(57)【要約】  本開示は、複数のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグ部分を含むタグ付きマルチヌクレオチド化合物に関する。本明細書において開示されるように、これらのタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、ポリメラーゼ基質として改善された特徴を有し、ナノポア合成時解読を含むさまざまな核酸検出およびシーケンシング法において使用できる。【選択図】図１
2019521096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグを含む化合物であって、前記タグが検出可能なシグナルを生成することができる分子部分であり、各ヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分がポリメラーゼの基質となることができるものである、前記化合物。
【請求項２】
２〜１２個のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に、場合により、２〜６個のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ポリメラーゼ基質として使用される場合に、単一のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸に共有結合によって連結された単一タグを含む化合物に対して増大した伸長効率をもたらす、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
以下の構造式（Ｉ）
［Ｎ−Ｐ−Ｌ］ｍ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、
Ｎはヌクレオシドであり、
Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、
Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、
ｍは、２〜１２であり、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分の数を示し、
Ｔは、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分に共有結合によって付けられたタグであり、前記タグが検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
以下の構造式（ＩＩ）
【化１】
2019521096.tif 000060
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、
ｍは、２〜１２であり、
タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
以下の構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｃ）
【化２−１】
2019521096.tif 000061
【化２−２】
2019521096.tif 000062
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、
タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
以下の構造式（ＩＩＩｄ）、（ＩＩＩｅ）または（ＩＩＩｆ）：
【化３−１】
2019521096.tif 000063
【化３−２】
2019521096.tif 000064
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
ｐは、２〜１０であり、
タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する、請求項５または６に記載の化合物。
【請求項８】
タグが、ポリエチレン−グリコール（ＰＥＧ）オリゴマー、有機色素部分、オリゴヌクレオチド（天然および／または非天然類似体モノマー単位を含む）、ポリペプチド（天然および／または非天然類似体モノマー単位を含む）およびこれらのうちいずれかの組合せを含むオリゴマー部分からなる群から選択される分子部分を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
タグが、オリゴヌクレオチド、場合により、表３、７または９から選択される構造を有するオリゴヌクレオチド、場合により、配列番号１〜１０９から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
タグが、ポリマー構造、場合により、表４から選択されるアミダイト試薬の反応から得られる少なくとも１つのモノマー単位を含むポリマー構造を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
タグが、ポリペプチド、場合により、表５から選択される構造を有するポリペプチド、場合により、配列番号１１０〜１２３から選択される配列を有するポリペプチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
タグまたはリンカーが、３個以上の分子部分との共有結合による連結を形成することができる分岐部分または樹状部分を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
分岐部分または樹状部分が、ダブラーリンカーであり、場合により、ダブラーリンカーが、アミダイト試薬の化合物（１９）
【化４】
2019521096.tif 000065
の反応によって得られる、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１４】
分岐部分または樹状部分が、トレブラーリンカーであり、場合により、トレブラーリンカーが、アミダイト試薬の化合物（２０）
【化５】
2019521096.tif 000066
の反応によって得られる、請求項２０に記載の化合物。
【請求項１５】
セット中の各化合物が、異なるタグを有し、各異なるタグが、異なる検出可能なシグナルを引き起こす、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物のセットを含む組成物。
【請求項１６】
核酸の配列を決定する方法であって、
（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を通って延在するナノポア、両電極と接触する電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼおよびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含むナノポアシーケンシング組成物を用意するステップと、
（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖および（ｉｉ）複数のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグをそれぞれが含む化合物のセットであって、タグが、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分であり、各ヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分が、ポリメラーゼの基質となることができ、化合物のセットの各メンバーが、タグがナノポア中に位置付けられると異なる遮断電流および／または滞留時間を生成する異なるタグを有する、化合物のセットと接触させるステップと、
（ｃ）タグの異なる遮断電流および／または異なる滞留時間を経時的に検出し、異なるタグのそれぞれを、核酸配列と相補的であるポリメラーゼによって組み込まれる異なる化合物と相関させ、それによって核酸配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
前記化合物のセットが、請求項１〜１３に記載の化合物から選択される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本出願は、複数のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグ部分を含むタグ付きマルチヌクレオチド化合物、開示される化合物を調製し、核酸をシーケンシングするための方法、特に、ナノポアベースのシーケンシング法において、ポリメラーゼ基質として使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]核酸シーケンシングは、核酸のヌクレオチド配列を決定するためのプロセスである。このような配列情報は、対象を診断および／または治療するのに役立ち得る。例えば、対象の核酸の配列は、遺伝病を同定し、診断し、潜在的に遺伝病の治療を開発するために使用できる。別の例として、病原体の研究は、伝染病の治療につながり得る。何百万ものヌクレオチドからなる鎖中のわずか１ヌクレオチドの相違を特徴とする疾患もあるので、高度に正確なシーケンシングが必須である。
【０００３】
[0003]ナノポアを使用する単一分子合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＢＳ）技術が開発されている。例えば、米国特許公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号、同第２０１３／０２６４２０７Ａ１号、同第２０１４／０１３４６１６Ａ１号を参照のこと。ナノポアＳＢＳは、ＤＮＡポリメラーゼ（またはその他の鎖延長酵素）を使用して標的配列鋳型と相補的なＤＮＡ鎖を合成し、伸長している鎖に各ヌクレオチドモノマーが添加されるのと同時に、各ヌクレオチドモノマーのアイデンティティを決定し、それによって標的配列を決定することを含む。添加されるヌクレオチドモノマーはそれぞれ、鎖が合成される時間にわたって、ポリメラーゼ活性部位に隣接して位置するナノポアを通る電流をモニタリングすることによって検出される。正確なシグナルを得ることは、ポリメラーゼ活性部位をナノポアの付近に適切に位置付けることと、ナノポアに入ることができ、細孔を流れる電流の同定可能な変化を提供することができる、各添加ヌクレオチド上のタグの使用とを必要とする。ヌクレオチドモノマー結合速度、処理能力、トランジション速度および全リード長を含むＤＮＡポリメラーゼ鎖延長反応のパラメータを制御することも必要である。正確なナノポアシーケンシングを実現するために、タグがナノポア中入り、十分な時間ナノポア中に留まること（すなわち「滞留時間」）と、ナノポア中に留まる間に、ナノポアを通る電流の十分に検出可能で同定可能な遮断を実現すること（すなわち「遮断電流」）が重要であり、その結果、タグが会合された特定のヌクレオチドを、他のタグ付きヌクレオチドから明白に区別することができる。
【０００４】
[0004]Ｋｕｍａｒら、（２０１２）「ＰＥＧ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、２：６８４；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ００６８４には、ナノポアを使用して、末端５’−ホスホルアミダートを介してｄＧヌクレオチドに付けられた４種の異なる長さのＰＥＧ−クマリンタグを区別することが記載されており、ＤＮＡポリメラーゼによるこれら４種のＰＥＧ−クマリンタグ付きｄＧヌクレオチドの効率的かつ正確な組込みを個々に実証する。２０１３年９月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号、２０１３年１０月１０日に公開された同第２０１３／０２６４２０７Ａ１号および２０１４年５月１４日に公開された同第２０１４／０１３４６１６Ａ１号も参照のこと。
【０００５】
[0005]ＷＯ２０１３／１５４９９９およびＷＯ２０１３／１９１７９３には、ナノポアＳＢＳのためのタグ付きヌクレオチドの使用が記載されており、分岐ＰＥＧ鎖を含む単一タグに付けられた単一ヌクレオチドの可能性ある使用を開示する。
【０００６】
[0006]ＷＯ２０１５／１４８４０２には、単一タグに付けられた単一ヌクレオチドを含むナノポアＳＢＳのためのタグ付きヌクレオチドであって、タグが、３０モノマー単位またはそれ以上の長さを有する、任意のまたはある範囲のオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド類似体）を含むタグ付きヌクレオチドの使用が記載されている。
【０００７】
[0007]上記の先行開示は、単一タグまたは分岐タグに付けられた単一ヌクレオチド部分を有するタグ付きヌクレオチド構造を教示する。これらの開示の一般的なアプローチは、タグの大きさおよび構造的可変性を増大し、それによって、ＳＢＳのより良好なナノポア検出を容易にすることである。しかし、これらの先に開示されたタグ付きヌクレオチドの大きさの増大は、達成され得る基質濃度を低下させることによってＳＢＳの有用性に対してさらなる障害を作り出す。
【０００８】
[0008]上記の先行開示は、特に、溶液量が最小であり、分子濃度が重大であるナノポア設定で、効率的なＳＢＳにとって望ましい速度でポリメラーゼ伸長反応を駆動するのに十分に高い基質濃度を提供できる特定のタグ付きヌクレオチド構造を教示できない。したがって、タグ付きヌクレオチド組成物ならびにナノポアＳＢＳおよびその他のシーケンシング技術において効率および処理量を改善するために使用され得る方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[0009]本開示は、複数のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグを含むタグ付きマルチヌクレオチド化合物であって、タグが、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分であり、各ヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分が、ポリメラーゼの基質となることができる、タグ付きマルチヌクレオチド化合物を提供する。本開示はまた、このようなタグ付きマルチヌクレオチド化合物を調製し、ナノポアシーケンシングにおけるその使用を含む、タグ付きマルチヌクレオチド化合物を使用するためのプロセスを提供する。これらのタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、ポリメラーゼ基質としてタグ付きヌクレオチドを利用し、ポリメラーゼ伸長反応のタグ付き副生成物の検出によって未知配列を同定する任意の核酸合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）システムにおいて使用するのに十分に適している。それぞれがポリメラーゼ基質となることができる複数のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグを含む特定のタグ付きマルチヌクレオチド構造は、分子量を大幅に増大し、溶解度を低下させるさらなるタグ部分を伴わずに、ポリメラーゼ活性部位での基質の有効濃度を増大する。有効濃度の増大は、ポリメラーゼ鎖延長反応の全体的な効率を高め、それによって、タグ検出、配列処理量およびシーケンシング精度を高める。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[0010]一部の実施形態においては、本開示は、複数のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグを含む化合物であって、タグが、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分であり、各ヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分が、ポリメラーゼの基質となることができる化合物を提供する。種々の実施形態では、化合物は、２〜１２個のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に、場合により、２〜６個のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグを含む。
【００１１】
[0011]一部の実施形態においては、化合物は、以下の構造式（Ｉ）
［Ｎ−Ｐ−Ｌ］ｍ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎはヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分の数を示し、Ｔは、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分に共有結合によって付けられたタグであり、ここで、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する。
【００１２】
[0012]一部の実施形態においては、化合物は、以下の構造式（ｉｉ）
【００１３】
【化１】
2019521096.tif 000003
【００１４】
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する。
【００１５】
[0013]一部の実施形態においては、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、ｍが２〜６であるか、または場合により、ｍが、２〜３である化合物を含む。
[0014]一部の実施形態においては、化合物は、以下の構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｃ）：
【００１６】
【化２−１】
2019521096.tif 000004
【００１７】
【化２−２】
2019521096.tif 000005
【００１８】
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する。
【００１９】
[0015]一部の実施形態においては、化合物は、以下の構造式（ＩＩＩｄ）、（ＩＩＩｅ）または（ＩＩＩｆ）：
【００２０】
【化３−１】
2019521096.tif 000006
【００２１】
【化３−２】
2019521096.tif 000007
【００２２】
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、ｐは、２〜１０であり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する。
【００２３】
[0016]本明細書において開示される化合物（例えば、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）の一部の実施形態においては、化合物は、ポリメラーゼ基質として使用される場合に、単一のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸に共有結合によって連結された単一タグを含む化合物に対して増大した伸長効率をもたらし、場合により、ポリメラーゼ基質としての化合物の使用に起因する伸長効率の増大は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍またはそれ以上である。
【００２４】
[0017]本明細書において開示される化合物（例えば、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）の一部の実施形態においては、検出可能なシグナルは、ナノポア検出可能なシグナル、光学的に検出可能なシグナルおよびマススペクトロメトリーによって検出可能なシグナルから選択される。一部の実施形態においては、検出可能なシグナルは、光学的に検出可能な、場合により、蛍光部分に由来するシグナルである。一部の実施形態においては、検出可能なシグナルは、ナノポア検出可能なシグナルであり、タグは、ナノポアに入ることができる、ナノポア中に配置するようになることができる、ナノポアによって捕獲され得る、ナノポアを通って転位置することができる、および／またはナノポアを横切ることができ、それによって、ナノポアを通る電流の検出可能な変化をもたらす分子部分である。
【００２５】
[0018]本明細書において開示される化合物（例えば、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）の一部の実施形態においては、タグは、ポリエチレン−グリコール（ＰＥＧ）オリゴマー、有機色素部分、オリゴヌクレオチド（ここで、オリゴヌクレオチドは、天然および／または非天然類似体モノマー単位を含む）、ポリペプチド（ここで、ポリペプチドは、天然および／または非天然類似体モノマー単位を含む）およびこれらのうちいずれかの組合せを含むオリゴマー部分からなる群から選択される分子部分を含む。一部の実施形態においては、タグは、オリゴヌクレオチド、場合により、表３、７または９から選択される構造を有するオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態においては、タグは、配列番号１〜１０９から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態においては、タグは、１５マー〜４５マー、２０マー〜４０マー、２０マー〜３０マーまたは２０マー〜２５マーのモノマー単位の長さを有するオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態においては、タグは、ポリマー構造、場合により、表４から選択されるアミダイト（ａｍｉｄｉｔｅ）試薬の反応から得られる少なくとも１つのモノマー単位を含むポリマー構造を含む。一部の実施形態においては、タグは、ポリペプチド、場合により、表５から選択される構造を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態においては、タグは、配列番号１１０〜１２３から選択される配列を有するポリペプチドを含む。
【００２６】
[0019]本明細書において開示される化合物（例えば、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）の一部の実施形態においては、オリゴリン酸は、３〜９個のリン酸基、場合により、４〜６個のリン酸基または場合により、６個のリン酸基からなる。
