(57)【要約】  シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子の機能を抑制する工程を少なくとも含む、花弁数が増加した多弁咲きシクラメン植物体の生産方法。
2011074646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子の機能を抑制する工程を少なくとも含む、花弁数が増加した多弁咲きシクラメン植物体の生産方法。
【請求項２】
前記転写因子が、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の生産方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項３】
シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子であって下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を有する転写因子の機能を抑制する工程をさらに含む、請求項２に記載の生産方法：
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項４】
前記転写因子が、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の生産方法：
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項５】
シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子であって下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を有する転写因子の機能が抑制されているシクラメンの突然変異体において；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子であって下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を有する転写因子の機能を抑制する工程を少なくとも含む、花弁数が増加した多弁咲きシクラメン植物体の生産方法：
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項６】
前記転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を用いて、前記転写因子の機能を抑制する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項７】
前記機能性ペプチドが、配列番号５〜４４のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項６に記載の生産方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の生産方法により生産されたシクラメン植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多弁咲きシクラメンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
花器官の形態は園芸植物の観賞性を向上させるための重要な要素である。花器官の形態形成においては、まず、花序分裂組織が分化して花原基が形成され、次いで花原基に含まれる花芽分裂組織が分化して、がく片、花びら、雄しべ、雌しべの４種類の花器官が形成される。その後、花器官を含む複合器官として成熟した花が形成される。
一般に「八重咲き」と呼ばれる花は、花弁の内側の雄しべや雌しべが並んでいる場所にさらに多くの花びらが並んで、花弁だけで花が構成されているように見える状態を指す。【０００３】
高等植物における花の形態形成は、一般にＡＢＣモデルによって説明されている。ＡＢＣモデルでは、花の形態変化が、ＭＡＤＳボックスファミリーに属する遺伝子の転写制御により説明される（非特許文献１）。ＭＡＤＳボックスファミリーは３０種以上の遺伝子からなる遺伝子ファミリーを形成しており、Ａ、Ｂ、Ｃの各クラスに細分される。ＭＡＤＳボックスファミリーに属する遺伝子は、ＭＡＤＳボックスと呼ばれる保存性領域を含む転写因子をコードしている。ＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）、ＡＰＥＴＡＬＡ（ＡＰ２）などの遺伝子がＡクラス遺伝子に、ＡＰＥＴＡＬＡ３（ＡＰ３）、ＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡ（ＰＩ）などの遺伝子がＢクラス遺伝子に、ＡＧＡＭＯＵＳ（ＡＧ）などの遺伝子がＣクラス遺伝子に分類され、これらの遺伝子の変異体において花の形態変化が確認されている。【０００４】
これまで、花弁の形態や花弁の数が改変された植物は、主に植物の品種を掛け合わせる交配育種や自然界で発生する突然変異体の探索により得られている。しかし、交配育種においては、目的とする形態を有する植物を生産するために長い年月と熟練した技術を要し、また、突然変異体の探索においては目的とする形態は偶発的に得られるにすぎず、簡易かつ確実に花弁の形態や花弁の数を改変する方法が求められている。【０００５】
遺伝子工学的に植物の形態を改変する方法として、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドを利用する方法が知られている（特許文献１〜７）。これらの機能性ペプチドは、Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＥＲＦ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）タンパク質や、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等の植物のジンクフィンガータンパク質（Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）から切り出されたもので単純な構造を有する。シロイヌナズナにおいては、ＡＰ３遺伝子やＡＧ遺伝子の発現を、ＡＰ３タンパク質やＡＧタンパク質と機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質をコードするＤＮＡを植物体内に導入することで抑制し、これにより雄性不稔体を生産することや花弁数を増加させることが報告されている（特許文献８〜９）。
しかしながら、シロイヌナズナはＡＧ遺伝子を１種類のみ有する花卉であり、複数のＡＧ遺伝子を有する花卉とは、ＡＧ遺伝子の働きが異なると考えられる。実際、シロイヌナズナのＡＧタンパク質と機能性ペプチドとが融合したキメラタンパク質は、トレニアにおいて花弁数を増加させることができなかったことが報告されている（非特許文献２）。また、複数のＡＧ遺伝子を有する花卉における各ＡＧ遺伝子の機能は、花卉の種類により異なることも知られている。【０００６】
シクラメンは観賞用花卉として人気があるが、シクラメンが有するＡＧ遺伝子に関する報告はなく、シクラメンが有するＡＧ遺伝子の数や機能については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７号公報
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８号公報
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６号公報
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７号公報
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６号公報
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９号公報
【特許文献７】国際公開ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット
【特許文献８】特開２００５−１９２４８３号公報
【特許文献９】特開２００６−４２７２９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】花の形態形成の分子遺伝学，新版「植物の形を決める分子機構」（秀潤社）１５０−１６３  ２０００
【非特許文献２】Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００８  ２５，  ４５−５３
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、花弁数が増加した多弁咲きシクラメンの生産方法を提供することを課題とする。また、本発明は、前記生産方法により得られるシクラメンの植物体を提供することを課題とする。
【００１０】
本発明者らは、シクラメンに由来する２種類のＡＧ遺伝子を単離することに成功した。さらに、本発明者らは、該遺伝子の発現を抑制することで、シクラメンの花弁数が増加することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１１】
本発明によれば、下記の手段が提供される：
［１］シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子の機能を抑制する工程を少なくとも含む、花弁数が増加した多弁咲きシクラメン植物体の生産方法。
