(57)【要約】  本開示は、タイプ１自然リンパ球（ＩＬＣ１）へのタイプ２自然リンパ球（ＩＬＣ２）の変換を阻害することによって、肺炎症を伴う疾患または障害を処置または予防する方法を提供する。【選択図】図7
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然リンパ球（サブセット２）（ＩＬＣ２）の、自然リンパ球（サブセット１）（ＩＬＣ１）への変換を阻害する方法であって、前記ＩＬＣ２の、Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＦＮγ＋ＩＬＣ１へのスイッチを防止し、ＩＬＣ１におけるＩＬ−１２レセプタおよび／もしくはＩＬ−１８レセプタの発現レベルを維持もしくは抑制し、かつ／またはＩＬＣ２におけるＳＴ２、ＣＲＴＨ２、および／もしくはＧＡＴＡ３の発現レベルを維持し、もしくは増大させるモジュレータに前記ＩＬＣ２を接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記モジュレータは、インヒビタまたはアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インヒビタまたは前記アゴニストは、小分子、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体、およびそれらの抗原結合フラグメントから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記モジュレータは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ジスルフィド結合（ｄｓＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、または一本鎖抗体から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記モジュレータと接触する前記ＩＬＣ２は、肺に、または肺組織に局所化している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記モジュレータと接触する前記ＩＬＣ２は、循環ＩＬＣ２である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
肺炎症を伴う疾患または障害の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、前記対象に疾患修飾性医薬品を投与することを含み、前記対象は、ＩＬＣ１の所定のレベルと比較して、かつ／または１つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるＩＬＣ１のレベルと比較して、前記対象からとられた１つまたは複数のサンプルにおけるＩＬＣ１のレベルが高いと判定される、方法。
【請求項１０】
肺炎症を伴う疾患または障害の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、前記対象に疾患修飾性医薬品を投与することを含み、前記対象は、ＩＬＣ１／ＩＬＣ２の所定の比率と比較して、かつ／または１つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率と比較して、前記対象からとられた１つまたは複数のサンプルにおけるＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率が高いと判定される、方法。
【請求項１１】
肺炎症を伴う疾患または障害の悪化の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、前記対象に疾患修飾性医薬品を投与することを含み、前記対象は、ＩＬＣ１の所定のレベルと比較して、かつ／または１つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるＩＬＣ１のレベルと比較して、前記対象からとられた１つまたは複数のサンプルにおけるＩＬＣ１のレベルが高いと判定される、方法。
【請求項１２】
前記肺炎症は、タバコ煙、細菌感染、またはウイルス感染によって引き起こされる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患または前記障害は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記悪化は、タバコ煙、細菌感染、またはウイルス感染によって引き起こされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記肺炎症、または前記疾患もしくは前記障害の前記悪化は、ウイルス感染によって引き起こされる、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ウイルス複製と関連する領域へのＩＬＣ１の移動を阻害することをさらに含む、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
疾患修飾性医薬品による処置の候補としての、肺炎症を伴う疾患または障害と診断される患者を選択する方法であって、前記患者が、ＩＬＣ１／ＩＬＣ２の所定の比率と比較して、かつ／または１つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率と比較して、前記対象からとられた１つまたは複数のサンプルにおけるＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率が高いと判定されるならば、前記患者を処置のために選択することを含む、方法。
【請求項１８】
前記疾患修飾性医薬品は、ＩＬＣ１変換へのＩＬＣ２のモジュレータである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患修飾性医薬品は、気管支拡張薬、吸入ステロイド、組合せインヘラー、経口ステロイド、またはホスホジエステラーゼ−４インヒビタである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記モジュレータは、インヒビタまたはアゴニストである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記インヒビタまたは前記アゴニストは、小分子化合物、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体、およびそれらの抗原結合フラグメントから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記モジュレータは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ジスルフィド結合（ｄｓＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、または一本鎖抗体から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＬＣ１／ＩＬＣ２の所定の比率と比較して、かつ／または１つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率と比較して、前記対象からとられた１つまたは複数のサンプルにおけるＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率が高いという前記判定、あるいはＩＬＣ１の所定のレベルと比較して、かつ／または１つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるＩＬＣ１のレベルと比較して、前記対象からとられた１つまたは複数のサンプルにおけるＩＬＣ１のレベルが高いという前記判定は、ＩＬＣ２の分子サインの、ＩＬＣ１の分子サインへのスイッチの判定に基づく、請求項９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＩＬＣ２の前記分子サインは、Ｇａｔａ３、Ｒｏｒａ、Ｉｌ４、Ｉｌ５、Ｉｌ９、ｌｌ１３、Ｐｅｎｋ（プロエンケファリン）、Ａｒｅｇ（アンフィレグリン）、Ｉｌ１７ｒｂ、およびＩｌ１ｒＩ１からなる群から選択される１つまたは複数のＴｈ２関連転写産物の発現に対応する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＩＬＣ１の前記分子サインは、請求項２６に記載の１つまたは複数のＴｈ２関連転写産物のより低い発現、ならびにＴｂｘ２１、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ１２ｒｂ２、Ｉｌ１８ｒ１、Ｃｘｃｒ３、およびＣｃｒ５からなる群から選択される１つまたは複数の転写産物のより高いレベルに対応し、前記レベルは、ＩＬＣ２の前記転写産物のレベルと比較される、請求項２５または２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
自然リンパ球（ＩＬＣ）は、最近記載された、組織に内在する自然リンパ球の集団であり、病原体に対する防御、上皮性関門機能の維持、共生微生物叢の封じ込め、組織修復、および代謝の調節が挙げられる、炎症において果たす多様な役割を有する（Ａｒｔｉｓ，Ｄ．＆  Ｓｐｉｔｓ，Ｈ．Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，２９３−３０１（２０１５）；ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ａ．，Ｓｐｉｔｓ，Ｈ．，＆  Ｅｂｅｒｌ，Ｇ．Ｉｎｎａｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１，３６６−３７４（２０１４））。当該細胞は、数が限られているにも拘らず、進行中の免疫反応に大きな影響を与える。ＩＬＣは、ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞系に酷似している、機能的に不連続なサブセット（ＩＬＣ１、ＩＬＣ２、およびＩＬＣ３）に分類される。ＣＤ４＋Ｔ細胞ヘルパーサブセットを調節する多くの転写因子およびサイトカインもまた、対応するＩＬＣ群において重要な役割を果たす。ゆえに、Ｔ−ｂｅｔが、ＩＬＣ１の発達および機能に重要であることが示されてきた一方、ＧＡＴＡ−３およびＲＯＲγｔが、ＩＬＣ２およびＩＬＣ３の機能にそれぞれ必要とされる。
【０００２】
ＩＬＣは、様々な表現型のサブセットに分類されてきたが、新しい証拠により、ＩＬＣは「固定」されていないこと、そして炎症性の環境に応じて、当該細胞は相当な機能的可塑性を示すことが示されている（Ａｒｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ，Ａ．，Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｍ．，＆  Ｋｏｙａｓｕ，Ｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１，３５４−３６５（２０１４））。例えば、ヒトＩＬＣ１は、局所的な環境シグナル、例えばＩＬ−１β、レチノイン酸、およびＩＬ−２３に反応して、ＩＬＣ３に分化することができる。ＩＬＣ３に分化するこの能力は、ＩＬＣ３がＩＬ−１２の存在下でＩＬＣ１に分化することができるので、双方向性である。さらに、腸に内在するＩＬＣ３は、Ｔ−ｂｅｔおよびＲＯＲγｔを共発現し、微生物叢駆動シグナル、ＩＬ−２３またはＩＬ−１２＋ＩＬ−１８に反応して、ＩＦＮγを生成することが示されてきた。最後に、ＩＬＣ３は、ＴＬＲ２リガンドに反応して、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を生成することができ、このことは、ＩＬＣ３がＩＬＣ２に分化し得ることを示唆している。しかしながら、ＩＬＣ１サブセットとＩＬＣ３サブセット間で実証されてきた可塑性にも拘らず、ＩＬＣ２が、生理的に関連した何らかの機能的可撓性を示すかは、明らかでない。異なるＩＬＣサブセット間の遺伝子発現プロフィールを分析した最近の報告では、ＩＬＣ２が最も同質であり、他のサブセットと異なっていることが明らかとなっており（Ｒｏｂｉｎｅｔｔｅ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｃｌａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，３０６−３１７（２０１５））、これは、ＩＬＣ２が、ＩＬＣ１およびＩＬＣ３と比較して、代替の表現型を採用する能力がより限られているかもしれないという考えと一致している。
【０００３】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、タバコ煙への長期の曝露と関連した障害であり、肺機能の進行性の、不可逆性の損失によって特徴付けられる。ＣＯＰＤ患者の一部は、気道感染症後に症候の急性的悪化を経験し、当該増悪は、罹患率および死亡率の重大な原因である。呼吸器感染症病原体インフルエンザ、呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス（ＨＲＶ）、および分類不可能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）は、ＣＯＰＤ関連増悪の推測される主要なトリガーの１つである。ＣＯＰＤは、世界中で２０３０年までで３番目の死因となると推定されている；しかしながら、ＣＯＰＤ関連トリガーが、肺において免疫反応にどのように影響するかについて、ほとんど理解されていない。ＩＬ−１、ＩＬ−１８、およびＩＬ−３３が挙げられるいくつかのＩＬ−１ファミリメンバのサイトカインが、マウスモデルにおける煙関連の炎症および増悪に関連付けられてきた（Ｋｅａｒｌｅｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ  Ｓｍｏｋｅ  Ｓｉｌｅｎｃｅｓ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ａｎ  Ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｄ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３３−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４２，５６６−５７９（２０１５））。Ｋｅａｒｌｅｙらにおいて、タバコ煙は、ＳＴ２レセプタ発現の印象的な再分布と関連し、その結果は、肺におけるＩＬ−３３反応を、Ｔｈ２関連ＩＬＣ２反応から離れて、Ｔｈ１スキュードＮＫ細胞およびマクロファージに向けて変更することが、以前に報告された。ゆえに、肺に内在するＩＬＣ集団の変化は、結果として生じる炎症反応の型および大きさに大きく影響を及ぼし得る。
【０００４】
マウス肺における大部分のＩＬＣはＩＬＣ２であるものの、稀であるが相当数の１型および３型のＩＬＣが存在する。タバコ煙への曝露は、肺に内在するＩＬＣによるＴｈ２サイトカインの生成の減少を伴うが、この環境における局所的ＩＬＣサブセット間の動力学および発達関係は、調査されていないままである。本発明において、ＩＬＣ２が、ＩＬＣ２のＩＬＣ１への分化を促進する局所的なＩＬ−１２シグナルおよびＩＬ−１８シグナルに依存するかなりの機能的可塑性を示すことが見出された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＩＬＣは、粘膜免疫の重要なメディエータであり、そしてＩＬＣ１群とＩＬＣ３群間の表現型可塑性は、以前に確立された。本明細書では、内在肺ＩＬＣ２もまた、感染性の、または有害な剤に反応して機能的可塑性を示すことが実証され、これは、ＧＡＴＡ−３の損失、およびＩＬＣ１を生成するＴ−Ｂｅｔ＋ＩＦＮ−γへの付随するスイッチによって特徴付けられる。Ｔｈ１サイトカイン、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８は、この変換を誘導する一方、炎症領域内の養子移入されたＧＦＰ＋ＩＬＣ２クラスターが、ウイルスに反応して、ＩＬＣ１様表現型を採用する。機構的に、当該ＩＬＣ１は、Ｔ−ｂｅｔ依存的に、ウイルス起因性炎症を著しく増大させる。特に、ＩＬ−１２は、ヒトＩＬＣ２を、Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＦＮ−γ生成ＩＬＣ１に変換し得、そしてＣＯＰＤ患者におけるＩＬＣ１の頻度は、疾患の重篤度、および増悪に対する感受性と相関する。まとめると、これらのデータは、ＩＬＣ２の機能的可塑性が、抗ウイルス免疫の悪化をもたらし得、これが、ＣＯＰＤのような呼吸器疾患において不都合な結果に至る虞があることを実証している。
【０００６】
本発明の主要な態様の一部が、以下に要約されている。更なる態様は、本開示の発明を実施するための形態、実施例、図面、および特許請求の範囲の節に記載されている。本開示の各節における記載は、他の節と併せて読まれることが意図されている。さらに、本開示の各節に記載される種々の実施形態は、種々の異なる方法で組み合わされ得、そしてそのような組合せは全て、本発明の範囲内にあることが意図されている。
【０００７】
一態様において、本開示は、自然リンパ球（サブセット２）（ＩＬＣ２）の、自然リンパ球（サブセット１）（ＩＬＣ１）への変換を阻害する方法であって、ＩＬＣ２の、Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＦＮγ＋ＩＬＣ１へのスイッチを防止し、ＩＬＣ１上でのＩＬ−１２レセプタもしくはＩＬ−１８レセプタの発現レベルを維持もしくは抑制し、かつ／またはＩＬＣ２上でのＳＴ２もしくはＧＡＴＡ３の発現レベルを維持し、もしくは増大させるモジュレータにＩＬＣ２を接触させることを含む方法を提供する。
【０００８】
開示される方法において、モジュレータと接触するＩＬＣ２は、ＩＬＣ２の局所的プールであってもよいし、肺または肺組織に局所化していてもよいし、循環ＩＬＣ２であってもよい。本発明の更なる態様において、ＩＬＣ１への変換が阻害されるＩＬＣ２は、循環ＩＬＣ２であってもよいし、他の組織、特に肺炎症性疾患またはＣＯＰＤに冒されている虞があり、またはこれらと関連している虞がある組織に局所化しているＩＬＣ２であってもよい。
【０００９】
他の態様において、本開示は、肺炎症を伴う疾患または障害の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、対象は、ＩＬＣ１の所定のレベルと比較して、かつ／または１つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるＩＬＣ１のレベルと比較して、対象からとられた１つまたは複数のサンプルにおけるＩＬＣ１のレベルが高いと判定される、方法を提供する。
【００１０】
他の態様において、本発明はまた、肺炎症を伴う疾患または障害の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、対象は、ＩＬＣ１／ＩＬＣ２の所定の比率と比較して、かつ／または１つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率と比較して、前記対象からとられた１つまたは複数のサンプルにおけるＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率が高いと判定される、方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、肺炎症を伴う疾患または障害の悪化の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、前記対象に疾患修飾性医薬品を投与することを含み、前記対象は、ＩＬＣ１の所定のレベルと比較して、かつ／または１つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるＩＬＣ１のレベルと比較して、前記対象からとられた１つまたは複数のサンプルにおけるＩＬＣ１のレベルが高いと判定される、方法を提供する。
