(57)【要約】  本発明はフルクトシルバリルヒスチジンに対する基質特異性が高いアマドリアーゼの提供を目的とする。本発明はコニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属由来のアマドリアーゼの９８位、２５９位、１５４位、１２５位、２６１位、２６３位、１０６位、１０３位、３５５位、９６位、６６位、６７位、７０位、１００位、１１０位、１１３位、１１４位、および１５６位よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するアマドリアーゼであり、本発明により、ε−フルクトシルリジンの存在下においても、糖化ヘモグロビンのβ鎖アミノ末端に由来するα−フルクトシルバリルヒスチジンを正確に測定できる。
2012018094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有するアマドリアーゼ：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列の以下（ｃ）から（ｓ）よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減しているか、および／または前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減していることを特徴とするアマドリアーゼ。
（ｃ）９８位のグルタミン酸
（ｄ）２５９位のバリン
（ｅ）１５４位のセリン
（ｆ）１２５位のヒスチジン
（ｇ）２６１位のチロシン
（ｈ）２６３位のグリシン
（ｉ）１０６位のアスパラギン酸
（ｊ）１０３位のグリシン
（ｋ）３５５位のアラニン
（ｌ）９６位のアスパラギン酸
（ｓ）６６位のリジンまたは／および６７位のバリン
（ｍ）７０位のグルタミン
（ｏ）１００位のスレオニン
（ｐ）１１０位のグルタミン
（ｑ）１１３位のアラニン
（ｒ）１１４位のロイシン
（ｓ）１５６位のアスパラギン酸
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸の以下（ｔ）から（ａｊ）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下（ｔ）から（ａｊ）の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換されており、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減しているか、および／または前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減していることを特徴とするアマドリアーゼ：
（ｔ）９８位のグルタミン酸がプロリン以外のアミノ酸、すなわちグルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンに置換されている；
（ｕ）２５９位のバリンがアラニン、システイン、セリンに置換されている；
（ｖ）１５４位のセリンがグリシン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、システインに置換されている；
（ｗ）１２５位のヒスチジンがアラニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニンに置換されている；
（ｘ）２６１位のチロシンがアラニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジンに置換されている；
（ｙ）２６３位のグリシンがリジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸に置換されている；
（ｚ）１０６位のアスパラギン酸が、アスパラギン酸よりも分子量の小さいアミノ酸、すなわちグリシン、アラニン、セリン、バリン、スレオニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギンに置換されている；
（ａａ）１０３位のグリシンがリジン、アルギニン、ヒスチジンに置換されている；
（ａｂ）３５５位のアラニンがリジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸に置換されている；
（ａｃ）９６位のアスパラギン酸がアラニン、アスパラギン、ヒスチジン、セリンに置換されている；
（ａｄ）６６位のリジンがグリシンまたは／および６７位のバリンがプロリンに置換されている；
（ａｅ）７０位のグルタミンがプロリンに置換されている；
（ａｆ）１００位のスレオニンがアルギニンに置換されている；
（ａｇ）１１０位のグルタミンがアラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン、ヒスチジン、リジン、アルギニンに置換されている；
（ａｈ）１１３位のアラニンがグルタミン酸、リジンに置換されている；
（ａｉ）１１４位のロイシンがリジン、アルギニンに置換されている；
（ａｊ）１５６位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されている。
【請求項４】
配列番号１に示すアミノ酸配列において、以下の（ba）から（be）よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、請求項３記載のアマドリアーゼ：
（ba）９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（bb）９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換；
（bc）９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のグルタミンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換；
（bd）９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（be）１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換、１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換。
【請求項５】
配列番号２７２に示すアミノ酸配列において、９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換を有し、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減しており、かつ前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減していることを特徴とするアマドリアーゼ。
【請求項６】
配列番号２４１に示すアミノ酸配列において、以下の（ca）から（cc）よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有し、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減しており、かつ前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減していることを特徴とするアマドリアーゼ：
（ca）９８位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、１１０位のリジンに対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（cb）９８位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（cc）１１０位のリジンに対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
【請求項８】
請求項７記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項９】
請求８記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
アマドリアーゼを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
（ａｋ）請求項９記載の宿主細胞を培養する工程；
（ａｌ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；および
（ａｍ）培養物からアマドリアーゼを単離する工程。
【請求項１１】
請求項１から請求項６のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質特異性が改変されたアマドリアーゼ、その遺伝子および組換え体ＤＮＡ、並びに基質特異性が改変されたアマドリアーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。【０００３】
これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。【０００４】
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα−フルクトシルバリルヒスチジン（以降αＦＶＨと表す）、若しくはα−フルクトシルバリン（以降αＦＶと表す）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１〜６参照。）。実際には、ＨｂＡ１ｃからαＦＶを切り出す方法では、夾雑物等による影響が大きいと考えられ、特に現在ではαＦＶＨを測る方法が主流となっている。【０００５】
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」とも言う）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する。【０００６】
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属、ユーペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、オフィオボラス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ）属、プレオスポラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウロクラディウム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、７〜１１、非特許文献１〜４参照。）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。【０００７】
酵素的方法によるＨｂＡ１ｃの測定においては、アマドリアーゼの性質として厳密な基質特異性が要求される。例えば、先述の様に、遊離されたαＦＶＨを定量することによりＨｂＡ１ｃの測定を実施する場合には、検体中に遊離状態で存在する、および／または、プロテアーゼ等を用いたＨｂＡ１ｃの処理工程において遊離される、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸や糖化ペプチドには作用しにくいアマドリアーゼを用いることが望ましい。特に、ヘモグロビン分子中に含まれるリジン残基側鎖のε位のアミノ基は糖化を受けることが知られており、この糖化を受けたリジン残基に由来する、ε位のアミノ基が糖化されたε−フルクトシルリジン（以降εＦＫと表す）が、プロテアーゼ処理等によって遊離されることが示唆されている（例えば、非特許文献５参照。）。そのため、測定誤差の原因物質となり得るεＦＫに対し作用しにくい、基質特異性の高いアマドリアーゼが強く望まれている。一方で、従来知られたアマドリアーゼのほとんどは、εＦＫへの反応性が十分に低いものであるとはいえない。【０００８】
一般的な技術として、酵素の基質特異性を改変するためには、酵素をコードするＤＮＡに変異を加え、酵素のアミノ酸に置換を導入し、目的とする基質特異性を備えた酵素を選抜する方法が知られている。また、相同性の高い酵素において、アミノ酸置換によって基質特異性を高めたという例が既に知られている場合には、その情報をもとに基質特異性の向上を予想することが可能である。【０００９】
実際、カーブラリア・クラベータ（Curvularia clavata）ＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼおよびネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ（Neocosmospora vasinfecta）４７４由来のケトアミンオキシダーゼについては、数個のアミノ酸を置換することによって、αＦＶＨに対する基質特異性が向上した改変型ケトアミンオキシダーゼが示されている（特許文献１参照。）。例えば、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼにおいては、５８位のイソロイシンをバリンに、６２位のアルギニンをヒスチジンに、３３０位のフェニルアラニンをロイシンに置換することにより、ε−フルクトシル−（α−ベンジルオキシカルボニルリジン）（以降εＦＺＫと表す）に対する酵素活性をαＦＶＨに対する酵素活性で割って導いた活性比であるεＦＺＫ／αＦＶＨが０．９５から０．０２５へと低減することが示されている。【００１０】
しかし、上記文献において改変型ケトアミンオキシダーゼの基質特異性の評価に用いられているεＦＺＫは、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで処理する工程において実際に生じるεＦＫとは、分子量や構造の点でも相当に異なる化合物である。そのため、εＦＺＫに対する反応性が低減していることをもって、実際の測定誤差の原因物質となり得るεＦＫに対する反応性が低減したとはいい難い。また、上記文献中の改変型ケトアミンオキシダーゼを用いてεＦＫに対する反応性の低減を確認している旨の記載もない。【００１１】
その他にも、アスペルギルス・ニードランス（Aspergillus nidulans）Ａ８９由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにアミノ酸置換を導入し、基質特異性を改変することにより、αＦＶＨに対する反応性を新たに付与した改変型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが報告されている（例えば、特許文献１０参照。）。例えば、アスペルギルス・ニードランスＡ８９由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの、５９位のセリンをグリシンに、かつ６５位のリジンをグリシンに置換することにより、または１０９位のリジンをグルタミンに置換することにより、新たにαＦＶＨに対する酵素活性が付与されることが示されている。しかしながら、当該アミノ酸置換がεＦＫに対する反応性の低減に寄与するとの記載は無い。【００１２】
また、他にも、アスペルギルス・ニードランスＡ８９由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにアミノ酸置換を導入し、基質特異性を改変することにより、εＦＫに対する酵素活性をαＦＶに対する酵素活性で割って導いた活性比であるεＦＫ／αＦＶを低減させた改変型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが報告されている（例えば、特許文献１２参照。）。しかしながら、この改変酵素のαＦＶＨに対する酵素活性については何ら言及されていない。【００１３】
すなわち、天然型もしくは変異型アマドリアーゼを含め、εＦＫに対する酵素活性をαＦＶＨに対する酵素活性で割って導いた活性比であるεＦＫ／αＦＶＨが低い、および／またはεＦＫ／αＦＶが低いアマドリアーゼの例は、これまでにごく僅か報告されているにすぎず、精度の高いＨｂＡ１ｃの測定を実現し得る、εＦＫに対する反応性が十分に低いアマドリアーゼが依然として求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００４／１０４２０３号
【特許文献２】国際公開第２００５／４９８５７号
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献４】特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献５】特開平１１−１２７８９５号公報
【特許文献６】国際公開第９７／１３８７２号
【特許文献７】特開２００３−２３５５８５号公報
【特許文献８】特開２００４−２７５０１３号公報
【特許文献９】特開２００４−２７５０６３号公報
【特許文献１０】特開２０１０−３５４６９号公報
【特許文献１１】特開２０１０−５７４７４号公報
【特許文献１２】特開２０１０−１０４２７８号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３１１，  １０４−１１，  ２００３
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０６，  ３５８−６６，  ２０１０
【非特許文献３】Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０２，  ２４１−３，  ２００６
【非特許文献４】Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４２，  ４９９−５０５，  １９９６
【非特許文献５】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９，  ２７６１３−２０，  ２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明が解決しようとする課題は、εＦＫに対する反応性、具体的には、εＦＫ/αＦＶＨが低い、および／またはεＦＫ/αＦＶが低いアマドリアーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼにおける特定のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。【００１８】
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１９】
（１）以下の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有するアマドリアーゼ：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している。【００２０】
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減している。【００２１】
（２）配列番号１に示すアミノ酸配列の以下（ｃ）から（ｓ）よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減しているか、および／または前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減していることを特徴とするアマドリアーゼ。【００２２】
（ｃ）９８位のグルタミン酸
（ｄ）２５９位のバリン
（ｅ）１５４位のセリン
（ｆ）１２５位のヒスチジン
（ｇ）２６１位のチロシン
（ｈ）２６３位のグリシン
（ｉ）１０６位のアスパラギン酸
（ｊ）１０３位のグリシン
（ｋ）３５５位のアラニン
（ｌ）９６位のアスパラギン酸
（ｓ）６６位のリジンまたは／および６７位のバリン
（ｍ）７０位のグルタミン
（ｏ）１００位のスレオニン
（ｐ）１１０位のグルタミン
（ｑ）１１３位のアラニン
（ｒ）１１４位のロイシン
（ｓ）１５６位のアスパラギン酸
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸の以下（ｔ）から（ａｊ）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下（ｔ）から（ａｊ）の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換されており、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減しているか、および／または前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減していることを特徴とするアマドリアーゼ：
（ｔ）９８位のグルタミン酸がプロリン以外のアミノ酸、すなわちグルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンに置換されている；
（ｕ）２５９位のバリンがアラニン、システイン、セリンに置換されている；
（ｖ）１５４位のセリンがグリシン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、システインに置換されている；
（ｗ）１２５位のヒスチジンがアラニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニンに置換されている；
（ｘ）２６１位のチロシンがアラニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジンに置換されている；
（ｙ）２６３位のグリシンがリジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸に置換されている；
（ｚ）１０６位のアスパラギン酸が、アスパラギン酸よりも分子量の小さいアミノ酸、すなわちグリシン、アラニン、セリン、バリン、スレオニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギンに置換されている；
（ａａ）１０３位のグリシンがリジン、アルギニン、ヒスチジンに置換されている；
（ａｂ）３５５位のアラニンがリジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸に置換されている；
（ａｃ）９６位のアスパラギン酸がアラニン、アスパラギン、ヒスチジン、セリンに置換されている；
（ａｄ）６６位のリジンがグリシンまたは／および６７位のバリンがプロリンに置換されている；
（ａｅ）７０位のグルタミンがプロリンに置換されている；
（ａｆ）１００位のスレオニンがアルギニンに置換されている；
（ａｇ）１１０位のグルタミンがアラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン、ヒスチジン、リジン、アルギニンに置換されている；
（ａｈ）１１３位のアラニンがグルタミン酸、リジンに置換されている；
（ａｉ）１１４位のロイシンがリジン、アルギニンに置換されている；
（ａｊ）１５６位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されている。【００２３】