【００２７】
[0020]本明細書において開示される化合物（例えば、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）の一部の実施形態においては、タグまたはリンカーは、３個以上の分子部分との共有結合による連結を形成することができる分岐部分または樹状部分を含む。一部の実施形態においては、分岐部分または樹状部分は、ダブラー（ｄｏｕｂｌｅｒ）リンカーであり、場合により、ダブラーリンカーは、アミダイト試薬の化合物（１９）の反応によって得られる。一部の実施形態においては、分岐部分または樹状部分は、トレブラー（ｔｒｅｂｌｅｒ）リンカーであり、場合により、トレブラーリンカーは、アミダイト試薬の化合物（２０）の反応によって得られる。
【００２８】
[0021]本明細書において開示される化合物（例えば、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）の一部の実施形態においては、リンカーは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、ベンゼン、ベンジルエーテル、フェノール、ビス−ヒドロキシエチルベンゼン、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を含む。
【００２９】
[0022]一部の実施形態においては、本開示は、本明細書において開示される化合物（例えば、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）を調製する方法であって、（ａ）（ｉ）３〜１２個のリン酸がその５’位に付けられ、末端リン酸が、第１のリンカー形成基に連結されるヌクレオチドおよび（ｉｉ）検出可能なシグナルを生成することができ、それぞれ第１のリンカー形成基と反応して、少なくとも２つのヌクレオチドと単一タグの間に共有結合リンカーを形成可能である少なくとも２つの第２のリンカー形成基を含む分岐もしくは樹状リンカーと連結された分子部分を含むタグを提供するステップであって、第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の対応する反応性化合物であるか、または第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の対応する反応性化合物であるステップと、（ｂ）第１のリンカー形成基を第２のリンカー形成基と反応させ、それによって、少なくとも２つのヌクレオチドと単一タグの間に共有結合連結を形成するステップを含む方法を提供する。
【００３０】
[0023]一部の実施形態においては、本開示は、本明細書において開示される化合物（例えば、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）のいずれかのセットを含む組成物であって、セット中の各化合物が、異なるタグを有し、各異なるタグが、異なる検出可能なシグナルを引き起こし、場合により、検出可能なシグナルが、ナノポア検出可能なシグナル、光学的に検出可能なシグナルおよびマススペクトロメトリーによって検出可能なシグナルから選択される組成物を提供する。一部の実施形態においては、異なる検出可能なシグナルは、タグがナノポア中に位置付けられるときの異なる遮断電流である。
【００３１】
[0024]化合物のセットを含む組成物の一部の実施形態においては、異なるタグのうちの少なくとも１つが、オリゴヌクレオチド、場合により、表３、７または９から選択される構造を有するオリゴヌクレオチド、場合により、配列番号１〜１０９から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態においては、化合物のセットは、（ｄＡ６Ｐ）２−ｄＴ５−（ＢＨＥＢ）−ｄＴ１４−Ｃ３、（ｄＣ６Ｐ）２−ｄＴ２０−Ｃ３、（ｄＴ６Ｐ）２−ｄＴ４−（Ｎ３ＣＥ−ｄＴ）３−ｄＴ１３−Ｃ３および（ｄＧ６Ｐ）２−ｄＴ６−（Ｔｍｐ）６−ｄＴ８−Ｃ３を含む。一部の実施形態においては、化合物のセットは、（ｄＡ６Ｐ）２−ｄＴ４−（ｉｄＳｐ−ｄＴ）４−ｄＴ８−Ｃ３、（ｄＣ６Ｐ）２−ｄＴ２０−Ｃ３、（ｄＴ６Ｐ）２−ｄＴ４−（Ｎ３ＣＥ−ｄＴ）３−ｄＴ１３−Ｃ３および（ｄＧ６Ｐ）２−ｄＴ６−（Ｔｍｐ）６−ｄＴ８−Ｃ３を含む。
【００３２】
[0025]一部の実施形態においては、本開示は、核酸の配列を決定する方法であって、（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を通って延在するナノポア、両電極と接触する電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼおよびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含むナノポアシーケンシング組成物を用意するステップと、（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖および（ｉｉ）複数のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグをそれぞれが含む化合物のセットであって、タグが、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分であり、各ヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分が、ポリメラーゼの基質となることができ、化合物のセットの各メンバーが、タグがナノポア中に位置付けられると異なる遮断電流および／または滞留時間を生成する異なるタグを有する、化合物のセットと接触させるステップと、（ｃ）タグの異なる遮断電流および／または異なる滞留時間を経時的に検出し、異なるタグのそれぞれを、核酸配列と相補的であるポリメラーゼによって組み込まれる異なる化合物と相関させ、それによって核酸配列を決定するステップとを含む方法を提供する。本方法の一部の実施形態においては、異なるタグを有する少なくとも２種の化合物は、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または少なくとも７５％異なる遮断電流を有する。本方法の一部の実施形態においては、化合物のセット中の各化合物は、異なるタグを有し、各異なるタグは、異なる検出可能なシグナルを引き起こす。一部の実施形態においては、異なるタグのうち少なくとも１つは、オリゴヌクレオチド、場合により、表３、７または９から選択される構造を有するオリゴヌクレオチド、場合により、配列番号１〜１０９から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。本方法の一部の実施形態においては、化合物のセットは、（ｄＡ６Ｐ）２−ｄＴ５−（ＢＨＥＢ）−ｄＴ１４−Ｃ３、（ｄＣ６Ｐ）２−ｄＴ２０−Ｃ３、（ｄＴ６Ｐ）２−ｄＴ４−（Ｎ３ＣＥ−ｄＴ）３−ｄＴ１３−Ｃ３および（ｄＧ６Ｐ）２−ｄＴ６−（Ｔｍｐ）６−ｄＴ８−Ｃ３を含む。本方法の一部の実施形態においては、化合物のセットは、（ｄＡ６Ｐ）２−ｄＴ４−（ｉｄＳｐ−ｄＴ）４−ｄＴ８−Ｃ３、（ｄＣ６Ｐ）２−ｄＴ２０−Ｃ３、（ｄＴ６Ｐ）２−ｄＴ４−（Ｎ３ＣＥ−ｄＴ）３−ｄＴ１３−Ｃ３および（ｄＧ６Ｐ）２−ｄＴ６−（Ｔｍｐ）６−ｄＴ８−Ｃ３を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】[0026]構造［ｄＴ６Ｐ−リンカー］２−ｄＴ３０（化合物（３ａ））のタグ付きマルチヌクレオチド基質を調製するのに有用なダブラー−リンカーコンジュゲーション反応を表す図である。
【図２】[0027]構造［ｄＴ６Ｐ−リンカー］３−ｄＴ３０−Ｃ３（化合物（３ｂ））のタグ付きマルチヌクレオチド基質を調製するのに有用なトレブラー−リンカーコンジュゲーション反応を表す図である。
【図３】[0028]単一オリゴヌクレオチドタグに連結された２、３および４種の基質を有するタグ付きマルチヌクレオチド基質ならびにタグ付き単一ヌクレオチド基質および非タグ付きヌクレオチド六リン酸基質の置換アッセイにおける、ポリメラーゼ基質としての速度（塩基／秒）に対するタグ濃度のプロットを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
[0029]本明細書における説明および添付の特許請求の範囲について、単数形「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、明確に別に示さない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「１種のタンパク質」への言及は、２種以上のタンパク質を含み、「１種の化合物」への言及は、２種以上の化合物を指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換可能であり、制限であるように意図されない。種々の実施形態の説明が、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合には、当業者ならば、一部の特別な場合においては、実施形態を、代替として、言語「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を使用して説明することができるということは、さらに理解されるべきである。
【００３５】
[0030]さまざまな値が提供される場合には、明確に別段の定めがない限り、その範囲の上限および下限の間の、値の介在する整数それぞれおよび明確に別段の定めがない限り、値の介在する整数それぞれの１０分の１ならびに任意のその他の示された値またはその示された範囲中の介在する値が、本発明内に包含されるということは理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立に、より小さい範囲中に含まれ得、また、本発明内に包含され、示された範囲中の任意の具体的に排除される限界の支配下にある。示された範囲が、限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界の（Ｉ）いずれか、または（ＩＩ）両方を排除する範囲も、本発明中に含まれる。例えば、「１〜５０」は、「２〜２５」、「５〜２０」、「２５〜５０」、「１〜１０」などを含む。
【００３６】
[0031]図面を含む前記の一般的な説明および以下の詳細な説明は、単に例示的なものおよび説明的なものであって、本開示を制限するものではないということは理解されるべきである。
【００３７】
[0032]定義
[0033]本明細書の説明において使用される技術用語および科学用語は、別段の定めがない限り、当業者に一般に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００３８】
[0034]「核酸」とは、本明細書において、核酸塩基、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）のうち１種またはそのバリアントを含む１種または複数の核酸サブユニットの分子を指す。核酸は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとも呼ばれる、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ）のポリマーを指すこともあり、一本鎖および二本鎖形態両方のＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらのハイブリッドを含む。
【００３９】
[0035]「ヌクレオチド」とは、本明細書において、核酸ポリメラーゼの基質または阻害剤として作用可能であるヌクレオシド−５’−オリゴリン酸化合物またはヌクレオシド−５’−オリゴリン酸の構造的類似体を指す。例示的ヌクレオチドとして、ヌクレオシド−５’−三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰ）、４つ以上のリン酸の長さの５’−オリゴリン酸鎖を有するヌクレオシド（例えば、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴおよびｄＵ）（例えば、５’−テトラホスフェート、５’−ペンタホスフェート、５’−ヘキサホスフェート、５’−ヘプタホスフェート、５’−オクタホスフェート）ならびに修飾塩基部分（例えば、置換プリンまたはピリミジン塩基）、修飾糖部分（例えば、Ｏ−アルキル化糖）および／または修飾オリゴリン酸部分（例えば、チオリン酸、メチレンおよび／またはリン酸間の他の架橋を含むオリゴリン酸）を有し得るヌクレオシド−５’−三リン酸の構造的類似体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
[0036]「ヌクレオシド」とは、本明細書において、糖部分（例えば、リボースまたはデオキシリボース）に付けられた天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基を含む分子部分を指す。
【００４１】
[0037]「オリゴリン酸」とは、本明細書において、リン酸基のオリゴマーを含む分子部分を指す。例えば、オリゴリン酸は、２〜２０のリン酸のオリゴマー、３〜１２のリン酸のオリゴマー、３〜９のリン酸のオリゴマーを含み得る。
【００４２】
[0038]「ポリメラーゼ」とは、本明細書において、ヌクレオチドモノマーの核酸ポリマーを形成する重合などの重合反応を触媒可能である、任意の天然の、または天然に存在しない酵素または他の触媒を指す。本開示の組成物および方法において使用できる例示的ポリメラーゼとして、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．７の酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．６またはＥＣ２．７．７．４８の酵素）、逆転写酵素（例えば、クラスＥＣ２．７．７．４９の酵素）およびＤＮＡリガーゼ（例えば、クラスＥＣ６．５．１．１の酵素）などの核酸ポリメラーゼが挙げられる。
【００４３】
[0039]「リンカー」とは、本明細書において、２以上の分子、分子基および／または分子部分の間の幾分かの空間を有する結合取付けを提供する任意の分子部分を指す。
[0040]「タグ」とは、本明細書において、タグと連結された分子または分子複合体を直接または間接的に検出および／または同定する能力を可能にする、または増強する部分または分子の一部を指す。例えば、タグは、立体容積または容量、帯電、電気化学電位、光学的および／または分光学的特徴などの検出可能な特性または特徴を提供することができる。
【００４４】
[0041]「ナノポア」とは、本明細書において、約０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍの特徴的な幅または直径を有する膜または他のバリア材料中に形成される、または別に提供される細孔、チャネルまたは通路を指す。ナノポアは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のα−溶血素などの天然に存在する細孔形成性タンパク質またはα−ＨＬ−Ｃ４６などの天然に存在しない（すなわち、操作された）または天然に存在するいずれかの、野生型細孔形成性タンパク質の変異体またはバリアントから作製することができる。膜は、脂質二重層などの有機膜であっても、天然に存在しないポリマー材料から作製された合成膜であってもよい。ナノポアは、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路などのセンサー、検出回路、または検出回路に連結された電極に隣接して、またはその近傍に配置してもよい。
【００４５】
[0042]「ナノポア検出可能なタグ」とは、本明細書において、ナノポア中に入ることができる、ナノポア中に配置するようになることができる、ナノポアによって捕獲され得る、ナノポアを通って転位置することができる、および／またはナノポアを横切ることができ、それによってナノポアを通る電流の検出可能な変化をもたらすタグを指す。例示的なナノポア検出可能なタグとして、検出可能なナノポア電流の変化をもたらし得る、いずれも場合により、色素部分またはフルオロフォアなどの化学基を用いて修飾されてもよく、それらと連結されてもよい、ポリエチレングリコール、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、ペプチド核酸ポリマー、ロックド核酸ポリマーなどの天然または合成ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
[0043]「バックグラウンド電流」とは、本明細書において、電位が印加され、ナノポアが開口し、遮断されていない（例えば、ナノポア中にタグがない）ときに、ナノポア中にわたって測定された電流レベルを指す。
【００４７】
[0044]「遮断電流」とは、本明細書において、電位が印加され、タグがナノポアに存在するときにナノポア中にわたって測定された電流レベルを指す。一般に、ナノポア中のタグ分子の存在は、ナノポアを通る帯電分子の流れを制限し、それによって、バックグラウンド電流レベルを変化させる。
【００４８】
[0045]「滞留時間」とは、本明細書において、ナノポアにおけるタグの捕獲に関連して、遮断電流によって検出されるような、タグが、ナノポア中で過ごす時間を指す。
[0046]「伸長効率」とは、本明細書において、ポリメラーゼの基質として作用するタグ付きマルチヌクレオチド化合物に関連して、それだけには限らないが、処理能力、トランジション速度、結合速度（ｋｏｎ）、リード長、リード長フェデリティー、伸長速度、シーケンシング精度、長い連続リード能を含むポリメラーゼ鎖延長反応の効率と関連する任意のパラメータを指す。
【００４９】
[0047]種々の実施形態の詳細な説明
[0048]概要：タグ付きマルチヌクレオチド化合物およびナノポアシーケンシング
[0049]本開示は、核酸のナノポアシーケンシングにとって有用である、タグ付きマルチヌクレオチド化合物の組成物および関連方法、デバイスおよびシステムを記載する。タグ付きマルチヌクレオチド化合物は、鋳型核酸鎖と相補的である成長する鎖への核酸ポリメラーゼによる個々のヌクレオチド組込みを正確に検出するための方法において使用できる。一般に、鎖延長酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、その活性部位で成長する核酸鎖とハイブリダイズされる、鋳型核酸鎖に対して相補的であるタグ付きマルチヌクレオチド化合物と特異的に結合する。鎖延長酵素は、次いで、タグ付きマルチヌクレオチオ化合物の相補性ヌクレオチド部分を、成長する核酸鎖の末端に触媒によって連結する（すなわち、組み込む）。触媒的組込み事象の完了は、タグ部分およびオリゴリン酸部分（成長する鎖中に組み込まれた１つのリン酸を引いた）の放出をもたらし、これは、次いで隣接するナノポアを通過する。
【００５０】
[0050]タグ付きマルチヌクレオチド化合物のタグ部分は、組み込まれたヌクレオチドからそれを放出する触媒的プロセスを受ける前であっても、ナノポアの細孔に入り、それによって、電位の下でナノポアのバックグラウンド電流を変化させ、検出することができる遮断電流を引き起こすことができる。タグ部分の種々の分子特性（例えば、質量、容量、三次元構造、帯電）は、細孔とのその相互作用に大きく影響を及ぼし、それによって、ナノポア検出のために、それぞれが異なるヌクレオチドに対応し得る異なるタグ部分を区別することができる。シーケンシングにおいてタグ付きヌクレオチドを含むタグ付き分子を検出するためにそれらを使用するためのさまざまなナノポアシステムおよび方法が、当技術分野で公知である。例えば、それぞれ、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、２００９年５月１８日に出願された米国特許出願第１２／３０８，０９１号、Ｊｕら；２０１３年６月１４日に出願された米国特許出願第１３／９９４，４３１号、Ｊｕら；２０１３年９月１９日に公開された米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０  Ａ１号；２０１３年１０月１０日に公開された米国特許公開第２０１３／０２６４２０７  Ａ１号および２０１４年５月１４日に公開された米国特許公開第２０１４／０１３４６１６  Ａ１号；２０１３年４月８日に出願されたＰＣＴ国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３５６３５号、Ｊｕら；および２０１３年４月８日に出願されたＰＣＴ国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３５６４０号、ＪｕらおよびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１５／１４８４０２を参照のこと。
【００５１】
[0051]ほとんどの実施形態において、ナノポアシーケンシングは、成長する鎖中に酵素によって組み込まれ得る４種のヌクレオチド類似体（例えば、ｄＡ６Ｐ、ｄＣ６Ｐ、ｄＧ６ＰおよびｄＴ６Ｐ）の混合物を使用し、各ヌクレオチド類似体は、ナノポアを用いて検出されるときに同定可能な、識別可能な特徴を提供する、共有結合によって付けられたタグ部分を有する。
【００５２】
[0052]背景節に記載されるように、ナノポア検出に関連して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）オリゴマー、有機色素部分、オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドは、天然および非天然類似体モノマー単位を含み得る）、ポリペプチド（ポリペプチドは、天然および非天然類似体モノマー単位を含み得る）およびこれらのうち任意の組合せを含むポリマー部分などのさまざまな分子部分を含むさまざまなタグ部分が使用されてきた。合成され得る（例えば、自動ホスホロアミダイトまたはペプチド合成法を使用して）広範なモノマー単位は、識別可能なナノポア検出を提供するように混合され、マッチされ得る極めて広範な分子特性を提供する。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１５／１４８４０２、２０１５年９月３０日に出願された米国仮特許出願番号第６２／２３５，５５１号、および２０１５年９月１０日に出願された第６２／２１６，６３４号を参照のこと。
【００５３】
[0053]タグ付きマルチヌクレオチド化合物構造
