(57)【要約】  本発明は、ストレプトコッカス  ニューモニアエ血清型２莢膜ポリサッカライド、およびその複合体に関する一般式（Ｉ）の合成サッカライド、並びにヒトおよび／または動物宿主において保護免疫応答を上昇させるための前記サッカライドおよび前記複合体の使用、に関する。さらに、一般式（Ｉ）の合成サッカライドは、ストレプトコッカス  ニューモニアエ２型細菌に対する抗体の検出のための免疫学的アッセイのマーカーとして有用である。
2019504017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2019504017.tif 000067
（式中、
ｘは、１、２、３、および４から選択される整数であり、
Ｕ１＝Ｕ５＝
【化２】
2019504017.tif 000068
、Ｕ２＝Ｕ６＝
【化３】
2019504017.tif 000069
、
Ｕ３＝Ｕ７＝
【化４】
2019504017.tif 000070
、Ｕ４＝
【化５】
2019504017.tif 000071
、
Ｖ＊−は、Ｈ−、Ｈ−Ｕｘ−、Ｈ−Ｕｘ＋１−Ｕｘ−、Ｈ−Ｕｘ＋２−Ｕｘ＋１−Ｕｘ−、またはＨ−Ｕｘ＋３−Ｕｘ＋２−Ｕｘ＋１−Ｕｘ−を表し、
Ｌはリンカーを表す。）
のサッカライド、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項２】
式中、ｘは１を表す、
一般式（Ｉ）に記載のサッカライド、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項３】
式中、
Ｕ２＝Ｕ６＝
【化６】
2019504017.tif 000072
である、
請求項１または請求項２に記載のサッカライド、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項４】
式中、
Ｕ１＝Ｕ５＝
【化７】
2019504017.tif 000073
である、
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のサッカライド、またはその薬学的に許容できる塩。
【請求項５】
請求項１に記載の一般式（Ｉ）のサッカライドの合成方法であって、
一般式（Ｉ）中、ｘは１を表し、Ｖ＊−は、Ｈ−を表し、および
Ｕ１＝
【化８】
2019504017.tif 000074
、
およびＵ２＝
【化９】
2019504017.tif 000075
であり、
次のステップ
Ａ）一般式（ＩＶ）
【化１０】
2019504017.tif 000076
（式中、Ｐ１〜Ｐ８は保護基を表す。）
のテトラサッカライドを得るために、
一般式（ＩＩ）
【化１１】
2019504017.tif 000077
（式中、Ｐ１〜Ｐ３は保護基を表し、およびＬＧ１は脱離基を表す。）
のジサッカライドを、
一般式（ＩＩＩ）
【化１２】
2019504017.tif 000078
（式中、Ｐ４〜Ｐ８は保護基を表し、およびＬは請求項１に定義される通りの意味を有する。）
のジサッカライドと反応させること、
および、
Ｂ）一般式（Ｖ）
【化１３】
2019504017.tif 000079
（式中、Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ６〜Ｐ８は保護基を表し、およびＬは請求項１に定義される通りの意味を有する。）
のテトラサッカライドを得るために、一般式（ＩＶ）のテトラサッカライドの選択的脱保護を行うこと、
および
Ｃ）一般式（ＶＩＩ）
【化１４】
2019504017.tif 000080
（式中、Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ６〜Ｐ１０は保護基を表し、およびＬは請求項１に定義される通りの意味を有する。）
のヘキササッカライドを得るために、
一般式（Ｖ）のテトラサッカライドを、一般式（ＶＩ）
【化１５】
2019504017.tif 000081
（式中、Ｐ９およびＰ１０は保護基を表し、およびＬＧ２は脱離基を表す。）
のジサッカライドと反応させること、
および、
Ｄ）一般式（ＶＩＩ）の化合物における保護基Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ６〜Ｐ１０の除去を行うこと、
を含む、方法。
【請求項６】
一般式（Ｖ）
【化１６】
2019504017.tif 000082
（式中、Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ６〜Ｐ８は保護基を表し、およびＬは請求項１に定義される通りの意味を有する。）
の中間体。
【請求項７】
一般式（Ｖ）中、Ｐ１、Ｐ６およびＰ７は、ベンジル基を表し、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、互いに独立して、ベンゾイル基およびアセチル基から選択され、およびＰ８は、ベンジルオキシカルボニル基を表す、
請求項６に記載の一般式（Ｖ）の中間体。
【請求項８】
−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して免疫原性担体に共有結合される請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）のサッカライドを含む複合体。
【請求項９】
一般式（Ｘ）
【化１７】
2019504017.tif 000083
（式中、ｍは約２〜約１８が含まれ、
−Ｗ−は、
【化１８】
2019504017.tif 000084
から選択され、
ａは１〜１０の整数を表し、
ｂは、１〜４の整数を表し、および
Ｖ＊、Ｕｘ＋３、Ｕｘ＋２、Ｕｘ＋１、Ｕｘ、ｘおよびＬは、請求項１〜請求項４のいずれか一項において定義される通りの意味を有する。）
の請求項７に記載の複合体。
【請求項１０】
ヒトおよび／または動物宿主の保護免疫応答を上昇させることにおいて使用のための請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載のサッカライド、または請求項８もしくは請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
ストレプトコッカス  ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）２型によって引き起こされる病気の予防および／または治療において使用のための請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載のサッカライド、または請求項８もしくは請求項９に記載の複合体。
【請求項１２】
少なくとも一つの薬学的に許容できるアジュバントおよび／または賦形剤と共に、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載のサッカライドおよび／またはその薬学的に許容できる塩、または請求項８もしくは請求項９に記載の複合体、を含むワクチン。
【請求項１３】
少なくとも、ストレプトコッカス  ニューモニアエの莢膜ポリサッカライド、および／またはストレプトコッカス  ニューモニアエの莢膜ポリサッカライドの断片、および／または担体タンパク質とストレプトコッカス  ニューモニアエの莢膜ポリサッカライドとの複合体、または担体タンパク質とストレプトコッカス  ニューモニアエの莢膜ポリサッカライドの断片との複合体をさらに含み、ここで、ストレプトコッカス  ニューモニアエは、ストレプトコッカス  ニューモニアエ１型、３型、４型、５型、６Ａ型、６Ｂ型、７Ｆ型、８型、９Ｎ型、９Ｖ型、１０Ａ型、１１Ａ型、１２Ｆ型、１４型、１５Ｂ型、１７Ｆ型、１８Ｃ型、１９Ｆ型、１９Ａ型、２０型、２２Ｆ型、２３Ｆ型、および３３Ｆ型から選択される、
請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
ストレプトコッカス  ニューモニアエ２型に対する抗体の検出のための免疫学的アッセイのマーカーとして使用のための請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載のサッカライド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ストレプトコッカス  ニューモニアエ血清型２莢膜ポリサッカライド、およびその複合体に関する一般式（Ｉ）の合成サッカライド、並びにヒトおよび／または動物宿主において保護免疫応答を上昇させるための前記サッカライドおよび前記複合体の使用、に関する。さらに、一般式（Ｉ）の合成サッカライドは、ストレプトコッカス  ニューモニアエ２型細菌に対する抗体の検出のための免疫学的アッセイのマーカーとして有用である。
【０００２】
［発明の背景］
ストレプトコッカス  ニューモニエアは、肺炎球菌または双球菌として一般的に知られており、莢膜ポリサッカライドでカプセル化されたヒト病原体グラム陽性細菌である。ポリサッカライドカプセルの化学的性質に基づいて、肺炎球菌は、９０個を超える血清型に分類されている。肺炎球菌は、ヒトの上気道において無症候にコロニー形成する共生細菌であり、肺炎、敗血症、髄膜炎、および中耳炎を引き起こす原因となる。肺炎球菌は、５歳未満の子供および世界中の高齢者においてワクチン予防可能な死の最も一般的な原因となる。世界的な見積もりでは、５歳未満の子供の全ての死の１８％は、肺炎球菌が原因である。
莢膜ポリサッカライドは、肺炎球菌病原性の要因である主要な毒性因子の一つである。一般的な血清型は、世界中に一貫して特定されるけれども、流行の莢膜型の範囲は、年、時、および地理学上の地域で変わる。世界的に、約２０個の血清型は、全ての年齢グループにおいて侵襲的な肺炎球菌疾患のうち８０％を超える疾患と関連し、１３個の最も一般的な血清型は、子供の侵襲性疾患の少なくとも７０〜７５％の原因となる。一般に利用可能である肺炎球菌ワクチンは、侵襲的な肺炎球菌疾患と最も頻繁に関連する血清型に基づく、および、包含するように設計される莢膜ポリサッカライドである。
利用可能な２３価のポリサッカライドワクチン（２３−ＰＰＶ）は、２歳未満の子供に効果がなく、一方、７価の複合体ワクチン（７−ＰＣＶ）は、子供に効果的であるが、血清型の範囲は制限される。
【０００３】
血清型の範囲を増大させるために、Ｓ．ニューモニアエ１型、４型、５型、６Ｂ型、７Ｆ型、９Ｖ型、１４型、１８Ｃ型、１９Ｆ型、および２３Ｆ型からの莢膜ポリサッカライド、並びにタンパク質Ｄ（分類不可能なヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質）、破傷風トキソイド、およびジフテリアトキソイドタンパク質の複合体を含む１０価複合体ワクチン、およびＳ．ニューモニアエ１型、３型、４型、５型、６Ａ型、６Ｂ型、７Ｆ型、９Ｖ型、１４型、１８Ｃ型、１９Ａ型、１９Ｆ型、および２３Ｆ型からの莢膜ポリサッカライド、並びにジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質を含む１３価複合体ワクチンは、使用のために認可されている。
【０００４】
一般に利用可能な複合体ワクチンは、２歳未満の子供において非常に効果的であり、これらのワクチンの使用は、深刻な肺炎球菌疾患の重大な減少につながっている。しかしながら、抗生物質耐性の出現および非ワクチン莢膜型との血清型置換は、将来の問題を示し、ワクチンスペクトルにおいて必要とする変更に取り組む必要があり、それらの高い費用は、いくつかの開発途上国において、それらの獲得および利用可能性の両方を減少させる。
【０００５】
国際特許出願ＷＯ２００７１１６０２８Ａ２は、担体タンパク質に複合体化される異なるＳ．ニューモニアエ血清型からの莢膜サッカライドの９価以上のＳ．ニューモニアエ免疫原性組成物を開示し、ここで当該組成物は、複合体化された莢膜サッカライド１８Ｃを含み、複合体化された莢膜サッカライド１８Ｃは、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、または１０％Ｏ−アセチル化される。出願人は、血清型１８Ｃの莢膜サッカライドにおける脱Ｏ−アセチル化は、バックボーンエピトープに対する免疫応答を焦点化するのに有利であってもよく、そのことは、高くＯ−アセチル化された１８Ｃ株および低くＯ−アセチル化された１８Ｃ株の両方に対して免疫応答保護を上昇させることに有利になり得ることを教示する。
【０００６】
国際特許出願ＷＯ２０１４０９７０９９Ａ２は、サッカライドをテトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシドのような安定なニトロキシルラジカルを用いて酸化し、続いて担体タンパク質のアミノ基にカップリングすることによって担体タンパク質に複合体化されるサッカライドを含む複合糖質を調製する方法を開示する。サッカライドは、Ｓ．ニューモニアエ由来の細菌の莢膜ポリサッカライドであることができる。
【０００７】
Ｐｏｚｇａｙは、様々なオリゴサッカライド抗原のタンパク質複合体を開示する（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８，８，ｐ．１２６〜１４０の時事問題（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ））。その中では、Ｓ．ニューモニアエ血清型３、６Ｂ、および１４の複合糖質が記載されている。
【０００８】
Ｊｏｏｓｔｅｎらは、血清型１４における莢膜ポリサッカライドのテトラ−、ペンタ−、およびヘキササッカライド断片の化学的酵素的合成を報告する（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３，３３８，ｐ．２６２９〜２６５１）。直線上中間体は化学合成によって合成され、続いて酵素的ガラトシル化が行われる。
【０００９】
最近の研究では、現在のところ商業的に利用可能なワクチンに含まれない血清型であるＳ．ニューモニアエ２型の血清型がＳＡＡＲＣ（南アジア地域協力連合）において出現している。Ｓ．ニューモニアエ２型は、ネパールにおいて子供の侵襲的な肺炎球菌疾患の４．５４％、バングラディシュにおいて子供の侵襲的な肺炎球菌疾患の８．９％の原因となる（病院ベースの研究）（ＳＡＡＲＣ国に住んでいる子供の血清型の分布、ワクチン範囲、およびストレプトコッカス  ニューモニアエにおける抗菌薬感受性パターン：Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｊａｉｓｗａｌ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ２０１４，９）。肺炎球菌血清型分布の研究に基づく更なる母集団は、Ｓ．ニューモニアエ２型がバングラディシュにおいて最も流行の血清型であり、侵襲的な肺炎球菌疾患の１２．２％の原因となることを証明する（アジアにおける肺炎球菌血清型分布の現在の傾向（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄ  ｉｎ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｓｉａ，Ｌｅ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｖａｃｃｉｎ  ２０１１））。したがって、現在商業化されるワクチンに包含されない血清型であるＳ．ニューモニアエ２型に対して保護するワクチンを提供する高い必要性がある。
【００１０】
本発明の目的は、ストレプトコッカス  ニューモニアエ血清型２莢膜ポリサッカライドに関連する一般式（Ｉ）のサッカライド、および担体タンパク質のような免疫原性担体と一般式（Ｉ）のサッカライドとの複合体を提供することである。一般式（Ｉ）のサッカライド、特に前記サッカライドの免疫原性担体との複合体は、ヒトおよび／または動物宿主においてＳ．ニューモニアエ血清型２に対する保護免疫応答を上昇させることができる。したがって、一般式（Ｉ）のサッカライド、および／または一般式（Ｉ）のサッカライドの複合体を含む、Ｓ．ニューモニアエ２型に対する免疫付与のためのワクチン組成物を提供する。さらに、一般式（Ｉ）の合成サッカライドは、ストレプトコッカス  ニューモニアエ血清型２細菌に対する抗体の検出のための免疫学的アッセイのマーカーとして有用である。
本発明の目的は、独立請求項の教示によって解決される。本発明のさらに有利な特徴、態様、および詳細は、本出願の独立請求項、明細書、図、および実施例から明らかである。
【００１１】
［発明の詳細］
［定義］
本願に使用される用語「リンカー」は、任意に少なくとも一つの相互接続分子に結合することよって、サッカライドの還元末端モノサッカライドを免疫原性担体または固体支持体と接続することが可能である分子断片を含む。したがって、リンカー自体の、または相互接続分子を伴うリンカーの機能は、還元末端モノサッカライドと、免疫原性担体または固体支持体との間の特別な距離を確立、維持、および／または架橋することである。より具体的には、リンカーの一方の末端は、還元末端モノサッカライドのアノマー中心で、環外酸素原子に接続され、他方の末端は、相互接続分子を有する窒素原子を介して、または免疫原性担体と、もしくは固体支持体と直接的に接続される。
【００１２】
本願に使用される用語「相互接続分子」は、官能基Ｘおよび官能基Ｙを含む二官能性分子に関し、ここで官能基Ｘは、リンカーＬの末端アミノ基と反応することが可能であり、官能基Ｙは、免疫原性担体または固体支持体に存在する官能基と反応することが可能である。図１は、市販の相互接続分子の例を示すが、本発明にしたがって使用されることができる相互接続分子を、本願に示される例に制限しない。
【００１３】
本願に使用される用語「アジュバント」は、免疫学的アジュバント、すなわち、アジュバントに関連する抗原性は有さずワクチンに含まれる与えられた抗原に対する免疫応答を高めることによって前記ワクチンの効果を修正し、または増大させるワクチン組成において使用される物質に関する。当業者にとって、アジュバントの古典的に認識される例は、
次を含む：    
−カルシウム塩、およびアルミニウム塩（またはそれらの混合物）を含む、鉱物−含有組成物。カルシウム塩は、リン酸カルシウムを含む。アルミニウム塩は、任意の適切な型（ゲル、結晶、アモルファス、など）を取る塩を伴う水酸化物、リン酸塩、硫酸塩、等を含む。これらの塩への吸着は好まれる。鉱物含有組成物は、金属塩の粒子塩として製剤化されてもよい。水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムのような公知のアジュバントを使用してもよい。本発明は、一般的にアジュバントとして使用されるいくつかの「水酸化」または「リン酸」アジュバントを使用することができる。「水酸化アルミニウム」のような公知のアジュバントは、典型的にオキシ水酸化アルミニウム塩であり、通常、少なくとも部分的に結晶体である。「リン酸アルミニウム」のような公知のアジュバントは、典型的にヒドロキシリン酸アルミニウムであり、しばしば、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）も含む。それらは、沈殿によって得られてもよく、沈殿中の反応条件および濃度は、塩におけるヒドロキシルのリン酸置換の程度に影響を与える。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合を、本発明に係る製剤化において使用することができる。
【００１４】
−サポニン、サポニンは、ステロールグリコシド、およびトリテルペノイドグリコシドの異種グループであり、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、さらに花においてさえも発見される。キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ）  サポナリア（ｓａｐｏｎａｒｉａ）、モリナ（Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮に由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンを、スミラックス  オルナタ（Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ）（サルサプリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、シュッコンカスミソウ（ブライデス  ベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびサボンソウ（ソープルート）から商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント製剤は、ＱＳ２１のような精製製剤、およびＩＳＣＯＭのような脂質製剤を含む。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技術を用いて精製された特定の画分が同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む。サポニン製剤は、コレステロールのようなステロールも含んでもよい。サポニンとコレステロールとの組み合わせを、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特な粒子を形成するために使用することができる。ＩＳＣＯＭは、一般的に、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質を含む。任意の公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭにおいて使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１つ以上を含む。
【００１５】
−微粒子（すなわち、直径１００ｎｍ〜１５０ｐｍの粒子、より好ましくは直径２００ｎｍ〜３０ｐｍの粒子、または直径５００ｎｍ〜１０ｐｍの粒子）は、生体分解性および非毒性である物質から形成された。当該非毒性および生体分解性物質は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシブチル酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンを含むが制限されない。
【００１６】
−例えば、α−グルコシルセラミド、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３’’−スルホ−ガラクトシル−セラミドなど、のようなＣＤ１ｄリガンド、
−例えば、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（グアノシン残基へのリン酸結合により連結される非メチル化シトシン残基を含むジヌクレオチド配列）、またはＣｐＩモチーフを含むオリゴヌクレオチド（イノシンへ連結されるシトシンを含むジヌクレオチド配列）、または二本鎖ＲＮＡ、またはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）を含むオリゴヌクレオチド、などのような免疫刺激性オリゴヌクレオチド。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾体のようなヌクレオチド修飾体／類似体を含むことができ、二本鎖または（ＲＮＡを除く）一本鎖であることができる。
【００１７】
−ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４のような、ホスフェート含有非環式骨格に連結される脂質を含む化合物。
−油エマルジョン（例えば、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）アジュバントなど）。
【００１８】
理論的に、免疫学的事象のカスケードにおいて特定の状態を支持、または増幅し、最終的により顕著な免疫学的応答につながることができる各分子、または物質は、アジュバントとして定義されることができる。
【００１９】
原理上は、ワクチン製剤においてアジュバントの使用を介して、アジュバントは、
