(57)【要約】本願は、アダプター鎖オリゴヌクレオチドと架橋鎖オリゴヌクレオチドとを採用する実施形態を含む、試料中の少なくとも１つの標的を画像化するための様々な改良された実施形態について記載する。いくつかの実施形態はさらに、駆逐剤オリゴヌクレオチド及び／または遮断剤オリゴヌクレオチドを採用する。いくつかの実施形態はさらに、２つの部分的連結鎖を使用して、部分的連結鎖の互いに対する近接性を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の少なくとも１つの標的を画像化する方法であって、
ａ．アダプター鎖オリゴヌクレオチドに結合した少なくとも１つの標的認識抗体を提供すること；
ｂ．前記アダプター鎖オリゴヌクレオチドに特異的に結合することができる領域と、連結鎖領域とを有する架橋鎖オリゴヌクレオチドを提供すること；
ｃ．前記架橋鎖オリゴヌクレオチドの前記連結鎖領域に特異的に結合することができる造影剤鎖オリゴヌクレオチドを提供すること
を含み、前記造影剤鎖が検出可能な標識で標識されている、前記方法。
【請求項２】
前記アダプター鎖オリゴヌクレオチドが抗体結合剤を介して前記標的認識抗体に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法がさらに、未結合の標的認識抗体、未結合のアダプター鎖オリゴヌクレオチド、及び／または未結合の架橋鎖オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上を除去する精製ステップを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記方法がさらに、前記試料中のいかなる標的に対しても特異的な結合をしない少なくとも１つの抗体を添加することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
試料中の少なくとも１つの標的を画像化する方法であって、
ａ．連結鎖オリゴヌクレオチドに結合した少なくとも１つの標的認識抗体を提供することを含み；
ｂ．前記連結鎖に対して第１領域にわたってハイブリダイズするが、その完全長または前記連結鎖の完全長にわたってハイブリダイズしない、遮断剤鎖を提供することを含み；
ｃ．少なくとも、前記遮断剤鎖にハイブリダイズしない前記連結鎖の領域では前記連結鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、造影剤鎖オリゴヌクレオチドを提供することを含み、前記造影剤鎖が検出可能な標識で標識されており；
ｄ．前記造影剤鎖を前記連結鎖とハイブリダイズさせて前記遮断剤鎖を置換することを含み；
ｅ．前記標的認識抗体が前記標的に結合したか否かを判定することを含む、前記方法。
【請求項６】
前記造影剤鎖がその完全長にわたってではないが第１領域にわたって遮断剤鎖にハイブリダイズする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記連結鎖にハイブリダイズする前記遮断剤鎖と、前記造影剤鎖にハイブリダイズする前記遮断剤鎖とが互いにハイブリダイズする、請求項５〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第１の前記遮断剤鎖と第２の前記遮断剤鎖とがそれらの全長にわたって互いにハイブリダイズする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
多数の標的を画像化しようとする場合、駆逐剤鎖オリゴヌクレオチドが、前記連結鎖の全てにハイブリダイズすることができる普遍的駆逐剤鎖オリゴヌクレオチドである、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
多数の標的を画像化しようとする場合、前記駆逐剤鎖オリゴヌクレオチドが、前記造影剤鎖の全てにハイブリダイズすることができる普遍的駆逐剤鎖オリゴヌクレオチドである、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
試料中の少なくとも２つの標的を画像化する方法であって、
ａ．連結鎖オリゴヌクレオチドに結合した少なくとも２つの標的認識抗体を提供することを含み；
ｂ．第１の前記標的認識抗体上の前記連結鎖にハイブリダイズすることができる第１造影剤鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、及び第２の前記標的認識抗体上の前記連結鎖にハイブリダイズすることができる第１遮断鎖を提供することを含み、前記造影剤鎖が検出可能な標識で標識されており、前記遮断鎖が検出可能な標識で標識されておらず、３つ以上の標的認識抗体が存在する場合には場合によってさらなる遮断鎖を使用し；
ｃ．前記第１の標的を画像化すること、ならびに前記造影剤鎖及び前記遮断鎖を少なくとも１つの駆逐剤鎖によって除去することを含み；
