(57)【要約】  本発明は、測定用生物学的サンプルを分類する方法であって、前記方法が、少なくとも１つの測定曲線と呼ばれる、前記測定用生物学的サンプルのＤＮＡ融解曲線を少なくとも１つ取得すること；前記少なくとも１つの測定曲線に由来するディスクリプタの分析によって、異なる可能グループの中から所定グループに前記測定用生物学的サンプルが属していることを決定すること；を含み、前記ディスクリプタが、各測定曲線の二次導関数の１以上の点を含み、および／または、各測定曲線の２次導関数の１つ以上の点、および／または各測定曲線の１つ以上の点、および／または各測定曲線の１つ以上の百分位数を含むことを特徴とする、前記方法に関する。本発明は、また、この方法を実施するデバイス（１００）に関する。
2019511242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定用生物学的サンプルを分類する方法であって、
前記方法が、
−  少なくとも１つの測定曲線と呼ばれる、前記測定用生物学的サンプルの少なくとも１つのＤＮＡ融解曲線の取得（９）；
−  前記少なくとも１つの測定曲線に由来するディスクリプタの分析による、異なる可能グループの中の所定グループに前記測定用生物学的サンプルが属していることの決定（１０）；
を含み、
前記ディスクリプタが、各測定曲線の二次導関数の１以上の点を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記ディスクリプタが、各測定曲線の一次導関数の１以上の点を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ディスクリプタが、各測定曲線の１以上の点を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ディスクリプタが、各測定曲線の１以上の百分位数を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記決定（１０）が、ランダムフォレスト法による決定を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、学習（６）を含み、その学習（６）が、
−  異なる初期グループに属する異なる基準用生物学的サンプルから開始される、基準曲線と呼ばれる異なるＤＮＡ融解曲線の取得（１）；それに続く、
−  基準曲線から開始するディスクリプタの決定（２，３）；それに続く、
−  前記ランダムフォレスト法によるいくつかの木の構築を含む、前記ランダムフォレスト法による森林の構築（８）であって、各木の各ノードで検討される１つ又は複数の変数が、１以上のディスクリプタを含み、各木の各葉が、異なる可能グループのうちの１つのグループにのみ相当する、前記構築；
を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ディスクリプタの決定（２，３）が、
−  ディスクリプタの予備決定（２）；次いで、
−  特定の不要なディスクリプタの削除（３）；
を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法
【請求項８】
特定のディスクリプタの削除（３）が、０．９５を超えるピアソン相関係数をペアで表示するディスクリプタの組毎に、１つのディスクリプタだけを保留することを含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
−  異なる基準曲線を取得した後におけるいくつかの基準曲線の識別であって、前記基準曲線が、あいまいなグループと呼ばれる同じ初期グループに相当し、かつ、いくつかのサブグループに分離されたプロファイルを有する、前記識別；及び
−  いくつかの可能グループへのこのあいまいなグループの分離（４）；
を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
−  異なる基準曲線を取得した後におけるいくつかの基準曲線の識別であって、前記基準曲線が、併合されたグループと呼ばれるいくつかの初期グループに相当し、そして、１つだけのグループ内で組み合わされたプロファイルを有する、前記識別；及び
−  １つだけの可能グループへのこれらの組み合わされたグループの統一（５）；
を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定用生物学的サンプルが所定グループに属することを決定する工程の信頼インデックスの計算をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記信頼インデックスの計算が、
−  前記所定グループに属する基準曲線間同士の平均近似性の分布についての計算；
−  前記所定グループに属する基準曲線と前記の少なくとも１つの測定曲線との平均近似性についての計算；及び
−  前記所定グループに属し、そして前記の少なくとも１つの測定曲線と前記所定グループに属する前記基準曲線との平均近似性よりも小さいものである、前記所定グループに属する他の基準曲線への平均近似性を有する、基準曲線のレベルの計算；
を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定用生物学的サンプルが所定グループに属することを決定する工程の後に、信頼インデックスの値の関数として、何らかの任意のグループに前記測定用生物学的サンプルを割り当てることを拒絶することをさらに含むことを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定用生物学的サンプルの少なくとも１つのＤＮＡ融解曲線の取得が、いくつかの標的ＤＮＡ分子を標的とするいくつかのプライマーペアの同時存在下で得られたＰＣＲの結果の少なくとも１つの融解曲線の取得を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
測定用生物学的サンプルを分類するデバイス（１００）であって、
そのデバイスが、
−  少なくとも１つの測定曲線と呼ばれる測定用生物学的サンプルの少なくとも１つのＤＮＡ融解曲線を取得（９）するために配置および／またはプログラムされた手段（１０１）；
−  前記測定用生物学的サンプルが、前記少なくとも１つの測定曲線に由来するディスクリプタの分析によって、異なる可能グループの中から所定グループに属することを決定（１０）するためにプログラムされた手段（１０２）；
を含み、
前記ディスクリプタが、各測定曲線の二次導関数の１つ以上の点を含むことを特徴とする、前記デバイス。
【請求項１６】
前記ディスクリプタが、各測定曲線の一次導関数の１つ以上の点を含むことを特徴とする、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記ディスクリプタが、各測定曲線の１つ以上の点を含むことを特徴とする、請求項１５又は１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記ディスクリプタが、各測定曲線の１つ以上の百分位数を含むことを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
決定（１０）するためにプログラムされた手段（１０２）が、ランダムフォレスト法によって決定（１０）するためにプログラムされた手段（１０２）を含むことを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記デバイスが、学習のために配置および／またはプログラムされた手段（１０１，１０２）を含み、
−  基準曲線と呼ばれる異なるＤＮＡ融解曲線を取得（１）するために配置および／またはプログラムされ、そして、異なる初期グループに属する異なる基準用生物学的サンプルから出発する手段（１０１）；それに続く、
−  前記基準曲線から前記ディスクリプタを決定（２，３）するために配置および／またはプログラムされた手段（１０２）；それに続く、
−  前記ランダムフォレスト法によっていくつかの木を構築（８）するために配置および／またはプログラムされた手段（１０２）を含む、前記ランダムフォレスト法によって森林を構築するために配置および／またはプログラムされた手段（１０２）であって、各木の各ノードで検討された１つまたは複数の変数が 、１つまたは複数のディスクリプタを含み、各木の各葉が、異なる可能グループの中から１つのグループのみに相当する、前記手段（１０２）；
を含むことを特徴とする、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記ディスクリプタを決定（２，３）するためにプログラムされた手段（１０２）が、
−  ディスクリプタを予備決定（２）するためにプログラムされた手段（１０２）；
