(57)【要約】  本明細書中で、ドロップレット添加物として、又はＤＭＦ駆動電極表面をコートするために使用される、界面活性剤添加物である、１６個のエチレンオキシドリピートユニット及び１８個のプロピレンオキシドリピートユニットを有するエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール（テトロニック９０Ｒ４としてその商品名により知られる）が開示され、それはデジタルマイクロ流体チップ上で高いタンパク質含有量の液体（例えば、全血）を扱う能力を劇的に改良する。この界面活性剤は、これまで不可能であった程度にＤＭＦ電極表面のタンパク質吸着及びファウリングを予防する。特に、この界面活性剤は、希釈されていない全血のドロップレット操作を、電極あたり＞１時間の間（任意の既知添加物で可能であるものより＞１５０倍良い）可能にする。高いタンパク質含有量媒体を扱うことにおけるこの改良は、デジタルマイクロ流体プラットフォーム上の血液ベースの診断法を革命的に変化させるであろう。【選択図】図２
2019518969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中で（１６個のエチレンオキシドリピートユニット及び１８個のプロピレンオキシドリピートユニットを有する）エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールを混合すること又は溶解させること：
を含む、タンパク質を含む流体を処理する間デジタルマイクロ流体電極のファウリングを予防する方法。
【請求項２】
エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールが少なくとも０．０２％ｗｔ：ｗｔの量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流体が血液であり、かつエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールが約０．０２％〜約０．４％ｗｔ：ｗｔの範囲で存在し、それ以上で溶血が始まる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
液体ドロップレットが乾燥された界面活性剤と接触する際に、エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールが前記液体ドロップレット中で少なくとも０．０２％ｗｔ：ｗｔの量で存在するように、それが可溶化されるようになるように、あらかじめ決定されたスポット中で又はデバイス表面全体にわたりコートされるかのいずれかで、一以上の駆動電極をあらかじめ乾燥されたエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール（１６個のエチレンオキシドリピートユニット及び１８個のプロピレンオキシドリピートユニットを有する）でコーティングすること：
を含む、タンパク質を含む流体を処理する間デジタルマイクロ流体デバイス中でデジタルマイクロ流体駆動電極のファウリングを予防する方法。
【請求項５】
前記流体が血液であり、かつエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールが約０．０２％〜約０．４％ｗｔ：ｗｔの範囲で存在し、それ以上で溶血が始まる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
あらかじめ乾燥されたエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール（１６個のエチレンオキシドリピートユニット及び１８個のプロピレンオキシドリピートユニットを有する）でコートされた一以上の駆動電極：
を含む、駆動電極のアレイを有するデジタルマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール（１６個のエチレンオキシドリピートユニット及び１８個のプロピレンオキシドリピートユニットを有する）が少なくとも０．０２％ｗｔ：ｗｔの量で存在するように流体中でエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールを混合すること又は溶解させること：
を含む、表面上でタンパク質を含む流体を処理する間に表面のファウリングを予防する方法。
【請求項８】
化合物が以下の式
【化１】
2019518969.tif 000004
を有するように流体中で化合物を混合すること又は溶解させること：
を含む、タンパク質を含む流体を処理する間デジタルマイクロ流体電極のファウリングを予防する方法であって、
式中、Ｒはｘ個のエチレンオキシドリピートユニット及びｙ個のプロピレンオキシドリピートユニットであり、ｘは約４〜約３２の範囲の整数であり、かつｙは約２〜約３６の範囲の整数である、方法。
【請求項９】
ｘが約８〜約２４の範囲であり、かつｙが約８〜約３０の範囲である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｘが約１２〜約２０の範囲であり、かつｙが約１２〜約２４の範囲である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ｘが約１４〜約１８の範囲であり、かつｙが約１６〜約２０の範囲である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
化合物が以下の式
【化２】
2019518969.tif 000005
を有するように流体中で化合物を混合すること又は溶解させること：
を含む、タンパク質を含む流体を処理する間デジタルマイクロ流体電極のファウリングを予防する方法であって、
