(57)【要約】  本発明は、塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸から選択される１以上の酸を含むｐＨ５．０以下の抽出試薬を用いて被検体中の黄色ブドウ球菌からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌抗原および／またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌抗原を含む黄色ブドウ球菌抗原を抽出することを特徴とする、黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法を提供する。本発明はまた、黄色ブドウ球菌の判定方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸から選択される１以上の酸を含むｐＨ５．０以下の抽出試薬を用いて被検体中の黄色ブドウ球菌からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌抗原および／またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌抗原を含む黄色ブドウ球菌抗原を抽出することを特徴とする、黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法。
【請求項２】
前記抽出試薬が、陰イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤から選択される１以上の界面活性剤を含む、請求項１記載の黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法。
【請求項３】
前記界面活性剤が、エマールＮＣ３５、ＭＥＧＡ−８、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｔｗｅｅｎ２０、レオコールＳＣ７０、レオコールＴＤ９０、レオドールＴＷ−０１２０、Ｂｒｉｊ７２１、コータミン８６Ｗ、コータミン２４Ｐ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、アンヒトール２０Ｎおよびアンヒトール２４Ｂから選択される１以上である、請求項２記載の黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法。
【請求項４】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌抗原が、ペニシリン結合タンパク２’であり、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌抗原が、ペニシリン結合タンパク２である、請求項１〜３記載の黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法。
【請求項５】
抗原の抽出を２５〜１００℃で行う、請求項１〜４記載の黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法。
【請求項６】
塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸から選択される１以上の酸を含むｐＨ５．０以下の抽出試薬を用いて被検体中の黄色ブドウ球菌からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌抗原および／またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌抗原を含む黄色ブドウ球菌抗原を抽出する工程と、黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体を用いた免疫測定法によって、抽出された黄色ブドウ球菌抗原を検出する工程と、その検出結果に基づいて、前記被検体中の黄色ブドウ球菌が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌であるか、またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌であるかを判定する工程とを含む、黄色ブドウ球菌の判定方法。
【請求項７】
前記免疫測定法が、ラテックス凝集法、比濁法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、ゲル内沈降反応、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法および抗体アレイからなる群より選択される、請求項６に記載の黄色ブドウ球菌の判定方法。
【請求項８】
塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸から選択される１以上の酸を含み、ｐＨが５．０以下である、黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬。
【請求項９】
陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両イオン性界面活性剤から選択される１以上の界面活性剤を含む、請求項８に記載の黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬。
【請求項１０】
請求項８または９記載の黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬を含む、黄色ブドウ球菌を検出するための免疫測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法、黄色ブドウ球菌抗原の抽出用試薬、および黄色ブドウ球菌の判定方法に関する。【０００２】
本出願は、国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成２０年度、２１年度、および２２年度独立行政法人  科学技術振興機構、先端計測分析技術・機器開発事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願）である。
【背景技術】
【０００３】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus、S.aureus）は、ヒトや動物に種々の疾患を惹起する病原性細菌の一種である。黄色ブドウ球菌が食物を汚染し、そこで増殖すると、菌体外毒素（エンテロトキシン）が産生される。エンテロトキシンを含有する食物を摂取すると、２〜６時間後に急性胃腸炎の症状が現れ、その後、嘔吐、腹痛、下痢を起こす。重症の場合には微熱を伴い、血圧の低下、胸内苦悶、意識混濁、脈拍数の減少などの著明な中毒症状を起こし、緊急入院を必要とする場合もある。【０００４】
黄色ブドウ球菌の一種であるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、ＭＲＳＡとも呼ぶ）は、大きな社会問題となっている病院内感染症の原因菌である。近年では、メチシリン以外にも、ペニシリン系及びセフェム系抗生物質のβラクタム剤を含む、その他多くの抗生物質にも抵抗性を示す各種の多剤耐性ＭＲＳＡが見られている。ＭＲＳＡは、そのような多剤耐性を有するために、感染時の治療が困難である。一方、黄色ブドウ球菌には、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（以下、ＭＳＳＡとも呼ぶ）も含まれる。【０００５】
最近ではＭＲＳＡに有効な治療法も開発されてはいるが、その一方で副作用の問題、あるいは新たな耐性菌出現の予防の観点から、ＭＲＳＡに感染した患者に対する治療法を、多剤耐性を有さないＭＳＳＡに感染した患者に対しても画一的に用いることは好ましくないとされている。すなわち、ＭＲＳＡを早期に発見し、ＭＲＳＡ感染者あるいはＭＲＳＡ汚染箇所に対して適切な処置を行うことが重要であると共に、黄色ブドウ球菌が検出された際には、その菌がＭＲＳＡなのか、あるいは多剤耐性を有さず、ＭＲＳＡとは異なる対応を行うべきであるＭＳＳＡなのかを確実に区別して、それぞれに適切な処置を行うことが極めて重要である。【０００６】
従来、黄色ブドウ球菌がＭＲＳＡなのか、あるいはＭＳＳＡなのかを判定するためには、希釈法、ディスク感受性試験等を用いて実際の薬剤に対する抵抗性を培養によって調べる方法が行われている。しかし、これらの方法は、培養時間に長時間を要し、培養中の各種因子（接種菌濃度、培養温度、培地組成、使用する薬剤等）、および操作者の熟練程度等により結果のばらつきがあるという問題を有している。【０００７】
一方、ＭＲＳＡに特有のタンパク質として、ペニシリン結合タンパク（ＰＢＰ１、ＰＢＰ２、ＰＢＰ３及びＰＢＰ４）の新たな代替酵素である「ＰＢＰ２’」を持っているか否かをＭＲＳＡ／ＭＳＳＡ判別のポイントとして、このＰＢＰ２’を、非放射性試験（例えば、非特許文献１、２参照）、あるいはＰＢＰ２’に対する抗体を用いた放射免疫測定法および酵素免疫測定法（例えば、特許文献１、非特許文献３参照）等により検出する方法が提案されている。しかし、これらの方法は、抗原を含む細胞膜画分を超遠心分離法によって調製するという煩雑な操作を必要とし、一般の検査施設で実施するには困難を伴う。また、これらの方法では、尿素を変性剤として用いて抗原の抽出を行うため、その後の免疫測定において、尿素が反応系に残ることにより、測定時間に数時間を要することからも、日常の検査に用いるには不便である。【０００８】
さらに、多剤耐性黄色ブドウ球菌の産生するＰＢＰ２’をコードする遺伝子であるｍｅｃＡをＰＣＲ法によって遺伝子工学的に検出し、試験菌株における該遺伝子の保有状況を指標としてＭＲＳＡの鑑別を行う方法も知られている（例えば、非特許文献４参照）。しかしながら、ｍｅｃＡの保有状況は必ずしも黄色ブドウ球菌の多剤耐性を反映しているとは限らず、ｍｅｃＡ遺伝子を保有しているにもかかわらず多剤耐性を獲得していない黄色ブドウ球菌も存在することが知られている。【０００９】
