(57)【要約】本開示は、新規脂質およびそれを含む組成物を特徴とする。脂質ナノ粒子は、新規脂質ならびに追加の脂質、例えばリン脂質、構造脂質、およびＰＥＧ脂質を含む。治療薬および／または予防薬、例えばＲＮＡをさらに含む脂質ナノ粒子は、例えば、ポリペプチド、タンパク質、または遺伝子発現を調節するための、哺乳動物細胞または臓器への治療薬および／または予防薬の送達において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性ポリマーと、イオン化可能脂質またはその薬学的に許容可能な塩を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）構成成分とを含む安定化ナノ粒子製剤。
【請求項２】
水性製剤またはその凍結乾燥もしくは冷凍製剤である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記両親媒性ポリマーとＬＮＰとの重量比は、約０．０００４：１〜約１００：１である、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
前記両親媒性ポリマーとＬＮＰとの重量比は、約０．００１：１〜約１０：１であるか、または約０．００１：１〜約５：１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
前記両親媒性ポリマーとＬＮＰとの重量比は、約０．００１：１〜約０．１：１、約０．００５〜約０．４：１、または約０．５：１〜約４：１である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６】
約４℃以下における少なくとも１ヵ月間の貯蔵後に約２０％以下のＬＮＰ平均サイズの増加を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
最大３０回の冷凍／解凍サイクル後に約２０％以下のＬＮＰ平均サイズの増加を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
精製前のＬＮＰ平均サイズと比較して精製プロセス後に約２０％以下のＬＮＰ平均サイズの増加を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
精製プロセスは、濾過を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
凍結乾燥前のＬＮＰ平均サイズと比較して凍結乾燥後に約２０％以下のＬＮＰ平均サイズの増加を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
不純物を実質的に有さない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、または約０．５％以下の不純物を含有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３】
ＬＮＰは、冷凍または凍結乾燥後に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９５％のクロマトグラフィー純度を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４】
前記両親媒性ポリマーは、非イオン性である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５】
前記両親媒性ポリマーは、リオプロテクタントである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１６】
前記両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポロキサミン（テトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１７】
前記両親媒性ポリマーは、Ｐ１８８である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１８】
両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で２×１０−４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１９】
両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で約０．１×１０−４Ｍ〜約１．３×１０−４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２０】
前記両親媒性ポリマーの濃度は、約０．０２５％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖの範囲である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２１】
前記両親媒性ポリマーの濃度は、冷凍または凍結乾燥前に約０．１％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖの範囲である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２２】
前記両親媒性ポリマーの濃度は、冷凍または凍結乾燥前に約０．１％ｗ／ｖ〜約２．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ、または約０．１％ｗ／ｖ〜約０．４％ｗ／ｖの範囲である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２３】
前記両親媒性ポリマーの濃度は、冷凍または凍結乾燥前に約０．１％ｗ／ｖ〜約０．５％ｗ／ｖの範囲である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２４】
前記両親媒性ポリマーの濃度が増加する場合、凍結乾燥後にサブビジブル粒子状物質の量の減少を有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２５】
糖をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２６】
糖は、二糖である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２７】
糖は、スクロースもしくはトレハロースまたはそれらの組合せである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２８】
糖の合計濃度は、冷凍または凍結乾燥前に０％ｗ／ｗ〜約３０％ｗ／ｗの範囲である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項２９】
塩をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３０】
塩は、塩化物塩、好ましくはＮａＣｌである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３１】
塩の濃度は、冷凍または凍結乾燥前に０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３２】
酸化防止剤をさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３３】
冷凍または凍結乾燥前に約４〜約８の範囲のｐＨ値を有する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３４】
治療剤および／または予防剤をさらに含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３５】
治療剤および／または予防剤は、核酸である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３６】
冷凍または凍結乾燥前に約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬの核酸、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの核酸を有する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３７】
前記両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１００：１である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３８】
前記両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１：１である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項３９】
前記両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．１：１〜約４：１である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４０】
前記両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約１０：１〜約４０：１である、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４１】
治療剤および／または予防剤は、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４２】
ＲＮＡは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４３】
ＲＮＡは、ｍＲＮＡである、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４４】
ｍＲＮＡは、ステムループ、鎖終結ヌクレオシド、ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、および／または５’キャップ構造の１つ以上を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４５】
ｍＲＮＡは、少なくとも３０ヌクレオチド長である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４６】
ｍＲＮＡは、少なくとも３００ヌクレオチド長である、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４７】
治療剤および／または予防剤の封入効率は、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４８】
封入効率は、約４℃以下における少なくとも１ヵ月間の貯蔵後に実質的に同一である、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項４９】
封入効率は、最大３０回の冷凍／解凍サイクル後に実質的に同一である、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５０】
封入効率は、精製前のものと比較して精製プロセス後に実質的に同一である、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５１】
封入効率は、凍結乾燥前のものと比較して凍結乾燥後に実質的に同一である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５２】
ＬＮＰと治療剤および／または予防剤とのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１〜約６０：１である、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５３】
Ｎ：Ｐ比は、約２：１〜約３０：１である、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５４】
ＬＮＰの平均サイズは、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍである、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５５】
凍結乾燥時に約７０℃以上のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５６】
免疫原性をほとんど有さないかまたはまったく有さない、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５７】
治療剤または予防剤をさらに含み、かつ、前記両親媒性ポリマーを含まない対応する製剤と比較して増加した治療指数を有する、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５８】
前記ＬＮＰ構成成分は、中性脂質をさらに含む、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５９】
中性脂質は、リン脂質またはその類似体もしくは誘導体である、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６０】
リン脂質は、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６リゾＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６１】
前記ＬＮＰ構成成分は、構造脂質をさらに含む、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６２】
構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソル酸、アルファ−トコフェロール、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６３】
前記ＬＮＰ構成成分は、ＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６４】
ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ−修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ−修飾セラミド、ＰＥＧ−修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ−修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ−修飾ジアルキルグリセロール、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６５】
前記ＬＮＰ構成成分は、約３０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質、約０ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％のリン脂質、約１８．５ｍｏｌ％〜約４８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約０ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６６】
前記ＬＮＰ構成成分は、約５０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質、約１０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６７】
イオン化可能脂質は、イオン化可能アミノ脂質を含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６８】
イオン化可能脂質は、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、および（ＩＩｅ）のいずれかの化合物を含む、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６９】
前記ＬＮＰ構成成分は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択されるカチオン性および／またはイオン化可能脂質をさらに含む、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７０】
免疫原性を低下させる方法であって、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の製剤を細胞中に導入することを含み、前記製剤は、前記両親媒性ポリマーを含まない対応する製剤によって誘導される細胞中での細胞免疫応答の誘導と比較して、前記製剤に対する前記細胞の細胞免疫応答の誘導を低減させる、方法。
【請求項７１】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を精製する方法であって、両親媒性ポリマーの存在下で第１のＬＮＰ製剤を濾過して第２のＬＮＰ製剤を得ることを含む方法。
【請求項７２】
前記第１のＬＮＰ製剤は、核酸をさらに含み、および前記両親媒性ポリマーと前記核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１：１である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を冷凍するかまたは凍結乾燥させる方法であって、両親媒性ポリマーの存在下で第１のＬＮＰ製剤を冷凍するかまたは凍結乾燥させて第２のＬＮＰ製剤を得ることを含む方法。
【請求項７４】
前記第１のＬＮＰ製剤は、核酸をさらに含み、および前記両親媒性ポリマーと前記核酸との重量比は、約０．１：１〜約４０：１である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記両親媒性ポリマーと前記核酸との重量比は、前記第１のＬＮＰ製剤を冷凍するために約０．１：１〜約４：１である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記両親媒性ポリマーと前記核酸との重量比は、前記第１のＬＮＰ製剤を凍結乾燥させるために約１０：１〜約４０：１である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
ストレスの適用時に脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を安定化させる方法であって、ストレスの適用前または適用中に前記ＬＮＰ製剤に両親媒性ポリマーを添加することを含む方法。
【請求項７８】
前記ＬＮＰ製剤は、核酸をさらに含み、および前記両親媒性ポリマーと前記核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１００：１である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ストレスは、前記ＬＮＰ製剤の生成または精製時に適用され、および前記両親媒性ポリマーと前記核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１：１である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ストレスは、冷凍／解凍ストレスであり、および前記両親媒性ポリマーと前記核酸との重量比は、約０．１：１〜約４：１である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記ストレスは、前記ＬＮＰ製剤の凍結乾燥時に適用され、および前記両親媒性ポリマーと前記核酸との重量比は、約１０：１〜約４０：１である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
安定化脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を生成する方法であって、第１の両親媒性ポリマーを、イオン化可能脂質およびｍＲＮＡを含む脂質組成物と混合して混合物を得ることを含む方法。
【請求項８３】
前記混合は、乱流またはマイクロ流体混合を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１：１である、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記混合物を精製することをさらに含む、請求項８２〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
精製は、任意選択的に第２の両親媒性ポリマーを添加するタンジェンシャルフロー濾過を含む、請求項８２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
第２の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１：１である、請求項８２〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
第３の両親媒性ポリマーを添加し、かつ任意選択的に塩、糖、またはそれらの組合せを添加して前記製剤を冷凍するかまたは凍結乾燥させることをさらに含む、請求項８２〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
第３の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．１：１〜約４０：１である、請求項８２〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
第３の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、前記製剤を冷凍するために約０．１：１〜約４：１である、請求項８２〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
第３の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、前記製剤を凍結乾燥させるために約１０：１〜約４０：１である、請求項８２〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
第４の両親媒性ポリマーを添加して前記製剤を包装することさらに含む、請求項８２〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
第４の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．２５：１〜約１００：１または約０．５：１〜約１２：１である、請求項８２〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記両親媒性ポリマーは、非イオン性である、請求項８２〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポロキサミン（テトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される、請求項８２〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記両親媒性ポリマーは、Ｐ１８８である、請求項８２〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で２×１０−４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する、請求項８２〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で約０．１×１０−４Ｍ〜約１．３×１０−４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する、請求項８２〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記両親媒性ポリマーは、約０．０２５％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖまたは約０．１％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖの範囲の濃度において存在する、請求項８２〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較してＬＮＰ平均サイズの増加を実質的に有さない、請求項８２〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較して約２０％以下のＬＮＰ平均サイズの増加を有する、請求項８２〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較して多分散指数の増加を実質的に有さない、請求項８２〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較して約２０％以下の多分散指数の増加を有する、請求項８２〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較して封入効率の減少を実質的に有さない、請求項８２〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較して約２０％以下の封入効率の減少を有する、請求項８２〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、両親媒性ポリマーおよび１つ以上の脂質ナノ粒子構成成分を含む新規安定化組成物、ならびに１つ以上の治療薬および／もしくは予防薬を哺乳動物細胞もしくは臓器に送達させ、かつ／または哺乳動物細胞もしくは臓器中でポリペプチドを産生させるための脂質ナノ粒子を含む方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
生物活性物質、例えば小分子薬物、タンパク質、および核酸の有効な標的化送達は、継続的な医学的課題を表す。特に、細胞への核酸の送達は、そのような種の相対的不安定性および低い細胞浸透性により困難となる。したがって、細胞への治療薬および／または予防薬、例えば核酸の送達を容易にするための方法および組成物を開発することが必要とされている。
【０００３】
脂質含有ナノ粒子または脂質ナノ粒子、リポソーム、およびリポプレックスは、生物活性物質、例えば小分子薬物、タンパク質、および核酸のための、細胞および／または細胞内コンパートメント中への輸送ビヒクルとして有効であることが証明されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
種々のそのような脂質含有ナノ粒子が実証されているが、安全性、効力、および特異性の改善が依然として欠落している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本開示は、両親媒性ポリマーと、イオン化可能脂質またはその薬学的に許容可能な塩を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）構成成分とを含む安定化ナノ粒子製剤を提供する。
【０００６】
安定化製剤は、以下の特徴の１つ以上を含み得る。
例えば、製剤は、水性製剤またはその凍結乾燥もしくは冷凍製剤である。
例えば、両親媒性ポリマーとＬＮＰとの重量比は、約０．０００４：１〜約１００：１（例えば、約０．００１：１〜約１０：１、約０．００１：１〜約５：１、約０．００１：１〜約０．１：１、約０．００５〜約０．４：１、または約０．５：１〜約４：１、約０．０５：１〜約５：１、約０．１：１〜約５：１、または約０．０５：１〜約２．５：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約５０：１、または約１：１〜約２５：１）である。
【０００７】
例えば、製剤は、４℃以下における少なくとも１ヵ月間の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。
例えば、製剤は、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によって計測して最大３０回の冷凍／解凍サイクル後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。
【０００８】
例えば、製剤は、精製前のＬＮＰ平均サイズと比較して精製プロセス後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。例えば、精製プロセスは、濾過を含む。
【０００９】
例えば、製剤は、凍結乾燥前のＬＮＰ平均サイズと比較して凍結乾燥後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。
例えば、製剤は、不純物（例えば、化学的および物理的不純物）を実質的に有さない。
【００１０】
例えば、製剤は、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、または約０．５％以下の不純物を含有する。
例えば、不純物としては、構造脂質（例えば、コレステロール）を有するリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）の凝集物が挙げられる。例えば、不純物としては、構造脂質（例えば、コレステロール）を有さないリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）の凝集物が挙げられる。例えば、不純物としては、コレステロールを有するＤＳＰＣの凝集物が挙げられる。例えば、不純物としては、コレステロールを有さないＤＳＰＣの凝集物が挙げられる。
【００１１】
例えば、ＬＮＰは、冷凍または凍結乾燥後に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９５％のクロマトグラフィー純度（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーもしくは「ＳＥＣ」による、あるいは逆相ＨＰＬＣもしくは「ＲＰ−ＨＰＬＣ」またはその両方による）を有する。
【００１２】
例えば、不純物としては、サブビジブル粒子状物質（例えば、１ミクロン超のサイズを有する粒子状物質）が挙げられる。
例えば、両親媒性ポリマーは、非イオン性である。
【００１３】
例えば、両親媒性ポリマーは、リオプロテクタントである。
例えば、両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポロキサミン（テトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。例えば、両親媒性ポリマーは、Ｐ１８８である。
【００１４】
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で２×１０−４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ：ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を有する。
【００１５】
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で約０．１×１０−４Ｍ〜約１．３×１０−４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、約０．０２５％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖの範囲である。例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、約０．０２５％ｗ／ｗ〜約３％ｗ／ｗの範囲である。
【００１６】
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、冷凍または凍結乾燥前に約０．０２５％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖの範囲である。例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、冷凍または凍結乾燥前に約０．０２５％ｗ／ｗ〜約１％ｗ／ｗの範囲である。
【００１７】
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、冷凍または凍結乾燥前に約０．１％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖの範囲である。例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、冷凍または凍結乾燥前に約０．１％ｗ／ｗ〜約３％ｗ／ｗの範囲である。
【００１８】
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、冷凍または凍結乾燥前に約０．１％ｗ／ｖ〜約２．５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ、または約０．１％ｗ／ｖ〜約０．４％ｗ／ｖの範囲である。例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、冷凍または凍結乾燥前に約０．１％ｗ／ｗ〜約２．５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ〜約１％ｗ／ｗ、または約０．１％ｗ／ｗ〜約０．４％ｗ／ｗの範囲である。
【００１９】
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、冷凍または凍結乾燥前に約０．１％ｗ／ｖ〜約０．５％ｗ／ｖの範囲である。例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、冷凍または凍結乾燥前に約０．１％ｗ／ｗ〜約０．５％ｗ／ｗの範囲である。
【００２０】
例えば、製剤は、両親媒性ポリマーの濃度が増加する場合、凍結乾燥後にサブビジブル粒子状物質の量の減少を有する。例えば、サブビジブル粒子状物質の量は、両親媒性ポリマーの存在下において、それを有さない場合と比較して少なくとも１０倍だけ（例えば、少なくとも５０倍、１００倍、または２００倍だけ）減少する。
【００２１】
例えば、製剤は、糖、例えば二糖（例えば、スクロースもしくはトレハロースまたはそれらの組合せ）をさらに含む。
例えば、糖の濃度は、冷凍または凍結乾燥前に合計で０％ｗ／ｗ〜約３０％ｗ／ｗの範囲である。例えば、糖の濃度は、冷凍または凍結乾燥前に０％ｗ／ｗ〜約２５％ｗ／ｗ（例えば、約０〜２５％ｗ／ｗ、０〜２０％ｗ／ｗ、０〜１５％ｗ／ｗ、０〜１０％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約８％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約１５％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、または約２５％ｗ／ｗ）の範囲である。
【００２２】
例えば、製剤は、塩、例えば塩化物塩、例えばＮａＣｌをさらに含む。
例えば、塩の濃度は、冷凍または凍結乾燥前に０ｍＭ〜約３００ｍＭ（例えば、７０〜１４０ｍＭ）の範囲である。
【００２３】
例えば、製剤は、酸化防止剤をさらに含む。
例えば、製剤は、冷凍または凍結乾燥前に約４〜約８の範囲のｐＨ値を有する。
例えば、製剤は、治療剤および／または予防剤、例えば核酸、例えばｍＲＮＡをさらに含む。例えば、ｍＲＮＡは、少なくとも３０ヌクレオチド長（例えば、少なくとも３００ヌクレオチド長）である。
【００２４】
例えば、製剤は、例えば、冷凍または凍結乾燥前に約０．２５ｍｇ／ｍＬ〜約８ｍｇ／ｍＬ（例えば、約０．２５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．７５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約０．２５〜６ｍｇ／ｍＬ、約０．２５〜４ｍｇ／ｍＬ、約０．２５〜２ｍｇ／ｍＬ、または約０．５〜２ｍｇ／ｍＬ、または約０．５〜１ｍｇ／ｍＬ）の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を有する。
【００２５】
例えば、製剤は、本明細書に記載のとおり貯蔵し、投与前または投与中に希釈することができる。例えば、投与用製剤は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｍＬ、約０．０２５ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ、約０．０７５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約０．０２５〜１ｍｇ／ｍＬ、または約０．０５〜１ｍｇ／ｍＬ、または約０．５〜１ｍｇ／ｍＬ）の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を有する。
【００２６】
例えば、両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１００：１（例えば、約０．０２５：１〜約１：１、約０．１：１〜約４：１、約１０：１〜約４０：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約５０：１、または約１：１〜約２５：１）である。例えば、両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、ＬＮＰ製剤を形成または処理するために約０．０２５：１〜約１：１である（例えば、ＬＮＰ構成成分と核酸を混合し、それらの混合物を精製し、製剤を濃縮し、および／または製剤のｐＨを調整する場合）。例えば、両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、ＬＮＰ製剤を冷凍および／または解凍するために約０．１：１〜約４：１である。例えば、両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、ＬＮＰ製剤を凍結乾燥させるために約１０：１〜約４０：１である。例えば、両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、（例えば、ネブライゼーションに）使用されるＬＮＰ製剤を包装するために約０．２５：１〜約１００：１（例えば、約０．５：１〜約１２：１）である。
【００２７】
例えば、治療剤および／または予防剤の封入効率は、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。
例えば、封入効率は、約４℃以下における少なくとも１ヵ月間の貯蔵後に実質的に同一である。例えば、封入効率は、約４℃以下における少なくとも１ヵ月間の貯蔵後に２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）減少し得る。
【００２８】
例えば、封入効率は、最大３０回の冷凍／解凍サイクル後に実質的に同一である。
例えば、封入効率は、精製前のものと比較して精製プロセス後に実質的に同一である。例えば、精製プロセスは、濾過（例えば、タンジェンシャルフロー濾過または「ＴＦＦ」）を含む。
【００２９】
例えば、封入効率は、凍結乾燥前のものと比較して凍結乾燥後に実質的に同一である。
例えば、ＬＮＰと治療剤および／または予防剤とのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１〜約６０：１（例えば、約２：１〜約３０：１）である。
【００３０】
例えば、ＬＮＰの平均サイズは、約７０ｎｍ〜約１３０ｎｍ（例えば、約７０〜１００ｎｍ）である。
例えば、製剤は、凍結乾燥時に約７０℃以上のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する。
【００３１】
例えば、製剤は、免疫原性（例えば、自然免疫応答の誘導）をほとんど有さないかまたはまったく有さない。例えば、製剤は、両親媒性ポリマーを含まない対応する製剤と比較して低い免疫原性を有する。一部の例において、両親媒性ポリマーを含む製剤は、製剤が導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
【００３２】
例えば、治療または予防剤を含む製剤は、両親媒性ポリマーを含まない対応する製剤と比較して増加した治療指数を有する。
例えば、ＬＮＰ構成成分は、中性脂質、例えばリン脂質またはその類似体もしくは誘導体をさらに含む。
【００３３】
例えば、ＬＮＰ構成成分は、例えば、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソル酸、アルファ−トコフェロール、およびそれらの混合物からなる群から選択される構造脂質をさらに含む。
【００３４】
例えば、ＬＮＰ構成成分は、例えば、ＰＥＧ−修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ−修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ−修飾セラミド、ＰＥＧ−修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ−修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ−修飾ジアルキルグリセロール、およびそれらの混合物からなる群から選択されるＰＥＧ脂質をさらに含む。
【００３５】
例えば、ＬＮＰ構成成分は、ＰＥＧ脂質を含まないかまたは低ＰＥＧである。
例えば、ＬＮＰ構成成分は、約３０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質、約０ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％のリン脂質、約１８．５ｍｏｌ％〜約４８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約０ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。
【００３６】
例えば、ＬＮＰ構成成分は、約５０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質、約１０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。
例えば、イオン化可能脂質は、イオン化可能アミノ脂質、例えば式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、および（ＩＩｅ）のいずれかの化合物を含む。
【００３７】
例えば、製剤は、無菌である。
例えば、製剤は、約２０℃〜約２５℃の範囲の温度において少なくとも１週間（例えば、少なくとも２週間、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、または少なくとも４ヵ月間）にわたって安定化される。
【００３８】
例えば、製剤は、約２℃〜約８℃において少なくとも２週間（例えば、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、または少なくとも４ヵ月間）にわたって安定化される。
例えば、製剤は、約４℃以下において、例えば約−１５０℃〜約０℃または約−８０℃〜約−２０℃（例えば、約−５℃、−１０℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃、−１３０℃、または−１５０℃）の温度において少なくとも２週間（例えば、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、または少なくとも４ヵ月間）にわたって安定化される。
【００３９】
例えば、製剤は、約−２０℃以下（例えば、約−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、または−８０℃）において少なくとも１ヵ月間（例えば、少なくとも２ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、または少なくとも１年間）にわたって安定化される。
【００４０】
別の態様において、本開示は、免疫原性を低下させる方法であって、本開示の製剤を細胞中に導入することを含み、製剤は、両親媒性ポリマーを含まない対応する製剤によって誘導される細胞中での細胞免疫応答の誘導と比較して、製剤に対する細胞の細胞免疫応答の誘導を低減させる、方法を特徴とする。例えば、細胞免疫応答は、自然免疫応答、適応免疫応答、またはその両方である。
【００４１】
さらに別の態様において、本開示は、ストレスの適用時に脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を安定化させる方法であって、ストレスの適用前または適用中にＬＮＰ製剤に両親媒性ポリマーを添加することを含む方法を特徴とする。例えば、ストレスとしては、製剤を生成し、精製し、包装し、貯蔵し、および使用する場合に製剤に適用される任意のストレス、例えば熱、剪断、過剰撹拌、膜濃度分極（電荷状態の変化）、脱水、冷凍ストレス、乾燥ストレス、冷凍／解凍ストレス、ネブライゼーションストレスなどが挙げられる。ストレスは、製剤の１つ以上の不所望な特性変化、例えば不純物、サブビジブル粒子の量の増加、またはその両方、ＬＮＰサイズの増加、封入効率、治療効力の減少、またはその両方、および寛容性の減少（例えば、免疫原性の増加）を引き起こし得る。
【００４２】
さらに別の態様において、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を精製する方法であって、両親媒性ポリマーの存在下で第１のＬＮＰ製剤を濾過して第２のＬＮＰ製剤を得ることを含む方法を特徴とする。
【００４３】
本開示はまた、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を冷凍するかまたは凍結乾燥させる方法であって、両親媒性ポリマーの存在下で第１のＬＮＰ製剤を冷凍するかまたは凍結乾燥させて第２のＬＮＰ製剤を得ることを含む方法を特徴とする。
【００４４】
安定化脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を生成する方法であって、第１の両親媒性ポリマーを、イオン化可能脂質およびｍＲＮＡを含む脂質組成物と混合して混合物を得ることを含む方法も開示される。例えば、混合は、第１の両親媒性ポリマーを脂質組成物と乱流またはマイクロ流体混合することを含む。例えば、本方法は、混合物を精製することをさらに含む。例えば、精製は、任意選択的に第２の両親媒性ポリマーを添加するタンジェンシャルフロー濾過を含む。例えば、本方法は、第３の両親媒性ポリマーを添加し、かつ任意選択的に塩、糖、またはそれらの組合せを添加して製剤を冷凍するかまたは凍結乾燥させることを含む。
【００４５】
本明細書に開示の方法のいずれも、本明細書の製剤について記載される特徴の１つ以上および以下の特徴の１つ以上を含み得る。
例えば、本方法は、第４の両親媒性ポリマーを添加して製剤を包装することをさらに含む。
【００４６】
例えば、第１、第２、第３、および第４の両親媒性ポリマーは、同一のポリマーである。
例えば、第１、第２、第３、および第４の両親媒性ポリマーは、異なる。
【００４７】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、非イオン性である。例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、非イオン性である。
【００４８】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポロキサミン（テトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、ポロキサマー（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポロキサミン（テトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
【００４９】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、Ｐ１８８である。例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、Ｐ１８８である。
【００５０】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で２×１０−４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、約３０℃および大気圧において水中で２×１０−４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
【００５１】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で約０．１×１０−４Ｍ〜約１．３×１０−４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、約３０℃および大気圧において水中で約０．１×１０−４Ｍ〜約１．３×１０−４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
【００５２】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、約０．１％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖまたは約０．１％ｗ／ｗ〜約３％ｗ／ｗの範囲の濃度において存在する。例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、約０．１％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖまたは約０．１％ｗ／ｗ〜約３％ｗ／ｗの範囲の濃度において存在する。
【００５３】
例えば、第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較してＬＮＰ平均サイズの増加を実質的に有さない。例えば、第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較して約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。
【００５４】
例えば、第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較して多分散指数の増加を実質的に有さない。
例えば、第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較して約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）の多分散指数の増加を有する。
【００５５】