式中、ｎは少なくとも２の整数であり、Ｒはｘ個のエチレンオキシドリピートユニット及びｙ個のプロピレンオキシドリピートユニットであり、かつｘは約４〜約３２の範囲の整数であり、かつｙは約２〜約３６の範囲の整数であり、かつＸ及びＹは以下の基
【化３】
2019518969.tif 000006
のいずれか一つである、方法。
【請求項１３】
ｎが２〜４０の範囲の整数である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
化合物が以下の式
【化４】
2019518969.tif 000007
を有するように流体中で化合物を混合すること又は溶解させること：
を含む、タンパク質を含む流体を処理する間デジタルマイクロ流体電極のファウリングを予防する方法であって、
式中、Ｒはｘ個のエチレンオキシドリピートユニット及びｙ個のプロピレンオキシドリピートユニットであり、かつｘは約４〜約３２の範囲の整数であり、かつｙは約２〜約３６の範囲の整数である、方法。
【請求項１５】
化合物が以下の式
【化５】
2019518969.tif 000008
を有するように流体中で化合物を混合すること又は溶解させること：
を含む、タンパク質を含む流体を処理する間デジタルマイクロ流体電極のファウリングを予防する方法であって、
式中、Ｒはｘ個のエチレンオキシドリピートユニット及びｙ個のプロピレンオキシドリピートユニットであり、かつｘは約４〜約３２の範囲の整数であり、かつｙは約２〜約３６の範囲の整数である、方法。
【請求項１６】
化合物が以下の式
【化６】
2019518969.tif 000009
を有するように流体中で化合物を混合すること又は溶解させること：
を含む、タンパク質を含む流体を処理する間デジタルマイクロ流体電極のファウリングを予防する方法であって、
式中、ｎは少なくとも２の整数であり、Ｒはｘ個のエチレンオキシドリピートユニット及びｙ個のプロピレンオキシドリピートユニットであり、ｘは約４〜約３２の範囲の整数であり、かつｙは約２〜約３６の範囲の整数であり、かつＸは
【化７】
2019518969.tif 000010
のいずれか１つである、方法。
【請求項１７】
ｎが２〜４０の範囲の整数である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
化合物が以下の式
【化８】
2019518969.tif 000011
を有するように流体中で化合物を混合すること又は溶解させること：
を含む、タンパク質を含む流体を処理する間デジタルマイクロ流体電極のファウリングを予防する方法であって、
式中、Ｒはｘ個のエチレンオキシドリピートユニット及びｙ個のプロピレンオキシドリピートユニットであって、ｘは約４〜約３２の範囲の整数であり、かつｙは約２〜約３６の範囲の整数であり、かつＸ、Ｙ及びＺは
【化９】
2019518969.tif 000012
のいずれか１つである、方法。
【請求項１９】
化合物が以下の式
【化１０】
2019518969.tif 000013
を有するように流体中で化合物を混合すること又は溶解させること：
を含む、タンパク質を含む流体を処理する間デジタルマイクロ流体電極のファウリングを予防する方法であって、
式中、Ｒはｘ個のエチレンオキシドリピートユニット及びｙ個のプロピレンオキシドリピートユニットであり、ｘは約４〜約３２の範囲の整数であり、かつｙは約２〜約３６の範囲の整数である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本開示は、デジタルマイクロ流体により操作されるドロップレットに添加物として含まれる場合に、これまで不可能であった程度にタンパク質吸着を予防する、両親媒性分子構造の使用に関する。特定の界面活性剤、エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール（テトロニック９０Ｒ４として知られる）は、希釈されていない全血のドロップレットを、電極あたり＞１時間の間（任意の既知添加物について可能であるものより＞１５０倍良い）、操作することを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
背景
血液は、人体から採集される最も重要な臨床標本であり、疾患診断法及び治療モニタリングのために、毎年数億のチューブが、採取されている１。臨床診断法における、一つの長年にわたる課題は、埋め込み可能なセンサー又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断プラットフォームなどの分析デバイスの表面での、血液タンパク質の非特異的な吸着である２。血液の細胞構成成分を除いた後でさえ、残存する流体（すなわち、血漿）は、これらのデバイスのパフォーマンスを妨げ得る高い濃度のタンパク質（＞６０ｇ・Ｌ−１）を有する３。その結果、化学者及び材料科学者は、タンパク質耐性表面の開発にとてつもなく多大な努力を充ててきた４、５。これらの材料は典型的に、しっかり結合している水分子層を表面で形成するような、親水性の、荷電されていない官能基［例えばポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）又はスルホベタイン］を含み、それはタンパク質の吸着を妨げる２。しかしながら、これらの表面は、すべての適用についての万能の解決策ではなく、事実、これらの材料の親水性により、それらは、臨床の診断適用において近年普及してきた流体ハンドリング技術である、デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）には適合しない６〜８。
【０００３】
デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）デバイスにおいて、試料及び試薬は、絶縁された駆動電極の汎用（ｍ×ｎ）アレイ上の電位の適用を介して、ピコリットル〜マイクロリットルサイズの別々のドロップレットの形で操作される（図１ａ）９。ＤＭＦの汎用ジオメトリ及び簡素な作動スキームは、ドロップレット操作：リザーバーから計器で測ること、分けること、混合する（ｍｅｒｇｉｎｇ）こと及び混合すること、のさまざまな組合せを含む一連の「機能」を呼び出す「プログラミング」アプローチを使用するアッセイプロトコルを、使用者が実行することを可能にする（図１ｂ）。ＤＭＦのための、最も多目的であり普及しているデバイスフォーマットは、２プレートコンフィギュレーションであり、それにおいて、ドロップレットは、電極でパターン化された２つの並行な基板の間に挟まれる（図１ａ）。典型的には、ボトムプレートは、絶縁誘電性層（例えば、パリレンＣ、シリコンナイトライド、ＰＤＭＳ又はＳＵ−８）により覆われる（任意の導電性の材料の）駆動電極アレイを収納する。これらの電極は、トッププレートにおける連続した接地電極を参照し、しばしば、光学的に透明な導電性材料である、インジウム  スズ  オキシド（ＩＴＯ）から形成される。スペーサーがトップ及びボトムプレートを分けるのに使用され、それらの間に固定された隙間をもたらす。
【０００４】
ＤＭＦの一つの重大な要求は、ドロップレットと接触する表面がフッ素化された疎水性のコーティング（例えば、ＤｕＰｏｎｔからのテフロンＡＦ（登録商標）、ＡｓａｈｉＧｌａｓｓからのＣｙｔｏｐ（登録商標）、又はＣｙｔｏｎｉｘからのＦｌｕｏｒｏＰｅｌ（登録商標））でコートされて、電極アレイ上を移動する間に水性のドロップレットが経験する摩擦を最小限にしなければならないことである。この疎水性の層の要求は、デバイスを、タンパク質ファウリングの影響を受けやすくさせる。タンパク質含有溶液のドロップレットがデバイス上に置かれると、タンパク質は、表面をファウリングし始め、それを親水性にし（十分なタンパク質分子吸着後に）ドロップレットが移動するのに不向きにする。例えば、ＤＭＦ中の水性ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の最大の可動濃度はたった０．００５ｇ・Ｌ−１であり；このレベルより大きい濃度で、タンパク質は、駆動電極表面を覆う誘電性層に急速に吸着するのでドロップレットが動けなくなる１０、１１。この制限は、ＤＭＦを、標本が少なくとも６０ｇ・Ｌ−１タンパク質を含む血液ベースの臨床の診断適用に、完全に不適当にする。
【０００５】
過去に、ＤＭＦデバイスへのタンパク質吸着の課題を克服するため、２つの戦略が開発された：（１）非導電性の不混和性液体中でドロップレットをカプセルに包むこと、又は（２）水性のドロップレットそれ自体に添加物をドープすること。方法（１）において、デバイスは低粘度流体（典型的にはシリコンオイル）で充填され；このコンフィギュレーション（左、図１ｃ）において、ドロップレット（それは、充填物と不混和性でなければならない）はフィルムによりカプセルに包まれ、それはドロップレットが疎水性の表面と直接的に接触することを予防する。例えば、このアプローチを使用して、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら１２は、最大４０分間の全血の良好な操作を実証し、その後、著者らは、デバイスのパフォーマンスの低下を観察した。
【０００６】
このアプローチの別の変形において、水性のドロップレットは、薄いオイルシェル中でカプセルに包まれ、主に空気で充填されるデバイス上にトランスポートされる（中、２図１ｃ）１３。この水性のオイルコアシェルコンフィギュレーションは、粘性抵抗を低下させ、デバイス中にシリコンオイルを閉じ込めるために必要とされる製造及びパッケージングを排除する。しかしながら、オイルの使用は、分析適用に対し、いくつかの欠点をもたらし得る。第一に、興味のある分析物（例えばタンパク質又は低分子）がオイルフェイズに分割されるかもしれず、それはアッセイパフォーマンスに悪影響を与えクロスコンタミネーションを引き起こし得る。第二に、ヌクレオチドハイブリダイゼーション又は電気化学的検出などのデバイス表面との相互作用を必要とする技術は、ドロップレットを取り囲むオイルバリアによって、妨げられるかもしれない。
【０００７】
ＤＭＦデバイスにおけるタンパク質吸着の効果を制限するのに使用される技術の第二のクラスにおいて、添加物が、タンパク質が表面と相互作用するのを予防するためにドロップレット組成物に含まれる（右、図１ｃ）。デジタルマイクロ流体中でタンパク質吸着を予防するための最も確立された添加物は、プルロニック類である。直鎖トリブロックコポリマーのこのファミリーは両親媒性であり；すなわち、それらは、２つの相対的に親水性のポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）鎖（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）が隣接する、相対的に疎水性のポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）鎖から形成される。水性の溶液に溶解されると、両親媒性の分子（疎水性及び親水性残基の両方を持つ）は、疎水性の表面へのタンパク質及び細胞の吸着を減らすことが知られている；多くの異なる種類のプルロニック類において、この特性は、ＰＰＯ及びＰＥＯ構成成分の長さを変えることにより調整される１４。プルロニック添加物は、ＤＭＦの開発において、抗ファウリング剤として、非常に有益であることが証明されている。例えば、初期の報告において、Ｌｕｋら１０は、低濃度（０．０８％）のプルロニックＦ１２７（１００／６５／１００のＰＥＯ／ＰＰＯ／ＰＥＯ平均鎖長を有する）を含むドロップレットについて、オイルフリーのデバイスでの最大５０ｇ・Ｌ−１のＢＳＡを含むドロップレットの持続的運動を実証した。より体系立てられた研究において、Ａｕら１５は、一連の８つのプルロニック界面活性剤の、ＤＭＦデバイス上の細胞培地（１０％ウシ血清を含む）のドロップレット中のファウリングの減少への適切性を試験した。以前の観察１４と一致して、著者らは、より長い疎水性ＰＰＯ鎖を有するプルロニックが、ドロップレット運動の間のタンパク質吸着を減らすのにより効果的であることを観察した。特に、３０より小さいＰＰＯユニット（Ｆ３８、Ｌ３５及びＬ４４）を持つプルロニック分子は、１０％ウシ胎仔血清を含むドロップレットの移転を可能にせず（表面ファウリングのため）、一方で３０より大きいＰＰＯユニット（Ｆ６８、Ｌ６４、Ｌ６２、Ｌ９２及びＰ１０５）を持つプルロニック分子は、ファウリングに抵抗し、数百のドロップレット操作について運動をサポートした。
