(57)【要約】  本発明は、微粒子化された高純度の金属銅粒子の化合物を含み、頻繁に使用される任意の種類の基板又は表面上で微生物菌活性の最大１００％の低減を可能にする、表面をコーティングするための抗菌組成物を提供する。さらに、該組成物を調製するためのプロセスを提供する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子化された高純度の金属銅粒子の化合物、及び低温で塗布される液体ビヒクルを含むことを特徴とする、表面をコーティングするための抗菌組成物。
【請求項２】
前記微粒子化された金属銅粒子の化合物が異なる形、サイズ、及び比率の粒子の分布を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記液体ビヒクル化合物が重合メカニズムによって硬化されるポリマーであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記微粒子化された金属銅粒子の化合物が球状、繊維状、非結晶、及び層状の形の粒子を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
銅粒子のサイズ分布が１ナノメートル〜５０ミクロンの範囲であることを特徴とする、請求項１〜４に記載の組成物。
【請求項６】
該組成物中の銅含有量が最終組成物の重量に関して３０％〜９０％であることを特徴とする、請求項１〜５に記載の組成物。
【請求項７】
該ポリマーがその硬化後に溶剤を含まないことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
該ポリマーがとりわけポリアミドエポキシ、ポリウレタン、ポリメチルメタクリレートなどの無機樹脂の中から選択され得ることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
表面をコーティングするための抗菌組成物を調製するためのプロセスであって、
ａ．高純度の微粒子化された金属銅の球状及び半球状の粒子を調製する工程；
ｂ．球状及び半球状の粒子の画分を分離し、ミルでそれらを処理し、かつ層状の粒子及び非結晶の粒子を取得する工程；
ｃ．繊維状の粒子を取得する工程；
ｄ．層状の粒子のみと樹脂を混合する工程；並びに
ｅ．生成物の調製時及び硬化剤と前記樹脂の「混合寿命」内により大きいサイズの粒子を前の混合物に組み込む工程、
を含むことを特徴とする、プロセス。
【請求項１０】
前記粒子が金属酸化を防止するために熱誘導溶融プロセスの手段及びその後の低温での不活性ガス媒体中での粉砕によって調製されることを特徴とする、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記得られた粒子が５０ミクロン未満の粒度分布範囲を得るためにスクリーニングされることを特徴とする、請求項９又は１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
（ｂ）で使用されるミルがボール及びローラーミルであることを特徴とする、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記繊維状粒子がマイクロワイヤーを用いる技術の手段によって調製されることを特徴とする、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記繊維状粒子がガラス毛細管中で銅を融解することによって調製されることを特徴とする、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１５】
添加剤Ｚｎリン酸塩がまた（ｄ）に記載の混合物に添加されることを特徴とする、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記樹脂が発熱性の珪質タイプのチキソトロープ性樹脂を含有することを特徴とする、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１７】
エアレス突起の手段によって又は手動手段によって塗布されることを特徴とする、表面をコーティングするための抗菌組成物を塗布するための方法。
【請求項１８】
