(57)【要約】  本発明は、キメラ胚およびキメララットの作製方法であって、ラット多能性幹細胞をＥＳ細胞分化抑制剤の存在下で宿主胚に接触させることを特徴とする方法を提供する。当該方法は、（ａ）雌のラットから採取された受精後の宿主胚と、ラット多能性幹細胞とを、ＥＳ細胞分化抑制剤の存在下で接触させる工程、（ｂ）ラット多能性幹細胞を接触させた宿主胚を培養し、キメラ胚を形成させる工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、キメラ胚の作製方法：
（ａ）雌のラットから採取された受精後の宿主胚と、ラット多能性幹細胞とを、ＥＳ細胞分化抑制剤の存在下で接触させる工程、
（ｂ）ラット多能性幹細胞を接触させた宿主胚を培養し、キメラ胚を形成させる工程。
【請求項２】
該接触が、ラット多能性幹細胞を宿主胚に注入することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）において、ラット多能性幹細胞と宿主胚とを、ＥＳ細胞分化抑制剤およびＲＯＣＫ阻害剤の存在下で接触させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ラット多能性幹細胞と接触させる前に、宿主胚をＥＳ細胞分化抑制剤の存在下で前培養する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前培養を、ＥＳ細胞分化抑制剤およびＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程(ｂ)の培養を、ＥＳ細胞分化抑制剤の存在下で行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）の培養を、ＥＳ細胞分化抑制剤およびＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＥＳ細胞分化抑制剤が、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＦＧＦ受容体阻害剤からなる群より選択される少なくとも２種の薬剤からなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＥＳ細胞分化抑制剤が、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤からなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
多能性幹細胞がＥＳ細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ラット多能性幹細胞が、工程（ａ）においてＥＳ細胞分化抑制剤の非存在下で宿主胚と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラットから作製された多能性幹細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
宿主胚が、工程（ａ）においてＥＳ細胞分化抑制剤の非存在下でラット多能性幹細胞と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラット由来である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法で作製されたキメラ胚を偽妊娠雌ラットの子宮または卵管に移植し、仔ラットを出産させることを含む、キメララットの作製方法。
【請求項１４】
キメララットを異性ラットと交配させることを含む、ラット多能性幹細胞が全身に寄与したラットの作製方法。
【請求項１５】
ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤を含む、キメララット作製のための培地。
【請求項１６】
ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、請求項１５に記載の培地。
【請求項１７】
両アレル遺伝子改変を施したラットＥＳ細胞が寄与してなる、遺伝子改変ラット。
【請求項１８】
ラットＥＳ細胞に両アレル遺伝子改変を施す工程を含む、遺伝子改変ラットの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラット多能性幹細胞、特にラット胚性幹細胞（以下、「ＥＳ細胞」という。）を用いた、ジャームライントランスミッション効率が改善されたキメラ胚の作製方法、該キメラ胚を用いたキメララットの作製方法、該方法で作製されるキメララット、およびキメララットの作製に有用な培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＳ細胞は、ほぼ全能性を有している細胞株であり、遺伝子改変動物の作製などに非常に有用である。例えば、特定の遺伝子を破壊したＥＳ細胞を正常な宿主の胚盤胞に注入して宿主胚の細胞と混合した後子宮に戻すと、キメラ動物を作製することができ、得られたキメラ動物またはその子孫同士を交配して産まれた動物を選別することにより、当該遺伝子が破壊された遺伝子改変動物（ノックアウト動物）を作製することができる。【０００３】
ラットは、マウスよりも取扱性の良い適当な大きさを有する哺乳動物であり、医学をはじめとする各分野で広範に利用される最も有用な実験動物の一つである。そのため、ラットＥＳ細胞の樹立および当該細胞を用いたキメララットの作製が望まれているが、ラットＥＳ細胞の系統、宿主胚の系統に影響されることなく、ＥＳ細胞が生殖細胞系列に分化し、ＥＳ細胞由来の遺伝情報が次世代に伝達される（即ち、ジャームライントランスミッションされた）キメララットを、効率よく作製できる手法は未だ確立されていない。【０００４】
ジャームライントランスミッションが確認できたキメララットの作製に関しては、２００８年にQi-Long YingらのグループとAustin Smithらのグループからそれぞれ報告がなされている（特許文献１、非特許文献１、２）。両報告ではラットＥＳ細胞を用いてキメララットが作製されているが、いずれも複数のＥＳ細胞系統と宿主胚系統との組み合わせのうち、単一の組合せからしか、ジャームライントランスミッションされたキメララットの作製に成功していない。ルーチン的なノックアウトラットの作製には、様々なＥＳ細胞系統および宿主胚系統の組み合わせでのキメララット作製の実現が重要であり、今後の解決課題であることが示唆されている。
また、このように限定的ではあるもののジャームライントランスミッションされたキメララットの作製例が報告されているにもかかわらず、依然として遺伝子ターゲッティングされた遺伝子改変ラット（例、ノックアウトラット、ノックインラット）の樹立は報告されていない。これには元となるラットＥＳ細胞の質が影響している可能性がある。【０００５】
なお、キメラ作製能力のあるラットｉＰＳ細胞は、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＩ型ＴＧＦβレセプターＡｌｋ５阻害剤（Ａ−８３−０１）を用いて樹立されているが、ジャームライントランスミッションは達成されていない（非特許文献３）。また、ＭＥＫ阻害剤とＡｌｋ５阻害剤との組み合わせはヒト線維芽細胞からのｉＰＳ細胞作製効率を飛躍的に改善することも報告されている（非特許文献４）。【０００６】
また近年、WatanabeらはＲｈｏ結合キナーゼ（Rho-associated kinase；ＲＯＣＫ）阻害剤Ｙ−２７６３２がヒトＥＳ細胞のアポトーシスをブロックし、酵素処理によるシングルセル分離後の増殖を誘導することを発見しており（非特許文献５）、ＲＯＣＫ阻害剤がヒト幹細胞培養に有用であることも報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１５４１８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８／０３５１１０号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Cell, 135, 1299-1310 (2008)
【非特許文献２】Cell, 135, 1287-1298 (2008)
【非特許文献３】Cell Stem Cell 4, 16-19 (2009)
【非特許文献４】Nat. Methods, 6, 805-808 (2009)
【非特許文献５】Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ラット多能性幹細胞の系統および宿主胚の系統の組合せが限定されることなく、効率よくジャームライントランスミッションされたキメララットが得られうる、新規なキメラ胚の作製方法、該キメラ胚を用いたキメララット作製方法およびそのための培地を提供し、以って、従来作製不可能であったラット多能性幹細胞系統および宿主胚系統の組み合わせによる、ジャームライントランスミッションされたキメララットを提供することにある。
本発明の別の目的は、ＥＳ細胞作製後に遺伝子改変を施しても、キメララット作製能、特に該遺伝子改変を生殖系列に伝達する能力が維持されたラットＥＳ細胞を提供し、当該ラットＥＳ細胞を用いて、遺伝子改変、特に遺伝子ターゲッティングされた遺伝子改変ラットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ラットＥＳ細胞を用いたキメララットの作製方法について鋭意研究を行った結果、ＥＳ細胞分化抑制剤の存在下においてラットＥＳ細胞を宿主胚に注入することにより、ジャームライントランスミッション効率が改善されたキメラ胚を作製することが効率よくでき、該キメラ胚を用いるとジャームライントランスミッションされたキメララットが作製できることを見出した。また、少量のラットＥＳ細胞を宿主胚に注入する場合は、ＥＳ細胞分化抑制剤に加えてさらにＲＯＣＫ阻害剤の存在下において注入処理を実施すると、ＥＳ細胞のブラストシストへの接着強度が増す点において、より好ましい結果が得られることが判明した。さらに本発明者らは、ＥＳ細胞分化抑制剤を用い、または当該ＥＳ細胞分化抑制剤にＲＯＣＫ阻害剤を組み合わせて用いることにより、様々なラットＥＳ細胞の系統および宿主系統の組み合わせにおいて、ジャームライントランスミッション効率が改善されたキメラ胚を作製でき、該キメラ胚を用いてジャームライントランスミッションされたキメララットが効率よく作製できることを新たに見出した。
さらに、本発明者らは、ラットＥＳ細胞を樹立する際にＥＳ細胞分化抑制剤とＲＯＣＫ阻害剤とを培地に添加することにより、遺伝子改変を施してもキメララット作製能を維持したラットＥＳ細胞を樹立することに成功し、当該ＥＳ細胞を用いて遺伝子ターゲッティングされたＥＳ細胞が寄与したキメララットを作製することに成功した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。【００１１】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、キメラ胚の作製方法：
（ａ）雌のラットから採取された受精後の宿主胚と、ラット多能性幹細胞とを、ＥＳ細胞分化抑制剤の存在下で接触させる工程、
（ｂ）ラット多能性幹細胞を接触させた宿主胚を培養し、キメラ胚を形成させる工程。
（２）該接触が、ラット多能性幹細胞を宿主胚に注入することにより行われる、（１）に記載の方法。
（３）工程（ａ）において、ラット多能性幹細胞と宿主胚とを、ＥＳ細胞分化抑制剤およびＲＯＣＫ阻害剤の存在下で接触させる、（１）または（２）に記載の方法。
（４）ラット多能性幹細胞が、遺伝子組み換え細胞である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ラット多能性幹細胞と接触させる前に、宿主胚をＥＳ細胞分化抑制剤の存在下で前培養する、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前培養を、ＥＳ細胞分化抑制剤およびＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行う、（５）に記載の方法。
（７）工程(ｂ)の培養を、ＥＳ細胞分化抑制剤の存在下で行う、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）工程（ｂ）の培養を、ＥＳ細胞分化抑制剤およびＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行う、（７）に記載の方法。
（９）ＥＳ細胞分化抑制剤が、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＦＧＦ受容体阻害剤からなる群より選択される少なくとも２種の薬剤からなる、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）ＥＳ細胞分化抑制剤が、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤からなる、（９）に記載の方法。
（１１）多能性幹細胞がＥＳ細胞である、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）ラット多能性幹細胞が、工程（ａ）においてＥＳ細胞分化抑制剤の非存在下で宿主胚と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラットから作製された多能性幹細胞である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）宿主胚が、工程（ａ）においてＥＳ細胞分化抑制剤の非存在下でラット多能性幹細胞と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラット由来である、（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法で作製されたキメラ胚を偽妊娠雌ラットの子宮または卵管に移植し、仔ラットを出産させることを含む、キメララットの作製方法。
（１５）キメララットにおけるジャームライントランスミッションを確認することをさらに含む、（１４）に記載の方法。
（１６）（１２）または（１３）に記載の方法で作製されたキメラ胚を偽妊娠雌ラットの子宮または卵管に移植し、仔ラットを出産させることにより得られる、ジャームライントランスミッションされたキメララット。
