(57)【要約】  本開示は、ＧＰＲ９２の活性および／または発現を調節する化合物を同定するための方法を提供する。該化合物は、ペットフード製品の味および／またはおいしさを改変するために用いることができるフレーバー組成物中に含ませることができる。いくつかの非限定的な実施形態では、本開示は、（ａ）試験薬をＧＰＲ９２受容体と接触させる工程、（ｂ）ＧＰＲ９２受容体の活性を決定する工程、および（ｃ）ＧＰＲ９２受容体の活性を増加させる試験薬を前記組成物として選択する工程を含む、ＧＰＲ９２受容体の活性を調節する組成物の同定方法を提供する。
2019520789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＲ９２受容体の活性を調節する組成物を同定する方法であって、
（ａ）試験薬をＧＰＲ９２受容体と接触させる工程、
（ｂ）ＧＰＲ９２受容体の活性を決定する工程、および
（ｃ）ＧＰＲ９２受容体の活性を増加させる試験薬を前記組成物として選択する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記ＧＰＲ９２受容体が、配列番号４のアミノ酸配列を含むネコＧＰＲ９２受容体および配列番号５のアミノ酸配列を含むイヌＧＰＲ９２受容体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＰＲ９２受容体の活性を調節する組成物を同定する方法であって、
（ａ）試験薬をＧＰＲ９２受容体と接触させる工程、
（ｂ）前記試験薬と、７膜貫通ドメイン（７ＴＭ）の１または複数のアミノ酸との相互作用を決定する工程、および
（ｃ）１または複数の前記アミノ酸と相互作用する試験薬を前記組成物として選択する工程
を含む方法。
【請求項４】
前記ＧＰＲ９２受容体が、配列番号４のアミノ酸配列を含むネコＧＰＲ９２受容体および配列番号５のアミノ酸配列を含むイヌＧＰＲ９２受容体からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＧＰＲ９２受容体が、ネコＧＰＲ９２受容体であり、かつ前記方法が、前記試験薬と、ヘリックス２のArg83；ヘリックス３のGly103、Phe106、Gln107、Met110および／またはCys114；ヘリックス４のThr161および／またはHis165；ヘリックス５のAla200、Gly204および／またはPro208；ヘリックス６のPhe248、Phe252、Tyr255、Asn256および／またはLeu259；ヘリックス７のArg281、Met285および／またはVal288；および／または第２細胞外（ＥＣ２）ループのGlu182からなる群より選択される７ＴＭの１または複数のアミノ酸との相互作用を決定する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＰＲ９２受容体が、イヌＧＰＲ９２受容体であり、かつ前記方法が、前記試験薬と、ヘリックス２のArg76；ヘリックス３のGly96、Phe99、Gln100、Met103およびCys107；ヘリックス４のThr154およびHis158；ヘリックス５のAla193、Gly197およびPro201；ヘリックス６のPhe241、Phe245、Tyr248、Asn249およびLeu252；ヘリックス７のArg274、Met278およびVal281；ならびにＥＣ２ループのGlu175からなる群より選択される７ＴＭの１または複数のアミノ酸との相互作用を決定する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）後に、前記ＧＰＲ９２受容体の活性を決定する工程をさらに含む、請求項３から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＧＰＲ９２受容体リガンドを前記ＧＰＲ９２受容体に接触させる工程をさらに含む、請求項３から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＰＲ９２受容体の活性を増加させる試験薬を前記組成物として選択する工程（ｃ）をさらに含む、請求項３から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記相互作用が、部位特異的突然変異誘発、Ｘ線結晶解析、Ｘ線分光分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、架橋結合評価、質量分析、電気泳動、置換分析、およびそれらの組み合わせにより決定される、請求項３から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＧＰＲ９２受容体の活性を調節する組成物を同定する方法であって、
（a）ＧＰＲ９２受容体アゴニストをＧＰＲ９２受容体と接触させ、該ＧＰＲ９２受容体の活性を決定する工程、
（b）試験薬を前記ＧＰＲ９２受容体と接触させ、該ＧＰＲ９２受容体の活性を決定する工程、および
（c）（b）の活性が（a）の活性より大きい時、前記試験薬を前記組成物として選択する工程
を含む方法。
【請求項１２】
前記ＧＰＲ９２受容体アゴニストが、ＮＡＧ（N-アラキドノイルグリシン）、 ＦＰＰ（3、7、11-トリメチル-2、6、10-ドデカトリエン-1-イル ピロホスファート）、 ＬＰＡ（１８：０）（1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、ＣＰＡ（１８：１）（1-オレオイル-sn-グリセロ-2、3-環状ホスファート）、ＬＰＡ（１４：０）（1-ミリスチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、ＬＰＡ（１６：０）（1-パルミチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、ＬＰＡ （１８：１）（1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、ファルネシルモノホスファート （ＦＭＰ）、アルキルグリセロホスファート （ＡＧＰ、アルキルＬＰＡとしても公知）、環状ホスファチジン酸 （ＣＰＡ）； カルバ−ＣＰＡ（ＣＣＰＡ）、2-カルバ−ＣＰＡ（２ＣＣＰＡ）、3-カルバ−ＣＰＡ（３ＣＣＰＡ） およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＧＰＲ９２受容体が、配列番号４のアミノ酸配列を含むネコＧＰＲ９２受容体および配列番号５のアミノ酸配列を含むイヌＧＰＲ９２受容体からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＰＲ９２受容体が、細胞により発現され、かつ前記試験薬が該細胞と接触される、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞がカルシウム結合発光タンパク質を発現する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記カルシウム結合発光タンパク質が、クリチン、エクオリン、オベリン、それらのあらゆる組み換え体もしくは単離体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞内カルシウム量が発光検出または蛍光検出により観察される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光検出が、Fura-2 AM、Fura-2ペンタカリウム、Fura Red AM、Indo-1 AM、Indo-1ペンタカリウム、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、Calcium 3、Calcium 4、Calcium 5、Rhod-2、それらの誘導体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１６年４月１４日出願の米国仮特許出願第６２／３２２，６０１号の優先権を主張し、該仮特許出願の全体は参照により本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本開示の主題は、ＧＰＲ９２の活性および／または発現を調節する化合物を同定する方法に関する。
【０００３】
（配列表）
本明細書は、さらに、ＥＦＳを介して２０１７年４月１４日に本明細書とともに提出された配列表を参照により包含する。米国特許法施行規則１．５２条（ｅ）項（５）に準じて、「seqlistingＧＰＲ９２.txt」で特定される配列表のテキストファイルは、１４，５６７バイトであり、２０１７年４月１４日に作成された。当該配列表は、本明細書とともに電子出願され、本明細書の範囲を逸脱するものではなく、したがって新規事項を含まない。
【背景技術】
【０００４】
食用組成物の味プロファイルは、甘味、塩味、苦味、酸味、旨味、コクミなどの基本的な味を含む。味プロファイルは、遊離脂肪酸味を含むとの説明もある。これら味を生じさせる化学物質は、しばしば味物質と称される。この理論に拘束されるものではないが、味物質は、味物質とそれにより生じる味プロファイルが記憶されている脳に信号を伝達する口腔および咽喉内の味受容体によって感知されると仮定される。味受容体は、Ｇタンパク質結合受容体（GPCR）（ロドプシン様GPCRとしても知られている）のクラスＡのメンバーであるＧＰＲ９２（GPR93およびＬＰＡR5としても知られている）を含む。ＧＰＲ９２は、味細胞で発現されることが示されており（非特許文献１参照）、タンパク質加水分解物、すなわちタンパク質加水分解生成物（ペプトン）によって活性化され得る（非特許文献２および３参照）。
【０００５】
ペットフード製造業界は、高い栄養価を有するペットフード製品の提供を長年にわたり望んでいる。さらにとりわけキャットフードおよびドッグフードに関して、ペットフード製造業界は、ペットがペットフードから完全栄養を摂取できるような高レベルのおいしさを強く欲している。飼育動物、特に猫は、周知のとおり自身の食嗜好に気まぐれであり、ペットフード製品の受け入れまでにしばしば時間がかかるか、または最小限の量以外はまったく食さないことでペットフード製品の食事を拒否する。この現象はおそらく、一部には、前記飼育動物がその味覚系と嗅覚系により知覚し得る原材料の官能プロファイルの微妙な差に起因するであろう。結果として、ペットの飼い主は、彼らのペットが健康で満足した状態でいられるために頻繁にペットフードのタイプやブランドを変える。
【０００６】
味およびフレーバー技術は近年進歩しているが、ペットフード製品の味プロファイル、質感プロファイルおよび／またはフレーバープロファイルを強化するか改変することによりペットフード製品のおいしさを高めるか改変することができる化合物が依然として求められている。味の向上または改変は、望ましい特質の度合いを高めること、ペットフード製品中に存在しないかまたは何らかのせいで損失した望ましい特質を補填すること、または望ましくない特質の度合いを低減させることであるといえる。特に、ペットフード製品中の望ましい味物質の度合いを高めることが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Haid et al., Histochem. Cell Biol., 140（2）: 137-145 （2013）
【非特許文献２】Choi et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 292: G98-G112 （2007）
【非特許文献３】Choi et al. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 292（5）: G1366-75 （2007）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そのため、この分野では依然として、ペットフード製品のおいしさの向上および／または味を調節する化合物を同定する方法およびそれら化合物を含むフレーバー組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示の主題は、 ＧＰＲ９２受容体の活性を強化する、増加させるおよび／または調節する化合物を同定するための方法を提供する。同定されると、そのような化合物は、さまざまなペットフード製品に、その製品の味を向上させるために添加され得るフレーバー組成物中に含まれ得る。たとえば、本開示のいくつかの実施形態において、そのようなフレーバー組成物は、ペットフード製品の味および／またはおいしさを充分に向上させ得る量で、ペットフード製品と組み合わされる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現を強化する、増加させるおよび／または調節する化合物を同定するための方法は、配列番号１、２または３に記載のヌクレオチド配列を有するＧＰＲ９２受容体、またはその断片もしくは変異体を細胞中で発現することを含む。該方法は、さらに、ＧＰＲ９２受容体を発現している細胞を試験化合物と接触させ、該化合物存在下のＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現を、該化合物不存在下の受容体の活性および／または発現と比較して決定することを含むことができる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２受容体の活性を強化する、増加させるおよび／または調節する化合物を同定するための方法は、配列番号４、５または６に記載のアミノ酸配列を有するＧＰＲ９２受容体、またはその断片もしくは変異体を細胞中で発現することを含む。該方法は、さらに、ＧＰＲ９２受容体を発現している細胞を試験化合物と接触させ、該化合物存在下のＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現を、該化合物不存在下の受容体の活性および／または発現と比較して決定することを含むことができる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２を発現する細胞はまた、カルシウム結合発光タンパク質を発現する。