(57)【要約】植物の遺伝子材料に挿入可能である遺伝子構築物の少なくとも１つの断片が提供され、遺伝子構築物の少なくとも１つの断片は、１つ以上の植物に由来する１つ以上のヌクレオチド配列を含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる。さらに提供されるのは、遺伝的に改善された植物の作製のための該遺伝子構築物の使用であり、改善された植物はそれにより改善される。改善された植物は、望ましい耐病性、非生物的ストレス耐性、または栄養的、嗜好性、もしくは形態学的特性を有してもよい。
2019515693.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の遺伝子材料に挿入可能な１つ以上の核酸断片を含む組換え遺伝子構築物であって、前記１つ以上の核酸断片の各々が、１つ以上の植物に由来する少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる、組換え遺伝子構築物。
【請求項２】
１つ以上の植物に由来する前記ヌクレオチド配列が１つの植物に由来する、請求項１に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項３】
１つ以上の植物に由来する前記ヌクレオチド配列が、同じ種の複数の植物に由来する、請求項１に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項４】
植物の遺伝子材料に挿入可能である前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片の全長が、少なくとも１００塩基対；少なくとも５００塩基対；少なくとも１０００；少なくとも２０００塩基対；または少なくとも３０００塩基対である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項５】
植物の遺伝子材料に挿入可能である前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片が、植物における１つ以上の発現用のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項６】
植物における発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列が、前記植物の形質を改変または修飾するための前記植物における発現に適応されている、請求項５に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項７】
植物における発現用の前記ヌクレオチド配列が、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項５または請求項６に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項８】
前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号３８〜４６、７６、７８、もしくは９８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項７に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項９】
植物における発現に適した前記１つ以上のヌクレオチド配列が、非タンパク質コードヌクレオチド配列である、請求項５または請求項６に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１０】
前記非タンパク質コードヌクレオチド配列が、１つ以上のスモールＲＮＡヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１１】
発現用の前記非タンパク質コードヌクレオチド配列が、配列番号１２〜２６、６４〜６６、８０〜８１、８３〜９２、９４、もしくは９６〜１０１で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１０に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１２】
植物における発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列が、１つ以上の選択可能マーカヌクレオチド配列を含む、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１３】
前記選択可能マーカヌクレオチド配列が、配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１２に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１４】
植物の遺伝子材料に挿入可能である前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片が、１つ以上の制御ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１５】
前記制御ヌクレオチド配列が、１つ以上のプロモータ配列を含む、請求項１４に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１６】
前記プロモータが、配列番号４〜７、６７、７３、７４、７６、７８、もしくは９８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１５に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１７】
前記制御配列が、１つ以上のターミネータ配列を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１８】
前記ターミネータが、配列番号８〜１１、１０６、１０８、１１１、もしくは１１２で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１７に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１９】
植物の遺伝子材料に挿入可能な前記１つ以上の核酸断片のフランキング配列またはそれらを囲むフランキング配列をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２０】
前記フランキング配列が制限消化部位を含む、請求項１９に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２１】
前記フランキング配列が、配列番号１０２、１０３、１０９、１１０、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、もしくは１２１で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２０に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２２】
第１の境界ヌクレオチド配列；
第２の境界ヌクレオチド配列；および
前記第１の境界ヌクレオチド配列と前記第２の境界ヌクレオチド配列との間に位置する１つ以上の追加的ヌクレオチド配列
を含み、ここで前記追加的ヌクレオチド配列、および前記追加的ヌクレオチド配列に隣接した前記第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部が、１つ以上の植物に由来する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２３】
前記１つ以上の追加的ヌクレオチド配列に隣接した前記第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部が、１つ以上の植物に由来し、ここで前記１つ以上の植物が、前記追加的ヌクレオチド配列および前記第１の境界ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部が由来する同じ１つ以上の植物である、請求項２２に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２４】
１つ以上の植物に由来する少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる、植物の遺伝子材料に挿入可能な前記１つ以上の核酸断片が、
（ｉ）１つ以上の植物に由来する前記第１の境界ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部；
（ｉｉ）前記１つ以上の植物に由来する前記１つ以上の追加的ヌクレオチド配列；および任意選択的には、
（ｉｉｉ）１つ以上の植物に由来する前記第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部
からなる、請求項２２または請求項２３に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２５】
前記第１の境界配列が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性Ｔ−ＤＮＡ植物形質転換において機能的な右境界ヌクレオチド配列に属する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２６】
前記第２の境界ヌクレオチド配列が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性Ｔ−ＤＮＡ植物形質転換において機能的な左境界ヌクレオチド配列に属する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
【請求項２７】
配列番号１〜３５、４９、５１〜５６、６６〜６８、７１〜９２、もしくは９４〜１０１で示されるヌクレオチド配列、または配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードする核酸、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２８】
組換え遺伝子構築物を作製するための方法であって、植物の遺伝子材料に挿入可能な１つ以上の核酸断片を１つ以上の植物から誘導するステップを含み、ここで前記１つ以上の核酸断片が少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、それにより前記組換え遺伝子構築物を作製する、方法。
【請求項２９】
第１の境界ヌクレオチド配列および第２の境界ヌクレオチド配列を１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の各末端に付加するステップを含み、ここで前記１つ以上の追加的ヌクレオチド配列および前記第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部が１つ以上の植物に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２８または請求項２９に記載の方法によって作製される組換え遺伝子構築物。
【請求項３１】
前記ヌクレオチド配列が由来するかまたは由来し得る元の前記１つ以上の植物が、ベシタブリア（Ｖｅｇｅｔａｂｉｌｉａ）、アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）、緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）、または有胚植物（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）という分類の生物であるかまたはそれを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物、または請求項２８もしくは請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記植物が単子葉植物または双子葉植物である、請求項３１に記載の組換え遺伝子構築物または方法。
【請求項３３】
前記植物が、サトウキビなどのイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）ファミリーの草；綿などのワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）種；イチゴなどのベリー；リンゴおよびオレンジなどの果樹ならびにアーモンドなどの堅果類を含む樹種；バラなどのバラ科植物を含む、観賞顕花植物などの観賞植物；ブドウなどのブドウ果実を含むブドウ；ソルガム、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、およびトウモロコシを含む穀類；大豆などのマメおよびピーナッツを含むマメ科種；トマトおよびジャガイモを含むナス科種；キャベツおよびオリエンタルマスタードを含むアブラナ属の種；カボチャおよびズッキーニを含むウリ科植物；バラを含むバラ科植物；レタス、チコリー、およびヒマワリを含むキク科植物、または前述の植物のいずれかの近縁種であるかまたはそれを含む、請求項３２に記載の組換え遺伝子構築物または方法。
【請求項３４】
前記植物が、トマト、イネ、およびソルガム、ならびにそれらの近縁種からなる群から選択される、請求項３３に記載の組換え遺伝子構築物または方法。
【請求項３５】
請求項１〜２８または３０〜３４のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物、および骨格ヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項３６】
前記骨格ヌクレオチド配列が、骨格挿入マーカヌクレオチド配列を含む、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
前記骨格挿入マーカヌクレオチド配列が、配列番号３６もしくは配列番号３７、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
請求項１〜２８もしくは３０〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３９】
植物を遺伝的に改善する方法であって、請求項１〜２８または３０〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片を植物細胞または植物組織の遺伝子材料に挿入するステップを含み、ここで遺伝的に改善される前記植物が、前記遺伝子構築物の前記核酸断片の前記１つ以上のヌクレオチド配列が由来する前記１つ以上の植物の同じ種に属する、方法。
【請求項４０】
前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片が、前記植物細胞または植物組織のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換を介して、前記植物細胞または植物組織の前記遺伝子材料に挿入される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片が、直接形質転換を介して前記植物細胞または植物組織の遺伝子材料に挿入される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記植物細胞または植物組織の遺伝子材料に導入される前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片が、植物の遺伝子材料に挿入可能な前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片からなる、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
遺伝的に改善された植物を選択するさらなるステップを含み、ここで前記植物の１つ以上の形質が、前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片の前記植物の遺伝子材料への挿入の結果として改変または修飾される、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記形質が、前記植物の形質を改変または修飾するための植物における発現に適した前記遺伝子構築物の１つ以上のヌクレオチド配列の発現に従って修飾される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記植物の前記形質が、１つ以上のスモールＲＮＡ配列を含む前記植物における１つ以上の核酸の発現により、比較的に改善され、増強され、あるいは陽性に改変され、前記核酸が、植物病原体の１つ以上の核酸および／または内因性植物核酸の発現および／または複製を改変する能力がある、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記植物の前記形質が、１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子の発現により、比較的に改善され、増強され、あるいは陽性に改変される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記形質が耐病性である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記耐病性が、植物ウイルス；線虫；昆虫；および細菌植物病原体から選択される病原体に対する耐性である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記形質が非生物的ストレス耐性である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記非生物的ストレス耐性が耐塩性である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記形質が栄養的および／または嗜好性形質である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記形質が形態学的形質である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
請求項３９〜５２のいずれか一項に記載の方法に従って作製される植物または植物部分。
【請求項５４】
植物であって、組換え遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片が前記植物の遺伝子材料に挿入されており、前記組換え遺伝子構築物が植物の遺伝子材料に挿入可能な１つ以上の核酸断片を含み、前記１つ以上の核酸断片が、１つ以上の植物に由来する少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる、植物。
【請求項５５】
前記植物が、ベシタブリア（Ｖｅｇｅｔａｂｉｌｉａ）、アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）、緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）、または有胚植物（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）という分類の生物である、請求項３９〜５２のいずれか一項に記載の方法、または請求項５３もしくは請求項５４に記載の植物。
【請求項５６】
前記植物が単子葉植物または双子葉植物である、請求項５５に記載の方法または植物。
【請求項５７】
前記植物が、サトウキビなどのイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）ファミリーの草；綿などのワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）種；イチゴなどのベリー；リンゴおよびオレンジなどの果樹ならびにアーモンドなどの堅果類を含む樹種；バラなどのバラ科植物を含む、観賞顕花植物などの観賞植物；ブドウなどのブドウ果実を含むブドウ；ソルガム、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、およびトウモロコシを含む穀類；大豆などのマメおよびピーナッツを含むマメ科種；トマトおよびジャガイモを含むナス科種；キャベツおよびオリエンタルマスタードを含むアブラナ科種；カボチャおよびズッキーニを含むウリ科植物；バラを含むバラ科植物；レタス、チコリー、およびヒマワリを含むキク科植物、または前述の植物のいずれかの近縁種であるかまたはそれを含む、請求項５６に記載の方法または植物。
【請求項５８】
前記植物が、トマト、イネ、およびソルガム、およびそれらの近縁種からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法または植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物形質転換に関する。より詳細には、本発明は、限定はされないが、イントラジェニック植物形質転換のための遺伝子構築物、およびこの構築物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新たな作物品種の作製のための遺伝子技術は、通常の育種方法と比べて、例えば、時間および経費節約、遺伝子引きずりの排除、ならびに作物と部分稔性を有するそれらの近縁野生種との間の交雑の防止について有意な利点を提供する。しかし、遺伝子技術を用いて作物の遺伝的改善を進める上での主な障害は、トランスジェニック品種のパブリックアクセプタンスの欠如である。少なくとも部分的には、これは分類学的に遠いグループに属する生物間での遺伝子材料の導入が「非天然」であるという認識に起因する。
【０００３】
同じ植物の変種、またはその他花受精可能な（ｓｅｘｕａｌｌｙ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）近縁種間での遺伝子材料の導入を含む遺伝子技術を用いて作製される植物は、一般にトランスジェニック作物よりも大衆に許容されると考えられる。これらの過程は、植物のゲノム（またはその他花受精可能な近縁種のゲノム）の一部が部分的に再配列され、組み換えられて、遺伝的多様性をもたらす場合、遺伝的組換えと考えることができる。遺伝的組換えは、多様な遺伝子プールを有する集団からの個体が環境変化に適応し得るための重要な自然過程である。遺伝的組換えの再現は、現在探究がなされている、「シスジェニック」および「イントラジェニック」と称される２つの手法により、分子生物学ツールを用いて達成することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
シスジェニック手法は、比較的保守的であり、同じ植物、またはその他花受精可能な近縁種からのイントロンおよび調節エレメントとともに完成する、遺伝子の非修飾ゲノムバージョンの導入のみを許容する。比較によると、イントラジェニック手法は、植物のゲノム内部の複数の領域、および／または同じ種の複数の個体植物、もしくはその他花受精可能な近縁種から得られる配列を含む核酸を導入することにより、機会を広げる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、広義には植物由来のヌクレオチド配列を用いた植物形質転換を対象とする。
組換え遺伝子構築物の少なくとも１つの断片が植物の遺伝子材料に挿入可能であり、１つ以上の植物に由来する１つ以上のヌクレオチド配列からなるような組換え遺伝子構築物を提供することは、本発明の好ましい対象である。本発明はまた、広範には、遺伝的に改善された植物の作製のための前記遺伝子構築物の使用を対象とする。
【０００６】
第１の態様では、本発明は、植物の遺伝子材料に挿入可能な１つ以上の核酸断片を含む組換え遺伝子構築物であって、前記１つ以上の核酸断片が、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５のヌクレオチド長、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列を含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる、組換え遺伝子構築物を提供する。
【０００７】
好ましくは、１つ以上の植物に由来する前記ヌクレオチド配列は、１つの植物に由来する。好適には、前記ヌクレオチド配列が２つ以上の植物に由来する実施形態では、前記植物は、異種交配可能であり、かつ／または同じ種である。
【０００８】
好ましくは、植物の遺伝子材料に挿入可能である遺伝子構築物の１つ以上の核酸断片の全長は、少なくとも１００塩基対；少なくとも５００塩基対；少なくとも１０００塩基対；少なくとも２０００塩基対；少なくとも２５００塩基対；または少なくとも３０００塩基対である。
【０００９】
好ましくは、植物の遺伝子材料に挿入可能であるこの態様の遺伝子構築物の１つ以上の核酸断片は、１つ以上の発現用のヌクレオチド配列を含む。好ましくは、前記１つ以上のヌクレオチド配列は、植物における発現に適する。
【００１０】
好ましくは、植物における発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列は、植物における発現に適応し、植物の形質を改変または修飾する。
特定の好ましい実施形態では、植物における発現用の前記ヌクレオチド配列の１つ以上は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい一実施形態では、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８〜４６、７６、７８、もしくは９８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００１１】
特定の好ましい実施形態では、植物における発現に適した前記ヌクレオチド配列の１つ以上は、非タンパク質コードヌクレオチド配列である。好ましくは、前記非タンパク質コードヌクレオチド配列は、１つ以上のスモールＲＮＡヌクレオチド配列を含む。好ましい一実施形態では、１つ以上のスモールＲＮＡヌクレオチド配列を含む、発現用の前記ヌクレオチド配列は、配列番号１２〜２６、６４〜６６、８０〜８１、８３〜９２、９４、もしくは９６〜１０１で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００１２】
好ましい実施形態では、植物における発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列は、１つ以上の選択可能マーカヌクレオチド配列を含む。好ましい一実施形態では、前記選択可能マーカヌクレオチド配列は、配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００１３】
好ましくは、植物の遺伝子材料に挿入可能であるこの態様の遺伝子構築物の１つ以上の核酸断片は、１つ以上の制御ヌクレオチド配列を含む。
好適には、植物の遺伝子材料に挿入可能である遺伝子構築物の核酸断片の発現可能なヌクレオチド配列は、前記制御ヌクレオチド配列の１つ以上に作動可能に連結される。
【００１４】
好ましくは、前記制御ヌクレオチド配列は、１つ以上のプロモータ配列を含む。好ましい一実施形態では、前記プロモータヌクレオチド配列は、配列番号４〜７、６７、７３、７４、７６、７８、もしくは９８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００１５】
好ましくは、前記制御配列は、１つ以上のターミネータ配列を含む。好ましい一実施形態では、前記ターミネータヌクレオチド配列は、配列番号８〜１１、１０６、１０８、１１１、もしくは１１２で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００１６】
好適には、この態様の組換え遺伝子構築物は、植物の遺伝子材料に挿入可能な１つ以上の断片に属するかまたはそれらを囲むフランキング配列を含んでもよい。一部の好ましい実施形態では、フランキング配列、またはその一部は、１つ以上の植物に由来する。
【００１７】
一部の好ましい実施形態では、フランキング配列は、制限消化部位を含む。特定の特に好ましい実施形態では、フランキング配列の１つ以上は、配列番号１０２、１０３、１０９、１１０、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、もしくは１２１で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００１８】
特定の特に好ましい実施形態では、この態様の組換え遺伝子構築物は、配列番号１〜３５、４９、５１〜５６、６６〜６８、７１〜９２、もしくは９４〜１０１で示されるヌクレオチド配列、または配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードする核酸、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００１９】
第１の態様の特定の好ましい実施形態では、組換え遺伝子構築物のフランキング配列は、境界配列を含む。好ましいかかる実施形態では、組換え遺伝子構築物は、
第１の境界ヌクレオチド配列；
第２の境界ヌクレオチド配列；および
第１の境界ヌクレオチド配列と第２の境界ヌクレオチド配列との間に位置する１つ以上の追加的ヌクレオチド配列
を含み、ここで前記追加的ヌクレオチド配列、および前記追加的ヌクレオチド配列に隣接した前記第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、１つ以上の植物種に由来する。
【００２０】
これらの実施形態では、任意選択的には、前記１つ以上の追加的ヌクレオチド配列に隣接した前記第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、１つ以上の植物に由来してもよい。好適には、前記１つ以上の植物は、追加的ヌクレオチド配列および第１の境界配列の少なくとも一部の由来元の同じ植物である。
【００２１】
第１の態様のこれらの好ましい実施形態では、好ましくは、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５のヌクレオチド長、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる、植物の遺伝子材料に挿入可能な１つ以上の核酸断片は、
（ｉ）１つ以上の植物に由来する第１の境界配列の少なくとも一部；
（ｉｉ）１つ以上の植物に由来する１つ以上の追加的ヌクレオチド配列；および任意選択的には、
（ｉｉｉ）１つ以上の植物に由来する第２の境界配列の少なくとも一部、
からなる。
【００２２】
特定の実施形態では、（ｉ）および（ｉｉ）の追加的ヌクレオチド配列は、少なくとも１５、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長である植物の同じヌクレオチド配列に由来する。
【００２３】
特定の実施形態では、（ｉｉｉ）および（ｉｉ）の追加的ヌクレオチド配列は、少なくとも１５、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長である植物の同じヌクレオチド配列に由来する。
【００２４】
好ましくは、これらの実施形態の遺伝子構築物の第１の境界ヌクレオチド配列は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）右境界ヌクレオチド配列である。
好ましくは、これらの実施形態の遺伝子構築物の第２の境界ヌクレオチド配列は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）左境界ヌクレオチド配列である。
【００２５】
好適には、これらの実施形態の追加的ヌクレオチド配列は、発現用のヌクレオチド配列および／または制御ヌクレオチド配列を含んでもよい。
特定の好ましい実施形態では、制御配列を含む追加的ヌクレオチド配列は、遺伝子構築物の第２の境界ヌクレオチド配列に隣接して位置し、選択可能マーカヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータ配列を含む。
【００２６】
組換え遺伝子構築物が境界配列を含む一部の特に好ましい実施形態では、該遺伝子構築物は、配列番号１〜３５、４９、５１〜６６、８１、９４、または１００で示されるヌクレオチド配列、および／または配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００２７】
第２の態様では、本発明は、組換え遺伝子構築物を作製するための方法であって、植物の遺伝子材料に挿入可能な１つ以上の核酸断片を１つ以上の植物から誘導するステップを含み、ここで前記１つ以上の核酸断片は、少なくとも１５のヌクレオチド長、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、それにより組換え遺伝子構築物を作製する、方法を提供する。
【００２８】
第２の態様の特定の好ましい実施形態では、該方法は、第１の境界ヌクレオチド配列および第２の境界ヌクレオチド配列を１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の各々の末端に付加するステップを含み、ここで１つ以上の追加的ヌクレオチド配列および第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、１つ以上の植物に由来する。
【００２９】
第３の態様では、本発明は、第２の態様の方法に従って作製される遺伝子構築物を提供する。特に好ましい実施形態では、前記遺伝子構築物は、配列番号１〜３５、４９、５１〜５６、６６〜６８、７１〜９２、または９４〜１０１で示されるヌクレオチド配列、または配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードする核酸、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００３０】
好ましくは、第１〜第３の態様の１つ以上の植物は、単子葉植物または双子葉植物であるかまたはそれを含む。
より好ましくは、前記１つ以上の植物は、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）ファミリーの草；ソルガム、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、およびトウモロコシを含む穀類；マメおよびピーナッツを含むマメ科種；トマトおよびジャガイモを含むナス科種；キャベツおよびオリエンタルマスタードを含むアブラナ属の種；カボチャおよびズッキーニを含むウリ科植物；バラを含むバラ科植物；レタスおよびヒマワリを含むキク科植物または前述の植物のいずれかの近縁種であるかまたはそれを含む。
【００３１】
特定の特に好ましい実施形態では、前記１つ以上の植物は、トマトまたはトマトの近縁種であるかまたはそれを含む。特定の特に好ましい実施形態では、前記１つ以上の植物は、イネ、またはイネの近縁種であるかまたはそれを含む。特定の特に好ましい実施形態では、前記１つ以上の植物は、ソルガム、またはソルガムの近縁種であるかまたはそれを含む。
【００３２】
第４の態様では、本発明は、第１または第３の態様の組換え遺伝子構築物を含むベクターを提供する。好適には、ベクターは、骨格ヌクレオチド配列をさらに含む。好ましい一実施形態では、前記ベクター骨格ヌクレオチド配列は、配列番号５０、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００３３】
好ましくは、この態様のベクターの骨格ヌクレオチド配列は、骨格挿入マーカヌクレオチド配列を含む。特定の好ましい実施形態では、骨格挿入マーカヌクレオチド配列は、配列番号３６または配列番号３７、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００３４】
この態様の特定の好ましい実施形態では、ベクターは、遺伝子構築物をさらに含む。
特定の実施形態では、さらなる遺伝子構築物は、植物に属しないかまたは由来しない植物の遺伝子材料への挿入のための１つ以上のヌクレオチド配列を含む。これらの実施形態では、好ましくは、前記１つ以上のヌクレオチド配列は、選択可能マーカヌクレオチド配列を含む。前記１つ以上のヌクレオチド配列は、制御ヌクレオチド配列を含んでもよい。１つの特に好ましいかかる実施形態では、前記さらなる遺伝子構築物は、配列番号６９で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００３５】
一部の特に好ましい実施形態では、第４の態様のベクターは、配列番号４７、４８、６３、７０、８２、９３、または９５で示されるヌクレオチド配列を含む。
第５の態様では、本発明は、第１または第３の態様の組換え遺伝子構築物、または第４の態様のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３６】
第６の態様では、本発明は、植物を遺伝的に改善する方法であって、第１または第３の態様の組換え遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片を植物細胞または植物組織の遺伝子材料に挿入するステップを含む、方法を提供する。
【００３７】
一部の好ましい実施形態では、遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片は、植物細胞または植物組織の細菌媒介性形質転換を介して、植物細胞または植物組織の遺伝子材料に挿入される。前記実施形態では、遺伝子構築物の前記少なくとも１つの断片は、好ましくは、植物細胞または植物組織のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換を介して、好ましくは第４の態様のベクターを用いて、植物細胞または植物組織の遺伝子材料に挿入される。
【００３８】
一部の好ましい実施形態では、遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片は、直接形質転換、例えば微粒子銃を介して、植物細胞または植物組織の遺伝子材料に挿入される。
【００３９】
この態様によると、植物細胞または植物組織の遺伝子材料に導入される、第１または第３の態様の遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片が、植物の遺伝子材料に挿入可能な１つ以上の核酸断片であり、ここで前記１つ以上の核酸断片が、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５のヌクレオチド長、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなることが特に好ましい。
【００４０】
好適には、この態様に従って遺伝的に改善される植物は、前記１つ以上の植物と異種交配可能であり、かつ／またはそれらと同じ種である植物に属する。
好ましくは、この態様の方法は、前記植物の１つ以上の形質が遺伝子構築物の少なくとも１つの断片の植物の遺伝子材料への挿入の結果として改変された、遺伝的に改善された植物を選択するステップをさらに含む。
【００４１】
好ましくは、前記ステップを含むこの態様の方法の実施形態では、植物における形質は、遺伝子構築物の発現におけるヌクレオチド配列の１つ以上の発現に従って改変される。
好ましい実施形態では、前記１つ以上の改変される形質は、相対的に増強された非生物的ストレス耐性である。好ましい実施形態では、前記１つ以上の改変される形質は、比較上の増強された耐病性である。好ましい実施形態では、前記１つ以上の改変される形質は、相対的に改善された栄養的および／または嗜好性特性である。好ましい実施形態では、前記１つ以上の改変される形質は、相対的に改善された形態学的特性である。
【００４２】
好ましくは、発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列は、少なくとも１５、またはより好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長である。
一部の好ましい実施形態では、発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
一部の好ましい実施形態では、発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列は、スモールＲＮＡ配列を含む。
この態様の特に好ましい一実施形態では、植物の耐病性は、１つ以上のスモールＲＮＡ配列を含む前記１つ以上の単離された核酸の発現により、比較的改善または増強され、ここで前記単離された核酸は、植物病原体の１つ以上の核酸の発現、翻訳および／または複製を改変する能力がある。
【００４４】
好ましくは、植物病原体は、植物ウイルス病原体である。
第６の態様の方法の特定の実施形態では、概方法は、さらに、
さらなる遺伝子構築物の核酸断片を植物の遺伝子材料に挿入するステップと；
植物の集団を、第１の態様の遺伝子構築物の核酸断片およびさらなる遺伝子構築物の核酸断片が遺伝子材料に挿入されている植物から作製するステップと；
植物を植物の前記集団から選択するステップと、
を含み、ここで前記植物の遺伝子材料は、第１の態様の遺伝子構築物の核酸断片を含むが、さらなる遺伝子構築物の核酸断片を含まない。
【００４５】
好ましくは、植物の遺伝子材料に挿入されるさらなる遺伝子構築物の核酸断片は、選択可能マーカヌクレオチド配列を含む。
一部の好ましいかかる実施形態では、第１の態様の遺伝子構築物およびさらなる遺伝子構築物は、第４の態様のベクターに属する。
【００４６】
追加的または代替的なかかる実施形態では、さらなる遺伝子構築物は、さらなるベクターに属する。
第７の態様では、本発明は、第６の態様の方法に従って作製される遺伝的に改善された植物または植物部分を提供する。
【００４７】
好ましい実施形態では、この態様の植物または植物部分は、相対的に改善された耐病性を有する。好ましくは、前記相対的に改善された耐病性は、ウイルス性病原体に対する耐性があるかまたはそれを含む。
【００４８】
好ましい実施形態では、この態様の植物または植物部分は、相対的に改善された非生物的ストレス耐性を有する。好ましくは、前記非生物的ストレス耐性は、耐塩性である。
好ましい実施形態では、この態様の植物または植物部分は、相対的に改善された栄養的および／または嗜好性特性を有する。
