(57)【要約】一部の態様では、本開示は、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト、ならびにＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを使用して肺高血圧症（ＰＨ）を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する、特に１つまたは複数のＰＨ関連合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する方法に関する。本開示はまた、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを使用して、肺血管リモデリング、肺線維症、および右心室肥大を含むがこれらに限定されない多様な状態を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する方法も提供する。本開示は、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを使用して、それを必要とする被験体における右室収縮期圧を低減する方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺動脈高血圧症を処置する方法であって、それを必要とする患者に、配列番号９のアミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のうちのいずれか１つから始まり、配列番号９のアミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む有効量のポリペプチドを投与する工程を含む方法。
【請求項２】
肺高血圧症を処置する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを投与する工程を含み、前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数を阻害する方法。
【請求項３】
肺高血圧症の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを投与する工程を含み、前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数を阻害する方法。
【請求項４】
前記肺高血圧症の１つまたは複数の合併症が、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右心室肥大、ならびに肺線維症からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記肺高血圧症が、肺動脈高血圧症である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
間質性肺疾患の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを投与する工程を含み、前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数を阻害する方法。
【請求項７】
前記間質性肺疾患が、特発性肺線維症である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、アクチビンを阻害する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、アクチビンＡを阻害する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、アクチビンＢを阻害する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＧＤＦ８を阻害する、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＧＤＦ１１を阻害する、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＧＤＦ３を阻害する、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＢＭＰ６を阻害する、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＢＭＰ１５を阻害する、請求項２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＢＭＰ１０を阻害する、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＡｃｔＲＩＩＡを阻害する、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＡｃｔＲＩＩＢを阻害する、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＡＬＫ４を阻害する、請求項２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＡＬＫ５を阻害する、請求項２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＡＬＫ７を阻害する、請求項２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、抗体または抗体の組合せである、請求項２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともＧＤＦ８に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともＧＤＦ１１に結合する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともアクチビンに結合する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともアクチビンＡに結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともアクチビンＢに結合する、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともＧＤＦ３に結合する、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともＢＭＰ６に結合する、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともＢＭＰ１５に結合する、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともＢＭＰ１０に結合する、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともＡｃｔＲＩＩＡに結合する、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合する、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともＡＬＫ４に結合する、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともＡＬＫ５に結合する、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくともＡＬＫ７に結合する、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が、多重特異性抗体である、請求項２２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が、二重特異性抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、小分子または小分子の組合せである、請求項２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともＧＤＦ８を阻害する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともＧＤＦ１１を阻害する、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともアクチビンを阻害する、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともアクチビンＡを阻害する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともアクチビンＢを阻害する、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともＧＤＦ３を阻害する、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともＢＭＰ６を阻害する、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともＢＭＰ１５を阻害する、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともＢＭＰ１０を阻害する、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともＡｃｔＲＩＩＡを阻害する、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害する、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともＡＬＫ４を阻害する、請求項３９〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともＡＬＫ５を阻害する、請求項３９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記小分子または小分子の組合せが、少なくともＡＬＫ７を阻害する、請求項３９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せである、請求項２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともＧＤＦ８を阻害する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともＧＤＦ１１を阻害する、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともアクチビンを阻害する、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともアクチビンＡを阻害する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともアクチビンＢを阻害する、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともＧＤＦ３を阻害する、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともＢＭＰ６を阻害する、請求項５４〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともＢＭＰ１０を阻害する、請求項５４〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともＢＭＰ１５を阻害する、請求項５４〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともＡｃｔＲＩＩＡを阻害する、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害する、請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともＡＬＫ４を阻害する、請求項５４〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともＡＬＫ５を阻害する、請求項５４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せが、少なくともＡＬＫ７を阻害する、請求項５４〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記患者に、肺高血圧症を処置するための追加的な活性薬剤および／または支持療法をさらに投与する工程を含む、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
肺高血圧症を処置するための前記追加的な活性薬剤および／または支持療法が、プロスタサイクリンおよびその誘導体（例えば、エポプロステノール、トレプロスチニル、およびイロプロスト）；プロスタサイクリン受容体アゴニスト（例えば、セレキシパグ）；エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、ｔｈｅｌｉｎ、アンブリセンタン、マシテンタン、およびボセンタン）；カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピン）；抗凝固剤（例えば、ワーファリン）；利尿剤；酸素治療；心房中隔開裂術；肺血栓内膜摘除術；ホスホジエステラーゼ５型阻害剤（例えば、シルデナフィルおよびタダラフィル）；可溶性グアニル酸シクラーゼ活性化剤（例えば、シナシグアトおよびリオシグアト）；ＡＳＫ−１阻害剤（例えば、ＣＩＩＡ；ＳＣＨ７９７９７；ＧＳ−４９９７；ＭＳＣ２０３２９６４Ａ；３Ｈ−ナフト［１，２，３−デ］キニリン−２，７−ジオン、ＮＱＤＩ−１；２−チオキソ−チアゾリジン、５−ブロモ−３−（４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデン）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン）；ＮＦ−κＢアンタゴニスト（例えば、ｄｈ４０４、ＣＤＤＯ−エポキシド；２．２−ジフルオロプロピオンアミド；Ｃ２８イミダゾール（ＣＤＤＯ−Ｉｍ）；２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアン−１，９−ジエン−２８−オイック酸（ＣＤＤＯ）；３−アセチルオレアノール酸；３−トリフルオロアセチルオレアノール酸；２８−メチル−３−アセチルオレアナン；２８−メチル−３−トリフルオロアセチルオレアナン；２８−メチルオキシオレアノール酸；ＳＺＣ０１４；ＳＣＺ０１５；ＳＺＣ０１７；オレアノール酸のペグ化誘導体；３−Ｏ−（ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；３−Ｏ−［ａ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルクロノピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［アルファ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルクロノピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；２８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−オレアノール酸；３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（ＣＳ１）；オレアノール酸３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（ＣＳ２）；メチル３，１１−ジオキソオレアン−１２−エン−２８−オレート（ＤＩＯＸＯＬ）；ＺＣＶＩ４−２；ベンジル３−デヒドロ−オキシ−１，２，５−オキサジアゾロ［３’，４’：２，３］オレアノレート）；肺および／または心臓移植からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記患者にＢＭＰ９ポリペプチドを投与する工程を含む、請求項２〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＢＭＰ９ポリペプチドが、成熟ＢＭＰ９ポリペプチドである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＢＭＰ９ポリペプチドが、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＢＭＰ９ポリペプチドが、医薬調製物として投与される、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記医薬調製物が、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＢＭＰ９ポリペプチドが、前記ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドに非共有結合により会合している、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記医薬調製物が、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドを実質的に含まないか、または含まない、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記患者が、少なくとも２５ｍｍＨｇ（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｍＨｇ）の安静時肺動脈圧（ＰＡＰ）を有する、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記患者におけるＰＡＰを低減する、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記患者におけるＰＡＰを少なくとも３ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも３、５、７、１０、１２、１５、２０、または２５ｍｍＨｇ）低減する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記患者における肺血管抵抗を低減する、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
肺毛細管楔入圧を増加させる、請求項１〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
左室拡張末期圧を増加させる、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記患者の運動能を増加させる、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記患者の６分間歩行距離を増加させる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記患者の６分間歩行距離を少なくとも１０メートル（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００メートル、またはそれを超えて）増加させる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記患者のボルグ呼吸困難指数（ＢＤＩ）を低減する、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記患者のＢＤＩを、少なくとも０．５指数ポイント（例えば、少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０指数ポイント）低減する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記患者が、世界保健機関によって認められる機能分類Ｉ度、ＩＩ度、ＩＩＩ度、またはＩＶ度の肺高血圧症を有する、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
肺高血圧症機能分類の進行を予防または遅延させる（例えば、世界保健機関によって認められる機能分類Ｉ度からＩＩ度へ、ＩＩ度からＩＩＩ度へ、またはＩＩＩ度からＩＶ度への肺高血圧症の進行を予防または遅延させる）、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
肺高血圧症機能分類の後退を促進または増加させる（例えば、世界保健機関によって認められるＩＶ度からＩＩＩ度へ、ＩＩＩ度からＩＩ度へ、またはＩＩ度からＩ度への肺高血圧症の後退を促進または増加させる）、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体である、請求項２〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、
ａ．配列番号１００のアミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のうちのいずれか１つから始まり、配列番号１００のアミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号１００のアミノ酸３４〜１０１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号１００のアミノ酸２４〜１２６に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号１０１のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｅ．配列番号１０５のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、
ａ．配列番号１のアミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のうちのいずれか１つから始まり、配列番号１のアミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号１のアミノ酸２９〜１０９に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号１のアミノ酸２５〜１３１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号２のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ．配列番号３のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｆ．配列番号５のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｇ．配列番号６のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含む、請求項９２または９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸を含まない、請求項９２〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＡＬＫ４ポリペプチドが、相互作用ペアの第１または第２のメンバーを含む異種ドメインをさらに含む融合タンパク質である、請求項９２〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、相互作用ペアの第１または第２のメンバーを含む異種ドメインをさらに含む融合タンパク質である、請求項９２〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記異種ドメインが、Ｆｃ免疫グロブリンドメインである、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項９２〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質が、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢドメインと前記異種ドメインとの間に位置するリンカードメインをさらに含む、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記リンカードメインが、ＴＧＧＧ（配列番号２３）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２１）、ＳＧＧＧＧ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）、ＧＧＧ（配列番号１９）、ＧＧＧＧ（配列番号２０）、およびＳＧＧＧ（配列番号２４）からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
ＡＬＫ４融合タンパク質が、
ａ．配列番号１１１のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号１１３のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号１１６のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号１１７のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ．配列番号１２２のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｆ．配列番号１２４のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項９２〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質が、
ａ．配列番号１０８のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号１１０のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号１１４のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号１１５のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ．配列番号１１８のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｆ．配列番号１２０のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項９２〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは融合タンパク質が、グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、請求項９２〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは融合タンパク質がグリコシル化されており、哺乳動物のグリコシル化パターンを有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは融合タンパク質が、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
ヘテロ多量体が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、およびＢＭＰ６からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する、請求項９２〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ヘテロ多量体が、アクチビンＡに結合する、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ヘテロ多量体が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、およびＢＭＰ６からなる群から選択される１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドを阻害する、請求項９２〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ヘテロ多量体が、アクチビンＡを阻害する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ヘテロ多量体が、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、およびＧＤＦ３からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合しないか、または実質的に結合しない、請求項９２〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ヘテロ多量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより低いアフィニティーでＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、またはＧＤＦ３のうちの１つまたは複数に結合する、請求項９２〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ヘテロ多量体が、医薬調製物に存在する、請求項９２〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記医薬調製物が、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記医薬調製物が、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む、請求項１１３または１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ヘテロ多量体が、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である、請求項９２〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドである、請求項２〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のうちのいずれか１つから始まり、配列番号９のアミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ポリペプチドが、
ａ．配列番号９の残基３０〜１１０に対応するアミノ酸の配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｂ．配列番号１０のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｃ．配列番号１１のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１または１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ポリペプチドが、免疫グロブリンのＦｃドメインをさらに含む融合タンパク質である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記免疫グロブリンの前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃドメインである、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
Ｆｃ融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドドメインと前記免疫グロブリンの前記Ｆｃドメインとの間に配置されるリンカードメインをさらに含む、請求項１２０または１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記リンカードメインが、ＴＧＧＧ（配列番号２３）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２１）、ＳＧＧＧＧ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）、ＧＧＧ（配列番号１９）、ＧＧＧＧ（配列番号２０）、およびＳＧＧＧ（配列番号２４）からなる群から選択される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ポリペプチドが、配列番号３２のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１、１１８、および１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ポリペプチドが、ホモ二量体タンパク質複合体の一部である、請求項１〜９１および１１７〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１〜９１および１１７〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ポリペプチドがチャイニーズハムスター卵巣細胞における発現によって得ることができるグリコシル化パターンを有する、請求項１〜９１および１１７〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記患者における肺動脈圧を減少させる、請求項１〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記患者における肺動脈圧を、少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記患者における心室肥大を減少させる、請求項１〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記患者における心室肥大を、少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記患者における平滑筋肥大を減少させる、請求項１〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記患者における平滑筋肥大を、少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記患者における肺細動脈筋性化を減少させる、請求項１〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記患者における肺細動脈筋性化を、少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記患者における肺血管抵抗を減少させる、請求項１〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記患者における肺血管抵抗を、少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記患者が、肺動脈高血圧症を有し、世界保健機関の肺高血圧症機能分類システムに従う機能分類ＩＩ度またはＩＩＩ度の肺高血圧症を有する、請求項１〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記患者が、特発性または遺伝性肺動脈高血圧症、薬物および／または毒素誘発性肺高血圧症、結合組織病に関連する肺高血圧症、およびシャント修復後少なくとも１年での先天性左右シャントに関連する肺高血圧症からなる群から選択される１つまたは複数のサブタイプとして分類される肺動脈高血圧症を有する、請求項１〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記患者が、１つまたは複数の血管拡張剤によって処置されている、請求項１〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記患者が、ホスホジエステラーゼ５型阻害剤、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激剤、プロスタサイクリン受容体アゴニスト、およびエンドセリン受容体アンタゴニストからなる群から選択される１つまたは複数の薬剤によって処置されている、請求項１〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記１つまたは複数の薬剤が、ボセンタン、シルデナフィル、ベラプロスト、マシテンタン、セレキシパグ、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、アンブリセンタン、およびタダラフィルからなる群から選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
１つまたは複数の血管拡張剤の投与をさらに含む、請求項１〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
ホスホジエステラーゼ５型阻害剤、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激剤、プロスタサイクリン受容体アゴニスト、およびエンドセリン受容体アンタゴニストからなる群から選択される１つまたは複数の薬剤の投与をさらに含む、請求項１〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記１つまたは複数の薬剤が、ボセンタン、シルデナフィル、ベラプロスト、マシテンタン、セレキシパグ、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、アンブリセンタン、およびタダラフィルからなる群から選択される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４６】
前記患者が１５０〜４００メートルの６分間歩行距離を有する、請求項１〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記患者の６分間歩行距離を、少なくとも１０メートル（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、または４００メートルを超えて）増加させる、請求項１〜１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記患者が８ｇ／ｄｌ超かつ１５ｇ／ｄｌ未満のヘモグロビンレベルを有する、請求項１〜１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
肺動脈高血圧症の臨床的悪化を遅らせる、請求項１〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
世界保健機関の肺高血圧症機能分類システムに従う肺高血圧症の臨床的悪化を遅らせる、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
肺動脈高血圧症に関連する１つまたは複数の合併症による入院のリスクを低減する、請求項１〜１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ１１からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する、請求項１〜９１および１１７〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８、およびＢＭＰ６からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドにさらに結合する、請求項１５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年７月１５日に出願された米国仮出願番号第６２／３６２，９５５号、２０１７年２月２日に出願された同第６２／４５３，８８８号、および２０１７年５月２４日に出願された同第６２／５１０，４０３号に基づく優先権の利益を主張している。前述の出願の開示は、それらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肺高血圧症（ＰＨ）は、肺動脈、肺静脈、および肺毛細管を含む肺の血管系における高い血圧によって特徴付けられる疾患である。一般的にＰＨは、平均肺動脈（ＰＡ）圧が安静時で≧２５ｍｍＨｇ、または運動時で≧３０ｍｍＨｇとして定義される［Ｈｉｌｌら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃａｒｅ、５４巻（７号）：９５８〜６８頁（２００９年）］。ＰＨの主症状は、呼吸困難または息切れであり、他の症状は、疲労、めまい、卒倒、末梢浮腫（足、脚、または足首の腫脹）、青みがかった唇および皮膚、胸痛、狭心症、運動時のふらつき、乾性咳嗽、速い脈、および動悸を含む。ＰＨは、肺高血圧症を有する人々の最も一般的な死因の１つである心不全を引き起こす重度の疾患であり得る。術後の肺高血圧症は、多くのタイプの手術または手順を困難にし、高い死亡率に関連する難題を呈し得る。
【０００３】
ＰＨは、病理生理学的機構、臨床所見、および治療アプローチにおいて類似性を共有する疾患の異なる症状に基づいて分類され得る［Ｓｉｍｏｎｎｅａｕら、ＪＡＣＣ、５４巻（１号）：Ｓ４４〜５４頁（２００９年）］。ＰＨの臨床分類は、１９７３年に初めて提唱されたが、最近更新された臨床分類が、２００８年に世界保健機関（ＷＨＯ）によって承認された。更新されたＰＨ臨床分類に従って、ＰＨの５つの主要な群が存在する：ＰＡ楔入圧≦１５ｍｍＨｇによって特徴付けられる肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）；ＰＡ楔入圧＞１５ｍｍＨｇによって特徴付けられる左心疾患によるＰＨ（肺静脈性肺高血圧症またはうっ血性心不全としても知られる）；肺疾患および／または低酸素症によるＰＨ；慢性血栓塞栓性ＰＨ；ならびに不明または多因性病因を有するＰＨ［Ｓｉｍｏｎｎｅａｕら、ＪＡＣＣ、５４巻（１号）：Ｓ４４〜５４頁（２００９年）；Ｈｉｌｌら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃａｒｅ、５４巻（７号）：９５８〜６８頁（２００９年）］。ＰＡＨは、ＰＡＨの家族歴も特定された危険因子もない散発性疾患である特発性ＰＡＨ（ＩＰＡＨ）；遺伝性ＰＡＨ；薬物および毒素によって誘発されるＰＡＨ；結合組織病、ＨＩＶ感染症、門脈高血圧症、先天性心疾患、住血吸虫症、および慢性溶血性貧血に関連するＰＡＨ；ならびに新生児遷延性ＰＨにさらに分類される［Ｓｉｍｏｎｎｅａｕら、ＪＡＣＣ、５４巻（１号）：Ｓ４４〜５４頁（２００９年）］。様々なタイプのＰＨの診断は、一連の検査を必要とする。
【０００４】
一般的に、ＰＨの処置は、ＰＨの原因または分類に依存する。ＰＨが、公知の薬または医学的状態によって引き起こされる場合、これは二次性ＰＨとして知られ、その処置は通常、基礎となる疾患を対象とする。肺静脈性肺高血圧症の処置は一般的に、利尿剤、ベータ遮断薬、およびＡＣＥ阻害剤を投与することによって、または僧帽弁もしくは大動脈弁を修復もしくは置き換えることによって左心室機能を最適化することを伴う。ＰＡＨ治療剤は、肺血管拡張剤、ジゴキシン、利尿剤、抗凝固剤、および酸素治療を含む。肺血管拡張剤は、プロスタサイクリン経路（例えば、静脈内エポプロステノール、皮下または静脈内トレプロスチニル、および吸入イロプロストを含むプロスタサイクリン類）、酸化窒素経路（例えば、シルデナフィルおよびタダラフィルを含むホスホジエステラーゼ−５阻害剤）、およびエンドセリン−１経路（例えば、経口ボセンタンおよび経口アンブリセンタンを含むエンドセリン受容体アンタゴニスト）を含む異なる経路を標的とする［Ｈｕｍｂｅｒｔ，  Ｍ．、Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１７９巻：６５０〜６頁（２００９年）；Ｈｉｌｌら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃａｒｅ、５４巻（７号）：９５８〜６８頁（２００９年）］。しかし、現在の治療は、ＰＨに対して治癒を提供せず、それらは多くのＰＨ患者において観察される基礎となる血管のリモデリングおよび血管の筋性動脈化を直接処置しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈｉｌｌら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃａｒｅ、５４巻（７号）：９５８〜６８頁（２００９年）
【非特許文献２】Ｓｉｍｏｎｎｅａｕら、ＪＡＣＣ、５４巻（１号）：Ｓ４４〜５４頁（２００９年
【非特許文献３】Ｈｉｌｌら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃａｒｅ、５４巻（７号）：９５８〜６８頁（２００９年）
【非特許文献４】Ｓｉｍｏｎｎｅａｕら、ＪＡＣＣ、５４巻（１号）：Ｓ４４〜５４頁（２００９年）
【非特許文献５】Ｈｕｍｂｅｒｔ，  Ｍ．、Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．、１７９巻：６５０〜６頁（２００９年）；Ｈｉｌｌら、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃａｒｅ、５４巻（７号）：９５８〜６８頁（２００９年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このように、肺高血圧症を処置するための有効な治療に対するアンメットニーズは高い。したがって、本開示の目的は、ＰＨを処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する、特に１つまたは複数のＰＨ関連合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する方法を提供することである。
【０００７】
発明の要旨
一部において、本明細書に示すデータは、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（阻害剤）を使用して、肺高血圧症を処置できることを実証する。例えば、可溶性のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体を個々に使用すると、モノクロタリン誘発肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）モデルにおいて血圧、心肥大および肺重量を低減できることが示された。類似の陽性効果が、Ｓｕｇｅｎ  ｈｙｐｏｘｉａＰＡＨモデルにおいてＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドについて観察された。組織学的分析により、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、モノクロタリン誘発およびＳｕｇｅｎ  ｈｙｐｏｘｉａＰＡＨモデルの両方において血管のリモデリングおよび血管の筋性動脈化の減少に対して驚くべき有意な効果を有することがさらに明らかとなった。その上、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体はいずれも、驚くべきことに、ＰＡＨの処置に関して承認されている薬物であるシルデナフィルと比較してＰＡＨの様々な合併症の改善に対して大きい効果を有した。このように、本開示は、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢ）シグナル伝達経路のアンタゴニストを使用して、肺高血圧症の重症度を低減できることを確立する。可溶性のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂリガンドの拮抗作用以外の機構を通して肺高血圧症に影響を及ぼし得るが、それにもかかわらず、本開示は、望ましい治療剤を、ＡｃｔＲＩＩシグナル伝達アンタゴニスト活性に基づいて選択できることを実証する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、高血圧症、特に肺高血圧症を処置するために、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂリガンド［例えば、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、およびＢＭＰ１０］を阻害するアンタゴニスト；１つまたは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ７、およびＡＬＫ５）を阻害するアンタゴニスト；ならびに１つまたは複数の下流のシグナル伝達構成要素（例えば、Ｓｍａｄ２および３などのＳｍａｄタンパク質）を阻害するアンタゴニストを含む、様々なＡｃｔＲＩＩシグナル伝達アンタゴニストを使用する方法を提供する。本明細書に使用するように、そのようなシグナル伝達アンタゴニストを、集合的に「ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト」または「ＧＤＦ／ＢＭＦ阻害剤」と呼ぶ。したがって、本開示は、一部には、肺高血圧症（例えば、ＰＡＨ）を処置するための、特に肺高血圧症の１つまたは複数の合併症（例えば、血圧上昇、心肥大、血管リモデリング、および血管の筋性動脈化）を処置するためのＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト組成物および方法を提供する。本開示の方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストには、例えばリガンドトラップ（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体��フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体アンタゴニスト、小分子アンタゴニスト、およびヌクレオチドアンタゴニストが挙げられる。任意選択で、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、肺高血圧症を処置するための１つまたは複数の支持療法および／または追加的な活性薬剤と組み合わせて使用してもよい。
【０００８】
ある特定の態様では、本開示は、肺動脈高血圧症を処置する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを投与する工程を含む方法に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のうちのいずれか１つから始まり、配列番号９のアミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５のうちのいずれか１つで終わるアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列に、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＡドメインおよびＡｃｔＲＩＩＡに対して異種である１つまたは複数のポリペプチドドメインを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、免疫グロブリンのＦｃドメインは、ＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃドメインである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドドメインと、１つまたは複数の異種ドメイン（例えば、Ｆｃ免疫グロブリンドメイン）との間に位置するリンカードメインをさらに含む。一部の実施形態では、リンカードメインは、ＴＧＧＧ（配列番号２３）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２１）、ＳＧＧＧＧ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）、ＧＧＧ（配列番号１９）、ＧＧＧＧ（配列番号２０）、およびＳＧＧＧ（配列番号２４）からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ホモ二量体タンパク質複合体の一部である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、グリコシル化されている。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、チャイニーズハムスター卵巣細胞における発現によって得ることができるグリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの投与は、患者における肺動脈圧を減少させる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの投与は、患者における肺動脈圧を少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの投与は、患者における心室肥大を減少させる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの投与は、患者における心室肥大を少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの投与は、患者における平滑筋肥大を減少させる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの投与は、患者における平滑筋肥大を少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの投与は、患者における肺細動脈筋性化を減少させる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの投与は、患者における肺細動脈筋性化を少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの投与は、患者における肺血管抵抗を減少させる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの投与は、患者における肺血管抵抗を少なくとも１０％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または少なくとも８０％）減少させる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの投与は、患者における肺血管抵抗を少なくとも２５〜３０％減少させる。一部の実施形態では、患者は、肺動脈高血圧症を有し、世界保健機関の肺高血圧症機能分類システムに従う機能分類ＩＩ度またはＩＩＩ度の肺高血圧症を有する。一部の実施形態では、患者は、特発性または遺伝性肺動脈高血圧症、薬物および／または毒素誘発性肺高血圧症、結合組織病に関連する肺高血圧症、ならびにシャント修復後少なくとも１年での先天性左右シャントに関連する肺高血圧症からなる群から選択される１つまたは複数のサブタイプとして分類される肺動脈高血圧症を有する。一部の実施形態では、患者は１つまたは複数の血管拡張剤によって処置されている。一部の実施形態では、患者は、ホスホジエステラーゼ５型阻害剤、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激剤、プロスタサイクリン受容体アゴニスト、およびエンドセリン受容体アンタゴニストからなる群から選択される１つまたは複数の薬剤によって処置されている。一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、ボセンタン、シルデナフィル、ベラプロスト、マシテンタン、セレキシパグ、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、アンブリセンタン、およびタダラフィルからなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数の血管拡張剤の投与をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ホスホジエステラーゼ５型阻害剤、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激剤、プロスタサイクリン受容体アゴニスト、およびエンドセリン受容体アンタゴニストからなる群から選択される１つまたは複数の薬剤の投与をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、ボセンタン、シルデナフィル、ベラプロスト、マシテンタン、セレキシパグ、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、アンブリセンタン、およびタダラフィルからなる群から選択される。一部の実施形態では、患者は１５０〜４００メートルの６分間歩行距離を有する。一部の実施形態では、方法は、患者の６分間歩行距離を少なくとも１０メートル（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、または４００メートルを超えて）増加させる。一部の実施形態では、患者は、８ｇ／ｄｌ超かつ１５ｇ／ｄｌ未満のヘモグロビンレベルを有する。一部の実施形態では、方法は、肺動脈高血圧症の臨床的悪化を遅らせる。一部の実施形態では、方法は、世界保健機関の肺高血圧症機能分類システムに従う肺高血圧症の臨床的悪化を遅らせる。一部の実施形態では、方法は、肺動脈高血圧症に関連する１つまたは複数の合併症による入院のリスクを低減する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ６からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示は、肺高血圧症を処置する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの組合せを投与する工程を含む方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症を予防する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの組合せを投与する工程を含む方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症の進行速度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの組合せを投与する工程を含む方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、間質性肺疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを投与する工程を含み、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数を阻害する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、間質性肺疾患の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを投与する工程を含み、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストが、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数を阻害する方法を提供する。一部の実施形態では、間質性肺疾患は、特発性肺線維症である。ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症の重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの組合せを投与する工程を含む方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症（例えば、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右心室肥大、ならびに肺線維症）を処置する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの組合せを投与する工程を含む方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症（例えば、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右心室肥大、ならびに肺線維症）を予防する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの組合せを投与する工程を含む方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症（例えば、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右心室肥大、ならびに肺線維症）の進行速度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの組合せを投与する工程を含む方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症（例えば、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右心室肥大、ならびに肺線維症）の重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの組合せを投与する工程を含む方法に関する。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書で記載される方法は、肺動脈高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、少なくとも２５ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｍＨｇ）の安静時肺動脈圧（ＰＡＰ）を有する患者に関する。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＰＡＰを低減する。例えば、方法は、肺高血圧症を有する患者におけるＰＡＰを、少なくとも３ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも３、５、７、１０、１２、１５、２０、または２５ｍｍＨｇ）低減し得る。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、肺高血圧症を有する患者における肺血管抵抗を低減する。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、肺高血圧症を有する患者における肺毛細管楔入圧を増加させる。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、肺高血圧症を有する患者における左室拡張末期圧を増加させる。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、肺高血圧症を有する患者における運動能（能力、耐性）を増加させる（改善する）。例えば、方法は、肺高血圧症を有する患者における６分間歩行距離を増加させ、任意選択で６分間歩行距離を少なくとも１０メートル（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００メートル、またはそれを超えて）増加させる。加えて、方法は、任意選択で６分間歩行試験後に評価され得る患者のボルグ呼吸困難指数（ＢＤＩ）を低減し得る。一部の実施形態では、方法は、患者のボルグ呼吸困難指数（ＢＤＩ）を少なくとも０．５指数ポイント（例えば、少なくとも０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０指数ポイント）低減する。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、世界保健機関によって認められるＩ度、ＩＩ度、ＩＩＩ度、またはＩＶ度の肺高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法は、肺高血圧症の臨床的進行（悪化）（例えば、世界保健機関の標準によって測定した進行）を遅らせることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症分類の進行を予防または遅延させる（例えば、世界保健機関によって認められるＩ度からＩＩ度へ、ＩＩ度からＩＩＩ度へ、またはＩＩＩ度からＩＶ度への肺高血圧症の進行を予防または遅延させる）。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症分類の後退を促進または増加させる（例えば、世界保健機関によって認められるＩＶ度からＩＩＩ度へ、ＩＩＩ度からＩＩ度へ、またはＩＩ度からＩ度への肺高血圧症の後退を促進または増加させる）。一部の実施形態では、患者に、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストに加えて、肺高血圧症を処置するための１つまたは複数の支持療法または活性薬剤をさらに投与する。例えば、患者に、プロスタサイクリンおよびその誘導体（例えば、エポプロステノール、トレプロスチニル、およびイロプロスト）；プロスタサイクリン受容体アゴニスト（例えば、セレキシパグ）；エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、ｔｈｅｌｉｎ、アンブリセンタン、マシテンタン、およびボセンタン）；カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピン）；抗凝固剤（例えば、ワーファリン）；利尿剤；酸素治療；心房中隔開裂術；肺血栓内膜摘除術；ホスホジエステラーゼ５型阻害剤（例えば、シルデナフィルおよびタダラフィル）；可溶性グアニル酸シクラーゼ活性化剤（例えば、シナシグアトおよびリオシグアト）；ＡＳＫ−１阻害剤（例えば、ＣＩＩＡ；ＳＣＨ７９７９７；ＧＳ−４９９７；ＭＳＣ２０３２９６４Ａ；３Ｈ−ナフト［１，２，３−デ］キニリン−２，７−ジオン、ＮＱＤＩ−１；２−チオキソ−チアゾリジン、５−ブロモ−３−（４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデン）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン）；ＮＦ−κＢアンタゴニスト（例えば、ｄｈ４０４、ＣＤＤＯ−エポキシド；２．２−ジフルオロプロピオンアミド；Ｃ２８イミダゾール（ＣＤＤＯ−Ｉｍ）；２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアン−１，９−ジエン−２８−オイック酸（ＣＤＤＯ）；３−アセチルオレアノール酸；３−トリフルオロアセチルオレアノール酸（Ｔｒｉｆｌｏｕｒｏａｃｅｔｙｌｏｌｅａｎｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ）；２８−メチル−３−アセチルオレアナン；２８−メチル−３−トリフルオロアセチルオレアナン；２８−メチルオキシオレアノール酸；ＳＺＣ０１４；ＳＣＺ０１５；ＳＺＣ０１７；オレアノール酸のペグ化誘導体；３−Ｏ−（ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；３−Ｏ−［ａ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルクロノピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［アルファ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルクロノピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；２８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−オレアノール酸；３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（ＣＳ１）；オレアノール酸３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（ＣＳ２）；メ���ル３，１１−ジオキソオレアン−１２−エン−２８−オレート（ＤＩＯＸＯＬ）；ＺＣＶＩ４−２；ベンジル３−デヒドロ−オキシ−１，２，５−オキサジアゾロ［３’，４’：２，３］オレアノレート）、肺および／または心臓移植からなる群から選択される１つまたは複数の支持療法または活性薬剤も投与してもよい。一部の実施形態では、患者に、ＢＭＰ９ポリペプチドも投与してもよい。一部の実施形態では、ＢＭＰ９ポリペプチドは、成熟ＢＭＰ９ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＢＭＰ９ポリペプチドは、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ９ポリペプチドは、任意選択でＢＭＰ９プロドメインポリペプチドを含み得る医薬調製物において投与される。ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドを含むそのようなＢＭＰ９医薬調製物において、ＢＭＰ９ポリペプチドは、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドに非共有結合により会合し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ９医薬調製物は、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドを実質的に含まないか、または含まない。一部の実施形態では、患者に、オレアノール酸またはその誘導体も投与してもよい。