さらに別の態様において、本開示は、上記態様による製剤および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を特徴とする。例えば、医薬組成物は、貯蔵および／または発送のために冷蔵されるかまたは冷凍される（例えば、４℃以下の温度、例えば約−１５０℃〜約０℃または約−８０℃〜約−２０℃の温度（例えば、約−５℃、−１０℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃、−１３０℃、または−１５０℃）において貯蔵される）。例えば、医薬組成物は、貯蔵および／または発送のために例えば約−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、または−８０℃において冷蔵される液剤である。
【００５６】
別の態様において、本開示は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）に治療薬および／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）を送達する方法を提供する。この方法は、対象（例えば、哺乳動物、例えばヒト）に（ｉ）両親媒性ポリマー、（ｉｉ）少なくとも１つの脂質ナノ粒子構成成分、ならびに（ｉｉｉ）治療薬および／または予防薬を含む本明細書に開示の製剤を投与することを含むステップを含み、投与は、細胞を製剤組成物と接触させることを含み、それにより治療薬および／または予防薬を細胞に送達する。
【００５７】
別の態様において、本開示は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）中で目的のポリペプチドを産生する方法を提供する。本方法は、細胞を、（ｉ）両親媒性ポリマー、（ｉｉ）少なくとも１つの脂質ナノ粒子構成成分、および（ｉｉｉ）目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む本明細書に開示の製剤と接触させるステップを含み、それにより、ｍＲＮＡは、細胞中で翻訳されてポリペプチドを産生し得る。
【００５８】
別の態様において、本開示は、疾患または障害の治療を、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）において行う方法を提供する。本方法は、哺乳動物に、（ｉ）両親媒性ポリマー、（ｉｉ）少なくとも１つの脂質ナノ粒子構成成分、ならびに（ｉｉｉ）治療有効量の治療薬および／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）を含む本明細書に開示の製剤を投与するステップを含む。一部の実施形態において、疾患または障害は、機能不全のまたは異常なタンパク質またはポリペプチド活性により特徴付けられる。例えば、疾患または障害は、奇病、感染性疾患、癌および増殖性疾患、遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症）、自己免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心血管性および腎血管性疾患、ならびに代謝性疾患からなる群から選択される。
【００５９】
別の態様において、本開示は、哺乳動物臓器（例えば、肝臓、脾臓、肺、または大腿骨）に治療薬および／または予防薬を送達する（例えば、特異的に送達する）方法を提供する。この方法は、対象（例えば、哺乳動物）に、（ｉ）両親媒性ポリマー、（ｉｉ）少なくとも１つの脂質ナノ粒子構成成分、ならびに（ｉｉｉ）治療薬および／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）を含む本明細書に開示の製剤を投与するステップを含み、投与は、細胞を製剤と接触させることを含み、それにより標的臓器（例えば、肝臓、脾臓、肺、または大腿骨）に治療薬および／または予防薬を送達する。
【００６０】
別の態様において、本開示は、標的臓器（例えば、肝臓、脾臓、肺、または大腿骨）への治療薬および／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）の送達を向上させる方法を特徴とする。この方法は、対象（例えば、哺乳動物）に、（ｉ）両親媒性ポリマー、（ｉｉ）少なくとも１つの脂質ナノ粒子構成成分、ならびに（ｉｉｉ）治療薬および／または予防薬を含む本明細書に開示の製剤を投与することを含み、投与は、標的臓器を製剤と接触させることを含み、それにより標的臓器に治療薬および／または予防薬を送達する。
【００６１】
本開示はまた、本明細書に開示の製剤または医薬組成物を生成する方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】Ｐ１８８の濃度により影響を受ける脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の直径を示すプロットであり、ナノ沈殿へのＰ１８８の添加が、得られたＬＮＰ分散液の平均直径を低減させたことを実証する。
【図２】緩衝液交換（透析）中のＰ１８８の添加が、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ：ｍｉｃｒｏ−ｆｌｏｗ  ｉｍａｇｉｎｇ）により計測された最終生成物中の合計のサブビジブル粒子状物質レベル（＞１μｍ）を有意に低減させた（約１０×）ことを示すプロットである。
【図３】Ｐ１８８の添加が、冷凍／解凍ストレスを介するＬＮＰ直径の保存を改善したこと、ならびに塩（例えば、ＮａＣｌ）およびＰ１８８の添加が、塩またはＰ１８８単独と対照的に粒子サイズ成長を有意に低減させる相乗効果を有したことを示すプロットである。
【図４Ａ】動的光散乱（ＤＬＳ）により計測されたＰ１８８の濃度増加に伴うＬＮＰサイズ制御のプロットである。淡灰色バーは、凍結乾燥前の平均ＬＮＰサイズを示し、暗灰色バーは、凍結乾燥後の平均ＬＮＰサイズを示す。エラーバーは、平均値の１標準誤差を示す。
【図４Ｂ】動的光散乱（ＤＬＳ）により計測されたＰ１８８の濃度増加に伴うＬＮＰサイズ制御のプロットである。淡灰色バーは、凍結乾燥前の平均ＬＮＰサイズを示し、暗灰色バーは、凍結乾燥後の平均ＬＮＰサイズを示す。エラーバーは、平均値の１標準誤差を示す。
【図５】増加するＰ１８８含有率を用いる試料中のＭＦＩにより計測されたサブビジブル粒子状物質の濃度のプロットである。淡灰色バーは、凍結乾燥前のサブビジブル粒子状物質の濃度を示し、暗灰色バーは、凍結乾燥後の濃度を示す。エラーバーは、平均値の１標準誤差を示す。
【図６Ａ】Ｐ１８８含有率の増加が、イオン化可能脂質を含有するＬＮＰの特徴を改善することを示すプロットである。図６Ａは、凍結乾燥前（淡灰色）および凍結乾燥後（暗灰色）のＬＮＰ直径のプロットである。エラーバーは、平均値の１標準誤差を表す。
【図６Ｂ】Ｐ１８８含有率の増加が、イオン化可能脂質を含有するＬＮＰの特徴を改善することを示すプロットである。図６Ｂは、凍結乾燥前（淡灰色）および凍結乾燥後（暗灰色）のサブビジブル粒子状物質の濃度のプロットである。エラーバーは、平均値の１標準誤差を表す。
【図７Ａ】ＰＳ２０（図７Ａ）の存在下での凍結乾燥前（淡灰色）および凍結乾燥後（暗灰色）のＬＮＰサイズのプロットであり、ポリマーの添加が、ポリマーを有さない同一糖組成物と比較してサイズ成長を低減させることを実証する。
【図７Ｂ】ＰＶＰ（図７Ｂ）の存在下での凍結乾燥前（淡灰色）および凍結乾燥後（暗灰色）のＬＮＰサイズのプロットであり、ポリマーの添加が、ポリマーを有さない同一糖組成物と比較してサイズ成長を低減させることを実証する。
【図８Ａ】ポリマーなし（図８Ａ）の経時的なサブビジブル粒子状物質の濃度のプロットである。ｙ軸は、群間で異なり、より低い値は、サブビジブル粒子状物質の良好な制御を示す。
【図８Ｂ】ＰＶＰ（図８Ｂ）ありの経時的なサブビジブル粒子状物質の濃度のプロットである。ｙ軸は、群間で異なり、より低い値は、サブビジブル粒子状物質の良好な制御を示す。
【図８Ｃ】ＰＳ２０（図８Ｃ）ありの経時的なサブビジブル粒子状物質の濃度のプロットである。ｙ軸は、群間で異なり、より低い値は、サブビジブル粒子状物質の良好な制御を示す。
【図９】異なる濃度のＰ１８８により影響を受ける乾燥ケーキのガラス転移（Ｔｇ）のプロットである。
【図１０Ａ】製剤のネブライゼーションありおよびなしで計測された異なる濃度のＰ１８８により影響を受ける封入効率のプロットである。製剤緩衝液は、酢酸緩衝液中で０．１〜２．０％の範囲のＰ１８８濃度を含有する。
【図１０Ｂ】製剤のネブライゼーションありおよびなしで計測された異なる濃度のＰ１８８により影響を受けるＬＮＰサイズのプロットである。製剤緩衝液は、酢酸緩衝液中で０．１〜２．０％の範囲のＰ１８８濃度を含有する。
【図１１】Ｐ１８８の添加が、ネブライゼーション後のＲＮＡ封入を改善することを実証する封入効率のプロットである。低ｐＨ緩衝液およびＰ１８８の組合せは、製剤特徴を相乗的に改善する。
【図１２Ａ】異なるポリマー（すなわち３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２９ｋＤａの分子量を有するＰＶＰ、Ｐ１２４、Ｐ１８８、およびＰ２３７）の存在下でのネブライゼーション前後のＬＮＰ特徴付けデータ：ＬＮＰサイズ（図１２Ａ）のプロットである。
【図１２Ｂ】異なるポリマー（すなわち３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２９ｋＤａの分子量を有するＰＶＰ、Ｐ１２４、Ｐ１８８、およびＰ２３７）の存在下でのネブライゼーション前後のＬＮＰ特徴付けデータ：封入効率（図１２Ｂ）のプロットである。
【図１３】ＤＬＳにより計測されたＬＮＰ直径により示される凍結乾燥製剤の安定性を示す一連のプロットである。行は、製剤を示す一方、列は、貯蔵温度を摂氏で示す。Ｐ１８８製剤１および２は、凍結乾燥製剤であり、同一産物の冷凍物と比較する。
【図１４Ａ】それぞれ種々の冷凍／解凍（Ｆ／Ｔ：ｆｒｅｅｚｅ／ｔｈａｗ）サイクル後に計測された３つの異なる製剤におけるＭＣ３ＬＮＰサイズのプロットである。図中のＭＣ３Ｉ、ＭＣ３ＩＩ、およびＭＣＩＩＩは、実施例４に記載の３つの異なる緩衝液条件下でのＭＣ３−ＬＮＰ製剤を指す。
【図１４Ｂ】それぞれ種々の冷凍／解凍（Ｆ／Ｔ：ｆｒｅｅｚｅ／ｔｈａｗ）サイクル後に計測された３つの異なる製剤における封入効率（ＥＥ：ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）のプロットである。図中のＭＣ３Ｉ、ＭＣ３ＩＩ、およびＭＣＩＩＩは、実施例４に記載の３つの異なる緩衝液条件下でのＭＣ３−ＬＮＰ製剤を指す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
核酸を含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、インタクト形態での核酸の細胞内送達を達成し、生物学的変化、例として治療効果を可能とするデリケートな送達系である。形成および貯蔵安定性、ＬＮＰのサイズおよび核酸の封入の程度は、性能の重要なパラメータである。１００ｎｍ未満の平均サイズを有する粒子が製剤に関して通常好ましい。粒子サイズの成長および／または封入の損失は、一般に、ＬＮＰに適用されるストレスの不所望な結果である。
【００６４】
ストレスとしては、以下の１つ以上：調製（例えば、形成、精製、ＬＮＰの濃度増加、および凍結乾燥）、貯蔵（例えば、低温または他の条件）、取扱（例えば、振盪および解凍）および送達（例えば、硝子体内送達のための超微細針を介するまたは吸入のためのネブライゼーションを介する剪断）を挙げることができる。ストレスとしては、加熱、剪断、過剰撹拌、冷凍濃度、膜濃度分極（電荷状態の変化）、脱水などを挙げることもできる。ＬＮＰに対するストレスの影響は、効力の損失（核酸分解および／または粒子凝集に起因）ならびに寛容性の変化（例えば、免疫刺激）であり得る。ＬＮＰが凝集し、またはそれらがサブビジブル（ミクロン）粒子の集団と会合している限り、プロセスおよび生成物の安定性に関する懸念ならびに凝集物に関連する潜在的な寛容性の懸念が存在し得る。換言すると、ＬＮＰ製剤（例えば、本明細書において考察されるもの）の生成、精製、包装、貯蔵、および使用からのストレスは、ＬＮＰ製剤の安定性に対するリスクをもたらし、したがってＬＮＰ技術に基づく核酸ベース治療薬の有用性を低減させ得る。例えば、ＬＮＰを使用するプロセスにおいてストレスが適用される場合、ＬＮＰの安定性のための解決策が必要とされる。さらに、核酸を含有する安全および有効な産物を可能とするために、上記課題のための解決策が必要とされる。
【００６５】
本開示は、部分的には、それらの課題に対する解決策を提供する。一態様において、本開示は、両親媒性ポリマーと、イオン化可能脂質またはその薬学的に許容可能な塩を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）構成成分とを含む安定化ナノ粒子製剤に関する。両親媒性ポリマーは、１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）構成成分（例えば、イオン化可能脂質）と一緒になって、ナノ粒子を形成し得る。代わりにまたはさらに、両親媒性ポリマーは、脂質ナノ粒子を封入するかまたは部分的に封入し得る。代わりにまたはさらに、両親媒性ポリマーは、脂質ナノ粒子中に含められることができる。肉眼レベルにおいて、ＬＮＰ分散液は、電荷相互作用（すなわち同じ電荷のクーロン反発）の組合せにより、および表面局在親水性部分により付与される立体的安定化により物理的に安定化される。上昇した濃度のナノ粒子において、分散液の安定性は、それらの環境中での粒子間相互作用または他の疎水性界面とのナノ粒子会合に由来し得る。それらの相互作用は、脂質再組織化、ファウリングおよび凝集を推進し得る。ＬＮＰの立体的安定化は、表面に結合し得る表面露出親水性ポリマーの濃度を増加させることにより改善することができる。両親媒性ポリマーは、疎水性界面に選択的に分配される一方、両親媒性ポリマーの親水性ポリマー領域は、バルク水溶液に向かって方向付けられたままである。理論により拘束されるものではないが、この相互作用を介して、両親媒性ポリマーは、ナノ粒子と疎水性界面との分子間相互作用を低減させ得る立体安定剤として機能し、それは、核酸およびオリゴヌクレオチド（例として、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡなど）を含む治療物において使用される脂質ナノ粒子の改善された安定性をもたらし得る。
【００６６】
核酸の性質は、例えば、ｓｉＲＮＡ（修飾および非修飾）、プラスミドＤＮＡ、およびｍＲＮＡ間でかなり異なる。修飾核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含有するＬＮＰは、一般に、物理的不安定性の理由から冷凍を目的としない（望ましくもない）冷蔵分散液として維持されている。したがって、貯蔵のための冷凍ＬＮＰは、一般的でなく、冷蔵が好ましい貯蔵条件であると考えられる。脂質−ＲＮＡ液体製剤の冷蔵は、より一般的である（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｍｔ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ１７／ｎ５／ｆｕｌｌ／ｍｔ２００９３６ａ．ｈｔｍｌを参照されたい）。例えば、アルニラム（Ａｌｎｙｌａｍ）ＡＬＮ−ＴＴＲ−０２フェーズＩＩＩ製品は、リン酸緩衝液中の冷蔵ＬＮＰ分散液である。現在、核酸負荷ＬＮＰの安定性は、そのサイズおよびｍＲＮＡ中のヌクレオチド上の２’−ヒドロキシ官能基の必須と考えられる存在に起因して、核酸負荷ＬＮＰの製剤を冷凍しかつ凍結乾燥させることにより改善することができる。
【００６７】
本発明は、部分的には、核酸構成成分（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｌｉｃＲＮＡ）を含む脂質ナノ粒子が、脂質ナノ粒子の溶解またはそのＲＮＡ封入およびサイズの両方の制御損失をもたらさずにＬＮＰと相互作用する有効量の両親媒性ポリマーの添加により、より安定にすることができるという発見に基づく。両親媒性ポリマーは、一般に、脂質構成成分を取り込み、ＬＮＰの破壊を引き起こし得る界面活性剤として作用する傾向を有するため、これは予期されない。例えば、トリトンＸ（ＴｒｉｔｏｎＸ）界面活性剤は、含有率分析中に封入薬剤の放出のためにＬＮＰを破壊するために一般に使用される。膜および他の親油性材料は、トリトンＸ（ＴｒｉｔｏｎＸ）および他の界面活性剤により脱安定化させ、溶解させることができる（例えば、Ｇ．サヘイ（Ｇ．Ｓａｈａｙ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第３１巻、２０１３年、ｐ．６５３〜６５８を参照されたい）。安定性の意味とは別に、界面活性剤の包含は、ＬＮＰ製剤の生体分布および薬理にも影響を与え得る。界面活性剤のレベル増加は、細胞取り込みおよび／またはエンドソームエスケープを阻害し、それによりＬＮＰによって送達されるｍＲＮＡの発現レベルを低減させ得る。本開示の製剤の他の予測されない特徴としては、本明細書に開示の両親媒性ポリマーが、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ；その濃度を超えると界面活性剤が膜破壊剤および安定剤としてのその効力のほとんどを達成する濃度）を超えてＬＮＰ安定性と適合性であることが挙げられる。
【００６８】
ＬＮＰのライフサイクルは、複数の段階、例として形成、処理、貯蔵および使用中を有する。
形成は、沈殿（有機相中の脂質および水相中の核酸）を誘導するための溶液の乱流もしくはマイクロ流体混合、またはＬＮＰを作出するための既に相分離した核酸および脂質の混合物を膜に通す押出のいずれかを含む。
【００６９】
処理は、ＬＮＰを（例えば、タンジェンシャルフロー濾過または「ＴＦＦ」を介して）精製し、ｐＨ調整し、緩衝液交換し、濃縮するステップを含む。滅菌濾過も処理に含まれる。
【００７０】
貯蔵は、薬物生成物を、それらが最終パッケージング中に配置される前にその最終状態でまたはＬＮＰのプロセス中貯蔵で貯蔵することを指す。貯蔵方式としては、限定されるものではないが、無菌バッグ中での冷蔵、バイアル中の冷蔵または冷凍製剤、バイアルおよびシリンジ中の凍結乾燥製剤などが挙げられる。
【００７１】
使用中は、ＬＮＰ製剤が患者に投与されているかまたは投与のために処理されている段階を指す。
それぞれの段階において、ＬＮＰが安定でなくなる機会、例えばサイズ成長、不純物増加、および／または封入効率の損失が存在することが留意される。驚くべきことに、核酸を含有する脂質ナノ粒子は、有効量の両親媒性ポリマーの添加により、そのライフサイクル全体にわたり、より安定になることが発見された。
【００７２】
本開示に関する「安定性」、「安定化」および「安定」は、所与の製造、調製、輸送、貯蔵および／または使用中の条件下において、例えばストレス、例えば剪断力、冷凍／解凍ストレスなどが適用される場合の化学的または物理的変化（例えば、分解、粒子サイズ変化、凝集、封入の変化など）に対するＬＮＰの耐性を指す。
【００７３】
本開示の「安定化」製剤は、好ましくは、所与の製造、調製、輸送、貯蔵および／または使用中の条件下でＬＮＰ製剤（例えば、ｍＲＮＡ負荷ＬＮＰ製剤）の出発、標準、または参照調製物の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％の純度（例えば、クロマトグラフィー純度）を保持する。
【００７４】
本開示の「安定化」製剤は、好ましくは、所与の製造、調製、輸送、貯蔵および／または使用中の条件下で出発、標準、または参照ＬＮＰ平均サイズの約２０％、１０％、５％、１％、０．５％以下の増加も有する。
【００７５】
例えば、製剤は、４℃以下における少なくとも１ヵ月間の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。例えば、製剤は、−２０℃以下における少なくとも６ヵ月間（例えば、少なくとも１年間、２年間、または３年間）の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。例えば、製剤は、約−８０℃以下における少なくとも６ヵ月間（例えば、少なくとも１年間、２年間、または３年間）の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。
【００７６】
例えば、製剤は、最大３０回の冷凍／解凍サイクル後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。
例えば、製剤は、精製前のＬＮＰ平均サイズと比較して精製プロセス後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。例えば、精製プロセスは、濾過を含む。
【００７７】
例えば、製剤は、凍結乾燥前のＬＮＰ平均サイズと比較して凍結乾燥後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。
本開示の「安定化」製剤は、好ましくは、所与の製造、調製、輸送、貯蔵および／または使用中の条件下でＬＮＰ製剤（例えば、ｍＲＮＡ負荷ＬＮＰ製剤）の出発、標準、または参照調製物のＬＮＰサイズ分布の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％を保持する。
【００７８】
本開示の「安定化」製剤は、好ましくは、所与の製造、調製、輸送、貯蔵および／または使用中の条件下でＬＮＰ製剤（例えば、ｍＲＮＡ負荷ＬＮＰ製剤）の出発、標準、または参照調製物の封入効率の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％を保持する。
【００７９】
例えば、封入効率は、約４℃以下（例えば、約−２０℃以下または約−８０℃以下）の少なくとも１ヵ月間（例えば、少なくとも６ヵ月間、１年間、２年間、または３年間）の貯蔵後に実質的に同一である。例えば、封入効率は、約４℃以下における少なくとも１ヵ月間の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）減少し得る。例えば、封入効率は、約−２０℃以下における少なくとも６ヵ月間（例えば、少なくとも１年間、２年間、または３年間）の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）減少し得る。例えば、封入効率は、約−８０℃以下における少なくとも６ヵ月間（例えば、少なくとも１年間、２年間、または３年間）の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）減少し得る。
【００８０】
例えば、封入効率は、最大３０回の冷凍／解凍サイクル後に実質的に同一である。
例えば、封入効率は、精製前のものと比較して精製プロセス後に実質的に同一である。例えば、精製プロセスは、濾過を含む。
【００８１】
例えば、封入効率は、凍結乾燥前のものと比較して凍結乾燥後に実質的に同一である。
本開示の「安定化」製剤は、好ましくは、所与の製造、調製、輸送、貯蔵および／または使用中の条件下でＬＮＰ製剤（例えば、ｍＲＮＡ負荷ＬＮＰ製剤）の出発、標準、または参照調製物の生物学的活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％も保持する。
【００８２】
例えば、製剤は、免疫原性（例えば、自然免疫応答の誘導）をほとんど有さないかまたはまったく有さない。例えば、免疫原性（例えば、自然免疫応答の誘導）は、約４℃以下（例えば、約−２０℃以下または約−８０℃以下）における少なくとも１ヵ月間（例えば、少なくとも６ヵ月間、１年間、２年間、または３年間）の貯蔵後に実質的に同一である。例えば、免疫原性（例えば、自然免疫応答の誘導）は、約４℃以下における少なくとも１ヵ月間の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）増加し得る。例えば、免疫原性（例えば、自然免疫応答の誘導）は、約−２０℃以下における少なくとも６ヵ月間（例えば、少なくとも１年間、２年間、または３年間）の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）増加し得る。例えば、免疫原性（例えば、自然免疫応答の誘導）は、約−８０℃以下における少なくとも６ヵ月間（例えば、少なくとも１年間、２年間、または３年間）の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）増加し得る。
【００８３】
例えば、免疫原性（例えば、自然免疫応答の誘導）は、最大３０回の冷凍／解凍サイクル後に実質的に同一である。
例えば、製剤は、両親媒性ポリマーを含まない対応する製剤と比較して低い免疫原性（例えば、自然免疫応答の誘導）を有する。
【００８４】
例えば、治療または予防剤負荷ＬＮＰ製剤の治療指数は、約４℃以下（例えば、約−２０℃以下または約−８０℃以下）における少なくとも１ヵ月間（例えば、少なくとも６ヵ月間、１年間、２年間、または３年間）の貯蔵後に実質的に同一である。例えば、治療指数は、約４℃以下における少なくとも１ヵ月間の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）減少し得る。例えば、治療指数は、約−２０℃以下における少なくとも６ヵ月間（例えば、少なくとも１年間、２年間、または３年間）の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）減少し得る。例えば、治療指数は、約−８０℃以下における少なくとも６ヵ月間（例えば、少なくとも１年間、２年間、または３年間）の貯蔵後に約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）減少し得る。
【００８５】
例えば、治療指数は、最大３０回の冷凍／解凍サイクル後に実質的に同一である。
例えば、治療または予防剤を含む製剤は、両親媒性ポリマーを含まない対応する製剤と比較して増加した治療指数を有する。
【００８６】
本開示の「安定化」製剤は、好ましくは、所与の製造、調製、輸送、貯蔵および／または使用中の条件下で不純物の出発、標準、または参照量の約２０％、１０％、５％、１％、０．５％以下の増加も有する。
【００８７】
本開示の「安定化」製剤は、好ましくは、所与の製造、調製、輸送、貯蔵および／または使用中の条件下でサブビジブル粒子の出発、標準、または参照量の約２０％、１０％、５％、１％、０．５％以下の増加も有する。
【００８８】
純度、ＬＮＰ平均サイズ、封入効率、生物学的活性、免疫原性、治療指数、不純物の量は、任意の当技術分野において認識される方法を使用して測定することができる。例えば、ＬＮＰ平均サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）により計測することができる。例えば、製剤の構成成分の濃度は、定型的方法、例えば紫外線−可視光分光光度法および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を使用して測定することができる。例えば、サブビジブル粒子の量は、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）により測定することができる。
【００８９】
ある実施形態において、本製剤は、約２〜８℃の範囲の温度において、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも８ヵ月間、少なくとも１０ヵ月間、少なくとも１２ヵ月間、少なくとも１４ヵ月間、少なくとも１６ヵ月間、少なくとも１８ヵ月間、少なくとも２０ヵ月間、少なくとも２２ヵ月間、または少なくとも２４ヵ月間にわたって安定化される。一実施形態において、製剤は、２〜８℃において少なくとも２ヵ月間にわたって安定化される。
【００９０】
ある実施形態において、本製剤は、約４℃の温度において、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも７ヵ月間、少なくとも８ヵ月間、少なくとも９ヵ月間、少なくとも１０ヵ月間、少なくとも１１ヵ月間、または少なくとも１２ヵ月間にわたって安定化される。一実施形態において、製剤は、約４℃において少なくとも２ヵ月間にわたって安定化される。
【００９１】
ある実施形態において、本製剤は、約−２０℃の温度において、少なくとも１ヵ月間、少なくとも２ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも８ヵ月間、少なくとも１０ヵ月間、少なくとも１２ヵ月間、少なくとも１４ヵ月間、少なくとも１６ヵ月間、少なくとも１８ヵ月間、少なくとも２０ヵ月間、少なくとも２２ヵ月間、または少なくとも２４ヵ月間にわたって安定化される。一実施形態において、製剤は、−２０℃において少なくとも６〜１２ヵ月間にわたって安定化される。一実施形態において、製剤は、−２０℃において少なくとも２４〜３６ヵ月間にわたって安定化される。
【００９２】
特定の実施形態において、本開示の製剤は、約−２０℃〜４℃の範囲の温度において、最大２ｍｇ／ｍＬの核酸濃度（例えば、ｍＲＮＡ濃度）において、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１６週間にわたって安定化される。
【００９３】
特定の実施形態において、本開示の製剤は、約−２０℃〜４℃の範囲の温度において、最大１ｍｇ／ｍＬの核酸濃度（例えば、ｍＲＮＡ濃度）において、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１６週間にわたって安定化される。
両親媒性ポリマー
本開示は、例えば、哺乳動物細胞または臓器への治療薬および／または予防薬の送達のための、両親媒性ポリマーおよび脂質ナノ粒子構成成分を含む安定化製剤を提供する。
【００９４】
例えば、両親媒性ポリマーは、非イオン性である。
例えば、両親媒性ポリマーは、ブロックコポリマーである。
例えば、両親媒性ポリマーは、リオプロテクタントである。
【００９５】
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で２×１０−４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で約０．１×１０−４Ｍ〜約１．３×１０−４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
【００９６】
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、例えば、冷凍または凍結乾燥前に製剤中で約そのＣＭＣ〜ＣＭＣの約３０倍（例えば、そのＣＭＣの最大約２５倍、約２０倍、約１５倍、約１０倍、約５倍、または約３倍）の範囲である。
【００９７】
例えば、両親媒性ポリマーとＬＮＰとの重量比は、約０．０００４：１〜約１００：１（例えば、約０．００１：１〜約１０：１、約０．００１：１〜約５：１、約０．００１：１〜約０．１：１、約０．００５〜約０．４：１、または約０．５：１〜約４：１、約０．０５：１〜約５：１、約０．１：１〜約５：１、または約０．０５：１〜約２．５：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約５０：１、または約１：１〜約２５：１）である。
【００９８】
例えば、治療薬および／または予防薬が核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む場合、両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１００：１（例えば、約０．０２５：１〜約１：１、約０．１：１〜約４：１、約１０：１〜約４０：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約５０：１、または約１：１〜約２５：１）である。例えば、両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、核酸を含むＬＮＰ製剤を形成または処理するために約０．０２５：１〜約１：１である（例えば、ＬＮＰ構成成分と核酸を混合し、それらの混合物を精製し、製剤を濃縮し、および／または製剤のｐＨを調整する場合）。例えば、両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、ＬＮＰ製剤を冷凍および／または解凍するために約０．１：１〜約４：１である。例えば、両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、ＬＮＰ製剤を凍結乾燥させるために約１０：１〜約４０：１である。例えば、両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、（例えば、ネブライゼーションに）使用されるＬＮＰ製剤を包装するために約０．２５：１〜約１００：１（例えば、約０．５：１〜約１２：１）である。
【００９９】
例えば、両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポロキサミン（テトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
【０１００】
例えば、両親媒性ポリマーは、ポロキサマーである。例えば、両親媒性ポリマーは、以下の構造のポリマー：
【０１０１】
【化１】
2019525901.tif 000002
【０１０２】
（式中、ａは、１０〜１５０の整数であり、ｂは、２０〜６０の整数である）
である。例えば、ａは、約１２であり、ｂは、約２０であり、またはａは、約８０であり、ｂは、約２７であり、またはａは、約６４であり、ｂは、約３７であり、またはａは、約１４１であり、ｂは、約４４であり、またはａは、約１０１であり、ｂは、約５６である。
【０１０３】
例えば、両親媒性ポリマーは、Ｐ１２４、Ｐ１８８、Ｐ２３７、Ｐ３３８、またはＰ４０７である。
例えば、両親媒性ポリマーは、Ｐ１８８（例えば、ポロキサマー１８８、ＣＡＳ番号９００３−１１−６、コリホル（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ）Ｐ１８８としても公知）である。
【０１０４】
例えば、両親媒性ポリマーは、ポロキサミン、例えばテトロニック（ｔｅｔｒｏｎｉｃ  ３０４）またはテトロニック（ｔｅｔｒｏｎｉｃ）９０４である。
例えば、両親媒性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、例えば３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２９ｋＤａの分子量を有するＰＶＰである。
【０１０５】
例えば、両親媒性ポリマーは、ポリソルベート、例えばＰＳ２０である。
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、例えば、冷凍または凍結乾燥前に製剤中で約０．１％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖの範囲である。
【０１０６】
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、例えば、冷凍または凍結乾燥前に製剤中で約０．１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖの範囲である。
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、例えば、冷凍または凍結乾燥前に製剤中で約０．１％ｗ／ｖ〜約０．５％ｗ／ｖの範囲である。
【０１０７】
例えば、製剤は、両親媒性ポリマーの濃度が増加する場合、凍結乾燥後にサブビジブル粒子状物質の量の減少を有する。例えば、サブビジブル粒子状物質の量は、両親媒性ポリマーの存在下でそれを有さない場合と比較して少なくとも１０倍だけ（例えば、少なくとも５０倍、１００倍、または２００倍だけ）減少する。
脂質
本開示は、中心アミン部分および少なくとも１つの生分解性基を含むイオン化可能脂質を提供する。本明細書に記載の脂質は、有利には、哺乳動物細胞または臓器への治療薬および／または予防薬の送達のための脂質ナノ粒子中で使用することができる。
【０１０８】
一実施形態において、本明細書に記載のイオン化可能脂質化合物は、式（Ｉ）の化合物：
【０１０９】
【化２】
2019525901.tif 000003
【０１１０】
（式中、
Ｒ１は、Ｃ５〜２０アルキル、Ｃ５〜２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ’’、−ＹＲ’’、および−Ｒ’’Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、Ｃ２〜１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ’’、−ＹＲ’’、および−Ｒ＊ＯＲ’’からなる群から独立して選択され、またはＲ２およびＲ３は、それらが付着している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し；
Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、および非置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、および−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、それぞれのｎは、１、２、３、４、および５から独立して選択され；
それぞれのＲ５は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から独立して選択され；
それぞれのＲ６は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から独立して選択され；
ＭおよびＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基から独立して選択され；
Ｒ７は、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から選択され；
それぞれのＲは、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ２〜３アルケニル、およびＨからなる群から独立して選択され；
それぞれのＲ’は、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ’’、−ＹＲ’’、およびＨからなる群から独立して選択され；
それぞれのＲ’’は、Ｃ３〜１４アルキルおよびＣ３〜１４アルケニルからなる群から独立して選択され；
それぞれのＲ＊は、Ｃ１〜１２アルキルおよびＣ２〜１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
それぞれのＹは、独立して、Ｃ３〜６炭素環であり；
それぞれのＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群から独立して選択され；および
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３から選択される）
またはその塩もしくは異性体である。
【０１１１】
ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＡ）の化合物：
【０１１２】
【化３】
2019525901.tif 000004
【０１１３】
（式中、ｌは、１、２、３、４、および５から選択され；ｍは、５、６、７、８、および９から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒであり；ＭおよびＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、およびヘテロアリール基から独立して選択され；およびＲ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から独立して選択される）
またはその塩もしくは異性体が挙げられる。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。他の可変部、例えばＲ、Ｒ’およびｎは、式（Ｉ）に定義のとおりである。
【０１１４】
ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物のサブセットとしては、式（ＩＩ）の化合物：
【０１１５】
【化４】
2019525901.tif 000005
【０１１６】
（式中、ｌは、１、２、３、４、および５から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｒ４は、非置換Ｃ１〜３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒであり；ＭおよびＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基およびヘテロアリール基から独立して選択され；およびＲ２およびＲ３は、Ｈ、Ｃ１〜１４アルキル、およびＣ２〜１４アルケニルからなる群から独立して選択される）
またはその塩もしくは異性体が挙げられる。他の可変部、例えばＲおよびＲ’は、式（Ｉ）に定義のとおりである。
【０１１７】
式（Ｉ）、（ＩＡ）、または（ＩＩ）のいずれか１つの化合物は、適用可能な場合、以下の特徴の１つ以上を含む。
一部の実施形態において、Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）ｎが１、２、３、４もしくは５である場合、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２でなく、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２である場合、Ｑは、５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルでない。
【０１１８】
一部の実施形態において、Ｍ１は、Ｍ’である。
一部の実施形態において、ＭおよびＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０１１９】
一部の実施形態において、ｌは、１、３、または５である。
一部の実施形態において、Ｒ４は、非置換メチルまたは−（ＣＨ２）ｎＱであり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
【０１２０】
一部の実施形態において、Ｑは、ＯＨである。
一部の実施形態において、Ｑは、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２である。
一部の実施形態において、Ｑは、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。
【０１２１】
一部の実施形態において、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒである。
一部の実施形態において、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
一部の実施形態において、ｎは、２である。
【０１２２】
一部の実施形態において、ｎは、３である。
一部の実施形態において、ｎは、４である。
一部の実施形態において、Ｍ１は、不存在である。
【０１２３】
一部の実施形態において、Ｒ’は、Ｃ１〜１８アルキル、Ｃ２〜１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ’’、または−ＹＲ’’である。
一部の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ３〜１４アルキルまたはＣ３〜１４アルケニルである。
【０１２４】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）の化合物：
【０１２５】
【化５】
2019525901.tif 000006
【０１２６】
（式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである）
またはその塩もしくは異性体である。
別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）の化合物：
【０１２７】
【化６】
2019525901.tif 000007
【０１２８】
（式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである）
またはその塩もしくは異性体である。
別の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）の化合物：
【０１２９】
【化７】
2019525901.tif 000008
【０１３０】
（式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである）
またはその塩もしくは異性体である。
さらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）の化合物
【０１３１】
【化８】
2019525901.tif 000009
【０１３２】
（式中、ｎは、２、３、または４であり；およびｍ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、本明細書に記載のとおりである）
またはその塩もしくは異性体である。例えば、Ｒ２およびＲ３のそれぞれは、Ｃ５〜１４アルキルおよびＣ５〜１４アルケニルからなる群から独立して選択することができる。
【０１３３】
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、および（ＩＩｅ）のいずれか１つの化合物は、適用可能な場合、以下の特徴の１つ以上を含む。
【０１３４】
一部の実施形態において、Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員芳香族または非芳香族複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、および−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、それぞれのｎは、１、２、３、４、および５から独立して選択される。
【０１３５】
別の実施形態において、Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、およびＣ１〜３アルキルから選択される１つ以上の置換基により置換されているＮ、Ｏ、およびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロシクロアルキルから選択され、それぞれのｎは、１、２、３、４、および５から独立して選択される。
【０１３６】
別の実施形態において、Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、それぞれのｎは、１、２、３、４、および５から独立して選択され；Ｑが５〜１４員複素環であり、（ｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ（式中、ｎは、１または２である）であり、または（ｉｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは、１である）であり、または（ｉｉｉ）Ｒ４が−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２である場合、Ｑは、５〜１４員ヘテロアリールまたは８〜１４員ヘテロシクロアルキルのいずれかである。
【０１３７】
別の実施形態において、Ｒ４は、Ｃ３〜６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、および−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑは、Ｃ３〜６炭素環、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５〜１４員ヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、それぞれのｎは、１、２、３、４、および５から独立して選択される。
【０１３８】
別の実施形態において、Ｒ４は、非置換Ｃ１〜４アルキル、例えば非置換メチルである。
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による脂質の中心アミン部分は、生理学的ｐＨにおいてプロトン化され得る。したがって、脂質は、生理学的ｐＨにおいて正電荷または部分正電荷を有し得る。このような脂質は、カチオン性またはイオン化可能（アミノ）脂質と称することができる。脂質は、双性イオン、すなわち正電荷および負電荷の両方を有する中性分子であり得る。
【０１３９】
本開示の製剤および方法に好適なカチオン性またはイオン化可能脂質の他の例は、例えば、同時係属出願の２０１６年５月９日出願の米国仮特許出願第６２／３３３，５５７号明細書、２０１５年９月１７日出願の米国仮特許出願第６２／２２０，０８５号明細書、２０１５年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／２７１，１６０号明細書、２０１５年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／２７１，１４６号明細書、２０１５年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／２７１，１７９号明細書、２０１５年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／２７１，１３７号明細書、２０１５年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／２７１，２００号明細書、および２０１６年５月１８日出願の米国仮特許出願第６２／３３８，４７４号明細書（それらのそれぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。本開示の製剤および方法に好適なカチオン性またはイオン化可能脂質の追加の例は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１７４２６１号明細書、米国特許出願公開第２０１４／３０８３０４号明細書、米国特許出願公開第２０１５／３７６１１５号明細書、国際公開第２０１４／１７２０４５号パンフレット、国際公開第２０１６／００４２０２号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５／１７４２６０号明細書、米国特許第９，００６，４８７号明細書、および米国特許第３，８７２，１７１号明細書（それらのそれぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１４０】
本明細書において使用される用語「アルキル」または「アルキル基」は、任意選択的に置換されている１つ以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の炭素原子）を含む直鎖または分枝鎖飽和炭化水素を意味する。表記「Ｃ１〜１４アルキル」は、１〜１４個の炭素原子を含む、任意選択的に置換されている直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素を意味する。特に規定のない限り、本明細書に記載のアルキル基は、非置換および置換アルキル基の両方を指す。
