(57)【要約】本開示は、生体分子の溶媒接近可能性および３次元構造を調べるための方法、システム、および物質の組成物を提供する。プラズマを使用してマーカーラジカルを生成することができ、マーカーラジカルは生体分子と相互作用して、生体分子の溶媒接近可能部分にマークを付けることができる。一局面において、試料中に位置する生体分子を修飾する方法が提供され、この方法は、ａ）流体中で、上記試料の１ｃｍ以内に少なくとも一部分を有するプラズマを生成し、および／または上記試料内でプラズマを生成し、それにより複数のマーカーラジカル前駆体の１つまたは複数を、１つまたは複数のマーカーラジカルに変換するステップ、ｂ）上記１つまたは複数のマーカーラジカルが上記生体分子と相互作用するのに十分な長さの時間を待ち、それにより上記生体分子を修飾するステップとを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に位置する生体分子を修飾する方法であって、前記試料は、流体によって接触されているかまたは閉鎖空間内に封入されており、前記試料または前記流体は、複数のマーカーラジカル前駆体を含有しており、前記方法は、
ａ）前記流体中で、前記試料の１ｃｍ以内に少なくとも一部分を有するプラズマを生成し、および／または前記試料内でプラズマを生成し、それにより前記複数のマーカーラジカル前駆体の１つまたは複数を、１つまたは複数のマーカーラジカルに変換するステップと、
ｂ）前記１つまたは複数のマーカーラジカルが前記生体分子と相互作用するのに十分な長さの時間を待ち、それにより前記生体分子を修飾するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップａ）のプラズマを生成することが、プラズマパルスのシーケンスを生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プラズマパルスが、１ピコ秒から１ミリ秒の間のパルス幅を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プラズマパルスのシーケンスが、１Ｈｚから１００ＧＨｚの間の周波数を有する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記プラズマパルスのシーケンスが、１ナノ秒から１時間の間の合計の時間の長さにわたり生成される、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）のプラズマが、プラズマジェットによって生成される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）のプラズマが、１Ｖから１ＭＶの範囲の電圧によって生成される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップａ）の生成することが、前記試料中のマーカーラジカルのピーク濃度を５０ｎＭから８００μＭの間の範囲で提供するように構成されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）の生成することが、５０℃未満の度合だけ前記試料の温度を上昇させる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップａ）の生成することが、３６０ＭＪ未満のエネルギー量を前記試料に移行させる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、１μＬから４００Ｌの間の体積を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記流体が、前記複数のマーカーラジカル前駆体を含有するガスである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数のマーカーラジカル前駆体が、複数の水分子である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、血液、血漿、尿、唾液、リンパ、涙、汗、脳脊髄液、羊水、房水、硝子体液、胆汁、母乳、耳垢、乳糜、チャイム（ｃｈｉｍｅ）、内リンパ、外リンパ、滲出液、糞便、膣液（ｆｅｍａｌｅ  ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、胃酸、胃液、粘液、囲心腔液、腹水、胸水、膿、粘膜分泌物（ｒｈｅｕｍ）、皮脂、漿液、精液、スメグマ、痰、滑液、膣分泌物、嘔吐物、生きている細菌の培養物、生きている組織または真核生物の培養物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が、真核生物の細胞内液、真核生物の細胞外液、原核生物の細胞内液、原核生物の細胞外液、均質化された組織または細胞、均質化された組織または細胞の培養物、均質化された植物組織、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞外液が、血管内液、間質液、リンパ液、細胞透過液、植物アポプラスト液または維管束液、原核生物または真核生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖からの余分な栄養培地、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が、生体分子および緩衝溶液を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記緩衝溶液が、リン酸緩衝生理食塩液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、トリス塩酸、炭酸水素アンモニウム、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノール（ビス−トリス）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＯＰＳＯ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビス−トリスプロパン）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｔｒｉｚｍａ、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物（ＰＯＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、グリシルグリシン（ＧＬＹ−ＧＬＹ）、２−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸（ＢＩＣＩＮＥ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］プロパン−１−スルホン酸（ＴＡＰＳ）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、１−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）、Ｌｙｓｏｇｅｎｙブロス、生物学的または生理学的に関連の塩、またはそれらの組み合わせを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体分子が、核酸分子、タンパク質、脂質、生物代謝物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
複数の試料中に位置する複数の生体分子を修飾する方法であって、前記複数の試料は、流体によって接触されているかまたは複数の閉鎖空間に隔離されており、前記複数の試料または前記流体は、複数のマーカーラジカル前駆体を含有しており、前記方法が、
ａ）前記流体中で、前記複数の試料のそれぞれの１ｃｍ以内に少なくとも一部分を有するプラズマまたは複数のプラズマを生成する、または前記複数の試料内で複数のプラズマを生成し、それにより前記複数のマーカーラジカル前駆体の１つまたは複数を、１つまたは複数のマーカーラジカルに変換するステップと、
ｂ）前記複数のマーカーラジカルの１つまたは複数が、前記複数の生体分子と相互作用するために十分な長さの時間を待ち、それにより前記複数の生体分子を修飾するステップと
を含む、方法。
【請求項２１】
前記複数の試料が、２〜１，０００，０００個の試料を含み、前記複数のプラズマが、２〜１，０００，０００個のプラズマを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の試料が、９６個の試料を含み、前記複数のプラズマが、９６個のプラズマを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
生体分子の一部分が溶媒に接近可能であるかを決定する方法であって、前記生体分子および前記溶媒は、試料に含有されており、前記試料は、流体によって接触されているかまたは閉鎖空間内に封入されており、前記試料または前記流体は、マーカーラジカル前駆体を含有しており、前記方法が、
ａ）前記試料にマーカーラジカルを導入するプラズマを介して、前記生体分子を酸化するステップと、
ｂ）ステップａ）に続けて、前記生体分子の前記一部分が、ステップａ）の酸化によって酸化されたかどうかを評価するステップであって、酸化の存在は、前記一部分が前記溶媒に接近可能であることを示し、酸化の不在は、前記一部分が前記溶媒に接近不能であることを示す、ステップと、
ｃ）前記一部分が前記溶媒に接近可能であるか前記溶媒に接近不能であるかを示すレポートを作成するステップと
を含む、方法。
【請求項２４】
ステップｂ）の評価することが、前記生体分子の質量分析を行うことを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップａ）の酸化することが、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
１つまたは複数の溶媒接近可能部分と１つまたは複数の溶媒接近不能部分とを有する１つまたは複数の生体分子を含有する生体試料を評価する方法であって、
ａ）前記生体試料の第１のサブ試料および第２のサブ試料を取得するステップであって、前記第１のサブ試料および前記第２のサブ試料は、実質的に同等な濃度の前記１つまたは複数の生体分子を含有している、ステップと、
ｂ）前記生体試料の第２のサブ試料に切断因子を導入するステップであって、前記切断因子は、前記１つまたは複数の生体分子を変化させて前記溶媒接近不能部分の少なくとも一部分を溶媒に曝露させるように構成されている、ステップと、
ｃ）前記第１のサブ試料および前記第２のサブ試料にマーカーラジカルを導入するプラズマを介して、前記第１のサブ試料および前記第２のサブ試料中の前記１つまたは複数の生体分子を酸化するステップと、