（１７）（１５）に記載の方法によりジャームライントランスミッションが確認されたキメララットを異性ラットと交配させることを含む、ラット多能性幹細胞が全身に寄与したラットの作製方法。
（１８）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤を含む、キメララット作製のための培地。
（１９）ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、（１８）に記載の培地。
（２０）キメララット作製用培地の製造のための、ＥＳ細胞分化抑制剤の使用。
（２１）キメララット作製用培地の製造のための、ＥＳ細胞分化抑制剤およびＲＯＣＫ阻害剤の使用。
（２２）ＥＳ細胞分化抑制剤が、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤である、（２０）または（２１）に記載の使用。
（２３）ＥＳ細胞分化抑制剤を含む、キメララットのジャームライントランスミッション効率改善剤。
（２４）ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、（２３）に記載の剤。
（２５）ＥＳ細胞分化抑制剤が、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＦＧＦ受容体阻害剤からなる群より選択される少なくとも２種の薬剤からなる、（２３）または（２４）に記載の剤。
（２６）ＥＳ細胞分化抑制剤が、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤からなる、（２５）に記載の剤。
（２７）ＥＳ細胞分化抑制剤とＲＯＣＫ阻害剤を用いたＥＳ細胞の作製方法。
（２８）ＥＳ細胞分化抑制剤が、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤の組み合わせ、またはＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＦＧＦ受容体阻害剤の組み合わせからなる、（２７）に記載の方法。
（２９）（１９）に記載の培地を用いたＥＳ細胞の作製方法。
（３０）ＥＳ細胞が、遺伝子改変を施してもキメララット作製能を維持できるラットＥＳ細胞である、（２７）〜（２９）のいずれかに記載の方法。
（３１）遺伝子改変が遺伝子ターゲッティングによる改変である、（３０）に記載の方法。
（３２）キメララットがジャームライントランスミッションされたキメララットである、（３０）または（３１）に記載の方法。
（３３）遺伝子改変を施してもキメララット作製能を維持できるラットＥＳ細胞。
（３４）遺伝子改変が遺伝子ターゲッティングによる改変である、（３３）に記載の方法。
（３５）キメララットがジャームライントランスミッションされたキメララットである、（３３）または（３４）に記載の細胞。
（３６）遺伝子改変を施された（３３）〜（３５）のいずれかに記載のラットＥＳ細胞が寄与してなる、遺伝子改変キメララット。
（３７）遺伝子改変ＥＳ細胞が生殖細胞系列に寄与した（３６）記載のラット。
（３８）（３７）記載のラットを交配して得られる、遺伝子改変ＥＳ細胞が全身に寄与したラット。
（３９）ＥＳ細胞分化抑制剤とＲＯＣＫ阻害剤を含む、遺伝子改変を施してもキメララット作製能を維持できるラットＥＳ細胞作製用培地。
（４０）ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む、遺伝子改変を施してもキメララット作製能を維持できるラットＥＳ細胞作製用培地。
（４１）両アレル遺伝子改変を施したラットＥＳ細胞が寄与してなる、遺伝子改変ラット。
（４２）ラットＥＳ細胞に両アレル遺伝子改変を施す工程を含む、遺伝子改変ラットの作製方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ラット多能性幹細胞の系統または宿主胚の系統を問わず、ジャームライントランスミッション効率が改善されたキメラ胚を作製することができ、該キメラ胚を用いることにより高効率にジャームライントランスミッションされたキメララットを作製することができる。これにより、様々な薬理研究または生理学的な研究、さらには再生医療の研究などに幅広く用いられる遺伝子改変ラット（ノックアウトラット、ノックインラットなど）を容易に作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（ａ）はＹＰＡＣ因子非添加、（ｂ）はＹＰＡＣ因子添加のＥＳ細胞用培地でのブラストシストのアウトグロースを示した写真である。４．５日ブラストシストは分裂を不活化されたＭＥＦ上に播種された。透明帯はタイロード溶液によって取り除かれた。（ｃ）は内部細胞塊（ＩＣＭ）中のＶｅｎｕｓ、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１の定量ＰＣＲ分析結果を示した図である。播種７日後、ＲＮＡはＹＰＡＣ因子非添加時、ＹＰＡＣ因子添加時の７または４個のブラストシストから誘導されたＩＣＭ中のドーム状の部分から抽出された。データは独立した３実験の平均値でありＲＥＦ、ＩＣＭ、ＩＣＭ＋ＹＰＡＣ因子中の遺伝子の相対的発現レベルである。
【図２−１】ラットＥＳ細胞の特性を調べた結果を示す図である。（ａ）はＹ−２７６３２の影響を示したコロニー写真である。分離された単一細胞（１×１０５個  ＴｇＷＷ１、経代数６）を６ウェルプレートに播種した。左図はＭＥＦ＋ＹＰＡＣ因子、中央図はＰＡＣ因子、右図はＹ因子をそれぞれ培地に添加したときのコロニーを示す。（ｂ）は各種同一細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色を示した写真である。（ｃ）はＴｇＷＬ２（継代数７)の５０細胞にギムザ染色を行った写真である。ＴｇＷＬ２（継代数７）は、ＸＸ性染色体を含む４２の染色体核型を示している。（ｄ）はスキャッタープロット分析による遺伝子発現パターン比較を行った図である。ＴｇＷＷ１とＲＥＦを左図に示し、ＴｇＷＷ１とＬＬを右図に示す。アジレントジーンチップ（ホールラットゲノムマイクロアレイキット）をマイクロアレイ分析として使用した。中央の線は当量直線を示し、その上下の線はサンプルの遺伝子発現レベルが２倍異なることを示す。（ｅ）はＲＥＦ、ＴｇＷＬ１、ＴｇＷＷ１、ＬＬでの遺伝子発現パターン比較を行った図である。ラットＥＳセルライン中のＶｅｎｕｓ、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１のＱ−ＰＣＲ結果である。データは独立した３実験の平均値であり、ＲＥＦ、ＴｇＷＬ１、ＴｇＷＷ１、ＬＬでの遺伝子の相対的発現レベルである。（ｆ）はラット細胞由来のテラトーマフォーメーションを示した写真である。２．６×１０６個のＴｇＷＷ１（継代数５）細胞を免疫不全マウスの皮下に移植して作製したテラトーマである。
【図２−２】（ｇ）は、マイクロアレイ解析および階層的クラスタ分析結果を示す図である。４１０００遺伝子を含むワンカラーマイクロアレイベースド遺伝子発現解析（Agilent Technology)を使用した。パネル上の数値は相関係数を示す。（ｈ）は、ラットＥＳ細胞中のＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２の免疫染色図（下パネル）である。上パネルはＤＡＰＩ染色像を示す。（ｉ）は、ＴｇＷＷ１  ＥＳセルラインから誘導されたテラトーマ三胚葉の組織切片図である。
【図３】エンブリオボディ（ＥＢｓ）とＹＰＡＣ因子の効果を調べた結果を示す図である。（ａ）はＰＡＣ因子非添加、（ｂ）はＰＡＣ因子添加のＥＳ細胞用基礎培地で、両方ともＹ−２７６３２非存在下の３日後および７日後のエンブリオボディ（ＴｇＷＬ１）を示した写真である。（ｃ）はＥＢｓ中のＶｅｎｕｓ、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１のＱ−ＰＣＲ分析結果を示した図である。データは独立した３実験の平均値であり、阻害剤なし（白丸印）、ＰＡＣ因子添加（黒四角印）時の０、３、および７日後におけるＥＳ細胞の各遺伝子発現レベルである。
【図４−１】ＹＰＡＣインジェクション法によるジャームラインキメラの作製に関する図である。（ａ）は、p-CAG-AmCyan1プラスミドの核酸導入による安定形質転換クローン中のAmCyan1の発現を示した図である。（ｂ）は、インジェクションプロセス中のＹＰＡＣ因子の影響を調べた結果を示す写真である。ＥＳ用基礎培地中へのＹＰＡＣ因子の添加を右図に示し、非添加を左図に示す。また上図はインキュベーション５時間後の写真であり、下図はインキュベーション３０時間後の写真である。（ｃ）は、胎児におけるジャームラインキメラを示す写真である。ＴｇＷＷ１＋Ｃ細胞は、Wistarブラストシストへインジェクションした。１８日後の胎児全体、腎臓、精巣にＶｅｎｕｓ及びAmCyan1蛍光が確認された。（ｄ）は、ＹＰＡＣインジェクション法によるキメラ色ラットの発生を示した図である。（ｅ）は、成体キメラにおけるジャームライントランスミッションを示した図である。キメラ（ＴｇＷＬ１）はWistarの雌と交配させた。ジャームライン個体（４／１６）は毛色によって確認した。（ｆ）は、雌キメラ（ＴｇＷＬ２）Ｆ１のジェノタイピング分析を示した図である。Ｖｅｎｕｓ領域は尻尾のゲノムＤＮＡを採取し、ＰＣＲで増幅した。６個体中３個体がジャームライン個体であると分析された。Ｖｅｎｕｓ遺伝子のサイズは１９９ｂｐであり、Ｍは１００ｂｐのＤＮＡマーカーを示す。レーン１、２、３はアグーチ毛色を呈しているジャームライン個体であり、レーン４、５、６はアグーチ毛色陰性（アルビノ）の個体である。（ｇ）は、シングルセル（ＴｇＷＷ１）をブラストシストにインジェクションした写真である。インジェクションをしてからインキュベーション３時間後のブラストシストを示す。矢印はインジェクトした細胞を示す。（ｈ）は、ジャームライントランスミッションが確認されたキメララットの胎児を示した写真である。Ｖｅｎｕｓ陽性ジャームセルは１６日後の性腺の片側で検出された。スケールバーは１００μｍである。
【図４−２】（ｉ）は、長期継代ＥＳ細胞におけるジャームライントランスミッションを示す図である。長期培養ＥＳ細胞（ＴｇＷＬ２：継代数２２）をブラストシストにインジェクションし、１７．５日後の性腺上のＶｅｎｕｓ蛍光を検出した（スケールバー：３００μｍ）。上パネルは明視野像、下パネルは蛍光像を示す。（ｊ）は、ＹＰＡＣ因子非添加インジェクションによるコートカラーキメラの例を示す図である。（ｋ）は、ＹＰＡＣ添加インジェクションによるコートカラーキメラの例を示す図である。
【図５】ＥＳ細胞からＴｇラット作製に関する図である。（Ａ）と（Ｂ）は、Ｏｃｔ４−Ｖｅｎｕｓ形質転換細胞のクローニングと発現を示した図である。Ｏｃｔ４−Ｖｅｎｕｓ導入遺伝子は継代数５のＥＳ細胞（ＬＬ２）中へ導入し、Ｖｅｎｕｓ陽性クローンは薬剤選択なしで継代した。（Ａ）の矢印はＶｅｎｕｓ発現が抑制されていることを示す。（Ｂ）は、ＥＳ細胞におけるホモジニアスなＯｃｔ４−Ｖｅｎｕｓの発現を示す。（Ｃ）は、Ｏｃｔ４−Ｖｅｎｕｓのホモジニアスな発現を示すＥＳ細胞から得られたＴｇラットを示した図である。矢印はキメララットからジャームライントランスミッションを介したｅｓＴＧラットを示す。（Ｄ）は、胎児１６日後のｅｓＴｇラットにおける性腺上のＶｅｎｕｓ蛍光を示した図である。（Ｅ）は、ＹＰＡＣ培地中でのｅｓＴｇブラストシストのアウトグロースを示した図である。（Ｆ）は、ｅｓＴｇブラストシスト由来のラットＥＳ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅを示した図である。Ｏｃｔ４−Ｖｅｎｕｓ発現抑制は１０継代後でも観察されていない。（スケールバー  ３００μｍ（Ａ，Ｂ，Ｄ），１００μｍ（Ｅ，Ｆ））
【図６】ＺＦＮを介したホモロガスリコンビネーションによるノックインラットの作製に関する図である。（Ａ）は、Ｏｃｔ４ターゲティングに関する概略図である。ＺＦＮペアはエクソン１を認識する。ボックス（グレー）はコーディング領域を、ボックス（白）は非コーディング領域を示す。太線はホモロジーアームを示す。Ｐはプライマーである。（Ｂ）は、ジーンターゲティングＥＳ細胞クローンのジェノタイピングＰＣＲ解析を示す。（Ｃ）は、ジーンターゲティングＥＳ細胞クローンＮｏ．１１（継代数１４）を示す図である（矢印（白）：未分化細胞、矢印（黒）：分化細胞）。
【図７】ＺＦＮを介したホモロガスリコンビネーションによるノックアウトラットの作製に関する図である。p53ターゲティングに関する概略図である。ＺＦＮペアはエクソン4を認識する。太線はホモロジーアームを示す。
【図８】（Ａ）は、ジーンターゲティングＥＳ細胞クローンのジェノタイピングＰＣＲ解析を示す(WT:野生型、KI: p53 gene-targeted alleles)。（Ｂ）は、ホモロガスリコンビネーションされたp53+/- ES細胞クローン中のAmCyan1の発現を示した図である。
【図９】（Ａ）は、雌キメラとワイルドタイプLEA系ラットを交配し、得られたp53遺伝子ノックアウトラットを示した図である（矢印がジャームライントランスミッションしたラットである）。（Ｂ）は、雌キメラとワイルドタイプLEA系ラットを交配させ生まれたラットのジェノタイピング解析を示す(KI: p53 gene-targeted alleles)。
【図１０】ＺＦＮを介したホモロガスリコンビネーションによるノックアウトラットの作製に関する図である。（Ａ）は、p53ターゲティングに関する概略図である。ＺＦＮペアはエクソン4を認識する。太線はホモロジーアームを示す。（Ｂ）は、ジーンターゲティングES細胞クローンのジェノタイピング解析を示す(WT:野生型、KI: p53 gene-targeted alleles)。左から順にlane 1-7。（Ｃ）は、p53-/- ES細胞[Cell Line: p53C/Z]のジーンターゲティングの詳細を示す。（Ｄ） は、ホモロガスリコンビネーションされたp53+/- ES細胞クローン中のAmCyan1の発現を示した図である。
【図１１】（Ａ）は、ジーンターゲティングES細胞クローンのジェノタイピング解析を示す(WT:野生型)。（Ｂ）は、ホモロガスリコンビネーションされたp53-/- ES細胞クローン中のAmCyan1とtdTomatoの発現を示した図である。