【０１４１】
本明細書において使用される用語「アルケニル」または「アルケニル基」は、任意選択的に置換されている２つ以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の炭素原子）および少なくとも１つの二重結合を含む直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。表記「Ｃ２〜１４アルケニル」は、２〜１４個の炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、任意選択的に置換されている直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。アルケニル基は、１、２、３、４つ以上の炭素−炭素二重結合を含み得る。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つ以上の二重結合を含み得る。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。特に規定のない限り、本明細書に記載のアルケニル基は、非置換および置換アルケニル基の両方を指す。
【０１４２】
本明細書において使用される用語「アルキニル」または「アルキニル基」は、任意選択的に置換されている２つ以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の炭素原子）および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。表記「Ｃ２〜１４アルキニル」は、２〜１４個の炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、任意選択的に置換されている直鎖または分枝鎖炭化水素を意味する。アルキニル基は、１、２、３、４つ以上の炭素−炭素三重結合を含み得る。例えば、Ｃ１８アルキニルは、１つ以上の炭素−炭素三重結合を含み得る。特に規定のない限り、本明細書に記載のアルキニル基は、非置換および置換アルキニル基の両方を指す。
【０１４３】
本明細書において使用される用語「炭素環」または「炭素環式基」は、１つ以上の炭素原子の環を含む、任意選択的に置換されている単環式または多環式系を意味する。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０員環であり得る。表記「Ｃ３〜６炭素環」は、３〜６つの炭素原子を有する単一環を含む炭素環を意味する。炭素環は、１つ以上の炭素−炭素二重または三重結合を含み得、非芳香族または芳香族であり得る（例えば、シクロアルキルまたはアリール基）。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、および１，２−ジヒドロナフチル基が挙げられる。本明細書において使用される用語「シクロアルキル」は、非芳香族炭素環を意味し、任意の二重または三重結合を含んでも含まなくてもよい。特に規定のない限り、本明細書に記載の炭素環は、非置換および置換炭素環基の両方、すなわち任意選択的に置換されている炭素環を指す。
【０１４４】
本明細書において使用される用語「複素環」または「複素環式基」は、少なくとも１つの環が少なくとも１つのヘテロ原子を含む１つ以上の環を含む、任意選択的に置換されている単環式または多環式系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素、または硫黄原子であり得る。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４員環であり得る。複素環は、１つ以上の二重または三重結合を含み得、非芳香族または芳香族であり得る（例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリール基）。複素環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、およびイソキノリル基が挙げられる。本明細書において使用される用語「ヘテロシクロアルキル」は、非芳香族複素環を意味し、任意の二重または三重結合を含んでも含まなくてもよい。特に規定のない限り、本明細書に記載の複素環は、非置換および置換複素環基の両方、すなわち任意選択的に置換されている複素環を指す。
【０１４５】
本明細書において使用される「生分解性基」は、哺乳動物実体中での脂質のより速い代謝を容易にし得る基である。生分解性基は、限定されるものではないが、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、およびヘテロアリール基からなる群から選択することができる。本明細書において使用される「アリール基」は、１つ以上の芳香族環を含む、任意選択的に置換されている炭素環式基である。アリール基の例としては、フェニルおよびナフチル基が挙げられる。本明細書において使用される「ヘテロアリール基」は、１つ以上の芳香族環を含む、任意選択的に置換されている複素環式基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、およびチアゾリルが挙げられる。アリールおよびヘテロアリール基の両方は、任意選択的に置換され得る。例えば、ＭおよびＭ’は、任意選択的に置換されているフェニル、オキサゾール、およびチアゾールからなる非限定的な基から選択することができる。本明細書の式において、ＭおよびＭ’は、上記生分解性基のリストから独立して選択することができる。特に規定のない限り、本明細書に記載のアリールまたはヘテロアリール基は、非置換および置換基の両方、すなわち任意選択的に置換されているアリールまたはヘテロアリール基を指す。
【０１４６】
アルキル、アルケニル、およびシクリル（例えば、カルボシクリルおよびヘテロシクリル）基は、特に規定のない限り、任意選択的に置換され得る。任意選択の置換基は、限定されるものではないが、ハロゲン原子（例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、−ＯＨ）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、代わりにＣ＝Ｏにより表される）、ハロゲン化アシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｘ（式中、Ｘは、臭化物、フッ化物、塩化物、およびヨウ化物から選択されるハロゲン化物である）、カルボネート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、−ＯＲ）、アセタール（例えば、−Ｃ（ＯＲ）２Ｒ’’’’（式中、それぞれのＯＲは、同一または異なり得るアルコキシ基であり、Ｒ’’’’は、アルキルまたはアルケニル基である）、ホスフェート（例えば、Ｐ（Ｏ）４３−）、チオール（例えば、−ＳＨ）、スルホキシド（例えば、−Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、−Ｃ（Ｓ）Ｈ）、スルフェート（例えば、Ｓ（Ｏ）４２−）、スルホニル（例えば、−Ｓ（Ｏ）２−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、−Ｎ３）、ニトロ（例えば、−ＮＯ２）、シアノ（例えば、−ＣＮ）、イソシアノ（例えば、−ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、−ＮＲ２、−ＮＲＨ、または−ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、または−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、およびシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群から選択することができる。上記のいずれにおいても、Ｒは、本明細書に定義のアルキルまたはアルケニル基である。一部の実施形態において、置換基自体は、例えば、本明細書に定義の１、２、３、４、５、または６つの置換基によりさらに置換され得る。例えば、Ｃ１〜６アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、４、５、または６つの置換基によりさらに置換基され得る。
【０１４７】
約、およそ：本明細書において使用される用語「およそ」および「約」は、１つ以上の目的の値に適用される場合、記述される参照値と類似の値を指す。ある実施形態において、用語「およそ」または「約」は、特に記述のない限り、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り（そのような数字が考えられる値の１００％を超過する場合を除く）、記述される参照値のいずれかの方向（参照値よりも大きいまたは少ない）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下内に収まる値の範囲を指す。例えば、ＬＮＰの脂質構成成分中の所与の化合物の量に関して使用される場合、「約」は、引用値の＋／−１０％を意味し得る。例えば、約４０％の所与の化合物を有する脂質構成成分を含むＬＮＰは、３０〜５０％の化合物を含み得る。
【０１４８】
本明細書において使用される用語「化合物」は、示される構造の全ての異性体および同位体を含むことを意味する。「同位体」は、同一原子番号を有するが、原子核中の異なる中性子数から生じる異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体としては、トリチウムおよびデューテリウムが挙げられる。さらに、本開示の化合物、塩、または錯体は、定型的方法により溶媒または水分子との組合せで調製して溶媒和物および水和物を形成することができる。
【０１４９】
本明細書において使用される用語「接触させること」は、２つ以上の実体間の物理的連結を確立することを意味する。例えば、哺乳動物細胞をＬＮＰと接触させることは、哺乳動物細胞およびナノ粒子に物理的連結を共有させることを意味する。インビボおよびエクスビボの両方で細胞を外部実体と接触させる方法は、生物学分野において周知である。例えば、ＬＮＰおよび哺乳動物内に配置された哺乳動物細胞を接触させることは、種々の投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、および皮下）により実施することができ、様々な量の脂質ナノ粒子を用い得る。さらに、２つ以上の哺乳動物細胞をＬＮＰにより接触させることができる。
【０１５０】
本明細書において使用される用語「送達すること」は、行き先に実体を提供することを意味する。例えば、治療薬および／または予防薬を対象に送達することは、対象に治療薬および／または予防薬を含むＬＮＰを（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路により）投与することを含み得る。哺乳動物または哺乳動物細胞へのＬＮＰの投与は、脂質ナノ粒子と１つ以上の細胞を接触させることを含み得る。
【０１５１】
本明細書において使用される用語「向上した送達」は、目的の標的組織への対照ナノ粒子（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）による治療薬および／または予防薬の送達のレベルと比較して目的の標的組織（例えば、哺乳動物肝臓）へのナノ粒子による治療薬および／または予防薬のより多い（例えば、少なくとも１．５倍多い、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い）送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルは、組織中で産生されるタンパク質の量を前記組織の重量と比較すること、組織中の治療薬および／もしくは予防薬の量を前記組織の重量と比較すること、組織中で産生されるタンパク質の量を前記組織中のタンパク質の総量と比較すること、または組織中の治療薬および／もしくは予防薬の量を前記組織中の治療薬および／もしくは予防薬の総量と比較することにより計測することができる。標的組織へのナノ粒子の向上した送達は、治療されている対象において測定する必要がないことが理解され、それは、サロゲート、例えば動物モデル（例えば、ラットモデル）において測定することができる。
【０１５２】
本明細書において使用される用語「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」は、標的外組織（例えば、哺乳動物脾臓）と比較して目的の標的組織（例えば、哺乳動物肝臓）へのナノ粒子による治療薬および／または予防薬のより多い（例えば、少なくとも１．５倍多い、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い）送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルは、組織中で産生されるタンパク質の量を前記組織の重量と比較すること、組織中の治療薬および／もしくは予防薬の量を前記組織の重量と比較すること、組織中で産生されるタンパク質の量を前記組織中のタンパク質の総量と比較すること、または組織中の治療薬および／もしくは予防薬の量を前記組織中の治療薬および／もしくは予防薬の総量と比較することにより計測することができる。例えば、腎血管標的化のため、治療薬および／または予防薬は、治療薬および／または予防薬の全身投与後に肝臓または脾臓に送達されるものと比較して組織１ｇ当たり１．５、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍多い治療薬および／または予防薬が腎臓に送達される場合、肝臓および脾臓と比較して哺乳動物腎臓に特異的に提供される。標的組織に特異的に送達するナノ粒子の能力は治療されている対象において測定する必要がないことが理解され、それは、サロゲート、例えば動物モデル（例えば、ラットモデル）において測定することができる。
【０１５３】
本明細書において使用される「封入効率（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」は、ＬＮＰの調製において使用される治療薬および／または予防薬の初回総量に対する、ＬＮＰの一部になる治療薬および／または予防薬の量を指す。例えば、組成物に初回提供される合計１００ｍｇの治療薬および／または予防薬のうちの９７ｍｇの治療薬および／または予防薬がＬＮＰ中で封入される場合、封入効率は、９７％として与えることができる。本明細書において使用される「封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）」は、完全、実質的、または部分的な囲い込み（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）、閉じ込め（ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）、包囲（ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ）、または箱詰め（ｅｎｃａｓｅｍｅｎｔ）を指し得る。
【０１５４】
本明細書において使用される核酸配列の「発現」は、ポリペプチドもしくはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳および／またはポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾を指す。
【０１５５】
本明細書において使用される用語「インビトロ」は、生物体（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく人工環境中、例えば試験管または反応容器中、細胞培養物中、ペトリ皿中などで生じるイベントを指す。
【０１５６】
本明細書において使用される用語「インビボ」は、生物体（例えば、動物、植物、もしくは微生物またはそれらの細胞もしくは組織）内で生じるイベントを指す。
本明細書において使用される用語「エクスビボ」は、生物体（例えば、動物、植物、もしくは微生物またはそれらの細胞もしくは組織）外で生じるイベントを指す。エクスビボイベントは、天然（例えば、インビボ）環境から最小限に変更された環境中で生じ得る。
【０１５７】
本明細書において使用される用語「異性体」は、化合物の任意の幾何異性体、互変異性体、双性イオン、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。化合物は、１つ以上のキラル中心および／または二重結合を含み得、したがって、立体異性体、例えば二重結合異性体（すなわち幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、エナンチオマー（すなわち（＋）または（−））またはシス／トランス異性体）として存在し得る。本開示は、本明細書に記載の化合物の任意のおよび全ての異性体、例として立体的に純粋な形態（例えば、幾何的に純粋、エナンチオマー的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）ならびにエナンチオマーおよび立体異性体混合物、例えばラセミ体を包含する。化合物のエナンチオマーおよび立体異性体混合物ならびにそれらをそれらの構成エナンチオマーまたは立体異性体に分割する手段は、周知である。
【０１５８】
本明細書において使用される「脂質構成成分」は、１つ以上の脂質を含む脂質ナノ粒子の構成成分である。例えば、脂質構成成分は、１つ以上のカチオン性またはイオン化可能、ＰＥＧ化、構造、または他の脂質、例えばリン脂質を含み得る。
【０１５９】
本明細書において使用される「リンカー」は、２つの部分を連結する部分、例えばキャップ種の２つのヌクレオシド間の連結部分である。リンカーは、１つ以上の基、例として、限定されるものではないが、ホスフェート基（例えば、ホスフェート、ボラノホスフェート、チオホスフェート、セレノホスフェート、およびホスホネート）、アルキル基、アミデート、またはグリセロールを含み得る。例えば、キャップ類似体の２つのヌクレオシドは、トリホスフェート基により、または２つのホスフェート部分およびボラノホスフェート部分を含む鎖によりそれらの５’位において結合させることができる。
【０１６０】
本明細書において使用される「投与の方法」としては、対象に静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または組成物を送達する他の方法を挙げることができる。投与の方法は、身体の特異的領域または系に標的送達（例えば、特異的に送達）するように選択することができる。
【０１６１】
本明細書において使用される「修飾」は、非天然を意味する。例えば、ＲＮＡは、修飾ＲＮＡであり得る。すなわち、ＲＮＡは、非天然発生の１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含み得る。「修飾」種は、本明細書において「変更」種と称することもできる。種は、化学的、構造的、または機能的に修飾または変更することができる。例えば、修飾核酸塩基種は、非天然発生の１つ以上の置換を含み得る。
【０１６２】
本明細書において使用される「Ｎ：Ｐ比」は、例えば、脂質構成成分およびＲＮＡを含むＬＮＰ中の、脂質中のイオン化可能（生理学的ｐＨ範囲で）窒素原子とＲＮＡ中のホスフェート基とのモル比である。
【０１６３】
本明細書において使用される「脂質ナノ粒子」は、１つ以上の脂質を含む組成物である。脂質ナノ粒子は、典型的には、マイクロメートル以下の桁でサイズ化され、脂質二重層を含み得る。本明細書において使用される脂質ナノ粒子は、特に規定のない限り、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質ベシクル）、およびリポプレックスを包含する。例えば、ＬＮＰは、５００ｎｍ以下の直径を有する脂質二重層を有するリポソームであり得る。
【０１６４】
本明細書において使用される「天然発生」は、人工的助力を用いない天然での存在を意味する。
本明細書において使用される「患者」は、治療を求め得、もしくは治療が必要とされ得、治療を要求し、治療を受けており、治療を受ける対象、または特定の疾患もしくは病態について熟練者による治癒中の対象を指す。
【０１６５】
本明細書において使用される「ＰＥＧ脂質」または「ＰＥＧ化脂質」は、ポリエチレングリコール構成成分を含む脂質を指す。
語句「薬学的に許容可能」は、妥当な利益／リスク比に見合い、過度の毒性も刺激もアレルギー応答も、他の問題も合併症もなく、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に好適である、正当な医学的判断の範囲内の化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために本明細書において使用される。
【０１６６】
本明細書において使用される語句「薬学的に許容可能な賦形剤」は、本明細書に記載の化合物以外の、患者において実質的に非毒性および非炎症性である特性を有する任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁させ、錯化させ、または溶解させ得るビヒクル）を指す。賦形剤としては、例えば、抗接着剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、色素（着色料）、エモリエント剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、皮膜形成剤またはコーティング剤、香味剤、芳香剤、流動促進剤（流動向上剤）、滑沢剤、保存剤、印刷インク、吸着剤、懸濁または分散剤、甘味剤、水和水を挙げることができる。例示的な賦形剤としては、限定されるものではないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ（アルファ−トコフェロール）、ビタミンＣ、キシリトール、および本明細書に開示の他の種が挙げられる。
【０１６７】
組成物は、１つ以上の化合物の塩も含み得る。塩は、薬学的に許容可能な塩であり得る。本明細書において使用される「薬学的に許容可能な塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することにより（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることにより）親化合物が変更される開示化合物の誘導体を指す。薬学的に許容可能な塩の例としては、限定されるものではないが、塩基性残基、例えばアミンの鉱酸または有機酸塩；酸性残基、例えばカルボン酸のアルカリまたは有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオン、例として、限定されるものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の慣用の非毒性塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、慣用の化学的方法により塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、水中、または有機溶媒中、またはそれら２つの混合物中でそれらの化合物の遊離酸または塩基形態を化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることにより調製することができ；一般に、非水性媒体、例えばエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルが好ましい。好適な塩のリストは、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン、ペンシルベニア、１９８５年、ｐ．１４１８、「薬学的塩：特性、選択、および使用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ）」、Ｐ．Ｈ．スタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）およびＣ．Ｇ．ワーマス（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）編、ウィレー−ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年、ならびにベルジュ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６６巻、ｐ．１〜１９、１９７７年（それらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に見出される。
【０１６８】
本明細書において使用される「リン脂質」は、ホスフェート部分および１つ以上の炭素鎖、例えば不飽和脂肪酸鎖を含む脂質である。リン脂質は、１つ以上の多重（例えば、二重または三重）結合（例えば、１つ以上の不飽和）を含み得る。リン脂質またはその類似体もしくは誘導体は、コリンを含み得る。リン脂質またはその類似体もしくは誘導体は、コリンを含み得ない。特定のリン脂質は、膜への融合を容易にし得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞または細胞内膜）の１つ以上の負荷電リン脂質と相互作用し得る。膜へのリン脂質の融合は、脂質含有組成物の１つ以上の要素が膜を通過することを可能とし得、例えば細胞へ１つ以上の要素の送達を許容する。
【０１６９】
本明細書において使用される「多分散指数」は、系の粒子サイズ分布の均一性を説明する比である。例えば、０．３未満の小さい値は、狭い粒子サイズ分布を示す。
本明細書において使用される両親媒性「ポリマー」は、オリゴマーまたはポリマーを含む両親媒性化合物である。例えば、両親媒性ポリマーは、オリゴマー断片、例えば２つ以上のＰＥＧモノマー単位を含み得る。例えば、本明細書に記載の両親媒性ポリマーは、ＰＳ２０であり得る。
【０１７０】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」または「目的のポリペプチド」は、典型的には、天然に産生され得（例えば、単離または精製され得）、または合成により産生され得るペプチド結合により結合しているアミノ酸残基のポリマーを指す。
【０１７１】
本明細書において使用される「ＲＮＡ」は、天然発生または非天然発生であり得るリボ核酸を指す。例えば、ＲＮＡは、修飾および／または非天然発生構成成分、例えば１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含み得る。ＲＮＡは、キャップ構造、鎖終結ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。例えば、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）であり得る。特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、例えば哺乳動物細胞内側でのｍＲＮＡのインビボ翻訳は、コードされるポリペプチドを産生し得る。ＲＮＡは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ：ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：Ｄｉｃｅｒ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ＲＮＡ）、小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ：ｌｏｎｇ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）、およびそれらの混合物からなる非限定的な群から選択することができる。
【０１７２】
本明細書において使用される「単一単位用量」は、１回の用量で／一度に／単一経路で／単一の接触点、すなわち単一の投与イベントで投与される任意の治療薬の用量である。
本明細書において使用される「分割用量」は、単一単位用量または総一日用量の２回以上の用量への分割量である。
【０１７３】
本明細書において使用される「総一日用量」は、２４時間の期間で与えられるかまたは処方される量である。これは、単一単位用量として投与することができる。
本明細書において使用される脂質ナノ粒子に関する「サイズ」または「平均サイズ」は、ＬＮＰの平均直径を指す。
【０１７４】
本明細書において使用される用語「対象」は、例えば、実験、診断、予防、および／または治療目的のために本開示による組成物または製剤を投与することができる任意の生物体を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒト）および／または植物が挙げられる。
【０１７５】
本明細書において使用される「標的細胞」は、任意の１つ以上の目的の細胞を指す。細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュ、または生物体の組織もしくは臓器中で見出すことができる。生物体は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であり得る。
【０１７６】
本明細書において使用される「標的組織」は、治療薬および／または予防薬の送達が所望の生物学的および／または薬理学的効果をもたらす任意の１つ以上の目的の組織タイプを指す。目的の標的組織の例としては、特異的な組織、臓器、およびそれらの系または群が挙げられる。特定の用途において、標的組織は、腎臓、肺、脾臓、血管（例えば、冠動脈内または大腿骨内）中の血管内皮、または腫瘍組織（例えば、腫瘍内注射を介する）であり得る。「標的外組織」は、コードされるタンパク質の発現が所望の生物学的および／または薬理学的効果をもたらさない任意の１つ以上の組織タイプを指す。特定の用途において、標的外組織としては、肝臓および脾臓を挙げることができる。
【０１７７】
用語「治療剤」または「予防剤」は、対象に投与された場合、治療、診断、および／もしくは予防効果を有し、ならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。治療剤は、「活性薬」または「活性剤」とも称される。このような薬剤としては、限定されるものではないが、細胞毒素、放射性イオン、化学療法剤、小分子薬物、タンパク質、および核酸が挙げられる。
【０１７８】
本明細書において使用される用語「治療有効量」は、感染、疾患、障害、および／または病態を罹患し、または罹患しやすい対象に投与された場合に感染、疾患、障害、および／または病態を治療し、それらの症状を改善し、診断し、予防し、および／またはそれらの発症を遅延させるために十分である、送達すべき薬剤（例えば、核酸、薬物、組成物、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。
【０１７９】
本明細書において使用される「形質移入」は、細胞中への種（例えば、ＲＮＡ）の導入を指す。形質移入は、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行うことができる。
【０１８０】
本明細書において使用される用語「治療すること」は、特定の感染、疾患、障害、および／または病態を部分的または完全に緩和し、良化させ、改善し、軽減させ、それらの発症を遅延させ、それらの進行を阻害し、それらの重症度を低減させ、および／またはそれらの１つ以上の症状もしくは特徴の発生を軽減させることを指す。例えば、癌を「治療すること」は、腫瘍の生存、成長、および／または拡散を阻害することを指し得る。治療は、疾患、障害、および／または病態に関連する病変発症のリスクを減少させる目的のために疾患、障害、および／もしくは病態の徴候を示さない対象ならびに／または疾患、障害、および／もしくは病態の早期徴候のみを示す対象に施与することができる。
【０１８１】
本明細書において使用される「ゼータ電位」は、例えば、粒子組成物中の脂質の運動電位である。
脂質ナノ粒子
本開示はまた、（ｉ）両親媒性ポリマーおよび（ｉｉ）イオン化可能脂質構成成分、例えばＭＣ３または本明細書に記載の式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による化合物を含むナノ粒子を含む製剤を特徴とする。
【０１８２】
一部の実施形態において、脂質ナノ粒子の最大寸法は、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）、透過型電子顕微鏡観察、走査型電子顕微鏡観察、または別の方法により計測された場合、１μｍ以下（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ以下）である。本明細書において使用される脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）としては、例えば、脂質ナノ粒子、リポソーム、脂質ベシクル、およびリポプレックスが挙げられる。一部の実施形態において、ＬＮＰは、１つ以上の脂質二重層を含むベシクルである。ある実施形態において、ＬＮＰは、水性コンパートメントにより離隔された２つ以上の同心円二重層を含む。脂質二重層は、官能化させ、および／または互いに架橋させることができる。脂質二重層は、１つ以上のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
【０１８３】
ＬＮＰは、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による少なくとも１つの化合物を含む脂質構成成分を含み、種々の他の構成成分も含み得る。例えば、ＬＮＰの脂質構成成分は、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による脂質に加えて１つ以上の他の脂質を含み得る。
【０１８４】
カチオン性／イオン化可能脂質
ＬＮＰは、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による脂質に加えて１つ以上のカチオン性および／またはイオン化可能脂質（例えば、生理学的ｐＨにおいて正電荷または部分正電荷を有し得る脂質）を含み得る。カチオン性および／またはイオン化可能脂質は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる非限定的な群から選択することができる。これらに加え、カチオン性脂質は、環式アミン基を含む脂質であり得る。
【０１８５】
ＰＥＧ脂質
ＬＮＰの脂質構成成分は、１つ以上のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含み得る。このような種は、代替的に、ＰＥＧ化脂質と称することができる。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールにより修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ−修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ−修飾セラミド、ＰＥＧ−修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ−修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ−修飾ジアルキルグリセロール、およびそれらの混合物からなる非限定的な群から選択することができる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【０１８６】
構造脂質
ＬＮＰの脂質構成成分は、１つ以上の構造脂質を含み得る。構造脂質は、限定されるものではないが、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、アルファ−トコフェロール、およびそれらの混合物からなる群から選択することができる。一部の実施形態において、構造脂質は、コレステロールである。一部の実施形態において、構造脂質としては、コレステロールおよびコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、およびヒドロコルチゾン）、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１８７】
リン脂質
ＬＮＰの脂質構成成分は、１つ以上のリン脂質、例えば１つ以上の（多価）不飽和脂質を含み得る。リン脂質は、１つ以上の脂質二重層に集合し得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分および１つ以上の脂肪酸部分を含み得る。例えば、リン脂質は、式（ＩＩＩ）による脂質：
【０１８８】
【化９】
2019525901.tif 000010
【０１８９】
（式中、Ｒｐは、リン脂質部分を表し、およびＲ１およびＲ２は、同一または異なり得る不飽和を有し、または有さない脂肪酸部分を表す）
であり得る。リン脂質部分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リゾホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択することができる。脂肪酸部分は、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択することができる。非天然種、例として修飾および置換、例として分枝、酸化、環化、およびアルキンを有する天然種も企図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合により置き換えられたアルケニル基）により官能化させ、またはそれに架橋させることができる。適切な反応条件下において、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅触媒環化付加を受け得る。このような反応は、膜透過もしくは細胞認識を容易にするためのＬＮＰの脂質二重層の官能化において、または有用な構成成分、例えば標的化もしくはイメージング部分（例えば、色素）へのＬＮＰのコンジュゲート化において有用であり得る。
【０１９０】
組成物および方法において有用なリン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６リゾＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、およびスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択することができる。一部の実施形態において、ＬＮＰは、ＤＳＰＣを含む。ある実施形態において、ＬＮＰは、ＤＯＰＥを含む。一部の実施形態において、ＬＮＰは、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＥの両方を含む。
【０１９１】
アジュバント
一部の実施形態において、１つ以上の本明細書に記載の脂質を含むＬＮＰは、１つ以上のアジュバント、例えばグルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、クラスＡまたはＢ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、水酸化アルミニウム、およびＰａｍ３ＣＳＫ４をさらに含み得る。
【０１９２】
治療剤
脂質ナノ粒子は、１つ以上の治療薬および／または予防薬を含み得る。本開示は、哺乳動物に治療薬および／もしくは予防薬を含むＬＮＰを投与し、ならびに／または治療薬および／もしくは予防薬を含むＬＮＰと哺乳動物細胞を接触させることを含む、哺乳動物細胞または臓器に治療薬および／または予防薬を送達する方法、哺乳動物細胞中で目的のポリペプチドを産生する方法、ならびに疾患または障害の治療を、それを必要とする哺乳動物において行う方法を特徴とする。
【０１９３】
治療薬および／または予防薬としては、生物活性物質が挙げられ、それらは、代替的に「活性剤」と称される。治療薬および／または予防薬は、細胞または臓器に送達されると、細胞、臓器、または他の身体組織もしくは系中で所望の変化を生じさせる物質であり得る。このような種は、１つ以上の疾患、障害、病態の治療において有用であり得る。一部の実施形態において、治療薬および／または予防薬は、特定の疾患、障害、または病態の治療において有用な小分子薬物である。脂質ナノ粒子中で有用な薬物の例としては、限定されるものではないが、抗新生物剤（例えば、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトテシン、シスプラチン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、およびストレプトゾトシン）、抗腫瘍剤（例えば、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シトシンアラビノシド、アントラサイクリン、アルキル化剤、白金化合物、代謝拮抗物質、およびヌクレオシド類似体、例えばメトトレキサートならびにプリンおよびピリミジン類似体）、抗感染剤、局所麻酔薬（例えば、ジブカインおよびクロルプロマジン）、ベータアドレナリン作動遮断剤（例えば、プロプラノロール、チモロール、およびラベタロール）、抗高血圧剤（例えば、クロニジンおよびヒドララジン）、抗鬱薬（例えば、イミプラミン、アミトリプチリン、およびドキセピン）、抗癲癇薬（例えば、フェニトイン）、抗ヒスタミン薬（例えば、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミン、およびプロメタジン）、抗生物質／抗菌剤（例えば、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、およびセフォキシチン）、抗真菌剤（例えば、ミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、ブタコナゾール、クロトリマゾール、イトラコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィン、およびアンホテリシンＢ）、抗寄生虫剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、免疫調節剤、神経伝達物質アンタゴニスト、抗緑内障剤、ビタミン、麻酔薬、およびイメージング剤が挙げられる。
【０１９４】
一部の実施形態において、治療薬および／または予防薬は、細胞毒素、放射性イオン、化学療法薬、ワクチン、免疫応答を誘発する化合物、ならびに／または別の治療薬および／もしくは予防薬である。細胞毒素または細胞毒性剤としては、細胞に有害であり得る任意の薬剤が挙げられる。例としては、限定されるものではないが、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リポカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド、例えばメイタンシノール、ラケルマイシン（ｒａｃｈｅｌｍｙｃｉｎ）（ＣＣ−１０６５）、およびそれらの類似体または相同体が挙げられる。放射性イオンとしては、限定されるものではないが、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、ホスフェート、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、およびプラセオジムが挙げられる。ワクチンとしては、感染性疾患、例えばインフルエンザ、麻疹、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、狂犬病、髄膜炎、百日咳、破傷風、ペスト、肝炎および結核に関連する１つ以上の病態に対する免疫を提供し得る化合物および調製物が挙げられ、感染性疾患由来抗原および／またはエピトープをコードするｍＲＮＡを挙げることができる。ワクチンとしては、癌細胞に対して免疫応答を指向する化合物および調製物も挙げられ、腫瘍細胞由来抗原、エピトープ、および／またはネオエピトープをコードするｍＲＮＡを挙げることができる。免疫応答を誘発する化合物としては、ワクチン、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）、および他の種を挙げることができる。一部の実施形態において、ワクチンおよび／または免疫応答を誘発し得る化合物は、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による化合物（例えば、化合物３、１８、２０、２６、または２９）を含む組成物を介して筋肉内投与される。他の治療薬および／または予防薬としては、限定されるものではないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびメイタンシノイド）が挙げられる。
【０１９５】
他の実施形態において、治療薬および／または予防薬は、タンパク質である。本開示におけるナノ粒子において有用な治療タンパク質としては、限定されるものではないが、ゲンタマイシン、アミカシン、インスリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）、第ＶＩＲ因子、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ：ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）類似体、インターフェロン、ヘパリン、Ｂ型肝炎表面抗原、腸チフスワクチン、およびコレラワクチンが挙げられる。
【０１９６】
ポリヌクレオチドおよび核酸
一部の実施形態において、治療剤は、ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、リボ核酸またはデオキシリボ核酸）である。用語「ポリヌクレオチド」には、その最も広い意味でオリゴヌクレオチド鎖であり、またはその中に取り込むことができる任意の化合物および／または物質が含まれる。本開示に従って使用される例示的なポリヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、リボ核酸（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、例としてメッセンジャーｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、それらのハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどの１つ以上が挙げられる。一部の実施形態において、治療薬および／または予防薬は、ＲＮＡである。本明細書に記載の組成物および方法において有用なＲＮＡは、限定されるものではないが、ショートマ（ｓｈｏｒｔｍｅｒ）、アンタゴｍｉｒ、アンチセンス、リボザイム、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、およびそれらの混合物からなる群から選択することができる。ある実施形態において、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
【０１９７】
ある実施形態において、治療薬および／または予防薬は、ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、任意の目的のポリペプチド、例として任意の天然または非天然発生またはそうでなければ修飾ポリペプチドをコードし得る。ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドは任意のサイズであり得、任意の二次構造または活性を有し得る。一部の実施形態において、ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドは、細胞中で発現された場合に治療効果を有し得る。
【０１９８】
別の実施形態において、治療薬および／または予防薬は、ｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子の発現を選択的にノックダウンまたは下方発現し得る。例えば、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰの、それを必要とする対象への投与時に特定の疾患、障害、または病態に関連する遺伝子をサイレンシングするように選択することができる。ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子またはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に相補的な配列を含み得る。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、免疫調節ｓｉＲＮＡであり得る。
【０１９９】
一部の実施形態において、治療薬および／または予防薬は、ｓｈＲＮＡまたはそれをコードするベクターもしくはプラスミドである。ｓｈＲＮＡは、核への適切な構築物の送達時に標的細胞内側で産生することができる。ｓｈＲＮＡに関連する構築物および機序は、関連分野において周知である。
【０２００】
本開示における有用な核酸およびポリヌクレオチドは、典型的には、目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１の領域（例えば、コード領域）、第１の領域の５’末端に局在する第１のフランキング領域（例えば、５’−ＵＴＲ）、第１の領域の３’末端に局在する第２のフランキング領域（例えば、３’−ＵＴＲ）、少なくとも１つの５’キャップ領域、および３’−安定化領域を含む。一部の実施形態において、核酸またはポリヌクレオチドは、ポリ−Ａ領域またはコザック配列（例えば、５’−ＵＴＲ中）をさらに含む。一部の場合、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドから切断され得る１つ以上のイントロンヌクレオチド配列を含有し得る。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド、ステムループ、ポリＡ配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。核酸の領域のいずれか１つは、１つ以上の代替構成成分（例えば、代替ヌクレオシド）を含み得る。例えば、３’−安定化領域は、代替ヌクレオシド、例えばＬ−ヌクレオシド、逆位チミジン、もしくは２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを含有し得、ならびに／またはコード領域、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、もしくはキャップ領域は、代替ヌクレオシド、例えば５−置換ウリジン（例えば、５−メトキシウリジン）、１−置換シュードウリジン（例えば、１−メチル−シュードウリジン）、および／もしくは５−置換シチジン（例えば、５−メチル−シチジン）を含み得る。
【０２０１】
