(57)【要約】  本発明は、生物学的材料、例えば細菌、真菌（例えば酵母及びカビ）、寄生生物、組換えベクター及びウイルス等で種子をコーティングする方法を提供する。この方法は、（a）湿潤ポリマーを含む湿潤液を種子に適用して種子を湿らせること、並びに（b）湿らせた種子を、有効量の乾燥組成物であって、生物学的材料、１又は複数の二糖、１又は複数のオリゴ糖、１又は複数の多糖、１又は複数のカルボン酸塩及び１又は複数の加水分解タンパク質を含む前記乾燥組成物でコーティングすることを含む。コーティングされた種子は、0.4未満の初期水分活性（Aw）を有し得て、コーティングされた種子上の微生物は、少なくとも5 logのコロニー形成単位/g種子（CFU/g種子）の初期生存率を有する。コーティングされた種子も提供される。
2019511912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）湿潤ポリマーを含む湿潤液を種子に適用して種子を湿らせること、並びに
（b）湿らせた種子を、有効量の乾燥組成物であって、生物学的材料、10〜50重量％の１又は複数の二糖、10〜80重量％の１又は複数のオリゴ糖、0.1〜10重量％の１又は複数の多糖、0.5〜20重量％の１又は複数のカルボン酸塩及び0.5〜40重量％１又は複数の加水分解タンパク質を含む前記乾燥組成物でコーティングすること
を含む、生物学的材料で種子をコーティングする方法であって、ここでコーティングされた種子は0.4未満の初期水分活性（Aw）を有する、前記方法。
【請求項２】
生物学的材料が細菌及び真菌よりなる群から選択される微生物であり、コーティングされた種子上の微生物が少なくとも5 logのコロニー形成単位/g種子（CFU/g種子）の初期生存率を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
乾燥組成物が、
（i）生物学的材料、１又は複数の二糖、１又は複数のオリゴ糖、１又は複数の多糖、１又は複数のカルボン酸塩及び１又は複数の加水分解タンパク質を水性溶媒中で組み合わせて、粘稠スラリーを形成させること；
（ii）スラリーを液体窒素中で急速凍結して、ビーズ、小滴又はひもの形態の固形凍結粒子を作製すること、
（iii）固形凍結粒子を真空下、固形凍結粒子の凍結温度を超える温度で一次乾燥させて一次乾燥製剤を形成させること、並びに
（iv）一次乾燥製剤を完全真空下で、少なくとも20℃の温度で、得られる乾燥組成物の水分活性（Aw）を0.3未満に低下させるのに十分な時間、二次乾燥させること
を含む乾燥方法によって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
乾燥組成物が、
（i）生物学的材料、１又は複数の二糖、１又は複数のオリゴ糖、１又は複数の多糖、１又は複数のカルボン酸塩及び１又は複数の加水分解タンパク質を水性溶媒中で組み合わせて、粘稠スラリーを形成させること；並びに
（ii）スラリーを凍結乾燥又は噴霧乾燥して乾燥粉末を形成させること
を含む乾燥方法によって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
コーティングされた種子の初期水分活性（Aw）が0.35未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生物学的材料が細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
生物学的材料が真菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
生物学的材料がウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
生物学的材料が酵母である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
コーティングされた種子上の微生物が少なくとも3ヶ月間安定であり、生存率低下が1 log CFU/g種子以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
コーティングされた種子上の微生物が少なくとも1年間安定であり、生存率低下が2 log CFU/g種子以下である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（a）において湿潤液が100gの種子あたり約1ml以下の量で種子に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
湿潤ポリマーが、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン（PVP）及び酢酸フタル酸セルロース（CAP）よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
湿潤液が、0.25〜1%（w/w）のポリビニルアルコール（PVA）を有する水溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（iii）が、2000mTORRを超える真空下、20℃の温度で少なくとも16時間行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（iv）が40℃の温度で少なくとも15分間行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
乾燥方法が、乾燥組成物の粒径を低減させることをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
乾燥組成物が約1000μm未満の粒径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細菌が窒素固定細菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
窒素固定細菌が根粒菌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
１又は複数の二糖が、トレハロース、スクロース、ラクトース及びそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
１又は複数のオリゴ糖が、シクロデキストリン、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクトオリゴ糖（FOS）、ガラクトオリゴ糖（GOS）、マンナンオリゴ糖（MOS）及びそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
１又は複数のオリゴ糖がシクロデキストリンからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
１又は複数の多糖が、酢酸フタル酸セルロース（CAP）、カルボキシメチルセルロース、ペクチン、アルギン酸の塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、メチルセルロース、カラギーナン、ゲランガム、グアーガム、アカシアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン、加工デンプン並びにそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
１又は複数の加水分解タンパク質が、加水分解カゼイン、加水分解ホエイタンパク質、加水分解エンドウマメタンパク質、加水分解ダイズタンパク質及びそれらの混合物よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
カルボン酸が、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸及びグルタミン酸よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法によってコーティングされた種子。
【請求項２８】
生物学的材料、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボン酸塩、加水分解タンパク質及び湿潤ポリマーでコーティングされた種子であって、0.4未満の初期水分活性（Aw）を有する種子。
【請求項２９】
生物学的材料が細菌及び真菌よりなる群から選択される微生物であり、コーティングされた種子上の微生物が、少なくとも5 logのコロニー形成単位/g種子（CFU/g種子）の初期生存率を有する、請求項２８に記載の種子。
【請求項３０】
細菌が窒素固定細菌である、請求項２９に記載の種子。
【請求項３１】
窒素固定細菌が根粒菌である、請求項３０に記載の種子。
【請求項３２】
生物学的材料が真菌である、請求項２８に記載の種子。
【請求項３３】
生物学的材料がウイルスである、請求項２８に記載の種子。
【請求項３４】
生物学的材料が酵母である、請求項２８に記載の種子。
【請求項３５】
コーティングされた種子上の微生物が少なくとも3ヶ月間安定であり、生存率低下が1 log CFU/g種子以下である、請求項２９に記載の種子。
【請求項３６】
コーティングされた種子上の微生物が少なくとも1年間安定であり、生存率低下が2 log CFU/g種子以下である、請求項２９に記載の種子。
【請求項３７】
湿潤ポリマーが、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン（PVP）及び酢酸フタル酸セルロース（CAP）よりなる群から選択される、請求項２８に記載の種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は2016年2月19日に出願された米国仮出願第62/297,228号の利益を主張し、その内容は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
高温及び高湿での長期保存中に生物学的材料の構造及び機能を維持することは、食品、栄養補助食品及び製薬産業にとって基本的に重要である。敏感な生物学的材料、例えばタンパク質、酵素、細胞、細菌、真菌及びウイルス等は、しばしば、後の使用のための長期保存のために維持されなければならない。保存中の生物学的材料を安定化するために多くの方法が試みられてきたが、多くは敏感な生物活性物質、例えば生きている又は弱毒化された細菌、真菌及びウイルス等には適さない。例えば、従来の凍結乾燥は、凍結と乾燥の両方によるストレスを併せ持つ。このプロセスの凍結ステップは、望ましくない効果、例えばタンパク質及び酵素の変性並びに細胞の破裂等を有することがある。
【０００３】
再水和の際にかなりの量の活性をなお保持しながらも、生物学的材料の輸送及び保存の間に遭遇するような高温及び様々な湿度において長期間にわたって広範囲の生物学的材料の優れた安定化及び維持を提供するために有用である、安定化組成物へのニーズが存在する。
【０００４】
生物学的材料の過剰な活性損失を伴わずに錠剤化用途において用いることができる安定化組成物へのニーズもまた存在する。生物学的材料の多くは、錠剤化の際に遭遇する高圧及び高温に敏感である。
【０００５】
さらに、種子に効果的に適用することができる安定化組成物へのニーズが存在する。マメ科植物の種子は根粒形成及び強力な植物成長を促すために、正しいタイプの窒素固定細菌（すなわち根粒菌の菌種（Rhizobia spp.））を接種する必要があることが長年にわたって知られている。従来の慣行は、根粒菌のような生物学的材料を種子を植える直前に種子に適用すること、又は植え付け時に種子が植え付けられる土壌に適用することを伴う。このような「ジャストインタイム（just-in-time）適用」は、種子上又は種々の粉末及び/若しくは液体製剤中の根粒菌の限られた安定性に基づくものである。実際には、安定化された根粒菌はまた、殺虫剤及び殺真菌剤で既に処理され、特定のポリマーでコーティングされた種子上に置かれ得る。歴史的に、（パック内又は種子上のいずれかでの）長期安定性を呈する根粒菌製剤を開発する努力は、限られた成功しか収めていない。現在入手可能な液体種子コーティング根粒菌製剤は、液体を輸送するコストが高いこと、こぼれる可能性があること、及びこれらのタイプの製剤のクリーンアップに費用がかかることといった多くの欠点を有する。さらに、現在入手可能な種子コーティング根粒菌製剤は、安定性を改善するために「エキステンダー（extender）」液を根粒菌ブロスと手動で混合することを必要とする。液体の混合は時間がかかり、スケールの誤差（例えば「エキステンダー」液又は根粒菌ブロスを過少又は過剰に入れること）につながる可能性がある。ストレスの多い条件下で数週間及び数ヶ月でさえも安定なままである根粒菌等の生物学的材料で種子をコーティングする方法への需要が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、種子を生物学的材料でコーティングするための安定化組成物、その調製及び使用方法、並びにコーティングされた種子に関する。
【０００７】
生物学的材料、例えば生きている微生物、組換えベクター、抗体又は酵素を含む種子をコーティングする方法が提供される。この方法は、湿潤液を種子に適用して種子を湿らせること、次いで、湿らせた種子を有効量の乾燥組成物でコーティングすることを含む。湿潤液は、湿潤ポリマーを含む。乾燥組成物は、生物学的材料、約10〜50%（w/w）の１又は複数の二糖、約10〜80%（w/w）の１又は複数のオリゴ糖、約0.1〜10%（w/w）の１又は複数の多糖、約0.5〜20%（w/w）の１又は複数のカルボン酸塩及び約0.5〜40%（w/w）の１又は複数の加水分解タンパク質を含む。コーティングされた種子は、0.4未満、例えば0.35未満の初期水分活性（Aw）を有する。コーティングされた種子上の生物学的材料、例えば生きている微生物等は、少なくとも5 logのコロニー形成単位/g種子（CFU/g種子）の初期生存率を有し得る。
【０００８】
乾燥組成物は、生物学的材料、１又は複数の二糖、１又は複数のオリゴ糖、１又は複数の多糖、１又は複数のカルボン酸塩及び１又は複数の加水分解タンパク質を水性溶媒中で合わせて粘稠スラリーを形成させること、スラリーを液体窒素中で急速凍結、例えば瞬間凍結（snap-freezing）してビーズ、小滴又はひもの形態の固形凍結粒子を作製すること、固形凍結粒子を真空下、固形凍結粒子の凍結温度を超える温度で一次乾燥させて一次乾燥製剤を形成させること、並びに一次乾燥製剤を完全真空下、少なくとも20℃の温度で、得られる乾燥組成物の水分活性（Aw）を0.3未満に低下させるのに十分な時間、二次乾燥させることを含む乾燥方法によって調製され得る。乾燥方法において、一次乾燥ステップは、2000mTORRを超える真空下、約20℃の温度で少なくとも約16時間、行われ得る。二次乾燥ステップは、約40℃の温度で少なくとも約15分間、行われ得る。乾燥組成物は、生物学的材料、１又は複数の二糖、１又は複数のオリゴ糖、１又は複数の多糖、１又は複数のカルボン酸塩及び１又は複数の加水分解タンパク質を水性溶媒中で合わせて粘稠スラリーを形成させること;並びにスラリーを凍結乾燥又は噴霧乾燥させて乾燥粉末を形成させることを含む乾燥方法によって調製され得る。
【０００９】
本発明の方法によれば、コーティングされた種子上の生物学的材料は、少なくとも約3ヶ月間安定であり得る。このタイプの特定の実施形態において、生物学的材料は、約1 log CFU/g種子以下の生存率低下を有する微生物である。いくつかの実施形態において、コーティングされた種子上の生物学的材料は、少なくとも約1年間安定であり得る。このタイプの特定の実施形態において、生物学的材料は、約2 log CFU/g種子以下の生存率低下を有する微生物である。
【００１０】
湿潤液は、100gの種子あたり約1ml以下の量で種子に適用され得る。湿潤液中の湿潤ポリマーは、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン（PVP）及び酢酸フタル酸セルロース（CAP）よりなる群から選択され得る。１つの実施形態において、湿潤液は、0.25〜1%（w/w）のポリビニルアルコール（PVA）を有する水溶液である。
【００１１】
コーティング方法は、コーティングステップの前に乾燥組成物の粒径を低減させることをさらに含み得る。乾燥組成物は、約1000μm未満の粒径を有し得る。
【００１２】
種子の生物学的材料は、微生物、例えば細菌、真菌（例えば酵母又はカビ）、寄生生物又はウイルス、組換えベクター、抗体又は酵素であり得る。細菌は、窒素固定細菌であり得る。窒素固定細菌は、根粒菌であり得る。
【００１３】
１又は複数の二糖は、トレハロース、スクロース、ラクトース及びそれらの混合物よりなる群から選択され得る。
【００１４】
１又は複数のオリゴ糖は、シクロデキストリン、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクトオリゴ糖（FOS）、ガラクトオリゴ糖（GOS）、マンナンオリゴ糖（MOS）及びそれらの混合物よりなる群から選択され得る。
【００１５】
１又は複数のオリゴ糖は、シクロデキストリンからなってもよい。
【００１６】
１又は複数の多糖は、酢酸フタル酸セルロース（CAP）、カルボキシメチルセルロース、ペクチン、アルギン酸の塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、メチルセルロース、カラギーナン、ゲランガム、グアーガム、アカシアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン、加工デンプン並びにそれらの混合物よりなる群から選択され得る。
【００１７】
１又は複数の加水分解タンパク質は、加水分解カゼイン、加水分解ホエイタンパク質、加水分解エンドウマメタンパク質、加水分解ダイズタンパク質及びそれらの混合物よりなる群から選択され得る。
【００１８】
カルボン酸は、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸及びグルタミン酸よりなる群から選択され得る。
【００１９】
本発明のコーティング方法の各々について、得られるコーティングされた種子が提供される。
【００２０】
生物学的材料、例えば生きている微生物、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボン酸塩、加水分解タンパク質及び湿潤ポリマーでコーティングされた種子が提供される。コーティングされた種子は、0.4未満の初期水分活性（Aw）を有する。種子上の微生物は、少なくとも5 logのコロニー形成単位/g種子（CFU/g種子）の初期生存率を有し得る。微生物は、細菌、真菌（例えば酵母又はカビ）、寄生生物又はウイルスであり得る。細菌は、窒素固定細菌であり得る。窒素固定細菌は、根粒菌であり得る。コーティングされた種子上の生物学的材料は、少なくとも3ヶ月間安定であり得る。このタイプの特定の実施形態において、生物学的材料は、1 log CFU/g種子以下の生存率低下を有する微生物である。コーティングされた種子上の生物学的材料は、少なくとも1年間安定であり得る。このタイプの特定の実施形態において、生物学的材料は、2 log CFU/g種子以下の生存率低下を有する微生物である。湿潤ポリマーは、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン（PVP）及び酢酸フタル酸セルロース（CAP）よりなる群から選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、市販のプロバイオティクス細菌及び本発明の乾燥組成物中のプロバイオティクス細菌の加速安定性を示す。
【図２】図２は、加速保存条件下（37℃及び33%RH）でのプロバイオティクス安定性（L. paracasei）に対する、組成物中のガラス強化剤と炭水化物混合物との間の種々のモル比の効果を示す。
【図３】図３は、プロバイオティクス細菌L.アシドフィラス（L.acidophilus）の保存安定性に対する本発明の組成物の効果を示す。乾燥プロバイオティクス細菌の安定性を、24℃、33%RHの加速保存条件で537日間試験した。
【図４】図４は、プロバイオティクス細菌L.アシドフィラスの保存安定性に対する種々のガラス強化剤化合物の効果を示す。乾燥プロバイオティクス細菌の安定性を、24℃、43%RHの加速保存条件で180日間試験した。
【図５】図５は、プロバイオティクス細菌ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）の保存安定性（35℃、43%RH）に対する種々のタンパク質加水分解物/糖の比の効果を示す。
【図６】図６は、プロバイオティクスL.ラムノサス（L. rhamnosus）の最大安定性のためのpH最適化を示す（40℃、33%RHで8週間の加速保存条件）。
【図７】図７は、本発明の方法による凍結固形ビーズとして種々のマトリックス及びガラス形成剤を含有する異なる乾燥組成物の目視観察を示す。
【図８】図８は、本発明の方法による凍結固形ビーズとして種々のマトリックス及びガラス形成剤を含有する異なる乾燥組成物の顕微鏡観察を示す。
【図９】図９は、新鮮なビーズ、凍結ビーズ又は乾燥粉末培養物としてのL.ラムノサス培養形態が、乾燥組成物中のその初発CFU数に及ぼす効果を示す。
【図１０】図１０は、液体窒素又は-80℃ディープフリーザー内での凍結固形ビーズとしての、及び+4℃の非凍結粘稠スラリーとしてのL.ラムノサスを含有する組成物の凍結温度が、乾燥組成物中の細菌初発CFU数に及ぼす効果を示す。結果は、乾燥前にパージする追加ステップなしでのスラリーの凍結温度の効果のみを示す。
【図１１】図１１は、液体窒素中の凍結固形ビーズとしての及び+4℃の非凍結粘稠スラリーとしてのビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）を含有する組成物の凍結温度が、乾燥組成物中の細菌初発CFU数に及ぼす効果を示す。結果は、乾燥前にパージする追加ステップなしでのスラリーの凍結温度の効果のみを示す。
【図１２】図１２は、凍結固形ビーズの真空下パージ持続時間が、乾燥組成物中のL.ラムノサスの初発CFU数に及ぼす効果を示す。
【図１３】図１３は、本発明の方法による組成物の凍結乾燥機における乾燥プロファイルを示す。
【図１４】図１４は、本発明の組成物及び乾燥方法におけるプロセス及びL.ラムノサスの乾燥損失を示す。
【図１５】図１５は、40℃及び33%の相対湿度での保存中の、乾燥プロバイオティクス細菌L.ラムノサス組成物の安定性の傾向を示す。
【図１６】図１６は、普通に凍結乾燥された又は本発明の組成物及び方法の中で配合した後のL.アシドフィラス菌種の、40℃及び43%RHでの貯蔵安定性（shelf storage stability）を示す。
【図１７】図１７は、普通に凍結乾燥された又は本発明の組成物及び方法の中で配合した後のL.ラムノサス菌種の、40℃及び43%RH並びに30℃及び60%RHでの貯蔵安定性を示す。
【図１８】図１８は、本発明の組成物中で安定化され保護されたプロバイオティクスL.ラムノサスの生存率並びに40℃及び43%RHでの保存安定性に対する、錠剤プレスにおける打錠の効果を実証する。
【図１９】図１９は、本発明の組成物中で安定化され保護されたプロバイオティクスL.ラムノサスの生存率に対する、マルチビタミン及びミネラルの混合物との錠剤化並びに40℃及び43%RHでの保存曝露の効果を示す。
【図２０】図２０は、遊離形態の又は本発明の組成物中で保護されたプロテアーゼ及びリパーゼ酵素の活性に対する、錠剤プレスにおける打錠の効果を図示する。酵素は個別に錠剤化するか、又は等量で混合して次いで錠剤化した。
【図２１】図２１は、（A）凍結乾燥安定化組成物、及び（B）真空乾燥安定化組成物の画像を示す。真空乾燥安定化組成物は、ガラス状で非晶質の性質を示す。