［２］前記転写因子が、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を有する、［１］に記載の生産方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［３］シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子であって下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を有する転写因子の機能を抑制する工程をさらに含む、［２］に記載の生産方法：
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［４］前記転写因子が、下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を有する、［１］に記載の生産方法：
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［５］シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子であって下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を有する転写因子の機能が抑制されているシクラメンの突然変異体において；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子であって下記の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列を有する転写因子の機能を抑制する工程を少なくとも含む、花弁数が増加した多弁咲きシクラメン植物体の生産方法：
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
［６］前記転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を用いて、前記転写因子の機能を抑制する、［１］〜［５］のいずれかに記載の生産方法。
［７］前記機能性ペプチドが、配列番号５〜４４のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドである、［６］に記載の生産方法。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の生産方法により生産されたシクラメン植物体。
【００１２】
本発明の生産方法によれば、野生型のシクラメンに比べて花弁数が増加した多弁咲きシクラメンを効率的に生産することができる。また、本発明の生産方法により、短期間に簡易かつ確実に花弁の数が増加したシクラメンを得ることができるので、交配育種や突然変異体の探索に比べて品種改良にかかる労力を大幅に削減することができる。
【００１３】
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、適宜添付の図面を参照して、下記の記載からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＣｐＡＧ１ＳＲＤＸで形質転換されたメロディホワイトの花器官（ａ）及び形質転換されていないメロディホワイトの花器官（ｂ）を示す写真である。Ａは花器官を横からみた写真であり、Ｂは花器官を正面からみた写真である。
【図２】ＣｐＡＧ２ＳＲＤＸで形質転換されたウインクピンクの花器官（ａ）、形質転換されていないウインクピンクの花器官（ｂ）及び野生型のシクラメンの花器官（ｃ）を示す写真である。
【図３】ＡｔＡＧＳＲＤＸで形質転換されたフレグランスミニの花器官（ａ）と形質転換されていないフレグランスミニの花器官（ｂ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子
本発明において「シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子」とは、シクラメンの花器官の形成過程において花器官の形態に影響を与える遺伝子の発現を制御する転写因子であり、雄しべや雌しべ等の花器官の形態形成に関与する遺伝子の発現を制御する転写因子であることが好ましい。このような転写因子としては、ＭＡＤＳボックスファミリーのＣクラスに属するＡＧＡＭＯＵＳ（ＡＧ）タンパク質が挙げられるが、中でも、ＡＧＡＭＯＵＳ１（ＡＧ１）タンパク質やＡＧＡＭＯＵＳ２（ＡＧ２）タンパク質が好ましい。
【００１６】
ＡＧ１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましく、配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
また、ＡＧ１タンパク質は、配列番号１の塩基配列における１１１番目〜８５１番目の塩基配列を有するＤＮＡにコードされるタンパク質であることが好ましく、配列番号１の塩基配列における１１１番目〜８５１番目の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡにコードされるタンパク質であってもよい。
【００１７】
ＡＧ２タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましく、配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
また、ＡＧ２タンパク質は、配列番号３の塩基配列における８７番目〜８３０番目の塩基配列を有するＤＮＡにコードされるタンパク質であることが好ましく、配列番号３の塩基配列における８７番目〜８３０番目の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡにコードされるタンパク質であってもよい。
【００１８】
本発明において「１若しくは数個」とは、１〜３０個であることが好ましく、１〜２０個であることがより好ましく、１〜１０個であることがより好ましく、１〜７個であることがより好ましく、１〜５個であることがさらに好ましく、１〜３個であることが特に好ましい。
【００１９】
本発明において「アミノ酸配列の同一性（％）」とは、比較する２つのアミノ酸配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大のアミノ酸配列の同一性（％）をいう。アミノ酸配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、通常の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株））並びにＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ゼネティックス）等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００２０】
本発明において「ストリンジェントな条件」とは、塩基配列の同一性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する温度及び塩濃度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、公知の方法で行うことができる。
【００２１】
（２）転写因子の機能抑制と多弁咲きシクラメンの生産
本発明において、シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子は、シクラメン植物体内においてその機能が抑制される。前記転写因子の機能を抑制する方法に特に制限はなく、例えば、転写抑制因子をシクラメン植物体に導入する方法、前記転写因子をコードする遺伝子を破壊する方法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などにより前記転写因子をコードする遺伝子の発現を抑制する方法が挙げられるが、転写抑制因子を植物体内に導入する方法が好ましい。転写抑制因子としては、例えば、転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質が好ましい。該キメラタンパク質をコードするＤＮＡを植物体内に導入し、植物体内で該キメラタンパク質を生産させ、これにより転写因子の機能を抑制することができる。
【００２２】
本発明において「転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有する機能性ペプチド」とは、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（以下、転写抑制転換ペプチドと呼ぶことがある）を意味する。転写抑制転換ペプチドは、転写因子と融合したキメラタンパク質の形態をとることで、当該転写因子の機能を抑制することができるペプチドであれば特に制限はない。このような転写抑制転換ペプチドとして、ＣｌａｓｓＩＩ  ＥＲＦ遺伝子ファミリーに属する、シロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質又はその部分ペプチド、ＡｔＥＲＦ４タンパク質又はその部分ペプチド、ＡｔＥＲＦ７タンパク質又はその部分ペプチド、ＡｔＥＲＦ８タンパク質又はその部分ペプチド、ＡｔＥＲＦ８タンパク質又はその部分ペプチド（特開２００１−２６９１７７号公報、特開２００１−２６９１７８号公報、特開２００１−２９２７７６号公報、特開２００１−２９２７７７号公報）、タバコ由来のＥＲＦ３タンパク質又はその部分ペプチド（特開２００１−２６９１７６号公報）、イネ由来のＯｓＥＲＦ３タンパク質又はその部分ペプチド（特開２００１−２６９１７９号公報）が例示される。また、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子ファミリーである、シロイヌナズナ由来のＺＡＴ１０タンパク質又はその部分ペプチド、ＺＡＴ１１タンパク質又はその部分ペプチドも例示される。