[0054]本開示は、さまざまな構造を特徴とし得るタグ付きマルチヌクレオチド化合物実施形態を提供する。一般に、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、複数のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグを含み、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分であり、各ヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分は、ポリメラーゼの基質となることができる。一部の実施形態においては、化合物は、２〜１２個のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分、場合により、２〜６個のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグを含む。
【００５４】
[0055]本明細書において別の場所に記載されたような、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物構造は、ポリメラーゼ基質の有効濃度の増大およびそれによって得られる伸長効率の増大を含む技術的利点をもたらす。したがって、一部の実施形態においては、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、単一のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸に共有結合によって連結された単一タグを含む基質化合物に対して、ポリメラーゼの基質として伸長効率を増大した。一部の実施形態においては、ポリメラーゼの基質としての効率は、少なくとも２倍増大される、場合により、効率は、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍またはそれ以上増大される。
【００５５】
[0056]本開示は、タグ付きマルチヌクレオチド化合物が、ナノポア検出を含むＳＢＳ法において使用され得る多数の実施形態を記載するが、タグ付きマルチヌクレオチド化合物が、核酸鎖延長酵素（例えば、ポリメラーゼ）による個々のヌクレオチド組込みの検出を含む任意の方法において使用され得ることも考慮される。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、タグ部分によって生成される検出可能なシグナルが、ナノポア検出可能なシグナル、光学的に検出可能なシグナルおよびマススペクトロメトリーによって検出可能なシグナルから選択される選択されるタグ付きマルチヌクレオチド化合物を提供する。
【００５６】
[0057]マススペクトロメトリーによって、または光学的に検出可能なシグナルを生成することができる分子部分は、当技術分野で周知である。例えば、単一ヌクレオチドを、ヌクレオチドの末端リン酸に付けられた蛍光、蛍光発生的または化学発光標識とともに利用する多数のＤＮＡ検出またはシーケンス技術がある（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３９９，３３５号および米国特許出願公開第２００３／００４４７８１号および同第２００３／０１２４５７６号を参照のこと）。このような末端リン酸標識されたヌクレオチドを使用するアッセイのいずれも、タグが、これらの既知蛍光、蛍光発生的または化学発光標識のいずれかであり得るタグ付きマルチヌクレオチドに容易に適応され得るということが考慮される、したがって、通常の技術者ならば、このような蛍光的タグ付きマルチヌクレオチド化合物を調製するために、本明細書において開示される化合物構造、分岐または樹状リンカーおよび合成方法を使用できる。
【００５７】
[0058]ナノポア検出可能なシグナルを生成することができるタグは、一般に、ナノポアに入ることができる、ナノポア中に配置するようになることができる、ナノポアによって捕獲され得る、ナノポアを通って転位置することができる、および／またはナノポアを横切ることができ、それによって、ナノポアを通る電流の検出可能な変化をもたらす任意の分子部分を含む。背景節においておよび本明細書において別の場所で記載されるように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）オリゴマー、有機色素部分、オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドは、天然および非天然類似体モノマー単位を含み得る）、ポリペプチド（ポリペプチドは、天然および非天然類似体モノマー単位を含み得る）およびこれらのうち任意の組合せを含むポリマー部分を含むさまざまなナノポア検出可能な分子部分が、当技術分野で記載されている。したがって、一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチド化合物は、タグを含み、タグは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）オリゴマー、有機色素部分、オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドは、天然および非天然類似体モノマー単位を含み得る）、ポリペプチド（ポリペプチドは、天然および非天然類似体モノマー単位を含み得る）およびこれらのうち任意の組合せを含むポリマー部分からなる群から選択される分子部分である。
【００５８】
[0059]一部の実施形態においては、本開示は、以下の構造式（Ｉ）
［Ｎ−Ｐ−Ｌ］ｍ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎはヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分の数を示し、Ｔは、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分に共有結合によって付けられたタグであり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
で示されるタグ付きマルチヌクレオチド化合物を提供する。
【００５９】
[0060]ヌクレオシド（Ｎ）は、ヌクレオシドが、三リン酸などのオリゴリン酸（Ｐ）に共有結合によって連結される場合にポリメラーゼなどの鎖延長酵素によって組み込まれることが可能な任意のヌクレオシドであり得る。ヌクレオシドは、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基およびリボースまたはデオキシリボース基などの天然に存在するまたは天然に存在しない糖部分を含み得る。一部の実施形態においては、核酸塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンからなる群から選択される。糖部分は、鎖延長酵素によって触媒的に組み込まれる場合に、成長するポリヌクレオチド鎖とリン酸ジエステル結合を形成できる位置に遊離ヒドロキシル基（例えば、３’−ＯＨ基）を提供しなくてはならない。ヌクレオシド糖部分もまた、オリゴリン酸部分の共有結合取付けを可能にする基（例えば、５’−Ｏ基）を提供しなくてはならない。
【００６０】
[0061]一部の実施形態においては、本開示は、以下の構造式（ＩＩ）
【００６１】
【化４】
2019521096.tif 000008
【００６２】
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
で示されるタグ付きマルチヌクレオチド化合物を提供する。
【００６３】
[0062]一部の実施形態においては、核酸塩基（「塩基」）は、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素によって組み込まれることが可能である任意の天然に存在する、または天然に存在しない（例えば、化学修飾された）塩基であり得る。一部の実施形態においては、核酸塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンからなる群から選択される。
【００６４】
[0063]タグ付きマルチヌクレオチド化合物のオリゴリン酸（Ｐ）部分は、ヌクレオシドの５’−Ｏに付けられる場合に、得られたヌクレオチドが、依然としてポリメラーゼなどの鎖延長酵素によって組み込まれることが可能であることを可能にする任意のオリゴリン酸であり得る。一般に、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素は、３〜１２個のリン酸基の鎖を有するオリゴリン酸を含むヌクレオチドを組み込むことが可能である。したがって、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物（例えば、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物）においては、オリゴリン酸（Ｐ）基は、３〜１２個のリン酸基を含み得る。
【００６５】
[0064]構造式（ＩＩ）の化合物に表されるように、３〜１２個のリン酸基のオリゴリン酸は、ｎ＝１〜ｎ＝１０の値によって表される。したがって、本開示の一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチド化合物は、３〜９個のリン酸基（または式（ＩＩ）のｎ＝１〜７）を含むオリゴリン酸（Ｐ）基を含む。一部の実施形態においては、オリゴリン酸基は、４〜６個のリン酸基（または式（ＩＩ）のｎ＝２〜４）を含む。一部の実施形態においては、オリゴリン酸基は、６個のリン酸基（または式（ＩＩ）のｎ＝４）を含む。
【００６６】
[0065]他の実施形態においては、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、４〜２０個のリン酸、４〜１２個のリン酸、４〜９個のリン酸、４〜６個のリン酸のオリゴリン酸鎖を含むことができ、鎖は、ヌクレオシドの５’位に付けられる（例えば、５’−四リン酸、５’−五リン酸、５’−六リン酸、５’−七リン酸、５’−八リン酸、５’−九リン酸、５’−十リン酸など）。
【００６７】
[0066]本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、修飾リン酸基、リン酸類似体または他の非リン酸化学基を含むオリゴリン酸部分を、このようなリン酸基を含むことが、オリゴリン酸がヌクレオシドの５’−Ｏに付けられる場合に、得られたタグ付きマルチヌクレオチドが鎖延長酵素によって組み込まれることを妨げないという条件で含み得ることがさらに考慮される。典型的には、鎖延長酵素による組込みは、α−位の天然に存在するリン酸基およびオリゴリン酸のα−位とβ−位の間のリン酸ジエステル結合を必要とする。したがって、一部の実施形態においては、オリゴリン酸は、三リン酸基を含み得る。さらに、オリゴリン酸は、リン酸またはメチレンなどの１つもしくは複数の非リン酸基を有するリン酸類似体基および／または２つ以上のリン酸基の間の架橋基のオリゴマーを含み得るということが考慮される。
【００６８】
[0067]リンカー
[0068]広範なリンカーは、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）のタグ付きマルチヌクレオチド化合物において使用され得るということも考慮される。一般に、リンカーは、複数のヌクレオチドと単一タグの間の共有結合性連結および所望の空間または構造を提供可能である任意の分子部分を含み得る。
【００６９】
[0069]タグ付きマルチヌクレオチド化合物の特定の使用のために、所望の空間または構造を選択し、最適化することができる。例えば、ナノポア検出の使用においては、複数のヌクレオチドのいずれか１つが隣接するポリメラーゼと三元複合体を形成するときに、タグがナノポアに入り、ナノポア中にあることを可能にする空間を提供するリンカーを選択することができる。ポリメラーゼがナノポア連結される方法に応じて、タグが細孔中の場所にあるときに適したナノポア検出可能シグナル（例えば、遮断電流）を提供するために、わずかに短いまたは長い空間を選択してもよい。しかし、一般に、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物において有用なリンカー（例えば、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物）は、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合した鎖を含む。一部の実施形態においては、２〜１００個の原子を有するリンカー鎖は、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、ベンゼン、ベンジルエーテル、フェノール、ビス−ヒドロキシエチルベンゼン、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の化学部分を含む。タグ付きマルチヌクレオチド化合物において有用であるさまざまな化学部分を含むさまざまなリンカーを、本明細書において記載し、例示する。
【００７０】
[0070]典型的には、リンカーは、タグに、またはタグに付けられたもしくはタグに共有結合によって付けられ得るリンカー部分に、オリゴリン酸部分の末端リン酸（リン酸類似体）を共有結合により連結する化学反応における、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）のタグ付きマルチヌクレオチド化合物の調製の際に形成される。より詳しくは、この化学反応は、典型的には、反応性リンカー形成基およびオリゴリン酸部分を含むヌクレオチドを用いて修飾されたタグを含み、オリゴリン酸の末端もまた、反応性リンカー形成基を用いて修飾される。このリンカー形成性化学反応を、スキーム１におけるように表すことができる。
スキーム１
【００７１】
【化５】
2019521096.tif 000009
【００７２】
[0071]スキーム１に表わされるように、ＸＡおよびＸＢは、反応性リンカー形成基であり、ＬＡおよびＬＢは、化学部分であり、それらは、構造−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−の最終的に形成されるリンカーへの前駆体リンカーである。したがって、ＸＡおよびＸＢは、複数のヌクレオチドのうち１つとタグの間の共有結合性連結をもたらす化学反応を起こすことが可能である化学部分である。式ＩＩの構造におけるように、括弧内の２〜１２の反応性部分が反応中に存在することを示すために、下付文字ｍがついた大括弧を使用する。したがって、得られる生成物は、単一タグにｍ個のヌクレオチド部分を連結する構造−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−のｍ個のリンカーを含む。リンカー形成基、ＸＡおよびＸＢの間の各共有結合性連結反応の生成物は、一般構造−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−を含むリンカーである。したがって、本開示の一部の実施形態においては、式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物におけるようなリンカー「Ｌ」または「リンカー」は、スキーム１に表されるような構造式「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」のリンカーである。化学部分、「Ｘ」（「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」の）は、リンカー形成反応において生成される新規化学リンカー部分である。ＬＡおよびＬＢによって提供されるリンカーの他の部分は、リンカーの全体的な構造に実質的に寄与し得るが、特定の化学基Ｘの名称を使用して、リンカーの種類を示すことが多い。例えば、特徴的なリンカー部分Ｘは、トリアゾール基であり得る。トリアゾール基は、アジドリンカー形成基とアルキンリンカー形成基の間の「クリック」反応において形成され得る。
【００７３】
[0072]さらに、全体的なリンカーは、トリアゾール部分の片側または両側にＣ５直鎖アルキルおよびアミド基を含み得る。したがって、一部の実施形態においては、リンカーは、リンカー形成試薬、ＸＡおよびＸＢの間のリンカー形成反応において生成した化学部分、Ｘを含み、Ｘは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、ベンゼン、ベンジルエーテル、フェノール、ビス−ヒドロキシエチルベンゼン、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステルおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群から選択される化学部分である。
【００７４】
[0073]化学部分、ＬＡおよびＬＢは、ヌクレオチドオリゴリン酸またはタグとそのリンカー形成基、ＸＡおよびＸＢの間のリンカーまたはスペーサーとして有効に作用できる化学基である。典型的には、ＬＡおよびＬＢは、リンカー形成反応において反応しないが、最終的に形成されるリンカーにさらなる空間または構造を提供する化学部分である。ＬＡおよびＬＢ部分は、同一であっても、異なっていてもよい。一部の実施形態においては、ＬＡまたはＬＢは、もう一方よりもかなり長いまたは短いこともあり、および／または異なる構造的特徴、例えば、多かれ少なかれコンホメーション的可動性をもたらす特徴を提供する。したがって、一部の実施形態においては、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物において有用なＬＡおよびＬＢ部分は、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合した鎖および場合により、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、ベンゼン、ベンジルエーテル、フェノール、ビス−ヒドロキシエチルベンゼン、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の化学部分を含む。
【００７５】
[0074]したがって、一部の実施形態においては、本開示は、構造式（ＩＩＩ）
【００７６】
【化６】
2019521096.tif 000010
【００７７】
［式中、「塩基」は、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜１０であり、ｍは、２〜１２であり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分であり、「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」は、ＬＡおよびＬＢがそれぞれ、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含み、ｘが、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、ベンゼン、ベンジルエーテル、フェノール、ビス−ヒドロキシエチルベンゼン、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾールおよびジヒドロピリダジンからなる群から選択される化学部分であるリンカーである］
で示されるタグ付きマルチヌクレオチド化合物を提供する。一部の実施形態においては、ＬＡおよびＬＢはそれぞれ独立に、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、ベンゼン、ベンジルエーテル、フェノール、ビス−ヒドロキシエチルベンゼン、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される化学部分を含む。
【００７８】
[0075]例示的リンカー形成基、ＸＡおよびＸＢ、リンカー前駆体部分、ＬＡおよびＬＢ並びに式−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−のそれらが形成する得られるリンカーを以下の表１に示す。
[0076]
【００７９】
【表１−１】
2019521096.tif 000011
【００８０】
【表１−２】
2019521096.tif 000012
【００８１】
【表１−３】
2019521096.tif 000013
【００８２】
【表１−４】
2019521096.tif 000014
【００８３】
[0077]表１は、共有結合性連結リンカーをもたらす反応を起こす、リンカーおよび対応する反応性リンカー形成基の範囲を例示する。これらの種々のリンカーおよび反応は、当技術分野で周知である。当業者ならば、これらの反応に必要な試薬を同定し、それらを合成するか、または商業的に入手することができるであろう。例えば、ポリペプチド（またはタンパク質）を、他の生体分子にコンジュゲートまたは架橋するための試薬を、リンカー形成基として使用して、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド構造を調製することができる。（例えば、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍでＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡから、またはｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍでＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡから入手可能な「ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ」のカタログを参照のこと）。同様に、末端リン酸修飾ヌクレオシドおよび／またはアジドもしくはアルキン基（または他のリンカー形成基）を用いるこのような修飾のための試薬は市販されている（例えば、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｇｍｂｈ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙを参照のこと）。さらに、ポリペプチドの自動固相合成において使用できるアジドまたはアルキン基（または他のリンカー形成基）を用いて修飾された、広範なＦＭＯＣ保護アミノ酸残基が市販されている（例えば、ＡｎａＳｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡを参照のこと）。同様に。
