(57)【要約】  本発明は、酸溶液中で、キチンまたはキトサンから、化学的および／または酵素的な加水分解によって、単糖類を得るための方法を開示している。低コストで容易に得られる試薬を用いることによって、この方法は、工業的に重要な糖溶液を得ることを可能にしている。新規な製造方法によって、本発明が関連している技術的なセクターは、食品工業および／または化学工業に、より複雑でなく、したがって技術的および財政的により実行可能な、単糖類を製造するための代替方法の使用を提供することをめざしている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチンまたはキトサンを酢酸溶液および／または無機酸に溶解させ、続いてこの混合物を濃亜硝酸と反応させるのを下記の工程で行う、工程１：１ないし５％（質量／体積）のキチンおよび／またはキトサンを含む酢酸溶液および／または無機酸（１ないし５％）の溶液を、室温で適当な時間（１ないし６０分であるが、好ましくは５分）撹拌させ、工程２：撹拌および加熱下で新たに調製され、種々の濃度範囲で種々の形態によって生成された亜硝酸で体積の５ないし５０％を加える、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに溶液中で単糖類を製造するためのその使用。
【請求項２】
請求項１に記載の前記溶液を、撹拌下および３０℃ないし５０℃の温度範囲での穏やかな加熱下で使用する、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに単糖類を製造するためのその使用。
【請求項３】
１分ないし７２時間の範囲の種々の反応時間条件によって得られた、請求項１および２に記載の前記溶液を使用する、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに単糖類を製造するためのその使用。
【請求項４】
変化する圧力下で、５５℃ないし２００℃の温度範囲での激しい加熱下で、撹拌しているあいだに加熱された、請求項１、２および３に記載の前記溶液を使用する、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに溶液中で単糖類を製造するためのその使用。
【請求項５】
請求項１、２、３および４に記載の前記溶液、およびアミロース分解活性を有する酵素を、（最適な酵素活性のための）好適なｐＨおよび温度条件下で、撹拌下または静止して好適な時間のあいだ用いる酵素的な加水分解の追加の工程の使用を含む、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに溶液中で単糖類を製造するためのその使用。
【請求項６】
キチンおよび／またはキトサンを酸溶液（鉱酸または有機酸）に溶解して、アミロース分解活性をもつ酵素を、（最適な酵素活性のための）好適なｐＨおよび温度条件下で、撹拌下でまたは静止してある時間のあいだ用いて、酵素的な加水分解を行い、続いて生成物を、種々の時間、温度およびｐＨ条件下で、亜硝酸と反応させる、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに溶液中で単糖類を製造するためのその使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸水溶液中のキチンまたはキトサンから単糖類を得る方法を開示している。前記方法は、低コストで容易に得られる試薬を用いてヘキソースの溶液を得ることを可能にする。この発明が関連している技術分野は、食品工業および／または化学工業における革新的な製造方法によって、技術的および経済的により実行可能な、糖を製造するための代替方法を提供することをめざしている。
【背景技術】
【０００２】
