(57)【要約】  細胞初期化因子が誘導型多能性幹細胞のゲノム中に挿入されることなく、簡便かつ効率的に、誘導型多能性幹細胞を製造しうる方法を提供することを目的とし、細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製し、該細胞から分泌される融合蛋白質を、体細胞に導入することにより、安全、簡便、かつ効率的に、誘導型多能性幹細胞を製造しうることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導型多能性幹細胞の製造方法であって、
（ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製する工程、ならびに
（ｂ）誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞と、工程（ａ）において調製された細胞とを共培養するか、または、誘導型多能性幹細胞に誘導するための細胞に対して、工程（ａ）において調製された細胞の培養上清を接触させる工程、
を含む方法。
【請求項２】
細胞初期化因子が、フューリン認識配列を消失させた、若しくは、フューリン認識配列が存在しないものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞初期化因子が、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、β−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｔａｔ３及びＧｒｂ２からなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞初期化因子が、配列番号：１から５に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
蛋白質導入ドメインが、フューリン認識配列を消失させた、若しくは、フューリン認識配列が存在しないものである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
蛋白質導入ドメインがＴＡＴである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
蛋白質導入ドメインが、配列番号：６から７に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞がフィーダ細胞である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の方法に用いられるキットであって、下記（ａ）から（ｃ）の少なくとも一つを含むキット
（ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持するベクター
（ｂ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持する細胞
（ｃ）（ｂ）の細胞の培養上清。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれかに記載の方法によって製造され、細胞初期化因子がゲノム中に外来的に挿入されていない、誘導型多能性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導型多能性幹細胞の製造方法、その方法に用いられるキット、並びにその方法によって得られる誘導型多能性幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）は、誘導型多能性幹細胞又は人工多能性幹細胞とも称され、数種類の転写因子の遺伝子を線維芽細胞等の体細胞に導入することにより、ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）様の分化多能性を獲得した細胞である。【０００３】
分化多能性を有する細胞は、生体を構成する全ての臓器や組織へ分化する能力を保持していることから、何らかの疾患で損傷した臓器等を再生する上で極めて有効な手段として期待されている。従来は、ＥＳ細胞を利用する再生医療研究が中心に行われていたが、ＥＳ細胞は生命の起源となる胚から取得されるものであるため、その使用上、倫理的な問題に直面することになる。また、ＥＳ細胞から調製した組織などは、移植の段階で拒絶反応を引き起こすおそれがあり、このような免疫的な問題を克服する必要もある。【０００４】
そこで、ＥＳ細胞を用いた場合に生じ得る倫理上の問題と免疫学上の問題とを解決することができる分化多能性細胞として、ｉＰＳ細胞に多くの期待が寄せられている。【０００５】
マウスのｉＰＳ細胞は、山中らによって、分化多能性の維持に重要なＮａｎｏｇ遺伝子の発現を指標にし、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの４つの遺伝子を導入することにより、初めて樹立された（非特許文献１、非特許文献２）。その後も同様の方法によるマウスｉＰＳ細胞の樹立が報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。そして、ｉＰＳ細胞の癌化の問題を克服するために、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）のみでも、ｉＰＳ細胞の樹立が可能であることも報告されている（非特許文献５〜７）。【０００６】
一方、ヒトのｉＰＳ細胞に関しては、Ｔｈｏｍｓｏｎらが、ヒトの線維芽細胞に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８を導入してヒトｉＰＳ細胞を樹立し（非特許文献８）、また、山中らは、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣをヒトの線維芽細胞に導入することにより、同じくｉＰＳ細胞を樹立することが可能であることが報告されている（非特許文献９）。【０００７】
このように、ｉＰＳ細胞の今後の利用可能性が注目され、その樹立（製造）方法の開発が進む中、いくつかの問題点が指摘されている。【０００８】
まず、分化多能性を体細胞に付与する因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２等、以下、細胞初期化因子とも称する）を体細胞へ導入するために、レトロウィルスベクター等による遺伝子導入法を用いると、体細胞のゲノム中に細胞初期化因子がランダムに挿入され、その結果、遺伝子の挿入による突然変異（特に、内在性発癌遺伝子の活性化等）が引き起こされる可能性が指摘されている。特に、癌遺伝子であるｃ−Ｍｙｃ遺伝子を導入すると、作製したｉＰＳ細胞の癌化が有意に高い確率で確認されている。ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を用いずにｉＰＳ細胞の作出に成功したことは報告されてはいるが（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）、樹立（作出）効率が極めて低いため、今後、臨床的な応用に利用することは難しいのではないかと考えられている。【０００９】
最近、アデノウィルスベクター用いて、細胞初期化因子の体細胞における発現を、一過的に大量に行うことでｉＰＳ細胞を作製する方法が報告された（非特許文献１０）。この方法で作製されたｉＰＳ細胞をマウスの胚盤胞にインジェクトすると、生まれたマウスの組織中にインジェクトしたｉＰＳ細胞由来の分化した細胞が確認され、また、少なくとも４〜１２週齢のマウスにおいて癌化は認められなかった。この方法によれば、細胞初期化因子の遺伝子導入に伴うｉＰＳ細胞の癌化の問題が解決される可能性がある。しかしながら、細胞初期化因子を遺伝子として導入してｉＰＳ細胞を作製する方法は、多くの煩雑な工程を必要とし、スクリーニング等に長い時間を要することから、効率性の問題が指摘されている。【００１０】
また、タンパク質を細胞内で機能させるためには、その遺伝子を導入して目的の細胞内で発現させる他、タンパク質自体を細胞内に直接導入することも可能である。タンパク質自体を直接細胞に導入する方法は、これまでに多くの方法が報告されているが、中でも蛋白質導入ドメイン（ＰＴＤ、膜透過ペプチド、細胞膜透過性ペプチドとも称する）との融合タンパク質を目的の細胞に接触させて、細胞内に導入する方法が多く利用されている（例えば、特許文献１〜９）。またｉＰＳ細胞を樹立するために、細胞初期化因子をタンパク質として体細胞に導入する方法については、例えば、Ｏｃｔ４タンパク質とＳｏｘ２タンパク質とを導入した例、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃタンパク質とアルギニンとを結合させて導入した例がある（非特許文献１０〜１３，特許文献１０〜１４）。しかしながらこれらの方法は、タンパク質を大腸菌等を用いて生産せしめ、しかる後にそれぞれのタンパク質を抽出、精製し用いることを必要とするため、コストと時間がかかり、またｉＰＳ細胞の樹立効率も低いという多くの問題点を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，８０４，６０４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７４７，６４１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６７４，９８０号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６７０，６１７号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６５２，１２２号明細書
【特許文献６】国際公開第２００２／０１８５７２号
【特許文献７】特開２００５−５２０８３号公報
【特許文献８】特開２００５−２５３４０８号公報
【特許文献９】特開２００１−１９９９９７号公報
【特許文献１０】国際公開第２００９／０３２４５６号
【特許文献１１】国際公開第２００９／０６７７５６号
【特許文献１２】国際公開第２００９／０６７７５７号
【特許文献１３】国際公開第２００９／１４９９５６号
【特許文献１４】特開２０１０−１１０２８９号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、２００６年、１２６巻、６６３〜６７６ページ
【非特許文献２】Ｏｋｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４８巻、３１３〜３１７ページ
【非特許文献３】Ｗｅｒｎｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４８巻、３１８〜３２４ページ
【非特許文献４】Ｍａｈｅｒａｌｉら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、２００７年、１巻、５５〜７０ページ
【非特許文献５】Ｐａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４５１巻、１４１〜１４６ページ
【非特許文献６】Ｎａｋａｇａｗａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００８年、２６巻、１０１〜１０６ページ
【非特許文献７】Ｗｅｒｎｉｇら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、２００８年、１０巻、１０〜１２ページ
【非特許文献８】Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、３１８巻、１９１７〜１９２０ページ
【非特許文献９】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ、２００７年、１３１巻、８６１〜８７２ページ
【非特許文献１０】Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８年、３２２巻、９４５〜９４９ページ
【非特許文献１１】Ｂｏｎｓｎａｌｉ及びＥｄｅｎｈｏｆｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００８年、３８９巻、８５１〜８６１ページ
【非特許文献１２】Ｈｏｎｇｙａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００９年、４巻、５号、３８１〜３８４ページ