【０００８】
これらの初期の報告のため、ＤＭＦのための試薬製剤化におけるプルロニック添加物の包含は、この前途有望な技術を使用する世界中の数百の科学者達の間で、ほとんど普遍的になった。例えば、プルロニックＬ６４は、ＤＭＦが可能にする免疫アッセイのための抗ファウリング添加物として広く使用されるようになった。残念ながら、プルロニック添加物技術は、特に、非常に高い濃度のタンパク質（全血のような）を含む溶液について、不完全なものである。事実、血液を含むＤＭＦ適用への多大な興味にもかかわらず、電極あたり１分より長い間、血液のドロップレット操作を確実に可能にし得る添加物の報告はない１６。これは、親水性のポリマー添加物（米国特許第８，４８１，１２５号を参照）の従来の特性が、５０ｇ・Ｌ−１より多いタンパク質を含む溶液（例えば、全血）のデジタルマイクロ流体操作には不十分であることを示唆する。
【発明の概要】
【０００９】
概要
デジタルマイクロ流体チップ上で高いタンパク質含有量の液体（例えば、全血）を扱う能力を劇的に改良する、独自の分子の構造を有する界面活性剤添加物が、本明細書中で開示される。本明細書中に開示されるこの目的のために高い効果のある界面活性剤は、１６のエチレンオキシドリピートユニット及び１８のプロピレンオキシドリピートユニットを有するエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール（テトロニック９０Ｒ４としてその商品名により知られる）であり、本発明者らによる研究は、この界面活性剤が、これまで不可能であった程度に、タンパク質吸着を予防することを示した。特に、この界面活性剤は、希釈されていない全血のドロップレットの操作を、電極あたり＞１時間の間（任意の既知添加物について可能なものよりも＞１５０倍良い）可能にする。高いタンパク質含有量媒体の操作におけるこの改良は、デジタルマイクロ流体プラットフォーム上での血液ベースの診断法を革命的に変化させるであろう。４つのＲ基を有する界面活性剤の他の態様が、さまざまな基を変化させることによりこの界面活性剤から誘導される。加えて本明細書中で、４つより多いＲ基を有する界面活性剤が開示される。
【００１０】
一態様において、
エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールが約０．０２％〜０．４％ｗｔ：ｗｔの量で存在するようにタンパク質を含む流体中でエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールを混合すること又は溶解すること
を含む、タンパク質を含む流体を処理する間にデジタルマイクロ流体電極のファウリングを予防する方法を提供する。
【００１１】
単純な非特異的乾燥により又は共有結合性の付着を介してエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールでコートされる一以上の駆動電極
を含む、駆動電極アレイを有するデジタルマイクロ流体デバイスも提供する。
【００１２】
以下の詳細な説明及び図面を参照することにより、本開示の機能な及び有利な側面のさらなる理解を実現できる。
【００１３】
以下、図面を参照し、実施形態を例示としてのみ説明する：
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】スタンダードＤＭＦデバイスを示し、（ａ）は、２プレートＤＭＦデバイスの図を示す上面図（左手側）及び側面図（右手側）であり；（ｂ）は、あらかじめプログラムされた電圧シーケンス（左手側）及びリザーバーからのドロップレットを計器で測ることを描写するビデオからの対応するフレーム（右手側）の図式的説明であり；及び（ｃ）は、オイル充填コンフィギュレーション（左）、コアシェルコンフィギュレーション（中）及び混和性添加物を有するオイルフリーのコンフィギュレーション（右）を含む、ＤＭＦ中のタンパク質吸着を予防するための従来型の方法を説明する。
【図２】「スタンダード」テトロニックである、テトロニック１１０７（上）及び「リバース」テトロニックでありその化学名がエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールである、テトロニック９０Ｒ４（下）の化学構造及び分子量（ＭＷ）を示す。
【図３Ａ】左手側にエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールの分子式を示し、右手側に示されるＲ基は、ｘ個のエチレンオキシドリピートユニット及びｙ個のプロピレンオキシドリピートユニットであり、ｘは、約４〜約３２の範囲の整数であり、及びｙは、約２〜約３６の範囲の整数である。
【図３Ｂ１】図３Ａの分子式の代わりに使用してもよい別の分子の分子式を左手側に示し、それにおいて４つのＲ基は、図３Ａの式と同じであり、Ｘ及びＹは、Ｉ〜ＩＸとラベルされる右手側に示される基のいずれか１つであり得る。
【図３Ｂ２】図３Ａの分子式の代わりに使用してもよい別の分子の分子式を左手側に示し、それにおいて４つのＲ基は、図３Ａの式と同じであり、Ｘは、ｉ〜ｖとラベルされる右手側に示される基のいずれか１つであり得る。
【図３Ｂ３】図３Ａの分子式の代わりに使用してもよい別の分子の分子式を示し、それにおいて４つのＲ基は、図３Ａの式と同じであり、それにおいて４つのＲ基は、図３Ａと同じである。