ｄ）ステップｃ）に続けて、前記第１のサブ試料の前記１つまたは複数の生体分子と前記第２のサブ試料の前記１つまたは複数の生体分子との間の酸化レベルの差異を評価し、それにより前記１つまたは複数の溶媒接近不能部分の少なくとも一部分を同定するステップと、
ｅ）前記１つまたは複数の溶媒接近不能部分の前記少なくとも一部分の同定を示すレポートを作成するステップと
を含む、方法。
【請求項２７】
ステップｂ）の評価することが、前記生体分子の質量分析を行うことを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップｃ）の酸化することが、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
生体分子を修飾するためのシステムであって、
生体分子を含む試料を含有するように構成された試料チャンバであって、化学的および生物学的に不活性な内面を含む試料チャンバと、
接地電極と、
前記試料チャンバを前記接地電極から分離する誘電体と、
プラズマ源点を含むプラズマ電極と、
プラズマ電極位置決めシステムと、
電源と、
前記電源、前記接地電極および前記プラズマ電極と電子通信する制御システムと
を含み、前記制御システムは、前記電源からの電力を前記プラズマ電極および前記接地電極とともに利用して前記プラズマ源点からプラズマを生成するように構成されており、前記プラズマは、前記生体分子を酸化するために適切なマーカーラジカルを生成するように構成されている、システム。
【請求項３０】
前記システムが複数の追加の試料チャンバをさらに含み、前記プラズマ電極が複数の追加のプラズマ源点をさらに含む、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
複数の追加の試料チャンバおよび複数の追加のプラズマ電極をさらに含む、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３２】
前記プラズマ電極が、少なくとも前記プラズマ源点を覆う誘電体コーティングを有する、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３３】
前記電源と前記プラズマ電極との間に位置し、前記プラズマ電極で電圧を増幅するように構成された増幅器をさらに含む、請求項２９から３２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３４】
少なくとも前記試料チャンバと前記プラズマ電極とを取り囲む保護ハウジングをさらに含む、請求項２９から３３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３５】
前記保護ハウジングは密閉されている、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
前記保護ハウジングが、前記保護ハウジング内のガスの組成および圧力を制御するように構成されたガスマニホールドに結合された入口を有する、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記保護ハウジングが、前記保護ハウジングの内部へのアクセスを提供するように構成されたドアを有し、前記ドアが、前記制御システムと電子通信されたロックを有し、前記制御システムが、前記システムの操作の間に前記ロックをロックするように構成されている、請求項３４から３６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３８】
前記制御システムが、少なくとも１００ミリ秒の時間分解能を有する前記プラズマを生成するように構成されている、請求項２９から３７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３９】
前記時間分解能が、少なくとも１０ミリ秒である、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
前記時間分解能が、少なくとも１ミリ秒である、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
生体分子を修飾するためのシステムであって、
生体分子を含む試料を含有するように構成された試料チャンバであって、化学的および生物学的に不活性な内面を含む試料チャンバと、
プラズマを生成し、前記プラズマを前記試料チャンバに向けるように構成されたプラズマジェットと、
プラズマジェット位置決めシステムと、
電源と、
前記電源および前記プラズマジェットと電子通信する制御システムと
を含み、前記制御システムは、前記電源からの電力を前記プラズマジェットとともに利用してプラズマを生成し、前記プラズマを前記試料チャンバに向けるように構成されており、前記プラズマは、前記生体分子を酸化するために適切なマーカーラジカルを生成するように構成されている、システム。
【請求項４２】
複数の追加の試料チャンバをさらに含む、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記試料チャンバが、対流冷却装置へ熱的に結合されたセラミックホルダー内に位置している、請求項４１または４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記対流冷却装置がペルチェ冷却器である、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
液体試料中の生体分子および少なくとも１つのマーカーラジカル前駆体と、
前記液体試料内のプラズマであって、前記少なくとも１つのマーカーラジカル前駆体をマーカーラジカルに変換するように構成されたプラズマと
を含む、物質の組成物。
【請求項４６】
液体試料中の生体分子であって、前記液体試料は流体によって接触されており、前記液体試料および／または前記流体は少なくとも１つのマーカーラジカル前駆体を含む、生体分子と、
前記液体試料および／または前記流体内のプラズマであって、前記少なくとも１つのマーカーラジカル前駆体をマーカーラジカルに変換するように構成されたプラズマと
を含む、物質の組成物。
【請求項４７】
プラズマ誘起酸化への予測可能な応答を有するように構成された合成生体分子を含む、物質の組成物。
【請求項４８】
プラズマ誘起酸化への既知の応答を有する参照試料と、
前記既知の応答に関する情報と
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年５月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３３８，６９９号に関連し、それへの優先権を主張し、そしてその全体を参考として本明細書に援用する。
【０００２】
連邦政府により資金供与を受けた研究に関する陳述
本発明は、アメリカ国立科学財団によって付与されたＭＣＢ１４１０１６４およびＣＢＥＴ１０６６２３１、ならびにアメリカ合衆国エネルギー省によって付与されたＤＥ−ＦＧ０２−８８ＥＲ１３９３８の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
生体システムを調べる既存の方法は、膨大な量の情報を導き出すことができる。既存の方法の例として、生物のゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム、プロテオームおよびメタボロームを決定するための方法が挙げられる。
【０００４】
ゲノムは、典型的にはＤＮＡの形態で（ＲＮＡも生物のサブセットで同様の目的を果たすが）、生物の遺伝物質を決定するために解くことができる。ゲノムは、遺伝物質内に保存された遺伝子の全てを含むことができる。エクソームは、エクソンによって形成されたゲノムの一部分である。
【０００５】
トランスクリプトームは、細胞、細胞群、または生物全体のｍＲＮＡの発現のレベルを指す。ｍＲＮＡ発現産物は環境条件に基づいて変動しうるので、トランスクリプトームは、特定の細胞株について環境に関するいくつかの情報を含有する。
【０００６】
プロテオームは、細胞、細胞群、または生物全体で発現されたタンパク質の集団を指す。タンパク質発現は環境条件に基づいて変動しうるので、プロテオームも特定の細胞株について環境に関する情報を含有する。
【０００７】
メタボロームは、生体試料中に存在する小分子の集団を指す。小分子の生成および消費は、環境条件に基づいて変動しうるので、メタボロームは、特定の細胞株について環境に関する追加のおよび異なる情報を含有する。
【０００８】
上述の全てを越えて、いまだ効果的または効率的に精査されていない領域、つまり、所与の生体試料中の生体分子のいずれかまたは全てについてのコンホメーション情報である「コンホメーショム（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｍｅ）」がある。コンホメーショムは、理想的には、天然および未変化のコンホメーション状態の様々な生体分子に関するコンホメーション情報を提供する。
【０００９】
コンホメーション構造情報を精査すると主張している現在の方法は、以下の問題の１つまたは複数を抱えている。第１に、一部の方法は、試料の結晶化（Ｘ線結晶学など）または生体分子を天然の状態で提示しない他の操作を必要とする。第２に、一部の方法は、試料をタグ付けするための種を提供するために、試料に非天然化学種を添加することを必要とする。一例は、生体分子を酸化するために過酸化水素を添加することを必要とする、タンパク質の高速光化学的酸化（ＦＰＯＰ）である。過酸化水素の添加は、調べられる生体分子のコンホメーション状態を変化させる可能性がある。第３に、一部の方法は、非常に高価な設備を必要とする。例えば、前述のＦＰＯＰは、高価な機器であるエキシマーレーザの使用を必要とする。他の方法、例えばシンクロトロンに基づくヒドロキシルラジカルフットプリンティングは、シンクロトロンなどの数百万ドルの施設の使用を要する場合がある。
【００１０】
目的の生体分子をその構造を変化させうる外来物質に導入する必要なしに、コンホメーショムを調べるための、安価なシステムおよび迅速な方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、生体分子のプラズマ誘起酸化に関する方法、システム、物質の組成物、およびキットを提供することにより、上述の欠点を克服する。
【００１２】
一態様では、本開示は、試料中に位置する生体分子を修飾する方法を提供する。試料は流体によって接触されているかまたは閉鎖空間内に封入されていることができる。試料または流体は、複数のマーカーラジカル前駆体を含有することができる。方法は、以下のステップの１つまたは複数を含むことができる：ａ）前記流体中で、前記試料の１ｃｍ以内に少なくとも一部分を有するプラズマを生成し、および／または前記試料内でプラズマを生成し、それにより前記複数のマーカーラジカル前駆体の１つまたは複数を、１つまたは複数のマーカーラジカルに変換するステップおよびｂ）前記１つまたは複数のマーカーラジカルが前記生体分子と相互作用するのに十分な長さの時間を待ち、それにより前記生体分子を修飾するステップ。