上記各タンパク質は、カルボキシル末端側の領域に、アスパラギン酸−ロイシン−アスパラギンを含むモチーフ（ＤＬＮモチーフ）を有し、転写抑制転換ペプチドとして機能する。上記各タンパク質の部分ペプチドはＤＬＮモチーフを含む。
【００２３】
また、シロイヌナズナ由来のＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質はＤＬＮモチーフを有さないが、転写抑制転換ペプチドとして機能することが知られており、その転写抑制機能は非常に強い（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１３  １９５９−１９６８  Ａｕｇｕｓｔ  ２００１、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５１４  ３５１−３５４  ２００２）。
【００２４】
さらに、転写抑制転換ペプチドとして、例えば、配列番号５〜４４のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。転写抑制転換ペプチドは、植物体から当業者に周知の方法で単離することもできるし、当業者に周知の方法で化学合成して得ることもできる。
【００２５】
シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子と転写抑制転換ペプチドとを融合させたキメラタンパク質は、該転写因子と転写抑制転換ペプチドとが含まれている限りにおいてその構成に特に制限はなく、該転写因子と転写抑制転換ペプチドのいずれがアミノ末端側に位置してもよい。また、転写因子と転写抑制転換ペプチドとを連結するためのリンカー機能を有するペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等の各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。
【００２６】
シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子と転写抑制転換ペプチドとを融合させたキメラタンパク質をシクラメンに導入する方法に特に制限はないが、該キメラタンパク質をコードするＤＮＡをシクラメンに導入し、シクラメンの花器官で該キメラタンパク質を生産させることが好ましい。
該キメラタンパク質をコードするＤＮＡ（キメラＤＮＡ）は、シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡと、転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡとを、該転写因子と転写抑制転換ペプチドとの融合タンパク質をコードするように連結することで得ることができる。
【００２７】
上記転写因子をコードするＤＮＡは、配列番号１又は配列番号３の塩基配列や、既知の転写因子の塩基配列に基づき通常の方法で作製したプライマー対を用いて、シクラメンのｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型として通常の方法でＰＣＲを行うことにより得ることができる。また、上記転写因子をコードするＤＮＡは、公知の方法により化学合成して得ることもできる。さらに、このようにして得られたＤＮＡに部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を導入することで、該ＤＮＡのバリアント、すなわち、該ＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを得ることができ、このようなバリアントも上記転写因子をコードするＤＮＡに含まれる。
また、転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡは、既知の転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に基づき通常の方法で作製したプライマー対を用いて、転写抑制転換ペプチドが由来する植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型として通常の方法でＰＣＲを行うことにより得ることができる。また、上記転写因子をコードするＤＮＡは、公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００２８】
キメラＤＮＡは、目的とするキメラＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡを当業者に周知の方法で化学合成することで得ることもできる。
上記キメラＤＮＡは、シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡと転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡとを連結するための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。また、上記キメラＤＮＡは、トリプレットの読み枠を調整するための塩基配列などの付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００２９】
上記キメラＤＮＡをシクラメンに導入する方法に特に制限はなく、上記キメラＤＮＡでシクラメンを形質転換する方法であればいずれも採用することができるが、上記キメラＤＮＡを挿入した組換え発現ベクターで形質転換する方法が好ましい。組換え発現ベクターの作製方法及び該発現ベクターで形質転換されたシクラメンの作製方法について以下に説明するが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。
【００３０】
（ａ）組換え発現ベクターの構築
組換え発現ベクターは、プロモーター配列と、シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子をコードする塩基配列と、転写抑制転換ペプチドをコードする塩基配列とを少なくとも含むベクターである。
【００３１】
上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、公知の種々のベクターを用いることができる。公知のベクターとしては、プラスミド、ファージ、又はコスミド等が挙げられ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げられる。これらのベクターの中から、導入される植物細胞や導入方法に応じたベクターを適宜選択することができるが、アグロバクテリウムを介してベクターをシクラメンに導入する場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００３２】
プロモーターは、植物体内で、その下流に存在する遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されない。かかるプロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げられるが、中でもカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター又はアクチンプロモーター好ましい。また、花器官特異的に発現するプロモーターも好適に使用できる。
【００３３】
組換え発現ベクターにおいて、プロモーターは、転写因子をコードするＤＮＡと転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡとを連結したキメラＤＮＡを発現しうるように連結されている。前記組換え発現ベクターは、上記プロモーター及び上記キメラＤＮＡに加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選抜マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列を含むＤＮＡセグメント等を挙げることができる。
【００３４】
前記ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではないが、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等が好ましく、中でもＮｏｓターミネーターが好ましい。
前記組換え発現ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させたりするような現象を防止することができる。
【００３５】
前記選抜マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の例として、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等の抗生物質に対する耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、形質転換処理を施したシクラメン植物体を前記抗生物質を含む培地中に培養し、生育してきた該植物体を選抜することによって、形質転換された細胞や組織を容易に選抜することができる。
