(57)【要約】  本発明は、癌免疫療法用のＤＮＡワクチンの製造方法であって、少なくとも以下のステップ：（ａ）少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を用いて、サルモネラの弱毒化株を形質転換し；（ｂ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンを特徴づけし；（ｃ）ステップ（ｂ）で特徴づけした少なくとも１つの形質転換細胞クローンを選択し、そして、前記少なくとも１つの選択された形質転換細胞クローンを更に特徴づけすること、を含む癌免疫療法用のＤＮＡワクチンに製造方法に関する。本発明は、更に、本発明による方法によって入手可能なＤＮＡワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌免疫療法用のＤＮＡワクチンの製造方法であって、少なくとも以下のステップ：
（ａ）少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を用いて、サルモネラの弱毒化株を形質転換し；
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンを特徴づけし；
（ｃ）ステップ（ｂ）で特徴づけした少なくとも１つの形質転換細胞クローンを選択し、そして、前述の少なくとも１つの選択された形質転換細胞クローンを更に特徴づけすること、
を含む方法。
【請求項２】
前記サルモネラの弱毒化株が、サルモネラ・エンテリカ種の弱毒化株、特に、サルモネラ・チフィの弱毒化株、より特には、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａの弱毒化株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの発現カセットが、真核生物の発現カセットである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原が、腫瘍抗原および腫瘍間質抗原から成る群から選択され、特にヒト腫瘍抗原およびヒト腫瘍間質抗原から成る群から選択され、より特にはヒト野生型腫瘍抗原、ヒト野性型腫瘍抗原と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、ヒト野性型腫瘍間質抗原、およびヒト野性型腫瘍間質抗原と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＤＮＡ分子が、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１ ｏｒｉ、および前記抗原をコードする真核生物の発現カセットを、ＣＭＶプロモーターの制御下で含み、特にここで、前記ＤＮＡ分子がＤＮＡプラスミドであり、より特にはここで、該ＤＮＡプラスミドが、配列番号１に示される核酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（ａ）における前記サルモネラの弱毒化株が、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む前記少なくとも１つのＤＮＡ分子を用いたエレクトロポレーションによって形質転換される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｂ）が、以下のサブステップ：
（ｂｉ）経時的に、ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンの細胞増殖を評価し；
（ｂｉｉ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンにおける少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子の安定性を評価し；
（ｂｉｉｉ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、そして、少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を、制限分析および／または配列決定によって特徴づけし；
（ｂｉｖ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を少なくとも１つの真核細胞にトランスフェクトし、そして、前記少なくとも１つの真核細胞において該少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片の発現を評価すること、
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（ｂ）が、前記サブステップ（ｂｉ）、（ｂｉｉ）、（ｂｉｉｉ）および（ｂｉｖ）のうちの１つ、２つ、３つ、または４つすべてを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｃ）が、以下のサブステップ：
（ｃｉ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンの細胞懸濁液１ｍｌあたりの生細胞数を評価し；
（ｃｉｉ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンにおける少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子の安定性を評価し；
（ｃｉｉｉ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、そして、少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を、制限分析および／または配列決定によって特徴づけし；
（ｃｉｖ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を少なくとも１つの真核細胞にトランスフェクトし、そして、前記少なくとも１つの真核細胞において少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片の発現を評価し；
（ｃｖ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンにおいての細菌、真菌および／またはウイルス混入物の存在を試験し；
（ｃｖｉ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンの細菌株の同一性を確認すること、
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（ｃ）が、前記サブステップ（ｃｉ）、（ｃｉｉ）、（ｃｉｉｉ）、（ｃｉｖ）、（ｃｖ）および（ｃｖｉ）のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（ｃｖ）における細菌および／または真菌混入物の存在が、少なくとも１つの好適な選択培地の中またはその上で、ステップ（ｃ）において選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンを培養することによって試験される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｃｖｉ）における細菌株の同一性が、ブロモチモールブルーガラクトース寒天培地および／またはＫｌｉｇｌｅｒ鉄寒天培地で、ステップ（ｃ）において選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンを培養することによって、および／またはサルモネラＯ５および／またはＯ９表面抗原の存在下で評価することによって検証される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって入手可能なＤＮＡワクチン。
【請求項１４】
癌免疫療法における使用のための、請求項１３に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１５】
前記癌免疫療法が個別化癌免疫療法を含む、請求項１３に記載の使用のためのＤＮＡワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも以下のステップ：（ａ）少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を用いて、サルモネラの弱毒化株を形質転換し；（ｂ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンを特徴づけし；および（ｃ）ステップ（ｂ）で特徴づけした少なくとも１つの形質転換細胞クローンを選択し、そして、前述の少なくとも１つの選択された形質転換細胞クローンを更に特徴づけする、を含む癌免疫療法用のＤＮＡワクチンの製造方法に関する。本発明は、更に、本発明による方法によって入手可能なＤＮＡワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ・エンテリカの弱毒化誘導体は、哺乳動物の免疫系へ異種抗原を送達するための魅力的な媒体となる。というのは、Ｓ．エンテリカ株は、免疫の粘膜経路を介して、つまり、経口または経鼻的に、送達され得るからである。これにより、非経口投与に比べ簡便かつ安全という利点がもたらされる。さらに、サルモネラ株は、全身および粘膜の両方のレベルで強い体液性および細胞性の免疫応答を誘発する。バッチ製造コストは比較的低く、そして生細菌性ワクチンの製剤は非常に安定している。弱毒化は、病原性遺伝子、調節遺伝子、および代謝遺伝子を含む種々の遺伝子の欠失により達成できる。
【０００３】
弱毒化サルモネラ・エンテリカ血清型チフス菌Ｔｙ２１ａ株（略称：Ｓ．チフィＴｙ２１ａ）は、ヒトでの使用が許可されており、Ｖｉｖｏｔｉｆ（登録商標）（PaxVax Ltd, UK）の商品名で流通している。この良好な忍容性を有する、腸チフスに対する経口生ワクチンは、野性型病原性細菌単離株Ｓ．チフィＴｙ２の化学的突然変異誘発により得られ、ｇａｌＥ遺伝子における機能喪失型変異、ならびに他のあまり規定されていない変異を保有する。これは、フィールド試験で有効かつ安全であることが示された後、多くの国で腸チフスワクチンとして認可されている。
【０００４】
ＷＯ２０１４／００５６８３は、癌免疫療法、特に膵臓癌の治療に用いるＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を含む、弱毒化サルモネラ株を開示する。
【０００５】
ＷＯ２０１３／０９１８９８は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠き、組換えＤＮＡ分子を保有する弱毒化変異サルモネラ・チフィ株を増殖させる方法を開示する。
【０００６】
個別化腫瘍学には、癌患者が将来的に治療される方法を変革する可能性がある。患者特異的腫瘍抗原および腫瘍間質抗原を標的化する可能性は、高い注目を集めている。個別化癌免疫療法アプローチのための前提条件は、高い薬物療法安全基準を満たす患者特異的癌ワクチンの迅速かつ費用対効果に優れた製造方法である。
【０００７】
よって、これまでに満たされていない癌ワクチン、特に患者特異的癌ワクチンの迅速かつロバストな製造方法の高い需要が存在する。
本発明の目的
【０００８】
従来技術の観点から、新規の癌免疫療法用、特に個別化癌免疫療法用のＤＮＡワクチンの製造方法を提供することが本発明の目的である。斯かる製造方法は、癌患者向けの治療選択肢を改善するための主要な利点を提供するであろう。
【発明の概要】
【０００９】
第一の態様では、本発明は、少なくとも：（ａ）少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を用いてサルモネラの弱毒化株を形質転換し；（ｂ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンを特徴づけし；および（ｃ）ステップ（ｂ）で特徴づけした少なくとも１つの形質転換細胞クローンを選択し、そして、前述の少なくとも１つの選択された形質転換細胞クローンを更に特徴づけする、のステップを含む癌免疫療法用のＤＮＡワクチンの製造方法に関する。
【００１０】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化株は、サルモネラ・エンテリカ種のもの、特にサルモネラ・チフィ、最も特にはサルモネラ・チフィＴｙ２１ａのものである。
【００１１】
特定の実施形態では、少なくとも１つの発現カセットとは、真核生物の発現カセットである。
【００１２】