【００１２】
本発明の方法において、肺炎症は、タバコの煙、細菌感染、またはウイルス感染によって引き起こされ得る。さらに、本発明の方法において、疾患または障害は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。
【００１３】
本発明はまた、疾患修飾性医薬品による処置の候補としての、肺炎症を伴う疾患または障害と診断される患者を選択する方法であって、患者が、ＩＬＣ１／ＩＬＣ２の所定の比率と比較して、かつ／または１つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率と比較して、前記対象からとられた１つまたは複数のサンプルにおけるＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率が高いと判定されるならば、患者を処置のために選択することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、疾患修飾性医薬品は、ＩＬＣ１変換へのＩＬＣ２のモジュレータ、気管支拡張薬、吸入ステロイド、組合せインヘラー、経口ステロイド、またはホスホジエステラーゼ−４インヒビタである。
【００１４】
特定の実施形態において、ＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率が高いという判定またはＩＬＣ１のレベルが高いという判定は、ＩＬＣ２の分子サインの、ＩＬＣ１の分子サインへのスイッチの判定に基づく。更なる実施形態において、ＩＬＣ２の分子サインは、Ｇａｔａ３、Ｒｏｒａ、Ｉｌ４、Ｉｌ５、Ｉｌ９、ｌｌ１３、Ｐｅｎｋ（プロエンケファリン）、Ａｒｅｇ（アンフィレグリン）、Ｉｌ１７ｒｂ、およびＩｌ１ｒＩ１からなる群から選択される１つまたは複数のＴｈ２関連転写産物の発現に対応する。更なる実施形態において、ＩＬＣ１の分子サインは、Ｇａｔａ３、Ｒｏｒａ、Ｉｌ４、Ｉｌ５、Ｉｌ９、ｌｌ１３、Ｐｅｎｋ（プロエンケファリン）、Ａｒｅｇ（アンフィレグリン）、Ｉｌ１７ｒｂ、およびＩｌ１ｒＩ１からなる群から選択される１つまたは複数のＴｈ２関連転写産物のより低い発現、ならびにＴｂｘ２１、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ１２ｒｂ２、Ｉｌ１８ｒ１、Ｃｘｃｒ３、およびＣｃｒ５からなる群から選択される１つまたは複数の転写産物のより高いレベルに対応し、前記レベルは、ＩＬＣ２の前記転写産物のレベルと比較される。
【００１５】
本発明の方法によって処置され、または予防される肺炎症は、タバコ煙、細菌感染、ウイルス感染、またはそれらの組合せによって引き起こされ得る。一実施形態において、開示される方法によって処置され、または予防される疾患または障害は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】インフルエンザ感染は、肺内在ＩＬＣにおいてＧＡＴＡ−３の下方制御をトリガーする。（ａ）フローサイトメトリによる肺内在ＩＬＣの、ＣＤ４５＋、生存可能、ＣＤ３−、ＣＤ４９ｂ−、リニイッジ（Ｌｉｎ）ネガティブ、ＣＤ９０＋としての同定。リニイッジマーカー：ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ、ＣＤ５、ＣＤ２７、Ｆ４／８０、Ｇｒ１、ＣＤ１９、Ｂ２２０、ＦＣεＲＩ、ＣＤ１１ｃ、およびＣＤ１１ｂ。（ｂ）アイソタイプコントロール（陰影をつけた灰色）と比較した、Ｌｉｎ−ＣＤ９０＋肺ＩＬＣ上のＩＬＣ関連マーカーの発現（陰影なし）。（ｃ）無感作マウスの肺におけるＩＬＣ１、ＩＬＣ２、およびＩＬＣ３の絶対数。Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、およびＲＯＲγｔの発現に基づいてそれぞれ定義したＩＬＣサブセット。（ｄ）ＳＴ２−ＧＦＰリポーターマウス由来の肺内在ＩＬＣにおけるＳＴ２−ＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳ。（ｅ）無感作マウスおよびインフルエンザＡ型に感染させたマウス由来の肺内在ＩＬＣにおける細胞内ＧＡＴＡ−３の代表的なＦＡＣＳおよび定量化。（ｆ）無感作マウスおよび感染マウスの肺内在ＩＬＣ上でのＴ１／ＳＴ２およびＩＬ−１８Ｒαの発現の代表的なＦＡＣＳおよび定量化。（ｇ）無感作マウスおよび感染マウスの肺内在ＩＬＣ上でのＳＴ２およびＩＬ−１８Ｒαの発現の相関。（ｈ）無感作マウスおよび感染マウスの肺内在ＩＬＣ上でのＩＬ−１２ｒβ２発現の代表的なＦＡＣＳプロットおよび平均蛍光強度（ＭＦＩ）。（ｉ）無感作マウスおよびｐ．ｉ．７日目の感染マウスの肺内在ＩＬＣ上での細胞内Ｔ−ｂｅｔ発現の代表的なＦＡＣＳプロットおよび定量化。（ｊ）ｐ．ｉ．７日目の感染マウスのＩＬ−１８ＲαネガティブまたはポジティブＩＬＣ上での細胞内Ｔ−ｂｅｔ発現。（ｋ）無感作マウスおよび感染マウスにおける、ＩＬ−１８Ｒαを発現するＫｉ６７＋細胞のパーセンテージ。（ｌ）示すように刺激した富化ＩＬＣ培養体由来の上清におけるＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびＩＦＮ−γのレベル。データを、偽感染マウス由来のＩＬＣと比較した、絶対サイトカインレベルの変化として示す。ａ〜ｃおよびｅ〜ｉのデータは、５つの独立した実験を表し、ｄの定量化は、３つの独立した実験からプールし、ｊは、２つの独立した実験からプールし、ｌ〜ｋは、２つの独立した実験を表す。＊ｐ＜．０１、＊＊ｐ＜．００１、＊＊＊ｐ＜．０００１。特に明記しない限り、感染マウス由来のデータは、７日目に分析した。
【図２】複数のトリガーが、肺内在ＩＬＣ動力学を劇的に変える。（ａ）インフルエンザＡ型（Ａ／ＦＭ／１／４７）、インフルエンザＡ型（ＰＲ８）、または呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、（ｂ）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、および（ｃ）インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）に感染させたＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺内在ＩＬＣのＧＡＴＡ−３  ＭＦＩ。（ｄ〜ｆ）無感作マウスおよびインフルエンザ菌（Ｈ．ｆｌｕ）に感染させた、感染後５日目のマウス由来の肺内在ＩＬＣ上でのＩＬ−１８ＲαおよびＴ−ｂｅｔの発現の代表的なＦＡＣＳおよびＭＦＩ定量化。（ｇ〜ｈ）無感作室内空気コントロールおよび示した時点にてタバコ煙に曝したマウス由来の肺内在ＩＬＣにおけるＧＡＴＡ−３発現の代表的なＦＡＣＳおよびＭＦＩ。（ｉ〜ｋ）無感作室内空気コントロールまたは８週間タバコ煙に曝したマウス由来の肺内在ＩＬＣ上でのＴ−ｂｅｔおよびＩＬ−１８Ｒαの発現の代表的なＦＡＣＳおよびＭＦＩ定量化。（ｌ〜ｍ）無感作室内空気コントロールまたは８週間タバコ煙に曝したマウス由来の肺内在ＩＬＣ上でのＩＬ−１２Ｒβ２発現の代表的なＦＡＣＳおよびＭＦＩ。ａ〜ｆのデータは、群あたり≧５頭のマウスの、２〜３つの独立した実験を表す。ｉ〜ｍのデータは、群あたり少なくとも５頭のマウスの、３〜４つの独立した実験を表す。＊ｐ＜．０１、＊＊ｐ＜．００１、＊＊＊ｐ＜．０００１。
【図３】（ａ）示したサイトカインと共に９６時間培養したマウス肺ＩＬＣ由来のＩＦＮ−γ発現を示す代表的なフローサイトメトリのプロット。（ｂ）ＩＬＣ培養体におけるＩＦＮ−γレベル。ＰＢＳ、ＩＬ−３３、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８、またはＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３を鼻腔内投薬したＳＣＩＤマウス由来のＩＬＣ上でのＧＡＴＡ−３（ｃ）の、またはＴ−ｂｅｔおよびＩＬ−１８Ｒα（ｄ）の発現を示す代表的なフローサイトメトリのプロット。（ｅ）示すように処理したマウスの肺に内在するＩＬＣ２（円）細胞またはＩＬＣ１（正方形）細胞の数。特定の処理群におけるマウスの肺から富化して、示すように２４時間刺激したＩＬＣ由来の上清におけるＩＬ−５（ｆ）およびＩＦＮ−γ（ｇ）レベル。（ｈ）ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３で処理したマウスの肺から富化したＩＬＣ上でのサイトカイン発現を示す代表的なフローサイトメトリのプロット。（ｉ）無感作同腹仔コントロールまたはＳＴ２−ＧＦＰリポーターマウスまたはＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３で処理したリポーターマウス由来の肺内在ＩＬＣ上でのＳＴ２−ＧＦＰ対ＩＬ−１８Ｒαの発現の代表的なフローサイトメトリプロット。（ｊ）示すように処理したリポーターマウスのＩＬＣ２細胞またはＩＬＣ１細胞上でのＳＴ２−ＧＦＰ発現のＭＦＩ。（ｋ）細胞を、無感作肺（ＩＬＣ２細胞およびＮＫ細胞）、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３で処理した肺（活性ＩＬＣ２細胞（ＳＴ２＋）および活性ＩＬＣ１細胞（ＩＬ−１８Ｒα＋））、または無感作肝臓（ＩＬＣ１細胞）からソートして、選択した遺伝子のｑＰＣＲ分析を、熱マップとして視覚化する。データを、３反復（ｆ〜ｇ）もしくは４反復（ａ〜ｄ）の平均もしくは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ；または５頭のマウス／群もしくは９頭のマウス／群（ＰＢＳ群のみ）による２つの独立した実験（ｅ）として表し；あるいは３頭（無感作）もしくは４頭（サイトカイン処理）のマウス／群による２つの独立した実験（ｉ〜ｊ）からプールする。＊ｐ＜．０１、＊＊ｐ＜．００１。
【図４】養子移入したＩＬＣ２は、インフルエンザによる感染後にＩＬＣ１マーカーを上方制御する。（ａ）移入したＧＦＰ＋ＩＬＣは、フローサイトメトリを介して、ＣＤ２５、ＣＤ９０、およびＳＴ２を発現するＬｉｎ−ＧＦＰ＋細胞として同定可能であった。（ｂ）ＳＴ２＋ＩＬ−１８Ｒα−ＩＬＣ２を、ＩＬ−３３で鼻腔内処理したＧＦＰリポーターマウス全体の肺からソートした。１００，０００個のソートしたＩＬＣ２、３０００万個の脾細胞、および３００万〜４００万個のＣ５７ＢＬ／６  ＧＦＰネガティブ肺由来Ｔ／ＮＫ細胞を、レシピエントＲＡＧ／ＳＣＩＤ欠損マウス中に静脈内から移入して、１２時間後にインフルエンザに感染させた。養子移入したＧＦＰ＋ＩＬＣ上の感染後７日目のＧａｔａ３（ｃ）、ＩＬ−１８Ｒα（ｄ）、およびＩＬ−１２Ｒβ２（ｅ）のフローサイトメトリ。養子移入したＧＦＰ＋ＩＬＣ上の感染後７日目のＧＡＴＡ−３（ｆ）、ＩＬ−１８Ｒα（ｇ）、およびＩＬ−１２Ｒβ２（ｈ）のＭＦＩ。ｂ〜ｈのデータは、群あたり少なくとも４頭のマウスの３つの独立した実験を表す。
【図５】ＩＬＣ２は、ウイルス複製およびＴｈ１サイトカイン生成と関連する領域においてクラスターを形成する。（ａ）個々のＧＦＰ＋細胞の分散ダイヤグラム、ならびにそれらの、自動セグメント化ＧＦＰ＋細胞マスク（ＲＯＩ；方法参照）におけるＤＮＡプローブＤＡＰＩ（暗い灰色）の平均強度として測定した、ＧＡＴＡ−３および核含有量の平均発現。（ｂ）核ＤＡＰＩ含有量について調整したＧＡＴＡ−３値に対する、コントロールマウスおよび感染マウスにおけるプールしたＧＦＰ＋細胞の頻度（ｙ軸）を示すヒストグラム。（ｃ）感染後６日目の個々のマウスにおけるＩＬＣ  ＧＡＴＡ−３発現の定量化。ａ〜ｃのデータは、条件あたり７００〜１７００個の総計数細胞を表す。
【図６】ＩＬＣ１細胞は、Ｔ−ｂｅｔ依存的に抗ウイルス免疫を強化する。インフルエンザＰＲ８による抗原投与後（ｐｏｓｔ−ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）７日目の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＴｂｘ２１−／−マウスの肺内在ＩＬＣにおける（ａ〜ｂ）ＧＡＴＡ−３、（ｃ〜ｄ）ＩＬ−１２Ｒβ２、ならびに（ｅ〜ｆ）ＳＴ２およびＩＬ−１８Ｒαの発現の定量化および代表的なフローサイトメトリのプロット。（ｇ）感染後７日目に富化した、無感作マウスならびに感染Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＴｂｘ２１−／−マウス由来のＩＬＣにおけるＩＦＮ−γ発現を示す代表的なフローサイトメトリプロット。ＩＬＣ２細胞およびＩＬＣ１細胞を、ＩＬ−３３またはＩＬ−３３＋ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８でそれぞれ処理したマウスから精製して、（ｈ）ＲＡＧ／γ  ｃ欠損マウス中に移入した。感染後２日目に測定した（ｊ）、サイトカイン処理マウスから精製したＩＬＣ２細胞またはＩＬＣ１細胞で再構築したＲＡＧ／γ  ｃ欠損マウス（方法参照）におけるウイルス起因性の体重減少および（ｉ）ＢＡＬサイトカイン発現。（ｋ）感染後２日目に測定した、Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴｂｘ２１−／−マウスから精製したＩＬＣ１細胞で再構築したＲＡＧ／γ  ｃ欠損マウスのＢＡＬ流体におけるサイトカインの発現。ａ〜ｇのデータは、５頭（Ｃ５７ＢＬ／６）、６頭（感染Ｔｂｘ２１−／−）、または７頭（無感作Ｔｂｘ２１−／−）のマウス／群による２つの独立した実験を表す。ｉ〜ｊのデータは、４頭（ＩＬＣ２再構築、ＩＬＣ１再構築コントロール）または５頭（ＩＬＣ１再構築感染）のマウス／群による２つの独立した実験を表す。ｋのデータは、７頭のマウス／群による１つの実験由来である。＊ｐ＜．０１、＊＊ｐ＜．００１。
【図７】ＩＬ−１２は、ヒトＩＬＣ２において、ＧＡＴＡ−３を抑制し、かつＴ−ｂｅｔおよびＩＦＮ−γを誘導する。ＣＤ４５＋生存可能ＣＤ３−ＣＤ１９−Ｌｉｎ−ＩＬ−７Ｒα＋ＣＤ１６１＋ＣＲＴＨ２＋と定義したＩＬＣ２を、正常なヒトドナーの末梢血からソートして、ＩＬ−３３、ＩＬ−１２、またはＩＬ−３３＋ＩＬ−１２と共に５日間培養した。全ての培養にＩＬ−２を含有させた。示した条件での培養の５日後の、ＩＬＣ２上の（ａ）ＧＡＴＡ−３、（ｂ）Ｔ−ｂｅｔ、および（ｃ）ＣＤ２５の発現。（ｄ）ＩＬ−１３、（ｅ）ＩＬ−４、および（ｆ）ＩＦＮ−γのレベルを、ＥＬＩＳＡによって培養液上清中で測定した。データは、４つの独立した実験を表し、細胞を、各実験について３〜４人の健康なドナーからプールした。
【図８】ＣＯＰＤ患者は、循環ＩＬＣ１のパーセンテージを増大させた。これは、疾患の重篤度と相関する。（ａ）禁煙コントロールおよびＣＯＰＤ患者の末梢血におけるＩＬＣ上での代表的なＴ−ｂｅｔおよびＣＲＴＨ２の発現。（ｂ）健康なコントロール、喫煙コントロール、および総ＣＯＰＤ患者における循環ＩＬＣ１のパーセンテージ；ＩＬＣ１をＴ−ｂｅｔ＋と定義する。（ｃ）健康なコントロール、喫煙コントロール、および総ＣＯＰＤ患者における循環ＩＬＣ２のパーセンテージ；ＩＬＣ２をＣＲＴＨ２＋と定義する。健康なコントロール、喫煙コントロール、およびＧＯＬＤの状態によって階層化したＣＯＰＤ患者間の（ｄ）循環ＩＬＣ１および（ｅ）循環ＩＬＣ２のパーセンテージ。（ｆ）ＩＬＣ１のパーセンテージと、予測されるＦＥＶ１％間の相関。健康なコントロール、喫煙コントロール、および悪化頻度によって階層化したＣＯＰＤ患者間の（ｇ）循環ＩＬＣ１および（ｈ）循環ＩＬＣ２のパーセンテージ。（ｉ）健康なコントロール、喫煙コントロール、および総ＣＯＰＤ患者における循環ＩＬＣ２および循環ＩＬＣ１のパーセンテージ間の相関。図における略語：ＮＳ＝非喫煙者；Ｓｍ＝喫煙者。＊ｐ＜．０５、＊＊ｐ＜．０１、＊＊＊ｐ＜．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、インフルエンザ関連炎症が、ＩＬ−１８Ｒα＋Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＬＣ１の著しい増殖と強く相関する、ＧＡＴＡ−３の損失およびＴｈ２関連マーカーの発現の減少によって特徴付けられる、肺ＩＬＣ集団内での顕著な表現型変化を引き起こすことを実証する。さらに、ＳＴ２−ＧＦＰリポーターマウス、およびＧＦＰ＋ＩＬＣ２の養子移入を利用して、ＩＬＣ１増殖が、ＩＬ−１２刺激およびＩＬ−１８刺激に反応して起こる肺内在ＩＬＣ２からの直接的変換の結果であるという新規の証拠も提供される。さらに、いくつかのウイルス感染および細菌感染ならびにタバコ煙への曝露が挙げられる、多種多様なトリガー、とりわけＣＯＰＤの増悪に関連したトリガーが、局所的ＩＬＣ２のこの可塑性を開始することが示される。特に、ＩＬＣ２のこの機能的変換をトリガーする傷害（ｉｎｓｕｌｔ）の大きさは、この反応が、肺における炎症および／または損傷の一般的な特徴であることを示唆している。
【００１８】
さらに、本発明は、ＩＬＣ２可塑性が、事象の多段階シーケンスを包含することを示す：ＩＬＣ２の、組織内の炎症領域への移動、ＧＡＴＡ−３の顕著な損失を介したサイレンシング、ならびにその後の、当該細胞の表現型スイッチおよび機能的局所的反応を決定する微環境的キューへの曝露。ＧＦＰ＋ＩＬＣ２による養子移入系を用いて、本発明は、以下の感染、「サイレンシングされた」ＩＬＣ（すなわちＧＡＴＡ−３ＬＯＷ）が、局所的なＩＬ−１２生成およびＩＬ−１８生成に関連する炎症領域内で収束して、ＩＬＣ１表現型にスイッチすることを示す。ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３刺激後の分子分析は、ＩＬＣ２可塑性についてのこの概念に合致する。なぜなら、新しいＩＬＣ１（すなわちｅｘ−ＩＬＣ２）は、部分的に重複するが、異なる遺伝子サインを、活性化されたＩＬＣ２と共有するからである。これは、炎症誘発性反応と関連する、Ｔｈ２転写産物の減少およびＴｈ１様遺伝子の顕著な増大によって特徴付けられる。重要なことに、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３活性化ＩＬＣ２は、静止ＩＬＣ２と比較して、転写因子ＧＡＴＡ−３およびＴ−ｂｅｔの共発現が挙げられる混合Ｔｈ１／Ｔｈ２サインを示し、このことは、肺ＩＬＣ２可塑性が、局所的微環境変化に反応して起こることを示している。
【００１９】
興味深いことに、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８のレセプタの上方制御が、細菌感染中に、そしてタバコ煙への曝露中にＩＬＣ上で起こり、このことは、これらのサイトカインが、複数の環境においてＩＬＣ１変換と関連することを示している。また、これらのＴｈ１様炎症性サイトカインは、細菌感染起因性および煙起因性炎症に対する宿主反応に不可欠であることが示されてきた。ゆえに、表現型をスイッチするＩＬＣ２の能力は、複数のシグナルを必要とし、かつＣＯＰＤ等の肺の疾患と関連するトリガーに関わるようである。
【００２０】
