(57)【要約】本明細書に開示される主題は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体及びバイエピトープ性抗体、ならびにかかる抗体のスクリーニング方法、ならびにかかる二重特異性抗体及びバイエピトープ性抗体のスクリーニングに使用することができる新規の抗体構造に関する。本開示は、二重特異性抗ＫＬＢ抗体、及びこれらの抗体を使用する疾患の治療方法を更に提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の抗原結合ポリペプチドを含む単離された多重特異性抗体であって、前記第１の抗原結合ポリペプチドが、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順序でＮ末端からＣ末端への方向に位置付けられる、ＶＬドメイン、リンカー、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、前記多重特異性抗体。
【請求項２】
前記多重特異性抗体がＣＬドメインを含まない、請求項１に記載の多重特異性抗体。
【請求項３】
ＣＬドメインを更に含む、請求項１に記載の多重特異性抗体。
【請求項４】
前記ＣＬドメインが、１つ以上のジスルフィド架橋によって前記第１の抗原結合ポリペプチドに連結する、請求項３に記載の多重特異性抗体。
【請求項５】
前記ジスルフィド架橋が、前記ＣＬドメインを前記第１の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ１ドメインと連結させる、請求項４に記載の多重特異性抗体。
【請求項６】
第２の抗原結合ポリペプチドを更に含み、前記第２の抗原結合ポリペプチドが、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順序でＮ末端からＣ末端への方向に位置付けられる、ＶＬドメイン、リンカー、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項７】
前記第２の抗原結合ポリペプチドがＣＬドメインを含まない、請求項６に記載の多重特異性抗体。
【請求項８】
前記多重特異性抗体が２つのＣＬドメインを含む、請求項６に記載の多重特異性抗体。
【請求項９】
前記２つのＣＬドメインが同じである、請求項８に記載の多重特異性抗体。
【請求項１０】
前記２つのＣＬドメインのうちの一方が、１つ以上のジスルフィド架橋によって前記第１の抗原結合ポリペプチドに連結し、前記２つのＣＬドメインのうちの２つ目が、１つ以上のジスルフィド架橋によって前記第２の抗原結合ポリペプチドに連結する、請求項８または９に記載の多重特異性抗体。
【請求項１１】
前記ジスルフィド架橋が、前記ＣＬドメインを前記第１の抗原結合ポリペプチド及び前記第２の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ１ドメインと連結させる、請求項１０に記載の多重特異性抗体。
【請求項１２】
前記第１及び第２の抗原結合ポリペプチドが、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合する、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１３】
前記第１及び第２の抗原結合ポリペプチドが、２つの異なる抗原に結合する、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１４】
前記リンカーが、１つ以上のグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１５】
前記リンカーが約１〜約５０アミノ酸長を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１６】
前記リンカーが約２０アミノ酸長である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１７】
前記リンカーがＧ４Ｓ反復を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１８】
前記リンカーが配列番号６８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項１９】
前記リンカーが切断可能である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項２０】
前記第１の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインと前記第２の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインとが、多重特異性抗体の形成を促進するように改変されている界面で会合する、請求項６〜１９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項２１】
（ａ）前記第１の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインの１つ以上のアミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有する１つ以上のアミノ酸残基で代置されて、前記第２の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインと相互作用する前記第１の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインの表面に突起を発生させ、
（ｂ）前記第２の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインの１つ以上のアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有する１つ以上のアミノ酸残基で代置されて、前記第１の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインと相互作用する前記第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインの表面上に空洞を発生させる、請求項２０に記載の多重特異性抗体。
【請求項２２】
前記より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の多重特異性抗体。
【請求項２３】
前記より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の多重特異性抗体。
【請求項２４】
前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥアイソタイプである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項２５】
前記抗体がＩｇＧアイソタイプである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項２６】
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項２５に記載の多重特異性抗体。
【請求項２７】
前記多重特異性抗体が、アゴニスト多重特異性抗体またはアンタゴニスト多重特異性抗体である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項２８】
前記多重特異性抗体が二重特異性抗体である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項２９】
前記二重特異性抗体がアゴニスト性バイエピトープ性抗体である、請求項２８に記載の多重特異性抗体。
【請求項３０】
第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドを含む単離されたバイエピトープ性アゴニスト抗体であって、前記第１及び第２の抗原結合ポリペプチドの各々が、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順序でＮ末端からＣ末端への方向に位置付けられる、ＶＬドメイン、リンカー、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、前記バイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項３１】
前記第１及び第２の抗原結合ポリペプチドが、同じ抗原上の２つの異なるエピトープに結合する、請求項３０に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項３２】
前記バイエピトープ性抗体がＣＬドメインを含まない、請求項３０または３１に記載のバイエピトープ性抗体。
【請求項３３】
２つのＣＬドメインを更に含む、請求項３０または３１に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項３４】
前記２つのＣＬドメインが同じである、請求項３３に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項３５】
前記２つのＣＬドメインのうちの一方が、１つ以上のジスルフィド架橋によって前記第１の抗原結合ポリペプチドに連結し、前記２つのＣＬドメインのうちの２つ目が、１つ以上のジスルフィド架橋によって前記第２の抗原結合ポリペプチドに連結する、請求項３３または３４に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項３６】
前記ジスルフィド架橋が、前記ＣＬドメインを前記第１の抗原結合ポリペプチド及び前記第２の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ１ドメインと連結させる、請求項３５に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項３７】
前記リンカーが、１つ以上のグリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含む、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項３８】
前記リンカーが約１〜約５０アミノ酸長を有する、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項３９】
前記リンカーが約２０アミノ酸長である、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項４０】
前記リンカーがＧ４Ｓ反復を含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項４１】
前記リンカーが配列番号６８のアミノ酸配列を含む、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項４２】
前記リンカーが切断可能である、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項４３】
前記第１の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインと前記第２の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインとが、多重特異性抗体の形成を促進するように改変されている界面で会合する、請求項３０〜４２のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項４４】
（ａ）前記第１の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインの１つ以上のアミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有する１つ以上のアミノ酸残基で代置されて、前記第２の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインと相互作用する前記第１の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインの表面に突起を発生させ、
（ｂ）前記第２の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインの１つ以上のアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有する１つ以上のアミノ酸残基で代置されて、前記第１の抗原結合ポリペプチドの前記ＣＨ３ドメインと相互作用する前記第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインの表面上に空洞を発生させる、請求項３０〜４３のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項４５】
前記より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される、請求項４４に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項４６】
前記より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される、請求項４４に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項４７】
前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥアイソタイプである、請求項３０〜４６のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項４８】
前記抗体がＩｇＧアイソタイプである、請求項３０〜４７のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項４９】
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項３０〜４８に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項５０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体または請求項３０〜４９のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項５１】
請求項５０に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項５２】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体または請求項３０〜４９のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体を発現する、宿主細胞。
【請求項５３】
請求項５０に記載の核酸または請求項５１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５４】
ＣＬドメインをコードする核酸を更に含む、請求項５３に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
多重特異性抗体の産生方法であって、請求項５２、５３、または５４に記載の宿主細胞を、前記多重特異性抗体の産生に十分な条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項５６】
バイエピトープ性アゴニスト抗体の産生方法であって、請求項５２、５３、または５４に記載の宿主細胞を、前記多重特異性抗体または前記バイエピトープ性アゴニスト抗体の産生に十分な条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項５７】
前記多重特異性抗体または前記バイエピトープ性アゴニスト抗体を前記培養から回収することを更に含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記多重特異性抗体または前記バイエピトープ性アゴニスト抗体を前記培養から回収することを更に含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
請求項５６または５７に記載の方法によって産生される、バイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項６０】
請求項１〜２９もしくは５８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体または請求項３０〜４９または５９のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項６１】
第２の治療剤を更に含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体または請求項３０〜４９のいずれか１項に記載のバイエピトープ性アゴニスト抗体を含む、キット。
【請求項６３】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を複数含む、ライブラリ。
【請求項６４】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を複数コードするポリヌクレオチドを複数含む、ライブラリ。
【請求項６５】
多重特異性抗体のスクリーニング方法であって、
（ａ）複数の多重特異性抗体を請求項６３または６４に記載のライブラリから得ることと、
（ｂ）前記複数の多重特異性抗体と第１及び第２の抗原または同じ抗原の第１及び第２のエピトープとの結合についてアッセイすることと、
（ｃ）前記第１及び第２の抗原または同じ抗原の前記第１及び第２のエピトープに結合する多重特異性抗体を識別することと、を含む、前記方法。
【請求項６６】
多重特異性抗体の識別方法であって、
（ａ）請求項１〜２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を細胞中で発現させることと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）の多重特異性抗体を第１の抗原及び第２の抗原または同じ抗原の第１のエピトープ及び第２のエピトープと接触させることと、
（ｃ）前記第１の抗原及び前記第２の抗原または同じ抗原の前記第１のエピトープ及び前記第２のエピトープに結合する多重特異性抗体を識別することと、を含む、前記方法。
【請求項６７】
バイエピトープ性アゴニスト抗体のスクリーニング方法であって、
（ａ）複数の多重特異性抗体を請求項６３または６４に記載のライブラリから得ることと、
（ｂ）前記複数の多重特異性抗体と、同じ抗原の第１及び第２のエピトープとの結合についてアッセイすることと、
（ｃ）１つ以上のバイエピトープ性アゴニスト抗体を、同じ抗原の前記第１及び第２のエピトープに結合する前記複数の多重特異性抗体から識別することと、
（ｄ）前記バイエピトープ性抗体を、アゴニスト活性を呈する前記１つ以上のバイエピトープ性アゴニスト抗体から識別して、バイエピトープ性アゴニスト抗体を得ることと、を含む、前記方法。
【請求項６８】
バイエピトープ性アゴニスト抗体のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１〜２９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を細胞中で発現させることと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）の多重特異性抗体を同じ抗原の第１のエピトープ及び第２のエピトープと接触させることと、
（ｃ）同じ抗原の前記第１のエピトープ及び前記第２のエピトープに結合する多重特異性抗体を識別して、バイエピトープ性抗体を得ることと、
（ｄ）前記バイエピトープ性抗体がアゴニスト活性を呈するかどうかを決定して、バイエピトープ性アゴニスト抗体を得ることと、を含む前記方法。
【請求項６９】
前記バイエピトープ性アゴニスト抗体の前記アゴニスト活性を、前記バイエピトープ性アゴニスト抗体が由来した単一特異性抗体と比較することを更に含む、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記多重特異性抗体を発現させることが、前記多重特異性抗体をコードする１つ以上の核酸を前記細胞に導入することを含む、請求項６６または６８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記多重特異性抗体が、前記第１及び第２の抗原または同じ抗原の前記第１及び第２のエピトープと、ステップ（ｂ）において同時に接触する、請求項６６または６８〜７０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項７２】
前記ステップ（ｂ）の多重特異性抗体が、前記多重特異性抗体を前記第１及び第２の抗原または同じ抗原の前記第１及び第２のエピトープに接触させる前に精製される、請求項６６または６８〜７１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項７３】
前記多重特異性抗体がタンパク質Ａクロマトグラフィーによって精製される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗原が生物複合体中にある、請求項６５〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞が原核細胞である、請求項６６または６８〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記原核細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞が真核細胞である、請求項６６または６８〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記真核細胞が酵母細胞または哺乳動物細胞である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記多重特異性抗体と前記第１及び／もしくは第２の抗原または第１及び／もしくは第２のエピトープとの結合が、ＥＬＩＳＡによって分析される、請求項６５〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
請求項６５〜８０のいずれかに記載の方法を使用して識別及び／または産生された、単離されたバイエピトープ性アゴニスト抗体。
【請求項８２】
ＫＬＢの２つのエピトープに結合する、単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８３】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号３４、３６、３８、４０、及び４２からなる群から選択され、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３、３５、３７、３９、及び４１からなる群から選択される、単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８４】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分であって、
（ａ）配列番号３〜７及びそれらの保存的置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号８〜１２及びそれらの保存的置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインと、
（ｃ）配列番号１３〜１７及びそれらの保存的置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインと、
（ｄ）配列番号１８〜２２及びそれらの保存的置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインと、
（ｅ）配列番号２３〜２７及びそれらの保存的置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインと、
（ｆ）配列番号２８〜３２及びそれらの保存的置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインと、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８５】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、
（ａ）配列番号３４に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３３に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号３６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３５に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号３８に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３７に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号４０に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３９に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、ならびに
（ｅ）配列番号４２に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号４１に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、からなる群から選択される、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８６】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、
（ａ）配列番号３４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３３に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号３６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３５に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号３８に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３７に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号４０に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号３９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、ならびに
（ｅ）配列番号４２に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域、及び配列番号４１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、からなる群から選択される、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８７】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域と、を含む、単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８８】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインが、配列番号３〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８７に記載の二重特異性抗体。
【請求項８９】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインが、配列番号８〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８７または請求項８８に記載の二重特異性抗体。
【請求項９０】
前記重鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインが、配列番号１３〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８７〜８９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９１】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインが、配列番号１８〜２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８７〜９０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９２】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインが、配列番号２３〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８７〜９１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９３】
前記軽鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインが、配列番号２８〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８７〜９２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項９４】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域と、を含み、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインが、
（ａ）配列番号３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２３に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２４に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；ならびに
