(57)【要約】本発明は、２つのベンゾフェノン系化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノンおよび４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノンの新しい医学的用途を開示し、具体的には、抗ＩＩ型糖尿病性腎症、急性腎盂腎炎および慢性腎炎を治療する薬物の調製における使用であり、同時に、本発明は上記２つの化合物を有効成分とする抗ＩＩ型糖尿病性腎症薬物および急性腎盂腎炎と慢性腎炎を治療する薬物も開示する。この２つの化合物はいずれもＩＩ型糖尿病性腎症モデルラット、急性腎盂腎炎モデルラットおよび慢性腎炎モデルラットの腎機能を効果的に改善することができ、抗糖尿病性腎症、急性腎盂腎炎および慢性腎炎の治療における重要な使用見通しを表示している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノンおよび４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノンの、抗ＩＩ型糖尿病性腎症薬物の調製における使用。
【請求項２】
抗ＩＩ型糖尿病性腎症薬物であって、
前記薬物の有効成分は化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノン、または化合物の４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノンである、
ことを特徴とする抗ＩＩ型糖尿病性腎症薬物。
【請求項３】
該薬物には、さらに上記有効成分に組合せて使用される一般的な薬物担体または賦形剤が含まれている、ことを特徴とする請求項２に記載の抗ＩＩ型糖尿病性腎症薬物。
【請求項４】
前記薬物は注射剤、錠剤、滴丸剤、固体分散体またはカプセル剤である、ことを特徴とする請求項２または３に記載の抗ＩＩ型糖尿病性腎症薬物。
【請求項５】
化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノンおよび４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノンの、急性腎盂腎炎と慢性腎炎を治療する薬物の調製における使用。
【請求項６】
急性腎盂腎炎と慢性腎炎を治療する薬物であって、
前記薬物の有効成分は化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノン、または化合物の４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノンである、
ことを特徴とする急性腎盂腎炎と慢性腎炎を治療する薬物。
【請求項７】
該薬物には、さらに上記有効成分に組合せて使用される一般的な薬物担体または賦形剤が含まれている、ことを特徴とする請求項６に記載の急性腎盂腎炎と慢性腎炎を治療する薬物。
【請求項８】
前記薬物は注射剤、錠剤、滴丸剤、固体分散体またはカプセル剤である、ことを特徴とする請求項６または７に記載の急性腎盂腎炎と慢性腎炎を治療する薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物の新しい用途分野に属し、２つのＩＩ型糖尿病性腎症、急性腎盂腎炎および慢性腎炎を予防し治療する効能を有する化合物に関する。より具体的には、化合物の４，５，２’’−トリヒドロキシ−２，５’’−ジブロモベンゾフェノンおよび４，５，２’’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’’−ジクロロベンゾフェノンのＩＩ型糖尿病性腎症、急性腎盂腎炎および慢性腎炎を予防し治療する薬物の調製における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病性腎症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ、ＤＮ）は糖尿病の一般的な主要合併症の１つであり、最終的には末期腎疾患（ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＥＳＲＤ）の原因となる。現在、中国の糖尿病患者数は１．１４億人、前糖尿病患者数は１．４億人であり、世界中糖尿病患者数の増加に伴い、ＤＮの罹患率も増加している。欧米各国において、ＤＮはＥＳＲＤの主要病因であり、２５〜４２％を占め、我が国のＥＳＲＤの主要病因でもある。ＤＮのＩＩ型糖尿病における罹患率は約２０〜２５％であり、ＤＮは最初に尿蛋白が出ることから高血圧、ネフローゼ症候群に至り、最終的には腎不全および死亡になる。
【０００３】
現段階、ＤＮの治療としては主に血糖を制御し、血中脂質を低下させ、炎症を抑制し、酸化ストレスを防御することであり、現在臨床投薬は主にアンジオテンシン変換酵素阻害薬／アンジオテンシン受容体拮抗薬（ＡＣＥＩ／ＡＲＢ）、ひいては抗糖尿病薬との併用を採用しており、ＡＣＥＩ／ＡＲＢの主要効能は血圧および尿中微量アルブミンを低下させることにより、糸球体の浸透圧を低下させるとともに、インスリンに対する利用を改善することである。しかし、多数のＤＮ患者にとって、特にＩＶ期以後のＤＮ患者にとって、ＡＣＥＩ／ＡＲＢ系の薬物を使用した後、電解質平衡異常が発生することが多く、高カリウム血症が併発しやすく、同時に空咳、起立性低血圧などが発生する副作用がある。
