【手続補正書】
【提出日】令和3年11月25日(2021.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸をシーケンシングする方法であって、
（ａ）二本鎖直線化伸長形態で前記核酸をテスト基板上に固定しそれにより固定された伸長二本鎖核酸を形成させること；
（ｂ）前記固定された伸長二本鎖核酸を前記テスト基板上で一本鎖形態に変性させそれにより前記核酸の固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を得ることであって、前記固定された第二の鎖の各塩基が、前記固定された第一の鎖の対応する相補性塩基に隣接して位置する、変性させること；
（ｃ）前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖をオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露することであって、オリゴヌクレオチドプローブの前記セット中のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、所定の配列および長さであり、前記暴露すること（ｃ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを前記各オリゴヌクレオチドプローブに相補的な前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の部分と結合させかつ各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こりそれにより光学活性の各インスタンスを生じる、暴露すること；
（ｄ）二次元イメージャを用いて暴露すること（ｃ）の間に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスの前記テスト基板上の場所および期間を測定すること；
（ｅ）オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて暴露すること（ｃ）および測定すること（ｄ）を反復することであって、それにより前記テスト基板上の位置の複数のセットを得て、前記テスト基板上の位置のそれぞれの各セットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応する、反復すること；ならびに
（ｆ）前記テスト基板上の位置の前記複数のセットにより表される前記テスト基板上の前記位置をコンパイルすることにより前記テスト基板上の位置の前記複数のセットから前記核酸の少なくとも一部の配列を決定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記暴露すること（ｃ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを前記個々のプローブに相補的な前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の部分と一過的かつ可逆的に結合させかつ前記各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こりそれにより光学活性のインスタンスを生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記暴露すること（ｃ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを前記個々のプローブに相補的な前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の部分と反復的に一過的かつ可逆的に結合させかつ前記各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こりそれにより光学活性の各インスタンスを反復的に生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、標識と結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記暴露することが、色素の形態の第一の標識の存在下であり、
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、第二の標識と結合され、かつ
前記第一の標識が、前記第一の標識と前記第二の標識が互いに接近している時に前記第二の標識を蛍光発光させる、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つより多くのオリゴヌクレオチドプローブが、前記暴露すること（ｃ）の単一インスタンスの間に前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記暴露すること（ｃ）の前記単一インスタンスの間に前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖に暴露されるオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける異なるオリゴヌクレオチドプローブが、異なる標識と会合される、請求項７に記載の方法。
【請求項８】
前記暴露すること（ｃ）が、第一の温度でオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施されかつ前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を前記反復すること（ｅ）が、第二の温度で前記第一のオリゴヌクレオチドについて前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記暴露すること（ｃ）が、第一の温度でオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施され、
前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を前記反復すること（ｅ）のインスタンスが、複数の異なる温度のそれぞれで前記第一のオリゴヌクレオチドについて前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を実施することを含み、かつ
前記第一の温度および前記複数の異なる温度でのそれぞれの温度について前記測定すること（ｄ）により記録された光学活性の前記測定された場所および期間を用いて前記第一のオリゴヌクレオチドプローブについて溶融曲線を構築することをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットが、前記オリゴヌクレオチドプローブの複数のサブセットを含みかつ前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）の前記反復すること（ｅ）が、オリゴヌクレオチドプローブの前記複数のサブセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの各サブセットについて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記テスト基板上の前記場所を測定することが、前記二次元イメージャにより得られたデータのフレームで光学活性の前記各インスタンスの中心を同定しかつ適合させるためにあてはめ関数で光学活性の前記各インスタンスを同定することかつ適合させることを含み、かつ
光学活性の前記各インスタンスの前記中心が、前記テスト基板上の光学活性の前記各インスタンスの前記位置であると見なされる、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
光学活性の前記各インスタンスが、前記二次元イメージャにより測定される複数のフレームにわたり持続し、
前記テスト基板上の前記場所を前記測定することが、前記複数のフレームにわたり光学活性の前記各インスタンスの中心を同定するために前記複数のフレームにわたりあてはめ関数で光学活性の前記各インスタンスを同定することかつ適合させることを含み、
光学活性の前記各インスタンスの前記中心が、前記複数のフレームにわたり前記テスト基板上の光学活性の前記各インスタンスの前記位置であると見なされる、
請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
テスト基板上の前記場所を前記測定することが、前記二次元イメージャにより測定されたデータのフレームをトレーニングされた畳み込みニューラルネットワークに入力することを含み、
データの前記フレームが、光学活性の複数のインスタンスの中の光学活性の前記各インスタンスを含み、