いくつかの実施形態において、カルシウム結合発光タンパク質は、クリチン、エクオリン、オベリンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本開示は、（ａ）試験薬をＧＰＲ９２受容体と接触させる工程、（ｂ）ＧＰＲ９２受容体の活性を決定する工程、および（ｃ）ＧＰＲ９２受容体の活性を高める試験薬を組成物として選択する工程を含む、ＧＰＲ９２受容体の活性を調節する組成物を同定するための方法を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本開示は、（ａ）試験薬をＧＰＲ９２受容体と接触させる工程、（ｂ）試験薬とＧＰＲ９２受容体の７膜貫通（７ＴＭ）ドメインの１または複数のアミノ酸との相互作用を検出する工程、および（ｃ）１または複数の該アミノ酸と相互作用する試験薬を組成物として選択する工程を含む、ＧＰＲ９２受容体の活性を調節する組成物を同定するための方法を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、調節性化合物が相互作用するアミノ酸は、ＧＰＲ９２受容体、たとえば、たとえば配列番号４に記載される、ネコＧＰＲ９２受容体のヘリックス２のArg83；ヘリックス３のGly103、Phe106、Gln107、Met110および／またはCys114；ヘリックス４のThr161および／またはHis165；ヘリックス５のAla200、Gly204および／またはPro208；ヘリックス６のPhe248、Phe252、Tyr255、Asn256および／またはLeu259；ヘリックス７のArg281、Met285、および／またはVal288；および／または第２細胞外（ＥＣ２）ループのGlu182、およびそれらの組み合わせを１または複数含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、調節性化合物が相互作用するアミノ酸は、ＧＰＲ９２受容体、たとえば、たとえば配列番号４に記載される、ネコＧＰＲ９２受容体のArg83、Arg281、Tyr255、およびそれらの組み合わせを１または複数含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、調節性化合物が相互作用するアミノ酸は、ＧＰＲ９２受容体、たとえば、たとえば配列番号５に記載される、イヌＧＰＲ９２受容体のヘリックス２のArg76；ヘリックス３のGly96、Phe99、Gln100、Met103および／またはCys107；ヘリックス４のThr154 および／またはHis158；ヘリックス５のAla193、Gly197および／またはPro201；ヘリックス６のPhe241、Phe245、Tyr248、Asn249および／またはLeu252；ヘリックス７のArg274、Met278および／またはVal281；および／またはＥＣ２ループのGlu175、およびそれらの組み合わせを１または複数含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、調節性化合物が相互作用するアミノ酸は、ＧＰＲ９２受容体、たとえば、たとえば配列番号５に記載される、イヌＧＰＲ９２受容体のArg76、Arg274、Tyr248、およびそれらの組み合わせを１または複数含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、相互作用は、部位特異的突然変異誘発、Ｘ線結晶解析、Ｘ線分光分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、架橋結合評価、質量分析、電気泳動、置換分析、およびそれらの組み合わせにより決定される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本開示は、（ａ）ＧＰＲ９２アゴニストをＧＰＲ９２受容体と接触させる工程、（ｂ）該ＧＰＲ９２受容体の活性を決定する工程、（ｃ）試験薬をＧＰＲ９２受容体と接触させる工程、（ｄ）該ＧＰＲ９２受容体の活性を決定する工程、および（ｅ）前記（ｄ）の活性が前記（ｂ）の活性より大きい時、前記試験薬を前記組成物として選択する工程を含む、ＧＰＲ９２受容体の活性を調節する組成物を同定するための方法を提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２受容体アゴニストは、ＮＡＧ（N-アラキドノイルグリシン）、ＦＰＰ （3、7、11-トリメチル-2、6、10-ドデカトリエン-1-イル ピロホスファート）、ＬＰＡ（１８：０）（1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、ＣＰＡ（１８：１）（1-オレオイル-sn-グリセロ-2、3-環状ホスファート）、ＬＰＡ（１４：０）（1-ミリスチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、ＬＰＡ（１６：０）（1-パルミチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、ＬＰＡ（１８：１） （1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、 ファルネシルモノホスファート （ＦＭＰ）、アルキルグリセロホスファート（ＡＧＰ、アルキルＬＰＡとしても公知）、環状ホスファチジン酸（ＣＰＡ）；カルバ-ＣＰＡ （ＣＣＰＡ）、2-カルバ-ＣＰＡ（２ＣＣＰＡ）、または3-カルバ-ＣＰＡ（３ＣＣＰＡ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、前記ＧＰＲ９２受容体は細胞で発現され、前記試験薬は該細胞と接触される。いくつかの実施形態において、細胞は、カルシウム結合発光タンパク質を発現する。いくつかの実施形態において、カルシウム結合発光タンパク質は、クリチン、エクオリン、オベリン、それらのあらゆる組み換え体もしくは単離体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、細胞内カルシウム量は、発光検出または蛍光検出により観察される。いくつかの実施形態において、カルシウム感応蛍光染料は、Fura-2 AM、Fura-2ペンタカリウム、Fura Red AM、Indo-1 AM、Indo-1ペンタカリウム、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、Calcium 3、Calcium 4、Calcium 5、Rhod-2、それらの誘導体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２３】
上記では、以下の詳細な説明のよりよい理解のために、本願の特徴および技術的優位性をある程度広く概説した。本願の特許請求の範囲の主題を形成する本願のさらなる特徴および利点を、以下に説明する。開示される概念および具体的な実施態様は、本願と同じ目的を実施するために改変または他の構造を設計するための基礎として容易に利用され得ることを当業者は高く評価すべきである。そのような同等の構成は、別記の特許請求の範囲に記載される本願の意図および範囲から逸脱するものではないことも当業者は認識すべきである。本願特有であるとみなされる新規な特徴は、その構成および操作方法の両方について、さらなる目的および利点とともに、以下の説明からよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ネコＧＰＲ９２ヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】イヌＧＰＲ９２ヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図３】ヒトＧＰＲ９２ヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図４】ネコＧＰＲ９２アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】イヌＧＰＲ９２アミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図６】ヒトＧＰＲ９２アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図７】ネコ、イヌおよびヒトＧＰＲ９２のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。
【図８】ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインのヘリックスプロットを示す。
【図９】イヌＧＰＲ９２の７ＴＭドメインのヘリックスプロットを示す。
【図１０】ヒトＧＰＲ９２の７ＴＭドメインのヘリックスプロットを示す。
【図１１Ａ】図１１は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＦＰＰ（3、7、11-トリメチル-2、6、10-ドデカトリエン-1-イルピロホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ａ） は、結合化合物の構造を示す。
【図１１Ｂ】図１１は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＦＰＰ（3、7、11-トリメチル-2、6、10-ドデカトリエン-1-イルピロホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｂ）は、ＧＰＲ９２に結合している化合物のモデルを示す。
【図１１Ｃ】図１１は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＦＰＰ（3、7、11-トリメチル-2、6、10-ドデカトリエン-1-イルピロホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｃ）は、結合化合物と相互作用する推定ＧＰＲ９２アミノ酸残基を示す。
【図１２Ａ】図１２は、イヌＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＦＰＰ（3、7、11-トリメチル-2、6、10-ドデカトリエン-1-イルピロホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ａ）は、ＧＰＲ９２に結合している化合物のモデルを示す。
【図１２Ｂ】図１２は、イヌＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＦＰＰ（3、7、11-トリメチル-2、6、10-ドデカトリエン-1-イルピロホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｂ）は、結合化合物と相互作用する推定ＧＰＲ９２アミノ酸残基を示す。
【図１３Ａ】図１３は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＬＰＡ（１８：０） （1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ａ）は、結合化合物の構造を示す。
【図１３Ｂ】図１３は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＬＰＡ（１８：０） （1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｂ）は、ＧＰＲ９２に結合している化合物のモデルを示す。
【図１３Ｃ】図１３は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＬＰＡ（１８：０） （1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｃ）は、結合化合物と相互作用する推定ＧＰＲ９２アミノ酸残基を示す。
【図１４Ａ】図１４は、イヌＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＬＰＡ（１８：０） （1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ａ）は、ＧＰＲ９２に結合している化合物のモデルを示す。
【図１４Ｂ】図１４は、イヌＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＬＰＡ（１８：０） （1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｂ）は、結合化合物と相互作用する推定ＧＰＲ９２アミノ酸残基を示す。
【図１５Ａ】図１５は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＮＡＧ （N-アラキドニルグリシン）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ａ） は、結合化合物の構造を示す。
【図１５Ｂ】図１５は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＮＡＧ （N-アラキドニルグリシン）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｂ）は、ＧＰＲ９２に結合している化合物のモデルを示す。
【図１５Ｃ】図１５は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＮＡＧ （N-アラキドニルグリシン）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｃ）は、結合化合物と相互作用する推定ＧＰＲ９２アミノ酸残基を示す。
【図１６Ａ】図１６は、イヌＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＮＡＧ （N-アラキドニルグリシン）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ａ）は、ＧＰＲ９２に結合している化合物のモデルを示し、
【図１６Ｂ】図１６は、イヌＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＮＡＧ （N-アラキドニルグリシン）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｂ）は、結合化合物と相互作用する推定ＧＰＲ９２アミノ酸残基を示す。