塗布され次いで乾燥されると、前記コーティングが静電手段によって活性化されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、頻繁に使用されるいずれの種類の基板又は表面上でも微生物活性を最大１００％低減できる、表面をコーティングするための抗菌組成物を提供する。
【０００２】
さらに、この組成物を調製するプロセスを提供する。
【背景技術】
【０００３】
医療関連感染症（ＨＡＩ）は患者の罹患率及び死亡率並びにケアの費用を増加させるのでそれらが公衆衛生上の問題を提起することを、複数の研究が実証している。チリでは毎年７０，０００人が病院で感染した病気を発症し、それはこの国にとって相当な費用となっていることが推定される。様々な研究が、これらのＨＡＩのいくつかは、床、壁、ベッドのサイドレール、机などの表面への接触を介して病原体が伝染することから発生することを指摘している。この問題は、抗菌特性を有し、従来の物及び表面と置き換えられ、かつそれにより健康及び経済の両方の点で大きな影響を与えることができる材料の分野での革新の機会を提供する。
【０００４】
２００８年に、米国の環境保護庁（ＥＰＡ）が、抗菌銅の合金が公衆衛生に有益であることを確認して、それらの登録を承認した。銅のこれらの殺菌特性は、既にヨーロッパ、米国、及びチリの病院で使用されており、銅処理された表面は病原体の負荷を減少させることが実証されている。しかしながら、金属銅材料には、酸化、高い費用、及びそれらの実装を制限する加工の困難さなどのいくつかの欠点がある。上記の欠点は、銅ベースの化合物の組み込みを介して抗菌特性が与えられるプラスチック（ポリマー）材料及びコーティング（塗料、ワニス、ゲル）を開発することによって克服できる。
【０００５】
このように、様々な研究者が、銅又はその合金から作られた表面がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、シュードモナス・エルギノーサ、エンテロバクター・アエロゲネス、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・エンテリカ、カンピロバクター・ジェジュニ、レジオネラ・ニューモフィラ、クロストリジウム・ディフィシル、及び結核菌を含む病原菌の９９．９％を数時間以内に排除できることを、ＥＰＡ（環境保護庁）によって確立された規準を適用して、実証した。
【０００６】
ＥＰＡによって確立された条件下での一貫した知見は、ステンレス鋼とは対照的に、室温での病原菌の排除における銅の有効性を実証する。これらの研究において、銅は９０分以内にＭＲＳＡを素早く排除するが、ステンレス鋼では６時間（３６０分）後にも細菌濃度の減少が観察されなかった。８０％の銅を含有する合金ブロンズでは、ＭＲＳＡは２７０分で完全に排除された。
【０００７】
実験室の証拠は、高い死亡率を有する病院感染症の大流行と関連する病院の病原体であるクロストリジウム・ディフィシルの、胞子および栄養形態の排除における銅の効能を立証する。これらの研究は、金属銅への暴露の２４時間後の胞子の排除を示し、別の研究は、有機物の存在下であっても、栄養形態については３０分後に、および胞子については３時間の時点でこの効果が出始めることを示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
銅の表面の殺菌効果は濃度に直接比例し、最大効果が金属銅（９９．９％）で達成され、かつ少なくとも７０％の銅を含有する合金で維持されること、並びに接着及び表面のコロニー形成を促進するために使用される細胞外ポリマーによって囲まれたバイオフィルム又は多細胞コロニーの形成を阻害することも可能であることを強調することは重要である。
【０００９】
そのため、２００８年３月２５日に、累積した科学的証拠によって、ＥＰＡは、抗菌特性を有する第１の及び唯一の金属として銅を登録し、「銅の表面は、暴露の２時間後に９９．９％の病原菌を排除する」という事実を含む重要な概念の普及を許可し、金属銅及びその合金で作られた表面が天然の抗菌剤であり、持続性の抗菌効力を有し、自己消毒効果を有し、かつ市場で利用可能な他のコーティング剤よりも優れているという事実を保証した。
【００１０】
この登録は、病院環境での銅表面の使用を許可する。
【００１１】