【図１２】（Ａ）は、p53-/-ES細胞[Cell Line: p53C/R2] から発生したキメララット胎児を示す。（Ｂ）は、p53-/-ES細胞[Cell Line: p53C/R2]から発生したキメララット胎児（図中左）の頭部の奇形を示す。（Ｃ）は、（Ｂ）の胎児頭部のAmCyan1の発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ラット多能性幹細胞の系統または宿主胚の系統が特定のものに限定されることなく、ジャームライントランスミッションされたキメララットを、ラット多能性幹細胞を用いて効率よく作製する方法を提供するものである。以下、本発明に係るラット多能性幹細胞、キメラ胚およびキメララットの作製方法、遺伝子改変ラットの作製方法、およびキメララット作製のためのキットについて説明する。
【００１５】
１．ラット多能性幹細胞
本発明において「多能性幹細胞」とは、ＥＳ細胞や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に代表される未分化・多能性を維持する細胞を指す。ＥＳ細胞は、体細胞から核初期化されて生じたＥＳ細胞であっても良いが、好ましくは後述の方法によりラット初期胚から作製される。またＥＳ細胞以外では、始原生殖細胞に由来するEmbryonic Germ Cell（ＥＧ細胞）、精巣から単離されたmultipotent germlinestem cell (ｍＧＳ細胞) などが挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるラット多能性幹細胞はラットＥＳ細胞またはラットｉＰＳ細胞であり、より好ましくはラットＥＳ細胞である。
【００１６】
１−１．ラットＥＳ細胞
本発明におけるキメララットの作製に用いるラットＥＳ細胞は、ジャームライントランスミッションされたキメララット作製能を有するラットＥＳ細胞であれば、如何なる系統のラット由来のＥＳ細胞であっても良い。当該ラットの系統としては、特に限定されないが、例えば、Wistar Kyoto株（ＷＫＹ）、Brown Norway株（ＢＮ）、Goto-Kakizaki株（ＧＫ）、ＳＤ株、Ｆ３４４／Ｄｕ株（Fischer）、Wistar株、Wistar Hannover株、Long-Evans Agouti株（ＬＥＡ）、ＡＣＩ株などの系統のラットから選択することができる。また本発明においては、当該系統は純粋な種であっても良く、または２種以上の交雑によって得られた種であっても良い。ラットＥＳ細胞の系統によらず、ジャームライントランスミッションされたキメララットを効率よく作製できるという本発明の特徴を考慮すれば、後述する宿主胚とラットＥＳ細胞との接触工程において、ＥＳ細胞分化抑制剤の非存在下で宿主胚と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラットから作製したＥＳ細胞を用いる際に、本発明は特に有用である。
【００１７】
ジャームライントランスミッションされたキメララット作製能を有するラットＥＳ細胞は、上記に例示した細胞株について所定の機関から入手することができ、またあるいは、自体公知の方法に従って作製することもできる。当該ラットＥＳ細胞の作製方法としては、例えば、Buehr Mらの方法（Cell 2008; 135:1287-1298）などが挙げられる。
【００１８】
また、ジャームライントランスミッションされたキメララット作製能を有するラットＥＳ細胞は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程：
（Ａ）ラット胚盤胞を培養することにより形成させた内部細胞塊を解離する工程、
（Ｂ）解離した内部細胞塊を培養することにより出現した初代ＥＳ細胞を、継代可能となるまで培養する工程、
（Ｃ）継代可能となった初代ＥＳ細胞を、細胞集塊を保持した状態で解離し、培養する工程、
を含むプロセスを行うことにより、樹立、作製することもできる。
【００１９】
上記作製方法における培養は、少なくとも２種類のＥＳ細胞分化抑制剤を含む培地を用いて行うことが好ましく、少なくとも２種類のＥＳ細胞分化抑制剤とＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地を用いて行うことがより好ましい。ここで、「ＥＳ細胞分化抑制剤」とは、ＥＳ細胞の他の細胞または組織などへの分化を抑制し得る、白血病阻害因子（ＬＩＦ）以外の物質を意味しており、本発明においては、ラットＥＳ細胞の分化を抑制する作用を有するものであれば、如何なる物質であっても良い。ＥＳ細胞分化抑制剤としては、例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＦＧＦ受容体阻害剤などが挙げられる。当該培養については、具体的には、ＭＥＫ阻害剤とＧＳＫ３阻害剤を含む培地を用いることが好ましく、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＦＧＦ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地、またはＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を用いることがより好ましく、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を用いることが特に好ましい。
ＥＳ細胞分化抑制剤とＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を用いることにより、ＥＳ細胞の樹立後に遺伝子改変を施しても、キメララット作製能、特にジャームライントランスミッションされたキメララットの作製能を維持できるラットＥＳ細胞を作製することができる。
【００２０】
ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫ（MAP kinase-ERK kinase）の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、ＡＺＤ６２４４、ＣＩ−１０４０（ＰＤ１８４３５２）、ＰＤ０３２５９０１、ＲＤＥＡ１１９（ＢＡＹ８６９７６６）、ＳＬ３２７、Ｕ０１２６（以上、Selleck社）、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２４、Ｕ０１２５（以上、コスモ・バイオ社）などが挙げられる。ＭＥＫ阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜５μＭの範囲から適宜選択され得る。
【００２１】
ＧＳＫ３阻害剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（glycogen synthase kinase：ＧＳＫ）３の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、ＳＢ２１６７６３（Selleck社）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１（以上、Axon medchem社）、ＳＢ４１５２８６（Tocris Bioscience社）、Kenpaullone（コスモ・バイオ社）などが挙げられる。ＧＳＫ３阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．０１〜１００μＭ、好ましくは１〜１０μＭの範囲から適宜選択され得る。
【００２２】
ＴＧＦβ受容体阻害剤は、トランスフォーミング増殖因子（transforming growth factor：ＴＧＦ）β受容体の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、2-(5-ベンゾ[1,3]ジオキソール-4-イル-2-tert-ブチル-1H-イミダゾール-4-イル)-6-メチルピリジン、3-(6-メチルピリジン-2-イル)-4-(4-キノリル)-1-フェニルチオカルバモイル-1H-ピラゾール（Ａ−８３−０１）、2-(5-クロロ-2-フルオロフェニル)プテリジン-4-イル)ピリジン-4-イルアミン（ＳＤ−２０８）、3-(ピリジン-2-イル)-4-(4-キノニル)]-1H-ピラゾール、2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン（以上、メルク社）、ＳＢ４３１５４２（Sigma Aldrich社）などが挙げられる。ＴＧＦβ受容体阻害剤には、ＴＧＦβ受容体アンタゴニストも含まれる。ＴＧＦβ受容体阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．０１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭの範囲から適宜選択され得る。
【００２３】
ＦＧＦ受容体阻害剤は、線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor：ＦＧＦ）受容体の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、ＳＵ５４０２（コスモ・バイオ社）、ＰＤ１７３０７４（STEMGENT社）などが挙げられる。ＦＧＦ受容体阻害剤には、ＦＧＦ受容体アンタゴニストも含まれる。ＦＧＦ受容体阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．００５〜５００μＭ、好ましくは０．０７〜５０μＭの範囲から適宜選択され得る。
【００２４】
ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ結合キナーゼの機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されない。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、ＧＳＫ２６９９６２Ａ（Axon medchem社）、Fasudil hydrochloride（Tocris Bioscience社）、Ｙ−２７６３２、Ｈ−１１５２（以上、和光純薬工業社）などが挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．０００１〜５００μＭ、好ましくは１〜５０μＭの範囲から適宜選択され得る。
【００２５】
ラットＥＳ細胞の樹立・培養において用いる基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハムＦ１２培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
また、当該培地は、血清含有培地または無血清培地とすることができる。無調整または未精製の血清を用いる場合は、血清の影響によりラットＥＳ細胞がジャームライントランスミッションされたキメララットの作製能を喪失しない程度で培地に添加されるべきである。５％以上、例えば約１０〜約２０％の血清を添加する場合には、ＥＳ細胞の培養用に調整または精製された血清を用いることが望ましい。そのようなＥＳ細胞培養用の血清（例えば、ウシ胎児血清）は市販されている。
当該培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有することができる。
【００２６】
また、ラットＥＳ細胞の培養においては、白血病阻害因子（ＬＩＦ）を用いることもできる。ＬＩＦとしては、ラット由来のＬＩＦ（ｒＬＩＦ）が特に好ましい。ＬＩＦは、上記の作製方法の工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の培養において適宜培地に加えて使用することができる。一方、工程（Ａ）においては、内部細胞塊の形成効率およびラットＥＳ細胞の樹立効率並びにラットＥＳ細胞の品質の向上のために、ｒＬＩＦの培地への添加濃度は、培地１ｍＬあたり１００単位以下であることがむしろ好ましく、少なくとも内部細胞塊の形成段階まで、好ましくは工程（Ａ）全体にわたって、ＬＩＦを含有しない培地で培養することがより好ましい。ｒＬＩＦは、市販品（ケミコン社など）を購入して利用することができる。
【００２７】
ラットＥＳ細胞の作製および培養においては、さらにフィーダー細胞を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては当業者に入手可能な如何なる種由来のフィーダー細胞であっても良いが、ライン化されたフィーダー細胞よりも正常線維芽細胞を用いることが好ましい。具体的には、マウス胎児の正常線維芽細胞が挙げられる。より具体的には、妊娠１２日〜１６日目のマウス胎児線維芽細胞の初代培養細胞（正常線維芽細胞）が挙げられ、当該正常線維芽細胞としては、例えばＩＣＲマウスの胎児１２．５日目の正常線維芽細胞が例示される。当該フィーダー細胞は常法により調製することもできれば、市販品（マウス線維芽細胞、旭テクノグラス株式会社など）を利用することもできる。当該フィーダー細胞は、マイトマイシンＣなどで処理して不活性化して用いることが好ましい。
【００２８】
ラットＥＳ細胞の培養に用いられる培養器は、細胞培養用であれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。培養器は、細胞非接着性であっても細胞接着性であっても良い。細胞接着性の培養器は、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で細胞支持用基質によりコーティングされたものを用いることができ、そのような細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ポリ−Ｌ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。
【００２９】
当該培養は、例えば、ＣＯ２インキュベータ中、約１〜約１０％、好ましくは約２〜約５％、より好ましくは約５％のＣＯ２濃度の雰囲気下において、約３０〜約４０℃、好ましくは約３５〜約３７．５℃、より好ましくは約３７℃で行うことができる。
【００３０】
培地中のその他の成分に関しては、ＥＳ細胞の培養に通常用いられる成分を、当業者の常識の範囲で組み合わせて適宜含有させることができる。
