(57)【要約】【課題】  高速な画像取得、励起光の効率的な利用、およびピンホールの容易な調整を可能にする共焦点撮像のための方法およびシステムを提供することである。【解決手段】  共焦点撮像のためのシステムおよび方法が説明される。一実装態様では、共焦点撮像システム（１００）は、１つまたは複数の波長を有する励起光（１０）を放出するように構成された光源（１１０）、試料を保持するように構成された試料保持器（１８０）、２次元（２−Ｄ）撮像装置（１９０）、ならびに第１の空間光変調器（１４０）および第２の空間光変調器（１５０）を含む光学系を備え、光学系は、（ｉ）励起光（１０）を平行にすること；（ｉｉ）第１の空間光変調器（１４０）を使用して、予め決定された位相変調パターンを平行にされた励起光（１２）に適用すること；（ｉｉｉ）位相変調された平行にされた励起光（１４）を、試料内の焦点面に対するフーリエ面に配置される励起パターンとして使用して試料を照射すること；（ｉｖ）試料内の焦点面から放出光（１８）を集光すること；および（ｖ）試料内の焦点面が第２の空間光変調器（１５０）のピクセルによって形成されたピンホールパターンと共役になるように、集光された放出光（２０）を第２の空間光変調器（１５０）を経て撮像装置に向けることを行うように構成される。【選択図】図１
2019521373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の波長を有する励起光を放出するように構成された光源と、
試料を保持するように構成された試料保持器と、
２次元撮像装置と、
光学系であって、
第１の空間光変調器（ＳＬＭ）と、
第２のＳＬＭとを備え、
（ｉ）前記励起光を平行にすることと、（ｉｉ）前記第１のＳＬＭを使用して、予め決定された位相変調パターンを前記平行にされた励起光に適用することと、（ｉｉｉ）前記位相変調された平行にされた励起光を、前記試料内の焦点面に対するフーリエ面に配置される励起パターンとして使用して、前記試料を照射することと、（ｉｖ）前記試料内の前記焦点面から放出光を集光することと、（ｖ）前記試料内の前記焦点面が前記第２のＳＬＭのピクセルによって形成されたピンホールパターンと共役になるように、前記集光された放出光を前記第２のＳＬＭを経て前記撮像装置に向けることと、を行うように構成される光学系と
を備える、共焦点撮像システム。
【請求項２】
対物レンズをさらに備え、前記対物レンズが、前記第１のＳＬＭと相互作用した前記励起光の焦点を前記試料内の前記焦点面に合わせて、前記試料内の前記焦点面から集光された前記放出光を平行にする、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記光学系が、１つまたは複数のリレーレンズをさらに備え、前記１つまたは複数のリレーレンズは、前記位相変調パターンを前記対物レンズの背面開口に撮像する、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記光学系が、前記１つまたは複数のリレーレンズの２つの間に配置された光ビームダンプをさらに備え、それにより、前記光ビームダンプは、前記第１のＳＬＭと相互作用した励起光内で最大のより低次の回折を吸収する、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記光学系が光ビームスプリッタをさらに備え、前記光ビームスプリッタは、前記第１のＳＬＭと相互作用した励起光を前記試料に向けて、前記試料からの前記放出光を前記第２のＳＬＭに透過させる、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記光学系が半波長板をさらに備え、前記半波長板は、前記励起光の偏光方向を変更する、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記第１のＳＬＭが、液晶デバイス（ＬＣＤ）または液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイスの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記第２のＳＬＭが、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）、液晶デバイス（ＬＣＤ）、または液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイスの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記光学系が１つまたは複数のチューブレンズをさらに備え、前記１つまたは複数のチューブレンズは、前記第２のＳＬＭの前記ピンホールパターンを前記撮像装置に撮像する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記光学系が前記一対のチューブレンズの間に配置された分光素子をさらに備え、前記分光素子は、前記集光された放出光をスペクトル的に分光する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記第１のＳＬＭ、前記第２のＳＬＭ、前記光源、および前記撮像装置に動作可能に結合されたコントローラをさらに備え、前記コントローラは、前記第１および第２のＳＬＭのピクセルを変調するため、前記光源を作動させるため、および前記撮像装置を作動させるために構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記励起パターンが、複数の励起スポットを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
光源から、１つまたは複数の波長を有する励起光を提供することと、
前記光源からの前記励起光を平行にすることと、
第１の空間光変調器（ＳＬＭ）によって、予め決定された位相変調パターンを前記平行にされた励起光に適用することと、
前記位相変調された平行にされた励起光を２次元励起パターンとして使用して試料を照射することと、
前記試料内の焦点面から放出光を集光することと、
前記試料内の前記焦点面が第２のＳＬＭのピクセルによって形成されたピンホールパターンと共役になるように、前記集光された放出光を前記第２のＳＬＭを経て撮像装置に向けることと
を含む、共焦点画像を取得するための方法。
【請求項１４】
半波長板を使用して前記励起光の偏光を制御することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対物レンズを使用して、前記第１のＳＬＭと相互作用した前記平行にされた励起光の焦点を前記試料内の前記焦点面に合わせることと、
１つまたは複数のリレーレンズを使用して、前記位相変調パターンを前記対物レンズの背面開口に撮像することと
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のリレーレンズの２つの間に配置された光ビームダンプを使用して、前記第１のＳＬＭと相互作用した励起光内で最大のより低次の回折を吸収することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
１つまたは複数のチューブレンズを使用して、前記第２のＳＬＭの前記ピンホールパターンを前記撮像装置に撮像することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料を、相互にシフトされた一連の励起パターンで連続して照射することと、
前記第２のＳＬＭで、各ピンホールパターンが、前記一連の励起パターン内の対応する励起パターンと一致する、一連のピンホールパターンを形成することと
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記撮像装置を使用し、各画像が前記一連の励起パターン内の一励起パターンに対応する、前記集光された放出光の複数の画像を取得することと、
前記複数の画像を再構成して前記試料の共焦点画像を提供することと
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１つまたは複数のプリズムまたは格子を使用して、前記集光された放出光をスペクトル的に分光することと、
前記撮像装置を使用して、各画像が前記一連の励起パターン内の一励起パターンに対応する、前記スペクトル的に分光された放出光の複数の画像を取得することと、