第二世代エタノールの製造は、バイオマスから発酵性単糖類を得る効率に強く依存する。伝統的に用いられている方法は、バイオマスの最も豊富なソースである、リグノセルロースの化学的および／または酵素的な加水分解に頼っている。リグノセルロース系バイオマスからのエタノールに関連する主要な問題は、リグノセルロースの耐熱構造に由来し、これはバイオマスの脱リグニンのプロセス（バイオマス中に存在するリグニンは用いられるセルロース酵素の活性を阻害する）およびプロセス中に生成したペントースの発酵（たとえばキシロースおよびアラビノース、これらはエタノールを生成するために用いられるほとんどの微生物、なかでもサッカロミケス属の酵母によって発酵できない）を必要とする。第二世代エタノールを製造するために研究されている代替的なアプローチはキチンを用いる。キチン、すなわち天然のポリ−Ｎ−アセチル−グルコサミン多糖類は、甲殻類、昆虫、菌類および他のキチン系ソースの構造成分であり、これは、セルロースより劣るだけで、自然において二番目に最も豊富なバイオポリマーである。１ないし１００ビリオントンのキチン系廃棄物が、主に漁業から、毎年世界中で発生していると見積もられている。キチンの加水分解はその脱アセチル化を起こし、キトサン、すなわちそのモノマー単位がグルコサミンであるポリマーを生成する。酸または塩基加水分解によるキチンからのキトサン生成のプロセスは、いくつかの要因、たとえば温度および反応時間によって影響を受ける。ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌｕｍｅ  ３２１に発表された論文においてＲＥＧＥ，Ｐ．Ｒ．およびＢＬＯＣＫ，Ｌ．Ｈ．（１９９９）によって認められたとおりである。
【０００３】
酵素的および化学的な経路の両方によるキトサン解重合反応によって作られたキトサンから糖を得ることが、数人の著者によって研究されている。Ｐａｎ  Ｓ．  Ｋ．ら（２０１１）は、市販のアルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼを用いることによって、キトサンからグルコサミン（アミノ糖）を生成させることができた。亜硝酸（ＨＮＯ２）は、キトサン解重合に関して大いに研究された。この酸はアミンと反応することができ、窒素ガス（Ｎ２）と水とを生成する。モノマー中に存在するアミノ基（−ＮＨ２）のため、キトサンは特にこの比を受けやすい。
【０００４】
酢酸（２．５％）と穏やかな条件（温度４℃、反応時間２４時間、暗環境および濃度１５ミリモルのＮａＮＯ２）との組み合わせを用い、Ｔｏｍｍｅｒａａｓら（２００１）は、ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌｕｍｅ  ３３３に発表された論文において、その末端に２，５−Ｄ−マンノース構造をもつモノマーを有する連鎖をもつオリゴマーを得ることができたが、モノマー（糖）を得ることができなかった。
【０００５】
より激しい条件（室温、反応時間２４時間、濃度０．６６ＭのＮａＮＯ２および濃塩酸−３７％）を用いることによって、Ｓａｌｉｍら（２０１４）は、末端鎖２，５−Ｄ−マンノフラノシドをもつオリゴマーを生成することができた。
【０００６】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌｕｍｅ  ８３Ａに発表された論文における、Ｋｎｉｇｈｔら（２００７）によって行われた脱アセチル化および解重合メカニズムの詳細な研究は、希釈濃度および種々のｐＨ値（１．６、２．９および５．１）でＮａＮＯ２を用い、ｐＨが決定的な仕方で反応の生成物に影響し、非常に低いｐＨ値で、Ｎ−ニトロソアミンが形成されることを実証した。
【０００７】
ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌｕｍｅ  ４６に発表された、Ｖａｌｕｍら（２００１）によって行われた他の研究において、濃ＨＣｌを含む媒質中では、部分的にアセチル化されたキトサン中のグルコシド結合の解重合反応は脱アセチル化反応より１０倍速い一方で、希酸中では、２つの反応は等しい速度で起こることを示した。
【０００８】
米国特許第３９２２２６０号（ＰＥＮＩＳＴＯＮ，Ｑ．Ｐ．；ＪＯＨＮＳＯＮ，Ｅ．Ｌ．キトサンの解重合のためのプロセス−米国特許第３９２２２６０号、１９７５年１１月２５日出願）は、希酢酸および亜硝酸ナトリウム希薄溶液（約０．１２４モル／Ｌの濃度）へのキトサンの溶解を用いて、短鎖還元分子を得るプロセスの発見を説明している。
【発明の概要】
【０００９】