【非特許文献１３】Ｄｏｈｏｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００９、４巻、６号、４７２〜４７６ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、細胞初期化因子が誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）のゲノム中に挿入されることなく、簡便かつ効率的に誘導型多能性幹細胞を製造しうる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメイン及び細胞初期化因子を構成要素とする融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製し、該細胞より分泌される融合蛋白質を、誘導型多能性幹細胞へ誘導するための標的細胞に作用させることにより、前記細胞初期化因子が誘導型多能性幹細胞のゲノム中に挿入されることなく、簡便かつ効率的に、誘導型多能性幹細胞を製造しうることを見出し、本発明を完成するに至った（図１  参照）。本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。【００１５】
（１）  誘導型多能性幹細胞の製造方法であって、
（ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製する工程、ならびに
（ｂ）誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞と、工程（ａ）において調製された細胞とを共培養するか、または、誘導型多能性幹細胞に誘導するための細胞に対して、工程（ａ）において調製された細胞の培養上清を接触させる工程、
を含む方法。【００１６】
（２）  細胞初期化因子が、フューリン認識配列を消失させた、若しくは、フューリン認識配列が存在しないものである、（１）に記載の方法。【００１７】
（３）  細胞初期化因子が、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、β−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｔａｔ３及びＧｒｂ２からなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質である、（１）または（２）に記載の方法。【００１８】
（４）  細胞初期化因子が、配列番号：１から５に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質である、（３）に記載の方法。【００１９】
（５）  蛋白質導入ドメインが、フューリン認識配列を消失させた、若しくは、フューリン認識配列が存在しないものである、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。【００２０】
（６）  蛋白質導入ドメインがＴＡＴである、（１）から（５）のいずれかに記載の方法。【００２１】
（７）  蛋白質導入ドメインが、配列番号：６から７に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質である、（６）に記載の方法。【００２２】
（８）  融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞がフィーダ細胞である、（１）から（７）のいずれかに記載の方法。【００２３】
（９）  （１）から（８）のいずれかに記載の方法に用いられるキットであって、下記（ａ）から（ｃ）の少なくとも一つを含むキット
（ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持するベクター
（ｂ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持する細胞
（ｃ）（ｂ）の細胞の培養上清。【００２４】
（１０）  （１）から（８）のいずれかに記載の方法によって製造され、細胞初期化因子がゲノム中に外来的に挿入されていない、誘導型多能性幹細胞。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、細胞初期化因子が誘導型多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）のゲノム中に挿入されることなく、簡便かつ効率的に、誘導型多能性幹細胞の製造しうる方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】形質導入可能な組換えタンパク質分泌システムの概略図である。フィーダ細胞株を作製するために用いる、安定的遺伝子導入（ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）用発現カセットの構造を図の上部に示す。また、図の下部にて、マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）ｋ鎖リーダー配列（Ｉｇｋ  Ｌｅａｄｅｒ）は、フィーダ細胞から組換えタンパク質が分泌される過程（図中「１」で示す過程）にて用いられることを示す。さらに、このリーダー配列は、分泌過程において、下流の４ペプチド配列（ＲＡＲＲ）にて、初期のタンパク質生成物から切り離され、結果として、蛋白質導入ドメイン（ＰＴＤ）及び細胞初期化因子のうちの１タンパク質（Ｃａｒｇｏ）からなる融合タンパク質が分泌され、標的細胞に形質導入（図中「２」で示す過程）されることを示す。
【図２】フューリンの特性を示す概略図である。すなわち、フューリンはゴルジ装置に豊富に存在する酵素であり、標的配列にて様々なタンパク質を特異的に切断する。また、フューリンは、潜在的前駆体タンパク質をそれらの生物学的活性産物に処理することで知られているプロタンパク質転換酵素ファミリーの１酵素であり、標的配列の下流を認識し、速やかに切断することを示す概略図である。
【図３】分泌型組換えタンパク質導入システムにおける、フューリンに起因する問題点を示す概略図である。すなわち、細胞初期化因子  ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４、並びに蛋白質導入ドメインとして用いるＴＡＴ配列は、全てフューリン認識部位（標的配列）を有しており、フィーダ細胞からの分泌の過程において切断されることが予想される。それゆえ、このフューリンを介する消化は、形質導入可能な組換えタンパク質分泌システムの効率を低下させるかもしれず、フューリンは形質導入可能な組換えタンパク質分泌システムに制限をかける可能性があることを示す概略図である。
【図４】分泌型組換えタンパク質導入システムにおける欠陥を補うために用いられる、ＴＡＴ配列及びｉＰＳ−４（５）−因子の変異体を示す概略図である。すなわち、フューリンを介するｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２、ｈＫＬＦ４及びＴＡＴペプチドの切断を回避するため、フューリン認識部位をノックダウンしたアミノ酸置換体（変異体）を分泌型組換えタンパク質導入システムに導入したことを示す概略図である。具体的には、野生型のＴＡＴペプチドの代わりに、ＴＡＴ４及びＴＡＴｋペプチド（以前にフューリン耐性を示す組換え体として報告されているペプチド配列）を使用し、ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４の代替形態として、ｈｃ−ＭＹＣ  Ｒ３６７Ｋ  Ｒ４２４Ｑ、ｈＳＯＸ２  Ｒ４３Ｑ  Ｒ１１４Ｑ及びｈＫＬＦ４  Ｒ３７７Ｓを各々使用した。また、ｈＫＬＦ５はフューリン認識部位を欠損しているため、ｈＫＬＦ４の置換体として使用した。
【図５】フューリンによる切断を回避するために設計した、組換えタンパク質分泌システムのためのコンストラクト、並びにそれらが導入されたフィーダ細胞の概略を示す図である。すなわち、誘導型多能性幹（ｉＰＳ）細胞（ｉＰＳＣ）の作製に対応するため、各組換えタンパク質に対応するコンストラクトをＳＮＬ親細胞にトランスフェクションし、ゼオシンの存在下にて選択することにより、形質導入可能な細胞初期化因子を分泌することができるフィーダ細胞を作製した。また、クサビラオレンジ（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ）はタンパク質分泌システムの確立及び最適化のためのマーカータンパク質として用いたことを示す概略図である。なお、図中「ＳＰ」は、タンパク質の分泌型（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であることを示す。
【図６】改変ＳＮＬ細胞株における、フューリン耐性ＰＴＤのによる分泌型組換えタンパク質の形質導入性について検証した結果を示す顕微鏡写真である。すなわち、ＴＡＴ４融合タンパク質及びＴＡＴｋ融合タンパク質（フューリン耐性ＰＴＤ）並びにノナアルギニン（Ｒ９)融合タンパク質の形質導入性を、融合パートナーとしてクサビラオレンジ（ＫＯ）を使用して検証した結果を示す蛍光顕微鏡写真を図中上部３パネルにて各々示す。また、該蛍光顕微鏡写真に対応する明視野での顕微鏡写真を図中下部３パネルにて各々示す。
【図７】改変ＳＮＬ細胞株から分泌されるＴＡＴ４−ＫＯ組換えタンパク質及びＴＡＴｋ−ＫＯ組換えタンパク質の形質導入効率をフローサイトメトリーによって分析した結果を示すドットプロット図である。なお図中「Ｊｕｒｋａｔ」はＳＮＬ親細胞とＪｕｒｋａｔ細胞との共培養の結果を示し、「ＳＰ−ＴＡＴ４−ｈｕＫＯ」は、ＴＡＴ４−ＫＯ組換えタンパク質を分泌するＳＮＬ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞との共培養の結果を示し、「ＳＰ−ＴＡＴｋ−ｈｕＫＯ」は、ＴＡＴｋ−ＫＯ組換えタンパク質を分泌するＳＮＬ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞との共培養の結果を示す。
【図８】改変ＳＮＬ細胞株を含む培養培地中のＴＡＴ４融合細胞初期化因子及びＴＡＴｋ融合細胞初期化因子をウェスタンブロッティングによって検出した結果を示す写真である。
【図９】改変ＳＮＬ細胞株から分泌された組換えタンパク質をウェスタンブロッティングによって検出した結果を示す写真である。なお図中「ＴＡＴ４−」は各細胞初期化因子にＴＡＴ４配列が融合している組換えタンパク質であることを示し、「（ＴＡＴ４−）」は各細胞初期化因子にＴＡＴ４配列が融合していない組換えタンパク質であることを示す。また、陰性対照として、「ＤＭＥＭ（ＦＢＳ−）」に細胞を培養していない培地を分析した結果を、「ＤＭＥＭ（ＦＢＳ−）＋ＳＮＬs」にＳＮＬ親細胞の培養培地を分析した結果を示す。
【図１０】分泌された形質導入可能なＴＡＴ４−ｈＯＣＴ４又はＴＡＴｋ−ｈＯＣＴ４タンパク質の機能性を、ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスにより導入したヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を用いたｉＰＳＣ作製において試験した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、上部４パネルは細胞の形態学的変化を示す顕微鏡写真であり、下部２パネルはアルカリフォスファタ―ゼ（ＡＰ）染色の結果を示す顕微鏡写真である。また「Ｒｅｔｒｏ−４  Ｆａｃｔｏｒｓ」は４因子（ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２、ｈＯＣＴ４及びｈＫＬＦ４）をレトロウィルスにより導入したＨＤＦの結果を示し、「Ｒｅｔｒｏ−Ｍ，Ｓ，Ｋ」はｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスにより導入したＨＤＦの結果を示す。さらに「ＳＰ−ＴＡＴ４−ｈＯＣＴ４」はｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスにより導入したＨＤＦを、ＴＡＴ４−ｈＯＣＴ４を分泌するＳＮＬ細胞株上にて培養した結果を示し、「ＳＰ−ＴＡＴｋ−ｈＯＣＴ４」はｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスにより導入したＨＤＦを、ＴＡＴｋ−ｈＯＣＴ４を分泌するＳＮＬ細胞株上にて培養した結果を示す。
【図１１】形質導入可能な細胞初期化因子（ヒト野生型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いたマウスｉＰＳ細胞作製のためのスキームを示す概略図である。
【図１２】形質導入可能な細胞初期化因子（野生型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いて作製したマウスｉＰＳ細胞（ＳＰ４−ｍｉＰＳＷＴ♯１〜１０）の特性を評価した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、「Ｐｈａｓｅ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ」は位相差顕微鏡による観察結果を示し、「ＡＰ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ」はＡＰ染色の結果を示し、「ＳＳＥＡ−１  Ｓｔａｉｎｉｎｇ」はＳＳＥＡ−１染色の結果を示す。また、上二段のパネルにおいては左が４０倍、右が１００倍の倍率で観察した結果を示す。さらに、最下段は左が明視野において２００倍の倍率で観察した結果を、右が蛍光観察（観察倍率：２００倍）の結果を示す。
