(57)【要約】【課題】粥状動脈硬化治療薬の提供を目的とする。【解決手段】S1P2受容体アンタゴニストを有効成分として含む、粥状動脈硬化治療薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
S1P2受容体アンタゴニストを有効成分として含む、粥状動脈硬化治療薬。
【請求項２】
S1P2受容体アンタゴニストが下記一般式（１）で表される化合物又はその製薬上許容される塩である、請求項１記載の粥状動脈硬化治療薬。
【化１】
2011087051.tif 000008
[式中、
Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基又は−ＣＯＲ７（ここで、Ｒ７は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、置換されていてもよいアリールオキシ基又は置換されていてもよいアラルキルオキシ基である）であり；
Ｒ２は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり；
Ｒ４は、水素原子又は置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、Ｃ２−６アルキニル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ハロアルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、アシル基、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ基、置換されていてもよいアラルキルオキシ基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいヘテロ環残基、Ｃ２−１２アルコキシアルキル基又は−ＣＯＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）であり；
Ｒ６は、水素原子、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、Ｃ２−６アルキニル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ハロアルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、アシル基、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ基、置換されていてもよいアラルキルオキシ基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいヘテロ環残基、Ｃ２−１２アルコキシアルキル基又は−ＣＯＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）であり；
Ｘは、−Ｎ（Ｒ９）−（ここで、Ｒ９は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は−ＮＨＲ１０（ここで、Ｒ１０は、カルボキシル基又はＣ２−６アルコキシカルボニル基である）である）、−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＣＨ＝又は−ＣＨ（Ｒ１１）−（ここで、Ｒ１１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である）であり；
Ｙは、−Ｎ（Ｒ１２）−（ここで、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基又は−ＣＯＮＨＲ１３（ここで、Ｒ１３は、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）である）、＝Ｎ−、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は単結合であり；
Ｚは、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−又は単結合であり；
Ｗは、−Ｎ（Ｒ１４）−（ここで、Ｒ１４は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基又はヘテロアリールＣ１−６アルキル基である）、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−（但し、窒素原子は環Ａと結合する）、−ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２−（但し、炭素原子は環Ａと結合する）又は単結合であり；
−−−−−−−−−は、二重結合又は一重結合であり；
環Ａは、アリール基、ヘテロ環残基又はＣ３−７シクロアルキル基である]
【請求項３】
Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は−ＣＯＲ７（ここで、Ｒ７は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、置換されていてもよいアリールオキシ基又は置換されていてもよいアラルキルオキシ基である）であり、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ５は、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、Ｒ６は、好ましくは、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、さらに好ましくは、ハロゲン原子、ハロアルキル基、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基及びニトロ基からなる群より選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい、アリール基又はヘテロ環残基であるか、あるいは水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、環Ａは、ピリジル基、チアゾリル基、又はチエニル基である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項４】
Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ４は、水素原子であり、Ｒ５及びＲ６は同一又は異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、又はハロゲン原子であり、Ｘが−ＮＨ−、−Ｎ＝、−ＣＨ２−又は−Ｏ−であり、Ｙが−ＮＨ−又は＝Ｎ−であり、Ｚが−ＣＯ−であり、Ｗが−ＮＨ−であり、環Ａがアリール基、好ましくはフェニル基又はヘテロアリール基、より好ましくはピリジル基である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項５】
Ｒ１及びＲ２はメチル基、Ｒ３はイソプロピル基、Ｒ４は水素、Ｘは−ＮＨ−、Ｙは−ＮＨ−、Ｘは−ＣＯ−、Ｗは−ＮＨ−、環Ａはピリジル基、Ｒ５及びＲ６は、独立に水素、塩素、フッ素、臭素、メチル基、又はメトキシ基である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項６】
[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素又は[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粥状動脈硬化治療薬に関する。
なお、本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願の特願2010-006300からの優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴシン1-リン酸（S1P）は、血管内皮細胞を始め様々な細胞種に対して、細胞増殖作用、細胞運動・形態調節作用、細胞分化作用など多彩な作用を及ぼす脂質性成長因子として注目されている。当初、S1Pのこれらの生物活性は細胞内作用による可能性が示唆されたが、1998年に、S1Pに対する特異的細胞表面受容体が同定されたことをきっかけに、その作用の多くはS1P受容体を介することが明らかにされた（非特許文献１を参照）。しかし、その後のS1P受容体ノックアウトマウスやS1P合成・代謝酵素のノックアウトマウスの解析により、生体で観察されるS1P作用のあるものは既知のS1P受容体を介するという考え方では説明できない点があり、S1Pの細胞内作用は今後さらに追求される必要がある。【０００３】
S1Pの生合成と分解:
S1Pの生合成はセラミドを出発物質としている。セラミドはセラミダーゼによりスフィンゴシンに加水分解される。スフィンゴシンがスフィンゴシンキナーゼ（SphK）によりリン酸化を受けることにより、S1Pが生成される。SphKには２つのサブタイプ、SphK1とSphK2とがあるが、この二つの合成酵素の役割分担は十分に明らかとなっていない。SphK1、SphK2はともに全身に広く発現している。【０００４】
S1Pの分解酵素には、S1P phosphohydrolase (SPP)とS1P lyase（SPL）の二つがある。前者はS1Pを脱リン酸化してスフィンゴシンを生成する。後者はS1Pをパルミトアルデヒドとホスホエタノールアミンに分解する。【０００５】
S1Pは血漿中に約10-7 Mオーダーの濃度で存在し、血清中のS1P濃度はこれより幾分高い。血小板はS1Pの重要な産生源である。これは、血小板がSphK活性は高いが、S1Pを分解するSPL活性は欠如しているというユニークな特徴による。血小板に豊富に貯蔵されているS1Pは、血小板凝集刺激に際して大量に細胞外へ放出される。このため、血小板凝集後の血液上清である血清の方が血漿に比してS1P濃度が高いと考えられる。血小板の他に赤血球や血管内皮も血漿S1Pの重要な起源と考えられている。これらの細胞以外に、全身の多くの臓器・細胞にSphKの発現がみられることから様々な末梢細胞もS1Pを産生・放出すると考えられる。また、血漿中ではS1Pはアルブミンや高密度リポタンパク（HDL）・低密度リポタンパク（LDL）などのリポ蛋白質に結合しており、血液中のS1Pリザーバーとして働いているものと考えられる。これまでに報告されているHDLやLDLの血管細胞作用の一部はこれらに結合しているS1Pが担っていると考えられている。【０００６】
S1Pは主に細胞の増殖・遊走を促進するが、前駆体であるセラミドやスフィンゴシンは細胞のアポトーシスを促進することが知られている。このことから、S1Pの合成・分解系は細胞の生死を決定する重要な系であるとの考えがある。【０００７】
S1P受容体:
S1P特異的Ｇ蛋白質共役型受容体は、5つのサブタイプ（S1P1/Edg (Endothelialdifferentiation gene)1、S1P2/Edg5/AGR16、S1P3/Edg3、S1P4/Edg6、S1P5/Edg8）が同定されており、S1P作用のすべてではないにしても、その作用の多くはこれらのEdgファミリーS1P受容体を介して細胞内に伝達されると考えられる。S1P受容体の組織発現分布はサブタイプごとに異なる。ラット、マウスではS1P1、S1P2、S1P3は全身のほとんどすべての臓器・組織に広範に発現している。一方、S1P4はリンパ系組織及び肺に、S1P5は神経系、脾臓に発現が限局している。多くの臓器では複数のS1P受容体サブタイプが発現している。血管内皮細胞には、S1P1とS1P3が強く発現している。S1P2の発現は一部の臓器の血管内皮には検出されるが、実験によく用いられるヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）などでは低発現である。【０００８】
S1P受容体のシグナル伝達経路は各受容体サブタイプ間で部分的には共通しているものの、サブタイプごとに独自のシグナル伝達経路を活性化する。近年、製薬企業によりS1P受容体アンタゴニスト・アゴニストの開発が精力的に行われており、臨床応用にむけて研究が進展中である。各S1P受容体サブタイプによって活性化されるシグナル伝達経路をまとめると、S1P1はGiを介して、Ras-ERK（extracellularsignal-regulated kinase）の活性化、ホスホリパーゼC（PLC）の活性化、アデニル酸シクラーゼの抑制に共役している。S1P3は、S1P1と同様にGiを介してRas-ERK及びアデニル酸シクラーゼの抑制に共役するほかに、Gqを介してPLCの活性化に、G12/13を介してRhoの活性化に共役している。S1P2はG12/13を介したRhoへの共役が最も優勢なシグナル経路である。【０００９】
ノックアウトマウスの研究から明らかになりつつあるS1Pの生理作用、病態における役割：
S1Pは、胎児期において血管新生、特に血管中膜平滑筋細胞や周皮細胞の血管壁への集積のプロセス（血管成熟あるいはリモデリング）、及び神経系の発達に必須である。また、リンパ球の生体内分布、血管透過性調節、血管内皮における一酸化窒素（NO）産生、血管収縮、内皮細胞上の接着分子発現や白血球の内皮接着、心拍数、腫瘍血管新生、妊娠子宮の脱落膜形成、内耳機能に作用を及ぼすことが明らかとなった。【００１０】
動脈硬化とS1P:
動脈硬化は、血管壁の傷害による慢性炎症性変化であると考えられており、実際に動脈硬化病変の形成には多くの炎症細胞、血小板が関与し、これらの細胞から分泌される様々なサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、生理活性脂質などにより動脈硬化に関与する血管内皮細胞・血管平滑筋細胞・単球・マクロファージが活性化される。すなわち、血管内皮細胞はその細胞表面にVCAM-1（vascular cell adhesion molecule-1）、ICAM-1（intracellular adhesion molecule-1）などの接着分子の発現・細胞遊走物質の産生をもたらす。これらの接着分子を介して血液中の単球は血管内皮細胞に接着し、次に血管内皮細胞下に侵入してマクロファージへ分化し、そして酸化LDLを細胞内に取り込んで泡沫細胞となる。血管平滑筋細胞は形質転換を起こして中膜から内膜へと遊走・増殖を促進し、動脈硬化巣の肥厚をもたらす。それ故、様々な生理活性脂質と動脈硬化に関与する細胞との相互作用の解明は動脈硬化の発症における極めて重要な研究課題の一つである。【００１１】
最近、動物モデル及び培養細胞モデルを使用した動脈硬化発症におけるS1Pの影響に関する報告がなされている。動脈硬化モデルマウス（ApoE欠損マウス及びLDL受容体欠損マウス）においてS1P前駆体のスフィンゴシンの合成アナログFTY720を用いた実験からS1P1やS1P3受容体機能の抑制による白血球機能の抑制が大動脈の粥状動脈硬化病変面積を減少させること、S1P1受容体作動薬を用いた実験からS1Pは血管内皮細胞のS1P1受容体を介して白血球の内皮接着（VCAM-1及びICAM-1の発現抑制）を抑制すること、さらにS1P1受容体作動薬・遮断薬を用いた実験からS1PはS1P1受容体を介して抗炎症型マクロファージへの分化を促進することからS1Pが抗動脈硬化因子である可能性が示唆された。一方、S1P1とS1P3受容体遺伝子ノックダウン実験からS1PがS1P1とS1P3受容体を介した単球の内皮接着（VCAM-1及びICAM-1の発現亢進）に必須であることからS1Pが催動脈硬化因子である可能性も示唆されている。【００１２】
このように、動物個体レベルでのS1Pが催動脈硬化因子あるいは抗動脈硬化因子であるのかどうかは依然として不明である。また、前述したように、動脈硬化に関与する血管内皮細胞・血管平滑筋細胞・単球・マクロファージ・泡沫細胞はそれぞれ数種のS1P受容体を発現しているが、どの細胞に発現するどの受容体サブタイプが動脈硬化発症に関わるかについても不明な点が多い。【００１３】
SIP受容体の拮抗剤を医薬として用いることは報告されていたが、粥状動脈硬化との関連は明確ではなかった（特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第WO2003/051876号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ryu Y etal., Circulation Research, 2002; 90: 325-332
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、粥状動脈硬化治療薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記のように、マウスにおいてS1P1やS1P3受容体機能の抑制が大動脈の粥状動脈硬化病変サイズを減少させることが報告されている。しかし、S1P2受容体が粥状動脈硬化においてどのような役割をはたすのかは不明であった。【００１８】
