(57)【要約】ＢＡＦＦ−Ｒ抗体に加えて、組成物、ならびにそれを作製及び使用する方法が本明細書において提供される。本明細書において提供される抗体は、とりわけがん及び自己免疫疾患の治療のために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）抗体であって、
前記軽鎖可変領域が、
配列番号１中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ１、配列番号２中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号３中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ３を含み；
前記重鎖可変領域が、
配列番号４中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ１、配列番号５中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号６中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ３を含む、
前記抗体。
【請求項２】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１８、配列番号２０または配列番号２２の配列を含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４】
前記重鎖可変領域が、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８の配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域が配列番号１４の配列を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記重鎖可変領域が配列番号１６の配列を含む、請求項５または６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）抗体であって、
前記軽鎖可変領域が、
配列番号７中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ１、配列番号８中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号９中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ３を含み；
前記重鎖可変領域が、
配列番号１０中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ１、配列番号１１中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号１２中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ３を含む、
前記抗体。
【請求項９】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
前記軽鎖可変領域が配列番号３０の配列を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記重鎖可変領域が配列番号３２の配列を含む、請求項１０または１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体がＩｇＧである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体がＩｇＧ１である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体がＦａｂ’断片である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体が一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、約５ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、約４ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体がＢＡＦＦ−Ｒタンパク質に結合される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
前記ＢＡＦＦ−Ｒタンパク質がヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
前記ＢＡＦＦ−Ｒタンパク質が細胞の一部を形成する、請求項１８または１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記ＢＡＦＦ−Ｒタンパク質が前記細胞の表面上で発現される、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
前記細胞がリンパ球様細胞である、請求項２１または２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
前記細胞がＢ細胞である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
前記細胞ががん細胞である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
前記がん細胞がリンパ腫細胞である、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項２８】
治療有効量の請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項３０】
がんの治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の請求項２９に記載のキメラ抗原受容体を対象へ投与し、それによって前記対象におけるがんを治療することを含む、前記方法。
【請求項３１】
がんの治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体を対象へ投与し、それによって前記対象におけるがんを治療することを含む、前記方法。
【請求項３２】
前記がんが、リンパ腫、白血病、または骨髄腫である、請求項３０または３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、またはバーキットリンパ腫である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記白血病が、リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、または有毛細胞白血病である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記骨髄腫が多発性骨髄腫である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
第２の治療剤を前記対象へ投与することをさらに含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療剤がＣＤ２０抗原と結合することができるキメラモノクローナル抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療剤がリツキシマブである、請求項３６または３７いずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
自己免疫疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療有効量の請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体を対象へ投与し、それによって前記対象における自己免疫疾患を治療することを含む、前記方法。
【請求項４０】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、または自己免疫性溶血性貧血である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
第２の治療剤を前記対象へ投与することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
細胞の分裂増殖を阻害する方法であって、
（ｉ）請求項１〜２６のいずれか一項に記載のＢＡＦＦ−Ｒ抗体と細胞を接触させ、それによって接触させた細胞を形成することと；
（ｉｉ）前記ＢＡＦＦ−Ｒ抗体が、前記接触させた細胞上のＢＡＦＦ−Ｒタンパク質を結合するようにし、それによって前記細胞の分裂増殖を阻害することと、
を含む、前記方法。
【請求項４３】
前記細胞がリンパ球様細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞がＢ細胞である、請求項４２または４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞ががん細胞である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞がリンパ腫細胞である、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ＢＡＦＦ−Ｒと約４ｎＭよりも低いＫＤで結合することができる、ヒト化Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）抗体。
【請求項４８】
ＢＡＦＦ−Ｒに約４ｎＭよりも低いＫＤで結合する、ヒト化Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）抗体。
【請求項４９】
前記抗体がＢＡＦＦ−Ｒ活性を誘導しない、請求項４７または４８のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項５０】
ヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質を発現するマウス線維芽細胞であって、前記ヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質が前記細胞の細胞表面上で発現される、前記マウス線維芽細胞。
【請求項５１】
前記ヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質が検出可能な部分を含む、請求項５０に記載のマウス線維芽細胞。
【請求項５２】
前記検出可能な部分が蛍光部分である、請求項５１に記載のマウス線維芽細胞。
【請求項５３】
前記検出可能な部分が増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）である、請求項５１または５２のいずれか一項に記載のマウス線維芽細胞。
【請求項５４】
抗ヒトＢＡＦＦ−Ｒ抗体を産生する方法であって、
（ｉ）請求項５０〜５３のいずれか一項に記載のマウス線維芽細胞をマウスへ投与し、それによって免疫付与されたＢＡＦＦ−Ｒマウスを形成することと；
（ｉｉ）前記免疫付与されたＢＡＦＦ−Ｒマウスからの脾細胞をヒトミエローマ細胞と融合し、それによってＢＡＦＦ−Ｒハイブリドーマ細胞を形成することと；
（ｉｉｉ）前記ＢＡＦＦ−Ｒハイブリドーマ細胞がＢＡＦＦ−Ｒ抗体を発現するようにし、それによって抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体を産生することと、
を含む、前記方法。
【請求項５５】
前記抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体が、請求項１または請求項８のいずれか一項に記載の抗体である、請求項５４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月６日に出願された米国仮特許出願第６２／３４６，３２４号の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
抗体療法は、血液学的悪性腫瘍を治療するクリニックにおいて利用可能な最も成功した免疫療法のうちの１つである。例示的な事例はリツキシマブであり、それはＣＤ２０を標的とし、Ｂ細胞リンパ腫に対して細胞毒性効果を誘発する。しかしながら、リツキシマブに関する主な関心事はリツキシマブ耐性の出現であり、それは、ＣＤ２０がダウンレギュレーションされ、したがって抗体が標的細胞と結合することを妨害するためであると考えられる。
【発明の概要】
【０００３】
軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）抗体が本明細書において提供される。軽鎖可変領域は、配列番号１中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ１、配列番号２中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号３中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ３を含む。重鎖可変領域は、配列番号４中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ１、配列番号５中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号６中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ３を含む。別の態様において、軽鎖可変領域は、配列番号７中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ１、配列番号８中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号９中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ３を含む。重鎖可変領域は、配列番号１０中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ１、配列番号１１中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号１２中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ３を含む。随意に、抗体はヒト化抗体である。開示される抗体の機能的断片も提供される。
【０００４】
ＢＡＦＦ−Ｒと約４ｎＭよりも低いＫＤで結合することができるヒト化Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）抗体またはその機能的断片が、提供される。
【０００５】
ＢＡＦＦ−Ｒと約４ｎＭよりも低いＫＤで結合するヒト化Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）抗体も、提供される。
【０００６】
本明細書において提供される抗体またはその機能的断片を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も、提供される。
【０００７】
ＢＡＦＦ−Ｒ抗体または抗体の機能的断片をコードする単離された核酸が、本明細書において提供される。
【０００８】
治療有効量の本明細書において開示されるようなＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物も提供される。
【０００９】
ヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質またはその機能的断片を発現するマウス線維芽細胞が提供され、ヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質またはその機能的断片は細胞の細胞表面上で発現される。
【００１０】
それを必要とする対象においてがんを治療する方法が提供される。方法は、治療有効量の本明細書において提供されるキメラ抗原受容体を対象へ投与し、それによって対象におけるがんを治療することを含む。
【００１１】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、治療有効量の本明細書において開示される抗体またはその機能的断片を対象へ投与し、それによって対象におけるがんを治療することを含んでさらに提供される。
【００１２】
それを必要とする対象において自己免疫疾患を治療する方法が提供される。方法は、治療有効量の対象を本明細書において開示されるような抗体またはその機能的断片を投与し、それによって対象における自己免疫疾患を治療することを含む。
【００１３】
細胞の分裂増殖を阻害する方法も提供される。方法は、本明細書において開示されるようなＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片と細胞を接触させ、それによって接触させた細胞を形成することを含む。ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片が、接触させた細胞上のＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合するようにし、それによって細胞の分裂増殖を阻害する。随意に、細胞はリンパ球様細胞である。
【００１４】
抗ヒトＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片を産生する方法が提供される。方法は、本明細書において提供されるようなＢＡＦＦ−Ｒタンパク質またはその断片を発現するマウス線維芽細胞をマウスへ投与し、それによって免疫付与されたＢＡＦＦ−Ｒマウスを形成することを含む。免疫付与されたＢＡＦＦ−Ｒマウスからの脾細胞をヒトミエローマ細胞と融合し、それによってＢＡＦＦ−Ｒハイブリドーマ細胞を形成する。次いでＢＡＦＦ−Ｒハイブリドーマ細胞が、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体を発現するようにし、それによって抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体を産生する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、ヒトＢＡＦＦ−Ｒに対する新規のモノクローナル抗体の生成及び特異性を示す、ＦＡＣＳ画像である。図１Ａは、マウス線維芽細胞（Ｌ細胞）におけるｈＢＡＦＦ−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞表面発現のＦＡＣＳ分析である。ＧＦＰ陽性細胞についてゲートして、操作されたＬ細胞クローン（右側プロット）を親Ｌ細胞（左側プロット）に比較する。クローンＤ２Ｃをさらなる研究のために選択した。図１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、細胞株及び患者サンプルと結合する抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体の蛍光カウントのＦＡＣＳトレースである。図１Ｂは、０．０５μｇ  ｍＡｂ／１０６細胞の濃度でＢＡＦＦ−Ｒ陽性のヒトＭＣＬ株（Ｍｉｎｏ、ＪｅＫｏ−１、ＲＥＣ−１、ＪＶＭ−１３及びＺ−１３８が含まれる）と結合する、親和性精製されたハイブリドーマｍＡｂ（Ｃ９０、Ｃ６７、Ｃ５５及びＣ５３）を示す。ＢＡＦＦ−Ｒ陰性２９３Ｔ胚腎臓細胞株を対照として使用した。図１Ｃは、ｈＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞と高濃度及び低濃度で結合する、キメラ抗体Ｃ５５及びＣ９０を示す。親Ｌ細胞及び二次抗ｈＩｇＧ−ＡＰＣ抗体のみを対照として使用した。図１Ｄは、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートキメラ抗体結合ＮＨＬ細胞株のパネルを示す。図１Ｅは、３つのタイプのＮＨＬ原発性患者サンプルと結合するキメラ抗体を示す。データは３つの独立した実験の代表である。図１Ｂ〜１Ｅのすべてについて、図中で示されるような上から下へのトレースは、図の下にまたは図の隣りに示された使用される変数（例えば抗体タイプまたは細胞タイプ）の上から下と相関する。
【図１−２】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、ヒトＢＡＦＦ−Ｒに対する新規のモノクローナル抗体の生成及び特異性を示す、ＦＡＣＳ画像である。図１Ａは、マウス線維芽細胞（Ｌ細胞）におけるｈＢＡＦＦ−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞表面発現のＦＡＣＳ分析である。ＧＦＰ陽性細胞についてゲートして、操作されたＬ細胞クローン（右側プロット）を親Ｌ細胞（左側プロット）に比較する。クローンＤ２Ｃをさらなる研究のために選択した。図１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、細胞株及び患者サンプルと結合する抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体の蛍光カウントのＦＡＣＳトレースである。図１Ｂは、０．０５μｇ  ｍＡｂ／１０６細胞の濃度でＢＡＦＦ−Ｒ陽性のヒトＭＣＬ株（Ｍｉｎｏ、ＪｅＫｏ−１、ＲＥＣ−１、ＪＶＭ−１３及びＺ−１３８が含まれる）と結合する、親和性精製されたハイブリドーマｍＡｂ（Ｃ９０、Ｃ６７、Ｃ５５及びＣ５３）を示す。ＢＡＦＦ−Ｒ陰性２９３Ｔ胚腎臓細胞株を対照として使用した。図１Ｃは、ｈＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞と高濃度及び低濃度で結合する、キメラ抗体Ｃ５５及びＣ９０を示す。親Ｌ細胞及び二次抗ｈＩｇＧ−ＡＰＣ抗体のみを対照として使用した。図１Ｄは、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートキメラ抗体結合ＮＨＬ細胞株のパネルを示す。図１Ｅは、３つのタイプのＮＨＬ原発性患者サンプルと結合するキメラ抗体を示す。データは３つの独立した実験の代表である。図１Ｂ〜１Ｅのすべてについて、図中で示されるような上から下へのトレースは、図の下にまたは図の隣りに示された使用される変数（例えば抗体タイプまたは細胞タイプ）の上から下と相関する。
【図１−３】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、ヒトＢＡＦＦ−Ｒに対する新規のモノクローナル抗体の生成及び特異性を示す、ＦＡＣＳ画像である。図１Ａは、マウス線維芽細胞（Ｌ細胞）におけるｈＢＡＦＦ−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞表面発現のＦＡＣＳ分析である。ＧＦＰ陽性細胞についてゲートして、操作されたＬ細胞クローン（右側プロット）を親Ｌ細胞（左側プロット）に比較する。クローンＤ２Ｃをさらなる研究のために選択した。図１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、細胞株及び患者サンプルと結合する抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体の蛍光カウントのＦＡＣＳトレースである。図１Ｂは、０．０５μｇ  ｍＡｂ／１０６細胞の濃度でＢＡＦＦ−Ｒ陽性のヒトＭＣＬ株（Ｍｉｎｏ、ＪｅＫｏ−１、ＲＥＣ−１、ＪＶＭ−１３及びＺ−１３８が含まれる）と結合する、親和性精製されたハイブリドーマｍＡｂ（Ｃ９０、Ｃ６７、Ｃ５５及びＣ５３）を示す。ＢＡＦＦ−Ｒ陰性２９３Ｔ胚腎臓細胞株を対照として使用した。図１Ｃは、ｈＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞と高濃度及び低濃度で結合する、キメラ抗体Ｃ５５及びＣ９０を示す。親Ｌ細胞及び二次抗ｈＩｇＧ−ＡＰＣ抗体のみを対照として使用した。図１Ｄは、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートキメラ抗体結合ＮＨＬ細胞株のパネルを示す。図１Ｅは、３つのタイプのＮＨＬ原発性患者サンプルと結合するキメラ抗体を示す。データは３つの独立した実験の代表である。図１Ｂ〜１Ｅのすべてについて、図中で示されるような上から下へのトレースは、図の下にまたは図の隣りに示された使用される変数（例えば抗体タイプまたは細胞タイプ）の上から下と相関する。
【図１−４】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、ヒトＢＡＦＦ−Ｒに対する新規のモノクローナル抗体の生成及び特異性を示す、ＦＡＣＳ画像である。図１Ａは、マウス線維芽細胞（Ｌ細胞）におけるｈＢＡＦＦ−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞表面発現のＦＡＣＳ分析である。ＧＦＰ陽性細胞についてゲートして、操作されたＬ細胞クローン（右側プロット）を親Ｌ細胞（左側プロット）に比較する。クローンＤ２Ｃをさらなる研究のために選択した。図１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、細胞株及び患者サンプルと結合する抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体の蛍光カウントのＦＡＣＳトレースである。図１Ｂは、０．０５μｇ  ｍＡｂ／１０６細胞の濃度でＢＡＦＦ−Ｒ陽性のヒトＭＣＬ株（Ｍｉｎｏ、ＪｅＫｏ−１、ＲＥＣ−１、ＪＶＭ−１３及びＺ−１３８が含まれる）と結合する、親和性精製されたハイブリドーマｍＡｂ（Ｃ９０、Ｃ６７、Ｃ５５及びＣ５３）を示す。ＢＡＦＦ−Ｒ陰性２９３Ｔ胚腎臓細胞株を対照として使用した。図１Ｃは、ｈＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞と高濃度及び低濃度で結合する、キメラ抗体Ｃ５５及びＣ９０を示す。親Ｌ細胞及び二次抗ｈＩｇＧ−ＡＰＣ抗体のみを対照として使用した。図１Ｄは、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートキメラ抗体結合ＮＨＬ細胞株のパネルを示す。図１Ｅは、３つのタイプのＮＨＬ原発性患者サンプルと結合するキメラ抗体を示す。データは３つの独立した実験の代表である。図１Ｂ〜１Ｅのすべてについて、図中で示されるような上から下へのトレースは、図の下にまたは図の隣りに示された使用される変数（例えば抗体タイプまたは細胞タイプ）の上から下と相関する。
【図１−５】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、ヒトＢＡＦＦ−Ｒに対する新規のモノクローナル抗体の生成及び特異性を示す、ＦＡＣＳ画像である。図１Ａは、マウス線維芽細胞（Ｌ細胞）におけるｈＢＡＦＦ−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞表面発現のＦＡＣＳ分析である。ＧＦＰ陽性細胞についてゲートして、操作されたＬ細胞クローン（右側プロット）を親Ｌ細胞（左側プロット）に比較する。クローンＤ２Ｃをさらなる研究のために選択した。図１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、細胞株及び患者サンプルと結合する抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体の蛍光カウントのＦＡＣＳトレースである。図１Ｂは、０．０５μｇ  ｍＡｂ／１０６細胞の濃度でＢＡＦＦ−Ｒ陽性のヒトＭＣＬ株（Ｍｉｎｏ、ＪｅＫｏ−１、ＲＥＣ−１、ＪＶＭ−１３及びＺ−１３８が含まれる）と結合する、親和性精製されたハイブリドーマｍＡｂ（Ｃ９０、Ｃ６７、Ｃ５５及びＣ５３）を示す。ＢＡＦＦ−Ｒ陰性２９３Ｔ胚腎臓細胞株を対照として使用した。図１Ｃは、ｈＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞と高濃度及び低濃度で結合する、キメラ抗体Ｃ５５及びＣ９０を示す。親Ｌ細胞及び二次抗ｈＩｇＧ−ＡＰＣ抗体のみを対照として使用した。図１Ｄは、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートキメラ抗体結合ＮＨＬ細胞株のパネルを示す。図１Ｅは、３つのタイプのＮＨＬ原発性患者サンプルと結合するキメラ抗体を示す。データは３つの独立した実験の代表である。図１Ｂ〜１Ｅのすべてについて、図中で示されるような上から下へのトレースは、図の下にまたは図の隣りに示された使用される変数（例えば抗体タイプまたは細胞タイプ）の上から下と相関する。