−ワクチンに適切な、または望ましい免疫応答を指示、および最適化することができ、
−ワクチンの粘膜輸送、すなわち、頬の、または胃の、または肺上皮のような粘膜表面、および関連するリンパ組織とワクチンの接触の結果起こる投与を可能にし、
−細胞媒介免疫応答を促進することができ、
−例えば高度精製、または組換え体抗原などのような、より弱い抗原の免疫原性を高めることができ、
−防御免疫を提供するために必要な抗原量、または予防接種の頻度を減らすことができ、
−例えば、新生児、高齢者、および免疫不全のワクチン接種者などの免疫応答の減少や弱体化を有する個人におけるワクチンの効果を改善することができる。
【００２０】
アジュバントの作用モードについて少しは知られているが、現在、アジュバントは次のメカニズムの一つによって免疫応答を増大させると信じられる：
−抗原の生物学的または免疫学的半減期を増加させる、
−ＡＰＣによって抗原−アジュバント複合体の摂取後に抗原がエンドソーム膜を横断し細胞質ゾルに入ることを可能にすること等によって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）への抗原輸送、並びに、ＡＰＣによる抗原処理および抗原提示を改善する、
−ストレス細胞、または損傷細胞からの危険誘導シグナルを模倣し、そのことは免疫応答を開始するのに役立つ、
−免疫調節サイトカインの生産を誘導する、
−免疫システムの特定のサブセットへの免疫応答にバイアスをかけ、および
−抗原チャレンジの急速な拡散を阻害する。
【００２１】
サッカライドは、ＴＩ−２（Ｔ細胞非依存性−２）抗原および弱い（ｐｏｏｒ）免疫原として当業者に知られている。したがって、サッカライドベースのワクチンを生産するために、前記サッカライドは、複合体を提供するために免疫原性担体に複合体化されており、複合体は、サッカライドと比較して免疫原性の増加を示す。この文脈において、用語「免疫原性担体」は、構造体として定義され、免疫原性担体は、複合体を形成するためにサッカライドに複合体化され、複合体は、サッカライド自体と比較して免疫原性の増加を示す。したがって、免疫原性担体へのサッカライドの複合体化は、前記免疫原性担体に対する免疫応答を誘導することなく、前記サッカライドに対する免疫応答を刺激する効果を有する。
【００２２】
驚くべきことに、本発明に係る一般式（Ｉ）の純粋なサッカライドは、保護免疫原性のグリカンエピトープを含み、ヒトおよび／または動物宿主においてＳ．ニューモニアエ血清型２細菌に対する保護免疫応答を誘導することができることを明らかにした。一般式（Ｉ）のサッカライドは、Ｓ．ニューモニアエ血清型２莢膜ポリサッカライドと交差反応性である抗体を誘引し（例えば、図５参照）、明確にＳ．ニューモニアエ血清型２細菌を認識し、食細胞によってＳ．ニューモニアエ血清型２細菌を殺すためにオプソニン化する。
【００２３】
したがって、本発明は、一般式（Ｉ）
【００２４】
【化１】
2019504017.tif 000003
（式中、
ｘは、１、２、３、および４から選択される整数であり、
【００２５】
Ｕ１＝Ｕ５＝
【化２】
2019504017.tif 000004
、Ｕ２＝Ｕ６＝
【化３】
2019504017.tif 000005
、
【００２６】
Ｕ３＝Ｕ７＝
【化４】
2019504017.tif 000006
、Ｕ４＝
【化５】
2019504017.tif 000007
であり、
Ｖ＊−は、Ｈ−、Ｈ−Ｕｘ−、Ｈ−Ｕｘ＋１−Ｕｘ−、Ｈ−Ｕｘ＋２−Ｕｘ＋１−Ｕｘ−、またはＨ−Ｕｘ＋３−Ｕｘ＋２−Ｕｘ＋１−Ｕｘ−を表し、
Ｌはリンカーを表す。）
のサッカライド、またはその薬学的に許容できる塩に関する。
【００２７】
−Ｌ−は、リンカーとして定義され、−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２断片の一部分である。したがって、リンカー−Ｌ−は、酸素原子に結合され、ＮＨ２−基の窒素原子に結合される。リンカーの少なくとも二つの炭素原子は、−Ｏ−Ｃ−Ｃ−ＮＨ２のように酸素原子とＮＨ２−基との間にあると好ましい。リンカー−Ｌ−は、脂肪族鎖であることができ、ここで脂肪族鎖は、任意に、脂肪族鎖に挿入される芳香族鎖、または０個〜１０個の振れ幅の多数のヘテロ原子を含む。
【００２８】
リンカーＬは、好ましくは、２個〜４０個の炭素原子（任意の側鎖における炭素原子を含む）、より好ましくは２個〜３０個、より好ましくは２個〜２０個、より好ましくは２個〜１４個、より好ましくは２個〜１２個、さらにより好ましくは２個〜１０個の炭素原子を含む。
【００２９】
酸素原子（すなわち、−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２の酸素）とＮＨ２−基との間の最も短い原子鎖は、好ましくは２個〜１４個の原子、より好ましくは２個〜１２個の原子、より好ましくは２個〜１０個の原子、より好ましくは２個〜８個の原子からなる。最も短い鎖（最も短い鎖は、アノマー中心の酸素とＮＨ２−基との間の最も短い可能な連結である）が２個〜６個の原子からなる場合、これらは、好ましくは、炭素原子である。最も短い鎖が４個〜８個の原子からなる場合、鎖は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される、１個、２個、または３個のヘテロ原子を含んでもよい。最も短い鎖が９個〜１４個の原子からなる場合、主鎖は、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヘテロ原子を含んでもよい。
【００３０】
リンカー−Ｌ−、または最も短い鎖は、完全に、または部分的にフッ素化されても好ましい。リンカー−Ｌ−は、３員、または４員、または５員、または６員の飽和炭素環、または５員の部分的に不飽和の炭素環（芳香族ではない）、または４員、または５員、または６員の飽和酸素ヘテロ環、または４員、または５員、または６員の飽和窒素ヘテロ環、または６員の芳香族炭素環を含んでもよい。
【００３１】
リンカー−Ｌ−は、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−）および／または尿素（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−）残基、好ましくは、一つのアミド残基のみ、または一つのウレア残基のみを含んでもよい。リンカーは、置換基、好ましくはＲ１０およびＲ１１のような２個の置換基、またはＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１５、およびＲ１４のような４個の置換基を含んでもよく、置換基は、本願に定義される通りの意味を有し、好ましくは、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ５Ｈ９、−Ｃ６Ｈ１３、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２、−ＳＣＨ３、−ＳＣ２Ｈ５、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、および−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２、から選択される。
【００３２】
リンカー−Ｌ−がフッ素化されている場合、３個以上の置換基−Ｆが好ましい。
好ましくは、リンカー−Ｌ−は、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）７−、−（ＣＨ２）８−、−（ＣＨ２）９−、−（ＣＨ２）１０−、−ＣＦ２−、−（ＣＦ２）２−、−（ＣＦ２）３−、−（ＣＦ２）４−、−（ＣＦ２）５−、−（ＣＦ２）６−、−（ＣＦ２）７−、−（ＣＦ２）８−、−（ＣＦ２）９−、−（ＣＦ２）１０−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）４−、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｄ−Ｌｃ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−、から選択され、
ここで、
−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＦ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−、−（ＣＲ１０Ｒ１１）ｏ−、
【００３３】
【化６】
2019504017.tif 000008
から選択され、
−Ｌｂ−、および−Ｌｃ−は、互いに独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＮＲ９−、−ＮＲ１８−、−ＳＯ２−、
【００３４】
【化７】
2019504017.tif 000009
から選択され、
−Ｌｄ−は、−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＦ２）ｑ−、−（ＣＲ１２Ｒ１３）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−、
【００３５】
【化８】
2019504017.tif 000010
を表し、
−Ｌｅ−は、−（ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＦ２）ｐ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ２−、−（ＣＲ１４Ｒ１５）ｐ１−、−（ＣＲ１４Ｒ１５）ｐ１−Ｏ−（ＣＲ
２１Ｒ２２）ｐ２−、
【００３６】
【化９】
2019504017.tif 000011
から選択され、
Ｒ９およびＲ１８は、互いに独立して、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、から選択され、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、およびＲ２２は、互いに独立して、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−Ｃ５Ｈ９、−Ｃ６Ｈ１３、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２、−ＳＣＨ３、−ＳＣ２Ｈ５、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、および−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２、から選択され、
ｏ、ｑ、ｐ１、およびｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択される整数である。
【００３７】
本発明のサッカライドは、塩基性および／または酸性置換基を有し、有機酸もしくは有機塩基、または無機酸もしくは無機塩基と共に塩を形成してもよい。
当該酸添加塩の形成に適した酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、マロン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、マレイン酸、スルホン酸、ホスホン酸、過塩素酸、硝酸、ぎ酸、プロピオン酸、グルコン酸、乳酸、酒石酸、ヒドロキシマレイン酸、ピルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、亜硝酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、エチレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフチルスルホン酸、スルファニル酸、カンファースルホン酸、キナ酸、マンデル酸、ｏ−メチルマンデル酸、水素−ベンゼンスルホン酸、ピクリン酸、アジピン酸、ｄ−ｏ−トリル酒石酸、タルトロン酸、（ｏ、ｍ、ｐ）−トルイル酸、ナフ
チルアミンスルホン酸、および当業者によく知られている他の鉱物またはカルボン酸である。塩は、従来の方法で塩を生成するために、遊離塩基型を十分な量の所望の酸と接触させることによって調製される。
【００３８】
適切な無機塩基または有機塩基の例は、例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、リジンやアルギニンなどである。塩は、例えば、一般式（Ｉ）の化合物の溶液を、上述の群から選択される、塩基の溶液と処理することなどによって、当該技術分野でよく知られている方法を用いて従来の方法で調製されてもよい。
【００３９】
一般式（Ｉ）のサッカライドは、サッカライドのアノマー炭素、またはＣ−１炭素を介して互いに連結される、または結合される−Ｏ−Ｏ−結合、およびまたは糖断片（Ｕｘ、Ｕｘ＋１、Ｕｘ＋２、Ｕｘ＋３）を含まないことは、炭水化物化学の当業者にとって明らかである。グリコシド結合の立体化学は、一般式の糖断片におけるアノマー中心に示される立体化学であることも当業者にとって明らかである。したがって、糖断片Ｕ１およびＵ５のアノマー中心の立体化学は、αまたはβであり、糖断片Ｕ２およびＵ６のラムノース残基のアノマー中心の立体化学は、αまたはβであり、糖断片Ｕ３およびＵ７のアノマー中心の立体化学は、βであり、糖断片Ｕ４のアノマー中心の立体化学は、βである。
【００４０】
一般式（Ｉ）のサッカライドは、保護免疫原性エピトープを含み、ヒトおよび／または動物宿主においてＳ．ニューモニアエ血清型２細菌に対する保護免疫応答を誘導することができる。一般式（Ｉ）のサッカライドは、Ｓ．ニューモニアエ血清型８莢膜ポリサッカライドと交差反応する抗体を誘引し（例えば、図５参照）、特異的にＳ．ニューモニアエ血清型２細菌を認識し、食細胞によって殺すためにＳ．ニューモニアエ血清型２細菌をオプソニン化する。さらに、本発明のサッカライドは、純粋に合成される化合物であり、ＧＭＰ調節にしたがって容易に製造されることができるという利点を有する。
【００４１】
したがって、本発明のワクチン組成物は、免疫原性担体、好ましくは担体タンパク質、およびより好ましくはＣＲＭ１９７に結合される一般式（Ｉ）の化合物を最も好ましくは一つだけ含む。したがって、一般式（Ｉ）の化合物は、よく定義され、よく特徴づけられる、合成的に調製された物のみを含む純粋なワクチンの調製に有用であり、並びに免疫原性担体に、好ましくは担体タンパク質に、より好ましくはＣＲＭ１９７に好ましくは連結される、よく特徴づけられるヘキサ−、ヘプタ−、オクタ−、ノナ−、デカ−、ウンデカ−、またはドデカ−サッカライドである。結果的に、本発明のワクチンは、免疫原性担体に、好ましくは担体タンパク質に、より好ましくはＣＲＭ１９７に好ましくは連結される合成的に合成された一般式（Ｉ）の化合物のみを含む。
【００４２】
好ましくは一般式（Ｉ）のサッカライド、および一般式（Ｉ）のサッカライドの薬学的に許容できる塩であり、式中ｘは１を表す。したがって、本願に定義される意味を有するＬおよびＶ＊を伴う一般式（Ｉ−ａ）
【００４３】
【化１０】
2019504017.tif 000012
のサッカライド、またはその薬学的に許容できる塩が特に好ましい。
【００４４】
さらに好ましくは、一般式（Ｉ）のサッカライドおよび一般式（Ｉ）のサッカライドの薬学的に許容できる塩であり、式中、ｘは２、３、または４を表す。したがって、本願に定義される意味を有するＬおよびＶ＊を伴う一般式（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）
【００４５】
【化１１】
2019504017.tif 000013
のサッカライド、またはその薬学的に許容できる塩も好ましい。
【００４６】
Ｕ２＝Ｕ６＝
【化１２】
2019504017.tif 000014
であると好ましい。
したがって、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドが特に好ましく、式中、糖断片Ｕ２およびＵ６は、ラムノース部分のアノマー中心で立体化学βを有する。
【００４７】
Ｕ２＝Ｕ６＝
【化１３】
2019504017.tif 000015
であるとさらに好ましい。
【００４８】
Ｕ１＝Ｕ５＝
【化１４】
2019504017.tif 000016
であるとさらに好ましい。
したがって、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドが特に好ましく、式中、糖断片Ｕ１および／またはＵ５は、当該アノマー中心で立体化学βを有する。
【００４９】
Ｕ１＝Ｕ５＝
【化１５】
2019504017.tif 000017
であるとさらに好ましい。
したがって、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドが特に好ましく、式中、糖断片Ｕ１および／またはＵ５は、当該アノマー中心で立体化学αを有する。
【００５０】
好ましくはＶ＊−はＨ−を表す。したがって、Ｖ＊−はＨ−を表す一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドが特に好ましい。
【００５１】
好ましくは、リンカー−Ｌ−は、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−、から選択され、式中、
−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−、から選択され、
−Ｌｂ−は、−Ｏ−を表し、
−Ｌｄ−は、−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＦ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−Ｃ２Ｈ４−、および−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｅ−は、−（ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＦ２）ｐ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、および−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ２−から選択され、
および、ｏ、ｐ、ｐ１、およびｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、および６から選択される整数である。
【００５２】
したがって、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドであると特に好ましく、式中、
−Ｌ−は、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、および−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−、から選択され、
−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−、から選択され、
−Ｌｂ−は、−Ｏ−を表し、
−Ｌｄ−は、−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＦ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−Ｃ２Ｈ４−、および−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｅ−は、−（ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＦ２）ｐ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、および−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ２−から選択され、
および、ｏ、ｐ、ｐ１、およびｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、および６から選択される整数である。
【００５３】
特に好ましくは、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドであり、式中、
−Ｌ−は、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、および−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−、から選択され、
−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−、から選択され、
−Ｌｂ−は、−Ｏ−を表し、
−Ｌｄ−は、−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＦ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−Ｃ２Ｈ４−、および−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｅ−は、−（ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＦ２）ｐ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、および−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ２−から選択され、
ｏ、ｐ、ｐ１、およびｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、および６から選択される整数であり、およびＶ＊−は、Ｈ−を表す。
【００５４】
−Ｌ−は、−（ＣＨ２）ｏ−を表し、ｏは、２、３、４、５、６、７、および８から選択される整数であると特に好ましい。したがって、特に好ましいサッカライドは、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドであり、式中、−Ｌ−は、−（ＣＨ２）ｏ−を表し、およびｏは、２、３、４、５、６、７、および８から選択される整数である。
【００５５】
さらにより好ましくは、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドであり、式中、−Ｌ−は、−（ＣＨ２）ｏ−を表し、およびｏは、２、３、４、５、６、７、および８から選択される整数であり、Ｖ＊−は、Ｈ−を表す。
【００５６】
好ましくは、本発明のサッカライドは、５−アミノペンチルβ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−｛α−Ｄ−グルコピラノシルウロネート−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）｝ラムノピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノシド、
４−アミノブチルβ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−｛α−Ｄ−グルコピラノシルウロネート−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）｝ラムノピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノシド、
６−アミノへキシルβ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−｛α−Ｄ−グルコピラノシルウロネート−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）｝ラムノピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノシド、