また、前記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域を有する組換え発現ベクターは、特にアグロバクテリウムを介して組換え発現ベクターをシクラメンに導入する場合に、シクラメンのゲノムＤＮＡ中への目的遺伝子の組み込み効率を高めることができる点で好ましい。
【００３６】
前記組換え発現ベクターの構築方法は特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、プロモーター、シクラメンの花器官の形態形成に関与する転写因子をコードするＤＮＡ、転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡ、及び必要に応じて前記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように挿入すればよい。例えば、前記転写因子をコードするＤＮＡと前記転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡとを連結してキメラＤＮＡを構築し、次に、このキメラＤＮＡの上流にプロモーターを連結し、必要に応じてキメラＤＮＡの下流にターミネーターを連結していわゆる発現カセットを構築し、これを母体となるベクターに導入することで組換え発現ベクターを作製することができる。
【００３７】
キメラＤＮＡの構築及び発現カセットの構築では、例えば、遺伝子、プロモーター、ターミネーター等の各ＤＮＡ要素の末端を制限酵素を用いて互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素を作用させることで、各ＤＮＡ要素を所定の順序で連結することが可能となる。前記制限酵素やライゲーション酵素等は市販のものを適宜選択して用いればよい。
【００３８】
作製した組換え発現ベクターを大腸菌等のホスト細胞に導入し、ホスト細胞を増殖させることで組換え発現ベクターを複製することが可能になる。増殖したホスト細胞から公知の方法で組換え発現ベクターを回収することができる。
【００３９】
（ｂ）形質転換
上述した組換え発現ベクターでシクラメン植物体を形質転換し、該細胞にキメラＤＮＡ発現カセットを導入することができる。
形質転換されるシクラメン植物体として、例えば、シクラメンの花、葉、根等の器官を構成する組織や細胞の他、カルス、不定胚、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
上記組換え発現ベクターをシクラメン植物体に導入する方法に特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。例えば、組換え発現ベクターを保持するアグロバクテリウムをシクラメンの組織や細胞等に感染させることでアグロバクテリウムが感染した細胞のゲノム中にキメラタンパク質の発現カセットを挿入する方法や、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等の、組換え発現ベクターを直接シクラメンの細胞内に導入する方法を用いることができる。
【００４０】
（ｃ）形質転換植物体の選抜及び再生
形質転換体の選抜方法に特に制限はなく、形質転換処理を施した植物体の、ハイグロマイシンやカナマイシン等の薬剤に対する耐性を指標として選抜してもよいし、形質転換処理を施した前記植物体を再生させて生育したシクラメンの花の形態を指標として選抜してもよい。
花の形態から選抜する例として、形質転換処理を施した前記植物体を再生させ、生育したシクラメンの花の形態を、形質転換していないシクラメンの花の形態と比較し、形質転換処理を施した植物体に由来するシクラメンにおいて、形質転換していないシクラメンに比べて花弁の数が増加しているシクラメンを選抜することが挙げられる。花の形態を指標とする選抜方法は、単に目視比較するだけで選抜が可能であり、また、花器官の形態の改変、特に花弁数の増加という本発明の効果そのものを確認することができる点で好ましい。
【００４１】
形質転換させた細胞等の植物体（以下、形質転換植物体と呼ぶことがある）を再生させ、花弁を有するシクラメンを生育させる方法は公知の方法を用いることができ、これにより花弁の数が増加した多弁咲きシクラメン植物体を得ることができる。
本発明の生産方法には、形質転換植物体に再生処理を施して該形質転換植物体から生育したシクラメンを得、このシクラメンから有性生殖又は無性生殖により花の形態が改変された子孫を得る工程が含まれていてもよい。また、形質転換細胞から再生させたシクラメンやその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを再生させて、再度、花弁を有する生育したシクラメンを得る工程が含まれていてもよい。すなわち、本発明の生産方法には、形質転換植物体を繁殖させる工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【００４２】
形質転換植物体に目的とするキメラＤＮＡが組み込まれていることの確認は、例えば、該植物体、又は該植物体から再生させたシクラメンの組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法もしくはサザンハイブリダイゼーション法等の通常の方法により行うことができる。
【００４３】
本発明において「花弁の数が増加した」とは、形質転換されていないシクラメンと比較して花弁の数が増加していることを意味する。花弁の数が増加した態様について特に制限はないが、例えば、雄しべや雌しべが花弁の形に改変された態様が挙げられる。
【００４４】
なお、本発明において「シクラメン植物体」なる用語は、シクラメン属に含まれる植物体を意味する。また。本発明において「植物体」なる用語は、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、植物器官、カルス、種子等を含む概念として使用される。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞には、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。
【００４５】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。以下の実験操作の手順は特に記述しない限り、「モレキュラー  クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）  第２版」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，１９８９年）に記載されている方法に従った。
【実施例】
【００４６】
参考例１  シクラメン由来のＡＧＡＭＯＵＳ転写因子の単離
（１）シクラメンの蕾由来の全ＲＮＡの調製
シクラメン（品種：フレグランスミニ）の蕾（がく、花弁、雄ずい、雌ずい）０．１ｇを液体窒素存在下で凍結後、凍結した蕾を破砕機ＭＭ３００（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて粉砕した。この粉砕物に０．７５ｍｌの２×ＣＴＡＢ溶液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、４％  β−メルカプトエタノール、２％臭化セチルトリメチルアンモニウム）を加えて撹拌し、６５℃で１０分間インキュベートした後、クロロフォルム抽出操作を２回行い核酸を回収した。得られた核酸抽出液に等量のイソプロパノールを加え、２１，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行って核酸を沈殿させ、これを０．８ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。この溶解液に０．２ｍｌの１０Ｍ  塩化リチウム溶液を加え、氷上に２時間静置後、２１，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離することで全（トータル）ＲＮＡを沈澱させた。沈殿した全ＲＮＡを蒸留水に溶解した後、フェノール／クロロフォルム抽出を行い、得られた核酸画分をエタノール沈殿操作に供することで全ＲＮＡを精製した。沈殿した全ＲＮＡを適当量のＴＥに溶解し、その濃度を分光光度計により測定したところ、収量が１１．５μｇであった。以降の実験に用いるため、ＲＮＡ溶液の濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整した。【００４７】
（２）シクラメンのＡＧＡＭＯＵＳ転写因子をコードする遺伝子の３’側領域に位置するｃＤＮＡ断片のクローニング
（ｉ）３’ＲＡＣＥ法を用いて、シクラメンのＡＧＡＭＯＵＳ転写因子（以下ＡＧとする。）をコードする遺伝子のｃＤＮＡ断片をクローニングするために、シロイヌナズナ、ガーベラ、ペチュニア及びバラのＡＧ遺伝子のアライメントをもとに縮重プライマーの設計を行った。配列番号４５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（塩基配列中のＫはＧ又はＴを表し、ＹはＴ又はＣを表し、ＭはＡ又はＣを表し、ＲはＡ又はＧを表す）を、それぞれ１ｓｔＰＣＲ用プライマー、ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ用プライマーとして設計し、ＤＮＡ合成サービス（北海道システムサイエンス（株））を利用してオリゴヌクレオチドを作製した。以下、オリゴヌクレオチドの作製は、ＤＮＡ合成サービス（北海道システムサイエンス（株））を利用した。【００４８】