【図１７Ａ】図１７は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＣＰＡ（１８：１） （1-オレオイル-sn-グリセロ-2、3-環状ホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ａ） は、結合化合物の構造を示す。
【図１７Ｂ】図１７は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＣＰＡ（１８：１） （1-オレオイル-sn-グリセロ-2、3-環状ホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｂ）は、ＧＰＲ９２に結合している化合物のモデルを示す。
【図１７Ｃ】図１７は、ネコＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＣＰＡ（１８：１） （1-オレオイル-sn-グリセロ-2、3-環状ホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｃ）は、結合化合物と相互作用する推定ＧＰＲ９２アミノ酸残基を示す。
【図１８Ａ】図１８は、イヌＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＣＰＡ（１８：１） （1-オレオイル-sn-グリセロ-2、3-環状ホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ａ）は、ＧＰＲ９２に結合している化合物のモデルを示す。
【図１８Ｂ】図１８は、イヌＧＰＲ９２の７ＴＭドメインへの化合物ＣＰＡ（１８：１） （1-オレオイル-sn-グリセロ-2、3-環状ホスファート）の結合のインシリコモデリングを示し、（Ｂ）は、結合化合物と相互作用する推定ＧＰＲ９２アミノ酸残基を示す。
【図１９Ａ】下記（Ａ）を用いて試験した時、選択されたクローンK1.4の応答を示し、模擬トランスフェクション細胞株からの応答も示す。（Ａ）ＬＰＡ  １４：０ （1-ミリスチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）。
【図１９Ｂ】下記（Ｂ）を用いて試験した時、選択されたクローンK1.4の応答を示し、模擬トランスフェクション細胞株からの応答も示す。（Ｂ）ＬＰＡ  １６：０ （1-パルミチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）。
【図１９Ｃ】下記（Ｃ）を用いて試験した時、選択されたクローンK1.4の応答を示し、模擬トランスフェクション細胞株からの応答も示す。（Ｃ）ＬＰＡ  １８：１ （1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート） 。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本開示の主題は、ＧＰＲ９２の活性および／または発現を調節する化合物を同定する方法に関し、該化合物は、完全栄養ペットフードまたはペット用おやつなどのさまざまなペットフード製品のおいしさを増加するおよび／または味を強化するか改変するために利用できるフレーバー組成物中に含まれ得る。
【００２６】
１．定義
本明細書で使用される用語は、通常、本発明の文脈内で各用語が使用される具体的状況において、当技術分野における通常の意味を有する。特定の用語は、以下に、または本明細書の別の箇所で、本発明の方法および組成物の説明において実施者に付加的ガイダンスおよびそれらの作製または使用方法を提供するために説明される。
【００２７】
本明細書での使用において、特許請求の範囲および／または本明細書中の用語「含む（comprising）」と対で用いられる冠詞「aまたはan」の使用は、「ひとつ」を意味することもあるが、「１以上」「少なくとも１」および「１または複数」の意味とも一致する。さらにまた、用語「有する（having）、含む（including、containingおよびcomprising）」は、互換性があり、当業者は、これら用語は非限定的（open ended）であると認識している。
【００２８】
用語「約（aboutまたはapproximately)」は、当業者によって決定される特定値に対し許容誤差範囲内であることを意味し、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの限界にある程度依存する。たとえば、「約」は、当該技術分野における慣習に従って、３以内または３超の標準偏差内を意味し得る。別の方法では、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらに好ましくはさらに１％までの範囲を意味することができる。別の方法では、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、該語は、値の１桁内、好ましくは５倍内、より好ましくは２倍内を意味することができる。
【００２９】
本明細書での使用における「味」とは、被験体の味蕾における受容体細胞の活性化によって引き起こされる感覚をいう。いくつかの実施形態において、味は、甘味、酸味、塩味、苦味、コクミ、旨味からなる群より選択することができる。いくつかの実施形態において、「味」は、遊離脂肪酸味を含むことができる（たとえば、Cartoni et al., J. of Neuroscience, 30（25）: 8376-8382 （2010）を参照。その内容は、参照により本明細書に援用される。）。いくつかの実施形態において、味は「味物質」によって被験体に誘発される。いくつかの実施形態において、味物質は合成味物質であり得る。いくつかの実施形態において、味物質は天然源から調製される。
【００３０】
本明細書での使用における「味プロファイル」とは、たとえば、１以上の甘味、酸味、塩味、苦味、旨味、コクミ、遊離脂肪酸味などの味の組み合わせをいう。いくつかの実施形態において、味プロファイルは、同一または異なる濃度で組成物中に存在する1または複数の味物質によって生成される。いくつかの実施形態において、味プロファイルは、被験体または当該分野で公知の任意のアッセイによって検出されるような、たとえば甘味、酸味、塩味、苦味、旨味、コク味および遊離脂肪酸味などの味または味の組み合わせの強さをいう。いくつかの実施形態において、味プロファイルにおける味物質の組み合わせの改変（modifying）、変更（changing）または変化（varying）は、被験体の知覚経験を変えることができる。
【００３１】
本明細書での使用における「フレーバー」とは、１または複数の感覚刺激、たとえば味（味覚的）、匂い（嗅覚的）、触感（触覚的）および温度（熱的）刺激をいう。いくつかの非限定的な実施形態において、フレーバーに曝露した被験体の知覚経験は、特定のフレーバーについて特有の経験として分類することができる。たとえば、フレーバーは、これらに限定されないが、花、柑橘類、ベリー、ナッツ、カラメル、チョコレート、ピーマン、燻製、チーズ、肉などのフレーバーとして、被験体に識別される。本明細書での使用において、フレーバー組成物は、液体、溶液、乾燥粉末、スプレー、ペースト、懸濁液およびこれらの任意の組み合わせから選択することができる。フレーバーは、天然組成物、人工組成物、ネイチャーアイデンティカルまたはこれらの任意の組み合わせであり得る。
【００３２】
本明細書で同義的に使用される場合、「香り（aroma）」および「匂い（smell）」とは、刺激に対する嗅覚応答をいう。たとえば、これらに限定するものではないが、香りは、嗅覚系の臭気受容体によって知覚される芳香物質によって引き起こされる。
【００３３】
本明細書での使用における「フレーバープロファイル」とは、知覚刺激、たとえば、甘味、酸味、塩味、苦味、旨味、コク味および遊離脂肪酸味などの味、および／または嗅覚、触覚および／または熱的刺激の組み合わせをいう。いくつかの実施形態において、フレーバープロファイルは、被験体の感覚的経験に寄与する１以上のフレーバーを含む。いくつかの実施形態において、フレーバープロファイルにおける刺激の組み合わせの改変、変更または変化は、被験体の知覚経験を変えることができる。
【００３４】
本明細書での使用における「おいしさ」とは、特定の食品に対する動物の全体的な食欲をいう。ペットフード製品の「おいしさ」が増すと、伴侶動物が該ペットフードをより楽しみかつ多く受け入れることになり、該動物の「健康的な量」のペットフード摂取を確実にする。本明細書での使用における用語ペットフードの「健康的な量」とは、伴侶動物が微量栄養素、主要栄養素およびカロリーについて、「マース社ペットケア必須栄養素規格（Mars Petcare Essential Nutrient Standards）」に定められているような健康全体的に寄与する摂取量を維持または達成することを可能にする量をいう。いくつかの実施形態において、「おいしさ」とは、一食品に対する動物の相対的な嗜好性を意味することができる。たとえば、動物が２つ以上の食品のうちの１つの食品に嗜好を示す場合、その好まれる食品はより「おいしく」、「おいしさが増した」ものである。いくつかの実施形態において、１以上の他の食品と比べられる一食品の相対的おいしさは、たとえば、並列自由選択比較、たとえば、食品の相対消費、またはおいしさを示す他の適切な嗜好尺度によって決定することができる。おいしさは、動物が「２つのボウル試験」または「対試験」と呼ばれる試験の両方の食品に等しくアクセスできる標準試験プロトコルによって決定することができる。このような選好は、動物の感覚のいずれかから生じ得るが、とりわけ、味覚、後味、嗅覚、食感または質感に関連し得る。
【００３５】
用語 「ペットフード」または「ペットフード製品」は、ネコ、イヌ、モルモット、マウス、ウサギ、トリおよびウマなどの伴侶動物による消費の意図される製品または組成物を意味する。たとえば、それらに限定するものではないが、伴侶動物は、イエネコなどの「飼い」 ネコであり得る。いくつかの実施形態において、伴侶動物は、「飼い」イヌ、たとえばイエイヌ（Canis lupus familiaris）であり得る。「ペットフード」または「ペットフード製品」は、いかなる食品、餌、スナック、食物サプリメント、液体、飲料、おやつ、おもちゃ（チュアブルおよび／または消耗品）、食事代替品または完全食も含む。
【００３６】
本明細書での使用における、 「栄養学的に完全食」とは、ペットフード製品の所定の給餌対象のために必要な栄養素を、たとえば、伴侶動物の栄養分野において広く認められているかまたは管轄当局の推奨に基づいた適切な量および比率で、すべて含んでいるペットフード製品をいう。したがって、そのような食品は、補助栄養源を追加することなく、生活を維持するための食物摂取の唯一の供給源としての役割を果たすことができる。
【００３７】
本明細書での使用における、 「フレーバー組成物」とは、動物またはヒトにおける、天然または合成の味物質、調味料、味プロファイル、フレーバープロファイルおよび／または質感プロファイルの味、匂い、フレーバーおよび／または質感を調節する、たとえば、強化する（enhancing）、倍増させる（multiplying）、促進する（potentiating）、減少させる（decreasing）、抑制する（suppressing）、または誘発する（inducing）、少なくとも１つの化合物または生物学的に許容されるその塩をいう。いくつかの実施形態において、フレーバー組成物は、化合物または生物学的に許容されるその塩の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、フレーバー組成物には、１以上の賦形剤が含まれる。
【００３８】
本明細書での使用における用語「調節する（modulates）」または「改変する（modifies）」とは、受容体の特定の活性の量、質または効果における増加または減少および／または受容体の発現、活性または機能における増加または減少をいう。本明細書での使用における「調節因子」とは、インシリコ、インビトロおよび／またはインビボのアッセイにより、たとえばアゴニスト、アンタゴニストおよびそれらの断片、変異体および模倣体などの相同体について同定された、あらゆる阻害または活性化化合物をいう。
【００３９】
本明細書での使用における、 「阻害剤」または「アンタゴニスト」 とは、対象の受容体または経路の生物学的活性および／または発現を、縮小（reduce）、減少（decrease）、阻害（block）、防止（prevent）、遅延活性化、不活性化、鈍化または下方制御する調節化合物をいう。
【００４０】
本明細書での使用における、「誘発剤」、「賦活剤」または「アゴニスト」とは、対象の受容体または経路を、増加、誘発、刺激、解放、活性化、促進、活性増強化、高感度化または上方制御する調節化合物をいう。
【００４１】
いくつかの実施形態において、「活性化合物」 は、ＧＰＲ９２受容体を調節する、すなわち、ＧＰＲ９２受容体に対し活性である化合物である。たとえば、活性化合物は、アゴニスト、アンタゴニスト、ポジティブアロステリック調節因子 （ＰＡＭ）、ネガティブアロステリック調節因子としての、または組み合わせの活性、たとえば、アゴニスト活性とともにポジティブアロステリック調節活性を示す、もしくはアゴニスト活性とともにネガティブアロステリック調節活性を示すことにより、ＧＰＲ９２受容体に対し活性といえる。
【００４２】
本明細書での使用における、用語「ベクター」および「発現ベクター」とは、適切なサイズの別のＤＮＡ配列断片をその中に組み込むことができる直線状または環状のＤＮＡ分子をいう。そのようなＤＮＡ断片（１以上）は、ＤＮＡ配列断片によってコードされる遺伝子の転写をもたらす付加的セグメントを含むことができる。該付加的セグメントとしては、これらに限定されないが、プロモーター、転写ターミネータ、エンハンサー、内部リボソーム進入部位、非翻訳領域、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点などが挙られる。発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターおよび酵母人工染色体から導かれることが多い。ベクターは、いくつかの供給源からのＤＮＡ配列を含有する組み換え分子であることが多い。
【００４３】
用語 「作動可能に連結された」 は、ＤＮＡ配列、たとえば発現ベクターにおいて用いられる場合、該配列がそれらの意図する目的を達成するために協同的に機能するように、すなわち、プロモーター配列が連結されたコード配列を介して終結シグナルまで進行する転写の開始をもたらすように配列される。
