤によれば、標的物を特異的に認識する分子により複合体粒子が標的物に集積し、放射線照射により過酸化チタンがヒドロキシラジカルを発生して、標的物を損傷することができる。本発明の放射線治療剤を用いれば、少ない放射線量でも標的物を効果的に損傷することができる。本発明の放射線治療剤により例えば腫瘍治療を行う場合には、腫瘍以外の正常組織に対する放射線による副作用を軽減させることができる。また、少ない線量で高い治療効果が得られるようになれば、放射線療法の患者に対する負担が軽減され、放射線療法の有用性が増す。現在の放射線療法では副作用等の観点から、照射する線量、照射する回数などに制限が設けられているが、本発明の放射線治療剤を併用することにより、その範囲でも十分な治療効果が得ることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】過酸化チタン−二酸化チタンの基体粒子にＸ線を照射した場合のヒドロキシラジカル発生量を示すグラフである。（実験例１）
【図２】過酸化チタン−二酸化チタンの基体粒子に紫外線を照射した場合のヒドロキシラジカル発生量を示すグラフである。（実験例１）
【図３】過酸化チタン−二酸化チタンの基体粒子に、臨床用Ｘ線照射装置（図３ａ，ｂ）もしくはSpring-8（図３ｃ）を用いてＸ線を照射した場合のヒドロキシラジカル発生量を示すグラフである。（実験例１）
【図４】ポリアクリル酸（ＰＡＡ）を修飾した二酸化チタン微粒子に、臨床用Ｘ線照射装置（図４ａ）もしくはSpring-8（図４ｂ）を用いてＸ線を照射した場合のヒドロキシラジカル発生量を示すグラフである。（実験例１）
【図５】本発明の複合体粒子に紫外線照射をしなかった場合の細胞障害性を示す写真である。（実験例２）
【図６】本発明の複合体粒子に紫外線照射をした場合の細胞障害性を示す写真である。（実験例２）
【図７】本発明の複合体粒子にＸ線照射をした場合と、しなかった場合の細胞障害性を示す写真である。（実験例３）
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、過酸化チタンを含む基体粒子に、標的物を特異的に認識する分子が結合してなる複合体粒子を含む放射線治療剤であって、過酸化チタンが放射線照射によりヒドロキシラジカルを発生することにより、標的物を攻撃する作用を発揮する、放射線治療剤に関する。
【００１８】
（過酸化チタンを含む基体粒子）
本発明における、過酸化チタンを含む基体粒子とは、過酸化チタンを含み、溶液中に分散可能な粒子であり、かつ、放射線照射により溶液中で活性酸素、特にヒドロキシラジカル（・ＯＨ）を生成することができる粒子である。本明細書においては過酸化チタンを含む基体粒子を、単に「基体粒子」と称することもある。
【００１９】
基体粒子において過酸化チタンは、少なくとも基体粒子の表面上に存在すればよい。基体粒子は過酸化チタン以外の材料を含んでいてもよい。過酸化チタン以外の材料はいかなるものであってもよいが、例えば酸化物半導体が例示され、二酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ３）、酸化ニッケル（ＮｉＯ）、酸化鉄（ＦｅＯ）、酸化クロム（ＣｒＯ、Ｃｒ２Ｏ３）、酸化モリブデン（ＭｏＯ３）などが例示される。基体粒子は過酸化チタン以外に二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むものが好ましく、後述する作製方法にて作製されるものを用いることが好ましい。過酸化チタン以外に二酸化チタンを含む基体粒子を、以下「過酸化チタン−二酸化チタン微粒子」と称することもある。
【００２０】
また本発明の基体粒子は分散液として存在することが望ましい。分散液の溶媒は、基体粒子が分散可能なものであればいかなるものであってもよいが、蒸留水が例示される。分散液における基体粒子の平均分散粒径は、生理的条件下において１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、好ましくは１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下、より好ましくは２０ｎｍ以上６０ｎｍ以下である。基体粒子の平均分散粒径がこの範囲内であれば、本発明における複合体粒子も同様の範囲内となる可能性が高く、標的物を特異的に認識する分子結合させるのに十分な大きさであり、哺乳動物の血流中などの水溶液中で十分な分散安定性および流動性を確保することができるためである。
【００２１】