【００４９】
好ましい実施形態では、この態様の植物または植物部分は、相対的に改善された形態学的特性を有する。
第８の態様では、本発明は、組換え遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片が植物の遺伝子材料に挿入されている植物を提供し、ここで前記組換え遺伝子構築物は、植物の遺伝子材料に挿入可能な１つ以上の核酸断片を含み、ここで前記１つ以上の核酸断片は、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５のヌクレオチド長、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる。
【００５０】
好ましくは、植物の遺伝子材料に挿入されている組換え遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片は、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５のヌクレオチド長、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる１つ以上の核酸断片である。
【００５１】
好適には、遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片が挿入されている植物は、同じ種に属する、かつ／または前記１つ以上のヌクレオチド配列が得られる元の１つ以上の植物と異種交配可能である。
【００５２】
好ましくは、第６〜第８の態様の植物は、単子葉植物または双子葉植物である。
より好ましくは、前記植物は、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）ファミリーの草；イネ、ソルガム、コムギ、オオムギ、カラスムギ、およびトウモロコシを含む穀類；マメおよびピーナッツを含むマメ科種；トマトおよびジャガイモを含むナス科種；キャベツおよびオリエンタルマスタードを含むアブラナ科種；カボチャおよびズッキーニを含むウリ科植物；バラを含むバラ科植物；レタスおよびヒマワリを含むキク科植物または前述の植物のいずれかの近縁種であるかまたはそれを含む。
【００５３】
特定の特に好ましい実施形態では、前記１つ以上の植物は、トマトまたはトマトの近縁種であるかまたはそれを含む。特定の特に好ましい実施形態では、前記１つ以上の植物は、イネ、またはイネの近縁種であるかまたはそれを含む。特定の特に好ましい実施形態では、前記１つ以上の植物は、ソルガム、またはソルガムの近縁種であるかまたはそれを含む。
【００５４】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」が、単数形の不定冠詞として、またはそれ以外では不定冠詞が指す単一の対象ではない２つ以上の対象を除外するものとして解釈されるべきでないことは理解されるであろう。例えば、「ａ」ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、１つのヌクレオチド配列、１つ以上のヌクレオチド配列または複数のヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
本明細書で用いられるとき、文脈上特に要求されない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載の整数または整数の群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数の群の除外を意味しないように理解されるであろう。
【００５６】
本発明が容易に理解され、実際的効果がもたらされ得るように、ここで好ましい実施形態が、以下の貼付図面に関連する例として説明されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の遺伝子構築物、および前記遺伝子構築物を含む本発明のベクター（ｐＩｎｔＲ  ２）の概略図を示す図。この遺伝子構築物のヌクレオチド配列は、配列番号１で示される。
【図２】本発明の遺伝子構築物、および前記遺伝子構築物を含む本発明のベクターの概略図を示す図。
【図３】本発明の遺伝子構築物、および前記遺伝子構築物を含む本発明のベクターの概略図を示す図。
【図４】ｐＲｂｃＳ３Ｃ：ｓＧＦＰ：ｔＲｂｃＳ３Ｃ構築物および対照としてのｐ３５Ｓ：ｓＧＦＰ：ｔＮＯＳを用いるトマト葉肉プロトプラストの一過性形質転換の結果を示す図。
【図５】脈管組織および気孔におけるトマト葉でのｐＲｂｃＳ３Ｃ：ｓＧＦＰ：ｔＲｂｃＳ３Ｃの発現の結果を示す図。
【図６−１】アグロ浸潤されたベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉における一過性発現による、トマトＡＣＴＩＮ（Ａｃｔ７）、ＣＹＣＬＯＰＨＩＬＩＮ（ＣｙＰ４０）およびＵＢＩＱＵＩＴＩＮ（Ｕｂｉ３）遺伝子に属するプロモータ−ターミネータ対によって駆動されるＧＦＰ発現の比較を示す図。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図７】アグロ浸潤されたベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉における一過性発現による、トマトＡＣＴＩＮ（Ａｃｔ７；左カラム）、ＣａＭＶ  ３５Ｓ（中カラム）およびＲＵＢＩＳＣＯサブユニット３Ｃ（ＲｂｃＳ３Ｃ）遺伝子（右カラム）に属するプロモータ−ターミネータ対によって駆動されるＧＦＰ発現の比較を示す図。
【図８】選択的な１ｍｇ／ＬのＧＡ培地上で２週間、遺伝子内ｐＲｂｃＳ３Ｃ：ＧＳ１Ｇ２４５Ｃ：ｔＲｂｃＳ３Ｃ構築物を用いて形質転換されたトマト子葉からの再生の結果を示す図であり；左側の２つのプレートは、構築物を宿すアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）とともに同時インキュベートされなかった同時対照子葉である。
【図９】選択的な１ｍｇ／ＬのＧＡ培地上で４週間、遺伝子内ｐＲｂｃＳ３Ｃ：ＧＳ１Ｇ２４５Ｃ：ｔＲｂｃＳ３Ｃ構築物を用いて形質転換されたトマト子葉からの初期再生の結果を示す図。
【図１０−１】キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）配列を標的にするためのトマト由来ａｍｉＲＮＡ構築物の使用の結果を示す図。ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉のアグロインフィルトレーション後の二重ＬＵＣアッセイが示される。Ｎ＝６；エラーバーは平均値の標準誤差を表す。
【図１０−２】同上。
【図１１】５つの野生型対５つのａｍｉ１０（配列番号１５）の発現植物におけるＣＭＶ病徴発現を示す図。Ａ：ＣＭＶ接種後３週目の野生型（上パネル）対ａｍｉ１０（下パネル）植物におけるＣＭＶ病徴発現。Ｂ：ＣＭＶ接種後３週目の野生型（左）対ａｍｉ１０（右）におけるＣＭＶ病徴発現。
【図１２−１】５つの野生型対５つのａｍｉ１０（配列番号１５）の発現植物におけるＣＭＶウイルス負荷のｑＲＴ−ＰＣＲによる定量化を示す図。相対的発現比は、２つの参照遺伝子ＡＣＴＩＮおよびＧＡＰＤＨの相対比の幾何平均に基づいて計算された。
【図１２−２】同上。
【図１３−１】配列番号１８を作成するためにバイオインフォマティクスにより共に用いられ、導かれた、トマト（栽培品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）配列を用いて、配列番号１８で示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡｉ構築物を設計する過程を示し、ここで各植物由来配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長である図。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【図１３−４】同上。
【図１４】キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）配列を標的にするためのトマト由来ＲＮＡｉ構築物の使用の結果を示す図。ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉のアグロインフィルトレーション後の二重ＬＵＣアッセイの結果が示される。Ｎ＝６；エラーバーは平均値の標準誤差を表す；ｔ検定は高度な有意差を示した。
【図１５】図１に図示される、基本的な遺伝子内クローニングベクターｐＩｎｔＲ  ２内に含まれる遺伝子構築物の配列（配列番号１）を示し、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲＢおよびＬＢを含む第１および第２の境界ヌクレオチド配列（太字）；トマトＲｂｃＳ３Ｃプロモータおよびターミネータ（下線部）；ならびに遺伝子および追加的な遺伝子内発現カセットの挿入用に用いられる制限酵素部位（太字）を示す図。第１の境界ヌクレオチド配列（ＲＢ配列）は該配列の５’末端に表され、第２の境界ヌクレオチド配列（ＬＢ配列）は該配列の３’末端に表されることに注意のこと。
【図１６−１】アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異体植物（ｍｅｄ１８）のウイルス耐性（Ａ）；およびトマト由来ａｍｉＲＮＡ配列を用いたトマトＭＥＤ１８の抑制を示す図。
【図１６−２】同上。
【図１７−１】配列番号１〜６６、６８、７１〜７２、７５、７７、８０、８３〜８９、９３、および９５をＦＡＳＴＡ形式で示す図。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【図１７−５】同上。
【図１７−６】同上。
【図１７−７】同上。
【図１７−８】同上。
【図１７−９】同上。
【図１７−１０】同上。
【図１７−１１】同上。
【図１７−１２】同上。
【図１７−１３】同上。
【図１７−１４】同上。
【図１７−１５】同上。
【図１７−１６】同上。
【図１７−１７】同上。
【図１７−１８】同上。
【図１７−１９】同上。
【図１７−２０】同上。
【図１７−２１】同上。
【図１７−２２】同上。
【図１７−２３】同上。
【図１７−２４】同上。
【図１７−２５】同上。
【図１７−２６】同上。
【図１７−２７】同上。
【図１７−２８】同上。
【図１７−２９】同上。
【図１７−３０】同上。
【図１７−３１】同上。
【図１７−３２】同上。
【図１７−３３】同上。
【図１７−３４】同上。
【図１７−３５】同上。
【図１７−３６】同上。
【図１７−３７】同上。
【図１７−３８】同上。
【図１７−３９】同上。
【図１７−４０】同上。
【図１７−４１】同上。
【図１７−４２】同上。
【図１７−４３】同上。
【図１７−４４】同上。
【図１７−４５】同上。
【図１７−４６】同上。
【図１７−４７】同上。
【図１７−４８】同上。
【図１７−４９】同上。
【図１８】本発明の好ましいクローニング構築物である、ｐＩｎｔｒＡのヌクレオチド配列および構造（配列番号６７）を示す図。ＢｂｖＣＩ制限酵素部位（配列番号１０２）；ＳｐｈＩ制限酵素部位（配列番号１０３）；ＲＢ（配列番号１０４）；ＬＢ（配列番号１０５）；ＨｐａＩ制限酵素部位；ＰｍｌＩ制限酵素部位；クローニング部位を作成するために付加されるヌクレオチド；部分的アクチン７（ＰＡＲＴＩＡＬ  ＡＣＴＩＮ７）プロモータ（配列番号１０６）および部分的アクチン７（ＰＡＲＴＩＡＬ  ＡＣＴＩＮ７）ターミネータ（配列番号１０７）は、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図１９−１】本発明の遺伝子構築物を併せた同時形質転換に用いるための、植物に属しないかまたは由来しない選択可能マーカ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を含む構築物のヌクレオチド配列（配列番号６９）および構造を示す図。ＲＢ；ＬＢ、ｎｐｔＩＩ選択マーカ；二重３５Ｓプロモータ；ｎｏｓターミネータ、ＡＮＴ１ソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）アントシアニン遺伝子；トマトＡＣＴＩＮ７プロモータ；およびトマトＲｂｃＳ３Ｃターミネータは、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図１９−２】同上。
【図２０−１】本発明に従う同時形質転換に用いるための、植物に属しないかまたは由来しない選択可能マーカ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を含むさらなる遺伝子構築物と一緒に本発明の好ましい遺伝子構築物を含む本発明のベクターのヌクレオチド配列（配列番号７０）および構造を示す図。ＨｐａＩ制限酵素部位；ＰｍｌＩ制限酵素部位；ＲＢ；ＬＢ、ｎｐｔＩＩ選択マーカ；視覚的選択ＡＮＴ１マーカ、ならびにｐａｒｔｉａｌ  ＡＣＴＩＮプロモータおよびターミネータは、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【図２０−４】同上。
【図２０−５】同上。
【図２１−１】モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）に由来するＵｂｉ１プロモータおよびターミネータ；ＣＴＧＣＡＧ  ＰｓｔＩ制限酵素部位；ならびにｇｇｃＧＣＣ  ＳｆｏＩ制限酵素部位を含む本発明の好ましいクローニング構築物である、ｐＳｂｉＵｂｉ１（配列番号７３）を示す図。Ｓｏｂｉｃ  ００４Ｇ０５００００に由来するＵｂｉ１プロモータおよびターミネータ（配列番号１０８）；ＣＴＧＣＡＧ  ＰｓｔＩ制限酵素部位（配列番号１０９）；およびｇｇｃＧＣＣ  ＳｆｏＩ制限酵素部位（配列番号１１０）は、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図２１−２】同上。
【図２２−１】モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）に由来するＵｂｉ２プロモータ；モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）に由来するＵｂｉ１ターミネータ；ＣＴＧＣＡＧ  ＰｓｔＩ制限酵素部位；およびｇｇｃＧＣＣ  ＳｆｏＩ制限酵素部位を含む本発明の好ましいクローニング構築物である、ｐＳｂｉＵｂｉ２（配列番号７４）を示す図。Ｓｏｂｉｃ．００４Ｇ０４９９００に由来するＵｂｉ２プロモータ（配列番号１１１）およびＳｏｂｉｃ．００４Ｇ０５００００に由来するＵｂｉ１ターミネータ；およびＣＴＧＣＡＧ  ＰｓｔＩ制限酵素部位；ｇｇｃＧＣＣ  ＳｆｏＩ制限酵素部位は、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図２２−２】同上。
【図２３】アジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＡＰＸプロモータおよびターミネータ；ならびにＳａｃＩまたはＥｃｏ５３ｋＩおよびブラントカッターＰｓｉＩからなるｇａｇｃＴＣＣＧＧＡＴＴＡｔａａの多重クローニング部位；ＧＡＡＣＧｔおよびｃＧＡＴＴＣ：ＸｍｎＩ制限酵素部位を含む本発明の好ましいクローニング構築物である、ｐＯｓａＡＰＸ（配列番号７６）を示す図。ＡＰＸプロモータ（配列番号１１２）；ＡＰＸターミネータ（配列番号１１３）；ＳａｃＩまたはＥｃｏ５３ｋＩおよびブラントカッターＰｓｉＩからなるｇａｇｃＴＣＣＧＧＡＴＴＡｔａａ多重クローニング部位（配列番号１１４）；ＧＡＡＣＧｔ（配列番号１１５）およびｃＧＡＴＴＣ（配列番号１１６）：ならびにＸｍｎＩ制限酵素部位は、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図２４】アントシアニンレベルの上昇を示す（紫茎、根、葉脈および葉の一部）、配列番号６９を発現するトマト植物を示す図。
【図２５】対照トマト植物（右）と比べての強力なアントシアニン産生を示す、配列番号６９で示される本発明のベクターで同時形質転換されたトマト植物（左）を示す図。
【図２６】アジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＤＲＥＢ１Ａ遺伝子；アジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＡＣＴＩＮ１プロモータ、およびアジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＤＲＥＢ１Ａターミネータのヌクレオチド配列を含む本発明のＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａ遺伝子構築物（配列番号７８）を示す図。遺伝子構築物は、切除およびクローニング用のＮｈｅＩおよびＰｍｌＩ制限消化部位をさらに含む。ＮｈｅＩ（配列番号１１７）およびＰｍｌＩ（配列番号１１８）制限部位；ＤＲＥＢ１Ａコード配列（配列番号１１９）；およびＤＲＥＢ１Ａコード配列の３’末端に付加されるＧＴＧＴＴ配列は、強調しかつ／または下線を引くことにより表される。
【図２７】アジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＤＲＥＢ１Ａ遺伝子；ならびにアジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ＮＣＥＤ３プロモータおよびターミネータのヌクレオチド配列を含む本発明のＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３遺伝子構築物（配列番号７９）を示す図。追加的なＴＧＣ（配列番号１２０）およびＧＣＡ（配列番号１２１）ヌクレオチド；ＮＣＥＤ３プロモータ（配列番号１２２）；およびＮＣＥＤ３ターミネータ（配列番号１２３）；およびＤＲＥＢ１Ａコード配列は、強調および／または下線の使用により表される。
【図２８】１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する培地上でのＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａ（左）またはＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３（右）で形質転換されたイネカルスの再生を示す図。
【図２９】ＣＭＶを接種したａｍｉ１１−Ｉ  Ｔ１植物およびＣＭＶを接種した野生型対照トマト植物を示す図。すべての野生型植物が新たな成長において「わずかな」症状を呈する（右側）。大部分のａｍｉ１１−Ｉ植物が無症状を呈する（左側）。
【図３０】野生型、Ｔ１不対性、およびａｍｉ１１−Ｉ  Ｔ１トマト植物におけるＣＭＶ負荷のＥＬＩＳＡ評価を示す図。
【図３１】野生型、Ｔ１不対性、およびａｍｉ１１−ＩＩ  Ｔ１トマト植物におけるＣＭＶ負荷のＥＬＩＳＡ評価を示す図。
【図３２】ａｍｉ１１−Ｉおよびａｍｉ１１−ＩＩトマト植物におけるＣＭＶの重症度および植物の丈の評価を示す図。
【図３３】ＣＭＶに感染したａｍｉ１１−Ｉおよびａｍｉ１１−ＩＩ系統からの果実数および例示的な果実形態を示す図。
【図３４】トマト由来抗ＣＭＶ  ａｍｉ１０およびａｍｉ１１を伴う「二重」抗ＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡインサートのヌクレオチド配列、ならびにインサートのＲＮＡ標的化の評価を示す図。
【図３５】ＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡ１０およびａｍｉＲＮＡ１１を含む本発明の好ましい遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号８１）および構造を示す図。ＬＢ；Ａｃｔｉｎプロモータ；Ｓｌｙ−ｍｉＲ１５６ｂ内のＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡ１０；Ｓｌｙ−ｍｉＲ１５６ａ内のａｍｉＲＮＡ１１；Ａｃｔｉｎターミネータ；ならびにＲＢは、強調／テキストカラーにより表される。
【図３６−１】図１９に示される選択可能マーカを有する遺伝子構築物と併せて図３５に示される遺伝子構築物を含む本発明の好ましいベクターのヌクレオチド配列（配列番号８２）および構造を示す図。ベクターの成分は、強調／テキストカラーにより表される。
【図３６−２】同上。
【図３６−３】同上。
【図３６−４】同上。
【図３６−５】同上。
【図３７】遺伝子内ＴＳＷＶ標的化ａｍｉＲＮＡ７配列（配列番号８３）；ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉のアグロインフィルトレーション後の二重ＬＵＣアッセイを用いてのこの配列によるＲＮＡ標的化の評価（エラーバーは平均値の標準誤差を表す）；およびこの配列を発現するように形質転換されたトマト植物の例示的形態を示す図。
【図３８】ＭＤＭＶおよびＳＣＭＶの保存領域を標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ３およびａｍｉＲＮＡ６）のヌクレオチド配列（配列番号８４〜８５）、これらの配列によるＲＮＡ標的化の評価、およびソルガム植物の再生を示す図。成功した形質転換体が、ＭＤＭＶ／ＳＣＭＶ耐性表現型を有することが予想される。
【図３９】ＪＧＭＶを標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ２、ａｍｉＲＮＡ４、ａｍｉＲＮＡ５、およびａｍｉＲＮＡ７）のヌクレオチド配列（配列番号８６〜８９）、これらの配列によるＲＮＡ標的化の評価、およびソルガム植物の再生を示す図。成功した形質転換体が、ＪＧＭＶ耐性表現型を有することが予想される。
【図４０−１】ソルガムＵｂｉ１プロモータおよびターミネータ、ならびにＪＧＭＶを標的化する３つのソルガム由来ａｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ４、ａｍｉＲＮＡ５、およびａｍｉＲＮＡ２）を含む本発明の遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号９０）および構造を示す図。構築物の成分は、テキストカラーにより表される。
【図４０−２】同上。
【図４０−３】同上。
【図４１−１】ソルガムＵｂｉ２プロモータおよびソルガムＵｂｉ１ターミネータ、ならびにＪＧＭＶを標的化する３つのソルガム由来ａｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ４、ａｍｉＲＮＡ５、およびａｍｉＲＮＡ２）を含む本発明の好ましい遺伝子構築物のヌクレオチド配列（配列番号９１）および構造を示す図。構築物の成分は、テキストカラーにより表される。
【図４１−２】同上。
【図４２】イネ由来ＲＴＳＶ  ａｍｉＲＮＡ１のヌクレオチド配列（配列番号９２）を示す図。
【図４３−１】ＴＳＷＶを標的化するトマト由来ヘアピンＲＮＡｉ構築物（配列番号９４）の設計を示す図。ＲＮＡｉベクターの完全ヌクレオチド配列は、配列番号９５で示される。
【図４３−２】同上。
【図４３−３】同上。
【図４３−４】同上。
【図４３−５】同上。
【図４３−６】同上。
【図４４】図４３に示される構築物によるＲＮＡ標的化の評価；図４３に示される構築物を用いて形質転換されたトマト植物の例示的な表現型；およびＴＳＷＶが負荷されるときの、野生型トマト植物と比べての図４３に示される構築物を用いて形質転換されたトマト植物におけるＴＳＷＶ負荷を示す図。
【図４５−１】トマト由来ａｍｉＲＮＡ２７によるＭＥＤ１８の標的化；野生型対照と比べての形質転換トマト植物におけるａｍｉＲＮＡ２７およびＭＥＤ１８の発現；ならびにａｍｉＲＮＡ２７形質転換植物（標識されたｍｅｄ１８）と比べての野生型におけるＣＭＶ負荷を示す図。
【図４５−２】同上。
【図４６−１】ａｍｉＲＮＡ２７形質転換（標識されたＡまたはＭＥＤ１８）トマト植物と比べての対照（標識されたＷまたはＷＴ）における葉脱落シュードモナス・シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）アッセイの結果；およびシュードモナス・シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）ＧｙｒａｓｅのｑＰＣＲにより測定された、ａｍｉＲＮＡ２７形質転換系統と比べての対照におけるシュードモナス・シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）の存在量を示す図。
【図４６−２】同上。
【図４７】１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する培地上でＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａを用いて形質転換されたイネ植物の再生および成長を示す図。
【図４８】１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する培地上でＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３を用いて形質転換されたイネ植物の再生および成長を示す図。
【図４９】野生型対照系統と比べてのトマト由来ａｍｉＲＮＡ２７を用いて形質転換されたトマト植物の形態の比較を示す図。
【図５０】ＭＥＤ２５を標的化するトマト由来ａｍｉＲＮＡ６のヌクレオチド配列；ａｍｉＲＮＡ６によるＭＥＤ２５の標的化の評価；ならびに野生型対照系統と比べてのａｍｉＲＮＡ６を用いて形質転換されたトマト系統におけるａｍｉＲＮＡ６およびＭＥＤ２５の発現を示す図。
【図５１】配列番号６９で示される構築物を用いて形質転換されたトマト系統におけるアントシアニンの発現（左）；および配列番号９８で示されるイネ由来構築物を用いて形質転換された再生イネ植物におけるアントシアニンの発現（右）を示す図。
【図５２】タイプＢヘテロ三量体Ｇタンパク質のγサブユニット（ＧＧＢ１）をコードするトマト遺伝子を標的化するトマト由来ヘアピンＲＮＡｉ構築物のヌクレオチド配列（配列番号１００）および構造；ならびに前記構築物および配列番号６９で示されかつアントシアニンを発現する構築物を用いて同時形質転換された例示的な形質転換トマト植物を示す図。
【図５３】イネＢＡＤＨ２を標的化するイネ由来ＲＮＡｉ構築物を用いた微粒子銃により作製された発生中のイネ植物を示す図。成功した形質転換体が、香り高い表現型を有することが予想される。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
（配列表の簡単な説明）
配列番号１  （図１中に図面で示される）本発明の基本的な遺伝子内クローニングベクターｐＩｎｔＲ  ２内部に含まれる本発明の遺伝子構築物のヌクレオチド配列
配列番号２  本発明の特定の好ましい遺伝子構築物中の第１の境界配列の一部のヌクレオチド配列
配列番号３  本発明の特定の好ましい遺伝子構築物中の第２の境界配列の一部のヌクレオチド配列
配列番号４  培養トマト（ソラヌム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））のＲＵＢＩＳＣＯサブユニット３Ｃ（ＲｂＳ３Ｃ）遺伝子のプロモータのヌクレオチド配列
配列番号５  培養トマトのアクチン（ＡＣＴＩＮ）遺伝子のプロモータのヌクレオチド配列
配列番号６  培養トマトのＵＢＩＱＵＩＴＩＮ遺伝子のプロモータのヌクレオチド配列
配列番号７  培養トマトのＣＹＣＬＯＰＨＩＬＩＮ遺伝子のプロモータのヌクレオチド配列
配列番号８  培養トマトのＲＵＢＩＳＣＯサブユニット３Ｃ（ＲｂＳ３Ｃ）遺伝子のターミネータのヌクレオチド配列
配列番号９  培養トマトのアクチン（ＡＣＴＩＮ）遺伝子のターミネータのヌクレオチド配列
配列番号１０  培養トマトのＵＢＩＱＵＩＴＩＮ遺伝子のターミネータのヌクレオチド配列
配列番号１１  培養トマトのＣＹＣＬＯＰＨＩＬＩＮ遺伝子のターミネータのヌクレオチド配列
配列番号１２  トマトｍｉＲ１５６ｂ遺伝子のヌクレオチド配列。ｍｉＲＮＡは大文字で書かれる。
【００５９】
配列番号１３  キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）Ｋセグメント１レプリカーゼ（ヌクレオチド２６６５〜２６８５）を標的化する配列番号１２に基づくトマト由来ａｍｉＲＮＡ構築物のヌクレオチド配列。ｍｉＲＮＡは大文字で書かれる。
【００６０】
配列番号１４  Ｋセグメント２  ｏｒｆ３（ヌクレオチド１９８〜２１８）を標的化する配列番号１２に基づくトマト由来ａｍｉＲＮＡ構築物のヌクレオチド配列。ｍｉＲＮＡは大文字で書かれる。
【００６１】
配列番号１５  ＣＭＶ  Ｋセグメント３  ｏｒｆ１（ヌクレオチド５６〜７６）を標的化する配列番号１２に基づくトマト由来ａｍｉＲＮＡ構築物のヌクレオチド配列。ｍｉＲＮＡは大文字で書かれる。
【００６２】
配列番号１６  ＣＭＶ  Ｋセグメント１レプリカーゼ（ヌクレオチド１４３７〜１４５７）を標的化する配列番号１２に基づくトマト由来ａｍｉＲＮＡ構築物のヌクレオチド配列。大文字で書かれたｍｉＲＮＡ。ｍｉＲＮＡは大文字で書かれる。
【００６３】
配列番号１７  ＣＭＶ  Ｋセグメント３  ｏｒｆ１（ヌクレオチド７０７〜７２７）を標的化する配列番号１２に基づくトマト由来ａｍｉＲＮＡ構築物のヌクレオチド配列。ｍｉＲＮＡは大文字で書かれる。
【００６４】
配列番号１８  ＣＭＶを標的化するトマト由来ＲＮＡｉ構築物のヌクレオチド配列
配列番号１９  ＣＭＶ  Ｋセグメント１レプリカーゼのヌクレオチド７５１〜８９６に高度に類似した配列番号１８の断片のヌクレオチド配列
配列番号２０  ＣＭＶ  Ｋセグメント１レプリカーゼのヌクレオチド１２３５〜１３５８に高度に類似した配列番号１８の断片のヌクレオチド配列
配列番号２１  ＣＭＶ  Ｋセグメント３  ｏｒｆ２（コートタンパク質）のヌクレオチド２５０〜３７５に高度に類似した配列番号１８の断片のヌクレオチド配列
配列番号２２  トマト黄化えそ病ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＳＷＶ）を標的化するトマト由来ＲＮＡｉ構築物のヌクレオチド配列
配列番号２３  ＴＳＷＶ  ＱＬＤ１セグメントＬ  ＲＤＲＰのヌクレオチド１９１８〜２１５５に高度に類似した配列番号２２の断片のヌクレオチド配列
配列番号２４  ＴＳＷＶ  ＱＬＤ１セグメントＬ  ＲＤＲＰのヌクレオチド８４２９〜８６３９に高度に類似した配列番号２２の断片のヌクレオチド配列
配列番号２５  ＴＳＷＶ  ＱＬＤ１セグメントＭ  ｏｒｆ１のヌクレオチド１８７〜３６０に高度に類似した配列番号２２の断片のヌクレオチド配列
配列番号２６  ＴＳＷＶ  ＱＬＤ１セグメントＭ  ｏｒｆ２のヌクレオチド２９７〜５１０に高度に類似した配列番号２２の断片のヌクレオチド配列
配列番号２７  トマトベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）ｃＤＮＡ（ｇｉ２０９３６２３４２）のヌクレオチド配列
配列番号２８  トマトソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）ｃＤＮＡ（ｇｉ７８１８３４１５）のヌクレオチド配列
配列番号２９  トマトオスモチンＣＤＳ（ｇｉ４６０４００２１０）のヌクレオチド配列
配列番号３０  トマトグルタミンシンテターゼ（ＧＴＳ）ｃＤＮＡ（ｇｉ４６０４０９５３５）のヌクレオチド配列
配列番号３１  トマトフィトエンデサチュラーゼｃＤＮＡ（ｇｉ５１２７７２５３２）のヌクレオチド配列
配列番号３２  トマト５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸ｃＤＮＡ（ｇｉ８２２０９２６６８）のヌクレオチド配列
配列番号３３  トマトアセト乳酸シンターゼｃＤＮＡ（ｇｉ７２３６８０７７１）のヌクレオチド配列
配列番号３４  トマトプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼｃＤＮＡ（ｇｉ７２３６５８５４９）のヌクレオチド配列
配列番号３５  ソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）アントシアニン１（ＡＮＴ１）ｃＤＮＡ（ｇｉ１２６６５３９３４）のヌクレオチド配列
配列番号３６  トマトクロロフィルシンターゼｃＤＮＡ（ｇｉ４６０４０１６２４）のヌクレオチド配列
配列番号３７  ジャガイモＳＴ−ＬＳ１遺伝子由来のイントロンを有する、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）の発現用にコドン最適化されたバルナーゼ自殺構築物のヌクレオチド配列
配列番号３８  配列番号２７によってコードされるベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列
配列番号３９  配列番号２８によってコードされるトマトソルビトールデヒドロゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４０  配列番号２９によってコードされるトマトオスモチンタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４１  配列番号３０によってコードされるトマトグルタミンシンテターゼタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４２  配列番号３１によってコードされるトマトフィトエンデサチュラーゼタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４３  配列番号３２によってコードされるトマト５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４４  配列番号３３によってコードされるトマトアセト乳酸シンターゼタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４５  配列番号３４によってコードされるトマトＰｒｏｔＯｘタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４６  配列番号３５によってコードされるソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）アントシアニン１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４７  図１に図示される基本的な遺伝子内クローニングベクターｐＩｎｔＲ２のヌクレオチド配列
配列番号４８  本発明のベクター「ｐＩｎｔＲ２  ＧＳ１  Ｇ２４５Ｃ  ＣＭＬ１８」のヌクレオチド配列
配列番号４９  天然ＧＳ１プロモータおよびターミネータ配列に作動可能に連結されたグルタミンシンテターゼ１（ＧＳ１）Ｇ２４５Ｃマーカ遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号５０  本発明の修飾ｐＡｒｔ２７骨格のヌクレオチド配列
配列番号５１  Ｇ２４５Ｃタンパク質をコードするトマトＧＳ１  Ｇ７３３Ｔ遺伝子のＣＤＳのヌクレオチド配列
配列番号５２  Ｈ２４９Ｙタンパク質をコードするトマトＧＳ１  Ｃ７４５Ｔ  ＣＤＳのＣＤＳヌクレオチド配列
配列番号５３  トマトＧＳ１プロモータのヌクレオチド配列
配列番号５４  トマトＧＳ１ターミネータのヌクレオチド配列
配列番号５５  トマトフィトエンデサチュラーゼプロモータのヌクレオチド配列
配列番号５６  トマトフィトエンデサチュラーゼターミネータのヌクレオチド配列
配列番号５７  トマトアセト乳酸シンターゼプロモータのヌクレオチド配列
配列番号５８  トマトアセト乳酸シンターゼターミネータのヌクレオチド配列
配列番号５９  トマト５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼプロモータのヌクレオチド配列
配列番号６０  トマト５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼターミネータのヌクレオチド配列
配列番号６１  トマトＰｒｏｔＯｘプロモータのヌクレオチド配列
配列番号６２  トマトＰｒｏｔＯｘターミネータのヌクレオチド配列
配列番号６３  ＰｍｌＩおよびＰｃｉＩ制限酵素による消化時に除去され、ヌクレオチド配列のｐＩｎｔＲ  ２へのライゲーションを促進する、遺伝子内クローニングベクターｐＩｎｔＲ  ２（配列番号１）のヌクレオチド配列
配列番号６４  トマト由来のＭＥＤ１８遺伝子のヌクレオチド配列（ｇｉ｜７２３７０４０９４｜ｒｅｆ｜ＸＭ＿０１０３２３５０２．１）
配列番号６５  トマトＭＥＤ１８を標的化するａｍｉＲＮＡ配列（ＭＥＤ１８ａｍｉ３）のヌクレオチド配列
配列番号６６  トマトＭＥＤ１８を標的化するａｍｉＲＮＡ配列（ＭＥＤ１８ａｍｉ２７）のヌクレオチド配列
配列番号６７  ｐＩｎｔｒＡの基本的な遺伝子内クローニング構築物のヌクレオチド配列
配列番号６８  ｐＩｎｔｒＡの制限消化部位を有する除去可能配列のヌクレオチド配列
配列番号６９  本発明の遺伝子構築物と併せた同時形質転換において用いられる、植物に属しないかまたは由来しない選択可能マーカ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を含む構築物のヌクレオチド配列
配列番号７０  本発明に従う同時形質転換において用いられる、植物に属しないかまたは由来しない選択可能マーカ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）を含むさらなる遺伝子構築物と一緒に本発明の好ましい遺伝子構築物を含む本発明のベクターのヌクレオチド配列
配列番号７１  本発明の特定の好ましい遺伝子構築物中の第１の境界配列の一部のヌクレオチド配列
配列番号７２  本発明の特定の好ましい遺伝子構築物中の第２の境界配列の一部のヌクレオチド配列
配列番号７３  ｐＳｂｉＵｂｉ１のヌクレオチド配列
配列番号７４  ｐＳｂｉＵｂｉ２のヌクレオチド配列
配列番号７５  ｐＳｂｉＵｂｉ１およびｐＳｂｉＵｂｉ２クローニング部位のスペーサのヌクレオチド配列
配列番号７６  ｐＯｓａＡＰＸ構築物のヌクレオチド配列
配列番号７７  ｐＯｓａＡＰＸクローニング部位のスペーサのヌクレオチド配列
配列番号７８  イネＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａ構築物のヌクレオチド配列
配列番号７９  イネＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３構築物のヌクレオチド配列
配列番号８０  トマト由来の二重抗ＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡインサートのヌクレオチド配列
配列番号８１  配列番号８０を含む遺伝子内トマト由来構築物のヌクレオチド配列
配列番号８２  配列番号８１を含むベクターのヌクレオチド配列
配列番号８３  トマト由来の抗ＴＳＷＶ  ａｍｉＲＮＡ７のヌクレオチド配列
配列番号８４  ＭＤＭＶおよびＳＣＭＶの保存領域を標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ３のヌクレオチド配列
配列番号８５  ＭＤＭＶおよびＳＣＭＶの保存領域を標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ６のヌクレオチド配列
配列番号８６  ＪＧＭＶを標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ２のヌクレオチド配列
配列番号８７  ＪＧＭＶを標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ４のヌクレオチド配列
配列番号８８  ＪＧＭＶを標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ５のヌクレオチド配列
配列番号８９  ＪＧＭＶを標的化するソルガム由来ａｍｉＲＮＡ７のヌクレオチド配列
配列番号９０  ｐＳｂｉＵｂｉ１内のソルガム由来三重抗ＪＧＭＶ  ａｍｉＲＮＡ構築物のヌクレオチド配列
配列番号９１  ｐＳｂｉＵｂｉ２内のソルガム由来三重抗ＪＧＭＶ  ａｍｉＲＮＡ構築物のヌクレオチド配列
配列番号９２  ＲＴＳＶを標的化するイネ由来ａｍｉＲＮＡ１のヌクレオチド配列
配列番号９３  配列番号９２を含むベクターのヌクレオチド配列
配列番号９４  ＴＳＷＶを標的化するトマト由来ヘアピンＲＮＡｉのヌクレオチド配列
配列番号９５  配列番号９４を含むベクターのヌクレオチド配列
配列番号９６  トマトＭＥＤ２５遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号９７  ＭＥＤ２５を標的化するトマト由来ａｍｉＲＮＡ６のヌクレオチド配列
配列番号９８  イネ由来Ｒ１Ｇ１Ｂ：ＯＳＢ２：Ｒ１Ｇ１Ｂ構築物のヌクレオチド配列
配列番号９９  トマトＧＧＢ１遺伝子のヌクレオチド配列
配列番号１００  タイプＢヘテロ三量体Ｇタンパク質のγサブユニット（ＧＧＢ１）をコードするトマト遺伝子を標的化するトマト由来ヘアピンＲＮＡｉ構築物のヌクレオチド配列
配列番号１０１  ＢＡＤＨ２を標的化するイネ由来ＲＮＡｉ構築物のヌクレオチド配列
配列番号１０２  ＢｂｖＣＩ制限酵素部位のヌクレオチド配列
配列番号１０３  ＳｐｈＩ制限酵素部位のヌクレオチド配列
配列番号１０４  ＲＢ配列のヌクレオチド配列
配列番号１０５  ＬＢ配列のヌクレオチド配列
配列番号１０６  部分的アクチン７（ｐａｒｔｉａｌ  ＡＣＴＩＮ７）プロモータのヌクレオチド配列
配列番号１０７  部分的アクチン７（ｐａｒｔｉａｌ  ＡＣＴＩＮ７）ターミネータのヌクレオチド配列
配列番号１０８  ソルガムＵｂｉ１プロモータおよびターミネータのヌクレオチド配列
配列番号１０９  ＰｓｔＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１０  ＳｆｏＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１１  ソルガムＵｂｉ２プロモータのヌクレオチド配列
配列番号１１２  イネＡＰＸプロモータのヌクレオチド配列
配列番号１１３  イネＡＰＸターミネータのヌクレオチド配列
配列番号１１４  ｐＯｓａＡＰＸの多重クローニング部位のヌクレオチド配列