ｄ．前記第２の標的認識抗体上の前記連結鎖にハイブリダイズすることができる第２造影剤鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、及び前記第１の標的認識抗体上の前記連結鎖にハイブリダイズすることができる第２遮断鎖を提供することを含み、前記造影剤鎖が検出可能な標識で標識されており、前記遮断鎖が検出可能な標識で標識されておらず、３つ以上の標的認識抗体が存在する場合には場合によってさらなる遮断鎖を使用し；
ｅ．前記第２の標的を画像化することを含み；
ｆ．場合によって前記造影剤鎖及び前記遮断鎖を少なくとも１つの駆逐剤鎖によって除去すること、ならびに場合によってさらなる任意の標的について前記画像化を繰り返すことを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記遮断剤鎖が、各連結鎖の一部にハイブリダイズすることができる普遍的遮断剤鎖である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記連結鎖が第１及び第２領域を有し、前記第１領域の方が前記抗体により近く、前記遮断剤鎖が前記第２領域にハイブリダイズする、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記造影剤鎖が第１、第２及び第３領域を有し、前記造影剤鎖の前記第１及び前記第２領域が前記連結鎖にハイブリダイズし、前記第１領域が、前記遮断剤鎖にハイブリダイズしていない前記連結鎖の一部にハイブリダイズする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記造影剤鎖を置換するために駆逐剤鎖をさらに採用する、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記駆逐剤鎖が前記造影剤鎖の３つ全ての領域にハイブリダイズする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
試料中の少なくとも１つの標的を画像化する方法であって、
ａ．第１連結鎖オリゴヌクレオチドに結合した少なくとも１つの第１標的認識抗体を提供することを含み；
ｂ．第２連結鎖オリゴヌクレオチドに結合した少なくとも１つの第２標的認識抗体を提供することを含み；
ｃ．前記第１連結鎖オリゴヌクレオチドと前記第２連結鎖オリゴヌクレオチドとが互いに近傍にあって完全長連結鎖を形成するときに前記第１連結鎖オリゴヌクレオチドと前記第２連結鎖オリゴヌクレオチドとに特異的に結合することができる、造影剤鎖オリゴヌクレオチドを提供することを含み、前記造影剤鎖が、前記第１または前記第２連結鎖オリゴヌクレオチドのどちらか単独に対する特異的な結合をしないものであり；
ｄ．前記造影剤鎖を検出することを含み、前記造影剤鎖が標識されている、前記方法。
【請求項１８】
前記第１連結鎖オリゴヌクレオチドが前記第２連結鎖オリゴヌクレオチドに特異的に結合することができる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標識が発蛍光団である、請求項１７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識が、金属粒子、プラズモン増強剤、酵素（例えばＨＲＰ）、プライマー、捕捉オリゴヌクレオチド、またはローリングサークル増幅のスプリント、または有限もしくは無限ハイブリダイゼーション連鎖反応の開始剤である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年５月１５日に出願された米国仮出願第６２／３３６，６７６号及び２０１６年５月３１日に出願された米国仮出願第６２／３４３，７９１号に基づく優先権の利益を主張するものであり、それらを参照によって全体的に任意の目的のために本明細書に援用する。
【０００２】
詳細な説明
分野
改良された、鎖置換を採用する試料中の標的の多重画像化。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ鎖置換は、ＤＮＡ複合体の等温的及び動的な交換のための方法である。１〜３鎖置換は、ＤＮＡハイブリダイゼーション相互作用及び熱力学の理解に基づいて設計されること及び意図的に制御されることができ、また、「足掛かりドメイン」として知られる操作された柄部を導入することによって容易にすることができる。結合相互作用を調節しハイブリダイゼーション相手を交換する能力は、一連の潜在的用途を生む。これらの用途のうちのいくつかは、免疫蛍光顕微鏡法を用いる固定細胞における多重タンパク質検出及びシグナル増幅の用途を含めて、Ｄｉｅｈｌら４〜７によって提案及び実証されている。
【０００４】
Ｄｉｅｈｌらによって提案された今日の技術水準は、蛍光顕微鏡法のための鎖置換のごく限られた具現化を提供する。Ｄｉｅｈｌらによって提案された設計は高価になることがある、というのも、それはアッセイにおいて別個の核酸配列を各標的認識要素と複合させることを必要とするからである。鎖置換の効率は最適ではなく、より長いＤＮＡ鎖の使用に起因して不要な非特異的結合を引き起こし得る。