本発明者は、S1P2受容体が粥状動脈硬化において果たす役割を検討すべく、S1P2 欠損（遺伝子ノックアウト（KO））マウス(S1P2 -/-) とリポ蛋白の構成蛋白であるApoE KO(ApoE -/-)マウスを交配して、S1P2 -/-, ApoE -/- の二重KOマウスを作製し、高コレステロール食を負荷して粥状動脈硬化を誘導した。S1P2-/-, ApoE -/-の二重KOマウスでは、オス、メスいずれにおいても、S1P2+/+, ApoE -/- マウスに比較して、大動脈の粥状動脈硬化病変の形成が抑制された。免疫組織染色では、二重KOマウスの粥状動脈硬化病変部位におけるマクロファージ（泡沫細胞）の集積がS1P2+/+, ApoE -/- マウスに比較して軽度であった。マウス骨髄由来マクロファージの酸化低密度リポ蛋白（酸化LDL） の取り込み能は、S1P2 -/-マウスでは野生型マウスに比較して低下していた。あらかじめマクロファージに取り込ませたコレステロールの細胞外への汲みだしはS1P2 -/-マウス由来マクロファージでは野生型マウスに比較して亢進していた。コレステロール汲みだし輸送体としてはたらくABCA1及びABCG1遺伝子発現がS1P2-/-マウス由来マクロファージでは野生型マウスに比較して亢進していた。S1P2-/-, ApoE -/- の大動脈ではS1P2 +/+, ApoE -/- マウス大動脈に比較して、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子-α(tumor necrosis  factor-α, TNF-α)、インターフェロン-γ（interferon-γ)、インターロイキン-6(interleukin-6, IL-6)の遺伝子発現が低下していた。ApoE-/-マウスに３か月間、S1P2受容体遮断薬である1-[1,3-Dimethyl-4-(2-methylethyl)-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridine-6-yl]-4-(2,6-dichloro-4-pyridinyl)-semicarbazide(JTE-K1)を投与したところ、非投与群に比較して大動脈の粥状動脈硬化病変の形成は抑制された。【００１９】
以上の結果より、S1P2受容体は粥状動脈硬化病変の形成に促進的にはたらいていること、その機構の少なくとも一部にS1P2受容体によるマクロファージの酸化LDL蓄積の促進が関与していることが示唆され、本発明者は、薬物によるS1P2受容体の遮断が粥状動脈硬化を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。【００２０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]  S1P2受容体アンタゴニストを有効成分として含む、粥状動脈硬化治療薬。【００２１】
[２]  S1P2受容体アンタゴニストが下記一般式（１）で表される化合物又はその製薬上許容される塩である、[１]の粥状動脈硬化治療薬。【００２２】
【化１】
2011087051.tif 000002
[式中、
Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基又は−ＣＯＲ７（ここで、Ｒ７は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、置換されていてもよいアリールオキシ基又は置換されていてもよいアラルキルオキシ基である）であり；
Ｒ２は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり；
Ｒ４は、水素原子又は置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、Ｃ２−６アルキニル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ハロアルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、アシル基、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ基、置換されていてもよいアラルキルオキシ基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいヘテロ環残基、Ｃ２−１２アルコキシアルキル基又は−ＣＯＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）であり；
Ｒ６は、水素原子、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、Ｃ２−６アルキニル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ハロアルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、アシル基、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ基、置換されていてもよいアラルキルオキシ基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいヘテロ環残基、Ｃ２−１２アルコキシアルキル基又は−ＣＯＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）であり；
Ｘは、−Ｎ（Ｒ９）−（ここで、Ｒ９は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は−ＮＨＲ１０（ここで、Ｒ１０は、カルボキシル基又はＣ２−６アルコキシカルボニル基である）である）、−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＣＨ＝又は−ＣＨ（Ｒ１１）−（ここで、Ｒ１１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である）であり；
Ｙは、−Ｎ（Ｒ１２）−（ここで、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基又は−ＣＯＮＨＲ１３（ここで、Ｒ１３は、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）である）、＝Ｎ−、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は単結合であり；
Ｚは、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−又は単結合であり；
Ｗは、−Ｎ（Ｒ１４）−（ここで、Ｒ１４は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基又はヘテロアリールＣ１−６アルキル基である）、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−（但し、窒素原子は環Ａと結合する）、−ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２−（但し、炭素原子は環Ａと結合する）又は単結合であり；
−−−−−−−−−は、二重結合又は一重結合であり；
環Ａは、アリール基、ヘテロ環残基又はＣ３−７シクロアルキル基である]【００２３】
[３]  Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は−ＣＯＲ７（ここで、Ｒ７は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、置換されていてもよいアリールオキシ基又は置換されていてもよいアラルキルオキシ基である）であり、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ５は、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、Ｒ６は、好ましくは、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、さらに好ましくは、ハロゲン原子、ハロアルキル基、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基及びニトロ基からなる群より選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい、アリール基又はヘテロ環残基であるか、あるいは水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、環Ａは、ピリジル基、チアゾリル基、又はチエニル基である、[２]の粥状動脈硬化治療薬。【００２４】
[４]  Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ４は、水素原子であり、Ｒ５及びＲ６は同一又は異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、又はハロゲン原子であり、Ｘが−ＮＨ−、−Ｎ＝、−ＣＨ２−又は−Ｏ−であり、Ｙが−ＮＨ−又は＝Ｎ−であり、Ｚが−ＣＯ−であり、Ｗが−ＮＨ−であり、環Ａがアリール基、好ましくはフェニル基又はヘテロアリール基、より好ましくはピリジル基である、[２]の粥状動脈硬化治療薬。【００２５】
[５]  Ｒ１及びＲ２はメチル基、Ｒ３はイソプロピル基、Ｒ４は水素、Ｘは−ＮＨ−、Ｙは−ＮＨ−、Ｘは−ＣＯ−、Ｗは−ＮＨ−、環Ａはピリジル基、Ｒ５及びＲ６は、独立に水素、塩素、フッ素、臭素、メチル基、又はメトキシ基である、[２]の粥状動脈硬化治療薬。【００２６】
[６]  [Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素又は[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素である、[２]の粥状動脈硬化治療薬。
【発明の効果】
【００２７】
実施例に示すように、本発明のS1P2受容体アンタゴニストを有効成分として含む医薬は、S1P2受容体を遮断し、血管内皮下組織に浸潤したマクロファージの酸化LDL取り込み能を低下させ、かつ酸化LDL汲みだし能を促進し、マクロファージの泡沫細胞化を抑制し、この結果、粥状動脈硬化病変の形成を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】各遺伝子改変マウスから単離した大動脈内腔面のOil red O染色像を示す図である。図１ＡはApoE -/-,S1P2+/+マウス、図１ＢはApoE -/-, S1P2 +/-マウス、図１ＣはApoE -/-, S1P2-/-マウスの結果である。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2 -/-はS1P2受容体欠損を、S1P2 +/-はS1P2受容体へテロ欠損を示す。図中、動脈硬化病変は赤色に染色されている。
【図２】各遺伝子改変マウスの粥状動脈硬化病変面積を示す図である。*:P<0.05、**:P<0.01。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2-/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図３Ａ】各遺伝子改変マウスの大動脈弁弁輪部の横断面のOil red O染色像を示す図である。bとdはそれぞれaとcの拡大像を示す。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2-/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図３Ｂ】各遺伝子改変マウスの大動脈弁弁輪部の横断面のOil red O染色像における染色面積の定量結果を示す図である。*:P<0.05。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2-/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図４Ａ】各遺伝子改変マウスの大動脈周囲横断面のOil red O染色像を示す図である。bとdはそれぞれaとcの拡大像を示す。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2-/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図４Ｂ】各遺伝子改変マウスの大動脈周囲横断面のOil red O染色像における染色面積の定量結果を示す図である。*:P<0.05。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2-/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図５Ａ】各遺伝子改変マウスの大動脈弁弁輪部横断面のアザン染色像を示す図である。bとdはそれぞれaとcの拡大像を示す。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2 -/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図５Ｂ】各遺伝子改変マウスの大動脈弁弁輪部横断面のアザン染色像における染色面積の定量結果を示す図である。n.s.; 有意差なし。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2 -/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図６Ａ】各遺伝子改変マウスの大動脈周囲横断面のアザン染色像を示す図である。bとdはそれぞれaとcの拡大像を示す。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2 -/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図６Ｂ】各遺伝子改変マウスの大動脈周囲横断面のアザン染色像における染色面積の定量結果を示す図である。n.s.; 有意差なし。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2 -/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図７Ａ】各遺伝子改変マウスの粥状動脈硬化病変のMac-3染色像を示す図である。緑がMac-3陽性領域を、青は核を示す。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2-/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図７Ｂ】各遺伝子改変マウスの粥状動脈硬化病変のMac-3染色像における染色面積の定量結果を示す図である。*:P<0.05。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2-/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図８Ａ】各遺伝子改変マウスの粥状動脈硬化病変のα-SMA染色像を示す図である。bとdはそれぞれaとcの拡大像を示す。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2 -/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図８Ｂ】各遺伝子改変マウスの粥状動脈硬化病変のα-SMA染色像における染色面積の定量結果を示す図である。*:P<0.05。ApoE -/-はApoE欠損を、S1P2-/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図９】Oil red O染色による各遺伝子改変マウスのマクロファージの酸化LDL（oxLDL)取り込み能を示す図である。図９ＡはoxLDL未処理のS1P2WTを、図９ＢはoxLDL未処理のS1P2KOを、図９ＣはoxLDL処理のS1P2WTを、図９ＤはoxLDL処理のS1P2KOを示す。S1P2WTは野生型マウスを、S1P2KOはS1P2受容体欠損マウスを示す。
【図１０】Oil red O染色による各遺伝子改変マウスのマクロファージの酸化LDL（oxLDL)取り込み能の定量結果を示す図である。S1P2WTは野生型マウスを、S1P2KOはS1P2受容体欠損マウスを示す。
【図１１Ａ】各遺伝子改変マウスから単離したマクロファージを用いた、半定量的PCR法による動脈硬化関連分子の遺伝子発現の解析結果を示す図である。S1P2WTは野生型マウスを、S1P2KOはS1P2受容体欠損マウスを示す。