【００３１】
以下に、培地の具体的組成を例示する。
1) ラットＥＳ細胞樹立用培地（培養液）
胚盤胞から内部細胞塊を形成するまでの段階で使用する培養液を、「ラットＥＳ細胞樹立用培養液」と称する。
（組成の具体例）
DMEM including 110mg/L Sodium Pyruvate and 200mM GlutaMax（GIBCO社）
20% FBS（ES Cell Qualified FBS）（GIBCO社）
0.1mM 2-Mercaptoethanol（Sigma社）
1% Non Essential Amino Acid Stock（GIBCO社）
1% 1×Antibiotic antimycotic（GIBCO社）
10μM Y-27632（WAKO社）
1μM PD0325901（Axon Medchem社）
0.5μM A-83-01（TOCRIS社）
3μM CHIR99021（Axon Medchem社）
【００３２】
2) ラットＥＳ細胞用培地（培養液）
内部細胞塊形成以降の培養（樹立ラットＥＳ細胞の培養も含む）において使用する培養液を、「ラットＥＳ細胞用培養液」と称する。
ラットＥＳ細胞用培養液は、ラットＥＳ細胞作製用培養液と同様のものであり、ラット由来白血病阻害因子（ｒＬＩＦ）を更に添加したものでもよい。ｒＬＩＦは、要時に添加して混合するのが好ましい。
【００３３】
（１）ラットＥＳ細胞の樹立方法
以下に、本発明におけるラットＥＳ細胞の樹立方法の具体例を示す。
1) 卵（胚盤胞期胚）の採取
卵採取用のラットとしては、前記したWistar Kyoto株（ＷＫＹ）、Brown Norway株（ＢＮ）、Goto-Kakizaki株（ＧＫ）、ＳＤ株、Ｆ３４４／Ｄｕ株（Fischer）、Wistar株、Wistar Hannover株、Long-Evans Agouti株（ＬＥＡ）、ＡＣＩ株などの系統のラットを用いることができる。当該ラットの週齢は８週齢〜４０週齢の範囲内であれば使用可能であるが、好ましくは１０週齢〜２０週齢のラットが用いられ、より好ましくは１０週齢〜１２週齢のラットが用いられる。
【００３４】
卵の採取は当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、ラットを自然交配させ、膣栓確認４〜５日目頃に採卵用雌ラットをと殺し子宮を摘出する。この子宮を適当な培地で灌流することにより、受精卵（胚）を回収する。ここで灌流に用いる培養液としては、例えばｍｗ培地（NaCl 640.0mg/100mL, KCl 35.6mg/100mL, KH2PO416.2mg/100mL, MgSO4-7H2O 29.4mg/100mL, NaHCO3190.0mg/100mL, Glucose 100.0mg/100mL, Na-Pyruvate 2.5mg/100mL, Ca-lactate 46.0mg/100mL, Streptomycin 5.0mg/100mL, Penicillin 7.5mg/100mL, 0.5% phenol red 0.2mL, 20mM beta-ME 10μL, 100mM EDTA-2Na 10μL, BSA 300.0mg/100mL）やＭ２培地（Calcium Chloride-2H20 0.251g/L, Magnesium Sulfate 0.143g/L, Potassium Chloride 0.356g/L, Potassium Phosphate 0.162g/L, Sodium Chloride 5.532g/L, Albumin 4.0g/L, D-glucose 1.0g/L, HEPES 4.969g/L, Phenol Red-Na 0.01g/L, Pyruvic Acid-Na 0.036g/L, Sodium Bicarbonate 0.35g/L, Penicillin G 0.06g/L, Streptomycin Sulfate 0.05g/L, DL-Lactic Acid 4.349g/L）などが挙げられる。
【００３５】
回収された胚は、ｍｗ培地、Ｍ２、Ｍ１６などの培養液中で培養を行うこともできる。培養により受精卵（胚）から桑実胚を経て胚盤胞（胚盤胞期胚）まで発生を進める。この段階まで発生を進めるためには通常、３７℃、５％  ＣＯ２培養装置内にて一晩培養を行う。胚盤胞まで発生が進んだことは、顕微鏡で観察することにより確認することができる。好ましくは、胚盤胞後期段階まで発生を進める。
【００３６】
2) 内部細胞塊の形成および分離
前記1)で得られた胚盤胞を顕微鏡下にて確認した後、透明帯を除去する。透明帯の除去は、酸性タイロード（ｐＨ２．５）、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼなどを用いて行うことができる。その後、マイトマイシンＣ処理を施したフィーダー細胞を培養皿に播種し、透明帯を除去したラット胚盤胞を該培養皿に移し、ラットＥＳ細胞樹立用培養液にて培養を開始する。
【００３７】
培養開始から１〜４日目に、透明帯を除去したラット胚盤胞（後期段階）がフィーダー細胞上に接着する。接着後５〜１０日目に胚盤胞から出現した内部細胞塊を２００μＬのピペットなどを用いて物理的に分離する。この分離した内部細胞塊を、ピペットなどを用いて物理的に解離するか、トリプシン・ＥＤＴＡ、アキュターゼ（登録商標、Innovative cell technologies社）などのタンパク質分解酵素を用いて解離する。この解離の工程は、５〜２０個程度の細胞からなる細胞集塊になるまでピペットなどを用いて物理的に解離するのが好ましい。細胞集塊を保持した状態であることは、顕微鏡下で確認することができる。
【００３８】
3) ＥＳ細胞の樹立
フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿において、前記2)で解離した内部細胞塊をラットＥＳ細胞用培養液で培養する。通常、培養開始から２〜４日目に初代ＥＳ細胞コロニーが出現する。初代ＥＳ細胞コロニーの出現は、顕微鏡下で観察することにより確認することができる（出現したＥＳ細胞を「初代ＥＳ細胞」と称する）。その後、５〜１０日間程度培養を継続することにより、初代ＥＳ細胞のコロニーが継代可能な状態となる。ここで「継代可能な状態」とは、形成された初代ＥＳ細胞コロニーを構成している細胞数が２００〜６００個前後に達し、かつ各細胞間が緊密になり細胞集塊が光沢を持つドーム状の形態を示した状態を意味する。このような形態となったことを顕微鏡下にて確認しながら、２００μＬのピペットなどを用いて当該ＥＳ細胞コロニーを分離する。この分離したＥＳ細胞コロニーを、ラットＥＳ細胞用培養液を含有する滅菌チューブなどに移し、５〜２０個程度の細胞からなる細胞集塊になるまで物理的に解離するか、アキュターゼ（登録商標）などのタンパク質分解酵素を用いて細胞解離を行う。解離は、物理的に解離することが望ましい。解離したＥＳ細胞コロニーは、フィーダー細胞を播種したゼラチンコート培養皿においてラットＥＳ細胞用培養液で初代培養を行う（継代１代目の細胞）。培養開始から２〜４日程度でＥＳ細胞コロニーが出現し、５〜１０日程度で継代可能な状態となる。
【００３９】
前記において継代可能となったＥＳ細胞コロニーから培養液を除去し、予め３７℃に保温したアキュターゼ（登録商標）または２．５％  トリプシンを全面に塗り広げる。顕微鏡下にて全体の７割以上のＥＳ細胞コロニーがフィーダー細胞から剥離してくる状態を確認し、タンパク質分解酵素処理を停止させる。例えば、１０％  ウシ胎仔血清を含む培養液を添加、あるいは大量の無血清培養液などを加えて、タンパク質分解酵素処理を停止させることができる。その後、５ｍＬのピペットなどを用いてさらに物理的にＥＳ細胞コロニーを剥離させ、細胞懸濁液を遠心（室温で１０００ｒｐｍ、３分間程度）にて細胞と培養液とに分離し、細胞のみを回収する。ラットＥＳ細胞用培養液で当該細胞を懸濁し、完全に単一化するのでは無く、顕微鏡下にて５〜２０個の細胞塊を形成している状態を確認し、フィーダー細胞を播種した培養皿に移し培養を行う（継代２代目の細胞）。
【００４０】
その後は、約３〜５日毎に継代可能な状態となるため、アキュターゼ（登録商標）などのタンパク質分解酵素により細胞を解離するか、物理的に細胞を解離することにより継代および培養を続行することができる。
【００４１】
ラットＥＳ細胞がＥＳ細胞としての性質を保持していること、すなわち未分化状態（多能性）を維持し、ＥＳ細胞としての望ましい性質を保持していることは、例えば、ＥＳ細胞特異的遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子）の発現、アルカリホスファターゼ活性、胚様体の形成能、ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４の発現、染色体の数、継代培養後の状態、インビトロでの多分化能、三胚葉系列の細胞への分化能、奇形腫（テラトーマ）形成能などを調べることにより確認することができる。これらの検証は自体公知の手法を用いて行うことができ（例えば、WO 2005/085427参照）、いくつかの具体例は後述の実施例に記載されている。
【００４２】
１−２．ラットｉＰＳ細胞
ラットｉＰＳ細胞は、例えば、Cell Stem Cell 4, 16-19 (2009) に記載される方法に従って作製することができる。出発材料となるラット体細胞としては、ラットＥＳ細胞について前記した系統から採取される胎児期、幼児期あるいは成体の体細胞を用いることができる。具体的には、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、精子幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）；組織前駆細胞；リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞等の既に分化した細胞等を用いることができる。核初期化に用いられる初期化因子としては、上記文献で用いられるものの他、可能な範囲で、マウスやヒトなどの他の哺乳動物のｉＰＳ細胞樹立に用いられ得る初期化因子を適宜選択して用いることもできる。核初期化効率を改善するためのＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤としては、ラットＥＳ細胞の樹立において前記したと同様の物質を適宜選択して使用することができる。樹立されたラットｉＰＳ細胞が未分化状態（多能性）を維持していることは、上記と同様の方法により確認することができる。
【００４３】
２．キメラ胚およびキメララットの作製方法
本発明は、ジャームライントランスミッション効率が改善されたキメラ胚を作製する方法であり、該キメラ胚を移植したラットから仔ラットを得ることによりキメララットを作製する方法である。本発明の方法を用いることにより、ラット多能性幹細胞や宿主胚の系統に制限されることなく、ジャームライントランスミッションされたキメララットを効率よく提供することができる。
【００４４】
ラットはマウスに比べて約１０倍という実験上適当な大きさの哺乳動物であり、（１）血管に容易に薬物投与可能である、（２）外科および移植実験が可能である、（３）組織を大量に採取可能である、といった利点を有する。従来から多くのヒト疾患モデルラットが開発および発見されてきたが、ラットＥＳ細胞系統や宿主ラット系統に限定されることなく効率よくジャームライントランスミッションされたキメララットを作製する方法が確立されていなかったために、遺伝子改変ラット、特にノックアウトラットやノックインラットといったジーンターゲッティングを要する遺伝子改変ラットの作製は行われていなかった。
【００４５】
本発明の方法により作製されたキメララットを用いることにより、ラット多能性幹細胞系統や宿主ラット系統に限定されることなく、容易に当該遺伝子改変ラットを作製することができる。なお、「遺伝子改変ラット」とは、キメララット、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラットおよびノックダウンラットなどのような当業者に周知の全ての遺伝子改変ラットを含むことを意味する。
【００４６】
より具体的には、本発明のキメラ胚の作製方法は、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む。
（ａ）雌のラットから採取された受精後の宿主胚と、ラット多能性幹細胞とをＥＳ細胞分化抑制剤の存在下で接触させる工程。
（ｂ）ラットＥＳ細胞と接触させた宿主胚を培養してキメラ胚を形成させる工程。
また、本発明のキメララットの作製方法は、上記方法により作製されたキメラ胚を偽妊娠雌ラットの子宮または卵管に移植し、仔ラットを出産させる工程を含む。
【００４７】
本発明におけるキメララットの作製に用いるラット多能性幹細胞は、上述の「１．ラット多能性幹細胞」に挙げられる細胞であり、好ましくはラットＥＳ細胞やラットｉＰＳ細胞であり、より好ましくはラットＥＳ細胞である。ラット多能性幹細胞は、公知の方法で特定の遺伝子が組み換えられた遺伝子組換え細胞であっても良い。例えば、特定の遺伝子を人工的に欠損させたＥＳ細胞や、特定の遺伝子を人工的に組み込んだＥＳ細胞等が挙げられる。
本発明において宿主胚を採取するラットは、如何なる系統のラットであっても良い。当該ラットの系統としては、例えば、Wistar Kyoto株（ＷＫＹ）、Brown Norway株（ＢＮ）、Goto-Kakizaki株（ＧＫ）、ＳＤ株、Ｆ３４４／Ｄｕ株（Fischer）、Wistar株、WistarHannover株、Long-Evans Agouti株（ＬＥＡ）、ＡＣＩ株などを挙げることができる。また本発明においては、当該系統は純粋な種であっても良く、または２種以上の交雑によって得られた種であっても良い。宿主胚の系統によらず、ジャームライントランスミッションされたキメララットを効率よく作製できるという本発明の特徴を考慮すれば、宿主胚とラット多能性幹細胞との接触工程において、ＥＳ細胞分化抑制剤の非存在下でラット多能性幹細胞と接触させた場合には、ジャームライントランスミッションされたキメララットを生じない系統のラットから採取した宿主胚を用いる際に、本発明は特に有用である。