前記複数の画像を再構成して前記試料のハイパースペクトル共焦点画像データセットを提供することと
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［0001］  関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／３４２，２５６号、および２０１７年５月２７日に出願された米国非仮出願第１５／６０７，４５５号の利益を主張し、その内容を参照により組み込む。
【０００２】
［0002］  本開示は、一般に、撮像の分野、ならびに顕微鏡検査システムおよび方法に関する。より詳細には、制限ではなく、開示する実施形態は、空間光変調器の使用を通した共焦点撮像のためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
［0003］  蛍光顕微鏡検査法は、光吸収、位相または干渉効果の代わりに、蛍光の原理を使用して、検査のために構造に光を当てる。例えば、蛍光顕微鏡検査法は、生物学および他の学問分野において試料を特性化するために適用できる。蛍光顕微鏡検査法では、試料中のフルオロフォアまたは他の光ラベルが、試料に向けられた励起光ビームによって励起される。励起すると、フルオロフォアは、画像として取得できる蛍光光を放出する。
【０００４】
［0004］  厚い試料を撮像する場合、光学セクショニングを実行する、すなわち、軸方向に高解像度の画像を取得するために、光学技術が採用できる。１つのかかる技術は、共焦点顕微鏡法である。共焦点顕微鏡法を実行するための最も一般的なアプローチは、焦点面の外側にある面から放出された光を拒絶する空間ピンホールを使用することである。焦点外蛍光光が実質的に低減または除外されるので、共焦点顕微鏡は、良好な軸分解能を達成する。従って、共焦点顕微鏡法は、軸方向に沿った一連の焦点面で取得された画像からの試料の３次元（３−Ｄ）画像（例えば、仮想体積画像）の再構成をさらに可能にできる。
【０００５】
［0005］  共焦点顕微鏡法では、光学セクショニングは、点照射および検出を使用することによって達成される。励起光源、通常はレーザービームが、あるスポットに焦点を合わせられ、試料にわたってスキャンされるか、またはレーザースポットを固定して、試料が横方向に平行移動される。試料から集光された蛍光光が次いで、単一のピンホールを通過して、試料の光切片を作成する。ピンホールまたは試料をポイントごとに側方に平行移動させることによって２次元（２−Ｄ）画像が生成される。仮想体積画像を生成するために、試料または対物レンズが軸方向に平行移動されて、焦点面に合わせられ、ピンホール（または試料）が横方向にスキャンされて、その平面内に画像を構築する。これは、画像取得の速度を著しく制限する。
【０００６】
［0006］  画像取得の速度は、ニプコー円板をピンホールの配列とともに使用する横河の走査装置などの、並列走査技術を使用することによって向上できる。ニプコー円板が高速で回転するとき、レーザー光が円板上のピンホールを並行して通過して、試料上の多くの離散点を同時に照射する。しかし、横河の走査装置の励起経路は、超低効率に悩まされる。隣接したピンホール間の間隔は、光学セクショニングまたは共焦点性の妥当な程度を維持するために大きい必要があるので、ニプコー円板は、典型的には、励起光の大部分を拒絶する。追加として、ピンホールのサイズおよび間隔は固定であり、対物レンズの１つの特定の開口数に対してのみ最適化され得る。光学セクショニングの程度の変更は、円板を物理的に取り除いて置換する必要があり得、それは、面倒で費用がかかり得るか、またはほとんどのシステムでは可能でさえない。
【０００７】
［0007］  従って、高速な画像取得、励起光の効率的な利用、およびピンホールの容易な調整を可能にする共焦点撮像のための方法およびシステムが必要である。
【発明の概要】
【０００８】
［0008］  本開示の実施形態は、複数の位置からの光を試料内の焦点面で同時に捕捉することにより、共焦点顕微鏡法のスループットまたは一時性（ｔｅｍｐｏｒａｌｉｔｙ）を改善するシステムおよび方法を含む。好都合に、例示的な実施形態は、マイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）または液晶デバイス（ＬＣＤ）などの、空間光変調器（ＳＬＭ）を使用することにより、励起光の効率的な利用および光学セクショニングの程度の簡単な調整を可能にする。
【０００９】
［0009］  本開示の例示的な実施形態によれば、共焦点撮像システムが説明される。本システムは、１つまたは複数の波長を有する励起光を放出するように構成された光源、試料を保持するように構成された試料保持器、２次元（２−Ｄ）撮像装置、第１のセットの光学素子、および第２のセットの光学素子を含み得る。
【００１０】
［0010］  第１のセットの光学素子は、第１の空間光変調器（ＳＬＭ）および少なくとも１つのレンズを含み得る。第１のセットの光学素子は、励起光を視準し、予め決定された位相変調パターンを平行にされた励起光に適用して、試料を励起パターンで照射するように構成され得る。励起パターンは、位相変調パターンのフーリエ面においてであり得る。第２のセットの光学素子は、第２のＳＬＭおよび少なくとも１つのレンズを含み得る。第２のセットの光学素子は、試料内の焦点面から集光された放出光を撮像装置に撮像するように構成され得る。焦点面は、第２のＳＬＭのピクセルによって形成されたピンホールパターンと共役であり得る。
【００１１】
［0011］  本開示のさらなる例示的な実施形態によれば、共焦点画像を取得するための方法が説明される。本方法は、１つまたは複数の波長を有する励起光を放出する光源を提供するステップ、光源からの励起光を平行にするステップ、第１の空間光変調器（ＳＬＭ）により、予め決定された位相変調パターンを平行にされた励起光に適用するステップ、試料を２次元励起パターンで照射するステップ、および試料内の焦点面から集光された放出光を撮像装置に撮像するステップを含む。励起パターンは、位相変調パターンのフーリエ面においてであり得る。焦点面は、第２のＳＬＭのピクセルによって形成されたピンホールパターンと共役であり得る。
【００１２】
［0012］  本開示のなおさらなる例示的な実施形態によれば、試料の共焦点画像を取得するために共焦点顕微鏡を構成するための方法が説明される。本方法は、１つまたは複数の波長を有する励起光を放出する光源を提供するステップ、光源からの励起光を平行にするステップ、第１の空間光変調器（ＳＬＭ）によって、予め決定された位相変調パターンを平行にされた励起光に適用するステップ、試料を２次元励起パターンで照射するステップ、および試料内の焦点面から集光された放出光を撮像装置に撮像するステップを含む。励起パターンは、位相変調パターンのフーリエ面においてであり得る。焦点面は、第２のＳＬＭのピクセルによって形成されたピンホールパターンと共役であり得る。
【００１３】
［0013］  開示する実施形態の追加の特徴および利点は、一部、以下に続く説明に記載され、一部、説明から明らかになるか、または開示する実施形態の実施によって習得され得る。開示する実施形態の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲で具体的に指摘される要素および組合せによって実現され達成される。
【００１４】
［0014］  前述の大まかな説明および以下の詳細な説明は、例であり、説明のために過ぎず、主張されるとおり、開示する実施形態を制限するものではないことを理解されたい。
【００１５】
［0015］  添付の図面は、本明細書の一部を構成する。図面は、本開示のいくつかの実施形態を示し、説明と共に、添付の特許請求の範囲に記載されているような開示する実施形態の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】［0016］本開示の実施形態に従った、例示的な共焦点撮像システムの略図である。
【図２】［0017］本開示の実施形態に従い、ハイパースペクトル共焦点撮像を実行するための例示的な方式に対するグラフィック図である。