【図１１Ｂ】各遺伝子改変マウスから単離したマクロファージを用いた動脈硬化関連分子の遺伝子発現の変化の定量結果を示す図である。各遺伝子のmRNA発現量は、β-アクチンのmRNA発現量で補正した。*:P<0.05、**:P<0.01。S1P2WTは野生型マウスを、S1P2KOはS1P2受容体欠損マウスを示す。
【図１２】各遺伝子改変マウスのマクロファージのコレステロール汲み出し能の定量結果を示す図である。コレステロール受容体として、２％血清及び50μg/ml HDLを用いた。ApoE-/-はApoE欠損を、S1P2 -/-はS1P2受容体欠損を示す。
【図１３Ａ】大動脈における動脈硬化関連炎症性サイトカインのmRNA発現量のreal-time PCR法による解析の結果を示す図である。*:P<0.05。値はGAPDHの発現量で補正した。
【図１３Ｂ】大動脈における内皮に発現する接着分子のmRNA発現量の半定量的PCR法による解析の結果を示す図である。
【図１３Ｃ】大動脈における内皮に発現する接着分子のmRNA発現量の半定量的PCR法による定量的解析の結果を示す図である。*:P<0.05。値はGAPDHの発現量で補正した。
【図１３Ｄ】大動脈における内皮型一酸化窒素（NO)合成酵素eNOSの発現とそのリン酸化の程度を示す図であり、eNOSタンパク量とリン酸化eNOSタンパク質のウエスタンブロット法による解析の結果を示す図である。
【図１３Ｅ】大動脈における内皮型一酸化窒素（NO)合成酵素eNOSの発現とそのリン酸化の程度を示す図であり、eNOSタンパク量とリン酸化eNOSタンパク質のウエスタンブッロト法による定量的解析の結果を示す図である。**:P<0.01。
【図１４】コントロール群（図１４Ａ）及びS1P2受容体遮断薬投与群マウス（図１４Ｂ）の大動脈Oilred-O染色像を示す図である。
【図１５】コントロール群及びS1P2受容体遮断薬投与群マウスの大動脈粥状動脈硬化病変面積を示す図である。*:P<0.05。
【図１６】S1P2遺伝子座にβガラクトシダーゼ(LacZ)遺伝子をノックインしたマウス（S1P2LacZ/LacZマウス）におけるX-gal染色と免疫染色によるS1P2発現細胞の同定の結果を示す図である。図１６Ａは大動脈洞部のX-gal染色像を示し、図１６Ｂは大動脈粥状動脈硬化病変部のX-gal染色を示す。A及びBではS1P2発現細胞が青色に染色されている。また、図１６ＣはX-gal染色とマクロファージマーカーMac-3の免疫染色の二重染色の結果を示す。Mac-3陽性（褐色）のマクロファージはX-gal染色も陽性である。さらに、図１６Ｄは、Xgal染色と血管内皮マーカーCD31の免疫染色の二重染色の結果を示す。CD-31陽性（褐色）の内皮の一部はX-gal染色陽性である。
【図１７Ａ】S1P2-/-マウス骨髄の移植による粥状動脈硬化の抑制の結果を示す図である。ApoE -/-, S1P2+/+マウスに、ApoE -/-, S1P2 +/+マウス骨髄又はApoE -/-, S1P2  -/-マウス骨髄を移植したマウス（BMTマウス）に高コレステロール食を負荷し、摘出大動脈の粥状動脈硬化病変をOilred O染色により、評価した。
【図１７Ｂ】S1P2-/-マウス骨髄の移植による粥状動脈硬化の抑制の定量結果を示す図である。*:P<0.001。
【図１８Ａ−１】S1P2欠損マウスマクロファージの細胞内情報伝達の変化を示す図であり、活性型Rho(GTP結合型Rho;GTP-Rho)の変化を示す。ApoE -/-, S1P2 +/+マウス及びApoE -/-,S1P2-/-マウスから単離したマクロファージをROCK阻害薬Y-27632又はS1P2遮断薬JTE-K1で前処理した後、あるいは前処理なしで、S1Pで刺激した。
【図１８Ａ−２】S1P2欠損マウスマクロファージの細胞内情報伝達の変化を示す図であり、活性型Rho(GTP結合型Rho;GTP-Rho)の変化の定量値を示す。ApoE -/-, S1P2+/+マウス及びApoE -/-, S1P2-/-マウスから単離したマクロファージをROCK阻害薬Y-27632又はS1P2アンタゴニストJTE-K1で前処理した後、あるいは前処理なしで、S1Pで刺激した。
【図１８Ｂ−１】S1P2欠損マウスマクロファージの細胞内情報伝達の変化を示す図であり、ROCKによりリン酸化されるタンパクMYPT1のリン酸化を示す。ApoE -/-, S1P2 +/+マウス及びApoE -/-, S1P2-/-マウスから単離したマクロファージをROCK阻害薬Y-27632又はS1P2アンタゴニストJTE-K1で前処理した後、あるいは前処理なしで、S1Pで刺激した。
【図１８Ｂ−２】S1P2欠損マウスマクロファージの細胞内情報伝達の変化を示す図であり、ROCKによりリン酸化されるタンパクMYPT1のリン酸化の定量値を示す。ApoE -/-, S1P2 +/+マウス及びApoE -/-,S1P2-/-マウスから単離したマクロファージをROCK阻害薬Y-27632又はS1P2アンタゴニストJTE-K1で前処理した後、あるいは前処理なしで、S1Pで刺激した。
【図１８Ｃ−１】S1P2欠損マウスマクロファージの細胞内情報伝達の変化を示す図であり、NF-κBリン酸化を示す。ApoE-/-, S1P2+/+マウス及びApoE -/-, S1P2-/-マウスから単離したマクロファージをROCK阻害薬Y-27632又はS1P2アンタゴニストJTE-K1で前処理した後、あるいは前処理なしで、S1Pで刺激した。
【図１８Ｃ−２】S1P2欠損マウスマクロファージの細胞内情報伝達の変化を示す図であり、NF-κBリン酸化の定量値を示す。ApoE-/-, S1P2+/+マウス及びApoE -/-, S1P2-/-マウスから単離したマクロファージをROCK阻害薬Y-27632又はS1P2アンタゴニストJTE-K1で前処理した後、あるいは前処理なしで、S1Pで刺激した。
【図１８Ｄ−１】S1P2欠損マウスマクロファージの細胞内情報伝達の変化を示す図であり、ABCA1のmRNA発現を示す。
【図１８Ｄ−２】S1P2欠損マウスマクロファージの細胞内情報伝達の変化を示す図であり、LXR-αのmRNA発現を示す。
【図１９Ａ】S1P2欠損マウスマクロファージの細胞遊走反応を示す図である。図１９Ａの上に示すボイデンチェンバーの上層にマクロファージを加え、下層にS1P, macrophage chemotatic peptide-1(MCP-1)を添加し、フィルター膜の下面に遊走した細胞数を測定した。測定結果を図１９Ａ下のグラフに示す。
【図１９Ｂ】S1P2欠損マウスマクロファージの細胞遊走反応を示す図である。図１９Ｂ上のボイデンチェンバーの上層にマクロファージとS1Pを加え、下層にMCP-1を添加し、フィルター膜の下面に遊走した細胞数を測定した。測定結果を図１９Ｂ下のグラフに示す。
【図１９Ｃ−１】S1P2欠損マウスマクロファージの活性型Rac (GTP結合型Rac; GTPRac)の測定結果を示す図である。
【図１９Ｃ−２】S1P2欠損マウスマクロファージの活性型Rac (GTP結合型Rac; GTPRac)の定量結果を示す図である。
【図２０−１】本発明の一般式（１）で表される化合物の具体例を示す図である。
【図２０−２】本発明の一般式（１）で表される化合物の具体例を示す図である（図２０−１の続き）。
【図２０−３】本発明の一般式（１）で表される化合物の具体例を示す図である（図２０−２の続き）。
【図２０−４】本発明の一般式（１）で表される化合物の具体例を示す図である（図２０−３の続き）。
【図２０−５】本発明の一般式（１）で表される化合物の具体例を示す図である（図２０−４の続き）。
【図２０−６】本発明の一般式（１）で表される化合物の具体例を示す図である（図２０−５の続き）。
【図２０−７】本発明の一般式（１）で表される化合物の具体例を示す図である（図２０−６の続き）。
【図２０−８】本発明の一般式（１）で表される化合物の具体例を示す図である（図２０−７の続き）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３０】
本発明は、S1P2受容体アンタゴニストを有効成分として含む、粥状動脈硬化治療薬である。アンタゴニストは、生体内の受容体分子に働いて、シグナル伝達等を遮断する化合物をいい、S1P2受容体アンタゴニストは、S1P2受容体拮抗作用を有する。
【００３１】
動脈硬化は、粥状動脈硬化（アテローム硬化）、細動脈硬化、中膜硬化に分類されるが、本発明のS1P2受容体アンタゴニストは、粥状動脈硬化に対して効果がある。本発明のS1P2受容体アンタゴニストを有効成分として含む、粥状動脈硬化治療薬は、粥状動脈硬化病変部位におけるマクロファージ（泡沫細胞）の集積を抑制し、マクロファージの酸化LDL取り込み能を低下させ、かつ酸化LDL汲みだし能を促進する。この結果、粥状動脈硬化病変の形成を抑制する。
【００３２】
本発明のS1P2受容体アンタゴニストとして、例えば以下の一般式（１）で表されるピラゾロピリジン誘導体、又はその製薬上許容される塩が挙げられる。
【００３３】
【化２】
2011087051.tif 000003
[式中、
Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基又は−ＣＯＲ７（ここで、Ｒ７は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、置換されていてもよいアリールオキシ基又は置換されていてもよいアラルキルオキシ基である）であり；
Ｒ２は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり；
Ｒ４は、水素原子又は置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、Ｃ２−６アルキニル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ハロアルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、アシル基、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ基、置換されていてもよいアラルキルオキシ基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいヘテロ環残基、Ｃ２−１２アルコキシアルキル基又は−ＣＯＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）であり；
Ｒ６は、水素原子、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、Ｃ２−６アルキニル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ハロアルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、アシル基、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ基、置換されていてもよいアラルキルオキシ基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいヘテロ環残基、Ｃ２−１２アルコキシアルキル基又は−ＣＯＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）であり；
Ｘは、−Ｎ（Ｒ９）−（ここで、Ｒ９は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は−ＮＨＲ１０（ここで、Ｒ１０は、カルボキシル基又はＣ２−６アルコキシカルボニル基である）である）、−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＣＨ＝又は−ＣＨ（Ｒ１１）−（ここで、Ｒ１１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である）であり；
Ｙは、−Ｎ（Ｒ１２）−（ここで、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基又は−ＣＯＮＨＲ１３（ここで、Ｒ１３は、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）である）、＝Ｎ−、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は単結合であり；
Ｚは、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−又は単結合であり；
Ｗは、−Ｎ（Ｒ１４）−（ここで、Ｒ１４は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基又はヘテロアリールＣ１−６アルキル基である）、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−（但し、窒素原子は環Ａと結合する）、−ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２−（但し、炭素原子は環Ａと結合する）又は単結合であり；
−−−−−−−−−は、二重結合又は一重結合であり；
環Ａは、アリール基、ヘテロ環残基又はＣ３−７シクロアルキル基である]
【００３４】
あるいは、式中、Ｒ１はＣ１−６アルキル基、水素原子又は−ＣＯＲ７（ここで、Ｒ７はＣ１−６アルキル基、アリール基、アラルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、アリールオキシ基又はアラルキルオキシ基である）であり；
Ｒ２はＣ１−６アルキル基又はアリール基であり；
Ｒ３は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基又はアリール基であり；
Ｒ４は水素原子又はＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ５及びＲ６は同一又は異なって、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、Ｃ２−６アルキニル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ハロアルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基、アシル基、水酸基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基又は−ＣＯＮＨＲ８（ここで、Ｒ８はアリール基又はアラルキル基である）、であり；
Ｘは−ＮＲ９−（ここで、Ｒ９は水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は−ＮＨＲ１０（ここで、Ｒ１０はカルボキシル基又はＣ１−６アルコキシカルボニル基である）である）、−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＣＨ＝又は−ＣＨＲ１１−（ここで、Ｒ１１は水素原子又はＣ１−６アルキル基である）であり；
Ｙは−ＮＲ１２−（ここで、Ｒ１２は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、アラルキル基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、又は−ＣＯＮＨＲ１３（ここで、Ｒ１３はアリール基又はアラルキル基である）、＝Ｎ−、−Ｎ＝、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は単結合であり；
Ｚは−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−又は単結合であり；
Ｗは−ＮＲ１４−（ここで、Ｒ１４は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、アラルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基又はヘテロアリールＣ１−６アルキル基である）、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２−又は単結合であり；
−−−−−−−−−は、二重結合又は一重結合であり；
Ａはアリール基、ヘテロアリール基又はシクロアルキル基である。
【００３５】
本発明において、「ハロゲン原子」として、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヨウ素原子が挙げられ、上記式におけるＲ５及びＲ６は、好ましくは塩素原子である。
【００３６】