【図２２】図２２は、（A）ガラス状で非晶質の真空乾燥組成物で、（B）凍結乾燥組成物で、又は（C）液化凍結乾燥組成物でコーティングした種子を示す。
【図２３】図２３は、真空乾燥組成物43A、43A-1、43B及び43B-1でコーティングしたダイズ種子上の根粒菌の拡大された安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定することを意図していないことが理解されるものである。本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「a」、「an」及び「the」は、その内容が明確に別段の指示をしない限り、複数形の指示対象を包含する。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は単一のタンパク質又は２以上のタンパク質の組み合わせを包含し、「酵素」、「細菌」、「真菌」、「酵母」、「カビ」、「ウイルス」等への言及は単一のもの又はいくつかのタイプの混合物を包含する。
【００２３】
本発明の記載及びクレームにおいて、以下の用語は以下に定める定義に従って用いられる。
【００２４】
「生物活性成分」、「生物活性材料」及び「生物学的材料」は全て、微生物、組換えベクター、酵素、抗体を包含する非酵素タンパク質、又は生物学的活性を可能にする成分を指す。本発明での使用に適した生物活性材料としては、限定されるものではないが、ペプチド、タンパク質、酵素、ホルモン、核酸、抗体、薬物、ワクチン、真菌（例えば酵母又はカビ）、細菌（プロバイオティクス又はその他）、土壌微生物、寄生生物（例えばコクシジウム、トキシプラズマ、クリプトスポリジウム）、ウイルス、病原体についての抗原として働く１又は複数のタンパク質をコードしてもよいベクター（組換えベクター、例えば組換え細菌ベクター、組換えRNA粒子及び組換えウイルスベクター、例えば組換えシチメンチョウヘルペスウイルス（HVT）等を包含する）、並びに抗原自体として働く組換えタンパク質、抗体といったタンパク質及び/又は細胞懸濁液が挙げられる。生物学的材料は、生きているものであり得る。
【００２５】
「生物学的組成物」は、生物活性成分又は剤の生物学的活性が明確に有効であることを可能にするような形態である調製物を指す。
【００２６】
「ガラス強化剤」、「ガラス強化化合物」及び「ガラス形成剤」は、臨界温度であるガラス転移温度（Tg）未満で非晶質又はガラス状の構造を形成させる能力を有する化合物を示すために、本明細書中で互換的に用いられる。ガラス状構造の形成中に、生物学的物質がガラス構造内に包埋された状態になることがある。本発明での使用に適したガラス強化剤としては、限定されるものではないが、有機酸の塩、例えば乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸等の塩が挙げられる。塩は、カチオン、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、ホスフェート等を包含し得る。他の有用なガラス強化剤としては、タンパク質、タンパク質加水分解物、ポリペプチド及びアミノ酸が挙げられる。ガラス形成剤の組み合わせもまた、単一の組成物内で考えられる。本発明の目的のためのガラス状構造を得るために用いられるプロセスは、一般に溶媒昇華（solvent sublimation）及び/又は蒸発技術である。理想的には、GRAS化合物である化合物がGRASではない化合物よりも好ましい。
【００２７】
「糖（sugar）」は、主に炭素、水素及び酸素から構成される糖類（saccharide）を指す。有用な糖類としては、還元性及び非還元性の糖及び糖アルコール及び二糖が挙げられる。２つの単糖が結合して二糖を形成する。二糖を形成するために用いられる２つの単糖は、同じであっても異なっていてもよい。本発明の組成物中で用いることができる二糖の例としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、イソマルトースが挙げられる。硫酸化二糖も用いられ得る。
【００２８】
「炭水化物」又は「ポリヒドロキシ化合物」は、主に炭素、水素及び酸素から構成される糖類（saccharide）を指す。典型的に直鎖又は非直鎖様式で連結された繰り返し構造単位の糖骨格から構成される糖類は、そのいくつかは正又は負に荷電した化学基を含有する。繰り返し単位は、2〜数百万の範囲であり得る。有用な糖類としては、還元性及び非還元性の糖及び糖アルコール、二糖、オリゴ糖、水溶性多糖並びにそれらの誘導体が挙げられる。２つの単糖が結合して二糖を形成する。二糖を形成するために用いられる２つの単糖は、同じであっても異なっていてもよい。本発明の炭水化物混合物中で用いることができる二糖の例としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、イソマルトースが挙げられる。硫酸化二糖も用いられ得る。少数（典型的には3〜20個）の単糖が結合してオリゴ糖を形成する。オリゴ糖を形成するために用いられる単糖は、同じ構成糖であっても異なる構成糖であってもよい。使用に適したオリゴ糖の例としては、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクトオリゴ糖（FOS）、ガラクトオリゴ糖（GOS）、マンナンオリゴ糖（MOS）及びそれらの組み合わせが挙げられる。多数（典型的には20個超）の単糖が結合して多糖を形成する。多糖を形成するために用いられる単糖は、同じ構成糖であっても異なる構成糖であってもよい。使用に適した多糖の例としては、限定されるものではないが、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース,及びヒプロメロース；可溶性デンプン又はデンプン画分、キサンタンガム、グアーガム、ペクチン、カラギーナン、ガラクトマンナン、ゲランガム、これらの任意の誘導体等、酢酸フタル酸セルロース（CAP）、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸の塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、アカシアガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン及び加工デンプン並びにシクロデキストリンが挙げられる。
【００２９】
「加水分解タンパク質」は、約1kDa〜約50kDaの分子量を有する加水分解タンパク質を得るために、部分的又は完全な酸又は酵素加水分解に供されたタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、本明細書において「高度加水分解タンパク質（extensively hydrolyzed protein）」と称される、タンパク質基質の少なくとも20%は、200〜2000ダルトンの分子質量を有するペプチドに変換される。加水分解タンパク質は、完全なタンパク質とほぼ同じアミノ酸組成を有し、いくつもの商業的供給元から入手し得る。低アレルギー性であるため、加水分解タンパク質は、過敏な消費者、例えば乳児及び高齢者等のためのある種の食品において有利に用いられ得る。
【００３０】
「安定な」製剤又は組成物は、その中の生物学的活性材料が保存の際にその物理的安定性、化学的安定性及び/又は生物学的活性を本質的に保持するものである。用語「製剤」、「配合物」及び「組成物」は、本明細書中で互換的に用いられる。安定性は、選択された温度及び湿度条件で、選択された期間にわたって測定することができる。傾向分析は、ある材料がその期間実際に保存される前に予想保存寿命を推定するために用いることができる。本発明の特定の態様において、生きている微生物、例えば細菌、真菌（例えば酵母又はカビ）、寄生生物及びウイルス等の安定性は、予め定義された条件、例えば温度、湿度及び期間の下での製剤中又は種子上の生きている微生物の生存率低下、例えば、約１又は予め決められたlog値の、細菌及び真菌（例えばカビ又は酵母）についてはコロニー形成単位/g、CFU/g、又はウイルスについてはプラーク形成単位/g（PFU/g）に基づいて定義される。
【００３１】
本明細書中で用いられる場合、本明細書中で教示されるように、「安定な」生物学的材料は種子上にコーティングされたときに1ヶ月間有効なままである。特定の実施形態において、安定な生物学的材料は、種子上にコーティングされ、少なくとも1ヶ月間有効なままである。他の特定の実施形態において、安定な生物学的材料は、種子上にコーティングされ、1〜2ヶ月間有効なままである。なお他の特定の実施形態において、安定な生物学的材料は、種子上にコーティングされ、少なくとも2ヶ月間有効なままである。さらに他の特定の実施形態において、安定な生物学的材料は、種子上にコーティングされ、3ヶ月間有効なままである。なお他の特定の実施形態において、安定な生物学的材料は、種子上にコーティングされ、2〜3ヶ月間有効なままである。なお他の特定の実施形態において、安定な生物学的材料は、種子上にコーティングされ、少なくとも3ヶ月間有効なままである。より特定の実施形態において、安定な生物学的材料は、種子上にコーティングされたとき、3〜6ヶ月で有効なままである。このタイプの特定の実施形態において、安定な病原体抗原は、種子上にコーティングされ、少なくとも6ヶ月間有効なままである。なおより特定の実施形態において、生物学的材料抗原は、種子上にコーティングされたとき、6〜12ヶ月有効なままである。このタイプの特定の実施形態において、安定な病原体抗原は、種子上にコーティングされ、少なくとも1年間有効なままである。さらにより特定の実施形態において、生物学的材料抗原は、種子上にコーティングされたとき、1〜3年有効なままである。
【００３２】
特定の実施形態において、安定な生物学的材料は、その酵素活性の少なくとも10%〜90%を保持した酵素、例えばリパーゼ又はプロテアーゼである。関連する実施形態において、安定な生物学的材料は、その酵素活性の少なくとも25%〜80%を保持した酵素である。別の実施形態において、安定な生物学的材料は、その酵素活性の少なくとも40%〜60%を保持した酵素である。細菌又は真菌（例えば酵母又はカビ）に関して、「生存性」は、細菌又は真菌の増殖のために適切な栄養培地上でコロニーを形成するそれらの能力（CFU又はコロニー形成ユニット）を指す。ウイルスに関して、生存性は、好適な宿主細胞に感染、増殖して、宿主細胞のローン（lawn）上にプラークの形成をもたらすそれらの能力（PFU又はプラーク形成ユニット）を指す。
【００３３】
「周囲」室温又は条件は、所与の環境における任意の所与の時点でのものである。典型的には、周囲室温は約22〜25℃であり、周囲大気圧は約760Torr又は1気圧であり、周囲相対湿度は冬で約30〜50%、夏で約40〜65%であって、これらは容易に測定することができ、季節、気象及び気候条件、高度等に応じて変化し得る。全ての測定（例えば水分活性）は、特に指示がない限り、周囲条件（すなわち周囲温度、周囲大気圧及び周囲湿度）下で行われる。
【００３４】
乾燥製剤組成物との関連での「水分活性」又は「Aw」は、水の利用可能性を指し、系における水のエネルギー状態を表す。これは、試料上の水の蒸気圧を、同じ温度の純水の蒸気圧で割ったものとして定義される。純粋な蒸留水は、正確に1の水分活性、すなわちAw＝1.0を有する。
【００３５】
保存安定性との関連での「相対湿度」又は「RH」は、所与の温度における空気中の水蒸気の量を指す。相対湿度は、通常、空気を飽和させるのに必要な湿度よりも低く、飽和湿度のパーセントで表される。
【００３６】
「乾燥した（dry）」及びそのバリエーションは、脱水された又は無水である、すなわち実質的に液体を欠く物理的状態を指す。乾燥（drying）としては、例えば噴霧乾燥、流動床乾燥、凍結乾燥及び真空乾燥が挙げられる。その水分活性が低い、例えば約0.4、0.35、0.3、0.2又は0.1以下である場合、材料、例えば製剤等は乾燥している。
【００３７】
「凍結乾燥する（lyophilize）」又は凍結乾燥（freeze drying）は、凍結状態における急速凍結及び脱水（時に昇華と呼ばれる）による乾燥形態の組成物の調製を指す。凍結乾燥は、糖の結晶化をもたらす温度で行われる。このプロセスは、凍結生成物を維持するのに十分な真空下で、いくつかの実施形態においては約<2000mTORRより低圧で行い得る。
【００３８】
本明細書中に記載されるプロセスに関して、「一次水除去」又は「一次乾燥」ステップ又は「液体乾燥」は、凍結粒子を解凍する時から二次乾燥が開始する時点まで行われる脱水乾燥を指す。典型的には一次乾燥の大部分が大規模な蒸発によって行われ、一方、生成物温度は熱源の温度よりも著しく低いままであった。このプロセスは、解凍された生成物を維持するのに十分な真空下で、いくつかの実施形態においては約>2000mTORRより高圧で行い得る。
【００３９】
本明細書中に記載されるプロセスに関して、「二次乾燥」は、熱源の温度に近い製剤温度で行われる乾燥ステップを指す。このプロセスは、製剤の水分活性を低下させるのに十分な真空下で、いくつかの実施形態において約＜1000mTORR未満で行うことができる。典型的な製剤乾燥プロセスにおいて、二次乾燥ステップは、製剤の水分活性を0.3以下のAwに低下させる。
【００４０】
本明細書中で用いられる場合、「急速凍結」は組成物の温度を非常に迅速に、一般に約70℃以下に低下させるプロセスである。これは、組成物が含有する液体、例えば水が結晶化して氷を形成するのを防ぐのに十分な速さで組成物を凍結させることを主要目的とするいくつもの方法によって達成することができる。生きている及び/又は活性のある成分、例えば生きている細菌、寄生生物、タンパク質又はウイルスを含有する急速凍結組成物は一般に、生きている及び/又は活性のある成分の活性/安定性の維持を援助する。特定の実施形態において、急速凍結のプロセスは、組成物を液体窒素と接触させることを包含する。特定の実施形態において、急速凍結法は、瞬間凍結により実施される。
【００４１】
本明細書中で用いられる場合、「ワクチン」は、動物への投与の際に野生型微生物による感染から生じる臨床疾患からの防御を最小限に援助するのに十分な強さ、すなわち、臨床疾患の予防を援助するのに、及び/又は臨床疾患を予防、改善若しくは治癒するのに十分な強さの免疫応答を誘導する、動物（ある実施形態においてヒトを包含する）への適用に適した組成物である。特に明示的に指示しない限り、ワクチンという用語の使用は、多価ワクチンを包含する。本発明のワクチンは、ワクチンが防御を援助することを意図する抗原及び病原体に応じて、とりわけヒト;又はイヌ、ネコ、ウマ、ブタ、家禽、例えばニワトリ又はシチメンチョウ、反芻動物、例えばウシ又はヒツジ、及び水生動物、例えば魚等といった任意の他の動物のために作製し、これらに投与することができる。
【００４２】
本明細書中で用いられる場合、「多価ワクチン」は、2以上の異なる抗原を含むワクチンである。このタイプの特定の実施形態において、多価ワクチンは、2以上の異なる病原体に対するレシピエントの免疫系を刺激する。
【００４３】
本明細書中で用いられる場合、用語「防御する」、「防御すること」、「防御を提供する」、「防御を提供すること」及び「防御における援助」は、感染の徴候からの完全な防御を必要としない。例えば、「防御における援助」は、チャレンジ後に根底にある感染の症状が少なくとも低減されるように防御が十分であることを、並びに/又は症状を引き起こす、根底にある細胞性、生理学的若しくは生化学的な原因若しくはメカニズムの1若しくは複数が低減及び/若しくは排除されることを意味することができる。この関連で用いられる「低減される」は、感染の生理学的状態だけでなく感染の分子状態を包含する感染の状態と比べたものを意味することが理解される。
【００４４】
本明細書中で用いられる場合、用語「治療有効量」は、単回投与で提供されたとき及び/又は1若しくは複数回のその後に続くブースター投与を伴う初回投与として意図、提供されたときに、それに対する防御のために抗原が投与される病原体からの防御を提供し、並びに/又はその病原体からの防御を援助するのに十分な、所与の抗原、例えば生きている弱毒化ウイルスの量である。
【００４５】
本明細書中で用いられる場合、「有効な」ワクチンは、治療有効量の所与の抗原を含む。
【００４６】
本明細書中で用いられる場合、用語「薬学的に許容される」は、修飾された名詞が医薬製品における使用に適していることを意味するために形容詞的に用いられる。例えば、医薬ワクチン中の賦形剤を記載するために用いられる場合、それは、賦形剤を、組成物の他の成分と適合性であり、意図されるレシピエントに対して不利に有害ではないものと特徴付ける。
【００４７】
用語「担体」は、化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビークルを指す。薬学的に許容される担体は、滅菌液体、例えば水及び/又は石油、動物、植物若しくは合成起源のものといった油等、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等であることができる。水又は生理食塩水溶液及びデキストロース水溶液及びグリセロール溶液を、とりわけ注射用溶液のための担体として使用することができる。
【００４８】
本明細書中で用いられる場合、「アジュバント」は、免疫学的イベントのカスケードに好都合である、又はこれを増幅することが可能であり、最終的により良好な免疫学的応答、すなわち抗原に対する統合された身体応答を導く物質である。アジュバントは一般に、免疫学的応答が起こるためには必要ではないが、この応答に好都合であるか、又はこの応答を増幅する。
【００４９】
本発明は、敏感な生物活性材料、例えばペプチド、タンパク質、ホルモン、核酸、抗体、薬物  ワクチン、真菌（例えば酵母又はカビ）、細菌（プロバイオティクス又はその他）、ウイルス及び/又は細胞懸濁液等を保存中に維持するための組成物及び乾燥方法を包含する。
【００５０】
本発明の組成物及び乾燥方法は、敏感な生物活性材料、例えばペプチド、タンパク質、ホルモン、核酸、抗体、薬物、ワクチン、真菌（例えば酵母又はカビ）、細菌、ウイルス及び/又は細胞懸濁液等を含有し、乾燥状態で著しく延長された寿命を有する、費用効果が高くかつ工業的に規模拡大可能な乾燥製剤を提供するという課題を解決する。本発明は、高度に可溶性の化合物の非晶質ガラス状構造によって囲まれた生物学的材料を含む保存組成物を提供する。本発明はさらに、種子上の生きている微生物、例えば細菌、真菌（例えば酵母又はカビ）及びウイルス等といった生物学的材料の安定性を改善する方法を提供する。乾燥プロセスは：生物学的材料及び組成物の他の成分を液体スラリー中で混合すること、前記スラリーを液体窒素中で瞬間凍結して小滴、ひも又はビーズの形態の粒子を形成させること、続いて、熱を供給しながら減圧レジメン下で水分を蒸発させることによって粒子を乾燥させてガラス状乾燥組成物を形成させることを含み得る。
【００５１】
本発明は、実質的な活性を保持しつつ、生物学的材料をガラス状構造で保護することができるという注目すべき発見に基づいている。本発明に従って生物学的材料を組成物混合物と合わせて乾燥させると、過酷な温度及び湿度条件に長時間曝露した際に優れた安定性が達成された。本発明は、生物学的材料、可溶性炭水化物の混合物及びガラス強化カルボン酸塩を含有する組成物を包含する。本発明の組成物は、典型的な凍結乾燥プロセス下で単純に乾燥された非粘性又は濃縮糖組成物とは物理的構造及び機能が本質的に異なる。例えば、米国特許第6,919,172号は、種々の炭水化物の混合物及びクエン酸ナトリウムを含有する、肺投与のためのエアロゾル化粉末組成物を開示している。しかしながら、この特許に記載されている組成物は、高濃度の糖を有する溶液の乾燥中に安定性を高め、望ましい物理的構造を形成させるのに必須である追加のタンパク質化合物を欠いている。この特許の中に記載されている組成物はまた、ガラス形成強化のための解凍溶液又は未凍結溶液の効率的な乾燥を可能にする粘度又はハイドロゲル構造を欠いている。対照的に、本発明の組成物及び乾燥プロセスは、生物学的材料の優れた安定性を達成しながら、これらの問題の全てを克服する。先行技術はまた、生物学的材料を保護及び安定化するために加水分解タンパク質と相乗的に作用する追加のカルボン酸成分を欠いている。
【００５２】
ガラス状構造の強化は、従来技術において、通常、溶液を真空下で発泡又は沸騰させて効果的な乾燥を容易にすることによって達成された。発泡ステップは一般に、未凍結溶液の乾燥の避けられない結果である溶液の大規模な沸騰及び噴出をもたらしており、結果として、バイアル又は容器中の溶液の非常に低い負荷容量のみを達成することができる（例えば米国特許第6,534,087号を参照のこと、ここでは最終発泡生成物の厚さは2mm未満である）。本発明の組成物及び乾燥方法は、製剤の沸騰及び発泡を回避し、それによって、乾燥面積あたりの材料のはるかに多い負荷を可能にし、その結果、特別に設計された容器及びトレイ又は装置を用いることなく、大量の材料の生産まで容易にスケールアップすることができる。
【００５３】
広範囲の生物学的材料を本発明の組成物と共に使用して、本発明による水性保存媒体を形成させることができる。次いで、この保存媒体を本発明の乾燥プロセスに供して、生物学的材料の安定な乾燥粉末を作製することができる。これらの生物学的材料としては、限定されるものではないが：酵素、例えば膵酵素、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ等;タンパク質、例えばインスリン等;ワクチン;ウイルス、例えばアデノウイルス等;原核細胞（細菌及び真菌を包含する）及び真核細胞といった細胞；薬物、核酸、ペプチド、ホルモン、ビタミン、カロテノイド、ミネラル、抗生物質、殺菌剤、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、殺精子剤、抗体及び脂質ベシクルといった他の生物学的材料が挙げられる。
【００５４】
プロバイオティクス細菌は、本発明の組成物及び乾燥方法からとりわけ利益を得ることが示されている。安定な乾燥プロバイオティクス粉末は、プロバイオティクス細菌の新鮮、凍結又は乾燥培養物を炭水化物及びガラス強化化合物の混合物と混合すること、粘性製剤を液体窒素中で瞬間凍結して凍結固形小滴、ひも又はビーズを形成させること、並びに製剤温度を凍結温度より高く上昇させるのに十分な真空を最初に適用し、20℃以上の熱源を供給して一次水除去を容易にすることによって乾燥させることを包含する本発明の組成物及び方法に従って調製される。製剤の温度を凍結点より高く維持することは、真空を調節すること及び製剤に熱を伝導することによって達成することができる。乾燥プロセスを完了し、さらに製剤の水分活性をAw0.3以下に低下させるために、二次乾燥ステップを最大真空で70℃までの高温で適用する。このような組成物は、図１５中に示されるように、40℃及び33%RHの保存条件で30日間以上安定なままであることができる。
【００５５】
打錠された錠剤中の生きている微生物、例えばプロバイオティクス細菌、真菌（例えば酵母又はカビ）、寄生生物及びウイルス等は、本発明の組成物及び乾燥方法からとりわけ利益を得ることが示されている。安定な乾燥生物学的粉末は、単細胞生物の新鮮、凍結又は乾燥培養物を、糖、加水分解タンパク質及び抗酸化剤の混合物であって、潜在的に追加量の多糖及びオリゴ糖及びガラス強化化合物を包含する混合物と混合すること、粘性製剤を液体窒素中で急速凍結、例えば瞬間凍結して凍結固形小滴、ひも又はビーズを形成させること、製剤温度をその凍結温度より高く上昇させるのに十分な真空を最初に適用し、20℃以上の熱源を供給して一次水除去を容易にすることによって水を蒸発させることを包含する本発明の組成物及び方法に従って調製される。製剤の温度を凍結点より高く維持することは、真空を調節すること及び製剤に熱を伝導又は放射することによって達成することができる。乾燥プロセスを完了し、さらに製剤の水分活性をAw0.3以下に低下させるために、二次乾燥ステップを最大真空で70℃までの高温で適用する。