【図３】［0018］本開示の実施形態に従い、共焦点画像を取得するための例示的な方法の流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［0019］  開示する実施形態は、高速な画像取得および励起光の効率的な利用を可能にする共焦点撮像を達成するためのシステムおよび方法に関する。本開示の実施形態は、１つまたは複数の２−Ｄ撮像装置、例えば、ＣＣＤもしくはＣＭＯＳセンサーまたはカメラ、を有する、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、透過顕微鏡、または反射率顕微鏡などの、顕微鏡を使用して実装され得る。代替として、光学的撮像システムは、適切な光学素子を使用して本開示の実施形態に従って構築され得る。
【００１８】
［0020］  所定のピンホールおよび／またはマイクロレンズ配列を有するニプコー円板を使用するのではなく、本開示の実施形態は、調整可能なサイズおよび間隔を備えたプログラム可能な人工ピンホールを使用して、試料内の焦点面の２−Ｄ画像の取得を可能にする。複数の２−Ｄ画像が複数の焦点面で取得され計算的に再構成されて、試料の３−Ｄまたは仮想体積画像が取得できる。追加として、本開示の実施形態は、試料内の焦点面のハイパースペクトル共焦点画像データセットの取得を可能にする。
【００１９】
［0021］  本開示の一態様によれば、１つまたは複数の波長を有する励起光が、試料中のフルオロフォアを励起するために使用され得る。励起光は、単色光源または多色光源によって放出され得る。いくつかの実施形態では、単色光源は、非常に狭いスペクトルをもつ光を放出するパルスまたは連続「単一波長」レーザーであり得る。他の実施形態では、単色光源は、モノクロメーターの出力であり得る。
【００２０】
［0022］  いくつかの実施形態では、多色光源は、連続スペクトルを有し得る。例えば、多色光源は、あるスーパーコンティニウムレーザー、白色光源（例えば、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、またはメタルハライドランプ）、または１つまたは複数のＬＥＤなどの、広帯域光源であり得る。他の実施形態では、多色光源は、離散スペクトルを有し得る。例えば、多色光源は、非常に狭いスペクトルをもつ光を放出するパルスまたは連続「単一波長」レーザーの組合せであり得る。
【００２１】
［0023］  本開示の一態様によれば、光源によって放出された励起光は、第１の空間光変調器（ＳＬＭ）を使用して、試料上の領域のサブセットを励起パターンで照射するために構造化され得る。励起光を構造化するために、第１のＳＬＭは、そのピクセルを選択的に変調する、例えば、作動させるか、または切り替えることにより、励起光の位相または振幅を変調し得る。ピクセルは、変調においてデジタルまたはアナログのいずれかにできる。第１のＳＬＭは、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）、可変鏡（ＤＭ）、回折光学素子、液晶デバイス（ＬＣＤ）、および液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイスを含む、ＳＬＭの群から選択され得る。
【００２２】
［0024］  本明細書で説明するように、試料上に照射される励起パターンは、励起光の複数の集束点（励起スポット）を含み得る。励起パターンは、試料上に同時に入射する励起スポットの２−Ｄ配列などの、任意のパターンまたは予め決定されたパターンであり得る。励起パターンによって照射された試料中のフルオロフォアまたは蛍光分子が励起されて、その後、蛍光光を放出し得る。
【００２３】
［0025］  いくつかの実施形態では、励起パターンは、第１のＳＬＭのピクセルを変調することにより、試料または視野にわたってスキャンされ得る。他の実施形態では、試料または対物レンズを側方方向に移動させることにより、励起パターンを試料または視野にわたってスキャンするためにｘ−ｙ平行移動ステージが使用され得る。ステージは、電動平行移動ステージ、圧電平行移動ステージ、または側方線形移動を可能にする任意の適切なステージであり得る。
【００２４】
［0026］  本開示の一態様によれば、本開示に従ったシステムおよび方法は、共焦点光学セクショニングを可能にする。これは、試料の軸方向に沿った複数の焦点面に対して画像を取得するのを可能にする。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の光学式ピンホールを焦点面と共役な面で実装することにより、所望の焦点面の画像が取得され得る。光学式ピンホールは、第２のＳＬＭのピクセルによって形成されたプログラム可能な人工ピンホールであり得る。第２のＳＬＭは、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）、液晶デバイス（ＬＣＤ）、および液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイスを含む、ＳＬＭの群から選択され得る。
【００２５】
［0027］  いくつかの実施形態では、ピンホールパターンは、励起光の励起パターンに一致させるために、第２のＳＬＭのピクセルによって、そのピクセルを選択的に変調するか、または切り替えることにより、形成され得る。好都合に、ピンホールパターンは、励起パターンによって同時に照射された試料上の複数の領域の共焦点撮像を可能にし得る。これは、連続的なポイントごとのスキャニングを使用する従来型の共焦点顕微鏡に比べて、焦点面での試料にわたる共焦点画像取得の速度および／またはスループットを改善し得る。追加として、光学セクショニングまたは共焦点性の程度は好都合に、第２のＳＬＭによって形成された人工ピンホールのサイズおよび／または分離を変更することにより必要に応じて調整可能であり得、所望の焦点面の深さ選択性の程度を調整可能にする。
【００２６】
［0028］  本明細書で説明するように、フルオロフォアは、本開示では、試料中の例示的な光ラベルとして使用される。フルオロフォアに言及した説明は、本開示の実施形態と一致する他のタイプの光ラベルに同様に当てはまる。例えば、光源から放出された励起光は、他のタイプの光ラベルも励起し得、それらは、励起時には、発光スペクトルをもつ光を放出し得る。従って、本開示における説明で使用される蛍光光および蛍光発光スペクトルは、他の光ラベルの放出光および発光スペクトルを表すためにも使用され得る。
【００２７】
［0029］  本開示の一態様によれば、本開示に従ったシステムおよび方法は、ハイパースペクトル撮像を可能にする。試料の所与の領域内の励起光によって励起されたフルオロフォアによって放出された蛍光光は、所与の側方方向（例えば、水平方向または垂直方向）にスペクトル的に分光され得る。少なくとも１つの分光素子が、蛍光光を、その所与の領域に対応する蛍光発光スペクトルにスペクトル的に分光するために採用され得る。試料上の領域のサブセットの蛍光発光スペクトルは、２−Ｄ撮像装置により一露光で２−Ｄ画像として取得され得る。
【００２８】
［0030］  いくつかの実施形態では、試料にわたるか、または視野にわたる全ての領域の蛍光発光スペクトルが、励起パターンを試料または視野にわたってスキャンすることにより、取得され得る。励起パターンの各空間的位置において、励起パターンに対応する蛍光発光スペクトルの２−Ｄ画像が取得される（例えば、励起パターンの励起スポットに対応する各蛍光発光スペクトル）。好都合に、試料のハイパースペクトル画像データセットが、蛍光発光スペクトルの複数のかかる２−Ｄ画像から計算的に再構成され得る。追加として、スキャニング中に第２のＳＬＭを使用して励起パターンと一致するピンホールパターンを形成することにより、試料のハイパースペクトル共焦点画像データセットが取得できる。
【００２９】
［0031］  ここで、その例が添付の図面で説明されている、本開示の実施形態および態様を詳細に参照する。可能な限り、同じ参照番号が、同じか、または同様の部品を指すために、図面を通して使用される。
【００３０】
［0032］  本明細書では、光の異なる波長または周波数を示すために、異なる密度のドット付きテクスチャが添付の図面で使用される。より高い密度は、光のより長い波長またはより低い周波数に対応する。追加として、側方または横方向を示すための例として、垂直および／または水平方向が使用される。
【００３１】
［0033］  図１は、例示的な共焦点撮像システム１００の略図である。いくつかの実施形態では、システム１００は、蛍光顕微鏡、透過顕微鏡、反射率顕微鏡、または共焦点蛍光顕微鏡であり得る。本開示の実施形態は、共焦点撮像および／またはハイパースペクトル撮像を実行するための他の適切な顕微鏡使用技術に適用可能である。
【００３２】
