(57)【要約】  ある標的分子に対する結合剤、または当該結合剤をライブラリーから選択する方法もしくはキットが提供される。当該ライブラリーで各変種はＦＨＡドメインの循環置換を有し、当該再配列整理はＦＨＡドメインのベータ−シート足場を実質的に破壊しないか、またはベータ−シート足場の安定性を高める。ＦＨＡドメインのランダム化領域は、ＦＨＡドメインの内因性結合境界面、当該内因性結合境界面の対向領域、および循環置換領域を含む。
2019521955.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、標的分子と結合する少なくとも１つの結合剤を製造する方法：
（ａ）タンパク質をコードするライブラリーを構築する工程であって、前記タンパク質の各々が循環置換を含む少なくとも１つのＦＨＡドメインを有し、前記ＦＨＡドメインが、前記ＦＨＡドメインの内因性ベータ−シート足場、内因性結合境界面、および対向する境界面、並びに前記ベータ−シート足場の近くのおよび／またはその部分の前記タンパク質のランダム化配列を有し、さらに、前記ランダム化配列および前記循環置換が前記ベータ−シート足場を実質的に崩壊させないか、または前記ベータ−シート足場の安定性を高める、前記構築工程；
（ｂ）前記ライブラリーの前記タンパク質を発現させる工程；
（ｃ）前記標的分子と結合するタンパク質について前記ライブラリーをスクリーニングする工程；および
（ｄ）前記スクリーニングされたタンパク質の少なくとも１つを結合剤として選択する工程。
【請求項２】
前記ライブラリーがファージディスプレーライブラリーまたはリボソームディスプレーライブラリーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ランダム化配列が、内因性結合境界面、対向境界面、および循環置換に位置する配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質の各々が追加のＦＨＡドメインを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質の各々がタンパク質タグをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質の各々が、ある分子に対して高親和性の結合特性を有する追加のペプチドまたはポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
既知機能または酵素活性を有するドメインをさらに含む、請求項６に記載の追加のペプチドまたはポリペプチド。
【請求項８】
前記ＦＨＡドメインがコンピュータ支援モデリングの方法から誘導される非内因性合成配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ライブラリーから選択される、標的分子と結合する、少なくとも１つのＦＨＡドメインを含む結合剤であって、
前記ＦＨＡドメインが前記ＦＨＡドメインの内因性ベータ−シート足場および循環置換を有し、前記ＦＨＡドメインが内因性結合境界面および対向する境界面、並びに前記ライブラリーから選択された結合境界面を有し、前記結合境界面が前記ＦＨＡドメインの少なくとも１つ配列領域のランダム化の生成物であり、前記ランダム化された少なくとも１つの配列領域および循環置換が前記ベータ−シート足場の安定性を実質的に崩壊させないか、または前記ベータ−シート足場の安定性を高める、前記結合剤。
【請求項１０】
前記結合境界面のランダム化配列領域が、内因性結合境界面、対向する境界面または循環置換を含む、請求項９に記載のＦＨＡドメイン。
【請求項１１】
ファージライブラリーまたはリボソームライブラリーを含む、請求項９に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記結合剤が追加のＦＨＡドメインを有する、請求項９に記載の結合剤。
【請求項１３】
前記結合剤がタンパク質タグを含む、請求項９に記載の結合剤。
【請求項１４】
前記結合タンパク質が、ある分子に対して高親和性の結合特性を有する追加のペプチドまたはポリペプチドをさらに含む、請求項９に記載の結合剤。
【請求項１５】
既知機能または酵素活性を有するドメインをさらに含む、請求項１４に記載の追加のペプチドまたはポリペプチド。
【請求項１６】
コンピュータ支援モデリング方法から誘導される非内因性合成配列を含む、請求項９に記載のＦＨＡドメイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は操作した非内因性フォークヘッド関連（ＦＨＡ）ドメインに関し、ＦＨＡドメインは実質的に同一の保存されたベータシート足場を有するが、当該ポリペプチドは循環置換を介して当該ベータ鎖の１つ以上の間で新規な配列を提示する。この操作ＦＨＡドメインをランダム化してライブラリーを構築することができ、当該ライブラリーを種々の標的分子／抗原との新規な結合相互反応についてスクリーニングすることができる。当該操作ＦＨＡドメイン変種の結合親和性は、ＦＨＡドメインの内因性結合面のループのランダム化および／またはＦＨＡドメインの内因性結合面に対向して位置するループのランダム化と密接に関係し得る。
【０００２】
本出願は仮特許出願６２／３２７，４２２（２０１６年４月２５日出願）の優先権を主張し、さらに米国特許出願１４／４９７，３２０（２０１４年９月２５日出願）を参照により本明細書に含む。
【背景技術】
【０００３】
ＦＨＡは原核生物及び真核生物の両方で構造的に保存され、一般的に５鎖β−シートおよび対抗する６鎖β−シートを含むβ−サンドイッチ構造を特色とする。ＦＨＡドメインを有する内因性タンパク質は、ホスホスレオニン部分及びホスホチロシンとの結合に密接に関係する。この相互反応は、ＦＨＡドメインの共通面で提示され、種々のβ−シート鎖の連結性を促進する突出ループによって作り出されるタンパク質配列によって媒介される。
構造的に保存されたコアのこの配列整理（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）は、相互反応特異的可変ループ領域と一緒になって、ＦＨＡドメインを効果的な抗体様タンパク質（ＡＬＰ）にする。保存されたコア足場の完全性を維持しつつランダム化されたＦＨＡドメイン可変ループ領域をコードするＤＮＡライブラリーを作製することによって、確立されたディスプレー技術を利用し事実上任意の所望標的と特異的に相互反応するＦＨＡドメインを作製できる。そのような性能は研究ツールおよび治療ツールとして細胞内および細胞外で密接な関係を有する。