特定の実施形態では、前述の抗原は、腫瘍抗原および腫瘍間質抗原から成る群から選択され、特にヒト腫瘍抗原およびヒト腫瘍間質抗原から成る群から選択され、より特にはヒト野生型腫瘍抗原、ヒト野性型腫瘍抗原と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、ヒト野性型腫瘍間質抗原、およびヒト野性型腫瘍間質抗原と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択される。好ましい実施形態では、その抗原は、腫瘍抗原、より好ましくは新生抗原である。
【００１３】
特定の実施形態では、前述の少なくとも１つのＤＮＡ分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１ ｏｒｉ、および前述の抗原をコードする真核生物の発現カセットを、ＣＭＶプロモーターの制御下で含み、特にここで、前述のＤＮＡ分子がＤＮＡプラスミドであり、より特にはここで、該ＤＮＡプラスミドが、配列番号１に示される核酸配列を含む。
【００１４】
特定の実施形態では、前述のサルモネラの弱毒化株は、ステップ（ａ）において、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む前述の少なくとも１つのＤＮＡ分子を用いたエレクトロポレーションによって形質転換される。
【００１５】
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、以下のサブステップ（ｂｉ）〜（ｂｉｖ）：（ｂｉ）経時的に、ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンの細胞増殖を評価し；（ｂｉｉ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンにおける少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子の安定性を評価し；（ｂｉｉｉ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、そして、少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を、制限分析（restriction analysis）および／または配列決定（sequencing）によって特徴づけし；（ｂｉｖ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を少なくとも１つの真核細胞にトランスフェクトし、そして、前述の少なくとも１つの真核細胞において少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片の発現を評価する、のうちの少なくとも１つを含む。
【００１６】
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、前述のサブステップ（ｂｉ）、（ｂｉｉ）、（ｂｉｉｉ）および（ｂｉｖ）のうちの１つ、２つ、３つ、または４つすべてを含む。
【００１７】
特定の実施形態では、ステップ（ｃ）は、以下のサブステップ（ｃｉ）〜（ｃｉｖ）：（ｃｉ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンの細胞懸濁液１ｍｌあたりの生細胞数を評価し；（ｃｉｉ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンにおける少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子の安定性を評価し；（ｃｉｉｉ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、そして、少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を、制限分析および／または配列決定によって特徴づけし；（ｃｉｖ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を少なくとも１つの真核細胞にトランスフェクトし、そして、前述の少なくとも１つの真核細胞において少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片の発現を評価し；（ｃｖ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンにおいて細菌、真菌および／またはウイルス混入物の存在を試験し；（ｃｖｉ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンの細菌株の同一性を確認する、のうちの少なくとも１つを含む。
【００１８】
特定の実施形態では、ステップ（ｃ）は、前述のサブステップ（ｃｉ）、（ｃｉｉ）、（ｃｉｉｉ）、（ｃｉｖ）、（ｃｖ）および（ｃｖｉ）のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてを含む。
【００１９】
特定の実施形態では、細菌および／または真菌混入物の存在は、ステップ（ｃｖ）において、少なくとも１つの好適な選択培地の中またはその上で、ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンを培養することによって試験される。
【００２０】
特定の実施形態では、細菌株の同一性は、ステップ（ｃｖｉ）において、ブロモチモールブルーガラクトース寒天培地および／またはＫｌｉｇｌｅｒ鉄寒天培地で、ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンを培養することによって、および／またはサルモネラＯ５および／またはＯ９表面抗原の存在下で評価することによって検証される。
【００２１】
第二の態様では、本発明は、本発明による方法によって入手可能なＤＮＡワクチンに関する。
【００２２】
第三の態様では、本発明は、癌免疫療法における使用のための本発明によるＤＮＡワクチンに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】薬剤製品製造の概要。
【図２】薬剤製品製造のフローチャート。
【図３】発現プラスミド合成。
【図４】ＶＸＭ０４クローンの増殖キネティックス−ＯＤ600。
【図５】ＶＸＭ０４クローンの増殖キネティックス−ＣＦＵ／ｍｌ。
【図６】ＶＸＭ０４クローンの増殖キネティックス−培養培地のｐＨ。
【図７】ＶＸＭ０８クローンの増殖キネティックス−ＯＤ600。
【図８】ＶＸＭ０８クローンの増殖キネティックス−ＣＦＵ／ｍｌ。
【図９】ＶＸＭ０８クローンの増殖キネティックス−培養培地のｐＨ。
【図１０】ＶＸＭ０１クローンの増殖キネティックス−ＯＤ600。
【図１１】ＶＸＭ０１クローンの増殖キネティックス−ＣＦＵ／ｍｌ。
【図１２】ＶＸＭ０１クローンの増殖キネティックス−培養培地のｐＨ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の発明の詳細な説明およびそこに含まれる実施例を参照することによってより容易に理解し得る。
第一の態様では、本発明は、少なくとも（ａ）少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を用いて、サルモネラの弱毒化株を形質転換し；（ｂ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンを特徴づけし；および（ｃ）ステップ（ｂ）で特徴づけした少なくとも１つの形質転換細胞クローンを選択し、そして、前述の少なくとも１つの選択された形質転換細胞クローンを更に特徴づけする、のステップを含む癌免疫療法用のＤＮＡワクチンの製造方法に関する。
本発明による方法は、サルモネラベースのＤＮＡワクチンの迅速かつ費用対効果に優れた製造を可能にする。抗原をコードするＤＮＡ分子の作出、サルモネラ受容株への形質転換、候補クローンの特徴づけ、そして、患者に投与されるべき最終的なＤＮＡワクチンの選択と更なる特徴づけを含めた全工程には、４週間未満、特に３週間未満、および典型的には最短１６日かかる。患者特異的ＤＮＡワクチンは、小バッチ製造によって好都合なことに製造されてもよく、そしてそれが、並行したいくつかの形質転換サルモネラクローンの同時作出、培養、および特徴づけを可能にする。段階的な細胞クローン特徴づけは、製品品質を最大にし、かつ工程の継続時間を最短にする。製造工程は、高度にロバストであり、安全かつ十分に特徴づけされたＤＮＡワクチンをもたらす。
【００２５】
本発明の文脈において、用語「ワクチン」は、投与により対象における免疫応答を誘発可能な薬剤を指す。ワクチンは、好ましくは、疾患を予防、軽減、または治療できる。本発明によるワクチンは、サルモネラ、好ましくはＳ．チフィＴｙ２１ａの弱毒化株を含む。本発明によるワクチンは、ヒト腫瘍抗原、ヒト腫瘍抗原の断片、ヒト腫瘍間質抗原、およびヒト腫瘍間質抗原の断片から好ましくは選択される、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセット、好ましくは真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１つのコピーを更に含む。
【００２６】
本発明によると、弱毒化サルモネラ株は、標的細胞への前述のＤＮＡ分子の送達のために、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の細菌キャリアとして機能する。例えば腫瘍抗原、腫瘍間質抗原またはその断片などの異種抗原をコードするＤＮＡ分子を含む斯かる送達ベクターは、ＤＮＡワクチンと呼ばれる。
【００２７】
遺伝子免疫は、従来のワクチン投与よりも有益であり得る。標的ＤＮＡは、かなりの期間にわたり検出可能なので、抗原のデポーとして作用する。いくつかのプラスミド中の配列モチーフは、ＧｐＣ島のように、免疫刺激性であり、ＬＰＳおよび他の細菌成分による免疫刺激によってさらに強化されたアジュバントとして機能できる。
【００２８】
生細菌ベクターは、リポ多糖（ＬＰＳ）といった、独自の免疫調節因子をｉｎ ｓｉｔｕで産生するため、マイクロカプセル化などの他の形態での投与を上回る利点となり得る。また、サルモネラのような多くの細菌は、腸管内腔から、パイエル板のＭ細胞を経由し、最終的にリンパ節および脾臓に移行するので、免疫系の誘発部位にワクチンを標的化することが可能になるため、自然経路を入口として利用するのが有益だと証明されている。サルモネラ・チフィＴｙ２１ａのワクチン株は、優れた安全性プロファイルを有することが最近実証された。腸管内腔からＭ細胞を経由する際に、細菌は、マクロファージや樹状細胞などの食細胞によって取り込まれる。これらの細胞は、病原体によって活性化され、分化し始め、そしておそらくリンパ節および脾臓に移行する。Ｓ．チフィＴｙ２１株の細菌は、弱毒化突然変異のため、これらの食細胞内で存続できず、この時点で死滅する。組換えＤＮＡ分子は、特定の輸送システムを介して、またはエンドソームの漏れのいずれかによって、放出され、続いて貪食免疫細胞のサイトゾルへ移動する。最終的に、組換えＤＮＡ分子は核に入り込む。核内で、それらの組換えＤＮＡ分子が転写され、食細胞のサイトゾル内で抗原が発現することになる。コードされている抗原に対する特異的細胞傷害性Ｔ細胞が、活性化した抗原提示細胞によって誘発される。
【００２９】
Ｓ．チフィＴｙ２１ａが全身の血流に侵入し得ることを示す今日利用可能なデータはない。よって、生弱毒化サルモネラ・チフィＴｙ２１ａワクチン株は、優れた安全性プロファイルを示しながら、免疫系の特異的な標的化を可能にする。
【００３０】
サルモネラ・エンテリカの弱毒化誘導体は、免疫の粘膜経路を介して、つまり経口または経鼻的に、送達できるため、哺乳動物の免疫系へ異種抗原を送達するための魅力的な媒体となる。これにより、非経口投与に比べ簡便かつ安全であるという利点がもたらされる。さらに、サルモネラ株は、全身および粘膜の両方のレベルで強い体液性および細胞性の免疫応答を誘発する。
【００３１】
本発明の文脈において、用語「弱毒化」は、弱毒化変異を有することなく、親菌株と比較して病原性が減少した細菌株を指す。弱毒化細菌性株は、好ましくは、元の病原性を失ったが、防御免疫を誘発する能力は保持している。弱毒化は、病原性遺伝子、調節遺伝子、および代謝遺伝子を含む種々の遺伝子の欠失により達成できる。弱毒化細菌は、天然に見出され得る、あるいは例えば新しい培地又は細胞培養物に適用することによって実験室で人為的に作製され得る、あるいは組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。約１０11ＣＦＵの本発明によるサルモネラの弱毒化株の投与は、好ましくは、対象の５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは１‰にサルモネラ症を引き起こした。
【００３２】