【００５６】
先行技術の種子処理は、生物学的材料を含有する液体組成物又は適用を提供する。例えば、米国特許第8,020,343号は、乾燥種子適用ではなく、部分的に乾いた液体接種材料を開示している。種子処理のための液体接種材料は、高い輸送及び保存コスト、並びにコストのかかるこぼれ及び時間のかかる洗浄の可能性という欠点を有する。本発明は、処理された種子上の生きている微生物が安定化されるように、生きている微生物、例えば細菌及び真菌等を含む種子処理組成物を適用する方法を提供する。このような種子処理は、作物の収量及び植物の健康を改善するだけでなく、農薬及び肥料を補完又は置換する。
【００５７】
本発明の１つの態様によれば、安定化された生物学的材料、例えば生きている微生物、例えば細菌、真菌（例えば酵母又はカビ）、寄生生物及びウイルス等、又は組換えベクター又はタンパク質（酵素又は抗体を包含する）でコーティングされた種子を生産する方法が提供される。この方法は、湿潤液を種子に適用して種子を湿らせること、次いで、湿らせた種子を有効量の乾燥組成物でコーティングすることを含む。湿潤液は、湿潤ポリマーを含む。乾燥組成物は、生物活性材料、例えば生きている微生物（例えば生きている細菌、真菌、寄生生物又はウイルス）等、１又は複数の二糖、１又は複数のオリゴ糖、１又は複数の多糖、１又は複数のカルボン酸塩、１又は複数の加水分解タンパク質を含む。
【００５８】
得られたコーティングされた種子は、約0.4、0.35又は0.3未満の初期水分活性（Aw）を有し得る。
【００５９】
種子は、任意のタイプであり得る。種子の例としては、マメ科植物又は非マメ科植物の種子が挙げられる。マメ科植物の種子としては、ダイズ種子、エンドウマメ、インゲンマメ、アルファルファ、クローバー、レンズマメ、イナゴマメ、ピーナッツ等が挙げられる。非マメ科植物の種子としては、トウモロコシ種子、コムギ、オオムギ、ライムギ、及びカラシ、ファセリア、ダイコン（ダイコン（radish））等の被覆作物が含まれる。いくつかの実施形態において、種子はマメ科植物の種子である。
【００６０】
本発明の生物活性材料、例えば微生物としては、病害及び昆虫の防除、土壌肥沃度及び植物活力を高めるための細菌、例えば窒素固定細菌等、ウイルス、寄生生物、又は真菌、例えば酵母及びカビ等が挙げられ得る。酵母の例としては、サッカロミセス（Saccharomyces）及びメチロトローフ酵母、デバロミセス（Debaromyces）、カンジダ（Candida）、菌根菌（mycorrhizal fungi）、ピチア・パストリス（Pitchia pastoris）及びトルロプシス（Torulopsis）が挙げられ；カビの例としてはアスペルギルス（Aspergillus）属、リゾプス（Rhizopus）属、ムコール（Mucor）属、ペニシリウム（Penicillium）属、トリコデルマ（Trichoderma）属及びグロムス（Glomus）属が挙げられ；細菌の例としてはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、クロストリジウム（Clostridium）属、フゾバクテリウム（Fusobacterium）属、メリソコッカス（Melisococus）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、コクリアウ（Kocuriaw）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、ペプトストレプトコッカス（Peptostrepococcus）属、バチルス（Bacillus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、マイクロコッカス（Micrococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ワイセラ（Weissella）属、アエロコッカス（Aerococcus）属、オエノコッカス（Oenococcus）属及びラクトバチルス（Lactobacillus）属が挙げられ;ウイルスの例としてはポリドナウイルス（Polydnavirus）、レトロウイルス（Retrovirus）、パラレトロウイルス（Pararetrovirus）、ヘルペスウイルス（Herpesvirus）、パラウイルス（Paravirus）、ファージ、酵母ウイルス、真菌ウイルス  植物ウイルス及び土壌ウイルスの群が挙げられる。土壌細菌の例としては、限定されるものではないが、リゾビウム（Rhizobium）、フランキア・アゾスピリラム（Frankia Azospirillum）、アゾトバクター（Azotobacter）及びクロストリジウム（Clostridium）のような好気性及び嫌気性の窒素固定細菌が挙げられる。いくつかの実施形態において、窒素固定細菌は根粒菌である。
【００６１】
コーティングされた種子上の細菌、真菌（例えば酵母又はカビ）又はウイルスは、少なくとも約4、5、6又は7 logのコロニー又はプラーク形成単位/グラム種子（CFU/g種子又はPFU/g種子）の初期生存率を有し得る。
【００６２】
コーティングされた種子上の細菌、真菌（例えば酵母又はカビ）及びウイルスは、予め定義された温度、湿度及び期間の条件下で、例えば処理後少なくとも約1、2、3、6又は12ヶ月の予め決められた期間、安定であり得て、生存率低下は約3.0、2.0、1.5、1.2、1.1、1.0又は0.5 logのCFU/g又はPFU/g種子以下であり得る。いくつかの実施形態において、種子上の細菌、真菌（例えば酵母又はカビ）又はウイルスは、少なくとも約3ヶ月間安定であり、生存率低下は約1.2、1.0、0.5 logのCFU/g又はPFU/g種子以下である。他の実施形態において、種子上の細菌、真菌（例えば酵母又はカビ）又はウイルスは、少なくとも約12ヶ月又は1年間安定であり、生存率低下は約3.0、2.0又は1.0 log以下のCFU/g又はPFU/g種子である。
【００６３】
「有効量」という用語は、規定の目標、すなわち安定化された生物学的材料、例えば生きている微生物等でコーティングされた種子の生産を達成するのに必要とされる、湿らせた種子に適用される乾燥組成物の量を指す。乾燥組成物の有効量は、種子上の生物学的材料のある一定の安定性を、例えば予め決められた期間（例えば少なくとも約1、2、3、6又は12ヶ月）にわたって予め決められた生存率低下（例えば約3.0、2.0、1.5、1.2、1.1、1.0又は0.5 log以下のCFU/g種子）を達成するように選択され得る。生物学的材料を含む乾燥組成物の有効量は、規定の安定性目標、乾燥組成物中の各成分の性質及び量、並びに種子に応じて変化し得る。乾燥組成物は、種子に1回又は複数回適用され得る。各適用について、少なくとも約0.1、0.5、1、2、5、10、100gの乾燥組成物を100gの種子に適用する。
【００６４】
湿潤液中の湿潤ポリマーは、コーティングされた種子の、例えば約0.4、0.35又は3.0未満の望ましい初期水分活性を、又はコーティングされた種子上の生きている微生物の望ましい安定性、例えば処理後少なくとも約1、2、3、6又は12ヶ月で約3.0、2.0、1.5、1.2、1.1、1.0又は0.5 log以下のCFU/g種子の生存率低下を達成するように選択され得る。好適な湿潤ポリマーとしては、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン（PVP）及び酢酸フタル酸セルロースセルロース（CAP）が挙げられる。400〜4000のMW範囲を有するポリエチレングリコール（例えばPEG 400〜PEG 4000）、アクリレート、ポリウレタン及びアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸ポリマー、及びアルギン酸カルシウムは適さない場合がある。
【００６５】
湿潤液は、少量で種子に適用され得る。例えば、湿潤液は、100gの種子あたり約10、5、１又は0.1ml以下で適用される。１つの実施形態において、100gの種子に1ml以下の湿潤液が適用される。湿潤液は、種子に1回又は複数回適用され得る。
【００６６】
湿潤液中の湿潤ポリマーは、湿らせた種子に適用される生物学的材料の安定性を保護又は改善するのに十分な量であり得る。湿潤ポリマーのかかる量は、微生物の標的安定性、例えば予め決められた期間（例えば処理後少なくとも約1、2、3、6又は12ヶ月）にわたる予め決められた生存率低下（例えば約3.0、2.0、1.5、1.2、1.1、1.0又は0.5 log以下のCFU/g種子）、乾燥組成物中の各成分の性質及び量、並びに種子に応じて変化し得る。例えば、湿潤液は、約0.25〜1%（w/w）のポリビニルアルコール（PVA）、例えば約0.4%（w/w）のPVAを含み得る。
【００６７】
乾燥組成物は、生物学的材料、10〜50%（w/w）の１又は複数の二糖、10〜80%（w/w）の１又は複数のオリゴ糖、0.1〜10%（w/w）の１又は複数の多糖、0.5〜20%（w/w）の１又は複数のカルボン酸塩、0.5〜40%（w/w）の１又は複数の加水分解タンパク質を含み得る。二糖は、トレハロース、スクロース、ラクトース及びそれらの混合物よりなる群から選択され得る。オリゴ糖は、シクロデキストリン、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクトオリゴ糖（FOS）、ガラクトオリゴ糖（GOS）、マンナンオリゴ糖（MOS）及びそれらの混合物よりなる群から選択され得る。オリゴ糖はシクロデキストリンであり得る。多糖は、酢酸フタル酸セルロース（CAP）、カルボキシメチルセルロース、ペクチン、アルギン酸の塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、メチルセルロース、カラギーナン、ゲランガム、グアーガム、アカシアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン、加工デンプン並びにそれらの混合物よりなる群から選択され得る。加水分解タンパク質は、加水分解カゼイン、加水分解ホエイタンパク質、加水分解エンドウマメタンパク質、加水分解ダイズタンパク質及びそれらの混合物よりなる群から選択され得る。カルボン酸は、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸及びグルタミン酸よりなる群から選択され得る。
【００６８】
乾燥組成物は：（i）生物学的材料、１又は複数の二糖、１又は複数のオリゴ糖、１又は複数の多糖、１又は複数のカルボン酸塩及び１又は複数の加水分解タンパク質を水性溶媒中で合わせて粘稠スラリーを形成させること;（ii）スラリーを液体窒素中で瞬間凍結してビーズ、小滴又はひもの形態の固形凍結粒子を作製すること;（iii）固形凍結粒子を真空下、固形凍結粒子の凍結温度を超える温度で一次乾燥させて一次乾燥製剤を形成させること、並びに;（iv）一次乾燥製剤を完全真空下、少なくとも20℃の温度で、得られる乾燥組成物の水分活性（Aw）を約0,4、0.35又は0.3未満に低下させるのに十分な時間、二次乾燥させることを含む乾燥方法によって調製され得る。一次乾燥ステップは、2000mTORRを超える真空下、20℃の温度で少なくとも16時間、行われ得る。二次乾燥ステップは、40℃の温度で少なくとも15分間、行われ得る。乾燥方法は、乾燥組成物の粒径を低減させることをさらに含み得る。乾燥組成物は、約10,000、5,000、1,000又は500μm未満の粒径を有し得る。１つの実施形態において、乾燥組成物は、約1,000μm未満の粒径を有する。
【００６９】
１つの実施形態において、真空乾燥された安定化組成物で農業用種子をコーティングする方法が提供される。真空乾燥された安定化組成物は、有益な生物活性材料（例えばブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum））を含む。真空乾燥された安定化組成物は、種子に、任意選択で湿潤ポリマーコーティングで保護された種子に適用される。ダイズ種子上の生物活性材料ブラディリゾビウム・ジャポニカム（根粒菌）の安定性の拡大は、乾燥適用プロセスを用いることによって達成される。
【００７０】
本発明の組成物
いくつかの実施形態において、製剤は二糖、オリゴ糖及び多糖の炭水化物混合物を含み、その中に生物活性材料が埋め込まれている。好適な多糖の例としては、限定されるものではないが、酢酸フタル酸セルロース（CAP）、カルボキシメチルセルロース、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸の塩、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、メチルセルロース、カラギーナン、ゲランガム、グアーガム、アカシアガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、キトサン及びキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプン及び加工デンプンが挙げられる。好適なオリゴ糖の例としては、限定されるものではないが、シクロデキストリン、フルクタン、イヌリン、FOS、マルトデキストリン、デキストラン等;及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な二糖の例としては、限定されるものではないが、ラクトース、トレハロース、スクロース等が挙げられる。１つの特定の実施形態において、好適な例示的多糖は、アルギン酸ナトリウム又はゲランガムである。別の実施形態において、製剤は、全乾燥物質の重量パーセントで、0.1〜20%のアルギン酸ナトリウムを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態において、炭水化物混合物は、全乾燥物質の重量パーセントで、0.1〜10%の多糖、1〜10%のオリゴ糖及び10〜90%の二糖を含む。さらなる実施形態において、炭水化物混合物は、二糖、オリゴ糖及び多糖を10：0.1〜4：0.1〜2の重量比で含むか、又は二糖/オリゴ糖/多糖の重量比が約10：0.2：0.1〜約10：2：1である。
【００７２】
いくつかの実施形態において、炭水化物混合物中の二糖画分は、様々な糖及び糖アルコールを包含する。好適な二糖は、凍結温度（例えば-20℃未満）で及び水除去中に結晶化せず、及び/又は製剤中の生物学的活性材料を損傷若しくは不安定化させないものである。例えば、生物活性材料は、ガラス形成糖、例えばスクロース、ラクトース又はトレハロース等の存在下で乾燥させることで、乾燥プロセス全体にわたって分子構造の保持を促し、乾燥状態の非晶質マトリックスに構造的剛性を付与することができる。好適な二糖は、乾燥の間に失われる水和の水と効果的に置き換わり、細胞膜への損傷及び酵素の変性を防ぐ（Crowe et al, 1998による総説を参照のこと）。組成物中の二糖の他の機能としては、有害な光、酸素、酸化剤及び水分への曝露から生物活性材料を保護することを挙げることができる。好適な二糖は、溶液中に容易に溶解するものでなければならない。トレハロースは干ばつ期間中に休眠状態に留まる植物及び生きている生物（例えば細菌、真菌、又は例えば昆虫及び線虫等の無脊椎動物）において見出される非還元性二糖であるため、とりわけ魅力的な保護剤である。いくつかの場合において、2以上の異なる二糖、例えばトレハロース及びスクロースの混合物等を包含することが、結晶の形成を阻害し、長期間の保存条件における乾燥生物活性材料製剤の安定性を高めるために、及びコストを低減するために有益なことがある。
【００７３】
いくつかの実施形態において、炭水化物混合物中のオリゴ糖画分は、イヌリン、マルトデキストリン、デキストラン、フルクトオリゴ糖（FOS）、ガラクトオリゴ糖（GOS）、マンナンオリゴ糖（MOS）及びそれらの組み合わせを包含する。オリゴ糖は、種々の維持される生物学的材料のための保護剤としてのトレハロースの単独使用に関連するいくつかの問題を軽減する。脱水及び再水和中の生物学的材料の保護に非常に有効であるが、安定剤としてのトレハロース単独では長期間、特に高温及び/又は高湿環境において、望ましい保存安定性を提供しない。この問題は、本発明において、炭水化物混合物にオリゴ糖、例えばイヌリンを添加することによって解決された。
【００７４】
炭水化物混合物中の糖類の好適な例示的質量比は10：0.1〜10：0.1〜2の二糖/オリゴ糖/多糖であり、いくつかの実施形態において、二糖/オリゴ糖/多糖の重量比は約10：0.2：0.1〜約5：10：1である。いくつかの実施形態において、炭水化物混合物は、全乾燥物質の重量パーセントで、10〜90%の二糖、1〜10%のオリゴ糖及び0.1〜10%の多糖を含む。他の実施形態において、炭水化物混合物は、全乾燥物質の重量パーセントで、10〜50%の二糖、10〜80%のオリゴ糖、及び0.1〜10%の多糖を含む。
【００７５】
特定の実施形態において、製剤はオリゴ糖の混合物を含む。オリゴ糖混合物は、組成物中のガラス強化材料としての単一のオリゴ糖の単独使用に関連するいくつかの問題を軽減する。ガラス転移温度を上昇させるのに非常に有効であるが、オリゴ糖は、特に高温及び/又は高湿環境において、急速に結晶化し、沈殿し、それによってガラス状非晶質構造を断片化する傾向がある。この問題は、本発明において、単一タイプのオリゴ糖の代わりにオリゴ糖の混合物を、いくつかの実施形態においてフルクタン及び低DEデキストリンの混合物を添加することによって解決された。いくつかの実施形態において、炭水化物混合物は、全乾燥物質の重量パーセントで、5〜40%のフラクタン及び5〜40%の低DEデキストリンを含む。
【００７６】
１つの好適な組成物は、少なくとも二糖、オリゴ糖及び多糖を包含する約0.5%〜約90%の炭水化物成分と、約0.5%〜約40%の加水分解タンパク質を含むタンパク質成分とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約30%〜約70%の炭水化物成分、並びに約10%〜約40%のタンパク質加水分解タンパク質及びカルボン酸等のガラス強化成分を含み、ここで炭水化物成分は約10%〜90%又は約40%〜80%の二糖；約1%〜約10%又は約5%〜10%のオリゴ糖；及び約0.1%〜約10%又は約5%〜約10%の多糖を含む。組成物は、別のガラス強化成分であると考えられる、組成物の総重量を基準にして約0.5%〜20%のカルボン酸を含む有機酸の塩をさらに含む。
【００７７】
付加的な実施形態において、組成物は、アルギン酸ナトリウム及びオリゴ糖の混合物を、1：1〜10又は1：1〜5のアルギン酸ナトリウム/オリゴ糖の重量比で含む。
【００７８】
本発明のなお別の実施形態において、組成物は、二価金属イオンで架橋されて、堅固なハイドロゲルを形成する。いくつかの実施形態において、架橋ハイドロゲル製剤は、2価金属イオン溶液を含有する浴中でスラリーを霧化若しくは押出することによって、又は2価金属イオンをスラリー中に直接加え、製剤を硬化させ、ハイドロゲルを形成することによって形成される。次いで、ハイドロゲル製剤を、本発明の乾燥方法に従ってフラッシュ凍結（flash freeze）し、乾燥させる。
【００７９】
他の実施形態において、組成物は、有機酸の塩、例えば乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸等を包含する有意な量のガラス強化化合物を含む。塩は、カチオン、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等を包含し得る。例としては、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、アスコルビン酸ナトリウム等が挙げられる。高いガラス転移温度（Tg）及び高い溶解度を有する塩が好ましい。例示的な有機酸としては、クエン酸及びその塩（例えばクエン酸ナトリウム又はカリウム、クエン酸三ナトリウムの脱水物）並びにアスコルビン酸及びその塩（例えばアスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム又はアスコルビン酸マグネシウム）が挙げられる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、二糖、オリゴ糖及び多糖の炭水化物混合物、並びに有機酸、例えばクエン酸及び/又はアスコルビン酸等のイオンを包含する。
【００８０】
組成物中で用いられるガラス強化剤の量は、全体の組成及びその意図される乾燥保存条件に応じて変わる。一般に、組成物中のガラス強化化合物の量は、溶液又は分散液のpHがわずかにアルカリ（pH7〜7.5）に維持される間、全乾燥物質の2重量%より多い。理論に束縛されるものではないが、本明細書中に記載される比較的高い含有量でのガラス強化化合物の機能は、得られる乾燥組成物の望ましい非晶質かつ剛性のガラス状構造に寄与することだけでなく、有害な光、酸素、酸化剤及び水分への暴露から生物活性材料を保護することでもあると考えられる。好適な例示的組成物は、全乾燥物質の重量パーセントで、1〜20%又は約2〜10全乾燥物質重量%のガラス強化化合物を含む。
【００８１】
その安定性をさらに向上させるために組成物中に包含される他の好適なガラス強化剤としては、タンパク質、タンパク質加水分解物、ポリペプチド及びアミノ酸が挙げられる。これらとしては、ゼラチン、アルブミン、ホエイタンパク質、ダイズタンパク質、カゼイン、カゼイン塩、免疫グロブリン、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質、綿実タンパク質若しくは他の食品及び乳若しくは植物タンパク質並びに/若しくはそれらの加水分解物、又は任意の他の加水分解タンパク質が挙げられる。ポリアミノ酸の例としては、ポリアラニン、ポリアルギニン、ポリグリシン、ポリグルタミン酸等が挙げられる。有用なアミノ酸としては、リジン、グリシン、アラニン、アルギニン又はヒスチジン、同様に疎水性アミノ酸（トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニン等）及びメチルアミン、例えばベタイン等が挙げられる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、カゼイン若しくはエンドウマメタンパク質、又は加水分解カゼイン若しくは加水分解エンドウマメタンパク質が用いられる。いくつかの実施形態において、組成物混合物中の加水分解タンパク質画分は、部分的加水分解又は高度加水分解のタンパク質、ポリペプチド及びアミノ酸を包含する。本明細書中で用いられる場合、高度加水分解タンパク質は、タンパク質の修飾（分解）のためのプロテアーゼの使用を通じた広範な酵素加水分解によって得られるタンパク質である。いくつかの実施形態において、加水分解された動物性若しくは植物性タンパク質、例えばカゼイン、ホエイ、ダイズ若しくはエンドウマメタンパク質等、又は高度加水分解されたカゼイン若しくはエンドウマメタンパク質。いくつかの実施形態は、約1kDa〜約50kDaの分子量を有する短鎖ペプチドを80%超有する高度加水分解タンパク質を使用し、このタンパク質基質の少なくとも20%は、200〜2000ダルトンの分子質量を有するペプチドに変換される。理論に束縛されるものではないが、本明細書中に記載される糖及び高度加水分解タンパク質から生じる混合物は、より速い乾燥を可能にし、得られる乾燥組成物の望ましい非晶質かつ剛性のガラス状構造に寄与すると考えられる。酵素加水分解タンパク質は、当業者に公知の方法によって調製することができ、又は商業的供給元から入手することができる。好適な例示的組成物は、全乾燥物質の重量パーセントで、5〜40%の高度加水分解タンパク質を含む。