【００４４】
本明細書での使用における用語 「核酸分子」および「ヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチドの一本鎖または二本鎖の共有結合配列をいい、各ヌクレオチドの３’末端および５’末端は、リン酸ジエステル結合で連結されている。核酸分子としては、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基が挙げられ、核酸分子は、インビトロ合成で作製、または天然源から単離することができる。
【００４５】
本明細書において互換可能に用いられる用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」および「タンパク質」とは、少なくとも２つのアミノ酸の結合により形成された分子をいう。１つのアミノ酸残基と次のアミノ酸残基との連結は、アミド結合であり、ペプチド結合ともいわれる。ポリペプチドは、当該分野で公知の適切な方法、たとえば天然源からの単離、組換え発現系での発現、化学合成または酵素合成などによって得ることができる。これら用語は、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーにも、天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００４６】
本明細書での使用における用語「アミノ酸」とは、天然および合成アミノ酸ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体をいう。天然アミノ酸は、遺伝コードでコードされたもの、ならびに後から修飾されたそれらアミノ酸、たとえばヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸およびＯ-ホスホセリンなどである。アミノ酸類似体および誘導体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する、すなわち、炭素が水素、カルボキシ基、アミノ基およびＲ基に結合している化合物、たとえばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシドおよびメチオニンメチルスルホニウムを挙げることができる。このような類似体は、修飾Ｒ基（たとえば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有することができるが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学物質を意味する。
【００４７】
本明細書での使用における用語「タンパク質加水分解物」とは、たとえば、タンパク質加水分解のタンパク質分解産物をいう。タンパク質加水分解物は、タンパク質の酵素、酸性またはアルカリ加水分解により調製することができる。タンパク質加水分解物としては、ペプチド、具体的に短鎖ペプチドおよびペプトン、ならびにタンパク質の構成アミノ酸などを挙げることができる。タンパク質加水分解物としては、脂肪、たとえば、遊離脂肪酸および食肉分解産物（すなわち、動物源の分解物）なども挙げることができる。
【００４８】
本明細書において互換可能に用いられる用語「単離された」または「精製された」とは、自然に結合した構成要素から解離された核酸、ポリペプチド、または他の生物学的部分をいう。用語 「単離された」 とは、その分子が本来は見出される生物全体から分離および離散されるか、または同じ型の他の生物学的高分子が実質的に存在しない状態で存在する、ポリペプチドといえる。ポリヌクレオチドに関連する用語 「単離された」とは、本来は通常それに結合している配列の全部または一部を欠いている核酸分子、または本来は存在するがそれに結合して異種配列を有する配列、または染色体から解離した分子をいう。
【００４９】
本明細書での使用における用語「組み換え体」は、核酸分子の説明に使用することができ、その起源または操作が原因で、本来は関連するポリヌクレオチドの全部または一部とは関連しないゲノムのＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成または合成由来のポリヌクレオチドをいう。
【００５０】
本明細書での使用における用語 「融合」とは、遺伝学的または化学的手法による異なるペプチドまたはタンパク質セグメントの結合をいい、ペプチドまたはタンパク質セグメントの結合末端は、互いに直接隣接していてもよく、アミノ酸残基または他の連結基などのリンカーまたはスペーサー部分によって分離されていてもよい。
【００５１】
２．ＧＰＲ９２受容体
本開示の主題は、本開示の方法で使用するためのＧＰＲ９２受容体を提供する。本開示のＧＰＲ９２受容体は、これらに限定されないが、たとえば、ネコ、イヌまたはヒトの受容体などの哺乳類の受容体である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本開示の主題で使用するためのＧＰＲ９２受容体は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列および／または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するネコＧＰＲ９２、その断片（たとえば、それらの機能性断片）およびその変異体などを包含する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本開示の主題で使用するためのＧＰＲ９２受容体は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列および／または配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するイヌＧＰＲ９２、その断片（たとえば、それらの機能性断片）およびその変異体などを包含する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本開示の主題で使用するためのＧＰＲ９２受容体は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列および／または配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ９２、その断片（たとえば、それらの機能性断片）およびその変異体などを包含する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本開示の主題で使用するためのＧＰＲ９２受容体としては、配列番号１、２または３と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む受容体が挙げられる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本開示の主題で使用するためのＧＰＲ９２受容体としては、配列番号４、５または６と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む受容体が挙げられる。
【００５７】
２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の同一性パーセントは、最適な比較目的のために配列を整列化し（たとえば、配列との最善の整列化のために第１の配列にギャップを導入することができる）、アミノ酸残基またはヌクレオチドを対応する部位で比較することにより決定することができる。同一性パーセントは、配列中の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数が比較されることによって決定することができる（たとえば同一性％＝同一部位の数／部位の全数×１００）。
【００５８】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。２つの配列を比較するための数学的アルゴリズムの非限定的な実施例は、KarlinおよびAltschulのアルゴリズム（1990） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264 2268、改訂されたKarlinおよびAltschul（1993） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877であり、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。AltschulらのNBLASTおよびXBLASTプログラム（1990） J. Mol. Biol. 215:403 410は、そのようなアルゴリズムを包含している。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラムを用いて、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施し、本発明のヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列相同性を得ることができる。
【００５９】
BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラムを用いて、スコア＝５０、ワード長＝３で実施し、本発明のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同性を得ることができる。比較を目的とするギャップ配列を得るために、Gapped BLAST Altschul et al. （1997） Nucleic Acids Res. 25:3389 3402の記載を用いることができ、その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。別の方法として、PSI Blastを用いて、分子間の遠隔関係を検出する反復検索を実施することができる。BLAST、Gapped BLASTおよびPSI Blastプログラムを用いる際、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（たとえば、XBLASTおよびNBLAST）を用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムのさらなる非限定的な実施例は、Myers and Miller，CABIOS （1989）のアルゴリズムであり、その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。CGC配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）は、そのようなアルゴリズムを包含している。当分野で公知の配列解析のためのアルゴリズムの他の非限定的な実施例としては、TorellisおよびRobotti著（1994） Comput. Appl. Biosci.，10:3 5に記載されるようなADVANCEおよびADAM、およびPearsonおよびLipman著（1988） Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 8中に記載されるFASTAなどが挙げられ、これら開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。FASTAにおけるktupは、検索の感度およびスピードを設定する制御オプションである。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本開示の主題は、単離または精製されたＧＰＲ９２受容体および／またはその変異体およびその断片の使用を提供する。本開示の主題は、配列変異体の使用も包含する。いくつかの実施形態において、変異は、ＧＰＲ９２のヌクレオチド配列のコード領域および非コード領域のいずれかまたは両方に生じ得る。変異体は、生物における、同一遺伝子座によってコードされる実質的に相同なタンパク質、すなわち対立遺伝子変異体を含むことができる。変異体はまた、生物、たとえばネコにおける、他の遺伝子座に由来するが、ＧＰＲ９２と実質的な相同性を有するタンパク質、すなわち相同体を包含する。変異体は、ＧＰＲ９２と実質的に相同であるが、他の生物に由来するタンパク質、すなわちオルソログも含むことできる。変異体は、化学合成によって生成されるＧＰＲ９２と実質的に相同であるタンパク質も含む。変異体はまた、組み換え法によって産生されるＧＰＲ９２と実質的に相同であるタンパク質も含まれる。
【００６１】
オルソログ、相同体および対立変異体は、当技術分野で周知の方法を用いて同定することができる。これら変異体は、配列番号１、２または３で示されるヌクレオチド配列に、少なくとも約６０−６５％、約６５−７０％、約７０−７５％、約８０−８５％、約９０−９５％、約９５−９９％またはそれ以上相同な受容体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。このような核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、２または３に示されるヌクレオチド配列またはその断片にハイブリダイズすることで容易に同定することができる。いくつかの実施形態において、２つのポリペプチド（またはその領域）は、配列番号４、５または６で示されるアミノ酸配列またはその断片と、少なくとも約６０−６５％、約６５−７０％、約７０−７５％、約８０−８５％、約９０−９５％、約９５−９９％またはそれ以上相同である時、実質的に相同である。本開示の主題によれば、実質的に相同のアミノ酸配列は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、２または３に示されるヌクレオチド配列の核酸配列またはその一部にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。
【００６２】