ＦＨＡドメインを有する内因性タンパク質フレームワークを用いるタンパク質ライブラリーの発現は、ＦＨＡ足場および／または標的結合に必ずしも必須ではない内因性配列のために細胞により大きな負担となり得る。さらにまた、そのような使用は、組換えタンパク質発現の収量の低下をもたらし得る。内因性タンパク質フレームワークの使用はまた、必要とされる熱安定性、所望の標的結合に対する結合親和性、または他のタイプの活性にとって最適でない可能性がある。他の（例えば溶解性またはより高いタンパク溶解性分解リスク）も存在し得る。内因性構造はまた、他の標的、マーカーまたは生物触媒との結合のために追加されるドメインの付加の利用を制限することがある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、再配列整理された一次アミノ酸配列（循環置換の特徴であり得る）を含む操作されたＦＨＡドメインであり、この場合、当該タンパク質の天然に生じた配列は、得られた一次アミノ酸配列がなお機能的ＦＨＡドメインへと構造的に折り畳まれるように再配列整理され、付加され、欠失されまたは除去され得る。操作されたＦＨＡドメインタンパク質を用いて、所望の標的と結合する特定の変種を選別する目的のためにランダム化変種ライブラリーを作製することができる。
操作されたＦＨＡドメインのある実施態様では、当該ドメインの本来のアミノ−およびカルボキシ−（それぞれＮ−およびＣ−）末端は戦略的に操作されて、得られた一次アミノ酸配列は、野生型（ＷＴ）と対比して当該ドメインのどこかに配列整理されたＮ−およびＣ−末端によりＦＨＡとしてなお構造的に折り畳まれ得る。様々な長さの余分なタンパク質配列を導入して、以前のＮ−およびＣ−末端に結合させることができる。余分なタンパク質付加はまた、内因性結合境界面に対向するＦＨＡドメイン面に新たなループを導入できる。このことは、完全に新たな結合境界面または対向する結合境界面の操作を可能にし、これは新たに形成されるループの少なくとも位置についてランダム化されるＤＮＡライブラリーを介して作出され得る。結果として二特異性ＦＨＡ足場を作出でき、操作されたＦＨＡドメインは、典型的な内因性結合境界面を介して１つの分子／標的と結合し、さらに第二の無関係な分子／標的と新たに導入された対向する結合境界面（Ｎ−およびＣ−末端は以前に見出された）を介して結合できる。操作されたＦＨＡドメインはまた、複数の新たに形成されたループ（ＦＨＡ足場の安定性を妨害しない）の導入を含むことができ、前記をさらに変種ライブラリーの作製でランダム化することができる。
【０００５】
新たに導入されるＮ−およびＣ−末端（ここでは保存結合面のループは既に占拠されている）を置くことによって、既知の相互反応を特徴とするペプチドを導入することができ、したがって内因性結合面で自由端を提供することができる。別個のペプチド配列を各末端に導入することができ、得られた境界面は２つの無関係の結合モチーフを提示する。末端に付加される追加ペプチド配列の含有は、操作ＦＨＡの導入された対向結合境界面と共同して三特異性ＦＨＡ（すなわち１つのドメインが３つの異なる分子／標的と結合する）を生じ得る。
新たに操作されたＦＨＡタンパク質の標的／分子にはペプチドまたはポリペプチド、核酸、イオン／放射性同位元素が含まれ得る。
操作ＦＨＡドメインを含む変種には、複数のＦＨＡコピーを有するタンパク質が含まれ得る。ホモダイマーを形成することが知られているいくつかのＦＨＡもまた、循環置換のためのランダム化ライブラリーの作製に用いることができる。
本発明はまた、高親和性の操作されたＦＨＡタンパク質を作製するためのキットを含むことができる。当該キットはオリゴヌクレオチドを含むことができ、前記オリゴヌクレオチドは、新たに操作される１つのループまたは複数のループとともに保存されたループを、当該操作ＦＨＡディスプレーベクターの保存ベータ−シート足場の配列の間でランダム化するために必要である。当該ディスプレーベクターは、ファージディスプレーライブラリーまたはリボソームディスプレーライブラリーのために適切であり得る。キットはさらにプライマー伸長および連結のために必要な試薬（ただしこれらに限定されない）を含むことができる。
様々な調製的、分析的、診断的な目的または治療目的のために、所望の標的分子と結合する操作タンパク質の合成を用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】野生型ＦＨＡドメインおよび操作されたＦＨＡタンパク質足場の例示的実施態様の模式図である。
【図２Ａ】図１の操作ＦＨＡタンパク質の各々の組換えタンパク質発現から得られるＮｉ−ＮＴＡ精製ピーク分画の例示的ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像である。
【図２Ｂ】図１の操作ＦＨＡタンパク質の各々の組換えタンパク質発現から得られるＮｉ−ＮＴＡ精製ピーク分画の例示的ＳＥＣプロフィールオーバーレイである。
【図３Ａ−Ｄ】図１の各操作ＦＨＡタンパク質の組換えタンパク質発現から得られる各モノマーのゲルろ過ピークの例示的ＳＥＣ−ＭＡＬデータである。
【図４】ファージディスプレー選別の模式図である。
【図５】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ抗原選別の例示的ポリクローナルＥＬＩＳＡである。
【図６】大腸菌β−ガラクトシダーゼ抗原選別の例示的モノクローナルＥＬＩＳＡである。
【０００７】
配列表
核酸およびアミノ酸配列表が、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２で規定されたようにヌクレオチドの標準省略文字およびアミノ酸三文字コードを用いて提供される。各核酸配列の一方の鎖のみが示される（提示の鎖の相補鎖配列については当業界で理解されている）。配列表は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ（〜１８ｋｂ）と命名したファイル形式でＡＳＣＩＩテキストファイル（２０１７年４月２５日に作成され、参照により本明細書に含まれる）として提出される。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
図面の詳細な説明
定義
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる技術、表記法および他の学術用語に関する全ての用語は、本発明が属する業界の業者が一般的に理解する意味を有することが意図される。いくつかの事例では、一般的に理解される意味を有する用語が、明確さおよび／または容易な言及のために本明細書で定義される。本明細書にそのような定義を含むからといって、当業界で普遍的に理解されている定義に対し実質的な相違を示そうとしていると解されるべきではない。本明細書に記載または引用される技術及び手順は、普遍的によく理解され、当業者によって通常的な方法論を用いて一般的に利用される。当該通常的な方法論は、例えば以下に記載された広く用いられる分子クローニング方法論である：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００１）。適切な場合には、市場で利用できるキットおよび試薬の使用を必要とする手順は、特段の記載がなければ概ね製造業者が規定したプロトコルおよび／またはパラメーターにしたがって実施される。
以下の定義は、特段の記載がなければ、本出願の全ての特徴および実施態様に適用される。
【０００９】
