(57)【要約】本発明は、ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）に結合する抗体に関する。本発明は、より具体的には、ｈＩＬ−２の特定のエピトープに特異的に結合するヒト化抗体、及びこのエピトープに結合した場合にｈＩＬ−２のＣＤ２５への結合を阻害する独特な能力を示すヒト化抗体に関する。【選択図】図１
2019511200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０９に記載のヒトＩＬ−２に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体又はその抗原結合部分は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＬＣＤＲ１は配列番号１２２を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号１２３を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号２１を含み、ＨＣＤＲ１は配列番号１１９を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１２０を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号１２１を含む、前記抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
前記抗体又はその抗原結合部分が、
配列番号１９、配列番号３１、配列番号６９、配列番号７２、配列番号８６及び配列番号９０からなる群から選択されるＬＣＤＲ１;
配列番号２０及び配列番号３２からなる群から選択されるＬＣＤＲ２;
配列番号２１に記載されているとおりのＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；と
配列番号４及び配列番号１３からなる群から選択されるＨＣＤＲ１;
配列番号２及び配列番号１２からなる群から選択されるＨＣＤＲ２;
配列番号３、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、及び配列番号４５からなる群から選択されるＨＣＤＲ３を含む重可変領域；と
を含む、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項３】
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１９、２０及び２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、２及び３である、又は、
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３１、３２及び２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、２及び３である、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１９、２０及び２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１３、１２及び３である、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３１、３２及び２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１３、１２及び３である、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６９、２０及び２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、２及び３である、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３１、３２及び２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、２及び３である、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６９、２０及び２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、２及び３である、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１９、２０及び２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、２及び３６である、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６９、２０及び２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、２及び３６である、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１９、２０、２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、２及び３６である、又は、
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６９、２０、２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、２及び３６である、
請求項１又は２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域が、アミノ酸配列：
ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号７、又は
ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号７、又は
ＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号７、又は
ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号１５、又は
ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号１５、又は
ＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号１５、又は
ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号１７、又は
ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号１７、又は
ＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号１７、又は
ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号７、又は
ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号３７、又は
ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号３７、又は
ＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号７、又は
ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号３７、又は
ＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号３７、又は
ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号１７、又は
ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号４９、又は
ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号４９、又は
ＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号１７、又は
ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号４９、又は
ＶＬ、配列番号７９：ＶＨ、配列番号４９
と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域が、アミノ酸配列：
ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号７、又は
ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号７、又は
ＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号７、又は
ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号１５、又は
ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号１５、又は
ＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号１５、又は
ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号１７、又は
ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号１７、又は
ＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号１７、又は
ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号７、又は
ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号３７、又は
ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号３７、又は
ＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号７、又は
ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号３７、又は
ＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号３７、又は
ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号１７、又は
ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号４９、又は
ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号４９、又は
ＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号１７、又は
ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号４９、又は
ＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号４９
を有する、請求項４に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３及び配列番号１０５からなる群より選択されるＦｃドメインを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された抗体。
【請求項７】
配列番号９３、配列番号１０１、配列番号１０３又は配列番号１０５に記載のＦｃドメインを含む、請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項８】
配列番号１２４に記載の軽鎖及び配列番号１２６に記載の重鎖を含み、又は配列番号１２８に記載の軽鎖及び配列番号１３０に記載の重鎖を含む、請求項７に記載の単離された抗体。
【請求項９】
アミノ酸Ｋ５２、Ｐ５４、Ｋ５５、Ｔ５７、Ｒ５８、Ｔ６１、Ｆ６２、Ｋ６３、Ｑ９４及びＫ９６を含むヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）エピトープに結合する、請求項１〜８のいずれかに記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
抗体又はその抗原結合性断片が、アミノ酸Ｋ５２、Ｐ５４、Ｋ５５、Ｔ５７、Ｒ５８、Ｔ６１、Ｆ６２、Ｋ６３、Ｑ９４及びＫ９６に特異的に結合する、請求項９に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
エピトープが、アミノ酸Ｎ５０、Ｎ５３、Ｎ９１、Ｌ９２、Ａ９３及びＮ９７のいずれか１つ以上をさらに含む、請求項１０に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸Ｎ５０、Ｋ５２、Ｎ５３、Ｐ５４、Ｋ５５、Ｔ５７、Ｒ５８、Ｔ６１、Ｆ６２、Ｋ６３、Ｎ９１、Ｌ９２、Ａ９３、Ｑ９４、Ｋ９６及びＮ９７に特異的に結合する、請求項１１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
配列番号１０９に記載のヒトＩＬ−２に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体又はその抗原結合部分が、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を順次含む軽鎖可変領域と、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を順次含む重鎖可変領域とを含み、
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２３１、２３２及び２３３であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１８１、１８２及び１８３であり、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２７９、２８０及び２８１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２１３、２１４及び２１５であり、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２３１、２３２及び２３３であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２１３、２１４及び２１５であり、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２６３、２６４及び２６５であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２１３、２１４及び２１５であり、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２６３、２６４及び２６５であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１４９、１５０及び１５１であり、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号６９、２０及び２１であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１９７、１９８、及び１９９であり、又は
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２３１、２３２及び２３３であり、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１９７、１９８、及び１９９である、
前記抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１４】
重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域が、アミノ酸配列： 
ＶＬ、配列番号２４３；ＶＨ、配列番号１９３、又は
ＶＬ、配列番号３９１；ＶＨ、配列番号２２５、又は
ＶＬ、配列番号２４３；ＶＨ、配列番号２２５、又は
ＶＬ、配列番号２７５；ＶＨ、配列番号２２５、又は
ＶＬ、配列番号２７５；ＶＨ、配列番号１６１、又は
ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号２０９、又は
ＶＬ、配列番号２４３；ＶＨ、配列番号２０９
と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１３に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１５】
重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域が、アミノ酸配列：
ＶＬ、配列番号２４３；ＶＨ、配列番号１９３、又は
ＶＬ、配列番号３９１；ＶＨ、配列番号２２５、又は
ＶＬ、配列番号２４３；ＶＨ、配列番号２２５、又は
ＶＬ、配列番号２７５；ＶＨ、配列番号２２５、又は
ＶＬ、配列番号２７５；ＶＨ、配列番号１６１、又は
ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号２０９、又は
ＶＬ、配列番号２４３；ＶＨ、配列番号２０９
を有する、請求項１４に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１６】
配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３及び配列番号１０５からなる群から選択されるＦｃドメインを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１７】
重鎖領域及び軽鎖領域がアミノ酸配列： 
重鎖配列番号１９５及び軽鎖配列番号２４５、又は
重鎖配列番号２２７及び軽鎖配列番号３９３、又は
重鎖配列番号２２７及び軽鎖配列番号２４５、又は
重鎖配列番号２２７及び軽鎖配列番号２７７、又は
重鎖配列番号１６３及び軽鎖配列番号２７７、又は
重鎖配列番号２１１及び軽鎖配列番号２６１、又は
重鎖配列番号２１１及び軽鎖配列番号２７７
を有する、請求項１５に記載の単離された抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体と、任意にヒトＩＬ−２とを含む組成物。
【請求項１９】
ヒトＩＬ−２が、配列番号１０９に記載のヒトＩＬ−２又は配列番号１１０に記載のアルデスロイキンからなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体とヒトＩＬ−２とを含む融合タンパク質。
【請求項２１】
抗体及びヒトＩＬ−２が、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０及び配列番号４１１からなる群から選択されるリンカー配列によって連結される、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
リンカー配列が配列番号４０５又は配列番号４０７である、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
抗体のＬＣＤＲ１がＫａｂａｔ定義による残基Ｙ２７及び残基Ｄ３０を含み、残基Ｙ２７がヒトＩＬ−２の残基Ｎ９７とＧＧリンカーで結合され、かつ、残基Ｄ３０は、ヒトＩＬ−２の残基Ｋ９６残基と配列番号４１２に記載のリンカーで結合される、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
医薬として使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の組成物、又は請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
医薬品の製造において使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の組成物、又は請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
癌治療に使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の組成物、又は請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体、又は請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の組成物、又は請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質を投与することによる、癌を治療する方法。
【請求項２８】
請求項１〜１７にいずれか１項に記載の抗体又はその断片、又は請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードし得る核酸分子を含むベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合断片、又は請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生することができる細胞。
【請求項３１】
前記産生された抗体が請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体又は請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質であることを特徴とする、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）に結合する抗体に関する。本発明は、より具体的には、ｈＩＬ−２の特定のエピトープに特異的に結合し、このエピトープに結合する場合に、ＣＤ２５へのｈＩＬ−２の結合を阻害する独特の能力を示し、かつ、前記抗体とｈＩＬ−２との融合を示す、前記ヒト化抗体に関する。さらに本発明は、ｈＩＬ−２との組合せにおける抗体のインビトロ及びインビボでの治療的適用、及び融合物のインビトロ及びインビボでの治療的適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、転移性腫瘍に対する細胞傷害性リンパ球を強力に刺激することができるサイトカインである。しかし、ＩＬ−２はまた、自己免疫疾患の予防に重要な、いわゆるＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）も刺激することができる。重要なことに、Ｔｒｅｇ細胞は細胞傷害性リンパ球による抗腫瘍応答を著しく衰退させることができ、それゆえにＩＬ−２の有益な抗腫瘍効果と多少なりとも拮抗する。さらに、臨床の抗腫瘍応答を達成するために必要な用量では、ＩＬ−２は有害な副作用を発揮するかもしれない。
【０００３】
ＩＬ−２を用いた免疫療法は１９８０年代初頭から、転移性黒色腫と及び転移性腎細胞癌の免疫療法のために使われてきており、それらの効能は、それぞれ１９９６年と１９９２年にＦＤＡからの承認に至っている。高用量で投与されたＩＬ−２は、これらの致死的転移性癌に罹患した患者の約１７％の他覚症状率を示し、約６％〜９％において完全退行を示した一方で、これらの用量で投与されたＩＬ−２は、低血圧、肺水腫、肝細胞障害、胃腸毒性、血管漏出症候群（ＶＬＳ）及び全身浮腫といった毒性の副作用をしばしば引き起こした。さらに、前述のように、ＩＬ−２は免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞を活性化し、次に、抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性を衰退させることができる。
【０００４】
ヒトＩＬ−２はいくつかの改変体が存在し、そしてＲｏｓａｌｉａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１４，２３：３９−４６（非特許文献１）において記述されるように、改良されたインビボ特性を有するＩＬ−２系化合物を見つけ出すために、様々なストラテジーがとられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒｏｓａｌｉａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１４，２３：３９−４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、適切な抗ヒトＩＬ−２抗体が欠如しているため、この原理に基づいた治療は、患者への使用において、いまだ成功していない。
【０００７】
本開示は、一般に、ヒトＩＬ−２の特異的エピトープに結合する抗体又はその断片に関し、障害の治療方法を含む、それらの調製及び使用のための方法に関する。
【０００８】
本明細書中に開示される抗ＩＬ−２抗体又はその断片は治療、予防、及び／又は、癌性障害（例えば、固形及び軟部組織腫瘍、及び血液学的腫瘍）及び感染症（例えば、慢性感染症）などの障害の診断に（単独で又は他の薬剤又は治療様式と組合せて）用いることができる。したがって、抗ＩＬ−２抗体又はその断片を含む組成物、並びに抗ＩＬ−２抗体又はその断片、又は抗ＩＬ−２抗体又はその断片を含む組成物を使用する癌及び／又は感染症を含む様々な障害を治療する方法が、本明細書に開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の側面では、本開示は、配列番号１０９記載のヒトＩＬ−２に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分を提供し、前記抗体又はその抗原結合部分は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号１２２を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号１２３を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号２１を含み、ＨＣＤＲ１は配列番号１１９を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１２０を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号１２１を含む。
【００１０】
一実施形態では、第１の側面による単離された抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１９、配列番号３１、配列番号６９、配列番号７２、配列番号８６及び配列番号９０から成る群から選択されるＬＣＤＲ１と、配列番号２０及び配列番号３２から成る群から選択されるＬＣＤＲ２と、配列番号２１に記載のＬＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、配列番号４、及び配列番号１３から成る群から選択されるＨＣＤＲ１と、配列番号２、及び配列番号１２から成る群から選択されるＨＣＤＲ２と、配列番号３、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、及び配列番号４５から成る群から選択されるＨＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含む。
【００１１】
さらなる実施形態では、第１の側面による単離された抗体又はその抗原結合部分であって、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、２及び３；、又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３１、３２及び２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、２及び３；、又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、配列番号１９、２０及び２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、配列番号１３、１２及び３；、又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、配列番号３１、３２及び２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、配列番号１３、１２及び３；、又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、配列番号６９、２０及び２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、２、及び３；、又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３１、３２及び２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、２、及び３；、又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６９、２０、及び２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、２、及び３；、又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１９、２０、及び２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、２、及び３６；、又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６９、２０、及び２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４、２、及び３６；、又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１９、２０、２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、２、及び３６；、及びＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６９、２０、２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、２、及び３６、である。
【００１２】
別の実施形態では、第１の側面により、単離された抗体又はその抗原結合部分であって、アミノ酸配列：ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号７、又はＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号７、又はＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号７、又はＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号１５、又はＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号１５、又はＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号１５、又はＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号１７、又はＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号１７、又はＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号１７、又はＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号７、又はＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号３７、又はＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号３７、又はＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号７、又はＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号３７、又はＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号３７、又はＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号１７、又はＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号４９、又はＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号４９、又はＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号１７、又はＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号４９、又はＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号４９、に対して、少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％といった同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
【００１３】
一実施形態では、第１の側面により、単離された抗体又はその抗原結合部分は、アミノ酸配列：ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号７、又は、ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号７、又は、ＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号７、又は、ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号１５、又は、ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号１５、又は、ＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号１５、又は、ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号１７、又は、ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号１７、又は、ＶＬ、配列番号３４；ＶＨ、配列番号１７、又は、ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号７、又は、ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号３７、又は、ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号３７、又は、ＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号７、又は、ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号３７、又は、ＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号３７、又は、ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号１７、又は、ＶＬ、配列番号２５；ＶＨ、配列番号４９、又は、ＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号４９、又は、ＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号１７、又は、ＶＬ、配列番号２７；ＶＨ、配列番号４９、又は、ＶＬ、配列番号７９；ＶＨ、配列番号４９、を有する重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を有する。
【００１４】
先の実施形態により単離された抗体は、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３及び配列番号１０５から成る群から選択されるＦｃドメインを含むことができる。好ましい実施形態においては、単離された抗体は、配列番号９３、配列番号１０１、配列番号１０３又は配列番号１０５に記載のＦｃドメインを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、単離された抗体は、配列番号１２４に記載の軽鎖及び配列番号１２６に記載の重鎖、又は配列番号１２８に記載の軽鎖及び配列番号１３０に記載の重鎖を含む。
【００１６】
