(57)【要約】  本発明は、リポソーム中に含有された親油性分子の水溶性の形態である。１つの実施形態では、親油性分子は、結晶ルテインであり、ルテイン充填リポソームは、化粧品産業に加えて、咀嚼錠、飲料の栄養強化、発泡錠、素錠、栄養バー、及び機能性食品における可能性を有する医薬製品、医療デバイス、及び栄養補助食品の産業に含まれる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親油性分子の可溶性の形態を得る方法であって、前記親油性分子を溶媒中に溶解して溶液を形成する工程、前記溶液を脂質膜形成液及び剛性改質剤に混合して混合物を形成する工程、前記混合物を乾燥して脂質膜を形成する工程、前記脂質膜を水和する工程、前記水和された脂質膜をホモジナイズしてリポソームを形成する工程、及び、前記得られたリポソームを滅菌する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記親油性分子が、ルテイン結晶を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脂肪コーティングを有するリポソーム内に含有されたルテイン結晶を含む組成物。
【請求項４】
前記ルテインが、０．００１％〜１０％の範囲内の濃度で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記脂肪が、ベヘン酸グリセリルである、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
ある量のルテインが充填されたリポソーム、及び医薬的に許容される賦形剤を含む組成物を含む医薬組成物。
【請求項７】
化粧品産業に加えて、咀嚼錠、飲料の栄養強化、発泡錠、素錠、栄養バー、及び機能性食品における可能性を有する医薬製品、医療デバイス、栄養補助食品の産業で用いるための原材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全内容が参照により本明細書に援用される２０１６年２月１５日に出願された米国特許出願第６２／２９５，２５８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、カロテノイドなどの親油性化合物の可溶性の形態を作製するための方法全般に関し、より詳細には、医薬製品、医療デバイス、及び食品の産業での使用に適するルテイン及びゼアキサンチンなどのリポソームカプセル化カルテノイドを高レベルで含有するエマルジョンに関する。
【０００３】
新規な医薬製品を開発する際の原材料の効能を規制する指令又はガイドラインは存在しないが、可能な限り、医薬品グレードの物質が用いられるべきである。
【背景技術】
【０００４】
ルテインは、医薬品産業（医療デバイス）で用いられており、様々な食品及び飲料の着色剤としても用いられている（Scotter MJ. 2011. Methods for the determination of European Union-permitted added natural colours in foods: a review. Food Additives and Contaminants. 28(5): 527-596）。天然形態のルテインは、結晶である。そのため、いくつかの希釈系には不溶性であり、このことが、錠剤製品、医療デバイス、及び食品関連製品へのその適用を困難としている。いわゆる「冷水可溶性ルテイン」（ＣＷＳルテイン）などの可溶性の形態の結晶ルテインが開発された。しかし、この食品グレード材料は、溶液状態での１又は２日後に視認可能となる沈澱の形成を含むいくつかの制限を示す。沈澱形成は、デンプン、グルコースシロップ、及びアスコルビン酸も含むその原材料の他の成分に起因するものと思われる。加えて、これらの物質の存在は、剛性なポリサッカリド様構造の形成に主として起因して、ルテインの放出を阻害する（Amar I, Abraham A and Garti N. Solubilization Patterns of Lutein and Lutein Esters in Food Grade Nonionic Microemulsions. 2003. J. Agric. Food Chem. 51:4775-4781）。曝光に対する不安定性は、ＣＷＳルテインの別の問題であり、それは、この原材料を用いて作製されるすべての製品を、褐色容器で供給するか、又は暗条件下に保存する必要があるからである。