本開示の主題の方法で使用されるＧＰＲ９２受容体は、受容体の生物学的活性を実質的に変えないアミノ酸残基（変異体）の付加、欠失または置換を有することができる。受容体の生物学的活性に影響を及ぼすことなく変化させ得るそれらの各部位または領域は、たとえば受容体細胞外ドメインの構造を調べることにより決定することができる。代替および／または付加的に、アラニン系統的変異導入法によるアミノ酸置換を許容する受容体のそれらの領域を実験的に決定することができ（Cunningham et al., Science 244, 1081-1085 （1989））、その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。アラニン系統的変異導入法において、選択されたアミノ酸残基は、生物学的活性上の効果を決定するために、個々に、中性アミノ酸（たとえば、アラニン）で置換される。
【００６３】
一般的に、保存アミノ酸の変化は、ポリペプチドの構造および／または機能を最も乱しにくいと認識されている。したがって、本開示の主題は、ＧＰＲ９２内の１または複数の保存アミノ酸変化を包含する。保存アミノ酸変化は、一般に、構造および／または機能が似ている他のアミノ酸（たとえば、サイズ、電荷および形が似ている側鎖を有するアミノ酸）による１アミノ酸の置換を含有する。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野において定義されている。これらファミリーとしては、塩基性側鎖（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖 （たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２内の１または複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換することができ、該改変されたタンパク質は、本明細書に記載される機能試験を用いて保持された機能を試験することができる。改変は、部位特異的突然変異誘発およびPCR介在性突然変異誘発などの当分野において公知の標準技術により本開示のＧＰＲ９２に導入することができる。このような置換によって生物学的活性が保持される場合、さらに置換変化を導入することができ、および／または、他の付加／欠失がなされてもよく、得られた生成物をスクリーニングしてもよい。いくつかの実施形態において、欠失または付加は、５−１０残基であり得、あるいは、２−５アミノ酸残基または１−２残基であり得る。
【００６４】
本開示の主題はまた、ＧＰＲ９２またはその断片を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の主題は、ＧＰＲ９２の融合タンパク質、またはその機能性断片、および免疫グロブリン重鎖定常領域を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の融合タンパク質としては、検出可能なマーカー、担体などの官能基、ラベル、安定化配列またはＧＰＲ９２アゴニスト結合を検出しうるメカニズムなどが挙げられる。ラベルの非限定的な実施形態としては、FLAGタグ、Hisタグ、MYCタグ、マルトース結合タンパク質および当分野において公知の他のものが挙げられる。本開示の主題はまた、そのような融合タンパク質をコードする核酸、融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターおよびそのような核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、融合は、ＧＰＲ９２のアミノ末端（Ｎ末端）またはＧＰＲ９２のカルボキシ末端（Ｃ末端）でなされ得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＧＰＲ９２は、たとえば、本開示の主題の方法において用いられる場合、その配列のＮ末端および／またはＣ末端に、付加アミノ酸を含有することができる。いくつかの実施形態において、該付加アミノ酸は、スクリーニング目的のために、ポリペプチドの固定を補助することができ、または生物学的活性の検出を容易にするために、上述のとおりポリペプチドを融合タンパク質の一部とさせることができる。
【００６６】
３．ＧＰＲ９２調節化合物の同定方法
本開示は、さらに、ＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現を調節する化合物の同定方法を提供する。たとえば、これに限定するものではないが、調節因子は、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。本開示の主題は、上述のＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現を調節する化合物を同定するためのインシリコおよびインビトロ方法を提供する。
【００６７】
３．１ インシリコ（In silico）方法
本開示の主題は、さらに、ＧＰＲ９２受容体と潜在的に相互作用する可能性のある、および／または、ＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現を調節する化合物を同定するためのインシリコ方法を提供する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、該方法としては、ＧＰＲ９２の三次元構造（３Ｄ）の予測、および推測のＧＰＲ９２調節化合物（すなわち、試験化合物）とともに予測された３Ｄ構造のスクリーニングが挙げられる。該方法は、さらに、推測化合物および受容体のアミノ酸の潜在的相互作用を分析することによって、前記推測化合物が受容体の結合部位と相互作用するかどうかを予測することも含むことができる。該方法は、さらに、化合物の３Ｄ構造が受容体の３Ｄ構造の結合部位内に収まるかどうかを決定することにより、ＧＰＲ９２に結合および／またはＧＰＲ９２の生物学的活性を調節する試験化合物を同定することも含むことができる。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本開示の方法で使用するためのＧＰＲ９２は、配列番号４、５または６のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を有する。いくつかの実施形態において、本開示の主題で使用するためのＧＰＲ９２としては、配列番号４、５または６と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む受容体、またはその断片もしくは変異体が挙げられる。いくつかの実施形態において、本開示の方法で使用するためのＧＰＲ９２は、配列番号１、２または３のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を有する。いくつかの実施形態において、本開示の主題で使用するためのＧＰＲ９２としては、配列番号１、２または３と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む受容体、またはその断片もしくは変異体が挙げられる。
【００７０】
本開示の方法を用いて試験することができる化合物（たとえば、潜在的ＧＰＲ９２調節因子）の非限定的な例としては、あらゆる小化学物質、または当分野において公知のペプチド、塩、およびアミノ酸などのあらゆる生物学的存在が挙げられる。いくつかの実施形態において、試験化合物は、小化学分子であり得る。いくつかの実施形態において、試験化合物は、タンパク質加水分解物であり得る。いくつかの実施形態において、試験化合物は、公知のＧＰＲ９２アゴニスト、たとえば、これらに限定されないが、ＮＡＧ（N-アラキドノイルグリシン）、ＦＰＰ（3、7、11-トリメチル-2、6、10-ドデカトリエン-1-イル ピロホスファート）、ＬＰＡ（１８：０）（1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、ＣＰＡ（１８：１）（1-オレオイル-sn-グリセロ-2、3-環状ホスファート）、ＬＰＡ（１４：０）（1-ミリスチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、ＬＰＡ（１６：０）（1-パルミチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、およびＬＰＡ（１８：１）（1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）であり得る。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ファルネシルモノホスファート （ＦＭＰ）、アルキルグリセロホスファート（ＡＧＰ、アルキルＬＰＡとしても公知）、環状ホスファチジン酸（ＣＰＡ）；カルバ-ＣＰＡ （ＣＣＰＡ）、2-カルバ-ＣＰＡ（２ＣＣＰＡ）、または3-カルバ-ＣＰＡ（３ＣＣＰＡ）であり得る。いくつかの実施形態において、試験化合物は、Williams, et al., The Journal of Biological Chemistry VOL. 284, NO. 25, pp. 17304−17319, June 19，2009に開示されるＧＰＲ９２アゴニストのいずれでもあり得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２受容体の構造モデルは、相同性モデリング用テンプレートとして他のGPCRの結晶構造を用いて構築することができる。たとえば、これに限定するものではないが、構造モデルは、他のクラスＡ  ＧＰCRの結晶構造を用いて創出することができる。いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２の構造モデルは、公知のクラスＡ  ＧＰCRの結晶構造の１つまたは組み合わせに基づくことができる。（たとえば、Lee et al., Eur. J Pharmacol. 2015 May 14. pii: S0014-2999（15）30012-1、およびBerman et al., Nucleic Acids Research, 28: 235-242 （2000）参照、これらの各々は参照によりその全体がそのまま本明細書に援用される）。他のクラスＡ  ＧＰＣＲの結晶構造の例としては、ヒトδオピオイド受容体の４Ｎ６Ｈ；および／またはＣＣＲ５ケモカイン受容体の４ＭＢＳ；および／またはヒトＧＰＲ４０の４ＰＨＵが挙げられる。図１１−１８は、本開示のインシリコ方法で用いることができるＧＰＲ９２の構造モデルの描写である。当分野において公知の好適なモデリングソフトウエアはいずれも用いることができる。いくつかの実施形態において、Ｍｏｄｅｌｌｅｒソフトウエアパッケージ（Eswar et al., Curr Protoc Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., Supplement 15, 5.6.1-5.6.30 （2006））および／またはI-TASSERプログラム集（Yang et al., Nature methods, 12: 7-8 （2015））を三次元タンパク質構造の創出に用いることができる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２に結合する化合物同定のインシリコ方法は、本明細書に記載のとおり、試験化合物がＧＰＲ９２相互作用ドメインの１または複数のアミノ酸と相互作用するかどうかを決定することを含む。
【００７３】
本開示のインシリコ方法によって同定される化合物は、さらに、本明細書に記載されるインビトロ方法を用いて試験することができる。
【００７４】
３．２ ＧＰＲ９２受容体結合部位
本願は、たとえば、ネコ、イヌまたはヒトＧＰＲ９２のＧＰＲ９２受容体の活性を調節する化合物であって、該受容体の１または複数のアミノ酸と相互作用する化合物のスクリーニング方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２受容体の結合部位は、受容体の７膜貫通（７ＴＭ）ドメイン内のアミノ酸を含み、本明細書に記載のとおり、インシリコモデリングを用いて受容体の相互作用マップを生成させることにより同定することができる。非限定的な一例において、７ＴＭ相互作用マップ中のアミノ酸の存在は、該残基がリガンド結合環境の近辺にあり、該リガンドと相互作用することを意味する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、前記化合物と本明細書に記載のＧＰＲ９２受容体の１または複数のアミノ酸との相互作用は、１または複数の水素結合、共有結合、非共有結合、塩橋、物理的相互作用、およびそれらの組み合わせを含むことができる。相互作用はまた、当分野において公知のリガンド受容体相互作用特有のいかなる相互作用でもよい。そのような相互作用は、たとえば、部位特異的突然変異誘発、Ｘ線結晶解析、Ｘ線もしくは他の分光分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、架橋結合評価、質量分析または電気泳動、低温顕微鏡法、公知のアゴニストに基づく置換分析、構造の決定およびそれらの組み合わせによって決定することができる。いくつかの実施形態において、相互作用は、インシリコで、たとえば、本明細書に記載されるとおり、化合物をネコまたはイヌＧＰＲ９２結合ポケットにドッキング（結合）させる、 たとえば、分子ドッキング、分子モデリング、分子シミュレーション、または他の当業者に公知の手段などの理論的手段により決定される。
【００７６】
いくつかの実施形態において、相互作用は、塩橋相互作用である。
【００７７】
いくつかの実施形態において、相互作用は、水素結合相互作用である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、相互作用は、疎水性相互作用である。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法にしたがって同定されるＧＰＲ９２受容体の活性を調節する化合物は、ＧＰＲ９２受容体の膜貫通ドメイン、たとえば７膜貫通（７ＴＭ）ドメインの１または複数のアミノ酸と相互作用する。いくつかの実施形態において、該化合物は、ヘリックス間に位置する疎水性領域を含むＧＰＲ９２活性部位の１または複数のアミノ酸と相互作用する。
【００８０】