「Ｃ１−６アルキル基」として、炭素数１〜６個の直鎖又は分枝してもよいアルキル基が挙げられる。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基又はヘキシル基等が挙げられ、好ましくは、炭素数１〜４個の直鎖又は分枝してもよいアルキル基が挙げられる。より好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基又はイソブチル基が挙げられる。上記式におけるＲ１は、好ましくはメチル基、エチル基であり、より好ましくはメチル基であり、Ｒ５及びＲ６は、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、３−メチルヘキシル基、ヘプチル基又はオクチル基であり、より好ましくはメチル基であり、Ｒ７は、好ましくはメチル基又はエチル基であり、Ｒ９は、好ましくはＣ１−４アルキル基（より好ましくはメチル基）であり、Ｒ１１は、好ましくはＣ１−４アルキル基（より好ましくはメチル基）であり、Ｒ１２は、好ましくはメチル基であり、Ｒ１４は、好ましくはメチル基であり、Ｒ１５は、好ましくはメチル基又はイソブチル基であり、Ｒ１６は、好ましくはメチル基であり、Ｒ１７は、好ましくはメチル基であり、Ｒ１８は、好ましくはメチル基であり、Ｒ１９は、好ましくはメチル基である。
【００３７】
なお、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４におけるＣ１−６アルキル基は、以下の置換基で置換されていてもよく、該置換基は同一であってもよく、異なっていてもよく、またその置換基の数及び位置は限定されない。該置換基としては、例えば、アラルキルオキシ基（好ましい総炭素数７〜１０であり、具体的にはベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基など）、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、カルバモイル基、アミノ基などが挙げられる。「置換されていてもよいＣ１−６アルキル基」の具体例は、上記式におけるＲ２は、好ましくはメチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジルオキシメチル基であり、より好ましくはメチル基又はｔｅｒｔ−ブチル基であり、特に好ましくはメチル基であり、Ｒ３は、好ましくはメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、イソプロピル基、１−ベンジルオキシプロパン−２−イル基又は１−ヒドロキシプロパン−２−イル基であり、より好ましくはメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基又はイソプロピル基であり、特に好ましくはメチル基又はイソプロピル基であり、Ｒ４は、好ましくはメチル基、イソプロピル基、１−ベンジルオキシプロパン−２−イル基又は１−ヒドロキシプロパン−２−イル基であり、特に好ましくはメチル基である。
【００３８】
「Ｃ１−６アルコキシ基」としては、炭素数１〜６個の直鎖又は分枝してもよいアルコキシ基が挙げられ、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基又はヘキシルオキシ基が挙げられる。好ましくは炭素数１〜４個の直鎖又は分枝してもよいアルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基）である。また、より好ましくはメトキシ基又はエトキシ基である。上記式におけるＲ３は、好ましくはメトキシ基であり、Ｒ５及びＲ６は、好ましくはメトキシ基又はエトキシ基であり、Ｒ７は、好ましくはメトキシ基である。
【００３９】
「Ｃ２−１２アルコキシアルキル基」としては、アルコキシ部が上記アルコキシ基と同義であり、かつアルキル部が上記アルキル基と同義である（すなわち、総炭素数が２〜１２個である）アルコキシアルキル基が挙げられ、例えばメトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ペンチルオキシメチル基、ヘキシルオキシメチル基、エトキシエチル基などが挙げられる。上記式におけるＲ５及びＲ６は、好ましくはメトキシメチル基、エトキシメチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル基であり、より好ましくはメトキシメチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル基である。
【００４０】
「Ｃ２−６アルコキシカルボニル基」としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等のアルキル部が炭素数１〜５個であるアルコキシカルボニル基が挙げられる。好ましくはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基である。上記式におけるＲ３、Ｒ５及びＲ６は、好ましくはメトキシカルボニル基であり、Ｒ１０は、好ましくはメトキシカルボニル基又はエトキシカルボニル基であり、Ｒ１２は、好ましくはメトキシカルボニル基又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基である。
【００４１】
「ハロアルキル基」としては、上記Ｃ１−６アルキル基が上記ハロゲン原子で置換されたものが挙げられ、例えばクロロメチル基、ブロモメチル基、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、トリブロモメチル基、トリクロロエチル基、トリフルオロエチル基、ペンタフルオロプロピル基又はクロロブチル基等が挙げられ、好ましくはクロロメチル基、ブロモメチル基、フルオロメチル基、トリフルオロメチル基又はトリクロロメチル基が挙げられる。また、より好ましくはトリフルオロメチル基である。上記式におけるＲ１は、好ましくは２，２，２−トリフルオロエチル基であり、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、好ましくはトリフルオロメチル基又はジフルオロメチル基である。
【００４２】
「Ｃ２−６アルキニル基」としては、炭素数２〜６個の直鎖又は分枝してもよいアルキニル基が挙げられ、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基、２−ペンチニル基、３−ペンチニル基、２−ヘキシニル基、３−ヘキシニル基等が挙げられ、好ましくは炭素数２〜４個の直鎖又は分枝してもよいアルキニル基が挙げられる。上記式におけるＲ５及びＲ６は、好ましくはエチニル基である。
【００４３】
「Ｃ１−６アルキルアミノ基」としては、１〜６個の直鎖又は分枝してもよいアルキル基で一置換されたアミノ基が挙げられ、例えばメチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ブチルアミノ基等が挙げられる。好ましくはメチルアミノ基又はエチルアミノ基等が挙げられる。上記式におけるＲ５及びＲ６は、好ましくはメチルアミノ基又はエチルアミノ基である。
【００４４】
「ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基」としては、１〜６個の直鎖又は分枝していてもよいアルキル基で二置換されたアミノ基が挙げられ、例えばジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基等が挙げられ、好ましくはジメチルアミノ基又はジエチルアミノ基等が挙げられる。上記式におけるＲ５及びＲ６は、好ましくはジメチルアミノ基又はジエチルアミノ基である。
【００４５】
「アシル基」としては、炭素数１のホルミル基；炭素数２〜６個のアルカノイル基（例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基若しくはピバロイル基等）；又はアリール基上に１〜３個の置換基を有してもよいアロイル基（例えば、ベンゾイル基等；ここでいう置換基とは、下記「置換されていてもよいアリール基」の置換基と同義である）が挙げられる。好ましくはホルミル基、アセチル基、ピバロイル基又はベンゾイル基である。上記式におけるＲ５及びＲ６は、好ましくはアセチル基である。
【００４６】
「アリール基」としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基等のＣ６−１２アリール基が挙げられ、上記式における環Ａは、好ましくはフェニル基である。
【００４７】
「置換されていてもよいアリール基」としては、少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい、例えばフェニル基、ナフチル基、ビフェニル基等のＣ６−１２アリール基であり、好ましくはフェニル基が挙げられる。置換基は、同一又であっても異なっていてもよく、また、その置換基の数及び位置は、特に制限されるものではない。具体的には、Ｃ１−６アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等）；水酸基；Ｃ１−６アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等）；Ｃ２−１２アルコキシアルキル基（上記式におけるＲ５及びＲ６における「Ｃ２−１２アルコキシアルキル基」と同義であり、例えばメトキシメチル基、エトキシメチル基など）；ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等）；ニトロ基；シアノ基；アシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基等）；アシルオキシ基（例えば、ホルミルオキシ基、アセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基等）；メルカプト基；Ｃ１−６アルキルチオ基（例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、ブチルチオ基、イソブチルチオ基等）；Ｃ１−６アルキルスルフィニル基（例えば、メチルスルフィニル基等）；アミノ基；Ｃ１−６アルキルアミノ基（例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ブチルアミノ基等）；ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基（例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基等）；カルボキシル基；−ＣＯＯＲ１５基（式中、Ｒ１５は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基を示す）；置換されていてもよいアラルキル基（「置換されていてもよいアリール基」における置換基（但し、置換されていてもよいアラルキル基は除く）で置換されていてもよいアラルキル基が挙げられ、例えばフェニルエチル基など）；アミド基（−ＣＯＮＨ２）；−ＮＨＣＯＲ１６基（式中、Ｒ１６は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基を示す）；−ＣＯＮＨＲ１７基（式中、Ｒ１７は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基を示す）；ハロアルキル基（例えば、トリフルオロメチル基等）；Ｃ１−６アルキルスルホニル基（例えば、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基等）；スルファモイル基；−ＳＯ２ＮＨＲ１８基（式中、Ｒ１８は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基を示す）；−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１９）２基（式中、Ｒ１９は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基を示す）；置換されていてもよいアラルキルオキシ基（「置換されていてもよいアリール基」における置換基（但し、置換されていてもよいアラルキルオキシ基は除く）で置換されていてもよいアラルキルオキシ基が挙げられる。例えば、ベンジルオキシ基、フェニルエチルオキシ基など）；Ｃ３−７シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等）；フェニル基；アシルアミド基（例えば、アセトアミド基、プロピオニルアミド基等）等であり、Ｒ５及びＲ６は、好ましくは、ハロゲン原子（より好ましくはフッ素原子、塩素原子、臭素原子）、ハロアルキル基（より好ましくはトリフルオロメチル基）、水酸基、ニトロ基、Ｃ１−６アルキル基（より好ましくはメチル基、エチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基）、Ｃ１−６アルコキシ基（より好ましくはメトキシ基、エトキシ基）、Ｃ２−１２アルコキシアルキル基（より好ましくはメトキシメチル基、エトキシメチル基）、−ＣＯＯＲ１５基（Ｒ１５は、より好ましくはメチル基、フェニル基、フェニルエチル基など）、−ＮＨＣＯＲ１６基（Ｒ１６は、より好ましくはメチル基、フェニル基、フェニルエチル基）、−ＣＯＮＨＲ１７基（Ｒ１７は、より好ましくはメチル基、フェニル基、フェニルエチル基）、Ｃ１−６アルキルチオ基（より好ましくはメチルチオ基）、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基（より好ましくはメチルスルフィニル基）、Ｃ１−６アルキルスルホニル基（より好ましくはメチルスルホニル基）、スルファモイル基、−ＳＯ２ＮＨＲ１８基（Ｒ１８は、より好ましくはメチル基、フェニル基、フェニルエチル基）、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ１９）２基（Ｒ１９は、より好ましくはメチル基、フェニル基、フェニルエチル基）、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基（より好ましくはジメチルアミノ基）又は置換されていてもよいアラルキルオキシ基（より好ましくはベンジルオキシ基）であり、より好ましくはハロゲン原子、ハロアルキル基、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基又はニトロ基が挙げられる。
【００４８】
上記式におけるＲ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９は、それぞれ独立して、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基を示し、ここで、「Ｃ１−６アルキル基」は前記したＲ１などで示される「Ｃ１−６アルキル基」と同義であり、「置換されていてもよいアリール基」は前記したＲ５などの「置換されていてもよいアリール基」と同義であり、「置換されていてもよいアラルキル基」は後記のＲ７などの「置換されていてもよいアラルキル基」と同義である。
【００４９】
「置換されていてもよいアリール基」の好ましい具体例としては、上記式におけるＲ１は、フェニル基、メチルフェニル基であり、Ｒ２及びＲ３は、フェニル基であり、Ｒ８は、フェニル基又はハロゲン原子で置換されたフェニル基（例えば、ブロモフェニル基など）であり、Ｒ１３は、フェニル基又はハロゲン原子で置換されたフェニル基（例えば、ブロモフェニル基、クロロフェニル基、ジクロロフェニル基など）であり、Ｒ５及びＲ６は、はフェニル基、クロロフェニル基、ジクロロフェニル基、クロロ−フルオロフェニル基、クロロ−メトキシフェニル基、フルオロフェニル基、ジフルオロフェニル基、トリフルオロフェニル基、フルオロ−メチルフェニル基、トリフルオロ−ジメトキシフェニル基、ブロモフェニル基、トリフルオロメチルフェニル基、ヒドロキシフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基、メトキシメチルフェニル基、エトキシメチルフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシカルボニルフェニル基、イソブトキシカルボニルフェニル基、フェニルオキシカルボニルフェニル基、（２−フェニルエチル）オキシカルボニルフェニル基、アセチルアミノフェニル基、イソバレリルアミノフェニル基、４−メチルペンタノイルアミノ基、ベンゾイルアミノフェニル基、（３−フェニルプロパノイル）アミノフェニル基、Ｎ−メチルアミドフェニル基、Ｎ−エチルアミドフェニル基、Ｎ−イソブチルアミドフェニル基、Ｎ−フェニルアミドフェニル基、Ｎ−（２−フェニルエチル）アミドフェニル基、メチルチオフェニル基、メチルスルフィニルフェニル基、メチルスルホニルフェニル基、ジメチルアミノフェニル基、スルファモイルフェニル基、Ｎ−メチルスルファモイルフェニル基、Ｎ−イソブチルスルファモイルフェニル基、Ｎ−フェニルスルファモイルフェニル基、Ｎ−（２−フェニルエチル）スルファモイルフェニル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイルフェニル基、Ｎ，Ｎ−ジイソブチルスルファモイルフェニル基、Ｎ，Ｎ−ジフェニルスルファモイルフェニル基、Ｎ，Ｎ−ビス（２−フェニルエチル）スルファモイルフェニル基、ベンジルオキシフェニル基又はアセチルアミノ−クロロフェニル基であり、より好ましくはフェニル基、クロロフェニル基、ジクロロフェニル基、クロロ−フルオロフェニル基、クロロ−メトキシフェニル基、フルオロフェニル基、ジフルオロフェニル基、トリフルオロフェニル基、フルオロ−メチルフェニル基、トリフルオロ−ジメトキシフェニル基、ブロモフェニル基、トリフルオロメチルフェニル基、ヒドロキシフェニル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、エチルフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基、ニトロフェニル基である。
