(57)【要約】  本発明は、特定の新生物状態に対して有効な他の処置、特にＥＧＦＲ阻害薬による抗癌処置、と組み合わせた治療薬による静止癌細胞の標的化によって、新生物を処置する組成物および方法を提供する。
2019511554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生物を有する被験者を処置する方法において、
前記被験者に、順次または同時に、ＤＹＲＫ１阻害剤を投与し、前記被験者にＥＧＦＲ  ＴＫＩを投与することを含み、前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化１】
2019511554.tif 000013
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
前記被験者に有効量の放射線療法を施すことをさらに含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、小細胞肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブから選択される、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２のリストから選択される、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブから選択される、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、Ｉ−５、Ｉ−６、およびＩ−７から選択される、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブから選択される、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２から選択される、方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブから選択される、方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、小細胞肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
【請求項１８】
新生物を有する被験者を処置する方法において、
前記被験者に、順次または同時に、
（ａ）ＤＹＲＫ１阻害剤であって、生化学アッセイにおいて１００ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＤＹＲＫ１ＡまたはＤＹＲＫ１Ｂキナーゼ活性を阻害し、このような阻害剤がない場合に見られるであろう静止癌細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）の割合を、少なくとも１０％だけ減少させる、ＤＹＲＫ１阻害剤と、
（ｂ）ＥＧＦＲ  ＴＫＩと、
を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化２】
2019511554.tif 000014
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る、方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法において、
前記被験者に有効量の放射線療法を施すことをさらに含む、方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、小細胞肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
【請求項２４】
請求項１８に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブのリストから選択される、可逆性阻害剤である、方法。
【請求項２５】
請求項１８に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
【請求項２６】
請求項１８に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２のリストから選択される、不可逆性阻害剤である、方法。
【請求項２７】
請求項１８に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブのリストから選択される、方法。
【請求項２８】
請求項１８に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、Ｉ−５、Ｉ−６、およびＩ−７から選択される、方法。
【請求項２９】
新生物を有する被験者を処置する方法において、
前記被験者に、順次または同時に、ＤＹＲＫ１阻害剤を投与し、前記被験者にＥＧＦＲ  ＴＫＩを投与することを含み、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩのＥＣ５０値は、細胞ベースのアッセイで決定される場合に、前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩ単独での同じ処置と比べて、組み合わせ処置では少なくとも２０％低い、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化３】
2019511554.tif 000015
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法において、
前記被験者に有効量の放射線療法を施すことをさらに含む、方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、小細胞肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
【請求項３３】
請求項２９に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
【請求項３４】
請求項２９に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
【請求項３５】
請求項２９に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブから選択される、方法。
【請求項３６】
請求項２９に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
【請求項３７】
請求項２９に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２から選択される、方法。
【請求項３８】
請求項２９に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブから選択される、方法。
【請求項３９】
請求項２９に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、Ｉ−５、Ｉ−６、およびＩ−７から選択される、方法。
【請求項４０】
新生物を有する被験者を処置する方法において、
前記被験者に、順次または同時に、ＤＹＲＫ１阻害剤を投与し、前記被験者にＥＧＦＲ  ＴＫＩを投与することを含み、この組み合わせ処置は、ＦＡＣＳアッセイによりサブ−Ｇ０細胞の割合によって決定される場合に、処置集団のアポトーシス細胞の割合を、いずれかの薬剤単独の場合と比較して少なくとも２倍だけ増やす、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化４】
2019511554.tif 000016
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る、方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法において、
前記被験者に有効量の放射線療法を施すことをさらに含む、方法。
【請求項４３】
請求項４０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、小細胞肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
【請求項４４】
請求項４０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
【請求項４５】
請求項４０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
【請求項４６】
請求項４０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブのリストから選択される、方法。
【請求項４７】
請求項４０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
【請求項４８】
請求項４０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２のリストから選択される、方法。
【請求項４９】
請求項４０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブから選択される、方法。
【請求項５０】
請求項４０に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、Ｉ−５、Ｉ−６、およびＩ−７から選択される、方法。
【請求項５１】
新生物を有する被験者を処置する方法において、
前記被験者に、順次または同時に、
（ａ）ＤＹＲＫ１阻害剤であって、生化学アッセイにおいて１００ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＤＹＲＫ１ＡまたはＤＹＲＫ１Ｂキナーゼ活性を阻害し、このような阻害剤がない場合に見られるであろう静止癌細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）の割合を、少なくとも１０％だけ減少させる、ＤＹＲＫ１阻害剤と、
（ｂ）ＥＧＦＲ  ＴＫＩであって、細胞集団（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）を前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩで処置すると、ＦＡＣＳアッセイにより決定される場合に、静止細胞（細胞周期のＧ０期にある細胞）の割合が、同じ細胞の未処置集団に比べて少なくとも２０％だけ増える、ＥＧＦＲ  ＴＫＩと、
を投与することを含む、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化５】
2019511554.tif 000017
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る、方法。
【請求項５３】
請求項５１に記載の方法において、
前記被験者に有効量の放射線療法を施すことをさらに含む、方法。
【請求項５４】
請求項５１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、小細胞肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
【請求項５５】
請求項５１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
【請求項５６】
請求項５１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
【請求項５７】
請求項５１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブから選択される、方法。
【請求項５８】
請求項５１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
【請求項５９】
請求項５１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２から選択される、方法。
【請求項６０】
請求項５１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブから選択される、方法。
【請求項６１】
請求項５１に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、Ｉ−５、Ｉ−６、およびＩ−７から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔背景〕
癌細胞静止、事実上睡眠状態にある細胞は、処置に対する癌細胞の耐性の、また疾患再発の経路を与えるための、主要なメカニズムとして近年認識されている。この静止は、代わりに細胞休眠とも呼ばれるが、細胞周期のＧ０期での停止によるものである。典型的には、細胞は、図１に示すように、ギャップ期１（Ｇ１）から細胞周期に入る。合成期（Ｓ）および短い有糸分裂前インターバル（Ｇ２）の後、細胞は、有糸分裂（Ｍ）により分裂し、その後Ｇ１に戻る。しかしながら、Ｇ１の代わりに、細胞は、Ｇ０期として示される細胞休眠または静止に入る場合がある。癌細胞は、老化と呼ばれる、最終分化を受ける前の不可逆状態に入るか、または、可逆性で真に静止したＧ０状態に入ることができ、このＧ０状態から、細胞は、静止繊維芽細胞のように、循環を再開し得る（Ｃｏｌｌｅｒ  ＨＡ，  Ｓａｎｇ  Ｌ，  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＪＭ  （２００６）  Ａ  ｎｅｗ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ，  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４，  ｅ８３）。
【０００２】
細胞集団は当然、いつでも静止状態にあってよく、また細胞分裂周期に入る信号を受け取るまでの予測できない期間にわたり静止したままであってよい。一例では、腫瘍内の集団において静止状態にある癌細胞の割合は、栄養素の欠乏、低酸素、高濃度の活性酸素種等といった、環境因子によって増大し得る。細胞はまた、薬理学的静止に見られるように、原薬の作用によって静止状態へと誘導され得る。
【０００３】
静止細胞のエネルギーおよび栄養素の必要性は、分裂細胞と比べて少ない。現在の癌療法は図２に示すように分裂細胞を標的としているので、癌細胞は、そのような処置が癌細胞に影響を及ぼすには細胞分裂周期になければならない。したがって、静止癌細胞は、露出したＤＮＡを損傷すること、ＤＮＡ複製もしくは修復を妨げること、有糸分裂を妨げること、または他のメカニズムによって１つ以上の（one of more）細胞増殖プロセスに影響を及ぼす処置に耐性を示す。
【０００４】
抗癌療法および放射線処置の両方が副作用を生じる。したがって、投与量および処置期間は、毒性により制限され、より低い有効投与量および／またはより短い処置期間が大いに望ましい。しかしながら、投与量を減少させるか、または処置を中止すると、生存静止癌細胞は、細胞周期に再び入った時に癌再発を引き起こす場合があり、そのタイミングは予測できない。さらに、血流中の転移性の癌細胞は、新たな微環境に順応する間、静止期間を経験し得る（Ｃｈａｆｆｅｒ  ＣＬ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ  （２０１１）  Ａ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３１，  １５５９−１５６４）。静止癌細胞はそれらのポリリボソームを分解し、よって、翻訳を阻止し、全ＲＮＡおよびタンパク質含量を低下させる。これらの収縮した癌細胞は、毛細血管の孔（約８μｍ直径）に入ることができ得るが、循環する癌細胞は、通常はるかに大きい（２０〜３０μｍ）。