肺に内在するＩＬＣ集団由来の、感染性の有害な剤に対する反応の顕著な類似性は、これらの表現型の変化の基礎となる共通の機構を支持する。ＩＬ−１２は最近、ヒトにおけるＩＬＣ３可塑性の重要なレギュレータとして現れ、データが、マウスおよびヒトのＩＬＣ２の可塑性を直接誘導するのにこのサイトカインが果たす役割を示している。実際、ＩＬ−１２は、本明細書で用いられるウイルスおよび細菌の感染中に生成され、そしてＩＬ−１２およびＩＬ−１８の鼻腔内投与が、非常に類似した表現型、すなわちＧＡＴＡ−３の損失およびＩＬＣ１の特異的出現をもたらす。加えて、ウイルス抗原投与中の外因性ＩＬ−１２の局所的投与は、ＧＡＴＡ−３の損失を増強して、その後のＩＬＣ１増殖を増大させる。ＩＬ−１８Ｒα前の、ＩＬＣ２上でのＩＬ−１２Ｒβ２の初期の発現、ならびにＳＴ２およびＩＬ−１２Ｒβ２を共発現するＩＬＣ２の存在は、ＩＬ−１２が当該細胞において初期のサイレンシングおよび表現型スイッチに寄与し得るという観察と一致している。ＩＬ−１２によって誘導される重要な下流エフェクタの１つが、ＩＦＮ−γであり、最近の報告は、このサイトカインが、ＩＬＣ２反応を直接低下させ得ることを示している（Ｍｏｌｏｆｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３３  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ  Ｃｏｕｎｔｅｒ−Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｇｒｏｕｐ  ２  Ｉｎｎａｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４３，１６１−１７４（２０１５））。ゆえに、ＩＬ−１２−ＩＦＮ−γアクシスは、ＩＬＣ２サイレンシングの調節、およびＩＬＣ１への表現型スイッチにおける重要な因子であるようである。
【００２１】
インフルエンザが挙げられるほとんどのウイルスによる感染は、ウイルスの複製領域と関連する炎症の組織学的に異なった遺伝子座によって特徴付けられる肺疾患を引き起こす。ＩＬＣの数が少ないにも拘らず、本研究において実行される広範な免疫組織化学的画像分析により、感染後、ＩＬＣが、組織の炎症領域内で収束することが明らかとなった。本発明は、肺におけるＩＬＣの詳細な視覚化の初めての例を開示しており、そして重要なことに、データにより、当該細胞が、ＩＬ−１２  ｍＲＮＡおよびＩＬ−１８  ｍＲＮＡを発現する脊髄由来の細胞にごく近いインフルエンザ密集領域内でクラスターを形成することが明らかとなった。ＩＬＣのこの蓄積は、当該細胞の高いサイトカインアウトプットに加えて、微環境サイトカイン濃度が、感染中に著しく増強されるであろうことを示している。実際に、養子移入されたＩＬＣ１は、感染前にＩＬＣ２を受け入れた動物と比較した場合に、ウイルス感染によって喚起されるＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ７０、およびＩＦＮ−γが挙げられるＴｈ１様炎症性サイトカインの生成、ならびにウイルス起因性の体重減少を顕著に拡大した。
【００２２】
注目すべきことに、肺の感染領域と関連するＩＬＣは、組織の冒されていない領域において見出されるよりもＧＡＴＡ−３の発現が低いことも見出された。まとめると、これらのデータは、炎症遺伝子座に直面するＩＬＣ２が、能動的にサイレンシングされて、スイッチ表現型に局所的に向けられて、代替メディエータを生成することでウイルス起因性免疫を拡大することを実証している。本発明の広範なＩＨＣ画像分析は、局所的変化の調査の重要性を強調した。というのも、集団全体でのレベル分析、すなわち、総肺ダイジェスト（ｔｏｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｄｉｇｅｓｔ）が、組織内在ＩＬＣ表現型のミクロ環境変化を不明瞭にし、または過小評価する虞があるからである。
【００２３】
タバコ煙への長期曝露が、ＣＯＰＤの進行の原因となり得、そして当該患者の一部において、悪化に対するその後の感受性に関連付けられてきた。驚くべきことに、肺の免疫系が、この有害な剤にどのように反応するかについて、比較的ほとんど理解されていない。本明細書中で示される重要な発見は、煙への曝露もまた、内在する肺ＩＬＣ２のＩＬＣ１への変換をトリガーすることによって、慢性喫煙者において観察される損傷への感受性、および炎症の悪化を潜在的に増大させることであった。機構的に、これらのデータはまた、煙に曝露させたマウスの肺から単離されたＩＬＣ２に及ぶ、観察されるサイレンシング効果についての根本的な状況を示しており、そこではＩＬ−５およびＩＬ−１３の生成が、イクスビボ刺激後に著しく引き下げられている。ＩＬ−１２は、感染環境におけるＩＬＣ２可塑性の重要なレギュレータであるようであるが、このサイトカインもまた、タバコ煙への曝露に反応して生成されることが示された。さらに、ＩＬ−１２起因性ＩＬＣ２可塑性を増大させる２つの因子、ＩＬ−１８およびＩＬ−３３は双方とも、実験上の煙曝露中に、そしてＣＯＰＤ患者において、著しく上方制御される。ゆえに、ＩＬ−１２誘導呼吸器感染症が、先行するタバコ煙曝露と関連してＩＬ−３３およびＩＬ−１８が高められるという状況の中で、超炎症性ＩＬＣ１反応を駆動するよう刺激される（ｐｒｉｍｅｄ）可能性がある。
【００２４】
以前の研究は、ＩＬ−１２とのヒトＩＬＣ３の培養が、ＩＬＣ１マーカーの上方制御をもたらす一方で、ＩＬＣ１が、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、およびレチノイン酸の存在下で、ＩＬＣ３に分化し得ることを示した。本発明におけるデータは、ＧＡＴＡ−３を下方制御し、かつＴ−ｂｅｔおよびＩＦＮ−γを上方制御することによって、ヒトＣＲＴＨ２＋ＩＬＣ２がＩＬ−１２に反応することを実証している。当該細胞はまた、ＣＤ２５を損なっており、これは、ＩＬ−１８Ｒα＋マウスＩＬＣ１においてＣＤ２５の発現が低いことと一致している。さらに、以前の研究は、ヒトＩＬＣ２が、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−１β＋ＩＬ−１２刺激の後に、ＩＬＣ１−ＩＦＮ−γ生成細胞にスイッチし得ることを確認している。全てのヒトＩＬＣサブセットが、機能的可塑性を示すことが現在明らかであり、これにより、疾患状態においてＩＬＣがどれくらい頻繁に表現型を反転させるかという疑問が出てくる。
【００２５】
本明細書では、患者が、循環するＩＬＣ２およびＩＬＣ１の比率を大きく変更したことを示す発見が、ヒトＣＯＰＤにも拡大された。詳細には、患者は、循環ＩＬＣ１数が多いほど、肺機能が悪く、疾患が重度であり、そして頻繁な増悪に感受性であるようである。それゆえに、循環ＩＬＣサブタイプは、この疾患における局所的ＩＬＣ集団を反映し得る。マウスにおいて感染起因性の炎症を劇的に拡大するＩＬＣ１の能力を考えると、ＣＯＰＤ患者におけるＩＬＣ１数の増大は、増悪の頻度または重篤度の原因となり得る可能性がある。炎症を起こしたマウス肺におけるＳＴ２＋ＩＬＣとＩＬ−１８Ｒα＋ＩＬＣ間の関係を反映する、ＣＯＰＤ患者におけるＩＬＣ１とＩＬＣ２間の強い相関は、可塑性がこの疾患における活性プロセスであり得ることを示す。ＩＬＣの表現型的に雑然とした性質、および枯渇についての既知の細胞特異的表面マーカーの不足を考えると、可塑性の操作による、すなわち超炎症性ＩＬＣ１を変換して組織保護ＩＬＣ２に戻すことによる当該細胞の標的化は、ＣＯＰＤにおける増悪の処置および管理における新規の治療的アプローチを提供し得る。
【００２６】
本発明の実行は、特に明記されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、細菌学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用することとなり、これらは当該技術の範囲内である。そのような技術は、文献において詳細に説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２０１５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ｅｄ．（２０１３）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄｓ．（２０１２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２０１２）Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ（１１ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１０）Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ）；Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（５ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）；Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，ｅｄｓ．，（１９９５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（２ｎｄ  ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１ｓｔ  ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）；およびＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（１ｓｔ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）参照。
【００２７】
本発明がより容易に理解され得るように、特定の用語が定義される。追加の定義が、本開示を通して示される。別途定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当該技術の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｌａｃｋｉｅ  ｅｄ．，２０１３）、ｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ  ｅｄ．Ｒ．Ｃａｍｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，２００８）、およびＴｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ  ｅｄ．Ｐ−Ｓ．Ｊｕｏ，２００２）が、本明細書中で用いられる一部の用語の一般的な定義を当業者に提供することができる。
【００２８】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに用語「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、互換的に用いられ得る。
【００２９】
さらに、「および／または」は、２つの具体的な特徴または成分のそれぞれの特定の開示としてとられるべきであり、他の特徴または成分の有無に拘らない。ゆえに、「Ａおよび／またはＢ」等のフレーズで用いられる用語「および／または」は、ＡおよびＢ、ＡまたはＢ、Ａ（のみ）、ならびにＢ（のみ）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」等のフレーズで用いられる用語「および／または」は、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；ならびにＣ（のみ）を含むことが意図される。
【００３０】
単位、接頭辞、および符号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で受け入れられている形態で表される。数の範囲は、範囲を定義する数を含む。本明細書中で提供される見出しは、本発明の種々の態様または実施形態の限定ではない。これは、本明細書を全体として参照することによって理解され得る。したがって、直ぐ下で定義される用語は、本明細書の全体を参照することによってより完全に定義される。
【００３１】
実施形態が文言「含む」で記載されている場合はいつでも、「からなる」および／または「から本質的になる」の文言で記載される異なる類似の実施形態が含まれる。
【００３２】
アミノ酸は、本明細書中で、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される、一般的に知られている３文字符号によって、または１文字符号によって示される。ヌクレオチドも同様に、それらの一般的に受け入れられている１文字コードによって示される。
【００３３】
「ＩＬ−１２」は、インターロイキン１２を指す。ＩＬ−１２の活性形態は、ヘテロダイマーである；ｐ３５サブユニットが、ＩＬ−１２Ａ遺伝子によってコードされ、ｐ４０サブユニットが、ＩＬ−１２Ｂ遺伝子によってコードされる。ヒトおよび他の哺乳類のＩＬ−１２のサブユニット双方についての全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、当該技術において知られている。ＩＬ−１２は、Ｉ型サイトカインレセプタに結合する。ＩＬ−１２レセプタ（ＩＬ−１２Ｒ）は、β１サブユニットおよびβ２サブユニットで構成される膜貫通タンパク質である。ヒトおよび他の哺乳類のＩＬ−１２β１およびＩＬ−１２β２についての全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、当該技術において知られている。
【００３４】
「ＩＬ−１８」は、ＩＦＮ−γ誘導因子とも呼ばれるインターロイキン１８を指す。ヒトおよび他の哺乳類のＩＬ−１８の全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、当該技術において知られている。ＩＬ−１８は、ＩＬ−１８レセプタ（ＩＬ−１８Ｒ）に結合する。これは、ＩＬ−１８レセプタアクセサリタンパク質（ＩＬ−１８ＲＡＰ）およびＩＬ−１８レセプタ１（ＩＬ−１８Ｒ１）タンパク質で構成されるヘテロマー複合体である。ヒトおよび他の哺乳類のＩＬ−１８ＲＡＰおよびＩＬ−１８Ｒ１についての全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、当該技術において知られている。
【００３５】
「インヒビタ」は、別の分子の活性を阻害し、阻止し、または抑制する分子である。リガンドの活性は、例えば、リガンドの、そのレセプタへの結合に干渉することによって、またはレセプタの結合起因性の活性化に干渉することによって、阻害され得る。阻害は、リガンドそれ自体を阻止することによって、または結合するレセプタを阻止することによって、達成され得る。さらに、膜貫通レセプタの場合、可溶性のレセプタ誘導体の導入が、リガンドの活性を阻害し得る。可溶性のレセプタ誘導体は、リガンド結合を、固有の膜貫通レセプタと競合するので、固有のレセプタへのリガンド結合に由来する細胞活性化またはシグナル伝達を引き下げ、または除外する。阻害は、アゴニスト的であってもアンタゴニスト的であってもよい。インヒビタは、例えば、小分子、結合分子（突然変異タンパク質および抗体またはその抗原結合フラグメントが挙げられる）、阻害ＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。本発明に用いられるインヒビタは好ましくは「特異的」であり、これは、１つの標的に、または構造的に関連した標的の一群に作用を及ぼすことを意味する。
【００３６】
用語「阻害する」、「阻止する」、および「抑制する」は、互換的に用いられており、活性の完全な阻止が挙げられる、生物学的活性の、統計学的に有意なあらゆる低下を指す。例えば、「阻害」は、生物学的活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低下を指し得る。したがって、用語「阻害」または「抑制」が、例えば、シグナル伝達経路に及ぼす作用を記載するために用いられる場合、当該用語は、未処理（コントロール）細胞と比較して、シグナル起因性もしくは標的起因性の細胞発達、可塑性、またはシグナル伝達を統計学的に有意に引き下げるインヒビタの能力を指す。特定の実施形態において、インヒビタは、例えば、フローサイトメトリ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、または当業者に知られている他のアッセイによって判定されて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または約１００％、標的反応性細胞における標的媒介細胞の活性化またはシグナル伝達を阻害することができる。「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、これが結合する抗原の生物学的活性を阻害し、または引き下げるものである。特定の態様において、ブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、実質的に、または完全に、抗原の生物学的活性を阻害する。望ましくは、生物学的活性は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％も引き下げられる。
【００３７】
「結合親和性」は一般に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば抗原）間の、非共有結合性の相互作用の全体の強度を指す。特に明記されない限り、本明細書中で用いられる「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹとの親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表され得る。親和性は、本明細書中に記載されるものが挙げられる、当該技術において知られている一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は一般に、抗原にゆっくり結合し、そして容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は一般に、抗原により速く結合し、そしてより長く結合したままとなる傾向がある。
【００３８】
抗原との抗体の親和性または結合力は、当該技術において知られている適切なあらゆる方法、例えばフローサイトメトリ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）もしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはカイネティクス（例えば、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）またはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）を用いて実験的に判定され得る。直接結合アッセイおよび競合結合アッセイフォーマットが容易に使用され得る（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）参照）。特定の結合分子−標的相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）下で測定されるならば、変わり得る。ゆえに、親和性、および他の標的−結合パラメータ（例えば、ＫＤまたはＫｄ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、当該技術において知られている、結合分子（例えば抗体）および標的（例えば抗原）の標準化された溶液、ならびに標準化されたバッファでなされる。
【００３９】
用語「モジュレータ」は、代謝経路に変化（例えば、活性の阻害、抑制、刺激、または増大）を引き起こす分子または化合物を指す。「モジュレータ」は、例えば、小分子、ポリペプチド、抗体、抗原結合フラグメント、または突然変異タンパク質であり得る。
【００４０】
「小分子」は典型的に、低分子量、すなわち約キロダルトン未満の有機分子である。小分子インヒビタは、例えば、ルーチンの方法を用いて小分子ライブラリをスクリーニングすることによって、同定され得る。
【００４１】