本発明の第２の側面によれば、アミノ酸Ｋ５２、Ｐ５４、Ｋ５５、Ｔ５７、Ｒ５８、Ｔ６１、Ｆ６２、Ｋ６３、Ｑ９４、及びＫ９６を含むヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）エピトープに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片が提供される。
【００１７】
一実施形態では、第２の側面による単離された抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸Ｋ５２、Ｐ５４、Ｋ５５、Ｔ５７、Ｒ５８、Ｔ６１、Ｆ６２、Ｋ６３、Ｑ９４、及びＫ９６に特異的に結合する。
【００１８】
第２の側面による単離された抗体又はその抗原結合性断片は、アミノ酸Ｋ５２、Ｐ５４、Ｋ５５、Ｔ５７、Ｒ５８、Ｔ６１、Ｆ６２、Ｋ６３、Ｑ９４、及びＫ９６に加えて、アミノ酸Ｎ５０、Ｎ５３、Ｎ９１、Ｌ９２、Ａ９３及びＮ９７のいずれか一つ以上を更に含む、ヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）エピトープに結合できる。
【００１９】
一実施形態では、第２の側面による抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸Ｎ５０、Ｋ５２、Ｎ５３、Ｐ５４、Ｋ５５、Ｔ５７、Ｒ５８、Ｔ６１、Ｆ６２、Ｋ６３、Ｎ９１、Ｌ９２、Ａ９３、Ｑ９４、Ｋ９６、及びＮ９７に特異的に結合する。
【００２０】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を順に含む軽鎖可変領域、及びＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を順に含む重鎖可変領域を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２３１、２３２及び２３３、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１８１、１８２及び１８３、；又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２７９、２８０及び２８１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２１３、２１４及び２１５、；又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２３１、２３２及び２３３、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２１３、２１４及び２１５、；又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２６３、２６４及び２６５、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２１３、２１４及び２１５、；又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２６３、２６４及び２６５、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１４９、１５０及び１５１、；又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号６９、２０及び２１、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１９７、１９８、及び１９９、；又はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２３１、２３２及び２３３、かつ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１９７、１９８、及び１９９である。
【００２１】
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変（ＶＨ）及び軽鎖可変（ＶＬ）領域が、アミノ酸配列ＶＬ、配列番号２４３；ＶＨ、配列番号１９３、又はＶＬ、配列番号３９１；ＶＨ、配列番号２２５、又はＶＬ、配列番号２４３；ＶＨ、配列番号２２５、又はＶＬ、配列番号２７５；ＶＨ、配列番号２２５、又はＶＬ、配列番号２７５；ＶＨ、配列番号１６１、又はＶＬ、配列番号７０；ＶＨ、配列番号２０９、又はＶＬ、配列番号２４３；ＶＨ、配列番号２０９に対して、少なくとも９５％の同一性、例えば１００％といった同一性を有する。
【００２２】
特定の実施形態において、単離された抗体は、配列番号１９５に記載の重鎖及び配列番号２４５に記載の軽鎖、又は配列番号２２７に記載の重鎖及び配列番号３９３に記載の軽鎖、又は配列番号２２７に記載の重鎖及び配列番号２４５に記載の軽鎖、又は配列番号２２７に記載の重鎖及び配列番号２７７に記載の軽鎖、又は配列番号１６３に記載の重鎖及び配列番号２７７に記載の軽鎖、又は配列番号２１１に記載の重鎖及び配列番号２６１に記載の軽鎖、又は配列番号２１１に記載の重鎖及び配列番号２７７に記載の軽鎖；のアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖領域を含む。
【００２３】
本発明の第３の側面によれば、本発明の第１又は第２の側面による抗体、及び所望によるが、好ましくは、ヒトＩＬ−２を含む組成物が提供される。
【００２４】
一実施形態では、第３の側面による組成物は、配列番号１０９に記載のヒトＩＬ−２又は、配列番号１１０に記載のアルデスロイキン、好ましくは配列番号１１０に記載のアルデスロイキンから成る群から選択されるヒトＩＬ−２を含む。
【００２５】
本発明の第４の側面によれば、本発明の第１又は第２の側面による抗体及びヒトＩＬ−２を含む融合タンパク質が提供される。
【００２６】
一実施形態では、抗体及びヒトＩＬ−２は、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、配列番号４０１、配列番号４０２、配列番号４０３、配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、及び配列番号４１１、好ましくは配列番号４０５又は配列番号４０７から成る群から選択されるリンカー配列により結合される。
【００２７】
一実施形態では、融合タンパク質は、抗体のＬＣＤＲ１がＫａｂａｔ定義による残基Ｙ２７及び残基Ｄ３０を含み、かつ、残基Ｙ２７はＧＧリンカーでヒトＩＬ−２の残基Ｎ９７に結合され、残基Ｄ３０は、配列番号４１２に記載のリンカーでトＩＬ−２の残基Ｋ９６残基と結合される、本発明の第１又は第２の側面による抗体を含む。
【００２８】
本発明の第５の側面によれば、医薬としての使用のために、本発明の第１又は第２の側面による抗体又はその抗原結合断片、又は本発明の第３の側面による組成物、又は第４の側面による融合タンパク質が提供される。
【００２９】
本発明の第６の側面によれば、医薬品の製造において使用するために、本発明の第１又は第２の側面による抗体又はその抗原結合断片、又は本発明の第３の側面による組成物、又は第４の側面による融合タンパク質が提供される。
【００３０】
本発明の第７の側面によれば、癌の治療に用いるために、本発明の第１又は第２の側面による抗体又はその抗原結合断片、又は本発明の第３の側面による組成物、又は第４の側面による融合タンパク質が提供される。
【００３１】
本発明の第８の側面によれば、本発明の第１又は第２の側面による抗体又はその抗原結合断片、又は本発明の第３の側面による組成物、又は融合本発明の第４の側面による融合タンパク質による癌の治療方法が提供される。
【００３２】
本発明の第９の側面によれば、本発明の第１又は第２の側面による抗体又はその断片、又は、第４の側面による融合タンパク質をコードすることができる核酸分子を含むベクターが提供される。
【００３３】
本発明の第１０の側面によれば、本発明の第８の側面によるベクターを含む細胞が提供される。
【００３４】
本発明の第１１の側面によれば、第１又は第２の側面によるヒトインターロイキン２（ｈＩＬ−２）特異的モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を産生することができる細胞が提供される。
【００３５】
本発明の第１２の側面によれば、本発明の第１又は第２の側面により、前記産生された抗体、又は本発明の第４の側面による融合タンパク質であることを特徴とする、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株が提供される。
【００３６】
本発明の側面による抗体は、例えば それらは以下の特性の1つ以上を有するため、有効である。ｈＩＬ−２に対する抗体の結合の際に、得られたｍＡｂ*ｈＩＬ−２複合体は、もはやヒトＩＬ−２レセプターアルファ（ＣＤ２５としても知られる）に効果的に結合できず、表面プラズモン共鳴によって測定すると、遊離の（非複合体化）ｈＩＬ−２へのヒトＣＤ２５の結合と比較して、ｍＡｂ*ｈＩＬ−２とヒトＣＤ２５との結合がバックグラウンドレベルに効果的に減少している。さらに、抗体は、ネズミＩＬ−２に対する測定可能な交差反応性を示さない可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、実施例２で得られたプロロイキン（登録商標）／Ｆａｂ−ＮＡＲＡ１複合体の三次元構造の概要を提供する。
【図２】図２は、エピトープ残基のさらなる分析を提供する。Ｘ軸は、配列番号１１０に記載のアミノ酸配列及び番号付けを列挙する。Ｙ軸の上側は、プロロイキン（登録商標）由来の対応する残基から４Å以内にあるＮＡＲＡ１−Ｆａｂの総原子数を示し、下側のＹ軸は、配列番号１３２に記載のＮＡＲＡ１−Ｆａｂへの結合の結果としてプロロイキン（登録商標）由来の対応する残基の減少した溶媒接触領域（Å２）を示す。
【図３】図３は、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂによって認識される最も重要なエピトープ残基を示す。
【図４】図４は、プロロイキン（登録商標）／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体とＩＬ−２／ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２四次複合体とのオーバーレイを示す。
【図５】図５は、ＩＬ−２＿Ｃ１４５Ａ（ＰＤＢ：３ＩＮＫ）、Ｄ１０ＩＬ−２−ムテイン（「スーパーカイン」（Ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ）：ＰＤＢ：３ＱＢ１）、ＩＬ−２／ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２（ＰＤＢ：２Ｂ５Ｉ）、及びプロロイキン（登録商標）／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ由来のＣヘリックスのオーバーレイを示す。
【図６】図６は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、低用量ヒトＩＬ−２（ＩＬ−２ＬＤ）、高用量ヒトＩＬ−２（ＩＬ−２ＨＤ）、又は指示されたモノクローナル抗体を用いて作製したＩＬ−２／抗体複合体を投与されたマウスの脾臓由来の免疫細胞の数を示す。値を表１４及び表１５に示す。
【図７】図７は、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓由来のＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の代表的なブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）プロファイルを示す。
【図８】図８は、図６にあるとおり処理したマウスの脾臓由来のＣＤ３−ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞の代表的なＢｒｄＵプロファイルを示す。
【図９】図９は、一実施形態による融合タンパク質を示す概略図である。
【図１０】図１０は、一実施形態による融合タンパク質を示す概略図である。
【図１１】図１１は、一実施形態による融合タンパク質のアラインメントを示す。
【図１２】図１２〜１５は、実施例に従って、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓由来の内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞及びＣＤ３−ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞の表現型の特徴付けを示す。
【図１３】図１２〜１５は、実施例に従って、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓由来の内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞及びＣＤ３−ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞の表現型の特徴付けを示す。
【図１４】図１２〜１５は、実施例に従って、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓由来の内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞及びＣＤ３−ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞の表現型の特徴付けを示す。
【図１５】図１２〜１５は、実施例に従って、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓由来の内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞及びＣＤ３−ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞の表現型の特徴付けを示す。
【図１６】図１６は、実施例に従って、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓から得た免疫細胞サブセットの数を示す。
【図１７】図１７は、実施例に従って、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓から得たＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の比を示す。
【図１８】図１８は、実施例に従って、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なＢｒｄＵプロファイルを示す。
【図１９】図１９は、実施例に従って、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓由来のＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の代表的なＢｒｄＵプロファイルを示す。
【図２０】図２０は、実施例に従って、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓由来のＣＤ３−ＮＫ１．１＋ＤＸ５＋ＮＫ細胞の代表的なＢｒｄＵプロファイルを示す。
【図２１】図２１は、実施例に従って、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的なＢｒｄＵプロファイルを示す。
【図２２】図２２は、実施例に従って、図６にあるとおり処置したマウスの脾臓由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の代表的なＢｒｄＵプロファイルを示す。
【図２３】図２３は、実施例に従って、ＰＢＳ、融合タンパク質Ｌ１５、Ｌ２０又はＬ２５、又はヒトＩＬ−２／ＮＡＲＡ１複合体を投与されたマウスの脾臓由来の内在性ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表現型の特徴付けを示す。
【図２４】図２４は、実施例に従って、図２３にあるとおり処置したマウスの脾臓から得られた、指示された免疫細胞の細胞数を示す。
【図２５】図２５は、実施例に従って、図２３にあるとおり処置したマウスの脾臓由来のＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞及びＣＤ３−ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞の代表的なＢｒｄＵプロファイルを示す。
【図２６】図２６は、実施例に従って、ヒトＩＬ−２／ＮＡＲＡ１複合体の融合タンパク質のＬ１５、Ｌ２０又はＬ２５又はヒトＩＬ−２の滴定された用量で刺激されたＣＴＬＬ−２細胞を使用したインビトロでの実験からのＣＴＬＬ−２細胞増殖曲線を示す。
【図２７】図２７は、実施例に従って、ヒトＩＬ−２／ＮＡＲＡ１複合体、ヒトＩＬ−２、又は融合タンパク質Ｌ１５、Ｌ２０又はＬ２５の滴定された用量で刺激されたＣＴＬＬ−２細胞のＳＴＡＴ５リン酸化レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
表の簡単な説明
表１は、本発明の実施形態に記載の抗ＩＬ−２抗体の概要である。
表２は、本発明の実施形態に記載のＩＬ−２ムテインの概要である。
表３は、プロロイキン（登録商標）／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体の構造統計を表す。
表４は、本発明の実施形態に記載のエピトープ及びパラトープの概要である。
表５は、本発明の実施形態に記載の可変重領域の概要である。
表６は、本発明の実施形態に記載の可変軽領域の概要である。
表７は、いくつかの実施形態に記載の抗体のｐＩデータを含む。
表８は、可変領域及び可変生殖系列領域の比較を含む。
表９は、本発明の実施形態に記載の構造改良された可変領域を含む。
表１０は、本発明の実施形態に記載の可変軽鎖及び可変重鎖に関する情報を含む。
表１１は、本発明の実施形態に記載の軽鎖ＣＤＲを含む。
表１２は、本発明の実施形態に記載の重鎖ＣＤＲを含む。
表１３は、本発明の実施形態に記載の最適化された可変軽鎖及び可変重鎖を含む。
表１４は、ＶＨ変異配列の概要である。
表１５は、ＶＫ変異配列の概要である。
表１６は、プラスミド配列の概要である。
表１７は、本発明の実施形態に記載の親和性成熟抗体の概要である。
表１８は、第１セットの抗体の配列概要である
表１９は、実施例に記載のＥＬＩＳＡ値の概要である。
表２０は、実施例に記載のＥＣ５０値の概要である。
表２１は、本発明の実施形態に記載の親和性成熟抗体のサブセットである。
表２２は、表２１に記載の抗体のサブセットの配列概要である。
表２３は、結合親和性データを示す。
表２４は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖データを示す。
表２５は、ＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞増殖データを示す。
表２６及び表２７は、細胞数データを示す。
表２８は、本発明の実施形態に記載のリンカー配列の概要である。
表２９は、本発明の実施形態に記載の融合タンパク質の概要である。
表３０は、ＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞増殖データを表す。
表３１は、ＣＤ８＋Ｔ、ＮＫ及びＴｒｅｇ細胞数データを表す。
表３２及び表３３は、細胞数データを示す。
表３４は、細胞数データの比を示す。
表３５及び表３６は、融合タンパク質の軽鎖配列を示す。
表３７は、融合タンパク質の概要である。
表３８は、細胞数データを示す。
表３９及び表４０は、実施例に記載のＥＣ５０値を示す。
表４１は、本発明の実施に有用な配列を含む配列表である。
【００３９】
詳細な説明
本開示は、ヒトＩＬ−２に結合し、このサイトカインのインビボ機能に影響を及ぼす抗体及びその断片に関する。
【００４０】
本明細書で使用する「ヒトインターロイキン−２」又は「ｈＩＬ−２」とは、本明細書において配列番号１０９に記載のとおり、ＵｎｉＰｒｏｔＩＤ番号Ｐ６０５６８のヒトＩＬ−２（野生型又はｗｔ）を意味する。本発明の様々な実施形態では、ヒト野生型ＩＬ−２の変異体、アイソフォーム、及び種同族体も含まれる。従って、本開示の抗体は、ある場合には、ヒト以外の種由来のＩＬ−２と交差反応することがある。ある実施形態においては、抗体は、１つ又は複数のヒトＩＬ−２タンパク質に完全に特異的なことがあり、若しくは非‐人交差反応性の他のタイプを示さないことがある。
【００４１】
「ムテイン」という用語は、インターロイキン−２タンパク質に対する特異的な置換がなされたポリペプチドを意味する。用語「ＩＬ−２ムテイン」は、投与様式及び治療に関して使用される場合、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ又はそれ以上のＩＬ−２変異タンパク質を意味する。例えば、ＩＬ−２ムテインを用いた治療は、単一のＩＬ−２ムテイン又は多重のＩＬ−２ムテインの組合せによる治療を指していることがある。ヒトＩＬ−２の一例は、ＷＯ２０１２／１０７４１７Ａ１に開示されたｗｔｈＩＬ−２と比較して３つの変異を有する、ＩＬ−２ムテインである。
【００４２】
プロロイキン（登録商標）（アルデスロイキン）は、当業者に周知のヒトｗｔＩＬ−２の変異体の別の例であり、本明細書において配列番号１１０で表される。
【００４３】
本明細書で使用されるとおり用語「抗体」又は「ＩＬ−２に対する抗体」などは、ＩＬ−２エピトープと相互作用し（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布により）、ＩＬ−２のＩＬ−２受容体アルファ（ＣＤ２５とも呼ばれる）への結合を阻害する。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができ、相補性決定領域（ＣＤＲ）には、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保護された領域が点在する。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を仲介することができる。用語「抗体」は、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科動物抗体又はキメラ抗体を含む。抗体は、任意のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）若しくはサブクラスになりえる。
【００４４】
軽鎖及び重鎖の両方は、構造的及び機能的相同の領域に分割される。用語「定常」及び「可変」は、機能的に使用される。この点では、軽（ＶＬ）鎖部分及び重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが抗原認識と特異性を決定することが理解されよう。反対に、軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を与える。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、抗体の抗原結合部位又はアミノ末端から遠位になるにつれて大きくなる。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である；ＣＨ３ドメイン及びＣＬドメインは実際に重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端をそれぞれ含む。特に、用語「抗体」は、具体的にはＩｇＧ−ｓｃＦｖのフォーマットを含む。
【００４５】
本明細書で使用されるとおり抗体（又は単に「抗原部分」）の「抗原結合部分」という用語は、例えば、抗原又はエピトープ（例えばＩＬ−２の一部）に特異的に結合する能力を保持しているタンパク質のような、抗体の完全長又は、１つ又は複数の断片を指す。
【００４６】
「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”５版、アメリカ公衆衛生局、国立衛生研究所、ベテスダ、ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、（１９９７）ＪＭＢ２７３、９２７−９４８（“Ｃｈｏｔｈｉａ”番号付けスキーム）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け（Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．−Ｐ．、ＴｈｅＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ、７、１３２−１３６（１９９９）、Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．−Ｐ．ら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２７、５５−７７（２００３）（“ＩＭＧＴ”番号付けスキーム）によって記述されているものを含む、多くの周知のスキームのいずれかを用いて決定される境界を有するアミノ酸配列である。例えば、古典的なフォーマットの場合、Ｋａｂａｔのもとでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基は３１−３５（ＨＣＤＲ１）、５０−６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５−１０２（ＨＣＤＲ３）と番号が付けられ、かつ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基は、２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９−９７（ＬＣＤＲ３）と番号が付けられる。Ｃｈｏｔｈｉａのもとでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸は、２６−３２（ＨＣＤＲ１）、５２−５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５−１０２（ＨＣＤＲ３）と番号が付けられ、かつ、ＶＬ中のアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と番号が付けられる。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組合せることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨでは、アミノ酸残基２６−３５（ＨＣＤＲ１）、５０−６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５−１０２（ＨＣＤＲ３）からなり、ヒトＶＬでは、アミノ酸残基２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）及び８９−９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴのもとでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基は約２６〜３５（ＣＤＲ１）、約５１〜５７（ＣＤＲ２）及び約９３−１０２（ＣＤＲ３）の番号が付けられ、かつ、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基は約２７〜３２ＣＤＲ１）、約５０−５２（ＣＤＲ２）及び約８９−９７（ＣＤＲ３）（「Ｋａｂａｔ」による番号付け）の番号が付けられる。ＩＭＧＴのもとでは、抗体のＣＤＲ領域はプログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ  Ａｌｉｇｎを用いて決定することができる。
【００４７】
「エピトープ結合ドメイン」又は「ＥＢＤ」という用語は、標的エピトープ上の結合部位と（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布により）特異的に相互作用する抗原結合部分（例えば、抗体、若しくはエピトープ結合断片又はその誘導体）の部分をいう。ＥＢＤはまた、ＩＬ−２エピトープへ特異的に（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布により）相互作用する能力を保持する抗体の一つ以上の断片をいい、かつ、ＩＬ−２のＩＬ−２受容体アルファ（ＣＤ２５）への結合を妨げる。抗体断片の例としては、限定されないが、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、ｓｃＦｖ断片；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）；並びに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれるがこれに限定されない。
【００４８】
本明細書で使用されるとおり用語「エピトープ」は、免疫グロブリンに高親和性で結合することができる任意の決定基を指す。エピトープは、その抗原を特異的に標的とする抗体によって結合される抗原領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗体に直接接触する特定のアミノ酸を含む。最も頻繁には、エピトープはタンパク質上に存在するが、いくつかの例では、核酸のような他の種類の分子上に存在することがある。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基を含むことができ、かつ、特定の３次元構造特性及び／又は比電荷特性を有し得る。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成する一本のタンパク質鎖（Ｆｖ（ｓｃＦｖ）一本鎖として知られる；例えばＢｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）米国科学アカデミー紀要、８５：５８７９−５８８３を参照）として作製されることを可能にする合成リンカーによって結合させることができる。
【００４９】
このような一本鎖抗体はまた、「断片」、「エピトープ結合断片」又は「抗体断片」という用語に包含されることが意図される。これらの断片は、当業者に周知の従来の技術を用いて得られ、そして、その断片は完全な抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００５０】
抗体断片は、一対の抗原結合領域を形成する相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込むことができ（Ｚａｐａｔａら、（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−１０６２；及び米国特許第５６４１８７０号）、かつ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体への抗Ｉｄ抗体を含む）、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を含む。
【００５１】
ＥＢＤは、また、当該技術分野（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６−１１３６を参照）において周知の、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、マキシボディー（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ユニボディー（ｕｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、二重特異性一本鎖ダイアボディー、又は二つの異なるエピトープに結合するように設計された一本鎖ダイアボディーを含む。ＥＢＤは、抗体様分子又は抗体模倣物も含み、これに限定されないが、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、マキシボディー（ｍａｘｙｂｏｄｉｅｓ）、Ｆｎ３に基づくタンパク質足場、Ａｎｋｒｉｎリピート（ＤＡＲｐｉｎとしても知られている）、ＶＡＳＰポリペプチド、鳥類膵臓ポリペプチド（ａＰＰ）、テトラネクチン、アフィリリン（Ａｆｆｉｌｉｌｉｎ）、ノッチン（Ｋｎｏｔｔｉｎ）、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、テンダミスタット（Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）、ネオカルチノスタチン（Ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、プロテインＡドメイン、リポカリン、トランスフェリン及び特異的にエピトープに結合するクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインが含まれ、それらは本発明の範囲内である。抗体断片は、フィブロネクチン３型（Ｆｎ３）のようなポリペプチドに基づく足場へ移植することができる。（フィブロネクチンポリペプチドモノボディーを記載する米国特許第６７０３１９９号参照）
【００５２】
本明細書で使用されるとおり語句「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう（例えば、ＩＬ−２に特異的に結合する単離された抗体は、ＩＬ−２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ＩＬ−２に特異的に結合する単離された抗体は、他の種由来のＩＬ−２分子のような他の抗原に対して交差反応性を有するかもしれない。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないかもしれない。
【００５３】
本明細書で使用されるとおり用語「一価抗体」は、ＩＬ−２のような標的分子上の単一のエピトープに結合する抗体をいう。
【００５４】
本明細書で使用されるとおり用語「二価抗体」は、少なくとも２つの同一のＩＬ−２標的分子上の２つのエピトープに結合する抗体をいう。二価抗体は、標的ＩＬ−２分子を相互に架橋することもできる。「二価抗体」はまた、少なくとも２つの同一のＩＬ−２標的分子上の２つの異なるエピトープに結合する抗体をいう。
【００５５】
用語「多価抗体」は、１価より多い価数を有する単一の結合分子を指し、「原子価」は、抗体構築物の分子あたりに存在する抗原結合部分の数として記載される。このように、単一の結合分子は、標的分子上の２つ以上の結合部位に結合することができる。多価抗体の例には、限定されないが、二価抗体、三価抗体、四価抗体、五価抗体などが含まれ、並びに、二重特異性抗体及び双極性抗体が含まれる。例えば、ＩＬ−２の場合、多価抗体（例えばＩＬ−２双極性抗体）は、ＩＬ−２の２つのドメインに対してそれぞれ結合部分を有する。
【００５６】
多価抗体は、（例えば、細胞殺傷を仲介又は促進することによって、又は生体利用可能な物質の量を調節することにより）、生物学的効果を仲介するか、又は被験体の疾患又は障害を調節する。
【００５７】
用語「多価抗体」はまた、２つの別個のＩＬ−２標的分子のための２つ以上の抗原結合部分を有する単一の結合分子をいう。例えば、ＩＬ−２標的分子及びＩＬ−２でない第２の標的分子の両方に結合する抗体などである。一実施形態では、多価抗体は、４つのエピトープ結合ドメインを有する４価抗体である。４価の分子は、その標的分子上の各結合部位に対して二重特異性及び二価であることがある。
【００５８】
本明細書で使用されるとおり用語「双極性抗体」は、単一のＩＬ−２標的上の２つの異なるエピトープに結合する抗体をいう。この用語はまた、少なくとも２つのＩＬ−２標的の２つのドメインに結合する抗体、例えば４価双性抗体を含む。
【００５９】
本明細書で使用されるとおり用語「二重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる標的（例えば、ＩＬ−２とＩＬ−２ではない標的）上の２つ以上の異なるエピトープに結合する抗体をいう。
【００６０】
本明細書で使用されるとおり語句「モノクローナル抗体」又は語句「モノクローナル抗体組成物」は、アミノ酸配列が実質的に同一である、又は、同じ遺伝子源に由来する、抗体、二重特異性抗体などを含むポリペプチドをいう。この用語はまた、単一分子組成の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００６１】
本明細書で使用されるとおり用語「ヒト化抗体」又は用語「ヒト化抗ＩＬ−２抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含む。さらなるフレームワーク領域の改変は、ヒトフレームワーク配列内、及び別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列内で行われることがある。
【００６２】
本発明のヒト化抗体は、ヒト配列により、コードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的変異誘発、又はインビボでの体細胞変異、又は安定性又は製造を促進するための保存的置換により導入された変異）を含むことがある。
【００６３】