採卵用雌ラットの週齢は８週齢〜４０週齢の範囲内であれば使用可能であるが、好ましくは１０週齢〜２０週齢のラットが用いられ、より好ましくは１０週齢〜１２週齢のラットが用いられる。
【００４８】
出発材料となる宿主胚は、雌のラットから採取された受精後の初期胚であれば特に限定されないが、通常、胚盤胞期胚以前の初期胚（例えば、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚、胚盤胞期胚）などが挙げられる。
宿主胚は自体公知の方法により交配後の雌ラットから採取することができる。交配は自然交配によってもよいし、排卵誘発後に交配を行ってもよい。当該宿主胚の採取方法としては特に限定されないが、具体的に説明すれば、採卵用雌ラットを同系の雄ラットと自然交配または性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に交配させ、適当な時期（例えば、８細胞期胚であれば交配後３．５日、１６細胞期胚であれば交配後３．７５日、桑実期胚であれば交配後４日、胚盤胞期胚であれば交配後４．５日）に採卵用雌ラットをと殺して子宮を摘出し、当該子宮を適当な培地で灌流することにより、初期胚を回収することができる。ここで灌流に用いる培養液としては、上述のラットＥＳ細胞樹立用培養液、初期胚の回収にも用いられる上記ｍｗ培地、Ｍ２培地などが、例示される。
【００４９】
採取された宿主胚は、ラット多能性幹細胞との接触に先立って前培養することができる。前培養用の基礎培地としては、ラットＥＳ細胞の樹立の際に使用される基礎培地と同様の培地を用いることができる。また当該培地は、血清含有培地または無血清培地とすることができる。当該培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有することができる。
好ましい実施態様においては、上記の前培養用培地にＥＳ細胞分化抑制剤が添加される。ＥＳ細胞分化抑制剤としては、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＦＧＦ受容体阻害剤から選択される少なくとも２種の薬剤が挙げられる。ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＦＧＦ受容体阻害剤としては、ラットＥＳ細胞の培養の際に前記した物質を使用することができる。好ましくは、ＥＳ細胞分化抑制剤として、ＭＥＫ阻害剤およびＧＳＫ阻害剤を含む組合せが挙げられ、より好ましい例として、さらにＴＧＦβ受容体阻害剤を用いる組合せが挙げられる。
ＭＥＫ阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜５μＭの範囲から適宜選択され得る。ＧＳＫ３阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．０１〜１００μＭ、好ましくは１〜１０μＭの範囲から適宜選択され得る。ＴＧＦβ受容体阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．００１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭの範囲から適宜選択され得る。ＦＧＦ受容体阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．００５〜５００μＭ、好ましくは０．０７〜５０μＭの範囲から適宜選択され得る。
別の好ましい実施態様として、宿主胚の前培養用培地に、ＥＳ細胞分化抑制剤に加えてＲＯＣＫ阻害剤をさらに添加することができる。ＲＯＣＫ阻害剤の具体例としては、ラットＥＳ細胞の培養の際に前記した物質が同様に挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．０００１〜５００μＭ、好ましくは１〜５０μＭの範囲から適宜選択され得る。
【００５０】
当該前培養は、例えば、ＣＯ２インキュベータ中、約１〜約１０％、好ましくは約２〜約５％、より好ましくは約５％のＣＯ２濃度の雰囲気下において、約３０〜約４０℃、好ましくは約３５〜約３７．５℃、より好ましくは約３７℃で行うことができる。
【００５１】
宿主胚と接触させるラット多能性幹細胞は上記１．に記載されたものから適宜選択されるが、好ましくは上記１−１．に記載されたラットＥＳ細胞である。ラット多能性幹細胞は、キメララットの作製を容易に確認するために、予めレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ（ＥＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ等の改変ＧＦＰを含む）、β−ｇａｌ、ルシフェラーゼ等）を常法により導入された組換えラット多能性幹細胞であることが望ましい。毛色のみを用いたキメララットの選択ではジャームライントランスミッションを子孫の代で確認することになるが、レポーター多能性幹細胞を用いれば、キメララットの生殖細胞における該レポーターの発現により、キメララット当代でジャームライントランスミッションを確認することができる。具体的には該レポーター遺伝子が導入されたトランスジェニックラットを予め作製し、該ラットから上記のようにして多能性幹細胞を得てもよいし、あるいは上記のようにして作製したラット多能性幹細胞に、該レポーター遺伝子とともに、薬剤耐性遺伝子などの形質転換細胞選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターをエレクトロポレーション法などによって導入し、薬剤選択などによって該レポーター遺伝子が組み込まれたラットＥＳ細胞を選択してもよい。
【００５２】
ラット多能性幹細胞と宿主胚との接触は、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。例えば、顕微鏡操作で、ラット胚盤胞の胚盤腔内や桑実胚期または１６細胞期に、ラット多能性幹細胞を注入して内部細胞塊と一緒に、または内部細胞塊の一部として発生させる方法（マイクロインジェクション法：Gordon J. W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77: 7380-7384 (1980) ）が挙げられる。あるいは、２個の８細胞期胚の透明帯を取り除き、ラット多能性幹細胞を注入して共培養し、凝集塊を作らせて、この凝集塊を培養して１個の胚盤胞を得る方法（細胞凝集法：Dvorak P. et al., Int. J. Dev. Biol., 39: 645-652 (1995) ）などを挙げることができる。ラット多能性幹細胞を注入する際は、ラットＥＳ細胞を、ミネラルオイル、オイルドロップまたは流動パラフィンなどで覆い、宿主胚に注入するのが好ましい。
【００５３】
ラット多能性幹細胞と宿主胚との接触の際に用いる培地も、基礎培地として、ラットＥＳ細胞の樹立の際に使用される基礎培地と同様の培地を用いることができる。また当該培地は、血清含有培地または無血清培地とすることができる。当該培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有することができる。
当該接触用培地には、２種以上のＥＳ細胞分化抑制剤が添加される。２種以上のＥＳ細胞分化抑制剤は、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＦＧＦ受容体阻害剤から選択される。ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤およびＦＧＦ受容体阻害剤の具体例としては、ラットＥＳ細胞の培養の際に前記した物質が同様に挙げられる。好ましくは、２種以上のＥＳ細胞分化抑制剤として、ＭＥＫ阻害剤およびＧＳＫ阻害剤を含む組合せが挙げられ、より好ましい例として、さらにＴＧＦβ受容体阻害剤を用いる組合せが挙げられる。
ＭＥＫ阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜５μＭの範囲から適宜選択され得る。ＧＳＫ３阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．０１〜１００μＭ、好ましくは１〜１０μＭの範囲から適宜選択され得る。ＴＧＦβ受容体阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．００１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭの範囲から適宜選択され得る。ＦＧＦ受容体阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．００５〜５００μＭ、好ましくは０．０７〜５０μＭの範囲から適宜選択され得る。
好ましい実施態様として、当該接触用培地に、ＥＳ細胞分化抑制剤に加えてＲＯＣＫ阻害剤をさらに添加することができる。ＲＯＣＫ阻害剤の具体例としては、ラットＥＳ細胞の培養の際に前記した物質が同様に挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤の培地への添加濃度は、例えば、０．０００１〜５００μＭ、好ましくは１〜５０μＭの範囲から適宜選択され得る。
【００５４】
ラット多能性幹細胞と接触させた後の宿主胚は、さらに培養を続けることによりキメラ胚を形成することができる。この後培養用の培地も、前記接触用培地と同様の組成のものを使用することができ、当該培地はＥＳ細胞分化抑制剤を含むものであることが好ましく、さらには２種類以上のＥＳ細胞分化抑制剤を含む培地がより好ましい。具体的には、ＭＥＫ阻害剤とＧＳＫ３阻害剤を含む培地が好ましく、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＴＧＦβ受容体阻害剤を含む培地がより好ましい。さらに当該培地には、ＲＯＣＫ阻害剤を添加することもできる。
【００５５】
当該後培養は、前述の前培養と同様の条件で行うことができる。
【００５６】
上記のようにして作製されたキメラ胚は、精管結紮処置を施した雄ラットと自然交配を行い準備した偽妊娠雌ラットの子宮または卵管に移植して仔ラットを出産させることにより、キメララットを得ることができる。
【００５７】
本発明の方法により作製されたキメララットが、ラット多能性幹細胞に由来する組織を有していることは、例えば、キメララットにおける、ラット多能性幹細胞が由来するラット系統の毛色の発現や、キメララットの組織切片におけるレポーター遺伝子の発現等により確認することができる。特に生殖細胞系列への分化を、生殖細胞におけるレポーター遺伝子の発現により検出することにより、迅速かつ簡便にジャームライントランスミッションの有無を確認することができる。ジャームライントランスミッションされていることの最終確認は、例えば、当該キメララット同士を兄妹交配して得られた子孫ラットの細胞よりＤＮＡを抽出し、レポーター遺伝子の存在をサザンブロッティングやゲノムＰＣＲなどにより検出することにより行うことができる。
【００５８】
ジャームライントランスミッションされていることが確認されたキメララットを異性ラットと交配することにより、ラット多能性幹細胞が全身に寄与したラット、即ち、すべての細胞がラット多能性幹細胞由来の遺伝情報を有するラットを作製することができる。例えば、ジャームライントランスミッションされたキメララットと野生型ラットとを交配して得られる仔ラットは、相同染色体の一方がラット多能性幹細胞由来となり、当該キメララット同士を兄妹交配して得られる仔ラットは、相同染色体の両方がラット多能性幹細胞由来となる。
【００５９】
３．遺伝子改変ラットの作製方法
上述のとおり、ジャームライントランスミッションされたキメララットを異性ラットと交配させることにより、ラット多能性幹細胞が全身に寄与したラットを作製することができるので、該ラット多能性幹細胞に遺伝子改変を施すことにより、全細胞が該遺伝子改変を有する遺伝子改変ラットを作出することができる。したがって、本発明はまた、上記の「２．キメラ胚およびキメララットの作製方法」により作製されたキメララットを用いた遺伝子改変ラットの作製方法、および当該方法により作製された遺伝子改変ラットを提供する。ここで「遺伝子改変ラット」とは、ノックアウトラット、ノックインラット、トランスジェニックラットおよびノックダウンラットなどのような当業者に周知の全ての遺伝子改変ラットを含むことを意味する。
好ましくは、遺伝子改変ラットの作製に用いられるキメララットは、上記１−１．に記載される、ＥＳ細胞分化抑制剤とＲＯＣＫ阻害剤とを用いて樹立されたラットＥＳ細胞が寄与したキメララットである。
【００６０】
「ノックアウトラット」とは、標的とする遺伝子を人為的に破壊した変異ラットを意味し、遺伝子ターゲッティングラットとも呼ぶことができる。ノックアウトラットの作製は、例えば、Donehower A. L. et al. Nature, 356: 215-221 (1992) などに記載されたノックアウトマウスの作製法に準じて行うことができる。具体的には、まず標的とする遺伝子のゲノムＤＮＡ配列をもとに遺伝子相同組み換えのためのベクター（ターゲッティングベクター）を構築する。このとき組み換えクローンの選別のために、マーカー遺伝子としてＧ４１８耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子などを組み込むことができる。この構築したターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法などによってラット多能性幹細胞に導入する。得られたターゲッティングベクター導入細胞の中から、マーカー遺伝子などを基準として、遺伝子相同組み換えを起こしたコロニーを選別する。このようにして得られた遺伝子組み換えラット多能性幹細胞を用いて、本発明のキメララット作製方法に従い、キメララットを作製する。当該キメララットを野生型ラットと交配させることにより、その仔ラットの中にヘテロノックアウトラットを産出させることができ、当該ヘテロノックアウトラット同士を交配させることにより、ホモノックアウトラットをその仔ラットとして産出させることができる。
近年、標的とする遺伝子について両アレル改変させることが、細胞レベルで容易に実施可能となっている。具体的には、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）等の技術を用いることで容易に行うことができる。従って、ラットES細胞について、これらの公知技術を用いて標的とする遺伝子の両アレル欠損を施し、両アレル欠損したES細胞を用いればホモノックアウトラットを容易に産出させることもできる。