（ｅ）配列番号７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２７に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、からなる群から選択される、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９５】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号３４に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸及びそれらの保存的置換を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸及びそれらの保存的置換を含む、単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９６】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号３６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸及びそれらの保存的置換を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３５に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸及びそれらの保存的置換を含む、単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９７】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号３８に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸及びそれらの保存的置換を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３７に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸及びそれらの保存的置換を含む、単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９８】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号４０に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸及びそれらの保存的置換を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３９に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸及びそれらの保存的置換を含む、単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９９】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号４２に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸及びそれらの保存的置換を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４１に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸及びそれらの保存的置換を含む、単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１００】
配列番号３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２３に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０１】
配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２４に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０２】
配列番号５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０３】
配列番号６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０４】
配列番号７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２７に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０５】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３４、３６、３８、４０、及び４２、ならびにそれらの保存的置換からなる群から選択され、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３、３５、３７、３９、及び４１、ならびにそれらの保存的置換からなる群から選択される、前記第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３４、３６、３８、４０、及び４２、ならびにそれらの保存的置換からなる群から選択され、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３、３５、３７、３９、及び４１、ならびにそれらの保存的置換からなる群から選択される、前記第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含み、
前記第１の抗体またはその抗原結合部分及び前記第２の抗体またはその抗原結合部分が、ＫＬＢ上に存在する異なるエピトープに結合する、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１０６】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３４に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３５に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１０７】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３４に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３８に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３７に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１０８】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３４に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号４０に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３９に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１０９】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３４に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号４２に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４１に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１１０】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３８に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３７に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３５に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１１１】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号４２に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４１に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３６に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３５に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１１２】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号４０に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３９に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３８に記載の配列と少なくとも９５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３７に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１１３】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号４２に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４１に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３８に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３７に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１１４】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号３６に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３５に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号４０に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３９に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１１５】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号４０に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３９に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２の抗体またはその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域が、配列番号４２に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４１に記載の配列と少なくとも８５％同一の配列を有するアミノ酸を含む、前記第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１１６】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）配列番号３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２３に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２４に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１１７】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）配列番号３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２３に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）配列番号５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１１８】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）配列番号３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２３に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）配列番号６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１１９】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）配列番号３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号８に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２３に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２８に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）配列番号７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２７に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１２０】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）配列番号５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２４に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１２１】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）配列番号６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２４に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１２２】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）配列番号７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２７に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）配列番号４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１４に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２４に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号２９に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１２３】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）配列番号５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）配列番号６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１２４】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）配列番号５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１５に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２５に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３０に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）配列番号７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２７に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１２５】
単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体であって、
（ａ）配列番号７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１７に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２７に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３２に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、
（ｂ）配列番号６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１６に記載の配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２６に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３１に記載の配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含む、前記単離された二重特異性抗ＫＬＢ抗体。
【請求項１２６】
単離された二重特異性抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第１のポリペプチドであって、前記重鎖可変領域が、配列番号３４、３６、３８、４０、及び４２、ならびにそれらの保存的置換からなる群から選択され、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３、３５、３７、３９、及び４１、ならびにそれらの保存的置換からなる群から選択される、前記第１のポリペプチドと、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチドであって、前記重鎖可変領域が、配列番号３４、３６、３８、４０、及び４２、ならびにそれらの保存的置換からなる群から選択され、前記軽鎖可変領域が、配列番号３３、３５、３７、３９、及び４１、ならびにそれらの保存的置換からなる群から選択される、前記第２のポリペプチドと、を含み、
前記第１及び第２のポリペプチドが、各々、ＫＬＢ上に存在する異なるエピトープに結合する、前記単離された二重特異性抗体。
【請求項１２７】
ＫＬＢ上に存在する２つのエピトープに結合し、前記２つのエピトープが前記ＫＬＢのＫＬ２ドメイン内に位置する、単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２８】
ＫＬＢ上に存在する２つのエピトープに結合し、前記ＫＬＢの２つのエピトープが前記ＫＬＢのＫＬ１ドメイン内に位置する、単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２９】
ＫＬＢ上に存在する２つのエピトープに結合し、前記ＫＬＢの２つのエピトープのうちの一方が前記ＫＬＢのＫＬ２ドメイン内に位置する、単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３０】
前記ＫＬＢ上に存在する２つのエピトープのうちの２つ目が前記ＫＬＢのＫＬ２ドメイン内に位置する、請求項１２９に記載の単離された二重特異性抗体。
【請求項１３１】
配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含む、ＫＬＢ上のエピトープに結合する、単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３２】
配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む、ＫＬＢ上のエピトープに結合する、単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３３】
配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含む、ＫＬＢ上のエピトープに結合する、単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３４】
前記抗体またはその抗原結合部分がＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃアゴニスト活性を有する、請求項８２〜１３３のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３５】
キメラ抗体またはその抗原結合部分である、請求項８２〜１３４のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３６】
前記抗体が完全長ＩｇＧ抗体である、請求項８２〜１３５のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３７】
ヒト化抗体またはその抗原結合部分である、請求項８２〜１３４のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３８】
前記抗原結合部分がＦ（ａｂ´）２または化学結合したＦ（ａｂ´）２である、請求項８２〜１３５または１３７のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３９】
前記抗体またはその抗原結合部分がＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体を活性化する、請求項８２〜１３８のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４０】
前記抗体またはその抗原結合部分がインビボの血中グルコース値を低下させる、請求項８２〜１３９のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４１】
前記抗体またはその抗原結合部分が骨密度に著しい影響を与えない、請求項８１〜１４０のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４２】
前記抗体またはその抗原結合部分が、約１０−８Ｍ以上の結合親和性でＫＬＢに結合する、請求項８２〜１４１のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４３】
代謝障害治療用の薬学的組成物の製造における請求項８２〜１４２のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体の使用であって、前記代謝障害が、多嚢胞性卵巣症候群、代謝症候群、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患、脂質異常症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、及び若年発症成人型糖尿病、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、及びＡＬＳ等の老齢疾患及び関連疾患からなる群から選択される、前記使用。
【請求項１４４】
代謝障害を有する個体の治療方法であって、治療有効量の請求項８２〜１４２のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項１４５】
第２の治療剤を前記個体に投与することを更に含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記代謝障害が、多嚢胞性卵巣症候群、代謝症候群、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患、脂質異常症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、及び若年発症成人型糖尿病、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、及びＡＬＳ等の老齢疾患及び関連疾患からなる群から選択される、請求項１４４または１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記代謝障害が糖尿病である、請求項１４４〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
請求項８２〜１４２のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１４９】
第２の治療剤を更に含む、請求項１４８に記載の組成物。
【請求項１５０】
個体におけるＫＬＢ−ＦＧＦＲ１受容体複合体の活性化方法であって、治療有効量の請求項８２〜１４２のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項１５１】
請求項８２〜１４２のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項１５２】
請求項８２〜１４２のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分を発現する、宿主細胞。
【請求項１５３】
請求項８２〜１４２のいずれか１項に記載の単離された二重特異性抗体またはその抗原結合部分を発現する、ハイブリドーマ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年１１月８日に出願された米国仮出願第６２／２５２，５４９号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年１１月７日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、名称が「ＢＢ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」、サイズが１７６，９４０バイトである。
【０００３】
本明細書に開示される主題は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体、及びかかる抗体のスクリーニング方法に関する。本明細書に開示される主題は、クロトー−ベータに結合する抗体、及びこれらの抗体を使用する疾患の治療方法を更に提供する。
【背景技術】
【０００４】
二重特異性抗体等の多重特異性抗体は、研究手段、診断手段、及び治療薬として重要である。これは主に、かかる抗体が、２つ以上の抗原または抗原中に存在する２つ以上のエピトープに高い特異性及び親和性で結合するように選択できるということに起因する。例えば、癌治療薬の場合、多重特異性抗体を使用して、癌細胞を、例えばその癌細胞に存在する抗原を免疫細胞に結合させることによって標的化して、免疫応答を誘発することができる。加えて、多重特異性抗体は、ヘテロ二量体受容体に対するリガンドとして使用することができ、このヘテロ二量体受容体は、通常は、それが受容体に結合し、受容体の構成要素間の相互作用を促進するときに、それらの同族リガンドによって活性化される。
【０００５】
多重特異性抗体は、これまで、所望の結合特性を保有するモノクローナル抗体等の抗体の化学結合断片によって産生され、またそれにより識別されてきた。この手順には、特異的抗体断片を生成し回収すること、架橋剤または相互作用する他の部分を使用して、断片をカップリングすること、及び抗体断片を連結させてヘテロ二量体を生成することが必要とされる。２つの重鎖−軽鎖対を共発現させることによる組換えＤＮＡ技法も使用されており、この場合、２つの重鎖−軽鎖は異なる結合特異性を有する。しかしながら、この手法は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせのため、異なる抗体分子の混合物を産生させる可能性があり、それらのうちのごく一部の分子のみが所望の多重特異性、例えば、二重特異性の構造を有する。例えば、これらの方法を使用すると、ホモ二量体が産生され得、重鎖が誤った軽鎖と対形成して、目的とする抗原またはエピトープへの所望の特異性を有しない抗体を産生させ得る。このため、ある特定の目的とする抗原及び／またはエピトープに対する多重特異性抗体、例えば、二重特異性及びバイエピトープ性抗体を識別及び選択するための改善した方法が当該技術分野で必要とされている。
【０００６】
多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、受容体のアゴニストとして機能することにおいて有用であることが分かっている（例えば、Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １０（１）：１−１８を参照されたい）。かかる抗体の恩恵を受け得る１つのかかる受容体はクロトー−ベータ（ＫＬＢ）である。ＫＬＢは、短い細胞内ドメインと、酵素活性に不可欠な特徴的なグルタミン酸残基を欠く２つの細胞外グリコシダーゼドメインとを有する、１１４−ｋＤａの１型膜貫通型タンパク質である（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９８：１１５−１１９）。哺乳動物種によってコードされる線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）の７つの主要アイソフォーム（１ｂ、２ｂ、３ｂ、１ｃ、２ｃ、３ｃ、及び４）のうち、ＦＧＦＲ１ｃ、２ｃ、及び３ｃが、補助受容体として作用するクロトー−ベータと相互作用して、ある特定のＦＧＦリガンドに対する機能的受容体複合体を形成することができる。例えば、クロトー−ベータとの複合体中に存在するＦＧＦＲ１ｃは、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）の代謝作用の媒介において中心的な役割を果たすようである（Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４（１８）：７４３２−３７；ＵＳ２０１０／０１８４６６５）。ＦＧＦ２１は、動物疾患モデルにおいて肥満及び２型糖尿病を回復させた強力な疾患修飾性タンパク質剤として特定された（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５（６）：１６２７−３５）。組換えＦＧＦ２１は、レプチンシグナル伝達欠損（ｏｂ／ｏｂまたはｄｂ／ｄｂ）マウスまたは高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられたマウスにおいて、肝臓脂質を減少させ、インスリン感受性を改善させ、血糖管理を正常化することが示されている。血中グルコースレベルの低下及び様々な心血管系危険因子の改善も、組換えＦＧＦ２１による治療を毎日受けた肥満及び糖尿病アカゲザルにおいて観察されている。
【０００７】
ＦＧＦＲ１ｃ及びＫＬＢを標的化する治療剤は、精力的な研究分野となっている。ＦＧＦＲ１ｃに特異的な抗体アンタゴニストは、マウス及びサルにおいて体重減少を誘導することが報告されており（ＷＯ２００５／０３７２３５）、アゴニスト抗体によって媒介されるＦＧＦＲ１ｃの選択的活性化は、糖尿病マウスにおけるＦＧＦ２１によるインスリン感作を再現するのに十分であった（ＷＯ２０１２／１５８７０４；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３（１１３）：１−１０）。ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体に結合する抗体は、活性化剤／治療剤として提案されている（ＵＳ７，５３７，９０３；ＷＯ２０１１／０７１７８３；ＷＯ２０１２／１５８７０４）。他の研究者らは、ＦＧＦＲ１ｃ／クロトー−ベータ複合体を選択的に活性化するための２つの代替的手法を調査した。Ｆｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．４：１６２ｒａ１５３は、ｍｉｍＡｂ１と呼ばれる高親和性抗クロトー−ベータ抗体を開示しており、米国特許第８，３７２，９５２号は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に連結する二重特異性抗ＦＧＦＲ１／クロトー−ベータアビマーポリペプチドＣ３２０１を開示している。グルコース代謝及び代謝性疾患におけるクロトー−ベータの重要な役割を考えると、当該技術分野で依然として治療用抗体及びＫＬＢ活性の調節方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書に開示される主題は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性及びバイエピトープ性抗体、ならびにかかる化合物のスクリーニング方法を提供する。本開示は、かかる抗体の産生及び分析方法を更に提供する。ある特定の態様において、本明細書に開示される主題は、抗ＫＬＢ抗体に更に関する。具体的には、本開示は、ＫＬＢ上に存在する少なくとも２つの異なるエピトープに特異的に結合する二重特異性抗体と、本二重特異性抗体、または単一特異性抗体各々の混合物を使用して、対象において疾患を治療するための方法とを提供する。
【０００９】