ここで分散粒子径とは、水溶液中における基体粒子の大きさを表し、基体粒子の結晶が凝集した凝集体の大きさを含む。平均分散粒径は、動的光散乱法によって測定を行い、キュムラント法解析から算出される平均値のことを示している。また、本明細書でいう生理的条件下とは２５℃、１気圧で、蒸留水の存在下もしくは、２５℃、１気圧で、リン酸緩衝食塩水（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４の組成）（ｐＨ７．４）存在下のことを示す。
【００２２】
（過酸化チタンを含む基体粒子の作製方法）
過酸化チタンを含む基体粒子は、上記のような性質を有する粒子を作製することが可能であれば、いかなる手法により作製してもよい。過酸化チタンを含む基体粒子は、例えば次のようにして作製することができる。チタン塩化物もしくはその水和物と第四級アンモニウム塩との中和反応を行い、中和反応後の溶液を８０〜１５０℃の水熱条件で水熱処理し、得られた分散液に過酸化水素水を添加し、ろ過洗浄することにより、過酸化チタンを含む基体粒子を含む分散液を作製することができる。
【００２３】
チタン塩化物としては、四塩化チタンが好ましく、第四級アンモニウム塩としては水酸化テトラメチルアンモニウム、炭酸テトラメチルアンモニウム、重炭酸テトラメチルアンモニウム、コリン、炭酸コリン、および重炭酸コリン等を例示することができるが、好ましくは水酸化テトラメチルアンモニウムである。
【００２４】
より具体的には、四塩化チタン（ＴｉＣｌ４）に水（例えば蒸留水）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）を加えて、１２５℃で加熱処理して水熱処理をし、その後過酸化水素水を加え、その後、限外ろ過膜でろ過洗浄することにより、基体粒子を含む分散液を得ることができる。
【００２５】
（標的物を特異的に認識する分子）
本発明の放射線治療剤において、過酸化チタンを含む基体粒子には、特定の標的物を特異的に認識する分子が結合している。過酸化チタンを含む基体粒子と特定の標的物を特異的に認識する分子とを含むものを、複合体粒子と称する。過酸化チタンを含む基体粒子および複合体粒子ともに、ナノ粒子であり、ナノ粒子とは一般的に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下の直径を持つ粒子を意味する。
【００２６】
標的物を特異的に認識する分子は、本発明の複合体粒子を、標的物に集積させる作用を有するものであり、例えば、標的物に存在する分子と特異的に結合する分子である。当該分子は、タンパク質、ポリペプチド、ＤＮＡ等のいかなる分子であってもよい。当該分子は好ましくはタンパク質であり、タンパク質としては例えば抗体、リガンド、レセプターが例示される。これらのうち、特に好ましくは抗体である。例えば、標的物が腫瘍である場合は、腫瘍細胞に特異的に存在する分子に対する抗体を用いればよい。腫瘍細胞に特異的に存在する分子に対する抗体とは、具体的には上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する抗体や、癌抗原を認識する抗体、遊離抗原を認識する抗体を使用することができる。癌抗原の具体例としては、上皮増殖因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor；ＥＧＦＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）などが挙げられる。
【００２７】
標的物を特異的に認識する分子を固定化する際の標的官能基としては、当該分子が単純タンパク質の場合はアミノ基およびチオール基、糖タンパク質の場合は糖のアルデヒド基を用いればよい。例えば、水溶性高分子により修飾した基体粒子のカルボキシル基にビオチン（または、アビジン）を導入しておき、タンパク質をアビジン（または、ビオチン）と架橋させることにより、ビオチン：アビジンの相互作用を利用して固定化することが可能である。
【００２８】
（高分子被膜）
本発明における複合体粒子は、基体粒子の表面の少なくとも一部が高分子被膜により被覆されていることが好ましい。当該高分子被膜を介して標的物を特異的に認識する分子を基体粒子の表面に容易に結合させることが可能となる。
【００２９】
