(57)【要約】  本願は、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）、ＰＳＣ、および統合失調症を有する対象においてみられるような、ＴＣＦ４の第３イントロン内に含まれるトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を切り出すための組成物および方法に関する。ＶＩＩＩ型コラーゲンα２サブユニット内の、ＦＥＣＤに寄与し得る変異を治療するための、ＶＩＩＩ型コラーゲンα２サブユニットを標的化するガイド配列を含む組成物もまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１０８４から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導するガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む組成物。
【請求項２】
配列番号１０８９〜１２７８から選択される配列と、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む組成物。
【請求項３】
配列番号１０８９〜１２７８から選択される配列と同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む組成物。
【請求項４】
前記ガイドＲＮＡが、転写因子４（ＴＣＦ４）遺伝子内のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）における配列またはその近傍の配列を標的化し、配列番号１〜１９０から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
配列番号１０８９〜１２７８から選択される配列と、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
以下のガイドＲＮＡの対：
ａ．ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｂ．ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｃ．ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｄ．ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｅ．ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｆ．ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０７に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｇ．ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１２５に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｈ．ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１２５に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｉ．ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０７に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｊ．ヌクレアーゼを配列番号６４に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０６に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｋ．ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｌ．ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｍ．ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｎ．ヌクレアーゼを配列番号５３に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｏ．ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する第２のガイドＲＮＡ、ならびに
ｐ．ヌクレアーゼを配列番号７４に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡ、から選択される２つのガイドＲＮＡを含む組成物。
【請求項７】
ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７７を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９７を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７３を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９７を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７４を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１２００を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７３を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１２００を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７４を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９７を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７３を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０７に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９５を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１３】
ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７１を含み、ヌクレアーゼを配列番号１２５に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１２１３を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１４】
ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７４を含み、ヌクレアーゼを配列番号１２５に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１２１３を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１５】
ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７４を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０７に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９５を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１６】
ヌクレアーゼを配列番号６４に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１５２を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０６に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９４を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１７】
ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７３を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１２０２を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１８】
ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７４を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１２０２を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１９】
ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７１を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１２０２を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項２０】
ヌクレアーゼを配列番号５３に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１４１を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１２０２を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項２１】
ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７１を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１２００を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項２２】
ヌクレアーゼを配列番号７４に誘導する前記第１のガイドＲＮＡが配列番号１１６２を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する前記第２のガイドＲＮＡが配列番号１２０２を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ガイドＲＮＡが、ＶＩＩＩ型コラーゲンのα２サブユニット（Ｃｏｌ８Ａ２）遺伝子を標的化し、配列番号１９１〜１０６３から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
配列番号１９１〜１０６３から選択される標的配列の最初の２０ヌクレオチドと相補的な配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるか、またはその配列と同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含み、配列番号１９１〜１０６３の最初の２０ヌクレオチド内のチミンがウラシルと置き換えられている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ガイドＲＮＡが、Ｃｏｌ８Ａ２遺伝子産物内のＧｌｎ４５５Ｌｙｓ変異を標的化し、配列番号１０６４〜１０６９から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
配列番号１０６４〜１０６９から選択される標的配列の最初の２０ヌクレオチドと相補的な配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるか、またはその配列と同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含み、配列番号１０６４〜１０６９の最初の２０ヌクレオチド内のチミンがウラシルと置き換えられている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ガイドＲＮＡが、Ｃｏｌ８Ａ２遺伝子産物内のＧｌｎ４５５Ｖａｌ変異を標的化し、配列番号１０７０〜１０７５から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
配列番号１０７０〜１０７５から選択される標的配列の最初の２０ヌクレオチドと相補的な配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるか、またはその配列と同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含み、配列番号１０７０〜１０７５の最初の２０ヌクレオチド内のチミンがウラシルと置き換えられている、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ガイドＲＮＡが、Ｃｏｌ８Ａ２遺伝子産物内のＬｅｕ４５０Ｔｒｐ変異を標的化し、配列番号１０７６〜１０８４から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
配列番号１０７６〜１０８４から選択される標的配列の最初の２０ヌクレオチドと相補的な配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるか、またはその配列と同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含み、配列番号１０７６〜１０８４の最初の２０ヌクレオチド内のチミンがウラシルと置き換えられている、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ガイドＲＮＡがデュアルガイドである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ガイドＲＮＡがシングルガイドである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含む請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
少なくとも１つのガイド配列がベクター上にコードされる、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ベクターが、第１のガイド配列および第２のガイド配列を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
第１のガイド配列と第２のガイド配列とが異なるベクター上にコードされる、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記第１のガイド配列および前記第２のガイド配列が、同一のプロモーターおよび／または制御配列によって制御される、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ガイド配列が、標的遺伝子のプラス鎖内の標的配列に相補的である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ガイド配列が、標的遺伝子のマイナス鎖内の標的配列に相補的である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
第１のガイド配列と第２のガイド配列が、標的遺伝子の反対の鎖内の第１の標的配列と第２の標的配列に相補的である、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ガイドＲＮＡが化学修飾されている、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
ヌクレアーゼをさらに含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である、請求項４２記載の組成物。
【請求項４４】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記Ｃａｓタンパク質がＣｐｆ１である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ヌクレアーゼがニッカーゼである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ヌクレアーゼが修飾されている、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４９】
前記修飾ヌクレアーゼが核局在シグナル（NLS）を含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
請求項１〜４９のいずれか１項に記載の組成物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬製剤。
【請求項５１】
ヒト対象において転写因子４（ＴＣＦ４）遺伝子内のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）の少なくとも一部を切り出す方法であって、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の組成物または請求項５０に記載の薬学的製剤を投与することを含む、方法。
【請求項５２】
２つのガイドＲＮＡが使用され、前記第１のものがヌクレアーゼを前記ＴＮＲの５’の配列に誘導し、前記第２のものがヌクレアーゼを前記ＴＮＲの３’の配列に誘導する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ヒト対象が、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象がＦＥＣＤの家族歴を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、投与の結果として、視力の改善、安定化、または低下の緩徐化を有する、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、投与の結果として、角膜厚測定によって測定されるときに、改善、安定化、または変化の緩徐化を有する、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、投与の結果として、スペキュラーマイクロスコピーに基づいて、改善、安定化、または変化の緩徐化を有する、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象が、投与の結果として、角膜移植が必要とされるまでの時間の遅延を有する、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＴＮＲが、約４０以上のトリヌクレオチドリピートである、請求項５１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＴＮＲ全体が切り出される、請求項５１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記組成物または薬学的製剤が、ウイルスベクターを介して投与される、請求項５１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記組成物または薬学的製剤が、脂質ナノ粒子を介して投与される、請求項５１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
点眼薬または軟膏の共投与をさらに含む、請求項５１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
ソフトコンタクトレンズの使用をさらに含む、請求項５１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ヒト対象が統合失調症を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
前記ヒト対象が原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６７】
ヒト対象において、Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、またはＬｅｕ４５０ＴｒｐのようなＣＯＬ８Ａ２遺伝子の変異アレルの発現を低下させるか、または前記変異アレルを修正するためにヌクレオチド配列を改変する方法であって、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の組成物または請求項５１に記載の薬学的製剤を投与することを含む、方法。
【請求項６８】
前記ヒト対象が、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）または後部多形性角膜ジストロフィー（ＰＰＣＤ）を有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記対象がＦＥＣＤの家族歴を有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象が、投与の結果として、視力の改善、安定化、または低下の緩徐化を有する、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記対象が、投与の結果として、角膜厚測定によって測定されるときに、改善、安定化、または変化の緩徐化を有する、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記対象が、投与の結果として、スペキュラーマイクロスコピーに基づいて、改善、安定化、または変化の緩徐化を有する、請求項６７〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象が、投与の結果として、角膜移植が必要とされるまでの時間の遅延を有する、請求項６７〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、またはＬｅｕ４５０Ｔｒｐ遺伝子産物の発現をもたらす前記変異が、それぞれｃ．１３６４Ｃ＞Ａ、ｃ．１３６３〜１３６４ＣＡ＞ＧＴ、またはｃ．１３４９Ｔ＞Ｇである、請求項６７〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記組成物または薬学的製剤が、ウイルスベクターを介して投与される、請求項６７〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記組成物または薬学的製剤が、脂質ナノ粒子を介して投与される、請求項６７〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
点眼薬または軟膏の共投与をさらに含む、請求項６７〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
ソフトコンタクトレンズの使用をさらに含む、請求項６７〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
ＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲ過伸長を有するか、またはＧｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ４５０Ｔｒｐ変異を有する遺伝子産物をもたらすＣＯＬ８Ａ２遺伝子内の変異を有するヒト対象を治療するための医薬の調製のための、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の組成物または請求項５１に記載の薬学的製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
記載
本出願は、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）、後部多形性角膜ジストロフィー（ＰＰＣＤ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、および統合失調症を含む、転写因子４（ＴＮＦ４）遺伝子内のトリヌクレオチドリピートと関連する疾患の治療のための組成物および方法に関する。
【０００２】
フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）は、フックスジストロフィーとしても知られ、角膜の内皮細胞単層内部に影響を及ぼす変性疾患である。角膜内皮の役割は、内皮バリアーを維持し、ポンプ機能を実施することによって、角膜の透明性を確保することである。ＦＥＣＤにおいて、角膜内皮における局所増殖（グッテー（ｇｕｔｔａｅ）と呼ばれる）および異常なコラーゲンの蓄積が存在する。角膜内皮および間質細胞間に散在するグッテーの存在は、疾患の臨床的な特徴とみなされる。進行性ＦＥＣＤは、広範なグッテー、内皮細胞の喪失、および実質浮腫を特徴とする。
【０００３】
ＦＥＣＤは、視力喪失を生じる可能性があり、進行性ＦＥＣＤは、角膜移植によってのみ治療可能である。米国における中年の白人のおよそ５％が、ＦＥＣＤに罹患していると推定される。さらに、ＦＥＣＤが毎年１４，０００件を超える角膜移植を占めることが推定されている。角膜移植に関連するリスクは、急性拒絶反応、慢性拒絶反応、移植片の宿主床への付着の失敗、感染、および宿主の眼の損傷を含む。ほとんどの移植片は、２０／２０未満の視力を有するレシピエントを残し、６ヶ月までの回復期間を含み、患者が手術後２年以上の間免疫抑制剤ドロップを使用することを必要とする。免疫抑制剤点眼薬の長期の使用は、白内障または緑内障のリスクを増大させる可能性がある。
【０００４】
転写因子４（ＴＣＦ４）遺伝子中に一塩基多型およびトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）の過伸長を含むＦＥＣＤにおける遺伝因子の役割が報告されている。ＦＥＣＤの臨床診断と関連する、５０リピートを超えるリピート長を有するＴＣＦ４遺伝子の第３イントロンにおけるＴＮＲは、疾患のほとんどの遺伝的素因を説明する（Wieben et al., PLOS One,7:11,e49083(2012)）。最近の研究は、このＴＮＲ過伸長が影響を受けたＴＣＦ４のＲＮＡの凝集および重要なＲＮＡスプライシング因子の隔離をもたらすことを示唆している(Mootha et al., Invest Ophthalmol Vis Sci.55(1):33-42(2014)、Mootha et al., Invest Ophthalmol Vis Sci.56(3):2003-11(2015)、Vasanth, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci.56(8):4531-6 (2015)、Soliman et al., JAMA Ophthalmol.133(12):1386-91(2015))。このような隔離は遺伝子発現における広範な変化を導くことがあり、細胞機能の大規模な変化を誘発し、これは最終的に細胞死をもたらす（Du et al., J BiologicalChem.290:10,5979-5990(2015)）。ＴＣＦ４変異はまた、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）および統合失調症と関連付けられており、Ellinghas et al., HEPATOLOGY,58:3,1074-1083(2013)およびForrest et al., Trends in Molecular Medicine 20:6(2014)を参照されたい。
【０００５】
他のリピート過伸長疾患において、ＲＮＡ毒性が提示されている。ＲＮＡ毒性の場合、過伸長マイクロサテライトＤＮＡ配列は、様々な遺伝子の非コード領域に見出すことができ、反復因子は、毒性の機能獲得型のＲＮＡまたは毒性タンパク質種へと転写される（Mohan et al., Brain Res.1584,3-14(2014)を参照）。近年、ＲＮＡ毒性は、ＦＥＣＤを有する患者においても示されている（Du 2015を参照）。さらに、ＴＣＦ４のＴＮＲ転写産物は、主に角膜内皮内に蓄積され、したがってＦＥＣＤの病理発生機序の特性をもたらすことが提示されている。ＲＮＡ毒性の役割は、ＦＥＣＤの滞在的な疾患メカニズムを明確にする手助けをするが、治療は依然として角膜移植に限定されている。
【０００６】
初期発症ＦＥＣＤの他の形態は、ＣＯＬ８Ａ２における変異と関連付けられてきている（Vedana et al., Clinical Ophthalmology 10 321-330(2016)を参照）。通常、ＶＩＩＩ型コラーゲンまたはＣＯＬ８（ＣＯＬ８Ａ１およびＣＯＬ８Ａ２を含む）は、角膜のデスメ膜の中で規則的に分布される。しかしながら、ＣＯＬ８Ａ２における変異を有する個体に由来する角膜は、非協調の様式での、異なる量のＣＯＬ８Ａ１およびＣＯＬ８Ａ２の不規則なモザイク状の堆積を有する。ＣＯＬ８Ａ２の３つの変異（Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、およびＬｅｕ４５０Ｔｒｐ）は、変異型ＶＩＩＩ型コラーゲンペプチドの細胞内蓄積をもたらし、早期発症ＦＥＣＤ、および関連する障害である後部多形性角膜ジストロフィー（ＰＰＣＤ）を引き起こす可能性がある。ＰＰＣＤは、角膜のデスメ膜および内皮層の変化を特徴とする。ＣＯＬ８Ａ２遺伝子内の変異と最も頻繁に関連付けられるＰＰＣＤの形態はＰＰＣＤ２である。
【０００７】
ＣＯＬ８Ａ２における（ＣＴＧ）ｎＴＮＲおよび点変異を直接調節する手段は、ＦＥＣＤ、ＰＰＣＤ、ＰＳＣ、および統合失調症を導く遺伝的変異を治療するために必要とされる。最近研究された遺伝子編集／破壊技法は、細菌のＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）システムに基づく。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集は、ＤＮＡの部位特異的破壊を誘導することができる「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９」（Ｃａｓ９）およびＣｐｆ１によって具現化されるような単一のヌクレアーゼに依存する。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、標的遺伝子に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と共に、ｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡと呼ばれる小型ＲＮＡによって特異的なＤＮＡ配列へと誘導される。ｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡとしても知られるガイドＲＮＡを共に形成する。ｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質の標的化を促進するためにシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）へと組み合わせることができ、また、デュアルガイド（ｄｇＲＮＡ）システムとして組み合わせずに同時に使用することもできる。ｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡと組み合わせたＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体と呼ばれる。
【０００８】
概要
本明細書においてＣＲＩＳＰＲ組成物およびそれらの使用方法を記載し、それらはいくつかの実施形態において、ＴＮＲ過伸長を含むＴＣＦ４を有する領域のいくらかまたは全てを切り取るよう設計されている。いくつかの実施形態において、これらのＴＮＲ過伸長は、ＦＥＣＤに罹患した個体において見出される。そうすることにより過伸長に関連する毒性を防止する。ＴＣＦ４内のＴＮＲの低減または排除は、ＲＮＡ毒性のようなＴＮＲの下流の効果を低減し、疾患経過を改善するであろう。したがって、ＴＣＦ４のイントロン３のＴＮＲに隣接する標的配列に相補的なガイドＲＮＡ、およびヌクレアーゼ（またはＣａｓ  ＲＮＰ）の他の修飾は、ＴＣＦ４におけるＴＮＲを示すＦＥＣＤの遺伝型、ならびにＰＳＣおよび統合失調症におけるＴＮＲを治療するための手段となり得る。さらに、ヌクレアーゼと共に、ＶＩＩＩ型コラーゲンのαサブユニットにおける変異を示すＦＥＣＤおよびＰＰＣＤの型において、ＣＯＬ８Ａ２をノックアウトまたは編集するガイドＲＮＡの設計における使用のためのガイド配列もまた開示される。
【０００９】