配列番号１１５  ＸｍｎＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１６  ＸｍｎＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１７  ＮｈｅＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１８  ＰｍｌＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１１９  ３’ＧＴＧＴＴの付加を伴うイネＤＲＥＢ１Ａコード配列のヌクレオチド配列
配列番号１２０  ＦｓｐＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１２１  ＦｓｐＩ制限部位のヌクレオチド配列
配列番号１２２  イネＮＣＥＤ３プロモータのヌクレオチド配列
配列番号１２３  イネＮＣＥＤ３ターミネータのヌクレオチド配列
配列番号１２４  Ｓｌｙ−ｍｉＲ１５６ｂ内のトマト由来抗ＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡ１０のヌクレオチド配列
配列番号１２５  Ｓｌｙ−ｍｉＲ１５６ａ内のトマト由来抗ＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡ１１のヌクレオチド配列
配列番号１２６〜１５２  本明細書中に示されるプライマーのヌクレオチド配列
（詳細な説明）
本発明は、少なくとも部分的には、植物の遺伝的改善に対する需要があるという認識に基づいて予測され、ここで植物に由来しないかまたは由来し得ないヌクレオチド配列の植物の遺伝子材料への導入は回避される。
【００６５】
したがって、本発明は、広義には、１つ以上の植物に由来するヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子構築物を用いて遺伝的に改善された植物を作製するための手段を提供する。好ましい一実施形態では、前記１つ以上のヌクレオチド配列は、単一の植物に由来する。好適には、前記１つ以上のヌクレオチド配列が２つ以上の植物に由来する場合の実施形態では、前記植物は、同じ種に属し、かつ／または異種交配可能である。
【００６６】
本発明の好ましい遺伝子構築物の核酸断片の植物の遺伝子材料への挿入の結果として生じる遺伝子変異が、天然に生じる遺伝的組換え、例えば植物集団内の遺伝子プールの多様性を増加させ、変化する環境条件下でその生存変化を増加させるのに役立つ天然遺伝的組換えと同じであり得るか、または少なくとも類似し得ることは理解されるであろう。
【００６７】
下記の通り、本発明の好ましい遺伝子構築物を用いて植物に挿入されるヌクレオチド配列が、少なくとも１５、または好ましくは少なくとも２０の植物由来のヌクレオチドを含むことが好ましいことはさらに理解されるであろう。ヌクレオチド配列のこの長さが、典型的には植物において機能的であると理解されているヌクレオチド配列の最小長さであることは、本発明において認識されている。
【００６８】
本明細書で用いられるとき、用語「植物」は、次を含むことが理解されるであろう。
「有胚植物（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）」または「陸生植物」は、マーギュリス，Ｌ（Ｍａｒｇｕｌｉｓ，Ｌ）著、１９７１年、「進化（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」、第２５巻、ｐ．２４２〜２４５（参照により本明細書中に援用される）を参照すると、苔類、ツノゴケ類、蘚類、および維管束植物を含み；
「緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）」または「緑色植物」は、コープランド，ＨＦ（Ｃｏｐｅｌａｎｄ，ＨＦ）著、１９５６年、パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）：パシフィックブックス（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｏｏｋｓ）、ｐ．６（参照により本明細書中に援用される）を参照すると、陸生植物および緑藻類を含み、
「アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）」は、キャヴァリエ・スミス，Ｔ（Ｃａｖａｌｉｅｒ−Ｓｍｉｔｈ，Ｔ）著、１９８１年、バイオシステムズ（ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、第１４巻、ｐ．４６１〜４８１（参照により援用される）を参照すると、陸生植物、緑色植物、紅色植物（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）（紅藻類）および灰色植物（Ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）（灰藻類）を含み；また
「ベシタブリア（Ｖｅｇｅｔａｂｉｌｉａ）」は、リナウス，Ｃ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ，Ｃ）著、１７５１年、「フィロソフィア・ボタニカ（Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉａ  ｂｏｔａｎｉｃａ）」、第１版、ｐ．３７（参照により援用される）を参照すると、陸生植物、緑色植物、アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）、ならびに多種多様な藻類および真菌、例えばマッシュルームを含む食用真菌を含む。
【００６９】
本明細書で用いられるとき、「遺伝子構築物」は、１つ以上の単離された核酸を含む遺伝子材料の人工的に作成されるセグメントを意味することは理解されるであろう。
本明細書で用いられるとき、植物に「由来する」または「由来し得る」ヌクレオチド配列は、植物の天然または内因性遺伝子材料中に見出されるヌクレオチド配列と実質的に同じであるヌクレオチド配列を意味することが理解されるであろう。植物に由来するかまたは由来し得るヌクレオチド配列を含む単離された核酸が、以下に提供される詳細を参照すると、植物から得られる必要がないが、任意の好適な様式で得ることができることは容易に理解されるであろう。
【００７０】
植物に「由来する」または「由来し得る」ヌクレオチド配列が天然または内因性植物ヌクレオチド配列と同一であることは好ましい。好適には、少なくとも、植物に由来するかまたは植物から由来し得るヌクレオチド配列がタンパク質コード配列である場合、由来するかまたは由来し得るヌクレオチド配列は、対応する天然または内因性アミノ酸配列と実質的に同一である、または好ましくは同一であるアミノ酸配列をコードすることになる。しかし、天然または内因性植物ヌクレオチド配列と同一である、植物に由来するかまたは植物に由来し得るヌクレオチド配列が好ましい一方で、特定の代替的な実施形態では、ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質が、対応する天然または内因性植物タンパク質と実質的に同一である、または好ましくは同一であるという条件で、同義のヌクレオチド置換を含んでもよいことは理解されるであろう。
【００７１】
遺伝子構築物を含む遺伝子材料と関連して本明細書で用いられるとき、「組換え」が複数の供給源に由来する遺伝子材料を意味することは理解されるであろう。「組換え」である遺伝子材料の部分（ｐａｒｔｓ）、部分（ｐｏｒｔｉｏｎｓ）、または断片が生物（植物など）の遺伝子材料の天然ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を含んでもよいが、組換え遺伝子材料中のヌクレオチド配列の配置が生物の遺伝子材料において生じないことは理解されるであろう。
【００７２】
本発明の組換え遺伝子構築物が、植物の遺伝的改善を容易にするように設計され、ここで植物に由来するかまたは由来し得る１つもしくは複数のヌクレオチド配列からなる遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片が植物の遺伝子材料に挿入されることは理解されるであろう。
【００７３】
好適には、１つ以上の植物に由来しないヌクレオチド配列を含む遺伝的に改善された植物の作製は、本発明の遺伝子構築物を用いて、回避されるか、または少なくとも実質的に最小化される。
【００７４】
好適には、本発明に従う植物に挿入される遺伝子構築物の核酸断片は、前記植物と異種交配可能である１つ以上の植物に由来するかまたは由来し得る、少なくとも１５、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の１つ以上のヌクレオチド配列からなる。
【００７５】
実施形態では、本発明の遺伝子構築物のヌクレオチド配列が由来するかまたは由来し得る元の１つ以上の植物は、上記のようなベシタブリア（Ｖｅｇｅｔａｂｉｌｉａ）という分類の生物であるかまたはそれを含む。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明の遺伝子構築物のヌクレオチド配列が由来するかまたは由来し得る元の１つ以上の植物は、上記のようなアーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）という分類の生物であるかまたはそれを含む。
【００７７】
より好ましくは、本発明の遺伝子構築物のヌクレオチド配列が由来するかまたは由来し得る元の１つ以上の植物は、上記のような緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）という分類の生物であるかまたはそれを含む。
【００７８】
さらにより好ましくは、本発明の遺伝子構築物のヌクレオチド配列が由来するかまたは由来し得る元の１つ以上の植物は、上記のような有胚植物（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）という分類の生物であるかまたはそれを含む。
【００７９】
一部の実施形態では、植物は、微細藻類および大型海藻を含む藻類である。
一部の実施形態では、植物は、マッシュルームを含む食用菌類である。
好ましくは、植物は、単子葉植物または双子葉植物である。
【００８０】
より好ましくは、前記１つ以上の植物は、サトウキビなどのイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）ファミリーの草；綿などのワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）種；イチゴなどのベリー；リンゴおよびオレンジなどの果樹ならびにアーモンドなどの堅果類を含む樹種；バラなどのバラ科植物を含む、観賞顕花植物などの観賞植物；ブドウなどのブドウ果実を含むブドウ；ソルガム、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、およびトウモロコシを含む穀類；大豆などのマメおよびピーナッツを含むマメ科種；トマトおよびジャガイモを含むナス科種；キャベツおよびオリエンタルマスタードを含むアブラナ科種；カボチャおよびズッキーニを含むウリ科植物；バラを含むバラ科植物；レタス、チコリー、およびヒマワリを含むキク科植物、または前述の植物のいずれかの近縁種であるかまたはそれを含む。
【００８１】
一部の特に好ましい実施形態では、前記植物は、トマトであるかまたはそれを含む。
一部の特に好ましい実施形態では、前記植物は、ソルガムであるかまたはそれを含む。
一部の特に好ましい実施形態では、前記植物は、野生イネを含むイネであるかまたはそれを含む。
【００８２】
（単離された核酸およびタンパク質）
本発明を意図して、「単離された」は、天然状態から除去されているか、あるいはヒト操作が行われている材料を意味する。
【００８３】
単離された材料は、通常は天然状態でそれに伴う成分を実質的または本質的に含まなくてもよく、または通常は天然状態でそれに伴う成分と一緒に人工的状態であるように操作されてもよい。単離された材料は、天然、化学合成または組換え形態であってもよい。
【００８４】
用語「核酸」は、本明細書で用いられるとき、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを指す。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｃＲＮＡおよび自己触媒ＲＮＡを含む。核酸はまた、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってもよい。核酸は、典型的にはＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ塩基を含むヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。しかし、ヌクレオチド配列は、イノシン、メチルシトシン、メチルイノシン、メチルアデノシンおよび／またはチオウリジンなどの他の塩基を、それらに限定はされないが含んでもよい。
【００８５】
「ポリヌクレオチド」は、８０以上の連続ヌクレオチドを有する核酸である一方で、オリゴヌクレオチドは、８０未満の連続ヌクレオチドを有する。
「プローブ」は、好適には、例えばノーザンまたはサザンブロッティングにおいて相補的配列を検出することを意図して標識された、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであってもよい。
【００８６】
「プライマー」は通常、相補的核酸「鋳型」にアニールして、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはシクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（商標）などのＤＮＡポリメラーゼの作用により鋳型依存的様式にて伸長される能力がある、好ましくは１５〜５０の連続ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００８７】
本明細書で用いられるとき、「タンパク質」は、当該技術分野で十分に理解されているように、Ｌ−およびＤ−異性体型を含む、天然および／または非天然アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。  
【００８８】
特定の実施形態では、本発明の遺伝子構築物の単離された核酸、または本発明の遺伝子構築物によってコードされる単離されたタンパク質は各々、核酸またはタンパク質断片である。
【００８９】
特定の実施形態では、核酸「断片」は、配列番号１〜３５、４９、５１〜５６、６６〜６８、７１〜９２、または９４〜１０１で示されるヌクレオチド配列の１００％未満であるが、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも８０％またはさらにより好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を構成するヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
特定の実施形態では、タンパク質「断片」は、配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列の１００％未満であるが、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも８０％またはさらにより好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を構成するアミノ酸配列を含む。
【００９１】
好ましい一実施形態では、本発明の遺伝子構築物の断片は、配列番号１、６７、７３〜７４、７６、８１、９５、９８、１００、または１０１で示されるヌクレオチド配列の１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、または３０００連続ヌクレオチド以下を含む。
【００９２】
本発明の遺伝子構築物により転写もしくは翻訳のサイレンシングもしくは増強をもたらすヌクレオチド配列の単離された核酸、またはそれによってコードされる単離されたタンパク質は各々、「変異体」核酸またはタンパク質であってもよく、ここでは１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸は各々、欠失されているか、または各々、異なるヌクレオチドもしくはアミノ酸により置換されている。
【００９３】
変異体は、天然に存在する（例えば、対立遺伝子）変異体、オルソログ（例えば、他の植物由来）および合成変異体、例えば突然変異誘発技術を用いてインビトロで作製されるものを含む。
【００９４】
一部の実施形態では、核酸変異体は、配列番号１〜３５、４９、５１〜５６、６６〜６８、７１〜９２、または９４〜１０１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性を有する単離された核酸を含む。
【００９５】
一部の実施形態では、タンパク質変異体は、配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を含む。
【００９６】
各々のヌクレオチド配列とアミノ酸配列との間の配列関係性を説明するために本明細書で一般に用いられる用語は、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」および「実質的同一性」を含む。各核酸／タンパク質が各々、（１）核酸／タンパク質によって共有される完全な核酸／タンパク質配列の１つ以上の部分のみ、および（２）核酸／タンパク質間で異なる１つ以上の部分を含み得ることから、配列比較は、典型的には、「比較ウインドウ」にわたる配列を比較し、配列類似性の局所領域を同定および比較することにより実施される。「比較ウインドウ」は、典型的には、参照配列と比較される６、９または１２の連続残基の概念的セグメントを指す。
【００９７】
比較ウインドウは、各配列の最適な整列化のため、参照配列と比べての約２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい。比較ウインドウを整列するための配列の最適な整列化は、アルゴリズム（インテリジェネティクス（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）によるジーンワークス（Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ）プログラム；ウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージリリース７．０（参照により本明細書中に援用される、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０）、ジェネティクスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、サイエンスドライブ５７５、マディソン、ウィスコンシン州、米国におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行により、または選択される様々な方法のいずれかにより得られる点検および最良な整列化（すなわち、比較ウインドウにわたる最大百分率の相同性をもたらす）により実施されてもよい。また、例えば、アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、１９９７年、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．）、第２５巻、ｐ．３３８９（参照により本明細書中に援用される）によって開示されるようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを参照してもよい。配列分析の詳細な考察は、「分子生物学における現在のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）」、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９９５〜１９９９年のユニット１９．３）に見出され得る。
【００９８】
用語「配列同一性」は、本明細書では、比較ウインドウにわたる配列が同一である程度を考慮して、標準的アルゴリズムを用いて適切な整列化を考慮した正確なヌクレオチドまたはアミノ酸の一致数を含む、その最も広義で用いられる。したがって、「配列同一性の百分率」は、比較ウインドウにわたり２つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）が両配列内に存在する位置の数を測定して一致した位置の数を生成し、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で除し、その結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を生成することにより計算される。例えば、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ウィンドウズ（登録商標）用でバージョン２．５；日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州、米国から入手可能）によって計算される「一致百分率」を意味するように理解されてもよい。
【００９９】
配列分析の詳細な考察は、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、上記の１９．３章の中に見出すことができる。
限定はされないが、核酸およびタンパク質変異体が、例えばランダム突然変異誘発または部位特異的変異誘発により、タンパク質またはコード核酸を突然変異誘発することによって作成され得ることは理解されるであろう。核酸突然変異誘発方法の例が、「分子生物学における現在のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）」、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、上記（参照により本明細書中に援用される）の９章に提供される。突然変異誘発はまた、化学的手段、例えばメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）および／または照射手段、例えば当該技術分野で公知の種子の高速中性子照射により誘導されてもよい（キャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）ら著、１９８５年、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８２巻、ｐ．４１６２；キャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）ら著、１９８５年、「植物生理学（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．）」、第７８巻、ｐ．３４；メン（Ｍｅｎ）ら著、２００２年、ゲノムレターズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第３巻、ｐ．１４７）。
【０１００】
（遺伝子構築物）
本発明の態様は、植物の遺伝子材料に挿入可能な１つ以上の核酸断片を含む組換え遺伝子構築物を提供し、前記１つ以上の核酸断片は、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５のヌクレオチド長、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列を含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる。
【０１０１】
これに関連して用いられるとき、１つ以上の植物に由来するかまたは由来し得るヌクレオチド配列「から本質的になる」核酸断片が、植物に由来しないかまたは由来し得ない１、２、３、または４以下のヌクレオチドを含むことは理解されるであろう。
【０１０２】
好ましくは、植物の遺伝子材料に挿入可能な１つ以上の核酸断片は、植物に由来するかまたは植物に由来し得るヌクレオチド配列からなる。
特定の好ましい実施形態では、植物の遺伝子材料に挿入可能である組換え遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または１４０ヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる。
【０１０３】
特定の好ましい実施形態では、前記複数のヌクレオチド配列は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチド長である。
【０１０４】
好ましい一実施形態では、前記１つ以上のヌクレオチド配列は、１つの植物に由来する。
好適には、前記１つ以上のヌクレオチド配列が２つ以上の植物に由来する実施形態では、前記植物は、異種交配可能であり、例えば他花受精可能な近縁種であり、かつ／または同じ種に属する。
【０１０５】
好ましくは、植物の遺伝子材料に挿入可能である遺伝子構築物の１つ以上の核酸断片の全長は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、または３５００塩基対である。
【０１０６】
実施例を参照すると、この態様の好ましい組換え遺伝子構築物ｐＩｎｔＲ  ２が、植物の遺伝子材料への挿入に適応する１１１０塩基対を含み、かつこの構築物が、植物の遺伝子材料への挿入または組み込みのためにさらなる植物由来のヌクレオチド配列を受けるように設計されたクローニング構築物であることは理解されるであろう。同様に、この態様の好ましい組換え遺伝子構築物ｐＩｎｔＲＡは、植物の遺伝子材料への挿入に適応する１７８７塩基対を含み、その上、この構築物は、植物の遺伝子材料への挿入または組み込みのためにさらなる植物由来のヌクレオチド配列を受けるように設計されたクローニング構築物である。さらに、配列番号７８、７９、８１、９８、および１００で示される好ましい組換え遺伝子構築物は各々、植物の遺伝子材料への挿入に適応する２３８７、３３６９、２０８４、３３０４、および３０７１塩基対を含む。
【０１０７】
遺伝子構築物の配列
この態様の組換え遺伝子構築物は、好適には次のように大別可能な１つ以上のヌクレオチド配列を含むことになる。
【０１０８】
発現用配列
好ましくは、この態様の組換え遺伝子構築物は、１つ以上の発現用のヌクレオチド配列を含む。好適には、発現用の前記ヌクレオチド配列は、植物の遺伝子材料に挿入可能であるこの態様の遺伝子構築物の１つ以上の核酸断片である。
【０１０９】
本発明の組換え遺伝子構築物と関連して本明細書で用いられるとき、「発現用の」ヌクレオチド配列は、宿主細胞または宿主生物、例えば植物において発現され得る遺伝子構築物のヌクレオチド配列を意味するように理解されるであろう。好ましくは、発現用配列は、植物における発現用配列である。
【０１１０】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物は、発現用の１つ以上の追加的ヌクレオチド配列を含み、ここで前記ヌクレオチド配列は、植物の形質を改変または修飾するための植物における発現に適する。実施例を参照すると、特定の好ましいヌクレオチド配列の発現が植物における非生物的ストレス耐性、栄養的特性、および耐病性を含む形質を改変または修飾することが実証されていることは理解されるであろう。
【０１１１】
特定の好ましい実施形態では、植物における発現用の前記ヌクレオチド配列の１つ以上は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。発現用のタンパク質コード配列は、任意の好適なタンパク質コード配列であり得る。好ましくは、該ヌクレオチド配列は、当該技術分野で周知の通り、望ましいまたは有利な植物の形質または特徴に関連したタンパク質をコードする。例として、耐塩性を含む非生物的ストレス耐性に関連したＤＲＥＢ１Ａ、およびアントシアニン産生に関連したＡＮＴ１を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現が本明細書中で示されている。
【０１１２】
特定の特に好ましい実施形態では、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８〜４６、７６、７８、または９８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【０１１３】
一部の好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、植物の形質を改変または修飾するための植物における発現に適した１つ以上の非コードヌクレオチド配列を含む１つ以上の配列を含む。
【０１１４】
好ましくは、前記非コード配列は、スモールＲＮＡ配列を含む。
本明細書で用いられるとき、「スモールＲＮＡ」は、他の核酸分子に結合し、他の核酸分子の発現、翻訳および／または複製を調節する能力を有する小型の非コードＲＮＡ分子を指すように理解されるであろう。当業者は、小型の非コードＲＮＡ分子、および植物におけるかかる分子の各々の概要については、イプサロ，Ｊ．Ｊ．（Ｉｐｓａｒｏ，Ｊ．Ｊ．）およびジョシュア・トーア，Ｌ．（Ｊｏｓｈｕａ−Ｔｏｒ，Ｌ．）著、２０１５年、ネイチャー構造・分子生物学（Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃ．＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２２巻、ｐ．２０；およびアクステル，Ｊ．Ｍ．（Ａｘｔｅｌｌ，Ｊ．Ｍ．）著、２０１３年、アニュアル・レビュー・オブ・プラント・バイオロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．）、第６４巻、ｐ．１３７〜１５９（参照により本明細書中に援用される）に着目する。
【０１１５】
本明細書で用いられるとき、スモールＲＮＡという用語が、科学界で用いられることがある特定名称と無関係に、すべてのかかる分子を包含することは理解されるであろう。非限定例として、当業者は、本明細書で用いられるとき、スモールＲＮＡという用語が、「ｍｉＲＮＡ」および「ｓｉＲＮＡ」と称される小型の非コードＲＮＡ分子を包含することは容易に理解するであろう。
【０１１６】
スモールＲＮＡ分子が一般に、対象として、結合し、その発現、翻訳、および／または複製を調節する能力を有する核酸分子と高度なヌクレオチド配列同一性を有することはさらに理解されるであろう。しかし、スモールＲＮＡ分子がかかる配列に対して必ずしも１００％の同一性を有する必要がないことも理解されるであろう。
【０１１７】
特定の実施形態では、本発明のスモールＲＮＡは、対象として、結合し、発現、翻訳、および／または複製を調節する能力を有する核酸分子に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する。
【０１１８】
成熟スモールＲＮＡが一般に１８〜４０ヌクレオチド長を有することは理解されるであろう。典型的には、成熟植物スモールＲＮＡは、１９〜２６ヌクレオチド長、特に１９〜２４ヌクレオチド長を有する。したがって、遺伝子構築物の発現用のスモールＲＮＡヌクレオチド配列のヌクレオチド配列は、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド長であってもよい。
【０１１９】
スモールＲＮＡ配列は、スモールＲＮＡ前駆体配列に属してもよい。当業者によって容易に理解されるように、スモールＲＮＡ前駆体は、成熟スモールＲＮＡよりも長いヌクレオチド配列を含む。植物において発現されるとき、スモールＲＮＡ前駆体は、成熟スモールＲＮＡにプロセシングされる。典型的には、限定はされないが、スモールＲＮＡ前駆体の成熟スモールＲＮＡへのプロセシングは、ＤＣＬ−１、ＤＣＬ−２、ＤＣＬ−４、および／またはアルゴノートタンパク質１（ＡＧＯ１）などのＤｉｃｅｒ様タンパク質によって媒介される。
【０１２０】
特定の好ましい実施形態では、１つ以上のマイクロＲＮＡ配列を含む遺伝子構築物の発現用のヌクレオチド配列は、ｍｉＲＮＡ前駆体（プレｍｉＲＮＡ）（例えば配列番号１２）、または修飾プレｍｉＲＮＡを含む人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）構築物（例えば配列番号１３〜１７）を含む。
【０１２１】
植物において、プレｍｉＲＮＡが、成熟スモールＲＮＡ配列が産生される元の非タンパク質コード配列であることは、当業者によって容易に理解されるであろう。典型的には、プレｍｉＲＮＡ配列は、約６０ヌクレオチド長〜約１００ヌクレオチド長の間であるが、数百を超えるヌクレオチド長であり得ることは理解されるであろう。これらのプレｍｉＲＮＡ配列は、１つ以上の成熟ｍｉＲＮＡへのプロセシング前に二次的な「ステムループ」構造を形成するが、Ａｘｔｅｌｌ，Ｊ．Ｍ．、上記を参照のこと。
【０１２２】
好適には、プレｍｉＲＮＡ配列の１つ以上のスモールＲＮＡ配列が、目的の１つ以上のスモールＲＮＡ配列（例えば配列番号１３〜１７）と置換される、修飾プレｍｉＲＮＡ配列を含むａｍｉＲＮＡ構築物を用いることができる。
【０１２３】
特定の他の好ましい実施形態では、１つ以上のスモールＲＮＡ配列を含む発現用配列は、「二本鎖ＲＮＡ」（「ｄｓＲＮＡ」）または「ＲＮＡｉ」構築物（例えば配列番号１８および配列番号２２）を含む。
【０１２４】
ｄｓＲＮＡまたはＲＮＡｉ構築物が二本鎖ＲＮＡ「ヘアピン」構造を形成するＲＮＡ配列を発現するように設計されることは容易に理解されるであろう。例として、当業者は、ミキ，Ｄ（Ｍｉｋｉ，Ｄ，）およびシマモト，Ｋ（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｋ）著、２００４年、プラント・アンド・セル・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、第４５巻、ｐ．４９０に着目する。一般に、前記ヘアピン構造は、長さが最大で数百の塩基対である。上記の通り、植物において発現されるとき、前記ヘアピン構造がスモールＲＮＡにプロセシングされることは容易に理解されるであろう。
【０１２５】
一部の好ましい実施形態では、遺伝子構築物の発現用のヌクレオチド配列の１つ以上のスモールＲＮＡ配列は、植物病原体の１つ以上の核酸の発現、翻訳および／または複製を改変する能力がある。
【０１２６】
特定の特に好ましい実施形態では、前記スモールＲＮＡは、植物ウイルスの核酸の複製を阻害する能力がある。他の特に好ましい実施形態では、前記スモールＲＮＡは、細菌植物病原体の感染および／または複製を阻害する能力がある。追加的または代替的には、前記スモールＲＮＡは、真菌植物病原体、および／または植物に感染または外寄生する卵菌、線虫、および／もしくは昆虫の感染および／または複製を阻害する能力があってもよい。
【０１２７】
特に好ましい実施形態では、スモールＲＮＡ配列を含む、発現における前記非コードヌクレオチド配列は、配列番号１２〜２６、８０、８１、８３〜９２、または９４〜１０１で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【０１２８】
発現用配列である、この態様の遺伝子構築物の１つ以上のヌクレオチド配列は、追加的または代替的には、１つ以上の選択可能マーカヌクレオチド配列を含んでもよい。
本明細書で用いられるとき、「選択可能マーカ」ヌクレオチド配列は、植物細胞、植物組織、または植物における発現に適し、かつ植物細胞、植物組織、または植物の同定を容易化するのに適応したヌクレオチド配列を指し、ここで本発明の遺伝子構築物、またはその断片は、前記植物細胞、植物組織、または植物の遺伝子材料に挿入されている。
【０１２９】
特に好ましい実施形態では、前記１つ以上の選択可能マーカヌクレオチド配列は、配列番号２７〜３５または１１９の１つ以上、またはその断片もしくは変異体、または配列番号３８〜４６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を各々コードする１つ以上のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【０１３０】
非限定例として、遺伝子構築物の発現用の１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の選択可能マーカヌクレオチド配列は、植物において発現されるとき、対応する野生型植物と比べて、有毒な代謝産物に対する植物耐性を増強する、または植物の代替的な栄養素供給源を利用する能力を増強する遺伝子に属してもよい。
【０１３１】
これに関連して、配列番号３８で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号２７で示されるヌクレオチド配列がベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子に属することは理解されるであろう。当業者は、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む選択可能マーカの発現が、化学物質ベタインアルデヒドに対する植物の耐性を増強し、外因性ベタインアルデヒドの適用により選択を容易にし得ることを理解するであろう。
【０１３２】
別の非限定例として、発現用の１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の選択可能マーカヌクレオチド配列は、除草剤耐性を付与する遺伝子に属してもよい。非限定例として、除草剤耐性を付与するように導入される突然変異を含む、除草剤作用の光合成関連または他の酵素標的をコードする選択可能マーカヌクレオチド配列が使用可能であることは理解されるであろう。
【０１３３】
これに関連して、配列番号４１で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号３０で示されるヌクレオチド配列が、グルタミンシンテターゼ遺伝子に属することは理解されるであろう。
【０１３４】
当業者は、対応する野生型タンパク質と比べて、１つ以上の突然変異を含むグルタミンシンテターゼタンパク質をコードする選択可能マーカヌクレオチド配列の発現が、除草剤（例えばグルホシネートアンモニウム）に対する植物の耐性を付与し、外因性除草剤の適用による選択を容易にし得ることを理解するであろう。これに関しては、当業者は、ティッシャー，Ｅ．（Ｔｉｓｃｈｅｒ，Ｅ．）、ダスサルマ，Ｓ（ＤａｓＳａｒｍａ，Ｓ．）、およびグッドマン、Ｈ．Ｍ．（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．）著、１９８６年、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、第２０３巻、ｐ．２２１；ならびにポーンプロム，Ｔ．（Ｐｏｒｎｐｒｏｍ，Ｔ．）、プロドマテー，Ｎ．（Ｐｒｏｄｍａｔｅｅ，Ｎ．）、およびチャトチャワンカンファニッチ，Ｏ．（Ｃｈａｔｃｈａｗａｎｋａｎｐｈａｎｉｃｈ，Ｏ．）著、２００９年、ペスト・マネージメント・サイエンス（Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｃｉ．）、第６５巻、ｐ．２１６（参照により本明細書中に援用される）に着目する。
【０１３５】
さらに別の非限定例として、発現用の１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の選択可能マーカヌクレオチド配列は、視覚的選択を容易にする遺伝子であってもよい。
これに関連して、配列番号４６で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の配列番号３５は、アントシアニン１遺伝子に属する。
【０１３６】
当業者は、アントシアニン１遺伝子のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む選択可能マーカの発現が、本発明の遺伝子構築物、またはその断片で形質転換された植物の視覚的選択を容易にし得ることを理解するであろう。
【０１３７】
様々な当業者に公知の他の好適な選択可能マーカが、本発明のこの実施形態に従って使用可能であることは容易に理解されるであろう。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子構築物の選択可能マーカヌクレオチド配列がまた、植物の形質を改変または修飾するための植物における発現に適したヌクレオチド配列であってもよいことは理解されるであろう。
【０１３８】
非限定例として、当業者は、（上記の通り）ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子に属する、配列番号３８で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号２７の発現が、植物における乾燥および／または塩分ストレスに対する増強された耐性を付与し得ることを理解するであろう。
【０１３９】
実施例を参照すると、ＤＲＥＢ１Ａの発現が耐塩性を付与し得、遺伝子内形質転換植物の作製に対して塩含有培地上での再生を介した選択を可能にしていることが本明細書で実証されていることはさらに理解されるであろう。
【０１４０】
別の非限定例として、当業者は、（上記の通り）アントシアニン１遺伝子に属する、配列番号４６で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号３５の発現が、植物におけるストレス耐性を増強し、かつヒト消費のための植物の栄養的特性を増強し得ることを理解するであろう。
【０１４１】
少なくとも特定の実施形態では、望ましい形質を付与することに加えて、選択可能マーカとして作用し得る発現用のヌクレオチド配列の使用は、非常に有利であり得る。この手法が、他の選択可能マーカの使用を要することなく、遺伝子内形質転換体の効率的選択を容易にし得ることは本明細書で実証されている。
【０１４２】
制御配列
この態様の組換え遺伝子構築物は、好ましくは１つ以上の制御ヌクレオチドを含む。好適には、１つ以上の制御配列は、植物の遺伝子材料に挿入可能であるこの態様の遺伝子構築物の核酸断片に属する。好適には、遺伝子構築物の発現用のヌクレオチド配列は、前記制御ヌクレオチド配列の１つ以上と作動可能に連結される。
【０１４３】
本明細書で用いられるとき、「制御配列」は、制御配列が作動可能に連結される相手の１つ以上の他のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を制御するか、あるいは促進し、可能にし、または修飾する能力があるヌクレオチド配列である。
【０１４４】