（４）  配列番号１に示すアミノ酸配列において、以下の（ba）から（be）よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、上記（３）記載のアマドリアーゼ：
（ba）９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（bb）９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換；
（bc）９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のグルタミンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換；
（bd）９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（be）１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換、１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換。【００２４】
（５）  配列番号２７２に示すアミノ酸配列において、９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換を有し、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減しており、かつ前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減していることを特徴とするアマドリアーゼ。【００２５】
（６）  配列番号２４１に示すアミノ酸配列において、以下の（ca）から（cc）よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有し、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリルヒスチジンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減しており、かつ前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、α−フルクトシルバリンに対する反応性に対するε−フルクトシルリジンに対する反応性の割合が低減していることを特徴とするアマドリアーゼ：
（ca）９８位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、１１０位のリジンに対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（cb）９８位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換；
（cc）１１０位のリジンに対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換。【００２６】
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。【００２７】
（８）上記（７）記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。【００２８】
（９）上記（８）記載の組換えベクターを含む宿主細胞。【００２９】
（１０）アマドリアーゼを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
（ａｋ）上記（６）記載の宿主細胞を培養する工程；
（ａｌ）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；および
（ａｍ）培養物からアマドリアーゼを単離する工程。【００３０】
（１１）上記（１）〜（６）のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるためのキット。【００３１】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-176967号および2010-213070号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用され得る基質特異性の優れたアマドリアーゼ、具体的には、εＦＫ/αＦＶＨが低い、および／またはεＦＫ/αＦＶが低いアマドリアーゼを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における相同性を例示する図である。
【図２】本発明のアマドリアーゼによるαＦＶＨの定量性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３５】
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。
【００３６】
本発明のアマドリアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコニオカエタ属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体である。このような変異体の例としては、配列番号１と高い配列同一性（例えば、７５％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、および、配列番号１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを挙げることができる。なお、請求の範囲に記載された、基質特異性および／またはアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、ユーペニシリウム属、アルスリニウム属、カーブラリア属、レプトスフェリア属、ネオコスモスポラ属、オフィオボラス属、プレオスポラ属、ピレノケータ属、アスペルギルス属、クリプトコッカス属、フェオスフェリア属、ウロクラディウム属、若しくはペニシリウム属のような、他の生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでも良い。
【００３７】
基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体はアマドリアーゼのアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基を置換することによって得ることができる。
【００３８】
基質特異性の改変をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
【００３９】
（１）  ９８位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリン以外のアミノ酸、すなわちグルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンへの置換。
【００４０】
（２）  ２５９位のバリンの置換、例えば、アラニン、システイン、セリンへの置換。
【００４１】
（３）  １５４位のセリンの置換、例えば、グリシン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、システインへの置換。
【００４２】
（４）  １２５位のヒスチジンの置換、例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニンへの置換。
【００４３】
（５）  ２６１位のチロシンの置換、例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジンへの置換。
【００４４】
（６）  ２６３位のグリシンの置換、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸への置換。
【００４５】
（７）  １０６位のアスパラギン酸の置換、例えば、アスパラギン酸よりも分子量の小さいアミノ酸、すなわちグリシン、アラニン、セリン、バリン、スレオニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギンへの置換。
【００４６】
（８）  １０３位のグリシンの置換、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンへの置換。
【００４７】
（９）  ３５５位のアラニンの置換、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸への置換。
【００４８】
（１０）  ９６位のアスパラギン酸への置換、例えば、アラニン、アスパラギン、ヒスチジン、セリンへの置換。
【００４９】
（１１）  ６６位のリジンの置換、例えば、グリシンへの置換。
【００５０】
（１２）  ６７位のバリンの置換、例えば、プロリンへの置換。
【００５１】
（１３）  ７０位のグルタミンの置換、例えば、プロリンへの置換。
【００５２】
（１４）  １００位のスレオニンの置換、例えば、アルギニンへの置換。
【００５３】
（１５）  １１０位のグルタミンの置換、例えば、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン、ヒスチジン、リジン、アルギニンへの置換。
【００５４】
（１６）  １１３位のアラニンの置換、例えば、グルタミン酸、リジンへの置換。
【００５５】
（１７）  １１４位のロイシンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
【００５６】
（１８）  １５６位のアスパラギン酸の置換、例えば、アスパラギンへの置換。
【００５７】
基質特異性が改変したアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８を有している。
【００５８】
その中でも、以下のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸の置換を有している変異体が好ましい。本発明において、例えば、第１１０位のグルタミン（Q)がアルギニン（R)へ置換された変異をQ110Rと表す。
【００５９】
６６位のリジンおよび６７位のバリンの置換、例えば、K66GおよびV67Pを有する変異体。
【００６０】
６６位のリジン、６７位のバリンおよび９８位のグルタミン酸の置換、例えば、K66G、V67PおよびE98Aを有する変異体。
【００６１】
６６位のリジン、６７位のバリンおよび１１０位のグルタミンの置換、例えば、K66G、V67PおよびQ110Rを有する変異体。
【００６２】
９８位のグルタミン酸および１１０位のグルタミンの置換、例えば、E98AおよびQ110Rを有する変異体。
【００６３】
１１０位のグルタミンおよび１２５位のヒスチジンの置換、例えば、Q110RおよびH125Qを有する変異体。
【００６４】
１１０位のグルタミンおよび１５４位のセリンの置換、例えば、Q110RおよびS154G若しくはS154Nを有する変異体。
【００６５】
１１０位のグルタミンおよび３５５位のアラニンの置換、例えばQ110RおよびA355Kを有する変異体。
【００６６】
９８位のグルタミン酸および１０３位のグリシンの置換、例えば、E98AおよびG103Rを有する変異体。
【００６７】
９８位のグルタミン酸および１５４位のセリンの置換、例えば、E98A若しくはE98RおよびS154Nを有する変異体。
【００６８】
１１０位のグルタミンおよび１５４位のセリンの置換、例えば、Q110RおよびS154Cを有する変異体。
【００６９】
９８位のグルタミン酸、１０６位のアスパラギン酸および１５４位のセリンの置換、例えば、E98A、D106SおよびS154Nを有する変異体。
【００７０】
９８位のグルタミン酸、１１０位のグルタミンおよび１５４位のセリンの置換、例えば、E98A、Q110RおよびS154Nを有する変異体。
【００７１】
１１０位のグルタミン、１２５位のヒスチジンおよび１５４位のセリンの置換、例えば、Q110R、H125QおよびS154Nを有する変異体。
【００７２】
９８位のグルタミン酸および２５９位のバリンの置換、例えば、E98QおよびV259A、E98QおよびV259C、E98HおよびV259A、E98HおよびV259C、E98RおよびV259C、E98AおよびV259Cを有する変異体。
【００７３】
９８位のグルタミン酸および２６３位のグリシンの置換、例えば、E98AおよびG263Rを有する変異体。
【００７４】
１１０位のグルタミンおよび２５９位のバリンの置換、例えば、Q110RおよびV259Aを有する変異体。
【００７５】
１５４位のセリンおよび２５９位のバリンの置換、例えば、S154DおよびV259Aを有する変異体。
【００７６】
９８位のグルタミン酸、１５４位のセリンおよび２５９位のバリンの置換、例えば、E98A、S154NおよびV259Cを有する変異体。
【００７７】
１１０位のグルタミン、１５４位のセリンおよび２５９位のバリンの置換、例えば、Q110R、S154NおよびV259Aを有する変異体。
【００７８】
これらのアミノ酸置換の組合わせの中でも以下の(ba)〜(be)のいずれかの組み合わせが好ましい。
【００７９】
（ba）９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換。
【００８０】
(bb)９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換。
【００８１】
（bc）９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のグルタミンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換。
【００８２】
（bd）９８位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換。
【００８３】
(be)１１０位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のアルギニンへの置換、１５４位のセリンに対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換および２５９位のバリンに対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換。
【００８４】
本発明の基質特異性が改変されたアマドリアーゼ変異体は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、上記の基質特異性の改変をもたらすアミノ酸の置換を有し、それらの置換アミノ酸以外の位置で、さらに1または数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは１個)のアミノ酸が欠失、挿入、付加および／または置換されたアミノ酸配列からなり、アマドリアーゼ活性を有し、基質特異性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。さらに、上記の基質特異性の改変をもたらすアミノ酸の置換変異、耐熱性を向上させるアミノ酸の置換変異を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列の該置換したアミノ酸以外のアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列に対して、90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アマドリアーゼ活性を有し、基質特異性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。
【００８５】
上記のアミノ酸置換において、アミノ酸の位置は配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を表しているが、他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。
【００８６】
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００８７】
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【００８８】
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特許文献７）が挙げられる。
【００８９】
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ（特許文献７）から、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）を用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを、抽出、精製して得ることができる。
【００９０】
（ベクター）
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が好ましい。
【００９１】
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【００９２】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
【００９３】
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、０２４〜３０、１９８９年６月号）。
【００９４】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２，  ９４４１  （１９８４）：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １５４，  ３５０  （１９８７）：  Ｇｅｎｅ，  ３７，  ７３  （１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３，  ８７４９  （１９８５）：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３，  ８７６５  （１９８５）：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １４，  ９６７９  （１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８２，  ４８８  （１９８５）：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １５４，  ３６７  （１９８７））等が挙げられる。
【００９５】
また、一般的なＰＣＲ法として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  １，  １１（１９８９）参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
【００９６】
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行うことができる。
【００９７】
（形質転換・形質導入）
上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。
【００９８】
（アミノ酸配列の相同性）
アミノ酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ  （Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
【００９９】
（アミノ酸に対応する位置の特定）
「アミノ酸に対応する位置」とは、配列番号１に示すコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
【０１００】
「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。図１に種々の生物種由来のアマドリアーゼの配列のアラインメントを示す。図１からコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を知ることができる。図１には、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびPenicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列を示してある。
【０１０１】
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６６位のリジンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６６位のリジンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１０２】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは６６位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは６６位のリジン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは６６位のプロリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは６６位のリジン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは６６位のリジン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６６位のプロリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６６位のプロリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６５位のリジン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６６位のリジン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６６位のグリシンである。