［0034］  図１に示すように、システム１００は、照射システムおよび検出システムを含み得る。照射システムは、光源１１０、第１のＳＬＭ１４０、ならびに１つまたは複数のレンズ、例えば、レンズ１２０ａ、１２０ｂ、および１２０ｃを含み得る。照射システムは、半波長板１３０、光ビームダンプ１２５、および／または光学フィルタ２００ａをさらに含み得る。検出システムは、第２のＳＬＭ１５０、２−Ｄ撮像装置１９０、ならびに１つまたは複数のレンズ、例えば、レンズ１２０ｄ、１２０ｅ、および１２０ｆを含み得る。検出システムは、分光素子２１０および／または光学フィルタ２００ｂをさらに含み得る。そのレイアウト、幾何学的形状、および／または用途に応じて、システム１００は、ビームスプリッタ１６０、対物レンズ１７０、および撮像する試料が置かれる試料保持器１８０をさらに含み得る。システム１００は、例えば、ミラー、ビームダンプ、ｘ−ｙ平行移動ステージ、ｚ軸平行移動ステージまたは調節可能な液体レンズ（図示せず）などの、他の光学素子をさらに含み得る。
【００３３】
［0035］  本明細書で説明するように、システム１００の光軸は、励起光および試料から放出された蛍光光がシステム１００を通って伝搬する経路を定義し得る。
【００３４】
［0036］  照射システムでは、図１に示すように、光源１１０は励起光１０を放出し、励起光１０、ＳＬＭ１４０に向けられる。励起光１０は、１つまたは２つのレンズ、例えば、レンズ１２０ａまたは一対のレンズ１２０ａを使用して、視準および／または拡大され得る。ＳＬＭ１４０は、そのピクセルを選択的に作動させるか、または切り替えることによる、励起光１２の位相または振幅の変調を通して、平行にされた励起光１２を構造化し得る。ＳＬＭ１４０は、透過型または反射型ＳＬＭであり得る。反射型ＳＬＭ１４０は図１に示す例示的な実施形態で使用されるが、透過型ＳＬＭ１４０は、代替として、本開示と一致して使用され得る。照射システムの幾何学的形状は、ＳＬＭ１４０のタイプに基づいて適切に設計され得る。
【００３５】
［0037］  図１に示すように、ＳＬＭ１４０が反射型ＳＬＭである場合、ＳＬＭ１４０のピクセルの少なくとも一部が励起光１２を反射し、反射された励起光１４をシステム１００の光軸に沿って向ける。いくつかの実施形態では、励起光１４は、ＳＬＭ１４０により、ビームスプリッタ１６０および／または対物レンズ１７０に真っ直ぐ向けられ得る。他の実施形態では、図１に示すように、反射された励起光１４は、ビームスプリッタ１６０および／または対物レンズ１７０に到達する前に、１つまたは複数のリレーレンズ、例えば、レンズ１２０ｂおよび１２０ｃを通過し得る。対物レンズ１７０は次いで、励起光の焦点を、試料保持器１８０上に置かれた試料に合わせる。
【００３６】
［0038］  検出システムでは、図１に示すように、試料中の励起されたフルオロフォアによって放出された蛍光光１８が、対物レンズ１７０によって集光され、かつ／または平行にされる。蛍光光１８は、ビームスプリッタ１６０およびレンズ１２０ｄをシステム１００の光軸に沿って通過し得る。ＳＬＭ１５０は、試料内の所望の深さで光軸に沿って配置された焦点面と共役な面のあたりに置かれ得る。例えば、対物レンズ１７０およびレンズ１２０ｄは、撮像構成を形成し得る。ＳＬＭ１５０が反射型ＳＬＭである場合、ＳＬＭ１５０は、蛍光光１８の少なくとも一部を反射し、反射された蛍光光２０をシステム１００の光軸に沿って撮像装置１９０に向け得る。反射された蛍光光２０は、撮像装置１９０の２−Ｄセンサーに到達する前に、一対のチューブレンズ、例えば、レンズ１２０ｅおよび１２０ｆを通り得る。
【００３７】
［0039］  本明細書で説明するように、反射型ＳＬＭ１５０は図１に示す例示的な実施形態で使用されるが、透過型ＳＬＭ１５０は、代替として、本開示と一致して使用され得る。検出システムの幾何学的形状は、ＳＬＭ１５０のタイプに基づいて適切に設計され得る。
【００３８】
［0040］  システム１００の様々な構成要素の機能および作動原理が以下で詳細に説明される。
【００３９】
［0041］  光源
前述のとおり、光源１１０は、単色光源または多色光源であり得る。いくつかの実施形態では、光源１１０によって放出された励起光１０は、直線偏光され得る。追加または代替として、励起光１０は、ＳＬＭ１４０に入射する前に、レンズ１２０ａによって平行にされて、平行にされた励起光１２になる。
【００４０】
［0042］  いくつかの実施形態では、平行にされた励起光１２は、半波長板１３０を通過し得る。半波長板１３０は、直線偏光された励起光の偏光方向を変更し得る。例えば、ＳＬＭ１４０がＬＣＤまたはＬＣＯＳデバイスである場合、半波長板１３０は、直線偏光された励起光の偏光方向を回転させて、ＳＬＭ１４０内の液晶分子の配向と平行に位置合わせさせる。これは、ＳＬＭ１４０のピクセルによる励起光の反射および／または変調の効率を改善し得る。
【００４１】
［0043］  いくつかの実施形態では、光源１１０は、プロセッサおよび、命令または操作ステップを格納するコンピュータ可読媒体を有するコントローラ（図示せず）に動作可能に接続され得る。これらの命令またはステップは、プロセッサによって実行される場合、光源１１０の動作状態を調整し得る。例えば、プロセッサは、光源１１０を起動もしくは停止し、パルス光源１１０のパルスの継続時間を調整し、かつ／または光源１１０の発光波長を切り替えるか、もしくは同調し得る。
【００４２】
［0044］  励起光を構造化するための空間光変調器
前述のとおり、試料を励起パターンで照射するための励起光１２を構造化するために、ＳＬＭ１４０は、動作状態間でそのピクセルを選択的に変調することにより、励起光１２の振幅または位相を変調し得る。
【００４３】
［0045］  振幅変調
いくつかの実施形態では、励起光１２の振幅は、ＳＬＭ１４０によって変調され得る。例えば、ＳＬＭ１４０は、反射型ＬＣＤまたはＬＣＯＳデバイスであり得る。ＬＣＤまたはＬＣＯＳデバイスは、試料との共役面に配置され得る。かかる場合、レンズ１２０ｂおよび１２０ｃの１つだけが、ＳＬＭ１４０と対物レンズ１７０との間に配置され得る。例えば、レンズ１２０ｂは、チューブレンズとして使用され、対物レンズ１７０と組み合わされて撮像構成を形成する。ＳＬＭ１４０は、レンズ１２０ｂの約１焦点距離前に配置され得る。
【００４４】
［0046］  ＳＬＭ１４０のピクセルは、ピクセルに入射する励起光の偏光を操作することにより、振幅変調パターンを生じ得る。振幅変調パターンは、例えば、レンズ１２０ｂおよび対物レンズ１７０により、励起パターンとして試料上に撮像され得る。レンズ１２０ｂおよび対物レンズ１７０の焦点距離に応じて、励起パターンは、振幅変調パターンの拡大または縮小された画像であり得る。
【００４５】
［0047］  振幅変調パターンを生成するために、ＳＬＭ１４０のピクセルは、ピクセルごとに「オン」状態と「オフ」状態との間で電気的に変調され得る。「オン」ピクセルは、直線偏光された光の偏光方向を約９０°回転させ得るが、他方、「オフ」ピクセルは回転を実行しない。かかる場合、第１の直線偏光子（図示せず）が、励起光１２を直線的に偏光するために使用され得る。第２の直線偏光子または偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）（図示せず）は、「オン」ピクセルによって反射された励起光１４を通し、「オフ」ピクセルによって反射された励起光１２を遮断するために使用され得る。
【００４６】
［0048］  ＳＬＭ１４０を使用して励起光１２の振幅を変調することの欠点は、変調中の光の損失である。これは、ＳＬＭ１４０のピクセルの大部分が典型的には、「オフ」状態であるためである。その結果、励起光１２の大部分は、光軸から逸れて試料に達せず、従って、失われる。
【００４７】
［0049］  位相変調
励起光１２の利用効率を改善するために、ＳＬＭ１４０は、励起光１２の位相を変調して、励起パターンを生成し得る。かかる場合、レンズ１２０ｂおよび１２０ｃの両方が、ＳＬＭ１４０と対物レンズ１７０との間に配置され得る。ＳＬＭ１４０は、例えば、反射型ＬＣＤまたはＬＣＯＳデバイスであり得る。ＬＣＤまたはＬＣＯＳデバイスは、開口面に配置され得、開口面は、対物レンズ１７０の背面開口との共役面または試料に対するフーリエ面であり得る。例えば、レンズ１２０ｂおよび１２０ｃは、撮像構成を形成し得る。レンズ１２０ｂは、ＳＬＭ１４０の約１焦点距離後ろに配置され得る。レンズ１２０ｃは、レンズ１２０ｂの約２焦点距離後ろに配置され得る。対物レンズ１７０は、レンズ１２０ｃの約１焦点距離後ろに配置され得る。