記載に従ういくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの組成物は、ＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲ過伸長に対して５’および３’の領域に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを誘導すると記載される。組成物は、ＴＣＦ４遺伝子からのＴＮＲ過伸長、ならびにＦＥＣＤ、ＰＰＣＤ、ＰＳＣ、および統合失調症の治療において有用である。他の実施形態において、ＦＥＣＤと関連する変異アレルを標的化するガイドＲＮＡを含む、ＣＯＬ８Ａ２遺伝子の領域を標的化するガイドＲＮＡの組成物もまた記載される。これらのガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの設計および治療に用いられる方法に応じて、ＴＮＲを切り取るためか、インデルを生成するためか、または二重鎖切断を介する相同組換え（ＨＲ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）を通じた遺伝子修正を誘導するために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと共に使用される。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、配列番号１〜１０８４から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導するガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１０８９〜１２７８から選択される配列と、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む組成物を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、配列番号１０８９〜１２７８から選択される配列と同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む組成物が提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、転写因子４（ＴＣＦ４）遺伝子内のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）を標的化し、配列番号１〜１９０から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１０８９〜１２７８から選択される配列と、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む。
【００１３】
以下のガイドＲＮＡの対：
ａ．ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｂ．ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｃ．ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｄ．ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｅ．ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｆ．ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０７に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｇ．ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１２５に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｈ．ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１２５に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｉ．ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０７に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｊ．ヌクレアーゼを配列番号６４に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１０６に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｋ．ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｌ．ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｍ．ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｎ．ヌクレアーゼを配列番号５３に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡ、
ｏ．ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する第２のガイドＲＮＡ、ならびに
ｐ．ヌクレアーゼを配列番号７４に誘導する第１のガイドＲＮＡと、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡ、から選択される２つのガイドＲＮＡを含む組成物が提供される。
【００１４】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７７を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９７を含む。
【００１５】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７３を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９７を含む。
【００１６】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７４を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１２００を含む。
【００１７】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７３を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１２００を含む。
【００１８】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７４を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０９に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９７を含む。
【００１９】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７３を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０７に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９５を含む。
【００２０】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７１を含み、ヌクレアーゼを配列番号１２５に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１２１３を含む。
【００２１】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７４を含み、ヌクレアーゼを配列番号１２５に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１２１３を含む。
【００２２】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７４を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０７に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９５を含む。
【００２３】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号６４に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１５２を含み、ヌクレアーゼを配列番号１０６に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１１９４を含む。
【００２４】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８５に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７３を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１２０２を含む。
【００２５】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８６に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７４を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１２０２を含む。
【００２６】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７１を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１２０２を含む。
【００２７】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号５３に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１４１を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１２０２を含む。
【００２８】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号８３に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１７１を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１２に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１２００を含む。
【００２９】
２つのｇＲＮＡを含むいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼを配列番号７４に誘導する第１のガイドＲＮＡが配列番号１１６２を含み、ヌクレアーゼを配列番号１１４に誘導する第２のガイドＲＮＡが配列番号１２０２を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＶＩＩＩ型コラーゲンのα２サブユニット（Ｃｏｌ８Ａ２）遺伝子を標的化し、配列番号１９１〜１０６３から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１９１〜１０６３から選択される標的配列の最初の２０ヌクレオチド（例えばＰＡＭがない標的配列）と相補的な配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるか、またはその配列と同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含み、ここで配列番号１９１〜１０６３の最初の２０ヌクレオチド内のチミンがウラシルと置き換えられている。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｃｏｌ８Ａ２遺伝子産物内のＧｌｎ４５５Ｌｙｓ変異を標的化し、配列番号１０６４〜１０６９から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１０６４〜１０６９から選択される標的配列の最初の２０ヌクレオチド（例えばＰＡＭがない標的配列）と相補的な配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるか、またはその配列と同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含み、ここで配列番号１０６４〜１０６９の最初の２０ヌクレオチド内のチミンがウラシルと置き換えられている。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｃｏｌ８Ａ２遺伝子産物内のＧｌｎ４５５Ｖａｌ変異を標的化し、配列番号１０７０〜１０７５から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１０７０〜１０７５から選択される標的配列の最初の２０ヌクレオチド（例えばＰＡＭがない標的配列）と相補的な配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるか、またはその配列と同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含み、ここで配列番号１０７０〜１０７５の最初の２０ヌクレオチド内のチミンがウラシルと置き換えられている。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｃｏｌ８Ａ２遺伝子産物内のＬｅｕ４５０Ｔｒｐ変異を標的化し、配列番号１０７６〜１０８４から選択される標的配列にヌクレアーゼを誘導する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１０７６〜１０８４から選択される標的配列の最初の２０ヌクレオチド（例えばＰＡＭがない標的配列）と相補的な配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるか、またはその配列と同一であるガイド配列を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡを含み、ここで配列番号１０７０〜１０７５の最初の２０ヌクレオチド内のチミンがウラシルと置き換えられている。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡはデュアルガイドである。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡはシングルガイドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのガイド配列は、ベクター上にコードされる。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列および第２のガイド配列は、同一のベクター上にコードされる。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列と第２のガイド配列とが異なるベクター上にコードされる。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列および第２のガイド配列は、同一のプロモーターおよび／または制御配列によって制御される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ガイド配列は、標的遺伝子のプラス鎖内の標的配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、標的遺伝子のマイナス鎖内の標的配列に相補的である。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列および第２のガイド配列は、標的遺伝子の反対側の鎖内の第１の標的配列および第２の標的配列（すなわち、ゲノムＤＮＡ内のＴＣＦ４内のＴＮＲのような対象の領域）に相補的である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態において、本発明はヌクレアーゼをさらに含む。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはＣａｓタンパク質、または二本鎖または一本鎖のＤＮＡを切断する他のヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９またはＣｐｆ１である。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはニッカーゼである。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは修飾されている。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレアーゼは核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本発明は、ガイドＲＮＡと薬学的に許容可能な担体との薬学的製剤を含む。いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、１つ以上のガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、１つ以上のガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明は、ヒト対象内の転写因子４（ＴＣＦ４）遺伝子内のトリヌクレオチドリピート（ＴＮＲ）の少なくとも一部を切り取る方法を含む。いくつかの実施形態において、２つのガイドＲＮＡが使用され、第１のものがＴＮＲの５’の配列に相補的であり、第２のものがＴＮＲの３’の配列に相補的である。２つのガイド配列が使用されるとき、ゲノムＤＮＡの標的領域間のＤＮＡ配列が切り取られる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＴＮＲは、約４０以上のトリヌクレオチドリピートである。いくつかの実施形態において、ＴＮＲは、約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５以上のトリヌクレオチドリピートである。いくつかの実施形態において、ＴＮＲは、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００以上のトリヌクレオチドリピートである。
【００４１】
いくつかの実施形態において、組成物または薬学的製剤は、ＴＮＲの少なくとも一部を切り取る少なくとも２つのガイドを含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＲ全体が切り取られる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、組成物または薬学的製剤は、ウイルスベクターを介して投与される。いくつかの実施形態において、組成物または薬学的製剤は、脂質ナノ粒子を介して投与される。当業者に公知の任意の脂質ナノ粒子が、本明細書において提供される１つ以上のガイドＲＮＡの送達に好適であり、任意選択でＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡと共に送達される。いくつかの実施形態において、３／３０／３０１７に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２４９７３に記載される脂質ナノ粒子が利用される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、本明細書において提供される１つ以上のガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡを伴わずに本明細書において提供される１つ以上のガイドＲＮＡを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本発明は、点眼薬または軟膏の共投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明は、ソフトコンタクトレンズの使用をさらに含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、統合失調症を有する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を有する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明は、ヒト対象において、Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、またはＬｅｕ４５０ＴｒｐのようなＣＯＬ８Ａ２遺伝子の変異アレルの発現を低下させるか、または該変異アレルを修正するためにヌクレオチド配列を改変する方法を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ヒト対象は、フックス角膜内皮ジストロフィー（ＦＥＣＤ）または後部多形性角膜ジストロフィー（ＰＰＣＤ）を有する。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、ＦＥＣＤを有する。いくつかの実施形態において、対象はＦＥＣＤの家族歴を有する。
【００４８】
いくつかの実施形態において、対象は、投与の結果として、視力の改善、安定化、または低下の緩徐化を有する。いくつかの実施形態において、対象は、投与の結果として、角膜厚測定によって測定されるときに、改善、安定化、または変化の緩徐化を有する。いくつかの実施形態において、対象は、投与の結果として、スペキュラーマイクロスコピーに基づいて、改善、安定化、または変化の緩徐化を有する。いくつかの実施形態において、対象は、投与の結果として、角膜移植が必要とされるまでの時間の遅延を有する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲ過伸長を有するか、またはＧｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、もしくはＬｅｕ４５０Ｔｒｐ変異を有する遺伝子産物をもたらすＣＯＬ８Ａ２遺伝子内の変異を有するヒト対象を治療するための医薬の調製のための、組成物または薬学的製剤の使用を含む。
【００５０】
さらなる目的および利点は、部分的には以下の説明に記載され、部分的には説明から明らかになるか、または実施によって知得され得る。目的および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせによって実現および達成されるであろう。
【００５１】
上述の概略的な説明と、以下の詳細な説明はいずれも例示であり、単に説明するためのものであり、特許請求の範囲を限定するものではない。
【００５２】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、１つの（いくつかの）実施形態を例示し、説明と共に、本明細書において記載される原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＴＮＲの５’にあるイントロン３の領域を標的化するガイド配列を有する一方のｇＲＮＡと、ＴＮＲの３’にあるイントロン３の領域を標的化するガイド配列を有する他方のｇＲＮＡとの１対のｇＲＮＡを用いる、ＴＣＦ４のイントロン３のＴＮＲ過伸長領域の切り取りの概略図を提供する。図面はＴＮＲの正確な境界で生じる切り取りを示すが、実際においては、切り取りはより大きくまたはより小さくあり得、イントロンの上流および／または下流の領域を含み得る。
【００５４】
【図２】切り取りについて試験された９３対のｇＲＮＡに関する切り取られたフラグメントの予測されるサイズを示す概略図を提供する。数は、試験されたガイドの各々の標的配列の配列番号に対応する。対は、切り取りパーセントの順で順序付けされる（リストの頂点の対が最高の切り取り率を有する）。「０」は、ＴＮＲ領域の中心を示す。
【００５５】
配列の説明
表１は、本明細書において参照される特定の配列のリストを提供する。
【表１−１】
2019515914.tif 000002
【表１−２】
2019515914.tif 000003
【表１−３】
2019515914.tif 000004
【表１−４】
2019515914.tif 000005
【００５６】
態様の記載
定義
本明細書において使用されるとき、用語「治療」は、対象における疾患のための治療の任意の投与または適用を包含し、疾患の阻害、その進行の停止、疾患の１つ以上の症状の緩和、疾患の治癒、または疾患の１つ以上の症状の再発の予防を含む。例えば、ＦＥＣＤの治療はＦＥＣＤの症状の緩和、およびＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲの数を低減させて、ＦＥＣＤの症状の寛解、疾患の進行の緩徐化、または、疾患の症状の治癒／再発の予防をもたらすことを含み得る。
【００５７】
本明細書において使用されるとき、「ＦＥＣＤ」はフックスジストロフィーとしても知られる、フックス角膜内皮ジストロフィーを指す。ＦＥＣＤはまた、症状を有さないが、ＦＥＣＤの増加した発症に関連するＴＣＦ４のイントロン３のＴＮＲ過伸長のような遺伝的障害を有する個体をも含む。ＦＥＣＤはまた、症状を有さないが、既知のＦＥＣＤおよびＴＣＦ４のイントロン３のＴＮＲ過伸長の家族歴を有する個体をも含む。
【００５８】
本明細書において使用されるとき、「ＴＮＲ」はトリヌクレオチドリピートを指す。「マイクロサテライトリピート」は、２〜９個の塩基対のセットの多重反復からなるＤＮＡの短い配列を指す。用語マイクロサテライトリピートはＴＮＲを包含する。「ＴＮＲ過伸長」は、正常数のトリヌクレオチドリピートよりも多いことを指す。例えば、ＴＣＦ４のイントロン３に関して、ＴＮＲ過伸長は、約５０以上のＴＮＲを特徴とすることができる。疾患と関連付けられるＴＮＲ過伸長の範囲は通常、５０〜１０００の間であるが、１０００を超えるリピートを有するいく人かの患者が同定されている。ＴＣＦ４のイントロン３内の５０未満のＴＮＲを有する患者は、一般的に、ＴＮＲ過伸長の機序を通じた疾患の増大したリスクにあるとはみなされないが、彼らはなおも低減した数のＴＮＲの恩恵を受け得る。
【００５９】
ＴＮＲによって引き起こされるか、および／またはＴＮＲの存在によって特徴づけられる疾患は、「トリヌクレオチドリピート障害」、「トリヌクレオチドリピート過伸長障害」、「トリプレットリピート過伸長障害」、または「コドン反復障害」と呼ばれ得る。
【００６０】
「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、本明細書において交換可能に使用される。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲのＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）を含むか、またはそれらからなる。ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、１つのＲＮＡ分子上で会合し得る（シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）か、または別々のＲＮＡ分子上に分離し得る（デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ））。
【００６１】
本出願において使用されるとき、「ガイド配列」は、標的配列に相補的であり、ヌクレアーゼによる切断のためにガイドＲＮＡを標的配列に誘導するよう作用する、ｃｒＲＮＡまたはｔｒＲＮＡ内の約２０塩基対の配列を指す。例えば、１５−、１６−、１７−、１８−、１９−、２１−、２２−、２３−、２４−、または２５−塩基対の長さのような、わずかにより短いまたはより長い配列もまたガイドとして使用できる。いくつかの実施形態において、ガイド配列の長さは、例えば、本明細書に記載されるような標的配列の長さに対応する。
【００６２】
本明細書において使用されるとき、「標的配列」は、ガイドＲＮＡが切断のためにヌクレアーゼを誘導する核酸の配列を指す。標的配列は対象のゲノムＤＮＡ内にある。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡによって標的配列へと誘導され得、そこでは、ガイドＲＮＡが標的配列にハイブリダイズし、ヌクレアーゼが標的配列を切断する。Ｃａｓタンパク質の核酸基質は二本鎖核酸であるので、標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖の両方（すなわち、与えられる配列と、配列の逆のコンプリメントを含む。したがって、ガイド配列が「標的配列に相補的」であると言われる場合、ガイド配列は、ガイドＲＮＡ（例えばＲＮＰ中の）を、本明細書において提供される標的配列の逆の相補体に結合するよう誘導できると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態において、ガイド配列が、標的配列の逆の相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列におけるＵのＴへの置換を除いて、標的配列の最初の２０ヌクレオチド（例えばＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。
【００６３】
本明細書において使用されるとき、「ＰＡＭ」または「プロトスペーサー隣接モチーフ」は、標的配列に隣接すべき配列をさす。必要とされるＰＡＭは、特定のＣＲＩＳＰＲシステムに応じて変動する。Streptococcus Pyogenesに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、最適な切断のために、標的ＤＮＡは、５’−ＮＧＧのＰＡＭ（ここで「Ｎ」は２つのグアニン核酸塩基が後に続く任意の核酸塩基である）の直ぐ前にある必要があるが、一方で他のＣａｓ９オーソログは、異なるＰＡＭ要件を有する。Streptococcus pyogenesのＣａｓ９はまた、５’−ＮＡＧのＰＡＭを認識することができるが、これらのＰＡＭ部位においては、より劣った効率で切断するらしい。表２の標的配列はＰＡＭを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質は「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）を形成し得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９のようなヌクレアーゼを標的配列へと誘導し、ガイドＲＮＡが標的配列にハイブリダイズし、ヌクレアーゼが標的配列を切断する。
【００６５】
本明細書において使用されるとき、「インデル」は、核酸の二重鎖切断（ＤＳＢ）の部位において挿入されるかまたは欠失するかのいずれかである多数のヌクレオチドからなる挿入／欠失変異を指す。
【００６６】
本明細書において使用されるとき、「切り取りフラグメント」は、２つ以上のガイドＲＮＡが、ＣａｓのｍＲＮＡまたはタンパク質と共に使用されるときに起こり得る、連続する数のヌクレオチドの欠失を指す。
【００６７】
組成物
ＦＥＣＤの治療に有用な組成物を記載する。いくつかの態様において、組成物は、ヌクレアーゼをＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲへと誘導し、それによってＴＮＲを切断し、それによって、ＦＥＣＤ、ＰＰＣＤ、ＰＳＣ、および統合失調症を含むＴＣＦ４遺伝子内にＴＮＲを有する疾患を治療するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ヌクレアーゼをＴＣＦ４のイントロン３内の第１および第２の位置へと誘導する２つのガイドＲＮＡを含み、ヌクレアーゼが第１および第２の位置でＴＣＦ４のイントロン３を切断し、第１および第２の位置の間の核酸フラグメントを切り取り、それによってＴＣＦ４のイントロン３内に含まれるＴＮＲのいくらかまたは全てを切り取り、ＦＥＣＤ、ＰＰＣＤ、ＰＳＣ、および統合失調症を含むＴＣＦ４遺伝子内にＴＮＲを有する疾患を治療する。他の態様において、組成物は、標的配列を介してヌクレアーゼをＣＯＬ８Ａ２遺伝子に誘導し、それによって、配列を切断し、インデルの導入をもたらすことを目的としてＮＨＥＪを媒介するか、またはＨＲもしくはＨＤＲを媒介して、テンプレートの使用によりＤＮＡにおける変異を修正することができ、ＦＥＣＤまたはＰＰＣＤを治療するガイドＲＮＡを含む。組成物の実施形態が以下に記載される。
【００６８】
ガイドＲＮＡ
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、Ｃａｓ９等のヌクレアーゼを標的ＤＮＡ配列に誘導するガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含む。本明細書において記載される各々の組成物および方法の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、１つのＲＮＡ上で会合し得る（ｓｇＲＮＡ）か、または別々のＲＮＡ上で分離し得る（ｄｇＲＮＡ）。
【００６９】
本明細書において記載される組成物および方法の各々の実施形態において、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含み得る。ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子、およびｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子を含む。第１および第２のＲＮＡ分子は共有結合していないが、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡ上のフラッグポール領域間での塩基対形成を介してＲＮＡ二本鎖を形成できる。
【００７０】