【図１３】形質導入可能な細胞初期化因子（フューリン耐性を示す変異型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いたマウスｉＰＳ細胞作製のためのスキームを示す概略図である。
【図１４】形質導入可能な細胞初期化因子（フューリン耐性を示す変異型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いて作製したマウスｉＰＳ細胞（ＳＰ４−ｍｉＰＳＭｕｔａｎｔ）の特性を評価した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、上部３パネル（「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  Ｃｌｏｎｅ」）は作製したマウスｉＰＳ細胞のコロニーを示す顕微鏡写真であり、右のパネルは明視野における観察結果を示し、真ん中のパネルは蛍光顕微鏡による観察結果を示し、左のパネルは右のパネルと真ん中のパネルとを重ね合わせた結果を示す。また真ん中の２パネル（「ｐＯＣＴ４−ＥＧＦＰ（１０×）」）はマウスＯｃｔ４プロモーターにＥＧＦＰを繋いだトランスジーンを組み込んだマウスのＭＥＦより作製したマウスｉＰＳ細胞を示す顕微鏡写真であり、右のパネルは蛍光顕微鏡による観察結果を示し、左のパネルは明視野における観察結果と蛍光顕微鏡による観察結果とを重ね合わせた結果を示す。さらに下部３パネルにおいて、左のパネルはＳＳＥＡ−１染色したマウスｉＰＳ細胞の蛍光顕微鏡による観察結果を示し、真ん中のパネルはＯＣＴ４プロモーターの活性化を表わすＥＧＦＰシグナルの蛍光顕微鏡による観察結果を示し、右のパネルは明視野におけるマウスｉＰＳ細胞の観察結果を示す。
【図１５】形質導入可能な細胞初期化因子を分泌するＳＮＬ細胞株（改変ＳＮＬ細胞株）を用いた様々な条件下でのｍｉＰＳＣ作製効率を、Ｐｏｃｔ４−ＥＧＦＰ（＋）コロニーに対するアレイスキャンにより分析した結果を示すグラフである。
【図１６】形質導入可能な細胞初期化因子（野生型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いたヒトｉＰＳ細胞作製のためのスキームを示す概略図である。
【図１７】形質導入可能な細胞初期化因子（野生型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いて作製したヒトｉＰＳ細胞（ＳＰ４−ｈｉＰＳＷＴ細胞）の特性を評価した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、一番上の２パネルは作製したヒトｉＰＳ細胞のコロニーの明視野における観察結果を示す顕微鏡写真である。また、上から２番目の２パネルは作製したヒトｉＰＳ細胞のＡＰ染色の結果を示す顕微鏡写真である。さらに、上２段のパネルにおいて、左は４０倍、右は１００倍の倍率で各々観察した結果を示す。また上から３〜５番目の各３パネルは、各々作製したヒトｉＰＳ細胞のＳＳＥＡ−４染色、ＴＲＡ−１−６０染色及びＴＲＡ−１−８１染色の結果を示す顕微鏡写真（観察倍率；１００倍）であり、さらに右のパネルは作製したヒトｉＰＳ細胞の明視野における各観察結果を示し、真ん中のパネルは作製したヒトｉＰＳ細胞の蛍光顕微鏡による各観察結果を示し、左のパネルは右のパネルと真ん中のパネルとを重ね合わせた結果を示す。
【図１８】形質導入可能な細胞初期化因子（フューリン耐性を示す変異型）を分泌するＳＮＬ細胞株を用いたヒトｉＰＳ細胞作製のためのスキームを示す概略図である。
【図１９】形質導入可能な細胞初期化因子（フューリン耐性を示す変異型）を分泌するＳＮＬ細胞株（ＳＰ−ＳＮＬ（ｍｕｔ））を用いて、ＨＤＦから樹立したヒトｉＰＳ細胞（ＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞）のコロニーの観察結果を示す顕微鏡写真（観察倍率：４０倍（左側）及び１００倍（右側））である。なお、顕微鏡観察は得られたヒトｉＰＳ細胞のコロニ―の中から２つをランダムに選んで行った。
【図２０】形質導入可能な細胞初期化因子を分泌するＳＮＬ細胞株を用いて作製したヒトｉＰＳ細胞（ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞）の特性を評価した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中、一番上の左のパネルは作製したヒトｉＰＳ細胞（ＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞由来）のＡＰ染色の結果を示し、一番上の真ん中のパネル（ＥＢ（ｄａｙ６）−ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ）はＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞由来の胚葉体を観察した結果を示し、一番上の右のパネル（ＥＢ（ｄａｙ６）−ＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ）はＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞由来の胚葉体を観察した結果を示す。また上から２番目の６パネルはＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞由来のｉＰＳ細胞につき、左側から各々、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＳＳＥＡ−１の蛍光染色像を示し、上から３番目の６パネルは各々、ＳＳＥＡ−４染色等とＤＡＰＩ染色との重ね合わせの結果を示す。さらに、一番下の６パネルは作製したヒトｉＰＳ細胞の明視野における各観察結果を示す。なお、ＳＳＥＡ−１はヒト由来の細胞においては発現していないので、陰性対照として観察した。
【図２１】ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞における、ヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現レベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲにて分析した結果を示す電気泳動の写真である。なお図中「ＫｈＥＳ−３」はＥＳ細胞を分析した結果（陽性対照）を示し、「ＨＤＦ（ｎｅｏｎａｔｅ）」はＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞の基になったヒト新生児組織由来のＨＤＦを分析した結果を示す。またＧＡＰＤＨ遺伝子については、内部標準としてその発現を分析した。
【図２２】ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞の核型を標準的なＧバンド染色体検査によって分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図２３】ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞又はＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞由来のテラトーマを、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって観察した結果を示す顕微鏡写真である。なお図中「Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」は腸上皮を示し、「Ｃａｒｔｉｌａｇｅ」は軟骨を示し、「Ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」は色素神経上皮を示し、「Ｒｅｔｉｎｏｃｙｔｅ」は網膜芽細胞を示す。
【図２４】形質導入可能な細胞初期化因子を分泌するＳＮＬ細胞株を用いて作製した、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞由来のｉＰＳ細胞の特性を評価した結果を示す顕微鏡写真である。上部左のパネル（ＳＰ−ｈｉＰＳＣＢ）はヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞由来のｉＰＳ細胞のコロニーの観察結果を示し、上部右のパネル（ＡＰ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ）はＡＰ染色の結果を示し、下部左のパネル（ＳＳＥＡ−４／ＤＡＰＩ）はＳＳＥＡ−４染色とＤＡＰＩ染色との結果を示し、下部真ん中のパネル（Ｍｅｒｇｅ）はＳＳＥＡ−４染色とＤＡＰＩ染色との重ね合わせの結果を示し、下部右のパネル（Ｐｈａｓｅ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ）は位相差顕微鏡による観察結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の誘導型多能性幹細胞の製造方法は、
（ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製する工程、ならびに
（ｂ）誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞と、工程（ａ）において調製された細胞とを共培養するか、または、誘導型多能性幹細胞に誘導するための細胞に対して、工程（ａ）において調製された細胞の培養上清を接触させる工程、
を含むことを特徴とする方法である。
【００２８】
先ず、本発明の誘導型多能性幹細胞の製造方法における工程（ａ）について説明する。
【００２９】
本発明において、「誘導型多能性幹細胞」とは、ｉＰＳ細胞又は人工多能性幹細胞とも称される細胞であり、体細胞に細胞初期化因子を導入することにより、ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）様の分化多能性を獲得した細胞である。
【００３０】
また、本発明に用いられる「細胞初期化因子」は、体細胞に導入されることにより、単独で、又は他の分化多能性因子と協働して該体細胞に分化多能性を付与できる因子であればよく、特に制限されることはないが、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＬＩＮ２８、Ｎａｎｏｇ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、β−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｔａｔ３及びＧｒｂ２からなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質であることが好ましい。なお、かかるタンパク質の典型的な例としては、表１において示されるＧｅnＢａｎｋアクセッション番号で特定される遺伝子がコードする蛋白質が挙げられる。
【００３１】
【表１】
2011158852.tif 000002
【００３２】
さらに、これらタンパク質の中では、少ない因子で効率良く誘導型多能性幹細胞を樹立できるという観点から、Ｏｃｔ３／４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（４因子）を後述の誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞（以下「標的細胞」とも称する）に導入することがより好ましい。また、得られる誘導型多能性幹細胞の癌化のリスクを低くするという観点から、ｃ−Ｍｙｃを除く、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（３因子）を体細胞に導入することがより好ましい。
【００３３】
また、ヒト及び非ヒト動物細胞（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）に存在する上掲の細胞初期化因子のホモログを用いて本発明を実施することにより、所望の動物由来のｉＰＳ細胞を容易に作製することができる。このようなホモログは、上掲の細胞初期化因子のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは、８０％以上、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上）の相同性を有する。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ。、  ２１５：  ４０３−４１０，  １９９０）を利用して決定することができる。さらに、本発明において使用される分化多能性因子は、必ずしも野生型である必要はなく、単独で、又は他の分化多能性因子と協働して該体細胞に分化多能性を付与できる能力を有する限り、変異タンパク質であってもよい。かかる変異タンパク質における挿入、置換又は欠失されるアミノ酸数は、通常、１〜３０であり、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５である。なお、かかる変異体は後述の「フューリン認識配列を消失させた細胞初期化因子を作製する方法」と同様の方法を用いて、作製することができる。