本発明における高分子被膜は、水溶性高分子であることが好ましく、水溶性高分子としては親水性のカチオンポリマーや親水性のアニオンポリマーが例示される。過酸化チタンを含む基体粒子は、それ自体溶液中（水系溶媒中）での分散性を有するが、例えば、水溶性高分子が基体粒子の表面に強固に結合することにより、複合体粒子の中性付近を含む幅広いｐＨの溶液中における分散安定性を増強することができる。また培地などのような複合体粒子以外の種々の成分が含まれるような溶液においても、水溶性高分子の被膜により複合体粒子の分散安定性を保持することが可能となる。過酸化チタンを含む基体粒子（好ましくは過酸化チタン−二酸化チタン微粒子）の場合は、水または塩を含む各種ｐＨ緩衝液中において、生理的条件下で、かつ分散剤等の他物質の添加なしに、分散性が極めて良好となり、２４時間以上にわたって安定な分散性を達成することができる。
【００３０】
本発明における高分子被膜の材料としては、カルボキシル基を有する水溶性高分子やアミンである水溶性高分子が望ましい。水溶性高分子としては、重量平均分子量が１０００以上１０００００以下の範囲のものであればいずれも使用可能である。カルボキシル残基やアミノ基には、所望の特定の標的物を特異的に認識する分子を固定化することが可能となり、有用である。カルボキシル基を有する高分子としては、例えばカルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリカルボン酸類、およびカルボキシル基単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸等のポリカルボン酸類、およびアクリル酸／マレイン酸やアクリル酸／スルフォン酸系モノマーの共重合体（コポリマー）がより好適に使用される。アミンである高分子としては、例えばポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミン類、およびアミン単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミン類がより好適に使用される。また、高分子被膜の材料として重量平均分子量が１０００以上１０００００以下のポリエチレングルコール等を用いてもよい。
【００３１】
これらの水溶性高分子により過酸化チタンを含む基体粒子を修飾することにより、特定の標的物を特異的に認識する分子の固定化後においても、水溶性高分子の官能基（カルボキシル基やアミノ基、水酸基）により、粒子間の電気的斥力が働くため、凝集することなく、長時間にわたってｐＨ３〜９の水系分散媒中で、安定的に分散した状態を維持できる。水溶性高分子の被膜を含む複合体粒子の分散粒径は、生理的条件下において１ｎｍ以上２００ｎｍ以下で安定化するため、哺乳動物の血流中において優れた分散安定性および流動性を示し、標的物に到達した複合体粒子に、放射線を照射することにより、標的物の破壊を促進することができる。
【００３２】
（高分子被膜の形成）
本発明の基体粒子に、高分子被膜を形成する手法としては特許文献２に記載の手法を用いることができる。具体的には、以下のような手法を用いることができる。例えば、基体粒子（好ましくは過酸化チタン−二酸化チタン微粒子）にカルボキシル基を複数有する水溶性高分子の被膜を形成するには、基体粒子と、カルボキシル基を複数有する水溶性高分子をジメチルホルムアミドに分散させて９０〜１８０℃で１〜１２時間水熱反応を行って両者をエステル結合で結合させればよい。ここで、基体粒子と水溶性高分子とがエステル結合するのは、粒子表面の過酸化チタンが反応系中の水に水和されてその表面に水酸基が生成し、その水酸基と水溶性高分子のカルボキシル基とが反応してエステル結合を形成することによるものである。エステル結合の確認方法としては種々の分析方法が適用できるが、例えば赤外分光法によりエステル結合の吸収帯である１７００〜１８００ｃｍ−１付近の赤外吸収の有無で確認することが可能である。
【００３３】
高分子被膜を有する基体粒子の分散液における平均分散粒径は、高分子被膜を有さない基体粒子と実質的に同様であり、生理的条件下において１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であり、好ましくは１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下、より好ましくは２０ｎｍ以上６０ｎｍ以下である。
【００３４】
（標的物を特異的に認識する分子の基体粒子への結合）