ある特定の実施形態では、本開示の単離された多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、第１の抗原結合ポリペプチドを含み、この第１の抗原結合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端への方向に位置付けられる、ＶＬドメイン、リンカー、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本二重特異性抗体は、ＶＬｆＨ（可変軽鎖完全重鎖）形式で構成される。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドの構成要素は、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順序でＮ末端からＣ末端への方向に位置付けられる。ある特定の実施形態では、本多重特異性抗体はＣＬドメインを含まない。あるいは、ある特定の実施形態では、本多重特異性抗体はＣＬドメインを更に含み得る。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体はｔｃＩｇＧ（三鎖（ｔｒｉ−ｃｈａｉｎ）ＩｇＧ）形式で構成される。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインは、１つ以上のジスルフィド架橋によって第１の抗原結合ポリペプチドに連結し得る。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインと第１の抗原結合ポリペプチドとの間のジスルフィド結合は、ＣＬドメインを第１の抗原結合ポリペプチドのＣＨ１ドメインと連結させる。
【００１０】
ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、第２の抗原結合ポリペプチドを更に含み得、この第２の抗原結合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端への方向に位置付けられる、ＶＬドメイン、リンカー、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合ポリペプチドの構成要素は、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順序でＮ末端からＣ末端への方向に位置付けられる。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合ポリペプチドはＣＬドメインを含まない。
【００１１】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は２つのＣＬドメインを含む。ある特定の実施形態では、２つのＣＬドメインは同じである。ある特定の実施形態では、２つのＣＬドメインの一方は、１つ以上のジスルフィド架橋によって第１の抗原結合ポリペプチドに連結し、２つのＣＬドメインのうちの２つ目は、１つ以上のジスルフィド架橋によって第２の抗原結合ポリペプチドに連結する。ある特定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、ＣＬドメインを第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ１ドメインと連結する。
【００１２】
本開示の多重特異性抗体が第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドを含むある特定の実施形態では、第１及び第２の抗原結合ポリペプチドは、同じ抗原上の２つの異なるエピトープに結合する。あるいは、第１及び第２の抗原結合ポリペプチドは２つの異なる抗原に結合する。ある特定の実施形態では、本多重特異性抗体はｔｃＢｓＩｇＧ形式で構成される。ある特定の実施形態では、本多重特異性抗体は、多重特異性アゴニスト抗体または多重特異性アンタゴニスト抗体であり得る。
【００１３】
本明細書に開示の抗体は、多重特異性アゴニスト抗体または多重特異性アンタゴニスト抗体であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題の多重特異性抗体は、二重特異性抗体、例えば、１つの標的に対するバイエピトープ性抗体、または２つの異なる標的に対する二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体はアゴニスト性バイエピトープ性抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体はアンタゴニスト性バイエピトープ性抗体である。
【００１４】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題は、第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドを含む単離されたバイエピトープ性アゴニスト抗体を提供し、第１及び第２の抗原結合ポリペプチドの各々は、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順序でＮ末端からＣ末端への方向に位置付けられる、ＶＬドメイン、リンカー、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本バイエピトープ性アゴニスト抗体の第１及び第２の抗原結合ポリペプチドは、同じ抗原上の２つの異なるエピトープに結合する。
【００１５】
ある特定の実施形態では、バイエピトープ性アゴニスト抗体はＣＬドメインを含まない。ある特定の実施形態では、バイエピトープ性アゴニスト抗体は２つのＣＬドメインを更に含む。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインは第１または第２の抗原結合ポリペプチドに共有結合しない。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインはＶＬドメインに共有結合しない。ある特定の実施形態では、ＶＬ及びＣＬは分離している。ある特定の実施形態では、この分離は、ＶＬとＣＬとの間の任意の結合部にあることができる。ある特定の実施形態では、結合部はＴ１０９にあり得る（即ち、ＣＬはＴ１０９で開始し得、ＶＬはＲ１０８で終結し得る）。ある特定の他の実施形態では、ＣＬはＶ１１０から開始し得る。
【００１６】
ある特定の実施形態では、２つのＣＬドメインは同じである。ある特定の実施形態では、バイエピトープ性アゴニスト抗体の２つのＣＬドメインは、１つ以上のジスルフィド架橋によって第１の抗原結合ポリペプチドに連結し、２つのＣＬドメインのうちの２つ目は、１つ以上のジスルフィド架橋によって第２の抗原結合ポリペプチドに連結する。ある特定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、ＣＬドメインを第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ１ドメインと連結する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、開示される抗体の抗原結合ポリペプチド内に存在するリンカーは、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を含み得る。ある特定の実施形態では、リンカーは約１〜約５０アミノ酸長を有する。ある特定の実施形態では、リンカーは約２０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、リンカーはＧ４Ｓ反復を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは配列番号６８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは切断可能である。
【００１８】
ある特定の実施形態では、開示される多重特異性抗体の第１の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインと第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインとは、多重特異性抗体の形成を促進するように改変されている界面で会合する。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインの１つ以上のアミノ酸残基は、より大きい側鎖体積を有する１つ以上のアミノ酸残基で代置されて、第１の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインの表面に突起を発生させる。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインの１つ以上のアミノ酸残基は、より小さい側鎖体積を有する１つ以上のアミノ酸残基で代置されて、第１の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインの表面上の突起と相互作用する第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインの表面上に空洞を発生させる。ある特定の実施形態では、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）を含み得る。ある特定の実施形態では、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）を含み得る。ある特定の実施形態では、突起等のノブ突然変異は、Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ付番）を含み得る。ある特定の実施形態では、空洞等のホール突然変異（複数可）は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ付番）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または全てを含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題の多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥアイソタイプのものである。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題の多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体は、ＩｇＧアイソタイプのものである。ある特定の実施形態では、本多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。ある特定の実施形態では、バイエピトープ性抗体はバイエピトープ性アゴニスト抗体である。
【００１９】
本明細書に開示される主題は、本開示の多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体をコードする配列を含む単離された核酸を更に提供する。ある特定の実施形態では、バイエピトープ性抗体はバイエピトープ性アゴニスト抗体である。本明細書に開示される主題は、開示される核酸を含むベクターを更に提供する。
【００２０】
本明細書に開示される主題は、本開示の多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体を発現する宿主細胞を更に提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体をコードする１つ以上の核酸を含む宿主細胞を提供する。例えば、限定するものではなく、本宿主細胞は、第１の抗原結合ポリペプチドをコードする核酸と、第２の抗原結合ポリペプチドをコードする別個の核酸とを含み得る。あるいは、本宿主細胞は、第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。ある特定の実施形態では、本宿主細胞は、ＣＬドメインをコードする別個の核酸、例えば、第２の核酸または第３の核酸を更に含む。ある特定の実施形態では、バイエピトープ性抗体はバイエピトープ性アゴニスト抗体である。
【００２１】
本明細書に開示される主題は、多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体、例えば、バイエピトープ性アゴニスト抗体の産生方法を更に提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体の産生に十分な条件下で宿主細胞を培養することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、例えば、精製技法によって、多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体を培地から回収することを更に含み得る。ある特定の実施形態では、バイエピトープ性抗体はバイエピトープ性アゴニスト抗体である。
【００２２】
別の態様では、本明細書に開示される主題は、本明細書に開示される多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体を含む薬学的組成物を更に提供する。ある特定の実施形態では、本組成物は第２の治療剤を更に含む。本明細書に開示される主題は、本明細書に開示される多重特異性抗体もしくはバイエピトープ性抗体またはその組成物を含むキットを更に提供する。ある特定の実施形態では、バイエピトープ性抗体はバイエピトープ性アゴニスト抗体である。
【００２３】
本明細書に開示される主題は、複数の開示される多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体を含むライブラリを更に提供する。ある特定の実施形態では、ライブラリは、複数の本明細書に開示される多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体をコードする複数のポリヌクレオチドを含み得る。
【００２４】
別の態様では、本明細書に開示される主題は、多重特異性抗体のスクリーニング方法を更に提供する。例えば、限定するものではなく、本明細書に開示される方法を使用して、抗体が同じ抗原上の２つのエピトープに結合するバイエピトープ性抗体をスクリーニングすることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を呈する多重特異性抗体、例えば、二重特異性またはバイエピトープ性抗体を識別することができる。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）複数の多重特異性抗体をライブラリから得ることと、（ｂ）複数の多重特異性抗体と第１及び第２の抗原または同じ抗原上の第１及び第２のエピトープとの結合についてアッセイすることと、（ｃ）第１及び第２の抗原または同じ抗原上の第１及び第２のエピトープに結合する多重特異性抗体を識別することと、を含み得る。
【００２５】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体のスクリーニング方法は、（ａ）多重特異性抗体を細胞中で発現させることと、（ｂ）ステップ（ａ）の多重特異性抗体を第１の抗原及び第２の抗原または同じ抗原の第１のエピトープ及び第２のエピトープと接触させることと、（ｃ）第１の抗原及び第２の抗原または同じ抗原上の第１のエピトープ及び第２のエピトープに結合する多重特異性抗体を識別することと、を含み得る。
【００２６】
更なる態様では、本明細書に開示される主題は、バイエピトープ性アゴニストまたはアンタゴニスト抗体のスクリーニング方法を更に提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）複数の多重特異性抗体をライブラリから得ることと、（ｂ）複数の多重特異性抗体と、同じ抗原の第１及び第２のエピトープとの結合についてアッセイすることと、（ｃ）同じ抗原の第１及び第２のエピトープに結合する１つ以上のバイエピトープ性抗体を識別することと、（ｄ）バイエピトープ性抗体を、アゴニストまたはアンタゴニスト活性を呈する１つ以上のバイエピトープ性抗体から識別して、バイエピトープ性アゴニストまたはアンタゴニスト抗体を得ることと、を含み得る。ある特定の実施形態では、本方法は、バイエピトープ性アゴニストまたはアンタゴニスト抗体のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を、バイエピトープ性アゴニストまたはアンタゴニスト抗体が由来した単独または組み合わせでの１つ以上の単一特異性親抗体と比較することを更に含み得る。
【００２７】
ある特定の実施形態では、バイエピトープ性アゴニストまたはアンタゴニスト抗体のスクリーニング方法は、（ａ）多重特異性抗体を細胞中で発現させることと、（ｂ）ステップ（ａ）の多重特異性抗体を同じ抗原の第１のエピトープ及び第２のエピトープと接触させることと、（ｃ）同じ抗原の第１のエピトープ及び第２のエピトープに結合する多重特異性抗体を識別して、バイエピトープ性抗体を得ることと、（ｄ）バイエピトープ性抗体がアゴニストまたはアンタゴニスト活性を呈するかどうかを決定して、バイエピトープ性アゴニストまたはアンタゴニスト抗体を得ることと、を含み得る。ある特定の実施形態では、本方法は、バイエピトープ性アゴニストまたはアンタゴニスト抗体のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を、バイエピトープ性アゴニストまたはアンタゴニスト抗体が由来した１つ以上の単一特異性親抗体と単独または組み合わせのいずれかで比較することを更に含み得る。
【００２８】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体を細胞中で発現させることは、多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体をコードする１つ以上の核酸を細胞に導入することを含み得る。ある特定の実施形態では、本多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体は、第１及び第２の抗原または同じ抗原の第１及び第２のエピトープと、ステップ（ｂ）において同時に接触する。ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体は、多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体を第１及び第２の抗原または同じ抗原の第１及び第２のエピトープと接触させる前に精製される。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体は、タンパク質Ａクロマトグラフィーによって精製される。ある特定の実施形態では、本抗原は生物複合体内に存在する。ある特定の実施形態では、細胞は、原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、真核細胞、例えば、酵母細胞または哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体と第１及び／または第２の抗原との結合はＥＬＩＳＡによって分析される。ある特定の実施形態では、バイエピトープ性抗体はバイエピトープ性アゴニスト抗体である。
【００２９】
別の態様では、本開示は、ＫＬＢ上に存在する少なくとも２つのエピトープに特異的に結合する、二重特異性、例えば、バイエピトープ性の抗体、及び／またはＫＬＢ上に存在する少なくとも２つのエピトープに特異的に結合する抗ＫＬＢ抗体の混合物と、これらの抗体及び／または混合物を使用して対象において疾患を治療する方法とを提供する。ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、第１の抗体またはその抗原結合部分、及び第２の抗体またはその抗原結合部分を含む。例えば、限定するものではなく、第１の抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得、第２の抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得、第１の抗体及び第２の抗体、またはそれらの抗原結合部分は、ＫＬＢ上に存在する異なるエピトープに結合する。
【００３０】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３４、３６、３８、４０、または４２に記載の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号３３、３５、３７、３９、または４１に記載の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。
【００３１】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、配列番号３８に記載の配列と約９５％同一の配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３７に記載の配列と約９５％同一の配列を有する軽鎖可変領域とを含み得る。ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、配列番号４２に記載の配列と約９５％同一の配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４１に記載の配列と約９５％同一の配列を有する軽鎖可変領域とを含み得る。
【００３２】
ある特定の実施形態では、本開示は、開示される二重特異性抗ＫＬＢ抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本薬学的組成物は更なる治療剤を含み得る。
【００３３】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題は、代謝障害、例えば、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、代謝症候群（ＭｅｔＳ）、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂質異常症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、及びＡＬＳ等の老齢疾患及び関連疾患の治療方法において使用するための二重特異性抗ＫＬＢ抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本二重特異性抗ＫＬＢ抗体は２型糖尿病の治療に使用される。本方法は、治療有効量の本明細書に開示される主題の抗体を個体に投与することを含み得る。ある特定の実施形態では、疾患は、糖尿病、例えば、２型糖尿病である。ある特定の実施形態では、本方法は、更なる治療剤を個体に投与することを更に含む。
【００３４】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題は、本明細書に開示される主題の二重特異性抗ＫＬＢ抗体をコードする単離された核酸を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題は、本明細書に開示される核酸を含む宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題は、本明細書に開示される二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分を発現するハイブリドーマ細胞を更に提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題は、二重特異性抗体の宿主細胞における産生方法を提供し、本方法は、宿主細胞を本開示の核酸によって形質転換させることと、宿主細胞を、二重特異性抗体を産生させる条件下で培養することとを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、抗体を宿主細胞から回収することを更に含む。
【００３５】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題は、ＫＬＢ−ＦＧＦＲ１ｃ受容体複合体の個体における活性化方法を提供し、本方法は、有効量の開示される二重特異性抗ＫＬＢ抗体を個体に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】開示される主題の１つの非限定的実施形態に従う、例示的な方法において使用される可変軽鎖完全重鎖（ＶＬｆＨ）形式を図示する。ＶＬｆＨは、本明細書において「三鎖ＩｇＧ」または「ｔｃＩｇＧ」とも称され得る。ｔｃＩｇＧが二重特異性抗体であるとき、このｔｃＩｇＧは、より具体的に「ｔｃＢｓＩｇＧ」と称され得る。
【図１Ｂ】開示される主題の１つの非限定的実施形態に従う、例示的な方法において使用される可変軽鎖完全重鎖（ＶＬｆＨ）形式を図示する。ＶＬｆＨは、本明細書において「三鎖ＩｇＧ」または「ｔｃＩｇＧ」とも称され得る。ｔｃＩｇＧが二重特異性抗体であるとき、このｔｃＩｇＧは、より具体的に「ｔｃＢｓＩｇＧ」と称され得る。
【図２Ａ】ＶＬｆＨにフォーマティングした二重特異性抗体のヘテロ二量体化を示す液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）グラフを図示する。
【図２Ｂ】ＶＬｆＨにフォーマティングした二重特異性抗体のヘテロ二量体化を示す液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）グラフを図示する。
【図３】対応する親である単一特異性のＶＬｆＨにフォーマティングした抗体と比較した、ＧＡＬ４−Ｅｌｋ１系ルシフェラーゼアッセイにおけるＫＬＢ上に存在する２つのエピトープに結合する様々なＶＬｆＨにフォーマティングした二重特異性抗ＫＬＢ抗体によるＫＬＢ−ＦＧＦＲ１ｃ受容体活性の誘導を図示する。
【図４】対応する親である単一特異性抗体と比較した、ＧＡＬ４−Ｅｌｋ１系ルシフェラーゼアッセイにおけるＫＬＢ上に存在する２つのエピトープに結合するＩｇＧ形式にある様々な二重特異性抗ＫＬＢ抗体によるＫＬＢ−ＦＧＦＲ１ｃ受容体活性の誘導を図示する。
【図５】対応する親であるモノクローナル抗体、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体（ＢｓＡｂ２）、及びアイソタイプが一致する対照抗体であるトラスツズマブと比較した、ＧＡＬ４−Ｅｌｋ１系ルシフェラーゼアッセイにおけるＫＬＢ上に存在する２つのエピトープに結合する様々な二重特異性抗ＫＬＢ抗体によるＫＬＢ−ＦＧＦＲ１ｃ受容体活性の誘導を図示する。
【図６】対応する親である単一特異性抗体の１：１混合物と比較した、ＧＡＬ４−Ｅｌｋ１系ルシフェラーゼアッセイにおけるＫＬＢ上に存在する２つのエピトープに結合する様々な二重特異性抗ＫＬＢ抗体によるＫＬＢ−ＦＧＦＲ１ｃ受容体活性の誘導を図示する。
【図７】ＧＡＬ４−Ｅｌｋ１系ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用した、抗ＫＬＢアゴニストモノクローナル抗体による、ＫＬＢ−ＦＧＦＲ１ｃ受容体活性（密接に関係した受容体複合体であるＫＬＢ−ＦＧＦＲ２ｃの活性ではない）の誘導を図示する。
【図８】二重特異性抗ＫＬＢ抗体がヒト初代脂肪細胞においてＥＲＫリン酸化を誘導したことを図示する。
【図９】フローサイトメトリーを使用して本明細書に開示される二重特異性抗ＫＬＢ抗体を生成するために使用されるモノクローナル抗体のＫＬＢ結合を図示する。
【図１０】キメラＫＬＢ及びＦＧＦＲタンパク質を使用して本明細書に開示される二重特異性抗ＫＬＢ抗体を生成するために使用されるモノクローナル抗体によるＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ受容体活性の誘導を図示する。
【図１１】（Ａ）二重特異性抗体及び対照の抗ＫＬＢモノクローナル抗体８Ｃ５を生成するために使用される抗ＫＬＢモノクローナル抗体についてのエピトープビニングの要約である。（Ｂ）ヒト／ラットＫＬＢキメラタンパク質を発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞とのＦＡＣＳ結合である。
【図１２】図７に要約するエピトープビンを決定するために使用される例示的なバイオレイヤーインフェロメトリー（ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）実験を図示する。この実施例では、２Ｃ１２（ヒトＩｇＧ１）が、組換えＫＬＢへの結合について、２３Ｂ３と競合するが２８Ｂ７または８Ｃ５とは競合しない。
【図１３−１】抗ＫＬＢ抗体、クローン１２Ｂ８についての軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を図示する。
【図１３−２】抗ＫＬＢ抗体、クローン１２Ｂ８についての軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を図示する。
【図１４−１】抗ＫＬＢ抗体、クローン２Ｃ１２についての軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を図示する。
【図１４−２】抗ＫＬＢ抗体、クローン２Ｃ１２についての軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を図示する。
【図１５−１】抗ＫＬＢ抗体、クローン４Ｈ７についての軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を図示する。
【図１５−２】抗ＫＬＢ抗体、クローン４Ｈ７についての軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を図示する。
【図１６−１】抗ＫＬＢ抗体、クローン２３Ｂ３についての軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を図示する。
【図１６−２】抗ＫＬＢ抗体、クローン２３Ｂ３についての軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を図示する。
【図１７−１】抗ＫＬＢ抗体、クローン２８Ｂ７についての軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を図示する。
【図１７−２】抗ＫＬＢ抗体、クローン２８Ｂ７についての軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列を図示する。
【図１８Ａ】ｔｃＢｓＩｇＧ形式により、単一細胞における二重特異性抗体生成が可能となることを図示する。（Ａ）ｔｃＢｓＩｇＧ形式の概略図である。抗体ＶＬドメインは、（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して抗体重鎖に繋留される（左）。ＣＨ１の折り畳みの欠陥は、別々のプラスミドからのトランスでのＣＬ発現によって補償される（右）。
【図１８Ｂ】ｔｃＢｓＩｇＧ形式により、単一細胞における二重特異性抗体生成が可能となることを図示する。（Ｂ）タンパク質Ａ親和性カラム精製回収後の、ＩｇＧ１、２、及び４のアイソタイプ、ならびにＩｇＧ１及びＩｇＧ４の脱グリコシル化（Ｎ２９７Ｇ）バージョンにおける、抗ＫＬＢ抗体、クローン２８Ｂ７単一エピトープ性ｔｃＩｇＧの発現のキャピラリー電気泳動である。ＶＬｆＨ発現が微量しかないかまたは全くない、ＨＥＣＫ２９３細胞におけるＣＬのない単独のＶＬｆＨとしての発現（レーン１）；標準ＩｇＧ発現（レーン３）と同等であるｔｃＩｇＧ発現（レーン２）をもたらす、ＣＬとのＶＬｆＨの同時発現。
【図１８Ｃ】ｔｃＢｓＩｇＧ形式により、単一細胞における二重特異性抗体生成が可能となることを図示する。（Ｃ）ノブ半ＩｇＧ（レーン１）；ホール半ＩｇＧ（レーン２）；単一細胞におけるノブ及びホール同時発現ＩｇＧとしての、標準ＩｇＧ１、２、及び４、ならびにｔｃＩｇＧ１、２、及び４カウンターパートについてのタンパク質Ａ親和性カラム精製回収後の抗ＫＬＢ抗体、クローン２８Ｂ７単一エピトープ性ｔｃＩｇＧの発現のキャピラリー電気泳動である。
【図１８Ｄ】ｔｃＢｓＩｇＧ形式により、単一細胞における二重特異性抗体生成が可能となることを図示する。（Ｄ）タンパク質Ａ及びサイズ排除クロマトグラフィー後の、抗ＫＬＢ抗体、クローン２８Ｂ７単一エピトープ性ｔｃＩｇＧの完全なＬＣ−ＭＳ／ＭＳである。
【図１９Ａ】ｔｃＢｓＩｇＧ形式の抗ＫＬＢバイエピトープ性抗体の産生を開示する。（Ａ）単一細胞においてｔｃＢｓＩｇＧを産生させるための、７×７のノブ及びホール組み合わせにおける陽性及び陰性発現対照ｔｃＩｇＧと５つの抗ＫＬＢ  ｔｃＩｇＧ半抗体との同時発現のキャピラリー電気泳動である。
【図１９Ｂ】ｔｃＢｓＩｇＧ形式の抗ＫＬＢバイエピトープ性抗体の産生を開示する。（Ｂ）単一細胞において発現された対応するｔｃＢｓＩｇＧの親ｔｃＩｇＧ発現のキャピラリー電気泳動である。
【図１９Ｃ−１】ｔｃＢｓＩｇＧ形式の抗ＫＬＢバイエピトープ性抗体の産生を開示する。（Ｃ）ＰｒｏＡクロマトグラフィー後のｔｃＩｇＧの分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。