【００３４】
さらに、本発明に用いられる「細胞初期化因子」は、フューリン認識配列を消失させた、若しくは、フューリン認識配列が存在しないものであることが好ましく、配列番号１〜５に記載のタンパク質からなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質であることがより好ましい。
【００３５】
フューリン（Ｆｕｒｉｎ）とは、ＰＡＣＥ（Ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）とも称されるプロテアーゼであり、細胞内のゴルジ体に豊富に存在することが知られている。また、フューリンは標的蛋白質中の特定の配列（フューリン認識配列）の直後を切断することも知られており、かかる特定の配列は「ＲＸＲＲ」又は「ＲＸＫＲ」である（図２  参照）。そのため、本発明に用いられる細胞初期化因子はかかる配列を消失させた、若しくは、かかる配列が存在しないものであることが好ましい。なお、前記認識配列において、「Ｒ］はアルギニンを、「Ｋ」はリシンを、「Ｘ」は任意のアミノ酸を示す。かかるフューリン認識配列を消失させた細胞初期化因子を作製する方法としては、公知の手法を用いることができる。例えば、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法、Ｋｕｎｋｅｌ法、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）法、又はこれらに準ずる方法が挙げられ、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））を用いて、又はＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  シリーズキットを用いて、前記ＧｅnＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒで特定される遺伝子がコードしているような細胞初期化因子（野性型）のフューリン認識配列中に変異を導入することにより、フューリン認識配列を消失させた細胞初期化因子を作製することができる。
【００３６】
また、本発明に用いられる「細胞外分泌シグナル」としては、後述の融合タンパク質を細胞外に分泌させることができるアミノ酸配列であればよく、該融合タンパク質の特性や該融合タンパク質を発現させる細胞等に合わせて、適宜公知のアミノ末端シグナルペプチド配列から選択される。例えば、抗体分子、受容体及び細胞外基質分子（ｍａｔｒｉｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、サイトカイン、ホルモン、成長及び分化因子、神経ペプチド、血管介在物質（ｖａｓｏｍｅｄｉａｔｏｒ）、ホスホキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホジエステラーゼ、Ｇタンパク質、Ｒａｓ関連タンパク質、イオンチャンネル、輸送体／ポンプ、プロテアーゼ、あるいは転写因子が含有するシグナル配列が挙げられる。好ましいシグナルペプチドとしては、例えば、抗体分子が含有するアミノ末端シグナルペプチド配列である、Ｉｇκ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチドを挙げることができる。
【００３７】
さらに、本発明に用いられる「プロテアーゼ認識配列」としては、後述の融合タンパク質が細胞外に分泌される際または分泌された後に、部位特異的エンドプロテアーゼによって認識されて切断される配列であればよく、公知の部位特異的エンドプロテアーゼによって認識される配列の中から適宜選択することができる。例えば、フューリン、トロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸａが認識する配列が挙げられる。好ましいプロテアーゼ認識配列としては、例えば、フューリン認識配列が挙げられる。
【００３８】
また、本発明に用いられる「蛋白質導入ドメイン」は、前記プロテアーゼ認識において切断された後述の融合タンパク質を、誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞（以下「標的細胞」とも称する。）内に導入する能力を有するペプチド配列であれば特に制限はない。例えば、ＶＰ２２、Ｋａｐｏｓｉ  ＦＧＦ、ＴＡＴ、ショウジョウバエ  アンテチィナペディア、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｍ９１８、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ−１０、Ｐｏｌｙ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ、及びこれらペプチドの派生物が挙げられる。好ましい蛋白質導入ドメインとしては、例えば、ＴＡＴが挙げられる。また、本発明に用いられる「蛋白質導入ドメイン」は、フューリン認識配列を消失させた、若しくはフューリン認識配列が存在しないものであることが好ましく、配列番号６又は７に記載のタンパク質であることがより好ましい。なお、かかる「蛋白質導入ドメイン」は、フューリン認識配列に変異を導入するといった前述の方法により適宜調製することができる。
【００３９】
また、本発明に用いられる「融合タンパク質」は、前記「細胞外分泌シグナル」、前記「プロテアーゼ認識配列」、前記「蛋白質導入ドメイン」および前記「細胞初期化因子」を含む融合タンパク質であり、前記「細胞外分泌シグナル」、前記「プロテアーゼ認識配列」、前記「蛋白質導入ドメイン」および前記「細胞初期化因子」をＮ末端側より順に含む融合タンパク質、または、前記「細胞外分泌シグナル」、前記「プロテアーゼ認識配列」、前記「細胞初期化因子」および前記「蛋白質導入ドメイン」をＮ末端側より順に含む融合タンパク質が好ましい。
【００４０】
本発明に用いられる「融合タンパク質」としては、更に機能性ペプチド又はタンパク質を含んでいてもよい。機能性ペプチド又はタンパク質としては、例えば、核移行シグナルペプチド等の細胞内局在化シグナルペプチド、蛍光タンパク質、ＦＬＡＧペプチド等のエピト―プタグ、薬剤耐性因子が挙げられる。
【００４１】
また、前記「細胞外分泌シグナル」、前記「プロテアーゼ認識配列」、前記「細胞初期化因子」、前記「蛋白質導入ドメイン」等における各々のペプチド間のアミノ酸の数および種類は、融合タンパク質の機能を阻害しない限り、特に制限されない。
【００４２】
本発明に用いられる、融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入される「細胞」（以下、「分泌用細胞」とも称する）としては、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の多能性を維持しながら培養する際に用いられるフィーダー細胞（例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞）、ＣＨＯ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｓ  ａ  ｓｕｂｃｌｏｎｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐａｒｅｎｔａｌ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂｉｏｐｓｙ  ｏｆ  ａｎ  ｏｖａｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｕｌｔ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ）、Ｓａｏｓ−２細胞（ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、Ｈ３５７細胞（ｈｕｍａｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ：ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ）が挙げられるが、これらに制限されない。かかる細胞の中では、幹細胞として維持するための物質の分泌が可能であるという観点から、フィーダー細胞が好ましく、さらに、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ、白血球遊走阻止因子）の分泌も可能であるという観点から、ＳＮＬ細胞がより好ましい。
【００４３】
また、細胞分裂を停止させるという観点から、これらの細胞は放射線照射や抗生物質処理（例えば、マイトマイシンＣ処理）を施して用いることが好ましい。
【００４４】
さらに、本発明に用いられる分泌用細胞としては、該細胞への前記「細胞初期化因子」の取り込みを阻害し、該細胞の初期化を抑制しつつ、標的細胞の前記「細胞初期化因子」の取り込み効率を亢進させるという観点から、前記「蛋白質導入ドメイン」を認識する受容体（例えば、ＴＡＴに対するヘパリン）が不活化されている細胞であることが好ましい。かかる「蛋白質導入ドメイン」を認識する受容体を不活化した細胞は適宜公知の技術、例えば、前記「蛋白質導入ドメイン」を認識する受容体をノックアウト若しくはノックインした動物の作製及び該動物からの培養細胞の樹立、又は前記「蛋白質導入ドメイン」を認識する受容体に対するｓｉＲＮＡの作製及び細胞への導入等の方法を適宜選択して調製することができる。
【００４５】
なお、かかる「分泌用細胞」の培養条件としては、各細胞の増殖等に適するよう確立された公知の条件を適宜採用することができる。
【００４６】
また、融合タンパク質をコードするＤＮＡが導入された細胞を調製するためには、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持するベクターを前記分泌用細胞に導入すればよい。用いられる「ベクター」としては、前記分泌用細胞に導入することができ、前記融合タンパク質を該細胞において発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、プラスミドＤＮＡ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等に、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を挿入したＤＮＡを用いることができる。また、かかるプラスミドＤＮＡ等としては、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させるために、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡシグナル、薬剤耐性遺伝子等の選択マーカー等の配列を有していることが望ましい。
【００４７】
さらに、前記分泌用細胞に前記ベクターを導入する方法としては、公知の遺伝子導入方法を適宜採用することができる。例えば、前記プラスミドＤＮＡを導入する方法として、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法を採用することができる。また、前記ウィルスベクターを導入する方法として、例えば、リン酸カルシウム法等のプラスミドＤＮＡを導入する方法により前記ウィルスベクターをパッケージング細胞に導入して得られたウィルス粒子を含有する培地上清を、前記細胞初期化因子分泌細胞に接触させる方法を用いることができる。かかる方法により調製された前記分泌用細胞における、前記融合タンパク質の発現は一過性なものであっても恒常的なものであってもよい。
【００４８】
次に、本発明の誘導型多能性幹細胞の製造方法における工程（ｂ）について説明する。本発明に係る工程（ｂ）は、工程（ａ）において調製された細胞から分泌される融合蛋白質を、誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞に導入するために、当該誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞と、工程（ａ）において調製された細胞とを共培養するか、または、当該誘導型多能性幹細胞に誘導するための細胞に対して、工程（ａ）において調製された細胞の培養上清を接触させる工程である。
【００４９】
本発明において用いられる「誘導型多能性幹細胞へ誘導するための細胞」（標的細胞）としては動物由来の体細胞であれば特に制限されることなく、例えば、ヒト及び非ヒト動物細胞（マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリ等）由来の体細胞（例えば、線維芽細胞、上皮細胞、血球系細胞、動物検体由来の任意の細胞）を用いることができる。