（ｉｉ）３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（インビトロジェン社製）を用いて、前記（１）で得られた全ＲＮＡの１μｇを鋳型として逆転写反応を行い、該反応産物を鋳型として、前記１ｓｔＰＣＲ用プライマーを最終濃度０．３μＭとなるように添加してＰＣＲを行った。続いて、該ＰＣＲ増幅産物を鋳型として、前記ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ用プライマーを最終濃度０．３μＭとなるように添加してＮｅｓｔｅｄＰＣＲを行うことでシクラメンＡＧ遺伝子の３’側領域に位置するｃＤＮＡ断片の増幅を行った。ＰＣＲ反応装置として、ＢｉｏＲａｄ社製、ｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラーを用いた。ＤＮＡポリメラーゼとしてはＴａｋａｒａ  ＬＡＴａｑ（タカラバイオ社製）を用い、増幅反応液は、付属の試薬を用いて調製した。９５℃で２分間の変性反応に続き、９４℃で３０秒間の変性反応・５２℃で１分間のアニーリング反応・７２℃で１分間の伸張（Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）反応からなる３工程の反応を３０サイクル行うことによってＰＣＲを実施した。
前記ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ後の反応液の５μｌを電気泳動し、設計されたプライマーから想定されるサイズのＤＮＡの増幅を確認した。【００４９】
（ｉｉｉ）前記ＮｅｓｔｅｄＰＣＲの増幅産物をＴＡベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎａｖａｇｅｎ社製）のＴＡサイトに連結した。得られた連結ベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換することにより、増幅反応産物であるＤＮＡ断片を保持する形質転換大腸菌を得た。【００５０】
前記形質転換大腸菌を複数個選抜して増殖させ、これからプラスミドＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて抽出した。以下、プラスミドＤＮＡの抽出にはＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。プラスミドＤＮＡ（ベクター）を、そのマルチクローニングサイトにある制限酵素サイトに対応する制限酵素で処理した後、これを電気泳動することにより目的の増幅産物がプラスミドＤＮＡ中に挿入されていることを確認し、続いてＤＮＡシークエンス受託サービス（ファスマック（株））を利用して、該増幅産物の塩基配列を決定した。以下、塩基配列の決定はＤＮＡシークエンス受託サービス（ファスマック（株））を利用した。
その結果、前記増幅産物はポリＡシグナルを含む８２６ｂｐの塩基配列を含むことが確認された。決定された塩基配列をこれまで明らかにされているＡＧ遺伝子ファミリーの塩基配列と比較した結果、上記増幅反応産物はシクラメン由来のＡＧ遺伝子の３’側領域をコードするＤＮＡ断片である事が強く示唆され、該ＤＮＡ断片をＣｐＡＧ３’と命名した。【００５１】
（３）シクラメンのＡＧＡＭＯＵＳ転写因子をコードする遺伝子の５’側領域に位置するｃＤＮＡ断片のクローニング
（ｉ）５’ＲＡＣＥ法を用いて前記ＣｐＡＧ３’を含む遺伝子における上流域をクローニングためのプライマーの設計を行った。配列番号４７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（塩基配列中のＫはＧ又はＴを表し、ＹはＴ又はＣを表し、ＭはＡ又はＣを表し、ＲはＡ又はＧを表す）及びＣｐＡＧ３’の塩基配列に基づき設計した配列番号４８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ１ｓｔＰＣＲ用プライマー及びＮｅｓｔｅｄＰＣＲ用プライマーとして作製した。【００５２】
（ｉｉ）５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（インビトロジェン社製）を用いて、前記（１）で得られた全ＲＮＡの１μｇを鋳型として逆転写反応を行い、該反応産物を鋳型として、前記１ｓｔＰＣＲ用プライマーを最終濃度０．３μＭとなるように添加してＰＣＲを行った。続いて、該ＰＣＲ増幅産物を鋳型として、前記ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ用プライマーを最終濃度０．２μＭとなるように添加してＮｅｓｔｅｄＰＣＲを行うことでシクラメンＡＧ遺伝子の５’側領域に位置するｃＤＮＡ断片の増幅を行った。ＰＣＲは、前記（２）（ｉｉ）と同一条件で行った。
前記ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ後の反応液を５μｌ電気泳動し、設計されたプライマーから想定されるサイズのＤＮＡの増幅を確認した。【００５３】
（ｉｉｉ）前記ＮｅｓｔｅｄＰＣＲの増幅産物をＴＡベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎａｖａｇｅｎ社製）のＴＡサイトに連結した。得られた連結ベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換することにより、増幅反応産物であるＤＮＡ断片を保持する形質転換大腸菌を得た。【００５４】
前記形質転換大腸菌を複数個選抜して増殖させ、これからプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡ（ベクター）を、そのマルチクローニングサイトの制限酵素サイトに対応する制限酵素で処理した後、これを電気泳動することにより目的の増幅産物がプラスミドＤＮＡ中に挿入されていることを確認し、続いて該増幅産物の塩基配列を決定した。
その結果、５３８ｂｐ及び４８２ｂｐの塩基配列を含む２種類のシクラメンＡＧ遺伝子の５’側上流域をコードすると思われるＤＮＡ断片が確認され、それぞれＣｐＡＧ５’−１及びＣｐＡＧ５’−２と命名した。【００５５】
（４）ＣｐＡＧ３’並びにＣｐＡＧ５’−１及びＣｐＡＧ５’−２の塩基配列解析
前記（２）及び（３）で決定されたＣｐＡＧ３’並びにＣｐＡＧ５’−１及びＣｐＡＧ５’−２の塩基配列を解析するために、ソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティクス社製）を用い、塩基配列アラインメント（Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）ファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成した。その結果、ＣｐＡＧ５’−１とＣｐＡＧ５’−２は９３％の塩基配列の同一性を有していた。また、ＣｐＡＧ３’遺伝子の塩基配列はＣｐＡＧ５’−１遺伝子の塩基配列と部分的に一致し、塩基配列を結合させたところ一つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をもつ遺伝子を構成することが明らかとなった。この単一のＯＲＦをもつ遺伝子をＣｐＡＧ１遺伝子と命名した。このＣｐＡＧ１遺伝子は、全長１０８３塩基、７４１塩基からなるＯＲＦを有するＤＮＡ配列を含む。また、ＣｐＡＧ５’−２を含む遺伝子をＣｐＡＧ２遺伝子と命名した。【００５６】
さらにＧｅｎｅｔｙｘを用いてＣｐＡＧ１遺伝子及びＣｐＡＧ５’−２の制限酵素地図を作成して比較したところ、ＣｐＡＧ５’−２には、ＣｐＡＧ１遺伝子には存在しないＳｐｅＩサイトが存在することがわかった。【００５７】
（５）ＣｐＡＧ１遺伝子のクローニング
ＣｐＡＧ１遺伝子及びＣｐＡＧ２遺伝子のＯＲＦをクローニングする目的で、配列番号４９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーとして作製した。
次に前記（１）で得られた全ＲＮＡの１μｇをテンプレートとして、逆転写酵素ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、１μｌのオリゴ（ｄＴ）Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８  ｐｒｉｍｅｒ（インビトロジェン社製）と逆転写酵素に付属の試薬を用いて逆転転写反応液２０μｌを調製して逆転写反応を行った。逆転写反応は、該逆転写反応液を３０℃で１０分間、５０℃で３０分間、９９℃で５分間、４℃で５分間、順次インキュベートすることで行った。【００５８】