【図１９Ｃ−２】ｔｃＢｓＩｇＧ形式の抗ＫＬＢバイエピトープ性抗体の産生を開示する。（Ｃ）ＰｒｏＡクロマトグラフィー後のｔｃＩｇＧの分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。
【図１９Ｃ−３】ｔｃＢｓＩｇＧ形式の抗ＫＬＢバイエピトープ性抗体の産生を開示する。（Ｃ）ＰｒｏＡクロマトグラフィー後のｔｃＩｇＧの分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。
【図２０】抗体アイソタイプが抗体アゴニスト活性に与える影響を開示する。（Ａ）は、異なるアイソタイプの活性を示すルシフェラーゼレポーターアッセイである。（Ｂ）は、異なる抗体アイソタイプがヒト初代脂肪細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化に与える影響である。（Ｃ）は、異なる抗体アイソタイプ及びそれらの組み合わせがヒト初代脂肪細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化に与える影響である。
【図２１】抗ＫＬＢ抗体クローン２８Ｂ７と４Ｈ７との間の結合親和性の差を開示する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
明瞭化のためであり、限定するものではなく、本明細書に開示される主題の発明を実施するための形態は、以下の小節に分けられる。
Ｉ．定義
ＩＩ．抗体
ＩＩＩ．スクリーニング及び産生方法
ＩＶ．使用方法
Ｖ．薬学的製剤
ＶＩ．製品及びキット
【００３８】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、またはそれは、アミノ酸配列変化を含有し得る。ある特定の実施形態では、アミノ酸変化の数は、約１０以下、約９以下、約８以下、約７以下、約６以下、約５以下、約４以下、約３以下、または約２以下である。ある特定の実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「親和性」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一結合部位の間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施形態が、以下に記載される。
【００４０】
「親和性成熟」抗体とは、改変を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の改変を有し、かかる改変により抗体の抗原に対する親和性が改善される抗体を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「クロトー−ベータ」、「ＫＬＢ」、及び「ベータ−クロトー」は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯動物（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意の天然クロトー−ベータを指す。この用語は、「完全長」の非プロセシングＫＬＢ、ならびに細胞内でのプロセシングから得られるＫＬＢの任意の形態を包含する。この用語は、ＫＬＢの突然変異型及び天然に存在する異型、例えば、スプライス異型または対立遺伝子異型も包含する。
【００４２】
シグナル配列を除く、本開示の二重特異性抗体によって標的化されるヒトＫＬＢアミノ酸配列の非限定例は、
ＦＳＧＤＧＲＡＩＷＳＫＮＰＮＦＴＰＶＮＥＳＱＬＦＬＹＤＴＦＰＫＮＦＦＷＧＩＧＴＧＡＬＱＶＥＧＳＷＫＫＤＧＫＧＰＳＩＷＤＨＦＩＨＴＨＬＫＮＶＳＳＴＮＧＳＳＤＳＹＩＦＬＥＫＤＬＳＡＬＤＦＩＧＶＳＦＹＱＦＳＩＳＷＰＲＬＦＰＤＧＩＶＴＶＡＮＡＫＧＬＱＹＹＳＴＬＬＤＡＬＶＬＲＮＩＥＰＩＶＴＬＹＨＷＤＬＰＬＡＬＱＥＫＹＧＧＷＫＮＤＴＩＩＤＩＦＮＤＹＡＴＹＣＦＱＭＦＧＤＲＶＫＹＷＩＴＩＨＮＰＹＬＶＡＷＨＧＹＧＴＧＭＨＡＰＧＥＫＧＮＬＡＡＶＹＴＶＧＨＮＬＩＫＡＨＳＫＶＷＨＮＹＮＴＨＦＲＰＨＱＫＧＷＬＳＩＴＬＧＳＨＷＩＥＰＮＲＳＥＮＴＭＤＩＦＫＣＱＱＳＭＶＳＶＬＧＷＦＡＮＰＩＨＧＤＧＤＹＰＥＧＭＲＫＫＬＦＳＶＬＰＩＦＳＥＡＥＫＨＥＭＲＧＴＡＤＦＦＡＦＳＦＧＰＮＮＦＫＰＬＮＴＭＡＫＭＧＱＮＶＳＬＮＬＲＥＡＬＮＷＩＫＬＥＹＮＮＰＲＩＬＩＡＥＮＧＷＦＴＤＳＲＶＫＴＥＤＴＴＡＩＹＭＭＫＮＦＬＳＱＶＬＱＡＩＲＬＤＥＩＲＶＦＧＹＴＡＷＳＬＬＤＧＦＥＷＱＤＡＹＴＩＲＲＧＬＦＹＶＤＦＮＳＫＱＫＥＲＫＰＫＳＳＡＨＹＹＫＱＩＩＲＥＮＧＦＳＬＫＥＳＴＰＤＶＱＧＱＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＳＶＡＳＳＰＱＦＳＤＰＨＬＹＶＷＮＡＴＧＮＲＬＬＨＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＡＱＣＴＤＦＶＮＩＫＫＱＬＥＭＬＡＲＭＫＶＴＨＹＲＦＡＬＤＷＡＳＶＬＰＴＧＮＬＳＡＶＮＲＱＡＬＲＹＹＲＣＶＶＳＥＧＬＫＬＧＩＳＡＭＶＴＬＹＹＰＴＨＡＨＬＧＬＰＥＰＬＬＨＡＤＧＷＬＮＰＳＴＡＥＡＦＱＡＹＡＧＬＣＦＱＥＬＧＤＬＶＫＬＷＩＴＩＮＥＰＮＲＬＳＤＩＹＮＲＳＧＮＤＴＹＧＡＡＨＮＬＬＶＡＨＡＬＡＷＲＬＹＤＲＱＦＲＰＳＱＲＧＡＶＳＬＳＬＨＡＤＷＡＥＰＡＮＰＹＡＤＳＨＷＲＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＥＰＬＦＫＴＧＤＹＰＡＡＭＲＥＹＩＡＳＫＨＲＲＧＬＳＳＳＡＬＰＲＬＴＥＡＥＲＲＬＬＫＧＴＶＤＦＣＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＭＨＥＱＬＡＧＳＲＹＤＳＤＲＤＩＱＦＬＱＤＩＴＲＬＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳＧＩＤＤＱＡＬＥＤＤＲＬＲＫＹＹＬＧＫＹＬＱＥＶＬＫＡＹＬＩＤＫＶＲＩＫＧＹＹＡＦＫＬＡＥＥＫＳＫＰＲＦＧＦＦＴＳＤＦＫＡＫＳＳＩＱＦＹＮＫＶＩＳＳＲＧＦＰＦＥＮＳＳＳＲＣＳＱＴＱＥＮＴＥＣＴＶＣＬＦＬＶＱＫＫＰＬＩＦＬＧＣＣＦＦＳＴＬＶＬＬＬＳＩＡＩＦＱＲＱＫＲＲＫＦＷＫＡＫＮＬＱＨＩＰＬＫＫＧＫＲＶＶＳ（配列番号１）である。
【００４３】
「ＫＬＢのＣ末端ドメイン」という用語は、ＫＬＢのカルボキシ末端グリコシダーゼ様ドメインを指す。例えば、配列番号１に示される例示的なＫＬＢタンパク質のＣ末端ドメインは、アミノ酸配列：
ＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＳＶＡＳＳＰＱＦＳＤＰＨＬＹＶＷＮＡＴＧＮＲＬＬＨＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＡＱＣＴＤＦＶＮＩＫＫＱＬＥＭＬＡＲＭＫＶＴＨＹＲＦＡＬＤＷＡＳＶＬＰＴＧＮＬＳＡＶＮＲＱＡＬＲＹＹＲＣＶＶＳＥＧＬＫＬＧＩＳＡＭＶＴＬＹＹＰＴＨＡＨＬＧＬＰＥＰＬＬＨＡＤＧＷＬＮＰＳＴＡＥＡＦＱＡＹＡＧＬＣＦＱＥＬＧＤＬＶＫＬＷＩＴＩＮＥＰＮＲＬＳＤＩＹＮＲＳＧＮＤＴＹＧＡＡＨＮＬＬＶＡＨＡＬＡＷＲＬＹＤＲＱＦＲＰＳＱＲＧＡＶＳＬＳＬＨＡＤＷＡＥＰＡＮＰＹＡＤＳＨＷＲＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＥＰＬＦＫＴＧＤＹＰＡＡＭＲＥＹＩＡＳＫＨＲＲＧＬＳＳＳＡＬＰＲＬＴＥＡＥＲＲＬＬＫＧＴＶＤＦＣＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＭＨＥＱＬＡＧＳＲＹＤＳＤＲＤＩＱＦＬＱＤＩＴＲＬＳＳＰＴＲＬＡＶＩＰＷＧＶＲＫＬＬＲＷＶＲＲＮＹＧＤＭＤＩＹＩＴＡＳＧＩＤＤＱＡＬＥＤＤＲＬＲＫＹＹＬＧＫＹＬＱＥＶＬＫＡＹＬＩＤＫＶＲＩＫＧＹＹＡＦＫＬＡＥＥＫＳＫＰＲＦＧＦＦＴＳＤＦＫＡＫＳＳＩＱＦＹＮＫＶＩＳＳＲＧＦＰＦＥＮＳＳＳＲ（配列番号２）を含む。
【００４４】
本明細書で言及される場合、「抗原結合ポリペプチド」は、結合相手である別の分子に対して強力な親和性を有する抗原結合領域または抗原結合部分を含むタンパク質またはポリペプチドである。抗原結合ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合断片、及び融合タンパク質を包含する。
【００４５】
「抗体」という用語は、本明細書で最も広義に使用され、所望の抗原結合活性を呈する、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）、または抗体の「抗原結合断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原及び／またはエピトープと結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆａｂ´−ＳＨ、Ｆ（ａｂ´）２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び多重特異性、例えば、二重特異性抗体から形成される抗体断片が挙げられる。
【００４７】
ある特定の実施形態では、「アゴニスト」及び「アゴニスト性」という用語は、受容体（例えば、抗原）と相互作用、例えば、結合し、受容体の天然リガンドによって惹起、模倣、及び／または刺激される反応または活性と類似または同じである反応または活性を惹起、模倣、及び／または刺激することができる、分子（例えば、抗原結合ポリペプチド及び／または抗体及び／または抗原結合抗体断片）を指し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるアゴニストは、受容体に関連するシグナル伝達経路の活性化を誘導、増強、強化、及び／または刺激することが可能である。
【００４８】
参照抗体と「結合において競合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原、例えばＫＬＢへの結合を５０％以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて抗体のその抗原、例えばＫＬＢへの結合を５０％以上遮断する。例示的な競合アッセイは、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記載されている。
【００４９】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の源または種に由来し、一方で重鎖及び／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００５０】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免役グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、開示される抗体のクラスまたはサブクラス（アイソタイプ）のうちのいずれであってもよい。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞機能を阻害もしくは阻止する、かつ／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性薬剤には、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤もしくは化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素等の酵素及びそれらの断片；抗生物質；細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素（それらの断片及び／または変異形を含む）等の毒素；ならびに下に記載される様々な抗腫瘍または抗癌薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化が挙げられる。
【００５３】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、しない場合もある。本明細書で別途明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されている、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番システムに従う。
【００５４】
「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）にＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４の順序で出現する。
【００５５】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同義に使用される。
【００５６】
同義に使用される「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、外因性核酸が中に導入されている細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数にかかわらずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではない場合があるが、変異を含み得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークを指す。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群からである。一般に、配列の下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に見られるような下位群である。ある特定の実施形態では、ＶＬの場合、下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に見られるような下位群カッパＩである。ある特定の実施形態では、ＶＨの場合、下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に見られるような下位群ＩＩＩである。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み得、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００６０】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照されたい。）単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して抗原に結合する抗体から単離されて、それぞれ、相補的ＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変であり（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）、かつ／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、かつ／または抗原接触残基（「抗原接触体」）を含有する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。本明細書における例示的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３〜１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触体（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））；ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｃ）の組み合わせ、を含む。
別途指定されない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に従って本明細書で付番される。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「免疫複合体」は、細胞傷害性薬剤を含むがこれに限定されない１つ以上の異種分子（複数可）に複合体化される抗体を指す。
【００６３】
本明細書で同義に使用される「個体」、「患者」、または「対象」は、哺乳動物を指す。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から分離された抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％または９９％を超える純度に精製される。抗体の純度を評定するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子が染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００６６】
「抗体をコードする単離された核酸」（特異的抗体、例えば、抗ＫＬＢ抗体への言及を含む）は、抗体重鎖及び軽鎖（またはそれらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター内のかかる核酸分子（複数可）を含み、かかる核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を運搬することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入される宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に結合している核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に発生する可能な変異型抗体（かかる変異型は、一般的に少量で存在する）、または多重特異性抗体、例えば、少なくとも２つの異なるエピトープに結合する抗体を除く。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるときの抗体の特徴を示しており、いかなる特定の方法による抗体の産生を必要とするものとしても解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、多様な技法によって作製されてもよく、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「裸の抗体」は、異種性部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識に複合されていない抗体を指す。裸の抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、限定するものではないが、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型うちの１つに割り当てられ得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、ＩｇＧの残基約２３１から約３４０まで延びる。ある特定の実施形態では、「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまで（即ち、ＩｇＧのアミノ酸残基約３４１からアミノ酸残基約４４７）の残基の伸展を含む。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」は、概して、ヒトＩｇＧｌのアミノ酸Ｇｌｕ２１６からＰｒｏ２３０を指す（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）を参照されたい）。ある特定の実施形態では、他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖内Ｓ−Ｓ結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に入れることによってＩｇＧ１配列と整列し得る。
【００７２】
「界面」という用語は、第２の抗原結合ポリペプチドの界面で１つ以上の「接触」アミノ酸残基（または他の非アミノ酸基）と相互作用する第１の抗原結合ポリペプチドにおける「接触」アミノ酸残基（または炭水化物群、ＮＡＤＨ、ビオチン、ＦＡＤ、またはヘム群等の他の非アミノ酸群）を含む。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「添付文書」という用語は、かかる治療薬の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、及び／またはその使用に関する警告を含有する、治療剤製品の市販パッケージに通例含まれる指示書を指す。
【００７４】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一の候補配列におけるアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的では、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって記述され、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権庁（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９に提出されており、米国著作権番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変動しない。
【００７５】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によって、そのプログラムのＡ及びＢの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくはならないことが理解されるだろう。別段具体的に述べられない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない調製物を指す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」等のその文法上の変形）とは、治療されている個体の自然経過を変更することを目的とした臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理過程中に実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患進行速度の減少、病状の回復または寛解、及び緩解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本発明の抗体を使用して、疾患の発達を遅延させるか、または疾患の進行を減速させる。
【００７９】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「治療有効量」または「有効量」とは、必要な投与量で必要な期間にわたって所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を指す。例えば、限定するものではなく、「治療有効量」または「有効量」は、疾患の何らかの直接的もしくは間接的な病理学的帰結の縮小、疾患進行の速度の低下、病態の回復、寛解もしくは予後改善、疾患の発生もしくは再発の防止、及び／または症状の緩和をもたらす、二重特異性抗体の投薬量を指し得る。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、値の測定方法または決定方法、即ち、測定システムの限界にある程度依存することになる、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内であることを意味する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣行により、３以上の標準偏差内であることを意味する。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、より好ましくは更に最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物系または生物学的過程に関して、本用語は、値の好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の桁内であることを意味し得る。
【００８１】
本明細書に記載される場合、いずれの濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲も、別途指定されない限り、挙げられる範囲内のいずれの整数値、及び適切な場合にはその分数（整数の１０分の１、及び１００分の１等）を含むことが理解される。
【００８２】
ＩＩ．抗体
本明細書に開示される主題は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体を提供する。本開示の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる結合特異性を有する。例えば、米国特許第５，９２２，８４５号及び同第５，８３７，２４３号；Ｚｅｉｌｄｅｒ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１２４６−１２５２；Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒａｍ（１９９９）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ９：４７−５４；Ｋｅｌｅｒ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４００８−４０１４を参照されたい。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性抗体、例えば、バイエピトープ性抗体は、抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに結合するか、または抗原上で重なり合う少なくとも２つのエピトープに結合し得る。あるいは、ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に結合し得る。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を指す。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面分類からなり、通常、特定の３次元構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。立体配座エピトープと非立体配座エピトープとは、変性溶媒の存在下で前者への結合が失われるが、後者への結合は失われないことにおいて区別される。
【００８４】
Ａ．多重特異性抗体
本明細書に開示される主題は、抗原上に存在する少なくとも２つのエピトープ、例えば、重なり合っているエピトープまたは重なり合っていないエピトープに結合する、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体及びバイエピトープ性抗体を提供する。本明細書に開示される主題は、第１の抗原上の少なくとも１つのエピトープと第２の抗原上の少なくとも１つのエピトープとに結合する多重特異性抗体を更に提供する。本明細書に開示される多重特異性抗体は、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体であり得る。
【００８５】
ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、１つ以上の抗原結合ポリペプチドを含み得る。例えば、限定するものではなく、本開示の多重特異性抗体は、第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドを含み得る。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドは、異なる結合特異性を有する。例えば、限定するものではなく、第１の抗原結合ポリペプチドは抗原上の第１のエピトープに結合することができ、第２の抗原結合ポリペプチドは抗原上の第２のエピトープに結合することができる。あるいは、ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドは第１の抗原に結合することができ、第２の抗原結合ポリペプチドは第２の抗原に結合することができる。
【００８６】
ある特定の実施形態では、また図１Ｂに示されるように、第１の抗原結合ポリペプチド及び／または第２の抗原結合ポリペプチドは、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及び／またはＣＨ３ドメインを含み得る。ある特定の実施形態では、開示される多重特異性抗体の抗原結合ポリペプチドは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み、これらの構成要素は、互いに対して、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順序でＮ末端からＣ末端への方向に位置付けられる。ある特定の実施形態では、第１及び／または第２の抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジ領域を更に含み得る。
【００８７】
ある特定の実施形態では、抗原結合ポリペプチド（例えば、第１の抗原結合ポリペプチド）内に存在するＶＬドメインは、リンカーによって、同じ抗原結合ポリペプチド内に存在するＶＨに接合し得る。例えば、限定するものではなく、ＶＬドメインのＣ末端は、ＶＨドメインのＮ末端に連結し得る。本開示の多重特異性抗体が少なくとも２つの抗原結合ポリペプチドを含むある特定の実施形態では、抗原結合ポリペプチドの各々の中に存在するリンカーは同じであり得る。あるいは、抗原結合ポリペプチドの各々の中に存在するリンカーは異なってもよい。
【００８８】
ある特定の実施形態では、リンカーは、中性、極性、または非極性アミノ酸を含み得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、約１〜約１００アミノ酸長、例えば、約１〜５０アミノ酸長の長さであり得る。例えば、限定するものではなく、第１及び／または第２の抗原結合ポリペプチド内に存在するリンカーは、約１以上、約２以上、約３以上、約４以上、約５以上、約６以上、約７以上、約８以上、約９以上、約１０以上、約１５以上、約２０以上、約２５以上、約３０以上、約３５以上、約４０以上、または約４５以上のアミノ酸を含み得る。リンカーの非限定例は、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８０（６）：１９１０−１９１７（２００８）及びＷＯ２０１４／０８７０１０に開示されており、これらの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、リンカーはＧｌｙ（Ｇ）４Ｓｅｒ（Ｓ）リンカー（配列番号７０）である。ある特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ反復配列、例えば、約２の反復配列（（ＧＧＧＧＳ）２）（配列番号７３）、約３の反復配列（（ＧＧＧＧＳ）３）（配列番号７４）、約４の反復配列（（ＧＧＧＧＳ）４）（配列番号６８）、約５の反復配列（（ＧＧＧＧＳ）５）（配列番号７５）、約６の反復配列（（ＧＧＧＧＳ）６）（配列番号７６）、または約７の反復配列（（ＧＧＧＧＳ）７）（配列番号７７）を含む。リンカーの追加の非限定例は表７に開示される。ある特定の実施形態では、リンカーは配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含む。
【００８９】
ある特定の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカー、例えば、自己切断可能な、酵素的に切断可能な、または化学的に切断可能なリンカーであり得る。全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０３４６０５を参照されたい。例えば、限定するものではなく、リンカーの酵素的切断は、エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼの使用を含み得る。エンドペプチダーゼの非限定例には、ウロキナーゼ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃ、Ｖ８、Ｇｌｕ−Ｃ、キモトリプシン、トリプシン、ペプシン、パパイン、トロンビン、ゲネナーゼ、第Ｘａ因子、ＴＥＶ（タバコエッチウイルスシステインプロテアーゼ）、エンテロキナーゼ、ＨＲＶ  Ｃ３（ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ）、イニノゲナーゼ（ｉｎｉｎｏｇｅｎａｓｅ）、スブチリシン様前駆タンパク質転換酵素（例えば、フーリン（ＰＣ１）、ＰＣ２、またはＰＣ３）、及びＮ−アルギニン二塩基性転換酵素が挙げられる。エキソペプチダーゼの非限定例には、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ（カルボキシペプチダーゼＨとも呼ばれる）、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、またはカルボキシペプチダーゼＺが挙げられる。ある特定の実施形態では、化学切断は、ヒドロキシルアミン、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、または臭化シアンを使用することによって行われ得る。