したがって、医薬品グレードの可溶性で分散可能であり、安定なカルテノイド含有原材料の開発が急いで必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ルテインを含む親油性分子の、数ある特徴の中でも特に、作製が容易であり、冷溶媒（例：冷水）を含む溶解性に関して改善された特性を有する形態を製造するための方法に関する。本発明者らは、ルテイン及び剛性改質剤（rigidity modifier）を用いてリン脂質リポソームを製剤して、医薬品グレードの原料のみを用いたリポソームの吸収プロファイルを改変することによる実験を行った。本発明者らの研究から、（１）この新しい材料が、数か月後であっても沈澱することなく水への良好な分散性を有すること；（２）リン脂質、剛性改質剤、及び親油性環境の存在が、眼／鼻／皮膚の構造中へのルテインの送達を促進すること；（３）リン脂質、剛性改質剤、及びルテインを含有するそのような製剤が、経口で用いる場合、ルテインの良好な分散性及び非常により良好な吸収を可能とすること；（４）ベヘン酸グリセリルなどの５０℃よりも高い融点を有する剛性改質剤の存在が、最終構造の剛性の改変を、したがって、吸収プロファイルの改変をもたらす可能性を有していること、が示される。また、滅菌後の製品が、透明に見え、沈澱の徴候をまったく示すことなく完全に分散されることを考慮することも重要である。さらに、この新規な構造は、市販の形態で用いられる食品グレードの賦形剤の排除を可能とし、このことは、より安全な製品に貢献する。
【０００６】
水に可溶性であるルテインのこの新規な形態は、その化粧品産業での使用に加えて、咀嚼錠、飲料の栄養強化、発泡錠、素錠、栄養バー、及び機能性食品における可能性を有する医薬製品、医療デバイス、栄養補助食品の産業で用いるための重要な進歩である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、室温で１及び６か月後のＴＨＦ中のＷＳルテインのＵＶ／可視スペクトルである。ルテインの特徴的な３つのピークが視認可能である。
【図２】図２は、５２℃で６か月後のＴＨＦ中のＷＳルテインのＵＶ／可視スペクトルを示す。６か月後には、ルテインの特徴的な３つのピークが視認されない。
【図３】図３は、３０分間のＷＳルテインでのインキュベーション、並びに２４時間、４８時間、及び７２時間の細胞回復後におけるＡＲＰＥ−１９細胞生存率のグラフである。染色剤なしでの細胞をコントロールとして用い、０．０２％ＳＤＳをポジティブコントロールとして用いた。３つの反復サンプルでの実験からの標準誤差が、エラーバーとして示される。
【図４】図４は、１２０分間のＷＳルテインでのインキュベーション、並びに２４時間、４８時間、及び７２時間の細胞回復後におけるＡＲＰＥ−１９細胞生存率のグラフである。染色剤なしでの細胞をコントロールとして用い、０．０２％ＳＤＳをポジティブコントロールとして用いた。３つの反復サンプルでの実験からの標準誤差が、エラーバーとして示される。
【図５】図５は、安定性実験の開始時、及び室温での１か月後における、ＷＳＲｅｔｉｄｙｎｅ（Ａ）、ＷＳＰｈａｃｏｄｙｎｅ（Ｂ）、及びＷＳＤｏｕｂｌｅｄｙｎｅ（Ｃ）のＵＶ／可視スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
「親油性分子」の用語は、本明細書で用いられる場合、脂質、脂肪、油、及び非極性溶媒に溶解する化合物を意味する。親油性分子は、医薬活性剤、薬物、造影剤、治療剤、診断剤、化合物、又は組成物であってよい。親油性分子の限定されない例は、ルテインである。親油性分子は、リポソーム組成物の約０．００１重量％から１０重量％を占めていてよい。言い換えると、親油性分子は、リポソーム組成物の約ｂ．ｃｄｅ重量％からａｂ重量％を占めていてよく、ここで、ａは、０又は１であり、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択されるが、但し、ａが１である場合、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅのすべてが０であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅのすべてが０にはならない。
【０００９】