【００１３】
別の態様では、本開示は、複数の試料中に位置する複数の生体分子を修飾する方法を提供する。複数の試料は、流体によって接触されているかまたは複数の閉鎖空間に隔離されていることができる。複数の試料または流体は、複数のマーカーラジカル前駆体を含有することができる。方法は、以下のステップの１つまたは複数を含むことができる：ａ）前記流体中で、前記複数の試料のそれぞれの１ｃｍ以内に少なくとも一部分を有するプラズマまたは複数のプラズマを生成する、または前記複数の試料内で複数のプラズマを生成し、それにより前記複数のマーカーラジカル前駆体の１つまたは複数を、１つまたは複数のマーカーラジカルに変換するステップおよびｂ）前記複数のマーカーラジカルの１つまたは複数が、前記複数の生体分子と相互作用するために十分な長さの時間を待ち、それにより前記複数の生体分子を修飾するステップ。
【００１４】
さらに別の態様では、本開示は、生体分子の一部分が溶媒に接近可能であるかを決定する方法を提供する。生体分子および溶媒は、試料に含有されていることができる。試料は流体によって接触されているかまたは閉鎖空間内に封入されていることができる。試料または流体は、マーカーラジカル前駆体を含有することができる。方法は、以下のステップの１つまたは複数を含むことができる：ａ）前記試料にマーカーラジカルを導入するプラズマを介して、前記生体分子を酸化するステップ、ｂ）ステップａ）に続けて、前記生体分子の前記一部分が、ステップａ）の酸化によって酸化されたかどうかを評価するステップであって、酸化の存在は、前記一部分が前記溶媒に接近可能であることを示し、酸化の不在は、前記一部分が前記溶媒に接近不能であることを示す、ステップ、およびｃ）前記一部分が前記溶媒に接近可能であるか前記溶媒に接近不能であるかを示すレポートを作成するステップ。
【００１５】
さらなる態様では、本開示は、１つまたは複数の溶媒接近可能部分と１つまたは複数の溶媒接近不能部分とを有する１つまたは複数の生体分子を含有する生体試料を評価する方法を提供する。方法は、以下のステップの１つまたは複数を含むことができる：ａ）前記生体試料の第１のサブ試料および第２のサブ試料を取得するステップであって、前記第１のサブ試料および前記第２のサブ試料は、実質的に同等な濃度の前記１つまたは複数の生体分子を含有している、ステップ、ｂ）前記生体試料の第２のサブ試料に切断因子を導入するステップであって、前記切断因子は、前記１つまたは複数の生体分子を変化させて前記溶媒接近不能部分の少なくとも一部分を溶媒に曝露させるように構成されている、ステップ、ｃ）前記第１のサブ試料および前記第２のサブ試料にマーカーラジカルを導入するプラズマを介して、前記第１のサブ試料および前記第２のサブ試料中の前記１つまたは複数の生体分子を酸化するステップ、ｄ）ステップｃ）に続けて、前記第１のサブ試料の前記１つまたは複数の生体分子と前記第２のサブ試料の前記１つまたは複数の生体分子との間の酸化レベルの差異を評価し、それにより前記１つまたは複数の溶媒接近不能部分の少なくとも一部分を同定するステップ、およびｅ）前記１つまたは複数の溶媒接近不能部分の前記少なくとも一部分の同定を示すレポートを作成するステップ。
【００１６】
さらに別の態様では、本開示は、生体分子を修飾するためのシステムを提供する。システムは、試料チャンバ、接地電極、誘電体、プラズマ電極、プラズマ電極位置決めシステム、電源、および制御システムを含むことができる。試料チャンバは、生体分子を含む試料を含有するように構成することができる。試料チャンバは、化学的および生物学的に不活性な内面を含むことができる。誘電体は、試料チャンバを接地電極から分離することができる。制御システムは、電源、接地電極およびプラズマ電極と電子通信することができる。制御システムは、電源からの電力をプラズマ電極および接地電極とともに利用して、プラズマ源点からプラズマを生成するように構成することができる。プラズマは、生体分子を酸化するために適切なマーカーラジカルを生成するように構成することができる。
【００１７】
さらなる態様では、本開示は、生体分子を修飾するためのシステムを提供する。システムは、試料チャンバ、プラズマジェット、プラズマジェット位置決めシステム、電源、および制御システムを含むことができる。試料チャンバは、生体分子を含む試料を含有するように構成することができる。試料チャンバは、化学的および生物学的に不活性な内面を有することができる。プラズマジェットは、プラズマを生成し、プラズマを試料チャンバに向けるように構成することができる。制御システムは、電源およびプラズマジェットと電子通信することができる。制御システムは、電源からの電力をプラズマジェットとともに利用してプラズマを生成し、プラズマを試料チャンバに向けるように構成することができる。プラズマは、生体分子を酸化するために適切なマーカーラジカルを生成するように構成することができる。
【００１８】
追加の態様では、本開示は、物質の組成物を提供する。物質の組成物は、液体試料中の生体分子および少なくとも１つのマーカーラジカル前駆体と、液体試料内のプラズマとを含むことができる。プラズマは、少なくとも１つのマーカーラジカル前駆体をマーカーラジカルに変換するように構成することができる。
【００１９】
なおさらなる態様では、本開示は、物質の組成物を提供する。物質の組成物は、プラズマ誘起酸化への予測可能な応答を有するように構成された合成生体分子を含むことができる。
【００２０】
別の追加の態様では、本開示は、キットを提供する。キットは、プラズマ誘起酸化への既知の応答を有する参照試料と、既知の応答に関する情報とを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本開示の一態様によるシステムである。
【００２２】
【図２】図２は、本開示の一態様によるシステムである。
【００２３】
【図３】図３は、本開示の一態様によるプラズマの画像である。
【００２４】
【図４】図４は、実施例１に記載される放電にわたる電圧および電流のプロットである。
【００２５】
【図５】図５は、実施例１に記載される生体分子の相対的修飾を示すプロットである。
【００２６】
【図６】図６は、実施例２に記載される生体分子の修飾％を示すプロットである。
【００２７】
【図７】図７は、実施例３に記載されるＤＮＡの分解を説明する電気泳動ゲルの画像である。
【００２８】
【図８】図８は、実施例３に記載されるＤＮＡの分解を説明する電気泳動ゲルの画像である。
【００２９】
【図９】図９は、実施例４に記載される細胞内の生体分子の修飾％を示すプロットである。
【００３０】
【図１０】図１０は、実施例４に記載される細胞内の特定の生体分子の特定の部分の修飾％を示すプロットである。
【００３１】
【図１１】図１１は、実施例６に記載される未消化および消化ウシ血清アルブミンの酸化の一対のプロットである。
【００３２】
【図１２】図１２は、実施例６に記載される未消化および消化ウシ血清アルブミンの酸化の一対のプロットである。
【００３３】
【図１３】図１３は、実施例６に記載される未消化および消化ウシ血清アルブミンの酸化の一対のプロットである。
【００３４】
【図１４】図１４は、実施例６に記載される未消化および消化ウシ血清アルブミンの酸化の一対のプロットである。
【００３５】
【図１５】図１５は、実施例６に記載される未消化および消化ウシ血清アルブミンの酸化の一対のプロットである。
【００３６】
【図１６】図１６は、実施例６に記載される未消化および消化ウシ血清アルブミンの酸化の一対のプロットである。
【００３７】
【図１７】図１７は、上皮増殖因子と結合したときに酸化が減少した残基を示している、上皮増殖因子受容体タンパク質の一結晶構造である。
【００３８】
【図１８】図１８は、上皮増殖因子と結合したときに酸化が減少した残基を示している、上皮増殖因子受容体タンパク質ホモ二量体の一結晶構造である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明をさらに詳細に説明する前に、本発明は、記載された特定の実施形態に限定されるものではないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解される。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示していない限り、複数の実施形態を含む。
【００４０】
生体分子を修飾することに関連する特定の構造、装置および方法が開示される。既に記載された事項に加えて、多くの追加的修飾が、本発明の概念から逸脱することなく可能であることは、当業者にとって明らかである。本開示の解釈において、全ての用語は、文脈と一致する最も広範な様式で解釈されるべきである。用語「含む」のバリエーションは、非排他的様式に要素、コンポーネントまたはステップを指すとして解釈されるべきであり、したがって、参照されている要素、コンポーネントまたはステップは、明示されていない他の要素、コンポーネントまたはステップと組み合わされる場合がある。ある特定の要素を「含む」として参照される実施形態は、これらの要素「から本質的になる」および「からなる」としても企図されている。特定の値について２つまたはそれよりも多い範囲が列挙されているとき、その開示は、明白に列挙されていないそれらの範囲の上限と下限の全ての組み合わせを企図している。例えば、１から１０の間の値または２から９の間の値の列挙は、１から９の間の値または２から１０の間の値も企図している。
【００４１】
様々な態様は、様々な機能コンポーネントおよび処理ステップの観点で本明細書に記載されている場合がある。そのようなコンポーネントおよびステップは、特定の機能を行うように構成された任意の数のハードウェアコンポーネントによって実現されうることが認識されるべきである。
【００４２】
方法
本開示は、様々な方法を提供する。様々な方法は、他の方法を用いた使用のために適していると認識されるべきである。同様に、様々な方法は、本明細書の他の箇所に記載のシステムおよび組成物を用いた使用のために適していると認識されるべきである。本開示の特徴が所与の方法に関連して記載されているとき、文脈が他のことを明確に指示していない限り、その特徴は、本明細書に記載の他の方法、システム、および組成物のためにも有用であることが明白に企図されている。
【００４３】
本開示の方法は、概して、生体分子を修飾するための新たなプロセスの発見から生まれたものである。この新たなプロセスには、生体分子の様々な置換基を酸化できるマーカーラジカル（例えば、ヒドロキシルラジカル）をそれ自体生成する、プラズマの生成が関与している。ヒドロキシルラジカルを使用する生体分子の酸化は一般に公知であり、本開示は、このプロセスの改善を示す。