７−アミノへプチルβ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−｛α−Ｄ−グルコピラノシルウロネート−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）｝ラムノピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノシド、
３−アミノプロピルβ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−｛α−Ｄ−グルコピラノシルウロネート−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）｝ラムノピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノシド、
２−（２−アミノエトキシ）エチルβ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−｛α−Ｄ−グルコピラノシルウロネート−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）｝ラムノピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノシド、および
２−アミノエチルβ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−｛α−Ｄ−グルコピラノシルウロネート−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）｝ラムノピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノシド、
から選択される。
［化学合成］
本発明に係る一般式（Ｉ）のサッカライドを、出発物質としてモノサッカライド１＊、２＊、３＊および４＊、並びにアミノ−アルコールリンカー５＊を用いて効率的に集合させることができる（スキーム１）。
【００５７】
【化１６】
2019504017.tif 000018
スキーム１において、Ｐ１、Ｐ６〜Ｐ９、Ｐ１１〜Ｐ１５は、保護基を表し、一方、ＬＧ３〜ＬＧ６は、脱離基または一時的な保護基を表す。
【００５８】
本願に使用される用語「保護基」は、アミノ基およびヒドロキシル基の保護のために有機合成において一般的に使用される基に関する。適切なヒドロキシル保護基は、アセチル、ベンジル、ベンゾイル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ブロモベンジル、ｐ−ニトロフェニル、アリル、イソプロピル、レブリノイル、ジメトキシトリチル、トリチル、２−ナフチルメチル、ピバロイル、トリイソプロピルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルメトキシフェニルシリル、トリエチルシリル、トリメチルシリル、２−トリメチルシリルエトキシメチル、ピコリル、９−フルオレニルメトキシカルボニルを含むが制限されない。
【００５９】
適切なアミノ保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル；トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、アセチル、またはベンゾイルのようなカルボニル；およびベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ブロモベンジル、ｐ−ニトロフェニル、または２−ナフチルメチルのような芳香族アルキル、を含むが制限されない。
【００６０】
保護基は、「永続する保護基」および「一時的な保護基」に区別されることができる。永続する保護基は、全合成の間安定であり、合成の後期の段階で効率的に除去されることができる保護基である。一時的な保護基は、モノサッカライドを含む異なる置換基の続く導入のためにヒドロキシル基をフリーにするために合成の異なる段階で選択的に除去されることができる一般的にオルソゴナル保護基であり、他の保護基、または他の残基は分子上に存在する。
【００６１】
保護基の独創的な選択は、免疫原性担体または固体支持体への連続的な複合体化のためにアミノ基を用いて官能基化された一般的（Ｉ）のサッカライドのライブラリーへの好都合なアクセスを可能にする。
【００６２】
一般式（Ｉ）のサッカライドを便宜上集合させるために、保護基Ｐ１、Ｐ２、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、およびＰ９は、永続する保護基であり、保護基Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４、およびＰ１５は、一時的な保護基を表し、および保護基Ｐ１１は、永続する保護基または一時的に永続する基のどちからである。
【００６３】
Ｐ１、Ｐ６、Ｐ７、およびＰ９はベンジル基であり、Ｐ２はアセチルまたはベンゾイル基であり、Ｐ８はベンジルオキシカルボニルであり、Ｐ１１はレブリノイル基またはベンゾイル基であり、Ｐ１２は、Ｐ１１およびＰ６に対してオルソゴナルな任意のヒドロキシル保護基であり、Ｐ１３は、Ｐ１に対してオルソゴナルな任意のヒドロキシル保護基であり、Ｐ１４は、Ｐ１に対してオルソゴナルな任意のヒドロキシル保護基であり、およびＰ１５は、Ｐ９に対してオルソゴナルな任意のヒドロキシル保護基であると特に有利である。したがって、一般式（Ｉ）のサッカライドは、モノサッカライド１＊−ａ、１＊−ｂ、２＊−ａ、３＊−ａ、３＊−ｂ、４＊−ａおよびアミノアルコールリンカー５＊−ａから出発して有利に合成されることができ、ここでＰ１２は、Ｐ１１およびベンジルに対してオルソゴナルな任意のアルコール保護基であり、Ｐ１３は、ベンジルに対してオルソゴナルな任意のアルコール保護基であり、Ｐ１４は、ベンジルおよびＰ２に対してオルソゴナルな任意のアルコール保護基であり、およびＰ１５は、ベンジルに対してオルソゴナルな任意のアルコール保護基である（スキーム２参照）。
【００６４】
【化１７】
2019504017.tif 000019
ＬＧ３〜ＬＧ６は、ハロゲン化物、チオエーテル、イミデート、アセテート、およびホスフェート、またはＯＰ１６を含む脱離基を表し、ここでＰ１６は、ｐ−メトキシフェニル、トリエチルシリル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、ｔｈｅｘｙジメチルシリル、およびトリメチルシリルエチル（Ｍｅ３ＳｉＣＨ２ＣＨ２）のような分子上の他の保護基に対してオルソゴナルである一時的な保護基である。
【００６５】
したがって、構成ブロック１＊、２＊、３＊、４＊および５＊、しかし、好ましくは、構成ブロック１＊−ａ、１＊−ｂ、２＊−ａ、３＊−ａ、３＊−ｂ、４＊−ａ、および５＊−ａから出発して、一般式（Ｉ）の任意のサッカライドを、線形合成によって、またはモジュール合成によって、グリコシル化、脱保護、および／または保護基転換反応を介して合成することができる。
【００６６】
本発明に係る他の態様は、一般式（Ｉ）
【００６７】
【化１８】
2019504017.tif 000020
（式中、
【００６８】
Ｕ１＝
【化１９】
2019504017.tif 000021
、Ｕ２＝
【化２０】
2019504017.tif 000022
、
【００６９】
Ｕ３＝
【化２１】
2019504017.tif 000023
、Ｕ４＝
【化２２】
2019504017.tif 000024
、
Ｖ＊−は、Ｈ−を表し、ｘは１を表し、およびリンカーＬは本願に定義される意味を有する。）のサッカライドの合成方法に関し、次のステップ
Ａ）一般式（ＩＶ）
【００７０】
【化２３】
2019504017.tif 000025
（式中、Ｐ１〜Ｐ８は保護基を表す。）
のテトラサッカライドを得るために、
一般式（ＩＩ）
【００７１】
【化２４】
2019504017.tif 000026
（式中、Ｐ１〜Ｐ３は保護基を表し、およびＬＧ１は脱離基を表す。）
のジサッカライドを、
一般式（ＩＩＩ）
【００７２】
【化２５】
2019504017.tif 000027
（式中、Ｐ４〜Ｐ８は保護基を表し、およびＬは本願に定義される意味を有する。）
のジサッカライドと反応させること、
および、
Ｂ）一般式（Ｖ）
【００７３】
【化２６】
2019504017.tif 000028
（式中、Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ６〜Ｐ８は保護基を表し、およびＬは本願に定義される意味を有する。）
の化合物を得るために、一般式（ＩＶ）のテトラサッカライドの選択的脱保護を行うこと、
および
Ｃ）一般式（ＶＩＩ）
【００７４】
【化２７】
2019504017.tif 000029
（式中、Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ６〜Ｐ１０は保護基を表し、およびＬは本願に定義される意味を有する。）
のヘキササッカライドを得るために、
一般式（Ｖ）のジサッカライドを、一般式（ＶＩ）
【００７５】
【化２８】
2019504017.tif 000030
（式中、Ｐ９およびＰ１０は保護基を表し、およびＬＧ２は脱離基を表す。）
の化合物と反応させること、
および、
Ｄ）一般式（ＶＩＩ）の化合物における保護基Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ６〜Ｐ１０の保護基の除去を行うこと、
を含む。
【００７６】
本発明の方法において試薬として使用される一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＶＩ）のジサッカライドを、構成ブロック１＊、２＊、３＊、４＊および５＊から、しかし、好ましくは、構成ブロック１＊−ａ、１＊−ｂ、２＊−ａ、３＊−ａ、３＊−ｂ、４＊−ａ、および５＊−ａから組み立てることができる。例えば、一般式（ＩＩ）のジサッカライドを、モノサッカライド２＊および３＊から出発して、および好ましくは、モノサッカライド２＊ａおよび３＊ａ、または３＊ｂから出発して合成することができ、一般式（ＩＩＩ）のジサッカライドは、モノサッカライド１＊およびアミノ−アルコール５＊から出発して、しかし好ましくは、モノサッカライド１＊ａおよび／または１＊ｂ並びにアミノ−アルコール５＊ａから出発して合成することができる。
【００７７】
Ｐ１〜Ｐ１０は、アミノ基、ヒドロキシル基、およびカルボン酸基のための保護基を表し、一方ＬＧ１およびＬＧ２は脱離基を表す。
適切なヒドロキシル保護基は、アセチル、ベンジル、ベンゾイル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ブロモベンジル、ｐ−ニトロフェニル、アリル、イソプロピル、レブリニル、ジメトキシトリチル、トリチル、２−ナフチルメチル、ピバロイル、トリイソプロピルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルメトキシフェニルシリル、トリエチルシリル、トリメチルシリル、２−トリメチルシリルエトキシメチル、ピコロイル、９−フルオレニルメトキシカルボニルを含むが制限されない。
【００７８】
適切なアミノ保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）；トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、アセチル、またはベンゾイルのようなカルボニル；およびベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ブロモベンジル、ｐ−ニトロフェニル、または２−ナフチルメチルのような芳香族アルキル、を含むが制限されない。
【００７９】
カルボン酸は、メチルエステル、エチルエステル、アリルエステル、イソプロピルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、フェニルエステル、ベンジルエステル、またはｐ−メトキシベンジルエステルとして保護されることができる。したがって、保護基Ｐ１０は、メチル、エチル、アリル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、フェニル、ベンジル、またはｐ−メトキシベンジルであることができる。
【００８０】
適切な脱離基は、ハロゲン化物、チオエーテル、イミデート、アセテート、およびホスフェートを含む。
高い反応収率を得るために、および合成を促進するために、保護基Ｐ１、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ９は、ベンジル基を表し、Ｐ８は、ベンジルオキシカルボニル基であり、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、互いに独立して、アセチル基またはベンゾイル基を表し、およびＰ５は、保護基Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ６〜Ｐ１０に対してオルソゴナルな任意のヒドロキシル保護基である、と有利である。保護基Ｐ５はレブリノイルであるとさらに好ましい。
【００８１】
脱離基ＬＧ１およびＬＧ２は、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、−ＳＰｈ、−ＯＰＯ３Ｂｕ２、
【００８２】
【化２９】
2019504017.tif 000031
から選択されると好ましい。
【００８３】
脱離基ＬＧ１は、
【００８４】
【化３０】
2019504017.tif 000032
から選択されると特に好ましい。
【００８５】
当該場合において、非極性溶媒中でイミデート活性化剤の存在下でステップＡを行うことは有利である。好ましい非極性溶媒は、トルエン、および例えばクロロホルムおよび塩化メチレンのようなハロゲン化溶媒である。イミデート活性化剤は、シリルトリフレートまたは銀トリフレートのようなルイス酸である。シリルトリフレートの例は、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルトリフルオロメタンスルホネート、トリイソプロピルトリフルオロメタンスルホネートを含むが制限されない。好ましくは、一般式（ＩＩ）のジサッカライドを、一般式（ＩＩＩ）のジサッカライドと約−６０℃〜０℃で、より好ましくは約−４０度〜約０℃で反応させる。
【００８６】
脱離基ＬＧ２は、−ＳＣＨ３、−ＳＣＨ２ＣＨ３、
【００８７】
【化３１】
2019504017.tif 000033
から選択されるとさらに好ましい。
【００８８】
当該場合において、極性非プロトン性溶媒と非極性溶媒との混合物中でチオエーテル活性化剤の存在下においてステップＣを行うと有利である。チオエーテル
活性化剤は、ＮＩＳ／ＴｆＯＨ、ＮＩＳ／ＴＭＳＯＴｆ、ＮＩＳ／ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ、ＮＩＳ／ＡｇＯＴｆ、ＤＭＴＳＴ／ＴＦ２Ｏ、ＩＤＰＣ、ＢＳＰ／Ｔｆ２Ｏ、Ｐｈ２ＳＯ／Ｔｆ２Ｏを含むが制限されない。好ましい極性非プロトン性溶媒は、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、および１，４−ジオキサンである。好ましい非極性溶媒は、トルエン、および例えばクロロホルムおよび塩化メチレンのようなハロゲン化溶媒である。非極性非プロトン性溶媒と極性非プロトン性溶媒との好ましい混合物は、塩化メチレン／１，４−ジオキサン、塩化メチレン／テトラヒドロフラン、塩化メチレン／ジエチルエーテル、トルエン／ジエチルエーテル、トルエン／テトラヒドロフランである。好ましくは、一般式（Ｖ）のテトラサッカライドを、一般式（ＶＩ）のジサッカライドと約−６０℃〜３０℃で、より好ましくは約−４５度〜約１５℃で、さらにより好ましくは−３０℃〜約０℃で反応させる。
【００８９】
一般式（ＶＩＩ）の化合物における保護基Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ６〜Ｐ１０の除去は、極性非プロトン性溶媒と極性プロトン性溶媒との混合物中で塩基と処理することによって塩基−不安定性基の第一の除去、および水素化に敏感な保護基の第二の切断を含む。第一のステップのために適切な非プロトン性溶媒は、テトラヒドロフラン、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、およびＮ，Ｎ−ジメチルスルホキシドを含み、それらは水、および例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、またはｔｅｒｔ−ブタノールを含むアルコールのような適切なプロトン性溶媒と混合される。
【００９０】
保護基の塩基性切断は、０℃〜室温を含む温度で好ましくは行われる。第一のステップを行うための適切な塩基は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、およびナトリウムメトキシドを含む。水素化に敏感な保護基の切断は、水素化触媒の存在下で、極性プロトン性溶媒と極性非プロトン性溶媒との混合物中、室温で水素に曝露することによって行われる。
［中間体］
本発明の他の態様は、一般式（Ｖ）
【００９１】
【化３２】
2019504017.tif 000034
の中間体に関し、
式中、Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ６〜Ｐ８は、保護基を表し、およびＬは本願に定義される意味を有する。Ｐ１〜Ｐ４、Ｐ５およびＰ６は、ヒドロキシル保護基であり、一方Ｐ７およびＰ８は、アミノ保護基である。
【００９２】
ヒドロキシル基のための適切な保護基は、アセチル、ベンジル、ベンゾイル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ブロモベンジル、ｐ−ニトロフェニル、アリル、イソプロピル、レブリニル、ジメトキシトリチル、トリチル、２−ナフチルメチル、ピバロイル、トリイソプロピルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルメトキシフェニルシリル、トリエチルシリル、トリメチルシリル、２−トリメチルシリルエトキシメチル、ピコロイル、９−フルオレニルメトキシカルボニルを含むが制限されない。
【００９３】
アミノ基のための適切な保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル；トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、アセチル、またはベンゾイルのようなカルボニル；およびベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ブロモベンジル、ｐ−ニトロフェニル、または２−ナフチルメチルのような芳香族アルキル、を含むが制限されない。
【００９４】
好ましくは、一般式（Ｖ）の中間体であり、式中Ｐ１、Ｐ６、およびＰ７はベンジル基を表し、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４は、互いに独立して、ベンゾイル基およびアセチル基から選択され、およびＰ８は、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）基を表す。当該中間体は、一般式（ＶＩＩ）のヘキササッカライドを提供するために一般式（ＶＩ）のジサッカライドと効率的に結合することができる。
［複合体］
本発明の他の態様は、−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して免疫原性担体に共有結合される（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｂｏｕｎｄ）、または共有結合される（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）一般式（Ｉ）の合成サッカライドを含む複合体に関する。言い換えると、本発明の他の態様は、−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して免疫原性担体と複合体化される一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のいずれかのサッカライドに関する。−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して免疫原性担体に共有結合される（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｂｏｕｎｄ）、または共有結合される（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）の合成サッカライドを含む本発明の複合体は、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のいずれかのサッカライドを、免疫原性担体と反応させることによって得られる複合体としても定義される。前記複合体は、ストレプトコッカス  ニューモニアエ血清型２細菌と関連する疾患に対する免疫付与のためのワクチンとして効果的であることが証明された。
【００９５】
サッカライドは、一般的にＴＩ−２（Ｔ細胞非依存性−２）抗原および低い免疫原として当業者に知られている。ＴＩ−２抗原は、表面曝露された免疫グロブリン受容体へのクロスリンクを介して成熟Ｂ細胞によってのみ認識される抗原である。Ｔ細胞ヘルプなしで、免疫記憶は生じず、ＩｇＭから他のＩｇＧサブクラスに同型転換することも、またはＢ細胞親和性成熟することも起こらない。さらに、サッカライドは、ヒト糖脂質およびヒト糖タンパク質に対する構造的相同性のために、ヒトにおいて低い免疫原として知られている。サッカライドの低い免疫原性特性のために、サッカライドは、強力なワクチン生産のために必須な
特徴であるＢ細胞による抗体生産、および記憶細胞の形成の両方を生産する能力が低いことが明らかである。
【００９６】
したがって、強力なサッカライドに基づくワクチンを生産するために、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドは、サッカライドと比較して免疫原性の増加を示す複合体を提供するために免疫原性担体に複合体化される。
【００９７】
前記複合体は、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）の少なくとも一つの合成サッカライドおよび免疫原性担体からなり、少なくとも一つの一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドは、免疫原性担体に共有結合される。
【００９８】
驚くべきことに、本発明に係る複合体を用いての免疫付与は、本発明に係るサッカライドの炭水化物部分に対して特異的な高い抗体価の産生をもたらすことが明らかになった。前記抗体は、天然のＳ．ニューモニアエ血清型２莢膜ポリサッカライドと交差反応し、オプソニン貪食作用および殺菌活性を示すので、Ｓ．ニューモニアエ血清型２細菌に対する保護を付与する。
【００９９】
この文脈において、用語「免疫原性担体」は、構造体として定義され、免疫原性担体は、サッカライド自体と比較して免疫原性の増加を示す複合体を形成するためにサッカライドに複合体化される。したがって、免疫原性担体への一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドの複合体化は、前記免疫原性担体に対する免疫応答を誘導することなく、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、または（Ｉ−ｄ）のサッカライドに対する免疫応答を刺激する効果を有する。
【０１００】