【０００４】
急性腎盂腎炎は、主に複数病原体の侵襲による腎尿細管、腎間質および腎実質の炎症性疾患であり、一般的に糸球体部位が損傷されることは少ない。治療に手遅れの場合、急性から慢性に変化し、最終的には腎不全に至る可能性がある。急性腎盂腎炎の発病機序は主に細菌の病原性、炎症および免疫反応などに関わり、後の両者は研究者にもっとも重要視されている。現在、臨床では主に適切な抗菌薬を使用して急性腎盂腎炎を治療している。ただし、抗菌薬の濫用に伴って、薬剤耐性菌が発生し続け、治療後に再発しやすいなど、その臨床的効果に影響を与えている。
【０００５】
慢性腎炎は慢性糸球体腎炎の略称であり、免疫介在炎症性疾患であり、臨床的には蛋白尿、血尿などが表現され、異なる程度の腎機能低下の可能性があり、腎機能悪化の傾向があり、最終的には慢性腎不全に至る１つの糸球体症である。近年、慢性腎炎の発病率は益々高くなり、若年化の傾向があり、家庭および社会に巨大な経済的負担を与えている。最近の研究によると、尿蛋白は糸球体疾患の兆候であるだけでなく、慢性および進行性腎不全患者の疾患進行の危険因子でもある。大量の臨床および実験研究から、尿蛋白自体が腎臓毒性を有し、腎不全を促進することが分かった。そのため、尿蛋白を減少させ取り除くことは、慢性腎炎を治療する重要な対策の１つである。現在、慢性腎炎の治療には、一般的にホルモンおよび免疫抑制剤による典型的な治療方法を採用し、一定の治療効果はあるが、深刻な副作用および再発性があるため、慢性腎炎の進行を根本的に抑えることは難しい。
【０００６】
従って、上記３つの腎臓病の危険性および現在臨床におけるこのような疾患の薬物治療に存在する欠陥に対し、適切な治療薬物を見つけることは現在医薬品業界において注目されている研究方向になっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、従来のＩＩ型糖尿病性腎症、急性腎盂腎炎および慢性腎炎の治療に存在する不備に対し、ベンゾフェノン系化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノンおよび４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノンの新しい薬理学的な用途を提供することであり、具体的には、抗ＩＩ型糖尿病性腎症および急性腎盂腎炎と慢性腎炎を治療する薬物の調製における使用である。
【０００８】
本発明の他の１つの目的は、新しい抗ＩＩ型糖尿病性腎症薬物および急性腎盂腎炎と慢性腎炎を治療する薬物を提供することであり、該薬物は化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノンおよび４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノンを有効成分とし、また、該薬物にはさらに前記有効成分と組合せて使用される一般的な薬物担体または賦形剤が含まれている。該薬物は、異なる要求に応じて固体分散体、錠剤、滴丸剤、カプセル剤または注射剤などの通常の製剤に製造することができる。
ここで、化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノン（ＬＭ４９）の構造式は以下のとおりである。
【化１】
2019518072.tif 000003
化合物の４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノン（Ａ８）の構造式は以下のとおりである。
【化２】
2019518072.tif 000004
【０００９】
前記化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノンおよび４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノンは、いわゆる当業者に熟知されている２つのベンゾフェノン系化合物であり、その調製方法も容易に実現できる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明はＳＤラットのＩＩ型糖尿病性腎症モデル、急性腎盂腎炎モデルおよび慢性腎炎モデルをそれぞれ作製し、胃内投与によって異なる用量の上記２つの化合物の固体分散体を投与し、その期間中に血糖、血中脂質、尿量、尿液、臓器指標、尿液および組織中細菌、腎機能関連指標、血液中ＣＤ４およびＣＤ８、炎症因子などの各指標を検査し、２つの化合物がＩＩ型糖尿病性腎症、急性腎盂腎炎および慢性腎炎のラットに対して強い腎臓保護作用を果たすことを証明し、糖尿病性腎症、急性腎盂腎炎および慢性腎炎を予防し治療することにおける重要な使用見通しを示している。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の主なイノベーションは以下のとおりである。