加えて、チリ大学によって行われた実験室研究は、細菌が急速にかつ非常に効率的に接着するステンレス鋼の表面上で観察されることとは対照的に、銅表面が、直接接触によって細菌を死滅させるだけでなく、ＭＲＳＡ、多耐性の肺炎桿菌、及び多耐性のアシネトバクター・バウマニを含む、病院感染症と関連する主要病原体の臨床株の接着を妨害しかつそれらの繁殖を阻害することを示した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
銅の抗菌活性を説明する正確なメカニズムは、完全には解明されていない。抗菌活性の１つの重要な要素は、連続プロセスで電子を放出し受け取る銅の能力である。いくつかの研究が、高濃度では、銅は、ヒドロペルオキシドラジカルの放出により細菌に対して毒性効果を有し；銅イオンが鉄などの細菌代謝に必須のイオンとおそらく置換され、最初に細胞膜の機能を妨害し、次いで、細胞質で、タンパク質の形成を阻害するか機能不全タンパク質を合成させるかにより、タンパク質合成を変更し、ひいては細菌代謝に必須である酵素の活性を変更する、と示唆している。
【００１３】
銅はまた、インフルエンザＡウイルス及びヒト免疫不全ウイルスＨＩＶを含む、医学的重要性が高いウイルスを、０．１６〜１．６ｍＭの低濃度で破壊する能力を示した。酸化銅を有するフィルターの開発は、体液を介するＨＩＶの伝染リスクを効率的に排除することを可能にした１４。抗ウイルス活性に関与するメカニズムは、ウイルスの複製に重要であるプロテアーゼ酵素の不活化及びリン脂質シェルの損傷である。
【００１４】
一方で、銅の抗真菌活性の証拠も存在する。例えば、カンジダ・アルビカンスを含む真菌種は、それらが銅の表面と接触すると、増殖が抑制され、次いで破壊される。抗真菌活性は、「接触による死」と呼ばれる複雑なプロセスの手段によっておそらく生じ、そこで細胞膜が損傷され脱分極し、細胞中への銅イオンの侵入を促進し、損傷を増大しかつ、二次的に、明白な損傷なしに酸化ストレスの増加を生じる。
【００１５】
先行技術において、銅の使用を説明するコーティング剤及び組成物を見つけることは可能であり、例えば、文書ＧＢ２４６６８０５は、反応エネルギー源として炎を使用する大気圧での化学蒸着を含む、基板上への抗菌特性を有する層の堆積の方法であって；金属の放出を安定化、保護、及び制御するための第２の金属も堆積され、金属及び第２の金属が同時に又は連続して堆積される方法を説明する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明による抗菌剤が特異的な粒径及び相組成によって特徴づけられる、論文ＲＵ ２４１６４３５に記載されるような、銅のナノ粒子及び酸化銅のナノ粒子に対応する、グラム陽性及びグラム陰性の微生物に対する抗菌剤を有する組成物を見つけることも可能である。ナノ粒子は６７〜９６％の銅および４〜３３％の酸化銅を含む。酸化銅のナノ粒子は、結晶の銅、ＣｕＯ及びＣｕ２Ｏを含有する。
【００１７】
ナノ粒子及びポリマーの使用に関して、公開されたＷＯ ２０１４０３０１２３は、防汚、殺菌、抗ウイルス、及び抗菌の特性を有するポリマー材料、特に熱可塑性材料又は樹脂に関し、ここで抗菌特性は、４〜５００ナノメートル、より好ましくは１０〜８０ナノメートルのナノ粒子を含む抗菌特性を有する要素又は化合物の、抗菌及び殺菌特性を有する要素又は無機化合物の経時的に制御され維持される放出によって与えられ、ここでナノ粒子は、最終分散を向上させるように前処理されており、かつ熱可塑性樹脂中に完全に包埋され、樹脂の表面から膨隆せず、かつここで抗菌特性を有する要素又は無機化合物のナノ粒子は、０．１〜１００マイクロメートルのサイズ範囲で、凝集体と呼ばれる二次構造を形成し、ここで要素又は無機化合物のナノ粒子と熱可塑性樹脂及び／又は熱安定性樹脂及び／又は塗装タイプの有機コーティング剤との重量比は１〜８０重量％であり、かつここで上記二次構造は樹脂中で均一に分散される。
【００１８】
生成物はこのように、船の輸送で使用するための銅の抗菌活性に基づくがヒトに対して非常に毒性であることが知られている。
【００１９】
細菌負荷を著しく低減することによって、銅は、臨床用囲い地および学校で、及び一般的に公共スペースで無菌状態を高めることを可能にし、食品関連プロセスにおける相互汚染を低減するのを助ける。それにもかかわらず、１時間で銅粒子によって細菌負荷を１００％低減できる組成物が知られていないことは確かである。
