(57)【要約】  アナライトの存在について液体サンプルを試験する方法であって、アナライトから過酸化水素を形成するためのオキシダーゼを含む組成物と、酸素ラジカルの存在下で蛍光指示薬を形成できる蛍光指示薬前駆体と、鉄化合物とを含む組成物を、サンプルと接触させることによって混合物を形成する工程であって、鉄化合物が混合物中に溶解される工程；混合物を照射する工程；および蛍光指示薬から蛍光を測定する工程を含む方法。この方法は、マイクロ流体デバイスのチャンネルまたはチャンバ（１０１）中の混合物が光源（１０３）からの光によって照射され、蛍光指示薬からの発光が光検出器（１０５）によって検出されるデバイスを用いて実施され得る。【選択図】図１Ａ、図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナライトの存在について液体サンプルを試験する方法であって、前記方法が：
前記アナライトから過酸化水素を形成するためのオキシダーゼと、酸素ラジカルの存在下で蛍光指示薬を形成できる蛍光指示薬前駆体と、鉄化合物とを含む組成物を、前記サンプルと接触させることによって混合物を形成する工程であって、前記鉄化合物が前記混合物中に溶解される工程；
前記混合物を照射する工程；および
前記蛍光指示薬から蛍光を測定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
過酸化水素が前記アナライトのオキシダーゼ触媒作用反応によって前記アナライトから形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アナライトがグルコースであり、前記オキシダーゼがグルコースオキシダーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アナライトがコレステロールであり、前記オキシダーゼがコレステロールオキシダーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記アナライトが１つ以上の予備反応を受けて、過酸化水素のオキシダーゼ触媒作用生成が可能な化合物を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光指示薬前駆体が、フルオレセインまたはその塩である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記混合物が、前記蛍光指示薬からの発光を消光することができる消光剤を含まない、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが生物学的液体である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記液体サンプルが、マイクロ流体デバイスまたはラテラルフローデバイスにおいて前記組成物と接触される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、前記マイクロ流体デバイスまたはラテラルフローデバイスにおいて固体形態で提供される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、マイクロ流体デバイスまたはラテラルフローデバイスにおいて凍結乾燥形態で提供される、請求項１０に記載の方法
【請求項１２】
前記サンプルが可視光線で照射される、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記アナライトの濃度が前記蛍光測定から決定される、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記混合物が、前記液体サンプルを固体形態の前記組成物と接触させることによって形成される、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記液体サンプルと組成物とを混合するためのデバイス；前記混合物の照射のための光源；および前記蛍光指示薬によって放出される光の検出のための光検出器を備えるセンサにおいて、前記液体サンプルと前記組成物とを接触させる、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記デバイスがマイクロ流体デバイスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記鉄化合物が鉄（ＩＩ）化合物である、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
アナライトから過酸化水素を形成するためのオキシダーゼ；鉄化合物；および酸素ラジカルの存在下、蛍光指示薬を形成できる蛍光指示薬前駆体を含む組成物であって、ここで前記蛍光指示薬前駆体が、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ホウ素−ジピロメテン、ナフタルイミド、ペリレン、ベンザントロン、ベンゾキサントロンおよびベンゾチオオキサントロンからなる群から選択される、組成物。