【００１０】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する薬剤（例えば、ＧＤＦ１１アンタゴニスト）である。ＧＤＦ１１阻害に対する効果は、例えば本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ１１に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくともＧＤＦ１１に結合する。本明細書で記載されるように、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、ＧＤＦ１１を阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１を阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ならびに１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【００１１】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＦＦ８を阻害する薬剤（例えば、ＧＦＦ８アンタゴニスト）である。ＧＦＦ８阻害に対する効果は、例えば本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＦＦ８に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくともＧＦＦ８に結合する。本明細書で記載されるように、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、ＧＦＦ８を阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＧＦＦ８を阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ならびに１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【００１２】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＦＦ３を阻害する薬剤（例えば、ＧＦＦ３アンタゴニスト）である。ＧＦＦ３阻害に対する効果は、例えば本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＦＦ３に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくともＧＦＦ３に結合する。本明細書で記載されるように、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、ＧＦＦ３を阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＧＦＦ３を阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ならびに１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【００１３】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ６を阻害する薬剤（例えば、ＢＭＰ６アンタゴニスト）である。ＢＭＰ６阻害に対する効果は、例えば本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ６に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくともＢＭＰ６に結合する。本明細書で記載されるように、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、ＢＭＰ６を阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６を阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ならびに１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【００１４】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１５を阻害する薬剤（例えば、ＢＭＰ１５アンタゴニスト）である。ＢＭＰ１５阻害に対する効果は、例えば本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１５に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくともＢＭＰ１５に結合する。本明細書で記載されるように、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、ＢＭＰ１５を阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１５を阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１，ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ならびに１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【００１５】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する薬剤（例えば、ＢＭＰ１０アンタゴニスト）である。ＢＭＰ１０阻害に対する効果は、例えば本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１０に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくともＢＭＰ１０に結合する。本明細書で記載されるように、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体ＦＬＲＧポリペプチド）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、ＢＭＰ１０を阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０を阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ならびに１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【００１６】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）を阻害する薬剤（例えば、アクチビンアンタゴニスト）である。アクチビン阻害に対する効果は、例えば、本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビンに結合し得る。リガンド結合活性は、例えば、本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくともアクチビンに結合する。本明細書で記載されるように、例えばリガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、アクチビンを阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、アクチビンを阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、および１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビンＢを阻害する薬剤である。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビンＡに実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍを超えるＫＤでアクチビンＡに結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）、および／またはアクチビンＡ活性を阻害しない。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビンＢを阻害するが、アクチビンＡに実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍを超えるＫＤでアクチビンＡに結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）、および／またはアクチビンＡ活性を阻害しない薬剤である。
【００１７】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩを阻害する薬剤（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）（例えば、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト）である。ＧＤＦ１１阻害に対する効果は、例えば本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩに結合し得る。リガンド結合活性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくともＡｃｔＲＩＩに結合する。本明細書で記載されるように、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、ＡｃｔＲＩＩを阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩを阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ならびに１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【００１８】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ４を阻害する薬剤（例えば、ＡＬＫ４アンタゴニスト）である。ＡＬＫ４阻害に対する効果は、例えば本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ４に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくともＡＬＫ４に結合する。本明細書で記載されるように、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、ＡＬＫ４を阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４を阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ならびに１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【００１９】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ５を阻害する薬剤（例えば、ＡＬＫ５アンタゴニスト）である。ＡＬＫ５阻害に対する効果は、例えば本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ５に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくともＡＬＫ５に結合する。本明細書で記載されるように、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、ＡＬＫ５を阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ５を阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ７、ならびに１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【００２０】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ７を阻害する薬剤（例えば、ＡＬＫ７アンタゴニスト）である。ＡＬＫ７阻害に対する効果は、例えば本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ７に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくともＡＬＫ７に結合する。本明細書で記載されるように、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、ＡＬＫ７を阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ７を阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＡＬＫ４、ならびに１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【００２１】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）を阻害する薬剤である。Ｓｍａｄ阻害に対する効果は、例えば、本明細書で記載されるアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを含む結合アフィニティーアッセイを使用して決定され得る。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０−７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍ、または少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで少なくとも１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）に結合する。本明細書で記載されるように、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、ＦＬＲＧポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびそれらの組合せを含む、１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）を阻害する種々のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを、本明細書で記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）を阻害するＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４のうちの１つまたは複数をさらに阻害し得る。
【００２２】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドである。用語「ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」は、天然に存在するＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびに本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、ＧＤＦトラップポリペプチド）などのその切断型および改変体を集合的に指す。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのリガンド結合性ドメインまたはその修飾（改変体）形態を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。例えば、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドのＡｃｔＲＩＩＡリガンド結合性ドメイン、例えばＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインの一部を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合性ドメイン、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの一部を含み得るか、これから本質的になり得るか、またはこれからなり得る。好ましくは、本明細書で記載される方法に従って使用されるＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、可溶性ポリペプチドである。
【００２３】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含む組成物およびその使用に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０の配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１〜３０のうちのいずれか１つに対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のうちのいずれか１つから始まり）、配列番号９のアミノ酸１１０〜１３５のうちのいずれか１つに対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５のうちのいずれか１つで終わる）ＡｃｔＲＩＩＡの部分に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得るか、これから本質的になり得るか、またはこれからなり得る。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得るか、これから本質的になり得るか、またはこれからなり得る。
【００２４】
他の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む組成物およびその使用に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９の配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９の配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸［天然に存在する（ＥまたはＤ）、または人工の酸性アミノ酸］を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１の配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１の配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のうちのいずれか１つに対応する残基から始まり、配列番号１のアミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のうちのいずれか１つに対応する残基で終わる配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のうちのいずれか１つに対応する残基から始まり、配列番号１のアミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のうちのいずれか１つに対応する残基で終わる配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。なお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。他では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４６のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４６のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含ことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４７のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４７のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含ことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含ことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７４のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７４のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含ことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７７のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７７のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含ことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７８のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７８のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含ことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含ことができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸を含まない。
【００２５】
本明細書で記載されるように、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、およびそれらの改変体（ＧＤＦトラップ）は、ホモ多量体、例えばホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体、ホモ五量体、および高次ホモ多量体複合体であり得る。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびその改変体は、ホモ二量体である。ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるＡｃｔＲＩＩポリペプチド二量体は、第２のＡｃｔＲＩＩポリペプチドに共有結合または非共有結合により会合した第１のＡｃｔＲＩＩポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩドメイン、および相互作用ペア（例えば、免疫グロブリンの定常ドメイン）の第１のメンバー（または第２のメンバー）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、および相互作用ペアの第２のメンバー（または第１のメンバー）のアミノ酸配列を含む。
【００２６】
ある特定の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体である。本明細書で記載されるように、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体タンパク質複合体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢおよびＡＬＫ４ホモ二量体と比較して異なるリガンド結合プロファイル／選択性を有することが発見されている。特に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較してアクチビンＢに対して増強された結合を示し、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体に関して観察されるようにアクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対して強い結合を保持し、ならびにＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３に対して実質的に低減された結合を示す。特に、ＢＭＰ９は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体に関して低いアフィニティーから観察不能なアフィニティーを示すが、このリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体に強く結合する。ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と同様に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＢＭＰ６に対して中間レベルの結合を保持する。図１９を参照されたい。したがって、これらの結果は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的アンタゴニスト（阻害剤）であることを実証する。したがって、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、このような選択的拮抗作用が有利であるある特定の適用においてＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体よりも有用であろう。例として、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のうちの１つまたは複数の拮抗作用を保持するが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３のうちの１つまたは複数の拮抗作用を最小にすることが望ましい治療的な適用が挙げられる。その上、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、患者におけるＰＡＨを処置することが示されている。特定の作用機構に限定することを望まないが、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ８、および／またはＧＤＦ１１のうちの少なくとも１つまたは複数に結合するＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体ならびにその改変体は、ＰＡＨ患者において有益な効果を促進するための有用な薬剤であろうと予想される。
【００２７】
したがって、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドおよび少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体の複合体（ヘテロ多量体）（ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）ならびにその使用を提供する。好ましくは、ＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡＬＫ４受容体のリガンド結合性ドメイン、例えばＡＬＫ４細胞外ドメインの一部を含む。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、一般的にＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド結合性ドメイン、例えばＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの一部を含む。好ましくは、このようなＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびに得られたそのヘテロ多量体は、可溶性である。
【００２８】
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１００のアミノ酸３４〜１０１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１０１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１０５に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１２２に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１２４に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１１６に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１１７に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１１１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。なお他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１１３に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。
【００２９】
ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号２に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号３に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号５に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号６に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１１８に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１２０に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１１４に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１１５に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１０８に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１１０に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸（例えば、ＥまたはＤ）を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含まない。
【００３０】
本明細書で記載されるように、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体構造は、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、ヘテロ五量体、および高次ヘテロ多量体の複合体を含む。例えば、図２１〜２３を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。ある特定の態様では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、融合タンパク質であり得る。
【００３１】
ある特定の態様では、その改変体（例えば、ＧＤＦトラップ）を含むＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドは、融合タンパク質であり得る。例えば、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）ポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）ポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＡｃｔＲＩＩ）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であり得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）ポリペプチドは、１つのドメインとしてＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）ポリペプチドに由来するアミノ酸配列（例えば、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）受容体のリガンド結合性ドメインまたはその改変体）、および改善された薬物動態、容易な精製、特定の組織への標的化等などの所望の特性を提供する１つまたは複数の異種ドメインを有する融合タンパク質であり得る。例えば、融合タンパク質のドメインは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、取込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および／または精製のうちの１つまたは複数を増強し得る。任意選択で、融合タンパク質のＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）ポリペプチドドメインは、１つまたは複数の異種ポリペプチドドメインに直接接続（融合）されるか、またはリンカーなどの介在配列が、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）ポリペプチドのアミノ酸配列と、１つまたは複数の異種ドメインのアミノ酸配列との間に配置されていてもよい。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）融合タンパク質は、異種ドメインとＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）ドメインとの間に位置する相対的非構造化リンカーを含む。この非構造化リンカーは、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）の細胞外ドメインのＣ末端でおよそ１５アミノ酸の非構造化領域に対応し得るか、または二次構造を相対的に含まない、３から１５、２０、３０、５０個またはそれを超えるアミノ酸の人工配列であり得る。リンカーは、グリシンおよび／またはプロリン残基に富んでいてもよく、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列を含有し得る。リンカーの例として、配列ＴＧＧＧ（配列番号２３）、ＳＧＧＧ（配列番号２４）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２１）、ＳＧＧＧＧ（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２５）、ＧＧＧＧ（配列番号２０）、およびＧＧＧ（配列番号１９）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）融合タンパク質は、例えば免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含み得る。例えば、アミノ酸配列は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃドメインに由来する。例えば、免疫グロブリンドメインのＦｃ部分は、配列番号１４〜１８のうちのいずれか一配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得るか、これから本質的になり得るか、またはこれからなり得る。このような免疫グロブリンド��インは、変更されたＦｃ活性を付与する、例えば１つまたは複数のＦｃエフェクター機能を減少させる１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに示されているアミノ酸配列を含む。例えば、Ｂ部分は、例えば本明細書で記載されるＮおよびＣ末端切断ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）ポリペプチドである。ＡおよびＣ部分は、独立してゼロ、１、または１つを超えるアミノ酸であり得て、ＡおよびＣ部分の両方がＢに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分を、リンカー配列を介してＢ部分に取り付けることができる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）融合タンパク質は、リーダー配列を含む。リーダー配列は、天然のＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）リーダー配列または異種リーダー配列であり得る。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー配列（例えば、配列番号３４）である。
【００３２】
その改変体を含むＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＡＬＫ４ポリペプチドは、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスリジン配列、およびＧＳＴ融合体などの精製部分配列を含み得る。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＡＬＫ４ポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および／または脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸から選択される１つまたは複数の修飾されたアミノ酸残基を含む。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＡＬＫ４ポリペプチドは、少なくとも１つのＮ結合型糖を含むことができ、２つ、３つ、またはそれを超えるＮ結合型糖を含み得る。このようなポリペプチドは、Ｏ結合型糖も含み得る。一般的に、ＡｃｔＲＩＩおよびＡＬＫ４ポリペプチドは、患者における好ましくない免疫応答の可能性を減少させるために、ポリペプチドの適切な天然のグリコシル化を媒介する哺乳動物細胞株において発現させることが好ましい。ＡｃｔＲＩＩおよびＡＬＫ４ポリペプチドは、操作された昆虫または酵母細胞、ならびにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳＯ細胞などの哺乳動物細胞を含む、患者での使用にとって適した様式でタンパク質をグリコシル化する種々の細胞株において産生され得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩまたはＡＬＫ４ポリペプチドは、グリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩまたはＡＬＫ４ポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において少なくとも４、６、１２、２４、３６、４８、または７２時間の血清半減期を示す。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩまたはＡＬＫ４ポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において少なくとも６、８、１０、１２、１４、２０、２５、または３０日間の血清半減期を示し得る。
【００３３】
ある特定の態様では、本開示は、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストおよび薬学的に許容されるキャリアを含む医薬調製物を提供する。医薬調製物は、肺高血圧症を処置するために、特に肺高血圧症の１つまたは複数の合併症（例えば、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右心室肥大、ならびに肺線維症）を処置または予防するために使用される化合物、例えばプロスタサイクリン、エポプロステノール、およびシルデナフィルなどの血管拡張剤；ボセンタンなどのエンドセリン受容体アンタゴニスト；アムロジピン、ジルチアゼム、およびニフェジピンなどのカルシウムチャネル遮断薬；ワーファリンなどの抗凝固剤；利尿剤；ＢＭＰ９ポリペプチド；ＢＭＰ１０ポリペプチド；バルドキソロンメチル；ならびにオレアノール酸を含む化合物などの、１つまたは複数の追加の活性薬剤も含み得る。一般的に、医薬調製物は、好ましくは発熱物質不含である（治療的使用のための産物の品質を管理する規則によって必要とされる程度に発熱物質不含であることを意味する）。
【００３４】
ある特定の例では、本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せを本明細書で記載される障害または状態に投与する場合、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの投与の間、赤血球に対する効果をモニターすること、または赤血球に対する望ましくない効果を低減するために、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの投薬を決定もしくは調整することが望ましいであろう。例えば、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、またはヘマトクリットレベルの増加は、血圧の望ましくない増加を引き起こし得る。
【００３５】
ある特定の態様では、本開示の方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、抗体または抗体の組合せである。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩに結合する抗体は、任意選択で、本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合に、ＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩに結合する抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド、Ｉ型受容体、または共受容体が、ＡｃｔＲＩＩに結合するのを阻害する。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩに結合する抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンドが、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３からなる群から選択されるＡｃｔＲＩＩに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＡＬＫ４に結合する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４に結合する抗体は、任意選択で、本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合に、ＡＬＫ４シグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４に結合する抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド、ＩＩ型受容体、または共受容体が、ＡＬＫ４に結合するのを阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４に結合する抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンドが、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３からなる群から選択されるＡＬＫ４に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＡＬＫ５に結合する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ５に結合する抗体は、任意選択で、本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合に、ＡＬＫ５シグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ５に結合する抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド、ＩＩ型受容体、または共受容体が、ＡＬＫ５に結合するのを阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ５に結合する抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンドが、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３からなる群から選択されるＡＬＫ５に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＡＬＫ７に結合する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ７に結合する抗体は、任意選択で、本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合に、ＡＬＫ７シグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ７に結合する抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド、ＩＩ型受容体、または共受容体が、ＡＬＫ７に結合するのを阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ７に結合する抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンドが、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３からなる群から選択されるＡＬＫ７に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＧＤＦ１１に結合する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１に結合する抗体は、任意選択で、本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合にＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１に結合する抗体は、ＧＤＦ１１−ＡｃｔＲＩＩ結合および／またはＧＤＦ１１−ＡＬＫ結合（例えば、ＧＤＦ１１−ＡＬＫ４、ＧＤＦ１１−ＡＬＫ５、および／またはＧＤＦ１１−ＡＬＫ７結合）を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＧＤＦ８に結合する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ８に結合する抗体は、任意選択で、本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合にＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ８に結合する抗体は、ＧＤＦ８−ＡｃｔＲＩＩ結合および／またはＧＤＦ８−ＡＬＫ結合（例えば、ＧＤＦ８−ＡＬＫ４、ＧＤＦ８−ＡＬＫ５、および／またはＧＤＦ８−ＡＬＫ７結合）を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＢＭＰ６に結合する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６に結合する抗体は、任意選択で、本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合にＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６に結合する抗体は、ＢＭＰ６−ＡｃｔＲＩＩ結合および／またはＢＭＰ６−ＡＬＫ結合（例えば、ＢＭＰ６−ＡＬＫ４、ＢＭＰ６−ＡＬＫ５、および／またはＢＭＰ６−ＡＬＫ７結合）を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＢＭＰ１５に結合する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１５に結合する抗体は、任意選択で、本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合にＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１５に結合する抗体は、ＢＭＰ１５−ＡｃｔＲＩＩ結合および／またはＢＭＰ１５−ＡＬＫ結合（例えば、ＢＭＰ１５−ＡＬＫ４、ＢＭＰ１５−ＡＬＫ５、および／またはＢＭＰ１５−ＡＬＫ７結合）を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＧＤＦ３に結合する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ３に結合する抗体は、任意選択で本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合にＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ３に結合する抗体は、ＧＤＦ３−ＡｃｔＲＩＩ結合および／またはＧＤＦ３−ＡＬＫ結合（例えば、ＧＤＦ３−ＡＬＫ４、ＧＤＦ３−ＡＬＫ５、および／またはＧＤＦ３−ＡＬＫ７結合）を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＢＭＰ１０に結合する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０に結合する抗体は、任意選択で、本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合にＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０に結合する抗体は、ＢＭＰ１０−ＡｃｔＲＩＩ結合および／またはＢＭＰ１０−ＡＬＫ結合（例えば、ＢＭＰ１０−ＡＬＫ４、ＢＭＰ１０−ＡＬＫ５、および／またはＢＭＰ１０−ＡＬＫ７結合）を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）に結合する。ある特定の実施形態では、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）に結合する抗体は、任意選択で、本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合にＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）に結合する抗体は、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩ結合および／またはアクチビン−ＡＬＫ結合（例えば、アクチビン−ＡＬＫ４、アクチビン−ＡＬＫ５、および／またはアクチビン−ＡＬＫ７結合）を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、アクチビンＢに結合する。ある特定の実施形態では、アクチビンＢに結合する抗体は、任意選択で、本明細書で記載されるアッセイなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定した場合にＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、アクチビンＢに結合する抗体は、アクチビンＢ−ＡｃｔＲＩＩ結合および／またはアクチビンＢ−ＡＬＫ結合（例えば、アクチビンＢ−ＡＬＫ４、アクチビンＢ−ＡＬＫ５、および／またはアクチビンＢ−ＡＬＫ７結合）を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ１５のうちの１つまたは複数に結合する多重特異性抗体または多重特異性抗体の組合せである。ある特定の態様では、多重特異性抗体または多重特異性抗体の組合せは、細胞ベースのアッセイにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ１５のうちの１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖ダイアボディ、タンデム一本鎖Ｆｖフラグメント、タンデム一本鎖ダイアボディ、または一本鎖ダイアボディおよび免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも一部を含む融合タンパク質である。
【００３６】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、小分子阻害剤または小分子阻害剤の組合せである。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＡＬＫ４の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＡＬＫ５の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＡＬＫ７の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＧＤＦ１１の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＧＤＦ８の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＢＭＰ６の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＢＭＰ１５の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＢＭＰ１０の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＧＤＦ３の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともアクチビンＢの阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）の阻害剤である。
【００３７】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、核酸阻害剤または核酸阻害剤の組合せである。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＡＬＫ４の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＡＬＫ５の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は少なくともＡＬＫ７の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＧＤＦ１１の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＧＤＦ８の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＢＭＰ６の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＢＭＰ１５の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＢＭＰ１０の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＧＤＦ３の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともアクチビンＢの阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくとも１つまたは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）の阻害剤である。
【００３８】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、フォリスタチンポリペプチドである。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号３０のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、ＦＬＲＧポリペプチドである。一部の実施形態では、ＦＬＲＧポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号２）およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号１０）の細胞外ドメインのアラインメントを示し、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡ結晶構造の合成解析に基づき、リガンドに直接接触すると本明細書において推定される残基は、ボックスで指し示す。
【００４１】
【図２】図２は、様々な脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質（配列番号５３〜５８）およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号５９）の複数の配列アラインメント、ならびにアラインメントに由来するコンセンサスＡｃｔＲＩＩ配列（配列番号６０）を示す。
【００４２】
【図３】図３は、様々な脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＡタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号６１〜６８）の複数の配列アラインメントを示す。
【００４３】
【図４】図４は、Ｃｌｕｓｔａｌ２．１を使用した、ヒトＩｇＧアイソタイプに由来するＦｃドメインの複数の配列アラインメントを示す。ヒンジ領域は、点線の下線によって指し示されている。二重の下線は、非対称鎖ペア形成を促進するようにＩｇＧ１  Ｆｃにおいて操作され得る位置と、他のアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に関する対応する位置の例を指し示す。
【００４４】
【図５】図５は、ＣＨＯ細胞において発現されたＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの精製を示す。分粒カラム（上パネル）およびクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（下パネル）（左レーン：分子量標準；右レーン：ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃ）によって可視化したとき、タンパク質は単一の明確なピークとして精製される。
【００４５】
【図６】図６は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイによって測定したときの、アクチビン（上パネル）およびＧＤＦ−１１（下パネル）へのＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの結合を示す。
【００４６】
【図７】図７は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃ（配列番号６９）の、完全なプロセシングされていないアミノ酸配列を示す。ＴＰＡリーダー（残基１〜２２）および二重に切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（残基２４〜１３１、配列番号１における天然の配列に基づく番号付けを使用）は、各々下線を引かれている。配列番号１と比較して２５位にある、成熟した融合タンパク質のＮ末端アミノ酸であることが配列決定によって明らかにされたグルタミン酸は、強調されている。
【００４７】
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列（コード鎖は上に示し、配列番号７０、相補体は下に３’−５’で示す、配列番号７１）を示す。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列は、下線が引かれている。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）の対応するアミノ酸配列も、示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列（コード鎖は上に示し、配列番号７０、相補体は下に３’−５’で示す、配列番号７１）を示す。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列は、下線が引かれている。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）の対応するアミノ酸配列も、示す。
【００４８】
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃをコードする代替のヌクレオチド配列（コード鎖は上に示し、配列番号７２、相補体は下に３’−５’で示す、配列番号７３）を示す。この配列は最初の形質転換体におけるタンパク質発現のより大きなレベルを付与し、細胞系の発達をより迅速な工程にする。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列は下線が引かれており、ＥＣＤの野生型ヌクレオチド配列における置換（図８を参照されたい）は強調されている。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）の対応するアミノ酸配列も、示す。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃをコードする代替のヌクレオチド配列（コード鎖は上に示し、配列番号７２、相補体は下に３’−５’で示す、配列番号７３）を示す。この配列は最初の形質転換体におけるタンパク質発現のより大きなレベルを付与し、細胞系の発達をより迅速な工程にする。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列は下線が引かれており、ＥＣＤの野生型ヌクレオチド配列における置換（図８を参照されたい）は強調されている。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）の対応するアミノ酸配列も、示す。
【００４９】
【図１０】図１０は、ＴＰＡリーダー配列（二重下線）、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２０〜１３４；単一の下線）およびｈＦｃドメインを含む、ＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃ（配列番号７４）の完全なアミノ酸配列を示す。成熟した融合タンパク質のＮ末端残基であることが配列決定によって明らかにされたグリシンのように、天然配列の７９位で置換されたアスパラギン酸は二重下線が引かれ、強調されている。
【００５０】
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号７５はセンス鎖に対応し、配列番号７６はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）は二重下線が引かれ、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜４２０）は単一の下線が引かれている。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号７５はセンス鎖に対応し、配列番号７６はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）は二重下線が引かれ、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜４２０）は単一の下線が引かれている。
【００５１】
【図１２】図１２は、ＴＰＡリーダー配列（二重下線）、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５〜１３１；単一の下線）およびｈＦｃドメインを含む、切断されたＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃ（配列番号７７）の完全なアミノ酸配列を示す。成熟した融合タンパク質のＮ末端残基であることが配列決定によって明らかにされたグルタミン酸のように、天然配列の７９位で置換されたアスパラギン酸は二重下線が引かれ、強調されている。
【００５２】
【図１３】図１３は、リーダー（配列番号７８）なしの切断されたＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃのアミノ酸配列を示す。切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５〜１３１）は、下線を引かれている。成熟した融合タンパク質のＮ末端残基であることが配列決定によって明らかにされたグルタミン酸のように、天然配列の７９位で置換されたアスパラギン酸は二重下線が引かれ、強調されている。
【００５３】
【図１４】図１４は、リーダー、ｈＦｃドメインおよびリンカー（配列番号７９）なしの切断されたＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）のアミノ酸配列を示す。成熟した融合タンパク質のＮ末端残基であることが配列決定によって明らかにされたグルタミン酸のように、天然配列の７９位で置換されたアスパラギン酸は下線が引かれ、強調されている。
【００５４】
【図１５Ａ】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号８０はセンス鎖に対応し、配列番号８１はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）は二重下線が引かれ、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）は単一の下線が引かれている。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５〜１３１）のアミノ酸配列も、示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号８０はセンス鎖に対応し、配列番号８１はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）は二重下線が引かれ、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）は単一の下線が引かれている。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５〜１３１）のアミノ酸配列も、示す。
【００５５】
【図１６Ａ】図１６Ａおよび１６Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃをコードする代替のヌクレオチド配列を示す。配列番号８２はセンス鎖に対応し、配列番号８３はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）は二重下線が引かれ、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）は単一の下線が引かれており、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列における置換は二重下線が引かれ、強調されている（配列番号８１、図１５と比較する）。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５〜１３１）のアミノ酸配列も、示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａおよび１６Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃをコードする代替のヌクレオチド配列を示す。配列番号８２はセンス鎖に対応し、配列番号８３はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）は二重下線が引かれ、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）は単一の下線が引かれており、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列における置換は二重下線が引かれ、強調されている（配列番号８１、図１５と比較する）。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５〜１３１）のアミノ酸配列も、示す。
【００５６】
【図１７】図１７は、図１６に示す代替のヌクレオチド配列（配列番号８２）のヌクレオチド７６〜３９６（配列番号８４）を示す。図１６に示す同じヌクレオチド置換はここでも下線が引かれ、強調されている。配列番号８４は、Ｌ７９Ｄ置換を有する、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５〜１３１に対応する）だけをコードする、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）。
【００５７】
【図１８】図１８は、様々な脊椎動物のＡＬＫ４タンパク質およびヒトＡＬＫ４（配列番号１２６〜１３２）の複数の配列アラインメントを示す。
【００５８】
【図１９】図１９は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体と比較した、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体のタンパク質複合体のリガンド結合データを示す。タンパク質複合体毎に、リガンドは、リガンドシグナル伝達阻害と十分に相関する速度定数であるｋｏｆｆによってランク付けされ、結合アフィニティーの降順で収載される（最も緊密に結合したリガンドが、上に収載される）。左側において、黄色、赤色、緑色および青色の線は、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）定数の規模を指し示す。実線の黒線は、そのヘテロ二量体への結合が、ホモ二量体と比較して増強されるまたは変化しないリガンドを指し示す一方、破線の赤線は、ホモ二量体と比較して実質的に低減した結合を指し示す。図示されている通り、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体は、どちらのホモ二量体と比較しても、アクチビンＢへの増強された結合を表示し、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体により観察される、アクチビンＡ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１への強い結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０およびＧＤＦ３への実質的に低減した結合を呈示する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と同様に、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６への中等度レベルの結合を保持する。
【００５９】
【図２０】図２０は、本明細書で記載されるＡ−２０４リポーター遺伝子アッセイによって判定したときの、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体／ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体ＩＣ５０の比較データを示す。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と同様に、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかし、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０シグナル伝達経路のＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体による阻害は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較して有意に低減している。これらのデータは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢ：ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを実証する。
【００６０】
【図２１Ａ】図２１Ａおよび２１Ｂは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体ポリペプチドを含むヘテロマータンパク質複合体の２つの模式的な例を示す。図２１Ａは、各ポリペプチド鎖内に含有される多量体化ドメインを介して共有結合または非共有結合的によりアセンブルすることができる、１個のＩ型受容体融合ポリペプチドおよび１個のＩＩ型受容体融合ポリペプチドを含むヘテロ二量体のタンパク質複合体を描写する。２個のアセンブルした多量体化ドメインはガイドされてもガイドされなくてもよい相互作用ペアを構成する。図２１Ｂは、図２１Ａと同様の、２個のヘテロ二量体の複合体を含むヘテロ四量体のタンパク質複合体を描写する。より高次の複合体を想定することができる。
【図２１Ｂ】図２１Ａおよび２１Ｂは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体ポリペプチドを含むヘテロマータンパク質複合体の２つの模式的な例を示す。図２１Ａは、各ポリペプチド鎖内に含有される多量体化ドメインを介して共有結合または非共有結合的によりアセンブルすることができる、１個のＩ型受容体融合ポリペプチドおよび１個のＩＩ型受容体融合ポリペプチドを含むヘテロ二量体のタンパク質複合体を描写する。２個のアセンブルした多量体化ドメインはガイドされてもガイドされなくてもよい相互作用ペアを構成する。図２１Ｂは、図２１Ａと同様の、２個のヘテロ二量体の複合体を含むヘテロ四量体のタンパク質複合体を描写する。より高次の複合体を想定することができる。
【００６１】
【図２２】図２２は、Ｉ型受容体ポリペプチド（「Ｉ」と指し示す）（例えば、本明細書で記載されるものなどのヒトまたは他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド）およびＩＩ型受容体ポリペプチド（「ＩＩ」と指し示す）（例えば、本明細書で記載されるものなどのヒトまたは他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド）を含むヘテロマータンパク質複合体の模式的な例を示す。例証されている実施形態では、Ｉ型受容体ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、ＩＩ型受容体ポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、Ｉ型またはＩＩ型の受容体ポリペプチドおよび相互作用ペアの対応するメンバーの間に配置することができる。相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、ガイドされる（非対称の）ペアとなることができ、これは、ペアのメンバーが自己会合するよりむしろ、互いと優先的に会合することを意味する、あるいは、相互作用ペアは、ガイドされなくてよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先度なしで、互いと会合しても自己会合してもよく、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得ることを意味する。伝統的なＦｃ融合タンパク質および抗体は、ガイドされない相互作用ペアの例である一方で、種々の操作されたＦｃドメインが、ガイドされる（非対称）相互作用ペアとして設計された（例えば、Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁）。
【００６２】