【００４８】
［0050］  ＳＬＭ１４０のピクセルは、励起光１２の波面を変調するためにカスタム位相変調パターンを形成し得る。ＳＬＭ１４０によって励起光１２を反射すると、反射された励起光１４の波面の異なる位置における位相が、位相変調パターンに従い、選択的に変更され得る。いくつかの実施形態では、ＳＬＭ１４０のピクセルは、ピクセルごとに「オン」状態と「オフ」状態との間で電気的に変調され得る。ＳＬＭ１４０のピクセルが「オン」状態の場合、それらは、液晶中で進む光の光路長を変更することにより反射光の位相を変更し得；それらが「オフ」状態の場合、それらは反射光の位相を変更しない可能性がある。これは、ＳＬＭ１４０のピクセルによって形成された位相変調パターンが必要に応じてデジタル的にカスタマイズされるのを可能にする。他の実施形態では、ＳＬＭ１４０のピクセルは、位相調整の複数の状態またはレベル（例えば、０〜２πの間の２５６レベル）を有し得、所望の状態またはレベルに個々に変調され得る。好都合に、ピクセルの調整の状態またはレベルを増加させると、位相変調パターンの調整の連続性、および従って、励起光１４の位相の調整が向上し、励起パターンにおける望ましくない回折次数をさらに低減し得る。
【００４９】
［0051］  位相変調は、異なる方向および／または位相を有する反射された励起光１４のウェーブレットをレンダリングし得る。反射された励起光１４は、光軸に沿って伝搬するので、レンズ１２０ｂおよび１２０ｃならびに対物レンズ１７０の各々は、反射された励起光１４の波面上でフーリエ変換を実行し得る。回折パターンが次いで、対物レンズ１７０の焦点面で形成され得る。この回折パターンは、本明細書では、試料に照射される場合、励起パターンと呼ばれる。
【００５０】
［0052］  いくつかの実施形態では、光ビームダンプ１２５が、光軸に沿ってレンズ１２０ｂと１２０ｃとの間に、例えば、レンズ１２０ｂの約１焦点距離後ろに、または試料の共役面に配置され得る。これは、光ビームダンプ１２５の位置で反射された励起光１４によって形成された回折パターンのより低次の回折スポット、例えば、ゼロ次および／または１次の回折スポットが実質的に吸収されて、試料に達するのを阻止されるのを可能にし得る。励起パターンは、光ビームダンプ１２５の位置で形成された回折パターンの像であるので、試料上に照射された励起パターンのより低次の回折スポットの強度が実質的に低減されよう。より低次の回折スポット、例えば、ゼロ次および／または１次の回折スポットは、典型的には、他の次数の回折スポットよりも明るいので、光ビームダンプ１２５の使用は好都合に、視野にわたる励起パターンの強度の均一性を改善し得る。
【００５１】
［0053］  前述のように、位相変調パターンは、試料に対するフーリエ面において、またはほぼフーリエ面においてであり得る。かかる場合、その位相がＳＬＭ１４０の位相変調パターンによって変調されている、反射された励起光１４の電場は、「反射された励起光が試料を所望の励起パターンで照射する前に、レンズ１２０ｂおよび１２０ｃならびに対物レンズ１７０によってさらにフーリエ変換を受ける。いくつかの実施形態では、励起パターンは、所望の位相プロファイルをもつ変換された励起光の波面の強度プロファイルであり得る。所望の位相プロファイルは、励起光の回折効率を改善するために予め決定され得る。
【００５２】
［0054］  いくつかの実施形態では、所望の励起パターンとなる位相変調パターンを生成するために、コンピュータアルゴリズム、例えば、Ｇｅｒｃｈｂｅｒｇ−Ｓａｘｔｏｎ（ＧＳ）アルゴリズムが使用され得る。さらに、カスタマイズされたコンピュータアルゴリズムが、所望の励起パターンを視野にわたってスキャンまたは平行移動するための時変位相変調パターンを生成するために使用され得る。
【００５３】
［0055］  好都合に、励起光１２の位相を変調すると、それが、ＳＬＭ１４０の近接場内を実質的に均一強度で伝搬する、従って、励起光１２の損失を低減するのを可能にするであろう。変調された励起光は次いで、カスタマイズ可能またはプログラム可能な励起パターンを、照射時に遠距離場内の試料上に形成し得る。従って、前述のような励起光１２の振幅の変調に比べて、励起光１２の位相を変調して所望の励起パターンを生成することは、励起光１２の損失を低減することにより、システム１００の照射効率を実質的に向上させ得る。
【００５４】
［0056］  ＳＬＭ１４０は、代替として、光軸に沿って実装された透過型デバイスであり得る。照射システムの幾何学的形状は、デバイスのピクセルによって形成された振幅または位相変調パターンが、前述と同様に励起光１２の振幅または位相を変調し得るように、適切に設計され得る。
【００５５】
［0057］  ＳＬＭ１４０が励起光１２の振幅を変調するか、または位相を変調するかに関わらず、試料上に照射された励起パターンは、ＳＬＭ１４０のピクセルを、必要に応じて、ピクセルごとに２つの動作状態の間で変調することにより、プログラムおよびカスタマイズできる。さらに、励起パターンは、ＳＬＭ１４０のピクセルの変調をスキャンまたは変更することにより、水平または垂直方向など、所与の空間方向に試料もしくは視野にわたって平行移動またはシフトされ得る。例えば、ＳＬＭ１４０が、励起光１２の位相を変調するために試料のフーリエ面に配置される場合、励起パターンは、直線位相ランプ（ｌｉｎｅａｒ  ｐｈａｓｅ  ｒａｍｐ）の傾斜を空間方向に沿って変更することにより、スキャンされ得る。これは好都合に、試料および／または試料保持器１８０をｘ−ｙ平行移動ステージを使用して移動させることなく、励起パターンをシステム１００の視野にわたってスキャンするのを可能にする。
【００５６】
［0058］  いくつかの実施形態では、ＳＬＭ１４０のピクセルのタイプおよび変調特徴に応じて、励起光１２は、ＳＬＭ１４０の平面に対して所定の角度でＳＬＭ１４０に向けられ得る。所定の角度は、ＳＬＭ１４０のタイプおよび／またはシステム１００の幾何学的形状によって決まり得る。例えば、ＳＬＭ１４０が、反射型ＳＬＭである場合、励起光１２は、反射された励起光１４がシステム１００の光軸に沿って伝搬するようにある角度でＳＬＭ１４０に向けられ得る。
【００５７】
［0059］  いくつかの実施形態では、ＳＬＭ１４０は、プロセッサおよび、命令または操作ステップを格納するコンピュータ可読媒体を有するコントローラ（図示せず）に動作可能に接続され得る。これらの命令またはステップは、プロセッサによって実行される場合、ＳＬＭ１４０のピクセルの動作状態を変調して、所望の励起パターンを形成し、かつ／または励起パターンを所望の空間方向に所定の距離を越えて視野にわたって平行移動し得る。
【００５８】
［0060］  複数の照射源
【００５９】
［0061］  いくつかの実施形態では、システム１００は、試料保持器１８０内の試料を複数の異なる波長の光で同時に、かつ／または連続して照射するように構成できる。これは、光源１１０の複数の異なる発光素子を操作してそれぞれ異なる波長で光を放出することを含み得る。追加または代替として、複数の異なる波長での試料の照射を容易にするために、複数の異なる光源、ＳＬＭ、リレーレンズ、または他の要素が提供できる。
【００６０】
［0062］  いくつかの例では、これは、複数の異なる光源からの照射を第１のＳＬＭ１４０に適用することを含む。位相シフトの位相格子パターンを所与の空間的周期で入射／透過された光に適用する第１のＳＬＭ１４０の操作のパターンに対して、第１のＳＬＭ１４０が入射光を２つの異なる波長でそれぞれ異なる角度から実質的に同じ方向（例えば、システム１００の対物レンズ１７０および／または他の要素を経て、試料保持器１８０に伝搬する方向）に回折するように、光源の各々からの励起光の第１のＳＬＭへの入射角度が選択され得る。
【００６１】
［0063］  いくつかの例では、システムは、適切に位相シフトされて、焦点を合わされたか、または別の方法で指定された励起光を、対物レンズ１７０を経て試料保持器１８０に提供するために、追加の光源、追加のＳＬＭ、および／または追加の他の光学素子（例えば、追加のレンズ、一対のリレーレンズ、光ダンプ、半波長板、または光学フィルタ）を含み得る。これは、かかる追加の励起光を、光源１１０によって放出されて、例えば、ビームスプリッタ、ダイクロイックミラー、または何らかの他の光学素子を使用して第１のＳＬＭ１４０によって変調された、励起光１０に結合することを含み得る。
【００６２】
［0064］  共焦点光学セクショニング