本明細書において記載される組成物および方法の各々の実施形態において、ガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」として単一のＲＮＡ分子を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡに共有結合したｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合される。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡ形態は、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡ上のフラッグポール領域間の塩基対形成を介してステムループ構造を形成する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来の野生型ｔｒＲＮＡ配列の全てまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、短縮型または修飾された野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに依存する。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。ある実施形態において、ｔｒＲＮＡは少なくとも２６ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、ｔｒＲＮＡは少なくとも４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ｔｒＲＮＡは、例えば１つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造等のいくつかの二次構造を含み得る。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは化学修飾されている。標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵ残基の代わりに、またはそれらに加えて用いられる１つ以上の非天然および／または天然に存在する構成要素または構造の存在を記載するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、非標準のヌクレオシドまたはヌクレオチドによって合成され、本明細書において「修飾された」と呼ばれる。修正ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは（ｉ）ホスホジエステル骨格結合における改変、例えば、非架橋のリン酸酸素の１つもしくは両方、および／または、架橋リン酸酸素の１つ以上の置き換え（例示的な骨格修飾の）、（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの改変、例えば、置き換え（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）リン酸部分の「脱リン酸型」リンカーによる大規模な置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準的な核酸塩基を含む天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボースリン酸骨格の置き換えまたは修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、または置き換え、部分、キャップ、またはリンカーの結合（そのような３’または５’のキャップ修飾は、糖および／または骨格の修飾を含み得る）、ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置き換え（例示的な糖修飾）の１つ以上を含み得る。
【００７３】
上に列挙される修飾を組み合せて、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の修飾を有し得るヌクレオシドおよびヌクレオチド（まとめて「残基」）を含む修飾ｇＲＮＡを提供することができる。例えば修飾残基は、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡの各々の塩基は修飾され、例えば、全ての塩基がホスホロチオエート基等の修飾リン酸基を有する。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て、または実質的に全てがホスホロチオエート基によって置き換えられる。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の修飾残基を含む。いくつかの実施形態において、修飾ｇＲＮＡ内の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）の位置が修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドである。
【００７５】
非修飾核酸は、例えば細胞ヌクレアーゼによって分解する傾向がある場合がある。例えば、ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様において、本明細書において記載されるｇＲＮＡは、例えば、ヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される修飾ｇＲＮＡ分子は、インビボとエクスビボの両方において細胞集団に導入されるとき、低減した自然免疫応答を示し得る。用語「自然免疫応答」は、サイトカイン発現および放出の誘導、特にインターフェロンおよび細胞死を含む、一本鎖核酸を含む外来性核酸に対する細胞応答を含む。
【００７６】
骨格修飾のいくつかの実施形態において、修飾残基のリン酸基は、１つ以上の酸素を異なる置換基によって置き換えることによって修飾され得る。さらに、修飾残基、例えば修飾核酸中に存在する修飾残基は、本明細書において記載されるように、非修飾リン酸部分の修飾リン酸基による大規模な置き換えを含み得る。いくつかの実施形態において、リン酸骨格の骨格修飾は、非荷電のリンカーまたは非対称電荷分布の荷電のリンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
【００７７】
修飾リン酸基の例は、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルを含む。非修飾リン酸基中のリン酸原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子または原子群のうちの１つによる置き換えは、リン原子をキラルにすることができる。立体リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書においてＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書においてＳｐ）のいずれかを有し得る。骨格は、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）による置き換えによってもまた修飾できる。置き換えは、いずれかの架橋酸素または両方の架橋酸素において生じ得る。
【００７８】
リン酸基は、ある骨格修飾において、非リン含有連結基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態において、荷電リン酸基は、中性部分によって置き換えることができる。リン酸基を置き換えることのできる部分の例は、非限定的に、例えば、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スフホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ（methylenehydrazo）、メチレンジメチルヒドラゾ（methylenedimethylhydrazo）、メチレンオキシメチルイミノ（methyleneoxymethylimino）を含み得る。
【００７９】
リン酸リンカーとリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドの代替物によって置き換えられている核酸を模倣できるスキャフォールドもまた構築できる。そのような修飾は、骨格および糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、代替骨格によって係留され得る。例は、非限定的に、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）核酸塩基代替物を含み得る。
【００８０】
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖基に対する１つ以上の修飾、すなわち糖修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾することができ、例えば、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが２’−アルコキシドイオンを形成するようにさらに脱プロトン化されることがもはや起こり得ないので、核酸の安定性を増強し得る。
【００８１】
２’ヒドロキシル基修飾の例は、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中「Ｒ」が、例えばアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲであって、式中Ｒが、例えば、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルであり、ｎが０〜２０の整数であり得るもの（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）を含み得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅであり得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、２’−ヒドロキシル基をフッ素で置き換える２’−フルオロ修飾であり得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えばＣ１−６アルキレンまたはＣ１−６ヘテロアルキレン架橋を介して、同一のリボース糖の４’炭素へと結合する、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）であり得、ここで、例示的な架橋は、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋、Ｏ−アミノ（ここでアミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ（ここでアミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）を含み得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’〜Ｃ３’結合を欠く、「アンロックド」核酸（ＵＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は,メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えばＰＥＧ誘導体）を含み得る。
【００８２】
「デオキシ」'２’修飾は、水素（すなわち、デオキシリボース糖、例えば、部分的なｄｓＲＮＡの突出部分）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）、アミノ（ここでアミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（ここでアミノは、例えば、本明細書において記載されるようなものである）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（ここでＲは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、シアノ、メルカプト、アルキル−チオ−アルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルを含み得、任意選択で、例えば本明細書において記載されるようなアミノによって置換されていてもよい。
【００８３】
糖修飾は、１つ以上の炭素を含んでもよく、リボースにおける対応する炭素のものとは反対の立体化学配置を有する糖基を含み得る。したがって、修飾核酸は、糖として例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖をも含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成要素の糖原子の１つ以上においてさらに修飾され得る。修飾核酸はまた、Ｌ−型にある１つ以上の糖、例えばＬ−ヌクレオシドを含み得る。
【００８４】
修飾核酸に組み込むことのできる本明細書において記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含むが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾されて、または完全に置き換えられて、修飾核酸に組み込むことのできる修飾残基をもたらすことができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリン類似体、またはピリミジン類似体から選択することができる。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、例えば、天然に存在する塩基、および塩基の合成誘導体を含み得る。
【００８５】
デュアルガイドＲＮＡを用いる実施形態において、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの各々は、修飾を含み得る。このような修飾は、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡの一方または両方の末端に存在してもよい。ｓｇＲＮＡを含む実施形態において、ｓｇＲＮＡの一方または両方の末端における１つ以上の残基は、化学修飾されていてもよく、またはｓｇＲＮＡ全体が化学修飾されていてもよい。ある実施形態は、５’末端修飾を含む。ある実施形態は、３’末端修飾を含む。ある実施形態において、ガイドＲＮＡ分子の一本鎖突出におけるヌクレオチドの１つ以上またはその全ては、デオキシヌクレオチドである。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるガイドＲＮＡは、２０１６年１２月８日に出願された「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡｓ」と題するＵＳ６２／４３１，７５６に開示された修飾パターンの１つを含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本発明は、１つ以上の修飾を含むｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、修飾は、ホスホロチオエート（ＰＳ）のヌクレオチド間結合を含む。
【００８８】
用語「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」という用語は、２’−Ｏ−Ｍｅによって修飾されているヌクレオチドを表すために使用され得る。
【００８９】
２’−Ｏ−メチルの修飾は、以下のように描写され得る。
【化１】
2019515914.tif 000006
【００９０】
ヌクレオチド糖環に影響を及ぼすことが示されている別の化学修飾はハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環上の２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性およびヌクレアーゼ安定性を増加させ得る。
【００９１】
本出願において、用語「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」、または「ｆＧ」は、２’−Ｆによって置換されているヌクレオチドを表すために使用され得る。
【００９２】
２’−Ｆの置換は、以下のように描写され得る。
【化２】
2019515914.tif 000007
【００９３】
ホスホロチオエート（ＰＳ）結合または結合は、例えばヌクレオチド塩基間の結合におけるホスホジエステル結合内の１つの非架橋リン酸酸素を硫黄が置換している結合を指す。ホスホロチオエートがオリゴヌクレオチドを生成するために使用されるとき、修飾オリゴヌクレオチドはＳ−オリゴとも称され得る。
【００９４】
「＊」は、ＰＳ修飾を描写するために使用され得る。本出願において、用語Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊は、ＰＳ結合を有するヌクレオチドの次（例えば３’）に連結するヌクレオチドを表すために使用され得る。
【００９５】
本出願において、用語「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」は、ＰＳ結合を有するヌクレオチドの次（例えば３’）に連結する、２’−Ｏ−Ｍｅによって置換されているヌクレオチドを表すために使用され得る。
【００９６】
下の図は、非架橋リン酸酸素へのＳ−の置換を示し、ホスホジエステル結合の代わりにＰＳ結合を生じる：
【化３】
2019515914.tif 000008
【００９７】
脱塩基ヌクレオチドは、窒素塩基を欠くものを指す。以下の図は、塩基を欠く脱塩基（脱プリンとしても知られる）部位を有するオリゴヌクレオチドを描写する。
【化４】
2019515914.tif 000009
【００９８】
反転（inverted）塩基は、通常の５’から３’への結合とは反転した結合を有するものを指す（すなわち、５’から５’への結合または３’から３’への結合のいずれか）。例えば、
【化５】
2019515914.tif 000010
【００９９】
脱塩基ヌクレオチドは、反転結合と結合することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’から５’への結合を介して末端５’ヌクレオチドに結合することができ、または脱塩基ヌクレオチドは３’から３’への結合を介して末端３’ヌクレオチドに結合することができる。末端５’または３’ヌクレオチドのいずれかにおける反転脱塩基ヌクレオチドはまた、反転脱塩基末端キャップと称され得る。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの５’末端における最初の３つ、４つ、または５つのヌクレオチドの１つ以上、および３’末端における最後の３つ、４つ、または５つのヌクレオチドの１つ以上が修飾されている。いくつかの実施形態において、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ、反転脱塩基ヌクレオチド、ＰＳ結合、または安定性および／もしくは性能を増加させることが当該技術分野において周知の他のヌクレオチド修飾である。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、５’末端における最初の4つのヌクレオチド、および３’末端における最後の４つのヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合と連結される。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、５’末端における最初の３つのヌクレオチド、および３’末端における最後の３つのヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、５’末端における最初の３つのヌクレオチド、および３’末端における最後の３つのヌクレオチドは、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、５’末端における最初の３つのヌクレオチド、および３’末端における最後の３つのヌクレオチドは、反転脱塩基ヌクレオチドを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、修飾ｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号１０８６に示される修飾パターンを含み、ここでＮは任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、Ｎの全体は、ＴＣ４標的配列にヌクレアーゼを誘導する本明細書に記載されるようなガイド配列を含む。
【０１０４】
ＴＣＦ４に対するガイドＲＮＡ
いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１〜１９０の核酸のうちの任意の１つに相補的なガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１〜１９０の核酸のうちの任意の１つにヌクレアーゼを誘導するガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一態様において、組成物は、配列番号１〜１９０の核酸のうちの任意のものと、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である標的配列に相補的なガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。一態様において、組成物は、配列番号１〜１９０の核酸のうちの任意のものと、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である標的配列にヌクレアーゼを誘導するガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。
【０１０５】
いくつかの態様において、組成物は、配列番号１０８９〜１２７８の核酸のうちの任意のものと、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。いくつかの態様において、組成物は、配列番号１０８９〜１２７８の核酸のうちの任意のものに同一なガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。
【０１０６】
他の実施形態において、組成物は、配列番号１〜１９０の核酸のうちの任意の２つ以上から選択される標的配列の任意の１つに相補的な少なくとも２つのガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１〜１９０の核酸のうちの任意のものと、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である核酸の任意の２つ以上から選択される標的配列の任意の１つの相補的な少なくとも２つのガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ＴＣＦ４のＴＮＲの５’の配列を標的化するｇＲＮＡは、ＴＣＦ４のＴＮＲを切り取ることを目的として、ＴＣＦ４のＴＮＲの３’の配列を標的化するｇＲＮＡと共に使用される。いくつかの実施形態において、配列番号１〜９３の標的配列に相補的なガイド配列は、配列番号９４〜１９０の標的配列に相補的なガイド配列と共に使用される。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ＴＣＦ４のＴＮＲの５’の配列を標的化するｇＲＮＡは、ＴＣＦ４のＴＮＲの３’の配列を標的化するｇＲＮＡと共に、過伸長したＴＮＲ配列を有する患者においてＴＣＦ４のイントロン３内のＴＮＲの完全長の配列を切り取る。例えば、いくつかの実施形態において、ＴＮＲ過伸長に対して５’および３’の配列を標的化するｇＲＮＡの組み合わせは、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、もしくは少なくとも１０００、またはそれ以上のリピートを有するＴＮＲを切りとる。いくつかの実施形態において、このアプローチは、４０を超える数のＴＮＲ過伸長を切り取るために使用される。いくつかの実施形態において、ＴＣＦ４のＴＮＲの５’の配列を標的化するｇＲＮＡをＴＮＲリピート内を標的化するｇＲＮＡと共に使用すること、またはＴＮＲリピート内を標的化するｇＲＮＡをＴＣＦ４のＴＮＲの３’の配列を標的化するｇＲＮＡと共に使用することは、過伸長したＴＮＲ配列を有する患者においてＴＣＦ４のイントロン内の過伸長したＴＮＲの一部を切り取り、それによって、ＴＮＲの長さを短くする。いくつかの実施形態において、１つのガイドＲＮＡは、ＴＣＦ４のＴＮＲの５’の配列を標的化し、他方のガイドＲＮＡがＴＣＦ４のＴＮＲの３’の配列を標的化し、それによってＴＮＲの全てを切り取る。
【０１０９】
ＴＣＦ４を標的化する２つ以上のガイドＲＮＡの組み合わせ
ある実施形態において、組成物は２つ以上のｇＲＮＡを含む。各々のｇＲＮＡは、異なるガイド配列を含み得、関連するヌクレアーゼが１つを超える標的配列を切断するようにする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ複合体内の活性または安定性等の、同一または異なる特性を有し得る。１つを超えるｇＲＮＡが使用されるベクターを含むいくつかの実施形態において、各々のｇＲＮＡは同一または異なるベクター上にコードされ得る。１つを超えるｇＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同一であっても異なっていてもよい。脂質ナノ粒子を含むある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡは、同一の脂質ナノ粒子または別個の脂質ナノ粒子中で製剤化され得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、各々のｇＲＮＡのガイド配列は、ＴＣＦ４遺伝子の同一鎖内の標的配列に相補的である。いくつかの実施形態において、各々のｇＲＮＡのガイド配列は、ＴＣＦ４遺伝子のプラス鎖内の標的配列に相補的である。いくつかの態様において、各々のｇＲＮＡのガイド配列は、ＴＣＦ４遺伝子のマイナス鎖内の標的配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡのガイド配列は、ＴＣＦ４遺伝子の反対の鎖内の標的配列に相補的である。
【０１１１】
いくつかの態様において、組成物は少なくとも２つのｇＲＮＡを含み、少なくとも２つのｇＲＮＡは、２つの異なる位置にヌクレアーゼを誘導するガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、２つのｇＲＮＡは、ＴＣＦ４遺伝子のＴＮＲに隣接し得る（すなわち、２つのｇＲＮＡは、ＴＮＲのいずれかの側に存在し、別言すれば、１つのｇＲＮＡがＴＮＲに対して５’であり、別のｇＲＮＡがＴＮＲに対して３’である）。いくつかの実施形態において、１つのｇＲＮＡは、ＴＣＦ４遺伝子のＴＮＲ内にあり、他のｇＲＮＡは、ＴＣＦ４遺伝子のＴＮＲの外側にある（すなわち、ＴＮＲに隣接する）。いくつかの実施形態において、２つのｇＲＮＡは、約３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、または３０ヌクレオチド離れた標的配列にヌクレアーゼを誘導する。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは各々の位置を切断し、ＴＣＦ４のイントロン３のＴＮＲ過伸長領域を含むＤＮＡフラグメントが切り取られる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、１つのｇＲＮＡのみが使用される。いくつかの実施形態において、ＴＣＦ４のＴＮＲの５’の配列を標的化するｇＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、配列番号１〜９３の標的配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ＴＣＦ４のＴＮＲの３’の配列を標的化するｇＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態において、配列番号９４〜１９０の標的配列に相補的なガイドが使用される。いくつかの実施形態において、ＴＣＦ４内のＴＮＲリピート過伸長内の配列を標的化するｇＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態において、シングルガイドの使用は、ＴＮＲ配列を低減または排除するＮＨＥＪ中のインデル形成をもたらす。いくつかの実施形態において、シングルガイドの使用は、ＴＮＲ配列の一部を低減または排除するＮＨＥＪ中のインデル形成をもたらす。
【０１１３】
ＣＯＬ８Ａ２に対するガイドＲＮＡ
いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１９１〜１０８４の核酸のうちの任意のものに相補的なガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一態様において、組成物は、配列番号１９１〜１０８４の核酸のうちの任意のものと、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である標的配列に相補的なガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。
【０１１４】
他の実施形態において、組成物は、配列番号１９１〜１０８４の核酸のうちの任意の２つ以上に相補的な少なくとも２つのガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１９１〜１０８４の核酸の配列と、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である核酸の任意の２つ以上に相補的な少なくとも２つのガイド配列を含むか、またはそれらからなる少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、公知の変異を有さない野生型ＣＯＬ８Ａ２内の配列を標的化するｇＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態において、配列番号１９１〜１０６３の標的配列に相補的なガイド配列が使用される。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ変異を生成することが知られているＣＯＬ８Ａ２における変異に対応する配列を標的化するｇＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態において、配列番号１０６４〜１０６９の標的配列に相補的なガイド配列が、例えば、ｃ．１３６４Ｃ＞Ａのヌクレオチド変化によって引き起こされるＧｌｎ４５５Ｌｙｓ変異の選択的な編集をするのに使用される。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ変異を生成することが知られているＣＯＬ８Ａ２における変異に対応する配列を標的化するｇＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態において、配列番号１０７０〜１０７５の標的配列に相補的なガイド配列が、例えば、ｃ．１３６３−１３６４ＣＡ＞ＧＴのヌクレオチド変化によって引き起こされるＧｌｎ４５５Ｖａｌ変異の選択的な編集をするのに使用される。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、Ｌｅｕ４５０Ｔｒｐ変異を生成することが知られているＣＯＬ８Ａ２における変異に対応する配列を標的化するｇＲＮＡが使用される。いくつかの実施形態において、配列番号１０７６〜１０８４の標的配列に相補的なガイド配列が、例えば、ｃ．１３４９Ｔ＞Ｇのヌクレオチド変化によって引き起こされるＬｅｕ４５０Ｔｒｐ変異の選択的な編集をするのに使用される。
【０１１９】
標的配列
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡはＣＯＬ８Ａ２遺伝子にヌクレアーゼを誘導する。いくつかの態様において、ｃｒＲＮＡは、ＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲに隣接する標的配列に相補的であり、それらにハイブリダイズするガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、２つのｇＲＮＡが利用される。このような実施形態において、２つのｇＲＮＡは、ＴＣＦ４遺伝子のＴＮＲに隣接し得る（すなわち２つのｇＲＮＡはＴＮＲのいずれかの側に存在する）。いくつかの実施形態において、１つのｇＲＮＡは、ＴＣＦ４遺伝子のＴＮＲ内にあり、他のｇＲＮＡは、ＴＮＲの外側にあり、（すなわち隣接する）ＴＣＦ４遺伝子のＴＮＲ。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ｔｒＲＮＡの一部に相補的であり、それとハイブリダイズするフラッグポール領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡは、細菌のＣＲＩＳＰＲ座位から転写される天然に存在するｃｒＲＮＡの構造と同等であり得、ここではガイド配列がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの「スペーサー」として作用し、フラッグポールがＣＲＩＳＰＲ座位上のスペーサーに隣接するリピート配列の一部に対応する。
【０１２０】
ＴＣＦ４に対する標的配列