【０００５】
したがって、新生物内における静止癌細胞集団の存在は、好結果で永続性のある処置に対する障害として認識されている（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＲＣ  （１９８９）  Ｔｈｅ  ｐｒｏｂｌｅｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ２９，  ２７−４６）。さまざまな癌型に由来する静止癌細胞の、さまざまな抗癌処置に対する耐性のエビデンスが報告されている。
【０００６】
しかし、癌細胞静止の重要性の評価の高まりにもかかわらず、この問題は、臨床的に取り組まれていない。
【０００７】
〔発明の概要〕
本発明は、特に、特定の新生物状態（neoplastic conditions）に対して有効な他の処置、特にＥＧＦＲ阻害薬による抗癌処置、と組み合わせた治療薬による静止癌細胞の標的化によって、新生物を処置する組成物および方法を提供する。
【０００８】
概して、本発明は、新生物を処置する方法を特徴とし、この方法は、新生物の処置を必要とする被験者に、治療上有効量の、（ａ）静止癌細胞に対して有効な治療薬、および（ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤である第２の薬剤を投与することを含み、これら２つの薬剤は、順次または同時に投与され得る。いくつかの実施形態では、新生物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの癌または癌細胞集団である。いくつかの実施形態では、この処置を受ける被験者は、（例えば転移性または前転移性の）癌と診断されている。いくつかの実施形態では、被験者は、以前に、癌に対する第一選択治療で処置されている。いくつかの実施形態では、被験者は、順次または同時に２つ以上のＥＧＦＲ阻害剤で処置されるか、または処置されている。
【０００９】
いくつかの実施形態では、組み合わせ処置は、生存の増加、重症度の低下、再発の遅れもしくは排除、または一次処置（すなわち、ＥＧＦＲ阻害剤）の副作用の減少など、転帰の改善を生じ得る。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、組み合わせの一環として投与される場合には、その薬剤のみでの処置に比べて、より低い投与量で、および／またはより短い期間にわたり、投与される。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤のＥＣ５０値は、例えば細胞ベースのアッセイで決定される場合に、単一の薬剤としてのＥＧＦＲ阻害剤での同じ処置と比べて、組み合わせ処置では少なくとも２０％低い。いくつかの実施形態では、組み合わせ処置は、例えばＦＡＣＳアッセイにおけるサブ−Ｇ０期細胞の割合によって決定される場合に、処置集団のアポトーシス細胞の割合を、いずれかの薬剤単独の場合と比較して少なくとも２倍だけ増やす。
【００１０】
一実施形態では、静止癌細胞に対して有効な治療薬はＤＹＲＫ１阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、例えば生化学アッセイにおいて１００ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＤＹＲＫ１キナーゼであるＤＹＲＫ１ＡまたはＤＹＲＫ１Ｂ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）いずれかの活性を阻害する化合物である。いくつかの実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、このような阻害剤がない場合に見られるであろう静止癌細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）の割合を、例えば少なくとも１０％だけ減少させる。いくつかの実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、ＤＹＲＫ１ＡおよびＤＹＲＫ１Ｂの両方を阻害する。いくつかの実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、ＤＹＲＫ１ＡまたはＤＹＲＫ１Ｂに対して選択的である。
【００１１】
一実施形態では、静止癌細胞に対して有効な治療薬はＤＹＲＫ１阻害剤である。一実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化１】
2019511554.tif 000003
の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る。
【００１２】
一実施形態では、式Ｉの化合物は以下から選択される。
【化２】
2019511554.tif 000004
【００１３】
別の実施形態では、本発明の方法は、（ｃ）被験者に、別の癌療法、例えば放射線療法または他の癌処置を施すこと、をさらに提供する。
【００１４】
一実施形態では、本発明の方法は、必要とする被験者に、治療上有効量の（ａ）式Ｉの治療薬、（ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤、および（ｃ）放射線療法を投与することを含み、各療法は、順次または同時に施される。例えば、いくつかの実施形態では、被験者はまず、放射線療法で処置され、その際、被験者は、式Ｉの治療薬を単独で、またはＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせて、投与される。いくつかの実施形態では、被験者は、（ａ）静止癌細胞に対して有効な治療薬、（ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤、およびオプションとして（ｃ）放射線療法を同時投与される。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、例えば生化学アッセイにおいて１００ｎＭ以下のＩＣ５０で、野生型または突然変異もしくは切断（truncated）ＥＧＦＲチロシンキナーゼ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）の活性を阻害する化合物である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、癌の処置に承認されたすべてのそのような化合物および哺乳動物の被験者（例えばマウス、ラット、イヌ、サル、ヒト）の癌の処置において別様に効力を示す化合物、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏで新生細胞に対して効力を示す化合物を含むがこれらに限定されない、新生物を処置または予防するのに有効なＥＧＦＲ阻害剤である。多くのそのような化合物が既知である。
【００１５】
ＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、小分子または抗ＥＧＦＲ抗体であってよい。
【００１６】
一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、可逆性ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ  ＴＫＩ）である。さらなる実施形態では、可逆性ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、例えば、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ（sapitinib）、バンデタニブ、バルリチニブ（varlitinib）、テセバチニブ（tesevatinib）、およびチルホスチンＡＧ  １４７８である。さらに別の実施形態では、可逆性ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９またはＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ  ＴＫＩの可逆性阻害剤はエルロチニブまたはラパチニブではない。
【００１７】
別の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、不可逆性ＥＧＦＲ  ＴＫＩである。さらなる実施形態では、不可逆性ＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、アファチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ロシレチニブ、ＴＡＫ２８５、およびＷＺ４００２である。さらに別の実施形態では、不可逆性ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、例えば、アリチニブ（allitinib）（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブである。
【００１８】
さらに別の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲに対する抗体、例えば、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））およびパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））である。
【００１９】
別の実施形態では、処置される新生物は、癌、例えば、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌である。さらなる実施形態では、癌は非小細胞肺癌である。さらなる実施形態では、癌は原発性または転移性である。なおさらなる実施形態では、癌は、実施例に示す細胞株種（cell line types）で表される種類のものである。いくつかの実施形態では、癌を有する被験者は、癌のリスクの増加および／または特定のＥＧＦＲ  ＴＫＩへの耐性と関連付けられるＥＧＦＲ遺伝子に突然変異を有する。
【００２０】
本明細書に記載する実施形態は、例示的なものであり、追加の組み合わせ成分、投与経路および順序、患者のタイプ（以前に処置を受けていないか、もしくは以前に処置を受けている、共存症状態の有無、年齢など）、または患者の疾患の病期、ＥＧＦＲ阻害剤の種類などに関して制限することは意図していない。
【００２１】
〔発明の詳細な説明〕
用語集
本発明では、「アルキル」基は、別段の指示がない限り、１〜８個の炭素原子（Ｃ１〜８アルキル基）、特に１〜６個または１〜４個の炭素原子を含む、飽和、直鎖、または分枝炭化水素基である。１〜６個の炭素原子を有するアルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル（例えばｎ−プロピル、イソ−プロピル）、ブチル（例えばｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ブチル）、ペンチル（例えばｎｅｏ−ペンチル）、ヘキシル（例えばｎ−ヘキシル）、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、およびそれらの他の異性体型である。アルキル基は、非置換であるか、または、ハロゲン原子、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、ＣＮ、ニトロ、およびアミノ基から選択された少なくとも１つの基で置換されていてよい。
【００２２】
本発明では、「アルケニル」基は、（別段の指示がない限り）２〜８個の炭素原子を含む、少なくとも１つの二重炭素−炭素結合を含む、直鎖または分枝炭化水素基である。２〜６個の炭素原子を含有するアルケニルの例は、ビニル、アリル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、およびそれらの異性体型である。アルケニル基は、非置換であるか、または、ハロゲン原子、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、ＣＮ、ニトロ、およびアミノ基から選択される少なくとも１つの基によって置換されていてよい。
【００２３】
本発明では、「アルキニル」基は、２〜８個の炭素原子を含む、少なくとも１つの三重炭素−炭素結合を含む直鎖または分枝炭化水素基である。アルキニル基は、ハロゲン原子、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、ＣＮ、ニトロ、およびアミノ基から選択される少なくとも１つの基によって置換されていてよい。
【００２４】
本発明では、「アリール」基は、５〜１４個の炭素原子を含む芳香族炭化水素環である。最も好適なアリール基は、単環式または二環式であり、６〜１４個の炭素原子を含み、例えばフェニル、α−ナフチル、３−ナフチル、アントラセニル（antracenyl）、好ましくはフェニルである。「アリール」基は、少なくとも別のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基に融合されたアリール環を含む、二環（bicycles）または三環（tricycles）、例えばベンゾジオキソラン（benzodioxolane）、ベンゾジオキサン、ジヒドロベンゾフラン（dihydrobenzofurane）、またはベンゾイミダゾールも含む。アリール基は、非置換であるか、または、ハロゲン原子、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、ＣＮ、ニトロ、およびアミノ基から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、もしくは３つ）の基で置換されていてよい。さらに、アリール基は、付着する炭素原子と合わせると、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を含有し得る五〜六員環を形成し得る隣接する置換基によって、置換されていてよい。
【００２５】
本発明では、「ハロゲン原子」または「ハロ」は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、またはＩ原子である。
【００２６】
本発明では、「アルコキシル」基は、式Ｏ−アルキルの、酸素原子を通じて分子の残りに結合されたアルキル基である。
【００２７】
本発明では、「アミノ」基は、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、またはＮ（アルキル）２基である。
【００２８】
本発明では、「ヘテロアリール」基は、環が少なくとも少なくとも１つのヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ、またはＳ原子によって遮られたアリール基、例えばチオフェンまたはピリジンである。ヘテロアリール基は、非置換であるか、または、ハロゲン原子、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、ＣＮ、ニトロ、およびアミノ基から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、もしくは３つ）の基で置換されていてよい。さらに、ヘテロアリール基は、付着する炭素原子と合わせると、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を含有し得る五〜六員環を形成し得る隣接する置換基によって、置換されていてよい。