一方、細胞膜画分の超遠心分離等の煩雑な操作なしにＭＲＳＡからＰＢＰ２’抗原を抽出する方法として、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アミンの水溶液等で抽出する方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平５−３３９２８９号公報
【特許文献２】特許第３６３８７３１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄ．Ｍ．Ｏ’Ｈａｒａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．  ２１２，  Ｎｏ．  ２，  ｐ２３７−２４１，（１９８７）
【非特許文献２】Ｊ．Ｌ．Ｇｅｒｂｅｒｄｉｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｏｌ．  ３５，  Ｎｏ．１２，２５７４−２５７９，（１９９１）
【非特許文献３】Ｋ．Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｖｏｌ．  ３９，  ｐ５４５−５５０，（１９９５）
【非特許文献４】生方ら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．  ３０，  ｐ．１７２８−１７３３，（１９９２）
【非特許文献５】Ｇｅｒｂｅｒ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，ｐｐ．１８７−１８９，（１９８３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述の通り、黄色ブドウ球菌の検出は、単にＭＲＳＡのみを検出すれば十分とは言い切れず、まず、黄色ブドウ球菌が検出されるかどうか、その上でそれがＭＲＳＡなのか、あるいは多剤耐性を有さないＭＳＳＡなのかを区別して適切な処置を行うことが重要であるという実情がある。しかし、これを考慮すると、上記の方法によってＰＢＰ２’のみを抽出し、これを何らかの手段により検出するという着想に基づく検出方法には、確実性の点で改善の余地がある。【００１３】
具体的には、ＰＢＰ２’のみを抽出し検出する方法の場合、検出対象である菌（検体）の抽出物中にＰＢＰ２’が検出された場合には、その検体がＭＲＳＡであると判断できる。しかし、ＰＢＰ２’が検出されなかった場合には、その結果のみから検体がＭＳＳＡであると判断することはできない。なぜならＰＢＰ２’が検出されない理由としては、検体がＭＳＳＡであったという場合以外にも、検体が黄色ブドウ球菌ではなかった、あるいは、黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡまたはＭＳＳＡ）ではあったが試験に供する検体量が少なすぎた、もしくは、何らかの操作を誤った等の不適切な検出条件で試験が行われた等、複数の理由が想定されるためである。【００１４】
検体がＭＳＳＡであることを確認するためには、ＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を抽出して検出する操作を行い、その上でＰＢＰ２’は検出されず、ＰＢＰ２のみが検出されるということを確認する必要がある。また、ＰＢＰ２’が検出されず、かつ、ＰＢＰ２も検出されないという検体については、再測定や測定手順の見直し、菌種の確認等を含めたさらなる対処が必要になる場合もあると考えられる。ＰＢＰ２’のみの検出に着目した方法ではこのような点に対応することが困難である。【００１５】
微生物から抗原を抽出する公知の方法の例としては、例えば、ストレプトコッカス属の微生物から亜硝酸を用いて抗原を抽出する「ミクロ亜硝酸抽出法」（例えば、非特許文献５参照）が知られている。しかし、発明者が確認したところ、この抽出法は、黄色ブドウ球菌からの抗原抽出、例えばＰＢＰ２’および／またはＰＢＰ２を抽出する目的には適さないことがわかった。【００１６】
すなわち、黄色ブドウ球菌からＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を同時に効率的に抽出でき、両者を測定可能な形で抽出液中に保持可能な抽出方法、ならびに、抽出されたＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を検出し、その結果に基づいて、前記判定対象とする黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性であるか、またはメチシリン感受性であるかを簡便に、かつ、より確実に判定できる判定方法が望まれている。【００１７】
本発明の目的は、黄色ブドウ球菌からＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を同時に効率的に抽出でき、両者を測定可能な形で抽出液中に保持可能な抽出方法、ならびにそのための抽出試薬を提供することにある。さらに、そのような抽出方法および抽出試薬を用いて得られた抽出物中の抗原を検出し、その結果に基づいて被検体がＭＲＳＡであるかＭＳＳＡであるかをより確実に判定できる黄色ブドウ球菌の判定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明者は、鋭意研究の結果、特定の酸を含有する酸性の水溶液を用いて黄色ブドウ球菌から両抗原を抽出でき、両抗原が抽出液中に保持されること、さらに、抽出物中の両抗原を免疫測定法によりそれぞれ検出することによって上記の目的を達成できることを見出し、本発明を完成した。【００１９】
すなわち、本発明によれば、塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸から選択される１以上の酸を含むｐＨ５．０以下の抽出試薬を用いて被検体中の黄色ブドウ球菌からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌抗原および／またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌抗原を含む黄色ブドウ球菌抗原を抽出することを特徴とする、黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法が提供される。かかる方法によれば、黄色ブドウ球菌からＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を同時に効率的に抽出することができる。また、抽出物中にＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を安定に保持することができる。【００２０】
また、本発明によれば、塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸から選択される１以上の酸を含むｐＨ５．０以下の抽出試薬を用いて被検体中の黄色ブドウ球菌からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌抗原および／またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌抗原を含む黄色ブドウ球菌抗原を抽出する工程と、黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体を用いた免疫測定法によって、抽出された黄色ブドウ球菌抗原を検出する工程と、その検出結果に基づいて、前記被検体中の黄色ブドウ球菌が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌であるか、またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌であるかを判定する工程とを含む、黄色ブドウ球菌の判定方法が提供される。かかる方法によれば、得られた抽出物中の抗原の検出結果に基づいて、被検体がＭＲＳＡであるかＭＳＳＡであるかを、より確実に判定することができる。【００２１】
また、本発明によれば、塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸から選択される１以上の酸を含み、ｐＨが５．０以下である、黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬が提供される。かかる試薬によれば、黄色ブドウ球菌からＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を同時に効率的に抽出することができ、また、抽出物中にＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を安定に保持することができる。【００２２】
さらに、本発明によれば、上記の黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬を含む、黄色ブドウ球菌を検出するための免疫測定キットが提供される。かかるキットによれば、得られた抽出物中の抗原の検出結果に基づいて、被検体がＭＲＳＡであるかＭＳＳＡであるかを、より確実に判定することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、黄色ブドウ球菌からＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を同時に効率的に抽出することができ、また、抽出物中にＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を安定に保持することができる。また、本発明によれば、得られた抽出物中の抗原の検出結果に基づいて、被検体がＭＲＳＡであるかＭＳＳＡであるかを、より確実に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、作製した抗体アレイの設計図である。
【図２】図２は、得られたＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの抗体アレイの測定画像である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
［用語の説明］