“オリゴヌクレオチド”は、長さが約１８から３０ヌクレオチドであり得る一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド核酸鎖を指す。オリゴヌクレオチドは遺伝物質（例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）とハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドは、それらの５’−末端にアミノ−若しくはチオール−リンカーを介して、または３’−末端でアミノ結合を介して以下のもので標識され得る（ただしこれらに限定されない）：蛍光色素（例えばＣｙ３TM、Ｃｙ５TM、フルオレセイン）、クエンチャ（例えばＤａｂｃｙｌまたはＴ−Ｄａｂｓｙｌ）、または代替標識（例えばビオチンおよび放射性同位元素）。標識オリゴヌクレオチドは、核酸の存在を相補的な核酸配列により検出するプローブとして機能し得る。標識または非標識オリゴヌクレオチドはまた、クローニングまたは遺伝子の存在の検出時にＰＣＲの実施に必要なプライマーとして用いることができる。オリゴヌクレオチドは、改変または非改変２’−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴ）またはリボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）を用いて固相合成によって合成される。
【００１０】
“タンパク質”、“ペプチド”および“ポリペプチド”という用語は、ペプチド結合によって一緒に共有結合された少なくとも２つの天然または非天然アミノ酸の線状巨大分子ポリマーを指す。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは、環状でないかまたはそのＮ−もしくはＣ−末端に特別にタグを有しない限り、Ｎ−末端に遊離アミノ基およびＣ−末端に遊離カルボキシル基を有する。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列は遺伝子のヌクレオチド配列によって決定される。タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドは一次、二次および三次構造を有し得る。時には、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドはまた補欠分子族または補因子により翻訳後改変され得る。
“プラスミド”はベクターであり、独立して複製するＤＮＡの環状二本鎖片を指す。プラスミドは、複製起点（例えば大腸菌ｏｒｉＣ）、選別可能な抗生物質耐性遺伝子（β−ラクタム、マクロライドおよびアミノグリコシド抗生物質（ただしこれらに限定されない）に対する耐性を付与する）、発現制御下にあるプロモーター配列、および制限部位を含むマルチクローニング部位（本明細書に記載の抗体様タンパク質のためのコード配列を含むことも含まないこともある）を含むことができる。
プラスミドは“発現プラスミド”または“発現ベクター”であり得る。発現プラスミドはクローン化遺伝子の発現を可能にする。発現プラスミドは、誘導可能なプロモーター領域（プラスミドのマルチクローニング部位でクローン化された遺伝子の遺伝子発現の調節及び誘導を可能にする）、リボソーム結合部位、開始コドン、終止コドン、および転写終了配列を含む。
【００１１】
“組換えタンパク質”という用語は、操作された“組換えＤＮＡ”コード配列から発現されるタンパク質を指す。組換えＤＮＡは、少なくとも２つの無関係のＤＮＡ鎖を自然界では通常生成されることのない１つの鎖にまとめる。分子クローニングを用いて組換えＤＮＡが構築され、対象ＤＮＡフラグメントの増幅およびクローニングベクターへの当該フラグメントの挿入を必要とし得る。続いて、組換えＤＮＡを宿主生物に導入し、挿入された組換えＤＮＡの存在について前記生物をスクリーニングおよび選別する。
“タンパク質発現”という用語は、宿主細胞（例えば細菌、酵母、植物または動物細胞）内でのタンパク質の生成を指す。プロモーターの制御下で組換えタンパク質のコード配列を運ぶベクター（例えば発現プラスミッド）が宿主細胞に挿入される。組換え遺伝子の発現を制御するプロモーターが続いて導入され、組換え遺伝子によってコードされるタンパク質が宿主細胞内で生成される。
“タンパク質精製”という用語は、タンパク質を精製するプロセスを指し、対象タンパク質を満足な純度レベルに分離及び単離するために用いられる任意の技術を利用できる。タンパク質精製ではタンパク質の多様な特性（例えばサイズ、荷電、結合親和性および生物学的活性）が利用される。液体カラムクロマトグラフィーはタンパク質精製で一般的に用いられ、この場合、発現されたタンパク質を含む細胞溶解物を対象タンパク質に対して特定の結合親和性を有する“樹脂”上を通過させる。樹脂は、イオン交換、疎水性相互反応、サイズ排除、逆相または親和性タグクロマトグラフィーを介してタンパク質の精製を支援する化学的特性を有する化合物またはポリマーである。タンパク質はまた、非クロマトグラフィー技術、例えば対象タンパク質サンプルを含むポリアクリルアミドゲル切取り細片のタンパク質エレクトロポレーションによって精製できる。
【００１２】
“タンパク質タグ”は、組換えタンパク質に新たな特徴を提供する当該組換えタンパク質内のアミノ酸配列を指す（前記新たな特徴は、当該タグの特徴および親和性に基づいてタンパク質精製、同定または活性を補助する）。タンパク質タグは新規な酵素活性を組換えタンパク質に提供することができる（例えばビオチンタグ）。またはタグはタンパク質同定手段を提供することができる（例えば緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質をコードする蛍光タグによって）。タンパク質タグはタンパク質のＮ−またはＣ−末端に付加できる。タンパク質精製で一般的に用いられるタンパク質タグはポリＨｉｓタグ（一続きの約６つのヒスチジンアミノ酸残基が付加される）であり、これにより、金属イオン（例えばニッケルまたはコバルト）にキレートされたタンパク質精製マトリックスへの当該タンパク質の結合を可能にする。タンパク質精製に一般的に用いられる他のタグには、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、およびＦＬＡＧ−タグが含まれる。例えば“エピトープタグ”のようなタグはまた、抗体に対する親和性をタンパク質に付与することができる。一般的な抗体エピトープタグにはＶ５タグ、ＭｙｃタグおよびＨＡタグが含まれる。
“融合タンパク質”または“融合されたタンパク質”という用語は、単一遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、当該単一遺伝子は、元々は少なくとも２つ以上の無関係のタンパク質をコードしたコード配列から構成される。融合タンパク質は、当該２つ以上の無関係のタンパク質の機能的ドメインを維持することができる。融合タンパク質のコード配列の部分はエピトープタグをコードすることができる。抗体様タンパク質について本明細書に記載したように、融合タンパク質はまた、その適用に基づいて様々な機能的役割を有する多様なタンパク質をコードする配列を含むことができる。