【００８３】
乾燥組成物中のタンパク質、加水分解タンパク質又は高度加水分解タンパク質及びアミノ酸の好適な例示的総量は、乾燥混合物の総質量の約1%〜約40%、又は約5%〜約40%、又は約10%〜約30%である。
【００８４】
組成物中のガラス強化剤の適切な量は、乾燥組成物の所望の特性に依存し得ることに留意されたい。例えば、炭水化物混合物及びタンパク質又はタンパク質加水分解物を含有する組成物は、穏やかな温度及び相対湿度下、例えば25℃及び25%RH等で保存される間、生物学的材料の化学的安定性を高めるために用いることができる。ガラス強化剤の適切な量、とりわけ二糖とオリゴ糖との間の相対比の決定は、所望の保存条件に応じてなされるべきである。例えば、高比率の二糖/オリゴ糖を含有する組成物は、穏やかな温度及び相対湿度下、例えば25℃及び25%RH等で保存される間、生物学的材料の化学的安定性を高めるために用いることができる。低比率の二糖/オリゴ糖を含有する組成物は、高温及び高湿下、例えば30℃及び40%RH以上等で保存される間、生物学的材料の化学的安定性を高めるために用いることができる。
【００８５】
アスコルビン酸イオンは、より高い温度及び湿度暴露での安定化の付加的な利益を得るためのガラス強化剤として、いくつかの実施形態において好まれ得る。あるいは、いくつかの実施形態において、クエン酸イオン及び/又はアスコルビン酸イオンと別のガラス強化剤、例えばタンパク質又はタンパク質加水分解物等との組み合わせがより好ましい。
【００８６】
いくつかの実施形態において、製剤は糖及び加水分解タンパク質の混合物を含み、その中に生物活性材料が埋め込まれている。好適な糖の例としては、限定されるものではないが、二糖、例えばラクトース、トレハロース、スクロース等及びそれらの混合物が挙げられる。好適な加水分解タンパク質の例としては、限定されるものではないが、高度加水分解されたゼラチン、アルブミン、ホエイタンパク質、ダイズタンパク質、カゼイン、カゼイン塩、免疫グロブリン、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質、綿実タンパク質、又は乳、動物若しくは植物起源の任意の他の高度加水分解タンパク質、及びそれらの混合物が挙げられる。乾燥組成物中の糖の好適な例示的総量は、乾燥混合物の総質量の約10%〜約80%、又は乾燥質量の約10%〜約60%である。
【００８７】
１つの例示的実施形態において、ガラス形成剤は、二糖及び加水分解タンパク質の混合物を含む。特定の実施形態において、好適な例示的ガラス形成剤は、トレハロース及び加水分解タンパク質の混合物である。いくつかの実施形態において、製剤は、全乾燥物質の重量パーセントで、10〜90%のトレハロース及び0.1〜30%の加水分解タンパク質、又は20〜80%のトレハロース及び0.1〜20%の加水分解タンパク質、又は40〜80%のトレハロース及び0.1〜20%の加水分解タンパク質を含む。
【００８８】
理想的には、一般に安全と認識される（GRAS：Generally Recognized As Safe）化合物がGRASでないものよりも好ましい。他のものとしては、賦形剤塩、例えば硫酸マグネシウム等;ポリオール、例えば三価又はより高級な糖アルコール等（例えばグリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトール）;プロピレングリコール;ポリエチレングリコール;プルロニック;界面活性剤;及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、生物学的材料は、生きている微生物、例えば細菌（例えば好気性菌、好熱性菌、腸内細菌、グラム陰性菌、グラム陽性菌、乳酸菌、嫌気性菌、中温性放線菌又は好熱性放線菌）、真菌（例えばカビ又は酵母）、寄生生物、ウイルス又は組換えベクター等を含む。好適な酵母の例としてはサッカロミセス（Saccharomyces）、デバロミセス（Debaromyces）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）及びトルロプシス（Torulopsis）が挙げられ；好適なカビの例としてはアスペルギルス（Aspergillus）、リゾプス（Rhizopus）、ムコール（Mucor）、ペニシリウム（Penicillium）及びトルロプシス（Torulopsis）が挙げられ；好適な細菌の例としてはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、クロストリジウム（Clostridium）属、フゾバクテリウム（Fusobacterium）属、メリソコッカス（Melisococus）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、コクリアウ（Kocuriaw）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、ペプトストレプトコッカス（Peptostrepococcus）属、バチルス（Bacillus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、マイクロコッカス（Micrococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ワイセラ（Weissella）属、アエロコッカス（Aerococcus）属、オエノコッカス（Oenococcus）属及びラクトバチルス（Lactobacillus）属が挙げられ;好適なウイルスの例としてはポリドナウイルス（Polydnavirus）、レトロウイルス（Retrovirus）、パラレトロウイルス（Pararetrovirus）、ヘルペスウイルス（Herpesvirus）、パラウイルス（Paravirus）、ファージ、細菌ウイルス、酵母ウイルス、真菌ウイルス  植物ウイルス及び土壌ウイルスが挙げられる。好適な土壌微生物の例としては、アゾバクター（Azobacter）、シュードモナス科（Pseudomonaceaceae）、放線菌類（Actinomycetes）、ストレプトミセス科（Streptomycetaceae）、グラム陰性無機栄養細菌（Chemolithotropic）、バチルス科（Bacillaceae）、ノカルディア科（Norcardiaceae）、藻菌類（Phycomycetes）、子嚢菌類（Ascomycetes）、担子菌類（Basidiomycetes）、不完全菌類（Fungi Imperfecti）、接合菌類（Zygomycetes）、及び酸化型硝化細菌（Nitrofying Bacteria Oxidizing type）である微生物、例えばニトロソモナス（Nitrosomonas）又はニトロバクター（Nitrobacter）等が挙げられる。好適なプロバイオティクス微生物の例としては、以下の種及びこれらの種内の全ての培養生物型が挙げられる：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、A.オリゼー（A. oryzae）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、B.レンタス（B. lentus）、B.リケニフォルミス（B. licheniformis）、B.メセンテリカス（B. mesentericus）、B.プミルス（B. pumilus）、B.サチリス（B. subtilis）、B.ナットー（B. natto）、バクテロイデス・アミロフィラス（Bacteroides amylophilus）、Bac.カピロスス（Bac. capillosus）、Bac.ルミノコラ（Bac. ruminocola）、Bac.スイス（Bac. suis）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、B.アニマリス（B. animalis）、B.ブレベ（B. breve）、B.ビフィダム（B. bifidum）、B.インファンティス（B. infantis）、B.ラクティス（B. lactis）、B.ロンガム（B. longum）、B.シュードロンガム（B. pseudolongum）、B.サーモフィラム（B. thermophilum）、カンジダ・ピントレペシ（Candida pintolepesii）、��ロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、エンテロコッカス・クレモリス（Enterococcus cremoris）、E.ジアセチラクティス（E. diacetylactis）、E.フェシウム（E. faecium）、E.インターメディウス（E. intermedius）、E.ラクティス（E. lactis）、E.ムンディ（E. muntdi）、E.サーモフィラス（E. thermophilus）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、クルイベロミセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、L.アリメンタリウス（L. alimentarius）、L.アミロボラス（L. amylovorus）、L.クリスパタス（L. crispatus）、L.ブレビス（L. brevis）、L.カゼ4（L. case 4）、L.カルバタス（L. curvatus）、L.セロビオサス（L. cellobiosus）、L.デルブリュッキ亜種ブルガリカス（L. delbrueckii ss. bulgaricus）、L.ファルシミニス（L. farciminis））、L.ファーメンタム（L. fermentum）、L.ガセリ（L. gasseri）、L.ヘルベティカス（L. helveticus）、L.ラクティス（L. lactis）、L.プランタラム（L. plantarum）、L.ジョンソニー（L. johnsonii）、L.ロイテリ（L. reuteri）、L.ラムノサス、L.サケイ（L. sakei）、L.サリバリウス（L. salivarius）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）P.セレビシエ（ダムノサス）（P. cereviseae（damnosus））、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、P.ペントサセウス（P. pentosaceus）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Propionibacterium freudenreichii）、Prop.シェルマニ（Prop. shermanii）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cereviseae）、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）、Staph.キシロサス（Staph. xylosus）、ストレプトコッカス・インファンタリウス（Streptococcus infantarius）、Strep. サリバリウス亜種サーモフィラス（Strep. salivarius ss. thermophilus）、Strep.サーモフィラス（Strep. Thermophilus）及びStrep.ラクティス（Strep. lactis）。
【００９０】
組成物の作製方法
生物学的材料及び組成物の１つの好適な混合プロセスは、生物学的材料を含有する濃縮培養物又は培地溶液中に全乾燥組成物混合物を加えることによる。培養培地中の生物学的材料の重量質量は、典型的には約5%〜30%w/vの間、又は約10%〜20%w/vの間である。培養培地中の組成物混合物の添加重量質量は、典型的には約10%〜約60%の間、又は約20%〜40%の間である。混合スラリー中の最終固形物含有量は、約20%〜約60%、より具体的には約30%〜約50%である。いくつかの実施形態において、溶液を室温で混合するか、又はわずかに加温して、粘性溶液中の材料の可溶化を援助する（例えば20℃〜40℃）。本発明の変形において、製剤中の炭水化物混合物の総量は、乾燥ステップの間に生じ得るゴム状形成又は過剰な発泡を回避しながら効率的な乾燥を可能にする所望の製剤粘度及び密度を達成するように調節される。好適な例示的スラリー粘度は、約1,000cP〜約50万cP、又は約5,000cP〜約30万cPである。最終スラリーの所望の粘度及び密度は、当該技術分野で公知の任意の手段によって、例えば炭水化物混合物中の多糖の量をわずかに調節することによって、又はガス、例えば空気、窒素、二酸化炭素、アルゴン等を脱気又は注入することによって達成することができる。
【００９１】
本発明の生物学的材料スラリーは典型的には-30℃〜-180℃の間に瞬間凍結され、又は製剤は液体窒素浴中への霧化、滴下若しくは注入によって液体窒素中で瞬間凍結される。液体窒素浴から粒子、ビーズ、ひも又は小滴を回収し、凍結乾燥機若しくは真空乾燥機内で乾燥させるか、又は代わりに、その後の凍結形態での使用のために若しくはその後の（例えば噴霧乾燥による）乾燥のためにそれらを（-30℃から-80℃の間の）ディープフリーザー内に保存する。
【００９２】
一般に、有用な乾燥プロセス技術としては、噴霧乾燥;又はスラリーの凍結温度より高い温度（-20〜50℃）での真空オーブン若しくは遠心エバポレーター中での非凍結溶液の蒸発乾燥、その後の望ましい粒径への粉砕が挙げられる。得られた粉末粒子はガラス状であり、ガラス状材料の大部分は生物学的材料をコーティングする。生物学的材料をガラス状材料でコーティングすることの利点は、生成物の物理的安定性を向上させ、粒子内の有害な分子間反応を低減させることである。好適な例示的実施形態において、凍結粒子をトレイ上に載せ、直ちに真空乾燥チャンバに移し、乾燥プロセスを以下を包含する３つの主要なステップで進める：（1）<2000mTORR未満の真空圧下での凍結粒子の任意選択の短いパージ及び構造安定化ステップ、（2）＞2000mTORRを超える真空下及びスラリーの凍結点より高い温度での一次乾燥ステップ、並びに（3）乾燥製剤の水分活性を0.3Aw以下に低下させるのに十分な時間の、完全真空圧及び高温下でのガラス状非晶質材料の二次及び最終乾燥ステップ。
【００９３】
本発明の１つの特定の実施形態において、乾燥製剤は、極端な温度及び湿度条件への短期間の曝露において維持を高めるために、溶融脂肪の混合物と共に造粒される。
【００９４】
乾燥された安定な生物学的組成物は、フレークとして直接的に用いることができ、又は磨砕して粉末にし、ふるい分けして約10μm〜約1000μmの平均粒径にすることができる。製剤は、濃縮粉末として、再構成液体（例えば飲料）としてヒトを包含する動物に直接投与することができ、又はフレーク若しくは粉末形態のいずれかで既存の食品若しくは飼料若しくは農産物に組み込むことができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、本発明による生物学的材料の安定な凍結又は乾燥粉末の調製のための組成物は、炭水化物混合物及びガラス強化剤を包含する。かかる材料は、生物活性材料と混合されると、液体窒素中でビーズひも又は小滴を形成し、本発明の方法に従って非晶質ガラス状構造で効率的に乾燥させることができ、前記生物活性材料の保存及び投与のための大量の安定な乾燥組成物を提供することができる（乾燥後の異なる製剤の目視及び顕微鏡観察並びに水分活性（Aw）については、図７及び図８を参照のこと）。炭水化物混合物は、上記の30℃及び40%RHのような高温及び高湿において製剤に構造的安定性を与え、及び/又は生物活性材料に物理的及び化学的保護利益を与え、再構成又は再水和の際の悪影響を防止又は低減する。
【００９６】
炭水化物混合物中の多糖画分は、製剤により濃い粘度を、及び真空下での製剤密度特性のより良好な制御を、及び本発明の乾燥製剤組成物に構造強度の増加を与えることができる（その特定の製剤のガラス状構造及び乾燥度については、図８−写真４、４ｂ、４ｃを参照されたい）。とりわけ生きている生物に好適な多糖は水溶性ガムであり、その理由は、穏やかな温度で粘性ゲルを形成するそれらの独特の特徴である。ある濃度のガムはまた、適切な粘度及び密度を製剤に与えて特定の粘度での一次水除去ステップ中に製剤の効果的な乾燥を可能にすることによって、真空下で製剤構造を効果的に安定化することが見出された。ある種のガムはまた、二価若しくは多価カチオンとの架橋によって（例えばアルギン酸塩、ペクチン又はキトサン）、又は温度若しくはpH変化によって（例えばゼラチン、CMC、CAP又はゲランガム）、ハイドロゲルを形成することができる。ハイドロゲル化溶液は、未凍結溶液の真空乾燥に関連する問題を防止する。ある濃度のガムはまた、製剤を効果的に安定化し、非晶質ガラス状構造の形成を容易にし、真空下での乾燥プロファイルを高めることも見出された（図７-写真３ａ、３ｂ、３ｃ、４及び図８-４ｃ及び図１３を参照されたい）。
【００９７】
特に、図７の写真を、下記の表１に示す結果と組み合わせて見ることによって、試料３ｂ、３ｃ、４、５及び６は全て、非晶質ガラス状構造にいくらかの多孔性を与えるのに十分に乾燥されたことが明らかである。
【表１】
2019511912.tif 000003
【００９８】
例えば、乾燥形態の生物活性材料は、組成物粉末混合物を含有する液体又は懸濁液に配合することができる。組成物混合物は、低剪断撹拌で温水溶液中に溶解した後、冷却して生物活性材料と混合することができる。生物活性材料、例えば培養ウイルス又は細菌等を濃縮し、遠心分離又は濾過によって培養培地から分離した後、製剤中に再懸濁することができる。あるいは、製剤中の水の全部又は一部が、濃縮された生物学的材料の液体中に提供される。懸濁液を室温よりわずかに高い温度で維持し、乾燥組成物粉末混合物を生物学的材料を含有する温かい（25℃〜40℃）懸濁液にゆっくりと加える。全ての成分が完全に分散又は溶解し、均一なスラリーが得られるまで、懸濁液をプラネタリーミキサー中で穏やかに撹拌する。
【００９９】
次いで、（多糖の特性に応じて）金属イオンを加える又はスラリーの温度若しくはpHを変化させることによって粘稠スラリーを架橋させてハイドロゲルを形成させ、次いで、本発明の乾燥方法に従って乾燥させることができる。あるいは、ドライアイス又は液体窒素浴中でノズルを通して霧化して、滴下して又は注入してスラリーを瞬間凍結することで、小さな粒子又は固形小滴ひも又はビーズを形成させることができる。凍結固形粒子は、安定な凍結生成物としてその後の使用のために、又は乾燥まで、-30℃〜-80℃の間のディープフリーザー内に保存することができる。好適な例示的乾燥方法は、生成物温度がその凍結温度よりわずかに高い温度に維持される真空乾燥である。凍結した小滴又はビーズを、約0.1kg/平方フィート〜約1.5kg/平方フィートの負荷容量でトレイ上に置き、本発明の方法に従って乾燥させる。いくつかの実施形態において、乾燥プロセスは短いパージステップによって開始され、これは、生成物を初期温度に順応させ、凍結粒子の構造を緩めて安定化し、過剰な空気を脱気する。典型的に、パージステップは、生成物の粘度及びトレイの負荷量に応じて、1〜60分かかる。ビーズ又は粒子は、全パージステップの間、固形凍結形態のままであるべきである。次いで、生成物温度をその凍結温度より高くし、全ての遊離水が生成物から蒸発するまで一次水除去ステップを続ける。製剤の温度が所望の温度に達したら、その温度を維持するように熱を調節し、蒸発による一次液体乾燥ステップを進める。このステップで、製剤は既に解凍され、沸騰又は発泡を全く伴わずに加速された水の蒸発が起こる。乾燥プロセスは、最高真空及び高温での付加的な二次乾燥フェーズで完了する。
【０１００】
先行技術における典型的な方法は、敏感な生物学的製剤に損傷を与え、高い負荷容量での工業的スケールアップを困難にし得る大規模な発泡及び/又は飛散並びに激しい沸騰を伴う（例えば米国特許第6,534,087号を参照されたい、ここで適用される真空圧は激しい沸騰及び発泡をもたらす）。しかし、現在の組成物及び方法は、製剤の沸騰又は発泡を避け、一方で著しくより速い乾燥速度を達成し、高い製剤負荷容量を可能にする。さらに、粘稠な液体スラリーの完全かつ効率的な脱気は困難であり、長時間を必要とすることがある。これらの障害は、本発明において、沸騰及び過剰な発泡を伴わずにガラス状構造を形成しながら、効果的な一次水除去を可能にする好適な組成物を用いることによって、全て解決された。固形凍結粒子をトレイ上に載せることは、スラリー又は粘性シロップとは対照的に、トレイ上の乾燥面積あたりの負荷容量を、先行技術によって与えられたものよりもはるかに大きくすることを可能にする。
【０１０１】
本発明の１つの好適な例において、生物学的材料は、生きている濃縮プロバイオティクス細菌培養物である。いくつかの実施形態において、粉末組成物混合物は、1〜4%のアルギン酸ナトリウム又はゲランガム、50〜75%のトレハロース、1〜10%のイヌリン又はFOS、10〜20%のタンパク質加水分解物、例えばカゼイン、ホエイ、エンドウマメ、ダイズ又は綿実加水分解物等、及び1〜10%のクエン酸ナトリウム又はアスコルビン酸ナトリウムを含有する。プロバイオティクス培養物は、新鮮なものであっても、凍結したものであっても、又は既に乾燥された乾燥粉末の形態のものであってもよい。
【０１０２】
本発明の別の好適な例において、生物学的材料は、生きている濃縮微生物培養物である。粉末組成物混合物は、1〜4%のアルギン酸ナトリウム又はゲランガム、5〜30%のトレハロース、5〜40%のイヌリン、5〜40%の低DEマルトデキストリン、10〜30%の高度加水分解タンパク質、例えばカゼイン、ホエイ、エンドウマメ、ダイズ又は綿実タンパク質等を混合することによって調製される。オプションとして、追加の0.1〜10%ガラス強化剤、例えばクエン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム又はアスコルビン酸ナトリウム等も組成物中に包含させることができる。微生物又は胞子培養物は、新鮮なものであっても、凍結したものであっても、又は既に乾燥された乾燥粉末の形態のものであってもよい。
【０１０３】
組成物混合物を濃縮プロバイオティクス培養培地に加え、溶液混合物の固形物含有量を40〜60%（w/w）とし、リン酸イオン又はクエン酸イオンでpHを6.5〜7.5に調整する。溶液は、全ての成分が完全に溶解するまで、室温よりわずかに高い温度（典型的には25℃〜37℃の間）で混合する。粘稠スラリーを液体窒素中に滴下して小さな小滴又はビーズを形成させ、次いでこれを液体窒素から取り出し、バッグに詰め、乾燥するまで-80℃のディープフリーザー内で保存する。
【０１０４】
生きているプロバイオティクス細菌の典型的な乾燥方法は、100〜1500g/平方フィートの間の負荷容量で均一な層でトレイ上に固形凍結ビーズを広げることを包含し、このトレイは直ちに凍結乾燥機中に入れられる。次いで、約1000mTORR以下で真空を適用し、凍結乾燥機のサイズ及び熱源のタイプに応じて棚温度を調節して、約-20〜約30℃で粒子を維持する。固形凍結ビーズを約1〜約60分間パージし、真空を2000〜10,000mTORRの間に調整し、熱伝導を増加させて、製剤温度を-20℃から0℃の間、又は-10℃から0℃の間、典型的には約-10℃に上昇させる。これらの温度及び真空圧条件は、トレイの負荷量に応じて数時間から24時間まで続くことがある一次水除去ステップの間、維持される。一次乾燥プロセス中のある時点で、溶媒の蒸発速度が遅くなり、乾燥チャンバー内の過剰な熱供給のために製剤温度が上昇し始める。この時点は、本発明における一次乾燥ステップの終了を指し示す。溶媒が製剤から追い出されるにつれて、溶液中のガラス形成化合物は、液体として流れるのを停止して非晶質及び/又は安定なガラス状構造を形成するまで、濃縮されてより濃くなっていく。