「リポソーム」の用語は、本明細書で用いられる場合、水性コンパートメントを封入している単一又は複数の同心脂質二重層を意味する。リポソームは、天然及び／又は合成脂質、並びに界面活性剤を含み得る。リポソームは、脂質膜に親油性分子をトラップする。本発明のこれらの球形状に近い脂質小胞のサイズは、５０から４５０ｎｍの範囲内であり得る。言い換えると、本発明のリポソームのサイズは、約ａｂｎｍから約ｃｄｅｎｍの範囲内であり、ここで、ａは、５、６、７、８、及び９から選択され、ｂは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択され、ｃは、０、１、２、３、及び４から選択され、ｄは、０、１、２、３、４、及び５から選択され、並びにｅは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、及び９から選択されるが、但し、ｃが４であり、ｄが５である場合、ｅは、０である。当然、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅのすべてが０ではあり得ない。
【００１０】
「脂質膜形成液」の用語は、本明細書で用いられる場合、乾燥後に膜を形成するいずれの脂質含有液体をも意味する。脂質膜形成液の限定されない例としては、レシチン及びリゾレシチンを含む可溶化リン脂質が挙げられる。
【００１１】
「溶媒」の用語は、本明細書で用いられる場合、親油性分子が可溶性であり、蒸発によって除去することのできる溶媒を意味する。溶媒の限定されない例は、クロロホルム、メタノール、及びテトラヒドロフランである。
【００１２】
「剛性改質剤」の用語は、本明細書で用いられる場合、本発明のリポソームの剛性を、したがって吸収プロファイルを改変する組成物を意味する。適切な剛性改質剤としては、高い融点を有する中鎖から長鎖脂肪酸基を有する脂肪が挙げられ、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リシノール酸、アラキジン酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、及びメリシン酸などである。剛性改質剤の限定されない例は、ベヘン酸グリセリルである。
【００１３】
例１
材料及び方法
材料及び試薬．  水素化ホスファチジルコリンを、Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨから入手し、ＦｌｏｒａＧＬＯ（登録商標）ルテインを、Ｋｅｍｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（デモイン、アイオワ州）から、及びベヘン酸グリセリルをＧａｔｔｅｆｏｓｓｅ（サンプリエスト、フランス）から入手した。ＣＷＳルテインは、ＤＳＭ（ヘールレン、オランダ）から、トリパンブルーは、Ｍｅｒｃｋ（ラーウェー、ニュージャージー州）から、ブリリアントブルーは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。すべての有機溶媒、クロロホルム、メタノール、及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）も、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、一方キニーネ−ＨＣｌは、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（グランドアイランド、ニューヨーク州）から購入した。細胞毒性実験に必要な試薬はすべて、Ｌｏｎｚａ（バーゼル、スイス）から入手した：ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、栄養混合Ｆ１２培地、熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ＰＢＳ Ｃａ２＋Ｍｇ２＋バッファー、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、及びストレプトマイシン。細胞増殖試薬ＷＳＴ−１は、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ペンツベルク、ドイツ）から購入した。
【００１４】
