(57)【要約】  本発明は、ポリエチレングリコール誘導体及びその用途に関する。
2019515972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（１）で示される化合物、その立体異性質体、またはその薬学的に許容可能な塩：
【化１】
2019515972.tif 000055
・・・（１）
（前記化学式（１）において、
Ｒ1は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ6−Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5−Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びこれらの誘導体からなる群から選択され、
Ｌ1〜Ｌ3は、それぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレンであり、
Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンであり、
ｎは１０〜２４００の自然数である）。
【請求項２】
前記Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド、チオールまたはヨードである、請求項１に記載の化合物、その立体異性質体、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３】
前記Ｒ1はアルデヒドである、請求項１に記載の化合物、その立体異性質体、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
前記Ｒ1及びＲ2は、互いに異なる官能基を有する、請求項１に記載の化合物、その立体異性質体、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項５】
前記化合物は、下記化学式（２）で示される、請求項１に記載の化合物、その立体異性質体、またはその薬学的に許容可能な塩：
CHO-(CH2)j-O-(CH2CH2O)n-(CH2)m-NH(CO)-(CH2)k-R2  ・・・（２）
（前記化学式（２）において、
ｎは１０〜２４００の自然数であり、
ｊ、ｍ及びｋは、それぞれ独立して１〜６の自然数であり、
Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide, OPSS）、チオール、またはハロゲンである）。
【請求項６】
前記化合物は、下記化学式（６）〜（１１）からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物、その立体異性質体、またはその薬学的に許容可能な塩：
【化２】
2019515972.tif 000056
・・・（６）
【化３】
2019515972.tif 000057
・・・（７）
【化４】
2019515972.tif 000058
・・・（８）
【化５】
2019515972.tif 000059
・・・（９）
【化６】
2019515972.tif 000060
・・・（１０）
【化７】
2019515972.tif 000061
・・・（１１）
（前記化学式（６）〜（１１）において、ｎは１０〜２４００の自然数である）。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項によるポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドを反応させ、ポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドを製造する工程を含む、
ポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
Ｒ2に位置したオルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンが生理活性ポリペプチドのシステイン残基に位置したチオール基と反応する、請求項７に記載のポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
さらに、ポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドを精製する工程を含む、請求項７に記載のポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
前記生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、インスリン分泌ペプチド、ニューロペプチド（neuropeptide）、脳下垂体ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウイルスペプチド、生理活性を有する非天然型ペプチド誘導体、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択される、請求項７に記載のポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
前記生理活性ポリペプチドは、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、ＰＹＹ（peptide YY）、ＮＰＹ（neuropeptide Y）、ＧＬＰ−１（Glucagon-like peptide-1）及びＧＬＰ−２（Glucagon-like peptide-2）のようなグルカゴン様ペプチド、エキセンジン−３（Exendin-3）、エキセンジン−４（Exendin-4）、オキシントモジュリン（Ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチド、繊維芽細胞成長因子（Fibroblast growth factor）、グレリン（Ghrelin）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（Corticotropin）、エレドイシン（Eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（Oxytocin）、バソプレシン（vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、セクレチン（secretin）、セルモレリン（Sermorelin）、ヒト成長ホルモン（hGH）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（GCSF）類、インターフェロン（IFN）類、インターロイキン（Interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン（Orexin）、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（Cholecystokinin）、ガストリン阻害ペプチド、カルモジュリン、ガストリン放出ペプチド（Gastric releasing peptide）、モチリン（Ｍｏｔｉｌｉｎ）、血管作動性腸管ペプチド（Vasoactive intestinal peptide）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（Atrial natriuretic peptide；ANP）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（B-type natriuretic peptide；BNP）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-type natriuretic peptide；CNP）、ニューロキニン（Neurokinin）Ａ、ニューロメジン（Neuromedin）、レニン（Renin）、エンドセリン（Endothelin）、サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin peptide）、カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin peptide）、デモルフィン（Dermorphin）、ダイノルフィン（Dynorphin）、エンドルフィン（Endorphin）、エンケファリン（Enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ阻害剤、チモポエチン（Thymopoietin）、チムリン（Thymulin）、チモペンチン（Thymopentin）、チモシン（Tymosin）、胸腺体液性因子（Thymic humoral factor）、アドレノメデュリン（Adrenomedullin）、アラトスタチン（Allatostatin）、アミロイドベータ−プロテイン断片（Amyloid beta-protein fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（Leucokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）及びフューゼオン（Fuzeon）、インターフェロン受容体、Ｇプロテイン関連受容体（Gprotein-coupled receptor）、インターロイキン受容体、酵素類、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、ア���ジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン抑制剤、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、リラキシン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片、赤血球増殖因子、白血球増殖因子、アミリン及びそのアナログからなる群から選択される、
請求項７に記載のポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
（ａ）請求項１〜６のいずれか一項によるポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドまたはキャリアタンパク質のいずれか一つを反応させて生理活性ポリペプチドまたはキャリアタンパク質が、一方の末端に付着し、他方の末端に反応基（reactive end group）を有する、ポリエチレングリコール化合物を製造する工程；及び
（ｂ）前記（ａ）工程で製造された、生理活性ポリペプチドまたはキャリアタンパク質が、一方の末端に付着し、他方の末端に末端反応基を有する、ポリエチレングリコール化合物とキャリアタンパク質または生理活性ポリペプチドの他の一つを反応させて前記ポリエチレングリコール化合物の末端反応基にキャリアタンパク質または生理活性ポリペプチドを連結させて生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質が、ポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、結合体を製造する工程を含む、
生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質がポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、結合体の製造方法。
【請求項１３】
前記生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、インスリン分泌ペプチド、ニューロペプチド（neuropeptide）、脳下垂体ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウイルスペプチド、生理活性を有する非天然型ペプチド誘導体、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択される、
生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質が、ポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、請求項１２に記載の結合体の製造方法。
【請求項１４】
前記（ａ）工程のポリエチレングリコール化合物は、下記化学式（１）の構造を有する、
生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質が、ポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、請求項１２に記載の結合体の製造方法：
【化８】
2019515972.tif 000062
・・・（１）
（前記化学式（１）において、
Ｒ1はアルデヒド基であり、
Ｌ1〜Ｌ3は、それぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレンであり、
Ｒ2はオルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンであり、
ｎは１０〜２４００の自然数である）。
【請求項１５】
（ａ）工程は、前記化学式（１）の構造を有するポリエチレングリコール化合物のＲ2を生理活性ポリペプチドのシステイン残基に位置したチオール基と反応させる、
生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質が、ポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、請求項１４に記載の結合体の製造方法。
【請求項１６】
（ｂ）工程は、ポリエチレングリコール化合物の末端アルデヒド基をキャリアタンパク質のアミン基と反応させる、
生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質がポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、請求項１５に記載の結合体の製造方法。
【請求項１７】
前記製造方法は、さらに生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質がポリエチレングリコール化合物を通じて連結された結合体を精製する工程を含む、
生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質がポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、請求項１２に記載の結合体の製造方法。
【請求項１８】
前記キャリアタンパク質は、アルブミン及びその断片、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカリド（saccharide）、またはエラスチンである、
生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質がポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、請求項１２に記載の結合体の製造方法。
【請求項１９】
前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ断片である、生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質がポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、請求項１８に記載の結合体の製造方法。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか一項の化合物が付着した、生理活性ポリペプチド。
【請求項２１】
前記化合物が付着した、生理活性ポリペプチドは下記化学式（１５）〜（１７）のいずれか一つで示される構造を含む、請求項２０に記載の生理活性ポリペプチド：
R1-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-L3-S-S-X  ・・・（１５）
R1-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-CH2-S-X  ・・・（１６）
X-NHCH2-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-L3-R2  ・・・（１７）
（前記化学式（１５）〜（１７）において、
Ｒ1は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ6−Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5−Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びこれらの誘導体からなる群から選択され、
Ｌ1〜Ｌ3は、それぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレンであり、
ｎは１０〜２４００の自然数であり、
Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンであり、