【０００５】
本明細書では、本発明者らは、ＤＮＡ鎖置換に基づくいくつかの新規な予期せぬ実施形態を提案する。
【発明の概要】
【０００６】
記載によれば、試料中の少なくとも１つの標的を画像化する方法は、（ａ）アダプター鎖オリゴヌクレオチドに結合した少なくとも１つの標的認識抗体を提供すること；（ｂ）アダプター鎖オリゴヌクレオチドに特異的に結合することができる領域と、連結鎖領域とを有する架橋鎖オリゴヌクレオチドを提供すること；及び（ｃ）架橋鎖オリゴヌクレオチドの連結鎖領域に特異的に結合することができる造影剤鎖オリゴヌクレオチドを提供することを含み、造影剤鎖は検出可能な標識で標識されている。
【０００７】
いくつかの実施形態では、試料中の少なくとも１つの標的を画像化する方法は、（ａ）連結鎖オリゴヌクレオチドに結合した少なくとも１つの標的認識抗体を提供することを含み；（ｂ）連結鎖に対して第１領域にわたってハイブリダイズするが、その完全長または連結鎖の完全長にわたってハイブリダイズしない、遮断剤鎖を提供することを含み；（ｃ）少なくとも、遮断剤鎖にハイブリダイズしない連結鎖の領域では連結鎖オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、造影剤鎖オリゴヌクレオチドを提供することを含み、造影剤鎖が検出可能な標識で標識されており；（ｄ）造影剤鎖を連結鎖とハイブリダイズさせて遮断剤鎖を置換することを含み；（ｅ）標的認識抗体が標的に結合したか否かを判定することを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、試料中の少なくとも２つの標的を画像化する方法は、（ａ）連結鎖オリゴヌクレオチドに結合した少なくとも２つの標的認識抗体を提供することを含み；（ｂ）第１の標的認識抗体上の連結鎖にハイブリダイズすることができる第１造影剤鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、及び第２の標的認識抗体上の連結鎖にハイブリダイズすることができる第１遮断鎖を提供することを含み、造影剤鎖が検出可能な標識で標識されており、遮断鎖が検出可能な標識で標識されておらず、３つ以上の標的認識抗体が存在する場合には場合によってさらなる遮断鎖を使用し；（ｃ）第１の標的を画像化すること、ならびに造影剤鎖及び遮断鎖を少なくとも１つの駆逐剤鎖によって除去することを含み；（ｄ）第２の標的認識抗体上の連結鎖にハイブリダイズすることができる第２造影剤鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、及び第１の標的認識抗体上の連結鎖にハイブリダイズすることができる第２遮断鎖を提供することを含み、造影剤鎖が検出可能な標識で標識されており、遮断鎖が検出可能な標識で標識されておらず、３つ以上の標的認識抗体が存在する場合には場合によってさらなる遮断鎖を使用し；（ｅ）第２の標的を画像化することを含み；（ｆ）場合によって造影剤鎖及び遮断鎖を少なくとも１つの駆逐剤鎖によって除去すること、ならびに場合によってさらなる任意の標的について画像化を繰り返すことを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、試料中の少なくとも１つの標的を画像化する方法は、（ａ）第１連結鎖オリゴヌクレオチドに結合した少なくとも１つの第１標的認識抗体を提供することを含み；（ｂ）第２連結鎖オリゴヌクレオチドに結合した少なくとも１つの第２標的認識抗体を提供することを含み；（ｃ）第１連結鎖オリゴヌクレオチドと第２連結鎖オリゴヌクレオチドとが互いに近傍にあって完全長連結鎖を形成するときに第１連結鎖オリゴヌクレオチドと第２連結鎖オリゴヌクレオチドとに特異的に結合することができる、造影剤鎖オリゴヌクレオチドを提供することを含み、造影剤鎖が、第１または第２連結鎖オリゴヌクレオチドのどちらか単独に対する特異的な結合をしないものであり；（ｄ）造影剤鎖を検出することを含み、造影剤鎖は標識されている。
【００１０】
さらなる目的及び利点は、一部は以下の説明において明記されることになり、一部は説明から明らかとなり、または実施によって習得され得る。目的及び利点は、別記の特許請求の範囲において詳しく示されている要素及び組み合わせによって実現及び達成されよう。
【００１１】
上記の一般的説明及び以下の詳細な説明はどちらも例示及び説明のためのものに過ぎず、特許請求の範囲を制限するものではない、ということは理解されるべきである。
【００１２】
本明細書中に組み込まれかつその一部を構成する添付の図面は、１つ（いくつか）の実施形態（複数可）を例示するものであり、説明と一緒になって、本明細書に記載の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】連結鎖を標的に繋げる普遍的試薬の用途を示す。１０１は、標的に結合することができる抗体を表す。１０２と１０３との組み合わせは普遍的アダプターを表し、この場合、１０２が抗体結合剤であり、１０３が普遍的アダプターである。１０４−１０５の組み合わせは、普遍的アダプター（１０３）に対して相補的であるドメインと連結部位（１０５）とを有する架橋鎖を表す。