【００６１】
前記ノックアウトラットの範疇には、コンディショナル・ノックアウトラットも含まれる。ここで「コンディショナル・ノックアウト」とは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムまたはＦＬＰ／ＦＲＴシステムを利用して、部位特異的または時期特異的に遺伝子をノックアウトするシステムをいう。具体的には、ターゲッティングする遺伝子の両端（３’末端および５’末端）をｌｏｘＰ配列またはＦＲＴ配列で挟んだものに置き換えておき、ＣｒｅまたはＦＬＰタンパク質の供給により前記ｌｏｘＰ配列またはＦＲＴ配列で挟んだ遺伝子を切り取るシステムである（Sternberg N., et al., J. Mol. Biol., 150: 487-507 (1981) ）。
【００６２】
「ノックインラット」とは、標的とする遺伝子の位置に、人為的に作製した相同性を有する外来性遺伝子を導入した変異ラットを意味する。当該外来性遺伝子の導入により、標的遺伝子の機能は破壊される場合もあれば破壊されない場合もある。例えば、標的遺伝子の発現をモニターするためにｌａｃＺ遺伝子やＧＦＰ遺伝子などのマーカー遺伝子を導入したり、遺伝子に変異を導入して入れ替えることも可能である。
【００６３】
当該ノックインラットは、例えばPewzner-Jung Y. et al., J. Immunol., 161: 4634-4645 (1998)などに記載されたノックインマウスの作製法に準じて作製することができる。基本的には前記ノックアウトラットの作製と全く同じ原理を利用して作製することができる。
【００６４】
「トランスジェニックラット」とは、人為的に外来遺伝子を導入したラットを意味する。トランスジェニック動物の作製は、ドナー動物から採取した受精卵の雄性前核に所望の遺伝子を顕微鏡操作によって注入する方法（マイクロインジェクション法）が従来から一般化されている。その受精卵をレシピエント動物の卵管内に移植し、自然分娩された出生動物がトランスジェニック動物となる。前記ノックアウトラットやノックインラットほどキメララットの必要性は高くないが、外来遺伝子の導入効率やトランスジェニック動物個体の作製効率を高めるためには、本発明のキメララット作製方法が有効に用いられる。
【００６５】
当該トランスジェニックラットは、例えばYamamoto H. et al., Cancer Res., 62: 1641-1647 (2002)などに記載されたトランスジェニックマウスの作製法に準じて作製することができる。
【００６６】
トランスジェニックラットの範疇には、コンディショナル・トランスジェニックラットも含まれる。ここで「コンディショナル・トランスジェニック」とは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムまたはＦＬＰ／ＦＲＴシステムを利用して、部位特異的または時期特異的に遺伝子を発現させるシステムをいう。具体的には、目的遺伝子内に薬剤耐性遺伝子などの両端（３’末端および５’末端）をｌｏｘＰ配列またはＦＲＴ配列で挟んだカセットを挿入して目的遺伝子を発現不能にしておき、ＣｒｅまたはＦＬＰタンパク質の供給により前記ｌｏｘＰ配列またはＦＲＴ配列で挟んだ遺伝子を切り取ることにより、目的遺伝子を発現させるシステムである（Sternberg N., et al., J. Mol. Biol., 150: 487-507 (1981) ）。
【００６７】
「ノックダウンラット」とは、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）の中間物質である短い２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）やアンチセンス核酸を人為的に導入および発現させ、当該ｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸の作用により標的遺伝子の発現を抑制させたラットを意味する。このようなノックダウン動物は、ベクター系によるｓｉＲＮＡの発現システムが確立したことに基づき、作製可能となった（Science 296: 550-553(2002)、Nature Biotech.20:500-505(2002)など）。
【００６８】
当該ノックダウンラットは、例えばTiscornia G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: 1844-1848 (2003)などに記載された方法に準じて作製することができる。基本的には前記トランスジェニックラットの作製と全く同じ原理を利用して作製することができる。
【００６９】
４．キメララット作製のためのキット
本発明は、ジャームライントランスミッションされたキメララットを作製するための培地を含むキットを提供する。本発明のキットに含まれる培地（例えば、培養液）は、ジャームライントランスミッションされたキメララット作製能を有するラットＥＳ細胞の樹立にも用いることができる。
【００７０】
本発明のキットは、ＥＳ細胞分化抑制剤を成分として含有する培地を含むことを特徴としている。ＥＳ細胞分化抑制剤は、本発明におけるラットＥＳ細胞の分化能を抑制する作用を有するものであれば、如何なる物質であっても良い。ＥＳ細胞分化抑制剤としては、例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＦＧＦ受容体阻害剤が挙げられる。これらのうち、本発明においては、少なくとも２種のＥＳ細胞分化抑制剤が用いられる。好ましくは、ＥＳ細胞分化抑制剤として、ＭＥＫ阻害剤およびＧＳＫ阻害剤の組合せ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤の組合せ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ阻害剤およびＦＧＦ受容体阻害剤の組合せが挙げられ、ジャームライントランスミッションされたキメララット作製能の高さから、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＴＧＦβ受容体阻害剤がより好ましい。別の好ましい実施態様として、ＥＳ細胞分化抑制剤に加えてＲＯＣＫ阻害剤をさらに添加することができる。ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＦＧＦ受容体阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤の詳細については上記に示した通りである。
【００７１】
本発明のキットは、前記ＥＳ細胞分化抑制剤を単独で、または少なくとも２種類以上を適宜組み合わせて含有させることができる。２種類以上のＥＳ細胞分化抑制剤を組み合わせてキットに含有させる場合、各種ＥＳ細胞分化抑制剤は混合して１つの容器の中に封入されていても良いが、それぞれ別々の容器に封入されていることが好ましい。
【００７２】
前記キットは、上述「１．ラット多能性幹細胞」のラット多能性幹細胞をキット構成成分の一つとして含有することができる。ラット多能性幹細胞は、ラットＥＳ細胞が好ましい。
【００７３】
前記キットは、さらにフィーダー細胞を構成成分として含有することができる。フィーダー細胞としては当業者に入手可能な如何なる種由来のフィーダー細胞であっても良いが、ライン化されたフィーダー細胞よりも正常線維芽細胞を用いることが好ましい。具体的には、妊娠１２日〜１６日目のマウス胎児の線維芽細胞の初代培養細胞（正常線維芽細胞）が挙げられ、当該正常線維芽細胞としては、例えばＩＣＲマウスの胎児１２．５日目の正常線維芽細胞が例示される。当該フィーダー細胞は常法により調製することもできれば、市販のマウス胎児線維芽細胞（旭テクノグラス株式会社）などを利用することもできる。
【実施例】
【００７４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例になんら限定されるものではない。【００７５】
実施例１  蛍光レポータートランスジェニックラットの作製
ＥＳ細胞の樹立、検証のためＯｃｔ４遺伝子発現を蛍光モニターするトランスジェニックラット作製を行った。Ｏｃｔ４プロモーター領域ＤＮＡは、WistarラットゲノムＤＮＡからKOD Ver.2 DNA polymerase（東洋紡）を用いＰＣＲで増幅し、pCS2-Venus plasmidに挿入した。Oct4 promoter-Venus DNAはWistarラットの受精卵前核内に注入し（Ｏｃｔ４−ＶＥＮＵＳトランスジェニックラット）を得た。【００７６】
実施例２  ラットＥＳ細胞の作製
（１）試薬、フィーダー細胞の調製
最初に、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２（WAKO社）、ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１（Axon Medchem社）、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体阻害剤であるＡ−８３−０１（TOCRIS社）、ＧＳＫ３阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（Axon Medchem社）の４種類の阻害剤を準備した（以下、これらの４種類の阻害剤を「ＹＰＡＣ因子」という。）。【００７７】
ＥＳ細胞用基礎培地として、110mg/L  Sodium Pyruvate、200mM  GlutaMax含有ＤＭＥＭ（GIBCO社）に20%  ＥＳ細胞用ＦＢＳ（LotNo.1204059：GIBCO社）、0.1mM  2-Mercaptoethanol（Sigma社）、1%  Non Essential Amino Acid Stock（GIBCO社）、1%  1×Antibiotic antimycotic（GIBCO社）を添加し調製した。【００７８】
このＥＳ細胞用基礎培地に、ＹＰＡＣ因子を各々、ＲＯＣＫ阻害剤  Ｙ−２７６３２  10μM、ＭＥＫ阻害剤  ＰＤ０３２５９０１  10μM、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体阻害剤  Ａ−８３−０１  0.5μM、ＧＳＫ３阻害剤  ＣＨＩＲ９９０２１  3μMとなるように添加し、実験に用いた（以下、この培地を「ＹＰＡＣ培地」という。）。【００７９】
フィーダー細胞はマイトマイシンＣ処理済ネオマイシン耐性マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ：Millipore）を用い、ＤＭＥＭに10% ＦＢＳ（EQUITECH-BIO社、LotNo.SFB30-1502）と1%  1×Antibiotic antimycotic（GIBCO社）を添加した培地で維持した。【００８０】
（２）ＥＳ細胞の樹立
ラット胚盤胞（ブラストシスト）は、４．５または５日目の妊娠ラット子宮をＥＳ細胞用基礎培地で灌流し、得た。タイロード液（Ark Resource社）で透明帯を除去後、６ウェルプレートに移し、フィーダー細胞（ＭＥＦ）上に（１）で調製したＹＰＡＣ因子を加えたＥＳ細胞用基礎培地（ＹＰＡＣ培地）で培養した。約７日後、胚盤胞のアウトグロースをＹＰＡＣ培地に再播種し、ＥＳ細胞コロニーをアキュターゼ（Innovative cell technologies社）で酵素的に分離し培養した。樹立したＥＳ細胞は、ＭＥＦ−ＹＰＡＣ培地条件で培養し、３〜４日おきに継代した。尚、ＥＳ細胞はＹＰＡＣ培地にＤＭＳＯ（dimethylsulfoxide）を加え常法に従い凍結、融解した。また、ＴｇＷＬ１（ＥＳ細胞）、ＴｇＷＬ２（ＥＳ細胞）培養時は、継代数３、４まで1000U/mL  ｒＬＩＦを加えて培養した。【００８１】
（３）様々な系統のラットを用いた検討
上記（２）のラットＥＳ細胞の樹立方法を用いて、Wistar以外のラット系統でラットＥＳ細胞の樹立が可能であるかどうかについて検討を行った。その結果、表１に示すように、検討を行った全ての系統でラットＥＳ細胞が樹立できた。【００８２】
【表１】
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【００８３】
実施例３  ラットＥＳ細胞の検証
実施例２で得られたラットＥＳ細胞および作製過程についての検証を行った。
（１）ＹＰＡＣ培地中での内部細胞塊（ＩＣＭ）のアウトグロース
実施例１で作製したトランスジェニックラットのブラストシスト由来内部細胞塊（ＩＣＭ）を用いて、実施例２のＥＳ細胞用基礎培地にＹＰＡＣ因子を加えた場合、加えない場合での検討を行った。ＹＰＡＣ因子非存在下でＯｃｔ４−Ｖｅｎｕｓ蛍光はプレート播種後３日後に検出されたが、７日後には、マウスＥＳコロニーに似たドーム形状増殖を示したものの消失した。ＹＰＡＣ因子の存在下、ＩＣＭ細胞は７日後もＯｃｔ４−Ｖｅｎｕｓ蛍光を維持したまま急速に増殖した（図１ａ、ｂ）。また、多能性因子であるＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１の遺伝子発現を定量ＰＣＲで確認したところ、ＹＰＡＣ因子非存在下に比較し、ＹＰＡＣ因子添加時が高レベルであった。ＹＰＡＣ因子非存在下の場合、Ｏｃｔ４のｍＲＮＡはVenus ｍＲＮＡ発現、蛍光強度と同様に減少した（図１ｃ）。本実験において、ブラストシストはトランスジェニックWistar（ＴｇＷＷ、Arbino）、Wild-type   Wistar（ＷＷ、albion）、ＬＥＡ（ＬＬ、agouti）、トランスジェニックWistar／ＬＥＡ（ＴｇＷＬ、agouti）ハイブリッド由来のものを使用した。ＹＰＡＣ因子の存在下で樹立したラットＥＳ細胞は、免疫染色でもOct４、Nanog、Sox2の発現が確認できた（図２ｈ）。【００８４】
（２）培地中のＹ因子（ＲＯＣＫ阻害剤）効果の検証