【００８４】
[0078]構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）および（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）のリンカー形成基の対のいずれかを、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物（例えば、式（ＩＩＩ）の化合物）中のリンカーを調製することにおいていずれかの配置で使用できるということが考慮される。すなわち、リンカー形成基、ＸＡおよびＸＢのいずれも、リンカー形成基が、リンカー部分Ｘを形成するリンカー反応を提供するために対合される限り、タグまたはヌクレオチドのいずれでも使用できる。したがって、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）のリンカー形成基のいずれも、タグまたはヌクレオチドのいずれにも付けることができ、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）のコンジュゲートリンカー形成基を、もう一方に付ける。したがって、表１において形態Ｒ１−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−Ｒ２のリンカーにおいて表されるような基Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、タグおよびヌクレオチドまたはヌクレオチドおよびタグのいずれかを表すことができる。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、式（ＩＩＩ）のタグ付きマルチヌクレオチド化合物を提供し、化合物は、式Ｒ１−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−Ｒ２の化合物を含み、ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、ヌクレオチドおよびタグであるか、またはＲ１およびＲ２は、タグおよびヌクレオチドであり、−ＬＡ−Ｘ−ＬＢ−は、表１における構造式（ＩＶｃ）〜（ＸＶＩＩｃ）の部分から選択される化学部分を含む。
【００８５】
[0079]上記のように、リンカーを構成する化学部分ＬＡおよびＬＢはそれぞれ独立に、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、ベンゼン、ベンジルエーテル、フェノール、ビス−ヒドロキシエチルベンゼン、カーボネート、カルバメート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せを含む化学部分を含み得る。リンカー形成基ＸＡおよびＸＢと同様に、リンカーを構成する化学部分ＬＡおよびＬＢのいずれも、リンカー形成基のいずれかとともにそれぞれ独立に使用されてもよく、タグまたはヌクレオチドのいずれかで使用されてもよいということが考慮される。さらに、化学部分ＬＡおよびＬＢは、同一である場合も、異なる場合もあるということが考慮される。式（ＩＩＩ）のタグ付きマルチヌクレオチド化合物の一部の実施形態においては、ＬＡおよびＬＢ化学部分は、表２におけるような式（ＸＶＩＩＩａ）〜式（ＸＶＩＩＩｆ）の部分構造からなる群から独立に選択される化学部分を含む。
【００８６】
[0080]
【００８７】
【表２−１】
2019521096.tif 000015
【００８８】
【表２−２】
2019521096.tif 000016
【００８９】
[0081]化合物（ＩＩＩ）の構造式は、タグから分離される部分として形成される「−ＬＢ−Ｘ−ＬＡ−」リンカーを表すが、一部の実施形態においては、リンカーは、タグの一部を含み得るリンカー形成基との反応において形成され得るということが考慮される。例えば、タグは、オリゴヌクレオチドを含むことができ、ここで、オリゴヌクレオチドは、アジド−アルキン「クリック」反応によって所望のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）に共有結合によって連結され得るプロパルギルまたはその他のアルキニル基を用いて修飾されたモノマー単位を含む。タグの一部と考えられ得るこのプロパルギル基は、リンカー形成基（すなわち「ＸＢ」）として作用することができ、ヌクレオチドに付けられたリンカー形成基とリンカー形成反応を起こす。
【００９０】
[0082]分岐または樹状リンカー
[0083]分子部分と共有結合により連結可能な２つの反応性末端を有する広範なリンカーに加えて、本開示のタグ付きマルチヌクレオチドは、一般に、３つまたはそれ以上の反応性末端を有するリンカー部分の一種である少なくとも１つの「分岐」または「樹状」リンカーを含む。分岐または樹状リンカー部分を含むリンカーの使用は、単一タグの、２つまたはそれ以上のヌクレオチドとの共有結合連結を容易にする。本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物において使用できる、３つまたはそれ以上の反応性末端を提供可能な分岐または樹状リンカー部分は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ａｓ  ｐｏｌｙｌａｂｅｌｌｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７年、第２５巻、２２号、４４４７〜４４５４頁を参照のこと。本開示の化合物において有用な３つまたはそれ以上の反応性末端を提供する分岐または樹状リンカー部分は、ＤＮＡ合成試薬の種々のベンダー、例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｖｉｒｇｉｎｉａ，  ＵＳＡ；  ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）から市販されている。
【００９１】
[0084]したがって、一部の実施形態においては、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物（例えば、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）は、リンカーを含むことができ、ここで、リンカーは、３個以上の分子部分との共有結合による連結を形成することができる分岐部分または樹状部分を含む。
【００９２】
[0085]リンカーが分岐部分または樹状部分を含む本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物を調製するのに有用な例示的試薬は、以下に示される保護されたホスホロアミダイト試薬化合物（１９）および（２０）を含む。
【００９３】
【化７】
2019521096.tif 000017
【００９４】
[0086]化合物（１９）および（２０）の分岐または樹状ホスホロアミダイト「ダブラー」および「トレブラー」単位を、オリゴヌクレオチド鎖の末端に容易に付けて、さらなるリンカー（例えば、本明細書において別の場所に開示されるような）を含む、２つまたはそれ以上の分子部分に取り付け可能なオリゴヌクレオチドのリンカー末端を作製し、次いで、それをヌクレオチドの末端オリゴリン酸に付けることができる。したがって、天然および／または非天然モノマー単位を含むオリゴヌクレオチドを、本開示のタグ付きマルチヌクレオチドを作製するためのタグとして使用できる。
【００９５】
[0087]本開示の一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチド化合物は、分岐または樹状「ダブラー」リンカー部分を含み、以下の構造式（ＩＩＩａ）：
【００９６】
【化８】
2019521096.tif 000018
【００９７】
［式中、「塩基」は、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、２〜１２であり、リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する。
【００９８】
[0088]本開示の一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチド化合物は、分岐または樹状「トレブラー」リンカー部分を含み、以下の構造式（ＩＩＩｂ）：
【００９９】
【化９】
2019521096.tif 000019
【０１００】
［式中、「塩基」は、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、２〜１２であり、リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する。
【０１０１】
[0089]さらに、２つまたはそれ以上の分岐または樹状ホスホロアミダイト化合物（１９）の「ダブラー」単位および／または化合物（２０）の「トレブラー」単位を組み合わせて、単一分子部分（例えば、タグ）を、４、６、８、９、１２またはそれ以上のヌクレオチドと共有結合連結可能なリンカーを作製できる。したがって、本開示の一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチド化合物は、２つのダブラー単位を含む分岐または樹状四次リンカー部分を含み、以下の構造式（ＩＩＩｃ）：
【０１０２】
【化１０】
2019521096.tif 000020
【０１０３】
［式中、「塩基」は、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、２〜１２であり、リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する。
【０１０４】
[0090]構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）のタグ付きマルチヌクレオチド化合物において有用であるさまざまな化学部分を含む種々のリンカー。構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）の化合物の一部の実施形態においては、２〜１００個の原子を有するリンカーは、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルケン、直鎖（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキン、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、イミド、ベンゼン、ベンジルエーテル、フェノール、ビス−ヒドロキシエチルベンゼン、カーボネート、カルバメート、スクアレート、チアゾール、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキシム、トリアゾール、ジヒドロピリダジン、ホスホジエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組合せからなる群から選択される１以上の化学部分を含み得る。
【０１０５】
[0091]本開示の一部の実施形態においては、構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）の化合物のリンカーは、アジドリンカー形成基とアルキンリンカー形成基の間の「クリック」反応において形成されるトリアゾール基を含む。したがって、一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチド化合物は、構造式（ＩＩＩｄ）、（ＩＩＩｅ）または（ＩＩＩｆ）：
【０１０６】
【化１１−１】
2019521096.tif 000021
【０１０７】
【化１１−２】
2019521096.tif 000022
【０１０８】
［式中、「塩基」は、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基であり、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、２〜１２であり、Ｐは、２〜１０であり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有し得る。
【０１０９】
[0092]構造式（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｆ）の化合物について上記で示されるように、分岐または樹状ホスホロアミダイト化合物（１９）の「ダブラー」単位および化合物（２０）の「トレブラー」単位を容易に組み合わせて、単一分子部分  （例えば、タグ）を、４、６、８、９、１２またはそれ以上のヌクレオチドと共有結合連結可能なリンカーを作製できる。例えば、タグを、標準ホスホロアミダイト合成法によって化合物（１９）と、次いで化合物（２０）と連結して、化合物（２１）を作製することができ、これは、少なくとも６つのさらなる分子部分、例えば、６つのヌクレオチドとさらに連結可能である。
【０１１０】
【化１２】
2019521096.tif 000023
【０１１１】
[0093]化合物（１９）の３つの末端のホスホロアミダイト「ダブラー」単位はまた、１つのＤＭＴ保護基および１つのＦＭＯＣ保護基を用いて調製（または商業的に入手）できる。次いで、２つの異なる保護基を有するこの「ダブラー単位」を使用して、続いて、２つの異なる分岐または樹状単位を付けることができる。例えば、化合物（１９）の「ダブラー」単位および化合物（２０）の「トレブラー」単位を、これまでは単一タグについていたＤＭＴおよびＦｍｏｃ保護基を有する「ダブラー」単位に連続的に共有結合によって付けてもよい。このような組合せは、少なくとも５つのさらなる分子部分、例えば、５つのヌクレオチドとさらに連結可能なリンカー部分を有する単一タグを提供する。
【０１１２】
[0094]当業者ならば、化合物（１９）および（２０）の分岐または樹状ホスホロアミダイト単位またはその他のこのような分岐または樹状リンカー部分を、多数の方法で組み合わせて、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物を作製できるということを直ちに認識するであろう。
【０１１３】
[0095]タグ
[0096]本開示のタグ付きマルチヌクレオチドにおいて有用なタグは、一般に、連結される分子部分（例えば、「タグ付き」であるヌクレオチド）を直接または間接的に検出および／または同定する能力を可能にする、または増強する任意の分子部分を含み得る。例えば、本明細書において開示のタグは、立体容積または容量、帯電、電気化学電位、光学的および／または分光学的特徴などの検出可能な特性または特徴を提供する分子部分を含み得る。本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物において使用するためのタグ構造の選択は、化合物の所望の使用において検出されるべきシグナルに応じて変わり得る。
【０１１４】
[0097]一部の実施形態においては、本開示のタグ付きマルチヌクレオチドは、ポリマー構造を有するタグを含む。ポリマー構造を有するタグは、さまざまな検出可能なシグナルを可能にする、広範な容易に修飾可能な分子構造および特性を提供する。ポリマー構造を有する例示的タグとして、いずれも場合により、色素部分またはフルオロフォアなどの化学基を用いて修飾されてもよく、それらと連結されてもよい、ポリエチレングリコール、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、ペプチド核酸ポリマー、ロックド核酸ポリマーなどの天然または合成ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドのポリマー（例えば、オリゴヌクレオチド）、アミノ酸（例えば、ポリペプチド）、および／またはエチレングリコール（例えば、種々の長さのＰＥＧ）を含む、このようなポリマータグは、ナノポア検出可能なタグとして使用されており、さまざまなナノポア検出可能なシグナル（例えば、遮断電流）をもたらすとわかっている。
【０１１５】
[0098]オリゴヌクレオチドタグ
[0099]ＷＯ２０１５／１４８４０２（Ｆｕｌｌｅｒら）は、広範なオリゴヌクレオチド−タグ付きヌクレオチドおよびナノポアシーケンシングにおけるその使用を開示する。ＷＯ２０１５／１４８４０２に開示されるオリゴヌクレオチド−タグ付きヌクレオチドは、典型的には、約３０モノマー単位の範囲の長さを有する単一オリゴヌクレオチド部分に共有結合によって連結された単一ヌクレオチドを有する。開示されたオリゴヌクレオチドタグは、天然に存在するＤＮＡヌクレオチド単位ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴおよび／または広範な非天然モノマー単位を含み得る。実際、ＷＯ２０１５／１４８４０２には、１００を超える別個の、天然および／または非天然モノマー単位（すなわち、ヌクレオチド類似体またはスペーサー単位）で構成されているオリゴヌクレオチドを含むタグ構造が開示されている。本開示のタグ付きマルチヌクレオチドは、ＷＯ２０１５／１４８４０２に開示されるタグのいずれかを含み得るということが考慮される。本開示のタグ付きマルチヌクレオチドにおいて有用な多数のオリゴヌクレオチドタグを表３において以下に提供する。
【０１１６】
[00100]
【０１１７】
【表３−１】
2019521096.tif 000024
【０１１８】
【表３−２】
2019521096.tif 000025
【０１１９】
【表３−３】
2019521096.tif 000026
【０１２０】
【表３−４】
2019521096.tif 000027
【０１２１】
【表３−５】
2019521096.tif 000028
【０１２２】
[00101]本開示のタグ付きマルチヌクレオチドは、表３中に上記で開示されるタグを含み得るということが考慮される。
[00102]本明細書において記載されるように、さまざまな天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド類似体または合成スペーサーモノマー単位が入手可能であり、本開示のタグ付きマルチヌクレオチドにおいて有用なポリマー構造を有するタグの合成において使用できる。一般に、これらのタグは、アミダイトカップリング化学によってタグポリマーに容易に合成される。
【０１２３】
[0103]表４（以下）は、本開示のタグ付きマルチヌクレオチドにおいて有用なタグを合成するために使用できる、３００を超える例示的アミダイト試薬（例えば、ホスホロアミダイトまたはホスホンアミダイト）を列挙する。表４中の各アミダイト試薬は、市販されているが、数千ではないとしても数百の、公開されているヌクレオチド類似体構造を有するより多くのアミダイト試薬があり、ポリマー構造を有するタグの調製において使用するために当業者に入手可能となろう。
【０１２４】
[0104]
【０１２５】
【表４−１】
2019521096.tif 000029
【０１２６】
【表４−２】
2019521096.tif 000030
【０１２７】
【表４−３】
2019521096.tif 000031
【０１２８】
【表４−４】
2019521096.tif 000032
【０１２９】
【表４−５】
2019521096.tif 000033
【０１３０】
【表４−６】
2019521096.tif 000034
【０１３１】
【表４−７】
2019521096.tif 000035
【０１３２】
[0105]表４において上記で列挙されるアミダイト試薬を使用して、標準アミダイトカップリング化学によってポリマー構造を有するタグを調製できる。すなわち、ホスホロアミダイト（またはホスホンアミダイト）試薬のそれぞれは、ヌクレオチドポリマー（例えば、オリゴヌクレオチド）とのアミダイトカップリング反応において反応して、その特定の構造を有するモノマー単位を、ポリマーに挿入する。この得られたポリマー構造は、ポリマー中の隣接するモノマー単位とのリン酸（またはホスホネート）連結を有する。したがって、表４は、それぞれのタグを調製するために使用できる、３００を超えるモノマー単位のリストを効率的に提供する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる２０１５年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２３５，５５１号を参照のこと。次いで、このようなタグを使用して、本明細書において開示される連結化学によって本開示のタグ付きマルチヌクレオチドを製造でき、当業者に周知である。したがって、本開示は、タグ付きマルチヌクレオチド化合物（例えば、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を有する）を提供し、ここで、タグは、表４から選択されるアミダイト試薬の反応から得られる少なくとも１つのモノマー単位を有するポリマー構造を含んでいた。
【０１３３】
[0106]一般に、本明細書において開示されるタグ付きマルチヌクレオチド化合物の実施形態のいずれにおいても、タグは、少なくとも１０マー、１５マー、２０マー、２５マー、３０マー、３５マー、４０マーまたはそれ以上のモノマー単位の長さのオリゴヌクレオチドを含むことができ、場合により、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、スペーサー単位、ホスホロアミダイト反応によって形成される任意の非天然モノマー単位およびそれらの任意の組合せから選択されるモノマー単位を含む。タグがオリゴヌクレオチドを含む例示的タグ付きマルチヌクレオチド化合物は、化合物（３ａ）および化合物（３ｂ）を含む実施例において開示される化合物を含む。
【０１３４】
[0107]当業者ならば、表４に開示されるモノマー単位の一部はまた、市販のオリゴヌクレオチド合成カタログにおいて、「スペーサー」（例えば、「ｉＳｐ」）、「色素」（例えば、「ｉＣｙ３」）または「リンカー」（例えば、「ヘキシニル」）とも呼ばれるということを認識するであろう。当業者ならば、本明細書（例えば、表３および実施例）において記載されるオリゴヌクレオチドタグの一部は、周知のオリゴヌクレオチド合成命名法（例えば、よく使用されるオリゴヌクレオチド合成命名法のさらなる記載のための、ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍの統合されたＤＮＡ技術のウェブサイトを参照のこと）を使用して呼ばれるということは認識するであろう。