【図２】４方向分岐点移動を用いて造影剤鎖を導入及び除去する動的複合体の用途を示す。図２の標的結合剤は、いくつかの実施形態では抗体であり得る。
【図３】（ａ）造影剤鎖を導入し、（ｂ及びｃ）それを連結鎖から除去する、１つの反応を示す。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、遮断剤鎖の用途の様々な実施形態を示す。図４Ａは、各々の標的に結合している、３本の連結鎖を有する３つの一次抗体を示す。図４Ｂでは、連結鎖２０７に対して相補的である蛍光標識造影剤鎖２１０で試料を処理する。連結鎖２０８及び２０９に対してそれぞれ相補的である未標識遮断剤鎖２１１及び２１２を添加し、その後、洗浄及び標的２０４の画像化を行う。図４Ｂ及び図４Ｃに示されている図の間で、造影剤鎖または遮断剤鎖２１０、２１１及び２１２に対して相補的である駆逐剤鎖の混合物が添加されてこれらの鎖が除去される。図４Ｄは、蛍光標識造影剤鎖２１４及び他の連結鎖のための遮断剤鎖を用いる標的２０５の画像化を示す。
【図５】遮断剤鎖及び駆逐剤鎖を使用する交換画像化を示す。結合ドメインは、相補対を指すために文字及び星印付き文字で標記されている（例えば、ドメインａはドメインａ＊とハイブリダイズする）。まず、２つのドメイン（例えばａ及びｂ）を連結鎖に含有し得る核酸−標的認識複合体によって、全ての標的が染色される。全ての標的のための遮断剤鎖が導入され得、この場合、各遮断剤鎖は連結鎖の少なくとも１つのドメインに対して相補的である（例えば、ｂ＊）。その後、画像化される標的（複数可）に対する造影剤鎖が導入され得、現在の画像化の回において画像化される標的（複数可）のみについて遮断剤鎖を置換することになる。画像取得後、造影剤鎖に対して相補的であるドメインを含有する駆逐剤鎖（例えば、ａ、ｂ及びｃ）が導入されて、造影剤鎖を置換し、洗い流す。このサイクルは、逐次多重化のための他の標的の画像化のさらなる回のために繰り返され得る。
【図６】半普遍的遮断剤鎖及び普遍的駆逐剤鎖を使用する交換画像化を示す。
【図７】造影剤鎖の鎖置換による多重化近接性検出のための方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
実施形態の説明
Ｉ．定義
連結鎖は、いくつかの実施形態では中間体分子（例えば、完全長抗体及びその抗原結合断片を含めた抗体）を介して、対象標的に付着する、核酸−標的認識複合体を形成しているオリゴヌクレオチドとして定義される。連結部位は、連結鎖と造影剤鎖との相補性または特異的結合親和性の領域として定義される。
【００１５】
造影剤鎖は、標識（例えば、発蛍光団、ナノ粒子など）に付けられたオリゴヌクレオチドとして定義される。遮断剤鎖は、連結鎖に対する相補性の領域を有するオリゴヌクレオチドであって、連結鎖に結合しているときにいかなる目標外の造影剤鎖との会合も遮断する、当該オリゴヌクレオチドとして定義され；同様に、遮断剤鎖は、造影剤鎖に対する相補性の領域を有するオリゴヌクレオチドであって、造影剤鎖に結合しているときにいかなる目標外の連結鎖との会合も遮断する、当該オリゴヌクレオチドであり得る（図２を参照のこと）。駆逐剤鎖は、遮断剤鎖または造影剤鎖に対する相補性の領域を有するオリゴヌクレオチドであって、連結鎖に結合している遮断剤鎖または造影剤鎖の鎖置換を結果的に起こさせる、当該オリゴヌクレオチドとして定義される
【００１６】
本願の全体を通して、ハイブリダイゼーションまたはハイブリダイゼーション条件について言及する場合、ハイブリダイゼーションを確実に起こすために室温で高イオン強度緩衝液条件（例えば、１ｘ生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液、またはリン酸緩衝液中１５０ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭもしくは６００ｍＭの塩化ナトリウム）が採用され得る。
【００１７】
ＩＩ．連結鎖を標的に繋げる普遍的試薬
連結鎖は大抵、標的認識分子、例えば抗体（その抗原結合断片を含む）またはアプタマーを介して標的に繋げられる。抗体は、よくある類の標的認識分子である。共有結合しか伴わないもの及び非共有結合を伴うものを含めて、多くの抗体−ＤＮＡ複合化方法が過去に記載された。非共有結合を伴う複合化方法の例としては、天然型及び操作型の抗体結合タンパク質、例えばプロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＡ／Ｇ、ならびに定常領域／ドメイン（例えば、Ｆｃ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＬドメイン）を認識する二次抗体及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）が関与するものが挙げられる。