１）２つの化合物は著しい抗ＩＩ型糖尿病性腎症の薬理学的活性および著しい急性腎盂腎炎および慢性腎炎を治療する薬理学的活性を有し、非常に良い開発応用の価値があることを見つけた。
２）２つの化合物は非常に強い血糖降下、血中脂質低下、抗酸化、抗炎症などの作用を有し、その活性多様性はＤＮの発病機序に多岐にわたって適合されている。
３）２つの化合物を固体分散体として投与する場合、いずれもＩＩ型糖尿病性腎症のラットの腎機能を効果的に改善することができ、その主な治療指標である尿酸、尿蛋白、尿中微量アルブミン、形質転換成長因子ＴＧＦ−β１、血糖、低比重リポ蛋白などは現在臨床における第１選択薬のカプトプリルより優れている。
４）２つの化合物は非常に強い抗菌、免疫調整などの作用を有する。
５）現在まで、２つの化合物の抗ＩＩ型糖尿病性腎症、急性腎盂腎炎および慢性腎炎を治療する薬理学的作用に対する国内外の関連報道がない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色を行い、電子顕微鏡で観察した、各群の糖尿病性腎症モデルラットの腎臓病理学的比較（ＨＥ×２００）を示す図である。
【図２】Ｍａｓｓｏｎ染色を行い、電子顕微鏡で観察した、各群の糖尿病性腎症モデルラットの腎臓病理学的比較（Ｍａｓｓｏｎ×４００）を示す図である。
【図３】急性腎盂腎炎モデルラットの尿液細菌培養状況を示す図である。
【図４】急性腎盂腎炎モデルラットの腎臓抽出液の細菌培養状況を示す図である。
【図５】ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色を行い、電子顕微鏡で観察した、各群の急性腎盂腎炎モデルラットの腎臓病理学的比較（ＨＥ×２００）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノンおよび４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノンの、抗ＩＩ型糖尿病性腎症薬物および急性腎盂腎炎と慢性腎炎を治療する薬物の調製における使用である。
【００１４】
上記抗ＩＩ型糖尿病性腎症薬物および急性腎盂腎炎と慢性腎炎を治療する薬物について、その有効成分は化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノン、または、化合物の４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノンである。該薬物にはさらに上記有効成分と組合せて使用される一般的な薬物担体または賦形剤が含まれている。該薬物は具体的な要求に応じて注射剤、錠剤、滴丸剤、固体分散体またはカプセル剤などの一般的な剤形に製造することができる。
【００１５】
本発明の化合物の４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノンおよび４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノンの、抗ＩＩ型糖尿病性腎症および急性腎盂腎炎と慢性腎炎の治療における薬理学的作用は、以下の具体的な実施例を介して説明する。説明すべきことは、以下の実施例は説明するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。
【００１６】
（実施例１）
＜材料＞
実験動物：オスのＳＤラット、体重１８０〜２２０ｇ、
動物入手先：中国食品薬品検定研究院、
ライセンス番号：ＳＣＸＫ−（京）２０１４−００１３、
合格証明書番号：１１４００５００００８４６５、
本実験に使用される動物およびかかる処置は動物福祉要求を満たし、実験を実施する前に本機関動物福祉委員会の倫理審査を受けなければならない。
【００１７】
＜飼料＞
高糖高脂質飼料の調合法：１０％ラード、２０％蔗糖、２．５％コレステロール、０．５％コール酸ナトリウム、６７％基本材料、
飼料入手先：北京科澳協力飼料有限公司、
ライセンス番号：ＳＣＸＫ−（京）２０１４−００１０、
合格証明書番号：１１００２９０００１６１２０。
【００１８】
＜薬品および試薬＞
４，５，２’−トリヒドロキシ−２，５’−ジブロモベンゾフェノン（以下、ＬＭ４９と略称し、山西医科大学薬物化学実験室により調製、純度≧９９．５％、ロット番号：２０１５０３２０）、
４，５，２’−トリス（４−モルホリニルオキシ）−２，５’−ジクロロベンゾフェノン（以下、Ａ８と略称し、山西医科大学薬物化学実験室により調製、純度≧９９．５％、ロット番号：２０１５０１１２）、
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ  Ｋ３０）（ＵＳＰ２６、江陰嘉豊化工有限公司）、
ツイーン８０（医薬品グレード、四川金山製薬有限公司）、
無水エタノール（分析用試薬の純度、北京化学試剤公司）、
カプトプリル（上海旭東海普薬業有限公司、生産ロット番号：１４０６０３）、
ストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ、生産ロット番号：１１２６Ｃ０３８）、
