(57)【要約】  本開示は、所定の３次元形状に折り畳まれるように構成された生体組織を生成するための方法およびシステムを提供する。本開示は、生体組織を３次元形状に折り畳むための収縮性細胞を利用する。この方法は、収縮性細胞によって作動する線維を含む表面上に収縮性細胞のパターンを配置することと、線維上の収縮性細胞の作動により表面を折り畳むことを含む。本開示の方法およびシステムを使用して生成された組織も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を作製する方法であって、
基質の表面上に収縮性細胞をパターン化することであって、
基質の表面上に核酸のパターンを配置する工程と、
ハイブリッド形成条件下で前記パターン化された核酸を前記収縮性細胞の懸濁液と接触させる工程であって、前記収縮性細胞が、前記パターン化された核酸と相補的な細胞表面付着核酸を含み、前記細胞表面付着核酸が、前記基質の前記表面上にパターン化された収縮性細胞を生成するよう前記パターン化された核酸とハイブリッド形成する、接触させる工程とを含む、パターン化すること、
前記基質の前記表面上の前記パターン化された収縮性細胞を、線維を含むポリマーマトリックスと接触させ、それにより、前記パターン化された収縮性細胞を前記ポリマーマトリックス中に包埋することと、
前記基質の前記表面から前記ポリマーマトリックスを取り出すことであって、取り出しの際に前記パターン化された収縮性細胞が前記ポリマーマトリックス中に保持され、それにより、３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を生成する、取り出すこと、
前記平面状生体組織を培地と接触させること、および
前記平面状生体組織を３次元形状に折り畳むために、前記線維上での前記収縮性細胞の動作に十分な時間、前記培地中で懸濁して前記平面状生体組織をインキュベートすることと
を含む方法。
【請求項２】
前記基質の表面上で収縮性細胞をパターン化することが、
第１の基質の第１の表面および第２の基質の第１の表面の上に核酸のパターンを配置することであって、前記第１の基質の前記第１の表面が、前記第１の基質と前記第２の基質との間にある間隙を介して、前記第２の基質の前記第１の表面から離間しており、前記表面が互いに向かい合っている構成である、配置することと、
ハイブリッド形成条件下で前記パターン化された核酸を前記収縮性細胞の懸濁液と接触させることであって、前記収縮性細胞が、前記パターン化された核酸と相補的な細胞表面付着核酸を含み、前記細胞表面付着核酸が、前記第１の基質の前記第１の表面および前記第２の基質の前記第１の表面の上にパターン化された収縮性細胞を生成するよう前記パターン化された核酸とハイブリッド形成する、接触させることとを含み、
前記ポリマーマトリックスを取り出すことが、前記第１の基質と前記第２の基質との間から前記ポリマーマトリックスを取り出し、それにより、平面状生体組織の上面および底面に前記パターン化された収縮性細胞を含む前記平面状生体組織を生成することと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記平面状生体組織が、ポリマーマトリックスおよび細胞のパターンを含有する領域と、細胞が存在しないポリマーマトリックスを含有する領域とを含み、３次元形状へと前記組織を折り畳むために懸濁状態にある前記平面状生体組織をインキュベートすることが、前記ポリマーマトリックスおよび細胞のパターンを含有する領域を、前記細胞が存在しないポリマーマトリックスを含有する領域から分離することと、前記ポリマーマトリックスおよび細胞のパターンを含有する領域をインキュベートすることとを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸のパターンが２次元である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記３次元形状にある前記ポリマーマトリックスを可溶化して、線維と収縮性細胞とを含む３次元形状を得ることをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸のパターンが、同じヌクレオチド配列を有する核酸の単一の集団を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸のパターンが核酸の２つ以上の集団を含み、核酸の各集団が独自のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸のパターンが核酸の２つ以上の集団を含み、核酸の各集団が独自のヌクレオチド配列を含み、各集団の前記核酸が前記基質の前記表面上で独自にアドレス指定可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸のパターンが核酸の２つ以上の集団を含み、核酸の各集団が独自のヌクレオチド配列を含み、各集団の前記核酸が前記第１および／または第２の基質の第１の表面上で独自にアドレス指定可能である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記収縮性細胞の懸濁液が、収縮性細胞の２つ以上の独自の集団を含み、収縮性細胞の各集団が、前記パターンにおける核酸の前記集団の１つと相補的な表面付着核酸を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記収縮性細胞が、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑細胞、心臓細胞、これらの前駆体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記配置することが、前記核酸を含む液体を前記基質上にプリントすることを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞表面付着核酸が、核酸に付着した脂質部分を含み、前記表面付着核酸が、前記収縮性細胞の細胞膜への前記脂質部分の挿入によって前記収縮性細胞に付着する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞表面付着核酸が、前記脂質部分と前記核酸の間にスペーサーを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記基質の前記表面から前記ポリマーマトリックスを取り出すことが、前記ポリマーマトリックスをヌクレアーゼへ曝露することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーマトリックスが、ヒドロゲル、アルギン酸塩、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ゼラチン、アガロース、またはセルロースポリマーを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記線維が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に提供される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＥＣＭが合成であるか、または生物源から得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＣＭが細胞株によって分泌される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記線維がコラーゲンを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記コラーゲンが合成物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を作製する方法であって、
基質上に、線維を含むポリマー層を配置することと、
収縮性細胞が前記ポリマー層上に互いに離間して配置されるように、前記収縮性細胞を前記ポリマー層上にパターン化することと、
前記ポリマー層への収縮性細胞の付着を可能にするのに十分な条件下で前記収縮性細胞を前記ポリマー層上でインキュベートし、それにより、前記ポリマー層中の前記線維上の前記収縮性細胞の動作により３次元形状に折り畳まれるように構成された生体組織を生成することとを含む方法。
【請求項２３】
前記収縮性細胞が前記ポリマー層の第１の表面上にパターン化され、前記方法が、前記ポリマー層の第２の表面上に収縮性細胞をパターン化することをさらに含み、前記第２の表面が前記第１の表面と反対側にあり、前記収縮性細胞が、前記ポリマー層の上で互いに離間した様式で配置される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の表面上の収縮性細胞の前記パターンが、前記第２の表面上の収縮性細胞の前記パターンに関してオフセットされている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の表面上の前記収縮性細胞が円形にパターン化され、前記第２の表面上の前記収縮性細胞が、前記円形よりも直径の大きな環にパターン化される、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記パターン化することが、前記収縮性細胞を前記ポリマー層上に離間した様式でプリントすることを含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記パターン化することが、前記収縮性細胞を前記ポリマー層上に離間した様式で、マイクロピペットで置くことを含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記生体組織を懸濁状態の培地中でインキュベートすることと、前記平面状生体組織を３次元形状に折り畳むことと、をさらに含む、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記パターン化することが、単一のタイプの収縮性細胞を含む収縮性細胞の集団を配置することを含む、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記パターン化することが、２つ以上のタイプの収縮性細胞を含む収縮性細胞の集団を配置することを含む、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記パターン化することが、第１のタイプの収縮性細胞の集団を第１のパターンで、そして第２のタイプの収縮性細胞の集団を第２のパターンで配置することを含む、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記収縮性細胞が、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑細胞、心臓細胞、これらの前駆体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリマー層が、ヒドロゲル、アルギン酸塩、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ゼラチン、アガロース、またはセルロースポリマーを含む、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記線維がコラーゲンまたはフィブロネクチンを含む、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記コラーゲンが合成物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
所定の形状に折り畳まれるように構成された３次元（３Ｄ）組織を生成する方法であって、
収縮性細胞と線維との混合物を基質上に配置して、前記収縮性細胞および線維を含む３Ｄ構造を形成することと、
前記３Ｄ構造を所定の形状に折り畳むための細胞培養条件下で、培地中で前記３Ｄ構造をインキュベートすることと、を含む、方法。
【請求項３７】
前記インキュベートすることの前に前記構造上に線維の溶液を配置することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記インキュベートすることの前に、前記収縮性細胞と線維との混合物および／または線維の溶液を前記構造上に配置することを反復することを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記インキュベートすることの前に前記基質から前記構造を取り出すことを含む、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記配置することが、プリントすることを含む、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記配置することが、３Ｄプリントすることを含む、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記配置することが、押出し加工を含む、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記線維がコラーゲンまたはフィブロネクチンを含む、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記収縮性細胞が、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑細胞、心臓細胞、これらの前駆体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を生成するためのシステムであって、
基質の表面上にパターンで配置された核酸集団と、
前記核酸集団と相補的な細胞表面付着核酸を含む収縮性細胞の集団であって、前記細胞集団が、前記核酸集団への前記表面付着核酸のハイブリダイゼーションによって前記核酸集団に付着している、集団と、
線維を含むポリマーマトリックスと、を含む、システム。
【請求項４６】
第２の基質から離間した第１の基質を含み、前記第１の基質の第１の表面が、前記第２の基質の第１の表面と対向する構成にあり、
核酸の集団が、前記第１の基質および第２の基質の前記第１の表面の上にパターンで配置される、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を生成するためのシステムであって、
線維を含む層を含むポリマー層であって、前記線維が前記ポリマー層の表面上に配置される、ポリマー層と、
収縮性細胞の集団と、を含む、システム。
【請求項４８】
３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を生成するためのシステムであって、
前記ポリマー層の上面および底面に配置された線維を含む層を含むポリマー層と、
収縮性細胞の集団と、を含む、システム。
【請求項４９】
前記収縮性細胞の集団が、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑細胞、心臓細胞、これらの前駆体およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞タイプを含む、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５０】
前記ポリマーが、ヒドロゲル、アルギン酸塩、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ゼラチン、アガロースまたはセルロースポリマーを含む、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５１】
前記線維が細胞外マトリックス中に提供される、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５２】
前記線維がコラーゲンを含む、請求項４５〜５１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５３】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法によって得られる生体組織。
【請求項５４】
請求項２１〜３５のいずれか１項に記載の方法によって得られる生体組織。
【請求項５５】
請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の方法によって得られる生体組織。
【請求項５６】
収縮性細胞の所定のパターンを含む操作された３次元（３Ｄ）生体組織であって、前記収縮性細胞の所定のパターンが前記３Ｄ生体組織の前記形状を決定する、３Ｄ生体組織。
【請求項５７】
生体組織が１種類の収縮性細胞のみからなる、請求項５６に記載の生体組織。
【請求項５８】
生体組織が２種類の収縮性細胞のみからなる、請求項５６に記載の生体組織。
【請求項５９】
前記収縮性細胞が、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑細胞、心臓細胞、これらの前駆体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の生体組織。
【請求項６０】
前記１種類の収縮性細胞が線維芽細胞を含む、請求項５７に記載の生体組織。
【請求項６１】
前記２種類の収縮性細胞が、線維芽細胞と上皮細胞とを含む、請求項５８に記載の生体組織。
【請求項６２】
生体組織の前記パターンが、収縮性細胞の離間したクラスターを含み、収縮性細胞の前記クラスターの前記間隔が所定である、請求項５６〜６１のいずれか１項に記載の生体組織。
【請求項６３】
各クラスターが５〜１００個の収縮性細胞を含む、請求項６２に記載の生体組織。
【請求項６４】
各クラスターが５〜５０個の収縮性細胞を含む、請求項６２に記載の生体組織。
【請求項６５】
各クラスターが５〜１０個の収縮性細胞を含む、請求項６２に記載の生体組織。
【請求項６６】
所定の濃度の線維を含む、請求項５６〜６５のいずれか１項に記載の生体組織。
【請求項６７】
前記生体組織が、血球、脂肪細胞、および神経細胞のうちの１つ以上を欠いている、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載の生体組織。
【請求項６８】
前記生体組織が、赤血球および免疫細胞のうちの１つ以上を欠いている、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載の生体組織。
【請求項６９】
前記平面状生体組織を培地と接触させることが、前記平面状生体組織の一部を拘束するステップを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記平面状生体組織の一部を拘束することが、前記平面状生体組織の前記一部を、付着状態にある前記一部を拘束する固体支持体へ付着させ、それにより、前記線維上の前記収縮性細胞の動作の際に前記一部が折り畳まれることを防止することを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記平面状生体組織の一部を拘束することが、前記一部に圧縮力を適用することを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記圧縮力が、前記平面状生体組織の前記一部における収縮によって生成される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記平面状生体組織の前記一部における前記収縮が、前記平面状生体組織を前記培地と接触する際に前記一部の体積を減少させる薬剤の組み込みによって生成される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記圧縮力が、前記一部への圧力の適用によって生成される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記平面状生体組織を培地と接触させることが、前記平面状生体組織の一部を膨張させ、それにより、前記一部における前記収縮性細胞を分離し、および／または前記膨張した一部が折り畳まれるのを防止するよう、前記一部の中に存在する線維の量を希釈するステップを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記方法が、生体組織の一部を拘束しながら培地中で前記生体組織をインキュベートすることを含む、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記生体組織の一部を拘束することが、前記生体組織の前記一部を、付着した状態にある前記一部を拘束する固相支持体に付着させ、それにより、前記線維上での前記収縮性細胞の動作の際に前記一部が折り畳まれることを防止することを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記生体組織の一部を拘束することが、前記一部に圧縮力を適用することを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記圧縮力が、前記生体組織の前記一部における収縮によって生成される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記生体組織の前記一部における前記収縮が、前記生体組織を前記培地と接触する際に、前記一部の体積を減少させる薬剤の組み込みによって生成される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記圧縮力が、前記一部への圧力の適用によって生成される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記方法が、前記平面状生体組織の一部を膨張させながら培地中で前記生体組織をインキュベートし、それにより、前記一部の中にある前記収縮性細胞を分離すること、および／または前記膨張した一部が折り畳まれるのを防止するよう、前記一部の中に存在する線維の前記量を希釈することを含む、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記３Ｄ構造を培地中でインキュベートすることが、前記３Ｄ構造を所定の形状に折り畳む間、前記３Ｄ構造の一部を拘束するステップを含む、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記３Ｄ構造の一部を拘束することが、付着した状態にある前記一部を拘束する固体支持体に前記一部を付着させ、それにより前記一部が前記線維上の前記収縮性細胞の動作の際に折り畳まれるのを防止することを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記３Ｄ構造の一部を拘束することが、前記一部へ圧縮力を適用することを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記圧縮力が、前記３Ｄ構造の前記一部における収縮によって生成される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記３Ｄ構造の前記一部における前記収縮が、前記生体組織を前記培地と接触させる際に前記一部の体積を減少させる前記一部における薬剤の組み込みによって生成される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記圧縮力が、前記一部への圧力の適用によって生成される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記方法が、前記３Ｄ構造の一部を膨張させながら、培地中で前記３Ｄ構造をインキュベートし、それにより、前記膨張した一部が折り畳まれるのを防止するよう、前記一部における前記収縮性細胞を分離すること、および／または前記一部の中に存在する線維の前記量を希釈することを含む、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