本発明において、それは、キトサンおよび／またはキチンから単糖類を得るための、単糖類を生成するキトサンおよび／またはキチンの加水分解を可能にする温度および亜硝酸濃度条件の組み合わせ、ならびにこのような化学的な加水分解とアミロース分解活性をもつ酵素（「アミルグルコシダーゼ」）を用いた酵素的な加水分解との組み合わせの発見に関する。このプロセスは、オリゴマーを生成する、以前に開発されたプロセスと違って、モノマー（単糖類）をキトサンおよび／またはキチンから直接得られるようにさせる。
【００１０】
穏やかな条件下の鉱酸たとえば塩酸および／または短鎖カルボン酸（たとえば酢酸）はオリゴマーの生成を伴う解重合を引き起こす一方で、酢酸中のキトサンの解重合反応において激しい条件下（高濃度の亜硝酸）にある酢酸を含む酸媒質は単糖類を生成することができる（このような条件の変化、たとえば反応媒質を酸化するために用いられる化学種の変更または亜硝酸濃度の変化は、種々の生成物を生じさせうる）ことが注目された。
【００１１】
同様に、亜硝酸による化学的な加水分解、すなわち亜硝酸によるキチンおよび／またはキトサンの解重合と、それに続くアミロース分解活性を有する酵素（これは亜硝酸による化学的な加水分解で生成したオリゴマーの解重合を促進できる）による酵素的な加水分解との組み合わせも単糖類を生成する。
【００１２】
ここにおいて記載した単糖類の生成は、糖工業ならびにバイオエタノールおよびヒドロキシメチルフルフラール（これはいくつかの化合物の前駆体であり、原材料、広く入手できる、再生可能で豊富なバイオマスとして使用されるという利点を有する）を含む糖派生物工業によって開拓されうる。このプロセスは実施するのに速く簡単であり、用いられる試薬は低コストである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】
【発明を実施するための形態】
【００１４】
製造方法
酸加水分解のために、一定の撹拌下に、１０．００ｇのキチンまたはキトサンを５００．０ｍＬの酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）に混合した。続いて、１００．０ｍＬの０．６６モル／Ｌ亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）溶液を（亜硝酸のその場での形成のために）加えて穏やかな温度（３５℃ないし５５℃）で３時間加熱した。最終生成物は低粘度の黄色がかった懸濁液である。
【００１５】
組み合わせの加水分解（化学的および酵素的）については、キチン（刻んだ甲殻類の外骨格、たとえばエビの外骨格−十脚目甲殻類）のサンプルに、前の節において記載した化学的な加水分解を行い、続いて最適なｐＨおよび酵素温度の条件下（ｐＨ約５．０およびＴ約５２℃）でアミルグルコシダーゼ（アミロース分解活性をもつ酵素）による加水分解を行った。化学的な加水分解におけるように、この生成物も単糖類（糖）を含む黄色の低粘度懸濁液である。
【００１６】
特性解析のために生成物中に存在する発酵性のヘキソースの単離を、Ａｓｃｅｎｃｉｏ［Ａｓｃｅｎｃｉｏ，Ｓ．Ｄ．紅藻（紅藻類）の低分子量マス炭水化物の抽出、定量および化学特性解析。クリチバ、２００２。学位論文（生化学修士）−生物化学、パラナ連邦大学。１００頁、２００２。指導教官：Ｄｒ．Ｍｉｇｕｅｌ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｎｏｓｅｄａ教授］に従い、ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ−２（排除限界：１８００−１００ダルトン）を含む、総容積（Ｖｔ）８８ｍＬ、空隙容量（Ｖ０）６０ｍＬをもつガラスカラム（５０×１．５ｃｍ  ｄ．ｉ．）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーによって行った。カラムの総容積は、ゲルによって充填されるように決定したレベルまでカラムに水を加えることによって測定し、溶離液は脱イオン水（ｐＨ  ６．５１）であった。
【００１７】