光学活性の前記複数のインスタンスにおける光学活性のそれぞれのインスタンスが、前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部に結合する個々のプローブに対応し、
前記入力に応答して、前記トレーニングされた畳み込みニューラルネットワークが、光学活性の前記複数のインスタンスにおける光学活性の１つまたは複数のインスタンスのそれぞれの前記テスト基板上の位置を同定する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定することが、少なくとも２０ｎｍの位置特定精度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
光学活性の前記各インスタンスの前記テスト基板上の前記場所および前記期間を前記測定すること（ｄ）が、前記場所で５０００光子を超えて測定する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
光学活性の前記各インスタンスが、前記テスト基板で観察されたバックグランドを上回る所定の数より大きな標準偏差である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記所定の数の標準偏差が、３より大きな標準偏差である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数のオリゴヌクレオチドプローブにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブが、ユニークなＮ量体配列を含み、Ｎが、セット｛１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０｝中のある整数でありかつ長さＮの全てのユニークなＮ量体配列が、前記複数のオリゴヌクレオチドプローブにより表される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ユニークなＮ量体配列が、１つまたは複数の縮重ヌクレオチド位置により占有される１つまたは複数のヌクレオチド位置を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記テスト基板が、前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を反復する前に洗浄され、それによりオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける別のオリゴヌクレオチドプローブに前記テスト基板を暴露する前に前記テスト基板から各オリゴヌクレオチドプローブを除去する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記固定すること（ａ）が、分子コーミング（後退メニスカス（ｒｅｃｅｄｉｎｇ ｍｅｎｉｓｃｕｓ））、フローストレッチングナノコンファインメント、またはエレクトロストレッチングにより、前記核酸を前記テスト基板に塗布することを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
光学活性のそれぞれの各インスタンスが、所定の閾値を充たす観察メトリックを有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブが、それ自体の対応する所定の閾値を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについての前記所定の閾値が、トレーニングデータセットから誘導される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、同じ長さＭであり、
Ｍが、２以上の正の整数であり、
前記テスト基板上の位置の前記複数のセットからの前記核酸の少なくとも一部の前記配列を前記決定すること（ｆ）が、位置の前記複数のセットにより表される前記オリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップ配列をさらに利用する、
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記テスト基板上の位置の前記複数のセットからの前記核酸の少なくとも一部の前記配列を前記決定することが、前記固定された第一の鎖に対応する第一のタイリングパスと前記固定された第二の鎖に対応する第二のタイリングパスを決定することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
核酸をシーケンシングする方法であって、
（ａ）直線化伸長形態の前記核酸をテスト基板上に固定しそれにより固定された伸長核酸を形成させること；
（ｂ）前記固定された伸長核酸をオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露することであって、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、所定の配列および長さであり、前記暴露すること（ｂ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの前記各プールの個々のプローブを前記各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である前記固定された核酸の一部に対して一過的かつ可逆的に可能にする条件下で起こりそれにより光学活性の各インスタンスを生じる、暴露すること；
（ｃ）二次元イメージャを用いて前記暴露すること（ｂ）の間に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスの前記テスト基板上の場所および期間を測定すること；
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて前記暴露すること（ｂ）および前記測定すること（ｃ）を反復し、それにより前記テスト基板上の位置の複数のセットを得、前記テスト基板上の位置のそれぞれの各セットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応すること；ならびに
（ｅ）前記テスト基板上の位置の前記複数のセットにより表される前記テスト基板上の前記位置をコンパイルすることにより前記テスト基板上の位置の前記複数のセットから前記核酸の少なくとも一部の前記配列を決定すること、
を含む、方法。
【請求項２８】
核酸をシーケンシングする方法であって、
（ａ）直線化伸長形態での前記核酸をテスト基板上に固定しそれにより固定された伸長核酸を形成させること；
（ｂ）前記固定された伸長核酸をオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露することであって、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、所定の配列および長さであり、前記暴露すること（ｂ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの前記各プールの個々のプローブを前記各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である前記固定された核酸の一部に対して一過的かつ可逆的に可能にする条件下で起こりそれにより光学活性の各インスタンスを生じる、暴露すること；
（ｃ）二次元イメージャを用いて前記暴露すること（ｂ）の間に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスの前記テスト基板上の場所および期間を測定すること；
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて前記暴露すること（ｂ）および前記測定すること（ｃ）を反復し、それにより前記テスト基板上の位置の複数のセットを得、前記テスト基板上の位置のそれぞれの各セットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応すること；ならびに
（ｅ）前記テスト基板上の位置の前記複数のセットにより表される前記テスト基板上の前記位置をコンパイルすることにより前記テスト基板上の位置の前記複数のセットから前記核酸の少なくとも一部の前記配列を決定すること、
を含む、方法。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡ、ＰＮＡを含む１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。