生体組織は、細胞の層および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を特徴とする。層間の界面はしばしば、乳房の腺房、大脳皮質の襞、真皮の表皮接合部、ならびに腸の陰窩および絨毛のようなより複雑な形状に折り畳まれる。３次元形状に折り畳むことができ、組織のインビトロでの折り畳みのモデルとして役立ち得る、組織をインビトロで生成することには、かなりの関心が寄せられている。
【発明の概要】
【０００２】
本開示は、組織内の収縮性細胞の配置に基づいて３次元形状に折り畳まれるよう構成された組織を生成するための方法およびシステムを提供する。組織内の収縮性細胞の配置は、組織が折り畳まれる３次元形状を決定する。このようなものとして、いくつかの実施形態において、本明細書で教示される方法およびシステムによって生成された組織は、組織内に存在する収縮性細胞のパターンによって指定された所定の３Ｄ形状に折り畳まれる。
【０００３】
本開示の方法は、収縮性細胞が作用する線維と一緒に収縮性細胞のパターンを配置し、それにより得られた組織を３Ｄ形状に折り畳むことを可能にすることを含む。
【０００４】
ある特定の態様において、本明細書に開示される方法は、線維マトリックス（例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ））を含む層の上に収縮性細胞のパターンを配置することと、ＥＣＭ中に存在する線維の上にある収縮性細胞の作用によって層のを折り畳むことを含む。
【０００５】
現に開示されている方法は、線維マトリックス内に配置された収縮性細胞のパターンを含む３次元組織を生成することも含む。いくつかの実施形態において、３次元組織は、線維マトリックス内の収縮性細胞の配置に基づいて種々の形状に折り畳まれる。
【０００６】
本明細書で開示される方法およびシステムを使用して生成された３Ｄ組織も提供される。
【０００７】
ある特定の態様において、３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を作製する方法は、基質の表面上に収縮性細胞をパターン化することであって、基質の表面上に核酸のパターンを配置する工程と、パターン化された核酸をハイブリッド形成条件下で収縮性細胞の懸濁液と接触させる工程であって、収縮性細胞が、パターン化された核酸と相補的な細胞表面付着核酸を含み、細胞表面付着核酸が、基質の表面上にパターン化された収縮性細胞を生成するようパターン化された核酸とハイブリッド形成する、接触させる工程とを含む、パターン化することと、基質の表面上にあるパターン化された収縮性細胞を、線維を含むポリマーマトリックスと接触させ、それにより、パターン化された収縮性細胞をポリマーマトリックスへと包埋することと、ポリマーマトリックスを基質の表面から取り出すことであって、パターン化された収縮細胞が取り出しの際にポリマーマトリックス中に保持され、それにより３次元形状に折り畳まれるよう構成された平面状生体組織を生成する、取り出すことと、平面状生体組織を培地と接触させることと、３次元形状へと組織を折り畳むために線維上の収縮性細胞の動作に十分な時間、培地中で懸濁状態にある平面状生体組織をインキュベートすることと、を含む。
【０００８】
ある特定の態様において、基質の表面上で収縮性細胞をパターン化することは、第１の基質の第１の表面および第２の基質の第１の表面の上に核酸のパターンを配置することと、第１の基質の第１の表面が、第１の基質と第２の基質との間の間隙を介して第２の基質の第１の表面から離間しており、これらの表面が互いに対面する配置にある。パターン化された核酸をハイブリッド条件下で収縮性細胞の懸濁液と接触させることであって、収縮性細胞が、パターン化された核酸と相補的な細胞表面付着核酸を含み、細胞表面付着核酸が、パターン化された核酸とハイブリッド形成して、第１の基質の第１の表面および第２の基質の第１の表面の上にパターン化された収縮性細胞を生成する、接触させることと、を含み、ポリマーマトリックスを取り出すことは、第１の基質と第２の基質との間からポリマーマトリックスを取り出すことを含み、それにより、平面状生体組織の上面および底面にパターン化された収縮性細胞を含む平面状生体組織を生成する。
【０００９】
ある特定の実施形態において、平面状生体組織は、ポリマーマトリックスおよび細胞のパターンを含有する領域と、細胞を欠くポリマーマトリックスを含有する領域と、を含み得、そして組織を３次元形状に折り畳むために懸濁状態にある平面状生体組織をインキュベートすることは、ポリマーマトリックスおよび細胞のパターンを含有する領域を、細胞を欠くポリマーマトリックスを含有する領域から分離することと、ポリマーマトリックスおよび細胞のパターンを含有する領域をインキュベートすることと、を含む。
【００１０】
ある特定の実施形態において、核酸のパターンは２次元である。ある特定の実施形態において、この方法は、３次元形状にあるポリマーマトリックスを可溶化して、線維と収縮性細胞とを含む３次元形状を得ることを含む。
【００１１】
ある特定の実施形態において、核酸のパターンは、同じヌクレオチド配列を有する核酸の単一の集団を含み得る。ある特定の実施形態において、核酸のパターンは核酸の２つ以上の集団を含み、核酸の各集団は独自のヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、核酸のパターンは核酸の２つ以上の集団を含み、核酸の各集団は独自のヌクレオチド配列を含み、各集団の核酸は基質の表面上で独自にアドレス指定可能である。ある特定の実施形態において、核酸のパターンは核酸の２つ以上の集団を含み、核酸の各集団は独自のヌクレオチド配列を含み、各集団の核酸は第１および／または第２の基質の第１の表面上で独自にアドレス指定可能である。ある特定の実施形態において、収縮性細胞の懸濁液は、収縮性細胞の２つ以上の独自の集団を含み、収縮性細胞の各集団は、パターン中の核酸の集団の１つに相補的な表面付着核酸を含む。
【００１２】
ある特定の場合において、配置することは、核酸を含む液体を基質上にプリントすることを含む。ある特定の場合において、細胞表面付着核酸は、核酸に付着した脂質部分を含み、この表面付着核酸は、収縮性細胞の細胞膜への脂質部分の挿入によって収縮性細胞へ付着する。ある特定の場合において、細胞表面付着核酸は、脂質部分と核酸との間にスペーサーを含む。いくつかの場合において、基質の表面からポリマーマトリックスを取り出すことは、ポリマーマトリックスをヌクレアーゼに曝露することを含む。
【００１３】
いくつかの態様において、線維は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に提供される。いくつかの実施形態において、ＥＣＭは合成物であるか、または生物源から得られる。いくつかの態様において、ＥＣＭは細胞株によって分泌される。いくつかの態様において、線維はコラーゲンを含む。いくつかの場合、コラーゲンは合成物である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を作製する方法は、基質上に線維を含むポリマー層を配置することと、収縮性細胞がポリマー層上で互いに離間した様式で配置されるように、収縮性細胞をポリマー層上にパターン化することと、ポリマー層への収縮性細胞の付着を可能にするのに十分な条件下で収縮性細胞をポリマー層上でインキュベートし、それにより、ポリマー層内の線維上の収縮性細胞の動作により３次元形状に折り畳まれるように構成された生体組織を生成することと、を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、収縮性細胞はポリマー層の第１の表面上にパターン化され、方法は、収縮性細胞をポリマー層の第２の表面上にパターン化することをさらに含み、第２の表面は、第１の表面と向かい合っており、収縮性細胞は、ポリマー層の上で互いに離間した様式で配置される。ある特定の実施形態において、第１の表面上の収縮性細胞のパターンは、第２の表面上の収縮性細胞のパターンに関してオフセットされてうる。ある特定の実施形態において、第１の表面上の収縮性細胞は、円形にパターン化され、第２の表面上の収縮性細胞は、円形よりも直径の大きな環にパターン化される。
【００１６】
ある特定の実施形態において、第１の表面上にパターン化された収縮性細胞の数および第１の表面と向かい合った第２の表面上にパターン化された収縮性細胞の数は、細胞の数が０．７５：１〜１：０．７５を有し得るなど、同様であり得る。例えば、第１の表面上にパターン化された収縮性細胞の数および第２の表面上にパターン化された収縮性細胞の数は、０．７５：１、０．８０：１、０．９：１、１：１、１：０．９、１：０．８、または１：０．７５である。
【００１７】
いくつかの場合において、パターン化することは、収縮性細胞をポリマー層上に離間した様式でプリントすることを含む。いくつかの場合において、パターン化することは、収縮性細胞をポリマー層上に離間した様式で、マイクロピペットで置くことを含む。
【００１８】
いくつかの場合において、この方法は、懸濁状態にある培地中の生体組織をインキュベートすることと、平面状生体組織を３次元形状に折り畳むことと、を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態において、パターン化することは、単一の種類の収縮性細胞を含む収縮性細胞の集団を配置することを含む。いくつかの場合において、パターン化することは、２種類以上の収縮性細胞を含む収縮性細胞の集団を配置することを含む。他の場合において、パターン化することは、第１のパターンの第１の種類の収縮性細胞の集団および第２のパターンの第２の種類の収縮性細胞の集団を配置することを含む。
【００２０】
別の態様において、所定の形状に折り畳まれるように構成された３次元（３Ｄ）組織を生成する方法が開示される。ある特定の場合において、この方法は、収縮性細胞と線維とを含む３Ｄ構造を形成するよう、収縮性細胞と線維との混合物を基質上に配置することと、この構造を所定の形状に折り畳むための細胞培養条件下で、培地中でこの構造をインキュベートすることと、を含む。
【００２１】
いくつかの場合において、この方法は、インキュベートする前にその構造上に線維溶液を配置することを含む。いくつかの態様において、この方法は、インキュベートする前に、収縮性細胞と線維との混合物ならびに／または線維溶液を構造上に配置することを繰り返すことを含む。いくつかの態様において、この方法は、インキュベートする前に基質から構造を取り出すことを含む。ある特定の場合において、配置することは、プリントすること、例えば３Ｄプリントすることを含む。ある特定の場合において、配置することは押出し加工を含む。
【００２２】
３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を生成するためのシステムも提供される。いくつかの場合において、システムは、基質の表面上のパターンに配置された核酸の集団と、核酸の集団に相補的な細胞表面付着核酸を含む収縮性細胞の集団であって、細胞の集団が、核酸の集団に対する表面付着核酸のハイブリッド形成によって核酸集団へ付着する集団と、線維を含むポリマーマトリックスと、を含む。
【００２３】
いくつかの場合において、第１の基質は第２の基質から離間しており、第１の基質の第１の表面は、第２の基質の第１の表面と対面する形状であり、核酸の集団は第１および第２の基質の第１の表面上にあるパターンに配置される。
【００２４】
別の態様において、３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を生成するためのシステムであって、ポリマー層の表面上に配置された線維を含む層を含むポリマー層と、収縮性細胞の集団と、を含む、システム。
【００２５】
別の態様において、３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を生成するためのシステムは、ポリマー層の上面および底面に配置された線維を含む層を含むポリマー層と、収縮性細胞の集団と、を含む。ある特定の実施形態において、線維は細胞外マトリックス中に提供される。
【００２６】
収縮性細胞の所定のパターンを含む操作された３次元（３Ｄ）生体組織であって、収縮性細胞の所定のパターンが３Ｄ生体組織の形状を決定する、３Ｄ生体組織も開示される。ある特定の場合において、生体組織は収縮性細胞を１種類のみ含む。ある特定の場合において、生体組織は収縮性細胞を２種類のみ含む。ある特定の実施形態において、１種類の収縮性細胞は線維芽細胞を含む。ある特定の実施形態において、２種類の収縮性細胞は、線維芽細胞と上皮細胞とを含む。ある特定の場合において、生体組織のパターンは、収縮性細胞の離間したクラスターを含む。いくつかの実施形態において、各クラスターは、５〜１００個の収縮性細胞を含む。いくつかの例において、各クラスターは５〜５０個の収縮性細胞を含む。さらに他の態様において、各クラスターは５〜１０個の収縮性細胞を含む。いくつかの場合において、生体組織は、所定の濃度の線維を含む。いくつかの実施形態において、生体組織は、血球、脂肪細胞、および神経細胞のうちの１つ以上を欠いている。ある特定の実施形態において、生体組織は、赤血球および免疫細胞のうちの１つ以上を欠いている。
【００２７】
いくつかの態様において、収縮性細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑細胞、心臓細胞、それらの前駆細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２８】
いくつかの態様において、ポリマーマトリックスは、ヒドロゲル、アルギン酸塩、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ゼラチン、アガロース、またはセルロースポリマーであり得る。いくつかの場合において、線維はコラーゲンまたはフィブロネクチンを含む。コラーゲンは、合成物であり得るか、または生物源から得られ得る。
【００２９】
ある特定の場合において、本明細書に開示された方法を使用して生成された生体組織は、生体組織の一部が折り畳まれないように生体組織の一部を拘束することによって所定の形状に折り畳まれるように誘導され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】平面曲率およびその測定結果を示す概略図である。
【図２】平面形状と対比した３次元形状における湾曲を示す概略図である。
【図３】整列したコラーゲンの領域に張力がかかっていることを示す。ストラップが形成された後の組織対間のゲルのレーザー微細切除により、ストラップに直交する領域の収縮および組織から離間した対照領域との比較で、ゲルの表面の収縮距離が有意に高かった。
【図４．１】間充織凝縮力学による組織の折り畳みの再構成を示す。
【図４．２】同上。
【図４．３】同上。
【図５．１】再構成された系が予測可能な軌道に沿って間充織の凝縮および折り畳みのサインを呈することを示す。
【図５．２】同上。
【図５．３】同上。
【図５．４】同上。
【図５．５】同上。
【図６．１】組織界面のＥＣＭ張力が、層力学の相違に依存して陥入または膨出につながることを示す。
【図６．２】同上。
【図７．１】細胞のＤＮＡプログラムされた集合体（ＤＰＡＣ）の微量流体集積による再構成組織作製を示す。
【図７．２】同上。
【図８】非接触細胞プリントによる再構成組織作製を示す。
【図９．１】細胞クラスターが、細胞タイプに依存する速度でコラーゲンを放射状に整列させる等方性牽引源であることを示す。
【図９．２】同上。
【図１０．１】細胞クラスター対が、数百ミクロンの距離にわたって細胞クラスター対間でのコラーゲン線維の整列を増幅することを示す。
【図１０．２】同上。
【図１１．１】再構成された組織の湾曲速度は、作動する細胞がゲルを歪ませる速度によって決定されることを示す。
【図１１．２】同上。
【図１２．１】等方性再構成組織が単調な湾曲軌道に従うことを示す。
【図１２．２】同上。
【図１３】アクチュエータ細胞を切除した後に部分的にしか展開しない再構成組織を示す。
【図１４．１】収縮性クラスターの移動によって異方性の折り畳みの忠実度が制限されることを示す。
【図１４．２】同上。
【図１４．３】同上。
【図１５．１】間充織凝縮が組織界面を多様な３Ｄ形状に整えるのに十分であることを示す。
【図１５．２】同上。
【図１５．３】同上。
【図１５．４】同上。
【図１６．１】カール状、管状、波状に再構成された組織についての断面解析を示す。
【図１６．２】同上。
【図１７．１】二重キャップ、球状、立方状、三浦状に再構成された組織の断面解析を示す。
【図１７．２】同上。
【図１８】再構成された組織の向かい合っている折り畳みが、ポップスルー欠陥に対して頑強であることを示す。
【図１９．１】間充織凝縮により駆動される組織折り畳みが、複雑な折り畳みの近くの複数の細胞タイプの同時自己集合に対して頑強であることを示す。
【図１９．２】同上。
【図１９．３】同上。
【図２０】パッセンジャーＨＵＶＥＣが新生の折り畳みに沿って偏った運動性を呈することを示す。
【図２１】（腸絨毛およびニワトリ皮膚芽における）生物学的湾曲部位におけるインビボでの間充織細胞の凝縮が、本明細書で提供される再構成組織モデルにおいて生成されたのと類似のコラーゲン１型の圧縮および整列と関係していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、３次元形状に折り畳まれるように構成された組織を生成するための方法およびシステムを提供する。本開示は、組織を３次元形状に折り畳むために収縮性細胞を利用する。この方法は、収縮性細胞が作用する線維のマトリックスと連動した収縮性細胞のパターンを配置して、組織を生成することと、線維上の収縮性細胞の作用によって、組織を折り畳むことと、を含む。本明細書で開示される方法およびシステムを使用して生成された３Ｄ組織も提供される。
【００３２】
本発明の例示的な実施形態が説明される前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、当然のことながら、変更され得ることを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものであるにすぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるので、限定することを意図するものでないことも理解されたい。
【００３３】
ある値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間に、明示的に別段の定めがない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載された何らかの値または介在値と、記載された範囲が本発明内に包含される記載された何らかの値または介在値との間にある、より小さな各範囲は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してこの範囲の中に含まれ得または除外され得、こうした限界のいずれかが、またはいずれもが、より小さな範囲に含まれる各範囲、またはいずれも含まれない各範囲も、本発明の範囲内に包含され、記載された範囲内で何らかの具体的に除外された制限を受ける。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００３４】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと同様または同等の何らかの方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、いくつかの見込みのある例示的な方法および材料をここで説明し得る。本明細書で言及されるいかなるおよび全ての公開物は、公開物が引用されるものとの関連で方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が存在する限り、組み込まれた公開物のいかなる開示にも優先することが理解される。
【００３５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示物を含むことに留意されなければならない。したがって、例えば、「膜結合ポリヌクレオチド」に対する参照は、複数のこのような膜結合ポリヌクレオチドを含み、「ポリヌクレオチド」に対する参照は、１以上のポリヌクレオチドへの参照を含む、などである。
【００３６】
特許請求の範囲は、任意であり得るいかなる要素も除外するように立案され得ることにさらに留意されたい。このようなものとして、この陳述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」およびこれらに類するものなど排他的な用語の使用または「否定的な」制限の使用のための先行基準としての役割を担うことを意図している。
【００３７】
本明細書に論じられる公開物は専ら、本出願の出願日前のそれらの開示のためのみに提供される。本明細書内のいずれのものも、先行の発明という理由によりそのような公開物に先立する権利がないという了解として解釈されるべきではない。さらに、示されている公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。このような公開物が、本開示の明示的または暗示的な定義と矛盾する用語の定義を示すことができる範囲で、本開示の定義は制御する。
【００３８】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、または組み合わせられ得る個別の要素および特徴を有する。いかなる列挙された方法も、引用された事象の順序で、または論理的に可能な何らかの他の順序で実施することができる。
【００３９】
定義
「膜表面付着核酸」、「膜結合ポリヌクレオチド」、「脂質−ＤＮＡ」という用語および類似の用語は、「膜結合ポリヌクレオチド」またはその一部が実際に膜の中へ挿入されているかどうかにかかわらず、何らかの手段によって、膜へと挿入されることのできる疎水性部分、親油性部分、」または両親媒性部分へ付着するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、アミンとのＮＨＳ−エステル反応および膜中に存在するグリコカリックスとの双直交化学反応によって細胞の膜へ付着する場合があり、したがって、膜内への挿入のための疎水性領域、親油性領域または両親媒性領域を含まない場合がある。ポリヌクレオチドは、何らかの信頼できる方法を介してガラス基板の表面に付着し得る。ガラス基板の表面へ付着したポリヌクレオチドは、疎水性領域、親油性領域、または両親媒性領域を任意に含み得る。
【００４０】
「膜」という用語または何らかの同様の用語は、何らかの脂質含有膜、細胞膜、単層、二重層、小胞、リポソーム、脂質二重層などを指すために、本明細書中で広範かつ総称的に使用され、本発明は、何らかの特定の膜に限定されるよう意味するものではない。
【００４１】
「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」という用語の特定の使用は決して限定的であると考えられるべきではなく、本明細書では相互交換可能に使用され得る。関連する核酸分子が典型的には約１００塩基未満を含む場合、「オリゴヌクレオチド」が使用される。関連する核酸分子が典型的には約１００塩基超を含む場合、「ポリヌクレオチド」が使用される。両方の用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾または合成のＤＮＡまたはＲＮＡ（合成および天然の塩基類似体を含む核酸、ジデオキシまたは他の糖、チオールまたは他の非天然もしくは天然ポリマー骨格を含むがこれらに限定されない）、あるいは他の核酸塩基含有ポリマーを示すために使用される。したがって、これらの用語は、本明細書で参照され使用される核酸の長さを定義または制限するよう解釈されるべきではない。