ラットインターロイキン−１β酵素結合免疫吸着検査キット（南京建成、ロット番号：１５０１２６１）、
ラットインターロイキン−６酵素結合免疫吸着検査キット（南京建成、ロット番号：１４１２２７１）、
ラット微量アルブミン（Ａｌｂ）酵素結合免疫吸着検査キット（南京建成、ロット番号：１５０６２０１）、
ラット可溶性細胞間接着分子（ｓＩＣＡＭ−１）検査キット（南京建成、ロット番号：１５０１２０１）、
ラット腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）酵素結合免疫吸着検査キット（南京建成、ロット番号：１５０７２８１）、
ラット血管内皮細胞接着分子（ｓＶＣＡＭ−１）酵素結合免疫吸着検査キット（南京建成、ロット番号：１５０８２２１）、
総抗酸化能（Ｔ−ＡＯＣ）キット（南京建成、ロット番号：２０１５１０１０）、
ＢＣＡ蛋白定量キット（博士徳生物、ロット番号：１０Ｋ１２Ｂ４６）、
尿素（ＢＵＮ）キット（上海複星長征医学科学有限公司、ロット番号：Ｐ１３１１０２１）、
尿酸（ＵＡ）キット（上海複星長征医学科学有限公司、ロット番号：ＰＦ１４０５０１１）、
クレアチニン（ＣＲＥＡ）キット（上海複星長征医学科学有限公司、ロット番号：Ｄ１  ４０４０６３）、
臨床化学総合品質管理血清（上海複星長征医学科学有限公司、ロット番号：８４２ＵＮ）、
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）キット（南京建成、ロット番号：２０１５０１２６）、
ラット核内転写因子（ＮＦ−κＢ）酵素結合免疫吸着検査キット（南京建成、ロット番号：１５０７２５１）、
ＳＯＤキット（ＷＳＴ−１法、南京建成、ロット番号：２０１５０１２７）、
Ｍａｓｓｏｎ染色液（南京建成、ロット番号：２０１５０９１５）。
【００１９】
＜器具＞
恒温水槽（上海和呈儀器製造有限公司）、
ＢＰ−１２１Ｓ電子天秤（上海精密化学儀器公司）、
ＴＵ−１８１０紫外可視分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、
血糖測定装置（ジョンソン・アンド・ジョンソン）、
マイクロプレートリーダー（Ｒａｙｔｏ、ＲＴ−６１００）、
低速自動平衡遠心分離機（河北省安新県白洋離心機廠）、
超低温フリーザ（Ｈａｉｅｒ）、
Ｋｏｎｅｌａｂ  Ｐｒｉｍｅ  ３０自動生化学分析装置（アメリカＴｈｅｒｍｏ）。
【００２０】
＜固体分散体の調製＞
溶媒法を採用して調製する。ＬＭ４９、ＰＶＰＫ３０、ｔｗｅｅｎ８０の質量比が１：５：１であり、Ａ８、ＰＶＰＫ３０、ｔｗｅｅｎ８０の質量比が１：４：１であるように、各薬品をそれぞれ精密に量り、適量の無水エタノールで溶解し、均一になるまで撹拌し混合させ、６０℃の水浴中で無水エタノールを蒸発除去し、粘着性のあるものを取得し、−２０℃のフリーザに入れて２ｈ冷凍し、取り出して真空オーブンに入れて２４ｈ乾燥し、脆化した後粉砕し８０メッシュの篩に通して、必要に応じて使えるように乾燥機に保存する。
【００２１】
＜糖尿病性腎症動物モデルの調製＞
健康な成熟オスのＳＤラット（１８０〜２２０ｇ）を高糖高脂質飼料で４週間飼育し、翌日断食し、腹腔へ４０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を注射し、正常対照群には同体積のクエン酸ナトリウム緩衝液を注射し、７２ｈ後、１２ｈ断食し、モデリングラットの空腹時血糖値を測定し、３回連続した空腹時血糖値＞１６．７ｍｍｏｌ／Ｌであり、糖尿病モデリングに成功したと考えられる。モデリングに成功した後のラットには、投与期間中に高脂質飼料を与え続け、正常対照群には一般的な飼料を与える。
投薬６週間後、代謝ケージで６ｈの尿を収集する。
【００２２】
断食して一晩越し、腹腔を麻酔し、腹部大動脈の血液を抽出して関連指標を検査する。生理食塩水で腎臓を洗浄、両腎臓の重量を記録し、腎臓係数（両腎臓重量／体重）を算出する。左側腎臓の同じ部位の腎臓組織（糸球体および尿細管を含む）を縦切り、１０％の中性ホルマリンに浸して病理形態学分析に用いる。他の一部分は生化学的指標の検査に、右側腎臓は機序研究に使用し、−８０℃のフリーザに保存する。
【００２３】
＜群別および用量設計＞
モデリングに成功した後、正常対照群（１０匹）以外に、その他の動物をランダムに８群に分け、各群を１２匹とする。モデル群、ＬＭ４９固体分散体低用量群（薬物含有量は３ｍｇ／ｋｇ）、ＬＭ４９固体分散体中等用量群（薬物含有量は９ｍｇ／ｋｇ）、ＬＭ４９固体分散体高用量群（薬物含有量は２７ｍｇ／ｋｇ）、Ａ８固体分散体低用量群（薬物含有量は３ｍｇ／ｋｇ）、Ａ８固体分散体中等用量群（薬物含有量は９ｍｇ／ｋｇ）、Ａ８固体分散体高用量群（薬物含有量は２７ｍｇ／ｋｇ）、カプトプリル対照群（薬物含有量は１５ｍｇ／ｋｇ）に分けられている。
【００２４】
＜投与方法＞
投与経路：胃内投与。
投与体積：正常対照群およびモデル群には生理食塩水１．０ｍｌ／１００ｇを投与し、陽性対照し、ＬＭ４９固体分散体の高、中、低用量群、Ａ８固体分散体の高、中、低用量群には異なる濃度の薬物をそれぞれ投与し、投与体積は１．０ｍｌ／１００ｇとする。