本発明の文脈において、用語「含む（comprises）」または「含む（comprising）」とは、「包含するがこれに限定されない（including, but not limited to）」という意味である。この用語は、言及する任意の特徴、要素、数、工程、または構成要素の存在を特定するのに、オープンエンドであることを意図するが、１つ以上の他の特徴、要素、数、工程、構成要素、またはそれらの存在または追加を排除しない。従って、用語「含む（comprising）」は、より制限的な用語「から成る（consisting of）」および「から本質的になる（essentially consisting of）」をも包含する。一実施形態では、本願、特に特許請求の範囲において使用される用語「含む（comprising）」は、用語「から成る（consisting of）」に置き換えられ得る。
【００３３】
少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子は、好適には、異なる起源のＤＮＡピースから好ましくは構成される組換えＤＮＡ分子、つまり、遺伝子操作されたＤＮＡ構築物である。前記ＤＮＡ分子は、直鎖状核酸、または好ましくは、発現ベクタープラスミド内に少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードするオープンリーディングフレームを導入することによって作り出される環状ＤＮＡプラスミドである。
【００３４】
本発明の文脈において、用語「発現カセット」は、その発現を制御する調節配列の制御下、少なくとも１つの抗原をコードする遺伝子または少なくとも１つのその断片を含む核酸単位を指す。サルモネラの弱毒化株に含まれる発現カセットは、好ましくは、標的細胞において少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードするオープンリーディングフレームの転写を媒介し得る。発現カセットは、典型的には、プロモーター、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム、および転写終結シグナルを含む。
【００３５】
本発明の文脈において、「形質転換細胞クローン」という用語は、サルモネラ受容株の形質転換後に得られた単一コロニー由来の細胞集団を指す。その細胞は選択培地寒天平板から得られた単一コロニーに由来するので、その細胞のすべてが１つのシングル形質転換サルモネラ細胞に由来すると考えられる。しかしながら、形質転換後に得られた斯かる単一コロニー由来の細胞集団も、例えば他の細菌、真菌またはウイルスなどの混入物を含み得る。
【００３６】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化株は、サルモネラ・エンテリカ種、より特にはサルモネラ・チフィ、最も特にはサルモネラ・チフィＴｙ２１ａの弱毒化株である。
【００３７】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化株は、サルモネラ・エンテリカ種である。特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化株は、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａである。弱毒化Ｓ．チフィＴｙ２１ａ株は、Ｔｙｐｈｏｒａｌ Ｌ（登録商標）（Ｖｉｖｏｔｉｆ（登録商標）としても知られるBerna Biotech Ltd., a Crucell Company, Switzerlandによって製造）の有効成分である。これは、腸チフスに対し現在認可されている唯一の経口生ワクチンである。このワクチンは広範に検査済みであり、患者に対する毒性並びに第三者への感染について安全であることが証明されている（Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295）。このワクチンは、４０カ国超で承認されている。Ｔｙｐｈｏｒａｌ Ｌ（登録商標）の販売許可番号は、ＰＬ １５７４７／０００１である（１９９６年１２月１６日付）。ワクチンの１回分の用量に、少なくとも２ｘ１０9コロニー形成単位の生Ｓ．チフィＴｙ２１ａ、および少なくとも５ｘ１０9個の非生存Ｓ．チフィＴｙ２１ａ細胞が含まれる。
【００３８】
サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ細菌株の生化学的特性の一つは、ガラクトースを代謝できないことである。また、この弱毒細菌株は、スルファートからスルフィドに還元できず、これにより野生型サルモネラ・チフィＴｙ２株と区別される。その血清学的特性に関しては、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ株は、細菌の外膜の多糖類であるＯ９抗原を含み、一方サルモネラ・チフィリウムの特徴的な成分であるＯ５抗原を欠く。この血清学的特性は、バッチリリース用の同一性試験のパネルにおける各検査を含む理論的根拠の裏づけとなる。
【００３９】
特定の実施形態では、Ｓ．チフィＴｙ２１ａ受容株、つまり、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を用いて形質転換すべきＳ．チフィＴｙ２１ａ細胞は、生化学的修飾なしに市販のＴｙｐｈｏｒａｌ Ｌ（登録商標）カプセルに基づいて作出される。寒天平板上での一晩の培養後に、単一コロニーが単離され、１００ｍｌのＴＳＢ培地中で３７℃にて一晩培養される。次に、培養物は、１５％の無菌グリセロールと共に処方され、等分され（１ｍｌ）、ラベルされ、凍結され、そして、使用するまでマスター細胞バンクとして−７５℃±５℃にて保存した。
【００４０】
特定の実施形態では、これにより得られたＳ．チフィＴｙ２１ａ受容株の細菌株同一性は、ブロモチモールブルーガラクトース寒天培地および／またはＫｌｉｇｌｅｒ鉄寒天培地で該株を培養することによって確認され得る。マスター細胞バンクとして使用される斯かる寒天平板上のＳ．チフィＴｙ２１ａコロニーの特徴は、表１に記載される。
【００４１】
特定の実施形態では、バクテリオファージの検出は、適切な宿主と、試験されるサンプルまたはファージの対照懸濁液のいずれかを含む軟寒天重層中で平板培養することによって行われ得る。このアッセイの感度を改善するために、潜行する濃縮ステップが含まれてもよい。この任意選択のステップでは、サンプルが、適切な宿主細胞と共に４時間インキュベートされる。それに続いて、これらの濃縮培養物のそれぞれのうちの１つのサンプルが平板培養される。
【表１】
2019521154.tif 000002
【００４２】
特定の実施形態では、調製した受容株アリコートの生菌数は、１０7〜１０11、より特には１０8〜１０10、最も特には約１０9ＣＦＵ／ｍｌである。
【００４３】
特定の実施形態では、発現カセットは、真核生物発現カセットである。本発明の文脈において、用語「真核生物発現カセット」とは、真核細胞におけるオープンリーディングフレームの発現を可能にする発現カセットを指す。異種抗原の量が十分な免疫応答を誘発するのに必要な量だと、細菌に対して毒性であり得るので、細胞死、異種抗原の過剰な弱毒化や発現の喪失を生じ得ることが示されている。細菌ベクター中では発現されず、標的細胞内でのみ発現される真核生物発現カセットを使用すると、この毒性についての問題を克服することができ、発現されたタンパク質は、真核生物のグリコシル化パターンを示し得る。
【００４４】
真核生物発現カセットは、真核細胞内のオープンリーディングフレームの発現を制御可能な調節配列、好ましくはプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む。本発明のサルモネラの弱毒化株に含まれる組換えＤＮＡ分子に包含されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、好ましくは、免疫化されるべき対象の細胞内で機能的であるように選択される。特にヒト用のＤＮＡワクチンの製造に適切なプロモーターとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、例えば、強力なＣＭＶ即時初期プロモーター；サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えば、ＨＩＶの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモーター；並びに、ヒト遺伝子、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、及びヒトメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター。特定の実施形態において、真核生物発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含む。本発明の文脈において、用語「ＣＭＶプロモーター」は、強力な即時初期サイトメガロウイルスプロモーターを指す。
【００４５】
特にヒト用のＤＮＡワクチンの製造に適切なポリアデニル化シグナルとしては、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、本発明のサルモネラの弱毒化株に含まれるＤＮＡ分子に包含される真核生物発現カセットは、ＢＧＨポリアデニル化部位を含む。
【００４６】
プロモーターおよびポリアデニル化シグナルのような異種抗原をコードする遺伝子の発現に必要な調節因子に加えて、他の因子も組換えＤＮＡ分子に含めることができる。このような追加的な因子としてはエンハンサーが挙げられる。エンハンサーとしては、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンのエンハンサー、およびＣＭＶ、ＲＳＶ、およびＥＢＶ由来のウイルスエンハンサーなどが挙げられる。
【００４７】
調節配列及びコドンは、一般的に種に依存するので、タンパク質の産生を最大にするように、調節配列及びコドンは、好ましくは、免疫対象の種において有効であるように選択される。当業者は、所定の対象種において機能的な組換えＤＮＡ分子を作成できる。
【００４８】
特定の実施形態では、前述の抗原は、腫瘍抗原および腫瘍間質抗原から成る群から選択される。特に、前述の抗原は、ヒト腫瘍抗原およびヒト腫瘍間質抗原から成る群から選択され、より特にはヒト野生型腫瘍抗原、ヒト野性型腫瘍抗原と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、ヒト野性型腫瘍間質抗原、およびヒト野性型腫瘍間質抗原と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質から成る群から選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの発現カセットは、少なくとも１つの抗原の少なくとも１つの断片、より特には腫瘍抗原の少なくとも１つの断片および／または腫瘍間質抗原の少なくとも１つの断片、より特には、ヒト野性型腫瘍抗原またはヒト野性型腫瘍間質抗原と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質の断片を含めた、少なくとも１つのヒト腫瘍抗原および／または少なくとも１つのヒト腫瘍間質抗原の少なくとも１つの断片をコードする。特定の実施形態では、少なくとも１つの抗原の少なくとも１つの断片は、参照抗原の少なくとも５つの連続したアミノ酸、より特には少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、２５の参照抗原のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの抗原断片は、参照抗原の少なくとも１個のエピトープ、より特には少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０または１００個のエピトープを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの抗原断片は、１〜１００、１〜７５、１〜５０、または１〜２５個のエピトープ、特に１〜１０個のエピトープ、より特には１〜５個のエピトープを含む。本発明の文脈において、「エピトープ」という用語は、抗原と、例えば抗体などの抗原結合性分子との間の特異的結合に参加する所定の抗原の一部を指す。エピトープは、連続していても、つまり、抗原内に存在する隣接している構造要素によって形成されていても、または非連続的であっても、つまり、抗原の一次配列、例えば抗原タンパク質のアミノ酸配列などの異なる位置に存在するにもかかわらず、例えば体液中などで抗原がとる三次元構造では極めて接近している構造要素によって形成されていてもよい。本発明に関する教示によると、抗原の少なくとも１つの断片は、抗原の断片が免疫原性である限り、参照抗原のアミノ酸をいくつ含んでもよい。好ましくは、少なくとも１つの抗原断片の免疫原性は、ＥＬＩＳＡによって計測した場合またはＥＬＩＳｐｏｔによって計測した場合、参照抗原と比較して５０％未満、４０％未満に、３０％未満に、２０％未満に、１０％未満、５％未満または１％未満低減される。