【図２−１】図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、ＢＡＦＦ−Ｒモノクローナル抗体がＢ細胞腫瘍株に対して特異的なインビトロの細胞毒性を表わしたことを示す、グラフである。抗体誘導性細胞毒性を、Ｃ５５、Ｃ９０またはリツキシマブ及びエフェクター（ＮＫ細胞または補体含有血清）によるインキュベーション後の、クロム−５１放出によって測定した。２０：１のＮＫエフェクター細胞：標的の比（Ｅ：Ｔ）。標的細胞の細胞特異的溶解のパーセンテージは以下の通りである。第１のパネルは、ＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞または対照の親Ｌ細胞を示し；第２及び第３のパネルは、ＢＡＦＦ−Ｒ陽性ＪｅＫｏ−１  ＭＣＬまたはＢＡＦＦ−Ｒ陰性Ｕ２６６多発性骨髄腫細胞を示し、変動する抗体濃度による用量応答曲線として示される。図２Ｂは、活性のある補体含有ヒト血清と混合された抗体（１：３希釈）の、ＣＤＣ感受性（Ｒａｊｉ）及びＣＤＣ耐性（Ｒａｊｉ−２Ｐ）に対する特異的溶解を示す。図２Ｃは、ＮＨＬ株ＪｅＫｏ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−６、Ｒａｊｉ及びＲＬに対する、ＮＫエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ＝２０：１）有りまたは無しのＢＡＦＦ−Ｒキメラ抗体によるＡＤＣＣ効果を示す。データは三重サンプルの平均±標準偏差として示される。＊両側スチューデントのｔ検定によってＮＫ細胞と比較して、Ｐ＜０．０５。
【図２−２】図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、ＢＡＦＦ−Ｒモノクローナル抗体がＢ細胞腫瘍株に対して特異的なインビトロの細胞毒性を表わしたことを示す、グラフである。抗体誘導性細胞毒性を、Ｃ５５、Ｃ９０またはリツキシマブ及びエフェクター（ＮＫ細胞または補体含有血清）によるインキュベーション後の、クロム−５１放出によって測定した。２０：１のＮＫエフェクター細胞：標的の比（Ｅ：Ｔ）。標的細胞の細胞特異的溶解のパーセンテージは以下の通りである。第１のパネルは、ＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞または対照の親Ｌ細胞を示し；第２及び第３のパネルは、ＢＡＦＦ−Ｒ陽性ＪｅＫｏ−１  ＭＣＬまたはＢＡＦＦ−Ｒ陰性Ｕ２６６多発性骨髄腫細胞を示し、変動する抗体濃度による用量応答曲線として示される。図２Ｂは、活性のある補体含有ヒト血清と混合された抗体（１：３希釈）の、ＣＤＣ感受性（Ｒａｊｉ）及びＣＤＣ耐性（Ｒａｊｉ−２Ｐ）に対する特異的溶解を示す。図２Ｃは、ＮＨＬ株ＪｅＫｏ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−６、Ｒａｊｉ及びＲＬに対する、ＮＫエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ＝２０：１）有りまたは無しのＢＡＦＦ−Ｒキメラ抗体によるＡＤＣＣ効果を示す。データは三重サンプルの平均±標準偏差として示される。＊両側スチューデントのｔ検定によってＮＫ細胞と比較して、Ｐ＜０．０５。
【図２−３】図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、ＢＡＦＦ−Ｒモノクローナル抗体がＢ細胞腫瘍株に対して特異的なインビトロの細胞毒性を表わしたことを示す、グラフである。抗体誘導性細胞毒性を、Ｃ５５、Ｃ９０またはリツキシマブ及びエフェクター（ＮＫ細胞または補体含有血清）によるインキュベーション後の、クロム−５１放出によって測定した。２０：１のＮＫエフェクター細胞：標的の比（Ｅ：Ｔ）。標的細胞の細胞特異的溶解のパーセンテージは以下の通りである。第１のパネルは、ＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞または対照の親Ｌ細胞を示し；第２及び第３のパネルは、ＢＡＦＦ−Ｒ陽性ＪｅＫｏ−１  ＭＣＬまたはＢＡＦＦ−Ｒ陰性Ｕ２６６多発性骨髄腫細胞を示し、変動する抗体濃度による用量応答曲線として示される。図２Ｂは、活性のある補体含有ヒト血清と混合された抗体（１：３希釈）の、ＣＤＣ感受性（Ｒａｊｉ）及びＣＤＣ耐性（Ｒａｊｉ−２Ｐ）に対する特異的溶解を示す。図２Ｃは、ＮＨＬ株ＪｅＫｏ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−６、Ｒａｊｉ及びＲＬに対する、ＮＫエフェクター細胞（Ｅ：Ｔ＝２０：１）有りまたは無しのＢＡＦＦ−Ｒキメラ抗体によるＡＤＣＣ効果を示す。データは三重サンプルの平均±標準偏差として示される。＊両側スチューデントのｔ検定によってＮＫ細胞と比較して、Ｐ＜０．０５。
【図３−１】図３Ａ及び３Ｂは、ＢＡＦＦ−Ｒモノクローナル抗体が原発性Ｂ細胞腫瘍に対してインビトロの抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導することを示す、グラフである。抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）効果を、Ｃ５５、Ｃ９０またはリツキシマブ及びエフェクター（ＮＫ細胞）によるインキュベーション後の、クロム−５１放出によって測定した。標的細胞の細胞特異的溶解のパーセンテージは以下の通りである。図３Ａは、ＮＨＬ患者サンプル（Ｅ：Ｔ＝２０：１または１０：１）を示し；図３Ｂは、リツキシマブ治療不応性患者からの原発性ＭＣＬ及びＣＬＬサンプル（Ｅ：Ｔ＝２０：１）を示す。データは三重サンプルの平均±標準偏差として示される。＊両側スチューデントのｔ検定によってＮＫ細胞と比較して、Ｐ＜０．０５。
【図３−２】図３Ａ及び３Ｂは、ＢＡＦＦ−Ｒモノクローナル抗体が原発性Ｂ細胞腫瘍に対してインビトロの抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導することを示す、グラフである。抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）効果を、Ｃ５５、Ｃ９０またはリツキシマブ及びエフェクター（ＮＫ細胞）によるインキュベーション後の、クロム−５１放出によって測定した。標的細胞の細胞特異的溶解のパーセンテージは以下の通りである。図３Ａは、ＮＨＬ患者サンプル（Ｅ：Ｔ＝２０：１または１０：１）を示し；図３Ｂは、リツキシマブ治療不応性患者からの原発性ＭＣＬ及びＣＬＬサンプル（Ｅ：Ｔ＝２０：１）を示す。データは三重サンプルの平均±標準偏差として示される。＊両側スチューデントのｔ検定によってＮＫ細胞と比較して、Ｐ＜０．０５。
【図４−１】図４Ａは、腫瘍の最小致死用量による０日目腫瘍の攻撃投与に後続する治療スケジュールを示す、概略図である。治療はＩＶ尾静脈注射から与えられた。図４Ｂ及び４Ｃは、Ｂ細胞腫瘍に対する、ヒトＢＡＦＦ−Ｒを標的とするキメラ抗体誘発インビボ治療有効性を示す、画像である。ルシフェラーゼ発現腫瘍：ＪｅＫｏ−１（ＭＣＬ）（図４Ｂ）またはＲＳ４；１１（ＡＬＬ）（図４Ｃ）により攻撃投与されたマウスの生物発光画像。実験群に、キメラＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂ（示されるようにＣ５５またはＣ９０）の治療を投与した。対照群マウスに、同じスケジュールでＰＢＳ、ＮＫ細胞単独、またはリツキシマブを投与した。データは３つの独立した実験の代表である。
【図４−２】図４Ａは、腫瘍の最小致死用量による０日目腫瘍の攻撃投与に後続する治療スケジュールを示す、概略図である。治療はＩＶ尾静脈注射から与えられた。図４Ｂ及び４Ｃは、Ｂ細胞腫瘍に対する、ヒトＢＡＦＦ−Ｒを標的とするキメラ抗体誘発インビボ治療有効性を示す、画像である。ルシフェラーゼ発現腫瘍：ＪｅＫｏ−１（ＭＣＬ）（図４Ｂ）またはＲＳ４；１１（ＡＬＬ）（図４Ｃ）により攻撃投与されたマウスの生物発光画像。実験群に、キメラＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂ（示されるようにＣ５５またはＣ９０）の治療を投与した。対照群マウスに、同じスケジュールでＰＢＳ、ＮＫ細胞単独、またはリツキシマブを投与した。データは３つの独立した実験の代表である。
【図４−３】図４Ａは、腫瘍の最小致死用量による０日目腫瘍の攻撃投与に後続する治療スケジュールを示す、概略図である。治療はＩＶ尾静脈注射から与えられた。図４Ｂ及び４Ｃは、Ｂ細胞腫瘍に対する、ヒトＢＡＦＦ−Ｒを標的とするキメラ抗体誘発インビボ治療有効性を示す、画像である。ルシフェラーゼ発現腫瘍：ＪｅＫｏ−１（ＭＣＬ）（図４Ｂ）またはＲＳ４；１１（ＡＬＬ）（図４Ｃ）により攻撃投与されたマウスの生物発光画像。実験群に、キメラＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂ（示されるようにＣ５５またはＣ９０）の治療を投与した。対照群マウスに、同じスケジュールでＰＢＳ、ＮＫ細胞単独、またはリツキシマブを投与した。データは３つの独立した実験の代表である。
【図５−１】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、キメラＢＡＦＦ−Ｒ抗体が薬物耐性リンパ腫モデル上でＡＤＣＣをインビトロで誘導することを示す、画像またはグラフである。図５Ａは、ＣＤ２０遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＨＤＲノックアウトに後続するＪｅＫｏ−１細胞上で結合するＣＤ２０を示す、ＦＡＣＳ分析のスキャッタープロットである。選択されたＣＤ２０−／−クローン番号２５についてのＣＤ２０発現を、野生型ＪｅＫｏ−１に比較した。ＡＤＣＣ効果を、Ｃ５５、Ｃ９０またはリツキシマブ及びエフェクターＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ＝２０：１）によるインキュベーション後の、クロム−５１放出によって測定した。標的細胞の細胞特異的溶解のパーセンテージは以下の通りである。リツキシマブ耐性ＪｅＫｏ−１−ＣＤ２０−ＫＯ（図５Ｂ）及びイブルチニブ耐性Ｚ−１３８及びＳＰ４９−ＩＲ（図５Ｃ）。すべてのデータは２つ以上の同一実験の代表である。データは三重サンプルの平均±標準偏差として示される。＊両側スチューデントのｔ検定によってＮＫ細胞と比較して、Ｐ＜０．０５。
【図５−２】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、キメラＢＡＦＦ−Ｒ抗体が薬物耐性リンパ腫モデル上でＡＤＣＣをインビトロで誘導することを示す、画像またはグラフである。図５Ａは、ＣＤ２０遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＨＤＲノックアウトに後続するＪｅＫｏ−１細胞上で結合するＣＤ２０を示す、ＦＡＣＳ分析のスキャッタープロットである。選択されたＣＤ２０−／−クローン番号２５についてのＣＤ２０発現を、野生型ＪｅＫｏ−１に比較した。ＡＤＣＣ効果を、Ｃ５５、Ｃ９０またはリツキシマブ及びエフェクターＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ＝２０：１）によるインキュベーション後の、クロム−５１放出によって測定した。標的細胞の細胞特異的溶解のパーセンテージは以下の通りである。リツキシマブ耐性ＪｅＫｏ−１−ＣＤ２０−ＫＯ（図５Ｂ）及びイブルチニブ耐性Ｚ−１３８及びＳＰ４９−ＩＲ（図５Ｃ）。すべてのデータは２つ以上の同一実験の代表である。データは三重サンプルの平均±標準偏差として示される。＊両側スチューデントのｔ検定によってＮＫ細胞と比較して、Ｐ＜０．０５。
【図５−３】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、キメラＢＡＦＦ−Ｒ抗体が薬物耐性リンパ腫モデル上でＡＤＣＣをインビトロで誘導することを示す、画像またはグラフである。図５Ａは、ＣＤ２０遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＨＤＲノックアウトに後続するＪｅＫｏ−１細胞上で結合するＣＤ２０を示す、ＦＡＣＳ分析のスキャッタープロットである。選択されたＣＤ２０−／−クローン番号２５についてのＣＤ２０発現を、野生型ＪｅＫｏ−１に比較した。ＡＤＣＣ効果を、Ｃ５５、Ｃ９０またはリツキシマブ及びエフェクターＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ＝２０：１）によるインキュベーション後の、クロム−５１放出によって測定した。標的細胞の細胞特異的溶解のパーセンテージは以下の通りである。リツキシマブ耐性ＪｅＫｏ−１−ＣＤ２０−ＫＯ（図５Ｂ）及びイブルチニブ耐性Ｚ−１３８及びＳＰ４９−ＩＲ（図５Ｃ）。すべてのデータは２つ以上の同一実験の代表である。データは三重サンプルの平均±標準偏差として示される。＊両側スチューデントのｔ検定によってＮＫ細胞と比較して、Ｐ＜０．０５。
【図６−１】薬物耐性Ｂ細胞腫瘍に対する、ヒトＢＡＦＦ−Ｒを標的とするキメラ抗体誘発インビボ治療有効性を示す、画像（図６Ａ及び６Ｂ）及びグラフ（図６Ｃ）である。ルシフェラーゼ発現腫瘍のＪｅＫｏ−１−ＣＤ２０−ＫＯ細胞（図６Ａ）またはイブルチニブ耐性Ｚ−１３８細胞（図６Ｂ）により攻撃投与され、図４中でのような抗体治療が後続した、マウスの生物発光画像。対照群マウスに、同じスケジュールでＰＢＳ、ＮＫ細胞単独、またはリツキシマブを投与した。図６Ｃは、（Ａ）及び（Ｂ）中で示されるマウスの８０日の無腫瘍曲線及び全生存曲線をそれぞれ示す。実験群とすべての対照群との間の無腫瘍率及び生存の差を、ログランク検定によって分析した（＊＊Ｐ＜０．００１）。データは３つの独立した実験の代表である。
【図６−２】薬物耐性Ｂ細胞腫瘍に対する、ヒトＢＡＦＦ−Ｒを標的とするキメラ抗体誘発インビボ治療有効性を示す、画像（図６Ａ及び６Ｂ）及びグラフ（図６Ｃ）である。ルシフェラーゼ発現腫瘍のＪｅＫｏ−１−ＣＤ２０−ＫＯ細胞（図６Ａ）またはイブルチニブ耐性Ｚ−１３８細胞（図６Ｂ）により攻撃投与され、図４中でのような抗体治療が後続した、マウスの生物発光画像。対照群マウスに、同じスケジュールでＰＢＳ、ＮＫ細胞単独、またはリツキシマブを投与した。図６Ｃは、（Ａ）及び（Ｂ）中で示されるマウスの８０日の無腫瘍曲線及び全生存曲線をそれぞれ示す。実験群とすべての対照群との間の無腫瘍率及び生存の差を、ログランク検定によって分析した（＊＊Ｐ＜０．００１）。データは３つの独立した実験の代表である。
【図６−３】薬物耐性Ｂ細胞腫瘍に対する、ヒトＢＡＦＦ−Ｒを標的とするキメラ抗体誘発インビボ治療有効性を示す、画像（図６Ａ及び６Ｂ）及びグラフ（図６Ｃ）である。ルシフェラーゼ発現腫瘍のＪｅＫｏ−１−ＣＤ２０−ＫＯ細胞（図６Ａ）またはイブルチニブ耐性Ｚ−１３８細胞（図６Ｂ）により攻撃投与され、図４中でのような抗体治療が後続した、マウスの生物発光画像。対照群マウスに、同じスケジュールでＰＢＳ、ＮＫ細胞単独、またはリツキシマブを投与した。図６Ｃは、（Ａ）及び（Ｂ）中で示されるマウスの８０日の無腫瘍曲線及び全生存曲線をそれぞれ示す。実験群とすべての対照群との間の無腫瘍率及び生存の差を、ログランク検定によって分析した（＊＊Ｐ＜０．００１）。データは３つの独立した実験の代表である。
【図７−１】図７Ａ及び７Ｂは抗ヒトＢＡＦＦ−Ｒモノクローナル抗体の生成及びクローン選択を示す。図７Ａは、Ｌ細胞クローンＤ２Ｃ（それは細胞内ドメイン上のＣ末端ＧＦＰタグを備えたヒトｈＢＡＦＦ−Ｒを安定的に発現する）を使用して、示されたスケジュールに従ってＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫付与したことを示す、概略図である。脾臓組織を２０日目に収穫し、Ｂ細胞ハイブリドーマクローンを確立した。図７Ｂは、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを使用する、５つのハイブリドーマ上清からのＥＬＩＳＡ結果を示す、表である。クローン５３、５５、６７及び９０はＢＡＦＦ−Ｒ特異的ｍＡｂを産生したが、クローン３７は産生しなかった（他の陰性クローンの代表）。
【図７−２】図７Ａ及び７Ｂは抗ヒトＢＡＦＦ−Ｒモノクローナル抗体の生成及びクローン選択を示す。図７Ａは、Ｌ細胞クローンＤ２Ｃ（それは細胞内ドメイン上のＣ末端ＧＦＰタグを備えたヒトｈＢＡＦＦ−Ｒを安定的に発現する）を使用して、示されたスケジュールに従ってＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫付与したことを示す、概略図である。脾臓組織を２０日目に収穫し、Ｂ細胞ハイブリドーマクローンを確立した。図７Ｂは、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを使用する、５つのハイブリドーマ上清からのＥＬＩＳＡ結果を示す、表である。クローン５３、５５、６７及び９０はＢＡＦＦ−Ｒ特異的ｍＡｂを産生したが、クローン３７は産生しなかった（他の陰性クローンの代表）。
【図８】選択されたハイブリドーマクローンがＭＣＬ細胞と結合するという確認を示す、フローサイトメトリーの結果である。Ｍｉｎｏ（マントル細胞リンパ腫）細胞株及び２９３Ｔ（陰性対照）細胞株へのハイブリドーマクローン５３、５５、６７及び９０の上清（１／１０、１／５０及び１／２００の希釈）の結合を、抗マウスＩｇＧ−ＡＰＣにより遂行されるフローサイトメトリーによって査定した。
【図９】精製されたｍＡｂのヒトＢＡＦＦ−Ｒへの用量依存的結合を示す、グラフである。ハイブリドーマクローン５３、５５、６７、９０からのマウスｍＡｂを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。連続的に希釈された（１μｇ／１０６細胞〜１．６ｎｇ／１０６細胞）精製マウスｍＡｂのＭｉｎｏ細胞への結合を、抗マウスＩｇＧ−ＡＰＣ二次抗体によるフローサイトメトリーによって査定した。
【図１０】ｈＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂがインビトロで非ホジキンリンパ腫細胞株を認識したことを示す、ＦＡＣＳスクリーニング分析の結果である。マウスｍＡｂクローン５５及び９０は、高用量（２μｇ  ｍＡｂ／１０６細胞）及び低用量（０．０５μｇ  ｍＡｂ／１０６細胞）で、追加の細胞株：ＪｅＫｏ−１（マントル細胞リンパ腫）、ＳＵ−ＤＨＬ−６（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）及びＲＬ（濾胞性リンパ腫）を結合した。フローサイトメトリー分析を抗マウスＩｇＧ−ＡＰＣにより遂行した。図中で示されるような上から下へのトレースは、図の隣りに示された使用される変数（例えば抗体タイプまたは細胞タイプ）の上から下と相関する。
【図１１】ｈＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂがリンパ腫患者サンプルを認識したことを示す、グラフである。マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び濾胞性リンパ腫の患者サンプルを、高用量（２μｇ／１０６細胞）及び低用量（０．０５μｇ／１０６細胞）で、マウスｍＡｂ  Ｃ５５及びＣ９０により染色した。フローサイトメトリー分析を抗マウスＩｇＧ−ＡＰＣにより遂行した。図中で示されるような上から下へのトレースは、図の下に示された使用される変数（例えば抗体タイプまたは細胞タイプ）の左から右と相関する。
【図１２】キメラ抗体がＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞に対してＡＤＣＣを誘導したことを示す、グラフである。ＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｄ２Ｃ  Ｌ細胞（標的）をクロム−５１により標識し、後続して、キメラｍＡｂ＋ＮＫ細胞（エフェクター対標的の比、２０：１）により一晩インキュベーションした。培養上清を放出されたクロムについて分析した。
【図１３】腫瘍細胞に対する細胞毒性のためにＮＫ細胞に要求されるキメラ抗体を示す、グラフである。ＪｅＫｏ−１細胞（標的）をクロム−５１により標識した。細胞を、キメラｍＡｂ（Ｃ５５、Ｃ９０またはリツキシマブ）により、及び２０：１のエフェクター対標的の比で、ＮＫ細胞（エフェクター）有りまたは無しでインキュベーションした。キメラ抗体を５０〜０．００５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。培養上清を放出されたクロムについて分析した。
【図１４】ｈＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂがＢＡＦＦ／ＢＡＦＦ−Ｒ相互作用をブロックしたことを示す、ＦＡＣＳの結果である。ＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｄ２Ｃ  Ｌ細胞クローンをＣ９０（０〜１０００ｎｇ／１０６細胞）により４℃で４５分間インキュベーションし、後続して、組み換えＢＡＦＦリガンド（０．５μｇ／１０６細胞）により４℃で９０分間インキュベーションした。フローサイトメトリーを遂行し、抗ＢＡＦＦ−ＰＥについてゲートした。シグナルプロットは、各々のｍＡｂ濃度の存在下におけるＢＡＦＦ／ＢＡＦＦ−Ｒの結合シグナルを示す。シグナルプロットにおいて示される濃度は、ＦＡＣＳの結果の各々の上部に示される。
【図１５】限定的な内部移行がＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂにより観察されたことを示す、ＦＡＣＳの結果である。Ｍｉｎｏ細胞をｍＡｂ  Ｃ９０（０．０５μｇ／１０６細胞）により４℃で２０分間インキュベーションし、後続して、３７℃で１時間インキュベーションした。フローサイトメトリー分析を抗マウスＩｇＧ−ＡＰＣにより遂行した。細胞を、表面局在化抗体（アウト）及び細胞表面染色の喪失（イン）についてゲートした。
【図１６−１】ＣＤ２０ノックアウトクローンがＣＲＩＳＰＲにより生成されたことを示す、ＦＡＣＳの結果（図１６Ａ）及びゲル画像（１６Ｂ）である。ＪｅＫｏ−１のＣＤ２０ノックアウトクローンは、ＣＤ２０遺伝子座でＲＦＰを置換する商業的ＣＲＩＳＰＲ／ＨＤＲシステムにより生成した。図１６Ａでは、クローンを、ＣＤ２０−／ＲＦＰ＋発現についてフローサイトメトリーによってスクリーニングし選別した。図１６Ｂでは、抗ＣＤ２０抗体によるウエスタンブロットを、ＣＤ２０−／ＲＦＰ＋クローンからの全細胞溶解物について遂行した。β−アクチンをローディング対照としてブロットした。図１６Ｃは、ＢＡＦＦ−Ｒ／ＲＦＰ＋発現についてスクリーニングして、ＢＡＦＦ−Ｒの発現がＣＤ２０のＣＲＩＳＰＲ／ＨＤＲ操作によって影響を受けていなかったことを確認した、図１６Ａ中と同じクローンについてのＦＡＣＳの結果を示す。
【図１６−２】ＣＤ２０ノックアウトクローンがＣＲＩＳＰＲにより生成されたことを示す、ＦＡＣＳの結果（図１６Ａ）及びゲル画像（１６Ｂ）である。ＪｅＫｏ−１のＣＤ２０ノックアウトクローンは、ＣＤ２０遺伝子座でＲＦＰを置換する商業的ＣＲＩＳＰＲ／ＨＤＲシステムにより生成した。図１６Ａでは、クローンを、ＣＤ２０−／ＲＦＰ＋発現についてフローサイトメトリーによってスクリーニングし選別した。図１６Ｂでは、抗ＣＤ２０抗体によるウエスタンブロットを、ＣＤ２０−／ＲＦＰ＋クローンからの全細胞溶解物について遂行した。β−アクチンをローディング対照としてブロットした。図１６Ｃは、ＢＡＦＦ−Ｒ／ＲＦＰ＋発現についてスクリーニングして、ＢＡＦＦ−Ｒの発現がＣＤ２０のＣＲＩＳＰＲ／ＨＤＲ操作によって影響を受けていなかったことを確認した、図１６Ａ中と同じクローンについてのＦＡＣＳの結果を示す。
【図１６−３】ＣＤ２０ノックアウトクローンがＣＲＩＳＰＲにより生成されたことを示す、ＦＡＣＳの結果（図１６Ａ）及びゲル画像（１６Ｂ）である。ＪｅＫｏ−１のＣＤ２０ノックアウトクローンは、ＣＤ２０遺伝子座でＲＦＰを置換する商業的ＣＲＩＳＰＲ／ＨＤＲシステムにより生成した。図１６Ａでは、クローンを、ＣＤ２０−／ＲＦＰ＋発現についてフローサイトメトリーによってスクリーニングし選別した。図１６Ｂでは、抗ＣＤ２０抗体によるウエスタンブロットを、ＣＤ２０−／ＲＦＰ＋クローンからの全細胞溶解物について遂行した。β−アクチンをローディング対照としてブロットした。図１６Ｃは、ＢＡＦＦ−Ｒ／ＲＦＰ＋発現についてスクリーニングして、ＢＡＦＦ−Ｒの発現がＣＤ２０のＣＲＩＳＰＲ／ＨＤＲ操作によって影響を受けていなかったことを確認した、図１６Ａ中と同じクローンについてのＦＡＣＳの結果を示す。
【図１７−１】正常なＢ細胞に対するＢＡＦＦ−Ｒ結合の特徴評価を示す、ＦＡＣＳの結果である。健康なドナーからのＰＢＭＣを、ＡＰＣコンジュゲートＣ９０キメラ抗体、及び（Ａ）リンパ球マーカーパネル（抗ＣＤ２０−ＰＥ、抗ＣＤ３−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、及び抗ＣＤ５６−ＦＩＴＣ）または（Ｂ）骨髄系細胞マーカーパネル（抗ＣＤ４５−ＰＥ、抗ＣＤ１５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、及び抗ＣＤ１４−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）により共染色した。各々の特異的免疫細胞亜集団を、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体との結合についてゲートし分析した。
【図１７−２】正常なＢ細胞に対するＢＡＦＦ−Ｒ結合の特徴評価を示す、ＦＡＣＳの結果である。健康なドナーからのＰＢＭＣを、ＡＰＣコンジュゲートＣ９０キメラ抗体、及び（Ａ）リンパ球マーカーパネル（抗ＣＤ２０−ＰＥ、抗ＣＤ３−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、及び抗ＣＤ５６−ＦＩＴＣ）または（Ｂ）骨髄系細胞マーカーパネル（抗ＣＤ４５−ＰＥ、抗ＣＤ１５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、及び抗ＣＤ１４−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）により共染色した。各々の特異的免疫細胞亜集団を、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体との結合についてゲートし分析した。