標的物を特異的に認識する分子は、基体粒子そのものに直接結合させたり、公知のリンカーを介して結合させることも可能であるが、基体粒子を被覆した高分子被膜を介して結合させてもよい。基体粒子を被覆した高分子被膜に、標的物を特異的に認識する分子を結合させる手法としては、特許文献２に記載の手法を用いることができる。基体粒子の表面に高分子被膜が形成されているため、高分子被膜に含まれる水溶性高分子のカルボキシル基またはアミノ基に目的分子に対して特異的な結合能を有する分子を固定化することができる。例えば、特異的な結合能を有する分子の基体粒子表面の高分子被膜への固定化には、主にこの分子が有するアミノ基またはカルボキシル基を用いてアミノカップリング法が行われる。例えば、高分子被膜のカルボキシル基に対し、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）を用いて、標的物を特異的に認識する分子中のアミノ基を結合させることができる。
【００３５】
（複合体粒子を含む分散液）
本発明は、複合体粒子を含む分散液にも及ぶ。本発明の複合体粒子の表面電位の最適範囲としては、＋２０ｍＶ以上あればよく、一般に自主分散（粒子が沈殿しない状態）が十分に達成できる電位として＋４０ｍＶ以上あればより望ましい。また本発明の複合体粒子を含む分散液には塩が含まれていることが望ましく、塩濃度は１Ｍ以下、好ましくは１００〜３００ｍＭ程度である。また分散液中の複合体粒子の濃度は、重量百分率（ｗｔ％）で２０ｗｔ％以下であればよく、さらに望ましくは重量百分率で０．０００１〜１０ｗｔ％、好ましくは０．００１〜５ｗｔ％、より好ましくは０．００２５〜２ｗｔ％であればよい。なお、本明細書において重量百分率（ｗｔ％）と質量百分率（ｍａｓｓ％）とは同義であり、相互に交換可能に用いられている。
【００３６】
本発明における分散液は、水、種々のｐＨ緩衝液、輸液、あるいは生理食塩水を用いた、均一で安定な分散液として提供することが可能となる。本発明の複合体粒子を含む分散液は中性付近の生理的条件においても凝集することがないために、生体に投与する際に有利である。
【００３７】
（放射線治療剤）
本発明において、放射線治療剤とは放射線治療の際に用いることのできる薬剤を意味する。本発明の放射線治療剤は、放射線照射により、基体粒子に含まれる過酸化チタンがヒドロキシラジカルを発生し、ヒドロキシラジカルが標的物を攻撃する作用を発揮する。本願発明の放射線治療剤は、放射線照射により標的物としての細胞を障害する機能を発揮する薬剤である。
【００３８】
本発明の放射線治療剤は、種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤またはカプセル剤等）とすることができ、その製剤形態としては、例えば、注射剤または経口剤（錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟若しくは硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤またはシロップ剤等）等を挙げることができる。本発明に係る放射線治療剤は、自体公知の方法に従ってこれら種々の製剤形態として製造することができる。本発明の放射線治療剤を製造する場合には、製剤の種類に応じて、所望により種々の添加物を添加することができ、添加物としては、例えば、安定化剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、結合剤、溶解補助剤、界面活性剤、崩壊抑制剤、酸化防止剤、無痛化剤または等張化剤等が挙げられる。
【００３９】
本発明の放射線治療剤を注射剤として患者等に投与する場合は、適宜に投与経路を選択して投与することができる。例えば、癌が存在する組織に直接投与若しくは局所投与することもできるし、また静脈、動脈、皮下、筋肉内または腹腔内等に投与することもできる。
【００４０】
本発明の放射線治療剤と併用することにより、標的物への殺傷効果を増大させることができる放射線としては、例えば、Ｘ線、ガンマ線、電子線、陽子線、ヘリウム線、炭素イオン線、ネオンイオン線、アルゴンイオン線、シリコンイオン線、負パイ中間子線、中性子線、ＵＶまたはマイクロ波等が挙げられる。本発明における放射線は好ましくはＸ線である。
【００４１】
本発明の放射線治療剤の生体への投与回数は、特に制限されず、例えば、１回〜１０回であり、投与時期は、患者に放射線を照射する前若しくは後、または照射するのと同時のいずれの時期であってもよく、最も好ましくは、放射線を照射する前である。
【００４２】