−  その予備決定の後に、特定の不要なディスクリプタを削除（３）するためにプログラムされた手段（１０２）；
を含むことを特徴とする、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
特定のディスクリプタを削除（３）するためにプログラムされた手段（１０２）が、０．９５より大きいピアソン相関係数をペアで表示するディスクリプタの組毎に、１つのディスクリプタだけを保留するためにプログラムされた手段（１０２）を含むことを特徴とする、請求項２１に記載のデバイス。
【請求項２３】
−  あいまいなグループと呼ばれる同じ初期グループに相当し、更にいくつかのサブグループに分離されたプロファイルを有するいくつかの基準曲線を、異なる基準曲線の取得後に識別するためにプログラムされた手段（１０２）；及び
−  このあいまいなグループをいくつかの可能グループへ分離（４）するためにプログラムされた手段（１０２）；
を含むことを特徴とする、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２４】
−  併合されたグループと呼ばれるいくつかの初期グループに相当し更に１つのグループに組み合わされたプロファイルを有するいくつかの基準曲線を、異なる基準曲線の取得後に識別するためにプログラムされた手段（１０２）；及び
−  これらの併合されたグループを１つの可能グループに統一（５）するためにプログラムされた手段（１０２）；
を含むことを特徴とする、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記測定用生物学的サンプルが所定グループに属することを決定するための前記工程の信頼インデックスを計算するためにプログラムされた手段（１０２）を更に含むことを特徴とする、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記信頼インデックスを計算するためにプログラムされた手段（１０２）が、
−  前記所定グループに属する基準曲線間同士の平均近似性の分布を計算するためにプログラムされた手段（１０２）；
−  前記所定グループに属する前記基準曲線と前記の少なくとも１つの測定曲線との平均近似性を計算するためにプログラムされた手段（１０２）；及び
−  前記所定グループに属し、更に、前記の少なくとも１つの測定曲線と前記所定グループに属する前記基準曲線との平均近似性よりも小さいものである、前記所定グループに属する他の基準曲線への平均近似性を有する、基準曲線のレベルを計算するためにプログラムされた手段（１０２）；
を含むことを特徴とする、請求項２５に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記信頼インデックス値の関数として、何らかの任意のグループに前記測定用生物学的サンプルを割り当てることを、前記測定用生物学的サンプルが所定グループに属することを決定する工程の後に、拒絶するためにプログラムされた手段（１０２）を更に含むことを特徴とする、請求項２５又は２６に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプルを分類する方法、およびそれに関連するデバイスに関する。
【０００２】
このようなデバイスによって、ユーザは、いくつかの可能グループの中から生物学的サンプルを分類することができる。本発明の技術分野は、生物学的分類についての分野である。
【背景技術】
【０００３】
公知の文献（ＷＯ２０１３／１６６３７３）には、細胞サンプルまたは被験体におけるＩＬ−６／ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の調節状態を決定する方法が記載されている。細胞サンプルまたは被験体におけるＩＬ−６／ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の調節状態は、発現サインの１６個の遺伝子のうちの１個または複数の発現レベルに基づいて分析することができる。バイオマーカー発現は、好ましくは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法を用いたＲＴ−ＰＣＲによって決定され、そして、発現データは、ランダムフォレスト法を用いて、対照サンプルと分析及び比較される。選択された変数（このケースでは１６個の遺伝子）の決定は、この問題に特有であり、そして新しい問題毎に手動で実施しなければならない。
【０００４】
グループ内において生物学的サンプルを分類する方法については、特に可能グループの数が多い場合には、例えば、以下のいくつかの技術的問題が生じる可能性がある：
−分類の細かさをどのように向上させるのか、および／または
−既知のグループに属していないサンプルをどのように扱うことができるか、
−変数を手動で選択することなく、どのように方法を自動化するのか。
【０００５】
本発明の目的は、これらの問題の少なくとも１つを解決することである。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的は、測定用生物学的サンプルを分類する方法であって、
その方法が、
−  少なくとも１つの測定曲線と呼ばれる、前記測定用生物学的サンプルの少なくとも１つのＤＮＡ融解曲線の取得（好ましくは、技術的反復とも呼ばれる、前記測定用生物学的サンプルのいくつかのＤＮＡ融解曲線の取得）（通常は、各測定曲線が異なる点（ｐｏｉｎｔ）を含み、各点が温度の関数として前記測定用サンプルのＤＮＡのレベルまたは変性量に比例する量に相当するか、またはそのレベルまたは変性量を代表する量に相当する）；
−  前記生物学的サンプルが、前記の少なくとも１つの測定曲線に由来するディスクリプタ（ｄｅｓｃｒｉｐｔｅｕｒ）の分析による、異なる可能グループの中の所定グループに属することの決定；
を含み、
前記ディスクリプタが、
−  各測定曲線の一次導関数の１つ以上（好ましくは、いくつか）の点、および／または、各測定曲線の二次導関数の１つ以上（好ましくは、いくつか）の点；および／または
−  各測定曲線の一次導関数の１つ以上（好ましくは、いくつか）の点、及び各測定曲線の二次導関数の１つ以上（好ましくは、いくつか）の点；および／または
−  各測定曲線の１つ以上の点；および／または
−  各測定曲線の１つ以上の百分位数；
を含むことを特徴とする、前記方法
によって達成される。
【０００７】
前記測定用生物学的サンプルの少なくとも１つのＤＮＡ融解曲線の取得は、（例えば、いくつかの病原体に相当する）いくつかの標的ＤＮＡ分子を標的とするいくつかのプライマーペアの同時存在下で得られたＰＣＲの結果の少なくとも１つの融解曲線の取得を含むことができる。これは、「マルチプレックス」条件と呼ばれる。この実施形態は、検索のスピードアップ、例えば、全く同一である生物学的サンプル中に一緒に存在することはめったにないいくつかの病原体に有用である。例えばサンプル中に一緒に存在するいくつかの病原体のまれなケースを同定する：通常、融解曲線は、存在する病原体と同じくらいの多くの変曲点を有する；それゆえ、異なる「所定グループ」は、これらの異なる病原体の存在の異なる組み合わせを含むことができる。
【０００８】
前記決定は、ランダムフォレスト法による決定を含むことができる。本発明による方法は、学習を含むことができ、その学習は、以下を含む：
−  学習前に決定された異なる既知の初期グループに属する異なる基準用生物学的サンプルから出発して、基準曲線と呼ばれる、異なるＤＮＡ融解曲線の取得すること；それに続く、
−  前記基準曲線からディスクリプタを決定すること；それに続く、
−  ランダムフォレスト法によるいくつかの木の構築を含む、ランダムフォレスト法による森林の構築であって、各木が、各ノードにおいて、閾値に関連するディスクリプタの１つの使用を含み、そして、その各木が、前記基準曲線を２つのサブセットに分離することを可能にし、各木の各葉が、異なる可能グループの中の１つのグループにのみに相当する、前記構築。
【０００９】
前記ディスクリプタの決定は、以下を含むことができる：
−  ディスクリプタの予備的決定；それに続く、
−  特定の不要なディスクリプタの削除。
【００１０】
特定のディスクリプタの削除は、０．９５より大きいピアソン相関係数をペアで表示するディスクリプタの組毎に、１つのディスクリプタだけの保留を含むことができる。
【００１１】
本発明による方法は、以下を含むことができる：
−  異なる基準曲線の取得後に（および／または、好ましくは、木の構築前に）、
あいまいなグループと呼ばれる、同じ初期グループに相当し、更にいくつかのサブグループに分離されたプロファイルを有する、いくつかの基準曲線の識別すること；
−  このあいまいなグループをいくつかの可能グループに分離すること。
【００１２】