「結合分子」は、結合分子が治療剤または診断試薬として有用であるように、十分な親和性でその標的に結合することができるものである。その標的に「特異的に結合する」結合分子は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）、ＫＩＮＥＸＡ（登録商標）、または当該技術において知られている他の結合アッセイによって測定されて、結合分子の、その標的への結合の約１０％未満の程度まで、無関係なタンパク質に結合する。特定の実施形態において、結合分子は、その標的に、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦１０ｐＭ、≦１ｐＭ、または≦０．１ｐＭの解離定数（ＫＤ）で結合する。用語「結合分子」は、抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施形態において、結合分子は、抗体でないポリペプチドである。タンパク質標的に高い親和性で結合する非抗体ポリペプチドを同定かつ生成する種々の方法が、当該技術において知られている。例えば、Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：２９５−３０４（２００７）、Ｈｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：１４−２７（２００６）、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：６５３−６５８（２００６）、Ｎｙｇｒｅｎ，ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５：２６６８−７６（２００８）、およびＳｋｅｒｒａ，ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５：２６７７−８３（２００８）参照。特定の実施形態において、ファージディスプレイ技術が、結合分子、例えばポリペプチドを同定かつ／または生成するのに用いられてきた。特定の実施形態において、ポリペプチドは、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、およびチオレドキシンからなる群から選択されるタイプのタンパク質スカフォールドを含む。
【００４２】
「突然変異タンパク質」は、天然に存在するタンパク質の類似体であり、その中では、天然のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基が、様々なアミノ酸残基に加えられ、それから欠失され、またはそれによって置換されている。突然変異タンパク質は、既知の合成方法によって、例えば、本明細書中で記載されるように、部位指向性突然変異誘発によって、または当該技術において知られている他の適切なあらゆる技術によって、調製され得る。
【００４３】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子を指し、これは、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位により、標的、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または上述の組合せを認識し、かつこれに特異的に結合する。本明細書中で用いられる用語「抗体」は、ポリクローナル抗体；モノクローナル抗体；多特異的抗体、例えば少なくとも２つの無傷抗体から生成される二重特異的抗体；ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質；および抗原認識部位を含む他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子を包含するが、抗体が、所望の生物学的活性を示す限りにおいてである。抗体は、免疫グロブリンの５つの主要なクラスのいずれかであってよい：それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる、重鎖定常ドメインの同一性に基づく、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元構造を有する。哺乳類の軽鎖の２つのクラス、ラムダおよびカッパが存在する。抗体は、裸であってもよいし、毒素、放射性同位体等の他の分子に結合されていてもよい。
【００４４】
用語「抗原結合フラグメント」は、抗体の相補性決定可変領域を含む無傷抗体の部分を指す。全長抗体のフラグメントは、抗体の抗原結合フラグメントであり得る。抗体フラグメントの例として、限定されないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメント、直鎖抗体、一本鎖抗体（例えばＳｃＦｖ）、および抗体フラグメントから形成される多特異的抗体が挙げられる。
【００４５】
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、単一の抗原決定因子またはエピトープの高度に特異的な認識および結合に関与する均一な抗体集団を指す。これは、様々な抗原決定因子に対して向けられる様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体と対照的である。用語「モノクローナル」は、無傷モノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体の双方に、そして抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む他の修飾されたあらゆる免疫グロブリン分子に当てはまり得る。さらに、「モノクローナル抗体」は、以下に限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物によるものが挙げられるいくつかの方法で製造されるような抗体を指す。
【００４６】
用語「ヒト化抗体」は、最小限の非ヒト（例えばマウス）配列を含有するように操作された、非ヒト（例えばマウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスター）のＣＤＲ由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＷ）残基は、所望される特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種由来の抗体中の対応する残基で置換されている。
【００４７】
ヒト化抗体はさらに、Ｆｖフレームワーク領域における、かつ／または置換された非ヒト残基内の、追加の残基の置換によって、抗体特異性、親和性、および／または能力を洗練し、かつ最適化するように修飾されていてよい。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに相当するＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てを含有する可変ドメインの少なくとも１つ、典型的には２つまたは３つを実質的に全て含むこととなるが、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含み得る。ヒト化抗体を生成するのに用いられる方法の例が、米国特許第５２２５５３９号明細書および米国特許第５６３９６４１号明細書に記載されている。
【００４８】
用語「ヒト抗体」は、ヒトによって生成される抗体、または当該技術において知られているあらゆる技術を用いて製造される、ヒトによって生成される抗体に相当するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体の定義は、少なくとも１つのヒトの重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを含む無傷抗体または全長抗体、例えばマウス軽鎖ポリペプチドおよびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。
【００４９】
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２種以上に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖双方の可変領域は、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギその他）の一種に由来する、所望される特異性、親和性、および能力を有する抗体の可変領域に相当する一方、定常領域は、別の種における免疫反応を誘発することを回避するために、その種（通常ヒト）に由来する抗体中の配列に相同である。
【００５０】
用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、本明細書中で互換的に用いられる。典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互に結合する少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと省略される）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと省略される）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃｌで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えばエフェクタ細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が挙げられる宿主の組織または因子への、免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００５１】
ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに再分割され得、フレームワーク（ＦＷ）領域と呼ばれるより保存された領域に散在している。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＷ領域によって隣接して一緒に保持されており、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＷで構成されており、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置されている：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４。
【００５２】
ＣＤＲを判定する少なくとも２つの技術が存在する：（１）種間配列変動性に基づくアプローチ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７））。また、これらの２つのアプローチの組合せが、時折、当該技術において、ＣＤＲを判定するのに用いられる。
【００５３】
Ｋａｂａｔのようなアミノ酸位置ナンバリングは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメイン（軽鎖のおおよそ残基１〜１０７および重鎖の残基１〜１１３）に用いられるナンバリング系を指す。このナンバリング系を用いて、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＷまたはＣＤＲの短縮、またはそれらへの挿入に対応するより少ない、または追加のアミノ酸を含有し得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、所定の抗体について、抗体の配列の相同領域での、Ｋａｂａｔナンバリングされる「標準的な」配列とのアラインメントによって、決定され得る。
【００５４】
「阻害ＲＮＡ」は、遺伝子発現をＲＮＡ干渉によって阻害するものである。阻害ＲＮＡの例として、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が挙げられる。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、ｍＲＮＡに結合してその翻訳を妨げる核酸鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはそれらの組合せで構成され得る。阻害ＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計して生成する方法が、当該技術において知られている。
【００５５】
「単離された」ポリペプチド、抗体、結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞は、自然界で見出されない形態である。単離されたポリペプチド、抗体、結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞として、もはや自然界で見出される形態でない程度にまで精製されたものが挙げられる。一部の実施形態において、単離されたポリペプチド、抗体、結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞は、実質的に純粋である。本明細書中で用いられる場合、用語「実質的に純粋」は、７５％を超える、好ましくは８０％または９０％を超える、最も好ましくは９５％を超える純度を指す。
【００５６】
「対象」、「個体」、「動物」、「患者」、または「哺乳類」が意味するのは、診断、予後、または治療が所望されるあらゆる対象、特に哺乳類の対象である。哺乳類の対象として、ヒト、家畜、農場の動物、スポーツ用の動物、および動物園の動物が挙げられ、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマその他が挙げられる。
【００５７】
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性が有効となり得るような形態であり、そして組成物が投与されることとなる対象にとって容認できないほど有毒な追加の成分を含有しない調製物を指す。そのような組成物は、滅菌され得、そして薬学的に許容可能なキャリア、例えば生理食塩水を含んでよい。適切な医薬組成物は、バッファ（例えば酢酸バッファ、リン酸バッファ、またはクエン酸バッファ）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、安定化剤（例えばヒトアルブミン）、防腐剤（例えばベンジルアルコール）、生体利用性を増強する吸収プロモータ、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤の１つまたは複数を含んでよい。
【００５８】
本明細書中で開示される結合分子の「有効な量」は、具体的に定められた目的、例えば、治療効果または予防効果を実行するのに十分な量である。「有効な量」は、定められた目的に関して、実験に基づいて、そしてルーチン様式で、決定され得る。
【００５９】
「処置」または「緩和」等の用語は、診断された病状または障害の症候を治療し、減速し、軽減し、かつ／またはその進行を停止する治療措置を指す。ゆえに、処置が必要なものとして、すでに障害があるものが挙げられる。特定の実施形態において、患者が、例えば、疾患または障害と関連する症候の完全な、部分的な、または一過性の緩和または排除を示すならば、対象は、本明細書中で提供される方法に従って、肺炎症を伴う疾患または障害について首尾よく「処置されている」。
【００６０】
「予防する」または「予防」は、標的の病状または障害の進行を予防し、かつ／または減速する予防的または防止的な措置を指す。ゆえに、予防が必要なものとして、障害を起こしやすく、またはこれに感受性であるものが挙げられる。特定の実施形態において、患者が、例えば、疾患もしくは障害と関連する、本発明の方法を受けなかった患者よりも低い重度の症候、または疾患もしくは障害と関連する症候の後の発症を一時的に、または永久に進行させるならば、肺炎症を伴う疾患または障害が、本明細書中で提供される方法に従って、首尾よく予防されている。
【００６１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーに言及するのに、本明細書中で互換的に用いられる。ポリマーは、直鎖状であっても分岐していてもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、そして非アミノ酸で中断されていてもよい。用語はまた、自然に、または介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他のあらゆる操作もしくは修飾、例えば標識成分との結合によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、定義内に含まれるものとして、例えば、アミノ酸（例えば非天然のアミノ酸その他が挙げられる）の１つまたは複数の類似体を含有するポリペプチド、および当該技術において知られている他の修飾がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、単鎖または結合鎖として生じ得る。
【００６２】
本明細書中で用いられる「ポリヌクレオチド」は、１つまたは複数の「核酸」、「核酸分子」、または「核酸配列」が挙げられ得、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを指し、そしてＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは修飾塩基、および／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマー中に組み込まれ得るあらゆる基質であってよい。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびその類似体を含み得る。先の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡが挙げられる、本明細書中で言及される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００６３】
結合分子の調製
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ法、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって記載されるものを用いて調製され得る。ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、免疫化抗原に特異的に結合すると考えられる抗体のリンパ球による生成を誘発するように免疫化される。リンパ球もインビトロで免疫化され得る。免疫化の後、リンパ球は単離されて、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、適切な骨髄腫細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞が形成されて、これがその後、融合しなかったリンパ球および骨髄腫細胞から選択され得る。免疫沈降、イムノブロッティングによって、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡ）によって判定されて、選択された抗原に対して特異的に向けられるモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマがその後、標準的な方法を用いるインビトロ培養（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）で、または動物における腹水腫瘍としてインビボで、増殖され得る。モノクローナル抗体はその後、培地または腹水から精製され得る。