放射線治療における標的物への放射線の照射方法は、公知の方法を用いることができ、例えば、直接的に、分割照射（例えば、１日に数分間、１〜２ヶ月間にわたって複数回）を行う方法が挙げられる。放射線の初期エネルギーは、患者等の腫瘍の大きさ、状態若しくは部位またはその周辺の状況等に応じて適宜選択することができるが、通常、約１００〜５００ＭｅＶ／ｎである。また患者等の腫瘍の大きさ、状態若しくは部位またはその周辺の状況等に応じて適宜選択することができるが、患者等への放射線の照射量は、通常約０．１〜１００Ｇｙであり、患者等への放射線の照射割合は、通常約０．０５〜５０Ｇｙ／分であり、放射線が標的物に対して与えるエネルギー（ｌｉｎｅａｒ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＬＥＴ）は、通常約５０〜７０ｋｅＶ／μｍである。
【００４３】
本発明の放射線治療剤の標的物は、生体内におけるいかなる病変組織であってもよいが、癌を含む腫瘍や、炎症組織、ウイルスに感染した組織などが挙げられる。腫瘍としては、例えば、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、子宮癌、胆管癌、膵島細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、睾丸腫瘍、甲状腺癌、皮膚癌、悪性カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマまたはグリオーマ等が挙げられる。本発明の放射線治療剤の標的物は、好ましくは膵臓癌または大腸癌である。
【００４４】
本発明は、本発明の放射線治療剤を含む抗腫瘍剤にも及ぶ。本発明の抗腫瘍剤は、他の抗腫瘍剤を用いた化学療法や、外科的療法等と組み合わせて用いることができる。他の抗腫瘍剤としては、例えば、アルキル化剤、各種代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質等が挙げられる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明の理解を深めるために実施例および実験例により具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。【００４６】
（実施例１）  複合体粒子の作製
（１）過酸化チタン−二酸化チタン微粒子である基体粒子の作製
過酸化チタン−二酸化チタン微粒子である基体粒子は以下のように調製した。
四塩化チタン（ＴｉＣｌ４）（和光純薬社製）０．０２ｍｏｌに水１０ｍｌ、２５％（重量百分率）水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）（多摩化学工業株式会社製）３０ｍｌを加えて水でトータル５０ｍｌになるように調整した。これを１２５℃で１時間加熱処理し、室温まで冷ました。その後３０％（重量百分率）過酸化水素水を５ｍｌ加えた。これを限外ろ過膜（アミコン；ミリポア社製；分画分子量１００ｋＤａ）で５回ろ過洗浄し、過酸化チタン−二酸化チタン微粒子である基体粒子の分散液（溶媒は蒸留水）を得た。【００４７】
（２）高分子による基体粒子の修飾
高分子であるポリアクリル酸を、（１）で得た基体粒子の表面に、以下の手法により修飾させた。 
まず、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）（重量平均分子量５０００、和光純薬）にＤＭＦを加えて混合し、１００ｍｇ／ｍｌ ＰＡＡ溶液を作製した。上記（１）で作製した５％（重量百分率）の基体粒子の分散液１ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍｌ ＰＡＡ溶液を、超音波発生装置で３０分間超音波照射した。ＤＭＦ ３７．５ｍｌ、ＰＡＡ溶液２ｍｌ、基体粒子の分散液０．５ｍｌの順に混合した。混合物を沈殿がなくなるまで超音波処理した。テフロン（登録商標）製の密閉容器にいれて１５０℃、５時間反応させた。反応液を１０ｍｌずつ５０ｍｌチューブ（コーニング(R)）にわけ、アセトンを２倍量（２０ｍｌ）加えて攪拌した後、室温で１時間静置した。遠心分離機にて４０００ｒｐｍ、１５℃、２０分間遠心分離を行い、分離した上澄み液をデカンテーションして捨てた。９９％（重量百分率） エタノールを２倍量（２０ｍｌ）加えて穏やかに攪拌し、遠心分離機にて４０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行った。分離した上澄み液を、デカンテーションして捨てた後、蒸留水で必要な濃度に懸濁し、ＰＡＡ修飾した基体粒子（以下「ＰＡＡ−基体粒子」と称することもある）の分散液を作製した。