【００４４】
一態様では、本開示は、生体分子を修飾する方法を提供する。生体分子は、試料中に位置することができる。試料は、流体によって接触されているかまたは閉鎖空間内に封入されていることができる。方法は、ａ）流体中で、試料のある距離以内にプラズマを生成する、または試料内でプラズマを生成するステップと、ｂ）ある時間の長さを待つステップとを含むことができる。プラズマは、最大１ｃｍの距離、例えば限定されないが、最大５ｍｍ、最大３ｍｍ、最大１ｍｍ、最大１００μｍ、最大１０μｍ、または最大１μｍの距離で、試料に最も近い点を有することができる。ある特定の態様では、プラズマは試料と接触することができる。プラズマが電極を介して生成されるある特定の態様では、プラズマは、試料に対して最大３ｃｍの距離、例えば限定されないが、最大１ｃｍの距離、または最大３ｍｍの距離で配置される電極によって生成され得る。当業者は、これらの距離が、例えば、より大きいまたは小さい電圧を使用するかまたはプラズマパルスの周波数を変化させることによって、拡大または縮小されてもよいことを認識する。
【００４５】
ステップａ）の生成は、それにより複数のマーカーラジカル前駆体の１つまたは複数を、１つまたは複数のマーカーラジカルに変換することができる。マーカーラジカルの例としては、限定されないが、ヒドロキシルラジカル（●ＯＨ）、水素ラジカル（Ｈ・）、亜硝酸もしくは二酸化窒素ラジカル（●ＮＯ２）、硝酸ラジカル（●ＮＯ３）、ペルオキシドラジカル（●ＯＯＨ）、ラジカル前駆体とプラズマ相互作用することにより生成されるとして当業者に既知の他のラジカルおよびそれらの組み合わせなどが挙げられる。マーカーラジカル前駆体の例としては、限定されないが、水または過酸化水素などのヒドロキシルラジカル前駆体、水素ガスなどの水素ラジカル前駆体、亜硝酸塩または二酸化窒素などの亜硝酸または二酸化窒素ラジカル前駆体、硝酸塩などの硝酸ラジカル前駆体、過酸化水素などのペルオキシドラジカル前駆体、プラズマと相互作用することによりラジカルに変換されることが当業者に既知の他の前駆体およびそれらの組み合わせなどが挙げられる。時間の長さは、１つまたは複数のマーカーラジカルが生体分子と相互作用するのに十分な時間の長さでありうる。この相互作用は、生体分子を修飾することができる。
【００４６】
いずれか特定の理論に限定されることは望まないが、流体中でプラズマを生成することは、流体中のマーカーラジカル前駆体をマーカーラジカルに変換することを含むことができ、マーカーラジカルは次いで拡散し、または一部が試料内に移行する。いずれか特定の理論に限定されることは望まないが、試料内でプラズマを生成することは、試料中のマーカーラジカル前駆体をマーカーラジカルに変換することを含むことができ、マーカーラジカルは試料内に拡散し、次いで生体分子と相互作用する。ある特定の態様では、流体中または試料内でプラズマを生成することは、流体内と試料内の両方にプラズマを生成することを含むことができる。
【００４７】
ある特定の態様では、プラズマを生成するステップは、プラズマジェットからプラズマを生成することを含むことができる。プラズマジェットの背後にある原理は、下記でより詳細に記載されるが、簡単には、プラズマジェットは、閉鎖空間にプラズマを生成し、続いて、生成されたプラズマを、ガス流を使用して標的の方へ（この場合は試料の方へ）発射することを含む。
【００４８】
プラズマを生成するステップは、単一のプラズマパルスまたはプラズマパルスのシーケンスを生成することを含むことができる。
【００４９】
ある特定の態様では、プラズマは、１Ｖから１ＭＶの間の電圧、例えば限定されないが５００Ｖから１００ｋＶの間、１ｋＶから５０ｋＶの間、または５ｋＶから１５ｋＶの間の電圧によって生成することができる。先に開示した距離と同様に、これらの電圧は、特定の操作パラメータに応じて拡大または縮小することができる。
【００５０】
プラズマパルスのシーケンスを利用する態様では、このパラグラフの操作パラメータを利用することができる。プラズマパルスは、１ピコ秒から１ミリ秒の間の範囲のパルス幅、例えば限定されないが５００ピコ秒から１００マイクロ秒の間または１ナノ秒から１０マイクロ秒の間の範囲内のパルス幅を有することができる。プラズマパルスのシーケンスは、１Ｈｚから１００ＧＨｚの間の範囲の周波数、例えば限定されないが１０Ｈｚから１００ＭＨｚの間または１ｋＨｚから１０ｋＨｚの間の範囲の周波数を有することができる。プラズマパルスのシーケンスは、１ナノ秒から数時間〜数日の間の範囲の合計の時間の長さ、例えば限定されないが１００ナノ秒から２０分の間、１マイクロ秒から１時間の間、１ミリ秒から３０分の間、１秒から１０分の間または３０秒から５分の間の範囲の合計の時間の長さにわたり生成することができる。プラズマパルスのシーケンスについての上述のパルス幅、周波数および合計の時間の長さパラメータは、生じるマーカーラジカルの寿命、標的生体分子の濃度、標的生体分子のサイズ、マーカーラジカル前駆体の濃度、変動する濃度のマーカーラジカルが存在する場合の標的生体分子の安定性、ならびに／または所望される生体分子の修飾および／もしくは破壊の程度に応じて変動することができる。
【００５１】
ある特定の態様では、プラズマ生成ステップは、試料中に、ある濃度のマーカーラジカルを生成するように構成することができる。マーカーラジカルの濃度は、プラズマの直後が最も高く、マーカーラジカルが生体分子と相互作用する、および／もしくは試料内の他のコンポーネントと相互作用するにつれて経時的に減衰する、ならびに／または再組み換えプロセスにより経時的に自然に減衰する。ある特定の態様では、プラズマを生成するステップは、５０ｎＭから８００μＭの間でありうる試料中のマーカーラジカルのピーク濃度、例えば限定されないが、５００ｎＭから８００ｎＭの間、５μＭから８μＭの間または５０μｍから８０μｍの間の試料中のマーカーラジカルのピーク濃度を提供するように構成することができる。ある特定の態様では、プラズマを生成するステップは、５０ｎＭから８００μＭの間の試料中のマーカーラジカルの平均濃度、例えば限定されないが、５００ｎＭから８００ｎＭの間、５μＭから８μＭの間、または５０μｍから８０μｍの間の試料中のマーカーラジカルのピーク濃度を提供するように構成することができる。ある特定の態様では、平均濃度は、プラズマの「オン」時間に基づいて与えられる値の一部またはパーセンテージ、例えば限定されないが、与えられる値の７５％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％であることができる。平均濃度は、プラズマまたはプラズマパルスのシーケンスが生成されている間の時間の長さに、約５秒、１０秒、３０秒または１分の時間の長さを加えた時間の長さについて測定することができる。
【００５２】
ある特定の態様では、プラズマを生成するステップは、生体分子または複数の生体分子の変性が開始する度合（ａｍｏｕｎｔ）よりも少ない度合だけ試料の温度を上昇させることができる。複数の生体分子が異なる変性温度を有する場合には、プラズマを生成するステップは、最も低い変性温度を有する生体分子の変性が開始する度合よりも少ない度合だけ試料の温度を上昇させることができる。本開示のこの態様について、変性は、四次、三次または二次構造の変性を指すことができる。
【００５３】
ある特定の態様では、プラズマを生成するステップは、試料の温度を５０℃未満、例えば限定されないが、５℃未満、または０．５℃未満上昇させることができる。ある特定の態様では、プラズマを生成するステップは、試料の温度を７３．５℃未満の温度へ、例えば限定されないが、２８．５℃未満の温度へ、または２３．５℃未満の温度へ上昇させることができる。
【００５４】
ある特定の態様では、プラズマを生成するステップは、６０ＭＪ／μＬ未満の単位体積当たりのエネルギー量を試料に移行することができ、例えば限定されないが、１８０ＭＪ／μＬ未満、または３６０ＭＪ／μＬ未満の単位体積当たりのエネルギー量を試料に移行することができる。
【００５５】
ある特定の態様では、方法は、１μＬから４００Ｌの間の体積を有する試料、例えば限定されないが、１０μＬから１００ｍＬの間の体積、または５０μＬから２００μＬの間の体積を有する試料に行うことができる。
【００５６】
試料が流体によって接触されている態様では、流体は、０．０１ｗｔ％から９９．９９ｗｔ％の間の濃度範囲、例えば限定されないが、１０％から９９．９％の間または９０％から９９％の間の濃度範囲のマーカーラジカル前駆体を含有する気体状フィードガスであることができる。気体状フィードガスは、空気、酸素、窒素、アルゴン、ヘリウム、キセノン、クリプトン、四フッ化炭素、水素、およびそれらの組み合わせなどであることができる。
【００５７】
マーカーラジカル前駆体が試料内に位置する態様では、試料は、０．０１ｗｔ％から９９．９９ｗｔ％の間の濃度範囲、例えば限定されないが、１０％から９９．９％の間または９０％から９９％の間の濃度範囲のマーカーラジカル前駆体を含有することができる。
【００５８】
生体分子を修飾する方法は、複数の生体分子を修飾するために拡張することができる。拡張は、少なくとも２つの方法で行うことができる。第１に、単一の試料が、多数の生体分子を含有することができる。第２に、それぞれ少なくとも１つの生体分子を含有する複数の試料に、本明細書に記載の方法を行うことができる。複数の試料が関与するこの第２のアプローチのために、単一の試料に関して記載された方法の、例えば体積などの態様は、複数の試料のそれぞれ適用することができる。
【００５９】
試料は、その試料内に１つまたは複数の生体分子を含有する生体試料であることができる、または試料は、生体分子を含むように調製された試料、例えば、緩衝溶液に溶解されたタンパク質試料であることができる。
【００６０】
ある特定の態様では、生体分子は、核酸分子、タンパク質、脂質、生物代謝物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
【００６１】