【請求項１９】
前記蛍光指示薬前駆体がフルオレセインである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
固体形態の請求項１８または１９に記載の組成物を含有するマイクロ流体デバイス。
【請求項２１】
請求項１８または１９に記載の組成物をその表面に固定化したラテラルフローデバイス。
【請求項２２】
液体サンプルを請求項１８または１９に記載の組成物と混合するためのデバイス；前記混合物を照射するように構成された光源；および前記蛍光指示薬によって放出された光を検出するように構成された光検出器を備えるセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光シグナルによるアナライトの検出方法、この信号を生成するための組成物、およびこの方法を実施するためのセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
フェントン試薬は、鉄（ＩＩ）化合物の不均化によって酸素ラジカルを形成するために使用される鉄（ＩＩ）化合物を含む過酸化水素の溶液である：
Ｆｅ２＋＋Ｈ２Ｏ２→Ｆｅ３＋＋ＨＯ・＋ＯＨ−
Ｆｅ３＋＋Ｈ２Ｏ２→Ｆｅ２＋＋ＨＯＯ・＋Ｈ＋
Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．‘Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  Ｆｅｎｔｏｎ’ｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ’Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９８５，７，４４９−４５３は、硫酸第一鉄の硫酸第二鉄への酸化による紫外光の吸収の増加を開示している。グルコースオキシダーゼおよびフェントン試薬のアッセイは、セルロースおよびβ−グルコシダーゼなどの酵素の活性を測定するために提案されている。
【０００３】
Ｊｉａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．‘Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ’Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１０，４９，４８００−４８０４は、吸光度の変化に基づくラットの脳におけるグルコースの直接比色視覚化のための金ナノ粒子系アッセイを開示している。
【０００４】
Ｈｕ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．‘Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｆｅｎｔｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ’Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１３，４１，４４２−４４５は、蛍光体および消光剤を含有する分子ビーコンを開示している。グルコースに対するグルコースオキシダーゼの作用によってインサイチュで形成されたヒドロキシルラジカルは、分子ビーコンを切断し、蛍光体および消光剤の分離を引き起こす。
【０００５】
Ｃｈｉｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．‘Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｏ２  ａｎｄ  Ｈ２Ｏ２  ｉｎｔｏ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｉｏｎ  ｒａｄｉｃａｌ  ｗｉｔｈ  ｃｌａｙ  ｍｉｎｅｒａｌｓ’Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００５，５８１，１５９−１６６は、プローブとしてａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄおよびスーパーオキシドディスムターゼを使用する蛍光アッセイによって特徴付けられる、モンモリロナイトＫ１０粘土鉱物を用いるＨ２Ｏ２およびＯ２からのスーパーオキシドアニオンラジカルの生成を開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．「Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｄ  Ｆｅｎｔｏｎ’ｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ」  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９８５，７，４４９−４５３