【００４２】
本開示のポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、三本鎖であり得、またはこれらの立体配座の組み合わせを含み得る。概して、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を含有するが、いくつかの場合、以下の概略するように、ホスホラミド、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合、ならびにペプチド核酸骨格および結合を含む代替的な骨格を有し得る核酸類似体が含まれる。他の類似体核酸には、モルホリノ、ならびに正の骨格、非イオン骨格、および非リボース骨格を有するものが含まれる。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸も、核酸の定義に含まれる。リボース−リン酸骨格のこれらの修飾は、標識などの追加の部分の付加を容易にするため、または生理学的環境におけるこのような分子の安定性および半減期を増大させるために行われ得る。
【００４３】
「核酸配列」または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ヌクレオチド塩基の連続鎖を指し、特に、ポリヌクレオチド中に現れる場合に、互いに関連するヌクレオチド塩基の特定の配置も指す。
【００４４】
「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対形成則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）をいう。例えば、配列「５’−ＡＧＴ−３‘」は、配列「５’−ＡＣＴ−３’」と相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対形成則によって一致する「部分的」であってもよく、または核酸間に「完全な」もしくは「完全な」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、規定された条件下での核酸鎖間のハイブリッド形成の効率および強度に影響を及ぼす。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ハイブリッド形成する」および「ハイブリッド形成」は、相補的な核酸の対形成に関して使用される。ハイブリッド形成およびハイブリッド形成の強度（すなわち、核酸間の結合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシーおよび形成された複合体のＴｍなどの因子によって影響される。「ハイブリッド形成」方法は、ある核酸の、別の相補的な核酸、すなわち相補的なヌクレオチド配列を有する核酸へのアニーリングを包含する。
【００４６】
「ハイブリッド形成条件下」によって意味するのは、特異的ハイブリッド形成を可能にする条件である。相補的な配列の長さ、２次構造、およびＧＣ含有量は、標的部位の標的核酸への特異的ハイブリッド形成を得るために必要なハイブリッド形成条件の熱融点Ｔｍに影響を及ぼす。
【００４７】
「熱融点」、「融解温度」または「Ｔｍ」という用語は、本明細書では、標的に相補的なプローブの５０％が標的配列に平衡状態でハイブリッド形成する（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下での）温度をいう（標的配列が過剰に存在すると、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。いくつかの場合、「Ｔｄ」という用語は、プローブの少なくとも半分が、完全に一致した標的核酸から解離する温度を規定するために使用される。
【００４８】
対応するヌクレオチド間の全ての完全に形成された水素結合を有する二本鎖分子の形成は、「一致した」または「完全に一致した」といい、対応しないヌクレオチドの１対またはいくつかの対との二本鎖は「ミスマッチ」という。一本鎖ＲＮＡ分子または一本鎖ＤＮＡ分子のいかなる組み合わせも、適切な実験条件下で二本鎖分子（ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＲＮＡ：ＲＮＡ）を形成することができる。
【００４９】
「選択的にハイブリッド形成する」または「特異的にハイブリッド形成する」という語句は、特定のヌクレオチド配列が、複合体混合物（例えば、全細胞のまたはライブラリのＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でその配列にのみ分子が結合、二本鎖形成またはハイブリッド形成することをいう。
【００５０】
当業者は、代替的なハイブリッド形成条件および洗浄条件を利用して類似のストリンジェンシーの条件を提供することができることを容易に認識することになっており、パラメータの組み合わせがいかなる単一のパラメータの尺度よりもはるかに重要であることを認識するであろう。
【００５１】
「フルオロフォア」という用語は、第１の波長のエネルギーを吸収し、異なる第２の波長でエネルギーを再放射することができる何らかの分子実体をいう。例示的なフルオロフォアとしては、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（ＦＲ６１０；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州ノバト市）、フルオレセインイソチオシアナート、フルオレセイン、ローダミンおよびローダミン誘導体、クマリンおよびクマリン誘導体、シアニンおよびシアニン誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，オレゴン州ユージーン市）、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，マサチューセッツ州ウォルサム市）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
「二重層」という用語は、内側に疎水性の尾部を、外側表面に極性のある頭部を有する２つの分子層として配置された両親媒性脂質分子（しばしばリン脂質）からなる「サンドイッチ様」構造をいう。
【００５３】
「単一層」という用語は、片側で濃縮して実質的に整列した頭部基と、濃縮して実質的に反対側にある疎水基とを備えた両親媒性分子の分子層によって定義される構造をいう。
【００５４】
「生理学的条件」という用語は、生細胞と適合する条件、例えば生細胞と適合する温度、ｐＨ、塩分などの主として水性条件を包含することを意味する。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「決定すること」、「測定すること」、および「評価すること」、および「アッセイすること」という用語は、相互交換可能に使用され、定量的測定および定性的測定の両方を含む。
【００５６】
核酸またはアミノ酸の配列同一性の文脈において使用される「実質的に類似の」という用語は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する２つ以上の配列をいう。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「％配列同一性」は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）の一部であるＴｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）から入手可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓツールを用いて決定される。このツールは、「ｗｗｗ．」を「ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎ／」の前に置くことによって位置付けられたウェブサイトからアクセスできる。このツールは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ包括的整列化アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３、Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｉｎ  Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ  ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ  ｅｄｉｔｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：  ｔｈｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１−４４  Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙを利用する。Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ：１０．０とＧａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ０．５とを含むデフォルト設定を利用する。デフォルトマトリックス「Ｂｌｏｓｕｍ６２」はアミノ酸配列に利用し、デフォルトマトリックス「ＤＮＡｆｕｌｌ」は核酸配列に利用する。
【００５８】
本開示全体を通じて、「表面付着核酸」または「膜結合ポリヌクレオチド」を説明するために使用される命名法は以下のとおりである。第１に、従来の名称は、ジアルキルホスホグリシエリドおよびモノアルキルアミドなど、化合物のある特定の膜結合部分に使用される。第２に、説明の便宜のために、以下の頭字語を利用することができる：ＦＡＣＳ、蛍光活性化細胞選別；ＤＮＡ、デオキシリボ核酸；ＤＩＦＯ、ジフルオロシクロオクチン；ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＭＦＩ；中央値折り畳み蛍光増大；ｄＴ、デオキシチミジン；ＭＥＦ、マウス胚線維芽細胞；ＰＢＳ、リン酸緩衝塩類溶液；ＴＥＡＡ、トリエチルアンモニウムアセタート；ＨＰＬＣ、高圧液体クロマトグラフィー；Ｐ／Ｉ、ホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート（ＰＭＡ）およびイオノマイシン；ＦＩＴＣ、フルオロセインイソチオシアナート。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「線維」という用語は、線維状であり、収縮性細胞の作用によって機械的に作動する合成または天然のポリマー（例えば、タンパク質または糖タンパク質）をいう。線維を含有する溶液がアニールしたままでより長い線維が得られる時間の量に依存して、線維の長さは変化し得る。例示的な線維には、コラーゲンおよびフィブロネクチンが含まれる。線維のマトリックスは、このマトリックス中に存在し得る何らかの細胞に対して構造的支持を提供する線維の足場をいう。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「細胞外マトリックス」またはＥＣＭという用語は、水と線維との混合物（例えば、収縮性細胞の作用によって機械的に作動するポリペプチド）をいう。ＥＣＭ中に存在し得る何らかの細胞を構造的に支持する足場を提供するために、線維はＥＣＭにおいて組織化される。
【００６１】
方法
本開示は、３次元形状に折り畳まれるようにプログラムされた組織を生成するための方法を提供し、３次元形状の形態は、組織における収縮性細胞のパターンに基づく。組織の方向付けられた折り畳みは、組織内の収縮性細胞の位置によって制御される。この方法は、収縮性細胞の作用により機械的に作動する線維を含む表面上に収縮性細胞のパターンを配置することと、線維上の収縮性細胞の作用による表面の折り畳みと、を含む。この方法は、線維のマトリックス内に（および場合によりその表面上に）配置された収縮性細胞のパターンを含む３次元組織を生成することも含む。３次元組織は、この３次元組織の内部（および存在する場合には表面上）における収縮性細胞の配置に基づいた種々の形態に折り畳まれることができる。
【００６２】
ある特定の実施形態において、本開示は、３次元形状に折り畳まれるようにプログラムされた平面状生体組織を作製するための方法を提供する。この方法は、基質の表面上に核酸のパターンを配置することによって、基質の表面上に収縮性細胞をパターン化することと、ハイブリッド形成条件下でパターン化された核酸を収縮性細胞の懸濁液と接触させることであって、収縮性細胞が、パターン化された核酸と相補的な細胞表面付着核酸を含み、細胞表面付着核酸が、基質の表面上でパターン化された収縮性細胞を生成する、接触させることと、基質の表面上のパターン化された収縮性細胞を、線維を含むポリマーマトリックスと接触させ、それにより、パターン化された収縮性細胞をポリマーマトリックス中へ包埋することと、基質の表面からポリマーマトリックスを除去することであって、パターン化された収縮性細胞が、除去の際にポリマーマトリックス中に保持され、それにより３次元形状に折り畳まれるようにプログラムされた平面状生体組織を生成する、除去することと、を含んでもよい。この方法は、平面状生体組織を懸濁培養物中で培養し、それにより、平面状生体組織の３次元形状への折り畳みを誘導することをさらに含み得る。
【００６３】
ある特定の実施形態において、基質の表面上に収縮性細胞をパターン化することは、第１の基質の第１の表面および第２の基質の第１の表面上に核酸のパターンを配置することであって、第１の基質の第１の表面が、第２の基質の第１の表面から、第１の基質と第２の基質の間の間隙を介して離間しており、これらの表面が互いに向かい合っている構成である、配置することと、パターン化された核酸をハイブリッド形成条件下で収縮性細胞の懸濁液と接触させることであって、収縮性細胞が、パターン化された核酸と相補的な細胞表面付着核酸を含み、細胞表面付着核酸が、第１の基質の第１の表面および第２の基質の第１の表面の上にパターン化された収縮性細胞を生成するよう、パターン化された核酸とハイブリッド形成し、ポリマーマトリックスを除去することが、第１の基質と第２の基質の間からポリマーマトリックスを除去し、それによって、パターン化された収縮性細胞を平面状生体組織の上面および底面に有する平面状生体組織を生成することを含む、接触させることと、を含み得る。
【００６４】
ある特定の実施形態において、この方法は、平面状生体組織を培地と接触させることと、細胞培養条件下でインキュベートすることと、平面状生体組織を３次元形状に折り畳むことと、をさらに含む。ある特定の実施形態において、平面状生体組織は、例えば、付着性表面を有さない容器を用いて、非付着性条件下で培養され、それにより平面状生体組織が容器の表面に付着しないようにする。ある特定の実施形態において、平面状生体組織は、培地中の平面状生体組織を保持する容器内で自由に浮遊している。
【００６５】
ある特定の実施形態において、収縮性細胞を含有する平面状生体組織が生成された後、パターン化された収縮性細胞を含有するポリマーマトリックスの領域を平面状生体組織から除去することができる。例えば、本発明の方法は、ポリマーマトリックスの連続した平面層上に収縮性細胞の複数の個々のパターンを生成するために使用することができる。その後、収縮性細胞の複数の個々のパターンを除去して、例えば、切り出して、平面状生体組織の個別の断片を得ることができる。切り出しは、外科用器具（生検パンチ、ブレードなど）またはレーザー微細切除などの何らかの適切な方法を用いて行うことができる。
【００６６】
３Ｄ形態に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を生成するための例示的なシステムを図４Ａに示す。図４Ａに示されたシステムは、平面状ポリマー層の片面（一面）に細胞を含有する平面状ポリマー層を生成するために使用することができる。図４Ｂは、パターン化された収縮性細胞を含有するポリマー層の個々の断片の、平面状生体組織からの除去を示す。
【００６７】
３Ｄ形状に折り畳まれるように構成された合成平面状生体組織を生成するための別の例示的なシステムを図５Ａに示す。図５Ａに示されたシステムは、第１の表面および平面状ポリマー層の第１の表面とは反対側の第２の表面（例えば、上面および底面）に細胞を含有するポリマー層を生成するために使用することができる。図５Ｂは、図５Ａに示された方法を使用した、線維を含むポリマーの連続平面層上の収縮性細胞の複数の個別パターンの生成を示す。線維および細胞を含有する平面状ポリマーは、図５Ａに示すフローセルから取り出され、培地中に浮遊し、収縮性細胞の個々のパターンを含有するポリマー層の領域は、平面状ポリマー層から取り出される。
【００６８】
ある特定の場合において、核酸のパターンは２次元であり得る。ある特定の場合において、核酸のパターンは、同じヌクレオチド配列を有する核酸の単一の集団を含む。ある特定の場合において、核酸のパターンは、核酸の２つ以上の集団を含み、核酸の各集団は独自のヌクレオチド配列を含む。ある特定の場合において、核酸のパターンは、核酸の２つ以上の集団を含み、核酸の各集団は独自のヌクレオチド配列を含み、各集団の核酸は基質の表面上で独自にアドレス指定可能である。ある特定の場合において、核酸のパターンは、核酸の２つ以上の集団を含み、核酸の各集団は独自のヌクレオチド配列を含み、各集団の核酸は第１および／または第２の基質の第１の表面上で独自にアドレス指定可能である。ある特定の場合において、配置することは、基質上に核酸を含む液体をプリントすることを含む。核酸（オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）は、折り畳み用にプログラムされた平面状組織を生成するためのフローセルを形成するために基質を組み立てる前または後に、基質の表面上にパターン化することができる。このようなものとして、開示された方法のある特定の実施形態は、第１の基質を第２の基質から離間した様式で配置することを含み、第１の基質の表面および／または第２の基質の表面は、その上に配置される核酸のパターンを含む。第１および第２の基質は、基質と弾性部材（例えば、ガスケット）との間の空間の密封をさらに容易にする弾性部材を用いて離間されることができる。ある特定の実施形態において、この方法は、第１の基質の第１の表面および第２の基質の第１の表面の上に核酸をパターン化することと、基質の第１の表面が向かい合っている向きにあるように第１の基質および第２の基質を離間した様式で配置することと、を含み得る。この方法は、第１および第２の基質の周縁部の間にシールを形成することをさらに含むことができる。基質のうちの１つは、材料（例えば、細胞、培地、ポリマーマトリックスなど）を２つの基質間の空間に導入するための１つまたは複数の開口部（例えば、ポート）を含むことができる。この方法は、パターン化された核酸をハイブリッド形成条件下で、収縮性細胞の懸濁液とともに、パターン化された核酸に対する細胞の結合に十分な時間インキュベートすることをさらに含み得る。この方法は、場合により、結合していない細胞を除去するための洗浄ステップを含んでもよい。他の実施形態において、洗浄ステップは、利用されなくてもよく、細胞を含有する培地は、結合していないいかなる細胞の除去も容易にすることができる。ある特定の実施形態において、パターン化された核酸をハイブリッド形成条件下で収縮性細胞の懸濁液と接触させるステップを複数回行うことができ、同じ第１の集団の細胞を複数回導入するか、または異なる集団の細胞（例えば、第１の集団、第２の集団、第３の集団の細胞）を異なる接触ステップにおいて、パターン化した核酸と接触させる。
【００６９】
ある特定の実施形態において、基質の表面上のパターン化した収縮性細胞を、線維を含有するポリマーマトリックスと接触させ、それにより、パターン化された収縮性細胞をポリマーマトリックスに包埋することは、平面状の層へのポリマーマトリックスの重合に十分な時間実施することができる。
【００７０】
ある特定の場合において、細胞表面付着核酸は、核酸へ付着した脂質部分を含み、この表面付着核酸は細胞の細胞膜への脂質部分の挿入によって細胞へ付着する。ある特定の場合において、細胞表面付着核酸は、脂質部分と核酸との間にスペーサーを含む。脂質部分は、いくつかの実施形態において、１２〜２４個の炭素原子、例えば、１２〜２２個、１２〜２０個、１２〜１８個、１４〜２２個、１４〜２０個、１４〜１８個、１６〜２２個、１６〜２０個、または１６〜１８個の炭素原子の長鎖アルキル鎖を含む。スペーサーは、１０〜８０ヌクレオチド長、例えば、１０〜６０ヌクレオチド長、１０〜４０ヌクレオチド長、２０〜８０ヌクレオチド長、２０〜６０ヌクレオチド長、２０〜４０ヌクレオチド長、４０〜６０ヌクレオチド長、４０〜８０ヌクレオチド長、５０〜８０ヌクレオチド長、５０〜８０ヌクレオチド長、または６０〜８０ヌクレオチド長を含み得る。
【００７１】
核酸をパターン化し、パターン化した核酸へ細胞を付着させるための何らかの適切な方法を使用することができる。例示的な方法としては、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２９４７８２号および第ＵＳ２０１６／００１００５４号に開示された方法が挙げられる。
【００７２】
ある特定の場合において、収縮性細胞の懸濁液は、収縮性細胞の２つ以上の独自の集団を含み、収縮性細胞の各集団は、このパターンにおける核酸の集団のうちの１つと相補的な表面付着核酸を含む。異なるタイプの細胞集団をパターン化するための方法も、出願公開第ＵＳ２００１／４０２９４７８２号および第ＵＳ２０１６／００１００５４号に開示されている。
【００７３】
ポリマー層に含まれる線維に収縮力を及ぼすことができる何らかのタイプの収縮性細胞を使用することができる。ある特定の場合において、収縮性細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑細胞、心臓細胞、これらの前駆体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある特定の場合において、収縮性細胞は線維芽細胞である。ある特定の場合において、収縮性細胞は上皮細胞である。ある特定の実施形態において、収縮性細胞は、本明細書に開示される方法によって生成された３Ｄ生体組織が移植されることになっている宿主から単離され得る。ある特定の実施形態において、収縮性細胞は、例えば、線維を作動させる能力、例えば、線維の収縮を増大させ、および／または線維の整列を亢進する能力を高めるよう遺伝的に操作され得る。例えば、収縮性細胞は、増大したレベルのＲａｓを発現するか、または恒常的に活性のあるＨ−ＲａｓＶ１２を発現し得る。
【００７４】