【０１３５】
[0108]本開示は、当業者に、広範なアッセイスキームにわたって、特に、ナノポア検出システムを用いる使用に有用な検出特徴を提供するタグを有するタグ付きマルチヌクレオチドを調製するためのツールを提供する。
【０１３６】
[0109]ポリペプチドタグ
[0110]一部の実施形態においては、本開示のタグ付きマルチヌクレオチドは、アミノ酸のポリマー、すなわち、ポリペプチドを含むタグを含み得る。ナノポアシーケンシングにおいて有用なタグ付きヌクレオチドのタグとしてのポリペプチドの使用は、参照により本明細書に組み込まれる２０１５年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２１６，６３４号に記載されている。米国特許出願第６２／２１６，６３４において開示されるポリペプチドタグは、一般に、全体的な電荷および少なくとも１つのヘリックス構造を有する３０個またはそれ以上のアミノ酸のポリマー鎖である。ポリペプチドタグのヘリックス構造は、タグ構造がナノポア中に入り、ナノポア中にあるときに、より少ない分散を示すより強い遮断電流を提供すると記載されている。１６個のアミノ酸またはより長い（例えば、１６〜８０個のアミノ酸）α−ヘリックスループなどのヘリックス構造を有するポリペプチドタグは、直鎖またはランダムコイル構造を有するポリペプチドよりも強力な電流遮断電流およびより長い滞留時間を提供するように、ナノポアの細孔中により良好に適合できると提案される。米国特許出願第６２／２１６，６３４には、さまざまな長さ、ヘリックス構造および全体的な電荷を有するアミノ酸配列を有するさまざまなポリペプチドタグが開示されている。
【０１３７】
[0111]米国特許出願第６２／２１６，６３４に開示されるようなナノポアシーケンシング実施形態における単一ポリペプチドタグを有する単一ヌクレオチドの有用性に基づいて、本明細書において開示されるタグ付きマルチヌクレオチド化合物の実施形態のいずれかにおいて、タグは、ポリペプチドを含み得るということが考慮される。タグがポリペプチドである、タグ付きマルチヌクレオチドの一部の実施形態においては、ポリペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１６個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸またはさらに多いアミノ酸である長さを有する。一部の実施形態においては、ポリペプチドの長さは、１０〜１００個のアミノ酸、１６〜９０個のアミノ酸、３０〜９０個のアミノ酸、４０〜８０個のアミノ酸または５０〜７０個のアミノ酸である。
【０１３８】
[0112]本開示の一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチドのポリペプチドタグは、ヘリックス構造を含む。ポリペプチドヘリックス構造は、ポリペプチドのアミノ酸残基のすべてまたはポリペプチドのいくつかの小部分を含み得る。したがって、タグ付きマルチヌクレオチドのポリペプチドタグの一部の実施形態においては、ポリペプチドヘリックス構造は、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１６個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸または少なくとも６０個のアミノ酸を含む。
【０１３９】
[0113]本開示の一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチドのポリペプチドタグは、α−ヘリックスを含むヘリックス構造を含む。一部の実施形態においては、α−ヘリックスは、少なくとも３個のアミノ酸を含む配列モチーフの少なくとも２つの反復を含む。場合により、少なくとも３個のアミノ酸を含む配列モチーフは、ホモポリマーであり、さらに場合により、少なくとも３個のアミノ酸を含むホモポリマー配列モチーフは、配列ＡＡＡを含む。
【０１４０】
[0114]ナノポアによるタグ付きヌクレオチドの捕獲および検出を、タグ分子の電荷によって促進することができる。一般に、ナノポア検出システムが、細孔のシス側（すなわち、ヌクレオチドおよびポリメラーゼを有するリザーバー側）が負電荷を有する電極を有し、トランス側が正電荷を有する電極を有する、交流電流（ＡＣ）または直流電流（ＤＣ）電位下で設定される場合には、タグ付きヌクレオチドのタグが負電荷を有することが好ましい。このような条件下で、負電荷を有するタグの捕獲および検出を、トランス側の正の電極によって提供される起電力によって促進することができる。あるいは、正電荷を有するタグは、一般に、ナノポアシステムのトランス側が負の電極を含む条件下が好ましい。
【０１４１】
[0115]本開示は、ポリペプチドタグを含むタグ付きマルチヌクレオチドを提供し、ポリペプチドは、３０個以上のアミノ酸および全体的な電荷を有する。全体的な電荷は、ポリペプチドを構成するアミノ酸側鎖のそれぞれの電荷を合計することに基づく全ポリペプチドのその正味電荷である。ポリペプチド配列中に組み込むことができる多種多様な荷電アミノ酸残基が利用可能であるので、広範な可能性あるナノポア検出特徴を見越して、本開示のポリペプチドタグの全体的な電荷を広範囲にわたって容易に調節（または調整）することができる。
【０１４２】
[0116]一部の実施形態においては、本開示は、タグ付きマルチヌクレオチドを提供し、ポリペプチドの全体的な電荷は負である。一部の実施形態においては、ポリペプチドの全体的な電荷は、約−１０から−３０の間である。ポリペプチドの全体的な電荷が負である実施形態では、ポリペプチド配列は、１個または複数の負電荷を有するアミノ酸残基を含むことができ、負電荷を有する残基は、同一である場合も異なっている場合もある。例えば、−１０の全体的な電荷を有するポリペプチドタグの場合には、ポリペプチド配列は、少なくとも１０個の負電荷を有する残基を含むことを必要とする。一部の実施形態においては、負電荷を有する残基は、グルタミン酸、アスパラギン酸、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシンおよびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１４３】
[0117]あるいは、タグがポリペプチドを含むタグ付きマルチヌクレオチドの一部の実施形態においては、ポリペプチドの全体的な電荷は、正であり、場合により、約＋１０から＋３０の間の全体的な電荷を有する。このような実施形態においては、ポリペプチド配列は、場合により、アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる群から選択される、１個または複数の正電荷を有するアミノ酸残基を含み得る。一部の実施形態においては、ポリペプチドタグの全体的な電荷を、タグの長さにわたって均等に分配できるということが考慮される。しかし、一部の実施形態においては、ポリペプチドタグの全体的な電荷を、ポリペプチド配列の長さにわたって不均等に分配することができる。このような不均等な電荷分布は、例えば、ＡＣまたはＤＣ電位のいずれかのナノポア検出条件下で、さらなる識別特徴を有するタグを提供し得る。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、タグがポリペプチドを含むタグ付きマルチヌクレオチドを提供し、リンカーから遠位の（すなわち、遠い）ポリペプチドタグの末端に位置するアミノ酸残基の２５％は、リンカーに近位の（すなわち、近い）ポリペプチドの末端に位置するアミノ酸残基の２５％の正味電荷絶対値よりも大きい正味電荷絶対値を有する。すなわち、全体的な電荷が負である場合には、リンカーから遠位のアミノ酸残基の２５％は、リンカーに近位のアミノ酸残基の２５％よりも多い負電荷を有する。
【０１４４】
[0118]アミノ酸残基、電荷、長さ、容量および質量特徴に関する当技術分野における知識ならびにポリペプチド配列に重合された場合に特定の種類の構造を形成するその公知の性質（例えば、α−ヘリックス形成傾向）を利用し、タグ付きマルチヌクレオチド化合物およびその使用に関する本開示に従って、さまざまな検出可能なシグナル、特に、ナノポア検出可能なシグナルを提供し得るポリペプチドを含むさまざまなタグを設計することが可能である。表５は、本開示のタグ付きマルチヌクレオチドにおいて使用できる例示的ポリペプチドタグを示す。
【０１４５】
[0119]
【０１４６】
【表５】
2019521096.tif 000036
【０１４７】
[0120]表５に示される例示的ポリペプチドタグは、天然および／または非天然アミノ酸モノマーを含み、標準固相ポリペプチド合成法によって調製できる。さらに、これらのポリペプチドタグ（最大８０個のアミノ酸の実質的に任意の他のポリペプチド配列）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ２．０（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ）またはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）のようなカスタムペプチドベンダーから市販されている。
【０１４８】
[0121]タグ付きマルチヌクレオチド化合物を調製する方法
[0122]本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物の調製において標準合成法を使用できる（例えば、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）の化合物）。標準アジドアルキンクリック反応を、上記で（例えば、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、（ＸＸＩ）または（ＸＸＩＩ）の化合物）および実施例において記載している。表１および２は、本開示のタグ付きマルチヌクレオチドの調製において使用できる、さまざまなリンカーおよびリンカー形成基反応を例示する。一実施形態では、表１に示される構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）のリンカー形成基のいずれも、タグに付けられた分岐もしくは樹状リンカーに、またはヌクレオチドの末端リン酸に付けることができ、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の対応するコンジュゲートリンカー形成基をもう一方に付ける。マルチヌクレオチド−オリゴリン酸−リンカー−タグ化合物を形成する得られる共有結合リンカー構造を、構造式（ＩＶｃ）〜（ＸＶＩＩｃ）によって表１に例示する。共有結合連結構造は、トランス−シクロオクテン（ＸＶＩＩａ）およびテトラジン（ＸＶＩＩｂ）リンカー形成基のクリック反応に起因するジヒドロピラジジン基構造（ＸＶＩＩｃ）を含む。
【０１４９】
[0123]したがって、本開示は、タグ付きマルチヌクレオチドを調製する方法であって、（ａ）（ｉ）５’位に３〜１２個のリン酸が付けられ、末端リン酸が第１のリンカー形成基（例えば、ＸＡまたはＸＢ）と連結されたヌクレオチドおよび（ｉｉ）第１のリンカー形成基と反応して、リンカー（例えば、−Ｘ−）を形成することが可能である少なくとも２つの第２のリンカー形成基（例えば、ＸＢまたはＸＡ）を含む分岐または樹状リンカーに連結されたタグを提供するステップと、（ｂ）第１のリンカー形成基を、分岐または樹状上リンカー上の２つの第２のリンカー形成基と反応させて、少なくとも２つのヌクレオチドを単一タグを連結するステップとを含む方法を提供する。反応してリンカーを形成することが可能である第１および第２のリンカー形成基は、上記の表１に例示されている。したがって、当該方法の一部の実施形態においては、第１のリンカー形成基は、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の対応する反応性化合物であるか、あるいは、第１のリンカー形成基が、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の化合物から選択され得、第２のリンカー形成基が、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の対応する反応性化合物である。分岐または樹状リンカー構造は、化合物（１９）または（２０）のダブラーまたはトレブラーリンカー単位を使用して作製できる。一部の実施形態においては、ダブラーまたはトレブラーリンカー単位は、連続的に連結して、４つまたはそれ以上の利用可能な反応性リンカー形成基を有する（例えば、化合物（２１）におけるような）分岐または樹状リンカーを作製できる。
【０１５０】
[0124]一部の実施形態においては、本開示は、構造式（ＩＩ）
【０１５１】
【化１３】
2019521096.tif 000037
【０１５２】
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
で示されるタグ付きマルチヌクレオチド化合物を調製する方法を提供し、方法は、
（ａ）（ｉ）５’位に３〜１２個のリン酸が付けられ、末端リン酸が第１のリンカー形成基と連結されたヌクレオチドおよび（ｉｉ）検出可能なシグナルを生成することができる分子部分を含み、それぞれ第１のリンカー形成基を反応して、少なくとも２つのヌクレオチドと単一タグの間に共有結合リンカーを形成することが可能である、少なくとも２つの第２のリンカー形成基を含む分岐または樹状リンカーに連結されたタグを提供するステップであって
（１）第１のリンカー形成基は、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基は、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の対応する反応性化合物であるか、または
（２）第１のリンカー形成基は、構造式（ＩＶｂ）〜（ＸＶＩＩｂ）の化合物から選択され、第２のリンカー形成基は、構造式（ＩＶａ）〜（ＸＶＩＩａ）の対応する反応性化合物であるステップと、
（ｂ）第１のリンカー形成基を、第２のリンカー形成基と反応させ、それによって、少なくとも２つのヌクレオチドと単一タグの間に共有結合連結を形成するステップと
を含む。
【０１５３】
[0125]タグ付きマルチヌクレオチド化合物を調製する方法の一部の実施形態においては、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、アジド基であり、タグに付けられた分岐または樹状リンカーに付けられた第２のリンカー形成基は、アルキンである。他の実施形態では、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、アルキン基であり、タグに付けられた分岐または樹状リンカーに付けられた第２のリンカー形成基は、アジドである。
【０１５４】
[0126]タグ付きマルチヌクレオチドを調製する方法の一部の実施形態においては、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、テトラジンであり、タグに付けられた分岐または樹状リンカーに付けられた第２のリンカー形成基は、トランス−シクロオクテンである。他の実施形態においては、末端リン酸に付けられた第１のリンカー形成基は、トランス−シクロオクテンであり、タグに付けられた第２のリンカー形成基は、テトラジンである。
【０１５５】
[0127]ナノポアシーケンシングにおけるタグ付きマルチヌクレオチドの使用
[0128]本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、既知ナノポアシーケンシング法において使用でき、これでは、ナノポアが、相補的ヌクレオチドに付けられたタグの存在を、ナノポアの近位に位置し、標的核酸配列に相補的なプライマーを延長する鎖延長酵素（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ）によってそれが組み込まれるときに（または組み込まれ、放出された後に）検出する。タグ付きヌクレオチドを使用してナノポアシーケンシングを実施するための一般的な方法、材料、デバイスおよびシステムは、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０  Ａ１号、同第２０１３／０２６４２０７  Ａ１号、同第２０１４／０１３４６１６  Ａ１号、同第２０１５／０１１９２５９  Ａ１号および２０１５年３月２３日に出願された米国特許出願第１４／６６６，１２４号に記載されており、それらのそれぞれは、本明細書において参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。核酸のナノポアシーケンシングのためにタグ付きヌクレオチドを使用するために、これらの一般的な方法において、本開示のタグ付きマルチヌクレオチドを使用できる。実際、本明細書において実施例において例示されるように、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、対応する単一ヌクレオチド−単一タグ化合物よりも、ナノポアシーケンシングにおいてより迅速な、より長い、より正確な配列リードを提供するポリメラーゼ基質として特徴を改善した。
【０１５６】
[0129]したがって、一実施形態では、本開示は、核酸の配列を決定する方法であって、（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を通って延在するナノポア、両電極と接触する電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼよびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含むナノポアシーケンシング組成物を用意するステップと、（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖および（ｉｉ）それぞれ異なるタグを有するタグ付きマルチヌクレオチドのセットであって、異なるタグがそれぞれ、タグがナノポア中に位置付けられると電極にわたる異なる遮断電流レベルを引き起こし、セットが、構造式（Ｉ）
［Ｎ−Ｐ−Ｌ］ｍ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎは、ヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分の数を示し、Ｔは、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分に共有結合によって付けられたタグであり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］で示される少なくとも１種の化合物を含むセットと接触させるステップと、（ｄ）電極にわたる電流レベルを継時的に検出することおよび核酸配列に相補的であるポリメラーゼによって組み込まれる異なるタグ付きマルチヌクレオチドのそれぞれに関連付け、それによって、核酸配列を決定するステップとを含む方法を提供する。
【０１５７】
[0130]核酸の配列を決定する方法の一部の実施形態においては、それぞれ異なるタグを有するタグ付きマルチヌクレオチドのセットは、式（ＩＩ）：
【０１５８】
【化１４】
2019521096.tif 000038
【０１５９】
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
で示される構造を含む少なくとも１種の化合物を含む。
【０１６０】
[0131]核酸の配列を決定する方法において使用される場合には、式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造を含むタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、本明細書において別の場所で開示される化合物実施形態の範囲のいずれかを含み得る。例えば、式（Ｉ）のヌクレオシド（Ｎ）は、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素によって組み込まれることが可能な任意のヌクレオシドであり得、ヌクレオシドが、三リン酸などのオリゴリン酸（Ｐ）に共有結合によって連結される場合には、ヌクレオシドは、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基およびリボースまたはデオキシリボース基などの天然に存在するまたは天然に存在しない糖部分を含み得る。
【０１６１】
[0132]タグ付きマルチヌクレオチドのセット
[0133]本明細書において別の場所に記載されるように、ナノポア検出を使用して核酸の配列を決定する方法は、一般に、それぞれ鎖延長酵素の基質となることができ、それぞれ検出されることが望まれるヌクレオチドと会合された異なるタグを含むタグ付きヌクレオチド化合物のセット必要とする。ＤＮＡ鎖をシーケンシングするための標準実施形態では、本方法は、少なくとも４種の標準デオキシ−ヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴのセットを必要とし、異なるヌクレオチドはそれぞれ、ヌクレオチドが近位の鎖延長酵素によって組み込まれるときに検出されることが可能である異なる単一タグに付けられ、さらに、タグの検出は、他の３種のタグそれぞれのナノポア検出から識別可能であり、それによって、酵素によって組み込まれる特定のヌクレオチドの同定が可能となる。一般に、セット中の異なるタグ付きヌクレオチドのそれぞれは、タグが鎖延長酵素によって新規相補鎖中に組み込まれるときに生成するそれぞれの検出可能なシグナルによって識別される。
【０１６２】
[0134]タグ付きマルチヌクレオチドを識別するために使用できる、単独または組み合わせたナノポア検出可能信号特徴の中でも、ナノポア検出システムの電極にわたる（ＤＣまたはＡＣ電位のいずれかの下での）遮断電流レベルおよび遮断電流の滞留時間が挙げられる。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、それぞれ異なるタグを有するタグ付きマルチヌクレオチドのセットを提供し、異なるタグはそれぞれ、ナノポア中に位置付けられると電極にわたる異なる遮断電流レベルおよび／または異なる滞留時間を引き起こし、セットは、構造式（Ｉ）