樹立したラットＥＳ細胞を、ROCK阻害剤（以下、「Y因子」という。）を含まないが、MEK阻害剤、Ｉ型TGF-β受容体阻害剤およびGSK3阻害剤（以下、これら3種の阻害剤を「PAC因子」という。）を添加したＥＳ細胞用培地で培養を行った場合、コロニーは未分化形態を維持したが、まばらなコロニーとなった（図２ａ）。一方、Ｙ因子のみ添加したＥＳ細胞用培地で培養した場合、ＭＥＦ上に接着し増殖するが、未分化能を維持できずアルカリフォスファターゼ活性を示さなかった（図２ａ、b）。【００８５】
（３）ＥＳ細胞中の核型解析
得られた５０個のラットＥＳ細胞の核型をギムザ染色により解析し、ほとんどの細胞が正常である４２本の核型を示した（図２ｃ）。結果は、ＴｇＷＬ１（70%, XX, P14)、ＴｇＷＬ２（84%, XX, P7, 図２ｃ)、ＴｇＷＷ１（92%, XX, P5)、ＬＬ１（84%, XX, P6）であった。【００８６】
（４）ＤＮＡマイクロアレイ分析
（ｉ）マイクロアレイ解析１
マイクロアレイ解析の結果、遺伝子発現においてＴｇＷＷ１とＬＬのＥＳ細胞間は類似しているが、ＴｇＷＷ１とラット胎児線維芽細胞（ＲＥＦ）間には差が認められた。ＥＳ細胞間の統計解析による相関係数は０．９６８であり、ＴｇＷＷ１、ＬＬ（図２ｄ）中の多能性マーカーＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｄｐｐａ３、Ｔｂｘ３、Ｆｂｘｏ１５、Ｅ−カドヘリンとして知られているＣｄｈ１の発現レベルはＴｇＷＷ１とＬＬは類似していたが、ＲＥＦよりは高値であった（図２ｅ）。
（ｉｉ）マイクロアレイ解析２
マイクロアレイ解析の結果、遺伝子発現においてＴｇＷＬ１、ＴｇＷＷ１とＬＬ１のＥＳ細胞間は類似しているが、ＥＳ細胞とラット胎児線維芽細胞（ＲＥＦ）間には差が認められた（図２ｇ）。ＥＳ細胞間の統計解析による相関係数はＴｇＷＬ１とＴｇＷＷ１間で０．９７１、ＴｇＷＷ１とＬＬ１間で０．９６１であった。【００８７】
（５）テラトーマの形成
実施例２で作製したＴｇＷＷ１（ＥＳ細胞）をアキュターゼでシングルセルに分散後、10mL  ＰＢＳで２回洗浄し、100μL  ＰＢＳで懸濁した２．６×１０６個を免疫不全マウス皮下に注入したところ、３４日目のマウスにてテラトーマが確認できた（図２ｆ）。テラトーマをパラフィンワックスで固定し、ヘマトキシリン・エオジンを用い組織染色を行ったところ、内胚葉、中胚葉、外胚葉の三胚葉への分化が確認できた（図２ｉ）。【００８８】
（６）ＥＳ細胞の胚様体（Embryoid bodies：ＥＢｓ）の形成
実施例２で作製したラットＥＳ細胞をアキュターゼでシングルセルに分散後、低接着性ディッシュ（NUNC社）上に、実施例２のＥＳ細胞用培地にＹ因子を含まない３阻害剤（ＰＡＣ因子）添加ＥＳ細胞用培地で培養し胚様体（ＥＢｓ）を作製したところ、細胞は高効率で凝集し、明瞭な３Ｄ体ＥＢｓを構築した（図３ｂ）。また、Ｏｃｔ４−Ｖｅｎｕｓ蛍光強度は７日目で増加し、Ｖｅｎｕｓ、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１の発現も定量ＰＣＲで維持されていることが確認できた（図３ｃ）。一方、ＰＡＣ因子非添加時にはマウスＥＢｓと比較し著しく低効率でＥＢｓを作製するものの（図３ａ）、各種の多能性マーカー遺伝子発現は減少した（図３ｃ）。【００８９】
実施例４  ＹＰＡＣインジェクションによる多系統でのジャームライントランスミッションキメララットの作製
以下の方法にて多系統のＥＳ細胞を用いたジャームライントランスミッションキメララットの作製を行った。【００９０】
（１）ブラストシストの準備
４．５日目妊娠ラットから得たブラストシストは、インジェクション培地（抗生物質不含ＹＰＡＣ培地）で２〜３時間インキュベートしマイクロインジェクションに使用した。【００９１】
（２）ＥＳ細胞の調製
実施例２のＥＳ細胞のドーム上コロニーをガラス管で１０〜２０個採取し、５分間アキュターゼで処理した後、インジェクション培地内でシングルセルに分散した。次に細胞をインジェクション培地500μLに移し、室温で３０〜６０分インキュベート後、遠心して得られたＥＳ細胞をインジェクション培地に移し、ミネラルオイル（SIGMA社）で覆った。【００９２】
（３）ブラストシストへのＥＳ細胞の注入
１０〜１５個のＥＳ細胞を胚盤胞に注入し、胚を元の状態に戻すためインジェクション培地で３７℃、３〜５時間インキュベーションした。１０〜２０個の胚を妊娠３．５日目の偽妊娠ラットの子宮角に移植した。キメララットは毛色で判定し、ジャームライントランスミッションは、キメララットの交配で誕生したＦ１ラットの毛色と胎児生殖細胞のＯｃｔ４−ＶＥＮＵＳ蛍光で判定した。ジェノタイピングは尾部ＤＮＡをＰＣＲすることで行った。【００９３】
実施例５  ジャームライントランスミッションキメララットおよび作製方法の検証
以下の方法でＹＰＡＣインジェクション法の有用性及びジャームライントランスミッションの検証を行った。【００９４】
（１）ラットＥＳレポーター細胞（シアン）の作製
ラットＥＳ細胞をモニターするため、5μg  pCAG-AmCyan1を３．２×１０６個のＴｇＷＷ１（ＥＳ細胞）にMouse ES Cell Nucreofector Kit（Amaxa社）を用い導入し、シアン・緑の蛍光を発するCAG-AｍCyan1・Ｏｃｔ４−ＶＥＮＵＳ陽性のＥＳ細胞のコロニーをガラス管で採取し、薬剤選択なしで増幅しモニター細胞（ＴｇＷＷ１＋Ｃ）とした。また、ＬＬ（ＥＳ細胞）細胞に対しても、２．４×１０６個の細胞に10μg  pOct4-Venusを導入し同様の方法でレポーターＥＳ細胞（ＬＬ１＋Ｖ）を作製した。【００９５】
（２）ＹＰＡＣ因子添加インジェクション培地の効果の検証
インジェクション培地へのＹＰＡＣ因子添加の有無について検討した。インキュベーション５時間後では、ＹＰＡＣ因子非存在下インジェクションとＹＰＡＣ因子存在下でのインジェクション（以下、「ＹＰＡＣインジェクション」という。）の間に差はなく、様々なシアン陽性の細胞は内部細胞塊（ＩＣＭ）及び栄養外胚葉（ＴＥ）上に接着した。しかしながら、インキュベーション３０時間後でＹＰＡＣ因子非存在下では少数のアポトーシスを起こしているシアン陽性細胞がブラストシスト内に存在する一方、ＹＰＡＣ因子存在下ではいくつかの細胞がＩＣＭ上に集積しており、ブラストシストの形状も維持されていた（図４ｂ）。【００９６】
（３）ジャームラインキメララット作製能力の検証
ブラストシストに実施例５（１）のＥＳ細胞ＴｇＷＷ１＋Ｃをインジェクションし、３．５時間インキュベートした後、偽妊娠３．５日のマウス子宮に移した。１８日胎児９個体中シアン陽性で表皮および腎臓におけるＯｃｔ４−Ｖｅｎｕｓ陰性の２個体が確認できた。Ｏｃｔ４−Ｖｅｎｕｓ陽性細胞は性腺上のジャームセル特異的に検出された（図４ｃ）。また、他の全てのＥＳ細胞においても胎児性腺上のＯｃｔ４−Ｖｅｎｕｓ蛍光を確認することによりジャームラインキメラの発生を確認した。ジャームラインキメラはＴｇＷＬ２細胞の２２継代の長期培養細胞でも１２匹中２匹を確認した。更にＬＥＡラット系統から誘導したＬＬ細胞にＯｃｔ４−Ｖｅｎｕｓ遺伝子を導入したＬＬ１＋Ｖにおけるジャームライントランスミッションも確認した。【００９７】
毛色によるキメラ確認のため、ＹＰＡＣ因子添加インジェクションによりＴｇＷＬ１細胞をWistarへインジェクションした。２３個体中８個体のキメラ色ラットが継代数１１または１２のＴｇＷＬ１細胞から発生した（図４ｄ）。一方、ＹＰＡＣ因子添加インジェクションを用いない場合、継代数６または８と継代数の少ない同一セルラインを用いたにも関わらず、キメラ色ラットの作製は難しく、４４匹の個体中唯一１個体のみであり、キメラ率は低いものであった。ＹＰＡＣ因子を用いたキメラ色ラットの作製は４セルライン全てで成功した。また、Ｆ１でのジャームライントランスミッションを確認する為、ＴｇＷＬ１キメラとWistarとを交配したところ、雌キメラのうち１個体はＴｇＷＬ１セルラインのジャームライントランスミッションを含む１６個体中４個体のアグーチ色の子供を得た（図４ｅ）。また、ＴｇＷＬ２セルライン由来でもＦ１ジャームライントランスミッションが確認できた。表２及び表３に示すように、キメララット作製にＹＰＡＣ因子を用いると、ラットＥＳ細胞系統や、宿主ラット系統に限定されることなく、ジャームライントランスミッションされたキメララットが作製できることが判明した。
なお、cell lineは、TgWL1とTgWL2がTgWLラット（トランスジェニックWistarとLEAのハイブリッドラット）から樹立したES細胞、TgWW1とTgWW2がTgWWラット（TgWW：トランスジェニックWistarとワイルドタイプWistarのハイブリッドラット）から樹立したES細胞、WW1がWWラット(ワイルドタイプWisterラット)から樹立したES細胞、LL1とLL2 がLLラット(LEAラット)から樹立したES細胞である。【００９８】
遺伝子解析によりＶｅｎｕｓ領域を確認するため、尻尾のゲノムＤＮＡを採取し、ＰＣＲで増幅した。Ｆ０キメラのＯｃｔ４−Ｖｅｎｕｓ遺伝子はアグーチ色を持つＦ１ジャームライン３個体中２個体へメンデルの法則に従い遺伝した（図４ｆ）。また、表２に示すように、長期培養ES細胞（ＴｇＷＬ２：継代数２２）をブラストシストにインジェクションしたところ、胎児17.5日に性腺上のVenus蛍光を検出することができた（図４ｉ）。
更に、ＹＰＡＣ因子のキメラ率に関する影響について検討した。ＴｇＷＬ１ラットES細胞（継代数６）をブラストシストにインジェクションする時、およびブラストシスト培養時にYPACを添加せずキメラを作製したところ（図４ｊ）、図４ｊの矢印に示すように、アグーチコートカラーのキメラ率が低いことが判明した。一方で、ＴｇＷＷ１、ＬＬ１のES細胞をYPAC因子存在下でキメラを作製したところ（A：ＴｇＷＷ１細胞をＬＥＡブラストシストにインジェクション、B :ＬＬ１細胞をWistar  ブラストシストにインジェクション）、図４ｋに示すように、アグーチコートカラーのキメラ率が高いことが判明した。図４ｋの矢印はＥＳ細胞のキメラ貢献度を示す。【００９９】
【表２】
2011068103.tif 000003
【０１００】
【表３】
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【０１０１】
（４）シングルラットＥＳ細胞由来のジャームラインキメラ作製
ラットＥＳ細胞の多能性を確認する為、ブラシストシストにシングルセルをインジェクションし確認を行った（図４ｇ）。継代数９のＴｇＷＷ１細胞のWistarブラストシストへのインジェクションの後、ＹＰＡＣ因子インジェクション培地で３時間インキュベーションしシングルセルを内表面に結合させた。３５個のブラシストシストから１６日の８胎児が発生し、１胎児でジャームライントランスミッションを達成した（図４ｈ）。【０１０２】
（５）ジャームライントランスミッションされたキメララット作製の条件検討
ＲＯＣＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体阻害剤とＧＳＫ３阻害剤からなる「ＹＰＡＣ因子」、またはＭＥＫ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体阻害剤（Ａ−８３−０１）とＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）の３種類の阻害剤からなる「ＰＡＣ因子」を用いてキメララット作製を検討した結果を表４に示す。なお、ｒＥＳ細胞はいずれもＹＰＡＣ培地を用いて樹立した。【０１０３】
検討の結果、ＹＰＡＣ因子だけでなくＰＡＣ因子でもキメララットを作製することが可能であり、得られたキメララットはジャームライントランスミッションされていることが確認できた。また、宿主胚盤胞に注入するｒＥＳ細胞が少ない場合は、ｒＥＳ細胞を宿主胚に注入する工程で、ＹＰＡＣまたはＰＡＣ因子にROCK阻害剤を加えると、ＥＳ細胞のブラストシストへの接着強度が増すため、望ましいと考えられた。【０１０４】
なお、これまでに、ラットＥＳ細胞やマウスＥＳ細胞を用いたキメラ動物の作製は報告されているが、宿主胚にＥＳ細胞を注入時にＥＳ細胞分化を抑制する化合物（ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤等）を添加したという報告はない。実施例１で作製したラットＥＳ細胞は、ジャームライントランスミッションできるラットＥＳ細胞という点では先行文献に記載のラットＥＳ細胞と同様の能力を有すると考えられるが、阻害剤を添加しない条件ではジャームライントランスミッションされたラットは作製できなかった。従って、従来の方法に比べて、ＥＳ細胞の分化を抑制する薬剤を用いたキメララット作製方法は、極めて効率良くジャームライントランスミッションされたラットを作製できることが判明した。【０１０５】
【表４】
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【０１０６】
実施例６  遺伝子改変ES細胞由来のジャームライントランスミッションキメララットの作製
以下の方法で遺伝子改変ES細胞を用いたジャームライントランスミッションキメララットの作製を行った。【０１０７】
（１）遺伝子改変ラットES細胞の作製
10μg pOct4-Venusを3×106個のLL2（ＹＰＡＣ因子で樹立したES細胞）にMouse ES Cell Nucleofector Kit（Amaxa社）を用い導入し、2% Matrigel(BD Bioscience社)が塗布された培養器で、MEF上に播種した。緑の蛍光を発するOct4-Venus陽性のES細胞のコロニーをガラス管で採取し、薬剤選択なしで増幅し、Oct4-Venus陽性ES細胞（LL2）とした。2回継代後、ES細胞コロニー15個のうち、13個は緑の蛍光は不均一であったが、2個は均一な蛍光を発していた（図５Ａ、Ｂ）。【０１０８】
（２）遺伝子改変ES細胞由来のジャームライントランスミッションキメララットの作製
Wister由来ブラストシストに、安定に緑の蛍光を発するES細胞LL2をＹＰＡＣ因子の存在下でインジェクションし、3-5時間インキュベーションした後、偽妊娠3.5日のマウス子宮に移し、トランスジェニックラット（esTGラット）を作製した。作製したesTGラットのジャームライントランスミッションはF1ラットの毛色と（図５Ｃ、表３）、胎児16日esTGラットの性腺上のVenus蛍光から確認した（図５Ｄ）。また、esTGラットは正常な生殖能力が保持されたまま成長した。【０１０９】
（３）esTGラットに由来するES細胞の検証