続いて、逆転写反応後の反応液１μｌを含むＰＣＲ増幅用反応液を調製し、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマー各々を、終濃度０．３μＭになるように添加し、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲを行った。ここで使用した増幅反応液は、ＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社製）に付属の試薬を用いて調製した。ＰＣＲ反応装置としては、ＢｉｏＲａｄ社製、ｉＣｙｃｌｅｒサーマルサイクラーを用い、９５℃で２分間の変性反応に続き、変性を９４℃で３０秒間の変性反応・５８℃で１分間のアニーリング反応・６８℃で１分間の伸張（Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）反応からなる３つの反応を３０サイクル行うことによりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ後の反応液５μｌを電気泳動し、設計したプライマーから想定されるサイズのＤＮＡの増幅を確認した。【００５９】
（ｉｉｉ）前記増幅反応産物をリン酸化処理した後、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＳｍａＩサイトへの増幅産物の連結操作を行った。得られた連結ベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換することにより、増幅反応産物であるＤＮＡ断片を保持する形質転換大腸菌を得た。【００６０】
上記形質転換大腸菌を複数個選抜して増殖させ、これからプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスドＤＮＡ（ベクター）を、そのマルチクローニングサイトにある制限酵素サイトに対応する制限酵素及びＳｐｅＩで処理した後、これを電気泳動することにより目的の増幅産物がプラスミドＤＮＡ中に挿入されていることを確認した。しかしながら、ＳｐｅＩサイトをもつクローンは得られなかった。
さらに形質転換大腸菌４クローンを選抜し、その増幅産物ＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、４クローンは全てＣｐＡＧ１遺伝子のＯＲＦを有していた。
上記方法によりＣｐＡＧ１遺伝子はクローニングできたがＣｐＡＧ２遺伝子はクローニングできなかった。その理由として、ＣｐＡＧ２遺伝子の３’側非翻訳領域の配列がＣｐＡＧ１遺伝子と大きく異なっていることが考えられた。【００６１】
（６）ＣｐＡＧ２遺伝子のクローニング
（ｉ）ＣｐＡＧ２遺伝子の３’側領域をクローニングするために、前記（４）で作成したＣｐＡＧ１遺伝子の塩基配列と、ＣｐＡＧ５’−２の塩基配列とのアライメントから配列同一性の低い部分を選択し、プライマーとして、配列番号５１及び配列番号５２の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチドを作製した。【００６２】
上記２種類のプライマーを用いて、前記（２）と同様に３’ＲＡＣＥを行い、クローニングした増幅産物の塩基配列を決定した。その結果、クローニングされたＤＮＡ断片はポリＡシグナルを含む６９８ｂｐの塩基配列を含むｃＤＮＡであることが確認された。【００６３】
（ｉｉ）さらに、ＣｐＡＧ２遺伝子の５’側領域の全長がクローニングされているか確認するために５’Ｒａｃｅを行うこととした。ＣｐＡＧ１遺伝子と上記（６）（ｉ）で決定した塩基配列を比較して同一性の低い塩基配列（配列番号５３）からなるオリゴヌクレオチドを１ｓｔＰＣＲ用プライマーとして作製した。また、配列番号４８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをＮｅｓｔｅｄプライマーとした。
前記（３）と同様に５’ＲＡＣＥを行い、クローニングした増幅産物の塩基配列を決定した。その結果、クローニングされたＤＮＡ断片は５１７ｂｐの塩基配列を含むｃＤＮＡであることが確認された。【００６４】
（ｉｉｉ）３’Ｒａｃｅ及び５’Ｒａｃｅで得られた塩基配列をアライメントすることにより、１０７３個の塩基よりなる一つのＯＲＦを含むｃＤＮＡが存在することがわかった。その後、前記（５）と同様の方法でＣｐＡＧ２遺伝子をクローニングした。
（７）ＣｐＡＧ１，２遺伝子の塩基配列解析
ＣｐＡＧ１遺伝子とＣｐＡＧ２遺伝子のＯＲＦの塩基配列は、９０％の同一性を有し、また推定アミノ酸配列においても、９０％の同一性を示した。該推定アミノ酸配列を既知のＡＧ遺伝子のアミノ酸配列と比較したところ、高い同一性を示し、ＣｐＡＧ１遺伝子及びＣｐＡＧ２遺伝子がＡＧ転写因子のオーソログ遺伝子であることが推測された。【００６５】
シクラメンのＣｐＡＧ１遺伝子は１０８３ｂｐの塩基配列からなり（配列番号１）、その内部には単一のオープンリーディングフレームである７４１個の塩基配列を含む（配列番号１の塩基番号第１１１番目〜第８５１番目の塩基配列）。該オープンリーディングフレームは、配列番号２の２４７個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードしている。
また、シクラメンのＣｐＡＧ２遺伝子は１０７３ｂｐの塩基配列からなり（配列番号３）、その内部には単一のオープンリーディングフレームである７４４個の塩基配列を含む（配列番号３の塩基番号第８７番目〜第８３０番目の塩基配列）。該オープンリーディングフレームは、配列番号４に示される２４８個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードしている。
ＣｐＡＧ１遺伝子及びＣｐＡＧ２遺伝子のｃＤＮＡはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクターにサブクローニングされ、これを導入した大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ＣｐＡＧ−１、ＣｐＡＧ−２）と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターを国際寄託当局として、２０１０年１１月５日付で、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３０６及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３０７として寄託されている。【００６６】
参考例２  形質転換用ベクターの構築
（１）形質転換用ベクターを構築するためのベクターｐ３５ＳＧの作製【００６７】
（ｉ）ｐＥＮＴＲベクター（インビトロジェン社製）上のａｔｔＬ１の領域を、ａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号５４）及びａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号５５）の２つのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、精製した。また、ａｔｔＬ２の領域を、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号５６）及びａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号５７）の２つのプライマーを用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲは、９４℃で１分間の変性、４７℃で２分間のアニール反応、７４℃で１分間の伸張反応を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。【００６８】
（ｉｉ）プラスミドｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、ＵＳＡ）を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下、ＣａＭＶ３５Ｓと呼ぶことがある）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下、Ｎｏｓ−ｔｅｒと呼ぶことがある）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。【００６９】
（ｉｉｉ）配列番号５８の塩基配列からなるＤＮＡ断片、及び配列番号５９の配列を有するＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号５８及び５９の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端側からＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩがこの順に含まれる。【００７０】
（ｉｖ）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、ベクターｐ３５ＳＧを完成させた。【００７１】
（２）転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧの構築
（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列からなる転写抑制転換ペプチド（ＳＲＤＸ）をコードし、３’末端に終止コドンＴＡＡを持つように設計したポリヌクレオチド（配列番号６０）及びその相補鎖（配列番号６１）を合成し、７０℃で１０分間加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。【００７２】
（ｉｉ）ベクターｐ３５ＳＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記のＳＲＤＸをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧを構築した。【００７３】