【００２０】
現在の、表面上の銅の使用の欠点は、全ての表面に適切な寸法をもたない金属銅プレートを使用するのにかかるコストが高いこと、及びそれがもたらす高い設置コストにある。ポリマー樹脂又はコーティング剤の場合は、使用に由来する自然な摩耗が表面の銅含有量を徐々に除去し、それらの抗菌能力を低減する。
【００２１】
定義
マイクロメートルの金属銅粒子：１マイクロメートル以上で、１０００マイクロメートル以下のサイズの粒子を指す。これは、ナノ粒子及び１０００ミクロンより大きい金属片と、上記粒子を区別するためである。
ナノメートル金属銅粒子：１ナノメートル〜２５０ミクロンのサイズの粒子を指す。
１００％固体樹脂：揮発性有機溶剤を含まない結合化合物を指す。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】表は、表面に塗布された時の組成物中の粒子の分散を示す。
【図２】大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に対する抗菌活性のアッセイのための最初の接種菌液及びＣＦＵカウント。［Ａ］１．９５×１０７細菌（アッセイ番号１、左）及び２．４×１０７細菌（アッセイ番号２、右）の最初の接種菌液、［Ｂ］各検体の生存細菌数。２回繰り返した実験及び技術が示される。拡張因子は、０、−１、−２、−３、−４、及び−５として示される。
【図３】黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性のアッセイのための最初の接種菌液及びＣＦＵカウント。［Ａ］４．３７×１０７細菌（アッセイ番号１、左）及び１．５×１０７細菌（アッセイ番号２、右）の最初の接種菌液、［Ｂ］各検体の生存細菌数。２回繰り返した実験及び技術が示される。拡張因子は、０、−１、−２、−３、−４、及び−５として示される。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、表面をコーティングする抗菌組成物及び上記組成物を調製するプロセスに関し、抗菌活性を有し得る表面の応答時間の短縮、効率、及び無菌状態の有効性において考えられる問題に対処することが意図される。
【００２４】
組成物及びプロセスは、組成物に暴露される表面上で微生物活性を最大１００％排除できる覆われた表面を取得する目的で塗布される基板に、コーティング剤が接着するのを可能にする、結合剤と銅粒子の組み合わせに基づく。
【００２５】
組成物は、銅粒子の抗菌作用を促進するように相互作用する３つの段階又はステージで動作し、それが塗布される表面が微生物による汚染又は接触感染のリスクなく使用されるのを可能にする。
【００２６】
本発明の詳細説明
本発明は、低温で塗布され重合メカニズムによって硬化される液体ビヒクル中に様々な形、サイズ、及び比率の粒子が分布する、微粒子化されたマイクロメートルの高純度の金属銅化合物及び任意にナノメートル金属銅である、表面をコーティングするための抗菌組成物に対応する（図１参照）。
【００２７】
使用される微粒子は、それら間で異なる形及び多様なサイズである：
・非結晶
・球状
・繊維状、及び
・層状。
【００２８】
微粒子のサイズ分布は、１マイクロメートル〜５０ミクロンの範囲である。図１に示すように、金属粒子の形及びサイズの多様性は、得られる表面が最大１００％の抗菌保護を有することを可能にする。
【００２９】
殺生物剤若しくは殺菌剤として作用する銅及び他の活性物質の粒子、ナノ粒子、又は色素沈着物を含有する他のコーティングタイプの製品とは異なり、本発明の形及び寸法の飽和（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）は、高密度の金属銅に基づき経時的に恒久的な抗菌作用を確実にし、その機能性においてそれは金属銅コーティング剤の塗布と同等であるかそれを上回るので、それを独特で他のものと区別されるものにする。
【００３０】
本発明による組成物の抗菌作用は、相互作用する３つの段階又はステージで動作する：
・第１段階は、最大のイオン電荷を有する銅の質量に対応する。この段階は、最大すなわち最も大きい粒子はコーティングの下部又はコーティングの内部へ移動するので、コーティングされる表面と接触するより低いゾーンに位置する傾向にある。