本明細書中で使用されるとおり、語句「組換えヒト化抗体」は、ヒト化抗体を発現するように形質転換された宿主細胞由来、例えばトランスフェクトーマ由来の単離された抗体のように、組換え手段によって、調製、発現、作成又は単離されるすべてのヒト抗体を含み、かつ、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部又は一部を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製又は単離された抗体を含む。
【００６４】
本明細書で使用されるとおり用語「Ｆｃ領域」は、抗体の定常ドメインのヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ３及びＣＨ２を含むポリペプチドをいう。任意に、Ｆｃ領域は、いくつかの抗体クラスに存在するＣＨ４ドメインを含み得る。Ｆｃ領域は、抗体の定常ドメインのヒンジ領域全体を含み得る。一実施形態では、本発明は、抗体のＦｃ領域及びＣＨ１領域を含む。一実施形態では、本発明は、抗体のＦｃ領域及びＣＨ３領域を含む。別の実施形態では、本発明は、抗体の定常ドメイン由来のＣカッパ／ラムダ領域、Ｆｃ領域及びＣＨ１領域を含む。一実施形態では、本発明の結合分子は、定常領域、例えば重鎖定常領域を含む。一実施形態では、このような定常領域は、野生型定常領域と比較して改変される。すなわち、本明細書で開示される本発明のポリペプチドは、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）及び／又は軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）一つ以上に対する変更又は改変を含み得る。例示的な改変は、一つ以上のドメインにおける一つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換を含む。そのような変化は、エフェクター機能、半減期などを最適化することを含むことがある。
【００６５】
本明細書で使用されるとおり、用語「結合部位」は、抗体又は抗原結合断片が選択的に結合するＩＬ−２標的分子上の領域を含む。
【００６６】
用語「融合タンパク質」は、２つの別々のタンパク質の融合物であり、追加のリンカー配列を有することもあるが、有さないこともある。
【００６７】
用語「リンカー配列」は、２つのタンパク質を連結又は結合するために使用されるアミノ酸配列である。
【００６８】
一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複合混合物中の標的抗原上のエピトープに結合する。
【００６９】
本明細書で使用されるとおり、用語「親和性」は、単一抗原部位における抗体と抗原との間の相互作用の強さをいう。各抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有結合力を介して多数の部位で抗原と相互作用する；つまり、より相互作用があれば、より親和性は強くなる。本明細書で使用されるとおり、ＩｇＧ抗体又はその断片（例えば、Ｆａｂ断片）に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対する１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、又は１０−１３Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかし、高親和性結合は、他の抗体のアイソタイプにより変化することができる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する高親和性結合とは、１０−７Ｍ以下、又は１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【００７０】
本明細書で使用されるとおり、用語「親和性」は、抗体―抗原複合体の全体的な安定性又は強度の有益な尺度を指す。それは、３つの主要な因子：抗体エピトープ親和性；抗原と抗体の両方の価数；相互作用する部分の構造的配置により制御される。最終的に、これらの因子は、抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が正確な抗原エピトープに結合する可能性を明らかにする。
【００７１】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当技術分野で周知のいくつものエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。例えば、分子生物学の方法におけるエピトープマッピングプロトコール、Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．を参照。例としては、直線状エピトープは、例えば、固体支持体上に多数のペプチドを同時に合成し、ペプチドがタンパク質分子の一部に応答し、そして、ペプチドが支持体に付着している間に、ペプチドと抗体を反応させることによって、決定することができる。このような技術は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第４７０８８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８４）米国科学アカデミー紀要ＵＳＡ８：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８５）米国科学アカデミー紀要ＵＳＡ８２：７８−１８２；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３：７０９−７１５に記載される。同様に、立体配座エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学及び二次元核磁気共鳴により、アミノ酸の空間的立体配座を決定することにより容易に同定される。上記のエピトープマッピングプロトコールを参照。タンパク質の抗原性領域は、例えば Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ．から入手可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを用いて計算したもののように、標準的な抗原性及び疎水性プロットを用いて同定することもできる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルを決定するためには、Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法、Ｈｏｐｐら、（１９８１）米国科学アカデミー紀要ＵＳＡ７８：３８２４−３８２８；そして、疎水性プロットには、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｋｙｔｅら、（１９８２）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ、１５７：１０５−１３２；を用いる。
【００７２】
明細書及び特許請求の範囲で使用されるとおり、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の参考を含む。例えば、用語「ａ  ｃｅｌｌ」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００７３】
例えば、範囲を含む、ｐＨ、温度、時間、濃度、及び分子量などのすべての数値指定は、０．１の増分で（＋）又は（−）に変化する近似値である。必ずしも明記されているわけではないが、すべての数値表示の前に用語「約」が付されていることも理解されたい。また、必ずしも明示的ではないが、本明細書に記載されている試薬は単なる例であり、それらの等価物は当技術分野で周知であることも理解されるべきである。
【００７４】
本明細書で使用されるとおり、用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸及び／又は非天然又は合成アミノ酸、並びにＤ及びＬ光学異性体、アミノ酸類似体及びペプチド模倣体のいずれかを指す。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、一般にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは一般にポリペプチド又はタンパク質と呼ばれる。用語「バイオマーカー」又は「マーカー」は、本明細書では交換可能に使用される。バイオマーカーは、核酸又はポリペプチドであり、ポリペプチドの変異又は差次的発現の有無は、本発明に記載の抗ＩＬ−２抗体を含む任意の治療に対する感受性を決定するために使用される。例えば、タンパク質が、正常（非癌性）細胞又は対照細胞における同じタンパク質と比較して、翻訳後改変、産生、発現、レベル、安定性及び／又は活性において、欠損、変異、欠失、又は減少している場合に、癌細胞のバイオマーカーとなる。
【００７５】
用語「ｃＤＮＡ」は、相補的ＤＮＡ、すなわち、逆転写酵素のような酵素を用いてｃＤＮＡに作られた細胞又は生物に存在するｍＲＮＡ分子を指す。「ｃＤＮＡライブラリ」は、細胞又は生物中に存在するすべてのｍＲＮＡ分子の集合体であり、すべて逆転写酵素でｃＤＮＡ分子に変換され、次いで「ベクター」（外来ＤＮＡの添加後に複製を続けることができる他のＤＮＡ分子）に挿入される。ライブラリについてのベクターの例は、バクテリオファージ（「ファージ」としても知られる）、細菌に感染するウイルス、例えばラムダファージが挙げられる。次いで、ライブラリは、目的の特定のｃＤＮＡ（したがって、ｍＲＮＡ）についてプローブされ得る。
【００７６】
「細胞増殖性障害」という用語には、異常な細胞増殖及び／又は機能の分裂又は機能喪失を特徴とする正常な生理学的機能の調節不全が含まれるものとする。「細胞増殖性障害」の例には、過形成、新形成、化生、及び例えば、Ｔ細胞アポトーシスの調節不全を特徴とする、様々な自己免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
「組合せ」は、一つの投薬単位形態において固定された組合せ、又は併用投与のことを指し、本発明の化合物と組合せパートナー（例えば、「治療剤」又は「補助剤」とも呼ばれる、以下に説明する別の薬剤）とは、同時に、又は時間間隔内で別々に投与することができ、特にこれらの時間間隔は、組合せパートナーが協力性、例えば、相乗効果を示すことを可能にする。単一の成分は、一つのキットに包装してもよいし、又は別々に包装してもよい。成分（例えば、粉末又は液体）の一方又は両方は、投与前に所望の用量に再構成又は希釈してもよい。本明細書で使用される「同時投与」又は「併用投与」などの用語は、それを必要とする単一の被験体（例えば、患者）へ選択された組合せパートナーの投与を含むことを意味し、かつ、薬剤が同じ投与経路によって、あるいは同時に必ずしも投与されない治療レジメンを含むことが意図される。本明細書で使用される用語「薬学的組合せ」は、２つ以上の有効成分の混合又は組合せから得られ、かつ、有効成分の固定及び非固定の組合せの両方を含む製品を意味する。用語「固定された組合せ」は、有効成分、例えば、本発明の化合物と組合せパートナーとが、両方とも、単一のもの（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｎｔｉｔｙ）の形態又は単一の投与量の形態で患者に同時に投与されることを意味する。用語「固定されない組合せ」は、有効成分、例えば、本発明の化合物と組合せパートナーとが、別個のものの状態で、同時に、一斉に、又は特定の時間制限なしで連続して、患者に両方とも投与されることを意味し、このような投与により、患者の体内において、２つの化合物が治療的に有効なレベルとなることができる。後者は、カクテル療法、例えば３種以上の有効成分の投与にも適用される。
【００７８】
「遺伝子」は、転写及び翻訳された後に特定のポリペプチド又はタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドをいう。ポリヌクレオチド配列は、関連する遺伝子のより大きな断片又は全長コード配列を同定するために使用され得る。より大きな断片配列を単離する方法は当業者に公知である。
【００７９】
「遺伝子発現」又は代替として「遺伝子産物」は、遺伝子が転写及び翻訳されるときに生成される核酸又はアミノ酸（例えば、ペプチド又はポリペプチド）を指す。
【００８０】
本明細書で使用されるとおり、「発現」は、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写されるプロセス及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００８１】
遺伝子に適用されるとおり、「示差的に発現される」とは、遺伝子又は遺伝子によってコードされるタンパク質産物から転写及び／又は翻訳されたｍＲＮＡの示差的産生を指す。示差的に発現される遺伝子は、正常細胞又は対照細胞の発現レベルと比較して、過剰発現又は過少発現され得る。しかしながら、本明細書中で使用されるとおり、過剰発現は遺伝子発現の増加であり、正常又は対照の細胞又は組織で検出されたものよりも、一般に、少なくとも１．２５倍、若しくは少なくとも１．５倍、若しくは少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、あるいは、少なくとも４倍の発現である。本明細書中で使用されるとおり、過少発現は、遺伝子発現の減少であり、一般に、正常又は対照の対応の細胞又は組織で検出されたものより、少なくとも１．２５倍、若しくは少なくとも１．５倍、若しくは少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、あるいは、少なくとも４倍、低い。「示差的に発現される」という用語はまた、癌細胞又は癌性組織における発現が検出されるが、対照細胞又は正常組織（例えば、非癌性細胞又は組織）における発現は検出されないことを指す。
【００８２】
遺伝子の高い発現レベルは、遺伝子の過剰発現又は遺伝子コピー数の増加のために起こり得る。遺伝子は、調節解除又はネガティブレギュレーターの不在のために、増加したタンパク質レベルに翻訳することもできる。最後に、遺伝子の高い発現は、タンパク質の安定化の増加又は分解の低下に起因して起こり得、タンパク質の蓄積をもたらす。
【００８３】
本明細書中で使用されるとおり、癌細胞の「阻害する」、「阻害すること」、又は「増殖を阻害する」又は「増殖を阻害すること」という用語は、癌細胞の増殖を遅らせ、中断させ、阻止させ、又は停止させることを指し、必ずしも癌細胞増殖の完全な排除を示すものではない。「阻害する」及び「阻害すること」などの用語は、２つの状態間の量的な差異を示し、少なくとも２つの状態間の統計的に有意な差異を指す。例えば、「癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量」は、細胞の増殖速度が少なくとも統計的に有意に未処理細胞とは異なることを意味する。そのような用語は、本明細書において、例えば、細胞増殖率に適用される。
【００８４】
用語「単離された」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はその断片が、通常、自然に由来する構成成分、細胞及びその他のものから分離されたことを意味する。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、通常、その天然又は自然環境に由来の、例えば、染色体上の、３’及び５’隣接ヌクレオチドから分離される。当業者には明らかであるとおり、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はその断片は、天然に存在するものと区別するために「単離」という用語を用いない。さらに、「濃縮された」、「分離された」又は「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体又はその断片は、その天然に存在する対応物と比較し、体積当たりの分子の濃度又は数が、「濃縮」バージョンにおいて多い、あるいは、「分離」バージョンにおいて少ないということにおいて、その天然に存在する対応物と区別可能である。
【００８５】
本明細書で使用されるとおり、用語「新生物細胞」、「腫瘍性疾患」、「新生物」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」及び「癌細胞」（互換的に使用される）は、比較的、自律的な成長を示す細胞を指し、そのため、それらは、細胞増殖の制御の有意な喪失（すなわち、調節されていない細胞分裂）によって特徴付けられる異常な増殖表現型を示す。新生物細胞は悪性又は良性であり得る。「転移性細胞又は組織」は、細胞が隣接する身体構造に侵入し、破壊することができることを意味する。
【００８６】
用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はその類似体のいずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、任意の機能を果たすことができる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ剤、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、あるいは、当技術分野で公知の、様々な改変又は置換のいずれかを用いて、１つ又は複数の塩基、糖及び／又はリン酸で改変又は置換することができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの改変されたヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチド構造の改変は、存在する場合には、ポリマーのアセンブリの前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合の後、例えば標識成分とのコンジュゲーションによりさらに改変することができる。この用語はまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。特に明記しない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態及び二本鎖形態を構成することが公知又は予測される各々の二つの相補的一本鎖形態の両方を包含する。
【００８７】
用語「ポリペプチド」は、用語「タンパク質」と互換的に用いられ、その最も広い意味で、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、又はペプチド模倣体の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結することができる。別の実施形態では、サブユニットは、例えば、エステル、エーテルなどの他の結合によって連結されてもよい。
【００８８】
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（又はポリペプチド又はポリペプチド領域）が、別の配列に対して、ある百分率（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％）の「配列同一性」を有することは、整列させたとき、２つの配列を比較すると、その百分率の塩基（又はアミノ酸）は、同じであることを意味する。このアラインメント及びパーセント相同性又は配列同一性は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、（１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３０、ｓｅｃｔｉｏｎ７．７．１８、Ｔａｂｌｅ７．７．１に記載される、当該分野で公知のソフトウェアプログラムにより決定されることができる。好ましくは、アラインメントのためにデフォルトパラメータが使用される。好ましいアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムはＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトパラメータを使用する：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；ストランド＝両方；カットオフ＝６０；期待＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０シーケンス；並べ替え＝ＨＩＧＨＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長。
【００８９】
腫瘍増殖を「抑制すること」又は腫瘍増殖の「抑制」は、本発明の化合物に記載の抗ＩＬ−２抗体と接触させることをしない腫瘍増殖と比較して、本発明に化合物に記載の抗ＩＬ−２抗体と接触させた場合の腫瘍細胞増殖の減少を示す。腫瘍細胞の増殖は、当技術分野で公知の任意の手段によって評価することができ、腫瘍の大きさの測定、腫瘍細胞が３Ｈ−チミジン取り込みアッセイを用いて増殖しているかどうかの決定、ＦＤＧ−ＰＥＴ（フルオロデオキシグルコース陽電子放射断層撮影）イメージングによるグルコース取込みの測定、又は腫瘍細胞の計数を含むが、これらに限定されない。腫瘍細胞の増殖を「抑制すること」は、次の状態のいずれか又は全てを意味する：腫瘍成長の減速、遅延及び停止、並びに腫瘍の収縮。「被験体」、「個体」又は「患者」は、本明細書中では交換可能に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳類には、マウス、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物、及びペットが含まれるが、これらに限定されない。
抗ＩＬ−２抗体
【００９０】
第１の側面において、本発明は、ヒトＩＬ−２に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分を提供し、前記抗体又はその抗原結合部分は、表１１に記載のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域及び表１２に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合部分は、表６又は表１０に記載の軽鎖可変領域及び表５又は表１０に記載の重鎖可変領域を含む重可変領域を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、単離された抗体は、表１０又は表１３に示されるような可変軽鎖及び可変重鎖を含む。
【００９３】
別の側面では、本発明は、ヒトＩＬ−２に結合する抗体又はその断片の変異体を提供する。したがって、本発明は、例えば、それぞれ表５及び表６に示す、重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列のいずれかの重鎖又は軽鎖のいずれかの親抗体の重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％同一である（少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する）重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を有する抗体又はその断片を提供する。同様に、重鎖又は軽鎖のいずれかの親抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列の非伸長ＣＤＲ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列の非伸長ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を有する抗体又はその断片が、本発明により提供される。好ましくは、重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列の非ＣＤＲ領域又は非伸長ＣＤＲ領域のアミノ酸配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％、特に９６％、より特に９７％、さらにより特に９８％、最も特定に９９％であり、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％である。
【００９４】
本開示はまた、重鎖及び／又は軽鎖定常領域、特にヒト重鎖及び／又はヒト軽鎖定常領域をさらに含む、ヒトＩＬ−２に結合する抗体又はその断片を提供する。ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡＩ（ＩＧＨＡｌ）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）、又はＩｇＥ（ｌＧＨＥ）、からなるヒト免疫グロブリンの群から選択されてもよいが、ヒト重鎖定常領域ＩｇＧ、特にＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）が好ましい。ヒト軽鎖定常領域は、カッパ（ｋａｐｐａ）又はラムダ（ｌａｍｂｄａ）定常領域からなるヒト免疫グロブリンの群から選択されてもよいが、ヒトカッパ定常領域が好ましい。好ましい実施形態では、ヒトＩＬ−２に結合する抗体又はその断片は、ヒトＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）重鎖定常ドメイン及びヒト軽鎖カッパ定常ドメインを含む。
【００９５】
フレームワーク領域又はＣＤＲ領域内で行われる改変のための付加又は代替において、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内の改変を含むように、設計することができ、典型的には、１つ又は複数の抗体の機能的特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃレセプター結合、及び／又は抗原依存性細胞傷害性などを改変するよう、設計することができる。
【００９６】
さらに、本発明の抗体は、化学修飾することができ（例えば、１つ以上の化学的部分は抗体に結合させることができる）、又はそのグリコシル化を改変するように修飾することができる。
【００９７】
本発明は、結果的にインビボにおいて半減期が変化したＩＬ−２に特異的に結合する抗体を提供する。
【００９８】
多くの因子は、インビボでのタンパク質の半減期に影響する。例えば、腎臓ろ過、肝臓での代謝、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解、及び免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質中和及びマクロファージ及び樹状細胞による取り込みなど）などがある。本発明の抗体及びその抗原結合断片の半減期を延長するために、様々なストラテジーをとることができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合リガンド、及び炭水化物シールドへの化学結合；アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎなどの血清タンパク質に結合するタンパク質への遺伝子融合、及び転写；ナノボディー、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎｓ、アビマー、アフィボディー及びアンチカリンのような血清タンパク質に結合する他の結合部分に（遺伝学的に又は化学的に）カップリングさせることによって；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンドメイン、アルブミン結合タンパク質、及びＦｃとの遺伝的融合によって；又は徐放性製剤、医療機器、又はナノキャリアへの組み込みによる。
【００９９】
インビボでの抗体の血清循環を延長するために、高分子量ＰＥＧのような不活性ポリマー分子は、抗体のＮ末端又はＣ末端へのＰＥＧの部位特異的コンジュゲーション、又はリジン残基上に存在するイプシロンアミノ基を介して、多官能性リンカーを有して、又は有さずに、抗体又はその断片に結合することができる。抗体をペグ化するためには、抗体、その抗原結合断片を、典型的には、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体のようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、一つ又は複数のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に結合するようになる条件下で反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアルキル化反応又はアシル化反応によって行うことができる。本明細書で使用されるとおり、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール、又はポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの形態のいずれかを包含することを意図する。一実施形態では、ペグ化される抗体は、グリコシル化された抗体である。生物学的活性の損失を最小限にするために、線状又は分枝状ポリマー誘導体化が使用される。コンジュゲーションの程度は、ＰＥＧ分子の抗体への適切なコンジュゲーションを確実にするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析によって綿密にモニターすることができる。未反応ＰＥＧは、サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーによって抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を用いて、例えば本明細書に記載のイムノアッセイによって、結合活性及びインビボ有効性について試験することができる。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は、当技術分野で公知であり、本発明の抗体及びその抗原結合断片に適用することができる。例えば、ニシムラらによるＥＰ  ０  １５４  ３１６、及びイシカワらによるＥＰ  ０  ４０１  ３８４を参照。これらの各々は、参考として援用される。
【０１００】
他の改変されたペグ化技術には、ｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡを含む再構成された系を介して生合成タンパク質に化学的に特定された側鎖を組み込む再構成化学的直交指向性工学技術（ＲｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ）が含まれる。この技術は、大腸菌、酵母、及び哺乳類細胞の生合成タンパク質に３０以上の新しいアミノ酸を組み込むことを可能にする。ｔＲＮＡは、アンバーコドンを終止コドンから化学的に特定されたアミノ酸の取り込みをシグナルするコドンへ変換し、アンバーコドンが配置された任意の場所に標準アミノ酸を組み込む。
【０１０１】
組換えペグ化技術（ｒＰＥＧ）も、血清半減期延長に使用することができる。この技術は、３００−６００アミノ酸の非構造化タンパク質テイルを既存の医薬タンパク質に遺伝的に融合させることを含む。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの分子量は実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期は非常に長くなる。化学的コンジュゲーション及び再精製を必要とする従来のＰＥＧ化とは対照的に、製造プロセスは非常に単純化され、生成物は均質である。
【０１０２】
ポリシアル化は天然ポリマーポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して活性寿命を延長し、治療用ペプチド及びタンパク質の安定性を改善する別の技術である。ＰＳＡはシアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質及び治療ペプチド薬物送達のために使用される場合、ポリシアル酸はコンジュゲーションにおいて保護微小環境を提供する。これは、循環中の治療用タンパク質の活性寿命を延ばし、免疫系によって認識されることを防ぐ。ＰＳＡポリマーは人体に天然に存在する。それは、ある種の細菌によって取り入れられ、何百万年にもわたって、ＰＳＡポリマーで、壁を覆うように進化した。そして、これらの天然のポリシアル化された細菌は、分子模倣により身体の防御システムを覆うことができた。自然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、このようなバクテリアから大量かつ所定の物理的特性で容易に製造することができる。バクテリアのＰＳＡは、人体のＰＳＡと化学的に同一であるため、タンパク質と結合しても完全に非免疫原性である。
【０１０３】
別の技術は、抗体に結合したヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳは、ワキシートウモロコシデンプン由来の改質天然ポリマーであり、身体の酵素によって代謝されることができる。ＨＥＳ溶液は、通常、不十分な血液量を代用し、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のヘキシル化は、分子の安定性を増加させることにより、並びに腎クリアランスを減少させることによって循環半減期の延長を可能にし、生物学的活性を増加させる。異なるパラメータ、例えばＨＥＳの分子量を変化させることにより、広範囲のＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることができる。
【０１０４】
インビボで増加した半減期を有する抗体は、１つ又は複数のアミノ酸改変（すなわち、置換、挿入又は欠失）をＩｇＧ定常ドメイン又はそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくは、Ｆｃ又はヒンジＦｃドメイン断片）に導入することで、生成することもできる。例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９８／２３２８９；ＰＣＴ国際公開ＷＯ９７／３４６３１；及び米国特許第６２７７３７５号を参照。これらの各々は、参考として援用される。
【０１０５】
さらに、抗体又は抗体断片をインビボでより安定にするために、又はインビボでより長い半減期を有するように、抗体をアルブミンにコンジュゲートさせることができる。これらの技術は当該技術分野において周知であり、例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００、及びＷＯ０１／７７１３７；及び欧州特許第ＥＰ４１３６２２号を参照。これらの各々は、参考として援用される。
【０１０６】
半減期を増加させるためのストラテジーは、増大したインビボ半減期が望ましいナノボディー、フィブロネクチンベースの結合剤、及び他の抗体又はタンパク質において特に有用である。
【０１０７】
別の実施形態において、抗体は、その生物学的半減期を増加させるように改変される。さまざまなアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄの米国特許第６２７７３７５号に記載されるとおり、次の変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの１つ又は複数を導入することができ、これらの各々は、参考として援用される。あるいは、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５８６９０４６号及び第６１２１０２２号に記載されるとおり、生物学的半減期を増加させるために、抗体をＣＨ１又はＣＬ領域内で改変して、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むことができ、これらの各々は、参考として援用される。
【０１０８】
一実施形態では、本発明による抗体は、表１に記載の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１０９】
【表１】
2019511200.tif 000003
１、核酸、ベクター及び宿主細胞
【０１１０】
本発明はまた、本発明の抗ＩＬ−２抗体又はその一部を発現する細胞株を対象とする。本発明の抗体を産生する細胞株の作製及び単離は、当該分野で公知の標準的な技術を用いて達成することができる。ＣＨＯ細胞株が好ましい（バージニア州マナッサスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣなどの公的な貯蔵所から入手可能）。
【０１１１】
本発明の抗体を発現するために、原核及び真核発現系（例えば、酵母、バキュロウイルス、植物、哺乳動物及び他の動物細胞、トランスジェニック動物、及びハイブリドーマ細胞）及びファージディスプレイ発現系を含む、多種多様な宿主発現系を用いることができる。適切な細菌発現ベクターの一例はｐＵＣ１１９であり、適切な真核生物発現ベクターは、弱化ｄｈｆｒ選択系を有する改変されたｐｃＤＮＡ３．１ベクターである。
他の抗体発現系も当該分野で公知である。
【０１１２】