薬物調合：固体分散体を生理食塩水で溶解し、陽性対照には０．５％ＣＭＣ−Ｎａの懸濁液を投与する。
投与時間：モデリング終了後に投与し始める。
投与頻度：毎週７日投与し、合計６週間投与する。
【００２５】
＜統計学的方法＞
ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２０ソフトウェアを使用してデータ処理を行い、データは
【数１】
2019518072.tif 000005
で示し、各群間の比較には１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を採用し、等分散性によって結果を検証し、例えば、等分散にはＬＳＤを採用して検証し、例えば、分散の不均一性にはＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  Ｔ３を採用して検証し、Ｐ＜０．０５を差とすることは統計学的に有意である。
【００２６】
＜結果および分析＞
１．ＬＭ４９、Ａ８の糖尿病性腎症ラットの腎機能に対する影響
【表１】
2019518072.tif 000006
注：正常対照群と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５、モデル群と比較して、□□Ｐ＜０．０１、□Ｐ＜０．０５。
【表２】
2019518072.tif 000007
注：正常対照群と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５、モデル群と比較して、□□Ｐ＜０．０１、□Ｐ＜０．０５、低用量群と比較して、▲▲Ｐ＜０．０１、▲Ｐ＜０．０５、中等用量群と比較して、○○Ｐ＜０．０１、○Ｐ＜０．０５、カプトプリル群と比較して、●●Ｐ＜０．０１、●Ｐ＜０．０５。
【表３】
2019518072.tif 000008
注：正常対照群と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５、モデル群と比較して、□□Ｐ＜０．０１、□Ｐ＜０．０５、低用量群と比較して、▲▲Ｐ＜０．０１、▲Ｐ＜０．０５、中等用量群と比較して、○○Ｐ＜０．０１０．０１、○Ｐ＜０．０５、カプトプリル群と比較して、●●Ｐ＜０．０１、●Ｐ＜０．０５。
【００２７】
２．ＬＭ４９、Ａ８の糖尿病性腎症ラットの血清中血糖レベルに対する影響
【表４】
2019518072.tif 000009
注：正常対照群と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５、モデル群と比較して、□□Ｐ＜０．０１、□Ｐ＜０．０５、低用量群と比較して、▲▲Ｐ＜０．０１、▲Ｐ＜０．０５、中等用量群と比較して、○○Ｐ＜０．０１０．０１、○Ｐ＜０．０５、カプトプリル群と比較して、●●Ｐ＜０．０１、●Ｐ＜０．０５。
【００２８】
３．ＬＭ４９、Ａ８の糖尿病性腎症ラットの血清中コレステロール（ＴＣＨＯ）、トリグリセリド（ＴＧ）、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ−Ｃ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ−Ｃ）レベルに対する影響
【表５】
2019518072.tif 000010
注：正常対照群と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５、モデル群と比較して、□□Ｐ＜０．０１、□Ｐ＜０．０５、低用量群と比較して、▲▲Ｐ＜０．０１、▲Ｐ＜０．０５、中等用量群と比較して、○○Ｐ＜０．０１０．０１、○Ｐ＜０．０５、カプトプリル群と比較して、●●Ｐ＜０．０１、●Ｐ＜０．０５。
【表６】
2019518072.tif 000011
注：正常対照群と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５、モデル群と比較して、□□Ｐ＜０．０１、□Ｐ＜０．０５、低用量群と比較して、▲▲Ｐ＜０．０１、▲Ｐ＜０．０５、中等用量群と比較して、○○Ｐ＜０．０１０．０１、○Ｐ＜０．０５、カプトプリル群と比較して、●●Ｐ＜０．０１、●Ｐ＜０．０５。
【００２９】
４．ＬＭ４９、Ａ８の糖尿病性腎症ラットの組織中炎症因子に対する影響
【表７】
2019518072.tif 000012
注：正常対照群と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５、モデル群と比較して、□□Ｐ＜０．０１、□Ｐ＜０．０５、低用量群と比較して、▲▲Ｐ＜０．０１、▲Ｐ＜０．０５、中等用量群と比較して、○○Ｐ＜０．０１０．０１、○Ｐ＜０．０５、カプトプリル群と比較して、●●Ｐ＜０．０１、●Ｐ＜０．０５。
【表８】
2019518072.tif 000013
注：正常対照群と比較して、＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５、モデル群と比較して、□□Ｐ＜０．０１、□Ｐ＜０．０５、低用量群と比較して、▲▲Ｐ＜０．０１、▲Ｐ＜０．０５、中等用量群と比較して、○○Ｐ＜０．０１０．０１、○Ｐ＜０．０５、カプトプリル群と比較して、●●Ｐ＜０．０１、●Ｐ＜０．０５。