Ｘは、生理活性ポリペプチドの一部分である）。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれか一項の化合物の両末端の反応基に、それぞれ生理活性ポリペプチド及びキャリアタンパク質が付着した、結合体。
【請求項２３】
前記結合体は、下記化学式（１８）または（１９）で示される構造を有する、請求項２２に記載の結合体：
Y-NHCH2-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-L3-S-S-X  ・・・（１８）
Y-NHCH2-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-CH2-S-X  ・・・（１９）
（前記化学式（１８）及び（１９）において、
Ｌ1〜Ｌ3はそれぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレンであり、
ｎは１０〜２４００の自然数であり、
Ｘは生理活性ポリペプチドの一部分であり、
Ｙはキャリアタンパク質の一部分である）。
【請求項２４】
前記キャリアタンパク質は、アルブミン及びその断片、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカリド（saccharide）、またはエラスチンである、請求項２２に記載の結合体。
【請求項２５】
前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ断片である、請求項２４に記載の結合体。
【請求項２６】
（ａ）ポリエチレングリコールの一方の末端に２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ6−Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5−Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びこれらの誘導体からなる群から選択されるＲ1を導入する工程；及び
（ｂ）前記ポリエチレングリコールの他方の末端に−ＮＨ（ＣＯ）Ｌ3−Ｒ2構造を導入する工程を含み、ここで、Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide, OPSS），チオール、またはハロゲンである、請求項１の化合物の製造方法。
【請求項２７】
化学式（２０）で示される化合物から化学式（２１）で示される化合物を準備する第１の工程；
化学式（２１）で示される化合物から化学式（２２）で示される化合物を準備する第２の工程；及び
化学式（２２）で示される化合物を酸溶液で処理して末端のジエトキシメチルをアルデヒドに転換する第３の工程を含む、請求項２６に記載の製造方法：
【化９】
2019515972.tif 000063
・・・（２０）
（式中、ｎ’はｎまたはｎ＋１である）
【化１０】
2019515972.tif 000064
・・・（２１）
【化１１】
2019515972.tif 000065
・・・（２２）
（式中、前記Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、ｎ及びＲ2については、請求項１に記載された通りである）。
【請求項２８】
前記第１の工程の化学式（２０）で示される化合物は、下記化学式（２３）で示される化合物をメタンスルホニルクロリドと反応させて準備する、請求項２７に記載の製造方法：
【化１２】
2019515972.tif 000066
・・・（２３）
【請求項２９】
前記第１の工程は、化学式（２０）で示される化合物をアンモニア水溶液及び塩化アンモニウムと反応させることにより行う、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項３０】
前記第１の工程は、化学式（２０）で示される化合物をヒドロキシアルキルテトラヒドロピラニルエーテルと反応させて化学式（２４）で示される化合物を製造する第１−１工程；
化学式（２４）で示される化合物をｐ−トルエンスルホン酸と反応させて末端のテトラヒドロピラニルオキシ基をヒドロキシ基に置換する第１−２工程；
以前の工程から得られた化合物をメタンスルホニルクロリドと反応させてヒドロキシ基をメタンスルホン酸基に転換する第１−３工程；及び
以前の工程から得られた化合物をアンモニア水溶液及び塩化アンモニウムと反応させる第１−４工程を含めて行う、請求項２７に記載の製造方法：
【化１３】
2019515972.tif 000067
・・・（２４）
【請求項３１】
前記第２の工程は、化学式（２１）で示される化合物を、下記化学式（２５）で示される化合物と反応させて行う、請求項２７に記載の製造方法：
【化１４】
2019515972.tif 000068
・・・（２５）
【請求項３２】
前記第２の工程は、化学式（２１）で示される化合物をクロロ（Ｃ2−Ｃ7アルカノイル）クロリドと反応させて中間体として下記化学式（２６）で示される、末端にクロロ基を含む化合物を合成した後、硫化水素ナトリウムの存在または不在の下でハロゲン金属塩と反応させてクロロ基をチオールまたはハロゲンに転換して行う、請求項２７に記載の製造方法：
【化１５】
2019515972.tif 000069
・・・（２６）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコール誘導体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリエチレングリコール（Polyethylene glycol、PEG）は、高い体内半減期を有し、抗原性を有さない物質であり、脂質やタンパク質など多様な生理活性物質と結合して薬剤学的に広く利用されており、それ自体としての薬学的用途として研究されている代表的な生体適合性物質である。
【０００３】
特に、ポリエチレングリコールは、タンパク質治療剤と結合して血中半減期を増加させ、タンパク質治療剤の抗原性を減少させる効果を有しており、タンパク質治療剤の側面で広く使用されている。また、タンパク質にポリエチレングリコール分子を共有結合させたペグ化（PEGylation）は、タンパク質治療剤の安定性を向上させることが報告された（Cantin et al., Am. J. 27:659-665 (2002)（非特許文献１））。
【０００４】
一方、このような薬剤を製造する過程において、タンパク質治療剤の活性を維持しながら、結合体の製造収率を高めるためには、精巧な製造技術を必要とする。これにより、ポリエチレングリコールを含むタンパク質治療剤を製造する方法と、このような製造に使用されるポリエチレングリコールに関する継続的な研究が進められてきた。
【０００５】
本発明者らは、ポリエチレングリコールを用いた生理活性ポリペプチド結合体を製造するにおいて、二つ以上の反応基を有するポリエチレングリコールをリンカーとして使用した（大韓民国公開特許第10-2014-0018462号（特許文献１）。
【０００６】
前記従来のポリエチレングリコールは、反応基としてアルデヒド基、スクシンイミジル基、マレイミド基（maleimide）、ビニルスルホン基（vinylsulfone）、ハロゲン化アセトアミン基、またはオルトピリジルジスルフィド基（Orthopyridyl disulfide、OPSS）などを有することが知られている。
【０００７】
ただし、既存に使用されたポリエチレングリコールは、このそれぞれの末端に目的とする反応基が含まれても、その構造に応じた反応性の違いを有する不便さがあった。
【０００８】
したがって、目的とする物質に結合する反応基を含みながらも、これら物質との反応がより容易な新たなポリエチレングリコール誘導体の開発が求められてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】大韓民国公開特許第１０−２０１４−００１８４６２号公報
【特許文献２】国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号公報
【特許文献３】国際特許公開第９６／３２４７８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．２７：６５９−６６５（２００２）
【非特許文献２】Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の一つの目的は、ポリエチレングリコール化合物、その立体異性質体、またはその薬学的に許容可能な塩を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記ポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドを反応させてポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドを製造する工程を含む、ポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質が、ポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、結合体の製造方法を提供することにある。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、前記ポリエチレングリコール化合物が付着した、生理活性ポリペプチドを提供することにある。
【００１５】
本発明のまた他の目的は、前記ポリエチレングリコール化合物の両末端の反応基に、それぞれ生理活性ポリペプチド及びキャリアタンパク質が付着した、結合体を提供することにある。
【００１６】
本発明のまた他の目的は、前記ポリエチレングリコール化合物の製造方法を提供することにある。
【００１７】
本発明のまた他の目的は、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を増加させるキャリアを生理活性ポリペプチドに連結させるための、前記ポリエチレングリコール化合物の用途を提供することにある。
【００１８】
本発明のまた他の目的は、前記ポリエチレングリコール化合物が付着した、生理活性ポリペプチドまたは前記結合体を含む組成物を提供することにある。
【００１９】
本発明のまた他の目的は、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を増加させるキャリアを生理活性ポリペプチドに連結させるためのポリエチレングリコール化合物のリンカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明を具現する一つの態様は、ポリエチレングリコール化合物、その立体異性質体、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【００２１】
一つの具体例としては、前記化合物は、下記化学式（１）で示される化合物であることを特徴とする：
【００２２】
【化１】
2019515972.tif 000003
・・・（１）
【００２３】
前記化学式（１）において、
Ｒ1は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ6−Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5−Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びこれらの誘導体からなる群から選択され、
Ｌ1〜Ｌ3は、それぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレンであり、
Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンであり、
ｎは１０〜２４００の自然数である。
【００２４】
他の具体例として、前記Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド、チオール、またはヨードであることを特徴とする。
【００２５】
他の具体例として、前記Ｒ1は、アルデヒドであることを特徴とする。
【００２６】
他の具体例として、前記Ｒ1及びＲ2は、互いに異なる官能基を有することを特徴とする。
【００２７】
他の具体例として、前記化合物は、下記化学式（２）で示されることを特徴とする：
【００２８】
CHO-(CH2)j-O-(CH2CH2O)n-(CH2)m-NH(CO)-(CH2)k-R2・・・（２）
【００２９】
前記化学式（２）において、
ｎは１０〜２４００の自然数であり、
ｊ、ｍ及びｋは、それぞれ独立して１〜６の自然数であり、
Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンである。
【００３０】
他の具体例として、前記化合物は、下記化学式（３）〜（１１）からなる群から選択されることを特徴とする：
【００３１】
【化２】
2019515972.tif 000004
・・・（３）
【００３２】
【化３】
2019515972.tif 000005
・・・（４）
【００３３】
【化４】
2019515972.tif 000006
・・・（５）
【００３４】
【化５】
2019515972.tif 000007
・・・（６）
【００３５】
【化６】
2019515972.tif 000008
・・・（７）
【００３６】
【化７】
2019515972.tif 000009
・・・（８）
【００３７】
【化８】
2019515972.tif 000010
・・・（９）
【００３８】
【化９】
2019515972.tif 000011
・・・（１０）
【００３９】
【化１０】
2019515972.tif 000012
・・・（１１）
【００４０】
前記化学式（３）〜（１１）において、ｎは１０〜２４００の自然数である。
【００４１】
本発明を具現する他の一つの態様は、ポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドを反応させてポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドを製造する工程を含む、ポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドの製造方法である。
【００４２】
一つの具体例として、前記製造方法においてＲ2に位置したオルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンが生理活性ポリペプチドのシステイン残基に位置したチオール基と反応することを特徴とする。
【００４３】
他の具体例として、前記製造方法は、さらにポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドを精製する工程を含むことを特徴とする。
【００４４】
他の具体例として、前記生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、インスリン分泌ペプチド、ニューロペプチド（neuropeptide）、脳下垂体ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウイルスペプチド、生理活性を有する非天然型ペプチド誘導体、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択されることを特徴とする。
【００４５】