【００２９】
本発明では、「シクロアルキル」は、好ましくは３〜１４個の炭素原子、さらに好ましくは３〜８個の炭素原子を有する１つの環を形成する飽和アルキル基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルを指す。シクロアルキル基は、非置換であるか、または、ハロゲン原子、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、ＣＮ、ニトロ、およびアミノ基から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、もしくは３つ）の基によって置換されていてよい。さらに、シクロアルキル基は、付着する炭素原子と合わせると、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を含有し得る五〜六員環を形成し得る隣接する置換基によって、置換されていてよい。
【００３０】
本発明では、「ヘテロシクロアルキル」基は、少なくとも１つのヘテロ原子を含むシクロアルキル基、例えば、ピロリジン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロフラン、ピペリジン、ピラン、ダイオキシン、モルフォリン、またはピペラジンである。ヘテロシクロアルキル基は、特に４〜１４個の炭素原子を含み得、例えば、モルホリニル、ピペリジニル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、ジチオラニル（dithiolanyl）である。ヘテロシクロアルキル基は、非置換であるか、または、ハロゲン原子、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、ＣＮ、ニトロ、およびアミノ基から選択される少なくとも１つの基によって置換されていてよい。さらに、ヘテロシクロアルキル基は、付着する炭素原子と合わせると、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を含有し得る五〜六員環を形成し得る隣接する置換基によって、置換されていてよい。
【００３１】
本明細書で使用される「新生物」は、新生組織形成によって生じる異常な組織塊を意味する。「新生組織形成」は、細胞の異常な増殖のプロセスを意味する。本発明のいくつかの実施形態では、新生物は、固形癌、または代わりに造血性癌である。新生組織形成は、良性、前悪性、または悪性であり得る。新生物という用語は、哺乳動物の癌、いくつかの実施形態ではヒト癌、および任意の組織の癌腫、肉腫、芽細胞腫（例えば腺癌、扁平上皮癌、骨肉腫など）、胚細胞性腫瘍、グリア細胞腫、リンパ腫、白血病を包含し、これらは、固形癌およびリンパ癌、腎癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、膵癌、胃癌、脳癌、頭頸部癌、皮膚癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、食道癌、甲状腺癌、肝癌、胆道癌、ならびに骨および軟骨組織の癌を含み、これらは、非ホジキンリンパ腫（例えばバーキットリンパ腫、小細胞型リンパ腫、および大細胞型リンパ腫）およびホジキンリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群を含む。
【００３２】
本明細書で使用される用語「処置する（treat）」、「処置すること（treating）」、または「処置（treatment）」は、医学的状態（例えば癌）を、その医学的状態が臨床的に許容可能な標準に従って改善される範囲で妨げることを意味する。癌の改善は、１）腫瘍増殖率の低下（腫瘍増殖阻害）、２）腫瘍縮小（退縮）、３）部分的かもしくは全体的かに関わらず、寛解、４）転移の減少、５）無増悪生存期間の延長、および６）再発の遅れもしくは排除を含み得る。本発明の特定の実施形態では、処置することは、以下の結果：癌の大きさ（mass）、もしくは体積、または悪性細胞数を部分的もしくは全体的に減らすこと；固形癌もしくは造血性癌に関連する臨床症状もしくは指標を向上もしくは改善すること；固形癌もしくは造血性癌の進行を遅らせるか、阻害するか、もしくは防止すること；または、固形癌もしくは造血性癌の発病もしくは発症を部分的もしくは全体的に遅らせるか、阻害するか、もしくは防止すること、のうちの１つ以上を部分的もしくは実質的に達成することを含む。また、「処置」は、処置なしで予測される生存と比べて、または標準的処置と比べて、長く生存することを意味し得る。
【００３３】
処置することは、予防的または防止的処置を含む。「予防的処置」は、対象の疾患の発症、重症度、または進行を防止、阻止、または低減するための、その疾患の臨床症状の出現または再発の前の処置を指す。
【００３４】
本明細書で使用される「有効量」は、対象の疾患の望ましい改善に作用するのに治療上または予防的に十分である治療薬、または治療薬の組み合わせの量を指す。有効量の例は、典型的には、１回の投薬につき体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約５００ｍｇの範囲であり、このような投薬は、１回、またはある期間にわたって施される。例としての範囲は、１回の投薬につき体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約５ｍｇである。他の実施例では、この範囲は、１回の投薬につき約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであってよい。さらに他の実施例では、有効量は、１回の投薬につき体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり５０ｍｇ、または１回の投薬につき体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ、体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり１ｍｇ、体重１ｋｇ当たり２ｍｇ、体重１ｋｇ当たり３ｍｇ、体重１ｋｇ当たり４ｍｇ、体重１ｋｇ当たり５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり６ｍｇ、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり２５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり３０ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり４０ｍｇの範囲である。既知の臨床用途の薬剤では、有効投与量の例は、適応症の処置のための規制機関により承認された量である。
【００３５】
本明細書で使用される用語「被験者」は、哺乳動物、例えばヒトを指すが、獣医学的処置を必要とする動物、例えば伴侶動物（例えばイヌ、ネコなど）、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）も意味し得る。
【００３６】
本明細書で使用される用語「治療薬」は、作用機序に関係なく、小分子であるか、もしくはペプチドであるか、もしくは抗体であるか、もしくはオリゴヌクレオチドであるかに関わらず、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤、もしくは標的剤を含む、癌処置に使用されるか、癌処置での使用を企図されるか、または癌処置での使用について研究される、任意の化学分子を意味する。本明細書で使用される用語「治療用物質」または「治療薬」は、医薬品有効成分（ＡＰＩ）またはその薬学的に許容される塩もしくは水和物（溶媒和物）、あるいは治療薬を含有するが調合された製剤を指し、ＡＰＩが非晶質であるか、または結晶質であるかを問わず、またいかなる多形体であるかを問わない。調合は、投与可能な剤形（製剤）を作るために賦形剤および／または送達ビヒクル（delivery vehicle）と組み合わせられた１つの医薬品有効成分（ＡＰＩ、原薬）または複数の医薬品有効成分（ＡＰＩｓ）の組み合わせを意味する。
【００３７】
生物学的原薬、例えばセツキシマブへの言及は、その生物学的製剤、または当業者によって、また規制機関によってバイオシミラーとして製造され、特徴づけられ、定義された、そのバイオシミラーを含有する、任意の製剤を意味する。
【００３８】
本発明の治療薬は、概して、（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓに記載されるような）標準的な薬務に関して、薬学的に許容されるキャリアと共に投与される。したがって、本発明のさらなる目的は、本明細書に定義される薬学的組成物、および薬学的に許容されるキャリアに関する。
【００３９】
本明細書で使用される用語「阻害剤」は、酵素活性を低下させる任意の組成物を意味する。阻害剤の例は化学分子である。阻害剤の効能の指標は、その「５０％阻害濃度」（ＩＣ５０）である。ＩＣ５０濃度またはＩＣ５０値は、酵素活性の５０％が阻害剤により阻害される、阻害剤の濃度である。例えばキナーゼ阻害剤の、ＩＣ５０値の決定方法は、当業者には既知であり、ＨｏｔＳｐｏｔ（商標）キナーゼアッセイテクノロジー（ペンシルバニア州マルバーンのＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ｗｗｗ．ｒｅａｃｔｉｏｎｂｉｏｌｏｇｙ．ｃｏｍ）などの直接および間接的な機能アッセイ、またはＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（登録商標）（カリフォルニア州フリーモントのＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ｗｗｗ．ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ．ｃｏｍ）などの競合結合アッセイを含む。
【００４０】
細胞株に対する治療薬の効能の指標は、その「５０％効果濃度」（ＥＣ５０）である。ＥＣ５０値は、例えば５０％の細胞増殖阻害または５０％の細胞生存能力低下など、最大半量の反応を生じる、薬品濃度である。例えばキナーゼ阻害剤の、ＥＣ５０値の決定方法は、当業者には既知である。
【００４１】
本明細書で使用される用語「静止」または「静止状態」は、当技術分野の専門家が理解するように、細胞周期のＧ０状態を指す。
【００４２】
本明細書で使用される用語「静止癌細胞に対して有効な治療薬」は、細胞集団中の静止癌細胞の割合を減少させるか、または、別の状況では集団中の静止癌細胞の割合の増加を生じるであろう条件下で、そのような増加を完全にもしくは実質的に防止する、分子を指す。
【００４３】
「静止新生細胞」は、代わりに（alternately）「静止癌細胞」と呼ばれるが、細胞周期の静止状態すなわちＧ０状態で存在する癌細胞を意味する。本明細書で使用される「静止新生細胞の割合」または「静止癌細胞の割合」は、細胞周期のＧ０状態で存在する癌細胞集団の部分を意味する。静止新生細胞の割合の決定は、細胞周期のステージ内のその構成細胞の分布によって、細胞集団を特徴づけることを含む。Ｇ０状態の細胞（すなわち、静止新生細胞）の割合は、細胞集団全体に対して定量化される。この割合は、細胞集団全体のパーセンテージ（すなわち（静止細胞の数を細胞集団中の全細胞で割ったもの）に１００を掛けたもの）として表すことができる。細胞周期のステージ内のその構成細胞の分布によって、細胞集団を特徴づけることは、当業者に既知の技術により達成され得、フローサイトメトリー法、例えば蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いた細胞周期内のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ含量分布による分析を含み得る。
【００４４】
本明細書で使用される用語「ＥＧＦＲ阻害剤」および「ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤」および「ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤」は、等価であり、互換的に使用され得る。ＥＧＦＲ阻害剤の例は、可逆性および不可逆性の小分子阻害剤を含む。例えば、可逆性ＥＧＦＲ阻害剤は、ブリガチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、ＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）、サピチニブ、バンデタニブ、およびバルリチニブを含み、不可逆性ＥＧＦＲ阻害剤は、アファチニブ、カネルチニブ、ダコミチニブ、ネラチニブ、オシメルチニブ、ペリチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、ＷＺ４００２を含む。
【００４５】
〔詳細な説明〕
本発明は、特に、特定の新生物状態に対して有効な他の処置、特にＥＧＦＲ阻害剤治療薬による抗癌処置、と組み合わせた、治療薬による静止癌細胞の標的化によって、新生物を処置する組成物および方法を提供する。
【００４６】
概して、本発明は、新生物を処置する方法を特徴とし、この方法は、新生物の処置を必要とする被験者に、治療上有効量の、（ａ）静止癌細胞に対して有効な治療薬、および（ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤である第２の薬剤を投与することを含み、これら２つの薬剤は、順次または同時に投与され得る。いくつかの実施形態では、新生物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの癌または癌細胞集団である。いくつかの実施形態では、この処置を受ける被験者は、（例えば転移性または前転移性の）癌と診断されている。いくつかの実施形態では、被験者は、以前に、癌に対する第一選択治療で処置されている。いくつかの実施形態では、被験者は、以前に、第二選択治療および／または他の療法で処置されている。いくつかの実施形態では、被験者は、放射線療法で処置されるか、または処置されている。いくつかの実施形態では、被験者は、例えば腫瘍を切除または摘除するために、手術で処置されている。他の実施形態では、被験者の新生物は再発している。いくつかの実施形態では、被験者は、順次または同時に２つ以上のＥＧＦＲ阻害剤で処置されるか、または処置されている。
【００４７】