【非特許文献２】Ｊｉａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．「Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｂｒａｉｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１０，４９，４８００−４８０４
【非特許文献３】Ｈｕ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．「Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｆｅｎｔｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ」  Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１３，４１，４４２−４４５
【非特許文献４】Ｃｈｉｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．「Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｏ２  ａｎｄ  Ｈ２Ｏ２  ｉｎｔｏ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｉｏｎ  ｒａｄｉｃａｌ  ｗｉｔｈ  ｃｌａｙ  ｍｉｎｅｒａｌｓ」  Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００５，５８１，１５９−１６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、低濃度のアナライトを検出することができる過酸化水素が形成され得るアナライトの検出方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、広い濃度範囲にわたってアナライトを検出することができる過酸化水素が形成され得るアナライトの検出方法を提供することである。
【０００９】
本発明のなおさらなる目的は、過酸化水素が形成され得るアナライトの検出のための低コストのアッセイを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様において、本発明は、アナライトの存在について液体サンプルを試験する方法を提供し、この方法が：
アナライトから過酸化水素を形成するためのオキシダーゼを含む組成物と、酸素ラジカルの存在下で蛍光指示薬を形成できる蛍光指示薬前駆体と、鉄化合物とを含む組成物を、サンプルと接触させることによって混合物を形成する工程であって、鉄化合物が混合物中に溶解される工程；
混合物を照射する工程；および
蛍光指示薬から蛍光を測定する工程
を含む。
【００１１】
第２の態様において、本発明は、アナライトから過酸化水素を形成するためのオキシダーゼ；鉄化合物；および酸素ラジカルの存在下、蛍光指示薬を形成できる蛍光指示薬前駆体を含む組成物を提供し、ここで蛍光指示薬前駆体が、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ホウ素−ジピロメテン、ナフタルイミド、ペリレン、ベンザントロン、ベンゾキサントロンおよびベンゾチオオキサントロンからなる群から選択される。
【００１２】
ここで本発明を、以下の図を参照してより詳細に記載する：
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】マイクロ流体デバイスの対向する側に光源と光検出器とを備える本発明の一実施形態によるセンサを示す；
【図１Ｂ】マイクロ流体デバイスの同じ側に光源と光検出器とを備える本発明の一実施形態によるセンサを示す；
【図２】相対的に低い鉄濃度を有する本発明の例示的な方法に従って形成された混合物のセンサ電流対グルコース濃度のグラフである；
【図３】相対的に高い鉄濃度を有する本発明の例示的な方法に従って形成された混合物のセンサ電流対グルコース濃度のグラフである；および
【図４】異なるグルコースオキシダーゼ濃度を有する本発明の例示的な方法に従って形成された混合物のセンサ電流対時間のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書に記載の方法は、液体サンプルを、鉄化合物、蛍光指示薬前駆体およびオキシダーゼ酵素を含む組成物と接触させることによって混合物を形成する工程を含む。混合物は、液体サンプルと組成物の成分とを任意の順序で合わせることによって形成されてもよい。組成物の各成分は、液体サンプルと混合する前に合わされてもよい。液体サンプルは、組成物の成分のすべてではないが１つ以上と混合され、次いで組成物の残りの（１または複数の）成分と混合されてもよい。