他の具体例として、前記生理活性ポリペプチドは、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、ＰＹＹ（peptide YY）、ＮＰＹ（neuropeptide Y）、ＧＬＰ−１（Glucagon-like peptide-1）及びＧＬＰ−２（Glucagon-like peptide-2）のようなグルカゴン様ペプチド、エキセンジン−３（Exendin-3）、エキセンジン−４（Exendin-4）、オキシントモジュリン（Oxyntomodulin）、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチド、繊維芽細胞成長因子（Fibroblast growth factor）、グレリン（Ghrelin）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（Corticotropin）、エレドイシン（Eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（Oxytocin）、バソプレシン（vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、セクレチン（secretin）、セルモレリン（Sermorelin）、ヒト成長ホルモン（hGH）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（GCSF）類、インターフェロン（IFN）類、インターロイキン（Interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン（Orexin）、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（Cholecystokinin）、ガストリン阻害ペプチド、カルモジュリン、ガストリン放出ペプチド（Gastric releasing peptide）、モチリン（Motilin）、血管作動性腸管ペプチド（Vasoactive intestinal peptide）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（Atrial natriuretic peptide；ANP）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（B-type natriuretic peptide；BNP）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-type natriuretic peptide；CNP）、ニューロキニン（Neurokinin）Ａ、ニューロメジン（Neuromedin）、レニン（Renin）、エンドセリン（Endothelin）、サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin peptide）、カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin peptide）、デモルフィン（Dermorphin）、ダイノルフィン（Dynorphin）、エンドルフィン（Endorphin）、エンケファリン（Enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ阻害剤、チモポエチン（Thymopoietin）、チムリン（Thymulin）、チモペンチン（Thymopentin）、チモシン（Tymosin）、胸腺体液性因子（Thymic humoral factor）、アドレノメデュリン（Adrenomedullin）、アラトスタチン（Allatostatin）、アミロイドβ−プロテイン断片（Amyloid beta-protein fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（Leucokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）及びフューゼオン（Fuzeon）、インターフェロン受容体、Ｇプロテイン関連受容体（Gprotein-coupled receptor）、インターロイキン受容体、酵素類、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン抑制剤、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、リラキシン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片、赤血球増殖因子、白血球増殖因子、アミリン及びそのアナログからなる群から選択されることを特徴とする。
【００４６】
本発明を具現する他の一つの態様は、生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質が、ポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、結合体の製造方法である。
【００４７】
一つの具体例として、前記製造方法は、
（ａ）前記ポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドまたはキャリアタンパク質のいずれか一つを反応させて生理活性ポリペプチドまたはキャリアタンパク質が、一方の末端に付着し、他方の末端に反応基（reactive end group）を有する、ポリエチレングリコール化合物を製造する工程；及び
（ｂ）前記（ａ）工程で製造された、生理活性ポリペプチドまたはキャリアタンパク質が、一方の末端に付着し、他方の末端に末端反応基を有する、ポリエチレングリコール化合物とキャリアタンパク質または生理活性ポリペプチドの他の一つを反応させて前記ポリエチレングリコール化合物の末端反応基にキャリアタンパク質または生理活性ポリペプチドを連結させて生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質が、ポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、結合体を製造する工程を含むことを特徴とする。
【００４８】
他の具体例として、
（ａ）前記ポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドを反応させて生理活性ポリペプチドが一方の末端に付着し、他方の末端に反応基（reactive end group）を有する、ポリエチレングリコール化合物を製造する工程；及び
（ｂ）前記（ａ）工程で製造された、生理活性ポリペプチドが、一方の末端に付着し、他方の末端に末端反応基を有する、ポリエチレングリコール化合物とキャリアタンパク質を反応させて前記ポリエチレングリコール化合物の末端反応基にキャリアタンパク質を連結させる工程を含むことを特徴とする。
【００４９】
他の具体例として、前記生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、インスリン分泌ペプチド、ニューロペプチド（neuropeptide）、脳下垂体ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウイルスペプチド、生理活性を有する非天然型ペプチド誘導体、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択されることを特徴とする。
【００５０】
他の具体例として、前記（ａ）工程のポリエチレングリコール化合物は、前記化学式（１）の構造を有することを特徴とする。
【００５１】
他の具体例として、前記方法において、（ａ）工程は、前記化学式（１）の構造を有するポリエチレングリコール化合物のＲ2を生理活性ポリペプチドのシステイン残基に位置したチオール基と反応させることを特徴とする。
【００５２】
他の具体例として、（ｂ）工程は、ポリエチレングリコール化合物の末端アルデヒド基を、免疫グロブリンＦｃ断片のアミン基と反応させることを特徴とする。
【００５３】
他の具体例として、前記製造方法は、さらに生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質が、ポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、結合体を精製する工程を含むことを特徴とする。
【００５４】
他の具体例として、前記キャリアタンパク質は、アルブミン及びその断片、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカリド（saccharide）、またはエラスチンであることを特徴とする。
【００５５】
他の具体例として、前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ断片であることを特徴とする。
【００５６】
本発明を具現する他の一つの態様は、前記ポリエチレングリコール化合物が付着した、生理活性ポリペプチドである。
【００５７】
一つの具体例としては、前記化合物が付着した、生理活性ポリペプチドは、下記化学式（１５）〜（１７）のいずれか一つで示される構造を含むことを特徴とする：
【００５８】
R1-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-L3-S-S-X  ・・・（１５）
【００５９】
R1-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-CH2-S-X  ・・・（１６）
【００６０】
X-NHCH2-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-L3-R2  ・・・（１７）
【００６１】
前記化学式（１５）〜（１７）において、
Ｒ1は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ6−Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5−Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びこれらの誘導体からなる群から選択され、
Ｌ1〜Ｌ3は、それぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレンであり、
ｎは１０〜２４００の自然数であり、
Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンであり、
Ｘは、生理活性ポリペプチドの一部分である。
【００６２】
本発明を具現する他の一つの態様は、前記ポリエチレングリコール化合物の両末端の反応基に、それぞれ生理活性ポリペプチド及びキャリアタンパク質が付着した、結合体である。
【００６３】
一つの具体例として、前記結合体は、下記化学式（１８）または（１９）で示される構造を有する、結合体であることを特徴とする：
【００６４】
Y-NHCH2-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-L3-S-S-X  ・・・（１８）
【００６５】
Y-NHCH2-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-CH2-S-X  ・・・（１９）
【００６６】
前記化学式（１８）及び（１９）において、
Ｌ1〜Ｌ3は、それぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレンであり、
ｎは１０〜２４００の自然数であり、
Ｘは、生理活性ポリペプチドの一部分であり、
Ｙは、キャリアタンパク質の一部分である。
【００６７】
他の具体例として、前記キャリアタンパク質はアルブミン及びその断片、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカリド（saccharide）、またはエラスチンであることを特徴とする。
【００６８】
他の具体例として、前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ断片であることを特徴とする。
【００６９】
本発明を具現する他の一つの態様は、前記ポリエチレングリコール化合物の製造方法である。
【００７０】
一つの具体例として、前記方法は、
（ａ）ポリエチレングリコールの一方の末端に２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ6−Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5−Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びこれらの誘導体からなる群から選択されるＲ1を導入する工程；及び
（ｂ）前記ポリエチレングリコールの他方の末端に−ＮＨ（ＣＯ）Ｌ3−Ｒ2構造を導入する工程を含み、ここで、Ｒ2はオルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンであることを特徴とする。
【００７１】
他の具体例として、
化学式（２０）で示される化合物から化学式（２１）で示される化合物を準備する第１の工程；化学式（２１）で示される化合物から化学式（２２）で示される化合物を準備する第２の工程；及び化学式（２２）で示される化合物を酸溶液で処理して末端のジエトキシメチルをアルデヒドに転換する第３の工程を含むことを特徴とする：
【００７２】
【化１１】
2019515972.tif 000013
・・・（２０）
【００７３】
ここで、ｎ’はｎまたはｎ＋１
【００７４】
【化１２】
2019515972.tif 000014
・・・.（２１）
【００７５】
【化１３】
2019515972.tif 000015
・・・（２２）
【００７６】
ここで、前記Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、ｎ及びＲ2については、前記で記述した通りである。
【００７７】
他の具体例として、前記第１の工程の化学式（２０）で示される化合物は、下記化学式（２３）で示される化合物をメタンスルホニルクロリドと反応させて準備することを特徴とする：
【００７８】
【化１４】
2019515972.tif 000016
・・・（２３）
【００７９】
他の具体例として、前記第１の工程は、化学式（２０）で示される化合物をアンモニア水溶液及び塩化アンモニウムと反応させることにより行うことを特徴とする。
【００８０】
他の具体例として、前記第１の工程は、化学式（２０）で示される化合物をヒドロキシアルキルテトラヒドロピラニルエーテルと反応させて化学式（２４）で示される化合物を製造する第１−１工程；
化学式（２４）で示される化合物をｐ−トルエンスルホン酸と反応させて末端のテトラヒドロピラニルオキシ基をヒドロキシ基に置換する第１−２工程；
以前の工程から得られた化合物をメタンスルホニルクロリドと反応させてヒドロキシ基をメタンスルホン酸基に転換する第１−３工程；及び
以前の工程から得られた化合物をアンモニア水溶液及び塩化アンモニウムと反応させる第１−４工程を含めて行うことを特徴とする。
【００８１】
【化１５】
2019515972.tif 000017
・・・（２４）
【００８２】
他の具体例として、前記第２の工程は、化学式（２１）で示される化合物を下記化学式（２５）で示される化合物と反応させて行うことを特徴とする：
【００８３】
【化１６】
2019515972.tif 000018
・・・（２５）
【００８４】
他の具体例として、前記第２の工程は、化学式（２１）で示される化合物をクロロ（Ｃ２−Ｃ７アルカノイル）クロリドと反応させて中間体として下記化学式（２６）で示される、末端にクロロ基を含む化合物を合成した後、硫化水素ナトリウムの存在または不在の下でハロゲン金属塩と反応させてクロロ基をチオールまたはハロゲンに転換して行うことを特徴とする：
【００８５】
【化１７】
2019515972.tif 000019
・・・（２６）
【００８６】
本発明を具現する他の一つの態様は、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を増加させるキャリアを生理活性ポリペプチドに連結させるための、前記ポリエチレングリコール化合物の用途である。
【００８７】
本発明を具現する他の一つの態様は、前記ポリエチレングリコール化合物が付着した、生理活性ポリペプチドまたは前記結合体を含む組成物である。
【００８８】
本発明を具現する他の一つの態様は、ポリエチレングリコール化合物、その立体異性質体、またはその薬学的に許容可能な塩を含む、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を増加させるキャリアを生理活性ポリペプチドに連結させるためのリンカーである。
【発明の効果】
【００８９】
本発明のポリエチレングリコール誘導体は、その末端に目的とする反応基を含みながらも、それと連結しようとする目的物質（例えば、タンパク質）との反応性が容易であり、タンパク質結合体などの結合薬物に対する薬剤の製造分野において有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１ａ−１ｂ】本発明の新規なポリエチレングリコール化合物の一例であり、１）アルデヒド基とオルトピリジルジスルフィド基を有する化合物の化学構造（リンカー１、４、７）、２）アルデヒド基とヨウ化アセトアミン基あるいはヨード基を有する化合物の化学構造（リンカー２、５、８）、及び３）アルデヒド基とスルフヒドリル基を有する化合物の化学構造（リンカー３、６、９）を示す。図１ｂにおいてリンカー１０〜１２は、比較群に該当する。
【図２】リンカー１の製造後、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）で分析、確認した結果である。
【図３】リンカー１の製造後、逆相クロマトグラフィーで分析した結果である。
【図４】リンカー２の製造後、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）で分析、確認した結果である。
【図５】リンカー２の製造後、逆相クロマトグラフィーで分析した結果である。
【図６】リンカー３の製造後、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）で分析、確認した結果である。
【図７】リンカー３の製造後、逆相クロマトグラフィーで分析した結果である。
【図８】リンカー５の製造後、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）で分析、確認した結果である。
【図９】リンカー５の製造後、逆相クロマトグラフィーで分析した結果である。
【図１０】リンカー５の製造後、分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した結果である。
【図１１】リンカー７の製造後、逆相クロマトグラフィーで分析した結果である。
【図１２】リンカー８の製造後、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）で分析、確認した結果である。
【図１３】リンカー８の製造後、逆相クロマトグラフィーで分析した結果である。
【図１４】リンカー８の製造後、分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで分析した結果である。
【図１５】リンカー９の製造後、逆相クロマトグラフィーで分析した結果である。
【図１６】リンカー１１の製造後、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）で分析、確認した結果である。