ある特定の実施形態において、この方法は、線維および細胞を含有するがポリマー材料を実質的に含まない組織を得るために、３次元形状からポリマーマトリックスを除去することをさらに含む。ポリマーマトリックスは、ポリマーを溶解することによって、例えば、ポリマーを重合するための架橋剤を逆転させることによって除去することができる。ある特定の場合において、ポリマーは、所定の時間後にインビボでの分解によって除去され得る生分解性ポリマーであり得る。生分解性ポリマーの層を作製し、分解速度を制御するための何らかの既知の方法を使用することができる。所定の分解速度を有する例示的な生分解性ポリマーは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０１７０２０４号に開示されている。ある特定の実施形態において、ポリマーマトリックスは、メタクリラートポリマー、ポリエチレンイミンおよび硫酸デキストラン、ポリ（ビニルシロキサン）エコポリマーエポリエチレンイミン、ホスホリルコリン、ポリ（エチルメタクリラート）、ポリウレタン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（乳酸グリコール酸）、ヒドロキシアペタイト、ポリ（乳酸）、ポリヒドロキシバレルテおよびコポリマー、ポリヒドロキシブチラートおよびコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリジアキサノン、ポリ無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリシアノクリラート、ポリ（アミノ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリエステル、コラーゲン、ゼラチン、セルロースポリマー、キトサン、ならびにアルギン酸塩またはこれらの組み合わせ、ヒドロゲル、アガロース、またはセルロースポリマーを含む。ある特定の場合において、プレポリマー状態のポリマーマトリックスを、本開示のフローセル（例えば、第２の基質から離間し、フローセルに材料を導入するためのポート（複数可）を含む第１の基質）に導入し、フローセル内で重合させることができる。ポリマーマトリックスを線維と事前に混合してもよく、または線維を別のステップで導入してもよい。
【００７５】
ある特定の場合において、ポリマーマトリックスはヌクレアーゼを含む。ある特定の実施形態において、線維および収縮性細胞を含有するポリマー層を基質（複数可）から分離することは、基質（複数可）に細胞を付着させるオリゴヌクレオチドを消化するためにポリマー層をヌクレアーゼに曝露することを包含し得る。他の実施形態において、線維および収縮性細胞を含有するポリマー層を基質（複数可）から分離することは、ヌクレアーゼの使用を包含しなくてもよく、むしろ、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、細胞培養条件によって逆転され得る。
【００７６】
本開示において使用される線維は、収縮性細胞の作用の際に機械的に作動する何らかの線維であり得る。このような線維は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、もしくはＸＩ型コラーゲンなどの線維状コラーゲン、またはフィブロネクチンを含み得る。線維は、哺乳類から、例えば齧歯類、ウシ、もしくはヒトから、または線維を発現するように遺伝的に操作された細胞から単離された合成物であってもよい。ある特定の場合において、線維はＥＣＭ中に含まれることができる。本開示において使用されるＥＣＭは、合成ＥＣＭ、動物から単離されたＥＣＭ、細胞株から分泌されたＥＣＭ、またはこれらの混合物を含み得る。ある特定の実施形態において、ポリマーマトリックスは、コラーゲンまたはＲＧＤペプチドフラグメントをグラフトしたポリマーを含み得る。
【００７７】
３次元形状に折り畳まれるように構成された平面状生体組織を生成する追加の方法も本明細書に開示される。ある特定の実施形態において、これらの方法は、基質の表面上に核酸をパターン化するステップを含まず、パターン化した核酸と相補的な細胞表面付着核酸を含む収縮性細胞を利用しない。このような方法は、基質上に、線維を含むポリマー層を配置することと、収縮性細胞ポリマー層上に互いに離間して配置されるように、収縮性細胞をポリマー層上にパターン化することと、ポリマー層への収縮性細胞の付着を可能にするのに十分な条件下で収縮性細胞をポリマー層上でインキュベートし、それによりポリマー層中の線維に及ぼす収縮性細胞の作用により３次元形状に折り畳まれるように構成された生体組織を生成することと、を含み得る。
【００７８】
ある特定の場合において、この方法は、ポリマー層を生成することと、ポリマー層上に線維（例えば、ＥＣＭ）を配置することと、収縮性細胞のパターンをポリマー層上に配置することと、を含む。
【００７９】
ある特定の場合において、配置することは、ポリマー層の上面に線維（例えば、ＥＣＭ）の第１の層を配置することと、ポリマー層の底面に線維の第２の層を配置することと、を含み、収縮性細胞をパターン化することは、線維の第１の層上の収縮性細胞をパターン化することと、線維への収縮性細胞の付着を可能にするのに十分な条件下で、収縮性細胞を線維の第１の層上でインキュベートすることと、収縮性細胞を線維の第２の層上にパターン化することと、線維への収縮性細胞の付着を可能にするのに十分な条件下で、収縮性細胞を線維の第２の層上でインキュベートすることと、を含む。
【００８０】
ある特定の場合において、パターン化することは、収縮性細胞を離間した様式で線維の層上にプリントすることを含む。細胞のプリントは、３−Ｄプリント、押出し加工、押出し加工３−Ｄプリントなどの何らかの適切な方法によって行うことができる。任意のタイプの微量流体ノズルまたは他の分注システム、例えばｓｃｉｅｎｉｏｎ細胞プリンタ、改造インクジェットプリンタ、液滴微量流体デバイスを、細胞または、収縮性細胞と線維（またはＥＣＭ）との溶液をプリントすることに使用することができる。ある特定の場合において、パターン化することは、収縮性細胞を線維層上に離間した様式で、マイクロピペットで置くことを含む。
【００８１】
開示される方法のある特定の態様において、収縮性細胞は、線維のプリントと併せてプリントされ得る。例えば、種々の実施形態において、収縮性細胞および線維は、混合物として押出し加工され、収縮性細胞および線維は、層状（例えば、収縮性細胞およびコラーゲンの交互の層）にプリントされ、収縮性細胞および線維は、個別のステップでプリントして、線維のパターンに隣接して収縮性細胞のパターンを作製するなどである。
【００８２】
ある特定の実施形態において、所定の形状に折り畳まれるように構成された３次元（３Ｄ）組織を生成するための方法は、収縮性細胞と線維との混合物を基質上へ配置して、収縮性細胞と線維とを含む３Ｄ構造を形成することと、構造を所定の形状に折り畳むための細胞培養条件下で、培地中で構造をインキュベートすることと、を含む。
【００８３】
ある特定の実施形態において、この方法は、インキュベートする前に構造上に線維の溶液を配置することをさらに含む。ある特定の実施形態において、この方法は、インキュベートする前に収縮性細胞と線維との混合物ならびに／または線維の溶液を構造上に配置することを反復することをさらに含むことができる。
【００８４】
この構造は、インキュベートすることの前に基質から任意に除去されるか、または任意に基質とインキュベートされる。ある特定の実施形態において、基質は、３Ｄ構造の折り畳みで折り畳むこともできる可撓性基質である。例えば、基質は、平面状ポリマー層または足場構造を有するポリマー層であってもよい。
【００８５】
ある特定の実施形態において、収縮性細胞および線維は、押出し加工３−Ｄプリントなどのプリント技術を用いて配置される。例えば、いくつかの実施形態において、コラーゲンの溶液は、ポリマー基質上の層として任意の所望のパターンでプリントされて、コラーゲンの複数の整列した線維を作製する。収縮性細胞は、ポリマー基質が折り畳まれることになっている所望の３次元形状に基づいて、このようなコラーゲン層における何らかの濃度およびパターンで任意に含まれる。
【００８６】
ある特定の実施形態において、この方法は、線維が３Ｄスラブ内で支柱を形成し、線維のこれらの支柱を収縮させることによって線維の２つ以上の支柱を接続する結節点を収縮性細胞が形成するよう、収縮性細胞と線維との混合物をポリマー材料のより大きな３Ｄスラブ内に押出し加工することを含む。
【００８７】
線維を含有する溶液は、新たに調製されるか、ある一定の長さの線維を形成する時間インキュベートされていてもよい。より長いインキュベーション時間は、任意に、より長い線維を生成するために使用され、その逆もまた同様である。線維の濃度は、生体組織の所望の特性に基づいて決定される。
【００８８】
線維の至適濃度は、いくつかの場合において、経験的に決定される。種々の実施形態において、コラーゲン、フィブロネクチンなどの線維の濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの場合において、収縮性細胞の位置取りおよび／または数によって、より高濃度の線維が使用される。
【００８９】
ある特定の実施形態において、生体組織に含まれる収縮性細胞は線維芽細胞を含む。他の実施形態において、生体組織に含まれる収縮性細胞は、上皮細胞を含む。ある特定の実施形態において、生体組織に含まれる収縮性細胞は、線維芽細胞と上皮細胞とを含む。
【００９０】
ある特定の場合において、この方法は、細胞培養条件の下で、培地中で線維と収縮性細胞とを含有する生体組織をインキュベートすることと、生体組織を３次元形状に折り畳むことと、をさらに含む。生体組織を生成するために使用される方法によって、生体組織は、いくつかの場合において、３−Ｄ形状に折り畳まれた平面状であるか、または生体組織は、いくつかの場合において、線維に及ぼす収縮性細胞の作用による折り畳みの導入によって改変された３−Ｄ形状にある。
【００９１】
本方法の例示的な実施形態としては、線維に及ぼす収縮性細胞の作用の際に、拘束された部分が折り畳まれるのを防止するために、生体組織の一部を拘束しながら、線維と所定のパターンの収縮性細胞とを含有する生体組織を培地中でインキュベートすることが挙げられる。拘束下にある生体組織の一部は、組織の縁、組織の表面、組織の内部領域などであってもよい。ある特定の場合において、生体組織の２つ以上の部分が拘束されてもよく、例えば、縁および表面の両方が拘束下に保持されてもよい。
【００９２】
一例では、生体組織は、実質的に平面状の表面を有してもよく、この平面状の表面は、線維に及ぼす収縮性細胞の作用の際に平面状の表面が折り畳まれるのを防ぐために支持体に付着していてもよい。ある特定の実施形態において、生体組織は、実質的に平面状であり得、第２の平面状の表面と向かい合った第１の平面状の表面を含み得る。第１の平面状の表面の一部または第１の平面状の表面の実質的に全部は、第２の平面状の表面が折り畳まれている間に線維に及ぼす収縮性細胞の作用の際に第１の平面状の表面が折り畳まれるのを防ぐために支持体に付着していてもよい。このような方法は、非対称的な様式で組織内に折り畳みを作製するために、例えば、第１の平面状の表面が実質的に平面状のままでありながら、第２の平面状の表面にくぼみを作製するために使用されてもよい。
【００９３】
別の例において、生体組織の縁を支持体に付着させて、収縮性細胞の作用の際に縁が折り畳まれるのを防止してもよい。
【００９４】
ある特定の実施形態において、生体組織の内部領域、縁、または表面は、収縮力に対抗して内部領域、縁、または表面の少なくとも一部を折り畳むのを防ぐ、この一部を縮ませる薬剤を含み得る。ある特定の実施形態において、生体組織の標的領域（例えば、生体組織の内部領域、縁、または表面）においてイオン強度を変化させて、標的領域のポリマーマトリックスを高度に架橋させ、それゆえ、収縮性細胞によって生じる収縮力に耐性となり得る。ある特定の実施形態において、生体組織の標的領域（例えば、生体組織の内部領域、縁、または表面）にリボースまたはリシルオキシダーゼを添加して、標的領域を収縮させて収縮力に反作用させ、収縮性細胞が標的領域を折り畳むのを防止する。
【００９５】
ある特定の場合において、生体組織の一部は、この一部を膨張させ、それによって収縮性細胞を分離し、および／または膨張した部分が折り畳まれないように線維の量を希釈するための膨張剤を含み得る。ある特定の例において、膨潤剤は、ポリマーマトリックスの架橋を逆転させる薬剤であってもよい。生体組織の領域の化学的膨潤は、文献、例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３４７，Ｉｓｓｕｅ  ６２２１，ｐｐ．５４３−５４８，２０１５において説明されるように行うことができる。
【００９６】
ある特定の場合において、パターン化することは、単一タイプの収縮性細胞を含む収縮性細胞の集団を配置することを含む。ある特定の場合において、パターン化することは、２つ以上のタイプの収縮性細胞を含む収縮性細胞の集団を配置することを含む。ある特定の場合において、パターン化することは、第１のパターンにおける第１のタイプの収縮性細胞の集団および第２のパターンにおける第２のタイプの収縮性細胞の集団を配置することを含む。ある特定の場合において、収縮性細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑細胞、心臓細胞、これらの前駆体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある特定の場合において、ポリマー層は、ヒドロゲル、アルギン酸塩、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ゼラチン、アガロース、セルロースポリマー、またはこれらの組み合わせを含む。
【００９７】
ある特定の場合において、ＥＣＭは、細胞株から分泌されるＥＣＭまたは合成ＥＣＭを含む。ある特定の場合において、ＥＣＭは、コラーゲンまたはフィブロネクチンなどの線維を含む。
【００９８】
ある特定の実施形態によると、核酸は、接触するステップの後に細胞が単一細胞の分解能で表面に付着するように、表面上に（例えば、分子書き込みによって）パターン化される。「単一細胞の分解能」とは、（例えば、それらの直交性パターン化された核酸への特異的結合によって）表面上に特異的にパターン化された細胞が互いに物理的に分離していることを意味する。すなわち、単一細胞は、表面上の重なり合わない位置でパターン化され、表面上の空白空間が単一細胞間に存在する。単一細胞の分解能は、例えば、表面上の適切な密度での表面上の核酸の高分解能配置によって、細胞の第１の懸濁液中の適切な濃度の細胞の選択などによって達成される。他の実施形態において、数個の細胞が離間した複数の位置に配置され、例えば、各位置は、１０００個未満の細胞、１００個未満の細胞、３０個未満の細胞、または１０個未満の細胞、例えば、２〜１０個の細胞を有し得る。
【００９９】
いくつかの実施形態において、パターン内に配置された細胞間の間隔は、ＥＣＭ内の細胞によって発揮される所望の湾曲および／または収縮力に基づいて変化する。例えば、より大きな折り畳みを誘導するために、細胞は、より小さな折り畳みを誘導するよりも、比較的密接に配置されてもよい。いくつかの場合において、細胞の間隔は経験的に決定される。
【０１００】
細胞表面付着核酸は、何らかの簡便な手段によって細胞の表面に付着する。ある特定の実施形態によると、細胞表面付着核酸は、代謝工学および銅非含有クリック化学を介して細胞表面グリカンに共有結合し、タンパク質はアミンアシル化によって修飾され得る。ある特定の態様において、細胞表面付着核酸は、核酸に（直接的にまたは間接的に）付着した脂質部分を含み、この表面付着核酸は、細胞の細胞膜内への脂質部分の挿入によって細胞に付着する。細胞表面付着核酸が、核酸に付着した脂質部分を含む場合、いくつかの場合においては、脂質部分と核酸との間にスペーサーが存在する。
【０１０１】
ある特定の実施形態によると、細胞表面付着核酸は膜結合型ポリヌクレオチドである。膜結合型ポリヌクレオチドの例は、例えば、Ｓｅｌｄｅｎ  ＮＳ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４，７６５−７６８、および米国特許出願公開第ＵＳ２０１４−０２９４７８２号および米国特許出願第６１／５５４，９１２号において説明されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。膜結合型ポリヌクレオチドは、概して、膜貫通領域とポリヌクレオチドとを含む。このポリヌクレオチドは、膜近位端および膜遠位端を有する。ポリヌクレオチドは、リンカー領域と膜遠位付着領域とを含み得る。ポリヌクレオチドのリンカー領域は、少なくとも約２０ヌクレオチドの連続鎖を含み得る。膜遠位付着領域は、少なくとも１０ヌクレオチドを含み得、リンカー領域に対して遠位に位置し得、リンカー領域は、膜遠位付着領域とハイブリッド形成することができない。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、膜結合型ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド部分は、ＤＮＡ、例えば、一本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡなどを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは一本鎖であってもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはリンカー領域を含み、リンカー領域は約２０〜約３０００ヌクレオチドの連続鎖を含む。いくつかの実施形態において、リンカー領域は、ポリヌクレオチドの膜遠位端から約１０ヌクレオチド以上離れている。例えば、リンカー領域は、場合により、ポリヌクレオチドの膜遠位端から約１０〜約２０００ヌクレオチド以上離れている。ある特定の態様において、ポリヌクレオチドは、３種類の塩基のみを含む約１０〜約２０００ヌクレオチドの連続鎖を含む。いくつかの実施形態において、３つの塩基は、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧから選択される。ある特定の実施形態において、３つの塩基はＡ、Ｃ、およびＴである。
【０１０４】
膜結合型ポリヌクレオチドは、１２〜２２個の炭素を含むアルキル鎖を含み得る膜貫通領域を場合により含有する。ある特定の態様において、膜貫通領域はポリヌクレオチドに付着する。ある特定の実施形態によると、膜貫通領域は疎水性である。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は親油性である。ある特定の態様において、膜貫通領域全体は疎水性である。ある特定の実施形態によると、膜貫通領域全体が親油性である。いくつかの実施形態において、一部分のみが親油性または疎水性である。ある特定の態様において、膜貫通領域は両親媒性である。ある特定の実施形態によると、膜貫通領域は、鎖が溶液（例えば、水）中に含有されるよりも膜に挿入されることがエネルギー上好ましくあるようなものである。このような実施形態において、膜貫通領域は、脂質膜に自発的に挿入される。
【０１０５】
本明細書に開示するように、いくつかの実施形態において、膜貫通領域は細胞の膜に挿入される。いくつかの実施形態において、膜貫通領域に付着したポリヌクレオチドは、細胞膜の細胞外側にある。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは細胞膜の細胞内側にある。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、単一のアルキル鎖を含む。他の実施形態において、膜貫通領域は２つのアルキル鎖を含む。ある特定の態様において、膜貫通領域は２つ以上のアルキル鎖を含む。３つ以上のアルキル鎖は、場合により含まれる。
【０１０６】
ある特定の実施形態によると、膜貫通領域は、アルキル鎖と、アルケニル鎖、アルキル鎖、アリール鎖またはアラルキル鎖とを含む。このアルケニル鎖、アルキル鎖、アリール鎖、またはアラルキル鎖は１２〜２２個の炭素原子を含むことができる。いくつかの実施形態において、アルキル鎖は約１２〜２２個の炭素原子を含み、アルケニル鎖、アルキル鎖、アリール鎖、またはアラルキル鎖は約１２〜２２個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、鎖は同じ数の炭素原子を共有する。他の実施形態において、一方の鎖はもう一方の鎖よりも約１〜１０個少ない炭素原子を有する。種々の実施形態において、一方の鎖は、もう一方の鎖よりも約１個少ない炭素原子、約２個少ない炭素原子、約３個少ない炭素原子、約４個少ない炭素原子、約５個少ない炭素原子、約６個少ない炭素原子、約７個少ない炭素原子、約８個少ない炭素原子、約９個少ない炭素原子、または約１０個少ない炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、各鎖が１２〜２２個の炭素原子を含む２つ以上のアルケニル鎖、アリール鎖、またはアラルキル鎖を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、１つ以上の不飽和炭素結合を含有する。いくつかの実施形態において、不飽和結合は全て同じ鎖内に含有される。他の実施形態において、不飽和結合は２つ以上の鎖に含有されていてもよい。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、膜貫通領域はジアルキルホスホグリシエリドを含み、ポリヌクレオチドはジアルキルホスホグリシエリドに結合する。いくつかの実施形態において、ジアルキルホスホグリシエリドの各鎖は、もう一方の鎖と同じ数の炭素原子を有する。他の実施形態において、炭素原子の数は、ジアルキルホスホグリシエリドの２つのアルキル鎖の間で異なる。いくつかの実施形態において、各鎖は１２〜２２個の炭素を有する。いくつかの実施形態において、各鎖は、約１２個の炭素原子、または約１４個の炭素原子、約１６個の炭素原子、約１８個の炭素原子、約２０個の炭素原子、または約２２個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの鎖は、約１２個の炭素原子、約１４個の炭素原子、約１６個の炭素原子、約１８個の炭素原子、約２０個の炭素原子、または約２２個の炭素原子を有する。特定の実施形態において、膜貫通領域はＣ１６ジアルキルホスホグリセリドを含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、膜貫通領域はモノアルキルアミドを含み、ポリヌクレオチドはモノアルキルアミドに結合している。いくつかの実施形態において、モノアルキルアミド鎖は１２〜２２個の炭素原子を有する。種々の実施形態において、モノアルキルアミド鎖は、約１２個の炭素原子、または約１４個の炭素原子、約１６個の炭素原子、約１８個の炭素原子、約２０個の炭素原子、または約２２個の炭素原子を有する。ある特定の実施形態において、モノアルキルアミドは、約１６または１８個の炭素原子を含む。
【０１１０】
ある特定の態様において、本開示の方法は、ハイブリッド形成条件下で表面上の細胞のパターンを、細胞の第２の懸濁液と接触させることを含み、第２の懸濁液の細胞は、パターン化した細胞の細胞表面付着核酸と相補的な細胞表面付着核酸を含み、第２の懸濁液の細胞の細胞表面付着核酸は、表面上にパターン化された細胞の細胞表面付着核酸とハイブリッド形成して、細胞の３次元パターンを形成する。ある特定の実施形態によると、第２の懸濁液の細胞は、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、リンパ球、幹細胞、またはこれらの何らかの組み合わせから選択される。
【０１１１】
対象の方法は、パターン化された細胞を表面から取り出すことを場合により含む。ある特定の態様において、パターン化された細胞は、細胞をマトリックス中に包埋することと、マトリックスを表面から取り出すこととによって取り出され、細胞のパターン化は取り出しの際にマトリックス中に保持される。関心対象のマトリックスには、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、コラーゲン、フィブリン、アガロース、ＰＥＧ−アクリラートなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、包埋することは、液状のゲルを維持する条件下で（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌの場合は４℃）、高い活性のＤＮアーゼを含有する液状ＥＣＭでＰＤＭＳフローセルを浸潤することを含む。次に、フローセルを生理学的温度にシフトさせて、ゲルマトリックスを同時にトリガーし、細胞とガラス基質との間でＤＮＡ鎖の酵素による開裂を開始させる。取り出しは、基質の表面からパターン化された細胞を含むマトリックスを剥離することを場合により含む。