【図１８】図１８Ａ及び１８Ｂは、末梢血からの正常な免疫細胞におけるｈＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂの特徴評価を示す、ＦＡＣＳの結果である。マウスｍＡｂクローン５５及び９０を、単離されたヒト免疫細胞亜集団への結合について試験した。Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を、商業的な特異的細胞タイプ単離キットにより単離し、Ｃ５５及びＣ９０（０．０５μｇ  ｍＡｂ／１０６細胞）により染色した。フローサイトメトリー分析を抗マウスＩｇＧにより遂行した。ＰＢＭＣからの骨髄系細胞をＣＤ６６ｂ＋についてゲートし、ｍＡｂＣ５５及びＣ９０についての染色を分析した。図中で示されるような上から下へのトレースは、図の隣りに示された使用される変数（例えば抗体タイプまたは細胞タイプ）の上から下と相関する。
【図１９−１】図１９Ａ及び１９Ｂは免疫組織化学画像である。図１９Ａでは、免疫組織化学を遂行して、抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体の組織特異性を同定した。１ｍｇ／ｍＬの抗体の１：１５０希釈を使用して、組織サンプルを染色した。ヒトＢＡＦＦ−Ｒに対するＣ５５  ｍＡｂの組織特異性（２０×対物レンズ）：１ｍｇ／ｍｌのストックの１：１５０希釈。図１９Ｂでは、免疫組織化学を追加で扁桃腺組織及び乳房組織で遂行して、抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体の組織特異性を同定した。１ｍｇ／ｍＬの抗体の１：１５０希釈を使用して、組織サンプルを染色した。ヒトＢＡＦＦ−Ｒに対するｍＡｂの組織特異性（上部パネル：扁桃腺組織；下部パネル：乳房組織；２０×対物レンズ）。
【図１９−２】図１９Ａ及び１９Ｂは免疫組織化学画像である。図１９Ａでは、免疫組織化学を遂行して、抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体の組織特異性を同定した。１ｍｇ／ｍＬの抗体の１：１５０希釈を使用して、組織サンプルを染色した。ヒトＢＡＦＦ−Ｒに対するＣ５５  ｍＡｂの組織特異性（２０×対物レンズ）：１ｍｇ／ｍｌのストックの１：１５０希釈。図１９Ｂでは、免疫組織化学を追加で扁桃腺組織及び乳房組織で遂行して、抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体の組織特異性を同定した。１ｍｇ／ｍＬの抗体の１：１５０希釈を使用して、組織サンプルを染色した。ヒトＢＡＦＦ−Ｒに対するｍＡｂの組織特異性（上部パネル：扁桃腺組織；下部パネル：乳房組織；２０×対物レンズ）。
【図２０−１】図２０Ａ及び２０Ｂは、ヒト化バリアントに対して遂行された機能的なインビトロのアッセイを示す、グラフである。図２０Ａでは、ＥＬＩＳＡアッセイをＣ９０の９つのヒト化バリアントに対して遂行した。ヒトＢＡＦＦ−Ｒの組み換え細胞外ドメインを抗原として使用した。抗体を０．７８〜１００ｎｇ／ｍＬの変動濃度で投与し、それらの吸光度を４５０ｎｍで採取した。図２０Ｂでは、ヒト化バリアントをクロム放出アッセイにおいてＪｅＫｏ−１細胞に対して試験した。細胞にクロムを取込ませ、後続して、ヒト化Ｃ９０バリアント及びエフェクターＮＫ細胞により処理した。細胞を６時間インキュベーションし、上清をクロム量のためにサンプリングした。
【図２０−２】図２０Ａ及び２０Ｂは、ヒト化バリアントに対して遂行された機能的なインビトロのアッセイを示す、グラフである。図２０Ａでは、ＥＬＩＳＡアッセイをＣ９０の９つのヒト化バリアントに対して遂行した。ヒトＢＡＦＦ−Ｒの組み換え細胞外ドメインを抗原として使用した。抗体を０．７８〜１００ｎｇ／ｍＬの変動濃度で投与し、それらの吸光度を４５０ｎｍで採取した。図２０Ｂでは、ヒト化バリアントをクロム放出アッセイにおいてＪｅＫｏ−１細胞に対して試験した。細胞にクロムを取込ませ、後続して、ヒト化Ｃ９０バリアント及びエフェクターＮＫ細胞により処理した。細胞を６時間インキュベーションし、上清をクロム量のためにサンプリングした。
【図２１−１】図２１Ａ及び２１Ｂは、様々なリンパ腫株の特異的細胞毒性についてのヒト化抗体Ｃ９０−４及びＣ９０−５の分析を示す、グラフである。図２１Ａでは、ＪｅＫｏ−１、Ｚ１３８及びＲＳ４に、ヒト化抗体Ｃ９０−４及びＣ９０−５によるクロム放出アッセイを行った。０〜５μｇ／ｍＬの間の濃度で抗体を細胞株へ投与し、２０：１のＥ：Ｔ比でＮＫ細胞により６時間インキュベーションした。細胞上清をクロム含有量について分析した。図２１Ｂでは、ＬＹ−１０、ＭＥＣ−２、ＲＬ及びＲａｊｉリンパ腫株に、ヒト化抗体Ｃ９０−４及びＣ９０−５によるクロム放出アッセイを行った。５μｇ／ｍＬで抗体を細胞株へ投与し、２０：１のＥ：Ｔ比でＮＫ細胞により６時間インキュベーションした。細胞上清をクロム含有量について分析した。
【図２１−２】図２１Ａ及び２１Ｂは、様々なリンパ腫株の特異的細胞毒性についてのヒト化抗体Ｃ９０−４及びＣ９０−５の分析を示す、グラフである。図２１Ａでは、ＪｅＫｏ−１、Ｚ１３８及びＲＳ４に、ヒト化抗体Ｃ９０−４及びＣ９０−５によるクロム放出アッセイを行った。０〜５μｇ／ｍＬの間の濃度で抗体を細胞株へ投与し、２０：１のＥ：Ｔ比でＮＫ細胞により６時間インキュベーションした。細胞上清をクロム含有量について分析した。図２１Ｂでは、ＬＹ−１０、ＭＥＣ−２、ＲＬ及びＲａｊｉリンパ腫株に、ヒト化抗体Ｃ９０−４及びＣ９０−５によるクロム放出アッセイを行った。５μｇ／ｍＬで抗体を細胞株へ投与し、２０：１のＥ：Ｔ比でＮＫ細胞により６時間インキュベーションした。細胞上清をクロム含有量について分析した。
【図２２−１】図２２Ａ及び２２Ｂは、原発性ＭＣＬサンプルに対する結合及び細胞毒性について試験されたヒト化Ｃ９０抗体最有力候補を示す、ＦＡＣＳの結果及びグラフである。図２２Ａでは、３つの原発性ＭＣＬ腫瘍サンプルをＣＤ２０−ＡＰＣ及びビオチン化ヒト化Ｃ９０により共染色し、後続して、ＰＥコンジュゲートストレプトアビジンを使用してシグナルを検出した。図２２Ｂでは、原発性腫瘍サンプルに対するヒト化Ｃ９０の細胞毒性を、クロム放出アッセイにより評価した。細胞をクロム−５１によりインキュベーションし、後続して、抗体及びエフェクターＮＫ細胞により処理した。一晩のインキュベーションに後続して、上清をサンプリングし、クロム含有量を決定した。
【図２２−２】図２２Ａ及び２２Ｂは、原発性ＭＣＬサンプルに対する結合及び細胞毒性について試験されたヒト化Ｃ９０抗体最有力候補を示す、ＦＡＣＳの結果及びグラフである。図２２Ａでは、３つの原発性ＭＣＬ腫瘍サンプルをＣＤ２０−ＡＰＣ及びビオチン化ヒト化Ｃ９０により共染色し、後続して、ＰＥコンジュゲートストレプトアビジンを使用してシグナルを検出した。図２２Ｂでは、原発性腫瘍サンプルに対するヒト化Ｃ９０の細胞毒性を、クロム放出アッセイにより評価した。細胞をクロム−５１によりインキュベーションし、後続して、抗体及びエフェクターＮＫ細胞により処理した。一晩のインキュベーションに後続して、上清をサンプリングし、クロム含有量を決定した。
【図２３】ビオチン化ヒト化Ｃ９０−４及びＣ９０−５のフローサイトメトリー分析を示す、ＦＡＣＳの結果である。抗体を使用してＰＢＭＣを染色し、後続して、蛍光ＰＥストレプトアビジンプローブにより検出した。ＰＢＭＣを、顆粒球マーカーＣＤ６６ｂ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、単球マーカーＣＤ１４−ＰＥ−Ｃｙ７、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０−ＡＰＣ、Ｔ細胞マーカーＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ５、及びＮＫ細胞マーカーＣＤ５６−ＦＩＴＣでも標識した。ＰＢＭＣをフローサイトメトリーによって分析した。
【図２４】ＢＡＦＦ−Ｒキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞のインビボの腫瘍治療を示す、画像である。ドナーＴ細胞を、４−１ＢＢモチーフを備えたＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインの上にキメラＣ５５抗ＢＡＦＦ−Ｒ一本鎖（ｓＦｖ）を発現するように操作した。ＮＳＧマウスを、最小致死用量（１×１０６細胞）のＮＨＬ  ＪｅＫｏ−１−Ｌｕｃｉ細胞により攻撃投与した。腫瘍が生物発光画像化によって検出可能であるまで、腫瘍細胞を生着させた（９日目）。腫瘍攻撃投与の９及び１５日後に、Ｔ細胞療法（５×１０６ＣＡＲ−Ｔ細胞）または対照のいずれかをマウスに投与した。マウスを３日ごとに厳密にモニタリング及び画像化して腫瘍発達を追跡した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
とりわけ、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むＢＡＦＦ−Ｒ抗体が本明細書において提供される。抗体の機能的断片も提供される。本明細書において提供されるＢＡＦＦ−Ｒ抗体及びその機能的断片は、ヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質へ結合することができ、ＢＡＦＦ−Ｒ発現する細胞（例えばＢ細胞）に抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する。随意に、本明細書において提供される抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部を形成する。したがって、本明細書において提供される組成物及び方法は、とりわけ、がん（例えばＢ細胞悪性腫瘍）または自己免疫疾患の治療のために使用され得る。
【００１７】
本明細書において参照される時、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＡＦＦ受容体またはＢＡＦＦ−Ｒタンパク質としては、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）の組み換え形態または天然に存在する形態のうちの任意のものが挙げられ、それらは、ＢＡＦＦ−Ｒ活性を維持する（例えばＢＡＦＦ−Ｒに比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％内の活性）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）またはそのバリアントもしくはホモログとしても公知である。随意に、バリアントまたはホモログは、天然に存在するＢＡＦＦ−Ｒに比較して、全体の配列または配列の部分（例えば５０、１００、１５０または２００の連続的なアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒは、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９６ＲＪ３またはそれへの実質的な同一性を有するバリアントもしくはホモログによって同定されるタンパク質に実質的に同一である。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒは、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号Ｑ９Ｄ８Ｄ０またはそれへの実質的な同一性を有するバリアントもしくはホモログによって同定されるタンパク質に実質的に同一である。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒは、ＮＣＢＩ参照番号ＧＩ：１６４４５０２７またはそれへの実質的な同一性を有するバリアントもしくはホモログによって同定されるタンパク質に実質的に同一である。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒは、ＮＣＢＩ参照番号ＧＩ：１６３０６４８１またはそれへの実質的な同一性を有するバリアントもしくはホモログによって同定されるタンパク質に実質的に同一である。
【００１８】
軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むＢ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）抗体が提供される。軽鎖可変領域は、配列番号１中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ１、配列番号２中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号３中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ３を含む。そして、重鎖可変領域は、配列番号４中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ１、配列番号５中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号６中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ３を含む。随意に、軽鎖可変領域は、配列番号７中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ１、配列番号８中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号９中で明記される通りのＣＤＲ  Ｌ３を含む。そして、重鎖可変領域は、配列番号１０中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ１、配列番号１１中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号１２中で明記される通りのＣＤＲ  Ｈ３を含む。随意に、抗体はヒト化抗体である。開示される抗体の機能的断片も提供される。
【００１９】
本明細書において提供されるようなヒト化抗体は、ＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができ、本明細書において提供されるＢＡＦＦ−Ｒ抗体の少なくとも１つのマウスＣＤＲまたはその機能的断片もしくはバリアント（例えば配列番号１または７のＣＤＲ  Ｌ１、配列番号２または８のＣＤＲ  Ｌ２、配列番号３または９のＣＤＲ  Ｌ３、配列番号４または１０のＣＤＲ  Ｈ１、配列番号５または１１のＣＤＲ  Ｈ２、配列番号７または１３のＣＤＲ  Ｈ３）を含む。ＣＤＲの機能的断片は完全なＣＤＲアミノ酸配列の部分であるが、機能的断片を含有する抗体またはその断片は、抗原（例えばＢＡＦＦ−Ｒ）へそれでもまだ結合することができる。ＣＤＲの機能的なバリアントは、ＣＤＲ配列への１つまたは複数の変化を備えたＣＤＲであるが、機能的なバリアントを含有する抗体またはその機能的断片は、抗原（例えばＢＡＦＦ−Ｒ）へそれでもまだ結合することができる。例えば、ＣＤＲをコードする核酸配列の機能的なバリアントは、１つまたは複数の変化を含み得るが、それでもまだＣＤＲの同じアミノ酸配列をコードする。さらに、抗体またはその機能的断片が抗原へ結合する限り、ＣＤＲのポリペプチド配列の機能的なバリアントは１つまたは複数のアミノ酸変化を含むことができる。したがって、ＣＤＲの機能的断片またはバリアントは、典型的には、抗原（例えばＢＡＦＦ−Ｒ）への抗体結合のために要求されるアミノ酸残基を含む。ヒト化抗体が少なくとも１つのＣＤＲを含む場合に、少なくとも１つのＣＤＲまたはその機能的断片は、ドナー抗体に由来する。随意に、ドナー抗体はマウス抗体である。当業者は、少なくとも１つのマウスＣＤＲを含むヒト化抗体がドナー抗体に由来する少なくとも１つのマウスＣＤＲを備えたヒト化抗体であり、追加のＣＤＲがアクセプター抗体に由来することを直ちに認識するだろう（例えば軽鎖が合計３つのＣＤＲを含み、重鎖が合計３つのＣＤＲを含む場合）。
【００２０】
本明細書において提供されるＢＡＦＦ−Ｒ抗体がヒト化抗体である場合に、抗体は、ヒト化重鎖可変領域及び／またはヒト化軽鎖可変領域を含み得る。随意に、ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域は、組み合わせられた１つのマウスＣＤＲまたはマウスＣＤＲの機能的断片もしくはバリアントを含む。したがって、ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域は、６つのＣＤＲのうちの少なくとも１つがマウスＣＤＲである、６つの組み合わせられたＣＤＲを含み得る。ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域が、組み合わせられた１つのマウスＣＤＲを含む場合に、ヒト化軽鎖可変領域またはヒト化重鎖可変領域は１つのマウスＣＤＲを含む。例えば、ヒト化抗体は、ドナー抗体に由来するＣＤＲ  Ｌ３（例えばマウス、本明細書においてマウスＣＤＲ  Ｌ３とも称される）、ならびにアクセプター抗体に由来するＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２及びＣＤＲ  Ｈ３（すなわちヒト）を含み得る。
【００２１】
随意に、ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域は、２つの組み合わせられたマウスＣＤＲを含む。ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域が、組み合わせられた２つのマウスＣＤＲを含む場合に、ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域は各々１つのマウスＣＤＲを含む（ｉ）か、ヒト化軽鎖可変領域は２つのマウスＣＤＲを含む（ｉｉ）か、または、ヒト化重鎖可変領域は２つのマウスＣＤＲを含む（ｉｉｉ）。例えば、ヒト化抗体は、ドナー抗体に由来するＣＤＲ  Ｌ３及びＣＤＲ  Ｈ３（例えばマウス、本明細書においてそれぞれマウスＣＤＲ  Ｌ３及びマウスＣＤＲ  Ｈ３とも称される）、ならびにアクセプター抗体に由来するＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｈ１、及びＣＤＲ  Ｈ２（すなわちヒト）を含み得る。
【００２２】
随意に、ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域は、３つの組み合わせられたマウスＣＤＲを含む。ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域が、組み合わせられた３つのマウスＣＤＲを含む場合に、ヒト化軽鎖可変領域は１つのマウスＣＤＲを含み、ヒト化重鎖可変領域は２つのマウスＣＤＲを含み得る（ｉ）か、ヒト化軽鎖可変領域は２つのマウスＣＤＲを含み、ヒト化重鎖可変領域は１つのマウスＣＤＲを含む（ｉｉ）か、ヒト化軽鎖可変領域は３つのマウスＣＤＲを含む（ｉｉｉ）か、または、ヒト化重鎖可変領域は３つのマウスＣＤＲを含む（ｉｖ）。例えば、ヒト化抗体は、ドナー抗体に由来するＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ３及びＣＤＲ  Ｌ２（例えばマウス、本明細書においてそれぞれマウスＣＤＲ  Ｌ３、マウスＣＤＲ  Ｈ３及びマウスＣＤＲ  Ｌ２とも称される）、ならびにアクセプター抗体に由来するＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｈ１、及びＣＤＲ  Ｈ２（すなわちヒト）を含み得る。
【００２３】
ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域は、４つの組み合わせられたマウスＣＤＲを含み得る。ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域が、組み合わせられた４つのマウスＣＤＲを含む場合に、ヒト化軽鎖可変領域は１つのマウスＣＤＲを含み、ヒト化重鎖可変領域は３つのマウスＣＤＲを含む（ｉ）か、ヒト化軽鎖可変領域は３つのマウスＣＤＲを含み、ヒト化重鎖可変領域は１つのマウスＣＤＲを含む（ｉｉ）か、または、ヒト化軽鎖可変領域は２つのマウスＣＤＲを含み、ヒト化重鎖可変領域は２つのマウスＣＤＲを含む（ｉｉｉ）。例えば、ヒト化抗体は、ドナー抗体に由来するＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ３、ＣＤＲ  Ｌ２及びＣＤＲ  Ｌ１（例えばマウス、本明細書においてそれぞれマウスＣＤＲ  Ｌ３、マウスＣＤＲ  Ｈ３、マウスＣＤＲ  Ｌ２及びマウスＣＤＲ  Ｌ１とも称される）、ならびにアクセプター抗体に由来するＣＤＲ  Ｈ１、及びＣＤＲ  Ｈ２（すなわちヒト）を含み得る。
【００２４】
ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域は各々、少なくとも１つのマウスＣＤＲを含み得る。ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域が各々、少なくとも１つのマウスＣＤＲを含む場合に、ヒト化軽鎖可変領域は少なくとも１つのマウスＣＤＲを含み、ヒト化重鎖可変領域は少なくとも１つのマウスＣＤＲを含む。したがって、ヒト化軽鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｌ１を含み、ヒト化重鎖はマウスＣＤＲ  Ｈ１を含み得る。随意に、マウスＣＤＲ  Ｌ１は配列番号１のアミノ酸配列を含み、マウスＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４のアミノ酸配列を含む。随意に、マウスＣＤＲ  Ｌ１は配列番号１のアミノ酸配列であり、マウスＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４のアミノ酸配列である。随意に、ヒト化軽鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｌ２を含み、ヒト化重鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｈ２を含む。随意に、マウスＣＤＲ  Ｌ２は配列番号２のアミノ酸配列を含み、マウスＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５のアミノ酸配列を含む。随意に、マウスＣＤＲ  Ｌ２は配列番号２のアミノ酸配列であり、マウスＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５のアミノ酸配列である。随意に、ヒト化軽鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｌ３を含み、ヒト化重鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｈ３を含む。随意に、マウスＣＤＲ  Ｌ３は配列番号３のアミノ酸配列を含み、マウスＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６のアミノ酸配列を含む。随意に、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号３のアミノ酸配列であり、マウスＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６のアミノ酸配列である。
【００２５】
随意に、マウスＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７のアミノ酸配列を含み、マウスＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１０のアミノ酸配列を含む。随意に、マウスＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７のアミノ酸配列であり、マウスＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１０のアミノ酸配列である。随意に、ヒト化軽鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｌ２を含み、ヒト化重鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｈ２を含む。随意に、マウスＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８のアミノ酸配列を含み、マウスＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１１のアミノ酸配列を含む。随意に、マウスＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８のアミノ酸配列であり、マウスＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１１のアミノ酸配列である。随意に、ヒト化軽鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｌ３を含み、ヒト化重鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｈ３を含む。随意に、マウスＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９のアミノ酸配列を含み、マウスＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１２のアミノ酸配列を含む。随意に、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９のアミノ酸配列であり、マウスＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１２のアミノ酸配列である。
【００２６】
マウスＣＤＲ  Ｌ３及びマウスＣＤＲ  Ｈ３の存在は、ヒト化抗体のＢＡＦＦ−Ｒへの結合のために十分であり得る。したがって、ヒト化抗体は、マウスＣＤＲ  Ｌ１、マウスＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｈ１またはマウスＣＤＲ  Ｈ２を含まなくてもよい。ヒト化抗体がマウスＣＤＲ  Ｌ１、マウスＣＤＲ  Ｌ２、マウスＣＤＲ  Ｈ１またはマウスＣＤＲ  Ｈ２を含まない場合に、ヒト化抗体は、アクセプター抗体（すなわちヒト）に由来するＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｈ１またはＣＤＲ  Ｈ２を含む。したがって、マウスＣＤＲ  Ｌ１、マウスＣＤＲ  Ｌ２、マウスＣＤＲ  Ｈ１またはマウスＣＤＲ  Ｈ２を含まないヒト化抗体は、ドナー抗体（例えばマウス、ラット、ウサギ）からのＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｈ１またはＣＤＲ  Ｈ２を含まないが、アクセプター抗体（すなわちヒト）からのＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｈ１またはＣＤＲ  Ｈ２を含む。したがって、ヒト化軽鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｌ１またはマウスＣＤＲ  Ｌ２を含まなくてもよく、ヒト化重鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｈ１またはマウスＣＤＲ  Ｈ２を含まない。随意に、ヒト化軽鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｌ１及びマウスＣＤＲ  Ｌ２を含まず、ヒト化重鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｈ１及びマウスＣＤＲ  Ｈ２を含まない。