いくつかの実施形態において、該化合物と相互作用するアミノ酸は、ＧＰＲ９２受容体、たとえば、たとえば配列番号４に記載される、ネコＧＰＲ９２受容体のヘリックス２のArg83；ヘリックス３のGly103、Phe106、Gln107、Met110および／またはCys114；ヘリックス４のThr161および／またはHis165；ヘリックス５のAla200、Gly204および／またはPro208；ヘリックス６のPhe248、Phe252、Tyr255、Asn256および／またはLeu259；ヘリックス７のArg281、Met285および／またはVal288；および／または第２細胞外（ＥＣ２）ループのGlu182を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９またはそれ以上を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態において、該化合物と相互作用するアミノ酸は、ＧＰＲ９２受容体、たとえば、たとえば配列番号４に記載される、ネコＧＰＲ９２受容体のArg83、Arg281、Tyr255、およびそれらの組み合わせを１または複数含む。いくつかの実施形態において、前記化合物は、さらに、ＧＰＲ９２受容体、たとえば、たとえば配列番号４に記載される、ネコＧＰＲ９２受容体のヘリックス３のGly103、Phe106、Gln107、Met110および／またはCys114；ヘリックス４のThr161および／またはHis165；ヘリックス５のAla200、Gly204および／またはPro208；ヘリックス６のPhe248、Phe252、Asn256および／またはLeu259；ヘリックス７のMet285および／またはVal288；および／または第２細胞外（ＥＣ２）ループのGlu182、およびそれらの組み合わせから選ばれる１または複数のアミノ酸と相互作用する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、前記化合物と相互作用するアミノ酸は、ＧＰＲ９２受容体、たとえば、たとえば配列番号５に記載される、イヌＧＰＲ９２受容体のヘリックス２のArg76；ヘリックス３のGly96、Phe99、Gln100、Met103および／またはCys107；ヘリックス４のThr154 および／またはHis158（His158はヘリックス４の末端である）；ヘリックス５のAla193、Gly197および／またはPro201；ヘリックス６のPhe241、Phe245、Tyr248、Asn249および／またはLeu252；ヘリックス７のArg274、Met278および／またはVal281；および／またはＥＣ２ループのGlu175を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９またはそれ以上を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、前記化合物と相互作用するアミノ酸は、ＧＰＲ９２受容体、たとえば、たとえば配列番号５に記載される、イヌＧＰＲ９２受容体のArg76、Arg274、Tyr248、およびそれらの組み合わせを１または複数含む。いくつかの実施形態において、前記化合物は、さらに、ＧＰＲ９２受容体、たとえば、たとえば配列番号５に記載される、イヌＧＰＲ９２受容体のヘリックス３のGly96、Phe99、Gln100、Met103および／またはCys107；ヘリックス４のThr154 および／またはHis158（His158はヘリックス４の末端である）；ヘリックス５のAla193、Gly197および／またはPro201；ヘリックス６のPhe241、Phe245、Asn249および／またはLeu252；ヘリックス７のMet278および／またはVal281；および／またはＥＣ２ループのGlu175、およびそれらの組み合わせから選ばれる１または複数のアミノ酸と相互作用する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、前記化合物は、本明細書に記載されるＧＰＲ９２受容体に相同である、たとえば、ネコまたはイヌ以外の種のＧＰＲ９２における、または本明細書に記載のＧＰＲ９２アミノ酸配列および／または核酸配列の変異体を発現するネコまたはイヌ由来の、ＧＰＲ９２受容体のアミノ酸残基に結合する
３．３  インビトロ方法
本開示の主題は、さらに、ＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現を調節する化合物を同定するインビトロ方法を提供する。
【００８５】
本開示の方法で使用するためのＧＰＲ９２受容体としては、本明細書に記載される、単離されたまたは組み換えＧＰＲ９２または細胞発現ＧＰＲ９２が挙げられる。いくつかの実施形態において、本開示の方法で使用するためのＧＰＲ９２受容体は、配列番号４、５または６、またはその断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有することができる。いくつかの実施形態において、本開示の方法において用いられるＧＰＲ９２は、配列番号４、５または６と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を有することができる。いくつかの実施形態において、本開示の方法において用いられるＧＰＲ９２は、配列番号１、２または３、またはその断片もしくは変異体のヌクレオチド配列を有することができる。いくつかの実施形態において、本開示の主題において用いられるＧＰＲ９２としては、配列番号１、２または３と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む受容体が挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現を調節する化合物を同定する方法は、試験化合物の不在および／または存在下、ＧＰＲ９２の生物学的活性を測定することを含む。いくつかの実施形態において、該方法としては、さまざまな濃度の試験化合物の存在下でのＧＰＲ９２の生物学的活性を測定することが挙げられる。方法は、さらに、試験化合物の不在下でのＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現と比較してＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現の調節をもたらす試験化合物を同定することを含むことができる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法にしたがい同定される化合物は、ＧＰＲ９２受容体の生物学的活性を、化合物が存在しない場合のＧＰＲ９２受容体の生物学的活性と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上向上させる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、方法は、さらに、２以上、３以上または４以上の組み合わせにおける試験化合物を分析することを含むことができる。いくつかの実施形態において、２以上、３以上または４以上の試験化合物は、別種の化合物、たとえば、アミノ酸、小化学物質および／またはタンパク質加水分解物であり得る。たとえば、これに限定するものではないが、方法は、１または複数のアミノ酸試験化合物の存在下、ＧＰＲ９２の生物学的活性および／または発現における１または複数の小化学試験物質の効果を分析することを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現を調節する化合物を同定する方法は、ＧＰＲ９２アゴニスト、たとえば、ＮＡＧ（N-アラキドノイルグリシン）、ＦＰＰ（3、7、11-トリメチル-2、6、10-ドデカトリエン-1-イル ピロホスファート）、ＬＰＡ（１８：０）（1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、ＣＰＡ（１８：１）（1-オレオイル-sn-グリセロ-2、3-環状ホスファート）、ＬＰＡ（１４：０）（1-ミリスチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、ＬＰＡ（１６：０）（1-パルミチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）、およびＬＰＡ（１８：１）（1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）の存在下、ＧＰＲ９２の生物学的活性および／または発現における試験化合物の効果を分析することを含む。いくつかの実施形態において、試験化合物は、ファルネシルモノホスファート （ＦＭＰ）、アルキルグリセロホスファート （ＡＧＰ、アルキルＬＰＡとしても公知）、環状ホスファチジン酸（ＣＰＡ）；カルバ-ＣＰＡ（ＣＣＰＡ）、2-カルバ-ＣＰＡ（２ＣＣＰＡ）、または3-カルバ-ＣＰＡ（３ＣＣＰＡ）であり得る。いくつかの実施形態において、試験化合物は、Williams, et al., The Journal of Biological Chemistry VOL. 284, NO. 25, pp. 17304−17319, June 19, 2009に開示されたＧＰＲ９２アゴニストのいずれでもあり得る。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現を調節する化合物を同定する方法は、化合物が受容体を、たとえば、アゴニストまたはアンタゴニストとして直接調節するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、受容体活性の活性化または阻害において、化合物が、たとえば他の化合物の効果を増強または減縮することにより、間接的に受容体の活性を調節（たとえば、アロステリック調節因子として）するかどうかを決定することを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２受容体の活性および／または発現を調節する化合物を同定する方法は、細胞株中でＧＰＲ９２受容体を発現すること、および試験化合物の存在および／または不在下で、受容体の生物学的活性を測定することを含む。方法は、さらに、試験化合物不在下での受容体の活性と比較して試験化合物存在下での受容体の活性に違いがあるかを決定することにより受容体の活性を調節する試験化合物を同定することを含むことができる。いくつかの実施形態において、推定ＧＰＲ９２調節因子の選択は、他のGPCRまたは味受容体、たとえば、旨味、脂肪酸、Ｔ１Ｒ、CaＳＲ、など受容体でのその効果を比較することにより評価することができる。
【００９１】
本開示の方法における受容体の活性化は、標識化合物および／または試薬の使用によって検出することができる。いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２受容体の活性は、第２の伝達物質、これらに限定されないが、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、ＤＡＧまたはカルシウムなどの検出によって決定することができる。いくつかの実施形態において、受容体の活性は、細胞内カルシウム量の検出によって決定することができる。観察は、カルシウム感応蛍光染料などの発光または蛍光検出方法により行い得る。いくつかの実施形態において、細胞内カルシウム量は、たとえば、細胞染色、たとえばＣａｌｃｉｕｍ ４などの蛍光カルシウム指示薬を用いて決定することができる。いくつかの非限定的な実施形態において、カルシウム感応蛍光染料は、Fura-2 AM、Fura-2ペンタカリウム、Fura Red AM、Indo-1 AM、Indo-1ペンタカリウム、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、Calcium 3、Calcium 4、Calcium 5、Rhod-2、それらの誘導体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、細胞内カルシウム量は、カルシウム結合タンパク質、たとえばカルモジュリンへのカルシウム結合レベルを測定することによって決定することができる。代替および／または付加的に、ＧＰＲ９２受容体の活性は、ＧＰＲ９２受容体の１または複数の下流タンパク質標的のリン酸化反応、転写量および／またはタンパク質量の検出によって決定することができる。
【００９２】
本開示の方法で使用される細胞株としては、ＧＰＲ９２を発現し得ればあらゆる細胞型が挙げられる。本開示の方法において使用し得る細胞の非限定的な例としては、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、アフリカミドリザル腎細胞 （COS細胞）、ゼノパス卵母細胞、HEK-293細胞およびマウス3T3線維芽細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、本方法は、HEK-293細胞においてＧＰＲ９２を発現させることを含むことができる。いくつかの実施形態において、本方法は、COS細胞においてＧＰＲ９２を発現させることを含むことができる。いくつかの実施形態において、細胞は、ＧＰＲ９２を構成的に発現する。他の実施形態において、細胞によるＧＰＲ９２の発現は誘導性である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、細胞は、カルシウム結合発光タンパク質を発現し、該発光タンパク質は、カルシウム結合すると発光する。いくつかの実施形態において、カルシウム結合発光タンパク質は、タンパク質クリチンを含む。いくつかの実施形態において、クリチンは、組み換えクリチンである。いくつかの実施形態において、クリチンは、単離されたクリチン、たとえば、Clytia gregarium由来の単離クリチンを含む。いくつかの実施形態において、カルシウム結合発光タンパク質は、タンパク質エクオリン、たとえば組み換えエクオリンまたは単離されたエクオリン、たとえばAequorea victoria由来の単離エクオリンを含む。いくつかの実施形態において、カルシウム結合発光タンパク質は、タンパク質オベリン、たとえば、組み換えオベリンまたは単離されたオベリン、たとえばObelia longissima由来の単離オベリンを含む。
【００９４】