（３）ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧへのＣｐＡＧ１遺伝子の組み込み
（ｉ）試験例１で取得したＣｐＡＧ１遺伝子から配列番号６２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、終止コドンを除くシクラメンＣｐＡＧ１遺伝子のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。【００７４】
（ｉｉ）得られたＣｐＡＧ１遺伝子のコード領域のＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいたベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。【００７５】
（ｉｉｉ）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調製して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＣｐＡＧ１遺伝子とＳＲＤＸをコードする遺伝子とが融合したキメラ遺伝子が組み込まれたベクターｐ３５ＳＣｐＡＧ１ＳＲＤＸＧを得た。【００７６】
（４）ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧへのＣｐＡＧ２遺伝子の組み込み
（ｉ）試験例１で取得したＣｐＡＧ２遺伝子から配列番号６２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、終止コドンを除くシクラメンＣｐＡＧ２遺伝子のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。【００７７】
（ｉｉ）得られたＣｐＡＧ２コード領域のＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
（ｉｉｉ）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調製して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＣｐＡＧ２遺伝子とＳＲＤＸをコードする遺伝子とが融合したキメラ遺伝子が組み込まれたベクターｐ３５ＳＣｐＡＧ２ＳＲＤＸＧを得た。【００７８】
（５）３５ＳＣｐＡＧ１ＳＲＤＸＧ及びＣｐＡＧ２ＳＲＤＸＧを保持するベクターの構築
前記（３）、（４）で調製したベクターｐ３５ＳＣｐＡＧ１ＳＲＤＸＧ及びｐ３５ＳＣｐＡＧ２ＳＲＤＸＧを利用し、３５ＳＣｐＡＧ１ＳＲＤＸＧ及び３５ＳＣｐＡＧ２ＳＲＤＸＧのＤＮＡ断片を同時に保持する、ベクターｐ３５ＳＣｐＡＧ１ＳＲＤＸＧ：３５ＳＣｐＡＧ２ＳＲＤＸＧを構築した。【００７９】
（６）組換え発現ベクターの構築
前記（３）、（４）及び（５）で調製したベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨ（独立行政法人産業技術総合研究所より入手）に組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。具体的には、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標、インビトロジェン社製）を用いて以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のとおりに行った。【００８０】
（ｉ）ｐ３５ＳＣｐＡＧ１ＳＲＤＸＧ１．５μｌ（約３００ｎｇ）又はｐ３５ＳＣｐＡＧ２ＳＲＤＸＧ１．５μｌ（約３００ｎｇ）を別々に、又は、ｐ３５ＳＣｐＡＧ１ＳＲＤＸＧ：３５ＳＣｐＡＧ２ＳＲＤＸＧ１．５μｌ（約３００ｎｇ）をｐＢＩＧＣＫＨ４．０μｌ（約６００ｎｇ）と混合し、各混合液に５倍希釈したＬＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ４．０μｌとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５．５μｌを加えた。
（ｉｉ）これらの溶液にＬＲ  ｃｌｏｎａｓｅ４．０μｌを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ２μｌを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。
（ｉｉｉ）これらの各溶液１〜２μｌを別々に大腸菌（ＤＨ５α等）に導入し、ハイグロマイシン耐性を指標にして形質転換大腸菌を選抜した。
これにより、植物形質転換用ベクターｐ３５ＣｐＡＧ１ＳＲＤＸ及びｐ３５ＣｐＡＧ２ＳＲＤＸ、並びにｐ３５ＳＣｐＡＧ１ＳＲＤＸ：３５ＳＣｐＡＧ２ＳＲＤＸを得た。【００８１】
（７）植物形質転換用ベクターによるアグロバクテリウムの形質転換
前記植物形質転換用ベクターｐ３５ＣｐＡＧ１ＳＲＤＸ又はｐ３５ＣｐＡＧ２ＳＲＤＸを有する各大腸菌から該ベクターをプラスミドＤＮＡとしてそれぞれ抽出して、各ベクターをそれぞれ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＥＨＡ１０１）及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＬＢＡ４４０４）にエレクトロポレーション法により導入した。また、ｐ３５ＣｐＡＧ１ＳＲＤＸ：３５ＣｐＡＧ２ＳＲＤＸをアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＬＢＡ４４０４）に対してエレクトロポレーション法により導入した。ハイグロマイシンを含むＬＢ培地上で、２８℃、２日間静置培養することで、植物形質転換用ベクターｐ３５ＣｐＡＧ１ＳＲＤＸを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＥＨＡ１０１）、植物形質転換用ベクターｐ３５ＣｐＡＧ２ＳＲＤＸを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＬＢＡ４４０４）、並びにｐ３５ＣｐＡＧ１ＳＲＤＸ：３５ＣｐＡＧ２ＳＲＤＸを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＬＢＡ４４０４）を得た。【００８２】
実施例  シクラメンへのキメラ遺伝子の導入
（１）一重咲き品種への導入
シクラメン（品種：メロディホワイト）の種子を有効塩素濃度が１％の次亜塩素酸ナトリウム液で２０分間浸漬し滅菌後、１／２無機塩濃度のＭＳ培地にショ糖を最終濃度３％、ゲランガムを最終濃度０．３％となるように加えた培地（ｐＨ５．８）に置床して、２０℃、暗所で６０日間培養した。種子から発芽して生じた幼苗の葉柄部分を長さ５ｍｍに切断し、遺伝子導入用組織片とした。１試験区あたり１００本の組織片を、１／２無機塩濃度のＭＳ培地にショ糖を最終濃度３％、植物ホルモンとしてチジアズロンを最終濃度１ｍｇ／ｌ、２，４−Ｄを最終濃度１ｍｇ／ｌ、アセトシリンゴンを最終濃度２０ｍｇ／ｌとなるように加え、ｐＨ５．８として、ゲルライトを最終濃度０．３％となるように加えた固体培地に置床した。この培養に用いられる容器は、滅菌したプラスチックシャーレ（直径９ｃｍ、高さ１．５ｃｍ）であり、シャーレ１枚あたり組織片１０本を置床している。これを２０℃で暗所にて７日間培養した。【００８３】
前記の組換えベクターｐ３５ＳＣｐＡＧ１ＳＲＤＸを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＥＨＡ１０１）をＬＢ培地で２８℃で一晩培養した。培養液から遠心分離によりアグロバクテリウム菌を集め、次いで１／３ＭＳ培地の無機塩組成にショ糖３％を添加してなる液体培地１０ｍｌに懸濁し、菌液を得、前記シクラメン葉柄の培養後の組織片１００個を３０分間浸漬処理した。浸漬処理後、１／２無機塩濃度のＭＳ培地にショ糖を最終濃度３％、植物ホルモンとしてチジアズロンを最終濃度１ｍｇ／ｌ、２，４−Ｄを最終濃度１ｍｇ／ｌ、アセトシリンゴンを最終濃度２０ｍｇ／ｌとなるように加え、ｐＨ５．８として、ゲルライトを最終濃度０．３％となるように加えた固体培地に置床した。２０℃の温度条件下で暗所にて６日間共存培養を行った。【００８４】
共存培養後の組織片１００個を、５０ｍｌ容の無菌の遠心管（内径２７ｍｍ、長さ１１５ｍｍ）に移し、洗浄液（１／２無機塩濃度のＭＳ液体培地にカルベニシリンを最終濃度３００ｍｇ／ｌとなるように加えたもの）３０ｍｌを加えて洗浄した。さらにこの操作を６回繰り返した後、無菌のろ紙を用いて余分な水分を取り除いた。洗浄された組織片は、１／２無機塩濃度のＭＳ培地にショ糖を最終濃度３％、植物ホルモンとしてチジアズロンを最終濃度１ｍｇ／ｌ、２，４−Ｄを最終濃度１ｍｇ／ｌ、カルベニシリンを最終濃度５００ｍｇ／ｌ、ハイグロマイシンを最終濃度５ｍｇ／ｌとなるように加え、ｐＨ５．８として、ゲルライトを最終濃度０．３％となるように加えたカルス増殖培地に置床した。２０℃、暗所にて１ヶ月毎に新しい選抜培地に移植した。【００８５】
（２）突然変異八重咲き品種への導入
シクラメン（品種：ウインクピンク）の葉身を遺伝子導入用組織として用い、組換えベクターｐ３５ＳＣｐＡＧ２ＳＲＤＸを包含するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＬＡＢ４４０４）を感染させた以外は、上記（１）と同様の方法で行った。