本明細書で使用される場合、「黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）」とは、ヒトや動物の皮膚、消化管(腸)常在菌(腸内細菌)であるブドウ球菌の一つをいう。ヒトの膿瘍等の様々な表皮感染症や食中毒、また肺炎、髄膜炎、敗血症等致死的となるような感染症の起因菌でもある。【００２６】
本明細書で使用される場合、「メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus： ＭＲＳＡ）」とは、抗生物質メチシリンに対する薬剤耐性を獲得した黄色ブドウ球菌を意味するが、メチシリン以外にも、ペニシリン系及びセフェム系抗生物質のβラクタム剤を含む、その他多くの抗生物質にも抵抗性を示す各種の多剤耐性ＭＲＳＡを包含する。一方、本明細書で使用される「メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus： ＭＳＳＡ）」とは、メチシリンに対する感受性のある黄色ブドウ球菌をいう。【００２７】
本明細書で使用される場合、「ＰＢＰ２’（ペニシリン結合タンパク質２’）」とは、ペプチドグリカン合成酵素を意味し、黄色ブドウ球菌が本来持っている４種の細胞壁合成酵素であるペニシリン結合タンパク質：ＰＢＰ１、ＰＢＰ２、ＰＢＰ３及びＰＢＰ４とは異なる架橋酵素であり、ＭＲＳＡに特有のタンパク質である。すなわち、ＭＲＳＡはＰＢＰ２’を有するが、ＭＳＳＡはＰＢＰ２’を有さない。なお、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡともに、４種のペニシリン結合タンパク質：ＰＢＰ１、ＰＢＰ２、ＰＢＰ３及びＰＢＰ４を有する。【００２８】
本明細書で使用される場合、「黄色ブドウ球菌抗原」は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌抗原およびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌抗原の両者を包含する意味で使用され、具体的には、黄色ブドウ球菌が本来持っている４種のペニシリン結合タンパク質：ＰＢＰ１、ＰＢＰ２、ＰＢＰ３及びＰＢＰ４に加え、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に特有のタンパク質ＰＢＰ２’を含み、好ましくは、ＰＢＰ２およびＰＢＰ２’である。本明細書で使用される場合、「メチシリン耐性黄色ブドウ球菌抗原」とは、ペニシリン結合タンパク質２’（ＰＢＰ２’）をいう。本明細書で使用される場合、「メチシリン感受性黄色ブドウ球菌抗原」とは、ＰＢＰ２’以外の黄色ブドウ球菌抗原を意味し、好ましくは、ＰＢＰ２である。【００２９】
以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。【００３０】
［実施形態１：黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法］
本実施形態に係る黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法は、塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸から選択される１以上の酸を含むｐＨ５．０以下の抽出試薬を用いて被検体中の黄色ブドウ球菌からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌抗原および／またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌抗原を含む黄色ブドウ球菌抗原を抽出することを特徴とする、黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法である。【００３１】
（抽出試薬中の酸）
本実施形態に係る抽出方法に用いることができる抽出試薬は、塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸から選択される１以上の酸を含む。これらの酸を用いることにより、本発明の目的を好適に達成することができる。【００３２】
（抽出試薬のｐＨ）
本実施形態に係る抽出方法に用いることができる抽出試薬は、５．０以下のｐＨを有する。抽出試薬のｐＨは５．０以下であれば特に限定はないが、４．５以下がより好ましく、４．０以下がさらに好ましい。また、本発明における抽出試薬は、抽出時のｐＨが５．０以下となるように調整されていることが好ましい。例えば、ＭＲＳＡの菌体浮遊液等を試料とする場合には、当該菌体浮遊液と本発明の抽出試薬とを混合した際のｐＨが５．０以下であることが好ましい。また、抽出試薬中の上記酸の濃度としては、０．０５Ｍ〜０．５Ｍが好ましい。【００３３】
（抽出試薬中の界面活性剤）
本実施形態に係る抽出方法に用いることができる抽出試薬中には各種の界面活性剤を任意に加えても良い。これにより、黄色ブドウ球菌からＰＢＰ２’およびＰＢＰ２をより効率的に抽出することができる。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤および両イオン性界面活性剤から選択される任意のものを用いることができる。【００３４】
例えば、陰イオン性界面活性剤としては、カルボン酸塩型およびスルホン酸塩型（例えば、アルキルベンゼンカルボキシレート、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルスルホネート、スルホスクシネートエステル塩等）、硫酸エステル塩型（例えば、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩またはポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸塩等）およびリン酸エステル塩型（例えば、アルキルホスフェートエステル塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルホスフェートエステル塩、または、ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテルホスフェートエステル塩等）が挙げられる。これらは、市販のものを用いることができ、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウムの場合、エマール（登録商標）２０Ｃ（花王社製）等の商品名で、また、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル硫酸ナトリウムの場合、エマール（登録商標）ＮＣ−３５（花王社製）の商品名で市販されている。【００３５】
陽イオン性界面活性剤としては、アルキルアミン塩型（例えば、モノメチルアミン塩酸塩、ジメチルアミン塩酸、塩トリメチルアミン塩酸塩）、第４級アンモニウム塩型（例えば、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルピリジニウムブロマイド、ベンジルトリエチルアンモニウムクロライド、ジドデシルジメチルアンモニウムブロマイド、ベンジルジメチルフェニルアンモニウムクロライド、テトラヘキシルアンモニウムクロライド、ステアリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドなど）等が挙げられる。これらは、市販のものを用いることができ、例えば、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライドの場合、コータミン（登録商標）８６Ｗ（花王社製）等の商品名で、また、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドの場合、コータミン（登録商標）２４Ｐ（花王社製）等の商品名で販売されている。【００３６】
非イオン性界面活性剤としては、エーテル型（例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル等）、エステル型（ラウリン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等）、エステルエーテル型（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヘキシタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルポリエチレングリコール）、アルカノールアミド型（ラウリン酸ジエタノールアミド、オレイン酸ジエタノールアミド、ステアリン酸ジエタノールアミド）、アルキルグリコシド型（オクチルグルコシド、デシルグルコシド、ラウリルグルコシド）、グルカミド型（オクタノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、ノナノイル−Ｎ−メチル−グルカミド、デカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド）が挙げられる。これらは、市販のものを用いることができ、例えば、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートとしては、ｔｗｅｅｎ２０等の商品名で、また、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルとしては、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００等の商品名で、また、オクタノイル−Ｎ−メチル−グルカミドとしては、ＭＥＧＡ−８等の商品名で販売されている。好適な界面活性剤の例として、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル類（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル類（例えば、ＮＰ４０等）、ポリオキシエチレンソルビトールエステル類（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０等）、ポリオキシエチレンドデシルエーテル類（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８等）、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２１等）、オクチルグルコシド等が挙げられる。他にも、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（レオドールＴＷ−０１２０：花王社製）、イソトリデシルアルコールエトキシレート９モル付加体（レオコールＴＤ−９０、ライオン（株）製）、高級アルキル基（例えば、炭素数１２〜１４のアルキル基等）にポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドを付加した化合物（レオコールＳＣ７０、ライオン（株）製）が好ましい例として挙げられる。【００３７】