「作動可能に接続される」または「作動可能に連結される」は、前記制御ヌクレオチド配列が、転写および／または翻訳の前記制御または修飾を達成するため、前記１つ以上のヌクレオチド配列に対して好適に位置づけられることを意味する。
【０１４５】
好適には、遺伝子構築物の追加的配列の制御配列は、制御配列が作動可能に連結される相手の、組換え遺伝子構築物の１つ以上の発現用のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を制御または修飾する能力がある。
【０１４６】
広範な制御配列は、当業者に公知であり、限定はされないが、プロモータ配列；リーダまたはシグナル配列；リボソーム結合部位；転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列；エンハンサーまたはアクチベータ配列；およびターミネータ配列を含んでもよい。
【０１４７】
好ましくは、１つ以上の制御ヌクレオチド配列は、プロモータ配列を含む。
好ましくは、１つ以上の制御配列は、ターミネータ配列を含む。
非限定例として、構成的発現；組織特異的発現；発生段階に特異的な発現、または誘導発現（例えば環境刺激に応答した）を促進する制御配列が本発明に従って使用可能であることは理解されるであろう。
【０１４８】
特定の好ましい実施形態では、１つ以上の植物の天然調節エレメント、またはその断片もしくは変異体は、それらが作動可能に連結される相手の植物遺伝子または非コード配列の内因性発現に基づいた本発明の遺伝子構築物における使用のため、選択されてもよい。
【０１４９】
好ましい実施形態では、制御配列は、配列番号４〜７、５３、５５、５７、５９、６１、６７、７３、７４、７６、７８、または９８で示されるヌクレオチド配列またはその断片もしくは変異体を含むプロモータを含む。
【０１５０】
好ましい実施形態では、制御配列は、配列番号８〜１１、：５４、５６、５８、６０、６２、１０６、１０８、１１１、または１１２で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含むターミネータを含む。
【０１５１】
その他の配列
この態様の遺伝子構築物は、下記のようなヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。前記その他の配列が、植物の遺伝子材料に挿入可能であるこの態様の組換え遺伝子構築物の１つ以上の核酸断片に属してもよいが、必ずしもその必要がないことは理解されるであろう。前記その他の配列が、発現用の１つ以上のヌクレオチド配列、および／または組換え遺伝子構築物の１つ以上の制御配列に属してもよいことはさらに理解されるであろう。
【０１５２】
好ましくは、遺伝子構築物は、１つ以上の制限消化物または制限酵素部位を含むヌクレオチド配列を含む。好適には、制限消化部位は、本発明の遺伝子構築物のヌクレオチド配列の付加および／または除去を促進する。
【０１５３】
特定の特に好ましい実施形態では、この態様の組換え遺伝子構築物は、植物の遺伝子材料に挿入可能な核酸断片のフランキング配列またはそれを囲むフランキング配列を含む。一部の実施形態では、フランキング配列、またはその一部は、１つ以上の植物に由来する。好ましくは、フランキング配列は、制限消化部位を含む。特定の特に好ましい実施形態では、フランキング配列の１つ以上は、配列番号１０２、１０３、１０９、１１０、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、または１２１で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【０１５４】
好適には、制限消化部位を含むフランキング配列は、より大規模な構築物および／またはベクターからの植物由来配列からなるこの態様の組換え遺伝子構築物の１つ以上の断片の除去または切除を促進する。実施例を参照すると、例として、配列番号７３〜７４、７８、７９、９８、および１０１で示される好ましい遺伝子構築物が、植物由来配列からなる組換え遺伝子構築物の断片の除去を促進するようなフランキング配列を含むことが理解されるであろう。
【０１５５】
かかる実施形態は、直接形質転換、例えば微粒子銃を含む、この態様の遺伝子構築物を用いる形質転換手法にとって特に望ましいことがある。植物由来ヌクレオチド配列からなる断片の除去または切除により、遺伝子構築物の非植物由来配列が植物の遺伝子材料に導入されることが予想されず、この断片の植物の形質転換への適用が容易になることは理解されるであろう。
【０１５６】
さらに、特定の実施形態では、本発明の遺伝子構築物は、１つ以上の「スペーサ」ヌクレオチド配列を含んでもよい。好ましくは、発現用ヌクレオチド配列または制御ヌクレオチド配列である、遺伝子構築物のヌクレオチド配列の機能は、前記スペーサ配列により損なわれないか、または実質的に損なわれない。
【０１５７】
非限定例として、１つ以上のスペーサヌクレオチド配列は、伸長された制御配列、遺伝子間配列および／またはイントロン配列を含んでもよい。組換え遺伝子構築物は、スペーサ配列を、任意の好適な位置、例えば遺伝子構築物の複数の他の追加的ヌクレオチド配列間に含むが、それに限定されない。
【０１５８】
境界配列
この態様の特定の好ましい実施形態では、組換え遺伝子構築物は、「境界」ヌクレオチド配列であるフランキング配列を含む。
【０１５９】
この関連で用いられるとき、「境界」ヌクレオチド配列は、植物、植物細胞、または植物組織の細菌媒介性形質転換の間に認識される配列を指すことが理解されるであろう。より詳細には、本発明の組換え遺伝子構築物において、境界ヌクレオチド配列は、細菌媒介性形質転換を介する遺伝子構築物の少なくとも１つの断片の植物の遺伝子材料への導入を容易にする。当業者によって理解される通り、細菌媒介性植物形質転換は、一般にアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いて実施される。これに関しては、当業者は、バンタＬ．Ｍ．（Ｂａｎｔａ  Ｌ．Ｍ．）、モンテネグロＭ．（Ｍｏｎｔｅｎｅｇｒｏ  Ｍ．）著、２００８年、「アグロバクテリウム：生物学からバイオテクノロジーへ（ＡＧＲＯＢＡＣＴＥＲＩＵＭ：ＦＲＯＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＴＯ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）」における「アグロバクテリウムおよび植物バイオテクノロジー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、ツフィラＴ．（Ｔｚｆｉｒａ  Ｔ．）、シトフスキーＶ．（Ｃｉｔｏｖｓｋｙ  Ｖ．）編（ニューヨーク、ＮＹ：スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ））に着目する。
【０１６０】
好適には、組換え遺伝子構築物が境界配列を含む実施形態では、構築物は、第１の境界ヌクレオチド配列；第２の境界ヌクレオチド配列；および第１の境界ヌクレオチド配列と第２の境界ヌクレオチド配列との間に位置する１つ以上の追加的ヌクレオチド配列を含み、ここで前記追加的ヌクレオチド配列、および前記追加的ヌクレオチド配列に隣接した前記第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、１つ以上の植物に由来するかまたは由来し得る。
【０１６１】
一部の実施形態では、追加的ヌクレオチド配列に隣接した第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、１つ以上の植物に由来する。好ましくは、前記１つ以上の植物は、追加的ヌクレオチド配列および第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも１つの断片の由来元である同じ植物である。
【０１６２】
植物のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換の間、一般に「右境界」（ＲＢ）および「左境界」（ＬＢ）ヌクレオチド配列と称される境界配列が、一般に「Ｔ−ＤＮＡ」と称されるＲＢおよびＬＢ配列間に位置するヌクレオチド配列の植物の遺伝子材料への挿入を可能にすることは理解されるであろう。一般に、前記ＲＢおよびＬＢ配列は、約２５ヌクレオチド長であるが、それに限定されない。
【０１６３】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の第１の境界ヌクレオチド配列は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲＢ配列を含む。好ましくは、本発明の遺伝子構築物の第２の境界ヌクレオチド配列は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢ配列を含む。これらの好ましい実施形態では、これらの実施形態に記載の組換え遺伝子構築物の１つ以上の追加的ヌクレオチド配列は、植物のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換の間、Ｔ−ＤＮＡとして機能し得ることは理解されるであろう。
【０１６４】
植物のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換の間、Ｔ−ＤＮＡ配列に隣接して位置するＲＢ配列の２または３ヌクレオチド部分が植物の遺伝子材料に挿入されることが多いことはさらに理解されるであろう（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）著、２００７年、モレキュラー・ジェネティクス・アンド・ゲノミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、第２７８巻、ｐ．４１１）。例えば、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）では、組込み後のＲＢが基準のＴ−ＤＮＡ挿入部位から第２および第５の塩基間で頻繁に（３６％）切断され、またトマトにおいては、組込み後にＲＢの３つ以下の塩基が典型的には維持される。
【０１６５】
したがって、上記の通り、境界配列を含むこの態様の好ましい遺伝子構築物では、１つ以上の追加的ヌクレオチド配列に隣接して位置する第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、１つ以上の植物に由来することになる。好適には、追加的ヌクレオチド配列に隣接した第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、少なくとも３ヌクレオチド長である。特定の好ましい実施形態では、追加的ヌクレオチド配列に隣接した第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、配列番号２または配列番号７１で示される配列を含む。これらの配列が任意の好適な植物に由来し得、かつこれらの配列が望ましい機能を備えた隣接するより大きい植物由来のＴ−ＤＮＡ配列の一部を形成し得ることは理解されるであろう。
【０１６６】
多くの場合（例えば、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）における７６％；トマトにおける１００％）、植物のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換の間、ＬＢ配列自身の一部または全部が；また場合によっては、ＬＢ配列の上流（すなわち、ＲＢ配列方向）の最大で１００またはそれより多いヌクレオチドの配列が、切断され、ひいては植物の遺伝子材料に挿入されないことも理解されるであろう（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）著、上記；ブルノー（Ｂｒｕｎａｕｄ）ら著、２００２年、欧州分子生物学機構（ＥＭＢＯ）、Ｒｅｐ．３、ｐ．１１５２）。一部の植物では、ＬＢ配列は、Ｔ−ＤＮＡの組込み後、完全に切断されることが多い（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）著、上記；トマトにおける場合の９８％）。したがって、境界配列を含むこの態様の好ましい遺伝子構築物において、第２の境界ヌクレオチド配列の一部が１つ以上の植物に由来する必要はない。
【０１６７】
しかし、植物のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換の間、一部の環境では、ＬＢ配列の一部がやはり植物の遺伝子材料に挿入され得ることも理解されるであろう。少なくとも特定の植物、例えばシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）では、ＬＢ配列の一部が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換の間、植物の遺伝子材料に挿入されるとき、前記一部は、典型的には１ヌクレオチド長〜２２ヌクレオチド長である（Ｂｒｕｎａｕｄら、上記を参照）。したがって、特定の実施形態では、追加的ヌクレオチド配列に隣接した第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、１つ以上の植物に由来する。好ましくは、境界ヌクレオチド配列の前記一部は、少なくとも２ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２の境界ヌクレオチド配列の前記一部は、少なくとも２２ヌクレオチド長である。
【０１６８】
植物に由来する第２の境界ヌクレオチド配列の前記一部の存在は、前記境界配列の一部が植物の遺伝子材料に挿入されるような環境下で有利であり得るが、これは植物に由来しない遺伝子構築物の任意のヌクレオチド配列がこれらの環境下で植物の遺伝子材料に挿入される可能性を低減するものであるからである。特定の好ましい実施形態では、１つ以上の植物に由来する、追加的ヌクレオチド配列に隣接した第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部は、配列番号３または配列番号７２で示される配列を含む。これらの配列が任意の好適な植物に由来し得、かつこれらの配列が望ましい機能を備えた隣接するより大規模な植物由来Ｔ−ＤＮＡ配列の一部を形成し得ることは理解されるであろう。
【０１６９】
組換え遺伝子構築物が境界配列を含む、特に好ましい実施形態では、好ましくは、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５のヌクレオチド長、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる、植物の遺伝子材料に挿入可能である組換え遺伝子構築物の１つ以上の核酸断片は、
（ｉ）１つ以上の植物に由来する第１の境界配列の少なくとも一部；
（ｉｉ）１つ以上の植物に由来する１つ以上の追加的ヌクレオチド配列；および、任意選択的には、
（ｉｉｉ）１つ以上の植物に由来する第２の境界配列の少なくとも一部
からなる。
【０１７０】
特定の前記好ましい実施形態では、単一の少なくとも１５、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド配列が、植物由来のヌクレオチド配列を含む第１の境界配列の一部および前記第１の境界配列に隣接して位置する追加的ヌクレオチド配列を形成し得ることは理解されるであろう。同様に、特定の前記好ましい実施形態では、単一の少なくとも１５、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド配列が、植物由来のヌクレオチド配列を含む第２の境界配列の一部および前記第２の境界配列に隣接して位置する追加的ヌクレオチド配列を形成し得ることは理解されるであろう。
【０１７１】
例として、図２に示される遺伝子構築物においては、トマトＲｂｃＳ３Ｃターミネータの単一の植物由来のヌクレオチド配列が、植物に由来する第１の境界配列の３ヌクレオチド部分および第１の境界配列に隣接して位置する追加的ヌクレオチド配列を形成し；かつトマトＲｂｃＳ３Ｃプロモータの単一の植物由来のヌクレオチド配列が、植物に由来する第２の境界配列の３ヌクレオチド部分および第２の境界配列に隣接して位置する追加的ヌクレオチド配列を形成することは理解されるであろう。
【０１７２】
組換え遺伝子構築物が境界ヌクレオチド配列を含む、この態様の一部の好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、第２の境界ヌクレオチド配列に隣接して位置する、上記のようなスペーサ配列をさらに含む。
【０１７３】
上記の通り、本発明の遺伝子構築物またはその断片がアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換を介して植物の遺伝子材料に挿入されるとき、一般に、第２の境界配列および第２の境界配列の方に位置する遺伝子構築物の１つ以上の追加的配列の少なくとも一部は、切断され、植物の遺伝子材料に挿入されない。
【０１７４】
したがって、第２の境界ヌクレオチド配列に隣接したスペーサ配列の位置は、これが植物の遺伝子材料に挿入されている遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列の他のすべてを含む１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の一部をもたらし得ることから有利であり得、ここでは前記スペーサ配列からなる１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の一部の切断が生じる。
【０１７５】
組換え遺伝子構築物が境界配列を含む、この態様の特定の好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、第２の境界ヌクレオチド配列に隣接して位置しかつ選択可能マーカ配列と作動可能に連結された、プロモータ配列である制御配列を含む。
【０１７６】
上記の通り、遺伝子構築物、またはその核酸断片が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換を介して植物の遺伝子材料に挿入されるとき、一般には第２の境界配列、および実質的に第２の境界配列の側に位置する遺伝子構築物の１つ以上の追加的配列の少なくとも一部は、切断され、植物の遺伝子材料に挿入されないことは理解されるであろう。しかし、一部の環境では、第２の境界配列の少なくとも一部は、植物の遺伝子材料に挿入されてもよい。
【０１７７】
したがって、第２の境界ヌクレオチド配列に隣接した選択可能マーカヌクレオチド配列と作動可能に連結されたプロモータ配列の位置は、これが本発明に従って作製される遺伝的に改善された植物の同定を容易にし得ることから有利であり得、ここでは本発明の遺伝子構築物の第２の境界ヌクレオチド配列が植物の遺伝子材料に挿入されている可能性が高い。
【０１７８】
特に、第２の境界ヌクレオチド配列が１つ以上のヌクレオチド配列に隣接して位置する植物由来のヌクレオチド配列の一部を含まないような本発明の実施形態では、植物に挿入される遺伝子構築物のヌクレオチド配列は、上記の通り、本発明によると望ましくない、１つ以上の植物に由来しない第２の境界配列の少なくとも１つの断片を含んでもよい。
【０１７９】
したがって、第２の境界配列に隣接して位置するプロモータ配列に作動可能に連結される選択可能マーカ配列の組み入れは、植物における前記選択可能マーカ配列の発現が、遺伝子構築物の第２の境界ヌクレオチド配列が植物の遺伝子材料に挿入されている可能性があることを示すことから、有利であり得る。これは、その植物が本発明によるさらなる使用にとって望ましくない場合があるか、または１つ以上の植物に由来しない第２の境界配列のヌクレオチド配列が植物の遺伝子材料に挿入されているか否かを判定するための植物のさらなる分析を行うことが有利であり得ることを示し得る。
【０１８０】
好ましい一実施形態では、第２の境界ヌクレオチド配列に隣接して位置する前記プロモータ配列は、上記の通り、アントシアニン１をコードする遺伝子に属する、配列番号４６で示されるアミノ酸配列をコードする選択可能マーカヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体と作動可能に連結される。
【０１８１】
（ベクター）
別の態様によると、本発明は、上記のような本発明の組換え遺伝子構築物を含むベクターを提供する。本発明の遺伝子構築物を含むベクターのヌクレオチド配列の特定の好ましい例が、配列番号４７、４８、６３、７０、８２、９３、および９５で示される。
【０１８２】
好適には、ベクターは、ベクター骨格配列をさらに含む。本発明のベクターのベクター骨格配列の好ましい一例が、配列番号５０で示される。しかし、当該技術分野で周知の通り、様々な好適な骨格配列を含む様々な好適なベクターが使用可能であることは理解されるであろう。
【０１８３】
組換え遺伝子構築物が境界配列を含む好ましい実施形態では、本発明のベクターは、細菌媒介性植物形質転換を介する、本発明の遺伝子構築物、またはその核酸断片を用いた植物の形質転換に適応される。好ましくは、前記細菌媒介性形質転換は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性植物形質転換である。
【０１８４】
当業者によって容易に理解されるように、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性植物形質転換は、一般に「バイナリー」ベクター系によって促進される。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性植物形質転換におけるバイナリーベクター系の概要については、当業者は、ガートランド（Ｇａｒｔｌａｎｄ）およびダベイ（Ｄａｖｅｙ）著、１９９５年、「アグロバクテリウムプロコル（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」（ヒューマナ・プレス・インコーポレイテッド（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）、ニュージャージー州、米国）；およびリー，Ｌ．Ｙ．（Ｌｅｅ，Ｌ．Ｙ．）およびゲルビン、Ｓ．Ｂ．（Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓ．Ｂ．）著、２００８年、プラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．）、第１４６巻、ｐ．３２５（参照により本明細書中に援用される）に着目する。
【０１８５】
簡潔に述べると、バイナリーベクターは、典型的には、上記のようなＲＢおよびＬＢ配列によって隣接されたＴ−ＤＮＡ配列、ならびに特定の共通した細菌の実験室株（例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株）、およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）におけるベクターの複製および選択を容易にするベクター骨格配列上に位置する追加的要素を含む。
【０１８６】
好適には、バイナリーベクターは、要素（「病原性」要素と称されることが多い）を含む別のベクター（「ヘルパープラスミド」と称されることが多い）を含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に導入することができ、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を用いるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性植物形質転換により、Ｔ−ＤＮＡ配列の植物の遺伝子材料への導入が容易になる。
【０１８７】
これらの実施形態では、好ましくは、ベクターは、バイナリーベクターである。
特定の好ましい実施形態では、ベクターの骨格配列は、骨格挿入マーカを含む。
本明細書で用いられるとき、用語「骨格挿入マーカ」は、ベクター骨格が植物の遺伝子材料に導入されている本発明のベクターを用いて形質転換された植物細胞、組織、または植物を、ベクター骨格が植物の遺伝子材料に導入されていない本発明のベクターを用いて形質転換された植物細胞、組織、または植物と区別することを容易にするヌクレオチド配列を指すように理解されるであろう。
【０１８８】
通常の環境下では、本発明のベクターを用いた植物のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換の結果として、ベクター骨格が植物の遺伝子材料に導入されないことは理解されるであろう。しかし、一部の環境下では、例えば本発明の遺伝子構築物の不正確なプロセシングに起因して、骨格は植物の遺伝子材料に挿入されることがある。植物の直接形質転換に適応した本発明の好ましい遺伝子構築物が、形質転換用の植物由来配列からなる断片の切除を可能にするように設計されても、（例えば技術的エラーに起因して）ベクター骨格が直接形質転換を介して植物遺伝子材料中に組み込まれ得る可能性があることはさらに理解されるであろう。
【０１８９】
かかる環境は、一般に本発明にとって望ましくなく、例えばベクター骨格配列は、１つ以上の植物に由来しない、およびまたは植物における本発明の遺伝子構築物の発現用の配列である１つ以上の追加的配列の発現にとって不必要であるかもしくは望ましくない配列を含んでもよい。したがって、骨格挿入マーカの組み入れは、これにより、ベクター骨格配列を有する植物を同定し、本発明に従うさらなる発生について回避することを可能にし得ることから、望ましい場合がある。
【０１９０】
本発明の骨格挿入マーカは、任意の好適な形態をとってもよい。特定の実施形態では、骨格挿入マーカは、本発明の遺伝子構築物の選択可能マーカに関して上記と同様に、化学物質の適用により、または視覚的スクリーニングにより、形質転換された植物のスクリーニングを容易にし得る。
【０１９１】
好ましい一実施形態では、骨格挿入マーカは、例えば配列番号３６で示される、クロロフィルシンターゼタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害または低減する能力があるスモールＲＮＡのヌクレオチド配列を含む。
【０１９２】
植物における本発明のベクターの骨格挿入マーカによる、クロロフィルシンターゼタンパク質をコードする遺伝子の発現の阻害または低減が、本発明のベクターを用いて形質転換された植物の視覚的スクリーニングを可能にし得、ここでクロロフィル色素沈着の低減または不在がベクター骨格が植物の遺伝子材料に挿入されているような形質転換を示すことは理解されるであろう。好適には、かかる植物は、本発明に従うさらなる発生が回避され得る。
【０１９３】
特定の好ましい実施形態では、骨格挿入マーカは、「致死」または「ネガティブ選択」マーカである。好適には、これらの実施形態では、骨格が植物の遺伝子材料に挿入される形質転換は、形質転換植物の、死滅をもたらすか、または成長および発生を実質的に阻害した。
【０１９４】
非限定例として、ネガティブ選択骨格挿入マーカは、バルナーゼ自殺遺伝子に属する、配列番号３７で示される配列、またはその断片もしくは変異体を含んでもよい。
別の非限定例として、本発明のベクターのネガティブ選択骨格挿入マーカは、植物の生存および／または成長および発生にとって重要である１つ以上の植物遺伝子または非タンパク質コード配列の発現または翻訳を阻害または低減する能力があるスモールＲＮＡ配列を含んでもよい。
【０１９５】
（宿主細胞）
本発明はまた、本発明の遺伝子構築物またはベクターを含む宿主細胞または生物を提供する。前記宿主細胞または生物は、原核生物または真核生物であってもよい。
【０１９６】
特定の好ましい実施形態では、前記宿主細胞は、本発明の遺伝子構築物またはベクターを増殖する能力がある細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞）であってもよい。
【０１９７】
好ましい一実施形態では、前記宿主細胞は、上記の通り、本発明のベクターを用いて植物細胞を形質転換する能力があるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞である。
【０１９８】
好ましい一実施形態では、前記宿主細胞は、上記の通り、形質転換構築物または本発明の遺伝子内配列へのＲＮＡの結合能を一過性に試験する能力がある植物細胞または植物組織（例えば、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ））である。
【０１９９】
（植物を遺伝的に改善する方法）
本発明の別の態様は、植物を遺伝的に改善する方法であって、本発明の遺伝子構築物の少なくとも１つの断片、またはその断片を、植物細胞または植物組織の遺伝子材料に導入するステップを含む、方法を提供する。
【０２００】
上記の通り、本発明においては、この態様の方法に従い、植物細胞または植物組織の遺伝子材料に導入される遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片が、１つ以上の植物に由来する１つ以上のヌクレオチド配列からなる遺伝子構築物の断片であるかまたはそれに属することは特に望ましい。好適には、植物の遺伝子材料に導入される遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片は、植物の遺伝子材料に挿入可能である、少なくとも１５のヌクレオチド長、または好ましくは少なくとも２０の塩基対長の植物由来のヌクレオチド配列からなる遺伝子構築物の１つ以上の断片からなる。
【０２０１】
この態様によると、遺伝的に改善される植物が、前記１つ以上のヌクレオチド配列の由来元の１つ以上の植物と同じ種、および／またはそれらと異種交配可能な種に属することは特に好ましい。
【０２０２】
一実施形態では、この態様の方法は、
（ｉ）植物細胞または植物組織を、本発明の遺伝子構築物または本発明の遺伝子構築物を含む本発明のベクターを用いて形質転換するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形質転換された植物細胞または植物組織からの遺伝的に改善された植物を選択的に成長するステップと、を含み、ここで遺伝子構築物の少なくとも１つの断片は植物細胞または植物組織の遺伝子材料に挿入されている。
【０２０３】
好適には、ステップ（ｉ）において用いられる植物細胞または植物組織は、リーフディスク、カルス、成長点、胚軸、根、葉の紡錘体または輪生、葉身、茎、苗条、葉柄、腋芽、茎頂、節間部、子葉節、花茎または花序組織であってもよいが、それらに限定されない。
【０２０４】
好適には、ステップ（ｉｉ）においては、形質転換された植物材料は、非限定例として、当該技術分野で周知の通り、苗条誘導培地とその後の苗条伸長培地で培養されてもよい。苗条は、当該技術分野で周知の通り、切断し、根誘導培地に挿入し、根形成を誘導してもよい。
【０２０５】
この態様の特定の好ましい実施形態では、ステップ（ｉ）に従う植物細胞または植物組織の形質転換は、細菌媒介性形質転換である。ステップ（ｉ）に従う植物細胞または植物組織の形質転換がアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換であることは特に好ましい。
【０２０６】
好ましくは、植物細胞または植物組織の形質転換が細菌媒介性形質転換であるような実施形態では、形質転換用に用いられる遺伝子構築物は境界配列を含む。好ましくは、本発明のベクターは、前記アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換用に用いられる。好ましくは、ベクターは、上記のようなバイナリーベクターである。
【０２０７】
特定の好ましい実施形態では、ステップ（ｉ）に従う植物細胞または植物組織の形質転換は、直接形質転換、例えば当該技術分野で周知ような微粒子銃形質転換である。当業者は、微粒子銃（フランクス（Ｆｒａｎｋｓ）およびバーチ（Ｂｉｒｃｈ）著、１９９１年、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・プラント・フィジオロジー（Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）、第１８巻、ｐ．４７１；バワー（Ｂｏｗｅｒ）ら著、１９９６年、モレキュラー・ブリーディング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ）、第２巻、ｐ．２３９；ナット（Ｎｕｔｔ）ら著、１９９９年、プロシーディング・オブ・オーストラリアン・ソサエティ・オブ・シュガーケイン・テクノロジー（Ｐｒｏｃ．Ａｕｓｔ．Ｓｏｃ．ＳｕｇａｒＣａｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．）、第２１巻、ｐ．１７１）、リポソーム媒介性（アホカス（Ａｈｏｋａｓ）ら著、１９８７年、ヘリディタス（Ｈｅｒｉｄｉｔａｓ）、第１０６巻、ｐ．１２９）、レーザー媒介性（グオ（Ｇｕｏ）ら著、１９９５年、フィジオロジア・プランタラム（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、第９３巻、ｐ．１９）、炭化ケイ素またはタングステンウィスカー媒介性（米国特許第５，３０２，５２３号明細書；ケップラー（Ｋａｅｐｐｌｅｒ）ら著、１９９２年、セオレティカル・アプライド・ジェネティクス（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、第８４巻、ｐ．５６０）、ウイルス媒介性（ブリッソン（Ｂｒｉｓｓｏｎ）ら著、１９８７年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３１０巻、ｐ．５１１）、ポリエチレングリコール媒介性（パスコフスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）ら著、１９８４年、欧州分子生物学機構ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第３巻、ｐ．２７１７）、ならびにマイクロインジェクション（ノイハウス（Ｎｅｕｈａｕｓ）ら著、１９８７年、セオレティカル・アプライド・ジェネティクス（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、第７５巻、ｐ．３０）およびプロトプラストのエレクトロポレーション（フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら著、１９８６年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３１９巻、ｐ．７９１）による形質転換（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）を含む種々の植物形質転換方法を理解するであろう。実施形態では、この態様のステップ（ｉ）に従う形質転換は、上記手法のいずれかを介してもよい。
【０２０８】
ステップ（ｉ）に従う植物細胞または植物組織の形質転換が直接形質転換であるような実施形態では、好ましくは、形質転換用に用いられる遺伝子構築物は、上記の通り、植物由来配列からなる断片の、形質転換用の前記断片の使用前の、切除のためのフランキング配列を含む。
【０２０９】
この態様の好ましい実施形態では、上記の通り、選択可能マーカである本発明の遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列の発現により、ステップ（ｉｉ）に従う遺伝的に改善された植物の選択的成長が容易になる。
【０２１０】
特定の好ましい実施形態では、前記選択可能マーカヌクレオチド配列は、対応する野生型植物と比べて、有毒な代謝産物に対する遺伝的に改善された植物の耐性を増強するか、または植物が代替的な栄養素供給源を利用する能力を増強することにより、選択を容易にする。好ましい一実施形態では、前記選択可能マーカは、上記の通り、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子に属する、配列番号３８で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２１１】
特定の他の好ましい実施形態では、前記選択可能マーカ配列は、遺伝的に改善された植物に対して除草剤耐性を付与することにより、選択を容易にする。好ましい一実施形態では、前記選択可能マーカは、上記の通り、グルタミンシンテターゼ遺伝子に属する、配列番号４１で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０２１２】
特定の他の好ましい実施形態では、前記選択可能マーカ配列は、遺伝的に改善された植物に対して耐塩性を付与することにより、選択を容易にする。好ましい一実施形態では、前記選択可能マーカは、上記の通り、ＤＲＥＢ１Ａ遺伝子に属する、配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列を含む。
【０２１３】
この態様の方法の特定の実施形態では、該方法は、
さらなる遺伝子構築物の核酸断片を植物の遺伝子材料に挿入するステップと；
第１の態様の遺伝子構築物の核酸断片およびさらなる遺伝子構築物の核酸断片が遺伝子材料に挿入されている植物から植物の集団を作製するステップと；
植物の前記集団から植物を選択するステップと、をさらに含み、前記植物の遺伝子材料は、第１の態様の遺伝子構築物の核酸断片を含むが、さらなる遺伝子構築物の核酸断片を含まない。
【０２１４】
好ましくは、植物の遺伝子材料に挿入されるさらなる遺伝子構築物の核酸断片は、選択可能マーカヌクレオチド配列を含む。
実施例を参照すると、これらの実施形態が、さらなる遺伝子構築物の選択可能マーカの植物の遺伝子材料への組み込みが形質転換植物の初期選択を容易にするのに望ましいような環境下で特に望ましいが、植物の遺伝子材料が前記選択可能マーカを含まない植物を最終的に作製することが望ましいことは理解されるであろう。
【０２１５】
例として、形質転換体の選択を容易にするため、配列番号６９で示されるさらなる構築物をこれらの実施形態に従って用いることが有利であり得ることは本明細書中で実証されている。しかし、前記構築物が、植物の遺伝子材料への、特に１つ以上の植物種に属しないかまたは由来しないＮＰＴＩＩ選択可能マーカ遺伝子を含む核酸断片の組み込みに適応されることは理解されるであろう。したがって、この断片を最終的にこの態様の方法に従って選択される形質転換植物から除去することは望ましい。
【０２１６】
さらなる遺伝子構築物の使用を含む一部の好ましいかかる実施形態では、第１の態様の遺伝子構築物およびさらなる遺伝子構築物は、第４の態様のベクターに属する。実施例を参照すると、第１の態様の遺伝子構築物とさらなる遺伝子構築物の双方を含むかかるベクターが配列番号７０で例示され、示される。
【０２１７】
追加的または代替的なかかる実施形態では、さらなる遺伝子構築物は、さらなるベクターに属する。
この態様の方法は、ベクター骨格が植物の遺伝子材料に挿入されていない遺伝的に改善された植物を選択するステップをさらに含んでもよい。好適には、このステップによると、上記の通り、本発明のベクターの骨格挿入マーカの発現が、遺伝的に改善された植物の選択を容易にする。
【０２１８】
特定の実施形態では、前記骨格挿入マーカは、視覚的マーカである。好適には、これらの実施形態では、ベクター骨格が植物の遺伝子材料に挿入されているとき、植物は、対応する野生型植物と比べて視覚的変化を示す。好適には、これらの実施形態では、視覚的マーカを示さない植物のみがこのステップに従って選択される。
【０２１９】
このステップを含む好ましい一実施形態では、骨格挿入マーカは、例えば配列番号３６で示される、クロロフィルシンターゼタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害または低減する能力があるスモールＲＮＡのヌクレオチド配列を含む。好適には、この実施形態によると、ベクター骨格が植物の遺伝子材料に挿入されているとき、植物は、対応する野生型植物と比べて実質的に改変されたクロロフィル発現を示す。好適には、この実施形態によると、実質的に改変されたクロロフィル発現を示さない植物のみがこのステップに従って選択される。
【０２２０】
このさらなるステップを含む方法の特定の他の実施形態では、骨格挿入マーカは、「致死」または「ネガティブ選択」マーカである。好適には、これらの実施形態によると、ベクター骨格が植物の遺伝子材料に挿入されているとき、植物は生存しないか、または対応する野生型植物と比べて実質的に妨害された成長および発生を示すことになる。好適には、これらの実施形態によると、生存する植物および／または実質的に妨害された成長および発生を示さない植物のみがこのステップに従って選択される。
【０２２１】
このさらなるステップを含む特に好ましい一実施形態では、このステップに従う遺伝的に改善された植物の選択は、上記の通り、バルナーゼ自殺遺伝子に属する、配列番号３７で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む骨格挿入マーカの発現によって容易になる。
【０２２２】
この態様の方法は、遺伝的に改善された植物を同定するステップをさらに含んでもよく、ここでは遺伝子構築物の第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部が植物の遺伝子材料中に組み込まれている可能性が増加する。
【０２２３】
好適には、このステップに従う遺伝的に改善された植物の同定は、プロモータヌクレオチド配列である遺伝子構築物の追加的配列と作動可能に連結された選択可能マーカヌクレオチド配列である遺伝子構築物の追加的配列の発現により容易になり、ここで前記プロモータ配列は、上記の通り、遺伝子構築物の第２の境界に隣接して位置する。
【０２２４】
好適には、この実施形態によると、選択可能マーカヌクレオチド配列を発現する植物は、遺伝子構築物の第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部が植物の遺伝子材料中に組み込まれている可能性の増加を有するとき、同定される。
【０２２５】
前記さらなるステップを含むこの態様の方法の特に好ましい一実施形態では、このステップに従う遺伝的に改善された植物の選択は、上記の通り、アントシアニン１タンパク質に属する、配列番号４６で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む選択可能マーカヌクレオチド配列の発現により容易になる。
【０２２６】