いくつかの実施形態において、細胞におけるＧＰＲ９２の発現は、ＧＰＲ９２をコードする核酸を細胞に導入することにより行うことができる。たとえば、これに限定するものではないが、配列番号１、２または３に記載のヌクレオチド配列を有する核酸またはその断片を細胞に導入することができる。いくつかの実施形態において、細胞中への核酸の導入は、これらに限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列含有ウィルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などの当分野において公知のあらゆる方法により実施することができる。外来遺伝子の細胞への導入について数多くの技術が当分野において公知であり（たとえば、Loeffler and Behr、 Meth. Enzymol. 217:599-618 （1993）； Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 （1993）； Cline、 Pharmac. Ther. 29:69-92 （1985）参照、これらの開示は、その全体の参照によりそのまま本明細書に援用される）、本開示の主題にしたがって用いることができる。いくつかの実施形態において、該技術は、核酸が細胞により発現し得かつその子孫により継承かつ発現し得るような、核酸の細胞への安定的な一過性導入をもたらし得る。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ＰＲ９２受容体をコードする核酸は、細胞中に導入されるクローニングベクター、たとえば、ｐｃＤＮＡ3.1ベクターまたはｐｃＤＮＡ5 TOベクターに含まれる。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本方法は、ＧＰＲ９２に結合する化合物を同定することを含むことができる。方法は、ＧＰＲ９２受容体を試験化合物と接触させること、および化合物とＧＰＲ９２受容体との間の結合を測定することを含むことができる。たとえば、これに限定するものではないが、方法は、無細胞系で単離されたまたは精製されたＧＰＲ９２受容体を提供すること、および試験化合物がＧＰＲ９２受容体に結合するかを決定するために、受容体を試験化合物と無細胞系で接触させることを含むことができる。いくつかの実施形態において、方法は、細胞表面に発現したＧＰＲ９２受容体を候化合物と接触させること、および候補化合物のＧＰＲ９２受容体への結合を検出することを含むことができる。結合は、たとえば、標識した試験化合物を用いて直接的に、または間接的に測定することができる。いくつかの実施形態において、検出は、化合物がＧＰＲ９２受容体への結合により生じる細胞内での生理学的事象、たとえば、細胞内カルシウム量の増加を検出することを含む。たとえば、これに限定するものではないが、検出は、カルシウム感応蛍光染料などの蛍光検出方法、発光の検出、または当分野において公知の他のあらゆる検出方法により行うことができる。いくつかの非限定的な実施形態において、カルシウム感応蛍光染料は、Fura-2 AM、Fura-2ペンタカリウム、Fura Red AM、Indo-1 AM、Indo-1ペンタカリウム、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8、Calcium Green-1、Calcium 3、Calcium 4、Calcium 5、Rhod-2およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００９７】
いくつかの非限定的な実施形態において、インビトロアッセイは、細胞元来のＧＰＲ９２を発現する細胞を含む。そのような天然型ＧＰＲ９２を発現する細胞としては、たとえば これらに限定されないが、イヌ（canine）および／またはネコ（feline）味細胞（たとえば、初代味受容体細胞）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２を発現するイヌおよび／またはネコ味細胞は、イヌおよび／またはネコから単離され、インビトロ培養される。いくつかの実施形態において、味受容体細胞は、たとえば、イヌおよび／またはネコから単離された細胞は培養で増殖されるように、不死化され得る。
【００９８】
いくつかの実施形態において、細胞におけるＧＰＲ９２の発現は、ＧＰＲ９２遺伝子を細胞のゲノムに取り込むため、または細胞元来のＧＰＲ９２遺伝子を編集または改変するために、遺伝子編集を介して、たとえば、CRISPR遺伝子編集システムの使用によって誘発される。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２受容体に結合する化合物を同定するインビトロ方法は、本明細書に記載のとおり、試験化合物がＧＰＲ９２相互作用ドメインの１または複数のアミノ酸と相互作用するかどうか決定することを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２の調節因子として同定された化合物は、その調節活性を確認または定量するために、さらに、他の分析方法、たとえばこれに限定されないが、インビボアッセイなどにおいて試験することができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、ＧＰＲ９２調節因子が味を増強する化合物、たとえば、ＧＰＲ９２アゴニストであるかどうか決定することを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２調節因子の同定方法は、ＧＰＲ９２アゴニストに対する試験化合物の効果を比較することを含むことができる。たとえば、ＧＰＲ９２アゴニストと接触した時、受容体の活性に比べて受容体の活性を向上させる試験化合物をＧＰＲ９２調節化合物（たとえば、アゴニスト）として選択することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２調節因子の同定方法は、受容体がアゴニストと接触する時に試験化合物が受容体の活性を調節するかどうか、あるいは試験化合物がポジティブアロステリック調節因子（ＰＡＭ）の活性を調節し得るかどうかを決定することを含むことができる。受容体における該アゴニストまたはＰＡＭの効果を増加または減少させる試験化合物は、ＧＰＲ９２調節化合物として（たとえば、アロステリック調節因子として）選択することができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、本開示のＧＰＲ９２受容体調節因子は、ＧＰＲ９２調節因子の塩、たとえば、これらに限定されないが、酢酸塩またはギ酸塩を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＲ９２調節因子の塩は、イオン結合を介してカチオン（＋）（たとえば、これらに限定されないが、Al3+、Ca2+、Na+、Ｋ+、Cu2+、Ｈ+、Fe3+、Mg2+、ＮＨ4+およびＨ3Ｏ+）と結合したアニオン（−）（たとえば、これらに限定されないが、Cl-、Br-、ＣＯ32-、ＨＣＯ3-、ＯＨ-、ＮＯ3-、ＰＯ43-、ＳＯ42-、ＣＨ3ＣＯＯ-、HＣＯＯ-およびＣ2Ｏ42-）を含む。他の実施形態において、ＧＰＲ９２アゴニストの塩は、アニオン（−）とイオン結合を介してと結合したカチオン（＋）を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、本願のＧＰＲ９２調節因子は、ＧＰＲ９２受容体、たとえば、ネコ、イヌまたはヒトＧＰＲ９２、のインシリコモデリングであって、本願のＧＰＲ９２アゴニストがＧＰＲ９２受容体の結合部位内に収まる構造を含むインシリコモデリングを介して同定される。いくつかの実施形態において、インシリコ方法は、前述および本願の実施例部分で説明されるインシリコ方法を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本願のＧＰＲ９２調節因子は、ＧＰＲ９２アゴニスト化合物が、本明細書に記載され、インビトロで細胞により発現される、ＧＰＲ９２受容体を活性化および／または調節する、インビトロ方法を介して同定される。いくつかの実施形態において、インビトロ方法は、前述および本願の実施例部分で説明されるインビトロ方法を含む。
【実施例】
【０１０７】
本開示の主題は、以下の実施例を参照することによりより理解されるが、これら実施例は、本発明の例として示されるものであり、本発明の限定を意図するものではない。
【０１０８】
（実施例１）−インシリコアッセイを用いるＧＰＲ９２調節因子の同定
本実施例は、ＧＰＲ９２の推定調節因子を同定するためのネコおよびイヌＧＰＲ９２のコンピュータによるモデリングを記述する。
【０１０９】
ＧＰＲ９２受容体を選択的に調節するために利用することができるポリペプチド領域を同定するために、コンピュータによるアプローチがＧＰＲ９２受容体の三次元構造の分析に用いられた。ＧＰＲ９２受容体の７膜貫通ドメインの構造的相同性モデルをタンパク質データバンク（ＰＤＢ）から複数のクラスＡ  ＧＰCRの構造に基づいて生成した（Berman et al., Nucleic Acids Research, 28: 235-242 （2000）参照、参照によりその全体が本明細書に援用される）。I-TASSERプログラム集（Yang et al., Nature Methods, 12: 7-8 （2015）、参照によりその全体が本明細書に援用される）およびDassault Systemes（BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA）より入手のDiscoveryStudio（ＤＳ）プログラム集からModellerソフトウエアパッケージ（Eswar et al., Curr Protoc Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., Supplement 15, 5.6.1-5.6.30 （2006）、参照によりその全体が本明細書に援用される）を用いて相同性モデルを構築した。
【０１１０】
「インシリコ」モデリングを、受容体活性部位にドッキングした化合物と相互作用するネコおよびイヌＧＰＲ９２受容体の７膜貫通（７ＴＭ）ドメインのアミノ酸を同定するために用いた。クラスＡ  ＧＰCR受容体は、７膜貫通（７ＴＭ）ドメインを包含する。ネコ（fＧＰＲ９２）、イヌ（cＧＰＲ９２）およびヒト（hＧＰＲ９２）由来のＧＰＲ９２受容体のアミノ酸配列の配列アラインメントが実行され、全長で７７％の配列同一性（図７）が示された。ＧＰＲ９２の７ＴＭドメインは、７つの膜貫通ヘリックスからなる。図８−１０は、ｆＧＰＲ９２、ｃＧＰＲ９２およびｈＧＰＲ９２の各７ヘリックスについて、それぞれ、配列開始、停止および範囲を示すヘリックスプロットを示す。
【０１１１】
ネコＧＰＲ９２の活性部位をライニングする残基は、ヘリックス２のArg83；ヘリックス３のGly103、Phe106、Gln107、Met110およびCys114；ヘリックス４のThr161およびHis165；ヘリックス５のAla200、Gly204およびPro208；ヘリックス６のPhe248、Phe252、Tyr255、Asn256およびLeu259；ヘリックス７のArg281、Met285およびVal288；ならびに第２細胞外（ＥＣ２）ループのGlu182を含む。特に、以下に述べるように、Arg83、Arg281およびTyr255は、相同性モデルにおいて、活性部位に結合した化合物の負に帯電した頭部基および極性部分と協働する塩橋形成および水素結合相互作用により重要な役割を果たした。
【０１１２】
イヌＧＰＲ９２残基の活性部位をライニングする残基は、ヘリックス２のArg76；ヘリックス３のGly96、Phe99、Gln100、Met103およびCys107；ヘリックス４のThr154およびHis158（His158はヘリックス４の末端である）；ヘリックス５のAla193、Gly197およびPro201；ヘリックス６のPhe241、Phe245、Tyr248、Asn249およびLeu252；ヘリックス７のArg274、Met278およびVal281；ならびにＥＣ２ループのGlu175を含む。特に、以下に述べるように、Arg76、Arg274およびTyr248は、相同性モデルにおいて、活性部位に結合した化合物の負に帯電した頭部基および極性部分と協働する塩橋形成および水素結合相互作用により重要な役割を果たした。
【０１１３】
４つの公知のヒトＧＰＲ９２結合性化合物を、ネコおよびイヌＧＰＲ９２の各の７ＴＭドメインの活性部位にドッキングした。化合物の受容体活性部位中へのドッキングをモデル化するために、ドッキングプログラムBioDock（BioPredict, Inc.（Oradell, NJ, USA）より入手）を使用した。
【０１１４】
ＦＰＰ（3,7,11-トリメチル-2,6,10-ドデカトリエン-1-イルピロホスファート）が、ネコＧＰＲ９２におけるArg83およびArg281と潜在的な塩橋相互作用および水素結合し、ならびにTyr255と水素結合を形成することを観察した（図１１）。同様に、ＦＰＰが、イヌＧＰＲ９２におけるArg76およびArg274と潜在的な塩橋相互作用および水素結合し、ならびにTyr248と水素結合を形成することを観察した（図１２）。さらに、ＦＰＰの末尾は、ネコおよびイヌＧＰＲ９２いずれととも、疎水性接触の広範なネットワークを形成した。
【０１１５】
公知の有力なＧＰＲ９２アゴニストであるＬＰＡ（１８：０）（1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート）（Choi et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 292: G98-G112 （2007）参照、参照によりその全体が本明細書に援用される）が、ネコＧＰＲ９２におけるArg83およびArg281と潜在的な塩橋相互作用および水素結合し、ならびにTyr255と水素結合を形成することを観察した（図１３）。同様に、ＬＰＡ（１８：０）が、イヌＧＰＲ９２におけるArg76およびArg274と潜在的な塩橋相互作用および水素結合し、ならびにTyr248と水素結合を形成することを観察した（図１４）。さらに、ＬＰＡ（１８：０）の末尾は、活性部位の疎水性底部内に深く進入し、ネコおよびイヌＧＰＲ９２いずれととも、疎水性接触の広範なネットワークを形成した。
【０１１６】