両イオン性界面活性剤としては、アルキルベタイン型（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ステアリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ドデシルアミノメチルジメチルスルホプロピルベタイン、オクタデシルアミノメチルジメチルスルホプロピルベタイン）、ＣＨＡＰＳ（３−〔３−コラミドプロピル〕ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸），ＣＨＡＰＳＯ（３−〔コラミドプロピル〕ジメチルアンモニオ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）等のスルホン酸型、アミンオキシド型（ラウリルジメチルアミンＮ‐オキシド、オレイルジメチルアミンＮ‐オキシド）等が挙げられる。これらは、市販のものを用いることができ、例えば、アルキルベタイン型の場合、アンヒトール（登録商標）２４Ｂ（花王社製）等の商品名で、また、アミンオキシド型の場合、アンヒトール（登録商標）２０Ｎ（花王社製）等の商品名で市販されている。【００３８】
上記の各種界面活性剤のうちで、エマール（登録商標）ＮＣ３５、ＭＥＧＡ−８、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｔｗｅｅｎ２０、レオコールＳＣ７０、レオコールＴＤ９０、レオドールＴＷ−０１２０、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２１、コータミン（登録商標）８６Ｗ、コータミン（登録商標）２４Ｐ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、アンヒトール（登録商標）２０Ｎ、アンヒトール（登録商標）２４Ｂ等は、好適な界面活性剤の一例である。これにより、黄色ブドウ球菌からＰＢＰ２’およびＰＢＰ２をより効率的に抽出することができる。【００３９】
本発明の抽出試薬中に含まれる界面活性剤の濃度は、通常、０．０１％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは０．０１〜５％（ｗ／ｗ）、より好ましくは、０．０５〜５．０％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは、０．０５〜１．０％（ｗ／ｗ）、よりさらに好ましくは、０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）である。界面活性剤の濃度を０．０１％（ｗ／ｗ）以上にすることにより、抽出効率が十分となる。また、界面活性剤の濃度を５．０％（ｗ／ｗ）以下にすることにより、濃度をそれ以上高めても抽出効率のさらなる改善がみられにくいことから経済的であり、また、界面活性剤がその後の各種測定系に悪影響を及ぼさないため、界面活性剤の除去や希釈等に操作が煩雑になるという問題を生じ得ず、好ましい。【００４０】
界面活性剤は、本発明の目的とする効果を損なわない限り、複数種類を併用しても、単独で用いても構わない。【００４１】
本発明の抽出試薬は、本発明の目的とする効果を損なわない限り、上記成分の他に保存料、緩衝剤などを含んでもよい。【００４２】
（黄色ブドウ球菌抗原の抽出条件）
本実施形態に係る黄色ブドウ球菌抗原の抽出方法は、上記抽出試薬を用いて、被検体中の黄色ブドウ球菌から、黄色ブドウ球菌抗原を抽出する。本発明の抽出方法の抽出条件は、黄色ブドウ球菌抗原の抽出が好適に進行する条件であれば、特に限定されず、抗原が良好に抽出されるのに適した温度、および抽出時間等が設定される。抗原の抽出温度は、室温以上、具体的には、２５〜１００℃が好ましい。これにより、黄色ブドウ球菌からＰＢＰ２’およびＰＢＰ２をより効率的に抽出することができる。抗原の抽出時間は、１分間〜６０分間程度が好ましいが、場合によりこれより長くても差し支えない。【００４３】
抽出温度が高いほど、抽出に要する時間は短くてよく、例えば、１００℃で抽出を行う場合は、抽出時間は概ね１分間〜３分間程度でよく、９５℃で抽出を行う場合は、抽出時間は概ね５分間〜１０分間、２５〜３７℃程度で抽出を行う場合には、抽出時間は６０分間程度が好ましい。【００４４】
本実施形態に係る抽出方法によれば、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両者から抗原を高効率で抽出することができる。さらに、抽出された両抗原が、いずれも抽出液中で分解を受けにくく、抽出物中にＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を安定に保持することができる点において優位である。【００４５】
［実施形態２：黄色ブドウ球菌の判定方法］
本実施形態に係る黄色ブドウ球菌の判定方法は、塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸から選択される１以上の酸を含むｐＨ５．０以下の抽出試薬を用いて被検体中の黄色ブドウ球菌からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌抗原および／またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌抗原を含む黄色ブドウ球菌抗原を抽出する工程と、黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体を用いた免疫測定法によって、抽出された黄色ブドウ球菌抗原を検出する工程と、その検出結果に基づいて、前記被検体中の黄色ブドウ球菌が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌であるか、またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌であるかを判定する工程とを含む、黄色ブドウ球菌の判定方法である。かかる方法によれば、ＭＲＳＡに特有の抗原であるＰＢＰ２’と、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡに共通に存在するＰＢＰ２の両者を、いずれも効率よく抽出できるとともに、抽出物中に両者を安定に保持することができるので、この両者を次段階の免疫測定系において検出することができ、検出対象の菌（被検体）がＭＲＳＡであるのか、又はＭＳＳＡであるのかを確実に判定することが可能になる。【００４６】
（黄色ブドウ球菌抗原を抽出する工程）
本実施形態における黄色ブドウ球菌抗原を抽出する工程は、基本的には上記実施形態１に係る黄色ブドウ球菌抗原を抽出する方法と同様の構成および作用効果を有するため、実施形態１と同様の内容については、適宜説明を省略する。【００４７】
（抽出された抗原の抽出試薬中での安定性）
本実施形態における抽出試薬を用いて黄色ブドウ球菌から黄色ブドウ球菌抗原を抽出する工程は、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両者から抗原を高効率で抽出することができるとともに、抽出された両抗原が、いずれも抽出液中で分解を受けにくいことを特徴とする。抽出は、次段階の免疫測定法等による黄色ブドウ球菌抗原の検出のために行うものであるから、抽出された抗原が抽出液中で直ちに分解してしまうようなことがあっては検出に支障をきたし、その後のＭＲＳＡ／ＭＳＳＡ判定を正確に行えなくなる。本実施形態における抽出工程によれば、抽出された抗原が抽出試薬中で分解を受けずに安定して存在することができるため、優位である。【００４８】
抽出された黄色ブドウ球菌抗原を免疫測定法に供する際には、本発明の抽出試薬を用いて抽出された黄色ブドウ球菌の抽出液を、必要に応じ、適当な緩衝剤又は塩基、好ましくはリン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムまたは水酸化ナトリウム等を用いて中和し、免疫測定系にとって好適なｐＨ条件、具体的にはｐＨ６．０〜８．０に調整することが好ましい。【００４９】
また、本発明の抽出試薬を用いて黄色ブドウ球菌の抗原を抽出した後に、細胞残屑や粒状物、またはその他の不溶物を任意の方法を用いて除去することも好ましい。それらの除去は、例えば、遠心分離、フィルターろ過等により行うことができる。【００５０】
（抽出された黄色ブドウ球菌抗原の検出）
次に、本実施形態においては、黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体を用いた免疫測定法によって、抽出された黄色ブドウ球菌抗原を検出する。本実施形態における「抗体」とは、特定のペプチドや多糖類、低分子化合物などの様々な分子を認識し、結合・架橋形成する「抗体」と総称されるタンパク質のことをいい、その改変体、修飾体も含む。マウス、ウサギ、ヒツジ由来のものなど様々なものが知られており、また特定のモノクローナル抗体を培養細胞で生産することや、遺伝子組み替え技術を用いて大腸菌や真核生物細胞で生産させることも可能であり、そのような組替え体も含む。また、上記の各種抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。また、抗体がモノクローナル抗体の場合、グロブリンタイプは特に限定されず、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどが挙げられる。また、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体でもよい。【００５１】
黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体としては、抗ＰＢＰ２抗体および抗ＰＢＰ２’抗体を用いることができ、これらはそれぞれ、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体がより好ましい。抗ＰＢＰ２抗体は、ＰＢＰ２を特異的に認識する。抗ＰＢＰ２’抗体は、ＰＢＰ２’を特異的に認識する。抗ＰＢＰ２抗体および抗ＰＢＰ２’抗体は、当該分野で公知の方法に従い作製することができ、例えば、特許第３６３８７３１号公報に記載の方法に準じて作製することができる。また、市販の抗体を入手することもできる。【００５２】
免疫測定方法としては、各種公知の免疫測定法を用いることができ、例えば、通常の免疫測定法、例えば、ラテックス凝集法、比濁法、放射免疫測定法（例えば、ＲＩＡ法、ＲＩＭＡ法）、酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法）、ゲル内沈降反応、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、蛍光抗体法（例えば、ＦＩＡ法、ＩＦＭＡ法）、イムノクロマトグラフィー法、抗体アレイ等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの免疫測定方法自体はこの分野において周知であり、当業者が容易に行うことができる。一般的な技術手段の詳細については、公知の総説、成書などを参照することができる。【００５３】
また、本実施形態における免疫測定法において、抗体を検出するために、シグナルを発生させることができる標識物質と抗体自体を結合させた標識抗体を用いてもよい。その際は、直接結合させたもの以外にも、抗体と標識物質とをアビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチン系、又は二次抗体により結合させたものを用いることも可能であり、本発明の技術的範囲に含まれる。ここで用いる二次抗体としては、一次抗体と結合できる抗体を使用することができる。【００５４】
標識として酵素を使用する場合には、例えば、ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸脱水素酵素、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェラーゼ、マロン酸エステルデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等を標識として使用することができる。これらの酵素で標識する方法としては、酵素の糖鎖を過ヨウ素酸で酸化し、生成したアルデヒド基に抗体又はレクチンのアミノ酸を結合させる方法や、酵素にマレイミド基あるいはピリジルスルフィド基等を導入し、抗体又はレクチンのＦａｂ’フラグメントに存在するチオール基と結合させる方法等を挙げることができる。【００５５】
標識として酵素を使用する場合、試験試料と標識抗体とをインキュベートした後、遊離した標識抗体を洗浄して除去してから、上記の標識酵素の基質を作用させて発色等で反応を測定することによって標識抗体を検出することができる。例えば、ペルオキシダーゼで標識される場合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまたはＯ−フェニレンジアミンと組み合わさって褐色または黄色を生じる。グルコースオキシダーゼで標識される場合には、基質として、例えば２，２’−アシド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）などを用いることができる。【００５６】
標識として蛍光色素を使用する場合には、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート）などの蛍光色素で抗体を標識することができる。抗体と蛍光色素との結合は常法によって行うことができる。【００５７】
標識として呈色標識物質を使用する場合には、例えば、コロイド金属および着色ラテックスなどを標識として使用できる。コロイド金属の代表例としては、金ゾル、銀ゾル、セレンゾル、テルルゾル又は白金ゾルなどのそれぞれの分散粒子である金属コロイド粒子を挙げることができる。コロイド金属の粒子の大きさは、通常は、直径３〜６０ｎｍ程度が好ましい。また、着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの着色料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスが挙げられる。ラテックスとして天然ゴムラテックスのような天然ラテックスを用いてもよい。着色ラテックスの大きさは、直径数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度から選択することができる。これらの呈色標識物質は市販品をそのまま使用することができるが、さらに加工し、または、それ自体公知の方法で製造することも可能である。【００５８】
抗体と呈色標識物質との結合は常法によって行うことができる。例えば、呈色標識物質が金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子の場合には、通常は、抗体と金ゾルとを室温下で混合することにより両者を物理的に結合することが可能である。【００５９】
なお、標識としては、上記以外にも放射性同位体標識（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等）等を使用することも可能であり、本発明の範囲内に含まれる。【００６０】
（ＥＬＩＳＡ）
本実施形態における免疫測定法として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用することができる。「酵素免疫測定法」（ＥＬＩＳＡ）とは、酵素標識した抗体を用いて、抗体に対する抗原を定量的に検出する方法であり、定量性、簡便性、確実性（再現性）に優れ、臨床検査などで広く用いられている。酵素免疫測定法は広くよく知られた技術であり、一般的な技術手段の詳細については、公知の総説、成書などを参照することができる。酵素免疫測定法としては、幾つかの方法が知られており、中でもサンドイッチＥＬＩＳＡと称される、抗体を固定化したプレートに抗原を結合させ、結合した抗原をまた別の抗体で検出するという方法が最も広く用いられている。【００６１】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の固相用担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ類、天然又は修飾されたセルロース類、ポリアクリルアミド類、斑糲岩（ｇａｂｂｒｏｓ）、及び磁鉄鉱（ｍａｇｎｅｔｉｔｅ）が挙げられる。固相用担体の材料は、抗体が結合できる限り、如何なる可能な構造上の輪郭を有してよい。例えば、ビーズのような球形、又は試験管あるいはマイクロタイタープレートのウェルの内部表面のような円筒形であってよい。また、上記表面は、平坦、例えばシート、膜、試験ストリップ、チップ、スライド等でもあってよい。好ましい担体は、ニトロセルロース膜、ニトロセルロースでコートされたスライド、９６−ウェルマイクロタイタープレート、及びポリスチレン又はカルボキシルビーズである。当業者は、多数の他の担体が抗体又は抗原を結合するのに適していることを理解し、または日常の実験により確かめることができる。【００６２】
上記の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、標識として酵素を用いたＥＬＩＳＡのみに限られず、放射性同位体を標識として用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や蛍光物質を標識として用いた蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）などの改変法も含む。これら個々の免疫化学的測定法を適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされず、公知の総説、成書などを参照することができる。【００６３】
本実施形態における免疫測定法として、ＥＬＩＳＡ法、中でもサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用することができる。【００６４】
（イムノクロマトグラフィー法）
本実施形態における免疫測定法として、イムノクロマトグラフィー法を使用することができる。イムノクロマトグラフィー法とは、毛細管現象により検体がメンブレン上を移動する際、検体中の抗原と標識抗体及び捕捉抗体の三者により免疫複合体が形成され、その標識物の集積を目視で確認できる測定方法である。特別な装置を必要とせず、また、洗浄操作が必要ないので、簡便に測定することができる。イムノクロマトグラフィー法は広くよく知られた技術であり、一般的な技術手段の詳細については、公知の総説、成書などを参照することができる。【００６５】
イムノクロマトグラフィー法は、大きく分けて補足試薬部と標識試薬部位を用いる。補足試薬部位では、抗原を補足するための抗体が固定される。補足試薬部位に使われる固相用担体としては、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性のものであって、使用される第一試薬、標識試薬、被検出物質などと反応しないものであれば、特にその素材が限定されるものではない。具体的には、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース又は酢酸セルロース等のセルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。好ましくはセルロース誘導体やナイロンの膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等であり、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙である。【００６６】