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、本明細書で記載されるものなどのヒトまたは他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド）、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、本明細書で記載されるものなどのヒトまたは他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド）を含むヘテロマータンパク質複合体の模式的な例を示す。例証されている実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。適した相互作用ペアは、例えば、本明細書で記載されるものなど、重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、それらの切断型および改変体を含んだ（例えば、Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁）。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび相互作用ペアの対応するメンバーの間に配置することができる。相互作用ペアの第１および第２のメンバーはガイドされなくてよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先度なしで互いと会合しても自己会合してもよいことを意味し、両者は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得る。図２３Ａを参照されたい。代替的に、相互作用ペアは、ガイドされる（非対称の）ペアとなることができ、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりもむしろ、互いと優先的に会合することを意味する。図２３Ｂを参照されたい。より高次の複合体を想定することができる。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照されたい。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、本明細書で記載されるものなどのヒトまたは他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド）、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、本明細書で記載されるものなどのヒトまたは他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド）を含むヘテロマータンパク質複合体の模式的な例を示す。例証されている実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。適した相互作用ペアは、例えば、本明細書で記載されるものなど、重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、それらの切断型および改変体を含んだ（例えば、Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁）。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび相互作用ペアの対応するメンバーの間に配置することができる。相互作用ペアの第１および第２のメンバーはガイドされなくてよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先度なしで互いと会合しても自己会合してもよいことを意味し、両者は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得る。図２３Ａを参照されたい。代替的に、相互作用ペアは、ガイドされる（非対称の）ペアとなることができ、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりもむしろ、互いと優先的に会合することを意味する。図２３Ｂを参照されたい。より高次の複合体を想定することができる。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照されたい。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、本明細書で記載されるものなどのヒトまたは他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド）、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、本明細書で記載されるものなどのヒトまたは他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド）を含むヘテロマータンパク質複合体の模式的な例を示す。例証されている実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。適した相互作用ペアは、例えば、本明細書で記載されるものなど、重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、それらの切断型および改変体を含んだ（例えば、Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁）。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび相互作用ペアの対応するメンバーの間に配置することができる。相互作用ペアの第１および第２のメンバーはガイドされなくてよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先度なしで互いと会合しても自己会合してもよいことを意味し、両者は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得る。図２３Ａを参照されたい。代替的に、相互作用ペアは、ガイドされる（非対称の）ペアとなることができ、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりもむしろ、互いと優先的に会合することを意味する。図２３Ｂを参照されたい。より高次の複合体を想定することができる。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照されたい。
【図２３Ｄ】図２３Ａ〜２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、本明細書で記載されるものなどのヒトまたは他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド）、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、本明細書で記載されるものなどのヒトまたは他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインに、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド）を含むヘテロマータンパク質複合体の模式的な例を示す。例証されている実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用ペアの第１のメンバー（「Ｃ１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用ペアの第２のメンバー（「Ｃ２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。適した相互作用ペアは、例えば、本明細書で記載されるものなど、重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用ペア、それらの切断型および改変体を含んだ（例えば、Ｓｐｉｅｓｓら（２０１５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁）。各融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび相互作用ペアの対応するメンバーの間に配置することができる。相互作用ペアの第１および第２のメンバーはガイドされなくてよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先度なしで互いと会合しても自己会合してもよいことを意味し、両者は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有し得る。図２３Ａを参照されたい。代替的に、相互作用ペアは、ガイドされる（非対称の）ペアとなることができ、これは、ペアのメンバーが、自己会合するよりもむしろ、互いと優先的に会合することを意味する。図２３Ｂを参照されたい。より高次の複合体を想定することができる。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
発明の詳細な説明
１．概要
ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、ＴＧＦ−ベータ、アクチビン、ｎｏｄａｌ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、および抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含む３０種を超える分泌因子で構成される［Ｗｅｉｓｓら（２０１３年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（１号）：４７〜６３頁］。脊椎動物および無脊椎動物の両方において見出されるスーパーファミリーのメンバーは、多様な組織で遍在性に発現され、発生段階最初期において、動物の生涯を通して機能する。実際に、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質は、幹細胞自己再生、原腸形成、分化、器官形態形成、および成体組織恒常性の重要なメディエーターである。この遍在性の活性と一貫して、異常なＴＧＦ−ベータスーパーファミリーシグナル伝達は、例えば自己免疫性疾患、心血管疾患、線維症性疾患、およびがんを含む広範囲のヒト病態に関連する。
【００６４】
ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのリガンドは、同じ二量体構造を共有し、その構造において、一方の単量体の中心３−１／２ターン・ヘリックスは、他方の単量体のベータ−ストランドによって形成される凹面表面に接して詰まっている。ＴＧＦ−ベータファミリーメンバーの大部分は、分子間ジスルフィド結合によってさらに安定化される。このジスルフィド結合は、２個の他のジスルフィド結合によって形成される環を横切り、「システインノット」モチーフと呼ばれているものを生成する［Ｌｉｎら（２００６年）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、１３２巻：１７９〜１９０頁；およびＨｉｎｃｋら（２０１２年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。
【００６５】
ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーシグナル伝達は、Ｉ型およびＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体によって媒介され、これはリガンド刺激により下流のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５、および８）をリン酸化および活性化する［Ｍａｓｓａｇｕｅ（２０００年）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１巻：１６９〜１７８頁］。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインに富む領域を備えるリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ特異性を有する細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。一般に、Ｉ型受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介する一方、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドの結合に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型受容体は、リガンド結合後に安定化した複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。
【００６６】
ＴＧＦ−ベータファミリーは、これが結合するＩ型受容体およびこれが活性化するＳｍａｄタンパク質に基づき、２つの系統発生上の分岐に分けることができる。１つは、より最近になって進化した分岐であり、これは例えば、Ｓｍａｄ２および３を活性化するＩ型受容体を介してシグナル伝達する、ＴＧＦ−ベータ、アクチビンＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ３、およびｎｏｄａｌを含む［Ｈｉｎｃｋ（２０１２年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。他方の分岐は、スーパーファミリーのより遠縁のタンパク質を含み、例えば、Ｓｍａｄ１、５、および８を介してシグナル伝達する、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７を含む。
【００６７】
アクチビンは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのメンバーであり、卵胞刺激ホルモンの分泌の調節因子として最初に発見されたが、その後、種々の生殖性および非生殖性の役割が特徴付けられた。２つの近縁のβサブユニットのホモ／ヘテロ二量体（それぞれ、βＡβＡ、βＢβＢ、およびβＡβＢ）である、３種の主要アクチビン型（Ａ、ＢおよびＡＢ）が存在する。ヒトゲノムは、肝臓で主に発現されるアクチビンＣおよびアクチビンＥもコードし、βＣまたはβＥを含有するヘテロ二量体型も公知である。ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤細胞におけるホルモン産生を刺激し、ニューロン細胞生存を支持し、細胞型に応じて細胞周期進行にプラスまたはマイナスに影響を与え、少なくとも両生類胚における中胚葉分化を誘導することができる、特有かつ多機能性の因子である。［ＤｅＰａｏｌｏら（１９９１年）Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．、１９８巻：５００〜５１２頁；Ｄｙｓｏｎら（１９９７年）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．、７巻：８１〜８４頁；およびＷｏｏｄｒｕｆｆ（１９９８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５５巻：９５３〜９６３頁］。いくつかの組織において、アクチビンシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体、インヒビンによって拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌の調節において、アクチビンは、ＦＳＨ合成および分泌を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨ合成および分泌を低減する。アクチビン生物活性を調節するおよび／またはアクチビンに結合することができる他のタンパク質は、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ、ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知）、およびα２−マクログロブリンを含む。
【００６８】
本明細書で記載される通り、「アクチビンＡ」に結合する薬剤は、単離されたβＡサブユニットの文脈であるか、または二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであるかにかかわらず、βＡサブユニットに特異的に結合する薬剤である。ヘテロ二量体の複合体（例えば、βＡβＢヘテロ二量体）の場合、「アクチビンＡ」に結合する薬剤は、βＡサブユニット内に存在するエピトープに特異的であるが、複合体の非βＡサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」に拮抗する（阻害する）本明細書で開示される薬剤は、単離されたβＡサブユニットの文脈であるか、または二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであるかにかかわらず、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性を阻害する薬剤である。βＡβＢヘテロ二量体の場合、「アクチビンＡ」を阻害する薬剤は、βＡサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害するが、複合体の非βＡサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）の活性は阻害しない薬剤である。この原理は、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」、および「アクチビンＥ」に結合するおよび／またはこれらを阻害する薬剤にも適用される。「アクチビンＡＢ」に拮抗する本明細書で開示される薬剤は、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性およびβＢサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性を阻害する薬剤である。
【００６９】
ＢＭＰおよびＧＤＦは共に、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの特徴的なフォールドを共有するシステインノットサイトカインのファミリーを形成する［Ｒｉｄｅｒら（２０１０年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、４２９巻（１号）：１〜１２頁］。このファミリーは、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２ａ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ１０としても公知）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２としても公知）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１としても公知）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７としても公知）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６としても公知）、ＢＭＰ１４（ＧＤＦ５としても公知）、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３（ＶＧＲ２としても公知）、ＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１５、およびデカペンタプレジックを含む。ＢＭＰにその名前を与えることになった骨形成を誘導する能力に加えて、ＢＭＰ／ＧＤＦは、広範囲の組織の発達における形態形成活性を表示する。ＢＭＰ／ＧＤＦホモおよびヘテロ二量体は、Ｉ型およびＩＩ型受容体二量体の組合せと相互作用して、複数の可能なシグナル伝達複合体を産生して、２つの競合するセットのＳＭＡＤ転写因子の一方の活性化をもたらす。ＢＭＰ／ＧＤＦは、高度に特異的かつ局在化した機能を有する。これらは、ＢＭＰ／ＧＤＦ発現の発生上の制限、および高いアフィニティーでサイトカインに結合するいくつかの特異的ＢＭＰアンタゴニストタンパク質の分泌によるものを含む、いくつかの仕方で調節される。不思議なことに、いくつかのこれらのアンタゴニストは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに似ている。
【００７０】
増殖分化因子−８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知である。ＧＤＦ８は、骨格筋量の負の調節因子であり、発生中および成体の骨格筋において高度に発現される。トランスジェニックマウスにおけるＧＤＦ８ヌル変異は、骨格筋の著しい肥大および過形成によって特徴付けられる［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）３８７巻：８３〜９０頁］。同様の骨格筋量増大は、ウシおよび際だったことにヒトにおいてＧＤＦ８の天然に存在する変異において明らかである［Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４年）Ｇｒｏｗｔｈ、３８巻：５０１〜５０７頁；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ、Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．（１９９４年）３８巻：７５２〜７５７頁；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９９７年）９４巻：１２４５７〜１２４６１頁；Ｋａｍｂａｄｕｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．（１９９７年）７巻：９１０〜９１５頁；ならびにＳｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２〜８頁］。研究は、ヒトにおけるＨＩＶ感染症に関連する筋消耗が、ＧＤＦ８タンパク質発現の増加を伴うことも示している［Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、ＰＮＡＳ（１９９８年）９５巻：１４９３８〜４３頁］。加えて、ＧＤＦ８は、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生をモジュレートし、筋芽細胞の細胞増殖をモジュレートすることができる［国際特許出願公開番号ＷＯ００／４３７８１］。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合により結合し、その生物学的活性を不活性化することができる［Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：６４０７〜６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻；７６４６〜７６５４頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９０年）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻：３５〜４３頁］。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、その生物学的活性を阻害する他のタンパク質は、フォリスタチンおよび潜在的にフォリスタチン関連タンパク質［Ｇａｍｅｒら（１９９９年）Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜２３２頁］を含む。
【００７１】
ＢＭＰ１１としても公知のＧＤＦ１１は、マウス発生の際に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに後根神経節において発現される分泌タンパク質である［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９９年）Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、２２巻：２６０〜２６４頁；およびＮａｋａｓｈｉｍａら（１９９９年）Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．、８０巻：１８５〜１８９頁］。ＧＤＦ１１は、中胚葉および神経組織の両方のパターン形成において特有の役割を果たす［Ｇａｍｅｒら（１９９９年）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜３２頁］。ＧＤＦ１１は、発生中のニワトリ肢における軟骨形成および筋形成の負の調節因子であることが示された［Ｇａｍｅｒら（２００１年）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２２９巻：４０７〜２０頁］。筋肉におけるＧＤＦ１１の発現も、ＧＤＦ８と同様の仕方での筋肉成長の調節におけるその役割を示唆する。加えて、脳におけるＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ１１が、神経系の機能に関連する活性も保有し得ることを示唆する。興味深いことにＧＤＦ１１は、嗅上皮における神経形成を阻害することが判明した［Ｗｕら（２００３年）Ｎｅｕｒｏｎ．、３７巻：１９７〜２０７頁］。したがって、ＧＤＦ１１は、筋肉疾患および神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）などの疾患の処置におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ適用を有し得る。
【００７２】
本明細書において実証されるように、可溶性のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、いずれも種々のＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢ相互作用リガンドに結合し、ＰＡＨモデルにおける血圧および心肥大の減少において有効である。任意の特定の機構に限定することを望まないが、これらの薬剤の効果は、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂシグナル伝達アンタゴニスト作用に主に起因すると予想される。機構にかかわらず、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂシグナル伝達アンタゴニスト（ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト）が、血圧を減少させ、心肥大を減少させ、および肺高血圧症の処置において他の陽性の効果を有することは、本明細書に示されているデータから明らかである。血圧および肥大は、動的であり、血圧および肥大を増加させる要因と、血圧および肥大を減少させる要因とのバランスに応じて変化することに留意すべきである。血圧および心肥大は、血圧および心肥大を低減する要因を増加させることによって、血圧上昇および心肥大を促進する要因を減少させることによって、またはその両方によって減少させることができる。血圧の減少または心肥大の減少という用語は、血圧および心組織における観察可能な物理的変化を指し、それによって変化が起こる機構に関して中立であることが意図される。
【００７３】
本明細書で記載される試験に使用したＰＡＨのラットモデルは、ヒトにおける有効性を予測すると考えられ、したがって本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体、および他のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを使用して、肺高血圧症（例えば、ＰＡＨ）、特にヒトにおける肺高血圧症の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度もしくは期間を低減する方法を提供する。本明細書に開示されるように、用語ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂリガンド［例えば、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０］を阻害するアンタゴニスト；１つまたは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ７、およびＡＬＫ５）を阻害するアンタゴニスト；ならびに１つまたは複数の下流のシグナル伝達構成要素（例えば、Ｓｍａｄ２および３などのＳｍａｄタンパク質）を阻害するアンタゴニストを含む、ＡｃｔＲＩＩＡ／Ｂシグナル伝達に拮抗するために使用され得る種々の薬剤を指す。本開示の方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、種々の形態、例えばリガンドトラップ（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体アンタゴニスト（例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ７、およびＡＬＫ５のうちの１つまたは複数を阻害する抗体）、小分子アンタゴニスト［例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ７、ＡＬＫ５、および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数を阻害する小分子］、ならびにヌクレオチドアンタゴニスト［例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ７、ＡＬＫ５、および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数を阻害するヌクレオチド配列］を含む。
【００７４】
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびにこれらの作製方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が、以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲または意味は、それが使用される特定の文脈から明らかである。
【００７５】
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて「共通する進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含む。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、パーセント同一性の観点であれ、特定の残基またはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。しかし、一般的な用法およびこの出願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化的起源に関連していてもしていなくてもよい。
【００７６】
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法上の形式において、共通の進化的起源を共有しても共有しなくてもよい核酸またはアミノ酸配列の間の同一性または一致の程度を指す。
【００７７】
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に関する「パーセント（％）配列同一性」は、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、最大パーセント配列同一性を達成した後に、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列におけるアミノ酸残基（または核酸）と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基（または核酸）のパーセンテージとして規定される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のアラインメントは、当技術分野の技能範囲内の種々の仕方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されたコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたる最大アラインメントの達成に必要とされるいずれかのアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメーターを決定することができる。しかし、本明細書における目的のため、％アミノ酸（核酸）配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して作成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著作され、ソースコードは、米国著作権局（Ｕ．Ｓ．  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９においてユーザー文書により提出され、そこでは、米国著作権登録番号（Ｕ．Ｓ．  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．）ＴＸＵ５１００８７にて登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から公開されている、またはソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティング・システムにおける使用のためにコンパイルされるべきである。あらゆる配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動させない。
【００７８】
「刺激する（ａｇｏｎｉｚｅ）」は、そのあらゆる文法上の形式において、タンパク質および／もしくは遺伝子を活性化する（例えば、該タンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することにより、または活性状態に入るように不活性タンパク質を誘導することにより）、またはタンパク質および／もしくは遺伝子の活性を増大する過程を指す。
【００７９】
「拮抗する」は、そのあらゆる文法上の形式において、タンパク質および／もしくは遺伝子を阻害する（例えば、該タンパク質の遺伝子発現を阻害もしくは減少させることにより、または不活性状態に入るように活性タンパク質を誘導することにより）、またはタンパク質および／または遺伝子の活性を減少させる過程を指す。
【００８０】
本明細書および特許請求の範囲を通して、数値に関連して使用される用語「約」および「およそ」は、当業者にとって精通し許容される、精度の間隔を表示する。一般に、このような精度の間隔は、±１０％である。代替的に、および特に、生物系において、用語「約」および「およそ」は、所定の値の１桁以内の、好ましくは≦５倍、より好ましくは≦２倍の値を意味することができる。
【００８１】
本明細書で開示される数的範囲は、範囲を規定する数を包括する。
【００８２】
用語「ａ（単数の）」および「ａｎ（単数の）」は、この用語が使用されている文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含む。用語「ａ（単数の）」（または「ａｎ（単数の）」）ならびに用語「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。さらに、「および／または」は、本明細書に使用される場合、他の特色または構成要素を含むまたは含まない、２つまたはそれを超える指定の特色または構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈するべきである。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むように意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句において使用される用語「および／または」は、次の態様のそれぞれを包含するように意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【００８３】
本明細書を通して、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、言及されている整数または整数の群の包含を含意するが、他のいかなる整数または整数の群の除外も含意しないものとして理解されるであろう。
【００８４】
２．ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、およびその改変体
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびその使用（例えば、肺高血圧症または肺高血圧症の１つもしくは複数の合併症、および／または間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症）を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減するための使用）に関する。本明細書において使用される用語「ＡｃｔＲＩＩ」は、ＩＩ型アクチビン受容体のファミリーを指す。このファミリーは、ＩＩＡ型アクチビン受容体（ＡｃｔＲＩＩＡ）およびＩＩＢ型アクチビン受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ）を含む。
【００８５】
本明細書で使用される用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」は、任意の種由来のアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質と、変異誘発または他の修飾によるこのようなＡｃｔＲＩＩＢタンパク質に由来する改変体のファミリーを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＢの参照は、現在同定された形態のうちのいずれか１つを参照するものと理解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは一般に、システインに富む領域を備えるリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。
【００８６】
用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例は、本開示を通して、ならびに参照によりそれらの全体を本明細書に組み込む国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０１２６２７、ＷＯ２００８／０９７５４１、ＷＯ２０１０／１５１４２６およびＷＯ２０１１／０２００４５に提供されている。本明細書で記載されるあらゆるＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、他に特段の指定がなければ、下記に示すヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列（配列番号１）の番号付けに基づく。
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列を次に示す：
【化１】
2019521144.tif 000002
【００８７】
シグナルペプチドは、単一の下線により指し示す；細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し；潜在的な内在性Ｎ結合型グリコシル化部位は、二重の下線により指し示す。
プロセシングされた（成熟）細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列を次に示す：
【００８８】
【化２】
2019521144.tif 000003
【００８９】
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端に「ＳＧＲ…」配列を有する状態で産生することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テイル」は、単一の下線によって指し示す。「テイル」を欠失した配列（Δ１５配列）を次に示す：
【００９０】
【化３】
2019521144.tif 000004
【００９１】
配列番号１の６４位にアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態（Ａ６４）も、文献に報告されている。例えば、Ｈｉｌｄｅｎら（１９９４年）Ｂｌｏｏｄ、８３巻（８号）：２１６３〜２１７０頁を参照されたい。本出願人らは、Ａ６４置換を有するＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対し相対的に低いアフィニティーを有することを確かめた。対照的に、６４位にアルギニンを有する同じＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ６４）は、低ナノモル濃度から高ピコモル濃度範囲内のアクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティーを有する。したがって、Ｒ６４を有する配列は、本開示におけるヒトＡｃｔＲＩＩＢの「野生型」参照配列として使用される。
６４位にアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態を次に示す：
【化４】
2019521144.tif 000005
【００９２】
シグナルペプチドは、単一の下線によって指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントによって指し示す。
【００９３】
代替的Ａ６４形態のプロセシングされた（成熟）細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列を次に示す：
【化５】
2019521144.tif 000006
【００９４】
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端に「ＳＧＲ…」配列を有する状態で産生することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テイル」は、単一の下線によって指し示す。「テイル」を欠失した配列（Δ１５配列）を次に示す：
【化６】
2019521144.tif 000007
【００９５】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列を下記に示し（配列番号７）、これは、ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のアミノ酸１〜５１３をコードする、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０６．３のヌクレオチド２５〜１５６０を表す。示されている配列は、６４位にアルギニンを提供し、そして代わりにアラニンを提供するように修飾することができる。シグナル配列に下線を引く。
【化７】
2019521144.tif 000008
【化８】
2019521144.tif 000009
【００９６】
プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸配列を次に示す（配列番号８）。示されている配列は、６４位にアルギニンを提供し、そして代わりにアラニンを提供するように修飾することができる。
【化９】
2019521144.tif 000010
【００９７】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントは、図１に例証されている。このアラインメントは、ＡｃｔＲＩＩリガンドに直接的に接触すると考えられる両方の受容体内のアミノ酸残基を指し示す。例えば、複合的ＡｃｔＲＩＩ構造は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合性ポケットが、残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８からＴ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３からＫ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８からＮ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２およびＥ９４からＦ１０１によって部分的に定義されることを指し示した。これらの位置において、保存的変異が許容されるであろうことが予想される。
【００９８】
加えて、ＡｃｔＲＩＩＢは、脊椎動物の間で十分に保存されており、細胞外ドメインの大きな区間（ｓｔｒｅｔｃｈ）が完全に保存されている。例えば、図２は、様々なＡｃｔＲＩＩＢオルソログと比較した、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの多重配列アラインメントを描写する。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントから、正常なＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合活性に重要な、リガンド結合性ドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測すると共に、正常なＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合活性を有意に変更することのない、置換に寛容である可能性があるアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、現在開示されている方法に従って有用な活性ヒトＡｃｔＲＩＩＢ改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢの配列由来の対応する位置に１つまたは複数のアミノ酸を含み得る、またはヒトまたは他の脊椎動物配列における残基と同様の残基を含み得る。限定を意味するものではないが、次の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＢ改変体を定義するこのアプローチを例証する。ヒト細胞外ドメイン（配列番号２）におけるＬ４６は、ツメガエル（ｘｅｎｏｐｕｓ）ＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号５８）においてバリンであるため、この位置は、変更することができ、任意選択で、Ｖ、ＩもしくはＦなどの別の疎水性残基またはＡなどの非極性残基に変更することができる。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ５２は、ツメガエルではＫであり、この部位が、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくＡなど、極性残基も含む多種多様な変化に寛容となり得ることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＴ９３は、ツメガエルではＫであり、この位置では幅広い構造変種が許容され、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなど、極性残基が好まれることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＦ１０８は、ツメガエルではＹであり、したがって、ＹまたはＩ、ＶもしくはＬなどの他の疎水性基が許容される筈である。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ１１１は、ツメガエルではＫであり、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨを含む荷電残基ならびにＱおよびＮがこの位置に許容されるであろうことを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＲ１１２は、ツメガエルではＫであり、ＲおよびＨを含む塩基性残基がこの位置に許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおける１１９位のＡは、相対的に十分には保存されておらず、齧歯類ではＰ、ツメガエルではＶとして出現することから、この位置では基本的にいかなるアミノ酸も許容される筈である。
【００９９】
さらに、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、構造および機能的な特徴の観点から、特に、リガンド結合に関して当技術分野で特徴付けされている［Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）Ｃｅｌｌ  ６８巻（１号）：９７〜１０８頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６巻（１号）：１８〜２２頁；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６年）ＰＮＡＳ  １０３巻（２０号：７６４３〜７６４８頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３年）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２２巻（７号）：１５５５〜１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号および同第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＢ改変体を生成する仕方についてのガイダンスを十分に提供する。
【０１００】
例えば、３−フィンガートキシンフォールドとして公知の明確な構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体の受容体の細胞外ドメイン内の変動的な位置に位置する保存されたシステイン残基によって形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ６巻：１８〜２２頁；およびＨｉｎｃｋ（２０１２年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。したがって、これらの保存されたシステインの最外部によって境界を画定されるヒトＡｃｔＲＩＩＢのコアリガンド結合性ドメインは、配列番号１（ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体）の２９〜１０９位に対応する。これらのシステインにより境界を画定されたコア配列に隣接する構造的により秩序的でないアミノ酸は、必ずしもリガンド結合を変更することなく、Ｎ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８残基、および／またはＣ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくは２２残基、切断することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端切断型のための例示的なＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは、配列番号２、３、５および６を含む。
【０１０１】
Ａｔｔｉｓａｎｏらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失が、アクチビンに対する受容体のアフィニティーを低減したことを示した。本配列番号１のアミノ酸２０〜１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質である「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１１９）−Ｆｃ」は、プロリンノット領域および完全膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１３４）−Ｆｃと比べて、ＧＤＦ１１およびアクチビンへの低減した結合を有する（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１２９）−Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されていても、野生型と比べて同様の、ただし幾分低減した活性を保持する。
【０１０２】
したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０および１２９（配列番号１に関して）で停止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て、活性であると予想されるが、１３４または１３３で停止する構築物が、最も活性となり得る。同様に、残基１２９〜１３４（配列番号１に関して）のいずれかにおける変異は、リガンド結合アフィニティーを大幅に変更するとは予想されない。これを支持して、Ｐ１２９およびＰ１３０（配列番号１に関して）の変異が、リガンド結合を実質的に減少させないことが当技術分野で公知である。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アミノ酸１０９（最終システイン）もの短さで終わることができるが、１０９および１１９でまたはその間（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８または１１９）で終わる形態は、低減したリガンド結合を有すると予想される。アミノ酸１１９（本配列番号１に関して）は、十分には保存されていないため、容易に変更または切断される。１２８（配列番号１に関して）またはそれより後で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、リガンド結合活性を保持する筈である。配列番号１に関して１１９および１２７でまたはその間（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６または１２７）で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、中等度の結合能力を有するであろう。臨床または実験設定に応じて、これらの形態のうちいずれかが、使用に望ましくなるであろう。
【０１０３】
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端において、アミノ酸２９またはそれ以前（配列番号１に関して）から始まるタンパク質が、リガンド結合活性を保持するであろうことが予想される。アミノ酸２９は、最初のシステインを表す。２４位（配列番号１に関して）におけるアラニンからアスパラギンへの変異は、リガンド結合に実質的に影響することなく、Ｎ結合型グリコシル化配列を導入する［米国特許第７，８４２，６６３号］。これは、アミノ酸２０〜２９に対応する、シグナル切断ペプチドおよびシステイン架橋領域の間の領域における変異が、十分に許容されることを確認する。特に、２０、２１、２２、２３および２４位（配列番号１に関して）から始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、一般的なリガンド結合活性を保持する筈であり、２５、２６、２７、２８および２９位（配列番号１に関して）から始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドも、リガンド結合活性を保持すると予想される。例えば、米国特許第７，８４２，６６３号において、驚くべきことに、２２、２３、２４または２５から始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物が、最も活性を有するであろうことが実証された。
【０１０４】
まとめると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合性部分）の一般式は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９を含む。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸２０〜２９のうちのいずれか１つに対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９のうちのいずれか１つから始まる）、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４のうちのいずれか１つに対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４のうちのいずれか１つで終わる）ＡｃｔＲＩＩＢの部分に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなることができる。他の例として、配列番号１の２０〜２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９位のうちのいずれか１つ）または２１〜２９（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９位のうちのいずれか１つ）位から始まり、配列番号１の１１９〜１３４（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４位のうちのいずれか１つ）、１１９〜１３３（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２または１３３位のうちのいずれか１つ）、１２９〜１３４（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４位のうちのいずれか１つ）または１２９〜１３３（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２または１３３位のうちのいずれか１つ）位で終わるポリペプチドが挙げられる。他の例として、配列番号１の２０〜２４（例えば、２０、２１、２２、２３または２４位のうちのいずれか１つ）、２１〜２４（例えば、２１、２２、２３または２４位のうちのいずれか１つ）または２２〜２５（例えば、２２、２２、２３または２５位のうちのいずれか１つ）位から始まり、配列番号１の１０９〜１３４（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４位のうちのいずれか１つ）、１１９〜１３４（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４位のうちのいずれか１つ）または１２９〜１３４（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４位のうちのいずれか１つ）位で終わる構築物が挙げられる。これらの範囲内の改変体、特に、配列番号１の対応する部分に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる改変体も考慮される。
【０１０５】
本明細書で記載される変種は、様々な仕方で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体は、リガンド結合性ポケットにおける１、２、５、６、７、８、９、１０または１５個以下の保存的アミノ酸変化、任意選択で、リガンド結合性ポケットにおける４０、５３、５５、７４、７９および／または８２位におけるゼロ、１つまたは複数の非保存的変更を含む。可変性が特に十分に許容され得る結合性ポケットの外側の部位は、細胞外ドメイン（上に記す通り）のアミノおよびカルボキシ末端、ならびに４２〜４６および６５〜７３位（配列番号１に関して）を含む。６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ｒ６４バックグラウンドにおけるリガンド結合を低減しないと思われる［米国特許第７，８４２，６６３号］。この変化はおそらく、Ａ６４バックグラウンドにおけるＮ６５のグリコシル化を排除し、これにより、この領域における有意な変化が許容される可能性があることを実証する。Ｒ６４Ａ変化は、十分に許容されないが、Ｒ６４Ｋは、十分に許容されるため、Ｈなど、別の塩基性残基が６４位において許容され得る［米国特許第７，８４２，６６３号］。その上、当技術分野に記載されている変異誘発プログラムの結果は、ＡｃｔＲＩＩＢには、保存することが有益なことが多いアミノ酸位置が存在することを指し示す。配列番号１に関して、このような位置として、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、特にトリプトファン）、３７位（酸性、特にアスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン）が挙げられる。したがって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおいて保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存することが望ましくなり得る他の位置を次に示す：５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８（極性または荷電、特にＥ、Ｄ、ＲまたはＫ）、これらは全て配列番号１に対してのものである。
【０１０６】
さらなるＮ結合型グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）をＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに付加することは良好に許容されることがこれまでに実証されている（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）。したがって、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を、一般的に本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおいて図１に定義されるリガンド結合性ポケット外の位置に導入してもよい。非内因性のＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列の導入にとって特に適した部位は、アミノ酸２０〜２９、２０〜２４、２２〜２５、１０９〜１３４、１２０〜１３４、または１２９〜１３４（配列番号１に関して）を含む。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列はまた、ＡｃｔＲＩＩＢ配列とＦｃドメインまたは他の融合構成要素との間のリンカーに、ならびに任意選択で融合構成要素そのものに導入してもよい。このような部位は、前から存在するＳもしくはＴに関して正しい位置にＮを導入することによって、または前から存在するＮに対応する位置にＳもしくはＴを導入することによって、最少の努力で導入され得る。したがって、Ｎ結合型グリコシル化部位を作製する望ましい変更は：Ａ２４Ｎ、Ｒ６４Ｎ、Ｓ６７Ｎ（おそらくＮ６５Ａ変更と組み合わせて）、Ｅ１０５Ｎ、Ｒ１１２Ｎ、Ｇ１２０Ｎ、Ｅ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｎ、Ａ１３２Ｎ、Ｒ１１２Ｓ、およびＲ１１２Ｔ（配列番号１に関して）である。グリコシル化によって与えられる保護のために、グリコシル化されると予測される任意のＳを、免疫原性部位を作製することなくＴに変更することができる。同様に、グリコシル化されると予測される任意のＴを、Ｓに変更することができる。したがって、変更Ｓ６７ＴおよびＳ４４Ｔ（配列番号１に関して）が考慮される。同様に、Ａ２４Ｎ改変体では、Ｓ２６Ｔ変更を使用してもよい。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、上記のように、１つまたは複数の追加の非内因性のＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列を有する改変体であり得る。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、本開示は、そのフラグメント、機能的改変体、および修飾形態を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（阻害剤）ならびにその使用（例えば、ＰＨまたは１つもしくは複数のＰＨ関連合併症を処置または予防すること）に関する。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、可溶性である（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含む）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１５、およびＢＭＰ１０］の活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）に拮抗する。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１５、およびＢＭＰ１０］に結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２０〜２９に対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のうちのいずれか１つから始まり）、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４に対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のうちのいずれか１つで終わる）ＡｃｔＲＩＩＢの部分に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸（天然に存在する酸性アミノ酸ＤおよびＥ、または人工の酸性アミノ酸）である。ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、４０、４２、４５、４６、４７、４８、６９、７４、７７、７８、７９、１０８、１１０、１１４、１１５、１１８、および１２０のうちのいずれか一配列のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、４０、４２、４５、４６、４７、４８、６９、７４、７７、７８、７９、１０８、１１０、１１４、１１５、１１８、および１２０のうちのいずれか一配列のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸ではない（すなわち、天然に存在するアミノ酸ＤもしくはＥまたは人工の酸性アミノ酸残基ではない）。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに関する。本明細書で使用される用語「ＡｃｔＲＩＩＡ」は、任意の種由来のアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）タンパク質、および変異誘発または他の修飾によるこのようなＡｃｔＲＩＩＡタンパク質に由来する改変体のファミリーを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＡの参照は、現在同定された形態のうちのいずれか１つを参照するものと理解される。ＡｃｔＲＩＩＡファミリーのメンバーは一般に、システインに富む領域を備えるリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。
【０１０９】
用語「ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＡファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの例は、本開示を通して、および参照によりその全体を本明細書に組み込む国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０１２６２７およびＷＯ２００７／０６２１８８に提供されている。本明細書で記載されるあらゆるＡｃｔＲＩＩＡ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、他に特段の指定がなければ、下記に示すヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列（配列番号９）の番号付けに基づく。
【０１１０】
正準ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列を次に示す：
【化１０】
2019521144.tif 000011
【０１１１】
シグナルペプチドは、単一の下線によって指し示し；細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し；潜在的な内在性Ｎ結合型グリコシル化部位は、二重の下線によって指し示す。
【０１１２】
プロセシングされた（成熟）細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド配列を次に示す：
【化１１】
2019521144.tif 000012
【０１１３】
細胞外ドメインのＣ末端「テイル」は、単一の下線によって指し示す。「テイル」を欠失した配列（Δ１５配列）を次に示す：
【化１２】
2019521144.tif 000013
【０１１４】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質をコードする核酸配列を下記に示し（配列番号１２）、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１６１６．４のヌクレオチド１５９〜１７００を示す。シグナル配列に下線を引く。
【化１３】
2019521144.tif 000014
【化１４】
2019521144.tif 000015
【０１１５】
プロセシングされた可溶性（細胞外）ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドをコードする核酸配列を次に示す：
【化１５】
2019521144.tif 000016
【０１１６】
ＡｃｔＲＩＩＡは、脊椎動物の間で十分に保存されており、細胞外ドメインの大きな区間（ｓｔｒｅｔｃｈ）が完全に保存されている。例えば、図３は、種々のＡｃｔＲＩＩＡオルソログと比較した、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインの多重配列アラインメントを描写する。ＡｃｔＲＩＩＡに結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントから、正常なＡｃｔＲＩＩＡリガンド結合活性に重要な、リガンド結合性ドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測すると共に、正常なＡｃｔＲＩＩＡリガンド結合活性を有意に変更することのない、置換に寛容である可能性があるアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、現在開示されている方法に従って有用な活性ヒトＡｃｔＲＩＩＡ改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＡの配列由来の対応する位置に１つもしくは複数のアミノ酸を含み得る、またはヒトもしくは他の脊椎動物配列における残基と同様の残基を含み得る。
【０１１７】
限定を意味するものではないが、次の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＡ改変体を定義するこのアプローチを例証する。図３に例証するように、ヒト細胞外ドメインにおけるＦ１３は、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ（配列番号６２）、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（配列番号６５）、Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ（配列番号６６）、Ｔｙｔｏ  ａｌｂａ（配列番号６７）、およびＭｙｏｔｉｓ  ｄａｖｉｄｉｉ（配列番号６８）ＡｃｔＲＩＩＡにおいてＹであり、Ｆ、Ｗ、およびＹを含む芳香族残基が、この位置で許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＱ２４は、Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ  ＡｃｔＲＩＩＡではＲであり、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、およびＥを含む荷電残基がこの位置で許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＳ９５は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓおよびＴｙｔｏ  ａｌｂａ  ＡｃｔＲＩＩＡではＦであり、この部位が、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙなどの極性残基、およびおそらくＬ、Ｉ、またはＦなどの疎水性残基を含む多種多様な変化に寛容となり得ることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ５２は、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ  ＡｃｔＲＩＩＡではＤであり、ＤおよびＥを含む酸性残基が、この位置で許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＰ２９は、保存が比較的不良であり、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ  ＡｃｔＲＩＩＡではＳとして出現し、Ｍｙｏｔｉｓ  ｄａｖｉｄｉｉ  ＡｃｔＲＩＩＡではＬとして出現し、したがって、本質的に任意のアミノ酸がこの位置で許容される筈である。