【図３Ｂ４】図３Ａの分子式の代わりに使用してもよい別の分子の分子式を示し、それにおいて４つのＲ基は、図３Ａと同じである。
【図３Ｃ１】図３Ａの分子式の代わりに使用してもよい別の分子の分子式を示し、それにおいて６つのＲ基は、図３Ａと同じであり、Ｘ、Ｙ及びＺは、図３Ｂ１中でＩ〜ＩＸとラベルされる右手側に示される基のいずれか１つであり得る。
【図３Ｃ２】図３Ａの分子式の代わりに使用してもよい別の分子の分子式を示し、それにおいて６つのＲ基は、図３Ａと同じである。
【図４】０．１％テトロニック９０Ｒ４（ａ）又は０．１％プルロニックＬ６４（ｂ）を補われた全血のドロップレットの運動についての代表的な速度プロファイルを示す。実験的データをグレイのドットとしてプロットし；データに対する指数関数的フィットを破線として示す。
【図５】さまざまな濃度のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（ａ）又はテトロニック９０Ｒ４（ｂ）を含むｐＨ８．０緩衝液中の０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルデータを示す。ＣＤの分解能は±０．１度である。
【図６】さまざまな濃度のテトロニック９０Ｒ４を補われた、全血から抽出された血漿の吸光度の棒グラフを示す（ｎ＝３；エラーバーは＋／−１  Ｓ．Ｄ．を表す）。破線は、ビヒクルのみで希釈された血液の吸光度を示し（無溶血）、実線は、１％ＳＤＳで希釈された血液の吸光度を示す（溶血）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
本開示の様々な態様及び局面を、以下に説明する詳細を参照して説明する。以下の説明及び図面は、本開示を説明するものであり、本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。図は縮尺どおりではない。多数の特定の詳細が、本開示のさまざまな態様の完全な理解を提供するために記載される。しかしながら、ある場合には、本開示の態様の簡潔な議論を提供するために、よく知られた又は従来型の詳細は記載されない。
【００１６】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的かつオープンエンドであり、排他的ではないと解釈されるべきである。具体的には、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、指定された特徴、ステップ又は構成要素が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ又は構成要素の存在を排除するものと解釈されるべきではない。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「例示的な」は、「例、事例、又は説明として機能する」を意味し、本明細書に開示される他の構成よりも好ましい又は有利であると解釈されるべきではない。
【００１８】
本明細書で使用する場合、用語「約」及び「およそ」は、特性、パラメータ及び寸法の変化などの、値の範囲の上限及び下限に存在し得る変形をカバーすることを意味する。一の非限定的な例において、用語「約」及び「およそ」は、プラス又はマイナス１０パーセント以下を意味する。
【００１９】
別に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有することが意図される。
【００２０】
界面活性剤である、１６のエチレンオキシドリピートユニット及び１８のプロピレンオキシドリピートユニットを有するエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール（テトロニック９０Ｒ４として知られる）は、希釈されていない全血のドロップレットの操作を電極あたり＞１時間の間（任意の既知添加物について可能であるものより＞１５０倍良い）可能にすることが発見された。テトロニック９０Ｒ４のＤＭＦドロップレット作動への効果の、この驚くべき発見は、本発明者らによる、バイオファウリングを予防する添加物としてのプルロニックファミリー（直鎖トリブロックコポリマー）の代替手段の探索（全血のドロップレットを扱いたいという願望により動機づけられた）から生じた。この探索は、本発明者らにテトロニックと呼ばれる、異なる分子構造を有する両親媒性の界面活性剤のファミリーの研究に導いた。テトロニックは、工業用適用において、消泡剤、湿潤剤、分散剤、増粘剤及び乳化破壊剤として広く使用される１７。ほとんどのテトロニックは、中央のエチレンジアミンリンカーに結合される４つのＰＰＯ−ＰＥＯ「アーム」を有する、「Ｘ」字型分岐ブロックコポリマーである（図２、上は、このファミリーの典型的なメンバーの例である、テトロニック１１０７である）。従って、プルロニックと同様に、テトロニックは、比較的親水性の鎖が隣接する、比較的疎水性のコアを有する。
【００２１】
初期の研究において、本発明者らは、商業的に利用可能なテトロニックのファミリー全体（すなわち、テトロニック１１０７、１３０１、１３０４、１３０７、１５０Ｒ１、３０４、７０１、９０１、９０４、９０８、９０Ｒ４）を、デジタルマイクロ流体により操作されるドロップレット中のタンパク質吸着を減らすそれらの能力についてスクリーニングした。驚くべきことに、これらの初めの試験において、後の分子であるテトロニック９０Ｒ４（Ｔ９０Ｒ４）は、（はるかに標準的な）プルロニック添加物より性能が良いことが観察された、テトロニックファミリーの唯一のメンバーであった。興味深いことに、Ｔ９０Ｒ４は、テトロニックの「リバース」バリアントであり、それにおいて疎水性のＰＰＯブロックは側面にありＰＥＯブロックはコアにある（図２、下）１７。
【００２２】