いくつかの実施形態では、組み合わせ処置は、生存の増加、重症度の低下、再発の遅れもしくは排除、または一次処置（すなわち、ＥＧＦＲ阻害剤）の副作用の減少など、転帰の改善を生じ得る。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、その薬剤のみでの処置に比べて、組み合わせの一環として投与される場合に、より低い投与量で、および／またはより短い期間にわたり、投与される。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤のＥＣ５０値は、例えば細胞ベースのアッセイで決定される場合に、単一の薬剤としてのＥＧＦＲ阻害剤での同じ処置と比べて、組み合わせ処置では少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％低い。いくつかの実施形態では、組み合わせ処置は、例えばＦＡＣＳアッセイにおけるサブ−Ｇ０期細胞の割合によって決定される場合に、処置集団中のアポトーシス細胞の割合を、いずれかの薬剤単独の場合と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍だけ増やす。いくつかの実施形態では、静止癌細胞の割合は、例えば細胞ベースのアッセイで決定される場合に、単一の薬剤としてのＥＧＦＲ阻害剤での同じ処置と比べて、組み合わせ処置では少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％以上、減少する。
【００４８】
一実施形態では、静止癌細胞に対して有効な治療薬はＤＹＲＫ１阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、例えば生化学アッセイにおいて＜１００ｎＭ、＜９０ｎＭ、＜８０ｎＭ、＜７０ｎＭ、＜６０ｎＭ、＜５０ｎＭ、＜４０ｎＭ、＜３０ｎＭ、＜２０ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜５ｎＭであるか、またはそれより低いＩＣ５０値で、ＤＹＲＫ１ＡまたはＤＹＲＫ１Ｂ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）いずれかのＤＹＲＫ１キナーゼの活性を阻害する化合物である。いくつかの実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、このような阻害剤がない場合に見られるであろう腫瘍または集団中の静止癌細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）の割合を、例えば少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％だけ、またはこれより多く減少させる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、ＤＹＲＫ１ＡおよびＤＹＲＫ１Ｂの両方を阻害する。いくつかの実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、ＤＹＲＫ１ＢのＩＣ５０とＤＹＲＫ１ＡのＩＣ５０との比率が１０００、１００、５０、２５、１０：１で、ＤＹＲＫ１Ａに対して選択的である。いくつかの実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、ＤＹＲＫ１ＡのＩＣ５０とＤＹＲＫ１ＢのＩＣ５０との比率が１０００、１００、５０、２５、１０：１で、ＤＹＲＫ１Ｂに対して選択的である。いくつかの実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、ＩＣ５０値の比率によって決定される場合に、ＤＹＲＫ２および／またはＤＹＲＫ３および／またはＤＹＲＫ４と比べて、少なくとも４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍だけＤＹＲＫ１に対して選択的である。いくつかの実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、ＩＣ５０値の比率によって決定される場合に、例えばＣＤＫ２などのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と比べて、少なくとも４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍だけＤＹＲＫ１に対して選択的である。
【００５０】
既知のＤＹＲＫ１阻害剤の例は、ＡＺ１９１、ＤＹＲＫｉ、ハルミン、ＩＤ−８、ｌｅｕｃｅｔｔｉｎｅ  Ｌ４１、ＮＣＧＣ００１８５９８１、ＩＮＤＹ、ＰｒｏＩＮＤＹ、ＴＣ−Ｓ  ７００４、およびＴＧ００３を含む。少なくとも１つの既知のＤＹＲＫ１阻害剤であるＴＣ−Ｓ  ７００４（ＵＳ２０１２０１８４５６２）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの静止癌細胞に対して有効であることが報告されている（Ｅｗｔｏｎ  ＤＺ，  Ｈｕ  Ｊ，  Ｖｉｌｅｎｃｈｉｋ  Ｍ，  Ｄｅｎｇ  Ｘ，  Ｌｕｋ  ＫＣ，  Ｐｏｌｏｎｓｋａｉａ  Ａ，  Ｈｏｆｆｍａｎ  ＡＦ，  Ｚｉｐｆ  Ｋ，  Ｂｏｙｌａｎ  ＪＦ，  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＥＡ．  （２０１１）  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＩＲＫ／ＤＹＲＫ１Ｂ  ｋｉｎａｓｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １０：  ２１０４−２１１４）。
【化３】
2019511554.tif 000005
【００５１】
一実施形態では、ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化４】
2019511554.tif 000006
の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物であり、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る。
【００５２】
一実施形態では、式Ｉの化合物は以下から選択される。
【化５】
2019511554.tif 000007
【００５３】
別の実施形態では、本発明の方法は、（ｃ）被験者に、別の癌療法、例えば放射線療法または他の癌処置を施すこと、をさらに提供する。
【００５４】
一実施形態では、本発明の方法は、必要とする被験者に、治療上有効量の（ａ）式Ｉの治療薬、（ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤、および（ｃ）放射線療法を投与することを含み、各療法は、順次または同時に施される。例えば、いくつかの実施形態では、被験者はまず、放射線療法で処置され、その際、被験者は、式Ｉの治療薬を単独で、またはＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせて、投与される。いくつかの実施形態では、被験者は、（ａ）静止癌細胞に対して有効な治療薬、（ｂ）ＥＧＦＲ阻害剤、およびオプションとして（ｃ）放射線療法を同時投与される。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、例えば生化学アッセイにおいて＜１００ｎＭ、＜９０ｎＭ、＜８０ｎＭ、＜７０ｎＭ、＜６０ｎＭ、＜５０ｎＭ、＜４０ｎＭ、＜３０ｎＭ、＜２０ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜５ｎＭ、またはそれより低いＩＣ５０で、野生型または突然変異もしくは切断ＥＧＦＲチロシンキナーゼ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）の活性を阻害する化合物である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ  ３（ＥｒｂＢ−３）、およびＨｅｒ  ４（ＥｒｂＢ−４）と比べて、ＥＧＦＲに対して４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍選択的である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はまた、生化学アッセイにおいて＜１００ｎＭ、＜９０ｎＭ、＜８０ｎＭ、＜７０ｎＭ、＜６０ｎＭ、＜５０ｎＭ、＜４０ｎＭ、＜３０ｎＭ、＜２０ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜５ｎＭ、またはそれより低いＩＣ５０値で、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ  ３（ＥｒｂＢ−３）、およびＨｅｒ  ４（ＥｒｂＢ−４）のうちの１つ以上を阻害する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はまた、生化学アッセイにおいて＜１００ｎＭ、＜９０ｎＭ、＜８０ｎＭ、＜７０ｎＭ、＜６０ｎＭ、＜５０ｎＭ、＜４０ｎＭ、＜３０ｎＭ、＜２０ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜５ｎＭ、またはそれより低いＩＣ５０値で、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、例えばクラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ、および／またはクラスＩＶのＨＤＡＣのうちの１つ以上を阻害する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、野生型ＥＧＦＲと比べて、突然変異ＥＧＦＲ、例えばＴ７９０Ｍ突然変異を含むＥＧＦＲに対して選択的である。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、癌の処置に承認されたすべてのそのような化合物、癌の処置のための臨床試験における化合物、哺乳動物の被験者（例えばマウス、ラット、イヌ、サル、ヒト）の癌の処置において別様に効力を示す化合物、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで新生細胞に対して効力を示す化合物を含むがこれらに限定されない、新生物を処置または予防するのに有効なＥＧＦＲ阻害剤である。多くのそのような化合物が既知である。
【００５５】
ＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、小分子または抗ＥＧＦＲ抗体であってよい。
【００５６】
一実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、可逆性ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ  ＴＫＩ）である。さらなる実施形態では、可逆性ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、例えば、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、バンデタニブ、バルリチニブ、テセバチニブ、およびチルホスチンＡＧ  １４７８である。さらに別の実施形態では、可逆性ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９またはＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）である。いくつかの実施形態では、可逆性ＥＧＦＲ  ＴＫＩはエルロチニブまたはラパチニブではない。
【００５７】
別の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、不可逆性ＥＧＦＲ  ＴＫＩである。さらなる実施形態では、不可逆性ＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、アファチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ロシレチニブ、ＴＡＫ２８５、およびＷＺ４００２である。さらに別の実施形態では、不可逆性ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、例えば、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブである。
【００５８】
さらに別の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲに対する抗体、例えば、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））およびパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））である。
【００５９】
別の実施形態では、処置される新生物は、癌、例えば、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌（例えば、黒色腫）、精巣癌、甲状腺癌、または子宮癌である。さらなる実施形態では、癌は非小細胞肺癌、膵癌、および頭頸部癌である。さらなる実施形態では、癌は原発性または転移性である。なおさらなる実施形態では、癌は、実施例に示す細胞株種で表される種類のものである。いくつかの実施形態では、癌を有する被験者は、癌のリスクの増加および／または特定のＥＧＦＲ  ＴＫＩへの耐性と関連付けられるＥＧＦＲ遺伝子に突然変異を有する。
【００６０】
本明細書に記載する実施形態は、例示的なものであり、追加の組み合わせ成分、投与経路および順序、患者のタイプ（以前に処置を受けていないか、もしくは以前に処置を受けている、共存症状態の有無、年齢、性別など）、または患者の疾患の病期、ＥＧＦＲ阻害剤の種類などに関して制限することは意図していない。
【００６１】
ＥＧＦＲ阻害剤は、当技術分野で既知である（Ｌｅｅ  ＣＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＥＧＦＲ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  ２３，  １３３３−１３４８）。これらの薬品は、癌がＥＧＦＲを活性化する突然変異または他のＥＧＦＲ異常（過剰発現など）を含む患者、最も重要なことには非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ならびに膵癌、乳癌、および頭頸部癌の患者を処置するのに使用される。臨床上使用されるＥＧＦＲ阻害剤は、特に無増悪生存期間の点で、患者に大きな利益を与える。しかしながら、癌がＥＧＦＲ阻害剤による最初の処置に反応する大部分の患者は、１〜２年の短期間で再発を経験する。さらに、それらの患者の癌は、最初に有効であった処置に対して耐性ができている。ＥＧＦＲタンパク質における突然変異は、この耐性の一部を証明し、突然変異ＥＧＦＲ、特にＴ７９０Ｍ突然変異を標的とした新しいＥＧＦＲ阻害剤が、利用可能となっている。
【００６２】
近年、可逆性ＥＧＦＲ阻害剤であるエルロチニブまたはラパチニブへのＰＣ９ヒト非小細胞肺癌細胞の曝露によって、薬理学的静止、すなわちＧ０にある細胞の割合の著しい増加を生じることが発見された（Ｔｙｓｏｎ  ＤＲ，  Ｇａｒｂｅｔｔ  ＳＰ，  Ｆｒｉｃｋ  ＰＬ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｖｅ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｄａｔａ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，  ９２３−９２８）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤に過敏なＰＣ９細胞のエルロチニブでの処置に対する抗増殖反応は、主に、細胞がアポトーシスではなく静止状態になることによるものである。