【００１８】
様々な標的認識分子（例えば抗体）に（様々な配列の）様々な連結鎖を取り付ける手順を簡素化させるために、本発明者らはここでは、１つまたは少数の普遍的アダプターの使用について記載する。図１に示すように、「普遍的」（つまり、標的非依存性）アダプター配列（１０３）を有するＤＮＡ鎖を、一次抗体（１０１）の定常領域／ドメインに結合することができる抗体結合剤（１０２）と複合化させてもよい。抗体結合剤（１０２）は、プロテインＡ、プロテインＧなど、または一価のＦａｂ、Ｆａｂ’などとすることができる。１３そのような普遍的アダプター（１０２及び１０３を含む）を、単純なインキュベーションによって一次抗体と複合体化させることができる。精製の有無にかかわらず、その後に「架橋鎖」を複合体に添加することができる。架橋鎖は、２つのドメインを含む：普遍的アダプター（１０３）に対して相補的である片方（１０４）、及び連結部位としての役割を担うもう片方（１０５）。新しい３部構成複合体は、精製を伴うかまたは伴わずに使用することができる。場合によっては、不要な相互作用を防止するために、過剰な普遍的アダプターまたは架橋鎖を不活化させる捕捉剤分子を複合体に加えてもよい。例えば、一次抗体がマウス由来のＩである場合、正常マウスＩｇＧ（または正常マウス血清）を使用して、試料中に存在し得る他のマウス一次抗体に普遍的アダプターが結合しないように過剰な普遍的アダプター（１０２−１０３）を失活させてもよい。別の例では、独立型ＤＮＡ鎖１０３を使用して、他の標的に結合した普遍的アダプター鎖に架橋鎖が結合しないように過剰な架橋鎖（１０４−１０５）を失活させてもよい。
【００１９】
さらには、この概念の一部を実施してもよい。例えば、（抗体結合剤である１０２を使用する代わりに）普遍的アダプター配列（１０３）を一次抗体に共有結合的に複合させて、例えば連結部位の配列を最適化させる必要がある場合に、異なるＤＮＡ配列を抗体に化学的に複合させる必要がないという利点を得てもよい。
【００２０】
ＩＩＩ．造影剤鎖を導入するための直接的ハイブリダイゼーションの利用
Ｄｉｅｈｌらの実証において造影剤鎖（それは、一本鎖ＤＮＡとして連結鎖を含有する）は、造影剤鎖に対して相補的な配列を有する「保護剤」鎖も含有する二本鎖の一部として試料に導入される。保護剤鎖は、造影剤鎖上のいくつかの塩基を「遮蔽」し、それと非標的分子とが不要なワトソン・クリック対合またはその他の非特異的相互作用によって相互作用することを防ぎ得る。しかしながら、この設計は、造影剤鎖が長いことを要求する。以前の設計では、特異的にするためには連結部位に対して相補的である造影剤鎖の一部が長くなければならない、というのも、それは次の２つのドメインを含有せねばならないからである：（ａ）連結部位との相互作用を開始する一本鎖足掛かりドメイン、及び（ｂ）保護剤鎖に結合しているドメイン。（ａ）の足掛かりは、高速な鎖置換を開始するためには（約５０％のＧＣ含有率を想定して）少なくとも約５ヌクレオチド長でなければならず、（ｂ）の保護剤鎖に結合したドメインは、安定なハイブリダイゼーションを確保するためには、（約５０％のＧＣ含有率を想定して）少なくとも約１２ヌクレオチド長でなければならない。したがって、以前の設計では、連結部位に対して相補的である造影剤鎖の一部の全長は、（約５０％のＧＣ含有率を想定して）少なくとも約１７ヌクレオチド長でなければならない。結果として、以前の設計では、連結部位もまた、（約５０％のＧＣ含有率を想定して）少なくとも約１７ヌクレオチドでなければならない。
【００２１】
本発明者らの新規な設計では、造影剤鎖を保護剤鎖なしの一本鎖ＤＮＡとして導入することができる。この設計では、連結部位に対して相補的である造影剤鎖の部分の長さの要件は、連結鎖との安定なハイブリダイゼーションを確保するのに十分長く、いくつかの実施形態では最小限の長さが（約５０％のＧＣ含有率を想定して）約１２ヌクレオチドである。連結部位も同様の長さであることができる。長さが短ければ短いほど、設計をより小型にすることができ、ＤＮＡ起因性の非特異的な結合の機会を減らすことができる。
【００２２】
ＩＶ．造影剤鎖を導入及び除去するための他の動的複合体の使用
足掛かりによって媒介される鎖置換を実施する標準的方法は、共通鎖、現役鎖及び侵攻鎖が関与する３方向分岐点移動を用いることである。このプロセスの一例は、ＵＳ２０１６／０００２７０４Ａ１の図２Ａの「標識」反応に示されており、この場合、蛍光標識された鎖が共通鎖であり、「廃棄」鎖が現役鎖であり、ＮＡタグが侵攻鎖である。３方向分岐点移動の欠点は、侵攻鎖が一本鎖でなければならないということである。そのような長い（先に記載したとおり、少なくとも約１７ヌクレオチド）一本鎖ＤＮＡは、不要な非特異的結合を招き得る。
【００２３】