表７
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【００９０】
ある特定の実施形態では、例えば、本開示の多重特異性抗体は、第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドを含み、第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドは、１つ以上のジスルフィド架橋によって相互作用し得る。例えば、限定するものではなく、ある特定の実施形態では、第１及び第２の抗原結合ポリペプチドのヒンジ領域は、１つ以上のジスルフィド架橋、例えば、２つのジスルフィド架橋によって相互作用し得る。
【００９１】
ある特定の実施形態では、本多重特異性、例えば、二重特異性抗体は、本明細書に開示される抗体の抗原結合ポリペプチドの各々の中にヘテロ二量体化ドメインを含み得る。ある特定の実施形態では、開示される多重特異性抗体の第１及び第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインは、第１及び第２の抗原結合ポリペプチドのヘテロ二量体化を促進するように改変され得る。例えば、限定するものではなく、第１及び／または第２の抗原結合ポリペプチドは、第１の抗原結合ポリペプチドと第２の抗原結合ポリペプチドとの間の会合及び／または相互作用を促進するために、ノブ・イン・ホール技術（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７３１，１６８号及び同第８，２１６，８０５号を参照されたい）を使用する１つ以上のヘテロ二量体化ドメインを含み得る。
【００９２】
ある特定の実施形態では、第１及び／または第２の抗原結合ポリペプチドは、抗原結合ポリペプチドの表面に突起または空洞を発生させるように改変され得る。例えば、限定するものではなく、第１の抗原結合ポリペプチドは、第１の抗原結合ポリペプチドの表面に突起を発生させるように改変され得、第２の抗原結合ポリペプチドは、第２の抗原結合ポリペプチド上に空洞を発生させるように改変され得、ここで、第１の抗原結合ポリペプチドの突起は、第２の抗原結合ポリペプチドの空洞と相互作用して、ヘテロ二量体化を促進する。ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性、例えば、二重特異性抗体は、界面で相互作用する第１の抗原結合ポリペプチドと第２の抗原結合ポリペプチドとを含み得、第１の抗原結合ポリペプチドは、界面で突起を有し、この突起は、第２の抗原結合ポリペプチドの界面の空洞の中に位置付けることができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２１６，８０５号を参照されたい。
【００９３】
ある特定の実施形態では、突起または空洞を発生させるように改変される抗原結合ポリペプチドの領域は、ＣＨ３ドメインの位置であり得る。例えば、第１の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメイン内の突起は、側鎖が小さいアミノ酸、例えば、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）を、側鎖が大きいアミノ酸、例えば、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）で代置することによって発生させることができる。例えば、限定するものではなく、突起（例えば、「ノブ」）を発生させるために抗原結合ポリペプチドに導入することができる突然変異には、Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ付番）が挙げられる。突起と同一または類似サイズの補償空洞を、例えば、側鎖がより大きいアミノ酸を、側鎖がより小さいアミノ酸で代置することによって、第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメイン内に発生させることができる。例えば、限定するものではなく、空洞（例えば、「ホール」）を生成するために抗原結合ポリペプチドに導入することができる突然変異には、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及び／またはＹ４０７Ｖ（ＥＵ付番）が挙げられる。
【００９４】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体、例えば、二重特異性またはバイエピトープ性抗体は、第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドを含み得、ここで第１の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインの１つ以上のアミノ酸残基は、より大きい側鎖体積を有する１つ以上のアミノ酸残基で代置されて、第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインと相互作用する第１の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインの表面に突起を発生させる。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインの１つ以上のアミノ酸残基は、より小さい側鎖体積を有する１つ以上のアミノ酸残基で代置されて、第１の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインと相互作用する第２の抗原結合ポリペプチドのＣＨ３ドメインの表面上に空洞を発生させる（例えば、図１Ｂを参照されたい）。
【００９５】
ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含まない。あるいは、本明細書に開示される多重特異性抗体は１つ以上のＣＬドメインを含むことができる。例えば、限定するものではなく、多重特異性抗体がＣＬドメインを含む場合、このＣＬドメインは、１つ以上のジスルフィド架橋によってＣＨ１ドメインと相互作用する。ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体が第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドを含む場合、本多重特異性抗体は２つのＣＬドメインを更に含み得る。ある特定の実施形態では、例えば、１つ以上のジスルフィド架橋を通して、ＣＬドメインのうちの一方が第１の抗原結合ポリペプチドと相互作用し、他方のＣＬドメインが第１の抗原結合ポリペプチドと相互作用する。例えば、限定するものではなく、これらのＣＬドメインは、抗原結合ポリペプチドのＣＨ１ドメインと相互作用することができる。ある特定の実施形態では、２つのＣＬドメインは同じであることも異なることもできる。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインは第１または第２の抗原結合ポリペプチドに共有結合しない。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインはＣＨ１ドメインに共有結合しない。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインはＶＬドメインに共有結合しない。ある特定の実施形態では、ＶＬ及びＣＬは分離している。ある特定の実施形態では、この分離は、ＶＬとＣＬとの間の任意の結合部にあることができる。ある特定の実施形態では、結合部はＴ１０９にあり得る（即ち、ＣＬはＴ１０９で開始し得、ＶＬはＲ１０８で終結し得る）。ある特定の他の実施形態では、ＣＬはＶ１１０から開始する。
【００９６】
本明細書に開示される主題は、アンタゴニスト抗体及びアゴニスト抗体を更に提供する。例えば、限定するものではなく、本開示のアゴニスト抗体はバイエピトープ性抗体であり、ここで、本抗体は同じ抗原上の２つのエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、本バイエピトープ性抗体が結合するエピトープは、抗原上で重なり合っていないか、または少なくとも部分的に重なり合っている。ある特定の実施形態では、本開示のバイエピトープ性抗体、例えば、アゴニスト性バイエピトープ性抗体は、本明細書に開示されるように、第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドを含み得る。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドは、異なる結合特異性を有し、ここで、第１の抗原結合ポリペプチドは抗原上で第１のエピトープに結合し得、第２の抗原結合ポリペプチドは抗原上で第２のエピトープに結合し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題のバイエピトープ性アゴニスト抗体の抗原結合ポリペプチドは、ＶＬ、リンカー、ＶＨ、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み得、これらの構成要素は、互いに対して、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順序でＮ末端からＣ末端への方向に位置付けられる。本開示のアゴニスト性バイエピトープ性抗体の抗原結合ポリペプチドは、本明細書に開示されるように、ポリペプチドの各々の中にヘテロ二量体化ドメインを更に含み得る。ある特定の実施形態では、これらのヘテロ二量体化ドメインは、ノブ・イン・ホール技法によって生成される。例えば、限定するものではなく、第１の抗原結合ポリペプチドは、例えば、そのＣＨ３ドメイン内に突起を有し得、第２の抗原結合ポリペプチドは、例えば、そのＣＨ３ドメイン内に空洞を有し得、これらが相互作用してヘテロ二量体化を促進する。
【００９７】
ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性アゴニスト抗体、例えば、バイエピトープ性アゴニスト抗体は、単独または組み合わせでの本バイエピトープ性アゴニスト抗体が由来する親の単一特異性抗体よりも優れたアゴニスト活性を呈する。例えば、限定するものではなく、本明細書に開示されるバイエピトープ性アゴニスト抗体は、同一のＶＬ及びＶＨ配列を有する単一特異性抗体よりも優れたアゴニスト活性を呈する。ある特定の実施形態では、本開示のバイエピトープ性アゴニスト抗体は、同一のＶＬ、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３配列を有する単一特異性抗体よりも優れたアゴニスト活性を呈する。
【００９８】
ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性アンタゴニスト抗体、例えば、バイエピトープ性アンタゴニスト抗体は、単独または組み合わせでの本バイエピトープ性アンタゴニスト抗体が由来する親の単一特異性抗体よりも優れたアンタゴニスト活性を呈する。例えば、限定するものではなく、本明細書に開示されるバイエピトープ性アンタゴニスト抗体は、同一のＶＬ及びＶＨ配列を有する単一特異性抗体よりも優れたアンタゴニスト活性を呈する。ある特定の実施形態では、本開示のバイエピトープ性アンタゴニスト抗体は、同一のＶＬ、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３配列を有する単一特異性抗体よりも優れたアンタゴニスト活性を呈する。
【００９９】
Ｂ．二重特異性抗ＫＬＢ抗体
本明細書に開示される主題は、クロトー−ベータ（ＫＬＢ）に結合し、ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ受容体複合体の活性を調節するように機能することができる、多重特異性抗体、例えば、二重特異性及びバイエピトープ性抗体を更に提供する。開示される抗ＫＬＢ抗体は、例えば、リガンドの効果を刺激し、かつ／またはＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ受容体複合体を活性化させる、ＦＧＦＲ１ｃ／ＫＬＢ受容体複合体のアゴニストとして機能し得る。
【０１００】
本明細書に開示される主題は、ＫＬＢタンパク質上に存在する少なくとも２つのエピトープに結合する抗ＫＬＢ抗体またはそれらの抗原結合部分、例えば、二重特異性または多重特異性抗体を提供する。例えば、限定するものではなく、本明細書に開示される主題は、ＫＬＢ上に存在する第１のエピトープのための１つの結合部位（例えば、抗原結合部位）と、ＫＬＢ上に存在する第２のエピトープのための第２の結合部位とを有する、二重特異性抗体、例えば、バイエピトープ性抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題は、少なくとも３つの結合部位を有する多重特異性抗体を提供する。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題の開示される二重特異性抗体は、ＫＬＢのグリコシダーゼ様ドメインであるＫＬ１内に存在する２つのエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、開示される二重特異性抗体は、ＫＬＢのグリコシダーゼ様ドメインであるＫＬ２内に存在する２つのエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、開示される二重特異性抗体は、ＫＬＢ上に存在する２つのエピトープに結合し、ここで、エピトープのうちの一方はＫＬ１内に存在し、第２のエピトープはＫＬ２内に存在する。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題の開示される二重特異性抗体は、アミノ酸配列ｉｑｆｙｎｋｖｉｓｓｒｇｆｐｆｅｎｓｓｓｒｃｓｑｔｑｅｎｔｅｃｔｖｃｌｆｌｖｑｋｋｐｌｉｆｌｇｃｃｆｆｓｔｌｖｌｌｌｓｉａｉｆｑｒｑｋｒｒｋｆｗｋａｋｎｌｑｈｉｐｌｋｋｇｋｒｖｖｓ（配列番号４３）またはその断片を含むＫＬＢの断片に結合する。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題の開示される二重特異性抗体は、アミノ酸配列ＡＤＳＨＷＲＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＥＰＬＦＫＴＧＤＹＰＡＡＭＲＥＹＩＡＳＫＨＲＲＧＬＳＳＳＡＬＰＲＬＴＥＡＥＲＲＬＬＫＧＴＶＤＦＣＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＭＨＥＱＬＡＧＳＲＹＤＳＤＲＤＩ（配列番号４４）またはその断片を含むＫＬＢの断片に結合する。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題の開示される二重特異性抗体は、アミノ酸配列
ＦＳＧＤＧＲＡＩＷＳＫＮＰＮＦＴＰＶＮＥＳＱＬＦＬＹＤＴＦＰＫＮＦＦＷＧＩＧＴＧＡＬＱＶＥＧＳＷＫＫＤＧＫＧＰＳＩＷＤＨＦＩＨＴＨＬＫＮＶＳＳＴＮＧＳＳＤＳＹＩＦＬＥＫＤＬＳＡＬＤＦＩＧＶＳＦＹＱＦＳＩＳＷＰＲＬＦＰＤＧＩＶＴＶＡＮＡＫＧＬＱＹＹＳＴＬＬＤＡＬＶＬＲＮＩＥＰＩＶＴＬＹＨＷＤＬＰＬＡＬＱＥＫＹＧＧＷＫＮＤＴＩＩＤＩＦＮＤＹＡＴＹＣＦＱＭＦＧＤＲＶＫＹＷＩＴＩＨＮＰＹＬＶＡＷＨＧＹＧＴＧＭＨＡＰＧＥＫＧＮＬＡＡＶＹＴＶＧＨＮＬＩＫＡＨＳＫＶＷＨＮＹＮＴＨＦＲＰＨＱＫＧＷＬＳＩＴＬＧＳＨＷＩＥＰＮＲＳＥＮＴＭＤＩＦＫＣＱＱＳＭＶＳＶＬＧＷＦＡＮＰＩＨＧＤＧＤＹＰＥＧＭＲＫＫＬＦＳＶＬＰＩＦＳＥＡＥＫＨＥＭＲＧＴＡＤＦＦＡＦＳＦＧＰＮＮＦＫＰＬＮＴＭＡＫＭＧＱＮＶＳＬＮＬＲＥＡＬＮＷＩＫＬＥＹＮＮＰＲＩＬＩＡＥＮＧＷＦＴＤＳＲＶＫＴＥＤＴＴＡＩＹＭＭＫＮＦＬＳＱＶＬＱＡＩＲＬＤＥＩＲＶＦＧＹＴＡＷＳＬＬＤＧＦＥＷＱＤＡＹＴＩＲＲＧＬＦＹＶＤＦＮＳＫＱＫＥＲＫＰＫＳＳＡＨＹＹＫＱＩＩＲＥＮＧＦＳＬＫＥＳＴＰＤＶＱＧＱＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＳＶＡＳＳＰＱＦＳＤＰＨＬＹＶＷＮＡＴＧＮＲＬＬＨＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＡＱＣＴＤＦＶＮＩＫＫＱＬＥＭＬＡＲＭＫＶＴＨＹＲＦＡＬＤＷＡＳＶＬＰＴＧＮＬＳＡＶＮＲＱＡ（配列番号４５）またはその断片を含むＫＬＢの断片に結合する。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題の開示される二重特異性抗体は、配列番号４２、４３、４４、及び／または４５に記載のアミノ酸配列を有するＫＬＢの１つ以上の断片に結合する。例えば、限定するものではなく、本開示の二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列またはその断片を含むＫＬＢの１つの断片に結合することができ、かつ配列番号４４に記載のアミノ酸配列またはその断片を含むＫＬＢの第２の断片に結合することができる。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題の開示される二重特異性抗体は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体活性を調節し、本複合体のＦＧＦＲ１ｃは、アミノ酸配列ＫＴＶＡＬＧＳＮＶＥＦＭＣＫＶＹＳＤＰＱＰＨＩＱＷＬＫＨＩＥＶＮＧＳＫＩＧＰＤＮＬＰＹＶＱＩＬＫＴＡＧＶＮＴＴＤＫＥＭＥＶＬＨＬＲＮＶＳＦＥＤＡＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧＬＳＨＨＳＡＷＬＴＶＬＥＡＬＥＥＲＰＡＶＭＴ（配列番号４６）またはその断片を含む。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体は、抗体断片またはダイアボディであり得る。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であり、この二重特異性抗体においては、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上のこれらの２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗体、例えば、抗原、抗原結合部位を創出する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、抗体がＫＬＢの標的化において診断薬及び／または治療剤として有用になるのに十分な親和性でＫＬＢに結合することができる抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＫＬＢ抗体が無関係の非ＫＬＢタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される、抗体のＫＬＢへの結合の約１０％未満である。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＫＬＢ抗体は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体活性を調節する抗体を指す。例えば、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、アゴニストとして機能し、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体を活性化させることができる。ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体の活性を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または９９．９％増加させる抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体の下流にある標的、例えば、ＭＡＰＫ及び／またはＥＲＫのリン酸化をもたらす抗体であり得る。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３４、３６、３８、４０、または４２に記載の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号３３、３５、３７、３９、または４１に記載の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を有するアミノ酸を含む。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、配列番号３４に記載の配列と約９５％同一である配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３３に記載の配列と約９５％同一である配列を有する軽鎖可変領域とを含み得る。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、配列番号３６に記載の配列と約９５％同一である配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３５に記載の配列と約９５％同一である配列を有する軽鎖可変領域とを含み得る。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、配列番号３８に記載の配列と約９５％同一の配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３７に記載の配列と約９５％同一の配列を有する軽鎖可変領域とを含み得る。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、配列番号４０に記載の配列と約９５％同一である配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３９に記載の配列と約９５％同一である配列を有する軽鎖可変領域とを含み得る。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、配列番号４２に記載の配列と約９５％同一である配列を有する重鎖可変領域と、配列番号４１に記載の配列と約９５％同一である配列を有する軽鎖可変領域とを含み得る。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域とを含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインは、配列番号３、４、５、６、または７に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインは、配列番号８、９、１０、１１、または１２に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインは、配列番号１３、１４、１５、１６、または１７に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ１ドメインは、配列番号１８、１９、２０、２１、及び２２に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ２ドメインは、配列番号２３、２４、２５、２６、または２７に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域ＣＤＲ３ドメインは、配列番号２８、２９、３０、３１、または３２に記載の配列を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、配列番号７に記載の配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１２に記載の配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１７に記載の配列を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２２に記載の配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２７に記載の配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び配列番号３２に記載の配列を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、第１の抗体またはその抗原結合部分、及び第２の抗体またはその抗原結合部分を含み、この第１の抗体またはその抗原結合部分及び第２の抗体またはその抗原結合部分は、ＫＬＢ上に存在する異なるエピトープに結合する。例えば、限定するものではなく、第１の抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得、第２の抗体またはその抗原結合部分は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得る。ある特定の実施形態では、第１及び／もしくは第２の抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号３４、３６、３８、４０、または４２に記載の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、第１及び／もしくは第２の抗体またはその抗原結合部分の軽鎖可変領域は、配列番号３３、３５、３７、３９、または４１に記載の配列を有するアミノ酸を含む。
【０１１９】
例えば、限定するものではないが、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、配列番号４０に記載の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３９に記載の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、配列番号４２に記載の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号４１に記載の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含み得る。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、配列番号３４に記載の配列と約９５％同一である配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３３に記載の配列と約９５％同一である配列を有する軽鎖可変領域を含む、第１の抗体またはその抗原結合部分と、配列番号４０に記載の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号３９に記載の配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、第２の抗体またはその抗原結合部分と、を含み得る。
【０１２１】
１．抗体親和性
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される多重特異性及び二重特異性抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、約０．００１ｎＭ〜約１μＭまたは約１０−８Ｍ〜約１０−１３Ｍであり得る。例えば、限定するものではなく、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、Ｋｄが、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下であり得る。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、Ｋｄが、約１０−８Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下、約１０−１１Ｍ以下、約１０−１２Ｍ、または約１０−１３Ｍ以下からまでであり得る。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、Ｋｄは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定され得る。ある特定の実施形態では、ＲＩＡは、目的とする二重特異性抗体のＦ（ａｂ）２バージョン及びその２つの抗原で実行される。例えば、抗原に対するＦ（ａｂ）２の溶液結合親和性は、非標識抗原の一連の滴定の存在下で、Ｆ（ａｂ）２を最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、その後、抗Ｆａｂ抗体でコーティングされたプレートで結合した抗原を捕捉することによって、測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２〜５時間にわたって室温（約２３℃）で遮断する。非吸着性のプレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭ［１２５Ｉ］−抗原を、目的とするＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）の抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次いで、目的とするＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションは、平衡に達することを確実にするために、より長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移す。その後、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を付加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）上で１０分間、計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を競合結合アッセイでの使用に選択する。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定することができる。  例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用するアッセイを、約１０の応答単位（ＲＵ）で、固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実行する。ある特定の実施形態では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ´−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）になるまで希釈した後に、５μＬ／分の流量で注入して、およそ１０応答単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、２５℃の０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳ中約２５μＬ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムとを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）を、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。オン速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって、１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オン速度は、撹拌されたキュベットを備えるストップトフロー装着分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計において測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、２５℃でのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の２０ｎＭ抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する、蛍光消光技法を使用することによって、判定することができる。