【００６３】
アニリノキナゾリンまたはアニリノピリミジン足場のいずれに基づくかに関わらず、不可逆性阻害剤を含む、第２および第３世代ＥＧＦＲ  ＴＫＩへの異なる癌細胞株の曝露は、Ｇ０の割合の大きな増加をもたらしたことが分かった。したがって、Ｇ０にある細胞（静止細胞）の増加は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤の一般的な性質であり、これまでに報告されたいくつかの特定の例に限られるものではなく、これは予測および予期されていないことであった。ＥＧＦＲ  ＴＫＩへの曝露時のＧ０にある細胞の集団の増加は、血清飢餓で誘発されるものより顕著であり、予期しない観察結果であった。したがって、ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、薬理学的静止を誘発する。この細胞静止作用は、一時的な癌の寛解に続く再発の、ＥＧＦＲ阻害剤に関する臨床的観察を少なくとも部分的に説明することができる。
【００６４】
Ｇ０状態は、遺伝子発現の特別なプログラムにより維持される。ＤＹＲＫ１ＡおよびＤＹＲＫ１ＢなどのＤＹＲＫ１キナーゼが、癌細胞の中でＧ０状態（静止状態）にある癌細胞を維持するのに重要となり得るというエビデンスが出現している。
【００６５】
ＤＹＲＫ１Ｂ／Ｍｉｒｋは、特定の正常組織において生存および分化を媒介するキナーゼのＭｉｎｉｂｒａｉｎ／ＤＹＲＫファミリーのメンバーである。（Ｋｅｎｔｒｕｐ  Ｈ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｗ，  Ｈｅｕｋｅｌｂａｃｈ  Ｊ，  Ｗｉｌｍｅｓ  Ａ，  Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ  Ａ，  Ｈｕｐｐｅｒｔｚ  Ｃ，  Ｋａｉｎｕｌａｉｎｅｎ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｊｏｏｓｔ  ＨＧ  （１９９６）  Ｄｙｒｋ，  ａ  ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｗｈｏｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｕｂｄｏｍａｉｎｓ  ＶＩＩ  ａｎｄ  ＶＩＩＩ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１，  ３４８８−３４９５；Ｂｅｃｋｅｒ  Ｗ，  Ｗｅｂｅｒ  Ｙ，  Ｗｅｔｚｅｌ  Ｋ，  Ｅｉｒｍｂｔｅｒ  Ｋ，  Ｔｅｊｅｄｏｒ  ＦＪ，  ａｎｄ  Ｊｏｏｓｔ  ＨＧ  （１９９８）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＹＲＫ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３，  ２５８９３−２５９０２）。ＤＹＲＫ１Ｂは、骨格筋細胞および精巣において検出可能なレベルで発現する。ＤＹＲＫ１Ｂのノックアウトは、マウスの発達中の筋肉においても明らかに異常な表現型を引き起こさず、これは、ＤＹＲＫ１Ｂが正常な発達にとって不可欠の遺伝子ではないことを示唆している。この解釈を裏付けるように、正常な繊維芽細胞は、ＤＹＲＫ１Ｂキナーゼレベルの２０倍枯渇後の生存に全く変化を示さなかった。よって、ＤＹＲＫ１Ｂは、正常細胞の生存に不可欠な遺伝子であるとは思われないが、ＤＹＲＫ１Ｂが癌細胞を静止状態に保持することにより生存を媒介すると考えられる特定の悪性癌細胞内でアップレギュレートされるというエビデンスがある。これらの異常な特徴は、ＤＹＲＫ１Ｂが治療的介入、特に静止癌細胞に直接対抗する抗癌療法にとって魅力的な標的となり得ることを示唆している。
【００６６】
開示される組み合わせおよび方法は、個々のそれぞれの成分または既存の単一および組み合わせ処置の使用に比べて、用語集で定義されるような改善のうちの１つ以上を提供し得る。また、開示される組み合わせおよび方法は、治療薬および放射線の投与量および／または投与回数の減少を可能にし、個々の成分または既存の単一および組み合わせ処置を用いて可能となるものに比べて、処置の結果として同じ改善を達成することができる。
【００６７】
開示される組み合わせは、ＥＧＦＲ阻害剤での単一療法に比べて処置の有効性の著しい改善を生じるように、相乗的であるか、またはＥＣ５０値の著しい低下すらもたらす必要はない。前述のとおり、静止癌細胞は、ＥＧＦＲ阻害剤を含む抗癌治療用物質に本質的に影響を受けにくく、処置後生存しているほんのわずかな静止細胞さえ、再発をもたらし得る。したがって、新生物中の耐性のある静止細胞集団を根絶することにより、ＥＣ５０値の相乗的な減少をもたらす場合ももたらさない場合もあるが、癌再発率および転移性の新生物の出現において著しい改善をもたらし得る。
【００６８】
開示される組み合わせの投与経路およびレジメンは、処置される新生物状態、新生物の進行の程度、被験者の年齢および健康状態、選択される厳密な組み合わせ、ならびに他の要因に応じて大いに変化し得る。投与レジメンは、ある期間につき複数回の投与を含み得、処置は、同時に、または連続するなどして、施される。例えば、静止癌細胞に対して有効な治療薬が、ＥＧＦＲ阻害剤の前に投与され得る。静止癌細胞に対して有効な治療薬は、ＥＧＦＲ阻害剤より６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間前に投与され得る。静止癌細胞に対して有効な治療薬は、ＥＧＦＲ阻害剤と同時に（付随して）投与され得る。静止癌細胞に対して有効な治療薬は、ＥＧＦＲ阻害剤の６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間後に投与され得る。静止癌細胞に対して有効な治療薬および／またはＥＧＦＲ阻害剤は、放射線または他の療法の前、後、またはそれに付随して投与され得る。
【００６９】
静止癌細胞に対して有効な治療薬は、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、週２回（１週間当たり２回）、週１回、２週間に１回、１か月に１回、経口（ＰＯ）、静脈内（ＩＶ）、腹膜内（ＩＰ）、皮下（ＳＣ）、腫瘍内（ＩＴ）、髄腔内、または他の投与経路によって、投与され得る。
【００７０】
組み合わせは、処置を受けたことがない（処置されていない）被験者、または第一選択、第二選択、第三選択、もしくは他の療法、放射線処置による処置を以前に受けたか、もしくは固形腫瘍の外科的切除もしくは摘除を受けている被験者、または、癌が再発した被験者、または、癌が非転移性もしくは転移性である被験者に投与され得る。
【００７１】
〔実施例〕
以下の実施例は限定的とすることを意図しない。当業者は、本開示を鑑みて、多くの変更を特定の材料において行うことができ、それらは、開示され、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに依然として同じようなまたは類似の結果を得ることを、認識するであろう。
【００７２】
実施例１．  集団内の静止癌細胞の割合の決定
以下の細胞株をＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣ推奨に従って培養した：Ｌ８５８ＲおよびＴ７９０Ｍ突然変異を含むＨ１９７５−非小細胞肺癌細胞株；ＥＧＦＲ  ＴＫ中にＥ７４６−Ａ７５０欠失を有するＨＣＣ８２７−非小細胞肺癌細胞株；ＥＧＦＲ  ＴＫ中にＥ７４６−Ａ７５０欠失を有するＰＣ９−非小細胞肺癌細胞株；野生型ＥＧＦＲを有するＡ５４９−非小細胞肺癌細胞株；ＰＡＮＣ１−膵癌細胞株；ＭｉａＰａＣａ−２−膵癌細胞株、およびＳＷ６２０−結腸癌細胞株。これらの株の細胞培養物を、６ウェルプレートに、３×１０５〜６×１０５細胞／ウェルで播種した；培養された細胞数は、細胞の大きさおよび増殖速度次第であり、約５０％コンフルエンシーを目標とした。播種後、細胞は、３７℃で、湿気のある５％  ＣＯ２環境においてインキュベートされながら、２４時間付着させられ、その後、所望の長さの時間（通常２４時間）にわたり化合物で処置されて、同じ条件下でインキュベートされた。次に、細胞を、トリプシン処置で採取し、細胞を浮遊させて貯蔵し、ＰＢＳ中で洗浄し、氷のように冷たい７０％エタノールで一晩固定した。アクリジン・オレンジ（ＡＯ）染色では、固定細胞を、氷のように冷たいＰＢＳで一度洗浄し、１００μＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、２００μＬの透過処置溶液（permeabilizing solution）と６００μＬのＡＯ染色溶液とを添加した。４８８ｎｍで励起するよう青色レーザーを用いてＧｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ＨＴフローサイトメーター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって測定を行い、５２６ｎｍでのＡＯ−ＤＮＡ複合体および６５０ｎｍでのＡＯ−ＲＮＡ複合体の発光をモニタリングした。緩衝液の完全なプロトコルおよび組成が文献に記載されている（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  Ｚ，  Ｊｕａｎ  Ｇ，  ａｎｄ  Ｓｒｏｕｒ  ＥＦ  （２００４）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  （２００４）．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ７：Ｕｎｉｔ  ７．３）。
【００７３】
実施例２．  ２Ｄ細胞培養における細胞生存率測定のための一般的な手順
生存率分析では、細胞を、９６ウェルプレートに２×１０３〜６×１０３細胞／ウェルで播種した；細胞の大きさおよびおよび増殖速度次第であり、約５０％コンフルエンシーを目標とした。細胞は、３７℃で、湿気のある５％  ＣＯ２環境においてインキュベートされて、２４時間付着させられた。この処置は、１：３連続希釈法において少なくとも６つの異なる濃度の化合物を用いて行った。結果を読み取る前に、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２インキュベーターにおいて９６時間インキュベートした。各処置は３回行った。結果を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７１）によって、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  Ｇｅｍｉｎｉ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて製造業者の指示に従って、分析した。
【００７４】
実施例３．  静止癌細胞に対して有効な分子とエルロチニブとの組み合わせ
ＨＣＣ８２７細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したエルロチニブの最高濃度は４０ｎＭであり、化合物Ｉ−５の濃度は２μＭおよび４μＭであった。エルロチニブについて観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−５が存在しなかった場合に１２．１５ｎＭ、化合物Ｉ−５が２μＭの濃度で存在した場合に２．９５ｎＭ、化合物Ｉ−５が４μＭの濃度で存在した場合に＜０．１ｎＭであった。図３を参照のこと。
【００７５】
ＰＣ９細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したエルロチニブの最高濃度は４０ｎＭであり、化合物Ｉ−５の濃度はそれぞれ２μＭおよび４μＭであった。エルロチニブについて観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−５が存在しなかった場合に１７．３ｎＭ、化合物Ｉ−５が２μＭの濃度で存在した場合に９．３ｎＭ、化合物Ｉ−５が４μＭの濃度で存在した場合に３．７ｎＭであった。図４を参照のこと。
【００７６】
Ａ５４９細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したエルロチニブの最高濃度は１０μＭであり、化合物Ｉ−７の濃度はそれぞれ３μＭおよび６μＭであった。エルロチニブについて観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に１０．４μＭ、化合物Ｉ−７が３μＭの濃度で存在した場合に５．９μＭ、化合物Ｉ−７が６μＭの濃度で存在した場合に０．４μＭであった。図５を参照のこと。
【００７７】
ＰＡＮＣ１細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したエルロチニブの最高濃度は３０μＭであり、化合物Ｉ−５の濃度はそれぞれ２．５μＭおよび５μＭであった。エルロチニブについて観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−５が存在しなかった場合に＞３０μＭ、化合物Ｉ−５が２．５μＭの濃度で存在した場合に＞３０μＭ、化合物Ｉ−５が５μＭの濃度で存在した場合に１４μＭであった。図６を参照のこと。
【００７８】
ＭｉａＰａＣａ−２細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したエルロチニブの最高濃度は３０μＭであり、化合物Ｉ−５の濃度はそれぞれ２．５μＭおよび５μＭであった。エルロチニブについて観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−５が存在しなかった場合に＞３０μＭ、化合物Ｉ−５が２．５μＭの濃度で存在した場合に６．４μＭ、化合物Ｉ−５が５μＭの濃度で存在した場合に３．５μＭであった。図７を参照のこと。
【００７９】
これらの実験では、可逆性ＥＧＦＲ阻害剤であるエルロチニブを化合物Ｉ−５と組み合わせると、ＨＣＣ８２７、ＰＣ９、およびＡ５４９非小細胞肺癌細胞株に対するエルロチニブの細胞毒性が著しく増加した（ＥＣ５０値の低下）ことが証明された。さらに、細胞毒性の著しい増加（より低いＥＣ５０値）が、ＰＡＮＣ１およびＭｉａＰａＣａ−２膵癌細胞株に対して観察された。この結果は、ＥＧＦＲの比較的低い発現を有する、ＭｉａＰａＣａ−２細胞株で特に予想外であった。
【００８０】
実施例４．  静止癌細胞に対して有効な分子とアファチニブとの組み合わせ
Ｈ１９７５細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したアファチニブの最高濃度は５００ｎＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は２μＭおよび４μＭであった。アファチニブについて観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に８９．４ｎＭ、化合物Ｉ−７が２μＭの濃度で存在した場合に２５．２ｎＭ、化合物Ｉ−７が４μＭの濃度で存在した場合に８．２ｎＭであった。図８を参照のこと。
【００８１】