【図１７】リンカー１１の製造後、逆相クロマトグラフィーで分析した結果である。
【図１８】本発明に係るポリエチレングリコール化合物のチオール反応性基（thiol reactive group）の反応性比較実験の結果を示す。
【図１９−２１】本発明に係るポリエチレングリコール化合物をリンカーとして使用して製造した三重活性体−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示したものである。図１９は本発明によるリンカー７を、図２０はリンカー８を、図２１はリンカー９を使用した場合におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
本発明を具現する一つの態様は、ポリエチレングリコール化合物、その立体異性質体、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【００９２】
これを具体的に説明すると次の通りである。一方、本願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。即ち、本願で開示された多様な要素のすべての組み合わせが本発明の範囲に属する。また、下記記述された具体的な叙述により本発明の範疇が限定されると見られない。
【００９３】
本発明において、用語「ポリエチレングリコール化合物」とは、ポリエチレングリコール構造  [−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−]を含む化合物をいう。より具体的には、本発明において前記ポリエチレングリコール化合物は、２つ以上の末端反応基を含むことができる。
【００９４】
この時、前記ポリエチレングリコール化合物に存在する２つ以上の末端反応基は、互いに同一または異なってもよい。より具体的には、互いに異なる種類の末端反応基に作用するヘテロ官能性（heterofunctional）リンカーであってもよい。例えば、前記化合物のいずれか一つの末端は、アミン基に作用性を有するのに対し、他方の末端は、チオール基に作用性を有することが挙げられる。しかし、特にこれに制限されるものではない。
【００９５】
また、前記ポリエチレングリコール化合物は、生理活性ポリペプチドにキャリアを結合させるためのリンカーとして使用することができる。したがって、前記２つ以上の末端反応基を有するポリエチレングリコール化合物の一つの末端は生理活性ポリペプチドに、他方の末端はキャリアに連結されてもよい。
【００９６】
一方、本発明において、前記ポリエチレングリコール化合物は、ポリエチレングリコール誘導体と混用して使用される。
【００９７】
具体的な様態として、本発明に係るポリエチレングリコール化合物は、次のようにチオール反応基（thiol reactive group）とポリエチレングリコール構造との間に−ＮＨＣＯ−の構造を含むものであってもよい。
【００９８】
具体的には、前記化合物は、下記化学式（１）で示される化合物であってもよい：
【００９９】
【化１８】
2019515972.tif 000020
・・・（１）
【０１００】
前記化学式（１）において、
Ｒ1は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ6−Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5−Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びこれらの誘導体からなる群から選択され、
Ｌ1〜Ｌ3は、それぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレンであり、
Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンであり、
ｎは１０〜２４００の自然数である。
【０１０１】
前記化学式において、Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド、チオール、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、またはＩであってもよく、より具体的には、オルトピリジルジスルフィド、またはＩであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
【０１０２】
前記化学式において、Ｒ1はアルデヒドであってもよいが、特にこれに限定されない。
【０１０３】
前記化学式において、Ｒ1は、スクシンイミド誘導体であってもよく、その種類としてスクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカーボネートが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【０１０４】
また、前記化合物は、互いに異なる種類の末端反応基に作用するヘテロ官能性（heterofunctional）であってもよく、具体的には、Ｒ1及びＲ2は、互いに異なる官能基を有することができる。しかし、特にこれに制限されるものではない。
【０１０５】
具体的には、Ｒ1はアルデヒドであり、Ｒ2はオルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
【０１０６】
前記化合物において、Ｌ1〜Ｌ3は、それぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレン、より具体的にはＣ1−Ｃ4アルキレンであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
【０１０７】
例えば、前記Ｌ1は、１、２、３、４、５、または６の自然数であってもよく、Ｌ2は、１、２、３、４、５、または６の自然数であってもよく、前記Ｌ3は、１、２、３、４、５、または６の自然数であってもよい。
【０１０８】
一つの例として、Ｌ2は２、４、または６であり、Ｌ1とＬ3は、１、２、３、４、５、または６であってもよい。
【０１０９】
前記化合物において、Ｒ1−Ｌ1−は、アルキルアルデヒドであってもよく、例えば、Ｃ2−Ｃ6アルキルアルデヒドであってもよく、具体的にプロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドなどであってもよいが、特にこれに限定されない。
【０１１０】
また、特にこれに限定されないが、本発明のポリエチレングリコール化合物は、約１００ダルトン〜約１１０，０００ダルトンの分子量、具体的には約４００〜約１１０，０００ダルトンの分子量は、より具体的には、約１０００〜１００，０００ダルトンの分子量、さらに具体的には約１０００〜２０，０００ダルトンの分子量を有することができるが、特にこれに限定されるものではない。
【０１１１】
前記ｎは１０〜２４００の自然数であってもよく、より具体的には２０〜４６０の自然数であってもよいが、特にこれに限定されない。
【０１１２】
具体的には、前記化合物は、下記化学式（２）で示されるものであってもよい：
【０１１３】
【化１９】
2019515972.tif 000021
【０１１４】
前記化学式（２）において、
ｎは１０〜２４００の自然数であり、
ｊ、ｍ及びｋは、それぞれ独立して１〜６の自然数であり、
Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド、チオール、またはハロゲンである。
【０１１５】
より具体的には、前記化学式（２）において、ｎは１０〜２４００の自然数、より具体的には２０〜４６０の自然数であってもよいが、特にこれに限定されない。
【０１１６】
具体的な態様において、前記ｊ、ｍ及びｋは、それぞれ独立して１〜６の自然数、具体的には１〜４の自然数であってもよい。
【０１１７】
例えば、前記ｊは１、２、３、４、５、または６の自然数であってもよく、ｍは１、２、３、４、５、または６の自然数であってもよく、ｋは１、２、３、４、５、または６の自然数であってもよい。
【０１１８】
一つの例として、ｊは２、３、４、５、または６であり、ｍは２、４、または６であり、ｋは１、２、３、４、５、または６であってもよい。
【０１１９】
また、前記Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド、チオール、またはハロゲン、具体的には、オルトピリジルジスルフィド、チオール、またはＦ、Ｂｒ、Ｃｌ、またはＩであってもよく、より具体的にはオルトピリジルジスルフィド、またはＩであってもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
【０１２０】
具体的には、前記化合物は、下記化学式６〜１１からなる群から選択されるものであってもよい。
【０１２１】
【化２０】
2019515972.tif 000022
・・・（６）
【０１２２】
【化２１】
2019515972.tif 000023
・・・（７）
【０１２３】
【化２２】
2019515972.tif 000024
・・・（８）
【０１２４】
【化２３】
2019515972.tif 000025
・・・（９）
【０１２５】
【化２４】
2019515972.tif 000026
・・・（１０）
【０１２６】
【化２５】
2019515972.tif 000027
・・・（１１）
【０１２７】
前記化学式（６）〜（１１）において、ｎは前記で定義した通りである。
【０１２８】
本願の実施例では、前記化学式（６）で示される化合物をリンカー＃４と、前記化学式（７）で示される化合物をリンカー＃５と、前記化学式（８）で示される化合物をリンカー＃６と、前記化学式（９）で示される化合物をリンカー＃７と、前記化学式（１０）で示される化合物をリンカー＃８と、前記化学式（１１）で示される化合物をリンカー＃９と命名した。
【０１２９】
本発明の一態様によると、前記化学式（１）に属する化合物が−ＮＨＣＯ−の構造を含まない前記化合物に比べてチオール基に対して高い反応性を示すことができることを確認したところ、前記化合物をチオール基を含む物質に付着するのに有用に使用することができる。
【０１３０】
一方、前記化合物は、具体的には下記化学式（３）〜（５）のいずれか一つの構造を有することができる：
【０１３１】
【化２６】
2019515972.tif 000028
・・・（３）
【０１３２】
【化２７】
2019515972.tif 000029
・・・（４）
【０１３３】
【化２８】
2019515972.tif 000030
・・・（５）
【０１３４】
ここで、ｎは、前記で定義した通りである。
【０１３５】
一方、前記化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で存在することができる。塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸（free acid）により形成された酸付加塩が有用である。
【０１３６】
前記塩の種類は特に制限されない。ただし、個体、例えば、哺乳類に安全かつ効果的な形であることが望ましいが、特にこれに限定されるものではない。
【０１３７】
前記用語「薬学的に許容可能な」とは、医薬学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、またはアレルギー反応などを誘発せずに目的とする用途に効果的に使用可能な物質を意味する。
【０１３８】
本発明において、用語「薬学的に許容可能な塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、または塩基から誘導された塩を含む。適切な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを挙げることができる。適切な塩基から誘導された塩は、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、及びアンモニウムなどを含むことができる。
【０１３９】
酸付加塩は、通常の方法、例えば、化合物を過量の酸水溶液に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを使用して沈殿させて製造することができる。同モル量の化合物及び水中の酸またはアルコール（例えば、グリコールモノメチルエーテル）を加熱し、次いで前記混合物を蒸発させて乾燥させるか、または析出された塩を吸引ろ過させることができる。
【０１４０】
また、塩基を使用して薬学的に許容可能な金属塩を作ることができる。アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解させ、非溶解化合物の塩をろ過した後、ろ液を蒸発、乾燥させて得ることができる。
【０１４１】
また、本発明の前記化合物及びその薬学的に許容可能な塩は、これから製造することができる可能な溶媒和物を含む概念である。
【０１４２】
本発明で使用される用語「溶媒和物」とは、本発明に係る化合物またはその塩が溶媒分子と複合体を形成したものをいう。
【０１４３】
併せて、本発明の化合物が、その置換基に非対称炭素中心を有する場合、ＲまたはＳ異性質体、ラセミ体、ジアステレオマーの混合物及び個々のジアステレオマーとして存在することができ、これらすべての異性質体及びこれらの混合物は、本発明の範疇に含まれる。
【０１４４】
本発明を具現する他の一つの態様は、ポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドを反応させてポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドを製造する工程を含む、ポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドの製造方法を提供する。
【０１４５】
前記ポリエチレングリコール化合物については、先に説明した通りである。
【０１４６】
前記製造方法は、前記ポリエチレングリコール化合物の両末端に位置した反応基のいずれか一つを、生理活性ポリペプチドに連結させる工程を含むことができる。より具体的には、Ｒ1に位置した反応基を、生理活性ポリペプチドに連結させるか、Ｒ2に位置した反応基を、生理活性ポリペプチドに連結させることができるが、特にこれに限定されない。
【０１４７】
より具体的には、Ｒ2に位置したオルトピリジルジスルフィド、チオール、またはハロゲンが生理活性ポリペプチドのシステイン残基に位置したチオール基と反応することを含むことができるが、特にこれに限定されない。
【０１４８】
上述したポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドとの間の反応は、ポリエチレングリコール化合物の反応基とポリエチレングリコールの混合物が連結される生理活性ポリペプチドの反応基の特性を考慮し、当業者が適切に決定することができる。
【０１４９】
例えば、クエン酸緩衝液またはＨＥＰＥＳのような適切な緩衝液とＣ1〜Ｃ6アルコールのような有機溶媒の存在下、前記反応が行われてもよいが、特にこれらに限定されるものではない。
【０１５０】
また、前記製造方法は、さらにポリエチレングリコール化合物が付着した生理活性ポリペプチドを精製する工程を含むことができる。
【０１５１】
このような精製には、当業界において公知となった方法を制限なく利用することができ、具体的には、クロマトグラフィーを利用することができるが、特にこれに限定されない。
【０１５２】
本発明において、用語「生理活性ポリペプチド」とは、生理活性を示すことができるペプチドあるいはタンパク質をすべて含む概念であり、好ましくは、対象体内で生理活性を示すようにする物質である。
【０１５３】
前記生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、インスリン分泌ペプチド、ニューロペプチド（neuropeptide）、脳下垂体ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウイルスペプチド、生理活性を有する非天然型ペプチド誘導体、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択されることを特徴とする。
【０１５４】
前記生理活性ポリペプチドの例として、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、レプチン（Leptin）受容体アゴニスト、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、Ｙ５受容体アンタゴニスト、ＭＣＨ（Melanin-concentrating hormone）受容体アンタゴニスト、Ｙ２／３受容体アゴニスト、ＭＣ３／４受容体アゴニスト、胃／膵臓リパーゼ（gastric/pancreatic lipase）阻害剤、５ＨＴ２ｃアゴニスト、β３Ａ受容体アゴニスト、アミリン（Ａｍｙｌｉｎ）受容体アゴニスト、グレリン（Ghrelin）アンタゴニスト、グレリン受容体アンタゴニストなどであってもよいが、特にこれに限定されない。
【０１５５】
また、生理活性ポリペプチドは、下記配列を含むアミノ酸配列を含むか、これにより必須で構成されるか、あるいはそれで構成されたペプチドであってもよい。前記ペプチドは、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するものであってもよく、このようなペプチドを三重活性体と命名する。
【０１５６】