【０１１８】
その上、上記のように、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、構造／機能的な特徴の観点から、特にリガンド結合に関して当該分野で特徴付けられている［Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）Ｃｅｌｌ、６８巻（１号）：９７〜１０８頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻（１号）：１８〜２２頁；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６年）ＰＮＡＳ、１０３巻（２０号）：７６４３〜７６４８頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３年）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２２巻（７号）：１５５５〜１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、第７，６１２，０４１号、および第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の所望の活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩ改変体を生成する仕方についてのガイダンスを十分に提供する。
【０１１９】
例えば、３−フィンガートキシンフォールドとして公知の明確な構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体の受容体の細胞外ドメイン内の変動的な位置に位置する保存されたシステイン残基によって形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ、６巻：１８〜２２頁；およびＨｉｎｃｋ（２０１２年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。したがって、これらの保存されたシステインの最外部によって境界を画定されるヒトＡｃｔＲＩＩＡのコアリガンド結合性ドメインは、配列番号９（ＡｃｔＲＩＩＡ前駆体）の３０〜１１０位に対応する。したがって、これらのシステインにより境界を画定されたコア配列に隣接する構造的により秩序的でないアミノ酸は、必ずしもリガンド結合を変更することなく、Ｎ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９残基、およびＣ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５残基、切断することができる。例示的なＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメイン切断は、配列番号１０および１１を含む。
【０１２０】
したがって、ＡｃｔＲＩＩＡの活性部分（例えば、リガンド結合）の一般式は、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるポリペプチドである。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、例えば、配列番号９のアミノ酸２１〜３０のうちのいずれか１つに対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のうちのいずれか１つから始まり）、配列番号９のアミノ酸１１０〜１３５のうちのいずれか１つに対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５のうちのいずれか１つで終わる）ＡｃｔＲＩＩＡの部分に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得るか、これから本質的になり得るか、またはこれからなり得る。他の例は、配列番号９の２１〜３０（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のうちのいずれか１つから始まり）、２２〜３０（例えば、アミノ酸２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のうちのいずれか１つから始まり）、２３〜３０（例えば、アミノ酸２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のうちのいずれか１つから始まり）、２４〜３０（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のうちのいずれか１つから始まり）から選択される位置から始まり、配列番号９の１１１〜１３５（例えば、アミノ酸１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のうちのいずれか１つで終わる）、１１２〜１３５（例えば、アミノ酸１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のうちのいずれか１つで終わる）、１１３〜１３５（例えば、アミノ酸１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のうちのいずれか１つで終わる）、１２０〜１３５（例えば、アミノ酸１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のうちのいずれか１つで終わる）、１３０〜１３５（例えば、アミノ酸１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のうちのいずれか１つで終わる）、１１１〜１３４（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のうちのいずれか１つで終わる）、１１１〜１３３（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３のうちのいずれか１つで終わる）、１１１〜１３２（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、または１３２のうちのいずれか１つで終わる）、または１１１〜１３１（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、または１３１のうちのいずれか１つで終わる）から選択される位置で終わる構築物を含む。これらの範囲内の改変体、特に、配列番号９の対応する部分に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる改変体も考慮される。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドを含み得るか、これから本質的になり得るか、またはこれからなり得る。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、リガンド結合性ポケットにおいて１、２、５、１０または１５個以下の保存的アミノ酸変化を含むポリペプチドを含む。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本開示は、そのフラグメント、機能的改変体、および修飾形態を含むＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（阻害剤）、ならびにその使用（例えば、それを必要とする患者における免疫応答を増加させること、およびがんを処置すること）に関する。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン）である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１５、および／またはＢＭＰ１０］を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１５、および／またはＢＭＰ１０］に結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１〜３０に対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のうちのいずれか１つから始まり）、配列番号９のアミノ酸１１０〜１３５のうちのいずれか１つに対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５のうちのいずれか１つで終わる）ＡｃｔＲＩＩＡの部分に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１〜１３５に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、３２、３６、および３９のうちのいずれか一配列のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０１２２】
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦトラップポリペプチド（「ＧＤＦトラップ」とも呼ばれる）に関する。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比較して１つまたは複数の変更されたリガンド結合活性を有するように、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、「野生型」または無修飾型ＡｃｔＲＩＩポリペプチド）の細胞外ドメイン（リガンド結合性ドメインとも呼ばれる）において１つまたは複数の変異（例えば、アミノ酸付加、欠失、置換、およびその組合せ）を含む改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）である。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに、少なくとも１つの類似の活性を保持している。例えば、好ましいＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合し、その機能を阻害する（例えば、拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップはさらに、ＧＤＦ／ＢＭＰのリガンドの１つまたは複数に結合して阻害する。したがって、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンドに対して変更された結合特異性を有するＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。
【０１２３】
例証するために、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、および／またはアクチビンＥ）、特にアクチビンＡなどの１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ結合性リガンドに対するＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８の変更されたリガンド結合性ドメインの選択性を増加させる１つまたは複数の変異を選択してもよい。任意選択で、変更されたリガンド結合性ドメインは、野生型リガンド結合性ドメインに関する比率と比べて少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００倍、またはさらに１０００倍大きい、アクチビン結合のＫｄの、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合のＫｄに対する比率を有する。任意選択で、変更されたリガンド結合性ドメインは、野生型リガンド結合性ドメインと比べて少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００、またはさらに１０００倍大きい、アクチビン阻害のＩＣ５０の、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８阻害のＩＣ５０に対する比率を有する。任意選択で、変更されたリガンド結合性ドメインは、アクチビン阻害のＩＣ５０より少なくとも２、５、１０、２０、５０、１００、またはさらに１０００倍小さいＩＣ５０でＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８を阻害する。
【０１２４】
ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質のアミノ酸残基（例えば、配列番号１に関してＥ３９、Ｋ５５、Ｙ６０、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｌ７９、Ｄ８０、およびＦ１０１）は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合性ポケットに存在し、例えば、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８を含むそのリガンドに対する結合を媒介するために役立つ。したがって、本開示は、それらのアミノ酸残基で１つまたは複数の変異を含むＡｃｔＲＩＩＢ受容体の変更されたリガンド結合性ドメイン（例えば、ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１結合性ドメイン）を含むＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。
【０１２５】
具体例として、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合性ドメインの陽性荷電アミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ８０）を、異なるアミノ酸残基に変異させて、ＧＤＦ８に優先的に結合するが、アクチビンに結合しないＧＤＦトラップポリペプチドを産生することができる。好ましくは、配列番号１のＤ８０残基を、非荷電アミノ酸残基、陰性アミノ酸残基、および疎水性アミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基に変化させる。さらなる具体例として、配列番号１の疎水性残基Ｌ７９を変更して、変更されたアクチビン−ＧＤＦ１１／ＧＤＦ８結合特性を付与することができる。例えば、Ｌ７９Ｐ置換は、アクチビン結合より大きい程度にＧＤＦ１１結合を低減する。これに対し、Ｌ７９を酸性アミノ酸［アスパラギン酸またはグルタミン酸；Ｌ７９ＤまたはＬ７９Ｅ置換］に置き換えると、アクチビンＡ結合アフィニティーを大きく低減するが、ＧＤＦ１１結合アフィニティーは保持する。例示的な実施形態では、本明細書で記載される方法は、任意選択で１つまたは複数の追加のアミノ酸置換、付加、または欠失と組み合わせて、配列番号１の７９位に対応する位置で酸性アミノ酸（例えば、ＤまたはＥ）を含む改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであるＧＤＦトラップポリペプチドを利用する。
【０１２６】
ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびその使用に関する。本明細書において使用される用語「ＡＬＫ４」は、任意の種由来のアクチビン受容体様キナーゼ−４タンパク質および変異誘発または他の修飾によるこのようなＡＬＫ４タンパク質に由来する改変体のファミリーを指す。本明細書におけるＡＬＫ４の参照は、現在同定された形態のうちのいずれか１つを参照するものと理解される。ＡＬＫ４ファミリーメンバーは、一般に、システインに富む領域を備えるリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成された膜貫通タンパク質である。
【０１２７】
用語「ＡＬＫ４ポリペプチド」は、ＡＬＫ４ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体、およびペプチド模倣体形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書で記載されるあらゆるＡＬＫ４関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、他に特段の指定がなければ、下のヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列（配列番号１００）の番号付けに基づく。
【０１２８】
ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿００４２９３）は、以下の通りである。
【化１６】
2019521144.tif 000017
【０１２９】
シグナルペプチドは、単一の下線により指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
【０１３０】
プロセシングされた細胞外ヒトＡＬＫ４ポリペプチド配列を次に示す：
【化１７】
2019521144.tif 000018
【０１３１】
ＡＬＫ４前駆体タンパク質をコードする核酸配列を下記に示し（配列番号１０２）、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４３０２．４のヌクレオチド７８〜１５９２に対応する。シグナル配列に下線を引き、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
【化１８】
2019521144.tif 000019
【化１９】
2019521144.tif 000020
【０１３２】
細胞外ＡＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸配列を次に示す：
【化２０】
2019521144.tif 000021
【０１３３】
ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列の選択的アイソフォームであるアイソフォームＣ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿０６４７３２．３）を次に示す：
【化２１】
2019521144.tif 000022
【化２２】
2019521144.tif 000023
【０１３４】
細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
【０１３５】
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド配列は以下の通りである：
【化２３】
2019521144.tif 000024
【０１３６】
Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＭ＿０２０３２７．３のヌクレオチド１８６〜１５４７に対応する、ＡＬＫ４前駆体タンパク質（アイソフォームＢ）をコードする核酸配列を以下に示す（配列番号１０６）。細胞外ドメインをコードするヌクレオチドを太字フォントで指し示す。
【化２４】
2019521144.tif 000025
【０１３７】
細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド（アイソフォームＢ）をコードする核酸配列は以下の通りである：
【化２５】
2019521144.tif 000026
【０１３８】
ＡＬＫ４は、脊椎動物の間で十分に保存されており、細胞外ドメインの大きな区間（ｓｔｒｅｔｃｈ）が完全に保存されている。例えば、図１８は、種々のＡＬＫ４オルソログと比較した、ヒトＡＬＫ４細胞外ドメインの多重配列アラインメントを描写する。ＡＬＫ４に結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントから、正常なＡＬＫ４リガンド結合活性に重要な、リガンド結合性ドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測すると共に、正常なＡＬＫ４リガンド結合活性を有意に変更することのない、置換に寛容である可能性があるアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、現在開示されている方法に従って有用な活性ヒトＡＬＫ４改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物ＡＬＫ４の配列由来の対応する位置に１つもしくは複数のアミノ酸を含み得る、またはヒトもしくは他の脊椎動物配列における残基と同様の残基を含み得る。
【０１３９】
限定を意味するものではないが、次の例は、活性ＡＬＫ４改変体を定義するこのアプローチを例証する。図１８に例証するように、ヒトＡＬＫ４細胞外ドメイン（配列番号１２６）におけるＶ６は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＡＬＫ４（配列番号１３０）ではイソロイシンであり、そのため位置を変更してもよく、任意選択でＬ、ＩもしくはＦなどの別の疎水性残基に変更してもよく、またはＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＡＬＫ４（配列番号１２９）に観察されるようにＡなどの非極性残基に変更してもよい。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ４０は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＡＬＫ４ではＫであり、この部位は、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙなどの極性残基、およびおそらくＡなどの非極性残基を含む多種多様な変化に寛容となり得ることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＳ１５は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＡＬＫ４ではＤであり、この位置では幅広い構造変化種が許容され、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ｇ、およびＹなどの極性残基が好まれることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ４０は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＡＬＫ４ではＫであり、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、ならびにＱおよびＮを含む荷電残基がこの位置に許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＲ８０は、Ｃｏｎｄｙｌｕｒａ  ｃｒｉｓｔａｔａ  ＡＬＫ４（配列番号１２７）ではＫであり、Ｒ、Ｋ、およびＨを含む塩基性残基がこの位置に許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＹ７７は、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ＡＬＫ４（配列番号１３１）ではＦであり、Ｆ、Ｗ、およびＹを含む芳香族残基がこの位置に許容されることを指し示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＰ９３は、相対的に十分には保存されておらず、Ｅｒｉｎａｃｅｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  ＡＬＫ４（配列番号１２８）ではＳおよびＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ＡＬＫ４ではＮとして出現することから、この位置では基本的にいかなるアミノ酸も許容される筈である。
【０１４０】
その上、ＡＬＫ４タンパク質は、構造および機能的な特徴の観点から、特にリガンド結合に関して当該分野で特徴付けられている［例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎら（２００３年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７８巻（２３号）：２１１２９〜２１１３５頁；Ｒｏｍａｎｏら（２０１２年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｏｄｅｌ、１８巻（８号）：３６１７〜３６２５頁；およびＣａｌｖａｎｅｓｅら（２００９年）１５巻（３号）：１７５〜１８３頁］。本明細書における教示に加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡＬＫ４改変体を生成する仕方についてのガイダンスを十分に提供する。
【０１４１】
例えば、３−フィンガートキシンフォールドとして公知の明確な構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体の受容体の細胞外ドメイン内の変動的な位置に位置する保存されたシステイン残基によって形成される［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ、６巻：１８〜２２頁；およびＨｉｎｃｋ（２０１２年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。したがって、これらの保存されたシステインの最外部によって境界を画定されるヒトＡＬＫ４のコアリガンド結合性ドメインは、配列番号１００（ＡＬＫ４前駆体）の３４〜１０１位に対応する。これらのシステインにより境界を画定されたコア配列に隣接する構造的により秩序的でないアミノ酸は、必ずしもリガンド結合を変更することなく、Ｎ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３残基、および／またはＣ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５残基、切断することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端切断型のための例示的なＡＬＫ４細胞外ドメインは、配列番号１０１および１０５を含む。
【０１４２】
したがって、ＡＬＫ４の活性部分（例えば、リガンド結合性部分）に関する一般式は、配列番号１００に関してアミノ酸３４〜１０１を含む。したがって、ＡＬＫ４ポリペプチドは、例えば、配列番号１００のアミノ酸２４〜３４のうちのいずれか１つに対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のうちのいずれか１つから始まり）、配列番号１００のアミノ酸１０１〜１２６のうちのいずれか１つに対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６のうちのいずれか１つで終わる）ＡＬＫ４の部分に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得るか、これから本質的になり得るか、またはこれからなり得る。他の例として、配列番号１００の２４〜３４（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４位のうちのいずれか１つ）、２５〜３４（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４位のうちのいずれか１つ）、または２６〜３４（例えば、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４位のうちのいずれか１つ）位から始まり、配列番号１００の１０１〜１２６（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６位のうちのいずれか１つ）、１０２〜１２６（例えば、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６位のうちのいずれか１つ）、１０１〜１２５（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、または１２５位のうちのいずれか１つ）、１０１〜１２４（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４位のうちのいずれか１つ）、１０１〜１２１（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、または１２１位のうちのいずれか１つ）、１１１〜１２６（例えば、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６位のうちのいずれか１つ）、１１１〜１２５（例えば、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、または１２５位のうちのいずれか１つ）、１１１〜１２４（例えば、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４位のうちのいずれか１つ）、１２１〜１２６（例えば、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６位のうちのいずれか１つ）、１２１〜１２５（例えば、１２１、１２２、１２３、１２４、または１２５位のうちのいずれか１つ）、１２１〜１２４（例えば、１２１、１２２、１２３、または１２４位のうちのいずれか１つ）、または１２４〜１２６（例えば、１２４、１２５、または１２６位のうちのいずれか１つ）位で終わる構築物が挙げられる。これらの範囲内の改変体、特に配列番号１００の対応する部分に対し、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有する改変体も考慮される。
【０１４３】
本明細書で記載される変種は、種々の仕方で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４改変体は、リガンド結合性ポケットにおける１、２、５、６、７、８、９、１０または１５個以下の保存的アミノ酸変化を含む。可変性が特に十分に許容され得る結合性ポケットの外側の部位は、細胞外ドメイン（上に記す通り）のアミノおよびカルボキシ末端を含む。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本開示は、そのフラグメント、機能的改変体、および修飾形態を含む、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体であるＢＭＰ／ＧＤＦアンタゴニストならびにその使用（例えば、ＰＡＨまたはＰＡＨの１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減すること）に関する。好ましくは、ＡＬＫ４ポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡＬＫ４の細胞外ドメイン）である。一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）。一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、配列番号１００のアミノ酸３４〜１０１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、配列番号１００、１０１、１０４、１０５、１１１、１１３、１１６、１１７、１２２、および１２４のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、配列番号１００、１０１、１０４、１０５、１１１、１１３、１１６、１１７、１２２、および１２４のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドからなるか、またはこれから本質的になる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。
【０１４５】
ある特定の態様では、本開示は、その使用（例えば、それを必要とする患者における免疫応答を増加させること、およびがんを処置すること）を含む、１つまたは複数のＡＬＫ４受容体ポリペプチド（例えば、配列番号１００、１０１、１０４、１０５、１１１、１１３、１１６、１１７、１２２、および１２４ならびにそれらの改変体）、および１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチド（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７３、７７、７８、１０８、１１０、１１４、１１５、１１８、および１２０ならびにそれらの改変体）を含むヘテロ多量体の複合体に関し、これらは一般的に本明細書において「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の複合体」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体」と呼ばれる。好ましくは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は可溶性である［例えば、ヘテロ多量体の複合体は、ＡＬＫ４受容体の可溶性部分（ドメイン）およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の可溶性部分（ドメイン）を含む］。一般的に、ＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインは、これらの受容体の可溶性部分に対応する。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡＬＫ４受容体の細胞外ドメインおよびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］を阻害する（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１００、１０１、１０４、１０５、１１１、１１３、１１６、１１７、１２２、および１２４のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体は、配列番号１００のアミノ酸２４〜３４、２５〜３４、または２６〜３４のうちのいずれか１つに対応する残基から始まり、配列番号１００の１０１〜１２６、１０２〜１２６、１０１〜１２５、１０１〜１２４、１０１〜１２１、１１１〜１２６、１１１〜１２５、１１１〜１２４、１２１〜１２６、１２１〜１２５、１２１〜１２４、または１２４〜１２６位で終わるＡＬＫ４の部分に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、��９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、これから本質的になるか、これからなる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１００のアミノ酸３４〜１０１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、これから本質的になるか、これからなる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４−ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７３、７７、７８、１０８、１１０、１１４、１１５、１１８、および１２０のうちのいずれか一配列のアミノ酸配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、これから本質的になるか、これからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の複合体は、配列番号１のアミノ酸２０〜２９、２０〜２４、２１〜２４、２２〜２５、または２１〜２９のうちのいずれか１つに対応する残基から始まり、配列番号１の１０９〜１３４、１１９〜１３４、１１９〜１３３、１２９〜１３４、または１２９〜１３３位で終わるＡｃｔＲＩＩＢの部分に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、これから本質的になるか、これからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、これから本質的になるか、これからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、これから本質的になるか、これからなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の複合体は、配列番号１のＬ７９に対応する位置が酸性アミノ酸ではない（すなわち、天然に存在するＤもしくはＥアミノ酸残基、または人工の酸性アミノ酸残基ではない）少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。本開示のＡＬＫ４：��ｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、およびさらに高次のオリゴマー構造を含む。例えば図２１〜２３を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体の複合体は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である。
【０１４６】
一部の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性（例えば、貯蔵寿命およびインビボにおけるタンパク質分解に対する抵抗性）の増強などの目的のために、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドの構造を修飾することによる機能的改変体の作製を考慮する。改変体は、アミノ酸置換、欠失、付加またはこれらの組み合わせによって産生することができる。例えば、イソロイシンもしくはバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるスレオニンの単離された置き換え、または構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置き換え（例えば、保存的変異）が、その結果得られる分子の生物学的活性に重大な影響を有さないと予想することは妥当である。保存的置き換えは、その側鎖が関係するアミノ酸ファミリー内で行われる置き換えである。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化が、機能的ホモログをもたらすか否かは、改変体ポリペプチドが、野生型ポリペプチドと同様の様式で細胞における応答を生じる能力、または例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳおよびレフティーを含む１つまたは複数のＴＧＦ−ベータリガンドに結合する能力を評価することにより容易に決定することができる。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更することができるような、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドの特異的な変異を考慮する。このような変異は、Ｏ結合型またはＮ結合型グリコシル化部位など、１つまたは複数のグリコシル化部位を導入または排除することができるように選択され得る。アスパラギン結合型グリコシル化認識部位は一般に、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（配列中、「Ｘ」は、任意のアミノ酸である）を含む。変更は、ポリペプチドの配列への１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加またはこれによる置換によって作製することもできる（Ｏ結合型グリコシル化部位のため）。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸欠失）は、修飾されたトリペプチド配列における非グリコシル化をもたらす。ポリペプチドにおける炭水化物部分の数を増大する別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素によるカップリングによる。使用したカップリング様式に応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）システイン中など、遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリン中など、遊離ヒドロキシル基；（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファン中など、芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に取り付けることができる。ポリペプチドに存在する１つまたは複数の炭水化物部分の除去は、化学的におよび／または酵素により達成することができる。化学的脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのポリペプチドの曝露が関与し得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトにしたままで、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分のまたは全ての糖の切断をもたらす。ポリペプチドにおける炭水化物部分の酵素による切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら［Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７年）１３８巻：３５０頁］によって記載されている種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。哺乳動物、酵母、昆虫および植物細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入することができるため、ポリペプチドの配列は、必要に応じて、使用した発現系の種類に応じて調整することができる。一般に、ヒトにおける使用のための本開示のポリペプチドは、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞株など、適切なグリコシル化をもたらす哺乳動物細胞株において発現させることができるが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に、有用であると予想される。
【０１４８】
本開示は、変異体、特にＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドのコンビナトリアル変異体のセットならびに切断型変異体を生成する方法をさらに考慮する。コンビナトリアル変異体のプールは、機能的に活性な（例えば、ＧＤＦ／ＢＭＰリガンド結合）ＡｃｔＲＩＩ配列を同定するのに特に有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、変更された薬物動態または変更されたリガンド結合などの変更された特性を有するポリペプチド改変体を生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイを以下に示し、このようなアッセイを使用して改変体を評価してもよい。例えば、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４改変体、ならびにそれらを含むヘテロ多量体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）に結合する能力、ＡｃｔＲＩＩおよび／もしくはＡＬＫ４ポリペプチドならびにそのヘテロ多量体へのＧＤＦ／ＢＭＰリガンドの結合を防止する能力、ならびに／またはＧＤＦ／ＢＭＰリガンドに起因するシグナル伝達に干渉する能力に関してスクリーニングすることができる。
【０１４９】
ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の活性は、細胞ベースのまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて検査することもできる。例えば、ＰＨの発病に関係する遺伝子の発現におけるＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の効果を評価する。これは必要に応じて、１つまたは複数の組換えリガンドタンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）の存在下で実施してもよく、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体、および任意選択でＧＤＦ／ＢＭＰリガンドを産生するように細胞にトランスフェクトしてもよい。同様に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体を、マウスまたは他の動物に投与してもよく、ＰＨ発病における効果を、当該分野で認識された方法を使用して評価してもよい。同様に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、もしくはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体またはその改変体の活性を、血球前駆細胞において、これらの細胞の成長における任意の効果に関して、例えば、本明細書で記載されるアッセイおよび当該分野で周知のアッセイによって検査してもよい。ＳＭＡＤ応答性レポーター遺伝子をこのような細胞株において使用して、下流のシグナル伝達における効果をモニターすることができる。
【０１５０】
参照ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体と比べて増加した選択性または全般的に増加した効力を有する、コンビナトリアル由来改変体を生成することができる。このような改変体は、組換えＤＮＡ構築物から発現される場合、遺伝子療法プロトコールにおいて使用することができる。同様に、変異誘発は、対応する無修飾ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体とは劇的に異なる細胞内半減期を有する改変体を生じることができる。例えば、変更されたタンパク質は、無修飾ポリペプチドのタンパク質分解、または破壊もしくはさもなければ不活性化をもたらす他の細胞過程に対してより安定またはより不安定のいずれかにすることができる。このような改変体およびこれをコードする遺伝子を利用して、ポリペプチドの半減期をモジュレートすることにより、ポリペプチド複合体レベルを変更することができる。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的効果を生じることができ、誘導性発現系の一部の場合、細胞内の組換えポリペプチド複合体レベルのより緊密な制御を可能にすることができる。Ｆｃ融合タンパク質において、変異をリンカー（あるとすれば）および／またはＦｃ部分において生じさせて、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の半減期を変更することができる。
【０１５１】
コンビナトリアルライブラリーは、それぞれ潜在的ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体配列の少なくとも部分を含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーとして産生することができる。例えば、潜在的ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４をコードするヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、または代替的により大型の融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイ用）発現可能となるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、遺伝子配列へと酵素によりライゲーションすることができる。
【０１５２】
縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的ホモログのライブラリーを生成することができる、多くの仕方が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で行うことができ、続いて合成遺伝子は、発現のための適切なベクターへとライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で周知である。［Ｎａｒａｎｇ、ＳＡ（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９巻：３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１年）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．  ３ｒｄ  ＣｌｅｖｅｌおよびＳｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２７３〜２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３巻：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８巻：１０５６頁ならびにＩｋｅら（１９８３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１巻：４７７頁］。このような技法は、他のタンパク質の定向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）において用いられてきた。［Ｓｃｏｔｔら（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：３８６〜３９０頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９巻：２４２９〜２４３３頁；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：４０４〜４０６頁；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７巻：６３７８〜６３８２頁；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号］。
【０１５３】
代替的に、他の形態の変異誘発を利用して、コンビナトリアルライブラリーを生成することができる。例えば、アラニンスキャニング変異誘発［Ｒｕｆら（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３巻：１５６５〜１５７２頁；Ｗａｎｇら（１９９４年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６９巻：３０９５〜３０９９頁；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３年）Ｇｅｎｅ  １３７巻：１０９〜１１８頁；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８巻：５９７〜６０１頁；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６８巻：２８８８〜２８９２頁；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０巻：１０８３２〜１０８３８頁；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４巻：１０８１〜１０８５頁］、リンカースキャニング変異誘発［Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３巻：６５３〜６６０頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９２年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２巻：２６４４〜２６５２頁；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２巻：３１６頁］、飽和変異誘発［Ｍｅｙｅｒｓら（１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２巻：６１３頁］；ＰＣＲ変異誘発［Ｌｅｕｎｇら（１９８９年）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １巻：１１〜１９頁］；または化学的変異誘発を含むランダム変異誘発［Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２年）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４年）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７巻：３２〜３４頁］を使用してスクリーニングすることにより、例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の複合体を生成し、ライブラリーから単離され得る。特にコンビナトリアル設定におけるリンカースキャニング変異誘発が、切断（生物活性）型のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドまたはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体を同定するための魅力的な方法である。
【０１５４】
点変異および切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、また、付け加えて言えば、ある特定の特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範囲の技法が当技術分野で公知である。このような技法は一般に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応可能であろう。大型の遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用されている技法は典型的に、複製可能な（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ）発現ベクターへと遺伝子ライブラリーをクローニングするステップと、その結果得られるベクターライブラリーにより適切な細胞を形質転換するステップと、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの相対的に容易な単離を容易にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させるステップとを含む。好ましいアッセイは、リガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳおよびレフティー）結合アッセイおよび／またはリガンド媒介性細胞シグナル伝達アッセイを含む。
【０１５５】
当業者によって認識されるように、本明細書で記載される、記載される変異、改変体、または修飾のほとんどは、核酸レベルで、または一部の場合では翻訳後修飾もしくは化学合成によって作製され得る。このような技術は、当該分野で周知であり、そのいくつかを本明細書で記載する。一部には、本開示は、本明細書で記載される本発明の範囲内で他の改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを生成および使用するためのガイダンスとして使用することができるＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の機能的活性部分（フラグメント）および改変体を同定する。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の機能的活性フラグメントは、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸の対応するフラグメントから組換えにより産生されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。加えて、フラグメントは、通常のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学などの当該分野で公知の技術を使用して化学合成することができる。フラグメントを産生（組換えによってまたは化学合成によって）し、試験して、ＡｃｔＲＩＩおよび／もしくはＡＬＫ４受容体ならびに／または１つもしくは複数のリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティー）のアンタゴニスト（阻害剤）として機能することができるそれらのペプチジルフラグメントを同定することができる。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体において天然に存在する任意の翻訳後修飾に加えて、翻訳後修飾をさらに含み得る。このような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類または単糖類、およびホスフェートなどの非アミノ酸要素を含有し得る。このような非アミノ酸要素の、リガンドトラップポリペプチドの機能性に対する影響は、他のＡｃｔＲＩＩ、ＡＫＬ４、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ改変体について本明細書で記載されるように試験することができる。本開示のポリペプチドが、ポリペプチドの新生型を切断することによって細胞内で生成される場合、翻訳後プロセシングも、タンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能にとって重要となり得る。様々な細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）が、このような翻訳後の活性のための特定の細胞機構（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的な機構（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を有し、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを保証するように選択され得る。
【０１５８】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよびＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩまたはＡＬＫ４ポリペプチドの少なくとも一部（ドメイン）および１つまたは複数の異種部分（ドメイン）を有する融合タンパク質を含む。このような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望の特性を付与するように選択され得る。例えば、一部の融合ドメインは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離にとって特に有用である。アフィニティー精製の目的に関して、グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケルまたはコバルトがコンジュゲートされた樹脂などの、アフィニティークロマトグラフィーのための関連するマトリクスが使用される。このようなマトリクスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよび（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）のような、「キット」の形態で利用可能である。別の例としては、融合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩまたはＡＬＫ４ポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。このような検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに特定の抗体に利用可能な、通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特定のモノクローナル抗体に容易に利用可能な周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連のプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を解放させることを可能にする、第Ｘａ因子またはトロンビンのためのもののようなプロテアーゼ切断部位を有する。解放されたタンパク質は、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって融合ドメインから単離することができる。選択され得る他のタイプの融合ドメインは、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメイン、および例えば免疫グロブリンからの定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）を含む機能的ドメイン（追加の生物学的機能を付与する）を含む。
【０１５９】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよびＡＬＫ４ポリペプチドは、ポリペプチドを「安定化する」ことができる１つまたは複数の修飾を含有する。「安定化する」とは、これが、薬剤の破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態効果によるものであるか否かによらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期、血清半減期を増加させるいかなるものも意味する。例えば、このような修飾は、ポリペプチドの貯蔵寿命を増強する、ポリペプチドの循環半減期を増強する、および／またはポリペプチドのタンパク質分解を低減する。このような安定化修飾として、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（またはＡＬＫ４ポリペプチド）ドメインおよびスタビライザードメインを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の修飾（例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む）、および炭水化物部分の修飾（例えば、本開示のポリペプチドからの炭水化物部分の除去を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で使用される用語「スタビライザードメイン」は、融合タンパク質の場合と同様の融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を指すだけではなく、炭水化物部分などの非タンパク質性修飾またはポリエチレングリコールなどの非タンパク質性部分も含む。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（またはＡＬＫ４ポリペプチド）を、ポリペプチドを安定化させる異種ドメイン（「スタビライザー」ドメイン）、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏでのポリペプチドの安定性を増加させる異種ドメインと融合させる。免疫グロブリンの定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）との融合は、広範囲のタンパク質に対して望ましい薬物動態特性を付与することが知られている。同様に、ヒト血清アルブミンとの融合も望ましい特性を付与することができる。
【０１６０】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号１４）。点線の下線はヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、天然に存在する改変体を有する位置を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号１４に対し、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃの天然に存在する改変体は、配列番号１４に使用した番号付けシステムに従って、Ｅ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含むであろう（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７を参照されたい）。
【化２６】
2019521144.tif 000027
【０１６１】
任意選択で、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リシン３２２、およびＡｓｎ−４３４などの残基で１つまたは複数の変異を有する。ある特定の場合、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異体ＩｇＧ１Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べてＦｃγ受容体への低減した結合能力を有する。他の場合において、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比べてＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）への増大した結合能力を有する。
【０１６２】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を、以下に示す（配列番号１５）。点線の下線はヒンジ領域を指し示し、二重の下線は、配列においてデータベースの矛盾が存在する位置を指し示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従って）。部分的に、本開示は、配列番号１５に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるポリペプチドを提供する。
【化２７】
2019521144.tif 000028
【化２８】
2019521144.tif 000029
【０１６３】
ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）に使用することができるアミノ酸配列の２つの例を、下記に示す。Ｇ３Ｆｃにおけるヒンジ領域は、他のＦｃ鎖におけるヒンジ領域の最大４倍の長さとなることができ、同様の１７残基セグメントに先行される３つの同一１５残基セグメントを含有する。下記に示される第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号１６）は、単一の１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含有する一方、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号１７）は、全長のヒンジ領域を含有する。いずれの場合でも、点線の下線はヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従う天然に存在する改変体を有する位置を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号１６および１７に対し、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるポリペプチドを提供する。
【化２９】
2019521144.tif 000030
【０１６４】
Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在する改変体（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８６０を参照）は、配列番号１６で使用する番号付けシステムに変換した場合に、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらの変種のうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長を特徴とする構造的多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９を参照］。特に、改変体ＷＩＳは、Ｖ領域の大部分およびＣＨ１領域の全てを欠いている。これは、ヒンジ領域に通常存在する１１位に加えて７位に余分な鎖間ジスルフィド結合を有する。改変体ＺＵＣは、Ｖ領域の大部分、ＣＨ１領域の全て、およびヒンジの一部を欠く。改変体ＯＭＭは、対立遺伝子型または別のガンマ鎖サブクラスを表すことができる。本開示は、これらの改変体のうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む追加的な融合タンパク質を提供する。
【０１６５】
ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）に使用することができる天然のアミノ酸配列の例を下記に示す（配列番号１８）。点線の下線はヒンジ領域を指し示す。部分的に、本開示は、配列番号１８に対し、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるポリペプチドを提供する。
【化３０】
2019521144.tif 000031
【０１６６】
Ｆｃドメインにおける種々の操作された変異が、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号１４）に関して本明細書に提示されており、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３Ｆｃ、およびＧ４Ｆｃにおける類似の変異は、図４におけるＧ１Ｆｃとそれらとのアラインメントに由来することができる。不等なヒンジ長のため、アイソタイプアラインメント（図４）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号１４、１５、１６、１７、および１８において異なるアミノ酸数を保持する。番号付けが、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースと同様にＩｇＧ１重鎖定常ドメイン全体（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）を包含する場合、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる免疫グロブリン配列（例えば、配列番号１４、１５、１６、１７、および１８）における所定のアミノ酸位置が、同じ位置とは異なる番号によって同定されるであろうと認めることもできる。例えば、ヒトＧ１Ｆｃ配列（配列番号１４）、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７）およびヒトＩｇＧ１重鎖における選択されたＣＨ３位置の間の対応を次に示す。
【表１】
2019521144.tif 000032
【０１６７】
ある特定の態様では、本明細書で開示されるポリペプチドは、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに共有結合または非共有結合により会合した少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含むタンパク質複合体を形成することができる。好ましくは、本明細書で開示されるポリペプチドは、ヘテロ二量体複合体を形成するが、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、およびさらなるオリゴマー構造（例えば、図２１〜２３を参照されたい）などが挙げられるがこれらに限定されない、より高次のヘテロ多量体の複合体（ヘテロ多量体）も含まれる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つの多量体化ドメインを含む。本明細書に開示される通り、用語「多量体化ドメイン」は、少なくとも第１のポリペプチドおよび少なくとも第２のポリペプチドの間の共有または非共有相互作用を促進するアミノ酸またはアミノ酸の配列を指す。本明細書で開示されるポリペプチドは、多量体化ドメインに共有結合または非共有結合により接続することができる。好ましくは、多量体化ドメインは、第１のポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチド）および第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の間の相互作用を促進して、ヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進し、任意選択で、ホモ多量体化（例えば、ホモ二量体形成）を妨害するまたは他の仕方で不利にし、これにより、所望のヘテロ多量体（例えば、図２２を参照されたい）の収量を増大する。