esTGラットに由来するES細胞のVenus蛍光の発現パターンを検証した。esTGラットに由来するブラストシストのアウトグロース（図５Ｅ）が発現するVenus蛍光は、実施例1で作製したコンベンショナルトランスジェニックラット（cvTG）に由来するブラストシストのアウトグロース（図１ｂ）と同じであった。また、１０回の継代後もVenus蛍光を安定に維持したまま培養できた（図５Ｆ）。これらの結果から、Venusを安定に発現する良質なesTGラットが作製できることが判明した。【０１１０】
実施例７  ジーンターゲティングラットES細胞によるキメララットの作製
Oct4遺伝子の最初のエクソン中のスタートコドンより124bp下流を認識するZFNペアをデザイン（シグマ社）し、図６Ａに示すショートホモロジーアームスで構成されるターゲティングドナーをラットゲノムDNAよりKOD  Ver.2  DNAポリメラーゼ（東洋紡）を用いPCRによって作製した。
このAmCyan1-IRES-NEOカセットを含むドナーの正確なターゲティングは内在性のOct4プロモーター制御下でAmCyan1とネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼの発現を導いた。10μgのターゲティングドナーと5μgのZFNエンコーディングmRNAsを、6×106個のES細胞（Long-Evans  Agouti(LEA)、継代数７）にMouse  ES  Cell  Nucreofector  kit（Amaxa  Inc.）と共に添加し、ヌクレオフェクションを行った。ES細胞は2%  Matrigel（BD  Bioscience）が塗布された培養器で、MEF上に播種しYPAC因子添加培地中で薬剤選択なしで培養し、ガラス管にてAmCyan1陽性細胞を採取した。ドナー単独の挿入によるAmCyan-1陽性コロニーはなく、ZFNエンコーディングmRNAとドナーの両方を挿入した18コロニーでAmCyan1の発現が確認できた。これら18コロニーの継代を行い、11コロニーが生存できた。ジェノタイピング解析の結果、11クローン中8クローンで正確にジーンターゲティングが行われていた（73%）（図６Ｂ）。
これらヘテロ（Oct4+/-）な８クローンは未分化細胞中で均一なAmCyan1発現を示したが、分化したものは示さなかった（図６Ｃ）。また増幅できた4つのクローンを4.5日妊娠ラットから得たブラシスト中にYPAC因子添加下で15〜18個のES細胞をインジェクションし、妊娠３．５日目の偽妊娠ラットの子宮角へ移植した（種：Wister）。3匹のコートカラーキメラが1種類（No.11)のクローンから発生した。
従って、ＹＰＡＣ因子で樹立したラットＥＳ細胞は、ＥＳ細胞樹立後にジーンターゲティング等の遺伝子改変を行っても、キメララット作製能を有することが判明した。【０１１１】
【表５】
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【０１１２】
実施例8  p53遺伝子欠損ラットES細胞（p53+/-）によるp53遺伝子ノックアウトラットの作製
（１）p53遺伝子欠損ラットES細胞（p53+/-）の作製
ラットp53遺伝子（exon 4）を認識するZFN発現プラスミドとZFNエンコーディング mRNA をデザイン（シグマ社）し、図７に示すショートホモロジーアームスで構成されるターゲティングドナーをラットゲノムDNAよりKOD Ver.2 DNAポリメラーゼ（東洋紡株式会社）を用いPCRによって作製した。
10μgのターゲティングドナーと5μgのZFNエンコーディングmRNAsを実施例6（1）で樹立した6.5 x 105個のOct4-Venus陽性ES細胞(LEA系ラット)[LL2] (継代数5) にMouse ES Cell Nucreofector kit（Amaxa社）と共に添加し、ヌクレオフェクションを行った。ES細胞は2% Matrigel（BD Bioscience社）が塗布された培養器で、MEF上に播種しYPAC因子添加培地中で培養した。培養1日後、ジェネティシンを0.2μg/ml濃度で培地に添加した。培養11日後に、ジェネティシン耐性のES細胞コロニーをガラス管に採取し、培養した。ジェノタイピング解析の結果、図８Ａに示すように、採取した7コロニー中の6コロニーでホモロガスリコンビネーションが行われ、p53遺伝子が欠損していた (p53+/- ES細胞)。1コロニー（Clone No. 3）はホモロガスリコンビネーションが行われなかった。シアン蛍光からもp53+/- ES細胞におけるp53遺伝子座へのホモロガスリコンビネーションが確認された（図８Ｂ）。【０１１３】
（２）p53遺伝子欠損ラットES細胞 (p53+/-)によるキメラットの作製
ホモロガスリコンビネーションが確認できたp53+/- ES細胞（継代数9）の1クローンをWistar系ラットから得たブラシスト90個中にYPAC因子添加下でインジェクション（12 cells / 1 blastocyst）し、妊娠3.5日目の偽妊娠ラットの子宮角へ移植した（種：Wister）。その結果、13個体中9個体のキメラ色ラット（雄キメラ：5個体、雌キメラ：4個体）が発生した。
雌キメラとワイルドタイプLEA系ラットを交配させ、生まれたラットのうちキメラ色ラットをジェノタイピング解析したところ、キメラ色ラット（ジャームライントランスミッションしたラット）の雄3匹中2匹は、p53遺伝子がノックアウト（p53+/-）されていた（図９）。
従って、YPAC因子で樹立したラットES細胞は、ES細胞樹立後にジーンターゲティング等の遺伝子改変を行っても、キメララット作製能を有し、更には、ジャームライントランスミッションしたキメララットが作製できることから、ノックアウトラットの作製に使用可能であることが判明した。【０１１４】
実施例9  p53遺伝子欠損ラットES細胞（p53-/-）によるキメラットの作製
（１）p53遺伝子欠損ラットES細胞（p53+/-）の作製
ラットp53遺伝子（exon 4）を認識するZFN発現プラスミドとZFNエンコーディング mRNA をデザイン（シグマ社）し、図１０Ａに示すショートホモロジーアームスで構成されるターゲティングドナー（CAG-AmCyan1-IRES-Neo-pA）をラットゲノムDNAよりKOD Ver.2 DNAポリメラーゼ（東洋紡株式会社）を用いPCRによって作製した。
10μgのターゲティングドナーと5μgのZFNエンコーディングmRNAsを4.5 x 106個のOct4-Venus陽性ES細胞（Wistar系ラット）(継代数3) にMouse ES Cell Nucreofector kit（Amaxa社）と共に添加し、ヌクレオフェクションを行った。ES細胞は2% Matrigel（BD Bioscience社）が塗布された培養器で、MEF上に播種しYPAC因子添加培地中で培養した。培養1日後、ジェネティシンを0.2μg/ml濃度で培地に添加した。培養9日後に、ジェネティシン耐性の46コロニーを採取し、培養した。ジェノタイピング解析の結果、ホモロガスリコンビネーションが行われたp53遺伝子欠損ES細胞 (p53+/-ES細胞[Cell Line: p53+/C])が確認できた（図１０Ｂ Lane2、図１０Ｄ）。46コロニー中の1コロニーは、両アレルでホモロガスリコンビネーションされていた(p53-/-ES細胞[Cell Line: p53C/C]) (2.2%)（図１０Ｂ Lane7、図１０Ｄ）。46コロニー中の7コロニーは、片アレルでホモロガスリコンビネーションされ、片アレルはフレームシフトが起こっていた(p53-/- ES細胞[Cell Line: p53C/Z]) (15%)（図１０Ｂ Lane3,4、図１０Ｃ、図１０Ｄ）。コントロールとして、10μgのターゲティングドナーだけを4.5 x 106個のOct4-Venus陽性ES細胞（Wistar系ラット）(継代数3) にヌクレオフェクションを行った。ES細胞は2% Matrigel（BD Bioscience社）が塗布された培養器で、MEF上に播種しYPAC因子添加培地中で培養した。培養1日後、ジェネティシンを0.2μg/ml濃度で培地に添加した。培養9日後に、ジェネティシン耐性の14コロニーを採取し、培養した。ジェノタイピング解析の結果、これらのコロニーはホモロガスリコンビネーションされておらず、ターゲティングドナーがランダムに組み込まれていた(p53+/+ ES細胞[Cell Line: p53+/+（-ZFN）]) （図１０Ｂ、Lane5）。【０１１５】
（２）p53遺伝子欠損ラットES細胞（p53-/-）の作製
ラットp53遺伝子（exon 4）を認識するZFN発現プラスミドとZFNエンコーディング mRNA をデザイン（シグマ社）し、図１０Ａに示すショートホモロジーアームスで構成されるターゲティングドナー（AmCyan1の代わりにレポーター遺伝子としてtdTomatoを含む; CAG-tdTomato-IRES-Neo-pA）をラットゲノムDNAよりKOD Ver.2 DNAポリメラーゼ（東洋紡株式会社）を用いPCRによって作製した。
10μgのターゲティングドナーと5μgのZFNエンコーディングmRNAsを2.5 x 106個の実施例9（1）で作製したp53+/- ES細胞[Cell Line: p53+/C] (継代数9) にMouse ES Cell Nucreofector kit（Amaxa社）と共に添加し、ヌクレオフェクションを行った。ES細胞は2% Matrigel（BD Bioscience社）が塗布された培養器で、MEF上に播種しYPAC因子添加培地中で培養した。培養6日後に、tdTomatoの赤色の蛍光を発現する8コロニーを採取し、培養した（図１１Ｂ）。ジェノタイピング解析の結果、3コロニー（Clone No. 1, 3, 8）でホモロガスリコンビネーションが起こっていた（38%）(p53-/- ES細胞[Cell Line: p53C/R])（図１１Ａ）。【０１１６】
（３）p53遺伝子欠損ラットES細胞（p53-/-）(p53+/-)によるキメラットの作製
実施例9（1）で作製したp53+/-ES細胞[Cell Line: p53+/C] と、実施例9（1）、（2）で作製したp53-/-ES細胞[Cell Line: p53C/C、p53C/Z、p53C/R]を、各々4.5日妊娠ラットから得たブラシスト中にYPAC因子添加下で12個のES細胞をインジェクションし、妊娠３．５日目の偽妊娠ラットの子宮角へ移植した（種：LEA）。
その結果、p53+/-ES細胞を用いた場合、コートカラーキメラが発生した。また、キメララット胎児の正常な発育は高頻度で確認でき、更には、p53+/-ES細胞の寄与率も高かった。
一方、p53-/-ES細胞を用いた場合、キメララット胎児209匹中184匹で奇形が生じた。このような奇形は、p53-/-ES細胞6クローンで確認できた（図１２）。奇形が生じたキメララット胎児の大部分は流産した（図１２Ａ）。p53-/-ES細胞2クローン（p53C/C1、p53C/R2）から発生したキメララット胎児は、頭部に奇形が生じていた（図１２Ｂ左）。この表現型は、シアン蛍光で確認できるように、p53-/-ES細胞が頭部に高く寄与したことによる（図１２Ｃ左）。正常に発育したキメララット胎児209匹中25匹のキメララット胎児（図１２Ｂ右）のp53-/-ES細胞の頭部への寄与は低かった（図１２Ｃ右）。キメラの異常な発育は、p53-/-ES細胞を用いた場合（85.5±2.6%）は、p53+/-ES細胞を用いた場合（25.2±5.7%）に比べ著しく高頻度で起こった。【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
従って、YPAC因子で樹立したラットES細胞は、ES細胞樹立後に2回のジーンターゲティング等の遺伝子改変を行っても、キメララット作製能を有することが判明した。
なお、従来は、遺伝子改変されたES細胞をセレクションするには膨大な時間と経費を要するため、目的遺伝子の両アレルを改変した遺伝子改変動物を作製するには、片側アレルを改変したES細胞が用いられていた。そのため、ラットES細胞の両アレルに目的の遺伝子を欠損させることにより遺伝子改変動物を作製した報告は全くない。また、2010年に、片側アレルのp53遺伝子を欠損させたES細胞から作製された片側アレル欠損のp53ノックアウトラット同士を交配させて産まれた両アレル欠損のp53ノックアウトラットに関する報告（Nature vol.467,211-215(2010)）があるが、上述の実施例９のように、奇形が生じたとは報告されていない。
本発明のように、ラットES細胞の段階で、目的遺伝子について両アレルを改変（遺伝子の破壊や変異等）して遺伝子改変動物を作製すれば、遺伝子改変動物作製期間を短縮できるため、個体レベルでの遺伝子機能解析を高速化できると考えられる。また、従来よりも、遺伝子機能解析の信頼性や精度が高くなることや、より病態に近い疾患モデル動物が作製できることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明の方法を用いることにより、ラットＥＳ細胞の系統または宿主胚の系統を問わず、ジャームライントランスミッション効率が改善されたキメラ胚を作製することができ、該キメラ胚を用いることにより高効率にジャームライントランスミッションされたキメララットを作製することができる。これにより、容易に遺伝子改変ラット（ノックアウトラット、ノックインラットなど）を作製することができ、様々な薬理研究または生理学的な研究、さらには再生医療の研究などに幅広く利用することができる。【０１２０】
本出願は、2009年12月1日付で出願された特願2009-274008及び2010年7月23日付で出願された特願2010-166571を基礎としており、それらの内容は全て本明細書に包含される。
【図２−２】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図２−１】
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【図３】
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【図４−１】
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【国際調査報告】
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