広い範囲のプルロニックバリアントは、疎水性表面へのタンパク質吸着の割合を減らすのに効果的であることが証明されており、それによりＤＭＦデバイス上でタンパク質リッチな溶液の扱いを容易にする。これらの分子は、同様の構造を有するが、それらのＰＥＯ及び／又はＰＰＯ鎖の長さにおいて異なる。同様に、本発明者らは、他のテトロニックバリアント（特にＴ９０Ｒ４と同様のＰＥＯ／ＰＰＯ鎖長を有するリバースバリアント）も、効果的な抗ファウリング剤であろうことを予期する。
【００２３】
エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロールについての一般的な分子式は図３ａに示され、Ｔ９０Ｒ４はｘ＝１６及びｙ＝１８を有し、この構造の変形はＴ９０Ｒ４と同様のいくらかの有効性を示すであろうことが予期される。例えば、ｘは整数であり、約４〜約３２の範囲であってよく、及びｙは整数であり、約２〜約３６の範囲であってよい（図３ａ）。また、ｘは約８〜約２４の範囲であってよく、ｙは約８〜約３０の範囲であってよい。また、ｘは約１２〜約２０の範囲であってよく、ｙは約１２〜約２４の範囲であってよい。さらに、ｘはまた約１４〜約１８の範囲であってよく、ｙは約１６〜約２０の範囲であってよい。
【００２４】
中央のエチレンジアミンリンカーは、他の適したリンカーにより取り替えられるか又は置換されてよいこともまた、理解されるであろう。非限定的な例は、図３Ｂ１に示される。Ｔ９０Ｒ４におけるリンカーは長い両親媒性のＰＥＯ／ＰＰＯ側鎖と比べて小さい（短い）が、その剛性は側鎖の柔軟性を決定し得、それにより抗ファウリング特性の有効性に影響を及ぼす。いくつかの可能性のある置換リンカーとして、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：（１）さまざまな長さの飽和（すなわち、二重結合のない）直鎖炭素−水素鎖（図３Ｂ１（構造Ｉ）、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル）、この場合、いずれかの末端で炭素は分子の４つの足に架橋する、（２）一以上のアミン基を連続して有する上記のいずれか（図３Ｂ１構造ＩＩ）、（３）一以上のエーテル基（−Ｃ−Ｏ−Ｃ−）を連続して有する上記のいずれか（図３Ｂ１構造ＩＩＩ）、（４）一以上のケトン基（−ＣＯ−Ｃ−）を連続して有する上記のいずれか（図３Ｂ１構造ＩＶ）、（５）一以上のエステル基（−ＣＯ−Ｏ−Ｃ−）を連続して有する上記のいずれか（図３Ｂ１構造Ｖ）、（６）一以上のアミド基（−ＣＯ−ＮＨ−）を連続して有する上記のいずれか（図３Ｂ１構造ＶＩ）、（７）一以上のジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を連続して有する上記のいずれか（図３Ｂ１構造ＶＩＩ）、（８）一以上の酸無水物基（−ＣＯ−Ｏ−ＣＯ−）を連続して有する上記のいずれか（図３Ｂ１構造ＶＩＩＩ）、（９）一以上の二重結合を連続して有する上記のいずれか（−Ｃ＝Ｃ−、図３Ｂ１構造ＩＸ）、（１０）水素がフッ素、塩素、サルフェイト及びフォスフェイトなどの他の側鎖基で取り替えられる、上記のいずれか（図３Ｂ２構造ｉ−ｖ）、（１１）１，２，４，５−ベンゼトテトラメタノール（図３ＣＩ）（１２）２，２−ビス（ヒドロキシメチル）１，３−プロパンジオール（図３Ｃ２）。
【００２５】
４つの（４）長いアーム（ＰＥＯ及びＰＰＯ）が上記図３Ａ、３Ｂ１、３Ｂ２、３Ｂ３及び３Ｂ４で使用されるが、４つ（４）より多いアームを適切な中央のリンカーと共に使用してよいことがまた理解されるであろう。例えば、図３Ｂ１に示されるリンカーのいずれか３つ（３）に連結する中央のアミン、この場合、３つの末端で炭素が合計６つの（６）アームに架橋し、非限定的な例が図３Ｃ１に示される。他のバリアントは、図３Ｂ２に示される他の側鎖基と取り替えられた水素、及び図３Ｃ２に示される最大６つの（６）アームに結合するシロキサンコアを有するＰＥＯ／ＰＰＯアームを含むかもしれない。
【００２６】
タンパク質を含む溶液に界面活性剤を添加する最も一般的な方法としては、それらをＤＭＦチップ上にロードする前に試薬を単純に混合すること（又は界面活性剤−添加物を溶解させること）が挙げられるが、いくつかの代替手順をその代わりに使用してもよい。これらとしては、液体が乾燥された界面活性剤と接触する際に可溶化するように、あらかじめ決定されたスポットにおいて又はデバイス表面全体にわたりコートして、ＤＭＦデバイス表面上に、本明細書中に開示される界面活性剤をあらかじめ乾燥することが挙げられるが、これらに限定されない。かかる方法は、任意のさらなる試料処理なしに、生物学的試料の直接的な添加（例えば、指の刺し傷から）をサポートするＤＭＦチップを作成するのに特に魅力的かもしれない。
【００２７】
テトロニック９０Ｒ４、及びマイクロ流体免疫アッセイ１８において一般に使用される界面活性剤であるプルロニックＬ６４の直接の比較において、本発明者らは、テフロン−パリレンＣ−コートされるデジタルマイクロ流体デバイス上でヒツジ全血−ＥＤＴＡ（０．１％のＴ９０Ｒ４又はＬ６４を補われた）のドロップレットを操作するそれらの能力を試験した（図４）。各実験において、２０μＮ・ｍｍ−１の力を適用して、最大４０分の間（電極あたり２０分に等しい）、一組の電極の間で１μＬドロップレットを動かした。各実験の間、ドロップレットの速度をインピーダンストラッキングを介してモニタリングした１９。予期されるように（以前の経験から）、Ｌ６４を補った血液のドロップレットは、デバイスが不可逆的にファウリングするようになる前の短い期間の間、移動できたのみであった。対照的に、Ｔ９０Ｒ４を添加したドロップレットは、全実験を完了できた。指数関数的減衰を用いて速度プロファイルを推定し、ドロップレットスピード（ｄｘ／ｄｔ）が１ｍｍ・ｓ−１になる時間としてｔＬ（デバイス寿命）を定義して、本発明者らは、Ｔ９０Ｒ４のデバイス寿命がＬ６４より〜１５０倍長い（６０．４対０．４分）ことを観察した。これは類まれな結果であり、全血において免疫アッセイを実行できる（テトロニック９０Ｒ４を補われたドロップレットについて）かできない（プルロニックＬ６４を補われたドロップレットについて）かの差を表し、それは米国特許第８，４８１．１２５号の教示を超える顕著な飛躍である。