【００２７】
随意に、ヒト化軽鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｌ２及びマウスＣＤＲ  Ｌ３を含み、ヒト化重鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｈ２及びマウスＣＤＲ  Ｈ３を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｌ１、マウスＣＤＲ  Ｌ２及びマウスＣＤＲ  Ｌ３を含み、ヒト化重鎖可変領域はマウスＣＤＲ  Ｈ１、マウスＣＤＲ  Ｈ２及びマウスＣＤＲ  Ｈ３を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は、配列番号１中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ１、配列番号２中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号３中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ３を含み、ヒト化重鎖可変領域は、配列番号４中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ１、配列番号５中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号６中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ３を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は、配列番号７中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ１、配列番号８中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号９中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ３を含み、ヒト化重鎖可変領域は、配列番号１０中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ１、配列番号１１中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号１２中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ３を含む。
【００２８】
ＣＤＲ及びＦＲの位置はＫａｂａｔナンバリングシステムによって定義され得る（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１））。同様に、抗体の軽鎖または重鎖内の個別の残基によって占められる位置は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによって定義され得る。したがって、ヒト化抗体のヒト化軽鎖及びヒト化重鎖内での結合のために要求される残基の所在位置は、当該技術分野において周知であるように、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従った残基の位置によって定義され得る。上記のように、ヒト化抗体は、ドナー抗体（例えばマウス）からのＣＤＲ及びヒト抗体からの可変領域フレームワーク（ＦＲ）を有する抗体であり得る。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒト化抗体中で正しい場所にＣＤＲを保持するとされる。アミノ末端から進行して、これらの領域は、軽鎖についてＦＲ  Ｌ１、ＦＲ  Ｌ２、ＦＲ  Ｌ３及びＦＲ  Ｌ４ならびに重鎖についてＦＲ  Ｈ１、ＦＲ  Ｈ２、ＦＲ  Ｈ３及びＦＲ  Ｈ４と、それぞれ表記される。フレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を含む、ヒト化抗体が本明細書において提供される。随意に、これらの残基は、ヒト化抗体のエピトープ結合のために重要である。エピトープ結合（例えばＢＡＦＦ−Ｒ結合）に関与（または重要）であるフレームワーク領域残基は、本明細書において結合フレームワーク領域残基と称される。結合フレームワーク領域残基は、ヒト化軽鎖可変領域のフレームワーク領域（すなわちＦＲ  Ｌ１、ＦＲ  Ｌ２、ＦＲ  Ｌ３、ＦＲ  Ｌ４）中に存在し得るか、または、それらは、ヒト化重鎖可変領域のフレームワーク（すなわちＦＲ  Ｈ１、ＦＲ  Ｈ２、ＦＲ  Ｈ３、ＦＲ  Ｈ４）中に存在し得る。ヒト化軽鎖のＦＲ  Ｌ３領域中に存在する結合フレームワーク残基は、ＦＲ  Ｌ３結合フレームワーク領域残基と本明細書において称される。したがって、ヒト化重鎖のＦＲ  Ｈ３領域中に存在する結合フレームワーク領域残基は、ＦＲ  Ｈ３結合フレームワーク領域残基と本明細書において称される。
【００２９】
随意に、ヒト化抗体は少なくとも１つの結合フレームワーク領域残基を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は少なくとも１つの結合フレームワーク領域残基を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は、１つまたは複数のＦＲ  Ｌ１、ＦＲ  Ｌ２、ＦＲ  Ｌ３またはＦＲ  Ｌ４結合フレームワーク領域残基を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は１つまたは複数のＦＲ  Ｌ１結合フレームワーク領域残基を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は１つまたは複数のＦＲ  Ｌ２結合フレームワーク領域残基を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は１つまたは複数のＦＲ  Ｌ３結合フレームワーク領域残基を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は１つまたは複数のＦＲ  Ｌ４結合フレームワーク領域残基を含む。随意に、ヒト化重鎖可変領域は、１つまたは複数のＦＲ  Ｈ１、ＦＲ  Ｈ２、ＦＲ  Ｈ３またはＦＲ  Ｈ４結合フレームワーク領域残基を含む。随意に、ヒト化重鎖可変領域は１つまたは複数のＦＲ  Ｈ１結合フレームワーク領域残基を含む。随意に、ヒト化重鎖可変領域は１つまたは複数のＦＲ  Ｈ２結合フレームワーク領域残基を含む。随意に、ヒト化重鎖可変領域は１つまたは複数のＦＲ  Ｈ３結合フレームワーク領域残基を含む。随意に、ヒト化重鎖可変領域は１つまたは複数のＦＲ  Ｈ４結合フレームワーク領域残基を含む。
【００３０】
ヒト化軽鎖可変領域は少なくとも１つの結合フレームワーク領域残基（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０以上の残基）を含み、ヒト化重鎖可変領域は少なくとも１つの結合フレームワーク領域残基（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０以上の残基）を含み得る。ヒト化抗体内の結合フレームワーク領域残基の位置は、ＣＤＲ残基の位置に類似するＫａｂａｔナンバリングシステムによって定義され得る。
【００３１】
随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置７に対応する位置でセリンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置８に対応する位置でプロリンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置１５に対応する位置でバリンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置２２に対応する位置でスレオニンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置２４に対応する位置でグルタミンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置４１に対応する位置でグリシンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置４２に対応する位置でリジンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置４３に対応する位置でアラニンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置４４に対応する位置でプロリンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置５６に対応する位置でスレオニンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置７２に対応する位置でスレオニンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置７３に対応する位置でフェニルアラニンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置７９に対応する位置でグルタミンを含む。随意に、軽鎖可変領域はＫａｂａｔ位置１０４に対応する位置でバリンを含む。
【００３２】
随意に、軽鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ位置７に対応する位置でセリン、Ｋａｂａｔ位置８に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置１５に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置２２に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置２４に対応する位置でグルタミンもしくはセリン、Ｋａｂａｔ位置４１に対応する位置でグリシン、Ｋａｂａｔ位置４２に対応する位置でリジン、Ｋａｂａｔ位置４３に対応する位置でアラニンもしくはスレオニン、Ｋａｂａｔ位置４４に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置５６に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置７２に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置７３に対応する位置でフェニルアラニンもしくはリジン、Ｋａｂａｔ位置７９に対応する位置でグルタミン、またはＫａｂａｔ位置１０４に対応する位置でバリンを含む。
【００３３】
随意に、軽鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ位置７に対応する位置でセリン、Ｋａｂａｔ位置８に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置１５に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置２２に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置２４に対応する位置でグルタミンまたはセリン、Ｋａｂａｔ位置４１に対応する位置でグリシン、Ｋａｂａｔ位置４２に対応する位置でリジン、Ｋａｂａｔ位置４３に対応する位置でアラニンまたはスレオニン、Ｋａｂａｔ位置４４に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置５６に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置７２に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置７３に対応する位置でフェニルアラニンまたはリジン、Ｋａｂａｔ位置７９に対応する位置でグルタミン、及びＫａｂａｔ位置１０４に対応する位置でバリンを含む。
【００３４】
随意に、軽鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ位置７に対応する位置でセリン、Ｋａｂａｔ位置８に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置１５に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置２２に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置２４に対応する位置でグルタミンもしくはセリン、Ｋａｂａｔ位置４１に対応する位置でグリシン、Ｋａｂａｔ位置４２に対応する位置でリジン、Ｋａｂａｔ位置４３に対応する位置でアラニンもしくはスレオニン、Ｋａｂａｔ位置４４に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置５６に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置７２に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置７３に対応する位置でフェニルアラニンもしくはリジン、Ｋａｂａｔ位置７９に対応する位置でグルタミン、またはＫａｂａｔ位置１０４に対応する位置でバリンである、結合フレームワーク領域残基を含む。
【００３５】
随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置１０に対応する位置でスレオニンまたはアラニンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置１１に対応する位置でリジンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置１２に対応する位置でバリンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置１５に対応する位置でスレオニンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置１９に対応する位置でスレオニンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置２３に対応する位置でスレオニンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置４１に対応する位置でプロリンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置４４に対応する位置でアラニンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置６１に対応する位置でプロリンまたはスレオニンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置６６に対応する位置でアルギニンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置７０に対応する位置でスレオニンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置７５に対応する位置でリジンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置７９に対応する位置でバリンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置８１に対応する位置でスレオニンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置８２に対応する位置でメチオニンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置８２Ｂに対応する位置でアスパラギンを含む。随意に、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ位置８２Ｃに対応する位置でメチオニンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置８４に対応する位置でプロリンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置８５に対応する位置でバリンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置１０８に対応する位置でリジンを含む。随意に、重鎖可変領域はＫａｂａｔ位置１０９に対応する位置でバリンを含む。
【００３６】
随意に、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ位置１０に対応する位置でスレオニンもしくはアラニン、Ｋａｂａｔ位置１１に対応する位置でリジン、Ｋａｂａｔ位置１２に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置１５に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置１９に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置２３に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置４１に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置４４に対応する位置でアラニン、プロリン、Ｋａｂａｔ位置６１に対応する位置でセリンもしくはスレオニン、Ｋａｂａｔ位置６６に対応する位置でアルギニン、Ｋａｂａｔ位置７０に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置７５に対応する位置でリジン、Ｋａｂａｔ位置７９に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置８１に対応する位置でスレオニンもしくはリジン、Ｋａｂａｔ位置８２に対応する位置でメチオニン、Ｋａｂａｔ位置８２Ｂに対応する位置でアスパラギン、Ｋａｂａｔ位置８２Ｃに対応する位置でメチオニン、Ｋａｂａｔ位置８４に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置８５に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置１０８に対応する位置でリジン、またはＫａｂａｔ位置１０９に対応する位置でバリンを含む。
【００３７】
随意に、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ位置１０に対応する位置でスレオニンもしくはアラニン、Ｋａｂａｔ位置１１に対応する位置でリジン、Ｋａｂａｔ位置１２に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置１５に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置１９に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置２３に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置４１に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置４４に対応する位置でアラニン、プロリン、Ｋａｂａｔ位置６１に対応する位置でセリンもしくはスレオニン、Ｋａｂａｔ位置６６に対応する位置でアルギニン、Ｋａｂａｔ位置７０に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置７５に対応する位置でリジン、Ｋａｂａｔ位置７９に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置８１に対応する位置でスレオニンもしくはリジン、Ｋａｂａｔ位置８２に対応する位置でメチオニン、Ｋａｂａｔ位置８２Ｂに対応する位置でアスパラギン、Ｋａｂａｔ位置８２Ｃに対応する位置でメチオニン、Ｋａｂａｔ位置８４に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置８５に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置１０８に対応する位置でリジン、及びＫａｂａｔ位置１０９に対応する位置でバリンを含む。
【００３８】
随意に、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔ位置１０に対応する位置でスレオニンもしくはアラニン、Ｋａｂａｔ位置１１に対応する位置でリジン、Ｋａｂａｔ位置１２に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置１５に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置１９に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置２３に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置４１に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置４４に対応する位置でアラニン、プロリン、Ｋａｂａｔ位置６１に対応する位置でセリンもしくはスレオニン、Ｋａｂａｔ位置６６に対応する位置でアルギニン、Ｋａｂａｔ位置７０に対応する位置でスレオニン、Ｋａｂａｔ位置７５に対応する位置でリジン、Ｋａｂａｔ位置７９に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置８１に対応する位置でスレオニンもしくはリジン、Ｋａｂａｔ位置８２に対応する位置でメチオニン、Ｋａｂａｔ位置８２Ｂに対応する位置でアスパラギン、Ｋａｂａｔ位置８２Ｃに対応する位置でメチオニン、Ｋａｂａｔ位置８４に対応する位置でプロリン、Ｋａｂａｔ位置８５に対応する位置でバリン、Ｋａｂａｔ位置１０８に対応する位置でリジン、またはＫａｂａｔ位置１０９に対応する位置でバリンである、結合フレームワーク領域残基を含む。
【００３９】
マウスＣＤＲ  Ｌ１、マウスＣＤＲ  Ｌ２またはマウスＣＤＲ  Ｌ３を含むヒト化軽鎖可変領域、及びマウスＣＤＲ  Ｈ１またはマウスＣＤＲ  Ｈ２またはマウスＣＤＲ  Ｈ３を含むヒト化重鎖可変領域を含む、ヒト化ＢＡＦＦ−Ｒ抗体が提供される。ヒト化軽鎖可変領域は、配列番号１中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ１、配列番号２中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ２、または配列番号３中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ３を含み得る。ヒト化軽鎖可変領域は、配列番号１中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ１、配列番号２中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号３中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ３を含み得る。ヒト化重鎖可変領域は、配列番号４中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ１、配列番号５中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ２、または配列番号６中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ３を含み得る。ヒト化重鎖可変領域は、配列番号４中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ１、配列番号５中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号６中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ３を含み得る。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は配列番号１中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ１を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は配列番号２中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ２を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は配列番号３中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ３を含む。随意に、ヒト化重鎖可変領域は配列番号４中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ１を含む。随意に、ヒト化重鎖可変領域は配列番号５中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ２を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は配列番号６中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ３を含む。さらなる実施形態において、ヒト化軽鎖可変領域は少なくとも１つの結合フレームワーク領域残基を含む。他のさらなる実施形態において、ヒト化重鎖可変領域は少なくとも１つの結合フレームワーク領域残基を含む。
【００４０】