［Ｎ−Ｐ−Ｌ］Ｍ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、Ｎは、ヌクレオシドであり、Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分の数を示し、Ｔは、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分に共有結合によって付けられたタグであり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
で示される少なくとも１種の化合物を含む。
【０１６３】
[0135]それぞれ異なるタグを有するタグ付きマルチヌクレオチドのセットの一部の実施形態においては、セットは、式（ＩＩ）：
【０１６４】
【化１５】
2019521096.tif 000039
【０１６５】
［式中、塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、ｎは、１〜４であり、リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、ｍは、２〜１２であり、タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
で示される構造を含む少なくとも１種の化合物を含む。
【０１６６】
[0136]本開示のタグ付きマルチヌクレオチドは、タグ付き単一ヌクレオチドも含むタグ付きヌクレオチドのセットならびに／またはオリゴヌクレオチドタグおよびポリペプチドタグの両方などの異なる種類のタグを有するタグ付きヌクレオチドを有するセットにおいて使用され得るということが考慮される。例えば、一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチドのセットは、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）のタグ付きマルチヌクレオチドを含み得、セット中の他のタグ付きヌクレオチドは、単一タグに付けられた単一ヌクレオチドを含み得る。あるいは、タグ付きマルチヌクレオチドのセットは、オリゴヌクレオチドタグ、ポリペプチドタグ、ポリエチレングリコールタグ、炭水化物タグおよび／または色素化合物タグなどのさまざまなタグ構造を含み得る。ナノポアシーケンシングにとって有用なオリゴヌクレオチド−タグ付きヌクレオチドのセットは、当技術分野で公知であり、これらのタグは、本明細書において開示されるタグ付きマルチヌクレオチド実施形態において使用され得る（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号、同第２０１３／０２６４２０７Ａ１号、同第２０１４／０１３４６１６Ａ１号、同第２０１５／０１１９２５９Ａ１号および２０１５年３月２３日に出願された米国特許出願第１４／６６６，１２４号を参照のこと）。
【０１６７】
[0137]一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチドのセットは、構造式（Ｉ）または構造式（ＩＩ）の少なくとも２種、少なくとも３種または少なくとも４種のタグ付きマルチヌクレオチド化合物を含み、ここで、セット中のタグ付きマルチヌクレオチド化合物の少なくとも２種、少なくとも３種または少なくとも４種の異なるタグのそれぞれは、セット中の他のものから識別可能であるナノポア検出可能なシグナルを生成する。遮断電流および／または滞留時間などのナノポア検出可能なシグナル特徴を決定する方法および技術は、当技術分野で公知である（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号、同第２０１３／０２６４２０７Ａ１号、同第２０１４／０１３４６１６Ａ１号、同第２０１５／０１１９２５９Ａ１号および２０１５年３月２３日に出願された米国特許出願第１４／６６６，１２４号を参照のこと）。このような方法は、本明細書において実施例に記載されるようなナノポアアレイを使用するＡＣ電位下でのナノポアシーケンシング実験を含む。
【０１６８】
[0138]したがって、一部の実施形態においては、本開示は、それぞれ異なるタグを有する少なくとも２種の異なるタグ付きマルチヌクレオチドを含むタグ付きマルチヌクレオチドのセットを提供し、少なくとも２種の異なるタグは、識別可能な遮断電流レベルおよび／または  滞留時間を示す。タグ付きマルチヌクレオチドのセットの一部の実施形態においては、少なくとも２種の異なるタグ付きマルチヌクレオチドは、構造（Ｉ）または構造（ＩＩ）の化合物を含む。一部の実施形態においては、少なくとも２種の異なるタグ付きマルチヌクレオチドはそれぞれ、表３から選択される異なるオリゴヌクレオチドタグ構造および／または配列番号１〜１０９から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態においては、少なくとも２種の異なるタグは、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または少なくとも７５％異なる遮断電流レベルを示す。遮断電流レベル間の相違の測定は、任意の適したナノポア検出法を使用して行うことができる。例えば、遮断それぞれ異なるオリゴヌクレオチドタグを有する少なくとも２種の異なるタグ付きマルチヌクレオチドのそれぞれの遮断電流は、本明細書において実施例において全般的に記載されるように、ナノポアシーケンシング実験において測定できる。
【０１６９】
[0139]ナノポアデバイス
[0140]ナノポアデバイスおよびそれを作製し、タグ付きヌクレオチドを使用するナノポアシーケンシングなどのナノポア検出適用において使用する方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第７，００５，２６４Ｂ２号、同第７，８４６，７３８号、同第６，６１７，１１３号、同第６，７４６，５９４号、同第６，６７３，６１５号、同第６，６２７，０６７号、同第６，４６４，８４２号、同第６，３６２，００２号、同第６，２６７，８７２号、同第６，０１５，７１４号、同第５，７９５，７８２号および米国特許出願公開第２０１５／０１１９２５９号、同第２０１４／０１３４６１６号、同第２０１３／０２６４２０７号、同第２０１３／０２４４３４０号、同第２００４／０１２１５２５号および同第２００３／０１０４４２８号を参照のこと、それらのそれぞれは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）。ナノポア検出を測定するのに有用なナノポアデバイスもまた、本明細書において開示される実施例において記載する。一般に、ナノポアデバイスはすべて、脂質二重膜中に埋め込まれた細孔形成性タンパク質を含み、膜は、ウェルまたはリザーバーを含む固体基板に固定化される、または付けられる。ナノポアの細孔は、膜を通って延在し、膜のシス側とトランス側の間の流体連絡を作り上げる。典型的には、固体基板は、ポリマー、ガラス、シリコンおよびそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む。さらに、固体基板は、ナノポアに隣接する、センサー、検出回路または検出回路に連結された電極、場合により、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路を含む。典型的には、ＤＣまたはＡＣ電位が、膜にわたって設定されることを可能にする膜のシスおよびトランス側の電極があり、これが、ナノポアの細孔を通るベースライン電流（または開口電流レベル）を生成する。本開示のタグ付きマルチヌクレオチドのタグなどのタグの存在は、この電流の遮断をもたらし、それによって、測定できる開口電流に対する遮断電流レベルを生成する。
【０１７０】
[0141]本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物を、天然に存在する、および天然に存在しない（例えば、操作された、または組換え）細孔形成性タンパク質の両方によって作製されたナノポアを含む広範囲のナノポアデバイスとともに使用できることが考慮される。本開示のタグ付きマルチヌクレオチドのナノポア検出にとって有用なナノポアを作製するために使用できる広範な細孔形成性タンパク質は、当技術分野で公知である。代表的な細孔形成性タンパク質として、α−溶血素、β−溶血素、γ−溶血素、アエロリジン、溶血毒、ロイコシジン、メリチン、ＭｓｐＡポリンおよびポリンＡが挙げられるが、これらに限定されない。細孔形成性タンパク質、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のα−溶血素（本明細書において、「α−ＨＬ」とも呼ばれる）は、細孔形成性タンパク質のクラスの最も研究されたメンバーのうち１種であり、ナノポアデバイスの作製において広範に使用されてきた。（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１１９２５９号、同第２０１４／０１３４６１６号、同第２０１３／０２６４２０７号および同第２０１３／０２４４３４０号を参照のこと）。α−ＨＬもまた、配列決定され、クローニングされ、部位特異的突然変異誘発および化学標識を含む広範な技術を使用して構造的および機能的に広く特性決定されている（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１）およびそれに引用される参考文献を参照のこと）。α−ＨＬモノマーの七量体複合体は、脂質二重膜中に埋め込まれ、脂質二重膜を通って細孔を作製するナノポアを自発的に形成する。６：１天然α−ＨＬ対変異体α−ＨＬの比を含むα−ＨＬの七量体は、ナノポアを形成できることがわかっている（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１）およびそれに引用される参考文献のこと）。さらに、α−ＨＬは、多数の位置でシステイン残基置換が挿入されて操作されており、マレイミドリンカー化学（同書）によるタンパク質の共有結合修飾が可能となっている。例えば、操作されたα−溶血素−Ｃ４６（「α−ＨＬ−Ｃ４６」）は、一般的なクリック反応化学を使用して、ポリメラーゼなどの鎖延長酵素を共有結合によって付けるために使用できるリンカーを用いる修飾を可能にする、Ｋ４６Ｃアミノ酸残基置換を含む。あるいは、α−ＨＬ七量体を、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇコンジュゲーション法を使用してＤＮＡ−ポリメラーゼを用いて共有結合によって修飾できる。
【０１７１】
[0142]したがって、一部の実施形態においては、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド組成物は、ナノポアデバイスとともに使用でき、ナノポアは、６：１天然α−ＨＬ対α−ＨＬの修飾されたまたは操作されたものを有し、修飾されたα−ＨＬが、ＤＮＡポリメラーゼなどの鎖延長酵素に共有結合によってコンジュゲートされる七量体α−ＨＬ複合体を含む。例えば、操作されたα−ＨＬ−Ｃ４６を、ＤＮＡポリメラーゼのＢｓｔ２．０バリアントを、七量体６：１ナノポアに共有結合によって付けるために、テトラジン−トランス−シクロオクテンクリック化学の使用を可能にするリンカーを用いて修飾できる。このような実施形態は、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年３月９日に出願された米国特許仮出願第６２／１３０，３２６号に記載されている。
【０１７２】
[0143]本明細書において提供されるタグ付きマルチヌクレオチドおよび関連する方法は、当技術分野で公知であるポリメラーゼおよびリガーゼなどの広範な鎖延長酵素とともに使用できる。
【０１７３】
[0144]ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型として一本鎖ＤＮＡを使用して、相補的ＤＮＡ鎖を合成する酵素のファミリーである。ＤＮＡポリメラーゼは、新規に形成する鎖の３’末端に遊離ヌクレオチドを付加して、５’から３’方向への新規鎖の延長をもたらす。ほとんどのＤＮＡポリメラーゼはまた、エキソヌクレアーゼ活性も有する。例えば、多数のＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。このような多機能性ＤＮＡポリメラーゼは、不正確に組み込まれたヌクレオチドを認識し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を使用して、不正確なヌクレオチドを切り出すことができる、プルーフリーディングとして知られる活性。ヌクレオチド切り出し後、ポリメラーゼは、正確なヌクレオチドを再挿入でき、鎖延長を継続できる。いくつかのＤＮＡポリメラーゼはまた、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も有する。
【０１７４】
[0145]ＤＮＡポリメラーゼは、ナノポアベースの合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を含む多数のＤＮＡシーケンシング技術において使用される。しかし、ＤＮＡ鎖は、ナノポアを通って迅速に移動することができ（例えば、１塩基あたり１〜５μｓの速度で）、これは、ポリメラーゼによって触媒される各組込み事象のナノポア検出を測定することを困難にすることがあり、高いバックグラウンドノイズを生じやすく、その結果、単一ヌクレオチド分離を得ることが困難になることがある。ＤＮＡポリメラーゼ活性の速度を制御する能力ならびに正しい組込みから得られた検出可能なシグナルを増大する能力は、合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の際に、特に、ナノポア検出を使用する場合に重要である。実施例において示されるように、本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、より正確な効率的な核酸検出およびシーケンシングを可能にする、処理能力、トランジション速度およびリード長などのＤＮＡポリメラーゼ活性のパラメータを制御する能力を提供する。
【０１７５】
[0146]本開示のタグ付きマルチヌクレオチド化合物および方法とともに使用してもよい例示的ポリメラーゼとして、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．７の酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．６またはＥＣ２．７．７．４８の酵素）、逆転写酵素（例えば、クラスＥＣ２．７．７．４９の酵素）およびＤＮＡリガーゼ（例えば、クラスＥＣ６．５．１．１の酵素）などの核酸ポリメラーゼが挙げられる。
【０１７６】
[0147]一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチドとともに有用なポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＥｑｕｅｎａｓｅ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎポリメラーゼ（エキソ−）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９ＶまたはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ）である。
【０１７７】
[0148]一部の実施形態においては、タグ付きマルチヌクレオチドを組み込む鎖延長酵素は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態においては、Ｂ．ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼの大断片。一実施形態においては、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ  ２．０（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡから市販されている）である。
【０１７８】
[0149]一部の実施形態においては、ポリメラーゼは、Ｐｏｌ６  ＤＮＡポリメラーゼまたは変異Ｄ４４Ａを有するＰｏｌ６などのＰｏｌ６のエキソヌクレアーゼ欠損バリアントである。本開示のタグ付きマルチヌクレオチドとともに有用なさまざまなさらなるＰｏｌ６バリアントは、参照により本明細書に組み込まれる２０１６年５月１０日に出願された米国特許出願第１５／１５１，２６４号に記載されている。
【実施例】
【０１７９】
[0150]本開示の種々の特徴および実施形態を以下の代表的な例において例示するが、これらは、例示であるよう意図され、制限ではない。当業者ならば、具体例は単に、以下の特許請求の範囲において、より十分に記載するような本発明の例示であることを容易に理解するであろう。本出願に記載されるどの実施形態および特徴も、含有されるどの実施形態とも互換可能であり、結合可能であると理解されなければならない。
【０１８０】
実施例１
タグ付きマルチヌクレオチド化合物の調製
[0151]この実施例は、構造式（Ｉ）または（ＩＩ）のタグ付きマルチヌクレオチドの調製のための一般的な方法を例示し、化合物は、表３に列挙されるようなオリゴヌクレオチドタグ構造などの、および／または配列番号１〜１０９の配列を含む、ポリマー構造を有する単一タグに連結された２または３種のヌクレオチドを含む。一般に、プロパルギル基または他のアルキン部分を用いて修飾できる任意のタグ。
【０１８１】
[0152]この実施例は、以下に示される化合物（３ａ）および（３ｂ）に対応する［ｄＴ６Ｐ−リンカー］２−（ｄＴ）３０−Ｃ３および［ｄＴ６Ｐ−リンカー］３−（ｄＴ）３０−Ｃ３の調製を記載する。
【０１８２】
【化１６】
2019521096.tif 000040
【０１８３】
[0153]化合物（３ａ）および（３ｂ）のタグ付きマルチヌクレオチドを、それぞれ、化合物（２ａ）または（２ｂ）
【０１８４】
【化１７】
2019521096.tif 000041
【０１８５】
として示される単一ｄＴ３０オリゴヌクレオチドタグに付けられたプロパルギル修飾「ダブラー」または「トレブラー」リンカーと、化合物（１）：
【０１８６】
【化１８】
2019521096.tif 000042
【０１８７】
のアジドリンカー修飾ヌクレオシド六リン酸、ｄＴ６Ｐ−（ＣＨ２）１１−Ｎ３の間のアジド−アルキンクリック反応によって合成する。
[0154]Ａ．合成ｄＴ６Ｐ−アジド（化合物（１））
[0155]１１−アジド−１−ウンデカノールの調製：１１−アジド−１−ウンデカノールを、以下の反応スキームおよび手順に従って調製する：
【０１８８】
【化１９】
2019521096.tif 000043
【０１８９】
[0156]乾燥丸底フラスコ中で、無水ＤＭＦ（４０ｍｌ）中の１１−ブロモ−１−ウンデカノール（１．８４ｇ、７．３８ｍｍｏｌ）の溶液にナトリウムアジド（１．４４ｇ、２２ｍｍ）を添加した。得られた白色懸濁液を、窒素雰囲気下、周囲温度で一晩撹拌した。懸濁液を濾過し、ＤＣＭ（５０ｍｌ）を用いてすすいだ。溶液を真空濃縮すると、黄色を帯びたオイルが得られた。化合物は、さらなる精製を用いずに、以後のステップにおいて使用できる。
【０１９０】
[0157]１１−アジド−１−ウンデカニル三リン酸の調製：１１−アジド−１−ウンデカニル三リン酸を、以下の反応スキームおよび手順に従って調製する：
【０１９１】
【化２０】
2019521096.tif 000044
【０１９２】
[0158]乾燥丸底フラスコ中で、１１−アジド−１−ウンデカノール（０．２０ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（２．０ｍｌ）中に溶解した。サリチルクロロホスファイト（０．２０ｇ、１．０３ｍｍｏｌ）を一度に添加した。得られた溶液を、周囲温度で、窒素下、４５分間撹拌した。別のフラスコ中で、無水ＤＭＦ中のピロホスフェートトリブチルアミン（０．５６６、１．０３ｍｍｏｌ）およびトリブチルアミン（１．３９ｇ、７．５１ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、次いで、反応溶液に添加した。得られた混合物を１時間撹拌し、２０ｍｍヨウ素溶液（８０ｍｌ、１．５５ｍｍｏｌ）を用いて酸化させると、環状メタ三リン酸中間体が得られ、これは質量分析計によって解析できた。さらに１時間撹拌した後、反応を、まずＮａ２ＳＯ３（１０％、４ｍｌ）を用いてクエンチし、２０分間撹拌したままにし、ＴＥＡＢ（０．１０ｍ、２０ｍｌ）を続けた。得られた混合物を、周囲温度で一晩撹拌した。粗生成物を、ＣＨ３ＣＮ／０．１ＴＥＡＡ（１６分で０％〜５０％  ＣＨ３ＣＮ）を用いて溶出する３０ｇのＨＰ  Ｃ１８カラムを使用するＴｅｌｅＤｙｎｅ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  ＲＦ＋カラムシステムによって精製した。生成物を真空濃縮し、凍結乾燥機で乾燥した。
【０１９３】
[0159]ｄＴ６Ｐ−アジド（化合物（１））の調製：ｄＴ６Ｐ−アジドを、以下の反応スキームおよび手順に従って調製する：
【０１９４】
【化２１】
2019521096.tif 000045
【０１９５】
[0160]１１−アジド−１−ウンデカニル三リン酸（０．０９１ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶解し、カルボニルジイミダゾール（「ＣＤＩ」）（０．０７８ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を用いて周囲温度で４時間活性化した。過剰のＣＤＩを、メタノール（０．０２９ｍｌ、０．７２ｍｍｏｌ）を用いてクエンチし、さらに３０分撹拌した。次いで、無水ＤＭＦ（２．０ｍｌ）中のｄＴＴＰ＋３Ｂｕ４Ｎ（０．２０ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、ＭｇＣｌ２（０．１１４ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）を続けた。得られたスラリー溶液を、周囲温度で２４〜３６時間撹拌した。反応を、ＴＥＡＢ  ０．１ｍ（２０ｍｌ）を用いてクエンチし、３０分撹拌した。粗化合物（１）を、イオン交換クロマトグラフィー（３０分で０．１Ｍ〜１Ｍ）によって、続いてＲＰ−Ｃ１８  ＨＰＬＣ（３５分で１０〜４５％  ＣＨ３ＣＮ）によって精製すると、１５〜３０μｍｏｌの生成物が得られた。化合物（１）の形成は、質量分析（陰イオンについて、理論値９１７．０６、実測値９１６．０３）によって確認した。