本発明の組成物は、ＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲ内のまたは隣接する標的配列に誘導され、それを切断することができる。例えば、ＴＮＲ標的配列は、提供されるヌクレアーゼによって認識および切断され得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡによってＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲに隣接する標的配列に誘導され得、ここではガイドＲＮＡのガイド配列が標的配列またはその逆の相補体にハイブリダイズし、標的配列を切断するようにＣａｓタンパク質を誘導する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡによってＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲ内の標的配列に誘導され得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、１つを超えるガイドＲＮＡによってＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲに隣接する２つの標的配列に誘導され得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、１つを超えるガイドＲＮＡによって２つの標的配列に誘導され得、ここでは、１つがＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲに隣接し、別のものが、ＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲ内に存在する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲ近傍の標的配列に基づいて決定される。例えば、いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡは、ＴＣＦ４遺伝子内のＴＮＲに隣接する標的配列に相補的であるガイドを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１〜１９０から選択される標的配列に相補的であり、それらにハイブリダイズする。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、標的配列はガイドＲＮＡのガイド配列に相補的であり得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡのガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の度合いは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態において、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態において、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、少なくとも１つのミスマッチを含み得る。例えば、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のミスマッチを含み得、ここでガイド配列の全長は約２０である。いくつかの実施形態において、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１〜６のミスマッチを含み得、ここでガイド配列は約２０の核酸である。いくつかの実施形態において、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１または２のミスマッチを含み得、ここでガイド配列や約２０の核酸である。
【０１２３】
標的配列の長さは、使用されるヌクレアーゼシステムに依存し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのための標的配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０または５０を超えるヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、１８〜２４ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、１９〜２１ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、２０ヌクレオチドを含み得る。ニッカーゼが使用されるとき、標的配列は、ＤＮＡ分子の対向する鎖上の一対のニッカーゼによって認識される一対の標的配列を含み得る。
【０１２４】
ＣＯＬ８Ａ２のための標的配列
本発明の組成物は、ＣＯＬ８Ａ２遺伝子内の標的配列に誘導され得る。例えば、ＣＯＬ８Ａ２標的配列は、提供されるヌクレアーゼによって認識および切断され得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡによってＣＯＬ８Ａ２の標的配列へと誘導されてもよく、そこでは、ガイドＲＮＡのガイド配列が標的配列にハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質が標的配列を切断する。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ＣＯＬ８Ａ２遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１９１〜１０８４から選択される標的配列に相補的であり、それらにハイブリダイズする。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ＶＩＩＩ型コラーゲンのαサブユニット（ＣＯＬ８Ａ２）の異常な機能をもたらす公知の変異を有さない野生型ＣＯＬ８Ａ２遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１９１〜１０６３から選択される標的配列に相補的であり、それらにハイブリダイズする。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ｃ．１３６４＞Ａヌクレオチド変化によって引き起こされるＣＯＬ８Ａ２タンパク質におけるＧｌｎ４５５Ｌｙｓ変異に対応するＣＯＬ８Ａ２遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１０６４〜１０６９から選択される標的配列に相補的であり、それらにハイブリダイズする。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ｃ．１３６３〜１３６４ＣＡ＞ＧＴヌクレオチド変化によって引き起こされるＣＯＬ８Ａ２タンパク質におけるＧｌｎ４５５Ｖａｌ変異に対応するＣＯＬ８Ａ２遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１０７０〜１０７５から選択される標的配列に相補的であり、それらにハイブリダイズする。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ｃ．１３４９Ｔ＞Ｇヌクレオチド変化によって引き起こされるＣＯＬ８Ａ２タンパク質におけるＬｅｕ４５０Ｔｒｐ変異に対応するＣＯＬ８Ａ２遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１０７６〜１０８４から選択される標的配列に相補的であり、それらにハイブリダイズする。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、標的配列はガイドＲＮＡのガイド配列に相補的であり得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡのガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の度合いは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態において、標的配列とｇＲＮＡの標的配列とは１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態において、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、少なくとも１つのミスマッチを含み得る。例えば、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のミスマッチを含み得、ここでガイド配列の全長は約２０である。いくつかの実施形態において、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１〜６のミスマッチを含み得、ここでガイド配列は約２０の核酸である。いくつかの実施形態において、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１または２のミスマッチを含み得、ここでガイド配列や約２０の核酸である。
【０１３１】
標的配列の長さは、使用されるヌクレアーゼシステムに依存し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのための標的配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０または５０を超えるヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、１８〜２４ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、１９〜２１ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、標的配列は、２０ヌクレオチドを含み得る。標的配列はＰＡＭを含み得る。ニッカーゼが使用されるとき、標的配列は、ＤＮＡ分子の反対の鎖上の一対のニッカーゼによって認識される一対の標的配列を含み得る。
【０１３２】
ベクター
本発明のある実施形態において、組成物は本明細書において記載されるガイドＲＮＡの任意のものをコードするＤＮＡベクターを含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ配列に加えて、ベクターは、ガイドＲＮＡをコードしない核酸をさらに含む。ガイドＲＮＡをコードしない核酸は、プロモーター、エンハンサー、制御配列、およびＣａｓ９等のヌクレアーゼをコードする核酸を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからの反復配列の全てまたは一部によって隣接されるガイド配列を含むか、またはそれらからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含むか、またはそれらからなる核酸は、さらにベクター配列を含み得、ここで、ベクター配列は、自然状態ではｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡと共に見出されない核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、１つのベクター内の非連続核酸によってコードされる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、連続核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一の核酸の反対側の鎖によってコードされる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一の核酸の同一の鎖によってコードされる。いくつかの実施形態において、ベクターは１つ以上のｓｇＲＮＡをコードする。他の実施形態において、ベクターは２つ以上のｓｇＲＮＡをコードする。
【０１３４】
ヌクレアーゼ
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｇＲＮＡに加えて、組成物はヌクレアーゼをさらに含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼと共にリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と呼ばれる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼはＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と共にＣａｓ  ＲＮＰと呼ばれる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の構成要素を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣｐｆ１である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９と共にＣａｓ９  ＲＮＰと呼ばれる。
【０１３５】
Ｃａｓヌクレアーゼを包含する実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型システム由来であり得る。Ｃａｓヌクレアーゼまたは他のＲＮＰ構成要素が由来し得る非限定的な例示的種は、Streptococcus pyogenes、Streptococcus thermophilus、Streptococcus sp.、Staphylococcus aureus、Listeria innocua、Lactobacillus gasseri、Francisella novicida、Wolinella succinogenes、Sutterella wadsworthensis、Gammaproteobacterium、Neisseria meningitidis、Campylobacter jejuni、Pasteurella multocida、Fibrobacter succinogene、Rhodospirillum rubrum、Nocardiopsis dassonvillei、Streptomyces pristinaespiralis、Streptomyces viridochromogenes、Streptomyces viridochromogenes、Streptosporangium roseum、Streptosporangium roseum、Alicyclobacillus acidocaldarius、Bacillus pseudomycoides、Bacillus selenitireducens、Exiguobacterium sibiricum、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus buchneri、Treponema denticola、Microscilla marina、Burkholderiales bacterium、Polaromonas naphthalenivorans、Polaromonas sp.、Crocosphaera watsonii、Cyanothece sp.、Microcystis aeruginosa、Synechococcus sp.、Acetohalobium arabaticum、Ammonifex degensii、Caldicelulosiruptor becscii、Candidatus Desulforudis、Clostridium botulinum、Clostridium difficile、Finegoldia magna、Natranaerobius thermophilus、Pelotomaculum thermopropionicum、Acidithiobacillus caldus、Acidithiobacillus ferrooxidans、Allochromatium vinosum、Marinobacter sp.、Nitrosococcus halophilus、Nitrosococcus watsoni、Pseudoalteromonas haloplanktis、Ktedonobacter racemifer、Methanohalobium evestigatum、Anabaena variabilis、Nodularia spumigena、Nostoc sp.、Arthrospira maxima、Arthrospira platensis、Arthrospira sp.、Lyngbya sp.、Microcoleus chthonoplastes、Oscillatoria sp.、Petrotoga mobilis、Thermosipho africanus、Streptococcus pasteurianus、Neisseria cinerea、Campylobacter lari、Parvibaculum lavamentivorans、Corynebacterium diphtheria、Acidaminococcus sp.、Lachnospiraceae bacterium ND2006、およびAcaryochloris marinaを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Streptococcus pyogenes由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Streptococcus thermophilus由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Neisseria meningitidis由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Staphylococcus aureus由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Francisella novicida由来のＣｐｆ１タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Acidaminococcus sp由来のＣｐｆ１タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Lachnospiraceae bacterium ND2006由来のＣｐｆ１タンパク質である。
【０１３６】
野生型Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドアカメン（doacmain）：ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。ＲｕｖＣドメインは、非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインはＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、１つを超えるＲｕｖＣドメインおよび／または１つを超えるＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９である。組成物および方法の実施形態の各々において、Ｃａｓは標的ＤＮＡにおける二重鎖切断を誘導する。
【０１３７】
ＲｕｖＣまたはＨＮＨのいずれかの１つの触媒ドメインを有するＣａｓ９の修飾バージョンは不活性であり、「ニッカーゼ」と呼ばれる。ニッカーゼは、標的ＤＮＡ上の１つの鎖のみを切断し、したがって一本鎖切断を生じる。一本鎖切断はまた、「ニック」としても知られ得る。いくつかの実施形態において、組成物および方法はニッカーゼを含む。いくつかの実施形態において、組成物および方法は、標的ＤＮＡ中の二鎖破断ではなく、ニックを誘導するニッカーゼＣａｓ９を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、１つの機能的ヌクレアーゼドメインのみを含むよう修飾され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つが、その核酸切断活性を低減させるために変異または完全にもしくは部分的に欠失しているように修飾され得る。いくつかの実施形態において、低減した活性を有するＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。いくつかの実施形態において、不活性なＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。いくつかの実施形態において、低減した活性を有するＨＮＨドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。いくつかの実施形態において、不活性なＨＮＨドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低減または改変するために置換されている。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸置換を含み得る。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換は、Ｄ１０Ａ（S. pyogenesのＣａｓ９タンパク質に基づく）を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸置換を含み得る。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換は、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、およびＤ９８６Ａ（S. pyogenesのＣａｓ９タンパク質に基づく）を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、組成物は、ニッカーゼおよび一対のガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、一対のガイドＲＮＡは、それぞれ、標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖に相補的である。この実施形態において、ガイドＲＮＡは、ニッカーゼを標的配列に誘導し、標的配列の反対側の鎖にニックを生じる（すなわち二重ニッキング）ことによってＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態において、二重ニッキングの使用は、特異性を改善し、オフターゲット効果を低減する。いくつかの実施形態において、ニッカーゼＣａｓは、ＤＮＡの反対側の鎖を標的化する２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用され、標的ＤＮＡに二重ニックを生成する。いくつかの実施形態において、ニッカーゼＣａｓは、ごく接近した位置にあるよう選択された２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用され、標的ＤＮＡに二重ニックを生成する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、キメラＣａｓタンパク質が使用され、ここでタンパク質の１つのドメインまたは領域が異なるタンパク質の一部によって置き換えられている。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１等の異なるヌクレアーゼ由来のドメインと置き換えられてもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は修飾ヌクレアーゼであり得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、-Ｃａｓ９−デアミナーゼ融合が使用され、Ｃａｓ９は二本鎖ＤＮＡを切断することができない（ｄＣａｓ９）。用語「デアミナーゼ」は、脱アミノ化反応を触媒する酵素を指す。いくつかの実施形態において、デアミナーゼは、シチジン（Ｃ）を、続いて細胞によってチミジン（Ｔ）に変換されるウラシル（Ｕ）に変換するシチジンデアミナーゼである。いくつかの実施形態において、デアミナーゼは、グアニン（Ｇ）を、続いて細胞によってアデニン（Ａ）に変換されるキサンチンに変換するグアニンデアミナーゼである。いくつかの実施形態において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１ファミリーデアミナーゼ、活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、およびＡＤＡＴファミリーデアミナーゼ等のアデノシンデアミナーゼ、またはアデニン（Ａ）を、続いて細胞によってグアニン（Ｇ）に変換されるヒポキサンチンに変換するＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である。
【０１４３】
他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＲＮＡ切断活性を有し得る。
【０１４４】
ＰＡＭ
いくつかの実施形態において、標的配列は、ＰＡＭに隣接し得る。いくつかの実施形態において、ＰＡＭは、標的配列の３’末端に隣接するか、またはその１、２、３、または４ヌクレオチド以内にあり得る。ＰＡＭの長さおよび配列は、使用されるＣａｓタンパク質に依存し得る。例えば、ＰＡＭは、コンセンサス配列または、特定のＣａｓ９タンパク質もしくはＣａｓ９オーソログに対する特定のＰＡＭ配列から選択することができ、参照により本明細書に組み込まれる、Ran et al., Nature 520:186-191(2015)の図１に開示されるものを含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＭは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長を含み得る。非限定的な例示的なＰＡＭ配列は、NGG、NAG、NGA、NGAG、NGCG、NNGRRT、TTN、NGGNG、NG、NAAAAN、NNAAAAW、NNNNACA、GNNNCNNA、およびNNNNGATTを含む（ここでＮは、いずれかのヌクレオチドとして定義され、Ｗは、ＡまたはＴのいずれかとして定義され、ＲはＡまたはＧのいずれかとして定義される）。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列はＮＧＧであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列はNGGNGであり得る。いくつかの実施形態において、ＰＡＭ配列はNNAAAAWであり得る。
【０１４５】
ＴＮＲを切り取る方法
ＴＣＦ４内のＴＮＲは、ＦＥＣＤの増大するリスクと相関している。さらに、ＴＣＦ４の変異は統合失調症およびＰＳＣと関連している。Ｃａｓタンパク質（またはＣａｓタンパク質をコードする核酸）と共にガイドＲＮＡを送達することが、例えば、ＴＣＦ４遺伝子からＴＮＲ（またはそれらの一部）を切り取ることによって、これらの障害の治療として使用され得る。したがって、本明細書において提供されるある実施形態は、ＴＣＦ４からＴＮＲを切り取る方法を含む。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書の表２に提供される標的配列にヌクレアーゼを誘導する１つ以上のｇＲＮＡを含む本明細書において提供されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ組成物のいずれか１つを細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、２つのｇＲＮＡをＣａｓタンパク質（またはＣａｓタンパク質をコードする核酸）と共に細胞に送達することを含み、ここで第１のｇＲＮＡは、ＴＮＲの５’領域を標的化し、配列番号１０８９〜１１８１からなる群から選択されるガイド配列を含み、第２のｇＲＮＡは、ＴＮＲの３’領域を標的化し、配列番号１１８２〜１２７８からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞はヒト細胞、例えば、ヒト角膜内皮細胞である。いくつかの実施形態において、方法は、集団のいくつかの画分がＴＣＦ４遺伝子から切り取られたＴＮＲを有する細胞の集団をもたらす。いくつかの実施形態において、集団内の、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％またはそれ以上の細胞がＴＣＦ４遺伝子から切り取られたＴＮＲを有する。細胞の集団内の切り取りパーセントを測定する方法は公知であり、本明細書において提供されるものを含み、例えば、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法、例えば、切り取りパーセントが、標的領域をオーバーラップする読み取りの全数によって割られた、ＴＮＲの欠失を含むシーケンシング読み取りの数によって定義される。
【０１４６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用は、ＤＮＡ中に二重鎖切断をもたらし得、または、ニッカーゼ酵素が使用される場合に、ＤＮＡ中に一本鎖切断をもたらし得る。
【０１４７】
ＮＨＥＪは、ＤＮＡ中の二本鎖切断（ＤＳＢ）が、切断末端の再連結によって修復されるプロセスであり、これは挿入／欠失（インデル）変異の形態でエラーを生成する可能性がある。したがって、コードエクソン内で生じるインデルが、フレームシフト変異および未成熟終止コドンをもたらす可能性があるので、ＮＨＥＪは、特定の遺伝子産物をノックアウトまたはそのレベルを低減する手段となり得る。
【０１４８】
ＨＲおよびＨＤＲは、外来性に導入された修復テンプレートの存在下で標的座位における、正確で定義された改変を生じるように強化できる、代替的な主要なＤＮＡ修復経路である。これは、単一塩基の変化、欠失、挿入、逆位、および他の変異を修正するのに使用できる。いくつかの場合において、修復プロセスを開始するためのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによる認識を避け、これによって修正された遺伝子内にインデル形成を防ぐためにＤＮＡ内にサイレントな（すなわち、同義の）ヌクレオチド変化を導入する修復テンプレートが使用される。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、テンプレートは、ＨＲにおいて、例えば、ＴＣＦ４および／またはＣＯＬ８Ａ２等の標的遺伝子を改変するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ＨＲはテンプレート配列またはテンプレート配列の一部の、標的核酸分子中への組込みをもたらすことができる。いくつかの実施形態において、単一のテンプレートが提供され得る。他の実施形態において、２つ以上のテンプレートが提供されてもよく、ＨＲが２つ以上の標的部位で生じ得るようになる。例えば、異なるテンプレートが、細胞内の単一の遺伝子を修復するため、または細胞内の２つの異なる遺伝子を修復するために提供され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのテンプレートの複数のコピーが細胞に提供される。いくつかの実施形態において、異なるテンプレートは、独立したコピー数または独立した量で提供され得る。
【０１５０】
他の実施形態において、テンプレートは、ＨＤＲにおいて、例えば、ＴＣＦ４および／またはＣＯＬ８Ａ２等の標的遺伝子を改変するために使用され得る。ＨＤＲは、核酸中の切断部位におけるＤＮＡストランド侵入を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＲは、編集された標的核酸分子中にテンプレート配列を含むことをもたらし得る。いくつかの実施形態において、単一のテンプレートが提供され得る。他の実施形態において、異なる配列を有する２つ以上のテンプレートが、ＨＤＲによって２つ以上の部位で使用され得る。例えば、異なるテンプレートが、細胞内の単一の遺伝子を修復するため、または細胞内の２つの異なる遺伝子を修復するために提供され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのテンプレートの複数のコピーが細胞に提供される。いくつかの実施形態において、異なるテンプレートは、独立したコピー数または独立した量で提供され得る。
【０１５１】
さらに他の実施形態において、テンプレートは、ＮＨＥＪによって媒介される遺伝子編集において、例えば、ＴＣＦ４および／またはＣＯＬ８Ａ２等の標的遺伝子を改変するために使用され得る。いくつかの実施形態において、テンプレート配列は、切断部位近傍の核酸配列に対して類似性を有さない。いくつかの実施形態において、テンプレートまたはテンプレート配列の一部が組み込まれる。いくつかの実施形態において、単一のテンプレートが提供され得る。他の実施形態において、異なる配列を有する２つ以上のテンプレートが、ＮＨＥＪによって２つ以上の部位に挿入され得る。例えば、異なるテンプレートが、細胞内で単一のテンプレートを挿入するため、または細胞内で２つの異なるテンプレートを挿入するために提供され得る。いくつかの実施形態において、異なるテンプレートは、独立したコピー数で提供され得る。いくつかの実施形態において、テンプレートは隣接する末端逆位（ＩＴＲ）配列を含む。
【０１５２】