【０１０３】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６７位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６７位のバリンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１０４】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは６７位のプロリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは６７位のバリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは６７位のバリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは６７位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは６７位のバリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６７位のバリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６７位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６６位のプロリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６７位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６７位のプロリンである。
【０１０５】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の７０位のグルタミンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの７０位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１０６】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは７０位のグルタミン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは７０位のグルタミン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは７０位のグルタミン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは７０位のグルタミン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは７０位のグルタミン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは７０位のグルタミン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは７０位のグルタミン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６９位のグルタミン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは７０位のグルタミン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは７０位のグルタミンである。
【０１０７】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の９６位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの９６位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１０８】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは９６位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは９６位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは９６位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは９６位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは９６位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９６位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは９６位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９５位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９６位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９６位のアスパラギン酸である。
【０１０９】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの９８位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１１０】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは９８位のセリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは９８位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは９８位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは９８位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは９８位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９８位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは９８位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９７位のセリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９８位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９８位のセリンである。
【０１１１】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１００位のスレオニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１００位のスレオニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１１２】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１００位のセリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１００位のグリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１００位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１００位のグリシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１００位のセリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１００位のスレオニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１００位のグリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９９位のスレオニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１００位のグリシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１００位のセリンである。
【０１１３】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０３位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０３位のグリシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１１４】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１０３位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１０３位のグリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１０３位のグリシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１０３位のグリシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１０３位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０３位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１０３位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０２位のグリシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０３位のグリシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０３位のグリシンである。
【０１１５】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０６位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１１６】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１０６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１０６位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１０６位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１０６位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１０６位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０６位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１０６位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０５位のグリシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０６位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０６位のセリンである。
【０１１７】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１０位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１１８】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１１０位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１０位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１０位のグルタミン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１１０位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１１０位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１１０位のグリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０９位のリジン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のリジンである。
【０１１９】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１３位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１２０】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１１３位のスレオニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１３位のスレオニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１３位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１１３位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１１３位のリジン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１３位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１１３位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１２位のセリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１３位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１３位のアスパラギン酸である。
【０１２１】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１４位のロイシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１４位のロイシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１２２】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１１４位のロイシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１４位のロイシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１４位のロイシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１１４位のロイシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１１４位のロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１４位のイソロイシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１１４位のロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１３位のロイシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１４位のロイシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１４位のロイシンである。
【０１２３】
また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１２５位のヒスチジンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の１２５位のヒスチジンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させることにより特定することができる。
【０１２４】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１２５位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１２５位のアスパラギン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１２５位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１２５位のスレオニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１２５位のヒスチジン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２５位のヒスチジン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２３位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２４位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２５位のスレオニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２５位のアスパラギンである。
【０１２５】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１５４位のセリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１５４位のセリンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させることにより特定することができる。
【０１２６】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１５４位のシステイン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１５４位のセリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１５４位のセリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１５４位のセリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１５４位のセリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５４位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１５２位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５３位のシステイン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５４位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５４位のシステインである。
【０１２７】
さらに、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１５６位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１５６位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１２８】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１５６位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１５６位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１５６位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１５６位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１５６位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５６位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１５４位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５５位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５６位のアスパラギン酸、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５６位のアスパラギン酸である。
【０１２９】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５９位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５９位のバリンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させることにより特定することができる。
【０１３０】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２５９位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のバリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５９位のバリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２５９位のバリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５９位のバリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５５位のバリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５９位のバリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のバリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５９位のバリンである。
【０１３１】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６１位のチロシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させることにより特定することができる。