“タンパク質コード配列”という用語はポリペプチドをコードする遺伝子の部分を指す。コード配列は翻訳コドンのＡＴＧ開始位置と翻訳コドンのＴＡＧ、ＴＡＡまたはＴＧＡ終止位置との間に位置する。真核遺伝子の特徴として、コード配列は遺伝子の“エクソン”（転写されポリペプチドに翻訳される遺伝子の配列）を含み、遺伝子の“イントロン”（転写されるがポリペプチドに翻訳されない遺伝子の配列）を除外できる。
【００１３】
“形質転換”という用語は、化学的または電気的手段を介して膜透過性を利用する方法によって外因性遺伝材料を細菌に導入するプロセスを指す。形質転換の実施は、遺伝材料（例えばプラスミド）をコンピテントな細菌細胞（例えば大腸菌）のアリコートに添加する工程および混合物を氷上でインキュベートさせる工程を必要とする。続いて、細菌細胞をエレクトロポレートするか、または４２℃に約１分置いてから氷上に戻してインキュベートする。続いてコロニーを見ることができるまで細菌細胞を寒天プレートで一晩増殖させる。寒天プレートはコロニーの選別のために抗生物質または栄養条件を含むことができる。
“トランスフェクション”という用語は意図的に核酸を細胞に導入するプロセスを指す。当該用語は真核細胞での非ウイルス的方法のためにしばしば用いられる。前記用語はまた他の方法および細胞タイプを指すことができるが、ただし他の用語が好ましい。すなわち、“形質転換”が、細菌、非動物性真核細胞（植物細胞を含む）での非ウイルス性ＤＮＡ移転を表すためにより頻繁に用いられる。動物細胞では、トランスフェクションが好ましい用語である。なぜならば、形質転換はまたこれらの細胞では癌状態への進行（発癌）を指すために用いられるからである。“形質導入”はウイルス媒介ＤＮＡ移転を記載するためにしばしば用いられる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２，８７５−８８３，２００５）。
“循環置換”という用語は、タンパク質構造が異なる連結性を有するようにタンパク質のアミノ酸ペプチド配列を配列整理する多数の方法を指すが、いくつかの事例では、“循環置換”は野生型配列と類似する三次元（３Ｄ）形状またはコア構造を有することができる。一般的には、Ｎ−およびＣ−末端は直接または間接的に一緒に結合され、さらに新たなＮ−およびＣ−末端が２つの隣接するベータ鎖構造成分間で作り出される。追加の配列（クローニング部位を含むことができる）も同様に含むことができる。循環置換は人工的変異操作により決定することができる。多様なアルゴリズムを用いて可能な実施し得る循環置換を操作することができる。
【００１４】
“ファージディスプレー”および“ファージライブラリー”という用語は確定された周知の技術を指し、前記技術は、Ｓｍｉｔｈ（Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ．Ｓｃｉ．２２８（４７０５）：１３１５−７，１９８５）によって最初に記載され、ファージウイルスの表面でポリペプチドを提示および生成するために用いられる。ファージライブラリーの表面で提示できるポリペプチドはとりわけ抗体および抗体フラグメント（例えばＦａｂおよびｓｃＦＶ）であり、以下の文献に記載されている：ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔ．３４８（６３０１）：５５２−５５４，１９９０；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８（１８）：７９７８−８２，１９９１；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８（２２）：１０１３４−７，１９９１；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９（１０）：４４５７−６１，  １９９２；およびＧａｏ  ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６（１１）：６０２５−３０，１９９９。ファージディスプレーでは、バクテリオファージの不可欠な遺伝子は除去され、ｃＤＮＡの形態を有する対象の固有遺伝子（本明細書では抗体様タンパク質をコードするｃＤＮＡ）がファージディスプレーベクターのファージ遺伝子配列（ファージ表面タンパク質をコードする）に挿入される。細菌（例えば大腸菌）をファージディスプレーベクターで形質転換し、或いはヘルパーファージに感染させ、ポリペプチド生成物（例えば本明細書に記載の操作されたＦＨＡドメインを含むタンパク質）をコードする対応するｃＤＮＡのバクテリオファージ表面における発現およびパッケージングを可能にする。続いて、ランダム化タンパク質が提示されているファージライブラリーを特異的標的または対象分子との結合によってスクリーニングおよび選別することができる。対象の標的分子はまた抗原と称することができる。抗原の範囲は、核酸、脂質及び脂肪、タンパク質並びに糖という一般的な生化学的クラスを含む任意の分子であり得る。標的との結合を示すファージがいったん同定されたら、続いて当該ファージを単離して第二ラウンドの感染およびスクリーニングに使用できる。複数ラウンドのスクリーニングおよび選別を実施して、所望の標的結合親和性を有するポリペプチドを同定することができる。
【００１５】
“リボソームディスプレー”という用語は、特異的標的と結合する選抜タンパク質を同定し導き出すために用いられる技術を指す。リボソームディスプレーでは、オリゴヌクレオチドライブラリーに由来するＤＮＡがリボソームディスプレーベクターに挿入および連結される。続いて、挿入された対象遺伝子はＰＣＲにより増幅される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって増幅ＰＣＲ生成物をｍＲＮＡに転写し、続いて前記をｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳する。続いて、ｍＲＮＡ−リボソーム−ポリペプチド複合体は、固定標的に当該複合体を結合させることによって親和性アッセイのために用いられる。非結合ｍＲＮＡ−リボソーム−ポリペプチド複合体を洗浄によって除去し、標的結合ｍＲＮＡ−リボソーム−ポリペプチド複合体を回収する。回収ｍＲＮＡ−リボソーム−ポリペプチド複合体から得られるｍＲＮＡをＰＣＲによって増幅し、続いてこのディスプレー選別プロセスを繰り返して標的特異性が強化された遺伝子生成物を濃縮することができる。各選別ラウンド後にランダム変異を導入し、標的特異性が強化された遺伝子生成物をさらに濃縮することができる。
“ＣＩＳディスプレー”という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレー技術を使用することにより極めて大きなライブラリーのディスプレー並びにペプチドおよびタンパク質の選別を可能にする技術を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写はプロモーターから開始され、ＲＮＡポリメラーゼがＣＩＳエレメントに達したときに休止する。同時翻訳は標的タンパク質を生成し、標的タンパク質は一過性にＣＩＳエレメントと相互反応し、それによって隣接ペプチド配列とのその後の結合を強制する。このプロセスは、鋳型ＤＮＡとそれがコードする発現ポリペプチドとの間の忠実な結合をもたらす。