【００１５】
液体サンプルと接触させる本明細書に記載されるような組成物は、固体形態であってもよく、凍結乾燥形態であってもよく、または溶液もしくは懸濁液であってもよい。
【００１６】
組成物がサンプルと接触すると、以下の工程が生じる：
（ｉ）アナライト化合物からの過酸化水素のオキシダーゼ触媒作用形成；
（ｉｉ）過酸化水素と鉄化合物との反応による酸素ラジカルの形成；および
（ｉｉｉ）蛍光指示薬前駆体と酸素ラジカルとの反応による蛍光指示薬の形成。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「酸素ラジカル」は、酸素ラジカル原子を含有する任意の種、例えばＨＯ・またはＨＯＯ・を意味する。
【００１８】
過酸化水素の形成
過酸化水素のオキシダーゼ触媒作用形成は、分子状酸素（Ｏ２）の存在を必要としてもよくまたは必要としなくてもよい。この反応は、好ましくは、周囲空気環境で起こる。
【００１９】
過酸化水素は、アナライトのオキシダーゼ触媒作用反応によってアナライトから形成されてもよく、またはアナライトは１つ以上の予備反応を受けて過酸化水素のオキシダーゼ触媒作用生成が可能な化合物を形成してもよい。
【００２０】
アナライトが１つ以上の予備反応を受ける場合、１つ以上の予備反応のためのその試薬または各試薬が組成物中に存在することが好ましい。このようにして、１つ以上の予備反応と過酸化水素のオキシダーゼ触媒作用生成とからなるカスケード反応が起こり得ることが理解される。１つ以上の予備反応のための１つ以上の試薬は、少なくとも１つの酵素を含んでいてもよい。
【００２１】
過酸化水素がアナライトのオキシダーゼ触媒作用反応によって形成される場合、オキシダーゼは組成物中に存在する唯一の酵素であってもよい。
【００２２】
例示的なアナライトおよびアナライトのオキシダーゼ触媒作用反応による過酸化水素の生成のための関連酵素は、限定されないが、以下を含む：
分子状酸素（Ｏ２）の存在下でのグルコースおよびグルコースオキシダーゼ。
【００２３】
分子状酸素の存在下でのコレステロールおよびコレステロールオキシダーゼ。
【００２４】
分子状酸素の存在下でのＤ−ガラクトースおよびガラクトースオキシダーゼ。
【００２５】
分子状酸素の存在下でのＤ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
【００２６】
分子酸素の存在下でのヒポキサンチンおよびキサンチンオキシダーゼ。
【００２７】
分子状酸素の存在下でのＬ−グロノ−１，４−ラクトンおよびＬ−グロノラクトンオキシダーゼ。
【００２８】
１つ以上の予備反応を受け得る例示的なアナライトは、トリグリセリドであり、これからグリセロールホスフェートが、分子状酸素の存在下、グリセロールホスフェートオキシダーゼ触媒作用反応による過酸化水素のオキシダーゼ触媒作用生成のために生成され得る。この場合、アッセイは、トリグリセリドからのグリセロールの形成のためのリパーゼ；ならびにグリセロールとＡＴＰとのグリセロールキナーゼ触媒作用反応によるグリセロールホスフェートの形成のためのＡＴＰおよびグリセロールキナーゼを含んでいてもよい。
【００２９】
別の例示的なアナライトは、α−アミラーゼおよびアミログルコシダーゼを介してグルコースに加水分解され得るデンプンであり、そこからグルコースオキシダーゼでＨ２Ｏ２が生成され得る。
【００３０】
組成物と液体サンプルとの混合物中のオキシダーゼの濃度は、０．５〜２００μｇ／ｍｌの範囲であってもよく、１〜１００μｇ／ｍｌの範囲であってもよい。
【００３１】
オキシダーゼ酵素および組成物の任意の他の試薬は、好ましくは、液体サンプルおよび組成物の混合物中に溶解される。
【００３２】
鉄化合物
混合物中に、鉄（ＩＩ）または鉄（ＩＩＩ）化合物、好ましくは鉄（ＩＩ）化合物が使用されてもよい。
【００３３】
オキシダーゼ触媒作用反応によりインサイチュで生成された過酸化水素は、組成物中に存在する鉄（ＩＩ）化合物の鉄（ＩＩ）と反応して酸素ラジカルを形成し得る。
【００３４】
鉄（ＩＩ）化合物は、これらに限定されないが、鉄（ＩＩ）塩、例えば硫酸鉄（ＩＩ）または鉄（ＩＩ）錯体、例えば鉄（ＩＩ）ＥＤＴＡまたは鉄（ＩＩ）ＤＴＰＡを含む任意の化合物であってもよい。
【００３５】