【０１１２】
ある特定の態様において、この方法は、パターン化された細胞を培養することを含む。パターン化された細胞は、パターン化された細胞を含有するマトリックスが自由に浮遊する形態を取り、ＥＣＭ上の収縮性細胞による収縮力の適用の際に折り畳むことができるような条件下で培養することができる。
【０１１３】
ある特定の実施形態において、有限要素モデル（ＦＥＭ）は、本明細書に開示された生体組織における折り畳みを予測するために場合により使用される。ＦＥＭは、いくつかの場合において、所望の３Ｄ形状に基づいて、線維の整列、細胞間の距離、細胞の濃度などを決定するために使用される。ある特定の場合において、本明細書に開示された方法を用いて生成された生体組織は、収縮性細胞を含有してもしなくてもよいＥＣＭの層（複数可）の上に積層されるか、またはＥＣＭの層の間に挟まれる。いくつかの場合において、ＥＣＭの層は、異なる濃度の線維および／または生体組織中に存在する線維とは異なる種類の線維を含む。
【０１１４】
ある特定の実施形態において、この方法は、複数の合成平面状組織を生成することと、そこから製造された平面状組織または３Ｄ形状を組み合わせてより高次の構造を形成することとを含む。例えば、本明細書に開示された方法は、いくつかの場合において、チューブ、ポップスルーまたはディンプルを備えた４つ折り接合部、ボックス、球、クマのかぎ爪などの３Ｄ形状の合成組織を生成するために使用される。これらの合成３Ｄ組織のうちの２つ以上を場合により組み合わせてより高次の構造を生成する。いくつかの場合において、本明細書に開示された方法によって製造された生体組織を解剖して、所望の形状および１つ以上の解剖した断片を生成して、具体的に成形した組織を生成するのに使用する。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、収縮性細胞のパターンにおける細胞のクラスターにおける細胞の数は、特定の組織において必要とされる収縮の程度に基づいて決定される。種々の実施形態において、細胞の数は１〜１０００個の細胞／クラスター、例えば３〜１０００、３〜３００、３〜１００、５〜１０００、５〜３００、５〜１００、８〜１０００、１０〜１００、１０〜３００、または１０〜１０００個の細胞／クラスターの範囲である。細胞のクラスター間の距離は、いくつかの場合において、特定の組織における所望の折り畳みに基づいて決定され、１０〜１０００μｍ、例えば、１０〜３００、１００〜３００、１００〜５００、１００〜１０００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、または４００〜６００などの範囲であり得る。収縮性細胞のクラスター化のパターンは、種々の実施形態において、平面状組織に対してＸ軸およびＹ軸（ならびに組織が３−Ｄ形状にある場合、Ｘ軸、Ｙ軸、およびＺ軸）に沿った隣接するクラスター間の距離に関して等方性パターン、異方性パターン、または段階的なパターンである。
【０１１６】
現に開示された方法を用いて生成されるような所定の様式で折り畳まれるようにプログラムされた組織のサイズは、種々の実施形態において、組織の最も幅の広い寸法にわたって約１ｍｍ〜約１ｃｍの範囲である。ある特定の場合において、組織は最初はより大きくてもよく、組織の最も幅の広い寸法を横切って約１ｍｍ〜約５ｍｍの範囲にあり得る組織のより小さな断片を得るために解剖されてもよい。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、収縮性細胞のパターン化は、折り畳まれた組織における所望の湾曲によって決定される。例えば、より大きな程度の湾曲を生成するために、収縮性細胞は、場合により、より短い距離だけ分離され、より小さな程度の湾曲を生成するために、収縮性細胞は、より長い距離だけ分離され得る。これに代えて、またはこれに加えて、より大きな程度の湾曲を生成するために、より多くの収縮性細胞を場合によりパターン化し、より小さな程度の湾曲を生じるために、より少数の収縮性細胞をパターン化することができる。同様に、より鋭い折り畳み（より大きな程度の湾曲）を生成するために、線維の収縮の増大および／または線維の整列の増大を作動させる収縮性細胞（例えば、線維芽細胞）が、場合により使用される。より滑らかな折り畳み（より小さな程度の湾曲）を生成するために、より低いレベルで線維の収縮および／または線維の整列を作動させる収縮性細胞（例えば、上皮細胞）が、場合により使用される。
【０１１８】
組織において対向する折り畳みを導入することが望ましい実施形態において、収縮性細胞を場合によりパターン化して、このような折り畳みを導入する。例えば、いくつかの実施形態において、収縮性細胞は、平面状基質（例えば、線維を含有するポリマー層）の第１および第２の表面が互いに向かい合っている平面状基質の第１の表面および第２の表面の上にパターン化される。第１の表面上の収縮性細胞のパターンは、場合により、第２の表面上の収縮性細胞のパターンからオフセットされている。いくつかの場合において、オフセットの距離は、折り畳みの間の所望の距離によって決定される。いくつかの場合において、第１および第２の表面上に配置される細胞の数は、折り畳みの所望の湾曲によって決定される。ある特定の実施形態において、第１および第２の表面の上の細胞の数はほぼ同じである。ある特定の実施形態において、第１および第２の表面の上の細胞の数は、２５％以下だけ異なっていてもよい。
【０１１９】
ある特定の実施形態において、この方法は、組織のｘ軸を横切って極性が交互に変化する折り畳み（例えば波形構造）を導入することを含む。このような実施形態において、各折り畳みを製造する細胞の数は、２５％以下だけ異なっていてもよい。
【０１２０】
ある特定の実施形態において、この方法は、チューブ形状に折り畳まれるように構成された平面状組織を製造することを含む。例えば、いくつかの実施形態において、本方法は、線維を有するポリマー層上に収縮性細胞をパターン化することを含み、収縮性細胞はｘ方向に３０〜１０００ミクロン（例えば、３０〜３００ミクロン、１００〜３００ミクロン、１００〜２５０ミクロン、３０〜２５０ミクロン、５０〜２５０ミクロン、１００〜２５０ミクロン、５０〜１５０ミクロン、または８０〜２５０ミクロン）の対数分布細胞間隔を用いてポリマー層のｘ軸に沿ってパターン化される。ｙに沿った組織間隔は、場合により、（例えば、約３０００〜３００ミクロン、例えば、２５００〜３００ミクロン、１０００〜３００ミクロン、５００〜３００ミクロン、または４００〜３００ミクロンで）比較的大きく維持され、チューブの長さに沿って湾曲を最小限にする。ある特定の場合において、ｘ方向における細胞の間隔は、１００〜３００ミクロンまたは８０〜２５０ミクロンの範囲内であり、ｙ軸に沿っては５００〜３００ミクロンまたは４００〜３００ミクロンであり得る。
【０１２１】
システム
本開示は、例えば、対象の方法を実施する上での使用を認められているシステムも提供する。ある特定の場合において、３次元形状に折り畳まれるように構成された合成平面状生体組織を生成するためのシステムが提供される。例えば、いくつかの実施形態において、システムは、基質の表面上のパターンに配置された核酸の集団と、核酸の集団に相補的な細胞表面付着核酸を含む収縮性細胞の集団であって、細胞の集団が、核酸の集団への表面付着核酸のハイブリッド形成によって核酸集団に付着している、収縮性細胞の集団と、細胞外マトリックスを含むポリマーマトリックスと、を含む。
【０１２２】
ある特定の場合において、システムは、第２の基質から離間した第１の基質を含み、第１の基質の第１の表面は、第２の基質の第１の表面に面する形態であり、核酸の集団は、第１および第２の基質の第１の表面の上にパターンが形成される。
【０１２３】
ある特定の場合において、３次元形状に折り畳まれるように構成された合成平面状生体組織を生成するための別のシステムが開示される。ポリマー層の表面上に配置された線維の層を含むポリマー層（例えば、細胞外マトリックス）と、収縮性細胞の集団と、を含む、システム。
【０１２４】
ある特定の場合において、３次元形状に折り畳まれるように構成された合成平面状生体組織を生成するための別のシステムが開示される。ポリマー層の上面と底面とに配置された線維層を含むポリマー層（例えば、細胞外マトリックス）と、収縮性細胞の集団と、を含む、システム。
【０１２５】
ある特定の場合において、収縮性細胞の集団は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑細胞、心臓細胞、これらの前駆体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞タイプを含む。
【０１２６】
ある特定の場合において、ポリマーは、ヒドロゲル、アルギン酸塩、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ゼラチン、アガロースまたはセルロースポリマーを含む。ある特定の場合において、ＥＣＭは、収縮性細胞によって作動可能な線維を含み得る。ある特定の場合において、線維はコラーゲンおよび／またはフィブロネクチンを含む。
【０１２７】
ある特定の場合において、システムは、コンピュータのプロセッサによって実行されると、コンピュータに、所定の様式で折り畳むように構成された組織を生成する方法を実行させる命令を含むプログラミングを含む。
【０１２８】
プログラミングは、場合により、コンピュータ可読媒体に組み込まれ、および／またはクラウドの中に保存される。いくつかの実施形態において、プログラミングは、所定の様式で折り畳むように構成された組織を生成するために、他の構成要素とは独立して提供される。ある特定の場合において、プログラミングは、所定の様式で折り畳むように構成された組織を生成するために、他の構成要素と一緒にバンドルされる。
【０１２９】
ある特定の場合において、プログラミングには、収縮性細胞のパターン、収縮性細胞の数、線維の濃度、および所望の構造で折り畳まれることになっている組織を生成するのに必要なものを計算するためのアルゴリズムが含まれる。例えば、プログラミングは、細胞を特定の数および特にパターンに配置して、チューブ、波形シートなどに折り畳まれることになっている組織を生成するために、命令をロボットまたはユーザに提供することができる。所定の様式で折り畳まれるように構成された組織を生成するための自動化または半自動化された器具を使用する実施形態において、プログラミングは、本明細書に開示される方法の１つ以上のまたは全部のステップを実行するために機器に命令を提供する。
【０１３０】
インビトロで生成した生体組織
所定のパターンの収縮性細胞を含む操作された３次元（３Ｄ）生体組織であって、収縮性細胞の所定のパターンが３Ｄ生体組織の形状を決定する、３Ｄ生体組織も開示される。ある特定の場合において、生体組織は、本明細書で説明される方法およびシステムから生成される。操作された３Ｄ生体組織という用語は、収縮性細胞の所定のパターンを含む人工の非天然の組織をいい、この収縮性細胞は、ある特定の形態の組織を得るための供給された指示によって位置決めされている。本明細書に開示される方法論は、所定の形態を有する組織を生成するために、互いに関して収縮性細胞の精確な位置を提供する。ある特定の場合において、収縮性細胞のクラスターは、同じ距離だけ離間していてもよい。他の場合において、収縮性細胞のクラスターは、１つ以上の軸に沿った設定増分だけ延びる距離だけ離間していてもよい。いくつかの場合において、収縮性細胞のクラスターは、１つ以上の軸に沿って指数関数的に延びる距離だけ離間していてもよい。ある特定の場合において、細胞は、例えば、それらの物理的特性または合成生物学的技術を用いて、自己組織化するようにプログラムされ得る。
【０１３１】
開示された方法によって生成される組織は、組織中に存在する細胞のサイズ、形態、およびパターンの点において実質的に同一であり得る。実質的に同一の組織の生成は、異なる条件にわたって均一性を必要とする方法において有利である。例えば、本方法によって生成された複数の異なる操作された３Ｄ生体組織は、同一であり得、したがって、これらの組織に影響を与える薬剤についてのスクリーニングに使用され得る。ある特定の場合において、複数の同一の操作された３Ｄ生体組織を用いて、細胞シグナル伝達、形態形成、器官形成、生存系組織化などを調節する薬剤をスクリーニングすることができる。これらの組織は、単離された生体組織に固有の細胞数および組織化の変化、または細胞培養系を用いてインビトロで生成された変化でさえも受けない。
【０１３２】
ある特定の場合において、生体組織は収縮性細胞をたったの１種類含む。ある特定の場合において、生体組織は収縮性細胞を２種類のみ含む。ある特定の実施形態において、１種類の収縮性細胞は線維芽細胞を含む。ある特定の実施形態において、２種類の収縮性細胞は、線維芽細胞と上皮細胞とを含む。
【０１３３】
ある特定の場合において、生体組織のパターンは、収縮性細胞の離間したクラスターを含む。いくつかの実施形態において、各クラスターは、５〜１００個の収縮性細胞を含む。いくつかの例において、各クラスターは５〜５０個の収縮性細胞を含む。さらに他の態様において、各クラスターは５〜１０個の収縮性細胞を含む。いくつかの場合において、生体組織は、所定の濃度の線維を含む。いくつかの実施形態において、生体組織は、血球、脂肪細胞、および神経細胞のうちの１つ以上を欠いている。ある特定の実施形態において、生体組織は、赤血球および免疫細胞のうちの１つ以上を欠いている。ある特定の実施形態において、生体組織は、リンパ球、好塩基球、好中球、好酸球、単球およびマクロファージなどの免疫細胞のうちの１つ以上を欠いている。
【０１３４】
本開示の方法によって生成された操作された３Ｄ生体組織は、多くの態様において、動物、例えば、ヒトから単離された生体組織とは異なる。本明細書に記載されるように、操作された３Ｄ生体組織は、組織内にインビボで通常存在する免疫細胞を欠いている。加えて、本明細書に開示された操作された３Ｄ生体組織は、血管ネットワーク、リンパ管ネットワークなどの自然に形成された組織中に存在するチャネル／管などの脈管ネットワークを欠いている。ある特定の実施形態において、本開示の方法によって生成された操作された３Ｄ生体組織は、動物から単離された生体組織のモデルとして機能するために、免疫細胞および／またはチャネル／管の脈管ネットワークの付加によってさらに修飾され得る。
【０１３５】
いくつかの態様において、収縮性細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、平滑細胞、心臓細胞、これらの前駆体、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１３６】
いくつかの態様において、操作された３Ｄ生体組織は、コラーゲンまたはフィブロネクチンであり得る線維を支持するために、ヒドロゲル、ゼラチン、アルギン酸塩、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、アガロース、セルロースまたは別のポリマーのマトリックスを含むことができる。コラーゲンは、合成されていてもよいか、または生物源から得られてもよい。
【０１３７】
ある特定の場合において、生体組織は、インビトロで生成された生体組織の別々のユニットを含む複合組織であってもよい。インビトロで生成された生体組織の別々のユニットは、複合組織を提供するために組み立てられてもよく、例えば、インビトロで生成された生体組織の別々のユニットは、別の上部の上にある層状のものであってもよい。インビトロで生成された生体組織の別々のユニットは、異なるタイプの細胞を有してもよく、例えば、第１のユニットは上皮細胞を有し得、第２のユニットは線維芽細胞を有し得る。
【０１３８】
ある特定の場合において、複合組織は、インビトロで生成された生体組織および哺乳類から単離された生体組織を含み得る。例えば、複合組織は、インビトロで生成された組織の第１のユニット（例えば、上皮細胞および／または線維芽細胞の層）および哺乳類から単離された生体組織の層を含むことができる。複合組織を生成するために使用することができる哺乳類から単離された生体組織には、血管、脂肪組織、神経組織などが含まれる。
【０１３９】
有用性
本開示の方法、基質、ポリマー層、およびシステムは、研究、前臨床および臨床での応用を含む種々の異なる応用における使用を認めている。例えば、本開示の方法を使用して生成された３Ｄ細胞構造は、例えば、皮膚、腸、前立腺、肝臓、および乳房のモデルとして有用である。このような組織／器官モデルは、分子効能および毒性試験、例えば薬剤または化粧品の試験に有用である。
【０１４０】
本開示の方法、基質、ポリマー層、およびシステムは、動物およびヒトへの移植、例えば糖尿病における膵機能を置換するための、または腎機能を置換するなどのための移植可能なバイオリアクターの文脈における合成オルガノイドの製造における使用を認めている。他の用途には、組織自己組織化、ＥＣＭ分泌、例えば合成皮革、天然化学製品、食品を利用することによる合成生体材料の製造が含まれる。
【０１４１】
本明細書に開示されている折り畳まれた組織は、細胞シグナル伝達、形態形成に関与する解読機序、器官形成、生存系組織などを試験するためのモデル系にも有用である。
【０１４２】
さらに、この方法、基質、およびシステムは、臨床での応用における使用を認めている。例えば、本開示の方法は、例えば対象が機能的な対応する組織または組織の部分構造を欠いているため、この方法を必要とする対象（例えば、ヒト患者）へこのような組織またはその基礎構造を提供する目的で、３Ｄ組織またはその部分構造を生成することが望ましい再生医療での応用において有用である。
【実施例】
【０１４３】
上述に提供される開示から認識できるように、本開示は広範な種々の応用を有する。したがって、以下の実施例は、当業者に、本発明の製造方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するように示唆されており、本発明者らがその発明とみなす範囲を限定することは意図されず、以下の実験が全てであるか、または単なる実験のみが行われることを表すよう意図してはいない。当業者は、本質的に類似の結果を生じるように変更または改変することができる種々の重要ではないパラメータを容易に認識することになっている。したがって、以下の実施例は、当業者に、本発明の製造方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するように示唆されており、本発明者がその発明とみなす範囲を限定することは意図されず、以下の実験が全てであるか、または単なる実験のみが行われることを表すよう意図してはいない。使用された数字（例えば、量、寸法など）に関する正確性を確保する努力がなされたが、ある程度の実験上の誤差および偏差は考慮されるべきである。
【０１４４】
材料および方法
細胞培養。マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ、Ｊａｙ  Ｄｅｂｎａｔｈ（ＵＣＳＦ）の寄贈物）、Ｈ２Ｂ−ＧＦＰおよび恒常的に活性のあるＨ−ＲａｓＶ１２を発現するＭＣＦ１０ＡＴ（Ｌｉｕ，ＪＳ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２，１４６１−１４７０（２０１２））（ＲＡＳ細胞、バルク集団およびクローン）、ｐＳｉｃｏＲ−Ｅｆ１ａ−ｍＣｈ−Ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ３１８４５）を用いて作られたレンチウイルスによる形質導入後にｍＣｈｅｒｒｙを発現するヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ）、ｐＳｉｃｏＲ−Ｅｆ１ａ−ｍａｘＧＦＰ−Ｐｕｒｏ（Ｊｕｓｔｉｎ  Ｆａｒｌｏｗ（ＵＣＳＦ）の寄贈物）を介してｍａｘＧＦＰを発現するヒト乳房線維芽細胞（Ｊｉｍ  Ｇａｒｂｅ（ＵＣＳＦ）の寄贈物）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）（ＵＣＳＦ細胞培養施設）、Ｊｕｒｋａｔ不死化Ｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、初代ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）（Ｊｉｍ  Ｇａｒｂｅ（ＵＣＳＦ）の寄贈物）、およびＣａｃｏ２ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（ＵＣＳＦ細胞培養施設）を、処理したポリスチレンプレートおよびフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した。ＲＡＳ細胞を、ＭＣＦ１０Ａ細胞について既に説明したように培養した（Ｄｅｂｎａｔｈ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０，２５６−２６８（２００３））。ＨＵＶＥＣをＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）中で維持した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地中で維持した。ＭＤＣＫおよびＣａｃｏ２細胞を、１０％ＦＢＳおよび１×非必須アミノ酸を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。既に説明されているとおり、ＨＭＥＣを、Ｍ８７Ａ培地中で維持し、継代４回で筋上皮（ＭＥＰ）および内腔（ＬＥＰ）上皮集団に分類した（Ｓｔａｍｐｆｅｒ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｃｈａｔｔｅｎ，Ｈ．編集）３２３−３６１（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０１３）。  ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６２７０３−６３４−４＿１５）。
【０１４５】
ブレビスタチン（Ａｂｃａｍ  ａｂ１２０４９１）およびスタウロスポリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ５９２１）を、示された濃度で、１０ｍＭ  ＤＭＳＯストックからの連続希釈によって細胞培地に添加した。
【０１４６】
再構成された組織の作製。フローセルは、工作用カッター（Ｓｉｌｈｏｕｅｔｔｅ）で切断したＰＤＭＳ膜ガスケット（０．０１インチ厚、ＳＳＰ  Ｍ８２３）に対してアルデヒドシラン処理したガラススライド（Ｓｃｈｏｔｔ  １０６４８７４）を挟むことによって構築した。上部スライドの通孔は、１５％出力のエッチングレーザー（ＶＬＳ３．５，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１０〜２０回を使用して作製した。基準標識を両方のガラススライドにエッチングし、細胞のパターン化の前に光学顕微鏡による整列を支援した。エッチングしたスライドを、既に詳述されたように（Ｔｏｄｈｕｎｔｅｒ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  １２，９７５−９８１（２０１５））、細胞のＤＮＡによりプログラムされた組立て（ＤＰＡＣ）のための基質として使用した。エッチング後、アミン修飾オリゴヌクレオチドをスライド上にプリントし、還元的アミノ化によって共有結合させた。プリント箇所はビットマップファイルで指定されていた。スライドを疎水性シランで処理し、ＰＤＭＳガスケットに対して組み立てる前にタンパク質吸着によってブロッキングした。挟む直前に、フローセルをプライミングし、スライド間に気泡を捕捉する傾向を低下させるために、ガスケットの間隙にＰＢＳを入れた。マイクロアレイハイブリッド形成カセット（ＡＨＣ１Ｘ１６，ＡｒｒａｙＩｔ）を用いてこの挟み込みにわずかな圧力を加えた。上部ガラススライドの通孔およびＰＤＭＳガスケットの間隙の位置は、１６個のフローセルが通孔の対を介して独立してアドレス指定できるように、カセットの寸法と一致させた）。