新しい手法として、一本鎖ＤＮＡの長さを減らすために、４方向分岐点移動を用いて造影剤鎖を導入及び除去してもよい。一例を図２に示す。図２は、連結鎖１の長さの一部にわたって遮断剤鎖３にハイブリダイズするものであり、かつ残りの長さの少なくともいくらかにわたって観測可能な標識を有する造影剤鎖２にハイブリダイズするものである連結鎖１によって標的認識抗体に取り付けられた連結鎖を示す。造影剤鎖２は、その長さの一部にわたって遮断剤鎖４にもハイブリダイズする。これにより、造影剤鎖２が遮断剤鎖３に取って代わることが可能になる。場合によっては、遮断剤鎖３と遮断剤鎖４とがそれらの完全長にわたって互いにハイブリダイズする。この実施形態は、連結鎖に対する遮断剤鎖と、造影剤鎖に対する遮断剤鎖との両方を示す。
【００２４】
ＤＮＡ構築物を単純なものにする別の方法は、ヘアピンを使用することである。例えば、図３の反応（ａ）を用いて、（Ｈ１によって具現化される）造影剤鎖を導入してもよく、反応（ｂ及びｃ）を用いてそれを、（Ｃ１によって具現化される）連結鎖から除去してもよい。図３は、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１１）３９（１６）：ｅ１１０を典拠とする。
【００２５】
Ｖ．シグナル増幅の他の形態
（ＤＮＡ複合体を介して標的のところへ送られる）発蛍光団を、直接的または間接的に観測されることができる他の分子または部分によって置き換えてもよい。これらの分子または部分としては、限定されないが例えば、金属粒子、プラズモン増強剤、酵素（例えばＨＲＰ）、プライマー、捕捉オリゴヌクレオチド、またはローリングサークル増幅のスプリント、有限もしくは無限ハイブリダイゼーション連鎖反応の開始剤などが挙げられる。
【００２６】
ＶＩ．遮断剤鎖の使用及び普遍的／自動化交換
Ａ．遮断剤鎖
多重画像化は、ある画像化回から次回への造影剤鎖の（例えば鎖置換による）効率的な交換を用いて実施することができる。例えば、第１標的を第１造影剤鎖で画像化してもよく、その後、第１造影剤鎖を洗浄ステップによって排除してもよく、その後、第２造影剤鎖を導入して第２標的を画像化してもよい、などである。１つの態様は、交差反応性を低減するため、及び造影剤鎖が目標外の連結鎖と結合するのを防ぐべく、積極的に画像化されない何らかの標的のための遮断剤鎖を添加することである。遮断剤鎖は、標的認識存在物を介して特異的標的に複合化する連結鎖の１つ以上のドメイン（複数可）に対して特異的でなければならない。一実施形態では、遮断剤鎖は、造影剤鎖に対して相補的である足掛かりドメインがハイブリダイズされずに残るように連結鎖の一部に結合する。この構成を用いれば、連結鎖の多数のドメイン（限定されないが、足掛かりドメインを含む）に対して相補的である造影剤鎖を導入して、標的の画像化の前に遮断剤鎖を置換することができる。別の態様では、駆逐剤鎖を導入して連結鎖から造影剤鎖を引き剥がすことができる。図４Ａ〜Ｄ及び図５は、交換のために遮断剤鎖及び駆逐剤鎖を添加する多重画像化のために用いられる構成要素及び方法の実施形態を実証する。
【００２７】
１つの実施形態は、画像化の逐次的な回を能率化するための、造影剤鎖の普遍的交換及び遮断剤鎖の置き換えの方法である。１つの方法では、１回以上の画像化を用いて１つ以上の標的を検出し、この場合、全ての駆逐剤鎖または全ての遮断剤鎖の混合物を、画像化回間の中間ステップとして導入する。任意の結合した造影剤鎖を置換する洗浄用緩衝液として、全種類の駆逐剤鎖の混合物を含んだ組成物が企図される。全種類の遮断剤鎖の混合物を含んだ組成物は、任意の造影剤鎖の添加に先立つ付加的ステップとして企図される。この組成物をキットの一部としてもよい。この方法は、手作業であってもよいし、または部分的もしくは完全に自動化されてもよい。液体の取り扱いのために流体工学を組み入れてもよい。画像の取得及び分析のためにソフトウェアを組み込んでもよい。この方法を、細胞または組織試料に対する免疫組織化学及び免疫蛍光に応用してもよい。
【００２８】
同様に簡素化された作業流れを獲得しかつＤＮＡ種間での交差ハイブリダイゼーションを軽減するための別の方法は、造影剤鎖（複数可）と遮断剤鎖（複数可）とを含む混合物の使用である。具体的には、ある標的を画像化するために、この標的に対する造影剤鎖と、その他全ての標的に対する遮断剤鎖とを混合することができ、そしてそれらを、全ての連結鎖を含有する試料に加えることができる。たとえ造影剤鎖が、間違った標的上の連結鎖に誤って結合したとしても、それは当該標的に対する遮断剤鎖によって置換されることができる。一例を図４Ｄに示す。この実施例では、本発明者らは、３つの標的（２０４、２０５、２０６）にそれぞれ結合しかつ３本の連結鎖（２０７、２０８、２０９）にそれぞれ取り付けられた、３つの一次抗体（２０１、２０２、２０３）が存在していることを想定している。試料を３つのＤＮＡ付着抗体で染色（段階Ａ）した後、（ｉ）連結鎖２０７に対して相補的である、蛍光標識された造影剤鎖２１０と、（ｉｉ）連結鎖２０８に対して相補的である未標識の遮断剤鎖２１１と、（ｉｉｉ）連結鎖２０９に対して相補的である未標識の遮断剤鎖２１２との混合物を添加することができる。洗浄後、標的２０４を画像化することができる（段階Ｂ）。次いで、造影剤鎖／遮断剤鎖２１０、２１１及び２１２に対して相補的である駆逐剤鎖の混合物を添加してこれらの鎖を試料から除去することができる（段階Ｃ）。次いで、（ｉ）連結鎖２０７に対して相補的である未標識の遮断剤鎖２１３と、（ｉｉ）連結鎖２０８に対して相補的である、蛍光標識された造影剤鎖２１４と、（ｉｉｉ）連結鎖２０９に対して相補的である未標識の遮断剤鎖２１２との混合物を添加することができる。洗浄後、標的２０５を画像化することができる（段階Ｄ）。同様のプロセスを用いて標的２０６を可視化することができる。