【００５０】
また、本発明において用いられる「共培養」の方法としては特に制限されることはなく、例えば、細胞培養容器に本発明の工程（ａ）において調製された細胞を播種して付着させた後、その上に標的細胞を播種して培養する方法、（ａ）において調製された細胞と標的細胞とを同時に細胞培養容器に播種して培養する方法が挙げられる。なお、かかる共培養の条件としては特に制限されることなく、各細胞に適した公知の条件を用いることができる。
【００５１】
また、本発明において用いられる「培養上清を接触させる」方法としては特に制限されることはなく、例えば、工程（ａ）において調製された細胞の培養中の培養上清をそのまま標的細胞に添加する方法、工程（ａ）において調製された細胞の培養上清を一旦冷蔵又は凍結保存し、再度細胞培養に適した温度（例えば３７℃）に戻した後に標的細胞に添加する方法が挙げられる。
【００５２】
また、かかる「培養上清」を調製するのに用いられる培地の基礎培地としては、本発明の方法により誘導型多能性幹細胞を製造し維持できるものであれば特に制限はない。例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＨＡＭ、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ３０、ＤＭ−１６０、ＤＭ−２０１、ＢＭＥ、ＳＦＭ−１０１、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ
５Ａ、Ｌｅ ｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５、ＲＩＴＣ８０−７、ＨＦ−Ｃ１、ＭＣＤＢ１０７、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４
ＳＦＭが挙げられる。また、ＥＳ細胞培養用等に改変された培地を用いてもよく、前記基礎培地の混合物を用いてもよい。かかる培地は、必要に応じて、添加物を含んでいてもよい。添加物としては、例えば、血清、血清の代替添加物（例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））、成長因子、ＬＩＦ、トランスフェリン等の鉄、ポリアミン類、ミネラル、糖類（例えばグルコース等）、有機酸、血清蛋白質、Ｌ−グルタミン等のアミノ酸、還元剤、ビタミン類、ステロイド、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）、栄養添加物が挙げられる。
【００５３】
さらに、本発明の誘導多能性幹細胞の製造方法においては、既存の方法（例えばレトロウィルスによる細胞初期化因子の導入方法）と組み合わせて用いてもよい。例えば、後述の図１０で示すように、レトロウィルスにより、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４をコードするＤＮＡを標的細胞に導入した後、Ｏｃｔ３／４を蛋白質として本発明の方法により導入し、誘導多能性幹細胞を樹立するということも可能である。
【００５４】
以上、本発明の誘導多能性幹細胞の製造方法の好適な実施形態について説明したが、かかる製造方法によって誘導多能性幹細胞を樹立することができたかを確認する方法としては公知の方法を適宜採用することができる。例えば、ＥＳ細胞のマーカー（例えば、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４）の発現やメチル化状態を解析する方法、アルカリフォスファタ―ゼ染色方法、本発明の製造方法で得られた細胞をヌードマウス等の免疫不全マウス（又は免疫寛容マウス）に移入し、テラトーマ形成能を解析する方法が挙げられる。
【００５５】
また、本発明の製造方法は、後述の図１５で示すように、ｃ−Ｍｙｃを用いずに、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（３因子）を用いて誘導多能性幹細胞を樹立する場合でも、レトロウィルスによる誘導多能性幹細胞の製造方法と比較して、遜色ない樹立効率を示している。したがって、本発明の製造方法は、高い樹立効率を示しつつ、高い安全性を有する（癌化の危険が少ない）ｉＰＳ細胞が得られるという点においても優れている。
【００５６】
さらに、本発明の製造方法は、後述の図１１、１３、１６及び１８で示すように、細胞初期化因子をタンパク質として体細胞に導入する公知の方法（非特許文献１０〜１３、特許文献１０〜１４）と比較して、誘導多能性幹細胞を樹立するまでの期間が短い。したがって、本発明の製造方法は、タンパク質として細胞初期化因子を導入する公知の方法と比較して、手間と時間とコストがかからないという点においても優れている。
【００５７】
次に、本発明のキットについて説明する。本発明のキットは、前述の本発明の誘導多能性幹細胞の製造方法に用いられるキットであって、下記（ａ）から（ｃ）の少なくとも一つを含むキットである。
（ａ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持するベクター
（ｂ）細胞外分泌シグナル、プロテアーゼ認識配列、蛋白質導入ドメインおよび細胞初期化因子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に保持する細胞
（ｃ）（ｂ）の細胞の培養上清
「ベクター」、「細胞（分泌用細胞）」、「培養上清」は前述の通りであり、これらの他に、本キットを使用する際の説明書、「ベクター」を細胞に導入するための試薬、本キットにより誘導多能性幹細胞が樹立できたかどうかを確認するための試薬（ＥＳ細胞のマーカー遺伝子を増幅するためのプライマーセット、ＥＳ細胞のマーカータンパク質を認識する抗体、アルカリフォスファタ―ゼ染色用試薬等）が含まれていてもよい。
【００５８】
次に、本発明の誘導型多能性幹細胞について説明する。本発明の誘導型多能性幹細胞は、前述の本発明の誘導多能性幹細胞の製造方法によって製造される細胞であって、細胞初期化因子がゲノム中に外来的に挿入されていないことを特徴とする誘導型多能性幹細胞である。本発明の製造方法により製造された誘導型多能性幹細胞は、癌化のリスクが少なく安全性が高いという観点から、ｃ−Ｍｙｃを除いた他の細胞初期化因子を本発明の方法により標的細胞によって導入して得られる誘導型多能性幹細胞であることが好ましい。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例において用いた各細胞の培養、並びにレトロウィルスによる各細胞への形質導入は下記方法に沿って行った。【００６０】
＜細胞培養＞
ヒト皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦ）はＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＳＩＧＭＡ社製）にて、ゼラチンコートディッシュ上で培養した。【００６１】
後述の本発明の方法によって樹立したヒト誘導型多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）クローンは、放射線照射したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）又はＳＮＬ細胞上にて、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培地を用いて維持した。【００６２】
なお、ｈＥＳＣ培地は、２０％ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ）、０．１ｍＭ  ６−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸（これら全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及び５ｎｇ／ｍｌ  ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｗａｋｏ社製）を添加した、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２ハム（ＤＭＥＭ−Ｆ１２、ＳＩＧＭＡ社製）からなる。【００６３】
さらに、前記の通り、ＳＮＬ細胞及びＭＥＦは、フィーダ細胞として利用するため、ヒトｉＰＳ細胞を樹立する際には、放射線照射（５０Ｇｙ）によってこれらの分裂を不活性化して用いた。また、マウスｉＰＳ細胞を樹立する際には、これらの細胞を、マイトマイシンＣ処理（ＭＭＣ処理：最高濃度１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンにて、３７度で２時間、細胞を処理）することによって、これら細胞の分裂を不活性化して用いた。【００６４】
また、ｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣは２０％ＫＳＲ、０．２５％トリプシン及び１ｍＭＣａＣｌ２添加ＰＢＳを用いて継代した。【００６５】
ＭＥＦは、分離したＣ５７ＢＬ／６及びＩＣＲマウス胎児（妊娠１２．５日目）から樹立した。さらに、Ｏｃｔ４プロモーターによって発現が制御されているＥＧＦＰ遺伝子を含むＭＥＦはトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６及びＩＣＲマウス胎児から得た。【００６６】
ＳＮＬ細胞はＭＥＦと同様の条件にて培養した。すなわち、ＭＥＦ及びＳＮＬ細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン及び１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭにて培養した。【００６７】
樹立したマウス誘導型多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）クローンは、ＭＭＣ処理したＭＥＦ又はＳＮＬ細胞上にて、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）培地を用いて維持した。【００６８】
なお、ｍＥＳＣ培地は、１５％ＫＳＲ、０．１ｍＭ  ６−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ社製）、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン及び１０３Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ（登録商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）からなる。【００６９】
また、ｍｉＰＳＣｓは０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、単一細胞懸濁液にして継代した。【００７０】
なお、これら全ての細胞（ＨＤＦ、ＳＮＬ、ｉＰＳＣ及びＥＳＣ）は、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。【００７１】
＜レトロウィルスによる形質導入＞
先ず、ＧＣｓａｍバイシストロニックバックボーンベクターを用いて、各細胞初期化因子を発現できるようにレトロウィルスベクターを構築した。次いで、各レトロウィルスベクターをパッケージング細胞に導入し、ウィルス上清を調製した。【００７２】
そして、ｍｉＰＳＣｓを作製するために、２０μｇ／ｍｌ  プロタミン存在下にて前記ウィルス上清を用いて、Ｏｃｔ４プロモーターによって発現が制御されているＥＧＦＰ遺伝子を含むＭＥＦに細胞初期化因子を形質導入した。次いで、ウィルス感染したＭＥＦを、新鮮な培地（１０％ＦＢＳ及び１％ＰＳＧ（ペニシリン、ストレプトマイシン及びＬ‐グルタミン）含有ＤＭＥＭ）にて毎日培地交換しながら培養した。形質導入してから３日目に、培養培地をｍＥＳＣ培地に置き換えると共に、ＭＭＣ処理ＭＥＦｓの上に前記ウィルス感染したＭＥＦをリプレート（ｒｅｐｌａｔｅ）した。その翌日より、ＥＧＦＰ＋（発現）コロニーが観察されるまで、一日おきに培地を新しいものに交換し続けた。【００７３】
そして、リプログラミング（初期化）効率を推測するためにＥＧＦＰ＋コロニーを数え、安定したｉＰＳＣクローン樹立のためにピックアップした。【００７４】
また、ｈｉＰＳＣｓを作製するために、２０μｇ／ｍｌ  プロタミン存在下にて前記ウィルス上清を用いて、ＨＤＦに細胞初期化因子を形質導入した。形質導入後５日目に、ＨＤＦ細胞を放射線照射ＭＥＦｓに播き直した。その翌日、培養培地をｈＥＳＣ培地に交換し、ヒトｉＰＳＣコロニーが観察されるまで一日おきに新たな培地を補充し続けた。【００７５】
（実施例１）
＜形質導入可能な細胞初期化因子を分泌するＳＮＬ細胞の作製＞