【００４９】
本発明の文脈において、「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍細胞で発現される抗原を指す。典型的には、斯かる腫瘍抗原は、腫瘍細胞によって優先的に発現される、つまり、それらは、非悪性細胞で発現されてもごく僅かであるか、または特定の非悪性組織でしか発現されない。対照的に、腫瘍間質抗原は、腫瘍間質によって、例えば、腫瘍血管系によって発現される。斯かる腫瘍間質抗原の一例がＶＥＧＦＲ−２であり、そしてそれは、腫瘍血管系によって高度に発現される。特定の実施形態では、コードされているＶＥＧＦＲ−２抗原は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するか、またはそれと少なくとも約８０％の配列同一性を有する。腫瘍間質抗原の別の例は、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。腫瘍抗原は、所定のタイプの癌または一般的な癌の大部分で一般的に発現される既知の腫瘍抗原から選択され得る。また、「腫瘍抗原」という用語は、新生抗原、つまり、腫瘍特異的突然変異の結果として生じる腫瘍特異的抗原も含む。これらの新生抗原は、患者特異的であっても、または多くの癌患者に起こっていてもよい。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するヒトウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）およびそれと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）およびそれと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するヒトＣＥＡおよびそれと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＭＶ ｐｐ６５およびそれと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＭＶ ｐｐ６５およびそれと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、ならびに配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＭＶ ｐｐ６５およびそれと少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質、から成る群から選択される。
【００５０】
特定の実施形態では、ヒトＶＥＧＦＲ−２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、ヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、ヒトＣＥＡは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＭＶ ｐｐ６５は、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する。
【００５１】
また、腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原は、患者特異的腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原、つまり、ある特定の患者の腫瘍細胞または腫瘍間質によって発現されることが示された抗原であってもよい。患者特異的腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原は、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでの患者の腫瘍および／または腫瘍間質に関する発現プロファイルを評価することによって同定され得る。あるいは、患者の腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原に対する既存のＴ細胞性免疫応答が評価されてもよい。患者特異的腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原を同定した後に、本発明による方法は、癌免疫療法に好適な安全かつ十分に特徴づけされている患者特異的ＤＮＡワクチンの迅速な製造を可能にする。典型的には、抗原をコードする発現プラスミドの作出、サルモネラ受容株への形質転換、候補クローンの特徴づけおよび選択、そして、患者に投与されるべき最終的なＤＮＡワクチンの更なる特徴づけを含めた全製造工程には、４週間未満、特に３週間未満、および典型的には最短１６日かかる。
【００５２】
本発明の文脈において、用語「所定の配列の腫瘍抗原または腫瘍間質抗原と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質」は、所定の参照タンパク質のアミノ酸配列および／または該アミノ酸をコードする核酸配列が異なるタンパク質を指す。このタンパク質は、天然由来、例えば、腫瘍抗原または腫瘍間質抗原のホモログであってもよく、あるいは改変タンパク質であってもよい。コドンの使用頻度は、種間で異なることが知られている。したがって、標的細胞において異種タンパク質を発現させる際に、核酸配列をその標的細胞のコドン使用頻度に適合させることが必要または少なくとも役立つことがあり得る。所定のタンパク質の誘導体を設計および構築する方法は当業者によく知られている。
【００５３】
所定のアミノ酸配列の腫瘍抗原または腫瘍間質抗原と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質は、所定の参照アミノ酸配列と比較した場合に、１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む１つまたは複数の変異を含み得る。本発明の教示によれば、上述の欠失、付加、および／または置換アミノ酸は、連続したアミノ酸であってもよく、あるいは、所定の腫瘍抗原または腫瘍間質抗原と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列の全長にわたり散在していてもよい。本発明の教示によれば、参照腫瘍抗原または腫瘍間質抗原との配列同一性が少なくとも約８０％であり、かつ、変異した腫瘍抗原または腫瘍間質抗原タンパク質が免疫原性である限り、任意の数のアミノ酸が、付加、欠失、および／または置換され得る。好ましくは、所定のアミノ酸配列の参照腫瘍抗原または腫瘍間質抗原と少なくとも約８０％の配列同一性を有する腫瘍抗原または腫瘍間質抗原の免疫原性は、ＥＬＩＳＡによって計測した場合、またはＥＬＩＳｐｏｔによって計測した場合、所定のアミノ酸配列の参照腫瘍抗原または腫瘍間質抗原と比較して、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満または１％未満低減される。タンパク質ホモログを設計および構築する方法、およびそれらの免疫原性に関して斯かるホモログを試験する方法は、当業者にとって周知である。特定の実施形態では、所定のアミノ酸配列の所定の腫瘍抗原または腫瘍間質抗原との配列同一性は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または、最も特には少なくとも約９５％である。親タンパク質と、親配列に対し欠失、付加、および／または置換を有するその誘導体との比較を含む配列同一性を決定するための方法およびアルゴリズムは、当技術分野の通常の技術の知識を有する者によく知られている。ＤＮＡレベルでは、所定のアミノ酸配列の腫瘍抗原または腫瘍間質抗原と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子コードの縮重により、より大きな程度で異なっていてもよい。
【００５４】
特定の実施形態では、前述の少なくとも１つのＤＮＡ分子は、選択マーカーとしてのカナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１ ｏｒｉ、および前述の抗原をコードする真核生物の発現カセットを、ＣＭＶプロモーターの制御下で含み、特にここで、前述のＤＮＡ分子がＤＮＡプラスミドであり、より特にはここで、該ＤＮＡプラスミドが、配列番号１に見られる核酸配列を含む。
【００５５】
特定の実施形態では、ＤＮＡ分子は、市販のｐＶＡＸ１（商標）発現プラスミド（Invitrogen, San Diego, California）由来の組換えＤＮＡ分子である。ｐＶＡＸ１は、ベクターｐｃＤＮＡ３．１を修飾することによるＤＮＡワクチンの開発に使用するために特別に設計された、真核細胞内でタンパク質を発現するためのプラスミドベクターである。哺乳動物細胞内での細菌の複製または組換えタンパク質の発現に必要でない配列を取り除いて、ヒトゲノムに対して相同性を有し得るＤＮＡ配列を制限することで、染色体組込みの可能性を最小限にした。さらに、アミノ配糖体抗生物質がヒトのアレルギー応答を誘発しにくいので、ｐｃＤＮＡ３．１のアンピシリン耐性遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子によって置換された。
【００５６】
ｐＶＡＸ１（商標）ベクターは、以下の要素：哺乳動物細胞における高レベルでの発現のためのヒトサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ）プロモーター、ｍＲＮＡの効率的な転写停止およびポリアデニル化のためのウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ならびに選択マーカーとしてのカナマイシン耐性遺伝子を包含する。
【００５７】
加えて、ｐＶＡＸ１（商標）は、クローン遺伝子の配列決定およびインビトロ翻訳を可能にするために、着目の遺伝子の挿入のための多重クローニング部位、ならびにＴ７プロモーター／プライミング部位上流および多重クローニング部位のＢＧＨリバースプライミング部位下流を包含する。
【００５８】
市販のｐＶＡＸ１（商標）発現ベクターは、高コピー数のｐＵＣ複製開始点をｐＢＲ３２２の低コピー数のｐＭＢ１複製開始点で置換することによってさらに修飾された。代謝負担を低減し、かつ、構築物をより安定化するために、低コピー修飾がおこなわれた。作出された発現ベクター骨格は、ｐＶＡＸ１０と命名された。重要なことに、２９３Ｔヒト細胞株を使用したトランスフェクション実験から得られたデータは、ｐＶＡＸ１０にコードされたカナマイシン耐性遺伝子がヒト細胞内で翻訳されないことを実証した。これにより、その発現系は、規制上の要件に準拠している。
【００５９】
特定の実施形態では、弱毒化サルモネラ受容株内に形質転換される少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子は、少なくとも１つの抗原ｃＤＮＡまたは少なくとも１つのその断片をｐＶＡＸ１０ベクター骨格内にクローニングすることによって作出される。
ベクター骨格は、ｐＶＡＸ１０ベクター骨格内にクローニングされたヒトＶＥＦＧＲ−２のｃＤＮＡを含有する、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１から単離され得る。ＶＥＧＦＲ−２ ｃＤＮＡは、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１から切り出されることができ、次に、ｐＶＡＸ１０ベクター骨格は、アガロースゲル電気泳動法によって単離され得る。
【００６０】
特定の実施形態では、ｃＤＮＡ挿入物の合成が、二本鎖のインビトロ遺伝子合成によって行われる。合成工程のステップは、図３に提示される。
【００６１】
特定の実施形態では、前述のサルモネラの弱毒化株は、ステップ（ａ）において、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む前述の少なくとも１つのＤＮＡ分子を用いて、エレクトロポレーションによって形質転換される。
【００６２】