ある特定の態様では、試料は、血液、血漿、尿、唾液、リンパ、涙、汗、脳脊髄液、羊水、房水、硝子体液、胆汁、母乳、耳垢、乳糜、チャイム（ｃｈｉｍｅ）、内リンパ、外リンパ、滲出液、糞便、膣液（ｆｅｍａｌｅ  ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、胃酸、胃液、粘液、囲心腔液、腹水、胸水、膿、粘膜分泌物（ｒｈｅｕｍ）、皮脂、漿液、精液、スメグマ、痰、滑液、膣分泌物、嘔吐物、生きている細菌の培養物、生きている組織または真核生物の培養物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。ある特定の態様では、試料は、真核生物の細胞内液、真核生物の細胞外液、原核生物の細胞内液、原核生物の細胞外液、均質化された組織または細胞、均質化された組織または細胞の培養物、均質化された植物組織、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。試料が細胞外液である、ある特定の態様では、細胞外液は、血管内液、間質液、リンパ液、細胞透過液、植物アポプラスト液または維管束液、原核生物または真核生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖からの余分な栄養培地、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。試料が生きている細菌、組織、または真核細胞の培養物である、ある特定の態様では、培養物は、原核生物の任意の種、任意の哺乳動物組織もしくは細胞の培養物、真核生物の任意の培養可能な種、またはそれらの組み合わせであることができる。ある特定の態様では、試料は、本明細書に記載のシステム中に適切に配置され得るおよび／または本明細書に記載の方法で使用するために適切であることができる、任意の生きている生物または生物のサブコンポーネント、例えば、１つまたは複数の細胞であることができる。
【００６２】
ある特定の態様では、試料は、１つまたは複数の生体分子および緩衝溶液を含むことができる。ある特定の態様では、緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、トリス塩酸、炭酸水素アンモニウム、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノール（ビス−トリス）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＯＰＳＯ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビス−トリスプロパン）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｔｒｉｚｍａ、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物（ＰＯＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、グリシルグリシン（ＧＬＹ−ＧＬＹ）、２−（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸（ＢＩＣＩＮＥ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）、３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］プロパン−１−スルホン酸（ＴＡＰＳ）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、１−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）、Ｌｙｓｏｇｅｎｙブロス（ＬＢ）または他の栄養学的増殖培地、「生物学的緩衝液」として定義される任意のもの、生物学的または生理学的に関連の塩、およびそれらの組み合わせを含むことができ、またはそれらであることができる。ある特定の態様では、緩衝溶液は、１から１４の間のｐＨ値、例えば限定されないが、３から９の間のｐＨまたは４から８の間のｐＨを有することができる。
【００６３】
上述の方法の操作パラメータは、生体分子へ所望の量の酸化を導入するために、当業者によって利用され得る。さらに、操作パラメータは、生体分子への最小限の量の損傷で、この酸化を誘導するために、当業者によって利用され得る。一方、操作パラメータは、生体分子へ所望の量の損傷を引き起こす条件下でこの酸化を誘導するために、当業者によって利用され得る。様々な種類の情報が、損傷を誘導しない方法から実現されうること、および様々な異なる種類の情報が、制御された損傷および／または完全な損傷を誘導する方法から実現されうることが認識されるべきである。
【００６４】
酸化のレベルおよび損傷の量の制御は、ある特定の理想的操作パラメータへ予測可能な既知の応答を有する対照試料を使用してモニタリングすることができる。例えば、下記で実施例１に記載のチトクロムＣ実験は、ある特定の実験のための操作パラメータが適切であるかを決定するためのベンチマークとして使用することができる。ある特定の態様では、本明細書に記載の方法は、プラズマ誘起酸化へ既知の応答を有する対照試料を使用して、一組の操作パラメータを確認するステップを含むことができる。
【００６５】
上記方法は、生体分子についての構造情報を決定するために利用することができる。生体分子は、生体分子の様々な部分との溶媒の相互作用を妨げる二次、三次、および四次構造を含むことができる。
【００６６】
別の態様では、本開示は、生体分子の一部分が溶媒に接近可能であるかを決定する方法を提供する。方法は、以下のステップを含むことができる：試料にマーカーラジカルを導入するプラズマを介して生体分子を酸化するステップ；酸化するステップに続けて、生体分子の一部分がステップａ）の酸化によって酸化されたかどうかを評価するステップであり、ここで酸化の存在は、一部分が溶媒に接近可能であることを示し、酸化の不在は、一部分が溶媒に接近不能であることを示す、ステップ；および、一部分が溶媒に接近可能であるか溶媒に接近不能であるかを示すレポートを作成するステップ。
【００６７】
別の態様では、本開示は、１つまたは複数の溶媒接近可能部分と１つまたは複数の溶媒接近不能部分とを有する１つまたは複数の生体分子を含有する生体試料を評価する方法を提供する。方法は、以下のステップを含むことができる；生体試料の第１のサブ試料および第２のサブ試料を取得するステップであって、第１のサブ試料および第２のサブ試料は、実質的に同等な濃度の１つまたは複数の生体分子を含有している、ステップ；生体試料の第２のサブ試料に切断因子を導入するステップであって、切断因子は、１つまたは複数の生体分子を変化させて溶媒接近不能部分の少なくとも一部分を溶媒に曝露させるように構成されている、ステップ；第１のサブ試料および第２のサブ試料にマーカーラジカルを導入するプラズマを介して、第１のサブ試料および第２のサブ試料中の１つまたは複数の生体分子を酸化するステップ；酸化に続けて、第１のサブ試料の１つまたは複数の生体分子と第２のサブ試料の１つまたは複数の生体分子との間の酸化レベルの差異を評価し、それにより１つまたは複数の溶媒接近不能部分の少なくとも一部分を同定するステップ；ならびにレポートを作成するステップ。
【００６８】
これらの方法の酸化は、本明細書の他の箇所に記載される方法によって達成することができる。
【００６９】
切断因子を導入するステップは、１つまたは複数の生体分子における構造上の予測可能な変化を促すために使用することができる。比較のベースラインとしてこの構造上の予測可能な変化を使用して、切断因子の対象でない生体分子の酸化レベルを、切断因子の対象となった生体分子の酸化レベルと比較することにより、溶媒接近可能性に関する情報を得ることができる。
【００７０】
いくつかの態様では、切断因子は、１つまたは複数の生体分子の溶媒接近不能部分の全てを、溶媒に曝露させることができる。例えば、タンパク質は、全てが溶媒に接近可能である個々のアミノ酸に消化することができ、この場合、消化タンパク質は、全ての部分が、溶媒に接近可能であり、したがって酸化され、未消化タンパク質は、溶媒に接近可能な通常の溶媒接近可能部分のみを有する。
【００７１】
切断因子は、トリプシン（ウシ）、キモトリプシン（ウシ）、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（マウス顎下腺）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（Ｖ８プロテアーゼ）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ）、ペプシン（ブタ）、サーモライシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏ−ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エラスターゼ（ブタ）、パパイン（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、プロテイナーゼＫ（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）、サブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、クロストリパイン（エンドプロテイナーゼ−Ａｒｇ−Ｃ）（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）、エキソペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ（ウシ）、カルボキシペプチダーゼＢ（ブタ）、カルボキシペプチダーゼＰ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）、カルボキシペプチダーゼＹ（酵母）、カテプシンＣ、アシルアミノ酸放出酵素（ブタ）、ピログルタメートアミノペプチダーゼ（ウシ）、当業者に既知の他の切断因子、およびそれらの組み合わせなどであることができる。
【００７２】
評価ステップは、質量分析、ゲル電気泳動、ＤＮＡ配列決定のような配列決定などを含むことができる。本明細書に記載の酸化は、生体分子の一部分の分子量を変化させることができる。例えば、ある特定のアミノ酸は、マーカーラジカルによる酸化を受けやすい。特定のアミノ酸の分子量の増加は、酸化の時点で溶媒接近可能であったことを示している。別の例として、ｉｎ  ｖｉｖｏのＤＮＡ片は、周囲の環境から（例えば、結合するタンパク質を有することによって）遮蔽される場合があり、そのＤＮＡ片は、本明細書に記載されるように生成されたラジカルに曝露されず、したがってラジカル切断を受けない。したがって、インタクトなままであり、そのように同定されたＤＮＡ片は、ｉｎ  ｖｉｖｏのタンパク質によって結合されていると関連づけられることができる。
【００７３】
本明細書に記載の方法は、様々な適用のために、例えば限定されないが、バイオ医薬品の品質制御のために有用であることができる。バイオ医薬品は、意図される生物学的環境で機能させるために必要な二次、三次および／または四次構造を保持する場合のみ、ある特定の場合に有効であることができる。したがって、製造時、輸送中、および使用前に、バイオ医薬品が、意図された二次、三次および／または四次構造を失っていないことを確認することが重要でありうる。本明細書に記載の方法は、この構造をモニタリングし、バイオ医薬品のコンプライアンスを評価するための手段を提供する。