細胞外分泌シグナルとしてＩｇＫリーダー配列を、プロテアーゼ認識配列としてフューリン認識配列（ＲＡＲＲ）を、蛋白質導入ドメインとしてＴＡＴ配列（野生型）を選択し、これら機能的ペプチド配列と、細胞初期化因子等とを含む融合タンパク質（形質導入可能な細胞初期化因子等）をコードするＤＮＡが導入された細胞を下記方法にて調製した。【００７６】
また、図３に示す通り、細胞初期化因子  ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４、並びにＴＡＴ配列の野生型のアミノ酸配列は、フューリン認識部位を有しているため、これらポリペプチドはフィーダ細胞からの分泌の過程において切断されることが予想される。そこで、このフューリンによる消化を回避し、形質導入可能な組換えタンパク質分泌システムの効率を亢進させるために、ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２、ｈＫＬＦ４及びＴＡＴ配列のフューリン耐性を示すアミノ酸変異体も調製した（図４及び５  参照）。すなわち、ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ及びｈＫＬＦ４については、フューリン認識部位をノックダウンしたアミノ酸変異体  ｈｃ−ＭＹＣ  Ｒ３６７Ｋ  Ｒ４２４Ｑ、ｈＳＯＸ２  Ｒ４３Ｑ  Ｒ１１４Ｑ及びｈＫＬＦ４  Ｒ３７７Ｓを各々作製し、さらにｈＫＬＦ５はフューリン認識部位を欠損しているため、ｈＫＬＦ４の変異体として調製した。また、ＴＡＴ配列については、フューリン耐性を示す組換え体として報告されているＴＡＴ４及びＴＡＴｋ配列を調製した（ＴＡＴ４配列については、Ａｌａｎ  Ｈｏら、ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ、２００１年１月１５日、６１巻、２号、４７４〜４７７ページ  参照。ＴＡＴｋ配列については、Ｍａｒｃｅｌｌａ  Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ、２００９年２月、１７巻、２号、３３４〜３４２ページ  参照）。【００７７】
具体的には、先ず、種々のタンパク質とＴＡＴ配列（野生型）とが融合している融合タンパク質をコードするＤＮＡが含まれているｐＴＡＴ−ＨＡベクターシリーズを構築した。すなわち、ＴＡＴ配列に、ｃ−ＭＹＣ、ｃ−ＭＹＣ  Ｒ３６７Ｋ  Ｒ４２４Ｑ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＳＯＸ２  Ｒ４３Ｑ  Ｒ１１４Ｑ、ＫＬＦ５又はクサビラオレンジ（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ）が融合している融合タンパク質を動物細胞にて発現させることができるベクターシリーズを構築した。また、ｐＴＡＴ−ＨＡベクターはＤｒ．Ｓｔｅｖｅｎ  Ｆ  Ｄｏｗｄｙから提供して頂いたものを使用した。【００７８】
次に、ｐＴＡＴ−ＨＡベクター中のＴＡＴ配列（野生型）をコードするＤＮＡ配列を、ＴＡＴ４配列又はＴＡＴｋ配列に対応するＤＮＡ配列に置換した。そして、ＴＡＴ４配列又はＴＡＴｋ配列を含む組換えタンパク質を分泌させるためのプラスミドベクターを構築するために、ＴＡＴ４‐ＨＡ‐融合パートナー又はＴＡＴｋ‐ＨＡ‐融合パートナーに対応する配列をコードするカセットを、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクターにクローニングした。なお、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクターは、特に組換えタンパク質の分泌用として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって開発されたベクターである。【００７９】
また、ＴＡＴ４／ＴＡＴｋ配列をコードするＤＮＡを含有しないプラスミドベクターを構築するために、細胞初期化因子各々のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅にて作製し、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂにダイレクトクローニングした。【００８０】
そして、このように構築した前記ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ由来ベクターをＳＮＬ細胞（ＳＮＬ親細胞）にトランスフェクションし、続いて最長２１日間、前記ベクターが耐性を示す薬剤  ２００μｇ／ｍｌ  ゼオシンによる選択を行い、各組換えタンパク質を安定して発現することができるＳＮＬ細胞株（以下、「改変ＳＮＬ細胞」とも称する）を樹立した。【００８１】
（実施例２）
＜マウスｉＰＳ細胞の作製＞
先ず、本発明の方法によって、ＭＥＦからｍｉＰＳＣを作製するために、各改変ＳＮＬ細胞にＭＭＣ処理を施し、フィーダ細胞として調製した。そして、標的細胞に導入する細胞初期化因子の組み合わせに合わせて、適宜これらフィーダ細胞をリプレートし、改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物を調製した。【００８２】
また、形質導入可能な細胞初期化因子等を含有する馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭ））を調製するために、改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物をもう１セット別に用意し、４ｘ１０６個を培地（ＤＭＥＭ又はｍＥＳＣ培地）とともにＴ‐７５フラスコに播き、一晩インキュベーションした。その翌日、得られた培地を回収しつつ、新たな培地を補充した。次いで、回収した一晩培養後の培養培地はフィルトレーション（孔径：０．４５μｍ）し、後述の培養に直ぐに用いるか、−３０℃にて保存した。また、このように調製したＣＭには、使用する直前に５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した。【００８３】
次に、このようにして調製した改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物及び／又はＣＭを用いて、標的細胞であるＭＥＦに細胞初期化因子等を形質導入するために、ＤＭＥＭを用いて調製したＣＭにてＭＥＦをインキュベーションし、その翌日もＤＭＥＭを用いて調製した新鮮なＣＭをＭＥＦに与えた。【００８４】
次いで、形質導入後３日目に、改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物又はＳＮＬ親細胞の上にＭＥＦを播き直した。なお、この日以降、ＣＭはＤＭＥＭの代わりにｍＥＳＣ培地を用いて調製したものを使用し、回収したてのＣＭ（改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物に新鮮なｍＥＳＣ培地を与え、１日おいた培地）に毎日交換し、又は交換することなく、細胞培養を維持した。【００８５】
そして、細胞初期化因子（野生型）をＭＥＦに形質導入した場合には、マウスｉＰＳＣを作製するために、Ｅ−カドヘリン及びＳＳＥＡ−１を発現している細胞画分をソーティングし、標準的なｍＥＳＣ培地と共にＭＭＣ処理ＭＥＦフィーダ細胞の上に播き直した（図１１参照）。【００８６】
一方、細胞初期化因子（変異型）をＭＥＦに形質導入した場合には、ＥＧＦＰ＋コロニー数をアレイスキャンＶＴ１ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）リーダー（ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  （ＨＣＳ）  Ｒｅａｄｅｒ、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社製）を用いて数え、選択したコロニーをピックアップし、標準的なｍＥＳＣ培地と共にＭＭＣ処理ＭＥＦフィーダ細胞の上に播き直した（図１３参照）。【００８７】
（実施例３）
＜ＨＤＦからヒトｉＰＳ細胞の作製＞
本発明の方法によってｈｉＰＳＣを作製するために、細胞源としてＨＤＦを用い、ｍＥＳＣ培地の代わりにｈＥＳＣ培地を用いた以外は、前記＜マウスｉＰＳ細胞の作製＞に記載の方法と同様にして行った。また、形質導入したＨＤＦには新たなＣＭを毎日補充した。【００８８】
そして、ＳＳＥＡ−４を発現している細胞画分をソーティングし、１０μＭ  ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２、Ｗａｋｏ社製）を添加した標準的なｈＥＳＣ培地と共に放射線照射ＭＥＦフィーダ細胞の上に播き直し、ｈｉＰＳＣコロニーが観察されるまで、新鮮なｈＥＳＣ培地に毎日交換し続けた。細胞初期化因子（野生型）をＨＤＦに形質導入し、ｈｉＰＳＣ（ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞）を得るまでの過程については図１６に示し、細胞初期化因子（変異型）をＨＤＦに形質導入し、ｈｉＰＳＣ（ＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞）を得るまでの過程については図１８に示す。【００８９】
（実施例４）
＜ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞からヒトｉＰＳ細胞の作製＞
また、細胞源としてＨＤＦの代わりにヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞を用いて、ｈｉＰＳＣを作製するために、５０ｎｇ／ｍｌ  ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びヒトＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）のカクテルを添加した適切な培地を用いて、前記同様に調製したＣＭにてヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞を５日間培養し、処理した。【００９０】
その後、細胞を同ＣＭと共に改変ＳＮＬフィーダ細胞の混合物上にリプレートし、その翌日から、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、ヒトＴＰＯ及びヒトＦＬＴ３−Ｌのカクテルを添加したｈＥＳＣ培地を用いて、前記同様に調製したＣＭにて培養した。【００９１】
そして、ＳＳＥＡ−４を発現している細胞をソーティングし、１０μＭ  ＲＯＣＫ阻害剤を添加したｈＥＳＣ培地にて培養した。また、ｈｉＰＳコロニーが観察された後、細胞はｈＥＳＣ培地のみにて培養した。【００９２】
このようにして調製した各細胞（実施例１に記載の改変ＳＮＬ細胞、実施例２〜４に記載のｉＰＳ細胞）については、その特性等を以下のようにして評価した。【００９３】
＜蛋白質導入ドメインによる形質導入性の評価１＞
蛋白質導入ドメインによる分泌型組換えタンパク質の形質導入性を評価するために、クサビラオレンジ（ＫＯ）を融合させたＴＡＴ４（ＴＡＴ４−ＫＯ）、ＴＡＴｋ（ＴＡＴｋ−ＫＯ）及びノナアルギニン（Ｒ９−ＫＯ）をコードするｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ由来のベクターをＳＮＬ細胞に導入した。なお、ノナアルギニン（Ｒ９）はフューリンによって分解されることが知られている。そして、２００μｇ／ｍｌ  ゼオシンによる選択の後、３種類のＳＮＬ細胞（ＴＡＴ４−ＫＯ−ＳＮＬ細胞、ＴＡＴｋ−ＫＯ−ＳＮＬ細胞、Ｒ９−ＫＯ−ＳＮＬ細胞）を観察し、各ＳＮＬ細胞から分泌された組換えタンパク質の各ＳＮＬ細胞自体への形質導入（自己形質導入（ｓｅｌｆ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ））の程度を評価した。得られた結果を図６に示す。【００９４】
図６に示した結果から明らかなように、組換えＫＯの発現はＴＡＴ４−ＫＯ−ＳＮＬ細胞及びＴＡＴｋ−ＫＯ−ＳＮＬ細胞の細胞内全体（細胞質）にて観察された（図６  左側及び真ん中のパネル  参照）。一方、Ｒ９−ＫＯ−ＳＮＬ細胞に関しては、特定の細胞小器官（小胞体及びゴルジ装置）においてＫＯの発現が観察され、細胞質におけるＫＯシグナルは示されなかった（図６  右側のパネル  参照）。なお、この要因は、Ｒ９が小胞体等においてフューリンによって消化されてしまっため、ＫＯ組換えタンパク質の分泌が困難になってしまったことにあると推測される。【００９５】
従って、これらの結果から、ＳＮＬ細胞株はフューリンを含有しており、ＴＡＴ４組換えタンパク質又はＴＡＴk組換えタンパク質を用いることによって、ＰＴＤ−タンパク質分泌システムにおいて、標的細胞への全体的な形質導入性を増強できることが示された。【００９６】
＜蛋白質導入ドメインによる形質導入性の評価２＞
蛋白質導入ドメインによる分泌型組換えタンパク質の形質導入性を評価するために、ＴＡＴ４−ＫＯ又はＴＡＴｋ−ＫＯを分泌するＳＮＬ細胞をＪｕｒｋａｔ細胞と一晩共培養した。そして、その翌日、Ｊｕｒｋａｔ細胞をフローサイトメトリーによって分析した。得られた結果を図７に示す。【００９７】