【００６４】
ヒト抗体は、当該技術において知られている種々の技術を用いて、直接調製され得る。標的抗原に向けられる抗体を生成する、インビトロで免疫化された、または免疫化個体から単離された不死化ヒトＢリンパ球が生成され得る（例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１）；および米国特許第５７５０３７３号明細書参照）。
【００６５】
インヒビタは、ファージライブラリから選択され得、ファージライブラリは、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３０９−３１４（１９９６））、Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：６１５７−６１６２（１９９８））、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１））、およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））によって記載されるように、ヒト抗体を発現する。また、生成技術および抗体ファージライブラリの使用が、米国特許第５９６９１０８号明細書、米国特許第６１７２１９７号明細書、米国特許第５８８５７９３号明細書、米国特許第６５２１４０４号明細書；米国特許第６５４４７３１号明細書；米国特許第６５５５３１３号明細書；米国特許第６５８２９１５号明細書；米国特許第６５９３０８１号明細書；米国特許第６３０００６４号明細書；米国特許第６６５３０６８号明細書；米国特許第６７０６４８４号明細書；および米国特許第７２６４９６３号明細書；ならびにＲｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７５：１１８２−１２００（２００７）に記載されている。
【００６６】
親和性成熟戦略および鎖シャッフリング戦略が、当該技術において知られており、高親和性ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを生成するのに使用され得る（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）参照）。
【００６７】
一部の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであってよい。非ヒト抗体またはヒト抗体を操作し、ヒト化し、またはリサーフェシングする方法もまた用いられ得、当該技術において周知である。ヒト化され、リサーフェシングされ、または同様に操作された抗体は、ヒト以外、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト以外の霊長類、または他の哺乳類であるソース由来の１つまたは複数のアミノ酸残基を有してよい。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「インポート」残基と呼ばれる残基によって置換されており、これは典型的に、既知のヒト配列の「インポート」可変ドメイン、定常ドメイン、または他のドメインからとられる。そのようなインポートされた配列は、当該技術において知られているように、免疫原性を引き下げ、または結合、親和性、オンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）、オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、結合力、特異性、半減期、もしくは他の適切なあらゆる特性を引き下げ、増強し、もしくは修飾するのに用いられ得る。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に、直接、かつほとんど実質的に、関与する。したがって、非ヒトＣＤＲ配列またはヒトＣＤＲ配列の一部または全てが維持される一方、可変領域および定常領域の非ヒト配列は、ヒトまたは他のアミノ酸で置換されていてよい。
【００６８】
また、抗体が、場合によっては、ヒト化され、リサーフェシングされ、操作され、またはヒト抗体が操作されて、標的抗原に対する高い親和性および他の有利な生物学的特性が保持され得る。この目標を達成するために、親の配列、操作された配列、およびヒト化配列の３次元モデルを用いて、ヒト化（またはヒト）抗体または操作された抗体およびリサーフェシングされた抗体が、場合によっては、親の配列および種々の概念上のヒト化された生成物および操作された生成物を分析するプロセスによって調製されてよい。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体配座構造を示してディスプレイするコンピュータプログラムが利用可能である。当該ディスプレイの調査により、候補の結合分子配列の機能において果たす、残基の可能性がある役割の分析、すなわち、標的に結合する候補結合分子の能力に影響する残基の分析が可能となる。このように、ＦＷ残基が、コンセンサス配列およびインポート配列から選択され得、かつ組み合わされ得るので、所望される結合分子特性、例えば、標的に対する親和性の増大が達成される。
【００６９】
抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化、リサーフェシング、または操作は、例えば、以下に限定されないが、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）），Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７），Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３），米国特許第５６３９６４１号明細書，米国特許第５７２３３２３号明細書；米国特許第５９７６８６２号明細書；米国特許第５８２４５１４号明細書；米国特許第５８１７４８３号明細書；米国特許第５８１４４７６号明細書；米国特許第５７６３１９２号明細書；米国特許第５７２３３２３号明細書；米国特許第５７６６８８６号明細書；米国特許第５７１４３５２号明細書；米国特許第６２０４０２３号明細書；米国特許第６１８０３７０号明細書；米国特許第５６９３７６２号明細書；米国特許第５５３０１０１号明細書；米国特許第５５８５０８９号明細書；米国特許第５２２５５３９号明細書；米国特許第４８１６５６７号明細書，米国特許第７５５７１８９号明細書；米国特許第７５３８１９５号明細書；および米国特許第７３４２１１０号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８９７８号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０９６３０号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５９３９号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３４号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１３３４号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；国際公開第９０／１４４２４号パンフレット；国際公開第９０／１４４３０号パンフレット；ならびにＥＰ２２９２４６号明細書に記載されるような既知のあらゆる方法を用いて実行されてよい。
【００７０】
また、免疫化して直ぐに、内在性免疫グロブリンの生成不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができるヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて、ヒト化抗体およびその抗原結合フラグメントが製造されてもよい。このアプローチは、米国特許第５５４５８０７号明細書；米国特許第５５４５８０６号明細書；米国特許第５５６９８２５号明細書；米国特許第５６２５１２６号明細書；米国特許第５６３３４２５号明細書；および米国特許第５６６１０１６号明細書に記載されている。
【００７１】
特定の実施形態において、抗体フラグメントが用いられる。抗体フラグメントの生成のための種々の技術が知られている。習慣的に、当該フラグメントは、無傷抗体のタンパク質分解消化を介して誘導される。例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．２４：１０７−１１７（１９９３）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１−８３（１９８５）参照。特定の実施形態において、抗体フラグメントは、組換えにより生成される。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｓｃＦｖの抗体フラグメントは全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の宿主細胞中で発現されて、これらから分泌され得るので、当該フラグメントの大量生成が可能となる。また、そのような抗体フラグメントは、先で考察した抗体ファージライブラリから単離され得る。また、抗体フラグメントは、米国特許第５６４１８７０号明細書に記載されるような直鎖状の抗体であってもよい。抗体フラグメントの生成のための他の技術は、当業者にとって明らかであろう。
【００７２】
本発明に従えば、所定の標的に対して特異的な一本鎖抗体の生成技術が応用されてよい（例えば、米国特許第４９４６７７８号明細書参照）。また、Ｆａｂ発現ライブラリの構築方法（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）参照）が応用されて、標的にとって所望される特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効率的な同定が可能となる。また、抗体フラグメントは、以下に限定されないが以下が挙げられる、当該技術の範囲内の技術によって生成され得る：（ａ）抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成されるＦａｂフラグメント、（ｃ）抗体分子の、パパインおよび還元剤による処理によって生成されるＦａｂフラグメント、ならびに（ｄ）Ｆｖフラグメント。
【００７３】
処置方法
肺炎症、例えばＣＯＰＤ、またはタバコ煙、細菌感染、ウイルス感染、もしくはそれらの組合せによって引き起こされる肺炎症を伴う疾患または障害の処置方法または予防方法が提供される。肺炎症を伴う疾患または障害として、喘息、嚢胞性線維症、気管支拡張症、および炎症性腸（ＩＢＤ）関連疾患が挙げられる。
【００７４】
本明細書中で記載されるように、本発明は、重大な表現型の変化が、ＣＯＰＤ患者または肺炎症を伴う障害に苦しむ患者の肺ＩＬＣ集団内で起こり得ることを実証する。本発明はさらに、ＣＯＰＤ患者または肺炎症性の症状がある患者の肺ＩＬＣ集団が、ＩＬ−１８Ｒα＋Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＬＣ１の著しい増殖と強く相関する、ＧＡＴＡ−３の損失およびＴｈ２関連マーカーの発現の低下によって特徴付けられ得ることを実証する。さらに、本発明はまた、ＩＬＣ１増殖が、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８の刺激に反応して起こる、内在する肺ＩＬＣ２からの直接的な変換によって引き起こされ得ることを示す。さらに、いくつかのウイルス感染および細菌感染、ならびにタバコ煙への曝露が挙げられる多種多様なトリガー、とりわけＣＯＰＤの増悪と関連するトリガーが、局所的ＩＬＣ２におけるこの可塑性を誘導することが示された。
【００７５】
これらの観察を鑑みて、自然リンパ球（サブセット２）（ＩＬＣ２）の、自然リンパ球（サブセット１）（ＩＬＣ１）への変換を阻害する方法が、本明細書中で提供され、ＩＬＣ２が、ＩＬＣ２の、Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＦＮγ＋ＩＬＣ１へのスイッチを妨げ、ＩＬＣ１におけるＩＬ−１２レセプタおよび／もしくはＩＬ−１８レセプタの発現レベルを維持もしくは抑制し、かつ／またはＩＬＣ２におけるＳＴ２、ＣＲＴＨ２、および／もしくはＧＡＴＡ３の発現レベルを維持し、もしくは増大させるモジュレータと接触する。ＩＬＣ２の集団の、ＩＬＣ１への変換の阻害が、予防、ＣＯＰＤまたは隠れた肺炎症性の症状に関連した症候の悪化を制限するための処置が挙げられる処置を促進し得る。さらに、ＩＬＣ２の、ＩＬＣ１へのそのような阻害は、ＣＯＰＤの進行を制限し得、または他の肺炎症性の症状の進行を制限し得る。
【００７６】
また、より多くの標的処置選択肢もしくは標的処置レジメンまたは増強処置選択肢もしくは増強処置レジメンを患者に提供するために、予防、症候の悪化を制限する処置が挙げられる処置が、ＩＬＣ１のレベルが高い、またはＩＬＣ１／ＩＬＣ２の比率が高いと判定された対象または患者に実行され、そのような判定が、モジュレータまたは疾患修飾性医薬品を投与する前に、ＩＬＣ２の分子サインの、ＩＬＣ１の分子サインへのスイッチを同定することによってなされる、追加の方法が提供される。
【００７７】
本発明はまた、本発明のＩＬＣ２の分子サインが、Ｇａｔａ３、Ｒｏｒａ、Ｉｌ４、Ｉｌ５、Ｉｌ９、ｌｌ１３、Ｐｅｎｋ（プロエンケファリン）、Ａｒｅｇ（アンフィレグリン）、Ｉｌ１７ｒｂ、およびＩｌ１ｒＩ１からなる群から選択される１つまたは複数のＴｈ２関連転写産物の発現に対応することを示す。本発明のＩＬＣ１の分子サインは、請求項２６に記載の１つまたは複数のＴｈ２関連転写産物のより低い発現、ならびにＴｂｘ２１、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ１２ｒｂ２、Ｉｌ１８ｒ１、Ｃｘｃｒ３、およびＣｃｒ５からなる群から選択される１つまたは複数の転写産物のより高いレベルに対応し、前記レベルは、ＩＬＣ２の前記転写産物のレベルと比較される。
【００７８】
一実施形態において、本明細書中に記載される方法は、モジュレータまたは疾患修飾性医薬品を対象に投与することを含む。モジュレータまたは疾患修飾性医薬品の投与に対する臨床反応は、スクリーニング技術、例えば磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、Ｘ線撮影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリ、または蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）分析、組織学、剖検所見、および血液化学を用いて評価され得、以下に限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＲＩＡ、クロマトグラフィ等によって検出可能な変化が挙げられる。さらに、モジュレータまたは疾患修飾性医薬品による治療を経験する対象は、疾患または障害に関連する症候の向上を経験し得る。
【００７９】
モジュレータまたは疾患修飾性医薬品を調製し、かつそれを必要とする対象に投与する方法は、当業者に周知であり、または当業者によって容易に決定され得る。投与経路は、例えば、経口、非経口であってもよいし、吸入によってもよいし、局所的であってもよい。本明細書中で用いられる用語「非経口」は、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹膜内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、および膣投与を含む。経口剤型として、例えば、カプセル、タブレット、水性懸濁液、および溶液が挙げられる。経鼻エーロゾルまたは吸入剤型は、例えば、ベンジルアルコール、または他の適切な防腐剤、生体利用性を増強する吸収プロモータ、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水溶液として調製されてよい。
【００８０】
通常、適切な医薬組成物は、バッファ（例えば酢酸バッファ、リン酸バッファ、またはクエン酸バッファ）、場合によっては界面活性剤（例えばポリソルベート）、場合によっては安定化剤（例えばヒトアルブミン）その他を含んでよい。薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤の形態および特性は、組み合わされることになる活性成分の量、投与経路、および他の周知の変量によって決定され得る。一実施形態において、投与は、例えば吸入または鼻腔内投与によって、気道に直接的になされる。
【００８１】
本明細書中で考察されるように、モジュレータまたは疾患修飾性医薬品は、肺炎症を伴う疾患または障害のインビボ処置にとって治療的に有効な量で投与され得る。この点に関して、インヒビタは、投与を容易にし、かつ活性剤の安定性を促進するように製剤化され得ることは勿論である。
【００８２】
本発明に従う医薬組成物は、薬学的に許容可能な、毒性のない、滅菌されるキャリア、例えば生理食塩水、無毒性バッファ、防腐剤等を含み得る。本明細書中で開示される治療方法に用いるのに適した製剤が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（２０００）に記載されている。
【００８３】
組成物は、単回用量、複数回用量として投与されてもよいし、点滴の確立された期間にわたって投与されてもよい。投薬量レジメンもまた、所望される最適反応（例えば、治療的反応または予防的反応）を実現するように調整され得る。キャリア材料と組み合わされて剤型を生成することができるモジュレータまたは疾患修飾性医薬品の量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態（すなわち、治療を受ける個体の疾患の重篤度、病歴、ならびに年齢、身長、体重、健康状態、および物理的状態）、処置が予防的であるか治療的であるか、他の医薬品が投与されるか、そして患者がヒトであるか動物であるかが挙げられる多くの様々な因子に応じて変わることとなる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒト哺乳類もまた処置され得る。投与されることになるモジュレータまたは疾患修飾性医薬品の量は、本開示を前提に、当業者によって、過度の実験をすることなく容易に決定される。処置投薬量は、当業者に知られているルーチンの方法を用いて、安全性および有効性を最適化するように滴定され得る。
【００８４】
本開示はまた、肺炎症、例えばＣＯＰＤ、またはタバコ煙、細菌感染、ウイルス感染、もしくはそれらの組合せによって引き起こされる肺炎症を伴う疾患または障害を処置し、または予防するためのモジュレータまたは疾患修飾性医薬品の使用を提供する。
【００８５】
本開示はまた、肺炎症、例えばＣＯＰＤ、またはタバコ煙、細菌感染、ウイルス感染、もしくはそれらの組合せによって引き起こされる肺炎症を伴う疾患または障害を処置し、または予防する医薬の製造におけるモジュレータまたは疾患修飾性医薬品の使用を提供する。
【００８６】
「疾患修飾性医薬品」は、短時間作用型または長時間作用型の気管支拡張薬、吸入ステロイド、組合せインヘラー、経口ステロイド、ホスホジエステラーゼ−４インヒビタ、またはテオフィリンが挙げられる気管支拡張薬であってよい。
【００８７】
本開示において引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。また、本明細書中で引用され、または言及されるあらゆる製品についてのメーカーのあらゆる説明書またはカタログが、参照によって組み込まれる。参照によって本文中に組み込まれる文献、または本文中のあらゆる教示は、本発明の実行に用いられ得る。参照によって本文中に組み込まれる文献は、先行技術であることが承認されていない。