テンプレートは任意の好適な長さであり得る。いくつかの実施形態において、テンプレートは、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、またはそれ以上のヌクレオチド長を含み得る。テンプレートは一本鎖核酸であり得る。テンプレートは、二本鎖または部分的に二本鎖の核酸であり得る。ある実施形態において、一本鎖テンプレートは、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態においてテンプレートは、標的配列を含む標的核酸分子の一部（すなわち「ホモロジーアーム」）に相補的である、核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、テンプレートは、標的核酸分子上の切断部位の上流または下流に位置する配列に相補的であるホモロジーアームを含み得る。いくつかの実施形態において、テンプレートは、それぞれ切断部位の上流および下流に位置する配列に相補的である第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアーム（第１および第２のヌクレオチド配列とも呼ばれる）を含み得る。テンプレートが２つのホモロジーアームを含む場合、各々のアームは同一の長さまたは異なる長さであり得、ホモロジーアーム間の配列は、ホモロジーアーム間の標的配列に実質的に類似または同一であり得るか、または全体的に無関係であり得る。いくつかの実施形態において、テンプレート上の第１のヌクレオチド配列と切断部位の上流の配列との間の相補性の程度、およびテンプレート上の第２のヌクレオチド配列と切断部位の下流の配列との間の相補性の程度は、テンプレートと標的核酸分子との間の相同組換え、例えば、高い忠実性の相同組換えを可能にし得る。いくつかの実施形態において、相補性の度合いは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態において、相補性の度合いは、約９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態において、相補性の度合いは、少なくとも９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態において、相補性の度合いは、１００％であり得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、テンプレートは、隣接する末端逆位（ＩＴＲ）配列を含むｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、テンプレートは、プラスミド、ミニサークル、ナノサークル、またはＰＣＲ産物として提供される。
【０１５４】
切り取りフラグメント
切り取りフラグメントの生成は、ＣＲＩＳＰＲ技術の力に、２つの標的配列間のＤＮＡの小領域を、それらの標的配列に相補的な２つのガイドＲＮＡの使用を通じて正確に除去することを付する手段である。いくつかの実施形態において、２つのガイドＲＮＡは、約３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、または３０ヌクレオチド離れた配列にヌクレアーゼを誘導し、標的配列間のＤＮＡフラグメントの切り取りを導く。
【０１５５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ組成物によるＦＥＣＤの治療
本明細書において記載される組成物のいずれも、ＦＥＣＤの増大したリスクを導く遺伝的変異を有する個体においてＦＥＣＤを治療するために対象に投与され得る。
【０１５６】
本明細書において記載される組成物のいずれも、ＴＣＦ４のイントロン３内のＴＮＲ過伸長を有する個体においてＦＥＣＤを治療するために対象に投与され得る。本明細書において記載される組成物のうちのいずれかを投与することを含むＦＥＣＤを治療する方法が包含される。いくつかの態様において、組成物は治療有効量で投与される。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物の１つ以上を投与することを含む、ＴＣＦ４のＴＮＲを、切り取る、変異導入する、そのコピー数を低減する、寛解する、および／または根絶する方法が包含される。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物の１つ以上を投与することを含む、対象の細胞当たり一方または両方のコピーのＴＣＦ４のＴＮＲを、切り取る、そのコピー数を低減する、寛解する、および／または根絶する方法が提供される。いくつかの実施形態において、細胞は角膜内皮細胞である。
【０１５７】
いくつかの態様において、本明細書において記載される組成物の１つ以上を投与することを含む、ＴＣＦ４のＲＮＡ毒性を低減、阻害、または寛解する方法が包含される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ毒性を阻害する方法は、本明細書において記載される組成物の１つ以上を投与することを包含し、ここで、ＴＣＦ４の毒性ＲＮＡ産物のレベルは治療後に投与前のレベルに戻らず、角膜内皮細胞に正常な機能を回復させ、細胞死を防ぐ。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、治療は、眼の前房へと送達される、適切なガイドまたは複数のガイドを含むベクターおよび／または脂質ナノ粒子によるものであってよい。いくつかの実施形態において、治療は、眼の後房へと送達される、適切なガイドまたは複数のガイドを含むベクターおよび／または脂質ナノ粒子によるものであってよい。いくつかの実施形態において、治療は、角膜自体へと送達される、適切なガイドまたは複数のガイドを含むベクターおよび／または脂質ナノ粒子によるものであってよい。いくつかの実施形態において、治療は、角膜実質へと送達される、適切なガイドまたは複数のガイドを含むベクターおよび／または脂質ナノ粒子によるものであってよい。いくつかの実施形態において、治療は、角膜縁へと送達される、適切なガイドまたは複数のガイドを含むベクターおよび／または脂質ナノ粒子によるものであってよい。いくつかの実施形態において、治療は、角膜の上皮表面上へと局所的に送達される、適切なガイドまたは複数のガイドを含むベクターおよび／または脂質ナノ粒子によるものであってよい。この段落の選好する実施形態および本明細書において記載される他の実施形態のいずれかにおいて、治療は、例えば脂質ナノ粒子を用いるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）の送達、またはベクターおよび／または脂質ナノ粒子を用いるＣａｓタンパク質をコードする核酸の送達をさらに含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子を用いる例として、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、適切なガイドまたは複数のガイドを送達するのに使用される、同一のベクターおよび／または脂質ナノ粒子を介して送達される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、適切なガイドまたは複数のガイドを送達するのに使用される、異なるベクターおよび／または脂質ナノ粒子を介して送達される。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ組成物の単回投与は、疾患と関連する根本的な遺伝的欠損または変異を修正するのに十分であり得る。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ治療の１回を超える投与は、累積効果を介して全ての標的細胞および全てのアレルにわたる編集を最大化するのに有益であり得る。
【０１６０】
ＦＥＣＤを治療するための医薬の調製のための本明細書において記載される組成物の使用が包含される。いくつかの実施形態において、ＦＥＣＤ、起こり得るＦＥＣＤ、および／またはＦＥＣＤを示唆する家族歴を有する患者は、本発明の組成物による治療の開始前にＴＣＦ４内のＴＮＲについてスクリーニングされる。いくつかの実施形態において、ＴＣＦ４のイントロン３内に５０以上のＴＮＲが存在する場合に、患者において治療が開始される。
【０１６１】
ＣＯＬ８Ａ２における変異は、ＦＥＣＤおよびＰＰＣＤの増大するリスクと相関している。本明細書において記載される組成物のいずれも、アミノ酸変異を有する遺伝子産物を導くＣＯＬ８Ａ２における変異を有する個体においてＦＥＣＤを治療するために対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、これらのアミノ酸変異はＧｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、またはＬｅｕ４５０Ｔｒｐである。
【０１６２】
本明細書において記載される組成物のうちのいずれかを投与することを含むＦＥＣＤを治療する方法が包含される。いくつかの態様において、組成物は治療有効量で投与される。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物の１つ以上を投与することを含む、ＣＯＬ８Ａ２における変異を、切断する、変異導入する、寛解する、および／または根絶する方法が包含される。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ組成物の使用は、ＮＨＥＪのプロセスと共に実施され、インデルの生成およびＣＯＬ８Ａ２アレルの喪失をもたらす。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ組成物の使用は、ＶＩＩＩ型コラーゲンのα２サブユニットのアミノ酸変異をもたらす核酸変異を修正する目的で、ＨＲ／ＨＤＲのための外来性テンプレートまたはＨＲ／ＨＤＲのためのテンプレートとしての内在性正常アレルの使用と共に実施される。いくつかの実施形態において、修正されるＣＯＬ８Ａ２遺伝子における変異は、ｃ．１３６４Ｃ＞Ａヌクレオチド変化によって引き起こされるＧｌｎ４５５Ｌｙｓ変異である。いくつかの実施形態において、修正されるＣＯＬ８Ａ２遺伝子における変異は、ｃ．１３６３〜１３６４ＣＡ＞ＧＴヌクレオチド変化によって引き起こされるＧｌｎ４５５Ｖａｌ変異である。いくつかの実施形態において、修正されるＣＯＬ８Ａ２遺伝子における変異は、ｃ．１３４９Ｔ＞Ｇヌクレオチド変化によって引き起こされるＬｅｕ４５０Ｔｒｐ変異である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ  ＲＮＰと併用するテンプレートの使用は、核酸配列の修正をもたらし、変異がもはや存在しないようにする。いくつかの実施形態において、細胞は角膜内皮細胞である。
【０１６３】
いくつかの態様において、本明細書において記載される組成物の１つ以上の投与を含む、変異ＣＯＬ８Ａ２によって形成される異常コラーゲンを低減、阻害、または寛解する方法が包含される。いくつかの実施形態において、異常なＶＩＩＩ型コラーゲンのαサブユニット（ＣＯＬ８Ａ２）の産生を阻害する方法は、本明細書において記載される組成物の１つ以上の投与を含むことを包含し、ここで、異常なＣＯＬ８Ａ２のレベルは、治療後に投与前のレベルに戻らない。いくつかの実施形態において、ＨＲまたはＨＤＲによる遺伝的変異を修正して正常なコラーゲンのみが産生されるようにする方法は、本明細書において記載される組成物の１つ以上を投与することを含むことを包含する。コラーゲンの変異形態の低減または修正は、ＦＥＣＤ患者の角膜に見られるような異常なコラーゲンの沈着を防ぐはずである。
【０１６４】
ＦＥＣＤを治療するための医薬の調製のための本明細書において記載される組成物の使用が包含される。いくつかの実施形態において、ＦＥＣＤ、起こり得るＦＥＣＤ、および／またはＦＥＣＤを示唆する家族歴を有する患者は、本発明の組成物による治療の開始前にＣＯＬ８Ａ２における変異についてスクリーニングされる。いくつかの実施形態において、ＰＰＣＤ、起こり得るＰＰＣＤ、および／またはＰＰＣＤを示唆する家族歴を有する患者は、本発明の組成物による治療の開始前にＣＯＬ８Ａ２における変異についてスクリーニングされる。いくつかの実施形態において、ｃ．１３６４Ｃ＞Ａヌクレオチド変化によって引き起こされるＧｌｎ４５５Ｌｙｓ変異、ｃ．１３６３〜１３６４ＣＡ＞ＧＴヌクレオチド変化によって引き起こされるＧｌｎ４５５Ｖａｌ変異、またはｃ．１３４９Ｔ＞Ｇヌクレオチド変化によって引き起こされるＬｅｕ４５０Ｔｒｐ変異等の変異が存在する場合、患者において治療が開始される。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ組成物の単回投与は、疾患と関連する根本的な遺伝的欠損または変異を修正するのに十分であり得る。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ治療の１回を超える投与は、累積効果を介して全ての標的細胞および全てのアレルにわたる編集を最大化するのに有益であり得る。いくつかの実施形態において、本発明の組成物による治療の有効性は、送達後、１年、２年、３年、４年、５年、または１０年において見られる。
【０１６６】
いくつかの異なる種類の評価は、ＦＥＣＤの治療の有効性を決定するのに使用でき、Eghrari and Gottsch, Expert Rev Ophthalmol.5(2):147-159(2010)を参照されたい。いくつかの実施形態において、組成物による治療の有効性は、細隙灯顕微鏡検査による経時的な評価に基づく。いくつかの実施形態において、組成物による治療の有効性は、経時的な角膜の厚さの角膜厚測定による疾患進行の定量的な測定に基づく。いくつかの実施形態において、組成物による治療の有効性は、経時的な角膜厚測定における改善、安定化、または変化の緩徐化に基づく。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、組成物による治療の有効性は、経時的な視力の評価に基づく。いくつかの実施形態において、組成物による治療の有効性は、経時的な視力の改善、安定化、または低下の緩徐化に基づく。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、組成物による治療の有効性は、スペキュラーマイクロスコピーに基づく。いくつかの実施形態において、このスペキュラーマイクロスコピーは、グッテーの存在を記録するために使用される。いくつかの実施形態において、組成物による治療の有効性は、新規のグッテーの形成の低下に基づく。いくつかの実施形態において、組成物による治療の有効性は、既存のグッテーの存在の低下に基づく。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、組成物による治療の有効性は、許容可能な視力を保持し、角膜移植の必要性を回避する患者に基づく。いくつかの実施形態において、組成物による治療の有効性は、角膜移植が必要とされるまでの時間の遅延に基づく。この角膜移植は、完全な角膜移植または、角膜の内層の移植であり得る。
【０１７０】
ＦＥＣＤに関連するものに加えて、ＴＣＦ４遺伝子内の遺伝的バリアントは、２つの他の状態である、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）および統合失調症に関連付けられている（Forrest MP et al., Trends Mol Med.2014 Jun;20(6):322-31を参照)。ＴＣＦ４遺伝子内の非コードバリアントが、どのようにＰＳＣおよび統合失調症のリスクを増大させるかについては依然として不明のままである。１つの可能性は、これらのバリアントが、ＦＥＣＤにおけるＲＮＡ媒介毒性に関連付けられているイントロン３内の同一のＴＮＲ領域において共遺伝される過伸長のマーカーとして機能するということである。この仮説は、未証明のままではあるが、ＰＳＣおよび統合失調症と関連するバリアントは、イントロン３内のＴＮＲ含有領域に物理的およびハプロタイプ的に近接しており、これらの隣接する領域におけるバリアントの共遺伝を示唆している。さらに、ＰＳＣおよび統合失調症と関連するリスクバリアントは、ＴＣＦ４遺伝子の発現の変化と関連付けられておらず、イントロン３内のＴＮＲ過伸長を有する患者に見られるようなＲＮＡ毒性等の、別の機序が関与していることを示唆している。
【０１７１】
併用療法
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ＦＥＣＤ、ＰＰＣＤ、ＰＳＣ、および／または統合失調症の治療のために単一の薬剤として使用される。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ＦＥＣＤ、ＰＰＣＤ、ＰＳＣ、および／または統合失調症の治療のために他の療法と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、併用療法は、ソフトコンタクトレンズである。いくつかの実施形態において、これらのソフトコンタクトレンズは、眼の表面の微細な隆起を滑らかにする。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、角膜から液体を引き出す点眼薬または軟膏と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、これらの点眼薬または軟膏は、Ｍｕｒｏ  １２８（登録商標）５％（塩化ナトリウム高浸透圧性点眼薬、５％、Bausch and Lomb）、Ｍｕｒｏ  １２８の５％軟膏（塩化ナトリウム高浸透圧性点眼薬、５％）（Bausch and Lomb）、または他の生理食塩水もしくは涙液代替液である。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、グルココルチコイドまたはコルチコステロイドは、本発明の組成物と共に用いて、治療に対する免疫応答を低減する。
【０１７４】
併用療法は、治療の個々の成分の、同時、連続的、または別個の投与によって達成され得る。投与が連続的または別個である場合、第２の成分を投与することにおける遅延は、組み合わせの有益な効果を失うようになるべきではない。
【０１７５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ組成物の送達
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ組成物は、適切なガイドまたは複数のガイドを含むベクターおよび／または脂質ナノ粒子を介して投与され得る。
【０１７６】
ウイルスベクター
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をベクター系によって送達し得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ組成物は、１つ以上のベクターによって提供され得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＤＮＡベクターであってもよい。他の実施形態において、ベクターは、ＲＮＡベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、ベクターは、環状であってもよい。他の実施形態において、ベクターは直線状であってもよい。いくつかの実施形態において、ベクターは、脂質ナノ粒子、リポソーム、非脂質ナノ粒子、またはウイルスカプシド内に封入され得る。非限定的な例示的なベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、染色体、ミニ染色体、トランスポゾン、ウイルスベクター、および発現ベクターを含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、その野生型の対応物から遺伝子組換えされていてもよい。例えば、ウイルスベクターは、クローニングを促進するため、またはベクターの１つ以上の特性を変更するようにするため、挿入、欠失、または１つ以上のヌクレオチドの置換を含み得る。このような特性は、パッケージング能力、形質導入効率、免疫原性、ゲノム組み込み、複製、転写、および翻訳を含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムの一部分は、より大きいサイズを有する外来性配列をパッケージングすることができるように、削除され得る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、増強した形質導入効率を有し得る。いくつかの実施形態において、宿主におけるウイルスによって誘発される免疫応答は低減され得る。いくつかの実施形態において、宿主ゲノムへのウイルス配列の組込みを促進するウイルス遺伝子（例えば、インテグレース等）は、ウイルスを非組み込み性になるようにするために変異され得る。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは複製欠損であってもよい。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ベクター上のコード配列の発現を駆動する外来性の転写または翻訳の制御配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルスはヘルパー依存性であってよい。例えば、増幅しベクターをウイルス粒子にパッケージングするのに必要とされるウイルスの構成要素（例えばウイルスタンパク質）を供給するための１つ以上のヘルパーウイルスを必要とし得る。このような場合、ウイルス構成要素をコードする１つ以上のベクターを含む１つ以上のヘルパー構成要素は、本明細書において記載されるベクター系と共に宿主細胞に導入され得る。いくつかの実施形態において、ウイルスはヘルパーフリーであってよい。例えば、ウイルスは、一切のヘルパーウイルスなしで増幅し、ベクターをパッケージングすることが可能であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるベクター系は、ウイルス増幅およびパッケージングに必要なウイルスの構成要素をもコードすることもできる。
【０１７８】
非限定的な例示的なウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター、バクテリオファージＴ４、バキュロウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは２、３、５、７、８、９またはｒｈ．１０のセロタイプを有する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、レンチウイルスは非組み込み性であってよい。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、アデノウイルスは、全てのコードウイルス領域が、５’および３’の末端逆位配列（ＩＴＲ）から離れており、パッケージングシグナル（「Ｉ」）がウイルスから削除されてそのパッケージング能力が増加している、高クローニング能、または「ガットレス」アデノウイルスであってよい。さらに他の実施形態において、ウイルスベクターは、ＨＳＶ−１ベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、ＨＳＶ−１に基づいたベクターは、ヘルパー依存性であり、他の実施形態において、それはベクター依存性ではない。例えば、パッケージング配列のみを保持するアンプリコンベクターは、パッケージングのために構造的な構成要素を有するヘルパーウイルスを必要とし、一方で、非必須のウイルス機能を除去した３０ｋｂ−欠失ＨＳＶ−１は、ヘルパーウイルスを必要としない。さらなる実施形態において、ウイルスベクターは、バクテリオファージＴ４であってもよい。いくつかの実施形態において、バクテリオファージＴ４は、ウイルスの頭部が空であるとき、任意の直線状または環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をパッケージングすることができる。更なる実施形態において、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクターであってもよい。なおもさらなる実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであってもよい。より小さいクローニング能力を有するＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを使用する実施形態において、本明細書において開示されるようなベクター系の全ての構成要素を送達するために１つを超えるベクターを使用する必要がある可能性がある。例えば、１つのＡＡＶベクターは、Ｃａｓタンパク質をコードする配列を含み得、第２のＡＡＶベクターは、１つ以上のガイド配列を含み得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、単一のＡＡＶベクターは、Ｃａｓタンパク質をコードする配列および１つ以上のガイド配列を含み得る。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの構成要素を送達するための単一ＡＡＶの使用を含むいくつかの実施形態において、小Ｃａｓ９オーソログが使用される。いくつかの実施形態において、小Ｃａｓ９オーソログは、Neisseria meningitidis、Campylobacter jejuni、またはStaphylococcus aureusに由来する。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、ベクターは、細胞内において１つ以上のコード配列の発現を駆動することができてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば細菌細胞等の原核生物細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物細胞等の真核生物細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、真核生物細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、真核生物細胞は、げっ歯類細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、真核生物細胞は、ヒト細胞であってもよい。異なる種類の細胞における発現を駆動するための好適なプロモーターは、当該技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、プロモーターは野生型であってもよい。他の実施形態において、プロモーターは、より効率的または効果的な発現のために改変されていてもよい。さらに他の実施形態において、プロモーターは短縮されているが、なおもその機能を維持していてもよい。例えば、プロモーターは、ウイルスへのベクターの適切なパッケージングのために、通常のサイズまたは低減されたサイズを有し得る。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書において記載されるヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターによってコードされるヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質であってよい。いくつかの実施形態において、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーを含み得る。他の実施形態において、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つを超えるコピーを含み得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写または翻訳の制御配列へと作動可能に連結されていてもよい。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つプロモーターへと作動可能に連結されていてもよい。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的、誘導性、または組織特異的であってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターであってもよい。非限定的な例示的な構成的プロモーターは、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期（ＭＬＰ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリゼリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子α（ＥＦ１ａ）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらの機能性フラグメント、または先行するいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、短縮型ＣＭＶプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＥＦ１ａプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。非限定的な例示的な誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを含む。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、Tet-On（登録商標）プロモーター（Clontech）などの、低い基底（非誘導）発現レベルを有するものであってよい。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、角膜内皮内での発現に特異的なプロモーターであってもよい。
【０１８４】
ベクターは、本明細書において記載されるガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、ガイドＲＮＡの１つのコピーを含む。他の実施形態において、ベクターは、ガイドＲＮＡの１つを超えるコピーを含む。１つを超えるガイドＲＮＡを有する実施形態において、ガイドＲＮＡは、それらが非同一であり、異なる標的配列を標的化するようであってもよく、それらが同一の標的配列を標的化する点において同一であってもよい。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つを超えるガイドＲＮＡを含み、各々のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ  ＲＮＰ複合体内の活性または安定性等の他の異なる特性を有し得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲ等の少なくとも１つの転写または翻訳の制御配列に作動可能に連結されていてもよい。一実施形態において、プロモーターは、ｔＲＮＡプロモーター、例えばｔＲＮＡLys3、またはｔＲＮＡキメラであってもよい。Mefferd et al., RNA.2015 21:1683-9、Scherer et al., Nucleic Acids Res.2007 35:2620-2628を参照。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって認識され得る。Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの非限定的な例は、Ｕ６およびＨ１プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに作動可能に連結され得る。他の実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＨ１プロモーターへと作動可能に連結され得る。１つを超えるガイドＲＮＡを有する実施形態において、発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同一または異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドおよびガイドＲＮＡのｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドは、同一のベクター上に提供され得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドおよびｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドは、同一のプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは単一の転写産物へと転写され得る。例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡを形成するように単一の転写産物から加工され得る。代替的に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡへと転写され得る。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、同一のベクター上のそれらの対応するプロモーターによって駆動され得る。さらに他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、異なるベクターによってコードされ得る。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む同一のベクター上に配置され得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質の発現は、それら自身の対応するプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの発現は、Ｃａｓ９タンパク質の発現を駆動する同一のプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質の転写産物は単一の転写産物内に含まれてもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質の転写産物の非翻訳領域（ＵＴＲ）内にあってもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質の転写産物の５’ＵＴＲ内にあってもよい。他の実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質の転写産物の３’ＵＴＲ内にあってもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質の転写産物の細胞内半減期は、その３’ＵＴＲ内にガイドＲＮＡを含み、それによって３’ＵＴＲの長さを短縮することによって低減することができる。さらなる実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質の転写産物のイントロン内にあってもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡが転写産物から適切にスプライシングされるように、ガイドＲＮＡが内部に位置するイントロンにおいて、好適なスプライス部位が追加され得る。いくつかの実施形態において、同一のベクター上に近接したＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡとの発現は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ複合体のより効率的な形成を促進し得る。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、組成物はベクター系を含み、ここで系は、１つを超えるベクターを含む。いくつかの実施形態において、ベクター系は、１つの単一のベクターを含み得る。他の実施形態において、ベクター系は、２つのベクターを含み得る。さらなる実施形態において、ベクター系は３つのベクターを含み得る。異なるガイドＲＮＡが多重化のために使用されるとき、またはガイドＲＮＡの複数のコピーが使用されるとき、ベクター系は、３つを超えるベクターを含み得る。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、ベクター系は、それが標的細胞に送達した後にのみ発現を開始するために、誘導性プロモーターを含み得る。非限定的な例示的な誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを含む。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、Tet-On（登録商標）プロモーター（Clontech）などの、低い基底（非誘導）発現レベルを有するものであってよい。