【０１４７】
上部フローセル壁および下部フローセル壁に集められることになっている細胞を、ＰＢＳ、次いで０．０５％トリプシンを用いてプレートから持ち上げ、先に説明したように脂質修飾オリゴヌクレオチドで標識した（Ｔｏｄｈｕｎｔｅｒ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  １２，９７５−９８１（２０１５））（一例ではＣａｃｏ２を除き、以下を参照されたい）。フローセルカセットを氷上に置き、約１０×１０６個／ｍｌの懸濁液中の細胞を一対の通孔のうちの１つの上に緩徐なピペット操作によってフローセルに導入し、ガラス上のＤＮＡスポットに付着させた。さらに１回の細胞集合を用いて、各ＤＮＡスポットに５〜８個の細胞のクラスターを生成した。細胞パターン化の後、液状ＥＣＭ模倣ゲル前駆体をフローセル当たり２０μｌの２つの一定分量で導入し、カセットを３７℃で２０分間置いて前駆体を硬化させた。再構成した組織ゲルは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の蛍光標識した１型コラーゲン線維の複合体からなる。まず、０．０２Ｍの酢酸中の約８．５ｍｇ／ｍｌラット尾部１型コラーゲン（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５４２４９）２００μｌを、氷上で１０μｌの２０×ＰＢＳおよび４μｌの３Ｍ    ＮａＯＨを用いた中和の直前に添加したＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５または６４７−ＮＨＳエステル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（撮像必要条件による）５μｌを用いて標識した。氷上で１０分後、７０μｌのこのコラーゲンストックを約９ｍｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５４２３４）４１５μｌとＴｕｒｂｏ  ＤＮアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＡＭ２２３８）１５μｌとからなる第２のストックに添加した。この５００μｌの前駆体溶液は、８〜１０個のフローセルを充填するのに十分であった。
【０１４８】
次に、フローセルカセットを穏やかに分解し、スライドの挟み込みを室温で適切な細胞培地中に浸漬した。剃刀の刃を使用して、ガラススライドを静かにこすった。ＥＣＭゲルとともに運ばれる細胞クラスターからなる再構成組織は、典型的には、培地中に自発的に浮遊するか、または微小スパチュラ（Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  １１００８９−１１）を用いてガラススライドのうちの１つから静かに剥離させることができる。次に、浮遊組織を、生検パンチもしくはカミソリの刃を用いて、またはレーザー微細切除（Ｚｅｉｓｓ  ＰＡＬＭ  ＭｉｃｒｏＢｅａｍ）によってのいずれかで手動で切り出した。完成した組織を、直径約７ｍｍにトリミングしたＰ１０００ピペットを用いて、ガラスカバースライドが底部にある２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移した。再構成した組織が折り畳まれるように意図されている場合、各ウェルのガラスをＰＢＳ中の１％アガロースでコーティングした後、再構成した組織を添加して、付着するのを防止した。コラーゲン株／整列および非折り畳み対照の撮像研究のため、または顕微解剖の前に、半乾燥状態（培地を一時的に抜去した状態）で、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、再構成組織をカバースライドウェルの底部に付着させるようにした。
【０１４９】
ＤＰＡＣによって組み立てられるよりもむしろ、Ｃａｃｏ２細胞の半コンフルエントな層を、これらをフローセルの底部に沈着するようにゲル前駆体中に４×１０６個／ｍｌで事前に混合した後、３７℃で硬化させることによって、下部組織表面に構築した。
【０１５０】
ＨＵＶＥＣを含有する再構成した組織を、各２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、間質細胞由来因子１ａ（ＳＤＦ−１ａ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含むＥＧＭ−２中で培養し、内腔化を促進した。単一のパッセンジャー細胞型を有する組織を、適切な線維芽細胞培地中で１２時間培養した後、パッセンジャー細胞型の培地へ移した。３細胞型の再構成組織（ＭＥＦ、ＨＵＶＥＣおよびＣａｃｏ２細胞を含有）を同様に、１２時間後に５０：５０のＨＵＶＥＣ：Ｃａｃｏ２培地へ移した。
【０１５１】
細胞プリント。ＤＰＡＣを使用するよりもむしろ、フローセル中で生成したゲルを、非接触プリントを用いて細胞クラスターでパターン化することができた。圧電性低容量ディスペンサーであるＳｃｉＦｌｅｘＡｒｒａｙｅｒ  Ｓ３（Ｓｃｉｅｎｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＰＢＳ中の１０×１０６個／  ｍｌのＭＥＦ懸濁液を分配した。細胞懸濁液の駆出された液滴は、容積がおよそ３００ｐＬであり、直径が１００μｍであり、平均して３個／滴を含有していた。再構成された組織を、プリント中に半乾燥状態で透明なスライドガラスに付着させた。その後、組織を３７℃で３０分間インキュベートして細胞接着を促し、過剰の培地を添加した後、マイクロスパチュラを用いてスライドを静かに持ち上げた。
【０１５２】
液滴の収縮。細胞収縮性の迅速なスクリーニングは、カバースライドが底部にあるマイクロウェル上に１０６個／ｍｌを含有するＥＣＭゲルの１μｌ滴を３７℃で２０分間硬化させることによって行った。次に、培地を添加し、タイムラプス撮像の前に穏やかなピペット操作により液滴を脱離させた。
【０１５３】
再構成された組織ゲルの特徴付け。単一細胞の近傍にある再構成された組織ゲル株を、粒子画像速度測定法によって測定した（ＰＩＶ  ＩｍａｇｅＪ  ｐｌｕｇｉｎ（Ｔｓｅｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０９，１５０６−１５１１（２０１２））。１ｍｌ当たり８×１０６個の１ミクロン赤色蛍光ポリスチレンビーズを有する再構成された組織ゲル前駆体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆ１３０８３）の３０μｌの一定分量および未標識コラーゲン線維を３７℃で２０分間、９６ウェルプレートのウェルに硬化させた。再構成した組織ゲルアンダーレイ上に１ウェル当たり３，０００個の細胞を沈降させ、ビーズ置換のため共焦点顕微鏡法により６０分ごとに撮像した。
【０１５４】
コラーゲン線維の向きおよびＦＥＭの縁の向きは、ＩｍａｇｅＪのＯｒｉｅｎｔａｔｉｏｎＪを用いて測定した（Ｐｕｓｐｏｋｉ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１９，６９−９３（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１６））。向きの画像は、解釈を可能にするために、細胞クラスター間隔の約０．１倍の長さ尺度でガウスぼかしを使用して平滑化した。
【０１５５】
コラーゲンストラップの向きは、手動注釈によってＩｍａｇｅＪで決定した。少なくとも３のシグナル対ノイズ比でコラーゲン蛍光を有するストラップを向きプロットに含めた。
【０１５６】
レーザー微細切除（Ｚｅｉｓｓ  ＰＡＬＭ  ＭｉｃｒｏＢｅａｍ）により約１００μｍ×１０μｍトラックの切除の３０分後にゲルの反発を測定した。レーザー出力は、細胞クラスターから離れた対照領域で調整して、ゲルの厚さ全体を確実に切断した。
【０１５７】
撮像。再構成された組織の折り畳みの３Ｄタイムラプスは、横河電機ＣＳＵＸ１スピニングディスクとＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｅｖｏｌｖｅ  ５１２  ＥＭＣＣＤカメラとを備えたＺｅｉｓｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１を用いた３０ミクロンのＺスライス空のあるＺｅｉｓｓ  Ｚｅｎ  ２０１２ソフトウェアを通じてタイル化共焦点顕微鏡を介して１０倍対物レンズを用いて３７℃、５％ＣＯ２で記録した。
【０１５８】
共焦点データからの再構成した組織の空間再構築。共焦点画像を、手動でまたは半自動閾値処理によってのいずれかでＩｍａｇｅＪにおいてセグメント化した。次に、２進法画像スタックを、ＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）に読み込み、マーチングキューブを介して等表面メッシュに変換した。メッシュを平滑化し、個別化したスクリプトを使用して局所的な湾曲にフェースカラーを割り当てた。
【０１５９】
キャップ再構成した組織について報告された湾曲は、再構成された組織の中心を手動で拾って起点として機能させた後に、放射状に再切断し、ＩｍａｇｅＪにおいて閾値処理することによって生成した。放射状スライスをＭＡＴＬＡＢに読み込み、最小二乗法を円に当てはめた。異方性湾曲を、示された切断平面および折り畳みについて同様に生成した。
【０１６０】
免疫蛍光。再構成した組織を新たな２４ウェルプレートへ移し、室温で４５分間、２％パラホルムアルデヒド中で固定した。液体処理は全て、ピペットチップによる機械的破壊を避けるために、再構成した組織を光学顕微鏡によって観察しながら行った。再構成した組織を１回の洗浄あたりＰＢＳ中の１００ｍＭグリシンで２０分間として３回洗浄し、ＰＢＳ中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で１５分間透過処理し、これらを全て室温で行い、ＰＢＳ中のヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂフラグメントの１：５０希釈物（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  １１５−００７−００３）を含む０．１％ウシ血清アルブミン、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０４％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％ヤギ血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １６２１００６４）中で、４℃で一晩ブロッキングした。再構築した組織をブロッキングバッファー中の１次抗体で、４℃で一晩プローブ付けし、ブロッキング緩衝液中で１回につき１時間、３回洗浄した。このプロセスを２次抗体について反復した。次に、再構成された組織をＦｏｃｕｓＣｌｅａｒ（ＣｅｄａｒＬａｎｅ  ＦＣ−１０１）で撮像した。１次抗体は、ウサギ抗ヒトサイトケラチン１４（１：５０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＲＢ−９０２０−Ｐ）およびマウス抗ヒトサイトケラチン１９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ６２８５０２）とした。２次抗体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（それぞれ１：２００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａ２１２３５およびＡ３１５５６）とした。
【０１６１】
ニワトリ腸撮像。受精した白色レグホン鶏卵を、インキュベートし、窓を開け、さもなくば既に説明したとおり取り扱った（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９９９）。示された胚の日に腸管を取り出すために胚を解剖した。管を約２ｍｍのセグメントに切断し、次に縦方向に管腔表面を露出させた。組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１回の洗浄につき５分間ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ臭化エチジウムで１５分間染色し、同様に洗浄し、これらを全て室温で行った（Ｅａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，２００５）。内腔表面を、２倍の倍率でマクロ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＡＺ−Ｃ２Ｓｉ）を用いて撮像した。
【０１６２】
有限要素モデル化。再構成された組織は、Ｒｈｉｎｏ  Ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒアルゴリズムモデル化環境内の位置を基にした動力学解像装置であるＫａｎｇａｒｏｏ２を使用してモデル化した。本発明者らは、双方向で迅速な再構成組織プロトタイプ分類を可能にするために、比較的抽象的な形状発見ＦＥＭアプローチを採用した。立方体状のユニットセルは、クワッドあたり２つの対角線を持つクワッドメッシュ面から構成された。ユニットセルを組み立てて、空間分解能とシミュレーション時間とのバランスを取りながら、単位縁長当たり０．１ｍｍの尺度で、再構成された組織をモデル化するよう集合させた。縁は全て、剛性ｋ１および初期長に等しい静止長を有する線形弾性要素としてモデル化した。組織位置はモデルのメッシュ頂点よりも１０倍高い解像度で指定されているため、ＤＰＡＣ組織座標を再スケーリングして丸めることによって、上または下のモデル面で指定されることになっているアクチュエータノードを生成した（空間エイリアシング人工産物を修正しようとはしなかった）。これらのノードと一致するｘｙ平面内の縁は、ばねネットワーク内の他の縁と比較して３倍超大きなばね定数ｋ２を持つ活動性の高い縁として指定され、ユーザが静止長を操作した。
【０１６３】
この方法で構築されたモデルはしたがって、２つのパラメータ、すなわち、活動性のない縁Ｋ１の剛性、および活動性のある縁の静止長Ｓを有していた。Ｋ１は、ｔ約２１時間で、ｄ＝１００ミクロンキャップの湾曲データを近似するために、ｓ＝０についてこれを反復することによって手動で取り付けた。このｋ１の値を次に、その後のシミュレーション全部について使用した。再構築された組織を、典型的には、０〜１の範囲のｓの１０個の値についてシミュレートし、再構成された各組織設計について中間的な折り畳み状態で対象のファミリーを生成した。モデルにより再構成した組織を焼灼してＲｈｉｎｏから運び出し、Ｚｂｒｕｓｈ（ＰＩｘｏｌｏｇｉｃ）で再メッシュして、メッシュ面の向きの欠陥を除去し、ＭＡＴＬＡＢに読み込ませ、ボクセル化し、等面メッシュに変換し、平滑化し、フェイルカラーを、カスタムスクリプトを用いて局所的な湾曲へとマッピングした。
【０１６４】
ｓは、再構成した組織のインビトロでの折り畳み時間に直接類似していないので、モデルにより再構成した組織を対応する撮像時点から実験により再構築された組織への湾曲分布の質的類似性に基づいてモデルにより再構成した組織を選択した。
【０１６５】
統計分析。Ｐｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ）におけるＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた通常の一方向ＡＮＯＶＡを介した試料手段間の統計学的有意差について、データを分析した。
【０１６６】
再構成した組織における切除後の局所的牽引からの張力の推定。ゲル表面での牽引のリアルタイム撮像は、適切な長さ尺度の切断と共焦点顕微鏡法とにおけるミスマッチによって制限されたので、およそ３０分後に切開を行い、結果として得られた切開を撮像した。３０分後、本発明者らは、弾性組織の反発による歪みが完全に実現されることになっていると予想した（Ｂｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）が、細胞クラスターにおける活動的な引きによる継続的な歪みは、コラーゲンストラップに沿って約１０μｍ未満に制限されることになった（図１１Ｃ）。生きた生物学的状況において粘弾性牽引を研究するために典型的に用いられるＫｅｌｖｉｎ−Ｖｏｉｇｔモデルから、時間依存性動力学を破棄して、張力下で弾性ばねを切断することに類似しているとみなす（Ｂｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｔａｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。したがって、切除後のゲル表面の緩和切開幅をＬとし、レーザー照射によって即時破壊されたゲルの幅をＬｏとすると（実際、細胞クラスターを欠く対照ゲルにおけるレーザービーム幅または切開幅）、切除した切開部Ｆα（Ｌ−Ｌｏ）に直交する前張力。
【０１６７】
等方性再構成組織湾曲のスケーリング解析。小さな湾曲（板厚よりも小さいたわみ）の場合、板の中央平面からの任意の垂直距離ｚにおけるｙｚ平面のひずみが次式で与えられるように、本発明者らは、再構成された組織を合成弾性板として近似する。
2019520048.tif 000003
【０１６８】
式中、Ｃｙｚはｙｚ平面に平行な中央平面の湾曲である（Ｔｉｍｏｓｈｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗｏｉｎｏｗｓｋｙ−Ｋｒｉｅｇｅｒ，１９５９）。本発明者らは、再構成した組織上の等方性アクチュエータのアレイが、総数Ｎｃに比例して、所与の時点ｔでゲル表面に正接する空間的に均質な歪みを生成すると仮定する。
2019520048.tif 000004
式中、εｙｚは、細胞クラスターのコラーゲンマトリックス歪み率であるようである。εｙｚの実験的に測定された値は、局所的および包括的なコラーゲンゲルの歪みにおける大きな範囲については経時的にほぼ一定であるように見える（Ｍｅｓｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。したがって、［１］と［２］とを組み合わせることは、中間時点で等方性の再構成された組織の折り畳みを説明する較正データに適合するように、形状Ｃｙｚ  αＮｃの１次モデルを示唆している。
【０１６９】
異方性の折り畳みの忠実度。本発明者らは、移動速度の細胞タイプ特異的差異が、初期クラスター位置が異方性湾曲をコードする忠実度を予測するであろうと仮定した。本発明者らは、間葉様癌細胞（ＭＣＣ）が特徴的な時間τｄ／２の７．５時間で８０μｍのクラスター対間隔ｄ／２の半分の特徴的な距離に移動したのに対し、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）がこの閾値に１１時間で達したことを発見した（図１４Ｃ）。類似の間隔の格子を有する等方性の再構成した組織の折り畳み時間は、それぞれＭＣＣおよびＭＥＦの細胞タイプについて約１０時間および５時間であったため、これらのデータは、ＭＣＣクラスターが有意な折り畳みの生じる前の初期位置から分散するのに対し、ＭＥＦはそうではないことを示唆する。折り畳み中に、意図された位置から離れる細胞のこの分散は、空間的に制御されないひずみ、したがって制御されていない湾曲を生じる傾向があるであろう。この仮説をさらに調べるために、本発明者らは、等方性または高度に異方性の格子において（横軸に対して）クラスター間に引張コラーゲンストラップが形成した角度を測定した（図１４Ｄ）。培養９時間では、クラスター間のストラップは、細胞の種類にかかわらず、等方性の格子において０度と９０度の角度に沿って最も近い隣に主として向けられていた。しかしながら、１５時間では、初期クラスター位置から離れる細胞移動の混乱効果のために、ストラップの向きが無作為に分布することとなった。
【０１７０】
異方性格子については、クラスター間のストラップは主に、９時間で最も近い隣に向けられ、横軸に沿って０°に集中した。しかしながら、１５時間では、ＭＥＦ格子と比較した場合、異方性ＭＣＣ格子において、ストラップはこの軸からより頻繁に離れるように向いており（すなわち、より混乱しており）、初期クラスター位置から離れる広範なＭＣＣの移動と一致していた。これらのデータは、細胞株率と移動速度との比における閾値が、所与の細胞タイプが再構成した組織を十分な忠実度で作動させる程度を決定することを示唆している。
【０１７１】
ポップスルーするために隣接する向かい合う折り畳みの頑強性。交互の負と正の湾曲（すなわち、向かい合う折り畳み）の隣接する折り畳みの設計についての中心的な懸念は、平面外の変形が意図しない方向に現れる「ポップスルー」欠陥に対する折り畳みの頑強である。向かい合う折り畳みは、ｘｙ平面における空間的に異なる領域でＥＣＭシートの反対側に細胞クラスターを配置することによって構築することができる。このような欠陥に対する本発明者らの再構成した組織の頑強性を研究するために、本発明者らは、同じ向きの３つの折り畳みと単一の点に収束する向かい合う向きの１つとを有する４つの折り畳みの頂点組織を構築した。本発明者らは、向かい合う折り畳みが首尾よく形成されるためには、類似の数の細胞クラスターによって作動する必要があるので、特定の折り畳みの向きは、より根本的に湾曲した隣接する折り畳みによって決定されないであろうと仮定した。実際に、向かい合う折り畳みのクラスターの数が２つの隣接する折り畳みの平均数の約半分未満であるときに、不正確な向きに向かい合う折り畳みが形成した臨界閾値が現れた（図１８）。しかしながら、この比の値が約０．７５を超えると、向かい合う折り畳みが常に正しい向きに突き出て、空間歪み特性が適切に管理されている場合、隣接する向かい合う折り畳みが頑強に形成されることを実証した。
【０１７２】
パッセンジャー細胞の挙動の調節。恐らく局所的なコラーゲン濃度および／または折り畳み時の線維芽細胞によって調整されたアライメントに応答して、折り畳みのない対照組織と比較して、ＨＵＶＥＣ細胞は、新生の折り畳みに沿って優先的に移動した４折り畳み頂点の再構成した組織中の３折り畳みの交差点でパッチとしてパターン化した（図２０）。これらのデータは、再構成された組織が、折り畳みに必要なマトリックス歪みおよび整列を生成する細胞、ならびに折り畳みが進行するにつれてこれらの微小環境上の手がかりに動的に応答する他の細胞タイプを組み込むことができることを示唆している。
【０１７３】
実施例１：プログラムされた細胞の収縮性を介した組織の指向性折り畳み
湾曲を薄いポリマー層に加工する努力は、しばしば、少なくとも部分的に予測可能な湾曲および座屈変形によって緩和することのできる、材料内の差次的な収縮または膨張による面内応力の発生に依存する。これらの平面外変形は、ヒンジを用いてシートを精巧にすることによって、または異方性材料特性を使用して所定の方向に沿って湾曲を偏向させることによって、さらに制御することができる。
【０１７４】
有意な操作の制御は、非生物的な系において達成されたが、折り畳まれた生体組織の構築に向けた進歩は、細胞が微小環境下で機械的な力をどのように発生させ、それに応答するかについての不完全な知識によってまず制限されてきた。次に、このような力に応答した湾曲および折り畳みの出現は、細胞タイプおよび分布、ならびにＥＣＭの剛性および組成などのパラメータに対する工学的制御を可能にする組織模倣モデル系の欠如の影響を受けている。これらの課題に対処するために、本発明者らは、均一なＥＣＭゲルの表面に包埋された収縮性組織間の力発生を研究し、パターン化された収縮ネットワークを用いてその後の平面外湾曲を研究する。
【０１７５】