【実施例】
【００８８】
本開示の実施形態は、本開示の特定の抗体の調製および本開示の抗体を用いる方法を詳細に記載する、以下の非限定的な実施例を参照してさらに定義され得る。材料および方法の双方に対する多くの改良が、本開示の要旨を逸脱しない範囲で実行され得ることは、当業者にとって明らかであろう。
【００８９】
実施例１．肺に内在するＩＬＣ２は、インフルエンザ抗原投与の後、ＧＡＴＡ−３を下方制御する
ＩＬＣ２は、肺の主要なＩＬＣ集団であり、ＧＡＴＡ−３の発現によって特徴付けられる。タバコ煙が、当該細胞においてＩＬ−５およびＩＬ−１３の生成を抑制することによって、肺に内在するＩＬＣ２反応をサイレンシングすることが以前に示された。本発明は、この変化の関連性、およびＣＯＰＤと関連する他の病原性の刺激が、これと同じことをし得るかを示すものである。
【００９０】
肺ＩＬＣ２は、非Ｔ／ＮＫ細胞の集団と定義され、これは、リニイッジマーカーの発現についてネガティブであり、そしてＣＤ９０、ＩＬ−７Ｒα、ＣＤ４４、ＩＣＯＳ、ＧＡＴＡ−３、およびＳＴ２についてポジティブ（高）であった（図１ａ、図１ｂ）。肺に内在する免疫細胞上でのＳＴ２の発現は、タバコ煙への曝露の後に、動的に調節される。したがって、ＳＴ２に特異的な試薬、およびその調節をより正確に理解するための必要性の不在下で、ＳＴ２−ＧＦＰ＋リポーターマウスを開発した。Ｔ−ｂｅｔまたはＲＯＲγｔを発現する無感作の肺に、Ｌｉｎ−ＣＤ９０＋細胞（すなわち、ＩＬＣ１細胞およびＩＬＣ３細胞）の小集団が存在するが、大部分のＩＬＣは、ＳＴ２ＨＩＧＡＴＡ−３ＨＩであり、総ＩＬＣプールのおおよそ８５〜９０％を表した。この観察は、ＳＴ２リポーターマウスにおいてＩＬＣ２を評価したときに確認され（図１ｃ、図１ｄ）、ＩＬＣ２が、ＣＤ９０、ＩＬ−７Ｒα、ＣＤ４４、およびＣＤ２５を発現するＬｉｎ−ＳＴ２−ＧＦＰ＋細胞として容易に同定可能であった。
【００９１】
興味深いことに、インフルエンザＡ型による感染は、非感染マウス由来のＩＬＣ２と比較した場合、ＧＡＴＡ−３の急速かつ劇的な損失（≧５０％）をもたらした。この損失は、感染後（ｐ．ｉ．）４８時間という早い時期に観察されて、ｐ．ｉ．６日目でも依然として明らかであった（図１ｅ）。さらに、ＧＡＴＡ−３の損失は、感染後の当該細胞において、ＩＬＣ２関連マーカーＳＴ２の発現の著しい低下と相関した（図１ｆ）。当該マーカーの損失は、ＩＬＣ２流出または細胞死と関連しなかった。なぜなら、血液、流入領域リンパ節（ｄＬＮ）、または気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）において、有意なＩＬＣの検出がなかったため；そして肺におけるＩＬＣが、ＰＩおよびアネキシンＶ染色の判定に従って、アポトーシスであるようではなかったためであった。
【００９２】
ウイルス感染が、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８が挙げられる炎症誘発性サイトカインの生成を伴うので、ＩＬＣにおけるこれらのＴｈ１関連メディエータのレセプタ発現を調査した。驚くほどに、ＩＬＣ２上でのＳＴ２の損失が、ＩＬ−１８Ｒα＋ＩＬＣ集団の平行増加と強く相関した（図１ｆ、図１ｇ；Ｒ＝−０．８５９）。ＩＬ−１２Ｒβ２発現が、ＳＴ２の損失と相関するようではなかったが、感染後のこのＩＬ−１８Ｒα＋ＩＬＣ集団上でのＩＬ−１２Ｒβ２の有意な増大も観察された（図１ｈ）ことから、ＩＬ−１２Ｒβ２は、当該細胞上のＩＬ−１８Ｒαよりも早く出現し得ることが示唆される。
【００９３】
Ｔ−ｂｅｔは、ＩＬ−１２の下流にある転写因子であり、これは、ＩＬＣ１のマーカーであり、Ｔｈ１反応の促進と強固に関連する。したがって、Ｔ−ｂｅｔを発現する肺内在ＩＬＣを調査して、ｐ．ｉ．７日目にＴ−ｂｅｔを発現するＩＬＣのパーセンテージの増大と付随して起こる、当該細胞におけるＧＡＴＡ−３の損失が見出された（図１ｉ）。実際に、ウイルス起因性Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＬＣは全て、肺におけるＩＬ−１８Ｒα＋サブセット内に含まれていた（図１ｊ）。ＩＬ−１８Ｒα＋Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＬＣは、ＣＤ３−、ＣＤ４９ｂ−、Ｌｉｎ−、ＣＤ９０＋、およびＣＤ４４＋のままであった一方、ＳＴ２＋ＩＬＣと比較して、中間レベルのＣＤ２５、ＩＬ−７Ｒα、ＩＣＯＳ、およびｃ−Ｋｉｔを発現した。
【００９４】
興味深いことに、ウイルス感染後のＩＬＣ集団の変化は、ＩＬＣ１様反応に特異的であるようであった。というのも、同時点での肺における顕著なＲＯＲγｔ＋ＩＬＣ３が検出されなかったからである。さらに、感染中の肺における大部分の増殖Ｋｉ６７＋ＩＬＣは、ＩＬ−１８Ｒα＋を発現した（図１ｋ）ことから、当該細胞の維持または機能にＩＬ−１８Ｒαが果たす役割が示唆された。
【００９５】
転写因子発現の変化の結果を調査するために、総肺内在ＩＬＣを、インフルエンザ感染マウスから単離して、イクスビボで刺激して、サイトカイン発現パターンを評価した。感染マウス由来の肺ＩＬＣは、ｐ．ｉ．７日目にて、モック（ＰＢＳ処理）動物由来のＩＬＣよりも著しく少ないＩＬ−５およびＩＬ−１３を生成することが見出された（図１ｌ）。しかしながら、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８についてのレセプタの上方制御に合わせて、感染動物の肺から単離したＩＬＣは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８のイクスビボ刺激に反応して、有意なレベルのＩＦＮ−γを生成した（図１ｌ）。
【００９６】
まとめると、これらのデータは、局所的ＩＬＣ２機能の低下およびＩＬ−１８Ｒα＋Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＦＮγ＋ＩＬＣ１の増殖によって特徴付けられる、ウイルス抗原投与中の肺内在ＩＬＣの表現型および機能的能力双方の主要な変化を実証している。
【００９７】
実施例２．タバコ煙への曝露および細菌感染は、肺ＩＬＣの表現型変化を誘導する
ＣＯＰＤの増悪が、ウイルスおよび細菌のいくつかの呼吸器感染と関連するので、ＩＬＣサブグループのスイッチが、様々なＣＯＰＤ関連病原体を抗原投与したマウスで起こるかを調査した。驚くほどに、酷似したパターンが見出された。インフルエンザＡ型（ＰＲ８）、呼吸合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（図２ａ）、またはグラム陽性菌およびグラム陰性菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（図２ｂ）および分類不可能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）（図２ｃ〜図２ｆ）の様々な株による接種は全て、ＧＡＴＡ−３の損失、およびその後の、肺ＩＬＣ集団内でのＩＬ−１２Ｒβ２、ＩＬ−１８Ｒα、およびＴ−ｂｅｔの発現の増大を誘導した。
【００９８】
ＩＬＣサブグループのこの移行は、ＣＯＰＤの主な起因因子の１つであるタバコ煙への曝露が、ＧＡＴＡ−３の劇的な損失を誘導した（すなわち、煙吸入の４日後および１０日後）点で、感染性トリガーに限定されなかった。ＧＡＴＡ−３レベルは、６ヵ月の連続的な煙曝露により、有意に引き下げられたままであった（図２ｇ〜図２ｈ；データを最大８週示す）。特に、ＩＬ−１２Ｒβ２＋、ＩＬ−１８Ｒα＋、Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＬＣ１集団の出現は、煙への曝露の８週後も観察され（図２ｉ〜図２ｍ）、更なる処理の６ヵ月後も維持された。最後に、ＣＯＰＤ増悪モデルにおいて、タバコ煙への曝露がウイルス感染と組み合わされる場合、肺に内在するＩＬＣの変化は、劇的に増大することが見出された。以前にタバコ煙に曝露されたマウスは、煙またはウイルス単独と比較して、ＧＡＴＡ−３およびＳＴ２の抑制がより大きく、かつ肺内在ＩＬＣのＩＬ−１８Ｒαのレベルが非常に高かった。
【００９９】
まとめると、これらのデータは、局所的ＩＬＣ集団における表現型のスイッチが、外来の、そして／または環境の傷害に反応する一般的な機構であり得ることを実証している。
【０１００】
実施例３．ＩＬ−１２およびＩＬ−１８は、局所的ＳＴ２＋ＩＬＣ２プールからＩＦＮ−γ生成ＩＬＣ１を誘導する
ＩＬＣ２がＩＬＣ１表現型を採用し得るかを試験するために、ＩＬ−３３拡張（ｅｘｐａｎｄｅｄ）ＩＬＣ２を、肺から＞９８％の純度に富化して、４〜７日間、種々のサイトカインと共に培養した。ＩＬ−１２またはＩＬ−１５による当該細胞の刺激は、ＩＬＣ２からのＩＦＮ−γの生成を誘導しなかった。しかしながら、ＩＬ−１８に、そして特にＩＬ−１２およびＩＬ−１８の組合せに反応して、当該細胞の約２０〜５０％（それぞれ）が、ＩＦＮ−γを生成した。これはまた、培養液上清中に存在するレベルにも反映された（図３ａ、図３ｂ）。これらのデータは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８が、ＩＬＣ３からのＩＦＮ−γ生成を誘導し得ることを実証する研究と一致している。
【０１０１】
ＩＬ−１５がＩＬＣ１によるＩＦＮ−γの発現を促進するという以前の報告にも拘らず、ＩＬ−１５は単独で、またはＩＬ−１２および／もしくはＩＬ−１８と組み合わされて、これらの条件下で、ＩＦＮ−γ生成に有意に影響を及ぼさないことが見出された（図３ｂ）。ＩＬ−５の生成は、注目すべきことに、このアッセイにおいて、様々な条件の全体にわたって一貫していた。このことは、ＩＬＣ２が当該サイトカインを本質的に生成するという概念を支持している。ＩＬ−１３生成はより可変的であったが、レベルは、ＮＦκＢ活性化サイトカイン、特にＩＬ−３３およびＩＬ−１８に反応して、一貫してより高かった。驚くほどに、ＩＬＣ２は、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８で刺激した場合に、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γを共発現した。このことは、当該細胞が、ＩＬＣ２の機能的可塑性と一致するサイトカイン発現の雑然としたパターンを有することを実証している。ゆえに、肺由来のＩＬＣ２は、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８に反応して、ＩＬＣ１関連マーカーを発現し得、かつ高いレベルのＩＦＮ−γを生成し得る。
【０１０２】
ＩＬ−１２およびＩＬ−１８がインビボでＩＬＣ１増殖を誘導し得るかを判定するために、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８、ＩＬ−３３単独、または３つ全てのサイトカインの組合せの鼻腔内投与後のＩＬＣ反応を調査した。ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−１８の、無感作マウスへの局所的共投与は、ＰＢＳまたはＩＬ−３３処理コントロールと比較して、総肺内在ＩＬＣにおけるＧＡＴＡ−３およびＳＴ２の発現を有意に減少させ（図３ｃ）、そしてウイルス感染中に観察されたものと同程度であった（図１）。さらに、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８処理は、ＩＬ−１８Ｒα＋、Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＬＣの発現および数を著しく増大させ、これは、ＰＢＳ処理またはＩＬ−３３処理と比較した場合、劇的に少ないＩＬ−５およびＩＬ−１３を、しかし有意に高い量のＩＦＮ−γを、イクスビボで生成した（図３ｄ〜図３ｇ）。
【０１０３】
ＩＬ−３３の鼻腔内送達は、肺内のＳＴ２＋、ＧＡＴＡ−３＋ＩＬＣ２の数を有意に増大させ、これは高いレベルのＩＬ−５（図３ｆ）およびＩＬ−１３を生成した。興味深いことに、ＩＬＣ１の割合の著しい増大にも拘らず、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８（図３ｃ、図３ｄ）に反応して、当該細胞の総数の最小の、それでも有意な増大が観察された（図３ｅ）。しかしながら、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８と組み合わせたＩＬ−３３の投与は、ＩＬＣ２増殖を犠牲にして、ＩＬＣ１の総数を劇的に増大させた（図３ｅ）。さらに、Ｔｈ２サイトカインの生成を誘導するＩＬ−３３の能力は、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８の存在下で著しく止められ、当該細胞は、かなりの量のＩＦＮ−γを生成した（図３ｇ）。当該細胞はまた、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γを共発現し（図３ｈ）、これは、局所的ＩＬＣ２プールからのＩＬ−１８Ｒα＋Ｔ−ｂｅｔ＋ＩＦＮ−γ＋ＩＬＣ１の発生と一致している。特に、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８いずれかの単独の投与は、ＧＡＴＡ−３、Ｔ−ｂｅｔ、ＩＬ−１８Ｒα、またはＩＦＮ−γの発現に及ぼす効果が最小であった。ゆえに、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８は、ＩＬＣ１増殖をインビボで共調節する一方、ＩＬ−３３は、コンテキスト依存的に作用して、この反応を拡大する。
【０１０４】
ＳＴ２は、ＩＬＣ２におけるＧＡＴＡ−３の直接の標的である。ＩＬＣ１がサイトカイン処理後に局所的ＩＬＣ２プールから増殖するかを判定するために、ＳＴ２  ＧＦＰ＋マウスにおいてこれらの実験を繰り返した。ＳＴ２−ＧＦＰ＋対ＩＬ−１８Ｒαの発現の比較により、無感作肺においてＩＬＣの２つの異なった集団、ＳＴ２−ＧＦＰ＋ＩＬ−１８Ｒα−ＩＬＣ２（９３．４％）およびＳＴ２−ＧＦＰ−ＩＬ−１８Ｒα＋ＩＬＣ１（４．０１％）が明らかとなり、これらは、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３処理と同時に劇的に変更されて、ＩＬ−１８Ｒαの発現によって判定して、ＩＬＣ１の頻度が増大した（図３ｉ）。驚くほどに、当該ＩＬ−１８Ｒα＋細胞はまた、ＳＴ２−ＧＦＰについて中程度であり（図３ｉ）、元のＳＴ２−ＧＦＰ＋ＩＬＣ２集団のおおよそ５０％を表すと推定された。ＧＦＰ＋平均蛍光強度（ＭＦＩ）のアドホック分析により、サイトカイン処理後のＩＬＣ２上でのＳＴ２発現の、中程度であるが有意な低下が明らかとなった。ＩＬ−１８Ｒα＋細胞上でのＳＴ２−ＧＦＰ＋の発現は、無感作の肺において、ＳＴ２−ＧＦＰ−ＩＬ−１８Ｒα＋ＩＬＣ１と比較して低いが、さらに著しく増大した（図３ｊ）。ゆえに、ＩＬＣ１は、肺内の既存の、真正の（ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ）ＩＬＣ１の増殖からではなく、局所的ＳＴ２＋ＩＬＣ２プールから出現する。
【０１０５】
無感作マウスからソートしたＩＬＣ２間の遺伝子発現プロフィールの、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３（サイトカイン）処理マウスからソートしたＩＬＣ２（ＳＴ２＋ＩＬ−１８Ｒα−）およびＩＬＣ１（ＳＴ２−ＩＬ−１８Ｒα＋）に対する比較により、部分的に重複するが異なった分子パターンが明らかとなった。無感作肺から単離したＩＬＣ２は、Ｇａｔａ３、Ｒｏｒａ、Ｉｌ４、Ｉｌ５、Ｉｌ９、ｌｌ１３、Ｐｅｎｋ（プロエンケファリン）、Ａｒｅｇ（アンフィレグリン）、Ｉｌ１７ｒｂ、およびＩｌ１ｒＩ１が挙げられるＴｈ２関連転写産物を発現した。同様に、サイトカイン処理マウス由来のＩＬＣ２は、多くの当該同遺伝子を上方制御した（図３ｋ）。それに対して、サイトカイン処理動物由来のＩＬ−１８Ｒα＋ＩＬＣ１は、上述のＩＬＣ２転写産物のより低い発現、ならびにＴｂｘ２１、Ｉｆｎｇ、Ｉｌ１２ｒｂ２、Ｉｌ１８ｒ１、Ｃｘｃｒ３、およびＣｃｒ５のより高いレベルによって特徴付けられる、変更された、特有の遺伝子発現プロフィールを有するようであった（図３ｋ）。特に、当該細胞は、無感作の肝臓ＩＬＣ１／肺ＮＫ細胞の、サイトカイン拡張ＩＬＣ２に対する表現型が中程度であった。というのも、Ｔｈ１関連転写産物は、より高かったが、細胞溶解機能に関連する遺伝子（例えば、Ｐｒｆ１、Ｇｚｍａ、Ｇｚｍｂ、Ｇｚｍｃ）を著しく低いレベルで発現したからである（図３ｋ）。興味深いことに、例えば、Ｃｃｒ５、Ｃｃｌ１７、およびＣｘ３ｃｒ１といったケモカインのレセプタに関する、サイトカイン処理マウス由来のＩＬＣのサブセットの差異も観察された一方、Ｉｌ７ｒａ、Ｉｌ２ｒ、およびＩｃｏｓの発現は、ＩＬＣ２と比較した場合に、活性化ＩＬＣ１においてより低かった（図３ｋ）。
【０１０６】
まとめると、これらのデータは、ＩＬＣ２可塑性が、分子サイン内のスイッチに関係することを強調しており、これは、フローサイトメトリを介して報告されるプロテオミクス変化と一致している。
【０１０７】
実施例４．ＩＬＣ２は、ウイルス抗原投与中にＩＬＣ１に直接変換して、炎症の領域内でクラスターを形成する
ＩＬＣ２が、感染中にＩＬＣ１に変換され、かつ／またはスイッチする能力を有し得るかを、ＩＬＣ、ＮＫ細胞、および成熟リンパ球を欠くＲＡＧ／γｃ二重ノックアウトマウスを用いて、直接試験した。肺内在ＳＴ２ＨＩＧＨ、ＩＬ−１８Ｒα−ＩＬＣ２を、インフルエンザＡ型感染の１２時間前に、ＩＬ−３３処理ＧＦＰ＋トランスジェニックマウスからＦＡＣＳソートして、ＲＡＧ／γｃ−／−マウス中に静脈内から移入した（図４ａ）。ＩＬ−３３拡張ＧＦＰ＋ＩＬＣ２は、高いレベルのＧＡＴＡ−３サイトカインおよびＴｈ２サイトカインを発現したが、ＩＬＣ１マーカーはそうではなかった（図４ｂ〜図４ｆ）。このプロトコルを用いて、全てのＩＬＣを、ＧＦＰ発現によって容易に定義可能であると考えられることを確実にした。
【０１０８】
感染への反応は、野生型マウスと比較して、ＲＡＧ／γｃ−／−動物において遅延し、かつ致死であった；したがって、生存を長くするために、当該マウスを、感染時に、ＧＦＰ−脾細胞、ならびに肺由来のＮＫ細胞およびＴ細胞で（腹膜内で）再構築した。その後、移入したＧＦＰ＋ＩＬＣを、ｐ．ｉ．７日目と１０日目に、ＧＡＴＡ−３、ＩＬ−１２Ｒβ２、およびＩＬ−１８Ｒαの発現が挙げられる表現型プロフィールの変化について分析した。養子移入して直ぐに、ＧＦＰ＋ＩＬＣは、レシピエントマウスの肺に浸潤し、フローサイトメトリによって、ＣＤ２５、ＣＤ９０、およびＳＴ２を発現するＬｉｎ−ＧＦＰ＋細胞として、無感作動物および感染動物において容易に定義可能だった（図４ｂ）。
【０１０９】
さらに、感染に反応して、当該ＧＦＰ＋ＩＬＣ２は、ｐ．ｉ．７日目までにＧＡＴＡ−３発現を有意に下方制御した（図４ｃ、図４ｆ）。さらに、ＧＡＴＡ−３のこの損失は、当該ＧＦＰ＋細胞上でのＩＬ−１８ＲαおよびＩＬ−１２Ｒβ２の顕著な上方制御と相関した（図４ｄ、図４ｅ、図４ｇ、図４ｈ）。また、ＧＦＰ＋ＩＬＣ２の表現型の同程度の変化が、ｐ．ｉ．１０日目に観察された。しかしながら、当該マウスにおける感染に対する反応の遅延に潜在的に起因して、ｐ．ｉ．７日目または１０日目のＴ−ｂｅｔ発現は検出されなかった。注目すべきことに、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８によるイクスビボ刺激の直後に、ＧＦＰ＋細胞は、ｐ．ｉ．１０日目にかなりの量のＩＦＮ−γを生成することができた。この変化は、ＩＬ−１３の下方制御と合致した。
【０１１０】