図７に示した結果から明らかなように、ＴＡＴ４−ＫＯ又はＴＡＴｋ−ＫＯを分泌するＳＮＬ細胞と共培養したＪｕｒｋａｔ細胞においては、明確にＫＯ由来の蛍光強度が確認された（図７  真ん中及び右側のドットプロット図  参照）。【００９８】
従って、各ＳＮＬ細胞から分泌された組換えタンパク質は、各ＳＮＬ細胞とは異なる細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）にも効率良く形質導入されており、図６に示した結果同様に、フューリンに対して耐性を示すＴＡＴ４及びＴＡＴｋは標的細胞に対しても高い形質導入性を有していることが実証された。【００９９】
＜フューリン耐性を示すアミノ酸変異体の評価＞
前述の通り、細胞初期化因子  ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４の野生型のアミノ酸配列は、フューリン認識部位を有しているため、これらポリペプチドはフィーダ細胞からの分泌の過程において切断されることが予想される（図３  参照）。そこで、実際に野生型のアミノ酸配列からなるタンパク質がフューリンによって切断されるかどうかをウェスタンブロッテイングによって確認した。得られた結果を図８に示す。【０１００】
また予想されるフューリンによる消化を回避し、形質導入可能な組換えタンパク質分泌システムの効率を亢進させるために、フューリン認識部位を不活化したｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２ｈＫＬＦ４のアミノ酸変異体（図４及び５  参照）を調製し、これら変異体のフューリンに対する耐性をウェスタンブロッテイングによって評価した。得られた結果を図９に示す。【０１０１】
なお、ウェスタンブロッティングは以下の通りに行った。すなわち先ず、改変ＳＮＬ細胞を２４ウェル（穴）プレートに播種した。そして、その翌日、培養培地を血清非含有ＤＭＥＭ培地に置き換えた。次いで、その２４時間後に培地を回収し、ビバスピン２カラム（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２  ｃｏｌｕｍｎ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、ＶＳ０２９１）によって濃縮した。得られた各濃縮培地１０μｌを、下記分子に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。
ｃ−ＭＹＣ（ｃ−ＭＹＣに対する抗体：Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、コード番号  ５６０５又はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、カタログ番号  ｓｃ−７６４）、ＯＣＴ４（ＯＣＴ４に対する抗体：Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、コード番号  ２８４０）、ＳＯＸ２（ＳＯＸ２に対する抗体：Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、コード番号  ３５７９）、ＫＬＦ５（ＫＬＦ５に対する抗体：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号  ＡＦ３７５８）。【０１０２】
そして、各々のタンパク質を対応する一次抗体でプローブし、次いで西洋ワサビぺルオキシダーゼ結合抗マウス／ウサギＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）と共にインキュベーションした。また、各々のバンドは、ＥＣＬプラスウェスタンブロッティング検出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて可視化した。【０１０３】
図８に示した結果から明らかなように、ＴＡＴ４又はＴＡＴｋと融合させて分泌させたｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４においては、各々予想されるフューリンによる分解産物の分子量のバンドが確認された。従って、ＳＮＬ細胞によって分泌された野生型のｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦはフューリンによって切断されていることが実証された。【０１０４】
図９のaに示した結果から明らかなように、フューリン感受性のＴＡＴ４−ｃ−ＭＹＣにおいては、図８に示した結果同様に分解された画分が確認された。一方、フューリン耐性のＴＡＴ４−ｃ−ＭＹＣ  Ｒ３６７Ｋ  Ｒ４２４Ｑにおいては分解された画分が確認されなかった。また、ＴＡＴ４を融合していない形質導入不可能な形態（ｃ−ＭＹＣ（ＴＡＴ４−）、ｃ−ＭＹＣ  Ｒ３６７Ｋ  Ｒ４２４Ｑ（ＴＡＴ４−））においても同様のパターンが確認された。【０１０５】
さらに図９のｂに示した結果から明らかなように、野生型のアミノ酸配列においてもフューリン認識配列が認められないＯＣＴ４においては、ＴＡＴ４−ＯＣＴ４及びＯＣＴ４（ＴＡＴ４−）において、分解された画分は確認されなかった。【０１０６】
また図９のcに示した結果から明らかなように、ＴＡＴ４−ＳＯＸ２は分解されていた。しかし、ＴＡＴ４−ＳＯＸ２  Ｒ４３Ｑ  Ｒ１１４Ｑは分解されていなかった。同様に、ＳＯＸ２（ＴＡＴ４−）は分解されていたが、ＳＯＸ２  Ｒ４３Ｑ  Ｒ１１４Ｑ（ＴＡＴ４−）は分解されていなかった。【０１０７】
また図９のｄに示した結果から明らかなように、ＴＡＴ４−ＫＬＦ５及びＫＬＦ５（ＴＡＴ４−）において、分解された画分は確認されなかった。【０１０８】
＜ＴＡＴ４／ＴＡＴｋ−ｈＯＣＴ４についての機能試験＞
フューリン認識部位を有さない、分泌されたＴＡＴ４−ｈＯＣＴ４又はＴＡＴｋ−ｈＯＣＴ４タンパク質の機能性を、ＨＤＦを用いたｈｉＰＳＣ作製において評価した。具体的には、ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスによって形質導入したＨＤＦを、ＴＡＴ４−ｈＯＣＴ４又はＴＡＴｋ−ｈＯＣＴ４タンパク質を分泌する改変ＳＮＬ細胞株（ＳＰ−ＴＡＴ４−ｈＯＣＴ４又はＳＰ−ＴＡＴｋ−ｈＯＣＴ４）と共培養し、その形態学的変化、アルカリホスファタ―ゼ（ＡＰ）染色を観察した。得られた結果を図１０に示す。【０１０９】
なお、ＡＰ染色はアルカリホスファタ―ゼ染色キット（Ｖｅｃｔｏｒ社製、ＳＫ−５１００、ＳＫ−５２００）を用い、そのメーカーの使用説明書に従って行った。【０１１０】
図１０に示した結果から明らかなように、ＳＰ−ＴＡＴ４−ｈＯＣＴ４又はＳＰ−ＴＡＴｋ−ｈＯＣＴ４上にて培養し、ｈＯＣＴ４を除く細胞初期化因子（ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４）をレトロウィルスによって形質導入したＨＤＦにおいては、いくつかの形態学的変化、例えば細胞膜の薄膜化、細長状から円形状への変化が確認された。また、注目すべきことに、ＡＰ染色によって、ＡＬＰ活性を示すいくつかの細胞も確認された。従って、ＳＮＬ細胞株から分泌されたＴＡＴ４／ＴＡＴｋ−ｈＯＣＴ４は標的細胞にリプログラミング効果をもたらすことが明らかになった。【０１１１】
なお、ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４をレトロウィルスによってＨＤＦに形質導入したが、ｉＰＳＣ様コロニーの形成は確認されなかった（図１０  Ｒｅｔｒｏ−Ｍ，Ｓ，Ｋ  参照）。一方、ＳＮＬ親細胞株と共に培養し、ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４に加え、ｈＯＣＴ４をレトロウィルスによって形質導入した場合、従前の報告（非特許文献９）通り、典型的なｉＰＳＣコロニーが出現が確認された（図１０  Ｒｅｔｒｏ−４  Ｆａｃｔｏｒｓ  参照）。【０１１２】
＜分泌型細胞初期化因子（野生型）によるマウスｉＰＳ細胞の構築＞
形質導入可能な分泌型細胞初期化因子（野生型）のみを用いて、マウスｉＰＳ細胞ができるかどうかを調べた。すなわち、図１１に示す通り、ＴＡＴ４に融合している細胞初期化因子を各々分泌している４種のＳＮＬフィーダ細胞の混合物と共に、ＴＡＴ４融合細胞初期化因子の混合物を含むＣＭにてＭＥＦを培養した。さらに、Ｅ−カドヘリン及びＳＳＥＡ−１発現細胞をソーティングして培養した結果、ｍｉＰＳＣのコロニーを得ることができた。【０１１３】
そして、このようにして得られたｍｉＰＳＣの特性について、ＡＰ染色及び免疫細胞化学的染色（ＳＳＥＡ−１染色）にて分析した。得られた結果を図１２に示す。なお免疫細胞化学染色は以下の通り行った。【０１１４】
先ず、細胞を、室温下１５分間、４％パラホルムアルデヒドにて固定した。そして４％正常ヤギ血清含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄した。【０１１５】
次いで、以下の抗体と固定化した細胞とを反応させた。
抗ＳＳＥＡ−１抗体（ａｂｃａｍ社製、ａｂ１６２８５、希釈率＝１：１００）、
フィコエリスリン結合  抗ＳＳＥＡ−４抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＦＡＢ１４３５Ｐ、希釈率＝１：１００）、
ＥＳ細胞キャラクタリゼーションキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＳＣＲ００１）含有；抗ＴＲＡ−１−６０抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＭＡＢ４３６０、希釈率＝１：１００）及び抗ＴＲＡ−１−８１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＭＡＢ４３８１、希釈率＝１：１００）。【０１１６】
また、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６結合  抗マウスＩｇＭ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ａ２１０４５、希釈率＝１：２５０）を、抗ＳＳＥＡ−１抗体、抗ＴＲＡ−１−６０抗体及び抗ＴＲＡ−１−８１抗体を検出するための二次抗体として用い、免疫細胞化学染色を行った。【０１１７】
図１２に示した結果から明らかなように、改変ＳＮＬ細胞株から分泌された、ＴＡＴ４に融合している細胞初期化因子４種（野生型）をＭＥＦに形質導入することによって得られたｍｉＰＳＣにおいて、典型的なｉＰＳ細胞様コロニーが観察された。また、多能性幹細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼ及びＳＳＥＡ−１の発現が確認された。【０１１８】
＜分泌型細胞初期化因子（変異型）によるマウスｉＰＳ細胞の構築＞
形質導入可能な分泌型細胞初期化因子（フューリンに対して耐性を示す変異型）のみを用いて、マウスｉＰＳ細胞ができるかどうかを調べた。すなわち、図１３に示す通り、ＴＡＴ４融合している細胞初期化因子（変異型）を各々分泌している４種のＳＮＬフィーダ細胞の混合物と共に、ＴＡＴ４融合細胞初期化因子（変異型）の混合物を含むＣＭにて、Ｏｃｔ４プロモーターによって発現が制御されているＥＧＦＰ遺伝子（ｐＯＣＴ４−ＥＧＦＰ）を含むＭＥＦを培養した。その結果、約９日目にＯＣＴ4−ＥＧＦＰ＋コロニーの発現が初めて確認された。【０１１９】
そして、このようにして得られたｍｉＰＳＣの特性について、ｐＯＣＴ４−ＥＧＦＰのシグナル観察、ＡＰ染色及び免疫細胞化学染色（ＳＳＥＡ−１染色）にて分析した。なお免疫細胞化学染色は前記の通り行った。得られた結果を図１４に示す。【０１２０】
図１４に示した結果から明らかなように、改変ＳＮＬ細胞株から分泌された、ＴＡＴ４に融合している細胞初期化因子４種（変異型）をＭＥＦに形質導入することによって得られたｍｉＰＳＣにおいて、多能性幹細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼ及びＳＳＥＡ−１の発現が確認された。また、ｐＯＣＴ４−ＥＧＦＰの持続的な発現も観察され、このｍｉＰＳＣの多分化能は安定しており、強いものであることが明らかになった。【０１２１】
＜改変ＳＮＬ細胞株を用いた様々な条件下でのｍｉＰＳＣ作製の効率比較＞
下記に示す様々な条件にて改変ＳＮＬ細胞株によるｍｉＰＳＣ作製の効率を、アレイスキャンＶＴ１  ＨＣＳリーダー（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社製）を用いて調べた。なお、細胞源としてはｐＯＣＴ４−ＥＧＦＰを含むＭＥＦを用い、ＴＡＴ４配列を蛋白質導入ドメインとして用い、図１１及び１３に示した方法に準じてｍｉＰＳＣを作製した。得られた結果を図１５に示す。【０１２２】