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Gly-Thr-Phe-Xaa7-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30-R1 （配列番号１０３）
【０１５７】
前記化学式において、
Ｘａａ１はヒスチジン、４−イミダゾアセチル、またはチロシンであり、
Ｘａａ２はグリシン、アルファ−メチル−グルタミン酸、またはＡｉｂであり、
Ｘａａ３はグルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘａａ７はトレオニンまたはイソロイシンであり、
Ｘａａ１０はロイシン、チロシン、リジン、システイン、またはバリンであり、
Ｘａａ１２はリジン、セリン、またはイソロイシンであり、
Ｘａａ１３はグルタミン、チロシン、アラニン、またはシステインであり、
Ｘａａ１４はロイシン、メチオニン、またはチロシンであり、
Ｘａａ１５はシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはロイシンであり、
Ｘａａ１６はグリシン、グルタミン酸、またはセリンであり、
Ｘａａ１７はグルタミン、アルギニン、イソロイシン、グルタミン酸、システイン、またはリジンであり、
Ｘａａ１８はアラニン、グルタミン、アルギニン、またはヒスチジンであり、
Ｘａａ１９はアラニン、グルタミン、システイン、またはバリンであり、
Ｘａａ２０はリジン、グルタミン、またはアルギニンであり、
Ｘａａ２１はグルタミン酸、グルタミン、ロイシン、システイン、またはアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２３はイソロイシンまたはバリンであり、
Ｘａａ２４はアラニン、グルタミン、システイン、アスパラギン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、
Ｘａａ２７はバリン、ロイシン、リジン、またはメチオニンであり、
Ｘａａ２８はシステイン、リジン、アラニン、アスパラギン、またはアスパラギン酸であり、
Ｘａａ２９はシステイン、グリシン、グルタミン、トレオニン、グルタミン酸、またはヒスチジンであり、
Ｘａａ３０はシステイン、グリシン、リジン、またはヒスチジンであるか、不存在であり、
Ｒ1はシステイン、ＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴ（配列番号１０４）、ｍ−ＳＳＧＡＰＰＰＳ−ｎ（配列番号１０５）、またはｍ−ＳＳＧＱＰＰＰＳ−ｎ（配列番号１０６）であるか、不存在であり、
ここで、
ｍは−Ｃｙｓ−、−Ｐｒｏ−、または−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−であり、
ｎは−Ｃｙｓ−、−Ｇｌｙ−、−Ｓｅｒ−、または−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−であるか、不存在である。
【０１５８】
前記三重活性体の例として、配列番号：１〜１０２からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられるが、特にこれに限定されない。
【０１５９】
また、前記生理活性ポリペプチドは、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、ＰＹＹ（peptide YY）、ＮＰＹ（neuropeptide Y）、ＧＬＰ−１（Glucagon-like peptide-1）及びＧＬＰ−２（Glucagon-like peptide-2）のようなグルカゴン様ペプチド、エキセンジン−３（Exendin-3）、エキセンジン−４（Exendin-4）、オキシントモジュリン（Oxyntomodulin）、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体、及びＧＩＰ受容体に対して活性を有するペプチド、繊維芽細胞成長因子（Fibroblast growth factor）、グレリン（Ghrelin）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（Corticotropin）、エレドイシン（Eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（Oxytocin）、バソプレシン（vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、セクレチン（secretin）、セルモレリン（Sermorelin）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）類、インターフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（Interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン（Orexin）、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（Cholecystokinin）、ガストリン阻害ペプチド、カルモジュリン、ガストリン放出ペプチド（Gastric releasing peptide）、モチリン（Motilin）、血管作動性腸管ペプチド（Vasoactive intestinal peptide）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（Atrial natriuretic peptide；ANP）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（B-type natriuretic peptide；BNP）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-type natriuretic peptide；CNP）、ニューロキニン（Neurokinin）Ａ、ニューロメジン（Neuromedin）、レニン（Renin）、エンドセリン（Endothelin）、サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin peptide）、カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin peptide）、デモルフィン（Dermorphin）、ダイノルフィン（Dynorphin）、エンドルフィン（Endorphin）、エンケファリン（Enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ阻害剤、チモポエチン（Thymopoietin）、チムリン（Thymulin）、チモペンチン（Thymopentin）、チモシン（Tymosin）、胸腺体液性因子（Thymic humoral factor）、アドレノメデュリン（Adrenomedullin）、アラトスタチン（Allatostatin）、アミロイドβ−プロテイン断片（Amyloid beta-protein fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（Leucokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）及びフューゼオン（Fuzeon）、インターフェロン受容体、Ｇプロテイン関連受容体（Gprotein-coupled receptor）、インターロイキン受容体、酵素類、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチ���類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン抑制剤、スーパーオキシドディスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、リラキシン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片、赤血球増殖因子、白血球増殖因子、アミリン及びそのアナログからなる群から選択されることができるが、特にこれに限定されるものではない。
【０１６０】
本発明を具現する他の一つの態様は、生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質が、ポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、結合体の製造方法を提供する。
【０１６１】
前記生理活性ポリペプチド及びポリエチレングリコール化合物については、先に説明した通りである。
【０１６２】
具体的には、前記製造方法は、
（ａ）前記ポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドまたはキャリアタンパク質のいずれか一つを反応させて生理活性ポリペプチドまたはキャリアタンパク質が、一方の末端に付着し、他方の末端に反応基（reactive end group）を有する、ポリエチレングリコール化合物を製造する工程；及び
（ｂ）前記（ａ）工程で製造された、生理活性ポリペプチドまたはキャリアタンパク質が、一方の末端に付着し、他方の末端に末端反応基を有する、ポリエチレングリコール化合物とキャリアタンパク質または生理活性ポリペプチドの他の一つを反応させて前記ポリエチレングリコール化合物の末端反応基にキャリアタンパク質または生理活性ポリペプチドを連結させて生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質が、ポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、結合体を製造する工程を含むものであってもよい。
【０１６３】
より具体的には、前記製造方法は、
（ａ）前記ポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドを反応させて生理活性ポリペプチドが一方の末端に付着し、他方の末端に反応基（reactive end group）を有する、ポリエチレングリコール化合物を製造する工程；及び
（ｂ）前記（ａ）工程で製造された、生理活性ポリペプチドが、一方の末端に付着し、他方の末端に末端反応基を有する、ポリエチレングリコール化合物とキャリアタンパク質とを反応させて前記ポリエチレングリコール化合物の末端反応基にキャリアタンパク質を連結させる工程を含むものであってもよい。
【０１６４】
具体的には、前記（ａ）工程のポリエチレングリコール化合物は、下記化学式（１）の構造を有することを特徴とする。
【０１６５】
【化２９】
2019515972.tif 000031
・・・（１）
【０１６６】
前記化学式（１）において、
Ｒ1は、アルデヒド基であり、
Ｌ1〜Ｌ3は、それぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレンであり、
Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンであり、
ｎは１０〜２４００の自然数である。
【０１６７】
特にこれに限定されないが、前記方法においてポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドとの間の反応は、ポリエチレングリコール化合物のＲ2を生理活性ポリペプチドのシステイン残基に位置したチオール基との反応を含むことができ、ポリエチレングリコール化合物とキャリアタンパク質との間の反応はポリエチレングリコール化合物の末端アルデヒド基とキャリアタンパク質のアミン基との間の反応を含むことができる。
【０１６８】
具体的には、前記方法において、（ａ）工程は、前記化学式（１）の構造を有するポリエチレングリコール化合物のＲ2を生理活性ポリペプチドのシステイン残基に位置したチオール基と反応させ、（ｂ）工程では、ポリエチレングリコール化合物の末端アルデヒド基をキャリアタンパク質のアミン基と反応させるものであってもよい。
【０１６９】
上述したポリエチレングリコール化合物と生理活性ポリペプチドまたはキャリアタンパク質との間の反応は、ポリエチレングリコール化合物の反応基とポリエチレングリコール化合物が連結される生理活性ポリペプチドまたはキャリアタンパク質の反応基の特性を考慮し、当業者が適切に決定することができる。
【０１７０】
例えば、ペグ化反応は、クエン酸緩衝液またはＨＥＰＥＳのような適切な緩衝液とＣ1〜Ｃ6アルコールのような有機溶媒の存在下で行われてもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【０１７１】
また、アルデヒド反応基は、低ｐＨでアミノ末端に選択的に反応し、高ｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件では、リジン残基と共有結合を形成することができる。
【０１７２】
一方、前記キャリアタンパク質は、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を増加させるために、前記ポリエチレングリコール化合物を通じて前記生理活性ポリペプチドに連結される物質であってもよい。
【０１７３】
前記キャリアタンパク質は、アルブミン及びその断片、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカリド（saccharide）、またはエラスチンであってもよく、前記ＦｃＲｎ結合物質は、免疫グロブリンＦｃ断片であってもよいが、特にこれに限定されない。
【０１７４】
具体的な例として、前記ポリエチレングリコール化合物の末端アルデヒド基は、免疫グロブリンＦｃ断片のアミン基、具体的には、Ｎ末端アミン基と反応するものであってもよいが、特にこれに限定されない。
【０１７５】
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び／または重鎖不変領域３（ＣＨ３）の部分を含む部位を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明の結合体の一部分をなす一構成であってもよい。
【０１７６】
このような免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖不変領域にヒンジ（hinge）部分を含むことができるが、これに限定されるものではない。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等または向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体の重鎖不変領域１（CH1）及び／または軽鎖不変領域１（CL1）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／またはＣＨ３に対応する非常に長い、一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。
【０１７７】
例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメイン中の１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。しかし、これに制限されるものではない。
【０１７８】
また、１つの具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、二量体形（dimeric form）であってもよく、二量体形の一つのＦｃ領域にＸの一つの分子が共有結合的に連結することができ、この時、前記免疫グロブリンＦｃとＸは、ポリエチレングリコール化合物によって互いに連結することができる。一方、二量体形の一つのＦｃ領域にＸの二分子が対称的に結合することも可能である。この時、前記免疫グロブリンＦｃとＸは、ポリエチレングリコール化合物によって互いに連結することができる。しかし、前記記述された例に制限されるものではない。
【０１７９】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有することを意味する。
【０１８０】
例えば、ＩｇＧ  Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基が変形のために適した部位として使用することができる。
【０１８１】
また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されたり、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去され、又は天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されることもできるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号（特許文献２）、国際特許公開第９６／３２４７８号（特許文献３）などに開示されている。