【０１３２】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２６１位のチロシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５９位のチロシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６１位のチロシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５９位のチロシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２６１位のチロシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６１位のチロシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５７位のチロシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６１位のチロシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５９位のチロシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６１位のチロシンである。
【０１３３】
さらに、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６３位のグリシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
【０１３４】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２６３位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６１位のグリシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６３位のグリシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２６１位のグリシン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２６３位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６３位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５９位のグリシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６３位のグリシン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６１位のグリシン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６３位のグリシンである。
【０１３５】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５５位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させることにより特定することができる。
【０１３６】
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３５５位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５３位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５６位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３５３位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３５５位のセリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５５位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５１位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５５位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５３位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５５位のアラニンである。
【０１３７】
（本発明のアマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られた基質特異性が改善されたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【０１３８】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【０１３９】
なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。
【０１４０】
培養は、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは３７℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは３７℃前後の培養温度で４〜８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
【０１４１】
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
【０１４２】
上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望の基質特異性が改善されたアマドリアーゼを得ることができる。
【０１４３】
（本発明のアマドリアーゼにおけるεＦＫに対する反応性の低下）
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して基質特異性が向上していることを特徴とする。具体的には、改変前のものと比較して、「αＦＶＨに対する反応性」に対する「εＦＫに対する反応性」の割合、あるいは、「αＦＶに対する反応性」に対する「εＦＫに対する反応性」の割合が低減していることを特徴とする。または、改変前のものと比較して、「αＦＶＨに対する反応性」に対する「εＦＫに対する反応性」の割合、および、「αＦＶに対する反応性」に対する「εＦＫに対する反応性」の割合がいずれも低減していることを特徴とする。
【０１４４】
糖化ヘモグロビンの測定において、εＦＫに対して反応性が高いことは測定誤差の原因となり得るため、εＦＫに対する反応性の割合は低ければ低いほど好ましい。具体的には、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合を示すεＦＫ／αＦＶＨは、改変前に対して１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上低減していることが好ましい。
【０１４５】
また、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合を示すεＦＫ／αＦＶは、改変前に対して１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以下低減していることが好ましい。
【０１４６】
αＦＶＨに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合、あるいは、αＦＶに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合は、公知のアマドリアーゼの測定法を用いて、任意の条件下で測定し、改変前のものと比較することができる。例えば、ｐＨ７．０において、５ｍＭのεＦＫを添加して測定した活性を、５ｍＭのαＦＶＨを添加して測定した活性で割った比率として求めることにより、αＦＶＨに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。また、例えば、ｐＨ７．０において、５ｍＭのεＦＫを添加して測定した活性を、５ｍＭのαＦＶを添加して測定した活性で割った比率として求めることにより、αＦＶに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。
【０１４７】
改変前のものと比較して基質特異性が向上している本発明のアマドリアーゼの一例としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｙ２６１Ｗ）株により生産されるアマドリアーゼが挙げられる。このような基質特異性が改善されたアマドリアーゼは、εＦＫをノイズとして測り込む度合が良好に低減され、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端由来の糖化アミノ酸であるαＦＶＨ、若しくはＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端由来の糖化アミノ酸であるαＦＶのみを測定することが可能となるため、精度の高い測定を行うことができ、産業利用上非常に有利である。
【０１４８】
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
【０１４９】
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
【０１５０】
本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りの無い限り、αＦＶＨ、もしくはεＦＫ、またはαＦＶを基質として用いる。なお、酵素力価は、αＦＶＨ、もしくはεＦＫ、またはαＦＶを基質として測定した時、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
【０１５１】
εＦＫ等の糖化アミノ酸、およびαＦＶＨ等の糖化ペプチドは、例えば、阪上らの方法に基づき合成、精製したものを用いることができる（特開２００１−９５５９８号公報参照）。
【０１５２】
Ａ．：試薬の調製
（１）試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液
５．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化成社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０またはｐＨ７．５もしくはｐＨ８．０）に溶解し、１０００ｍｌに定容する。
【０１５３】
（２）試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
【０１５４】
（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；  終濃度５ｍＭ）
αＦＶＨ  ６２５ｍｇ、もしくはεＦＫ  ４６２ｍｇまたはαＦＶ  ４１９ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
【０１５５】
Ｂ：活性測定法
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５５５ｎｍにおける１分後から２分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。これを予め作製しておいた過酸化水素の標準溶液を試薬３の代わりに、また酵素液の代わりにイオン交換水を用い、その生成色素量との関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、３７℃、１分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を計算し、この数値を酵素液中の活性単位とする。
【０１５６】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１５７】
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡの調製
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号２）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、３ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。【０１５８】
この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを得た。【０１５９】
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号３、４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。【０１６０】
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。【０１６１】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、配列番号１記載のアミノ酸配列の６６位のリジンがグリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｋ６６Ｇ）を得た。【０１６２】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６７位のバリンをプロリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号５、６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６７位のバリンがプロリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｖ６７Ｐ）を得た。【０１６３】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の６６位のリジンをグリシンに、かつ６７位のバリンをプロリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号７、８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６６位のリジンがグリシンに、かつ６７位のバリンがプロリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｋ６６ＧＶ６７Ｐ）を得た。【０１６４】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の７０位のグルタミンをプロリンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号９、１０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の７０位のグルタミンがプロリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｑ７０Ｐ）を得た。【０１６５】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の９６位のアスパラギン酸をアラニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１１、１２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の９６位のアスパラギン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｄ９６Ａ）を得た。【０１６６】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸をグルタミンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３、１４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸がグルタミンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｅ９８Ｑ）を得た。【０１６７】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１００位のスレオニンをアルギニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１５、１６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１００位のスレオニンがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｔ１００Ｒ）を得た。【０１６８】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１０３位のグリシンをアルギニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１７、１８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１０３位のグリシンがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｇ１０３Ｒ）を得た。【０１６９】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸をアラニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１９、２０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｄ１０６Ａ）を得た。【０１７０】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンをアラニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２１、２２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｑ１１０Ａ）を得た。【０１７１】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンをグルタミン酸に置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２３、２４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンがグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ａ１１３Ｅ）を得た。【０１７２】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１４位のロイシンをリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２５、２６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１４位のロイシンがリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｌ１１４Ｋ）を得た。【０１７３】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１２５位のヒスチジンをグルタミン酸に置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２７、２８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１２５位のヒスチジンがグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ１２５Ｅ）を得た。【０１７４】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１５４位のセリンをグルタミン酸に置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号２９、３０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１５４位のセリンがグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｓ１５４Ｅ）を得た。【０１７５】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の１５６位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号３１、３２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１５６位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｄ１５６Ｎ）を得た。【０１７６】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５９位のバリンをアラニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号３３、３４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５９位のバリンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰＴ７−Ｖ２５９Ａ）を得た。【０１７７】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンをアラニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号３５、３６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｙ２６１Ａ）を得た。【０１７８】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンをアルギニンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号３７、３８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンがアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｇ２６３Ｒ）を得た。【０１７９】
続いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンをリジンに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号３９、４０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンがリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ａ３５５Ｋ）を得た。【０１８０】
（３）各種改変型アマドリアーゼの生産
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌ＪＭ１０９株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、基質特異性確認のための酵素液０．６ｍｌを調製した。【０１８１】
（４）εＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶの測定
上述の酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株から生産した改変前のアマドリアーゼについても、同様の測定を行った。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。【０１８２】
その結果、上述の酵素活性測定の結果から得られた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株によって生産される改変前のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨは０．３１６であり、εＦＫ／αＦＶは０．０９３であった。【０１８３】
これに対し、部位特異的変異導入により作製した改変後の各種のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶ、および改変前のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶの値を１００％とした時の改変後のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶの比率は、表１の通りとなった。
【表１】
2012018094.tif 000003
【０１８４】
すなわち、表１に示す通り、これら全ての改変型アマドリアーゼにおいては、基質特異性が改善されていることがわかった。
【実施例２】
【０１８５】
（９６位のアスパラギン酸の点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の９６位のアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表２に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号４１〜４６）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の９６位のアスパラギン酸が各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０１８６】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０１８７】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表２に示す。
【表２】
2012018094.tif 000004
【０１８８】
表２に示したように、配列番号１記載のアミノ酸配列の９６位のアスパラギン酸をアラニン、セリン、アスパラギン、ヒスチジンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、εＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。
【実施例３】
【０１８９】
（９８位のグルタミン酸の点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸を他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表３に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号４７〜８２）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸が各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０１９０】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０１９１】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表３に示す。
【表３】
2012018094.tif 000005
【０１９２】
表３に示したように、配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸をプロリン以外の他のアミノ酸、すなわちグルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、εＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。なお、配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸をプロリンに置換した場合、酵素の発現が認められなくなった。
【実施例４】
【０１９３】
（１０３位のグリシンの点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の１０３位のグリシンを他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表４に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号８３、８４、２５５、２５６）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１０３位のグリシンが各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０１９４】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０１９５】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表４に示す。
【表４】
2012018094.tif 000006
【０１９６】
表４に示したように、配列番号１記載のアミノ酸配列の１０３位のグリシンをアルギニン、リジン、ヒスチジンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、εＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。
【実施例５】
【０１９７】
（１０６位のアスパラギン酸の点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸を他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表５に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号８５〜１００）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸が各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０１９８】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０１９９】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表５に示す。
【表５】
2012018094.tif 000007
【０２００】
表５に示したように、配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸をアスパラギン酸よりも分子量が小さいアミノ酸、すなわちグリシン、アラニン、セリン、バリン、スレオニン、システイン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、εＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。
【実施例６】
【０２０１】
（１１０位のグルタミンの点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンを他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表６に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号１０１〜１１８）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンが各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０２０２】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０２０３】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表６に示す。
【表６】
2012018094.tif 000008
【０２０４】
表６に示す通り、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンをアラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン、ヒスチジン、リジン、アルギニンに置換した改変型のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、１１０位のグルタミンをアラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン、ヒスチジン、リジン、アルギニンに置換した改変型のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であることがわかった。一方、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンをグルタミン酸に置換した改変型のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．３１６、０．０９３より高くなった。
【実施例７】
【０２０５】
（１１３位のアラニンの点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンを他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表７に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号１１９、１２０）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンがリジンに置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０２０６】
こうして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０２０７】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ．活性測定法に示した方法により、αＦＶＨおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表７に示す。
【表７】
2012018094.tif 000009
【０２０８】
表７に示すように、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンをグルタミン酸、リジンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低く、上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。
【実施例８】
【０２０９】
（１１４位のロイシンの点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の１１４位のロイシンを他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表８に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号１２１〜１２４）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１４位のロイシンが各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０２１０】
こうして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０２１１】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ．活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表８に示す。
【表８】
2012018094.tif 000010
【０２１２】
表８に示したように、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１４位のロイシンをリジン、アルギニンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、εＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。一方、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１４位のロイシンをグルタミン酸に置換した改変型のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨは、改変前の値である０．３１６より高くなった。
【実施例９】
【０２１３】
（１２５位のヒスチジンの点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の１２５位のヒスチジンを他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表９に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号１２５〜１３４、２５７〜２６０）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１２５位のヒスチジンが各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０２１４】
こうして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０２１５】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ．活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表９に示す。
【表９】
2012018094.tif 000011
【０２１６】
表９に示したように、配列番号１記載のアミノ酸配列の１２５位のヒスチジンをグルタミン酸、アスパラギン、リジン、アラニン、グルタミン、アルギニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、１２５位のヒスチジンをアスパラギン、リジン、グルタミン、アルギニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。
【実施例１０】
【０２１７】
（１５４位のセリンの点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の１５４位のセリンを他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表１０に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号１３５〜１５０）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１５４位のセリンが各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０２１８】
こうして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０２１９】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ．活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表１０に示す。
【表１０】
2012018094.tif 000012
【０２２０】
表１０に示したように、配列番号１記載のアミノ酸配列の１５４位のセリンをグルタミン酸、グリシン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、システインに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、εＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。一方、配列番号１記載のアミノ酸配列の１５４位のセリンをアラニンに置換した改変型のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨは、改変前の値である０．３１６とほぼ同様で、低下が認められなかった。
【実施例１１】
【０２２１】
（２５９位のバリンの点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の２５９位のバリンを他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表１１に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号１５１〜１５４）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５９位のバリンが各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０２２２】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０２２３】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表１１に示す。
【表１１】
2012018094.tif 000013
【０２２４】
表１１に示したように、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５９位のバリンをアラニン、システイン、セリンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、εＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。
【実施例１２】
【０２２５】
（２６１位のチロシンの点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンを他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表１２に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号１５５〜１６２）、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンが各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０２２６】
こうして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０２２７】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ．活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表１２に示す。
【表１２】
2012018094.tif 000014
【０２２８】
表１２に示したように、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンをアラニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、２６１位のチロシンをフェニルアラニン、トリプトファンに置換した改変型のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。
【実施例１３】
【０２２９】
（２６３位のグリシンの点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンを他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表１３に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号１６３、１６４、２６１〜２６６）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンが各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０２３０】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０２３１】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表１３に示す。
【表１３】
2012018094.tif 000015
【０２３２】
表１３に示したように、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンをアルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸に置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、εＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。
【実施例１４】
【０２３３】
（３５５位のアラニンの点変異試験）