マウスＣＤＲ  Ｌ１、マウスＣＤＲ  Ｌ２またはマウスＣＤＲ  Ｌ３を含むヒト化軽鎖可変領域、及びマウスＣＤＲ  Ｈ１またはマウスＣＤＲ  Ｈ２またはマウスＣＤＲ  Ｈ３を含むヒト化重鎖可変領域を含む、ヒト化ＢＡＦＦ−Ｒ抗体が提供される。ヒト化軽鎖可変領域は、配列番号７中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ１、配列番号８中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ２、または配列番号９中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ３を含み得る。ヒト化軽鎖可変領域は、配列番号７中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ１、配列番号８中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ２、及び配列番号９中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ３を含み得る。ヒト化重鎖可変領域は、配列番号１０中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ１、配列番号１１中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ２、または配列番号１２中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ３を含み得る。ヒト化重鎖可変領域は、配列番号１０中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ１、配列番号１１中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ２、及び配列番号１２中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ３を含み得る。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は配列番号７中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ１を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は配列番号８中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ２を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は配列番号９中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｌ３を含む。随意に、ヒト化重鎖可変領域は配列番号１０中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ１を含む。随意に、ヒト化重鎖可変領域は配列番号１１中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ２を含む。随意に、ヒト化軽鎖可変領域は配列番号１２中で明記される通りのマウスＣＤＲ  Ｈ３を含む。さらなる実施形態において、ヒト化軽鎖可変領域は少なくとも１つの結合フレームワーク領域残基を含む。他のさらなる実施形態において、ヒト化重鎖可変領域は少なくとも１つの結合フレームワーク領域残基を含む。
【００４１】
随意に、軽鎖可変領域は、配列番号１８、配列番号２０、または配列番号２２の配列を含む。随意に、軽鎖可変領域は、配列番号１８の配列を含む。随意に、軽鎖可変領域は、配列番号２０の配列を含む。随意に、軽鎖可変領域は、配列番号２２の配列を含む。随意に、軽鎖可変領域は、配列番号１８の配列である。随意に、軽鎖可変領域は、配列番号２０の配列である。随意に、軽鎖可変領域は、配列番号２２の配列である。随意に、重鎖可変領域は、配列番号２４、配列番号２６、または配列番号２８の配列を含む。随意に、重鎖可変領域は、配列番号２４の配列を含む。随意に、重鎖可変領域は、配列番号２６の配列を含む。随意に、重鎖可変領域は、配列番号２８の配列を含む。随意に、重鎖可変領域は、配列番号２４の配列である。随意に、重鎖可変領域は、配列番号２６の配列である。随意に、重鎖可変領域は、配列番号２８の配列である。したがって、別の態様において、ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域を含むヒト化ＢＡＦＦ−Ｒ抗体が提供され、そこで、ヒト化軽鎖可変領域は配列番号１８の配列を含み、重鎖可変領域は配列番号２４の配列を含む。別の態様において、ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域を含むヒト化ＢＡＦＦ−Ｒ抗体が提供され、そこで、ヒト化軽鎖可変領域は配列番号２０の配列を含み、重鎖可変領域は配列番号２６の配列を含む。別の態様において、ヒト化軽鎖可変領域及びヒト化重鎖可変領域を含むヒト化ＢＡＦＦ−Ｒ抗体が提供され、そこで、ヒト化軽鎖可変領域は配列番号２２の配列を含み、重鎖可変領域は配列番号２８の配列を含む。
【００４２】
随意に、抗体はキメラ抗体である。随意に、軽鎖可変領域は、配列番号１４の配列を含む。随意に、重鎖可変領域は、配列番号１６の配列を含む。随意に、軽鎖可変領域は、配列番号１４の配列である。随意に、重鎖可変領域は、配列番号１６の配列である。したがって、別の態様において、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むキメラＢＡＦＦ−Ｒ抗体が提供され、そこで、軽鎖可変領域は配列番号１４の配列を含み、重鎖可変領域は配列番号１６の配列を含む。
【００４３】
随意に、軽鎖可変領域は、配列番号３０の配列を含む。随意に、重鎖可変領域は、配列番号３２の配列を含む。随意に、軽鎖可変領域は、配列番号３０の配列である。随意に、重鎖可変領域は、配列番号３２の配列である。したがって、別の態様において、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むキメラＢＡＦＦ−Ｒ抗体が提供され、そこで、軽鎖可変領域は配列番号３０の配列を含み、重鎖可変領域は配列番号３２の配列を含む。
【００４４】
抗体が本明細書において列挙される各々の事例において、機能的断片は使用され得る。したがって、例えば、重鎖（例えば定常領域及び可変領域を含む）及び軽鎖（例えば定常領域及び可変領域を含む）を含み得る、Ｆａｂ’断片が提供される。随意に、Ｆａｂ’断片は、ヒト化重鎖（例えば定常領域及び可変領域を含む）及びヒト化軽鎖（例えば、定常領域及び可変領域を含む）を含む。
【００４５】
随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその断片はヒト定常領域を含む。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその断片はＩｇＧである。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその断片はＩｇＧ１である。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその断片はＩｇＧ２である。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその断片はＩｇＧ３である。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその断片はＩｇＧ４である。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその断片はＩｇＡである。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその断片はＩｇＭである。
【００４６】
随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその断片は一本鎖抗体である。一本鎖抗体は可変軽鎖及び可変重鎖を含む。当業者は、免疫グロブリン抗体（それは２つの同一ペアのポリペプチド鎖を含み、各々のペアは１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する）とは対照的に、一本鎖抗体が単一軽鎖及び単一重鎖を含むことを、直ちに認識するだろう。そして各々の軽鎖及び重鎖は、２つの領域：標的抗原の結合に関与する可変（「Ｖ」）領域（すなわち可変軽鎖及び可変重鎖）、及び免疫系の他の構成要素と相互作用する定常（「Ｃ」）領域からなる。一本鎖抗体中の可変軽鎖及び可変重鎖は、リンカーペプチドを介して連結され得る。一本鎖抗体のリンカーペプチドについての例は、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４２（４８７７）：４２３−６（１９８８）中で記載される。ｓｃＦｖ抗体を作製する方法が記載されている。Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）；及びＶａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９−３１４（１９９６）を参照されたい。簡潔には、免疫付与された動物からのＢ細胞からのｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを調製する。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域についての特異的プライマーを使用して、ｃＤＮＡを増幅する。ＰＣＲ産物を精製し、核酸配列を連結する。リンカーペプチドが所望されるならば、ペプチドをコードする核酸配列を重鎖核酸配列と軽鎖核酸配列との間に挿入する。ｓｃＦｖをコードする核酸はベクターの中へ挿入され、適切な宿主細胞中で発現される。
【００４７】
抗体またはその機能的断片が特異的エピトープ（例えばＢＡＦＦ−Ｒ）と結合する能力は、平衡解離定数（ＫＤ）によって記載され得る。本明細書において定義されるような平衡解離定数（ＫＤ）は、ＢＡＦＦ−Ｒタンパク質へのＢＡＦＦ−Ｒ抗体の解離速度（Ｋ−オフ）及び会合速度（Ｋ−オン）の比である。それは以下の式：ＫＤ＝Ｋ−オフ／Ｋ−オン、によって記載される。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体は、約５ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体は、約４．５ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体は、約４ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体は、約３．５ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体は、約３ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体は、約２．５ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体は、約２ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体は、約１．５ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体は、約１ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体は、約０．５ｎＭよりも低い平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。
【００４８】
随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、約０．５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、約１ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、約１．５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、約２ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、約２．５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、約３ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、約３．５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、約４ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、約４．５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、約５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合することができる。
【００４９】
随意に、ＢＡＦＦ−Ｒと約４ｎＭよりも低いＫＤで結合することができる提供されるヒト化Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）抗体が、提供される。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒと約４ｎＭよりも低いＫＤで結合するヒト化Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）抗体が、提供される。随意に、抗体はＢＡＦＦ−Ｒ活性を誘導しない。
【００５０】
随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体はＢＡＦＦ−Ｒタンパク質へ結合される。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒタンパク質はヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質である。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒタンパク質は、ＮＣＢＩ遺伝子識別番号１１５６５０によって同定される核酸配列によってコードされる。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒタンパク質は細胞の一部を形成する。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒタンパク質は前記細胞の表面上に発現される。随意に、細胞はリンパ球様細胞である。随意に、細胞はＢ細胞である。随意に、細胞はがん細胞である。随意に、がん細胞はリンパ腫細胞である。
【００５１】
様々な診断用部分及び治療用部分ならびにその組み合わせは、本明細書において提供されるＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片（その実施形態を含む）へコンジュゲートされ得、それによって、高度に安定的及び／もしくは多用性のある薬物送達ならびに／または診断組成物を提供する。随意に、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は治療用部分または診断用部分を含む。随意に、治療用部分または診断用部分は、化学的リンカーを介してＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片へ結合される。随意に、化学的リンカーは共有結合リンカーまたは非共有結合リンカーである。抗体への治療用部分のコンジュゲートのための技法は周知である（例えばＡｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（編）中のページ２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５））；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（編）、ページ６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（編）、ページ４７５−５０６（１９８５）；及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照）。本明細書において使用される時、抗体医薬コンジュゲートまたはＡＤＣという用語は、抗体またはその機能的断片へコンジュゲートされた治療用部分、またはそうでなければ共有結合された治療用部分を指す。
【００５２】
本明細書において提供されるような治療用部分という用語は、その平易な通常の意味に従って使用され、それを必要とする対象へ与えられた場合に治療利益（例えば治療されている根底にある障害の予防、根絶、改善）を有する一価化合物を指す。本明細書において提供されるような治療用部分としては、ペプチド、タンパク質、核酸、核酸類似体、小分子、抗体、酵素、プロドラッグ、細胞毒性剤（例えば毒素）が限定されずに挙げられ、これらには、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、及びグルココルチコイドが含まれるがこれらに限定されない。随意に、治療用部分は、本明細書において記載されるような抗がん剤または化学療法剤である。随意に、治療用部分は、核酸部分、ペプチド部分または小分子薬物部分である。随意に、治療用部分は核酸部分である。随意に、治療用部分は抗体部分である。随意に、治療用部分はペプチド部分である。随意に、治療用部分は小分子薬物部分である。随意に、治療用部分はヌクレアーゼである。随意に、治療用部分は免疫促進物質である。随意に、治療用部分は毒素である。随意に、治療用部分はヌクレアーゼである。
【００５３】
本明細書において提供される抗体またはその機能的断片を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も、本明細書において提供される。
【００５４】
本明細書において提供されるＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片（その実施形態を含む）をコードする単離された核酸が、提供される。単離された核酸によってコードされるＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、本出願（上の記載及び実施例切片を含む）を通して詳細に記載される。例えば、核酸は、少なくとも１つのＣＤＲ、エピトープの結合に関与する特異的残基、または結合フレームワーク残基をコードし得る。例えば、核酸は、配列番号１の配列を含む軽鎖をコードし得る。
【００５５】
随意に、単離された核酸は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２９、または配列番号３１の配列を含む。随意に、単離された核酸は、配列番号１３の配列及び配列番号１５の配列を含む。随意に、単離された核酸は、配列番号２９の配列及び配列番号３１の配列を含む。
【００５６】
随意に、単離された核酸は、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号２７の配列を含む。随意に、単離された核酸は、配列番号１７の配列及び配列番号２３の配列を含む。随意に、単離された核酸は、配列番号１９の配列及び配列番号２５の配列を含む。随意に、単離された核酸は、配列番号２１の配列及び配列番号２７の配列を含む。
【００５７】
治療有効量の本明細書において提供されるＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００５８】
本明細書において提供されるような治療有効量は、その意図された目的を達成するのに有効な量を指す。特定の適用のために有効な実際の量は、とりわけ治療されている病態に依存するだろう。疾患を治療する方法において投与される場合に、本明細書において記載される医薬組成物は、所望される結果（例えば標的分子（例えばＢＡＦＦ−Ｒ）の活性を修飾すること、及び／または、疾患症状（例えばがん、自己免疫疾患）の進行を低減、消失もしくは減速すること）を達成するのに有効な活性のあるヒト化抗体の量を含有するだろう。本明細書において提供されるＢＡＦＦ−Ｒ抗体の治療有効量の決定は、特に本明細書における詳細な開示に照らして、当業者の能力内で十分に行われる。
【００５９】
許容される担体、賦形剤または安定化物質は用いられる投薬量及び濃度でレシピエントへ非毒性であり、典型的には、５．０〜８．０（随意に６．０〜７．０）のｐＨでバッファー（リン酸塩、クエン酸塩または酢酸塩等）；等張にするための塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び同種のもの等）；抗酸化物質；防腐物質；低分子量ポリペプチド；タンパク質；親水性ポリマー（ポリソルベート８０等）；アミノ酸（グリシン等）；炭水化物；キレート剤；糖；及び当業者に公知の他の標準的な成分（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版、Ｌｏｙｄ  Ｖ．Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））を含む。ｍＡｂは、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば１〜１０ｍｇ／ｍｌまたは１０〜５０ｍｇ／ｍｌ、例えば５、１０、２０、３０、４０、５０または６０ｍｇ／ｍｌ）の濃度で存在し得る。
【００６０】
抗体（例えばヒト化抗体）または本明細書において記載されるようなその機能的断片を含む、医薬組成物は、当技術分野において公知の多様な方法によって投与され得る。経路及び／または投与モードは、所望される結果に依存して変動する。随意に、投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内もしくは皮下であるか、または標的の部位に近位に投与される。薬学的に許容される賦形剤は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊柱、表皮の投与（例えば注射または点滴によって）に好適であり得る。
【００６１】
抗体またはその機能的断片の医薬組成物は、周知のルーチンに当技術分野において実践された方法に従って調製され得る。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版、Ｌｏｙｄ  Ｖ．Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）；及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、治療有効用量または有効用量のヒト化抗体は、医薬組成物中で用いられる。提供されるヒト化抗体は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される投薬形態へと製剤化され得る。投薬量レジメンは、至適の所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調整される。例えば、単一ボーラスは投与され得るか、複数の分割用量は経時的に投与され得るか、または、用量は治療状況の要件によって指摘されるように比例して低減もしくは増加され得る。他の治療法または薬剤と組み合わせてヒト化抗体を製剤化することは有利であり得る。投与の容易性及び投薬量の均一性のために、非経口組成物を投薬量単位形態で製剤化することは有利であり得る。投薬量単位形態は、本明細書において使用される時、治療される対象のための一体型投薬量として適した物理的に分離した単位を指し；各々の単位は、要求される医薬賦形剤と共同して、所望される治療上の効果を産生することが意図される既定の量のヒト化抗体を含有する。
【００６２】
医薬組成物中の実際の投薬量レベルの活性成分は、患者への毒性無しに、特定の患者、組成物及び投与モードについて所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように、変動され得る。選択される投薬レベルは、様々な薬物動態因子に依存し、それらには、用いられる特定の組成物の活性、投与経路、投与の時間、用いられる特定の抗体の排泄の率、治療の継続期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全体的な健康及び従来の病歴、ならびに同種の因子が含まれる。
【００６３】
医師または獣医師は、医薬組成物中で用いられる抗体またはその機能断片の用量を、所望される治療効果の達成に要求されるものよりも低いレベルで開始し、所望される効果が達成されるまで徐々に投薬量を増加させることができる。一般に、組成物の有効用量は、異なる因子（治療される具体的な疾患または病態、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトまたは動物であるか、投与される他の医薬物、及び処置が予防または治療であるか、が挙げられる）に依存して、変動し得る。治療投薬量は、安全性及び有効性を至適化するように力価測定する必要がある。抗体による投与のために、投薬量は、宿主体重について約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ（通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ）の範囲である。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇの体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇの体重であり得るか、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な治療レジームは、２もしくは３週間ごとに１回、または月に１回、または３〜６か月ごとに１回の投与を伴う。
【００６４】
本明細書において提供されるＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片は、複数の機会で投与され得る。単一投薬量の間の間隔は、週１回、月１回または年１回であり得る。間隔は、患者中のヒト化抗体の血中レベルを測定することによって指摘されるように、不規則でもあり得る。いくつかの方法において、投薬量は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、及びいくつかの方法において、２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調整される。あるいは、抗体は持続放出製剤として投与され得、その場合には、よりそれほど頻繁でない投与が要求される。投薬量及び頻度は患者中での抗体の半減期に依存して変動する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体及び非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。投与の投薬量及び頻度は、処置が予防または治療であるかどうかに依存して変動し得る。予防上の適用において、比較的低い投薬量が、比較的頻繁でない間隔で長い期間にわたって投与される。ある患者は、人生の残りの間治療を受け続ける。治療上の適用において、疾患の進行が低減または終了するまで、及び好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、時には比較的高い投薬量が比較的短い間隔で要求される。その後は、患者は予防レジームを投与され得る。
【００６５】
ヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質またはその断片を発現するマウス線維芽細胞が提供され、ヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質またはその断片は細胞の細胞表面上で発現される。随意に、ヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質またはその断片は検出可能な部分を含む。随意に、検出可能な部分は蛍光部分である。随意に、検出可能な部分は増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）である。
【００６６】
それを必要とする対象においてがんを治療する方法が提供される。方法は、治療有効量の本明細書において提供されるキメラ抗原受容体を対象へ投与し、それによって対象におけるがんを治療することを含む。
【００６７】
別の態様において、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、治療有効量の本明細書において提供される抗体またはその機能的断片を対象へ投与し、それによって対象におけるがんを治療することを含んで提供される。随意に、がんは、リンパ腫、白血病、または骨髄腫である。随意に、がんはリンパ腫である。随意に、リンパ腫は、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、またはバーキットリンパ腫である。随意に、リンパ腫はマントル細胞リンパ腫である。随意に、リンパ腫は濾胞性リンパ腫である。随意に、リンパ腫はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。随意に、リンパ腫は辺縁帯リンパ腫である。随意に、リンパ腫はバーキットリンパ腫である。