【００７４】
本明細書に記載の方法はまた、被験体における１つまたは複数の生体分子のコンホメーション変化によって発現される疾患状態を評価することに利用することができる。例えば、疾患状態が、タンパク質の二量体が分裂することによって発現される場合、本開示の方法は、通常は溶媒に接近可能でない二量体のサブユニット間の接触表面が、溶媒に接近可能になったことを同定するために使用することができる。本開示の方法は、接触表面が溶媒に接近可能であると決定する場合、この情報を、疾患状態の診断を形成するために使用することができる。
【００７５】
本明細書に記載の方法は、目的の試料の温度依存特性を調べるために利用することができる。例えば、動態、タンパク質の折り畳み、および他の目的の温度依存性メカニズムは、本明細書に記載の方法の温度依存展開を用いて調べることができる。
【００７６】
本明細書に記載の方法は、目的の試料内のコンポーネントまたはサブコンポーネントの修飾速度を決定するために利用することができる。例えば、本明細書に記載の方法は、目的のタンパク質の２つの異なる残基の酸化速度を比較することができ、それらの速度間の差異に基づいて、様々な後続の推論、例えば溶媒接近可能性のレベルの決定をなすことができる。
【００７７】
システム
本開示は、システムも提供する。システムは、本明細書に記載の方法および組成物を用いた使用のために適切であることができる。本開示の特徴が所与のシステムに関連して記載されているとき、文脈が他のことを明確に指示していない限り、特徴はさらに、本明細書に記載の他のシステム、方法、および組成物と組み合わせ可能であることが明白に企図されている。さらに、図１に示される本開示の態様に関連して以下に記載されている特徴は、文脈が他のことを明確に指示していない限り、図２に示される本開示の態様にも適用可能であり、逆も同様である。例えば、図２に示される冷却装置４４、試料チャンバホルダー４６、または保護ハウジング４８およびドア５０は、本開示の範囲を逸脱することなく、図１の文脈において展開することができる。
【００７８】
一態様では、図１を参照して、本開示は、生体分子を修飾するためのシステム１０を提供する。生体分子を修飾するためのシステム１０は、試料チャンバ１２、接地電極１４、プラズマ電極１６、電源１８、および制御システム２０を含むことができる。システム１０は、電源１８とプラズマ電極１６との間に位置する増幅器２２も含むことができる。システムは、試料チャンバ１２と接地電極１４との間に位置する誘電体２４を含むことができる。
【００７９】
試料チャンバ１２は、試料２６を受けるように構成することができる。試料２６は、本明細書の他の箇所に記載されたものであることができる。試料チャンバ１２は、化学的および生物学的に不活性な内面を有することができる。本明細書で使用されるとき、生物学的に不活性とは、１つまたは複数の生体分子のコンホメーション状態に影響を与えない材料を指す。
【００８０】
試料チャンバ１２は、円筒、楕円の円筒、立方体、円錐の切頭体、角錐（三角形、長方形、五角形など）の切頭体、プリズム（三角形、五角形、六角形など）、液体試料を保持するための任意の適切な形状、それらの任意の分割体（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）（例えば、半円筒）などの様々な形状をとることができる。
【００８１】
試料チャンバ１２は、最適なプラズマ生成および生成されたマーカーラジカルのその後の相互作用を提供するように構成されており、高さ２８および幅３０を有することができる。高さ２８は０．７５インチであることができ、幅３０は０．５インチであることができるが、試料チャンバ１２の他のサイズも企図されており、適切なサイズは、当業者によって決定され得る。
【００８２】
一部の態様では、試料チャンバ１２は、オープントップを有することができる。一部の態様では、試料チャンバは、クローズドトップを有することができる。試料チャンバ１２がクローズドトップを有する態様では、試料２６は、試料２６と接触する流体、例えば、ガス、空気などがないように試料チャンバ１２を完全に満たすことができ、または試料２６は、試料チャンバ１２の一部分を満たし、流体が試料チャンバ１２の残りの部分を占めることができる。
【００８３】
ある特定の態様では、試料チャンバ１２は、マイクロ流体装置および／またはチャネルの一部分であることができる。
【００８４】
接地電極１４は、当業者に既知の導電性材料から構成することができる。接地電極１４に使用するための適切な導電性材料の例としては、限定されないが、銅、銀、金、アルミニウム、鉄、黒鉛、カルシウム、ベリリウム、マグネシウム、ロジウム、モリブデン、イリジウム、タングステン、亜鉛、コバルト、カドミウム、ニッケル、ルテニウム、リチウム、オスミウム、白金、パラジウム、セレン、タンタル、コロンビウム、鉛、バナジウム、スズ、チタン、それらの導電性酸化物、それらの導電性合金、導電性ポリマー、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８５】
プラズマ電極１６は、当業者に既知の導電性材料から構成することができる。プラズマ電極１６で使用するために適切な導電性材料の例としては、限定されないが、接地電極１４に使用するために適切として上記に列挙した材料が挙げられる。
【００８６】
いくつかの態様では、プラズマ電極１６は、試料の近傍にあることができ、または試料と接触することができる。プラズマ電極１６が試料の近傍にあるまたは試料と接触する場合では、プラズマ電極１６は、試料を汚染しない材料から作ってもよい。当業者は、プラズマ電極１６が試料を汚染する程度が試料の特性に依存することを認識している。プラズマ電極１６は、本明細書の他の箇所に記載の試料を汚染しないものであることができる。
【００８７】
プラズマ電極１６は、プラズマ３４が生じる点である、プラズマ源点３２を含むことができる。プラズマ電極１６は、複数のプラズマ源点３２を含むことができる。
【００８８】
ある特定の態様では、プラズマ電極１６は、プラズマ電極１６と試料２６との間の直接接触を防止することができる誘電体コーティング（図示せず）を有することができる。誘電体コーティングは、少なくともプラズマ源点３２を覆うことができる。当業者は、そのようなコーティングが有し得るシステム１０のプラズマ生成特性に与えうる影響を認識し、そのようなコーティングを収容しながらシステム１０の全体的性能を維持するためのシステム１０の様々な態様を調節することができる。
【００８９】
ある特定の態様では、プラズマ電極１６は、針の形状、またはプラズマ３４を発生させるために適切な任意の形状を有することができる。プラズマ源点３２は、本開示によるプラズマ３４を発生させるために適切な形状をとることができる。ある特定の態様では、プラズマ源点３２は、針の先端の形状、丸みを帯びた凸面、平らな面、複数の針の先端、円盤、球、またはプラズマ３４の生成に適することが当業者に既知の他の形状をとることができる。
【００９０】
ある特定の態様では、プラズマ３４は、電極を含まないプラズマ生成器によって生成することができる。一例として、マイクロ波源は、本明細書の他の箇所に記載された特性を有するプラズマ３４を生成するように構成することができる。
【００９１】
ある特定の態様では、プラズマ電極１６は、プラズマ電極並進装置３６に機械的に結合することができる。プラズマ電極並進装置３６の例としては、限定されないが、１、２または３次元並進ステージ（手動および電動）、ロボットアーム、電極のアレイなどが含まれる。
【００９２】
試料チャンバ１２、接地電極１４、および任意選択で誘電体２４が、試料チャンバ並進装置（図示せず）を介してプラズマ電極１６に対して移動可能であるシステムも企図されている。試料チャンバ並進装置の例としては、プラズマ電極並進装置３６に関して上記したものが含まれる。
【００９３】
制御システム２０は、様々な機能生成器、プログラマブル制御、パルス生成器、電圧計、電流計、光センサ、温度計、ガス圧力センサ、ガス流量制御器、蛍光光度計、モノクロメータ、液体流量計、液体流量制御器、タイマー、またはシステム１０の様々なコンポーネントの制御のために有用であると当業者が認識する他のコンポーネントを含むことができる。一部の場合では、制御システム２０は、コンピュータである。制御システム２０は、プラズマ放電の時間を正確に制御するように構成することができる。制御システム２０は、プラズマ放電のミリ秒の分解能、例えば１００ミリ秒を超える、１０ミリ秒を超える、または１ミリ秒を超える分解能を提供することができる。
【００９４】
システム１０は、ユーザーインターフェース３８を含むことができる。ユーザーインターフェース３８は、制御システム２０および／または電極並進装置３６と通信することができる。ユーザーインターフェースは、コンピュータ、タブレットもしくはスマートフォンなどのパーソナル装置、ボタン、ノブ、スイッチなどの機械的入力の配置、またはユーザ入力を受け取り、シグナルを制御システム２０および／もしくは電極並進装置３６に提供し、システム１０を操作するための、他の手段の形態をとることができる。
【００９５】
ある特定の態様では、システム１０は、１個よりも多い試料チャンバ１２を有することができる。これらの態様では、システム１０は、試料チャンバ１６の数と同じ量の１個よりも多いプラズマ電極１６を有することもできる。例えば、システム１０は、９６ウェルプレートと同様の試料チャンバ１２のアレイと、それぞれの試料チャンバ１２が、その中に配置される、プラズマ３４の生成のためのプラズマ源点３２を含むように構成された個々のまたは独立したプラズマ電極１６のアレイとを有することができる。
【００９６】
一態様では、システム１０は、生体試料を評価するために使用することができる。生体試料を評価するためのシステム１０は、生体分子の一部分がマーカーラジカルによって修飾されたかどうかを決定することができる分析装置４０を任意選択で含むことができる。分析装置４０は、制御システム２０および／またはユーザ入力３８と、任意選択で電子通信することができる。制御システム２０は、システム１０の他の態様に従って、分析装置４０の制御を任意選択で調整することができる。ユーザーインターフェース３８は、任意選択で、分析装置を制御するようにおよび／または分析装置４０の制御のためのユーザ入力を直接受け取るように、分析装置４０と協調して使用することができる。
【００９７】
ある特定の態様では、分析装置４０は、質量分析計であることができる。質量分析計は、特定の関連の種を検出するように構成された専用の質量分析計であることができる。例えば、専用の質量分析計は、他の質量を無視する一方で、修飾されたアミノ酸を位置づける配列情報を取得できるようにするため、酸化および非酸化ペプチドの質量を検出するように構成することができる。
【００９８】