【００５０】
上記式におけるＲ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８及びＲ１９の「置換されていてもよいアリール基」は、上記「置換されていてもよいアリール基」と同義である。
【００５１】
「アラルキル基」としては、アリール部がフェニル基（ここで、該フェニル基は上記置換されていてもよいアリール基で述べた置換基で置換されてもよく、置換基の数及び位置は特に限定されない）であり、かつアルキル部が炭素数１〜８個、好ましくは１〜６個のアルキル基であるアリールアルキル基であって、例えば、ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基又はフェニルヘキシル基のＣ７−１２アラルキル基等が挙げられ、好ましくはベンジル基又はフェニルエチル基である。上記式におけるＲ１、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１２及びＲ１３は、好ましくはベンジル基であり、Ｒ５及びＲ６は、好ましくはフェニルエチル基又はフルオロベンジル基であり、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８及びＲ１９は、好ましくはフェニルエチル基である。
【００５２】
「アリールオキシ基」としては、アリール部が上記アリール基と同義であるアリールオキシ基が挙げられ、ここでいうアリール部は上記置換されていてもよいアリール基で述べた置換基で置換されてもよい。置換基の数及び位置は特に限定されない。例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基等のＣ６−１２アリールオキシ基が挙げられ、好ましくはフェノキシ基である。上記式におけるＲ５、Ｒ６及びＲ７は、好ましくはフェノキシ基である。
【００５３】
「アラルキルオキシ基」としては、アリール部が上記アリール基と同義であり、かつアルコキシ部が炭素数１〜４個のアルコキシ基であるＣ７−１６アラルキルオキシ基が挙げられ、ここでいうアリール部は上記置換されていてもよいアリール基で述べた置換基で置換されてもよい。置換基の数及び位置は特に限定されない。例えば、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基、フェニルプロピルオキシ基、フェニルブチルオキシ基等が挙げられ、好ましくはベンジルオキシ基である。上記式におけるＲ５、Ｒ６及びＲ７は、好ましくはベンジルオキシ基又は２−フェニルエチルオキシ基である。
【００５４】
「アリールオキシカルボニル基」としては、アリール部が上記アリール基と同義であるＣ７−１３アリールオキシカルボニル基が挙げられ、ここでいうアリール部は上記置換されていてもよいアリール基で述べた置換基で置換されてもよい。置換基の数及び位置は特に限定されない。例えば、フェノキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基等が挙げられ、好ましくはフェノキシカルボニル基である。上記式におけるＲ１２及びＲ１４は、好ましくはフェノキシカルボニル基である。
【００５５】
「アラルキルオキシカルボニル基」としては、アリール部が上記アリール基と同義であり、かつアルコキシ部が炭素数１〜４個のアルコキシ基であるＣ８−１７アラルキルオキシカルボニル基が挙げられ、ここでいうアリール部は上記置換されていてもよいアリール基で述べた置換基で置換されてもよい。置換基の数及び位置は特に限定されない。例えば、ベンジルオキシカルボニル基、フェネチルオキシカルボニル基、フェニルプロピルオキシカルボニル基、フェニルブチルオキシカルボニル基等が挙げられ、好ましくはベンジルオキシカルボニル基である。上記式におけるＲ１２及びＲ１４は、好ましくはベンジルオキシカルボニル基である。
【００５６】
「Ｃ３−７シクロアルキル基」は、炭素数３〜７個のシクロアルキル基をいい、具体的にはシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、１−メチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。好ましくは炭素数３〜６個のシクロアルキル基が挙げられ、具体的にはシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基が挙げられる。より好ましくはシクロプロピル基又はシクロヘキシル基が挙げられる。上記式におけるＲ３は、好ましくはシクロプロピル基である。環Ａは、好ましくはシクロヘキシル基である。Ｒ５及びＲ６は、好ましくは炭素数４〜７のシクロアルキル基（例えば、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル）である。
【００５７】
「ヘテロ環残基」としては、環を構成する原子として炭素原子以外に、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる複素原子を１〜３個含む５〜６員の芳香族複素環、飽和複素環、不飽和複素環又はこれらの複素環とベンゼン環が縮合した縮合複素環が挙げられ、具体的には、チオフェン−２−イル基、チオフェン−３−イル基、フラン−２−イル基、フラン−３−イル基、ピロール−１−イル基、ピロール−２−イル基、ピロール−３−イル基、イミダゾール−１−イル基、イミダゾール−２−イル基、イミダゾール−４−イル基、ピラゾール−１−イル基、ピラゾール−３−イル基、ピラゾール−４−イル基、チアゾール−２−イル基、チアゾール−４−イル基、チアゾール−５−イル基、オキサゾール−２−イル基、オキサゾール−４−イル基、オキサゾール−５−イル基、イソオキサゾール−３−イル基、イソオキサゾール−４−イル基、イソオキサゾール−５−イル基、ピリミジン−２−イル基、ピリミジン−４−イル基、ピリミジン−５−イル基、ピリジン−２−イル基、ピリジン−３−イル基、ピリジン−４−イル基、ベンゾチオフェン−２−イル基、ベンゾチオフェン−３−イル基、ベンゾフラン−２−イル基、ベンゾフラン−３−イル基、インドール−２−イル基、インドール−３−イル基、ベンゾイミダゾール−１−イル基、ベンゾイミダゾール−２−イル基、ベンゾチアゾール−２−イル基、ベンゾオキサゾール−２−イル基、キノリン−２−イル基、キノリン−３−イル基、キノリン−４−イル基、イソキノリン−１−イル基、イソキノリン−３−イル基、イソキノリン−４−イル基、１，３，４−チアジアゾール−２−イル基、モルホリン−４−イル基等が挙げられる。
【００５８】
上記式における環Ａは、好ましくはピリジル基（例えば、ピリジン−２−イル基、ピリジン−３−イル基、ピリジン−４−イル基など）、ベンゾオキサゾール−２−イル基、モルホリン−４−イル基、ベンゾイミダゾール−２−イル基、ピリミジン−２−イル基、ピリミジン−４−イル基、チエニル基（例えば、チオフェン−２−イル基、チオフェン−３−イル基など）、フラン−２−イル基、フラン−３−イル基、ピロール−２−イル基、ピロール−３−イル基、ピラゾール−３−イル基、チアゾリル基（例えば、チアゾール−４−イル基、チアゾール−５−イル基など）、ベンゾイミダゾール−２−イル基、ベンゾチオフェン−２−イル基、ベンゾフラン−２−イル基等であり、より好ましくはピリジル基、チエニル基又はチアゾリル基であり、特に好ましくは、ピリジル基（ピリジン−４−イル基）、チエニル基（チオフェン−２−イル基）、チアゾリル基（チアゾール−４−イル基）である。
【００５９】
上記式におけるＲ５及びＲ６の「ヘテロ環残基」は、ヘテロ環部が上記ヘテロ環残基と同義であり、かつ上記「置換されていてもよいアリール基」で述べた置換基で置換されていてもよく、置換基の数及び位置は特に限定されない。「ヘテロ環残基」としては、好ましくはピリジル基（例えば、ピリジン−２−イル基、ピリジン−３−イル基、ピリジン−４−イル基など）、チアゾリル基（例えば、チアゾール−４−イル基、チアゾール−５−イル基など）、チエニル基（チオフェン−２−イル基、チオフェン−３−イル基）等が挙げられ、特に好ましくは、ピリジル基（ピリジン−４−イル基）、チエニル基（チオフェン−２−イル基、チオフェン−３−イル基）が挙げられ、置換されたヘテロ環残基としては、例えば、クロロピリジル基、クロロ−メトキシピリジル基、ジクロロピリジル基等が挙げられる。
【００６０】
「ヘテロアリールＣ１−６アルキル基」は、ヘテロアリール部が上記ヘテロ環残基であるものをいい、かつアルキル部が１〜６個の直鎖又は分枝してもよいアルキル基であるヘテロアリールアルキル基であって、例えば、ピリジルメチル基（例えば、２−ピリジルメチル基、３−ピリジルメチル基、４−ピリジルメチル基等）、キノリニルメチル基（例えば、２−キノリニルメチル基等）、インドリルメチル基（例えば、２−インドリルメチル基、３−インドリルメチル基等）、チオフェン−２−イルメチル基、チオフェン−３−イルメチル基、２−フラニルメチル基、３−フラニルメチル基、１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルメチル基、ベンゾチアゾール−２−イルメチル基、２−（チオフェン−２−イル）エチル基、２−（フラン−２−イル）エチル基等が挙げられる。好ましくは、２−ピリジルメチル基、３−ピリジルメチル基、４−ピリジルメチル基、３−ピリジルエチル基、４−ピリジルエチル基等が挙げられる。上記一般式（１）におけるＲ１４は、好ましくは３−ピリジルエチル基（例えば、２−（ピリジン−３−イル）エチル基）である。
【００６１】
例えば、上記一般式（１）において、Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は−ＣＯＲ７（ここで、Ｒ７は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、置換されていてもよいアリールオキシ基又は置換されていてもよいアラルキルオキシ基である）であり、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。さらに、Ｒ５は、例えば、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、さらに好ましくは、置換されていてもよいアリール基である。Ｒ６は、好ましくは、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、さらに好ましくは、ハロゲン原子、ハロアルキル基、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基及びニトロ基からなる群より選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい、アリール基又はヘテロ環残基であるか、あるいは水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子又はＣ２−１２アルコキシアルキル基である。また、環Ａは、ピリジル基、チアゾリル基、又はチエニル基である。
【００６２】
また、例えば、上記一般式（１）において、Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ４は、水素原子である。さらに、Ｒ５及びＲ６は同一又は異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、又はハロゲン原子であり、Ｘが−ＮＨ−、−Ｎ＝、−ＣＨ２−又は−Ｏ−であり、Ｙが−ＮＨ−又は＝Ｎ−であり、Ｚが−ＣＯ−であり、Ｗが−ＮＨ−であり、環Ａがアリール基、好ましくはフェニル基又はヘテロアリール基、より好ましくはピリジル基である。
【００６３】
さらに、例えば、Ｒ１は、メチル基、エチル基、ベンジル基、水素、フェニル基、メチル基で置換されたフェニル基、及び−Ｃ−ＣＦ３−からなる群から選択され、特に好ましくはメチル基である。Ｒ２は、メチル基、水素、−Ｃ−Ｏ−Bn−（Bnはベンジル基）、フェニル基、及びtert-ブチル基からなる群から選択され、特に好ましくはメチル基である。Ｒ３は、メチル基、イソプロピル基、−Ｃ（Me)−Ｃ−Ｏ−Bn−（Meはメチル基、Bnはベンジル基）、−Ｃ（Me)−Ｃ−ＯＨ−（Meはメチル基）、フェニル基、tert-ブチル基、エチル基、イソブチル基、メトキシ基、及びＣＦ３からなる群から選択され、特に好ましくはイソプロピル基であり、Ｒ４は、水素又はメチル基であり、特に好ましくは水素である。また、Ｘは、−ＮＨ−、−Ｎ＝、−Ｎ−Ｍｅ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ＝、−ＣＨ−Me−、−Ｏ−、−Ｎ（−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ−Ｍｅ）−、及び−ＣＨ（Ｒ１１）−（ここで、Ｒ１１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である）からなる群から選択され、Ｙは、−ＮＨ−、−ＣＨ２−、−ＣＯ−、−Ｏ−、＝ＣＨ−、−Ｎ−ＣＯ２−Ｍｅ−、−Ｎ−ＣＯ２−Ｐｈ−、−Ｎ−ＣＯ２−tBu−、−Ｎ−ＣＯ２−Ｂｎ−、−Ｎ−ＣＯ２−Ｐｈ−、−Ｎ−Ｂｎ−、−Ｎ−Ｍｅ−、−Ｎ（ＣＯＮＨ−Ｐｈ−Ｃｌ２）−、−Ｎ（ＣＯ−ＮＨ−Ｐｈ−Ｂｒ）−、−Ｎ（ＣＯ−ＮＨ−Ｐｈ−Ｃｌ２）−、−Ｎ（ＣＯ−ＮＨ−Ｐｈ−Ｃｌ）−、−Ｎ（Ｒ１２）−（ここで、Ｒ１２は、水素原子）、及び単結合からなる群から選択され、Ｚは、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＣＨ２−、及び単結合からなる群から選択され、Ｗは、−ＮＨ−、−ＮＨＣＨ２−、−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ−Ｍｅ−、−Ｎ−ＣＯ２−Ｂｎ−、−Ｎ−ＣＯ２−Ｐｈ−、−Ｎ−（ＣＨ２）２−ピリジル基−、及び単結合からなる群から選択される。
【００６４】
また、環Ａは、ピリジル基、チアゾリル基、チエニル基、フェニル基、及びモルホリン基からなる群から選択され、特に好ましくはピリジル基である。また、Ｒ５は、例えば、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、さらに好ましくは、置換されていてもよいアリール基である。さらに、Ｒ６は、好ましくは、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、さらに好ましくは、ハロゲン原子、ハロアルキル基、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基及びニトロ基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい、アリール基又はヘテロ環残基であるか、あるいは水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子又はＣ２−１２アルコキシアルキル基である。Ｒ５及びＲ６は、好ましくは、独立にハロゲン又は水素であり、好ましいハロゲンはフッ素又は塩素である。特に好ましくはＲ５及びＲ６はいずれも塩素である。環Ａは、好ましくはピリジル基である。
【００６５】
本発明の式（１）で表される化合物の具体例として、図２０−１から２０−８に示すものが挙げられる。図２０−１から２０−８には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｗ、Ａ、Ｒ５、及びＲ６の組合せを示す。
【００６６】
上記の一般式（１）の化合物中でも、特に本発明のS1P2受容体アンタゴニストとして好適な化合物において、Ｒ１及びＲ２はメチル基、Ｒ３はイソプロピル基、Ｒ４は水素、Ｘは−ＮＨ−、Ｙは−ＮＨ−、Ｘは−ＣＯ−、Ｗは−ＮＨ−、環Ａはピリジル基、Ｒ５及びＲ６は、独立に水素、塩素、フッ素、臭素、メチル基、又はメトキシ基であり、好ましくはＲ５及びＲ６のいずれもが塩素であり、この場合、塩素の結合位置として、２及び６位、３及び５位、２及び３位、２及び５位、３及び４位が例示できる。