抗体を固相するための濃度は、０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度が好ましく、１０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度がより好ましい。【００６７】
標識試薬部位には、抗原を検出するために標識された抗体が含まれる。標識は、上述の標識手段を適宜用いることができる。【００６８】
イムノクロマトグラフは、これら２つの部位と検体を供給するためのガラスフィルター、吸収用のろ紙などを合わせる事で構築される。使用される媒体の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び結果の観察の点において適切であればよい。操作をより簡便にするためには、判定部位が表面に形成されているクロマトグラフ媒体の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることもできる。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。【００６９】
（抗体アレイ）
本実施形態における免疫測定法として、抗体アレイを使用することができる。抗体アレイとは、抗体を支持体に多数固定化し、それに対する反応（低分子化合物や他のタンパク質の結合など）を検出する方法である。かかる抗体アレイを用いることにより、本発明のＰＢＰ２及びＰＢＰ２’抗原を含む複数の抗原やタンパク質について同時に評価を行うことが可能となり、迅速な検出が可能となる。【００７０】
抗体アレイの支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例えば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜）、ガラス（例えば、ガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、ゲル、金属（例えば、金薄膜）、セラミクスなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。ナイロン、ニトロセルロースおよびＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）などの膜が、本発明のアレイにおける支持体としての使用に適している。【００７１】
抗体アレイによる抗原の検出は、使用する抗体アレイの形態によっても異なるが、例えば、試料から抽出された抗原を標識し、次いでこれを抗体アレイ上の各抗体に反応させることにより行なうこともできるし、あるいは、固相化された抗体と標識抗体を用いてサンドイッチアッセイにより行うこともできる。標識は、上述の標識手段を適宜用いることができる。【００７２】
抗体アレイは、当該分野で周知の方法によって、抗体を支持体上に固定することにより作製することができる。抗体を支持体上に固定する方法としては、例えば、共有結合により固定する方法、非共有相互作用（例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子−双極子結合）により固定する方法、静電的結合により固定する方法が挙げられるが、実験の再現性を考慮すれば共有結合により固定する方法が好ましい。また、支持体がガラス、プラスチック、金薄膜などの場合は、支持体表面上の官能基に、抗体に含まれるアミノ酸の官能基を反応・結合させることにより、抗体を支持体上に固定することもできる。【００７３】
本実施形態における抗体アレイは、タンパク質または核酸アレイを製造するために使用される任意の方法を用いて作製することができる。例えば、スプリットピンまたはインクジェットプリンタを備えるロボットのプリンタであるマイクロスポッタを使用して、抗体をアレイ上にスポットできる。スポットされる抗体濃度としては、０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度が好ましく、１０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度がより好ましい。スポットの大きさは、半径０．０１ｍｍ以上１０ｍｍ以下が望ましく、半径０．０５ｍｍ以上２ｍｍ以下が望ましい。抗体アレイの製造方法としては、例えば、特表２０１０−５３３８４２に記載されている。【００７４】
抗体アレイでの検出は、例えば基質と反応し発光する酵素を標識物質として使用した場合、例えばＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ）カメラ等で全てのアレイ領域を画像撮影し、発光量を輝度値として測光すればよい。このような抗体アレイの測定装置として、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ３００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製）が挙げられる。【００７５】
抗原抗体反応および検出工程における反応条件、反応に用いる試薬成分等は、本発明の目的を果たせる範囲で最適化すればよい。本発明のＰＢＰ２及びＰＢＰ２’抗原の両抗原の検出は、別個に行ってもよく、順次行ってもよく、また、同時に行っても良い。例えば、イムノクロマトグラフィー法や抗体アレイのような、複数の抗体を同時に使用し、それぞれの抗原の存在を同時検出できるような検出系を選択すれば、検出操作が一層簡便となり、効率良い検出・判定が可能となる。【００７６】
（抽出物を用いたＭＲＳＡ／ＭＳＳＡの判定）
本実施形態に係る黄色ブドウ球菌の判定方法は、上記の抽出工程、検出工程の後、その検出結果に基づいて、前記被検体中の黄色ブドウ球菌が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌であるか、またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌であるかを判定することを特徴とする。【００７７】
上記のような各種抗原検出方法を用いてＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を検出する工程を行った結果、抽出物中にＰＢＰ２’が検出された検体は、「ＭＲＳＡ」であると判断される。また、ＰＢＰ２が検出されたがＰＢＰ２’は検出されなかった検体は「ＭＳＳＡ」である、と判断される。【００７８】
一方、ＰＢＰ２’が検出されず、かつ、ＰＢＰ２も検出されなかった検体については、その菌が黄色ブドウ球菌ではないか、あるいは、黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡまたはＭＳＳＡ）ではあったが検体量が少なすぎた、もしくは、何らかの操作を誤った等の不適切な検出条件で試験が行われたことが示唆される。本発明の方法は、このような場合に直ちに再測定や測定手順の見直しを行うことができるという点でも、ＰＢＰ２’のみを検出する方法よりも確実性に優れている。【００７９】
［実施形態３：黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬］
本実施形態に係る黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬は、塩酸、酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸から選択される１以上の酸を含み、ｐＨが５．０以下である、黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬である。かかる試薬によれば、黄色ブドウ球菌からＰＢＰ２’およびＰＢＰ２を同時に効率的に抽出することができる。【００８０】
本実施形態に係る黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬は、基本的には、実施形態１において具体的に説明した抽出試薬と同様の構成および作用効果を有する。よって、実施形態１と同様の内容については、適宜説明を省略する。本実施形態に係る黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬は、上述の各成分を組み合わせて調製することができる。また、本実施形態に係る黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬は、所望により、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両イオン性界面活性剤から選択される１以上の界面活性剤を含む。【００８１】
本発明の抽出試薬は、本発明の目的とする効果を損なわない限り、上記成分の他に保存料、緩衝剤などを含んでもよい。また、本発明の抽出試薬は、構成成分の全てを混合した状態で１つの容器に収納しても、あるいは二成分以上に分けて複数容器に収容し、使用時に混合調製してもよい。【００８２】
［実施形態４：黄色ブドウ球菌抗原を検出するための免疫測定キット］
本実施形態に係る黄色ブドウ球菌を検出するための免疫測定キットは、上記の黄色ブドウ球菌抗原を抽出するための試薬を含む、黄色ブドウ球菌を検出するための免疫測定キットである。かかるキットによれば、得られた抽出物中の抗原の検出結果に基づいて、試験菌株がＭＲＳＡであるかＭＳＳＡであるかを、より確実に判定することができる。本実施形態に係る黄色ブドウ球菌を検出するための免疫測定キットは、必要に応じて、上記の抽出試薬を収容した容器と、抗原の検出手段と、測定方法の説明書と、必要に応じ被検物質（抗原）の標準品等とを含むことができる。例えば、抗原の検出手段として抗原の免疫測定手段を含む黄色ブドウ球菌を検出するための免疫測定キットは、本実施形態に係る免疫測定キットの好ましい一例である。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、以下記載される記述は本発明の技術的範囲を何ら限定するものではない。なお、特に断りのない限り、実施例中の「％」および「部」は、重量％および重量部をいう。【００８４】
（実施例１）  ブドウ球菌抗原抽出試薬の調製とＭＲＳＡからの黄色ブドウ球菌抗原の抽出
１．  ＭＲＳＡ検体の調製