ある特定の態様では、試料チャンバ１２は、ユーザが試料を分析装置に移す必要なしに試料を自動的に処理できるように、分析装置４０に直接的に接続することができる。ある特定の態様では、自動移送は、例えば、ロボットピペットシステムを介して行うことができる。
【００９９】
ある特定の態様では、システム１０は、試料２６を、試料チャンバ１２に自動的に導入するための試料ホッパーを含むことができる。試料ホッパーの例としては、限定されないが、試料チャンバの上方に配置される自動ピペットが挙げられる。当業者は、ガスクロマトグラフィーのような他の技術で使用可能な自動化技術が、システム１０で使用可能であり得ることを認識する。
【０１００】
下記の参照試料およびキットと組み合わせて、自動ローディングおよび／または分析装置への自動移送を使用することにより、システム１０は、操作パラメータを自動的に最適化することができる。例えば、システム１０は、参照質量スペクトルをメモリに保存することができた。システムは、次いで、参照試料を試料チャンバに自動的に導入し、参照試料を一組の操作パラメータで自動的に酸化し、酸化された参照試料を質量分析計に自動的に移行させ、参照試料の質量スペクトルを自動的に取得し、取得した質量スペクトルと保存された参照質量スペクトルとを比較することができる。システムは、取得された質量スペクトルが、保存された参照質量スペクトルと実質的に一致するまで、このプロセスを繰り返すことができ、最適化ルーチンを使用して操作パラメータを変動させることができる。
【０１０１】
本明細書で使用されるとき、「接地電極」は、個々の接地電極、または互いに実質的に同等に接地されている複数の接地電極を指す。例えば、単一の接地に全て電気的に接続されている複数の銅電極は、この開示の文脈において、一つの接地電極と考えることができる。分かり易くするために、接地電極への参照は、任意の数の個々の接地電極を含む。
【０１０２】
図２を参照して、図１に示される特徴に匹敵し、交換可能である修飾を有するシステム１０を説明する。図２に示され、図１に関連して上述された特徴は、効率のためにここでは繰り返さないが、上述と同じおよび／または同様の文脈で展開される。そのような特徴が図２の文脈で使用されるように適合する必要がある場合、当業者はそのような適合に対応する方法を理解する。一態様では、図２を参照して、本開示は、プラズマジェット４２を含むシステム１０を提供する。システム１０は、プラズマジェット４２から生じるプラズマ３４を正確に送達するために、プラズマジェット４２を物理的に操作するように構成されたプラズマジェット並進装置３７を含むことができる。システム１０は、試料チャンバ１２内の試料２６を熱的に冷却するように構成された冷却装置４４を含むことができる。システムは、試料チャンバ１２を受けるように構成された試料チャンバホルダー４６を含むことができる。システム１０は、保護ハウジング４８を含むことができる。保護ハウジング４８は、ドア５０を含むことができる。システム１０は、ガスマニホールド５２を含むことができる。システム１０は、温度センサ５４を含むことができる。
【０１０３】
本明細書で使用されるとき、用語「プラズマジェット」は、第１の空間内でプラズマを生成し、生成されたプラズマを、ガスの移動およびプラズマジェットの形成を介して標的へ向けて推進する装置を指す。プラズマ生成分野における当業者は、プラズマジェットが、本開示の範囲を逸脱することなく、様々な形態をとりうることを認識する。一例では、プラズマジェット４２は、上記のようなマーカーラジカル前駆体を有する流体が流れるガラス管であることができる。ガラス管は、ガラス管内でプラズマ３４を生成するように構成された電極、一部の場合では巻電極、によって包囲されていることができる。次いで、流体の流量は、ガラス管の外へ試料２６に向かってプラズマ３４を推進するように、調整することができる。ガラス管は、プラズマ３４の再現可能な方向づけを容易にする形状を有することができる。プラズマジェット４２は、当業者に既知のフィードガス制御を有することができ、制御システム４２によって制御され得る。またプラズマジェット４２は、プラズマ３４の方向性、サイズ、および形状の制御のためのシースガスを展開する能力を有することができる。市販のプラズマジェットの非限定的な例としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ、ＧＡに本社を置くＰｌａｓｍａ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から市販されているＰｌａｓｍａＪｅｔ（登録商標）が挙げられる。
【０１０４】
プラズマジェット４２を使用する利点としては、例えば限定されないが、位置の柔軟性、プラズマ３４の制御の増強、および当業者に認識される他の利点を挙げることができる。一例として、プラズマジェット４２の使用は、より大きな試料チャンバ１２の使用を容易にすることができる。この例では、プラズマジェット４２を展開して、試料２６の広い表面にわたって「走査」（例えば、ラスタ走査運動）することができ、プラズマ３４を試料２６の様々なエリアに導入することができた。
【０１０５】
一部の場合では、プラズマジェット４２は、その機能に関連した乱流を有することができる。乱流は、試料２６の混合を助けるために有利に使用することができる。
【０１０６】
冷却装置４４は、当業者に既知の対流冷却装置であることができる。適切な冷却装置４４の例としては、限定されないが、液体フロースルー冷却装置、ペルチェ冷却器などを挙げることができる。冷却装置４４は、制御システム２０によって制御され得る。図示されないが、冷却装置４４は、加熱装置または冷却加熱装置であってもよいことが認識されるべきである。
【０１０７】
試料チャンバホルダー４６は、試料チャンバ１２を受けるように構成されることができ、したがって試料チャンバ１２のサイズおよび形状を基準にしたサイズおよび形状を有することができる。一部の場合では、試料チャンバホルダー４６は、試料チャンバ１２を受けるように構成された凹状のキャビティを有することができる。一部の場合では、試料チャンバホルダー４６は、試料チャンバ１２が静置される平らな表面を有することができる。試料チャンバ１２が円筒形状を有する、ある特定の場合では、試料チャンバホルダー４６は、試料チャンバを受けるように構成された円筒状のキャビティを有することができる。試料チャンバホルダー４６は、セラミックなどの熱伝導性材料で作ることができる。試料チャンバホルダー４６は、電気的に絶縁していることができる。
【０１０８】
保護ハウジング４８は、密閉されていることができる。保護ハウジング４８のドア５０は、自動ロック機構を有することができる（図示せず）。自動ロック機構は、制御システム２０と電子通信することができ、制御システム２０によって制御され得る。自動ロック機構は、システム１０の使用時にはドア５０をロックし、システム１０が使われていないときはドア５０のロックを解除することによって機能することができる。保護ハウジング４８は、保護ハウジング内の環境を制御するためにガスを受ける入口５１を有することができる。ガスマニホールド５２は、入口に結合することができ、保護ハウジング４８内の大気組成を制御することができる。ガスマニホールド５２は、手動で制御することができ、または、任意選択で制御システム２０によって、自動で制御することができる。保護ハウジング４８は、透明であることができる。保護ハウジング４８は、プレキシガラスで作ることができる。
【０１０９】
温度センサ５４は、試料チャンバ１２の近く、試料チャンバ１２内、試料２６の近く、および／または試料２６内に配置され得る。複数の温度センサ５４を使用することができる。温度センサ５４は、温度計、熱電対、またはガスおよび／もしくは液体の温度を測定するために有用であることが当業者に既知の他の任意の装置であることができる。温度センサ５４は、任意選択で、制御システム２０と通信することができる。温度センサ５４で測定された温度は、システム１０を制御するために、特にプラズマ３４および／または冷却装置４４を制御するために、フィードバックとして利用することができる。
【０１１０】
電源１８は、フライバック変成器を含むこと、および利用することができ、したがってより低いコストで高電圧性能を提供することができる。
【０１１１】
制御システム２０は、試料に導入されたプラズマパルスの数に関してフィードバックを受けることができ、フィードバックに基づいてシステム１０をさらに制御することができる。
【０１１２】
一部の場合では、試料２６は、蒸発および／または乱流を最小にするために試料２６の上に油の層（図示せず）を有することができる。
【０１１３】
物質の組成物
本開示は、物質の組成物を提供する。
【０１１４】
一態様では、物質の組成物は、液体試料中の生体分子と、試料内のプラズマとを含むことができる。液体試料は、少なくとも１つのマーカーラジカル前駆体を含むことができる。プラズマは、マーカーラジカル前駆体をマーカーラジカルに変換するように構成することができる。
【０１１５】
一態様では、物質の組成物は、流体によって接触されている液体試料中の生体分子と、液体試料および／または流体内のプラズマを含むことができる。液体試料および／または流体は、少なくとも１つのマーカーラジカル前駆体を含むことができる。プラズマは、マーカーラジカル前駆体をマーカーラジカルに変換するように構成することができる。
【０１１６】
上記物質の組成物のある特定の態様では、組成物は、複数のマーカーラジカル前駆体を含むことができ、前駆体のいくつかの部分はマーカーラジカルに変換され、したがって組成物は、プラズマと、マーカーラジカル前駆体と、マーカーラジカルとを含むことができる。
【０１１７】
一態様では、物質の組成物は、プラズマ誘起酸化への予測可能な応答を有するように構成された合成生体分子を含むことができる。合成生体分子は、所定の質量および／または所定の配列を有することができる。合成生体分子は、所定の回数、例えば１回、２回、３回など、最大ｎ回の回数、選択的に酸化されるように構成することができる。合成生体分子は、特定のアミノ酸などの特定の残基、または複数の特定の残基で選択的に酸化されるように構成することができる。合成生体分子は、特定のラジカルマーカーによって選択的に酸化されるように構成することができる。
【０１１８】
合成生体分子は、ある特定の条件下で溶媒接近可能であり、他の条件下で溶媒接近不能である特定の残基で選択的に酸化されるように構成することができる。例えば、特定の残基は、第１の温度、ｐＨ、塩分または他のパラメータで溶媒接近可能であり、第２の温度、ｐＨ、塩分または他のパラメータで溶媒接近不能であることができる。
【０１１９】
ある特定の態様では、物質の組成物は、合成生体分子に関連して上記に示したものおよび／またはプラズマ誘起酸化への予測可能な応答などの所定の特性を有するように構成された合成生体分子の混合物を含むことができる。
【０１２０】
ある特定の態様では、物質の組成物は、本明細書に記載のシステムおよび方法のベンチマークとなる性能のための基準として利用することができる。