【００６７】
本発明の治療薬に有効成分として含まれるS1P2受容体アンタゴニストの具体的な化合物として以下の化合物が挙げられる。
【００６８】
下記式で表される、[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素
【化３】
2011087051.tif 000004
【００６９】
下記式で表される、[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素
【化４】
2011087051.tif 000005
【００７０】
国際公開第WO2003/051876号パンフレット、特開2004-123539号公報に記載のピラゾロピリジン化合物及びその誘導体を本発明のS1P2受容体アンタゴニストとして用いることができる。
【００７１】
上記化合物は、公知の手法で合成することが可能である。
【００７２】
また、本発明のS1P2受容体アンタゴニストは、S1P2受容体に対するアンタゴニスト抗体も含む。該抗体は、S1P2受容体に結合することにより、受容体を遮断し、受容体にリガンドが結合することを阻止し、シグナル伝達を阻害する。抗体は、モノクローナル抗体もポリクローナル抗体も含み、好ましくはモノクローナル抗体である。また、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体も含まれる。抗体は、公知の手法によって作製することができる。
【００７３】
本発明において、「製薬上許容される塩」とは、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩又は硝酸塩等の各種無機酸付加塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トシル酸塩又はアスコルビン酸塩等の各種有機酸付加塩；アスパラギン酸塩、又はグルタミン酸塩等の各種アミノ酸との塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、場合によっては、含水物、水和物あるいは溶媒和物であってもよい。
【００７４】
本発明の治療薬は、製剤化に際し通常用いられる担体、賦形剤、増粘剤、保剤、安定化剤、酸化防止剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤、着色剤、芳香剤、嬌味剤、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、界面活性剤、無痛化剤、含硫還元剤等の成分や吸収改善、固体安定化等を目的として種々の他の機能性成分を適宜配合することができる。担体、賦形剤の例としては、水溶性又は難溶性のもので、例えば糖類、多糖類、デキストリン類、セルロース類、合成又は半合成高分子類、アミノ酸類、ポリアミノ酸類、タンパク質類、リン脂質類等が挙げられる。
【００７５】
本発明の治療薬の投与経路としては、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、経口があげられる。治療剤の剤形は、投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、たとえば、水溶液、乳剤、懸濁液などの液剤、又は錠剤などがあげられる。通常は、経口投与が好ましいため、水溶液又は錠剤が好ましい。
【００７６】
投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、病状などによって適宜設定することができるが、一回に0.005〜５mg/kg体重が好ましく、0.005〜１mg/kg体重がより好ましい。１日１回あるいは数回に分けて連日投与することができる。
【実施例】
【００７７】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００７８】
以下の実施例において、S1P2受容体アンタゴニストとして、[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素を合成して用いた。本実施例において、該化合物をJTE-K1と呼ぶ。
方法【００７９】
1)  動物実験
S1P2-/-を動脈硬化モデルマウスであるApoE -/-と交配し、S1P2とApoEをともに欠損するApoE -/-, S1P2 -/-マウスを樹立した。大動脈粥状動脈硬化病変は、生後6週齢雄性のApoE -/-, S1P2 +/+、ApoE -/-, S1P2 +/-及びApoE -/-, S1P2-/-マウスを高コレステロール食餌(1.25％コレステロール、7.5％ココアバター)で3〜4ヶ月間飼育して誘発した。【００８０】
2)  単球・マクロファージの調製
マウス末梢血単球は、採血後、Ficoll-PaquePlus（BD Biosciences）により単核細胞を分離し、CD11b抗体を固定化した磁性粒子（マイクロビーズ、Miltenyi Biotec）と反応させ、マイクロビーズと結合した細胞をAutoMACS（磁性装置、Miltenyi Biotec）を用いて分離することにより、調製した。【００８１】
マウス骨髄由来マクロファージは、マウス大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を回収し、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF、Sigma）存在下で1週間培養して得た。マクロファージへの分化はラットモノクローナル抗Mac-3（マクロファージマーカー）抗体（BD Pharmingen）及びAlexa488標識抗ラットIg抗体を用いた免疫染色により確認した。【００８２】
マウス腹腔マクロファージは、4%チオグリコール酸をマウス腹腔に注射後3〜4日間飼育した後、腹腔内を冷リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄して回収した。【００８３】
3)  粥状動脈硬化病変巣の定量
深麻酔下にて、マウス心臓からリン酸緩衝化生理食塩水及び4%中性緩衝パラホルムアルデヒド水溶液を注入して還流固定後、大動脈を大動脈起始部から左右総腸骨動脈分岐部まで採取した。大動脈粥状動脈硬化病変面積は、大動脈起始部〜腹部大動脈を切開・展開し、Oil red-Oで脂質染色後、画像解析ソフトにて硬化巣面積を算出し、血管内腔面全面積に対する割合（％値）で表示した。【００８４】
4)  免疫染色
摘出大動脈から大動脈弁弁輪部及びより末梢の大動脈を切り出し、摘出組織をパラフィン包埋してパラフィン切片を、あるいはOCTコンパウンド中に包埋して凍結切片を、それぞれ作製した。切片をヘマトキシリン・エオジン染色、粥状動脈硬化病変巣におけるコラーゲン繊維の増加はアザン染色により、観察した。また、切片上の粥状動脈硬化病変巣面積は、Oil red-Oで脂質染色後に定量した。また、動脈硬化病変のマクロファージおよび、平滑筋細胞の浸潤・遊走は、ラットモノクローナル抗Mac-3抗体（BD Bioscience社）、マウスモノクローナル抗α-平滑筋アクチン抗体(Sigma社)を用いた免疫染色で評価した。【００８５】
5)  逆転写PCR（RT-PCR）法によるmRNA発現量の測定
RT-PCR法あるいはリアルタイムPCR法を用いて、動脈内皮に発現している接着分子、ケモカイン等のサイトカイン、スカベンジャー受容体、抗動脈硬化因子、単球に発現しているS1P各受容体及び接着分子等の発現量を解析した。摘出大動脈や、単球及びマクロファージからtotal RNAを酸・グアニジン・フェノール・クロロフォルム法（Anal. Biochem. 1987; 162:156）を用いて抽出した。逆転写酵素ReverTraAce（東洋紡）を用いてcDNAを合成し、DNAポリメラーゼGoTaq（プロメガ）を用いてPCRを行った。【００８６】
リアルタイムPCR解析は、TaqMan Reverse Transcriptase Reagents（AppliedBiosystems社）を用いてcDNAを合成し、TaqManプローブ（Applied Biosystems社）を用いてPCRを行い、AppliedBiosystems 7300リアルタイムPCRシステムにより検出・解析した。【００８７】
6)  マクロファージの機能解析
マクロファージへの酸化LDLの取込み実験では、酸化LDLを含む培地中でマクロファージを37℃6時間インキュベーションした後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、4％中性緩衝パラホルムアルデヒド水溶液で固定後、Oil red-O染色をおこない、1視野当たりのOil red-O陽性細胞数をもとめた。【００８８】
マクロファージからのコレステロール汲み出し実験では、[3H]コレステロールで標識した細胞を、コレステロール受容体として2％血清あるいはHDLを加えた培地中で37℃、4時間インキュベーションした。インキュベーション後、培地中（汲み出されたコレステロール量）及び0.1 N NaOHで可溶化した細胞内（細胞内コレステロール量）の[3H]放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。汲み出されたコレステロール量を全コレステロール量（汲み出されたコレステロール量＋細胞内コレステロール量）の割合として算出した。【００８９】
細胞遊走は、改変ボイデンチェンバー（Neuroprobe社, 8μm径孔）を用いて評価した。活性型Rho(GTP結合型Rho)量は、Rhoを結合するタンパクRhothekinのRho結合部位をglutathione-s-transferase融合組み換えタンパク（セファロースビーズに結合）を用いたプルダウン法により、定量した（非特許文献１を参照）。【００９０】
7)  高コレステロール食餌で誘発される大動脈粥状動脈硬化病変に対するS1P2アンタゴニストの効果
生後6週齢で雄性のApoE欠損マウスを2群に分け、被験群には0.5％メトローズ（信越化学工業）に懸濁したS1P2アンタゴニスト20mg/kgを、コントロール群は0.5％メトローズを1日2回経口投与し、高コレステロール食餌にて3ヶ月間飼育した。【００９１】
8)  骨髄移植実験
致死量の放射線照射をおこなった8週齢のApoE -/-, S1P2+/+マウスに、ApoE -/-,S1P2+/+マウス及びApoE -/-, S1P2 -/-マウスの大腿骨及び脛骨からより調製した骨髄細胞を尾静脈から静脈内注射し、骨髄移植を施行した。マウスを一ヶ月間回復させ、3ヶ月間の高コレステロール食負荷をおこない誘発される大動脈粥状動脈硬化巣を比較した。骨髄置換率はGFPトランスジェニックマウスの骨髄細胞を用いた。骨髄移植から5週間後、採血し、フローサイトメーターを用いて骨髄置換率を測定し、骨髄移植の成功を確認した（置換率95％以上）。【００９２】
9)  単離肺微小血管内皮細胞の調製
S1P2-/-マウスと+/+マウスの肺の酵素消化物からCD105抗体を固定化した磁性粒子（マイクロビーズ、MiltenyiBiotec）と反応させ、マイクロビーズと結合した細胞をAutoMACS（磁性装置、Miltenyi Biotec）を用いて肺微小血管内皮細胞分離した。【００９３】
10)  単離マクロファージ及び血管内皮細胞の機能解析
S1P2-/-マウスと+/+マウスより調製した血管内皮細胞をオーバーナイトで血清不含培養液を用いてスタベーションを行った後、非刺激下及びS1Pで刺激し、MYPT1のリン酸化及びNF-κBのリン酸化をウエスタンブロット法によって評価した。2倍濃度のLaemmli SDSサンプル緩衝液を用いて細胞を回収し、5分間煮沸した。回収したサンプルをSDS-10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離した。イモビロン-Pメンブレンに転写後、抗リン酸化Thr850MYPT1抗体及び抗非リン酸化MYPT1抗体、抗リン酸化p65NF-κB抗体及び抗非リン酸化p65NF-κB抗体を用いてバンドを検出し、デンシティーを定量した。バンドのデンシティーはデンシトメーター(PDI,San Francisco, USA)にて定量した。【００９４】
結果
1)  S1P2欠損による大動脈粥状動脈硬化巣の軽減
粥状動脈硬化病変の形成におけるS1P2の効果を検討するために、生後6週齢雄性のApoE -/-, S1P2+/+マウス、ApoE -/-, S1P2 +/- マウス、及びApoE-/-, S1P2 -/- マウスに高コレステロール食餌を与え、3〜4ヶ月間飼育後、誘発される大動脈粥状動脈硬化巣を比較した。また、戻し交配による遺伝的背景の影響を検討するため、3世代（N3）及び7世代（N7）戻し交配を行った上記マウスを実験に用いた。N3マウス、N7マウスともに、試験期間を通じてApoE -/- S1P2+/+及びApoE -/-, S1P2 -/- マウス間で体重増加の差異は認められなかった。また、N3マウスの血中総コレステロール(1492 ± 284（平均値±標準誤差）vs. 1749 ± 291 mg/dl)、中性脂肪(174 ± 23 vs. 97 ±22 mg/dl)、HDLコレステロール(10 ± 2 vs. 15 ± 3.2 mg/dl)は各遺伝子型のマウス群間で有意な差を認めなかった（表１）。【００９５】
【表１】
2011087051.tif 000006
【００９６】
末梢血液の白血球数、特に、単球、リンパ球の数は、ApoE -/-, S1P2+/+及びApoE -/-,S1P2-/- マウス間で差異は見られなかった（表２）。【００９７】
【表２】
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【００９８】
大動脈のOil red-O染色像を図１Ａ〜Ｃに、Oil red-O陽性の粥状動脈硬化巣面積の定量結果を図２に示した。大動脈起始部（胸部大動脈）から腹部大動脈にいたる大動脈全域の内腔面総面積に占める粥状動脈硬化巣面積の割合は、ApoE -/-, S1P2 +/+（N7）、ApoE -/-, S1P2 +/-（N7）及びApoE -/-, S1P2 -/-（N7）の各マウスでそれぞれ28.8 ± 6.7、20.7 ± 6.5及び8.0 ± 0.6％であった。ApoE -/-, S1P2 +/+（N3）及びApoE -/-, S1P2 -/-（N3）マウスでは、それぞれ32.5 ± 5.7及び15.1 ± 2.2％であった。N3及びN7のいずれにおいても、ApoE -/-, S1P2 -/-はApoE -/-, S1P2+/+に比し有意に低値を示した(P<0.05)。これらの結果から、S1P2は粥状動脈硬化病変の形成に促進的に作用することが示唆された。また、以後の実験には、C57BL/6あるいはApoE -/-による3世代（N3）戻し交配を行ったS1P2-/-及びApoE -/-, S1P2-/-マウスを用いた。【００９９】
次に、大動脈弁弁輪部と末梢大動脈の組織切片上の、Oil-red O染色陽性の粥状動脈硬化病変の面積をもとめた。代表的な組織染色像を図３Ａ及び図４Ａに、その定量結果を図３Ｂ及び図４Ｂに示した。大動脈弁弁輪部（図３）及びより末梢の大動脈（図４）のいずれにおいても、ApoE -/-, S1P2 -/- マウスではApoE -/-,S1P2 +/+マウスに比して粥状動脈硬化病変面積が低値であった。【０１００】
アザン染色で、粥状動脈硬化病巣のコラーゲン線維量を評価した。ApoE -/-, S1P2 -/-マウス、ApoE-/-,S1P2 +/+マウス間で、コラーゲン線維量に差異は認めなかった（図５Ａ及びＢ並びに図６Ａ及びＢ）。【０１０１】
マクロファージを特異的に認識する抗Mac3抗体を用いた免疫染色により、粥状動脈硬化病巣におけるマクロファージ浸潤を評価した。粥状動脈硬化病巣のMac3陽性領域は、ApoE-/- , S1P2-/-マウスではApoE -/-, S1P2+/+マウスに比較して低値であった（図７Ａ及びＢ）。【０１０２】
粥状動脈硬化病変の内膜へのα-平滑筋アクチン(α-SMA)陽性平滑筋細胞の浸潤を検討するために、血管平滑筋マーカーである抗α-SMA抗体により粥状動脈硬化病巣を免疫染色した。ApoE -/-, S1P2-/-マウスにおいて内膜のα-SMA陽性領域はApoE-/-, S1P2 +/+マウスに比較して大であり、平滑筋細胞の浸潤がより強かった（図８Ａ及びＢ）。【０１０３】
以上の免疫組織染色の結果より、ApoE-/-, S1P2-/- マウスではApoE -/-, S1P2+/+マウスに比較して粥状動脈硬化病変が軽微であることが明らかとなった。【０１０４】
2)  S1P2欠損によるマクロファージの酸化LDL取りこみ能の減少