【０１０５】
次いで、その後に二次乾燥ステップを最大真空及び30℃〜50℃の間の製剤温度で行う。二次乾燥ステップの目的は、残留する閉じ込められた又は結合した水分を除去し、周囲温度で長期間の保存において安定な組成物を提供することである。二次乾燥ステップは数時間続くことがあり、その終了点は製剤が完全に乾燥していて、その水分活性が0.3Awより低いときである。
【０１０６】
本発明の乾燥方法は、非晶質ガラス状構造内に包まれた生物学的活性材料をもたらし、それにより、非晶質ガラス状組成物内の化合物及び他の分子の移動度が大幅に低減されるため、タンパク質のアンフォールディング又は変性を防止し、分子相互作用又は交差反応性を著しく遅くする。非晶質固形構造がそのガラス転移温度より低い温度で維持され、残留水分が比較的低いままである限り、プロバイオティクス細菌は比較的安定なままであることができる。図１５を参照されたい。いくつかの生物学的材料はより結晶性の状態においてより良好に進み得ることから、ガラス状構造を達成することは長期安定性のための必要条件ではないことに留意されたい。
【０１０７】
乾燥されたガラス状構造は、ひとまとめで用いられ、所望の形状及びサイズに切断され、又は破壊及び粉砕されて、湿式又は乾式凝集、造粒、錠剤化、圧縮、ペレット化又は任意の他の種類の送達プロセスのような容易な後処理プロセスを提供する流動性粉末にすることができる。破壊（crushing）、粉砕（milling）、摩砕（grinding）又は粉化（pulverizing）のプロセスは、当該技術分野において周知である。例えば、ハンマーミル、エアミル、インパクトミル、ジェットミル、ピンミル、ウィリーミル又は同様のミリング装置を用いることができる。好適な例示的粒径は約1000μm未満であり、いくつかの実施形態において500μm未満である。
【０１０８】
本発明の別の例において、生物活性材料を含有する乾燥安定粉末を溶融脂肪と凝集させる。乾燥粉末を40℃のプラネタリーミキサー内に入れ、溶融脂肪、例えばカカオバター、天然ワックス若しくは水素化油又はそれらの混合物等を混合下の温かい粉末にゆっくり加え、凝集粉末の視覚的に均一なサイズが達成されるまで混合を続けながら、混合物を脂肪の融解温度未満まで冷却する。組成物中の溶融脂肪混合物の重量は、約20%〜約70%の間、いくつかの実施形態において約30〜50%の間である。最終生成物は凝集形態で摂取するか、又は錠剤プレス機で打錠し、錠剤形態で摂取することができる。
【０１０９】
１つの特定の例において、乾燥粉末は、錠剤プレス機で打錠されて、望ましい形状及びサイズの錠剤を形成する。安定で乾燥した生物学的組成物は、錠剤の効力を調整して望ましい投与量にするために、任意選択で充填剤と混合される。充填剤としては、限定されるものではないが、マルトデキストリン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、コロイド状二酸化シリカ及びそれらの組み合わせが挙げられる。任意選択で、崩壊促進剤も錠剤化混合物中に包含される。崩壊促進剤の例としては、限定されるものではないが、ナトリウムクロスカルメロース、クロスポビドン（不溶性ポリビニルピロリドン）、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプングルコン酸ナトリウム（sodium starch glyconate）、プレゼラチン化デンプン等が挙げられ得る。本明細書中で用いられる場合、錠剤化混合物は、流動剤を包含してもよい。流動剤としては、限定されるものではないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、亜鉛状態、ステアリン酸、及び例えば親水性又は疎水性ヒュームドシリカ等のヒュームドシリカが挙げられ得る。
【０１１０】
安定な生物学的組成物及び他の錠剤成分から錠剤を生産するために適した方法としては、標準的なプレス錠剤化方法が挙げられ、これは多層錠剤を生産するために慣用的に用いられるものを包含する。100N未満の張力強度に相当する50kN/cm2までの錠剤打錠圧（Erweka装置）が好ましいが、生物学的材料が生きている微生物である場合には温熱曝露を60℃未満に制限すべきである。
【０１１１】
錠剤は、まるごと飲み込んだり、噛んだり、又は発泡性飲料錠剤として摂取されるように設計され得る。錠剤が摂取時に口内、飲料内又は胃内のいずれであっても崩壊すると、生物学的材料は、錠剤構造によって分離して保持されていた他の活性材料に曝露される。これは、有害材料の局所濃度が高すぎる場合、生物学的材料を損なう可能性がある。したがって、いくつかの実施形態において、錠剤中の他の活性成分の内容物を希釈し分散させるために生物学的活性材料の崩壊を遅延させることが好ましい。この問題は、本発明において、本明細書中に記載される硬化又は架橋構造化組成物を形成させることによって解決された。いくつかの実施形態において、生物学的材料は、水中で混合した際に組成物マトリックス内で無損傷のままである。いくつかの実施形態において、生物学的材料は、動物の消化管に沿った所望の作用部位で組成物マトリックスから無傷で放出される。
【０１１２】
本発明による錠剤は、その初期乾燥状態を許容限度内で維持するように包装され得る。これは、水分不透過性区画、例えばチューブ若しくはブリスターパック等の中に、又は容器内の水分活性を低下させるように水を吸収するための乾燥剤、例えばシリカゲル等を含有する容器の中に錠剤を包装することを伴い得る。酸素に対する保護のために、このようなパックはまた、酸素捕捉物質、例えばFreshPax（登録商標）、Ageless（商標）、パルミチン酸アスコルビル又は他のアスコルビン酸塩、プロピルガレート又は他のガレート、α-トコフェロール、亜硫酸マグネシウム又はナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール又はブチル化ヒドロキシトルエン等を含有し得る。
【０１１３】
本発明の別の例において、生物学的活性材料を含有する安定化組成物を用いる種子処理の方法が提供される。真空乾燥安定化組成物は、種子適用のための乾燥粉末を作製するために、種々の成分を生物活性材料（例えばブラディリゾビウム・ジャポニカム）と組み合わせることによって調製される。
【０１１４】
真空乾燥安定化組成物を調製する方法は、以下を含み得る：（a）生物活性材料（例えばブラディリゾビウム・ジャポニカム、液体水性スラリーとしてABMから市販されている）を他の成分と組み合わせること、（b）スラリーを液体窒素中で瞬間凍結して固形物を形成させること、（c）＞2000mTORRの真空での水除去によって一次乾燥すること、及び（d）最高真空で二次乾燥して水分活性を典型的には0.3未満にすること。真空乾燥プロセスは、凍結乾燥された安定化成分とは物理的に異なって見える粉末を生み出す（図２１Ｂ及び図２２Ａ）。真空乾燥された安定化組成物を種子に適用することにより、コーティングされた種子上の生物活性材料（例えばブラディリゾビウム・ジャポニカム）の安定性が高められる（表２）。
【０１１５】
真空乾燥安定化組成物は、従来の方法によって種子に効率的かつ均質に適用するための乾燥粉末になるように粒径を低減させることができる。破壊、粉砕、摩砕又は粉化のプロセスは、当該技術分野において周知である。例えば、ハンマーミル、エアミル、インパクトミル、ジェットミル、ピンミル、ウィリーミル又は同様のミリング装置を用いることができる。典型的には、種子コーティングの場合、乾燥組成物の粒径は約250ミクロン、100ミクロン又は25ミクロン未満であり得る。
【０１１６】
生物活性材料（例えばブラディリゾビウム・ジャポニカム）を含む真空乾燥安定化組成物は、湿潤ポリマーコーティングでさらに保護されている種子に組成物の乾燥粉末を少しずつ加え、組成物を接着させることによって、種子に適用され得る。種子は、当該技術分野で公知の種子処理装置、例えばドラム又はボウル処理装置内で処理され得る。このプロセスは、バッチ式又は連続式のいずれでもよい。種子コーティングに有用な湿潤ポリマーとしては、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン（PVP）、酢酸フタル酸セルロース（CAP）等が挙げられ得る。PVAは、そのコスト及び種子への適用の容易さのために好ましい。真空乾燥された安定化組成物を種子に接着させるために、希釈ポリマー水溶液又はスラリーを用いるのが好ましい。希釈ポリマー水溶液を種子に加え、続いて真空乾燥安定化組成物を少しずつ又は計量して添加することができる。ポリマー水溶液は、好ましくは水に対して1.0%（w/w）未満のポリマー、より好ましくは水に対して約0.5%（w/w）未満のポリマーである。1kgの種子あたり10ml未満のポリマー水溶液を種子に適用し、乾燥安定化組成物を接着させることができる。PVAバリアコートは、根粒菌のより長い生存期間（例えば1ヶ月超）を確実にするために有利であることが見出されており、そうでなければ細菌は裸の種子に適用されると迅速に死滅し得る。PVAは、コーティングされた種子上の細菌の安定性を改善するために有効であることが見出されている。ポリマーコーティング及び真空乾燥安定化組成物のこの二重製剤技術はまた、安定性を改善するための他の細菌種又は他の生物学的材料の種子上へのコーティングのためにも適用可能である。溶液中のPVAレベルは高すぎることはできず、そうでなければ種子はべたつき、コーティングは不均一である。同様に、種子上のPVAレベルは、種子相互の物理的分離、同様に迅速な乾燥を確実にするために低い（例えば約0.25〜1%）ことが望ましい。
【０１１７】
本発明におけるPVAは、粘着剤及びバリアコーティングの両方として機能し得る。いくつかのアクリレート及びポリウレタンは細菌に対して毒性であり、種子適用における使用に望ましくない。加えて、殺真菌剤及び殺虫剤のような作物保護化学薬品の摩滅を低減するために用いられる市販の種子コーティングポリマーは、本発明による種子コーティングにおいて有用であり得る。有用な市販の種子コーティングとしては、種子処理ポリマーのDisco Ag（Incotec）及びSemkote（Croda）系統が挙げられ得る。真空乾燥された安定化組成物は、迅速な乾燥を可能にし、水分の影響に対する種子の感受性を低くする、種々の高Tg糖（例えばトレハロース）と共に特に配合され得る。乾燥ストレス下で細菌を安定化し保護することが知られている成分と細菌を混合することが望ましい。
【０１１８】
当該技術分野ではマイカ、タルク又はケイ酸塩の添加を必要としない非粘着性コーティング製剤を開発する強いニーズがあり、なぜなら、これらは種子が定植装置に通されるときに、不健康な粉塵レベルを生み出すからである。本アプローチはこれらの粉末の使用を回避し、不快な粉塵の発生なしに種子上に根粒菌のコーティングを付与する。
【０１１９】
真空乾燥安定化シードコーティングは、1×105の最小根粒菌CFU/g種子を送達し得て、これは包装及び保存湿度レベルに応じて少なくとも3ヶ月間安定であり得る。
【０１２０】
本明細書中に記載される組成物及び方法は、生物学的材料を安定化し、上の周囲温度及び相対湿度において長期の保存期間にわたってその活性を維持する。例えば、組成物の安定性は、高温（例えば40℃）及び高湿（例えば33%RH又は43%RH）に供し、製剤の生物学的活性を測定することによって試験する。生きているプロバイオティクス細菌の例として、これらの研究の結果は、これらの組成物中に配合された細菌が少なくとも60日間安定であることを実証する。安定性は、1 log CFU/gの効力損失の時間として定義される。このような製剤は、高濃度の生物学的活性材料が用いられる場合でさえ安定である。したがって、これらの製剤は、室温以上の温度で長期間輸送及び保存することができるという点で有利である。
【０１２１】
本発明はまた、本発明のコーティング方法に従って調製されるコーティングされた種子を提供する。
【０１２２】
本発明はさらに、生物学的材料、二糖、オリゴ糖、多糖、カルボン酸塩、加水分解タンパク質及び湿潤ポリマーでコーティングされた種子を提供する。コーティングされた種子は、0.4未満の初期水分活性（Aw）を有し得る。コーティングされた種子上の微生物は、少なくとも5 logのコロニー形成単位/g種子（CFU/g種子）の初期生存率を有し得る。微生物は、細菌、真菌、ウイルス又は酵母であり得る。細菌は、窒素固定細菌であり得る。窒素固定細菌は、根粒菌であり得る。コーティングされた種子上の微生物は少なくとも3ヶ月間安定で、生存率低下は1 log CFU/g又はPFU/g種子以下であり得る。コーティングされた種子上の微生物は少なくとも1年間安定で、生存率低下は2 log CFU/g又はPFU/g種子以下であり得る。湿潤ポリマーは、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン（PVP）及び酢酸フタル酸セルロース（CAP）よりなる群から選択され得る。
【実施例】
【０１２３】
実施例１．乾燥した安定な組成物の調製
基本炭水化物混合物：約70gのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）、約5gのインスタントイヌリン（Cargill Minneapolis, MN）及び約3gのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を乾燥形態で均一に混合した。
【０１２４】
基本ガラス強化剤混合物：約17gのカゼイン加水分解物又はエンドウマメ加水分解物（限外ろ過加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）及び5gのクエン酸ナトリウム又はアスコルビン酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）を乾燥形態で均一に混合した。
【０１２５】
プロバイオティクス細菌の安定化：ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）の新鮮な濃縮物（10%固形分のものを100ml、発酵回収物から直接）をブレンダー内に加え、35℃で維持した。約78gの基本炭水化物混合物及び約22gの基本ガラス強化剤混合物をプロバイオティクス培養物にゆっくりと加え、35℃で10分間混合を行った。粘稠スラリーを次いで底部に穴のあいた容器に移し、液体窒素を含有する浴の中に滴下させた。ビーズを次いで液体窒素から取り出し、直ちに乾燥に移した。
【０１２６】
プロバイオティクス細菌を含有する凍結ビーズの乾燥：凍結ビーズを200g/平方フィートの負荷容量でトレー上に広げ、すぐに凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚上に置いた。真空を次いで2000〜2700mTORRの間に調整し、棚温度を+30℃に上げた。これらの温度及び真空圧設定を5時間維持した。任意選択で、一次液体乾燥を開始する前に、約1000mTORRの真空圧を適用して固形凍結ビーズを約10分間パージすることによって凍結ビーズの温度を約-20℃に順応させた。次いでその後に、真空圧を2000〜2700mTORRの間に調整し、棚温度を+30℃に上昇させることによって一次乾燥ステップを行った。これらの温度及び真空圧設定を5時間維持した。次いでその後に、完全真空（150〜200mTORR）にし、棚温度を30℃〜50℃の間で維持してさらに3時間、二次乾燥ステップを行った。製剤を完全に乾燥させ、Hygropalm Aw1装置（Rotonic Instrument Corp, Huntington, NY）によって測定されたその水分活性はAw＝0.23であった。
【０１２７】
実施例２．乾燥プロバイオティクス細菌の保存安定性
図１は、実施例１からの乾燥安定プロバイオティクス細菌及び市販の乾燥プロバイオティクス細菌（Culturelle, Amerifit, Inc., Cromwell, CT）の40℃及び33%RH並びに30℃及び43%RHの２つの異なった加速保存条件下での保存安定性を示す。市販のプロバイオティクス細菌は加速保存条件下で最初の数週間以内にその生存能力を完全に失ったが、本発明のプロバイオティクス細菌の乾燥組成物は30℃及び43%RHで60日後に1.18 logしか失わず、40℃及び33%RHで1.09 logしか失わなかった。
【０１２８】
実施例３．プロバイオティクス細菌ラクトバチルス・ラムノサスを含有する安定な乾燥組成物のスケールアップ生産
ラクトバチルス・ラムノサス（商業的供給元からの400gの凍結濃縮物）を、ジャケット付きデュアルプラネタリーミキサー（DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA）内で37℃で解凍し、固形物含有量を蒸留水で10重量%の固形分に調整した。約212gのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）、約20gのインスタントイヌリン（Cargill Minneapolis, MN ）、約12gのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）、約136gのカゼイン加水分解物（限外ろ過加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）及び約20gのアスコルビン酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）を乾燥形態で均一に混合した。粉末混合物をプロバイオティクス培養物にゆっくりと加え、40rpm及び37℃で10分間混合を行った。スラリーを次いで底部に穴のあいた容器に移し、液体窒素を含有する浴の中に滴下させた。ビーズを次いで液体窒素から取り出し、密封アルミニウムホイルバッグの中に入れ、-80℃のディープフリーザー内で数週間保存した。
【０１２９】
乾燥のため、凍結ビーズを500〜1500g/平方フィートまでの範囲の負荷容量でトレイ上に均等に広げ、トレイを凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚上に置いた。真空圧を2000〜2700mTORRの間に調整し、生成物温度を上昇させて-10〜-5℃の間で安定させることによって一次液体乾燥ステップを開始した。時間とともに（約10〜16時間）、生成物温度は約20〜25℃まで上昇し、その時点で二次乾燥ステップを最高真空（150〜200mTORR）で開始し、生成物温度を30〜40℃の間でさらに14時間維持した。製剤を完全に乾燥させ、測定されたその水分活性は0.23Awであった。
【０１３０】
実施例４．プロバイオティクス細菌ビフィドバクテリウム・ラクティスを含有する安定な乾燥組成物のスケールアップ生産
ビフィドバクテリウム・ラクティス（商業的供給元からの400gの凍結濃縮物）を、ジャケット付きデュアルプラネタリーミキサー（DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA）内で37℃で解凍した。約212gのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）、約20gのインスタントイヌリン（Cargill Minneapolis, MN）、約12gのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）及び約20gのアスコルビン酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）を乾燥形態で均一に混合した。粉末混合物をプロバイオティクス培養物にゆっくりと加えた。約136gのエンドウマメ加水分解物（限外ろ過加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）を80gの蒸留水中に溶解し、混合物を完全に溶解するまで短時間電子レンジで又は水浴中で60℃に加熱し、次いで約35℃に冷却した。乾燥ミックス粉末及びエンドウマメタンパク質加水分解物を含有する溶液をプロバイオティクス濃縮液に加え、40rpm及び37℃で20分間混合を行った。スラリーを次いで底部に穴のあいた容器に移し、液体窒素を含有する浴の中に滴下させた。ビーズを次いで液体窒素から取り出し、密封アルミニウムホイルバッグの中に入れ、-80℃のディープフリーザー内で数週間保存した。
【０１３１】
乾燥のため、凍結ビーズを800g/平方フィートの負荷容量でトレイ上に均等に広げ、トレイを凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚上に置いた。真空圧を2000〜2700mTORRの間に調整し、生成物温度を上昇させて-10〜-5℃の間で安定させることによって一次液体乾燥ステップを開始した。時間とともに（約10〜16時間）、生成物温度は約20〜25℃まで上昇し、その時点で二次乾燥ステップを最高真空（150〜200mTORR）で開始し、生成物温度を30〜40℃の間でさらに14時間維持した。製剤を完全に乾燥させ、測定されたその水分活性は0.23Awであった。
【０１３２】
実施例５．プロバイオティクス細菌ビフィドバクテリウム・ラクティスを含有するハイドロゲル製剤の調製
ビフィドバクテリウム・ラクティスの濃縮プロバイオティクススラリーを実施例１に従って調製する。基本製剤に、0.5gの二塩基性リン酸カルシウムを加え、続いて0.5gのグルコノラクトンを加える。スラリーを室温で次の2時間をかけて硬化させ、固形ハイドロゲルを形成させる。硬いゲルを、市販のスライサー/シュレッダーを用いて、細く長い糸にスライスする。細い糸を、湿った形態でトレイ上に直接載せるか又は液体窒素中で瞬間凍結して500g/平方フィートの負荷容量でトレイ上に載せ、実施例３に記載されるように乾燥のために凍結乾燥機中に置く。製剤の水分活性（Aw）は0.05である（HygroPalm Aw1, Rotonic Huntington, NYにより測定される）。乾燥製剤を、標準的なハンマーミリング装置を用いてさらに磨砕して微粉末にして、50〜250ミクロンのスクリーンを通してふるい分けする。
【０１３３】
実施例６．ガラス強化剤と炭水化物混合物との間のモル比の最適化
種々のモル比のガラス強化剤及び炭水化物混合物を含有するいくつかの組成物を、実施例１に従って調製した。プロバイオティクス細菌L.パラカゼイ（L. paracasei）の濃縮培養物を商業的供給元から入手し、スラリーを瞬間凍結及びパージステップなしで湿った形態で直ちにトレー上に載せたこと以外は実施例１に記載されるように乾燥組成物に調製した。一次乾燥ステージ及び二次乾燥ステージの間に棚温度を40℃に上げたこと以外は実施例１及び３に記載されるように、スラリーを一次ステージ及び二次ステージで乾燥した。安定な粉末を、37℃及び33%RHで84日間の加速保存条件に供した。図２は、乾燥細菌の安定性に対する種々のモル比の効果を示す。結果は、ガラス強化剤と炭水化物混合物との間の最適なモル比が約0.12〜0.15であることを示唆した。
【０１３４】
実施例７．プロバイオティクス細菌L.アシドフィラスの保存安定性に対する本発明の組成物の効果
実施例１に記載される炭水化物混合物及びガラス強化剤混合物を含有する組成物を調製した。プロバイオティクス細菌L.アシドフィラスの濃縮培養物を商業的供給元から入手し、実施例１及び３に記載されるように乾燥組成物に調製し、安定な粉末を24℃及び33%RHで537日間の加速保存条件に供した。図３は、本発明の組成物と共に配合されたプロバイオティクスの優れた安定性を実証する。結果は、プロバイオティクス生存率が指定された条件下での537日間の保存期間にわたって0.18 logしか低下しなかったことを示す。
【０１３５】
実施例８．プロバイオティクス細菌L.アシドフィラスの保存安定性に対する種々のガラス強化剤化合物の効果