本発明の抗体は、当業者に周知のとおり、宿主細胞中の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。組換えにより抗体を発現させるために、宿主細胞は、軽鎖及び／又は重鎖が宿主細胞で発現されるように、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び／又は重鎖をコードするＤＮＡ断片を有する一つ又は複数の組換え発現ベクターで、形質転換、形質導入、感染などされる。重鎖及び軽鎖は、同じ又は異なる宿主細胞において発現され得る。好ましくは、組換え抗体は宿主細胞が培養される培地中に分泌され、そこから抗体を回収又は精製することができる。
【０１１３】
抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子を得て、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、そのベクターを宿主細胞に導入するために、標準的な組換えＤＮＡ法が使用される。そのような標準的な組換えＤＮＡ技術は、例えば、Ｇｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋ（編）、分子クローニング;ラボラトリーマニュアル、第４版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、２０１２に記載される。
【０１１４】
一実施形態では、本発明は、ベクター、好ましくは（これに限定されないが、）、プラスミド、組換え発現ベクター、酵母発現ベクター、又は本発明の抗ＩＬ−２抗体をコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルス発現ベクターを提供する。ベクターにおけるコード領域は、任意のサイズ又は含量のリンカー配列によって分離されてもよく、好ましくは、そのようなリンカーは、存在する場合、内部リボソーム侵入部位をコードするポリヌクレオチドである。
【０１１５】
本発明の抗体を発現させるために、表４１に記載のとおり、部分アミノ酸鎖をコードするＤＮＡは、発現ベクターに挿入され、遺伝子が転写制御配列及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるようにする。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。さらに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗ＩＬ−２抗体の軽鎖及び／又は重鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端に作動可能にインフレームで連結されるように、抗ＩＬ−２抗体軽鎖及び／又は重鎖遺伝子は、ベクターにクローニングされることが可能である。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチドであり得る。
【０１１６】
軽鎖及び／又は重鎖の発現のために、重鎖及び／又は軽鎖をコードする発現ベクターは、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、形質導入、感染などの、標準技術によって宿主細胞に導入される。原核又は真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現させることは理論的に可能であるが、真核細胞が好ましく、哺乳動物宿主細胞が最も好ましい。なぜなら、このような細胞は、適切に折りたたまれた免疫学的に活性な抗体を集成して分泌する可能性がより高いからである。
【０１１７】
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞は、例えば、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、米国科学アカデミー紀要ＵＳＡ７７：４２１６−２０、１９８０に記載のとおり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞において抗体の発現を可能にするのに十分な時間、より好ましくは、当該分野で公知の適切な条件下で、宿主細胞において抗体の培養培地への分泌が増加するのに十分な時間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的な精製方法を用いて、宿主細胞及び／又は培地から回収することができる。
ＩＬ−２変異体
【０１１８】
本発明の特定の実施形態では、野生型（ｗｔ）のヒトＩＬ−２が使用される。それはＵｎｉＰｒｏｔＩＤ番号Ｐ６０５６８を有し、配列番号１０９として再現される。ヒトＩＬ−２の別の例は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１２／１０７４１７Ａ１に開示されたＩＬ−２ムテインであり、ｗｔｈＩＬ−２と比較して３つの変異を有する。アルデスロイキン（商品名プロロイキン（登録商標））は、当業者に周知のヒトＩＬ−２の変異体の別の例であり、配列番号１１０により本明細書に表される。ＩＬ−２変異体の他の例は、表２に示すとおり、非アルファ（ｎｏ−ａｌｐｈａ）ムテイン及びＩＬ−２スーパーカイン（Ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ）である。
【０１１９】
【表２】
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ＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体の組み合わせ
【０１２０】
一実施形態では、上記抗体又はその抗原結合部分は、上述のとおり、ヒトＩＬ−２又はＩＬ−２変異体と組み合わせられる。
【０１２１】
この組み合わせは、ＩＬ−２：抗体結合部位が、１：１、２：１、又は他の割合を有する予め作製された混合物であり得る。
【０１２２】
一実施形態では、抗ＩＬ−２抗体及びＩＬ−２は、抗体の第一の注射、及びその後の抗ＩＬ−２抗体／ＩＬ−２の組み合わせの注射によって連続的に投与される。
【０１２３】
別の実施形態において、抗ＩＬ−２抗体及びＩＬ−２は、抗ＩＬ−２抗体／ＩＬ−２の組み合わせの第一の注射、及びその後のＩＬ−２の注射によって、連続して投与される。
【０１２４】
医薬組成物
本開示の医薬組成物は、併用療法で、すなわち他の薬剤と併用療法で投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗炎症剤又は別の化学療法剤と組み合わせた本開示に記載のＩＬ−２抗体又はその断片を含み得る。併用療法で使用することができる治療薬の例は、以下の併用療法の項で詳述される。
【０１２５】
本明細書中で使用されるとおり、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合する任意の及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は注入による）に適していなければならない。一実施形態では、担体は皮下経路に適しているべきである。投与経路に依存する活性化合物、すなわち抗体、免疫抱合体、又は二重特異性分子は、化合物を不活性化し得る酸及び他の天然条件の作用から化合物を保護する材料で被覆され得る。
【０１２６】
本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒物学的作用を与えない塩を意味する（例えば、Ｂｅｒｇｅ、Ｓ．Ｍら、１９７７、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ、６６：１−１９参照）。このような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が含まれる。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸などの非毒性無機酸に由来するもの、並びに脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩は、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、並びにＮ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものを含む。
【０１２７】
本開示の医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容される酸化防止剤の例には、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤：を含む。
【０１２８】
本開示の医薬組成物において採用され得る適切な水性及び非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油、及び例えばオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料の使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、並びに界面活性剤の使用より維持することができる。
【０１２９】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のようなアジュバントを含有してもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順と、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など種々の抗菌剤及び抗真菌剤を含めることの両方により保証され得る。例えば、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。さらに、注射用医薬形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅らせる薬剤の包含によってもたらされ得る。
【０１３０】
薬学的に許容される担体は、滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のために、滅菌水性溶液又は分散液及び滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、本開示の医薬組成物におけるその使用が企図される。補充活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０１３１】
治療用組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、例えば糖のような等張剤、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムのようなポリアルコールを組成物中に含むことができる。注射用組成物の長期吸収は、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【０１３２】
安定なタンパク質（例えば、抗体）処方の開発に関するレビューは、Ｃｌｅｌａｎｄら、１９９３、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ１０（４）：３０７−３７７及びＷｅｉＷａｎｇ  １９９９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｃｓ  １８５：１２９−８８で見ることができる。抗体についてのさらなる処方の議論は、例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ及びＭｒｓｎｙ  ２００６、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５８：６８６−７０６；米国特許第６１７１５８６号、第４６１８４８６号、米国公開第２００６０２８６１０３号、ＰＣＴ国際公開 ＷＯ０６／０４４９０８、ＷＯ０７／０９５３３７、ＷＯ０４／０１６２８６、Ｃｏｌａｎｄｅｎｅら、２００７、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ９６：１５９８−１６０８；Ｓｃｈｕｌｍａｎ  ２００１、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、１６４：Ｓ６−Ｓ１１及び他の既知の参考文献で見ることができ、これらの各々は、参考として援用される。
【０１３３】
皮内又は皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、典型的には、次の成分：注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒のような滅菌希釈剤、ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースのような張度調整剤のうちの一つ以上を含む。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調節することができる。そのような調製物は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与バイアルに封入することができる。
【０１３４】
滅菌注射溶液は、活性化合物を、必要に応じて上に列挙した成分の一つ又は組合せと共に、適切な溶媒中に必要な量で組み込み、次いで滅菌精密濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、本開示の抗体又はタンパク質を、基本的な分散媒体及び上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、予め滅菌濾過されたその溶液からの有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥（凍結乾燥）である。
【０１３５】
一つの特定の実施形態では、本開示に記載の抗体は、バイアル中の液体製剤として投与された。バイアルあたりの薬物量は１５０ｍｇであった。液体は、ｐＨ６．０±０．５で１５０ｍｇ／ｍＬの抗体、４．８ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５．２ｍＭのＬ−ヒスチジンＨＣｌ  ２２０ｍＭのスクロース、及び０．０４％のポリソルベート２０を含有した。意図する用量の完全な除去を可能にするために、２０％の過剰充填が加えられた。
【０１３６】
治療及びその他の用途
本発明の抗体は、ＩＬ−２依存性病態生理を伴う障害の診断及び治療を含む多くのインビトロ及びインビボの診断的及び治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、ＩＬ−２依存性病態生理を伴う様々な障害を治療、予防及び診断するために、培養液中の、インビトロ又はエクスビボの、又は例えばインビボなどのヒト被験体の細胞に投与することができる。
【０１３７】
したがって、一実施形態では、本発明は本明細書中に開示されるとおり、抗ＩＬ−２抗体の治療有効量を対象に投与することを含む対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。一実施形態では、本方法はインビボでの癌の治療に適している。一実施形態では、ＩＬ−２に対する抗体は、ＩＬ−２との組み合わせのように、ＩＬ−２と一緒に投与される。
【０１３８】
ＩＬ−２に対する抗体が１つ以上の薬剤と組み合わせて投与される場合、その組み合わせは、いずれかの順序で、又は同時に投与することができる。
【０１３９】
別の側面では、対象において、例えば、増殖状態又は障害（例えば、癌）、例えば固形腫瘍、軟部組織腫瘍、又は転移性病変などを軽減又は改善して対象を治療する方法が提供される。
【０１４０】
癌という用語は、組織病理学的タイプ又は侵襲性のステージに関係なく、あらゆるタイプの癌性増殖又は発癌プロセス、転移組織又は悪性に形質転換された細胞、組織又は器官を含むことを意味する。癌性疾患の例には、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、及び転移性病変が含まれるがこれらに限定されない。固形腫瘍の例には、悪性腫瘍を含み、例えば、肺、乳房、リンパ系、胃腸（例え結腸）、尿生殖路（例えば腎臓、尿路上皮細胞）、前立腺及び咽頭に影響を与えるものなど、様々な臓器系の肉腫、腺癌、及び癌腫などを含む。腺癌は、大腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸癌及び食道癌のような悪性腫瘍が含まれる。一実施形態において、癌はメラノーマであり、例えば進行期のメラノーマである。前述の癌の転移性病変は、本発明の方法及び組成物を用いて治療又は予防することもできる。
【０１４１】
本明細書中に開示される抗体分子を用いて増殖が阻害され得る例示的な癌としては、典型的には免疫療法に応答する癌を含む。治療に好ましい癌の非限定的な例としては、メラノーマ（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば明細胞性癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺癌）、乳癌、結腸癌及び肺癌（例えば、非小細胞肺癌）を含む。さらに、難治性又は再発性悪性腫瘍は、本明細書に記載の抗体分子を用いて治療することができる。
【０１４２】
治療できる他の癌の例には、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門癌、胃食道、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道、陰茎の癌、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍脈管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、例えばアスベストに起因するものを含む環境に起因する癌、及び前記癌の組み合わせを含む。
【０１４３】
他の実施形態では、癌は血液悪性腫瘍又は癌であり、白血病又はリンパ腫に限定されないが、これらが含まれる。例えば抗ＩＬ−２療法は、例えばＢ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）に限定されないが、これらを含む癌及び悪性腫瘍；例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）に限定されないが、これらを含む一つ以上の慢性白血病；さらに、例えば、B細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛状細胞白血病、小細胞又は大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、骨髄性血液細胞の非効果的な産生（又は異形成）によって結びついた血液学的状態が、様々に寄せ集められたものである前白血病などに限定されないが、これらを含む血液癌又は血液学的状態；を治療するために使用される。いくつかの実施形態において、リンパ腫（例えば、未分化大細胞リンパ腫又は非ホジキンリンパ腫）は、ＡＬＫ転座、例えばＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を有する、あるいは有するとして同定される。
【０１４４】
一実施形態では、癌は、肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（例えば扁平及び／又は非扁平上皮組織構造を有するＮＳＣＬＣ））、メラノーマ（例えば進行性黒色腫）、腎癌（例えば腎細胞癌、例えば透明細胞腎細胞癌）、肝臓癌、骨髄腫（例えば多発性骨髄腫）、前立腺癌、乳癌（例えばエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、又はＨｅｒ２／ｎｅｕの一つ、二つ又は全てを発現しない乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌）、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌（例えば頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ））、肛門癌、胃食道癌、甲状腺癌、子宮頸癌、リンパ増殖性疾患（例えば移植後リンパ増殖性疾患）又は血液学的癌、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又は白血病（例えば骨髄性白血病）から選択される。
【０１４５】
別の実施形態では、癌は、癌腫（例えば、進行癌又は転移性癌）、メラノーマ又は肺癌（例えば、非小細胞肺癌）から選択される。
【０１４６】
一実施形態では、癌は肺癌であり、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。特定の実施形態では、肺癌、例えば非小細胞肺癌は、ＡＬＫ再構成又は転位、例えばＡＬＫ融合、例えばＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を有する、あるいは有するとして同定される。
【０１４７】
別の実施形態において、癌は炎症性筋線維芽細胞腫（ＩＭＴ）である。特定の実施形態では、炎症性筋線維芽細胞腫瘍は、ＡＬＫ再構成又は転位、例えばＡＬＫ融合、例えばＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を有する、あるいは有するとして同定される。
【０１４８】
他の実施形態では、癌はＮＳＣＬＣであり、ＮＳＣＬＣは、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の異常な活性化、増幅、又は変異：の一つ以上によって特徴付けられる。特定の実施形態では、癌は、ＮＳＣＬＣであり、ＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲエクソン２０挿入、ＥＧＦＲエクソン１９欠失、ＥＧＦＲＬ８５８Ｒ変異、ＥＧＦＲＴ７９０Ｍ、又はそれらの任意の組み合わせを有することよって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、ＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ及びＴ７９０Ｍ変異を有することよって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、ＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲのエクソン２０挿入及びＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ変異を有することよって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、ＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲのエクソン１９欠失及びＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ変異を有することよって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、エクソン２０挿入、エクソン１９欠失、Ｌ８５８Ｒ変異、Ｔ７９０Ｍ変異、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＥＧＦＲ変異を有することよって特徴付けられる。
【０１４９】
さらに別の実施形態において、癌は神経芽細胞腫である。
特定の実施形態では、神経芽細胞腫は、ＡＬＫ転位又は転座、例えばＡＬＫ融合、例えばＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を有する、あるいは有するとして同定される。
本明細書に開示される方法及び組成物は、前述の癌に関連する転移性病変を治療するために有用である。
【０１５０】
別の実施形態において、ウイルス感染、例えば慢性ウイルス性肝炎の有無にかかわらず、癌は肝細胞癌であり、例えば進行性肝細胞癌である。
【０１５１】
別の実施形態では、癌は前立腺癌であり、例えば進行した前立腺癌である。
【０１５２】
さらに別の実施形態において、癌は骨髄腫、例えば多発性骨髄腫である。
【０１５３】
さらに別の実施形態において、癌は腎臓癌、例えば腎細胞癌（ＲＣＣ）である（例えば、転移性ＲＣＣ又は透明細胞腎細胞癌）。
【０１５４】
一実施形態では、癌はメラノーマであり、例えば進行したメラノーマである。一実施形態では、癌は、他の療法に応答しない進行性又は切除不能な黒色腫である。他の実施形態では、癌はＢＲＡＦ変異を有するメラノーマである（例えばＢＲＡＦ  Ｖ６００変異）。
【０１５５】
別の実施形態において、癌は炎症性筋線維芽細胞腫（ＩＭＴ）である。特定の実施形態では、炎症性筋線維芽細胞腫瘍は、ＡＬＫ再構成又は転座、例えばＡＬＫ融合、例えばＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を有する、あるいは有するとして同定される。
【０１５６】
さらに別の実施形態において、癌は神経芽細胞腫である。特定の実施形態では、神経芽細胞腫は、ＡＬＫ再構成又は転座、例えばＡＬＫ融合、例えばＥＭＬ４−ＡＬＫ融合を有する、あるいは有するとして同定される。本明細書に開示される方法及び組成物は、前述の癌に関連する転移性病変を治療するために有用である。
【０１５７】
併用療法
本開示の抗体又はその抗原結合部分は、単独の活性成分として、又は例えばアジュバントとして併用して、又は例えば、上述の疾患の治療又は予防のための免疫調節剤又は細胞傷害性又は抗癌剤などの他の薬物と組み合わせて、投与することができる。
【０１５８】
１．例示的なＳＴＩＮＧアゴニスト
一実施形態では、組み合わせはＳＴＩＮＧアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、組み合わせは、例えば、本明細書に記載の癌、例えば、固形腫瘍（例えば、乳癌、扁平上皮癌、メラノーマ、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、軟部組織肉腫、メラノーマ、乳癌、食道癌、頭頸部癌、子宮内膜癌  、子宮頸癌、又は基底細胞癌）、例えば血液悪性腫瘍（例えば白血病（例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）又はリンパ腫（境界域Ｂ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など）））などの癌を治療するために使用される。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチドであり、例えば、プリン又はピリミジン核酸塩基（例えば、アデノシン、グアニン、ウラシル、チミン又はシトシン核酸塩基）を含む環状ジヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、環状ジヌクレオチドの核酸塩基は、同じ核酸塩基又は異なる核酸塩基を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、アデノシン又はグアノシン核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、一つのアデノシン核酸塩基及び一つのグアノシン核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、二つのアデノシン核酸塩基又は二つのグアノシン核酸塩基を含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、改変環状ジヌクレオチドを含み、例えば、改変された核酸塩基、改変されたリボース、又は改変されたリン酸結合を含む。いくつかの実施形態では、改変された環状ジヌクレオチドは、改変されたホスフェート結合、例えばチオホスフェートを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、２’、５’又は３’、５’リン酸結合を有する環状ジヌクレオチド（例えば、改変環状ジヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、リン酸結合の周囲にＲｐ又はＳｐ立体化学を有する環状ジヌクレオチド（例えば、改変された環状ジヌクレオチド）を含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、Ｒｐ、Ｒｐジチオ２’、３’ｃ−ジ−ＡＭＰ（例えばＲｐ、Ｒｐ−ジチオｃ−［Ａ（２’、５’）ｐＡ（３’、５’）ｐ］）、又はその環状ジヌクレオチド類似体である。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、米国特許出願公開第２０１５／００５６２２４号（例えば図２ｃの化合物の例、例えば化合物２１又は化合物２２）に示される化合物である。いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−［Ｇ（２’、５’）ｐＧ（３’、５’）ｐ］、そのジチオリボースＯ−置換誘導体、又はＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１４／１８９８０５及びＷＯ２０１４／１８９８０６の図４に示される化合物であり、これらの各々は、参考として援用される。いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃ−［Ａ（２’、５’）ｐＡ（３’、５’）ｐ］又はそのジチオリボースＯ−置換誘導体であるか、あるいはＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１４／１８９８０５及びＷＯ２０１４／１８９８０６の図５に示される化合物である。いくつかの実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、２’−Ｏ−プロパルギル−環状−［Ａ（２’、５’）ｐＡ（３’、５’）ｐ］（２’−Ｏ−プロパルギル−ＭＬ−ＣＤＡ）又はＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１４／１８９８０６の図７に示されている化合物であり、参考として援用される。
【０１６４】
他の例示的なＳＴＩＮＧアゴニストは、例えばＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１４／１８９８０５及びＷＯ２０１４／１８９８０６、及び米国特許出願公開第２０１５／００５６２２５号に開示されており、これらの各々は、参考として援用される。
【０１６５】
２．例示的なＰＤ−１インヒビター
一実施形態では、組み合わせは、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせは、例えば固形腫瘍（例えば乳癌、扁平上皮癌、メラノーマ、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、軟部組織肉腫、メラノーマ、乳癌、食道癌、頭頸部癌、子宮内膜癌  、子宮頸癌、又は基底細胞癌）、例えば血液悪性腫瘍（例えば白血病（例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）又はリンパ腫（境界域Ｂ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など）））など、例えば本明細書に記載の癌を治療するために使用される。
【０１６６】
抗ＰＤ−１抗体分子の例示的な非限定的な組合せ及び使用は、２０１５年７月３０日に公開された「抗体分子からＰＤ−１及びその使用」と題する米国特許出願第２０１５／０２１０７６９に開示され、全てが参考として本明細書に援用される。
【０１６７】
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、ＢＡＰ０４９−クローン−Ａ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｂ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｃ、ＢＡＰ０４９−クローン−Ｄ、又はＢＡＰ０４９−クローン−Ｅ；あるいは、米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に記載されるとおり、若しくは、米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１のヌクレオチド配列によってコードされる；あるいは、前述の配列のいずれかに実質的に同一の配列（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性）のアミノ酸配列を含む、少なくとも一つ又は二つの重鎖可変ドメイン（任意に定常領域を含む）、少なくとも一つ又は二つの軽鎖可変ドメイン（任意に定常領域を含む）、あるいは両方を含む。抗ＰＤ−１抗体分子は、任意に、米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表４に示されるとおり、重鎖、軽鎖、又はその両方由来のリーダー配列を含む。
【０１６８】
さらに別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、本明細書に記載の抗体、例えば、ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０１，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０２，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０３，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０４，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０５，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０６，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０７，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０８，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ０９，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１０，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１１，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１２，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１３，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１４，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１５，ＢＡＰ０４９−ｈｕｍ１６，ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ａ，ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｂ，ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｃ，ＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｄ，又はＢＡＰ０４９−Ｃｌｏｎｅ−Ｅ；あるいは、米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９の表１に記載される、又は米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１のヌクレオチド配列によってコードされる；あるいは、前述の配列のいずれかに実質的に同一の配列（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性）のいずれかから選択される抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ又は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１６９】
さらに別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に示される、又は表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、又は３つのＣＤＲ（又は集合的にすべてのＣＤＲ）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つ又は複数（又は総称してＣＤＲのすべて）は、米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に示されるアミノ酸配列、又は米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に関連する、例えばアミノ酸置換又は欠失など、１つ，２つ，３つ，４つ，５つ，６つ又はそれ以上の変化を有する。