【００６８】
随意に、がんは白血病である。随意に、白血病は、リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、または有毛細胞白血病である。随意に、白血病はリンパ芽球性白血病である。随意に、白血病は慢性リンパ球性白血病である。随意に、白血病は有毛細胞白血病である。
【００６９】
随意に、がんは骨髄腫である。随意に、骨髄腫は多発性骨髄腫である。
【００７０】
随意に、方法は、第２の治療剤を対象へ投与することをさらに含む。随意に、治療剤は、ＣＤ２０抗原と結合することができるキメラモノクローナル抗体である。随意に、治療剤はリツキシマブである。「リツキシマブ」という用語は、ＡＴＣコードＬ０１ＸＣ０２によって同定される、タンパク質ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体を、通常の意味で指す。
【００７１】
それを必要とする対象における自己免疫疾患を治療する方法も提供される。方法は、治療有効量の対象を本明細書において提供されるような抗体またはその機能的断片を投与し、それによって対象における自己免疫疾患を治療することを含む。随意に、自己免疫疾患は、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、または自己免疫性溶血性貧血である。随意に、自己免疫疾患は関節リウマチである。随意に、自己免疫疾患は全身性紅斑性狼瘡である。随意に、自己免疫疾患は多発性硬化症である。随意に、自己免疫疾患は糸球体腎炎である。随意に、自己免疫疾患はシェーグレン症候群である。随意に、自己免疫疾患は自己免疫性溶血性貧血である。随意に、方法は、第２の治療剤を対象へ投与することをさらに含む。
【００７２】
別の態様において、細胞の分裂増殖を阻害する方法が提供される。方法は、本明細書において提供されるようなＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片（その実施形態を含む）と細胞を接触させ、それによって接触させた細胞を形成することを含む。ＢＡＦＦ−Ｒ抗体またはその機能的断片が、接触させた細胞上のＢＡＦＦ−Ｒタンパク質と結合するようにし、それによって細胞の分裂増殖を阻害する。随意に、細胞はリンパ球様細胞である。随意に、細胞はＢ細胞である。随意に、細胞はがん細胞である。随意に、細胞はリンパ腫細胞である。
【００７３】
別の態様において、抗ヒトＢＡＦＦ−Ｒ抗体を産生する方法が提供される。方法は、本明細書において提供されるようなマウス線維芽細胞をマウスへ投与し、それによって免疫付与されたＢＡＦＦ−Ｒマウスを形成することを含む。免疫付与されたＢＡＦＦ−Ｒマウスからの脾細胞をヒトミエローマ細胞と融合し、それによってＢＡＦＦ−Ｒハイブリドーマ細胞を形成する。次いでＢＡＦＦ−Ｒハイブリドーマ細胞が、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体を発現するようにし、それによって抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体を産生する。随意に、抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体は、本明細書において提供されるような抗体である。
【００７４】
様々な実施形態及び態様が本明細書において示され記載されるが、かかる実施形態及び態様が単なる例として提供されることは当業者へ明らかだろう。多数の変動、変化及び置換がここで当業者に思い浮かぶだろう。本明細書において記載される実施形態への様々な代替が用いられ得ることが理解されるべきである。
【００７５】
抗体は、複雑な内部構造を備えた大きな複合体分子（約１５０，０００Ｄａの分子量または約１３２０アミノ酸）である。天然の抗体分子は２つの同一ペアのポリペプチド鎖を含有し、各々のペアは１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する。そして各々の軽鎖及び重鎖は、２つの領域：標的抗原の結合に関与する可変（「Ｖ」）領域、及び免疫系の他の構成要素と相互作用する定常（「Ｃ」）領域からなる。抗原（例えば細胞の表面上の受容体）を結合する可変領域を形成するように、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、三次元空間において一緒になる。各々の軽鎖可変領域または重鎖可変領域内に、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる３つの短いセグメント（長さで平均１０のアミノ酸）がある。抗体可変ドメイン中の６つのＣＤＲ（軽鎖から３つ及び重鎖から３つ）は、実際の抗体結合部位（パラトープ）を形成するように三次元空間において一緒に折り畳まれ、それは標的抗原（エピトープ）の上にドッキングする。ＣＤＲの位置及び長さは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８３、１９８７によって正確に定義された。ＣＤＲ中に含有されない可変領域のパーツはフレームワーク（「ＦＲ」）と呼ばれ、それは、ＣＤＲのための環境を形成する。
【００７６】
抗体という用語は、当技術分野における通常の公知の意味に従って使用される。抗体は例えばインタクトな免疫グロブリンとして存在する。しかしながら、抗体（複数可）という用語が本明細書において列挙される場合は常に、機能的抗体断片（複数可）が使用され得る。例えば、多くの十分に特徴づけられた機能的抗体断片は、様々なペプチダーゼによる消化によって産生することができる。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２（Ｆａｂ（軽鎖がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１へ連結されたもの自体）の二量体）を産生する。Ｆ（ａｂ）’２はヒンジ領域中のジスルフィド結合を破壊する穏やかな条件下で還元され、それによってＦ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は本質的にヒンジ領域の一部を備えたＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版（１９９３））を参照）。様々な抗体断片がインタクトな抗体の消化の面から定義されるが、当業者は、かかる断片が化学的にまたは組み換えＤＮＡ方法論を用いることによってのいずれかで、デノボに合成され得ることを認識するだろう。したがって、抗体という用語は本明細書において使用される時例示的であり、全体の抗体の修飾によって産生される抗体断片、または組み換えＤＮＡ方法論を用いてデノボに合成されるもの（例えば一本鎖Ｆｖ）またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定されたもの（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照）が、抗体についての記載として使用され得る。
【００７７】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製のために、当技術分野において公知の任意の技法が使用され得る（例えばＫｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）中でページ７７−９６）を参照）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、単一クローンに由来する抗体を指す。一本鎖抗体の産生のための技法（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本明細書において記載されるポリペプチドへの抗体を産生するように適合され得る。遺伝子導入マウスまたは他の生物体（他の哺乳動物等）も使用して、ヒト化抗体を発現することができる。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原へ特異的に結合する抗体及びヘテロマーのＦａｂ断片を同定することができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）を参照）。
【００７８】
ｍＡｂのエピトープは、ｍＡｂが結合するその抗原の領域である。各々が他のものの抗原への結合を競合的に阻害する（ブロックする）ならば、２つの抗体が同じまたはオーバーラップするエピトープへ結合する。すなわち、競合結合アッセイにおいて測定されるように、１×、５×、１０×、２０×または１００×過剰量の１つの抗体は、少なくとも３０％だが、好ましくは５０％、７５％、９０％または場合によっては９９％まで、他のものの結合を阻害する（例えばＪｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０を参照）。あるいは、１つの抗体の結合を低減または消失させる抗原中の本質的にすべてのアミノ酸突然変異が、他のものの結合を低減または消失させるならば、２つの抗体は同じエピトープを有する。１つの抗体の結合を低減または消失させるいくつかのアミノ酸突然変異が、他のものの結合を低減または消失させるならば、２つの抗体はオーバーラップするエピトープを有する。
【００７９】
リガンドは、受容体分子（例えば抗体）へ結合することができる薬剤（例えばポリペプチドまたは他の分子）を指す。
【００８０】
標識または検出可能な部分は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度の試薬、酵素（例えば通常はＥＬＩＳＡにおいて使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、または例えば標的ペプチドと特異的な反応性のあるペプチドもしくは抗体の中へ放射性同位体標識を援用することによって検出可能にすることができる、ハプテン及びタンパク質もしくは他の実体が挙げられる。標識への抗体のコンジュゲートのために当技術分野において公知の任意の適切な方法が用いられ得る（例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ中に記載される方法を使用して）。
【００８１】
接触することは、その平易な通常の意味に従って使用され、少なくとも２つの別種のもの（例えば生体分子または細胞を含む、化学化合物）が、反応するか、相互作用するか、または物理的に接するために十分に近くなることを可能にするプロセスを指す。しかしながら、もたらされる反応産物は、添加された試薬間の反応から、または反応混合物中で産生され得る添加された試薬のうちの１つもしくは複数からの中間体から、直接産生され得ることは認識すべきである。
【００８２】
接触することという用語は、２つの種が反応するか、相互作用するか、または物理的に接することを可能にすることを含み、そこで、２つの種は、例えば本明細書において記載されるような抗体及びＢＡＦＦ−Ｒタンパク質であり得る。接触することは、例えば本明細書において記載されるようなヒト化抗体がＢＡＦＦ−Ｒと相互作用することを可能にすることを含む。
【００８３】
本明細書において使用される時、病態、疾患もしくは障害、または病態、疾患もしくは障害と関連する症状を治療することまたはそれらの治療は、有益または所望の結果（臨床結果を含む）を得るためのアプローチを指す。有益または所望の臨床結果としては、１つまたは複数の症状または病態の緩和または改善、病態、障害または疾患の程度の縮小、病態、障害または疾患の状態の安定化、病態、障害または疾患の発生の予防、病態、障害または疾患の伝播の予防、病態、障害または疾患の進行の遅延または減速、病態、障害または疾患の開始の遅延または減速、病態、障害または疾患の状態の寛解または緩和、及び寛解（部分的または全体的であるかにかかわらず）が挙げられ得るがこれらに限定されない。治療は、治療の非存在下において予想されるものを超える対象の長期生存も意味し得る。治療は、いくつかの事例において、病態、障害または疾患の進行を恒久的に停止させることを包含するが、病態、障害または疾患の進行の阻害、病態、障害または疾患の進行の一時的な減速も意味し得る。本明細書において使用される時、治療、治療する、または治療することという用語は、プロテアーゼの発現によって特徴づけられる疾患もしくは病態の１つまたは複数の症状の影響、またはプロテアーゼの発現によって特徴づけられる疾患もしくは病態の症状を低減させる方法を指す。したがって、開示した方法において、治療は、確立された疾患、病態、または疾患もしくは病態の症状の重症度における１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の低減を指し得る。例えば、疾患を治療する方法は、対照と比較して、対象における疾患の１つまたは複数の症状に１０％の低減があるならば、治療であると判断される。したがって、低減は、ネイティブのレベルまたは対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％〜１００％の間の任意のパーセント低減であり得る。治療は、疾患、病態、または疾患もしくは病態の症状の治癒または完全な除去を必ずしも指さないことが理解される。さらに、本明細書において使用される時、減少、低減または阻害への参照には、対照レベルに比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の変化が含まれ、かかる用語には完全な消失が含まれ得るが、必ず含まれるわけではない。
【００８４】
ポリペプチド、ペプチド及びタンパク質という用語はアミノ酸残基のポリマーを指すように本明細書において互換的に使用され、そこで、ポリマーはアミノ酸からならない部分へコンジュゲートされ得る。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに加えて、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物である、アミノ酸ポリマーへ適用される。融合タンパク質は、単一部分として組み換えにより発現される、２つ以上の分離したタンパク質配列をコードするキメラのタンパク質を指す。ペプチジル及びペプチジル部分という用語は一価ペプチドを意味する。
【００８５】
アミノ酸という用語は、本明細書において使用される時、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸に加えて、天然に存在するアミノ酸に類似する様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされたものに加えて、後に修飾されるそれらのアミノ酸（例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−フォスフォセリン）である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造（すなわち水素へ結合されたα炭素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基）を有する化合物（例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なるが、天然に存在するアミノ酸に類似する様式で機能する構造を有する化学化合物を指す。天然に存在しないアミノ酸及び非天然アミノ酸という用語は、天然で見出されないアミノ酸類似体、合成アミノ酸、及びアミノ酸模倣物を指す。
【００８６】
アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨された、それらの一般的に公知である３文字記号または１文字記号のいずれかによって本明細書において参照され得る。ヌクレオチドは、同様にそれらの一般的に認められる１文字コードによって参照され得る。
【００８７】
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸及び核酸配列の両方へ適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指す。遺伝コードの縮重があるので、多くの核酸配列が任意の与えられたタンパク質をコードするだろう。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが規定されるすべての位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変更せずに、記載された対応するコドンのうちの任意のものへ変更され得る。かかる核酸バリエーションはサイレントバリエーションであり、それは保存的に修飾されたバリエーションの一種である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるすべての核酸配列は、核酸のすべての可能なサイレントバリエーションも記述する。当業者は、核酸中の各々のコドン（通常メチオニンについてのただ一つのコドンであるＡＵＧ及び通常トリプトファンについてのただ一つのコドンであるＴＧＧ以外）が、機能的に同一の分子をもたらすように修飾され得ることを認識するだろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレントバリエーションは、各々の記載された配列において黙示的である。
【００８８】
アミノ酸配列に関して、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列への個別の置換、欠失または添加（それはコードされた配列中の単一アミノ酸またはアミノ酸のわずかなパーセンテージを変更、添加または欠失させる）は、改変が化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合に、保存的に修飾されたバリアントであると認識するだろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の目録は、当技術分野において周知である。かかる保存的に修飾されたバリアントは、多型バリアント、異種間のホモログ、及び対立遺伝子に加えられ、これらを除外しない。
【００８９】
以下の８群：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
は各々、互いについて保存的置換であるアミノ酸を含有する（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
【００９０】
配列同一性のパーセンテージは比較ウィンドウにわたって２つの至適にアライメントさせた配列の比較によって決定され、そこで、２つの配列の至適のアライメントのために、参照配列（それは追加または欠失を含まない）に比較して、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、追加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、比較のウィンドウ中の位置の合計数によって一致した位置の数を割ること、及び結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００９１】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、同一であるまたはパーセント同一性という用語は、比較ウィンドウ、または以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してもしくは手動アライメント及び視覚的検査によって測定されるような指定の領域にわたって、最大の対応のために比較及びアライメントさせた場合に、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの規定のパーセンテージ（すなわち、例えばポリペプチドの全体のポリペプチド配列または個別のドメインの規定の領域にわたって、６０％の同一性、随意に６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性）を有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。次いで、かかる配列は実質的に同一であると言える。この定義は試験配列の相補物も指す。随意に、同一性は、長さで少なくとも約５０のヌクレオチドである領域にわたって、より好ましくは長さで１００〜５００または１０００以上のヌクレオチドである領域にわたって、存在する。本記載は、配列番号３０〜５１のうちの任意のものに実質的に同一のポリペプチドを含む。
【００９２】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として働き、それへ試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列はコンピューターへと入力され、必要であるならばサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが使用され得るか、または、代替パラメーターが指定され得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に比べた試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００９３】
比較ウィンドウは、本明細書において使用される時、例えば全長配列、または２０〜６００、約５０〜約２００もしくは約１００〜約１５０のアミノ酸もしくはヌクレオチドからなる群から選択される連続した位置の数のうちの任意の１つのセグメントへの参照を含み、そこで、配列は、２つの配列が至適にアライメントされた後に、連続した位置の同じ数の参照配列へ比較され得る。比較のための配列のアライメントの方法は当技術分野において周知である。比較のための配列の至適のアライメントは、例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局部的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性のためのサーチ方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中の、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動アライメント及び視覚的検査（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）によって、遂行され得る。
【００９４】
パーセント配列同一性及び配列類似性の決定のために好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、それらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０中で記載される。ＢＬＡＳＴリアルタイム分析の遂行のためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の長さＷのワードとアライメントさせた場合に、クエリ配列中の同じ長さのショートワード（一致するかまたはいくつかの正値閾値スコアＴを満たすかのいずれかである）の同定によって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを包含する。Ｔは近隣ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。これらの最初の近隣ワードヒットはサーチを開始するためのシードとして働いて、シードを含有するより長いＨＳＰが見出される。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各々の配列に沿って両方向で伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基のペアのための報酬スコア；常に＞０）及びＮ（残基のミスマッチのためのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。各々の方向でのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ落ちるか；累積スコアが１つもしくは複数の負スコアの残基アライメントの蓄積に起因して０以下になるか；または、いずれかの配列の末端に到達する場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの感度及びスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは、ヌクレオチド配列に関して、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照）、５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。
【００９５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計解析も遂行する。（例えばＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列の間の一致が偶然によって起こる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸への試験核酸の比較において、最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満ならば、核酸は参照配列に類似すると判断される。
【００９６】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して作製された抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、例えば２つのペプチドが保存的置換でのみ異なる場合に、第２のポリペプチドへ典型的には実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、以下に記載されるように、２つの分子またはそれらの相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅するできることである。
【００９７】
与えられた残基と抗体内の同じ必須の構造的位置を占める場合に、抗体中のアミノ酸残基は与えられた残基に対応する。例えば、比較抗体中の選択された残基は、選択された残基が、当技術分野において適用可能な方法を使用して査定されるようなＫａｂａｔ位置４８に同じ必須の空間的関係または構造的関係を占める場合に、本明細書において提供される抗体中の位置４８（本明細書において記載されるようなＫａｂａｔナンバリングシステムに従って）に対応する。例えば、比較抗体は本明細書において提供された抗体と最大の配列相同性でアライメントされ、Ｋａｂａｔ位置４８とアライメントするアライメント比較抗体中の位置は、それに対応すると決定され得る。あるいは、上記のような一次配列アライメントの代わりに（またはそれに加えて）、例えば比較抗体の構造が本明細書において提供される抗体と最大の対応でアライメントされ、全体構造が比較された場合に、三次元の構造的アライメントも使用され得る。この事例において、構造モデル中のＫａｂａｔ位置４８と同じ必須の位置を占めるアミノ酸は、対応すると言える。
【００９８】