【０１８２】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸の交換は、当該分野において公知となっている（H.Neurath、R.L.Hill、The Proteins、Academic Press、New York、1979（非特許文献２））。最も通常的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、ＶａＬ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、ＴｈＲ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、ＳｅＲ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、ＳｅＲ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）及びアミド化（amidation）などで修飾（modification）されてもよい。
【０１８３】
上述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させたものであってもよい。
【０１８４】
また、このようなＦｃ領域は、ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラットまたはモルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全体の免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して取得する方法であってもよい。パパインを処理する場合には、Ｆａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）2に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。さらに具体的な実施形態では、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から収得した組換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
【０１８５】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を利用した遺伝子工学的方法のような通常の方法を用いることができる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（c1q）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性が減少または除去されるため、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点で、薬物のキャリアとしての本来の目的に、より合致する形態は、糖鎖が除去されたり非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域であると言える。
【０１８６】
本発明において、「糖鎖の除去（Deglycosylation）」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域をいい、非糖鎖化（Aglycosylation）は原核動物、より具体的な実施形態では、大腸菌から生産して糖鎖化されていないＦｃ領域を意味する。
【０１８７】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトまたはウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、より具体的な実施形態ではヒト起源である。
【０１８８】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。より具体的な実施形態では、ヒトの血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、より具体的な実施形態では、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となったＩｇＧ由来である。さらに具体的な実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４  Ｆｃ領域であり、最も具体的な実施形態において前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非糖鎖化されたＦｃ領域であるが、これに限定されるものではない。
【０１８９】
一方、本発明において「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成するとき、同一起源短鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の短鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。即ち、ＩｇＧ  Ｆｃ、ＩｇＡ  Ｆｃ、ＩｇＭ  Ｆｃ、ＩｇＤ  Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【０１９０】
また、前記製造方法は、さらに生理活性ポリペプチドとキャリアタンパク質が、ポリエチレングリコール化合物を通じて連結された、結合体を精製する工程を含むことができる。
【０１９１】
このような精製には、当業界において公知となった方法を制限なく利用することができ、具体的には、クロマトグラフィーを利用することができるが、特にこれに限定されない。
【０１９２】
本発明を具現する他の一つの態様は、前記ポリエチレングリコール化合物が付着した、生理活性ポリペプチドを提供する。
【０１９３】
前記ポリエチレングリコール化合物及び生理活性ポリペプチドについては、先に説明した通りである。
【０１９４】
一つの具体例として、前記化合物が付着した、生理活性ポリペプチドは、下記化学式（１５）〜（１７）のいずれか一つで示される構造を含むものであってもよい：
【０１９５】
R1-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-L3-S-S-X  ・・・（１５）
【０１９６】
R1-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-CH2-S-X  ・・・（１６）
【０１９７】
X-NHCH2-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-L3-R2  ・・・（１７）
【０１９８】
前記化学式（１５）〜（１７）において、
Ｒ1は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ6−Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5−Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びこれらの誘導体からなる群から選択され、
Ｌ1〜Ｌ3は、それぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレンであり、
ｎは１０〜２４００の自然数であり、
Ｒ2は、オルトピリジルジスルフィド、チオール、またはハロゲンであり、
Ｘは、生理活性ポリペプチドの一部分に該当する。
【０１９９】
前記記述された変数の具体的な様態及び組み合わせについては、先に説明した内容がすべて適用される。
【０２００】
前記化学式（１５）において−Ｓ−Ｓ−Ｘは、Ｘに位置したチオール基がオルトピリジルジスルフィドまたはチオール基と反応して形成された連結構造であってもよく、化学式（１６）において−ＣＨ2−Ｓ−Ｘは、Ｘに位置したチオール基がハロゲン、具体的にはＩＡ（iodoacetamide）と反応して形成された連結構造であってもよく、化学式（１７）においてＸ−ＮＨＣＨ2−は、Ｘに位置したアミン基がアルデヒド基と反応し、還元的アルキル化を通じて形成された連結構造であってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【０２０１】
本発明を具現する他の一つの態様は、前記ポリエチレングリコール化合物の両末端の反応基に、それぞれ生理活性ポリペプチド及びキャリアタンパク質が付着した、結合体を提供する。
【０２０２】
前記ポリエチレングリコール化合物、生理活性ポリペプチド、及びキャリアタンパク質については、先に説明した通りである。
【０２０３】
一つの具体例として、前記結合体は、下記化学式（１８）または（１９）で示される構造を有する、結合体であることを特徴とする：
【０２０４】
Y-NHCH2-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-L3-S-S-X  ・・・（１８）
【０２０５】
Y-NHCH2-L1-O-(CH2CH2O)n-L2-NH(CO)-CH2-S-X  ・・・（１９）
【０２０６】
前記化学式（１８）及び（１９）において、
Ｌ1〜Ｌ3は、それぞれ独立して直鎖または分岐鎖Ｃ1−Ｃ6アルキレンであり、
ｎは１０〜２４００の自然数であり、
Ｘは、生理活性ポリペプチドの一部分であり、
Ｙは、キャリアタンパク質の一部分である。
【０２０７】
本発明を具現する他の一つの態様は、前記ポリエチレングリコール化合物の製造方法を提供する。
【０２０８】
ポリエチレングリコール化合物については、先に説明した通りである。
【０２０９】
具体的には、前記方法は、
（ａ）ポリエチレングリコールの一方の末端に２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ6−Ｃ20アリールジスルフィド、Ｃ5−Ｃ20ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びこれらの誘導体からなる群から選択されるＲ1を導入する工程；及び
（ｂ）前記ポリエチレングリコールの他方の末端に−ＮＨ（ＣＯ）Ｌ3−Ｒ2構造を導入する工程を含み、ここで、Ｒ2はオルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、チオール、またはハロゲンである工程を含むことができる。
【０２１０】
非限定的な方法として、
前記方法は、
化学式（２０）で示される化合物から化学式（２１）で示される化合物を準備する第１の工程；
化学式（２１）で示される化合物から化学式（２２）で示される化合物を準備する第２の工程；及び
化学式（２２）で示される化合物を酸溶液で処理して末端のジエトキシメチルをアルデヒドに転換する第３の工程を含むことができる：
【０２１１】
【化３０】
2019515972.tif 000032
・・・（２０）
【０２１２】
ここで、ｎ’はｎまたはｎ＋１
【０２１３】
【化３１】
2019515972.tif 000033
・・・（２１）
【０２１４】
【化３２】
2019515972.tif 000034
・・・（２２）
【０２１５】
ここで、前記Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、ｎ及びＲ2については、前述した通りである。
【０２１６】
リンカー５（化学式（７））のように、Ｌ2が２であるポリエチレングリコール化合物を製造する場合には、前記ｎ’はｎ＋１であってもよい。
【０２１７】
前記方法において、前記第１の工程の化学式（２０）で示される化合物は、下記化学式（２３）で示される化合物をメタンスルホニルクロリドと反応させて準備するものであってもよい：
【０２１８】
【化３３】
2019515972.tif 000035
・・・（２３）
【０２１９】
リンカー５（化学式（７））のように、Ｌ2が２であるポリエチレングリコール化合物を製造する場合などにおいて、第１の工程は、化学式（２０）で示される化合物をアンモニア水溶液及び塩化アンモニウムと反応させることにより行うものであってもよい。
【０２２０】
一方、リンカー７〜９（化学式（９）〜（１１））のように、Ｌ2が３以上であるポリエチレングリコール化合物を製造する場合などにおいて、
前記第１の工程は、化学式（２０）で示される化合物をヒドロキシアルキルテトラヒドロピラニルエーテルと反応させて化学式（２４）で示される化合物を製造する第１−１工程；
化学式（２４）で示される化合物をｐ−トルエンスルホン酸と反応させて末端のテトラヒドロピラニルオキシ基をヒドロキシ基に置換する第１−２工程；
以前の工程から得られた化合物をメタンスルホニルクロリドと反応させてヒドロキシ基をメタンスルホン酸基に転換する第１−３工程；及び
以前の工程から得られた化合物をアンモニア水溶液及び塩化アンモニウムと反応させる第１−４工程を含めて行うことを特徴とする。
【０２２１】
【化３４】
2019515972.tif 000036
・・・（２４）
【０２２２】
ここで、前記第１−１工程は、カリウムｔ−ペントキシドの存在下で行うことができる。
【０２２３】
また、Ｒ2にＯＰＳＳを反応基に導入した場合において、前記第２の工程は、化学式（２１）で示される化合物を、下記化学式（２５）で示される化合物と反応させて行うものであってもよい。
【０２２４】
【化３５】
2019515972.tif 000037
・・・（２５）
【０２２５】
一方、Ｒ2に−Ｉまたは−ＳＨを反応基に導入した場合において、前記第２の工程は、化学式（２１）で示される化合物をクロロ（Ｃ2−Ｃ7アルカノイル）クロリドと反応させて中間体として下記化学式（２６）で示される、末端にクロロ基を含む化合物を合成した後、硫化水素ナトリウムの存在または不在の下でハロゲン金属塩と反応させてクロロ基をチオールまたはハロゲンに転換して行うものであってもよい。
【０２２６】
【化３６】
2019515972.tif 000038
・・・（２６）
【０２２７】
本発明を具現する他の一つの態様は、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を増加させるキャリアを生理活性ポリペプチドに連結させるための、前記ポリエチレングリコール化合物の用途を提供する。
【０２２８】
前記生理活性ポリペプチド、キャリア、及びポリエチレングリコール化合物については、先に説明した通りである。
【０２２９】
本発明を具現する他の一つの態様は、前記ポリエチレングリコール化合物が付着した、生理活性ポリペプチドまたは前記結合体を含む組成物を提供する。
【０２３０】
前記生理活性ポリペプチド、結合体及びポリエチレングリコール化合物については、先に説明した通りである。
【０２３１】
前記組成物は薬学的組成物であってもよく、薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。
【０２３２】
薬剤学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造することができる。例えば、経口投与の際には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウエハースなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤などに剤形化することができる。
【０２３３】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギン酸、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが使用されてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含むことができる。
【０２３４】
本発明を具現する他の一つの態様は、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を増加させるキャリアを生理活性ポリペプチドに連結させるためのポリエチレングリコール化合物のリンカーを提供する。
【０２３５】
前記生理活性ポリペプチド、キャリア、及びポリエチレングリコール化合物については、先に説明した通りである。
【０２３６】
本発明の化合物は、下記反応式で示される一連の反応を通じて合成することができる。しかし、下記反応式は、本発明の化合物の例示的な製造方法に過ぎず、本発明の化合物の製造方法は、これに限定されず、当業界において公知となった方法を利用したり、適切に変更して行うことができる。
【０２３７】
［反応式］
【化３７】
2019515972.tif 000039
【０２３８】
＜反応例１＞化合物（２）の製造
反応容器に化合物（１）とジクロロメタンを投入する。反応温度を１０℃以下に維持しながら、トリエチルアミンとメタンスルホニルクロリドを投入する。室温で３時間撹拌する。反応を完結した後、水とジクロロメタンを投入し、５分間攪拌する。有機層を抽出した後、水層に再びジクロロメタンを投入して追加抽出する。有機層を集めて蒸留水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（２）を得る。
【０２３９】
＜反応例２＞化合物（３）の製造
反応容器にトルエンと化合物（１０）を投入する。カリウムｔ−ペントキシドを投入した後、約５０℃まで昇温させ、５０℃で１時間撹拌する（activation溶液）。他の反応容器に化合物（２）とトルエンを投入する。室温に冷却させたａｃｔｉｖａｔｉｏｎ溶液を前記混合液に３０℃で１時間滴加する。３０℃で３時間攪拌させた後、反応溶液に水を添加して抽出する。層分離した後、水溶液層にジクロロメタンを添加して抽出する。水層に再びジクロロメタンを投入して追加抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（３）を得る。
【０２４０】
＜反応例３＞化合物（４）の製造