【０１８８】
さらなる実施形態において、ベクター系は、それが特異的な組織に送達した後にのみ発現を開始するために、組織特異的プロモーターを含み得る。
【０１８９】
ベクターは、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、または微小胞によって送達され得る。ベクターは、脂質ナノ粒子によって送達されてもよく、例えば、２０１６年３月３０日出願のU.S.S.N.62/315,602の優先権を主張し、“LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS”と題する２０１７年３月３０日出願のPCT/US2017/024973を参照でき、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、ベクターは、角膜に直接送達される溶液を介して送達され得る。送達は、局所投与、角膜自体への注射、前房への注射、後房への注射、角膜縁への注射、または他の手段を介して、達成され得る。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、ベクターは、全身的に送達され得る。
【０１９２】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるガイドＲＮＡ組成物は、単独で、または１つ以上ベクターにコードされて、脂質ナノ粒子を介して投与され、例えば、２０１６年３月３０日出願のU.S.S.N.62/315,602の優先権を主張し、“LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS”と題する２０１７年３月３０日出願のPCT/US2017/024973を参照でき、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。対象にヌクレオチドを送達することが可能である当業者に公知の任意の脂質ナノ粒子が、本明細書において記載されるガイドＲＮと、ＣａｓまたはＣａｓデアミナーゼ融合タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはＣａｓ９またはＣａｓ９−デアミナーゼ融合タンパク質のいずれかを投与するのに使用することができる。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、（ｉ）カプセル化およびエンドソーム脱出のためのＣＣＤ脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）同様に安定化のためのヘルパー脂質、および（ｉｖ）ステルス脂質を含む。ＬＮＰは、以下の：Ｃａｓ９またはＣａｓ９−デアミナーゼ等のＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓ−デアミナーゼをコードするｍＲＮＡ、１つ以上のガイドＲＮＡまたは１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸、およびＣａｓ９もしくはＣａｓ９−デアミナーゼ、１つ以上のガイドＲＮＡ、またはＣａｓ９／Ｃａｓ９−デアミナーゼとガイドＲＮＡとの両方をコードする１つ以上のウイルスベクターのいずれかまたは全てを含むカーゴを運搬する。一実施形態において、ＬＮＰは、脂質Ａ、脂質Ｂ、脂質Ｃ、または脂質Ｄ等のＣＣＤ脂質を含む。いくつかの態様において、ＣＣＤ脂質は脂質Ａである。いくつかの態様において、ＣＣＤ脂質は脂質Ｂである。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、ＣＣＤ脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質を含む。ある実施形態において、ヘルパー脂質はコレステロールである。ある実施形態において、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかの実施形態において、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。さらなる実施形態において、ＬＮＰは、脂質Ａまたは脂質Ｂ、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧから選択されるＣＣＤ脂質を含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、好適なＬＮＰ製剤は、ヘルパー脂質、中性脂質、およびステルス脂質と共にＣＣＤ脂質を含む。「脂質ナノ粒子」によって、分子間力によって互いに物理的に結合する複数の（すなわち、１つを超える）脂質分子を含む粒子を意味する。ＬＮＰは、例えば、ミクロスフェア（単層および多層の小胞、例えば、いくつかの実施形態において、実質的に球形であり、より特定の実施形態において、水性コアを含み得る「リポソーム」ラメラ相脂質二重層を含み、例えば、ＲＮＡ分子の実質的な部分を含む）、エマルション中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相であってよい。エマルション、ミセル、および懸濁液は、局所送達および／または局所送達のための好適な組成物であり得る。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、ＣＣＤ脂質は、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）−３（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノアートである脂質Ａである。脂質Ａは以下のように描写できる：
【０１９６】
【化６】
2019515914.tif 000011
【０１９７】
脂質Ａは、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば８４〜８６ページ）に従って合成できる。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、ＣＣＤ脂質は、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノアート）とも呼ばれる、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノアート）である脂質Ｂである。脂質Ｂは以下のように描写できる：
【０１９９】
【化７】
2019515914.tif 000012
【０２００】
脂質Ｂは、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１４／１３６０８６（例えば１０７〜０９ページ）に従って合成できる。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、ＣＣＤ脂質は、２−（（４−（（（３−ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノアート）である脂質Ｃである。脂質Ｃは以下のように描写できる：
【化８】
2019515914.tif 000013
【０２０２】
いくつかの実施形態において、ＣＣＤ脂質は、３−（（（３−ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル３−オクチルウンデカノアートである脂質Ｄである。
【０２０３】
脂質Ｄは以下のように描写できる：
【０２０４】
【化９】
2019515914.tif 000014
【０２０５】
脂質Ｃおよび脂質Ｄは、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１５／０９５３４０に従って合成できる。
【０２０６】
脂質組成物における使用に好適な「中性脂質」は、例えば、様々な中性、非荷電、または双性イオン性の脂質を含む。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例は、５−ヘプタデシルベンゼン−１，３−ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ポスホコリン（pohsphocholine）（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン、およびこれらの組み合わせを含むが、これらには限定されない。一実施形態において、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択され得る。別の実施形態において、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり得る。中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、その加工を改善するよう機能する。
【０２０７】
「ヘルパー脂質」はトランスフェクション（例えば、生理活性物質を含むナノ粒子のトランスフェクション）を増強する脂質である。ヘルパー脂質がトランスフェクションを強化する機序は、粒子安定性を増強することを含む。ある実施形態において、ヘルパー脂質は、膜の膜融合性を増強する。ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールを含む。ＬＮＰにおける使用に好適なヘルパー脂質は、コレステロール、５−ヘプタデシルレゾルシノール、およびコレステロールヘミスクシナートを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、ヘルパー脂質はコレステロールであってもよい。いくつかの実施形態において、ヘルパー脂質はコレステロールヘミスクシナートであってもよい。
【０２０８】
「ステルス脂質」は、ナノ粒子がインビボ（例えば血管中）で存在し得る時間の長さを変化させる脂質である。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒子サイズを制御することによって製剤化プロセスにおいて有用であり得る。本明細書において使用されるステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。脂質組成物における使用に好適なステルス脂質は、脂質部分に結合した親水性頭部基を有するステルス脂質を含むが、これらに限定されない。本開示の脂質組成物における使用に好適なステルス脂質およびそのような脂質の生化学に関する情報は、Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol.25,No.1,2008,pg.55-71、およびHoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004)41-52に見出すことができる。追加の好適なＰＥＧ脂質は、ＷＯ２００６／００７７１２に開示される。
【０２０９】
一実施形態において、ステルス脂質の親水性頭部基は、ＰＥＧ（しばしばポリ（エチレンオキシド）と呼ばれる）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］に基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含む。
【０２１０】
ステルス脂質は、脂質部分を含み得る。いくつかの実施形態において、ステルス脂質の脂質部分は、独立して約Ｃ４〜約Ｃ４０の飽和または不飽和の炭素原子を含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含むジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから由来し得、ここで鎖は１つ以上の、例えばアミドまたはエステル等の官能基を含み得る。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基をさらに含み得る。
【０２１１】
別に指示されない限り、本明細書において使用されるとき、用語「ＰＥＧ」は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、任意選択で置換されたエチレングリコールまたはエチレンオキシドの直鎖または分岐鎖のポリマーである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは非置換である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、例えば、１つ以上のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシ、またはアリール基によって置換されている。いくつかの実施形態において、用語は、ＰＥＧ−ポリウレタンまたはＰＥＧ−ポリプロピレンのようなＰＥＧコポリマー（例えば、J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry:biotechnical and biomedical applications(1992)を参照）を含み、別の実施形態において、用語はＰＥＧコポリマーを含まない。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１３０〜約５０，０００、サブ実施形態において、約１５０〜約３０，０００、サブ実施形態において、約１５０〜約２０，０００、サブ実施形態において、約１５０〜約１５，０００、サブ実施形態において、約１５０〜約１０，０００、サブ実施形態において、約１５０〜約６，０００、サブ実施形態において、約１５０〜約５，０００、サブ実施形態において、約１５０〜約４，０００、サブ実施形態において、約１５０〜約３，０００、サブ実施形態において、約３００〜約３，０００、サブ実施形態において、約１，０００〜約３，０００、および、サブ実施形態において、約１，５００〜約２，５００の分子量を有する。
【０２１２】
ある実施形態において、ＰＥＧ（例えばステルス脂質などの脂質に共役する）は、「ＰＥＧ−２Ｋ」であり、「ＰＥＧ２０００」とも呼ばれ、これは約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧ−２Ｋは、本明細書において、以下の式（Ｉ）によって表され、式中、ｎは４５であり、この数は、数平均重合度が約４５サブユニットを含むことを意味する。
【化１０】
2019515914.tif 000015
しかしながら、例えば、数平均重合度が約２３サブユニット（ｎ＝２３）、および／または６８サブユニット（ｎ＝６８）を含む、当該技術分野において公知の他のＰＥＧの実施形態を使用してもよい。いくつかの実施形態において、ｎは約３０〜約６０の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、ｎは約３５〜約５５の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、ｎは約４０〜約５０の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、ｎは約４２〜約４８の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、ｎは４５であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒは、Ｈ、置換アルキル、および非置換アルキルから選択され得る。いくつかの実施形態において、Ｒは非置換アルキルであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｒはメチルであってもよい。
【０２１３】
本明細書において記載される実施形態のいずれにおいても、ステルス脂質は、ＰＥＧ−ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（catalog # GM-020 from NOF, Tokyo, Japan）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（catalog # DSPE-020CN, NOF, Tokyo, Japan）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ−ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスト−５−エン−３［ベータ］−オキシ）カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）（cat.#880150P from Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥ）(cat.#880120C from Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール(PEG2k-DSG;GS-020,NOF Tokyo, Japan)、ポリ（エチレングリコール）−２０００−ジメタクリラート（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡ）、および１，２−ジステアリロキシプロピル−３−アミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡ）から選択され得る。一実施形態において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧであってもよい。いくつかの実施形態において、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＳＧであってもよい。一実施形態において、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥであってもよい。一実施形態において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡであってもよい。一実施形態において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡであってもよい。一実施形態において、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１であってもよい。いくつかの実施形態において、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１４であってもよい。いくつかの実施形態において、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１６であってもよい。いくつかの実施形態において、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１８であってもよい。
【０２１４】
本開示の実施形態はまた、製剤中の成分の脂質のそれぞれのモル比に従って記載される脂質組成物も提供する。一実施形態において、ＣＣＤ脂質のモル％は、約３０モル％〜約６０モル％であり得る。一実施形態において、ＣＣＤ脂質のモル％は、約３５モル％〜約５５モル％であり得る。一実施形態において、ＣＣＤ脂質のモル％は、約４０モル％〜約５０モル％であり得る。一実施形態において、ＣＣＤ脂質のモル％は、約４２モル％〜約４７モル％であり得る。一実施形態において、ＣＣＤ脂質のモル％は、約４５モル％であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチのＣＣＤ脂質のモル％は、標的モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％である。ある実施形態において、ＬＮＰのロット間可変性は、１５％未満、１０％未満、または５％未満であろう。
【０２１５】
一実施形態において、ヘルパー脂質のモル％は、約３０モル％〜約６０モル％であり得る。一実施形態において、ヘルパー脂質のモル％は、約３５モル％〜約５５モル％であり得る。一実施形態において、ヘルパー脂質のモル％は、約４０モル％〜約５０モル％であり得る。一実施形態において、ヘルパー脂質のモル％は、約４１モル％〜約４６モル％であり得る。一実施形態において、ヘルパー脂質のモル％は、約４４モル％であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチのヘルパー脂質のモル％は、標的モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％である。ある実施形態において、ＬＮＰのロット間可変性は、１５％未満、１０％未満、または５％未満であろう。
【０２１６】
一実施形態において、中性脂質のモル％は、約１モル％〜約２０モル％であり得る。一実施形態において、中性脂質のモル％は、約５モル％〜約１５モル％であり得る。一実施形態において、中性脂質のモル％は、約７モル％〜約１２モル％であり得る。一実施形態において、中性脂質のモル％は、約９モル％であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチの中性脂質のモル％は、標的モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％である。ある実施形態において、ＬＮＰのロット間可変性は、１５％未満、１０％未満、または５％未満であろう。
【０２１７】
一実施形態において、ステルス脂質のモル％は、約１モル％〜約１０モル％であり得る。一実施形態において、ステルス脂質のモル％は、約１モル％〜約５モル％であり得る。一実施形態において、ステルス脂質のモル％は、約１モル％〜約３モル％であり得る。一実施形態において、ステルス脂質のモル％は、約２モル％であり得る。一実施形態において、ステルス脂質のモル％は、約１モル％であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰバッチのステルス脂質のモル％は、標的モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％である。ある実施形態において、ＬＮＰのロット間可変性は、１５％未満、１０％未満、または５％未満であろう。
【０２１８】
投与の位置
いくつかの実施形態において、組成物は眼の前房に送達される。いくつかの実施形態において、組成物は眼の後房に送達される。いくつかの実施形態において、組成物は角膜自体に送達される。いくつかの実施形態において、組成物は角膜実質に送達される。いくつかの実施形態において、組成物は角膜縁に送達される。いくつかの実施形態において、組成物は角膜の上皮表面上に送達される。この段落の選好する実施形態および本明細書において記載される他の実施形態のいずれかにおいて、治療は、例えば脂質ナノ粒子を用いるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）の送達、またはベクターおよび／または脂質ナノ粒子を用いるＣａｓタンパク質をコードする核酸の送達をさらに含む。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子を用いる例として、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、適切なガイドまたは複数のガイドを送達するのに使用される、同一のベクターおよび／または脂質ナノ粒子を介して送達される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸は、適切なガイドまたは複数のガイドを送達するのに使用される、異なるベクターおよび／または脂質ナノ粒子を介して送達される。
【０２１９】
本明細書において記載される組成物のいずれも、ＴＣＦ４のイントロン３内のＴＮＲ過伸長の一部またはすべてを切り取るために対象に投与され得る。本明細書において記載される組成物のうちのいずれかを投与することを含むＦＥＣＤを治療する方法が包含される。いくつかの態様において、組成物は治療有効量で投与される。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物の１つ以上を投与することを含む、ＴＣＦ４のＴＮＲを、切り取る、変異導入する、そのコピー数を低減する、寛解する、および／または根絶する方法が包含される。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物の１つ以上を投与することを含む、対象の細胞当たり一方または両方のコピーのＴＣＦ４のＴＮＲを、切断する、変異導入する、そのコピー数を低減する、寛解する、および／または根絶する方法が提供される。いくつかの実施形態において、細胞は角膜内皮細胞である。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、２つのｇＲＮＡは、ＴＣＦ４内の全てのＴＮＲを切り取るために使用される。いくつかの実施形態において、ＴＮＲに対して５’である第１のガイドが、ＴＮＲに対して３’である第２のガイドと共に提供され、逆もまた同様である。２つのｇＲＮＡが企図されると、以下のガイドの組み合わせのいずれかを含む組成物が提供される：
組み合わせ０１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１０８９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ０２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１０９０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ０３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１０９１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ０４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１０９２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ０５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１０９３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ０６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１０９４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ０７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１０９５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ０８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１０９６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ０９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１０９７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１０９８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１０９９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１００を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１０１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１０２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１０３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１０４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１０５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１０６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１０７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ２０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１０８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ２１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１０９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ２２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１１０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ２３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１１１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ２４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１１２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ２５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１１３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ２６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１１４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ２７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１１５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ２８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１１６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ２９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