好適には、これらの実施形態によると、対応する野生型植物と比べて実質的に増加したレベルのアントシアニンを示す植物が、このステップに従って同定される。
修飾された形質を有する遺伝的に改善された植物
好ましくは、この態様の方法は、対応する野生型植物と比べて１つ以上の改変、修飾、または改善された形質を含む遺伝的に改善された植物を選択するさらなるステップを含む。
【０２２７】
好ましくは、１つ以上の形質は、植物の形質を改変または修飾するための、植物における発現に適した遺伝子構築物の１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の発現に従って改変される。
【０２２８】
この態様の特定の好ましい実施形態では、前記１つ以上のヌクレオチド配列は、スモールＲＮＡヌクレオチド配列を含む。
この態様の特定の好ましい実施形態では、前記１つ以上のヌクレオチド配列は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０２２９】
この態様の方法に従って植物にて修飾されてもよい形質の特定の非限定例として、栄養的品質（種子もしくは子実の品質特性および／または植物の栄養部分の栄養もしくは嗜好品質を含む）；ストレス耐性、例えば乾燥または耐塩性などの非生物的ストレス耐性；植物収量（種子もしくは子実の収量および／または植物の栄養部分の収量を含む）；成長力；植物の丈；および種子または子実の休眠性；疾患への耐性などの生物的ストレス耐性；ならびに栄養素の使用および／または効率、が挙げられる。耐病性は、ウイルス、細菌、真菌、線虫、および／または昆虫耐性を含んでもよい。
【０２３０】
形質が、形態学的形質、例えば改善された修飾特性、または果実、葉、もしくは任意の他の植物部分の望ましい形状であってもよいことはさらに理解されるであろう。
例えば医薬品および／または栄養補助食品の生産との関連で、特定の所望される作用物質を発現するための植物の遺伝子内形質転換が形質改善と考えられ得ることはさらに理解されるであろう。
【０２３１】
好ましい一実施形態では、形質は、耐病性形質である。
好ましい一実施形態では、形質は、非生物的ストレス耐性形質である。
好ましい一実施形態では、形質は、栄養的および／または嗜好品質形質である。
【０２３２】
好ましい一実施形態では、形質は、形態学的形質である。
この態様の特定の好ましい実施形態では、植物の形質は、比較的改善または増強されるか、あるいは、１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子の発現により陽性に改変される。実施例を参照すると、この態様の方法に従うＤＲＥＢ１Ａの発現が非生物的ストレス耐性、特に耐塩性を付与し得ることが実証されている。
【０２３３】
この態様の特定の好ましい実施形態では、植物の形質は、比較的改善または増強されるか、あるいは、スモールＲＮＡ配列である遺伝子構築物の１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の発現により陽性に改変される。
【０２３４】
好ましいかかる実施形態では、植物における耐病性が改善または増強され、ここで前記スモールＲＮＡ配列は、植物病原体の１つ以上の核酸の発現、翻訳および／または複製を改変する能力がある。
【０２３５】
限定はされないが、植物病原体の１つ以上の核酸の発現および／または複製を改変する能力がある１つ以上のスモールＲＮＡ配列の発現が、この態様の遺伝的に改善された植物における耐病性を、植物の感染を促進する植物病原体の遺伝子または非タンパク質コード配列の発現を減弱させ、阻害し、または除去することにより、相対的に改善または増強し得ることは理解されるであろう。
【０２３６】
限定はされないが、植物病原体の１つ以上の核酸の発現および／または複製を改変する能力がある１つ以上のスモールＲＮＡ配列の発現が、この態様の遺伝的に改善された植物における耐病性を、植物における植物病原体の複製または生殖を減弱させ、阻害し、または除去することにより、相対的に改善または増強し得ることはさらに理解されるであろう。
【０２３７】
特定の好ましい実施形態では、植物病原体は、植物ウイルス病原体である。
好ましい一実施形態では、植物ウイルスの１つ以上の核酸の発現および／または複製を改変する能力がある１つ以上のスモールＲＮＡ配列の発現により、植物における植物ウイルスの複製を減弱させ、阻害し、または除去することができる。
【０２３８】
特定の特に好ましい実施形態では、植物ウイルス病原体は、キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）および／またはトマト黄化えそ病ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＳＷＶ）などのトマトウイルスである。特定の特に好ましい実施形態では、植物ウイルス病原体は、ムギ類ウイルス、例えばモロコシのウイルスまたはイネウイルスである。これらの実施形態に従う特に好ましいムギ類植物ウイルスは、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス（Ｍａｉｚｅ  ｄｗａｒｆ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＤＭＶ）、サトウキビモザイクウイルス（Ｓｕｇａｒｃａｎｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＣＭＶ）、およびセイバンモロコシモザイクウイルス（Ｊｏｈｎｓｏｎｇｒａｓｓ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＪＧＭＶ）を含む。
【０２３９】
特定の好ましい実施形態では、植物病原体は、細菌植物病原体である。特に好ましいかかる実施形態では、細菌植物病原体は、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）である。
【０２４０】
特定の実施形態では、植物病原体は、真菌植物病原体である。真菌植物病原体は、生体栄養性、死体栄養性、または半生体栄養性の真菌植物病原体であってもよい。
他の実施形態では、植物の形質は、スモールＲＮＡ配列である遺伝子構築物の１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の発現により、改善されるか、増強されるか、あるいは、陽性に改変されてもよく、ここでスモールＲＮＡ配列は、植物における内因性遺伝子の発現を低減するか、阻害するか、または除去する。
【０２４１】
特定の好ましいかかる実施形態では、形質は、栄養的および／または嗜好性形質である。実施例を参照すると、この態様の方法に従う方法を用いる香り米の作製が探索中であることは理解されるであろう。
【０２４２】
特定の好ましいかかる実施形態では、形質は、形態学的形質である。実施例を参照すると、この態様の方法に従う方法を用いる「心臓形」トマトの作製が探索中であることは理解されるであろう。
【０２４３】
代替的な選択方法
この態様の方法の特定の好ましい実施形態では、選択可能マーカである本発明の遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列の発現が、上記の通り、ステップ（ｉｉ）に従う遺伝的に改善された植物の選択的成長を容易にするが、追加的または代替的には、別の選択構築物が、別の選択可能マーカを含む、ステップ（ｉ）で包含され得ることは理解されるであろう。
【０２４４】
非限定例として、好適なかかる選択可能マーカは、カナマイシンおよびジェネテシン／Ｇ４１８耐性（ｎｐｔＩＩ；レイナーツ（Ｒａｙｎａｅｒｔｓ）ら著、「植物分子生物学マニュアル（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ａ９：１−１６．ゲルビン（Ｇｅｌｖｉｎ）およびシルペルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）編（クルーワー、ドルトレヒト、１９８８）、ビアラホス／ホスフィノトリシン耐性（ｂａｒ；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら著、１９８７年、欧州分子生物学機構ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第６巻、ｐ．１５８９）、ストレプトマイシン耐性（ａａｄＡ；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら著、１９８７年、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、第２１０巻、ｐ．８６）パロモマイシン耐性（マウロ（Ｍａｕｒｏ）ら著、１９９５年、プラント・サイエンス（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．）、第１１２巻、ｐ．９７）、β−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ；ヴァンカネイト（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ）ら著、１９９０年、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、第２２０巻、ｐ．２４５）およびハイグロマイシン耐性（ｈｍｒまたはｈｐｔ；ワルドロン（Ｗａｌｄｒｏｎ）ら著、１９８５年、プラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第５巻、ｐ．１０３；パール（Ｐｅｒｌ）ら著、１９９６年、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、第１４巻、ｐ．６２４）を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩを含んでもよい。
【０２４５】
上記の通り、植物に由来しないかまたは由来し得ないヌクレオチド配列を含む別の選択可能マーカの使用を含む好ましい実施形態では、該方法は、前記ヌクレオチド配列を遺伝子材料中に含まない植物の最終的な選択をもたらすさらなるステップを含む。
【０２４６】
加えて、ステップ（ｉｉ）に従う遺伝的に改善された植物の選択が選択可能マーカの使用を必ずしも必要としないことは理解されるであろう。
例えば、この態様に従って作製された遺伝的に改善された植物の選択は、様々な当業者の公知の方法のいずれかを用いての本発明の遺伝子構築物のヌクレオチド配列またはその断片の植物の遺伝子材料中での存在についてのスクリーニングにより実施されてもよい。非限定例として、サザンハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲが用いて、適切なヌクレオチド配列に特異的なプライマーを用いることにより、この態様に従って遺伝的に改善された植物の遺伝子材料に挿入された遺伝子構築物のＤＮＡまたはその断片を検出してもよい。
【０２４７】
さらに、遺伝子構築物が１つ以上のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む実施形態では、この態様に従って作製された遺伝的に改善された植物の選択は、例えば、
（ｉ）参照により本明細書に援用される、「分子生物学における現在のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）」、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９９５年）の１１．２章に記載のようなＥＬＩＳＡにおける；または
（ｉｉ）参照により本明細書に援用される、「タンパク質科学における現在のプロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ）」、コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９９７年）の１２章に記載のようなウエスタンブロッティングおよび／または免疫沈降による、
前記タンパク質に特異的な抗体を用いることによる、植物における前記ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現についてのスクリーニングにより実施されてもよい。
【０２４８】
上記のようなタンパク質に基づく技術はまた、参照により本明細書に援用される、「植物分子生物学：実験室マニュアル（ＰＬＡＮＴ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、上記の４．２章に見出すことができる。
【０２４９】
遺伝子構築物が１つ以上の発現用のヌクレオチド配列を含む実施形態では、この態様の方法に従って作製された遺伝的に改善された植物の選択が、前記核酸の発現についてのスクリーニング、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（定量ＲＴ−ＰＣＲを含む）、ノーザンハイブリダイゼーション、および／またはマイクロアレイ分析により実施されてもよいことも理解されるであろう。
【０２５０】
ＲＮＡ単離およびノーザンハイブリダイゼーション法の例として、当業者は、参照により本明細書に援用される、「植物分子生物学：実験室マニュアル（ＰＬＡＮＴ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、上記の３章を参照する。サザンハイブリダイゼーションは、例えば、参照により本明細書に援用される、「植物分子生物学：実験室マニュアル（ＰＬＡＮＴ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、上記の１章に記載される。
【０２５１】
本明細書に記載のような選択可能マーカが、植物形質転換の間、陽性形質転換体の数を増加させるために有利であり得る一方で、ＰＣＲおよび他のハイスループット型システム（例えば、マイクロアレイ、ハイスループット配列決定）による遺伝的に改善された植物の同定が、多数の試料が容易に試験可能である理由で、選択可能マーカの使用を伴わずに遺伝的に改善された植物の選択を可能にし得ることは容易に理解されるであろう。
【０２５２】
非限定例として、ＰＣＲは、導入遺伝子またはその一部に特異的なプライマーを用いて数千の試料に対して実施されてもよく、増幅されたＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動により分離され、マルチウェルプレート上にコーティングされ、かつ／または膜上にドットブロットし、好適なプローブ、例えば遺伝的に改善された植物を同定するための放射性および蛍光プローブを含む本明細書に記載のプローブとハイブリダイズされてもよい。
【０２５３】
本発明の関連態様は、前述の態様の方法に従って作製される遺伝的に改善された植物を提供する。好ましくは、前記植物は、対応する野生型植物に対して改変または修飾された形質を有する。
【０２５４】
実施形態では、この態様に従う植物、または一つ前の態様に従う遺伝的に改善された植物は、上記のようなベシタブリア（Ｖｅｇｅｔａｂｉｌｉａ）という分類の生物である。
好ましい実施形態では、前記植物は、上記のようなアーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）という分類の生物である。
【０２５５】
より好ましくは、前記植物は、上記のような緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）という分類の生物である。
さらにより好ましくは、前記植物は、上記のような有胚植物（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）という分類の生物である。
【０２５６】
一部の実施形態では、植物は、微細藻類および大型海藻を含む藻類である。
一部の実施形態では、植物は、マッシュルームを含む食用菌類である。
好ましくは、植物は、単子葉植物または双子葉植物である。
【０２５７】
より好ましくは、前記植物は、サトウキビなどのイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）ファミリーの草；綿などのワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）種；イチゴなどのベリー；リンゴおよびオレンジなどの果樹ならびにアーモンドなどの堅果類を含む樹種；バラなどのバラ科植物を含む、観賞顕花植物などの観賞植物；ブドウなどのブドウ果実を含むブドウ；ソルガム、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、およびトウモロコシを含む穀類；大豆などのマメおよびピーナッツを含むマメ科種；トマトおよびジャガイモを含むナス科種；キャベツおよびオリエンタルマスタードを含むアブラナ科種；カボチャおよびズッキーニを含むウリ科植物；バラを含むバラ科植物；レタス、チコリー、およびヒマワリを含むキク科植物、または前述の植物のいずれかの近縁種である。
【０２５８】
一部の特に好ましい実施形態では、前記植物は、トマトまたはトマトの近縁種である。
一部の特に好ましい実施形態では、前記植物は、ソルガムまたはソルガムの近縁種である。
【０２５９】
一部の特に好ましい実施形態では、前記植物は、イネまたはイネの近縁種である。
（実施例）
実施例１．好ましい遺伝子構築物およびベクター
本実施例は、本発明のために設計している特定の好ましい遺伝子構築物、およびこれらの遺伝子構築物を含む好ましいベクターの詳細を示す。
【０２６０】
これらの好ましい遺伝子構築物およびベクターは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換を介して植物の遺伝子修飾を促進するように設計しており、ここでは１つ以上の植物に由来する複数のヌクレオチド配列からなる遺伝子構築物の断片を植物の遺伝子材料に挿入する。１つ以上の植物に由来する前記複数のヌクレオチド配列は、少なくとも２０のヌクレオチド配列長である。しかし、本明細書に記載の遺伝子構築物および／またはベクターを用いる植物形質転換においては、直接遺伝子導入（例えば、微粒子銃の使用による）もまた用いることができることは容易に理解されるであろう。
【０２６１】
基本的なクローニング構築物およびベクター：トマト
１つの好ましい遺伝子構築物、およびこの遺伝子構築物を含むベクター（ｐＩｎｔＲ  ２）の模式図を図１に示す。この遺伝子構築物の完全ヌクレオチド配列を配列番号１で示す。ベクターの完全ヌクレオチド配列を配列番号４７で示す。
【０２６２】
図１で示すベクターの骨格配列は、バイナリーベクターｐＡｒｔ２７の骨格配列である。
遺伝子構築物は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲＢ配列に属する第１の境界配列；アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢ配列に属する第２の境界配列；ならびにＲＢ配列とＬＢ配列との間に位置する複数の追加的配列を含む。追加的ヌクレオチド配列ならびにＲＢ配列およびＬＢ配列の各々の一部は、培養トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）に由来する。
【０２６３】
トマト由来のＲＢ配列の一部は、配列番号２で示す配列を含む、遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列に隣接したＲＢ配列の３ヌクレオチドである。トマト由来のＬＢ配列の一部は、配列番号３で示す配列を含む、追加的ヌクレオチド配列に隣接した第２の境界配列の３ヌクレオチドである。
【０２６４】
遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列は、
（ｉ）ＬＢ配列に隣接して位置する、トマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のプロモータに属する配列番号４で示す制御配列；
（ｉｉ）ＲＢ配列に隣接して位置する、トマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のターミネータに属する配列番号８で示す制御配列；
（ｉｉｉ）スペーサ配列
を含む。
【０２６５】
ＬＢ配列の３ヌクレオチド部分が（ｉ）のトマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のプロモータ配列の断片であり、ＬＢ配列のこの部分および（ｉ）が単一の植物由来ヌクレオチド配列に属することは理解されるであろう。
【０２６６】
同様に、ＲＢ配列の３ヌクレオチド部分が（ｉｉ）のトマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のターミネータ配列の断片であり、ＲＢ配列のこの部分および（ｉｉ）が単一の植物由来ヌクレオチド配列に属することは理解されるであろう。
【０２６７】
遺伝子構築物のスペーサ配列は、ＬＢ配列に隣接して位置する（ｉ）のプロモータヌクレオチド配列の「拡張された」部分の形態である。（ｉ）のヌクレオチド配列は、このスペーサ配列の切断が（ｉ）のプロモータ機能を実質的に傷つけないように設計している。
【０２６８】
この例の遺伝子構築物は、制限酵素部位ＳｐｅＩ、ＰｍｉＩ、ＰｃｉＩ、およびＮｓｉＩをさらに含む。制限酵素部位ＳｐｅＩは、ＲｂｃＳ３Ｃターミネータ配列に属し；制限酵素部位ＮｓｉＩは、ＲｂｃＳ３Ｃプロモータ配列に属する。制限酵素部位ＰｃｉＩは、ＲｂｃＳ３Ｃプロモータ配列とＲｂｃＳ３Ｃターミネータ配列との間に位置するヌクレオチド配列ＧＴＧＣＧＣＡＣＡＴＧ（配列番号６３）に属する。制限酵素部位ＰｍｌＩは、ＲｂｃＳ３Ｃターミネータ配列のヌクレオチド配列の３塩基対（ＣＡＣ）および配列番号６３の３塩基対（ＧＴＧ）から形成される。
【０２６９】
この遺伝子構築物に示す配列番号６３が、必ずしも１つ以上の植物に由来するかまたは由来し得る必要がないことは理解されるであろう。むしろ、この例の遺伝子構築物に示す配列番号６３の配列および位置は、トマトまたはトマトの近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列の、この例の遺伝子構築物への導入を、上記のＰｍｌＩおよびＰｃｉＩ制限酵素部位を用いた消化およびライゲーションにより容易にするように設計している。
【０２７０】
ＰｍｌＩおよびＰｃｉＩ制限部位を用いた消化およびライゲーション、ならびにトマトまたはトマトの野生近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列の挿入の後、配列番号６３が遺伝子構築物から除去されることは理解されるであろう。
【０２７１】
好適には、トマトまたはトマトの野生近縁種に由来する前記１つ以上のヌクレオチド配列の遺伝子構築物への導入後、本実施例の遺伝子構築物の断片は、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、前記断片は、
（ｉ）トマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のプロモータ配列の断片であるＬＢ配列の３ヌクレオチド部分；
（ｉｉ）ＬＢ配列に隣接して位置する、トマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のプロモータ；
（ｉｉｉ）遺伝子構築物に導入される、トマトまたはトマトの野生近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列；
（ｉｖ）ＲＢ配列に隣接して位置する、トマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のターミネータ；および
（ｖ）トマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のターミネータ配列の断片であるＲＢ配列の一部
からなる。
【０２７２】
本発明の別の好ましい遺伝子構築物の模式図を図１８に示す。この遺伝子構築物（ｐＩｎｔｒＡ）の完全ヌクレオチド配列を配列番号６７で示す。
ｐＩｎｔＲ  ２と同様、ｐＩｎｔｒＡにおけるベクターの骨格配列は、バイナリーベクターｐＡｒｔ２７の骨格配列である。それは、ＲＢおよびＬＢ内部のセグメントをブランクｐＡｒｔ２７からＡｓｅＩ酵素で除去し（一部の反復制限酵素部位を除去し）、残存部分を再ライゲートし、ＢｂｖＣＩおよび（ここで固有）ＳｐｈＩ部位の間の断片を、骨格の除去部分、ＲＢ、ＬＢならびにトマトＡＣＴＩＮ７プロモータおよびターミネータとともに、それらの間のクローニング部位ＨｐａＩおよびＰｍｌＩを含む合成された配列と置換することによって開発した。ｐａｒｔｉａｌ  ＡＣＴＩＮ７プロモータとｐａｒｔｉａｌ  ＡＣＴＩＮ７ターミネータとの間にクローニング部位を作成するために付加されるヌクレオチドを含む合成された断片の配列を配列番号６７で示す。
【０２７３】
この遺伝子構築物は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲＢ配列に属する第１の境界配列；アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢ配列に属する第２の境界配列；ならびにＲＢ配列とＬＢ配列との間に位置する複数の追加的配列を含む。追加的ヌクレオチド配列ならびにＲＢ配列およびＬＢ配列の各々の一部は、培養トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）に由来する。
【０２７４】
トマト由来のＲＢ配列の一部は、配列番号２で示す配列を含む、遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列に隣接したＲＢ配列の３ヌクレオチドである。トマト由来のＬＢ配列の一部は、配列番号３で示す配列を含む、追加的ヌクレオチド配列に隣接した第２の境界配列の５ヌクレオチドである。
【０２７５】
遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列は、
（ｉ）ＬＢ配列に隣接して位置する、トマトＡＣＴＩＮ７遺伝子のプロモータに属する制御配列；
（ｉｉ）ＲＢ配列に隣接して位置する、トマトＡＣＴＩＮ７遺伝子のターミネータに属する制御配列；
（ｉｉｉ）スペーサ配列
を含む。
【０２７６】
ＬＢ配列の５ヌクレオチド部分が（ｉ）のトマトＡＣＴＩＮ７遺伝子のプロモータ配列の断片であり、ＬＢ配列のこの部分および（ｉ）が単一の植物由来ヌクレオチド配列に属することは理解されるであろう。
【０２７７】
同様に、ＲＢ配列の３ヌクレオチド部分が（ｉｉ）のトマトＡＣＴＩＮ７遺伝子のターミネータ配列の断片であり、ＲＢ配列のこの部分および（ｉｉ）が単一の植物由来ヌクレオチド配列に属することは理解されるであろう。
【０２７８】
遺伝子構築物のスペーサ配列は、ＬＢ配列に隣接して位置する（ｉ）のプロモータヌクレオチド配列の「拡張された」部分の形態である。（ｉ）のヌクレオチド配列は、このスペーサ配列の切断が（ｉ）のプロモータ機能を実質的に傷つけないように設計している。
【０２７９】
この例の遺伝子構築物は、ＡＣＴＩＮ７プロモータ配列とＡＣＴＩＮ７ターミネータ配列との間に位置する制限酵素部位ＨｐａＩおよびＰｍｌＩを含む。制限酵素部位ＨｐａＩはＡＣＴＩＮ７プロモータからの３’塩基対（ＧＴＴ）から形成され、３塩基対（ＡＡＣ）が付加され、それはＤＮＡの制限および望ましいＤＮＡの挿入後に失われる。同様に、制限酵素部位ＰｍｌＩはＡＣＴＩＮ７ターミネータからの５’塩基対（ＧＴＧ）から形成され、３塩基対（ＣＡＣ）が付加され、それはＤＮＡの制限および望ましいＤＮＡの挿入後に失われる。
【０２８０】
本発明の遺伝子構築物に示す配列番号６７におけるＡＣＴＩＮ７プロモータおよびターミネータ間の配列番号６８が、必ずしも１つ以上の植物に由来するかまたは由来し得る必要がないことは理解されるであろう。むしろ、この例の遺伝子構築物に示す配列番号６８の配列および位置は、トマトまたはトマトの近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列の、この例の遺伝子構築物への導入を、上記のＨｐａＩおよびＰｍｌＩ制限酵素部位を用いた消化およびライゲーションにより容易にするように設計している。
【０２８１】
ＨｐａＩおよびＰｍｌＩ制限部位を用いた消化およびライゲーション、ならびにトマトまたはトマトの野生近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列の挿入の後、配列番号６８が遺伝子構築物から除去されることは理解されるであろう。
【０２８２】
好適には、トマトまたはトマトの野生近縁種に由来する前記１つ以上のヌクレオチド配列の遺伝子構築物への導入後、本実施例の遺伝子構築物の断片は、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、前記断片は、
（ｉ）トマトＡＣＴＩＮ７遺伝子のプロモータ配列の断片であるＬＢ配列の５ヌクレオチド部分（配列番号７１）；
（ｉｉ）ＬＢ配列に隣接して位置する、トマトＡＣＴＩＮ７遺伝子のプロモータ；
（ｉｉｉ）遺伝子構築物に導入される、トマトまたはトマトの野生近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列；
（ｉｖ）ＲＢ配列に隣接して位置する、トマトＡＣＴＩＮ７遺伝子のターミネータ；および
（ｖ）トマトＡＣＴＩＮ７遺伝子のターミネータ配列の断片であるＲＢ配列の一部（配列番号７２）
からなる。
【０２８３】
ｐＩｎｔｒＡへの配列のクローニングでは、インサートで補完される必要がある固有の平滑末端クローニング制限酵素部位を用い、それに対してヌクレオチドを、インサートを増幅するために用いるプライマーとともに付加し、またこれらのプライマー、すなわち
フォワードプライマー：５’ＰｈｏｓＧＡＴＴＡＡＡＡ［開始インサート配列］
リバースプライマー：５’ＰｈｏｓＣ［インサート配列の末端の逆相補鎖）
はまた、平滑末端ライゲーションを可能にするため、５’リン酸化を行う必要がある。
【０２８４】
上記のもの（ｐＩｎＲ  ２およびｐＩｎｔｒＡ）のようなＴ−ＤＮＡ構築物は、植物ゲノム内に組み込まれるとき、完全に遺伝子内に存在するようになり（植物ゲノム由来）、その際、ＲＢの５’末端の３塩基のみが組込み後に維持される一方で、ＬＢは、組込みの間に切断されることが多い（隣接する配列の一部を除去することが多い；トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）著、上記）。したがって、隣接プロモータ配列は、たとえ５’末端のプロモータの一部が組込みの間に切断されてもプロモータ機能が損なわれない程度に十分に大規模であるように選択している。
【０２８５】
発現用配列を有する構築物およびベクター：トマト
前記遺伝子構築物を含む別の遺伝子構築物およびベクターの模式図を図２に示す。
図２に示すベクターの骨格配列は、バイナリーベクターｐＡｒｔ２７の骨格配列から修飾し、配列番号５０で示す。修飾したｐＡｒｔ２７骨格配列は、好適なプロモータ配列（例えば、図２に示すようなＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータ配列であるが、これは要望に応じて変化し得る）および好適なターミネータ配列に作動可能に連結された骨格挿入マーカ配列を含む。
【０２８６】
遺伝子構築物は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲＢ配列に属する第１の境界配列；アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢ配列に属する第２の境界配列；ならびにＲＢ配列とＬＢ配列との間に位置する複数の追加的配列を含む。追加的ヌクレオチド配列ならびにＲＢ配列およびＬＢ配列の各々の一部は、培養トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）または培養トマトの野生近縁種であるソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）に由来する。
【０２８７】
トマト由来のＲＢ配列の一部は、配列番号２で示す配列を含む、遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列に隣接したＲＢ配列の３ヌクレオチドである。トマト由来のＬＢ配列の一部は、配列番号３で示す配列を含む、追加的ヌクレオチド配列に隣接した第２の境界配列の３ヌクレオチドである。
【０２８８】
遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列は、
（ｉ）ＬＢ配列に隣接して位置しかつ（ｉｉ）と作動可能に連結された、トマトＣｙＰ４０遺伝子のプロモータ配列に属する配列番号７で示す制御ヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）ＡＮＴ１アントシアニン遺伝子に属する配列番号３５で示す選択可能マーカヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）と作動可能に連結された、トマトＣｙＰ４０遺伝子のターミネータに属する配列番号１１で示す制御配列；
（ｉｖ）（ｖ）と作動可能に連結された、トマトＡＣＴＩＮ遺伝子のプロモータ配列に属する配列番号５で示す制御ヌクレオチド配列；
（ｖ）トマトベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子に属する配列番号２７で示す選択可能マーカヌクレオチド配列；
（ｖｉ）（ｖ）と作動可能に連結された、トマトＡＣＴＩＮ遺伝子のターミネータに属する配列番号９で示す制御ヌクレオチド配列；
（ｖｉｉ）（ｖｉｉｉ）と作動可能に連結された、トマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のプロモータに属する配列番号４で示す制御ヌクレオチド配列；
（ｖｉｉｉ）植物ウイルスの１つ以上の核酸の発現および／または複製を修飾する能力がある１つ以上のスモールＲＮＡヌクレオチド配列を含む発現用のヌクレオチド配列；
（ｉｘ）ＲＢ配列に隣接して位置しかつ（ｖｉｉｉ）と作動可能に連結された、トマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のターミネータ配列に属する配列番号８で示す制御ヌクレオチド配列
を含む。
【０２８９】
ＬＢ配列の３ヌクレオチド部分が（ｉ）のトマトＣｙＰ４０遺伝子のプロモータ配列の断片であり、ＬＢ配列のこの部分および（ｉ）が単一の植物由来ヌクレオチド配列に属することは理解されるであろう。
【０２９０】
同様に、ＲＢ配列の３ヌクレオチド部分が（ｉｘ）のトマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のターミネータ配列の断片であり、ＲＢ配列のこの部分および（ｉｘ）が単一の植物由来ヌクレオチド配列に属することは理解されるであろう。
【０２９１】
（ｉ）の配列は、ＣｙＰ４０プロモータ配列の実質的切断が（ｉ）のプロモータ機能を除去するかまたは実質的に損なわせることになり、ソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）ＡＮＴ１アントシアニン遺伝子に属する選択可能マーカ配列（ｉｉ）の発現を駆動する（ｉ）の能力が除去されるかまたは実質的に低減されるように設計している。
【０２９２】
ＬＢおよびＲＢ配列の上記の３ヌクレオチド部分、ならびにそれらの間のすべての配列からなる本実施例の遺伝子構築物の断片が、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）またはソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）に由来する少なくとも２０のヌクレオチド配列長の複数のヌクレオチド配列からなることは理解されるであろう。
【０２９３】
発現用配列を有する構築物およびベクター：一般
さらに別の好ましい遺伝子構築物、および前記遺伝子構築物を含む好ましいベクターの模式図を図３に示す。
【０２９４】
遺伝子構築物を含む好ましいベクターは、骨格配列をさらに含む。骨格配列は、好適なプロモータ配列（例えば、図３に示すようなＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータ配列であるが、これは要望に応じて変化し得る）および好適なターミネータ配列（例えば、図３に示すようなＯＣＳターミネータであるが、これは要望に応じて変化し得る）に作動可能に連結された骨格挿入マーカ配列を含む。図３に示すように、骨格挿入マーカはバルナーゼ自殺遺伝子であるが、これは要望に応じて変化し得る。
【０２９５】
図３に示すベクターの遺伝子構築物は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲＢ配列に属する第１の境界配列；アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢ配列に属する第２の境界配列；ならびにＲＢ配列とＬＢ配列との間に位置する複数の追加的配列を含む。
【０２９６】
追加的ヌクレオチド配列ならびにＲＢ配列およびＬＢ配列の各々の一部は、１つ以上の植物に由来する。前記植物は、任意の好適な植物であり得る。追加的配列が複数の植物に由来する実施形態では、好適には、前記植物は異種交配可能である。
【０２９７】
植物に由来するＲＢ配列の一部は、遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列に隣接する。植物に由来するＬＢ配列の一部は、遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列に隣接する。
【０２９８】
遺伝子構築物の追加的ヌクレオチド配列は、
（ｉ）（ｉｉ）と作動可能に連結されたプロモータに属する制御ヌクレオチド配列；
（ｉｉ）選択可能マーカ配列。図３に示すように、前記選択可能マーカ配列はアントシアニン遺伝子に属するが、これは要望に応じて変化し得る；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）と作動可能に連結されたターミネータに属する制御配列；
（ｉｖ）（ｖ）と作動可能に連結された、プロモータに属するさらなる制御ヌクレオチド配列；
（ｖ）好ましくは（ｉｉ）の配列と異なる、さらなる選択可能マーカ配列；
（ｖｉ）（ｖ）と作動可能に連結された、ターミネータに属する制御ヌクレオチド配列；
（ｖｉｉ）（ｖｉｉｉ）と作動可能に連結されたプロモータに属する制御ヌクレオチド配列；
（ｖｉｉｉ）植物の形質を改変または修飾するための植物における発現に適した発現用の１つ以上のヌクレオチド配列；
（ｉｘ）（ｖｉｉｉ）と作動可能に連結されたターミネータに属する制御ヌクレオチド配列
を含む。
【０２９９】
任意選択的には、１つ以上の植物に由来するＬＢ配列の一部は、（ｉ）のプロモータ配列の断片であり、ＬＢ配列のこの部分および（ｉ）は、単一の植物由来ヌクレオチド配列に属する。
【０３００】
任意選択的には、１つ以上の植物に由来するＲＢ配列の一部は、（ｉｘ）のターミネータ配列の断片であり、ＬＢ配列のこの部分および（ｉｉ）は、単一の植物由来ヌクレオチド配列に属する。
【０３０１】
（ｉ）の配列は、（ｉ）のプロモータ配列の実質的切断が（ｉ）のプロモータ機能を除去するかまたは実質的に損なわせることになり、選択可能マーカ配列（ｉｉ）の発現を駆動する（ｉ）の能力が除去されるかまたは実質的に低減されることになるように設計する必要がある。
【０３０２】
好適には、１つ以上の植物に由来するＬＢおよびＲＢ配列の上記部分、およびそれらの間のすべての配列からなる本実施例の遺伝子構築物の少なくとも断片は、（ａ）１つの植物；または（ｂ）２つ以上の異種交配可能な植物に由来する少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる。
【０３０３】
本実施例で示すような遺伝子構築物は、１つ以上の植物に由来する少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる遺伝子構築物の断片（またはその一部）が植物の遺伝子材料に挿入されるような植物の形質転換に用いるように設計し、ここで形質転換された植物は、遺伝子構築物の前記断片のヌクレオチド配列の由来元の１つ以上の植物と同じか、またはそれらと異種交配可能である。
【０３０４】
発現用配列を有する構築物およびベクター：ソルガム
ソルガム形質転換のための好ましい方法は、微粒子銃を用いる直接遺伝子導入による。ソルガムゲノム由来の配列のみを用いることを保証するため、直接遺伝子導入における直鎖状ＤＮＡ断片が微粒子銃に先立ち容易に切除できる場合でベクターを用いる。かかる好ましい遺伝子構築物（ｐＳｂｉＵｂｉ１）の模式図を図２１に示す。この遺伝子構築物の完全ヌクレオチド配列を配列番号７３で示す。
【０３０５】
このベクターの骨格配列は、ベクターｐＫａｎｎｉｂａｌの骨格配列である。それは、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｏｃｏｌｏｒ）ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ１遺伝子（Ｓｏｂｉｃ．００４Ｇ０４９９００）のプロモータ配列およびモロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｏｃｏｌｏｒ）ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ２遺伝子（Ｓｏｂｉｃ．００４Ｇ０５００００）のターミネータを含む。それは、プライマーＦ  ５’Ｐｈｏｓ  ｃｃｔｃａｃＧＴＧＴＴＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣ（配列番号１２６）（直接遺伝子導入前に遺伝子内カセットの切除を可能にするためのブラントカッター部位ＰｍｌＩを作成するため、プロモータの開始部位（ｓｔａｒｔ）に３ヌクレオチドを付加する）およびＲ  ｔｃｃＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＧＧＴ（配列番号１２５）を用いてソルガムｇＤＮＡから増幅したＵｂｉ１プロモータの３’末端の天然ＰｓｔＩ部位を利用することにより開発した。断片をＰｓｔＩで消化し、ＳｔｕＩおよびＰｓｔＩで切り出したベクターｐＫａｎｎｉｂａｌにライゲートした。ターミネータＵｂｉ１を、プライマーＦ  ｔｃｃＣＴＧＣＡＧｃｇｃｔａｇｇｃＧＣＣＡＴＡＧＧＴＣＧＴＴＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧ（配列番号１２７）（ブラントカッタークローニング部位ＳｆｏＩを作成するため、ターミネータの開始部位に３ヌクレオチドを付加する）およびＲ  ｔｃｃＣＡＣＴＡＧＴｃａｃＧＴＧＴＡＴＡＧＣＡＣＡＡＴＧＣＡＴＧＡＴＣＴＴＧＣＴ（配列番号１２８）（遺伝子内カセットの切除用のブラントカッター部位ＰｍｌＩ、および先行するベクターへの挿入用のＳｐｅＩ部位を作成するため、ターミネータの末端に３ヌクレオチドを付加する）を用いて増幅した。断片をＰｓｔＩおよびＳｐｅＩで消化し、同じ酵素で切り出した２つの先行的に得られた中間体ベクターにライゲートした。