１０ｍＬのろ液の画分を、１５分ごとに、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ  ＣＦ−２自動分取装置によって９時間収集した。クロマトグラフィー的なスクリーニングに用いた最初の手法は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）であり、ＷＡＫＳＭＵＮＤＺＫＡ−ＨＡＪＮＯＳ，Ｍ．；ＳＨＥＲＭＡ，Ｊ．；ＫＯＷＡＬＳＫＡ，Ｔ．「植物化学における薄層クロマトグラフィー」Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ：９９，２００８に記載されたように、シリカゲル６０層（ＡＬＵＧＲＡＭ（登録商標））を用い；１１０℃で３０分間事前に活性化し；固定相として用いることからなっていた。種々のサンプルを、下部において、種々のスポットで、シートの始まりの上２．５ｃｍの線に、ガラスキャピラリーによって塗布した。この後、クロマトグラフィー容器内で、シートのベースを移動相に浸漬し、移動相が規定の最高高さ（シートの端の下２．５ｃｍ）に達するまで実行した。
【００１８】
この分析に用いた移動相は、酢酸エチル：イソプロピルアルコール：酢酸：蒸留脱イオン水（４：２：２：１）からなっていた。展開を１００℃で、所望の着色に達するまで（約５分）行った。展開液は、９５ｍｌのエタノールおよび５ｍｌの硫酸に可溶化した２５０ｍｇのオルシノールからなっており、これをプレート上に、それを炉へもっていく前に散布した。用いた標準試料はグルコースであった。用いたすべての試薬ならびに標準は高い純度レベルを呈した。
【００１９】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による最初のスクリーニングの後、糖を含むと確認された画分をＨＰＬＣ分析に送った。ＵＶ−ＶＩＳ検出の代わりに屈折率検出器（ＲＩＤ）を用いたため、誘導体化によって炭水化物分子を修飾することは不要であった。
【００２０】
用いたのはＳｈｉｍａｄｚｕ高速液体クロマトグラフ（ＬＣ−１０シリーズＡｖｐ；脱ガス装置：ＤＧＵ−１４Ａ、統合装置：クラスＬＣ−１０）であり、５ｍＭ硫酸を含む超純水（蒸留および脱イオン）からなる移動相をポンピング（ＬＣ−１０ＡＤ）することによって、均一濃度で溶離させた。溶離液の流量は、３０℃（ＣＴＯ−１０Ａカラム炉）で０．６ｍＬ／分で、総実行時間２０分であった。屈折率検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、モデルＲＩＤ−１０Ａ）で検出した。２０．０μｌ試料のアリコートを、マニュアルで注入し（Ｒｈｅｏｄｙｎｅインジェクタ、２０メッシュ）、メインカラムの材料に類似した材料で充填されたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃａｒｂｏ−Ｈ安全カートリッジ（４×３ｍｍ）に直接連結されたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｒｅｚｅｘ  ＲＯＡ−Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈ＋カラム（３００×７．８ｍｍ）で浸透させた。図１に示した、フラスコ９のサンプルにおいて、ヘキソースの存在を確認することができた。この手法はグルコースリテンションと同時に単糖類の存在を可視化することを可能にし、図１でわかるように、サンプル中の糖の存在を示した。
【００２１】
また、Ｆａｃｔｏｒ  ＦｏｕｒキャピラリーカラムＶＦ−１ｍｓカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を備えた、Ｓａｔｕｒｎマススペクトロメーターに結合したガスクロマトグラフ、４０００モデルによってサンプルを特性解析した。初期温度は５０℃であり、酢酸アルジトールの分析温度である２２０℃まで徐々に昇温した（毎分４０℃のフロー）。温度は、分析時間（２５分）のあいだ、一定に維持した。同伴ガスはヘリウムであり、１ｍＬ／分の流量であった。着目したピークの面積を、Ｖａｒｉａｎ  ＷＳソフトウェアを用いた積分により決定し、７０ｍｅＶでの電子衝撃によるマスフラグメントを得た。それらの値はマススペクトル中に認められる。保持時間およびサンプルのフラグメンテーションプロファイルおよびパターンを比較することによって分析を行った。
【００２２】