【０１２１】
キット
本開示は、キットを提供する。
【０１２２】
一態様では、キットは、参照試料と、上記方法の１つまたは複数に従って生体分子の特性の同定において参照試料を有用なものとすることができる情報とを有することができる。参照試料は、プラズマ誘起酸化への既知の応答を有することができる。情報は、既知の応答を含むことができる。例えば、情報は、参照試料の最適なプラズマ誘起酸化のための既知の質量スペクトルであることができ、メモリに保存することができる。
【０１２３】
実験者は、タンパク質試料が貴重でありうることを認識する。したがって、本開示のキットは、ユーザが、適切な設定により、さほど貴重でない参照試料の破壊しかリスクがないように、システムをチューニング可能なものであってもよい。例えば、上述の方法に対する既知の応答を有する参照試料および既知の応答を記載する情報を使用してシステムの操作パラメータを最適化することができ、次いで最適化された操作パラメータを、目的の試料自体に使用することができる。
【０１２４】
一態様では、キットは、システムが適切に構成されているかどうかを決定するために使用することができる。
【０１２５】
参照試料は、プラズマ誘起酸化に対する応答がある程度既知である限り、本明細書の他の箇所に記載の試料の特徴を含むことができる。
【０１２６】
情報は、参照質量スペクトルまたは参照質量スペクトルのカタログの形態であることができる。
【実施例】
【０１２７】
（実施例１  チトクロムＣの標識化）
【０１２８】
図１に示されるシステムを使用して、タンパク質溶液中のラジカルを生成した。プラズマは以下のように発生させた。低電圧ａ．ｃ．源により、可聴周波数範囲の可変周波数シグナルを生成した。このシグナルをＴｒｅｋ増幅器（Ｔｒｅｋ，Ｉｎｃ．、Ｌｏｃｋｐｏｒｔ、ＮＹから市販）に供給し、最大３０ｋＨｚの同じ周波数で高電圧シグナルを発生させた。次いで、Ｔｒｅｋ増幅器の出力を、ガラス管中のタンパク質溶液の上に配置されたニッケル針に供給した。ガラス管は、高さ０．７５インチ、直径０．５インチであった。ガラス管を、誘電体バリアとして機能するガラスの薄いシート（厚さ０．０６２５インチ）に密封した。銅電極を、ガラス誘電体の反対側に配置し、シグナル生成器の他の側（接地された側）に接続した。針と銅電極の間の電圧が、電圧の大きさおよびシグナル生成器の周波数に依存した特定の値を超えるときはいつでも、プラズマがマイクロ秒バーストで形成された。プラズマは、タンパク質溶液上の空気中で生成し、液体自体の中へ広がった。
【０１２９】
得られた誘電体バリア放電の写真を図３に示す。放電にわたる電圧および電流のプロットを図４に示しており、ここで電圧はＵで標識し、電流はＩで標識している。プロットは、分解が起こった時間およびプラズマが生成した時間を示している。電圧は急上昇し、電流は正の値と負の値との間で振れ、パルス幅は３〜４マイクロ秒であった。
【０１３０】
この方法のタンパク質標識化能力を説明するために、精製タンパク質チトクロムＣを、タンパク質溶液で使用した。チトクロムＣは、背景技術の項目に記載のシンクロトロンに基づく方法を含む他の方法で歴史的にベンチマークとされているモデルタンパク質である。方法の有効性を実証するために、濃度５０μＭの弱緩衝塩溶液（ｌｉｇｈｔｌｙ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のチトクロムＣを、以下の条件下で試験した：プラズマ曝露なし；３０秒のプラズマ曝露；および２分のプラズマ曝露。実験は独立して２回実施し、２つの異なる補完的質量分析技術を使用して分析した。結果を図５に要約しており、この図は、プラズマ曝露時間が増加すると、チトクロムＣの特定の領域の修飾が増加したことを説明している。これらの実験は、上述の方法の用量依存性と再現性の両方を確証した。
【０１３１】
（実施例２  ウシ血清アルブミンの標識化）
【０１３２】
図１に示されるシステムを使用して、実施例１の記載と同じ操作パラメータで、タンパク質溶液中のラジカルを生成した。
【０１３３】
濃度１０μＭの弱緩衝塩溶液中の精製ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、以下の条件下で試験した：プラズマ曝露なし；３０秒のプラズマ曝露；および１分のプラズマ曝露。ＢＳＡ内の４つの異なるペプチドを、用量依存的様式で上記方法によって修飾した。
【０１３４】
図６を参照して、プロットに、３つの異なる条件下の４つの異なるペプチドの修飾％を示す。実施例１と組み合わせて、この実施例は、異なる濃度でのタンパク質の標識化、サイズの異なるタンパク質の標識化、および異なる生理化学的特性を有するタンパク質の標識化におけるシステムおよび方法の有効性を説明する。
【０１３５】
（実施例３  サイズ依存的および曝露用量依存的様式でのＤＮＡの分解）
【０１３６】
水中の精製ラムダファージゲノムＤＮＡ試料を、図１に示されたものと同様の実験セットアップおよび実施例１に記載の実験パラメータで、試料として用いた。ラムダファージゲノムは、４８，５００塩基対を含有しており、線形である。試料を、プラズマなし、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、４５秒および６０秒のプラズマに曝露した。図７を参照して、プラズマ曝露後のＤＮＡ試料を用いた電気泳動ゲルの試行を示す。曝露なし、５秒曝露および１０秒曝露の試料は、大半が修飾されていなかった。１５秒、３０秒、４５秒および６０秒曝露の試料は、ゲル中にスメアを生じた。スメアは、ＤＮＡを非特異的に切断し、したがって様々な異なるサイズの片を導くヒドロキシルラジカルから生じた多くの様々なＤＮＡ分解産物を表す。曝露時間が増加したときのスメアのシフトは、曝露時間の増加に応じた分解産物のサイズの減少を説明している。
【０１３７】
７５００塩基対のプラスミド（環状ＤＮＡ）を、同じ条件で、曝露なし、５秒の曝露、１０秒の曝露、１５秒の曝露、および３０秒の曝露に曝露した。図８を参照して、プラズマ曝露後のＤＮＡ試料を用いた電気泳動ゲルの試行を示す。この例の場合、ラムダファージゲノムＤＮＡと比較して、このＤＮＡの分解を開始するために必要な全体的曝露時間は短かったが、同様の結果が全体的に観察された。
【０１３８】
（実施例４  インタクト／生細胞内のタンパク質の標識化）
【０１３９】
生きているＥ．ｃｏｌｉを実施例１に記載のプラズマ条件に曝露した。試料を、プラズマなし、１分のプラズマ曝露、３分のプラズマ曝露、および５分のプラズマ曝露に曝露した。プラズマ曝露の結果として、Ｅ．ｃｏｌｉの生存度に有意な減少は観察されなかった。配列情報が質量分析後に導き出された全てのペプチドを試験し、少なくとも１つの酸化事象を含むペプチドのパーセンテージの用量依存的増加を同定した。結果を図９にまとめる。
【０１４０】
Ｅ．ｃｏｌｉ由来の単一タンパク質であるグリセロールキナーゼを、分析のためにプロテオミクスバックグラウンドから単離した。図１０を参照して、タンパク質内の位置に対する修飾％のプロットを示す。プロットは、修飾が、タンパク質の特定の領域、特に溶媒に曝露される領域で、選択的に生じたことを説明している。
【０１４１】
（実施例５  酸化に対するコンホメーションの感受性）
【０１４２】
実施例１の実験パラメータを以下の２つの試料について繰り返した：１）インタクトのチトクロムＣを含有する溶液；および２）最初にタンパク分解によってペプチドにすることによって変性されたチトクロムＣを含有する溶液。両方の溶液を、同じ時間の長さにわたりプラズマに曝露した。標識化は、インタクトのチトクロムＣと比較したとき、変性されたチトクロムＣでより広範であった。この結果は、コンホメーション情報が、本明細書に記載のシステムおよび方法から導き出せることの証拠を提供する。
【０１４３】
（実施例６  天然  対  消化ウシ血清アルブミンの比較）
【０１４４】
水中の未消化および消化ウシ血清アルブミン試料を、図１に示されたものと同様の実験セットアップおよび実施例１に記載の実験パラメータで、試料として用いた。図１１〜１６を参照して、未消化（上部）および消化（下部）ウシ血清アルブミンの酸化レベルを比較するプロットを示す。図１１および１２は、１００％の尺度とし、図１３および１４は１０％の尺度とし、図１５および１６は１．０％の尺度とした。１００％の尺度のプロットでは多少類似して見えるが、１０％および１．０％の尺度のプロットでは、未消化実験と消化実験との間の大きな差異が示される。詳細には、これらのデータは、タンパク質が消化されていないとき、溶媒の相互作用の減少によって、様々な残基の酸化は制限されることの証拠を示している。一方で、消化により、ほとんどの残基が溶媒接近可能となり、消化実験で得られた酸化レベルは、より多くの残基が接近可能であることを説明している。この実施例は、本明細書に記載の方法が、溶媒接近可能性を調べるために有用であること、および消化タンパク質が、未消化タンパク質と比較するためのベンチマークとして利用できることを確認する。
【０１４５】
（実施例７  リガンドに結合されたおよび結合されていないタンパク質の溶媒接近可能性の調査）
【０１４６】
この実施例では、図１に示されたものと同様の実験セットアップおよび実施例１に記載の実験パラメータを使用した。図１７を参照して、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質のタンパク質結晶構造を示す。黒色の残基は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）に結合されたＥＧＦＲの酸化と比較したとき、ＥＧＦに結合されていないＥＧＦＲで酸化が大きい残基を表す。図１８を参照して、ＥＧＦＲタンパク質活性化ホモ二量体のタンパク質結晶構造を示す。両方の場合でＥＧＦは図示していない。測定された酸化の減少（つまりＥＧＦに結合したときの酸化の減少）と関連する残基の多くがＥＧＦＲホモ二量体の界面に位置しており、これにより、結合および二量体形成の構造的修飾の結果として、ＥＧＦの結合および活性化ホモ二量体の形成における相互作用エリア（加えてこれらの相互作用エリアから離れたいくつかの残基）で酸化が減少していることが示唆されることが認識されるべきである。
【０１４７】
本発明を、ある特定の態様に関連してかなり詳細に記載してきたが、当業者は、本発明が、説明の目的で提示された、限定のない、記載された実施形態以外の方法で実施できることを認識する。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲は、本明細書に含まれる実施形態の記載に限定されるべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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