一般に、ポリヌクレオチドの最短長さは、ジペプチドをコードするために十分なポリヌクレオチド配列の長さであり得る。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、トリペプチドをコードするために十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、テトラペプチドをコードするために十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ペンタペプチドをコードするために十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ヘキサペプチドをコードするために十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ヘプタペプチドをコードするために十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、オクタペプチドをコードするために十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ノナペプチドをコードするために十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、デカペプチドをコードするために十分である。
【０２０２】
代替ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例としては、限定されるものではないが、カルノシンおよびアンセリンが挙げられる。
一部の場合、ポリヌクレオチドは、３０ヌクレオチド長よりも長い。別の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、３５ヌクレオチド長よりも長い。別の実施形態において、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５０００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチド超である。
【０２０３】
核酸およびポリヌクレオチドは、１つ以上の天然発生構成成分、例として正準ヌクレオチドＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）、またはＴ（チミジン）のいずれかを含み得る。一実施形態において、（ａ）５’−ＵＴＲ、（ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）、（ｃ）３’−ＵＴＲ、（ｄ）ポリＡテール、および（上記のａ、ｂ、ｃ、またはｄ）の任意の組合せを含むヌクレオチドの全てまたは実質的に全てが天然発生正準ヌクレオチドＡ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）、またはＴ（チミジン）を含む。
【０２０４】
核酸およびポリヌクレオチドは、有用な特性、例として増加した安定性および／またはポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の実質的誘導の欠落を付与する本明細書に記載の１つ以上の代替構成成分を含み得る。例えば、代替ポリヌクレオチドまたは核酸は、対応する未変更ポリヌクレオチドまたは核酸に対してポリヌクレオチドまたは核酸が導入される細胞中での低減した分解を示す。これらの代替種は、タンパク質産生の効率、ポリヌクレオチドの細胞内保持、および／または接触される細胞の生存率を向上させ、低減した免疫原性を有し得る。
【０２０５】
ポリヌクレオチドおよび核酸は、天然発生または非天然発生であり得る。ポリヌクレオチドおよび核酸は、１つ以上の修飾（例えば、変更または代替）核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはそれらの組合せを含み得る。ＬＮＰにおいて有用な核酸およびポリヌクレオチドは、任意の有用な修飾または変更、例えば核酸塩基、糖、またはヌクレオシド間結合の（例えば、結合ホスフェートの／ホスホジエステル結合の／ホスホジエステル骨格の）修飾または変更を含み得る。ある実施形態において、変更（例えば、１つ以上の変更）は、核酸塩基、糖、およびヌクレオシド間結合のそれぞれにおいて存在する。本開示による変更は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（例えば、リボフラノシル環の２’−ＯＨの２’−Ｈへの置換）、トレオース核酸（ＴＮＡ：ｔｈｒｅｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコール核酸（ＧＮＡ：ｇｌｙｃｏｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、それらのハイブリッドへのリボ核酸（ＲＮＡ）の変更であり得る。追加の変更は、本明細書において記載される。
【０２０６】
ポリヌクレオチドおよび核酸は、分子の全長に沿って均等に変更されていてもいなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ以上または全てのタイプ（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上または全て）は、ポリヌクレオチドもしくは核酸中またはその所与の所定配列領域中で均等に変更されていてもいなくてもよい。一部の例において、ポリヌクレオチド中（またはその所与の配列領域中）の全てのヌクレオチドＸは変更されており、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、または組合せＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣもしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであり得る。
【０２０７】
異なる糖変更および／またはヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、ポリヌクレオチド中の種々の位置に存在し得る。当業者は、ポリヌクレオチドの機能が実質的に減少されないようにヌクレオチド類似体または他の変更がポリヌクレオチドの任意の位置に局在し得ることを認識する。変更は、５’−末端変更または３’−末端変更であり得る。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、３’−末端における変更を含む。ポリヌクレオチドは、約１％〜約１００％の代替ヌクレオチド（全ヌクレオチド含有率に対して、またはヌクレオチドの１つ以上のタイプ、すなわちＡ、Ｇ、ＵもしくはＣのいずれか１つ以上に対してのいずれかで）または任意の介在割合（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％）の代替ヌクレオチドを含有し得る。任意の残りの割合は、正準ヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣ）の存在により占有されることが理解される。
【０２０８】
ポリヌクレオチドは、最小でゼロおよび最大で１００％の代替ヌクレオチド、または任意の介在割合、例えば少なくとも５％の代替ヌクレオチド、少なくとも１０％の代替ヌクレオチド、少なくとも２５％の代替ヌクレオチド、少なくとも５０％の代替ヌクレオチド、少なくとも８０％の代替ヌクレオチド、または少なくとも９０％の代替ヌクレオチドを含有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、代替ピリミジン、例えば代替ウラシルまたはシトシンを含有し得る。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、代替ウラシル（例えば、５−置換ウラシル）により置き換えられている。代替ウラシルは、単一ユニーク構造を有する化合物により置き換えられ得、または異なる構造（例えば、２、３、４つ以上のユニーク構造）を有する複数の化合物により置き換えられ得る。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、代替シトシン（例えば、５−置換シトシン）により置き換えられている。代替シトシンは、単一ユニーク構造を有する化合物により置き換えられ得、または異なる構造（例えば、２、３、４つ以上のユニーク構造）を有する複数の化合物により置き換えられ得る。
【０２０９】
一部の例において、核酸は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導される自然免疫応答の特徴としては、１）炎症促進性サイトカインの発現増加、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５などの活性化、および／または３）タンパク質翻訳の終結もしくは低減が挙げられる。
【０２１０】
核酸としては、任意選択的に、他の薬剤（例えば、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター）を挙げることができる。一部の実施形態において、核酸としては、１つ以上の代替ヌクレオシドまたはヌクレオチドを有する１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（すなわち代替ｍＲＮＡ分子）を挙げることができる。
【０２１１】
一部の実施形態において、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）分子、製剤、組成物またはそれらに関連する方法は、全て参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００２／０９８４４３号パンフレット、国際公開第２００３／０５１４０１号パンフレット、国際公開第２００８／０５２７７０号パンフレット、国際公開第２００９１２７２３０号パンフレット、国際公開第２００６１２２８２８号パンフレット、国際公開第２００８／０８３９４９号パンフレット、国際公開第２０１００８８９２７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３７５３９号パンフレット、国際公開第２００４／００４７４３号パンフレット、国際公開第２００５／０１６３７６号パンフレット、国際公開第２００６／０２４５１８号パンフレット、国際公開第２００７／０９５９７６号パンフレット、国際公開第２００８／０１４９７９号パンフレット、国際公開第２００８／０７７５９２号パンフレット、国際公開第２００９／０３０４８１号パンフレット、国際公開第２００９／０９５２２６号パンフレット、国際公開第２０１１０６９５８６号パンフレット、国際公開第２０１１０２６６４１号パンフレット、国際公開第２０１１／１４４３５８号パンフレット、国際公開第２０１２０１９７８０号パンフレット、国際公開第２０１２０１３３２６号パンフレット、国際公開第２０１２０８９３３８号パンフレット、国際公開第２０１２１１３５１３号パンフレット、国際公開第２０１２１１６８１１号パンフレット、国際公開第２０１２１１６８１０号パンフレット、国際公開第２０１３１１３５０２号パンフレット、国際公開第２０１３１１３５０１号パンフレット、国際公開第２０１３１１３７３６号パンフレット、国際公開第２０１３１４３６９８号パンフレット、国際公開第２０１３１４３６９９号パンフレット、国際公開第２０１３１４３７００号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０６２６号パンフレット、国際公開第２０１３１２０６２７号パンフレット、国際公開第２０１３１２０６２８号パンフレット、国際公開第２０１３１２０６２９号パンフレット、国際公開第２０１３１７４４０９号パンフレット、国際公開第２０１４１２７９１７号パンフレット、国際公開第２０１５／０２４６６９号パンフレット、国際公開第２０１５／０２４６６８号パンフレット、国際公開第２０１５／０２４６６７号パンフレット、国際公開第２０１５／０２４６６５号パンフレット、国際公開第２０１５／０２４６６６号パンフレット、国際公開第２０１５／０２４６６４号パンフレット、国際公開第２０１５１０１４１５号パンフレット、国際公開第２０１５１０１４１４号パンフレット、国際公開第２０１５０２４６６７号パンフレット、国際公開第２０１５０６２７３８号パンフレット、国際公開第２０１５１０１４１６号パンフレット（それらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の特徴を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０２１２】
核酸塩基代替物
代替ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、代替核酸塩基を含み得る。核酸の核酸塩基は、有機塩基、例えばプリンまたはピリミジンまたはそれらの誘導体である。核酸塩基は、正準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）塩基（例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）であり得る。これらの核酸塩基は、向上した特性、例えば増加した安定性、例えばヌクレアーゼに対する耐性を有するポリヌクレオチド分子を提供するために変更し、または全体的に置き換えることができる。非正準または修飾塩基は、例えば、１つ以上の置換または修飾、例として、限定されるものではないが、アルキル、アリール、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルキルオキシ、および／またはチオ置換；１つ以上の縮合または開環；酸化；および／または還元を含み得る。
【０２１３】
代替ヌクレオチド塩基対合は、標準的なアデニン−チミン、アデニン−ウラシル、またはグアニン−シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチドおよび／または非標準または代替塩基を含む代替ヌクレオチド間で形成される塩基対（水素結合供与体および水素結合受容体の配置が、非標準塩基と標準塩基との間または２つの相補的非標準塩基構造間の水素結合を許容する）も包含する。このような非標準塩基対合の一例は、代替ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。
【０２１４】
一部の実施形態において、核酸塩基は、代替ウラシルである。例示的な核酸塩基および代替ウラシルを有するヌクレオシドとしては、シュードウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウラシル、６−アザ−ウラシル、２−チオ−５−アザ−ウラシル、２−チオ−ウラシル（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウラシル（ｓ４Ｕ）、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウラシル（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウラシル、５−ハロ−ウラシル（例えば、５−ヨード−ウラシルまたは５−ブロモ−ウラシル）、３−メチル−ウラシル（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウラシル（ｍｏ５Ｕ）、ウラシル５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウラシル５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウラシル（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウラシル（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウラシルメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウラシル（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウラシル（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウラシル（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウラシル（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウラシル（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウラシル、１−プロピニル−シュードウラシル、５−タウリノメチル−ウラシル（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウラシル（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−メチル−ウラシル（ｍ５Ｕ、すなわち核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウラシル（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウラシル（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチル−ジヒドロウラシル（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウラシル、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウラシル、２−メトキシ−４−チオ−ウラシル、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウラシル（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウラシル（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、５，２’−Ｏ−ジメチ���−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２−チオ−２’−Ｏ＿メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、および５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウラシル、デオキシチミジン、５−（２−カルボメトキシビニル）−ウラシル、５−（カルバモイルヒドロキシメチル）−ウラシル、５−カルバモイルメチル−２−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチル−２−チオ−ウラシル、５−シアノメチル−ウラシル、５−メトキシ−２−チオ−ウラシル、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）］ウラシルが挙げられる。
【０２１５】
一部の実施形態において、核酸塩基は、代替シトシンである。例示的な核酸塩基および代替シトシンを有するヌクレオシドとしては、５−アザ−シトシン、６−アザ−シトシン、シュードイソシチジン、３−メチル−シトシン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シトシン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シトシン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シトシン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シトシン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シトシン（例えば、５−ヨード−シトシン）、５−ヒドロキシメチル−シトシン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シトシン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シトシン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シトシン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シトシン、２−メトキシ−５−メチル−シトシン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−（３−アジドプロピル）−シトシン、および５−（２−アジドエチル）−シトシンが挙げられる。
【０２１６】
一部の実施形態において、核酸塩基は、代替アデニンである。例示的な核酸塩基および代替アデニンを有するヌクレオシドとしては、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデニン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデニン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデニン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデニン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデニン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデニン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデニン、８−アジド−アデニン、Ｎ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデニン、２，８−ジメチル−アデニン、Ｎ６−ホルミル−アデニン、およびＮ６−ヒドロキシメチル−アデニンが挙げられる。
【０２１７】
一部の実施形態において、核酸塩基は、代替グアニンである。例示的な核酸塩基および代替グアニンを有するヌクレオシドとしては、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、非修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアニン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−キューオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアニン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアニン（ｐｒｅＱ１）、アーケオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアニン、６−チオ−グアニン、６−チオ−７−デアザ−グアニン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアニン、７−メチル−グアニン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアニン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアニン、１−メチル−グアニン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアニン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアニン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアニン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアニン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアニン、７−メチル−８−オキソ−グアニン、１−メチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、１−チオ−グアニン、およびＯ−６−メチル−グアニンが挙げられる。
【０２１８】
ヌクレオチドの代替核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体であり得る。例えば、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、ヒポキサンチンの代替物であり得る。別の実施形態において、核酸塩基としては、例えば、塩基の天然発生および合成誘導体、例としてピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例えば、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ａ］１，３，５トリアジノン、９−デアザプリン、イミダゾ［４，５−ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン、ピラジン−２−オン、１，２，４−トリアジン、ピリダジン；または１，３，５トリアジンを挙げることもできる。ヌクレオチドが略記Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵを使用して示される場合、それぞれの文字は、代表的な塩基および／またはその誘導体を指し、例えばＡとしては、アデニンまたはアデニン類似体、例えば７−デアザアデニンが挙げられる）。
【０２１９】
糖上の変更
ヌクレオシドは、糖分子（例えば、５−炭素または６−炭素糖、例えばペントース、リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、またはそれらのデオキシ誘導体）を核酸塩基との組合せで含む一方、ヌクレオチドは、ヌクレオシドおよびホスフェート基または代替基（例えば、ボラノホスフェート、チオホスフェート、セレノホスフェート、ホスホネート、アルキル基、アミデート、およびグリセロール）を含有するヌクレオシドである。ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、正準種、例えば正準核酸塩基、糖、およびヌクレオチドの場合、ホスフェート基を含むヌクレオシドもしくはヌクレオチドであり得、または１つ以上の代替構成成分を含む代替ヌクレオシドもしくはヌクレオチドであり得る。例えば、代替ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖上で変更することができる。一部の実施形態において、代替ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、構造：
【０２２０】
【化１０】
2019525901.tif 000011
【０２２１】
を含む。
式ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩのそれぞれにおいて、
ｍおよびｎのそれぞれは、独立して、０〜５の整数であり、
ＵおよびＵ’のそれぞれは、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ｎｕは、０〜２の整数であり、それぞれのＲＵは、独立して、Ｈ、ハロ、または任意選択的に置換されているアルキルであり；
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ１’’、Ｒ２’’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、独立して、存在する場合、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意選択的に置換されているアルキル、任意選択的に置換されているアルコキシ、任意選択的に置換されているアルケニルオキシ、任意選択的に置換されているアルキニルオキシ、任意選択的に置換されているアミノアルコキシ、任意選択的に置換されているアルコキシアルコキシ、任意選択的に置換されているヒドロキシアルコキシ、任意選択的に置換されているアミノ、アジド、任意選択的に置換されているアリール、任意選択的に置換されているアミノアルキル、任意選択的に置換されているアミノアルケニル、任意選択的に置換されているアミノアルキニルであり、または不存在であり；Ｒ３と、Ｒ１’、Ｒ１’’、Ｒ２’、Ｒ２’’、またはＲ５の１つ以上との組合せ（例えば、Ｒ１’およびＲ３の組合せ、Ｒ１’’およびＲ３の組合せ、Ｒ２’およびＲ３の組合せ、Ｒ２’’およびＲ３の組合せ、またはＲ５およびＲ３の組合せ）は、一緒になって結合して、任意選択的に置換されているアルキレンまたは任意選択的に置換されているヘテロアルキレンを形成し、それらが付着している炭素と一緒になって、任意選択的に置換されているヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し；Ｒ５と、Ｒ１’、Ｒ１’’、Ｒ２’、またはＲ２’’の１つ以上との組合せ（例えば、Ｒ１’およびＲ５の組合せ、Ｒ１’’およびＲ５の組合せ、Ｒ２’およびＲ５の組合せ、またはＲ２’’およびＲ５の組合せ）は、一緒になって結合して、任意選択的に置換されているアルキレンまたは任意選択的に置換されているヘテロアルキレンを形成し、それらが付着している炭素と一緒になって、任意選択的に置換されているヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し；Ｒ４と、Ｒ１’、Ｒ１’’、Ｒ２’、Ｒ２’’、Ｒ３、またはＲ５の１つ以上との組合せは、一緒になって結合して、任意選択的に置換されているアルキレンまたは任意選択的に置換されているヘテロアルキレンを形成し、それらが付着している炭素と一緒になって、任意選択的に置換されているヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し；ｍ’およびｍ’’のそれぞれは、独立して、０〜３の整数（例えば、０〜２、０〜１、１〜３、または１〜２）であり；
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３のそれぞれは、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意選択的に置換されているアルキレン、または任意選択的に置換されているヘテロアルキレンであり、ＲＮ１は、Ｈ、任意選択的に置換されているアルキル、任意選択的に置換されているアルケニル、任意選択的に置換されているアルキニル、任意選択的に置換されているアリールであり、または不存在であり；
それぞれのＹ４は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意選択的に置換されているアルキル、任意選択的に置換されているアルケニル、任意選択的に置換されているアルキニル、任意選択的に置換されているアルコキシ、任意選択的に置換されているアルケニルオキシ、任意選択的に置換されているアルキニルオキシ、任意選択的に置換されているチオアルコキシ、任意選択的に置換されているアルコキシアルコキシ、または任意選択的に置換されているアミノであり；
それぞれのＹ５は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意選択的に置換されているアルキレン（例えば、メチレン）、または任意選択的に置換されているヘテロアルキレンであり；および
Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基のいずれかである。
【０２２２】
一部の実施形態において、２’−ヒドロキシ基（ＯＨ）は、いくつかの異なる置換基により修飾されるかまたは置き換えられ得る。２’−位における例示的な置換としては、限定されるものではないが、Ｈ、アジド、ハロ（例えば、フルオロ）、任意選択的に置換されているＣ１〜６アルキル（例えば、メチル）；任意選択的に置換されているＣ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）；任意選択的に置換されているＣ６〜１０アリールオキシ；任意選択的に置換されているＣ３〜８シクロアルキル；任意選択的に置換されているＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ、任意選択的に置換されているＣ１〜１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載の任意のもの）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、Ｈまたは任意選択的に置換されているアルキルであり、ｎは、０〜２０の整数（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、４〜２０）である）；「ロックド」核酸（ＬＮＡ）（２’−ヒドロキシは、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋により同一のリボース糖の４’−炭素への架橋により連結しており、例示的な架橋は、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋を含んだ）；本明細書に定義のアミノアルキル；本明細書に定義のアミノアルコキシ；本明細書に定義のアミノ；ならびに本明細書に定義のアミノ酸が挙げられる。
【０２２３】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。例示的な非限定的代替ヌクレオチドとしては、リボース中の酸素の置き換え（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはアルキレン、例えばメチレンまたはエチレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルにより置き換えるため）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成するため）；リボースの環拡張（例えば、追加の炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環、例えばアンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびモルホリノ（ホスホラミデート骨格も有する）を形成するため）；多環式形態（例えば、トリシクロおよび「アンロック」形態、例えばグリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ（リボースは、ホスホジエステル結合に付着しているグリコール単位により置き換えられている））、トレオース核酸（ＴＮＡ（リボースは、α−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）により置き換えられている）））、およびペプチド核酸（ＰＮＡ（２−アミノ−エチル−グリシン結合がリボースおよびホスホジエステル骨格を置き換える））が挙げられる。
【０２２４】
一部の実施形態において、糖基は、リボース中の対応する炭素の反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を含有する。したがって、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アラビノースまたはＬ−リボースを糖として含有するヌクレオチドを含み得る。
【０２２５】
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、糖がＬ−リボース、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−フルオロ−リボース、アラビノース、ヘキシトール、ＬＮＡ、またはＰＮＡである少なくとも１つのヌクレオシドを含む。
【０２２６】
ヌクレオシド間結合上の変更
代替ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、ホスフェート骨格）上で変更することができる。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格に関して、語句「ホスフェート」および「ホスホジエステル」は、互換的に使用される。骨格ホスフェート基は、酸素原子の１つ以上を異なる置換基により置き換えることにより変更することができる。
【０２２７】
代替ヌクレオチドは、本明細書に記載の別のヌクレオシド間結合による非変更ホスフェート部分の大規模な置き換えを含み得る。代替ホスフェート基の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロジアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、硫黄により置き換えられている非結合酸素の両方を有する。ホスフェートリンカーは、窒素（架橋ホスホラミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレン−ホスホネート）による結合酸素の置き換えにより変更され得る。
【０２２８】
代替ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、ボラン部分（ＢＨ３）、硫黄（チオ）、メチル、エチル、および／またはメトキシによる非架橋酸素の１つ以上の置き換えを含み得る。非限定的な例として、同一位置（例えば、アルファ（α）、ベータ（β）またはガンマ（γ）位）における２つの非架橋酸素原子は、硫黄（チオ）およびメトキシにより置き換えることができる。
【０２２９】
ホスフェート部分（例えば、α−チオホスフェート）のα位における酸素原子の１つ以上の置き換えは、非天然ホスホロチオエート骨格結合を介してＲＮＡおよびＤＮＡに安定性（例えば、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対する）を付与するために提供される。ホスホロチオエートＤＮＡおよびＲＮＡは、増加したヌクレアーゼ耐性および結果的に細胞環境中でのより長い半減期を有する。
【０２３０】
本開示に従って用いることができる他のヌクレオシド間結合、例としてリン原子を含有しないヌクレオシド間結合は、本明細書において記載される。
内部リボソーム進入部位
ポリヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）を含有し得る。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡの唯一のリボソーム結合部位として作用し得、または複数のリボソーム結合部位の１つとして機能し得る。２つ以上の機能的リボソーム結合部位を含有するポリヌクレオチドは、リボソームにより独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（例えば、多シストロン性ｍＲＮＡ）。ポリヌクレオチドがＩＲＥＳとともに提供される場合、第２の翻訳可能領域がさらに任意選択的に提供される。本開示に従って使用することができるＩＲＥＳ配列の例としては、限定されるものではないが、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺病ウイルス（ＣｒＰＶ）からのものが挙げられる。
５’−キャップ構造
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’−キャップ構造を含み得る。ポリヌクレオチドの５’−キャップ構造は、核輸送およびポリヌクレオチド安定性の増加に関与し、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ：Ｃａｐ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合し、それは、ＣＢＰとポリ−Ａ結合タンパク質との会合により成熟環式ｍＲＮＡ種を形成することにより細胞中でのポリヌクレオチド安定性および翻訳能を担う。キャップは、ｍＲＮＡスプライシング中の５’−近位イントロン除去の除去をさらに補助する。
【０２３１】
内因性ポリヌクレオチド分子は５’−末端キャッピングされ得、ポリヌクレオチドの末端グアノシンキャップ残基と、５’−末端転写センスヌクレオチドとの間で５’−ｐｐｐ−５’−トリホスフェート結合を生成する。次いで、この５’−グアニレートキャップがメチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニレート残基が生成され得る。ポリヌクレオチドの５’末端の末端および／または末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）転写ヌクレオチドのリボース糖は、任意選択的に、２’−Ｏ−メチル化され得る。グアニレートキャップ構造の加水分解および開裂を介する５’−デキャッピングは、分解のためにポリヌクレオチド分子、例えばｍＲＮＡ分子を標的化し得る。
【０２３２】
ポリヌクレオチドの変更は非加水分解性キャップ構造を生成し得、それは、デキャッピングを防止し、したがってポリヌクレオチド半減期を増加させる。キャップ構造加水分解は５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の開裂を要求するため、キャッピング反応中に代替ヌクレオチドを使用することができる。例えば、ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（イプスウイッチ、マサチューセッツ）製のワクシニアキャッピング酵素を、製造業者の説明書に従ってα−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに使用して５’−ｐｐｐ−５’キャップ中でホスホロチオエート結合を作出することができる。追加の代替グアノシンヌクレオチド、例えばα−メチル−ホスホネートおよびセレノ−ホスフェートヌクレオチドを使用することができる。
【０２３３】
追加の変更としては、限定されるものではないが、糖の２’−ヒドロキシ基上のポリヌクレオチド（上記）の５’−末端および／または５’−末端前ヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化が挙げられる。複数の区別される５’−キャップ構造を使用してポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ分子の５’−キャップを生成することができる。
【０２３４】
５’−キャップ構造としては、国際特許出願公開の国際公開第２００８１２７６８８号パンフレット、国際公開第２００８０１６４７３号パンフレット、および国際公開第２０１１０１５３４７号パンフレット（それらのそれぞれのキャップ構造は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものが挙げられる。
【０２３５】
本明細書において、合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造もしくは機能的キャップ類似体とも称されるキャップ類似体は、それらの化学構造が天然（すなわち内因性、野生型、または生理学的）５’−キャップと異なる一方、キャップ機能を保持する。キャップ類似体は、化学的に（すなわち非酵素的に）または酵素的に合成し、ポリヌクレオチドに結合させることができる。
【０２３６】
例えば、抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ：Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ）キャップは、５’−５’−トリホスフェート基により結合している２つのグアノシンを含有し、一方のグアノシンは、Ｎ７−メチル基および３’−Ｏ−メチル基（すなわちＮ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン、ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ、それは、同じく３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと命名することができる）を含有する。他方の非変更グアノシンの３’−Ｏ原子は、キャッピングされるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−末端ヌクレオチドに結合される。Ｎ７−および３’−Ｏ−メチル化グアノシンは、キャッピングされるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。
【０２３７】
別の例示的なキャップは、ＡＲＣＡと類似するが、グアノシン上の２’−Ｏ−メチル基を有するｍＣＡＰ（すなわちＮ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）である。
【０２３８】
キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体であり得る。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、異なるホスフェート位置においてボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート基により修飾され得、例えば米国特許第８，５１９，１１０号明細書（そのキャップ構造は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のジヌクレオチドキャップ類似体である。
【０２３９】
代わりに、キャップ類似体は、当技術分野において公知の、および／または本明細書に記載のＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップ類似体であり得る。Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップ類似体の非限定的な例としては、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧおよびＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体（例えば、コア（Ｋｏｒｅ）ら著、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０１３年、第２１巻、ｐ．４５７０〜４５７４（そのキャップ構造は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の種々のキャップ類似体およびキャップ類似体を合成する方法を参照されたい）が挙げられる。他の例において、本開示のポリヌクレオチドにおいて有用なキャップ類似体は、４−クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
【０２４０】
キャップ類似体がインビトロ転写反応におけるポリヌクレオチドの同時キャッピングを可能とする一方、転写物の最大２０％がキャップされないままである。これは、内因性細胞転写機構により産生されるポリヌクレオチドの内因性５’−キャップ構造とのキャップ類似体の構造的差異と同様、低減した翻訳能および低減した細胞安定性をもたらし得る。
【０２４１】
代替ポリヌクレオチドは、酵素を使用して転写後にキャッピングしてより真性の５’−キャップ構造を生成することができる。本明細書において使用される語句「より真性の」は、内因性または野生型の特徴部を構造的または機能的のいずれかで厳密に反映し、または模倣する特徴部を指す。すなわち、「より真性の」特徴部は、従来技術の合成の特徴部または類似体と比較して良好な内因性、野生型、天然もしくは生理学的細胞機能、および／もしくは構造の代表例であり、または対応する内因性、野生型、天然、もしくは生理学的特徴部を１つ以上の点で上回るものである。本開示のポリヌクレオチドにおいて有用なより真性の５’−キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当技術分野において公知の合成５’−キャップ構造と比較して（または野生型、天然もしくは生理学的５’−キャップ構造と比較して）キャップ結合タンパク質の向上した結合、増加した半減期、５’−エンドヌクレアーゼに対する低減した感受性、および／または低減した５’−デキャッピングを有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’−末端ヌクレオチドとグアノシンキャップヌクレオチドとの間で正準５’−５’−トリホスフェート結合を作出し得、キャップグアノシンはＮ７−メチル化を含有し、ポリヌクレオチドの５’−末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含有する。このような構造は、Ｃａｐ１構造と呼ばれる。このキャップは、例えば、当技術分野において公知の他の５’キャップ類似体構造と比較して高い翻訳能、細胞安定性、および細胞炎症促進性サイトカインの活性化低減をもたらす。他の例示的なキャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｐＮ２ｐ（Ｃａｐ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（Ｃａｐ１）、７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（Ｃａｐ２）、およびｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ（Ｃａｐ４）が挙げられる。
【０２４２】
代替ポリヌクレオチドは、転写後にキャッピングすることができるため、およびこのプロセスは、より効率的であるため、代替ポリヌクレオチドのほぼ１００％をキャッピングすることができる。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程においてポリヌクレオチドに結合している場合の約８０％とは対照的である。
【０２４３】
５’−末端キャップとしては、内因性キャップまたはキャップ類似体を挙げることができる。５’−末端キャップとしては、グアノシン類似体を挙げることができる。有用なグアノシン類似体としては、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンが挙げられる。
【０２４４】
一部の場合、ポリヌクレオチドは、修飾５’−キャップを含有する。５’−キャップ上の修飾は、ポリヌクレオチドの安定性を増加させ、ポリヌクレオチドの半減期を増加させ得、ポリヌクレオチド翻訳効率を増加させ得る。修飾５’−キャップとしては、限定されるものではないが、以下の修飾の１つ以上：キャッピングされるグアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）の２’−および／もしくは３’−位における修飾、メチレン部分（ＣＨ２）による（炭素環式環を生成した）糖環酸素の置き換え、キャップ構造のトリホスフェート架橋部分における修飾、または核酸塩基（Ｇ）部分における修飾を挙げることができる。
【０２４５】
５’−ＵＴＲ
５’−ＵＴＲは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）にフランキング領域として提供することができる。５’−ＵＴＲは、ポリヌクレオチド中に見出されるコード領域に対して同種または異種であり得る。複数の５’−ＵＴＲをフランキング領域中に含めることができ、同一配列または異なる配列であり得る。フランキング領域の任意の一部は、存在しない場合を含め、コドン最適化することができ、いずれも、コドン最適化前および／または後に独立して１つ以上の異なる構造または化学的変更を含有し得る。
【０２４６】
米国仮特許出願第６１／７７５，５０９号明細書の表２１、ならびに米国仮特許出願第６１／８２９，３７２号明細書の表２１および表２２（それらは、参照により本明細書に組み込まれる）に代替ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の開始および終止部位のリストが示されている。表２１において、それぞれの５’−ＵＴＲ（５’−ＵＴＲ−００５〜５’−ＵＴＲ６８５１１）は、その天然または野生型（同種）転写物に対するその開始および終止部位により同定されている（ＥＮＳＴ；ＥＮＳＥＭＢＬデータベースにおいて使用される識別子）。