最後に、１Ｄおよび２Ｄ核磁気共鳴分析を、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＲＸ４００（ＢｒｕｋｅｒＧｅｒｍａｎｙ）スペクトロメータによって、４００ＭＨｚ（１Ｈ）および１００ＭＨｚ（１３Ｃ）のベース周波数で、ならびにＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ６００スペクトロメータ（ＢｒｕｋｅｒＧｅｒｍａｎｙ）によって、１５０ＭＨｚ（１３Ｃ）および６００ＭＨｚ（１Ｈ）のベース周波数で行った。分析温度は３０ないし５０℃であった。サンプルを、９９％Ｄ２Ｏ中に、１３Ｃ分析については８０ｍｇ／ｍＬの濃度で、１Ｈおよび２Ｄ分析については２０ｍｇ／ｍＬの濃度で可溶化し、５ｍｍＯＤチューブに入れた。ｐｐｍで表した化学シフトを、内部標準としてアセトンを用い、１３Ｃ（３０．２０ｐｐｍ）および１Ｈ（２．２２４ｐｐｍ）の両方について決定し、これらはアンヒドロマンノースに対応するプロファイルをもつグルコース類似のヘキソースの存在を可視化した。
【実施例】
【００２３】
本発明において、我々は、バイオマスの単糖類への転化において高い収率をもつ亜硝酸の組み合わせ使用による、効率的なキチンまたはキトサン解重合の発酵性単糖類への結果を報告している。あるいは、この技法は、アミロース分解活性をもつ酵素の使用によるキチンまたはキトサンの酵素的な加水分解を上述した化学的な加水分解と組み合わせた組み合わせを使用した場合にも効率を示す。
【００２４】
実施例１
酢酸溶液（１−５％）中の１−５％（質量／体積）のキチンまたはキトサン溶液を、室温で適当な時間（１−３０分）の撹拌下で調製する。次に、新たに作った濃亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）溶液（０．５ないし５モル／Ｌ）を前記溶液に（前記溶液の体積の５−５０％）、室温で撹拌下に加える（亜硝酸塩は酸化して硝酸塩になりがちなので、古い調製溶液の使用はこのプロセスの効率を低減させる）。この反応は窒素ガスを生成し、これは激しいガス放出によって観察されうる。
【００２５】
実施例２
撹拌しながらの混合物の加熱を穏やかな加熱（３０℃ないし５５℃）に変えることによって実施例１によるキチンまたはキトサン溶液を調製する。温度は反応を加速して生成物を得るための総時間を減少させる。
【００２６】
実施例３
撹拌しながらの混合物の加熱を激しい加熱（５５℃ないし９９℃）に変えることによって実施例１によるキチンまたはキトサン溶液を調製する。
【００２７】
実施例４
酢酸溶液（１−５％）中の１−５％（質量／体積）のキチンまたはキトサン溶液を、室温で適当な時間（１秒ないし５９秒）の迅速な撹拌により調製する。新たに作った濃亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）溶液（０．５ないし５モル／Ｌ）を撹拌せずに加え、混合物を３０分より長いあいだ保管する。反応は通常、グルコースを含む溶液を得ることによって進行する。
【００２８】
実施例５
酢酸とのキトサン混合物の調製および亜硝酸ナトリウム溶液の添加のあいだの穏やかな加熱（３０℃−５５℃）により実施例４による混合物を調製する。
【００２９】
実施例６
酢酸とのキトサン混合物の調製および亜硝酸ナトリウム溶液の添加のあいだの激しい加熱（５５℃−１００℃）により実施例４による混合物を調製する。
【００３０】
実施例７
キチンまたはキトサンを含む短鎖有機酸または鉱酸の混合物を、１−２０％の範囲の濃度で調製する。次に、濃または希亜硝酸ナトリウム溶液（ＮａＮＯ２）を、加熱（３０℃超）および撹拌下でまたは静止して加える。続いて、アミロース分解活性をもつ酵素を、（酵素活性のために）好適なｐＨおよび温度条件下で、撹拌下でまたは静止して十分な時間のあいだ加えて、収率を最適化する。
【００３１】
実施例８
実施例７によるキチンまたはキトサンの混合物を調製する。次に、濃または希亜硝酸ナトリウム溶液を、室温において撹拌下でまたは静止して加える。直後に、アミロース分解活性をもつ酵素を、酵素活性のために好適なｐＨおよび温度条件下で、撹拌下でまたは静止して十分な時間のあいだ加えて、収率を最適化する。
【００３２】
実施例９
実施例７によるキチンまたはキトサンの混合物を調製する。アミロース分解活性をもつ酵素を、（酵素の最適な活性のために）好適なｐＨおよび温度条件下で、撹拌下でまたは静止して十分な時間のあいだ加えて、収率を最適化する。直後に、濃または希亜硝酸ナトリウム溶液（ＮａＮＯ２）を、加熱（３０℃超の温度）および撹拌下でまたは静止して加える。