１１７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ３０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１１８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ３１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１１９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ３２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１２０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ３３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１２１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ３４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１２２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ３５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１２３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ３６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１２４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ３７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１２５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ３８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１２６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ３９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１２７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ４０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１２８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ４１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１２９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ４２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１３０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ４３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１３１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ４４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１３２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ４５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１３３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ４６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１３４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ４７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１３５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ４８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１３６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ４９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１３７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ５０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１３８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ５１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１３９を含む第１の、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ５２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１４０を含む第１の、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ５３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１４１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ５４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１４２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ５５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１４３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ５６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１４４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ５７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１４５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ５８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１４６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ５９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１４７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ６０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１４８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ６１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１４９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ６２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１５０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ６３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１５１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ６４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１５２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ６５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１５３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ６６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１５４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ６７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１５５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ６８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１５６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ６９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１５７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ７０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１５８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ７１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１５９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ７２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１６０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ７３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１６１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ７４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１６２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ７５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１６３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ７６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１６４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ７７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１６５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ７８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１６６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ７９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１６７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ８０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１６８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ８１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１６９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ８２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１７０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ８３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１７１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ８４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１７２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ８５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１７３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ８６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１７４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ８７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１７５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ８８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１７６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ８９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１７７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ９０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１７８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ９１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１７９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ９２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１８０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ９３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１８１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１１８２〜１２７８から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ９４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１８２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ９５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１８３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ９６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１８４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ９７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１８５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ９８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１８６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ９９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１８７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１００：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１８８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１０１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１８９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１０２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１９０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１０３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１９１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１０４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１９２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１０５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１９３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１０６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１９４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１０７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１９５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１０８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１９６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１０９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１９７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１１０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１９８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１１１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１１９９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１１２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２００を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１１３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２０１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１１４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２０２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１１５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２０３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１１６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２０４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１１７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２０５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１１８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２０６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１１９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２０７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１２０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２０８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１２１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２０９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１２２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２１０を含む第１の、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１２３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２１１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１２４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２１２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１２５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２１３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１２６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２１４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１２７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２１５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１２８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２１６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１２９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２１７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１３０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２１８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１３１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２１９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１３２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２２０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１３３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２２１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１３４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２２２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１３５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２２３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１３６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２２４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１３７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２２５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１３８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２２６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１３９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２２７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１４０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２２８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１４１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２２９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１４２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２３０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１４３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２３１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１４４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２３２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１４５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２３３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１４６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２３４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１４７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２３５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１４８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２３６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１４９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２３７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１５０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２３８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１５１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２３９を含む第１のｇＲＮＡｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１５２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２４０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１５３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２４１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１５４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２４２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１５５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２４３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１５６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２４４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１５７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２４５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１５８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２４６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１５９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２４７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１６０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２４８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１６１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２４９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１６２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２５０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１６３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２５１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１６４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