基質特異性の向上に効果の高い配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンを他のアミノ酸に置換し、基質特異性に優れた改変型アマドリアーゼの探索を試みた。組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、表１４に示した合成オリゴヌクレオチド（配列番号１６５〜１６８、２６７〜２７０）、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンが各種アミノ酸に置換された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０２３４】
こうして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０２３５】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ．活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表１４に示した。
【表１４】
2012018094.tif 000016
【０２３６】
表１４に示したように、配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンをリジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸に置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１６より低い値となり、また、３５５位のアラニンをリジン、アルギニン、グルタミン酸に置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶはいずれも、改変前の値である０．０９３より低い値となった。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。
【実施例１５】
【０２３７】
（基質特異性改善に有効な変異の蓄積）
表１５に示した各種組換え体プラスミドＤＮＡを鋳型として、合成オリゴヌクレオチド（配列番号７、８、１７、１８、３９、４０、５１、５２、５５、５６、８７、８８、１１５、１１６、１３１、１３２、１３５、１３６、１３９、１４０）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列に表１５中の「アミノ酸変異」の欄に記載した複数のアミノ酸置換が導入された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０２３８】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０２３９】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表１５に示す。
【表１５】
2012018094.tif 000017
【０２４０】
表１５に示した多重アミノ酸置換が導入された改変型アマドリアーゼでは、εＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶはいずれも各アミノ酸置換を単独で導入した場合と比較して低い値となった。故に、配列番号１に示したアマドリアーゼの基質特異性改善に効果的な単一変異を組み合わせることにより、更なる基質特異性の改善が見込めることが明らかとなった。
【実施例１６】
【０２４１】
（基質特異性改善に有効な変異の蓄積）
表１６に示した使用プラスミドＬおよびＳを制限酵素ＫｐｎI及びＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、使用プラスミドＬから約５．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、使用プラスミドＳから約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動により分離した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（マシュレ‐ナゲル社製）によりゲルから各ＤＮＡ断片を抽出、精製した。続いて、両ＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（東洋紡績社製）を用いて連結し、連結したプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列に表１６中の「アミノ酸変異」の欄に記載した複数のアミノ酸置換が導入された改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９株を得た。【０２４２】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０２４３】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表１６に示す。
【表１６】
2012018094.tif 000018
【０２４４】
表１６中の多重アミノ酸置換が導入された改変型アマドリアーゼでは、εＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶはいずれも各アミノ酸置換を単独で導入した場合と比較して低い値となった。故に、配列番号１に示したアマドリアーゼの基質特異性改善に効果的な単一変異を組み合わせることにより、更なる基質特異性の改善が見込めることが明らかとなった。
【実施例１７】
【０２４５】
（改変型アマドリアーゼの生産および精製）
野生型アマドリアーゼ、および上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼを生産する形質転換体、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｑ１１０Ｒ）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｑ１１０Ｋ）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｙ２６１Ｆ）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｙ２６１Ｗ）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｅ９８Ａ／Ｖ２５９Ｃ）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｅ９８Ａ／Ｓ１５４Ｎ／Ｖ２５９Ｃ）を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地４０ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液８ｍｌを調製した。【０２４６】
調製した粗酵素液を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した４ｍｌのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に８０ｍｌの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で樹脂に吸着していたタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。【０２４７】
得られたアマドリアーゼ活性を示す画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５，  ３０Ｋ  ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で濃縮した。その後、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収し、野生型および改変型アマドリアーゼの精製標品を得た。得られた精製標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、単一なバンドまで精製されていることを確認した。【０２４８】
得られた野生型および改変型アマドリアーゼの精製標品を用いて、αＦＶＨ、εＦＫ、αＦＶを基質とした時の酵素活性を測定した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表１７、表１８に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法に基づく比色定量法、もしくは280nmにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した。各定量法により測定したタンパク質濃度から算出した比活性はそれぞれU/mg、U/A280で表した。
【表１７】
2012018094.tif 000019
【表１８】
2012018094.tif 000020
【０２４９】
表１７に示す通り、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンをアルギニン、リジンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１０より低い値を示し、また、１１０位のグルタミンをアルギニンに置換した改変型のアマドリアーゼの、εＦＫ／αＦＶは改変前の値である０．０９２より低い値を示した。また、表１８に示す通り、配列番号１記載のアミノ酸配列の２６１位のチロシンをフェニルアラニン、またはトリプトファンに置換した改変型のアマドリアーゼ、配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸をアラニンに、かつ２５９位のバリンをシステインに置換した改変型のアマドリアーゼ、及び配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸をアラニンに、かつ１５４位のセリンをアスパラギンに、かつ２５９位のバリンをシステインに置換した改変型のアマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨはいずれも、改変前の値である０．３１０より低い値を示し、また、εＦＫ／αＦＶは改変前の値である０．０９２より低い値を示した。上記アミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であった。【０２５０】
また、野生型及び各改変型アマドリアーゼの精製標品を用いて酵素活性を測定して算出したεＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶの値は、野生型及び各改変型アマドリアーゼの粗酵素液を用いて酵素活性を測定して算出したεＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶの値との間に大きな乖離は認められなかった。従って、改変型アマドリアーゼの粗酵素液を用いて酵素活性の測定において基質特異性の改善が認められれば、改変型アマドリアーゼの精製酵素標品を用いた酵素活性の測定においても基質特異性の改善が認められると見なすことが可能である。
【実施例１８】
【０２５１】
（改変型アマドリアーゼによるαＦＶＨの定量）
次に、改変型アマドリアーゼを用いてＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端よりプロテアーゼ等により遊離されるαＦＶＨを定量する際に、共存するεＦＫが測定値に与える影響について評価した。【０２５２】
Ｃ．：試薬の調製
（４）試薬４：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液
７．５ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１５０ｍｇの４−アミノアンチピリン（東京化成社製）を０．１５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、１０００ｍｌに定容する。【０２５３】
（５）試薬５：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。【０２５４】
（６）試薬６：アマドリアーゼ溶液
精製した配列番号１記載のアマドリアーゼ、及び配列番号１記載のアマドリアーゼの９８位のグルタミン酸をアラニンに、かつ１５４位のセリンをアスパラギンに、かつ２５９位のバリンをシステインに置換した改変型のアマドリアーゼ（配列番号２７１）を０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈し、それぞれ１．０Ｕ／ｍｌ、２．３Ｕ／ｍｌとなるように調製した。【０２５５】
（７）試薬７：αＦＶＨ溶液
αＦＶＨ  ６２５ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容することにより、１５０ｍＭのαＦＶＨ溶液を調製した。続いて、１５０ｍＭのαＦＶＨ溶液をイオン交換水により希釈することで、９０μＭ、１８０μＭ、２７０μＭ、３６０μＭ、４５０μＭのαＦＶＨ溶液を調製した。【０２５６】
（８）試薬８：血液モデル試料
εＦＫ  ４６２ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容することで調製した１５０ｍＭのεＦＫ溶液と、（７）で調製した１５０ｍＭのαＦＶＨ溶液をイオン交換水で希釈し、以下の４種類の血液モデル溶液を調製した。【０２５７】
８−１．２１５μＭ  αＦＶＨ
８−２．２１５μＭ  αＦＶＨ、２１５μＭ  εＦＫ
８−３．２１５μＭ  αＦＶＨ、１０７５μＭ  εＦＫ
８−４．２１５μＭ  αＦＶＨ、２１５０μＭ  εＦＫ
なお、ヘモグロビン濃度１５ｇ／ｄＬ、ＨｂＡ１ｃ６．１％（ＪＤＳ値、ＮＧＳＰ値６．５％相当、ＩＦＣＣ値４６．５ｍｍｏｌ／ｍｏｌ相当）の血液では、ヘモグロビンの分子量を６５ｋＤａとすると、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端から遊離されるαＦＶＨの濃度は２１５μＭとなる。【０２５８】
（改変型アマドリアーゼによるαＦＶＨの定量性の確認）
１．８ｍｌの試薬４、１００μｌの試薬５、および１００μｌの試薬６を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、３７℃で５分間予備加温しておいた試薬７を１０００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度を測定し、その１分間あたりの吸光度変化量（ΔＡ５５５）を算出した。なお、対照液は、１０００μｌの試薬７の代わりに１０００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。結果を図２に示した。図２から明らかなように、αＦＶＨ濃度と吸光度変化量（ΔＡ５５５）には相関関係が成立した。従って、配列番号１記載のアマドリアーゼ、及び配列番号２７１記載の改変型アマドリアーゼは共に、９０μＭから４５０μＭの範囲でαＦＶＨの定量に用いることができることを確認した。【０２５９】
（改変型アマドリアーゼによる血液モデル試料の定量）
１．８ｍｌの試薬４、１００μｌの試薬５、および１００μｌの試薬６を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、３７℃で５分間予備加温しておいた試薬８−１から８−４のいずれかを１０００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度を測定し、その１分間あたりの吸光度変化量（ΔＡ５５５）を算出した。なお、対照液は、１０００μｌの試薬８−１から８−４の代わりに１０００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。結果を表１９に示した。表１９から明らかなように、配列番号１記載のアマドリアーゼを用いた場合、αＦＶＨと同濃度のεＦＫが共存すると、その測定値は本来の測定値と比較して３％弱の乖離が認められ、αＦＶＨの５倍、１０倍濃度のεＦＫが共存すると、その測定値は本来の測定値と比較して８％、１７％の乖離が認められた。それに対し、配列番号２７１記載の改変型アマドリアーゼを用いた場合にはαＦＶＨの同濃度、５倍濃度のεＦＫが共存しても、本来の測定値との乖離は１％弱であり、また、αＦＶＨの１０倍濃度のεＦＫが共存しても、本来の測定値との乖離は２％弱である。従って、配列番号２７１記載の改変型アマドリアーゼを用いれば、εＦＫが共存している試料でも正確にαＦＶＨのみを定量することが可能である。
【表１９】
2012018094.tif 000021
【実施例１９】
【０２６０】
（アスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子のクローニングおよび大腸菌での発現）
（ａ）アスペルギルス・ニードランスＦＧＳＣ Ａ２６株からの全ＲＮＡの抽出
アスペルギルス・ニードランスＦＧＳＣ Ａ２６株を、液体培地（０．４％イーストエキストラクト、１．０％マルツエキストラクト、０．１％トリプトン、０．１％リン酸２水素１カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、２．０％グルコース、ｐＨ６．５）において、３０℃で２４時間培養した。培養後、回収した菌体を液体窒素で粉砕し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて付属のプロトコールに従い全ＲＮＡを調製した。また、調製した全ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（インビトロジェン社製）で処理することにより、ＤＮＡの混入を防いだ。【０２６１】
（ｂ）アスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼｃＤＮＡのクローニング
得られた全ＲＮＡ１μｇを用いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉt（タカラバイオ社製）により、付属のプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。このとき、逆転写反応ではＫｉｔ付属のＯｌｉｇｏ  ｄＴ  Ｐｒｉｍｅｒを用い、その後のＰＣＲ反応では配列番号１６９、１７０  に示した合成オリゴヌクレオチドを用いた。その結果、約１３００ｂｐのｃＤＮＡ断片が特異的に増幅した。次に、この増幅したｃＤＮＡ断片についてシーケンス解析を行った結果、配列番号１７１に示した１３１７ｂｐからなる塩基配列であることがわかった。また、配列番号１７１より予想されるアミノ酸配列（配列番号１７２）は図１のアスペルキルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの配列と一致していた。【０２６２】
（ｃ）アスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの大腸菌での発現
続いて、アスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記でクローニングしてきたｃＤＮＡ断片は配列番号１６９、１７０に示した合成ヌクレオチド由来のＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトをそれぞれ５´末端と３´末端に有しているため、クローニングしてきたｃＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ´を取得した。【０２６３】
次に、アスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ´を鋳型にして、配列番号１７３、１７４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１７２記載のアミノ酸配列の５９位のセリンがグリシンに置換されたアスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ）を取得した。そして、この得られた組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ニッポンジーン社製）に形質転換することで、アスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを産生する大腸菌を取得した。【０２６４】
上記で得られたアスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを産生する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １（ノバジェン社製）の試薬を加えたＬＢ−ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することで粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法により、αＦＶに対する酵素活性を測定したところ、２．２Ｕ／ｍｌであった。ただし、このときの活性測定の試薬１はｐＨ７．５に調整したものを使用した。
【実施例２０】
【０２６５】
（アスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを鋳型にして、配列番号１７５、１７６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１７２記載のアミノ酸配列の１５３位のシステインがアスパラギン酸に置換されたアスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ−Ｃ１５３Ｄ）を得た。【０２６６】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを鋳型にして、配列番号１７７、１７８及び１７９、１８０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１７２記載のアミノ酸配列の２５９位のバリンがそれぞれアラニン、システインに置換されたアスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ−Ｖ２５９Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ−Ｖ２５９Ｃ）を得た。【０２６７】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸを鋳型にして、配列番号１８１、１８２及び１８３、１８４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１７２記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンがそれぞれリジン、アルギニンに置換されたアスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ−Ｇ２６３Ｋ、ｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ−Ｇ２６３Ｒ）を得た。
【実施例２１】