・第２段階は、層状粒子−好ましくは及び任意には微粒子金属銅の一部−が位置し表面と接触して浮いているコーティングの表面、及びコーティングの内部媒体に対応する。これらの粒子は低い電荷を有するが、コーティングの外側に向かうより大きな表面暴露を有する。
・第３段階は、ポリマーの助けをかりてイオンの接触及び伝達のネットワークを形成する、金属銅の、球状、非結晶、繊維状、樹状の粒子・ナノ粒子を含み、ポリマーは銅粒子の結合ビヒクルとして作用する。これらの粒子は質量も表面領域もほとんどもたないが、表面の層状粒子と電荷の寄与が高い粒子の間のコミュニケーションの橋渡しをする。
【００３１】
異なる銅粒子とポリマーのこの組み合わせはしたがって、材料のイオン容量を促進することによって銅の抗菌作用を促進し、ひいては、達成される抗菌作用を最大１００％有効にし、それが塗布される表面が病原体の汚染又は接触感染のリスクなく使用されることを可能にする。この改善されたイオン効果はしたがって、ポリマーと組み合わせた粒子の形状及びその分布によるものである。
【００３２】
組成物の銅含有量に関して、それは最終組成物の重量に対し３０％以上であり、最大９０％である。
【００３３】
ポリマーは、架橋によって硬化され、かつコーティングされる表面又は基板へ十分に接着できる結合剤に対応する。ポリマーの使用は、基板の全体的な形又は形状を容易に覆うコーティングを得ることを可能にする。
【００３４】
使用されるポリマーは、とりわけ、ポリアミドエポキシ樹脂、ポリウレタン、及びポリメチルメタクリレートなどのエポキシコーティング剤を含む。
【００３５】
（調製プロセス）
以下に記載される製造方法は例示の態様で示されているのであり、故に、記載にしたがって粒子が調製される方法は本発明で使用される粒子を限定するものではないことに留意されたい。
【００３６】
粒子を、金属酸化を防止するために熱誘導溶融プロセス及びその後の低温での不活性ガス媒体中での粉砕によって調製する。球状及び半球状の粒子をこの方法で取得し、平均２５ミクロンの、１ミクロン〜５０ミクロンの粒度分布範囲の粒子を取得するためにスクリーニングする。
【００３７】
これらの粒子の画分、好ましくはそのような粒子の１０〜２０％を、層状で非結晶の粒子を取得するためにボール及びローラーミル中で分離及び処理する。繊維状粒子は、粒子の総重量の最大１０重量％を有し、ガラス毛細管内で銅を融解することによって得られるマイクロワイヤーを用いる技術によって他の種類の粒子から独立して取得され、マイクロワイヤーをスプールに巻いてそこから５０ミクロン未満の長さで繊維状粒子が切断される。
【００３８】
コーティング剤を生成するために、層状粒子のみ事前に混合し、これは特徴的な銅の色を提供し、添加剤の亜鉛で、及び発熱性の珪質タイプのチキソトロープ性添加剤を含有する樹脂で安定化される。より大きいサイズのナノメートルの、及び、非結晶、球状、半球状粒子を、生成物が調製される時点で及び硬化剤との樹脂の「混合寿命」内に、続いて単独で組み込み、この理由でそれらは付随容器中で運ばれる。これにより、最終的に、３つの成分−着色基材、硬化剤、及びシステム活性化粒子を有する生成物が得られる。
【００３９】
塗布の方法及び作用メカニズム
組成物を塗布するための、第１の工程は、調製物を作成し、組成物が塗布される基板を浄化することである。Ｚｎリン酸塩のチキソトロープ性の安定化添加剤を含有する樹脂基材をより大きいサイズの活性化剤粒子と次いで混合し、次いでそれを硬化試薬と混合する。組成物をエアレス装置（エアレス突起）を用いて塗布する。塗布される生成物は、表面及びコーティングの内部媒体と接触して浮いている銅粒子を含有する。
【００４０】
コーティング剤が塗布された表面が使用のために浄化されたら、静電活性化プロセスを行い、その後でそれはその抗菌力を発揮し始める。
【００４１】
銅の抗菌活性を説明する正確なメカニズムは、完全には解明されていない。しかし、抗菌活性の１つの重要な要素は、連続プロセスで電子を放出し受け取る銅の能力である。
【００４２】
いくつかの研究が、高濃度では、銅は、ヒドロペルオキシドラジカルの放出により細菌に対して毒性効果を有し；銅イオンが鉄などの細菌代謝に必須のイオンとおそらく置換され、最初に細胞膜の機能を妨害し、次いで、細胞質で、タンパク質の形成を阻害するか機能不全タンパク質を合成させるかにより、タンパク質合成を変更し、ひいては細菌代謝に必須である酵素の活性を変更する、と示唆している。