反応容器に化合物（３）とエタノール、ジクロロメタンを投入する。ｐ−トルエンスルホン酸（p-TsOH）を投入した後、室温で２０時間撹拌する。水酸化ナトリウムを投入した後、溶媒を減圧濃縮させる。ジクロロメタンと水を投入し、５分間攪拌する。有機層を抽出した後、有機層を水で洗浄する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（４）を得る。
【０２４１】
＜反応例４＞化合物（５）の製造
反応容器に化合物（４）とジクロロメタンを投入する。反応温度を１０℃以下に維持しながら、トリエチルアミンとメタンスルホニルクロリドを投入する。室温で３時間撹拌する。反応を完結した後、水とジクロロメタンを投入し、５分間攪拌する。有機層を抽出した後、水層に再びジクロロメタンを投入して追加抽出する。有機層を集めて蒸留水６０ｍｌで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（５）を得る。
【０２４２】
＜反応例５＞化合物（６）の製造
容器にジメチルホルムアミドと化合物（５）を投入する。３０℃まで昇温させ、カリウムチオアセテートを投入した後、３０℃で５時間撹拌する。室温に冷却させた後、ジクロロメタンと水を加えて抽出する。層分離した後、水層をジクロロメタンで再抽出する。層分離した後、抽出した有機層を集め、２０％の塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。層分離した後、有機層に硫酸ナトリウムを投入して３０分間攪拌する。前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを５分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（６）を得る。
【０２４３】
＜反応例６＞化合物（７）の製造
容器に水と化合物（６）を投入する。反応液がｐＨ１４になるように０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を滴加する。室温で１２ｈｒ攪拌した後、１Ｎの塩酸溶液を使用してｐＨ６〜７に合わせる。中和させた後、ジクロロメタンを投入して抽出する。層分離した後、水層をジクロロメタンで再抽出する。層分離した後、抽出した有機層を集めて硫酸ナトリウムを投入し、３０分間撹拌する。前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを５分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（７）を得る。
【０２４４】
＜反応例７＞化合物（８）の製造
反応容器に化合物（７）とメタノールを投入する。化合物（１１）を滴加した後、室温で３日間撹拌する。反応溶媒を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（８）を得る。
【０２４５】
＜反応例８＞化合物（９）の製造  ［リンカー＃１］
反応容器に化合物（８）と蒸留水を投入する。１ＮのＨＣｌを使用して反応溶液のｐＨを１に合わせた後、室温で１時間撹拌する。反応を完結した後、水とジクロロメタンを投入し、５分間攪拌する。５％の炭酸水素ナトリウムを使用してｐＨ６に合わせた。ジクロロメタンを添加して抽出した後、有機層に硫酸ナトリウムを投入し、３０分間攪拌する。前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタン１ｍｌを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（９）を得る。
【０２４６】
【化３８】
2019515972.tif 000040
【０２４７】
＜反応例９＞化合物（１３）の製造
反応容器にトルエンと化合物（１２）を投入する。カリウムｔ−ペントキシドを投入した後、約５０℃まで昇温させ、５０℃で１時間撹拌する（activation溶液）。他の反応容器に化合物（２）とトルエンを投入する。室温に冷却させたａｃｔｉｖａｔｉｏｎ溶液を前記混合液に３０℃で１時間滴加する。３０℃で３時間攪拌させた後、反応溶液に水を添加して抽出する。層分離した後、水溶液層にジクロロメタンを添加して抽出する。水層に再びジクロロメタンを投入して追加抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（１３）を得る。
【０２４８】
＜反応例１０＞化合物（１４）の製造
反応容器に化合物（１３）とエタノールとジクロロメタンを投入する。ｐ−ＴｓＯＨを投入した後、室温で２０時間撹拌する。水酸化ナトリウムを投入した後、溶媒を減圧濃縮させる。ジクロロメタンと水を投入し、５分間攪拌する。有機層を抽出した後、有機層を水で洗浄する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（１４）を得る。
【０２４９】
＜反応例１１＞化合物（１５）の製造
反応容器に化合物（１４）とジクロロメタンを投入する。反応温度を１０℃以下に維持しながら、トリエチルアミンとメタンスルホニルクロリドを投入する。室温で３時間撹拌する。反応を完結した後、水とジクロロメタンを投入し、５分間攪拌する。有機層を抽出した後、水層に再びジクロロメタンを投入して追加抽出する。有機層を集めて蒸留水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（１５）を得る。
【０２５０】
＜反応例１２＞化合物（１６）の製造
反応容器にアセトンと化合物（１５）を投入する。３０℃まで昇温させ、ヨウ化カリウムを投入した後、約５０℃まで昇温させ、５０℃で１５時間撹拌する。前記反応液を減圧濃縮させた後、ジクロロメタンと水で洗浄する。層分離した後、有機層を水で再度洗浄する。層分離した後、有機層に硫酸ナトリウムを投入し、３０分間攪拌する。前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテル３０ｍｌを５分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（１６）を得る。
【０２５１】
＜反応例１３＞化合物（１７）の製造  ［リンカー＃２］
容器に水と化合物（１６）を投入する。反応液がｐＨ１．０になるように１Ｎの塩酸溶液を滴加する。室温で１時間攪拌した後、５％の炭酸水素ナトリウム溶液を使用してｐＨ６〜７に合わせる。中和させた後、ジクロロメタンを投入して抽出する。層分離した後、水層をジクロロメタンで再抽出する。層分離した後、抽出した有機層を集めて硫酸ナトリウムを投入し、３０分間撹拌する。前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを５分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（１７）を得る。
【０２５２】
【化３９】
2019515972.tif 000041
【０２５３】
＜反応例１４＞化合物（１８）の製造
容器にジメチルホルムアミドと化合物（１５）を投入する。３０℃まで昇温させ、カリウムチオアセテートを投入した後、３０℃で５時間撹拌する。室温に冷却させた後、ジクロロメタンと水を加えて抽出する。層分離した後、水層をジクロロメタンで再抽出する。層分離した後、抽出した有機層を集め、２０％の塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。層分離した後、有機層に硫酸ナトリウムを投入して３０分間攪拌する。前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを５分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（１８）を得る。
【０２５４】
＜反応例１５＞化合物（１９）の製造
容器に水と化合物（１８）を投入する。反応液がｐＨ１４になるように０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を滴加する。室温で１２時間攪拌した後、１Ｎの塩酸溶液を使用してｐＨ６〜７に合わせる。中和させた後、ジクロロメタンを投入して抽出する。層分離した後、水層をジクロロメタンで再抽出する。層分離した後、抽出した有機層を集めて硫酸ナトリウムを投入し、３０分間撹拌する。前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを５分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（１９）を得る。
【０２５５】
＜反応例１６＞化合物（２０）の製造  ［リンカー＃３］
容器に水と化合物（１９）を投入する。反応液がｐＨ１．０になるように１Ｎの塩酸溶液を滴加する。室温で１時間攪拌した後、５％の炭酸水素ナトリウム溶液を使用してｐＨ６〜７に合わせる。中和させた後、ジクロロメタンを投入して抽出する。層分離した後、水層をジクロロメタン５ｍｌで再抽出する。層分離した後、抽出した有機層を集めて硫酸ナトリウムを投入し、３０分間撹拌する。前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを５分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（２０）を得る。
【０２５６】
【化４０】
2019515972.tif 000042
【０２５７】
＜反応例１７＞化合物（２１）の製造
反応容器にアンモニア水溶液と塩化アンモニウムを投入する。化合物（５）を投入した後、室温で４日間撹拌する。ジクロロメタンを投入し、５分間攪拌する。有機層を抽出した後、水層に再びジクロロメタンを投入して追加抽出する。有機層を集めて蒸留水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（２１）を得る。
【０２５８】
＜反応例１８＞化合物（２２）の製造
反応容器に化合物（２１）とジクロロメタンを投入する。トリエチルアミンとクロロアセチルクロリドを滴加した後、室温で１６時間撹拌する。反応を完結した後、反応液を水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（２２）を得る。
【０２５９】
＜反応例１９＞化合物（２３）の製造
反応容器に化合物（２２）とアセトンを投入する。ＫＩを投入した後、５５℃で６時間撹拌する。反応液を室温に冷やした後、反応溶媒を減圧濃縮させる。ジクロロメタンと水を投入し、５分間攪拌する。有機層を抽出した後、水層に再びジクロロメタンを投入して追加抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（２３）を得る。
【０２６０】
＜反応例２０＞化合物（２４）の製造  ［リンカー＃５］
反応容器に化合物（２３）と蒸留水を投入する。１ＮのＨＣｌを使用して反応溶液のｐＨを１．０に合わせた後、室温で１時間撹拌する。反応を完結した後、水とジクロロメタンを投入し、５分間攪拌する。５％の炭酸水素ナトリウムを使用してｐＨ６に合わせた。ジクロロメタンを添加して抽出した後、有機層に硫酸ナトリウムを投入し、３０分間攪拌する。前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（２４）を得る。
【０２６１】
【化４１】
2019515972.tif 000043
【０２６２】
＜反応例２１＞化合物（２５）の製造
反応容器に化合物（５）とアセトンを投入する。ＫＩを投入した後、５５℃で２０時間撹拌する。反応液を室温に冷やした後、反応溶媒を減圧濃縮させる。ジクロロメタンと水を投入し、５分間攪拌する。有機層を抽出した後、水層に再びジクロロメタンを投入して追加抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（２５）を得る。
【０２６３】
＜反応例２２＞化合物（２６）の製造  ［リンカー＃１１］
反応容器に化合物（２５）と蒸留水を投入する。１ＮのＨＣｌを使用して反応溶液のｐＨを１．０に合わせた後、室温で１時間撹拌する。反応を完結した後、水とジクロロメタンを投入し、５分間攪拌する。５％の炭酸水素ナトリウムを使用してｐＨ６に合わせた。ジクロロメタンを添加して抽出した後、有機層に硫酸ナトリウムを投入し、３０分間攪拌する。前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（２６）を得る。
【０２６４】
【化４２】
2019515972.tif 000044
【０２６５】
＜反応例２３＞化合物（２７）の製造
反応容器にアンモニア水溶液と塩化アンモニウムを投入する。化合物（５）を投入した後、室温で４日間撹拌する。ジクロロメタンを投入して有機層を抽出した後、水層に再びジクロロメタンを投入して追加抽出する。有機層を集めて蒸留水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（２７）を得る。
【０２６６】
＜反応例２４＞化合物（２８）の製造
反応容器に化合物（２７）、化合物（３０）、ＥＤＣ（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）、ＨＯＢｔ（Hydroxybenzotriazole）、トリエチルアミン、ジメチルホルムアミドを投入する。室温で１６時間撹拌する。ジクロロメタンと水を加えて抽出する。層分離した後、水層をジクロロメタンで再抽出する。層分離した後、抽出した有機層を集め、２０％の塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。層分離した後、有機層に硫酸ナトリウムを投入して攪拌する。前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを５分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（２８）を得る。
【０２６７】
＜反応例２５＞化合物（２９）の製造  ［リンカー＃７］
反応容器に化合物（２８）と蒸留水を投入する。１ＮのＨＣｌを使用して反応溶液のｐＨを１に合わせた後、室温で１時間撹拌する。反応を完結した後、水とジクロロメタンを投入して攪拌する。５％の炭酸水素ナトリウムを使用してｐＨ６に合わせる。ジクロロメタンを添加して抽出した後、有機層に硫酸ナトリウムを投入し、前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（２９）を得る。
【０２６８】
【化４３】
2019515972.tif 000045
【０２６９】
＜反応例２６＞化合物（３１）の製造
反応容器に化合物（２７）とジクロロメタンを投入する。トリエチルアミンとクロロアセチルクロリドを滴加した後、室温で１６時間撹拌する。反応を完結した後、反応液を水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（３１）を得る。
【０２７０】
＜反応例２７＞化合物（３２）の製造
反応容器に化合物（３１）とアセトンを投入する。ＫＩを投入した後、５５℃で６時間撹拌する。反応液を室温に冷やした後、反応溶媒を減圧濃縮させる。ジクロロメタンと水を投入して有機層を抽出した後、水層に再びジクロロメタンを投入して追加抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（３２）を得る。
【０２７１】
＜反応例２８＞化合物（３３）の製造  ［リンカー＃８］
反応容器に化合物（３２）と蒸留水を投入する。１ＮのＨＣｌを使用して反応溶液のｐＨを１に合わせた後、室温で１時間撹拌する。反応を完結した後、水とジクロロメタンを投入し、５分間攪拌する。５％の炭酸水素ナトリウムを使用してｐＨ６に合わせる。ジクロロメタンを添加して抽出した後、有機層に硫酸ナトリウムを投入し、前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（３３）を得る。
【０２７２】
【化４４】
2019515972.tif 000046
【０２７３】
＜反応例２９＞化合物（３４）の製造
反応容器に化合物（３１）とメタノールを投入する。ＫＩとＮａＳＨを投入した後、室温で６時間撹拌する。反応液を室温に冷やした後、反応溶媒を減圧濃縮させる。ジクロロメタンと水を投入して有機層を抽出した後、水層に再びジクロロメタンを投入して追加抽出する。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、残ったろ液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（３４）を得る。
【０２７４】
＜実施例３０＞化合物（３５）の製造  ［リンカー＃９］
反応容器に化合物（３４）と蒸留水を投入する。１ＮのＨＣｌを使用して反応溶液のｐＨを１に合わせた後、室温で１時間撹拌する。反応を完結した後、水とジクロロメタンを投入し、５分間攪拌する。５％の炭酸水素ナトリウムを使用してｐＨ６に合わせる。ジクロロメタンを添加して抽出した後、有機層に硫酸ナトリウムを投入し、前記混合液をろ過した後、ろ過液を減圧濃縮させる。濃縮液にジクロロメタンを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテルを２０分間滴加する。生成された結晶をろ過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥して目的化合物である化合物（３５）を得る。
【０２７５】
以下、本発明の理解を助けるために実施例などを挙げて詳しく説明する。しかし、本発明に係る実施例は、種々の異なる形態に変形することができ、本発明の範囲が下記実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は、当業界における平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【０２７６】