尚、ウインクピンク品種について、ＲＴ−ＰＣＲによりＣｐＡＧ１及びＣｐＡＧ２の発現を確認したところ、ＣｐＡＧ１の発現は認められず、ＣｐＡＧ２の発現のみが確認された。すなわち、ウインクピンク品種はＣｐＡＧ１遺伝子の機能が喪失した突然変異八重咲き品種であった。【００８６】
（３）形質転換シクラメンの作出−１
前記（１）、（２）において選抜培地に移植された組織片は、約２ヶ月でハイグロマイシン抵抗性の形質転換カルスを形成した。これらのカルスを、１／３無機塩濃度のＭＳ培地にショ糖を最終濃度３％、植物ホルモンとしてＮＡＡを最終濃度０．２ｍｇ／ｌ、ＢＡを最終濃度０．０２ｍｇ／ｌ、カルベニシリンを最終濃度３００ｍｇ／ｌ、ハイグロマイシンを最終濃度５ｍｇ／ｌとなるように加え、ｐＨ５．８として、ゲルライトを最終濃度０．３％となるように加えた不定芽再生培地に置床した。２０℃、暗所にて１ヶ月毎に新しい不定芽再生培地に移植した。【００８７】
再生培地に移植後、約２ヶ月で形質転換カルスから不定芽が形成した。これらの不定芽を切除して、１／３無機塩濃度のＭＳ培地にショ糖を最終濃度３％、植物ホルモンとしてＮＡＡを最終濃度０．１ｍｇ／ｌとなるように加え、ｐＨ５．８として、ゲルライトを最終濃度０．３％となるように加えた発根培地に置床した。２０℃、明所（１０００ルックス、１６時間照明）培養した結果、ＣｐＡＧ１ＳＲＤＸにより形質転換された組織片から生育したシクラメン植物体（メロディホワイトの形質転換体）が８個体、ＣｐＡＧ２ＳＲＤＸにより形質転換された組織片から生育したシクラメン植物体（ウインクピンクの形質転換体）が１２個体得られた。【００８８】
（４）形質転換シクラメンの栽培評価−１
前記（３）で得られた形質転換シクラメンについて、その葉を遺伝子解析用の材料とし、ＰＣＲによりＣｐＡＧ１遺伝子又はＣｐＡＧ２遺伝子とＳＲＤＸをコードする遺伝子との融合遺伝子が導入されていることを確認した。【００８９】
ＣｐＡＧ１ＳＲＤＸで形質転換された一重咲き品種であるメロディホワイトの表現型を、形質転換されていないメロディホワイトの表現型と比較した結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＣｐＡＧ１ＳＲＤＸで形質転換されたメロディホワイトは、形質転換されていないメロディホワイトに比べて花弁数が増加し、雄しべが花弁化していることも確認できた。【００９０】
また、ＣｐＡＧ２ＳＲＤＸで形質転換された突然変異八重咲き品種であるウインクピンクの表現型を、形質転換されていないウインクピンクの表現型と比較した結果を図２に示す。図２から明らかなように、ＣｐＡＧ２ＳＲＤＸで形質転換されたウインクピンクでは、雄しべと雌しべが花弁化しており、形質転換されていないウインクピンクに比べて顕著に花弁数が増加していた。そして、野生型のシクラメンと比較した場合には、花弁数の増加が極めて顕著であることがわかった。【００９１】
（５）一重咲き品種への２種類のキメラ遺伝子の導入
シクラメン（品種：フレグランスミニアメジストブルー）の遺伝子導入用組織片を上記（１）と同様の方法で用意した。１試験区あたり１００本の組織片を、ショ糖５％、２，４−Ｄ４ｍｇ／ｌ、カイネチン０．１ｍｇ／ｌ、アセトシリンゴン２０ｍｇ／ｌ、ゲルライト０．３％を含有する固体培地に置床した。この培養に用いられる容器は、滅菌したプラスチックシャーレ（直径９ｃｍ、高さ１．５ｃｍ）であり、シャーレ１枚あたり組織片１０本を置床している。これを２０℃で暗所にて７日間培養した。【００９２】
上記のｐ３５ＳＣｐＡＧ１ＳＲＤＸ：３５ＳＣｐＡＧ２ＳＲＤＸを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌（ＬＡＢ４４０４）をＬＢ液体培地で１２時間、２８℃で培養した。培養液から遠心分離によりアグロバクテリウム菌を集め、次いで１／３ＭＳ培地の無機塩組成にショ糖３％を添加してなる液体培地１０ｍｌに懸濁し、菌液を得、前記シクラメン葉柄の培養後の組織片１００個を３０分間浸漬処理した。処理後、葉柄を菌液から取り出し、滅菌したろ紙上で余分な菌液を吸い取った後、共存培地で７日間、２０℃、暗黒下で培養した。共存培地はＭＳ培地の無機成分組成において、さらにショ糖５％、２，４−Ｄ４ｍｇ／ｌ、カイネチン０．１ｍｇ／ｌ、アセトシリンゴン２０ｍｇ／ｌ、ゲルライト０．３％を含有する培地である。【００９３】
上記のように感染処理した葉柄は、抗生物質カルベニシリンを０．５ｇ／ｌの濃度になるように添加した不定胚形成培地で３０日毎に継代培養しながら、６０日間、２５℃、暗黒下で培養し、アグロバクテリウム菌を完全に除去した。不定胚形成培地はＭＳ培地の無機成分組成において、さらにショ糖５％、２，４−Ｄ４ｍｇ／ｌ、カイネチン０．１ｍｇ／ｌ、ゲルライト０．３％を含有する培地である。培養６０日後に形質転換カルスから不定胚が形成された。【００９４】
（６）形質転換シクラメンの作出−２
次に上記で得られた不定胚から植物体を再生した。具体的には、ＭＳ培地の無機成分組成において、さらにショ糖３％、ＢＡ０．１ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．０１ｍｇ／ｌ、ジベレリン０．２ｍｇ／ｌ、ゲルライト０．５％を含有してなる再生培地上に、上記不定胚をシャーレあたり１００個の密度になるよう調整して置床した。これを２５℃暗所で３０日間培養し、さらに２５℃、１００００ルックスの光を１日当たり１６時間照明しながら培養することで形質転換された再生植物体を得た。この再生植物体（幼植物体）を、ショ糖を３０ｇ／l、ゲルライトを３ｇ／ｌの濃度で含むＭＳ培地を入れた試験管に移殖した。移殖された幼植物体を培養し、生育したシクラメン植物体（フレグランスミニアメジストブルーの形質転換体）２４株を得た。【００９５】
（７）形質転換シクラメンの栽培評価−２
前記で得られた形質転換シクラメンについて、その葉を遺伝子解析用の材料とし、ＰＣＲによりＣｐＡＧ１遺伝子とＳＲＤＸをコードする遺伝子との融合遺伝子、及びＣｐＡＧ２遺伝子とＳＲＤＸをコードする遺伝子との融合遺伝子の双方が導入されていることを確認した。【００９６】
上記で得られたフレグランスミニアメジストブルーの形質転換体は、ＣｐＡＧ２ＳＲＤＸで形質転換されたウインクピンクと同様に雄しべと雌しべとが花弁化し、非形質転換体に比べて花弁の数が顕著に増加した表現型を示した。【００９７】
本発明は、シクラメンが機能の異なる２種類のＡＧ遺伝子を有することを初めて見出し、さらに、該シクラメンにおいて前記遺伝子の少なくとも一つの機能を抑制した場合に、花弁数が顕著に増加するという優れた効果が得られることを初めて見出したことに基づくものである。【００９８】
比較例  シクラメンへのシロイヌナズナＡＧＡＭＯＵＳ遺伝子の導入
シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリー（独立行政法人産業技術総合研究所から入手）から、配列番号６５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、終止コドンを除くシロイヌナズナＡＧ遺伝子（ＡｔＡＧ遺伝子）のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。【００９９】
得られたＡｔＡＧ遺伝子のコード領域のＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた前記の構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。このプラスミドで大腸菌を形質転換し、増殖させた形質転換大腸菌からプラスミドを回収して塩基配列を決定することで順方向に挿入されたクローンを選抜し、ＡｔＡＧ遺伝子とＳＲＤＸをコードする遺伝子とのキメラ遺伝子が組み込まれたベクターｐ３５ＳＡｔＡＧＳＲＤＸを得た。続いて、前記実施例と同様の方法で、植物形質転換用ベクターｐ３５ＡｔＡＧＳＲＤＸを構築し、これをシクラメン（品種：フレグランスミニ）に導入することで形質転換されたシクラメン植物体を１１個体得た。ＡｔＡＧＳＲＤＸで形質転換されたシクラメンの表現型を、形質転換されていないものの表現型と比較した結果を図３に示す。図３から明らかなように、ＡｔＡＧＳＲＤＸで形質転換されたシクラメンにおいて花弁数の増加は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明により、花弁数が増加したシクラメンを得ることができ、これによりシクラメンの鑑賞性を高めることができる。したがって、本発明は、園芸分野、農業分野、アグリビジネスの分野において有用である。【０１０１】
本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。【０１０２】
本願は、２００９年１２月１７日に日本国で特許出願された特願２００９−２８６７０３に基づく優先権を主張するものであり、これらはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。
【図１】
2011074646.tif 000003
【図２】
2011074646.tif 000004
【図３】
2011074646.tif 000005
【配列表】
2011074646000001.app
【国際調査報告】
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2011074646.tif 000007
2011074646.tif 000008
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