特定の実施形態では、市販のＴｙｐｈｏｒａｌ Ｌ（登録商標）カプセルに基づくＳ．チフィＴｙ２１ａ株マスター細胞バンク（ＭＣＢ）が、バッチ製造クローンの調製のための出発株として使用される。エレクトロポレーション用のコンピテント細胞を得るために、Ｓ．チフィＴｙ２１ａ ＭＣＢが、５００ｍｌの氷冷Ｈ2Ｏ中に再懸濁され、そして、遠心分離される。氷冷水／１０％のグリセロールによる２回の追加洗浄後に、ペレットは、２ｍｌの１０％のグリセロール（動物成分不含）中に再懸濁され、等分され（５０μｌ）、そして、ドライアイス上で凍結させる。コンピテント細胞バッチは、新しいコンピテント細胞バッチが新たに作製されてから最長４週間、＜−７０℃にて保存される。形質転換のために、コンピテント細胞の１つのアリコートが、解凍され、３〜５μｌの所望の抗原をコードするプラスミドＤＮＡの存在下でエレクトポレーション処理される。１ｍｌのＬＢ（ＡＣＦ）培地中での３７℃にて短時間の培養期間に続いて、細胞懸濁液は、カナマイシン（２５および５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ（ＡＣＦ）寒天平板上に画線接種される。その平板は、３７℃にて一晩インキュベートされる。
【００６３】
バッチ製造クローンの調製のための少なくとも１つの形質転換細胞クローンの選択を可能にするために、少なくとも１つの単一コロニー、典型的には１〜１０個のコロニー、より特には２〜５個のコロニーが試験される。好都合なことに、３つの単一コロニーが、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する３ｍｌのＬＢ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）に植菌するのに使用される。培養物は、３７℃にて一晩インキュベートされる。プラスミドＤＮＡが単離され、そして、選択されたクローンが５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中に広げる。培養物は、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールと混合され、等分され（１ｍｌ）、そして、−７０℃にて冷凍されて保存される。
【００６４】
特定の実施形態では、以下の分析パラメータ：ＯＤ600、ｐＨおよびＣＦＵによって決定される選択培地中での培養するときの経時的な増殖キネティックス；凍結保存後のプラスミド安定性（％ＰＳ）；プラスミド制限分析によるプラスミドＤＮＡ抽出および同一性の確認；ならびに真核細胞株へのプラスミドＤＮＡの一過性トランスフェクション後の抗原発現効果の測定、のうちの少なくとも１つが、バッチ製造クローンの選択のために、ステップ（ｂ）で評価される。特定の実施形態では、次に、バッチ製造クローンは薬剤原料（ＤＳ）を製造するために使用され、そしてそれは、次に、ステップ（ｃ）において更に特徴づけされて、患者に投与される最終的な薬剤製品（ＤＰ）が確定される。
【００６５】
よって、特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、以下のサブステップ（ｂｉ）〜（ｂｉｖ）：（ｂｉ）経時的に、ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンの細胞増殖を評価し；（ｂｉｉ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンにおける少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子の安定性を評価し；（ｂｉｉｉ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、そして、制限分析および／またはシークエンシングによって、少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を特徴づけし；（ｂｉｖ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、該少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を少なくとも１つの真核細胞にトランスフェクトし、そして、前述の少なくとも１つの真核細胞において該少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片の発現を評価する、のうちの少なくとも１つを含む。
【００６６】
特に、ステップ（ｂｉｉ）は、前述の少なくとも１つの形質転換細胞クローンの凍結とその後の解凍の後に実施され得る。
【００６７】
特に、ステップ（ｂｉｖ）は、サルモネラ受容株の形質転換後に得られた単一コロニーから単離されるプラスミドＤＮＡを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、そして、コードされている抗原の適切な抗体を使用した、細胞抽出物のウエスタンブロット分析をおこなうことによって実施され得る。
【００６８】
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、前述のサブステップ（ｂｉ）、（ｂｉｉ）、（ｂｉｉｉ）および（ｂｉｖ）のうちの１つ、２つ、３つ、または４つすべてを含む。
【００６９】
特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、サブステップ（ｂｉ）、（ｂｉｉ）および（ｂｉｉｉ）のみを含む。
【００７０】
増殖特性、プラスミド安定性、プラスミド同一性および／またはタンパク質発現の試験から得られたデータを検討した後に、少なくとも１つの形質転換細胞クローンが、バッチ製造クローンとして選択される。特定の実施形態では、次に、バッチ製造クローンは、薬剤原料（ＤＳ）を調製するのに使用され、そしてそれは、次に、ステップ（ｃ）において更に特徴づけされて、患者に投与するための最終的な薬剤製品（ＤＰ）が確定される。
【００７１】
薬剤製品の製造の概要が、図１および２に示される。
【００７２】
薬剤原料（ＤＳ）の製造は、好都合なことに、以下に記載したとおり実施され得る：ＤＳは、典型的には、ＧＭＰ要件に従って製造される。少なくとも１つのバッチ製造クローンは、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えたＴＳＢ培地が入った３本の５０ｍｌフラスコに移される（前培養１）。コロニーは、３０℃にて９時間±１時間にわたり＜１．０の最大ＯＤ600まで培養される。それぞれのフラスコの撹拌は、１２０ｒｐｍに設定される。最も高いＯＤ値を有するフラスコが、更なる培養のために選択される。５０ｍｌの体積の前培養１を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えた１０００ｍｌのＴＳＢ培地が入ったフラスコに移す（本培養）。１８０ｒｐｍの撹拌セットを用いた、３０℃にて９時間±１時間のインキュベーション後に、細菌は０．９〜１．５の目標ＯＤ600まで培養される。発酵が完了した時点で、グリセロールが１５％（ｗ／ｗ）の終濃度まで培養物に加えられる。懸濁液は、混合され、次に、２ｍｌの凍結バイアル中に等分される（１ｍｌ）。そのバイアルは、ラベルが付され、そして、保管のため−７５℃±５℃にてすぐに冷凍される。記載した工程ワークフローが薬剤原料を製造するのが可能な方法の一つを記載したにすぎないことは、理解すべきである。もちろん、工程パラメータ、例えば、培養液量は変更されてもよい。
【００７３】
次に、薬剤原料は、更に試験されて、最終的な薬剤製品濃度までそれが希釈される。公開仕様書が、薬剤原料および薬剤製品の両方について規定された。表２および表３にまとめられた特性のうちの少なくとも１つが試験される。
【表２】
2019521154.tif 000003
【表３】
2019521154.tif 000004
【００７４】
よって、特定の実施形態では、ステップ（ｃ）は、以下のサブステップ（ｃｉ）〜（ｃｉｖ）：（ｃｉ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンの細胞懸濁液１ｍｌあたりの生細胞数を評価し；（ｃｉｉ）ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンにおける少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子の安定性を評価し；（ｃｉｉｉ）ステップ（ｃ）で選択された該少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、そして、制限分析および／またはシークエンシングによって、少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を特徴づけし；（ｃｉｖ）ステップ（ｃ）で選択された該少なくとも１つの形質転換細胞クローンから、少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む少なくとも１つのＤＮＡ分子を単離し、該少なくとも１つの単離されたＤＮＡ分子を少なくとも１つの真核細胞にトランスフェクトし、そして、前述の少なくとも１つの真核細胞において該少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片の発現を評価し；（ｃｖ）ステップ（ｃ）で選択された該少なくとも１つの形質転換細胞クローン中の細菌、真菌および／またはウイルス混入物の存在を試験し；（ｃｖｉ）ステップ（ｃ）で選択された該少なくとも１つの形質転換細胞クローンの細菌株の同一性を確認する、のうちの少なくとも１つを含む。
【００７５】
特定の実施形態では、サブステップ（ｃｉｉ）は、前述の少なくとも１つの形質転換細胞クローンの凍結とその後の解凍の後に実施される。
【００７６】
特定の実施形態では、ステップ（ｃ）は、前述のサブステップ（ｃｉ）、（ｃｉｉ）、（ｃｉｉｉ）、（ｃｉｖ）、（ｃｖ）および（ｃｖｉ）のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてを含む。
【００７７】
特定の実施形態では、ステップ（ｃ）は、サブステップ（ｃｉ）、（ｃｉｉ）、（ｃｉｉｉ）、（ｃｖ）および（ｃｖｉ）を含む。
【００７８】
特に、生細胞数は、寒天平板上で段階希釈物を平板培養することによって測定されてもよい。好都合なことに、１０-8の希釈係数に至るまでの細菌懸濁液の段階希釈物が調製され、そして、寒天平板上で平板培養される。適切なインキュベーション後に、コロニーがカウントされる。カウントは、コロニーがはっきり見えるが、それほど大きくないときに、開始すべきである。
【００７９】
プラスミド安定性は、プラスミド含有サルモネラ細菌のカナマイシン耐性に基づいて測定され得る。カナマイシン含有ＴＳＢ上での細菌細胞の増殖は、カナマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミドの存在を示す。カナマイシン含有および不含のＴＳＢ上で平板培養された同じサンプルのＣＦＵを比較することで、該プラスミドを担持する細菌の画分の決定が可能になる。特に、細菌懸濁液の段階希釈は、調製され、そして、任意選択で抗生物質のカナマイシンを含有するＴＳＢ上で平板培養される。適切なインキュベーション後に、コロニーがカウントされた。カウントは、コロニーがはっきり見えるが、それほど大きくないときに、開始すべきである。プラスミド安定性は、次のようにしてカナマイシン含有または不含ＴＳＢ上のコロニー形成単位を比較することによって計算される：ＰＳＴ＝（カナマイシンありのＣＦＵ／カナマイシンなしのＣＦＵ）×１００。
【００８０】
プラスミドの同一性は、サイズマーカーと、ワクチン株から単離された消化プラスミドのサイズパターンとの比較によって規定され得る。特に、組換えプラスミドは、担体から単離され、そして、適切な時間にわたり、別々の反応において、少なくとも１つ、典型的には少なくとも２つの別々の消化酵素／組み合わせ物で消化される。反応は、止められ、そして、アガロースゲルにより分析される。
【００８１】
遺伝子構築物の同一性は、更に、プラスミドの古典的なＤＮＡ配列決定により決定され得る。プラスミド全体の配列は、配列決定によって決定され、そして、プラスミドの本来の配列に対してアラインされる。特に、プラスミドは、サルモネラから調製され、そして、定量化される。それは、次に、Ｅ．コリで再び形質転換され、単離され、定量化され、そして、配列決定反応に使用される。
【００８２】
真核細胞における少なくとも１つの抗原または少なくとも１つのその断片の発現は、真核細胞株内へのプラスミドトランスフェクション後に発現解析とウエスタンブロット法によって確認され得る。特に、組換え構築物は、担持株から単離され、そして、好適な真核生物永久細胞株のトランスフェクションに使用される。真核生物プロモーターの存在により、コード配列が発現される。好適なインキュベーション、タンパク質単離とそれに続くウエスタンブロット法の後に、組換えタンパク質の存在が実証され、そして、準定量ベースで参照物質と比較される。
【００８３】