ＮＡＧ（N-アラキドノイルグリシン）が、ネコＧＰＲ９２におけるArg83とArg281と潜在的な塩橋相互作用し、ならびにTyr255と水素結合を形成することを観察した（図１５）。同様に、ＮＡＧが、イヌＧＰＲ９２におけるArg76およびArg274と潜在的な塩橋相互作用をし、ならびにTyr248と水素結合を形成することを観察した（図１６）。さらに、ＮＡＧの末尾は、活性部位の疎水性底部内に深く進入し、ネコおよびイヌＧＰＲ９２いずれととも、疎水性接触の広範なネットワークを形成した。
【０１１７】
ＣＰＡ（１８：１） （1-オレオイル-sn-グリセロ-2、3-環状ホスファート）が、ネコＧＰＲ９２におけるArg83およびArg281と潜在的な塩橋相互作用および水素結合し、ならびにTyr255と水素結合を形成することを観察した（図１７）。同様に、ＣＰＡ（１８：１）が、イヌＧＰＲ９２におけるArg76およびArg274と潜在的な塩橋相互作用をし、ならびにTyr248と水素結合を形成することを観察した（図１８）。さらに、ＣＰＡ（１８：１）の末尾は、活性部位の疎水性空洞内に深く進入し、ネコおよびイヌＧＰＲ９２いずれととも、疎水性接触の広範なネットワークを形成した。
【０１１８】
（実施例２）  インビトロアッセイを用いるＧＰＲ９２調節因子の同定
本実施例は、ネコＧＰＲ９２活性を調節する化合物を同定するためのインビトロアッセイを記述する。
【０１１９】
要旨：ネコリゾホスファチジン酸受容体５（ｆＬＰＡＲ５，ＧＰＲ９２）の全長を合成し、ｐｃＤＮＡ３発現ベクターにサブクローニングした。構築物は、空ベクターと並行して、ＣＨＯ／natClytinレポーター細胞株にトランスフェクションした。次いで、トランスフェクション細胞を抗生物質選択し、２回の限界希釈を実施した。陽性クローンを、発光読み出しおよびリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）参照賦活剤の１４：０ＬＰＡ、１６：０ＬＰＡおよび１８：１ＬＰＡを用いて分析した。
最高パフォーマンスのCHO／natClytin／fＧＰＲ９２クローンのＫ１．４を、リガンド薬理学およびアッセイ信頼性のために完全最適化した。得られた結果は、ＨＴＳ目的に適したｆＧＰＲ９２のための機能的細胞系アッセイを示す。
【０１２０】
結果：CHO／natClytin／fＧＰＲ９２細胞株は、ネコＧＰＲ９２受容体をコードする発現構築物とともにCHO／natClytin細胞の安定なトランスフェクションで発生し、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）リガンドを用いるＦＬＩＰＲTETRA装置で特性を明らかにした。
２つの最良の２°Ｌ.Ｄクローン第２限界希釈クローンであるＫ１．２と１．４を、アゴニストＥＣ５０確認、ＤＭＳＯ効果、シグナル経時安定性、凍結／解凍のために最適化した。Ｋ１．４を、最終検定クローンとして選択し、次いで、マルチプレート中で信頼性および再現性を明らかにした（図１９）。
【０１２１】
方法: fＧＰＲ９２ＤＮＡ配列を、Kozak配列および5'BamHI、3'XhoI末端をもつGeneArt（構築物16AA4JVP_fＧＰＲ９２_pMK-RQ）により合成した。fＧＰＲ９２をBamHI／XhoIで抽出し、同一制限酵素で切断されたpcＤＮＡ3.1発現ベクター中で一定方向にクローン化した。陽性クローンのスクリーニングのための分析は、PvuIを用いて実施し、正確なＤＮＡ断片化（４１７９＋２３２４ｐｂ）を有するクローンから、クローンＫ３を選択し、全挿入領域の配列を確認した。
【０１２２】
ネコＬＰＡＲ５全長コード配列を、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター内にクローン化した。ｐｃＤＮＡ３．１＿ｆＬＰＡＲ５構築物を、ｐｃＤＮＡ３．１空ベクターと並行して、安定的にCHO／natClytin細胞株内にトランスフェクションした。トランスフェクション細胞を２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８の存在下で生育した。抗生物質選択およびクローンプール試験の後、トランスフェクトされた標的およびモックプールの１°第１限界希釈を実施し、セレンテラジンを含む細胞を培養することにより分析した。細胞を１４：０および１６：０ＬＰＡアゴニストで刺激することにより、陽性クローン選択を行った。ＦＬＩＰＲTETRA装置を用いて受容体依存性発光を測定した。
【０１２３】
４つのモッククローンと並行して、１０の１°第１限界希釈クローンについて、異なるアゴニスト:１４：０ＬＰＡ、１６：０ＬＰＡおよび１８：１ＬＰＡに対する応答を分析した。１°第１限界希釈選択クローンは、試験したすべての試験リガンドと良好で特定の用量反応を示した。
【０１２４】
３つの最大応答クローンに２°第２限界希釈を実施した。クローン選択は、１４：０ＬＰＡおよび１６：０ＬＰＡアゴニスト刺激に基づく発光読み出しおよびを用いて行われた。次いで、６つの最良２°第２限界希釈クローンを、さらに、異なるアゴニスト:１４：０ＬＰＡ、１６：０ＬＰＡおよび１８：１ＬＰＡで特徴付けた。
【０１２５】
２つの最良２°第２Ｌ.DクローンＫ１．２と１．４を、アゴニストＥＣ５０確認、ＤＭＳＯ効果、シグナル経時安定性および凍結／解凍のために最適化した。Ｋ１．４を、最終検定クローンとして選択し、次いで、マルチプレート中で安定性および再現性を明らかにした。
【０１２６】
Ｋ１．４最終クローンについて、１４：０ＬＰＡおよび１６：０ＬＰＡを用いてＨＴＳアッセイ信頼性および再現性を評価した。１０,０００細胞／ウェル、６×３８４ＭＴＰに播種し、２４時間後に細胞を、１０μＭセレンテラジン（２０μＬ／ｗ）を含むタイロードバッファ中、３７℃で３時間および室温で１時間培養した。発光測定を、以下に示す単一注入（２×最終濃度、２０μＬ／ウェル）後、感度２８００００ゲインで１分間行った。
１４：０ＬＰＡ用量反応（３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ）の０.５％ＤＭＳＯ添加タイロード溶液。
０.５％ＤＭＳＯ添加タイロードバッファ溶液（対照参照）および１４：０ＬＰＡ ＥＣ１００値（３μＭ、シグナル参照）の０.５％ＤＭＳＯ添加タイロードバッファ溶液。
１６：０ＬＰＡ用量反応（１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ）の０.５％ＤＭＳＯ添加タイロード溶液。
０.５％ＤＭＳＯ添加タイロードバッファ溶液（対照参照）および１６：０ＬＰＡ ＥＣ１００値（１０μＭ、シグナル参照）の０.５％ＤＭＳＯ添加タイロードバッファ溶液。
【０１２７】
化合物注入後、Screenworks（著作権）ソフトウエア（Molecular Devices, バージョン3.0.1.4）を用いてＦＬＩＰＲTETRA測定分析を行い、絶対応答の最大統計（ＲＬＵ）として計算されたデータを出力した。ＲＬＵは、「サンプルｎにおける減算バイアス」 （n＝化合物注入の時点）として獲得される。
【０１２８】
平均および標準偏差値を、Microsoft Excel ソフトウエアで出力データに基づいて算出し、次いで、値を用いて、シグモイド用量反応曲線（勾配変化のある法面）または、GraphPad PRISM（登録商標）ソフトウエア（バージョン７）によるヒストグラムを作成した。
【０１２９】
得られた値を用いて、下記の式にしたがい、ＥＣ５０値を算出した。
ＥＣX＝［（Ｘ／１００−Ｘ）１／傾き］＊ＥＣ５０
下記の式にしたがい、ロバストＺプライム（ｒＺ’）、最小（対照参照，ＣＲ）ウェルシグナルおよび最高（シグナル参照，ＳＲ）ウェルシグナルについて、プレート内ばらつきおよびプレート間ばらつきを算出した。
【０１３０】
【数１】
2019520789.tif 000003
【０１３１】
細胞株、培地および培養条件
ＣＨＯ／natClytin細胞を、natClytin発光タンパク質耐性として、５ｍＬの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム（BioWittaker cat.ＢＥ１３−１１５Ｅ）、２５ｍＬの７．５％炭酸水素ナトリム（BioWittaker cat.ＢＥ１７−６１３Ｅ）、６．５ｍＬの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（BioWittaker cat.ＢＥ１７−７３７Ｅ）、５ｍＬの１００×ペニシリン／ストレプトマイシン（BioWittaker cat. ＤＥ１７−６０２Ｅ）、５０ｍＬのウシ胎児血清（Euroclone cat. Nｏ．:ＥＣＳ ０１８０Ｌ）および０．２５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬピューロマイシン（InvivoGen cat. Ant-pr-1）を添加した培地ＤＭＥＭ Ｆ−１２（１：１）混合物（BioWittaker cat.ＢＥ０４−６８７Ｆ／Ｕ１）で培養した。
【０１３２】
２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（InvivoGen cat. Ant-gn-5）を添加した標準培地を用いてＣＨＯ／natClytin／fＬＰＡR５細胞を選択し、次いで１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を添加した標準培地で保持した。
【０１３３】
細胞維持および増殖
標準増殖条件は、T７５フラスコ中３×１０５細胞固定し、約８−１０×１０６細胞／T７５フラスコ（３−４日後）を回収することからなる。代わりに、７０−８０％コンフルエントな細胞集団を３−４日ごとに１：２０−１：３０希釈した。３８４ＭＴＰにおける実験のための標準播種条件は、１０，０００細胞／ウェルで播種し、２４時間後に分析した。細胞を穏やかなＰＢＳ洗浄により分割し、次いでトリプシン−ＥＤＴＡ溶液とともに３７℃で５分培養した。分離された細胞を完全培地で希釈し、BECKMAN COULTER Z1TM 粒子計数機を用いて計数し、所望数の細胞を新たなフラスコに固定するかまたは付着性実験に使用した。
【０１３４】
凍結培地を以下のとおり調製した：９０％ＦＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ。凍結条件は、１ｍＬの凍結培地中、８−１０×１０６細胞（７０−８０％コンフルエンス）であった。解凍手順は以下の通りであった：細胞を液体窒素から取り出し、ただちに３７℃水浴中に浸漬してすばやく解凍する。解氷後ただちに、７０％エタノールまたは同等物でバイアルの外側を滅菌する：完全培地を含むＴ７５フラスコにバイアルの内容物を移す。フラスコを３７℃、５％CO2を含む加湿培養器内に置く。翌日、回復をチェックし、付着細胞が８０％のコンフルエンスに達する継代培養を行う。
【０１３５】
バッファおよびリガンド
タイロードバッファ／ハウス溶液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ HepesのｐＨ７．４水溶液；滅菌濾過し、加圧滅菌した。）。
【０１３６】
ＬＰＡリガンド:１４：０ＬＰＡ （1-ミリスチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート，ナトリウム塩）、Avanti Polar Lipids，cat. 857120P；１６：０ＬＰＡ（1-パルミチル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート，ナトリウム塩）、Avanti Polar Lipids，cat. 857123P；１８：１ ＬＰＡ （1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート，ナトリウム塩）、Avanti Polar Lipids，cat. 857130P。
【０１３７】
３７℃で加温し、Branson 3200 超音波水槽内で２０分間超音波処理して調製された１００％ＤＭＳＯ中の５ｍＭストック溶液。ガラス瓶中−２０℃で保存されたアリコート。用量反応は、常に、脂肪酸フリーの０．０１％ＢＳＡが添加されたがタイロードバッファが調製され、ただちに使用された。ウシ胎児血清（ＢＳＡ）脂肪酸フリー：Sigma，cat. A8806、使用直前に調製された１％タイロードバッファ溶液。セレンテラジン：PharmaTech Int.，cat. CAS 55779-48-1，ＤＭＳＯ−グルタチオンで調製された１０ｍＭストック溶液、−２０℃でアリコート中で保存された。希釈標準液は、使用直前にタイロードバッファで調製された。
【０１３８】
機器および消耗品
実験作業は、ＩＣＣＤカメラFLIPRTETRA（Molecular Devices社）を用いて行った。分析は、３８４ウェルポリスチレン検定プレート中で行った。細胞培養フラスコ：７５ｃｍ２フラスコ  CORNING，cat. 430641。試験プレート：３８４ウェル組織培養処理マイクロプレート（ＭＴＰ），ブラック／透明底板：MATRIX cat. 4332。化合物プレート：３８４ウェル：ポリプロピレン検定プレート，Ｖ底：ＭATRIX，cat. 4312.
本開示の主題およびその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、本明細書においてさまざまな変更、置換および改変がなされ得ると理解されよう。さらに、本発明の範囲は、本明細書に記載された具体的な実施形態のプロセス、装置、製造および物質の組成、手段、方法および工程に限定されることを意図するものではない。本開示の主題の説明から当業者は容易に理解するとおり、本明細書に存在するか、または本明細書に開示された実施形態に対応して実質的に同等の機能を果たすかもしくは実質的に同等の結果を達成するものとして後から開発されるプロセス、装置、製造および物質の組成、手段、方法および工程は、本開示の主題にしたがい利用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、装置、製造、物質の組成、手段、方法またはステップをその範囲内に包含することが意図されている。
【０１３９】
本明細書に引用される特許、特許出願、刊行物、製品の説明およびプロトコルの開示は、あらゆる目的のためにそのすべてが参照により本明細書に援用される。
【図１】
2019520789.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【配列表】
2019520789000001.app
【国際調査報告】
2019520789.tif 000037
2019520789.tif 000038