なお、ＤＬＳ（動的光散乱法）（Zetasizer Nano ZS、Malvern社製）によって測定した平均分散粒経は約５８．４ｎｍであった。平均分散粒径の測定条件は、１気圧、２５℃、蒸留水の存在下である。【００４８】
（３）抗ＥＧＦＲ抗体のＰＡＡ−基体粒子への結合
０．４Ｍ 水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ、和光純薬）溶液１２５μｌに、０．１ＭのＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ、和光純薬）溶液１２５μｌを加え、混合液２５０μｌを、上記（２）で作製した５％（重量百分率）ＰＡＡ−基体粒子溶液５００μｌに加え、室温にて１時間緩やかに撹拌させながら反応させた。混合液に、０．０２ＭのＡＢ−ＮＴＡ溶液２５０μｌを添加し、その後０．０１５ＭのＮｉ２＋  ５００μｌを添加して攪拌した。その混合液５０μｌに対して、０．０２Ｍ  抗ＥＧＦＲ抗体溶液（抗ＥＧＦＲ抗体は、Journal of Biochemistry, 46(6), 867-874に記載の方法で調製した）５０μｌを加え、４℃にて４時間〜１晩緩やかに撹拌させながら反応させた。０．１Ｍモノエタノールアミンを１ｍｌ加え４℃にて３０分緩やかに撹拌させながら反応させて、抗ＥＧＦＲ抗体がＰＡＡ−基体粒子に結合した複合体粒子（以下「抗ＥＧＦＲ抗体−ＰＡＡ−基体粒子」と称することもある）を作製した。【００４９】
複合体粒子を作製した後、限外ろ過膜（アミコン：ミリポア社製）分画分子量１００ｋＤａを用いて、複合体粒子と未修飾の抗体とを分離した。ＨＥＰＥＳ緩衝液を加えて３回限外ろ過を行った。【００５０】
（実験例１）放射線による基体粒子のラジカル発生の確認
ＡＰＦ（Aminophenyl Fluoroscein）は中性水溶液中でほとんど蛍光を持たないが、ＡＰＦが強い活性を持つ活性酸素種（特に、・ＯＨ、・Ｏ２−）と反応すると、強蛍光性化合物であるフルオレセインが生成し、蛍光強度に増大が観察される。この反応を利用して、実施例１（１）にて得られた基体粒子（0、0.00025、0.0025、0.025、0.25、2.5  mass%（質量百分率））について、放射線照射によるラジカルの発生量の変化を確認した。放射線照射は、臨床用高エネルギーＸ線照射装置  リニアック：三菱 EXL-15DP（以下「臨床用Ｘ線照射装置」とも称する）またはSpring-8の装置で、照射線量のグレイ（Gy）数を揃えて（0〜100Gy）、装置の説明書通りに行った。また、ポジティブコントロールとして基体粒子に紫外線照射を行い、ラジカルの発生量の変化を確認した。紫外線照射はATTO社製、DNA-FIXを用いて照射ジュール量を合わせて（0〜16J/cm2）行った。さらにネガティブコントロールとして、ＰＡＡ修飾した二酸化チタン微粒子（蒸留水中に分散したもの）を用いて放射線照射を行った。なお、二酸化チタン微粒子は製品名「STS01」（石原産業株式会社製）を用いた。【００５１】
結果を図１〜４に示す。図１は臨床用Ｘ線照射装置を用いて基体粒子にＸ線を照射した結果を示し、図２は基体粒子に紫外線を照射した結果を示す。図３は、臨床用Ｘ線照射装置もしくはSpring-8を用いて、過酸化チタンを含む基体粒子にＸ線を照射した結果を示し、図４は臨床用Ｘ線照射装置もしくはSpring-8を用いて、ＰＡＡ修飾した二酸化チタン微粒子にＸ線を照射した結果を示す。過酸化チタンを含む基体粒子が放射線照射によりラジカルを発生することが確認できた。過酸化チタンを含む基体粒子によるラジカル発生量は、二酸化チタン微粒子によるラジカル発生量よりも大きいことがわかった。また一定の濃度までは、過酸化チタンを含む基体粒子の濃度が高くなるにしたがって生成されるラジカル量が増加することがわかった。【００５２】
（実験例２）複合体粒子による細胞障害効果の確認
実施例１にて作製した複合体粒子の癌細胞に対する特異性および複合体粒子による癌細胞の殺傷・損傷効果を検討した。実験例１において、過酸化チタンを含む基体粒子が放射線によりラジカルを発生することが確認されたため、本実験例では便宜上、放射線照射ではなく、紫外線照射を用いて実験を行った。【００５３】