特定の実施形態では、細菌および／または真菌混入物の存在は、少なくとも１つの好適な選択培地中またはその上での、ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンを培養することによって、ステップ（ｃｖ）において試験される。特に、全好気性細菌、カビ、および真菌のカウントを測定するために、および特定の病原性エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、サルモネラ亜種（Salmonella sp.）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）およびクロストリジウム亜種の不存在を確認するために、サンプルは、好適な選択培地を使用して、European Pharmacopoeia 04/2009:1055 <Thyphoid Vaccine (Live, oral, strain Ty 21a)>のモノグラフに従って試験され得る。特に、試験は、European Pharmacopoeia Ph. Eur. monographs 2.6.12および2.16.13に従っておこなわれる。
【００８４】
特定の実施形態では、細菌株の同一性は、ステップ（ｃｖｉ）において、ブロモチモールブルーガラクトース寒天培地（ＢＴＢ−Ｇａｌ）上および／またはＫｌｉｇｌｅｒ鉄寒天培地（ＫＩＡ）で、ステップ（ｃ）で選択された少なくとも１つの形質転換細胞クローンを培養することによって、および／またはサルモネラＯ５および／またはＯ９表面抗原の存在下で評価することによって、確認される。
【００８５】
生化学的同定テストは、微生物の生化学的性質（主にガラクトース発酵と硫化物産生）を検出する２つの選択培地に依存する。他のサルモネラ種とは対照的に、弱毒化ワクチン株Ｔｙ２１ａはガラクトースを代謝できない。ＢＴＢ−Ｇａｌ寒天培地での培養は、培地の色を変化させることなく、緑色〜黄色がかったコロニーをもたらす。対照的に、ＢＴＢ−Ｇａｌ上での野性型サルモネラの培養は、ガラクトースの代謝中の酸産生とそれに続くｐＨ指示薬（ブロムチモールブルー）の色変化により、培地の強い黄色の着色をもたらす。Ｓ．チフィＴｙ２１ａは、ＢＴＢ−Ｇａｌ上で増殖するとき、形態学的に異なるサブクローンを構築する可能性がある。この更なるタイプは、特徴的なサルモネラコロニー上およびその間の小さくて、灰色のコロニーの遅い増殖を特徴とする。
【００８６】
Ｋｌｉｇｌｅｒ鉄寒天培地は、腸内細菌のメンバーを識別するのに使用される。この培地の性質は、デキストロースとラクトースを代謝して、硫化物を遊離させる腸内細菌の能力に基づいている。Ｔｙ２１ａワクチン株は、赤色から黄色にｐＨ指示薬の色変化によって示されるデキストロースを代謝できる。しかしながら、菌株Ｓ．チフィＴｙ２１ａは、スルファートをスルフィドに還元することができないが、一方、他のサルモネラは、硫化水素産生中に培地の色を黒くし、および寒天培地内部に気泡生成をもたらすガスを遊離する。Ｓ．チフィＴｙ２１ａの増殖は、ガス産生をもたらし得るが、この株にとって典型的ではない。Ｐ．エルギノーサのようにどちらの糖も代謝できない生物体は、培地の色を変化させない。
【００８７】
特に、細菌株の同一性は、以下に記載のように生化学的に確認され得る。ループの完全に解凍された懸濁液が、ＢＴＢ−Ｇａｌ寒天平板に移され、そして、単一コロニーを得るのに適切な画線接種方法が適用される。対照生物体Ｐ．エルギノーサ（ＡＴＣＣ９０２７）およびＳ．チフィムリウム（Moskau）の植菌が、ｍｉｃｒｏｂａｎｋ（登録商標）（培養微生物の貯蔵方式）のビーズを移し、それに続いて寒天平板上に画線接種することによって行われる。ＫＩＡの植菌のために、同じバイアルのループ（ビーズ）は、最初に、斜面培地の表面に画線接種され、次に、残片の中に送り込まれる。培地は、３７℃にて４８時間インキュベートされる。
【００８８】
サルモネラ属の異なる血清型は、適切なポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を使用することで識別できる。弱毒化組換えＳ．チフィＴｙ２１ａ株は、外膜の多糖類であるＯ９抗原を含有する。Ｓ．チフィは、Ｏ９を担持するが、同様にしてＳ．チフィムリウムの特徴であるＯ５を欠いている。Ｏ５およびＯ９抗原に関する試験の組み合わせによって、Ｓ．チフィＴｙ２１ａ株は、他の細菌、特に、野性型サルモネラ種から十分に識別され得る。特に、血清型は、以下に記載のように行われ得る。１滴の抗血清（Ｏ５またはＯ９）がチャンバースライドに移される。原料を含有するコロニーのループは、ＫＩＡの下（濡れた）側から採取され、抗血清の横に配置される。溶液はそのループと混合される。得られた懸濁液は、わずかに濁っているはずである。懸濁液は、チャンバースライドの何回かの拭き取りによって広げられる。反応物は２分後に黒色の背景に対して評価される。
【００８９】
第二の態様では、本発明は、本発明による方法によって入手可能なＤＮＡワクチンに関する。
【００９０】
第三の態様では、本発明は、癌免疫療法における使用のための本発明によるＤＮＡワクチンに関する。
【００９１】
特定の実施形態では、癌免疫療法は個別化癌免疫療法を含む。
【００９２】
特定の実施形態では、癌免疫療法は、腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含む少なくとも１コピーのＤＮＡ分子を含む１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒化株を投与することを更に含み、特に、ここで、前記１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒化株は、真核生物発現カセットを含むサルモネラ・チフィＴｙ２１ａであり、より特には、ここで、前記１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒化株は、ヒトＶＥＧＦＲ−２および／またはヒトウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）および／またはヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）および／またはヒトＣＥＡおよび／またはヒトＣＭＶのｐｐ６５をコードするサルモネラの弱毒化株を含む。
【００９３】
２の異なる腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原標的化ＤＮＡワクチンを組み合わせることで、相乗的な抗癌効果を有し得る。特に、異なる腫瘍抗原／腫瘍間質抗原の同時標的化は、腫瘍回避のリスクを最小限にし得る。腫瘍間質抗原標的化ＤＮＡワクチンと、腫瘍抗原標的化ＤＮＡワクチンとを組み合わせることは、腫瘍細胞および腫瘍間質が同時に攻撃されるので、特別な効果を示し得る。
【００９４】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化株は、前記１つまたは複数の更なるサルモネラの弱毒化株と共に同時投与される。
【００９５】
本発明の文脈において、用語「同時投与（co-administration）」または「同時投与（co-administer）」は、連続した３日間以内、より特には連続した２日間日以内に、より特には同日に、より特には１２時間以内に、２つの異なるサルモネラの弱毒化株を投与することを意味する。本発明の文脈において、特定の場合、用語「同時投与」は、２つの異なるサルモネラの弱毒化株を同時に投与することを意味する。
【００９６】
特定の実施形態では、患者は最初に、患者が罹患している癌のタイプで一般的に過剰発現されている腫瘍抗原または腫瘍間質抗原を標的化するＴｙ２１ａベースのＤＮＡワクチンを投与されてもよい。この第一選択治療中に、患者特異的腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原が同定されてもよい。この目的のために、患者の腫瘍および／または間質抗原発現パターン、および／または、腫瘍および／または間質の抗原に対する患者の既存のＴ細胞性免疫応答は、例えば、患者の特異的腫瘍および／または間質抗原パターンを標的化するコンパニオン診断によって、第１ステップで評価されてもよい。次に、本発明による方法は、安全かつ十分に特徴づけされている患者特異的（個別化）ＤＮＡワクチンの迅速な確定を可能にし、そしてそれは、患者特異的腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原の識別のほんの数週間後に、第二選択治療または主たる治療として使用され得る。
【００９７】
特定の実施形態では、癌免疫療法は、化学療法、放射線療法、または生物学的癌療法を伴う。癌の治療にとっては、癌幹細胞の完全な根絶が重要である。効力を最大にするために、異なる治療アプローチを組み合わせることが有益であり得る。
【００９８】
本発明の文脈において、「生物学的癌療法」という用語は、生きた生物、生きた生物由来の物質、または斯かる物質の研究室で製造されたバージョンの使用を伴う癌療法を指す。癌向けの一部の生物療法は、癌細胞に対して作用するように身体の免疫系を刺激することを目指す（いわゆる、生物学的癌免疫療法）。生物学的癌治療のアプローチとしては、腫瘍抗原を送達すること、薬剤として治療抗体を送達すること、免疫刺激性サイトカインを投与すること、および免疫細胞を投与することが挙げられる。治療用抗体としては、腫瘍抗原または腫瘍間質抗原を標的化する抗体、ならびに例えば、これだけに限定されるものではないが、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＴＬＡ４などのチェックポイント阻害剤として機能する抗体が挙げられる。
【００９９】
本発明のサルモネラの弱毒化株と組み合わせて使用できる化学療法剤としては、例えば、以下が挙げられる：ゲムシタビン、アミフォスチン（エチオール）、カバジタキセル、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ニムスチン（ＡＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、フォリン酸、ゲムシタビン（ジェムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノキソーム）、プロカルバジン、ケトコナゾール、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、オキサリプラチン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、およびそれらの組み合わせ。
【０１００】
起こる可能性のある副作用の発生により抗生物質や抗炎症薬を用いる治療を含むのが有利なことがある。
【０１０１】
ヒスタミン、ロイコトリエン、またはサイトカインが媒介する過敏反応に似た有害事象が発生した場合、発熱、アナフィラキシー、血圧不安定、気管支痙攣、および呼吸困難に対する治療という選択肢がある。不要なＴ細胞による自動攻撃の場合、治療の選択肢は、幹細胞の移植後に起こる急性および慢性の移植片対宿主病における標準的な治療スキームに基づく。シクロスポリンやグルココルチコイドが、治療の選択肢として提案されている。
【０１０２】
サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ型の感染の可能性が低い場合、適切な抗生物質、例えば、シプロフロキサシンまたはオフロキサシンを含むフルオロキノロンを用いた治療が推奨される。胃腸管の細菌感染は、リファキシミンのような各種薬剤を用いて治療することになる。
【０１０３】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化株は、化学療法または放射線療法の治療サイクルの前もしくはその間、または生物学的癌療法の前もしくはその間、あるいは、化学療法または放射線療法の治療サイクルの前もしくはその間、または生物学的癌療法の前もしくはその間に投与される。このアプローチは、化学療法又は放射線療法を、癌免疫を強めた条件下で行うことができるという利点を有し得る。
【０１０４】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化株は、化学療法または放射線療法の治療サイクルの後、または生物学的癌療法の後に投与される。
【０１０５】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化株は、経口的に投与される。経口投与は、非経口投与よりも簡単、安全、そして安楽である。対照的に、細菌生ワクチンの静脈内投与は、当初、敗血症タイプの安全性リスクに関連する菌血症を引き起こし、そのため、注意した観察及び臨床学的症状、例えばサイトカイン放出のモニタリングを必要とする。本発明の弱毒化株の経口投与は、記載されるリスクを少なくとも部分的に克服することができる。しかしながら、本発明のサルモネラの弱毒化株はまた、他の任意の適切な経路によっても投与され得ることは注目されるべきである。好ましくは、治療的有効量を対象に投与する。この量は、特定の用途、悪性腫瘍の種類、対象の体重、年齢、性別、健康状態、投与の方法、および処方等に依存する。投与は、必要に応じて、単回または複数回行ってもよい。