ＷＳルテイン：製剤開発．  ４リットルのリポソームを作製するために、水素化ホスファチジルコリン、ＦｌｏｒａＧＬＯ（登録商標）、及びベヘン酸グリセリル（表１）を、５００ｍＬのクロロホルム及びメタノール（２：１ 体積／体積）に、３０〜３５℃で加熱することによって溶解して、透明溶液を得た。溶媒を除去するために、この溶液を、Ｈｅｉｄｏｌｐｈロータリーエバポレーターにより、４０℃〜５０℃で真空乾燥し、１〜２時間後に、乾燥薄膜を得た。すべての微量溶媒を確実に除去するために、薄膜を、少なくとも１６時間、室温で真空下に置き、ガスクロマトグラフィを行って、いかなる残留物も、２５ｐｐｍ未満であることを確認した。そして、この膜を、蒸留水又はリン酸緩衝溶液を加えることにより、マグネティックスターラーで撹拌しながら、４０〜４５℃で少なくとも２〜３時間水和して、濁った分散体を得た。次に、この濁った分散体を、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘホモジナイザー（Ｉｋａ Ｗｏｒｋｓ）により、室温で３０分間にわたり、２０００〜４０００ｐｐｍでホモジナイズして、大きい小胞体が得られ、続いて大スケールのマイクロフルイダイザーを用い、５０〜６０℃及び１２００バールでの押出しによって、ナノサイズ範囲まで微細化した。このプロセスを少なくとも５回繰り返した。リン脂質ベヘネートの小ビーズを、１２１℃、１気圧で１５分間にわたるスチーム滅菌によって滅菌した。Hupfeld et alによる記載に従って（Hupfeld S, Holsaeter AM, Skar M, et al. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. 2006. J Nanosci Nanotechnol., 6(9-10):3025-3031)、動的光散乱（Ｎｉｃｏｍｐ ３８０ ＤＬＳ）によるリポソームサイズ分析を行った。
【００１５】
【表１】
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分散性及び沈澱形成の特定．  これらの特定は、経時での目視評価によって行った。
【００１６】
ＵＶ／可視スペクトル分析．  ルテインは、水に不溶性であることから、ルテインを可溶化するためにＴＨＦを用い、そのＵＶ／可視スペクトルを追跡した。簡潔に述べると、１ｍＬのサンプルを１０ｍＬのメスフラスコに移し、これを蒸留水で満たした。次に、５００μＬを２５ｍＬのメスフラスコに移し、ピペットチップをＴＨＦで洗浄してフラスコ中に洗い入れた。ＴＨＦで体積を２５ｍＬとし、ＴＨＦで予めブランク調整しておいたＵＶ／可視分光光度計で、３００から７５０ｎｍのスペクトルを追跡した。
【００１７】
細胞毒性実験．  ＷＳルテイン原材料の細胞毒性について、ヒト網膜色素上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞での比色分析によって評価した。細胞を、５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿雰囲気のインキュベーター中、３７℃で培養し、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（０．５ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１５ｍＭ），ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭの１：１混合物（体積：体積）中で増殖させた。細胞を適切な密度まで増殖させ、４８〜７２時間ごとに培地を入れ替えた。
【００１８】
染色剤の希釈は、網膜硝子体手術に典型的な体積に従って選択した：０．３ｍＬの染色剤が、硝子体腔（４ｍＬ）に注入され、手順の過程での液流量は８〜１０ｍＬ／分（特に、ＢＳＳ、リンゲル液、連続灌流）とされて、手術あたり６００ｍＬに達し（通常の６０分間の手術の場合）、これによって、希釈は、１／１５（染色剤注入時）、１／３０（ｔ＝約１分）、１／６０（ｔ＝約１．５分）、及び１／２０（ｔ＝約３分）となる。白内障手術の流量は、眼内で１２０ｍＬ／分の液量と推定され、網膜硝子体手術の場合よりも非常に高い希釈となる。
【００１９】
生体外での細胞毒性を試験するために、ＷＳＴ−１比色分析を、製造元の推奨事項に従って行った。
【００２０】