２×１０５ｃｅｌｌｓ／ ｄｉｓｈになるように３．５ｃｍ ｄｉｓｈに２ｍｌずつ癌細胞（Hela細胞）懸濁液を添加した。培地はDMEM培地（ナカライテスク製）を用いた。３７℃、５％ ＣＯ２にて２４時間インキュベートした。培地を捨てて新しい培地を２ｍｌ添加して、１％（重量百分率）の複合体粒子（抗ＥＧＦＲ抗体−ＰＡＡ−基体粒子）を０．１５ｍｌ添加した。次に、紫外線照射（条件：３．０Ｊ／ｃｍ２）を行った。コントロールとして培地のみのもの、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）を添加したもの、抗ＥＧＦＲ抗体のみを添加したもの、ＰＡＡ−基体粒子を添加したもの、ＲＦＰでＰＡＡ−基体粒子を修飾したもの（以下「ＲＦＰ−ＰＡＡ−基体粒子」とも称する）を添加したものについても、紫外線照射を行った。その後、エチジウムホモダイマー１（ＥｔｈＤ−１）およびカルセインを添加して、蛍光顕微鏡にて細胞を観察した。生きている細胞は、緑色の蛍光を示し、死滅した細胞は赤色の蛍光を示す。【００５４】
図５は、紫外線照射のない場合の細胞を、図６は紫外線照射を行った場合の細胞の写真である。図５および図６の上段の写真は、透過光像であり、中段の写真は緑色蛍光像（生細胞）であり、下段の写真は赤色蛍光像（死細胞）である。本発明の複合体粒子に紫外線照射を行ったものでは、明らかに死滅した細胞が見られ、複合体粒子により細胞障害性が発揮されていることがわかった。なお、抗ＥＦＧＲ抗体のない場合でも、死滅した細胞が見られたが、抗ＥＧＦＲ抗体のある複合体粒子の場合では、より多くの細胞が死滅したため、癌細胞への集積性が、特異的な細胞障害性を発揮するのに重要であることが示唆された。【００５５】
（実験例３）複合体粒子による細胞障害効果の確認
実施例１にて作製した複合体粒子の癌細胞に対する特異性および複合体粒子による癌細胞の殺傷・損傷効果を検討した。本実験例では放射線照射を行い、効果を確認した。【００５６】
１×１０３ｃｅｌｌｓ／ ｗｅｌｌになるように９６穴プレートに癌細胞（MIA PaCa-2細胞：ヒト膵臓腺癌、HCTp53+/+細胞：ヒト大腸癌（いずれもＡＴＣＣより入手）を添加した。培地はいずれもRPMI培地（ナカライテスク製）を用いた。MIA PaCa-2細胞、HCTp53+/+細胞とも、ＥＧＦＲを発現していることが知られている。３７℃、５％ ＣＯ２にて２４時間インキュベートした。培地を捨てて新しい培地を２ｍｌ添加し、１．６％（重量百分率）の複合体粒子（抗ＥＧＦＲ抗体−ＰＡＡ−基体粒子）を０．１５ｍｌ添加した。次に、Ｘ線照射（０，５Ｇｙ）を行った。Ｘ線照射は、実験例１と同様の臨床用高エネルギーＸ線照射装置  リニアック：三菱 EXL-15DP（150kVp、5mA、1.0Al  Filter）を用いて行った。コントロールとして培地のみのもの、１．６％（重量百分率）のＰＡＡ−基体粒子を添加したものについて、Ｘ線照射を行った。Ｘ線照射した日を０日目とし、MIA PaCa-2細胞については７日目に、HCTp53+/+細胞については１２日目に、生細胞数を測定した。生細胞数の測定は、WST-8（Cell Counting Kit-8、株式会社  同仁化学研究所）を添加して３時間インキュべートした後、４９０ｎｍで吸光度を測定することにより行った。細胞生存率は０Ｇｙの場合の細胞数に対する割合として算出した。【００５７】
結果を図７に示す。図７ａはMIA PaCa-2細胞の結果であり、図７ｂはHCTp53+/+細胞の結果である。培地のみのコントロールと比較して、ＰＡＡ−基体粒子を添加したもの、抗ＥＧＦＲ抗体を含む複合体粒子を添加したものでは、細胞数が減少しており、基体粒子にＸ線を照射することによる細胞障害効果を確認することができた。両細胞とも、抗体を含む複合体粒子を添加した場合は、ＰＡＡ−基体粒子を添加した場合と比較して細胞数が減少していたことから、複合体粒子が抗ＥＧＦＲ抗体を含むことによって、癌細胞に集積し、細胞障害効果を増強したことが予測された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の放射線治療剤によれば、標的物を特異的に認識する分子により複合体粒子が標的物に集積し、放射線照射により過酸化チタンがヒドロキシラジカルを発生して、標的物を損傷することができる。本発明の放射線治療剤を用いれば、少ない放射線量でも標的物を効果的に損傷することができる。本発明の放射線治療剤により例えば腫瘍治療を行う場合には、腫瘍以外の正常組織に対する放射線による副作用を軽減させることができ、放射線療法の患者に対する負担が軽減され、放射線療法の有用性が増す。本発明の放射線治療剤を利用することにより、深部に存在する腫瘍などにおいて強い放射線を照射する必要がなくなり、患者のＱＯＬを保ったまま癌治療を行うことが可能となることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年12月15日(2011.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