本発明による方法は、以下を含むことができる：
−  異なる基準曲線の取得後に（および／または、好ましくは、木の構築後に）、
併合されたグループと呼ばれる、いくつかの初期グループに相当し、そして、１つのグループだけに組み合わされたプロファイルを有する、いくつかの基準曲線を識別すること；および
−  これらの併合されたグループを１つの可能グループだけに統一すること。
【００１３】
本発明による方法は、前記測定用生物学的サンプルが所定グループに属することを決定するための工程の信頼インデックスの計算をさらに含むことができる。信頼インデックスの計算は、以下を含むことができる：
−  前記所定グループに属する基準曲線間同士の平均近似性の分布の計算；
−  少なくとも１つの測定曲線と前記所定グループに属する基準曲線との平均近似性の計算；および
−  前記所定グループに属し、更に、前記の少なくとも１つの測定曲線と前記所定グループに属する前記の他の基準曲線との平均近似性よりも小さいものである、前記所定グループに属する他の基準曲線への平均近似性を有する、基準曲線のレベルの計算。
【００１４】
本発明による方法は、前記測定用生物学的サンプルが所定グループに属することを決定するための工程の後に、信頼インデックス値の関数として、何らかの任意のグループに前記測定用生物学的サンプルを割り当てることを拒絶することをさらに含むことができる。
【００１５】
本発明のさらに別の観点によれば、測定用生物学的サンプルを分類するためのデバイスが提案され、このデバイスは、
−  少なくとも１つの測定曲線と呼ばれる、前記測定用生物学的サンプルの少なくとも１つのＤＮＡ融解曲線の取得（好ましくは、技術的反復とも呼ばれる、前記測定用生物学的サンプルのいくつかのＤＮＡ融解曲線の取得）（通常は、好ましくは各測定曲線が異なる点を含み、各点が、温度の関数として、前記測定用サンプルのＤＮＡのレベルまたは変性量に比例する量に相当するか、またはそのレベルまたは変性量を代表する量に相当する）するように配置および／またはプログラムされた手段；
−  前記生物学的サンプルが、前記の少なくとも１つの測定曲線に由来するディスクリプタの分析によって、異なる可能グループの中から所定グループに属することを決定するように配置および／またはプログラムされた手段；
を含み、
前記ディスクリプタが、
−  各測定曲線の一次導関数の１つ以上（好ましくは、いくつか）の点、および／または、各測定曲線の二次導関数の１つ以上（好ましくは、いくつか）の点；および／または
−  各測定曲線の一次導関数の１つ以上（好ましくは、いくつか）の点、及び各測定曲線の二次導関数の１つ以上（好ましくは、いくつか）の点；および／または
−  各測定曲線の１つ以上の点；および／または
−  各測定曲線の１つ以上の百分位数；
を含むことを特徴とする。
【００１６】
前記決定するために配置および/またはプログラムされた手段は、好ましくは、ランダムフォレスト法により決定するために配置および/またはプログラムされた手段を含む。本発明による前記デバイスは、学習するために配置および/またはプログラムされた手段を含むことができ、その学習は、以下を含む：
−  学習前に決定された異なる既知の初期グループに属する異なる基準用生物学的サンプルから出発して、基準曲線と呼ばれる、異なるＤＮＡ融解曲線を取得するために配置および/またはプログラムされた手段；それに続く、
−  前記基準曲線からディスクリプタを決定するために配置および/またはプログラムされた手段；それに続く、
−  前記ランダムフォレスト法によって木を構築するために配置および/またはプログラムされた手段であって、その手段が、前記ランダムフォレスト法によっていくつかの木を構築するために配置および/またはプログラムされた手段を含み、各木が、各ノードにおいて、閾値に関連するディスクリプタの１つの使用を含み、そして、その各木が、前記基準曲線を２つのサブセットに分離することを可能にし、各木の各葉が、異なる可能グループの中の１つのグループにのみに相当する、前記手段。
【００１７】
ディスクリプタを決定するために配置および／またはプログラムされた手段は、以下を含むことができる：
−  ディスクリプタの予備的決定のために配置および／またはプログラムされた手段；
−  予備的決定の後に、特定の不要なディスクリプタを削除するために配置および／またはプログラムされた手段。
【００１８】
特定のディスクリプタを削除するために配置および／またはプログラムされた手段は、０．９５より大きいピアソン相関係数をペアで表示するディスクリプタの組毎に、１つのディスクリプタだけの保留を含むために配置および／またはプログラムされた手段を含むことができる。
【００１９】
本発明による前記デバイスは、以下を含むことができる：
−  異なる基準曲線の取得後に（および／または、好ましくは、木の構築前に）、
あいまいなグループと呼ばれる、同じ初期グループに相当し、更にいくつかのサブグループに分離されたプロファイルを有する、いくつかの基準曲線の識別するために配置および／またはプログラムされた手段；及び
−  このあいまいなグループをいくつかの可能グループに分離するために配置および／またはプログラムされた手段。
【００２０】
本発明による前記デバイスは、以下を含むことができる：
−  異なる基準曲線の取得後に（および／または、好ましくは、木の構築後に）、
併合されたグループと呼ばれる、いくつかの初期グループに相当し、そして、１つのグループだけに組み合わされたプロファイルを有する、いくつかの基準曲線を識別するために配置および／またはプログラムされた手段；及び
−  これらの併合されたグループを１つの可能グループだけに統一するために配置および／またはプログラムされた手段。
【００２１】
本発明による前記は、前記測定用生物学的サンプルが所定グループに属することを決定するための工程の信頼インデックスの計算をさらに含むことができる。前記信頼インデックスを計算するために配置および／またはプログラムされた手段は、好ましくは、以下を含む：
−  前記所定グループに属する基準曲線間同士の平均近似性の分布を計算するために配置および／またはプログラムされた手段；
−  少なくとも１つの測定曲線と前記所定グループに属する基準曲線との平均近似性を計算するために配置および／またはプログラムされた手段；および
−  前記所定グループに属し、更に、前記の少なくとも１つの測定曲線と前記所定グループに属する前記の他の基準曲線との平均近似性よりも小さいものである、前記所定グループに属する他の基準曲線への平均近似性を有する、基準曲線のレベルを計算するために配置および／またはプログラムされた手段。
【００２２】
本発明による前記デバイスは、前記測定用生物学的サンプルが所定グループに属することを決定するための工程の後に、信頼インデックス値の関数として、何らかの任意のグループに前記測定用生物学的サンプルを割り当てることを拒絶するために配置および／またはプログラムされた手段をさらに含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明の他の利点および特徴は、決して限定的ではない実施および実施形態の詳細な説明、および以下の添付図面を読むことにより明らかになるであろう。
−図１は、本発明による方法の好ましい実施形態のフローチャートである。
−図２は、本発明による方法の実施を学ぶための、いくつかのいわゆる「基準」融解曲線１２を示す。
−図３は、以下を示す：
○サンプルのいくつかのいわゆる標準化された「測定」融解曲線１３（「技術的反復」（“ｒｅｐｌｉｃａｔｓ”ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ））（それが、いくつかの可能グループ中における所定グループに属することを決定しようとする）、
○これらの測定曲線の百分位数（ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）１４、
○これらの測定曲線の一次導関数１５、
○これらの測定曲線の二次導関数１６。
−図４は、いくつかのサンプル（生物学的反復（ｒｅｐｌｉｃａｔｓ  ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ））のいくつかの基準融解曲線（技術的反復）（すべてのサンプルは、初期グループ「マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）」に属する）を示す。
−図５は、初期グループ「Ｍ．ａｖｉｕｍ」または「Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ」に属するいくつかのサンプル（生物学的反復）のいくつかの基準融解曲線（技術的反復）を示す。