実施例１に記載される炭水化物混合物を含有するいくつかの組成物、及びカゼイン加水分解物及びクエン酸ナトリウム又はアスコルビン酸ナトリウム又は両方の組合せを含有するガラス強化剤混合物を調製した。プロバイオティクス細菌L.アシドフィラスの濃縮培養物を商業的供給元から入手し、スラリーを瞬間凍結及びパージステップなしで湿った形態で直ちにトレー上に載せたこと以外は実施例１に記載されるように乾燥組成物に調製した。スラリーを実施例１及び３に記載されるように一次ステージ及び二次ステージで乾燥させ、安定な粉末を24℃及び43%RHで180日間の加速保存条件に供した。図４は、乾燥細菌の安定性に対する種々のガラス強化化合物の効果を示す。結果は、タンパク質加水分解物の上部に追加のガラス強化剤を包含させることによって著しく良好な安定性が得られることを示唆した。とりわけ、等量の酢酸ナトリウム及びアスコルビン酸ナトリウムの包含は、最も安定な組成物を提供した。実施例5及び6の両方からの結果はまた、種々のガラス強化剤が細菌株に依存してより効果的であり得て、又は不安定化（destabilize）として作用すらし得ることを示唆した。
【０１３６】
実施例９．プロバイオティクス細菌ビフィドバクテリウム・ラクティスの保存安定性に対する種々のタンパク質加水分解物/糖の比の効果
実施例１に記載される炭水化物混合物及びガラス強化剤を含有するいくつかの組成物、並びに等量であるが種々の比のエンドウマメ加水分解物/トレハロースを含有し、アスコルビン酸ナトリウムを含む又は含まない組成物を調製した。プロバイオティクス細菌ビフィドバクテリウム・ラクティスの濃縮培養物を商業的供給元から入手し、実施例１及び３に記載されるように乾燥組成物に調製し、安定な粉末を35℃及び43%RHで7週間の加速保存条件に供した。図５は、乾燥細菌の安定性に対する、アスコルビン酸ナトリウムを含む又は含まないエンドウマメ加水分解物/トレハロースの1：4、1：2.5及び1：1.5の比の効果を示す。結果は、エンドウマメ加水分解物/トレハロースの比を増加させると、著しく良好な安定性が得られることを示唆した。とりわけ、1：1.5のエンドウマメ加水分解物/トレハロースの比は、より安定な組成物を提供した。より高いエンドウマメ加水分解物/トレハロース比でのアスコルビン酸ナトリウムの包含は、アスコルビン酸ナトリウムを含まない製剤と比較して優れた安定性をもたらした。
【０１３７】
実施例１０.プロバイオティクス  ラクトバチルス・ラムノサスの最大安定性のためのpH最適化
実施例１に記載される炭水化物混合物及びガラス強化剤を含有するいくつかの組成物を異なるpHで調製した。プロバイオティクス細菌L.ラムノサスの濃縮培養物を商業的供給元から入手し、実施例１及び３に記載されるように乾燥組成物に調製した。安定な粉末を、40℃及び33%RHで8週間の加速保存条件に供した。図６は、乾燥細菌の安定性に対するスラリーのpHの効果を示す。結果は、最適な安定性が中性pH（約7）で達成されることを示唆した。
【０１３８】
実施例１１．酵素を含有する安定な乾燥粉末
40重量%のフィターゼ（BASF, GmBH）を含有するハイドロゲル配合物を、実施例１及び４に記載される400gの炭水化物混合物及び200gのガラス強化剤混合物と400gのフィターゼとを1000mlの水中で混合することによって調製する。細断したハイドロゲル製剤を液体窒素中で瞬間凍結し、真空オーブン中で50℃の一次及び二次乾燥温度で乾燥させる。乾燥配合物の負荷量及び保存安定性を測定するため：乾燥試料を微量遠心管内で正確に秤量する（<100mg）。200μl分量のジメチルスルホキシド（DMSO）を加える。製剤をボルテックスによりDMSOバッファー中に溶解する。この試料に、0.05N NaOH、0.5% SDS及び0.075Mクエン酸（三ナトリウム塩）を含有する溶液0.8mlを加える。チューブを45℃で10分間超音波処理し、続いて5,000rpmで10分間、短時間遠心分離する。透明なDMSO/NaOH/SDS/クエン酸塩溶液の一定量をマイクロプレートのウェル内に入れ、Bradfordアッセイ法を用いてタンパク質含量について分析する。95℃に20分間曝露した後の安定な酵素乾燥組成物の安定性は、本発明の組成物を含まない乾燥酵素よりも著しく高い。
【０１３９】
実施例１２．感染性サケ貧血ウイルス（ISAV）ワクチンを含有する安定な乾燥粉末
ISAVワクチン（Novozymes, Denmark）の濃縮スラリーを、ISAVワクチン濃縮物、炭水化物混合物及びガラス強化剤を含有するスラリーに0.5%酢酸中の4%キトサン溶液20mLを加えること以外は実施例４に従って調製する。0.5gの二塩基性リン酸カルシウムを加え、続いて0.5gのグルコノラクトンを加える。スラリーを室温で次の2時間をかけて硬化させ、固形ハイドロゲルを形成させる。硬いゲルを、市販のスライサー/シュレッダーを用いて、細く長い糸にスライスする。細い糸を、湿った形態でトレイ上に直接載せるか又は液体窒素中で瞬間凍結して1500g/平方フィートの負荷容量でトレイ上に載せ、実施例３に記載されるように乾燥のために凍結乾燥機中に置く。製剤の水分活性（Aw）は0.25である。乾燥製剤を、標準的なハンマーミリング装置を用いてさらに磨砕して微粉末にして、50〜150ミクロンのスクリーンを通してふるい分けする。安定な乾燥ISAV組成物は、市販の飼料を乾燥組成物でトップコーティングし、アトランティックサーモンに給餌することによって、経口ワクチン接種に用いられる。
【０１４０】
実施例１３．侵入種の餌の調製
本発明による特に標的とされる侵入種のためのペレット化餌を、駆除剤を含有して調製する。実施例９に記載される製剤200gを調製し、水200gmに加える。この溶液に、90gmのロテノン及び0.5gmの二塩基性リン酸カルシウム、続いて0.5gmのグルコノラクトンを加える。スラリーは、標準的な工業用噴霧乾燥機中で直ちに噴霧乾燥され、乾燥製剤は環境又は近くの生態系に対する毒素の有害な影響を伴わずに、特定の侵入種を標的とするために用いられる。
【０１４１】
実施例１４．保護された植物プロバイオティクス製剤の調製
生物学的制御剤、例えばリゾ細菌等を、実施例４に従って乾燥組成物中に調製する。乾燥リゾ細菌組成物の有効性を、ノトバイオート条件下でのレタスの成長について評価する。100mg/植物の用量のリゾ細菌乾燥組成物を、砂を入れたジャーに接種し、予め発芽させた（24時間）レタス苗を植える。栄養量（nutrient dose）の5mlの滅菌ホーグランド溶液をジャー内の植物に施用する。ジャーを、12時間の光周期で28℃に維持した成長チャンバーの中にランダムに配置する。接種後7日間隔毎に、植物及び付着している砂をジャーから注意深く取り出す。滅菌リン酸バッファー（pH7.0）で根を洗浄し、根の長さの測定値を記録する。
【０１４２】
実施例１５．乾燥した安定なプロバイオティクス物質の調製
基本製剤：75g分量のトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）及び22gの高度加水分解カゼイン（Marcor, Carlstadt, NJ）を、3gの乾燥形態のアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）と均一に混合した。ラクトバチルス・アシドフィラスの新鮮な濃縮物（少なくとも10%の固形分を含有する100ml、発酵回収物から直接）をブレンダー内に加え、35℃で維持した。ガム、糖及び加水分解タンパク質の乾燥ミックスをプロバイオティクス培養物にゆっくりと加え、35℃で10分間混合を行った。粘稠スラリーを次いで底部に穴のあいた容器に移し、窒素を含有する浴の中に滴下させた。ビーズを次いで液体窒素から取り出し、直ちに乾燥に移した。
【０１４３】
基本製剤の凍結ビーズの乾燥：凍結ビーズを100g/平方フィートの負荷容量でトレー上に均等に広げ、直ちに凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚上に置いた。真空圧を次いで1000mTORRで適用し、固形凍結ビーズを10分間パージした。真空を次いで2700mTORRに調整し、棚温度を+30℃に上げた。これらの温度及び真空圧を3時間維持した。次いでその後に、完全真空（150〜200mTORR）で、棚温度を30℃に上げてさらに２時間、二次乾燥ステップを行った。製剤を完全に乾燥させ、Hygropalm Aw1装置（Rotonic Instrument Corp, Huntington, NY）によって測定されたその水分活性はAw＝0.23であった。
【０１４４】
実施例１６．プロバイオティクス細菌ラクトバチルス・ラムノサスLGGを含有する安定な乾燥組成物
ラクトバチルス・ラムノサスLGG（商業的供給元からの500gの凍結濃縮物）を、ジャケット付きデュアルプラネタリーミキサー（DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA）内で37℃で解凍した。２つのガラス形成剤;トレハロース（387g、Cargill Minneapolis, MN）及び高度加水分解カゼイン（83g、Marcor, Carlstadt, NJ）を、２つのマトリクス形成剤;アルギン酸ナトリウム（15g、ISP Corp., Wayne, NJ）及びインスタントイヌリン（25g、Cargill Minneapolis, MN）と乾燥形態で均質に混合した。乾燥ミックスを解凍したプロバイオティクス細菌にゆっくりと加え、40rpm及び37℃で10分間混合を行った。50〜200mlの水を添加することによって、スラリーの粘度を12,000Cpに調整した。スラリーを次いで底部に穴のあいた容器に移し、液体窒素を含有する容器の中に滴下させた。ビーズを次いで液体窒素から取り出し、密封アルミニウムホイルバッグの中に入れ、-80℃のディープフリーザー内で数週間保存した。
【０１４５】
乾燥のため、凍結ビーズを100〜500g/平方フィートまでの範囲の負荷容量でトレイ上に均等に広げ、トレイを凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚上に置いた。真空圧を1000mTORRで適用し、棚温度を+20℃に調整した。固形凍結ビーズを1〜30分間パージした。パージステップに続いて、真空圧を2700mTORRに調整し、棚温度を+30℃に上げた後に一次乾燥ステップを行った。これらの温度及び真空圧を12時間維持した。次いでその後に、完全真空（150〜200mTORR）で、棚温度を30℃で維持してさらに4時間、二次乾燥ステップを行った。製剤を完全に乾燥させ、測定されたその水分活性は0.23Awであった。図１３は、プロバイオティクス製剤の乾燥プロファイルを示す。
【０１４６】
異なる温度（+4℃、-80℃及び-180℃）でスラリーを凍結させた後の、並びに凍結ビーズの調製及び凍結乾燥機中での乾燥を包含する乾燥プロセス後の生存率低下を図１０、図１１及び図１４中に表す。プロセス全体の生存率低下は、細菌培養物のタイプ（凍結又は乾燥した培養物）及び粘稠スラリーの凍結温度に依存して、概して<1 log未満であった。結果は、液体窒素（-180℃）中でのプロバイオティクス細菌の瞬間凍結は-80℃で凍結するよりも損傷の少ないプロセスであることを示す。
【０１４７】
図１２及び図１５は、乾燥組成物中のプロバイオティクス細菌の初発数に対する、並びに40℃及び33%RHの加速保存条件下での保存安定性に対する、0分（パージなし）から30分までの範囲の種々のパージ時間の効果を示す。結果は、より長いパージ時間は概して乾燥製剤中の細菌初発数を改善するが、プロバイオティクス製剤の保存安定性に影響を及ぼさないことを示唆する。
【０１４８】
実施例１７．
トレハロース（752g、Cargill Minneapolis, MN）、高度加水分解エンドウマメタンパク質（167g、Marcor, Carlstadt, NJ）、アルギン酸ナトリウム（30g、ISP Corp., Wayne, NJ）及びインスタントイヌリン50g、Cargill Minneapolis, MN）を乾燥形態で均質にブレンドした。乾燥ミックスを、ジャケット付きデュアルプラネタリーミキサー（DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA）内で、80℃の熱脱イオン水1000mlの中にゆっくりと加え、40rpmで10分間混合を行った。混合物の温度を37℃に下げ、商業的供給元から入手した100gのラクトバチルス・ラムノサスLGG乾燥粉末をゆっくり加え、20分間混合を続けた。スラリーを次いで2mmオリフィスニードルを通して液体窒素を含有する浴の中に押出した。/ひも/ビーズを次いで液体窒素から取り出し、密封アルミニウムホイルバッグの中に入れ、-80℃のディープフリーザー内で数週間保存した。乾燥のため、凍結ひも/ビーズを100〜500g/平方フィートの範囲の負荷容量でトレイ上に均等に広げ、トレイを凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚上に置き、実施例１６に記載されるように乾燥させた。全ての製剤は、トレイ内に満足に保持され、全ての負荷レベルにおいて飛散又は発泡は観察されなかった。製剤は、より高い負荷容量であっても完全に乾燥され、全ての試料について測定された水分活性は0.26Aw以下であった。
【０１４９】
実施例１８．プロバイオティクス細菌ビフィドバクテリウム属菌を含有するハイドロゲル製剤の調製
ビフィドバクテリウム属菌の濃縮プロバイオティクススラリーを実施例１５に従って調製する。基本製剤に、0.5gの二塩基性リン酸カルシウムを加え、続いて0.5gのグルコノラクトンを加える。スラリーを室温で次の2時間をかけて硬化させ、固形ハイドロゲルを形成させた。硬いゲルを、市販のスライサー/シュレッダーを用いて、細く長い糸にスライスした。細い糸を液体窒素中で瞬間凍結し、700g/平方フィートの負荷容量でトレイ上に載せ、実施例１６に記載されるように乾燥のために凍結乾燥機中に置く。製剤の水分活性（Aw）は0.05であった（HygroPalm Aw1, Rotonic Huntington, NYにより測定された）。乾燥製剤を、標準的なハンマーミリング装置を用いてさらに磨砕して微粉末にして、50〜250ミクロンのスクリーンを通してふるい分けした。
【０１５０】
実施例１９．プロバイオティクス細菌ラクトバチルス・アシドフィラスを含有するアレルゲンを含まない組成物
トレハロース（752g、Cargill Minneapolis, MN）、高度加水分解エンドウマメタンパク質（167g、Marcor, Carlstadt, NJ）、アルギン酸ナトリウム（30g、ISP Corp., Wayne, NJ）及びインスタントイヌリン50g、Cargill Minneapolis, MN）を乾燥形態で均質にブレンドした。乾燥ミックスを、ジャケット付きデュアルプラネタリーミキサー（DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA）内で80℃の熱脱イオン水1000mLの中にゆっくりと加えることによって滅菌し、なめらかで透明なスラリーが形成されるまで40rpmで10分間混合を行った。混合物の温度を37℃に下げ、商業的供給元から入手したラクトバチルス・アシドフィラスを含有する凍結ビーズ1000gをゆっくり加え、10分間混合を続けた。スラリーを次いで2mmオリフィスニードルを通して液体窒素を含有する浴の中に押出した。/ひも/ビーズを次いで液体窒素から取り出し、密封アルミニウムホイルバッグの中に入れ、-80℃のディープフリーザー内で数週間保存した。乾燥のため、凍結ひも/ビーズを1000g/平方フィートの負荷容量でトレイ上に均等に広げ、トレイを凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚上に置き、実施例１６に記載されるように乾燥させた。乾燥組成物中のプロバイオティクス細菌の初発CFU数は10.53 log/gであり、40℃及び33%RHの加速保存条件下で42日間保存した後の生存率低下は0.69 log CFU/gであった。
【０１５１】
実施例２０．本発明の乾燥製剤を含有する乳児用配合物
ラクトバチルス・ラムノサスを含有する安定な乾燥製剤を実施例１６に従って調製し、続いて２つの粒径群（50μm超及び150μm未満）にふるい分けした。99.9gのNutramigen（Mead Johnson; Evansville, IL）を、大きさが50μm〜150μmの間の範囲にある乾燥製剤粒子0.1gと混合することによって、乳児用配合物を調製した。最終生成物は、100gの乳児用配合物あたり約108cfuのラクトバチルス・ラムノサスを含有する。
【０１５２】
実施例２１．本発明の安定な乾燥製剤を含有するプロバイオティクスサプリメント
ラクトバチルス・アシドフィラスを含有する安定な乾燥組成物を、経口剤形、例えば錠剤、カプレット又はカプセル等に製剤化する。99.9gの圧縮剤（デキストロース）及び0.1gの、サイズ範囲が50μm〜150μmの間の乾燥製剤粒子を含有するオレンジ風味錠剤を、1/2インチの丸い標準的凹型工具を用いて回転機上で直接打錠することによって調製する。最終生成物は、約108cfu/単位用量を含有する。錠剤の硬度は8〜10kpの範囲内にあり、崩壊時間は約20秒である。打錠した錠剤を100錠ずつ180cc HDPEボトル内に包装し、40℃/33%RHの制御温度/湿度に曝露する。この生成物を、12ヶ月の期間にわたって又は1×106/単位用量を下回るアッセイカウントの低下が観察されるまで、毎月の微生物学的安定性試験に供する。
【０１５３】
実施例２２．本発明の安定な乾燥製剤を含有する機能性飲料（functional beverage drink）
71%（質量%）のスクロース、14%のマルトデキストリン、10%のイヌリン、2%のデキストロース、1%のクエン酸無水物、0.3%のアカシアガム、0.3%のフレーバー、0.3%のリン酸三カルシウム、及び0.1%の、サイズ範囲が50μm〜250μmの間の乾燥プロバイオティクス製剤粒子（L.アシドフィラス）を含有する乾燥ミックスを調製する。最終生成物は、約109cfu/単位用量（30gドライミックス）を含有する。この生成物を、340milの水の中で攪拌することによって飲用の小さなアルミニウムホイルバッグ中に包装する（30g単位用量/バッグ）。飲料乾燥ミックス中のプロバイオティクス細菌の安定性を、12ヶ月の期間にわたって又は1×107/単位用量を下回るアッセイカウントの低下が観察されるまで、毎月の微生物学的安定性試験に供する。
【０１５４】
実施例２３．プロバイオティクスペットフードの調製
市販のイヌ用ペレット化ペットフードを対流オーブン中で水分活性0.1まで乾燥させ、次いで実施例１7に記載されるように調製した安定なプロバイオティクス乾燥製剤でコーティングする。乾燥ペレットに約5%の脂肪ベースの水分バリア（40%ニワトリ脂肪、40%カカオバター及び20%蜜蝋の混合物）を噴霧し、ドラムタンブラー中で乾燥粉末製剤（通常は全ペットフードの0.1〜0.5%、これは10.sup.8 CFU/gの投与量を与える）と混合し、最後に脂肪ベースの水分バリアの追加コーティングを噴霧する。コーティングの総量は、（ペットフードの）約15%である。コーティング時間は約30分である。
【０１５５】
実施例２４．いくつかのプロバイオティクス微生物を使用した魚類飼料の調製
本発明による魚類用ペレット化飼料を、いくつかのプロバイオティクスの混合物を用いて調製する。L.ラムノサス、L.アシドフィラス及びビフィドバクテリウム・ラクティスを含有する安定な乾燥プロバイオティクス製剤を、実施例１５に記載されるように調製する。市販のサケ用スターター飼料（Zeigler Bros., Gardners, PA）を最初に対流オーブン中で水分活性0.1まで乾燥させ、次いでドラムタンブラー中でプロバイオティクス製剤でコーティングする。ペレット（1000g）に、最初に、約5重量%の脂肪ベースの水分バリア（40%魚油、40%カカオバター及び20%蜜蝋の混合物）を噴霧し、次いで1gの安定な乾燥プロバイオティクス製剤と混合し（107cfu/g飼料の投与量を達成するため）、最後に脂肪ベースの水分バリアの追加コーティングを噴霧する。コーティングの総量は、（魚類飼料の）約10%である。
【０１５６】
実施例２５．酵素を含有する安定な乾燥粉末
40重量%のSavinase（Novozymes, Denmark）を含有するハイドロゲル配合物を、実施例１8に記載される600gの製剤と400gのサビナーゼとを1000gの水溶液に混合することによって調製する。細断したハイドロゲル製剤を液体窒素中で瞬間凍結し、真空オーブン中で50℃の製剤乾燥温度で乾燥させる。乾燥配合物の負荷量及び保存安定性を測定するため：乾燥試料を微量遠心管内で正確に秤量する（<100mg）。200μlのジメチルスルホキシドを加える。製剤をボルテックスによりDMSOバッファー中に溶解する。この試料に、0.05N NaOH、0.5% SDS及び0.075Mクエン酸（三ナトリウム塩）を含有する溶液0.8mlを加える。チューブを45℃で10分間超音波処理し、続いて5,000rpmで10分間、短時間遠心分離する。透明なDMSO/NaOH/SDS/クエン酸塩溶液の一定量をマイクロプレートのウェル内に入れ、Bradfordアッセイ法を用いてタンパク質含量について分析する。安定な酵素製剤の保存安定性は、本発明の製剤を含まない乾燥酵素よりも著しく高い。
【０１５７】
実施例２６．ビタミンAを含有する安定な乾燥粉末
30重量%のビタミンAを含有する製剤を、320gのインスタントイヌリン、320gのマルトデキストリンDE-1（Tate & Lyle, London, UK）、50gのカルボキシメチルセルロースナトリウム（Ashland Aqualon Functional Ingredients, Wilmington, DE）、10gのアスコルビン酸ナトリウム及び300gのビタミンA結晶（BASF Corp., Florham Park, NJ）を1000gの水の中で混合することによって調製する。湿潤製剤を、Mobile-Minor噴霧乾燥機（GEA Process Engineering Inc., Columbia MD）中で、それぞれ180℃及び80℃の入口及び出口温度で噴霧乾燥するか、又は液化窒素中で瞬間凍結し、次いで1000g/平方フィートの負荷容量でトレー上に広げ、実施例１６に記載されるように乾燥する。ビタミンA組成物は、40℃及び75%RHで３ヶ月間安定（>80%）である。
【０１５８】
実施例２７．生物学的利用能が高められた保護された製剤中のカロテンの調製
保存中又は生物に給餌した後に飼料中の他の成分による酸化を受けることになるカロテンの生物学的利用能を保護して高める製剤を、本発明の製剤及び方法に従って調製する。6gの水溶性キトサン（LSK BioPartners, Inc., Salt Lake City, Utah）を含有する製剤を、200gの水中に溶解する。この溶液に90gの天然アスタキサンチン（Naturose（商標）, Cyanotech Corp., Kailua-Kona, HI）を加え、スラリーを5%トリポリリン酸ナトリウムを含有する浴の中に霧化又は押出する。ハイドロゲル化微粒子又はひもを室温で4時間かけて硬化させる。粒子を架橋浴から取り出し、水で洗浄し、90gのスクロース及び10gの高度加水分解カゼインの乾燥ブレンドと混合する。糖/タンパク質を負荷した粒子を瞬間凍結し、直ちに500g/平方フィートでトレー上に置き、水分活性が0.3未満に低下するまで凍結乾燥機中で凍結乾燥する。乾燥製剤をさらに粉砕して所望のサイズ分布にし、包装する。
【０１５９】
実施例２８．侵入種の餌の調製
特に標的とされる侵入種のためのペレット化餌を、本発明に従って調製する。実施例１に記載される駆除剤を含有する200gの製剤を調製し、200gmの水中に加える。この溶液に、90gmのロテノン及び0.5gmの二塩基性リン酸カルシウム、続いて0.5gmのグルコノラクトンを加える。スラリーを室温で2時間かけて硬化させる。硬いゲルを、スライサー/シュレッダーを通して細く長い糸にスライスする。細い糸をトレイ上に載せ、凍結乾燥機の中に置く。棚温度を-30℃に設定し、製剤を凍結させた後、完全真空を適用し、保存温度を+60℃に上昇させ、一晩乾燥させる。乾燥製剤を磨砕して、標的とする特定の種のための餌サイズ規格に適切なサイズ分布にする。