２５２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１６５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２５３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１６６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２５４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１６７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２５５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１６８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２５６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１６９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２５７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１７０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２５８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１７１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２５９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１７２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２６０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１７３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２６１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１７４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２６２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１７５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２６３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１７６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２６４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１７７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２６５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１７８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２６６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１７９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２６７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１８０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２６８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１８１：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２６９を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１８２：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２７０を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１８３：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２７１を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１８４：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２７２を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１８５：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２７３を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１８６：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２７４を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１８７：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２７５を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１８８：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２７６を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１８９：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２７７を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
組み合わせ１９０：いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１２７８を含む第１のｇＲＮＡ、および配列番号１０８９〜１１８１から選択される配列を含む第２のｇＲＮＡを含む２つのｇＲＮＡを含む。
【実施例】
【０２２１】
実施例１．ＴＣＦ４からＴＮＲ過伸長を切り取るための一対のｇＲＮＡの使用
ＴＣＦ４からＴＮＲを除去し、毒性ＲＮＡの産生を制限するために、ＣＲＩＳＰＲガイドが、特異的標的配列を用いて過伸長の両側を同時に切断するように設計された。これらのｇＲＮＡは、野生型のS. pyogenesのＣａｓ９（「Ｓｐｙ  Ｃａｓ９」）と共に機能するよう設計されている。他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの使用に適した他のｇＲＮＡも同様に設計できる。
【０２２２】
対象配列を、隣接するエクソンを有するＴＣＦ４のイントロン３配列の配列を用いて選択した（配列番号１０８５）。この配列は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅブラウザ、ヒト、２００９年２月（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）アセンブリに基づく。この配列は、イントロンの位置ｃｈｒ１８：５３２５２５８４−５３２５４２７５内の５３２５３３８７〜５３２５３４５８の範囲における２４のＣＴＧリピート（ＴＮＲ）のセットを含む。このイントロン内のＣＴＧリピートの正確な範囲は、リピートの数に基づいて変動する可能性があり、４０を超えるリピートの数は、疾患を発症する増大したリスクに関連付けられる。ｈｇ３８ビルドにおいて、リピートは、ｃｈｒ１８：５５，５８５，２８０−５５，５８７，１３６にわたるイントロン内のｃｈｒ１８：５５，５８６，１５６−５５，５８６，２２８に位置する。標的配列および対応するガイド配列は表２（配列番号１〜１９０（標的配列）および配列番号１０８９〜１２７８（ガイド配列））に列挙される。この実施例１で使用されるｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの特定の形態は、それぞれ配列番号１０８７および配列番号１０８８として表１に提示される。５’ガイド配列の標的配列（配列番号：１０８９〜１１８１）は、ｃｈｒ１８：５５，５８５，２８５−５５，５８６，１５３の間に位置し、ＴＮＲの位置の上流である。３’ガイド配列の標的配列（配列番号：９４〜１９０）は、Ｃｈｒ１８：５５５８６２２５−５５５８７２０３の間に位置し、ＴＮＲの位置の下流である。表２は、配列番号１〜１９０（標的配列）および配列番号１０８９〜１２７８（ヌクレアーゼを対応する標的配列に誘導し、標的配列の逆の相補体に結合するガイド配列）を列挙する。Doench et al., Nat Biotechnol. 2016 Feb;34(2):184-191によって報告される方法論に従って、各々のガイド配列について切断頻度決定（Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（ＣＦＤ）スコアをインシリコで生成した。これらのスコア（Doench et alがスコアを報告する方法との比較として小数に変換するために１００倍されている）は、所与のｇＲＮＡのオフターゲットの可能性の基準を提供する。
【表２−１】
2019515914.tif 000016
【表２−２】
2019515914.tif 000017
【表２−３】
2019515914.tif 000018
【表２−４】
2019515914.tif 000019
【表２−５】
2019515914.tif 000020
【表２−６】
2019515914.tif 000021
【表２−７】
2019515914.tif 000022
【表２−８】
2019515914.tif 000023
【表２−９】
2019515914.tif 000024
【表２−１０】
2019515914.tif 000025
【表２−１１】
2019515914.tif 000026
【表２−１２】
2019515914.tif 000027
【表２−１３】
2019515914.tif 000028
【表２−１４】
2019515914.tif 000029
【表２−１５】
2019515914.tif 000030
【表２−１６】
2019515914.tif 000031
【０２２３】
表２に提示されるガイド配列を有するｇＲＮＡを、それらの編集（例えばインデル形成）効率を決定するために、９６ウェルフォーマットでスクリーニングした。この終わりに、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３細胞株（「ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９」）を、１０％のウシ胎仔血清および５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。トランスフェクション前に２０時間に、細胞を９６ウェルプレート中に、１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．１３７７８１５０）によって、製造者のプロトコールに従ってトランスフェクトした。細胞を、各々のｃｒＲＮＡ（２５ｎＭ）、ｔｒＲＮＡ（２５ｎＭ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（０．３μＬ／ウェル）、およびＯｐｔｉＭｅｍを含むリポプレックスによってトランスフェクトした。ゲノムＤＮＡを、各々のウェルから５０μＬ／ウェルのＢｕｃｃａｌ  Ａｍｐ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｃａｔ．ＱＥ０９０５０）を用いて、製造者のプロトコールに従って抽出した。
【０２２４】
ゲノム内の標的位置における編集効率を定量的に決定するために、ディープシークエンシングを、遺伝子編集によって導入された挿入および欠失（「インデル」）の存在を同定するのに使用した。標的部位の周りのＰＣＲプライマーを設計し対象のゲノム領域を増幅した。シーケンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造者のプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを実施した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ装置上でシーケンシングした。読み取りを、低い品質スコアを有するものを除去した後に、ヒト参照ゲノムとアラインした。読み取りを含む生じたファイルを参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングし、ここで対象の標的領域にオーバーラップする読み取りを選択し、野生型の読み取りの数対挿入、置換、または欠失を含む読み取りの数が計算した。編集パーセンテージ（例えば「編集効率」または「編集パーセント」）は、野生型を含む配列読み取りの全数に対する、挿入または欠失を有する配列読み取りの全数として定義される。使用される各々のｇＲＮＡの編集効率数は、表２に報告する。
【０２２５】
最適な編集効率を有するものを特定するための上述の初期評価を完了した後、図１に示されるように、ＤＮＡの介在部分を除去することのできる対を決定するために、ｇＲＮＡの対をスクリーニングした。介在区画の切り取り後、次いで、切断は、角膜内におけるもののような非分裂細胞においてさえ高い効率である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路を通じて細胞によって修復されるであろう。このプロセスは、２つのガイド配列の間のＤＮＡフラグメントの切り取りの後に続き、これは、ガイド配列が３０００を超えるヌクレオチド離れているときでさえ高い頻度でおきることがある。この編集アプローチのために追加の相同テンプレートＤＮＡはまったく必要なく、プロセスを大幅に単純化する。欠失した範囲がイントロン内に含まれるとき、イントロンが最終的なｍＲＮＡ産物またはタンパク質産物に影響を与えないので、ＴＣＦ４の遺伝子産物に対する影響はまったく予測されない。
【０２２６】
ＴＮＲリピートの除去後、ＴＣＦ４のＲＮＡ転写産物はもはや細胞内で凝集せず、通常の細胞機能に必要とされるスプライシング因子を隔離することもない。イントロン３内の関連領域の除去は、このイントロンが通常、最終的なＲＮＡ産物の成熟化の間にＲＮＡスプライシングによって除去されるので、ＲＮＡ安定性またはＴＣＦ４遺伝子の発現に対し、有害な影響を有する可能性が低い。したがって、イントロン３内のＤＮＡの領域は、ＴＣＦ４タンパク質の翻訳に使用される最終的なＲＮＡ産物内に含まれない。ＴＮＲの非存在において、ＴＣＦ４のｍＲＮＡおよび遺伝子産物は、最小のＴＮＲ過伸長を有する通常のアレルとほぼ同様に、通常に機能するはずである。さらに、角膜内皮細胞が本質的に非分裂であるので、一度の細胞の修正が、疾患の永久的寛解をもたらすはずである。治療は、疾患の特徴であるコラーゲンの異常沈着（すなわち、グッテー）を停止させ、既存のグッテーの経時的な再吸収をもたらし得る。この技術を使用した、疾患の家族歴を有するもの等のＦＥＣＤの既知の素因を有する個体およびＴＣＦ４のイントロン３のＴＮＲ過伸長を有することが確認された個体の治療が疾患の発症を防ぎ得ることも提案されている。
【０２２７】
ＴＮＲの切り取りを実証するために、各々がＴＮＲの一方の側を標的化するｇＲＮＡを有するＲＮＰの対を形成した。手短に、予めアニールしたｇＲＮＡ（例えばｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡを有するｄｇＲＮＡ）の５０μＭ溶液が、エキモル（eqimolar）量のｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡを水中で９５℃において２分間加熱し、それらを室温で冷却するようにして調製された。予めアニールしたｇＲＮＡは、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９タンパク質（５０μＭ濃度）へと添加され、室温で１０分間インキュベートされ、３．３３μＭでｇＲＮＡと１．６６μＭでＣａｓ９タンパク質とを有する最終的なＲＮＰ溶液をもたらす。Ｃａｓ９を構成的に発現していないＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルフォーマット中で、２０μＬの容量中約５０，０００細胞／ウェルで、ＳＦエレクトロポレーション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）中に播種された。５μＬの各々のＲＮＰ溶液（例えば、試験された各々の対について）をウェルに添加し、Ｌｏｎｚａ  Ａｍａｘａ装置を用いて細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、８０μＬの細胞培地をウェルに添加し、細胞を９６ウェルの平底組織培養プレートに移し、３７℃において２４時間培養した。次いで、細胞を溶解し、ゲノムＤＮＡを上述のように抽出した。
【０２２８】
ＴＮＲ切除の効率を決定するために、編集効果について上述したのと同様のＮＧＳ解析を実施した。手短に、ＴＮＲに隣接する２つの位置の遺伝子編集によって生じる欠失を同定するためにディープシークエンシングを実施した。標的部位（ＴＣＦ４のイントロン３内のＴＮＲ）の周りのＰＣＲプライマーを設計し対象のゲノム領域を増幅した。シーケンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造者のプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを実施した。生じたアンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ装置上でシーケンシングした。低い品質スコアを有する読み取りを排除するようフィルターにかけ、生じる読み取りを参照ゲノムにマッピングした。標的領域にオーバーラップする読み取りを、さらにフィルターにかけ、大きい欠失を同定するために局所的に再アラインした。２つの標的領域にわたる欠失を含む読み取りの数を計算した。切り取りパーセンテージは、標的領域をオーバーラップする読み取りの全数で割ったＴＮＲの欠失を含むシーケンシング読み取りの数として定義される。試験された各々の対の切り取りパーセンテージを表７に報告する。
【０２２９】
表７および図２に示すように、９３対のｇＲＮＡが試験され、いくつかの対が８０％を超える切り取りを達成し、特に１つのペア（例えば、それぞれ配列番号１１７７および配列番号１１９７を含むガイドＲＮＡに対応する、配列番号８３および配列番号１０９を含む標的配列にヌクレアーゼを誘導するガイド配列を有するｇＲＮＡを用いる）が８８％を超える切り取りを達成した。
表７
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【０２３０】
実施例２．ＣＯＬ８Ａ２における変異を治療するためのｇＲＮＡの使用
ＣＯＬ８Ａ２における３つの変異、Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、およびＬｅｕ４５０Ｔｒｐは、早期発症ＦＥＣＤおよび後部多形性角膜ジストロフィー（ＰＰＤＣ）と関連付けられ、ノックイン動物研究は、ヒト早期発症ＦＥＣＤと一致する病態を示している。これらのモデルは、三重らせん構造の変化した安定性を有する変異型ＶＩＩＩ型コラーゲンペプチドの異常な細胞内蓄積と関連付けられる。したがって、診断またはＣＯＬ８Ａ２における変異の家族歴を有する患者において、変異型ＶＩＩＩ型コラーゲンを減少させることは、疾患の経過を改善し得る。代替的に、Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、またはＬｅｕ４５０Ｔｒｐのいずれかにおける変異を有するＣＯＬ８Ａ２のレベルを選択的に低減させて、変異型ＶＩＩＩ型コラーゲンペプチドのレベルを低減し得、疾患の経過を改善し得る。別のアプローチは、ＶＩＩＩ型コラーゲンのαサブユニット２（ＣＯＬ８Ａ２）におけるアミノ酸変異をもたらすＤＮＡ内の変異を修正し、それによって異常な遺伝子産物を除去することであろう。
【０２３１】
Ｃａｓ  ＲＮＰ療法を開発するために、標的配列を、ＣＯＬ８Ａ２遺伝子の転写産物バリアント１のＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００５２０２．３を用いて選択した。この配列は、ＶＩＩＩ型コラーゲン遺伝子産物のアミノ酸配列の４５５位と４５０位において、生じることが知られている変異を含まず、「野生型ＣＯＬ８Ａ２配列」と呼ばれ得る。標的配列は、表３（配列番号１９１〜１０６３）に列挙されるように、Ｃｈｒ１：３６０９７５３２−３６１００２７０（ｈｇ３８  ｖｅｒｓｉｏｎ）の間で選択した。標的配列に相補的なガイド配列は、ＣＯＬ８Ａ２を標的化するためにＲＮＰと共に使用するためのｇＲＮＡを生成するのに利用できる。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表４−１９】
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【表４−２０】
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【表４−２１】
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【表４−２２】
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【表４−２３】
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【表４−２４】
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【表４−２５】
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【表４−２６】
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【表４−２７】
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【表４−２８】
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【表４−２９】
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【表４−３０】
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【表４−３１】
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【表４−３２】
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【表４−３３】
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【表４−３４】
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【表４−３５】
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【表４−３６】
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【表４−３７】
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【表４−３８】
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【０２３２】
配列番号１９１〜１０６３に相補的であるか、または配列番号１９１〜１０６３の逆の相補体に結合するガイド配列を含むｇＲＮＡの使用は、ＣＯＬ８Ａ２の配列へとヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＣａｓ９  ＲＮＰ）を誘導すると予測される。ＣＯＬ８Ａ２のヘテロ接合型変異が早期発症ＦＥＣＤを特徴としているので、配列番号１９１〜１０６３の標的配列に相補的はガイド配列を含むｇＲＮＡによってＣａｓ  ＲＮＡを誘導することは、ＮＨＥＪを介するインデルの生成をもたらし得る。インデルの生成は、ＣＯＬ８Ａ２の発現を減少させ得、それによって毒性のコラーゲン−８タンパク質のα−サブユニットを減少させる。毒性のＣＯＬ８Ａ２産物の減少は、他の形態のコラーゲンがα−２サブユニットにとって代わり得るので、早期発症ＦＥＣＤの疾患過程を改善し得る。あるガイドは、公知の疾患関連変異を含むＣＯＬ８Ａ２遺伝子の領域を切り取るためか、そのような変異を含まない好ましいアイソフォームにスプライスパターンを変更するために有用であり得る。あるガイドを用いるＣＯＬ８Ａ２遺伝子のノックアウトはまた、野生型ＣＯＬ８Ａ２置き換え戦略と併用できる。例えば、野生型ＣＯＬ８Ａ２コード配列は、内在性の、ドミナントネガティブ変異型の発現を除去した後に、トランスジェニック手段を介して発現し得る。
【０２３３】
変異アレルのヌクレオチド配列の相違に基づいて、変異アレルに特異的な標的配列もまた同定された。
【０２３４】
表４は、ｃ．１３６４Ｃ＞Ａヌクレオチド変化によって引き起こされるＧｌｎ４５５Ｌｙｓをもたらす変異に特異的な標的配列を列挙する。配列番号１０６４〜１０６９に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡの使用は、変異アレルを標的化するが、一方で、野生型アレルを標的化しないか、または低い効率で標的化する。Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ変異を有する個体は通常、一方のみの影響を受けたアレルを有し、ＣＯＬ８Ａ２の変異アレルを標的化するＣａｓ  ＲＮＰに媒介されるＮＨＥＪに起因するインデルの選択的生成は、このアレルの欠失のみを引き起こし、他の野生型ＣＯＬ８Ａ２アレルを保存すると予測できる。代替的に、配列番号１０６４〜１０６９に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡ、または配列番号１０６４〜１０６９の逆の相補体に結合するガイド配列は、変異の修正を媒介するテンプレートと共に使用することもできる。
【表５】
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【０２３５】
表５は、ｃ．１３６３〜１３６４ＣＡ＞ＧＴヌクレオチド変化によって引き起こされるＧｌｎ４５５Ｖａｌをもたらす点変異に特異的な標的配列を列挙する。標的配列１０７０〜１０７５にヌクレアーゼを誘導するガイド配列を含むｇＲＮＡの使用は、変異アレルを標的化するが、一方で、野生型アレルを標的化しないか、または低い効率で標的化する。Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ変異を有する個体は通常、一方のみの影響を受けたアレルを有し、ＣＯＬ８Ａ２の変異アレルを標的化するヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ  ＲＮＰ）に媒介されるＮＨＥＪに起因するインデルの選択的生成は、このアレルの欠失のみを引き起こし、他の野生型ＣＯＬ８Ａ２アレルを保存すると予測できる。代替的に、配列番号１０７０〜１０７５に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡはまた、変異の修正を媒介するテンプレートと共に使用することができる。
【表６】
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【０２３６】
表６は、ｃ．１３４９Ｔ＞Ｇヌクレオチド変化によって引き起こされるＬｅｕ４５０Ｔｒｐをもたらす点変異に特異的な標的配列を列挙する。標的配列１０７６〜１０８４に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡの使用は、変異アレルを標的化するが、一方で、野生型アレルを標的化しないか、または低い効率で標的化する。Ｌｅｕ４５０Ｔｒｐ変異を有する個体は通常、一方のみの影響を受けたアレルを有し、ＣＯＬ８Ａ２の変異アレルを標的化するＣａｓ  ＲＮＰに媒介されるＮＨＥＪに起因するインデルの選択的生成は、このアレルの欠失のみを引き起こし、他の野生型ＣＯＬ８Ａ２アレルを保存すると予測できる。代替的に、配列番号１０７６〜１０８４に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡはまた、変異の修正を媒介するテンプレートと共に使用することができる。
【表７】
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【０２３７】
Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、またはＬｅｕ４５０Ｔｒｐ変異のいずれかを有するＶＩＩＩ型コラーゲンの生成をもたらすヌクレオチド変異を修正するために、テンプレートをＣａｓ  ＲＮＰと共に使用することができる。このようにして、Ｃａｓ  ＲＮＰは変異を標的化し、ＮＨＥＪを開始し、次いで、外来性テンプレートに基づいて変異の修正を媒介することができる。Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ産物の発現をもたらす変異を修正するためにＣａｓ  ＲＮＰを誘導することは、配列番号１０６４〜１０６９の標的配列に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡをテンプレートと共に使用することで実施できる。Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ産物の発現をもたらす変異を修正するためにＣａｓ  ＲＮＰを誘導することは、配列番号１０７０〜１０７５の標的配列に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡをテンプレートと共に使用することで実施できる。Ｌｅｕ４５０Ｔｒｐ遺伝子産物の発現をもたらす変異を修正するためにＣａｓ  ＲＮＰを誘導することは、配列番号１０７６〜１０８４の標的配列に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡをテンプレートと共に使用することで実施できる。このようにして、Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、またはＬｅｕ４５０Ｔｒｐ変異のいずれかによって引き起こされる欠陥ＶＩＩＩ型コラーゲンを修正するための変異アレルの選択的編集が実施できる。
【０２３８】
したがって、ＣＯＬ８Ａ２の標的配列に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡを含むＣａｓ  ＲＮＰの使用は、ＦＥＣＤまたはＰＰＣＤを治療する新規の手段であり得る。標的配列は、野生型ＣＯＬ８Ａ２に対するものと、ＣＯＬ８Ａ２の変異アレルを引き起こし得、Ｇｌｎ４５５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ４５５Ｖａｌ、またはＬｅｕ４５０Ｔｒｐ変異を有する遺伝子産物をもたらす変異に特異的な標的配列とを含む。表４、５、および６に列挙される変異特異的標的配列は、変異アレルにさらなる変異を導入してその機能を排除するための特異性を有するＣａｓ（例えばＣａｓ  ＲＮＰ内で）と共に使用するためのガイドＲＮＡを開発するために、または代替的に、ＣＯＬ８Ａ２の原因となるヌクレオチド変異を修正するためのテンプレートと併用した使用のために、使用できる。
【０２３９】
均等物
上述の明細書は、当業者が実施形態を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。上述の説明および実施例は、ある実施形態を詳細に詳述し、本発明者らによって想定される最良の形態を説明する。しかしながら、上述のものがテキストにおいていかに詳細に表れていようとも、実施形態は多くの方法によって実施でき、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の均等物に従って解釈されるべきであることは理解されよう。
【０２４０】
本明細書において使用されるとき、用語、約は、明示的に示されるか否かにかかわらず、例えば整数、分数、およびパーセンテージを含む数値を指す。用語、約は、一般に、当業者が言及された値と等価（例えば同一の機能または結果を有する）であると考える数値の範囲（例えば、言及された範囲の＋／−５〜１０％）を指す。少なくともおよび約などの用語が、数字の値または範囲の列挙に先行するとき、用語は、リストに提示される全ての値または範囲を修飾する。いくつかの場合において、用語、約は、もっとも近い有効数字に四捨五入された数字を含み得る。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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