【００３０】
５．ＬＭ４９、Ａ８の糖尿病性腎症ラットの組織中酸化因子に対する影響
【表９】
2019518072.tif 000014
【００３１】
上記研究は、ＬＭ４９は明確な抗ラット糖尿病性腎症作用を有し、腎組織病変を効果的に軽減することができ、ラット血清中尿酸、血糖、コレステロール、トリグリセリド、低比重リポ蛋白レベル、腎組織中形質転換成長因子、尿蛋白および尿中微量アルブミンのレベルを顕著に低下させることができ、腎組織中ＴＮＦ−α、ＮＦ−κＢ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βなどの炎症因子の発現を顕著に抑制し、尿細管の水腫性変性、糸球体線維化レベルを低下させる（図１、図２）ことを表明する。同時に上記結果は、ＬＭ４９は非常に強い抗ラット糖尿病性腎症作用を有し、その主な治療指標の尿酸、尿蛋白、尿中微量アルブミン、形質転換成長因子ＴＧＦ−β１、血糖、低比重リポ蛋白などは現在臨床における第１選択薬であるカプトプリルより優れ、重要な使用見通しを示していることを表明する。
【００３２】
Ａ８はより強い抗ラット糖尿病性腎症作用を有し、腎組織病変を効果的に軽減することができ、ラット血清中尿酸、グリコヘモグロビン、血糖、コレステロール、トリグリセリド、低比重リポタンパク質レベル、および腎組織中形質転換成長因子、尿蛋白および尿中微量アルブミンのレベルを顕著に低下させることができ、腎組織中ＴＮＦ−α、ＮＦ−κＢ、ＩＬ−６、ＩＬ−１βなどの炎症因子の発現を顕著に抑制し、尿細管の水腫性変性、糸球体線維化レベルを低下させる（図１、図２）。同時に上記結果は、Ａ８は非常に強い抗ラット糖尿病性腎症作用を有し、その主な治療指標である腎臓指標、尿酸、尿蛋白、尿中微量アルブミン、形質転換成長因子ＴＧＦ−β１、血糖、低比重リポ蛋白などは現在臨床における第１選択薬のカプトプリルより明らかに優れ、重要な使用見通しを示していることを表明する。
【００３３】
＜結論＞
上記実験によって化合物のＬＭ４９およびＡ８は明確な抗ＩＩ型糖尿病性腎症の機能を有することを説明することができる。特に、高用量群の効果がより顕著であり、化合物のＡ８はＬＭ４９に比べてより高い抗ＩＩ型糖尿病性腎症活性を有し、非常に良い使用開発の見通しを表示している。
【００３４】
（実施例２）
１．実験材料、器具および試薬
＜動物＞
ＳＰＦレベルのオスのＳＤラット２００匹、体重（２００＋２０）ｇ、
北京華阜康生物科技股ふん有限公司から購入、
実験動物のライセンス番号：ＳＣＸＫ（京）２０１４−０００８、
合格証明書番号：１１００３８００００８３１２。
【００３５】
＜動物飼育および飼育環境＞
清潔かつ恒温の環境であり、飼育環境の平均温度は２５℃、平均湿度は３７％であり、１５〜２０回／時間に完全に新鮮な空気を換気する。
照明：１２時間を明るく、１２時間を暗くする。
自由に水を飲み食事させる。
【００３６】
＜動物飼料＞
北京華阜康生物科技股ふん有限公司から購入、
ライセンス番号：ＳＣＸＫ（京）２０１４−０００８、
合格証明書番号：１１００３８００００８３１２。
【００３７】
＜薬品および試薬＞
ＬＭ４９、Ａ８、山西医科大学により提供、
ノルフロキサシンカプセル（山西太原薬業有限公司、ロット番号：１５０４０１）、
酢酸デキサメタゾン錠剤（浙江仙きょ股ふん有限公司、ロット番号：１４１００６）、
大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２標準菌株（上海魯微科技有限公司、ロット番号：Ａ１００８Ｂ）、
血清中クレアチニン、尿中クレアチニンＥＬＩＳＡキット（南京建成科技有限公司、ロット番号：２０１６０４２１）、
ＩＬ−１α（欣博盛生物科技有限公司、ロット番号：１６０４２９−００９ａ）、
ＩＬ−１β（欣博盛生物科技有限公司、ロット番号：１６０４２９−００７ａ）、
ＩＬ−６（欣博盛生物科技有限公司、ロット番号：１６０４２９−００３ａ）、
ＩＬ−１０（欣博盛生物科技有限公司、ロット番号：１６０４２９−００４ａ）、
ＭＣＰ−１（欣博盛生物科技有限公司、ロット番号：１６０４２９−１１３ａ）、
ＣＸＣＬ−２（博士徳生物工程公司、ロット番号：３７７１１９０４２８）、
血液像キット（アメリカＤＲＥＷ科技有限公司、ロット番号：６５７２）、
ａｎｔｉ−Ｒａｔ  ＣＤ４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司、ロット番号：４６−００４０）、
ａｎｔｉ−Ｒａｔ  ＣＤ８−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司、ロット番号：１２−００８４）。
【００３８】
＜主要器具＞
ｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１マイクロプレート検出器（アメリカＢｉｏＴｅｋ有限公司）、
ＬＲＨ−１５０Ｂ生化学培養器（広東韶関泰宏医療器械有限公司）、