【０１６０】
実施例２９．水不溶性製剤中の保護された駆除剤の調製
保存中又は環境中での施用後に製剤中の他の成分による分解を受けることになる駆除剤の保護された顆粒製剤を、本発明の製剤及び方法を用いて調製する。6gのペクチン及び102gのスクロースを含有する製剤を200gの水に加える。この溶液に、90gの敏感な駆除剤の乾燥製剤と、1.5gの二塩基性リン酸カルシウム及び0.5gの塩化カルシウムを含有する混合物と、続いて0.85gのグルコノラクトンとを加える。スラリーを室温で4時間かけて硬化させ、次いでスライサー/シュレッダーを通して細く長い糸にスライスする。細い糸をトレイ上に載せ、凍結乾燥機中で乾燥させて、0.1の水分活性に到達させる。乾燥製剤をさらに粉砕して所望のサイズ分布にし、包装する。
【０１６１】
実施例３０．保護された植物プロバイオティクス製剤の調製
生物学的制御剤、例えばリゾ細菌等を、実施例１８に従って乾燥組成物中に調製する。乾燥リゾ細菌組成物の有効性を、ノトバイオート条件下でのレタスの成長について評価する。100mg/植物の用量のリゾ細菌乾燥組成物を、砂を入れたジャーに接種し、予め発芽させた（24時間）レタス苗を植える。栄養量（nutrient dose）の5mlの滅菌ホーグランド溶液をジャー内の植物に施用する。ジャーを、12時間の光周期で28℃に維持した成長チャンバーの中にランダムに配置する。接種後7日間隔毎に、植物及び付着している砂をジャーから注意深く取り出す。滅菌リン酸バッファー（pH7.0）で根を洗浄し、根の長さの測定値を記録する。
【０１６２】
実施例３１．プロバイオティクス細菌ラクトバチルス・アシドフィラス（DSM-20356）を含有する安定な乾燥組成物の生産
凍結細菌濃縮物（現地の発酵プロセスから入手した10g）を水浴中、37℃で解凍し、蒸留水で固形物含有量を10%固形分湿重量に調整した。約5gの加水分解エンドウマメタンパク質（限外ろ過加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）を50gの温水中に完全に溶解し、解凍した細菌培養物に加える。約2.5gのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）、約5gのインスタントイヌリン、約5gのマルトデキストリンDE-1（Cargill Minneapolis, MN）及び約1.5gのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を乾燥形態で均一に混合した。粉末混合物を細菌培養物にゆっくりと加え、小さなスパチュラを用いて37℃で20分間混合を行った。スラリーを次いで液体窒素を含有する浴の中に滴下させた。ビーズを次いで液体窒素から取り出し、密封アルミニウムホイルバッグの中に入れ、乾燥させるまで-80℃のディープフリーザー内で保存した。
【０１６３】
乾燥のため、凍結ビーズを500〜1500g/平方フィートまでの範囲の負荷容量でトレイ上に均等に広げ、トレイを凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚上に置いた。真空圧を2000〜2700mTORRの間に調整し、生成物温度を上昇させて-10〜-5℃の間で安定させることによって一次液体乾燥ステップを開始した。時間とともに（約10〜16時間）、生成物温度は約20〜25℃まで上昇し、その時点で二次乾燥ステップを最高真空（150〜200mTORR）で開始し、生成物温度を30〜40℃の間でさらに14時間維持した。製剤を完全に乾燥させ、測定されたその水分活性は0.3Aw未満であった。この製剤を、市販のハンマーミルを用いて磨砕し、粒子を100ミクロン未満にふるい分けした。
【０１６４】
安定なプロバイオティクス細菌の生存率を、普通に凍結乾燥された細菌の粉末と一緒に、希釈及びLMRS寒天プレート上で播種の標準的手順に従って、毎週モニターした。図１６は、40°RHで14日後、本発明の組成物中に配合されたプロバイオティクス細菌の安定性は普通に凍結乾燥された細菌の安定性よりも2 log高かったことを示す。これらの結果は、本発明の組成物及び方法を使用すると、高湿及び非冷蔵保存条件において、プロバイオティクス細菌の安定性は劇的に改善されることを実証する。
【０１６５】
実施例３２．プロバイオティクス細菌ラクトバチルス・アシドフィラス（DSM-20356）を含有する安定な乾燥溶融脂肪凝集組成物の生産
10gの乾燥粉末組成物を実施例３１に記載されるように生産した。乾燥粉末を40℃水浴中のビーカー内に入れた。８部のカカオバター及び２部のステアレート（27-ステアリン、Loders Croklaan, Channahon, IL）を含有する10gの溶融脂肪混合物を、混合下で温粉末にゆっくりと加えた。視覚的に均一なサイズの凝集粉末に達するまで混合を続けながら、混合物を10℃に冷却した。
【０１６６】
実施例３３．プロバイオティクス菌ラクトバチルス・ラムノサス種を含有する乾燥組成物の40℃及び43%RH又は30℃及び60%RHでの貯蔵安定性
プロバイオティクス細菌ラクトバチルス・ラムノサス種（現地の発酵元から入手）を含有する10gの乾燥粉末組成物を、実施例３１に記載されるように生産した。乾燥安定組成物をデシケーター中に入れ、40℃及び43%RH又は30℃及び60%RHに曝露した。安定なプロバイオティクスの生存率を、普通に凍結乾燥された細菌の粉末と一緒に、希釈及びLMRS寒天プレート上で播種の標準的手順に従って、毎週モニターした。図１７は、40℃及び43%RHで14日後、本発明の組成物中に配合されたプロバイオティクス細菌の安定性は普通に凍結乾燥された細菌の安定性よりも3 log高かったことを示す。30℃及び60%RHで7日後、本発明の組成物中に配合されたプロバイオティクス細菌の安定性はまた、普通に凍結乾燥された細菌の安定性よりも3 log高かった。これらの結果は、本発明の組成物及び方法を使用すると、高湿非冷蔵保存条件において、プロバイオティクス細菌の安定性は劇的に改善されることを実証する。
【０１６７】
実施例３４．病原性微生物に対するプロバイオティクス細菌を含有する安定な乾燥組成物を含有する動物飼料の生産
約10kgの去勢牛用又はニワトリ用いずれかの市販動物飼料を、ドラムタンブラー中で、実施例３１又は３２に記載される１部の磨砕生物学的材料及び２部の植物油、例えばトウモロコシ油等を含有する3%の油混合物でトップコーティングする。プロバイオティクス細菌のCFU数は、1E9/g飼料である。コーティングされた飼料を40℃の43%相対湿度チャンバー中に入れ、これらの極端な条件で14日間保存した後のプロバイオティクス細菌の生存率低下は、初発CFUの1 log未満である。別のコーティングされた飼料を30℃の33%相対湿度チャンバー中に入れ、これらの条件で6ヶ月間保存した後のプロバイオティクス細菌の生存率低下は、初発CFUの1 log未満である。これらの例は、コンパニオンアニマルを包含する種々の動物を処置するために用いられる微生物、例えばラクトバチルス属菌等を、本発明の組成物及び乾燥方法の中で維持し、次いでコーティングされていない飼料が保存される典型的な湿度及び温度条件下、棚上で長期間又は飼料ホッパー中で少なくとも2週間保存するために飼料上にコーティングすることができることを実証する。
【０１６８】
実施例３５．単細胞真菌S.セレビシエを含有する安定な乾燥組成物の生産
新鮮なパン酵母ペースト（現地の流通業者から入手した100g）を10℃の水浴中に入れる。約50gの加水分解エンドウマメタンパク質（限外ろ過加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）を500gの温水中に完全に溶解する。溶液を10℃に冷却し、混合しながら酵母ペーストに加える。約25gのスクロース（現地の食料品店から入手）、約50gのインスタントイヌリン、約50gのマルトデキストリンDE-1（Cargill Minneapolis, MN）、約12gのアスコルビン酸ナトリウム（Sigma）及び約15gのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を乾燥形態で均一に混合する。粉末混合物を酵母培養物にゆっくりと加え、40rpm及び10℃で20分間混合を行う。スラリーを次いで底部に穴のあいた容器に移し、液体窒素を含有する浴の中に滴下させる。ビーズを次いで液体窒素から取り出し、密封アルミニウムホイルバッグの中に入れ、-80℃のディープフリーザー内で数週間保存する。乾燥及び粉砕を実施例３１に記載されるように行う。
【０１６９】
実施例３６．単細胞真菌S.セレビシエを含有する安定な乾燥組成物の噴霧乾燥
酵母スラリーを実施例３４に記載されるように調製する。スラリーを冷たい（10℃の）蒸留水でさらに希釈して、約1000〜2000cPの粘度を得る。希釈したスラリーを、180℃/60℃の入口/出口温度設定を用いて噴霧乾燥する（Mobile Minor spray drier, GEA Niro Inc., Columbia, MD）。
【０１７０】
実施例３７．単細胞真菌を含有する安定な乾燥組成物でのトウモロコシ種子のコーティング
約10kgの市販トウモロコシ種子を、ドラムタンブラー中、40℃で、実施例３４又は実施例３５に記載される１部の磨砕生物学的材料及び２部の植物油、例えばパーム油又はココナッツ油等を含有する3%の溶融油混合物でトップコーティングする。酵母CFU数は、1E8/g種子である。コーティングされた種子を30℃の60%相対湿度チャンバー中に入れ、これらの極端な条件で3ヶ月保存した後の酵母の生存率低下は、初発CFUの1 log未満である。この例は、農業接種物として用いられる微生物、例えばペニシリウム属菌の種々の株等を、本発明の組成物及び乾燥方法の中で維持し、次いでコーティングされていない種子が保存される典型的な湿度及び温度条件下で長期保存のために穀物上にコーティングすることができることを実証する。
【０１７１】
実施例３８．プロバイオティクス細菌ビフィドバクテリウム属菌を含有するハイドロゲル組成物の調製
ビフィドバクテリウム属菌の濃縮プロバイオティクススラリーを実施例３１に従って調製する。粉末混合物に、5gの二塩基性リン酸カルシウムを加える。粉末混合物を混合下でプロバイオティクス培養物に加え、続いて5gのグルコノラクトンを加える。スラリーを室温で次の2時間をかけて硬化させ、固形ハイドロゲルを形成させる。硬いゲルを、市販のスライサー/シュレッダーを用いて、細く長い糸にスライスする。細い糸を、湿った形態でトレイ上に直接載せるか又は液体窒素中で瞬間凍結して500g/平方フィートの負荷容量でトレイ上に載せ、実施例３１に記載されるように乾燥のために凍結乾燥機中に置く。標準的なハンマーミリング装置を用いて乾燥製剤を磨砕して微粉末にし、50ミクロンスクリーンを通してふるい分けする。
【０１７２】
実施例３９．プロバイオティクス細菌を含有する安定な発酵乳の生産
100グラムの低温殺菌したプレーン発酵乳（Dannon、現地の食料品店から入手）に、実施例３７に記載される安定なプロバイオティクスを含有する0.5グラムの架橋粉末を加える。発酵乳中の初発CFU数は、1E9/g発酵乳である。発酵乳を4℃の冷蔵庫で6週間保存する。冷蔵発酵乳中のプロバイオティクス細菌の生存率低下は、初発CFUの1 log未満である。この例は、プロバイオティクス細菌、例えばラクトバチルス及びビフィドバクテリウムの種々の株等を本発明の組成物及び乾燥方法の中で維持することができることを実証する。ここで組成物中のプロバイオティクス細菌は完全に含水し、維持されていないプロバイオティクス細菌が生存しない典型的な条件下で長期間、乳製品中で活性があるままであることができる。
【０１７３】
実施例４０．酵素を含有する安定な乾燥組成物
40重量%のフィターゼ（Marcor, Carlstadt, NJ）を含有するハイドロゲル配合物を、実施例３４に記載される250gの粉末混合物と200gのフィターゼとを、約50gの加水分解エンドウマメタンパク質を含有する500mLの水溶液中で混合することによって調製する。細断したハイドロゲル製剤を液体窒素中で瞬間凍結し、真空オーブン中で50℃の一次及び二次乾燥温度で乾燥させる。乾燥組成物の負荷量及び保存安定性を測定するため：乾燥試料を微量遠心管内で正確に秤量する（<100mg）。200μlのジメチルスルホキシドを加える。製剤をボルテックスによりDMSOバッファー中に溶解する。この試料に、0.05N NaOH、0.5% SDS及び0.075Mクエン酸（三ナトリウム塩）を含有する溶液0.8mlを加える。チューブを45℃で10分間超音波処理し、続いて5,000rpmで10分間、短時間遠心分離する。透明なDMSO/NaOH/SDS/クエン酸塩溶液の一定量をマイクロプレートのウェル内に入れ、Bradfordアッセイ法を用いてタンパク質含量について分析する。95℃に20分間曝露した後の安定な酵素乾燥組成物の安定性は、本発明の組成物を含まない乾燥酵素よりも著しく高い。
【０１７４】
実施例４１．植物生物学的防除剤を含有する安定な乾燥組成物
生物学的制御剤、例えばリゾ細菌等を、実施例３４に従って乾燥組成物中に調製する。乾燥リゾ細菌組成物の有効性を、ノトバイオート条件下でのレタスの成長について評価する。100mg/植物の用量のリゾ細菌乾燥組成物を、砂を入れたジャーに接種し、予め発芽させた（24時間）レタス苗を植える。栄養量（nutrient dose）の5mlの滅菌ホーグランド溶液をジャー内の植物に施用する。ジャーを、12時間の光周期で28℃に維持した成長チャンバーの中にランダムに配置する。接種後7日間隔毎に、植物及び付着している砂をジャーから注意深く取り出す。滅菌リン酸バッファー（pH7.0）で根を洗浄し、根の長さの測定値を記録する。リゾ細菌組成物で処理したレタス苗は、未処理の苗よりも成長増進を示す。
【０１７５】
実施例４２．プロバイオティクス細菌ラクトバチルス・ラムノサス種の安定な乾燥組成物を含有する錠剤の生産
凍結細菌濃縮物（現地の発酵プロセスから入手した10g）を水浴中、37℃で解凍し、蒸留水で固形物含有量を10%固形分湿重量に調整した。約5gの加水分解エンドウマメタンパク質（限外ろ過加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）を50gの温水中に完全に溶解し、解凍した細菌培養物に加えた。約5gのトレハロース（Cargill Minneapolis, MN）及び約2.5gのアスコルビン酸ナトリウムを乾燥形態で均一に混合した。任意選択で、約5gのインスタントイヌリン、約5gのマルトデキストリンDE-1（Cargill Minneapolis, MN）及び約1.5gのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）も加えて、約50,000cPの望ましい粘度の粘稠スラリーを形成させ、乾燥材料のガラス状構造をさらに増大させた。粉末混合物を細菌培養物にゆっくりと加え、37℃で20分間混合を行った。粘稠な細菌懸濁液を次いで液体窒素浴中にゆっくりと滴下した。凍結ビーズを次いで液体窒素から取り出し、密封アルミニウムホイルバッグの中に入れ、乾燥させるまで-80℃のディープフリーザー内で保存した。
【０１７６】
乾燥のため、凍結ビーズを500〜1500g/平方フィートまでの範囲の負荷容量でトレイ上に均等に広げ、トレイを凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚上に置いた。真空圧を2000〜2700mTORRの間に調整し、生成物温度を上昇させてマイナス-10−5℃の間で安定させることによって一次水分除去ステップを開始した。時間とともに（約10〜16時間）、生成物温度は約20〜25℃まで上昇し、その時点で二次乾燥ステップを最高真空（50〜200mTORR）で開始し、生成物温度を30〜45℃の間でさらに14時間維持した。製剤を完全に乾燥させ、測定されたその水分活性は0.3Aw未満であった。コーヒーグラインダーを用いて製剤を粉砕し、粒子を250ミクロン未満にふるい分けした。
【０１７７】
錠剤化のため、乾燥した安定なプロバイオティクス組成物（100mg）を、2%w/wステアリン酸マグネシウム及び2%w/w親水性ヒュームドシリカ（AEROSIL（登録商標）200, Evonik Industries）を含有する400mgのマルトデキストリンDE-1と混合し、手持ち式丸剤プレス装置（1/2インチ錠剤径筐体を用いたもの）中で打錠した。普通に凍結乾燥されたプロバイオティクス細菌（遊離プロバイオティクス）の粉末を含有する同様の錠剤も調製し、保護されたプロバイオティクス細菌を含有する錠剤との比較に用いた。
【０１７８】
錠剤化の前後、並びに40℃及び43%RHにおける保存中の安定なプロバイオティクス細菌の生存率を、遊離プロバイオティクスと一緒に、希釈及びLMRS寒天プレート上で播種の標準的手順に従って、毎週モニターした。図１８は、遊離のプロバイオティクス細菌は錠剤化プロセスにおける生存率低下が1 log超だったが、保護された細菌の生存率は錠剤化プロセスの後、本質的に同じままであったことを示す。40℃及び43%RHにおける14日間の保存後、本発明の組成物中に配合されたプロバイオティクス細菌の生存率はわずかに約0.3 log低下した一方、普通に凍結乾燥された細菌の生存率はさらに約0.6 log低下した。これらの結果は、本発明の組成物及び方法が、プロバイオティクス細菌の錠剤化中並びに高湿及び非冷蔵保存条件での保存中に、打錠圧及び付随する熱に対する顕著な保護を提供することを実証する。
【０１７９】
実施例４３．プロバイオティクス細菌ラクトバチルス・ラムノサス種の安定な乾燥組成物を含有するマルチビタミン/プロバイオティクス錠剤の調製
次いで、本明細書中に開示される組成物及び方法の保護を、マルチビタミン成分を含有する錠剤においてさらに調査した。10gの乾燥粉末組成物を実施例４２に記載されるように生産した。錠剤化のため、乾燥した安定なプロバイオティクス組成物（100mg）を、2%w/wステアリン酸マグネシウム及び2%w/w親水性ヒュームドシリカ（AEROSIL（登録商標）200, Evonik Industries）を含有する400mgの市販マルチビタミン粉末（Centrum（登録商標）、Pfizer）と混合し、手持ち式丸剤プレス装置（1/2インチ錠剤径筐体を用いたもの）中で打錠した。普通に凍結乾燥されたプロバイオティクス細菌（遊離プロバイオティクス）の粉末を含有する同様の錠剤も調製し、保護されたプロバイオティクス細菌を含有する錠剤との比較に用いた。得られた錠剤を次いで総プロバイオティクス数について試験した。結果を図１９に示す。
【０１８０】
図１９に示されるように、遊離プロバイオティクス細菌はマルチビタミン成分を用いた錠剤化プロセスにおける生存率低下が2 log超だったが、保護された細菌の生存率は1 log未満低下した。40℃及び43%RHにおける14日間の保存後、本発明の組成物中に配合されたプロバイオティクス細菌の生存率は本質的に同じままであったが、普通に凍結乾燥された細菌の生存率はさらに3 log急激に低下した。これらの結果は、本発明の組成物及び方法はまた、敏感な生物学的材料に錠剤ミックス中の他の有害化合物からの顕著な保護を提供し、それによって、それらの全体的な効力に影響を及ぼすことなく、１つの錠剤中での種々の生物学的材料の混合を可能にすることを実証する。
【０１８１】
実施例４４．保護された酵素を含有する安定な乾燥組成物の錠剤化
プロテアーゼ又はリパーゼ（両方ともSigmaからのもの）を含有する乾燥した安定な組成物を、実施例４２に記載されるように調製した。最終乾燥組成物は、10%のプロテアーゼ又はリパーゼ、40%のトレハロース、20%の高度加水分解エンドウマメタンパク質、10%のアスコルビン酸ナトリウムを含有した。さらに、6%アルギン酸ナトリウム及び14%イヌリンも組成物中に包含させた。
【０１８２】
錠剤化のため、乾燥酵素組成物（それぞれ50mg）を、2%w/wステアリン酸マグネシウム及び2%w/w親水性ヒュームドシリカを含有する450mgのマルトデキストリンDE-1と混合し、手持ち式丸剤プレス装置（1/2インチ錠剤径筐体を用いたもの）中で打錠した。等量の両方の保護された酵素を含有する錠剤もまた、25mgのプロテアーゼ及び25mgのリパーゼと450mgのマルトデキストリンDE1ミックスとを混合することによって調製した。遊離形態の酵素の乾燥粉末（遊離酵素又は両者の混合物）を含有する同様の錠剤も調製し、保護された酵素を含有する錠剤との比較に用いた。
【０１８３】
錠剤化前の粉末ミックス中のそれらの活性と比較した、錠剤化後のプロテアーゼ及びリパーゼの残存活性を、それぞれ基質としてアゾカゼイン及びpNP-パルミテートを使用して当該分野で公知の方法に従って決定した。
【０１８４】
図２０に示されるように、遊離プロテアーゼを単独で又は遊離リパーゼと組み合わせて錠剤化すると、約40%の活性損失をもたらしたが、保護されたプロテアーゼは単独で錠剤化したときは何ら活性を失わず、保護されたリパーゼとのミックスの中で錠剤化したときは約17%しか失わなかった。遊離リパーゼ又は保護されたリパーゼの錠剤化は著しい活性損失を何らもたらさなかったが、遊離プロテアーゼの存在下での遊離リパーゼの錠剤化は64%の活性損失をもたらしたが、保護されたプロテアーゼの存在下での保護されたリパーゼの錠剤化は33%の活性損失しかもたらさなかった。これらの結果は、本発明の組成物及び方法が、酵素の錠剤化中に打錠圧及び付随する熱に対する顕著な保護を提供することを実証する。結果はまた、本発明の組成物及び方法が錠剤ミックス中の他の消化酵素からの保護を提供し、それによって、それらの全体的な活性に影響を及ぼすことなく、１つの錠剤の中で種々の所望の酵素を混合することを可能にすることを示す。
【０１８５】
実施例４５．病原性微生物に対するプロバイオティクス細菌を含有する安定な乾燥組成物を含有する動物飼料の錠剤化
本明細書中に開示される組成物及び方法の保護を、動物飼料成分を含有する錠剤においてさらに調査する。実施例４２に記載したように、プロバイオティクス細菌L.アシドフィラス種を含有する約100gの乾燥した安定な組成物を調製し、乾燥させる。最終的な乾燥組成物は、10%の乾燥細菌細胞バイオマス、54%のトレハロース、20%の高度加水分解エンドウマメタンパク質、10%のアスコルビン酸ナトリウムを含有した。さらに、6%アルギン酸ナトリウムも組成物中に包含させる。
【０１８６】
約10kgの市販ドッグフード又はニワトリ完成飼料ペレット（finished feed pellet）を40℃で一晩風乾し、次いで細かく磨砕して流動性粉末とする。安定な乾燥プロバイオティクス組成物を飼料粉末と混合し、手持ち式丸剤プレス装置（1/8-7/8インチ丸剤径筐体を用いたもの）中で打錠して、1gの飼料あたり約100億個の生細胞を含有する約200〜2000mgの大きさの丸剤を形成させる。ニワトリの処置のため、プロバイオティクス飼料丸剤を、100kgの標準的な市販飼料に混合しながらゆっくりと注ぐ。処理された完成飼料は、すぐに鳥に給餌し、病原体、例えばサルモネラ等に対する抵抗性をブーストすることができる。安定性試験のため、プロバイオティクス丸剤を40℃の43%相対湿度チャンバー中に入れ、これらの極端な条件で14日間保存した後のプロバイオティクス細菌の生存率低下は、初発CFUの1 log未満である。この例は、コンパニオンアニマルを包含する種々の動物を処置するために用いられる微生物、例えば種々のラクトバチルス属菌等を、本発明の組成物及び乾燥方法の中で保護し、次いで錠剤プレス中で打錠し、典型的な湿度及び温度条件下で典型的な飼料ホッパーにおいて標準的な供給を提供することができることを実証する。
【０１８７】