【０１７０】
さらに別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に示されるアミノ酸配列、又は米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、又は３つのＣＤＲ（又は集合的にすべてのＣＤＲ）を含む。一実施形態では、１つ又は複数のＣＤＲ（又は集合的に全てのＣＤＲ）は、例えば米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に示されるアミノ酸配列、又は米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に関連する例えばアミノ酸置換又は欠失など、１つ，２つ，３つ，４つ，５つ，６つ又はそれ以上の変化を有する。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、軽鎖のＣＤＲ、例えば、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３における１つ又は複数の置換を含む。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、軽可変領域の１０２位の軽鎖ＣＤＲ３における置換を含み、例えば米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に記載の軽可変領域の１０２位のシステインからチロシン、又はシステインからセリン残基への置換（例えば改変されないマウス又はキメラの場合は配列番号１６又は２４、又は改変された配列の場合は、配列番号：３４，４２，４６，５４，５８，６２，６６，７０，７４又は７８のいずれか）を含む。
【０１７１】
別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に示されるアミノ酸配列、又は米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖可変領域に由来する少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＣＤＲ（又は集合的にＣＤＲの全て）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つ又は複数（又は集合的にＣＤＲの全て）は、例えば米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に示されるアミノ酸配列、又は米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に関連する、例えばアミノ酸の置換又は欠失など、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の変化を有する。
【０１７２】
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体分子は、下記を含む：
（ａ）それぞれ米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に開示される、配列番号４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３のＶＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号１３のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３３のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
【０１７３】
（ｂ）それぞれ米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に開示される、配列番号１から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＨ；及び配列番号１０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３２のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ；
【０１７４】
（ｃ）それぞれ米国特許出願公開２０１５／０２１０７６９の表１に開示される、配列番号２２４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＨ；及び配列番号１３のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３３のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ；又は、
【０１７５】
（ｄ）それぞれ米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に開示される、配列番号２２４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＨ；及び配列番号１０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３２のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ。
【０１７６】
本明細書の以下の組み合わせでは、別の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体分子は、それぞれ米国特許出願公開第２０１５／０２１０７６９号の表１に開示される、（ｉ）配列番号１、配列番号４、又は配列番号２２４から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２又は配列番号５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び（ｉｉ）配列番号１０又は配列番号１３のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１又は配列番号１４のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３２又は配列番号３３のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１７７】
他の実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）又はピディリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）から選択される抗ＰＤ−１抗体である。
【０１７８】
一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はニボルマブである。ニボルマブの代替名には、ＭＤＸ−１１０６、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、又はＢＭＳ−９３６５５８が含まれる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４−９４−４）である。ニボルマブは、ＰＤ１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）及びＰＤ１に特異的に結合する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８００８４４９号及びＰＣＴ国際公開ＷＯ２００６／１２１１６８に開示されている。一実施形態では、ＰＤ−１の阻害剤は、ニボルマブであり、本明細書に開示される配列を有する（又はそれと実質的に同一又はその類似の配列、例えば、指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％同一又はそれ以上の同一性の配列）。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブである。ペムブロリズマブ（Ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ＭＫ−３４７５、ＭＫ０３４７５、ＳＣＨ−９００４７５又はＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）；Ｍｅｒｃｋとも呼ばれる）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ−１抗体は、Ｈａｍｉｄ，Ｏ．ら（２０１３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６９（２）：１３４−４４、米国特許第８３５４５０９号及びＰＣＴ国際公開ＷＯ２００９／１１４３３５に開示される。
一実施形態では、ＰＤ−１の阻害剤は、例えば、米国特許第８３５４５０９号及びＰＣＴ国際公開ＷＯ２００９／１１４３３５に開示されたペムブロリズマブであり、本明細書に開示された配列を有する（又はそれと実質的に同一又は類似の配列、例えば少なくとも指定された配列と８５％、９０％、９５％同一又はそれ以上の同一性の配列）。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はピディリズマブである。ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｃｕｒｅ  Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００９／１０１６１１に開示されている。
【０１８１】
他の抗ＰＤ１抗体は、中でも、ＡＭＰ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）を含み、例えば米国特許第８６０９０８９号、米国特許出願公開第２０１００２８３３０号及び／又は米国特許出願公開第２０１００１１４６４９号に開示される抗ＰＤ１抗体が含まれる。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２の細胞外又はＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ＡＭＰ−２２４（例えばＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１０／０２７８２７及びＷＯ２０１１／０６６３４２に開示される、Ｂ７−ＤＣＩｇ；  Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ社）であり、ＰＤ−１とＢ７−Ｈ１との間の相互作用をブロックするＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【０１８３】
３．例示的なＴＩＭ−３阻害剤
一実施形態では、この組み合わせは、ＴＩＭ−３阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、例えば本明細書に記載の癌、例えば固形腫瘍（例えば乳癌、扁平上皮細胞癌、メラノーマ、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌、子宮体癌、子宮頸癌、又は基底細胞癌）、例えば血液悪性腫瘍（例えば白血病（例えば慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、又はリンパ腫（例えば、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫））などの癌を治療するために使用される。
【０１８４】
一実施形態では、本明細書に記載の組み合わせは、ＴＩＭ−３阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、癌を治療するために使用され、例えば本明細書に記載の癌、例えば固形腫瘍又は血液悪性腫瘍を治療するために使用される。
【０１８５】
抗ＴＩＭ−３抗体分子の例示的な非限定的な組合せ及び使用は、「ＴＩＭ−３に対する抗体分子及びその使用」と題する２０１５年８月６日に公開された米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号に開示され、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０１８６】
一実施形態では、抗ＴＩＭ−３抗体分子は、ＡＢＴＩＭ３，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０１，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０２，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０３，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０４，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０５，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０６，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０７，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０８，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０９，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１０，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１１，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１２，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１３，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１４，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１５，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１６，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１７，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１８，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１９，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２０，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２１，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２２，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２３；又は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に記載の通り；又は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４のヌクレオチド配列によってコードされる；又は、上記の配列のいずれかと実質的に同一の配列（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性のある配列）；のアミノ酸配列を含む、少なくとも１つ又は２つの重鎖可変ドメイン（任意に定常領域を含む）、少なくとも１つ又は２つの軽鎖可変ドメイン（任意に定常領域を含む）、又は両方を含む。抗ＴＩＭ−３抗体分子は、任意に、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号に示されるとおり、重鎖、軽鎖、又は両方からのリーダー配列を含み；又はそれと実質的に同一の配列を含む。
【０１８７】
さらに別の実施形態では、抗ＴＩＭ−３抗体分子は、本明細書に記載の抗体、例えばＡＢＴＩＭ３，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０１，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０２，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０３，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０４，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０５，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０６，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０７，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０８，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ０９，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１０，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１１，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１２，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１３，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１４，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１５，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１６，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１７，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１８，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１９，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２０，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２１，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２２，ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ２３；又は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に記載の通り；又は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４のヌクレオチド配列によってコードされる；又は、上記の配列のいずれかと実質的に同一の配列（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性のある配列）；のいずれかから選択される抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ又は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１８８】
さらに別の実施形態では、抗ＴＩＭ−３抗体分子は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に示される、又は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、又は３つのＣＤＲ（又は集合的にすべてのＣＤＲ）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つ以上（又は集合的にすべてのＣＤＲ）は、国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に示される、又は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、１つ，２つ，３つ，４つ，５つ，６つ、又はそれ以上の変化、例えばアミノ酸置換又は欠失を有する。
【０１８９】
さらに別の実施形態では、抗ＴＩＭ−３抗体分子は、国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４の表１〜４に示される、又は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ又は３つのＣＤＲ（又は集合的にすべてのＣＤＲ）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つ以上（又は集合的にすべてのＣＤＲ）は、国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に示される、又は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、１つ，２つ，３つ，４つ，５つ，６つ、又はそれ以上の変化、例えばアミノ酸置換又は欠失を有する。
特定の実施形態では、抗ＴＩＭ−３抗体分子は、軽鎖ＣＤＲにおける置換、例えば、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３における１つ又は複数の置換を含む。
【０１９０】
別の実施形態では、抗ＴＩＭ−３抗体分子は、国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に示される、又は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４の表１〜４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖の可変領域に由来する少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＣＤＲ（又は集合的にすべてのＣＤＲ）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つ以上（又は集合的にすべてのＣＤＲ）は、国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に示される、又は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、１つ，２つ，３つ，４つ，５つ，６つ、又はそれ以上の変化、例えばアミノ酸置換又は欠失を有する。
【０１９１】
一実施形態では、抗ＴＩＭ−３抗体分子は以下を含む：
（ａ）米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４にそれぞれ開示される、配列番号９から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号１０のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び配列番号５のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、かつ、配列番号１２のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号１４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列からなる軽鎖可変領域（ＶＬ）；
【０１９２】
（ｂ）米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４にそれぞれ開示される、配列番号３から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び配列番号５のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；を含むＶＨ、かつ、配列番号６のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ；
【０１９３】
（ｃ）米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４にそれぞれ開示される、配列番号９から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び配列番号５のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；を含むＶＨ、かつ、配列番号１２のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ；
【０１９４】
（ｄ）米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４にそれぞれ開示される、配列番号３から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２４のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び配列番号５のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；を含むＶＨ、かつ、配列番号６のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列及び配列番号８のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ；
【０１９５】
（ｅ）米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４にそれぞれ開示される、配列番号９から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３１のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び配列番号５のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；を含むＶＨ、かつ、配列番号１２のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１４のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ；又は
【０１９６】
（ｆ）米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号の表１〜４にそれぞれ開示される、配列番号３から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３０のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び配列番号５のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列；を含むＶＨ、かつ、配列番号６のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列及び配列番号８のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ。
【０１９７】
例示的な抗ＴＩＭ−３抗体は、米国特許第８５５２１５６号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１１／１５５６０７、欧州特許ＥＰ２５８１１１３及び米国特許出願公開第２０１４／０４４７２８号に開示される。
【０１９８】
４．例示的なＬＡＧ−３阻害剤
【０１９９】
一実施形態では、組み合わせは、ＬＡＧ−３阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせは、癌、例えば本明細書に記載の癌、例えば固形腫瘍（例えば、乳癌、扁平上皮癌、メラノーマ、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、軟部組織肉腫、メラノーマ、乳癌、食道癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、又は基底細胞癌）、例えば血液悪性腫瘍（例えば白血病（例えば慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、又はリンパ腫（例えば、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫）））を治療するために使用される。
【０２００】
一実施形態では、本明細書に記載の組み合わせは、ＬＡＧ−３阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせは、癌を治療するために使用され、例えば本明細書に記載の癌、例えば固形腫瘍又は血液悪性腫瘍を治療するために使用される。
【０２０１】
抗ＬＡＧ−３抗体分子の例示的な非限定的な組み合わせ及び使用は、「抗体分子対ＬＡＧ−３及びその使用」と題する２０１５年９月１７日に公開された米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号に開示され、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０２０２】
一実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体分子は、ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１６，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１７，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０，ｈｕＢＡＰ０５０（Ｓｅｒ）（例えばＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９−Ｓｅｒ，又はＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０−Ｓｅｒ），ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｆ，ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｇ，ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｈ，ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｉ，又はＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｊ；又は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に記載のとおり；又は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２号の表１のヌクレオチド配列によってコードされる；又は、上記の配列のいずれかと実質的に同一の配列（例えば、少なくとも８０％，８５％，９０％，９２％，９５％，９７％，９８％，９９％又はそれ以上の同一性のある配列）；のいずれかのアミノ酸配列を含む、少なくとも１つ又は２つの重鎖可変ドメイン（任意で定常領域を含む）、少なくとも１つ又は２つの軽鎖可変ドメイン（任意で定常領域を含む）又はその両方を含む。
【０２０３】
さらに別の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体分子は、本明細書に記載の抗体、例えばＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１６，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１７，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０，ｈｕＢＡＰ０５０（Ｓｅｒ）（例えばＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０１−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０２−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０３−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０４−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０５−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０６−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０７−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０８−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ０９−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１０−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１１−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１２−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１３−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１４−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１５−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１８−Ｓｅｒ，ＢＡＰ０５０−ｈｕｍ１９−Ｓｅｒ，又はＢＡＰ０５０−ｈｕｍ２０−Ｓｅｒ），ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｆ，ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｇ，ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｈ，ＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｉ，又はＢＡＰ０５０−Ｃｌｏｎｅ−Ｊ；米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に記載のとおり；又は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１のヌクレオチド配列によってコードされる；又は、上記の配列のいずれかと実質的に同一の配列（例えば、少なくとも８０％，８５％，９０％，９２％，９５％，９７％，９８％，９９％又はそれ以上の同一性のある配列）；のいずれかから選択される抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ又は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０２０４】
さらに別の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体分子は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるアミノ酸配列、又は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、又は３つのＣＤＲ（又は集合的にすべてのＣＤＲ）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つ又は複数（又は集合的にすべてのＣＤＲ）は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるアミノ酸配列、又は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、１つ，２つ，３つ，４つ，５つ，６つ又はそれ以上の変化、例えばアミノ酸置換又は欠失を有する。
【０２０５】