前述のように、システム１００は、共焦点光学セクショニングを可能にし、それは、試料内の焦点面の深さを選択するのを可能にする。焦点面の深さは、１つまたは複数の光学式ピンホールを、選択された焦点面と共役な面で導入することによって選択され得る。
【００６３】
［0065］  共焦点光学セクショニングを達成するためにＳＬＭ１５０が使用される。前述のように、ＳＬＭ１５０は、試料内の所望の深さで光軸に沿って配置された焦点面と共役な面あたりに置かれ得る。レンズ１２０ｄがチューブレンズとして使用され得、対物レンズ１７０と一緒に撮像構成を形成し得る。例えば、図１に示すように、レンズ１２０ｄは、対物レンズ１７０の後ろに配置され得、ＳＬＭ１５０は、レンズ１２０ｄの約１焦点距離後ろに配置され得る。対物レンズ１７０の背面開口とレンズ１２０ｄとの間の空間が視準空間であり、それは、必要に応じて、システム１００の幾何学的形状および最小ビーム開口の所望の位置など、様々な要因に基づいて調整され得る。いくつかの実施形態では、レンズ１２０ｄは、対物レンズ１７０の約１焦点距離後ろに配置される。
【００６４】
［0066］  いくつかの実施形態では、ＳＬＭ１５０は、複数のマイクロミラー１５２の配列を有するデジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）であり得る。これらのマイクロミラーは、２つの操作位置、「オン」位置と「オフ」位置、の間で切り替えるために個々に作動され得る。マイクロミラーが「オン」位置にあるように構成される場合、試料内の焦点面からの蛍光光１８は反射されて、反射された蛍光光２０として光軸に沿って伝搬し、反射された蛍光光２０は撮像装置１９０に向けられる。マイクロミラーが「オフ」位置にあるように構成される場合、蛍光光１８は、光軸から逸れた方向に向かって反射されて、撮像装置１９０には向けられない。いくつかの実施形態では、「オフ」マイクロミラーによって反射された蛍光光１８は、ミラーまたはビームダンプ（図示せず）などの、他の光学素子に向けられ得る。
【００６５】
［0067］  いくつかの実施形態では、マイクロミラーは、その辺が約数マイクロメートル〜約１０μｍの範囲の長さの正方形である。他の形状およびサイズのマイクロミラーも可能であり、適切に使用され得る。ＤＭＤは、典型的には、マイクロミラーの「オン」および「オフ」位置の非常に高速な変更または交互切換えが可能である。
【００６６】
［0068］  いくつかの実施形態では、ＤＭＤの単一のマイクロミラーが単一のピクセルと見なされ得る。他の実施形態では、複数のマイクロミラーが単一のピクセルと見なされ得る。例えば、直接隣接したマイクロミラーのグループが単一のピクセルと見なされ得、一致して変調または作動され得る。
【００６７】
［0069］  ＳＬＭ１５０のピクセルは、試料上に照射された励起パターンに一致（共役）するピンホールパターンを形成するために、選択的に「オン」または「オフ」位置に作動されるか、または切り替えられ得る。ピンホールパターンは、複数の人工的な光学式ピンホールを共役面に含み、試料からの焦点外の蛍光光を拒絶し得る。従って、焦点外の蛍光光は、検出システムを通過せず、実質的に、撮像装置１９０によって取得される画像から除去または除外される。
【００６８】
［0070］  ピンホールパターン内の人工ピンホールのサイズおよび分離は、プログラム可能であり、励起パターンならびに対物レンズ１７０およびレンズ１２０ｄによって形成された撮像構成の倍率に基づいてカスタマイズされ得る。例えば、ピンホールパターン内の人工ピンホールは、励起パターン内の励起スポットのサイズと一致するように、「オン」ピクセルの配列によって形成され得る。
【００６９】
［0071］  ＳＬＭ１５０の「オン」ピクセルによって反射された蛍光光２０は、次いで、レンズ１２０ｅおよび１２０ｆによって撮像装置１９０に撮像され得る。例えば、レンズ１２０ｅは、反射された蛍光光２０を再度平行にするように、レンズ１２０ｄによって生成された像を約１焦点距離越えて（例えば、ＳＬＭ１５０の約１焦点距離後ろに）配置され得る。撮像装置１９０は、レンズ１２０ｆの約１焦点距離後ろに、またはＳＬＭ１５０の共役面に配置され得る。蛍光光はレンズ１２０ｅと１２０ｆとの間の空間で平行にされるので、レンズ１２０ｅと１２０ｆとの距離は要求に応じて調整され得る。いくつかの実施形態では、レンズ１２０ｆは、レンズ１２０ｅと１２０ｆとの中間の平面がシステム１００の射出瞳と共役になるように、レンズ１２０ｅの約２焦点距離後ろであり得る。
【００７０】
［0072］  ＳＬＭ１４０を使用して励起パターンを、およびＳＬＭ１５０を使用して一致するピンホールパターンをそれに応じて、デジタル的に変更し、かつ／または側方にシフトすることにより、共焦点画像を取得するために、全視野がスキャンされ得る。試料にわたって視野をさらにスキャンすることにより、試料全体がスキャンされて、試料の完全な共焦点画像データセットを取得できる。
【００７１】
［0073］  いくつかの実施形態では、撮像装置１９０は、収差を低減し、従って、取得された画像の品質を向上させるために適切に傾斜され得る。これは、少なくとも、レンズ１２０ｅおよび１２０ｆによって形成された像平面が傾斜され得るように、ＳＬＭ１５０の「オン」ピクセルが、反射された蛍光光２０をＳＬＭ１５０の表面に垂直でない角度に向けるためである。この傾斜効果によって生じた収差は、撮像装置１９０を適切に傾けることによって補正され得る。
【００７２】
［0074］  焦点面の深さを変更または選択するために、いくつかの実施形態では、試料保持器１８０がｚ軸平行移動ステージ上に据え付けられ得る。焦点面の所望の深さは、ｚ軸平行移動ステージを使用して試料保持器１８０を光軸に沿って動かすことにより選択され得る。代替として、対物レンズ１７０がｚ軸平行移動ステージ上に据え付けられ得、焦点面の所望の深さが、対物レンズ１７０を光軸に沿って動かすことにより選択され得る。本明細書で説明するように、ｚ軸平行移動ステージは、システム１００の視野を試料にわたって側方方向に動かすためにｘ−ｙ平行移動機能も含み得る。
【００７３】
［0075］  いくつかの実施形態では、ＳＬＭ１４０が励起光１２の位相を変調するためにフーリエ面にある場合、焦点深度は、ＳＬＭ１４０のピクセルによって形成された位相変調パターンを変更することによって調整され得る。かかる場合、ＳＬＭ１４０のピクセルによって変調された励起光１４は、反射時に、位相変調パターンによって決定されたビームをわずかに逸らすか、または収束する重ね合わせ（ｓｕｐｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含み得る。拡散または収束のそれらの程度に応じて、これらのビームは、顕微鏡対物レンズを通過した後、増加または減少した深さで焦点を合わせるであろう。
【００７４】
［0076］  他の実施形態では、焦点面の所望の深さは、対物レンズ１７０の後ろに配置された調節可能な液体レンズ（図示せず）の焦点を調整することによって選択され得る。本明細書で説明するように、ｚ平行移動ステージ、調節可能な液体レンズ、および／またはＳＬＭ１４０の位相変調パターンは、オートフォーカスを達成するためにコンピュータプログラムによって制御され得る。
【００７５】
［0077］  好都合に、共焦点性の程度は、必要に応じ、ＳＬＭ１５０によって形成された人工ピンホールのサイズおよび／または分離を変更することによって調整され得る。例えば、ピンホール内のピクセル数を増加させ、かつ／またはピンホール間隔を減少させることにより、ピンホールのサイズを増加させると、共焦点性の程度が、従って、所望の焦点面の深さ選択度の程度が減少し得る。他方、ピンホール内のピクセル数を減少させ、かつ／またはピンホール間隔を増加させることにより、ピンホールのサイズを減少させると、共焦点性の程度が、従って、所望の焦点面の深さ選択度の程度が増加し得る。いくつかの実施形態では、深さ選択度は、ＳＬＭ１５０の「オフ」および「オン」ピクセル数の割合に比例し得る。従って、ＳＬＭ１５０は、好都合に、要求に応じて、ピンホールサイズおよび／または分離を都合よく調整することにより、広視野撮像と共焦点撮像との間での切替えを可能にし得る。
【００７６】
［0078］  追加として、ＳＬＭ１５０のピクセルによって形成されたピンホールパターンは、好都合に、ＳＬＭ１４０によって生成された励起パターンによって同時に照射された試料上の複数の領域の共焦点撮像を可能にする。これは、連続的なポイントごとのスキャニングを使用する従来型の共焦点顕微鏡に比べて、所望の焦点面で試料にわたる共焦点画像データセット取得の速度および／またはスループットを改善し得る。