好ましい免疫原性担体は、免疫調節特性を有する担体タンパク質、または担体スフィンゴ糖脂質ある。当業者にとって、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド、変異ジフテリアトキソイド、修飾ジフテリアトキソイド、変異および修飾ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、修飾破傷風トキソイド、変異破傷風トキソイド、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホール  リンペット  ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）（ＫＬＨ）、コレラトキソイド（ＣＴ）、およびタンパク質Ｄ（分類不可能なヘモフィルス  インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質）を含む、またはからなる群から選択されるタンパク質である。
【０１０１】
本願に使用される用語「トキソイド」は、細菌毒素（通常、外毒素）に関し、細菌の毒性は、化学的(ホルマリン)または熱処理によって活性化されていない、または抑制されており、一方、他の特性、一般的に免疫原性は維持される。本願に使用される変異トキソイドは、組換え体細菌毒素であり、変異トキソイドは、野生型アミノ酸配列を修飾することによってより少ない毒性、または非毒性であるように修飾されている。当該変異は、一つ以上のアミノ酸の置換が可能である。当該変異トキソイドは、修飾されたトキソイドを提供するために、相互接続分子の官能基Ｙと反応することができる官能基を当該表面に示す。前記官能基は、当業者に公知であり、還元剤の存在下で、活性エステル、イソシアネート基、またはアルデヒドと反応することができるリジン残基の第一級アミノ官能基、カルボジイミドにより活性化され得るグルタミン酸又はアスパラギン酸の残基のカルボキシレート官能基、又は、システイン残基のチオール官能基を含むが制限されない。
【０１０２】
活性化エステルは、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル−３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルアジペート（ＤＳＡ）、２−ピリジルジチオール−テトラオキサテトラデカン−Ｎ−ヒドロキシスクインイミド（ＰＥＧ−４−ＳＰＤＰ）、ビス−（４−ニトロフェニル）アジペート、およびビス−（４−ニトロフェニル）スクシネートを含むが制限されない（図１参照）。好ましい活性化エステルは、ジスクシンイミジルアジペート（ＤＳＡ）、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ビス−（４−ニトロフェニル）アジペート、およびビス−（４−ニトロフェニル）スクシネートである。
【０１０３】
担体タンパク質におけるシステイン残基を、対応するデヒドロアラニンに変換することができ、担体タンパク質の表面上に相互連結分子の官能基Ｘを有する修飾担体タンパク質を提供するために、適切な相互連結分子とさらに反応させることができる。
【０１０４】
本願に記述される本発明のサッカライドは、リジン残基の第一級アミン官能基を官能基として提示する非毒性変異ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７に複合体化されると特に好ましい。
【０１０５】
野生型ジフテリア毒素のようなＣＲＭ１９７は、ジスルフィド結合によって連結される２つのサブユニットからなる５３５アミノ酸の単一ポリペプチド鎖（５８ｋＤ）であり、グリシンをグルタミン酸へと単一アミノ酸置換を有する。ＣＲＭ１９７は、プレベナー（Ｐｒｅｖｎａｒ）などのような疾患のための数多くの承認された複合体ワクチンにおいて、担体タンパク質として利用される。
【０１０６】
したがって、本発明の好ましい実施形態において、担体タンパク質は、当該表面に相互連結分子の前記官能基Ｘを有する修飾担体タンパク質を提供するために、相互連結分子の官能基Ｙと反応することができるリジン残基の第一級アミノ官能基を当該表面に提示し、担体タンパク質は、本発明のサッカライドを官能基化するリンカーの末端アミノ基と反応することもできる。
【０１０７】
相互連結分子の前記官能基Ｘは、マレイミド、α−ヨードアセチル、α−ブロモアセチル、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）、アルデヒド、イミドエステル、カルボン酸、アルキルスルホネート、塩化スルホニル、エポキシド、無水物、カルボネートを含む、またはからなる群から選択される（図２参照）。
【０１０８】
好ましくは、一般式（Ｘ）
【０１０９】
【化３３】
2019504017.tif 000035
の複合体であり、
式中、ｍは約２〜約１８を含み、
−Ｗ−は、
【０１１０】
【化３４】
2019504017.tif 000036
から選択され、
ａは、１〜１０の整数を表し、
ｂは、１〜４の整数を表し、
Ｖ＊、Ｕｘ＋３、Ｕｘ＋２、ＵＸ＋１、Ｕｘ、およびＬは、本願に定義される意味を有する。
【０１１１】
当業者に公知なように、構造Ｘにおける「ｍ」は、対照としてＣＲＭ１９７タンパク質の平均分子量を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法によって決定されるＣＲＭ１９７タンパク質単位あたりのサッカライド単位の平均負荷に一致する（例えば、図４参照）。本発明に係るサッカライドのＣＲＭ１９７担体タンパク質への結合のための反応条件を変えることによって、約２〜約１８を含むｍを有する構造Ｘの任意の複合体を得ることができる。
【０１１２】
好ましくは、リンカー−Ｌ−は、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、および−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−、から選択され、
−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−、から選択され、
−Ｌｂ−は、−Ｏ−を表し、
−Ｌｄ−は、−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＦ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−Ｃ２Ｈ４−、および−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｅ−は、−（ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＦ２）ｐ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、および−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ２−から選択され、
および、ｏ、ｐ、ｐ１、およびｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、および６から選択される整数である。
【０１１３】
−Ｗ−は、
【０１１４】
【化３５】
2019504017.tif 000037
を表すとさらに好ましく、およびａは２、３、４、５、および６から選択される整数であると特に好ましい。
【０１１５】
したがって、一般式（Ｘ）の複合体は、式中、
リンカー−Ｌ−は、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、および−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−、から選択され、
−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−、から選択され、
−Ｌｂ−は、−Ｏ−を表し、
−Ｌｄ−は、−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＦ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−Ｃ２Ｈ４−、および−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｅ−は、−（ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＦ２）ｐ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、および−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ２−から選択され、
ｏ、ｐ、ｐ１、およびｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、および６から選択される整数であり、
−Ｗ−は、
【０１１６】
【化３６】
2019504017.tif 000038
を表し、およびａは２、３、４、５、および６から選択される整数であると特に好ましい。
【０１１７】
さらにより好ましくは、一般式（Ｘ）の複合体であり、式中ｘは１を表す。
したがって、一般式（ＸＩ）
【０１１８】
【化３７】
2019504017.tif 000039
の複合体であり、
式中、ｍは約２〜約１８を含み、
−Ｗ−は、
【０１１９】
【化３８】
2019504017.tif 000040
から選択され、
ａは１〜１０の整数を表し、
ｂは、１〜４の整数を表し、
Ｖ＊−は、Ｈ−、Ｈ−Ｕ１−、Ｈ−Ｕ２−Ｕ１−、Ｈ−Ｕ３−Ｕ２−Ｕ１−、またはＨ−Ｕ４−Ｕ３−Ｕ２−Ｕ１−を表し、およびＬは、本願に定義される意味を有する。
【０１２０】
好ましくは、一般式（ＸＩ）において、リンカー−Ｌ−は、−Ｌａ−、−Ｌａ−Ｌｅ−、−Ｌａ−Ｌｂ−Ｌｅ−、および−Ｌａ−Ｌｄ−Ｌｅ−、から選択され、
−Ｌａ−は、−（ＣＨ２）ｏ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｏ−ＣＨ２−、から選択され、
−Ｌｂ−は、−Ｏ−を表し、
−Ｌｄ−は、−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＦ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−Ｃ２Ｈ４−、および−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−から選択され、
−Ｌｅ−は、−（ＣＨ２）ｐ１−、−（ＣＦ２）ｐ１−、−Ｃ２Ｈ４−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ１−、および−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ２−から選択され、
ｏ、ｐ、ｐ１、およびｐ２は、互いに独立して、１、２、３、４、５、および６から選択される整数であり、
−Ｗ−は、
【０１２１】
【化３９】
2019504017.tif 000041
を表し、およびａは２、３、４、５、および６から選択される整数である。
【０１２２】
特に好ましくは、一般式（Ｘ）または（ＸＩ）の複合体であり、式中、リンカー−Ｌ−は、−（ＣＨ２）ｏ−を表し、
ｏは、２、３、４、５、６、７、および８から選択される整数であり、
−Ｗ−は、
【０１２３】
【化４０】
2019504017.tif 000042
を表し、およびａは２、３、４、５、および６から選択される整数である。
【０１２４】
一般式（Ｘ）および（ＸＩ）においてＶ＊−はＨ−を表すとさらに好ましい。したがって、特に好ましくは、一般式（Ｘ）または（ＸＩ）の複合体であり、式中、Ｖ＊−はＨ−を表し、リンカーＬ−は−（ＣＨ２）ｏ−を表し、
ｏは、２、３、４、５、６、７、および８から選択される整数であり、
−Ｗ−は、
【０１２５】
【化４１】
2019504017.tif 000043
を表し、およびａは２、３、４、５、および６から選択される整数である。
【０１２６】
好ましくは、ｍは約２〜約１８、より好ましくは、約５〜約１５、さらにより好ましくは約８〜約１２を含む。
他の実施形態において、前記免疫原性担体は、免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質であると好ましく、より好ましくは、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−ヘキサコサノイルアミノオクタデカン−３，４−ジオールである。本願に使用される用語、免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質は、標的抗原に対して免疫システム応答を刺激することが可能な適切なスフィンゴ糖脂質に関するが、スフィンゴ糖脂質自体において上記に定義されるような免疫を付与しない。
【０１２７】
本願に使用されるスフィンゴ糖脂質は、スフィンゴ脂質にα−連結される炭水化物部分を含む化合物である。好ましくは、炭水化物部分は、ヘキソピラノースであり、最も好ましくは、α−Ｄ−ガラクトピラノースである。当業者にとって、スフィンゴ脂質は、脂肪酸に対してアミド結合を介して連結されるＣ１８アミノアルコールを含む脂質のクラスである。Ｃ１８アミノアルコールは、ヒドロキシル基を用いて好ましくは、モノ−、ジ−、またはポリ置換される。特に好ましくは、Ｃ１８アミノアルコールは、フィトスフィンゴシンである。脂肪酸は、好ましくは、１６個〜２８個、より好ましくは、１８個〜２６個の炭素数の飽和アルキル鎖を有するモノカルボン酸である。免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質は、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−ヘキ
サコサノイルアミノオクタデカン−３，４−ジオールを含むが制限されず、ナチュラルキラー（ＮＫ）活性、およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞によるサイトカイン産生を刺激することができ、インビボにおいて強力な抗腫瘍活性を示す（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，５６９０）。
【０１２８】
免疫調節特性を有し、スフィンゴ糖脂質を有する本発明のサッカライドの複合体は、熱安定性であるという利点を有する。適切な複合体であるために、免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質において官能基が導入される。前記官能基は、サッカライドの複合体を提供するために、本発明におけるリンカーの末端アミノ基と、または免疫調節特性を有する修飾スフィンゴ糖脂質を提供するために、相互連結分子の官能基Ｙと、直接反応する傾向がある。
【０１２９】
好ましくは、前記官能基は、免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質の炭水化物部分のＣ６に導入される。したがって、免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質は、官能基を用いて官能基化され、サッカライドの末端アミノ基と、または相互連結分子の官能基Ｙと反応する傾向がある。アミノ基と反応する傾向がある官能基は、活性化エステル、イソシアネート基、アルデヒド、エポキシド、イミドエステル、カルボン酸、アルキルスルホネート、および塩化スルホニルを含むが制限されない。相互連結分子の官能基Ｙと反応する傾向がある官能基は、相互連結分子の官能基Ｘを提示する免疫調節特性を有する修飾スフィンゴ糖脂質を提供することになり、アミン、アルコール、チオール、活性化エステル、イソシアネート基、アルデヒド、エポキシド、ビニル、イミドエステル、カルボン酸、アルキルスルホネート、塩化スルホニル、ビニル基、アルキニル基、およびアジド基を含むが制限されない。
【０１３０】
好ましくは、免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質における炭水化物部分のＣ６位に導入される官能基は、アミン、チオール、アルコール、カルボン酸、ビニル、マレイミド、α−ヨードアセチル、α−ブロモアセチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）、２−ピリジルジチオールを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、または含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）群から選択される。
【０１３１】
相互連結分子の前記官能基Ｘは、マレイミド、α−ヨードアセチル、α−ブロモアセチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）、アルデヒド、カルボン酸、エポキシド、アルキルスルホネート、塩化スルホニル、無水物、カルボネートを含む、またはからなる群から選択される。
【０１３２】
好ましくは、ジ（Ｎ−スクシンイミジル）アジペート、またはビス（４−ニトロフェニル）アジペートは、第一級アミノ基を有する合成サッカライドと最初に反応する。活性化サッカライドは、続いてスフィンゴ糖脂質と縮合し、複合体を提供するために、末端アミノ官能基を有する相互連結分子によってＣ−６位で修飾される。
【０１３３】
本願に使用される用語「相互連結分子」は、官能基Ｘおよび官能基Ｙを含む二官能性分子に関し、ここで、官能基Ｘは、リンカー−Ｌ−の末端アミノ基と反応することができ、官能基Ｙは、免疫原性担体に、または固体支持体に存在する官能基と反応することができる。
【０１３４】
−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して免疫原性担体に共有結合された（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｂｏｕｎｄ）、または共有結合された（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、および（Ｉ−ｄ）のサッカライド、または言い換えると、一般式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｃ）、および（Ｉ−ｄ）のサッカライドを免疫原性担体と反応させることによって得られる複合体、特に、一般式（Ｘ）、および（ＸＩ）の複合体は、ヒトおよび／または動物宿主において保護免疫応答を誘引するので、Ｓ．ニューモニアエ血清型２によって引き起こされる病気の予防および／または治療に有用であることが明らかになった。
【０１３５】
当該病気は、肺炎、髄膜炎、中耳炎、菌血症、並びに慢性気管支炎、副鼻腔炎、関節炎、および結膜炎の急性悪化を含む。
［ワクチン組成物］
本発明の他の態様は、本発明に係る少なくとも一つの合成サッカライドおよび／もしくは合成サッカライドの薬学的に許容できる塩を含むワクチン組成物に、並びに／または少なくとも一つの薬学的に許容できるアジュバントおよび／もしくは賦形剤と共に−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して、免疫原性担体に、好ましくはＣＲＭ１９７担体タンパク質に共有結合される本発明に係るサッカライドを含む複合体に、関する。
【０１３６】
好ましい実施形態において、前記ワクチン組成物は、少なくとも一つのストレプトコッカス  ニューモニアエの莢膜ポリサッカライド並びに／またはストレプトコッカス  ニューモニアエの莢膜ポリサッカライドの断片並びに／または担体タンパク質とストレプトコッカス  ニューモニアエの莢膜ポリサッカライドとの複合体、もしくは担体タンパク質とストレプトコッカス  ニューモニアエの莢膜ポリサッカライドの断片との複合体をさらに含み、ここで、ストレプトコッカス  ニューモニアエは、ストレプトコッカス  ニューモニアエを含む群から選択され、ここでストレプトコッカス  ニューモニアエは、ストレプトコッカス  ニューモニアエ型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ、好ましくは、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ、より好ましくは血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆを含む、またはからなる群から選択される。当該ワクチン組成物は、Ｓ．      ニューモニアエ２型に対して、および特定の人々に特異的な他の血清型に対して同時保護を提供するので特に有利である。
【０１３７】
本願に使用される用語「アジュバント」は、免疫学的アジュバント、すなわち、ワクチン組成において使用される物質に関し、アジュバントに関連する抗原性ではなく、ワクチンに含まれる与えられた抗原に対する免疫応答を高めることによって前記ワクチンの効果を修飾、または増加させる。当業者にとって、免疫学的アジュバントの古典的に認識される例は、油性エマルジョン（例えば、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）アジュバント、、サポニン、アルミニウムまたはカルシウム塩（例えば、アルム（ａｒｍ）など）、非イオン性ブロックポリマー界面活性剤、および他多数を含むが制限されない。
【０１３８】
ワクチン組成物は、好ましくは、特に投与の時点では水性形であるが、非水性液体形で、または例えば、ゼラチンカプセルのような、または凍結乾燥物などのような乾燥形で存在することもできる。
【０１３９】
ワクチン組成物は、例えば、チオメルサール、または２−フェノキシエタノールなどのような一つ以上の防腐剤を含んでもよい。水銀を使わない組成物が好ましく、防腐剤を使わないワクチンを調製することができる。
【０１４０】
ワクチン組成物は、緊張性を制御するために、例えばナトリウム塩などのような生理学的塩を含んでもよい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が典型的であり、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在してもよい他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを含む。
【０１４１】
ワクチン組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有することができる。
ワクチン組成物は、ただの水（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．など）中の化合物（不溶性の金属塩の有無にかかわらず）を含んでもよいが、通常１つ以上のバッファーを含むだろう。典型的なバッファーは、リン酸バッファー、トリスバッファー、ホウ酸バッファー、コハク酸バッファー、ヒスチジンバッファー（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを用いる）、またはクエン酸バッファー、を含む。バッファー塩は、５〜２０ｍＭ範囲で典型的に含まれるだろう。
【０１４２】
ワクチン組成物は、典型的に、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０などのｐＨ５．０〜ｐＨ９．５を有する。
ワクチン組成物は、好ましくは、滅菌しており、グルテンを用いていない。
【０１４３】
ワクチン組成物は、動物（および、特に、ヒト）患者に対する投与に適しているので、人用および獣医用を含む。ワクチン組成物は、患者に組成物を投与するステップを含み、患者の免疫応答を上昇させる方法において使用されてもよい。
【０１４４】
本発明のワクチン組成物は、被検体がストレプトコッカス  ニューモニアエ型２にさらされる前、および／または被検体がストレプトコッカス．ニューモニアエ型２にさらされる後に投与されてもよい。
【０１４５】
ワクチン組成物は、ユニットドーズ形で調製されてもよい。いくつかの実施形態において、ユニットドーズは、例えば、約０．５ｍＬなどの０．１〜１．０ｍＬの容量を有してもよい。
【０１４６】