Ｔｈｅｒｍｏ  １３００シリーズＩＩレベルＡ２型安全キャビネット（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、
ＪＫ−ＣＣ３０Ａコロニーカウンタ（上海精科儀器公司）、
ＨＥＭＡＶＥＴ９５０ＦＳ自動血液分析装置（アメリカＤＲＥＷ公司）、
ＣＹＴＯＭＩＣＳ  ＦＣ５００フローサイトメトリ（アメリカＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ公司）。
【００３９】
２．固体分散体の調製
溶媒法を採用して調製する。ＬＭ４９、ＰＶＰＫ３０、ｔｗｅｅｎ８０の質量比が１：５：１であり、Ａ８、ＰＶＰＫ３０、ｔｗｅｅｎ８０の質量比が１：４：１であるように、各薬品をそれぞれ精密に量り、適量の無水エタノールで溶解し、均一になるまで撹拌し混合させ、６０℃の水浴中で無水エタノールを蒸発除去し、粘着性のあるものを取得し、−２０℃のフリーザに入れて２ｈ冷凍し、取り出して真空オーブンに入れて２４ｈ乾燥し、脆化した後に粉砕し８０メッシュの篩に通して、必要に応じて使えるように乾燥機に保存する。
【００４０】
３．モデルの調製および投与
１）急性腎盂腎炎モデルラットの調製および群別投与
ＳＤラット９０匹、オス、体重１８０〜２２０ｇ。１０匹を選択して偽手術群（結紮のみで、大腸菌は注射しない）とする。残りのラットは（中国実験動物学雑誌、１９９８、８（１）：３１−３４）における方法に従って、急性腎盂腎炎モデルを調製するために、濃度１０８／ｍｌの大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２溶液を注射する。
【００４１】
３ｄ日後に尿液を収集して、細菌培養を行い、細菌の成長状況を観察し、陽性が出ることをモデルの調製に成功したとし、不合格者は取り除き、同時に再手術により動物数を補充する。調製に成功したモデルをランダムにモデル群、ノルフロキサシン群（６６．７ｍｇ／ｋｇ）、ＬＭ４９固体分散体低用量群（含有量は３ｍｇ／ｋｇ）、中等用量群（含有量は９ｍｇ／ｋｇ）、高用量群（含有量は２７ｍｇ／ｋｇ）、Ａ８固体分散体低用量群（含有量は３ｍｇ／ｋｇ）、中等用量群（含有量は９ｍｇ／ｋｇ）、高用量群（含有量は２７ｍｇ／ｋｇ）に分ける。
【００４２】
偽手術群およびモデル群には胃内投与により同体積の生理食塩水を投与し、残りの群には対使用量の薬物を投与し、毎日１回投与、連続した胃内投与で１０日投与する。
【００４３】
２）慢性腎炎モデルラットの調製および群別投与
不活化型Ｈｅｙｍａｎｎ腎炎は人の慢性腎臓病を研究するための典型的モデルである。したがって、本発明は該モデルを用いて本発明における２つの化合物の慢性腎炎に対する予防治療作用を研究する。
【００４４】
オスのＳＤラット９０匹、体重１８０〜２２０ｇ。１０匹を選択して空白群とし、残りのラットは（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１２、７５（３）：３８６６−３８７６）方法に従ってラットＨｅｙｍａｎｎ腎炎モデルに調製する。ランダムにモデル群、陽性対照群（デキサメタゾン、０．１ｍｇ／ｋｇ）、ＬＭ４９固体分散体低用量群（薬物含有量は３ｍｇ／ｋｇ）、中等用量群（薬物含有量は９ｍｇ／ｋｇ）、高用量群（薬物含有量は２７ｍｇ／ｋｇ）、Ａ８固体分散体低用量群（薬物含有量は３ｍｇ／ｋｇ）、中等用量群（薬物含有量は９ｍｇ／ｋｇ）、高用量群（薬物含有量は２７ｍｇ／ｋｇ）に分ける。
【００４５】
空白群およびモデル群には同体積の生理食塩水を投与、残りの群には対使用量の薬物を投与し、モデリング当日から、毎日胃内投与し、合計４週間投与する。
【００４６】
４．サンプル収集および関連指標の検査
１）急性腎盂腎炎モデルラット
全ての群のラットはいずれも投与終了後に尿液を収集し（細菌成長状況を観察する）、腹部大動脈血を採集し（血液像、ＣＤ４／ＣＤ８および血清中の尿中クレアチニン、血清中クレアチニンを検査し、ＥＬＩＳＡ法により血清中ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１などの含有量を検査する）、両側の腎臓を切り取る（一部のホモジネートは細菌培養に使用し、もう一部は病理形態学的変化を観察するのに使用する）。
【表１０】
2019518072.tif 000015
【００４７】
２）慢性腎炎モデルラット
全て群のラットはモデリング開始の第２および第４週に採血し２４時間の尿液を収集し、それぞれ尿中アルブミンおよび血清中クレアチニン（Ｓｃｒ）、尿素窒素（ＢＵＮ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０などの含有量を検査する。
【００４８】
５．統計学的方法
平均±標準偏差
【数２】
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を採用してデータを表示し、ＳＰＳＳ  １９．０統計ソフトウェアで処理し、複数群の比較にはＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ一元配置分散分析を採用し、その後、ＬＳＤ−Ｔｅｓｔを採用して一対比較を行う。有意差レベルはＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１を標準とする。