【０３０６】
このベクター（ｐＳｂｉＵｂｉ１）は、インサートをプライマーＦ  ＣＴＧＣＡＧ［インサート配列の開始部位］およびＲ  ５’Ｐｈｏｓ［インサート配列の末端の逆相補鎖］を用いて増幅することにより、ソルガムにおける目的の配列を発現するのに好適である。次に、断片をＰｓｔＩで消化し、ＰｓｔＩおよびＳｆｏＩ制限酵素で切り出したｐＳｂｉＵｂｉ１にライゲートする。
【０３０７】
切除後、直接遺伝子導入のための配列が植物由来のヌクレオチド配列からなることは理解されるであろう。
ＰｓｔＩおよびＳｆｏＩ制限部位を用いた消化およびライゲーション、ならびにソルガムまたはソルガムの野生近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列の挿入の後、配列番号７５のスペーサが遺伝子構築物から除去されることは理解されるであろう。
【０３０８】
好適には、ソルガムまたはソルガムの野生近縁種に由来する前記１つ以上のヌクレオチド配列の遺伝子構築物への導入後、本実施例の遺伝子構築物の断片は、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、ここで前記断片は、
（ｉ）ソルガムＵＢＩＱＵＩＴＩＮ１遺伝子のプロモータ、
（ｉｉ）遺伝子構築物に導入される、ソルガムまたはソルガムの野生近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）ソルガムＵＢＩＱＵＩＴＩＮ１遺伝子のターミネータ
からなる。
【０３０９】
別の好ましい遺伝子構築物（ｐＳｂｉＵｂｉ２）の模式図を図２２に示す。この遺伝子構築物の完全ヌクレオチド配列を配列番号７４で示す。
このベクターの骨格配列は、ベクターｐＫａｎｎｉｂａｌの骨格配列である。それは、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｏｃｏｌｏｒ）ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ２遺伝子（Ｓｏｂｉｃ．００４Ｇ０５００００）のプロモータおよびターミネータ配列を含む。それは、プライマーＦ  ５Ｐｈｏｓ／ｃｃｔｃａｃＧＴＧＡＧＧＣＣＣＧＴＡＴＡＧＡＴＧＴＡＧＴＴＡＡＡＴＡＧＣＴＡＡＡ（配列番号１２９）（遺伝子内カセットの切除を可能にするためのブラントカッター部位ＰｍｌＩを作成するため、プロモータの開始部位に３ヌクレオチドを付加する）およびＲ  ｔｃｃＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＣＣＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧ（配列番号１３０）を用いてソルガムｇＤＮＡから増幅したＵｂｉ２プロモータの３’末端の天然ＰｓｔＩ部位を利用することにより開発した。断片をＰｓｔＩで消化し、ＳｔｕＩおよびＰｓｔＩで消化したベクターｐＫａｎｎｉｂａｌにライゲートした。ｐＳｂｉＵｂｉ１について上記の通り、ターミネータＵｂｉ１を増幅し、クローン化した。
【０３１０】
このベクター（ｐＳｂｉＵｂｉ２）は、インサートをプライマーＦ  ＣＴＧＣＡＧ［インサート配列の開始部位］およびＲ  ５’Ｐｈｏｓ［インサート配列の末端の逆相補鎖］を用いて増幅することにより、ソルガムにおける目的の配列を発現するのに好適である。次に、断片をＰｓｔＩで消化し、ＰｓｔＩおよびＳｆｏＩ制限酵素で切り出したｐＳｂｉＵｂｉ１にライゲートする。
【０３１１】
切除後、直接遺伝子導入のための配列が植物由来のヌクレオチド配列からなることは理解されるであろう。
ＰｓｔＩおよびＳｆｏＩ制限部位を用いた消化およびライゲーション、ならびにソルガムまたはソルガムの野生近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列の挿入の後、配列番号７５のスペーサが遺伝子構築物から除去されることは理解されるであろう。
【０３１２】
好適には、ソルガムまたはソルガムの野生近縁種に由来する前記１つ以上のヌクレオチド配列の遺伝子構築物への導入後、本実施例の遺伝子構築物の断片は、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、ここで前記断片は、
（ｉ）ソルガムＵＢＩＱＵＩＴＩＮ２遺伝子のプロモータ、
（ｉｉ）遺伝子構築物に導入される、ソルガムまたはソルガムの野生近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）ソルガムＵＢＩＱＵＩＴＩＮ１遺伝子のターミネータ
からなる。
【０３１３】
発現用配列を有する構築物およびベクター：イネ
イネ形質転換のための好ましい方法は、微粒子銃を用いる直接遺伝子導入による。イネゲノム由来の配列のみを用いることを保証するため、直接遺伝子導入における直鎖状ＤＮＡ断片が微粒子銃に先立ち容易に切除できる場合でベクターを用いる。かかる好ましい遺伝子構築物（ｐＯｓａＡＰＸ）の模式図を図２３に示す。この遺伝子構築物の完全ヌクレオチド配列を配列番号７６で示す。
【０３１４】
このベクターの骨格配列は、ベクターｐＵＣ５７−ＫＡＮの骨格配列である。それは、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ＡＰＸ遺伝子のプロモータおよびターミネータ配列を含む。それは、配列番号７６の合成された配列をｐＵＣ５７−ＫＡＮの切断Ｅｃｏ５３ｋＩ部位にライゲートすることにより開発した。ＡＰＸ遺伝子プロモータは、植物全体を通じてのその構成および葉におけるその強力な発現を意図して選択した。
【０３１５】
このベクター（ｐＯｓａＡＰＸ）は、インサートをプライマーＦ  ＧＡＧＣＴＣ［インサート配列の開始部位］およびＲ  ５’Ｐｈｏｓ［インサート配列の末端の逆相補鎖］を用いて増幅することにより、イネにおける目的の配列を発現するのに好適である。次に、断片をＳａｃＩ（またはＥｃｏ５３ｋＩ）で消化し、ＳａｃＩ（またはＥｃｏ５３ｋＩ）およびＰｓｉＩＩ制限酵素で切り出したｐＯｓａＡＰＸ１にライゲートする。
【０３１６】
切除後、直接遺伝子導入のための配列が植物由来のヌクレオチド配列からなることは理解されるであろう。
ＳａｃＩ（またはＥｃｏ５３ｋＩ）およびＰｓｉＩ制限部位を用いた消化およびライゲーション、ならびにイネまたはイネの野生近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列の挿入の後、配列番号７７のスペーサが遺伝子構築物から除去されることは理解されるであろう。
【０３１７】
好適には、イネまたはイネの野生近縁種に由来する前記１つ以上のヌクレオチド配列の遺伝子構築物への導入後、本実施例の遺伝子構築物の断片は、１つ以上の植物に由来する、少なくとも１５、または好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、ここで前記断片は、
（ｉ）イネＡＰＸ遺伝子のプロモータ、
（ｉｉ）遺伝子構築物に導入される、イネまたはイネの野生近縁種に由来する１つ以上のヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）イネＡＰＸ遺伝子のターミネータ
からなる。
【０３１８】
実施例２．本発明の遺伝子構築物において用いられる制御配列の評価
遺伝子内制御配列、例えばプロモータおよびターミネータの使用は、植物において所望される発現を達成するのに重要である。例えば、これは、植物全体を通じての強力な構成的発現、様々な植物器官または細胞型における発現、特定の発生段階中の発現、および／またはシグナル伝達化合物（例えば植物ホルモン）での誘発時の発現を達成し得る。
【０３１９】
植物全体を通じての特異性および発現パターンは別として、本発明の構築物の好ましい実施形態では、構築物を用いる発現用配列と同じ種または関連種に由来するプロモータおよびターミネータなどの遺伝子内制御配列を選択する。
【０３２０】
さらに、構築物が境界配列を含みかつアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換において最適化される好ましい実施形態では、ＬＢまたはＲＢ配列の一部を含む制御配列を用いる。加えて、構築物がアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換でない形質転換（例えば直接遺伝子導入法）において最適化される好ましい実施形態では、少なくとも部分的な制限部位を含む制御配列を用いることで、任意の周囲の非植物由来配列の不在下で、植物の遺伝子材料に導入されるべき植物由来断片の切除が促進される。
【０３２１】
本発明においては、幾つかのトマト制御配列を、単離し、レポータ遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を用いて試験し、本発明の遺伝子構築物のための制御ヌクレオチド配列としてのそれらの可能性を検討した。
【０３２２】
トマトＲＵＢＩＳＣＯサブユニット３Ｃ（ＲｂｃＳ３Ｃ）遺伝子のプロモータの配列番号４で示すヌクレオチド配列を、同じ遺伝子に属するターミネータの配列番号８で示すヌクレオチド配列と一緒に、トマト葉肉プロトプラストにおけるＧＦＰの一過性発現、およびトマト植物の安定なアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換により試験した。
【０３２３】
汎用されるカリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモータによって駆動される場合に相当する強力なＧＦＰの発現がプロトプラストにおいて得られ、ＲｂｃＳ３Ｃターミネータの機能性を確認した（図４）。安定な形質転換実験の目的の１つが、ＲｂｃＳ３Ｃ駆動発現のパターンを確立することであった。ＲｂｃＳ３Ｃ調節エレメントによって調節された報告される遺伝子の発現が植物の緑色部分に制限されることが仮定された一方で、根、および葉内の一部の細胞型においてＧＦＰ蛍光が認められた（図５）。これは、ＲｂｃＳ３Ｃプロモータの７６３ヌクレオチドのみを用いたという事実によって説明され得る。
【０３２４】
本発明の遺伝子構築物において用いられる他の候補調節エレメントを同定するため、共通のトマトハウスキーピング遺伝子の発現レベルについての情報は、参照により本明細書中に援用される、マシア，Ｔ．（Ｍａｓｃｉａ，Ｔ．）ら著、２０１０年、「分子植物病理学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」、第１１巻、ｐ．８０５から得られた。
【０３２５】
苗条および根双方における最も高度でかつ最も安定な発現を有するものの中で、ＡＣＴＩＮ（ｇｉ４６０３７８６２２）ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ（ｇｉ１９３９６）およびＣＹＣＬＯＰＨＩＬＩＮ（ｇｉ２２５３１２１１６）遺伝子が特に顕著であった。次に、アグロ浸潤されたベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉におけるこれらの調節遺伝子によって駆動されるＧＦＰの一過性発現を実施し、それらの発現を調節する能力を評価した。
【０３２６】
遺伝子の開始コドンの上流の約１０００ヌクレオチドおよび停止コドンの下流の数〜数百ヌクレオチドの配列を、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、トマトゲノムＤＮＡ（栽培品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）から増幅し、ＧＦＰ構築物におけるプロモータおよびターミネータとして用いた。次に、ＧＦＰ発現カセットを、バイナリーベクターｐＡｒｔ２７に挿入し、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミドを宿す大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株を含む三親交配により、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ．ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）株ＧＶ３１０１に導入した。一晩、バイナリーベクターを宿すアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ．ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）培養液を、４０００×ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを、２００ｍＭアセトシリンゴンを添加した１０ｍＭ塩化マグネシウムに再懸濁し、ＯＤ６００を１．０にした。懸濁液を室温で４時間インキュベートし、無針注射器を用いて、４〜６週齢ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の若葉に浸潤させた。
【０３２７】
浸潤後３日後、蛍光顕微鏡を用いて、ＧＦＰの発現が認められた。ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）における葉の一過性アグロインフィルトレーションアッセイにおいて、３つすべてのプロモータ−ターミネータ対がＧＦＰの発現を駆動することができた。ＡＣＴＩＮプロモータにおいては、発現の明るさおよび発現細胞を含有する葉領域の大規模サイズの双方の観点で、最良レベルのＧＦＰ発現が認められた（図６）。別のアグロインフィルトレーション試験では、ＡＣＴＩＮ遺伝子調節エレメントが、明るさおよび均一性の観点で、伝統的に用いられるプロモータと同様に、またはそれより良好に機能する場合、トマトＡＣＴＩＮプロモータ−ターミネータの組み合わせの活性を、トマトＲｂｃＳ３ＣおよびＣａＭＶ  ３５Ｓの場合と比べた（図７）。
【０３２８】
トマトＡＣＴＩＮプロモータおよびＲｂｃＳ３Ｃターミネータについても安定に形質転換された植物において十分に機能するか否かを試験するため、プロモータ−レポータ−ターミネータカセットを構築し、ｐＡｒｔ２７に挿入した。このカセットは、ＡＣＴＩＮ７プロモータ、ＡＮＴ１遺伝子およびＲｂｃＳ３Ｃターミネータを含んだ（ｐＡｒｔ２７  ＡＣＴ：ＡＮＴ１：ＲｂｃＳ３Ｃ  ３５Ｓ：ｎｐｔＩＩ：ＮＯＳ）。このカセットおよびそのベクターの構成は、実施例１に記載しており、図１９に示す。このレポータ遺伝子構築物の配列を配列番号６９で示す。
【０３２９】
次に、トマト植物を、ｐＡｒｔ２７  ＡＣＴ：ＡＮＴ１：ＲｂｃＳ３Ｃ  ３５Ｓ：ｎｐｔＩＩ：ＮＯＳを用いる（スブラマニアン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ）ら著、２０１６年、プラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、第１７０巻、ｐ．１１１７による方法に従う）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換によって作製した。それらの形質転換状態は、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって確認し、それらのＡＮＴ１発現は、定量リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって確認した。
【０３３０】
図２４に示すように、配列番号６９を発現するこれらの植物は、対応する野生型トマト植物と比べて、アントシアニンレベルの増加を示した（紫茎、根、葉脈および葉の一部）。これは、ほぼ恒常的な遺伝子発現用のトマトＡＣＴＩＮ７プロモータおよびＲｂｃＳ３Ｃターミネータならびに図２４および配列番号６９に含まれる遺伝子内カセットの機能性を示す。
【０３３１】
同様に、他の遺伝子内植物プロモータおよびターミネータの機能性もまた確立された。これは、イネＡＣＴＩＮ１プロモータを、イネＤＲＥＢ１Ａターミネータ（実施例７参照）、ならびにＡＢＡ生合成遺伝子ＮＣＥＤ３のアブシジン酸（ＡＢＡ）誘導性プロモータおよびターミネータ、Ｒ１Ｇ１Ｂプロモータおよびターミネータ、ならびにＡＰＸプロモータおよびターミネータ（図２３；配列番号７６）と組み合わせて含む。すべてのプロモータおよびターミネータは、選択可能マーカ（実施例３参照）としても役立つ遺伝子内構築物中のイネＤＲＥＢ１Ａ遺伝子（実施例７参照）と組み合わせて試験した。
【０３３２】
イネＡＣＴＩＮ１プロモータは、イネにおける機能的な構成的プロモータとして十分に確立されている（マッケルロイ（ＭｃＥｌｒｏｙ）ら著、１９９１年、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第２３１巻、ｐ．１５０）。イネＮＣＥＤ３プロモータおよびターミネータは、対応するＮＣＥＤ３遺伝子がＡＢＡ誘導性であることから、誘導性制御配列における例として選択した。イネＲ１Ｇ１Ｂプロモータおよびターミネータは、植物全体を通じて、特に胚乳において高度に発現することが予想されることから選択し（パーク（Ｐａｒｋ）ら著、２０１０年、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・ボタニー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ）、第６１巻、ｐ．２４５９）、ひいては米粒において発現する形質（例えば香り米；実施例９参照、およびアントシアニンの生成）を発現させるために用いた。イネＡＰＸプロモータおよびターミネータは、イネにおける予想される強力かつ構成的な発現に基づいて選択した。これらの遺伝子内ＤＮＡ断片およびそれらの配列の構成は、ＡＰＸ、ＡＣＴＩＮ１／ＤＲＥＢ１Ａ／ＮＣＥＤ３、およびＲ１Ｇ１Ｂの各々について、実施例２、３、および９において示す。
【０３３３】
イネカルス（アジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）栽培品種Ｒｅｉｚｉｑ）を作製し、切除された直鎖状ＤＮＡの直接遺伝子導入に用いた（イネ体細胞の胚形成および形質転換に関する詳細については、実施例７を参照）。ＤＲＥＢ１Ａターミネータと組み合わせたイネＡＣＴＩＮ１構成的プロモータの機能性は、再生中、高塩分（１００ｍＭ  ＮａＣｌ）培地上で生存する形質転換イネカルスの９％として確認した（実施例３および図２８を参照）。
【０３３４】
イネＮＣＥＤ３  ＡＢＡ誘導性プロモータおよびターミネータの機能性および誘導能は、再生中、高塩分（１００ｍＭ  ＮａＣｌ）培地上で生存する形質転換イネカルスの１９％として確認した（実施例３および図２８を参照）。
【０３３５】
イネＲ１Ｇ１Ｂプロモータおよびターミネータの機能性および誘導能は、再生中、高塩分（１００ｍＭ  ＮａＣｌ）培地上で生存する形質転換イネカルスの２１％として確認した。
【０３３６】
さらに、ソルガム遺伝子内植物プロモータおよびターミネータの機能性が確立された。これは、Ｓｏｂｉｃ．００４Ｇ０５００００からの過去に試験しなかったソルガムＵＢＩＱＵＩＴＩＮ１（Ｕｂｉ１）プロモータおよびターミネータ、ならびに過去に用いたＵＢＩＱＵＩＴＩＮ２プロモータ（ＲＥＦ）（ＵＢＩＱＵＩＴＩＮ１ターミネータでも試験した）を含む。これら２つのクローニングカセットの構成は、実施例２に示しており、図２１および２２と、各々、配列番号７４および配列番号７７とで示す。
【０３３７】
実施例３．形質転換における選択可能マーカとしての天然遺伝子の使用
植物形質転換中での選択可能マーカの使用により、形質転換植物の効率的選択が容易にされる。この目的のため、本発明の遺伝子構築物が、１つ以上の植物に由来する選択可能マーカヌクレオチド配列である１つ以上の追加的ヌクレオチド配列を含むことは有利である。
【０３３８】
本発明においては、幾つかの天然トマト遺伝子を、本発明の遺伝子構築物における選択可能マーカヌクレオチド配列として作用する可能性について評価した。
配列番号２７で示すヌクレオチド配列を含む、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼに対する相同性を有する遺伝子をトマトにおいて同定し（ｇｉ２０９３６２３４２）、３５ＳまたはトマトＲｂｃＳ３Ｃプロモータの制御下のこの遺伝子を含むトランスジェニックカセットを用いる安定なアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換により試験した。５ｍＭのＢＡを含有する選択培地上で再生させた苗条の中で、１８％が組み込まれたｐ３５Ｓ：ＢＡＤＨカセットを有した。ｐＲｂｃＳ３Ｃ：ＢＡＤＨ再生剤は得られなかった。ｐ３５Ｓ：ＢＡＤＨ形質転換体は通常インビトロで発生し、それらが健全に成長し、形態学的に正常な花をもたらした場合、土壌に植えた。
【０３３９】
加えて、双方に対してアミノ酸配列における９０％を超える類似性およびコード配列における８０％を超える同一性を有する配列番号３０で示すヌクレオチド配列を含む、アルファルファおよび大豆の細胞質グルタミンシンテターゼ１（ＧＳ１）に相同な遺伝子をトマトにおいて同定した（ｇｉ４６０４０９５３６）。アルファルファ（ティッシャー，Ｅ．（Ｔｉｓｃｈｅｒ，Ｅ．）ら著、上記；米国特許第  ４９７５３７４Ａ号明細書）および大豆（ポーンプロム，Ｔ．（Ｐｏｒｎｐｒｏｍ，Ｔ．）ら著、上記）において除草剤に対する耐性を付与することが記述されているこのトマトＧＳ１の突然変異を、部位特異的変異誘発により導入した。
【０３４０】
詳細には、生成される２つの突然変異体は、Ｇ２４５Ｃ（配列番号５１で示すヌクレオチド配列によってコードされる）およびＨ２４９Ｙ（配列番号５２で示すヌクレオチド配列によってコードされる）であった。トマトＧＳ１変異体を、上記の通り、トマトＲｂｃＳ３Ｃプロモータおよびターミネータの制御下で、最初のトランスジェニックおよび後の遺伝子内バイナリーベクターにクローン化した。例として、Ｇ２４５Ｃ変異体をコードする遺伝子内バイナリーベクターの完全ヌクレオチド配列を配列番号４８で示す。
【０３４１】
ベクターを宿すアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で処理したトマト子葉外植片を１ｍｇ／Ｌのグルホシネートアンモニウム（ＧＡ）を含有する苗条再生培地上で培養した。ＧＳ１  Ｇ２４５Ｃを用いるトランスジェニック形質転換から再生した複数の苗条の８６％が、マーカに対してＰＣＲ陽性であった。ＧＳ１  Ｈ２４９Ｙを用いる形質転換からの苗条の再生はほとんど効率的でなかった。
【０３４２】
ｐＲｂｃＳ３Ｃ：ＧＳ１  Ｇ２４５Ｃが左境界に直に隣接したプロモータの開始に位置する、２つの発現カセットを含む遺伝子内ベクターを用いる形質転換試験により、活発な苗条成長がもたらされ、同じ再生培地上で非アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）共培養対照の外植片から何ももたらされないことと対照をなす（図８および９）。しかし、ｐＲｂｃＳ３Ｃ：ＧＳ１  Ｇ２４５Ｃカセットの組込みにおけるＰＣＲ陽性は、苗条の少ない割合に過ぎず、第２の発現カセットのみの組込みの場合はかなり多めであった。
【０３４３】
これまでトランスジェニックおよびイントラジェニックでの形質転換試験の双方の場合に、組み込まれたｐＲｂｃＳ３Ｃ：ＧＳ１  Ｇ２４５Ｃを含む、最初に急速に形成された活発な苗条の土壌に移植する準備が整う段階までの再生には、主に不均等な成長パターンに起因して、幾つかの困難が生じている。有望な解決策として、明らかに重要な２４５位での異なるアミノ酸置換、例えばＧ２４５ＳまたはＧ２４５Ｒについて、代替的な天然プロモータの利用とともに、ＧＡ耐性アルファルファにおいて天然に生じるものとの、例えば既に試験したものの数からの類似性により試験してもよい。
【０３４４】
本発明の目的として、視覚的選択可能マーカとしてのアントシアニンの有用性についても試験した。図２４に示す通り、配列番号６９を発現するトマト植物は、対応する野生型トマト植物と比べて、アントシアニンレベルの増加を示した（紫茎、根、葉脈および葉の一部）。これは、原則として、好適な視覚的マーカ遺伝子としてのＡＮＴ１遺伝子、ならびに図２４および配列番号６９に含まれる遺伝子内カセットの機能性を示す。
【０３４５】
しかし、唯一の選択可能マーカとしてのアントシアニンの使用は、非形質転換細胞に対して視覚的なだけで生理学的に活性な選択でないことから、労力を要する可能性があり、多数の形質転換事象を必要とし得る。したがって、トランスジェニック選択可能マーカ遺伝子、例えばゲンタマイシンまたはカナマイシン耐性を付与するＮＰＴＩＩ遺伝子で別々に形質転換するための通常の選択肢がある。この別々に形質転換された遺伝子カセットであれば、後に（例えば戻し交配により）外交配され得る異なる遺伝子座での植物のゲノムへの非依存性組込みを経ることになる。視覚的マーカとしてのアントシアニンの使用は、推定的に選択可能マーカが除去されている場合の植物について迅速にスクリーニングすることをここで大いに支援し得る。この手法を評価するため、２つの選択肢における構築物を、実施例１で示すように調製した。選択肢１では、ＡＮＴ１を有する選択可能マーカカセットを、同時形質転換を活用する別のベクターとして供し（図１９；配列番号６９）、選択肢２では、ＡＮＴ１を有する選択可能マーカカセットを、同じプラスミド上に含めるが、それ自身のＬＢおよびＲＢ配列を提供することにより独立的に組み込む（図２０；配列番号７０）。
【０３４６】
次いで、トマト植物を、心臓形トマトの望ましい形質を付与する構築物と同時形質転換されるｐＡｒｔ２７  ＡＣＴ：ＡＮＴ１：ＲｂｃＳ３Ｃ  ３５Ｓ：ｎｐｔＩＩ：ＮＯＳ（図１９）を用いる（スブラマニアン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ）ら著、２０１６年、プラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、第１７０巻、ｐ．１１１７での方法に従う）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換により作製した（詳細については実施例９；図Ｘを参照）。それらの形質転換状態は、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって確認し、それらのＡＮＴ１発現は、定量リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって確認した。
【０３４７】
図２５に示すように、ｐＡｒｔ２７  ＡＣＴ：ＡＮＴ１：ＲｂｃＳ３Ｃ  ３５Ｓ：ｎｐｔＩＩ：ＮＯＳと同時形質転換したトマト植物が強力なアントシアニン生成を示した（左）一方で、この構築物を有しない同等な植物（右）は、アントシアニン生成増加の視覚的徴候を示さなかった。これは、アントシアニン生成遺伝子が、Ｆ１世代にて外交配されるべき選択可能マーカカセットのための視覚的ツールとして選択可能マーカと同時形質転換されるとき、有用であることを示す。イネおよびソルガムにおけるアントシアニン生成のための遺伝子構築物もまた作製し（実施例８参照）、それは視覚的選択可能マーカとして役立ち得る。
【０３４８】
遺伝子内植物形質転換のための別の内因性（遺伝子内）選択可能マーカを開発するため、イネＤＲＥＢ１Ａ遺伝子を試験した。この方法を可能にするため、まずイネカルスに対する殺菌曲線を確立した。アジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）栽培品種ＲｅｉｚｉｑおよびＩＲ６４におけるイネカルスを作製し、植物を実施例７に記載のように再生させた。Ｇａｍｂｏｒｇｅ  Ｂ５ビタミン、１ｍｇ．Ｌ−１のＮＡＡ、２ｍｇ．Ｌ−１のＢＡＰ、２ｍｇ．Ｌ−１のキネチン、３％スクロースおよび７％寒天７％を添加したＭＳ基本培地をイネ再生培地として最適であると判定した。塩化ナトリウムの６つの濃度（１００、１５０、２００、２５０、３００および３５０ｍＭ）を培地に添加した。数週後の結果４によると、１００ｍＭ  ＮａＣｌが、両栽培品種（ＲｅｉｚｉｑおよびＩＲ６４）における再生を十分に抑制する選択のための最適な条件をもたらすことが示された。したがって、１００ｍＭ  ＮａＣｌは、形質転換イネ植物を作製するための有効な選択として考えられた。
【０３４９】
次いで、イネＤＲＥＢ１Ａ遺伝子を、耐塩性を供することによるイネ形質転換に適した選択可能マーカとして、イネＡＣＴＩＮ１プロモータおよびＤＲＥＢ１ＡターミネータまたはイネＮＣＥＤ３プロモータおよびターミネータのいずれかと組み合わせて試験した。
【０３５０】
これらの完全に遺伝子内の構築物を、まず発現カセットを合成し、次に製造業者（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によりそれらをサブクローニングベクターｐＵＣ５７−ＫＡＮのＥｃｏＲＶ制限酵素部位に挿入することにより作製したものの、平滑末端クローニング部位を有する任意の他の大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）プラスミドが好適となる。ＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａカセットは、図２６および配列番号７８で示す。ＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３カセットは、図２７および配列番号７９で示す。微粒子銃によるイネカルスの形質転換に先立ち、固有の制限酵素部位としてＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１ＡにおけるＮｈｅＩ／ＰｍｌＩおよびＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３におけるＦｓｐＩを用いて、カセットを切除した。
【０３５１】
図２８に示すように、ＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａカセットで形質転換した１８０のカルスからの９％が、１５日後、１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有培地上で生存し、ＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３カセットで形質転換した３００のカルスからの１９％が、１５日後、１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有培地上で生存し、これらの大部分は１か月後も生存した。比較によると、非形質転換対照カルスは、１００ｍＭ含有培地中でいずれも生存しなかった。
【０３５２】
これらの百分率は許容できる形質転換効率であり、それ故、ＤＲＥＢ１Ａ遺伝子および対応する遺伝子内カセットは、形質転換遺伝子内植物の作製のための本発明の構築物中で用いられる完全に遺伝子内の選択可能マーカとして好適であると考えられた。
【０３５３】
実施例４．同時形質転換方法
非依存性ベクターを用いた同時形質転換
少なくとも特定の環境では、「２ベクター２アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株」同時形質転換方法において、本明細書中に記載のような遺伝子内構築物を用いることが好ましい可能性がある。ここで構築物は、異なる遺伝子座に組み込むことになる選択可能マーカ遺伝子を含む別のＴ−ＤＮＡ構築物と併用することができ、またＦ１またはＦ２世代において外交配させ、そのゲノム内に外来配列を含まない植物を残すことができる。
【０３５４】
選択可能マーカとして好適な前記遺伝子構築物を含む、かかる別のＴ−ＤＮＡ構築物およびベクターの模式図を図１９に示す。この選択可能マーカ構築物の配列は、配列番号６９で示し、予め上述している。植物の遺伝子材料中に組み込まれるように設計された非植物由来の制御および選択可能マーカ配列の存在に起因し、この構築物が本質的に本発明の好ましい構築物でないが、かかる好ましい構築物と特定成分を確かに共有することは理解されるであろう。
【０３５５】
図１９に示すベクターの骨格配列は、バイナリーベクターｐＡｒｔ２７の骨格配列である。選択可能マーカ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）は別として、上記の通り、容易な外交配を可能にするため、アントシアニン生合成のための視覚的マーカ遺伝子（ＡＮＴ１）を含めている。遺伝子構築物は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲＢ配列の配列；アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢ配列の配列を含む。ＲＢおよびＬＢ配列間に位置するのは、
（ｉ）ＲＢ配列に隣接して位置しかつ（ｉｉ）と作動可能に連結された、トマトＡＣＴＩＮ７遺伝子のプロモータ配列に属する配列番号５で示すヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）ＡＮＴ１アントシアニン遺伝子に属する配列番号３５で示すヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）と作動可能に連結された、トマトＲｂｃＳ３Ｃ遺伝子のターミネータに属する配列番号８で示すヌクレオチド配列；
（ｉｖ）（ｖ）と作動可能に連結された、カリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）の二重３５Ｓプロモータ配列のヌクレオチド配列；
（ｖ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子に属するヌクレオチド配列；
（ｖｉ）ＬＢ配列に隣接して位置する、（ｖ）と作動可能に連結された、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｎｏｓ遺伝子のターミネータに属するヌクレオチド配列
である。
【０３５６】
（ｉ）の配列は、ＡＣＴＩＮプロモータ配列の実質的切断が（ｉ）のプロモータ機能を除去するかまたは実質的に損なわせることになり、ソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｃｈｉｌｅｎｓｅ）ＡＮＴ１アントシアニン遺伝子に属する選択可能マーカ配列（ｉｉ）の発現を駆動する（ｉ）の能力が除去されるかまたは実質的に低減されるように設計している。
【０３５７】
あるいは、ＡＣＴＩＮプロモータをＲｂｃＳ３Ｃプロモータと置換した場合のこのベクターの別のバージョンを作製した（ｐＡｒｔ２７  ＲｂｃＳ３Ｃ：ＡＮＴ１：ＲｂｃＳ３Ｃ  ３５Ｓ：ｎｐｔＩＩ：ＮＯＳ）。
【０３５８】
単一のベクター上の非依存性構築物を用いた同時形質転換
２ベクターを用いた同時形質転換が達成可能である一方で、場合によっては同時形質転換効率がかなり低い可能性がある。この課題を回避するための、上述のような遺伝子内Ｔ−ＤＮＡ構築物の別の好ましい使用は、１ベクターによるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）同時形質転換方法である。ここでは、両Ｔ−ＤＮＡ構築物は、同じベクター上に同時存在し得る。しかし、それら各々がそれら自身のＬＢおよびＲＢ配列を含むことから、それらはまた、異なる遺伝子座に組み込まれた別のＴ−ＤＮＡを生成する。したがって、選択可能マーカ遺伝子を含むＴ−ＤＮＡインサートは、Ｆ１またはＦ２世代において外交配させ、そのゲノム内に外来配列を含まない植物を残すことができる。
【０３５９】
前記遺伝子構築物を含むかかる二重Ｔ−ＤＮＡベクターの模式図を図２０に示す。このベクターの配列を配列番号７０で示す。
選択可能マーカ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）は別として、容易な外交配を可能にするため、アントシアニン生合成のための視覚的マーカ遺伝子（ＡＮＴ１）を含めている。ベクターの構成は、次の通りであった。すなわち、トマトＰＡＲＴＩＡＬ  ＡＣＴＩＮプロモータおよびターミネータを含むＴ−ＤＮＡを、ブランクｐＩｎｔｒＡクローニングベクターを鋳型として用いて、フォワードプライマー（ＢｓｉＷＩ）ＣＧＴＡＣＧＧＡＡＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号１３１）およびリバースプライマー（ＢｓｒＧＩ）ＴＧＴＡＣＡＡＴＣＧＴＣＡＡＣＧＴＴＣＡＣＴＴＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号１３２）を用いて増幅し、ＢｓｉＷＩ酵素を用いた消化により、単一のＴ−ＤＮＡプラスミドに挿入した（ｐＡｒｔ２７  ＲｂｃＳ３Ｃ：ＡＮＴ１：ＲｂｃＳ３Ｃ  ３５Ｓ：ｎｐｔＩＩ：ＮＯＳ）。
【０３６０】
次に、所望されるインサートは、５’リン酸化プライマー：フォワード５’ＰｈｏｓＧＡＴＴＡＡＡＡ［開始インサート配列］およびリバース５’ＰｈｏｓＣ［インサート配列の末端の逆相補鎖］を用いて増幅し、ＨｐａＩおよびＰｍｌＩ制限酵素での切り出しにより得られるベクターに挿入することができ、それらの部位はクローニングベクター配列において固有である。
【０３６１】
実施例５．植物ウイルスに対する耐性を改善するためのスモールＲＮＡ配列を含む発現用配列
上記の通り、特定の好ましい実施形態では、本発明の遺伝子構築物は、１つ以上のスモールＲＮＡヌクレオチド配列を含む１つ以上の発現用のヌクレオチド配列を含み、ここで前記スモールＲＮＡ配列は、植物病原体の１つ以上の核酸の発現、翻訳および／または複製を修飾または改変する能力がある。前記遺伝子構築物を用いて遺伝的に改善された植物は、植物病原体、例えば植物ウイルスに対する相対的に改善または増強された耐病性を示し得る。
【０３６２】
従来では、ウイルス性病原体に対する改善された耐病性を有する遺伝的に改善された植物を開発するための手法では、ウイルス配列由来の抗ウイルス配列を用いている。これら従来の手法は、感染中でのウイルスゲノムとの組換えのリスクを提示し、新しい株の形成の可能性を生み出した。事実、これは、例えば、グリーネ，Ａ．Ｅ．（Ｇｒｅｅｎｅ，Ａ．Ｅ．）、１９９３年、モレキュラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２２巻、ｐ．３６７において実験的に示されており、病原性が高まったウイルス株を生じ得る現実的リスクと考えられる。
【０３６３】
本実施例は、ウイルス性病原体核酸の発現および／または複製を改変または修飾するのに、植物由来のスモールＲＮＡヌクレオチド配列を用いることができることを実証する。
本実施例に記載する本発明の好ましい実施形態では、植物に由来するスモールＲＮＡ配列は、ウイルス標的に完全には一致せず、ウイルスの機能にとって必要とされるアミノ酸をコードしないことから、ウイルスゲノム内部での生存可能な組換え事象に適する必要はない。しかし、これらのスモールＲＮＡ配列はやはり、これらウイルス標的の発現を効率的に抑制する能力がある。
【０３６４】
本実施例においては、植物配列に由来する幾つかのａｍｉＲＮＡ配列を作製し、試験した。さらに、植物配列由来のスモールＲＮＡ配列を含むより長いＲＮＡｉ構築物を作製し、試験している。
【０３６５】
本実施例では、植物病原体の核酸の発現および／または複製を阻害するのに適した構築物が植物配列に由来し得ることを示す。かかる配列を含む本発明の遺伝子構築物は、改善された耐病性を伴う遺伝的に改善された植物を作製するのに有用であることが予想される。例として、本発明のかかる構築物で形質転換したトマト植物は、実施例６で示すように、ＣＭＶに対する改善された耐性を示した。
【０３６６】
ａｍｉＲＮＡ手法
キュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）を標的化するように、天然（トマトｃｖ．Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）ゲノム由来の人工的マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）ヌクレオチド配列を設計しクローン化した。天然ｍｉＲＮＡ１５６ｂを用い（配列番号１２）、その中にＣＭＶの様々な単離物用の保存された領域内のＣＭＶ単離物Ｋ（ＣＭＶ−Ｋ）配列に部分的に一致する幾つかのトマトゲノム由来の成熟マイクロＲＮＡ配列を導入した。
【０３６７】
これらのａｍｉＲＮＡ構築物を、二重ＬＵＣアッセイを用いて試験した。試験対象の設計したａｍｉＲＮＡ、例えば配列番号１３〜１８で示すヌクレオチド配列を有する構築物の約２５％が、効率的に作用し、相補的ウイルス標的配列を有するホタルルシフェラーゼに対して発現のノックダウンを引き起こした（図１０）。
【０３６８】
概念のさらなる証拠として、これらのａｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の１つ（配列番号１５で示すａｍｉＲＮＡ１０）を発現するトマト植物を、標準のバイナリーベクター（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータおよびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＯＣＳターミネータを含むｐＡｒｔ２７）を用いて、（スブラマニアン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ）ら著、２０１６年、プラント・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、第１７０巻、ｐ．１１１７による方法に従う）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換により作製した。図１１に示すように、配列番号１５を発現するこれらの植物は、対応する野生型トマト植物と比べて、ＣＭＶに対する改善された耐性を示し、ＣＭＶ病徴の低減を示した。さらに、図１２に示すように、平均ＣＭＶウイルス負荷は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって評価するとき、野生型植物と比べて有意に減少した。
【０３６９】