【００２９】
Ｂ．半普遍的または普遍的な遮断剤鎖の使用
半普遍的遮断剤鎖のための構成について記載する。そのような半普遍的遮断剤鎖は、普遍的である（つまり、全ての標的に対して複合化する全ての連結鎖にわたって不変である）１つのドメインと、標的特異的である１つのドメインとを含有し得る。
【００３０】
普遍的駆逐剤鎖のための構成について記載する。普遍的駆逐剤鎖は、各種の連結鎖に対合する固有の配列を探す複雑さを軽減し、かくして、非常に高度な多重化を容易にし得る。１つの実施形態では、普遍的駆逐剤鎖は、全ての標的複合体において不変に保たれた連結鎖の領域に結合する１つのドメインからなる。普遍的駆逐剤鎖の結合は、足掛かりによって媒介される鎖置換を通じて起こり得、半普遍的遮断剤鎖を置換し得る。
【００３１】
半普遍的遮断剤鎖と普遍的駆逐剤鎖とを使用する、反復画像化及び逐次多重化の方法について記載する（図６）。まず、全ての標的を核酸−標的認識複合体で染色するが、この場合、複合体は、不変ドメイン（図６中、ｕ＊と標記される）と標的特異的ドメイン（図６中、Ｎ番目の標的としてＮ＊と標記される）とを含有し得る連結鎖を含む。全ての標的に対する半普遍的遮断剤鎖（例えば、不変ドメインｕと、標的特異的ドメインＮとからなる）が添加され得、連結鎖の不変ドメインと標的特異的ドメインとに結合することができる。その後、普遍的駆逐剤鎖と、Ｎ番目の標的に対する造影剤鎖と、Ｎ番目の標的に対して特異的なドメインを含有するものを除く全ての半普遍的遮断剤鎖とを含有する混合物が添加され得る。このステップの間、普遍的駆逐剤は、連結鎖の不変領域において利用可能である足掛かりに結合し、遮断剤鎖を置換し始める。造影剤鎖は、連結鎖のドメインＮ＊において利用可能である足掛かりに結合して遮断鎖の置換を完遂する。他の全ての標的に対する半普遍的遮断鎖の混合物を添加して、それらの標的が遮断されたまま残ることを確かなものにする。その後、画像取得を実施してＮ番目の標的を検出することができる。ひとたび画像取得が完了したならば、Ｎ番目の標的に対して特異的である遮断鎖を含めた全ての半普遍的遮断鎖の混合物を使用して全ての造影鎖及び普遍的駆逐鎖を、次の画像化のサイクルまたは回に先立って置換することができる。このサイクルは、逐次画像化において他の標的の画像化のさらなる回のために繰り返されることができる。各結合対の熱力学を正確に理解せねばならないこと、及び普遍的駆逐鎖と半普遍的遮断鎖とが関与する方法を促進するために各順方向反応の平衡を正確に制御せねばならないことは、理解されねばならない。
【００３２】
ＶＩＩ．近接性検出
別の実施形態では、多重化近接性検出の方法を提案する。近接性検出は、造影剤鎖に対する部分的な（例えば半分の）連結部位に対応するドメインを各々が含有している核酸−標的認識複合体の対を使用して、成し遂げられる。核酸−標的認識複合体の対が互いに近傍にある場合、完全な連結部位が形成されて、造影剤鎖または遮断剤鎖と結合することが可能になる。標的認識複合体間の距離は、連結鎖の設計によって様々であり得、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、５０、１００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さで変化し得る。近接性検出は、５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍまたはそれ以上の距離長さのために設計されることができる。ハイブリダイゼーションを確実に起こすために室温で高イオン強度緩衝液条件（例えば、１ｘ生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液、またはリン酸緩衝液中１５０ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭもしくは６００ｍＭの塩化ナトリウム）が採用され得る。核酸−標的認識複合体の対は、シグナル分子標的または２つの別個の標的に結合するように設計されることができる。造影剤鎖は、完全な連結部位に対して相補的である１つのドメインと、鎖置換のための足掛かりとしての役割を担う１つのドメインとの、２つのドメインを含有し得る。
【００３３】
例えば、図７において、標的は、同一標的上の異なるエピトープに結合する２つのＤＮＡ複合化抗体に結合しており、ＤＮＡ鎖同士を近寄らせて完全な連結部位を形成している。対応する造影剤鎖が添加されると、造影剤鎖は完全な連結部位に結合することになり、標的は（例えば、落射蛍光、共焦点顕微鏡法、ＴＩＲＦなどを用いて）画像化されることができる。画像化シグナルを消去するために、造影剤鎖を、造影鎖上の足掛かりに結合する駆逐鎖の添加によって置換することができる。多数の標的の多重化近接性検出は、１回以上の鎖置換によって行うことができる。