実施例１：ポリエチレングリコール誘導体の製造
本発明者は、目的とする反応基を両末端に導入したポリエチレングリコール誘導体を製造した。その製造方法は、反応例１〜２５に示した通りである。
【０２７７】
代表的に、ポリエチレングリコール骨格（backbone）の一方の末端にプロピオニルアルデヒド基を付加した後、他方の末端にオルトピリジルジスルフィド（Orthopyridyl disulfide、OPSS）、ヨウ化アセトアミン（Iodoacetamide、IA）、ヨード基またはスルホンヒドリル（sulfhydryl group、SH-）を付加したヘテロ官能性（heterofunctional）ＰＥＧを製造する[図１]。
【０２７８】
それぞれの製造されたＰＥＧの純度はＮＭＲとＲＰＣ（reversed phase chromatography）分析法で分析した。
【０２７９】
代表的なポリエチレングリコール誘導体に関する具体的な内容は、次の通りである。
【０２８０】
（１）リンカー＃１：ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィド（orthopyridyl disulfide）
【０２８１】
【化４５】
2019515972.tif 000047
・・・（３）
【０２８２】
ここで、ｎは２００〜３００である。
【０２８３】
製造されたポリエチレングリコールリンカーの分子量は約１０ＫＤａであり、ＮＭＲを通じて構造を確認し、ＲＰＣ分析の結果、約８０％の純度を示した。
【０２８４】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，  ４００  ＭＨｚ）  δ  ９．７９（ｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝  ２．０  Ｈｚ），  ８．５０（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝  ５．６  Ｈｚ），  ７．７１−７．６４（ｍ，  ２Ｈ），  ７．０９−６．７０（ｍ，  １Ｈ），  ３．８７−３．４０（ｍ，  ９０８Ｈ），  ２．８２（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝  ５．６  Ｈｚ），  ２．６８（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝  ２．０Ｈｚ），  １．８６−１．６６（ｍ，  ４Ｈ）
【０２８５】
（２）リンカー＃２：ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ヨード（ｉｏｄｉｄｅ）
【０２８６】
【化４６】
2019515972.tif 000048
・・・（４）
【０２８７】
ここで、ｎは２００〜３００である。
【０２８８】
製造されたポリエチレングリコールリンカーの分子量は約１０ＫＤａであり、ＮＭＲを通じて構造を確認し、ＲＰＣ分析の結果、約８７％の純度を示した。
【０２８９】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，  ４００  ＭＨｚ）  δ  ９．８１（ｓ，  １Ｈ），  ３．８４−３．４７（ｍ，  ９１０Ｈ），  ３．２９（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝  ６．８  Ｈｚ），  ２．７１−２．６９（ｍ，  ２Ｈ），  ２．１０−２．０６（ｍ，  ２Ｈ）
【０２９０】
（３）リンカー＃３：ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−スルフヒドリル基
【０２９１】
【化４７】
2019515972.tif 000049
・・・（５）
【０２９２】
ここで、ｎは２００〜３００である。
【０２９３】
製造されたポリエチレングリコールリンカーの分子量は約１０ＫＤａであり、ＮＭＲを通じて構造を確認し、ＲＰＣ分析の結果、約７６％の純度を示した。
【０２９４】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，  ４００  ＭＨｚ）  δ  ９．７９（ｓ，  １Ｈ），  ３．８２−３．４５（ｍ，  ９１０Ｈ），  ２．７４（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝  ６．８  Ｈｚ），  ２．６９−２．６７（ｍ，  ２Ｈ），  １．９９−１．９５（ｍ，  ２Ｈ）
【０２９５】
（４）リンカー＃５：ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ヨード（ｉｏｄｉｄｅ）
【０２９６】
【化４８】
2019515972.tif 000050
・・・（７）
【０２９７】
ここで、ｎは２００〜３００である。
【０２９８】
製造されたポリエチレングリコールリンカーの分子量は約１０ＫＤａであり、ＮＭＲを通じて構造を確認し、ＲＰＣ分析の結果、約８８％の純度を示した。
【０２９９】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，  ４００  ＭＨｚ）  δ  ９．７８（ｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝  １．６  Ｈｚ），  ３．８２−３．４１（ｍ，  ９１２Ｈ），  ２．６７（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝  ２．０  Ｈｚ）
【０３００】
（５）リンカー＃７：ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィド  （ｏｒｔｈｏｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）
【０３０１】
【化４９】
2019515972.tif 000051
・・・（９）
【０３０２】
ここで、ｎは２００〜３００である。
【０３０３】
製造されたポリエチレングリコールリンカーの分子量は約１０ＫＤａであり、ＲＰＣ分析の結果、約８１％の純度を示した。
【０３０４】
（６）  リンカー＃８：ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ヨード（iodide）
【０３０５】
【化５０】
2019515972.tif 000052
・・・（１０）
【０３０６】
ここで、ｎは２００〜３００である。
【０３０７】
製造されたポリエチレングリコールリンカーの分子量は約１０ＫＤａであり、ＮＭＲを通じて構造を確認し、ＲＰＣ分析の結果、約７８％の純度を示した。
【０３０８】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，  ４００  ＭＨｚ）  δ  ９．７８（ｓ，  １Ｈ），  ３．８２−３．４１（ｍ，  ９１２Ｈ），  ２．７０（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝  ２．０Ｈｚ），  １．４４−１．２４（ｍ，  ４Ｈ）
【０３０９】
（７）  リンカー＃９：ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−スルフヒドリル基
【０３１０】
【化５１】
2019515972.tif 000053
・・・（１１）
【０３１１】
ここで、ｎは２００〜３００である。
【０３１２】
製造されたポリエチレングリコールリンカーの分子量は約１０  ＫＤａであり、ＲＰＣ分析の結果、約７６％の純度を示した。
【０３１３】
（８）  リンカー＃１１：ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ヨード（iodide）−比較例
【０３１４】
【化５２】
2019515972.tif 000054
・・・（１３）
【０３１５】
ここで、ｎは２００〜３００である。
【０３１６】
製造されたポリエチレングリコールリンカーの分子量は約１０ＫＤａであり、ＮＭＲを通じて構造を確認し、ＲＰＣ分析の結果、約８９％の純度を示した。
【０３１７】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，  ４００  ＭＨｚ）  δ  ９．７９（ｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝  ２．０  Ｈｚ），  ３．８２−３．４１（ｍ，  ９０８Ｈ），  ３．２９−３．２２（ｍ，  ２Ｈ），  ２．６９（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝  ２．０Ｈｚ）
【０３１８】
実施例２：新規なポリエチレングリコール誘導体の反応性の比較  
前記実施例１で製造したポリエチレングリコール誘導体を用いて生理活性ポリペプチドの連結体を製造するために、生理活性ペプチドの代表的な例としてＧＬＰ−１／Ｇｌｕｃａｇｏｎ／ＧＩＰ三重活性体（Triple Agonist）ペプチドを用いて連結体を製造した。該三重活性体ペプチドは、３０個のアミノ酸からなり、システイン残基を含むペプチドに該当する。したがって、これを本発明に係るポリエチレングリコール誘導体のチオール反応基の反応性の比較に使用した。
【０３１９】
また、ポリエチレングリコール誘導体として、約１０Ｋ（１０，０００Ｄａ）分子量を有するリンカー＃２、３、５、８、９及び１１を使用した。ここで、リンカー＃３及び＃９は、１０Ｋ  ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ＳＨ（両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基とスルフヒドリル基を一つずつ有しているＰＥＧ）に該当するが、リンカー＃９は、リンカー＃３とは異なり、チオール反応基の前にアミド構造を含む特性がある。また、リンカー＃２、５、８及び１１は、１０Ｋ  ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−Ｉ（両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基とヨード基を一つずつ有しているＰＥＧ）に該当するが、リンカー＃５及び８は、リンカー＃２と１１と異なり、チオール反応基の前にアミド構造を含む特性がある。
【０３２０】
ペプチド粉末を１０ｍＭ  ＨＣｌに溶解させた後、１０Ｋ  ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−Ｉと１０Ｋ  ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ＳＨをペプチドのシステイン残基にペグ化させるために、ペプチド：ＰＥＧのモル比を１：３〜５に、反応濃度を３ｍｇ／ｍｌにしてＲＴで約２時間反応させる。その時、反応は５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、または５０ｍＭのヘペス（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）、６０％のイソプロパノール（ＩＰＡ）で行われた。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った後、ｂａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ方法で、各チオール反応基の反応性を比較した[図１８]。反応性を確認した結果、チオール反応基の前にアミド構造を含む特性があるＰＥＧの場合、反応性が優れていることが確認された。
【０３２１】
実施例３：新規なポリエチレングリコール誘導体を用いた生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ結合体の製造
【０３２２】
前記実施例１で製造したポリエチレングリコール誘導体を用いて生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ結合体を製造するために、実施例２に記載したペプチドを用いて結合体を製造した。
【０３２３】
まず、ポリエチレングリコール誘導体として、約１０Ｋ（１０，０００Ｄａ）分子量を有するリンカー＃７を使用した。ここで、リンカー＃７は約１０Ｋ  ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ（両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基（propionaldehyde）とオルトピリジルジスルフィド基（orthopyridyl disulfide）を一つずつ有しているＰＥＧ）に該当する。ペプチド粉末を１０ｍＭ  ＨＣｌに溶解させた後、前記１０Ｋ  ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳをペプチドのシステイン残基にペグ化させるために、ペプチド：ＰＥＧのモル比を１：１〜１：３に、反応濃度を１または３ｍｇ／ｍｌにしてＲＴで約２時間反応させた。この時、反応は５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０〜５．０）または５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、６０％のイソプロパノールで行われた。
【０３２４】
また、ポリエチレングリコール誘導体として、約１０Ｋ（１０，０００Ｄａ）分子量を有するリンカー＃８と９を使用した。ここで、リンカー＃８は、約１０Ｋ  ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ＩＡ（両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基（ｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ）とＩＡ（iodoacetamide）を一つずつ有しているＰＥＧ）に該当し、リンカー＃９は、約１０Ｋ  ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ＳＨ（両末端にそれぞれプロピオンアルデヒド基とスルフヒドリル基を一つずつ有しているＰＥＧ）に該当する。
【０３２５】
前記ｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ＩＡ、そしてｐＡＬＤ−ＰＥＧ−ＳＨをリンカーとして使用した結合体を製造するために、前記実施例２とペグ化反応と同じ条件でペグ化反応を進行した後、反応液をクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、４５％のＥｔＯＨを含むバッファーとＫＣｌ濃度勾配を利用したＳＰ−ＨＰ（GE Healthcare、米国）カラムを使用して精製した。
【０３２６】
次に、それぞれの反応基で結合された後、前記精製されたモノペグ化された（ｍｏｎｏ−ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ペプチドと免疫グロブリンＦｃとのモル比が１：５になるようにし、全タンパク質の濃度を２０ｍｇ／ｍｌにして、４℃で１５時間反応させた。この時、反応液は、１００ｍＭのリン酸化カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に２０％のイソプロパノールと還元剤として２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。
【０３２７】
反応が終結した後、反応液は、ビス−トリス（Bis-Tris）（ｐＨ６．５）バッファーで塩化ナトリウム濃度勾配を利用してＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ（GE Healthcare、米国）カラムに適用し、硫酸アンモニウムとトリス（ｐＨ７．５）の濃度勾配を利用してＳｏｕｒｃｅ  ＩＳＯ（ＧＥ、米国）に適用し、三重活性体−１０Ｋ  ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を精製した。製造された結合体試料の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法で確認し、三重活性体とＰＥＧが結合された分子量を確認した。その後、三重活性体−ＰＥＧ結合体と免疫グロブリンＦｃが結合された三重活性体−１０Ｋ  ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の分子量を還元、非還元の条件で確認した。これに対する実験結果を図１９〜２１に示した[図１９〜２１]。
【０３２８】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図１ａ】
2019515972.tif 000070
【図１ｂ】
2019515972.tif 000071
【図２】
2019515972.tif 000072
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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