例えば「Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｂｙ  ｃａｔｅｃｈｏｌ−ｄｒｉｖｅｎ  Ｆｅｎｔｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」，Ｗａｔｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４９（４）：８１−４，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００４．に開示されるように、鉄（ＩＩＩ）化合物は、カテコールと組み合わせて使用され得る。
【００３６】
鉄化合物は、その所望の溶解度に従って選択されてもよい。鉄化合物は水溶性であることが好ましい。好ましくは、組成物のすべての鉄イオンは、組成物および液体サンプルから形成される混合物中に溶解される。
【００３７】
混合物中の鉄イオン濃度は、好ましくは少なくとも０．１ｍＭ、より好ましくは少なくとも１または少なくとも５ｍＭであり、５０ｍＭまでであってもよい。
【００３８】
蛍光指示薬の形成
過酸化水素と鉄化合物との反応によって形成された酸素ラジカルは、アッセイに存在する蛍光指示薬前駆体と反応して、蛍光指示薬を形成し得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「蛍光指示薬」は、光の照射により蛍光を発する材料を意味する。
【００４０】
蛍光指示薬の存在は、指示薬を光源で励起し、光検出器を使用して蛍光を測定することによって測定されてもよい。
【００４１】
サンプル中のアナライトの存在は、蛍光測定から決定され得る。アナライトが存在する場合、サンプル中のその濃度が決定されてもよい。
【００４２】
蛍光指示薬前駆体は、光源（蛍光指示薬に比較して可視範囲（３９０〜７００ｎｍ）またはＵＶ範囲（１０より大きく３９０ｎｍ未満（１００〜３８０ｎｍであってもよい））内で光を放出する光源であってもよい）での照射時にほとんどまたは全く蛍光を放出しない。
【００４３】
好ましくは、蛍光指示薬は、可視範囲の光の照射により光を放出する。
【００４４】
蛍光指示薬前駆体は、限定されるものではないが、それぞれが置換されていないかまたは１つ以上の置換基で置換されていてもよい以下の化合物から選択され得る：フルオレセインおよびその塩、ローダミン、クマリン、ホウ素−ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）、ナフタルイミド、ペリレン、ベンザントロン、ベンゾキサントロン；およびベンゾチオオキサントロン。
【００４５】
例示的な置換基は、塩素、アルキルアミノ；フェニルアミノ；およびヒドロキシフェニルである。例示的なフルオレセインとしては、２，７−ジクロロフルオレセイン、３’−（ｐ−アミノフェニル）フルオレセインおよび３’−（ヒドロフェニル）フルオレセインが挙げられるが、これらに限定されない。フルオレセイン指示薬前駆体は、酸素ラジカルと反応して、蛍光性の酸化されたフルオレセイン指示薬を生成し得る。
【００４６】
組成物と液体サンプルとの混合物中の蛍光指示薬前駆体の濃度は、０．１〜１０ｍＭの範囲であってもよく、１〜１０ｍＭの範囲内であってもよい。
【００４７】
フルオレセインは、式（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）またはその塩を有していてもよい：
【化１】
2019520070.tif 000003
【００４８】
各出現におけるＸは独立してＨ、ＦまたはＣｌであり、ＲはＨまたは置換基であり、非置換であってもよくまたは１つ以上の置換基で置換されていてもよいフェニルであってもよい。フェニルの置換基は、ヒドロキシル基またはアミノ基であってもよい。
【００４９】
蛍光指示薬前駆体は好ましくは水に可溶性である。蛍光指示薬前駆体は好ましくは混合物中に溶解される。
【００５０】
液体サンプル
本明細書に記載されるような液体サンプルは、周囲圧力（１気圧）および周囲温度（２０℃）で液体状態にある。「液体」サンプルは、溶液、コロイド状液体または懸濁液であってもよいが、これらに限定されないことが理解される。
【００５１】
本明細書に記載の液体サンプルは、生物学的液体（血液、尿、唾液、涙、糞便、胃液、胆汁、汗、脳脊髄液または羊水；細胞培養培地または他の生物学的サンプル；あるいは非生物学的サンプル、例えば食品、環境水、例えば川、海もしくは雨水、ワイン、または土壌抽出物であってもよい）であってもよい。
【００５２】
生物学的液体は、生理学的ｐＨ（約７．４）で分析されてもよい。組成物と生物学的液体との接触時、ｐＨにほとんどまたは全く影響がなくてもよい。組成物との接触時の生物学的液体のｐＨの任意の変化は、０．５、０．２または０．１以下であってもよい。
【００５３】
アナライト検出
サンプル中のアナライトを検出する方法は、液体サンプルを、鉄化合物、蛍光指示薬前駆体およびオキシダーゼ酵素を含むかまたはそれらからなる組成物と接触させる工程を含む。好ましくは、組成物は、蛍光指示薬からの発光を消光することができる消光剤を含まない。
【００５４】