【００１６】
“変異誘導”という用語は、ある生物の遺伝情報に変化を生じさせるために用いられる当業界で周知の任意のタイプのプロセスまたは方法を指すことができる。変異誘導は、本質的に偶発的に生じるか、または変異原を介してまたは実験室技術を用いて実験的に生じ得る。いくつかの例示的方法には、位置指定変異誘導、クンケル変異誘導（Ｋｕｎｋｅｌ▼ｓ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、カセット変異誘導、全プラスミド変異誘導、およびｉｎ  ｖｉｖｏ位置指定変異誘導が含まれ得る。
“クンケル変異誘導”という用語は、変異させるべきＤＮＡフラグメントをファージミドに挿入し、続いて前記で細菌細胞株を形質転換することにより慣例的に実施される方法を指す。前記細胞株はｄＵＴＰａｓｅおよびウラシルデグリコシダーゼが欠損し、ｄＵＴＰを有するｓｓＤＮＡは変異誘導のための鋳型として機能する（Ｋｕｎｋｅｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２（２）：４８８−９２，１９８５）。抽出ｓｓＤＮＡの変異誘導に続いて、ｄＵＴＰａｓｅおよびウラシルデグリコシダーゼの非欠損細菌細胞株を親ｓｓＤＮＡおよび変異ＤＮＡで形質転換させる。この場合、ウラシル含有親ＤＮＡ鎖および非変異鎖は最終的に分解される。いくつかの例示的方法が以下の参考文献で提供される：Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７３（４）：９２４−９４０，２００７；およびＴｏｎｉｋｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２（６）：１３６８−１３８６，２００７。
【００１７】
“ＭＡＸランダム化”という用語は非縮重飽和変異誘導のプロセスを指し、前記では正確に２０コドン（各アミノ酸について１つ）またはそれらのコドンの要求される他の任意のサブセットが用いられる。当該ランダム化は、あるタンパク質内のまたはあるアルファ−ヘリックスの１つの面上の孤立した場所に位置するコドンを飽和させる。このプロセスは、各アミノ酸の発現のために好ましいコドンを総合的に表すコドンをもっぱらクローニングすることを必要とする。前記プロセスを用いて、ジンクフィンガータンパク質の使用によりオーバーラップする遺伝子ライブラリーを迅速に構築することができる。さらにまた、当該ランダム化は重複コドンを排除して、ライブラリーサイズの最小化および固有のアミノ酸偏向の排除の両方のために役立つ。加えて、このプロセスはまたランダム化される場所で終止コドンを排除する。
【００１８】
“ポリクローナル”という用語は、異なる系統または遺伝構成の２つ以上の細胞が関与するまたはそれらから誘導されることによって生成されることを指す。
“モノクローナル”という用語は、単一細胞株が関与するまたは単一細胞株から誘導されることによって生成されることを指す。
“ファージ選別”という用語は、標的抗原と結合する、バクテリオファージライブラリー内の変種を同定する方法を指す。ある方法はＥＬＩＳＡの使用を必要とし、この場合、プレートは一次抗体タンパク質で被覆され、種々のペプチドまたはポリペプチドをその表面に提示するひとそろいのバクテリオファージでプローブされる。一次抗体と結合するファージ−ペプチドは、定量可能な活性を有する酵素と結合させた二次抗体によって検出される。例示的な酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり得る。
“治療用分子”とは医療的な目的を提供する化合物を指す。治療用分子は、任意の薬剤、麻酔剤、ビタミンまたは当業界で公知のサプリメント（米国食品医薬局が提供する冊子（Ｏｒａｎｇｅ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ）に列挙されている（ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ））、またはメルクインデックス（Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（ｗｗｗ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｍｅｒｃｋ−ｉｎｄｅｘ））に列挙されている任意の化学物質、薬剤または生物学的分子であり得る。
“保存された配列”という用語は、ある範囲の種全体で類似する、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのヌクレオチド配列またはポリペプチドのアミノ酸配列を指す。保存された配列は、同じまたは異なる種の相同な遺伝子またはタンパク質の特定の位置に最高頻度で出現するヌクレオチドまたはアミノ酸によって表される。“非保存配列”という用語は、保存されずかつ保存配列よりも高い変動性を有する、遺伝子またはタンパク質のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。
【００１９】
“Ｚｉｍｍプロット”という用語は、分子量および相対的レイリー比およびｄＲＩを決定するために用いられるプロットを指す。これらの値は下記の表現を用いて決定される：
【数１】
2019521955.tif 000003
式中、Ｒ（θ，ｃ）は散乱角θおよび濃度χの関数としての当該溶液の過剰レイリー比である。それは、純粋な溶媒によって散乱される光の過剰下で散乱光の強度に正比例する。ｃは溶質濃度である。Ｍwは重量平均溶質モル質量である。Ａ2は、当該浸透圧のビリアル展開における第二ビリアル係数である。Ｋ*は定数４π2（ｄｎ／ｄｃ）2ｎ02／Ｎaλ04である。Ｎaはアボガドロ数である。この数は、濃度がｇ／ｍＬで測定されモル質量がｇ／ｍｏｌで測定されるときにいつも出現する。Ｐ（θ）は散乱光の角度依存を表し、ｒｍｓ半径と関係を有し得る。以下もまた参照されたい：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｙａｔｔ．ｃｏｍ／ｌｉｂｒａｒｙ／ｔｈｅｏｒｙ／ｍｕｌｔｉ−ａｎｇｌｅ−ｌｉｇｈｔ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ−ｔｈｅｏｒｙ．ｈｔｍｌ。
【００２０】
ＦＨＡドメインの循環置換
ＦＨＡドメインの構造的な配列整理は循環置換を介してもたらすことができる（循環置換はいくつかの事例では天然に生じるが、一方、いくつかは人工的にもたらされることがあることが知られている）。この生物工学技術ではまた折畳み認識のための予測ソフトの使用を利用して、保存されたＦＨＡベータシート足場を破壊することなく再配列整理構造を開発できる。予測ソフトの例はＰｈｙｒｅ２である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｐｈｙｒｅ２／ｈｔｍｌ／ｐａｇｅ．ｃｇｉ？ｉｄ＝ｉｎｄｅｘ．）。