−図６は、３種のディスクリプタα、βおよびδと、２つの可能グループ（グループ（ｇｒｏｕｐｅ）１およびグループ２）との場合において作り出されたランダムフォレストの木の例を示す。各ノード（ｎｏｕｅｄ）における質問に対する肯定的な答えは、次の枝の左側を選択することに相当する。各ノードにおける質問に対する否定的な答えは、次の枝の右側を選択することに相当する。
−図７は、本発明による信頼度指標についての原理を図式的に示す。
−図８は、正しいグループに割り当てられた観測または正しくないグループに割り当てられた観測を識別するための、グループ内の近似性（ｐｒｏｘｉｍｉｔｅ）に基づく、信頼度指標の使用に関連するＲＯＣ曲線である。
−図９は、本発明によるデバイス１００の実施形態を模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
これらの実施形態は決して限定的ではないので、本発明の変形は、記載または図示された他の特徴とは別に（たとえ、下記の選択が、これらの他の特性を含むフレーズ内において孤立している場合であっても）、本明細書において記載または図示された特徴の選択のみを含むと考えることができる。但し、特性についてのこの選択が、技術的な優位性を与えるか、または最新技術に対する本発明を区別するのに十分である場合に限る。この選択は、構造的な詳細を有さないか、および／または構造的な詳細の一部のみ（但し、この部分だけで、技術的な利点を与えるか、または先行技術に対して本発明を区別するのに十分なものである）を有する少なくとも１つの特性（好ましくは、機能的な特性）を含む。
【００２５】
したがって、本発明による方法の好ましい実施形態が、図１〜図８を参照して説明される。本明細書の以降の部分では、用語「本発明による方法」は、この実施形態のみしか意味しておらず、これは決して限定的なものではない。
【００２６】
この実施形態の目的は、異なる種を区別することができることにある。 マイコバクテリウム属の異なる種の間での識別は、一例として選択されており、これは決して限定的なものではない。
【００２７】
この実施形態において、「生物学的サンプル」は、生物学的材料を含有する任意のタイプのサンプルであるか、または生物学的材料を含有することができる任意のタイプのサンプルに相当する。好ましくは、それは、マイコバクテリアを含有することができるサンプル、および／またはマイコバクテリアのデオキシリボ核酸（または「ＤＮＡ」）若しくは微量のＤＮＡを含有することができるサンプルである。
【００２８】
≪融解曲線を得る原理≫
この実施形態において、「高感度ＤＮＡ融解」と呼ばれる分子生物学技術は、「ＨＲＭ」（高感度融解：ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ）」とも呼ばれる。このＨＲＭ技術は、二本鎖ＤＮＡから出発して実施される。ＨＲＭによる分析を行う前に、目的の突然変異が位置することができるＤＮＡの断片を、ＰＣＲ（「ポリメラーゼ連鎖反応」）により増幅する。次いで、サンプルは、ＰＣＲによって標的化及び増幅されたＤＮＡ断片の多くのコピーを含む。
【００２９】
次いで、ＨＲＭ分析は、変性を引き起こすために、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片を正確に制御が行われる加熱からなる。したがって、ＨＲＭ分析中において、ＤＮＡの変性をモニタすることによって、標的ＤＮＡ断片の特定の融解プロファイルを決定することが可能になる。
【００３０】
「融解プロファイル」（「融解曲線」とも呼ばれる）は、温度の関数としての１つ（または各平均）のＤＮＡ分子の変性の進行に相当している。本発明が意味する範囲内では、融解曲線は、必ずしもグラフ曲線ではなく、温度の関数としての１つ（または各平均）のＤＮＡ分子の変性中における１つの（または平均して）ＤＮＡ分子のこの変性の間のこの曲線のいくつかの点の値のリストまたは表であってもよい。
【００３１】
ＰＣＲ反応は、例えば、以下の３つの工程によって構成されるサイクルの繰り返しを含む：
−  ９０℃〜９９℃の温度での５〜３０秒間の工程、
−  それに続く、５８℃〜６４℃の温度での５〜３０秒間の工程、
−  それに続く、７０〜７４℃の温度での５秒〜１分間の工程。
【００３２】
ＰＣＲサイクルを構成する３つの工程は、それぞれ、以下の工程に相当する：
−  （９０℃〜９９℃での）ＤＮＡの変性、
−  （５８℃〜６４℃での）ＤＮＡのプライマーへのハイブリダイゼーション、
−  （７０℃〜７４℃での）プライマーから開始するＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの伸長。
【００３３】
このサイクルは、通常、４０〜５０回、好ましくは４５回繰り返される。
【００３４】
前記ＰＣＲ反応を行う前に、好ましくは９５℃で１０分間、前記生物学的サンプル中に含まれるＤＮＡを最初に変性させる工程が行われる。
【００３５】
この最初の変性工程は、ＰＣＲサイクルの前に実施される加熱工程である。これは、特に二本鎖ＤＮＡを完全に脱ハイブリダイズすることによって、ＤＮＡの二次構造を破壊することによって、またはＤＮＡポリメラーゼを活性化することによって、増幅反応中のマトリックスとして役立つサンプルのＤＮＡを調製することを可能にする。
【００３６】
前記ＰＣＲ反応は、例えば、少なくとも以下：  
−  生物学的サンプルに含まれるＤＮＡ、
−  ３ｍＭの割合でのＭｇＣｌ２、
−  ０．４μＭの割合でのプライマー、および
−  少なくとも１ユニットのＤＮＡポリメラーゼ
を含む反応混合物を使用して行われる。
【００３７】
前記ＰＣＲ反応の後において、増幅産物の変性を生じさせ、かつ前記増幅産物の融解プロファイルを得るための、例えば、６０℃〜１００℃（好ましくは、６５℃〜９５℃）の間で徐々に加熱する工程が続いて行われる。
【００３８】
徐々に加熱するこの段階は、制御された方法で実施されるサンプルの加熱に相当し、この間では、温度は、例えば０．２℃／秒の上昇のように、経時的に段階的に増加する
【００３９】
前記増幅産物の変性は、通常、好ましくはＬＣ  Ｇｒｅｅｎ、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、ＣｈｒｏｍｏｆｙおよびＳＹＴＯ９から選択される蛍光マーカーを用いて、モニタリングされる。
【００４０】
増幅および融解の工程は、高感度融解キット  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０  ｍａｓｔｅｒ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。反応混合物は、最終容量１０μｌ中の、２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＭｇＣｌ２、センス、およびアンチセンスプライマー、ゲノムＤＮＡ、および水からなる。増幅手順は、最初の変性、それに続く４５サイクルの変性、ハイブリダイゼーション、および伸長からなる。増幅後において、融解プログラムによって、９５℃での１分間の加熱、４０℃での１分間の冷却、それに続く６５〜９５℃での０．２℃／ｓの上昇速度による温度上昇の追加、及び蛍光の連続測定が行われた。各反応は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、９６ウェルプレートで３回行われた。各ＨＲＭ分析は、ＤＮＡマトリックスが水に置き換えられたネガティブコントロールを含んでいる。
【００４１】
本発明は、有利には、遺伝子のサブセットの発現を測定するよりも融解曲線を得ることが有利であることに留意されたい。
【００４２】
≪学習≫
図１に示すように、本発明による方法の実施形態は学習６を含み、この学習（ａｐｐｒｅｎｔｉｓｓａｇｅ）６は、以下を含む。
−  学習前に決定された異なる既知の「初期グループ」に属する異なる基準用生物学的サンプルから出発する、基準曲線と呼ばれる異なるＤＮＡ融解曲線の取得１；次に、
−  基準曲線からのディスクリプタの決定２，３；次に
−  ランダムフォレスト法によるいくつかの木の構築を含む、ランダムフォレスト法による森林の構築８（ここで、各木は、各ノードにおいて、閾値に関連するディスクリプタのうちの１つの使用を含み、そして基準曲線を２つのサブセットに分離することを可能にし；各木（ａｒｂｒｅ）の各葉（ｆｅｕｉｌｌｅ）は、異なる可能グループの内における１つだけのグループにのみ相当する。木の分類では、葉は、常に１つだけのグループに相当し、これは、一般に、この葉に「落下する」大多数のグループの観測である。純粋な葉の特徴は、この葉に「落下する」基準用サンプルの観測のすべてが、同じグループに属することである）。
【００４３】
「可能グループ（ｇｒｏｕｐｅｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅｓ）」（このグループ中で、未知の生物学的サンプルを分類することが求められる）は、学習工程中に使用される異なる基準用生物学的サンプルの異なる「初期グループ」からなり、場合により、（例えば、グループを分離するための少なくとも1つの工程、および/またはグループを合理化するための以下に記載されるようなグループを統一するための少なくとも1つの工程によって）変形される。好ましくは、「可能グループ」は、異なる「初期グループ」の少なくとも一部を含む。
【００４４】
この学習段階は、アプリケーションのタイプ毎に１回実施される（新しい基準用サンプルおよび／または新しいグループを含めるために、この段階を繰り返すオプションが存在する）。これは、（最終の）可能グループを定義して、決定ルールを構築するという目的があり、以下を有する：    
−  学習工程の入力として：それぞれの事前に定められた初期グループに、１つ毎に、割り当てられた標準化された学習の融解プロファイルのライブラリ。各初期グループは、いくつかの生物学的反復によって表されなければならない。各生物学的反復は、いくつかの技術的反復によって表されなければならない。
−  学習工程の出力として：割り当てについてのルール決定
標準化された信号の読み込み：学習に役立つための異なる「基準」ＤＮＡ融解曲線の取得工程１については、上述の融解曲線を得るためのプロトコールが使用され、そして、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ）に関連するソフトウェアによって提供されるような標準化の方法を応用することによって、連続する６つの実験が、マイコバクテリウムの１９の異なる種（または、「初期グループ」）に相当する４１７ＨＲＭプロファイル（すなわち、４１７の基準融解曲線）を作り出すことを可能にする異なる日付で行われた。各種は、いくつかの生物学的反復（種毎に２〜２０個の生物学的反復）のいくつかの技術的反復により表される。「生物学的反復」は、全く同一である種における異なる個体に由来する異なる生物学的サンプルのために使用される用語である。全く同一である生物学的反復の「技術的反復」は、同じ生物学的サンプルから得られた異なる融解曲線に使用される用語である。ソフトウェア入力は、機械出力でソフトウェアによって標準化された後における融解プロファイルの座標を含むテキストファイルである。
【００４５】
それぞれの種における生物学的反復の分布は、表１に示されており、異なる生物学的反復についての一組の技術的反復に関連する標準化された基準曲線１２は、図２に示されている。
【００４６】
【表１】
2019511242.tif 000003
これらの１９種は、１９の最初のグループを形成する。
【００４７】
ディスクリプタの決定：ディスクリプタがその後決定される。ディスクリプタの決定２，３は、最初に、「基準」融解曲線Ｄ（Ｔ）（温度“Ｔ”の関数としてのＤＮＡの変性「Ｄ」（通常、％または蛍光シグナルとして））からのディスクリプタの予備決定２を含み、これは以下を考慮に入れる：
−標準化された各融解曲線の測定点（本ケースでは、１８０の点）：従って、１８０のディスクリプタが得られ、これによって、各融解曲線を特徴付けることが可能となる；
−百分位数（０から１００までの、１０１の分位点（ｑｕａｎｔｉｌｅ））：ｉ番目の百分位数は、標準化された融解曲線の温度（ここにおいて、ｉ％のＤＮＡの変性が起こっている）に使用される用語である。したがって、１０１の分位点に相当する１０１のディスクリプタが得られ（測定点の間における補間によって得られ）、そして、このディスクリプタによって、各融解曲線を特徴付けることが可能となる。
【００４８】
更に、ディスクリプタの予備決定２では、厳密な意味での融解曲線は、曲線をより正確に記載することが可能な得られたデータで補完される。
●標準化された各融解曲線についての一次（数値）導関数  
2019511242.tif 000004
。したがって、１８０の点（すなわち、変性レベルについての１８０の値）で最初に確立された融解曲線については、１７８個の追加のディスクリプタが得られ、これによって、各融解曲線の一次導関数を特徴付けることが可能となる。
●標準化された各融解曲線についての二次（数値）導関数  
2019511242.tif 000005
。したがって、１８０点（すなわち、変性レベルの１８０の値）で最初に確立された融解曲線については、１７６個の追加のディスクリプタが得られ、これによって、各融解曲線の二次導関数を特徴付けることが可能となる。
【００４９】
最後に、以下が得られる：
１８０＋１０１＋１７８＋１７６＝６３５  各融解曲線または技術的反復を記載するためのディスクリプタ。
【００５０】
ディスクリプタの決定２，３は、以下を含む：
−  上述のディスクリプタの予備決定２、それに続く、
−  特定の不要なディスクリプタの削除３。
【００５１】
データの不要性は、可能グループを学習することにとって有害である。さて、融解曲線の連続する値またはその導関数の連続する値との間には、非常に強い相関がある。そのため、０．９５を超えるピアソン相関係数をペアで表示するディスクリプタのセット毎に、１つのディスクリプタしか保留されない。したがって、特定のディスクリプタの削除３は、０．９５より大きいピアソン相関係数をペアで表示する各組のディスクリプタ毎に、１つだけのディスクリプタの保留を含む。最後に、不要なディスクリプタを削除した後に、（初期の６３５のうちの）２０８個のディスクリプタが保留され、これは、以下を含む：
−  融点曲線の３８の点；
−  １２の百分位数；
−  一次導関数の５９の点；
−  二次導関数の９９の点。
【００５２】
選択された各ディスクリプタの位置は、図３の縦線に示されている。
【００５３】
これは、本発明による方法の利点を明確に示している。（第１および第２の、特に第２の）融解曲線の導関数は、最終的に保留されているディスクリプタの大部分を含んでいるので、生物学的サンプルが所定の可能な群に属することを決定することを可能にする識別データにおいて、非常に豊富であると考えることができる。これは、融解プロファイル同士のより微細な識別において反映される。
【００５４】
グループの合理化：
本発明による方法の実施形態は、様々な学習の複雑さを伴う多数の問題または応用に応用することができる。多かれ少なかれ遺伝的に近いグループ同士を区別する必要があるかもしれない。したがって、最初のグループがすべて融解曲線によって区別できるかどうかを知ることは、演繹的には不可能である。こうした理由で、学習中において、「グループの合理化」の工程が挿入される。これは、区別可能なまたは区別できない初期のグループの周囲を定めることを可能にする。この工程は、２つの主要な知見の結果である：
−  特定の初期グループは、異なる種のサブグループによって構成される；
−  特定の初期グループは、融解曲線によって相互に区別されない。
【００５５】
図２では、次のことが理解され得る：
１）生物学的または技術的反復は、全く同一の初期グループ内において非常に異なるプロファイルを有することができる。この現象は、２つの初期グループ、特に、図４に示す初期グループ「Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ」に現れる。したがって、これらの２つの初期グループのそれぞれは、学習のためにいくつかの（この場合には、２つの）可能なサブグループに分割され、  学習の作業を容易にすることができる；そして、
２）異なる初期グループについての全ての生物学的または技術的反復は、十分にコンパクトにすることができる。
【００５６】
したがって、上記のケース１）では、本発明による方法の実施形態（より正確には、学習６）は、以下を含む：
−  異なる基準曲線を取得した後（しかしながら、好ましくは、木の構築前）における、あいまいなグループ（例えば、初期グループ  “Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ”（図４）、つまり、初期グループ「Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ」）と呼ばれ、そしていくつかのサブグループに分離されているプロファイルを有している同じ初期グループに相当するいくつかの基準曲線の識別。この識別は、例えば、グループ内での隔たりに関する基準を使用して実施され、このために閾値が定められる；そして、
−  このあいまいなグループの、いくつかの可能グループ１２ａおよび１２ｂへの分離４。
【００５７】
同様に、上記のケース２）では、本発明による方法の実施形態（より正確には、学習６）は、以下を含む：