ＨＣＣ８２７細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したアファチニブの最高濃度は５０ｎＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は３μＭおよび６μＭであった。アファチニブについて観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に３．８ｎＭ、化合物Ｉ−７が３μＭの濃度で存在した場合に１．６ｎＭ、化合物Ｉ−７が６μＭの濃度で存在した場合に０．２ｎＭであった。図９を参照のこと。
【００８２】
ＰＣ９細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したアファチニブの最高濃度は５ｎＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は４μＭおよび８μＭであった。アファチニブについて観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に２．１ｎＭ、化合物Ｉ−７が３μＭの濃度で存在した場合に１．３ｎＭ、化合物Ｉ−７が６μＭの濃度で存在した場合に０．４ｎＭであった。図１０を参照のこと。
【００８３】
Ａ５４９細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したアファチニブの最高濃度は１０μＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は４μＭおよび８μＭであった。アファチニブについて観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に４．７μＭ、化合物Ｉ−７が３μＭの濃度で存在した場合に２．６μＭ、化合物Ｉ−７が６μＭの濃度で存在した場合に１．０μＭであった。図１１を参照のこと。
【００８４】
ＰＡＮＣ１細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したアファチニブの最高濃度は１０μＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は２μＭおよび４μＭであった。アファチニブについて観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に１．９μＭ、化合物Ｉ−７が２μＭの濃度で存在した場合に１．８μＭ、化合物Ｉ−７が４μＭの濃度で存在した場合に１．５μＭであった。図１２を参照のこと。
【００８５】
この実験では、不可逆性ＥＧＦＲ阻害剤であるアファチニブを化合物Ｉ−７と組み合わせると、Ｈ１９７５細胞および他の非小細胞肺癌細胞であるＨＣＣ８２７、ＰＣ９、およびＡ５４９に対するアファチニブの細胞毒性が著しく増加したこと（より低いＥＣ５０値）が証明された。さらに、アファチニブを化合物Ｉ−７と組み合わせると、ＰＡＮＣ１膵癌細胞に対する細胞毒性が増大したことが証明された。この最後の組み合わせは、相乗的なものではない、あるいは、ＥＣ５０値の劇的な減少を引き起こさないかもしれないが、単一療法による処置では生存する、新生物中の耐性のある静止細胞集団を根絶することにより、ＥＧＦＲ阻害剤での単一療法と比べて処置の有効性の著しい改善を十分にもたらし得る。
【００８６】
実施例５．  静止癌細胞に対して有効な分子とオシメルチニブとの組み合わせ
Ｈ１９７５細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したオシメルチニブの最高濃度は５０ｎＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は２μＭおよび４μＭであった。観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に８．７ｎＭ、化合物Ｉ−７が２μＭの濃度で存在した場合に７．９ｎＭ、化合物Ｉ−７が４μＭの濃度で存在した場合に４．２ｎＭであった。図１３を参照のこと。
【００８７】
ＰＡＮＣ１細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したオシメルチニブの最高濃度は２０μＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は２μＭおよび４μＭであった。観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に５．３μＭ、化合物Ｉ−７が２μＭの濃度で存在した場合に４．６μＭ、化合物Ｉ−７が４μＭの濃度で存在した場合に４．５μＭであった。図１４を参照のこと。
【００８８】
この実験では、不可逆性ＥＧＦＲ阻害剤であるオシメルチニブを化合物Ｉ−７と組み合わせると、Ｈ１９７５細胞に対するオシメルチニブの細胞毒性が著しく増加したこと（より低いＥＣ５０値）が証明された。さらに、オシメルチニブを化合物Ｉ−７と組み合わせると、ＰＡＮＣ１膵癌細胞に対する細胞毒性が増大したことが証明された。この最後の組み合わせは、相乗的なものではない、あるいは、ＥＣ５０値の劇的な減少を引き起こさないかもしれないが、単一療法による処置では生存する、新生物中の耐性のある静止細胞集団を根絶することにより、ＥＧＦＲ阻害剤での単一療法と比べて処置の有効性の著しい改善を十分にもたらし得る。
【００８９】
実施例６．  オシメルチニブ、および静止癌細胞に対して有効な分子とオシメルチニブとの組み合わせの細胞周期効果および細胞毒性
Ｈ１９７５細胞を、実施例１および２に記載のとおりに培養し、処置し、分析した。異なる濃度のオシメルチニブ、化合物Ｉ−７、またはオシメルチニブおよび化合物Ｉ−７の両方が存在する場合の結果を図１５および図１６に示す。
【００９０】
これらの実験では、Ｈ１９７５細胞をオシメルチニブに暴露することで細胞周期分布に変化が生じ、大部分の細胞を静止（Ｇ０）状態に誘発するのに、血清飢餓（ＦＢＳ−）よりもオシメルチニブが有効であることが証明された。無血清培地（ＦＢＳ−）および標準的な成長培地（ＦＢＳ＋）でインキュベートされたものである、正常に増殖するＨ１９７５細胞の細胞周期分布を比較のため示す。オシメルチニブは、細胞が、オシメルチニブで処置する前にＧ０にある細胞の割合を増やすために正常な成長培地（ＦＢＳ＋）で予めインキュベートされているか、無血清（ＦＢＳ−）培地で予め飢餓状態にされている（pre-starved）かに関わらず、細胞周期分布に変化をもたらした。さらに、化合物Ｉ−７とオシメルチニブとの組み合わせは、サブＧ０集団として証明され生存率測定によって証明されるアポトーシス細胞の著しい増加によって記録されるように、Ｇ０にある細胞の割合を減らし、結果として生じる細胞毒性を大いに高めた。この効果は、細胞が成長培地で予めインキュベートされたか、または血清飢餓条件下にあったかに関係なく、観察された。
【００９１】
実施例７．  静止癌細胞に対して有効な分子とロシレチニブとの組み合わせ
Ｈ１９７５細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したロシレチニブの最高濃度は５００ｎＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は２μＭおよび４μＭであった。ロシレチニブの阻害について観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に３５１ｎＭ、化合物Ｉ−７が２μＭの濃度で存在した場合に２２．５ｎＭ、化合物Ｉ−７が４μＭの濃度で存在した場合に１４．９ｎＭであった。図１７を参照のこと。
【００９２】
ＰＡＮＣ１細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したロシレチニブの最高濃度は２０μＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は２μＭおよび４μＭであった。観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に１１．４μＭ、化合物Ｉ−７が２μＭの濃度で存在した場合に９．９μＭ、化合物Ｉ−７が４μＭの濃度で存在した場合に７．１μＭであった。図１８を参照のこと。
【００９３】
この実験では、不可逆性ＥＧＦＲ阻害剤であるロシレチニブを化合物Ｉ−７と組み合わせると、Ｈ１９７５細胞に対するロシレチニブの細胞毒性が著しく増加したこと（より低いＥＣ５０値）が証明された。さらに、オシメルチニブを化合物Ｉ−７と組み合わせると、ＰＡＮＣ１膵癌細胞に対する細胞毒性が増加したこと（より低いＥＣ５０値）が証明された。この最後の組み合わせは、相乗的なものではない、あるいは、ＥＣ５０値の劇的な減少を引き起こさないかもしれないが、単一療法による処置では生存する、新生物中の耐性のある静止細胞集団を根絶することにより、ＥＧＦＲ阻害剤での単一療法と比べて処置の有効性の著しい改善を十分にもたらし得る。
【００９４】
実施例８．  ロシレチニブ、および静止癌細胞に対して有効な分子とロシレチニブとの組み合わせの細胞周期効果および細胞毒性
Ｈ１９７５細胞を、実施例１および２に記載のとおりに培養し、処置し、分析した。異なる濃度のロシレチニブ、化合物Ｉ−７、またはロシレチニブおよび化合物Ｉ−７の両方が存在する場合の結果を図１９に示す。
【００９５】
この実施例では、Ｈ１９７５細胞を、血清飢餓（ＦＢＳ−）条件下で２４時間インキュベートし、その後、処置の有無にかかわらず正常な成長培地（ＦＢＳ＋）中に「放出（released）」した。これらの条件下で、ロシレチニブへの曝露は、静止状態（Ｇ０）にある細胞の割合を著しく増加させた。細胞をロシレチニブと化合物Ｉ−７との組み合わせで同時に処置した場合、サブ−Ｇ０の割合によって決定されるようなアポトーシス細胞の大幅な増加によって判断されるように、このような静止細胞の割合の増加は観察されず、ロシレチニブの細胞毒性の大幅な増加が観察された。
【００９６】
実施例９．  ＥＧＦＲ阻害剤でＨ１９７５細胞を処置した際のＤＹＲＫ１Ｂの誘導
Ｈ１９７５細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。ウエスタンブロット分析では、細胞を６ウェルプレートに（細胞の大きさおよび増殖速度に応じて）５×１０５〜９×１０５細胞／ウェルで播種し、２４時間付着させ、その後、化合物で２４時間処置し、採取した。免疫ブロット法を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ）に記載されるとおりに、従来の技術を用いて実行した。
【００９７】
ブロッティングに使用した抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＳＴ）からのものであった：ＤＹＲＫ１Ｂ（Ｄ４０Ｄ１）Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ  ＃５６７２；ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｄ３８Ｂ１）ＸＰ（登録商標）Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ  ＃４２６７；Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｔｙｒ１０６８）（Ｄ７Ａ５）ＸＰ（登録商標）Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ  ＃３７７７；β−Ａｃｔｉｎ（１３Ｅ５）Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ  ＃４９７０；抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体  ＃７０７４。５％ＢＳＡ（ＣＳＴ  ＃９９９８）を含むＰｒｉｍａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １Ｘ  ＴＢＳＴを用いた。検出には、ＳｉｇｎａｌＦｉｒｅ（商標）ＥＣＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＣＳＴ  ＃６８８３）を使用した。
【００９８】
ウエスタンブロット分析により観察されたような、ロシレチニブ、オシメルチニブ、ダコミチニブ、およびアファチニブで２４時間処置した後のＨ１９７５細胞におけるＤＹＲＫ１Ｂ、ｐｈ−Ｙ１０６８  ＥＧＦＲ、全ＥＧＦＲ、およびβ−アクチンの発現レベルを図２０に示す。ＤＹＲＫ１Ｂタンパク質の発現を、ＦＢＳを含有する標準的な成長培地（ＦＢＳ＋）または無血清培地（ＦＢＳ−）でインキュベートされた未処置細胞と比較した。ＥＧＦＲ阻害剤それぞれによる処置が、ＥＧＦＲリン酸化を抑制し、血清飢餓により生じたのと同様であるかまたはそれより高いＤＹＲＫ１Ｂタンパク質の発現も誘発したことが、証明された。
【００９９】
実施例１０．  静止癌細胞に対して有効な分子とダコミチニブとの組み合わせ
Ｈ１９７５細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したダコミチニブの最高濃度は５００ｎＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は２μＭおよび４μＭであった。ダコミチニブ阻害について観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に１１０．３ｎＭ、化合物Ｉ−７が２μＭの濃度で存在した場合に８８．６ｎＭ、化合物Ｉ−７が４μＭの濃度で存在した場合に３４．８ｎＭであった。図２１を参照のこと。
【０１００】
ＰＡＮＣ１細胞を、実施例１および２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したダコミチニブの最高濃度は１０μＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は２μＭおよび４μＭであった。観察されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に１１．４μＭ、化合物Ｉ−７が２μＭの濃度で存在した場合に９．９μＭ、化合物Ｉ−７が４μＭの濃度で存在した場合に７．１μＭであった。図２２を参照のこと。
【０１０１】
この実験では、不可逆性ＥＧＦＲ阻害剤であるダコミチニブを化合物Ｉ−７と組み合わせると、Ｈ１９７５細胞に対するダコミチニブの細胞毒性が著しく増加したこと（より低いＥＣ５０値）が証明された。さらに、オシメルチニブを化合物Ｉ−７と組み合わせると、ＰＡＮＣ１膵癌細胞に対する細胞毒性が増加したことが証明された。この最後の組み合わせは、相乗的なものではない、あるいは、ＥＣ５０値の劇的な減少を引き起こさないかもしれないが、単一療法による処置では生存する、新生物中の耐性のある静止細胞集団を根絶することにより、ＥＧＦＲ阻害剤での単一療法と比べて処置の有効性の著しい改善を十分にもたらし得る。
【０１０２】
実施例１１．  ＡＺ１９１の細胞周期効果および化合物Ｉ−７との比較
ＳＷ６２０細胞を、実施例１に記載のとおりに培養し、処置した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色では、フローサイトメトリー用のＧｕａｖａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に付属の製造業者のプロトコルに従った。５３５ｎｍで励起するよう緑色レーザーを用いてＧｕａｖａ  ＰＣＡ−９６フローサイトメーター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって測定を行い、６１７ｎｍでの発光をモニタリングした。
【０１０３】