ウイルスの他の部分もまた標的にされ得るか否かや、耐性形質が遺伝性であるか否か試験するため、異なる遺伝子内ａｍｉＲＮＡヌクレオチド配列（配列番号１６で示すａｍｉＲＮＡ１１）を発現するトマト植物を、通常の上記と同一の条件を用いてのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換により作製した。植物形質転換に先立ち、図１０に示すように、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉｎａ）葉のアグロインフィルトレーションにより、一過性ルシフェラーゼアッセイを用いた。この結果、ＣＭＶ標的配列の有意な下方制御をもたらし、ａｍｉＲＮＡ１１も安定に形質転換された植物においてこのウイルスの発現を抑制するのに好適となることが示唆された。Ｔ０植物を上記のように作製し、得られた系統を、形質転換構築物の存在および発現を確認するため、各々定量ＰＣＲおよび定量的逆転写酵素ＰＣＲにより試験した。次に、２系統からの植物（ａｍｉ１１−Ｉおよびａｍｉ−１１−ＩＩ）を成熟するまで成長させ、一次形質転換体からの種子を収集した。ホモ接合性またはヘテロ接合性のａｍｉＲＮＡ１１配列またはａｍｉＲＮＡ１１でない配列（不対性）を発現する実生を、定量ＰＣＲにより同定した。
【０３７０】
２〜３葉期まで成長し（発芽後３週）、ＣＭＶを負荷したとき、両系統においてａｍｉＲＮＡ１１を宿すホモ接合性およびヘテロ接合性双方の植物がウイルス耐性を示した一方で、ａｍｉＲＮＡ１１を含有しない不対性植物は、野生型植物に類似したＣＭＶ症状を示した。これらの植物の例を図２９に表す。これは、ＣＭＶ検出用にクイーンズランド州農水省（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ）（ＤＡＦ）によって開発された酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）を用いるときに得られた結果に一致した。図３０および３１（ａｍｉ１１−Ｉおよびａｍｉ−１１−ＩＩ  Ｔ１子孫ウイルス負荷試験）に示すように、野生型および不対性植物が、試験した大部分の植物においてＣＭＶの強力な存在を示した一方で、ａｍｉ  ＲＮＡ１１構築物を宿すほぼすべての植物は、ＥＬＩＳＡで検出可能なＣＭＶの存在をほとんどまたは全く示さなかった。さらに、ＣＭＶを接種した植物の症状の通常の重症度スコア化を、２つの時点（接種後３週および１５週）でＤＡＦにより実施した。これらのデータは、図３２に示すが、ａｍｉ１１−Ｉおよびａｍｉ−１１−ＩＩ  Ｔ１子孫植物が、初期および後期双方の時点で、ａｍｉ１１構築物を含まない野生型および不対性植物と比べて耐性を示したことをさらに示す。さらに、ＣＭＶを接種した野生型植物は、モック接種植物よりも短かったが、ａｍｉ１１−Ｉおよびａｍｉ１１−ＩＩ植物は、平均でモックを接種した野生型植物よりも短いことはなかった（図３２）。
【０３７１】
果実の品質および量は、正常に見え、野生型または不対性植物と区別がつかなかった（図３３）。ＣＭＶ負荷植物からの果実は、野生型植物においては重度に冒されたが、ａｍｉＲＮＡ１１形質転換植物においては症状をほとんどまたは全く示さなかった。
【０３７２】
まとめると、これは、植物ゲノム由来の遺伝子内スモールＲＮＡ配列を巧みに用いて、正常な収量および果実品質を伴うウイルス耐性植物を作製することができ、かつこの形質は新たな世代に伝えることができることを示す。
【０３７３】
ウイルス耐性の耐久性をさらに改善するため、両方の示されたａｍｉＲＮＡに基づく手法（ａｍｉＲＮＡ１０およびａｍｉＲＮＡ１１）が一緒に試験された。この目的のため、両ａｍｉＲＮＡは、２つの異なる天然トマトマイクロＲＮＡにより発現される必要があった。したがって、天然Ｓｌｙ−ｍｉＲ１５６ａおよびＳｌｙ−ｍｉＲ１５６ｂマイクロＲＮＡにおけるヌクレオチドを各々、遺伝子内抗ＣＭＶ  ａｍｉ１０およびａｍｉ１１と置換した。この遺伝子内二重ａｍｉ配列を図３４および配列番号８０で示す。構築物が対応するウイルス配列を抑制できるか否かを試験する目的で、ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物のアグロインフィルトレーションを用いる二重ルシフェラーゼアッセイを上記のように用いた。このアッセイを目的として、該配列を、ＣａＭＶ  ３５ＳプロモータおよびＯＣＳターミネータによって隣接されるｐＡｒｔ２７プラスミドにクローン化した。図３４に示すように、構築物は、対応するＣＭＶ標的配列を有意に（Ｐ＜０．００１；スチューデントｔ検定）抑制した。
【０３７４】
植物を形質転換するため、両方の示されたａｍｉＲＮＡに基づく手法（ａｍｉＲＮＡ１０およびａｍｉＲＮＡ１１）が１つの完全に遺伝子内の構築物中で組み合わされた。図３５および配列番号８１で示すように、「２ベクター２アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株同時形質転換方法」のベクターを、別の選択可能マーカ構築物と併用可能である骨格としてｐＡｒｔ２７を用いて作製したが、それは商業化に先立つ後期の段階で外交配され得る。この目的のため、配列（配列番号８１）をｐＩｎｔｒＡ（図１８；配列番号６７）に挿入した。まず配列番号８１を合成し、次にＦプライマー５’Ｐｈｏｓ  ＧＡＴＴＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＴＡＴＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧ（配列番号１３３）およびＲプライマー５’Ｐｈｏｓ  ＣｃｇａａａｇａｇｇｔｇａａｇｇｔｇａＴＧＡＴＣＡ（配列番号１３４）を用いて増幅し、ＡＣＴＩＮプロモータおよびターミネータの欠損した末端を補完し、その後、ＨｐａＩおよびＰｍｌＩで切り出したｐＩｎｔｒＡとライゲートした。インサートの方向を、配列決定により試験した。
【０３７５】
トマト植物を、形質転換植物の視覚的認識のためのトマトＡＮＴ１遺伝子も宿す別のベクターとして、図１９および配列番号６９で示す選択可能マーカ構築物と一緒に上記のようなこの構築物（図３５）を用いて形質転換した。再生した植物は紫根を呈し、それらの形質転換状態が確認された。二重ａｍｉＲＮＡ発現およびＣＭＶ耐性についてのさらなる試験は、現在進行中である。
【０３７６】
あるいは、図２０および配列番号７０で示す二重カセット（２つのＴ−ＤＮＡカセットを含む１つのベクター）手法を用いた。この目的のため、二重ａｍｉＲＮＡ  Ｔ−ＤＮＡカセット（配列番号８１）を、ｐＡｒｔ２７  ＲｂｃＳ３Ｃ：ＡＮＴ１：ＲｂｃＳ３Ｃ  ３５Ｓ：ｎｐｔＩＩ：ＮＯＳ（図１９；配列番号６９）に挿入した。最初に、二重ａｍｉＲＮＡ  Ｔ−ＤＮＡを、プライマー：フォワード（ＢｓｉＷＩ）ＣＧＴＡＣＧＧＡＡＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号１３５）およびリバース（ＢｓｒＧＩ）ＴＧＴＡＣＡＡＴＣＧＴＣＡＡＣＧＴＴＣＡＣＴＴＣＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号１３６）を用いて、図３５で示すベクターから増幅し、次に、ＢｓｉＷＩ酵素で切り出した単一のＴ−ＤＮＡプラスミドｐＡｒｔ２７  ＲｂｃＳ３Ｃ：ＡＮＴ１：ＲｂｃＳ３Ｃ  ３５Ｓ：ｎｐｔＩＩ：ＮＯＳ（図１９；配列番号６９）に挿入した。この手法におけるトマト植物の形質転換、再生およびＣＭＶ負荷実験は、現在進行中である。耐久性のある遺伝子内ＣＭＶ耐性のためのこの二重Ｔ−ＤＮＡベクターの遺伝的構成および完全配列を図３６および配列番号８２で示す。
【０３７７】
イントラジェニックａｍｉＲＮＡ手法を他のウイルスにも適用するため、世界中で深刻な収量低下を引き起こしている別のウイルスである、トマトにおけるトマト黄化えそ病ウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｓｐｏｔｔｅｄ  ｗｉｌｔ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＳＷＶ）への耐性を意図して、遺伝子内構築物を作製した。ＣＭＶにおける場合と同様、最初にＴＳＷＶ配列に一致する十分な長さの遺伝子内配列を同定した。次いで、天然Ｓｌｙ−ｍｉＲ１５６ｂマイクロＲＮＡにおけるヌクレオチドを遺伝子内抗ＴＳＷＶ  ａｍｉＲＮＡ７配列と置換し、図３７および配列番号８３で示す遺伝子内配列を得た。
【０３７８】
構築物が対応するウイルス配列を抑制できるか否かを試験する目的で、ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物のアグロインフィルトレーションを用いる二重ルシフェラーゼアッセイを上記のように用いた。このアッセイを目的として、該配列を、ＣａＭＶ  ３５ＳプロモータおよびＯＣＳターミネータによって隣接されるｐＡｒｔ２７プラスミドにクローン化した。図３７に示すように、構築物は、対応するＴＳＷＶ標的配列を有意に（Ｐ＜０．００１；スチューデントｔ検定）抑制した。
【０３７９】
植物を形質転換するため、配列（配列番号８３）をｐＩｎｔｒＡ（図１８；配列番号６７）に挿入した。まず配列番号８３を合成し、次にＦプライマー５’Ｐｈｏｓ  ＧＡＴＴＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＴＡＴＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧ（配列番号１３７）およびＲプライマー５’Ｐｈｏｓ  ＣｃｇａａａｇａｇｇｔｇａａｇｇｔｇａＴＧＡＴＣＡ（配列番号１３８）を用いて増幅し、ＡＣＴＩＮプロモータおよびターミネータの欠損した末端を補完し、その後、ＨｐａＩおよびＰｍｌＩで切り出したｐＩｎｔｒＡとライゲートした。インサートの方向を、配列決定により試験した。
【０３８０】
トマト植物を、形質転換植物の視覚的認識のためのトマトＡＮＴ１遺伝子も宿す別のベクターとして、図１９および配列番号６９で示す選択可能マーカ構築物と一緒に上記のようなこの構築物（図３７）を用いて形質転換した。ａｍｉＲＮＡ７の存在および発現についての試験では、７つの系統に対して陽性であり、トマトを種子収集のために収穫した。植物は、通常よりも高く成長していても、正常な表現型を有し、野生型と同等の速度で結実し、種子を生産した。Ｔ１実生のＴＳＷＶ耐性試験（野生型、不対性、ホモ接合性およびヘテロ接合性）は、現在進行中である。
【０３８１】
この手法が他の作物についても有効か否かを試験するため、ソルガムにおけるジョンソングラスモザイクウイルス（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｇｒａｓｓ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＪＧＭＶ）−、サトウキビモザイクウイルス（Ｓｕｇａｒｃａｎｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＣＭＶ）およびトウモロコシ萎縮モザイクウイルス（Ｍａｉｚｅ  ｄｗａｒｆ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＤＭＶ）耐性、ならびにイネにおけるイネツングロ桿菌状ウイルス（Ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ  ｖｉｒｕｓ）（ＲＴＢＶ）耐性を意図して、遺伝子内ａｍｉＲＮＡ構築物を作製した。
【０３８２】
ソルガムにおける複数のウイルス耐性のためのこの手法を開発するため、ａｍｉＲＮＡは、複数のウイルスまたは同じウイルスの複数のウイルス単離物のいずれかを標的にするように設計した。最初に、保存領域内のＪＧＭＶ、ＳＣＭＶおよび／またはＭＤＭＶに一致する十分な長さの遺伝子内配列を同定した。次いで、天然ソルガムのマイクロＲＮＡ  Ｓｂｉ−ｍｉＲ１５６ｂにおけるヌクレオチドを様々な遺伝子内抗ウイルスａｍｉＲＮＡ配列と置換した。これらの一部を、図３８〜３９および配列番号８３〜８９で示す。ａｍｉＲＮＡは、プライマーＦ  ｔｃｃＣＴＧＣＡＧｇｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｇａａｇａｇａｇｇａｃｇ（配列番号１３９）およびＲ  ５’Ｐｈｏｓ  ｇｃｔｃｃａａａｔｃｇｇａｃａｇａｇａｇａｔｇａｇｃ（配列番号１４０）を用いて合成および増幅し、ＰｓｔＩで消化し、ＰｓｔＩおよびＳｆｏＩ酵素で切り出したベクターｐＳｂｉＵｂｉ１（図２１；配列番号７３）またはｐＳｂｉＵｂｉ２（図２２；配列番号７４）に挿入した。得られたプラスミドをＰｍｌＩで切断し、最小の遺伝子内形質転換カセットを得た。
【０３８３】
しかし、植物形質転換に先立ち、ａｍｉＲＮＡ構築物を、ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉のアグロインフィルトレーションを用いて試験した。図３８は、ＭＤＭＶ−ＳＣＭＶ標的配列の有意な（Ｐ＜０．０５；スチューデントｔ検定）ノックダウンをもたらした、二重ルシフェラーゼアッセイを用いた２つの抗ＭＤＭＶ−ＳＣＭＶ  ａｍｉＲＮＡ構築物の試験の奏功を示す。図３９は、ＪＧＭＶ標的配列の有意な（Ｐ＜０．０１；スチューデントｔ検定）ノックダウンをもたらした、二重ルシフェラーゼアッセイを用いた４つの抗ＪＧＭＶ  ａｍｉＲＮＡ構築物の試験の奏功を示す。
【０３８４】
次に、ソルガム植物（モロコシ（Ｓｏｒｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）栽培品種Ｔｘ４３０）を、発現用の遺伝子内ｐＳｂｉＵｂｉ１およびｐＳｂｉＵｂｉ２カセットを用いて上記ａｍｉＲＮＡで形質転換した。線状遺伝子内ＤＮＡカセットを切除し、ソルガム未熟胚の微粒子銃に用いた。リウ（Ｌｉｕ）ら著、２０１４年（ＩＮ：「穀類ゲノミクス：方法およびプロトコル、分子生物学における方法（Ｃｅｒｅａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｒ．Ｊ．ヘンリー（Ｒ．Ｊ．Ｈｅｎｒｙ）およびＡ．フルタド（Ａ．Ｆｕｒｔａｄｏ）編、スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、ニューヨーク）により記載のソルガム形質転換プロトコルを用いた。植物は、現在再生中であり、ＳＣＭＶおよびＪＧＭＶウイルス負荷用に調製する。
【０３８５】
ＪＧＭＶに対するソルガムにおける複数の遺伝子内耐性を提供するため、三重ａｍｉＲＮＡ手法を用いた。図４０および配列番号９０で示す通り、これらの構築物の１つは、ｐＳｂｉＵｂｉ１（配列番号７３）内に、ａｍｉＲＮＡ２（配列番号８６）、ａｍｉＲＮＡ４（配列番号８７）、およびａｍｉＲＮＡ５（配列番号８８）を含む。図４１および配列番号９１で示す通り、これらの構築物のもう１つは、ｐＳｂｉＵｂｉ２（配列番号７４）内に、ａｍｉＲＮＡ２（配列番号８６）、ａｍｉＲＮＡ４（配列番号８７）、およびａｍｉＲＮＡ５（配列番号８８）を含む。
【０３８６】
これらの構築物のためのクローニング方法は以下の通りである。ａｍｉＲＮＡ４は、プライマーＦ  ｔｃｃＣＴＧＣＡＧｇｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｇａａｇａｇａｇｇａｃｇ（配列番号１４１）（ＰｓｔＩ部位を５’末端に付加）およびＲ  ｇｔｇｃａｃｔｃｃａａａｔｃｇｇａｃａｇａｇａｇａｔｇａｇｃｃ（配列番号１４２）（ＡｐａＬＩ部位を３’末端に付加）を用いて増幅した。ＡｍｉＲＮＡ５は、プライマーＦ  ｇｔｇｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｇａａｇａｇａｇｇａｃｇ（配列番号１４３）（ＡｐａＬＩ部位を５’末端に付加）およびＲ  ａａｃｃｃｃｔａｇｇｃｔｃｃａａａｔｃｇｇａｃａｇａｇａｇａｔｇａｇ（配列番号１４４）（ＡｖｒＩＩ部位を３’末端に付加）を用いて増幅した。ＡｍｉＲＮＡ２は、プライマーＦ  ｃｃｔａｇｇｇｇｔｔｔｔｇｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｇ（配列番号１４５）（ＡｖｒＩＩ部位を５’末端に付加）およびＲ  ５’Ｐｈｏｓ  ｇｃｔｃｃａａａｔｃｇｇａｃａｇａｇａｇａｔｇａｇｃ（配列番号１４６）を用いて増幅した。断片を、各々の酵素で消化し、１回の反応でＰｓｔＩおよびＳｆｏＩで切り出したベクターｐＳｂｉＵｂｉ１またはｐＳｂｉＵｂｉ２のいずれかにライゲートした。
【０３８７】
イネにおけるウイルス耐性についてのイントラジェニックａｍｉＲＮＡ手法を開発するため、ａｍｉＲＮＡは、ＲＴＢＶによって引き起こされる症状の重症度を媒介するヘルパーウイルスであるイネツングロ球状ウイルス（Ｒｉｃｅ  ｔｕｎｇｒｏ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ｖｉｒｕｓ）（ＲＴＳＶ）を標的にするように設計した。この目的のため、天然イネマイクロＲＮＡ  Ｏｓａ−ｍｉＲ１５６ａにおけるヌクレオチドを様々な遺伝子内抗ウイルスａｍｉＲＮＡ配列と置換した。これらの１つ（ａｍｉＲＮＡ１）を、図４２および配列番号９３で示す。遺伝子内イネ形質転換カセットを作製するため、ａｍｉＲＮＡ１配列を、プライマーＦ  ＧＡＧＣｔｃａａａｔｇｔａｔｇｔｃｔａａｃｃａｔｇｃａｃａｔａｔｇｇ（配列番号１４７）（完全ＳａｃＩ部位をその５’末端まで完成させるためにヌクレオチドを導入する）およびＲ  ５’Ｐｈｏｓ  ｔａｇｔｃａｇｇａａｔｔａｃｇａａｇｇｇｔｇｔａｇｔｔａｔｇｔｔａｔｔｃ（配列番号１４８）を用いて合成し、増幅した。それをＳａｃＩで制限し、ＳａｃＩおよび平滑末端カッターＰｓｉＩで切り出したｐＯｓａＡＰＸ（図２３；配列番号７６）に挿入したが、その３つの最終ヌクレオチドは、データベースにおけるその全配列と同一である天然Ｏｓａ−ｍｉＲ１５６ａの折り畳みの「継続性」に寄与する。イネ植物におけるさらなる試験は、現在進行中である。
【０３８８】
ＲＮＡｉ手法
二本鎖ＲＮＡをもたらすＲＮＡヌクレオチド配列を含む「伝統的な」ヘアピンＲＮＡｉ構築物が本発明における植物由来配列を用いて作製できたか否かを試験するため、数百ヌクレオチドにわたる長いＲＮＡｉ構築物を、ＣＭＶ−Ｋを標的にするＲＮＡ配列（配列番号１８）を含むように設計した。遺伝子内ＲＮＡｉ配列は、トマトゲノムに対してＣＭＶ−Ｋセグメント配列をブラスト（ｂｌａｓｔ）し、≧２０ヌクレオチド長の最も良く一致する断片を選択し、可能であればそれらを小さい重複部分と一緒に配列することにより作成した。図１３は、各植物由来配列が少なくとも２０ヌクレオチド長であった場合、配列番号１８を作成するためにトマト（栽培品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）配列をいかにして一緒に用い、導いたかを示す。配列は、９０％のＣＭＶ−Ｋ配列（配列番号１９〜２１）に対して全体的一致を示した。
【０３８９】
この配列を、（二重ＬＵＣアッセイを用いて）３つの異なる対応するＣＭＶ標的配列と接触状態にしたときのそのＲＮＡｉの発現抑制能力について試験した。図１４に示すように、ＣＭＶ  ＲＮＡｉ構築物は、対照と比べて、３つすべてのＣＭＶ標的に対する発現の強力なノックダウンを引き起こした。
【０３９０】
トマト形質転換においては、最初に遺伝子内ＲＮＡｉ構築物を、センス方向にＣＭＶ−Ｋ  ＲＮＡｉ配列（配列番号１８）、次いでスペーサとしてのＰＤＫイントロン配列および抗センスＣＭＶ−Ｋ  ＲＮＡｉ配列を含めることによりｐＫａｎｎｉｂａｌに組み込んだ。次に、カセットを、ＳａｃＩおよびＳｐｅＩ部位を用いてｐＡｒｔ２７に移した。対応するベクターの完全配列を配列番号９３で示す。植物を再生し、１４系統が遺伝子内構築物を含むことが確認された。これらは、正常な表現型を有した（図１４）が、ＣＭＶ耐性試験を現在受けている。
【０３９１】
他のヘアピンＲＮＡｉ構築物が、本発明における植物由来配列を用いて作製可能か否かを試験するため、数百ヌクレオチドにわたる長いＲＮＡｉ構築物を、ＴＳＷＶ（配列番号９４）を標的にするＲＮＡｉ配列を含むように設計した。遺伝子内ＲＮＡｉ配列は、トマトゲノムに対してＴＳＷＶ−ＱＬＤ１セグメント配列をブラストし、≧２０ヌクレオチド長の最も良く一致する断片を選択し、可能であればそれらを小さい重複部分と一緒に配列することにより作成した。図４３は、各植物由来配列が少なくとも２０ヌクレオチド長であった場合、配列番号９４を作成するためにトマト（栽培品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）配列をいかにして一緒に用い、導いたかを示す。配列は、９１％のＴＳＷＶ配列に対して全体的一致を示した。
【０３９２】
この配列を、（本明細書に記載のような二重ＬＵＣアッセイを用いて）４つの異なる対応するＴＳＷＶ標的配列と接触状態にしたときのそのＲＮＡｉの発現抑制能力について試験した。図４４に示すように、ＴＳＷＶ  ＲＮＡｉ構築物は、対照と比べて、４つの標的の２つに対する発現の強力なノックダウンを引き起こした（Ｐ＜０．００１；スチューデントｔ検定）。
【０３９３】
トマト形質転換においては、最初に遺伝子内ＲＮＡｉ構築物を、センス方向にＴＳＷＶ  ＲＮＡｉ配列（配列番号９４）、次いでスペーサとしてのＰＤＫイントロン配列および抗センスＴＳＷＶ  ＲＮＡｉ配列を含めることによりｐＫａｎｎｉｂａｌに組み込んだ。次に、カセットを、ＳａｃＩおよびＳｐｅＩ部位を用いてｐＡｒｔ２７に移した。対応するベクターの完全配列を配列番号９５で示す。植物を再生し、１４系統が遺伝子内構築物を含むことが確認された。これらは正常な表現型を有し、Ｔ１実生のＴＳＷＶ負荷試験のためにトマト種子を収集した（図４４）。これらの系統の１つからのＴ１実生（Ｌ４）は、ｑＲＴ−ＰＣｒによる試験時、ＴＳＷＶ感染のやや低下したレベルを示したが（図４４）、他の系統のさらなる試験が進行中である。
【０３９４】
実施例６．多種にわたる作物における有用な形質を提供するための迅速なイントラジェニック方法の開発
本明細書に記載の通り、本発明の遺伝子内構築物は、作物における形質の改善、例えばトマトにおける耐病性を発現させるためのａｍｉＲＮＡの使用に適し得る。さらに、本発明の構築物は、別の植物において得られた情報に基づく、１つの植物における形質改善を促進し得る。例として、トマト作物における使用を意図したシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）モデル植物を用いて開発したイントラジェニック方法の評価は、図１６
を参照して、本明細書に記載する。
【０３９５】
このストラテジーの開発においては、植物ウイルス耐性が植物におけるサリチル酸（ＳＡ）経路の活性化により得られ得ることが仮定された。この経路は、活性化されるとき、生体栄養性病原体を迅速に認識し、反応性酸素種の産生により酸化的破裂を起こし、次に感染部位での局所過敏反応および局所的プログラム細胞死をもたらし得る（ムール（Ｍｕｒ）ら著、１９９７年、プラント・ジャーナル（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．）、第１２巻、ｐ．１１１３）。結果として、生細胞に依存する生体栄養性病原体は増殖することができず、植物は耐性をもつ。しかし、ＳＡシグナル伝達は、典型的には、ＳＡ経路に拮抗するジャスモン酸（ＪＡ）シグナル伝達によって損なわれ、多数の植物病原体が、一方の経路をハイジャックし、活性化することで他方を損い、疾患の進行を促進するように見える（サッチャー（Ｔｈａｔｃｈｅｒ）ら著、２００９年、プラント・ジャーナル（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．）、第５８巻、ｐ．９２７）。したがって、生体栄養性病原体、例えばウイルスに対する植物耐性を誘導することを意図して、ＪＡ経路を抑制し、ＳＡ経路を上方制御するための新しい方法を開発した。
【０３９６】
メディエータサブユニットは、植物における様々な生理学的経路を制御し、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において本明細書に提示する例によると、ＭＥＤ１８  ＭＥＤＩＡＴＯＲサブユニット遺伝子を突然変異させることにより、ＪＡシグナル伝達の抑制およびＳＡシグナル伝達の同時的上方制御が達成され得ることが示される。本実施例では、機能障害性のＭｅｄｉａｔｏｒ  １８サブユニットを伴うアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性Ｔ−ＤＮＡ挿入による突然変異体植物（ｍｅｄ１８）が、カブモザイクウイルス（Ｔｕｒｎｉｐ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＴｕＭＶ；図１６Ａ）を負荷したとき、ウイルス耐性を示したことを示す。内因性ＭＥＤ１８遺伝子の発現の改変は、ＪＡ媒介性の防御シグナル伝達の低減を引き起こすが、ＳＡ媒介性の防御シグナル伝達の増強を引き起こし、有意な（Ｐ＜０．０５）ウイルス耐性をもたらした。
【０３９７】
ＭＥＤ１８または多数の他の遺伝子の突然変異が、イントラジェニック方法において、例えば実施例３に示すような内因性（ゲノム由来配列）のみを含むアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｔ−ＤＮＡを導入することにより達成され得ることは理解されるであろう。あるいは、ＲＮＡｉまたはａｍｉＲＮＡ手法は、実施例４に示すようなイントラジェニック方法にて用いることで、遺伝子またはタンパク質の発現を抑制することができる。
【０３９８】
この有用な形質（防御シグナル伝達の修飾を介した植物におけるウイルス耐性）のための方法が他の植物において迅速に開発され得るか否かを試験するため、トマトのゲノムを、ＭＥＤ１８オルソログ（配列番号６４）の存在について探索した。次に、２つのトマト由来ａｍｉＲＮＡ配列（配列番号６５〜６６）を、実施例４に記載の通り、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）におけるアグロインフィルトレーションの使用によるルシフェラーゼレポータ遺伝子構築物の一過性遺伝子発現アッセイを用いて、トマトＭＥＤ１８の抑制について試験した。図１６Ｂに示すように、両構築物は、トマトＭＥＤ１８の抑制をもたらし、この方法を確認し、作物における耐病性（および潜在的には他の形質）を改善するための、本発明の遺伝子構築物の使用を意図した代替的方法を提供した（実施例７参照）。
【０３９９】
シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｍｅｄ１８突然変異体のさらなる試験によると、３つの他のウイルスに対する耐性が示された。図１６Ｃに示すように、これらは、ＣＭＶ、ＣａＭＶおよびツルノゲイトウ属モザイクウイルス（Ａｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｌｔＭＶ）を含む。ＴｕＭＶと共に、これは、潜在的には耐性がイントラジェニック手法を用いて達成され得る、４つの異なるウイルスファミリーを含む。これは、十分に研究されたモデル植物、例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）を用いて、作物形質に対する新しいイントラジェニック方法を迅速に開発するための強力な手法を示す。
【０４００】
実施例７．作物ウイルスに対する耐性を改善するための生理学的経路の調節
実施例６に示すように、十分に研究されたモデル植物、例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）は、作物における新しい遺伝子内形質発現を発生させるのに有用である。
【０４０１】
植物病原体は、２つのグループ：それらの栄養分（生体栄養性および半生体栄養性）を抽出するために生細胞に依存するものおよび死細胞からの栄養分に依存して生きるもの（死体栄養性）に大別され得る。植物ウイルスは、偏性生体栄養性病原体である。シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）についての実施例６に示すように、ウイルス感染細胞の局所的プログラム細胞死は、生体栄養性病原体、例えば異なるタイプのウイルスによる植物の全身感染を予防するための植物における好適な応答である（図１６）。植物における病原体に対処するための一方法は、予測される感染に先立ち、植物防御経路を調節することにより、植物を調製することである。メディエータサブユニットは、植物における様々な生理学的経路を制御し、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびトマト植物における本明細書中に提示される例によると、ＭＥＤ１８サブユニット遺伝子を突然変異させるかまたは下方制御することにより、ＪＡシグナル伝達の抑制およびＳＡシグナル伝達の同時的上方制御が達成され得ることが示される。さらに、それらは、この手法がオルソロガス遺伝子の迅速な同定をもたらし得ることを示す。
【０４０２】
ａｍｉＲＮＡ２７（配列番号６６）によって標的化された、トマトにおけるＭＥＤ１８について同定された有望なオルソログ（配列番号６４）を、ウイルス耐性についての遺伝子内形質のさらなる発現に対して選択した。最初に、ルシフェラーゼアッセイにて得られた実験（図１６Ｂ）を反復し、この手法における信頼性をさらに高めた。図４５に示すように、ａｍｉＲＮＡ２７は、ＭＥＤ１８標的配列を有意に（Ｐ＜０．００１；スチューデントｔ検定）下方制御し、過去のデータが確認された。次に、トマト植物を、スブラマニアン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ）ら著、上記の方法を用いて、標準のバイナリーベクター（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータ、ａｍｉＲＮＡ２７およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＯＣＳターミネータを含むｐＡｒｔ２７）で形質転換し、ａｍｉＲＮＡ２７を過剰発現させた。ＰＣＲ陽性系統をクローン的に増殖し、クローンを、ａｍｉＲＮＡ２７の発現およびＭＥＤ１８のノックダウンについてｑＲＴ−ＰＣＲで試験した。
【０４０３】
図４５に示すように、これらの植物において高いａｍｉＲＮＡ２７の発現が達成され（ＧＡＰＤＨ転写物よりも最大で６０倍高い発現）、その結果、植物においてＭＥＤ１８の発現が有意に（Ｐ＜０．０５；スチューデントｔ検定）下方制御された。それらの表現型外観は、より活発な成長とともに、植物の丈の増加および葉の拡大（図４５）、正常サイズの果実であるものの種子数の減少、を含んだ（実施例９および１１を参照）。その結果として、ウイルス耐性が予測されたモデル植物（シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））におけるＣＭＶ耐性について試験するため、苗条脱落アッセイを開発した。高さが約１５ｃｍであり、同等の発生段階の苗条は、植物（野生型およびＭＥＤ１８に損なわれた植物）から脱落した。上記のように、これらは、ＣＭＶを機械的に接種し、その後、水保持装置内で保持した。接種後２週目、新規に発生した葉において、ＣＭＶの存在をｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。図４５に示すように、ＭＥＤ１８が下方制御された植物は、野生型植物よりも有意に低いＣＭＶの増殖を示したが、これらの植物において確かにウイルス耐性があることが示される。
【０４０４】
ＭＥＤ１８または多数の他の遺伝子の下方制御が、イントラジェニック方法において、例えば実施例３に示すような内因性（ゲノム由来配列）のみを含むアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｔ−ＤＮＡを導入することにより達成され得ることは理解されるであろう。あるいは、ＲＮＡｉ手法は、実施例４に示すようなイントラジェニック方法にて用いることで、遺伝子またはタンパク質の発現を抑制することができる。
【０４０５】
実施例８．非ウイルス性病原体に対する耐病性を付与するためのイントラジェニック手法の使用
様々なイントラジェニック手法（ａｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、経路調節）が実施例４〜６における様々なウイルス性病原体に対する耐性について実証されていることから、この手法の他の非ウイルス性病原体に対する耐性付与への適用が可能であるか否かが本発明の目的であった。これらの方法の１つがモデル植物シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の使用とともに示されていたが、ここでは、生理学的経路の調節により、植物が生体栄養性病原体に対する迅速な耐性を発現する能力を獲得可能であることを実証することができた。
【０４０６】
特に、ＪＡ防御経路の下方制御は、ＳＡ経路の上方制御をもたらし得、それは一部の態様ではＪＡシグナル伝達に対して拮抗的方法で作用する。経路間でなされるこの決定が、植物が、耐性を可能にする適切な経路（すなわち、生体栄養性／半生体栄養性病原体に対するＳＡ経路ならびに死体栄養性病原体および吸汁性昆虫に対するＪＡ経路）を備えることを可能にすると考えられる。しかし、多数の病原体が、植物における防御シグナル伝達のためのこのハードな配線を、不適切な経路を故意に誘導することにより乗っ取るように見える。例えば、半生体栄養性細菌病原体シュードモナス・シリンガエｐｖ．トマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）および他の植物におけるＪＡ防御シグナル伝達経路を誘導し得る、ＪＡ模倣物のコロナチンを生成する。この経路は、反応性酸素種の産生、過敏反応およびプログラム細胞死を阻止または低減し、それは通常であれば生体栄養性病原体に対する最も有効な応答となる。
【０４０７】
したがって、本発明の目的として、イントラジェニック方法におけるＪＡシグナル伝達の下方制御（および関連するＳＡシグナル伝達の上方制御）が、植物ウイルス以外の生体栄養性病原体に対する耐性を付与し得るか否かを試験した。最初に、葉脱落アッセイを、トマトにおけるシリンジ浸潤を用いて、シュードモナス・シリンガエｐｖ．トマト（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）に対して開発した。耐病性は、接種後５日目、定量ＰＣＲを用いて、症状のスコア化および病原体の定量化により、巧みに評価することができた。次に、野生型およびＭＥＤ１８が損なわれたトマト植物（実施例６からのＪＡシグナル伝達の低下を伴う）を、シュードモナス・シリンガエｐｖ．トマト（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）接種実験において用いた。
【０４０８】
図４６に示すように、シュードモナス・シリンガエｐｖ．トマト（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）のシリンジ浸潤を有する葉が、接種後５日目、明らかな病変および黄変症状を示した一方で、モック接種葉は黄変を示さなかったが、一部の創傷誘導性病変を認めることができた。ＭＥＤ１８が下方制御された植物における創傷誘導性病変が明らかにより顕著であることが認められたが、これらの植物がプログラム細胞死をもたらすようなより強力な過敏反応を起こす能力を有することが確認される。これは、これらの植物の高まったＳＡシグナル伝達能力から予測される形質に合致する。
【０４０９】
トマトＧＡＰＤＨゲノム配列と相対的なシュードモナス・シリンガエｐｖ．トマト（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）の定量化を、シュードモナス・シリンガエｐｖ．トマト（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）におけるＧｙｒａｓｅをコードする遺伝子に特異的なプライマーを用いる定量ＰＣＲを通じて達成した。図４６に示すように、すべての接種葉でシュードモナス・シリンガエｐｖ．トマト（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）が増殖された一方で、モック接種葉はこれらの細菌を数量化できる量で含まなかった。特に、ＭＥＤ１８が下方制御された植物からの葉は、野生型植物よりも植物細胞あたりで有意に（Ｐ＝０．０１１；スチューデントｔ検定）減少した細菌を示したが、このイントラジェニック手法がまた、作物に対する細菌への耐性を付与するための有効な方法を提供することが示される。他の生体栄養性および半生体栄養性病原体（例えば、真菌病原体のフザリウム・エスピー（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．））に対する耐性が予想可能であり、これらの病原体に対する試験が進行中である。
【０４１０】
実施例９．作物における非生物的ストレス耐性をもたらすためのイントラジェニック手法の使用
作物体系における非生物的ストレス、例えば、塩分、乾燥、高温、低温および洪水は、年間、数十億ドルの収量減少を引き起こす。かかるストレスはまた、食料安全保障および増加する世界人口における主要な課題であるように、作物栽培用の土地の利用を甚だしく制限する。例えば、耕地面積の拡大もまた、過剰な灌漑実施によって引き起こされることが多い高い土壌塩分による影響を受ける。オーストラリア単独では、土地の１２％が塩分ひいては乾燥による影響を受けることが推定される。したがって、非生物的ストレス耐性が増強された作物栽培品種を開発することが急務である。
【０４１１】
米は、数十億人の食を賄う主要な作物である。したがって、本実施例において、内因性（遺伝子内）ゲノム配列のみを用い、外来配列を用いない耐塩性イネ品種を開発した。本実施例に記載のこの完全にイントラジェニック手法が、他のイネ栽培品種および他の重要な作物に適用可能であることは理解することができる。
【０４１２】
最初に、オーストラリアや他の場所において市販作物として広範に利用されるイネ変種を同定した。栽培品種ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）Ｒｅｉｚｉｑは、高収率能を有することが栽培者の間で有名であるが、非生物的ストレス、特に低温および塩分に対する耐性が欠如している。したがって、この変種は、耐塩性のための形質を含む、非生物的ストレス耐性の遺伝子内導入のための理想的候補と考えられた。その商業化により、塩分による影響を受ける世界中の多くの地域を含めることによる栽培の拡大化がもたらされ得る。
【０４１３】
本実施例の目的として、最初に、Ｒｅｉｚｉｑ変種のため、新しい形質転換プロトコルを確立する必要があった。培地は次の通りであった。カルス誘導培地は、ＬＳ基本培地、ＬＳビタミン、５００ｍｇ．Ｌ−１のグルタミン、５０ｍｇ．Ｌ−１のトリプトファン、３％スクロース、２．５ｍｇ．Ｌ−１の２，４−Ｄおよび５％Ｐｈｙｔａｇｅｌを含んだ。再生培地は、ＭＳ基本培地、Ｇａｍｂｏｒｇｅ  Ｂ５ビタミン、１ｍｇ．Ｌ−１のＮＡＡ、３ｍｇ．Ｌ−１のＢＡＰ、１ｍｇ．Ｌ−１のキネチン、３％スクロースおよび５％Ｐｈｙｔａｇｅｌを含んだ。選択培地（１）は、２００ｍＭ  ＮａＣｌを有する再生培地を含んだ。選択培地（２）は、１００ｍＭ  ＮａＣｌを有する再生培地を含んだ。選択培地（３）は、２５ｍＭ  ＮａＣｌを有する再生培地を含んだ。
【０４１４】
種子表面滅菌法は、種子の脱殻、脱殻種子の７０％エタノールへの浸漬および３０秒間の振盪、その後の種子の３滴のツイーン２０を含有する４％（ｍ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム溶液への２０分間の浸漬および振盪、次いで種子を滅菌蒸留水で５回すすいでブリーチを洗い流すこと、を含んだ。
【０４１５】
体細胞胚形成カルス誘導方法は、１５〜２０の種子を層状気流中の各ペトリ皿に置くことと、カルス誘導培地において種子を軽く押すことと、体細胞胚形成カルスを生成するため、ペトリ皿を暗室内に３〜４週間置くこととを含んだ。次に、体細胞胚形成カルスを、カルス誘導培地における形質転換または継代培養のために直接的に用いた。形質転換用に１４〜２０日齢の胚形成カルスを用いることは、有利であることが見出された。
【０４１６】
微粒子銃および形質転換ステップは、精製したプラスミドＤＮＡを対応するフランキング制限部位（残存するヌクレオチドが遺伝子内配列の一部を形成する）で切断することによる遺伝子内ＤＮＡ断片の調製、その後の電気泳動を受けたアガロースゲルからの断片の精製、を含んだ。あるいは、合成されたＤＮＡを直接的に用いることができる。胚形成カルスの微粒子銃は、１μｇ／μＬの線状精製ＤＮＡ１０μＬを用い、金粒子（０．６μｍの直径）を用いて実施した。２つのＤＮＡ断片の同時照射においては、各断片から５μｇを用いた。少なくとも１０μｇのカルスを選択培地（１）を含有するプレートの中央に位置づけ、遺伝子内ＤＮＡ断片を照射した。
【０４１７】
選択ステップは、プレートを暗所に３日間置くことと、カルスの選択培地（１）に継代することとを含んだ。次に、１０日後、健常なカルスを選択培地（２）に継代した。次に、緑色（生存）カルスを、葉が出現するまで、選択培地（３）に継代した。十分な根の形成後、植物を土壌に慎重に移し、透明プラスチック容器を植物の最上部に置くことにより寒さに慣れさせた。
【０４１８】
イネ植物に耐塩性を付与することを目的として、Ｒｅｉｚｉｑ胚形成カルスを、制限酵素ＮｈｅＩおよびＰｍｌ１で切断後、配列番号７８で示す遺伝子内ＤＮＡ断片ＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａで形質転換した。次に、遺伝子内耐塩性イネ植物を上記のように作製し、再生した。図４７に示すように、これらのイネ植物は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有培地中で成長することができた一方で、対照植物はこれらの条件で全く生存しなかった。１００ｍＭの塩濃度は、６ｐｐｔの塩分含有量（または１７％の海水濃度）に対応する。耐塩性の最大範囲およびこれが収量および穀粒品質にいかに影響し得るかを判定するため、この新しいイネ栽培品種を用いた現行試験が進行中である。これらの植物における他の非生物的ストレス耐性もまた予想可能であり、この目的で追加的試験が計画される。
【０４１９】
上記の新しいイネ変種は、比較的強力なほぼ恒常的なプロモータ（ＡＣＴＩＮ１）によって媒介される耐塩性を有する。当該技術分野で経験される場合においては、植物が耐塩性を付与するための追加的資源を割り当てる必要があることから、イネにおけるＤＲＥＢ１Ａ媒介性経路の連続的活性化が幾らかの収量損失をもたらし得るか否かの課題が生じ得る。この潜在的課題を克服するため、イネＡＢＡ誘導性プロモータＮＣＥＤ３を含む別の構築物でのイネ形質転換を試験した。ＡＢＡシグナル伝達は、典型的には植物における非生物的ストレスの間に活性化され、それ故、非生物的ストレスの不在下での成長中の植物により、資源が全くまたはほとんど用いられないことが予想され得る。結果として、ＮＣＥＤ３プロモータ媒介性のＡＢＡ誘導性ストレス耐性を有する植物がストレスのない条件下で成長する場合であれば、収量損失が予想されないことになる。