単離されたという用語は、タンパク質に適用される場合に、タンパク質が天然状態において結び付いている他の細胞構成要素が、本質的にないことを表わす。それは乾燥または水溶液のいずれかであり得るが、好ましくは均一の状態である。純度及び均一性は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技法を使用して決定される。調製物中に存在する優勢種のタンパク質が、実質的に精製される。単離されたという用語は、タンパク質が電気泳動ゲル中で本質的に１つのバンドを生じることを表わす。特に、それは、タンパク質が少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、及び最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。
【００９９】
特異的に（または選択的に）抗体へ結合する、または特異的に（または選択的に）〜と免疫反応性である、という語句は、タンパク質またはペプチドを参照する場合に、タンパク質及び他の生物製剤の不均一集団中でのタンパク質の存在の決定要因である、結合反応を指す。したがって、指定の免疫アッセイ条件下で、規定の抗体はバックグラウンドの少なくとも２倍で特定のタンパク質へ結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質へ有意な量で実質的に結合しない。典型的には、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍、及びより典型的にはバックグラウンドの１０〜１００倍以上であるだろう。
【０１００】
細胞は、本明細書において使用される時、ゲノムＤＮＡを維持または複製するのに十分な代謝機能または他の機能を実行する細胞を指す。細胞は当技術分野において周知の方法（例えばインタクトな膜の存在、特定の色素による染色、子孫を産生する能力、または配偶子の事例において、第２の配偶子と合体して生存可能な子を産生する能力が挙げられる）によって同定され得る。細胞としては原核生物及び真核生物細胞が挙げられ得る。原核生物細胞としては細菌が挙げられるがこれらに限定されない。真核生物細胞としては、酵母細胞ならびに植物及び動物に由来する細胞（例えば哺乳動物細胞、昆虫（例えばｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ属）細胞及びヒト細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０１】
本明細書において定義される時、阻害、阻害する、阻害することという用語、及び同種のものは、タンパク質阻害物質（例えば本明細書において提供されるＢＡＦＦ−Ｒ抗体）相互作用に関して、阻害物質（例えばＢＡＦＦ−Ｒ抗体）の非存在下におけるタンパク質の活性または機能と比べて、タンパク質の活性または機能に負に影響する（例えば減少させる）（例えばＢＡＦＦ−Ｒの活性を減少させる）ことを意味する。阻害は、疾患、または疾患（例えばがんまたは自己免疫疾患）の症状の低減を含む。したがって、阻害は、少なくとも一部分、部分的にもしくは完全に、刺激をブロックすること、シグナル伝達または酵素活性またはタンパク質の量を減少すること、防止すること、活性化を遅延すること、不活性化すること、脱感作すること、またはダウンレギュレートすることを含む。同様に、阻害物質は、例えば結合すること、部分的もしくは完全にブロックすること、減少させること、防止すること、遅延すること、不活性化すること、脱感作すること、または活性（例えばＢＡＦＦ−Ｒシグナル伝達活性）をダウンレギュレートすることによって、ＢＡＦＦ−Ｒ活性を阻害する化合物またはタンパク質である。
【０１０２】
本明細書において提供される薬剤（例えば抗体）は、活性のある治療剤及び多様な他の薬学的に許容される構成要素を含む、医薬組成物として多くの場合投与される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版、Ｌｏｙｄ  Ｖ．Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）を参照されたい。好ましい形態は意図される投与モード及び治療上の適用に依存する。組成物は、所望される製剤に依存して、薬学的に許容される非毒性の担体または希釈物質（通常は動物またはヒト投与のための医薬組成物の製剤化に使用されるベヒクルとして定義される）も含み得る。希釈物質は、組み合わせたものの生物学的活性に影響を与えないように選択される。かかる希釈物質の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤としては、他の担体、アジュバント、または非毒性の非治療用の非免疫原性の安定物質及び同種のものも挙げられる。
【０１０３】
組成物は、治療的処置または予防的処置のために投与され得る。治療上の適用において、組成物は、治療有効用量で疾患（例えばがん）を患う患者へ投与される。この使用のために有効な量は、疾患の重症度及び患者の健康の一般的な状態に依存するだろう。組成物の単回投与または複数回投与は、必要に応じて投薬量及び頻度に依存して投与され、患者に忍容され得る。患者または対象としては、ヒト及び他の動物（特に哺乳動物）の両方が挙げられる。したがって、方法は、ヒト治療及び動物への適用の両方へ適用可能である。随意に、患者は、哺乳動物、霊長動物またはヒトである。
【０１０４】
経口投与のために好適な製剤は、（ａ）溶液（水または食塩水またはＰＥＧ  ４００等の希釈物質中で懸濁された、有効量の本明細書において提供される抗体等）；（ｂ）カプセル、分包または錠剤（各々は、液体、固体、顆粒またはゼラチンとして、活性成分の所定量を含有する）；（ｃ）適切な液体中の懸濁物；及び（ｄ）好適なエマルションからなり得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及び他の賦形剤、着色物質、充填物質、結合物質、希釈物質、緩衝剤、湿潤剤、防腐物質、着香剤、色素、崩壊剤、ならびに薬学的適合性のある担体のうちの１つまたは複数を含み得る。ロゼンジ形態は、香料（例えばスクロース）中で活性成分を含み、同様に、トローチは、不活性基剤（ゼラチン及びグリセリンまたはスクロース及びアカシアエマルション、ゲル等）中で活性成分を含み、同種のものは、活性成分に加えて当技術分野において公知の担体を含有し得る。
【０１０５】
医薬組成物は、大きな緩慢に代謝されるマクロ分子、例えばタンパク質、多糖（キトサン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びコポリマー（ラテックス、官能化セファロース（ＴＭ）、アガロース、セルロース及び同種のもの等）、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集物（油滴またはリポソーム等）も含み得る。加えて、これらの担体は免疫刺激剤（すなわちアジュバント）として機能し得る。
【０１０６】
直腸投与のために好適な製剤としては、例えば坐剤（坐剤基剤によりパッケージングされた核酸からなる）が挙げられる。好適な坐剤基剤としては、天然または合成のトリグリセリドまたはパラフィン炭化水素が挙げられる。加えて、基剤（例えば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール及びパラフィン炭化水素が挙げられる）と選択化合物の組み合わせからなる、ゼラチン直腸カプセルを使用することも可能である。
【０１０７】
非経口投与（例えば関節内（関節中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内及び皮下の経路によって等）のために好適な製剤としては、水性及び非水性の等張滅菌済み注射液（抗酸化物質、バッファー、静菌物質、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る）、ならびに水性及び非水性の滅菌済み懸濁物（懸濁化剤、可溶化物質、増粘剤、安定化物質、及び防腐物質を含み得る）が挙げられる。組成物は、例えば静脈内点滴によって、経口、局所、腹腔内、膀胱内、または鞘内に投与され得る。非経口投与、経口投与及び静脈内投与は、投与の好ましい方法である。化合物の製剤は、単位用量または複数用量の密封容器（アンプル及びバイアル等）で提供され得る。
【０１０８】
注射溶液及び懸濁物は、これまでに記載された種類の滅菌済み粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。エクスビボの治療法のための核酸が形質導入された細胞も、静脈内または非経口的に上記のように投与され得る。
【０１０９】
医薬調製物は単位投薬形態であり得る。かかる形態において、調製物は、適切な量の活性のある構成要素を含有する単位用量へと細分される。単位投薬形態はパッケージングされた調製物であり得、パッケージは離散量の調製物（バイアルまたはアンプル中で小分けした錠剤、カプセル剤及び粉末等）を含有する。さらに、単位投薬形態はカプセル、錠剤、カシェー、もしくはロゼンジそれ自体であり得るか、または、それはパッケージングされた形態でのこれらのうちの任意のものの適切な数であり得る。組成物は、所望されるならば、他の適合性のある治療剤も含有し得る。
【０１１０】
組み合わせ投与は、分離した製剤または単一医薬製剤を使用する共投与、及びいずれかの順序での一続きの投与を企図し、そこで、好ましくは、両方（またはすべて）の活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間がある。
【０１１１】
本明細書において提供される組成物の有効用量は、異なる因子（投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトまたは動物であるか、投与される他の医薬物、及び処置が予防または治療であるかが挙げられる）に依存して、変動し得る。しかしながら、当業者は、ガイダンスのための、がんを治療及び予防するために認可された組成物の投薬量を考慮して、適切な及び／または等価な用量を直ちに認識するだろう。
【０１１２】
疾患または病態という用語は、本明細書において提供される化合物、医薬組成物もしくは方法により治療されている状態、または、そのように治療することができるな患者または対象の健康状況を指す。随意に、疾患は、がん（例えば肺癌、卵巣癌、骨肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌（例えばメルケル細胞癌）、精巣癌、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、メラノーマ、乳癌、神経芽細胞腫）である。疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん性疾患、感染性疾患、代謝疾患、発育性疾患、心血管性疾患、肝疾患、消化管疾患、内分泌疾患、神経系疾患、または他の疾患であり得る。
【０１１３】
本明細書において使用される時、がんという用語は、哺乳動物において見出されるすべてのタイプのがん、新生物または悪性腫瘍を指し、白血病、リンパ腫、メラノーマ、神経内分泌腫瘍、癌腫及び肉腫が挙げられる。本明細書において提供される化合物、医薬組成物または方法により治療され得る例示的ながんとしては、リンパ腫、肉腫、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、骨髄腫、甲状腺癌、白血病、前立腺癌、乳癌（例えばトリプルネガティブ、ＥＲ陽性、ＥＲ陰性、化学療法耐性、ハーセプチン耐性、ＨＥＲ２陽性、ドキソルビシン耐性、タモキシフェン耐性、腺管癌、小葉癌、原発性、転移性）、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌（例えば肝細胞癌）、肺癌（例えば非小細胞肺癌、扁平上皮肺癌、腺癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌、カルチノイド、肉腫）、多形性神経膠芽腫、神経膠腫、メラノーマ、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、神経膠芽細胞腫、卵巣癌、肺癌、扁平上皮細胞癌（例えば頭部、頸部または食道）、結腸直腸癌、白血病、急性骨髄白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫が挙げられる。追加の例としては、甲状腺癌、内分泌系癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、大腸、頭頚部癌、食道癌、肝臓癌、腎臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、メラノーマ、中皮腫、卵巣癌、肉腫、胃癌、子宮癌もしくは髄芽細胞腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前悪性皮膚損傷、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮内膜癌、副腎皮質癌、膵臓内分泌腺もしくは膵臓外分泌腺の新生物、甲状腺髄様癌、甲状腺髄様癌、メラノーマ、結腸直腸癌、甲状腺乳頭癌、肝細胞癌、乳房パジェット病、葉状腫瘍、小葉癌、腺管癌、膵星細胞の癌、肝星細胞の癌、または前立腺癌が挙げられる。
【０１１４】
白血病という用語は造血臓器の進行性の悪性疾患を広く指し、血液及び骨髄中の白血球及びそれらの前駆体の歪んだ分裂増殖及び発生によって一般的には特徴づけられる。白血病は、一般的には、（１）疾患の継続期間及び特徴（急性または慢性）；（２）関与する細胞のタイプ；骨髄性（骨髄原性）、リンパ性（リンパ原性）、または単球性；（３）血液中の異常細胞数の増加または非増加（白血性または非白血性（亜白血性））、に基づいて臨床的に分類される。本明細書において提供される化合物、医薬組成物または方法により治療され得る例示的な白血病は、例えば急性非リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、幹細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛細胞白血病、血芽球性白血病、血球芽細胞性白血病、組織球白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病、リンパ性白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、または未分化細胞性白血病が挙げられる。
【０１１５】
本明細書において使用される時、転移及び転移がんという用語は互換的に使用され、１つの器官または別の非隣接器官または身体部分からの分裂増殖性疾患または障害（例えばがん）の伝播を指し得る。がんは起源の部位（例えば乳房）で起こり、その部位は原発性腫瘍（例えば原発性乳癌）と称される。原発性腫瘍または起源の部位中のいくつかのがん細胞は、局部領域中の周囲の正常な組織を透過及び浸潤する能力、ならびに／または、身体中の他の部位及び組織へ系を介して循環リンパ系もしくは血管系の壁を透過する能力を取得する。原発性腫瘍のがん細胞から形成された第２の臨床的に検出可能な腫瘍は、転移性腫瘍または二次腫瘍と称される。がん細胞が転移する場合に、転移性腫瘍及びその細胞はもとの腫瘍のものに類似することが推定される。したがって、肺癌が乳房へ転移するならば、乳房の部位での二次腫瘍は異常な乳腺細胞ではなく異常な肺細胞からなる。乳房中の二次腫瘍は転移性肺癌と称される。したがって、転移がんという語句は、対象が原発性腫瘍を有するかまたは有していた、そして１つまたは複数の二次腫瘍を有する疾患を指す。非転移がん、または転移性でないがんに罹患する対象、という語句は、対象が原発性腫瘍を有するが１つまたは複数の二次腫瘍を有していない疾患を指す。例えば、転移性肺癌は、原発性肺腫瘍に罹患するかまたはその病歴があり、第２の所在位置または複数の所在位置での（例えば乳房中での）１つまたは複数の二次腫瘍に罹患する、対象中の疾患を指す。
【０１１６】
関連する、または、〜と関連する、という用語は、疾患（例えばがん（例えば白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫または多発性骨髄腫））と関連する物質または物質の活性もしくは機能の文脈において、物質または物質の活性もしくは機能によって、その疾患（例えばがん（例えば白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫または多発性骨髄腫））が（全部または部分的に）もたらされるか、または、その疾患の症状が（全部または部分的に）もたらされることを意味する。
【０１１７】
本明細書において使用される時、自己免疫疾患は、例えば対象の身体中に通常は存在する物質組織及び／または細胞に対する対象の免疫系による免疫反応の変更から生じる疾患または障害を指す。自己免疫疾患としては、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、硬皮症、全身性強皮症、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、重症筋無力症、若年型糖尿病、１型糖尿病、ギラン−バレー症候群、橋本の脳炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、乾癬、シェーグレン症候群、血管炎、糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病、クローン病、潰瘍性大腸炎、水疱性類天疱瘡、サルコイドーシス、乾癬、魚鱗癬、グレーブス眼症、炎症性大腸疾患、アジソン病、白斑、喘息、及びアレルギー喘息が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１８】
本明細書において使用される時、炎症性疾患は、炎症の異常または変更と関連する疾患または障害を指す。炎症は、病原体、損傷した細胞もしくは組織または刺激物に応答する治癒プロセスの一部として免疫系によって開始される生物学的応答である。慢性炎症は多様な疾患を導き得る。炎症性疾患としては、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、喘息、関節リウマチ、移植拒絶、セリアック病、慢性前立腺炎、炎症性大腸疾患、骨盤内炎症性疾患、及び炎症性筋疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１９】
ヒト化抗体は遺伝子操作抗体であり、そこで、マウス抗体（「ドナー抗体」、それはラット、ハムスターまたは他の非ヒト種でもあり得る）からの少なくとも１つのＣＤＲ（またはその機能的断片またはバリアント）が、ヒト抗体フレームワーク（「アクセプター抗体」）の上へグラフトされる。随意に、２つ以上のマウスＣＤＲがグラフトされる（例えばすべての６つのマウスＣＤＲがグラフトされる）。アクセプター抗体の配列は、例えば成熟ヒト抗体配列（またはその断片）、ヒト抗体配列のコンセンサス配列（またはその断片）、または生殖細胞系列領域配列（またはその断片）であり得る。したがって、ヒト化抗体は、ドナー抗体からの１つまたは複数のＣＤＲ、及び可変領域フレームワーク（ＦＲ）を有する抗体であり得る。ＦＲは、ヒト抗体内の定常領域及び／または可変領域の一部を形成し得る。加えて、高い結合親和性を保持するために、ヒトアクセプター配列中のアミノ酸は、例えば（１）アミノ酸がＣＤＲ中にある、または（２）アミノ酸がヒトフレームワーク領域中にある（例えばアミノ酸がＣＤＲのうちの１つにじかに隣接する）、ドナー配列からの対応するアミノ酸によって、置き換えられ得る。ヒト化抗体の構築のための詳細なインストラクションを提供する、米国特許第５，５３０，１０１号及び同第５，５８５，０８９号（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。ヒト化抗体は、多くの場合マウス抗体からすべての６つのＣＤＲ（例えばＫａｂａｔによって定義されるように、しかし多くの場合Ｃｈｏｔｈｉａによって定義されるとように超可変ループＨ１も含む）を取込むが、それらは、より少ない数のマウスＣＤＲ及び／または完全なマウスＣＤＲ配列よりも小さなもの（例えばＣＤＲの機能的断片）によっても作製することができる（例えばＰａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２；Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２０：４１５−４２８，２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−１０９１，１９９９；Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４：１４３２−１４４１，２０００）。
【０１２０】
典型的には、本明細書において提供されるようなヒト化抗体は、（ｉ）マウス抗体からの少なくとも１つのＣＤＲ（多くの場合３つのＣＤＲ）（本明細書においてマウスＣＤＲとも称される）及びヒト可変領域フレームワークを含む軽鎖可変領域；ならびに（ｉｉ）マウス抗体から少なくとも１つのＣＤＲ（多くの場合３つのＣＤＲ）及びヒト可変領域フレームワーク（ＦＲ）を含む重鎖可変領域を含み得る。軽鎖及び重鎖の可変領域フレームワーク（ＦＲ）は各々、成熟ヒト抗体可変領域フレームワーク配列（またはその断片）、生殖細胞系列可変領域フレームワーク配列（Ｊ領域配列と組み合わせて）（またはその断片）、またはヒト抗体可変領域フレームワーク配列のコンセンサス配列（またはその断片）であり得る。随意に、ヒト化抗体は、（ｉ）中で記載されるような軽鎖可変領域、（ｉｉ）中で記載されるような重鎖可変領域を、軽鎖ヒト定常領域及び重鎖ヒト定常領域と一緒に、含む。
【０１２１】
キメラ抗体は、マウス（または他の齧歯動物）抗体の可変領域がヒト抗体の定常領域と組み合わせられる抗体であり；遺伝子操作を用いたキメラ抗体の構築は周知である。かかる抗体はマウス抗体の結合特異性を保持する一方で、約３分の２はヒトである。マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体中に存在する非ヒト配列の比率は、キメラ抗体の免疫原性がマウス抗体とヒト化抗体との間の中間であることを示唆する。マウス抗体に比べて低減された免疫原性を有し得る他のタイプの遺伝子操作抗体としては、ファージディスプレイ法を使用して（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／００１０４７；Ｗｉｎｔｅｒ，ＷＯ９２／２０７９１；及びＷｉｎｔｅｒ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３：９２，１９９８、その各々は参照により本明細書に援用される）、または遺伝子導入動物を使用して（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９３／１２２２７；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ＷＯ９１／１０７４１、その各々は参照により本明細書に援用される）、作製されたヒト抗体が挙げられる。
【０１２２】
ヒト化抗体をデザインする他のアプローチを使用しても、米国特許第５，５３０，１０１号及び同第５，５８５，０８９号中の方法と同じ結果を達成することができる。例えば、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９，２００２及び米国特許第６，８８１，５５７号またはＳｔｕｄｎｉｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．７：８０５，１９９４の方法中で記載されるような超ヒト化である。さらに、遺伝子操作された低減された免疫原性のｍＡｂを産生する他のアプローチとしては、例えばＶａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８１：１０５，１９９８；Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：８９５，１９９６；ならびに米国特許第６，０７２，０３５号及び同第５，６３９，６４１号中で記載されるような、再成形（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）、超キメラ化、及びベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）／表面再建（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）が挙げられる。
【０１２３】
開示される方法及び組成物のために使用され得るか、それらと併用して使用され得るか、それらの調製において使用され得るか、またはそれらの産物である、材料、組成物及び構成要素が開示される。これら及び他の材料は本明細書において開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用及び群などが開示される場合に、これらの化合物の各々の様々な個別の及び集合的な組み合わせ及び順列の具体的な参照が明示的に開示されなくてもよいが、各々は本明細書において具体的に企図及び記載されることが理解される。例えば、方法が開示及び検討され、多くの分子へ行われ得る多くの修飾（方法を含む）が検討されるならば、各々及びすべての方法の組み合わせ及び順列ならびに可能な修飾は、相反することが具体的に指摘されない限り、具体的に企図される。同様に、任意のサブセットまたはこれらの組み合わせも具体的に企図及び開示される。この概念は、本開示のすべての態様（開示される組成物を使用する方法におけるステップが挙げられるがこれらに限定されない）へ適用される。したがって、遂行され得る多様な追加のステップがあるならば、任意の具体的な方法ステップまたは開示される方法の方法ステップの組み合わせにより、これらの追加のステップのうちの各々が遂行され得ること、及び、かかる組み合わせまたは組み合わせのサブセットは各々具体的に企図及び開示されたと判断されるべきであることが理解される。
【０１２４】
以下の実施例は、本明細書において記載される方法及び組成物の特定の態様をさらに例示することが意図され、特許請求の範囲を限定するようには意図されない。
【実施例】
【０１２５】
実施例１。ネイティブに折り畳まれた組み換えタンパク質への新規のＢＡＦＦ受容体抗体は、薬剤耐性のヒトＢ細胞悪性腫瘍をインビボで消失させる。
ｍＡｂの開発のために細菌において産生された従来の組み換え免疫原タンパク質は翻訳後修飾を欠如し、原核生物は真核生物と比較してシャペロンタンパク質及び酸化環境を欠如するので、単純化して折り畳まれる。結果として、かかるタンパク質は、対応する原形質膜にアンカーされた天然タンパク質とは立体配座的構造で異なり得る。さらに、抗体は、標的外のドメイン（標的タンパク質の膜貫通ドメインまたは細胞内ドメイン等）に対して作製され得る。本明細書において記載されるように、真核生物細胞上で発現されるネイティブに折り畳まれ糖鎖付加された免疫原に対するｍＡｂを生成するストラテジーが適用された。特に、ヒトＢＡＦＦ−Ｒはマウス線維芽細胞上でネイティブタンパク質としてあり、マウスにおける免疫原として操作された細胞クローンを使用した。ヒト悪性Ｂ細胞株及び原発性リンパ腫をインビトロで特異的に結合及び溶解し、異種の腫瘍モデルにおいて薬剤耐性リンパ腫細胞株の増殖をインビボで阻害する、新規のｍＡｂの生成が本明細書において記載される。
【０１２６】
材料及び方法