さらに別の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体分子は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるアミノ酸配列、又は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域由来の少なくとも１つ、２つ、又は３つのＣＤＲ（又は集合的にすべてのＣＤＲ）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つ又は複数（又は集合的にすべてのＣＤＲ）は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるアミノ酸配列、又は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、１つ，２つ，３つ，４つ，５つ，６つ又はそれ以上の変化、例えばアミノ酸置換又は欠失を有する。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体分子は、軽鎖のＣＤＲ、例えば、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３における１つ又は複数の置換を含む。
【０２０６】
別の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体分子は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるアミノ酸配列、又は米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖の可変領域に由来する少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＣＤＲ（又は集合的にすべてのＣＤＲ）を含む。一実施形態では、ＣＤＲの１つ又は複数（又は集合的にすべてのＣＤＲ）は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるアミノ酸配列、又は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、１つ，２つ，３つ，４つ，５つ，６又はそれ以上の変化、例えばアミノ酸置換又は欠失を有する。
【０２０７】
一実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体分子は：
（ｉ）米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１にそれぞれ開示される、配列番号１、配列番号４又は配列番号２８６から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号２のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列；及び配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；、かつ、
【０２０８】
（ｉｉ）米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１にそれぞれ開示される、配列番号１０のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１２のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２０９】
別の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体分子は：
（ｉ）米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１にそれぞれ開示される、配列番号１、配列番号４又は配列番号２８６から選択されるＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号５のＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３のＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；かつ、
（ｉｉ）米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１にそれぞれ開示される、配列番号１３のＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号１５のＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２１０】
一実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体分子は、配列番号１のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体分子は、配列番号４のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体分子は、配列番号２８６のＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列を含み、米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２０号の表１にそれぞれ開示される。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体はＢＭＳ−９８６０１６である。ＢＭＳ−９８６０１６（ＢＭＳ９８６０１６とも呼ばれる；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＬＡＧ−３に結合するモノクローナル抗体である。ＢＭＳ−９８６０１６及び他のヒト化抗ＬＡＧ−３抗体は、米国特許出願公開第２０１１／０１５０８９２号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１０／０１９５７０及びＷＯ２０１４／００８２１８に開示される。
【０２１２】
５．例示的なＣＴＬＡ−４インヒビター
一実施形態では、組み合わせは、ＣＴＬＡ−４阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、この組み合わせは、癌、例えば本明細書に記載の癌、例えば固形腫瘍（例えば、乳癌、扁平上皮癌、メラノーマ、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、軟部組織肉腫、メラノーマ、乳癌、食道癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、又は基底細胞癌）、例えば血液悪性腫瘍（例えば白血病（例えば慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、又はリンパ腫（例えば、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫）））を治療するために使用される。
【０２１３】
一実施形態では、本明細書に記載の組み合わせは、ＣＴＬＡ−４阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせは、癌を治療するために使用され、例えば、本明細書に記載の癌、例えば、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍を治療するために使用される。
【０２１４】
例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体には、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）（以前はチシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）、ＣＰ−６７５，２０６として知られているＰｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体）；及びイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）（ＭＤＸ−０１０、ＣＡＳ番号４７７２０２−００−９としても知られるＣＴＬＡ−４抗体）を含む。
【０２１５】
一実施形態では、組み合わせは、例えば本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体分子、及び例えばイピリムマブなどの抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む。例示的な用量としては、約１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＰＤ−１抗体分子、例えば３ｍｇ／ｋｇなど、及び抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えばイピリムマブ約３ｍｇ／ｋｇなどの用量である。
【０２１６】
他の例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、米国特許第５８１１０９７号に記載され、これは参照により援用される。
【０２１７】
６．例示的なＧＩＴＲモジュレーター
一実施形態では、組み合わせは、アゴニスト又はアンタゴニストなどのＧＩＴＲモジュレーターを含む。一実施形態では、ＧＩＴＲモジュレーターはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、組み合わせは、癌、例えば、本明細書に記載の癌、例えば、固形腫瘍（例えば乳癌、扁平上皮癌、メラノーマ、卵巣癌、卵管癌、腹膜癌、軟部組織肉腫、メラノーマ、乳癌、食道癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、又は基底細胞癌）、例えば血液悪性腫瘍（例えば白血病（例えば慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、又はリンパ腫（例えば、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫）））を治療するために使用される。
【０２１８】
例示的なＧＩＴＲモジュレーターには、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質及び抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）を含み、米国特許第６１１１０９０号、欧州特許第０９２０５０５Ｂ１号、米国特許第８５８６０２３号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１０／００３１１８及び２０１１／０９０７５４に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質、又は、例えば、米国特許第７０２５９６２号、欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号、米国特許第７８１２１３５号、米国特許第８３８８９６７号、米国特許第８５９１８８６号、欧州特許第１８６６３３９号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、米国特許第８７０９４２４号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１３／０３９９５４、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、米国特許出願公開第２０１４／００７２５６６号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１５／０２６６８４号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００５／００７１９０、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００７／１３３８２２、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００５／０５５８０８、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９９／４０１９６、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００１／０３７２０、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９９／２０７５８、米国特許第６６８９６０７号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００６／０８３２８９、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００５／１１５４５１、米国特許第７６１８６３２号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１１／０５１７２６、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００４０６０３１９、及びＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１４０１２４７９に記載の抗ＧＩＴＲ抗体であり、これらの各々は、参考として援用される。
【０２１９】
実施例
実施例１：マウス抗ヒトＩＬ−２抗体ＮＡＲＡ１の作製とスクリーニング
参照抗体、指定されたＮＡＲＡ１を、当業者に周知の方法に従って、誘導し、単離し、構造的に特徴付けした。
【０２２０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスをフロイントアジュバント（Ｆ−５８８１、Ｓｉｇｍａ）中のヒト（ｈ）ＩＬ−２（３４−８０２９、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、０日目、１４日目（皮下）及び２８日目（静脈内）に免疫化した。抗ｈＩＬ−２抗体力価を調べるために、最初の免疫化の前に、かつ、すべての免疫化の後の９〜１１日目に血清を回収した。３５日目にマウスを安楽死させ、標準的な手順に従って脾臓細胞を回収した。脾細胞をポリエチレングリコール１５００（１０７８３６４１００１、Ｒｏｃｈｅ）と５：１の比でミエローマ細胞と混合した。Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔洗浄から得られたフィーダー層を用いて、１０％超低ＩｇＧ  ＦＢＳ（１６２５０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０μＭメルカプトエタノール（３１３０５０、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１：１００インスリントランスフェリンセレン（４１４００−０４５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２％ＩＬ−６条件培地、ペニシリン−ストレプトマイシン（１５２４０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲンタマイシン（１５７５０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ、Ｈ０３７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＩＭＤＭ選択培地（２１９８０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、数日間クローンを培養した。そして、ＥＬＩＳＡ直接結合を用いて、並びにＥＬＩＳＡ競合を特異的に用いて、ポリクローナルをｈＩＬ−２結合についてスクリーニングし、希釈してモノクローナルクローンを得た。モノクローナルの増殖のために、ＨＡＴ培地をヒポキサンチン−チミジン培地（ＨＴ、４１０６５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に置き換えた。次いで、供給業者の推奨（ＵＦＣ９１００、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従って、１００ｋＤａ遠心フィルターユニットを用いてモノクローナルを濃縮した。ＥＬＩＳＡ競合を使用して、インビボで１．５μｇのｈＩＬ−２と複合体化した２００μｌ濃縮物を毎日４回、腹腔内注射を行い、用量依存性においての特異性について濃縮物をさらに試験し、続いて、Ｔ細胞サブセット及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をフローサイトメトリーにより評価した。ＮＡＲＡ１は、プロテインＧアガロース（２０３９８．ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、供給者の推奨に従って精製した。
【０２２１】
ＮＡＲＡ１の全長重鎖は配列番号１１５であり、ＮＡＲＡ１の全長軽鎖アミノ酸配列は配列番号１１７である。
【０２２２】
対応する可変領域、ＮＡＲＡ１のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列は、配列番号１１１（可変重鎖）及び配列番号１１３（可変軽鎖）である。
【０２２３】
ＮＡＲＡ１の全長軽鎖及び重鎖ヌクレオチドコード配列は、配列番号１１６（リーダー配列を含む重鎖コード配列）及び配列番号１１８（リーダー配列を含む軽鎖コード配列）である。
【０２２４】
ＮＡＲＡ１の可変軽鎖及び重鎖ヌクレオチドコード配列は、配列番号１１２（可変重鎖コード配列）及び配列番号１１４（可変軽鎖コード配列）である。
【０２２５】
ＮＡＲＡ１のＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ．ＥＡら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２、Ｚｈａｏ＆Ｌｕ  ２００９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４７：６９４−７００も参照）を用いて描写される。ＣＤＲ領域がＫａｂａｔの定義に従って描写されている場合、読みやすさのために、以下ではそれぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と呼ぶ。ＮＡＲＡ１のＣＤＲ領域は：配列番号４に記載のＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のＨＣＤＲ３、配列番号１９に記載のＬＣＤＲ１、配列番号２０に記載のＬＣＤＲ２、配列番号２１に記載のＬＣＤＲ３である。
【０２２６】
実施例２：ＮＡＲＡ１の結晶構造
（１）材料と方法
プロロイキン（登録商標）（アルデスロイキン）として当業者に一般的に知られ、抗体ＮＡＲＡ１のＦａｂ断片に結合する、ヒトインターロイキン２変異体（配列番号１１０）の複雑な構造を決定した。得られたプロロイキン（登録商標）上の残基の番号付けは、ｗｔＩＬ−２の番号付けに従って与えられる。
【０２２７】
以下に詳述するように、プロロイキン（登録商標）とｗｔｈＩＬ−２との間の配列の相違に関係なく、プロロイキン（登録商標）はｈＩＬ−２の構造解析の有効なモデルである。
【０２２８】
エピトープを決定するために、Ｘ線結晶学を用いて上記複合体の原子分解構造を解析した。Ｘ線結晶学は、抗体及びその抗原との複合体を含む生体分子の構造データを生成するために日常的かつ広く使用されている技術である（Ａｄａｍｓら，（２０１３）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ４２：２６５−２８７；Ｇａｒｍａｎ，（２０１４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３：１１０２−１１０８；Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ，  （２００９）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９：５７３−５８４）。
【０２２９】
抗原、プロロイキン（登録商標）は、賦形剤と共に凍結乾燥粉末として商業的に入手可能である（プロロイキン（登録商標）約１ｍｇは、約５０ｍｇのマンニトール、０．１８ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム、０．１７３ｍｇのリン酸二水素ナトリウム及び０．８９ｍｇのリン酸水素二ナトリウムと混合される）。複合体形成のために使用する前に、逆相ＨＰＬＣによってプロロイキン（登録商標）を精製して賦形剤を除去した。
【０２３０】
ＮＡＲＡ１のＦａｂ断片（ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ）は、全長抗体をパパイン切断し、続いてプロテインＡクロマトグラフィーによって生成した。簡潔には、６．５ｍｌの全長ＮＡＲＡ１（ｐＨ７．０の９０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液中９ｍｇ／ｍｌ）を５ｍＭ  ＤＴＴ及び５９０ｕｇ  パパイン（Ｒｏｃｈｅ）と混合した。切断反応を室温で１６時間維持し、１５ｍＭの５６ｍＭ  Ｅ６４溶液（Ｒｏｃｈｅ）を添加することによって停止させた。次いで、切断溶液を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で１０倍に希釈し、５カラム容量の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化した５ｍｌプロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。Ｆａｂ断片はローディングスルー画分で得られ、Ｆｃ断片はプロテインＡカラムに結合させて得た。
【０２３１】
複合体を形成するために、ＨＰＬＣ後のプロロイキン（登録商標）粉末を５．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＨ２Ｏに溶解した。６．６ｍｇプロロイキン（登録商標）を過剰に、１１．５ｍｇのＮＡＲＡ１  Ｆａｂ断片溶液に滴下した。遠心分離を使用して、現在の条件下で沈殿した過剰のプロロイキン（登録商標）を除去した。次いで、複合体を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４のランニングバッファーを有するＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０ｘ３００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたゲル濾過によって精製した。
【０２３２】
ゲル濾過後のプロロイキン（登録商標）／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体を１４ｍｇ／ｍｌに濃縮し、シッティングドロップのような蒸気拡散法によりスクリーニングした。
タンパク質溶液をリザーバ緩衝液と１：１で混合して、０．４μｌの総容量とした。実験をＰｈｏｅｎｉｘロボティックシステム（Ａｒｔ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて設定し、１９ｏＣでＲｏｃｋＩｍａｇｅｒホテル（Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ）に保存され、自動的に画像化した。２０％ｗ／ｖポリエチレングリコール３３５０及び０．２Ｍ硝酸ナトリウムの条件下で、スクリーニングの４日後に結晶を回収した。結晶を、１０％グリセロールを含むリザーバ緩衝液で低温保護し、データ収集の前に液体窒素中でフラッシュ凍結した。回折データを、０．９９９９８ÅのＸ線放射波長を使用するＰｉｌａｔｕｓ画素検出器を備えたビームラインＰＸ−ＩＩのＳｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｖｉｌｌｉｇｅｎ、スイス）で収集した。
【０２３３】
データセットはＸＤＳとＸＳＣＡＬＥ（バージョン２０１０年１２月６日）で処理され、構造は、ＩＬ−２の検索モデルとしてタンパク質データバンクエントリー”３ＩＮＫ”を、Ｆａｂ断片の検索モデルとしてタンパク質データバンクエントリー”３ＴＴＩ”を用いて、プログラムＰＨＡＳＥＲによる分子置換方法により解析された。反復モデルの構築及び改良は、プログラムＣｏｏｔ（結晶学的オブジェクト指向ツールキット）及びＡＵＴＯＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅら，２０１１）を用いて実施した。全ての図はプログラムＰｙＭＯＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；  ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ；  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて作成した。
【０２３４】
エピトープ残基は、ＮＡＲＡ１のＦａｂ断片中の任意の原子から４Å以内にあるプロロイキン（登録商標）由来の残基として決定され、さらにＣＣＰ４プログラムＣＯＮＴＡＣＴ及びＡＲＥＡＩＭＯＬ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｎｕｍｂｅｒ  ４、ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．４．０）によって確認される。同様にパラトープ残基は、プロロイキン（登録商標）の任意の原子から４Å以内にあるＮＡＲＡ１−Ｆａｂの残基として決定される。
【０２３５】
（２）結果
プロロイキン（登録商標）／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体は、単位格子寸法ａ＝２０１．８Å、ｂ＝３６．２Å、ｃ＝８８．７Å、α＝９０°、β＝１０２．９°、γ＝９０°を有する空間群Ｃ１２１において〜１．９５Åで解析された。構造の詳細な統計情報については、表３を参照。各非対称単位には、一つの複合分子が存在する。
【０２３６】
【表３】
2019511200.tif 000005
【０２３７】
（３）エピトープ及びパラトープ解析
図１は、実施例１で得られたプロロイキン（登録商標）／Ｆａｂ−ＮＡＲＡ１複合体の三次元構造の概要を提供する。ＮＡＲＡ１のＦａｂ断片の軽鎖をＡ、ＮＡＲＡ１のＦａｂ断片の重鎖をＢとして示し、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂによって認識されるエピトープ残基をＤ、プロロイキン（登録商標）をＣと示し、変異Ｃ１４５Ｓを示す。
図２は、エピトープ残基のさらなる分析を提供する。Ｘ軸は、配列番号１１０に記載のアミノ酸配列と番号付けとを列挙する。Ｙ軸の上側は、プロロイキン（登録商標）からの対応する残基から４Å以内にあるＮＡＲＡ１−Ｆａｂの総原子数を示し、Ｙ軸の下側は、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂに結合した後の減少した溶媒接近可能領域（Å２）を示す。
【０２３８】
実施例１で用いたプロロイキン（登録商標）は、Ｃ１４５Ｓの変異を含む。図１に示すように、Ｃ１４５Ｓはエピトープ領域から遠い。さらに、実施例１のプロロイキン（登録商標）と、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、及びＣＤ１３２（ＰＤＢ：２Ｂ５Ｉ）との複合体中のｗｔｈＩＬ−２由来のＣα原子との間のＣα原子の重ね合わせは、０．４４７ÅのＲＭＳＤを示し、これは、変異が全体的な構造を妨害しないことを示す。したがって、Ｃ１４５Ｓ変異を有するプロロイキン（登録商標）は、ｗｔｈＩＬ−２の構造解析のための有効なモデルである。
【０２３９】
ｈＩＬ−２は４−ヘリックスバンドルタンパク質であり、４つのヘリックスはそれぞれＮ末端からＣ末端へＡ、Ｂ、Ｃ及びＤと名付けられる。図１に示すＮＡＲＡ１−Ｆａｂによって認識されるエピトープは、図２に示すように、立体配座エピトープであり、２つの領域にまたがる：１つの領域（Ｎ５０−Ｋ６３）は、ループ及びショートへリックスを含み、へリックスＡとＢを連結し、他の領域（Ｎ９１−Ｎ９７）はループを含み、へリックスＢとＣとを連結する。
【０２４０】
ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ由来の相互作用するパラトープ残基と共に、エピトープ残基を表４に概要する。全てのエピトープ残基の中で、図２に示すＡｒｇ５８は、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂとの結合のための最も重要なエピトープ残基である。これは、この残基はＮＡＲＡ１−Ｆａｂ由来の４２個の相互作用する原子を単独で有し、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂへの結合の結果として減少した総溶媒接近可能領域の１７．７％を占めるためである。さらに、Ａｒｇ５８は、図３に示すように、それぞれＨＣＤＲ１中のＧｌｕ３５と、ＬＣＤＲ３由来のＡｓｐ１００との２つの強い塩橋を形成する。Ａｒｇ５８はまた、ＬＣＤＲ３由来のＴｙｒ１００の芳香環とπ−作用相互作用を形成する。ＮＡＲＡ１−Ｆａｂとの結合にはＫ５２、Ｋ５２，Ｐ５４，Ｋ５５，Ｔ５７，Ｔ６１，Ｆ６２，Ｋ６３，Ｑ９４，及びＫ９６の残基も重要であると考えられる。それは、それら全てがＮＡＲＡ１−Ｆａｂ由来の５原子かそれ以上と相互作用し、図２に示すとおり、減少した溶媒接近可能領域は３０Å２を超えるためである。
【０２４１】
【表４】
2019511200.tif 000006
図３は、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂを認識する最も重要なエピトープ残基としてＡｒｇ５８を例示する。Ａはプロロイキン（登録商標）を表し、Ｂは重鎖を表し、Ｃは軽鎖を表す。関係する残基は分枝として示す。
【０２４２】
（４）ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ結合特性
図４は、ＩＬ−２／ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２四次複合体とのプロロイキン（登録商標）／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体のオーバーレイを示す。四次複合体構造は、ＰＤＢに登録の「２Ｂ５Ｉ」から用い、淡いシアンの画像ＤはｗｔｈＩＬ−２、赤色の画像ＢはＣＤ１２２、青色の画像ＣはＣＤ１３２、及び緑色の表面ＡはＣＤ２５を表す。プロロイキン（登録商標）／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体構造において、ｗｔｈＩＬ−２でオーバーレイされたシアンの画像Ｄはプロロイキン（登録商標）を表し、マゼンタの画像Ｅは重鎖を表し、黄色の画像Ｆは軽鎖を示す。
【０２４３】
図４に示す２つの複合体の構造オーバーレイは、ＮＡＲＡ１−ＦａｂがＣＤ２５に対して直接的競合を形成するが、ＣＤ１２２／ＣＤ１３２に対しては直接的競合を形成しないことを明らかに示しており、これはＩＬ−２／ＮＡＲＡ１複合体がｐｒｏ−Ｔｒｅｇ活性よりもｐｒｏ−Ｔエフェクター細胞活性を主に示すという観測と一致する。
【０２４４】
（５）四次複合体と同様の立体配座をとるＮＡＲＡ１−Ｆａｂと複合体化したプロロイキン（登録商標）のＣヘリックス
【０２４５】
図５は、ＩＬ−２＿Ｃ１４５Ａ（ＰＤＢ：３ＩＮＫ）、スーパーカイン（Ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ）（ＰＤＢ：３ＱＢ１）、ＩＬ−２／ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２（ＰＤＢ：２Ｂ５Ｉ）及びプロロイキン（登録商標）／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ由来のＣヘリックスのオーバーレイを示す。
【０２４６】
ＩＬ−２中のヘリックスＣとＣＤ１２２との間の極性界面は、２つの部分の間の結合において重要な役割を果たす（（Ｗａｎｇら  （２００５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：１１５９−１１６３）。２０１２年、Ｌｅｖｉｎらは、ＩＬ−２変異体であるスーパーカイン（Ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ）のみが、四次複合体のそれと同様の立体配座をとるヘリックスＣを有し、スーパーカイン（Ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ）はｗｔＩＬ−２より、から２１５倍までのＣＤ１２２に対する高い結合親和性を示すことを示した（Ｌｅｖｉｎら，（２０１２）  Ｎａｔｕｒｅ  ４８４：５２９−５３３）。ヘリックスＣにおけるそのような立体配座の変化は、立体配座安定化に関連し、ＣＤ１２２への結合についてのエネルギーペナルティーが減少することが観察された。図５に示すように、ＮＡＲＡ１−Ｆａｂと複合体化したプロロイキン（登録商標）からのヘリックスＣの立体配座も、スーパーカイン（Ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ）及びＩＬ−２／ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２四次複合体において観察されるものと同様であり、それゆえ、プロロイキン（登録商標）／ＮＡＲＡ１−Ｆａｂ複合体は、ｈＩＬ−２  ｗｔよりもＣＤ１２２に対して高い結合親和性を示す可能性がある。
【０２４７】
実施例３：マウスモノクローナル抗体ＮＡＲＡ１のヒト化
ヒトＣＤＲ移植アクセプターフレームワークの結合特性を実質的に保持及び／又は向上させる、ヒトのアクセプターフレームワークの選択、逆変異、及び変異を含む抗ヒトＩＬ−２マウス抗体ＮＡＲＡ１のヒト化が記載される。
【０２４８】
ヒト化のプロセスは、当該分野において十分に記載されている（Ｊｏｎｅｓら  １９８６，Ｑｕｅｅｎら  １９８９，Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら  １９８８，  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＷｉｎｔｅｒ  １９８８）。ヒト化という用語は、非ヒト抗体の抗原結合部位、例えば、マウス由来の抗体が、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト生殖細胞系列配列（Ｒｅｔｔｅｒら  ２００５）への転移として説明される。抗体をヒト化する主な論理的根拠は、ヒト抗体の免疫原性応答を発症するリスクを最小限にすることにある（Ｒｅｂｅｌｌｏら  １９９９）
【０２４９】
抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ  １９８７、Ｋａｂａｔら  １９９１）及びＣＤＲの外側の部位、すなわち、結合に直接的又は間接的に影響を及ぼす可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）のフレームワーク領域にある部位を含む。結合に直接影響し得るフレームワーク残基は、例えば、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する、いわゆる「外側」ループ領域に見出され得る。間接的に結合に影響を及ぼす残基は、例えば、いわゆるＶｅｒｎｉｅｒゾーン（Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ  １９９２）に見出される。それらはＣＤＲ立体配座を支持すると考えられる。フレームワーク領域中のヒト生殖細胞系列配列に対し、最終的なヒト化抗体の偏差の数を最小にするために適切なアクセプターフレームワークを選択する場合、これらのＣＤＲの外側の位置が考慮される。
【０２５０】
１．親和性成熟の配列最適化
特定のアミノ酸配列モチーフは、グリコシル化（すなわちＮｘＳ／Ｔ、Ｐ以外の任意のｘ）、遊離システインの酸化、脱アミド化（例えばＮＧ）又は異性化（例えばＤＧ）のような翻訳後改変（ＰＴＭ）を受けることが知られる。ＣＤＲ領域に存在する場合、これらのモチーフは、産物の均一性を高めるために、部位特異的変異誘発によって理想的に除去される。
【０２５１】
親和性成熟のプロセスは当技術分野で十分に記載されている。多くのディスプレイシステムの中で、ファージディスプレイ（Ｓｍｉｔｈ  １９８５）及び酵母のような真核細胞上のディスプレイ（Ｂｏｄｅｒ  Ｅ．及びＷｉｔｔｒｕｐ  Ｋ．（１９９７）、コンビナトリアルポリペプチドライブラリのスクリーニングのための酵母表面ディスプレイ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５（６）、ｐｐ  ５５３−７）は、抗体−抗原相互作用を選択するために最も一般的に適用されるシステムであると思われる。これらのディスプレイシステムの利点は、それらが広範囲の抗原に適しており、選択の厳密さを容易に調整できることである。ファージディスプレイでは、ｓｃＦｖ又はＦａｂ断片を表示することができ、酵母ではさらに全長ＩｇＧを表示することができる。これらの一般的に適用される方法は、１０７を超える多様性を有するより大きなライブラリから所望の抗体変異体を選択することを可能にする。より多様性の低いライブラリ、例えば１０３は、マイクロ発現及びＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。