【００７７】
［0079］  ハイパースペクトル撮像能力
いくつかの実施形態では、ハイパースペクトル撮像能力が好都合に、システム１００に追加されて、試料内の選択された焦点面でのハイパースペクトル撮像データセットの取得を可能にし得る。ハイパースペクトル撮像データセットは、３次元（３−Ｄ）：２つの空間方向（水平方向および垂直方向）および１つのスペクトル次元（λ）で表され得る。ハイパースペクトル撮像データセットのスペクトル次元内の情報は、試料中のフルオロフォアの発光波長の範囲の関数として蛍光強度を反映し得る。
【００７８】
［0080］  ハイパースペクトル撮像能力は、システム１００内の分光素子２１０を使用することによって獲得され得る。例えば、分光素子２１０は、レンズ１２０ｅと１２０ｆとの間の視準空間内に配置され得る。分光素子２１０は、非偏光プリズム（例えば、アミチプリズムまたは二重アミチプリズム）などの、回折格子またはプリズムであり得る。分光素子２１０は、ＳＬＭ１５０から反射された蛍光光２０を所与の側方方向に沿ってスペクトル的に分光し得る。スペクトル的に分光された蛍光光２２は次いで、レンズ１２０ｆを通過し、撮像装置１９０によって取得される。
【００７９】
［0081］  図２は、本開示の実施形態に従って、ハイパースペクトル共焦点撮像を実行するための例示的な方式に対するグラフィック図である。いくつかの実施形態では、システム１００が単色撮像モードの場合、撮像装置１９０は、ＳＬＭ１５０上に形成されたピンホールパターンによって反射された蛍光光２０の画像を取得し得る。ピンホールパターンは、試料上に照射された励起パターンを共役させる。例えば、撮像装置１９０によって取得された２−Ｄ画像１９２は、励起パターン内の励起スポットの２−Ｄ配列に対応する蛍光スポット３０２の２−Ｄ配列３００を示し得る。
【００８０】
［0082］  他の実施形態では、システム１００がハイパースペクトル撮像モードの場合、ＳＬＭ１５０によって反射された蛍光光２０は、分光素子２１０により、所与の方向、例えば、水平方向に、スペクトル的に分光される。かかる場合、撮像装置１９０によって取得された２−Ｄ画像１９２は、蛍光発光スペクトル３１２の２−Ｄ配列３１０を示し得る。各蛍光発光スペクトル３１２は、水平方向に分光されて、試料上の異なる空間的位置で励起パターンの励起スポットに対応し得る。
【００８１】
［0083］  前述のように、視野または試料にわたってスキャンするために、励起パターンが側方に、例えば、垂直および水平方向に、シフトされ得る。励起パターンの各空間的位置において、励起パターンによって照射された試料上の領域に対応する蛍光発光スペクトル３１２の配列３１０が、２−Ｄ画像１９２内に取得できる。蛍光発光スペクトルの複数の２−Ｄ画像１９２が、相互に側方にシフトされた一連の励起パターンに対応して取得され、次いで、ハイパースペクトル撮像データセットを取得するために計算的に再構成され得る。
【００８２】
［0084］  従って、励起パターンおよびＳＬＭ１５０上の一致するピンホールパターンをそれに応じてデジタル的に変更し、かつ／または側方にシフトすることにより、試料の焦点面におけるハイパースペクトル撮像データセットを取得するために、全視野がスキャンされ得る。試料にわたって視野をさらにスキャンすることにより、試料全体がスキャンされて、試料の焦点面における完全なハイパースペクトル撮像データセットを取得できる。
【００８３】
［0085］  励起パターンの励起スポットの間の、水平および／または垂直の、空間的分離は、励起波長、試料のサイズ、システム１００の視野、所望の測定スループット、空間分解能、および／または速度、ならびに励起光２２のスペクトル分光の量などの、様々な要因に基づいて事前に決定され得る。例えば、励起スポット間の水平方向における空間的分離は、蛍光発光スペクトル３１２が２−Ｄ画像１９２内で水平方向に相互に重なり合わないように、蛍光発光スペクトル３１２の水平方向における範囲に基づいて予め決定され得る。
【００８４】
［0086］  分光素子２１０によって生じるスペクトル分光の程度は、蛍光光２０のスペクトル範囲、試料または視野のサイズ、撮像装置１９０のサイズ、所望のススペクトル分解能、およびシステム１００の用途などの、様々な要因に基づいて予め決定され得る。
【００８５】
［0087］  いくつかの実施形態では、分光素子２１０によって生じるスペクトル分光の程度は、好都合に、調整可能であり得る。例えば、分光素子２１０は、システム１００の光軸に沿って配置された一対の二重アミチプリズムであり得る。一対の二重アミチプリズムの少なくとも１つは、光軸の周りを他に対して回転可能である。二重アミチプリズムの互いに対する回転は、蛍光光２２のスペクトル分光の量および／または角度配向（例えば、分光角度）の連続制御を可能にし得る。
【００８６】
［0088］  レンズおよび対物レンズ
レンズ１２０ａ〜１２０ｆなどの、システム１００の様々なレンズは、システムの色および／または球面収差の効果を制限するか、または低下させるための、色消しダブレットもしくはトリプレットなどの、色消しであり得る。さらに、システム１００の対物レンズ１７０は、色消しであり得る。代替または追加として、対物レンズ１７０が、その背面開口から入る平行にされた光ビームの所望の焦点（例えば、集束点または集束パターン）を形成し得るように、対物レンズ１７０は、無限補正対物レンズであり得る。色消しレンズおよび／または色消しもしくは無限補正対物レンズを使用すると、試料内の焦点面からの異なる波長の蛍光光が、撮像装置１９０で焦点の合った画像を同様に形成するのを可能にし得る。従って、色消しレンズおよび／または色消し対物レンズを使用すると、システム１００によって取得された共焦点画像の品質が向上し得る。
【００８７】
［0089］  光学フィルタおよびビームスプリッタ
いくつかの実施形態では、光学フィルタ２００ａが、照射システム内に光軸に沿って追加され得る。光学フィルタ２００ａは、実質的に、励起光１２の所望の波長を透過させて、不要な波長を遮断するクリーンアップフィルタであり得る。例えば、光学フィルタ２００ａは、光源１１０からのノイズの多い自然放出を遮断するため、または実質的にバックグラウンドノイズを低減するために、約数ナノメートルの範囲の狭通過帯域を有し得る。
【００８８】
［0090］  励起光１２の強度は蛍光光１８よりも数桁強い可能性があるので、試料および／または試料保持器１８０によって反射および／または拡散された励起光１２は、検出システムに入って、撮像装置１９０による蛍光光の検出または取得に影響を及ぼし得る。従って、本開示の実施形態は、以下で説明するように、励起光１２が検出システムに伝搬するのを低減または阻止し得る。
【００８９】
［0091］  いくつかの実施形態では、ビームスプリッタ１６０は、励起光１２が撮像装置１９０に向かって伝搬するのを阻止するために使用され得る。ビームスプリッタ１６０は、実質的に、励起光１２の波長を反射し、蛍光光１８の波長の少なくとも一部を透過させる、ロングパス二色性ビームスプリッタであり得る。励起光１２のスペクトルは、典型的には、紫外線から可視スペクトルまでであり、蛍光光１８のスペクトルは、典型的には、可視から近赤外スペクトルまでである。従って、ロングパス二色性ビームスプリッタは、励起光１２の波長を遮断し、蛍光光１８の波長の範囲を透過させ得る。
【００９０】
［0092］  代替または追加として、光学フィルタ２００ｂが検出システム内に光軸に沿って追加され得る。光学フィルタ２００ｂは、実質的に、励起光１２の波長または狭スペクトル帯を反射し、それにより、励起光１２が撮像装置１９０に達するのを阻止し得るノッチフィルタであり得る。
【００９１】
［0093］  他の実施形態では、励起光１２が直線偏光される場合、ビームスプリッタ１６０は、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）であり得る。ＰＢＳは、直線偏光された励起光の偏光方向と同じ偏光方向を有する光を反射し、偏光された励起光の偏光方向と直交する偏光方向を有する光を透過させるように選択され得る。対物レンズ１７０によって集光された励起光のほとんどは、従って、このＰＢＳから反射して、撮像装置１９０に達しないであろう。いくつかの場合、試料および対物レンズ１７０の両方は、反射または拡散された励起光を少ない程度まで偏光解消（ｄｅｐｏｌａｒｉｚｅ）させ得、従って、幾分かの励起光がＰＢＳを通って透過して検出システムに入るのを不必要に可能にし得る。