【００４３】
銅粒子が細菌に対して作用する順番は、
１．銅イオンが銅表面から放出され、細菌細胞に浸透し細胞膜への損傷を引き起こす。
２．細胞膜の破壊が銅イオンの侵入を促進し、これが膜の機能不全および酸化ストレスの増加をもたらす。
３．必須酵素の機能的損傷と共に、細胞質内でタンパク質合成の変更が起こる。
４．細胞死及び細菌ＤＮＡの分解
である。
【００４４】
技術的利点
これはマイクロメートルの銅であるので、コーティングされる表面に暴露される使用者に対し無毒である。ナノメートル粒子の使用に関し、それは金属銅にも相当する。
【００４５】
得られるコーティングは、高レベルの耐摩耗性及び様々な基板への完全接着を達成し、環境保護庁（ＥＰＡ）の基準及びプロトコルで定義される細菌に対する１００％抗菌保護を提供する。
【００４６】
本発明による組成物は金属銅の単なる凝集や粒子を含み、このことは、毒性の可能性のある活性成分及び閉鎖スペースでのその塗布を制限しかつ使用者が直接接触する表面での使用が安全ではない溶剤を含有する代替製品と比較して、それを安全にする。
【００４７】
別の利点は、塗布を低温で行うことができ、高温で塗布される類似の銅含有物を有する製品と比較して、それを全ての種類の表面に好適にしかつ塗布費用を削減する、という事実にある。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態
樹脂はチキソトロピック添加剤を含有するが、より大きいサイズの球状、非結晶、及び繊維状の粒子の密度及び形により、粒子は取り込まれた後数日で沈降することが見出され、この理由から、樹脂基材は、１〜３％の割合で層状粒子と共に、Ｃｕの酸化を安定化する発熱性シリカのチキソトロピック添加剤及びＺｎリン酸塩添加剤と共に運ばれる。硬化剤と同時に塗布時にのみ組み込まれるために、５０ミクロン程度の、より大きな非結晶又は球状の粒子は別々に運ばれ；高純度の金属銅の３０〜９０重量％の球状粒子が組み込まれる。混合物の寿命は２０℃で１時間未満であり、寿命は高温で減少する。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、第一相で使用される粒子はより大きなサイズの非結晶であり、そのためこれらは通常の球状又は半球状粒子と比較してより大きな付着性を有する。
【００５０】
実施例
実施例１：「銅鎧」コーティングを有する検体の抗菌活性の定量（実験室報告）
以下のデータは、本発明者の依頼により、Ｄａｖｉｄ Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｍ．ＳＣ．，Ｐｈ．Ｄ．（ｃ）によって２０１５年９月２５日に行われた分析からのものである。
【００５１】
方法：銅を含有する固体表面上の抗菌活性の分析用プロトコル
銅を含有する表面の殺菌剤の有効性を決定するために、米国環境保護庁（ＥＰＡ）によって記載されたプロトコル１を、少し変更して用いた。
【００５２】
目的の試料（種類Ａ：Ａ１、Ａ２、Ａ３；種類Ｂ：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３）を、次亜塩素酸ナトリウム（２０％  ｖ／ｖ）及びエタノール（７０％  ｖ／ｖ）で２４時間簡潔に滅菌した。各検体を次いでプラスチックのペトリ皿に入れ、層流チャンバ中で１時間乾燥させ、両側に１５分間、ＵＶを照射した。
【００５３】
各検体を、１×１０７及び５×１０７の細菌を含有する大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ４３８９５）又は黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２９２１３）の接種菌液を用いて評価した。
【００５４】
大腸菌及び黄色ブドウ球菌の接種菌液を、それぞれルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天及びブレインハートインフュージョン寒天上で細菌を一晩増殖させることによって得た。接種後１時間の時点で、各検体を１ｍｌの生理食塩水リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、希釈系列の方法によって細菌計数を行った。