マクロファージの酸化LDLの取りこみ能を検討するために、S1P2+/+マウスとS1P2 -/-マウスより骨髄由来マクロファージを調製した。マクロファージを酸化LDLとインキュベート後Oil red-Oで染色し、酸化LDLを取り込んだ細胞数をもとめた。S1P2 -/-マウスのマクロファージにおいて、Oil red-O陽性細胞数はS1P2+/+マウスに比較して低値であった（図９Ａ〜Ｄ及び図１０）。すなわち、S1P2 -/-マウスマクロファージにおいて酸化LDLを取り込み能が低下していた。これらの結果から、S1Pはマクロファージによる変性リポタンパクの取りこみ能力に影響を与えることが考えられるが、さらにS1P2受容体 -/-マクロファージにおける酸化LDL取りこみ低下の分子機構を検討した。変性リポタンパク取り込みに関与するスカベンジャー受容体であるCD36遺伝子のmRNA発現がS1P2-/-マウスマクロファージで低下していた（図１１Ａ及びＢ）。【０１０５】
3)  S1P2欠損によるマクロファージのコレステロール汲み出し能の亢進
マクロファージのコレステロール汲み出し能を検討するために、S1P2-/-マウスとS1P2+/+マウスから腹腔マクロファージを調製し、3H標識コレステロールを負荷した。そして、培地中のHDL存在下でマクロファージから細胞外へのコレステロール汲み出しを測定した。マクロファージからのコレステロール放出には、HDLから遊離する蛋白質ApoA-I及び細胞膜に存在するトランスポーターABCA1を介する経路と、HDL及びトランスポーターABCG1を介する2つの経路が重要である。コレステロール受容分子として培地に血清(ApoA-Iを含む)あるいはHDLを添加した。血清存在下では、S1P2 -/-マウスマクロファージにおいてコレステロール汲み出しがS1P2 +/+マウスマクロファージより高値であった。一方、HDL存在下では両マウス間で差が認められなかった（図１２）。また、S1P2 -/-マクロファージからの非特異的な拡散によるコレステロール流出もS1P2 +/+マウスマクロファージではより高値であった。これらの結果から、S1P2はマクロファージのコレステロールの汲み出し能、特にApoA-IとABCA1を介した経路に影響を与えることが明らかとなった。このS1P2作用の分子機構を解明するために、コレステロール汲み出し関連分子の遺伝子発現を検討した。S1P2-/-マウスマクロファージでは、ABCA1及びABCG1遺伝子発現が亢進していた。このほか、ABCA1及びABCG1遺伝子転写を促進するLXRの遺伝子発現も亢進していた（図１１）。【０１０６】
4)  動脈硬化関連遺伝子発現
S1P2受容体の有無が血管における他の動脈硬化関連分子の遺伝子発現に及ぼす影響を検討した。生後6週齢雄性のApoE -/-, S1P2 +/+及びApoE -/-, S1P2-/-に高コレステロール食餌を与え、3〜4ヶ月間飼育後大動脈を摘出し、RT-PCR法によりmRNA発現を評価した。ApoE-/-, S1P2 -/-マウスの大動脈ではApoE -/-, S1P2 +/+マウスに比して、TNF-α, IFN-γ, IL-6のmRNA発現が低下していた（図１３Ａ）。また、内皮細胞に発現し血液中の白血球の内皮下への浸潤を媒介する接着分子、VCAM-1の遺伝子発現がApoE-/-, S1P2 -/-マウスの大動脈ではApoE -/-,S1P2 +/+マウスに比して、低下していた（図１３Ｂ及び１３Ｃ）。抗動脈硬化作用を及ぼす一酸化窒素(nitric oxide, NO)を産生する内皮型NO合成酵素eNOSのタンパク発現は差がなかったが、eNOSのアミノ酸セリン1177（S1177,eNOSの活性化をひきおこすリン酸化部位）のリン酸化はApoE-/-, S1P2 -/-マウス大動脈で顕著に亢進していた（図１３Ｄ及び１３Ｅ）。【０１０７】
5)  S1P2アンタゴニスト投与による大動脈粥状動脈硬化巣の軽減
以上の結果から、S1P2は動脈硬化の発症・進展に促進的に作用することが示された。そこで、ApoE欠損マウスを使い、S1P2アンタゴニストの投与が高コレステロール食餌により誘発される粥状動脈硬化巣に影響を与えるかどうかを検討した。生後6週齢で雄性のApoE欠損マウスにS1P2アンタゴニストを1日2回経口投与し、高コレステロール食餌にて3ヶ月間飼育、誘発される大動脈粥状動脈硬化巣を比較した。Oil-red O染色像を図１４に、粥状動脈病変面積を図１５に示した。大動脈全域に占める粥状動脈硬化巣面積はコントロール群及び被験群でそれぞれ20.5 ± 8.93及び10.0 ± 5.80 ％であり、被験群はコントロール群に比し有意に低値を示した(P<0.05)。これらの結果から、S1P2アンタゴニストの動脈硬化性疾患の予防に有用である可能性が示唆された。【０１０８】
6)  粥状動脈硬化発症における、単球/マクロファージを初めとする骨髄由来細胞に発現しているS1P2受容体の関与
S1P2遺伝子座にβ-galactosidase (LacZ)遺伝子をノックインしたマウス（S1P2LacZ/LacZマウス）（最近掲載決定した当研究室論文  Wa Du et al. Cancer Resに詳細を記載）の大動脈組織切片を用いてX-gal染色を行い、免疫染色と組み合わせて動脈硬化血管におけるS1P2発現細胞を同定した。正常大動脈の根部では、血管内皮と平滑筋、弁輪間葉系胞がX-gal染色陽性（青色に染色）、すなわち、S1P2を発現した（図１６Ａ）。大動脈粥状動脈硬化病変部ではプラーク内にX-gal染色陽性細胞の集積が見られた（図１６Ｂ）。X-gal染色とマクロファージマーカーであるMac-3免疫染色の二重染色により、Mac-3陽性（褐色）のマクロファージがX-gal染色も陽性であり、マクロファージがS1P2を発現していることが示された（図１６Ｃ）。X-gal染色と血管内皮CD31の免疫染色の二重染色により、CD-31陽性（褐色）の内皮の一部がX-gal染色陽性であることがわかった（図１６Ｄ）。【０１０９】
単球/マクロファージは粥状動脈硬化発症に重要な役割をはたす。単球/マクロファージなどの骨髄由来細胞に発現しているS1P2受容体の関与を検討するために，骨髄移植(BMT)を用いてキメラマウスを作製した。致死量の放射線照射をおこなったApoE -/-, S1P2 +/+マウスにApoE-/-,S1P2-/-マウス骨髄を移植した(ApoE -/-, S1P2-/- BMTマウス)。回復後、3ヶ月間の高コレステロール食負荷をおこない、誘発された大動脈粥状動脈硬化病変面積を比較した。コントロールとしてApoE-/-, S1P2 +/+にApoE -/-, S1P2 +/+マウスの骨髄細胞を移植した(ApoE -/-, S1P2 +/+ BMT)マウスを用いた。全大動脈内腔面の脂質染色像を図１７Ａに、病変面積定量結果を図１７Ｂに示した。胸部大動脈から腹部大動脈の全体の血管壁域に対する粥状動脈硬化巣面積はApoE -/-, S1P2 +/+ BMTマウス及びApoE-/-, S1P2-/- BMTマウスでそれぞれ平均約２０％及び１０％であり、ApoE -/- , S1P2-/- BMTマウスはApoE -/-, S1P2 +/+ BMTマウスに比し有意に低値を示した。これらの結果から、骨髄由来細胞に発現しているS1P2受容体が粥状動脈硬化発症に重要であることが示された。【０１１０】
7）  マクロファージにおけるS1P2受容体を介したシグナル経路
S1P2はG12/13を介したRhoの活性化が最も優勢なシグナル経路である。ApoE -/-, S1P2+/+マウスから単離したマクロファージでは、S1P刺激によりRhoが活性化されたが、ApoE-/-, S1P2 -/-マウスマクロファージでは、S1P刺激によるRho活性化が見られなかった（図１８Ａ-１及びＡ-２）。ApoE -/-, S1P2+/+マウスのマクロファージでは、S1P刺激によるThr850残基におけるMYPT1リン酸化レベルの上昇が見られ、このS1PによるMYPT1リン酸化レベルの上昇はRhoキナーゼ阻害薬Y-27632により強く抑制された（図１８Ｂ-１及びＢ-２）。一方、ApoE -/-, S1P2 -/-マウスからの細胞ではS1P刺激によるMYPT1リン酸化の増加は見られなかった。次に、TNFαやIL-6などの炎症性サイトカイン、またVCAM1などの接着因子の発現調節などを誘導するNF-κBのリン酸化を検討した。ApoE -/-, S1P2 +/+マウスマクロファージでは、S1P刺激によりNF-κBリン酸化レベルの上昇が認められ、これはS1P2受容体アンタゴニストJTE-K1及びRhoキナーゼ(ROCK)阻害薬Y-27632により強く抑制された（図１８Ｃ-１及びＣ-２）。一方、ApoE -/-, S1P2 -/-マウスからの細胞では、S1P刺激によるNF-κBリン酸化の増加がほぼ完全に抑制された。以上の結果から、血管内皮細胞において、S1P2はRho、ROCKを介してNF-κBの活性化に重要な役割をはたすことが示された。コレステロールの細胞内から細胞外への排出をつかさどるトランスポーターABCA1及びその遺伝子発現促進転写因子LXR-aのmRNA発現は、ApoE -/-, S1P2 +/+マウスマクロファージでは、JTE-K1及びY-27632により促進された（図１８Ｄ-１及びＤ-２）。一方、ApoE -/-, S1P2 -/-マウスから単離したマクロファージでは両遺伝子の発現が亢進しており、JTE-K1, Y-27632は影響をおよぼさなかった。【０１１１】
8）  S1P2受容体欠損マクロファージの細胞遊走反応
血液中の単球は内皮下に遊走しマクロファージとなり、変性LDLを貪食して泡沫細胞に変じ粥状動脈硬化病変を形成する。単球の内皮下への遊走にはケモカインMCP-1などが関与する。また、S1PもS1P1及びS1P2受容体を介して、それぞれ遊走を正負に調節すると予想される。そこで、ボイデンチェンバーを用いてApoE -/-, S1P2 +/+マウス、ApoE -/-,S1P2 -/-マウスから単離したマクロファージの遊走を検討した。図１９Ａに示すように、ボイデンチェンバーの上層にマクロファージを加え、下層にS1P, MCP-1を添加し、フィルター膜の下面に遊走した細胞数を測定したところ、ApoE-/-, S1P2 +/+マウスマクロファージは下層への遊走促進を示さなかったのに対し、ApoE-/-, S1P2-/-マクロファージでは下層への遊走亢進が観察された。S1P単独の存在下でも下層への遊走亢進が観察された。一方、図１９Ｂに示すように、ボイデンチェンバーの上層にマクロファージとS1Pを加え、下層にMCP-1を添加すると、ApoE -/-, S1P2 +/+マクロファージは下層への遊走亢進が観察された。しかし、ApoE-/-, S1P2 -/-マクロファージでは下層への遊走亢進が見られなかった。マウス生体内では血液中のS1P濃度が血管壁組織中のS1P濃度より高値であるので、単球は図１９Ｂに類似した状況におかれていると考えられる。すなわち、ApoE -/-, S1P2 -/-マウスでは単球の血液中から内皮下組織への遊走が低下していると推測される。マクロファージでは下層への遊走亢進細胞遊走に必須の役割を担う低分子量GタンパクRacの活性化を測定したところ、ApoE -/-, S1P2 +/+マクロファージはS1PがMCP-1によるRac活性化を抑制したのに対し、ApoE -/-, S1P2 -/-マクロファージではS1Pによる抑制がみられず、S1P単独によるRac活性化も増強されていた(図１９Ｃ-１及びＣ-２)。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の本発明のS1P2受容体アンタゴニストを有効成分として含む医薬は、粥状動脈硬化の治療に有用である。
【図１】
2011087051.tif 000009
【図２】
2011087051.tif 000010
【図３Ａ】
2011087051.tif 000011
【図３Ｂ】
2011087051.tif 000012
【図４Ａ】
2011087051.tif 000013
【図４Ｂ】
2011087051.tif 000014
【図５Ａ】
2011087051.tif 000015
【図５Ｂ】
2011087051.tif 000016
【図６Ａ】
2011087051.tif 000017
【図６Ｂ】
2011087051.tif 000018
【図７Ａ】
2011087051.tif 000019
【図７Ｂ】
2011087051.tif 000020
【図８Ａ】
2011087051.tif 000021
【図８Ｂ】
2011087051.tif 000022
【図９】
2011087051.tif 000023
【図１０】
2011087051.tif 000024
【図１１Ａ】
2011087051.tif 000025
【図１１Ｂ】
2011087051.tif 000026
【図１２】
2011087051.tif 000027
【図１３Ａ】
2011087051.tif 000028
【図１３Ｂ】
2011087051.tif 000029
【図１３Ｃ】
2011087051.tif 000030
【図１３Ｄ】
2011087051.tif 000031
【図１３Ｅ】
2011087051.tif 000032
【図１４】
2011087051.tif 000033
【図１５】
2011087051.tif 000034
【図１６】
2011087051.tif 000035
【図１７Ａ】
2011087051.tif 000036
【図１７Ｂ】
2011087051.tif 000037
【図１８Ａ−１】
2011087051.tif 000038
【図１８Ａ−２】
2011087051.tif 000039
【図１８Ｂ−１】
2011087051.tif 000040
【図１８Ｂ−２】
2011087051.tif 000041
【図１８Ｃ−１】
2011087051.tif 000042
【図１８Ｃ−２】
2011087051.tif 000043
【図１８Ｄ−１】
2011087051.tif 000044
【図１８Ｄ−２】
2011087051.tif 000045
【図１９Ａ】
2011087051.tif 000046
【図１９Ｂ】
2011087051.tif 000047
【図１９Ｃ−１】
2011087051.tif 000048
【図１９Ｃ−２】
2011087051.tif 000049
【図２０−１】
2011087051.tif 000050
【図２０−２】
2011087051.tif 000051
【図２０−３】
2011087051.tif 000052
【図２０−４】
2011087051.tif 000053
【図２０−５】
2011087051.tif 000054
【図２０−６】
2011087051.tif 000055
【図２０−７】
2011087051.tif 000056
【図２０−８】
2011087051.tif 000057
【手続補正書】
【提出日】平成23年11月10日(2011.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１Ｐ２受容体アンタゴニストを有効成分として含む、粥状動脈硬化治療薬。
【請求項２】
Ｓ１Ｐ２受容体アンタゴニストが下記一般式（１）で表される化合物又はその製薬上許容される塩である、請求項１記載の粥状動脈硬化治療薬。
【化１】
2011087051.tif 000058
［式中、
Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基又は−ＣＯＲ７（ここで、Ｒ７は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、置換されていてもよいアリールオキシ基又は置換されていてもよいアラルキルオキシ基である）であり；
Ｒ２は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり；
Ｒ４は、水素原子又は置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、Ｃ２−６アルキニル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ハロアルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、アシル基、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ基、置換されていてもよいアラルキルオキシ基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいヘテロ環残基、Ｃ２−１２アルコキシアルキル基又は−ＣＯＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）であり；