【０２４７】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の１つ以上の特性を変更するため、代替ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のコード領域に対して異種である５’−ＵＴＲを遺伝子操作することができる。次いで、細胞、組織または生物体にポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を投与することができ、アウトカム、例えばタンパク質レベル、局在化、および／または半減期を計測して異種５’−ＵＴＲが代替ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）に対して有し得る有益な効果を評価することができる。１つ以上のヌクレオチド、例としてＡ、Ｔ、ＣまたはＧが末端に付加され、または末端から除去された５’−ＵＴＲのバリアントを利用することができる。５’−ＵＴＲは、本明細書に記載の任意の様式でコドン最適化し、または変更することもできる。
【０２４８】
５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、および翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ：ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲは、少なくとも１つの翻訳エンハンサーエレメントを含み得る。用語「翻訳エンハンサーエレメント」は、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる配列を指す。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモータと開始コドンとの間に局在させることができる。５’−ＵＴＲ中の少なくとも１つのＴＥＥを有するポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’−ＵＴＲにおけるキャップを含み得る。さらに、少なくとも１つのＴＥＥは、キャップ依存的またはキャップ非依存的翻訳を受けるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ中に局在させることができる。
【０２４９】
一態様において、ＴＥＥは、ポリヌクレオチドの翻訳活性、例えば、限定されるものではないが、キャップ依存的またはキャップ非依存的翻訳を促進し得るＵＴＲ中の保存エレメントである。これらの配列の保存は、ペネック（Ｐａｎｅｋ）ら（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年、ｐ．１〜１０）により、ヒトを含む１４種にわたり既に示されている。
【０２５０】
１つの非限定的な例において、公知のＴＥＥは、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５’−リーダ中に存在し得る（チャッペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０１巻、ｐ．９５９０〜９５９４、２００４年（そのＴＥＥは、参照により本明細書に組み込まれる））。
【０２５１】
別の非限定的な例において、ＴＥＥは、米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書および同第２０１３／０１７７５８１号明細書、国際特許出願公開の国際公開２００９／０７５８８６号パンフレット、国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット、および国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、米国特許第６，３１０，１９７号明細書、および同第６，８４９，４０５号明細書（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０２５２】
さらに別の非限定的な例において、ＴＥＥは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＨＣＶ−ＩＲＥＳまたはＩＲＥＳエレメント、例えば、限定されるものではないが、米国特許第７，４６８，２７５号明細書、米国特許出願公開第２００７／００４８７７６号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書ならびに国際特許出願公開の国際公開２００７／０２５００８号パンフレットおよび国際公開第２００１／０５５３６９号パンフレット（それらのそれぞれのＩＲＥＳ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものであり得る。ＩＲＥＳエレメントとしては、限定されるものではないが、チャッペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）ら（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０１巻、ｐ．９５９０〜９５９４、２００４年）およびゾウ（Ｚｈｏｕ）ら（米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第１０２巻、ｐ．６２７３〜６２７８、２００５年）ならびに米国特許出願公開第２００７／００４８７７６号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書ならびに国際特許出願公開の国際公開２００７／０２５００８号パンフレット（それらのそれぞれのＩＲＥＳ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＧｔｘ配列（例えば、Ｇｔｘ９−ｎｔ、Ｇｔｘ８−ｎｔ、Ｇｔｘ７−ｎｔ）を挙げることができる。
【０２５３】
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」は、本明細書において例示され、および／または当技術分野において開示される規定のＴＥＥ（例えば、米国特許第６，３１０，１９７号明細書、同第６，８４９，４０５号明細書、同第７，４５６，２７３号明細書、同第７，１８３，３９５号明細書、米国特許出願公開第２００９０／２２６４７０号明細書、同第２００７／００４８７７６号明細書、同第２０１１／０１２４１００号明細書、同第２００９／００９３０４９号明細書、同第２０１３／０１７７５８１号明細書、国際特許出願公開の国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレット、国際公開第２００７／０２５００８号パンフレット、国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット、国際公開第２００１／０５５３７１号パンフレット、国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、ならびに欧州特許第２６１０３４１号明細書および同第２６１０３４０号明細書（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）またはそれらのバリアント、相同体もしくは機能的誘導体の１つ以上を含むポリヌクレオチドである。特異的ＴＥＥの１つまたは複数のコピーが、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）中に存在し得る。翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中のＴＥＥは、１つ以上の配列セグメントにおいて組織化することができる。配列セグメントは、本明細書において例示される特異的ＴＥＥの１つ以上を保有し得、それぞれのＴＥＥは１つ以上のコピー中に存在する。複数の配列セグメントが翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中に存在する場合、それらは、同種または異種であり得る。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中の複数の配列セグメントは、本明細書において例示される同一もしくは異なるタイプの特異的ＴＥＥ、同一もしくは異なるコピー数の特異的ＴＥＥのそれぞれ、および／またはそれぞれの配列セグメント内の同一もしくは異なる組織化のＴＥＥを保有し得る。
【０２５４】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、国際特許出願公開の国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット、国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレット、国際公開第２００７／０２５００８号パンフレット、国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、欧州特許第２６１０３４１号明細書および同第２６１０３４０号明細書、米国特許第６，３１０，１９７号明細書、同第６，８４９，４０５号明細書、同第７，４５６，２７３号明細書、同第７，１８３，３９５号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書、同第２０１１／０１２４１００号明細書、同第２００７／００４８７７６号明細書、同第２００９／００９３０４９号明細書、および同第２０１３／０１７７５８１号明細書（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の少なくとも１つのＴＥＥを含み得る。ＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ中に局在させることができる。
【０２５５】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書、同第２００７／００４８７７６号明細書、同第２０１３／０１７７５８１号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書、国際特許出願公開の国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット、国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレットおよび国際公開第２００７／０２５００８号パンフレット、欧州特許第２６１０３４１号明細書および同第２６１０３４０号明細書、米国特許第６，３１０，１９７号明細書、同第６，８４９，４０５号明細書、同第７，４５６，２７３号明細書、同第７，１８３，３９５号明細書（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＴＥＥとの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＴＥＥを含み得る。
【０２５６】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または６０個超のＴＥＥ配列を含み得る。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ中のＴＥＥ配列は、同一ＴＥＥ配列または異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢ、ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、もしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣのようなパターン、またはその変形であり得、１、２、または４回以上リピートさせることができる。これらのパターンにおいて、それぞれの文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルにおいて異なるＴＥＥ配列を表す。
【０２５７】
一部の場合、５’−ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を離隔するためのスペーサを含み得る。非限定的な例として、スペーサは、１５ヌクレオチドスペーサおよび／または当技術分野において公知の他のスペーサであり得る。別の非限定的な例において、５’−ＵＴＲは、５’−ＵＴＲ中で少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４倍、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または１０回以上リピートされるＴＥＥ配列−スペーサモジュールを含み得る。
【０２５８】
他の例において、２つのＴＥＥ配列を離隔するスペーサは、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を調節し得る当技術分野において公知の他の配列、例えば、限定されるものではないが、ｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位およびｍｉＲシード）を含み得る。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を離隔するために使用されるそれぞれのスペーサは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の構成成分（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
【０２５９】
一部の例において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ中のＴＥＥは、米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書、同第２００７／００４８７７６号明細書、同第２０１３／０１７７５８１号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書、国際特許出願公開の国際公開１９９９／０２４５９５号パンフレット、国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット、国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレットおよび国際公開第２００７／０２５００８号パンフレット、欧州特許第２６１０３４１号明細書および同第２６１０３４０号明細書、ならびに米国特許第６，３１０，１９７号明細書、同第６，８４９，４０５号明細書、同第７，４５６，２７３号明細書、および同第７，１８３，３９５号明細書（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示のＴＥＥ配列の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または９９％超を含み得る。別の実施形態において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ中のＴＥＥは、米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書、同第２００７／００４８７７６号明細書、同第２０１３／０１７７５８１号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書、国際特許出願公開の国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット、国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレットおよび国際公開第２００７／０２５００８号パンフレット、欧州特許第２６１０３４１号明細書および同第２６１０３４０号明細書、ならびに米国特許第６，３１０，１９７号明細書、同第６，８４９，４０５号明細書、同第７，４５６，２７３号明細書、および同第７，１８３，３９５号明細書（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示のＴＥＥ配列の５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、５〜１０ヌクレオチド断片を含み得る。
【０２６０】
ある場合、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ中のＴＥＥは、チャッペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）ら（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０１巻、ｐ．９５９０〜９５９４、２００４年）およびゾウ（Ｚｈｏｕ）ら（米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第１０２巻、ｐ．６２７３〜６２７８、２００５年）、ヴェレンジーク（Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋ）らにより開示されている補足表１および補足表２（「ヒトキャップ非依存的翻訳向上エレメントのゲノムワイドプロファイリング（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）」、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２０１３年、ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示のＴＥＥ配列の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または９９％超を含み得る。別の実施形態において、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ中のＴＥＥは、チャッペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）ら（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０１巻、ｐ．９５９０〜９５９４、２００４年）およびゾウ（Ｚｈｏｕ）ら（米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第１０２巻、ｐ．６２７３〜６２７８、２００５年）、ヴェレンジーク（Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋ）らにより開示されている補足表１および補足表２（「ヒトキャップ非依存的翻訳向上エレメントのゲノムワイドプロファイリング（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）」、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２０１３年、ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示のＴＥＥ配列の５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、５〜１０ヌクレオチド断片を含み得る。
【０２６１】
一部の場合、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおいて使用されるＴＥＥは、ＩＲＥＳ配列、例えば、限定されるものではないが、米国特許第７，４６８，２７５号明細書および国際特許出願公開の国際公開第２００１／０５５３６９号パンフレット（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものである。
【０２６２】
一部の例において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおいて使用されるＴＥＥは、米国特許出願公開第２００７／００４８７７６号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書ならびに国際特許出願公開の国際公開第２００７／０２５００８号パンフレットおよび国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット（それらのそれぞれの方法は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により同定することができる。
【０２６３】
一部の場合、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおいて使用されるＴＥＥは、米国特許第７，４５６，２７３号明細書および同第７，１８３，３９５号明細書、米国特許出願公開第２００９／００９３０４９号明細書、ならびに国際特許出願公開の国際公開第２００１／０５５３７１号パンフレット（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の転写調節エレメントであり得る。転写調節エレメントは、当技術分野において公知の方法、例えば、限定されるものではないが、米国特許第７，４５６，２７３号明細書および同第７，１８３，３９５号明細書、米国特許出願公開第２００９／００９３０４９号明細書、ならびに国際特許出願公開の国際公開第２００１／０５５３７１号パンフレット（それらのそれぞれの方法は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により同定することができる。
【０２６４】
さらに他の例において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおいて使用されるＴＥＥは、米国特許第７，４５６，２７３号明細書および同第７，１８３，３９５号明細書、米国特許出願公開第２００９／００９３０４９号明細書、ならびに国際特許出願公開の国際公開第２００１／０５５３７１号パンフレット（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のポリヌクレオチドまたはその一部である。
【０２６５】
本明細書に記載の少なくとも１つのＴＥＥを含む５’−ＵＴＲは、モノシストロン性配列、例えば、限定されるものではないが、ベクター系またはポリヌクレオチドベクター中に取り込むことができる。非限定的な例として、ベクター系およびポリヌクレオチドベクターとしては、米国特許第７，４５６，２７３号明細書および同第７，１８３，３９５号明細書、米国特許出願公開第２００７／００４８７７６号明細書、同第２００９／００９３０４９号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書、ならびに国際特許出願公開の国際公開第２００７／０２５００８号パンフレットおよび国際公開第２００１／０５５３７１号パンフレット（それらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを挙げることができる。
【０２６６】
本明細書に記載のＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲ中に局在させることができる。３’−ＵＴＲ中に局在するＴＥＥは、５’−ＵＴＲ中に局在し、および／またはその中の取り込みについて記載されるＴＥＥと同一でありかつ／または異なり得る。
【０２６７】
一部の場合、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または６０個超のＴＥＥ配列を含み得る。本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲ中のＴＥＥ配列は、同一ＴＥＥ配列または異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢ、ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、もしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣのようなパターン、またはその変形であり得、１回、２回、または４回以上リピートさせることができる。これらのパターンにおいて、それぞれの文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルにおいて異なるＴＥＥ配列を表す。
【０２６８】
一例において、３’−ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を離隔するためのスペーサを含み得る。非限定的な例として、スペーサは、１５ヌクレオチドスペーサおよび／または当技術分野において公知の他のスペーサであり得る。別の非限定的な例として、３’−ＵＴＲは、３’−ＵＴＲ中で少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または１０回以上リピートされるＴＥＥ配列−スペーサモジュールを含み得る。
【０２６９】
他の場合、２つのＴＥＥ配列を離隔するスペーサは、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を調節し得る当技術分野において公知の他の配列、例えば、限定されるものではないが、本明細書に記載のｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位およびｍｉＲシード）を含み得る。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を離隔するために使用されるそれぞれのスペーサは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の構成成分（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
【０２７０】
一部の実施形態において、本開示のポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲおよび／またはＴＥＥ配列を含む。一部の実施形態において、本開示のポリリボヌクレオチド中へのｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の取り込みはステムループ領域の形状を変化させ得、それが翻訳を増加させ、および／または減少させ得る。例えば、ケッデ（Ｋｅｄｄｅ）ら著、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１０年、第１２巻（１０）、ｐ．１０１４〜２０（参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０２７１】
センサー配列およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
センサー配列は、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列および／またはモチーフ、内因性核酸結合分子のための偽受容体として作用するように遺伝子操作された人工結合部位、ならびにそれらの組合せを含む。センサー配列の非限定的な例は、米国特許出願公開第２０１４／０２００２６１号明細書（その内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２７２】
一部の実施形態において、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本開示のポリリボヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、センサー配列をさらに含む。一部の実施形態において、センサー配列は、ｍｉＲＮＡ結合部位である。
【０２７３】
ｍｉＲＮＡは、ポリリボヌクレオチドに結合し、ポリリボヌクレオチドの安定性を低減させることにより、またはその翻訳を阻害することにより遺伝子発現を下方調節する１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位の領域中の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８または２〜７位を占め得る。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、７つのヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ結合部位中のシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡの１位と反対のアデノシン（Ａ）によりフランキングされている。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、６つのヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ結合部位中のシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡの１位と反対のアデノシン（Ａ）によりフランキングされている。例えば、グリムソン  Ａ（Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ）、ファー  ＫＫ（Ｆａｒｈ  ＫＫ）、ジョンストン  ＷＫ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ）、ガレット−エンゲレ  Ｐ（Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ）、リム  ＬＰ（Ｌｉｍ  ＬＰ）、バーテル  ＤＰ（Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ）著、モレキュラー・セル（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．）、２００７年、７月６日、第２７巻（１）、ｐ．９１〜１０５を参照されたい。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを実施してその細胞または組織中のｍｉＲＮＡの存在または不存在を決定することができる。一部の実施形態において、本開示のポリリボヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡシードを含む。このような配列は、任意の公知のマイクロＲＮＡ、例えば米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書および米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書（それらのそれぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）において教示されるものに対応し得る。
【０２７４】
本明細書において使用される用語「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」は、ｍｉＲＮＡと相互作用し、それと会合し、またはそれに結合するために十分なｍｉＲＮＡの全てまたは一領域との相補性を有するポリリボヌクレオチド内、例えばＤＮＡ内またはＲＮＡ転写物内、例として５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ中の配列を指す。一部の実施形態において、ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本開示のポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。例示的な実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０２７５】
ｍｉＲＮＡとの十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介調節、例えばポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介翻訳抑制または分解を容易にするために十分な相補性の程度を指す。本開示の例示的な態様において、ｍｉＲＮＡとの十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介分解、例えばｍＲＮＡのｍｉＲＮＡガイドＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）媒介開裂を容易にするために十分な相補性の程度を指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９〜２５ヌクレオチドｍｉＲＮＡ配列との、１９〜２３ヌクレオチドｍｉＲＮＡ配列との、または２２ヌクレオチドｍｉＲＮＡ配列との相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部のみ、例えば天然発生ｍｉＲＮＡ配列の全長の１、２、３、または４ヌクレオチド未満の一部と相補的であり得る。所望の調節がｍＲＮＡ分解である場合、完全長または完全相補性（例えば、天然発生ｍｉＲＮＡの長さの全てまたは要部にわたる完全長相補性または完全相補性）が好ましい。
【０２７６】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との相補性（例えば、部分または完全相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との完全相補性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との相補性（例えば、部分または完全相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との完全相補性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１、２、もしくは３つのヌクレオチド置換、末端付加、および／またはトランケーションを除きｍｉＲＮＡ配列との完全相補性を有する。
【０２７７】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同一の長さである。他の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡよりも５’末端、３’末端、またはその両方において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、対応するマイクロＲＮＡよりも５’末端、３’末端、またはその両方において２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然として、ｍｉＲＮＡ結合部位の１つ以上を取り込むｍＲＮＡを分解し、またはｍＲＮＡの翻訳を防止し得る。
【０２７８】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ダイサーを含有する活性ＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態において、ＲＩＳＣ中の対応するｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の結合は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡを分解し、またはｍＲＮＡの翻訳を防止する。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドを開裂するようにｍｉＲＮＡとの十分な相補性を有する。他の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドの不安定性を誘導するように不完全な相補性を有する。別の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドの転写を抑制するように不完全な相補性を有する。
【０２７９】
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のミスマッチを有する。
一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、それぞれ、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続ヌクレオチドに相補的な少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続ヌクレオチドを有する。
【０２８０】
本開示のポリリボヌクレオチド中に１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を遺伝子操作することにより、対象のｍｉＲＮＡが利用可能である限り、分解または翻訳低減のためにポリリボヌクレオチドを標的化することができる。これは、ポリリボヌクレオチドの送達時の標的外効果を低減させ得る。例えば、本開示のポリリボヌクレオチドを組織または細胞に送達するのではなく、そこで役割を終えることを意図する場合、組織または細胞中で豊富なｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位がポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲ中に遺伝子操作されている場合に目的の遺伝子の発現を阻害し得る。
【０２８１】
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、それらが天然に発生するポリリボヌクレオチド配列から除去して特異的組織中でのタンパク質発現を増加させることができる。例えば、特異的ｍｉＲＮＡについての結合部位をポリリボヌクレオチドから除去してｍｉＲＮＡを含有する組織または細胞中でのタンパク質発現を改善することができる。
【０２８２】
一実施形態において、本開示のポリリボヌクレオチドは、特異的細胞、例えば、限定されるものではないが、正常および／または癌性細胞に細胞毒性または細胞保護ｍＲＮＡ治療薬を指向するための５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。別の実施形態において、本開示のポリリボヌクレオチドは、特異的細胞、例えば、限定されるものではないが、正常および／または癌性細胞に細胞毒性または細胞保護ｍＲＮＡ治療薬を指向するための５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
【０２８３】
複数の組織中での発現の調節は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去を介して達成することができる。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するか挿入するかの判定は、疾患におけるｍｉＲＮＡ発現パターンおよび／またはそれらのプロファイリングに基づいて行うことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、ならびにそれらの発現パターンおよび生物学における役割の同定が報告されている（例えば、ボナウアー（Ｂｏｎａｕｅｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ターゲッツ（Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ）、２０１０年、第１１巻、ｐ．９４３〜９４９；アナンド（Ａｎａｎｄ）およびチェレッシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１〜１７６；コントレラス（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ）およびラオ（Ｒａｏ）著、ルーキーミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、２０１２年、第２６巻、ｐ．４０４〜４１３（２０１１年、１２月２０日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）著、セル（Ｃｅｌｌ）、２００９年、第１３６巻、ｐ．２１５〜２３３；ランドグラフ（Ｌａｎｄｇｒａｆ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、２００７年、第１２９巻、ｐ．１４０１〜１４１４；ゲントナー（Ｇｅｎｔｎｅｒ）およびナルディニ（Ｎａｌｄｉｎｉ）著、ティシュー・アンティゲンズ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ）、２０１２年、第８０巻、ｐ．３９３〜４０３ならびにそれらにおける全ての参照文献（それらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる））。
【０２８４】
ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ結合部位は、任意の公知の配列、例として米国特許出願公開第２０１４／０２００２６１号明細書、同第２００５／０２６１２１８号明細書、および同第２００５／００５９００５号明細書（それらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載の非限定的な例に対応し得る。
【０２８５】
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、それによりタンパク質発現を調節することが公知である組織の例としては、限定されるものではないが、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられる。
【０２８６】
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などにおいて示差的に発現されることが公知である。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子療法および組織／臓器移植後の不所望な免疫応答に関与する。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化およびアポトーシスの多くの局面も調節する。例えば、ｍｉＲ−１４２およびｍｉＲ−１４６は、もっぱら免疫細胞中でのみ発現され、特に骨髄樹状細胞中で豊富である。ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答は、ポリリボヌクレオチドの３’−ＵＴＲにｍｉＲ−１４２結合部位を付加することにより遮断することができ、組織および細胞中でのより安定な遺伝子移動を可能とすることが実証されている。ｍｉＲ−１４２は、抗原提示細胞中で外因性ポリリボヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入された細胞の細胞毒性排除を抑制する（例えば、アンノニ  Ａ（Ａｎｎｏｎｉ  Ａ）ら著、ブラッド（ｂｌｏｏｄ）、２００９年、第１１４巻、ｐ．５１５２〜５１６１；ブラウン  ＢＤ（Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ）ら著、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ  ｍｅｄ．）、２００６年、第１２巻（５）、ｐ．５８５〜５９１；ブラウン  ＢＤ（Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ）ら著、ブラッド（ｂｌｏｏｄ）、２００７年、第１１０巻（１３）、ｐ．４１４４〜４１５２（それらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる））。
【０２８７】
抗原媒介免疫応答は、生物体に流入した場合、抗原提示細胞によりプロセシングされ、抗原提示細胞の表面上でディスプレイされる外来抗原によりトリガーされる免疫応答を指し得る。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識し、抗原を発現する細胞の細胞毒性排除を誘導し得る。
【０２８８】
本開示のポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ中へのｍｉＲ−１４２結合部位の導入は、ｍｉＲ−１４２媒介分解を介して抗原提示細胞中での遺伝子発現を選択的に抑制し得、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）中での抗原提示を制限し、それによりポリリボヌクレオチドの送達後の抗原媒介免疫応答を防止する。次いで、ポリリボヌクレオチドは、細胞毒性排除をトリガーせずに標的組織または細胞中で安定的に発現される。
【０２８９】
一実施形態において、免疫細胞、特に抗原提示細胞中で発現されることが公知のｍｉＲＮＡについての結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチド中に遺伝子操作してｍｉＲＮＡ媒介ＲＮＡ分解を介して抗原提示細胞中でのポリリボヌクレオチドの発現を抑制し、抗原媒介免疫応答を抑えることができる。ポリリボヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現されない非免疫細胞中で維持される。例えば、一部の実施形態において、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を防止するため、任意のｍｉＲ−１２２結合部位を除去することができ、ｍｉＲ−１４２（および／またはｍｉｒＲ−１４６）結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ中に遺伝子操作することができる。
【０２９０】
ＡＰＣおよびマクロファージ中での選択的分解および抑制をさらにドライブするため、本開示のポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ中のさらなる負調節エレメントを単独でまたはｍｉＲ−１４２および／もしくはｍｉＲ−１４６結合部位との組合せのいずれかで含み得る。非限定的な例として、さらなる負調節エレメントは、構成的崩壊エレメント（ＣＤＥ：Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｄｅｃａｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）である。
【０２９１】
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｈｓａ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−１−−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２−−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７９、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４７ａ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１９７−３ｐ、ｍｉＲ−１９７−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９０９、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３１−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５４２、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｊ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、およびｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられる。さらに、新規ｍｉＲＮＡは、免疫細胞中でマイクロアレイハイブリダイゼーションおよびミクロトーム分析（例えば、ジマ  ＤＤ（Ｊｉｍａ  ＤＤ）ら著、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２０１０年、第１１６巻、ｅ１１８〜ｅ１２７；バズ  Ｃ（Ｖａｚ  Ｃ）ら著、バイオメド・セントラル・ゲノミクス（ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、２０１０年、第１１巻、ｐ．２８８（それらのそれぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる））を介して同定することができる。
【０２９２】
肝臓中で発現されることが公知のｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１２２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２２８−５ｐ、ｍｉＲ−１２４９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０３、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−５８１、ｍｉＲ−９３９−３ｐ、およびｍｉＲ−９３９−５ｐが挙げられる。任意の肝臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドに導入し、またはそれから除去して肝臓中でのポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらには本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組合せで遺伝子操作することができる。
【０２９３】
肺中で発現されることが公知のｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３８１−３ｐ、およびｍｉＲ−３８１−５ｐが挙げられる。任意の肺特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドに導入し、またはそれから除去して肺中でのポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。肺特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらには本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組合せで遺伝子操作することができる。
【０２９４】
心臓中で発現されることが公知のｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、およびｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられる。任意の心臓特異的マイクロＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドに導入し、またはそれから除去して心臓中でのポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらには本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組合せで遺伝子操作することができる。