簡潔に述べると、ＡＰＲＥ−１９細胞を、９６ウェルプレートに１０〜１２×１０３細胞／ｃｍ２で播種した。１８〜２２時間の増殖後、複数の染色剤希釈物（１／１５、１／３０、１／６０、及び１／１２０）を、３０又は１２０分間にわたって細胞に適用した。インキュベーションの後、細胞を、ＰＢＳ Ｃａ２＋Ｍｇ２＋で３回洗浄し、次に、新しい培地＋２％ＦＢＳと共に一晩インキュベートした。細胞は、２４、４８、又は７２時間にわたって回復することができ、１０％ＷＳＴ−１試薬を含有する新しい培地を添加し、３時間のインキュベーション後、ＴＥＣＡＭ ２００リーダー（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯ）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定し、生細胞数と相関する代謝活性細胞のレベルに換算した。ポジティブコントロールとして、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いた。試験した濃度及び時間あたり、３つの独立した実験を３つの反復サンプルとして用いた。データは、Ｅｘｃｅｌ−Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅを用いて得られた平均±標準偏差（ＳＤ）として報告する。
【００２１】
Ｋｅｍｉｎ Ｐｈａｒｍａ染色剤：ＷＳルテインによる製剤開発．  ＷＳルテインを用いて、表２に従い、ブリリアントブルー（Ｒｅｔｉｄｙｎｅ（商標）の模擬として）、トリパンブルー（Ｐｈａｃｏｄｙｎｅ（商標）の模擬として）、及び両方の青色染色剤（Ｄｏｕｂｌｅｄｙｎｅ（商標）の模擬として）と共に染色剤を製剤した。色は、それぞれ、青色、緑色、及び緑がかった青色であった。
【００２２】
【表２】
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熱安定性実験．  室温及び５２℃での１及び６か月間におけるＷＳルテインの安定性について試験した。ＷＳＲｅｔｉｄｙｎｅ、ＷＳＰｈａｃｏｄｙｎｅ、及びＷＳＤｏｕｂｌｅｄｙｎｅ製剤を、室温で１ヶ月間における安定性について試験した。製剤を入れたバイアルはすべて透明であったが、遮光条件下で保存し、２つの反復サンプルで行った。
【００２３】
光安定性実験．  ＷＳルテイン単独の光安定性について実験した。さらに、ＷＳＤｏｕｂｌｅｄｙｎｅ及びＤｏｕｂｌｅｄｙｎｅ（商標）（表２に記載したように、ＣＷＳルテインで製剤）の光安定性を実験し、褐色及び透明のガラスバイアルで比較した。これらの試験では、代表数のサンプル（３）を選択して、光安定性チャンバー中で光に曝露するか、又は遮光条件に曝露した。
【００２４】
新規な薬物物質又は製品のための光安定性試験は、ＩＣＨ Ｑ１Ｂ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅに定められている。簡潔に述べると、サンプルは、バリデートされた光安定性チャンバー中で、数時間にわたって光源に曝される必要がある。この実験で用いた光安定性チャンバーは、これらの種類の実験に対して、Ａｕｔｏｒｉｄａｄｅ Ｎａｃｉｏｎａｌ ｄｏ Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｏ ｅ Ｐｒｏｄｕｔｏｓ ｄｅ Ｓａｕｄｅ Ｉ．Ｐ．（ＩＮＦＡＲＭＥＤ）によってバリデートされている。ＩＣＨ Ｑ１Ｂ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅによると、最小限の曝光を確認するために、サンプルは、バリデートされた化学光量測定システムと並べて曝光されるか、又はキャリブレート済みの放射計／照度計を用いて条件がモニタリングされた場合の適切な期間にわたって曝光される必要がある。キニーネ−ＨＣｌの２つの２％（重量／体積）溶液を、化学光量測定のコントロールとして用い、光又は遮光条件に、後者はアルミホイルで包むことで曝露した。この試験により、Ａｂｓ４００ｎｍを測定することによって、入射時間（incidence time）が何らかの考え得る分解を引き起こすのに充分であるかどうかを特定することが可能である。
【００２５】
染色剤サンプル及びキニーネ−ＨＣｌサンプルを、光安定性チャンバーに挿入し、ＵＶ及び可視光の同じ曝光条件を４８時間施した。次に、ＷＳルテイン又はＤｏｕｂｌｅｄｙｎｅ（ＣＷＳ又はＷＳ）サンプルを、定められたパラメーター：外観、色、ｐＨ、及び浸透圧により、考え得る製品分解について評価した。ＷＳＤｏｕｂｌｅｄｙｎｅ及びＤｏｕｂｌｅｄｙｎｅ（商標）については、ＵＶ−可視スペクトルの分析も分光光度計で行った。ｐＨ及び浸透圧は、ｐＨ計（Ｍｅｔｒｏｈｍ ７１３）及び浸透圧計（Ｋｎａｕｅｒ、ベルリン、ドイツ）を用いて評価した。試験サンプル及びコントロールサンプルにおけるｐＨ及び浸透圧の減衰を特定し、結果を、式１を用いてパーセントで表した。
【００２６】
減衰％＝１００−（Ｐサンプル×１００／Ｐコントロール）
式１．任意のパラメーター（Ｐ）の減衰パーセントの特定