３．７ｇのＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｂｒｏｔｈ  （Ｍｅｒｃｋ社カタログ番号１１０４９３）を１００ｍｌの水に溶かし、１２１℃、２０分間、オートクレーブ殺菌して培地とした。この培地にＭＲＳＡの臨床分離株を殖菌し、３７℃で４８時間培養を行った。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、１０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した。次いで、溶解したＭＲＳＡ菌体液（５０μｌ）をマイクロチューブに分注し、遠心分離により上清を取り除いた。【００８５】
２．  黄色ブドウ球菌抗原抽出試薬を用いたＭＲＳＡからの抗原抽出
０．１Ｍ  ＨＣｌからなるブドウ球菌抗原抽出試薬、ならびに０．１Ｍ  ＨＣｌおよび２．０％（ｗ／ｗ）各種界面活性剤からなるブドウ球菌抗原抽出試薬（いずれもｐＨ５．０以下）を調製した。界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤であるエマールＮＣ３５（花王社製）、非イオン性界面活性剤であるＭＥＧＡ−８（同仁化学社製）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬工業社製）、Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業社製）、Ｂｒｉｊ７２１（ＳＩＧＭＡ社製）、陽イオン性界面活性剤であるコータミン８６Ｗ（花王社製）、両イオン性界面活性剤であるＣＨＡＰＳ（同仁化学社製）、アンヒトール２０Ｎ（花王社製）を用いた。
前記１．に記載の上清除去後のＭＲＳＡ菌体に、上述の各種抽出試薬及び、対照として０．１Ｍ  水酸化ナトリウム溶液、または０．１Ｍ  亜硝酸溶液（２００μｌ）をそれぞれ加えて懸濁した。この菌懸濁液を沸騰水中で２分間煮沸して抽出を行った。抽出工程後の菌懸濁液を氷上で冷却後、０．１Ｍ  ＮａＯＨ（２００μｌ）と１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、２０μｌ）を菌懸濁液に添加し、ｐＨ６．０〜８．０に中和した。その後、１，５００×ｇで５分間遠心分離し、上清を得て、続く免疫抗体測定法のための検体を得た。【００８６】
３．  抗ＰＢＰ２抗体および抗ＰＢＰ２’抗体の作製および固相化
ＰＢＰ２及びＰＢＰ２’を特異的に検出する抗体（抗ＰＢＰ２抗体および抗ＰＢＰ２’抗体）は、公知の方法に従い作製した（例えば、特許第３６３８７３１号公報記載の方法に準ずる）。得られたモノクローナル抗体の中から、公知の選抜方法により、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で好適に使用可能な「固相用抗体」と、「標識用抗体」との組み合わせを見出した。なお、標識用抗体には、公知の方法（例えば、Ｐ．ＴＩＪＳＳＥＮ：エンザイムイムノアッセイ，東京化学同人，２１６−２４１記載の方法に準ずる）を用いた化学修飾により、ビオチンを結合させた。
上述の「固相用」の抗ＰＢＰ２抗体および抗ＰＢＰ２’抗体を、０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を用いて２μｇ/ｍｌの濃度となるよう希釈し、１ウェルあたり５０μｌをプレートへ分注して、２５℃で１時間反応を行うことにより抗体を固相化した。その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）（ＴＢＳ−Ｔ）を１ウェル当り２００μｌずつ、３回用いて、洗浄を行った。次いで、２％のＢＳＡをＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１ウェル当り２００μｌ加えて１時間反応させ、ブロッキングを行った。その後、ＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄を行った。【００８７】
４．  固相化抗ＰＢＰ２抗体および抗ＰＢＰ２’抗体を用いた免疫測定
抗体を固相化したマイクロプレートに、希釈液（１％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．１％）にて１０倍希釈した検体を、１ウェルあたり５０ｕｌずつプレートへ分注し、２５℃で１時間、抗原抗体反応を行わせた。その後、ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０濃度は０．１％）にて、１ウェル当り２００ｕｌずつ、３回洗浄を行った。次いで、ビオチンが結合した標識用抗ＰＢＰ２抗体および抗ＰＢＰ２’抗体を、希釈液（１％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．１％）にて１．０ｕｇ／ｍｌになるように希釈し、１ウェル当り５０ｕｌずつプレートへ分注し、２５℃で１時間、抗原抗体反応を行わせた。【００８８】
ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０濃度は０．１％）にて、１ウェル当り２００ｕｌずつ、３回洗浄した後、希釈液（１％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．１％）にて１ｕｇ／ｍｌとなるよう調製したストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ社カタログ番号２１１２６）を、１ウェルあたり５０ｕｌずつプレートへ分注し、２５℃で３０分反応させた。【００８９】
ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０濃度は０．１％）にて、１ウェル当り２００μｌずつ、３回洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン１ｍｇ／ｍｌ、過酸化水素０．５μｌ／ｍｌを加えた２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を、１ウェル当り１００μｌずつ加えて１０分間発色反応を行わせた後、純水で９０倍に希釈した濃硫酸溶液を１ウェル当り３０ｕｌ加えて、反応を停止した。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ）を用いて、波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表１に示す。【００９０】
（結果と考察）
ＰＢＰ２’、ＰＢＰ２それぞれに対する抗体を用いて測定した結果に関し、検体の代わりに希釈液（ＴＢＳ−Ｔ）を入れたものを用いて測定した吸光度をブランクとして差し引いた後の値を表中に示す。表１に示す通り、塩酸を含む抽出試薬、または塩酸および界面活性剤を含む抽出試薬を用いて抽出を行った検体においては、ＰＢＰ２’およびＰＢＰ２両方の測定値がブランクに比べて明確に高く、ＰＢＰ２’およびＰＢＰ２の両方を検出できた。また、界面活性剤の種類により、抽出効率には差がみられることも確認され、コータミン８６Ｗ、アンヒトール２０Ｎ、Ｂｒｉｊ７２１などを塩酸と組み合わせて用いた場合には、特に高い吸光度が得られた。なお、塩酸以外の他の酸（酢酸、クエン酸、リン酸、硫酸および硝酸）を使用した場合も、同様の結果が得られた。【００９１】
一方、水酸化ナトリウムを使用した塩基性の抽出試薬を使用した場合には、ＰＢＰ２’については検出できたが、ＰＢＰ２を測定した場合の吸光度は０となり、検出する事ができなかった。塩基性条件下においては、水酸化ナトリウムによってＰＢＰ２が良好に抽出されないか、抽出されてもその後抽出液中でＰＢＰ２が分解されてしまい、測定値として検出できていない可能性が示唆される。さらに、亜硝酸を使用した方法では、ＰＢＰ２、ＰＢＰ２’共に検出できなかった。この原因は明確ではないが、非特許文献５に開示されているような亜硝酸を用いた抗原抽出法は、糖鎖など、炭水化物性の抗原を抽出する目的に使用されているものであり、ＰＢＰ２、ＰＢＰ２’などのタンパク性の抗原を抽出する目的に対しては効果がなかったと推測される。【００９２】
【表１】
2011081075.tif 000002
【００９３】
（実施例２）  ウェスタンブロット法によるＭＲＳＡの検出
実施例１記載の方法に準じ、ＭＲＳＡの臨床分離株から抗原を抽出し、シェーガーらの方法に準じて電気泳動した。このとき、標品として精製抗原も同時に泳動した。泳動後、トービンらの方法（Ｔｏｗｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ．  ７６，ｐ．４３５０−４３５４（１９７９））の方法に準じて、泳動された抽出抗原をＰＶＤＦ膜上に固定化した。次いで、ＰＶＤＦ膜上の蛋白非固定化部分を、２％ＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液によりブロッキングした。【００９４】
ブロッキング後のＰＶＤＦ膜に、１％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．１％で１，０００倍に希釈したＰＢＰ２’またはＰＢＰ２に対するポリクローナル抗体を滴下し、室温に１時間放置した。その後、ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０濃度は０．１％）にてこのＰＶＤＦ膜を洗浄し、未反応のポリクローナル抗体を除去した。続いて０．１％ＢＳＡ（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．１％）で５，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（市販品）を滴下して室温で３０分間放置した。その後、再びＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０濃度０．１％）でＰＶＤＦ膜を洗浄し、続いて、精製水でＰＶＤＦ膜を洗浄した。発光検出キットＥＣＬ−ＰＬＵＳ（ＧＥ社製カタログ番号ＲＰＮ２１３２）を４ｍｌ滴下して、発光検出装置ＬＡＳ−３０００（富士フィルム社製）を使用し、６分間積算してバンドを検出した。バンドは、ＰＢＰ２の場合８１ｋＤａ付近、ＰＢＰ２’の場合７８ｋＤａ付近に検出される。【００９５】