【０１６８】
当該分野で公知の多くの方法を使用して、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を生成することができる。例えば、第１と第２のポリペプチドの間でジスルフィド結合が形成されるように、第１のポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチド）において、遊離チオールが第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）における別の遊離チオール含有残基と相互作用するように、システインなどの遊離チオール含有残基により天然に存在するアミノ酸を置き換えることによって、天然に存在しないジスルフィド結合を構築することができる。ヘテロ多量体形成を促進するための相互作用の追加的な例としては、Ｋｊａｅｒｇａａｒｄら、ＷＯ２００７１４７９０１に記載されているようなイオン性相互作用；Ｋａｎｎａｎら、Ｕ．Ｓ．８，５９２，５６２に記載されているような静電ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｕ．Ｓ．２０１２０３０２７３７に記載されているようなコイルドコイル相互作用；ＰａｃｋおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（１９９２年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１巻：１５７９〜１５８４頁に記載されているようなロイシンジッパー；およびＰａｃｋら（１９９３年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１巻：１２７１〜１２７７頁に記載されているようなヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、化学的架橋、ペプチドリンカー、ジスルフィド架橋などによる共有結合により、またはアビジン−ビオチンもしくはロイシンジッパー技術などによるアフィニティー相互作用により、様々なセグメントの連結を得ることができる。
【０１６９】
ある特定の態様では、多量体化ドメインは、相互作用ペアの一方の構成要素を含み得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチドは、第２のポリペプチドと共有結合または非共有結合により会合した第１のポリペプチドを含むタンパク質複合体を形成することができ、第１のポリペプチドは、ＡＬＫ４ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第１のメンバーのアミノ酸配列を含み；第２のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用ペアの第２のメンバーのアミノ酸配列を含む。相互作用ペアは、相互作用して複合体、特に、ヘテロ二量体の複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列の場合もあるが、実効性のある実施形態は、ホモ二量体の複合体を形成することができる相互作用ペアを用いることもできる。相互作用ペアの一方のメンバーを、例えば、配列番号２、３、５、６、１０１、および１０３のうちのいずれか１つの配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるポリペプチド配列を含む、本明細書で記載されるＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに融合してもよい。相互作用ペアは、増大された血清半減期などの改善された特性／活性を付与するように、または改善された特性／活性をもたらす別の部分が取り付けられるアダプターとして作用するように選択され得る。例えば、ポリエチレングリコール部分を相互作用ペアの１つまたは両方の構成要素に取り付けて、改善された血清半減期などの改善された特性／活性をもたらすことができる。
【０１７０】
相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、非対称ペアとなることができ、これは、ペアのメンバーが、自己会合するのではなく、互いに優先的に会合することを意味する。したがって、非対称相互作用ペアの第１および第２のメンバーは会合して、ヘテロ二量体の複合体を形成することができる（例えば、図２２を参照されたい）。代替的に、相互作用ペアは、ガイドされなくてよく、これは、ペアのメンバーが、実質的な優先度なしで、互いと会合しても自己会合してもよく、よって、同じまたは異なるアミノ酸配列を有することができることを意味する。したがって、ガイドされない相互作用ペアの第１および第２のメンバーは、会合して、ホモ二量体の複合体またはヘテロ二量体の複合体を形成することができる。任意選択で、相互作用ペア（例えば、非対称ペアまたはガイドされない相互作用ペア）の第１のメンバーは、相互作用ペアの第２のメンバーと共有結合により会合する。任意選択で、相互作用ペア（例えば、非対称ペアまたはガイドされない相互作用ペア）の第１のメンバーは、相互作用ペアの第２のメンバーと非共有結合により会合する。任意選択で、相互作用ペア（例えば、非対称ペアまたはガイドされない相互作用ペア）の第１のメンバーは、相互作用ペアの第２のメンバーと非共有結合により会合する。
【０１７１】
具体例として、本開示は、ヘテロ多量体形成を促進するように修飾されているヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４に由来するＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインなどの、免疫グロブリンの定常ドメインを含むポリペプチドに融合したＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢを含む融合タンパク質を提供する。単一細胞株からの非対称の免疫グロブリンに基づくタンパク質の大規模産生において生じる問題は、「鎖会合課題」として公知である。二重特異性抗体の産生において顕著に直面するように、鎖会合課題は、単一細胞株において異なる重鎖および／または軽鎖が産生される場合に、固有に生じる複数の組合せの中から所望の多重鎖タンパク質を効率的に産生するという難題に関係する［Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ、４巻：６５３〜６６３頁］。この問題は、同じ細胞内で２種の異なる重鎖および２種の異なる軽鎖が産生される場合に最も喫緊となり、この場合、１種のみが典型的に望まれるときに、総計１６通りの可能な鎖組合せ（これらのいくつかは同一であるが）が存在する。にもかかわらず、同じ原理が、２種の異なる（非対称）重鎖のみを取り込む所望の多重鎖融合タンパク質の収量縮小の原因である。
【０１７２】
単一細胞株においてＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の所望のペア形成を増加させて、許容される収量で好ましい非対称融合タンパク質を産生する種々の方法が、当該分野で公知である［Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ、４巻：６５３〜６６３頁；およびＳｐｉｅｓｓら（２０１５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６７巻（２Ａ号）：９５〜１０６頁］。Ｆｃ含有鎖の所望のペア形成を得るための方法として、電荷に基づくペア形成（静電ステアリング）、「ノブ・ホール型（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」立体ペア形成、ＳＥＥＤｂｏｄｙペア形成、およびロイシンジッパーベースのペア形成が挙げられるがこれらに限定されない。［Ｒｉｄｇｗａｙら（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、９巻：６１７〜６２１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（１９９８年）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６巻：６７７〜６８１頁；Ｄａｖｉｓら（２０１０年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ、２３巻：１９５〜２０２頁；Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（２０１０年）；２８５巻：１９６３７〜１９６４６頁；Ｗｒａｎｉｋら（２０１２年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８７巻：４３３３１〜４３３３９頁；ＵＳ５９３２４４８；ＷＯ１９９３／０１１１６２；ＷＯ２００９／０８９００４およびＷＯ２０１１／０３４６０５］。本明細書で記載される通り、これらの方法を使用して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ多量体の複合体を生成することができる。例えば、図２３を参照されたい。
【０１７３】
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体およびこのようなヘテロ多量体を作製する方法は、既に開示されている。例えば、その教示全体を参照により本明細書に組み込む、ＷＯ２０１６／１６４４９７を参照されたい。
【０１７４】
所望の機能性と一貫したいずれかの様式で、融合タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質）の異なるエレメントを配置することができることが理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（またはＡＬＫ４ポリペプチド）ドメインは、異種ドメインに対してＣ末端に置くことができる、あるいは代替的に、異種ドメインは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（またはＡＬＫ４ポリペプチド）ドメインに対してＣ末端に置くことができる。ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（またはＡＬＫ４ポリペプチド）ドメインおよび異種ドメインは、融合タンパク質において隣接している必要はなく、追加的なドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインに対してＣもしくはＮ末端に、またはドメイン間に含まれていてよい。
【０１７５】
例えば、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）受容体融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに示されているアミノ酸配列を含み得る。Ｂ部分は、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）ポリペプチドドメインに対応する。ＡおよびＣ部分は独立して、ゼロ、１つ、または２つ以上のアミノ酸となることができ、ＡおよびＣ部分の両方は、存在する場合、Ｂに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に取り付けることができる。リンカーは、グリシン（例えば、２〜１０、２〜５、２〜４、２〜３個のグリシン残基）またはグリシンおよびプロリン残基に富むことができ、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの単一配列、またはスレオニン／セリンおよび／もしくはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号１９）、ＧＧＧＧ（配列番号２０）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２１）、ＳＧＧＧＧ（配列番号２２）、ＴＧＧＧ（配列番号２３）、ＳＧＧＧ（配列番号２４）、またはＧＧＧＧＳ（配列番号２５）単体（ｓｉｎｇｌｅｔ）または反復を含有することができる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに示されているアミノ酸配列を含み、式中、Ａは、リーダー（シグナル）配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）ポリペプチドドメインからなり、Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、取込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製のうちの１つまたは複数を増強するポリペプチド部分である。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに示されているアミノ酸配列を含み、式中、Ａは、ＴＰＡリーダー配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４）受容体ポリペプチドドメインからなり、Ｃは、免疫グロブリンＦｃドメインである。好ましい融合タンパク質は、配列番号３２、３６、３９、４０、４２、４５、４６、４８、６９、７４、７７、７８、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、１２２、および１２４のうちいずれか一配列に示されているアミノ酸配列を含む。
【０１７６】
好ましい実施形態では、本明細書で記載される方法に従って使用されるＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、単離されたポリペプチドである。本明細書で使用される、単離されたタンパク質またはポリペプチドは、その天然の環境の構成要素から分離されたものである。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える純度まで精製される。純度の評価方法は、当該分野で周知である［例えば、Ｆｌａｔｍａｎら（２００７年）Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ、８４８巻：７９〜８７頁を参照されたい］。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法に従って使用されるべきＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、組換えポリペプチドである。
【０１７７】
本開示のＴＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、種々の当技術分野で公知の技法によって産生することができる。例えば、本開示のポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３年）およびＧｒａｎｔ  Ｇ．  Ａ．（編）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２年）に記載されている技法など、標準タンパク質化学技法を使用して合成することができる。加えて、自動ペプチド合成機が市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；  Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００を参照されたい）。代替的に、それらのフラグメントまたは改変体を含む、本開示のポリペプチドは、当技術分野で周知の通り、様々な発現系［例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス］を使用した組換えにより産生することができる。さらなる実施形態では、本開示の修飾または無修飾ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシンまたはペア形成した塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）を使用することによる、組換えによって産生された全長ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの消化によって産生することができる。コンピュータ解析（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用）を使用して、タンパク分解性切断部位を同定することができる。あるいは、このようなポリペプチドは、化学的切断（例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン等）を使用して、組換えにより生成された全長のＡｃｔＲＩＩまたはＡＬＫ４ポリペプチドから産生してもよい。
【０１７８】
３．ＡｃｔＲＩＩおよびＡＬＫ４ポリペプチドならびにそれらの改変体をコードする核酸
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチド（そのフラグメント、機能的改変体、および融合タンパク質を含む）をコードする単離核酸および／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号７は、天然に存在するヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチド（上述のＲ６４改変体）をコードする一方、配列番号８は、ＡｃｔＲＩＩＢ（上述のＲ６４改変体）のプロセシングされた細胞外ドメインをコードする。対象核酸は、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。これらの核酸は、ＤＮＡ分子でもよく、またはＲＮＡ分子でもよい。これらの核酸は、例えば、本明細書で記載されるＡｃｔＲＩＩに基づくリガンドトラップポリペプチドを作製するための方法で使用することができる。
【０１７９】
本明細書で使用される、単離された核酸（複数可）は、その天然の環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含有する細胞に含有された核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外にまたはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩまたはＡＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７、８、１２、１３、３７、４３、４９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、８０、８１、８２、８３、８４、１０２、１０３、１０６、１０７、１０９、１１２、１１９、１２１、１２３および１３５のうちのいずれか一配列の改変体である核酸を含むと理解されている。改変体ヌクレオチド配列は、対立遺伝子改変体を含む、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失によって異なる配列を含み、したがって、配列番号７、８、１２、１３、３７、４３、４９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、８０、８１、８２、８３、８４、１０２、１０３、１０６、１０７、１０９、１１２、１１９、１２１、１２３および１３５のうちのいずれか一配列において指定されたヌクレオチド配列とは異なるコード配列を含むであろう。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩまたはＡＬＫ４ポリペプチドは、配列番号７、８、１２、１３、３７、４３、４９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、８０、８１、８２、８３、８４、１０２、１０３、１０６、１０７、１０９、１１２、１１９、１２１、１２３および１３５のうちのいずれか一配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離配列および／または組換え核酸配列によってコードされる。当業者は、配列番号７、８、１２、１３、３７、４３、４９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、８０、８１、８２、８３、８４、１０２、１０３、１０６、１０７、１０９、１１２、１１９、１２１、１２３および１３５に相補的な配列に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列およびそれらの改変体も、本開示の範囲内であることを察知するだろう。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離され得る、組換えとなり得る、および／または異種ヌクレオチド配列と融合され得る、あるいはＤＮＡライブラリー中に存在し得る。
【０１８２】
他の実施形態では、本開示の核酸は、配列番号７、８、１２、１３、３７、４３、４９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、８０、８１、８２、８３、８４、１０２、１０３、１０６、１０７、１０９、１１２、１１９、１２１、１２３および１３５において指定されたヌクレオチド配列、配列番号７、８、１２、１３、３７、４３、４９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、８０、８１、８２、８３、８４、１０２、１０３、１０６、１０７、１０９、１１２、１１９、１２１、１２３および１３５の相補体配列、またはそれらのフラグメントに、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。上記で考察されている通り、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションの後に、５０℃における２．０×ＳＳＣの洗浄を行い得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方が変更されても、温度または塩濃度が一定に保たれ、他の変数が変更されてもよい。一実施形態では、本開示は、室温における６×ＳＳＣとその後の室温で２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【０１８３】
遺伝子コードにおける縮重により、配列番号７、８、１２、１３、３７、４３、４９、７０、７１、７２、７３、７５、７６、８０、８１、８２、８３、８４、１０２、１０３、１０６、１０７、１０９、１１２、１１９、１２１、１２３および１３５に示される核酸と異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が１より多いトリプレットによって示される。同じアミノ酸を特定するコドンまたは同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに対する同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じ得る。しかしながら、哺乳動物細胞の中には、本主題のタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が存在することが予想される。当業者は、天然の対立遺伝子改変に起因して、所与の種の個体間に、特定のタンパク質をコードする核酸の１または複数のヌクレオチド（約３〜５％までのヌクレオチド）におけるこれらのバリエーションが存在し得ることを理解する。任意およびあらゆるこのようなヌクレオチドのバリエーションと、結果として生じるアミノ酸の多型とは、本開示の範囲内である。
【０１８４】
特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において１または複数の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知であり、使用できる。代表的には、上記１または複数の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモーターが、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞により変化し得る。
【０１８５】
ある特定の態様では、本明細書に開示される本主題の核酸は、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドをコードし、そして、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語、調節性配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴＲＣシステム、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子（ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮されるべきである。
【０１８６】
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方において発現させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。
【０１８７】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞において発現される１または複数の真核生物の転写単位との両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体が、真核生物細胞におけるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な組換え手順、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年）。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β−ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）が挙げられる。
【０１８８】
好ましい実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本主題のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ））。明らかであるように、本主題の遺伝子構築物は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成するため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本主題のＡｃｔＲＩＩポリペプチドポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
【０１８９】
本開示はまた、１または複数の本主題のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株］において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１９０】
したがって、本開示はさらに、対象のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドを産生する方法に関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドの発現を起こすことが可能な適切な条件下で培養され得る。ポリペプチドは、ポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。代替的に、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、細胞質に保持されるか、または収集し溶解した膜画分もしくは細胞および単離されたタンパク質中にあり得る。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当技術分野で周知である。対象のポリペプチドは、タンパク質を精製するための当技術分野で公知の技法であって、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫アフィニティー精製、ならびにＡｃｔＲＩＩポリペプチドに融合されたドメインに結合する薬剤によるアフィニティー精製（例えば、プロテインＡカラムを使用して、ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃおよび／またはＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質を精製することができる）を含む技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞またはこれらの両方から単離することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、その精製を容易とするドメインを含有する融合タンパク質である。
【０１９１】
一部の実施形態では、精製は、例えば、次のうち３種またはそれ超を任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成される：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了することができる。ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４融合タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定される＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％または＞９９％、およびＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定される＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％または＞９９％の純度まで精製することができる。純度の標的レベルは、哺乳動物の系、特に、非ヒト霊長類、齧歯類（マウス）およびヒトにおける望ましい結果の達成に十分なレベルとなるべきである。
【０１９２】
別の実施形態では、精製用リーダー配列（例えば、組換えＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドの所望の部分のＮ末端に位置するポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列）をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引き続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４ポリペプチドを提供し得る。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、（１９９１）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８巻：８９７２頁を参照のこと。
【０１９３】
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もしくは突出（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端のフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照のこと。
【０１９４】
４．抗体アンタゴニスト
ある特定の態様では、本明細書で開示される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、抗体（ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体）または抗体の組合せである。ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０および／またはＧＤＦ３）、ＡｃｔＲＩＩ受容体（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、Ｉ型受容体（ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）および／または共受容体に結合することができる。本明細書で記載される通り、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体を、単独で、または１つもしくは複数の支持療法もしくは活性薬剤と組み合わせて使用して、肺高血圧症（ＰＨ）を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減すること、特に、１つまたは複数のＰＨ関連合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することができる。
【０１９５】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともアクチビンに結合する。本明細書で使用される通り、アクチビン抗体（または抗アクチビン抗体）は、一般に、抗体が、アクチビンを標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでアクチビンに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、アクチビン抗体が無関係の非アクチビンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、アクチビンに対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、アクチビン抗体は、異なる種に由来するアクチビンの間で保存されているアクチビンのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗アクチビン抗体は、ヒトアクチビンに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンがＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害し、したがってアクチビン媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンがＡｃｔＲＩＩ共受容体に結合することを阻害し、したがってアクチビン媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。アクチビンＡは、アクチビンＢと同様の配列相同性を有するため、アクチビンＡに結合する抗体は、一部の例では、アクチビンＢに結合するおよび／またはそれを阻害する場合もあり、これは抗アクチビンＢ抗体にも当てはまることに留意されたい。一部の実施形態では、本開示は、アクチビンに結合し、さらに、例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）ならびに／または１つもしくは複数の共受容体に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、アクチビンに結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、アクチビンに結合する多重特異性抗体は、アクチビンＡに結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでアクチビンＡに結合するか、または比較的低い結���性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、アクチビン抗体、ならびに例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１５］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、および／または１つもしくは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。一部の実施形態では、アクチビン抗体を含む抗体の組合せは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、アクチビン抗体を含む抗体の組合せは、アクチビンＡ抗体を含まない。
【０１９６】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともアクチビンＢを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともアクチビンＢに結合する。本明細書で使用される通り、アクチビンＢ抗体（または抗アクチビンＢ抗体）は、一般に、抗体が、アクチビンＢを標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでアクチビンＢに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、アクチビンＢ抗体が無関係の非アクチビンＢタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、アクチビンに対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、アクチビンＢ抗体は、異なる種に由来するアクチビンＢの間で保存されているアクチビンＢのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗アクチビンＢ抗体は、ヒトアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、アクチビンＢ抗体は、アクチビンＢがＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害し、したがってアクチビンＢ媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、アクチビンＢ抗体は、アクチビンＢが共受容体に結合することを阻害し、したがってアクチビンＢ媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。アクチビンＢは、アクチビンＡと同様の配列相同性を有するため、アクチビンＢに結合する抗体は、一部の例では、アクチビンＡに結合するおよび／またはそれを阻害する場合もあることに留意されたい。一部の実施形態では、本開示は、アクチビンＢに結合し、さらに、例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）ならびに／または１つもしくは複数の共受容体に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、アクチビンＢに結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、アクチビンＢに結合する多重特異性抗体は、アクチビンＡに結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでアクチビンＡに結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、アクチビンＢ抗体、ならびに例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）および／または１つもしくは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。一部の実施形態では、アクチビンＢ抗体を含む抗体の組合せは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、アクチビンＢ抗体を含む抗体の組合せは、アクチビンＡ抗体を含まない。
【０１９７】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ８を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ８に結合する。本明細書で使用される通り、ＧＤＦ８抗体（または抗ＧＤＦ８抗体）は、一般に、抗体が、ＧＤＦ８を標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでＧＤＦ８に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ８抗体が無関係の非ＧＤＦ８タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、ＧＤＦ８に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ８抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ８の間で保存されているＧＤＦ８のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、ヒトＧＤＦ８に結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ８抗体は、ＧＤＦ８がＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害し、したがってＧＤＦ８媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＧＤＦ８抗体は、ＧＤＦ８が共受容体に結合することを阻害し、したがってＧＤＦ８媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。ＧＤＦ８は、ＧＤＦ１１と高い配列相同性を有するため、ＧＤＦ８に結合する抗体は、一部の例では、ＧＤＦ１１に結合するおよび／またはそれを阻害する場合もあることに留意されたい。一部の実施形態では、本開示は、ＧＤＦ８に結合し、さらに、例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）ならびに／または１つもしくは複数の共受容体に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＧＤＦ８に結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、ＧＤＦ８に結合する多重特異性抗体は、アクチビンＡに結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでアクチビンＡに結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、ＧＤＦ８抗体、ならびに例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、および／または１つもしくは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ８抗体を含む抗体の組合せは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、ＧＤＦ８抗体を含む抗体の組合せは、アクチビンＡ抗体を含まない。
【０１９８】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ１１に結合する。本明細書で使用される通り、ＧＤＦ１１抗体（または抗ＧＤＦ１１抗体）は、一般に、抗体が、ＧＤＦ１１を標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでＧＤＦ１１に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体が無関係の非ＧＤＦ１１タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、ＧＤＦ１１に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ１１の間で保存されているＧＤＦ１１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、ヒトＧＤＦ１１に結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体は、ＧＤＦ１１がＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合すること阻害し、したがってＧＤＦ１１媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体は、ＧＤＦ１１が共受容体に結合することを阻害し、したがってＧＤＦ１１媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。ＧＤＦ１１は、ＧＤＦ８と高い配列相同性を有するため、ＧＤＦ１１に結合する抗体は、一部の例では、ＧＤＦ８に結合するおよび／またはそれを阻害する場合もあることに留意されたい。一部の実施形態では、本開示は、ＧＤＦ１１に結合し、さらに、例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）ならびに／または１つもしくは複数の共受容体に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１に結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１に結合する多重特異性抗体は、アクチビンＡに結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでアクチビンＡに結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、ＧＤＦ１１抗体、ならびに例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）および／または１つもしくは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体を含む抗体の組合せは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体を含む抗体の組合せは、アクチビンＡ抗体を含まない。
【０１９９】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ６を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ６に結合する。本明細書で使用される通り、ＢＭＰ６抗体（または抗ＢＭＰ６抗体）は、一般に、抗体が、ＢＭＰ６を標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでＢＭＰ６に結合することができる抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６抗体が無関係の非ＢＭＰ６タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、ＢＭＰ６に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６抗体は、異なる種に由来するＢＭＰ６の間で保存されているＢＭＰ６のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、ヒトＢＭＰ６に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ６がＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合すること阻害し、したがってＢＭＰ６媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ６が共受容体に結合することを阻害し、したがってＢＭＰ６媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、本開示は、ＢＭＰ６に結合し、さらに、例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０およびＧＤＦ１１］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）ならびに／または１つもしくは複数の共受容体に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＢＭＰ６に結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、ＢＭＰ６に結合する多重特異性抗体は、アクチビンＡに結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでアクチビンＡに結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、ＢＭＰ６抗体、ならびに例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、および／または１つもしくは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体を含む抗体の組合せは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体を含む抗体の組合せは、アクチビンＡ抗体を含まない。
【０２００】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ３を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ３に結合する。本明細書で使用される通り、ＧＤＦ３抗体（または抗ＧＤＦ３抗体）は、一般に、抗体が、ＧＤＦ３を標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでＧＤＦ３に結合することができる抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ３抗体が無関係の非ＧＤＦ３タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、ＧＤＦ３に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ３抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ３の間で保存されているＧＤＦ３のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、ヒトＧＤＦ３に結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ３抗体は、ＧＤＦ３がＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害し、したがってＧＤＦ３媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＧＤＦ３抗体は、ＧＤＦ３が共受容体に結合することを阻害し、したがってＧＤＦ３媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、本開示は、ＧＤＦ３に結合し、さらに、例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０およびＧＤＦ１１］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）ならびに／または１つもしくは複数の共受容体に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＧＤＦ３に結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、ＧＤＦ３に結合する多重特異性抗体は、アクチビンＡに結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでアクチビンＡに結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、ＧＤＦ３抗体、ならびに例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、および／または１つもしくは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ３抗体を含む抗体の組合せは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、ＧＤＦ３抗体を含む抗体の組合せは、アクチビンＡ抗体を含まない。
【０２０１】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１５を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１５に結合する。本明細書で使用される通り、ＢＭＰ１５抗体（または抗ＢＭＰ１５抗体）は、一般に、抗体が、ＢＭＰ１５を標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでＢＭＰ１５に結合することができる抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１５抗体が無関係の非ＢＭＰ１５タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、ＢＭＰ１５に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１５抗体は、異なる種に由来するＢＭＰ１５の間で保存されているＢＭＰ１５のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ１５抗体は、ヒトＢＭＰ１５に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１５抗体は、ＢＭＰ１５がＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害し、したがってＢＭＰ１５媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＢＭＰ１５抗体は、ＢＭＰ１５が共受容体に結合することを阻害し、したがってＢＭＰ１５媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、本開示は、ＢＭＰ１５に結合し、さらに、例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）ならびに／または１つもしくは複数の共受容体に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１５に結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、ＢＭＰ１５に結合する多重特異性抗体は、アクチビンＡに結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでアクチビンＡに結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、ＢＭＰ１５抗体、ならびに例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０およびＧＤＦ１１］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、および／または１つもしくは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ１５抗体を含む抗体の組合せは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１５抗体を含む抗体の組合せは、アクチビンＡ抗体を含まない。
【０２０２】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１０に結合する。本明細書で使用される通り、ＢＭＰ１０抗体（または抗ＢＭＰ１０抗体）は、一般に、抗体が、ＢＭＰ１０を標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでＢＭＰ１０に結合することができる抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体が無関係の非ＢＭＰ１０タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、ＢＭＰ１０に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、異なる種に由来するＢＭＰ１０の間で保存されているＢＭＰ１０のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、ヒトＢＭＰ１０に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０がＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合すること阻害し、したがってＢＭＰ１０媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０が共受容体に結合することを阻害し、したがってＢＭＰ１０媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、本開示は、ＢＭＰ１０に結合し、さらに、例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）ならびに／または１つもしくは複数の共受容体に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０に結合する多重特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでＢＭＰ９に結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０に結合する多重特異性抗体は、アクチビンＡに結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きなＫＤでアクチビンＡに結合するか、または比較的低い結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、ＢＭＰ１０抗体、ならびに例えば１つもしくは複数の追加的なＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３  ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０およびＧＤＦ１１］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）および／または１つもしくは複数の共受容体に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体を含む抗体の組合せは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体を含む抗体の組合せは、アクチビンＡ抗体を含まない。
【０２０３】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合する。本明細書で使用される通り、ＡｃｔＲＩＩＢ抗体（抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）は、一般に、抗体が、ＡｃｔＲＩＩＢを標的化する診断剤および／または治療剤に有用となるように十分なアフィニティーでＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体が無関係の非ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、ＡｃｔＲＩＩＢに対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、異なる種に由来するＡｃｔＲＩＩＢの間で保存されているＡｃｔＲＩＩＢのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢに結合する。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５］がＡｃｔＲＩＩＢに結合することを阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢ、ならびに１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、共受容体、および／または追加的なＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、ならびに例えば１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８，アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３およびＢＭＰ１０］、共受容体、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）および／または追加的なＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ）に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。ＡｃｔＲＩＩＢは、ＡｃｔＲＩＩＡと配列類似性を有するため、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体は、一部の例では、ＡｃｔＲＩＩＡに結合するおよび／またはそれを阻害する場合もあることに留意されたい。
【０２０４】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡに結合する。本明細書で使用される通り、ＡｃｔＲＩＩＡ抗体（抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体）は、一般に、抗体が、ＡｃｔＲＩＩＡを標的化する診断剤および／または治療剤に有用となるように十分なアフィニティーでＡｃｔＲＩＩＡに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体が無関係の非ＡｃｔＲＩＩＡタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、ＡｃｔＲＩＩＡに対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、異なる種に由来するＡｃｔＲＩＩＡの間で保存されているＡｃｔＲＩＩＡのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、ヒトＡｃｔＲＩＩＡに結合する。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５］がＡｃｔＲＩＩＡに結合することを阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡ、ならびに１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、共受容体、および／または追加的なＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、ならびに例えば１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８，アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、共受容体、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、および／または追加的なＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。ＡｃｔＲＩＩＡは、ＡｃｔＲＩＩＢと配列類似性を有するため、ＡｃｔＲＩＩＡに結合する抗体は、一部の例では、ＡｃｔＲＩＩＢに結合するおよび／またはそれを阻害する場合もあることに留意されたい。
【０２０５】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ４を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ４に結合する。本明細書で使用される通り、ＡＬＫ４抗体（抗ＡＬＫ４抗体）は、一般に、抗体が、ＡＬＫ４を標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでＡＬＫ４に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体が無関係の非ＡＬＫ４タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、ＡＬＫ４に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、異なる種に由来するＡＬＫ４の間で保存されているＡＬＫ４のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ヒトＡＬＫ４に結合する。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５］がＡＬＫ４に結合することを阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ＡＬＫ４、ならびに１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、共受容体、および／または追加的なＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、抗ＡＬＫ４抗体、ならびに例えば１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８，アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、共受容体、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、および／または追加的なＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。
【０２０６】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ５を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ５に結合する。本明細書で使用される通り、ＡＬＫ５抗体（抗ＡＬＫ５抗体）は、一般に、抗体が、ＡＬＫ５を標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでＡＬＫ５に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体が無関係の非ＡＬＫ５タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、ＡＬＫ５に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、異なる種に由来するＡＬＫ５の間で保存されているＡＬＫ５のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、ヒトＡＬＫ５に結合する。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５］がＡＬＫ５に結合することを阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、ＡＬＫ５、ならびに１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、共受容体、および／または追加的なＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、抗ＡＬＫ５抗体、ならびに例えば１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８，アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、共受容体、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、および／または追加的なＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７）に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。
【０２０７】
ある特定の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ７を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ７に結合する。本明細書で使用される通り、ＡＬＫ７抗体（抗ＡＬＫ７抗体）は、一般に、抗体が、ＡＬＫ７を標的化する診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでＡＬＫ７に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ７抗体が無関係の非ＡＬＫ７タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合アフィニティーアッセイにより測定して、ＡＬＫ７に対する抗体の結合性の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ７抗体は、異なる種に由来するＡＬＫ７の間で保存されているＡＬＫ７のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ７抗体は、ヒトＡＬＫ７に結合する。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ７抗体は、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ１５］がＡＬＫ７に結合することを阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ７抗体は、ＡＬＫ７、ならびに１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、共受容体、および／または追加的なＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ５）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せおよびその使用に関し、抗体の組合せは、抗ＡＬＫ７抗体、ならびに例えば１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８，アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０］、共受容体、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、および／または追加的なＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ５）に結合する１つまたは複数の追加的な抗体を含む。
【０２０８】
用語「抗体」は、本明細書では最も幅広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントが挙げられるがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。抗体フラグメントは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体［例えば、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．９巻：１２９〜１３４頁；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２６９〜３１５頁（１９９４年）；ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号；同第５，５８７，４５８号；および同第５，８６９，０４６号を参照］が挙げられるがこれらに限定されない。ダイアボディは、二価性でもよくまたは二重特異性でもよい２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである［例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９巻：１２９〜１３４頁（２００３年）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０巻：６４４４〜６４４８頁を参照］。トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９巻：１２９〜１３４頁に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは部分または軽鎖可変ドメインの全てもしくは部分を含む抗体フラグメントである。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である［例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照］。本明細書で開示される抗体は、ポリクローナル抗体でもよく、またはモノクローナル抗体でもよい。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、それに付着され、検出することができる標識を含む（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）。ある特定の好ましい実施形態では、本開示の抗体は、単離された抗体である。ある特定の好ましい実施形態では、本開示の抗体は、組換え抗体である。