【００３３】
実施例１０
実施例７によるキチンまたはキトサンの混合物を調製する。アミロース分解活性をもつものを、酵素の活性のために好適なｐＨおよび温度条件下で、撹拌下でまたは静止して十分な時間のあいだ加えて、収率を最適化する。次に、濃または希亜硝酸ナトリウム溶液を、室温において撹拌下でまたは静止して加える。
【００３４】
実施例１１
代替的な形態の亜硝酸の使用、たとえば窒素酸化物たとえば四酸化二窒素、Ｎ２Ｏ４、五酸化二窒素、Ｎ２Ｏ５などによる反応媒体の飽和に変えることによって、亜硝酸を含む反応溶媒を得て、続いて実施例２、３、４、５、６、７、８、９および１０に記載した変形により、実施例１によるキチンまたはキトサンの溶液を調製する。
【図１】
2019518083.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月18日(2019.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、
ａ）キチンおよび／またはキトサンを酢酸溶液および／または鉱酸に溶解させ、続いてこの混合物を濃亜硝酸と反応させるのを下記の工程で行う、工程１：１ないし５％（質量／体積）のキトサンおよび／またはキチンを含む酢酸溶液および／または鉱酸（１ないし２０％）の溶液を、室温で、１ないし３０分、好ましくは５分の適当な時間撹拌させ、
ｂ）亜硝酸で体積の５ないし５０％を工程（ａ）に記載した溶液に加え、ここで亜硝酸は、撹拌および加熱下で、０．５ないし５モル／Ｌの濃度で新たに調製された亜硝酸ナトリウム溶液を加えることによる、または工程（ａ）の溶液を気体窒素酸化物（四酸化二窒素および五酸化二窒素）で飽和させることによる、反応環境において生成される、
化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法。
【請求項２】
工程（ａ）は、撹拌下および３０℃ないし５０℃の温度範囲での穏やかな加熱下で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
任意に、工程（ｂ）は、１分ないし７２時間の範囲の種々の反応時間条件を提供する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）は、５５℃ないし１００℃の温度範囲での激しい加熱を提供する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）は、請求項１、２、３または４によって限定された撹拌および加熱条件下で新たに調製された０．５ないし５．０モル／Ｌの限定された濃度範囲にある亜硝酸でその体積の１５％ないし３５％の価値付加を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）は、請求項１、２、３または４によって限定された撹拌および加熱条件下で新たに調製された０．５ないし５．０モル／Ｌの限定された濃度範囲にある亜硝酸でその体積の３５％ないし５０％の価値付加を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
任意に、アミロース分解活性を有する酵素を、（最適な酵素活性のための）好適な５．０のｐＨおよび５２℃の温度条件下で、撹拌下または静止して用いる酵素的な加水分解の追加の工程を含む、請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項８】
キチンおよび／またはキトサンを工程（ａ）に記載の酸溶液（鉱酸または有機酸）に溶解させることを含み、続いてアミロース分解活性をもつ酵素を、（最適な酵素活性のための）好適な５．０のｐＨおよび５２℃の温度条件下で、撹拌下でまたは静止して用いて、酵素的な加水分解を行い、続いて生成物を請求項１、２、３、４、５または６で限定した条件下で、亜硝酸と反応させる追加の工程を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