−  異なる基準曲線の取得後（しかしながら、好ましくは、木の構築後；グループの溶解または統一には、木の最初の構築が必要な場合がある）における、１つだけのグループに組み合されたプロファイルを有する、併合されたグループと呼ばれる幾つかの初期グループに相当するいくつかの基準曲線の識別。この識別は、例えば、学習のエラー率を用いて実施される。すなわち、１つのグループにエラーが生じた場合には、十分に分類されていない観測は、観測と組み合わせることができ（この組み合わせのために、それらの観測は、最も近似している）、融合されたグループまたは統一されたグループを形成することができる；そして、
−  これらの併合されたグループの、１つだけの可能グループへの統一５。
【００５８】
本発明による方法のこの実施形態では、最初のグループ「Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ」１２ｃと「Ｍ．ａｖｉｕｍ」１２ｄとは、例えば非常に近似しているが、本発明による方法の分析の微細さのせいで、それらの近似性にもかかわらず最終的には統一されない。
【００５９】
最後に、表２に列挙される以下の２１の可能な最終グループが得られる：
【表２】
2019511242.tif 000006
【００６０】
「グループの合理化」の工程は、以下に説明するランダムな森林を構築した後に、さらに、反復的に行うことができる。最初に、パラメータの最適化後、交差検証（ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）に適合したランダムフォレスト法が２つのブロックに応用される。次に、悪いグループに割り当てられた生物学的反復に基準が与えられる。これらの反復毎に、新しいグループが、作成され、そして、この悪い方に割り当てられた反復と、間違って割り当てられたグループの最も近似する生物学的反復とを一緒に集める。したがって、「ハイブリッド」グループが、作製され、そして、二重タグ（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｔｉｑｕｅｔｔｅ）を含む。学習サンプルのすべての生物学的反復が正しく割り当てられるまで、この手順が再び開始される。この工程の最後に、１つまたは複数の「タグ」を有する一定数のグループが得られる。
【００６１】
もちろん、この工程は、ハイブリッドグループの作成を含むことができ、このハイブリッドグループは、いくつかの初期グループを含む。しかし、多数のグループを有する予測の状況では、可能性の数を大幅に削減する可能性を有することは、非常に価値がある。なおさら、この方法ではグループ全体が別のグループと融合することが強制されないために、理論は、生物学的反復の規模で行われる。したがって、初期のグループが、別のグループに近づく生物学的反復のサブセットと異種である場合には、２つの可能な最終グループが最終的に得られる：最終グループは、初期グループとハイブリッド最終グループとの反復のみを含む。
【００６２】
学習方法のパラメータを予測し決定する方法の定義：
学習６は、最終的に、ランダムフォレスト法による森林の構築８を含む。
【００６３】
このランダムフォレスト法の操作は、ここでは、本発明による技術的反復／生物学的反復としてのデータの構造に応用される。技術的な反復によって、溶解プロファイルを得るための技術的なばらつき（非常に限定されたばらつき）を考慮に入れることが可能となる。生物学的なばらつきは、学習の中心にある。なぜならば、本発明による方法の実施形態が、実際の使用条件下で直面するばらつきを反映しているからである。これは、全く同一の可能グループの個体の間で観測され得る配列の相違に関連している。
【００６４】
したがって、ｋ個の異なる可能グループ（この例ではｋ＝２１の可能グループ、表２参照）を区別するために、周知のランダムフォレスト法が使用される（このランダムフォレスト法のよく知られた一般的な考慮事項に関する詳細については、参考文献［２］、［３］、［４］参照）。（木の分類に基づいた）この方法の原理は、各木について、ｎ個の開始基準融解曲線（「観測」とも称される）（この例では、ｎ＝４１７の基準融解曲線）のサブセット毎に使用して、そして、そして、木のノード毎に、ｐ個の開始ディスクリプタのサブセット（「ばらつき」とも称される）（この例では、ｐ＝２０８個のディスクリプタ）を使用して、いくつかの分類木を構築することである。この方法は、２つのパラメータに依存する：
−  ｎ木（ｎａｒｂｒｅ）  構築された木の数、すなわち、最終決定のルールに含まれる木の総数、および
−  ｍ木（ｍａｒｂｒｅ）  各木の各ノードで調査されたディスクリプタの数（
2019511242.tif 000007
）、すなわち、各木の各ノードの学習中に利用可能な一組のディスクリプタからランダムに選択されたディスクリプタの数。
【００６５】
これらの２つのパラメータは、学習データ（基準曲線）上の２つのブロックの交差検証によって最適化工程７の間に決定される。（学習６の一部を形成する）この工程７について、そして、交差検証の使用毎に、作業は、生物学的反復のスケールで、すなわち、交差検証の各工程において実施され、生物学的反復の技術的反復は、学習ブロックにすべて割り当てられるか、または、検証ブロックのすべてに割り当てられるかのいずれかである。この制約は、実際の学習条件を最も近似して模倣するという利点がある。選択されたパラメータは、学習／テストブロック内における１００個のランダム分布で得られた「十分に分類される」の平均パーセンテージを最大にするパラメータである。したがって、ペア（ｎ木、ｍ木）の可能な値毎に、森林は、ｎ個の観測の半分に基づいてランダムフォレスト法によって（複数の木を使用して）構築され、この森林は、ｎ個の観測の残りの半分でテストされる（これによって、ｋ個の可能グループのそれぞれに属しているかどうかは、それが、実際にはすでにわかっている）。次いで、ペア（ｎ木、ｍ木）の値が選択され、平均で最良の結果をもたらす森林が構築される（この理由としては、値のペア毎に、１００個の森林を含む１００個のランダムな分布が実行されるからである）。ｎ木＝１０００個の木の最適数と、ノード毎にｍ木＝１０個の変数の最適数が得られる。
【００６６】
次に、ランダムフォレストのｎ木＝１０００の木は、ｎ＝４１７個の観測を用いて構築される。
各木を構築するために：
−  利用可能なｎ＝４１７から１００個の観測（または基準曲線）がランダムに採取され、
−  各木の各ノード１７において、利用可能なｐ＝２０８からランダムにｍ木＝１０のディスクリプタが採取され、そして、採取されたｍ木＝１０のディスクリプタから、Ｇｉｎｉインデックスを一緒に最適化するディスクリプタおよび関連する閾値が選択される。各岐の端１８または純粋である「葉」１８に必要な多くのノードが存在する（すなわち、そこに「落ちる」観測は、すべて同じ初期グループに属する。）
【００６７】
図６は、３つのディスクリプタα、βおよびδ（ｐ＝３）と２つの可能グループ（ｋ＝２、グループ１及びグループ２）とを有する場合における、ランダムフォレストの木の例を示している。この木が、図２における本発明による方法の実施形態の場合に相当しない場合（ｋ＝２１の可能グループ、ｐ＝２０８のディスクリプタ、大きすぎて図示できない木）であっても、この木は、本発明による方法のこの実施形態において構築された木の原理を完全に示している。
【００６８】
各ノード１７は、通常、ディスクリプタに関連してもたらされる質問に相当する：このディスクリプタは、しきい値未満（または、それ以下）の値を有しているかどうか。
【００６９】
例えば：
−  融解曲線の点の一部を形成するディスクリプタ（３８個のディスクリプタ）毎に：このディスクリプタに特有の温度の値について、変成率（ｐｏｕｒｃｅｎｔａｇｅ  ｄｅ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）（または、融解曲線の他の任意の単位）が所定の閾値未満（または、以下）の値を有するかどうか。
−  百分位数の一部を形成するディスクリプタ（１２個のディスクリプタ）毎に：
このディスクリプタに特有の変成率（または、融解曲線の他の任意の単位）の値について、温度が所定の閾値未満（または、以下）の値を有するかどうか。
−  一次導関数の点の一部を形成するディスクリプタ（５９個のディスクリプタ）毎に：
このディスクリプタに特有の温度の値について、融解曲線の一次導関数が所定の閾値未満（または、以下）の値を有するかどうか。
−  二次導関数の点の一部を形成するディスクリプタ（９９個のディスクリプタ）毎に：このディスクリプタに特有の温度の値について、融解曲線の二次導関数が所定の閾値未満（または、以下）の値を有するかどうか。
各葉１８は、ｋ個の可能な最終グループのうちの１つに相当する。
【００７０】
信頼インデックスの学習：
構築することによって、ランダムフォレスト法は、木の数を調べること（この木の数において、２つの観測が同じ葉の中に「落ちる」）によって、観測間同士の近似性を計算することを可能にする。この近似性は、予測の信頼指標を計算するために、従って、可能グループの１つに観測を割り当てることを場合により拒否するために使用される。