本発明のある特徴は、循環置換ＦＨＡドメイン（新規であるかまたは保存ＦＨＡドメイン由来の非内因性である）上に結合境界面を作製することである。本発明の例示的な実施態様は、結合された以前のアミノ末端およびカルボキシ末端の間に追加のペプチド配列を有する循環置換体であり得る。そのような循環置換体を用いて、〜をコードするＤＮＡライブラリーを作製できる。この場合、追加のペプチド配列がランダム化され、続いて新たに作製された結合境界面の結合親和性について変種が選別される。そのような結合境界面は、内因性結合境界面に対向する領域に位置することができる。
図１Ｂ−１Ｄは例示的な操作ＦＨＡタンパク質足場の模式図であり、操作ＦＨＡタンパク質足場は、ヒトキネシンファミリーメンバーＣ  ＦＨＡドメイン、親２Ｇ１Ｌ（“Ｐ”；配列番号：７）（図１Ａ）から誘導された循環置換体で、ＫＩＦ１Ｃ遺伝子（配列番号：１）に由来する。当該Ｐ配列は循環置換体設計用キメラ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｇｌ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｃｈｉｍｅｒａ／）を用いて可視化された。続いて、この循環置換体を、Ｐｈｙｒｅ２を用いて評価した。最適化遺伝子ブロックはＧｅｎａｒｔのオンラインツールを用いて決定された（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｇｅｎｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／ｇｅｎｅａｒｔ−ｇｅｎｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ｈｔｍｌ）。
【００２１】
循環置換体の各々が可能な再配列整理を示し、この場合、その本来のアミノ−およびカルボキシ−末端は付加リンカーによって結合され、新たなアミノ−およびカルボキシ−末端は保存足場の間または周辺に作製される。リンカーは任意の配列でよく、好ましくは足場の温度安定性を高めるか、および／またはＦＨＡ足場の折畳みを実質的に妨害しないか、または足場の温度安定性を高める。各模式図は、構造的に保存されたＦＨＡドメインβ−サンドイッチを形成する５−鎖β−シートおよび対向する６−鎖β−シートの野生型アミノ酸の数え方を使用している。
以前のＮ−およびＣ−末端を結合させるために導入される追加のタンパク質配列は様々な長さであり得る。追加の配列を用いて、保存された結合面に対向する当該循環置換ＦＨＡドメインの面に新たなループを形成することができる。図１Ｂ−１Ｄの各例で、付加されたペプチドリンカー配列はＴＧＴＧＳである。これは新たなかつ非内因性の結合境界面の生成を可能にする。新規な結合境界面の開発で可能なある方法は、循環置換ＦＨＡドメイン変種（当該配列の変異、付加、挿入、入替えまたは欠失を有する新たに付加されたループを有する）をコードするランダム化ＤＮＡライブラリーの選別により変種を構築することである。これらの選別変種は２つの結合境界面を有するＦＨＡ足場を有することができる。選別変種はまた二特異性であると考えることができ、この場合、足場は、典型的な内因性結合境界面を介して１つの分子／標的と結合することができ、さらに第二の無関係な分子／標的と導入された対向する結合境界面（Ｎ−およびＣ−末端は以前に見出された）を介して結合できる。
【００２２】
既知ではあるが必ずしもランダム化されていないペプチドまたはポリペプチドの挿入もまた、循環置換ＦＨＡドメインの新たに付加されたループに加えることができる。当該ペプチドまたはポリペプチドは、既知の相互反応および／または良く特徴づけられた機能的役割を有する１つのドメインまたは複数のドメインを有することができる。そのようなドメインには、付加されるループに代わる蛍光タンパク質ドメインまたはＴ４リゾチームドメインが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
標的分子と結合することができる循環置換体は、内因性結合境界面で操作された、非内因性標的との結合相互反応を有するＦＨＡドメインを用いて作製できる。そのようなＦＨＡドメインは、米国特許出願１４／４９７，３２０（２０１４年９月２５日出願）に記載された方法を用いて構築できる。
【００２３】
既知の機能的活性または結合相互反応を有する追加のペプチドまたはポリペプチドは、当該循環置換ＦＨＡドメインの新たに導入されたＮ−およびＣ−末端に導入することができる。いくつかの実施態様は融合タンパク質の付加を含むことができる。融合タンパク質は、別のタイプのタンパク質、別の特定のタンパク質ドメインであってもよく、または別のＦＨＡドメイン含有タンパク質であってもよい。ある可能な実施態様は、３つまたは４つの異なる結合特異性を有するタンパク質であることができ、この場合、当該結合相互反応の２つは記載の操作ＦＨＡドメインに位置し、第三および第四のものはＦＨＡドメインの１つ以上の末端に融合させたタンパク質／ペプチドによって与えられる。そのような導入ペプチドまたはポリペプチドは、既知の機能および／または良く特徴づけられた相互反応を有するか、またはランダム化ライブラリーから同定され特異的なタンパク質または他の生物学的に関連する標的選択物と結合する新規なアミノ酸配列であり得る。
上記のＦＨＡドメインの循環置換体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを作製し、任意の適切な発現ベクター（例えばｐＥＴ、ｐＱＥ、Ｔ７プロモーターベクターなど）でクローン化し、適切な宿主（例えば大腸菌）で構成的にまたは一過性に発現させ、適切な発現について評価することができる。さらにまた、発現されるタンパク質が縦に並ぶ複数のＦＨＡドメインを有することができるように、操作されたＦＨＡドメインの複数のコピーを発現ベクターに挿入することができる。
【００２４】
他の可能なＦＨＡドメイン
ＦＨＡドメインは２００を超える種々のタンパク質に存在し、これらタンパク質の各々が高度に保存されたＦＨＡドメインβ−サンドイッチを有する（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００１）。これら種々のタンパク質に由来するこれらＦＨＡドメインのいずれも循環置換体の形成に用いることができ、さらに当該循環置換体を用いて上記で考察したランダム化ＤＮＡライブラリーを作製することができる。ＦＨＡ含有タンパク質のいくつかの他の例には、Ｒａｄ５３（すなわちＦＨＡ１およびＦＨＡ２）、ＫＩＦ１Ｂβ、Ｙｈｒ１１５ｃ、Ｎｂｓ１、ＫＡＰＰ、ＥｓｐＡ、Ｄｕｎ  １、ＸＲＳ２、およびＦｋｈ２が含まれるが、ただしこれらに限定されない。他のＦＨＡドメインには、内因性ＦＨＡドメインの後でコンピュータ支援モデリングに基づいて作製された、天然には存在しないＦＨＡ様ドメインが含まれる。別の実施態様では、ＣＣ１ドメインを個々のＦＨＡドメインがホモダイマーを形成できるように用いることができる（Ｈｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃ．，２０，１５５０−１５６１）。
【００２５】