【０２０９】
本明細書の抗体は、任意のクラスのものでよい。抗体のクラスは、その重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。
【０２１０】
一般に、本明細書で開示される方法で使用するための抗体は、その標的抗原に、好ましくは高い結合アフィニティーで特異的に結合する。アフィニティーは、ＫＤ値として表すことができ、内因性結合アフィニティーを反映する（例えば、最小限の結合活性効果を有する）。典型的には、結合アフィニティーは、無細胞のまたは細胞関連の設定に関わらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される。本明細書で開示されるものを含む当技術分野で公知のいくつかのアッセイのうちのいずれかを使用して、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）およびＥＬＩＳＡを含む結合アフィニティー測定値を得ることができる。一部の実施形態では、本開示の抗体は、少なくとも１×１０−７もしくはそれより強力な、１×１０−８もしくはそれより強力な、１×１０−９もしくはそれより強力な、１×１０−１０もしくはそれより強力な、１×１０−１１もしくはそれより強力な、１×１０−１２もしくはそれより強力な、１×１０−１３もしくはそれより強力な、または１×１０−１４もしくはそれより強力なＫＤで、それらの標的抗原（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ６）に結合する。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、ＫＤは、以下のアッセイに記載のように、目的の抗体のＦａｂ型およびその標的抗原を用いて実施されるＲＩＡにより測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合アフィニティーは、滴定系列の未標識抗原の存在下で最小濃度の放射標識抗原（例えば、１２５Ｉ標識）を用いてＦａｂを平衡化し、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートで捕捉することによって測定する［例えば、Ｃｈｅｎら（１９９９年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３巻：８６５〜８８１頁を参照］。アッセイの条件を確立するため、マルチウェルプレート（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標））を、捕捉抗Ｆａｂ抗体（例えば、Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓからの）でコーティングし（例えば、一晩）、その後、好ましくは室温（およそ２３℃）にてウシ血清アルブミンで遮断する。放射標識抗原を、非吸着性プレート中で目的のＦａｂの系列希釈と混合する［例えば、Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７巻：４５９３〜４５９９頁の、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致］。次いで、目的のＦａｂを、好ましくは一晩インキュベートするが、インキュベーションは、平衡に到達していることを確実にするために、より長期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を、好ましくは室温で約１時間インキュベーションするために捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、好ましくはポリソルベート２０およびＰＢＳ混合物で数回洗浄する。プレートが乾燥したら、シンチラント（例えば、ＰａｃｋａｒｄからのＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（登録商標））を添加し、プレートをガンマカウンター（例えば、ＰａｃｋａｒｄからのＴＯＰＣＯＵＮＴ（登録商標））で計数する。
【０２１２】
別の実施形態によると、ＫＤは、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップで、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して測定される。手短に言えば、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の説明書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。例えば、抗原を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈してから、５μｌ／分の流速で注入して、およそ１０応答ユニット（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成することができる。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。動力学的測定は、Ｆａｂ（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）の２倍系列希釈物を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳに、およそ２５μｌ／分の流速にて注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、例えば、会合および解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより、単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェア、バージョン３．２）を使用して算出する。平衡解離定数（ＫＤ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する［例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９９年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３巻：８６５〜８８１頁を参照］。オン速度が、例えば、上記の表面プラズモン共鳴アッセイで１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合には、オン速度は、分光光度計を装備したストップフロー（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベット付きの８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（登録商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ中の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（例えば、励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定する蛍光クエンチング技法を使用することにより決定され得る。
【０２１３】
抗体フラグメントは、本明細書で記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解性消化ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製され得る。ヒトＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣおよびアクチビンＥ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ６の核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。加えて、抗体を生成するための多数の方法が、当技術分野で周知であり、それらのいくつかは、本明細書に記載されている。したがって、本開示に従って使用するための抗体アンタゴニストは、当技術分野の知識および本明細書で提供される教示に基づき、当業者により慣例的に作製され得る。
【０２１４】
ある特定実施形態では、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は、重鎖および／または軽鎖の部分が特定の供給源または種に由来するが、重鎖および／または軽鎖の残りは異なる供給源または種に由来する抗体を指す。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁に記載されている。一部の実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変更されている「クラススイッチ」抗体である。一般に、キメラ抗体は、その抗原結合性フラグメントを含む。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）に由来するアミノ酸残基およびヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＨＶＲに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むだろう。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも部分を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。ヒト化抗体、およびヒト化抗体を作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３巻：１６１９〜１６３３頁で概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻：３２３〜３２９頁；Ｑｕｅｅｎら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：１００２９〜１００３３頁；米国特許第５，８２１，３３７号；同第７，５２７，７９１号；同第６，９８２，３２１号；および同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、（２００５年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６巻：２５〜３４頁［ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植が記載されている］；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１年）２８巻：４８９〜４９８頁（「リサーフェイシング」が記載されている）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（２００５年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６巻：４３〜６０頁（「ＦＲシャフリング」が記載されている）；Ｏｓｂｏｕｒｎら（２００５年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６巻：６１〜６８頁；ならびにＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）８３巻：２５２〜２６０頁（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチが記載されている）にさらに記載されている。ヒト化に使用し得るヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域［例えば、Ｓｉｍｓら（１９９３年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１巻：２２９６頁を参照］；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域［例えば、Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁；およびＰｒｅｓｔａら（１９９３年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁を参照］；ヒト成熟（体細胞変異された）フレームワーク領域またはヒト生殖系フレームワーク領域［例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３巻：１６１９〜１６３３頁を参照］；およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域［例えば、Ｂａｃａら（１９９７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２巻：１０６７８〜１０６８４頁；およびＲｏｓｏｋら、（１９９６年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１巻：２２６１１〜２２６１８頁を参照］が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の種々の技法を使用して産生され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ（２００８年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５巻：３６８〜７４頁（２００１年）ならびにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０巻：４５０〜４５９頁に記載されている。例えば、ヒト抗体は、抗原負荷に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されているトランスジェニック動物に、免疫原（例えば、ＧＤＦ１１ポリペプチド、アクチビンＢポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を投与することにより調製され得る。そのような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは部分を含有し、それらは、内在性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、または動物の染色体に無作為に組み込まれる。そのようなトランスジェニック動物では、内在性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説は、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００５年）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３巻：１１１７〜１１２５頁；米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術が記載されている）；米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術が記載されている）；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術が記載されている）；ならびに米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術が記載されている）を参照されたい。そのような動物により生成されるインタクトな抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに修飾され得る。
【０２１７】
本明細書で提供されるヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている［例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９８４年）１３３巻：３００１頁；Ｂｒｏｄｅｕｒら（１９８７年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＢｏｅｒｎｅｒら（１９９１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６頁を参照］。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体は、Ｌｉら、（２００６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０３巻：３５５７〜３５６２頁にも記載されている。追加的な方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞系からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生が記載されている）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ（２００６年）２６巻（４号）：２６５〜２６８頁（２００６年）（ヒト−ヒトハイブリドーマが記載されている）に記載されているものが挙げられる。また、ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）が、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）Ｈｉｓｔｏｌ．  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２０巻（３号）：９２７〜９３７頁（２００５年）ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２７巻（３号）：１８５〜９１頁に記載されている。本明細書で提供されるヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。次いで、そのような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
【０２１８】
例えば、本開示の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特徴を保有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で公知である。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（２００１年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８巻：１〜３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．で概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８巻：５５２〜５５４頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２巻：６２４〜６２８頁；Ｍａｒｋｓら（１９９２年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２巻：５８１〜５９７頁；ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ（２００３年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８巻：１６１〜１７５頁、Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．；Ｓｉｄｈｕら（２００４年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３８巻（２号）：２９９〜３１０頁；  Ｌｅｅら（２００４年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４０巻（５号）：１０７３〜１０９３頁；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ（２００４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１巻（３４号）：１２４６７〜１２４７２頁；ならびにＬｅｅら（２００４年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４巻（１〜２号）：１１９〜１３２頁にさらに記載されている。
【０２１９】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリーで無作為に組み換え、次いでそれらをＷｉｎｔｅｒら（１９９４年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３〜４５５頁に記載のように抗原結合性ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体フラグメントを、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかとして提示する。免疫した供給源に由来するライブラリーは、免疫原（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ３またはＢＭＰ６）に対する高アフィニティー抗体を提供し、ハイブリドーマの構築は必要としない。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ、１２巻：７２５〜７３４頁に記載のように、免疫を行うことなく、ナイーブレパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）、広範な非自己およびまた自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリーは、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１〜３８８頁に記載のように、幹細胞に由来する再編成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、無作為配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再編成を達成することによっても、合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーが記載されている特許広報として、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号および同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれよりも多くの）抗原の少なくとも２つの異なるエピトープ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれよりも多くの）に対する結合特異性を有する多重特異性抗体（典型的には、モノクローナル抗体）。
【０２２１】
多重特異性抗体を作製するための技法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアの組換え体共発現が挙げられるがこれに限定されない［例えば、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ（１９８３年）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５巻：５３７頁；国際特許公開番号ＷＯ９３／０８８２９；ならびにＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０巻：３６５５頁、ならびに米国特許第５，７３１，１６８号（「ノブ・ホール型」作出」を参照］。多重特異性抗体は、抗体をＦｃヘテロ二量体分子にするための静電ステアリング効果を作出すること（例えば、ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１を参照）；２つまたはそれよりも多くの抗体またはフラグメントを架橋すること［例えば、米国特許第４，６７６，９８０号；およびＢｒｅｎｎａｎら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１号を参照］；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること［例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻（５号）：１５４７〜１５５３頁を参照］；二重特異性抗体フラグメントを作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること［例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁を参照］；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること［例えば、Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２巻：５３６８頁を参照］；および三重特異性抗体を調製すると（例えば、Ｔｕｔｔら（１９９１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７巻：６０頁を参照）によっても作製され得る。多重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメントとして調製され得る。「オクトパス抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」を含む、３つまたはそれよりも多くの機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる［例えばＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照］。
【０２２２】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。つまり、集団を構成する個々の抗体は、例えば、天然に存在する変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、一般に少量で存在する考え得る改変体抗体を除いて、同一であるおよび／または同じエピトープに結合する。典型的には異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈されるべきではない。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは部分を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがそれらに限定されない様々な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【０２２３】
例えば、アクチビンに由来する免疫原を使用することによって、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を、標準的プロトコールによって作製することができる［例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８年を参照］。マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物を、免疫原形態のアクチビンポリペプチド、抗体応答を誘発することができる抗原性フラグメントまたは融合タンパク質で免疫することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法としては、キャリアとのコンジュゲーションまたは当技術分野で周知の他の技法が挙げられる。アクチビンポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫の進行は、血漿または血清で抗体力価を検出することによってモニターすることができる。標準的ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを、抗原としての免疫原と共に使用して、抗体産生のレベルおよび／または結合アフィニティーのレベルを評価することができる。
【０２２４】
アクチビンの抗原性調製物で動物を免疫した後、抗血清を得ることができ、所望の場合、血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を産生するために、免疫した動物から抗体産生細胞（リンパ球）を収集し、標準的体細胞融合手順によって骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を産出することができる。そのような技法は当技術分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技法［例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁を参照］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法［例えば、Ｋｏｚｂａｒら（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁を参照］、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技法［Ｃｏｌｅら（１９８５年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．、Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、７７〜９６頁］が挙げられる。ハイブリドーマ細胞を、アクチビンポリペプチドと特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングし、そのようなハイブリドーマ細胞を含む培養からモノクローナル抗体を単離することができる。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に１つまたは複数のアミノ酸修飾を導入し、それによってＦｃ領域改変体を生成することができる。Ｆｃ領域改変体は、１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失および／または付加）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含んでいてもよい。
【０２２６】
例えば、本開示は、全てではないが一部のエフェクター機能を保有し、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は重要であるが、ある特定のエフェクター機能［例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）］が不必要または有害であるような応用に関して望ましい候補である抗体改変体を企図する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがってＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを保証することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、例えば、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ（１９９１年）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９巻：４５７〜４９２頁に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｉ．ら（１９８６年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３巻：７０５９〜７０６３頁；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｉら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２巻：１４９９〜１５０２頁；米国特許第５，８２１，３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，  Ｍ．ら（１９８７年）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６６巻：１３５１〜１３６１頁に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）、フローサイトメトリー用の非放射性細胞傷害性アッセイ；ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的にまたはその上、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻：６５２〜６５６頁に開示されているものなどの動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣの活性を欠くことを確認することができる［例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照］。補体活性化を評価するためには、ＣＤＣアッセイを実施することができる［例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９６年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２巻：１６３頁；Ｃｒａｇｇ，  Ｍ．  Ｓ．ら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ  １０１巻：１０４５〜１０５２頁；ならびにＣｒａｇｇ，  Ｍ．  ＳおよびＭ．  Ｊ．  Ｇｌｅｎｎｉｅ（２００４年）Ｂｌｏｏｄ  １０３巻：２７３８〜２７４３を参照］��また、ＦｃＲｎ結合およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス／半減期決定は、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる［例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，  Ｓ．  Ｂ．ら（２００６年）Ｉｎｔｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８巻（１２号）：１７５９〜１７６９頁を参照］。エフェクター機能が低減された本開示の抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうちの１つまたは複数の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体としては、残基２６５および２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７および３２７位のうちの２つまたはそれよりも多くが置換されているＦｃ変異体が挙げられる。
【０２２７】
ある特定の実施形態では、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている、システインが作出された抗体、例えば「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基を、それにより抗体のアクセス可能な部位に配置し、薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートさせるために使用して、本明細書でさらに記載されるイムノコンジュゲートを作製することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基のうちの任意の１つまたは複数をシステインで置換してもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システインが作出された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載のように生成することができる。
【０２２８】
加えて、望ましい抗体を同定するために抗体のスクリーニングに使用される技法は、得られる抗体の特性に影響を及ぼす場合がある。例えば、抗体を溶液中での抗原結合に使用する場合、溶液結合を試験することが望ましい場合がある。様々な異なる技法が、抗体と抗原との相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために利用可能である。そのような技法としては、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズ系）、ウエスタンブロット、免疫沈殿アッセイおよび免疫組織化学法が挙げられる。
【０２２９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列改変体が企図される。例えば、抗体および／または結合性ポリペプチドの結合アフィニティーおよび／または他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合がある。抗体および／または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、抗体および／もしくは結合性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾としては、例えば、抗体および／または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組合せを作製して、最終構築物に到達することができる。ただし、最終構築物は、所望の特徴、例えば標的結合（例えば、ならびにアクチビンＥおよび／またはアクチビンＣなどのアクチビン結合）を保有する。
【０２３０】
ＨＶＲに変更（例えば、置換）を作製して、例えば、抗体アフィニティーを向上させることができる。そのような変更を、ＨＶＲ「ホットスポット」、つまり体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を起こすコドンによってコードされる残基［例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ（２００８年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０７巻：１７９〜１９６頁（２００８年）を参照］および／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）に作製し、その結果生じる改変体ＶＨまたはＶＬを、結合アフィニティーに関して試験することができる。二次ライブラリーから構築および再選択することによるアフィニティー成熟は、当技術分野に記載されている［例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８巻：１〜３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．、（２００１年）を参照］。アフィニティー成熟の一部の実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリングまたはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発）のうちのいずれかによって、成熟させるために選択した可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーを作製する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望のアフィニティーを有する任意の抗体改変体を同定する。多様性を導入するための別の方法には、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）が無作為化されるＨＶＲ特異的アプローチが含まれる。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して特異的に同定され得る。特にＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３が標的化されることが多い。
【０２３１】
ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、そのような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内に生じてもよい。例えば、結合アフィニティーを実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）を、ＨＶＲに作製してもよい。そのような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外部でもよい。上記で提供される改変体ＶＨおよびＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、変更されていないか、または１つ、２つ、もしくは３つ以内のアミノ酸置換しか含有しないかのいずれかである。
【０２３２】
変異誘発の標的化することができる抗体および／または結合性ポリペプチドの残基または領域を同定するための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁によって記載されている「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基の群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電した残基）を同定し、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置き換えて、抗体−抗原の相互作用が影響を受けるか否かを決定する。最初の置換に対する機能的感受性が実証されているアミノ酸位置に、さらなる置換を導入してもよい。代替的にまたはその上、抗原−抗体複合体の結晶構造を決定して、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基および近隣残基を、置換の候補として標的化または排除してもよい。改変体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するか否かを決定してもよい。
【０２３３】
アミノ酸配列挿入としては、長さが１個の残基から１００個またはそれよりも多くの残基を含有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入改変体としては、抗体のＮ末端またはＣ末端を、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドと融合させることが挙げられる。
【０２３４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合性ポリペプチドは、当技術分野で公知であり、容易に利用可能な追加的な非タンパク質性部分を含有するように、さらに修飾してもよい。抗体および／または結合性ポリペプチドの誘導体化に好適な部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）およびデキストラン、またはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であるため、製造に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものでもよく、分岐または非分岐でもよい。抗体および／または結合性ポリペプチドに付着するポリマーの数は変動し得、１つよりも多くのポリマーが付着される場合、それらは同じ分子でもよく、または異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／またはタイプは、抗体誘導体および／または結合性ポリペプチド誘導体が、規定の条件下で療法に使用されることになるか否かに関わりなく、向上させようとする抗体および／または結合性ポリペプチドの特定の特性または機能を含むがこれらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。
【０２３５】
５．小分子アンタゴニスト
他の態様では、本明細書で記載される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、小分子（ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニスト）または小分子アンタゴニストの組合せである。ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、例えば、１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド（例えば、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ１５）、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＡｃｔＲＩＩＡ）、共受容体、および／または１つもしくは複数のシグナル伝達因子（例えば、Ｓｍａｄ２および３などのＳｍａｄタンパク質）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、例えば、本明細書で記載されるものなどの細胞ベースのアッセイで決定される、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンドによって媒介されるシグナル伝達を阻害する。本明細書で記載される通り、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストを、単独で、または１つもしくは複数の支持療法もしくは活性薬剤と組み合わせて使用して、肺高血圧症（ＰＨ）を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することができ、特に１つまたは複数のＰＨ関連合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することができる。
【０２３６】
一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ１１を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ８を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビンＢを阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ６を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１５を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ３を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１０を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡを阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ４を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ５を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ７を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＢＭＰ１０および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、ＢＭＰ９を阻害しないかまたは実質的に阻害しない。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、アクチビンＡを阻害しないかまたは実質的に阻害しない。
【０２３７】
ＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストは、直接的または間接的な阻害剤であり得る。例えば、間接的な小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくとも１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥまたはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＧＤＦ８］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、共受容体、および／または１つもしくは複数の下流のシグナル伝達構成要素（例えば、Ｓｍａｄ）の発現（例えば、転写、翻訳、細胞分泌、またはそれらの組合せ）を阻害することができる。代替的に、直接的な小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、例えば、１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥまたはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＧＤＦ８］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、共受容体、および／または１つもしくは複数の下流のシグナル伝達構成要素（例えば、Ｓｍａｄ）に直接的に結合しそれらを阻害することができる。１つまたは複数の間接的なＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストおよび１つまたは複数の直接的なＧＤＦ／ＢＭＰ小分子アンタゴニストの組合せを、本明細書で開示される方法に従って使用することができる。
【０２３８】
本開示の結合性小分子アンタゴニストは、公知の方法論を使用して、同定および化学合成することができる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照）。一般に、本開示の小分子アンタゴニストは、通常、サイズが約２０００ダルトン未満であり、代替的には、サイズが約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満であり、そのような有機小分子は、本明細書で記載されるポリペプチドに、好ましくは特異的に結合することができる。これらの小分子アンタゴニストは、周知の技法を使用して、過度の実験作業を行うことなく同定することができる。この点で、ポリペプチド標的に結合することができる分子の有機小分子ライブラリーをスクリーニングするための技法は、当技術分野で周知であることに留意されたい（例えば、国際特許公開番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照）。
【０２３９】
本開示の結合性有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハライド、スルホン酸アリール、アルキルハライド、スルホン酸アルキル、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、塩化スルホニル、ジアゾ化合物および酸塩化物でもよい。
【０２４０】
６．ポリヌクレオチドアンタゴニスト
他の態様では、本明細書で開示される方法および使用に従って使用されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、ポリヌクレオチド（ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニスト）またはポリヌクレオチドの組合せである。ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、例えば、１つもしくは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド（例えば、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ１５）、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、共受容体、および／または下流のシグナル伝達構成要素（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害することができる。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、例えば、本明細書で記載されるものなどの細胞ベースのアッセイで決定される、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンドによって媒介されるシグナル伝達を阻害する。本明細書で記載される通り、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストを、単独で、または１つもしくは複数の支持療法もしくは活性薬剤と組み合わせて使用して、肺高血圧症（ＰＨ）を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することができ、特に１つまたは複数のＰＨ関連合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することができる。
【０２４１】
一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ１１を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ８を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビンＢを阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ６を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１５を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ３を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１０を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡを阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ４を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ５を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ７を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＢＭＰ１０および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、ＢＭＰ９を阻害しないかまたは実質的に阻害しない。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、アクチビンＡを阻害しないかまたは実質的に阻害しない。
【０２４２】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子［例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）］、アプタマーおよび／またはリボザイムでもよい。ヒトＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣおよびアクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ＢＭＰ１５およびＳｍａｄタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。加えて、ポリヌクレオチドアンタゴニストを生成する多数の異なる方法が、当技術分野で周知である。したがって、本開示に従って使用するためのポリヌクレオチドアンタゴニストは、当技術分野の知識および本明細書で提供される教示に基づき、当業者によって慣例的に作製され得る。
【０２４３】
アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによりまたは三重らせん形成により遺伝子発現を制御するために使用することができる。アンチセンス技法は、例えば、Ｏｋａｎｏ（１９９１年）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５６巻：５６０頁；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）で考察されている。三重らせん形成は、例えば、Ｃｏｏｎｅｙら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１巻：４５６頁；およびＤｅｒｖａｎら（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１巻：１３００頁で考察されている。方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合性に基づく。一部の実施形態では、アンチセンス核酸は、本明細書で開示される遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも部分に相補的な一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。しかしながら、絶対的な相補性は、好ましいものの、必要ではない。
【０２４４】
本明細書で引用される「少なくともＲＮＡの部分に相補的な」配列は、十分な相補性を有し、ＲＮＡとハイブリダイズして安定二重鎖を形成することができる配列を意味する。したがって、本明細書で開示される遺伝子の二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの単一鎖を試験してもよく、三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の度合いおよびアンチセンス核酸の長さの両方に依存するだろう。一般に、ハイブリダイズする核酸は、大きくなると共に、ＲＮＡとの塩基ミスマッチをより多く含有するが、依然として安定二重鎖（または場合によっては三重鎖でもよい）を形成することができる。当業者は、標準的手順を使用して、ハイブリダイズされた複合体の融点を決定することによって、許容可能なミスマッチの度合いを確認することができる。
【０２４５】
メッセージの５’末端、例えばＡＵＧ開始コドンまででありおよびそれを含む５’−非翻訳配列に相補的なポリヌクレオチドは、翻訳阻害に最も効率的に働くはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’−非翻訳配列に相補的な配列は、同様に、ｍＲＮＡの翻訳阻害に効果的であることが示されている［例えば、Ｗａｇｎｅｒ，  Ｒ．、（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３７２巻：３３３〜３３５頁を参照］。したがって、本開示の遺伝子の５’−または３’−非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、アンチセンスアプローチで内在性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために使用することができる。ｍＲＮＡの５’−非翻訳領域に相補的なポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、効率がより低い翻訳阻害剤であるが、本開示の方法に従って使用することができる。本開示のｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域にハイブリダイズするように設計されているか否かに関わらず、アンチセンス核酸は、長さが少なくとも６個のヌクレオチドであるべきであり、好ましくは、長さが６〜約５０個ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも２５個のヌクレオチドまたは少なくとも５０個のヌクレオチドである。
【０２４６】
一実施形態では、本開示のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその部分が転写され、本開示の遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）が産生される。そのようなベクターは、所望のアンチセンス核酸をコードする配列を含有するだろう。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生することができる限り、エピソームのままでもよく、または染色体に組み込まれてもよい。そのようなベクターは、当技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術法によって構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞での複製および発現に使用される、当技術分野で公知のプラスミドまたはウイルスなどであり得る。本開示の所望の遺伝子またはそれらのフラグメントをコードする配列の発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞で作用することが当技術分野で公知の任意のプロモーターによってであり得る。そのようなプロモーターは、誘導可能でもよく、または構成的でもよい。そのようなプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域［例えば、ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ（１９８１年）Ｎａｔｕｒｅ  ２９０巻：３０４〜３１０頁を参照］、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含有されているプロモーター［例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０年）Ｃｅｌｌ  ２２巻：７８７〜７９７頁を参照］、ヘルペスチミジンプロモーター［例えば、Ｗａｇｎｅｒら（１９８１年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７８巻：１４４１〜１４４５頁を参照］、およびメタロチオネイン遺伝子の調節性配列［例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２年）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６巻：３９〜４２頁を参照］が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンタゴニストは、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣおよびアクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ＢＭＰ１５およびＳｍａｄタンパク質のうちの１つまたは複数の発現を標的化する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡｉは、標的化ｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）による特定のｍＲＮＡとの相互作用によって標的化遺伝子を沈黙させる。次いで、ｄｓＲＮＡ複合体は、細胞による分解の標的となる。ｓｉＲＮＡ分子は、十分に相補的（例えば、遺伝子と少なくとも８０％同一）である標的遺伝子の発現に干渉する、長さが１０〜５０個ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ二重鎖である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２４８】
追加的なＲＮＡｉ分子としては、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられ、短鎖干渉ヘアピンおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループによって接続されている、標的遺伝子に由来するセンスおよびアンチセンス配列を含有する。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質内へと輸送され、ｍＲＮＡと共に分解される。Ｐｏｌ  ＩＩＩまたはＵ６プロモーターを使用して、ＲＮＡｉのＲＮＡを発現させることができる。Ｐａｄｄｉｓｏｎら［Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．（２００２年）１６巻：９４８〜９５８頁、２００２年］は、ＲＮＡｉに影響を及ぼす手段として、ヘアピンにフォールディングされた小型ＲＮＡ分子を使用している。したがって、そのような短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子も、本明細書で記載される方法に有利に使用される。機能的ｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは様々であり、ステム長は、約２５〜約３０ｎｔの任意の範囲でもよく、ループサイズは、４〜約２５ｎｔの範囲でもよく、サイレンシング活性に影響を及ぼさない。任意の特定の理論によって束縛されることは望まないが、これらのｓｈＲＮＡはＤＩＣＥＲ  ＲＮａｓｅの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物と類似しており、いずれにしても、特定の遺伝子の発現を阻害するための同じ能力を有すると考えられる。ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターから発現させることができる。ｍｉＲＮＡは、「ステム−ループ」構造によって特徴付けられるプレｍｉＲＮＡとして初期に転写される、長さが約１０〜７０個ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡであり、それは、その後、ＲＩＳＣによるさらなるプロセシング後に、成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。
【０２４９】
ｓｉＲＮＡを含むがそれに限定されない、ＲＮＡｉを媒介する分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１巻：１９５〜１９９頁、２００２年）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９巻：９９４２〜９９４７頁、２００２年）によって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０巻：ｅ４６頁、２００２年；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９巻：６０４７〜６０５２頁、２００２年）によって、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩなどのヌクレアーゼを使用した二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９巻：９９４２〜９９４７頁、２００２年）によって産生され得る。
【０２５０】
別の態様によると、本開示は、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、封入化ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、封入化ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を発生させることができる分子、またはそれらの組合せを含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。
【０２５１】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、標的分子と特異的に結合する三次構造に結合し、それを形成する二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ分子を含む核酸分子である。アプタマーの生成および治療的使用は、当技術分野で十分に確立されている（例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照）。アプタマーに関する追加的な情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見出すことができる。核酸アプタマーは、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、指数関数的濃縮よるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）プロセスにより選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，５８０，７３７号、同第５，５６７，５８８号、同第５，７０７，７９６号、同第５，７６３，１７７号、同第６，０１１，５７７号、および同第６，６９９，８４３号に記載されている、標的分子と高度に特異的に結合する核酸分子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで進化させるための方法である。アプタマーを同定するための別のスクリーニング法は、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている。ＳＥＬＥＸプロセスは、単量体であるかまたは多量体であるかに関わらず、他の核酸分子およびポリペプチドを含む、事実上あらゆる化学的化合物とのリガンドとして作用する（特異的結合ペアを形成する）ように、様々な二次元および三次元構造を形成する核酸の能力ならびにヌクレオチド単量体内で利用可能な化学的多用途性に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的として機能し得る。ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、および同じ基本選択スキームを使用して、所望の結合アフィニティーおよび選択性を達成するための、結合、分割および増幅の段階的反復を含む。ＳＥＬＥＸ法は、無作為化配列のセグメントを含み得る核酸の混合物から開始して、結合に好ましい条件下で混合物を標的と接触させる工程；未結合核酸を、標的分子と特異的に結合した核酸から分割する工程；核酸−標的複合体を解離させる工程；核酸−標的複合体から解離された核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を産出する工程を含む。結合する、分割する、解離させる、および増幅する工程は、高いアフィニティーおよび特異性で標的分子に結合する核酸リガンドが産出されるまで、必要に応じて多数のサイクルで繰り返される。
【０２５２】
典型的には、そのような結合性分子は、別々に動物に投与されるが［例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ（１９９１年）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５６巻：５６０頁を参照］、そのような結合性分子は、宿主細胞によって取り込まれるポリヌクレオチドからｉｎ  ｖｉｖｏでも発現され得、ｉｎ  ｖｉｖｏでも発現され得る［例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）を参照］。
【０２５３】
７．フォリスタチンおよびＦＬＲＧアンタゴニスト
他の態様では、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストは、フォリスタチンまたはＦＬＲＧポリペプチドである。本明細書で記載される通り、フォリスタチンおよび／またはＦＬＲＧポリペプチドを使用して、肺高血圧症（ＰＨ）を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することができ、特に１つまたは複数のＰＨ関連合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することができる。