異なる濃度のＡＺ１９１が存在した場合の結果を図２３に示す。データは、２つの複製物の平均である。
【０１０４】
ＳＷ６２０細胞を、実施例１で説明したように培養し、処置し、分析した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色では、フローサイトメトリー用のＧｕａｖａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に付属の製造業者のプロトコルに従った。５３５ｎｍで励起するよう緑色レーザーを用いてＧｕａｖａ  ＰＣＡ−９６フローサイトメーター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって測定を行い、６１７ｎｍでの発光をモニタリングした。
【０１０５】
異なる濃度の化合物Ｉ−７が存在した場合の結果を図２４に示す。データは、２つの複製物の平均である。
【０１０６】
これらの実験では、ＳＷ６２０細胞を、異なる濃度のＡＺ１９１または化合物Ｉ−７を含有するＦＢＳ−培地で２４時間インキュベートした。これらの条件下で、ＡＺ１９１への曝露は、Ｇ０＋Ｇ１期の細胞の割合に変化が観察されなかったことに基づくと、静止状態（Ｇ０）にある細胞の割合を減少させなかった。同じ条件下で、同じかまたはより低い濃度の化合物Ｉ−７への曝露は、Ｇ０＋Ｇ１期の細胞の割合が著しく減少したことに基づくと、静止状態（Ｇ０）にある細胞の割合を著しく減少させた。
【０１０７】
ＡＺ１９１は、１７ｎＭでＤＹＲＫ１Ｂを阻害した（Ａｓｈｆｏｒｄ  ＡＬ，  Ｏｘｌｅｙ  Ｄ，  Ｋｅｔｔｌｅ  Ｊ，  Ｈｕｄｓｏｎ  Ｋ，  Ｇｕｉｃｈａｒｄ  Ｓ，  Ｃｏｏｋ  ＳＪ，  Ｌｏｃｈｈｅａｄ  ＰＡ  （２０１４）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＤＹＲＫ１Ｂ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＡＺ１９１  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｔｈａｔ  ＤＹＲＫ１Ｂ  ａｃｔｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＧＳＫ３ｂｅｔａ  ｔｏ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ａｔ  Ｔｈｒ（２８６），  ｎｏｔ  Ｔｈｒ（２８８）．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４５７，  ４３−５６）。
【０１０８】
この実験では、すべてのＤＹＲＫ１阻害剤が静止癌細胞に対して有効とは限らないことが証明された。
【０１０９】
実施例１２．  ３Ｄ細胞培養（スフェロイド）における細胞生存率測定の一般的手順
３Ｄ培養での生存率分析では、処置の初めに、４００〜６００μＭの直径のスフェロイド形成を目的として、細胞を９６ウェルＵＬＡ（超低付着（ultra-low attachment））プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃４５１５）に、細胞の大きさおよび増殖速度に応じて５×１０３〜６×１０３細胞／ウェルで播種した。細胞は、３７℃で、湿気のある５％  ＣＯ２環境において（細胞株に応じて）２〜３日間インキュベートされ、緊密なスフェロイド形成を可能にした。この処置では、５０μＬの培地を各ウェルから除去し、化合物を有する新鮮培地と取り換えた。この処置は、１：３連続希釈法において少なくとも６つの異なる濃度の化合物を用いて実行した。結果を読み取る前に、細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２インキュベーターにおいて４〜１０日間インキュベートした。処置時間が４日を超えた場合、各ウェルの７０μＬの培地を、試験化合物を含有する新鮮培地と、３日おきに取り換えた。各処置は、２回行った。結果を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）３Ｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ９６８２）によって、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  Ｇｅｍｉｎｉ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて製造業者の指示に従って、分析した。分析前に、スフェロイドを、５０倍の倍率で撮影した。
【０１１０】
実施例１３．  ３Ｄ細胞培養における静止癌細胞に対して有効な分子とアファチニブとの組み合わせ
Ｈ１９７５スフェロイドを、実施例１および１２で説明したように培養および処置した。このアッセイで使用したアファチニブの濃度は１００ｎＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は２．５μＭであった。処置時間は７日であった。図２５を参照のこと。
【０１１１】
この実験では、不可逆性ＥＧＦＲ阻害剤であるアファチニブを化合物Ｉ−７と組み合わせた療法により、Ｈ１９７５細胞の３Ｄ培養（スフェロイド）に対するアファチニブの細胞毒性が著しく増加した（より低いＥＣ５０値）ことが証明され；この組み合わせは、スフェロイドを完全に根絶したが、スフェロイドの一部は、アファチニブ単独での処置後も生存していた。
【０１１２】
実施例１４．  ３Ｄ細胞培養における静止癌細胞に対して有効な分子とオシメルチニブとの組み合わせ
Ｈ１９７５スフェロイドを、実施例１、２、および１２で説明したように７日間培養および処置した。このアッセイで使用したオシメルチニブの最高濃度は１０ｎＭであり、化合物Ｉ−７の濃度は２．５μＭであった。標準的な成長培地（ＦＢＳ＋）では、オシメルチニブについて決定されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に０．６８ｎＭ、化合物Ｉ−７が２．５μＭの濃度で存在した場合に０．２８ｎＭであった。血清飢餓（ＦＢＳ−）条件下では、オシメルチニブについて決定されたＥＣ５０値は、化合物Ｉ−７が存在しなかった場合に３．３ｎＭ、化合物Ｉ−７が２．５μｍの濃度で存在した場合に１．０ｎＭであった。図２６を参照のこと。
【０１１３】
この実験では、不可逆性ＥＧＦＲ阻害剤であるオシメルチニブを化合物Ｉ−７と組み合わせると、スフェロイドが標準的な培地（ＦＢＳ＋）で培養されるか枯渇培地（ＦＢＳ−）で培養されるかに関わらず、Ｈ１９７５細胞の３Ｄ培養（スフェロイド）に対するオシメルチニブの細胞毒性が著しく増加したこと（ＥＣ５０の低下）が証明された。意外にも、このＥＣ５０の低下率は、ＦＢＳ＋での３Ｄ培養よりもＦＢＳ−のほうが大きかった。
【０１１４】
本発明は、例としての実施形態を参照して具体的に図示および説明してきたが、形態および詳細のさまざまな変更が、特許請求の範囲により包含される本発明の範囲を逸脱せずに行われ得ることを、当業者は理解するであろう。
【０１１５】
〔実施の態様〕
（１）  新生物を有する被験者を処置する方法において、
前記被験者に、順次または同時に、ＤＹＲＫ１阻害剤を投与し、前記被験者にＥＧＦＲ  ＴＫＩを投与することを含み、前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化６】
2019511554.tif 000008
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る、方法。
（２）  実施態様１に記載の方法において、
前記被験者に有効量の放射線療法を施すことをさらに含む、方法。
（３）  実施態様１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、小細胞肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
（４）  実施態様１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
（５）  実施態様１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
【０１１６】
（６）  実施態様１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブから選択される、方法。
（７）  実施態様１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
（８）  実施態様１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２のリストから選択される、方法。
（９）  実施態様１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブから選択される、方法。
（１０）  実施態様１に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、Ｉ−５、Ｉ−６、およびＩ−７から選択される、方法。
【０１１７】
（１１）  実施態様１０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブから選択される、方法。
（１２）  実施態様１０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
（１３）  実施態様１０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２から選択される、方法。
（１４）  実施態様１０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブから選択される、方法。
（１５）  実施態様１０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、小細胞肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
【０１１８】
（１６）  実施態様１０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
（１７）  実施態様１０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
（１８）  新生物を有する被験者を処置する方法において、
前記被験者に、順次または同時に、
（ａ）ＤＹＲＫ１阻害剤であって、生化学アッセイにおいて１００ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＤＹＲＫ１ＡまたはＤＹＲＫ１Ｂキナーゼ活性を阻害し、このような阻害剤がない場合に見られるであろう静止癌細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）の割合を、少なくとも１０％だけ減少させる、ＤＹＲＫ１阻害剤と、
（ｂ）ＥＧＦＲ  ＴＫＩと、
を投与することを含む、方法。
（１９）  実施態様１８に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化７】
2019511554.tif 000009
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る、方法。
（２０）  実施態様１８に記載の方法において、
前記被験者に有効量の放射線療法を施すことをさらに含む、方法。
【０１１９】
（２１）  実施態様１８に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、小細胞肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
（２２）  実施態様１８に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
（２３）  実施態様１８に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
（２４）  実施態様１８に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブのリストから選択される、可逆性阻害剤である、方法。
（２５）  実施態様１８に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
【０１２０】
（２６）  実施態様１８に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２のリストから選択される、不可逆性阻害剤である、方法。
（２７）  実施態様１８に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブのリストから選択される、方法。
（２８）  実施態様１８に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、Ｉ−５、Ｉ−６、およびＩ−７から選択される、方法。
（２９）  新生物を有する被験者を処置する方法において、
前記被験者に、順次または同時に、ＤＹＲＫ１阻害剤を投与し、前記被験者にＥＧＦＲ  ＴＫＩを投与することを含み、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩのＥＣ５０値は、細胞ベースのアッセイで決定される場合に、前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩ単独での同じ処置と比べて、組み合わせ処置では少なくとも２０％低い、方法。
（３０）  実施態様２９に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化８】
2019511554.tif 000010
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る、方法。
【０１２１】
（３１）  実施態様２９に記載の方法において、
前記被験者に有効量の放射線療法を施すことをさらに含む、方法。
（３２）  実施態様２９に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、小細胞肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
（３３）  実施態様２９に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
（３４）  実施態様２９に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
（３５）  実施態様２９に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブから選択される、方法。
【０１２２】
（３６）  実施態様２９に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
（３７）  実施態様２９に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２から選択される、方法。
（３８）  実施態様２９に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブから選択される、方法。