【０１０６】
本発明のサルモネラの弱毒化株は、溶液、懸濁液、凍結乾燥物、または他の適切な任意の形態で提供できる。これは、医薬的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤と組み合わせて設けてもよい。ｐＨ調整剤、緩衝剤、毒性調整剤などを含めてもよい。本発明の文脈において、用語「医薬的に許容される」とは、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与したとき、生理学的に許容可能で、典型的には予期しない有害反応を生じない医薬組成物の分子的な実体物および他の成分を指す。また、用語「医薬的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトにおける使用に関し、連邦政府の規制当局または州政府によって承認されること、あるいは米国薬局方その他の一般に認められた薬局方のリストに載っていることを意味することもある。
【０１０７】
本発明のワクチンは、比較的低用量でも驚くほど効果的である。特定の実施形態では、１回分の用量は、約１０5〜約１０11、特に約１０6〜約１０10、より特には約１０6〜約１０9、更により特には約１０6〜約１０8、最も特には、約１０6〜約１０7コロニー形成単位（ＣＦＵ）である。この細菌性生ワクチンは低用量で投与するので、排出のリスクが低減し、第三者への感染も最小限に抑える。
【０１０８】
この文脈において、「約（about）」または「約（approximately）」という用語は、特定の値または範囲の３倍以内、あるいは、２倍以内（１．５倍以内を含む）を意味する。
【０１０９】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒化株は、例えば、患者の特異的腫瘍および／または間質抗原パターンを標的としたコンパニオン診断によって、患者の少なくとも１つの腫瘍抗原および／または少なくとも１つの腫瘍間質抗原の発現、および／または、少なくとも１つの腫瘍抗原および／または少なくとも１つの腫瘍間質抗原に対する免疫前応答を計測するステップを含む個別化した（individualized）癌免疫療法における使用のためのものである。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：ｃＤＮＡをコードする抗原／抗原断片の合成
ｃＤＮＡ挿入物の合成を、二本鎖のインビトロ遺伝子合成によっておこなった。５つの異なる腫瘍抗原および１つの腫瘍間質抗原をコードするｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを表４に列挙される。
【表４】
2019521154.tif 000005
【０１１１】
合成されるべきｃＤＮＡの配列を、４０〜５０塩基の別々のオリゴヌクレオチドに細分した。設計したオリゴヌクレオチドは、両方のＤＮＡ鎖とオーバーラップし、かつ、合致する。これらのオリゴヌクレオチドは、化学合成によって製造した。インビトロで合成したフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドを、エッペンドルフチューブ内で合わせ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを伴ったインキュベーションによって５’リン酸化した。リン酸化フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドを、９５℃にて変性させた。相補的オリゴヌクレオチドを、その混合物の段階的な冷却（１°／分）によってアニーリングさせた。アニーリング工程の後に、アラインしているオリゴヌクレオチドを、熱安定性Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。変性およびアニーリング工程を、サーモサイクラーで何回か繰り返して、ミスマッチ塩基対を解消し、断片の全長にわたる相補鎖の完全なマッチングを達成する。連結された断片の収率を高めるために、連結ステップ完了後に、断片の外向きの位置にアニーリングするプライマーを使用したＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ増幅産物を、調製用アガロースゲル電気泳動法によって単離した。
実施例２：発現プラスミド内への抗原ｃＤＮＡのクローニング
【０１１２】
実施例１で合成したｃＤＮＡを、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩを用いてプラスミドｐＶＡＸ１０内にクローニングした。
【０１１３】
こうして作り出した組換えプラスミドを、Ｅ．コリに形質転換し、単離し、そして配列決定した。合成プラスミドの完全配列を、決定し、そして、対応する参照配列にアラインした。配列検証の結果を表５にまとめる。
【表５】
2019521154.tif 000006
【０１１４】
１つのミスマッチ変異が、ｃＤＮＡの位置６５７に相当する、プラスミド位置１３９２（グアニンの代わりにアデニン）にてｈＭＳＬＮのオープンリーディングフレーム内に検出された。このミュート変異（不安定位置）は、ＭＳＬＮに変更されたコンセンサスアミノ酸をもたらさない。そのため、変異配列は、Ｓ．チフィＴｙ２１ａの形質転換およびバッチ製造クローンの作出に受け入れられない。他のすべてのプラスミドに関して、クローン配列は、参照配列に対して１００％の配列同一性を示した。
実施例３：抗原コードプラスミドを用いたＳ．チフィＴｙ２１ａの形質転換
【０１１５】
サルモネラ・チフィＴｙ２１ａを、実施例２で得た５種類の組換えプラスミドを用いて形質転換した。そのために、単独のＳ．チフィＴｙ２１ａコロニーを、寒天平板から選出し、１００ｍＬのＴＳＢ培地中で３７℃にて一晩培養した。次に、培養物を、１５％の無菌グリセロールと共に処方し、ラベルし、凍結し、等分し（１ｍｌ）、そして、使用するまでマスター細胞バンクとして−７５℃±５℃にて保存した。調製し、ＶＡＸ．Ｔｙ２１−１およびＶＡＸ．Ｔｙ２１−２と命名した２つの単離株を、更なる使用のために選択した。
【０１１６】
調製した単離株の細菌株同一性を、ブロモチモールブルーガラクトース寒天培地および／またはＫｌｉｇｌｅｒ鉄寒天培地で該単離株を培養することによって検証した。マスター細胞バンクとして使用される、得られた細胞コロニーの特徴を、表６に記載する。
【表６】
2019521154.tif 000007
【０１１７】
単離株ＶＡＸ．Ｔｙ２１−１を、実施例２で作出した組換えプラスミドを用いた形質転換の受容株として使用した。単離株ＶＡＸ．Ｔｙ２１−１の凍結グリセロールストックを、ＬＢ寒天平板（ＡＣＦ大豆ペプトン）上に画線接種した。１つの単一コロニーを、釣菌し、３ｍｌのＬＢ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）中で３７℃にて一晩培養した。この培養物を、２×３００ｍｌのＬＢ培地に植菌するのに使用し、そしてそれを、ＯＤ600が０．５に達するまで３７℃にて更にインキュベートした。エレクトロポレーション用のコンピテント細胞を得るために、その培養物を４℃にて遠心分離することによって集菌した。そのペレットを、５００ｍｌの氷冷Ｈ2Ｏ中に再懸濁し、再び遠心分離した。氷冷水／１０％のグリセロールによる２回の追加洗浄後に、ペレットを２ｍｌの１０％のグリセロール（動物質不含）中に再懸濁し、等分し（５０μｌ）、そしてドライアイス上で凍結させた。
【０１１８】
形質転換のために、１つの組換えプラスミドにつきコンピテント細胞の１つのアリコートを解凍し、それぞれ３〜５μｌの組換えプラスミドＤＮＡを用いてエレクトポレーション処理した。１ｍｌのＬＢ（ＡＣＦ）培地中での３７℃にて短時間の培養期間に続いて、細胞懸濁液を、カナマイシン（２５および５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ（ＡＣＦ）寒天平板上に画線接種した。その平板を、３７℃にて一晩インキュベートした。
【０１１９】
３つの単一コロニーを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する３ｍｌのＬＢ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）に植菌するのに使用した。培養物を、３７℃にて一晩インキュベートした。プラスミドＤＮＡを単離し、そしてプラスミドの同一性を制限分析によって確認した。
【０１２０】
選択したクローンを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で増やした。培養物を、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールと混合し、等分し（１ｍｌ）、そして−７０℃にて冷凍状態で保存した。組換えＴｙ２１ａクローンのプラスミドを単離し、そして完全配列決定をおこなった。１つのサイレント点突然変異が同定されたｈＭＳＬＮクローンを除いて、参照配列と、選択したクローンそれぞれのプラスミドとの１００％の配列同一性を確認した（表５を参照）。
【０１２１】
作出した形質転換クローンを表７で列挙する。
【表７】
2019521154.tif 000008
実施例４：形質転換細胞クローンの特徴づけおよびバッチ製造クローンの選択
【０１２２】
以下の分析パラメータ：
−ＯＤ600、ｐＨおよびＣＦＵによって決定される選択培地中での培養するときの経時的な増殖キネティックス；
−凍結保存後のプラスミド安定性（％ＰＳ）；
−プラスミド制限分析によるプラスミドＤＮＡ抽出および同一性の確認；
−真核細胞株へのプラスミドＤＮＡの一過性トランスフェクション後の抗原発現効果の測定、
を、それぞれの薬剤原料の確定に使用するためのＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４、およびＶＸＭ０８バッチ製造クローンの選択のために評価した。
【０１２３】
表７で列挙したＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４、およびＶＸＭ０８形質転換クローンの増殖特性を測定した。増殖増加について試験した６個のＶＸＭ０１クローン（ＶＡＸ．１１−０１、ＶＡＸ．１１−０２、ＶＡＸ．２１−０１、ＶＡＸ．２１−０２、ＶＡＸ．２１−０３）のすべてが十分に増殖したが、クローンＶＡＸ．１１−０２のみが、その起源であるＴｙ２１ａ単離株と同じレベルで増殖した。ＶＸＭ０４クローンＶＸＭ０４＿Ｋ０６４２４、ＶＸＭ０４＿Ｋ０６４２５、およびＶＸＭ０４＿Ｋ０６４２６の増殖特性を、図４、図５および図６に示す。３つのクローンすべてが、クローンＶＸＭ０４＿Ｋ０６４２６に対してわずかな増殖上の利点を有する、培地中での匹敵する増殖速度を示した。ＶＸＭ０８候補（ＶＸＭ０８ｈ＿Ｋ０８．１．１、ＶＸＭ０８ｈ＿Ｋ０８．２．２、およびＶＸＭ０８ｈ＿Ｋ０８．４．４）に関して、すべてのクローンが、匹敵する増殖特性を示したが、しかしながら、クローンＶＸＭ０８ｈ＿Ｋ０８．１．１は他の２つのクローンより優れていた。
【０１２４】
６つのＶＸＭ０１クローンの試験では、ＶＡＸ．１１−０２のプラスミド安定性が最も高く、ＶＡＸ．１１−０３およびＶＡＸ．２１−０２がそれに続くことが明らかになった。冷凍前後のプラスミド安定性に関して、３つのＶＸＭ０４クローンの間に有意差がないことは明白であった。３つのＶＸＭ０８クローンの試験では、ＶＸＭ０８ｈ＿Ｋ０８．４．４のプラスミド安定性が最も高く、それにＶＸＭ０８ｈ＿Ｋ０８．１．１およびＶＸＭ０８ｈ＿Ｋ０８．２．２が続くことが明らかになった。
【０１２５】
６つのＶＸＭ０１クローンそれぞれから単離したプラスミドＤＮＡの制限分析では、制限断片の期待したパターンが明らかになった。同等の量のプラスミドＤＮＡを、３つのクローンから単離できた。
【０１２６】
３つのＶＸＭ０４クローンそれぞれから単離したプラスミドＤＮＡの制限分析では、制限断片の期待したパターンが明らかになった。同等の量のプラスミドＤＮＡを、３つのクローンから単離できた。
【０１２７】
３つのＶＸＭ０８クローンそれぞれから単離したプラスミドＤＮＡの制限分析では、制限断片の期待したパターンが明らかになった。同等の量のプラスミドＤＮＡを、３つのクローンから単離できた。
【０１２８】