【０１２４】
２．抗体断片
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆ（ａｂ´）２、ダイアボディ、及び以下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、ＰＣＴ出願第ＷＯ９３／１６１８５号ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。
【０１２５】
ダイアボディは、二価または二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ特許出願第４０４，０９７号；ＰＣＴ出願第ＷＯ１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）で説明されている。
【０１２６】
抗体断片の追加の非限定例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆａｂ´−ＳＨ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片が挙げられる。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む、抗体断片である。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６  Ｂ１号を参照されたい）。
【０１２７】
サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ´）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０１２８】
抗体断片は、本明細書に記載される、インタクトな抗体のタンパク分解、ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない、様々な技法によって作製され得る。
【０１２９】
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される多重特異性及び二重特異性抗体はキメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。ある特定の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。非ヒト抗体は、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるために、ヒト化され得る。ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲまたはその一部が非ヒト抗体由来であり、かつＦＲまたはその一部がヒト抗体配列由来である１つ以上の可変ドメインを含み得る。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含み得る。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１３１】
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植について説明）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」について説明）；Ｄａｌｌ´Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」について説明）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチについて説明）に更に記載されている。
【０１３２】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「最良適合」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位集団のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞突然変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞株フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照されたい）、ならびにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照されたい）。
【０１３３】
４．ヒト抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される多重特異性及び二重特異性抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、概して、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【０１３４】
ヒト抗体は、抗原投与に応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体内にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有する。かかるトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について説明）、米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術について説明）、米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について説明）、及び米国特許出願公開第ＵＳ  ２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術について説明）を参照されたい。かかる動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって更に修飾され得る。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が説明されてきた（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体もまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載される。更なる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて説明）に記載の方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載されている。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。かかる可変ドメイン配列は、次いで、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技法は、以下に記載される。
【０１３７】
５．ライブラリ由来抗体
本開示の多重特異性及び二重特異性抗体、例えば、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、所望の活性（単数または複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、限定するものではないが、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を保有する抗体についてかかるライブラリをスクリーニングするための多様な方法が、当該技術分野で既知である。かかる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ´Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に更に記載されている。
【０１３８】
ある特定のファージディスプレイ方法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリでランダムに組み換えられ、その後、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように抗原結合ファージについてスクリーニングされる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして抗体断片をディスプレイする。免疫付与源由来のライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載されるように、ナイーブレパートリーは、クローニングされ（例えば、ヒトから）、いかなる免疫付与も伴わずに、幅広い非自己抗原また自己抗原に対する抗体の単一の源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、無作為配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再配列を達成することによって、合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公開としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０１３９】
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０１４０】
６．抗体変異型
ある特定の実施形態では、開示される抗体のアミノ酸配列変異型が本明細書で提供される。例えば、抗体のアミノ酸配列変異型を生成することによって、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。本開示の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗ＫＬＢ抗体のアミノ酸配列変異型は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列の残基からの欠失、及び／またはそこへの挿入、及び／またはその置換が含まれる。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができるが、但し、その最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
【０１４１】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異型
ある特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異型が提供される。置換型変異誘発の目的の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換の非限定例が、「好ましい置換」の見出しで表１に示される。より実質的な変化の非限定例は、「例示的な置換」という見出しで表１に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載される。アミノ酸置換を、目的とする抗体中に導入することができ、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減、または補体依存性細胞傷害もしくは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害の改善について生成物をスクリーニングすることができる。
【０１４２】
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って群分けされ得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０１４３】
ある特定の実施形態では、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
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【０１４４】
ある特定の実施形態では、一種の置換型変異型は、親抗体、例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、更なる研究のために選択される、得られた変異型（複数可）は、親抗体と比べて、親和性の増加、免疫原性の低減等であるがこれらに限定されないある特定の生物学的特性における改変、例えば、改善を有し、かつ／または実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有することになる。置換変異型の非限定例は親和性成熟抗体であり、これは、例えば、本明細書に記載される技法等のファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成され得る。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異形抗体がファージにディスプレイされ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、改変（例えば、置換）は、ＨＶＲにおいて、例えば、抗体親和性を改善するために行われ得る。かかる改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を経るコドンによってコードされた残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）参照されたい）、及び／または抗原に接触する残基において行われ得、得られた変異型ＶＨまたはＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７に記載されている（Ｏ´Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））。親和成熟のある特定の実施形態では、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性が導入され得る。次いで、二次ライブラリが創出される。次いで、ライブラリがスクリーニングされ、所望の親和性を有する任意の抗体変異型を特定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６つの残基）がランダム化されるＨＶＲ指向アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に特定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が標的化されることが多い。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ間で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）がＨＶＲ内で行われ得る。かかる改変は、例えば、ＨＶＲ内の抗原接触残基の外側であってもよい。上述の変異型ＶＨ配列及びＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、改変されないか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
【０１４７】
変異誘発のために標的とされ得る抗体の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５によって説明される「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基）が特定され、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗体と抗原との相互作用に影響が及ぼされたかどうかを決定する。更なる置換が最初の置換に対する機能感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは、または更に、抗体と抗原との間の接触点を識別するための抗原−抗体複合体の結晶構造。かかる接触残基及び隣接する残基が置換の候補として標的とされ得るか、または排除され得る。変異型がスクリーニングされて、それらが上記の所望の特性を有するかを決定することができる。
【０１４８】
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれ得る。末端挿入の非限定例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入型変異型には、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのため）またはポリペプチドへの抗体のＮ末端もしくはＣ末端の融合を挙げることができる。
【０１４９】
ｂ）グリコシル化変異型
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される多重特異性及び二重特異性抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変され得る。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が創出または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成され得る。
【０１５０】
抗体がＦｃ領域を含むある特定の実施形態では、それに結合した炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。ある特定の実施形態では、本発明の抗体中におけるオリゴ糖の修飾は、特定の特性の改善を有する抗体変異型を作製するために行われ得る。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異型が提供される。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、約１％〜約８０％、約１％〜約６５％、約５％〜約６５％、または約２０％〜約４０％、及びその間の値であり得る。
【０１５２】
フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対するＡｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定され得る。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ付番）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体内のわずかな配列変異に起因して、２９７位から約±３アミノ酸上流または下流、即ち２９４〜３００位の間に位置し得る。かかるフコシル化変異型は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、同第ＵＳ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異形に関する公報の例には、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。
【０１５３】
脱フコシル化抗体は、タンパク質フコシル化が欠乏した任意の細胞株中で産生させることができる。細胞株の非限定例には、タンパク質フコシル化が欠乏したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ  ２００３／０１５７１０８  Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及びＷＯ２００４／０５６３１２  Ａ１、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、ならびにアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞等のノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）が挙げられる。
【０１５４】
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分される、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異型が更に提供される。かかる抗体変異型は、低減されたフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。かかる抗体変異型の非限定例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）、及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異型も提供される。かかる抗体変異型は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。かかる抗体変異形は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１５５】
ｃ）Ｆｃ領域変異型
ある特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異型が生成され得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置でアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含んでもよい。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、本発明は、全てではなくいくつかのエフェクター機能を保有し、それにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、更にある特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣ等）が不必要であるか、または有害である用途に対して望ましい候補となる、抗体変異型を企図する。インビトロ及び／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照されたい）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、同第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるもの等の動物モデルにおいて、評価されてもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定も、当該技術���野で既知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ´ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照されたい）。
【０１５７】
低下したエフェクター機能を有する抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位のうちの２つ以上における置換を有するＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１５８】
ＦｃＲへの結合が改善したまたは減衰したある特定の抗体変異型が説明されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい）。ある特定の実施形態では、抗体変異型は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位（残基のＥＵ付番）での置換を有するＦｃ領域を含む。ある特定の実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、改変された（即ち、改善したまたは減衰した）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらす改変がＦｃ領域中でなされる。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される二重特異性抗体のＦｃ領域中でなされた改変により、増加した半減期と、母体ＩｇＧの胎児への移送に関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合とを有する変異型抗体を産生させることができ（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、これは、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異形は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうちの１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０１６０】
Ｆｃ領域変異形の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【０１６１】
ｄ）システイン操作された抗体変異型
特定の実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。ある特定の実施形態では、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じ得る。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基がそれにより抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、薬物部分またはリンカー−薬物部分等の他の部分に抗体を複合体化して、本明細書に記載されるように、免疫複合体を作製することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
【０１６２】
ｅ）抗体誘導体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される多重特異性、例えば、二重特異性抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するように更に修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐状であっても非分岐状であってもよい。抗体に結合するポリマーの数は異なり得、１つ以上のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下で治療に使用されるかどうか等を含むがこれらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る、抗体及び非タンパク質性部分の複合体が提供される。ある特定の実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブ（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））である。ある特定の実施形態では、放射線は、任意の波長のものであることができ、通常の細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に隣接する細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むがこれらに限定されない。
【０１６４】
Ｃ．免疫複合体
本明細書に開示される主題はまた、化学療法剤もしくは化学療法薬、成長阻害剤、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、もしくはそれらの断片）、または放射性同位体等の１つ以上の細胞傷害性薬剤と複合された本明細書に開示される多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体を含む、免疫複合体を提供する。例えば、開示される主題の抗体または抗原結合部分は、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣体等の１つ以上の他の結合分子に機能的に連結し得る（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有的会合などによって）。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、免疫複合体は、抗体が１つ以上の薬物に複合体化された抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であり、この薬物としては、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許第０  ４２５  ２３５  Ｂ１号を参照されたい）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ等のオーリスタチン（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号及び同第７，４９８，２９８号を参照されたい）；ドラスタチン：カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３）、ならびにＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８（１９９８）を参照されたい）、ダウノマイシンまたはドキソルビシン等のアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７−５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６：３５８−３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７−７２１（２００５）、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：８２９−８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：１５２９−１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６−４３４３（２００２）、及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル等のタキサン；トリコテシン；ならびにＣＣ１０６５を含むが、これらに限定されない。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、免疫複合体は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含むがこれらに限定されない酵素活性毒素またはその断片に複合された本明細書に記載される抗体を含む。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、免疫複合体は、放射性原子に複合されて放射性複合体を形成する、本明細書に記載される多重特異性抗体を含む。放射性複合体の産生には、様々な放射性同位体が利用可能である。非限定例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性複合体を検出のために使用する場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ｍｒｉ）のためのスピン標識、例えば、再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄を含み得る。
【０１６８】
抗体及び細胞傷害性剤の複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）等の多様な二官能性タンパク質結合剤を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７）に記載されている通りに調製することができる。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への複合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内において細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０）が使用され得る。リンカーの非限定例は上に開示されている。
【０１６９】
本明細書の免疫複合体またはＡＤＣは、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびに（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されているＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸塩）を含むが、これらに限定されない架橋剤試薬で調製される複合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。