【００２８】
進行中の実験において、高いタンパク質濃度の水性溶液を含むドロップレットが、テトロニック９０Ｒ４を補われた場合に長い期間動くことができるが、さまざまなプルロニック又は他の（非「リバース」又は「スタンダード」）テトロニックを補われた場合には、動くことができない（又は非常に短い期間の間動くことができるのみである）という図４に示される傾向が、多くの回数再現された（データは示さず）。本発明者らは、この方法が、全血、血清、血漿、細胞培地、組織抽出物、唾液、脳脊髄液、羊水、汗、涙、皮脂、尿などを含む（がこれらに限定されない）任意のタンパク質リッチな溶液についてデバイス寿命を増加させるのに非常に有益であろうことを提唱する。
【００２９】
従って、いかなる理論に束縛されることなく、本発明者らは、２つの一般的な現象がバイオファウリングの減少に関連するかもしれないと仮定する。第一に（１）、Ｔ９０Ｒ４ユニマーは、タンパク質分子が「コートされる」ようになり、従って表面上に吸着できないような、タンパク質分子との錯体形成（ミセルとして、又は単にタンパク質分子との一以上の界面活性剤分子の相互作用により）により、デバイス表面へのタンパク質吸着を減らすと考えられる。第二に（２）、Ｔ９０Ｒ４ユニマーは、インターフェイスで接触し吸着される層を形成することにより、従って溶液中のタンパク質分子から表面を「遮蔽すること」により、デバイス表面へのタンパク質吸着を減らすと考えられる。本発明者らは、２つのデータセット（以下の段落において説明される）を収集し、現象２（すなわち、インターフェイスでの遮蔽）がバイオファウリングの減少における主要な原因であり得ることを示唆する。
【００３０】
第一のデータセットにおいて、本発明者らは、タンパク質の分子配置がＴ９０Ｒ４の存在により変化しないことを観察し、それは現象１（すなわち、界面活性剤−タンパク質錯体形成）が起こりそうにないことを示唆する。界面活性剤−タンパク質錯体形成は、しばしばタンパク質の分子再配置（すなわち、タンパク質構造における変化）と関連する。例えば、タンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と混合する場合、２つの種は分子複合体を形成することが知られており、これはＢＳＡの構造において変化をもたらす。図５に説明するように、円偏光二色性（ＣＤ）実験を用いて、タンパク質構造変化を調べることができる。図５ａにおいて、０．１ｇ・Ｌ−１ＢＳＡ（ＳＤＳなし）のスペクトルは、１、２、２．５、４、又は６ｍＭ  ＳＤＳ［この濃度幅は、ＢＳＡを含むＰＢＳ中のＳＤＳについての臨界凝集濃度（ＣＡＣ）及び臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）のそれぞれ上下に広がるよう選択されたことに留意する］と混合した０．１ｇ・Ｌ−１ＢＳＡのスペクトルと明瞭に異なるＣＤスペクトルを有する。対照的に、図５ｂにおいて、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｔ９０Ｒ４なし）のスペクトルは、０．０００５％、０．００１％、０．０１％、０．１％又は１％  Ｔ９０Ｒ４（ｗ／ｖｏｌ）（この濃度幅は、ＢＳＡを有するＰＢＳ中でＴ９０Ｒ４についてのＣＡＣ及びＣＭＣのそれぞれ上下に広がるよう選択されたことに留意する）と混合した０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡから生じるものとほとんど同じＣＤスペクトルを有する。これらのデータは、ＢＳＡ及びＴ９０Ｒ４間に錯体形成がない、又はある場合には、タンパク質確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）は影響されないことを示唆する。
【００３１】
第二のデータセットにおいて、本発明者らは、タンパク質に対する界面活性剤の低いモル比（１：１０より小さい）が抗ファウリングに十分であること及び一定比を維持することはデジタルマイクロ流体中で同じドロップレット運動パフォーマンスを生じないことを観察し、それは現象１（界面活性剤−タンパク質錯体（ｃｏｍｐｌｅｘｉｏｎ））が起こりそうにないことを再び示唆する。タンパク質分子が界面活性剤分子と複合体を形成することによりデバイス表面に吸着することを予防される場合、２つの種のモル比が少なくとも１：１（界面活性剤：タンパク質）であることをまず予期するであろう。この場合、所与の比がファウリングを減らすよう決定されるならば、この比は、たとえ種の絶対濃度が変化しても同様の効果を有するであろう（例えば、１０ｍＭ界面活性剤及び１ｍＭタンパク質は、１００ｍＭ界面活性剤及び１０ｍＭタンパク質と同じように振る舞うはずである）と、さらに推測するかもしれない。ＤＭＦデバイス上でドロップレット操作を用いる予備実験は、この考えを支持しない。［この研究では、ドロップレットは新品のテフロン−ＡＦ表面にわたり直ちに移動すると知られるため、「運動」は、減少したファウリングの代わりとなるものである。同様に、ドロップレットは吸着されたタンパク質でファウリングした表面上で「動きが取れな」くなると知られるため、「無運動」は、ファウリングの増加の代わりとなるものである。また、少なくとも一の「無運動」結果が観察されることを確かにするため、Ｔ９０Ｒ４の濃度を、全血（０．１％ｗｔ／ｖｏｌ）を移動させるために必要な濃度より少なくとも１０倍低いよう選んだ。］表１に示すように、Ｔ９０Ｒ４及びＢＳＡの（さまざまな濃度での）５つの異なる組合せから形成されたドロップレットを、ＤＭＦデバイス上で１ｍｍ／ｓで移動するそれらの能力について評価した。興味深いことに、１：２２．４の同じモル比を有する３つの条件は、異なる結果を生じた。最も重要なことに、これらの条件のすべては１：１（界面活性剤：タンパク質）よりもかなり低いモル比を有するが、条件のうち２つはロバストなドロップレット運動をもたらした。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