驚くほどに、当該同マウス由来の肺組織の免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析は、肺内で、感染に対する著しいパッチ様反応を明らかにした。移入したＧＦＰ＋ＩＬＣは、ウイルス起因性炎症と特徴的に関連する炎症巣内にクラスターを形成するようであった。倍率が高いほど、ＩＬＣは典型的に、非炎症領域に密接する組織の領域においてでさえ、ウイルス複製領域内でクラスターを形成することが明らかとなった。しかしながら、実質組織の非炎症領域におけるＧＦＰ＋ＩＬＣも観察されたが、数は非常に少なく、大部分は孤立していた。二重ＩＨＣを用いて、インフルエンザ＋上皮細胞によるＩＬＣの当該クラスターの共局所性、および炎症を起こした気道に隣接する血管周囲領域を確認した。重要なことに、ＩＨＣおよびインサイチュハイブリダイゼーションの組合せは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８のｍＲＮＡを発現する脊髄由来細胞が、肺の炎症領域内でＧＦＰ＋ＩＬＣに隣接して頻繁に同定されることを明らかにした。
【０１１１】
四重組織化学（Ｑｕａｄｒｕｐｌｅ  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を、免疫蛍光および発色性ＩＨＣの組合せと使用して（実施例９参照）、感染後の肺におけるＧＡＴＡ−３関連ＩＬＣ発現を調査し、かつ定量化した。デジタル化したスライド画像全体のコンピュータ処理画像解析を用いて、個々の全ＧＦＰ＋ＩＬＣ（緑色の蛍光）を、組織内で自動的に同定して、青色ＤＡＰＩ（断面あたりの総核含有量についてのＤＮＡマーカー）ならびにその赤色／ピンク色のＧＡＴＡ−３についての免疫染色について、染色強度でスコア化した。
【０１１２】
コントロールマウスにおけるＧＡＴＡ−３ＨＩＧＨＩＬＣに、そしてインフルエンザ処理動物由来の非感染領域に、感染領域における典型的なＧＡＴＡ−３ＬＯＷＩＬＣと比較して、それぞれｐ．ｉ．５日目および６日目に分析を実行した。最初に、コントロールマウス（ＰＢＳ処理）対感染マウス由来の肺切片全体におけるＩＬＣ２関連ＧＡＴＡ−３発現を調査した。個々のＧＦＰ＋細胞の分散ダイヤグラム分析により、明らかに、ウイルス感染肺が、非感染マウスと比較して、有意に多くのＧＡＴＡ−３ＬＯＷ発現ＩＬＣを含有したことが示される（図５ａ）。全インフルエンザ処理マウスにおける均一な感染の更なる確認の後に、そして核の表示が２Ｄ断面細胞領域において異なるので、各ＧＦＰ＋細胞におけるＧＡＴＡ−３発現を、細胞の核ＤＡＰＩ含有量に対して標準化した。ここでも、コントロールと比較した、感染マウスにおけるＧＡＴＡ−３ＨＩＧＨＩＬＣ頻度の著しい引き下げが見出された（図５ｂ）。
【０１１３】
興味深いことに、インフルエンザ処理マウス由来のＩＬＣにおけるＧＡＴＡ−３の時間依存的損失が観察された。なぜなら、ＧＡＴＡ−３強度が、ｐ．ｉ．５日目に対して６日目に調査したマウスのＧＦＰ＋細胞において、さらに縮小したからである（図５ａ、５ｂ）。ＦＡＣＳデータは、ＧＡＴＡ３発現のこの時間経過を確認した。重要なことに、コントロールマウスと感染マウス間のＩＬＣ関連ＧＡＴＡ−３レベルの統計学的に有意な引き下げを、個々のマウス肺切片あたりの平均ＧＦＰ＋ＧＡＴＡ−３発現を比較することによって、定量化した（図５ｃ；ｐ．ｉ．５日目由来のデータ）。
【０１１４】
最後に、感染の不規則な性質を考えると、ＧＡＴＡ−３発現の損失は、評価した肺組織の全体を通して、炎症微環境に特異的であった。ゆえに、四重（インフルエンザ、ＧＦＰ、ＧＡＴＡ−３、およびＤＡＰＩ）染色切片由来の空間データ（ｘ、ｙ座標）を用いて、肺組織の領域におけるＧＡＴＡ−３発現レベルを、細胞およびウイルスの高密度対低密度と比較する詳細な分析を実行した。肺のパッチ状の細胞高密度領域を、同切片由来のウイルス密度ヒートマップと、そして個々のＧＦＰ細胞の空間分布をプロットして、それらのＧＡＴＡ−３強度に従って色分けした画像と、比較した。注目すべきことに、ＧＡＴＡ−３ＬＯＷＩＬＣは、肺の感染領域内で、かなり高頻度であった。それに対して、周囲の、非感染組織領域において見出されるＩＬＣは、大部分がＧＡＴＡ−３ＨＩＧＨであった。
【０１１５】
要約すれば、これらのデータは、ＩＬＣ２が直接、ウイルス抗原投与後にＩＬＣ１様表現型に変換されて、ウイルス複製と関連する領域に移動することを実証している。これはおそらく、その後の可塑性を決定する局所的炎症誘発キュー、例えばＩＬ−１２およびＩＬ−１８に対する反応である。
【０１１６】
実施例５．Ｔ−ｂｅｔは、ＩＬＣ２のサイレンシングに必ずしも必要でないが、ＩＦＮ−γの生成に必要とされる
ウイルス抗原投与の後にＩＬＣ１の維持および／または増殖に果たすＴ−ｂｅｔの機能的役割があるかを判定するために、Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスのＩＬＣ反応を調査した。興味深いことに、Ｔ−ｂｅｔは、Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）マウスと比較した場合に、当該細胞上でのＧＡＴＡ−３およびＳＴ２の発現の損失またはＩＬ−１２Ｒβ２およびＩＬ−１８Ｒαの発現の増加に必要とされず、Ｔ−ｂｅｔは、ＩＬＣ１増殖にも必要とされなかった（図６ａ〜図６ｆ）。しかしながら、感染Ｔ−ｂｅｔ−／−動物から単離したＩＬＣは、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８によるイクスビボ刺激の後に、ＩＦＮ−γを生成する能力が著しく損なわれた（図６ｇ）。さらに、ＷＴマウスおよびＴ−ｂｅｔ−／−マウス由来のＩＬＣは、同様に、ＧＡＴＡ−３およびＳＴ２を下方制御し、かつＩＬ−１２Ｒβ２鎖およびＩＬ−１８Ｒα鎖を上方制御することによって、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８の鼻腔内投与に反応した。しかしながら、ウイルス感染研究の場合のように、Ｔ−ｂｅｔは、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８に反応するＩＦＮ−γの最大発現に必要とされた。ゆえに、Ｔ−ｂｅｔは、Ｔｈ１型炎症に反応するＩＬＣ１へのＩＬＣ２の変換に必ずしも必要でないが、当該細胞におけるＩＦＮ−γの最適な生成に不可欠であるようである。
【０１１７】
実施例６．ＩＬＣ１は病原性であり、ウイルス起因性の体重減少および感染に対する炎症反応を劇的に拡大する
次に、感染中のＩＬＣ２可塑性、およびＩＬＣ１への特異的表現型スイッチについての生物学的関連性を調査した。しかしながら、ＩＬＣ特異的表面マーカーの不足を考えると、ＩＬＣ集団の抗体媒介枯渇の戦略は、限られている。Ｔｈｙ抗原（ＣＤ９０）に向けられる抗体が、適応性の免疫細胞が全くない動物において、組織内在ＩＬＣを枯渇させるのに首尾よく用いられてきた。抗ＣＤ９０抗体による処理が、肺内在ＩＬＣの＞９０％を枯渇させるという事実が確認された一方、当該抗体が、全身的に、ＮＫ細胞の約７０％、および肺内在ＣＤ９０＋ＣＤ４５−ＣＤ１６６＋Ｓｃａ−１＋間葉系幹細胞の集団を枯渇させることも見出された。
【０１１８】
したがって、ＩＬＣ１の生物学的機能により明確に対処するために、免疫不全マウスにおけるＩＬＣ１またはＩＬＣ２の養子移入を実行した（図６ｈ）。肺内在ＩＬＣ２（ＳＴ２＋、ＧＡＴＡ−３＋）およびＩＬＣ１（ＩＬ−１８Ｒα＋、Ｔ−ｂｅｔ＋）を、ＩＬ−３３またはＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３で処理したＣ５７ＢＬ／６マウスから単離して、インフルエンザＡ型感染の２４時間前に、Ｃ５７ＢＬ／６ＲＡＧ／γｃ欠損マウス中に移入した。驚くほどに、養子ＩＬＣ１を受け入れた動物は、感染前にＩＬＣ２で再構築したマウスと比較して、感染に対して有意に大きな体重減少を示した（図６ｈ）。さらに、ＩＬＣ１の移入は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦα、ＩＬ−１α、およびＩＬ−６が挙げられる、劇的な、増幅された炎症誘発性サイトカインの生成と相関した（図６ｉ）。
【０１１９】
この時点でのＩＬＣ１移入後の細胞炎症の差異は、おそらくＲＡＧ／γｃ欠損マウスにおける感染に対する反応の遅延に起因して、観察されなかった。Ｔ−ｂｅｔ／ＩＦＮ−γがＩＬＣ１の炎症潜在性に必要とされたかを最終的に試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）マウスおよびＴ−ｂｅｔ欠損マウスから単離したＩＬＣ１を用いて、養子移入を繰り返した。先で示すように（図６ｉ）、ＩＬＣ１移入は、Ｔｈ１サイトカイン生成の増幅を伴った（図６ｊ）；しかしながら、Ｔ−ｂｅｔ欠損ＩＬＣ１は、ＩＦＮγ生成が挙げられる、この強化された抗ウイルス反応を促進することができなかった（図６ｊ）。驚くほどに、当該細胞におけるＴ−ｂｅｔの不在は、肺内で、Ｔｈ２サイトカイン、すなわちＩＬ−４およびＩＬ−５の生成を、有意にトリガーした（図６ｋ）。
【０１２０】
ゆえに、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８は、ウイルス起因性炎症を劇的に強化する能力と共にＩＬＣ１の集団を増殖させる一方、Ｔ−ｂｅｔは、当該細胞の完全な炎症潜在性に必要とされる。
【０１２１】
実施例７．ＩＬ−１２は、ヒトＩＬＣ２の可塑性を誘導する
ヒトＩＬＣ２が可塑性を実証することができ、かつＩＬＣ１に分化することができるかを試験するために、Ｌｉｎ−ＩＬ−７Ｒα＋ＣＲＴＨ２＋ＣＤ１６１＋ＩＬＣ２を、健康なドナーの末梢血からソートして、ＩＬ−２＋ＩＬ−３３またはＩＬ−２＋ＩＬ−１２の存在下で５日間培養して、表面マーカーおよびサイトカインアウトプットについて調査した。以前に報告されたように、ＣＲＴＨ２がヒトＩＬＣ２のマーカーであることが見出されており、そしてＩＬ−２＋ＩＬ−３３中で培養したＩＬＣ２は、ＣＲＴＨ２＋、ＧＡＴＡ３＋、Ｔｂｅｔ−、ＣＤ２５＋、ＣＤ１６１＋、およびＩＬ−７Ｒα＋であった（図７ａ〜図７ｃ）。当該細胞は、高いレベルのＩＬ−１３およびＩＬ−４を生成したが、ＩＦＮ−γの量を有意に低くした（図７ｄ〜図７ｆ）。特に、フレッシュに単離した末梢血ＩＬＣ２は、ＩＬ−３３に反応して、ＩＬ−５をほとんど生成しなかった。これは、Ｏｈｎｅらの観察と一致している。それに対して、培地へのＩＬ−１２の付加により、ＩＬＣ２中のＧＡＴＡ−３およびＣＤ２５のレベルが有意に引き下げられたが、付随して、当該同細胞におけるＴ−ｂｅｔ発現の劇的な増大を促進し（図７ａ〜図７ｃ）、マウスＩＬＣ表現型における観察を補強した。さらに、ＩＬ−１２に反応して、当該ＩＬＣ２は、ＩＬ−３３の存在下でさえ、低いレベルのＩＬ−１３およびＩＬ−４を生成した（図７ｄ、図７ｅ）。さらに、ＩＬ−１２は、ヒトＩＬＣ２において高いレベルのＩＦＮ−γを誘導し、当該レベルは、ＩＬ−３３の存在下で強化された（図７ｆ）。
【０１２２】
ゆえに、ヒトＩＬＣ２は、ＩＬ−１２刺激後にＩＬＣ１表現型を得ることができ、そして、マウスＩＬＣ２に類似して、ＩＬ−３３は、当該細胞によってＩＦＮ−γの生成を拡大することができる。
【０１２３】
実施例８．ＣＯＰＤ患者が、疾患重篤度と相関するＩＬＣ反応を劇的に変更した
ＣＯＰＤの個体は、ウイルス病原体または細菌病原体による感染後に症候の急性的な悪化を経験し、当該増悪は、患者の罹患率および死亡率と相関する。本発明のために開発して利用したＣＯＰＤのマウスモデルにより、ウイルス感染、細菌感染、またはタバコ煙のみへの曝露の後に、肺内在ＩＬＣ集団の有意な機能的表現型の変化が実証され、当該効果は、煙をウイルス感染と組み合わせた場合に増幅する（図２）。類似の変化がＣＯＰＤ患者で起こったかを調査するために、ＣＯＰＤＧｅｎｅコホート由来の安定した患者の末梢血におけるＩＬＣサブセットの頻度を調査した。健康なコントロールの末梢血における循環ＩＬＣの分析により、循環ＩＬＣの約４０％が、ＩＬＣ２マーカーＣＲＴＨ２、ならびにＣＤ２５、ＩＬ７Ｒα、およびＧＡＴＡ−３を発現すること、そして循環ＩＬＣの約５％が、ＩＬＣ１（本明細書でＴ−ｂｅｔＨＩと定義する、図８ａ）であることが明らかとなり、これは以前の報告と一致している。循環している多くのＩＬＣが、知られているＩＬＣ１、ＩＬＣ２またはＩＬＣ３のマーカーを発現しないことが見出された。そして、これらが循環ＩＬＣ前駆体または未発達細胞を表しているかは、不明である。
【０１２４】
ＣＯＰＤ患者におけるＩＬＣ１の頻度は、健康なコントロールと比較した場合、循環系において著しく高いことが観察された（図８ａ、図８ｂ）。ＩＬＣ１のこの増大は、循環ＩＬＣ２細胞の頻度の付随する低下と相関した（図８ｃ）。さらに、より重度の疾患の患者（ＧＯＬＤ  ＩＩＩ／ＩＶ）は、より軽度の疾患（ＧＯＬＤ  Ｉ／ＩＩ）の患者と比較した場合、ＩＬＣ１の頻度が有意に高かった（図８ｄ）。逆に、ＩＬＣ２比は、より軽度の患者（ＧＯＬＤ  ＩＩ）または健康な喫煙者と比較して、より重度の患者（ＧＯＬＤ  ＩＩＩ／ＩＶ）において著しく低かった（図８ｅ）。マッチした（年齢および喫煙パックイヤー）健康な喫煙者はまた、健康なコントロールと比較して、ＩＬＣ１比の有意な増大を示したが、健康な喫煙者と比較して、全てのＣＯＰＤ患者（ＧＯＬＤ  Ｉ〜ＩＶ）において、ＩＬＣ１の頻度がより高い（明らかな）傾向があった（図８ｂ）。興味深いことに、「健康な喫煙者」群の何人かの個体は、比較的低いＦＥＶ１／ＦＶＣ比（０．７３〜０．７１）を示した；すなわち、より軽度のＣＯＰＤ患者において見出される比率（≦０．７）と同程度であり、これは、当該対象の一部において、ＩＬＣ１の増大の原因であり得る。それでもやはり、％ＩＬＣ１と肺機能との間には、予測したＦＥＶ１％（Ｒ＝−０．４１６２、ｐ＜０．０１）およびＦＥＶ１／ＦＶＣ比（Ｒ＝−０．４１５４、ｐ＜０．０１）によって評価されるように、有意な逆相関があった（図８ｆ）。それに対して、ＣＯＰＤ患者の％ＩＬＣ２は、肺機能パラメータと正相関した。
【０１２５】
重要なことに、％ＩＬＣ１と増悪の平均数との間で有意な線形トレンドが存在し、増悪／年が≧２である患者は、ＩＬＣ１頻度が最も高く、かつＩＬＣ２頻度が最も低かった（図８ｇ、図８ｈ）。％ＩＬＣ１対％ＩＬＣ２と、疾患関連臨床エンドポイントとの相互関係と一致して、ＩＬＣ１対ＩＬＣ２の比率の強い相関（Ｒ＝−０．５５２９、ｐ＜０．００１）が見出されたので、ＣＯＰＤにおけるＩＬＣ２の、ＩＬＣ１への直接変換についての仮説が支持される（図８ｉ）。実際に、ＩＬＣ１とＩＬＣ２間の逆相関が一貫して観察された；それでも、ＩＬＣ１およびＩＬＣ２の総計は、同じレベルのままであり（４２．３±１３．１％；平均±ＳＤ）、これは、既存のＩＬＣ集団内の可塑性に起因し得ることを示唆している。
【０１２６】
まとめると、これらのデータは、ＣＯＰＤが、循環ＩＬＣのプールの著しい変化と関連すること、そしてＩＬＣ１の頻度の増大が、疾患の重篤度、肺機能、および増悪の頻度と相関することを実証している。
【０１２７】
実施例９．材料および方法
マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ）、ＳＣＩＤマウス（Ｊａｘ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｘ）、ＲＡＧ／ＳＣＩＤ欠損マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）、ＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）１３１Ｏｓｂ／ＬｅｙＳｏｐＪ、Ｊａｘ）を、ＩＡＣＵＣによって承認されるプロトコルに従ってＭｅｄＩｍｍｕｎｅにて収容して、処理した。Ｔ−ｂｅｔ−／−マウス（Ｊａｘ）を、施設ガイドラインおよびプロトコルに従って、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにて収容して維持した。
【０１２８】
ＳＴ２−ＧＦＰリポーターマウスの生成
標的構築体を、マウス胚盤胞中に注射した。構築体は、上流の４ｋｂの短いホモロジーアームに続いて、イントロン１０内に位置するＦＲＴ隣接ピューロマイシン耐性カセットの後に、Ｉｌ１ｒｌ１遺伝子のエキソン１１を含有し、そこで終止コドンは欠失しており、そして直ぐ後に、ｅＧＦＰに融合したＴ２Ａ自己切断ペプチドの融合配列に続いて、新しい終止コドンが続いた。構築体は、長さ６ｋｂのホモロジーアームで終わった。標的構築体を生じさせるのに用いた全配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写産物ＥＮＳＭＵＳＴ００００００９７７７２（Ｉｌ１ｒｌ１−００１）に基づいた。これは、Ｉｌ１ｒｌ１アイソフォームＡ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ；Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ１４７１９−１）に相当する。Ｆｌｐ媒介組換えの後、ピューロマイシン選択遺伝子が欠失して、標的Ｉｌ１ｒｌ１遺伝子のイントロン１０内に、単一のＦＲＴ部位に続いて、エキソン１１−Ｔ２Ａ−ｅＧＦＰ融合配列をそのまま残した。実験に用いた全てのＳＴ２−リポーターマウスは、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンド上のヘテロ接合ＳＴ２＋／ＧＦＰであった。同腹仔をコントロールとして用いた。
【０１２９】
煙モデル
タバコ煙に曝露するマウスを、以前に公開されたプロトコルに従って、１日２回、１週あたり５日喫煙させて、図２に指定した時点にて分析した。
【０１３０】
細菌およびウイルスの抗原投与モデル
インフルエンザＡ型の５０ＸＴＣＩＤ５０（Ａ／ＦＭ／１／４７）、５０ＸＴＣＩＤ５０  ＰＲ８株（双方ともＨ１Ｎ１である）、または１０６ｐｆｕのＲＳＶＡ２を、マウスに鼻腔内投与した。一部の研究において、インフルエンザＡ型を、以前に確立されたプロトコルに従う煙曝露の後に投与した。マウスを、図に指定した時点にて分析した。マウスを、１０７ｃｆｕの分類不可能なインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）で鼻腔内処理して、感染後２日目および５日目に分析し、または、１０５ｃｆｕの黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）で処理して、感染後５日目に分析した。
【０１３１】
インサイチュＩＬＣ増殖
インビトロ実験用にＩＬＣ集団を増殖させるために、ＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスを、１日目、３日目、および５日目に、組換えＩＬ−３３（社内で生成）、ＩＬ−１２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ）の１μｇで鼻腔内処理して、７日目に犠牲にした。ＩＬＣを、以下に記載するように、エキソビボ分析用に富化した。ＩＬＣ２を増殖させるために、ＩＬ−３３を用いた。ＩＬＣ１増殖のために、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３を用いた。
【０１３２】
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ分析
ＩＬＣ２（ＣＤ４５＋生存可能ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ−Ｌｉｎ−ＣＤ９０＋ＳＴ２＋ＩＬ−１８Ｒα−と定義する）を、無感作肺からソートした。ＩＬＣ２（ＣＤ４５＋生存可能ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ−Ｌｉｎ−ＣＤ９０＋ＳＴ２＋ＩＬ−１８Ｒα−）およびＩＬＣ１（ＣＤ４５＋生存可能ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ−Ｌｉｎ−ＣＤ９０＋ＳＴ２−ＩＬ−１８Ｒα＋）を、先に記載したように、ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３で処理したマウスの肺からソートした。コントロールについて、ＮＫ細胞（ＣＤ４５＋生存可能ＣＤ４９ｂ＋ＣＤ３−）を無感作肺からソートして、ＩＬＣ１を、無感作肝臓からソートした（ＣＤ４５＋生存可能ＣＤ３−ＣＤ１９−ＮＫｐ４６−ＣＤ１１ａ＋ＴＲＡＩＬ＋）。ＲＮＡを細胞から単離して、ｑＰＣＲを、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｄｙｎａｍｉｃアレイを用いて実行して、注目する転写産物用のプローブ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）と共にロードした。