【０１７０】
ＩＶ．スクリーニング及び産生方法
本明細書に開示される主題の多重特異性抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／または生物活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、特定し、スクリーニングし、または特徴付けることができる。
【０１７１】
Ａ．多重特異性抗体スクリーニングアッセイ
ある特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体は、既知の方法によって特定することができる。例えば、限定するものではなく、二重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体は、上で考察した「ノブ・イントゥ・ホール」ヘテロ二量体化技法を使用して特定することができる。Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９：７，ｐ６１７−６２１（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０，２６−３５（１９９７）、及びＳｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１，７５３−７５９（２０１３）を参照されたい。
【０１７２】
本明細書に開示される主題は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体またはバイエピトープ性抗体のスクリーニング方法を更に提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を呈する多重特異性抗体、例えば、二重特異性またはバイエピトープ性抗体を識別することができる。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、本方法は、多重特異性抗体を１つ以上の細胞中で発現させることを含む。例えば、限定するものではなく、本多重特異性抗体は、第１の抗原結合ポリペプチド、第２の抗原結合ポリペプチド、及びＣＬドメインを含み得る。第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドは、別個の結合特異性を有し得る。例えば、限定するものではなく、第１の抗原結合ポリペプチドは抗原の第１のエピトープに結合することができ、第２の抗原結合ポリペプチドは抗原上の第２のエピトープに結合することができる。あるいは、第１の抗原結合ポリペプチドは第１の抗原に結合することができ、第２の抗原結合ポリペプチドは第２の抗原に結合することができる。ある特定の実施形態では、本抗原結合ポリペプチドの各々は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み、これらの構成要素は、互いに対して、ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順序でＮ末端からＣ末端への方向に位置付けられる。ある特定の実施形態では、第１及び／または第２の抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジ領域を更に含み得る。ある特定の実施形態では、ＶＬドメインのＣ末端は、ＶＨドメインのＮ末端にリンカーを介して連結し得る。第１及び／または第２の抗原結合ポリペプチドは、本明細書に開示されるヘテロ二量体化ドメイン、例えば、ＣＨ３ドメイン中の突起または空洞を更に含み得る。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、核酸、例えば、第１の抗原結合ポリペプチドをコードする第１の核酸、またはその核酸を含むベクターを、細胞に導入し得る。第２の抗原結合ポリペプチドをコードする第２の核酸、または第２の核酸を含むベクターを細胞に導入し得る。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインをコードする第３の核酸、または第３の核酸をコードするベクターを細胞に導入し得る。これらの核酸は、当該技術分野で既知の任意の方法によって細胞に導入することができる。例えば、限定するものではなく、核酸は、形質転換またはトランスフェクションによって細胞に導入することができる。
【０１７５】
開示される方法で使用される細胞は、本明細書に開示される細胞のうちの任意のもの、例えば、本明細書に開示される宿主細胞であり得る。例えば、限定するものではなく、細胞は、原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得る。ある特定の実施形態では、細胞は、真核細胞、例えば、酵母細胞または哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、本方法は、１つ以上の細胞から得た多重特異性抗体を、２つ以上の抗原、例えば、第１及び第２の抗原または同じ抗原上に存在する２つ以上のエピトープ、例えば、抗原上の第１及び第２のエピトープと接触させることを更に含み得る。ある特定の実施形態では、２つ以上のエピトープは、重なり合っていても重なり合っていなくてもよい。ある特定の実施形態では、本多重特異性抗体は、２つ以上の抗原または２つ以上のエピトープと同時にまたは連続して接触させることができる。例えば、限定するものではなく、本多重特異性抗体を２つ以上の抗原または２つ以上のエピトープのうちの一方と接触させた後、本多重特異性抗体を２つ以上の抗原または２つ以上のエピトープのうちの２つ目と接触させることができる。多重特異性抗体を抗原またはエピトープと接触させる前に、本多重特異性抗体を、例えば細胞から、精製及び／または単離し得る。例えば、限定するものではなく、本多重特異性抗体は、クロマトグラフィー方法によって、例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィーによって精製することができる。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、本方法は、２つ以上の抗原または２つ以上のエピトープに結合する多重特異性抗体を識別することを更に含み得る。ある特定の実施形態では、結合は、当該技術分野で既知であり、本明細書に開示される任意のアッセイによって決定することができる。例えば、限定するものではなく、結合は、ＥＬＩＳＡによって、またはフローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって決定することができる。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体のスクリーニング方法は、複数の本明細書に開示される多重特異性抗体を含むライブラリの生成を含み得る。例えば、限定するものではなく、このライブラリは、複数の細胞を含み得、ここで各細胞は、単個の本明細書に開示される多重特異性抗体を発現する。ある特定の実施形態では、ライブラリの各細胞は、第１の抗原結合ポリペプチド、第２の抗原結合ポリペプチド、及びＣＬドメインを発現する。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチド、第２の抗原結合ポリペプチド、及び／またはＣＬドメインをコードする核酸、またはかかる核酸を含むベクターは、例えば、形質転換またはトランスフェクションによって、細胞に導入することができる。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチド、第２の抗原結合ポリペプチド、及び／またはＣＬドメインの各々は、別個の核酸、またはかかる核酸を含む別個のベクターによってコードされる。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドは第１の核酸（または第１の核酸を含む第１のベクター）によってコードされ、ＣＬドメインは第２の核酸（または第２の核酸を含む第２のベクター）によってコードされる。例えば、限定するものではなく、本明細書に開示される主題の第１の核酸は、第１の抗原結合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、第２の抗原結合ポリペプチドをコードするＯＲＦとを含み得る。ある特定の実施形態では、第２の核酸は、ＣＬドメインをコードするＯＲＦを含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＬドメインは、第１の抗原結合ポリペプチド及び／または第２の抗原結合ポリペプチドをコードする同じ核酸（またはその核酸を含むベクター）によってコードされない。
【０１７９】
本方法は、ライブラリ内の複数の多重特異性抗体を、抗原上の２つ以上のエピトープ、例えば、抗原上の第１及び第２のエピトープへの結合についてアッセイすることとを更に含み得る。あるいは、または更に、本方法は、ライブラリ内の複数の多重特異性抗体を、２つ以上の抗原、例えば、第１の抗原及び第２の抗原への結合についてアッセイすることを含み得る。ある特定の実施形態では、結合は、当該技術分野で既知であり、本明細書に開示される任意のアッセイによって決定することができる。本方法は、２つ以上の抗原または抗原上の２つ以上のエピトープに結合する多重特異性抗体を識別することを更に含み得る。例えば、限定するものではなく、バイエピトープ性抗体は、抗原上の２つのエピトープに結合する多重特異性抗体を識別することによって、開示される方法を使用して得ることができる。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性抗体のスクリーニング方法は、例えばルシフェラーゼアッセイによって、多重特異性抗体の活性を決定することを更に含み得る。例えば、限定するものではなく、本方法は、多重特異性抗体がアンタゴニスト活性を呈するかどうかを決定することを含み得る。ある特定の実施形態では、本方法は、多重特異性抗体がアゴニスト活性を呈するかどうかを決定することを含み得る。ある特定の実施形態では、本方法は、多重特異性抗体の活性を、それが由来する単一特異性親抗体の活性と比較して、単独または組み合わせでの単一特異性親抗体よりも優れた活性、例えば、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を呈する多重特異性抗体を識別することを更に含み得る。多重特異性抗体の活性は、当該技術分野で既知であり、本明細書に開示される任意の活性アッセイによって決定することができる。
【０１８１】
本明細書に開示される主題は、本明細書に開示されるスクリーニング方法を使用するバイエピトープ性抗体の識別方法を更に提供する。例えば、限定するものではなく、開示されるスクリーニング方法は、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を呈するバイエピトープ性抗体を識別するために使用することができる。ある特定の実施形態では、開示されるスクリーニング方法を使用して、アゴニスト活性を呈するバイエピトープ性抗体を識別することができる。ある特定の実施形態では、開示される方法を使用して識別されたバイエピトープ性抗体は、単独または組み合わせでのバイエピトープ性抗体が由来する単一特異性親抗体よりも優れたアゴニスト活性を呈する。ある特定の実施形態では、開示される方法を使用して識別されるバイエピトープ性抗体は、同一のＶＬ及びＶＨ配列を有する単一特異性抗体よりも優れたアゴニスト活性を呈する。ある特定の実施形態では、本開示のバイエピトープ性抗体は、例えば、バイエピトープ性抗体の抗原結合ポリペプチドのうちの１つとして、同一のＶＬ、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３配列を有する単一特異性抗体よりも優れたアゴニスト活性を呈する。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、バイエピトープ性アゴニスト抗体の識別方法は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性またはバイエピトープ性抗体を１つ以上の細胞中で発現させることを含み得る。例えば、限定するものではなく、本多重特異性抗体は、本明細書に開示されるように、第１の抗原結合ポリペプチド、第２の抗原結合ポリペプチド、及びＣＬドメインを含み得る。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドは抗原上の第１のエピトープに結合し、第２の抗原結合ポリペプチドは抗原上の第２のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドは、第１の単一特異性抗体の同じ結合特異性ならびに／または同じＶＬ及びＶＨ配列を有し、第２の抗原結合ポリペプチドは第１の単一特異性抗体の同じ結合特異性ならびに／または同じＶＬ及びＶＨ配列を有する。
【０１８３】
本方法は、１つ以上の細胞から得た多重特異性抗体、例えば、二重特異性またはバイエピトープ性抗体を、目的とする同じ抗原上に存在する２つのエピトープ、例えば、抗原上の第１及び第２のエピトープと接触させることを更に含み得る。例えば、限定するものではなく、本多重特異性抗体を２つのエピトープのうちの一方と接触させた後、多重特異性抗体を２つのエピトープのうちの２つ目と接触させることができる。上記のように、本多重特異性抗体、例えば、二重特異性またはバイエピトープ性抗体は、２つのエピトープと接触させる前に精製することができる。ある特定の実施形態では、本方法は、目的とする２つのエピトープに結合する多重特異性抗体を識別することを更に含み得る。エピトープへの結合は、当該技術分野で既知であり、本明細書に開示される任意のアッセイによって決定することができる。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、本方法は、識別された２つのエピトープに結合するバイエピトープ性抗体の活性を決定することを更に含み得る。例えば、限定するものではなく、本方法は、バイエピトープ性抗体がアゴニスト活性を呈するかどうかを決定することを含み得る。バイエピトープ性抗体のアゴニスト活性は、当該技術分野で既知であり、本明細書に開示される任意の活性アッセイによって決定することができる。ある特定の実施形態では、バイエピトープ性抗体のアゴニスト活性は、抗原、例えば、受容体を、バイエピトープ性抗体と接触させ、そのバイエピトープ性抗体が、その受容体と関連付けられるシグナル伝達経路の活性化をもたらすかどうかを分析することによって決定され得る。例えば、限定するものではなく、アゴニスト活性は、インビトロのレポーター系アッセイ、例えば、ルシフェラーゼアッセイを使用してすることによって決定され得、このルシフェラーゼアッセイでは、受容体、例えば、抗原の活性化が、レポーター、例えば、ルシフェラーゼの発現をもたらす。あるいは、または更に、アゴニスト活性は、受容体のシグナル伝達経路の下流標的、例えば、タンパク質の発現、活性、及び／またはリン酸化を分析することによる、受容体、例えば、抗原の活性化が、受容体によって調節されるシグナル伝達経路の活性化をもたらす、インビトロの細胞アッセイによって決定することができる。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、本方法は、バイエピトープ性抗体のアゴニスト活性を、単独または組み合わせでの単一特異性親抗体（例えば、そのバイエピトープ性抗体が由来したもの）のアゴニスト活性と比較すること、及び単一特異性親抗体の活性よりも優れたアゴニスト活性を呈するバイエピトープ性抗体を識別することを更に含み得る。例えば、限定するものではなく、本方法は、バイエピトープ性抗体のアゴニスト活性を決定して、バイエピトープ性抗体のアゴニスト活性と単一特異性抗体のアゴニスト活性とを比較するために使用する技法と同じ技法を使用して、バイエピトープ性アゴニスト抗体の単一特異性親抗体のアゴニスト活性（例えば、単独または組み合わせでの）を決定することを更に含み得る。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチドのＶＬ、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３ドメインは、第１の親モノクローナル抗体のＶＬ、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３ドメインと同じ配列を有し得る。ある特定の実施形態では、第２の抗原結合ポリペプチドのＶＬ、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３ドメインは、第２の親モノクローナル抗体のＶＬ、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３ドメインと同じ配列を有し得る。開示される方法により、２つの親モノクローナル抗体、例えば、単一特異性抗体の結合特異性を有する２つの抗原結合ポリペプチドを対にすることで、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体及びバイエピトープ性抗体の識別が可能となり得る。ある特定の実施形態では、開示されるスクリーニングアッセイによって識別される多重特異性抗体は、単独または組み合わせでの親抗体、例えば、単一特異性抗体よりも高い結合親和性、及び／または活性、例えば、アゴニスト活性を呈する。その結果、開示される方法により、単一特異性抗体のＶＬ領域及びＶＨ領域を対ごとにスクリーニングして、多重特異性、例えば、二重特異性またはバイエピトープ性抗体を識別するためのスループット方法が得られる。ある特定の実施形態では、開示されるスクリーニング方法によって識別される多重特異性抗体、例えば、二重特異性またはバイエピトープ性抗体は、異なる抗体フォーマットにフォーマティングすることができる。例えば、限定するものではなく、開示される方法によって識別される多重特異性抗体、例えば、二重特異性またはバイエピトープ性抗体は、完全抗体フォーマット、例えば、ＩｇＧアイソタイプのものに再フォーマティングすることができる。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体、二重特異性抗体、またはバイエピトープ性抗体が結合する抗原は、受容体である。ある特定の実施形態では、抗原は生物複合体である。例えば、限定するものではなく、受容体は、生物複合体内、例えば、１つ以上の補助受容体及び／またはタンパク質との複合体中に存在する。
【０１８８】
Ｂ．結合アッセイ及び他のアッセイ
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはウェスタンブロットアッセイ等の既知の方法によって、その抗原結合活性について試験され得る。これらのアッセイの各々は、概して、目的とする複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体）を用いることによって、特に目的とするタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、抗原（例えば、ＫＬＢ）−抗体複合体は、例えば、その抗原（例えば、ＫＬＢ）−抗体複合体を認識し、それらに特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を使用して検出することができる。あるいは、これらの複合体は、様々な他の免疫アッセイのうちの任意のものを使用して検出することができる。例えば、本抗体は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において放射性標識され使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６を参照されたい）。放射性同位体は、ガイガー計数管もしくはシンチレーション計数管の使用等の手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、競合アッセイを使用して、本明細書に開示される主題の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体と競合する抗体を識別することができる。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイの非限定例において、固定化された抗原（例えば、ＫＬＢ）を、抗原（例えば、ＫＬＢ）に結合する第１の標識抗体、及び抗原（例えば、ＫＬＢ）への結合について第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートし得る。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化された抗原（例えば、ＫＬＢ）を、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原（例えば、ＫＬＢ）への結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化された抗原（例えば、ＫＬＢ）に関連する標識の量を測定する。固定化された抗原（例えば、ＫＬＢ）に関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で相当量低減している場合、それは、第２の抗体が抗原（例えば、ＫＬＢ）への結合について第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体の、抗体の抗原を発現している細胞、例えば、２９３Ｔ細胞への結合は、フローサイトメトリーを使用して決定することができる。例えば、限定するものではないが、（例えば、ＫＬＢの）抗原またはエピトープを発現している細胞株を、０．１％のＢＳＡ及び１０％のウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中の様々な濃度の二重特異性抗体と混合し、３７℃で１時間インキュベートし得る。洗浄後、細胞を、一次抗体染色と同じ条件下で、フルオレセインで標識した抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させ得る。次に、試料を、光及び側方散乱特性を使用してＦＡＣＳｃａｎ機器によって分析し、単一細胞に対してゲーティングし得る。フローサイトメトリーアッセイに加えてまたはその代わりに、フルオレセイン顕微鏡法を使用する代替的なアッセイを使用してもよい。細胞を上記の通りに染色し、フルオレセイン顕微鏡法によって検査し得る。この方法により、個々の細胞が可視化され、細胞中の抗原の局在を分析できるようになる。
【０１９２】
本開示の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体を、ウェスタンブロットによって、抗体のエピトープまたは抗原との反応性について更に試験することができる。例えば、限定するものではないが、目的とする抗原（例えば、ＫＬＢ）を発現している細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し得る。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％のウシ胎仔血清でブロックし、試験するモノクローナル抗体でプローブする。二重特異性抗体結合を、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて現像し得る。
【０１９３】
Ｃ．活性アッセイ
本開示は、生物活性を有する多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体の識別用アッセイを提供する。例えば、限定するものではなく、本開示は、生物活性を有する多重特異性抗体、例えば、抗ＫＬＢ抗体の識別用アッセイを提供する。例えば、限定するものではなく、抗ＫＬＢ抗体についての生物活性は、例えば、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ受容体複合体の活性化を含み得る。かかる生物学的活性をインビボ及び／またはインビトロで有する抗体も提供される。ある特定の実施形態では、本アッセイは、本開示の二重特異性抗体を、細胞、例えば、ＫＬＢを発現している２９３Ｔ細胞に結合させること、及びＫＬＢ−ＦＧＦＲ１受容体複合体の１つ以上の下流にある標的、例えば、ＥＲＫの活性及び／またはリン酸化状態を分析することを含み得る。ある特定の実施形態では、本アッセイは、本開示の二重特異性抗体を、対象、例えば、非ヒト動物に投与すること、及び抗体が対象においてグルコース値に与える影響を分析することを含み得る。
【０１９４】
Ｄ．産生方法
本明細書に開示される多重特異性、二重特異性、及びバイエピトープ性抗体は、当該技術分野において利用可能であるかまたは既知である任意の技法を使用して産生させることができる。例えば、限定するものではないが、抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている組換え方法及び組成物を使用して産生させることができる。二重特異性抗体、例えば、抗ＫＬＢ二重特異性抗体を生成するための詳細な手順は、以下の実施例に記載されている。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、二重特異性、バイエピトープ性、及び／または多重特異性抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する、例えばＶＬｆＨ形式にある、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、ならびに例えば「ノブ・イン・ホール」操作を使用して産生させたヘテロ二量体化ドメイン（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。「ノブ・イン・ホール」技法は、突然変異をＣＨ３ドメインに導入して、接触界面を修飾することによって、２つの異なる抗体重鎖を対形成させることを狙いとする。１つの重鎖において、１つ以上の元のアミノ酸を、側鎖が短いアミノ酸によって代置して、「ホール」または「空洞」を創出し得る。ある特定の実施形態では、ホール突然変異（複数可）は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及び／またはＹ４０７Ｖ（ＥＵ付番）のうちの１つ以上を含み得る。逆に、側鎖が大きい１つ以上のアミノ酸を第２の抗体重鎖の他方のＣＨ３ドメインに導入して、「ノブ」を創出した。ある特定の実施形態では、ノブ突然変異はＴ３６６Ｗ（ＥＵ付番）を含み得る。これらの２つの重鎖（及び両方の重鎖に適した２つの同一の軽鎖）を同時発現させることによって、ヘテロ二量体形成（「ノブ−ホール」）対ホモ二量体形成（「ホール−ホール」または「ノブ−ノブ」）の高い収率が観察される（Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７−６２１、及びＷＯ９６／０２７０１１を参照されたい）。ノブ・イン・ホール技術は、２つの重鎖が各々異なるかまたは同族である軽鎖と対になる場合にも使用されている。例えば、限定するものではなく、２つの重鎖／軽鎖対は、各々、別々の細胞中で産生されて折り畳まれ、精製され、組織化されて、インビトロでノブ・イン・ホール二重特異性抗体を形成し得る。例えば、ＷＯ２０１２／１０６５８７、ＷＯ２０１１／１３３８８６、及びＷＯ２０１３／０５５９５８を参照されたい。これらの内容は、ここに全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示の実施例２も参照されたい。２つの重鎖のヘテロ二量体化を促進するために開示される抗体のＦｃ領域に導入され得る更なる突然変異は、以下に開示されている。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成が非常に好ましい他のヘテロ二量体化ドメインは、開示される多重特異性抗体中に、例えば、かかる抗体のインビトロまたはインビボでの産生のために、組み込むことができる。かかるヘテロ二量体化ドメインの非限定例は、ＷＯ２００７／１４７９０１（イオン相互作用を説明する）、ＷＯ２００９／０８９００４（静電ステアリング効果を説明する）、ＷＯ２０１０／０３４６０５（コイルドコイルを説明する）に開示されており、これらの内容は、ここに全体が参照により本明細書に組み込まれる。ロイシンジッパーを説明しているＰａｃｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９−１５８４（１９９２）、及びヘリックスターンヘリックスモチーフを説明しているＰａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−１２７７（１９９３）も参照されたい。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性抗体は、ヘテロ二量体を生成して、例えば、多重特異性抗体の第１の抗原結合ポリペプチドと第２の抗原結合ポリペプチドとの間の相互作用を促進するために、１つ以上のヘテロ二量体化ドメインを含み得る。ヘテロ二量体化ドメインを、抗体内、例えば、本開示の抗体の第１及び／または第２の抗原結合ポリペプチド内で生成するために使用することができる技法の更なる非限定例には、第１の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＦ４０５Ｌ及び第２の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＫ４０９Ｒ（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ１  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｆａｂ−ａｒｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０：５１４５−５１５０（２０１３））；第１の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＴ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ、ならびに第２の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＴ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ（Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｔｏ  ａｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ：ｑｕａｌｉｔｙ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｓｉｇｎ．ＭＡｂｓ  ５：６４６−６５４（２０１３））；第１の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ、ならびに第２の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＩｇＧ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１９６３７−１９６４６（２０１０））；第１の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＤ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、及びＬ３６８Ｅ、ならびに第２の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＤ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、及びＫ４０９Ｒ（Ｓｔｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ａｎｄ  ＩｇＧ２  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｎｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐａｉｒ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２０：２０４−２１９（２０１２））；ＩｇＧ／Ａキメラ（Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ＳＥＥＤｂｏｄｉｅｓ：ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ＣＨ３  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｉｎ  ａｎ  Ｆｃ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｂｉｎｄｅｒｓ  ｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ  ２３：１９５−２０２（２０１０））；第１または第２の抗原結合ポリペプチド鎖のうちの一方におけるＨ４３５Ｒ（ＵＳ  ２０１４／０２４８６６４Ａ１）；第１の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＹ３４９Ｃ、Ｋ３６０Ｅ、及びＫ４０９Ｗ、ならびに第２の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＳ３５４Ｃ、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、及びＦ４０５Ｔ（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｃ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：３７７−３８３（２０１５））；ならびに第１の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＳ３６４Ｈ及びＦ４０５Ａ、ならびに第２の抗原結合ポリペプチド鎖におけるＹ３４９Ｔ及びＴ３９４Ｆ（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏ−ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ  ３：５４６−５５７（２０１１））が挙げられる。