液体サンプルは、組成物の溶液もしくは懸濁液と混合されてもよく、または固体形態（凍結乾燥形態であってもよい）の組成物と接触させてもよい。
【００５５】
鉄化合物および蛍光指示薬前駆体は、好ましくは、アナライト検出中に溶解した形態である。液体サンプルが組成物の溶液または懸濁液と混合される場合、鉄化合物および蛍光指示薬前駆体は、好ましくは、溶液または懸濁液の溶媒に溶解される。液体サンプルを、固体形態での組成物と接触させる場合、鉄化合物および蛍光指示薬は好ましくは液体サンプル中に溶解する。
【００５６】
オキシダーゼは、溶液または懸濁液に溶解され得る。
【００５７】
オキシダーゼは、溶液もしくは懸濁液または固体組成物において、固体表面（ポリマー表面であってもよい）に固定化されていてもよい。
【００５８】
アナライトが１つ以上の予備反応によって過酸化水素のオキシダーゼ触媒作用生成が可能な化合物に転化される場合、１つ以上の予備反応のためのその試薬または各試薬は、それぞれ独立して固体表面に固定化されてもよく、溶媒中に溶解されてもよく、または固体形態で組成物中に提供されてもよい。
【００５９】
液体サンプルは、液体サンプルと組成物を混合するためのデバイスの中または上に配置された組成物と接触させてもよい。組成物は、マイクロ流体デバイスのチャンネルもしくはチャンバに提供されてもよく、またはラテラルフローデバイスの表面上に固定されてもよい。
【００６０】
この混合物に光源で照射する。無機ＬＥＤまたはＬＥＤアレイ；１つ以上の有機発光デバイス（ＯＬＥＤ）；レーザ；またはアーク灯を含むが、これらに限定されない任意の光源が使用されてもよい。光源は好ましくはＯＬＥＤである。
【００６１】
ＯＬＥＤは、アノード、カソード、およびアノードとカソードとの間に有機発光材料を含む発光層を備える。アノードとカソードとの間に１つ以上のさらなる層（１つ以上の電荷輸送層、電荷注入層または電荷ブロッキング層であってもよい）が提供されてもよい。アノードとカソードとの間にバイアスを印加すると、有機発光材料から光が放出される。ＯＬＥＤは、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｉｇｈｔ−Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｚｈｉｇａｎｇ  Ｌｉ  ａｎｄ  Ｈｏｎｇ  Ｍｅｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００７に記載される通りであってもよく、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
蛍光指示薬は、３９０〜７００ｎｍの可視範囲の光の照射により光を放出することが好ましく、それに応じて光源から放出される光の波長範囲を選択してもよい。
【００６３】
蛍光指示薬から放出される光は、好ましくは可視範囲または赤外範囲（７００ｎｍより大きい（少なくとも７５０ｎｍから約１０００ｎｍまでであってもよい））、好ましくは可視範囲である。
【００６４】
蛍光指示薬から放出された光は、光検出器（有機光検出器（ＯＰＤ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管であってもよい）、好ましくはＯＰＤまたはＣＣＤによって検出されてもよい。
【００６５】
ＯＰＤは、アノード、カソード、およびアノードとカソードとの間の有機半導体領域を備える。有機半導体領域は、隣接する電子供与性および電子受容性層を備えていてもよく、または電子受容性材料と電子供与性材料との混合物を含む単一層を備えていてもよい。アノードとカソードとの間に、１つ以上のさらなる層が提供されてもよい。入射光の電流への変換は、ゼロバイアス（光起電力）モードまたは逆バイアスモードで検出され得る。ＯＰＤは、Ｒｕｔｈ  Ｓｈｉｎａｒ＆Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓｈｉｎａｒ  「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  ２００９に記載されている通りであってもよく、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
正確な縮尺では描かれていない図１Ａは、光源、光検出器およびマイクロ流体デバイスを備える本明細書に記載の方法における使用に適したセンサを示す。
【００６７】
使用時には、液体サンプルを、マイクロ流体デバイスのチャンネルまたはチャンバ１０１において本明細書に記載の組成物と接触させ、波長ｈν１の光源１０３からの光で照射する。蛍光指示薬が形成されている場合、光源からの光は、蛍光指示薬によって吸収され、より長い波長ｈν２の光として再放出され、これが、光が入射する表面１０５Ｓを有する光検出器１０５によって検出され得る。
【００６８】