【０１９６】
[0161]Ｂ．プロパルギル修飾ダブラーおよびトレブラーリンカー（化合物（２ａ）および（２ｂ））を用いるｄＴ３０タグの合成
[0162]タグとして使用されるｄＴ３０オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ  ３９００  ＤＮＡシンセサイザーで標準固相ホスホロアミダイト化学プロトコールおよび市販の試薬を使用して合成した。最後から２番目の合成ステップにおける、化合物（１９）のダブラーリンカーホスホロアミダイト単位または化合物（２０）のトレブラーリンカーホスホロアミダイト。
【０１９７】
【化２２】
2019521096.tif 000046
【０１９８】
[0163]次いで、最後の自動オリゴヌクレオチド合成ステップにおいて、プロパルギル−Ｃ５−ホスホロアミダイトリンカーを添加し、その結果、それぞれ、化合物（２ａ）および（２ｂ）のプロパルギル修飾ダブラーおよびトレブラー試薬が得られた。
【０１９９】
[0164]Ｃ．化合物（３ａ）および化合物（３ｂ）のタグ付きマルチヌクレオチドを形成するための、ヌクレオチドの、ダブラーまたはトレブラーリンカーを用いるタグとのクリックコンジュゲーション
[0165]ダブラーリンカーコンジュゲーション：タグ付きマルチヌクレオチド化合物（３ａ）とのダブラー−リンカーコンジュゲーション反応を、図１に表わされる一般的な反応スキームおよび以下の手順に従って実施する。ｄＴ６Ｐ−アジド（化合物（１））（３００ｎｍｏｌ）およびダブラー−ｄＴ３０（化合物（２ａ））（１００ｎｍｏｌ）を、ＤＩ−水（１００μｌ）中に混合した。ＤＭＳＯ／ｔ−ブタノール（３：１）の混合物溶液中で臭化Ｃｕ（Ｉ）（６０００ｎｍｏｌ）およびＴＨＰＴＡ（４０００ｎｍｏｌ）を使用する標準文献手順に従って、銅触媒されたアジド−アルキンクリック反応によってコンジュゲーションを開始した。反応溶液を、シェーカー上で周囲温度で一晩混合した。粗混合物を、ＲＰ  Ｃ１８−ＨＰＬＣ（０．１Ｍ  ＴＥＡＡ／ＣＨ３ＣＮ）によって精製した。化合物（３ａ）の所望のコンジュゲート生成物の形成は、質量分析計によって確認した（陰イオンについて、理論値１１７０８、実測値１１７０８．９７）。
【０２００】
[0166]トレブラーリンカーコンジュゲーション：タグ付きマルチヌクレオチド化合物（３ｂ）とのトレブラー−リンカーコンジュゲーション反応を、図２に表わされる一般的な反応スキームおよびダブラー−リンカーコンジュゲーションに使用されたものと同様の以下の手順に従って実施する。ｄＴ６Ｐ−アジド（化合物（１））（４５０ｎｍｏｌ）およびトレブラー−ｄＴ３０（化合物（２ｂ））（１００ｎｍｏｌ）を、ＤＩ−水（１００μｌ）中に混合した。臭化Ｃｕ（Ｉ）（６０００ｎｍｏｌ）およびＴＨＰＴＡ（４０００ｎｍｏｌ）を使用して、コンジュゲーションを開始し、シェーカー上で４０Ｃの温度で一晩混合する。粗混合物を、ＨＰＬＣによって精製し、化合物（３ａ）の所望のコンジュゲート生成物の形成は、質量分析計によって確認する（陰イオンについて、理論値１２８０４．７、実測値１２８０６．６２）。
【０２０１】
実施例２
タグ付きマルチヌクレオチドの比較ポリメラーゼ基質特徴
[0167]この実施例は、単一ヌクレオチドに連結された単一オリゴヌクレオチドタグを有する標準タグ付きヌクレオチド化合物に対する、単一タグに連結された２つまたは３つのヌクレオチドを含むタグ付きマルチヌクレオチド化合物の改善されたポリメラーゼ基質特徴を例示する。
【０２０２】
[0168]アッセイプロトコール：アッセイは、Ｃｙ５標識置換鋳型およびＢＨＱ標識クエンチャープライマーと一緒に、Ｐｏｌ６ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠損バリアント（例えば、Ｄ４４Ａ変異を有するバリアントである「Ｐｏｌ６−４４  Ｄ４４Ａ」）を使用する置換アッセイである。参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年５月１０日に出願された米国特許出願第１５／１５１，２６４号において開示されるＰｏｌ６バリアントなどの、ナノポアシーケンシングにとって有用なさまざまなさらなるＰｏｌ６バリアントが入手可能であり、この実施例のアッセイにおいて使用できる。７５ｍｍグルタミン酸カリウム（「Ｋ−Ｇｌｕ」）中に、Ｐｏｌ６ポリメラーゼ、５’−Ｃｙ５標識置換ＤＮＡ鋳型および３’−ＢＨＱ標識クエンチャープライマーを含有するアッセイ溶液を、任意の基質またはＭｇ２＋イオンの不在下で調製する（その他のバッファー条件：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ  ＴＣＥＰ、２５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ７．５）。
【０２０３】
[0169]ＤＮＡ置換鋳型は、Ｃｙ５を用いて５’標識され、３’末端付近に３炭素スペーサーを有するヘアピン配列である：／５Ｃｙ５／ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＧＴＡ  ＴＧＡ  ＴＴＡ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  Ｔ／ｉＳｐＣ３／ＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＡＴＴ  ＣＧＧ（配列番号１２４）。ＢＨＱ−２を用いて３’標識されたクエンチャープライマー配列は：ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ／３ＢＨＱ＿２／（配列番号１２５）である。（「ＢＨＱ−２」＝ブラックホールクエンチャー−２＝４’−（４−ニトロ−フェニルジアゾ）−２’−メトキシ−５’−メトキシ−アゾベンゼン−４’’−（Ｎ−エチル−２−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル））−Ｎ−エチル−２−Ｏ−グリコレート−ＣＰＧ；Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ、ＵＳＡから入手可能）
【０２０４】
[0170]試験されるべきタグ付きマルチヌクレオチド化合物およびＤＮＡ鋳型に相補的な鎖のポリメラーゼ合成に必要とされる３つの他のヌクレオチド−六リン酸（「ｄＮ６Ｐ」」）基質（すなわち、ｄＡ６Ｐ、ｄＣ６Ｐ、ｄＧ６Ｐ）を含有する溶液を、ポリメラーゼ溶液に添加する。混合物中の総Ｋ−Ｇｌｕ濃度を、最大３００ｍＭにするために、さらなるＫ−Ｇｌｕを添加する。次いで、ＭｇＣｌ２の添加によってポリメラーゼ反応を開始する。アッセイ反応混合物中の最終濃度は：１００ｎＭ  Ｐｏｌ６−４４  Ｄ４４Ａ酵素、５０ｎＭ  Ｃｙ５置換ＤＮＡ鋳型、４０μＭ  各他のｄＮ６Ｐ基質、３００ｍＭ  Ｋ−Ｇｌｕ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ  ＴＣＥＰ、２５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５。アッセイを、試験基質のそれぞれについて、以下の初期濃度：０μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭおよび５０μＭで実施する。ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡ延長反応においてポリメラーゼが基質を組み込むときのＣｙ５およびＢＨＱレベルの間のＦＲＥＴの変化を蛍光的にモニタリングすることによってたどる。
【０２０５】
[0171]アッセイプロトコールにおいて試験される特定のポリメラーゼ基質およびアッセイの結果を表６に示す：
[0172]
【０２０６】
【表６】
2019521096.tif 000047
【０２０７】
[0173]表６においてポリメラーゼアッセイ結果によって示されるように、タグ付きマルチヌクレオチド化合物、単一ｄＴ３０−Ｃ３オリゴヌクレオチドタグ（配列番号１０１）に共有結合によって連結された２つのヌクレオチドを有する［ｄＴ６Ｐ−リンカー］２−（ｄＴ）３０−Ｃ３は、単一ｄＴ３０−Ｃ３オリゴヌクレオチドタグを有する単一ｄＴ６Ｐヌクレオチド基質のものの２倍の初期速度を示した。ポリメラーゼ活性のこの増大された速度（ｋｃａｔ＋ｋｏｎ）は、ポリメラーゼ活性部位での大幅に増大した結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）および／または有効濃度を有するタグ付きマルチヌクレオチド基質と一致する。
【０２０８】
実施例３
単一タグに連結された単一、二重、三重および四重ヌクレオチドの比較ポリメラーゼ基質特徴
[0174]この実施例は、単一ヌクレオチドに連結された単一オリゴヌクレオチドタグを有する標準タグ付きヌクレオチド化合物に対する、単一タグに連結された２つ、３つまたは４つのヌクレオチドを含むタグ付きマルチヌクレオチド化合物の改善されたポリメラーゼ基質を例示する。
【０２０９】
[0175]この実施例において使用される標準タグ付き単一ヌクレオチド基質は、以下に示されるような構造式（ＸＶｄ）（標準クリック化学によって形成される）：
【０２１０】
【化２３】
2019521096.tif 000048
【０２１１】
で示される「Ｃ１１−トリアゾール−Ｃ４」リンカーを介してｄＴ３０−Ｃ３オリゴヌクレオチドタグに連結されたｄＡ６Ｐ部分を含む、化合物（３ｄ）のｄＡ６Ｐ−ｄＴ３０−Ｃ３（「全タグ」）である。
【０２１２】
[0176]この実施例において使用されるタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、それぞれ、化合物（３ａ）および（３ｂ）に対応する（実施例１を参照のこと）（ｄＴ６Ｐ）２−（ｄＴ）３０−Ｃ３（「Ｙ−タグ」）および（ｄＴ６Ｐ）３−（ｄＴ）３０−Ｃ３（「Ｗ−タグ」）である。実施例はまた、化合物（３ｃ）：
【０２１３】
【化２４】
2019521096.tif 000049
【０２１４】
に対応する四次リンカー、（ｄＴ６Ｐ）４−（ｄＴ）２０−Ｃ３（「Ｑ−タグ」）を介して４つのヌクレオチドを有するマルチヌクレオチド化合物のポリメラーゼ基質特徴も記載する。
【０２１５】
[0177]Ａ．化合物（３ｃ）の「Ｑ−タグ」の合成
[0178]１．試薬、６−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−１−ヘキサノール一リン酸（２）を、以下に記載するスキーム５の反応および手順に従って調製した：
スキーム５
【０２１６】
【化２５】
2019521096.tif 000050
【０２１７】
[0179]６−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−１−ヘキサノール（２．５４ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリル（２０ｍｌ）とともに３回共蒸発させ、次いで、高真空下１時間置いた。黄色オイルを、無水ＴＨＦ（１２ｍｌ）に、続いて、トリエチルアミン（５．５８ｍｍｏｌ）に溶解した。溶液を氷浴を用いて冷却し、約１０分後、ＰＯＣｌ３（５．７０ｍｍｏｌ）を、シリンジによって添加した。反応溶液を、周囲温度で一晩撹拌したままにした。反応を水を用いてクエンチし、４時間撹拌した。溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を用いてｐＨ９に調整し、酢酸エチル（２０ｍｌ）を用いて２回洗浄して、有機可溶性不純物を除去した。次いで、水溶液を濃ＨＣｌを用いてｐＨ１に調整した。溶液を２０ｍｌの酢酸エチルを用いて３回抽出して、生成物を回収した。酢酸エチル溶液を、Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥させ、次いで、ｒｏｔａｖａｐ下で濃縮すると、黄色オイルが得られた。生成物６−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−１−ヘキサノール一リン酸を、さらなる精製を行わずに、６−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−１−ヘキサノール三リン酸の調製において使用できる。
【０２１８】
[0180]２．試薬、６−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−１−ヘキサノール三リン酸（３）を、以下に記載するスキーム６の反応および手順に従って調製した。
スキーム６
【０２１９】
【化２６】
2019521096.tif 000051
【０２２０】
[0181]ステップ１（上記）の６−（ｆｍｏｃ−アミノ）−１−ヘキサノール一リン酸（１．０２ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリル（２０ｍｌ×３）とともに共蒸発させ、真空下に１時間に置いた。オイルを取り出して、無水ＤＭＦ（４ｍｌ）中に入れ、ＣＤＩ（４．１ｍｍｏｌ）を一度に添加し、窒素下、周囲温度で４時間撹拌した。メタノール（６．１４ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間撹拌したままにして、溶液中の過剰のＣＤＩを分解した。次いで、ＤＭＦ（２ｍｌ）中のＢｕ３Ｎ−Ｐ２Ｏ７（２．５６ｍｏｌ）の溶液を添加し、窒素下、周囲温度で一晩撹拌した。反応を、ＴＥＡＡ  （０．１Ｍ、５０  ｍｌ）を用いて．クエンチし、約３０分後、粗生成物を、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ／ＣＨ３ＣＮ  （２０分で０〜５０％  ＣＨ３ＣＮ）を用いて溶出する、３０ｇのＨＰ  Ｃ１８で、ＬＣ−ＴｅｌｅＤｙｎｅ  Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  ＲＦ＋カラムシステムによって精製した。溶液を、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃで濃縮し、次いで、凍結乾燥すると、所望の６−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−１−ヘキサノール三リン酸が白色固体として得られた。
【０２２１】
[0182]３．ヌクレオチド−六リン酸−リンカー試薬、ｄＴ６Ｐ−Ｃ６−ＮＨ２（６）を、以下に記載されるスキーム７の反応および手順に従って調製した：
スキーム７
【０２２２】
【化２７】
2019521096.tif 000052
【０２２３】
[0183]ステップ２（上記）の６−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−１−ヘキサノール三リン酸（０．２９１ｍｍｏｌ）試薬を、無水アセトニトリルとともに３回共蒸発させ、次いで、高真空下に１時間置いた。オイル残渣を取り出して、無水ＤＭＦ（２．５０ｍｌ）中に入れ、三リン酸をＣＤＩ（１．１６ｍｍｏｌ）と反応させ、窒素下、周囲温度で４時間撹拌した。クエンチされた未反応のままのＣＤＩにメタノール（１．７４ｍｍｏｌ）を添加した。さらに３０分後、ＤＭＦ（２ｍｌ）中のｄＴＴＰ＋（Ｂｕ４Ｎ）４（０．４０７ｍｍｏｌ）溶液の溶液を、続いて、ＭｇＣｌ２（２．９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた懸濁液を、窒素下、周囲温度で７２時間撹拌した。次いで、ＴＥＡＡ（０．１Ｍ、５０ｍｌ）を用いてクエンチし、１時間撹拌した。粗混合物を、ＴＥＡＡ（０．１Ｍ〜１Ｍ勾配）を使用してＳｅｐｈａｄｅｘ−Ａ２５  ＤＥＡＥイオン交換カラムを通して溶出して、イオン不純物を除去した。生成物画分を集め、質量分析計によって解析し、次いで、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃで濃縮した。回収された生成物を、濃水酸化アンモニウムを用いて周囲温度で２時間処理して、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。生成物を、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ／ＣＨ３ＣＮ（４５分で１０〜５０％  ＣＨ３ＣＮ）を用いて溶出するＣ１８カラムでＨＰＬＣによって精製すると、純粋な生成物ｄＴ６Ｐ−Ｃ６−ＮＨ２（６）が得られた。
【０２２４】
[0184]４．アジド修飾ヌクレオチド六リン酸試薬、ｄＴ６Ｐ−Ｃ６−Ｎ３（６）を、以下に記載されるスキーム８の反応および手順に従って調製した：
スキーム８
【０２２５】
【化２８】
2019521096.tif 000053
【０２２６】
[0185]ステップ３（上記）のｄＴ６Ｐ−Ｃ６−ＮＨ２生成物（２μｍｏｌ）を、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃで乾燥させ、４００μｌのＮａＨＣＯ３溶液（０．１Ｍ、ｐＨ８．９）に再溶解した。次いで、アジド酪酸ＮＨＳエステル（５μｍｏｌ、ＤＭＦ中、１２５ｍＭ）の溶液を添加した。溶液を激しく混合し、周囲温度で一晩Ｔｈｅｒｍｏ−Ｍｉｘｅｒ上に置いた。溶媒として０．１Ｍ  ＴＥＡＡ／ＣＨ３ＣＮおよび４０分で１０〜４０％  ＣＨ３ＣＮの勾配を使用してＨＰＬＣ  Ｃ１８カラムで精製を実施した。
【０２２７】
[0186]５．化合物（２ｃ）の試薬は、４つのアジド修飾ヌクレオチドへのクリック化学取付けのために利用可能な４つのプロパルギル反応性基を有する「四次リンカー」にホスホジエステル結合によって付けられた単一ｄＴ２０−Ｃ３タグを含む。
【０２２８】
【化２９】
2019521096.tif 000054
【０２２９】
[0187]化合物（２ｃ）のｄＴ２０−Ｃ３タグ試薬を用いて四次リンカーを、最後から２番目のオリゴヌクレオチド合成ステップにおいて、化合物（１９）の第２の連続ダブラー−リンカーホスホロアミダイト単位を添加する点を除いて、概して、実施例１において化合物（２ｂ）について記載されるように、ＡＢＩ  ３９００  ＤＮＡシンセサイザーで合成する。第２のダブラーリンカーは、２つのダブラー−リンカー上の４つの利用可能な基のそれぞれへの、プロパルギル−Ｃ５−ホスホロアミダイトリンカーの付加に利用可能な合計４つのＤＭＴ保護された基をもたらす。得られた生成物は、化合物（２ｃ）の四次リンカーである。
【０２３０】
[0188]６．ステップ５（上記）において生成された化合物（２ｃ）の四次リンカーを、ステップ４のアジド修飾ヌクレオチド、ｄＴ６Ｐ−Ｃ６−Ｎ３を用いるクリック化学によってコンジュゲートして、化合物（３ｃ）の「Ｑ−タグ」マルチヌクレオチドを生成し、これは、ｄＴ６Ｐの末端リン酸とダブラー−リンカーの間の式（ＸＶｅ）の「Ｃ６−アミド−Ｃ４−トリアゾール−Ｃ４」リンカーを含む。反応を、ダブラー−リンカーコンジュゲーションのための実施例１、ステップＣに記載されるスキームの一般反応に従って実施する。手短には、ｄＴ６Ｐ−Ｃ６−Ｎ３（５２５ｎｍｏｌ）および化合物（２ｃ）の四次リンカー試薬（８７．５ｎｍｏｌ）を、ＤＩ−水（１００μｌ）中に混合する。臭化Ｃｕ（Ｉ）（８０００ｎｍｏｌ）およびＴＨＰＴＡ（１２０００ｎｍｏｌ）を使用してコンジュゲーション反応を開始し、その反応物をシェーカー上で４０Ｃで一晩混合する。得られた粗生成物混合物をＨＰＬＣによって精製する。化合物（３ｃ）のコンジュゲートされた「Ｑ−タグ」生成物の形成は、質量分析計によって確認した（陰イオンについて、理論値１１５２１．１、実測値１１５２７．１３）。
【０２３１】
[0189]Ｂ．アッセイプロトコール：アッセイは、実施例２に記載されるようなＰｏｌ６ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠損バリアントを使用する置換アッセイであり、ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡ延長反応においてポリメラーゼが基質を組み込むときのＣｙ５およびＢＨＱラベルの間のＦＲＥＴの変化を蛍光的にモニタリングすることによってたどる。
【０２３２】
[0190]手短には、７５ｍＭグルタミン酸カリウム（「Ｋ−Ｇｌｕ」）中のＰｏｌ６ポリメラーゼ、配列番号１２４の５’−Ｃｙ５標識置換ＤＮＡ鋳型および配列番号１２４の３’−ＢＨＱ標識クエンチャープライマーを含有するアッセイ溶液を、基質またはＭｇ２＋イオンの不在下で調製する。アッセイされるべきマルチヌクレオチド化合物（すなわち、「Ｙ−タグ」、「Ｗ−タグ」または「Ｑ−タグ」）、非タグ付きｄＴ６Ｐ（「ヘキサ−ＰＯ４）または化合物（３ｄ）のタグ付き単一ヌクレオチド基質、ｄＡ６Ｐ−ＤＴ３０−Ｃ３（「全タグ」）のいずれかを含有する基質溶液を調製する。また、ＤＮＡ鋳型に相補的な鎖のポリメラーゼ合成に必要とされる他の３つのヌクレオチド六リン酸（「ｄＮ６Ｐ」」）基質（すなわち、ｄＡ６Ｐ、ｄＣ６Ｐ、ｄＧ６Ｐ）も、基質溶液中に含まれる。この基質溶液を、ポリメラーゼ溶液に添加する。アッセイを、試験基質のそれぞれについて、以下の初期濃度：０．２５μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、４．０μＭおよび８．０μＭで実施する。混合物中の総Ｋ−Ｇｌｕ濃度を最大３００ｍＭにするために、さらなるＫ−Ｇｌｕを添加する。次いで、ＭｇＣｌ２の添加によってポリメラーゼ反応を開始する。アッセイ反応混合物中の最終濃度は：１００ｎＭ  Ｐｏｌ６酵素、５０ｎＭ  Ｃｙ５置換ＤＮＡ鋳型、４０μＭ  各他のｄＮ６Ｐ基質、３００ｍＭ  Ｋ−Ｇｌｕ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ  ＴＣＥＰ、２５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５。初期速度を、図３に示されるようにプロットし、濃度および速度の値は、表７にまとめる。
【０２３３】
[0191]
【０２３４】
【表７】
2019521096.tif 000055
【０２３５】