上記データに基づき、本発明者らは、Ｔ９０Ｒ４はインターフェイスで接触する遮蔽層を形成することにより表面ファウリングを主に減らすこと、及び２つの特徴（以下の段落において説明される）がＴ９０Ｒ４バリアントの優れたパフォーマンスに必要であることを仮定する。これらの２つの特徴の組合せは、結び付いて液体／表面インターフェイスでのＰＥＯ／ＰＰＯブロックコポリマー鎖の独自に構造化された３Ｄ組織を生み出すようであり、この構造は疎水性の表面を有するタンパク質の相互作用を予防するのに特に効果的であるようである。
【００３４】
従って、いかなる理論に束縛されることなく、本発明者らは、テトロニック９０Ｒ４について観察される独自の特性は、その分子の構造：（１）そのＸ構造（Ｔ９０Ｒ４は、直鎖トリブロック構造を有する全ての知られるプルロニックバリアントより優れている）、及び（２）ＰＥＯ及びＰＰＯブロックの相対位置（ＰＰＯブロックがＰＥＯブロックに隣接するリバースバリアントＴ９０Ｒ４は、通常のＴ９０４バリアントよりかなり優れたパフォーマンスを有する）に関連すると仮定する。Ｔ９０Ｒ４のこの「リバース」オリエンテーションは、分子が固体−液体インターフェイスで高く秩序だった層を形成することを可能にするようであると考えられる。液体／表面インターフェイスでのこれらの界面活性剤分子の構造組織は、タンパク質が疎水性の表面と相互作用するのを予防するのに特に効果的であるようである。従って、これらの２つの特徴の組合せは、結び付いて液体／表面インターフェイスでのＰＥＯ／ＰＰＯブロックコポリマー鎖の構造化された独自の３Ｄ組織を生み出し、及びこの構造は疎水性表面とタンパク質との相互作用を予防するのに特に効果的であるようである。
【００３５】
２つの商業的に利用可能な「リバース」バリアント（テトロニック９０Ｒ４及び１５０Ｒ１）のみが存在するため、Ｔ９０Ｒ４がタンパク質吸着の予防に全体に最適であるかどうかを予測することは困難である；しかしながら、７０Ｒ４、１１０Ｒ４、９０Ｒ３、又は９０Ｒ５バリアントを合成するならば、それらが同様の又はより良いパフォーマンスを達成するかもしれないことが予期される。
【００３６】
典型的に０．０１〜０．２％ｗ／ｖのＴ９０Ｒ４がＤＭＦデバイス上に液体をロードする前にタンパク質を含む液体に添加されたが、一般に、より高い濃度の界面活性剤はタンパク質吸着の比率をさらに減少し（それによりデバイス寿命を延ばす）であろうが、濃度が高過ぎる場合、それは全血の場合に溶血（血液細胞の溶解）、又は細胞増殖媒体の場合には、細胞毒性を引き起こし得ることが理解されるであろう。界面活性剤はまた、チップ上にロードされるとすぐに界面活性剤が試料中で自動的に再構成されるように、便宜上ＤＭＦチップ上にあらかじめ乾燥され得る。
【００３７】
血液ベースの診断法についての重要な懸念事項は、全血標本の溶血であることに留意されたい。溶血は、それがそうでなければ細胞内に含まれる、臨床のアッセイを妨げ得る構成成分を放出するため、通常望ましくない。従って、本発明者らは、さまざまなＴ９０Ｒ４の最終濃度で、テトロニック９０Ｒ４を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をヒツジ全血と混合することにより（Ｔ９０Ｒ４：血液１：８を含むＰＢＳ）、この効果を試験した。これらの混合物を室温で１時間インキュベートした後、血漿を遠心分離（５００ｇ／５分）により抽出し、放出されたメトヘモグロビンを６３０ｎｍで血漿吸光度を測定することにより決定した。図６に示すように、＜０．４％テトロニック９０Ｒ４を補われた試料について、感知できる溶血は観察されなかった。これは、テトロニック９０Ｒ４が、全血中の非溶血性アッセイと適合する適切性を裏付ける。
【００３８】
従って、結論として、添加物としてエチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール（テトロニック９０Ｒ４）を含むこと（又はそれを表面上にあらかじめコーティングすること）は、そうでなければ数秒間を超えて移動させることが不可能である、高いタンパク質含有量の溶液（例えば、全血）の操作を可能にするという点で、非常に有利であることが示された。この界面活性剤の使用は、全てのタンパク質を含む溶液に対しＤＭＦデバイス寿命を延ばすよう作用し、この界面活性剤を使用して他のシステム（例えば、チャネル及び／又は２−フェイズマイクロ流体）でのバイオファウリングを減らし得ることが予期される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ１】
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【図３Ｂ２】
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【図３Ｂ３】
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【図３Ｂ４】
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【図３Ｃ１】
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【図３Ｃ２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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