酵素的および化学的な経路の両方によるキトサン解重合反応によって作られたキトサンから糖を得ることが、数人の著者によって研究されている。Ｐａｎ  Ｓ．  Ｋ．ら（２０１１）は、市販のアルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼを用いることによって、キトサンからグルコサミン（アミノ糖）を生成させることができた。亜硝酸（ＨＮＯ２）は、キトサン解重合に関して大いに研究された。この酸はアミンと反応することができ、窒素ガス（Ｎ２）と水とを生成する。モノマー中に存在するアミノ基（−ＮＨ２）のため、キトサンは特にこの反応を受けやすい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
実施例１０
実施例７によるキチンまたはキトサンの混合物を調製する。アミロース分解活性をもつ酵素を、酵素の活性のために好適なｐＨおよび温度条件下で、撹拌下でまたは静止して十分な時間のあいだ加えて、収率を最適化する。次に、濃または希亜硝酸ナトリウム溶液を、室温において撹拌下でまたは静止して加える。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
実施例１１
代替的な形態の亜硝酸の使用、たとえば窒素酸化物たとえば四酸化二窒素、Ｎ２Ｏ４、五酸化二窒素、Ｎ２Ｏ５などによる反応媒体の飽和に変えることによって、亜硝酸を含む反応溶媒を得て、続いて実施例２、３、４、５、６、７、８、９および１０に記載した変形により、実施例１によるキチンまたはキトサンの溶液を調製する。
以下、本願の出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。 
［１］  キチンまたはキトサンを酢酸溶液および／または無機酸に溶解させ、続いてこの混合物を濃亜硝酸と反応させるのを下記の工程で行う、工程１：１ないし５％（質量／体積）のキチンおよび／またはキトサンを含む酢酸溶液および／または無機酸（１ないし５％）の溶液を、室温で適当な時間（１ないし６０分であるが、好ましくは５分）撹拌させ、工程２：撹拌および加熱下で新たに調製され、種々の濃度範囲で種々の形態によって生成された亜硝酸で体積の５ないし５０％を加える、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに溶液中で単糖類を製造するためのその使用。
［２］  ［１］に記載の前記溶液を、撹拌下および３０℃ないし５０℃の温度範囲での穏やかな加熱下で使用する、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに単糖類を製造するためのその使用。
［３］  １分ないし７２時間の範囲の種々の反応時間条件によって得られた、［１］および［２］に記載の前記溶液を使用する、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに単糖類を製造するためのその使用。
［４］  変化する圧力下で、５５℃ないし２００℃の温度範囲での激しい加熱下で、撹拌しているあいだに加熱された、［１］、［２］および［３］に記載の前記溶液を使用する、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに溶液中で単糖類を製造するためのその使用。
［５］  ［１］、［２］、［３］および［４］に記載の前記溶液、およびアミロース分解活性を有する酵素を、（最適な酵素活性のための）好適なｐＨおよび温度条件下で、撹拌下または静止して好適な時間のあいだ用いる酵素的な加水分解の追加の工程の使用を含む、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに溶液中で単糖類を製造するためのその使用。
［６］  キチンおよび／またはキトサンを酸溶液（鉱酸または有機酸）に溶解して、アミロース分解活性をもつ酵素を、（最適な酵素活性のための）好適なｐＨおよび温度条件下で、撹拌下でまたは静止してある時間のあいだ用いて、酵素的な加水分解を行い、続いて生成物を、種々の時間、温度およびｐＨ条件下で、亜硝酸と反応させる、化学的および／または酵素的な加水分解によるキチンおよび／またはキトサンからの単糖類の製造方法ならびに溶液中で単糖類を製造するためのその使用。
【国際調査報告】
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