（３９）  実施態様２９に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、Ｉ−５、Ｉ−６、およびＩ−７から選択される、方法。
（４０）  新生物を有する被験者を処置する方法において、
前記被験者に、順次または同時に、ＤＹＲＫ１阻害剤を投与し、前記被験者にＥＧＦＲ  ＴＫＩを投与することを含み、この組み合わせ処置は、ＦＡＣＳアッセイによりサブ−Ｇ０細胞の割合によって決定される場合に、処置集団のアポトーシス細胞の割合を、いずれかの薬剤単独の場合と比較して少なくとも２倍だけ増やす、方法。
【０１２３】
（４１）  実施態様４０に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化９】
2019511554.tif 000011
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る、方法。
（４２）  実施態様４０に記載の方法において、
前記被験者に有効量の放射線療法を施すことをさらに含む、方法。
（４３）  実施態様４０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、小細胞肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
（４４）  実施態様４０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
（４５）  実施態様４０に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
【０１２４】
（４６）  実施態様４０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブのリストから選択される、方法。
（４７）  実施態様４０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
（４８）  実施態様４０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２のリストから選択される、方法。
（４９）  実施態様４０に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブから選択される、方法。
（５０）  実施態様４０に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、Ｉ−５、Ｉ−６、およびＩ−７から選択される、方法。
【０１２５】
（５１）  新生物を有する被験者を処置する方法において、
前記被験者に、順次または同時に、
（ａ）ＤＹＲＫ１阻害剤であって、生化学アッセイにおいて１００ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＤＹＲＫ１ＡまたはＤＹＲＫ１Ｂキナーゼ活性を阻害し、このような阻害剤がない場合に見られるであろう静止癌細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）の割合を、少なくとも１０％だけ減少させる、ＤＹＲＫ１阻害剤と、
（ｂ）ＥＧＦＲ  ＴＫＩであって、細胞集団（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）を前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩで処置すると、ＦＡＣＳアッセイにより決定される場合に、静止細胞（細胞周期のＧ０期にある細胞）の割合が、同じ細胞の未処置集団に比べて少なくとも２０％だけ増える、ＥＧＦＲ  ＴＫＩと、
を投与することを含む、方法。
（５２）  実施態様５１に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、式Ｉ：
【化１０】
2019511554.tif 000012
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し、
式中、
Ｒ１は、置換もしくは非置換のＣ１〜８アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、または置換もしくは非置換のベンジルであり、
Ｒ２は、オプションとしてハロ、ＣＮ、ＮＯ２、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルキル、ＯＨ、ＯＣ１〜４アルキルから独立して選択された最大で４つの基で置換された、フェニルであり、２つの隣接する基およびそれらの介在炭素原子は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択された１つ以上のヘテロ原子を含有する五〜六員環を形成し得る、方法。
（５３）  実施態様５１に記載の方法において、
前記被験者に有効量の放射線療法を施すことをさらに含む、方法。
（５４）  実施態様５１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、腎癌、頭頸部癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、小細胞肺癌、卵巣癌、および前立腺癌から選択される原発性または転移性の癌である、方法。
（５５）  実施態様５１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の非小細胞肺癌である、方法。
【０１２６】
（５６）  実施態様５１に記載の方法において、
処置される前記新生物は、原発性または転移性の膵癌である、方法。
（５７）  実施態様５１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ブリガチニブ、ＣＵＤＣ−１０１、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イコチニブ、ラパチニブ、サピチニブ、テセバチニブ、チルホスチンＡＧ  １４７８、バンデタニブ、およびバルリチニブから選択される、方法。
（５８）  実施態様５１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、ＡＺＤ３７５９およびＭＴＫｉ−３２７（ＪＮＪ−２６４８３３２７）から選択される、方法。
（５９）  実施態様５１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アファチニブ、カネルチニブ、ＣＬ−３８７７８５（ＥＫＩ−７８５）、ＣＮＸ−２００６、ダコミチニブ、ナコチニブ（ＡＳＰ８２７３）、ネラチニブ、オルムティニブ（ＨＭ６１７１３）、オシメルチニブ、ＰＤ１６８３９３、ペリチニブ、ポジオチニブ、ＴＡＫ２８５、ロシレチニブ、およびＷＺ４００２から選択される、方法。
（６０）  実施態様５１に記載の方法において、
前記ＥＧＦＲ  ＴＫＩは、アリチニブ（ＡＬＳ−１３０６；ＡＳＴ−１３０６）、ＡＶ−４１２（ＭＰ−４１２）、ナザルチニブ（ＥＧＦ８１６）、およびピロチニブから選択される、方法。
【０１２７】
（６１）  実施態様５１に記載の方法において、
前記ＤＹＲＫ１阻害剤は、Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、Ｉ−５、Ｉ−６、およびＩ−７から選択される、方法。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】真核細胞の有糸分裂周期の概略図を示す。
【図２】利用可能な抗癌治療薬が作用すると考えられる細胞周期のステージを示すように注釈を付けられた、真核癌細胞の有糸分裂周期の概略図を示す。
【図３】ＨＣＣ８２７細胞の増殖に対する、エルロチニブと化合物Ｉ−５（０、２．５、５μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図４】ＰＣ９細胞の増殖に対する、エルロチニブと化合物Ｉ−５（０、２．５、５μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図５】Ａ５４９細胞の増殖に対する、エルロチニブと化合物Ｉ−７（０、３、６μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図６】ＰＡＮＣ１細胞の増殖に対する、エルロチニブと化合物Ｉ−５（０、２．５、５μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図７】ＭｉａＰａＣａ−２細胞の増殖に対する、エルロチニブと化合物Ｉ−５（０、２．５、５μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図８】Ｈ１９７５細胞の増殖に対する、アファチニブと化合物Ｉ−７（０、２、４μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図９】ＨＣＣ８２７細胞の増殖に対する、アファチニブと化合物Ｉ−７（０、３、６μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図１０】ＰＣ９細胞の増殖に対する、アファチニブと化合物Ｉ−７（０、３、６μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図１１】Ａ５４９細胞の増殖に対する、アファチニブと化合物Ｉ−７（０、３、６μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図１２】ＰＡＮＣ１細胞の増殖に対する、アファチニブと化合物Ｉ−７（０、３、６μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図１３】Ｈ１９７５細胞の増殖に対する、オシメルチニブと化合物Ｉ−７（０、２、４μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図１４】ＰＡＮＣ１細胞の増殖に対するオシメルチニブと化合物Ｉ−７（０、２、４μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図１５】以下で２４時間インキュベートされたＨ１９７５細胞の細胞周期分布のＦＡＣＳ分析を示す：パネルＡ：ＦＢＳ−培地；パネルＢ：ＦＢＳ＋培地；パネルＣ：５μＭの化合物Ｉ−７を含むＦＢＳ＋培地；パネルＤ：１８ｎＭのオシメルチニブを含むＦＢＳ＋培地；パネルＤ：５μＭの化合物Ｉ−７および１８ｎＭのオシメルチニブを含むＦＢＳ＋培地。
【図１６】以下でインキュベートされたＨ１９７５細胞の細胞周期分布のＦＡＣＳ分析を示す：パネルＡ：４８時間ＦＢＳ−培地；パネルＢ：２４時間ＦＢＳ−培地の後で標準的なＦＢＳ＋培地に２４時間放出；パネルＣ：２４時間ＦＢＳ−培地の後で２４時間５μＭの化合物Ｉ−７を含むＦＢＳ−培地に放出；パネルＤ：２４時間ＦＢＳ−培地の後で２４時間１８ｎＭのオシメルチニブを含むＦＢＳ−培地に放出；パネルＥ：２４時間ＦＢＳ−培地の後で２４時間１８ｎＭのオシメルチニブおよび５μＭの化合物Ｉ−７を含むＦＢＳ−培地。
【図１７】Ｈ１９７５細胞の増殖に対する、ロシレチニブと化合物Ｉ−５（０、２．５、５μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図１８】ＰＡＮＣ１細胞の増殖に対する、ロシレチニブと化合物Ｉ−７（０、２、４μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図１９】以下でインキュベートされたＨ１９７５細胞の細胞周期分布のＦＡＣＳ分析を示す：パネルＡ：２４時間ＦＢＳ−培地の後で２４時間ＦＢＳ＋培地に放出；パネルＢ：２４時間ＦＢＳ−培地の後２４時間５μＭの化合物Ｉ−７を含むＦＢＳ＋培地に放出；パネルＣ：２４時間ＦＢＳ−培地の後で２４時間８０ｎＭのロシレチニブを含むＦＢＳ＋培地に放出；パネルＤ：２４時間ＦＢＳ−培地の後で２４時間８０ｎＭのロシレチニブおよび５μＭの化合物Ｉ−７を含むＦＢＳ＋培地に放出。
【図２０】ロシレチニブ、オシメルチニブ、ダコミチニブ、およびアファチニブで２４時間処置した後の、Ｈ１９７５細胞におけるＤＹＲＫ１Ｂ、リン酸化Ｙ１０６８−ＥＧＦＲ、全ＥＧＦＲ、およびβ−アクチンの発現レベルを示すウエスタンブロット分析を示す。
【図２１】Ｈ１９７５細胞の増殖に対する、ダコミチニブと化合物Ｉ−５（０、２．５、５μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図２２】ＰＡＮＣ１細胞の増殖に対する、ダコミチニブと化合物Ｉ−７（０、２、４μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図２３】ＳＷ６２０細胞の細胞周期分布のＤＮＡ含量によるＦＡＣＳ分析を示す。細胞は以下でインキュベートされた：パネルＡ：２４時間ＦＢＳ−培地；パネルＢ：２４時間２．５μＭのＡＺ１９１を含むＦＢＳ−培地；パネルＣ：２４時間５μＭのＡＺ１９１を含むＦＢＳ−培地；パネルＤ：２４時間１０μＭのＡＺ１９１を含むＦＢＳ−培地。
【図２４】ＳＷ６２０細胞の細胞周期分布のＤＮＡ含量によるＦＡＣＳ分析を示す。細胞は以下でインキュベートされた：パネルＡ：２４時間ＤＭＳＯ対照を含むＦＢＳ−培地；パネルＢ：２４時間１．２５μＭの化合物Ｉ−７を含むＦＢＳ−培地；パネルＣ：２４時間２．５μＭの化合物Ｉ−７を含むＦＢＳ−培地；パネルＤ：２４時間５μＭの化合物Ｉ−７を含むＦＢＳ−培地。
【図２５】Ｈ１９７５細胞の３Ｄ細胞培養（スフェロイド）に対する、アファチニブと化合物Ｉ−７（０、２．５μＭ）との組み合わせの効果を示す。
【図２６】Ｈ１９７５細胞の３Ｄ細胞培養（スフェロイド）に対する、オシメルチニブと化合物Ｉ−７（０、２．５μＭ）との組み合わせの効果を示す。スフェロイドは異なる濃度のオシメルチニブで、以下で処置した：パネルＡ：ＦＢＳ＋培地；パネルＢ：ＦＢＳ−培地。
【図１】
2019511554.tif 000018
【図２】
2019511554.tif 000019
【図３】
2019511554.tif 000020
【図４】
2019511554.tif 000021
【図５】
2019511554.tif 000022
【図６】
2019511554.tif 000023
【図７】
2019511554.tif 000024
【図８】
2019511554.tif 000025
【図９】
2019511554.tif 000026
【図１０】
2019511554.tif 000027
【図１１】
2019511554.tif 000028
【図１２】
2019511554.tif 000029
【図１３】
2019511554.tif 000030
【図１４】
2019511554.tif 000031
【図１５】
2019511554.tif 000032
【図１６】
2019511554.tif 000033
【図１７】
2019511554.tif 000034
【図１８】
2019511554.tif 000035
【図１９】
2019511554.tif 000036
【図２０】
2019511554.tif 000037
【図２１】
2019511554.tif 000038
【図２２】
2019511554.tif 000039
【図２３】
2019511554.tif 000040
【図２４】
2019511554.tif 000041
【図２５】
2019511554.tif 000042
【図２６】
2019511554.tif 000043
【国際調査報告】
2019511554.tif 000044