【００４９】
６．結果および分析
１）２つの化合物の急性腎盂腎炎に対する治療作用の結果
【表１１】
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注：偽手術群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【表１２】
2019518072.tif 000018
注：偽手術群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【表１３】
2019518072.tif 000019
注：偽手術群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【表１４】
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注：偽手術群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【表１５】
2019518072.tif 000021
注：偽手術群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【表１６】
2019518072.tif 000022
注：偽手術群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【表１７】
2019518072.tif 000023
注：偽手術群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【表１８】
2019518072.tif 000024
注：偽手術群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【００５０】
結果によれば：２つの化合物は急性腎盂腎炎モデルラットの腎臓指標および膀胱指標（表１１）を顕著に低下させ、腎臓組織および尿液の細菌感染程度（表１２、図３および図４）を軽減し、腎臓組織内の皮質と髄質構造および腎盂、腎杯などの組織構造病変および慢性炎症細胞の浸潤または膿瘍（図５）を明らかに軽減することができる。そして、２つの化合物の急性腎盂腎炎に対する治療効果は、主にＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ４／ＣＤ８を調整することによりモデルラット自体の免疫機能を向上させ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６などの炎症因子の発現を抑制し、炎症反応を低下させることによって実現される。同時に、上記結果は、化合物のＬＭ４９およびＡ８の高用量群のＣＤ４／ＣＤ８に対する調整は陽性薬より明らかに優れ、重要な使用見通しを示すことを表明する。
【００５１】
２）２つの化合物の慢性腎炎に対する治療作用の結果
【表１９】
2019518072.tif 000025
注：空白群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【表２０】
2019518072.tif 000026
注：空白群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【表２１】
2019518072.tif 000027
注：空白群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【表２２】
2019518072.tif 000028
注：空白群と比較：＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、モデル群と比較：△△Ｐ＜０．０１、△Ｐ＜０．０５、陽性薬物群と比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。
【００５２】
結果によれば：２つの化合物はいずれも尿蛋白量を顕著に低下させ、腎機能を顕著に改善することができ、高用量群は陽性薬群（表１９）より明らかに優れている。そして、２つの化合物の慢性腎炎に対する治療効果はＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６などの炎症因子の発現を抑制し、炎症反応を低下させることによって実現される。
【００５３】
＜結論＞
２つの化合物は急性腎盂腎炎モデルラットおよび慢性腎炎モデルラットに対していずれも明確な治療作用を有し、特に高用量群の効果はより顕著である。これは該化合物が非常に良い使用開発見通しを有することを表示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2019518072.tif 000036
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