【０１３３】
ＩＬＣ富化（マウス）
肺をＰＢＳで灌流し、約２ｃｍのピースの小立方体にし、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）およびＤＮａｓｅ（双方ともＲｏｃｈｅ）と共に３７℃にて４５分間インキュベートしてから、７０μｍの細胞ストレーナによってマッシュして、完全ＲＰＭＩで洗浄した。残りの血球を、ＡＣＫ細胞溶解バッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶解して、単細胞懸濁液を、ＣＤ３、ＣＤ１９、Ｂ２２０、ＣＤ５、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ、ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、Ｇｒ１、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４９ｂ、およびＣＤ２７に対するビオチン化抗体と共にインキュベートした。次に細胞を、メーカーのプロトコルに従って、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｌｔｅｎｙｉ）と共にインキュベートして、枯渇させた。各ＩＬＣ富化について、枯渇を２回繰り返して、典型的に＞９５％の純粋なＩＬＣ集団を産出した。
【０１３４】
インビトロ培養（ヒト）用のＩＬＣ単離
ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｏｎｏｒプログラムによって動員した健康なボランティアから採血した。全ボランティアは、インフォームドコンセントを提出した。ＣＰＴ管（ＢＤ）を用いて、メーカーのプロトコルに従って、ＰＢＭＣを単離した。残りの赤血球を、ＡＣＫ溶解バッファを用いて溶解した。３〜４人の健康なドナー由来のＰＢＭＣをプールして、ＮＫ細胞富化キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて枯渇させた。次に、ＩＬＣを、生存可能、ＣＤ４５＋、非Ｔ／非Ｂ、Ｌｉｎ−、ＩＬ−７Ｒα＋、ＣＤ１６１＋、ＣＲＴＨ２＋細胞として、９９％の純度にソートした。
【０１３５】
ＩＬＣのイクスビボ刺激
ＩＬＣを、上記のようにマウス肺またはヒト血液から単離して、図において述べるように、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−３３、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５、またはそれらの組合せで刺激した。全てのサイトカインを、５０ｎｇ／ｍＬにて用いた。細胞を、フローサイトメトリによって分析して、上清を、ＭＳＤまたはＥＬＩＳＡ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって、サイトカイン生成についてアッセイした。
【０１３６】
ＣＯＰＤサンプル
血液を、ＣＯＰＤＧｅｎｅコホートに登録した健康なコントロール、喫煙コントロール、およびＣＯＰＤ患者から収集した。患者背景を、表１および表２に示す。全ての研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｅｗｉｓｈ  ＨｅａｌｔｈのＩＲＢによって承認された。
【０１３７】
【表１】
2019515902.tif 000003
【０１３８】
【表２】
2019515902.tif 000004
【０１３９】
フローサイトメトリ
マウスＩＬＣを、ＣＤ３、ＣＤ４９ｂ、ＩＬ−１８Ｒα（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４５、ＣＤ２５、ＣＤ９０、ＣＤ４４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＳＴ２（ＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する抗体で染色した。リニイッジカクテルは、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ、ＣＤ５、ＣＤ２７、Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｃ、Ｇｒ１、ＣＤ１９、ＦＣεＲＩ、およびＢ２２０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する抗体を含んだ。細胞内抗体は、ＧＡＴＡ−３、Ｔ−ｂｅｔ、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、およびＩＦＮ−γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含んだ。Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、全てのＦＡＣＳ実験に用いた。ＩＬＣの細胞内サイトカイン染色のために、細胞を、示した期間、示したサイトカインと共にインキュベートしてから、２〜４時間、ＰＭＡ／イオノマイシンおよびブレフェルディンＡで刺激してから、表面を染色し、固定し、かつ透過化処理して（ＦｏｘＰ３染色キット、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、細胞内を染色した。
【０１４０】
ＣＯＰＤ患者由来のヒトＩＬＣの染色（図８）のために、健康な禁煙コントロール、喫煙コントロール、または安定したＣＯＰＤ患者由来のＰＢＭＣを、メーカーのプロトコルに従って、Ｈｅｐａｒｉｎ  ＣＰ  Ｔｕｂｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から単離して、ＣＤ３およびＣＤ１９のマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、Ｔ細胞およびＢ細胞を枯渇させた。全てのドナーを、研究ガイドラインに従って、ＣＯＰＤｇｅｎｅプールおよび所定のインフォームドコンセントから抽出した。次に、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＩＬ−７Ｒα、ＣＤ１６１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＲＴＨ２、およびＣＤ５６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する抗体で染色した。リニイッジカクテルは、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１α、ＣＤ３０３α、ＣＤ１２３、ＦｃεＲ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する抗体を含む。細胞内抗体は、ＧＡＴＡ−３およびＴ−ｂｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含んだ。Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、全てのＦＡＣＳ実験に用いた。全てのサンプルを、ＬＳＲ  ＩＩ上でランして、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。
【０１４１】
ＩＬＣの養子移入
ＩＬＣ２移入（図４、図５、および図６）のために、マウスを、２．５μｇの組換えＩＬ−３３で１日目、３日目、および５日目に鼻腔内処理してＩＬＣ２を増殖させ、またはＩＬ−１２＋ＩＬ−１８＋ＩＬ−３３で鼻腔内処理してＩＬＣ１を増殖させた。７日目に、ＣＤ４５＋生存可能ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ−Ｌｉｎ−ＣＤ９０＋ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋ＳＴ２＋ＩＬ−１８Ｒα−細胞を精製して、１〜１．５×１０５個を、尾静脈注射を介して移入した。ＩＬＣ２に加えて、２．５〜３×１０６個の肺由来のＴ／Ｂ／ＮＫ細胞を移入した。１２時間後に、レシピエントマウスを、先に述べたようにインフルエンザＡ型に感染させた。分析を、感染後７日目および１０日目に行った。ＢＡＬ中のサイトカインを、感染後２日目に、ＭＳＤによって測定した。
【０１４２】
免疫組織化学的手順
ＧＦＰポジティブ細胞の同定。
パラフィン包埋肺切片を、熱誘導エピトープ回収（ｈｅａｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ；ＨＩＥＲ）にかけてから、自動化免疫組織化学ロボット（ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＰｌｕｓ，Ｄａｋｏ）において免疫組織化学的に染色した。簡潔に、切片を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸペルオキシダーゼブロッキング試薬および無血清タンパク質ブロック（双方ともＤａｋｏ）で順次ブロックしてから、一次ニワトリ抗ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ）と共にインキュベートした。次に、切片を、ＨＲＰに結合したヤギ抗ニワトリ抗体（Ａｂｃａｍ）と共にインキュベートしてから、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質−クロモゲン溶液と共にインキュベートして、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン（ｂｌｕｅ  ｎｕｃｌｅｉ）で対比染色した。最後に、切片を、エタノールシリーズにより脱水して、キシレン中でクリアにして、Ｐｅｒｔｅｘ（ＨｉｓｔｏＬａｂ）でマウントした。
【０１４３】
ＧＦＰポジティブ細胞およびインフルエンザＡ型の二重免疫組織化学的染色
ＧＦＰおよびインフルエンザＡ型の免疫反応性を、マウス肺において共視覚化した。簡潔に、ＨＩＥＲ処理切片を、ニワトリ抗ＧＦＰ抗体と共にインキュベートして、ＨＲＰに結合したヤギ抗ニワトリ抗体（Ａｂｃａｍ）によって検出して、褐色に着色した免疫反応生成物を、ペルオキシダーゼ基質ＤＡＢを用いて、クロモゲンとして生じさせた。次に、切片を、変性溶液（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で処理してから、ヤギ抗インフルエンザＡ型抗体（Ａｂｃａｍ）と共にインキュベートした後に、ＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギ抗体（Ｄａｋｏ）と共にインキュベートした。最後に、緑色に着色したインフルエンザ免疫反応生成物を、ペルオキシダーゼ基質Ｖｉｎａ  Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、クロモゲンとして生じさせた。ヘマトキシリンを、背景染色（ｂｌｕｅ  ｎｕｃｌｅｉ）として用いて、組織切片を、キシレン中でクリアにして、Ｐｅｒｔｅｘでマウントした。
【０１４４】
ＧＦＰ、ＧＡＴＡ−３、およびインフルエンザＡ型の三重免疫組織化学的染色
ＨＩＥＲ処理組織切片を、ヤギ抗インフルエンザＡ型抗体と共にインキュベートしてから、ＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギ抗体と共にインキュベートして、インフルエンザ免疫反応性の部位にて褐色のＤＡＢクロモゲンを発現させた。次に、切片を、変性ブロッキング溶液で処理して、ニワトリ抗ＧＦＰ一次抗体およびウサギ抗ＧＡＴＡ３一次抗体（Ａｂｃａｍ）と共にインキュベートした。これを続いて、Ａｌｅｘａ  ４８８または５５５にそれぞれ結合したヤギ抗ニワトリ二次抗体およびヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にインキュベートした。最後に、組織を、ＤＮＡ結合蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ（ｂｌｕｅ  ｎｕｃｌｅｉ）で処理して、ＰＢＳ／グリセロールでマウントした。３つのマーカー全てについての免疫反応性を、組み合わせた明視野および落射蛍光デジタルスライドスキャナユニット（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＶＳ１２０）によってキャプチャしてデジタル化した。
【０１４５】
インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）
ＩＬ−１２およびＩＬ−１８のｍＲＮＡを、ＲＮＡｓｃｏｐｅ  ２．０  ＦＦＰＥアッセイキットを用いて、メーカーの説明書に従って、視覚化した（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。簡潔に、組織切片を脱パラフィンして、内在性酵素ブロックと共にインキュベートして、前処理バッファ中で沸騰させて、プロテアーゼで処理してから、Ｍｍ−ＩＬ１２ｂ（３１９５５１、ＡＣＤ）プローブおよびＭｍ−ＩＬ１８（４１６７３１、ＡＣＤ）プローブを用いて、標的プローブハイブリダイゼーションを行った。ハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＢまたは細菌遺伝子ＤａｐＢに対するプローブを、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして機能させた。次に、標的ＲＮＡを増幅させて、ＤＡＢクロモゲンで検出した。最後に、組織切片を脱水して、Ｐｅｒｔｅｘを用いてマウントした。
【０１４６】
ＩＬ−１２またはＩＬ−１８のｍＲＮＡおよびＧＦＰポジティブＩＬＣの、組み合わせた視覚化
その後、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８のｍＲＮＡについてインサイチュハイブリダイゼーションにより先で着色した組織切片を、ニワトリ抗ＧＦＰ抗体と共にインキュベートしてから、ヤギ抗ニワトリＨＲＰおよびＶｉｎａ  Ｇｒｅｅｎクロモゲン発現を用いて検出した。
【０１４７】
ＧＦＰ＋細胞におけるＧＡＴＡ−３強度の四重組織化学および定量化
切片を、ＧＦＰ、ＧＡＴＡ−３（それぞれＡｌｅｘａ  ４８８およびＡｌｅｘａ−５５５による免疫蛍光）、およびインフルエンザ（ＤＡＢクロモゲンによる明視野視覚化）についての三重免疫組織化学的染色と組み合わせたＤＮＡ／核染色（ＤＡＰＩ、Ａｌｅｘａ  ３５５）にかけた。全ての染色チャンネルを、組み合わせた蛍光および明視野Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＶＳ−１２０バーチャルスライド顕微鏡によってデジタル化して、各マーカーについて切片全体の１つの高解像度画像を生成した。個々のＧＦＰポジティブ細胞におけるＧＡＴＡ−３免疫染色の強度を、自動化関心領域（ＲＯＩ）ベース法（ソフトウェアＩｍａｇｅＪ  １．４７ｖ）を用いて測定した。簡潔に、Ａｌｅｘａ４８８の画像で始めて、強度閾値を調整して、ロックして、ＧＦＰポジティブ細胞に対応するＲＯＩを生じさせるのに用いた。次に、複数のＧＦＰ  ＲＯＩを、対応するＡｌｅｘａ−５５５画像中にペーストして、各ＧＦＰポジティブＲＯＩにおけるＧＡＴＡ−３の強度（すなわち、Ａｌｅｘａ５５５平均強度）を測定するのに用いた。同様に、ＧＦＰ  ＲＯＩを、Ａｌｅｘａ  ３５５画像中にペーストして、同じＧＦＰポジティブＲＯＩにおけるＤＡＰＩの強度を算出して、核含有量についてＧＡＴＡ−３強度を調整した。インフルエンザ染色のスキャンした明視野画像を用いて、ＧＦＰ細胞と、ＧＡＴＡ−３強度と、局所の継続中の感染との空間関係を視覚化した。
【０１４８】
ＧＦＰ＋細胞におけるインフルエンザＡ型の定量化
切片を、ＧＦＰおよびインフルエンザＡ型についての免疫組織化学的染色にかけて（それぞれ、ＤＡＢおよびＶｉｎａ  Ｇｒｅｅｎによる明視野視覚化）、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＶＳ−１２０バーチャルスライド顕微鏡によってデジタル化した。インフルエンザＡ型および総組織領域の総免疫反応性を、コンピュータ処理画像分析（Ｖｉｓｉｏｍｏｒｐｈ−ＤＰ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて算出した。インフルエンザＡ型陽性を、インフルエンザＡ型免疫反応性を有する、総組織領域の％として算出した。
【０１４９】
統計分析
ＣＯＰＤサンプル
群内不均一性の分散による一元配置混合効果ＡＮＯＶＡモデルを、連続測定値の比較に用いた。線形対比を用いて、測定値と、１年あたりの平均増悪のレベルとの線形トレンドを試験した。Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を、カテゴリカル測定値の比較に用い、そしてＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を、患者背景表における１年あたりの平均増悪を比較するのに用いた。Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数を、２つの連続する測定値間の相関を評価するのに用いた。ＳＡＳ  ９．３を統計分析に用いた。
【０１５０】
他の全ての分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、図面の簡単な説明に記載したようにデータを分析して、表した。誤差棒は、平均値の標準誤差を表す。
【０１５１】
特定の実施形態の上述の記載は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにすると考えられるので、本発明の一般的な概念を逸脱しない範囲で、過度の実験なく、当該技術の技術範囲内の知識を用いることによって、そのような特定の実施形態を他のものに容易に修正し、かつ／または種々の用途に適合させることができる。したがって、そのような適合および修正は、本明細書中で提示される教示およびガイダンスに基づいて、開示される実施形態の等価物の意味および範囲の中にあることが意図される。本明細書の専門用語または言い回しが、教示および案内を考慮して当業者によって解釈され得るように、本明細書中の言い回しまたは専門用語は、限定ではなく説明を目的としていると理解されるべきである。本発明は、以下の特許請求の範囲によってさらに説明される。
【図１】
2019515902.tif 000005
【図２】
2019515902.tif 000006
【図３】
2019515902.tif 000007
【図４】
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【図５】
2019515902.tif 000009
【図６】
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【図７】
2019515902.tif 000011
【図８】
2019515902.tif 000012
【国際調査報告】
2019515902.tif 000013
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