ファージディスプレーおよび変種選別
Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｂｉｏ．，８，（Ｒ２５４）１−１８，２００７）が記載した方法または当業界で公知の任意の他の方法に基づいて、操作ＦＨＡドメインのファージライブラリーを作製できる。図４は、ファージライブラリーを作製しその結合親和性を基準にして変種を選別する方法の例示的図解を提供する。ランダム化された操作ＦＨＡドメインコドンをベクター（例えばｐＳＡＮＧ４）に挿入することができる（同上）。エレクトロポレーションまたは他の同等な方法により組換え体発現プラスミドで細菌細胞を形質転換できる。前記方法は、ファージが細胞に侵入できるようにＦ線毛を発現する細菌細胞を要求する。典型的には低コピー数のＦプラスミッドを運ぶ可能な細胞株が好ましく、限定はされないが、Ｋ１２派生株、ＴＧ−１細胞であり得る。形質転換およびコロニー選別が成功した後、グルコースの非存在下で操作されたＦＨＡドメイン変種の発現を実施する。ｌａｃプロモーターの制御下の誘導性ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する細胞株では、ＩＰＴＧを用いて操作されたＦＨＡドメイン変種の発現を誘導することができる。
【００２６】
この例示的実施態様にさらに付け加えれば、組換えファージ粒子を生成するために形質転換された細菌細胞を続いて重感染に付すことができる。ヘルパーファージ（例えばＭ１３ＫＯ７またはＫＭ１３）をファージミドＤＮＡのファージ粒子への好ましいパッケージングで用いることができる。
図４の例示的実施態様では、ライブラリーレスキューおよびファージ選別は文献に記載されたように実施できる：Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４（３）：３０９−３１４，Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ．３（５）３２１−３２８，Ｇｏｌｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５（５）：１０８７−１０９７。標的分子との結合は多様な方法に基づいて評価できる。そのような方法は、ファージ−ＦＨＡライブラリーの構築前に操作ＦＨＡドメイン変種への融合タグ添付の利用を含むか、または操作されたＦＨＡドメイン変種への標的分子の結合を直接モニターする工程を含むことができる。分析方法にはＥＬＩＳＡ、生化学的アッセイ、および細胞によるアッセイが含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。
１つ以上の標的分子と結合する１つ以上の操作ＦＨＡドメイン変種の選別方法はまた、選別の一次手段または二次手段としてリボソームディスプレーの使用をファージディスプレーと組み合わせることができる（例えば、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：６８３−６９０；およびＷＯ２０１５０４８３９１Ａ）。
【００２７】
キット
本発明の別の特徴は、高親和性を有する操作されたＦＨＡタンパク質の作製に有用なキットを提供する（上掲書）。本発明のキットは、操作されたＦＨＡドメインの多様な実施態様を用いてライブラリーの作製を容易にすることができる。ＦＨＡドメインの高度に保存されたベータシート足場をコードする配列の間でループ領域をランダム化するために用いることができるオリゴヌクレオチドもまた含むことができる。本発明のアッセイを実施するための多様な材料および試薬もまた提供できる。キットは以下を含む複数の試薬（ただしこれらに限定されない）を含むことができる：発現ベクター、細胞の形質転換若しくはトランスフェクション試薬、酵素とともに、当該アッセイまたは本発明の他の方法の実施で有用な他の溶液若しくは緩衝液。キットはまた、コントロールサンプル、本発明のアッセイの較正で有用な材料、並びに、アッセイ反応をその中で実施できる容器、チューブ、マイクロタイタープレートなどを含むことができる。キットは複数の容器に梱包することができ、前記容器は、キットの内容物、アッセイを実施するための指示を入れるための区画を含むことができる。
【実施例１】
【００２８】
ＫＩＦ１Ｃ遺伝子配列で見いだされる親ＦＨＡドメイン２Ｇ１Ｌ（Ｐ）核酸配列（配列番号：１、配列番号：７）を土台にして、１つの例示的循環置換体、２Ｇ１Ｌ＿Ｍ１（“Ｍ１”）（配列番号：２、配列番号：８）を操作した。操作したコドン最適化遺伝子ブロックをＮｏｔＩ−ＮｃｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の制限消化に付し、標準的クローニング技術を用いてｐＳＡＮＧ１５ベクターに挿入した（Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４６，２００６）。組換えタンパク質発現および配列の確認のために構築物で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテント細胞を形質転換した。続いて培養を４０００ｇで１５分間遠心分離し、再懸濁ペレットを音波破砕した。さらに細胞破砕片を遠心分離（４０００ｇ、３０分）によって除去し、溶解物を５μｍのフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）に通した。
続いて溶解物をＣｏ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によってさらに分離した。続いて、ピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図２Ａは、Ｍ１は可溶性でＰと類似する収量を有することを示す。続いて、３Ｋ分子量遠心分離フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を用いてピーク分画を濃縮し、さらにスーパーデックス２００  １０／３００（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーに適用した。図２Ｂに示すように、正確なＭＷに対応するピークを収集して、分析用ゲルろ過のために、サイズ排除クロマトグラフィー連結マルチアングル光散乱カラム（ｍｕｌｔｉ−ａｎｇｌｅ  ｌｉｇｈｔｉｎｇ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ）（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）に適用した（Ｗｙａｔｔ  Ｄａｗｎ  Ｈｅｌｅｏｓ  ＩＩおよびＷｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＤ）。光散乱屈折率検出装置を通す前に、サンプルをスーパーデックス２００インクリース１０／３００分析用ゲルろ過カラムで分解した。データを収集し、ＡＳＴＲＡ６ソフト（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて分析した。推定誤差を有する分子量を各タンパク質ピークにわたって計算した。０．１８５０ｍＬ／ｇのｄｎ／ｄｃ値でＺｉｍｍプロットを用いた。図３Ｂは、Ｍ１の平均モノマー分子量（図３Ａに示すＰの平均分子量のそれと類似する）を示す。