組織の折り畳みを駆動する凝縮力学の十分性を確立するために、本発明者らは、細胞圧縮、ＥＣＭ再配列、機械的力、およびこれらの特性と近傍の組織界面の折り畳みとの関連性の詳細な解析を可能にするインビトロモデルを開発した。本発明者らは、胚性間充織に類似した微小環境を再構築することから始まり、その上にラミニンに富む基底膜の成分を、２５０μｍ厚のゆるやかでコラーゲンに富む線維性ＥＣＭのスラブに組み込んだ（Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｗａｔｔ，１９９３、Ｇｅｒｓｄｏｒｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｓｔｕａｒｔ  ａｎｄ  Ｍｏｓｃｏｎａ，１９６７）。本発明者らは、ゲルスラブの表面近くにマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を包埋した（図４Ｃ〜図４Ｅ、図５Ａ）。ゲル中の初期細胞位置を制御するために、本発明者らは、ＤＮＡでプログラムされた細胞集合（ＤＰＡＣ）（Ｔｏｄｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）のようなパターン化技術を使用し、ゲル線維再配列をモデル化するために、本発明者らは有限要素モデル化（ＦＥＭ）を使用した（図５Ｂ、図６〜図８）。細胞は初期に等方性ゲル中でマトリックス線維をひずませ、整列させることが既に示されている牽引力を発生させる（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、Ｓａｗｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ、２００２、Ｖａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。これらの報告と一致して、本発明者らは、ＭＥＦの格子が焦点に向かって凝縮すること、および凝縮と関係した放射方向の歪みが主に周囲のＥＣＭの圧縮によって説明されることを発見した（図５Ａ）。再構成された組織界面に５〜８個のＭＥＦの単一クラスターを含む最小限の収縮系でさえ、コラーゲン線維の顕著な局所的な濃縮および放射方向の整列を生じた（図９）。そのうえ、最大４００μｍほど分離されたクラスターの単離された対について、本発明者らは、それらの相互作用軸に沿って増幅されたコラーゲン線維の圧縮および再編成が「ストラップ」を形成することを発見した（図５Ｂ、図１０）（Ｓａｗｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ，２００２）。
【０１７６】
図１０（Ｅ）は、線維芽細胞の離間したクラスターと、基質に対するゲルの反対側の表面の付着との組み合わせを利用して、反対側の表面が第１の表面における局在性湾曲の導入の際に反対側の表面が折り畳まれるのを防ぐことによって、コラーゲンの豊富なゲルの第１の表面における局在性湾曲の形成を示す。図１０（Ｅ）は、線維（例えば、コラーゲン）を含むポリマーマトリックスの表面を拘束することによって、折り畳みがマトリックスの片側にのみおよびその側の局在性領域においてくぼみまたは湾曲があるよう、ゲルの片側（すなわち、片面）にのみ折り畳みが制限されることができ、すなわち一方の表面上の所定の領域のみが圧縮を受け、局在的な裂け目の形成をもたらす。このような方法は、真皮乳頭における毛包形成の初期段階をモデル化するために利用され得る。
【０１７７】
拘束および局在的な折り畳みの変形例において、組織の周縁を付着させること、例えば、平面状組織の周囲を基質へ付着させる一方で、平面状組織の上面および底面が基質への付着から自由となっていることを包含し得る。離間した線維芽細胞クラスターの配置は、クラスター間の位置に存在するポリマーマトリックスを折り畳ませると同時に、線維芽細胞クラスター間の領域に存在するゲルが、ゲルの周囲に配置された拘束のために引き伸ばされて薄くもなる。
【０１７８】
開示された方法の他の変形例において、組織の内部の１つ以上の領域は、収縮性細胞の所定のパターンが組織の他の領域を折り畳ませる一方で、局所領域へ圧縮力を加えることによって拘束され得る。
【０１７９】
弾性ばねから構成された単位細胞の格子内の等方性収縮結節点からなる２パラメータＦＥＭは、結節点間で同じ増幅されたメッシュ整列を定性的に捕捉し、これらの領域があまり強く整列されていない領域と比較して高い引張応力と一致することを示唆した。生物物理学的研究は、増大した引張応力下でのゲルの領域が、切開部に直交する局所的な張力に比例して切断の際に弾性反動を受けなければならないことを示唆している（Ｂｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｌｅｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。実際、両方の実験およびＦＥＭにおいて、ストラップに直交する領域、または細胞から離れた対照領域と比較して、ストラップに集束ＵＶレーザーを用いた切除の際に、ゲル表面の有意により大きな反動が起こった（図５Ｃ）。
【０１８０】
細胞凝縮、ＥＣＭ圧縮、および線維整列は、いくつかのインビボ系で観察される間充織凝縮の署名変化である。整列した線維の引張応力の蓄積をさらに実証することにより、本発明者らの観察は、間充織凝縮のプロセスが線維性ＥＣＭゲルを歪ませる力を発生させる可能性があることを示している。単一の組織界面に沿った小さなひずみについては、その湾曲の比例変化を本発明者らは予想するであろう。実際に、本発明者らは、単一凝縮クラスターに近接した組織界面において、ならびにクラスターの対間のコラーゲンストラップに沿って、湾曲の進行性の出現を観察した（図９、図１０）。本発明者らは、個々の細胞クラスターの周りの湾曲の変化を引き起こす同じ現象が、機械的に結合した細胞のネットワークの累積作用を通じて、かなりより大きな距離にわたって組織界面の湾曲を設定することができると仮定した。このようにして、間充織細胞を凝縮させる位置および密度は、界面の歪みを決定しなければならず、それによって組織の最終的な構造との直接的、予測可能、および再現性のある関連性が得られ、これらは、何らかの頑強な発生上のプログラムの鍵となる必要条件である。
【０１８１】
このことを確認するために、本発明者らは、凝縮格子における細胞配列を、等方性および異方性の細胞格子（図５Ｄ）の２つの折り畳みモチーフについて、面外湾曲に定量的にマッピングした。本発明者らはまず、ＤＰＡＣを用いて遊離浮遊しているＥＣＭゲルの上面に細胞クラスターの等方性グリッドを調製した（ｘおよびｙにおけるクラスター間の等間隔ｄ＝ｄｘ＝ｄｙ）。これらのゲルは、経時的に増大した湾曲を有する放射方向に対称な陥入を形成した。そのうえ、陥入ゲルの初期湾曲は、凝縮する細胞タイプが周囲のＥＣＭをひずませる速度に比例するとともに、湾曲の動的特性は約５〜４０時間超の特徴的な時間スケールに及んだ（図１１、図１２）。
【０１８２】
本発明者らは、組織全体の共焦点顕微鏡法による折り畳みの時間的動的特性の詳細な測定を可能にするために、間充織様癌腫細胞（ＭＣＣ）の等方性格子を有する比較的緩徐な折り畳みにより再構成された組織を選択した。本発明者らは、与えられた時点でのゲル湾曲Ｃがより小さなｄについて単調に増大することを発見した（クラスター数ＮｃはＮｃ〜１／ｄ２として増大した）（図５Ｄ）。実験的なＣのデータ対Ｎｃのデータは、両方の比例する尺度関連性によって（定常歪み−速度アクチュエータによって誘導される湾曲についてＲ２＝０．８）（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｔｉｍｏｓｈｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗｏｉｎｏｗｓｋｙ−Ｋｒｉｅｇｅｒ，１９５９）、および本発明者らのＦＥＭの３Ｄ実装によって適切に適合した。本発明者らは、湾曲の出現が、スタウロスポリンを用いた凝縮細胞のアポトーシスを誘導する際に、事前に折り畳まれていた組織が４０％未満ほど開いていたので、広範かつ不可逆的なゲル再モデル化と一致することをさらに発見した（図１３）。
【０１８３】
放射方向に対称な陥入を超えて移動する場合、凝縮中の異方性格子における最も近い隣接するクラスター間で優先的に、張力を支持するコラーゲンストラップが形成されるので、本発明者らは、ｙ軸と比較してｘ軸に沿った細胞クラスターの密度がより高い異方性モチーフが、ｙ軸に沿って実行する折り畳みをプログラムするであろうと予測した（図１４）。実際に、異方性ＭＥＦ格子は、期待軸に沿って一貫してゲルを折り畳み、ｘおよびｙにおける湾曲の異方性は、クラスター間隔の異方性にほぼ比例していた（図５Ｄ）。驚くべきことに、収縮性が比較的低く移動性が比較的高いＭＣＣによって作動する同一の格子は、予測可能な軸に沿って制御された異方性の折り畳みを形成しなかった（図１５）。さらなる調査の際、本発明者らは、所与の凝縮する細胞タイプの細胞移動速度に対する折り畳み速度の比が、異方性の折り畳みを特定できる忠実度を決定する上で重要であることを発見した。
【０１８４】
本発明者らは、等方性、異方性、および３つの追加の折り畳みモチーフ（カール、複合、および対向）を構築および組み合わせることによって、間充織凝縮物がゲルを複雑な形状に折り畳むことができる一般性および頑強性を探求し続けた（図１５、図１６および図１７）。本発明者らはまず、１ｍｍの間隔および２００ミクロンの半径の部分的に閉じたらせん状をコードする、ＭＥＦクラスターのラインを長方形のＥＣＭ基質に対して４５°の角度で配置したカールモチーフを実装した（対応するＦＥＭファミリーのメンバーにおける１．２ｍｍおよび２２０ミクロンと同等の値）（図１５Ｂおよび図１５Ｃ）。モチーフを組み合わせて、本発明者らは、異方性格子に複合湾曲を組み込んで、ｙにおける３００ミクロンほど離れたｘ設定における８０〜２５０ミクロンの対数間隔クラスターのラインを使用してロール状のチューブ形態にした（データ非表示）。チューブは、全長にわたって中空であり、内径は長さ方向に５５０ミクロン±９％（５５５ミクロン±４％ＦＥＭ）であった。本発明者らは次に、対向する湾曲のモチーフを４折り畳み頂点の形態に組み込み、同じ向きの３つの折り畳みが単一の点で反対向きのものに収束するようにした。本発明者らは、隣接する折り畳みをコードするクラスター密度が同等である場合（図１８）、このような対向する折り畳みパターンが「ポップスルー」欠陥に対して頑強であることを発見した。
【０１８５】
異方性、複合、および対向する湾曲の折り畳みモチーフを組み合わせると、間隔１．６ｍｍおよび振幅１３０ミクロンの波形（ＦＥＭにより、１．６ｍｍおよび１１５ミクロン）が生じた（図１５Ｄおよび図１５Ｅ）。次に、本発明者らは、上面および底面に同心の細胞クラスター格子のセットを使用して、単一のＥＣＭシートに２つの隣接する対向する等方性キャップをコードした。局所的には、このようにして生成された湾曲特性は、方位角が＋１．６±３４％で、培養１２時間後に−２．１ｍｍ−１±３０％で類似していた（が、反対のサインであった）（＋２．３ｍｍ−１＋ＦＥＭにより１５％および−２．１±２９％）が、この「非展開性」形状の残留面内応力は、その周辺で観察されるシートのさらなる座屈をもたらしそうであった（Ａｒｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１８６】
局所的な面内残留応力と組織の折り畳みの軌道とのインビボでの関連性は、組織境界条件の複雑な関数であり、細胞分裂、細胞形態変化、およびＥＣＭ再モデル化を含む代償性細胞挙動のフィードバックである（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ａｎｄ  Ｄｕｆｒｅｓｎｅ，２０１４、Ｌｅｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。本発明者らは、球形および立方体の再構成した組織を可能にするために、折り畳む前に表面を戦略的に切断することによって組織境界条件の改変を具体的に探究した（切り紙芸術形態にあるように）（Ｓｕｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。本発明者らは、折り畳む前にゲル基質のレーザー微量切除を用いて両方の組織構造を構築し（図１５Ｆおよび図１５Ｇ）、後者の場合、連続的な立方体の縁で異方性の湾曲を利用して折り畳みを作動させる。
【０１８７】
形態形成のプロセスは、しばしば、腎臓のネフロン、肺の肺胞、および真皮−表皮接合部の折り畳みなどの構造モチーフの反復的な並置をもたらす。本発明者らは、異なる折り畳みモチーフを組み合わせて多様な折り畳みのファミリーを作ることができると考え、これらの折り畳みは、より大きなサイズおよび複雑ささえ、構造を構築するためにサブユニットを反復するようにタイル貼りすることができた。第１３〜１６日胚（Ｅ１３〜Ｅ１６）のニワトリ腸のジグザグ形状の内腔表面（Ｓｈｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に触発されて、本発明者らは、三浦折りと類似の４折り畳み接合部のモザイク細工を設計した（図１９Ａ）。三浦折りは、負のポアソン比、および複雑な標的表面に概して適合する能力を含む、いくつかの珍しい幾何学的特徴を有する（Ｄｕｄｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。本発明者らの三浦設計の有限要素モデル化は、ニワトリ腸との著しい類似性で折り畳み軌道を予測した（図１９Ｂ）。実際に、構築された三浦折りは、６×８ｍｍの平らなシートから４×６ｍｍのジグザグ構造まで１５時間で自律的に出現し、３１の折り畳みが全て、ＦＥＭの場合と同様の正確な向き、周期性および振幅を有する。
【０１８８】
発達における組織の折り畳みプロセスの顕著な態様は、複雑な細胞組成を有する微小環境内であっても、これらの湾曲軌道が概して頑強であることである（Ｎｅｌｓｏｎ，２０１６、Ｓａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。それゆえ、本発明者らは、他の細胞タイプを「パッセンジャー」として組み込む再構成した組織における間充織凝縮駆動折り畳みの頑強性を試験した。本発明者らは、ＥＣＭ上のパッセンジャー細胞の機械的活性が凝縮間充織細胞の機械的活性よりも有意に低い場合、ＦＥＭによって予測される所与の折り畳み軌道が崩壊しないであろうと推論した。それゆえ、本発明者らは、ＭＥＦおよび初代ヒト乳房線維芽細胞が、内皮株および上皮株を含む他の一般的な細胞タイプよりもはるかに大きく液滴を収縮させることを発見したので、ＥＣＭ液滴を収縮させる能力について７つの細胞タイプをスクリーニングした（図１９Ｃ）。これらのデータは、それ自体が大部分の組織の重要な構成要素である後者の細胞タイプが、間充織の特性によって支配される折り畳み軌道に干渉しないことを示唆した。同様に、凝縮間充織と並置して追加の細胞タイプを含む本発明者らの能力は、凝縮間充織によって方向付けられる変化する組織構造に応じて、パッセンジャー細胞の挙動が変化するという２次的な可能性を高めた（Ｍａｍｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｓｈｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１８９】
これらの仮説を試験するために、本発明者らは、三浦パターンに折り畳まれるように方向付けられた再構成組織中の複数の細胞型をパターン化した（図１９Ｄ〜図１９Ｆ）。３つ折りのＨＵＶＥＣコードは、初期の折り畳みの真下に配置され、折り畳みプロセス中に運ばれたのに対し、Ｃａｃｏ２細胞（結腸癌細胞株）は、これらを組織表面の近くに均一に包埋することによって、上部に担持された。本発明者らは、これらのパッセンジャー細胞を含む三浦組織の折り畳まれた形態が、ＦＥＭによって予測されたものと類似しており、凝縮間充織細胞の特性が折り畳み軌道を支配することを確認した（図１９Ｂ、図１９Ｅ）。さらに、本発明者らは、ＨＵＶＥＣの移動が初期の折り畳みに沿って偏っていることを発見し、新生組織の形状および変化するＥＣＭ特性がパッセンジャー細胞の挙動にフィードバックすることを示唆した（図２０）。後者の時点で、ＨＵＶＥＣコードはジグザグ折り畳み内に完全に封入されることとなり、３６時間後に１００〜２００ミクロンの管にわたって内腔化された。最後に、本発明者らは、マトリゲル中で３Ｄ嚢胞を形成するＣａｃｏ２細胞（Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）が線維芽細胞のネットワークの上部にある谷折りの底に集中することを発見した。この完全に合成された折り畳まれた組織は、発達中の小腸と著しい類似性を備えた大まかな構造を有していた（Ｗａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０１９０】
動物の発生は、複数の長さスケールでの組織構造の漸進的な形成を包含し、形態形成の各ステップは、先行ステップにおいて形成された構造に基づいて断定される。したがって、組織は、局所的な細胞運命決定を彫刻し、最終的に組織機能を決定するその後の自己組織化プロセスを方向付けるために重要な、その形状および異方性の発生歴が固有に刻印される。間充織凝縮は、上皮と間充織の界面における形状と細胞組成の刻印の根底にある中心的な脊椎動物発生プログラムのうちの１つである（Ｍａｍｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。間充織凝縮中の湾曲の出現と一致する事象は複雑であり、各層の複数の細胞構成要素間の機序および傍分泌シグナル伝達の変化を包含する（Ｅａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，２００５、Ｖａｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ，２０１４、Ｗａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）  。しかしながら、これらのプロセスにおける間充織の機序の寄与は詳細に研究されておらず、湾曲の開始は主に移動または形状変化などの上皮細胞の挙動によって駆動されると仮定されている（Ｌｅｃｕｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ゆるくて線維状のＥＣＭ複合体の文脈において、凝縮間充織細胞の機序および力学は、近くの組織界面における種々の形態移行を説明するのに十分であることを認めている。これらの場合において、間充織は、細胞がＥＣＭをひずませて圧縮し、ＥＣＭ線維を圧縮領域の間に整列させ、最大線維整列の領域に沿って材料の応力をコード化する活動的な複合材料のように挙動する。これらの応力は、有限要素モデル化を使用して予測できる軌道に沿った組織界面における材料の平面外座屈をもたらした。この生体材料の予測可能な挙動は、インビボで認められた構造と著しい類似性を有する種々の３Ｄ構造に細胞−ＥＣＭ複合体の自律的な折り畳みをプログラムすることを可能にした。このプロセスは、非生物的材料から複雑な形態への自律的な折り畳みに類似している（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｓｙｄｎｅｙ  Ｇｌａｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｔａｌｌｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６  ）。そのうえ、間充織細胞−ＥＣＭ複合体の自己組織化および動的特性は、再構成したアクトミオシンネットワークにおいて観察される現象と顕著な類似性を有しており（Ｌｉｎｓｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、これらの活性のある材料が共通の物理的原理によって誘導され得ることを示唆する。
【０１９１】
重要なことに、本発明者らのモデルは、上皮などの上層組織層のいかなる物理的特性も誘発しない。しかしながら、このモデルは、これらの特性が組織の折り畳みの程度および極性に影響を与えるであろうことを予測する。ここで、再構成された組織およびＦＥＭモデルは、重なり合う材料を無視できる曲げ弾性率を有するものとして処理する。したがって、再構成された組織の上面付近の凝縮は、常に凹状湾曲の領域を形成する。しかしながら、重なっている材料が間充織よりも大きな曲げ弾性率を有する場合、モデル化は湾曲方向の反転を予測し、陥入を血管拡張に変換する（図６）。このモデルはさらに、凝縮事象中の重なっている層の同時の側面からの圧縮を示唆し、プラコードと類似の構造を形成する。これらの研究では興味深い可能性が開かれており、間充織に由来する傍分泌シグナル伝達が重なっている上皮の機械的性質を設定するよう機能し得、それにより、凝縮事象中の折り畳みの方向および程度を決定し得る。間充織上皮相互作用に関するこのような見解は、組織力学と傍分泌シグナル伝達との間の相互作用を通じて、著しく異なる組織構造への上皮および間充織の異なる組み合わせがどのように変化するかを説明し得る。組織座屈における上皮の確立された役割と合わせて、本発明者らの結果は、機械的に活動性のある組織構成要素の組み合わせが、組織の折り畳みのパターン、極性、および程度を開始および強化するために協力し得ることを示唆する（Ｈｉｒａｓｈｉｍａ，２０１４、Ｌｅｃｕｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｎｅｌｓｏｎ，２０１６、Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１、Ｏｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｂｅｒｃｈ，１９８２、Ｓａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｓｈｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｔａｌｌｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｖａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１９２】
発生生物学との関連は別として、本発明者らの研究は、細胞−ＥＣＭ複合体の材料特性および物理的特性の両方に対する動的制御が容易に達成可能である可能性を提起する。この見解において、組織を新しく構築することは、最初の組織構造が３Ｄで組み立てられ、特定の発生原理により、複数の長さのスケールにわたって時間的に進化し、最終的にはより明確で生体様の構造特徴を有する新たな３Ｄ構造に収束する４Ｄプロセスである。このアプローチは、メソスケールでオルガノイド組織モデルの構造、成熟、血管新生を有意に改善することができた（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，２０１４、Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。本発明者らは、これらの努力が、疾患のインビトロモデル操作のために、再生医療のために、およびソフトロボット工学におけるなどの生きた活動性のある材料の将来的な応用のために重要な意味を持つと考えている。
【０１９３】
図４．１〜４．３ 間充織凝縮機構を介した組織の折り畳みの再構成。（Ａ）脊椎動物の胚における組織層の境界面での形態の変化は、しばしば内向きまたは外向きの湾曲部位での間充織細胞の凝縮と一致する。（Ｂ）界面に沿った細胞は病巣に収束し、間充織の凝縮中に３つのサインを呈する。（Ｃ）コラーゲンマトリックス線維を含有するＥＣＭゲルの上面および下面の近傍に細胞の小さなクラスターを構築するために、ＤＮＡでプログラムされた細胞の集合を用いた凝縮の再構成。（Ｄ）ひずみ場は、細胞クラスターの収縮によって、線維性細胞外微小環境へと与えられ、局所的にコラーゲン線維を整列させ、組織座屈（Ｅ）につながる面内力を生成する。