ｐＨ及び浸透圧について式１によって得られた結果を、透明バイアル（サンプル）及び褐色バイアル（コントロール）で比較した（表５及び６）。加えて、曝光（サンプル）及び遮光（コントロール）での比較も、同じ種類のバイアルについて行った（表５及び６）。点眼用途に適合させるには、ｐＨは６．０〜７．４（すなわち、ｐＨ＝６．７±０．７又はｐＨ＝６．７±１０．４５％）の範囲内でなければならず、浸透圧は、２５０〜３８０ｍＯｓｍ／Ｌ（すなわち、浸透圧＝３１５±６５ｍＯｓｍ／Ｌ又は３１５±２０．６３％ｍＯｓｍ／Ｌ）の範囲内でなければならない。したがって、厳密な基準を確立するために、条件間での相違が１０％未満である場合に、結果を有効とした。さらなる詳細は、結果のセクションに記載する。
【００２７】
死体眼での実験．  ＷＳルテインに非常に類似したリポソーム製剤（１％リン脂質＋０．０５％ＦｌｏｒａＦＬＯ）を、Ｋｅｍｉｎ Ｐｈａｒｍａ製品のターゲットである眼内膜の染色におけるその効果について、死体眼で試験した。４つの死体眼を、これまでに報告されているように用い７（ＡＲＶＯの研究ガイドライン及びヘルシンキ宣言の原則に従う）、ＣＷＳルテインの代わりにこのリポソーム溶液で製剤したＲｅｔｉｄｙｎｅ及びＰｈａｃｏｄｙｎｅを試験した。染色強度を、表３からのグレードスケールを用い、熟練した外科医により、盲検実験で特定した。
【００２８】
【表３】
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結果
ＷＳルテイン製剤及び分析．  可溶性ルテインの新規な形態は、医薬製品、医療デバイス、及び他の薬物様製品で用いるための重要な進歩である。リン脂質剛性小ビーズ（水素化ホスファチジルコリン）、ＦｌｏｒａＧＬＯ（登録商標）ルテイン、及びベヘン酸グリセリルを含有する新規なルテイン原材料を、高品質グレードの原料のみを用いて製剤し、作製した。
【００２９】
リン脂質中にカプセル化されたルテインの量は、実際のＫｅｍｉｎ Ｐｈａｒｍａ製品に基づいて選択した。ＣＷＳルテインが、５％のＦｌｏｒａＧＬＯ（登録商標）を含有し、Ｋｅｍｉｎ Ｐｈａｒｍａの染色剤が、０．０５％から０．１％のルテインを含有することが分かっている。したがって、カプセル化するべきルテインの量は、０．１５％を選択し、したがって、同じルテイン含有量の製剤が作製されることとした。
【００３０】
すべての成分を有機溶媒中に溶解した後、これらの溶媒を除去し、乾燥薄膜を得た。次に、この膜を水和し、微細化し、滅菌した。
【００３１】
滅菌後、この製品は、透明の外観であり、明白な沈澱のない完全に分散された状態であった。次に、この原材料を、その溶解性について分析し（表４）、数日間の後、沈澱することなく、水への良好な分散性を有することが示された。さらに、１週間後に観察された沈澱の現象は、現行のＣＷＳルテインで見られるよりも目立ったものではなかった。まとめると、この新規な材料は、ＣＷＳルテインと比較した場合、溶解性は高く、沈澱の傾向は低く、分散性は高いことが示された。加えて、滅菌後の粒子サイズ分析から、ルテインの構造が維持され、サイズは２００〜８００ｎｍと推定されることが示された。浸透圧及びｐＨも、この製剤について特定し、薬局方記載の眼の生理学的パラメーターに従うものであった（ｐＨ＝７、浸透圧＝１７１〜１７１１）。ＵＶ／可視スペクトルの分析を行い、ルテインに特徴的である３つのピークが示された（図１）。
【００３２】
【表４】
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ＷＳルテインの安定性について、室温で１及び６ヶ月間にわたって実験し、結果を表５に示す。図１はさらに、１及び６か月後の平均ＵＶ／可視スペクトルを示す。５２℃での促進実験も、６ヶ月間にわたって行った（表６及び図２）。
【００３３】
新規なＷＳルテイン原材料は、室温での６ヶ月間の保存後に安定であることが示された（図１及び表５）。しかし、より高い温度（５２℃）では、ＵＶ／可視スペクトルにルテインのピークが見られず（図２）、変色も観察されたことから（表６）、不安定であることが認められた。
【００３４】
【表５】
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【００３５】
【表６】
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この製剤の光安定性も、透明及び褐色バイアル中で評価した。結果を表７及び８にまとめるが、ｐＨにおいても浸透圧においても、曝光及び遮光サンプルの間での著しい減衰は示されていない（＜１０％）。また、透明及び褐色バイアル間での差異も検出されなかった。これらの結果から、この新規な原材料が、曝光に対して安定であり、透明バイアル中に保存可能であることが実証される。