図１Ａの実施形態では、光源１０３は、マイクロ流体デバイスの第１の表面上に提供され、光検出器１０５は、対向する第２の表面上に提供される。
【００６９】
蛍光指示薬によって放出される波長範囲以外の光の波長の一部または全部を除去するために、光源と光検出器との間にフィルタ（図示せず）を提供してもよい。
【００７０】
蛍光指示薬によって吸収される波長範囲以外の光の波長の一部または全部を除去するために、光源と混合物との間にフィルタ（図示せず）を提供してもよい。
【００７１】
正確な縮尺では描かれていない図１Ｂは、光源１０３および光検出器１０５がマイクロ流体デバイスの第１の表面上に提供されている別のセンサの他の構成を示している。この実施形態では、光源から放出された光は、第１の表面に対向するマイクロ流体デバイスの第２の表面上または表面にわたる高吸収性（黒色）層の使用によって、および／または光が入射する光検出器の表面上または表面にわたってフィルタを使用することによって、光検出器１０５に到達することが防止され得る。
【００７２】
光源１０３および光検出器１０５は、マイクロ流体デバイスの第１の表面に隣接して提供されたガラスまたはプラスチック基板などの共通基板１０７上に提供される。別の実施形態では、マイクロ流体デバイスの第１の表面は、光源および光検出器が形成される共通基板を形成してもよい。さらに別の実施形態では、光源１０３および光検出器１０５は、第１の表面上の別々の基板上に提供されてもよい。
【００７３】
光源がＯＬＥＤであり、光検出器がＯＰＤである場合、ＯＬＥＤおよび光検出器は共通の基板上に形成され得、次いでこれをマイクロ流体デバイスの第１の表面に隣接させてセンサを形成する。この実施形態のＯＰＤおよびＯＬＥＤは、基板上の共通の透明アノード層（共通のインジウムスズオキシド層であってもよい）を使用して形成されてもよい。
【００７４】
光源および光検出器は、蛍光指示薬からの蛍光の発光を感知するための広い範囲の構成で提供され得、これらに限定されないが、フィルタ、光吸収層、光反射層、レンズ、光ファイバおよびこれらの組み合わせと共に使用され得ることが理解される。
【００７５】
センサは、マイクロ流体デバイスが光源および／または光検出器から分離可能なモジュール式構造を有していてもよい。センサのマイクロ流体デバイスは、使い捨てガラスまたは透明なプラスチックマイクロ流体チップを備えていてもよく、これを取り外して別のチップと交換してもよい。
【００７６】
マイクロ流体デバイスはモジュール式ではなくてもよく、センサ全体が使い捨てセンサである。
【００７７】
組成物のその成分または各成分は、その中に溶解または懸濁した組成物の１つ以上の（すべてであってもよい）成分を含む溶液または懸濁液からマイクロ流体デバイスに導入され、次いで溶液または懸濁液を凍結乾燥してもよい。
【００７８】
固体組成物は、組成物の成分を１つ以上の溶液または懸濁液からデバイスの表面に適用し、続いて溶液または懸濁液の（１または複数の）溶媒を蒸発させることによって、ラテラルフローデバイスの上または中に吸収され得る。
【００７９】
センサはポータブルデバイスであってもよい。センサはハンドヘルドデバイスであってもよい。
【００８０】
図１Ａおよび図１Ｂは、サンプルを組成物と接触させるマイクロ流体デバイスを備えるセンサを示しているが、液体サンプルを組成物と混合するために他の装置、例えば、組成物が固体形態で固定されている表面を有するラテラルフローデバイスが使用されてもよいことが理解される。
【００８１】
図１Ａおよび図１Ｂは、１つの光源のみおよび１つの光検出器のみを有するセンサを示す。各検出器には複数の光源が存在してもよい。
【００８２】
センサは、マルチチャンネルマイクロ流体デバイスであってもよく、ここで少なくとも１つのチャンネルは、本明細書に記載されるようなアナライトを検出するために構成され、この１つ以上のさらなるチャンネルは、それぞれが本明細書に記載されるような方法または当業者に既知の別の方法によって異なるアナライトを検出するように構成される。
【００８３】
本明細書に記載のセンサは、低濃度および／または広いアナライト濃度範囲にわたってアナライトの検出を可能にし得る。分析のためのサンプル中のアナライト濃度は、約１ｐＭ〜３００ｍＭの範囲であってもよく、０．１〜１００ｍＭの範囲であってもよく、０．２〜１０ｍＭの範囲であってもよい。
【００８４】
用途
本明細書に記載の組成物は、限定するものではないが、本明細書に記載されるようなグルコース、コレステロール、トリグリセリドを含むアナライトの検出のためのアッセイで使用されてもよく、本明細書に記載されるようなセンサは、このアナライトの定量測定のためのポイント・オブ・ケアセンサとして使用されてもよい。
【００８５】
［実施例］
すべての試薬はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００８６】
［実施例１］