【００７１】
したがって、ランダムフォレストの構築後、学習工程６の間において、全く同一の可能な同じグループに属する学習ライブラリの生物学的反復のすべてのペアについて、ペアの近似性の分布が計算される。生物学的反復間同士での近似性は、その技術的反復間同士で計算された近似性の最小値（いわゆる、完全リンク法）によって定められる。この分布は、カーネル法でスムーズにすることができる。  この操作は、可能グループ毎に繰り返され、したがって、各グループに特有のグループ内での距離の分布が得られる。
【００７２】
予測：未知の、いわゆる「測定用」生物学的サンプルについての分類
予測は、本発明による方法の実施形態の現在の工程である。（特に、グループの合理化の工程の後の）学習の出力として得られる可能な最終グループ（「クラス」とも呼ばれる）のうちの1つに対する割り当てを得るために、生物学的サンプルに決定ルールを応用することを目的としており、そして、この割り当ては、信頼指標と一致している。
したがって、結果は、以下を伴うことになる：
- 予測工程の入力として：全く同一の「測定用」生物学的サンプルから得られた融解プロファイル（技術的反復）のセット。
- 予測工程の出力として：「測定用」サンプルの信頼指標への割り当てに関する決定、または、場合により、可能グループのいずれかへの割り当ての拒絶。
【００７３】
実際、本発明による方法の実施形態の目的は、融解曲線による「測定用」サンプルのディスクリプション（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）に基づいて、学習中に定められたｋ個の可能な最終グループの１つにこの個体を割り当てること（監視方法）、および提案された決定に信頼指標を割り当てることができるかどうかを決定することである。
【００７４】
したがって、本発明による方法の実施形態は、少なくとも１つの測定曲線と呼ばれる、測定用生物学的サンプルのＤＮＡ融解の標準化曲線（上記参照）少なくとも１つの取得（９）を含んでおり、各測定曲線は異なる点を含み、各点は、温度の関数としての測定用サンプルのＤＮＡの変性についてのレベル（通常、％）若しくは量に比例（例えば、蛍光シグナル）する量に相当するか、または代表する量に相当する。この取得は、（実験室での）ＰＣＲおよび融解曲線それ自体、および／またはこの融解曲線のデータ（例えば、コンピュータデータ）の単純なダウンロードを実施することを含むことができる。
【００７５】
場合により、この融解曲線についてのＰＣＲは、いくつかの標的ＤＮＡ分子を標的とするいくつかのプライマーペアを同時に存在させて行うことができる。続いて、「マルチプレックス」条件を言及する。
【００７６】
本発明による方法の実施形態は、更に、測定用生物学的サンプルが、ｋ個の異なる最終の可能グループ中において、所定グループに属するということを、学習段階中に構築された木の森林に基づくランダムフォレスト法によって決定１０することを含む。この決定は、学習段階中に構築された木の森林に基づくランダムフォレスト法による、少なくとも１つの測定曲線から生じるディスクリプタの分析を含む。このディスクリプタは、以下を含む：
○各測定曲線の１つ以上の点、および／または
○各測定曲線の変性レベルの１０１の百分位数の一部または全部、および／または
○各測定曲線の一次導関数の１つ以上の点（通常、少なくとも３０個の点）、および／または
○各測定曲線の二次導関数の１つ以上の点（通常、少なくとも３０個の点）
【００７７】
測定用生物学的サンプルの技術的反復は、ランダムフォレストを独立して行うことになり、更に、可能グループが、技術的反復のそれぞれに割り当てられる。デフォルトによって、測定用生物学的サンプルは、技術的反復毎に予測されたグループのうちの多数のグループに割り当てられる。複数のグループの場合、信頼指標を使用して決定することができる。
ランダムフォレストは確率的方法（いくつかの応用は、種々の結果を与えることができる）であるので、この方法は、生物学的サンプルの割り当てを予測するために数回（この実施形態では、３回）応用される。
【００７８】
各ディスクリプタの位置は、図３の縦軸に示されている。
図３は、以下を示している：
−左上には、全く同一の測定用サンプルの３つの測定融解曲線１３（３つの技術的反復）（それが、ｋ個の可能グループのうちの１つに属するかを決定する）；
−右上には、３つの技術的反復１３に相当する百分位数を示す３つの曲線１４；
−左下には、３つの測定融解曲線１３の３つの一次導関数１５；及び
−右下には、３つの測定融解曲線１３の３つの二次導関数１６。
【００７９】
信頼指標の計算：
本発明による方法の実施形態の品質は、初期学習ライブラリの品質によって決定される。生物学的なばらつきにおいてこれが豊かになればなるほど、学習は、ますます、新しいサンプルの多様性に対して正確で一般化することができるようになる。しかしながら、学習ライブラリの品質にかかわらず、新しいサンプルの予測中において、それに完全に異なるサンプルに遭遇する可能性が依然としてある。この場合でも、従来の学習方法は、それに最も近い可能グループに新しいサンプルを割り当てることによって予測を供給しているであろう。本発明による方法の実施形態は、何らかの任意の可能グループに新しいサンプルを割り当てることを拒否することができなければならない。
【００８０】
このために、本発明による方法の実施形態は、所定グループに測定用生物学的サンプルが属することを決定する工程の信頼指標の計算を含む。
【００８１】
信頼指標を計算するこの工程には、２つの目的がある：
−  作成された予測の信頼性を定量化すること；
−  生物学的反復が、任意の可能グループに割り当てられていないことを予測することを可能にすること。
【００８２】
ランダムフォレストには、観測間同士の近似性の測定値を提供するという利点がある。ランダムフォレスト法におけるこの周知の「近似性」の概念の詳細については、参考文献［３］および［４］を参照することができる。
【００８３】
これらの測定は、信頼インデックスを提供するために使用される。実際、可能グループの観測に予測される観測（その観測が、可能グループに割り当てられている）が近い場合には、予測される観測が可能グループの観測（その観測が、可能グループに割り当てられている）から遠い場合よりも、分類の品質の方が潜在的に優れている。この原則は、信頼インデックスを構築するために使用される。
【００８４】
学習データは、全く同一の可能グループの基準融解曲線の平均近似性の分布を計算するための基礎として採用された。次に、測定用生物学的サンプルが可能グループに割り当てられると、このグループの生物学的反復へのその平均近似性が計算され、そして、この可能グループの基準融解曲線の近似性と比較される。次いで、基準融解曲線のパーセンテージ（この基準融解曲線の近似性は、予測される測定融解曲線の近似性よりも小さい）を計算することが可能である。このパーセンテージは、予測されたグループに属するかの可能性の推定であり、信頼インデックスとして使用される。
【００８５】
図７は、２つの可能グループ２２，２３（基準融解曲線（×：バツ）３２および３３は、それぞれ、このグループに属する）を有するこのインデックスの原理を示している。
【００８６】
その（または、各々の、または平均の）測定曲線１３ａ（△：三角形）が、
−  グループ２３よりもグループ２２に近く、そして、
−  グループ２２の融解曲線３２の間で観察される近似性と一致するような、グループ２２の融解曲線３２への近似性を有してしている場合には、曲線１３ａに相当するサンプルは、グループ２２に属すると考えられ、そして、本発明による方法の実施形態は、決定されたグループが確かにグループ２２であることを確認する。
【００８７】
その（または、各々の、または平均の）測定曲線１３ｂ（△：三角形）が、
−  グループ２３よりもグループ２２に近いが、
−  グループ２２の融解曲線３２の間で観察される近似性よりも非常に低い、グループ２２の融解曲線３２への近似性を有している場合には、曲線１３ｂに相当するサンプルは、グループ２２またはグループ２３のいずれにも属さず、そして、好ましくは、本発明による方法の実施形態は、測定用生物学的サンプルを、所定グループ２２に（場合により、何らかの任意のグループに）割り当てることを拒絶することを含む。
【００８８】
学習段階において、全く同一のグループに属する学習ライブラリの生物学的反復のすべてのペアについての近似性の分布を計算した。
【００８９】
予測工程において、任意の新しい観測（すなわち、任意の新しい「測定」融解曲線）について、グループの基準用生物学的反復へのその平均近似性（その平均近似性は、グループに割り当てられていた）が、同じ方法によって計算される。続いて、以前に得られた全体分布は、このグループに属する可能性の推定を計算するために使用される。
【００９０】