【０４２０】
ＡＢＡ誘導性耐塩性をイネ植物に付与することを目的として、Ｒｅｉｚｉｑ胚形成カルスを、制限酵素ＦｓｐＩで切断後、配列番号７９で示す遺伝子内ＤＮＡ断片ＮＣＥＤ３：ＤＲＥＢ１Ａ：ＮＣＥＤ３で形質転換した。次に、遺伝子内耐塩性イネ植物を上記のように作製し、再生した。図４８に示すように、これらのイネ植物は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有培地中で成長することができた一方で、対照植物はこれらの条件で全く生存しなかった。耐塩性の最大範囲を判定するため、この新しいイネ栽培品種を用いた現行試験が計画される。収量および穀粒品質が損なわれないことが予想される。これらの植物における他の非生物的ストレス耐性もまた予想可能であり、この目的で追加的試験を実施することになる。
【０４２１】
耐塩性および他の非生物的ストレス耐性が、イネひいては他の作物におけるイントラジェニック方法において、上記の例で示すイントラジェニック方法を用いることにより付与され得ることは理解することができる。
【０４２２】
実施例１０．作物における植物構造および外観を修飾するためのイントラジェニック手法の使用
植物構造および外観における改変は、作物における望ましい形質である。例えば、穀類における矮性変種は、より高い収量およびより早期の収穫を可能にし、「緑の革命」の一部を形成した。矮性変種は、多くの結果樹において容易な収穫を可能にするのに望ましい一方で、より高くてふさふさした変種は、他の植物、例えばブルーベリーにおいて望ましい。豊かな葉をもたらす飼料植物は望ましく、より頑丈で強力な茎であれば、バナナ植物に、サイクロン耐性を可能にするような利点を提供できる。果実では、多くの改善点、例えば、果実サイズ、香りの増加および種子の減少が望ましい。
【０４２３】
本明細書に記載の通り、イントラジェニック技術は、作物の植物構造および外観を修飾するという選択肢を提供し得る。この可能性を探索するため、一組の植物ＭｅｄｉａｔｏｒサブユニットをイントラジェニックａｍｉＲＮＡ技術により取り組んだ。植物Ｍｅｄｉａｔｏｒは、植物プロモータのＴＡＴＡボックスに結合するＲＮＡポリメラーゼＩＩと、典型的にはＴＡＴＡボックスの上流に位置するプロモータ内の他のシスエレメントに結合する転写因子との間を関連づける。メディエータ複合体は、約３０のサブユニットからなり、それらの一部は様々な転写因子に結合する。したがって、異なるＭｅｄｉａｔｏｒサブユニットは、植物における様々な生理学的経路におけるシグナル伝達および調節性制御ユニットを提供する。この特徴は、ＪＡシグナル伝達の低減ならびにウイルスおよび細菌病原体に対する生物的ストレス耐性の増加を示したＭＥＤ１８に損なわれた植物についての実施例６において既に探索していた。
【０４２４】
それらの表現型外観の評価により、これらの植物が、図４９に示すような植物の丈の増加および葉の拡大を伴うより活発な成長を示すことが示された。植物は、サイズは正常であるが種子数が減少した果実を生成した。これらの植物がこの段階で果実収量における変動を示すか否かは試験しないままであるが、植物の丈の増加、葉の拡大（より豊か）および種子重の減少を伴う植物は、農夫または消費者のいずれかに幾つかの利点をもたらし得る。
【０４２５】
細胞質雄性不稔は、Ｍｅｄｉａｔｏｒサブユニット調節に対するイントラジェニック手法を用いて探索するべきもう一つの形質である。というのは、これは、これらの植物を親系統として用いることができ、得られる子孫が純種であることを望まない種子企業にとっての商業的価値がある形質であるからである。これは市販トマト変種に共通の特徴であり、栽培者にとって種子を種子企業から購入することが求められる。
【０４２６】
トマトにおける他のＭｅｄｉａｔｏｒサブユニットの調節が望ましい植物の構造的形質をもたらし得るか否かを試験するため、推定上のＭＥＤ２５オルソログ（配列番号９６）をトマトにおいて同定し、遺伝子内ａｍｉＲＮＡ（配列番号９７；図５０）をその下方制御に対して設計した。図５０に示すように、上記のベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）において二重ルシフェラーゼアッセイを用いるとき、ａｍｉＲＮＡ６はトマトＭＥＤ２５配列を有意に（Ｐ＜０．００１；スチューデントｔ検定）下方制御することができた。ＡｍｉＲＮＡ９をｐＩｎｔｒＡに挿入し、トマト植物を上記のように形質転換した。９つのＰＣＲ陽性形質転換体（系統）を、ａｍｉＲＮＡ６の発現およびＭＥＤ２５のノックダウンについてｑＲＴ−ＰＣＲを用いて試験した。図５０に示すように、野生型植物と比べて、９つすべての系統がａｍｉＲＮＡ６を発現し、ＭＥＤ２５の発現は、作製したすべての系統において有意に（Ｐ＜０．０５）低下した。
【０４２７】
これらの植物の表現型外観は、野生型植物とは著しく異なり、小さいままの植物の丈、より豊かな植物、渦巻いた葉の拡大および葉の黄班を含んだ。これは、植物構造および外観を改変するため、本発明で示されるようなイントラジェニック手法を用いることができることを示す。改変された植物構造および外観が、トマト、ひいては他の作物に、上の例に示すイントラジェニック方法を用いることにより、イントラジェニック方法で付与され得ることは理解することができる。
【０４２８】
実施例１０．作物の栄養価の改善
食物供給源としての植物の栄養価は、疑いなく消費者によって高く評価されている形質である。したがって、改善された栄養価を有する遺伝子内植物は、消費者利益に直結し、容易に受け入れられることを見出す可能性が高い。栄養価が増加した植物は、タンパク質、ビタミン、ミネラル、抗酸化剤、多価不飽和脂肪酸のレベル上昇を有するものを含んでもよい。消費者の健康にとって有利であると重視されている１つの特定の栄養的局面は、果実および野菜におけるアントシアニン含量である。アントシアニンレベルが上昇したこれらの「スーパーフード」の一部は、ブルーベリー、ムラサキニンジン、ビートルートおよびクイーンガーネットプラムを含む。特に、摂取食品におけるアントシアニンレベルの上昇は、血圧低下や他の心血管およびがんを予防する効果をもたらしている。
【０４２９】
本発明の目的として、また食用作物の栄養価を高めるため、野生型植物よりも上昇したアントシアニンレベルを含有するトマトおよびイネ植物双方を作製した。トマト植物は、以前に記載のように、天然ＡＣＴＩＮプロモータおよびＲｂｃＳ３ＣターミネータによってフランキングされたトマトＡＮＴ１遺伝子を含む配列番号６９で示す構築物で形質転換した。植物は、着果段階およびそれらの果実色を評価するまでガラス温室内で生育した。図５１に示すように、現れてくるトマト果実は、見かけ上は、それらの高いアントシアニンレベルを示す紫色の外観を有した。
【０４３０】
さらに、市販の広く消費されている主要な食用作物の栄養価を改善するため、米粒中のアントシアニンレベルを上昇させるための完全に遺伝子内のカセットを宿す新しいＲｅｉｚｉｑイネ栽培品種の植物を作製した。イネ栽培品種Ｒｅｉｚｉｑ植物は、ＡＣＴＩＮ１：ＤＲＥＢ１Ａ：ＤＲＥＢ１Ａカセットに加えて天然Ｒ１Ｇ１ＢプロモータおよびターミネータによってフランキングされたイネＯＳＢ２遺伝子を含む、配列番号９８で示す遺伝子内構築物を用いて上記のように形質転換した。微粒子銃に先立ち、遺伝子内ＯＳＢ２カセットを、ＦｓｐＩおよびＡｐａｌＩ制限酵素により切断することにより、切除および精製した。イネＲ１Ｇ１Ｂプロモータおよびターミネータカセットは、対応する遺伝子が成熟した米粒の胚乳中で最も強力に発現することから選択した。植物は、図５１に示すように巧みに作製したが、現在、米粒中のアントシアニンレベルを測定するだけの成熟度に至るまで生育している。これらの植物の消費者受容性は、これらの植物が直接的な消費者の利益をもたらし、完全にイントラジェニックであることから、高くなるものと予想される。さらに、それらは、この変種の栽培者に利益を与え得る、遺伝子内ＤＲＥＢ１Ａカセットによって媒介される改善された非生物的ストレス耐性を提示する可能性が高い。将来的な他の変種との交雑については、これらの植物が育種プログラムに組み込まれるものと予測することができる。
【０４３１】
アントシアニンレベルの上昇および他の改善された栄養価が、トマト、イネ、ひいては他の作物に、上の例に示すイントラジェニック方法を用いることにより、イントラジェニック方法で付与され得ることは理解することができる。
【０４３２】
実施例１１．他の消費者に好都合な形質
新しい作物品種の利益は、それらが既存の植物生成物に対する改善を経る場合、消費者によって最も良く理解され得る。本発明の目的として、また本特許中で示すイントラジェニック技術が消費者の経験に直接的利益をもたらすことにより有用であるような状況をつくるため、２つの改善された作物変種を作製した。これらは、心臓形状トマトおよび香り米を含む。
【０４３３】
心臓形状トマトは、その色およびオリジナルな形状に基づいて消費者に人気があることが判明することがある。それがその消費者の経験を高める可能性を有することから、この生成物に対する潜在的市場が存在する。香り（ジャスミン）米は、調理後に放出される揮発物に基づいて、この米に対してより高額を支払う用意がある消費者に既に人気がある。したがって、これらの消費者に好都合な形質は、本発明で説明されるイントラジェニック技術における例として選択した。
【０４３４】
心臓形状トマトを生成する植物は、タイプＢヘテロ三量体Ｇタンパク質のγサブユニット（ＧＧＢ１）をコードするトマト遺伝子のＲＮＡｉ媒介性下方制御により作製した。近年、トランスジェニックの様式でのこの遺伝子の下方制御は、それが先のとがった果実をもたらしたＭｉｃｒｏＴｏｍトマトについて、記載がなされている（スブラマニアン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ）ら著、上記）。この遺伝子の転写物配列は配列番号９９で示す。
【０４３５】
ＡＣＴＩＮプロモータ−ターミネータ発現カセット（ｐＩｎｔｒａＡ）内に遺伝子内ＲＮＡｉ構築物を作製するため、最初に長い「フォワード」断片を、ＡＣＴＩＮプロモータの末端を補完するＦプライマー  ５’ＰｈｏｓＧＡＴＴＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣ（配列番号１４９）および一時的なＭｆｅＩ制限酵素部位を作成するために３つのヌクレオチドを付加するＲプライマー  ｔｃｃｃａａＴＴＧＴＣＡＡＧＴＴＧＡＡＡＣＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＴＡＴＡＡＣ（配列番号１５０）を用いて増幅した。より短い「リバース」断片は、一時的なＭｆｅＩ制限酵素部位を作成するために３つのヌクレオチドを付加するＦプライマー  ｔｃｃｃａａＴＴＧＧＧＡＡＧＴＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡＣＡＡＡＡＣＡＴＡＣＴＴＡＣＣＴ（配列番号１５１）およびＡＣＴＩＮターミネータの開始部位を補完するＲプライマー  ５’ＰｈｏｓＣＴＡＣＡＡＡＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＣ（配列番号１５２）を用いて増幅した。断片はＭｆｅＩを用いて制限し、ＨｐａＩおよびＰｍｌＩで切り出したｐＩｎｔｒＡを用いる１回のライゲーションで構築した。ＭｆｅＩ部位を長い断片と短い断片との間にライゲートするとき、その半分は長い断片に属し、残り半分は短い断片に属する。インサートの方向は、プロモータおよびターミネータの相補性について検証した。ＬＢおよびＲＢ断片を包含する完全な遺伝子内構築物は、配列番号１００および図５２で示す。
【０４３６】
トマト形質転換（ｃｖ．Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）は、配列番号１００の構築物を、上の例に記載の通り、形質転換植物の選択用のＡＮＴ１およびＮＰＴＩＩ遺伝子双方を含むマーカ遺伝子カセットと同時形質転換することにより実施した。紫色の植物（その陽性形質転換状態を示す）を選択し、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、遺伝子発現についてさらに試験した。ＡＮＴ１遺伝子の発現を伴わない他の植物もまた選択した。これらの植物により作製したトマト果実は、各々、紫色または赤色いずれかの果実色の、先がとがり、心臓形状の外観であることが予想される。
【０４３７】
米は主要な食用作物である。消費者に好都合なものをイントラジェニック方法で開発することを目的として、高い香り米の栽培品種を、現在この形質を有しない、人気の高いオーストラリア変種（Ｒｅｉｚｉｑ）から開発した。この形質を達成するための本発明に記載のイントラジェニック手法が他のイネ栽培品種やおそらくは他の重要な作物に適用可能であることは理解することができる。
【０４３８】
高収量の可能性を有する栽培品種ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）Ｒｅｉｚｉｑは、栽培者間で人気があるが、典型的にはジャスミン（香り）米において見出される香りが欠如する。米における香りは、米におけるＢＡＤＨ２遺伝子の発現を破壊することにより、得ることができる。したがって、イネ胚乳において発現する、内因性Ｒ１Ｇ１Ｂプロモータおよびターミネータを有するＢＡＤＨ２  ＲＮＡｉカセットを構築した。完全カセットは、配列番号１０１で示す。イネカルスの微粒子銃に先立つこのＤＮＡカセットの切除は、ＦｓｐＩ制限酵素およびアガロースゲル電気泳動サイズ断片化を用いて達成している。潜在的な香りを有する開発中の遺伝子内イネ植物を図５３で示す。
【０４３９】
本明細書全体を通じて、目的は、本発明を任意の一実施形態または特徴の具体的コレクションに限定することなく、本発明の好ましい実施形態を説明することであった。本発明から逸脱することなく説明および例示される実施形態に対して、様々な改変および修飾を行ってもよい。
【０４４０】
本明細書中で参照される特許および科学文書、コンピュータプログラムおよびアルゴリズムの各々の開示は、その全体が参照により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１７−８】
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【図１７−９】
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【図１７−１０】
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【図１７−１１】
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【図１７−１２】
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【図１７−１３】
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【図１７−１４】
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【図１７−１５】
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【図１７−１６】
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【図１７−１７】
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【図１７−１８】
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【図１７−１９】
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【図１７−２０】
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【図１７−２１】
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【図１７−２２】
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【図１７−２３】
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【図１７−２４】
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【図１７−２５】
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【図１７−２７】
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【図１７−２８】
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【図１７−２９】
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【図１７−３０】
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【図１７−３１】
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【図１７−３２】
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【図１７−３３】
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【図１７−３４】
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【図１７−３５】
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【図１７−３６】
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【図１７−３７】
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【図１７−３８】
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【図１７−３９】
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【図１７−４０】
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【図１７−４１】
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【図１７−４２】
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【図１７−４３】
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【図１７−４４】
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【図１７−４５】
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【図１７−４６】
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【図１７−４７】
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【図１７−４８】
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【図１７−４９】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３６−３】
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【図３６−４】
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【図３６−５】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４０−３】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４３−３】
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【図４３−４】
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【図４３−５】
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【図４３−６】
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【図４４】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月30日(2018.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐病性形質、非生物的ストレス耐性形質、および形態学的形質からなる群から選択された植物の形質を改変または修飾するための植物の遺伝子材料への挿入に適応した１つ以上の核酸断片を含む組換え遺伝子構築物であって、前記１つ以上の核酸断片の各々が、１つ以上の植物に由来する少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、植物の遺伝子材料に前記１つ以上の核酸断片が挿入されると、前記植物の前記遺伝子材料に挿入されたヌクレオチド配列が、前記植物由来のヌクレオチド配列からなる、組換え遺伝子構築物。
【請求項２】
１つ以上の植物に由来する前記ヌクレオチド配列が１つの植物に由来する、請求項１に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項３】
１つ以上の植物に由来する前記ヌクレオチド配列が、同じ種の複数の植物に由来する、請求項１に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項４】
植物の遺伝子材料に挿入可能である前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片の全長が、少なくとも１００塩基対；少なくとも５００塩基対；少なくとも１０００；少なくとも２０００塩基対；または少なくとも３０００塩基対である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項５】
植物の遺伝子材料に挿入可能である前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片が、植物における１つ以上の発現用のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項６】
植物における発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列が、前記植物の形質を改変または修飾するための前記植物における発現に適応されている、請求項５に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項７】
植物における発現用の前記ヌクレオチド配列が、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項５または請求項６に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項８】
前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号３８〜４６、７６、７８、もしくは９８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項７に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項９】
植物における発現に適した前記１つ以上のヌクレオチド配列が、非タンパク質コードヌクレオチド配列である、請求項５または請求項６に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１０】
前記非タンパク質コードヌクレオチド配列が、１つ以上のスモールＲＮＡヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１１】
発現用の前記非タンパク質コードヌクレオチド配列が、配列番号１２〜２６、６４〜６６、８０〜８１、８３〜９２、９４、もしくは９６〜１０１で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１０に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１２】
植物における発現用の前記１つ以上のヌクレオチド配列が、１つ以上の選択可能マーカヌクレオチド配列を含む、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１３】
前記選択可能マーカヌクレオチド配列が、配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または配列番号１１９で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１２に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１４】
植物の遺伝子材料に挿入可能である前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片が、１つ以上の制御ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１５】
前記制御ヌクレオチド配列が、１つ以上のプロモータ配列を含む、請求項１４に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１６】
前記プロモータが、配列番号４〜７、６７、７３、７４、７６、７８、もしくは９８で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１５に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１７】
前記制御配列が、１つ以上のターミネータ配列を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１８】
前記ターミネータが、配列番号８〜１１、１０６、１０８、１１１、もしくは１１２で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１７に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項１９】
植物の遺伝子材料に挿入可能な前記１つ以上の核酸断片のフランキング配列またはそれらを囲むフランキング配列をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２０】
前記フランキング配列が制限消化部位を含む、請求項１９に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２１】
前記フランキング配列が、配列番号１０２、１０３、１０９、１１０、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、もしくは１２１で示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２０に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２２】
第１の境界ヌクレオチド配列；
第２の境界ヌクレオチド配列；および
前記第１の境界ヌクレオチド配列と前記第２の境界ヌクレオチド配列との間に位置する１つ以上の追加的ヌクレオチド配列
を含み、ここで前記追加的ヌクレオチド配列、および前記追加的ヌクレオチド配列に隣接した前記第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部が、１つ以上の植物に由来する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２３】
前記１つ以上の追加的ヌクレオチド配列に隣接した前記第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部が、１つ以上の植物に由来し、ここで前記１つ以上の植物が、前記追加的ヌクレオチド配列および前記第１の境界ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部が由来する同じ１つ以上の植物である、請求項２２に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２４】
１つ以上の植物に由来する少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなる、植物の遺伝子材料に挿入可能な前記１つ以上の核酸断片が、
（ｉ）１つ以上の植物に由来する前記第１の境界ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部；
（ｉｉ）前記１つ以上の植物に由来する前記１つ以上の追加的ヌクレオチド配列；および任意選択的には、
（ｉｉｉ）１つ以上の植物に由来する前記第２の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部
からなる、請求項２２または請求項２３に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２５】
前記第１の境界配列が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性Ｔ−ＤＮＡ植物形質転換において機能的な右境界ヌクレオチド配列に属する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２６】
前記第２の境界ヌクレオチド配列が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性Ｔ−ＤＮＡ植物形質転換において機能的な左境界ヌクレオチド配列に属する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
【請求項２７】
配列番号１〜３５、４９、５１〜５６、６６〜６８、７１〜９２、もしくは９４〜１０１で示されるヌクレオチド配列、または配列番号３８〜４６で示されるアミノ酸配列をコードする核酸、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物。
【請求項２８】
組換え遺伝子構築物を作製するための方法であって、耐病性形質、非生物的ストレス耐性形質、および形態学的形質からなる群から選択された植物の形質を改変または修飾するための植物の遺伝子材料への挿入に適応した１つ以上の核酸断片を１つ以上の植物から誘導するステップを含み、ここで前記１つ以上の核酸断片が少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、それにより前記組換え遺伝子構築物を作製し、植物の遺伝子材料に前記１つ以上の核酸断片が挿入されると、前記植物の前記遺伝子材料に挿入されたヌクレオチド配列が、前記植物由来のヌクレオチド配列からなる、方法。
【請求項２９】
第１の境界ヌクレオチド配列および第２の境界ヌクレオチド配列を１つ以上の追加的ヌクレオチド配列の各末端に付加するステップを含み、ここで前記１つ以上の追加的ヌクレオチド配列および前記第１の境界ヌクレオチド配列の少なくとも一部が１つ以上の植物に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２８または請求項２９に記載の方法によって作製される組換え遺伝子構築物。
【請求項３１】
前記ヌクレオチド配列が由来するかまたは由来し得る元の前記１つ以上の植物が、ベシタブリア（Ｖｅｇｅｔａｂｉｌｉａ）、アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）、緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）、または有胚植物（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）という分類の生物であるかまたはそれを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物、または請求項２８もしくは請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記植物が単子葉植物または双子葉植物である、請求項３１に記載の組換え遺伝子構築物または方法。
【請求項３３】
前記植物が、サトウキビなどのイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）ファミリーの草；綿などのワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）種；イチゴなどのベリー；リンゴおよびオレンジなどの果樹ならびにアーモンドなどの堅果類を含む樹種；バラなどのバラ科植物を含む、観賞顕花植物などの観賞植物；ブドウなどのブドウ果実を含むブドウ；ソルガム、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、およびトウモロコシを含む穀類；大豆などのマメおよびピーナッツを含むマメ科種；トマトおよびジャガイモを含むナス科種；キャベツおよびオリエンタルマスタードを含むアブラナ属の種；カボチャおよびズッキーニを含むウリ科植物；バラを含むバラ科植物；レタス、チコリー、およびヒマワリを含むキク科植物、または前述の植物のいずれかの近縁種であるかまたはそれを含む、請求項３２に記載の組換え遺伝子構築物または方法。
【請求項３４】
前記植物が、トマト、イネ、およびソルガム、ならびにそれらの近縁種からなる群から選択される、請求項３３に記載の組換え遺伝子構築物または方法。
【請求項３５】
請求項１〜２８または３０〜３４のいずれか一項に記載の組換え遺伝子構築物、および骨格ヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項３６】
前記骨格ヌクレオチド配列が、骨格挿入マーカヌクレオチド配列を含む、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
前記骨格挿入マーカヌクレオチド配列が、配列番号３６もしくは配列番号３７、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
請求項１〜２８もしくは３０〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３９】
植物を遺伝的に改善する方法であって、請求項１〜２８または３０〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片を植物細胞または植物組織の遺伝子材料に挿入するステップを含み、ここで遺伝的に改善される前記植物が、前記遺伝子構築物の前記核酸断片の前記１つ以上のヌクレオチド配列が由来する前記１つ以上の植物の同じ種に属する、方法。
【請求項４０】
前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片が、前記植物細胞または植物組織のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換を介して、前記植物細胞または植物組織の前記遺伝子材料に挿入される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片が、直接形質転換を介して前記植物細胞または植物組織の遺伝子材料に挿入される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記植物細胞または植物組織の遺伝子材料に導入される前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片が、植物の遺伝子材料に挿入可能な前記遺伝子構築物の前記１つ以上の核酸断片からなる、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
遺伝的に改善された植物を選択するさらなるステップを含み、ここで前記植物の１つ以上の形質が、前記遺伝子構築物の前記少なくとも１つの核酸断片の前記植物の遺伝子材料への挿入の結果として改変または修飾される、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記形質が、前記植物の形質を改変または修飾するための植物における発現に適した前記遺伝子構築物の１つ以上のヌクレオチド配列の発現に従って修飾される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記植物の前記形質が、１つ以上のスモールＲＮＡ配列を含む前記植物における１つ以上の核酸の発現により、比較的に改善され、増強され、あるいは陽性に改変され、前記核酸が、植物病原体の１つ以上の核酸および／または内因性植物核酸の発現および／または複製を改変する能力がある、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記植物の前記形質が、１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子の発現により、比較的に改善され、増強され、あるいは陽性に改変される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記形質が耐病性である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記耐病性が、植物ウイルス；線虫；昆虫；および細菌植物病原体から選択される病原体に対する耐性である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記形質が非生物的ストレス耐性である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記非生物的ストレス耐性が耐塩性である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記形質が栄養的および／または嗜好性形質である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記形質が形態学的形質である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
請求項３９〜５２のいずれか一項に記載の方法に従って作製される植物または植物部分。
【請求項５４】
植物であって、組換え遺伝子構築物の少なくとも１つの核酸断片が前記植物の遺伝子材料に挿入されており、前記組換え遺伝子構築物が、耐病性形質、非生物的ストレス耐性形質、および形態学的形質からなる群から選択された植物の形質を改変または修飾するための植物の遺伝子材料への挿入に適応した１つ以上の核酸断片を含み、前記１つ以上の核酸断片が、１つ以上の植物に由来する少なくとも２０のヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列からなり、植物の遺伝子材料に前記１つ以上の核酸断片が挿入されると、前記植物の前記遺伝子材料に挿入されたヌクレオチド配列が、前記植物由来のヌクレオチド配列からなる、植物。
【請求項５５】
前記植物が、ベシタブリア（Ｖｅｇｅｔａｂｉｌｉａ）、アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）、緑色植物亜界（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）、または有胚植物（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）という分類の生物である、請求項３９〜５２のいずれか一項に記載の方法、または請求項５３もしくは請求項５４に記載の植物。
【請求項５６】
前記植物が単子葉植物または双子葉植物である、請求項５５に記載の方法または植物。
【請求項５７】
前記植物が、サトウキビなどのイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）ファミリーの草；綿などのワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）種；イチゴなどのベリー；リンゴおよびオレンジなどの果樹ならびにアーモンドなどの堅果類を含む樹種；バラなどのバラ科植物を含む、観賞顕花植物などの観賞植物；ブドウなどのブドウ果実を含むブドウ；ソルガム、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、およびトウモロコシを含む穀類；大豆などのマメおよびピーナッツを含むマメ科種；トマトおよびジャガイモを含むナス科種；キャベツおよびオリエンタルマスタードを含むアブラナ科種；カボチャおよびズッキーニを含むウリ科植物；バラを含むバラ科植物；レタス、チコリー、およびヒマワリを含むキク科植物、または前述の植物のいずれかの近縁種であるかまたはそれを含む、請求項５６に記載の方法または植物。
【請求項５８】
前記植物が、トマト、イネ、およびソルガム、およびそれらの近縁種からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法または植物。
【国際調査報告】
2019515693.tif 000133
2019515693.tif 000134
2019515693.tif 000135
2019515693.tif 000136
2019515693.tif 000137
2019515693.tif 000138
2019515693.tif 000139
2019515693.tif 000140
2019515693.tif 000141