【００３４】
均等物
上記の明細書は、実施形態を当業者が実施することを可能にするのに十分であると考えられる。上記の記載及び実施例は、特定の実施形態について詳述し、本発明者らによって企図される最良の形態を記載している。しかしながら、上記が本文中でどれほど詳しく述べられているようであっても、実施形態が多くの方法で実施され得、別記の請求項及びそれらの任意の均等物に準拠して解釈されねばならないことは、理解されよう。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、約という用語は、明確に示されているか否かにかかわらず、例えば整数、小数及び百分率を含めた数値を指す。約という用語は、通常、当業者であれば挙げられた値と等価であるとみなすであろう（例えば、同じ機能または結果を有する）数値の範囲（例えば、挙げられた範囲の＋／−５〜１０％）を指す。少なくともという用語、及び約という用語が、数値または範囲の列挙に先行する場合、それらの用語は、当該列挙において提供された値または範囲の全てを修飾する。ある場合には、約という用語は、最も近い有効数字として概数で表した数値を含み得る。
【００３６】
参考文献
１．  Ｙｕｒｋｅ，Ｂ．＆Ｍｉｌｌｓ，Ａ．Ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｔｏ  Ｐｏｗｅｒ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．１１１−１２２（２００３）。
【００３７】
２．  Ｙｕｒｋｅ，Ｂ．，Ｔｕｒｂｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｊｒ，Ａ．Ｐ．Ｍ．，Ｓｉｍｍｅｌ，Ｆ．Ｃ．＆Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｊ．Ｌ．Ａ  ＤＮＡ−ｆｕｅｌｌｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｍａｄｅ  ｏｆ  ＤＮＡ．４０６，６０５−６０８（２０００）。
【００３８】
３．  Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ｙ．，Ｔｕｒｂｅｒｆｉｅｌｄ，Ａ．，Ｙｕｒｋｅ，Ｂ．＆Ｗｉｎｆｒｅｅ，Ｅ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｅｎｔｒｏｐｙ−Ｄｒｉｖｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０−．）．３１８，１１２１（２００７）。
【００３９】
４．  Ｄｕｏｓｅ，Ｄ．Ｙ．，Ｓｃｈｗｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｉｔｔｅｌｍａｎ，Ｗ．Ｎ．＆Ｄｉｅｈｌ，Ｍ．Ｒ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ａｎｄ  Ｒｅｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｖｉａ  ＤＮＡ  Ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２１，２３２７−２３３１（２０１０）。
【００４０】
５．  Ｄｕｏｓｅ，Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｆｉｇｕｒｉｎｇ  ｒｏｂｕｓｔ  ＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｅｓ．４０，３２８９−３２９８（２０１２）。
【００４１】
６．  Ｓｃｈｗｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｙｎａｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．５１，９２９２−９２９６（２０１２）。
【００４２】
７．  Ｚｉｍａｋ，Ｊ．，Ｓｃｈｗｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｄｕｏｓｅ，Ｄ．Ｙ．，Ｈｉｔｔｅｌｍａｎ，Ｗ．Ｎ．＆Ｄｉｅｈｌ，Ｍ．Ｒ．Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｄｙｎａｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．７７０５４，２７２２−２７２８（２０１２）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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