【００５５】
大腸菌及び黄色ブドウ球菌の細菌計数を、ＬＢ寒天及びベアードパーカー寒天上でそれぞれ１０μｌの各希釈液をプレーティングすることによって行った。ＬＢ寒天及びベアードパーカー寒天プレートを、それぞれ２４時間及び４８時間、３５±２℃でインキュベートした。１０〜２００コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有するプレートを記録した。評価を、実験的及び技術的な２度繰り返しで行った。
【００５６】
データ分析：
検体あたりの生菌数：
Ｎ＝（Ｃ×Ｄ×Ｖ）／ｖ２
式中、
Ｎ＝試験検体あたりの回収された生菌数
Ｃ＝２度繰り返した検体の平均カウント
Ｄ＝各プレートの計数された希釈係数
Ｖ＝ｍｌ単位の、各検体に加えられたＰＢＳの量
Ｖ２＝ｍｌ単位の、プレーティング量
減少率：
減少率（％）＝［（ａ―ｂ）／ａ］×１００
式中、
ａ＝対照検体における平均の最初の接種菌液又は回収された生菌数
ｂ＝目的の検体中の平均の回収された生菌数
【００５７】
結果
１．大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に対する抗菌活性
使用した接種菌液：
アッセイ１
Ｎ＝（Ｃ×Ｄ×Ｖ）／Ｖ２
Ｎ＝（（２５＋１４）（１００００）（１ｍｌ））／０．０１ｍｌ
Ｎ＝１．９５×１０７
アッセイ２
Ｎ＝（（２２＋２６）（１００００）（１ｍｌ））／０．０１ｍｌ
Ｎ＝２．４×１０７
第１のアッセイについて、１．９５×１０７の細菌の接種菌液（図２Ａ、左）、及び２．４×１０７の細菌の接種菌液を第２のアッセイのために使用した（図２Ａ、右）。
検体あたりの生菌カウント：
種類Ａ１−３試料及び種類Ｂ１−３試料を用いて行ったアッセイの全てにおいて、接触の１時間後に、生菌は観察されなかった（図２Ｂ）。結果として、細菌負荷の減少は１００％であった。
【００５８】
２．黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性
使用した接種菌液：
アッセイ１
Ｎ＝（（４３＋４４）（１００００）（１ｍｌ））／０．０１ｍｌ
Ｎ＝４．３５×１０７
アッセイ２
Ｎ＝（（１２＋１８）（１００００）（１ｍｌ））／０．０１ｍｌ
Ｎ＝１．５×１０７
第１のアッセイについて、４．３５×１０７の細菌の接種菌液（図３Ａ、左）、及び１．５×１０７の細菌の接種菌液を第２のアッセイのために使用した（図３Ａ、右）。
検体あたりの生菌カウント：
種類Ａ１−３試料及び種類Ｂ１−３試料を用いて行ったアッセイの全てにおいて、接触の１時間後に、生菌は観察されなかった（図２Ｂ）。結果として、細菌負荷の減少は１００％であった。
【００５９】
知見は、種類Ａ及び種類Ｂの検体が、記載の方法のプロトコルを実行した場合に、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７及び黄色ブドウ球菌に対して殺菌剤効果を有するものとして予備的に分類できることを示唆する。得られた結果を実証するために、より多くの研究及び複製が必要である。
【００６０】
参考文献
１  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ  （ＥＰＡ）．  ２０１４．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｈａｒｄ，  Ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ  Ｃｏｐｐｅｒ／Ｃｏｐｐｅｒ−Ａｌｌｏｙ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ．  ＥＰＡ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ
【図１】
2019504045.tif 000003
【図２】
2019504045.tif 000004
【図３】
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【国際調査報告】
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