Ｒ６は、水素原子、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、Ｃ２−６アルキニル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ハロアルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、アシル基、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ基、置換されていてもよいアラルキルオキシ基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいヘテロ環残基、Ｃ２−１２アルコキシアルキル基又は−ＣＯＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）であり；
Ｘは、−Ｎ（Ｒ９）−（ここで、Ｒ９は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は−ＮＨＲ１０（ここで、Ｒ１０は、カルボキシル基又はＣ２−６アルコキシカルボニル基である）である）、−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＣＨ＝又は−ＣＨ（Ｒ１１）−（ここで、Ｒ１１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である）であり；
Ｙは、−Ｎ（Ｒ１２）−（ここで、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基又は−ＣＯＮＨＲ１３（ここで、Ｒ１３は、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）である）、＝Ｎ−、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は単結合であり；
Ｚは、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−又は単結合であり；
Ｗは、−Ｎ（Ｒ１４）−（ここで、Ｒ１４は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基又はヘテロアリールＣ１−６アルキル基である）、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−（但し、窒素原子は環Ａと結合する）、−ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２−（但し、炭素原子は環Ａと結合する）又は単結合であり；
−−−−−−−−−は、二重結合又は一重結合であり；
環Ａは、アリール基、ヘテロ環残基又はＣ３−７シクロアルキル基である］
【請求項３】
Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は−ＣＯＲ７（ここで、Ｒ７は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、置換されていてもよいアリールオキシ基又は置換されていてもよいアラルキルオキシ基である）であり、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ５は、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、Ｒ６は、好ましくは、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、さらに好ましくは、ハロゲン原子、ハロアルキル基、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基及びニトロ基からなる群より選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい、アリール基又はヘテロ環残基であるか、あるいは水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、環Ａは、ピリジル基、チアゾリル基、又はチエニル基である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項４】
Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ４は、水素原子であり、Ｒ５及びＲ６は同一又は異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、又はハロゲン原子であり、Ｘが−ＮＨ−、−Ｎ＝、−ＣＨ２−又は−Ｏ−であり、Ｙが−ＮＨ−又は＝Ｎ−であり、Ｚが−ＣＯ−であり、Ｗが−ＮＨ−であり、環Ａがアリール基、好ましくはフェニル基又はヘテロアリール基、より好ましくはピリジル基である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項５】
Ｒ１及びＲ２はメチル基、Ｒ３はイソプロピル基、Ｒ４は水素、Ｘは−ＮＨ−、Ｙは−ＮＨ−、Ｘは−ＣＯ−、Ｗは−ＮＨ−、環Ａはピリジル基、Ｒ５及びＲ６は、独立に水素、塩素、フッ素、臭素、メチル基、又はメトキシ基である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項６】
［Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素又は［Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項７】
病変部位の平滑筋密度を増加させることを特徴とする請求項６記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項８】
粥状病変部位を減少させることを特徴とする請求項６記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項９】
病変部位の平滑筋密度を増加させ、並びに粥状病変部位を減少させることを特徴とする請求項６記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項１０】
［Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素又は［Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素を含む、粥状動脈硬化患者用病変部位の平滑筋密度増加剤。
【請求項１１】
［Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素又は［Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素を含む、粥状動脈硬化患者用粥状病変部位減少剤。
【請求項１２】
［Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素又は［Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素を含む、粥状動脈硬化患者用病変部位のマクロファージの泡沫細胞の抑制化剤。
【手続補正書】
【提出日】平成24年7月11日(2012.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
S1P2受容体アンタゴニストを有効成分として含む、粥状動脈硬化治療薬。
【請求項２】
S1P2受容体アンタゴニストが下記一般式（１）で表される化合物又はその製薬上許容される塩である、請求項１記載の粥状動脈硬化治療薬。
【化１】
2011087051.tif 000059
[式中、
Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基又は−ＣＯＲ７（ここで、Ｒ７は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、置換されていてもよいアリールオキシ基又は置換されていてもよいアラルキルオキシ基である）であり；
Ｒ２は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり；
Ｒ４は、水素原子又は置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ５は、水素原子、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、Ｃ２−６アルキニル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ハロアルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、アシル基、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ基、置換されていてもよいアラルキルオキシ基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいヘテロ環残基、Ｃ２−１２アルコキシアルキル基又は−ＣＯＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）であり；
Ｒ６は、水素原子、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、Ｃ２−６アルキニル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、ハロアルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、アシル基、水酸基、置換されていてもよいアリールオキシ基、置換されていてもよいアラルキルオキシ基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいヘテロ環残基、Ｃ２−１２アルコキシアルキル基又は−ＣＯＮＨＲ８（ここで、Ｒ８は置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）であり；
Ｘは、−Ｎ（Ｒ９）−（ここで、Ｒ９は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は−ＮＨＲ１０（ここで、Ｒ１０は、カルボキシル基又はＣ２−６アルコキシカルボニル基である）である）、−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＣＨ＝又は−ＣＨ（Ｒ１１）−（ここで、Ｒ１１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である）であり；
Ｙは、−Ｎ（Ｒ１２）−（ここで、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基又は−ＣＯＮＨＲ１３（ここで、Ｒ１３は、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいアラルキル基である）である）、＝Ｎ−、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、−Ｏ−、−ＣＯ−又は単結合であり；
Ｚは、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−ＣＨ２−、−Ｏ−又は単結合であり；
Ｗは、−Ｎ（Ｒ１４）−（ここで、Ｒ１４は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基又はヘテロアリールＣ１−６アルキル基である）、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−（但し、窒素原子は環Ａと結合する）、−ＣＨ２−、−ＮＨＣＨ２−（但し、炭素原子は環Ａと結合する）又は単結合であり；
−−−−−−−−−は、二重結合又は一重結合であり；
環Ａは、アリール基、ヘテロ環残基又はＣ３−７シクロアルキル基である]
【請求項３】
Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又は−ＣＯＲ７（ここで、Ｒ７は、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、置換されていてもよいアリールオキシ基又は置換されていてもよいアラルキルオキシ基である）であり、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルコキシカルボニル基、ハロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ５は、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、Ｒ６は、好ましくは、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロ環残基又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、さらに好ましくは、ハロゲン原子、ハロアルキル基、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基及びニトロ基からなる群より選ばれる少なくとも１つの置換基で置換されていてもよい、アリール基又はヘテロ環残基であるか、あるいは水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子又はＣ２−１２アルコキシアルキル基であり、環Ａは、ピリジル基、チアゾリル基、又はチエニル基である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項４】
Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ３は、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ４は、水素原子であり、Ｒ５及びＲ６は同一又は異なっていてもよく、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、又はハロゲン原子であり、Ｘが−ＮＨ−、−Ｎ＝、−ＣＨ２−又は−Ｏ−であり、Ｙが−ＮＨ−又は＝Ｎ−であり、Ｚが−ＣＯ−であり、Ｗが−ＮＨ−であり、環Ａがアリール基、好ましくはフェニル基又はヘテロアリール基、より好ましくはピリジル基である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項５】
Ｒ１及びＲ２はメチル基、Ｒ３はイソプロピル基、Ｒ４は水素、Ｘは−ＮＨ−、Ｙは−ＮＨ−、Ｘは−ＣＯ−、Ｗは−ＮＨ−、環Ａはピリジル基、Ｒ５及びＲ６は、独立に水素、塩素、フッ素、臭素、メチル基、又はメトキシ基である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項６】
[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６
−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素又は[Ｎ−（１Ｈ
−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素である、請求項２記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項７】
病変部位の平滑筋密度を増加させることを特徴とする請求項６記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項８】
粥状病変部位を減少させることを特徴とする請求項６記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項９】
病変部位の平滑筋密度を増加させ、並びに粥状病変部位を減少させることを特徴とする請求項６記載の粥状動脈硬化治療薬。
【請求項１０】
[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素又は[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素を含む、粥状動脈硬化患者用病変部位の平滑筋密度増加剤。
【請求項１１】
[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素又は[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素を含む、粥状動脈硬化患者用粥状病変部位減少剤。
【請求項１２】
[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）尿素又は[Ｎ−（１Ｈ−４−イソプロピル−１，３−ジメチルピラゾロ[３，４−ｂ]ピリジ−６−イル）アミノ−Ｎ’−（２，６−ジクロロピリジン−４−イル）尿素を含む、粥状動脈硬化患者用病変部位のマクロファージの泡沫細胞の抑制化剤。
【国際調査報告】
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