【０２５２】
非標的又はランダム抗体変異体ライブラリは、例えばエラープローンＰＣＲ（Ｃａｄｗｅｌｌ及びＪｏｙｃｅ  １９９４）によって生成され得、非常に単純であるが時には限定されたアプローチを提供し得る。別のストラテジーは、抗体候補のＣＤＲ指向性多様化である。１つ又は複数のＣＤＲの１つ又は複数の位置は、例えば縮重オリゴ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら  １９９６）、トリヌクレオチド変異誘発（ＴＲＩＭ）（Ｋａｙｕｓｈｉｎら  １９９６）又は当技術分野で知られている任意の他の方法を用いて特異的に標的化することができる。
【０２５３】
２．発現プラスミドの作製
ホモサピエンスのコドン最適化を含み、ヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で注文した。ＧｅｎｅＡｒｔ由来ベクターから、哺乳類細胞における分泌に適した発現ベクターへカットアンドペーストすることにより、ＶＬ及びＶＨドメインをコードする配列をサブクローニングした。重鎖及び軽鎖を個々の発現ベクターにクローニングして、共トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を可能にした。発現ベクターの要素は、プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサープロモーター）、分泌を促進するシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、原核生物におけるエピソーム複製及び複製を可能にする要素（例えば、ＳＶ４０起源及びＣｏｌＥ１又は当技術分野で公知の他のもの）及び選択（アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー）を可能にする要素を含む。
【０２５４】
３．ヒト化抗体候補の発現及び精製
ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＨＥＫ２９３−Ｔ  ＡＴＣＣ１１２６８）を恒常的に発現するヒト胚性腎臓細胞は、ヒト化及び／又は最適化されたＩｇＧタンパク質の一過性発現のための好ましい宿主細胞系の一つである。トランスフェクションは、トランスフェクション試薬としてＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＭＷ２５．０００  ｌｉｎｅａｒ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ  Ｃａｔ．Ｎｏ．２３９６６）を用いて行う。ＰＥＩストック溶液は、９００ｍｌの細胞培養グレードの水に室温（ＲＴ）で１ｇのＰＥＩを注意深く溶解することによって調製される。ＰＥＩの溶解を促進するために、溶液にＨＣｌをｐＨ３〜５に添加することにより酸性化し、続いてＮａＯＨで最終的に７．０５のｐＨに中和する。最後に、容量を１Ｌに調整し、溶液を０．２２μｍフィルターで濾過し、分取し、さらに使用するまで−８０℃で凍結する。解凍後、分取は、−２０℃で３回まで再凍結を行うことができるが、−２０℃で長期間保存してはいけない。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞は、細胞のトランスフェクション及び増殖のためのノバルティス独自の無血清培地、及び生産／供給培地としてのＥｘＣｅｌｌ  ＶＰＲＯ無血清培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２４５６１Ｃ）を用いて培養する。一過性トランスフェクションのために調製された細胞は、懸濁培養において培養される。小規模（＜５Ｌ）のトランスフェクションのために、細胞を、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で、オービタルシェーカー（１００〜１２０ｒｐｍ）上でコーニングシェイクフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）で増殖する（シードフラスコ）。種培養物中の細胞は指数増殖期（細胞密度は５ｘ１０５と３ｘ１０６／ｍＬの間）に維持されなくてはならなく、かつ、トランスフェクションのため＞９０％の生存率を示されなければならない。この範囲外の細胞密度は、希釈後のラグ期又はトランスフェクション効率の低下のいずれかをもたらす。小規模（＜５Ｌ）トランスフェクションのために、細胞の分取では、種培養液から取り出し、ノバルティス無血清培地で最終体積の３６％中に１．４ｘ１０６細胞／ｍＬに調整する。ＤＮＡ溶液（１Ｌトランスフェクションにおいて、溶液１：０．５ｍｇの重鎖発現プラスミド及び０．５ｍｇの軽鎖発現プラスミド）を、最終培養体積の７％中に１ｍｇ／Ｌ（最終体積）へＤＮＡを希釈することによって調製し、続いて穏やかな混合する。細菌汚染を防ぐために、この溶液を０．２２μｍフィルター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ）を用いて濾過する。その後、３ｍｇ／Ｌ（最終体積）のＰＥＩ溶液を、また最終培養体積の７％中で希釈し、穏やかに混合する（溶液２）。両方の溶液を室温（ＲＴ）で５〜１０分間インキュベートする。その後、溶液２を穏やかに混合しながら溶液１に加え、室温でさらに５〜１５分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を細胞に添加し、細胞の培養を４〜６時間続ける。最後に、総生産体積の残りの５０％は、ＥｘＣｅｌｌ（登録商標）ＶＰＲＯ無血清培地を添加することによって達成される。トランスフェクション後１１日間細胞培養を継続する。４℃で２０分間、４５００ｒｐｍの遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ（登録商標）、Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ３Ｓ−Ｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により培養物を回収する。回収された細胞上清を、ステリックアップフィルター（０．２２μｍ）で滅菌濾過し、さらなる処理が行われるまで４℃で保存する。
【０２５５】
精製は、新たに消毒した（０．２５Ｍ  ＮａＯＨ）ＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅ、５ｍｌカラムを使用して、冷却キャビネット中、４℃において「ＡＫＴＡ  １００  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ａｉｒ」クロマトグラフィーシステムで行った。カラムを５ＣＶのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で平衡化し、次いで滅菌濾過した上清（２Ｌ）を４．０ｍｌ／分でロードした。カラムを８ＣＶのＰＢＳで洗浄して結合していない試料を溶出し、５ＣＶのＰＢＳで再度洗浄した。抗体を５ＣＶの５０ｍＭクエン酸塩、７０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ３．２で溶出した。溶出液を３ｍｌの画分に集めた；画分をプールし、１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ１０でｐＨ７に調整した。該プールをプールし、滅菌濾過し（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ、０．２２ｕｍ）、ＯＤ２８０ｎｍを分光光度計ＮＤ−１０００（ＮａｎｏＤｒｏｐ）で測定し、そして、タンパク質濃度を配列データに基づいて計算した。溶出液を凝集（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）及び純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＬＡＬ及びＭＳ）について試験した。必要であれば、第二の精製工程のために、第一の精製からのプールを新たに消毒した（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）ＳＰＸ（Ｈｉ  Ｌｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００グレード１２０ｍＬ（ＧＥ−Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ））にロードした。カラムをＰＢＳで平衡化し、１ｍｌ／分のＰＢＳ緩衝液で実施し、溶出液を１．２ｍｌの画分に集め、第一の精製工程について記載したとおり分析した。
【０２５６】
したがって、表５に示されるとおり、３つのヒト化可変重鎖領域；ＶＨ１、ＶＨ３及びＶＨ５が生成した。
【０２５７】
【表５】
2019511200.tif 000007
【０２５８】
また、表６に示されるとおり、３つのヒト化可変軽（カッパ）領域；ＶＫ１、ＶＫ２及びＶＫ３が生成した。
【０２５９】
【表６】
2019511200.tif 000008
【０２６０】
実施例４：構造改訂されたヒト化
実施例２の結晶構造ＮＡＲＡ１／ｈＩＬ−２の結果を用いて、ヒト化設計を改良した。
同一性は、実施例３の最初のヒト化配列と最も近い生殖系列との間で計算された。これとは別に、等電点（ｐＩ）を重鎖及び軽鎖について計算した。
結果を表７及び以下に示す．
【０２６１】
【表７】
2019511200.tif 000009
【０２６２】
【表８】
2019511200.tif 000010
【０２６３】
このデータに基づいて、構造ＶＨ３及びＶＫ３を改良することが決定され、その結果、表９に示されるとおり生成された配列が得られた。ＶＨ３はが選ばれたのは、構造情報により配列を改良された生殖細胞系が、７７％から８５％までヒト鋳型との同一性のパーセンテージを増加させるのに寄与したためである。
【０２６４】
ｐＩが４．７から５．０に増加したためにＶＫ３が選択された。（ＶＫ１は既に５．３であり、ＶＫ２では構造情報によりｐＩを増加させないため、ＶＫ３に決定した）。
【０２６５】
【表９】
2019511200.tif 000011
【０２６６】
これらの６つの可変重鎖及び軽鎖領域に基づいて、表１０の概要に従って配列番号１０３で表されるとおりＮ２９７Ａ点変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを用いて９つの抗体を生成した。
【０２６７】
【表１０】
2019511200.tif 000012
【０２６８】
任意のＦｃドメインを用いて、当業者に知られているように、さらなる抗体を生成することができる。特に考えられるＦｃドメインは、配列番号９３に記載の非Ｆｃ改変ヒトＩｇＧ１、配列番号９５に記載のヒトＩｇＧ２、配列番号９７に記載のヒトＩｇＧ３、配列番号９９に記載のヒトＩｇＧ４、配列番号１０１に記載のＬＡＬＡ変異で改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、配列番号１０３に記載のＮ２９７Ａ変異で改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、配列番号１０５に記載のＤＡＰＡ変異で改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃである。
【０２６９】
好ましい実施形態によれば、Ｆｃドメインは配列番号９３に記載のヒトＩｇＧ１であり、さらにより好ましい実施形態によれば、Ｆｃドメインは配列番号１０３に記載のＮ２９７Ａ変異で改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃである。
【０２７０】
特定の実施形態によれば、抗体１０４３４３の完全軽鎖配列は配列番号１２４に記載されており、完全な重鎖配列は配列番号１２６に記載される。別の特定の実施形態によれば、抗体１０４３４８の完全軽鎖配列は、配列番号１２８に記載されており、完全重鎖配列は配列番号１３０に記載される。
【０２７１】
実施例５：構造最適化
実施例２の結晶構造ＮＡＲＡ１／ｈＩＬ−２の結果を使用して、ＣＤＲにおける特定のアミノ酸残基をさらなる構造最適化のために同定した。特に、ＬＣＤＲ１ではいわゆるＤＧ部位が同定され、並びにＨＣＤＲ３では別のＤＧ部位が同定された。驚くべきことに、これらの部位におけるいくつかの変異はヒトＩＬ−２に対する親和性を劇的に低下させるが、他の変異は親和性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。
【０２７２】
複合体の構造をＰｙＭＯＬ又はＭＯＥのようなモデリングソフトウェアを用いて分析し、そして、さらなるヒト化のためヒト化配列とヒト鋳型との間の同一性のパーセンテージを増加させるために、抗原と密接に接触しない（すなわち、抗原から４オングストローム以上の）ＣＤＲループ上の残基を選択していた。
【０２７３】
Ｋａｂａｔ定義により得られた軽鎖（カッパ）ＣＤＲを表１１に示す。
【０２７４】
【表１１】
2019511200.tif 000013
【０２７５】
Ｋａｂａｔの定義により得られた重鎖ＣＤＲを表１２に示す。
【表１２】
2019511200.tif 000014
【０２７６】
ＶＨ５変異Ｄ９８Ｅは耐性を示したが、Ｄ９８Ｓ及びＤ９８Ｑは驚くほど耐性を示さなかった。変異Ｇ９９Ａも耐性を示した。ＶＫ１については、変異Ｄ２８Ｑは耐性を示したが、驚くべきことに変異Ｇ２９Ａは耐性を示さなかった。
【０２７７】
本発明者らの非結合理論によれば、ＶＨＤ９８アミノ酸及び／又はＶＬＤ２８アミノ酸をアミノ酸Ａ、Ｇ又はＴで置換することにも耐性を示すことが可能であった。また、ＶＨ  Ｇ９９アミノ酸又はＶＬ  Ｇ２９アミノ酸をアミノ酸Ｔ又はＳで置換することにも耐性を示すことが可能であった。
【０２７８】
これらの最適化された可変重鎖及び軽鎖領域に基づいて、Ｎ２９７Ａ点変異を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン及び表１３の概要に従う可変軽鎖及び可変重鎖領域を用いて、１２個の最適化された抗体を生成した。
【０２７９】
【表１３】
2019511200.tif 000015
【０２８０】
任意のＦｃドメインを用いて、当業者に知られているように、さらなる抗体を生成することができる。特に考えられるＦｃドメインは、配列番号９３に記載の非Ｆｃ改変ヒトＩｇＧ１、配列番号９５に記載のヒトＩｇＧ２、配列番号９７に記載のヒトＩｇＧ３、配列番号９９に記載のヒトＩｇＧ４、配列番号１０１に記載のＬＡＬＡ変異で改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、配列番号１０３に記載のＮ２９７Ａ変異で改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、配列番号１０５に記載のＤＡＰＡ変異で改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃである。
【０２８１】
好ましい実施形態によれば、Ｆｃドメインは配列番号９３に記載のヒトＩｇＧ１であり、さらにより好ましい実施形態によれば、Ｆｃドメインは配列番号１０３に記載のＮ２９７Ａ変異で改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃである。
【０２８２】
１つの具体的な実施形態によれば、抗体１０４３４８＿ＶＨ５Ｄ９８Ｅ＿ＶＫ１Ｄ２８Ｑの完全重鎖配列は配列番号２２９に記載され、完全軽鎖配列は配列番号３９５に記載される。
【０２８３】
実施例６：親和性成熟
ヒト化ＮＡＲＡ１（１０４３４８＿ＶＨ５Ｄ９８Ｅ＿ＶＫ１Ｄ２８Ｑ）は、酵母表面上のＦａｂとして親ＶＨ（配列番号４９）及びＶＫ（配列番号７０）をクローニング及び発現することから始まる複数の段階に基づく、親和性成熟プロセスの出発点として用いられ、かつ、ビオチン化プロロイキン（登録商標）の最適かつ準最適な結合濃度決定に用いられた。
【０２８４】
要するに、親又は野生型（ＷＴ）ＶＨ（配列番号４９）配列及びＶＫ（配列番号７０）配列を、ＶＨのカルボキシル末端と軽鎖のカルボキシル末端を伴うβ−アミロイド（ＡＰＰ−タグ）のインフレーム由来の６アミノ酸タグとを有するａｇａ２配列のインフレームを含む酵母ディスプレイベクターにおいてＦａｂとしてクローニングした。このタグの検出は、表面上のＦａｂの発現レベルの視覚化を可能にするが、これは当業者に周知である。酵母におけるベクターの電気穿孔（Ｂｅｎａｔｕｉｌ  Ｌ．ら．（２０１０）、非常に大きなヒト抗体ライブラリの生成のための改良された酵母形質転換法、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．，２３（４），ｐｐ．１５５−９）の後、細胞をＣＭグルコースブロスマイナスウラシル中で増殖させた。誘導時に、指数関数的に増殖する７．８Ｅ＋４個の酵母細胞を誘導培地（ＣＭガラクトースブロスマイナスＵｒａ／０．０５％グルコース）７ｍｌで洗浄し、細胞を４０００ｒｐｍで１０分間スピニングしペレット化した。ペレットを誘導培地（１Ｅ＋７細胞／ｍｌ）に再懸濁し、シェーカーで２２℃にて１６時間（ＨＲ）増殖させた。誘導された酵母細胞（４Ｅ＋７）を、４℃の予め冷却した遠心分離機において、１３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によって回収した。ペレットを１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ）に再懸濁し、続いて４℃の予め冷却した遠心分離機で１３０００ｒｐｍ、１分間遠心分離することによって細胞を洗浄した。酵母ペレットを１ｍｌ  ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５０μｌを、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈（０ｎｍ／０．０２ｎＭ／０．０５ｎＭ／０．１５ｎＭ／０．４５ｎＭ／１．３ｎＭ／４ｎＭ／１２ｎＭ／３６ｎＭ／１００ｎＭ／３３３ｎＭ／１μＭ）した様々な濃度のビオチン化プロロイキン（登録商標）を含む１２本の管に移した。酵母をローターで室温（ＲＴ）にて１時間インキュベートし、上記に記載のとおり１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ペレットを、抗ＡＰＰマウスモノクローナル抗体を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ローターで室温において３０分間インキュベートした後、酵母を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ペレットを２００μｌの標識緩衝液（アロフィコシアニン（ＡＰＣ）−コンジュゲート化ストレプトアビジン／フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗マウス抗体／ＦＡＣＳ緩衝液）に再懸濁した。ローター上でＲＴにて３０分間インキュベートした後、細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５００μｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳチューブのキャップを通して濾過した。ＦＡＣＳ分析まで試料を暗所に保持した。ＦＡＣＳ分析のゲーティング法は、ＰＥシグナル（酵母の表面上のＦａｂ発現のレベル）及びＡＰＣシグナル（ビオチン化プロロイキン（登録商標）の結合）が単一酵母細胞（一重項）について測定されるように選択された。酵母の表面上のＦａｂへのビオチン化プロロイキン（登録商標）の結合は、ＰＥシグナル及びＡＰＣシグナルの両方において陽性であったＦＡＣＳプロットにおける事象として視覚化することができた（データ示さず）。予想通り、高濃度のビオチン化プロロイキン（登録商標）（１μＭ−１２ｎＭ）と酵母をインキュベートすると、ＰＥとＡＰＣの両方で多数の陽性の事象が検出された。この濃度範囲を最適濃度範囲とみなした。４ｎＭ及び１．３ｎＭのビオチン化プロロイキン（登録商標）を有する酵母のインキュベーションは、結果としてＰＥシグナルと同様のレベルであったが、ＡＰＣシグナルの劇的な低下は、ビオチン化プロロイキン（登録商標）が酵母の表面上のＦａｂに結合しなかったことを示した。この濃度範囲は準最適濃度と考えられた。１．３ｎＭ（０．４５ｎＭ／０．１５ｎＭ／０．０５ｎＭ／０．０２ｎＭ）未満のビオチン化プロロイキン（登録商標）濃度でインキュベートした酵母は、ＡＰＣシグナルのバックグラウンドレベルを示し、これはビオチン化プロロイキン（登録商標）がＦａｂに結合していないことを示した。
【０２８５】
次のステップでは、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号２００５５０）を使用し、エラープローンＰＣＲ（Ｃａｄｗｅｌｌ  Ｒ．及びＪｏｙｃｅ  Ｇ．（１９９４）．  Ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ＰＣＲ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，３（６），ｐｐ．１３６−４０．）によって、ＶＨ（配列番号４９）及びＶＫ（配列番号７０）は、個々にランダム変異誘発した。これにより、親ＶＫ（ＶＫｐ）（配列番号７０）と対になる変異誘発されたＶＨ（ＶＨｅｐ）からなるＦａｂ又は親ＶＨ（ＶＨｐ）（配列番号４９）と対になる変異誘発されたＶＫ（ＶＫｅｐ）からなるＦａｂ、どちらかを発現する２つの酵母ライブラリが生成された（Ｂｅｎａｔｕｉｌら．２０１０）。一回目の選択では、酵母ライブラリ（ＶＨｅｐ／ＶＫｐ及びＶＨｐ／ＶＫｅｐ）と親（ＶＨｐ／ＶＫｐ）発現酵母の両方を誘導し、上記に記載される手順を用いて最適な濃度（１０ｎＭ）のビオチン化プロロイキンで、ＦＡＣＳ染色した（１Ｅ＋９  ＶＨｅｐ／ＶＫｐ及びＶＨｐ／ＶＫｅｐ：１Ｅ＋７  ＶＨｐ／ＶＫｐ）。ＰＥ及びＡＰＣの両方に対して陽性である少なくとも８０，０００個の酵母細胞を、１ｍｌのＣＭグルコースブロスマイナスウラシルを含む１５ｍｌファルコンチューブでＦＡＣＳ選別した。この選択は、酵母の表面の機能的Ｆａｂの発現の富化を可能にする。
【０２８６】
一回目からＦＡＣＳ選別酵母を増殖させた後、二回目の選択を行った。ＶＨｐ／ＶＫｐ、ＶＨｅｐ／ＶＫｐ及びＶＨｐ／ＶＫｅｐを発現する酵母を、ビオチン化プロロイキン（登録商標）、１０ｎＭビオチン化プロロイキン（登録商標）（最適濃度）又は２ｎＭビオチン化プロロイキン（登録商標）（準最適濃度）なしでインキュベートし、上記に記載のとおりＦＡＣＳ染色した。以前に観察されたように、１０ｎＭのプロロイキン（登録商標）を用いたＶＨｐ／ＶＫｐを発現する酵母のインキュベーションは、ＰＥ及びＡＰＣの両方について有意な数の陽性の事象の検出をもたらした。酵母のＶＨｐ／ＶＫｅｐライブラリの発現についても同様の結果が得られた。興味深いことに、この濃度では、ＡＰＣシグナルはＶＨｅｐ／ＶＫｐライブラリではるかに強力であったが、ＰＥシグナルは、ＶＨｐ／ＶＫｐ及びＶＨｐ／ＶＫｅｐを発現する酵母で観察されたものに相当した。このことはより多くのビオチン化プロロイキン（登録商標）は、酵母の表面上に発現されたＦａｂに結合したことを示唆している。この傾向は、酵母を準最適濃度のビオチン化プロロイキン（登録商標）とともにインキュベートした場合にさらに顕著になった。これらの条件下で、ＶＨｐ／ＶＫｐ発現酵母及びＶＨｐ／ＶＫｅｐ発現酵母の両方は、ＰＥ及びＡＰＣの両方に対して陽性であった事象は少なかったが、ＶＨｅｐ／ＶＫｐ発現酵母はＰＥのレベルは同等であったが、ＡＰＣのレベルははるかに高く示した。これらの知見に基づいて、２ｎＭのビオチン化プロロイキン（登録商標）とインキュベートしたＶＨｅｐ／ＶＫｐライブラリを発現する酵母はすべて、ＰＥ及びＡＰＣの両方について陽性であり、前に記載したとおりＦＡＣＳ選択した。１０ｎＭビオチン化プロロイキン（登録商標）とともにインキュベートしたＶＨｐ／ＶＫｅｐを発現する酵母ライブラリについても同様のことを行った。
【０２８７】
２つのライブラリを増殖させた後、酵母ペレットをザイモリエイス（Ｚｙｍｏｌａｓｅ）（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｅ１００４）でプレインキュベーションし、続いて、ミニプレップスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇ＃２７１０６）を用いてプラスミドを回収して、プラスミドを酵母から抽出した。回収したプラスミドを細菌に電気穿孔し、選択プレート上で増殖させた。単一コロニーを採取し、９６ウェルプレート中で一晩増殖させた後、製造元手順（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｃａｔａｌｏｇ＃７４０６１６．２４）に従ってＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ９６  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを単離した。プラスミドを配列決定し分析した。ＶＨ変異は表１４にまとめられる。
【０２８８】
観察された変異は、親ＩｇＧ１哺乳動物発現ベクター（表１６）への様々な組み合わせ（表１４のＶＨ配列番号及び表１５ＶＫ配列番号）でクローニングした。
【０２８９】
【表１４】
2019511200.tif 000016
【０２９０】
【表１５】
2019511200.tif 000017
【０２９１】
【表１６】
2019511200.tif 000018
【０２９２】
続いて、表１７に見られるとおり、３５個の独特な抗体を生成するＶＨ及びＶＫの野生型又は変異型のいずれかをコードするプラスミドのトランスフェクションマトリックスを設計した。Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）ＨＤ（プロメガ、カタログ＃Ｅ２３１１）を製造業者の手順に従って用いて、プラスミドを、６ウェルプレートで増殖させたＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に上清を採取し、プロテインＡ／ＨＰＬＣ（Ｈｏｌｅｎｓｔｅｉｎ  Ｆ．ら．（２０１５）、抗体を含む未精製哺乳動物細胞培養ブロスの自動収穫及び２段階精製、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．，１４１８，ｐｐ．１０３−９）を用いて上清中の抗体力価（内部プロセスコントロール、ＩＰＣ）を決定した。
【０２９３】
【表１７】
2019511200.tif 000019
抗体の配列を表４１に示し、以下の表１８に概要する。
【０２９４】
【表１８】
2019511200.tif 000020
【０２９５】
続いて、ＥＬＩＳＡを用いて上清中に存在する抗体のｈＩＬ−２結合効率を測定した。
要するに、ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルブラックマイクロタイタープレート）を４℃で１００μＬ／ウェルのプロロイキン（登録商標）（５μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）で一晩被覆した。プレート洗浄器（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴ（１×ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で１回洗浄した。３５０μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（０．２２μｍで濾過したＴＢＳ／１Ｘカゼイン（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  １０Ｘ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ＃ＳＰ−５０２０））を添加することによってプレートをブロックし、穏やかに攪拌しながら室温で２時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去した後、プレート洗浄機を用いてプレートをＴＢＳＴで１回洗浄した。上清をブロッキング緩衝液中で１：２に希釈し、５０μｌをＥＬＩＳＡプレートの指定のウェルに移した。各試料は３つのＥＬＩＳＡプレート上に存在した。３つのプレートを穏やかに撹拌しながら室温でインキュベートした。２時間のインキュベーション後、１００μｌ／ウェル検出抗体（ＴＢＳＴ／ヤギポリクローナルＨＲＰ結合抗ヒトＦａｂ２；Ｄｉａｎｏｖａ／Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３６−００６）を添加する前にプレートの１つをＴＢＳＴで３回洗浄した。検出抗体を添加する前に、他の２枚のプレートを毎時３回で４時間又は毎時３回で１２時間、ＴＢＳＴで洗浄した。緩やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベートした後、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＢＭ  ＣｈｅｍｉＬｕｍｉｎｅｓｅｎｃｅ  ＥＬＩＳＡ基質（ＰＯＤ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ＃１１５８２９５０００１）を添加する前に、プレートを、ペーパータオルを何枚も重ねた上で軽くたたいて乾燥させた。発光シグナルは、暗所で５分間インキュベートした後に測定した。３５抗体のＥＬＩＳＡ値を表１９に示す。すべてのＥＬＩＳＡ値は、２回の測定に基づく平均値である。
【０２９６】
【表１９】
2019511200.tif 000021
導入された変異のほとんど（例えば、抗体番号：８／１１／１２／１３／１５／１６／２０／２８／３０／３１）は、親抗体（抗体番号：１）と比較して同等又はより低い力価を示したが、結合効率は劇的に改善した。１２時間の過度の洗浄の後でさえ、いくつかの変異体は依然として高レベルの結合を示した（例えば、抗体番号：１２／１３／１５／２０／２８）。種々の抗体をランク付けするために、上清を系列希釈し、結合親和性をＥＬＩＳＡによって決定した。
【０２９７】
ＥＣ５０値は、当業者に周知の標準的な方法に従って、プロテインＡ／ＨＰＬＣによって決定された力価を用いて計算した。結果を表２０に概要する。
【０２９８】
【表２０】
2019511200.tif 000022
【０２９９】
結合効率及び変異の表現に基づいて、７つの抗体のパネル（表２１）が選択され、発現させ、精製し（Ｈｏｌｅｎｓｔｅｉｎら．２０１５）、さらに特徴付けした。
【０３００】
【表２１】
2019511200.tif 000023
【０３０１】
選択された抗体の配列を表４１に示し、以下の表２２に概要する。
【０３０２】
【表２２】
2019511200.tif 000024
【０３０３】
実施例：７結合親和性
１．酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
【０３０４】
候補をスクリーニングするために、当業者に周知のＥＬＩＳＡを使用した。
【０３０５】
ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２（プロロイキン（登録商標））で４℃にて一晩被覆した。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、次いで１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中で２時間ブロックした。ブロッキング及び洗浄の後、抗ヒトＩＬ−２抗体を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中で１１ポイント希釈シリーズのプレート上に加え、２時間インキュベートした。その後、プレートを再度洗浄し、続いて、抗マウスＩｇＧ−ビオチン化（ＮＡＲＡ１）又は抗ヒトＩｇＧ−ビオチン化（ヒト化抗体）のいずれかの検出抗体と共に１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴにおいて、１：１００００希釈において２時間インキュベートした。次いで、プレートを再び洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼと共に４５分間インキュベートした。洗浄後、基質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をプレートに添加し、停止溶液を添加して３分後に酵素反応を停止させた。プレートを、波長補正を５４０ｎｍに設定して、４５０ｎｍのマイクロプレートリーダーによって読み取った。
【０３０６】
全プロセスは室温で行った。
【０３０７】
３つの独立したＥＬＩＳＡ実験の平均を表２３に示す
【０３０８】
２．溶液平衡滴定（ＳＥＴ）アッセイ
【０３０９】
５つのヒト化抗ＩＬ−２抗体及び抗ＩＬ−２（ＮＡＲＡ１）マウスＩｇＧ２ａのＩＬ−２タンパク質に対する親和性（ＫＤ）を決定し、かつ、比較するために、当業者に周知のＳＥＴアッセイを行った。
【０３１０】
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）アッセイは、強い結合に対する抗体−抗原相互作用親和性（ＫＤ）の測定を可能にする。この技術は、相互作用パートナーのいずれかの固定化又は標識化を必要とせず、強い相互作用に適している（ＫＤ＝ｐＭから低いｎＭ範囲）。
【０３１１】
平衡に達するまで、一定濃度の抗体の混合物（予想されるＫＤ以下の濃度）を適切な濃度範囲（ＫＤに十分に下及び十分に上）で抗原と共にインキュベートする。遊離抗体結合部位の量は、混合物を抗原被覆プレート上に移して短時間インキュベートすることによって決定される。遊離抗体は結果的にプレートに結合し、検出抗体で検出される。得られたシグナルを抗原濃度に対してプロットする。ＫＤは非線形曲線適合によって正確に決定される。
【０３１２】
（１）材料及び方法
【０３１３】
以下の抗体を使用した：
・ａｎｔｉ−ＩＬ−２（ＮＡＲＡ１）−ｍＩｇＧ２ａ：８．７ｍｇ／ｍｌ，１５０ｋＤａ，５８．００μＭ
・ａｎｔｉ−ＩＬ−２−ｈｓＩｇＧ１  １０４３４０  （キメラＮＡＲＡ１抗体）：４．２５ｍｇ／ｍｌ，１５０ｋＤａ，２８．３３μＭ
・ａｎｔｉ−ＩＬ−２−ｈｓＩｇＧ１  １０４３４３：３．６９ｍｇ／ｍｌ，１５０ｋＤａ，２４．６０μＭ
・ａｎｔｉ−ＩＬ−２−ｈｓＩｇＧ１  １０４３４７：４．０３ｍｇ／ｍｌ，１５０ｋＤａ，２６．８７μＭ
・ａｎｔｉ−ＩＬ−２−ｈｓＩｇＧ１  １０４３４８：２．７１ｍｇ／ｍｌ，１５０ｋＤａ，１８．０７μＭ
・ａｎｔｉ−ＩＬ−２−ｈｓＩｇＧ１  １０４３４９：３．２９ｍｇ／ｍｌ，１５０ｋＤａ，２１．９３μＭ
抗原
・ＩＬ−２（プロロイキン（登録商標））：１．００ｍｇ／ｍｌ，１５．３３ｋＤａ，６５．２４μＭ
・ＩＬ−２（ＷＴ）：０．１５ｍｇ／ｍｌ，１５．５５ｋＤａ，９．６５μＭ
検出抗体
・ＭＳＤスルホ標識ヤギ抗ヒト抗体、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カタログ番号Ｒ３２ＡＪ−５
・ＭＳＤスルホ標識ヤギ抗マウス抗体、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩＲ、カタログ番号１１５−００５−０７１
計測器とソフトウェア
・Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアによって制御されるＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００
・ＸＬｆｉｔによるデータ処理、ＭＳ  Ｅｘｃｅｌアドインソフトウェア
アッセイプレート
・ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００用標準３８４ウェルプレート、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃａｔ＃Ｌ２１ＸＡ
・ポリプロピレン３８４ウェルプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｃａｔ＃７８１２８０
試薬
・ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＶＷＲカタログ番号４２２３５１Ｓ
・リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｘ、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｃａｔ＃Ｐ０１９５
・ＭＳＤリードバッファＴ  ４ｘ、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃａｔ＃Ｒ９２ＴＣ−１
・トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）２０ｘ、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｃａｔ＃Ｔ１６８０
・Ｔｗｅｅｎ−２０，  ＶＷＲ  Ｃａｔ＃４３７０８２Ｑ
緩衝液
・ブロッキング緩衝液：１×ＰＢＳ＋５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ
・コーティング緩衝液：１×ＰＢＳ
・試料緩衝液：１ｘＰＢＳ＋０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ＋０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０
・洗浄緩衝液：１ｘＴＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０
・リードバッファ：１ｘＭＳＤ  リードバッファ
試料緩衝液で抗原の２２系列２倍希釈液を調製した。一定濃度の抗体を添加した。
抗原及び抗体濃度を以下に示す。６０μｌの各抗原：抗体混合物の体積を、３８４ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレート（ＰＰ  ＭＴＰ）に二重に分配した。試料緩衝液は陰性対照として、及び陽性対照のような抗原を含まない試料（Ｂｍａｘ）として、用いた。プレートを密封し、室温（ＲＴ）で一晩（ｏ／ｎ）インキュベートした。３８４ウェル標準ＭＳＤアレイプレートを、２μｇ／ｍｌのＩＬ−２でｏ／ｎでコーティングした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、プレートを５０μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液でＲＴにて１時間ブロックした。洗浄後、３０μｌ／ウェルの量の抗原：抗体混合物をＰＰ  ＭＴＰから被覆ＭＳＤプレートに移し、ＲＴで２０分間インキュベートした。さらなる洗浄ステップの後、３０μｌの試料緩衝液中の検出抗体（１：２０００に希釈）を各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。ＭＳＤプレートを洗浄し、３５μｌ／ウェルのリードバッファを添加し、５分間インキュベートした。ＥＣＬシグナルは、ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００で測定した。
【０３１４】
（２）結果
ＳＥＴの結果を表２３に示す。試験したすべての抗ＩＬ−２抗体は、低ｐＭ範囲（ＩＬ−２重量は示さず）でＩＬ−２タンパク質と同様の親和性を示した。
【０３１５】
【表２３】
2019511200.tif 000025
【０３１６】
表２３に見られるとおり、ほとんどのヒト化抗体は、ＮＡＲＡ１と同様のヒトＩＬ−２との結合親和性を有する。しかしながら、驚くべきことに、いくつかのヒト化抗体は、より低い結合親和性を有し、これは１０４３４７の場合である。
【０３１７】
実施例８：インビトロでのＩＬ−２  ／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ複合体の評価
ＰＢＭＣ由来ＣＤ８  Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、ヒト化抗ＩＬ−２抗体の活性をＮＡＲＡ１と比較した。
バフィーコートからＦｉｃｏｌｌ後に陰性の磁気分離によって単離したヒトＣＤ８  Ｔ細胞を、５％ヒト血清を補充した完全ＲＰＭＩ培地に１０００００細胞／ウェルに播種した。抗ＩＬ−２抗体単独（０．５μｇ／ｍｌ）又はＩＬ−２（プロロイキン（登録商標）；０．１μｇ／ｍｌ）＋抗ＩＬ−２抗体（０．５μｇ／ｍｌ）を２：１のモル比で用いて３７℃で４８時間刺激した。細胞は、最後の１６時間、３  Ｈ−チミジンでパルスし、回収し、そしてβ−カウンターで増殖を測定した。実験は３回実施し、抗体単独のカウントは非刺激細胞のバックグラウンドシグナルレベルと同等であった。
【０３１８】
【表２４】
2019511200.tif 000026
【０３１９】
表２４に見られるとおり、ほとんどのヒト化抗体は、インビトロでのヒトＣＤ８  Ｔ細胞増殖の誘導に関してＮＡＲＡ１と同様の能力を有する。
【０３２０】
別の方法では、いくつかのヒト化抗ＩＬ−２抗体の活性を、ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ８  Ｔ及びＮＫ細胞における７日間の増殖アッセイで評価した。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によってバフィーコートから精製したヒトＰＢＭＣを磁気ビーズ陰性選択に付して、ＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞を単離した。細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット増殖キットで標識し、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地に５００００細胞／ウェルで９６Ｕ底プレートに播種した。次いで、細胞をｈＩＬ−２又はｈＩＬ−２／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ複合体（２：１モル比、１０倍系列希釈）で刺激し、３７℃で７日間インキュベートした。増殖は、ＦＡＣＳによって測定したＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレットの組み込みによって評価した。実験は３回実施し、２回の独立した実験から平均ＥＣ５０値を計算した。
【０３２１】
【表２５】
2019511200.tif 000027
【０３２２】
実施例９：インビボでのＩＬ−２  ／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ複合体の評価
ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＮＫ細胞の数を、以下に記載するように、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２ｍＡｂ複合体を投与したＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスで測定した。並行して、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖レベルを評価した。
【０３２３】
（１）材料及び方法
次の抗体を用いた：１０４３４０（キメラＮＡＲＡ１抗体）、１０４３４３，１０４３４７，１０４３４８，１０４３４９，１０４３４１。
プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２を使用した。
この実験は二重に行った；初回はヒト化１０４３４１を含まなかった。
マウスは、１．５μｇ（低用量；ＬＤ）又は２０μｇ（高用量；ＨＤ）のｈＩＬ−２、又はｈＩＬ−２／モノクローナル抗体（それぞれ１．５μｇ及び１５μｇであり、１：１のモル比に相当する）の４回の連続注射を受けた。最後の注射の日、飲料水中に０．８ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を２４時間与えた。
翌日、マウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節（ＬＮ）をフローサイトメトリーによって分析した。これを行うために、標準の手順に従ってＬＮ及び脾臓の単細胞懸濁液を調製し、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び蛍光色素結合抗体のＰＢＳを用いてフローサイトメトリー分析のために２＊１０６個の細胞を染色した（下記参照）。２つの異なる染色を行った：最初の染色は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋Ｔ調節細胞を同定及び定量するために行った。この目的のために、ＦｏｘＰ３染色緩衝液を使用し、サプライヤーの推奨（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、００−５５２３−００）に従って、次のマーカー：ＣＤ２５、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＦｏｘＰ３へる蛍光色素結合抗体を使用して、単一細胞懸濁液を染色した。
【０３２４】
第二の染色は、特定の細胞サブセットの細胞増殖を同定及び定量するために行われ、増殖した細胞を染色するために蛍光色素結合抗ＢｒｄＵ抗体が使用された。ＢｒｄＵ染色は、ＦＩＴＣ  ＢｒｄＵキットを使用して行われ、そしてサプライヤーの推奨（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５１−２３５４  ＡＫ）に従い、次のマーカー：ＣＤ４４、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＮＫ１．１、ＣＤ３、ＣＤ１２２、Ｂｒｄｕへ蛍光色素結合抗体を使用して行われた。
【０３２５】
データは、当業者に周知のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて収集した。
【０３２６】
（２）結果
細胞数データの結果を表２６及び表２７に示す。
【０３２７】
【表２６】
2019511200.tif 000028
【０３２８】
【表２７】
2019511200.tif 000029
【０３２９】
表２６及び表２７に見られるとおり、ＩＬ−２と複合体化した抗体１０４３４３，１０４３４７，１０４３４８，１０４３４９及び１０４３４１は、インビボでＣＤ８及びＮＫ細胞を刺激することができる。
【０３３０】
また、図６は、マウスの脾臓で得られた免疫細胞の数を示す。  プロットした値を表２３及び表２４に示す。図７は、マウスの脾臓におけるＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋  Ｔ細胞の代表的なＢｒｄＵプロファイルを示す。図８は、マウスの脾臓におけるＣＤ３−ＮＫ１．１＋  ＮＫ細胞の代表的なＢｒｄＵプロファイルを示す。
【０３３１】
これらの結果から、ＩＬ−２と組み合わせたキメラＮＡＲＡ１抗体１０４３４０のようなヒト化抗体１０４３４３，１０４３４８，１０４３４９及び１０４３４１は、ＣＤ８＋  Ｔ  Ｔ細胞及びＮＫ細胞を優先的に刺激することができると結論することができる。これは、ヒト化１０４３４７抗体の場合ではない。
【０３３２】
実施例１０：リンカーを用いたＩＬ−２  ／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ融合タンパク質の作製
実施例２の結晶構造ＮＡＲＡ１／ｈＩＬ−２の結果を用いて、ＮＡＲＡ１重鎖及び軽鎖Ｎ末端領域をｈＩＬ−２に連結する方法が特定されている。
【０３３３】
複合体の構造をＰｙＭＯＬ又はＭＯＥのようなモデリングソフトウェアを用いて分析した。ｈＩＬ−２のＣ末端が抗体の抗原結合部位の反対側にあることが観察されたので、連結にリンカーが必要とされた。得られる融合タンパク質は、ＩＬ−２、続いてリンカー領域、続いて抗体重鎖領域で構成される。リンカー領域は、少なくとも６０オングストローム（Å）の距離をカバーしなければならず、したがって、様々なリンカーの長さ及び組成も、最適な接続のために設計及び試験されることがある。
【０３３４】
融合分子はまた、ＩＬ−２、続いてリンカー、続いて抗体の軽鎖でもあり得る。このタイプの融合において、リンカー領域は少なくとも５０オングストローム（Å）の距離をカバーしなければならず、したがってここでもいくつかのリンカーの長さ及び組成が最適な接続のために設計及び試験されることがある。
【０３３５】
抗体重鎖又は軽鎖の配列は、配列番号９３によって表されるヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン及び表１０に報告されるとおりの可変ドメインを用いて生成された抗体のいずれかであり得る。
【０３３６】
ＩＬ−２配列は、配列番号１０９で表されるｗｔ  ＩＬ−２又は配列番号１１０で表されるアルデスロイキンであり得る。
【０３３７】
ＩＬ−２のＣ末端及び抗体重鎖又は軽鎖のＮ末端残基を接続するために使用できるリンカー配列を表２８に報告する。
【０３３８】
【表２８】
2019511200.tif 000030
表２９に従い、２つの特異的融合タンパク質が生成された。
【０３３９】
【表２９】
2019511200.tif 000031
【０３４０】
実施例１１：ＩＬ−２／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ融合タンパク質の作製
複合体ＮＡＲＡ１／ｈＩＬ−２の構造は、ＩＬ−２のＮＡＲＡ１抗体の重鎖又は軽鎖への包埋を誘導するために使用されている。抗体のＬＣＤＲ１及び残基Ｋ９６とＮ９７の間のｈＩＬ−２ヘリックスＢ及びヘリックスＣを連結する領域は、さらなる工学のために使用される領域として見なすことができる。ＬＣＤＲ１は、Ｙ２７ｄとＤ２８との間、及びＧ２９とＤ３０との間で開かれ、Ｋａｂａｔの定義に従って番号付けされた。ｈＩＬ−２はＫ９６とＮ９７の間で開かれた。図９参照。
【０３４１】
抗体のＬＣＤＲ１の残基Ｄ２８Ｇ２９をＧｓに置き換えた。ｈＩＬ−２の新しいＮ末端Ｎ９７は、ＧＧＧリンカーを介してＬＣＤＲ１  Ｙ２７ｄの新しいＣ末端に連結される。ｈＩＬ−２  Ｃ末端Ｋ９６は、ＧＧＧＧリンカーを介してＬＣＤＲ１  Ｎ末端Ｄ３０に接続される。図１０を参照。ｈＩＬ−２の２つの元のＮ末端及びＣ末端は一緒に接続されており、すなわちＩＬ−２−Ｔ１５３  Ｃ末端残基はＩＬ−２  Ｎ末端残基Ｐ２２に直接融合される。図１１は、ＩＬ−２及び抗体ＶＬ配列がどのように融合されるかの概略図である。
【０３４２】
得られた融合タンパク質を１０７３５１と指定した。
【０３４３】
この工学的手順により、ｈＩＬ−２はＮＡＲＡ１抗体の軽鎖に完全に埋め込まれた。この埋め込みは、表１０に報告されるとおりヒト化配列のいずれかを用いることによって行うことができる。ＨＩＬ−２を軽鎖に埋め込むために使用されるリンカーの配列及び長さは、グリシン（Ｇ）の１〜１０の反復であることがあり、融合が、ＬＣＤＲ１  Ｙ２７ｄ及びｈＩＬ−２  Ｎ９７、ＬＣＤＲ１  Ｄ３０及びｈＩＬ−２  Ｋ９６がリンカー配列を介さずに直接的に接続されていることも試験されることがある。ｈＩＬ−２の番号付けは、配列番号１０９に報告されるとおり全長配列を指す。配列番号１１０で表されるアルデスロイキン中の対応する残基も、包埋手順に使用することができる。
【０３４４】
実施例１２：ＩＬ−２／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ融合タンパク質の活性
いくつかのＩＬ−２／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ融合タンパク質の活性を、ヒトＰＢＭＣ由来ＣＤ８  Ｔ細胞及びＮＫ細胞における７日間の増殖アッセイで評価した。
【０３４５】
Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によってバフィーコートから精製したヒトＰＢＭＣを磁気ビーズ陰性選択に付して、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を単離した。細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット増殖キットで標識し、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地に５００００細胞／ウェルで９６Ｕ底プレートに播種した。次いで、細胞をｈＩＬ−２又はｈＩＬ−２／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ複合体（２：１モル比、１０倍段階希釈）で刺激し、３７℃で７日間インキュベートした。増殖は、ＦＡＣＳによって測定したＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット組み込みによって評価した。実験を３回実施し、３つの独立した実験から平均ＥＣ５０値を計算し、表３０に示す。
【０３４６】
【表３０】
2019511200.tif 000032
【０３４７】
２５又は３５残基のリンカー配列を用いたＩＬ−２／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ融合タンパク質は、ＮＫ細胞増殖及びＣＤ８  Ｔ細胞増殖に対してそれぞれ活性がなく制限されている。対照的に、ヒト化ＮＡＲＡ１抗体の軽鎖に移植されたＩＬ−２／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ融合タンパク質は、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖を活性化するのにＩＬ−２単独と同様に強力であり、ＩＬ−２よりも強力であり、ＮＫ細胞増殖を刺激するＩＬ−２よりも強力である。
【０３４８】
その後、続いて融合タンパク質をインビボで評価した。マウスに１０７３５１（３６０μｇ／ｋｇ、７２０μｇ／ｋｇ又は１４４０μｇ／ｋｇ）又はＰＢＳの単回投与を受け、注射の９６時間後にマウスを屠殺した。脾細胞を、標準的な手順に従ってフローサイトメトリーにより分析し、結果を表３１に概要する。
【０３４９】
【表３１】
2019511200.tif 000033
【０３５０】
融合タンパク質１０７３５１は、用量依存的様式において、インビボで調節性Ｔ細胞の非常に制限された活性化を伴うＣＤ８＋及びＮＫ細胞の堅牢な増殖を誘導することができる。
【０３５１】
実施例１３：インビボでのＩＬ−２／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ複合体の評価（ヒト化及びアフィニティー成熟ヒト化抗ｈＩＬ−２抗体）
ＩＬ−２／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ複合体のインビボでの効果を評価するために、２つの実験的アプローチを行った。最初の実験では、以下に記載するとおり、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２  ｍＡｂ複合体の２回の注射を受けたＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＮＫ細胞の数を決定した。第２の実験では、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２ｍＡｂ複合体の単回注射後に、ＢｒｄＵを用いてＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖レベルを評価した。
【０３５２】
（１）材料及び方法
以下の抗体を用いた：ＮＡＲＡ１，１０４３４８，１０６２６０，１０８９２３，１０８９２４，１０８９２５，１０８９２６，１０８９２９及び１０８９３０。
【０３５３】
プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２を使用した。
【０３５４】
最初の実験では、１．５μｇのｈＩＬ−２及びｈＩＬ−２／モノクローナル抗体（モル比１：１に相当する１５μｇ）の１日目及び３日目に２回の注射をマウスに与えた。５日目にマウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節（ＬＮ）をフローサイトメトリーで分析した。これを行うために、ＬＮ及び脾臓の単細胞懸濁液を標準的なプロトコールに従って調製し、フローサイトメトリー分析のために、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び蛍光色素結合抗体とともにＰＢＳを用いて、２−３＊１０６個の細胞を染色した。染色は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇｓ）を同定及び定量するために行った。この目的のために、ＦｏｘＰ３染色緩衝液を使用し、サプライヤーの推奨（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、００−５５２３−００）に従い、次のマーカー：ＣＤ２５、ＣＤ８ａ、ＣＤ４４、ＣＤ１２２、ＮＫ１．１、ＤＸ５、ＣＤ４、ＣＤ３、ＦｏｘＰ３に対して蛍光色素結合抗体を使用して、単一細胞懸濁液を染色した。
【０３５５】
第二の実験では、１．５μｇのｈＩＬ−２及びｈＩＬ−２／モノクローナル抗体（１：１のモル比に相当する１５μｇ）の単回注射をマウスに与えた。同時に、ＢｒｄＵを０．８ｍｇ／ｍｌの飲料水中に与えた。翌日（注射及びＢｒｄＵ後２４時間）、染色は、特定の細胞免疫サブセットの細胞増殖を同定及び定量化するために行われ、増殖した細胞を染色するために蛍光色素結合抗ＢｒｄＵ抗体が使用された。ＢｒｄＵ染色は、ＦＩＴＣ  ＢｒｄＵキットを使用し、サプライヤーの推奨（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５１−２３５４  ＡＫ）に従って、次のマーカー：ＣＤ４４，ＣＤ８ａ，ＣＤ４，ＮＫ１．１，ＣＤ３，ＣＤ１２２，Ｂｒｄｕ，ＣＤ４に対して蛍光色素結合抗体を使用して行われた。
【０３５６】
データは、当業者に周知のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて収集した。
【０３５７】
（２）結果
細胞数データの結果を表３２及び表３３に示す。
【０３５８】
【表３２】
2019511200.tif 000034
【０３５９】
【表３３】
2019511200.tif 000035
【０３６０】
【表３４】
2019511200.tif 000036
【０３６１】
表３２、表３３及び表３４に見られるとおり、ＩＬ−２と複合体化した抗体１０４３４８，１０６２６０，１０８９２３，１０８９２４，１０８９２５，１０８９２６，１０８９２９及び１０８９３０は、インビボでＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を優先的に刺激することができる。
【０３６２】
また、図１２〜１５は、内在性ＣＤ８＋，ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋，ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞及びＮＫ細胞の表現型の特徴付けを示す。図１６〜１７は、マウスの脾臓で得られた免疫細胞サブセットの数を示し、表３２、表３３及び表３４のプロットされた値を示す。図１８〜２２は、マウスの脾臓におけるＴ細胞、ＣＤ３−ＮＫ１．１＋ＤＸ５＋ＮＫ細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の代表的なＢｒｄＵプロファイルを示す。これからわかるとおり、ＩＬ−２と複合体化したヒト化抗体１０４３４８，１０６２６０及び親和性成熟ヒト化抗体１０８９２３，１０８９２４，１０８９２５，１０８９２６，１０８９２９及び１０８９３０は、インビボでＣＤ４＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞より、ＣＤ８＋Ｔ細胞（特にＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞）及びＮＫ細胞の増殖レベルを増強させた。
【０３６３】
これらの結果から、ｈＩＬ−２（プロロイキン（登録商標））と混合した場合、親ＮＡＲＡ１抗体（１０５１９２）と同様のヒト化抗体１０４３４８，１０６２６０及び親和性成熟ヒト化抗体１０８９２３，１０８９２４，１０８９２５，１０８９２６，１０８９２９及び１０８９３０は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を優先的に刺激することができる。
【０３６４】
実施例１４：ＮＡＲＡ１に基づく融合タンパク質の発現プラスミドの作製
ヒトＩＬ−２（ｐＯＲＦ−ｈＩＬ−２  プラスミド、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ｐｏｒｆ−ｈＩＬ−２）及びＮＡＲＡ１の軽鎖をコードするＤＮＡ配列をカットアンドペーストによりサブクローニングし、標準的なクローニング技術（フュージョンポリメラーゼ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｆ−５３０Ｓ、を用いたＰＣＲ増幅／アセンブリ）を用いて、プライマー内に目的のリンカー（例えば、表３５、表３６、及び表３７に示す１５，２０又は２５アミノ酸リンカー）を付加する。得られたＰＣＲ産物を、哺乳類細胞における分泌に適した発現ベクターに切断してペーストで挿入した。ｈＩＬ−２に融合したＮＡＲＡ１の重鎖及びＮＡＲＡ１の軽鎖を、個々の発現ベクターにクローニングして、同時トランスフェクションを可能にした。発現ベクターの要素は、プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサープロモーター）、分泌を促進するシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、原核生物におけるエピソーム複製及び複製を可能にする要素（例えば、Ｖ４０オリジン及びＣｏｌＥ１又は当技術分野で公知の他のもの）及び選択（アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー）を可能にする要素を含む。
【０３６５】
【表３５】
2019511200.tif 000037
【０３６６】
実施例１５：ＮＡＲＡ１に基づく融合タンパク質の発現及び精製
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＩｇＧタンパク質の一過性発現のための好ましい宿主細胞系の１つである。トランスフェクションは、トランスフェクション試薬としてＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＭＷ  ２５．０００  ｌｉｎｅａｒ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ  Ｃａｔ．Ｎｏ．２３９６６）を用いて行う。ＰＥＩストック溶液は、９００ｍｌの細胞培養グレードの水に室温（ＲＴ）で１ｇのＰＥＩを注意深く溶解することによって調製される。ＰＥＩの溶解を促進するために、溶液を、ＨＣｌをｐＨ３−５に添加することで酸性化し、続いてＮａＯＨで中和して最終ｐＨを７にする。最後に、容量を１Ｌに調整し、溶液を０．２２μｍフィルターで濾過し、分注し、さらに使用するまで−８０℃で凍結する。ＣＨＯ細胞は、補助剤としてヒポキサンチンナトリウム及びチミジン（ＨＴ、４１０６５０１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン（１７−６０５Ｃ、Ｌｏｎｚａ）及び抗生物質−抗真菌剤（１５２４００６２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＰｏｗｅｒ  ＣＨＯ−２Ｄ培地及びＰｒｏＣＨＯ−４培地（増殖及びトランスフェクションのための無血清培地、それぞれ１２−７７０Ｑ及び１２−０２９Ｑ  Ｌｏｎｚａ）を使用して培養される。一過性トランスフェクションのために調製された細胞は、１５０ｒｐｍでシェーカー上の懸濁培養において培養される。種培養物中の細胞は、指数関数的増殖期（１．５ｘ１０５と３ｘ１０６／ｍＬの間の細胞密度）で維持されるべきであり、トランスフェクションのために＞  ９８％の生存率を示すべきである。この範囲外の細胞密度は、希釈後にラグ期又はトランスフェクション効率の低下のいずれかをもたらす。トランスフェクションのために、細胞の分注は、種培養液から取り出され、Ｐｏｗｅｒ  ＣＨＯ−４無血清培地で最終容量の５０％で２ｘ１０６細胞／ｍＬに調整される。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液中でＤＮＡを希釈することにより、ＤＮＡ溶液（ＩＬ−２に融合された重鎖及び軽鎖の１：１モル比に調整された、全ＤＮＡ＝１００ｍｌスケールについて１２５μｇ）を調製する。次に、ＰＥＩ溶液（１００ｍｌスケールで０．５ｍｌ）をＤＮＡ溶液に加える。混合物を撹拌し、室温で１０〜１２分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合物を細胞に添加し、細胞の培養を３〜４時間続ける。最後に、総生産量の残りの５０％を、Ｐｏｗｅｒ  ＣＨＯ−２Ｄ無血清培地を添加することによって得る。トランスフェクション後４〜６日間細胞培養を続ける。４℃にて４７００ｒｐｍで４５分間の遠心分離により培養物を回収する（Ｈｅｒａｅｕｓ（登録商標）、Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  ３Ｓ−Ｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）。回収された細胞上清を、ステリックアップフィルター（０．２２μｍ）で滅菌濾過し、２．５ｍＭ  ＥＴＤＡ及びアジ化ナトリウム（０．０１％）と共に４℃でさらなる処理まで保存する。
【０３６７】
精製は、４℃でプロテインＧアガロース（２０３９７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。したがって、ＩＬ−２のＣ末端がＮＡＲＡ１の軽鎖のＮ末端に１５，２０又は２５アミノ酸長のグリシン−セリンリンカーで融合された３つの融合タンパク質が、表３６に示されるとおり生成された。ＮＡＲＡ１の重鎖は同じままである（配列番号１１５）。
【０３６８】
【表３６】
2019511200.tif 000038
【０３６９】
【表３７】
2019511200.tif 000039
【０３７０】
実施例１６：インビボでのＮＡＲＡ１系融合タンパク質の評価
以下に記載するとおり、Ｌ１５、Ｌ２０、Ｌ２５、又はＩＬ−２／ＮＡＲＡ１を投与されたＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＮＫ細胞の百分率及び数を決定した。並行して、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いてＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖レベルを評価した。
【０３７１】
（１）材料及び方法
次の抗体及び融合タンパク質を使用した：ＮＡＲＡ１、Ｌ１５、Ｌ２０及びＬ２５。
【０３７２】
組換えヒトＩＬ−２（Ｔｅｃｅｌｅｕｋｉｎ（登録商標））を使用した。
【０３７３】
ｈＩＬ−２／モノクローナル抗体（２:１のモル比に対応するＮＡＲＡ１，１０μｇ）、Ｌ１５、Ｌ２０、Ｌ２５（活性の点で対応するＩＬ−２量）又はＰＢＳとともに、マウスに２μｇ（２０，０００ＩＵ）でｈＩＬ−２の３回連続注射を与えた。最後の注射の日に、ＢｒｄＵを０．８ｍｇ／ｍｌにて飲料水中に入れ、２４時間与えた。翌日、マウスを屠殺し、脾臓及びリンパ節（ＬＮ）をフローサイトメトリーによって分析した。これを行うために、標準手順に従ってＬＮ及び脾臓の単細胞懸濁液を調製し、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び蛍光色素結合抗体を有するＰＢＳを用いてフローサイトメトリー分析のために２＊１０６個の細胞を染色した（以下参照）。
【０３７４】
２つの異なる染色を行った：最初の染色は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）＋Ｔ調節細胞を同定及び定量するために行った。この目的のために、ＦｏｘＰ３染色緩衝液を使用し、サプライヤーの推奨（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、００−５５２３−００）に従って、次のマーカー：ＣＤ２５、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ３、ＦｏｘＰ３に対する蛍光色素複合抗体を用いて単一細胞懸濁液を染色した。
【０３７５】
第二の染色は、特定の細胞サブセットの細胞増殖を同定及び定量するために行われ、増殖した細胞を染色するために、蛍光色素結合抗ＢｒｄＵ抗体が使用された。ＢｒｄＵ染色は、ＦＩＴＣ  ＢｒｄＵキットを使用し、サプライヤーの推奨（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５１−２３５４  ＡＫ）に従い、以下のマーカー：ＣＤ４４、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＮＫ１．１、ＣＤ３、ＣＤ１２２、Ｂｒｄｕに対する蛍光色素結合抗体を使用して行われた。
【０３７６】
データは、当業者に周知のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて収集した。
【０３７７】
（２）結果
細胞数データの結果を表３８に示す。
【０３７８】
【表３８】
2019511200.tif 000040
【０３７９】
表３８に見られるとおり、融合タンパク質Ｌ１５、Ｌ２０及びＬ２５は、インビボでＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を刺激することができる。
【０３８０】
また、図２３は、内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表現型の特徴付けを示す。図２４は、マウスの脾臓で得られた免疫細胞の数を示し、表３８のプロットされた値を示す。図２５は、マウスの脾臓におけるＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ１２２＋  Ｔ細胞及びＣＤ３−ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞の代表的なＢｒｄＵプロファイルを示す。
【０３８１】
これらの結果から、ヒトＩＬ−２と組み合わせにおいて、ＮＡＲＡ１系融合タンパク質は、親ＮＡＲＡ１抗体と同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を優先的に刺激することができると結論することができる。
【０３８２】
実施例１７：インビトロにおけるＮＡＲＡ１系融合タンパク質の評価
ヒトＩＬ−２に応答するＣＴＬＬ−２ネズミ細胞系を用いた細胞増殖アッセイにおいて、ＮＡＲＡ１系融合タンパク質の活性をＮＡＲＡ１及びＩＬ−２単独と比較した。
【０３８３】
ｈＩＬ−２、又はｈＩＬ−２／ＮＡＲＡ１複合体（モル比２：１）、Ｌ１５、Ｌ２０又はＬ２５（対応するＩＬ−２量）を用いて、ＣＴＬＬ−２細胞を９６ウェルプレート（１００００細胞／ウェル）に播種し、３７℃で４８時間のインキュベーション後に増殖を評価した。増殖は、ＷＳＴ−１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を細胞に少なくとも４時間添加し、続いてｉＭａｒｋマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにて読み取ることによって評価した。
【０３８４】
実験を二重に行い、表３９は得られたＥＣ５０値を示す。
【０３８５】
【表３９】
2019511200.tif 000041
【０３８６】
表３９に見られるとおり、ＮＡＲＡ１系融合タンパク質は、ｈＩＬ−２及びｈＩＬ−２／ＮＡＲＡ１と比較して、インビトロでＣＴＬＬ−２細胞増殖を誘導する能力を有するが、より低い程度で誘導する能力を有する。
【０３８７】
また、図２６は、得られた増殖曲線を示す。
【０３８８】
ヒトＩＬ−２に応答するＣＴＬＬ−２マウス細胞株を用いたＳＴＡＴ５リン酸化（Ｐ−ＳＴＡＴ５）アッセイにおいて、ＮＡＲＡ１系融合タンパク質の活性をＮＡＲＡ１及びＩＬ−２単独と比較した。９６ウェルプレートにＣＴＬＬ−２（２０００００細胞／ウェル）を播種し、ｈＩＬ−２  ｈＩＬ−２／ＮＡＲＡ１複合体（モル比２：１）、Ｌ１５、Ｌ２０又はＬ２５（対応するＩＬ−２量）を用いて刺激した。１５分の刺激後にＳＴＡＴ５のリン酸化を評価し、ｐＳＴＡＴ５特異的ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞内染色を用いて検出した。
【０３８９】
実験を二重に行い、表４０は得られたＥＣ５０値を示す。
【０３９０】
【表４０】
2019511200.tif 000042
【０３９１】
また、図２７は得られたリン酸化レベルを示す。観察されるように、ＣＴＬＬ−２細胞のような高ＣＤ２５レベルを発現する細胞上で得られるインビトロでの効果は、ＩＬ−２又はＩＬ−２／ＮＡＲＡ１よりも、Ｌ１５、Ｌ２０及びＬ２５で細胞を刺激するとより低くなる。この差は、短時間（例えば、Ｐ−ＳＴＡＴ５の刺激１５分間）で、より顕著である。実際、最短のリンカー：Ｌ１５をもつＩＬ−２は短時間で細胞の刺激を可能にするＮＡＲＡ１に容易に解離することがある。一方、融合Ｌ２０及びＬ２５については、ＩＬ−２はＮＡＲＡ１に長く結合したままであり、ＣＴＬＬ−２細胞の刺激を妨げる可能性がある。
【０３９２】
配列表
本発明を実施するための有用なアミノ酸及びヌクレオチド配列を表４１に示す。本出願の本文全体にわたって、明細書の記載（例えば表４１）と配列表との間に相違がある場合、明細書の記載が優先する。
【表４１】
2019511200.tif 000043
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【図１】
2019511200.tif 000103
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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