本発明のワクチン組成物は、様々な形で調製されてもよい。例えば、ワクチン組成物は、液体溶液として、または懸濁液として、注射可能なように調製されてもよい。注射前の液体ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）の溶液に、または懸濁液に適している固体形も調製することができる（例えば、凍結乾燥組成物、またはスプレー凍結乾燥組成物など）。組成物は、例えば、軟膏、クリーム、または粉末などの局所投与のために調製されてもよい。組成物は、例えば、錠剤またはカプセルとして、スプレーとして、またはシロップとしてなど（任意に香りをつけて）経口投与用に調製されてもよい。組成物は、微粉末または噴霧を用いて、例えば吸入器によってなどで肺投与用に調製されてもよい。組成物は、坐剤として調製されてもよい。組成物は、例えば、噴霧として、または滴下としてなどで、鼻用、耳用または眼用に調製されてもよい。筋肉内投与の注射が一般的である。
【０１４７】
医薬組成物は、アジュバントの有効量、すなわち、個々に投与される場合、単回投与またはシリーズの一部として、共投与されるときにＳ．ニューモニアエ型２抗原に対する免疫応答を高めるのに効果的な量、を含んでもよい。この量は、治療される個々の健康状態および体調、年齢、治療される個々の分類群（例えば非ヒト霊長類、霊長類など）、合成抗体に対する個々の免疫システムの能力、所望とされる保護の程度、ワクチン製剤、医療状況における治療する医師の評価、および、他の関連因子、に依存して変更することができる。量は、慣例の試験によって決定されることができる比較的広い範囲内に収まるだろう。
【０１４８】
本発明のワクチン製剤およびワクチンの投与のための技術は、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）  マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、ペンシルベニア州イーストン、において明らかにされてもよい。
【０１４９】
本発明に係る一つの複合体の、または一般式（Ｉ）の一つのサッカライドの治療有効量は、病気に対して少なくとも部分的な免疫化をもたらす化合物の量に関する。当該化合物の毒性および治療効果は、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的、薬理学的、および毒物学的手順によって決定されることができる。毒性効果と治療効果との用量比は、治療指標になる。投与される組成物の実際量は、治療される患者、患者の体重、苦痛の重症度、投与方法、および処方する医師の判断に依存するだろう。
【０１５０】
［免疫学的アッセイ］
本発明の更なる実施形態は、ストレプトコッカス  ニューモニアエ型２に対する抗体の検出のための免疫学的アッセイにおけるマーカーとして使用するための本発明に係るサッカライドに関する。当該アッセイは、例えば、マイクロアレイおよびＥＬＩＳＡなどを含む。
【０１５１】
したがって、本発明のサッカライドを、Ｓ．ニューモニアエ血清型２によって引き起こされる病気の診断のために使用することができる。本発明に係る診断目的のために行われるアッセイは、固相酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、特に「間接」ＥＬＩＳＡ、または放射免疫アッセイのような免疫アッセイであってもよい。好ましくは、本発明に係るサッカライドは相互連結分子を介して固体支持体に共有結合される。したがって、本発明に係るサッカライドは、−Ｏ−Ｌ−ＮＨ２基の窒素原子を介して直接的に、または間接的に固体支持体に共有結合されることができる。固体支持体は、好ましくは、ガラススライド、マイクロタイタープレート、試験管、ミクロスフェア、ナノ粒子、またはビーズを含む、またはからなる群から選択される。
【０１５２】
固体支持体は、ガラススライドまたはマイクロタイタープレートであると特に好ましい。マイクロタイタープレート、またはマイクロプレート、またはマイクロウェルプレートは、小さい試験管として使用される多数の「ウェル」を有する平たいプレートである。典型的に、６サンプル、２４サンプル、９６サンプル、３８４サンプル、または１５３６サンプルでさえも有するマイクロタイタープレートを使用することができる。マイクロプレートは、ＰＣＲに使用されるマイクロタイタープレート用のポリカーボネートのような、いくつかの異なる材料から生産される。もっとも一般的なものは、多くの光学的検出マイクロプレートに使用されるようなポリスチレンである。マイクロプレートを、吸光度または発光検出のための二酸化チタンの添加によって白色に、または蛍光生物学的アッセイのための炭素の添加によって黒色に色づけすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１Ａ】本発明に係る市販の相互連結分子。
【図１Ｂ】本発明に係る市販の相互連結分子。
【図２】本発明に係る相互連結分子における官能基Ｘの例。
【図３】図３は、本発明のＣＲＭ１９７複合体を示す。
【図４】複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２の特徴付け。（Ａ）タンパク質量を、公知のＢＳＡ濃度を用いてプロットされた標準曲線を用いて推定した。（Ｂ）複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を、ＣＲＭ１９７と共に１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに溶解し、クマシーブリリアントブルーＲ２５０を用いて染色した。（Ｃ）マトリックス−支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析を、複合体の平均分子サイズを測定するために行った。ＣＲＭ１９７を標準として使用した。
【図５】グリカンマイクロアレイ分析。アルムアジュバントと共に複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を用いて免疫付与されたマウスにおいて調達された高度免疫血清は、マイクロアレイ分析を受けた。（Ａ）免疫付与パターン。（Ｂ）複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を用いて免疫付与された、および強化されたマウス（ｎ＝３）から集められた血清（免疫前、および最初の免疫付与後毎週）を用いての代表的なマイクロアレイスキャンニング。蛍光は、集められたマウス血清（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に１００倍希釈）を用いて、続いて抗−マウスＩｇＧアレクサ  フルオロ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）６３５（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中に４００倍希釈）を用いてインキュベートされたマイクロアレイスライドを６３５ｎｍで励起した。（Ｃ）合成オリゴサッカライドおよびポリサッカライドを用いてプリントされたマイクロアレイスライドのプリンティングパターン。プリントされたスライドは、１９Ｆ型ポリサッカライド、細胞壁ポリサッカライド（ＣＷＰＳ）およびプリンティングバッファーも含む。
【図５Ｄ】グリカンマイクロアレイ分析。スライド上にプリントされたオリゴサッカライド名および位置。図５（Ｂ）に示されるように、複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を用いての免疫付与は、Ｓ．ニューモニアエ血清型２に存在しているコアなグリカン構造を認識する特異的な抗体を誘導する。生成された抗体は、ネイティブの血清型２莢膜ポリサッカライドに交差反応するが、対照ＳＰ１９Ｆポリサッカライド、または細菌細胞壁に含まれるポリサッカライドとは反応しないので、血清型２に特異的である。
【図６】ＥＬＩＳＡおよびオプソニン食作用殺害アッセイ（ＯＰＫＡ）。（Ａ）マウスを、アルムと共に複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２（１：１）を用いて、およびアルムなしで複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を用いて免疫付与した。免疫付与前および免疫付与後の血清を集め、エンドポイント力価をＥＬＩＺＡによって分析した。ネガティブコントロールにおいて、マウスはＰＢＳ単独、およびアルムと共にＰＢＳを受けた。（Ｂ）オプソニン食作用殺害アッセイを、プレ−オプソニン化された２型肺炎球菌株Ｄ３９およびアルムと共に複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２（１：１）から調達された抗体、並びにプレ−オプソニン化された型２肺炎球菌株Ｄ３９およびアルムなしで複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２（１：１）から調達された抗体、と共にインキュベートされたＨＬ−６０細胞を用いて行った。生存を４５分インキュベーション後に評価した。肺炎球菌の殺害率を、対照血清と比較して、得られた生存する肺炎球菌コロニーに基づいて算出した。ＰＢＳおよびＰＢＳ＋アルム血清を、ネガティブコントロールとして使用した。データを３回の平均±ＳＤ値として示した。図６は、水酸化アルミニウムの存在下での複合体ＣＲＭ１９７ヘキササッカライド２を用いての繰り返しの免疫付与後にマウスにおける十分な血清型２特異的抗体力価の誘導（Ａ）および免疫血清オプソニン化細菌の重大な殺害（Ｂ）を示す。明らかに、検出できるＯＰＫＡは、免疫付与プロトコール中に水酸化アルミニウムの不存在下で誘導されている血清を用いても観察された。  これらの結果は、ワクチンを含む複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２は高い免疫原性であり、マウスにおいて機能的な抗体を誘導することを示す。
【図７】複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を用いての免疫付与は、マウスにおいて保護免疫を誘導する。雌Ｃ７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１１）を、アルムと共に複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を用いて、またはアルムなしで複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を用いて、皮下に免疫付与した（黒丸およびダイアモンド型）。対照グループは、ＰＢＳ（四角）またはアルムと共にＰＢＳ（三角）を受けた。マウスの全てグループは、１×１０７ｃｆｕのＤ３９株を用いて鼻腔内にチャレンジされ、マウスの生存を１２時間毎に監視した。保護をｃｆｕ測定によって３６時間後に分析した。図７は、複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を用いてのみの免疫付与は、細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の重大な減少につながるので、病原体Ｓ．ニューモニアエ血清型２株Ｄ３９を用いてのチャレンジの後に保護されたマウス数は増加することを示す。分析された感染マウスの二体の区画、肺（Ａ）および血液（Ｂ）において、チャレンジ感染後に部分的な細菌排出（Ａ）または完全な細菌排出（Ｂ）を観察した。
【発明を実施するための形態】
【０１５４】
次の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。実施例において開示される技術は、本発明の実施においてよく機能するために発明者によって発見された表現技術に従うので、当該実施において好ましい形態を構成するために考慮されることができることを当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示の下で、いくつかの変更が特定の実施形態において行われることができ、開示され、同様の、または類似の結果をさらに得られることを認識するべきである。
本発明の様々な態様におけるさらなる修正および代替的な実施形態は、この明細書を考慮して当業者に明らかになるだろう。加えて、この明細書は、実例としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する一般的な方法を当業者に教示する目的のためである。本願に示される、および記述される本発明の形態は、実施形態の実施例としてとらえられるべきであることを、理解されるべきである。要素および材料は、本願に説明される、および記述されるものに置換されてもよく、部分および工程は、転換されてもよく、本発明のある特徴は、独立して利用されてもよく、全ては、本発明のこの明細書における利点を有すると当業者に明らかになるだろう。
【実施例】
【０１５５】
Ａ．化学合成
一般的な情報
特に明記されない限り、商業用グレード溶媒を使用した。乾燥溶媒を、水乾燥溶媒システム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｒｙ  Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｓｉｓｔｅｍ）から得た。クロマトグラフィーのための溶媒は、使用前に蒸留した。鋭敏反応を、熱乾燥ガラス容器で、アルゴン雰囲気下で行った。分析的薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、０．２５ｍｍのシリカゲルの厚さでプレコートされたキエセルゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）６０  Ｆ２５４ガラスプレートで行った。スポットをバニリン溶液（９５％ＥｔＯＨ中に６％（ｗ／ｖ）バニリンおよび１０％（ｖ／ｖ）硫酸を有する溶液）、またはハネシアン染色液（水中に、５％（ｗ／ｖ）モリブデン酸アンモニウム、１％（ｗ／ｖ）硫酸セリウム（ＩＩ）、および１０％（ｖ／ｖ）硫酸を有する溶液）を用いて染色することによって可視化した。シリカ
カラムクロマトグラフィーを、フルカ（Ｆｌｕｋａ）  キエセルゲル６０（２３０〜４００メッシュ）で行った。
【０１５６】
１Ｈ、１３Ｃ、および二次元ＮＭＲスペクトルを、２９６Ｋでバリアン（Ｖａｒｉａｎ）４００−ＭＲ、６００−ＭＲ、およびブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）  アバンス（Ａｖａｎｃｅ）７００分光計を用いて測定した。化学シフト（δ）を、それぞれの残留溶媒ピークに対して１００万分の１で報告する（ＣＤＣｌ３：１Ｈ  ＮＭＲにおいてδ７．２６、および１３Ｃ  ＮＭＲにおいてδ７７．１６、Ｄ２Ｏ：１Ｈ  ＮＭＲにおいてδ４．７９）。次の略語を、ピーク多重度を示すために使用する：ｓ  シングレット、ｄ  ダブレット、ｄｄ  ダブレットのダブレット、ｔ  トリプレット、ｄｔ  トリプレットのダブレット、ｑ  カルテット、ｍ  マルチプレット。カップリング定数（Ｊ）を、ヘルツ（Ｈｚ）で報告する。高分解能質量分析法（ＨＲＭＳ）を、ベルリン自由大学、質量分析の中核施設で、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）６２１０  ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いて行った。
略語
Ａｃ  アセチル
ＡｃＯＨ  酢酸
Ａｃ２Ｏ  無水酢酸
ＢＡＩＢ  ビスアセチルヨードベンゼン
Ｂｎ  ベンジル
ｔＢｕＯＨ  ｔ−ブタノール
Ｂｚ  ベンゾイル
ＣＡＮ  硝酸セリウムアンモニウム
Ｃｂｚ  ベンジルオキシカルボニル
Ｃｕ（ＯＡｃ）２  酢酸銅（ＩＩ）
ＤＢＵ  １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン
ＤＣＣ  Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ  ジクロロメタン
ＤＭＡＰ  Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ  Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＥＳＩ  エレクトロスプレイイオン化
Ｅｔ３Ｎ  トリエチルアミン
Ｅｔ  エチル
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル
ＦｍｏｃＣｌ  クロロギ酸９−フルオレニルメチル
ｇ  グラム
ｈ  時間
ＨＲＭＳ  高分解能質量分析計
Ｌｅｖ  レブリニル
ｍｉｎ  分
ｍＬ  ミリリットル
Ｍｅ  メチル
ＭｅＩ  ヨウ化メチル
ＭｅＯＨ  メタノール
ＭＰ  ｐ−メトキシフェニル
ＭＳ  モレキュラーシーブス
ＮａＨＣＯ３  重炭酸ナトリウム
ＮａＯＨ  水酸化ナトリウム
ＮａＯＭｅ  ナトリウムメトキシド
ＮＩＳ  Ｎ−ヨードスクシンイミド
ＮＭＲ  核磁気共鳴
Ｐｄ／Ｃ  木炭上のパラジウム
Ｐｈ  フェニル
Ｐｉｃｏ  ピコロイル
ＣＰＳ  莢膜ポリサッカライド
Ｐｙ  ピリジン
ＲＴ  室温
ＴＣＡ  トリクロロアセトアミド
ＴＥＭＰＯ  ２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシ
ＴｆＯＨ  トリフルオロメタンスルホン酸
ＴＭＳＯＴｆ  トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
Ｔｏｌ  ｐ−トリル
【０１５７】
［実施例Ａ．１：ジサッカライド受容体８の合成］
【化４２】
2019504017.tif 000044
構成ブロック１４の合成
【０１５８】
【化４３】
2019504017.tif 000045
ＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）中に１３（Ｄｈｅｎｉｎ  Ｓ．Ｇ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９，７，５１８４）（６．７ｇ，１４．４ｍｍｏｌ）を有する透明溶液にＦｍｏｃＣｌ（５．６ｇ，２１．６２ｍｍｏｌ）、およびピリジン（２．４ｍＬ，２８．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。出発物質の完全な消費後、反応混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）を用いて希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（６０ｍＬ）、水（６０ｍＬ）、および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（６０ｍＬ）を用いて連続的に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、および濃縮した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（９：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、白色泡として所望の生成物１４（９．３ｇ，９４％）を得た。
Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０６（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．７８−７．６７（ｍ，２Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５８−７．５２（ｍ，２Ｈ），７．４９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４４−７．０５（ｍ，１３Ｈ），５．８９（ｓ，１Ｈ），５．４９（ｓ，１Ｈ），５．２９（ｄｄ，Ｊ＝９．５，３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．８７（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），４．７１（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），４．６１−４．４８（ｍ，１Ｈ），４．４１（ｄｑ，Ｊ＝１２．２，６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．７６（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），１．４２（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６５．６，１５４．３，１４３．７，１４３．２，１４１．４，１４１．３，１３８．２，１３７．９，１３３．６，１３２．７，１３０．１，１３０．０，１２９．７，１２９．６，１２８．６，１２８．５，１２８．１，１２８．０（２Ｃ），１２７．９，１２７．３，１２７．２，１２５．５，１２５．２，１２０．１（２Ｃ），８６．２，７８．８，７６．８，７５．４，７２．１，７０．４，６９．１，４６．８，２１．３，１８．１；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ４２Ｈ３８Ｏ７Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値７０９．２２３６，実測値：７０９．２２３８．
構成ブロック１２の合成
【０１５９】
【化４４】
2019504017.tif 000046
ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中に化合物１４（０．１７ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、アミノペンチルリンカー１５（０．１６ｇ，０．５ｍｍｏｌ）、および４Å酸洗浄モレキュラーシーブス（ＡＷＭＳ）（０．３ｇ）を有する溶液を、室温で３０分間撹拌した。溶液を−２０℃に冷却し、ＮＩＳ（６２ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）、およびＴｆＯＨ（２．５μＬ，０．０２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２時間にわたって徐々に室温にもっていった。出発物質の完全な消費後、Ｅｔ３Ｎ（２ｍＬ）を加え、反応混合物をさらに２時間室温で撹拌した。反応混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を用いて希釈し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（１０ｍＬ）を用いて洗浄した。分離された有機層を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、および濃縮した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（４：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、無色オイルとして所望の生成物１２（０．１３５ｇ，８２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０６（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．５９（ｑ，Ｊ＝９．３，８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４２−７．１３（ｍ，１５Ｈ），５．３２（ｓ，１Ｈ），５．１８（ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，２Ｈ），４．８６（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８３−４．７９（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２１（ｓ，１Ｈ），３．７８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．６２（ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４２−３．１３（ｍ，２Ｈ），２．１６（ｓ，１Ｈ），１．７０−１．４２（ｍ，６Ｈ），１．３９（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７４．０，１６６．４，１３３．５，１３０．０，１２９．８，１２８．７，１２８．６，１２８．２，１２８．１，１２８．０，１２７．４，１２５．３，１１０．１，９７．４，８１．９，７５．４，７３．５，７０．７，６７．６，６７．３，５０．４，２９．２，１８．３；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ４０Ｈ４５Ｏ８Ｎ［Ｍ＋Ｋ］＋の計算値７０６．２７８２，実測値：７０６．２７０５．