実施例４６．プロバイオティクス細菌の安定な乾燥組成物を含有する泡立つ発泡性飲料錠剤の調製
約10gのプロバイオティクス細菌L.アシドフィラス種又はビフィドバクテリウム種を含有する乾燥した安定組成物粉末を、実施例４２及び４５に記載されるように調製し、乾燥させる。
【０１８８】
発泡性錠剤、例えばAlka Seltzer（登録商標）、Fizzies（登録商標）又はスポーツドリンク等を細かく磨砕して流動性粉末にする。安定な乾燥プロバイオティクス組成物を発泡性粉末と混合し、手持ち式丸剤プレス装置（7/8インチ錠剤径筐体を用いたもの）中で打錠して、錠剤１個あたり約100億個の生細胞を含有する約2000mgの大きさの錠剤を形成させる。安定性試験のため、プロバイオティクス発泡性錠剤を33℃の43%相対湿度チャンバー中に入れ、これらの極端な条件で90日間保存した後のプロバイオティクス細菌の生存率低下は、初発CFUの1 log未満である。この例は、敏感な生物学的材料、例えば生きているプロバイオティクス細菌等を本発明の組成物及び乾燥方法中で保護及び安定化し、次いで錠剤プレスで打錠し、過酷な湿度及び温度の消費条件下で保存することができることを実証する。
【０１８９】
実施例４７．膣感染症、例えば酵母又は細菌性膣症等を処置するためのプロバイオティクス細菌の安定な乾燥組成物を含有する錠剤の調製
約15gのプロバイオティクス細菌L.アシドフィラス種を含有する乾燥した安定組成物粉末を、実施例１及び４に記載されるように調製し、乾燥させる。
乾燥プロバイオティクス組成物を、74gのラクトース、10gのコーンスターチ、0.5gのステアリン酸マグネシウム、0.01gのカルボキシメチルセルロースナトリウム、0.01gのポリビニルピロリジン及び0.01gの疎水性ヒュームドシリカとブレンドし、15分間混合する。粉末混合物を手持ち式錠剤プレス装置中で打錠する。得られる錠剤の重量は約1.5gである。最大錠剤硬度は6〜8kgである。錠剤は水中で約30秒で崩壊した。
【０１９０】
実施例４８．プロバイオティクス菌ラクトバチルス・アシドフィラス（DSM-20356）の安定な乾燥組成物を含有する油懸濁液の生産
凍結L.アシドフィラス濃縮物（現地の発酵プロセスから入手した200g）を水浴中で37℃で解凍し、200gの3%加水分解エンドウマメタンパク質（限外ろ過加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）溶液を加えた。細菌懸濁液を4000gで15分間遠心分離し（Sorvall RC-5B, Du-Pont Company, Wilmington, DE）、上清をデカントした。細菌沈殿物を3%加水分解エンドウマメタンパク質溶液で元の重量（200g）にした。さらに50gの加水分解エンドウマメタンパク質を80gの温水中に完全に溶解し、20% NaOH溶液でpHを9に調整し、細菌培養物に加えた。85.6gのスクロース（現地市場から入手）、30gのシクロデキストリン-7（Cargill Minneapolis, MN）、20gのアスコルビン酸ナトリウム（Sigma）及び15gのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を乾燥形態で均一に混合した。粉末混合物を細菌培養物にゆっくりと加え、1qtプラネタリーミキサー（Charles Ross & Son Company, Hauppauge, New York）中で37℃で20分間混合を行った。スラリーを次に液体窒素を含有する浴の中にゆっくりと滴下した。凍結ビーズを次いで液体窒素から取り出し、密封アルミニウムホイルバッグの中に入れ、乾燥させるまで-80℃のディープフリーザー内で保存した。
【０１９１】
乾燥のため、凍結ビーズを500〜1500g/平方フィートまでの範囲の負荷容量でトレイ上に均等に広げ、トレイを凍結乾燥機（Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY）中の棚上に置いた。真空圧を2000〜2700mTORRに調節し、生成物温度を上昇させて-12℃〜-5℃で安定させることによって一次乾燥ステップを開始した。時間とともに（約10〜16時間）、生成物温度は約20〜25℃まで上昇し、その時点で二次乾燥ステップを最高真空（100〜150mTORR）で開始し、生成物温度を30〜40℃の間でさらに14時間維持した。製剤を完全に乾燥させ、測定されたその水分活性は0.3Aw未満であった。この製剤を、市販のハンマーミルを用いて磨砕し、粒子を250ミクロン未満にふるい分けした。
【０１９２】
プロバイオティクス細菌の安定組成物の生存率を、40℃及び43%RHで14日間、乾燥粉末形態で、又はトウモロコシ油懸濁液（1gの乾燥粉末を100gの油中に混合）中で、又は45gのニワトリ飼料ペレット（飼料ペレットは最初に33%RH湿度チャンバー中で2週間順化させた）上に10gの油懸濁液をコーティングした後に、試験した。40℃及び43%RHで14日間インキュベートした後、プロバイオティクス細菌は、乾燥形態で保存したときに0.5 log CFU/g、油懸濁液中に混合したときに0.34 log、ニワトリ飼料上にコーティングしたときに0.65 logしか失わなかった。これらの結果は、本発明の組成物及び方法を用いると、高湿及び非冷蔵保存条件で14日間曝露した後に、種々の飼料適用においてプロバイオティクス細菌の生存性が維持されることを実証する。
【０１９３】
実施例４９．ビブリオ‐アングイラルム（Vibrio anguillarum）に対する生きているファージを含有する安定な乾燥組成物の生産
濃縮された生きているファージの培養物（製造業者から入手した100g）を、10℃のジャケット付きプラネタリーミキサー中に入れる。約50gの加水分解エンドウマメタンパク質（限外ろ過加水分解物、Marcor, Carlstadt, NJ）を300gの温水中に完全に溶解する。溶液を10℃に冷却し、混合しながらファージ培養物に加える。174gのスクロース（現地市場から入手）、60gのシクロデキストリン-7（Cargill Minneapolis, MN）、40gのアスコルビン酸ナトリウム（Sigma）及び30gのアルギン酸ナトリウム（ISP Corp., Wayne, NJ）を乾燥形態で均一に混合する。粉末混合物をファージ培養物にゆっくりと加え、1qtプラネタリーミキサー中、10℃で20分間混合を行う。スラリーを次に液体窒素を含有する浴の中にゆっくりと滴下する。凍結ビーズを次いで液体窒素から取り出し、密封アルミニウムホイルバッグの中に入れ、乾燥させるまで-80℃のディープフリーザー内で保存する。乾燥及び粉砕を実施例４8に記載されるように行う。10gの乾燥組成物粉末を100gの魚油と混合し、懸濁液を10kgのアトランティックサーモン飼料ペレット上にコーティングする。コーティングされた飼料を次いで典型的な倉庫保存条件下で保存する。魚類飼料中のページ（page）の生存性は、本発明の組成物及び方法を用いると、高湿及び非冷蔵保存条件で14日間曝露した後に維持される。
【０１９４】
実施例５０．乾燥安定化組成物でコーティングされた種子
３つの異なる乾燥方法を用いて、ダイズ種子をコーティングするための、ブラディリゾビウム・ジャポニカムを包含する同じ成分を有する乾燥安定化組成物を作製した。コーティングされた種子上の根粒菌安定性を比較した。
【０１９５】
Encap-3乾燥粉末の調製：以下の市販の製剤成分：47.0gのトレハロース、15gのシクロデキストリン-7、3gのアルギン酸ナトリウム、5gのアスコルビン酸ナトリウム、5gのフェルラ酸及び25gのエンドウマメタンパク質加水分解物をジップロックバッグに加え、混合することで乾燥粉末を与え、プラスチックのジップロックバッグを閉じ、バッグを10秒間振ることによって成分を合わせた。
【０１９６】
濃縮根粒菌懸濁液の調製：300mlの根粒菌（すなわちブラディリゾビウム・ジャポニカム）の市販懸濁液（America's Best Inoculant, Advanced Biological Marketing, Van Wert, OH）を8000rpmで20分間遠心分離し（Fisher Centrific）、上部270mlをデカントした。
【０１９７】
液体Encap-3/根粒菌濃縮物の調製：底部30mlの濃縮根粒菌懸濁液を、50mlのFalconチューブ中の10gのEncap-3乾燥粉末に加え、約10秒間ボルテックスした。
【０１９８】
真空乾燥されたEncap-3/根粒菌安定化組成物の調製：液体Encap-3/根粒菌濃縮物を以下のように真空乾燥した：（a）液体Encap-3/根粒菌濃縮物を液体窒素中で瞬間凍結して、ビーズ、小滴又はひもの形態の固形凍結粒子を作製し、（b）固形凍結粒子を2000mTORRを超える真空下で16時間、20℃の棚温度で一次乾燥し、（c）40℃の棚温度及び完全真空で15分間二次乾燥して、水分活性を0.3Aw未満に低下させる。得られた真空乾燥安定化組成物（図２１Ｂ）を用いてダイズ種子をコーティングした。
【０１９９】
真空乾燥されたEncap-3/根粒菌安定化組成物での種子のコーティング：約1mLの0.4%ポリビニルアルコール（PVA）水溶液を、ドラムタンブラー（Gustafson Batch Lab Seed Treater, Gustafson LLC, Skopee, MN）中で100gの市販のダイズ種子（Asgrow）上に噴霧して、種子表面を湿らせた。0.5gの真空乾燥されたEncap-3/根粒菌安定化組成物を、湿らせた種子に回転させながら少しずつ加えた。コーティングされたダイズ種子を4分間回転させ、平皿の上に注ぎ、30分間風乾し、次いでアルミニウムホイルで裏打ちしたパウチの中に包装し、保存及び長期安定性試験のために密封した。得られた乾燥種子を図２２Ａに示す。得られた乾燥コーティング種子の初期水分活性（Aw）を測定したところ、28.4℃で0.358であった。
【０２００】
凍結乾燥されたEncap-3/根粒菌安定化組成物の調製：上記のように調製した液体Encap-3/根粒菌濃縮物を以下のように凍結乾燥した：（a）液体Encap-3/根粒菌濃縮物を液体窒素中で瞬間凍結して、固形凍結粒子、ビーズ、小滴又はひもを形成させ、（b）固形凍結粒子、ビーズ、小滴又はひもを完全真空（例えば約190Torr）下で16時間、20℃の棚温度で一次乾燥し、（c）40℃の棚温度及び完全真空下で1時間二次乾燥して、水分活性を0.3Aw未満に低下させる。得られた凍結乾燥安定化組成物（図２１Ａ）を用いてダイズ種子をコーティングした。
【０２０１】
凍結乾燥されたEncap-3/根粒菌安定化組成物での種子のコーティング：約1mlの0.4%ポリビニルアルコール（PVA）水溶液を、ドラムタンブラー（Gustafson Batch Lab Seed Treater）中で100gの市販のダイズ種子（Asgrow）上に噴霧して、種子表面を湿らせた。0.5gの凍結乾燥されたEncap-3/根粒菌安定化組成物を、湿らせた種子に回転させながら少しずつ加えた。コーティングされたダイズ種子を最大4分間回転させ、平皿の上に注ぎ、30分間風乾し、次いでアルミニウムホイルで裏打ちしたパウチの中に包装し、保存及び長期安定性試験のために密封した。得られた乾燥種子を図２２Ｂに示す。得られた乾燥コーティング種子の初期水分活性（Aw）を測定したところ、28.4℃で0.367であった。
【０２０２】
液化凍結乾燥Encap-3/根粒菌安定化組成物での種子のコーティング：約1mlの0.4%ポリビニルアルコール（PVA）水溶液を、ドラムタンブラー（Gustafson Batch Lab Seed Treater）中で100gの市販のダイズ種子（Asgrow）上に噴霧して、種子表面を湿らせた。0.5gの凍結乾燥されたEncap-3/根粒菌安定化組成物を5mlの脱イオン水中に分散させて液化した。液化した凍結乾燥安定化組成物を、湿らせた種子に回転させながらピペットで滴下して加えた。コーティングされた種子を4分間回転させ、平皿の上に注ぎ、30分間風乾し、次いでアルミニウムホイルで裏打ちしたパウチの中に包装し、保存及び長期安定性試験のために密封した。得られた乾燥種子を図２２Ｃに示す。得られた乾燥コーティング種子の初期水分活性（Aw）を測定したところ、28.6℃で0.367であった。
【０２０３】
真空乾燥、凍結乾燥又は液化凍結乾燥Encap-3/根粒菌安定化組成物でコーティングされた種子上の根粒菌の生存率を、コロニー形成単位（CFU）/g種子（CFU/g種子）に基づいて決定した。コーティングされた種子上の細菌の初期生存率（T=0）及び周囲温度（例えば25℃）での保存後120日目（T=120）での細菌生存率を、表２に要約したように決定した。
表２．コーティングされた種子上での根粒菌の安定性
【表２】
2019511912.tif 000004
【０２０４】
実施例５１．真空乾燥された安定化組成物
根粒菌（例えばブラディリゾビウム・ジャポニカム）を含む４つの真空乾燥安定化組成物を調製し、これを用いてダイズ種子をコーティングした。
【０２０５】
１.コーティング種子43A
Encap-3乾燥粉末を実施例50に記載されるように調製した。濃縮根粒菌懸濁液を以下のように調製した：50mlの根粒菌の市販懸濁液（America's Best Inoculant, Advanced Biological Marketing, Van Wert, OH）を8000rmで20分間遠心分離（Fisher Centrific）し、上部45mlをデカントした。底部5mlの濃縮懸濁液を次いで50mlのFalconチューブ中の5gのEncap-3乾燥粉末に加え、約10秒間ボルテックスした。
【０２０６】
得られた液体Encap-3/根粒菌濃縮物を以下のように乾燥した：（a）液体Encap-3/根粒菌濃縮物を液体窒素中で瞬間凍結して、固形凍結粒子、ビーズ、小滴又はひもを形成させ、（b）固形凍結粒子、ビーズ、小滴又はひもを2000mTORRを超える真空下で12時間、20℃の棚温度で一次乾燥し、（c）次いで、40℃の棚温度、完全真空下で15分間二次乾燥して、水分活性を0.3Aw未満に低下させる。得られた真空乾燥された安定化組成物を用いて、ダイズ種子をコーティングした。
【０２０７】
約1mLの0.4%ポリビニルアルコール（PVA）水溶液を、ドラムタンブラー（Gustafson Batch Lab Seed Treater, Gustafson LLC, Skopee, MN）中で100gの市販のダイズ種子（Asgrow）上に噴霧して、種子表面を湿らせた。2.0gの真空乾燥された安定化組成物を、湿らせた種子に回転させながら少しずつ加えた。コーティングされたダイズ種子を4分間回転させ、平皿上に注ぎ、30分間風乾した。次いで、50gの乾燥コーティング種子をアルミニウムホイルで裏打ちしたパウチ中に包装し、保存及び長期安定性試験のために密封した。得られた乾燥コーティング種子43Aの初期水分活性を測定したところ、20.1℃で0.321であった。
【０２０８】
２.コーティング種子43A-1
50gのコーティングされたダイズ種子43Aをドラムタンブラー（Gustafson Batch Lab Seed Treater, Gustafson LLC, Skopee, MN）に戻し、さらにヘアドライヤーを用いて5分間乾燥させた。種子を次いで平皿上に注ぎ、30分間風乾し、アルミニウムホイルで裏打ちしたパウチ中に包装し、保存及び長期安定性試験のために密封した。得られたさらなる乾燥コーティング種子43A-1の初期水分活性を測定したところ、20.3℃で0.296であった。
【０２０９】
３．コーティング種子43B
Encap-3乾燥粉末を調製した。以下の市販の製剤成分：47.0gのトレハロース、15gのシクロデキストリン-7、3gのアルギン酸ナトリウム、5gのアスコルビン酸ナトリウム、5gのフェルラ酸及び24gのエンドウマメタンパク質加水分解物及び1gの乾燥ダイズ根をジップロックバッグに加え、混合することで乾燥粉末を与え、プラスチックのジップロックバッグを閉じ、バッグを10秒間振ることによって成分を合わせた。
【０２１０】
50mlの根粒菌の市販懸濁液（America's Best Inoculant, Advanced Biological Marketing, Van Wert, OH）を8000rmで20分間遠心分離（Fisher Centrific）し、上部45mlをデカントした。
底部5mlの濃縮懸濁液を次いで50mlのFalconチューブ中の5gのEncap-3乾燥粉末に加えた。
【０２１１】
得られた液体Encap-3/根粒菌濃縮物を以下のように乾燥した：（a）液体Encap-3/根粒菌濃縮物を液体窒素中で瞬間凍結して、固形凍結粒子、ビーズ、小滴又はひもを形成させ、（b）固形凍結粒子、ビーズ、小滴又はひもを2000mTORRを超える真空下で12時間、20℃の棚温度で一次乾燥し、（c）次いで、40℃の棚温度、完全真空下で15分間二次乾燥して、水分活性を0.3Aw未満に低下させる。得られた真空乾燥された安定化組成物を用いて、ダイズ種子をコーティングした。
【０２１２】
約1mLの0.4%ポリビニルアルコール（PVA）水溶液を、ドラムタンブラー（Gustafson Batch Lab Seed Treater, Gustafson LLC, Skopee, MN）中で100gの市販のダイズ種子（Asgrow）上に噴霧して、種子表面を湿らせた。2.0gの真空乾燥された安定化組成物を、湿らせた種子に回転させながら少しずつ加えた。コーティングされたダイズ種子を4分間回転させ、平皿上に注ぎ、30分間風乾した。次いで、50gの乾燥コーティング種子をアルミニウムホイルで裏打ちしたパウチ中に包装し、保存及び長期安定性試験のために密封した。得られた乾燥コーティング種子43Bの初期水分活性を測定したところ、20.1℃で0.321であった。
【０２１３】
４.コーティング種子43B-1
50gの乾燥されたコーティングダイズ種子43Bをドラムタンブラー（Gustafson Batch Lab Seed Treater, Gustafson LLC, Skopee, MN）に戻し、さらにヘアドライヤーを用いて5分間乾燥させた。種子を次いで平皿上に注ぎ、30分間風乾し、アルミニウムホイルで裏打ちしたパウチ中に包装し、保存及び長期安定性試験のために密封した。得られたさらなる乾燥種子43B-1の初期水分活性を測定したところ、20.3℃で0.296であった。
【０２１４】
コーティングされた種子43A、43A-1、43B及び43B-1上の根粒菌の安定性を、周囲温度（例えば25℃）での保存後0、50、90又は120日で経時的に測定した（図２３）。コーティング材料及び初期水分活性（Aw）にわずかな変動があるコーティング種子43A、43A‐1、43B及び43B‐1は、処理後120日での微生物生存率が平均で0.45 log CFU/g種子の低下を示した。傾向線分析は、処理後360日で平均1.34 log CFU/g種子の低下を予測する。
【０２１５】
実施例５２．乾燥した安定化組成物でコーティングされた種子
以下の方法を用いて、ワタ種子をコーティングするために市販されている、ペニシリウム・ビライ（Penicillium bilaii）を包含する同じ成分を有する乾燥した安定化組成物を作製した。
【０２１６】
Encap-3乾燥粉末の調製：以下の市販の製剤成分：47.0gのトレハロース、15gのシクロデキストリン-7、3gのアルギン酸ナトリウム、5gのアスコルビン酸ナトリウム、5gのフェルラ酸及び25gのエンドウマメタンパク質加水分解物をジップロックバッグに加え、混合することで乾燥粉末を与え、プラスチックのジップロックバッグを閉じ、バッグを10秒間振ることによって成分を合わせた。その結果、Encap-3乾燥粉末を調製した。
【０２１７】
液体Encap-3/真菌濃縮物の調製：50mlのFalconチューブ中の10gのEncap-3乾燥粉末に、10mlのペニシリウム・ビライ含有濃縮真菌ブロスを加え、次いで約10秒間ボルテックスした。
【０２１８】
真空乾燥されたEncap-3/真菌安定化組成物の調製：液体Encap-3/真菌濃縮物を以下のように真空乾燥した：（a）液体Encap-3/真菌濃縮物を液体窒素中で瞬間凍結して、ビーズ、小滴又はひもの形態の固形凍結粒子を作製し、（b）固形凍結粒子を2000mTORRを超える真空下で16時間、20℃の棚温度で一次乾燥し、（c）40℃の棚温度及び完全真空で15分間二次乾燥して、水分活性を0.3Aw未満に低下させる。得られた真空乾燥安定化組成物を使用して、ワタ種子をコーティングした。
【０２１９】
真空乾燥されたEncap-3/真菌安定化組成物での種子のコーティング：約1mLの0.4%ポリビニルアルコール（PVA）水溶液を、ドラムタンブラー（Gustafson Batch Lab Seed Treater, Gustafson LLC, Skopee, MN）中で100gの市販のワタ種子（例えばMcGreary Grain Inc., Lancaster, PA）上に噴霧して、種子表面を湿らせた。0.5gの真空乾燥されたEncap-3/真菌安定化組成物を、湿らせた種子に回転させながら少しずつ加えた。コーティングされたワタ種子を4分間回転させ、平皿の上に注ぎ、30分間風乾し、次いでアルミニウムホイルで裏打ちしたパウチの中に包装し、保存及び長期安定性試験のために密封した。得られた乾燥コーティング種子の初期水分活性（Aw）を測定したところ、20℃で0.4であった。
【０２２０】
測定可能な値、例えば量、パーセンテージ等を指すときに本明細書中で用いられる「約」という用語は、そのような変動が適切であるため、指定された値からの±20%又は±10%、より好ましくは±5%、なおより好ましくは±1%、いっそうより好ましくは±0.1%の変動を包含することを意味する。
【０２２１】
本明細書中に引用される全ての文書、書籍、マニュアル、論文、特許、公開された特許出願、ガイド、要約及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮及び本明細書中に開示される本発明の実行から当業者に明らかである。明細書及び例は例示としてのみ考慮され、本発明の真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲によって指し示されることが意図される。
【図１】
2019511912.tif 000005
【図２】
2019511912.tif 000006
【図３】
2019511912.tif 000007
【図４】
2019511912.tif 000008
【図５】
2019511912.tif 000009
【図６】
2019511912.tif 000010
【図７】
2019511912.tif 000011
【図８】
2019511912.tif 000012
【図９】
2019511912.tif 000013
【図１０】
2019511912.tif 000014
【図１１】
2019511912.tif 000015
【図１２】
2019511912.tif 000016
【図１３】
2019511912.tif 000017
【図１４】
2019511912.tif 000018
【図１５】
2019511912.tif 000019
【図１６】
2019511912.tif 000020
【図１７】
2019511912.tif 000021
【図１８】
2019511912.tif 000022
【図１９】
2019511912.tif 000023
【図２０】
2019511912.tif 000024
【図２１Ａ】
2019511912.tif 000025
【図２１Ｂ】
2019511912.tif 000026
【図２２Ａ】
2019511912.tif 000027
【図２２Ｂ】
2019511912.tif 000028
【図２２Ｃ】
2019511912.tif 000029
【図２３】
2019511912.tif 000030
【国際調査報告】
2019511912.tif 000031
2019511912.tif 000032