【００９２】
［0094］  撮像装置
撮像装置１９０は、試料内の選択された焦点面と共役な像平面に配置された適切な２−Ｄセンサーを含み得る。センサーは、ＣＭＯＳセンサー、ＣＣＤセンサー、シリコンアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）の２−Ｄ配列、または他の適切なタイプの２−Ｄセンサーにできる。
【００９３】
［0095］  撮像装置１９０は、その動作を制御するコントローラまたはコンピューティング装置（図示せず）に動作可能に接続され得る。例えば、コントローラ（図示せず）は、プロセッサおよび、命令または操作ステップを格納する１つまたは複数のコンピュータ可読媒体を有し得る。命令または操作ステップは、プロセッサによって実行される場合、撮像装置１９０の露光を操作して、２−Ｄ画像１９２を取得し、かつ／または２−Ｄ画像１９２のデータセットをメモリに格納し得る。コンピュータ可読媒体は、プロセッサによって実行される場合に、取得した２−Ｄ画像データセットのデータ処理を実行し、かつ／または２−Ｄ画像データセットから共焦点画像および／もしくはハイパースペクトル撮像データセットを再構成し得る、命令または操作ステップをさらに格納し得る。
【００９４】
［0096］  本明細書で説明するように、システム１００は、共焦点および／またはハイパースペクトル撮像のための様々な方法で利用され得る。図３は、共焦点撮像を実行するため、または試料の共焦点画像を取得するための、例示的な方法４００の流れ図である。方法４００は、図１および図２を参照して前述した、システム１００およびシステム１００の実施形態の特徴を使用する。
【００９５】
［0097］  ステップ４０２で、光源１１０が提供されて、１つまたは複数の波長を有する励起光１０を放出するように構成される。ステップ４０４で、励起光１０が、レンズ１２０ａによって平行にされて、平行にされた励起光１２になる。ステップ４０６で、平行にされた励起光１２は、ＳＬＭ１４０のピクセルによって形成された予め決定された位相変調パターンが適用されることにより、構造化または変調される。ステップ４０８で、構造化された励起光が、試料に向けられて、試料を２次元励起パターンで照射する。励起パターンは、位相変調パターンのフーリエ面に配置される。ステップ４１０で、試料内の焦点面から集光された放出光が撮像装置１９０に撮像される。焦点面は、ＳＬＭ１５０のピクセルによって形成されたピンホールパターンと共役にできるか、またはその共役面においてであり得る。
【００９６】
［0098］  方法４００は、追加のステップをさらに含み得る。例えば、方法４００は、２−Ｄ画像１９２を取得する前に較正システム１００を含み得る。小さくされたか、または最小の収差および／もしくは歪みの焦点の合った２−Ｄ画像１９２が取得できるように、システム１００内の様々な光学要素が、適切に較正されて位置合わせされ得る。
【００９７】
［0099］  方法４００は、分光素子２１０を使用して、試料から集光された蛍光光１８を側方方向にスペクトル的に分光することをさらに含み得る。スペクトル的に分光された蛍光光２２は、撮像装置１９０により２−Ｄ画像１９２内に取得され得る。
【００９８】
［0100］  方法４００は、試料を、一連の相互に側方にシフトされた励起パターンで連続して照射すること、および一連の励起パターンと一致する一連のピンホールパターンを形成することをさらに含み得る。
【００９９】
［0101］  いくつかの実施形態では、方法４００は、一連の励起パターンに対応する放出光２０の複数の２−Ｄ画像１９２を取得すること、および複数の２−Ｄ画像１９２を再構成して共焦点画像を提供することをさらに含み得る。前述のように、２−Ｄ画像１９２は、励起パターンの各側方シフトおよびその一致するピンホールパターンの形成後に取得され得る。各２−Ｄ画像１９２は、各側方にシフトされた励起パターンに対応する蛍光スポット３０２の配列３００を記録し得る。
【０１００】
［0102］  他の実施形態では、方法４００は、一連の励起パターンに対応するスペクトル的に分光された放出光２２の複数の２−Ｄ画像１９２を取得すること、および複数の２−Ｄ画像１９２を再構成してハイパースペクトル画像データセットを提供することをさらに含み得る。前述のように、スペクトル的に分光された放出光の２−Ｄ画像１９２は、励起パターンの各側方シフトおよびその一致するピンホールパターンの形成後に取得され得る。各２−Ｄ画像１９２は、各側方にシフトされた励起パターンに対応する蛍光発光スペクトル３１２の配列３１０を記録し得る。
【０１０１】
［0103］  前述の説明は、例示目的のために提示されている。それは包括的でなく、開示する正確な形式または実施形態に限定されない。実施形態の修正および適応は、開示する実施形態の仕様の検討および実施から明らかであろう。例えば、説明する実装態様は、ハードウェアおよびソフトウェアを含むが、本開示と一致するシステムおよび方法は、ハードウェアだけとして実装できる。加えて、ある構成要素は相互に結合されていると説明されているが、かかる構成要素は相互に統合されるか、または任意の適切な方法で分散され得る。
【０１０２】
［0104］  さらに、例示的な実施態様が本明細書で説明されているが、範囲は、等価な要素を有するありとあらゆる実施形態、本開示に基づく修正、省略、組合せ（例えば、様々な実施形態にわたる態様の）、適応および／または変更を含む。特許請求の範囲内の要素は、特許請求の範囲内で採用された用語に基づき、本明細書で説明する例に限定されず、または本出願の手続遂行中、広く解釈されるものとし、その例は、包括的として解釈されるべきでない。さらに、開示する方法のステップは、ステップの順序変更および／またはステップの挿入もしくは削除を含む、任意の方法で修正できる。
【０１０３】
［0105］  コンピュータ可読媒体によって格納された命令または操作ステップは、コンピュータプログラム、プログラムモジュール、またはコードの形であり得る。本明細書で説明するように、コントローラによって使用されるものなど、本明細書の記述された説明に基づくコンピュータプログラム、プログラムモジュール、およびコードは、容易に、ソフトウェア開発者の管理権限内である。コンピュータプログラム、プログラムモジュール、またはコードは、様々なプログラミング技術を使用して作成できる。例えば、それらは、Ｊａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、アセンブリ言語、または任意のかかるプログラミング言語で設計できるかまたはそれらの言語が使用され得る。かかるプログラム、モジュール、またはコードの１つまたは複数が、装置システムまたは既存の通信ソフトウェアに統合できる。プログラム、モジュール、またはコードは、ファームウェアまたは回路論理としても実装または複製できる。
【０１０４】
［0106］  本開示の特徴および利点は、詳細な明細書から明らかであり、従って、添付の特許請求の範囲は、本開示の真の精神および範囲に含まれる全てのシステムおよび方法を包含することを意図する。本明細書では、不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は「１つまたは複数」を意味する。同様に、複数用語の使用は、所与の文脈で曖昧でない限り、必ずしも複数を意味しない。「および」または「または」などの用語は、別段の明確な指示がない限り、「および／または」を意味する。さらに、多数の修正および変形が本開示の検討から容易に生じ得るので、本開示を例示および説明した正確な構成および動作に限定することは望まず、その結果、全ての適切な修正および同等物が用いられ得、本開示の範囲に含まれる。
【０１０５】
［0107］  他の実施形態は、本明細書の検討および本明細書で開示する実施形態の実施から明らかであろう。本明細書および例は、例に過ぎないと考えられることを意図し、開示する実施形態の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲によって示されている。
【図１】
2019521373.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2019521373.tif 000007
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