構成ブロック１１の合成
【０１６０】
【化４５】
2019504017.tif 000047
ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中に１６（Ｒａｊｐｕｔ  Ｖ．Ｋ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００８，７３，６９２４）（２．４ｇ，６．６ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃＣｌ（１．８ｇ，７．０ｍｍｏｌ）を有する攪拌溶液に、ピリジン（０．８ｍＬ，１０．０ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した。混合物を２時間にわたって室温に徐々に加熱し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）を用いて希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍＬ）、および水（５０ｍＬ）を用いて連続的に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、および濃縮した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（１０：１〜４：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、２４ａ（０．９２ｇ，２４％）および２４ｂ（１．３ｇ，３４％、１６を２０％取り戻した）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．７１（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ)，７．４２（ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，４Ｈ），７．３８−７．２８（ｍ，７Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），５．３９（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），４．８６−４．７１（ｍ，３Ｈ），４．５６−４．４２（ｍ，２Ｈ），４．３６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｄｔ，Ｊ＝８．２，３．６Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．４１（ｄｄ，Ｊ＝９．５，５．８Ｈｚ，１Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），１．４６（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１５５．８，１４３．５，１４１．５，１３８．３，１３８．２，１３２．５，１３０．２，１３０．０，１２８．８，１２８．２（２Ｃ），１２８．０，１２７．４，１２７．３，１２５．６，１２５．５，１２０．２，１２０．１，８５．７，８０．９，７７．９，７６．２，７５．６，７４．３，７０．７，４６．９，２１．３，１８．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３５Ｈ３４Ｏ６Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値６０５．１９７４，実測値：６０９．１９９３．
ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中に２４ｂ（１．３ｇ，２．２３ｍｍｏｌ）を有する撹拌溶液に、レブリン酸無水物（１．４ｇ，６．６９ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．５４ｍＬ，６．６９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２日間撹拌後、反応混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を用いて希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍＬ）、および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）を用いて連続的に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、および濃縮した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（４：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、粘性オイルとして１１（１．０４ｇ，６９％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４５−７．２７（ｍ，１１Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），５．６２（ｄｄ，Ｊ＝３．２，１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．１６（ｄｄ，Ｊ＝９．７，３．３Ｈｚ，１Ｈ），４．８３（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），４．６７（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｄｄ，Ｊ＝１０．３，６．７Ｈz，１Ｈ），４．４２−４．２４（ｍ，３Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），２．８０−２．６５（ｍ，４Ｈ），２．３３（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），１．３６（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）；
１３ＣＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２０６．１，１７１．８，１５４．１，１４３．６，１４３．１，１４１．３，１４１．２，１３８．１，１３７．８，１３２．６，１２９．９，１２９．５，１２８．４，１２７．９，１２７．８（２Ｃ），１２７．２，１２７．１，１２５．２，１２５．１，１２０．１，１２０．０，８５．８，７８．６，７６．３，７５．３，７１．７，７０．１，６８．９，４６．７，３７．９，２９．８，２８．０，２１．１，１７．８；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ４０Ｈ４０Ｏ８Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値７０３．２３４２，実測値：７０３．２３５９．
【０１６１】
ジサッカライド受容体８の合成
【化４６】
2019504017.tif 000048
ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中に供与体１１（０．２５ｇ，０．３７ｍｍｏｌ）、受容体１２（０．１６５ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、および４Å酸洗浄モレキュラーシーブス（ＡＷＭＳ）（０．３ｇ）を有する溶液を、室温で３０分間撹拌した。溶液を−２０℃に冷却し、ＮＩＳ（８３ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）、ＴｆＯＨ（３．３μＬ，０．０３７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２時間にわたって室温に徐々にもっていった。出発物質の完全な消費後、Ｅｔ３Ｎ（２ｍＬ）を加え、反応混合物を室温でさらに２時間撹拌した。反応混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２を用いて希釈し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液を用いて洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、および濃縮した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（３：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、無色オイルとして所望の生成物８（０．１８ｇ，７３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０５（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．６０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３９−７．１８（ｍ，２０Ｈ），５．３２（ｓ，１Ｈ），５．２４−５．１２（ｍ，３Ｈ），４．８７（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．８３−４．７６（ｍ，２Ｈ），４．７６−４．５５（ｍ，３Ｈ），４．５０（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），４．２６−４．１５（ｍ，１Ｈ），３．９７（ｄｄ，Ｊ＝９．５，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７７（ｄｄ，Ｊ＝９．７，６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．５７（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ），３．２４（ｄｄ，Ｊ＝１９．８，１０．２Ｈｚ，４Ｈ），２．７５（ｑ，Ｊ＝６．４，５．８Ｈｚ，２Ｈ），２．６０（ｑｄ，Ｊ＝１６．７，８．１Ｈｚ，２Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），１．６４−１．４３（ｍ，６Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）；
１３ＣＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２０７．１，１７２．２，１６６．０，１３８．４，１３８．０，１３３．４，１２９．９，１２９．８，１２８．６（２Ｃ），１２８．５（２Ｃ），１２８．５１，１２８．４，１２８．３，１２８．０，１２７．７（２Ｃ），１２７．３，９９．５，９７．０，８１．４，８０．５，７７．９，７７．４，７５．７，７４．１，７３．０，６９．９，６８．３，６７．８，６７．３，５０．６，５０．３，４７．２，４６．３，３８．３，２９．９，２９．２，２８．３，２３．５，１８．２，１７．９；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ５８Ｈ６７Ｏ１４Ｎ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値１０２４．４４５９，実測値：１０２４．４３２１．
【０１６２】
実施例Ａ．１に記述される合成手順をリンカー構成ブロック１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、および１５ｄに適用しジサッカライド８ａ、８ｂ、８ｃ、および８ｄを得る。
【化４７】
2019504017.tif 000049
【０１６３】
実施例Ａ．２：ジサッカライド供与体７の合成
【化４８】
2019504017.tif 000050
【０１６４】
構成ブロック９の合成
【化４９】
2019504017.tif 000051
ＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）中に化合物１７（Ｂｏｕｒｋｅ  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４，１２，１１１４）（０．２５ｇ，０．５５ｍｍｏｌ）を有する攪拌溶液に、ピコリン酸（９３ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（０．１７ｇ，０．８ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（１３．５ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２．５時間撹拌後、反応混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を用いて希釈し、冷水（１０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）を用いて連続的に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、および濃縮した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（３：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、薄い黄色がかったオイルとして所望の生成物９（０．３０７ｇ，定量的）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．８０（ｄｄｄ，Ｊ＝４．７，１．８，０．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄｔ，Ｊ＝７．９，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｔｄ，Ｊ＝７．７，１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄｄｄ，Ｊ＝７．６，４．７，１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３２−７．２７（ｍ，２Ｈ），７．２５−７．１７（ｍ，４Ｈ），７．１７−７．０９（ｍ，４Ｈ），５．４３（ｄｄ，Ｊ＝９．５，３．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３１（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），４．８５（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），４．７４−４．６５（ｍ，２Ｈ），４．５７（ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ），４．２７−４．１４（ｍ，１Ｈ），４．１１（ｄｄ，Ｊ＝３．４，１．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９０（ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），２．７４−２．５１（ｍ，２Ｈ），１．３８（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），１．２７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）．
【０１６５】
ジサッカライド１８の合成
【化５０】
2019504017.tif 000052
ＮＩＳ（０．１５ｇ，０．６５ｍｍｏｌ）およびＴｆＯＨ（６．０μＬ，０．０６５ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中に供与体９（０．３２ｇ，０．６４ｍｍｏｌ）、受容体１０（Ｂｕｎｄｌｅ  Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２，７，１７５４）（０．２５ｇ，０．４３ｍｍｏｌ）、および４Å酸洗浄モレキュラーシーブス（ＡＷＭＳ）（２．０ｇ）を有する冷却溶液に、−４０度で加えた。反応混合物を、１時間にわたって−２０℃に徐々に温め、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）を用いて希釈し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（１５ｍＬ）を用いて洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、および濃縮した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（４：１〜３：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、薄い黄色がかったオイルとして所望の生成物１８（０．２３ｇ，５３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．８８（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５９−７．４４（ｍ，３Ｈ），７．４２−７．１７（ｍ，２０Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），５．５９（ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），５．０９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），５．０３（ｄｄ，Ｊ＝９．８，３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．８８−４．８２（ｍ，３Ｈ），４．７６−４．５８（ｍ，６Ｈ），４．５４（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２７（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．００−３．７９（ｍ，４Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．３９（ｄｑ，Ｊ＝１１．９，６．２Ｈｚ，１Ｈ），１．４０（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６５．３，１６４．０，１５５．４，１５１．５，１５０．２，１４７．７，１３８．７，１３８．４，１３８．０，１３７．０，１３３．４，１２９．８（２Ｃ），１２８．９，１２８．６，１２８．４，１２８．３（３Ｃ），１２８．１，１２８．０，１２７．８，１２７．６，１２７．５（２Ｃ），１２７．０，１２５．２，１１８．６，１１４．５，１００．８，１００．５，８３．２，７８．６，７５．８，７５．７，７５．３，７４．８，７４．０，７３．５，７１．７，７０．０，５５．６，１７．９；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ６０Ｈ５９Ｏ１３Ｎ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値１０２４．３８８４，実測値：１０２４．３８９６．
【０１６６】
ジサッカライド構成ブロック１９の合成
【化５１】
2019504017.tif 000053
Ｃｕ（ＯＡｃ）２・Ｈ２Ｏ（７０ｍｇ，０．３４７ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ）とＭｅＯＨ（３ｍＬ）との中に１８（０．２３ｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を有する溶液に加えた。室温で１時間撹拌後、反応混合物をセライトパッドに通してろ過し、残渣を濃縮した。粗生成物をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解し、この溶液にＡｃ２Ｏ（１ｍＬ）およびメチルイミダゾール（０．２ｍＬ）を加えた。１時間後、反応混合物を蒸発させ、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（６：１〜５：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、無色オイルとして所望の生成物１９（０．１９３ｇ，９０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０１（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３３−７．０１（ｍ，２０Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），５．４２（ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），４．９３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），４．７１（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），４．６５−４．４３（ｍ，７Ｈ），４．３９（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１５−４．０７（ｍ，１Ｈ），３．８３−３．６７（ｍ，４Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ），３．６３−３．４１（ｍ，２Ｈ），３．１９（ｄｑ，Ｊ＝１２．１，６．２Ｈｚ，１Ｈ），１．８７（ｓ，３Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．２，１６５．３，１５５．４，１５１．６，１３８．７，１３８．６，１３８．２，１３７．１，１３３．４，１２９．９，１２９．８，１２８．８，１２８．７，１２８．６，１２８．５，１２８．４，１２８．３（２Ｃ），１２８．０，１２７．９，１２７．８，１２７．６，１２７．５，１１８．７，１１４．５，１００．８，１００．６，８３．１，７８．７，７７．４，７６．０，７５．７９，７５．７６，７５．４（２Ｃ），７５．３，７４．９，７４．０，７３．５，７１．８，７０．１，５５．７，２９．８，２１．１，１７．９；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ５６Ｈ５８Ｏ１３［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値９６１．３７７５，実測値：９６１．３８４１．
【０１６７】
イミデート供与体７の合成
【化５２】
2019504017.tif 000054