なお、図１５中の棒グラフは、１×１０５ＭＥＦから作製されたＯＣＴ４−ＥＧＦＰ＋ＥＳ様コロニーの平均数（三重に測定した平均値±標準偏差（ｓ．ｄ））を示す。また平均値についてはグラフの下部にその具体的な数値を示す。さらに、Ｘ軸の表示における略語は各々ｍｉＰＳＣの作製の際の条件を示す。
４：細胞初期化因子として４因子（ｈＯＣＴ４、ｈｃ−ＭＹＣ、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４）をＭＥＦに導入
３：細胞初期化因子として３因子（ｃ−Ｍｙｃ以外の４因子、すなわち、ｈＯＣＴ４、ｈＳＯＸ２及びｈＫＬＦ４）をＭＥＦに導入
Ｆ：形質導入可能な細胞初期化因子を、ＳＮＬフィーダ細胞の混合物から分泌させることにより、ＭＥＦに導入
ＣＭ：形質導入可能な細胞初期化因子を、ＣＭにて培養することにより、ＭＥＦに導入
Ｒｅｔｒｏ：細胞初期化因子をレトロウィルスによりＭＥＦに導入
ＷＴ：野生型細胞初期化因子をＭＥＦに導入
Ｍｕｔ：フューリン耐性を示す細胞初期化因子の変異体をＭＥＦに導入。【０１２３】
図１５に示した結果から明らかなように、４因子を導入してｉＰＳ細胞を作製する際の効率において、レトロウィルスを用いて導入する方法（「４，Ｒｅｔｒｏ，ＷＴ」）に比べて、ＳＮＬフィーダ細胞の混合物及び/又はＣＭを用いて導入する方法は劣るものの、３因子を導入してｉＰＳ細胞を作製する際の効率においては、レトロウィルスによる方法（「３，Ｒｅｔｒｏ，ＷＴ」）と比較して、ＳＮＬフィーダ細胞及びＣＭを用いる方法（「３，Ｆ＋ＣＭ，ＷＴ」及び「３，Ｆ＋ＣＭ，Ｍｕｔ」）は遜色ない樹立効率を示した。したがって、本発明の製造方法は高い作製効率を示しつつ、癌化の危険が少ない高い安全性を有するｉＰＳ細胞を作製できる点において優れていることが明らかになった。【０１２４】
＜分泌型細胞初期化因子（野生型）によるヒトｉＰＳ細胞の構築＞
形質導入可能な分泌型細胞初期化因子（野生型）のみを用いて、ヒトｉＰＳ細胞ができるかどうかを調べた。すなわち、図１６に示す通り、ＴＡＴ４に融合している細胞初期化因子を各々分泌している４種のＳＮＬフィーダ細胞の混合物と共に、ＴＡＴ４細胞初期化因子の混合物を含むＣＭにて新生児組織由来のＨＤＦを培養した。さらに、ＳＳＥＡ−４発現細胞をソーティングして培養した結果、ｈｉＰＳＣのコロニーを得ることができた。なお、このようにして得られたｉＰＳ細胞をＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞とも称する。【０１２５】
そして、ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞の特性について、ＡＰ染色及び免疫細胞化学的染色にて分析した。なお免疫細胞化学染色は前記の通り行った。得られた結果を図１７に示す。【０１２６】
図１７に示した結果から明らかなように、改変ＳＮＬ細胞株から分泌された、ＴＡＴ４に融合している細胞初期化因子４種（野生型）をＨＤＦに形質導入することによって得られたｈｉＰＳＣ（ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞）において、多能性幹細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１の発現が確認された。【０１２７】
＜分泌型細胞初期化因子（変異型）によるヒトｉＰＳ細胞の構築＞
形質導入可能な分泌型細胞初期化因子（フューリンに対して耐性を示す変異型）のみを用いて、ヒトｉＰＳ細胞ができるかどうかを調べた。すなわち、図１８に示す通り、ＴＡＴ４融合している細胞初期化因子（変異型）を各々分泌している４種のＳＮＬフィーダ細胞の混合物と共に、ＴＡＴ４融合細胞初期化因子（変異型）の混合物を含むＣＭにて、新生児組織由来のＨＤＦを培養した。さらに、ＳＳＥＡ−４発現細胞をソーティングして培養した結果、ｈｉＰＳＣのコロニーを得ることができた。また、このようにして得られたｈｉＰＳＣは図１９に示す通り、典型的なヒトＥＳ／ｉＰＳ様の形態を示した。なお、このようにして得られたｉＰＳ細胞をＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞とも称する。【０１２８】
そして、前記のようにして得られたＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞については、さらに以下の特性評価を行った。【０１２９】
＜ＡＰ染色及び免疫細胞化学的染色＞
ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞について、前記の方法により、ＡＰ染色及び免疫細胞化学的染色を行った。また、これらヒトｉＰＳ細胞のインビトロ分化を行い、胚葉体形成の有無を観察した。すなわち、胚葉体形成を行うために、ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞又はＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞をＳＮＬフィーダ細胞の混合物から解離し、低付着性培養ディッシュ（ｌｏｗ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ、Ｓｔｅｒｉｌｉｎ社製）に移し、ｂＦＧＦを含有しないｈＥＳＣ培地にて培養した。得られた結果を図２０に示す。【０１３０】
図２０に示した結果から明らかなように、本発明の製造方法によって作製したヒトｉＰＳ細胞は典型的なヒトＥＳ様形態を示し、アルカリフォスファターゼ染色も陽性であった。また、ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞は懸濁培養にて、低付着性培養ディッシュに移してから３日後に共に胚葉体の形成が観察された。さらに、多分化能マーカーの発現（ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ）も観察された。なお、マウスの多分化能マーカーであるＳＳＥＡ−１の発現は観察されず、改変ＳＮＬ細胞株に対しては放射線照射を行なっているので、改変ＳＮＬ細胞株からの自己形質導入によるｍｉＰＳＣの形成の可能性は極めて低い。【０１３１】
＜半定量的ＲＴ−ＰＣＲによるヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現分析＞
ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞における、ヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現分析を半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって行った。すなわち、各細胞から、トータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  マイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）により調製し、ハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、そのメーカーの使用説明書に従って、逆転写を行った。そして、Ｔａｑ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）及び表２に示すプライマーを用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。得られた結果を図２１に示す。【０１３２】
【表２】
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【０１３３】
図２１に示した結果から明らかなように、ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞の全てのクローンにおいて、全ての多分化能（ＥＳ細胞）マーカー遺伝子及び内在性ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ５の発現が確認された。【０１３４】
＜核型分析＞
ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞の核型を分析するため、標準的なＧバンド染色体検査（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇ−ｂａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。得られた結果を図２２に示す。【０１３５】
図２２に示した結果から明らかなように、ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞において、標準的なＧバンド染色体検査によって正常な核型が確認された。【０１３６】
＜テラトーマ形成＞
ＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞及びＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞の多分化能を確認するため、これらの細胞のテラトーマ形成能を調べた。すなわち、先ず麻酔したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ，  Ｉｎｃ．製）の精巣内にＳＰ−ｈｉＰＳＷＴ細胞又はＳＰ−ｈｉＰＳｍｕｔ細胞を注入した。次に注入してから６〜８週間後に前記マウスを安楽死させ、腫瘍を解剖した。そして、得られた腫瘍を４％パラホルムアルデヒドにて固定してスライスし、次いで、得られた切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）にて染色し、顕微鏡にて観察した。得られた結果を図２３に示す。【０１３７】
図２３に示した結果から明らかなように、いずれのヒトｉＰＳ細胞クローン由来のテラトーマにおいて、内胚葉、中胚葉、外胚葉の組織全ての形成が確認された。【０１３８】
従って、本発明の製造方法によって得られるヒトｉＰＳ細胞についても、高い多分化能を有していることが、遺伝子又はタンパク質レベルでの発現解析においても、形態学的観察においても明らかになった。【０１３９】
＜ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞からのｈｉＰＳＣの作製＞
一般的にＨＤＦやＭＥＦ等の線維芽細胞に比べ、ウイルスを用いずに造血系細胞からｉＰＳ細胞を作製することは困難だと言われている。例えば、Ｈｏｎｇ  Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４６０巻、７２５９号、１１３２〜１１３５ページや、Ｔａｋｅｎａｋａ  Ｃ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２０１０年、３８巻、１５４〜１６２ページに記載されているように、レトロウィルスによってＭＥＦに細胞初期化因子を導入するとｉＰＳ細胞は樹立できるが、同方法によってＴリンパ球等に細胞初期化因子を導入してもｉＰＳ細胞（コロニー）を得ることができなかったことが知られている。そこで、実施例４に記載の方法にて、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞からのｈｉＰＳＣ作製を試み、さらに得られた細胞におけるアルカリフォスファタ―ゼ及びＳＳＥＡ−４の発現を前記方法にて調べた。得られた結果を図２４に示す。【０１４０】
図２４に示した結果から明らかなように、本発明の製造方法によって、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞由来のｈｉＰＳＣ様コロニーの形成が確認され、さらに得られたｈｉＰＳＣにおいて、アルカリフォスファタ―ゼ及びＳＳＥＡ−４の発現も確認された。【０１４１】
従って、線維芽細胞のみならず、ウイルスを用いずにｉＰＳ細胞を樹立することが困難である造血系細胞を用いても、本発明の製造方法によって、ｉＰＳ細胞の作製が可能であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
以上説明したように、本発明によれば、細胞初期化因子が誘導型多能性幹細胞のゲノム中に挿入されることなく、樹立効率が高く、しかも手間と時間とコストのかからない、誘導型多能性幹細胞の製造方法を提供することが可能となる。【０１４３】
したがって、本発明の誘導型多能性幹細胞の製造方法、キット、誘導型多能性幹細胞は、誘導型多能性幹細胞を臨床上利用する上で、特に再生医療に利用する上で、極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４４】
配列番号１、３、４、６及び７
＜２２３＞  人工的に合成されたポリペプチドの配列
配列番号８〜４３
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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