【０２５４】
用語「フォリスタチンポリペプチド」は、フォリスタチンの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含み、フォリスタチンの任意の機能的な単量体または多量体をさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のフォリスタチンポリペプチドは、アクチビン活性、特にアクチビンＡに結合するおよび／またはそれを阻害する。アクチビン結合特性を保持するフォリスタチンポリペプチドの改変体は、フォリスタチンおよびアクチビン相互作用に関する以前の研究に基づき同定することができる。例えば、ＷＯ２００８／０３０３６７には、アクチビン結合に重要であることが示されている特定のフォリスタチンドメイン（「ＦＳＤ」）が開示されている。下記の配列番号２８〜３０に示されるように、フォリスタチンＮ末端ドメイン（「ＦＳＮＤ」配列番号２８）、ＦＳＤ２（配列番号３０）および程度はより少ないがＦＳＤ１（配列番号２９）は、アクチビン結合に重要なフォリスタチン内の例示的なドメインを表す。加えて、ポリペプチドのライブラリーを作製および試験するための方法は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの文脈で上述されており、そのような方法も、フォリスタチンの改変体の作製および試験にふさわしい。フォリスタチンポリペプチドとしては、フォリスタチンポリペプチドの配列と少なくとも約８０％同一の、および任意選択で少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性の配列を有する任意の公知のフォリスタチンの配列に由来するポリペプチドが挙げられる。フォリスタチンポリペプチドの例としては、成熟フォリスタチンポリペプチドまたは例えばＷＯ２００５／０２５６０１に記載されている、ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのより短いアイソフォーム（配列番号２６）もしくは他の改変体が挙げられる。
【０２５５】
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドアイソフォームＦＳＴ３４４は、以下の通りである：
【化３１】
2019521144.tif 000033
【化３２】
2019521144.tif 000034
【０２５６】
シグナルペプチドに下線を引き、このフォリスタチンアイソフォームを、下記に示されるより短いフォリスタチンアイソフォームＦＳＴ３１７と区別するＣ末端伸長を表わす最後の２７残基にも上で下線を引く。
【０２５７】
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドアイソフォームＦＳＴ３１７は、以下の通りである：
【化３３】
2019521144.tif 000035
【０２５８】
シグナルペプチドに下線を引く。
フォリスタチンＮ末端ドメイン（ＦＳＮＤ）配列は、以下の通りである：
【化３４】
2019521144.tif 000036
ＦＳＤ１およびＦＳＤ２の配列は、以下の通りである：
【化３５】
2019521144.tif 000037
【０２５９】
他の態様では、本明細書で開示される方法に従って使用するための薬剤は、フォリスタチン様関連遺伝子（ＦＬＲＧ）であり、フォリスタチン関連タンパク質３（ＦＳＴＬ３）としても公知である。用語「ＦＬＲＧポリペプチド」は、ＦＬＲＧの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合体およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＦＬＲＧポリペプチドは、アクチビン活性、特にアクチビンＡに結合するおよび／またはそれを阻害する。アクチビン結合特性を保持するＦＬＲＧポリペプチドの改変体は、慣例的な方法を使用してＦＬＲＧおよびアクチビン相互作用をアッセイして同定することができる（例えば、ＵＳ６，５３７，９６６を参照）。加えて、ポリペプチドのライブラリーを作製および試験するための方法は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの文脈で上述されており、そのような方法も、ＦＬＲＧの改変体の作製および試験にふさわしい。ＦＬＲＧポリペプチドとしては、ＦＬＲＧポリペプチドの配列と少なくとも約８０％同一の、および任意選択で少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれよりも高い同一性の配列を有する任意の公知のＦＬＲＧの配列に由来するポリペプチドが挙げられる。
【０２６０】
ヒトＦＬＲＧ前駆体（フォリスタチン関連タンパク質３前駆体）ポリペプチドは、以下の通りである：
【化３６】
2019521144.tif 000038
【０２６１】
シグナルペプチドに下線を引く。
【０２６２】
ある特定の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドおよびＦＬＲＧポリペプチドの機能的改変体または修飾形態としては、フォリスタチンポリペプチドまたはＦＬＲＧポリペプチドの少なくとも部分と、例えば、ポリペプチドの単離、検出、安定化または多量体化を促進するドメインなどの１つまたは複数の融合ドメインとを有する融合タンパク質が挙げられる。好適な融合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関して上で詳細に考察されている。一部の実施形態では、本開示のアンタゴニスト剤は、Ｆｃドメインと融合されたフォリスタチンポリペプチドのアクチビン結合部分を含む融合タンパク質である。別の実施形態では、本開示のアンタゴニスト剤は、Ｆｃドメインと融合されたＦＬＲＧポリペプチドのアクチビン結合部分を含む融合タンパク質である。
【０２６３】
８．スクリーニングアッセイ
ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症（ＰＨ）を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減するために、特に１つまたは複数のＰＨ関連合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減するために使用することができる化合物（薬剤）を同定するための、対象ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびその改変体）の使用に関する。
【０２６４】
１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンドのシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を標的化することによってＰＨを処置するための治療剤をスクリーニングするためのアプローチは多数存在する。ある特定の実施形態では、化合物のハイスループットスクリーニングを実施して、選択された細胞株に対するＧＤＦ／ＢＭＰリガンド媒介性効果を撹乱する薬剤を同定することができる。ある特定の実施形態では、アッセイを実施して、ＧＤＦ／ＢＭＰリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ１１またはＢＭＰ１０）の、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）などのその結合パートナーへの結合を特異的に阻害または低減する化合物をスクリーニングおよび同定する。代替的に、アッセイを使用して、ＧＤＦ／ＢＭＰリガンドの、ＩＩ型受容体などのその結合パートナーへの結合を増強する化合物を同定することができる。さらなる実施形態では、化合物は、ＩＩ型受容体と相互作用するそれらの能力によって同定することができる。
【０２６５】
種々のアッセイ形式が十分であり、本開示を踏まえると、本明細書に明確に記載されていないアッセイであっても、当業者によって理解されるであろう。本明細書で記載される通り、本発明の被験化合物（薬剤）は、任意のコンビナトリアル化学方法によって作製することができる。代替的に、対象化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成された天然に存在する生体分子の場合もある。組織成長のモジュレーターとして作用するその能力に関して検査しようとする化合物（薬剤）は、例えば、細菌、酵母、植物もしくは他の生物によって産生することができる（例えば、天然の産物）、化学的に産生することができる（例えば、ペプチド模倣物を含む小分子）、または組換えにより産生することができる。本発明によって考慮される被験化合物は、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、被験薬剤は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する有機小分子である。
【０２６６】
本開示の被験化合物は、単一の別々の実体として提供することができる、またはコンビナトリアル化学によって作製されるなど、より複雑性の大きいライブラリーにおいて提供することができる。このようなライブラリーは、例えば、アルコール、アルキルハライド、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび他のクラスの有機化合物を含み得る。試験系への被験化合物の提示は、特に、初期スクリーニング工程において、単離された形態または化合物の混合物のいずれかの場合もある。任意選択で、化合物は、他の化合物により任意選択で誘導体化し、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有し得る。誘導体化基の非限定例として、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化可能なクロスリンカーまたはこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。
【０２６７】
化合物および天然抽出物のライブラリーを検査する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所定の期間で調査される化合物の数を最大化するためには、ハイスループットアッセイが望ましい。精製または半精製タンパク質により得ることができるものなど、無細胞系において行われるアッセイは、被験化合物によって媒介される分子標的における変更の迅速な発生および相対的に容易な検出を可能にするために生成され得るという点において、「一次」スクリーニングとして好ましいことが多い。さらに、被験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの効果は一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系では無視することができ、その代わりアッセイでは、ＧＤＦ／ＢＭＰリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１５、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６またはＢＭＰ１０）と、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）などのその結合パートナーとの間の結合アフィニティーが変更されることで明らかになる場合がある、分子標的に対する薬物の効果に主に焦点が置かれる。
【０２６８】
単に例証するために、本開示の例示的なスクリーニングアッセイでは、アッセイの意図に適切であるように、目的の化合物を、通常、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合することができる、単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと接触させる。次いで、化合物およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの混合物を、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ１１）を含有する組成物に添加する。ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢ−リガンド複合体の検出および定量化は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の複合体形成を阻害（または増強）する化合物の有効性を決定するための手段を提供する。化合物の有効性は、種々の濃度の被験化合物を使用して得られるデータから用量応答曲線を作成することによって評価することができる。さらに、対照アッセイを実施して、比較のためのベースラインを提供することもできる。例えば、対照アッセイでは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含有する組成物に、単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢリガンドを添加し、ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の形成を、被験化合物の非存在下で定量化する。一般に、反応物を混合することができる順序は変動させてもよく、同時に混合してもよいことが理解されるであろう。さらに、精製されたタンパク質の代わりに、細胞抽出物およびライセートを使用して、好適な無細胞アッセイ系を提供することができる。
【０２６９】
ＧＤＦ／ＢＭＰリガンドとその結合タンパク質との間の複合体形成は、様々な技法によって検出することができる。例えば、複合体の形成のモジュレーションは、例えば、放射標識された（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識された（例えば、ＦＩＴＣ）または酵素により標識されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはその結合タンパク質など、検出可能に標識されたタンパク質を使用して、イムノアッセイによって、あるいはクロマトグラフィー検出によって定量化することができる。
【０２７０】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＧＤＦ／ＢＭＰリガンドおよびその結合タンパク質の間の相互作用の程度の直接的または間接的な測定における、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を考慮する。さらに、光導波路（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号を参照されたい）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサおよび表面力センサ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｏｒｃｅ  ｓｅｎｓｏｒ）に基づく検出方式など、他の検出方式が、本開示の多くの実施形態と適合性である。
【０２７１】
さらに、本開示は、ＧＤＦ／ＢＭＰリガンドおよびその結合パートナーの間の相互作用を破壊または増強する薬剤を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知の、相互作用トラップアッセイの使用を考慮する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３年）Ｃｅｌｌ  ７２巻：２２３〜２３２頁；Ｍａｄｕｒａら（１９９３年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８巻：１２０４６〜１２０５４頁；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４巻：９２０〜９２４頁；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８巻：１６９３〜１６９６頁）を参照されたい。特異的な実施形態では、本開示は、ＧＤＦ／ＢＭＰリガンドおよびその結合タンパク質の間の相互作用を解離させる化合物（例えば、小分子またはペプチド）を同定するための、リバースツーハイブリッド系（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）の使用を考慮する［例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７巻：９１９〜２９頁；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７巻：３７４〜８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号を参照されたい］。
【０２７２】
ある特定の実施形態では、対象化合物は、ＧＤＦ／ＢＭＰリガンドと相互作用するその能力によって同定される。化合物およびＧＤＦ／ＢＭＰリガンドの間の相互作用は、共有結合または非共有結合の場合もある。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射標識リガンド結合およびアフィニティークロマトグラフィーを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生化学的方法を使用して、タンパク質レベルで同定することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｙ  ＷＢら（１９７４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４６巻：１頁を参照されたい。ある特定の場合において、化合物は、ＧＤＦ／ＢＭＰリガンドに結合する化合物を検出するためのアッセイなど、機構に基づくアッセイにおいてスクリーニングすることができる。これは、固相または液相結合事象を含み得る。代替的に、ＧＤＦ／ＢＭＰリガンドをコードする遺伝子は、レポーター系（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）と共に細胞にトランスフェクトし、好ましくは、ハイスループットスクリーニングによって、またはライブラリーの個々のメンバーにより、ライブラリーに対してスクリーニングすることができる。他の機構に基づく結合アッセイ；例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイを使用することができる。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップへと固定された、または固定化された抗体によって捕捉された標的により行うことができる、あるいはキャピラリー電気泳動によって分離することができる。結合された化合物は、比色定量エンドポイントまたは蛍光もしくは表面プラズモン共鳴を通常使用して検出することができる。
【０２７３】
９．治療的使用
部分的には、本開示は、肺高血圧症（例えば、肺動脈高血圧症）を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質のうちの１つまたは複数のアンタゴニスト）を投与する工程を含む方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症（例えば、肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞増殖、肺動脈における血管新生、呼吸困難、胸痛、肺血管リモデリング、右室肥大および肺線維症）を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを投与する工程を含む方法を企図する。一部の実施形態では、本開示は、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症を予防する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを投与する工程を含む方法を企図する。一部の実施形態では、本開示は、肺高血圧症の進行速度を低減する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを投与する工程を含む方法を企図する。一部の実施形態では、本開示は、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症の進行速度を低減する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを投与する工程を含む方法を企図する。一部の実施形態では、本開示は、肺高血圧症の重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを投与する工程を含む方法を企図する。一部の実施形態では、本開示は、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症の重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを投与する工程を含む方法を企図する。任意選択で、肺高血圧症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減するための、特に肺高血圧症の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減するための本明細書で開示される方法は、肺高血圧症を処置するための１つまたは複数の支持療法または追加的な活性薬剤を患者に投与する工程をさらに含んでいてもよい。例えば、患者に、プロスタサイクリンおよびその誘導体（例えば、エポプロステノール、トレプロスチニル、およびイロプロスト）；プロスタサイクリン受容体アゴニスト（例えば、セレキシパグ）；エンドセリン受容体アンタゴニスト（例えば、ｔｈｅｌｉｎ、アンブリセンタン、マシテンタン、およびボセンタン）；カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピン）；抗凝固剤（例えば、ワーファリン）；利尿剤；酸素治療；心房中隔開裂術；肺血栓内膜摘除術；ホスホジエステラーゼ５型阻害剤（例えば、シルデナフィルおよびタダラフィル）；可溶性グアニル酸シクラーゼ活性化剤（例えば、シナシグアトおよびリオシグアト）；ＡＳＫ−１阻害剤（例えば、ＣＩＩＡ；ＳＣＨ７９７９７；ＧＳ−４９９７；ＭＳＣ２０３２９６４Ａ；３Ｈ−ナフト［１，２，３−デ］キニリン−２，７−ジオン、ＮＱＤＩ−１；２−チオキソ−チアゾリジン、５−ブロモ−３−（４−オキソ−２−チオキソ−チアゾリジン−５−イリデン）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン）；ＮＦ−κＢアンタゴニスト（例えば、ｄｈ４０４、ＣＤＤＯ−エポキシド；２．２−ジフルオロプロピオンアミド；Ｃ２８イミダゾール（ＣＤＤＯ−Ｉｍ）；２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアン−１，９−ジエン−２８−オイック酸（ＣＤＤＯ）；３−アセチルオレアノール酸；３−トリフルオロアセチルオレアノール酸；２８−メチル−３−アセチルオレアナン；２８−メチル−３−トリフルオロアセチルオレアナン；２８−メチルオキシオレアノール酸；ＳＺＣ０１４；ＳＣＺ０１５；ＳＺＣ０１７；オレアノール酸のペグ化誘導体；３−Ｏ−（ベータ−Ｄ−グルコピラノシル）オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；３−Ｏ−［ベータ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−ベータ−Ｄ−グルコピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；３−Ｏ−［ａ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルクロノピラノシル］オレアノール酸；３−Ｏ−［アルファ−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→３）−ベータ−Ｄ−グルクロノピラノシル］オレアノール酸２８−Ｏ−ベータ−Ｄ−グルコピラノシルエステル；２８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−オレアノール酸；３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（ＣＳ１）；オレアノール酸３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（ＣＳ２）；メチル３，１１−ジオキソオレアン−１２−エン−２８−オレート（ＤＩＯＸＯＬ）；ＺＣＶＩ４−２；ベンジル３−デヒドロ−オキシ−１，２，５−オキサジアゾロ［３’，４’：２，３］オレアノレート）、肺および／または心臓移植からなる群から選択される１つまたは複数の支持療法または活性薬剤も投与してもよい。一部の実施形態では、患者に、ＢＭＰ９ポリペプチドも投与してもよい。一部の実施形態では、ＢＭＰ９ポリペプチドは、成熟ＢＭＰ９ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＢＭＰ９ポリペプチドは、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ９ポリペプチドは、任意選択でＢＭＰ９プロドメインポリペプチドを含み得る医薬調製物において投与される。ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドを含むそのようなＢＭＰ９医薬調製物において、ＢＭＰ９ポリペプチドは、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドに非共有結合により会合し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ９医薬調製物は、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチドを実質的に含まないか、または含まない。ＢＭＰ９ポリペプチド（成熟ポリペプチドおよびプロポリペプチド）、ＢＭＰ９プロドメインポリペプチド、それを含む医薬組成物、ならびにそのようなポリペプチドおよび医薬組成物の発生の方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１５２２１３に記載されている。本明細書で使用される通り、障害または状態を「予防」する治療薬は、統計学的試料において、無処置対照試料と比べて処置された試料における障害もしくは状態の発生を低減する、または無処置対照試料と比べて障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発病を遅延させるもしくはその重症度を低減する化合物を指す。
【０２７４】
一部の実施形態では、本開示は、間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症）を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の、本明細書で開示されるＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストのいずれか（例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質のうちの１つまたは複数のアンタゴニスト）を投与する工程を含む方法に関する。一部の実施形態では、間質性肺疾患は、肺線維症である。一部の実施形態では、間質性肺疾患は、以下のうちのいずれか１つによって引き起こされる：珪肺症、石綿症、ベリリウム症、過敏性肺炎、薬物使用（例えば、抗生物質、化学療法薬、抗不整脈剤、スタチン）、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、感染症（例えば、非定型肺炎、ニューモシスティス肺炎、結核、ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよび／またはＲＳウイルス）、リンパ管性癌腫症、喫煙または発達障害。一部の実施形態では、間質性肺疾患は、特発性である（例えば、サルコイドーシス、特発性肺線維症、ハンマン−リッチ症候群および／または抗合成酵素症候群）。特定の実施形態では、間質性肺疾患は、特発性肺線維症である。一部の実施形態では、特発性肺線維症の処置は、追加的な治療剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、追加的な治療剤は、ピルフェニドン、Ｎ−アセチルシステイン、プレドニゾン、アザチオプリン、ニンテダニブ、それらの誘導体およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０２７５】
本明細書で使用される用語「処置する」は、確立された後の状態の好転または排除を含む。いずれの場合でも、予防または処置は、医師または他の医療提供者によって提供される診断および治療剤の投与の意図した結果において識別することができる。
【０２７６】
一般に、本開示に記載されている疾患または状態の処置または予防は、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを「有効量」で投与することにより達成される。薬剤の有効量は、必要な投薬量および期間で、所望の治療または予防的結果の達成に有効な量を指す。本開示の薬剤の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子に応じて変動し得る。「予防有効量」は、必要な投薬量および期間で、所望の予防的結果の達成に有効な量を指す。
【０２７７】
用語「被験体」、「個体」または「患者」は、明細書の全体にわたって交換可能であり、一般に哺乳動物を指す。哺乳動物としては、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよび齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７８】
肺高血圧症（ＰＨ）は、一次（特発性）または二次として以前に分類されている。最近、世界保健機構（ＷＨＯ）は、肺高血圧症を５つのグループに分類している：グループ１：肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）；グループ２：左心疾患を有する肺高血圧症；グループ３：肺疾患および／または低酸素血症を有する肺高血圧症；グループ４：慢性血栓性疾患および／または塞栓性疾患による肺高血圧症；ならびにグループ５：その他の状態（例えば、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシスＸ、リンパ管腫症および肺血管の圧迫）。例えば、Ｒｕｂｉｎ（２００４年）Ｃｈｅｓｔ  １２６巻：７〜１０頁を参照されたい。
【０２７９】
ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する（例えば、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する）方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質のうちの１つまたは複数のアンタゴニスト）を投与する工程を含む方法に関する。一部の実施形態では、方法は、肺動脈高血圧症を有する肺高血圧症患者に関する。一部の実施形態では、方法は、左心疾患を有する肺高血圧症を有する肺高血圧症患者に関する。一部の実施形態では、方法は、肺疾患および／または低酸素血症を有する肺高血圧症患者に関する。一部の実施形態では、方法は、慢性血栓性疾患および／または塞栓性疾患を有する肺高血圧症患者に関する。一部の実施形態では、方法は、サルコイドーシス、ヒスチオサイトーシスＸまたはリンパ管腫症および肺血管の圧迫を有する肺高血圧症患者に関する。
【０２８０】
肺動脈高血圧症は、著明な血管収縮および肺動脈壁における平滑筋細胞の異常増殖により特徴付けられる、肺血管系の重大で進行性の命にかかわる疾患である。肺の血管の重度収縮は、非常に高い肺動脈圧に結び付く。こうした高い圧力は、心臓が血液を酸素化のために肺に送り出すことを困難にする。ＰＡＨを有する患者は、心臓がこうした高い圧力に反して送血しようと奮闘する際に極端な息切れを被る。ＰＡＨを有する患者は、典型的には、肺血管抵抗（ＰＶＲ）の著しい増加および肺動脈圧（ＰＡＰ）の持続的上昇を発症する。これらは、最終的には右心不全および死に結び付く。ＰＡＨと診断された患者は、予後不良および同様に損なわれた生活の質を有し、平均余命は、処置しない場合は、診断時から２〜５年である。
【０２８１】
血管リモデリングに寄与する場合がある肺細胞の増殖（つまり過形成）を含む様々な因子が、肺高血圧症の病因に寄与する。例えば、肺血管リモデリングは、主に、肺高血圧症を有する患者の動脈内皮細胞および平滑筋細胞の増殖によって生じる。種々のサイトカインの過剰発現は、肺高血圧症を促進すると考えられている。さらに、肺高血圧症は、肺動脈平滑細胞および肺内皮細胞の過剰増殖から生じる場合があることが見出されている。またさらに、進行ＰＡＨは、遠位肺細動脈の筋性動脈化（ｍｕｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｔａｌ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉｏｌｅｓ）、同心円内膜肥厚（ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｉｎｔｉｍａｌ  ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ）および内皮細胞の増殖による血管腔の閉塞によって特徴付けることができる。Ｐｉｅｔｒａら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．、４３巻：２５５〜３２５頁（２００４年）。
【０２８２】
ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する（例えば、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する）方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質のうちの１つまたは複数のアンタゴニスト）を投与する工程を含み、患者が、少なくとも２５ｍｍ  Ｈｇ（例えば、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｍ  Ｈｇ）の安静時肺動脈圧（ＰＡＰ）を有する、方法に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも２５ｍｍ  Ｈｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも３０ｍｍ  Ｈｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも３５ｍｍ  Ｈｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも４０ｍｍ  Ｈｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも４５ｍｍ  Ｈｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも５０ｍｍ  Ｈｇの安静時ＰＡＰを有する患者に関する。
【０２８３】
一部の実施形態では、本開示は、ＰＨ患者の１つまたは複数の血行動態パラメーターを、より正常な（例えば、類似の年齢および性別の健康な人々と比較して正常な）レベルへと向けて調整する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質のうちの１つまたは複数のアンタゴニスト）を投与する工程を含む方法に関する。一部の実施形態では、方法は、ＰＡＰを低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも３ｍｍＨｇ低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも５ｍｍＨｇ低減することに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも７ｍｍＨｇ低減することに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも１０ｍｍＨｇ低減することに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも１２ｍｍＨｇ低減することに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも１５ｍｍＨｇ低減することに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも２０ｍｍＨｇ低減することに関する。ある特定の実施形態では、方法は、患者のＰＡＰを少なくとも２５ｍｍＨｇ低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、肺血管抵抗（ＰＶＲ）を低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、肺毛細血管楔入圧（ＰＣＷＰ）を増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、左室拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ）を増加させることに関する。
【０２８４】
ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質のうちの１つまたは複数のアンタゴニスト）を投与する工程を含む方法に関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の肺動脈における細胞増殖を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の肺動脈における平滑筋および／または内皮細胞の増殖を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の肺動脈における血管新生を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の身体活動を増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の呼吸困難を処置する、予防する、またはその進行速度および／または重症度を低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の胸痛を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の疲労を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の肺線維症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の繊維症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の肺血管リモデリングを処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症患者の右室肥大を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減することに関する。
【０２８５】
ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症を有する患者の運動能力を増加させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質のうちの１つまたは複数のアンタゴニスト）を投与する工程を含む、方法に関する。運動能力の任意の好適な尺度を使用することができる。肺高血圧症の重症度および疾患進行を評価するには、例えば、被験体が６分間でどれくらい遠くまで歩くことができるか、つまり６分間歩行距離（６ＭＷＤ）が測定される６分間歩行試験（６ＭＷＴ）での運動能力を使用することが多い。ボルグ呼吸困難指数（ＢＤＩ）は、自覚的な呼吸困難（呼吸不快感）を評価するための数値スケールである。この指数では、例えば６ＭＷＴの終了後の息切れの度合いが測定され、ＢＤＩが０の場合は息切れがないことを示し、１０の場合は息切れが最大であることを示す。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の６ＭＷＤを、少なくとも１０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の６ＭＷＤを、少なくとも２０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の６ＭＷＤを、少なくとも３０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の６ＭＷＤを、少なくとも４０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の６ＭＷＤを、少なくとも５０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の６ＭＷＤを、少なくとも６０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の６ＭＷＤを、少なくとも７０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の６ＭＷＤを、少なくとも８０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の６ＭＷＤを、少なくとも９０メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者の６ＭＷＤを、少なくとも１００メートル増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも０．５指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも１指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも１．５指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも２指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも２．５指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも３指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも３．５指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも４指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも４．５指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも５指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも５．５指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも６指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも６．５指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも７指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも７．５指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも８指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも８．５指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも９指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも９．５指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、少なくとも３指数ポイント低下させることに関する。一部の実施形態では、方法は、肺高血圧症を有する患者のＢＤＩを、１０指数ポイント低下させることに関する。
【０２８６】
ベースラインでの肺高血圧症は、例えば、肺高血圧症を有する患者の疾患重症度の尺度である世界保健機構（ＷＨＯ）機能分類により測定すると、軽度、中等度または重度であり得る。ＷＨＯ機能分類化は、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）方式の改変版であり、活動耐容能を質的に評価するために、例えば、疾患進行および処置に対する応答のモニターに慣例的に使用される（Ｒｕｂｉｎ（２００４年）Ｃｈｅｓｔ  １２６巻：７〜１０頁）。ＷＨＯ方式では４つの機能分類が認識される：Ｉ度：身体活動の制限を生じさせない肺高血圧症；通常の身体活動で、過度の呼吸困難もしくは疲労、胸痛またはめまいを引き起こさない；ＩＩ度：身体活動のわずかな制限を生じさせる肺高血圧症；患者は安静時には不快感はない；通常の身体活動で、過度の呼吸困難もしくは疲労、胸痛またはめまいを引き起こす；ＩＩＩ度：身体活動の顕著な制限を生じさせる肺高血圧症；患者は安静時には不快感はない；通常未満の活動で、過度の呼吸困難もしくは疲労、胸痛またはめまいを引き起こす；ＩＶ度：症状を示さずに一切の身体活動を行なうことができないことが生じる肺高血圧症；患者は、右心不全の徴候を呈する；呼吸困難および／または疲労は、安静時でさえ存在する場合がある；あらゆる身体活動によって不快感が増加される。
【０２８７】
ある特定の態様では、本開示は、肺高血圧症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する（例えば、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／もしくは重症度を低減する）方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質のうちの１つまたは複数のアンタゴニスト）を投与する工程を含み、患者が、ＷＨＯによって認められるＩ度、ＩＩ度、ＩＩＩ度またはＩＶ度の肺高血圧症を有する、方法に関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩ度の肺高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩＩ度の肺高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩ度の肺高血圧症からＩＩ度の肺高血圧症への患者進行を予防また遅延させることに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩＩ度の肺高血圧症からＩ度の肺高血圧症への患者後退を促進または増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩＩＩ度の肺高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩＩ度の肺高血圧症からＩＩＩ度の肺高血圧症への患者進行を予防また遅延させることに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩＩＩ度の肺高血圧症からＩＩ度の肺高血圧症への患者後退を促進または増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩＩＩ度の肺高血圧症からＩ度の肺高血圧症への患者後退を促進または増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩＶ度の肺高血圧症を有する患者に関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩＩＩ度の肺高血圧症からＩＶ度の肺高血圧症への患者進行を予防また遅延させることに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩＶ度の肺高血圧症からＩＩＩ度の肺高血圧症への患者後退を促進または増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩＶ度の肺高血圧症からＩＩ度の肺高血圧症への患者後退を促進または増加させることに関する。一部の実施形態では、方法は、ＷＨＯによって認められるＩＶ度の肺高血圧症からＩ度の肺高血圧症への患者後退を促進または増加させることに関する。
【０２８８】
肺高血圧症の公知の治癒方法は存在しない。現行の処置方法では、患者寿命の延長および患者の生活の質の増強に焦点が置かれている。肺高血圧症の現行の処置方法としては、プロスタシクリン、エポプロステノールおよびシルデナフィルなどの血管拡張薬；ボセンタンなどのエンドセリン受容体アンタゴニスト；アムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピンなどのカルシウムチャネル遮断薬；ワルファリンなどの抗凝血薬；ならびに利尿薬の投与が挙げられる。また、肺高血圧症の処置は、酸素療法、心房中隔開口術、肺血栓内膜摘除術ならびに肺および／または心臓移植を使用して実施されている。しかしながら、これらの方法の各々には、有効性の欠如、重大な副作用、低患者服薬遵守および高コストを含み得る１つまたは複数の欠点がある。ある特定の態様では、方法は、肺高血圧症を処置する、予防する、またはその進行速度および／または重症度を低減する（例えば、肺高血圧症の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその進行速度および／または重症度を低減する）ことに関し、それを必要とする患者に、有効量のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（例えば、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質のうちの１つまたは複数のアンタゴニスト）を、肺高血圧症を処置するための１つまたは複数の追加的な活性薬剤および／または支持療法（例えば、プロスタサイクリン、エポプロステノールおよびシルデナフィルなどの血管拡張薬；ボセンタンなどのエンドセリン受容体アンタゴニスト；アムロジピン、ジルチアゼムおよびニフェジピンなどのカルシウムチャネル遮断薬；ワルファリンなどの抗凝血薬；利尿薬；酸素療法；心房中隔開口術；肺血栓内膜摘除術：ならびに肺および／または心臓移植）、ＢＭＰ９ポリペプチド、ＢＭＰ１０ポリペプチド、バルドキソロンメチルまたはその誘導体、オレアノール酸またはその誘導体と組み合わせて投与する（例えば、同時にまたは異なる時点で、しかし、一般に、薬理学的／生理的効果の重複を達成するような様式で投与する）工程を含む。
【０２８９】
ある特定の実施形態では、本開示は、患者の１つまたは複数の血液学的パラメーターを測定することによって、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＧＤＦトラップポリペプチドなどのリガンドトラップ）で処置されているかまたは処置しようとする候補である患者を管理するための方法を提供する。血液学的パラメーターを使用して、本開示のアンタゴニストにより処置される候補である患者に適切な投薬を評価する、処置の際の血液学的パラメーターをモニターする、１つもしくは複数の本開示のアンタゴニストによる処置の際に投薬量を調整するべきかどうかを評価する、および／または１つもしくは複数の本開示のアンタゴニストの適切な維持用量を評価することができる。血液学的パラメーターのうち１つまたは複数が、正常レベルの外側にある場合、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストによる投薬は、低減、遅延または終結することができる。
【０２９０】
本明細書に提供されている方法に従って測定することができる血液学的パラメーターは、例えば、赤血球レベル、血圧、鉄貯蔵、および当技術分野で認識される方法を使用して、赤血球レベル増加と相関する体液中に見出される他の作用物質を含む。このようなパラメーターは、患者由来の血液試料を使用して決定することができる。赤血球レベル、ヘモグロビンレベルおよび／またはヘマトクリットレベルの増加は、血圧増加を引き起こすことができる。
【０２９１】
一実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメーターが、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストにより処置される候補である患者の正常範囲の外側または正常の高い側にある場合、１つまたは複数の本開示のアンタゴニストの投与の開始は、血液学的パラメーターが、天然にまたは治療介入により正常または許容されるレベルに戻るまで、遅延することができる。例えば、候補患者が、高血圧性または前高血圧性である場合、患者の血圧を低減するために、患者を降圧剤により処置することができる。例えば、利尿薬、アドレナリン作動性阻害剤（アルファ遮断薬およびベータ遮断薬を含む）、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬を含む、個々の患者の状態に適切な任意の降圧剤を使用することができる。血圧は、食事および運動レジメンを使用して代替的に処置することができる。同様に、候補患者が、正常よりも低いまたは正常の低い側にある鉄貯蔵を有する場合、患者の鉄貯蔵が正常または許容されるレベルに戻るまで、患者は、食事および／または鉄サプリメントの適切なレジメンにより処置することができる。正常よりも高い赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを有する患者のため、１つまたは複数の本開示のアンタゴニストの投与は、レベルが正常または許容されるレベルに戻るまで、遅延することができる。
【０２９２】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメーターが、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストにより処置される候補である患者における正常範囲の外側または正常の高い側にある場合、投与の開始は、遅延されなくてよい。しかし、１つまたは複数の本開示のアンタゴニストの投薬の投薬量または頻度は、１つまたは複数の本開示のアンタゴニストの投与により生じる血液学的パラメーターの許容できない増加のリスクを低減するであろう量に設定することができる。代替的に、望ましくないレベルの血液学的パラメーターに取り組む治療剤と、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストとを組み合わせる治療レジメンを、患者のために開発することができる。例えば、患者が、上昇した血圧を有する場合、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストおよび降圧剤の投与が関与する治療レジメンを設計することができる。所望の鉄貯蔵に満たないものを有する患者のため、１つまたは複数の本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストおよび鉄補給の治療レジメンを開発することができる。
【０２９３】
一実施形態では、１つまたは複数の本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストにより処置される候補である患者のために、１つまたは複数の血液学的パラメーターのベースラインパラメーター（複数可）を確立することができ、該患者のために確立される適切な投薬レジメンは、このベースライン値（複数可）に基づく。代替的に、患者の病歴に基づく確立されたベースラインパラメーターを使用して、患者に適切なアンタゴニスト投薬レジメンを通知することができる。例えば、健康な患者が、定義された正常範囲を上回る確立されたベースライン血圧読み取り値を有する場合、患者の血圧を、１つまたは複数の本開示のアンタゴニストによる処置に先立つ母集団にとって正常と考慮される範囲に収める必要がない場合がある。１つまたは複数の本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストによる処置に先立つ１つまたは複数の血液学的パラメーターの患者ベースライン値は、１つまたは複数の本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストによる処置における血液学的パラメーターに対するいずれかの変化をモニターするための関連する比較値として使用することもできる。
【０２９４】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメーターは、１つまたは複数の本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストにより処置されている患者において測定される。血液学的パラメーターを使用して、処置中の患者をモニターし、１つもしくは複数の本開示のアンタゴニストによる投薬または別の治療剤による追加的な投薬の調整または終結を可能にすることができる。例えば、本開示の１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの投与が、血圧、赤血球レベルもしくはヘモグロビンレベルの増加または鉄貯蔵の低減をもたらす場合、１つまたは複数の血液学的パラメーターにおける１つまたは複数の本開示のアンタゴニストの効果を減少させるために、１つまたは複数の本開示のアンタゴニストの用量は、量または頻度を低減することができる。１つまたは複数の本開示のアンタゴニストの投与が、患者にとって有害である１つまたは複数の血液学的パラメーターの変化をもたらす場合、血液学的パラメーター（複数可）が許容されるレベルに戻るまで一時的に、あるいは永続的に、１つまたは複数の本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストの投薬を終結することができる。同様に、１つまたは複数の本開示のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーヘテロ多量体の複合体の用量または投与頻度を低減した後に、１つまたは複数の血液学的パラメーターが、許容される範囲内に収まらない場合、投薬を終結することができる。１つまたは複数の本開示のアンタゴニストによる投薬の低減または終結の代替として、またはそれに加えて、患者に、例えば、降圧剤または鉄サプリメントなど、血液学的パラメーター（複数可）における望ましくないレベルに取り組む追加的な治療剤を投薬することができる。例えば、１つまたは複数の本開示のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストにより処置されている患者が、上昇した血圧を有する場合、１つまたは複数の本開示のアンタゴニストによる投薬を同じレベルで続けることができ処置レジメンに降圧剤が加えられる、１つまたは複数の本開示のアンタゴニストによる投薬を低減する（例えば、量および／または頻度において）ことができ処置レジメンに降圧剤が加えられる、あるいは１つまたは複数の本開示のアンタゴニストによる投薬を終結することができ患者を降圧剤により処置することができる。
【０２９５】
１０．医薬組成物
本明細書に記載される治療剤（例えば、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト）は、医薬組成物へと製剤化することができる。本開示に従って使用するための医薬組成物は、１つまたは複数の生理的に許容されるキャリアまたは賦形剤を使用して、従来の様式で製剤化することができる。そのような製剤は、一般に、実質的に発熱物質不含であり、ほとんどの規制要件を遵守するだろう。
【０２９６】
ある特定の実施形態では、本開示の治療方法は、組成物を、全身的にまたはインプラントもしくはデバイスとして局所的に投与する工程を含む。本開示での使用のための治療組成物は、投与されるときに、実質的に発熱物質不含のまたは発熱物質不含の生理的に許容される形態である。上に記載されている組成物にも任意選択で含まれていてもよい、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト以外の治療上有用な薬剤は、本明細書で開示される方法では対象化合物と同時にまたは逐次的に投与してよい。
【０２９７】
典型的には、本明細書で開示されるタンパク質治療剤は、非経口で、特に静脈内にまたは皮下に投与されるであろう。非経口的投与に適する医薬組成物は、１つもしくは複数の薬学的に許容される無菌等張性水性もしくは非水性溶液、分散物、懸濁物もしくはエマルジョン、または使用直前に無菌注射用溶液もしくは注射用分散物に再構成され得る無菌粉末と組み合わせて、１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを含み得る。注射用溶液または注射用分散物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有し得る。本開示の医薬組成物中で利用され得る、適切な水性および非水性のキャリアの例として、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなど）およびそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散物の場合には必要とされる粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０２９８】
組成物および製剤は、所望の場合、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在し得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付されていてもよい。
【０２９９】
さらに、組成物は、標的組織部位に送達するための形態で封入または注射することができる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数の治療化合物（例えば、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト）を標的組織部位に送達し得、成長中の組織のための構造を提供し得、および最適には身体内へと吸収され得るマトリクスを含み得る。例えば、マトリクスは、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストのゆっくりとした放出を提供し得る。そのようなマトリクスは、他の移植医療用途に現在使用される材料から形成され得る。
【０３００】
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面の特性に基づく。対象組成物の特定の用途が、適切な製剤を定義するであろう。組成物のための可能性のあるマトリクスは、生分解性でかつ既知組成の硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ酸無水物であり得る。他の可能性のある材料は、骨または皮膚コラーゲンなど、生分解性でかつ生物学的に十分に規定されているものである。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクスの成分から構成される。他の可能性のあるマトリクスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩または他のセラミクスなど、非生分解性でかつ化学的に規定されたものである。マトリクスは、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなど、上述の種類の材料のうちのいずれかの組合せで構成されていてよい。バイオセラミクスは、カルシウム−アルミン酸−リン酸（ｃａｌｃｉｕｍ−ａｌｕｍｉｎａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などの組成を変化させることができ、孔径、粒子径、粒子の形状および生分解性を変更するように加工することができる。
【０３０１】
ある特定実施形態では、本発明の方法は、例えば、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（矯味矯臭基剤（ｆｌａｖｏｒｅｄ  ｂａｓｉｓ）、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガントを使用）、散剤、顆粒剤の形態で、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁物として、または水中油型もしくは油中水型の液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップまたは香錠（ｐａｓｔｉｌｌｅ）（ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を使用）として、および／またはうがい薬などとして経口投与することができる。各々は、既定量の薬剤を活性成分として含有する。薬剤は、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与することもできる。
【０３０２】
経口投与のための固体剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤および顆粒剤など）において、１つまたは複数の本発明の治療化合物は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなどの１つもしくは複数の薬学的に許容されるキャリア、ならびに／または以下のうちのいずれかと混合され得る：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／もしくはケイ酸などの充填剤もしくは増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／もしくはアカシアなどの結合剤；（３）グリセロールなどの保湿剤；（４）アガー−アガー、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケートおよび炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；（６）四級アンモニウム化合物などの吸収加速剤；（７）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイトクレイなどの吸着剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物などの滑沢剤；ならびに（１０）着色剤。カプセル、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝剤も含み得る。同様の種類の固体組成物も、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟質充填ゼラチンカプセル中および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することができる。
【０３０３】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシル剤を含む。活性成分に加えて、液体剤形は、水もしくは他の溶媒、可溶化剤および乳化剤など、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、アメリカホドイモ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含有し得る。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤および保存剤などのアジュバントも含み得る。
【０３０４】
懸濁物は、活性化合物に加えて、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、アガー−アガー、およびトラガント、およびこれらの組合せなどの懸濁剤を含有し得る。
【０３０５】
また、本発明の組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の活動の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノールおよびフェノールソルビン酸などの包含によって確実にすることができる。糖および塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に組み入れることも望ましいと考えられる。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の延長も、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を組み入れることによりもたらすことができる。
【０３０６】
投与レジメンは、本開示の対象化合物（例えば、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト）の作用を修飾する種々の因子を考慮して主治医によって決定されることが理解される。種々の因子としては、患者の年齢、性別および食事、重症度疾患、投与の時間ならびに他の臨床的因子が挙げられるがこれらに限定されない。任意選択で、投薬量は、再構成に使用されるマトリクスの種類、および組成物中の化合物の種類に応じて様々であり得る。最終組成物への他の公知の増殖因子の追加も、投薬量に影響を与え得る。進行は、骨成長および／または修復の定期的評価、例えば、Ｘ線（ＤＥＸＡを含む）、組織形態計測的決定およびテトラサイクリン標識化によってモニターすることができる。
【０３０７】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストのｉｎ  ｖｉｖｏ産生のための遺伝子療法も提供する。このような治療法は、上に収載されている障害を有する細胞または組織内へのＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストポリヌクレオチド配列の導入によって、その治療効果を達成するであろう。ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を使用して達成することができる。ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストポリヌクレオチド配列の好ましい治療送達は、標的化リポソームの使用である。
【０３０８】
本明細書で教示される遺伝子療法に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの追加的なレトロウイルスベクターが、複数の遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターには全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーの遺伝子を移送または組み込むことができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって標的特異的にすることができる。好ましい標的化は、抗体を使用することによって達成される。当業者であれば、特定のポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムに挿入するかまたはウイルスエンベロープに付着させて、ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にすることができることを認識する。好ましい実施形態では、ベクターは、骨または軟骨を標的化する。
【０３０９】
あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、レトロウイルスの構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、次いで、関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【０３１０】
ＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニストポリペプチドのための別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして有用な人工の膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンが、水性の内部に封入され得、そして生物学的に活性な形態で細胞へと送達され得る。例えば、Ｆｒａｌｅｙら（１９８１年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、６巻：７７頁を参照されたい。リポソームビヒクルを用いた効率的な遺伝子移入のための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８年を参照されたい。通常、リポソームの組成は、通常はステロイド、特にコレステロールと組み合わせたリン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質も使用することができる。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