【０２９５】
神経系中で発現されることが公知のｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３６６６、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１０、ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５７１、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９−３ｐ、およびｍｉＲ−９−５ｐが挙げられる。神経系中で豊富なｍｉＲＮＡとしては、ニューロン中で特異的に発現されるもの、例として、限定されるものではないが、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−３２０ｅ、ｍｉＲ−３２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−９２２ならびにグリア細胞中で特異的に発現されるもの、例として、限定されるものではないが、ｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｍｉＲ−３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、およびｍｉＲ−６５７がさらに挙げられる。任意のＣＮＳ特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドに導入し、またはそれから除去して神経系中でのポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらには本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組合せで遺伝子操作することができる。
【０２９６】
膵臓中で発現されることが公知のｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｍｉＲ−１０５−３ｐ、ｍｉＲ−１０５−５ｐ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、およびｍｉＲ−９４４が挙げられる。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドに導入し、またはそれから除去して膵臓中でのポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらには本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組合せで遺伝子操作することができる。
【０２９７】
腎臓中で発現されることが公知のｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、およびｍｉＲ−５６２が挙げられる。任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドに導入し、またはそれから除去して腎臓中でのポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらには本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組合せで遺伝子操作することができる。
【０２９８】
筋肉中で発現されることが公知のｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、およびｍｉＲ−２５−５ｐが挙げられる。任意の筋肉特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドに導入し、またはそれから除去して筋肉中でのポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらには本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組合せで遺伝子操作することができる。
【０２９９】
ｍｉＲＮＡは、異なるタイプの細胞、例えば、限定されるものではないが、内皮細胞、上皮細胞、および脂肪細胞中でも示差的に発現される。
内皮細胞中で発現されることが公知のｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２３６−３ｐ、ｍｉＲ−１２３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、およびｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられる。多くの新規ｍｉＲＮＡは、内皮細胞中でディープシーケンシング分析から発見される（例えば、ボエレンクル  Ｃ（Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ  Ｃ）ら著、ＲＮＡ、２０１２年、第１８巻、ｐ．４７２〜４８４（参照により全体として本明細書に組み込まれる））。任意の内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドに導入し、またはそれから除去して内皮細胞中でのポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。
【０３００】
上皮細胞中で発現されることが公知のｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−８０２およびｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ−３ｐ、呼吸線毛上皮細胞中で特異的なｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、肺上皮細胞中で特異的なｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３８２−３ｐ、腎臓上皮細胞中で特異的なｍｉＲ−３８２−５ｐ、および角膜上皮細胞中で特異的なｍｉＲ−７６２が挙げられる。任意の上皮細胞特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドに導入し、またはそれから除去して上皮細胞中でのポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。
【０３０１】
さらに、ｍｉＲＮＡの大きいグループが胚性幹細胞中で豊富であり、幹細胞自己再生、ならびに種々の細胞系統、例えば神経細胞、心臓細胞、造血細胞、皮膚細胞、骨形成原細胞および筋細胞の発生および／または分化を制御する（例えば、クップサミー  ＫＴ（Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ＫＴ）ら著、カレント・モレキュラー・メディシン（Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ）、２０１３年、第１３巻（５）、ｐ．７５７〜７６４；ビディガル  ＪＡ（Ｖｉｄｉｇａｌ  ＪＡ）およびベンチュラ  Ａ（Ｖｅｎｔｕｒａ  Ａ）著、セミナーズ・イン・キャンサー・バイオロジー（Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．）、２０１２年、第２２巻（５〜６）、ｐ．４２８〜４３６；ゴフ  ＬＡ（Ｇｏｆｆ  ＬＡ）ら著、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ）、２００９年、第４巻、ｅ７１９２；モリン  ＲＤ（Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ）ら著、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ）、２００８年、第１８巻、ｐ．６１０〜６２１；ヨウ  ＪＫ（Ｙｏｏ  ＪＫ）ら著、ステム・セルズ・アンド・ディベロップメント（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．）、２０１２年、第２１巻（１１）、ｐ．２０４９〜２０５７（それらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる））。胚性幹細胞中で豊富なｍｉＲＮＡとしては、限定されるものではないが、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１５４−３ｐ、ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｅ、ｍｉＲ−３６７−３ｐ、ｍｉＲ−３６７−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−５４８ｌ、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−９６−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐおよびｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられる。多くの予測新規ｍｉＲＮＡは、ディープシーケンシングによりヒト胚性幹細胞中で発見される（例えば、モリン  ＲＤ（Ｍｏｒｉ��  ＲＤ）ら著、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ）、２００８年、第１８巻、ｐ．６１０〜６２１；ゴフ  ＬＡ（Ｇｏｆｆ  ＬＡ）ら著、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ）、２００９年、第４巻、ｅ７１９２；バール  Ｍ（Ｂａｒ  Ｍ）ら著、ステム・セルズ（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、２００８年、第２６巻、ｐ．２４９６〜２５０５（それらのそれぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる））。
【０３０２】
一実施形態において、胚性幹細胞特異的ｍｉＲＮＡの結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドの３’ＵＴＲ中に含め、またはそれから除去して胚性幹細胞の発生および／もしくは分化をモジュレートし、変性病態（例えば、変性疾患）における幹細胞の老化を阻害し、または疾患病態（例えば、癌幹細胞）における幹細胞の老化およびアポトーシスを刺激することができる。
【０３０３】
種々の癌細胞／組織および他の疾患におけるｍｉＲＮＡの示差的発現をプロファイリングするために多くのｍｉＲＮＡ発現研究が実施されている。一部のｍｉＲＮＡは、ある癌細胞中では異常に過剰発現され、他の癌細胞中では過小発現される。例えば、ｍｉＲＮＡは、癌細胞（国際公開第２００８／１５４０９８号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／００５９０１５号明細書、米国特許出願公開第２０１３／００４２３３３号明細書、国際公開第２０１１／１５７２９４号パンフレット）；癌幹細胞（米国特許出願公開第２０１２／００５３２２４号明細書）；膵臓癌および疾患（米国特許出願公開第２００９／０１３１３４８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１７１６４６号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０２８６２３２号明細書、米国特許第８３８９２１０号明細書）；喘息および炎症（米国特許第８４１５０９６号明細書）；前立腺癌（米国特許出願公開第２０１３／００５３２６４号明細書）；肝細胞癌腫（国際公開第２０１２／１５１２１２号パンフレット、米国特許出願公開第２０１２／０３２９６７２号明細書、国際公開第２００８／０５４８２８号パンフレット、米国特許第８２５２５３８号明細書）；肺癌細胞（国際公開第２０１１／０７６１４３号パンフレット、国際公開第２０１３／０３３６４０号パンフレット、国際公開第２００９／０７０６５３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１０／０３２３３５７号明細書）；皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（国際公開第２０１３／０１１３７８号パンフレット）；結腸直腸癌細胞（国際公開第２０１１／０２８１７５６号明細書、国際公開第２０１１／０７６１４２号明細書）；癌陽性リンパ節（国際公開第２００９／１００４３０号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０２６３８０３号明細書）；上咽頭癌（欧州特許第２１１２２３５号明細書）；慢性閉塞性肺疾患（米国特許出願公開第２０１２／０２６４６２６号明細書、米国特許出願公開第２０１３／００５３２６３号明細書）；甲状腺癌（国際公開第２０１３／０６６６７８号パンフレット）；卵巣癌細胞（米国特許出願公開第２０１２／０３０９６４５号明細書、国際公開第２０１１／０９５６２３号パンフレット）；乳癌細胞（国際公開第２００８／１５４０９８号パンフレット、国際公開第２００７／０８１７４０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１２／０２１４６９９号明細書）、白血病およびリンパ腫（国際公開第２００８／０７３９１５号パンフレット、米国特許出願公開第２００９／００９２９７４号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０３１６０８１号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０２８３３１０号明細書、国際公開第２０１０／０１８５６３号パンフレット（それらのそれぞれの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる））において示差的に発現される。
【０３０４】
非限定的な例として、ある癌および／または腫瘍細胞中で過剰発現されるｍｉＲＮＡについてのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドの３’ＵＴＲから除去することができ、癌細胞中で過剰発現されるｍｉＲＮＡにより抑制される発現を回復させ、したがって、対応する生物学的機能、例えば転写刺激および／または抑制、細胞周期停止、アポトーシスおよび細胞死を良化させる。ｍｉＲＮＡ発現が上方調節されない正常細胞および組織は、影響を受けないままである。
【０３０５】
ｍｉＲＮＡは、複雑な生物学的プロセス、例えば血管新生も調節し得る（例えば、ｍｉＲ−１３２）（アナンド（Ａｎａｎｄ）およびチェレッシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１〜１７６）。本開示のポリリボヌクレオチドにおいて、そのようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位は、除去するかまたは導入してポリリボヌクレオチドの発現を生物学的に関連する細胞タイプまたは関連する生物学的プロセスに合わせることができる。これに関して、本開示のポリリボヌクレオチドは、栄養要求性ポリリボヌクレオチドとして定義される。
【０３０６】
ステムループ
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ステムループ、例えば、限定されるものではないが、ヒストンステムループを含み得る。ステムループは、約２５または約２６ヌクレオチド長であるヌクレオチド配列、例えば、限定されるものではないが、国際特許出願公開の国際公開第２０１３／１０３６５９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものであり得る。ヒストンステムループは、コード領域に対して３’で（例えば、コード領域の３’−末端に）局在させることができる。非限定的な例として、ステムループは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの３’−末端に局在させることができる。一部の場合、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、２つ以上のステムループ（例えば、２つのステムループ）を含む。ステムループ配列の例は、国際特許出願公開の国際公開第２０１２／０１９７８０号パンフレットおよび国際公開第２０１５０２６６７号パンフレット（そのステムループ配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の例において、ポリヌクレオチドは、ステムループ配列ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号１）を含む。他の例において、ポリヌクレオチドは、ステムループ配列ＣＡＡＡＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号２）を含む。
【０３０７】
ステムループは、ポリヌクレオチドの第２の末端領域中に局在させることができる。非限定的な例として、ステムループは、第２の末端領域中の非翻訳領域（例えば、３’−ＵＴＲ）内に局在させることができる。
【０３０８】
一部の場合、ヒストンステムループを含むポリヌクレオチド、例えば、限定されるものではないが、ｍＲＮＡは、３’−安定化領域（例えば、少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドを含む３’−安定化領域）の付加により安定化させることができる。理論により拘束されるものではないが、少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドの付加は、ポリヌクレオチドの分解を減速させ得、したがってポリヌクレオチドの半減期を増加させ得る。
【０３０９】
他の場合、ヒストンステムループを含むポリヌクレオチド、例えば、限定されるものではないが、ｍＲＮＡは、オリゴ（Ｕ）の付加を防止し、および／または阻害し得るポリヌクレオチドの３’−領域の変更により安定化させることができる（例えば、国際特許出願公開の国際公開第２０１３／１０３６５９号パンフレットを参照されたい）。
【０３１０】
さらに他の場合、ヒストンステムループを含むポリヌクレオチド、例えば、限定されるものではないが、ｍＲＮＡは、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド３’−Ｏ−メチルヌクレオシド、３’−Ｏ−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシド、ならびに当技術分野において公知の、および／または本明細書に記載の他の代替ヌクレオシドで終結するオリゴヌクレオチドの付加により安定化させることができる。
【０３１１】
一部の例において、本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループ、ポリ−Ａ領域、および／または５’−キャップ構造を含み得る。ヒストンステムループは、ポリ−Ａ領域の前および／または後に存在し得る。ヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域配列を含むポリヌクレオチドは、本明細書に記載の鎖終結ヌクレオシドを含み得る。
【０３１２】
他の例において、本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループおよび５’−キャップ構造を含み得る。５’−キャップ構造としては、限定されるものではないが、本明細書に記載のものおよび／または当技術分野において公知のものを挙げることができる。
【０３１３】
一部の場合、保存ステムループ領域は、本明細書に記載のｍｉＲ配列を含み得る。非限定的な例として、ステムループ領域は、本明細書に記載のｍｉＲ配列のシード配列を含み得る。別の非限定的な例として、ステムループ領域は、ｍｉＲ−１２２シード配列を含み得る。
【０３１４】
ある例において、保存ステムループ領域は、本明細書に記載のｍｉＲ配列を含み得、ＴＥＥ配列も含み得る。
一部の場合、ｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の取り込みは、ステムループ領域の形状を変化させ、それが翻訳を増加させ、および／または減少させ得る（例えば、ケッデ（Ｋｅｄｄｅ）ら著、「ｐ２７−３’ＵＴＲ中のプミリオ誘導ＲＮＡ構造スイッチは、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２のアクセス性を制御する（Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３’ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ」）、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０年（参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０３１５】
ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルを含み得る。少なくとも１つのヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列の非限定的な例は、国際特許出願公開の国際公開第２０１３／１２０４９７号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０６２９号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０５００号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０６２７号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０４９８号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０６２６号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０４９９号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１２０６２８号パンフレット（それらのそれぞれの配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ある場合、ヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、病原体抗原またはその断片をコードし得、例えば国際特許出願公開の国際公開第２０１３／１２０４９９号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１２０６２８号パンフレット（それらの両方の配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のポリヌクレオチド配列である。他の場合、ヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、治療タンパク質をコードし得、例えば国際特許出願公開の国際公開第２０１３／１２０４９７号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１２０６２９号パンフレット（それらの両方の配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のポリヌクレオチド配列である。一部の場合、ヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、腫瘍抗原またはその断片をコードし得、例えば国際特許出願公開の国際公開第２０１３／１２０５００号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１２０６２７号パンフレット（それらの両方の配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のポリヌクレオチド配列である。他の場合、ヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、アレルギー性抗原または自己免疫自己抗原をコードし得、例えば国際特許出願公開の国際公開第２０１３／１２０４９８号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１２０６２６号パンフレット（それらの両方の配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のポリヌクレオチド配列である。
【０３１６】
ポリ−Ａ領域
ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリＡ配列および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリＡ配列は、全体的にまたは大部分がアデニンヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体からなり得る。ポリＡ配列は、核酸の３’非翻訳領域に隣接して局在するテールであり得る。
【０３１７】
ＲＮＡプロセシング中、アデノシンヌクレオチドの長鎖（ポリ−Ａ領域）は、通常、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に付加されて分子の安定性が増加する。転写直後、転写物の３’−末端は、遊離３’−ヒドロキシに開裂される。次いで、ポリ−Ａポリメラーゼがアデノシンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。このプロセスは、ポリアデニル化と呼ばれ、１００〜２５０残基長のポリ−Ａ領域を付加する。
【０３１８】
ユニークなポリ−Ａ領域長は、ある利点を本開示の代替ポリヌクレオチドに提供し得る。
一般に、本開示のポリ−Ａ領域の長さは、少なくとも３０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、ポリ−Ａ領域は、少なくとも３５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも７０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１７００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１９００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。
【０３１９】
一部の例において、ポリ−Ａ領域は、本明細書に記載の代替ポリヌクレオチド分子上で８０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド長であり得る。
他の例において、ポリ−Ａ領域は、本明細書に記載の代替ポリヌクレオチド分子上で２０、４０、８０、１００、１２０、１４０または１６０ヌクレオチド長であり得る。
【０３２０】
一部の場合、ポリ−Ａ領域は、代替ポリヌクレオチド全体の長さに対して設計される。この設計は、代替ポリヌクレオチドのコード領域の長さ、代替ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の特定の特徴部または領域の長さに基づくか、または代替ポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づき得る。代替ポリヌクレオチドの任意の特徴部（例えば、ポリ−Ａ領域を含むｍＲＮＡ部分以外）に対する場合、ポリ−Ａ領域は、追加の特徴部よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％長いことができる。ポリ−Ａ領域は、それが属する代替ポリヌクレオチドの一部分として設計することもできる。これに関して、ポリ−Ａ領域は、構築物の全長またはポリ−Ａ領域を減算した構築物の全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上であり得る。
【０３２１】
ある場合、ポリ−Ａ結合タンパク質のために遺伝子操作された結合部位および／またはポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のコンジュゲーションを使用して発現を向上させることができる。遺伝子操作結合部位は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の局所微小環境のリガンドについての結合部位として作動し得るセンサー配列であり得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ−Ａ結合タンパク質（ＰＡＢＰ：ｐｏｌｙ−Ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）およびその類似体の結合親和性を変更するための少なくとも１つの遺伝子操作結合部位を含み得る。少なくとも１つの遺伝子操作結合部位の取り込みは、ＰＡＢＰおよびその類似体の結合親和性を増加させ得る。
【０３２２】
さらに、複数の区別されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ−Ａ領域の３’−末端における代替ヌクレオチドを使用して３’−末端を介してＰＡＢＰ（ポリ−Ａ結合タンパク質）に一緒に結合させることができる。形質移入実験を関連細胞系において実施することができ、形質移入の１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日後にタンパク質産生をＥＬＩＳＡによりアッセイすることができる。非限定的な例として、形質移入実験を使用して少なくとも１つの遺伝子操作結合部位の付加の結果としてのＰＡＢＰまたはその類似体の結合親和性に対する効果を評価することができる。
【０３２３】
ある場合、ポリ−Ａ領域を使用して翻訳開始をモジュレートすることができる。理論により拘束されるものではないが、ポリ−Ａ領域は、次いで翻訳開始複合体と相互作用し得、したがってタンパク質合成に不可欠であり得るＰＡＢＰをリクルートする。
【０３２４】
ある場合、ポリ−Ａ領域を本開示において使用して３’−５’−エキソヌクレアーゼ消化から保護することもできる。
一部の例において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリＡ−Ｇカルテットを含み得る。Ｇ−カルテットは、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の両方のＧ−リッチ配列により形成され得る４つのグアノシンヌクレオチドの環式水素結合の配列である。この実施形態において、Ｇ−カルテットは、ポリ−Ａ領域の末端に取り込まれる。得られるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、安定性、タンパク質産生および他のパラメータ、例として半減期について種々の時点においてアッセイすることができる。ポリＡ−Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリ−Ａ領域を単独で使用して見られるものの少なくとも７５％と同等のタンパク質産生をもたらすことが発見された。
【０３２５】
一部の場合、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ−Ａ領域を含み得、３’−安定化領域の付加により安定化させることができる。ポリ−Ａ領域を有するポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’−キャップ構造をさらに含み得る。
【０３２６】
他の場合、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ−Ａ−Ｇカルテットを含み得る。ポリ−Ａ−Ｇカルテットを有するポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’−キャップ構造をさらに含み得る。
【０３２７】
一部の場合、ポリ−Ａ領域またはポリ−Ａ−Ｇカルテットを含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を安定化させるために使用することができる３’−安定化領域は、限定されるものではないが、国際特許出願公開の国際公開第２０１３／１０３６５９号パンフレット（そのポリ−Ａ領域およびポリ−Ａ−Ｇカルテットは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものであり得る。他の場合、本開示により使用することができる３’−安定化領域は、鎖終結ヌクレオシド、例えば３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、例えば２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミン、２’−デオキシヌクレオシド、またはＯ−メチルヌクレオシドを含む。
【０３２８】
他の場合、ポリＡ領域またはポリ−Ａ−Ｇカルテットを含むポリヌクレオチド、例えば、限定されるものではないが、ｍＲＮＡは、オリゴ（Ｕ）の付加を予防し、および／または阻害し得るポリヌクレオチドの３’−領域の変更により安定化させることができる（例えば、国際特許出願公開の国際公開第２０１３／１０３６５９号パンフレットを参照されたい）。
【０３２９】
さらに他の例において、ポリ−Ａ領域またはポリ−Ａ−Ｇカルテットを含むポリヌクレオチド、例えば、限定されるものではないが、ｍＲＮＡは、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド３’−Ｏ−メチルヌクレオシド、３’−Ｏ−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシド、ならびに当技術分野において公知のおよび／または本明細書に記載の他の代替ヌクレオシドで終結するオリゴヌクレオチドの付加により安定化させることができる。
【０３３０】
鎖終結ヌクレオシド
核酸は、鎖終結ヌクレオシドを含み得る。例えば、鎖終結ヌクレオシドとしては、糖基の２’および／または３’位においてデオキシ化されたヌクレオシドを挙げることができる。このような種としては、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、ならびに２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、例えば２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、および２’，３’−ジデオキシチミンを挙げることができる。
【０３３１】
他の構成成分
ＬＮＰは、上記セクションに記載のものに加えて１つ以上の構成成分を含み得る。例えば、ＬＮＰは、１つ以上の疎水性小分子、例えばビタミン（例えば、ビタミンＡまたはビタミンＥ）またはステロールを含み得る。
【０３３２】
脂質ナノ粒子は、１つ以上の透過性向上剤分子、炭水化物、ポリマー、表面変更剤、または他の構成成分も含み得る。透過性向上剤分子は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号明細書により記載されている分子であり得る。炭水化物としては、単糖（例えば、グルコース）および多糖（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体および類似体）を挙げることができる。
【０３３３】
ポリマーは、ＬＮＰ中に含め、および／またはＬＮＰを封入し、もしくは部分的に封入するために使用することができる。ポリマーは、生分解性および／または生体適合性であり得る。ポリマーは、限定されるものではないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカルボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレート（ｐｏｌｙａｒｙｌａｔｅ）から選択することができる。例えば、ポリマーとしては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノクリレート、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカルボネート、ポリアルキレン、例えばポリエチレンおよびポロプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアルキレンテレフタレート、例えばポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えばポリ（酢酸ビニル）、ポリハロゲン化ビニル、例えばポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えばポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ならびにそれらのコポリマーおよび混合物、ポリジオキソランおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポロプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、トリメチレンカルボネート、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）（ＰＭＯＸ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ならびにポリグリセロールを挙げることができる。
【０３３４】
表面変更剤としては、限定されるものではないが、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、例えばジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロミド）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、オオヨモギ、ブロメライン、パパイン、クレオデンドラム、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルソリン、チモシンβ４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、およびエルドステイン）、およびＤＮアーゼ（例えば、ｒｈＤＮアーゼ）を挙げることができる。表面変更剤は、ナノ粒子内および／またはＬＮＰの表面上で（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスにより）配置することができる。
【０３３５】
ＬＮＰは、１つ以上の官能化脂質も含み得る。例えば、脂質は、適切な反応条件下でアジドに曝露した場合に環化付加反応を受け得るアルキン基により官能化することができる。特に、脂質二重層は、この様式で膜透過、細胞認識、またはイメージングの容易化において有用な１つ以上の基により官能化することができる。ＬＮＰの表面は、１つ以上の有用な抗体とコンジュゲートすることもできる。標的細胞送達、イメージング、および膜透過において有用な官能基およびコンジュゲートは、当技術分野において周知である。
【０３３６】
これらの構成成分に加えて、脂質ナノ粒子は、医薬組成物において有用な任意の物質を含み得る。例えば、脂質ナノ粒子は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤または副成分、例えば、限定されるものではないが、１つ以上の溶媒、分散媒、希釈剤、分散助剤、懸濁助剤、顆粒化助剤、崩壊剤、充填剤、流動促進剤、液体ビヒクル、結合剤、表面活性剤、等張化剤、増粘または乳化剤、緩衝剤、滑沢剤、油、保存剤、および他の種を含み得る。賦形剤、例えばワックス、バター、着色剤、コーティング剤、香味剤、および着香剤を含めることもできる。薬学的に許容可能な賦形剤は、当技術分野において周知である（例えば、「レミントンの製薬の科学および実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ボルチモア、メリーランド、２００６年を参照されたい）。
【０３３７】
希釈剤の例としては、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉糖、および／またはそれらの組合せを挙げることができる。顆粒化および分散剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘パルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木質製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、および／またはそれらの組合せからなる非限定的なリストから選択することができる。
【０３３８】
表面活性剤および／または乳化剤としては、限定されるものではないが、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド状粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末化セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン［ツイン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ツイン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）６０］、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ツイン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびソルトール（ＳＯＬＵＴＯＬ）（登録商標））、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、クレモホル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、モノラウリル酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー（ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ）（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム、ならびに／またはそれらの組合せを挙げることができる。
【０３３９】
結合剤は、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプンペースト）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然および合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワールガム（ｐａｎｗａｒ  ｇｕｍ）、ガティガム、イサポール外皮（ｉｓａｐｏｌ  ｈｕｓｋ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、およびカラマツアラボガラクタン（ｌａｒｃｈ  ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール；ならびにそれらの組合せ、または任意の他の好適な結合剤であり得る。
【０３４０】
保存剤の例としては、限定されるものではないが、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性保存剤、抗真菌性保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、および／または他の保存剤を挙げることができる。酸化防止剤の例としては、限定されるものではないが、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または亜硫酸ナトリウムが挙げられる。キレート剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。抗菌性保存剤の例としては、限定されるものではないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが挙げられる。抗真菌性保存剤の例としては、限定されるものではないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が挙げられる。アルコール保存剤の例としては、限定されるものではないが、エタノール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、フェノール、フェノール系化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および／またはフェニルエチルアルコールが挙げられる。酸性保存剤の例としては、限定されるものではないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ−カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が挙げられる。他の保存剤の例としては、限定されるものではないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、グリダント・プラス（ＧＬＹＤＡＮＴ  ＰＬＵＳ）（登録商標）、フェノニップ（ＰＨＥＮＯＮＩＰ）（登録商標）、メチルパラベン、ジェルマール（ＧＥＲＭＡＬＬ）（登録商標）１１５、ジェルマーベン（ＧＥＲＭＡＢＥＮ）（登録商標）ＩＩ、ネオロン（ＮＥＯＬＯＮＥ）（商標）、ケーソン（ＫＡＴＨＯＮ）（商標）、および／またはユーキシル（ＥＵＸＹＬ）（登録商標）が挙げられる。
【０３４１】
緩衝剤の例としては、限定されるものではないが、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプチン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、アミノスルホン酸緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、および／またはそれらの組合せが挙げられる。滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの組合せからなる非限定的な群から選択することができる。
【０３４２】
油の例としては、限定されるものではないが、アーモンド油、杏仁油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、クロフサスグリ種子油、ルリジサ油、ジュニパータール油、カモミール油、キャノーラ油、カラウェー油、カルナバ油、ヒマシ油、桂皮油、ココアバター油、ココナッツ油、タラの肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、月見草油、魚油、アマニ油、ゲラニオール油、ヒョウタン油、ブドウ種子油、ヘーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル油、ホホバ油、ククイナッツ油、ラバンジン油、ラベンダー油、レモン油、リツェアクベバ油、マカダミアナッツ油、ゼニアオイ油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、桃仁油、ピーナッツ油、ケシ油、カボチャ種子油、菜種油、米糠油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サザンカ油、セボリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター油、シリコーン油、大豆油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチベル油、胡桃油、および小麦胚芽油、ならびにステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、シメチコン、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
【０３４３】
製剤
本開示の製剤は、両親媒性ポリマーと、例えば脂質ナノ粒子の安定性を増加させるための少なくとも１つの脂質ナノ粒子構成成分とを含む。脂質ナノ粒子は、脂質構成成分および１つ以上の追加の構成成分、例えば治療薬および／または予防薬を含み得る。ＬＮＰは、１つ以上の規定の用途または標的について設計することができる。ＬＮＰの要素は、特定の用途もしくは標的に基づいて、および／または１つ以上の要素の効力、毒性、費用、使用容易性、利用可能性、もしくは他の特徴に基づいて選択することができる。同様に、ＬＮＰの特定の製剤は、例えば、要素の特定の組合せの効力および毒性に従って特定の用途または標的について選択することができる。ＬＮＰ製剤の効力および寛容性は、製剤の安定性により影響を受け得る。
【０３４４】
ある実施形態において、製剤中の両親媒性ポリマーの濃度は、例えば、冷凍または凍結乾燥前に約そのＣＭＣ〜ＣＭＣの約３０倍（例えば、そのＣＭＣの最大約２５倍、約２０倍、約１５倍、約１０倍、約５倍、または約３倍）の範囲である。
【０３４５】
ある実施形態において、両親媒性ポリマーとＬＮＰとの重量比は、約０．０００４：１〜約１００：１（例えば、約０．００１：１〜約１０：１、約０．００１：１〜約５：１、約０．００１：１〜約０．１：１、約０．００５〜約０．４：１、または約０．５：１〜約４：１、約０．０５：１〜約５：１、約０．１：１〜約５：１、または約０．０５：１〜約２．５：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約５０：１、または約１：１〜約２５：１）である。
【０３４６】
ＬＮＰの脂質構成成分は、例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による脂質、リン脂質（例えば、不飽和脂質、例えばＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）、ＰＥＧ脂質、および構造脂質を含み得る。ＬＮＰの脂質構成成分は、例えば式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による脂質、リン脂質（例えば、不飽和脂質、例えばＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）、および構造脂質を含み得る。脂質構成成分の要素は、規定の分率で提供することができる。
【０３４７】