【０２６８】
（点変異を導入したアスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの基質特異性改善効果の評価）
上記で得られた組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ、ｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ−Ｃ１５３Ｄ、ｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ−Ｖ２５９Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ−Ｖ２５９Ｃ、ｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ−Ｇ２６３Ｋ、ｐＥＴ２２ｂ−ＡｎＦＸ−Ｇ２６３Ｒをそれぞれ保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １（ノバジェン社製）の試薬を加えたＬＢ−ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することで粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法により、αＦＶ、αＦＶＨ及びεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。ただし、このときの活性測定の試薬１はｐＨ７．５に調整したものを使用した。結果を表２０に示す。
【表２０】
2012018094.tif 000022
【０２６９】
表２０に示したように、配列番号１７２記載のアミノ酸配列の１５３位のシステインをアスパラギン酸に、２５９位のバリンをアラニンまたはシステインに、２６３位のグリシンをリジンまたはアルギニンに置換することにより、アスペルギルス・ニードランス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのεＦＫ／αＦＶＨ及びεＦＫ／αＦＶはいずれも置換前より低い値となった。よって、これらアミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であることがわかった。
【実施例２２】
【０２７０】
（ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子のクローニングおよび大腸菌での発現）
（ａ）ペニシリウム・クリソゲナムＮＢＲＣ９２５１株からの全ＲＮＡの抽出
ペニシリウム・クリソゲナムＮＢＲＣ９２５１株を、液体培地（０．４％イーストエキストラクト、１．０％マルツエキストラクト、０．１％トリプトン、０．１％リン酸２水素１カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、２．０％グルコース、ｐＨ６．５）において、３０℃で２４時間培養し、上記と同様の手順で全ＲＮＡを調製した。【０２７１】
（ｂ）ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼｃＤＮＡのクローニング
得られた全ＲＮＡ１μｇを用いて、上記と同様にしてＲＴ−ＰＣＲを行った。このとき、逆転写反応ではＫｉｔ付属のＯｌｉｇｏ  ｄＴ  Ｐｒｉｍｅｒを用い、その後のＰＣＲ反応では配列番号１８５、１８６  に示した合成オリゴヌクレオチドを用いた。その結果、約１３００ｂｐのｃＤＮＡ断片が特異的に増幅した。次に、この増幅したｃＤＮＡ断片についてシーケンス解析を行った結果、配列番号１８７に示した１３１７ｂｐからなる塩基配列であることがわかった。また、配列番号１８７より予想されるアミノ酸配列（配列番号１８８）は、図１で記載したペニシリウム・ヤンシネラムの配列の６９番目のロイシンがトリプトファンに、１４２番目のスレオニンがアラニンに置換されたものと一致していた。【０２７２】
（ｃ）ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの大腸菌での発現
続いて、ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記でクローニングしてきたｃＤＮＡ断片は配列番号１８５、１８６に示した合成ヌクレオチド由来のＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトをそれぞれ５´末端と３´末端に有しているため、クローニングしてきたｃＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸ´を取得した。【０２７３】
次に、ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸ´を鋳型にして、配列番号１８９、１９０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１８８記載のアミノ酸配列の６０位のセリンがグリシンに置換されたペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸ）を取得した。そして、この得られた組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換することで、ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを産生する大腸菌を取得した。【０２７４】
上記で得られたペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを産生する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １（ノバジェン社製）の試薬を加えたＬＢ−ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ノバジェン社製）を用いて溶菌した後、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することで粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法により、αＦＶに対する酵素活性を測定したところ、０．０９０Ｕ／ｍｌであった。ただし、このときの活性測定の試薬１はｐＨ７．５に調整したものを使用した。
【実施例２３】
【０２７５】
（ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸを鋳型にして、配列番号１９１、１９２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１８８記載のアミノ酸配列の１１０位のリジンがアルギニンに置換されたペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸ−Ｋ１１０Ｒ）を得た。【０２７６】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＰｃＦＸを鋳型にして、配列番号１９３、１９４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１８８記載のアミノ酸配列の１５４位のシステインがアスパラギン酸に置換されたペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸ−Ｃ１５４Ｄ）を得た。【０２７７】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸを鋳型にして、配列番号１９５、１９６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１８８記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンがリジンに置換されたペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸ−Ｇ２６３Ｋ）を得た。
【実施例２４】
【０２７８】
（点変異を導入したペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの特性評価）
上記で得られた組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸ、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸ−Ｋ１１０Ｒ、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸ−Ｃ１５４Ｄ、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｃＦＸ−Ｇ２６３Ｋをそれぞれ保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １（ノバジェン社製）の試薬を加えたＬＢ−ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ノバジェン社製）を用いて溶菌した後、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することで粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法により、αＦＶ、αＦＶＨ及びεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。ただし、このときの活性測定の試薬１はｐＨ７．５に調整したものを使用した。結果を表２１に示す。
【表２１】
2012018094.tif 000023
【０２７９】
表２１に示したように、配列番号１８８記載のアミノ酸配列の１１０位のリジンをアルギニンに、１５４位のシステインをアスパラギン酸に置換することにより、ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのεＦＫ／αＦＶＨ及びεＦＫ／αＦＶはいずれも置換前より低い値となった。また、配列番号１８８記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンをリジンに置換することにより、ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのεＦＫ／αＦＶＨは置換前より低い値となった。よって、これらアミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であることがわかった。
【実施例２５】
【０２８０】
（クリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの大腸菌での発現）
既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列をもとに、ゲノムデータベース（http://www.genome.jp/tools/blast/）より検索したクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(Cryptococcus neoformans B-3501A: GENE ID: 4934641 CNBB5450  hypothetical protein)について、Ｃ末端から３４アミノ酸を除いた、配列番号１９７で示す４４３アミノ酸を大腸菌で発現させることを試みた。そこで、配列番号１９７のアミノ酸配列をコードし、且つ大腸菌発現用にコドンを最適化した、配列番号１９８で示す１３３２ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＧＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号１の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列は図１のクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのＣ末端から３４アミノ酸を除いた配列と一致していることを確認した。【０２８１】
続いて、取得した配列番号１９８の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸを取得し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。次に、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １（ノバジェン社製）の試薬を加えたＬＢ−ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することで粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法により、αＦＶに対する酵素活性を測定したところ、それぞれ２．２Ｕ／ｍｌであった。ただし、このときの活性測定の試薬１はｐＨ７．５に調整したものを使用した。
【実施例２６】
【０２８２】
（クリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＣｎＦＸを鋳型にして、配列番号１９９、２００の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１９７記載のアミノ酸配列の１００位のスレオニンがアルギニンに置換されたクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｔ１００Ｒ）を得た。【０２８３】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＣｎＦＸを鋳型にして、配列番号２０１、２０２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１９７記載のアミノ酸配列の１１０位のセリンがアルギニンに置換されたクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｓ１１０Ｒ）を得た。【０２８４】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＣｎＦＸを鋳型にして、配列番号２０３、２０４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１９７記載のアミノ酸配列の１５４位のセリンがアスパラギンに置換されたクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｓ１５４Ｎ）を得た。【０２８５】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸを鋳型にして、配列番号２０５、２０６及び２０７、２０８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１９７記載のアミノ酸配列の２５９位のバリンがそれぞれアラニン、システインに置換されたクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｖ２５９Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｖ２５９Ｃ）を得た。【０２８６】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸを鋳型にして、配列番号２０９、２１０及び２１１、２１２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１９７記載のアミノ酸配列の２６３位のセリンがそれぞれリジン、アルギニンに置換されたクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｓ２６３Ｋ、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｓ２６３Ｒ）を得た。
【実施例２７】
【０２８７】
（点変異を導入したクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの特性評価）
上記で得られた組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｔ１００Ｒ、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｓ１１０Ｒ、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｓ１５４Ｎ、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｖ２５９Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｖ２５９Ｃ、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｓ２６３Ｋ、ｐＥＴ２２ｂ−ＣｎＦＸ−Ｓ２６３Ｒをそれぞれ保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １（ノバジェン社製）の試薬を加えたＬＢ−ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することで粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法により、αＦＶ、αＦＶＨ及びεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。ただし、このときの活性測定の試薬１はｐＨ７．５に調整したものを使用した。結果を表２２に示す。
【表２２】
2012018094.tif 000024
【０２８８】
表２２に示したように、配列番号１９７記載のアミノ酸配列の１００位のスレオニンをアルギニンに、１１０位のセリンをアルギニンに、１５４位のセリンをアスパラギンに、２５９位のバリンをアラニンまたはシステインに、２６３位のセリンをリジンまたはアルギニンに置換することにより、クリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのεＦＫ／αＦＶＨ及びεＦＫ／αＦＶはいずれも置換前より低い値となった。よって、これらアミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であることがわかった。
【実施例２８】
【０２８９】
（ネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼの大腸菌での発現）
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼを大腸菌で発現させることを試みた。すでに明らかになっているネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号２１３に示した（特許文献１参照）。この配列番号２１３で示した４４１アミノ酸をコードし、且つ大腸菌発現用にコドンを最適化した、配列番号２１４で示す１３２６ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＧＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号１の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図１のネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼの配列と一致していることを確認した。【０２９０】
続いて、取得した配列番号２１４の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸを取得し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。次に、この組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １（ノバジェン社製）の試薬を加えたＬＢ−ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することで粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法により、αＦＶに対する酵素活性を測定したところ、１９．３Ｕ／ｍｌであった。ただし、このときの活性測定の試薬１はｐＨ７．５に調整したものを使用した。
【実施例２９】
【０２９１】
（ネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入）