【０１９４】
図５．１〜５．５ 再構成されたシステムは、予測可能な軌道に沿って間充織の凝縮および折り畳みのサインを呈する。（Ａ）マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）のパターン化された格子は、中心の焦点に向かって収束する。細胞−格子の放射方向のひずみおよびその基礎をなすＥＣＭの独立した測定は、組織−媒体界面におけるマトリックス圧縮を支配的な要因とする（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（Ｂ）ＭＥＦクラスターは、数百ミクロンにわたってコラーゲン線維を整列させる。有限要素モデル（ＦＥＭ）における弾性縁の類似の整列は、細胞クラスターによって局所的なゲルひずみを模倣するために長さを減少させることができる活動的な縁からなる収縮性結節点間で生じる。（Ｃ）レーザー切除後のゲル退縮は、ＦＥＭにおける類似の挙動（オフライン）を伴う、縦軸に対するクラスター間（オンライン）の軸に沿った有意に高い引張力を意味する（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋの複数比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ、１群あたりｎ＞９か所の切開）。（Ｄ）ｘｚ平面とｙｚ平面の再構成した組織の湾曲を定量的にコードする等方性ＭＣＣおよび異方性ＭＥＦのクラスター格子の較正曲線（平均±ＳＥＭ、格子形状あたりｎ＞２）。（Ｂ）のＦＥＭの３Ｄ版は、これらの湾曲関係を広範に捕捉している。
【０１９５】
図６．１、６．２ 組織界面におけるＥＣＭ張力は、層機構の相違に依存して陥入または拡張をもたらす。（Ａ）異なる非活動性縁の剛性ｋ１，Ａおよびｋ１，Ｂを有する２つの層ＡおよびＢの界面における活動性縁を介して課せられた内部平面状歪みを受ける弾性ネットワークからなる有限要素モデル。（Ｂ）ｓ＝１からｓ＝０．５まで長さを短くすることによって活動性縁に歪みを与えると、界面での湾曲が始まり、その程度およびサインは、非活動性縁の剛性比ｋ１，Ａ／ｋｋ１，Ｂにより、（Ｃ）。さらに、歪み部位でのプラコード状の肥厚は、モデル（ｋ１，Ａ＋ｋｋ１，Ｂ）における全体的な剛性が低下するにつれてより顕著になる。
【０１９６】
図７．１、７．２ ＤＮＡによりプログラムされた細胞の集合（ＤＰＡＣ）の微小流体統合による再構成した組織の作製。（Ａ）再構成した組織は、離間したガラス顕微鏡スライドからガスケットを介して作製されたガラスフローセルに組み込まれる。上部のガラススライドには、フローセルごとに２つの通孔があり、流体アクセスが可能である。ゲル中の収縮性細胞の位置は、ＤＰＡＣによってまたは標準的な細胞配列技術によってコードされる（図８）。ＤＰＡＣにおいて、細胞上およびスライドガラス上の相補的ＤＮＡ鎖を用いて、各フローセルの上面および／または下面の特定のｘ−ｙ位置に細胞を方向付ける。次に、液状ゲル前駆体を添加して硬化させ、最後に（Ｂ）スライドガラスを分離し、再構成した組織を手動解剖またはレーザー微量切除により切断する。ここでは、本発明者らは、マウスの胚線維芽細胞クラスターの等方性格子を使用してキャップの形態をコードした。（Ｃ）共焦点撮像（ここでは、中間平面ｘｙ切片およびｘｚ切片）は、ＦＥＭからの対応するメッシュと半定量的に比較できるメッシュ対象の計算による再構成によって、円の適合または局所的な湾曲の測定によって対象全体の湾曲を測定することを可能にする。
【０１９７】
図８．非接触細胞プリントによる再構築した組織の作製。（Ａ）ＥＣＭゲルは、非接触アレイ装置を用いて、セミドライフォーマットで細胞を鋳造した後、プリントすることができる。（Ｂ）マウス胚線維芽細胞は、緩やかなクラスターで正常に付着する。（Ｃ）等方性格子を有する細胞プリントした再構成した組織は、培養６時間後に湾曲を呈する。
【０１９８】
図９．１、９．２ 細胞クラスターは、細胞タイプに依存する速度でコラーゲンを放射方向に整列させる等方性牽引物質である。（Ａ）コラーゲンに富むＥＣＭゲルの表面に包埋されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）は、蛍光標識１型コラーゲン線維を局所的に整列させ、界面の湾曲を経時的に誘導する。（Ｂ）（左）ＭＥＦまたは間充織様癌細胞（ＭＣＣ）クラスターによって誘導された平均のコラーゲンの向きのマップ。（右）線維の向きは、ｘ軸およびｙ軸に沿った関心対象の領域（ＲＯＩ）において、およびクラスターに対する２つの半径（ｒ）において、平均の画像の向きを採取することによって定量化した。（Ｃ）２Ｄ弾性有限要素モデルにおいて観測される対応する放射方向の整列。（Ｄ）整列過剰（平均のＲＯＩの向き−ｔ＝０での向き、平均±ＳＥＭ、条件当たりｎ＞４）は、ｘ軸およびｙ軸に沿って等しく、ＭＣＣクラスターよりも単離されたＭＥＦクラスターについて６時間で高かった。（Ｅ）６時間時の整列は、ＭＥＦクラスターおよびＭＣＣクラスターから放射状に崩壊した（平均±ＳＥＭ、条件当たりｎ＝１２）。Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡにより、（Ｄ）および（Ｅ）における整列過剰データを解析した。（Ｆ）ｘとｙの類似の整列過剰の程度も、活動性縁歪みの適用の際に、ＦＥＭにおいて観察される。（Ｇ）整列過剰に関する類似の放射方向の空間的な崩壊がモデル内で観察される。
【０１９９】
図１０．１、１０．２ 細胞クラスター対は、数百ミクロンの距離にわたってそれらの間のコラーゲン線維の整列を増幅する。（Ａ）マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）クラスター間のコラーゲンストラップ形成。（Ｂ）（左）３つの距離範囲で分離されたクラスターについての平均のコラーゲンの向きのマップ。（右）各対の左側のクラスターからｘ軸およびｙ軸に沿った５０μｍのＲＯＩにおける平均の向きを採取することによって、線維の向きを定量化した。（Ｃ）（ｘに沿った）ＭＥＦクラスター間の整列過剰は、６時間時の全ての距離範囲、および単離された等方性牽引物質としてクラスターが挙動するように見える、最大距離以外の間充織様癌細胞（ＭＣＣ）クラスター対について（ｙに沿った）直交方向におけるよりも高かった（すなわち、整列の場はこの時点では互いに連結していなかった）。整列の過剰は、平均±ＳＥＭとしてプロットされ、条件あたりｎ＞４であり、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって解析した。（Ｄ）活動的な縁の歪みの適用の際に、有限要素モデルにおいて、クラスター間の軸に沿った整列余剰の同様の増加が観察される。（Ｅ）ＭＥＦクラスターの単離した対間のストラップ形成は、局所的な界面湾曲の空間的に拡大する領域と一致する。
【０２００】
図１１．１、１１．２ 再構成した組織の湾曲の速度は、作動する細胞がゲルを歪ませる速度によって決定される。（Ａ）（上）細胞の歪み速度は、コラーゲンに富むＥＣＭゲルの上部で、間充織様癌細胞（ＭＣＣ）株クローン（ＭＣＣ１〜３）および初代ヒト乳房線維芽細胞（ｍａｍ．ｆｉｂ．）からの単一の細胞に近位のビーズ変位を測定することによって与える。挿入物：局部的なビーズの変位に至る牽引力を発揮する単一のＭＣＣ２細胞。（下）中間平面のｘｙ共焦点切片は、再構築した組織の湾曲速度を評価することによって定量化することができる細胞タイプによる折り畳み状態の変化を示す（Ｂ）ｄ＝１８１μｍの湾曲等方性組織は、時間に対する（半径方向の）最大曲率軌道の初期勾配から決定される。（Ｃ）所与の作動細胞タイプによって誘導される組織の湾曲速度（平均±ＳＥＭ、細胞のタイプあたりｎ＞２）は、その歪み速度にほぼ比例する。
【０２０１】
図１２．１、１２．２ 等方性の再構成した組織は、単調な湾曲軌道に従う。（Ａ）（左）収縮性の間充織様癌細胞（ＭＣＣ）クラスターの等方性格子でパターン化されたＥＣＭゲルについての湾曲測定手順の概略図。（右）再構成した組織が、格子密度の関数として増大する速度で湾曲を発達させることを示すｘｙ共焦点切片。（Ｂ）示された間隔のＭＣＣクラスター格子によって作動する個々の組織の湾曲軌道。湾曲は、ゲル厚の桁により、半径で飽和するように見える。
【０２０２】
図１３．再構成した組織は、作動細胞を切除した後に部分的にしか開かない。（Ａ）２０μＭのスタウロスポリン（非特異的キナーゼ阻害剤）を用いて間充織様癌腫細胞を死滅させることは、ｘｙ共焦点切片を介して観察され、スタウロスポリンの添加の直前に、再構成された各組織群における平均最大湾曲に対する最大ワン強としてプロットされるように、事前に折り畳まれた等方性組織の湾曲において中等度の低下をもたらす（条件あたりｎ＝４の再構成した組織、平均±９５％信頼区間エンベロープとしてプロット）。（Ｂ）スタウロスポリンの効能は、２０μＭのスタウロスポリンがほぼ完全な細胞死を引き起こすのに十分である標準的な組織培養プラスチックで培養された細胞に関する別個の実験においてアッセイした（細胞生存度は平均±ＳＥＭとしてプロット、ｎ＝６）。
【０２０３】
図１４．１〜１４．３ 異方性の折り畳みの忠実度は、収縮性クラスターの移動によって制限される。（Ａ）（左）間充織様癌細胞（ＭＣＣ）またはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）クラスターの異方性格子でパターン化された再構成した組織についての湾曲測定結果を示す概略図。（右）異方性ＭＥＦ格子が、意図された軸に沿って異方性の折り畳みを誘導するが、異方性ＭＣＣ格子はそうではないことを示す、ｘｙ共焦点切片および再構成メッシュ。（Ｂ）湾曲異方性は、ＭＥＦ再構成組織についてはクラスター間隔異方性とともに増大したが、ＭＣＣ組織については増大しなかった。（Ｃ）（Ｄ）と同じ実験における異方性格子における細胞移動の定量。本発明者らは、細胞が初期位置からのクラスター間隔ｄ／２の半分の距離に達するための中央値時間τｄ／２を定量化する。（Ｄ）等方性および異方性のＭＣＣ格子およびＭＥＦ格子についての横に対するコラーゲンストラップの向きについての最大ビン値によって正規化された放射方向の棒グラフ。１５時間でのＭＣＣ格子については軸外ストラップの有意な向きだが、ＭＥＦ格子については有意な向きではないことに留意されたい。
【０２０４】
図１５．１〜１５．４ 間充織の凝縮は、組織界面を多様な３Ｄ形状に彫刻するのに十分である。（Ａ）３Ｄ有限要素モデルを用いて構築された５つの折り畳みモチーフ。（Ｂ）局所的な平均湾曲Ｃによって着色されたメッシュとして、および中央組織切片として示される、モデルのらせん状および管状の組織をコードする収縮性結節点の位置。（Ｃ）２つの撮像時点における対応する組織の湾曲でマッピングされたメッシュとしての共焦点顕微鏡写真の再構成。（Ｄ）、（Ｅ）発生可能な波状組織および発生不可能な向かい合ったキャップ組織。向かい合った湾曲は、再構成された組織の上面（オレンジ色）および底面（白色）の両方にマウス胚線維芽細胞を配置することによってコードされる。ｙ軸周りの方位角において１０°の増分で各キャップに局所的に取り付けられた中間組織切片は、隣接するキャップ間およびモデルと実験組織との間の同等の湾曲特性を示す。（Ｆ）、（Ｇ）レーザー微量切除を用いた戦略的切断によって可能になった、折り畳まれた球状および立方体の再構成組織。
【０２０５】
図１６．１、１６．２ カール状、チューブ状、波形の再構成組織の断面解析（Ａ）図１５Ｂおよび図１５Ｃにおけるカール状組織についての実験用メッシュおよびモデルメッシュ、ならびに直交図。（Ｂ）図１５Ｂおよび図１５Ｃの管についてのメッシュおよび図。（Ｃ）図１５Ｄおよび図１５Ｅの波形組織についてのｘｙ平面およびいくつかのｘｚ切片。
【０２０６】
図１７．１、１７．２ 二重キャップ、球体、立方体および三浦再構成組織の切片解析。（Ａ）図１５Ｄおよび図１５Ｅにおける二重キャップ組織のキャップ中心を通る実験用メッシュおよびモデルメッシュ、ｘｙ切片、ならびにｙｚ切片。ｘｙ平面における角度の関数としてキャップに取り付けられた円は、湾曲の均一性を示す。（Ｂ）図１５Ｆおよび図１５Ｇにおける球についてのメッシュおよび直交図。（Ｃ）図１５Ｆおよび図１５Ｇにおける立方体のメッシュおよび直交図。（Ｄ）図１９Ｂにおける１５時間での三浦テッセレーションの長さに沿った実験用メッシュおよびモデルメッシュならびにｘｚ切片。
【０２０７】
図１８．再構成された組織の向かい合う折り畳みは、ポップスルー欠陥に対して頑強である。（Ａ）単純な向かい合う折り畳みは４つの折り畳みの頂点である。本発明者らは、向かい合う折り畳み（折り畳み２）においてパターン化された異なる数のマウス胚線維芽細胞で再構成した組織についての各折り畳みにおける湾曲を定量した。（Ｂ）向かい合う折り畳みに沿ったクラスターの数が少ない場合、不正確な向きへと外側に飛び出すのに対し、隣接する折り畳みにおけるクラスターの平均数の約０．７５倍より高い比でクラスター数についての正確な向きに現れる（線形最小二乗法に適合してプロットした比、および実験データ用の９５％信頼区間エンベロープ）。（Ｃ）ポップスルーおよび正確な折り畳み構造における再構成組織のメッシュ再構成。
【０２０８】
図１９．１〜１９．３ 間充織凝縮で駆動される組織の折り畳みは、複雑な折り畳みの近くでの複数の細胞タイプの同時の自己集合に対して頑強である。（Ａ）第１６日胚（Ｅ１６）ニワトリ腸管腔は、マウス胚線維芽細胞を凝縮させることによってコードされる４折り畳み頂点パターンのタイル形成によって再構成することができるジグザグの三浦様折り畳みを呈する。（Ｂ）モデルと実験用の折り畳みは、折り畳み周期および振幅が一致する複数のｘｚ特性を示す。（Ｃ）コラーゲン含有ＥＣＭ液滴の収縮は、間充織細胞タイプおよび他の線維芽細胞タイプについてはるかに大きな程度まで生じる（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。（Ｄ）三浦組織（Ｅ）における４折り畳み頂点パターンの隣接した折り畳みに沿って３本のコードとしてパターン化されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）。（Ｆ）三浦折り畳みによって包まれた内腔化されたＨＵＶＥＣコード、および組織の上面内に包埋された部分的に連続した層として堆積されたＣａｃｏ２細胞を示す代表的な断面図。Ｃａｃｏ２細胞クラスターは、凹状の折り畳みの内部の収縮性線維芽細胞の頂上に形成される。
【０２０９】
図２０．パッセンジャーＨＵＶＥＣは、新生の折り畳みに沿ってバイアスのかかった運動性を呈する。（Ａ）ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のパッチを、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）によって作動するｎ＝９の４折り畳み頂点再構成組織において等価の極性の３折り畳みの収束点でパターン化した。ＨＵＶＥＣの空間分布を６時間後に測定し、折り畳みを作動させるためにＭＥＦが存在しなかった対照組織のものと比較した。折り畳みは、６時間で最大湾曲が１ｍｍ−１未満であったため、細胞位置の測定における視差誤差は無視できた。（Ｂ）局所的に平均した放射方向の細胞距離プロットは、新生湾曲に沿ったＨＵＶＥＣ移動バイアスを示す。
【０２１０】
実施例２：湾曲のインビボ部位での間充織細胞凝集は、１型コラーゲンの圧縮および整列と関係している
本発明者らの研究は、（腸絨毛およびニワトリの皮膚芽における）生体湾曲の部位におけるインビボでの間充織細胞凝縮が、本発明者らの再構築した組織モデルにおいて本発明者らが生成する類似の１型コラーゲンの圧縮および整列と関係していることを広く示す。
【０２１１】
図２１．（Ａ）マウス胚における腸絨毛は、絨毛の湾曲部位にＰＤＧＦＲ陽性間充織線維芽細胞の凝縮とともに形成される。これらのクラスターは、Ｅ−カドヘリン陽性上皮に対する１型コラーゲン原線維の局所的整列および圧縮に関連する。示されていない結果において、本発明者らは、ミオシンＩＩ阻害剤であるブレビスタチンで処理した外植した腸において、細胞のクラスター化および１型コラーゲンの再モデル化が生じず、このことがこの系における細胞の機械的収縮性を阻害することを発見した。Ｂ）ニワトリ胚の羽芽は扁平上皮から形成され、非特異的臭化エチジウム染色で視覚化することができる。Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ−Ｈａｍｉｌｔｏｎ（ＨＨ）のステージ３２におけるニワトリ皮膚外植片は、培養において羽芽を形成するが、羽芽の間隔および高さは、ブレビスタチンの存在下で破壊される。
【０２１２】
上述の発明は、理解を明確にするために、例示および例によってある程度詳細に説明されているが、本発明の教示に照らして当業者には、ある特定の変更および修正が添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明を実施することができることは容易に明らかである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものであるにすぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるので、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【０２１３】
したがって、上述の説明は単に本発明の原理を例示するにすぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に説明または図示していないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨および範囲内に含まれる種々の構成を考案できることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されている全ての例および条件付き言語は、主として、本発明の原理および本発明者が当該技術を促進することに寄与する概念を理解する上で読者を助けることを意図しているものであり、このような具体的に列挙された例および条件に限定されるものではないと解釈されることになっている。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体例を列挙する本明細書における全ての記述は、その構造的および機能的等価物を両方とも包含するように意図されている。さらに、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たす開発されたいかなる要素も含むことが意図される。それゆえ、本発明の範囲は、本明細書に示し説明した例示的な実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４．１】
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【図４．２】
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【図４．３】
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【図５．１】
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【図５．２】
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【図５．３】
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【図５．４】
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【図５．５】
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【図６．１】
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【図６．２】
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【図７．１】
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【図７．２】
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【図８】
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【図９．１】
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【図９．２】
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【図１０．１】
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【図１０．２】
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【図１１．１】
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【図１１．２】
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【図１２．１】
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【図１２．２】
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【図１３】
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【図１４．１】
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【図１４．２】
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【図１４．３】
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【図１５．１】
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【図１５．２】
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【図１５．３】
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【図１５．４】
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【図１６．１】
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【図１６．２】
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【図１７．１】
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【図１７．２】
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【図１８】
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【図１９．１】
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【図１９．２】
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【図１９．３】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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