一部の実施形態において、ＬＮＰの脂質構成成分は、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による脂質、リン脂質、ＰＥＧ脂質、および構造脂質を含む。ある実施形態において、脂質ナノ粒子の脂質構成成分は、約３０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％の式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）の化合物、約０ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％のリン脂質、約１８．５ｍｏｌ％〜約４８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約０ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含み、但し、合計ｍｏｌ％は、１００％を超過しない。一部の実施形態において、脂質ナノ粒子の脂質構成成分は、約３５ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％の式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）の化合物、約５ｍｏｌ％〜約２５ｍｏｌ％のリン脂質、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％の構造脂質、および約０ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態において、脂質構成成分は、約５０ｍｏｌ％の前記化合物、約１０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。別の特定の実施形態において、脂質構成成分は、約４０ｍｏｌ％の前記化合物、約２０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む。一部の実施形態において、リン脂質は、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣであり得る。他の実施形態において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧであり得、および／または構造脂質は、コレステロールであり得る。
【０３４８】
脂質ナノ粒子は、１つ以上の規定の用途または標的について設計することができる。例えば、ＬＮＰは、治療薬および／または予防薬、例えばＲＮＡを哺乳動物体内の特定の細胞、組織、臓器、またはそれらの系もしくは群に送達するように設計することができる。脂質ナノ粒子の物理化学的特性は、特定の身体標的についての選択性を増加させるように変更することができる。例えば、粒子サイズは、異なる臓器の有窓サイズに基づいて調整することができる。ＬＮＰ中に含まれる治療薬および／または予防薬は、１つまたは複数の所望の送達標的に基づいて選択することもできる。例えば、治療薬および／または予防薬は、特定の適応症、病態、疾患、もしくは障害について、および／または特定の細胞、組織、臓器、もしくはそれらの系もしくは群への送達（例えば、局在化または特異的送達）について選択することができる。ある実施形態において、ＬＮＰは、目的のポリペプチドを産生するための細胞内で翻訳され得る目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含み得る。このような組成物は、特定の臓器に特異的に送達されるように設計することができる。一部の実施形態において、組成物は、哺乳動物肝臓に特異的に送達されるように設計することができる。
【０３４９】
ＬＮＰ中の治療薬および／または予防薬の量は、脂質ナノ粒子のサイズ、組成、所望の標的および／もしくは用途、または他の特性ならびに治療薬および／または予防薬の特性に依存し得る。例えば、ＬＮＰにおいて有用なＲＮＡの量は、ＲＮＡのサイズ、配列、および他の特徴に依存し得る。ＬＮＰ中の治療薬および／または予防薬ならびに他の要素（例えば、脂質）の相対量も変動し得る。一部の実施形態において、ＬＮＰ中の脂質構成成分と治療薬および／または予防薬とのｗｔ／ｗｔ比は、約５：１〜約６０：１、例えば５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、および６０：１であり得る。例えば、脂質構成成分と治療薬および／または予防薬とのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１〜約４０：１であり得る。ある実施形態において、ｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１である。ＬＮＰ中の治療薬および／または予防薬の量は、例えば、吸収分光光度法（例えば、紫外線−可視光分光光度法）を使用して計測することができる。
【０３５０】
一部の実施形態において、ＬＮＰは１つ以上のＲＮＡを含み、１つ以上のＲＮＡ、脂質、およびそれらの量は、規定のＮ：Ｐ比を提供するように選択することができる。組成物のＮ：Ｐ比は、１つ以上の脂質中の窒素原子と、ＲＮＡ中のホスフェート基の数とのモル比を指す。一般に、より低いＮ：Ｐ比が好ましい。１つ以上のＲＮＡ、脂質、およびそれらの量は、約２：１〜約３０：１、例えば２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１のＮ：Ｐ比を提供するように選択することができる。ある実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約２：１〜約８：１であり得る。他の実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約５：１〜約８：１である。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約５．０：１、約５．５：１、約５．６７：１、約６．０：１、約６．５：１、または約７．０：１であり得る。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１であり得る。
【０３５１】
一部の実施形態において、両親媒性ポリマーおよびＬＮＰを含む製剤は、塩、例えば塩化物塩をさらに含み得る。
一部の実施形態において、両親媒性ポリマーおよびＬＮＰを含む製剤は、糖、例えば二糖をさらに含み得る。一部の実施形態において、製剤は、糖をさらに含むが、塩、例えば塩化物塩を含まない。
【０３５２】
物理的特性
ＬＮＰの特徴は、その構成成分に依存し得る。例えば、構造脂質としてコレステロールを含むＬＮＰは、異なる構造脂質を含むＬＮＰと異なる特徴を有し得る。同様に、ＬＮＰの特徴は、その構成成分の絶対または相対量に依存し得る。例えば、より高いモル分率のリン脂質を含むＬＮＰは、より低いモル分率のリン脂質を含むＬＮＰと異なる特徴を有し得る。特徴は、脂質ナノ粒子の調製の方法および条件によっても変動し得る。
【０３５３】
脂質ナノ粒子は、種々の方法により特徴付けすることができる。例えば、顕微鏡観察（例えば、透過型電子顕微鏡観察または走査型電子顕微鏡観察）を使用してＬＮＰの形態およびサイズ分布を試験することができる。動的光散乱または電位差測定（例えば、電位差滴定）を使用してゼータ電位を計測することができる。動的光散乱を利用して粒子サイズを測定することもできる。機器、例えばゼータサイザ・ナノＺＳ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）（マルバーン・インスツルメンツ社（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）、マルバーン、ウスターシャ、英国）を使用してＬＮＰの複数の特徴、例えば粒子サイズ、多分散指数、およびゼータ電位を計測することもできる。
【０３５４】
ＬＮＰの平均サイズは、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）により計測して数十ｎｍ〜数百ｎｍであり得る。例えば、平均サイズは、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、例えば約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍであり得る。一部の実施形態において、ＬＮＰの平均サイズは、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、または約９０ｎｍ〜約１００ｎｍであり得る。ある実施形態において、ＬＮＰの平均サイズは、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍであり得る。特定の実施形態において、平均サイズは、約８０ｎｍであり得る。他の実施形態において、平均サイズは、約１００ｎｍであり得る。
【０３５５】
ＬＮＰは、相対的に均一であり得る。多分散指数を使用してＬＮＰの均一性、例えば脂質ナノ粒子の粒子サイズ分布を示すことができる。小さい（例えば、０．３未満）多分散指数は、一般に、狭い粒子サイズ分布を示す。ＬＮＰは、約０〜約０．２５、例えば０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５の多分散指数を有し得る。一部の実施形態において、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０〜約０．２０であり得る。
【０３５６】
ＬＮＰのゼータ電位を使用して組成物の運動電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を説明し得る。相対的に低い正または負電荷を有する脂質ナノ粒子が一般に所望される。なぜなら、より高荷電の種は、体内の細胞、組織、および他の要素と不所望に相互作用し得るためである。一部の実施形態において、ＬＮＰのゼータ電位は、約−１０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約−５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ〜約＋１０ｍＶであり得る。
【０３５７】
治療薬および／または予防薬の封入の効率は、提供される初回量に対する、調製後に封入され、またはそうでなければＬＮＰと会合する治療薬および／または予防薬の量を説明する。封入効率は、高いことが望ましい（例えば、１００％に近い）。封入効率は、例えば、１つ以上の有機溶媒または洗浄剤による脂質ナノ粒子の破壊の前後で、脂質ナノ粒子を含有する溶液中の治療薬および／または予防薬の量を比較することにより計測することができる。蛍光を使用して溶液中の遊離治療薬および／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）の量を計測することができる。本明細書に記載の脂質ナノ粒子について、治療薬および／または予防薬の封入効率は、少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。一部の実施形態において、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある実施形態において、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。
【０３５８】
ＬＮＰは、任意選択的に、１つ以上のコーティングを含み得る。例えば、ＬＮＰは、コーティングを有するカプセル剤、フィルム剤、または錠剤中で製剤化することができる。本明細書に記載の組成物を含むカプセル剤、フィルム剤、または錠剤は、任意の有用なサイズ、引張強度、硬度、または密度を有し得る。
【０３５９】
医薬組成物
両親媒性ポリマーおよび脂質ナノ粒子を含む製剤は、医薬組成物として全体的または部分的に製剤化することができる。医薬組成物は、１つ以上の両親媒性ポリマーおよび１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。例えば、医薬組成物は、１つ以上の両親媒性ポリマーと、１つ以上の異なる治療薬および／または予防薬を含む１つ以上の脂質ナノ粒子とを含み得る。医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤または副成分、例えば本明細書に記載のものをさらに含み得る。医薬組成物および薬剤の製剤化および製造のための一般的指針は、例えば、レミントンの製薬の科学および実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、ボルチモア、メリーランド、２００６年において利用可能である。慣用の賦形剤および副成分は、任意の慣用の賦形剤または副成分が本開示の製剤中のＬＮＰの１つ以上の構成成分または１つ以上の両親媒性ポリマーと不適合性であり得る場合を除き、任意の医薬組成物において使用することができる。賦形剤または副成分は、構成成分または両親媒性ポリマーとのその組合せが任意の不所望な生物学的効果またはそうでなければ有害効果をもたらし得る場合、ＬＮＰの構成成分または製剤の両親媒性ポリマーと不適合性であり得る。
【０３６０】
一部の実施形態において、１つ以上の賦形剤または副成分は、ＬＮＰを含む医薬組成物の総質量または容量の５０％超を構成し得る。例えば、１つ以上の賦形剤または副成分は、医薬慣習の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上を構成し得る。一部の実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。一部の実施形態において、賦形剤は、ヒトにおける使用および獣医学的使用に承認される。一部の実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局により承認される。一部の実施形態において、賦形剤は、医薬グレードである。一部の実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ：Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、欧州薬局方（ＥＰ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の規格を満たす。
【０３６１】
本開示による医薬組成物中の１つ以上の両親媒性ポリマー、１つ以上の脂質ナノ粒子、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象のアイデンティティ、サイズ、および／または状態に応じて、ならびにさらに組成物を投与すべき経路に応じて変動する。例として、医薬組成物は、０．１％〜１００％（ｗｔ／ｗｔ）の１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。別の例として、医薬組成物は、０．１％〜１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の１つ以上の両親媒性ポリマー（例えば、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、または１２．５％ｗ／ｖ）を含み得る。
【０３６２】
ある実施形態において、本開示の脂質ナノ粒子および／または医薬組成物は、貯蔵または発送のために冷蔵または冷凍される（例えば、４℃以下の温度において、例えば約−１５０℃〜約０℃または約−８０℃〜約−２０℃（例えば、約−５℃、−１０℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃、−１３０℃または−１５０℃）の温度において貯蔵される。例えば、１つ以上の両親媒性ポリマーおよび１つ以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、貯蔵および／または発送のために、例えば約−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、または−８０℃において冷蔵される溶液または固体（例えば、凍結乾燥を介する）である。ある実施形態において、本開示はまた、有効量の両親媒性ポリマーを添加することにより、ならびに４℃以下の温度、例えば約−１５０℃〜約０℃または約−８０℃〜約−２０℃、例えば約−５℃、−１０℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃、−１３０℃または−１５０℃）の温度において脂質ナノ粒子および／またはその医薬組成物を貯蔵することにより脂質ナノ粒子の安定性を増加させる方法に関する。
【０３６３】
脂質ナノ粒子および／または１つ以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、任意の患者または対象、例として１つ以上の特定の細胞、組織、臓器、またはその系もしくは群、例えば腎臓系への治療薬および／または予防薬の送達により提供される治療効果から利益を受け得る患者または対象に投与することができる。脂質ナノ粒子および脂質ナノ粒子を含む医薬組成物の本明細書に提供される説明は、主にヒトへの投与に好適な組成物を対象とするが、そのような組成物は、一般に、任意の他の哺乳動物への投与に好適であることが当業者により理解される。組成物を種々の動物への投与に好適なものとするためのヒトへの投与に好適な組成物の修飾は十分理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、修飾する場合には単に通常の試験を用いてそのような修飾を設計および／または実施することができる。組成物の投与が企図される対象としては、限定されるものではないが、ヒト、他の霊長類、ならびに他の哺乳動物、例として商業関連の哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラットが挙げられる。
【０３６４】
１つ以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、薬理学分野において公知のまたは今後開発される任意の方法により調製することができる。一般に、このような調製方法は、活性成分を賦形剤および／もしくは１つ以上の他の副成分と会合させ、次いで所望または必要により、生成物を所望の単回または複数回用量単位に分割し、成形し、ならびに／またはパッケージングすることを含む。
【０３６５】
本開示による医薬組成物は、バルクで、単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として調製し、パッケージングし、および／または販売することができる。本明細書において使用される「単位用量」は、所定量の活性成分（例えば、脂質ナノ粒子）を含む医薬組成物の区別される量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の投与量および／またはそのような投与量の簡便な分量、例えばそのような投与量の２分の１もしくは３分の１などに等しい。
【０３６６】
医薬組成物は、種々の投与の経路および方法に好適な種々の形態で調製することができる。例えば、医薬組成物は、液体剤形（例えば、エマルション剤、マイクロエマルション剤、ナノエマルション剤、液剤、懸濁液剤、シロップ剤、およびエリキシル剤）、注射形態、固体剤形（例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤）、局所および／または経皮投与用の剤形（例えば、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤、およびパッチ剤）、懸濁液剤、散剤、および他の形態で調製することができる。
【０３６７】
経口または非経口投与用の液体剤形としては、限定されるものではないが、薬学的に許容可能なエマルション剤、マイクロエマルション剤、ナノエマルション剤、液剤、懸濁液剤、シロップ剤、および／またはエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加え、液体剤形は、当技術分野において一般に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステルなど、ならびにそれらの混合物を含み得る。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、追加の治療薬および／または予防薬、追加の薬剤、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、および／または着香剤を含み得る。非経口投与のためのある実施形態において、組成物は、可溶化剤、例えばクレモホル（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはそれらの組合せと混合される。
【０３６８】
注射用調剤、例えば滅菌注射用水性または油性懸濁液は、公知の技術に従って好適な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤を使用して製剤化することができる。滅菌注射用調剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤および／または溶媒中の滅菌注射用液剤、懸濁液剤、および／またはエマルション剤、例えば１，３−ブタンジオール中の液剤としてのものであり得る。用いることができる許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液がある。無菌固定油が溶媒または懸濁媒体として慣習的に用いられる。この目的のため、任意の無刺激の固定油、例として合成モノまたはジグリセリドを用いることができる。脂肪酸、例えばオレイン酸を注射剤の調製において使用することができる。
【０３６９】
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通す濾過により、および／または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体中に溶解させ、もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を取り込むことにより、滅菌することができる。
【０３７０】
活性成分の効果を延長するため、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を減速させることが望ましいことが多い。これは、水溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用により達成することができる。この場合、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、溶解速度は、したがって結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。代わりに、非経口投与される薬物形態の吸収遅延は、薬物を油ビヒクル中に溶解させ、または懸濁させることにより達成される。注射用デポー形態は、薬物のマイクロ封入マトリックスを生分解性ポリマー、例えばポリラクチド−ポリグリコリド中で形成することにより作製される。薬物とポリマーとの比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中で薬物を捕捉することにより調製される。
【０３７１】
経直腸または経膣投与用組成物は、典型的には坐剤であり、それは、周囲温度において固体であるが、体温において液体であり、したがって直腸または膣腔で溶融し、活性成分を放出する好適な非刺激性賦形剤、例えばココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスと組成物を混合することにより調製することができる。
【０３７２】
経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、フィルム剤、散剤、および顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形において、活性成分は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容可能な賦形剤、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または充填剤もしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシア）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、あるケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収加速剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土、ケイ酸塩）、および滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、ならびにそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含み得る。
【０３７３】
類似タイプの固体組成物は、軟および硬充填ゼラチンカプセル剤中の充填剤として、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して用いることができる。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、コーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティングおよび医薬製剤化分野において周知の他のコーティングにより調製することができる。これらは、任意選択的に乳白剤を含み得、それらは、活性成分のみをまたはそれを優先的に腸管のある部分中において任意選択的に遅延様式で放出する組成物であり得る。使用することができる埋込型組成物は、ポリマー物質およびワックスを含む。類似タイプの固体組成物は、軟および硬充填ゼラチンカプセル剤中の充填剤として、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して用いることができる。
【０３７４】
組成物の局所および／または経皮投与用の剤形としては、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤、および／またはパッチ剤を挙げることができる。一般に、活性成分は、滅菌条件下で要求され得るとおりに薬学的に許容可能な賦形剤ならびに／または任意の必要とされる保存剤および／もしくは緩衝剤と混和される。さらに、本開示は、経皮パッチ剤の使用を企図し、それは、多くの場合、身体への化合物の制御送達を提供するという追加の利点を有する。このような剤形は、例えば、化合物を適切な媒体中に溶解させ、および／または分注することにより調製することができる。代わりにまたはさらに、速度は、律速膜を提供することにより、ならびに／または化合物をポリマーマトリックスおよび／もしくはゲル中に分散させることにより制御することができる。
【０３７５】
本明細書に記載の皮内医薬組成物の送達における使用に好適なデバイスとしては、短針デバイス、例えば米国特許第４，８８６，４９９号明細書；同第５，１９０，５２１号明細書；同第５，３２８，４８３号明細書；同第５，５２７，２８８号明細書；同第４，２７０，５３７号明細書；同第５，０１５，２３５号明細書；同第５，１４１，４９６号明細書；および同第５，４１７，６６２号明細書に記載のものが挙げられる。皮内組成物は、皮膚中への針の有効な貫通長さを制限するデバイス、例えばＰＣＴ出願公開の国際公開第９９／３４８５０号パンフレットに記載のものおよびその機能的均等物により投与することができる。液体ジェット注射器を介して、および／または角質層を穿通し、真皮に到達するジェットを生成する針を介して液体組成物を真皮に送達するジェット注射デバイスが好適である。ジェット注射デバイスは、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号明細書；同第５，５９９，３０２号明細書；同第５，３３４，１４４号明細書；同第５，９９３，４１２号明細書；同第５，６４９，９１２号明細書；同第５，５６９，１８９号明細書；同第５，７０４，９１１号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；同第５，８９３，３９７号明細書；同第５，４６６，２２０号明細書；同第５，３３９，１６３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，５０３，６２７号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，５２０，６３９号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第４，９４０，４６０号明細書；ならびにＰＣＴ出願公開の国際公開第９７／３７７０５号パンフレットおよび国際公開第９７／１３５３７号パンフレットに記載されている。圧縮ガスを使用して粉末形態中のワクチンを加速して皮膚の外層を通して真皮に到達させる弾道粉末／粒子送達デバイスが好適である。代わりにまたはさらに、慣用のシリンジを皮内投与の古典的なツベルクリン法において使用することができる。
【０３７６】
局所投与に好適な製剤としては、限定されるものではないが、液体および／もしくは半液体調剤、例えばリニメント剤、ローション剤、水中油型および／もしくは油中水型エマルション、例えばクリーム剤、軟膏剤、および／もしくはパスタ剤、ならびに／または液剤および／もしくは懸濁液剤が挙げられる。局所的に投与可能な製剤は、例えば、約１％〜約１０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解度の限度ほど高いことができる。局所投与用の製剤は、本明細書に記載の追加の成分の１つ以上をさらに含み得る。
【０３７７】
医薬組成物は、口腔を介する経肺投与に好適な製剤で調製し、パッケージングし、および／または販売することができる。このような製剤は、活性成分を含む乾燥粒子を含み得る。このような組成物は、簡便には、粉末を分散させるように噴射剤流を指向することができる乾燥粉末リザーバを含むデバイスを使用する投与、および／または自己噴射溶媒／粉末分注容器、例えば密封容器中において低沸点噴射剤中で溶解され、および／または懸濁された活性成分を含むデバイスを使用する投与のために乾燥粉末の形態である。乾燥粉末組成物は、固体微粉末希釈剤、例えば糖を含み得、簡便には単位用量形態で提供される。
【０３７８】
低沸点噴射剤としては、一般に、大気圧において６５°Ｆ（約１８．３℃）未満の融点を有する液体噴射剤が挙げられる。一般に、噴射剤は、組成物の５０％〜９９．９％（ｗｔ／ｗｔ）を構成し得、活性成分は、組成物の０．１％〜２０％（ｗｔ／ｗｔ）を構成し得る。噴射剤は、追加の成分、例えば液体非イオン性および／もしくは固体アニオン性界面活性剤ならびに／または固体希釈剤（活性成分を含む粒子と同一のオーダの粒子サイズを有し得る）をさらに含み得る。
【０３７９】
肺送達のために製剤化される医薬組成物は、活性成分を液剤および／または懸濁液剤の液滴の形態で提供し得る。このような製剤は、活性成分を含む、任意選択的に滅菌された水性および／または希アルコール液剤および／または懸濁液剤として調製し、パッケージングし、および／または販売することができ、簡便に、任意のネブライゼーションおよび／またはアトマイゼーションデバイスを使用して投与することができる。このような製剤は、１つ以上の追加の成分、例として、限定されるものではないが、香味剤、例えばサッカリンナトリウム、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、および／または保存剤、例えばメチルヒドロキシ安息香酸塩をさらに含み得る。この投与経路により提供される液滴は、約１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
【０３８０】
肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗粉である。このような製剤は、鼻からの吸入が行われる様式で、すなわち鼻に近接して保持される粉末の容器からの鼻孔に通す急速な吸入により投与される。
【０３８１】
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、約０．１％（ｗｔ／ｗｔ）ほどの少量〜１００％（ｗｔ／ｗｔ）ほどの多量の活性成分を含み得、本明細書に記載の追加の成分の１つ以上を含み得る。医薬組成物は、バッカル投与に好適な製剤で調製し、パッケージングし、および／または販売することができる。このような製剤は、例えば、慣用の方法を使用して作製される錠剤および／またはトローチ剤の形態であり得、例えば０．１％〜２０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分であり得、残部は経口的に溶解性および／または分解性の組成物、ならびに任意選択的に本明細書に記載の追加の成分の１つ以上を含む。代わりに、バッカル投与に好適な製剤は、活性成分を含む粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくはアトマイズ化溶液および／もしくは懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散された場合、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均粒子および／または液滴サイズを有し得、本明細書に記載の任意の追加の成分の１つ以上をさらに含み得る。
【０３８２】
医薬組成物は、経眼投与に好適な製剤で調製し、パッケージングし、および／または販売することができる。このような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中の、例えば０．１／１．０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分の液剤および／または懸濁液剤を含む点眼薬の形態であり得る。このような液滴は、緩衝剤、塩、および／または本明細書に記載の他の任意の追加の成分の１つ以上をさらに含み得る。有用である他の眼内投与可能な製剤としては、微結晶形態でおよび／またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものが挙げられる。点耳および／または点眼薬は、本開示の範囲内にあるものとして企図される。
【０３８３】
ＬＮＰ製剤を安定化させる方法
本開示は、ストレスの適用前または適用時にＬＮＰ製剤に両親媒性ポリマーを添加することにより、ストレスの適用時に脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を安定化させる方法を提供する。
【０３８４】
一部の実施形態において、ストレスとしては、製剤の生成、精製、包装、貯蔵、輸送および使用時に製剤に適用される任意のストレス、例えば熱、剪断、過剰の撹拌、膜濃度分極（電荷状態の変化）、脱水、冷凍ストレス、乾燥ストレス、冷凍／解凍ストレス、ネブライゼーションストレスなどが挙げられる。例えば、ストレスは、製剤の１つ以上の不所望な特性変化、例えば不純物、サブビジブル粒子、またはその両方の量の増加、ＬＮＰサイズの増加、封入効率、治療効力、またはその両方の減少、および寛容性の減少（例えば、免疫原性の増加）を引き起こし得る。
【０３８５】
一部の実施形態において、適用されるストレスは、ＬＮＰ製剤の生成、例えば有機相を生成するための有機溶媒（例えば、エタノール）中での脂質構成成分の混合、水相を生成するための酸性溶液中へのｍＲＮＡの混合、水相のｐＨ値の調整、および／またはＬＮＰ製剤を生成するための有機相と水相との混合に由来する。例えば、それぞれの前記混合ステップは、乱流混合またはマイクロ流体混合を含み得る。例えば、有機相と水相との混合前、それぞれの相は、例えば、濾過（例えば、タンジェンシャルフロー濾過またはＴＦＦ）を介して精製することができる。例えば、適用されるストレスは、そのような精製に由来する。
【０３８６】
一部の実施形態において、適用されるストレスは、ＬＮＰ製剤化後のＬＮＰの処理、例えばタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ：ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による下流精製および濃縮に由来する。例えば、典型的なＴＦＦプロセス中、ＬＮＰ分散液は、種々の疎水性界面、剪断力、および乱流に曝露される。例えば、典型的なＴＦＦプロセス中、膜細孔よりも大きい分子（すなわちＬＮＰ）は、膜表面に蓄積してゲルまたは濃度分極層を形成する。例えば、ＬＮＰの濃度増加は、脱安定化ストレスとして機能し、より大きい粒子状物質種を生成し得る分子間相互作用を促進する。
【０３８７】
一部の実施形態において、適用されるストレスは、ＬＮＰ製剤の精製に由来する。したがって、本開示はまた、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を精製する方法であって、両親媒性ポリマーの存在下で第１のＬＮＰ製剤を濾過して第２のＬＮＰ製剤を得ることを含む方法を特徴とする。
【０３８８】
一部の実施形態において、適用されるストレスは、ＬＮＰ製剤の冷凍または凍結乾燥に由来する。したがって、本開示はまた、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を冷凍するかまたは凍結乾燥させる方法であって、両親媒性ポリマーの存在下で第１のＬＮＰ製剤を冷凍するかまたは凍結乾燥させて第２のＬＮＰ製剤を得ることを含む方法を特徴とする。
【０３８９】
例えば、第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較してＬＮＰ平均サイズの増加を実質的に有さない。例えば、第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較して約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）のＬＮＰ平均サイズの増加を有する。
【０３９０】
例えば、第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較して多分散指数の増加を実質的に有さない。
例えば、第２のＬＮＰ製剤は、第１のＬＮＰ製剤と比較して約２０％以下（例えば、約１５％、約１０％、約５％以下）の多分散指数の増加を有する。
【０３９１】
安定化脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を生成する方法であって、第１の両親媒性ポリマーを、イオン化可能脂質およびｍＲＮＡを含む脂質組成物と混合して混合物を得ることを含む方法も開示される。例えば、混合は、第１の両親媒性ポリマーを脂質組成物と乱流またはマイクロ流体混合することを含む。例えば、本方法は、混合物を精製することをさらに含む。例えば、精製は、任意選択的に第２の両親媒性ポリマーを添加するタンジェンシャルフロー濾過を含む。例えば、本方法は、第３の両親媒性ポリマーを添加し、任意選択的に塩、糖、またはそれらの組合せを添加して製剤を冷凍するかまたは凍結乾燥させることを含む。例えば、本方法は、第４の両親媒性ポリマーを添加して製剤を包装することをさらに含む。
【０３９２】
本明細書に開示の方法のいずれも、本明細書の製剤について記載された特徴の１つ以上および以下の特徴の１つ以上を含み得る。
例えば、第１、第２、第３、および第４の両親媒性ポリマーは、同一のポリマーである。
【０３９３】
例えば、第１、第２、第３、および第４の両親媒性ポリマーは、異なる。
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、非イオン性である。
【０３９４】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、ブロックコポリマーである。
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポロキサミン（テトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
【０３９５】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、Ｐ１８８である。
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で２×１０−４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
【０３９６】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、約３０℃および大気圧において水中で約０．１×１０−４Ｍ〜約１．３×１０−４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
【０３９７】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、製剤中でポリマーの濃度が約そのＣＭＣ〜ＣＭＣの約３０倍（例えば、そのＣＭＣの最大約２５倍、約２０倍、約１５倍、約１０倍、約５倍、または約３倍）の範囲になるように添加される。
【０３９８】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、約０．０２５％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖまたは約０．０２５％ｗ／ｗ〜約３％ｗ／ｗの範囲の濃度において存在する。
【０３９９】
例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、非イオン性である。
例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、ブロックコポリマーである。
【０４００】
例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、ポロキサマー（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポロキサミン（テトロニック（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
【０４０１】
例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、Ｐ１８８である。
例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、約３０℃および大気圧において水中で２×１０−４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
【０４０２】
例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、約３０℃および大気圧において水中で約０．１×１０−４Ｍ〜約１．３×１０−４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
【０４０３】
例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、製剤中でポリマーの濃度が約そのＣＭＣ〜ＣＭＣの３０倍（例えば、そのＣＭＣの最大約２５倍、約２０倍、約１５倍、約１０倍、約５倍、または約３倍）の範囲になるように添加される。
【０４０４】
例えば、第１、第２、第３、または第４の両親媒性ポリマーの少なくとも１つは、約０．０２５％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖまたは約０．０２５％ｗ／ｗ〜約３％ｗ／ｗの範囲の濃度において存在する。
【０４０５】
例えば、第１の両親媒性ポリマーは、約０．０２５％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ（例えば、約０．０２５％ｗ／ｖ、約０．０５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約０．０２５〜０．５％ｗ／ｖ、約０．０５〜１％ｗ／ｖ、約０．１〜１％ｗ／ｖ、または約０．１〜０．５％ｗ／ｖ）の範囲の濃度において存在する。例えば、第１の両親媒性ポリマーは、約０．０２５％ｗ／ｗ〜約１％ｗ／ｗ（例えば、約０．０２５％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ、約０．０２５〜０．５％ｗ／ｗ、約０．０５〜１％ｗ／ｗ、約０．１〜１％ｗ／ｗ、または約０．１〜０．５％ｗ／ｗ）の範囲の濃度において存在する。
【０４０６】
例えば、第２の両親媒性ポリマーは、約０．０２５％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ（例えば、約０．０２５％ｗ／ｖ、約０．０５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約０．０２５〜０．５％ｗ／ｖ、約０．０５〜１％ｗ／ｖ、約０．１〜１％ｗ／ｖ、または約０．１〜０．５％ｗ／ｖ）の範囲の濃度において存在する。例えば、第２の両親媒性ポリマーは、約０．０２５％ｗ／ｗ〜約１％ｗ／ｗ（例えば、約０．０２５％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ、約０．０２５〜０．５％ｗ／ｗ、約０．０５〜１％ｗ／ｗ、約０．１〜１％ｗ／ｗ、または約０．１〜０．５％ｗ／ｗ）の範囲の濃度において存在する。
【０４０７】
例えば、第３の両親媒性ポリマーは、約０．１％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖ（例えば、約０．１％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ、約２．５％ｗ／ｖ、約０．１〜２．５％ｗ／ｖ、約０．１〜１％ｗ／ｖ、約０．１〜０．５％ｗ／ｖ、または約０．１〜０．４％ｗ／ｖ）の範囲の濃度において存在する。例えば、第３の両親媒性ポリマーは、約０．１％ｗ／ｗ〜約３％ｗ／ｗ（例えば、約０．１％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約２．５％ｗ／ｗ、約０．１〜２．５％ｗ／ｗ、約０．１〜１％ｗ／ｗ、約０．１〜０．５％ｗ／ｗ、または約０．１〜０．４％ｗ／ｗ）の範囲の濃度において存在する。
【０４０８】
例えば、第４の両親媒性ポリマーは、約０．１％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖ（例えば、約０．１％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ、約０．１〜２．５％ｗ／ｖ、約０．１〜１％ｗ／ｖ、約０．１〜０．５％ｗ／ｖ、または約０．１〜０．４％ｗ／ｖ）の範囲の濃度において存在する。例えば、第４の両親媒性ポリマーは、約０．１％ｗ／ｗ〜約３％ｗ／ｗ（例えば、約０．１％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約２．５％ｗ／ｗ、約０．１〜２．５％ｗ／ｗ、約０．１〜１％ｗ／ｗ、約０．１〜０．５％ｗ／ｗ、または約０．１〜０．４％ｗ／ｗ）の範囲の濃度において存在する。
【０４０９】
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１００：１である。
例えば、第１の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１：１である。
【０４１０】
例えば、第２の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．０２５：１〜約１：１である。
例えば、第３の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．１：１〜約４０：１である。
【０４１１】
例えば、第３の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、製剤を冷凍するために約０．１：１〜約４：１である。
例えば、第３の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、製剤を凍結乾燥させるために約１０：１〜約４０：１である。
【０４１２】
例えば、第４の両親媒性ポリマーと核酸との重量比は、約０．２５：１〜約１００：１（例えば、約０．５：１〜約１２：１）である。
例えば、両親媒性ポリマー、または第１、第２、第３もしくは第４の両親媒性ポリマーは、ポリマーとＬＮＰとの重量比が約０．０００４：１〜約１００：１（例えば、約０．００１：１〜約１０：１、約０．００１：１〜約５：１、約０．００１：１〜約０．１：１、約０．００５〜約０．４：１、または約０．５：１〜約４：１、約０．０５：１〜約５：１、約０．１：１〜約５：１または約０．０５：１〜約２．５：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約５０：１または約１：１〜約２５：１）になるように添加される。
【０４１３】
細胞中でポリペプチドを産生する方法
本開示は、哺乳動物細胞中で目的のポリペプチドを産生する方法を提供する。ポリペプチドを産生する方法は、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを含む本開示の製剤と細胞を接触させることを含む。細胞と脂質ナノ粒子との接触時、ｍＲＮＡが細胞中に取り込まれ、翻訳されて目的のポリペプチドが産生され得る。
【０４１４】
一般に、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰと哺乳動物細胞を接触させるステップは、インビボ、エクスビボ、培養物中、またはインビトロで実施することができる。細胞と接触させる脂質ナノ粒子の量、および／またはその中のｍＲＮＡの量は、接触させる細胞または組織のタイプ、投与手段、脂質ナノ粒子およびその中のｍＲＮＡの物理化学的特徴（例えば、サイズ、電荷、および化学組成）、ならびに他の因子に依存し得る。一般に、有効量の脂質ナノ粒子は、細胞中での効率的なポリペプチド産生を可能とする。効率についての測定基準としては、ポリペプチド翻訳（ポリペプチド発現により示される）、ｍＲＮＡ分解のレベル、および免疫応答指標を挙げることができる。
【０４１５】
ｍＲＮＡを含むＬＮＰを細胞と接触させるステップは、形質移入を含み、または引き起こし得る。ＬＮＰの脂質構成成分中に含まれるリン脂質は、例えば、細胞または細胞内膜と相互作用し、および／または融合することにより形質移入を容易にし、および／または形質移入効率を増加させ得る。形質移入は、細胞内でのｍＲＮＡの翻訳を可能とし得る。
【０４１６】
一部の実施形態において、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、治療的に使用することができる。例えば、ＬＮＰ中に含まれるｍＲＮＡは、治療ポリペプチドを（例えば、翻訳可能領域中で）コードし、細胞への接触および／または細胞中への流入（例えば、形質移入）時に治療ポリペプチドを産生し得る。他の実施形態において、ＬＮＰ中に含まれるｍＲＮＡは、対象の免疫を改善し、または増加させ得るポリペプチドをコードし得る。例えば、ｍＲＮＡは、顆粒球コロニー刺激因子またはトラスツズマブをコードし得る。
【０４１７】