動物、細胞株及び原発性ヒト腫瘍サンプル。抗体開発のためにＢＡＬＢ／ｃマウス及びＮＯＤ  ｓｃｉｄγ（ＮＳＧ）繁殖ペアを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。ＮＳＧ繁殖コロニーはＣｉｔｙ  ｏｆ  ＨｏｐｅのＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒによって維持された。マウスは、施設のガイドラインに従って病原体除去動物施設中で飼育した。すべての動物研究は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ：１５０２０）によって承認された。ＪｅＫｏ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−６、Ｒａｊｉ、Ｕ２６６及びＲＬは、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ（ＶＡ））から購入した。Ｚ−１３８株は、Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗａｎｇ（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）によって提供された。イブルチニブ耐性ＳＰ４９−ＩＲ株は、Ｄｒ．Ｊｉａｎｇｕｏ  Ｔａｏ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｆｌｏｒｉｄａ）によって開発され提供された。イブルチニブ耐性ＳＰ４９細胞株（ＳＰ４９−ＩＲ）は、漸増用量のイブルチニブにより細胞を処理することによって確立した。ＩＣ５０は、ＳＰ４９−ＩＲについての＞１００ｎＭに比較して、親ＳＰ４９では５ｎＭであった。１００ｎＭのイブルチニブで、ＳＰ４９−ＩＲ細胞の＞９０％と比較して、ＳＰ４９細胞の約５％が生存可能であった。ヒトＮＫ−９２  １７６Ｖ細胞は、Ｃｏｎｋｗｅｓｔ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得た。ヒト血液及び腫瘍のサンプルのために、培養していない原発性ヒトリンパ腫を、１０％のＤＭＳＯ中で冷凍保存された生存可能な単一細胞懸濁液として、施設内審査委員会に認可されたプロトコール（ＩＲＢ：２００５−０６５６）下で、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＬｙｍｐｈｏｍａ  Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋから得た。原発性患者サンプルは、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）に罹患する患者からの白血球除去血輸血または血液、ならびにびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）または濾胞性リンパ腫（ＦＬ）に罹患する患者から切除されたリンパ節を含んでいた。各々のサンプル中の腫瘍細胞は、白血球除去血輸血または血液について８０％〜９８％及びリンパ節生検について５０％〜６０の範囲であった。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  ＨｏｐｅのＭｉｃｈａｅｌ  Ａｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｃｅｎｔｅｒによって提供された（ＩＲＢ：１５２８３）。
【０１２７】
ヒトＢＡＦＦ−Ｒ発現マウス線維芽細胞の生成。ヒトＢＡＦＦ−Ｒ（ｈＢＡＦＦ−Ｒ）ｃＤＮＡはヒトＢ細胞からのものであり、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｔａｋａｒａ／Ｃｌｏｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）上のＧＦＰ遺伝子とインフレームでクローン化した。ｈＢＡＦＦ−Ｒ  ｃＤＮＡ配列をＮＣＢＩ遺伝子配列データベース（遺伝子識別番号：１１５６５０）に対して確認した。ｈＢＡＦＦ−Ｒ−ＧＦＰ融合物をコードするｃＤＮＡを、続いてレンチウイルス遺伝子送達系（ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の中へクローン化して、マウス線維芽細胞（Ｌ）細胞の中へ形質導入された場合にｈＢＡＦＦ−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質を産生させる。単一細胞クローンを、選別したＧＦＰ陽性のＬ細胞から確立し、（ｈ）ＢＡＦＦ−Ｒ−ＧＦＰ発現Ｌ細胞クローンＤ２Ｃをさらなる研究において使用した。
【０１２８】
抗体産生ハイブリドーマ。２匹の６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｄ２Ｃ細胞の５回の脚パッドの皮下注射によって３日ごとに１回で免疫付与した。血液サンプルを両方のマウスから得て、Ｄ２Ｃに対する血清抗体をＥＬＩＳＡによって測定した。脾臓組織を２０日目に収穫した。収穫した脾細胞をＳｐ２／０骨髄腫と融合してハイブリドーマを確立し、Ｄ２Ｃまたは親Ｌ細胞をコーティングしたプレートを使用して、抗体についてＥＬＩＳＡスクリーニングをした。免疫付与及びハイブリドーマの手順は、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで遂行した。
【０１２９】
キメラ抗体産生。抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域をコードする、選択されたハイブリドーマからのｃＤＮＡを、それぞれのヒトＩｇＧ１定常領域を含有する発現ベクターの上へ操作した。ベクターを、製造者の指示に従って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の中へ共トランスフェクションした。培養上清中の抗体を、製造者の指示に従って、ＨｉＴｒａｐプロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）によって精製した。
【０１３０】
細胞毒性アッセイ。標的細胞（Ｌ細胞、ヒト腫瘍株、原発性患者サンプル）を、５１Ｃｒ放出アッセイのためにクロム−５１（５１Ｃｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により標識した。簡潔には、抗体及びエフェクター（ＮＫ細胞または補体血清スタンダード［Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ］）を、標識された標的細胞へ添加し、１８時間までインキュベーションした。ＮＫ細胞をＰＢＭＣからエンリッチした（ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｋｉｔ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、カナダ）。上清の中へ放出された５１Ｃｒを、Ｗｉｚａｒｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により検出した。
【０１３１】
ＪｅＫｏ−１−ＣＤ２０−ＫＯの生成。ＦＡＣＳ選別された安定的なＪｅＫｏ−１−ＣＤ２０−ＫＯを、製造者の指示に従って、ＣＤ２０−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＨＤＲ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を使用して生成した。ＣＤ２０ノックアウトは、フローサイトメトリー及びウエスタンブロットによって検証した。
【０１３２】
インビボの研究。腫瘍モデルのために、安定的なルシフェラーゼ発現腫瘍株をマウスモデルにおける生物発光画像化のために確立した。簡潔には、ルシフェラーゼ遺伝子を、レンチウイルス遺伝子送達系（ｐＬｅｎｔｉ７．３／Ｖ５−ＤＥＳＴ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって腫瘍株の中へ導入した。１マウスあたりの最小致死用量を、用量力価測定によって各々の腫瘍細胞株について決定した。腫瘍細胞を静脈内（ＩＶ）注射し、インビボの生物発光画像化によってマウスをモニタリングして最小腫瘍用量の生着を確実にした。最小致死腫瘍用量は、１×１０６のＪｅＫｏ−１細胞、５×１０５のＲＳ４；１１細胞、５×１０５のＪｅＫｏ−１−ＣＤ２０−ＫＯ細胞、または２．５×１０４のＺ−１３８細胞であった。
【０１３３】
生物発光画像化：イソフルランによりマウスに麻酔をかけ、画像化の１０分前に腹腔内（ＩＰ）注射経由で１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を投与した。画像化は、ＡｍｉＸ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）上で遂行した。
【０１３４】
抗体研究：マウス（１群あたりｎ＝５）に、５日ごとに１回の４回の治療の３日前に、ＩＶで腫瘍を攻撃投与した。治療は、３００μＬのＩＶ注射（２００μｇの治療抗体、１０×１０６のエフェクターヒトＮＫ−９２−１７６Ｖ細胞、及び５×１０４ＩＵのＩＬ−２（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））であった。対照群は、対照抗体有り、または抗体及び／もしくはＮＫ細胞無しで、同じ体積の注射を受けた。生物発光画像化は毎週で８０日目まで遂行した。生存は腫瘍攻撃投与１００日後まで追跡した。
【０１３５】
結果
ヒトＢＡＦＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体の生成。ＢＡＦＦ−Ｒの生物学的に意義のあるエピトープへの治療抗体を生成するために、真核生物細胞表面発現系が使用され、そこで、内在性細胞表面タンパク質は、適切な翻訳後修飾によりそれらのネイティブな立体配座で提供される。マウス線維芽細胞（Ｌ）細胞クローンを、細胞表面ＧＦＰタグ付加されたヒトＢＡＦＦ−Ｒを発現するように操作した。ＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞クローンを生成し、ＧＦＰ発現について特徴づけた（図１Ａ）。クローンＤ２Ｃを増やし、これを使用して、方法及び図７Ａ中で免疫付与スケジュールに従ってＢＡＬＢ／ｃマウスに成功裡に免疫付与した。
【０１３６】
ハイブリドーマクローンを生成及びスクリーニングした後に、４つのクローン（５３、５５、６７及び９０）が、ＢＡＦＦ−Ｒを発現するＬ細胞と特異的に結合するが親Ｌ細胞を結合しない抗体を産生すると同定された（図７Ｂ）。すべての４つのクローンの上清は、ＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｍｉｎｏ細胞株（ＭＣＬ）と用量依存的様式で結合する抗体を含有した。抗体結合はＢＡＦＦ−Ｒ陰性対照細胞株（２９３Ｔ）において検出されなかった（図８）。
【０１３７】
４つのハイブリドーマ上清からの抗体をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。精製された抗体は、Ｍｉｎｏ細胞（図９）に加えて、他のヒトＭＣＬ株（ＪｅＫｏ−１、ＲＥＣ−１、ならびにイブルチニブ耐性ＪＶＭ−１３及びＺ−１３８が挙げられる）（図１Ｂ）を用量依存的様式で結合した。
【０１３８】
４つの抗体上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の分析から、クローン５３、５５及び６７はほぼ同一の配列を有するが、クローン９０がユニークであることが明らかにされた。したがって、クローン５５及び９０をさらなる調査のために選択した。両方のクローン５５及び９０は、高濃度（２μｇ／１０６細胞）及び低濃度（０．０５μｇ／１０６細胞）で、ＪｅＫｏ−１（ＭＣＬ）、ＳＵ−ＤＨＬ−６（ＤＬＢＣＬ）、Ｒａｊｉ（バーキットリンパ腫）、及びＲＬ（ＦＬ）を有効に結合した（図１０）。
【０１３９】
ヒトＢＡＦＦ−Ｒに対するキメラｍＡｂは、インビトロ及びインビボで抗腫瘍効果を誘導した。クローン５５及び９０を、ヒトＩｇＧ１定常領域を含有するそれぞれのキメラｍＡｂへとさらに発展させた（Ｃ５５及びＣ９０と称される）。キメラ抗体は、ＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞への特異的な用量依存的結合を保持した（図１Ｃ）。Ｃ５５及びＣ９０はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８へコンジュゲートされ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）株のＪｅＫｏ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−６、Ｒａｊｉ、及びＲＬへの直接結合を表わした（図１Ｄ）。重要なことには、キメラｍＡｂは、ＭＣＬ、ＤＬＢＣＬ、及びＦＬの患者原発性腫瘍サンプルを容易に結合した（図１Ｅ及び図１１）。
【０１４０】
Ｃ５５及びＣ９０は、特異的にＢＡＦＦ−Ｒ発現Ｌ細胞及びＪｅＫｏ−１に対する抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発したが、ＢＡＦＦ−Ｒ陰性Ｌ細胞及びＢＡＦＦ−Ｒ陰性ヒト多発性骨髄腫株（Ｕ２６６）では誘発しない（図２Ａ及び  図１２）。これとは対照的に、抗体はインビトロで補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発しなかった（図２Ｂ）。ＳＵ−ＤＨＬ−６、Ｒａｊｉ及びＲＬリンパ腫細胞株について示されるように、細胞毒性にはＮＫ細胞の添加が要求され（図２Ｃ及び図１３）、抗体媒介性細胞毒性の主要なメカニズムとしてＡＤＣＣが示唆された。重要なことには、キメラ抗体は原発性患者腫瘍サンプルに対してＡＤＣＣを誘発した（図３Ａ）。
【０１４１】
抗体はＢＡＦＦ／ＢＡＦＦ−Ｒ結合を用量依存的様式で阻害し（図１４）、腫瘍細胞におけるＢＡＦＦ／ＢＡＦＦ−Ｒ生存シグナリングの破壊の可能性が示唆された。さらに、Ｃ５５及びＣ９０は、ＢＡＦＦ−Ｒの結合に際して限定的なインターナリゼーションを示した（図１５）。
【０１４２】
インビボで、ＮＳＧマウスにルシフェラーゼノックインＪｅＫｏ−１  ＭＣＬ細胞株を攻撃投与し、後続して、抗体による治療を行った。治療は、図４Ａ中のスケジュールに従った。ＰＢＳまたはＮＫ細胞単独の対照群と比較して、Ｃ５５またはＣ９０のいずれかを投与したマウスは、腫瘍増殖の有意な遅れを実証した（図４Ｂ）。同様に、Ｃ５５及びＣ９０は、リツキシマブまたは対照による阻害がないことと比較して、ＲＳ４；１１（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ））を攻撃投与したＮＳＧマウスにおいても腫瘍増殖を著しく遅らせた（図４Ｃ）。
【０１４３】
キメラｍＡｂは、薬剤耐性リンパ腫に対して強力な抗腫瘍効果をインビトロ及びインビボで誘導した。以前にリツキシマブにより治療された患者からの原発性のＣＬＬ（ｎ＝３）及びＭＣＬ（ｎ＝２）サンプルに対して、抗体をさらに試験した。５つの原発性サンプルはすべてＣ５５及びＣ９０によるＡＤＣＣによる殺傷に感受性があり、リツキシマブへの曝露後の臨床的に進行した腫瘍に対するそれらの有効性を示唆した（図３Ｂ）。
【０１４４】
薬剤耐性のリンパ腫のモデルを作成するために、ＪｅＫｏ−１の安定的なＣＤ２０ノックアウト（ＫＯ）クローンをＣＲＩＳＰＲ／ＨＤＲ系を使用して生成した。ＣＤ２０−ＫＯクローンは、フローサイトメトリー及びウエスタンブロットによるＣＤ２０表面発現の非存在（図５Ａならびに図１６Ａ及び１６Ｂ）及びフローサイトメトリーによるＢＡＦＦ−Ｒ表面発現の存在（図１６Ｃ）について確認した。さらなる研究のために選択されたＪｅＫｏ−１−ＣＤ２０−ＫＯクローン２５は、Ｃ５５及びＣ９０に媒介されるＡＤＣＣへの感受性を保持したが、抗ＣＤ２０リツキシマブによって媒介される細胞毒性へ非感受性になった（図５Ｂ）。
【０１４５】
薬剤耐性リンパ腫の第２のモデルとして、キメラＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂを、天然のイブルチニブ耐性ヒトＭＣＬ株（Ｚ−１３８）、及び誘導されイブルチニブ耐性ＭＣＬ株（ＳＰ４９−ＩＲ、イブルチニブへの耐性をインビトロで誘導された（方法を参照））に対するＡＤＣＣについて試験した。有意なインビトロのＡＤＣＣが、両方のイブルチニブ耐性株に対して、抗体により観察された（図５Ｃ）。
【０１４６】
最終的に、ＪｅＫｏ−１−ＣＤ２０−ＫＯ腫瘍細胞のＩＶによるインビボの攻撃投与の３日後に、ＮＳＧマウス（１群あたりｎ＝５）に、方法中で記載されるように、及び図４Ａ中のスケジュールに従って、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体治療（Ｃ５５またはＣ９０）またはリツキシマブを投与した。２０日目の生物発光画像化は、対照マウス及びリツキシマブ治療マウスにおいて実質的な腫瘍量があるが、ＢＡＦＦ−Ｒ抗体治療群において目視可能な腫瘍はないことを明らかにした（図６Ａ）。無腫瘍モニタリング及び長期的な全生存により、両方のＢＡＦＦ−Ｒ抗体の有意な抗腫瘍効果が確認されたが、リツキシマブではなかった（図６Ｃ）。同様に、対照（ＰＢＳまたはＮＫのみ）と比較して、いずれかのＢＡＦＦ−Ｒ抗体によるイブルチニブ耐性Ｚ−１３８担腫瘍マウスの治療に後続して、有意な効果が観察された（図６Ｂ〜Ｃ）。
【０１４７】
ＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂは正常なＢ細胞とも結合する。正常なＰＢＭＣに対して試験された場合に、抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体Ｃ９０は、任意のＴ細胞、ＮＫ細胞、顆粒球または単球を染色せずに、予想されるようにＢ細胞に対する特異的結合を示した（図１７）。陽性染色結果を精製Ｂ細胞で検証した（図１８）。さらに、精製されたＴ細胞、ＮＫ細胞及びゲートされた骨髄系細胞は結合しないことを示した。
【０１４８】
本研究の範囲を拡大すると、免疫組織化学研究は、扁桃腺及び脾臓のサンプルでの本発明の抗体の陽性染色を示し、心臓、肺、腎臓及び脳を含む他のすべての重要臓器は染色されなかった（図１９Ａ及び１９Ｂ）。
【０１４９】
考察
提供されたＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂは、ＮＨＬ、ＣＬＬ及びＡＬＬを含む複数のＢ細胞腫瘍タイプに対する単一剤として着実なインビボの抗腫瘍効果を誘発した。さらに、抗体は確立された腫瘍を根絶し、それはインビボで長期の無腫瘍生存を導いた。
【０１５０】
ＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂの差異的な特性は、それらの生成に使用されるアプローチに起因し得る。提供されるアプローチは、免疫付与のためにマウス線維芽細胞上のネイティブの表面タンパク質としてヒトＢＡＦＦＦ−Ｒを発現させ、ネイティブに折り畳まれ糖鎖付加された免疫原を提示する可能性を増加させることである。したがって、抗体が、記載される他の抗体とは異なる接近可能なヒトＢＡＦＦ−Ｒエピトープを結合している可能性は非常に高い。したがって、技術的ストラテジーは、ネイティブに折り畳まれて真核生物的に糖鎖付加されたヒトＢＡＦＦ−Ｒに対するモノクローナル抗体（それはインビボでＢ細胞腫瘍を特異的に結合、溶解及び阻害する）の生成について実証された。これらの結果から、インビトロの活性のためにｍＡｂに加えてＮＫ細胞が要求されたので、本発明のｍＡｂの主要な抗腫瘍メカニズムはＡＤＣＣであることが示唆され（図２）；ＣＤＣの証拠は観察されなかった。両方の抗体は、ＢＡＦＦリガンドがＢＡＦＦ−Ｒへ結合することを競合的に阻害することができた（図１４）。
【０１５１】
リツキシマブへの耐性の１つの臨床的に意義のあるメカニズムは、ＣＤ２０のダウンレギュレーションである。薬物耐性のこの現象は、ＣＲＩＳＰＲ編集ＭＣＬ株（ＪｅＫｏ−１、それはＣＤ２０を欠損する）によりモデル化された。この株に対して、及び同様に天然のイブルチニブ耐性Ｚ−１３８  ＭＣＬに対しての、Ｃ５５またはＣ９０の有意なインビボの抗腫瘍効果（しかしリツキシマブ治療ではその効果はない）は、薬物耐性リンパ腫に対する有効性を示唆する（図５）。以前にリツキシマブにより治療され、それへの応答が進行したリンパ腫患者からの原発性腫瘍に対するこれらの抗体のインビトロの細胞毒性を総合すると、これらのデータは、薬物耐性を克服する治療ストラテジーとしてのＣ５５及びＣ９０の可能性を示唆する（図３）。
【０１５２】
実施例２。ＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂのヒト化。
キメラ抗体（クローン９０）は、その結合特異性及び細胞毒性効果を保持しながらヒト化された。ＣＤＲのコンピューター分析及び予測された構造を介して、重鎖の３つのバリアント及び軽鎖の３つのバリアントを、変動するヒト抗体への類似度により産生した。合計９つの組み合わせのバリアントを、ヒト化された重鎖及び軽鎖から構築した。これらのバリアントはすべて、２．６〜５．０ｎＭの範囲のＫＤ値であり、結合親和性において親キメラ抗体に匹敵することが証明された（表１）。
【表１】
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【０１５３】
９つの候補抗体をさらに査定し、最有力候補を決定した。ヒト化抗体の結合はＢＡＦＦ−Ｒへの特異性を有し、すべてのものは用量依存的様式の類似の相対的結合を有することが観察された（図２０Ａ）。加えて、ヒト化抗体のＡＤＣＣ効果を査定した。この場合もやはり、ヒト化候補は特異的な細胞毒性を維持し、キメラ対照及びリツキシマブに比較して、同じように良好に動作したことが見出された（図２０Ｂ）。
【０１５４】
ヒト化クローン９０バリアント４及び５をさらなるインビトロ試験のために選択した。ヒト化抗体バリアントをビオチン化し、蛍光ストレプトアビジンプローブにより可視化した。様々な非ホジキンリンパ腫株、リンパ芽球性白血病株、及び多発性骨髄腫株（ＪｅＫｏ−１、Ｌｙ−１０、ＭＥＣ−２、ＲＬ、ＲＳ４、Ｒａｊｉ、Ｚ１３８及びＵ２６６が含まれる）に対するそれらの結合を査定した（図２２Ａ）。フローサイトメトリーの結果から、これらの細胞株の各々への有意な結合が明らかにされる。正常なＰＢＭＣに対するヒト化バリアントによるさらなるフロー分析から、結合における特異性が示される。正常で健康なＰＢＭＣ中の顆粒球、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の結合について査定した場合に、抗体はＢ細胞集団のみと結合する（図２２Ｂ）。
【０１５５】
２つのバリアントを、ＡＤＣＣを開始する能力についてさらに査定した。クロム取込みの期間後に、ＪｅＫｏ−１株、Ｚ１３８株及びＲＳ４株へ、濃度を変動させて抗体を投与した。細胞及び抗体をエフェクターＮＫ細胞と共にインキュベーションした。上清を治療の６時間後に分析した（図２１Ａ）。抗体は、腫瘍株に対する明らかな細胞毒性効果を有し、各々の１０倍希釈による用量依存性を実証する。結果はリツキシマブのものに匹敵するが、リツキシマブが活性のないＲＳ４急性リンパ芽球性リンパ腫においても観察することができる。ＬＹ−１０、ＭＥＣ−２、ＲＬ及びＲａｊｉによるさらなるアッセイ（図２１Ｂ）を継続して、ヒト化抗体治療の効力を実証した。見出されたすべての結果は、リツキシマブによる現行の従来の治療のものに匹敵した。
【０１５６】
実施例３。キメラ抗原受容体Ｔ細胞。
高い結合親和性及び生物活性を備えた抗体を使用して、インビボの研究のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を構築した。重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのためのＤＮＡ配列を一本鎖（ｓＦｖ）フォーマットへとアレンジし、４−１ＢＢモチーフと一緒にＴ細胞シグナル伝達ドメイン（δ鎖）へ操作した。操作されたＣＡＲ遺伝子を共発現ＧＦＰと一緒に、精製された健康なドナー由来のＣＤ８＋  Ｔ細胞の中へレンチウイルス経由で導入した。ＣＡＲ−Ｔ細胞をＧＦＰの発現について細胞選別し、動物研究のためにＣＤ３及びＣＤ２８のビーズによりインビトロで増やした。ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼを発現するＪｅＫｏ−１  ＭＣＬ株（ＪｅＫｏ−１−ｌｕｃｉ）を攻撃投与した。腫瘍を発達させ、腫瘍細胞の目視可能な集団が観察されるまで、生物発光画像化によってモニタリングし、それはおよそ腫瘍攻撃投与の９日後であった。マウスに、腫瘍攻撃投与の９及び１５日後に、５×１０６のＣＡＲ−Ｔ細胞（抗ＢＡＦＦ−Ｒ及び抗ＣＤ１９）の２回の用量を投与した。対照群に、無処理のＴ細胞または食塩水（ＰＢＳ）を投与した。ＣＡＲ−Ｔ療法の治療的抗腫瘍効果を評価するために、マウスを３日ごとに厳密にモニタリング及び画像化して腫瘍発達を追跡した。
【０１５７】
ヒト化抗ＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂを、それらの結合及び細胞毒性について原発性患者腫瘍サンプルに対してさらに査定した。３つのマントル細胞リンパ腫の患者サンプルは、腫瘍細胞の大多数がＢＡＦＦ−Ｒを発現することにより特徴づけられた。フローサイトメトリーの結果から、本発明のヒト化抗体によって結合されるこれらの原発性腫瘍細胞の別個の集団が明らかになる（図２２Ａ）。さらに、同じ原発性腫瘍サンプルに対するクロム放出細胞毒性アッセイから、対照に比較して、高い特異性の殺傷が明らかにされた。結果はリツキシマブの効果に匹敵し、以前に開発されていたキメラ抗体と一致していた（図２２Ｂ）。ヒト化抗体の細胞タイプ特異性を、正常なＰＢＭＣへのそれらの結合の査定によって決定した。感知可能な結合は、ＰＢＭＣの主な群（顆粒球、単球、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる）について指摘されなかった。Ｂ細胞集団は抗体によって結合される唯一の検出可能な集団であった（図２３）。このアッセイの結果も、以前に特徴づけられたキメラ抗体と一致している。
【０１５８】
抗ＢＡＦＦ−Ｒ  ｍＡｂをさらに使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を作成する。実験は、一本鎖（ｓＦｖ）フォーマットへと操作されたキメラＣ５５可変領域を利用した。抗ＢＡＦＦ−Ｒ  Ｃ５５  ｓＦｖを４−１ＢＢモチーフを含有するＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインへ添付し、ＰＢＭＣから単離された健康な正常なヒトドナーＣＤ８＋  Ｔ細胞の中へ成功裡に導入した。ＣＡＲ−Ｔ細胞を、感知できる腫瘍量を持った担腫瘍マウスへ投与した（図２４）。食塩水または非操作Ｔ細胞の対照群のいずれかに比較した場合に、抗ＢＡＦＦ−Ｒ  ＣＡＲ−Ｔ細胞により治療されたマウスは有意な腫瘍クリアランスを有していた。加えて、本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果は、抗ＣＤ−１９  ＣＡＲ−Ｔ治療群のものに匹敵する。
【０１５９】
キメラ抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体Ｃ９０を複数のバリアントによりヒト化した。ヒト化プロセスは、キメラ抗体の可変領域及び特にＣＤＲの分析を考慮に入れた。そこから、各々の重鎖及び軽鎖について３つのバリアントを、１（最もヒト）から３（キメラに対して最も保存的）の範囲で変動するヒトへの類似度で開発した。バリアントを組み合わせて９つのバリアントを産生した。Ｂｉａｃｏｒｅ分析を、各々のバリアントに加えてキメラの親Ｃ９０で遂行して、それらの平衡解離定数ＫＤを決定した。抗原は、商業的な組み換えヒトＢＡＦＦ−Ｒの細胞外ドメインであった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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