新しい観察がこの工程を通過する場合には、この可能グループに属する可能性は、予測されたグループと同時にユーザに提供される。
【００９１】
もちろん、この最後の工程を応用する可能性は、学習ライブラリの十分なサイズに依存する。
【００９２】
図８は、この指標に関連するＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）を示す（ＡＵＣ＝０．９９８８、ＡＵＣは、ＲＯＣ曲線の面積、または「その曲線下の面積」である）。
【００９３】
この図８は優れた品質のものである。実際、図７を参照すると、０．１４に等しい閾値が信頼インデックスのために使用される場合には、（ループ１９で表されている）この閾値以下の未満のインデックスを有する全ての観測は、分類されていない観測であり、１つのよく分類された観測だけがこの閾値を超えるインデックスを有する。このインデックスのおかげで、よく分類された観測は非常に満足に識別することができる。
【００９４】
（ランダムフォレストの異なる応用の結果として、または異なる技術的反復の矛盾した結果として）いくつかの可能グループへの割り当ての場合、または信頼性の低いインデックスの場合には、生物学的反復に関して（森林の木のすべてから）少なくとも一回予測される可能グループのセットへの近似性を再度計算することができる。これらの可能グループのうちの１つが、０．１４の閾値を超えるインデックスを示す場合には、この測定曲線は、最大インデックス値を有する可能グループにおそらく属するものとして、タグ付けすることができる。
【００９５】
このルールを基準曲線に応用してその有効性をテストすると、融解曲線は、「回収（ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ）」であり、この「回収」では、ほとんどが間違った種に割り当てられていたが、正しい種が少なくとも１回は予測されており、計算された信頼インデックスが０．１４より大きかった。
【００９６】
最後に、信頼インデックスは、測定融解曲線に同じ回数割り当てられた２つの可能グループの間で決定するために使用することができる。
したがって、要約すると、信頼インデックスの計算は、以下を含む：
−所定グループに属する基準曲線の間における平均近似の分布を計算する工程、
−所定グループに属する基準曲線と測定用生物学的サンプルの平均近似を計算する工程、
−所定グループに属し、そして、（少なくとも１つの基準曲線と所定グループに属する基準曲線との平均近似より小さくなる）所定グループに属する他の基準曲線への平均近似性を有する、基準曲線のレベルを計算する工程。
【００９７】
測定用生物学的サンプルが所定グループに属すると決定した工程の後に、本発明による方法の実施は、 以下を含む：
（結果を提供する工程、通常は、スクリーン上に表示されるか、またはコンピュータメモリまたは電子メモリに格納される工程１１として、）拒絶するか、または信頼インデックスの値の関数として何らかの任意の可能グループに測定用生物学的サンプルを割り当てない、より正確には、
−  信頼インデックスが閾値未満である場合には、測定用生物学的サンプルを何らかの任意の可能グループに割り当てることを拒否すること、または
−  信頼インデックスが閾値を上回る場合には、測定用生物学的サンプルを可能最終グループの１つに割り当てることを承認すること。
【００９８】
ランダムフォレストの生の結果と信頼インデックスの使用とを組み合わせることにより、観測の９５．７４％が、正しく割り当てられる。観測の残りの４．２６％に関して、それらは、本発明による方法の実施形態によって、それらの割り当てに関して疑わしいものとして明確に識別される。
【００９９】
図３の曲線の場合には、サンプルは、グループ「アブセサス（ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）」に属するものとして識別される。
【０１００】
本発明による方法のこの実施形態では、以下の各工程が、純粋に抽象的に、または純粋に知的に実行されるのではないが、（一般に、本発明による方法のこの実施形態の他のすべての工程と同様に、）技術的手段の使用を伴っている：
−取得１；
−ディスクリプタ２，３の決定；
−グループ４，５の合理化；
−学習６；
−パラメータの最適化７；
−ランダムフォレスト８の構築；
−  取得９；
−  ディスクリプタの分析、ランダムフォレストの応用、いくつかの可能グループのうちからの所定グループの決定、信頼インデックスの計算、測定用生物学的サンプルを所定グループに割り当てることを確認する決定、および測定用生物学的サンプルを何らかの任意のグループへ割り当てることを拒否する工程１０；
−  結果の提供または表示１１。
【０１０１】
図９は、本発明による方法のこの実施形態を実施するために配置され、プログラムされた、本発明によるデバイス１００の実施形態を模式的に示す。
【０１０２】
デバイス１００は、以下の各工程を実施するために構成され、プログラム化された手段１０２を含む：
−  ディスクリプタ２，３の決定；
−  グループ４，５の合理化；
−  パラメータの最適化７；
−  ランダムフォレスト８の構築；
−  ディスクリプタの分析、ランダムフォレストの応用、いくつかの可能グループのうちからの所定グループの決定、信頼インデックスの計算、および測定生体サンプルを所定グループに割り当てることを確認する決定、または生物学的サンプルを何らかの任意のグループに割り当てることを拒否する工程１０；
−  結果の提供または表示１１。
【０１０３】
デバイス１００は、以下の工程を実現するように配置および／またはプログラムするための手段１０１および１０２を含む：
−  学習工程６、より正確には基準曲線を取得する工程１、
−  少なくとも１つの測定曲線を取得する工程９。
【０１０４】
手段１０２は、コンピュータ、および／または中央または計算ユニット、および／または（好ましくは、専用の）アナログ電子回路、および／または（好ましくは、専用の）デジタル電子回路、および／または（好ましくは、専用の）マイクロプロセッサ、および／またはソフトウェアを含む。これらの手段１０２は、好ましくは、結果を提供または表示する工程１１のために、スクリーン若しくは印刷手段、またはデータをエクスポートする手段をさらに含む。
【０１０５】
手段１０１は、ＰＣＲ機器を含み、および／または、変形例によれば、ＤＮＡ融解曲線をロードおよび読み取りのために配置およびプログラムされたコンピュータ手段（ＵＳＢポート、ＳＤカードリーダ、コンピュータネットワークへの接続などと組み合わせたソフトウェア）を含む。したがって、これらの手段１０１は、手段１０２に接続されるか、または手段１０２の一部を形成する。
【０１０６】
もちろん、本発明は、上記の実施例に限定されず、本発明の範囲を逸脱することなく、これらの実施例に対して多くの調整を加えることができる。
【０１０７】
例えば、この概念の別の証明が、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｓｐｐ、Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、およびＡｎａｐｌａｓｍａを含めた他の微生物についても行われ、同様の成功を収めた。開発された方法によって、マルチプレックス条件下で（すなわち、上記の（５つの）病原体すべての標的ＤＮＡ分子を標的とするすべてのプライマーペアを同時に存在させることでＰＣＲを増幅させることを介して）異なる病原体を同定することを可能にすることは、実験によって証明されている。
【０１０８】
一般に、本発明は、任意の生物学的サンプル、特に、人間、動物、植物、ウイルス、細菌、古細菌、菌類、酵母、ウイロイド、真核生物、または原生動物に応用可能である。
【０１０９】
もちろん、本発明の種々の特性、形態、変形例、および実施形態は、互いに組み合わせることができる。
引用文献：
[1]：WO2013 / 166373
[2]：≪ Random Forests ≫, Leo Breiman, paru dans ≪ Machine learning ≫, 45, 5-32, 2001
[3]：≪ Classification and Regression by RandomForest ≫, Andy Liaw and Matthew Wiener, R News, vol . 2/3, December 2002, ISSN 1609-3631
[4]：≪ Manual on setting up, using, and understanding random Forests V3.1 ≫, Leo Breiman, 2002
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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