【００２９】
Ｎｃｏ１−Ｎｏｔ１制限部位を用いて、操作されたＭ１をｐＳＡＮＧ４プラスミドでクローン化した。このプラスミドをその後のランダム化に用いた。２つのオリゴ指定クンケル変異誘導を用いて操作Ｍ１ライブラリーを設計した。対抗する２つのループ領域をランダム化するプライマー配列番号：５および配列番号：６を用いた。この例示的実施態様では、タイタープレートはライブラリーサイズを５ｘ１０9変種と概算した。
以前に記載されたように、ポリクローナルライブラリーレスキューおよびファージ選別を実施した（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ；およびＷｉｎｔｅｒ  １９９８，Ｇｏｌｅｔｚ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。１つの例示的ファージ選別は、本発明を明示するために、標的抗原大腸菌β−ガラクトシダーゼに結合する操作ＦＨＡドメイン変種のためであった。
操作されたＦＨＡを提示するファージは、ストックをＴＧ−１細胞に感染多重度（ＭＯＩ）＝１０のヘルパーファージとともに感染させることによってレスキューされた。続いて培養を遠心分離し、ファージ上清を単離し濃縮した。１０Ｘ、１Ｘおよび０１Ｘのファージ希釈物を各選別ラウンドのために作成し、１ｘＰＢＳ中のドライミルク（Ｍ−ＰＢＳ）を用いてブロックした。
【００３０】
ＥＬＩＳＡプレートをβ−ガラクトシダーゼで被覆し、Ｍ−ＰＢＳでブロックした。ＰＢＳでの洗浄ラウンドの後で、続いてファージ希釈物をプレートの適切なウェルに移してインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ洗浄の後で、マウス抗Ｍ１３抗体およびＭ−ＰＢＳとともにプレートをインキュベートした。ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎおよびＰＢＳで引き続き洗浄した後で、ユウロピウム標識抗マウス抗体およびＭ−ＰＢＳを添加して結合のためにインキュベートした。プレートを再度ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎおよびＰＢＳで洗浄した。続いてＤＥＬＦＩＡ強化溶液を添加した。続いてプレートリーダーを用い、３４０ｎｍでの励起および６１５ｎｍで測定される発光によりデータを収集した。
図５はＭ１ライブラリーの操作ＦＨＡ変種のラウンド１（Ｒ１）およびラウンド２（Ｒ２）選別のスクリーニングを示し、β−ガラクトシダーゼに対し結合親和性特性を有する変種が存在することが提示される。
個々のクローンについてスクリーニングする前に、各選別アウトプットを発現ベクターｐＳＡＮＧ１５でサブクローン化した（上掲書、Ｍａｒｔｉｎ，  Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。ＦＨＡドメインにフランキングするプライマーを用いるＰＣＲによってＦＨＡ遺伝子集団を多様な選別ラウンドのグリセロールストックから増幅し、さらにＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）による制限消化に付した。続いて、精製した増幅ＤＮＡをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＳＡＮＧ１５発現ベクターにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）で連結し、続いてＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を形質転換した。
Ｍａｒｔｉｎらの論文（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６）に記載された手順を用いてＥＬＩＳＡを実施した。各選別キャンペーンのために９４のクローンを選別し、自動誘導培地（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ２００５）を用いて増殖させた。一晩誘発の後で、細菌ペレットをバグバスター（Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ，ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて溶解した。清澄化溶解物を陽性クローンのためのアッセイで用い、コントロールより３倍以上の特異的シグナルを有する任意のクローンを陽性と採点した。図６は、以下についてβ−ガラクトシダーゼに対するＭ１変種結合親和性を示す：ラウンド２選別（“Ｒ２”）、ラウンド３選別（“Ｒ３”）、β−ガラクトシダーゼの限定濃度（１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭ）を使用するビーズによる選別、および低解離結合物質のために“オフレート”選別（すなわち１−２ｈおよび２−２０ｈ）として実施されるビーズによる選別。
【実施例２】
【００３１】
図１Ｃは、ＦＨＡドメインタンパク質の循環置換体の別の実施態様、２ＧＩＬ＿Ｍ２（“Ｍ２”、配列番号：３、配列番号：９）のトポロジーの模式図である（実施例１と同様に発現および分析した）。図２Ａ、２Ｂおよび３はＭ２の期待される発現および分子量を示す。Ｍ２はプライマー配列番号：５および配列番号：６を用いてランダム化された。タイタープレートはライブラリーサイズを８ｘ１０9と概算した。
【実施例３】
【００３２】
図１Ｄは、ＦＨＡドメインタンパク質の循環置換体のある実施態様、２ＧＩＬ＿Ｍ３（“Ｍ３”、配列番号：４、配列番号：１０）のトポロジーの模式図である（実施例１と同様に発現および分析した）。図２Ａ、２Ｂおよび３はＭ３の期待される発現および分子量を示す。
本明細書は本発明の特定の実施態様を記載しているが、当業者は本発明の概念から逸脱することなく本発明の変形を考案することができるであろう。
【図１Ａ】
2019521955.tif 000004
【図１Ｂ】
2019521955.tif 000005
【図１Ｃ】
2019521955.tif 000006
【図１Ｄ】
2019521955.tif 000007
【図２Ａ】
2019521955.tif 000008
【図２Ｂ】
2019521955.tif 000009
【図３Ａ】
2019521955.tif 000010
【図３Ｂ】
2019521955.tif 000011
【図３Ｃ】
2019521955.tif 000012
【図３Ｄ】
2019521955.tif 000013
【図４】
2019521955.tif 000014
【図５】
2019521955.tif 000015
【図６】
2019521955.tif 000016
【配列表】
2019521955000001.app
【国際調査報告】
2019521955.tif 000017