６つのＶＸＭ０１クローンから単離したプラスミドＤＮＡを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションおよび細胞抽出物のウエスタンブロット分析後に、ウエスタンブロットゲルのバンドの目視検査によると、ＶＡＸ．１１−０２、ＶＡＸ．１１−０３およびＶＡＸ．２１−０２が最高レベルを示し、そしてＶＡＸ．１１−０２がより高い発現レベルに向かう傾向を示して、６つのクローンすべてがＶＥＧＦＲ−２タンパク質を発現した。
【０１２９】
３つのＶＸＭ０４クローンから単離したプラスミドＤＮＡを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションおよび細胞抽出物のウエスタンブロット分析後に、約６５ｋＤａ、４０ｋＤａおよび２８ｋＤａの見かけ上の分子量を有する３つのバンドを、抽出物のそれぞれで同定した。染色度に基づいて、発現は、クローン６３１６から単離したプラスミドＤＮＡをトランスフェクトしたときに最も高かった。
【０１３０】
３つのＶＸＭ０８クローンから単離したプラスミドＤＮＡを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションおよび細胞抽出物のウエスタンブロット分析後に、ウエスタンブロットゲルのバンドの目視検査によると、クローンＶＸＭ０８ｈ＿Ｋ０８．１．２が最高レベルを示して、３つのクローンすべてが、グリコシル化ヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質を発現した。
【０１３１】
増殖特性、プラスミド安定性、およびタンパク質発現の研究から得られたデータに基づいて、ＶＡＸ．１１−０２を、薬剤原料の製造のためのＶＸＭ０１バッチ製造クローンとして選択した。
【０１３２】
増殖特性、プラスミド安定性、およびタンパク質発現の研究から得られたデータを検討した後に、クローンＶＸＭ０４＿Ｋ０６４２６を、薬剤原料の製造のためのＶＸＭ０４バッチ製造クローンとして選択した。
【０１３３】
増殖特性、プラスミド安定性の研究から得られたデータに基づいて、クローンＶＸＭ０８ｈ＿Ｋ０８．４．４を、薬剤原料の製造のためのＶＸＭ０８バッチ製造クローンとして選択した。
実施例５：薬剤原料の製造および放出試験
【０１３４】
ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４、およびＶＸＭ０８薬剤原料を、選択されたバッチ製造クローンそれぞれの単一コロニーから開始して、ＧＭＰ要件に従って製造した。バッチ製造クローンごとにいくつかの細胞懸濁液希釈物を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有したＴＳＢ寒天平板上で平板培養した（前培養１）。その平板を、３７℃にて２０〜３０時間インキュベートした。インキュベーション時間の完了時に、それぞれ３つの単一コロニーを選択し、そして２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えたＴＳＢ培地が入った３本の５０ｍｌフラスコに移した（前培養２）。コロニーを、３０℃にて９時間±１時間にわたり＜１．０の最大ＯＤ600まで培養した。それぞれのフラスコの撹拌を１２０ｒｐｍに設定した。最も高いＯＤ値を有するフラスコを、更なる培養のために選択した。５０ｍｌの体積の前培養２を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えた１０００ｍＬのＴＳＢ培地が入ったフラスコに移した（本培養）。１８０ｒｐｍの撹拌セットを用いた、３０℃にて９時間±１時間のインキュベーション後に、細菌を０．９〜１．５の目標ＯＤ600まで培養した。発酵が完了した時点で、グリセロールを１５％（ｗ／ｗ）の終濃度まで培養物に加えた。懸濁液を、混合し、次に、２ｍｌの凍結バイアル中に等分した（１ｍｌ）。そのバイアルに、ラベルを付し、そして、保管のため−７５℃±５℃にてすぐに冷凍した。
【０１３５】
こうして調製された薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８を、次に、それぞれの最終的な薬剤製品を確定するために更に試験した（放出の仕様）。薬剤原料の放出特徴は、表３で列挙した受入基準に基づいた。
５．１  生化学的プロフィール
【０１３６】
Ｔｙ２１ａ、ならびに薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８のループの完全に解凍された懸濁液を、ＢＴＢ−Ｇａｌ寒天平板に移し、そして、単一コロニーを得るのに適切な画線接種方法を適用した。対照生物体Ｐ．エルギノーサ（ＡＴＣＣ９０２７）およびＳ．チフィムリウム（Moskau）の植菌を、ｍｉｃｒｏｂａｎｋ（登録商標）（培養微生物の貯蔵方式）のビーズを移し、それに続いて寒天平板上に画線接種することによって行った。ＫＩＡの植菌のために、同じバイアルのループ（ビーズ）を、最初に、斜面培地の表面に画線接種し、次に、残片の中に送り込んだ。培地を３７℃にて４８時間インキュベートした。
【０１３７】
得られたコロニーは、期待したコロニー形態を示した。３つ薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８のすべてが、ブロモチモールブルーガラクトース寒天培地で１．２５％のガラクトースの存在下でコロニー増殖を示した。そのコロニーは、透明な水色および／または緑色〜黄色がかっていて、培地の色変化をもたらさなかった。
５．２  血清型決定
【０１３８】
１滴の抗血清（Ｏ５またはＯ９）をチャンバースライドに移した。試験すべき薬剤原料それぞれの細胞原料のループを、ＫＩＡの下（濡れた）側から採取し、抗血清の横に配置した。溶液をそのループと混合した。得られた懸濁液は、わずかに濁っているはずであった。懸濁液を、チャンバースライドの何回かの拭き取りによって広げた。反応物を２分後に黒色の背景に対して評価した。
【０１３９】
３つの薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８すべてが、期待したＯ９陽性およびＯ５陰性抗原型に適合した。
５．３  制限分析
【０１４０】
組換えプラスミドを、薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８から単離し、適切な時間にわたる別々の反応において２つの異なる消化酵素／組み合わせで消化した。反応を停止させ、そしてアガロースゲルにより分析した。制限分析に使用したエンドヌクレアーゼを表８に示す。
【表８】
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【０１４１】
薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８から単離した３つの組換えプラスミドのすべてが、期待した制限パターンを示した。
５．４  プラスミドの配列分析
【０１４２】
薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８から単離した組換えプラスミドを、定量化した。Ｅ．コリに再形質転換した後に、組換えプラスミドを、再び単離し、定量化し、そして配列決定した。
【０１４３】
３つの組換えプラスミドと、それらのそれぞれの参照配列との１００％の配列同一性を確認した。
５．５  発現解析
【０１４４】
市販のＤＮＡ抽出と精製キットを使用して、組換えプラスミドを薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８から単離し、そしてＤＮＡ含量は測定した。トランスフェクションの１日前に、６ウェルプレートの１ウェルあたり７．５×１０5個の２９３Ｔ細胞を平板培養して、アッセイ時に９０〜９５％コンフルエントを得た。トランスフェクションのために、単離したプラスミドＤＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）から成るトランスフェクション複合体を細胞に加え、約２４時間インキュベートした。インキュベーション後に、その細胞を再懸濁し、ＰＢＳで１回洗浄し、そして溶菌した。細胞破片を、遠心分離によってペレット化した。上清を回収し、そしてタンパク質含有量を測定した。ウエスタンブロット分析が行われるまで、サンプルを−７０℃にて保存した。組換えタンパク質の存在を実証し、準定量ベースで適切な基準物質と比較した。
【０１４５】
抗原ＶＥＧＦＲ−２、ＭＳＬＮおよびＣＥＡの発現レベルは、選択された基準物質と同等であった。
５．６  生菌数の測定
【０１４６】
１０-8の希釈係数に至るまでの薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８の細菌懸濁液の段階希釈を調製し、寒天平板上で平板培養した。適切なインキュベーション後に、コロニーをカウントした。カウントは、コロニーがはっきりと見えるが、それほど大きくないときに、開始した。
【０１４７】
測定した生菌数を表９に列挙する。
【表９】
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５．７  プラスミド安定性
【０１４８】
薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８（生菌カウント試験に使用したのと同じバイアル）の細菌懸濁液の段階希釈を調製し、抗生物質カナマイシンを含有するＴＳＢ平板上で平板培養した。適切なインキュベーション後に、コロニーをカウントした。カウントを、コロニーがはっきり見えるが、それほど大きくないときに開始した。プラスミド安定性を、次のようにしてカナマイシン含有または不含ＴＳＢ上のコロニー形成単位を比較することによって計算した：ＰＳＴ＝（カナマイシンありのＣＦＵ／カナマイシンなしのＣＦＵ）×１００。
【０１４９】
３つ薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８すべてが、表３に明記したあらかじめ設定されたプラスミド安定性の受入基準を満たした。３つの組換えプラスミドすべてについて決定されたプラスミド安定性は、少なくとも７５％であった。
５．８  微生物不純物
【０１５０】
全好気性細菌、カビ、および真菌のカウントを測定するために、および特定の病原性エシェリキア・コリ、サルモネラ亜種、シュードモナス・エルギノーサ、スタフィロコッカス・アウレウスおよびクロストリジウム亜種の不存在を確認するために、薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８を、European Pharmacopoeia Ph. Eur. monographs 2.6.12および2.16.13に従って試験した。
【０１５１】
３つの薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８のすべてが、表３に明記したあらかじめ設定された微生物不純物の受入基準を満たした。
３つの薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８のすべてで、全好気性細菌カウント（ＴＡＭＣ）は１０2ＣＦＵ／ｍｌ以下であり、全酵母およびカビカウント（ＴＹＭＣ）は２ＣＦＵ／ｍｌ以下であり、かつ、Ｐ．エルギノーサ、Ｓ．アウレウス、Ｅ．コリ、クロストリジウム亜種、および他のサルモネラ株は、１ｍｌの細胞懸濁液中で検出できなかった。
５．９  バクテリオファージ試験
【０１５２】
バクテリオファージの検出のための試験手順は、適切な宿主と、試験すべきサンプルまたは対照ファージ懸濁液のいずれかを含む軟寒天培地重層における平板培養を利用した。アッセイの感度を改善するために、事前の濃縮ステップを含んだ。このステップでは、サンプルを、適切な宿主細胞と共に４時間インキュベートした。それに続いて、これらの濃縮培養物のそれぞれの１つのサンプルを平板培養した。
【０１５３】
３つ薬剤原料ＶＸＭ０１、ＶＸＭ０４およびＶＸＭ０８のすべてが、表３に明記したあらかじめ設定されたファージ受入基準を満たした。濃縮ステップ後の１００μｌの細胞懸濁液中では、ファージを検出できなかった。
【０１５４】
配列表の説明
配列番号１：発現プラスミド
配列番号２：アミノ酸配列ＶＥＧＦＲ−２
配列番号３：アミノ酸配列ＷＴ１
配列番号４：アミノ酸配列ＭＳＬＮ
配列番号５：アミノ酸配列ＣＥＡ
配列番号６：アミノ酸配列ＣＭＶ ｐｐ６５
配列番号７：アミノ酸配列ＣＭＶ ｐｐ６５
配列番号８：アミノ酸配列ＣＭＶ ｐｐ６５
配列番号９：ｃＤＮＡ ＶＥＧＦＲ−２
配列番号１０：ｃＤＮＡ ＷＴ１
配列番号１１：ｃＤＮＡ ＭＳＬＮ
配列番号１２：ｃＤＮＡ ＣＥＡ
配列番号１３：ｃＤＮＡ ＣＭＶｐｐ６５
配列番号１４：ｃＤＮＡ ＣＭＶｐｐ６５
配列番号１５：ｃＤＮＡ ＣＭＶｐｐ６５
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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