【０３１１】
リポソーム産生に有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。また、リポソームの標的化は、例えば、器官特異性、細胞特異性および細胞小器官特異性に基づくことも可能であり、当技術分野で公知である。
【０３１２】
本開示は、ｐＨを調整するための酸および塩基ならびにｐＨを狭い範囲内に維持する緩衝剤を含むように変更され得る製剤を提供する。
【実施例】
【０３１３】
本発明について全般的に記載してきたが、次の実施例を参照することにより、より容易に理解できるであろう。この実施例は、単に本発明のある特定の実施形態を例証する目的で含まれており、本発明の限定を意図するものではない。
（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質
【０３１４】
その間に最小限のリンカーを有する、ヒトまたはマウスのＦｃドメインに融合しているヒトＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメインを有する、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質を構築した。構築物は、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃとそれぞれ呼ぶ。
【０３１５】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、ＣＨＯ細胞系から精製されたものを下に示す（配列番号３２）：
【化３７】
2019521144.tif 000039
【０３１６】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃタンパク質は、ＣＨＯ細胞系で発現された。３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号３３）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号３４）
（ｉｉｉ）天然：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号３５）。
【０３１７】
選択された形態はＴＰＡのリーダーを用い、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する：
【化３８】
2019521144.tif 000040
【０３１８】
このポリペプチドは、以下の核酸配列によってコードされる：
【化３９】
2019521144.tif 000041
【化４０】
2019521144.tif 000042
【０３１９】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃの両方は、組換え発現に非常に適合した。図５に示すように、タンパク質は、タンパク質の単一の明確なピークとして精製された。Ｎ末端配列決定は、−ＩＬＧＲＳＥＴＱＥ（配列番号３８）の単一の配列を明らかにした。精製は、例えば、次のうち３種またはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了することができる。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって判定したときは９８％を超える、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって判定したときは９５％を超える純度に精製された。
【０３２０】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃは、リガンドへの高いアフィニティーを示した。標準のアミンカップリング手順を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップの上にＧＤＦ１１またはアクチビンＡを固定化した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃタンパク質を系に加え、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは５×１０−１２の解離定数（ＫＤ）でアクチビンに結合し、９．９６×１０−９のＫＤでＧＤＦ１１に結合した。図６を参照されたい。類似の結合アッセイを使用して、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、例えば、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６およびＢＭＰ１０を含む他のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドへの高度から中等度のアフィニティーを有すると判定された。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃは、同様にふるまった。
【０３２１】
薬物動態学的研究において、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは非常に安定していた。ラットに１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質を投与し、タンパク質の血漿中レベルを２４、４８、７２、１４４および１６８時間後に測定した。別個の研究では、ラットに１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇで投与した。ラットでは、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは１１〜１４日の血清中半減期を有し、薬物の循環レベルは２週後にかなり高かった（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの最初の投与の場合はそれぞれ１１μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌまたは３０４μｇ／ｍｌ）。カニクイザルでは、血漿中半減期は１４日を実質的に超え、薬物の循環レベルは１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの最初の投与の場合はそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、３０４μｇ／ｍｌまたは１４４０μｇ／ｍｌであった。
（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質の特徴付け
【０３２２】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃ融合タンパク質は、配列番号３４の組織プラスミノーゲンリーダー配列を使用して、ｐＡＩＤ４ベクター（ＳＶ４０複製起点／エンハンサー、ＣＭＶプロモーター）から安定してトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞において発現された。実施例１において上記の通り精製されたタンパク質は、配列番号３２の配列を有した。配列番号３２に示すように、Ｆｃ部分は、ヒトのＩｇＧ１  Ｆｃ配列である。タンパク質分析は、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃ融合タンパク質がジスルフィド結合を有するホモ二量体として形成されることを明らかにする。
【０３２３】
ＣＨＯ細胞で発現された物質は、ヒトの２９３細胞で発現されたＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃ融合タンパク質について報告されたものより高いアフィニティーをアクチビンＢリガンドに対して有する（ｄｅｌ  Ｒｅら（２００４年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９巻（５１号）：５３１２６〜５３１３５頁を参照）。さらに、ＴＰＡリーダー配列の使用は他のリーダー配列より大きな生産を提供し、天然のリーダーで発現されるＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃと異なって高度に純粋なＮ末端配列を提供した。天然のリーダー配列の使用は、異なるＮ末端配列を各々有する２つの主要な種類のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃをもたらした。
（実施例３）
代替ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃタンパク質
【０３２４】
本明細書で記載される方法によって使用することができる様々なＡｃｔＲＩＩＡ改変体は、参照によりそれらの全体を本明細書に組み込む、ＷＯ２００６／０１２６２７として公開された国際特許出願（例えば、５５〜５８頁を参照）に記載される。代替構築物は、Ｃ末端のテイル（ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインの最後の１５アミノ酸）の欠失を有することができる。そのような構築物の配列は、下に提示される（Ｆｃ部分は下線が引かれる）（配列番号３９）：
【化４１】
2019521144.tif 000043
（実施例４）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の生成
【０３２５】
本出願人らは、その間に最小限のリンカーを有する、ヒトまたはマウスのＦｃドメインに融合しているヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを有する、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質を構築した。構築物は、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃとそれぞれ呼ぶ。
【０３２６】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃは、ＣＨＯ細胞系から精製されたものを下に示す（配列番号４０）：
【化４２−１】
2019521144.tif 000044
【０３２７】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃタンパク質は、ＣＨＯ細胞系で発現された。３つの異なるリーダー配列を検討した：（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）、（ｉｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、および（ｉｉｉ）天然：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号４１）。
【０３２８】
選択された形態はＴＰＡのリーダーを用い、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列（配列番号４２）を有する：
【化４２−２】
2019521144.tif 000045
【０３２９】
このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号４３）によってコードされる：
【化４３】
2019521144.tif 000046
【化４４】
2019521144.tif 000047
【０３３０】
ＣＨＯ細胞で生成された物質のＮ末端配列決定は、−ＧＲＧＥＡＥの主要な配列（配列番号４４）を明らかにした。注目すべきことに、文献で報告された他の構築物は、−ＳＧＲ…配列で始まる。
【０３３１】
精製は、例えば、次のうち３種またはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了することができる。
【０３３２】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＯＳ細胞でも発現された。全ての細胞系および相応な培養条件に由来する物質はｉｎ  ｖｉｖｏで筋肉増強活性を有するタンパク質を提供したが、おそらく細胞系の選択および／または培養条件に関係した効力の変動が観察された。
【０３３３】
本出願人らはＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインにおける一連の突然変異を生成し、これらの突然変異タンパク質を細胞外ＡｃｔＲＩＩＢとＦｃドメインの間の可溶性融合タンパク質として生成した。バックグラウンドＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合は、配列番号４０の配列を有する。
【０３３４】
Ｎ末端およびＣ末端の切断を含む様々な突然変異を、バックグラウンドＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質に導入した。本明細書に提示されるデータに基づいて、ＴＰＡリーダーと発現されるならば、これらの構築物はＮ末端のセリンを欠くと予想される。ＰＣＲ突然変異誘発によって、突然変異をＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに生成した。ＰＣＲの後、Ｑｉａｇｅｎカラムを通して断片を精製し、ＳｆｏＩおよびＡｇｅＩで消化し、ゲル精製した。ライゲーションの後にそれがヒトＩｇＧ１と融合キメラを形成するように、これらの断片を発現ベクターｐＡＩＤ４（ＷＯ２００６／０１２６２７を参照されたい）にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５アルファへの形質転換の後に、コロニーを選び出し、ＤＮＡを単離した。マウス構築物（ｍＦｃ）のために、マウスのＩｇＧ２ａをヒトのＩｇＧ１のために置換した。全ての突然変異体の配列を検証した。
【０３３５】
突然変異体の全ては、一時的なトランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生成した。要約すると、５００ｍｌスピナーにおいて、２５０ｍｌ容量のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地においてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６×１０５細胞／ｍｌに設定し、一晩増殖させた。翌日、これらの細胞を、０．５μｇ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度のＤＮＡ：ＰＥＩ（１：１）複合体で処理した。４時間後に、２５０ｍｌの培地を加え、細胞を７日間増殖させた。細胞を遠沈させることによって馴化させた培地を収集し、濃縮した。
【０３３６】
突然変異体は、例えば、プロテインＡカラムを含む様々な技術を使用して精製し、低ｐＨ（３．０）のグリシン緩衝液で溶出した。中和の後、これらをＰＢＳに対して透析した。
【０３３７】
類似の方法によって、ＣＨＯ細胞においても突然変異体を生成した。本明細書に参照により組み込まれているＷＯ２００８／０９７５４１およびＷＯ２００６／０１２６２７に記載される結合アッセイおよび／またはバイオアッセイにおいて、突然変異体を試験した。一部の場合には、アッセイは、精製タンパク質ではなく馴化培地で実行した。ＡｃｔＲＩＩＢのさらなる変異形は、米国特許第７，８４２，６６３号に記載されている。
【０３３８】
本出願人らは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃ融合タンパク質を生成し、それは、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを、天然のＡｃｔＲＩＩＢのリーダーのために置換されたＴＰＡリーダー配列とＮ末端で、および最小限のリンカー（３つのグリシン残基）を通してヒトＦｃドメインとＣ末端で融合している、Ｎ末端およびＣ末端の切断（天然タンパク質配列番号１の残基２５〜１３１）と含む（図７）。この融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、図８に示す。本出願人らはコドンを改変し、最初の形質転換体の発現レベルにおける実質的な向上を提供したＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃタンパク質をコードする改変体核酸を見出した（図９）。
【０３３９】
成熟したタンパク質は、以下のようなアミノ酸配列を有する（Ｎ末端はＮ末端配列決定によって確認された）（配列番号４５）：
【化４５】
2019521144.tif 000048
【化４６】
2019521144.tif 000049
【０３４０】
例えば、次のうち３種またはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程を使用して、発現された分子を精製した：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了することができる。
【０３４１】
ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃおよびその完全長対応物ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃのためのいくつかのリガンドのアフィニティーを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）機器によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価し、結果は下の表に要約されている。Ｋｄ値は、ｋｏｎおよびｋｏｆｆの正確な判定を阻止した、複合体の非常に迅速な会合および解離による定常状態のアフィニティーあてはめによって得られた。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５〜１３１）−ｈＦｃは、例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１に高いアフィニティーで結合した。
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ形態のリガンドアフィニティー：
【表２】
2019521144.tif 000050
【０３４２】
（実施例５）
ＧＤＦトラップの生成
【０３４３】
ＧＤＦトラップは、以下の通りに構築した。ＧＤＦ１１と比較して大いに低減されたアクチビンＡ結合性を有するＡｃｔＲＩＩＢの改変された細胞外ドメイン（Ｌ７９Ｄ置換を有する配列番号１のアミノ酸２０〜１３４）、および／またはミオスタチン（配列番号１の７９位のロイシンからアスパラギン酸への置換の結果として）を有するポリペプチドを、その間に最小限のリンカーを有する、ヒトまたはマウスのＦｃドメインに融合させた。構築物は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｍＦｃとそれぞれ呼ばれる。７９位にアスパラギン酸ではなくグルタミン酸を有する代替形態は、同様の成績を上げた（Ｌ７９Ｅ）。下の配列番号６４に関して２２６位にバリンではなくアラニンを有する代替形態も生成し、試験したあらゆる点で同等の成績を上げた。７９位（配列番号１に関連して）のアスパラギン酸は、下において二重下線で示される。配列番号６４に関連して２２６位のバリンも、下において二重下線で示される。
【０３４４】
ＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃは、ＣＨＯ細胞系から精製されたものを下に示す（配列番号４６）。
【化４７】
2019521144.tif 000051
【０３４５】
ＧＤＦトラップのＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分は、下に示すアミノ酸配列を有し（配列番号４７）、その部分は、単量体として、または非Ｆｃ融合タンパク質として、単量体、二量体もしくはより大きなオーダーの複合体として使用することができる。
【化４８】
2019521144.tif 000052
【０３４６】
ＧＤＦトラップタンパク質は、ＣＨＯ細胞系で発現させた。３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）、（ｉｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、および（ｉｉｉ）天然。
【０３４７】
選択された形態はＴＰＡのリーダーを用い、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する：
【化４９】
2019521144.tif 000053
【０３４８】
このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号４９）によってコードされる：
【化５０】
2019521144.tif 000054
【０３４９】
精製は、例えば、次のうち３種またはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了することができる。精製スキームの例では、プロテインＡカラムに細胞培地を通し、１５０ｍＭトリス／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄し、次に５０ｍＭトリス／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄し、０．１ＭグリシンｐＨ３．０で溶出する。低ｐＨの溶出液は、ウイルスのクリアランス工程として３０分の間室温に保たれる。溶出液を次に中和し、Ｑ−セファロースイオン交換カラムに通し、５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌで洗浄し、１５０ｍＭから３００ｍＭの間のＮａＣｌ濃度を有する５０ｍＭトリスｐＨ８．０で溶出する。溶出液を次に５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１．１Ｍ硫酸アンモニウムに変更し、フェニルセファロースカラムに通し、洗浄し、１５０から３００ｍＭの間の硫酸アンモニウムを有する５０ｍＭトリスｐＨ８．０で溶出する。溶出液を透析し、使用のために濾過する。
【０３５０】
さらなるＧＤＦトラップ（アクチビンＡ結合のミオスタチンまたはＧＤＦ１１結合に対する比を低減するように改変したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質）は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／０９７５４１およびＷＯ２００６／０１２６２７に記載される。
（実施例６）
ＧＤＦ１１−およびアクチビン媒介シグナル伝達のためのバイオアッセイ
【０３５１】
ＧＤＦ−１１およびアクチビンＡによるシグナル伝達に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの作用を評価するために、Ａ−２０４リポーター遺伝子アッセイを使用した。細胞系：ヒト横紋筋肉腫（筋肉に由来する）。リポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８年、ＥＭＢＯ１７巻：３０９１〜３１００頁に記載される）。ＣＡＧＡ１２モチーフはＴＧＦ−ベータ応答性遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１遺伝子）に存在するので、このベクターはＳＭＡＤ２および３を通してシグナル伝達する因子のために一般的に有用である。
１日目：Ａ−２０４細胞を４８ウェルプレートに分割する。
２日目：Ａ−２０４細胞は、１０μｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０μｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）およびＦｕｇｅｎｅでトランスフェクトした。
３日目：因子（培地＋０．１％のＢＳＡに希釈する）を加える。細胞に加える前に、阻害剤を因子と１時間プレインキュベートする必要がある。６時間後に、細胞をＰＢＳですすぎ、溶解した。
【０３５２】
これの後に、ルシフェラーゼアッセイが続く。いかなる阻害剤の不在下で、アクチビンＡは、リポーター遺伝子発現の１０倍の刺激および約２ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０を示した。ＧＤＦ−１１：１６倍の刺激、ＥＤ５０：約１．５ｎｇ／ｍｌ。
【０３５３】
このアッセイにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）は、例えば、アクチビンＡ、ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−１１活性の強力な阻害剤である。下記のように、ＡｃｔＲＩＩＢ変異体もこのアッセイで試験した。
（実施例７）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ改変体、細胞ベースの活性
【０３５４】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの活性を、上記の通り細胞ベースのアッセイで試験した。結果は、下の表に要約する。一部の改変体は、異なるＣ末端の切断構築物の形で試験した。上記のように、５または１５アミノ酸の切断は、活性の低減を引き起こした。ＧＤＦトラップ（Ｌ７９ＤおよびＬ７９Ｅ変異体）は、アクチビンＡ阻害のかなりの低下を示したが、ＧＤＦ１１の野生型の阻害をほとんど保持していた。
ＧＤＦ１１およびアクチビンＡへの可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの結合：
【表３−１】
2019521144.tif 000055
【表３−２】
2019521144.tif 000056
【０３５５】
Ａ２４Ｎ改変体は、細胞ベースのアッセイ（上）において、野生型分子に同等である活性を有する。Ａ２４Ｎ改変体、および上で試験した他の改変体のいずれも、Ｌ７９ＤまたはＬ７９Ｅ改変体などのＧＤＦトラップ分子と組み合わせることができる。
【０３５６】
（実施例８）
ＧＤＦ１１およびアクチビンＡ結合
【０３５７】
ある特定のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップのリガンドへの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイで試験した。
【０３５８】
抗ｈＦｃ抗体を使用して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ改変体または野生型タンパク質を系の上で捕捉した。リガンドを注入し、捕捉した受容体タンパク質の上に流した。結果は、下の表に要約する。
【０３５９】
ＩＩＢ改変体のリガンド結合特異性。
【表４−１】
2019521144.tif 000057
【表４−２】
2019521144.tif 000058
【表４−３】
2019521144.tif 000059
【０３６０】
無細胞アッセイで得られたこれらのデータは、細胞ベースのアッセイのデータを追認し、Ａ２４Ｎ改変体が、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃ分子のそれと類似であるリガンド結合活性を保持すること、ならびに、Ｌ７９ＤまたはＬ７９Ｅ分子はミオスタチンおよびＧＤＦ１１結合を保持するが、アクチビンＡに対しては著しく低下した（数量化不可能）結合を示すことを実証する。
【０３６１】
ＷＯ２００６／０１２６２７（参照によりそれらの全体を本明細書に組み込む）に報告されるように、他の改変体が生成され、試験されている。例えば、装置に連結したリガンドを使用し、連結したリガンドの上に受容体を流す５９〜６０頁を参照。注目すべきことに、野生型Ｋ７４分子と比較して、Ｋ７４Ｙ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ（および、おそらくＫ７４ＬなどのＫ７４における他の疎水性の置換）およびＤ８０Ｉは、アクチビンＡ（ＡｃｔＡ）結合のＧＤＦ１１結合に対する比の低下を引き起こす。これらの改変体に関するデータの表を、下に再生する：
ＧＤＦ１１およびアクチビンＡへの可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ改変体の結合（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ）
【表５−１】
2019521144.tif 000060
【表５−２】
2019521144.tif 000061
【表５−３】
2019521144.tif 000062
（実施例９）
切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインによるＧＤＦトラップの生成
【０３６２】
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃと呼ばれるＧＤＦトラップは、ロイシンからアスパラギン酸への置換（配列番号１の残基７９における）を含有するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２０〜１３４）へのＴＰＡリーダーのＮ末端融合、および最小限のリンカー（３つのグリシン残基）によるヒトＦｃドメインのＣ末端融合によって生成した（図１０；配列番号７４）。この融合タンパク質に対応するヌクレオチド配列は、図１１に示す（配列番号７５、センス鎖；配列番号７６、アンチセンス鎖）。
【０３６３】
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃと呼ばれる、切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップは、ロイシンからアスパラギン酸への置換（配列番号１の残基７９における）を含有する切断された細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５〜１３１）へのＴＰＡリーダーのＮ末端融合、および最小限のリンカー（３つのグリシン残基）によるヒトＦｃドメインのＣ末端融合によって生成した（図１２；配列番号７７）。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃの細胞精製形態の配列は、図１３に提示される（配列番号７８）。この融合タンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列は、その相補配列（配列番号８１）と一緒に図１５（配列番号８０）に示し、正確に同じ融合タンパク質をコードする代替のヌクレオチド配列は、その相補性配列（配列番号８３）と図１６（配列番号８２）に示す。
（実施例１０）
二重に切断されたＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインによるＧＤＦトラップによる選択的リガンド結合
【０３６４】
いくつかのリガンドに対するＧＤＦトラップおよび他のＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃタンパク質のアフィニティーを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）機器によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。結果は、下の表に要約する。Ｋｄ値は、ｋｏｎおよびｋｏｆｆの正確な判定を阻止した、複合体の非常に迅速な会合および解離による定常状態のアフィニティーあてはめによって得られた。
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ改変体のリガンド選択性：
【表６】
2019521144.tif 000063
【０３６５】
切断された細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃは、より長い改変体、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃによって提示されるリガンド選択性と同等であったかそれを凌ぎ、Ｌ７９Ｄ置換を欠いているＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ対応物と比較して、アクチビンＡ結合の顕著な減少、アクチビンＢ結合の部分的な喪失、およびＧＤＦ１１結合のほとんど完全な保持を伴った。切断単独（Ｌ７９Ｄ置換なし）は、ここに提示されるリガンドの間での選択性を変更しなかったことに留意する（ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９  ２５〜１３１）−ｈＦｃをＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９  ２０〜１３４）−ｈＦｃと比較する）。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃは、Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達リガンドＧＤＦ８ならびにＳｍａｄ１／５／８リガンドＢＭＰ６およびＢＭＰ１０への強力ないし中程度の結合も保持する。
（実施例１１）
ＡｃｔＲＩＩＢ５に由来したＧＤＦトラップ
【０３６６】
他の人は、ＡｃｔＲＩＩＢ膜貫通ドメインを含むエクソン４が異なるＣ末端配列と置き換えられた、ＡｃｔＲＩＩＢの代わりの可溶性形態を報告した（ＡｃｔＲＩＩＢ５と命名された）（例えば、ＷＯ２００７／０５３７７５を参照）。
【０３６７】
そのリーダーのない天然のヒトＡｃｔＲＩＩＢ５の配列は、以下の通りである：
【化５１】
2019521144.tif 000064
【０３６８】
天然の７９位（下線付き）において、以下の配列を有する改変体ＡｃｔＲＩＩＢ５（Ｌ７９Ｄ）を構築すると記載された、ロイシンからアスパラギン酸への置換または他の酸性置換を実行することができる：
【化５２】
2019521144.tif 000065
【化５３】
2019521144.tif 000066
【０３６９】
以下の配列を有するヒトＡｃｔＲＩＩＢ５（Ｌ７９Ｄ）−ｈＦｃ融合タンパク質を生成するために、この改変体は、ＴＧＧＧリンカー（単一の下線）でヒトＦｃ（二重下線）に連結することができる：
【化５４】
2019521144.tif 000067
【０３７０】
この構築物は、ＣＨＯ細胞で発現させることができる。
【０３７１】
本出願人らは、細胞外ドメインとＦｃドメインとの間に位置するリンカーを用いてＦｃドメインに対して各々別々に融合される、ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡＬＫ４の細胞外ドメインを含む、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロマーの複合体を構築した。この個々の構築物は、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドと呼ばれ、各々の配列を下に示す。
【０３７２】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体の複合体とは対照的に、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロマーの複合体の形成を促進するための方法論は、非対称ヘテロマーの複合体の形成をガイドするために、Ｆｃドメインのアミノ酸配列に変更を導入することである。Ｆｃドメインを使用して非対称相互作用ペアを作製するための多くの異なるアプローチが、本開示に記載されている。
【０３７３】
１つのアプローチにおいて、それぞれ、配列番号１０８および１１０および配列番号１１および１１３のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃポリペプチド配列において例証されている通り、一方のＦｃドメインが、相互作用面にカチオン性アミノ酸を導入するように変更されているが、他方のＦｃドメインは、相互作用面にアニオン性アミノ酸を導入するように変更されている。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、各々、組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー：
を用いる。
【０３７４】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１０８）を下に示す。
【化５５】
2019521144.tif 000068
【０３７５】
このリーダー（シグナル）配列およびリンカーには下線を引く。可能性のあるホモ二量体の複合体のいずれでもなく、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するため、２個のアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンにより置き換える）を、上記の二重下線で指し示す通り、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のＦｃドメインに導入してもよい。配列番号１０８のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）が取り除かれてもよい。
【０３７６】
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号１０９）によってコードされる。
【化５６】
2019521144.tif 000069
【化５７】
2019521144.tif 000070
【０３７７】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１１０）は以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）が取り除かれてもよい。
【化５８】
2019521144.tif 000071
【０３７８】
相補的な形態のＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１１１）は、以下の通りである。
【化５９】
2019521144.tif 000072
【０３７９】
リーダー配列およびリンカーには、下線を引く。上記の配列番号１０８および１１０のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成をガイドするために、２アミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸により置き換える）を上記の二重下線で指し示す通りＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入してもよい。配列番号１１１のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端でリシン（Ｋ）が付加されてもよい。
【０３８０】
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１１２）によってコードされる：
【化６０】
2019521144.tif 000073
【化６１】
2019521144.tif 000074
【０３８１】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号１１３）は以下の通りであり、任意選択でＣ末端でリシンが付加されてもよい。
【化６２】
2019521144.tif 000075
【０３８２】
それぞれ配列番号１１０および配列番号１１１３のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質を共発現させ、ＣＨＯ細胞株から精製して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを含むヘテロマーの複合体を生じさせてもよい。
【０３８３】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体の複合体の形成を促進するための別のアプローチでは、Ｆｃドメインを、それぞれ配列番号１１４および１１５ならびに配列番号１１６および１１７のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃポリペプチド配列に図示されるように、相補的な疎水性相互作用および追加の分子間ジスルフィド結合を導入するように変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは各々、組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダーを用いる。
【０３８４】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１１４）を以下に示す：
【化６３】
2019521144.tif 000076
【０３８５】
リーダー（シグナル）配列およびリンカーには、下線を引く。可能なホモ二量体の複合体のいずれかではなくＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、上の二重の下線で指し示す通り、２個のアミノ酸置換（セリンをシステインにより、また、スレオニンをトリプトファン（ｔｒｙｔｏｐｈａｎ）により置き換える）を融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１１４のアミノ酸配列は任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）を除去して提供することができる。
【０３８６】
成熟ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の通りである：
【化６４】
2019521144.tif 000077
【化６５】
2019521144.tif 000078
【０３８７】
相補的な形態のＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１１６）は以下の通りであり、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）が取り除かれてもよい。
【化６６】
2019521144.tif 000079
【０３８８】
リーダー配列およびリンカーには、下線を引く。上記の配列番号１１４および１１５のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成をガイドするために、４個のアミノ酸置換を、上記の二重下線で指し示す通りＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入してもよい。配列番号１１６のアミノ酸配列は、任意選択で、Ｃ末端からリシン（Ｋ）が取り除かれてもよい。
【０３８９】
成熟ＡＬＫ４−Ｆｃ融合タンパク質配列は以下の通りであり、任意選択でＣ末端からリシン（Ｋ）が取り除かれてもよい。
【化６７】
2019521144.tif 000080
【０３９０】
それぞれ配列番号１１５および配列番号１１７のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質を共発現させ、ＣＨＯ細胞株から精製して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを含むヘテロマーの複合体を生じさせてもよい。
【０３９１】
様々なＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ複合体の精製は、例えば、次のうち３種またはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了することができる。
【０３９２】
非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用するヘテロ多量体の複合体の形成を促進するための別のアプローチでは、Ｆｃドメインを、それぞれ配列番号１１８〜１２１および１２２〜１２５のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃポリペプチド配列に図示されるように、相補的な疎水性相互作用および追加の分子間ジスルフィド結合ならびにネット分子電荷に基づき精製を容易にするための２つのＦｃドメイン間の静電差を導入するように変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダーを各々用いる。
【０３９３】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１１８）は、下に示す：
【化６８】
2019521144.tif 000081
【０３９４】
リーダー配列およびリンカーには、下線を引く。可能なホモ二量体の複合体のいずれでもなく、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２個のアミノ酸置換（セリンをシステインで、およびトレオニンをトリプトファンで置き換える）を、上の二重下線で指し示す通り、融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、２個のアミノ酸置換（酸性アミノ酸でリシンを置き換える）を、上記の二重下線で指し示す通り、融合タンパク質のＦｃドメインに導入することもできる。Ｃ末端にリシンを加えた、配列番号１１８のアミノ酸配列を任意選択で提供することができる。
【０３９５】
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１１９）によってコードされる：
【化６９】
2019521144.tif 000082
【０３９６】
成熟したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは以下の通りであり（配列番号１２０）、任意選択でリシンをＣ末端に加えて提供することができる。
【化７０】
2019521144.tif 000083
【化７１】
2019521144.tif 000084
【０３９７】
このＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１２１）によってコードされる：
【化７２】
2019521144.tif 000085
【０３９８】
ＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号１２２）の相補形態は以下の通りであり、任意選択でリシンをＣ末端から除去して提供することができる。
【化７３】
2019521144.tif 000086
【化７４】
2019521144.tif 000087
【０３９９】
リーダー配列およびリンカーには、下線を引く。上記の配列番号１１８および１２０のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成をガイドするために、４個のアミノ酸置換（チロシンをシステインで、トレオニンをセリンで、ロイシンをアラニンで、およびチロシンをバリンで置き換える）を上記の二重下線で指し示す通りＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、２個のアミノ酸置換（アスパラギンをアルギニンで、およびアスパラギン酸をアルギニンで置き換える）を上記の二重下線で指し示す通りＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することもできる。リシンをＣ末端から除去して、配列番号１２２のアミノ酸配列を任意選択で提供することができる。
【０４００】
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１２３）によってコードされる：
【化７５】
2019521144.tif 000088
【化７６】
2019521144.tif 000089
【０４０１】
成熟したＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチド配列は以下の通りであり（配列番号１２４）、任意選択でリシンをＣ末端から除去して提供することができる。
【化７７】
2019521144.tif 000090
【０４０２】
このＡＬＫ４−Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１２５）によってコードされる：
【化７８】
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【化７９】
2019521144.tif 000092
【０４０３】
それぞれ配列番号１２０および配列番号１２４のＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃタンパク質は、ＣＨＯ細胞系から同時発現させ、精製して、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを含むヘテロマーの複合体を生成することができる。
【０４０４】
様々なＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ複合体の精製は、例えば、次のうち３種またはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィー工程によって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、エピトープに基づくアフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢの上のエピトープに対する抗体または機能的に同等なリガンドによる）、および多モードクロマトグラフィー（例えば、静電的リガンドおよび疎水性リガンドの両方を含有する樹脂による）。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了することができる。
（実施例１３）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体と比較したＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
【０４０５】
上記のＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性をＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体複合体のそれと比較するために、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用した。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体は、抗Ｆｃ抗体を使用して系の上で独立して捕捉した。リガンドを注入し、捕捉した受容体タンパク質の上に流した。結果は下の表に要約するが、そこでは、有効なリガンドトラップを最も示すリガンド解離速度（ｋｄ）は、灰色の陰影によって表される。
【表７−１】
2019521144.tif 000093
【表７−２】
2019521144.tif 000094
【０４０６】
これらの比較結合データは、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体またはＡＬＫ４−Ｆｃホモ二量体のいずれかに対して変更された結合プロファイル／選択性を有することを実証する。ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較してアクチビンＢに対する結合の増強を示し、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体で観察されるアクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１への強力な結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０およびＧＤＦ３に対する結合の実質的な低減を呈示する。特に、ＢＭＰ９は、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体に対して観察可能なアフィニティーが低いかまたは全く見られないが、このリガンドはＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体に強く結合する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と同様に、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６への中間レベルの結合を保持する。図１９を参照のこと。
【０４０７】
さらに、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９によるシグナル伝達に及ぼすＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体の作用を評価するために、Ａ−２０４リポーター遺伝子アッセイを使用した。細胞系：ヒト横紋筋肉腫（筋肉に由来した）。リポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８年、ＥＭＢＯ１７巻：３０９１〜３１００頁に記載される）。ＣＡＧＡ１２モチーフはＴＧＦβ応答性遺伝子（ＰＡＩ−１遺伝子）に存在するので、このベクターはＳｍａｄ２および３を通してシグナル伝達する因子のために一般的に有用である。例示的なＡ−２０４リポーター遺伝子アッセイを、下に概説する。
１日目：Ａ−２０４細胞を４８ウェルプレートに分割する。
２日目：Ａ−２０４細胞は、１０μｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０μｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）およびＦｕｇｅｎｅでトランスフェクトした。
３日目：因子（培地＋０．１％のＢＳＡに希釈する）を加える。細胞に加える前に、阻害剤を因子と約１時間プレインキュベートする必要がある。約６時間後に、細胞をＰＢＳですすぎ、その後溶解する。
【０４０８】
上記の工程の後、ルシフェラーゼアッセイを実行した。
【０４０９】
ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体の両方は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８の強力な阻害剤であるとこのアッセイで判定された。特に、図１９に図示されるホモ二量体／ヘテロ二量体のＩＣ５０比較データに見られるように、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と同様に、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかし、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０シグナル伝達経路のＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体による阻害は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較して有意に低減している。このデータは、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体の両方は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１への強力な結合を示すが、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較してＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体への有意に低減したアフィニティーを有することが観察された、上述の結合データと一貫している。
【０４１０】
ともに、これらの結果は、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを実証する。したがって、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体は、そのような選択的拮抗作用が有利である特定の適用において、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃホモ二量体よりも有用であろう。例としては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＣ、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１のうちの１つまたは複数の拮抗作用を保持するが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３およびＢＭＰ６のうち１つまたは複数の拮抗作用を最小にすることが望ましい治療的な適用が挙げられる。
（実施例１４）
モノクロタリンラットモデルにおける肺高血圧症に及ぼすＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の作用
【０４１１】
肺動脈高血圧（ＰＡＨ）のラットモデルにおいて、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ融合タンパク質（実施例１に記載のＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃホモ二量体）、ＡＬＫ４−Ｆｃ−ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体（実施例１２および１３に記載される）およびシルデナフィル（ＰＡＨの処置のために承認されたホスホジエステラーゼ５阻害剤）の作用を調べた。このモデルでは、ＰＡＨを誘導するために、療法の開始の２４時間前に、ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットはモノクロタリン（ＭＣＴ）の皮下注射を受けた。
【０４１２】
ラットを、異なる処置群（１群につき１０匹のマウス）に分けた：１）ＭＣＴ（試験の１日目に単一の用量として６０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した）およびトリス緩衝食塩水（３日ごとに１ｍｌ／ｋｇで腹腔内投与）（ビヒクル処置群）による処置、２）ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃポリペプチド（３日ごとに１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した）およびＭＣＴ（試験の１日目に単一の用量として６０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した）による処置、３）ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃヘテロ二量体（３日ごとに１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した）およびＭＣＴ（試験の１日目に単一の用量として６０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した）による処置、４）シルデナフィル（１日に２回、３０ｍｇ／ｋｇを経口投与した）およびＭＣＴ（試験の１日目に単一の用量として６０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した）による処置、５）対照ラット（３日ごとに１ｍｌ／ｋｇでトリス緩衝食塩水を腹腔内投与した）。ラットは、２８日間、処置した。体重は、１日目の最初の投与の前、およびその後は試験を通して毎週記録した。
【０４１３】
２８日目に、ケタミン／キシラジン（８０／１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によってラットに麻酔をかけた。頸部に切開を設け、頸静脈を単離し、前側でライゲーションした。液を充てんした圧カテーテルを右の頸静脈に導入して、肺動脈圧（ＰＡＰ）を測定した。別の切開を鼠径部に設け、大腿動脈を単離し、前側でライゲーションした。収縮期の動脈圧、拡張期圧および心拍数を測定するために、ミラー圧カテーテルを大腿動脈に導入した。安定した測定が得られるまで、Ｎｏｔｏｃｏｒｄ  ＨＥＭ（Ｃｒｏｉｓｓｙ  ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒｎａｃｅ）ｖ３．５データ収集系を概ね５〜１０分間使用して、平均動脈圧および右のＰＡＰをモニタリングした。測定の間、ラットを加熱パッドの上で概ね３７℃で維持し、手順の間中、体温度を直腸温度プローブでモニタリングした。手順の終わりにラットを安楽死させ、心肺を取り出した。全体の心臓を計量した。次に、心房を除去し、中隔と一緒に左心室（ＬＶ＋Ｓ）を右心室（ＲＶ）から分離した。心室を別々に計量した。一部、ＲＶ／ＬＶ＋Ｓを計算することによって、肥大を調査した。肺も、計量した。
【０４１４】
対照動物と比較して、モノクロタリン処置ラット（ビヒクル処置群）は、減少した体重、高いＰＡＰ、右心臓の肥大および増加した肺重量を有することが観察され、ＰＡＨの確立を示した。シルデナフィル処置ラットは、モノクロタリン処置ラットと比較して体重のいかなる向上も有しなかった。しかし、モノクロタリン処置ラットと比較して、シルデナフィル処置は高いＰＡＰを３０％低減し、右心臓の肥大を１８．５％低下させ、肺重量を１０％低下させた。驚くべきことに、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃの両方は、シルデナフィルと比較してこのモデルにおけるＰＡＨの処置で有意により大きな作用を有することが見出された。例えば、ＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ処置は、体重の向上（＋５．１％）、高いＰＡＰの４４．６％の低減、右心臓の肥大の３９．６％の低下、および肺重量の１９．０％の低下をもたらした。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ処置は体重の向上を示さなかったが、それはＰＡＨの他の合併症の処置にかなりの作用を及ぼした。例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ処置は、高いＰＡＰの６８％の低減、右心臓の肥大の４７．１％の低下、および肺重量の１８．４％の低下をもたらした。
【０４１５】
組織病理評価に基づく血管筋性化で、類似の傾向が観察された。αＳＭＡ／エラスチンを検出するための組織試料の染色の後に、サイズが１０μｍから５０μｍの間の１動物につき１００個の肺細動脈を、筋性動脈化していない、部分的に筋性動脈化した、または完全に筋性動脈化した、に分類した。ビヒクル処置ラットからの肺細動脈は、６２．３％が完全に筋性動脈化し、３６．４％が部分的に筋性動脈化し、１．４％が筋性動脈化していないと判定された。シルデナフィル処置は、血管筋性化の低下に穏やかな作用だけを有した（例えば、肺細動脈は、５７．９％が完全に筋性動脈化し、４１．６％が部分的に筋性動脈化し、０．９％は筋性動脈化していない）。対照的に、シルデナフィル処置動物と比較して、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ処置は、血管筋性化の有意な低下をもたらした（例えば、ビヒクル処置動物と比較して、肺細動脈は、２５．８％が完全に筋性動脈化し、６６．９％が部分的に筋性動脈化し、７．３％が筋性動脈化していない）。肺細動脈の平滑筋肥大の組織病理評価も、以下の通りに記録した：０（正常）、１（最小限）、２（軽度）、３（中等度）または４（顕著）。ビヒクル処置ラットは、中等度から顕著な（スコア３．８）平均平滑筋肥大を有した。再び、シルデナフィル処置は、３（中等度）の平均スコアで、肥大への穏やかな作用を有するのが観察された。一方、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ処置動物は、ビヒクルおよびシルデナフィル処置動物と比較して、平滑筋肥大におけるかなりの低減（１．６の平均スコア）を有するのが観察された。全体として、このＰＡＨモデルにおいて、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ処置は、血管の筋性化および肥大を有意に低減した。
【０４１６】
合わせると、これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの両方は、このモノクロタリン誘導モデルにおいてＰＡＨの様々な合併症の寛解において有効であることを実証する。特に、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの両方は、動脈圧、右心臓の肥大および血管筋性動脈化の低減において、ＰＡＨの処置のための承認薬であるシルデナフィルについて観察されたより大きな作用を有した。さらに、データは、他のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト、特にＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃおよびＡＬＫ４−Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃと類似の活性を有するものが、ＰＡＨの処置において、特にＰＡＨの様々な合併症の予防またはその重症度の低減において有益である可能性を示す。
（実施例１５）
Ｓｕｇｅｎ低酸素ラットモデルにおける肺高血圧に及ぼすＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の作用
【０４１７】
ＰＡＨのＳｕｇｅｎ低酸素モデルにおいて、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ融合タンパク質（実施例１に記載のＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃホモ二量体）およびシルデナフィル（ＰＡＨの処置のために承認されたホスホジエステラーゼ５阻害剤）の作用をさらに調べた。このモデルでは、ラットは、セマキサニブの日用量を受け、療法の開始の２４時間前に、ＰＡＨを誘導するために低酸素環境（概ね１３％の酸素）に置かれる。
【０４１８】
ラットを、異なる処置群（１群につき１０匹のマウス）に分けた：１）セマキサニブ（単一の日用量として２００ｍｇ／ｋｇを皮下投与した）／低酸素およびトリス緩衝食塩水（３日ごとに１ｍｌ／ｋｇで腹腔内投与）（ビヒクル処置群）による処置、２）ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃポリペプチド（３日ごとに１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した）およびセマキサニブ（単一の日用量として２００ｍｇ／ｋｇを皮下投与した）／低酸素による処置、３）シルデナフィル（１日に２回、３０ｍｇ／ｋｇを経口投与した）およびセマキサニブ（単一の日用量として２００ｍｇ／ｋｇを皮下投与した）／低酸素による処置、および４）対照ラット（３日ごとに１ｍｌ／ｋｇでトリス緩衝食塩水を腹腔内投与した）。ラットは、２８日間処置した。体重は、１日目の最初の投与の前、およびその後は試験を通して毎週記録した。
【０４１９】
２８日目に、ケタミン／キシラジン（８０／１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によってラットに麻酔をかけた。頸部に切開を設け、頸静脈を単離し、前側でライゲーションした。液を充てんした圧カテーテルを右の頸静脈に導入して、肺動脈圧（ＰＡＰ）を測定した。別の切開を鼠径部に設け、大腿動脈を単離し、前側でライゲーションした。収縮期の動脈圧、拡張期圧および心拍数を測定するために、ミラー圧カテーテルを大腿動脈に導入した。安定した測定が得られるまで、Ｎｏｔｏｃｏｒｄ  ＨＥＭ（Ｃｒｏｉｓｓｙ  ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒｎａｃｅ）ｖ３．５データ収集系を概ね５〜１０分間使用して、平均動脈圧および右のＰＡＰをモニタリングした。測定の間、ラットを加熱パッドの上で概ね３７℃で維持し、手順の間中、体温度を直腸温度プローブでモニタリングした。手順の終わりにラットを安楽死させ、心肺を取り出した。全体の心臓を計量した。次に、心房を除去し、中隔と一緒に左心室（ＬＶ＋Ｓ）を右心室（ＲＶ）から分離した。心室は、別々に計量した。一部、ＲＶ／ＬＶ＋Ｓを計算することによって、肥大を調査した。肺も、計量した。
【０４２０】
対照動物と比較して、セマキサニブ／低酸素処置ラット（ビヒクル処置群）は、減少した体重、高いＰＡＰ、右心臓の肥大および増加した肺重量を有することが観察され、ＰＡＨの確立を示した。シルデナフィル処置は、ビヒクル処置動物と比較して、平均の肺動脈圧を２２．４％低減し、右心臓の肥大を１０％減少させた。再び、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ処置は、シルデナフィルと比較してこのモデルにおけるＰＡＨの処置において有意により大きな作用を有することが見出された。例えば、ビヒクル処置動物と比較して、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ処置は、平均肺動脈圧の５１．３％の低減および右心臓の肥大の５３．５％の減少をもたらした。
【０４２１】
組織病理評価に基づく血管筋性化で、類似の傾向が観察された。αＳＭＡ／エラスチンを検出するための組織試料の染色の後に、サイズが１０μｍから５０μｍの間の１動物につき１００個の肺細動脈を、筋性動脈化していない、部分的に筋性動脈化した、または完全に筋性動脈化した、に分類した。ビヒクル処置ラットからの肺細動脈は、７２．５％が完全に筋性動脈化し、２７．４％が部分的に筋性動脈化し、０．１％が筋性動脈化していないと判定された。シルデナフィル処置は、ビヒクル処置動物と比較して、血管筋性化の低下に穏やかな作用だけを有した（例えば、肺細動脈は、６７．４％が完全に筋性動脈化し、３１．６％が部分的に筋性動脈化し、１．０％は筋性動脈化していない）。対照的に、シルデナフィル処置動物と比較して、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ処置は、血管筋性化の有意な低下をもたらした（例えば、ビヒクル処置動物と比較して、肺細動脈は、２９．３％が完全に筋性動脈化し、６９．３％が部分的に筋性動脈化し、１．４％が筋性動脈化していない）。肺細動脈の平滑筋肥大の組織病理評価も、以下の通りに記録した：０（正常）、１（最小限）、２（軽度）、３（中等度）または４（顕著）。ビヒクル処置ラットは、中等度から顕著な（スコア３．６）平均平滑筋肥大を有した。再び、シルデナフィル処置は、３（中等度）の平均スコアで、肥大への穏やかな作用を有するのが観察された。一方、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ処置動物は、シルデナフィル処置動物と比較して、平滑筋肥大におけるかなりの低減（１．４の平均スコア）を有するのが観察された。全体として、このＰＡＨモデルにおいて、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃ処置は、血管の筋性化および肥大を有意に低減した。
【０４２２】
合わせると、これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃが、Ｓｕｇｅｎ低酸素モデルにおいてＰＡＨの様々な合併症の寛解において有効であることを実証する。特に、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃは、動脈圧、右心臓の肥大および血管筋性動脈化の低減において、ＰＡＨの処置のための承認薬であるシルデナフィルについて観察されたより大きな作用を有した。さらに、データは、他のＧＤＦ／ＢＭＰアンタゴニスト、特にＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃと類似の活性を有するものが、ＰＡＨの処置において、特にＰＡＨの様々な合併症の予防またはその重症度の低減において有益である可能性を示す。
【０４２３】
参照による組み込み
本明細書で言及されている刊行物および特許は全て、あたかも個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるために具体的におよび個々に示されているかの如く、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４２４】
主題の特定の実施形態が考察されているが、上記の明細書は例示であり、限定ではない。当業者であれば、本明細書および下記の特許請求の範囲を参考にして、多数の変形形態が明白になるだろう。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲およびそれらの等価物の完全な範囲、ならびに本明細書およびそのような変形形態を参照して決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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