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号２１５、２１６及び２１７、２１８及び２１９、２２０及び２２１、２２２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２１３記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸がそれぞれグルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニンに置換されたネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｅ９８Ｑ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｅ９８Ｈ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｅ９８Ｋ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｅ９８Ｒ）を得た。【０２９２】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号２２３、２２４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のケトアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２１３記載のアミノ酸配列の１０３位のグリシンがアルギニンに置換されたネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｇ１０３Ｒ）を得た。【０２９３】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号２２５、２２６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のケトアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２１３記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミン酸がアルギニンに置換されたネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｅ１１０Ｒ）を得た。【０２９４】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号２２７、２２８及び２２９、２３０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のケトアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２１３記載のアミノ酸配列の１５４位のセリンがそれぞれアスパラギン、アスパラギン酸に置換されたネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｓ１５４Ｎ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｓ１５４Ｄ）を得た。【０２９５】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号２３１、２３２及び２３３、２３４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のケトアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２１３記載のアミノ酸配列の２５９位のバリンがそれぞれアラニン、システインに置換されたネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｖ２５９Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｖ２５９Ｃ）を得た。【０２９６】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号２３５、２３６及び２３７、２３８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のケトアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２１３記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンがそれぞれリジン、アルギニンに置換されたネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｇ２６３Ｋ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｇ２６３Ｒ）を得た。【０２９７】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号２３９、２４０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のケトアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２１３記載のアミノ酸配列の６６位のリジンがグリシンに、６７位のバリンがプロリンに置換されたネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｋ６６ＧＶ６７Ｐ）を得た。
【実施例３０】
【０２９８】
（点変異を導入したネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼの特性評価）
上記で得られた組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｅ９８Ｑ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｅ９８Ｈ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｅ９８Ｋ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｅ９８Ｒ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｅ１１０Ｒ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｓ１５４Ｎ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｓ１５４Ｄ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｖ２５９Ａ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｖ２５９Ｃ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｇ２６３Ｋ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｇ２６３Ｒ、ｐＥＴ２２ｂ−ＮｖＦＸ−Ｋ６６ＧＶ６７Ｐをそれぞれ保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １（ノバジェン社製）の試薬を加えたＬＢ−ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することで粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法により、αＦＶ、αＦＶＨ及びεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。ただし、このときの活性測定の試薬１はｐＨ７．５に調整したものを使用した。結果を表２３に示す。
【表２３】
2012018094.tif 000025
【０２９９】
表２３に示したように、配列番号２１３記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸をグルタミンまたはヒスチジンまたはリジンまたはアルギニンに、１０３位のグリシンをアルギニンに、１１０位のグルタミン酸をアルギニンに、１５４位のセリンをアスパラギンまたはアスパラギン酸に、２５９位のバリンをアラニンまたはシステインに、２６３位のグリシンをリジンまたはアルギニンに置換することにより、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのεＦＫ／αＦＶＨ及びεＦＫ／αＦＶはいずれも置換前より低い値となった。また、６６位のリジンをグリシンに、かつ６７位のバリンをプロリンに置換することにより、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ケトアミンオキシダーゼのεＦＫ／αＦＶＨは置換前より低い値となった。よって、これらアミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であることがわかった。
【実施例３１】
【０３００】
（ユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼ遺伝子への点変異導入）
配列番号２４１は熱安定性向上型変異（Ｇ１８４Ｄ、Ｎ２７２Ｄ、Ｈ３８８Ｙ）を導入したユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼのアミノ酸配列であり、配列番号２４１のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号２４２）を挿入した組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５を大腸菌で発現させることにより、ユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼの活性が確認されている（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）。【０３０１】
ユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼに基質特異性向上型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５を鋳型にして、配列番号２４３、２４４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＤＨ５αの形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２４１記載のアミノ酸配列の９８位のセリンがアラニンに置換されたユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｓ９８Ａ）を得た。【０３０２】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５を鋳型にして、配列番号２４５、２４６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＤＨ５αの形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２４１記載のアミノ酸配列の１１０位のリジンがアルギニンに置換されたユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｋ１１０Ｒ）を得た。【０３０３】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５を鋳型にして、配列番号２４９、２５０及び２５１、２５２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＤＨ５αの形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２４１記載のアミノ酸配列の２５９位のバリンがそれぞれアラニン、システインに置換されたユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｖ２５９Ａ、ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｖ２５９Ｃ）を得た。【０３０４】
続いて、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５を鋳型にして、配列番号２５３、２５４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＤＨ５αの形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２４１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンがリジンに置換されたユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｇ２６３Ｋ）を得た。
【実施例３２】
【０３０５】
（点変異を導入したユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼの基質特異性改善効果の評価）
上記で得られた組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｓ９８Ａ、ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｋ１１０Ｒ、ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｖ２５９Ａ、ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｖ２５９Ｃ、ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｇ２６３Ｋをそれぞれ保持する大腸菌ＤＨ５α株を、０．１ＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することで粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法により、αＦＶ、αＦＶＨ及びεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。ただし、このときの活性測定の試薬１はｐＨ８．０に調整したものを使用した。活性測定結果を表２４に示す。
【表２４】
2012018094.tif 000026
【０３０６】
表２４に示したように、配列番号２４１記載のアミノ酸配列の９８位のセリンをアラニンに、１１０位のリジンをアルギニンに、２５９位のバリンをアラニンまたはシステインに、２６３位のグリシンをリジンに置換することにより、ユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼのεＦＫ／αＦＶＨ及びεＦＫ／αＦＶはいずれも置換前より低い値となった。よって、これらアミノ酸置換は基質特異性が改善されたアマドリアーゼの作製に有効な置換であることがわかった。
【実施例３３】
【０３０７】
（ユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼ遺伝子の基質特性向上型多重変異体の作製）
ユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼ遺伝子の基質特異性向上型多重変異体を作製することで、εＦＫへの反応性を著しく低下させたアマドリアーゼの開発に試みた。【０３０８】
組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｖ２５９Ｃを鋳型にして、配列番号２４３、２４４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＤＨ５αの形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２４１記載のアミノ酸配列の９８位のセリンがアラニンに、２５９位のバリンがシステインに置換されたユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｓ９８Ａ／Ｖ２５９Ｃ）を得た。【０３０９】
同様にして、基質特異性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｋ１１０Ｒを鋳型にして、配列番号２４７、２４８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＤＨ５αの形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２４１記載のアミノ酸配列の１１０位のリジンがアルギニンに、１５４位のシステインがアスパラギンに置換されたユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｋ１１０Ｒ／Ｃ１５４Ｎ）を得た。【０３１０】
同様にして、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｖ２５９Ｃを鋳型にして、配列番号２４５、２４６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＤＨ５αの形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２４１記載のアミノ酸配列の１１０位のリジンがアルギニンに、２５９位のバリンがシステインに置換されたユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｋ１１０Ｒ／Ｖ２５９Ｃ）を得た。【０３１１】
同様にして、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｓ９８Ａ−Ｖ２５９Ｃを鋳型にして、配列番号２４５、２４６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＤＨ５αの形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号２４１記載のアミノ酸配列の９８位のセリンがアラニンに、１１０位のリジンがアルギニンに、２５９位のバリンがシステインに置換されたユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｓ９８Ａ／Ｋ１１０Ｒ／Ｖ２５９Ｃ）を得た。
【実施例３４】
【０３１２】
（ユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼ遺伝子への基質特性向上型多重変異の導入による基質特異性改善効果の評価）
上記で得られた組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｓ９８Ａ／Ｖ２５９Ｃ、ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｋ１１０Ｒ／Ｃ１５４Ｎ、ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｋ１１０Ｒ／Ｖ２５９Ｃ、ｐＵＴＥ１００Ｋ´−ＥＦＰ−Ｔ５−Ｓ９８Ａ／Ｋ１１０Ｒ／Ｖ２５９Ｃをそれぞれ保持する大腸菌ＤＨ５α株を、０．１ＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することで粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法により、αＦＶ、αＦＶＨ及びεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。ただし、このときの活性測定の試薬１はｐＨ８．０に調整したものを使用した。活性測定結果を表２５に示す。
【表２５】
2012018094.tif 000027
【０３１３】
表２５に示したように、多重アミノ酸置換が導入されたユウペニシリウム・テレナム由来アマドリアーゼでは、εＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶはいずれも各アミノ酸置換を単独で導入した場合と比較してさらに低い値となり、εＦＫへの反応性が著しく低下することが明らかとなった。
【実施例３５】
【０３１４】
（組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡの調製）
配列番号２７２は熱安定性向上型変異（Ｇ１８４Ｄ、Ｆ２６５Ｌ、Ｎ２７２Ｄ、Ｈ３０２Ｒ、Ｈ３８８Ｙ）を導入したConiochaeta属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列であり、配列番号２７３の遺伝子にコードされている。【０３１５】
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号２７３）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、[実施例１]記載の方法と同様にして培養し、培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡを得た。【０３１６】
（組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡの部位特異的改変操作）
配列番号２７２記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸をアラニンに、１５４位のセリンをアスパラギンに、２５９位のバリンをシステインに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡを鋳型として、配列番号５５、５６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、[実施例１}に述べた条件と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、９８位のグルタミン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−Ｅ９８Ａ）を得た。【０３１７】
上記と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−Ｅ９８Ａ  ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３９、１４０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、９８位のグルタミン酸がアラニンに、１５４位のセリンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−Ｅ９８Ａ／Ｓ１５４Ｎ）を得た。【０３１８】
さらに上記と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−Ｅ９８Ａ／Ｓ１５４Ｎ  ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５１、１５２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、９８位のグルタミン酸がアラニンに、１５４位のセリンがアスパラギンに、２５９位のバリンがシステインに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−Ｅ９８Ａ／Ｓ１５４Ｎ／Ｖ２５９Ｃ）を得た。【０３１９】
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼ生産能を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、上記[実施例１]（３）記載の方法で培養して、各種改変型アマドリアーゼの粗酵素液０．６ｍｌを調製した。【０３２０】
このようにして調製した酵素液について上記Ｂ：活性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定し、εＦＫ／αＦＶＨおよびεＦＫ／αＦＶを算出した。なお、活性測定にはｐＨ７．０に調整した試薬１：パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン溶液を用いた。結果を表２６に示す。
【表２６】
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【０３２１】
表２６中の多重アミノ酸置換が導入された改変型アマドリアーゼでは、εＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶはいずれも変異導入以前と比較して極めて低い値となった。故に、配列番号１に示したアマドリアーゼの基質特異性改善に効果的な単一変異を、配列番号２７２に示したアマドリアーゼに蓄積させることによっても、極めて大きな基質特異性の改善が見込めることが明らかとなった。
【図１】
2012018094.tif 000029
【図２】
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【配列表】
2012018094000001.app
【国際調査報告】
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