硝酸セリウムアンモニウム（０．４６ｇ，０．８５ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）中に１９（０．１６ｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を有する溶液に加えた。室温で１時間撹拌後、Ｎａ２ＳＯ４を反応混合物に加え、セライトパッドに通してろ過した。残渣を濃縮し、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（４：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、薄い黄色がかったオイルとして所望のヘミアセタールを得た。
【０１６８】
得られたヘミアセタールをＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解し、この溶液に、Ｃｌ３ＣＣＮ（０．１７ｍＬ，０．１７ｍｍｏｌ）、ＤＢＵ（５．２μＬ）を加えた。３０分後、ヘキサン（５ｍＬ）を反応混合物に加え、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（５：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、無色オイルとして所望の生成物７（０．１２６ｇ，７６％，α／β＝９：１）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．４７（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３２−７．０１（ｍ，２０Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），５．２９（ｄｄ，Ｊ＝９．９，３．５Ｈｚ，１Ｈ），４．７６（ｓ，１Ｈ），４．７０−４．４９（ｍ，７Ｈ），４．４３（ｄｄ，Ｊ＝２３．８，１１．２Ｈｚ，２Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），４．０５−３．９０（ｍ，２Ｈ），３．９０−３．７６（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５１（ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｄｔ，Ｊ＝１２．１，６．２Ｈｚ，１Ｈ），１．９０（ｓ，３Ｈ），１．１９（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．２，１６５．５，１６０．６，１３８．５（２Ｃ），１３８．２，１３７．２，１３３．６，１２９．９，１２９．３，１２８．８，１２８．７，１２８．６，１２８．５，１２８．４，１２８．３（２Ｃ），１２７．９，１２７．８（２Ｃ），１２７．６，１２７．５，１０１．２，９４．１，９１．３，７９．６，７８．７，７６．０，７５．９，７５．９，７５．３，７５．０，７４．８，７３．４，７３．３，７２．９，７１．８，６８．６，２９．８，２１．２，１７．９．
【０１６９】
実施例Ａ．３：テトラサッカライド受容体４の合成
テトラサッカライド２０の合成
【化５３】
2019504017.tif 000055
ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中に供与体７（６０ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）、受容体８（４０ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）、および４Å酸洗浄モレキュラーシーブス（ＡＷＭＳ）（１００ｍｇ）を有する溶液に、−４０℃でＴＭＳＯＴｆ（１．５μＬ，８μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３時間にわたって０℃に徐々に温めた。供与体の完全な消費後、Ｅｔ３Ｎを滴下し、溶媒を真空下で除去した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（３：１〜２：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、薄い黄色がかったオイルとして所望の生成物２０（４９ｍｇ，６８％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．５４−７．３３（ｍ，６Ｈ），７．３１−７．１４（ｍ，３６Ｈ），６．９８−６．９０（ｍ，２Ｈ），６．７９−６．７０（ｍ，２Ｈ），５．３０（ｓ，１Ｈ），５．２１（ｓ，１Ｈ），５．１９−５．０５（ｍ，３Ｈ），４．９５（ｓ，１Ｈ），４．８０（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），４．７６−４．６２（ｍ，３Ｈ），４．６１−４．４５（ｍ，５Ｈ），４．４３−４．３７（ｍ，４Ｈ），４．３５−４．２１（ｍ，４Ｈ），４．１２−４．０９（ｍ，２Ｈ），３．８０−３．６９（ｍ，２Ｈ），３．６７−３．５７（ｍ，３Ｈ），３．５５−３．３７（ｍ，５Ｈ），３．３０−３．０３（ｍ，７Ｈ），２．６３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．５５−２．４５（ｍ，２Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），１．８５（ｓ，３Ｈ），１．６２−１．３１（ｍ，６Ｈ），１．１９（ｓ，３Ｈ），１．１０（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ），０．９１（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２０６．９，１７１．７，１７０．１，１６６．１，１６５．０，１３９．１，１３８．６，１３８．５，１３８．２，１３８．１，１３８．０，１３６．７，１３３．３，１３０．１，１２９．９，１２９．７，１２９．６，１２８．７，１２８．６（２Ｃ），１２８．５（２Ｃ），１２８．４，１２８．３（２Ｃ），１２８．２（２Ｃ），１２８．０，１２７．９（２Ｃ），１２７．８，１２７．７，１２７．３，１２７．２，１２７．１，１２６．７，１０１．１，１００．９，９９．２９，９７．０，８３．１，８０．４，８０．１，７８．６，７８．０，７７．４，７６．０，７５．８，７５．６，７５．３，７５．２，７４．８，７４．７，７４．１，７４．０，７３．１，７３．０，７２．４，７１．６，６９．３，６８．３，６７．８，６７．５，６７．２，６２．４，６０．５，５０．６，５０．３，４７．２，４６．２，３８．３，２９．８，２９．２，２８．３，２８．０，２７．６，２５．０，２３．４，２２．８，２２．３，２１．２，２１．１，１８．１，１７．７，１７．６；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１０７Ｈ１１７Ｏ２５Ｎ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値１８３９．７８４６，実測値：１８３９．７６２１．
【０１７０】
テトラサッカライド受容体４の合成
【化５４】
2019504017.tif 000056
ヒドラジン溶液［３１０μＬ，Ｈ２ＮＮＨ２  Ｈ２Ｏ（５０μＬ）、ピリジン（０．６ｍＬ）、およびＡｃＯＨ（０．４ｍＬ）の予混合溶液］を、ＣＨ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ）とピリジン（２ｍＬ）との混合溶液中に化合物２０（５７ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）を有する撹拌溶液に０℃で加えた。０℃で１時間撹拌後、反応混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）を用いて希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（５ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｍＬ）を用いて連続的に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、および濃縮した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（３：１〜２．５：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、無色オイルとして所望の生成物４（４９ｍｇ，９０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９８（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５２−７．３２（ｍ，６Ｈ），７．３１−７．１３（ｍ，２８Ｈ），７．１２−６．９４（ｍ，１０Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），５．２４（ｄｄ，Ｊ＝１４．９，６．１Ｈｚ，２Ｈ），５．０９（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，２Ｈ），４．９０（ｓ，１Ｈ），４．８１−４．６７（ｍ，３Ｈ），４．６５−４．３８（ｍ，１０Ｈ），４．３６−４．２１（ｍ，３Ｈ），４．２０−３．９６（ｍ，４Ｈ），３．８５−３．６３（ｍ，５Ｈ），３．６０−３．３９（ｍ，６Ｈ），３．３５−３．０７（ｍ，７Ｈ），１．８６（ｓ，３Ｈ），１．５６−１．３８（ｍ，６Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），１．１９（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．２，１６５．９，１６５．２，１３８．６，１３８．５，１３８．４，１３８．３，１３８．１，１３８．０，１３６．９，１３３．３，１３３．２，１３０．２，１２９．９，１２９．８，１２９．５，１２８．８，１２８．７，１２８．６，１２８．５（３Ｃ）  １２８．４（３Ｃ），１２８．３，１２８．１，１２７．９（３Ｃ），１２７．８（２Ｃ），１２７．６，１２７．４，１２７．２，１２７．１，１０１．２，１００．９，１００．５，９７．１，８３．０，８２．１，８０．２，７９．２，７８．６，７８．３，７７．４，７６．０，７５．７，７５．６，７５．５，７５．３，７４．８，７４．４，７４．３，７３．６，７３．５，７２．９，７１．７，７０．１，６９．５，６８．１，６８．０，６７．６，６７．３，５０．７，５０．３，４７．２，４６．３，２１．１，１８．２，１７．９，１７．７；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１０２Ｈ１１１Ｏ２３Ｎ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値１７４１．７４７８，実測値：１７４１．７２４０．
【０１７１】
実施例Ａ．４：ジサッカライド供与体３の合成
【化５５】
2019504017.tif 000057
【０１７２】
グルクロン酸構成ブロック２２の合成
【化５６】
2019504017.tif 000058
ＢＡＩＢ（４．３４ｇ，１３．４７ｍｍｏｌ）およびＴＥＭＰＯ（０．１７ｇ，１．０８ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）とＨ２Ｏ（７．５ｍＬ）との中に２１（Ｚ．Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１２，７７，８８８８）（３ｇ，５．３９ｍｍｏｌ）を有する溶液に加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌後、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液を用いてクエンチした。水相を、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）を用いて抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、残渣を、溶出液としてシクロヘキサンおよび酢酸エチル（７：１および溶出液中に０．５％ギ酸）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、白色固体として酸（２．９２ｇ，９５％）を得た。
【０１７３】
ＤＭＦ（２５ｍＬ）中に酸（２．９２ｇ，５．１２ｍｍｏｌ）を有する撹拌溶液に、ＭｅＩ（１．４５ｇ，１０．２３ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１．７ｇ，１２．３ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で１０時間撹拌し、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）の添加によってクエンチした。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（８０ｍＬ）を用いて希釈し、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）を用いて洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し濃縮した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（９：１〜６：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、白色固体として所望の生成物２２（２．７ｇ，９０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４９−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．２７（ｍ，１３Ｈ），７．２２（ｍ，２Ｈ），７．１５−７．０９（ｍ，２Ｈ），４．９１−４．６７（ｍ，５Ｈ），４．６１（ｍ，２Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．８１（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｄｄ，Ｊ＝９．７，８．７Ｈｚ，１Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ）；
１３ＣＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６８．９，１３８．２（２Ｃ），１３８．０，１３７．８，１３３．０，１２９．９，１２９．４，１２８．６，１２８．５（３Ｃ），１２８．３，１２８．１，１２８．０（２Ｃ），１２７．９（２Ｃ），１２７．７，８８．７，８６．０，８０．４，７９．４，７８．１，７６．０，７５．６，７５．２，５２．６，２１．３；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３５Ｈ３６Ｏ６Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値６０７．２１３０，実測値：６０７．２１４０．
【０１７４】
イミデート供与体５の合成
【化５７】
2019504017.tif 000059
ＮＩＳ（９２ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）およびＴｆＯＨ（３μＬ，０．３４ｍｍｏｌ）を、アセトン（２ｍＬ）と水（１ｍＬ）との中に２２（０．２ｇ，０．３４ｍｍｏｌ）を有する溶液に０℃で加えた。０℃で４時間撹拌後、反応混合物を、Ｅｔ３Ｎ（０．５ｍＬ）を用いてクエンチした。反応混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）を用いて希釈し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（５ｍＬ）を用いて洗浄した。分離された有機層を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（４：１〜３：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、薄い黄色がかった液体としてヘミアセタール（０．１６４ｇ）を得た。
【０１７５】
ＤＢＵ（５μＬ，０．０３４ｍｍｏｌ）およびＣｌ３ＣＣＮ（０．３４ｍＬ，３．４２ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中にヘミアセタール（０．１６４ｇ，０．３４２ｍｍｏｌ）を有する冷却溶液に０℃で加えた。０℃で１時間撹拌後、反応混合物を、ローターで蒸発させ、粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（５：１〜４：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、無色オイルとして生成物５（０．１８３ｇ，８６％，α／β＝２．７／１）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．６０（ｓ，１Ｈ），７．３３−７．０８（ｍ，１５Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），５．００−４．５０（ｍ，５Ｈ），４．３６（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１１−３．９５（ｍ，１Ｈ），３．８２−３．６６（ｍ，３Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６９．３，１６１．１，１３８．４，１３８．０，１３７．８，１３７．７，１２９．２，１２８．６，１２８．５（３Ｃ），１２８．４，１２８．３，１２８．２，１２８．１，１２８．０（２Ｃ），１２７．９，１２７．８（２Ｃ），１２５．４，９４．０，９１．１，８３．７，８０．８，７８．９，７８．８，７５．９，７５．７，７５．５，７５．２，７３．２，７２．６，５２．７；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３０Ｈ３０Ｏ７ＮＣｌ３［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値６４４．０９８６，実測値：６４４．１０１４．
【０１７６】
ジサッカライド３の合成
【化５８】
2019504017.tif 000060
ＴＭＳＯＴｆ（４μＬ，０．０２μｍｏｌ）を、トルエン（２ｍＬ）およびジオキサン（６ｍＬ）の混合溶液中に供与体５（０．１４ｇ，０．２２ｍｍｏｌ）およびアクセプター２１（９０ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）を有する溶液に−２０℃で加えた。反応混合物を２時間にわたって０℃に徐々に温めた。Ｅｔ３Ｎを滴下し溶媒を真空下で除去した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（７：１〜５：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、薄い黄色がかったオイルとして所望の生成物３（０．１２ｇ，７３％，α／β＝３．５：１）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，α−アノマー）δ７．４３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４０−７．１８（ｍ，３０Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），５．０８（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），４．９４（ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，１Ｈ），４．８８−４．６０（ｍ，９Ｈ），４．５８−４．４７（ｍ，３Ｈ），４．２９（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９５（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝１２．１，４．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８２−３．６９（ｍ，３Ｈ），３．６７（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，３Ｈ），３．６４−３．５４（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｄｄ，Ｊ＝９．７，３．９Ｈｚ，１Ｈ），３．１７（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．４，１３８．６，１３８．３，１３８．２，１３８．１（２Ｃ），１３８．０，１３３．２，１２９．９，１２８．６（２Ｃ），１２８．５（３Ｃ），１２８．４（３Ｃ），１２８．３，１２８．１（２Ｃ），１２８．０，１２７．９，１２７．８，１２７．７，１２７．６（２Ｃ），９８．０，８８．６，８６．７，８１．１，８１．０，７９．８，７９．６，７８．９，７７．３，７５．９，７５．７，７５．６，７５．２，７５．１，７２．６，７０．４，６６．５，５２．５，２１．２；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ６２Ｈ６４Ｏ１１Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値１０３９．４０６７，実測値：１０３９．４０９１．
【０１７７】
実施例Ａ．５：ヘキササッカライド２の合成
【化５９】
2019504017.tif 000061
【０１７８】
ヘキササッカライド２３の合成
【化６０】
2019504017.tif 000062
ＮＩＳ（１２ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）およびＴｆＯＨ（１μＬ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）とジオキサン（１ｍＬ）との混合溶液中に供与体３（５２ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、受容体４（４５ｍｇ，０．０２６ｍｍｏｌ）、および４Å酸洗浄モレキュラーシーブス（ＡＷＭＳ）（０．２ｇ）を有する冷却溶液に、−３０度で加えた。反応混合物を、１時間にわたって−１０℃に徐々に温め、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）を用いて希釈し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（５ｍＬ）を用いて洗浄した。分離された有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、および濃縮した。粗生成物を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（４：１〜３：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、無色オイルとして所望の生成物２３（４５ｍｇ，６６％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０５（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５０−７．３２（ｍ，８Ｈ），７．３０−７．０１（ｍ，６３Ｈ），６．９８−６．８９（ｍ，３Ｈ），６．８６−６．８３（ｍ，２Ｈ），５．２５（ｓ，１Ｈ），５．１９−５．１２（ｍ，２Ｈ），５．０７（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ），４．９０−４．４５（ｍ，２０Ｈ），４．４２−４．０８（ｍ，１２Ｈ），４．０６−３．５２（ｍ，１６Ｈ），３．５０（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，３Ｈ），３．４８−２．９５（ｍ，１３Ｈ），１．８７（ｓ，３Ｈ），１．５８−１．３６（ｍ，６Ｈ），１．１４（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），１．０７（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）；