【００３６】
【表７】
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【００３７】
【表８】
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細胞毒性実験．  ＷＳルテイン（染色剤希釈物 １／１５、１／３０、１／６０、及び１／１２０）のＡＲＰＥ−１９細胞での細胞毒性を、ＷＳＴ−１比色分析を用い、４５０ｎｍでの吸光度を測定することによって生体外で評価した。図３及び４の結果は、コントロールと染色剤処理細胞との間で、細胞生存率に最小限の差異しか見られなかったことから、これらの染色剤希釈物による３０分間又は１２０分間のインキュベーション及び２４、４８、又は７２時間の細胞回復後において、この製剤に細胞毒性がないことを示している。
【００３８】
ＷＳルテインで製剤した染色剤の分析．  新規なＷＳルテイン原材料を用いて、Ｄｏｕｂｌｅｄｙｎｅ（商標）、Ｒｅｔｉｄｙｎｅ（商標）、及びＰｈａｃｏｄｙｎｅ（商標）を製剤した（表２参照）。これらの製剤を、その色、外観、ｐＨ、浸透圧、及びＵＶ／可視スペクトルについて分析した（表９）。さらに、室温で１ヶ月にわたる製剤の安定性についての実験も行い、結果は、これらの条件において安定であることを示している（表９及び図５）。
【００３９】
【表９】
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ＷＳルテインで製剤したＤｏｕｂｌｅｄｙｎｅの光安定性について実験し、Ｄｏｕｂｌｅｄｙｎｅ（商標）（ＣＷＳルテインによる）の光安定性と比較した。表１０及び１１は、透明及び褐色バイアルを比較した結果を示す。
【００４０】
【表１０】
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【００４１】
【表１１】
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ＣＷＳルテインで製剤したＫｅｍｉｎ Ｐｈａｒｍａ製品の品質を確認するために用いられる仕様では、ｐＨ及び浸透圧が、眼の生理学的パラメーターに完全に適合することを確保する必要がある。したがって、ｐＨは、６．０〜７．４（すなわち、ｐＨ＝６．７±０．７又はｐＨ＝６．７±１０．４５％）の範囲内でなければならず、浸透圧は、２５０〜３８０ｍＯｓｍ／Ｌ（すなわち、浸透圧＝３１５±６５ｍＯｓｍ／Ｌ又は３１５±２０．６３％ｍＯｓｍ／Ｌ）の範囲内でなければならない。
【００４２】
ｐＨ及び浸透圧は、点眼用のこれらの製剤の重要な特性であるが、４５２ｎｍでの吸光度は、ルテイン含有量に完全に依存していることから、ルテイン安定性に関連する最も重要なパラメーターである。ＣＷＳで製剤された市販のＤｏｕｂｌｅｄｙｎｅに対する仕様は、４５２ｎｍでの吸光度が、０．６３３〜０．８６１（すなわち、０．８６１±０．２２８又は０．８６１±２６．５０％）の範囲内でなければならないものと予測される。光安定性を評価するために、本発明者らは、ルテイン安定性を精密に評価していることを確実とするために、条件間の吸光度の変動１０％というより厳密な間隔を考慮した。
【００４３】
表１０及び１１にまとめた結果は、曝光透明バイアルを遮光透明バイアルと比較した場合のＣＷＳＤｏｕｂｌｅｄｙｎｅにおける４５２ｎｍでの吸光度でのみ、著しい減衰（＞１０％）が存在することを示している。表１１より、いずれのパラメーターにおいても著しい減衰が見られなかったことから、ＷＳＤｏｕｂｌｅｄｙｎｅは光安定性であると見なすことができる。
【００４４】
死体眼実験．  ＣＷＳルテインの代わりに、非常に類似するＷＳルテインリポソーム溶液で製剤したＲｅｔｉｄｙｎｅ及びＰｈａｃｏｄｙｎｅを、眼の膜及び構造の染色におけるその効果を特定する目的で、ヒトの死体眼で評価した。結果を表１２に挙げるが、ＩＬＭ染色に対してはＲｅｔｉｄｙｎｅの、前嚢染色（主要な標的構造）に対してはＰｈａｃｏｄｙｎｅの良好な染色能力が示される。
【００４５】
【表１２】
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考察
ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．から市販されているＣＷＳルテインの望ましくない挙動を有しない新規な水溶性ルテイン／ゼアキサンチンを開発することが求められている。現時点では、いくつかの染色剤が、この可溶性ＣＷＳルテインを用いて生産されている。残念なことに、この可溶性の形態は、溶解状態で１〜２日間の後に沈澱が見られたことから、経時で不安定であることが示され、さらに、主としてその非常に剛性のポリサッカリド様材料組成に起因して、ルテインの分散性にとっても有利ではなかった（Amar I, Abraham A and Garti N. Solubilization Patterns of Lutein and Lutein Esters in Food Grade Nonionic Microemulsions. 2003. J. Agric. Food Chem. 51:4775-4781）。加えて、ビタミン／栄養補助食品／医療デバイス製品の製造業者は、ルテインの変換に用いることのできる原料に対して大きな制限を課している広範囲の打錠圧力及び滅菌プロトコルに耐えることのできる材料を必要としている。用いられる新規な方法は、この分子を確実に放出する必要があることから、これらの同じ制限が、ルテインのバイオアベイラビリティにおいても非常に重要な役割を担うものと考えられる。
【００４６】
したがって、沈澱を起こさず、ルテインにバイオアベイラビリティを与え、スチーム滅菌に対する耐性を有する水に可溶性である新規な原材料の開発が必要とされている。このことは、専売染色剤（proprietary dyes）に対してだけではなく、錠剤製品、医療デバイス、及び食品関連製品の生産業者すべてにとっても利点となる。
【００４７】
本文書は、これらの目的を達成し、安定で水に可溶性であることが示されたリポソームルテイン（２００〜８００ｎｍ）であるＷＳルテインを作製するために開発された製剤及び作製方法について記載するものである。さらに、沈澱の現象も、ＣＷＳルテインで見られるほど目立ったものではない。リン脂質、ベヘン酸グリセリル、及び親油性環境の存在により、眼、鼻、又は皮膚の構造中へのルテインの送達が促進され、経口で用いる場合、ルテインの良好な分散性及び非常により良好な吸収が可能となる。さらに、５０℃よりも高い融点を有するベヘン酸グリセリルの存在が、最終構造の剛性の改変を、したがって、吸収プロファイルの改変をもたらす可能性を有している。
【００４８】
ＷＳルテインの染色剤製剤（トリパンブルー及び／又はブリリアントブルーと組み合わせた）による予備試験では、これらの染色剤は、ＷＳルテインと同様に、オートクレーブ処理を通して、及び室温で１ヶ月間後において、安定であることを示した。また、ＷＳルテイン原材料は、室温で６ヶ月間にわたって安定であることも示した。ＩＣＨガイドラインに従うさらに長い安定性の実験を行う予定であり、それは、この原材料の安定性プロファイルのより良好な理解に寄与することになる。曝光に対する感受性は、ＣＷＳルテインの別の所望されない特性である。光安定性実験において、ＷＳルテイン（及びＷＳルテインで製剤した染色剤）は、光安定性であることが示され、この特性も、この原材料のより高い品質を支持するものである。医薬産業における別の重要な課題は、用いられる材料の安全性であるが、ＷＳルテインは、網膜細胞株において細胞毒性を示さず、この新規な原材料の利点がそれによって強化される。
【００４９】
したがって、ＷＳルテインは、その化粧品産業での使用に加えて、咀嚼錠、飲料の栄養強化、発泡錠、素錠、栄養バー、及び機能性食品における多大な可能性を有する医薬製品、医療デバイス、及び栄養補助食品の産業での使用が提案される。
【００５０】
この製品に対するさらなる安定性実験が行われており、並行して、承認を得ることができるように、ＷＳルテインで製剤した染色剤による安全性実験の評価も行われている（細胞毒性、感作性及び刺激性試験、並びに生体内での効果）。
【００５１】
上記の記述及び図面は、本発明の例示的な実施形態を含む。上記の実施形態及び本明細書で述べる方法は、当業者の能力、経験、及び選好に基づいて変動し得る。特定の順序での方法の工程の単なる列挙は、方法の工程の順序に対するいかなる制限をも成すものではない。上記の記述及び図面は、単に本発明を説明し、例示するものであり、本発明はそれに限定されないが、但し、請求項がそのように限定される場合はその限りではない。本開示を前にする当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、それに改変及び変更を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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