ある実施形態において、ＬＮＰ中に含まれるｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子と接触させる細胞中で実質的に不存在であり得る１つ以上のポリペプチドを置き換え得る組換えポリペプチドをコードし得る。１つ以上の実質的に不存在のポリペプチドは、コード遺伝子またはその調節経路の遺伝子突然変異に起因して欠落し得る。代わりに、ｍＲＮＡの翻訳により産生される組換えポリペプチドは、細胞中に存在するか、その表面上に存在するか、またはそれから分泌される内因性タンパク質の活性をアンタゴナイズし得る。アンタゴニスト性組換えポリペプチドは、内因性タンパク質の活性により引き起こされる有害効果、例えば突然変異により引き起こされる活性または局在化の変更を撲滅するために望ましいことがある。別の代替例において、ｍＲＮＡの翻訳により産生される組換えポリペプチドは、細胞中に存在するか、その表面上に存在するか、またはそれから分泌される生物学的部分の活性を間接的または直接的にアンタゴナイズし得る。アンタゴナイズされる生物学的部分としては、限定されるものではないが、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、および小分子毒素を挙げることができる。ｍＲＮＡの翻訳により産生される組換えポリペプチドは、細胞内での、例えば特異的コンパートメント、例えば核内での局在化のために遺伝子操作することができ、または細胞からの分泌のためもしくは細胞の細胞膜へのトランスロケーションのために遺伝子操作することができる。
【０４１８】
一部の実施形態において、ｍＲＮＡを含むＬＮＰと細胞を接触させることは、外因性核酸に対する細胞の自然免疫応答を低減させ得る。細胞は、翻訳可能領域を含む第１の量の第１の外因性ｍＲＮＡを含む第１の脂質ナノ粒子と接触させることができ、第１の外因性ｍＲＮＡに対する細胞の自然免疫応答のレベルを測定することができる。続いて、第２の量の第１の外因性ｍＲＮＡを含む第２の組成物と細胞を接触させることができ、第２の量は、第１の量と比較して少ない第１の外因性ｍＲＮＡの量である。代わりに、第２の組成物は、第１の外因性ｍＲＮＡと異なる第１の量の第２の外因性ｍＲＮＡを含み得る。第１および第２の組成物と細胞を接触させるステップは、１回以上繰り返すことができる。さらに、細胞中でのポリペプチド産生（例えば、翻訳）の効率を任意選択的に測定することができ、細胞は、標的のタンパク質産生効率が達成されるまで第１および／または第２の組成物と繰り返して再接触させることができる。
【０４１９】
細胞および臓器に治療剤を送達する方法
本開示は、哺乳動物細胞または臓器に治療薬および／または予防薬を送達する方法を提供する。細胞への治療薬および／または予防薬の送達は、対象に治療薬および／または予防薬を含むＬＮＰを含む本開示の製剤を投与することを含み、組成物の投与は、組成物と細胞を接触させることを含む。例えば、細胞または臓器にタンパク質、細胞毒性剤、放射性イオン、化学療法剤、または核酸（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を送達することができる。治療薬および／または予防薬がｍＲＮＡである例において、脂質ナノ粒子との細胞の接触時、翻訳可能ｍＲＮＡは、細胞中で翻訳されて目的のポリペプチドが産生され得る。しかしながら、細胞に実質的に翻訳可能でないｍＲＮＡを送達することもできる。実質的に非翻訳可能なｍＲＮＡは、ワクチンとして有用であり得、および／または細胞の翻訳構成成分を封鎖して細胞中での他の種の発現を低減させ得る。
【０４２０】
一部の実施形態において、ＬＮＰは、特定のタイプまたはクラスの細胞（例えば、特定の臓器またはその系の細胞）を標的化し得る。例えば、目的の治療薬および／または予防薬を含むＬＮＰは、哺乳動物の肝臓、腎臓、脾臓、大腿骨、または肺に特異的に送達することができる。特定のクラスの細胞、臓器、またはその系もしくは群への特異的送達は、例えば、哺乳動物へのＬＮＰの投与時、治療薬および／または予防薬を含む脂質ナノ粒子が目的の行き先（例えば、組織）に他の行き先に対して高い比率で送達されることを意味する。一部の実施形態において、特異的送達は、別の行き先（例えば、脾臓）と比較して標的化される行き先（例えば、目的の組織、例えば肝臓）の組織１ｇ当たりの治療薬および／または予防薬の量の２倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍超の増加をもたらし得る。一部の実施形態において、目的の組織は、肝臓、腎臓、肺、脾臓、大腿骨、血管（例えば、冠動脈内または大腿骨内）中の血管内皮または腎臓、および腫瘍組織（例えば、腫瘍内注射を介する）からなる群から選択される。
【０４２１】
標的化または特異的送達の別の例として、ＬＮＰ中にタンパク質結合パートナ（例えば、抗体またはその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチド）または細胞表面上の受容体をコードするｍＲＮＡを含めることができる。ｍＲＮＡは、さらにまたは代わりに使用されて脂質、炭水化物、または他の生物学的部分の合成および細胞外局在化を指向することができる。代わりに、ＬＮＰの他の治療薬および／または予防薬または要素（例えば、脂質またはリガンド）は、ＬＮＰが受容体を含む標的細胞集団とより容易に相互作用し得るように特定の受容体（例えば、低密度リポタンパク質受容体）についてのそれらの親和性に基づいて選択することができる。例えば、リガンドとしては、限定されるものではないが、特異的結合ペアのメンバー、抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体およびその断片、ヒト化抗体およびその断片、ならびにそれらの多価形；多価結合試薬、例として単一または二重特異的抗体、例えばジスルフィド安定化Ｆｖ断片、ｓｃＦｖタンデム、ダイアボディ、トリボディ、またはテトラボディ；ならびにアプタマー、受容体、および融合タンパク質を挙げることができる。
【０４２２】
一部の実施形態において、リガンドは、細胞標的化特異性のチューニングを可能とし得る表面結合抗体であり得る。これは、所望の標的化部位についての目的のエピトープに対する高度に特異的な抗体を生じさせることができるため、特に有用である。一実施形態において、複数の抗体が細胞の表面上で発現され、それぞれの抗体は、所望の標的についての異なる特異性を有し得る。このようなアプローチは、標的化相互作用のアビディティおよび特異性を増加させ得る。
【０４２３】
リガンドは、例えば、生物学分野の当業者が、細胞の所望の局在化または機能に基づいて選択することができる。例えば、エストロゲン受容体リガンド、例えばタモキシフェンは、増加した数のエストロゲン受容体を細胞表面上に有するエストロゲン依存的乳癌細胞に細胞を標的化し得る。リガンド／受容体相互作用の他の非限定的な例としては、ＣＣＲ１（例えば、関節リウマチにおける炎症関節組織もしくは脳、および／または多発性硬化症の治療のため）、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８（例えば、リンパ節組織への標的化）、ＣＣＲ６、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０（例えば、腸組織に標的化するため）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０（例えば、皮膚に標的化するため）、ＣＸＣＲ４（例えば、通り抜けの全般的な向上のため）、ＨＣＥＬＬ（例えば、炎症および炎症性障害、骨髄の治療のため）、アルファ４ベータ７（例えば、腸粘膜標的化のため）、およびＶＬＡ−４ＮＣＡＭ−１（例えば、内皮に標的化するため）が挙げられる。一般に、標的化（例えば、癌転移）に関与する任意の受容体を本明細書に記載の方法および組成物における使用に利用することができる。
【０４２４】
標的化される細胞としては、限定されるものではないが、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜表層細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞を挙げることができる。
【０４２５】
一部の実施形態において、ＬＮＰは、肝細胞を標的化し得る。アポリポタンパク質、例えばアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ：ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｎ  Ｅ）は、中性またはほぼ中性の脂質含有脂質ナノ粒子と体内で会合することが示されており、受容体、例えば肝細胞の表面上に見出される低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ：ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｏｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と会合することが公知である。したがって、対象に投与される中性またはほぼ中性の電荷を有する脂質構成成分を含むＬＮＰは、対象の体内でａｐｏＥを獲得し得、続いてＬＤＬＲを含む肝細胞に治療薬および／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）を標的化様式で送達し得る。
【０４２６】
疾患および障害を治療する方法
脂質ナノ粒子は、疾患、障害、または病態の治療に有用であり得る。特に、このような組成物は、欠損または異常タンパク質またはポリペプチド活性により特徴付けられる疾患、障害、または病態の治療において有用であり得る。例えば、欠損または異常ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを含む本開示の製剤を、細胞に投与し、または送達することができる。後続のｍＲＮＡの翻訳は、ポリペプチドを産生し得、それによりそのポリペプチドの不存在またはそれにより引き起こされる異常な活性により引き起こされる問題を低減させ、または排除する。翻訳は急速に生じ得るため、本方法および組成物は、急性疾患、障害、または病態、例えば敗血症、脳卒中、および心筋梗塞の治療において有用であり得る。ＬＮＰ中に含まれる治療薬および／または予防薬は、所与の種の転写速度も変更し得、それにより遺伝子発現に影響を与える。
【０４２７】
組成物を投与することができる、機能不全または異常タンパク質またはポリペプチド活性により特徴付けられる疾患、障害、および／または病態としては、限定されるものではないが、希少疾患、感染性疾患（ワクチンおよび治療薬の両方として）、癌および増殖性疾患、遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症）、自己免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心臓および腎血管疾患、ならびに代謝性疾患が挙げられる。複数の疾患、障害、および／または病態は、欠損（または実質的に縮小し、その結果、適切なタンパク質機能が生じない）タンパク質活性により特徴付けることができる。このようなタンパク質は、存在しなくてよく、またはそれらは本質的に非機能的であり得る。機能不全タンパク質の具体例は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ：ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）遺伝子のミスセンス突然変異バリアントであり、それは、嚢胞性線維症を引き起こすＣＦＴＲタンパク質の機能不全タンパク質バリアントを産生する。本開示は、ＲＮＡと、式（Ｉ）による脂質、リン脂質（任意選択的に不飽和）、ＰＥＧ脂質、および構造脂質を含む脂質構成成分とを含むＬＮＰを投与することにより対象におけるそのような疾患、障害、および／または病態を治療する方法であって、ＲＮＡは、対象の細胞中に存在する異常タンパク質活性をアンタゴナイズし、またはそうでなければ克服するポリペプチドをコードするｍＲＮＡであり得る方法を提供する。
【０４２８】
本開示は、１つ以上の治療薬および／または予防薬を含む脂質ナノ粒子ならびにそれを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。治療薬および予防薬という用語は、本開示の特徴および実施形態に関して本明細書において互換的に使用することができる。治療組成物、またはそのイメージング、診断、もしくは予防組成物は、対象に、疾患、障害、および／または病態の予防、治療、診断、もしくはイメージングおよび／または任意の他の目的に有効な任意の妥当な量および任意の投与経路を使用して投与することができる。所与の対象に投与される具体量は、対象の種、年齢、および全身状態；投与目的；特定の組成物；投与方式などに応じて変動し得る。本開示による組成物は、容易な投与および投与量の均等性のために単位剤形で製剤化することができる。しかしながら、本開示の組成物の総一日使用量は、担当医により正当な医学的判断の範囲内で決定されることが理解される。任意の特定の患者についての具体的な治療有効、予防有効、またはそうでなければ適切な用量レベル（例えば、イメージング用）は、種々の因子、例として治療されている障害（存在する場合）の重症度およびアイデンティティ；用いられる１つ以上の治療薬および／または予防薬；用いられる規定の組成物；患者の年齢、体重、全身健康、性別、および食事；用いられる規定の医薬組成物の投与時間、投与経路、および排泄速度；治療の継続時間；用いられる規定の医薬組成物との組合せでまたはそれと同時に使用される薬物；ならびに医学分野において周知の同様の因子に依存する。
【０４２９】
１つ以上の治療薬および／または予防薬を含むＬＮＰは、任意の経路により投与することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の脂質ナノ粒子を含む組成物、例として予防、診断、またはイメージング組成物は、種々の経路の１つ以上により、例として経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、皮下、脳室内、経皮または皮内、皮膚間（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、直腸、膣内、腹腔内、局所（例えば、散剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、および／または滴剤により）、粘膜、鼻腔、バッカル、腸、硝子体内、腫瘍内、舌下、鼻腔内；気管内滴下注入、気管支滴下注入、および／または吸入により；経口スプレーおよび／もしくは散剤、鼻スプレー、および／もしくはエアロゾルとして、ならびに／または門脈カテーテルを介して投与される。一部の実施形態において、組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、動脈内、腫瘍内、皮下、または吸入投与することができる。しかしながら、本開示は、薬物送達の科学において期待される進展を考慮する任意の適切な経路による本明細書に記載の組成物の送達または投与を包含する。一般に、ほとんどの適切な投与経路は、種々の因子、例として１つ以上の治療薬および／または予防薬を含む脂質ナノ粒子の性質（例えば、種々の身体環境、例えば血流および胃腸管中のその安定性）、患者の状態（例えば、患者が特定の投与経路を寛容し得るか否か）などに依存する。
【０４３０】
ある実施形態において、本開示による組成物は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇの治療薬および／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）を送達するために十分な投与量レベルにおいて所与の用量で投与することができ、１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量は、対象の体重１ｋｇ当たり１ｍｇの治療薬および／または予防薬を提供する。一部の実施形態において、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量のＬＮＰの治療薬および／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）を投与することができる。他の実施形態において、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇの用量の治療薬および／または予防薬を投与することができる。ある実施形態において、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。他の実施形態において、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。用量は、１日１回以上、同一または異なる量で投与して所望レベルのｍＲＮＡ発現および／または治療、診断、予防、もしくはイメージング効果を得ることができる。所望の投与量は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回送達することができる。ある実施形態において、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回以上の投与）を使用して送達することができる。一部の実施形態において、単一用量は、例えば、外科的処置前もしくは後にまたは急性疾患、障害、もしくは病態の場合において投与することができる。
【０４３１】
１つ以上の治療薬および／または予防薬を含む脂質ナノ粒子は、１つ以上の他の治療、予防、診断、またはイメージング剤との組合せで使用することができる。「との組合せで」は、薬剤を同時に投与し、および／または送達のために一緒に製剤化しなければならないことを意味するものではないが、それらの送達方法は本開示の範囲内である。例えば、１つ以上の異なる治療薬および／または予防薬を含む１つ以上の脂質ナノ粒子を組合せで投与することができる。組成物は、１つ以上の他の所望の治療または医学的処置と同時に、その前に、またはそれに続いて投与することができる。一般に、それぞれの薬剤は、その薬剤について決定された用量においておよび／または時間スケジュールで投与される。一部の実施形態において、本開示は、組成物、またはそのイメージング、診断、もしくは予防組成物と、それらのバイオアベイラビリティを改善し、それらの代謝を低減させ、および／または修飾し、それらの排泄を阻害し、および／またはそれらの体内分布を修飾する薬剤との組合せの送達を包含する。
【０４３２】
組合せにおいて利用される治療、予防、診断、またはイメージング活性剤は、単一組成物中で一緒に投与し、または異なる組成物中で別個に投与することができることがさらに認識される。一般に、組合せにおいて利用される薬剤は、それらが個々に利用されるレベルを超過しないレベルにおいて利用されることが予期される。一部の実施形態において、組合せにおいて利用されるレベルは、個々に利用されるものよりも低いことができる。
【０４３３】
組合せレジメンにおいて用いるための治療法の特定の組合せ（治療薬または処置）について、所望の治療薬および／または予防薬の適合性ならびに達成すべき所望の治療効果が考慮される。用いられる治療法は、同一障害について所望の効果を達成し得（例えば、癌の治療に有用な組成物は、化学療法剤と同時に投与することができる）、またはそれらは、異なる効果（例えば、任意の有害効果、例えば輸注関連反応の制御）を達成し得ることも認識される。
【０４３４】
ＬＮＰは、組成物の有効性および／または治療ウインドウを増加させるための薬剤との組合せで使用することができる。このような薬剤は、例えば、抗炎症化合物、ステロイド（例えば、コルチコステロイド）、スタチン、エストラジオール、ＢＴＫ阻害剤、Ｓ１Ｐ１アゴニスト、グルココルチコイド受容体モジュレータ（ＧＲＭ：ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｇｕｌａｔｏｒ）、または抗ヒスタミン薬であり得る。一部の実施形態において、ＬＮＰは、デキサメタゾン、メトトレキサート、アセトアミノフェン、Ｈ１受容体遮断剤、またはＨ２受容体遮断剤との組合せで使用することができる。一部の実施形態において、治療を、必要とする対象において行うか、または治療薬および／もしくは予防薬を対象（例えば、哺乳動物）に送達する方法は、ＬＮＰの投与前に１つ以上の薬剤により対象を前治療することを含み得る。例えば、対象は、有用な量（例えば、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、または任意の他の有用な量）のデキサメタゾン、メトトレキサート、アセトアミノフェン、Ｈ１受容体遮断剤、またはＨ２受容体遮断剤により前治療することができる。前治療は、脂質ナノ粒子の投与の２４時間以下（例えば、２４時間、２０時間、１６時間、１２時間、８時間、４時間、２時間、１時間、５０分、４０分、３０分、２０分、または１０分）前に行うことができ、例えば増加投与量で１または２回以上行うことができる。
【０４３５】
当業者は、本明細書に記載の開示による具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、または定型未満の実験を使用して確認することができる。本開示の範囲は、上記の詳細な説明に限定されるものではく、添付の特許請求の範囲に記載のとおりである。
【０４３６】
特許請求の範囲において、冠詞、例えば「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、それとは反対の指定があるかまたは文脈から特に明白でない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。群の１つ以上のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または詳細な説明は、それとは反対の指定があるかまたは文脈から特に明白でない限り、その群のメンバーの１つ、２つ以上、または全てが所与の生成物またはプロセスにおいて存在し、それらにおいて用いられ、またはそうでなければそれらと関連する場合に満たされるとみなされる。本開示は、群の厳密に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスにおいて存在し、それらにおいて用いられ、またはそうでなければそれらと関連する実施形態を含む。本開示は、群のメンバーの２つ以上または全てが所与の生成物またはプロセスにおいて存在し、それらにおいて用いられ、またはそうでなければそれらと関連する実施形態を含む。
【０４３７】
用語「含む」は、オープンであるものとし、追加の要素またはステップの包含を許容するが要求しないことも留意される。したがって、用語「含む」が本明細書において使用される場合、用語「〜から本質的になる」および「〜からなる」も包含され、開示される。詳細な説明全体にわたり、組成物が規定の構成成分を有し、包含するまたは含むとして記載される場合、組成物はまた、引用される構成成分から本質的になり、またはそれからなることが企図される。同様に、方法またはプロセスが規定のプロセスステップを有し、包含するまたは含むとして記載される場合、そのプロセスはまた、引用される処理ステップから本質的になり、またはそれからなる。さらに、ステップの順序またはある動作を実施するための順序は、本発明が作動可能であるままである限り、重要でないことを理解すべきである。さらに、２つ以上のステップまたは動作を同時に実施することができる。
【０４３８】
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、特に指定されるかまたは文脈および当業者の理解から特に明白でない限り、範囲として表現される値は、文脈がそうでないと明確に指示しない限り、本開示の異なる実施形態において記述される範囲内において、その範囲の下限の単位の１０分の１までの任意の具体的な値または部分範囲をとり得ることを理解すべきである。
【０４３９】
さらに、従来技術の範囲内に収まる本開示の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲の任意の１つ以上から明示的に除外することができることを理解すべきである。このような実施形態は、当業者に公知であるとされるため、その除外が本明細書に明示的に記載されないとしても、それらを除外することができる。
【０４４０】
全ての引用される資源、例えば参照文献、刊行物、特許出願、データベース、データベースエントリ、および本明細書に引用される技術は、引用において明示されないとしても参照により本出願に組み込まれる。引用資源および本出願の記述が矛盾する場合、本出願の記述が優先されるものとする。
【０４４１】
（実施例）
実施例１：脂質ナノ粒子の生成
Ａ．脂質ナノ粒子の生成
細胞への治療薬および／または予防薬の送達において使用される安定化、安全および有効な脂質ナノ粒子を調査するため、一連の製剤を調製し、試験した。具体的には、脂質ナノ粒子の脂質構成成分中の特定の要素およびそれらの比を最適化する。
【０４４２】
ナノ粒子は、混合プロセス、例えば一方が治療薬および／または予防薬を含有し、他方が脂質構成成分を有する２つの流体流のマイクロ流体およびＴ字混合により作製することができる。
【０４４３】
脂質組成物は、イオン化可能脂質、例えばＭＣ３、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による化合物、リン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ、アバンティ・ポーラ・リピッズ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、アラバスター、アラバマから入手可能）、ＰＥＧ脂質（例えば、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール、ＰＥＧ−ＤＭＧとしても公知、アバンティ・ポーラ・リピッズ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、アラバスター、アラバマから入手可能）、および構造脂質（例えば、コレステロール、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、タウフキルヘン、独国から入手可能、またはコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、およびヒドロコルチゾン）、またはそれらの組合せ）をエタノール中で約５０ｍＭの濃度において合わせることにより調製する。溶液は、例えば、−２０℃における貯蔵のため冷蔵物でなければならない。脂質を合わせて所望のモル比（例えば、表１を参照されたい）を生じさせ、水およびエタノールにより約５．５ｍＭ〜約２５ｍＭの最終脂質濃度に希釈する。
【０４４４】
【表１−１】
2019525901.tif 000012
【０４４５】
【表１−２】
2019525901.tif 000013
【０４４６】
治療薬および／または予防薬ならびに脂質構成成分を含む脂質ナノ粒子は、治療薬および／または予防薬を脂質構成成分と治療薬および／または予防薬とのｗｔ：ｗｔ比約５：１〜約５０：１において含む溶液と脂質溶液を合わせることにより調製する。脂質溶液は、約１０ｍｌ／分〜約１８ｍｌ／分の流量においてナノアセンブル（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ）マイクロ流体ベースシステムを使用して治療薬および／または予防薬溶液中に迅速に注入して水とエタノールとの比約１：１〜約４：１を有する懸濁液を生成する。
【０４４７】
脂質ナノ粒子は、透析により処理してエタノールを除去し、緩衝液交換を達成することができる。１０ｋＤの分子量カットオフを有するスライド−Ａ−ライザー（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ）カセット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、ロックフォード、イリノイ）を使用して一次生成物の２００倍の容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）に対して製剤を２回透析する。最初の透析は、室温において３時間実施する。次いで、製剤を４℃において一晩透析する。得られるナノ粒子懸濁液は、０．２μｍの滅菌フィルター（サルステッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）、ヌンブレヒト、独国）に通してガラスバイアル中に濾過し、圧着クロージャにより密閉する。
【０４４８】
上記の方法は、ナノ沈殿および粒子形成を誘導する。代替プロセス、例として、限定されるものではないが、Ｔ字合流管および直接注入を使用して同一のナノ沈殿を達成することができる。
【０４４９】
Ｂ．脂質ナノ粒子の特徴付け
ゼータサイザ・ナノＺＳ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）（マルバーン・インスツルメンツ社（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）、マルバーン、ウスターシャ、英国））を使用して脂質ナノ粒子の粒子サイズ、多分散指数（ＰＤＩ：ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）およびゼータ電位を測定することができ、粒子サイズの測定では１×ＰＢＳ中およびゼータ電位の測定では１５ｍＭのＰＢＳ中で使用する。
【０４５０】
紫外線−可視光分光光度法を使用して脂質ナノ粒子中の治療薬および／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）の濃度を測定することができる。９００μＬのメタノールおよびクロロホルムの４：１（ｖ／ｖ）混合物に１×ＰＢＳ中の希釈された１００μＬの製剤を添加する。混合後、溶液の吸収スペクトルをＤＵ８００分光光度計（ベックマン・コールタ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ベックマン・コールタ社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、ブレア、カリフォルニア）上で例えば２３０ｎｍ〜３３０ｎｍで記録する。脂質ナノ粒子中の治療薬および／または予防薬の濃度は、組成物中で使用される治療薬および／または予防薬の吸光係数、ならびに例えば２６０ｎｍの波長における吸光度と、例えば３３０ｎｍの波長におけるベースライン値との差に基づいて計算することができる。
【０４５１】
ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子について、クォント−イット（ＱＵＡＮＴ−ＩＴ）（商標）リボグリーン（ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ）（登録商標）ＲＮＡアッセイ（インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カールスバッド、カリフォルニア）を使用して脂質ナノ粒子によるＲＮＡの封入を評価することができる。試料は、ＴＥ緩衝溶液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中でおよそ５μｇ／ｍＬの濃度に希釈する。５０μＬの希釈試料をポリスチレン９６ウェルプレートに移し、５０μＬのＴＥ緩衝液または５０μＬの２％のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）溶液のいずれかをウェルに添加する。プレートを３７℃の温度において１５分間インキュベートする。リボグリーン（ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ）（登録商標）試薬をＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、１００μＬのこの溶液をそれぞれのウェルに添加する。蛍光プレートリーダ（ワラック・ビクター１４２０マルチラベル・カウンター（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）；パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ウォルサム、マサチューセッツ）を例えば約４８０ｎｍの励起波長、および例えば約５２０ｎｍの発光波長において使用して蛍光強度を計測することができる。試料のそれぞれの値から試薬ブランクの蛍光値を減算し、破壊された試料（トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の添加により引き起こされる）の蛍光値により無傷の試料（トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の添加なし）の蛍光強度を除算することにより、遊離ＲＮＡの割合を測定する。
【０４５２】
Ｃ．インビボ製剤試験
種々の脂質ナノ粒子が治療薬および／または予防薬を標的細胞にどの程度効率的に送達するかをモニタリングするため、特定の治療薬および／または予防薬（例えば、修飾または天然発生ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）を含む様々なナノ粒子組成物を調製し、げっ歯類集団に投与する。マウスに製剤、例えば実施例２において提供されるものを有するＬＮＰを含む単回用量を静脈内、筋肉内、動脈内、または腫瘍内投与する。一部の例において、マウスに用量を吸入させることができる。用量サイズは、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得、１０ｍｇ／ｋｇは、マウスの体重それぞれ１ｋｇ当たりＬＮＰ中の１０ｍｇの治療薬および／または予防薬を含む用量を説明する。ＰＢＳを含む対照組成物を用いることもできる。
【０４５３】
マウスへの脂質ナノ粒子の投与時、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、生物発光イメージング、または他の方法により用量送達プロファイル、用量応答、ならびに特定の製剤の毒性およびその用量を計測することができる。ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子について、タンパク質発現の経時変化を評価することもできる。評価のためにげっ歯類から回収される試料としては、血液、血清、および組織（例えば、筋肉内注射の部位からの筋肉組織および内部組織）を挙げることができ；試料回収は、動物の屠殺を必要とし得る。
【０４５４】
ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子は、治療薬および／または予防薬の送達のための種々の製剤の効力、免疫原性および有用性の評価において有用である。ｍＲＮＡを含む組成物の投与により誘導されるより高いレベルのタンパク質発現は、より高いｍＲＮＡ翻訳および／または脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ送達効率を示す。非ＲＮＡ構成成分が翻訳機構自体に影響を与えると考えられないため、より高いレベルのタンパク質発現は、他の脂質ナノ粒子またはその不存在の場合に対して、所与の脂質ナノ粒子による治療薬および／または予防薬の送達のより高い効率を示す可能性が高い。
【０４５５】
実施例２：製剤の安定性
【０４５６】
【表２】
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【０４５７】
ある例において、ＰＥＧ２０００−ＤＭＧ構成成分が除去された低ＰＥＧ製剤を試験した。
ナノ沈殿中のポリマー包含
ポロキサマー１８８（Ｐ１８８）をナノ沈殿反応中に賦形剤として添加した。Ｐ１８８は、非イオン性および非細胞毒性であるポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）のコポリマーである。このポリマーは、静電気に非依存性の表面圧力依存様式で脂質単層と会合することが示されている（例えば、マスカリネク  ＳＡ（Ｍａｓｋａｒｉｎｅｃ  ＳＡ）ら著、バイオフィジカル・ジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．）、第８２巻、２００２年３月、ｐ．１４５３〜１４５９を参照されたい）。表面活性コポリマーとしてのＰ１８８は、脂質膜中への吸着または挿入に関与する。ＬＮＰ製剤に関して、Ｐ１８８は、ポリマーのＣＭＣにおいてまたはわずかにＣＭＣ超、すなわち約０．１％〜１％ｗ／ｖのＰ１８８において分散液に有益な影響を与える。
【０４５８】
ナノ沈殿単位操作は、乱流またはマイクロ流体混合機内での脂質含有エタノール原液および酸性化ｍＲＮＡ溶液の混合からなる。析出反応は、部分水性媒体中のエタノール含有率の減少および急速に縮小する脂質溶解度に起因して生じる。超飽和系内において、ナノ粒子は、脂質の疎水性会合およびイオン化カチオン性脂質（および媒体中の他の荷電平衡化種）によるＲＮＡの電荷捕捉の結果として形成し、成熟する。
【０４５９】
脂質組成物中に含まれるＰＥＧ−脂質のレベルは、最終粒子サイズに影響を与える（例えば、チェン  Ｓ（Ｃｈｅｎ  Ｓ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ）、第１９６巻、ｐ．１０６〜１１２、２０１５年）。ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、分散液の立体安定化を提供することが意図され、大きい粒子直径は、形成中に極めて低レベルのＰＥＧ−脂質から生じる。ナノ沈殿中、Ｐ１８８は、立体安定剤としてＰＥＧ−脂質を補い得る。図１は、ナノ沈殿においてＰ１８８の濃度が増加するにつれ、得られるＬＮＰの直径が低減されることを示す。粒子サイズは、文献ＣＭＣ値と合致し、またはそれを超過するＰ１８８濃度においてプラトーになる。
【０４６０】
Ｐ１８８により分散液に付与される安定化は、界面活性剤の両親媒性の表面活性粒子によるものであった。界面活性剤のＣＭＣ値未満では、添加されるＰ１８８分子は、界面領域、例としてＬＮＰ／水界面および他の親水性／疎水性界面（および空気／水界面）に分配される。界面活性剤の表面被覆が増加するにつれ、表面自由エネルギー（表面張力）が減少し、疎水性領域の利用可能な接触区域が減少される。ＣＭＣ値以上において、界面活性剤の継続添加は、ミセル形成を促進して系の自由エネルギーをさらに減少させる。図１に実証されるとおり、ナノ沈殿中のＬＮＰの安定化は、文献ＣＭＣ値（約０．１％）に接近するＰ１８８濃度と一致すると考えられる。
【０４６１】
ＴＦＦ中のポリマー包含
ナノ沈殿後にＬＮＰを処理するための重要な課題は、ＬＮＰ集団よりも大きいサブビジブル凝集物の形成である。タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による下流の精製および濃縮中、ナノ粒子分散液は、種々の疎水性界面、剪断力、および乱流に曝露される。典型的なＴＦＦプロセス中、膜細孔よりも大きい分子（すなわちＬＮＰ）は、膜表面に蓄積してゲルまたは濃度分極層を形成する。ＬＮＰの濃度増加は、脱安定化ストレスとして機能し、より大きい粒子状物質種を生成し得る分子間相互作用を促進する。別個の試験において、ＴＦＦは、緩衝液交換の結果として粒子直径のわずかな変化を誘導することが実証された。しかしながら、透析プロセスは、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）により検出されるとおり粒子状物質（＞１μｍ）の濃度増加ももたらした。対照的に、ＴＦＦ交換緩衝液中のＰ１８８の包含は、粒子のレベルを有意に低減させた（図２を参照されたい）。
【０４６２】
最終生成物の貯蔵前のポリマー添加
ＴＦＦ精製後、最終濾過およびバイアル充填前に安定化賦形剤の添加を介して製剤を濃縮し、またはｐＨ調整し、修飾することができる。別個の実験において、ＮａＣｌの添加により単一製剤のイオン強度を修飾した一方、Ｐ１８８の添加ありおよびなしで別個の実験群を調製した。２回以上の冷凍−解凍サイクル（取扱、調査、ラベリングなど）を必要とする見込みに起因して、−２０℃への冷凍とそれに続く室温への解凍の複数のサイクルを調査した。分散液をかなり激しい冷凍／解凍ストレスイベントに供することにより、物理的安定性の差を明らかにした。
【０４６３】
図３に示されるとおり、Ｐ１８８は、トリス／スクロース媒体に対してＬＮＰサイズ成長を有意に低減させた一方、塩（ＮａＣｌ）のさらなる添加は、サイズ制御のレベルを改善し、少なくとも１９サイクルにわたり堅牢な冷凍−解凍プロファイルをもたらした。
【０４６４】
凍結乾燥製剤の乾燥状態へのさらなる処理は、ｍＲＮＡを有するＬＮＰの安定化の機会である。凍結乾燥は、最適な処理および得られる生成物の安定性を確保するための製剤組成の追加の検討を要求する。
【０４６５】
長期貯蔵について、凍結乾燥生成物は、安定性の改善および貯蔵温度上昇の機会を提供する。従来の研究は、ＬＮＰが、両方とも凍結乾燥（冷凍−乾燥）に存在する冷凍および乾燥ストレスに感受性であることを実証した。ＬＮＰサイズ制御およびサブビジブル粒子状物質の低減について凍結乾燥製剤へのＰ１８８の添加を調査した。
【０４６６】
冷凍および凍結乾燥についての分散液の熱特性に対する塩の悪影響を考慮して、塩を凍結乾燥試験に含めなかった。代わりに、ＬＮＰのサイズを制御し、熱安定性を有する薬学的に洗練されたケーキ構造を促進するための増量剤として非結晶化二糖を調査した。二糖を含有する凍結乾燥製剤中に両親媒性ポリマーを取り込むことは、サイズ制御を改善し、サブビジブル粒子状物質を低減させることが見出された。さらに、Ｐ１８８の添加は、スクロース／トレハロース製剤についてのＴｇにより計測されるとおり熱強度を増加させた（図９を参照されたい）。
【０４６７】
ＬＮＰ粒子サイズ制御に関して、ビヒクル中のスクロース／トレハロースの固定糖組成物にＰ１８８を補給して凍結乾燥後のＬＮＰサイズに対するＰ１８８濃度の効果を調査した。図４Ａ〜４Ｂにおいて、固定スクロースおよびトレハロース含有率の存在下で２つの異なる濃度（すなわち０．５ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬ）におけるｍＲＮＡを凍結乾燥させ（図４Ａ〜４Ｂ中の「１５−１０」は、１５％のスクロースおよび１０％のトレハロースを指す）、変動レベルのＰ１８８を取り込んだ。Ｐ１８８濃度の増加は、ＬＮＰサイズ制御を改善することが明らかであり、最適範囲は、両方のＬＮＰ濃度において１．５〜２％のＰ１８８である。重要なことに、Ｐ１８８の存在は、賦形剤の割合および比を増加させずにＬＮＰ濃度の２倍化を可能とし、それは、他の製剤では可能でなかった。
【０４６８】
Ｐ１８８は、凍結乾燥プロセスにおいて生成されるサブビジブル粒子状物質を低減させる。図５は、Ｐ１８８含有率の増加に伴うサブビジブル粒子状物質の低減を明白に実証し、最終的に、２％のＰ１８８を添加した場合に界面活性剤なしと比較して粒子濃度を１ｌｏｇだけ低減させる。さらに、２％のＰ１８８条件は、任意の製剤中において生成されるサブビジブル粒子状物質の最小濃度を示す。
【０４６９】
これまでの凍結乾燥研究のほとんどがＭＣ３ＬＮＰを中心に展開されてきたが、式（Ｉ）のイオン化可能脂質を用いる最初の研究は、類似の結果を生成した。図６Ａ〜６Ｂは、ＭＣ３ＬＮＰ製剤について上記のものと同一の条件下で凍結乾燥させた式（Ｉ）のイオン化可能脂質を含有するＬＮＰ製剤についてのサイズおよびサブビジブル粒子状物質の結果をまとめる。ｍＲＮＡの濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬであった。一部の初期試験は、両親媒性ポリマーの添加により１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ製剤の安定性を達成することもできることを示唆した。
【０４７０】
ポロキサマー１８８は、凍結乾燥中のＬＮＰのサイズ成長の最小化において極めて有効であることが実証された。他の両親媒性ポリマーも改善を実証した。二糖とともにポリソルベート２０（ＰＳ２０またはツイン２０（Ｔｗｅｅｎ２０））およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含めた。図７Ａ〜７Ｂは、ＰＳ２０およびＰＶＰを含めた場合のＬＮＰサイズ変化を実証した。図８Ａ〜８Ｃは、ＰＳ２０およびＰＶＰを含めた場合のサブビジブル粒子状物質の量の変化を実証する。試験された全ての製剤は、０．５ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡをＭＣ３ＬＮＰとともに含有した。
【０４７１】
ＬＮＰ中のワクチンｍＲＮＡ候補を用いたデータは、ＰＶＰおよびＰＳ２０製剤が４℃において少なくとも２ヵ月間安定したままであったことを示唆する。凍結乾燥生成物の熱強度および安定性の別の態様は、ガラス転移温度Ｔｇである。Ｐ１８８の添加は、スクロース／トレハロース製剤のＴｇを増加させた（図９を参照されたい）。長期貯蔵の相関が生成され得ることが多く、Ｔｇの現在の標的は、＞７０℃であり、理想的には＞７５℃である。
【０４７２】
生成物使用中におけるポリマー添加
ネブライゼーションの試験は、使用中イベント中のＬＮＰのストレス誘導変化の課題を説明する。対象の投与は、ＬＮＰに機械的ストレスを引き起こし得る振動メッシュネブライザーを使用する。両親媒性ポリマーの不存在下において、エクスビボでのネブライゼーションは、封入の有意な損失および粒子サイズの増加を引き起こすことが見出された（図１０Ａ〜１０Ｂ）。サイズおよび封入効率（ＥＥ）をネブライゼーション前および後に計測した。ネブライゼーション後にキャップからメッシュを通過しなかった分析用試料（プレメッシュと称される）およびエアロゾル化された材料（ポストメッシュと称される）を回収した。
【０４７３】
製剤緩衝液へのＰ１８８の添加は、ネブライゼーション後の封入効率を有意に改善した。Ｐ１８８は、立体障害を提供して機械的ストレス時のＬＮＰの凝集を防止し得る。いかなるポロキサマーも添加しない場合、ネブライゼーション後に封入効率は完全に損失した（図１１を参照されたい）。
【０４７４】
ネブライゼーション中の封入効率の維持は、低ｐＨ環境およびＰ１８８の取り込みの組合せ効果であると考えられる。わずかに酸性、例えば４．６のｐＨが、粒子凝集を防止し、粒子整合性を保存するのに役立つことが発見された（図１１を参照されたい）。
【０４７５】
酸性緩衝液への賦形剤の添加が封入効率を改善するという発見に基づき、いくつかの他のポリマーを製剤緩衝液中でスクリーニングした。酢酸緩衝液ｐＨ４．６にポロキサマーおよび種々の分子量のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を添加し、ネブライゼーション中のＬＮＰ統合性の保護について試験した。結果（図１２Ａおよび１２Ｂを参照されたい）は、スクリーニングされた他のポリマーと比較して封入効率および粒子サイズが最良に維持されたため、Ｐ１８８が、試験された他のポリマーよりも優れていることを示す。
【０４７６】
実施例３：凍結乾燥製剤の安定性
凍結乾燥製剤を実施例２に記載のものと同様の方法において調製した。緩衝溶液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８）中に２０ｍＭのトリス、８％のスクロース中で１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡを有する原液を透析し、次いで２０ｍＭのトリス、ｐＨ＝８中でＰ１８８を含有する賦形剤原液と混合して２５ｍＭのＬＮＰ（ＭＣ３  ５０％、ＤＳＰＣ１０％、コレステロール３８．５％およびＰＥＧ−ＤＭＧ１．５％）および２％ｗ／ｖのＰ１８８を含む製剤を生成した。安定性試験のため、ウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）イグルー型ストッパーを有するウィートン（Ｗｈｅａｔｏｎ）１型ガラスバイアル中に製剤の２ｍＬのアリコートを装入した。凍結乾燥サイクル条件を以下に列記した。
【０４７７】
冷凍：
０．５℃／分において２５℃から−６０℃に冷凍する。
−６０℃において５時間保持する。
一次乾燥
６６時間の３０ｍＴにおける−４０℃棚温度。
二次乾燥
０．５℃／分において−４０℃から１０℃に傾斜させる。
６６時間保持する。
【０４７８】
サイクル終了：
窒素をオーバーレイ処理し、密栓する。
大気に通気する。
【０４７９】
結果（図１３を参照されたい）は、全ての凍結乾燥の場合、凍結乾燥プロセスステップ（プロットのゼロ未満の時間）の結果としてサイズが増加するが、安定性について経時的に一定のままであることを示す。逆に、冷凍製剤は、経時的に継続してサイズが増加する。
【０４８０】
実施例４：冷凍製剤の安定性
製剤を実施例２に記載のものと同様の方法において調製した。適切量のトリス緩衝液、ＮａＣｌ、およびポロキサマー１８８を濃縮ｍＲＮＡ−ＭＣ３ＬＮＰ製剤中に添加して最終１ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡ濃度においてそれぞれのＬＮＰ製剤について３つの緩衝液条件を達成した。
条件Ｉ：２０ｍＭのトリス緩衝液、８％ｗ／ｖのスクロース、０．４％ｗ／ｖのＰ１８８
条件ＩＩ：２０ｍＭのトリス緩衝液、８％ｗ／ｖのスクロース
条件ＩＩＩ：２０ｍＭのトリス緩衝液、５％ｗ／ｖのスクロース、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．４％ｗ／ｖのＰ１８８
０．５ｍＬのそれぞれの製剤を２ｍＬの滅菌バイアル中に装入した。それぞれのバイアルを−２０℃において少なくとも２時間冷凍し、次いで室温に少なくとも３０分間解凍した。それぞれの冷凍／解凍（Ｆ／Ｔ）サイクルについて、それぞれのバイアルからＤＬＳ計測のために１μＬの製剤を取り出した。５回ごとのＦ／Ｔサイクルについてそれぞれのバイアルから２５μＬの製剤を取り出してリボグリーン（ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ）（登録商標）ＲＮＡアッセイ（インビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カールスバッド、カリフォルニア）を使用して封入を評価し、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）を介して粒子状物質（＞１μｍ）を評価した。合計２０回のＦ／Ｔサイクルを実施した。
【０４８１】
以下の表は、冷凍／解凍サイクル前の一部の開始時特徴付けを示す。
【０４８２】
【表３】
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【０４８３】
図１４Ａおよび１４Ｂに示されるとおり、ＭＣ３ＬＮＰは、３つ全ての緩衝液条件にわたり類似の安定性を示した。
均等物
本開示をその詳細な説明とともに記載してきた一方、上記説明は、本開示を説明するものであり、その範囲を限定するものではなく、その範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義されることを理解すべきである。他の態様、利点、および変更形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
2019525901.tif 000019
【図４Ｂ】
2019525901.tif 000020
【図５】
2019525901.tif 000021
【図６Ａ】
2019525901.tif 000022
【図６Ｂ】
2019525901.tif 000023
【図７Ａ】
2019525901.tif 000024
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2019525901.tif 000026
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【国際調査報告】
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