過酸化チタンを含む基体粒子に、標的物を特異的に認識する分子が結合してなる、Ｘ線照射により標的物に障害を与える活性酸素を発生する複合体粒子を含む、放射線治療剤。
【請求項２】
前記活性酸素がヒドロキシラジカルである請求項１に記載の放射線治療剤。
【請求項３】
前記基体粒子の過酸化チタンが主として基体粒子表面に分布していることを特徴とする請求項１または２に記載の放射線治療剤。
【請求項４】
基体粒子が、さらに二酸化チタンを含むものである、請求項１〜３のいずれか１に記載の放射線治療剤。
【請求項５】
基体粒子の平均分散粒径が、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下である、請求項１〜４のいずれか１に記載の放射線治療剤。
【請求項６】
標的物を特異的に認識する分子が、抗体である、請求項１〜５のいずれか１に記載の放射線治療剤。
【請求項７】
前記複合体粒子が、基体粒子の表面の少なくとも一部が高分子被膜により被覆されており、標的物を特異的に認識する分子が、当該高分子被膜を介して基体粒子に結合してなる、請求項１〜６のいずれか１に記載の放射線治療剤。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
水、ｐＨ緩衝液、輸液、又は生理食塩水の中に複合体粒子が自主分散しており、当該複合体粒子が、過酸化チタンを含む基体粒子に、標的物を特異的に認識する分子が結合してなる、Ｘ線照射により標的物に障害を与える活性酸素を発生する複合体粒子である、分散液。
【請求項１０】
前記複合体粒子の表面電位が＋２０ｍＶ以上である、請求項９に記載の分散液。
【請求項１１】
請求項９または１０の分散液である、放射線治療剤。
【請求項１２】
標的物を特異的に認識する分子が、腫瘍細胞を特異的に認識し得る抗体である、請求項１〜７および１１のいずれか１に記載の放射線治療剤を含む、抗腫瘍剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
種類に応じて、所望により種々の添加物を添加することができ、添加物としては、例えば、安定化剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、結合剤、溶解補助剤、界面活性剤、崩壊抑制剤、酸化防止剤、無痛化剤または等張化剤等が挙げられる。
［００３９］
本発明の放射線治療剤を注射剤として患者等に投与する場合は、適宜に投与経路を選択して投与することができる。例えば、癌が存在する組織に直接投与若しくは局所投与することもできるし、また静脈、動脈、皮下、筋肉内または腹腔内等に投与することもできる。
［００４０］
本発明の放射線治療剤と併用することにより、標的物への殺傷効果を増大させることができる放射線としては、例えば、Ｘ線、ガンマ線、電子線、陽子線、ヘリウム線、炭素イオン線、ネオンイオン線、アルゴンイオン線、シリコンイオン線、負パイ中間子線、中性子線、またはマイクロ波等が挙げられる。本発明における放射線は好ましくはＸ線である。
［００４１］
本発明の放射線治療剤の生体への投与回数は、特に制限されず、例えば、１回〜１０回であり、投与時期は、患者に放射線を照射する前若しくは後、または照射するのと同時のいずれの時期であってもよく、最も好ましくは、放射線を照射する前である。
［００４２］
放射線治療における標的物への放射線の照射方法は、公知の方法を用いることができ、例えば、直接的に、分割照射（例えば、１日に数分間、１〜２ヶ月間にわたって複数回）を行う方法が挙げられる。放射線の初期エネルギーは、患者等の腫瘍の大きさ、状態若しくは部位またはその周辺の状況等に応じて適宜選択することができるが、通常、約１００〜５００ＭｅＶ／ｎである。また患者等の腫瘍の大きさ、状態若しくは部位またはその周辺の状況等に応じて適宜選択することができるが、患者等への放射線の照射量は、通常約０．１〜１００Ｇｙであり、患者等への放射線の照射割合は、通常約０．０５〜５０Ｇｙ／分であり、放射線が標的物に対して与えるエネルギー（ｌｉｎｅａｒ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＬＥＴ）は、通常約５０〜７０ｋｅＶ／μｍである。
【国際調査報告】
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