１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．６，１７０．２，１６６．２，１６４．６，１３９．４，１３９．３，１３８．９（２Ｃ），１３８．８，１３８．７，１３８．５，１３８．３，１３８．２，１３７．０，１３３．３，１３３．０，１３０．２，１３０．０，１２９．９，１２８．８，１２８．６（２Ｃ），１２８．５（３Ｃ），１２８．４（３Ｃ），１２８．３，１２８．２（３Ｃ），１２８．１，１２８．０，１２７．９（３Ｃ），１２７．８，１２７．７，１２７．６，１２７．５，１２７．４，１２７．３，１２７．２，１２７．１，１２６．６，１０１．４，１００．７，９９．３，９８．１，９７．０，９５．９，８３．２，８１．７，８１．０，８０．７，８０．４，８０．２，７９．８，７９．６，７８．７，７７．５，７７．４，７７．３，７７．２，７６．８，７６．１，７５．７，７５．２，７５．１，７５．０，７４．７，７３．８，７３．７，７３．３，７３．１，７２．７，７１．８，７１．５，７１．３，７０．４，６７．６，６７．３，６６．９，５８．６，５３．６，５２．３，３１．１，２９．８，２１．１，１８．６，１８．１，１７．８，１７．６；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１５７Ｈ１６７Ｏ３４Ｎ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値２６３４．１３０１，実測値：２６３４．０９１２．
【０１７９】
５−アミノペンチルβ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−｛α−Ｄ−グルコピラノシルウロネート−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）｝ラムノピラノシル−（１→３）−α−Ｌ−ラムノピラノシド（２）の合成
【化６１】
2019504017.tif 000063
ＴＨＦ（０．５ｍＬ）とＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）との中にヘキササッカライド２３（６ｍｇ，２．３μｍｏｌ）を有する撹拌溶液に、ＮａＯＨ水溶液（１５％，１００μＬ）を加えた。室温で１時間撹拌後、ＮａＯＭｅ（６ｍｇ）を加え、１２時間撹拌させた。出発材料の完全な消費後、反応混合物をアンバーライト１２０Ｈ＋樹脂を用いて中和し、ろ過し、濃縮した。粗材料を、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（１：１〜１：２）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色固体として所望のジアシル化生成物を得た。得られたジアシル化生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、ｔＢｕＯＨ（１ｍＬ）、および水（０．５ｍＬ）の中に溶解した。この溶液にｔＢＵＯＨ（１ｍＬ）および水（０．５ｍＬ）の混合物中にＰｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を有する懸濁液を加え、３６時間水素雰囲気下撹拌した。反応混合物をその後、ろ過し、濃縮し、Ｃ１８カラムによって精製し、白色固体として所望の生成物２（０．７ｍｇ，３０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ５．０７（ｓ，１Ｈ），５．０２−４．９４（ｍ，２Ｈ），４．９１（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７３（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），４．６３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３５−４．１８（ｍ，３Ｈ），４．０５（ｍ，４Ｈ），３．９６−３．８１（ｍ，３Ｈ），３．８０−３．６１（ｍ，８Ｈ），３．６１−３．４０（ｍ，８Ｈ），３．３８−３．２５（ｍ，３Ｈ），３．２４−３.１３（ｍ，１Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６６（ｄｔ，Ｊ＝１５．９，８．０Ｈｚ，４Ｈ），１．４３（ｐ，Ｊ＝７．８，７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．３３−１．１９（ｍ，９Ｈ）；
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ４１Ｈ７１Ｏ２９Ｎ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値１０６４．４００９，実測値：１０６４．４０６７．
【０１８０】
実施例Ａ．５の合成手順をジサッカライド１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、および１５ｄに適用しヘキササッカライド２ａ、２ｂ、２ｃおよび２ｄをそれぞれ得る。
【化６２−１】
2019504017.tif 000064
【０１８１】
【化６２−２】
2019504017.tif 000065
実施例Ａ．６：合成および複合体の特徴付け
一般的な合成手順
ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰ）アミドの形成
ガラス瓶中の、一般式（Ｉ）のサッカライド（１等量）およびジフェニルアジペート（７等量）に、ピリジンおよびＤＭＳＯ（１：１）の混合物を加え、混合物を完全な可溶化のために５分間撹拌した。その後、トリエチルアミン（０．８３μＬ，６μｍｏｌ，１０等量）を加え、２０分間撹拌した。ＴＬＣは出発材料の完全な消費を示した。溶媒を真空中で除去した。残渣を、ジクロロメタン（３×１ｍＬ）を用いて洗浄し過剰なＰＮＰエステルを除去し、得られた白色固体を真空中で乾燥した。
ＣＲＭ１９７に対するＰＮＰエステル誘導体化サッカライドの複合体化
４０等量の凍結乾燥したＣＲＭ１９７を、０．４ｍＬの滅菌０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０に溶解し、１０，０００Ｄａ  ミリポア遠心フィルターの上部チャンバー（０．５ｍＬ）に移した。滅菌０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０を３×０．４ｍＬでガラス瓶をリンスし、同じ遠心フィルターに移した。１０，０００ｒｐｍで６分間〜８分間遠心分離する。必要な場合、上部チャンバーの容量を８０〜１００μＬにするように、最終遠心分離ステップを延長する。ＣＲＭ１９７溶液を、その後、凍結乾燥したＰＮＰエステル誘導体化サッカライドを含む１．５ｍＬチューブに移し、ゆっくり（約１８０〜２００ｒｐｍ）１８〜２４時間、室温で撹拌した。複合体を、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０を用いて一度洗浄し、１０，０００Ｄａミリポア遠心フィルターを用いて脱イオン化されたオートクレーブ処理水で２〜３回洗浄した。ＭＡＬＤＩ分析のために少量を取り、当該複合体をＰＢＳに移す。必要な場合、上部チャンバーの容量を約２５０μＬにするように、最終遠心分離ステップを延長する。上部チャンバーの含有物を新しい１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、４℃で保存した。
糖複合体の特徴付け
Ａ．ＭＡＬＤＩ分析：複合体の平均分子サイズを、標準物質としてＣＲＭ１９７を用いてマトリックス−支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析によって決定し、ＣＲＭ１９７分子ごとでの平均オリゴサッカライド付着物を計算する。
Ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：複合体を変性条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）によって決定した。試料を６×ＳＤＳ試料ローディングダイで調製した。電気泳動を１２０Ｖおよび２５ｍＡで１時間３０分、電極バッファーで行い、クマシーブリリアントブルーＲ２５０を用いて染色した。
タンパク質評価
タンパク質濃度を、製造業者の指示に従って、マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）（サーモ−サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ−ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国）を用いて評価した。試料をＰＢＳで調製し、等量の試薬混合物（Ｂ：Ｃ：Ａ  ２４：１：２５）と混合した。プレートを３７℃でインキュベートし、吸光度を５６０ｎｍで測定した。標準カーブを、キットで提供された公知のＢＳＡ濃度と共にプロットした。
複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２の合成
上述の手順に従って、複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を合成した。複合体を標準物質として公知の量のＢＳＡを用いて評価し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、非複合体化ＣＲＭ１９７と比較して糖複合体の高質量の方へのシフトを確認した（図４Ａおよび図４Ｂ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を、オリゴサッカライド対ＣＲＭ１９７モル比を決定するために使用した（図４Ｃ）。複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２の質量分析は、平均して７〜８分子のヘキササッカライド２が１分子のＣＲＭ１９７にロードされたことを明らかにした。
【０１８２】
【化６３】
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Ｂ．生物学的評価
実施例Ｂ．１：マウス免疫付与およびポリクローナル血清の生成
材料および方法
マウス：６〜８週の老齢雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ近交系マウスを、チャールス  リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）、ズルツフェルト（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）（ドイツ）から得た。動物を静養し、協会の動物倫理ガイドラインに従って取り扱った。
マウス免疫付与およびポリクローナル血清の生成
要約すると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌の６〜８週齢近交系マウスの３グループを、１：１（ｖ／ｖ）アルム（水酸化アルミニウム）アジュバントを用いて乳状化した複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２（投与量当たり３μの糖）を用いて皮下に免疫付与した。１４日、および２８日に、マウスは、１：１（ｖ／ｖ）アルムを用いて乳状化した同量の抗原と共にブースター注射を受けた。一群のマウスを、免疫原性を確認するためだけに複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２（投与量当たり３μの糖）を用いても免疫付与した。マウスを、滅菌の使い捨て血液ランセットを用いて週に一度、顎下に出血させた。対照マウスは、ＰＢＳのみ、およびアルム中のＰＢＳを受けた。抗体応答を、グリカンマイクロアレイおよびＥＬＩＳＡによって両方の血清で測定した。
マイクロアレイスライドの調製：コードリンク（ＣｏｄｅＬｉｎｋ）ＮＨＳ活性化ガラススライド（サーモディクス（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ））を、プリンティングバッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，ｐＨ８．５）中に２つの異なる濃度（１００μＭおよび２００μＭ）の合成グリカンおよびネイティブポリサッカライドと共に、４型被覆ノズルを装備したＳ３ピエゾエレクトリック（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ）マイクロアレイプリンター（サイエニオン（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ）社）を用いることによってスポットした。スポットされたチャンバーの相対湿度を常に６５％に維持した。スポットされたスライドを、加湿チャンバー内で、室温で一晩インキュベートした。スライド上の未反応グループを５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭエタノールアミンｐＨ９．０を用いて室温で１時間ブロックした。続いてスライドを５分間水で３回洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離することによって乾燥し（コンビスライド（ＣｏｍｂｉＳｌｉｄｅ）システム，エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）社）、使用まで４℃で保存した。
マイクロアレイ結合アッセイ：プリントされたスライドを、１時間室温でＰＢＳ−ＢＳＡ（１％）を用いてブロックし、ＰＢＳを用いて３回洗浄した。スライドを、使用前に１２００ｒｐｍで５分間、遠心分離によって乾燥した。フレックスウェル（ＦｌｅｘＷｅｌｌ）６４（グレースバイオ−ラボズ（Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）社  ベンド，オレゴン州，米国）グリッドをマイクロアレイスライドに適用した。スライドを、複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２に対してマウスから調達されたポリクローナル血清と共に複数の希釈でインキュベートし、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈し、加湿チャンバー内で１時間、室温でインキュベートした。スライドを、ＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０含有ＰＢＳ）を用いて３回洗浄し、遠心分離（３００×ｇ，５分）によって乾燥した。スライドを、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｗ／ｖ）で希釈された蛍光標識ヤギ抗−マウス二次抗体（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）と共に、加湿チャンバー内で１時間室温でインキュベートし、ＰＢＳＴを用いて三回洗浄し、脱イオン化水を用いて一度リンスし、ジーンピックス（ＧｅｎｅＰｉｘ）４３００Ａマイクロアレイスキャナー（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社、サニーベール、カリフォルニア州、米国）を用いてスキャンニングする前に、遠心分離（３００×ｇ、５分）によって乾燥した。画像分析をジーンピックス（ＧｅｎｅＰｉｘ）プロ（Ｐｒｏ）７ソフトウェア（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社）を用いて行った。光電子増倍管（ＰＭＴ）電圧を、スキャンが飽和信号なしであるように調節した。
結果：
複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２に対する抗体応答を分析するために、複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を用いて免疫付与されたマウスから調達された高度免疫血清は、合成オリゴサッカライドおよびポリサッカライドでプリントされたマイクロアレイスライドに異なる希釈で行われた。マイクロアレイデータは、免疫付与の前および後に毎週行われた分析によって示されるように、複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２が、マウスにおいて免疫原性となり、強い抗体応答を示すということを確認した（図４Ｂ）。興味深いことに、ヘキササッカライド２特異的血清抗体レベルは、免疫付与後に徐々に増加し、強化（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）後の強い誘導を観察し、ネイティブポリサッカライドとの反応性を示した。ヘキササッカライド２特異的抗体は、スライドにプリントされたヘキササッカライド２の他の断片とも交差反応した（図４Ｂ）。したがって、マイクロアレイ分析は、ヘキササッカライド２がマウスにおいて免疫原性であり、交差反応性抗体を誘導することを証明する。
実施例Ｂ．２：抗体の交差反応性の評価
ＥＬＩＳＡ：複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２で免疫付与されたマウスから調達された抗体の交差反応性を、ＥＬＩＳＡによって、Ｓ．ニューモニアエ血清型２の莢膜ポリサッカライド（ＣＰＳ）を用いて分析した。９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社、ニューヨーク）を、リン酸バッファー生理食塩水、ｐＨ７．４にＣＰＳ（ウェル当たり１０μｇ／ｍｌで５０μｌ）を有する溶液と共に４℃で一晩被覆した。プレートをＰＢＳ含有０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（ＰＢＳＴ）を用いて三回洗浄し、室温で１時間２％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いてブロックした。ＰＢＳＴを用いて三回洗浄後、プレートを、５００分の１希釈液から出発して２倍希釈のプール血清と共に、室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴを用いて４〜５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体化ヤギ抗−マウスＩｇ抗体（０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳの１００００分の１希釈）と共にさらにインキュベートし、続いて室温で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴを用いて徹底的に洗浄し、１−ステップウルトラＴＭＢ（１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ）（サーモフィッシャーサエインティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ．）社、米国）を用いて展開した。反応を、２％Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止し、吸光度を４５０ｎｍで記録した。
結果：
ＥＬＩＳＡデータは、複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２のみを用いてワクチン接種されたマウス、またはＰＢＳ（ＰＢＳ＋アルムまたはＰＢＳのみ）を用いて免疫化されたマウスと比較して、アルムを用いる複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２は、高力価のＣＰＳ特異的抗体を誘導したことを示した（図６Ａ参照）。
実施例Ｂ．３：オプソニン食作用殺害アッセイ（Ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）
Ｓ．ニューモニアエ血清型２株３９（ＮＣＴＣ７４６６）を、高度免疫血清を用いて１５分、３７℃でプレ−オプソニン化し、区別されたＨＬ−６０細胞（ＤＳＭＺ（ドイツ細胞バンク）  ｎｏ．ＡＣＣ３）と１：４００比率（細菌：ＨＬ−６０細胞）でインキュベートした。幼若ウサギ補体（セダーレーン（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）社、カナダ、ｃａｔ＃ＣＬ３４４１−Ｓ）を補体源として使用した。全混合物を撹拌しながら４５分、３７度でインキュベートした。貪食能を２０分間氷上で混合物を保つことによって止め、生存率を、５％羊血液プレートを有するコロンビア寒天基礎培地上にプレーティングすることによって評価した。肺炎球菌の致死率を、対照血清と比較して、得られた生存肺炎球菌コロニーに基づいて計算した。
【０１８３】
結果は、抗−複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２抗体は、対照グループと比較して非常に高い殺菌活性を示したことを示唆する（図６Ｂ）。これらの結果は、複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２は、機能的な免疫応答を誘導することによって、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で肺炎球菌の致死に貢献したという考えを支持した。
実施例Ｂ．４：複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を用いてのワクチン接種は、Ｓ．ニューモニアエを用いての鼻腔内チャレンジに対してマウスにおいて完全な保護を提供する。
【０１８４】
７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１１）を、ＰＢＳ中に水酸化アルミニウム（１２５ｍｇＡｌ）を有する、または有しない複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２（投与当たり２．２μｇ糖）を用いて０日、１４日、および２８日目に皮下に免疫付与した。二つの対照グループ（ｎ＝１１）は、ＰＢＳのみ、およびＰＢＳ＋水酸化アルミニウム（１２５ｍｇＡｌ）を受けた。他のシェイム（ｓｈａｍｅ）グループ（ｎ＝１１）は、バックグラウンドをマイナスにするためにＰＢＳのみを投与された。二回目のブースター後の一週、マウスに、マウス毎に１×１０７ｃｆｕのＤ３９株型を用いて鼻腔内チャレンジした。シェイムグループは、鼻腔内にＰＢＳのみを受けた。動物を１２時間毎に観察した。チャレンジ後３６時間のマウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、滅菌条件で安楽死させた。細菌負荷を肺および血液で分析した。洗い流された肺を均質化し、単一細胞懸濁液を注射器の助けを伴って調製した。肺胞および血液からの肺炎球菌を、血液寒天培地上にプレーティングすることによって数えた。
【０１８５】
コロニー形成単位データ（ＣＦＵ）は、複合体ＣＲＭ１９７−ヘキササッカライド２を用いてワクチン接種されたマウスが、ＰＢＳ投与マウスと比較して、鼻腔内チャレンジに対してＣＦＵ数は重大に減少し（図７Ａおよび７Ｂ参照）、鼻腔内チャレンジに対する抗体媒介保護は、活性保護モデルにおいて達成されたことを示すことを示唆した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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