（結果と考察）
表２に結果を示す。バンドが確認できたものを＋、出来なかったものを−と示した。表２に示す通り、本抽出方法がＰＢＰ２、ＰＢＰ２’の両方を同時に抽出できる事が示された。
また、実施例１の結果と同様に、水酸化ナトリウムを使用した塩基性の抽出試薬を使用した場合には、ＰＢＰ２’のバンドは検出できたが、ＰＢＰ２のバンドは確認できなかった。さらに、亜硝酸を使用した方法では、ＰＢＰ２、ＰＢＰ２’共に検出できなかった。【００９６】
【表２】
2011081075.tif 000003
【００９７】
（実施例３）  本発明の黄色ブドウ球菌の判定方法を用いた、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの判別
本発明の黄色ブドウ球菌の判定方法を用いてＭＲＳＡ、ＭＳＳＡの判別が行えることを確認する目的で、予めＭＲＳＡまたはＭＳＳＡであることが確認されている臨床分離株３株ずつを用いて、ＭＲＳＡとＭＳＳＡの判別試験を行った。実施例１と同様の方法に従い、それぞれ菌を培養し、回収した菌体を本抽出試薬である０．１Ｍ  ＨＣｌ＋２．０％ｔｗｅｅｎ２０溶液２００μｌ（ｐＨ５．０以下）に懸濁した。菌懸濁液を沸騰水中で２分間煮沸し、氷上で冷却後、この菌懸濁液に０．１Ｍ  ＮａＯＨ（２００μｌ）と１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、２０μｌ）を添加し、ｐＨ６．０〜８．０に中和した。その後、１，５００×ｇで５分間遠心し、上清を検体とし、実施例１の４．に記載の免疫測定法に供した。【００９８】
（結果と考察）
表３に結果を示す。結果の表示は、ブランクと比べて明確に吸光度が高くなった検体を＋、吸光度が上がらなかった検体を−として示す。表３の通り、ＭＲＳＡ株は３株とも、ＰＢＰ２、ＰＢＰ２’の両方を保持しており、実際に両方の抗原が検出され、ＭＲＳＡであることが確認できた。一方、ＭＳＳＡ株はＰＢＰ２’を持たず、ＰＢＰ２のみが検出された。
これらの結果から、本抽出方法がＭＲＳＡとＭＳＳＡの判別に有効である事が示された。【００９９】
【表３】
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【０１００】
（実施例４）  抗体アレイ法によるＭＲＳＡ、ＭＳＳＡの判別
本発明の黄色ブドウ球菌の判定方法を用いてＭＲＳＡ、ＭＳＳＡの判別が行えることを確認する目的で、予めＭＲＳＡまたはＭＳＳＡであることが確認されている臨床分離株ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡそれぞれ各２９株を用いて、抗体アレイ法によるＭＲＳＡの判別試験を行った。実施例１と同様の方法に従い、それぞれ菌を培養し、回収した菌体を本抽出試薬である０．１Ｍ  ＨＣｌ＋２．０％アンヒトール２０Ｎ溶液２００μｌ（ｐＨ５．０以下）に懸濁した。菌懸濁液を沸騰水中で２分間煮沸し、氷上で冷却後、この菌懸濁液に０．１Ｍ  ＮａＯＨ（２００μｌ）と１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、２０μｌ）を添加し、ｐＨ６．０〜８．０に中和した。その後、１，５００×ｇで５分間遠心し、上清を検体とした。【０１０１】
抗体アレイの作製
図１に示したレイアウトの抗体アレイを作製した。アレイ用のスライドはＰＡＴＨ  Ｓｌｉｄｅ（ＧＥＮＴＥＬ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社）を使用し、実施例１で使用した固相用の抗ＰＢＰ２抗体、抗ＰＢＰ２’抗体を各０．５  ｍｇ／ｍｌの濃度でマイクロインジェクトスポッターを使用してスライドにスポットした。また、ポジティブコントロールとして、ビオチン化ＢＳＡを１．０μｇ／ｍｌの濃度でスポットした。作製したスライドは６時間室温で放置したのち、使用する前まで４℃で保存した。【０１０２】
スライドインキュベーションチャンバー１６ウェル（ＧＥヘルスケア社  Ｎｏ．  １０４８６０４６）とチップクリップ（ＧＥヘルスケア社  Ｎｏ．  １０４８６０８１）を使用しアレイの周囲を囲みブロックで分けた。各ウェルに２％のＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を１ウェル当り１００μｌ加えて１時間反応させ、ブロッキングを行った。次に各ウェルにＴＢＳ−Ｔを１００μｌ入れて洗浄を行い、これを３回繰り返した。次に、菌株から抽出したサンプルを、１ウェルあたり５０μｌずつウェルへ分注し、２５℃で１時間、抗原抗体反応を行わせた。その後、ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０濃度は０．１％）にて、１ウェル当り１００μｌずつ、３回洗浄を行った。次いで、ビオチンが結合した標識用ＰＢＰ２抗体、ＰＢＰ２’抗体を、希釈液（１％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．１％）にて各１０．０μｇ／ｍｌになるように濃度を調整した混合液を１ウェル当り５０μｌずつ分注し、２５℃で１時間、抗原抗体反応を行わせた。【０１０３】
ＴＢＳ−Ｔにて、１ウェル当り１００μｌずつ、３回洗浄を行った後、ＩｎｔｅｌｉｔｅＡＢ（キッコーマン社製）のビオチン化ルシフェラーゼ−ストレプトアビジン複合体を１ウェル当り５０μｌずつへ分注し３０分反応させた。その後、ＴＢＳ−Ｔにて、１ウェル当り１００μｌずつ、３回洗浄を行い、さらにＴＢＳで１ウェル当り１００μｌずつ、１回洗浄を行った。【０１０４】
抗体アレイの測定は、発光検出装置であるルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ３００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製）を使用した。ルシフェリンとＡＴＰとマグネシウムイオンが含まれたＩｎｔｅｌｉｔｅＡＢのルシフェラーゼ発光基質液を各ウェルに１００μｌずつ添加し発光させ、５分間発光を測定した。【０１０５】
（結果と考察）
図２に得られたＭＳＳＡとＭＲＳＡの抗体アレイ測定画像をそれぞれ１株ずつ示す。図は発光が検出された部分を黒色で表している。ＭＳＳＡを測定した場合、抗ＰＢＰ２抗体をスポットした部分は発光しており、ＰＢＰ２の検出を示している。一方、抗ＰＢＰ２’抗体をスポットした部分は発光せず、ＰＢＰ２’が検体中にないことを示している。したがって、この検体がＭＳＳＡであると判別できた。また、ＭＲＳＡを測定した場合、ＰＢＰ２、ＰＢＰ２’抗体をスポットした部分が両方発光しており、ＰＢＰ２、ＰＢＰ２’が検体中に含まれている事を示している。よってこの検体がＭＲＳＡであると判別できた。【０１０６】
表４にＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ各２９株を抗体アレイで測定した時の判別結果を示す。結果の表示は、検査数に対して、各抗原が検出された検体の数を記した。抗原の検出は、固相した抗体の位置にブランクと比べて１０倍以上の高い発光量が測定された場合を検出されたと判定した。表４の通り、ＭＲＳＡ株は２９株とも、ＰＢＰ２、ＰＢＰ２’両方の抗原が同時に検出され、ＭＲＳＡであることが確認できた。一方、ＭＳＳＡ株はＰＢＰ２’を持たず、ＰＢＰ２のみが検出された。
これらの結果から、本発明による判定方法がＭＲＳＡとＭＳＳＡの判別に有効である事が示された。【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
（実施例５）  イムノクロマトグラフィー法によるＭＲＳＡ、ＭＳＳＡの判別
本発明の試験方法を用いてＭＲＳＡ、ＭＳＳＡの判別が行えることを確認する目的で、予めＭＲＳＡまたはＭＳＳＡであることが確認されている臨床分離株ＭＲＳＡ２９株、ＭＳＳＡ２９株を用いて、イムノクロマトグラフィー法によるＭＲＳＡの判別試験を行った。イムノクロマトグラフィーテストストリップは下記のように常法に従って作製した。【０１０９】
実施例１で使用した標識用の抗ＰＢＰ２抗体、抗ＰＢＰ２’抗体をそれぞれ金コロイドで標識し、ポリスチレン不織布に噴霧した。これを標識試薬部位とする。一方、実施例１で使用した固相用の抗ＰＢＰ２抗体、固相用の抗ＰＢＰ２’抗体をそれぞれ同一のニトロセルロースメンブレンに２本のテストラインになるように塗布し、充分に乾燥させた。対照用試薬としてＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧを同様にニトロセルロースメンブレンに塗布し、充分に乾燥した。これを補足試薬部位とした。【０１１０】
上記で作製した部位２つと、検体を供給するためのガラスフィルター、吸収用のろ紙を合わせて、イムノクロマトグラフィーテストストリップとした。【０１１１】
実施例４と同様に、ＭＲＳＡ２９株、ＭＳＳＡ２９株から抗原を抽出し、これを測定サンプルとした。測定サンプル１００μｌを作製したイムノクロマトグラフィーテストストリップの検体供給部位に投入し、１５分後、補足試薬部のテストラインを目視で確認した。【０１１２】
（結果と考察）
ＭＳＳＡはＰＢＰ２検出用テストラインだけに呈色が確認された。一方、ＭＲＳＡは、ＰＢＰ２検出用テストライン、ＰＢＰ２’検出用テストライン両方にラインが確認できた。表５に測定した検査数と検出数を示す。これらの結果から、本発明による判定方法がＭＲＳＡとＭＳＳＡの判別に有効である事が示された。【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
以上のように、本発明によれば、ＭＲＳＡを早期に発見し、ＭＲＳＡ感染者あるいはＭＲＳＡ汚染箇所に対して適切な処置を行うことが可能となり、また、黄色ブドウ球菌が検出された際には、その菌がＭＲＳＡなのか、ＭＲＳＡとは異なる対応を行うべきであるＭＳＳＡなのかを確実に区別して、それぞれに適切な処置を行うことが可能となり、黄色ブドウ球菌の検査・診断、特に日常的な検査・診断に非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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