２，７−ジクロロフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）検出試薬の形成
２，７−ジクロロフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）ジアセテートを１ｍｇ／ｍＬ（２ｍＭ）の濃度でＤＭＳＯに溶解した。この溶液５０μＬにメタノール（５０μＬ）および２Ｍの水酸化カリウム水溶液（５０μＬ）を添加し、混合物を室温で１時間放置した（検出試薬の最終濃度は０．６７ｍＭである）。
【００８７】
［実施例２］
グルコースアッセイ−低鉄（ＩＩ）濃度
以下のものを含有する溶液を調製した：検出試薬溶液（実施例１で調製したもの）１５μＬ、ＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）の水溶液１００μＬ、硫酸鉄（ＩＩ）（２．５ｍＭ）の水溶液１００μＬおよびリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中のＤ−（＋）−グルコース（０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭまたは１０ｍＭ）の溶液６８５μＬ。これらの溶液のそれぞれに、グルコースオキシダーゼ（２０ｍｇ／ｍＬ）の水溶液１００μＬを添加し、サンプル管を迅速に反転させて混合した。１時間後、〜１３０μＬの溶液を使用して、マイクロ流体フローセル（光路長０．５ｍｍの２０×９ｍｍの面積）を完全に充填した。
【００８８】
このフローセルを、図１Ａに示すようなＯＬＥＤ／ＯＰＤ検出器であって、ＯＬＥＤとマイクロ流体フローセルとの間にショートパスフィルタを、マイクロ流体フローセルとＯＰＤとの間にロングパスフィルタを有する検出器に入れた。
【００８９】
ＯＬＥＤは、ガラス基板上に支持され、透明アノード、正孔注入層、ポリマー正孔輸送層、蛍光青色発光ポリマーを含む発光層およびカソードを備えていた。ＯＬＥＤのピーク発光波長は４８０ｎｍであった。
【００９０】
ＯＰＤはガラス基板上に支持され、透明アノード、正孔輸送層、以下に示すドナーポリマーとＣ７０フラーレンアクセプタ材料との混合物の層およびカソードを備えていた。
【化２】
2019520070.tif 000004
【００９１】
蛍光指示薬からの蛍光を、２０ｍＡの駆動電流、０ＶのＯＰＤバイアスおよび１００ｍｓのパルス時間を用いて測定した。印刷ショートパスフィルタおよびロングパスフィルタを使用して、ＯＬＥＤスペクトルをシャープにし、励起光がＯＰＤに到達するのを防止した。
【００９２】
図２を参照すると、センサ電流（蛍光指示薬からの蛍光の強度に対応する）とグルコースの濃度との間に直線的な関係がある。
【００９３】
［実施例３］
グルコースアッセイ−より高い鉄（ＩＩ）濃度
以下を含有する溶液を調製した：検出試薬溶液（実施例１で調製したもの）１５μＬ、硫酸鉄（ＩＩ）水溶液（１００ｍＭ）５０μＬ、ＥＤＴＡ水溶液５０μＬ、リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中のＤ−（＋）グルコース（０、０．０６、０．６または６μＭ）７８５μＬ。これらの溶液のそれぞれに、グルコースオキシダーゼ（２０ｍｇ／ｍＬ）の水溶液１００μＬを添加し、サンプル管を迅速に反転させて混合した。室温で５分後、〜１３０μＬの溶液を用いて、マイクロ流体フローセル（光路長０．５ｍｍの２０×９ｍｍの面積）を完全に充填し、蛍光強度を実施例２に記載のように測定した。
【００９４】
図３を参照すると、グルコース濃度とセンサ電流との間に実質的に直線的な関係が観察された。
【００９５】
［実施例４］
実施例３のように３つの溶液を調製した。これらの溶液のそれぞれに、グルコースオキシダーゼ水溶液を添加し、０．０２、０．２または２ｍｇ／ｍＬの最終酵素濃度および１ｍＬの最終容量を得た。混合後、〜１３０μＬの溶液をマイクロ流体フローセル（光路長０．５ｍｍの２０×９ｍｍ面積）に直ちに移し、ＯＬＥＤ／ＯＰＤプラットフォームおよび実施例２に記載の測定パラメータを用いて、２０分にわたって１５秒ごとに蛍光強度を測定した。
【００９６】
図４を参照すると、所与の時点におけるセンサ電流およびセンサ電流増加率はどちらも、グルコースオキシダーゼ酵素の濃度に比例する。
【００９７】
本発明は特定の例示実施形態に関して記載されたが、本明細書に開示される特徴の種々の変更、代替および／または組み合わせが、以下の特許請求の範囲に示されるような本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明らかであることが理解される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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