[0192]図３および表７の結果によって示されるように、２つ以上（ｔｗｏ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）のヌクレオチドを有するタグ付きマルチヌクレオチド化合物は、化合物（３ｄ）の単一ｄＴ３０−Ｃ３オリゴヌクレオチドタグ基質（「全タグ」）を有する単一ヌクレオチド基質のもののほぼ２倍の初期速度を示す。化合物（３ａ）、（３ｂ）および（３ｃ）のタグ付き二重−、三重−および四重ヌクレオチド基質は、比較的増大した速度を示す。ポリメラーゼ活性の増大した速度は、ポリメラーゼ活性部位での大幅に増大した結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）および／または有効濃度を有するタグ付きマルチヌクレオチド基質と一致する。三重および四重ヌクレオチド基質の速度のさらなる増大は、これらの化合物におけるダブラーおよびトレブラーリンカー分岐点からのヌクレオチドの距離の最適化によって得ることができる可能性がある。
【０２３６】
実施例４
ナノポアシーケンシングのためのタグ付きマルチヌクレオチドの使用
[0193]この実施例は、４種の異なったタグ付きマルチヌクレオチド化合物のセットの改善された特徴を例示し、そのそれぞれは、ダブラー−リンカーを介して、それぞれポリメラーゼ基質となることができる２つのヌクレオチド六リン酸（ｄＮ６Ｐ）部分に共有結合によって連結された異なる単一２０マー長のオリゴヌクレオチドタグを含む。これらのタグ付きマルチヌクレオチドを、タグ付き単一ヌクレオチド化合物のセットと比較し、タグのセットは、化合物（３ｄ）におけるようにＣ１１−トリアゾール−Ｃ４リンカーを介してヌクレオチド基質に接続された匹敵する３０マーのオリゴヌクレオチドを含む。単一ヌクレオチド基質における３０マーオリゴヌクレオチドタグの使用は、ヌクレオチド基質およびタグの間にさらなるダブラー−リンカーを含むマルチヌクレオチド基質に対してより短いリンカーを構成する。実施例において比較されるタグ付きｄＮ６Ｐ基質の２つのセットを、表８に示す。
【０２３７】
[0194]
【０２３８】
【表８】
2019521096.tif 000056
【０２３９】
[0195]手短には、ナノポアシーケンシングを、それぞれＰｏｌ６ポリメラーゼにコンジュゲートされたα−ＨＬナノポアのアレイを使用して実施する。α−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポアコンジュゲートは、個別にアドレス可能な集積回路チップのアレイにわたって形成される膜中に埋め込まれる。このα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポアアレイを、ＤＮＡ鋳型および４種の異なるタグ付きヌクレオチド基質のセット、表８に示される４種の単一ｄＮ６Ｐ基質または二重ｄＮ６Ｐ基質のセットのいずれかに曝露する。二重ｄＮ６Ｐ基質を、所望のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドタグが置換される点を除いて、化合物（３ａ）を調製するための実施例１の一般方法に従って、ダブラー−リンカーを使用して調製する。ＤＮＡ鋳型に相補的である特定のタグ付きヌクレオチドは、Ｐｏｌ６ポリメラーゼ活性部位に捕獲され、結合されるので、タグ部分は、隣接してコンジュゲートされるα−ＨＬナノポア中に位置付けられるようになる。印加ＡＣ電位下で、細孔中のタグの存在は、開口細孔電流（すなわち、ナノポア中にタグがない電流）と比較して、特有の遮断電流を引き起こす。コンジュゲートされたＰｏｌ６が、鋳型に相補的なＤＮＡ延長鎖を合成する時に測定される遮断電流の順序が、ＤＮＡ鋳型の順序を同定する。
【０２４０】
[0196]ナノポア検出システム：ナノポア遮断電流測定を、浅いウェル内に１２８，０００の銀電極のアレイを有するＣＭＯＳマイクロチップを含むナノポアアレイマイクロチップ（ＧＥＮＩＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡによって製作されたチップ）を使用して実施する。このようなナノポアアレイマイクロチップを製作し、使用するための方法はまた、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号、同第２０１３／０２６４２０７Ａ１号および同第２０１４／０１３４６１６Ａ１号に見出すことができ、それらのそれぞれは、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる。アレイ中の各ウェルは、生物学的試薬および伝導性塩との一定の接触を考慮する表面修飾を用いて、標準的なＣＭＯＳプロセスを使用して製造される。各ウェルは、ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートが中に埋め込まれたリン脂質二重膜を支持できる。各ウェルの電極は、コンピュータインターフェースによって個々にアドレス可能である。使用されるすべての試薬は、コンピュータによって制御されたシリンジポンプを使用してアレイマイクロチップの上の簡単なフローセル中に入れられる。チップは、アナログからデジタルへの変換を支持し、１秒あたり１０００点を超える速度ですべての電極からの電気的測定値を独立に報告する。ナノポア遮断電流測定は、ミリ秒（ｍｓｅｃ）毎に少なくとも１回、アレイ中の１２８Ｋのアドレス可能なナノポアを含有する膜のそれぞれで非同期的に行い、インターフェースで接続したコンピュータに記録することができる。
【０２４１】
[0197]チップ上での脂質二重層の形成：１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＡＶＡＮＴＩ  ＰＯＬＡＲ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用してチップ上にリン脂質二重膜を調製する。脂質粉末を１５ｍＭでデカンに溶解し、次いで、チップ上のウェルにわたって塗布して層にする。次いで、アレイウェルのシス側を通って空気を送り、こうして多重層脂質膜を単一二重層に減少することによって、薄化プロセスを開始する。０〜１０００ｍＶのランピング電圧を使用して、二重層形成を試験する。典型的な単一二重層は、３００〜５００ｍＶの間の印加電圧で一時的に開口する。
【０２４２】
[0198]膜へのα−ＨＬ−Ｐｏｌ６コンジュゲート挿入：脂質二重層をアレイチップのウェル上に形成した後、すべて、２０℃の３ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび５００ｍＭ  Ｋ−Ｇｌｕ、ｐＨ８のバッファー溶液中の、３μＭのタグ付きヌクレオチドのセット（表８から）、０．１μＭの６：１  α−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲート、０．４μＭの所望のＤＮＡ鋳型を、チップのシス側に添加した。混合物中のナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートは、脂質二重層中に自発的に挿入する。Ｃａ２＋のみが存在する（およびＭｇ２＋イオンなし）ので、三元複合体はＰｏｌ６活性部位で形成できるが、タグ付きヌクレオチドは組み込まれず、５’−リン酸が連結されたタグは放出されない。
【０２４３】
[0199]ＤＮＡ鋳型は、以下の配列を有するダンベル型円形鋳型、「ＨＰ７」である：
ＣＧＡＴＴＡＣＴＴＴＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＴＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＡＴＴＡＣＴＴＴＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＴＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＴＡＡＴＣＧ（配列番号１２６）。
【０２４４】
[0200]ナノポア遮断電流測定：ナノポア電流遮断測定のための電解質溶液として使用されるバッファー溶液は、２０℃の、５００ｍＭ  グルタミン酸カリウム、ｐＨ８、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＴＣＥＰである。Ｐｔ／Ａｇ／ＡｇＣｌ電極設定を使用し、−１０ｍＶ〜２００ｍＶ矩形波形のＡＣ電流を印加した。ＡＣ電流は、タグが、反復的にナノポア中に向けられ、次いで、ナノポアから排出されることを可能にし、それによって、検出するより多くの機会を提供するので、ナノポア検出にとって特定の利点を有し得る。ＡＣ電流はまた、経時的に、より安定な電流シグナルおよび電極のより少ない分解のための、より不変の電位を提供し得る。
【０２４５】
[0201]４つのそれぞれの電流遮断事象を表すシグナルが、４つの異なるタグ付きヌクレオチドのセットから、それらが、ＤＮＡ鋳型を用いてプライムされたα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートによって捕獲されるときに観察される。遮断電流事象の順序のプロットを経時的に記録し、解析する。一般に、１０ｍｓより長く持続し、開口チャネル電流を０．８から０．２に低減する遮断電流事象は、鋳型鎖と相補的である正しい塩基のポリメラーゼ組込みと一致する生産的ヌクレオチド捕獲を示す。
【０２４６】
[0202]結果
[0203]２セットのタグ付きｄＮ６Ｐ基質を用いて実施される実験において決定される関連するナノポアアレイシーケンシングパラメータの平均値を表９に示す。
【０２４７】
[0204]
【０２４８】
【表９】
2019521096.tif 000057
【０２４９】
[0205]表９中の結果によって示されるように、４種の異なるタグ付きマルチヌクレオチドポリメラーゼ基質のセットは、ナノポアシーケンシング実験において使用される場合に大幅に増大した処理能力およびリード長を示す。加えて、リード長対精度（順序のコーリングにおける）のプロットは、タグ付きマルチヌクレオチド化合物は、単一ヌクレオチド−単一タグ基質化合物に対してより長いリード長を用いた場合に精度の喪失をもたらさないことを示す。アレイ中の選択されたナノポアは、８００ｂｐを超えるリード長を達成できる。タグ付きマルチヌクレオチド基質を用いて達成可能なより長いヘテロポリマーリード長の典型的な例では、５３１ｂｐのヘテロポリマー配列のリード長が、以下のスコアでコールされる：７１％（３７５／５３１）、２１挿入、１３３欠失、２ミスマッチ。タグ付きマルチヌクレオチド基質を用いて達成可能なより長いホモポリマーリード長の典型的な例では、７７０ｂｐのホモポリマー配列のリード長が、以下のスコアでコールされる：５３％（５２１／９８２）、２１２挿入、２４７欠失、２ミスマッチ。
【０２５０】
実施例５
タグ付きマルチヌクレオチドを使用するナノポアシーケンシングの改善された条件
[0206]この実施例は、ナノポアシーケンシングのために４種の異なるタグ付きマルチヌクレオチド化合物のセットを使用する方法をさらに例示し、さらに改善されたシーケンシング結果を提供する材料および条件を例証する。実施例４におけるように、ダブラー−リンカーを介して、２０マー長のオリゴヌクレオチドタグに付けられた、タグあたり２つのヌクレオチドを有するタグ付きマルチヌクレオチドのセットを、３０マー長のオリゴヌクレオチドタグの匹敵するセットを有するタグ付き単一ヌクレオチド化合物のセットと比較する。実施例において使用される２セットのタグ付きｄＮ６Ｐ基質を表１０に示す。
【０２５１】
[0207]
【０２５２】
【表１０】
2019521096.tif 000058
【０２５３】
[0208]二重ｄＮ６Ｐ基質を、所望ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドタグが置換されている点を除いて、化合物（３ａ）を調製するための実施例１の一般方法に従って、ダブラー−リンカーを使用して調製する。
【０２５４】
[0209]この実施例においてナノポアシーケンシングは、遮断電流測定の際に使用されるバッファーおよびＡＣ波形条件のいくつかの変化を除いて、実施例４におけるものと同一の材料および方法を使用して実施する。最も重大には、Ｋ−Ｇｌｕの濃度は、実施例３におけるような５００ｍＭではなく３００ｍＭである。シス側バッファーは、３００ｍＭ  Ｋ−Ｇｌｕ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＴＣＥＰおよび１０μＭの表１０のタグ付きｄＮ６Ｐ基質のそれぞれを含有する。トランス側のバッファーは、３４０ｍＭ  Ｋ−Ｇｌｕおよび３ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する。ＡＣ波形は、以下を特徴とする：電圧モード、５０Ｈｚ、４０％デューティーサイクル、２３５ｍＶ、７２００ｓ。
【０２５５】
[0210]ＤＮＡ鋳型は、同一のダンベル型円形鋳型、実施例３に記載される配列番号１２６のＨＰ７である。
【０２５６】
[0211]結果
[0212]２セットのタグ付きｄＮ６Ｐ基質を用いて実施される実験において決定される関連ナノポアアレイシーケンシングパラメータの平均値を、表１１に示す。
【０２５７】
[0213]
【０２５８】
【表１１】
2019521096.tif 000059
【０２５９】
[0214]表１１中の結果によって示されるように、表１０の４種の異なるタグ付きマルチヌクレオチドポリメラーゼ基質のセットは、３００ｍＭ  Ｋ−Ｇｌｕの存在下でナノポアシーケンシング実験において使用される場合に大幅に増大したポリメラーゼ処理能力およびリード長を示す。３００ｍＭ  Ｋ−Ｇｌｕ条件下でタグ付きマルチヌクレオチド基質を用いて達成可能なより長いヘテロポリマーリード長の典型的な例では、２９２６ｂｐのリード長が達成され、以下のスコアを有する：７０％（１３９９／２０１１）、進行長（ｐｒｏｃｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｎｇｔｈ）：２９２６、７３挿入、５２９欠失、１０ミスマッチ。３００ｍＭ  Ｋ−Ｇｌｕ条件下でタグ付きマルチヌクレオチド基質を用いて達成可能なホモポリマーリード長：５１％（１７９７／３５５４）、進行長（ｐｒｏｃｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｎｇｔｈ）：２９２６、６２８挿入、１１１８欠失、１１ミスマッチ。
【０２６０】
[0215]さらに、表１０に示される（ｓｈｏｗ）４種のマルチタグ付きヌクレオチドのセットは、この実施例の３００ｍＭ  Ｋ−Ｇｌｕ条件下で特に良好な遮断電流レベル分離を示す。遮断電流レベル（開口電流の画分として測定される）は以下のとおりである：
[0216]（ｄＡ６Ｐ）２−ｄｔ５−（ＢＨＥＢ）−ｄＴ１４−Ｃ３＝０．８８＋／−０．０３、
[0217]（ｄＣ６Ｐ）２−ｄＴ２０−Ｃ３＝０．７６＋／−０．０４、
[0218]（ｄＴ６Ｐ）２−ｄＴ４−（Ｎ３ＣＥ−ｄＴ）３−ｄＴ１３−Ｃ３＝０．６２＋／−０．０５、
[0219]（ｄＧ６Ｐ）２−ｄＴ６−（Ｔｍｐ）６−ｄＴ８−Ｃ３＝０．３８＋／−０．０８
[0220]これらのタグの遮断電流レベル間の良好な分離は、ナノポアシーケンシングにおけるより正確なコールを可能にする。
【図１】
2019521096.tif 000067
【図２】
2019521096.tif 000068
【図３】
2019521096.tif 000069
【配列表】
2019521096000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月7日(2019.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグを含む化合物であって、前記タグが検出可能なシグナルを生成することができる分子部分であり、各ヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分がポリメラーゼの基質となることができるものである、前記化合物。
【請求項２】
２〜１２個のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に、場合により、２〜６個のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ポリメラーゼ基質として使用される場合に、単一のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸に共有結合によって連結された単一タグを含む化合物に対して増大した伸長効率をもたらす、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
以下の構造式（Ｉ）
［Ｎ−Ｐ−Ｌ］ｍ−Ｔ
（Ｉ）
［式中、
Ｎはヌクレオシドであり、
Ｐは、ヌクレオシドの５’−Ｏ基に共有結合によって付けられたオリゴリン酸であり、オリゴリン酸は、３〜１２個のリン酸基からなり、
Ｌは、オリゴリン酸の末端リン酸基に共有結合によって付けられたリンカーであり、
ｍは、２〜１２であり、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分の数を示し、
Ｔは、Ｎ−Ｐ−Ｌ部分に共有結合によって付けられたタグであり、前記タグが検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
以下の構造式（ＩＩ）
【化１】
2019521096.tif 000070
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、
ｍは、２〜１２であり、
タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
以下の構造式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｃ）
【化２−１】
2019521096.tif 000071
【化２−２】
2019521096.tif 000072
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
リンカーは、２〜１００個の原子を有する、共有結合によって結合された鎖を含むリンカーであり、
タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
以下の構造式（ＩＩＩｄ）、（ＩＩＩｅ）または（ＩＩＩｆ）：
【化３−１】
2019521096.tif 000073
【化３−２】
2019521096.tif 000074
［式中、
塩基は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンから選択され、
Ｒは、ＨおよびＯＨから選択され、
ｎは、１〜４であり、
ｐは、２〜１０であり、
タグは、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分である］
を有する、請求項５または６に記載の化合物。
【請求項８】
タグが、ポリエチレン−グリコール（ＰＥＧ）オリゴマー、有機色素部分、オリゴヌクレオチド（天然および／または非天然類似体モノマー単位を含む）、ポリペプチド（天然および／または非天然類似体モノマー単位を含む）およびこれらのうちいずれかの組合せを含むオリゴマー部分からなる群から選択される分子部分を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
タグが、オリゴヌクレオチド、場合により、表３、７または９から選択される構造を有するオリゴヌクレオチド、場合により、配列番号１〜１０９から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
タグが、ポリマー構造、場合により、表４から選択されるアミダイト試薬の反応から得られる少なくとも１つのモノマー単位を含むポリマー構造を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
タグが、ポリペプチド、場合により、表５から選択される構造を有するポリペプチド、場合により、配列番号１１０〜１２３から選択される配列を有するポリペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
タグまたはリンカーが、３個以上の分子部分との共有結合による連結を形成することができる分岐部分または樹状部分を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
分岐部分または樹状部分が、ダブラーリンカーであり、場合により、ダブラーリンカーが、アミダイト試薬の化合物（１９）
【化４】
2019521096.tif 000075
の反応によって得られる、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
分岐部分または樹状部分が、トレブラーリンカーであり、場合により、トレブラーリンカーが、アミダイト試薬の化合物（２０）
【化５】
2019521096.tif 000076
の反応によって得られる、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
セット中の各化合物が、異なるタグを有し、各異なるタグが、異なる検出可能なシグナルを引き起こす、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物のセットを含む組成物。
【請求項１６】
核酸の配列を決定する方法であって、
（ａ）膜、膜のシス側およびトランス側の電極、細孔が膜を通って延在するナノポア、両電極と接触する電解質溶液、ナノポアに隣接して位置する活性ポリメラーゼおよびポリメラーゼと複合体を形成しているプライマー鎖を含むナノポアシーケンシング組成物を用意するステップと、
（ｂ）ナノポアシーケンシング組成物を、（ｉ）核酸の鎖および（ｉｉ）複数のヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分に共有結合によって連結された単一タグをそれぞれが含む化合物のセットであって、タグが、検出可能なシグナルを生成することができる分子部分であり、各ヌクレオシド−５’−オリゴリン酸部分が、ポリメラーゼの基質となることができ、化合物のセットの各メンバーが、タグがナノポア中に位置付けられると異なる遮断電流および／または滞留時間を生成する異なるタグを有する、化合物のセットと接触させるステップと、
（ｃ）タグの異なる遮断電流および／または異なる滞留時間を経時的に検出し、異なるタグのそれぞれを、核酸配列と相補的であるポリメラーゼによって組み込まれる異なる化合物と相関させ、それによって核酸配列を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
前記化合物のセットが、請求項１〜１４に記載の化合物から選択される、請求項１６に記載の方法。
【国際調査報告】
2019521096.tif 000077
2019521096.tif 000078
2019521096.tif 000079