【０１９７】
本開示の多重特異性、バイエピトープ性、及び二重特異性抗体は、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２つ以上の抗体または断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））；ロイシンジッパーを使用する二重特異性抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）；二重特異性抗体断片作製のための「ダイアボディ」技法の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）；ならびに単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）；ならびに例えばＴｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているような三重特異性抗体の調製によって作製することができる。
【０１９８】
本開示の二重特異性及び多重特異性分子も、化学的技法（例えば、Ｋｒａｎｚ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５８０７を参照されたい）、「ポリドーマ」技法（例えば、米国特許第４，４７４，８９３号を参照されたい）、または組換えＤＮＡ技法を使用して作製することができる。本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、構成結合特異性、例えば、第１のエピトープ及び第２のエピトープ結合特異性を、当該技術分野で既知であり本明細書に記載される方法を使用して複合させることによって調製することもできる。例えば、二重特異性及び多重特異性分子の各結合特異性は、別個に生成した後で互いに複合させ得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合には、多様な結合剤または架橋剤を共有的符複合体化に使用することができる。架橋剤の例には、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及び４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６、Ｌｉｕ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８を参照されたい）。他の方法には、Ｐａｕｌｕｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．（１９８５）Ｎｏ．７８，１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３）、Ｇｌｅｎｎｉｅ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５）によって説明されているものが挙げられる。結合特異性が抗体（例えば、２つのヒト化抗体）である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して複合体化され得る。このヒンジ領域は、複合前に、奇数、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含有するように修飾され得る。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、両方の結合特異性が、同じベクター中でコードされ、同じ宿主細胞中で発現され組織化され得る。本方法は、二重特異性及び多重特異性分子がＭＡｂ×ＭＡｂ、ＭＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ´）２、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、単鎖分子、例えば、単鎖二重特異性抗体、１つの単鎖抗体及び結合決定基を含む単鎖二重特異性分子、または２つの結合決定基を含む単鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性及び多重特異性分子は、単鎖分子であることもでき、あるいは少なくとも２つの単鎖分子を含んでもよい。二重または多重特異性分子の調製方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号、及び米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位（例えば、エピトープ結合部位）を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
【０２００】
ある特定の実施形態では、動物系を使用して、開示される抗体を産生させることができる。ハイブリドーマを調製するための１つの動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、極めて確立されている手順である。免疫付与プロトコル、及び融合のための免疫付与した脾細胞の単離技法は、当該技術分野で既知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順も既知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい）。
【０２０１】
本明細書に開示される主題は、本明細書に開示される多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体をコードする単離された核酸を更に提供する。例えば、単離された核酸は、多重特異性抗体の第１の抗原結合ポリペプチド及び／または第２の抗原結合ポリペプチドをコードし得る。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ポリペプチド及び第２の抗原結合ポリペプチドは、２つの別個の核酸によってコードされる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題は、ＣＬドメイン、例えば、カッパＣＬドメインをコードする単離された核酸を更に提供する。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、この単離された核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列、例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖をコードし得る。ある特定の実施形態では、単離された核酸は、配列番号３４、３６、３８、４０、及び４２に記載の配列を有する重鎖可変領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、及び／または配列番号３３、３５、３７、３９、及び４１に記載の配列を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。ある特定の実施形態では、本核酸は、１つ以上のベクター、例えば、発現ベクター中に存在し得る。
【０２０３】
本明細書において使用される場合、「ベクター」は、それが連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの一種には「プラスミド」があり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、これにおいて、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムへとライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに統合することができるため、宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある特定のベクター、発現ベクターは、それらが動作可能に連結されている遺伝子の発現を導くことが可能である。一般に、組換えＤＮＡ技法における利用される発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態である場合が多い。しかしながら、開示される主題は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス）等の発現ベクターの他の形態を含むことが意図される。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体をコードする核酸及び／またはその核酸を含む１つ以上のベクターを、宿主細胞中に導入する、例えば、形質転換することができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、（１）第１の抗原結合ポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター；（２）第２の抗原結合ポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター；及び（３）本抗体のＣＬドメインを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第３のベクターで形質転換することができる。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、（１）本抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び本抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）本抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び本抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含み得る、例えば、形質転換されている。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体の作製方法は、本抗体または本抗体の特定の成分、例えば、第１の抗原結合ポリペプチド、第２の抗原結合ポリペプチド、及び／またはＣＬドメインをコードする１つ以上の核酸が導入されている宿主細胞を抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意に抗体を宿主細胞及び／または宿主細胞培地から回収することとを含み得る。ある特定の実施形態では、本抗体は、宿主細胞を溶解させることによって、宿主細胞から回収することができる。あるいは、本抗体は、宿主細胞から分泌され、宿主細胞培地から回収することができる。ある特定の実施形態では、本抗体は、クロマトグラフィー技法によって、宿主細胞、例えば、宿主細胞溶解物、または宿主細胞培地から回収される。
【０２０７】
本発明の抗体の組換え産生については、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／または発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。かかる核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することで）、容易に単離され、配列決定され得る。
【０２０８】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載される原核生物細胞または真核生物細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌中で産生され得る。細菌における抗体断片及び抗原結合ポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現について説明している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい。）発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製され得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。
【０２０９】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母等の真核微生物は、抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌及び酵母株を含む。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得ることができる。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が挙げられる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用され得る、多数のバキュロウイルス株が特定されている。
【０２１０】
ある特定の実施形態では、植物細胞培養物を宿主細胞として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について説明）を参照されたい。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、脊椎動物細胞を宿主として使用してもよい。例えば、懸濁液中で成長するように適合させた哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３または２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ  ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に好適なある特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
【０２１２】
ＩＶ．使用方法
本明細書に開示される主題は、開示される多重特異性及び二重特異性抗体の使用方法を更に提供する。ある特定の実施形態では、開示される方法は、本明細書に開示される抗体の治療的使用を対象とする。ある特定の実施形態では、開示される方法は、診断方法における開示される抗体の使用を対象とする。
【０２１３】
Ａ．治療方法
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題の１つ以上の抗体は、対象において疾患を治療するために使用され得る。ある特定の実施形態では、個体の治療方法は、個体に治療有効量の本明細書に開示される抗体を投与することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、対象に、治療有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与することを更に含み得る。追加の治療剤、例えば、第２の治療剤の非限定例は、以下に記載される。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、疾患は代謝障害であり得る。代謝障害の非限定例には、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、代謝症候群（ＭｅｔＳ）、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂質異常症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、及びＡＬＳ等の老齢疾患及び関連疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題は、自己免疫疾患または障害及び炎症性疾患等の免疫関連疾患または障害の治療方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、本開示の抗体、または本抗体を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。免疫関連疾患または障害の非限定例には、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、骨関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、特発性炎症性筋疾患、シェーグレン症候群、全身性脈管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、甲状腺炎、真性糖尿病、Ｉ型またはＩＩ型真性糖尿病、免疫介在性腎疾患、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経炎、またはギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆汁性疾患、例えば、感染性自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、グルテン過敏性腸症及びウィップル病、水疱性皮膚症、多形性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、及び蕁麻疹、肺の免疫疾患、例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、及び過敏性肺炎、移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が挙げられる。ある特定の他の実施形態では、免疫関連疾患は、喘息、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、紅斑性狼瘡、乾癬、慢性閉塞性肺疾患、または特発性肺線維症である。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される主題は、本開示の抗体、または本抗体を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、細胞増殖関連疾患または障害の治療方法を提供する。ある特定の実施形態では、細胞増殖関連疾患は、結腸直腸癌、腎細胞癌（例えば、腎細胞癌腫）、黒色腫、膀胱癌、卵巣癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２陽性乳癌、またはホルモン受容体陽性癌）、及び非小細胞肺癌（例えば、扁平上皮非小細胞肺癌または非扁平上皮非小細胞肺癌）であり得るが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本開示の方法による治療対象の癌には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本開示の方法による治療対象の癌には、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む）、黒色腫、腎細胞癌腫、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または胃の癌（消化管癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌、及び様々なタイプの頭頸部癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ、巨大病変性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（例えば脳腫瘍に関連するもの等）、及びメイグス症候群に関連する異常血管増殖が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、癌は、早期癌であっても後期癌であってもよい。ある特定の実施形態では、癌は、原発性腫瘍であってもよい。ある特定の実施形態では、癌は、上記の種類の癌のいずれかに由来する第２の部位における転移性腫瘍であってもよい。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、開示される方法において使用するための多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、薬学的組成物中に存在し得る。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。更にまたはあるいは、本薬学的組成物は第２の治療剤を含み得る。抗体が別の治療剤と一緒に投与されるとき、それらの２つは、いずれの順序で投与することも、または同時に投与することもできる。
【０２１８】
疾患の予防または治療に関して、本明細書に開示される主題の抗体の適切な投薬量、例えば、治療有効量は、単独で、または１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の療法、患者の病歴及び抗体への応答、ならびに主治医の裁量に左右されることになる。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、本抗体は、１回で、または一連の治療にわたって患者に投与される。例えば、限定するものではないが、本抗体及び／または薬学的製剤は、本明細書に開示される抗体を含有し、１日２回、１日１回、２日毎に１回、３日毎に１回、４日毎に１回、５日毎に１回、６日毎に１回、週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、月１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、６カ月毎に１回、または年１回、対象に投与され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される本抗体及び／または抗体を含有する薬学的製剤は、週１回または月１回、対象に投与され得る。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、疾患の種類及び重症度に応じて、例えば１回以上の別個の投与によってであれ連続注入によってであれ、約１μｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者に投与するための初回候補投薬量となり得る。１つの典型的な日用量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲に及び得る。ある特定の実施形態では、日用量は約１００ｍｇ／ｋｇ超であり得る。いくつかの方法において、投薬量は、１〜１０００μｇ／ｍＬの血漿中抗体濃度、及びいくつかの方法においては、２５〜３００μｇ／ｍＬの血漿中抗体濃度を達成するように、調整される。あるいは、抗体は、持続放出製剤として投与することができ、その場合、必要とされる投与の頻度はより低い。投薬量及び頻度は、患者における本抗体の半減期に基づいて変動し得る。
【０２２１】
数日間以上にわたる反復投与では、病態に応じて、治療は一般に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられ得る。ある特定の実施形態では、本抗体の投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量が患者に投与されてもよい。かかる用量は、間欠的に、例えば、毎週または３週間に１回（例えば、患者が約２〜約２０回、または例えば約６回用量の抗体を受けるように）投与され得る。より高い初回負荷量、続いて１回以上のより低い用量が、投与され得る。
【０２２２】
ある特定の実施形態では、本方法は、対象のモニタリング及び治療効果の決定を更に含み得る。例えば、この療法の進行は、従来の技法及びアッセイによって容易にモニタリングすることができる。
【０２２３】
Ｂ．診断及び検出方法
本明細書に開示される主題は、本明細書に開示される、開示される抗体を使用する疾患の診断及び／または検出方法を提供する。更なる態様では、生体試料中の抗原の存在及び／またはレベルの検出方法が提供される。本明細書で使用される場合、「検出すること」という用語は、定量及び／または定性検出を包含する。
【０２２４】
試料の非限定例には、培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液（例えば、血液、血漿、血清、便、尿、リンパ液、腹水、乳管洗浄液、乳頭吸引液、唾液、気管支肺胞洗浄液、涙液、及び脳脊髄液）、ならびに組織試料が挙げられるが、これらに限定されない。試料の供給源は、個体由来の固形組織（例えば、採取したての、凍結された、及び／もしくは保存された、臓器、組織試料、生体組織、もしくは吸引液）、血液もしくは任意の血液組成成分、体液（例えば、尿、リンパ液、脳脊髄液、羊膜液、腹腔液、もしくは間質液等）、または細胞であり得る。ある特定の実施形態では、生体試料は肝臓由来の組織及び／または細胞である。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、診断または検出方法は、二重特異性抗ＫＬＢ抗体のＫＬＢへの結合を許容する条件下で、生体試料を本明細書に記載の二重特異性抗ＫＬＢ抗体と接触させることと、複合体が二重特異性抗ＫＬＢ抗体とＫＬＢとの間で形成されるかどうかを検出することと、を含む。かかる方法は、インビトロ方法またはインビボ方法、例えば、免疫蛍光またはウェスタンブロットであってもよい。ある特定の実施形態では、例えば、ＫＬＢが患者選択のためのバイオマーカーである場合に、本明細書に開示される二重特異性抗ＫＬＢ抗体を使用して、抗ＫＬＢ抗体による療法に適格な対象を選択する。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、本方法において使用するための開示される抗体は標識され得る。標識には、直接的に検出される標識または部分、例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用を介して間接的に検出される部分、例えば、酵素またはリガンドが含まれるがこれらに限定されない。標識の非限定例には、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレートまたはフルオレセイン及びその誘導体等のフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅｓ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号を参照されたい）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化させる酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼとカップリングされた、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等の複素環式オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定した遊離ラジカル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２７】
Ｖ．薬学的製剤
本明細書に開示される主題は、薬学的に許容される担体を伴う、本明細書に記載される多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体を含有する薬学的製剤を更に提供する。ある特定の実施形態では、本薬学的組成物は、複数の（例えば、２つ以上の）単離された本明細書に開示される主題の多重特異性、例えば、二重特異性抗体、及び／またはその抗原結合部分の組み合わせを含み得る。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、開示される薬学的製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有する開示される多重特異性、例えば、二重特異性抗ＫＬＢ抗体を、１つ以上の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と組み合わせることによって調製することができる。例えば、限定するものではないが、凍結乾燥された抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。ある特定の実施形態では、水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２２９】
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、純度が、約８０％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、約９９．１％超、約９９．２％超、約９９．３％超、約９９．４％超、約９９．５％超、約９９．６％超、約９９．７％超、約９９．８％超、または約９９．９％超であり得る。
【０２３０】
薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投薬量及び濃度ではレシピエントに非毒性であり、それらとしては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体の更なる非限定例には、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の介在性薬物分散剤を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されており、その内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２３１】
担体は、（例えば、注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または上皮投与に好適であり得る。投与経路に応じて、本活性化合物、即ち、二重特異性抗体は、化合物を、酸の作用及び化合物を不活性化し得る他の天然の条件から保護するために物質中にコーティングされてもよい。
【０２３２】
本開示の医薬組成物はまた、併用療法において、即ち、他の薬剤と組み合わせて、投与することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、治療される特定の適応症の必要に応じて２つ以上の活性成分、例えば、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する活性成分も含み得る。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、第１の治療薬により治療される疾患と同じ疾患を治療するための第２の活性成分を含み得る。かかる活性成分は、好適には、意図される目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
【０２３３】
本開示の組成物は、当該技術分野で既知の多様な方法によって投与することができる。投与の経路及び／または様式は、所望の結果に応じて変動する。活性化合物は、化合物を、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル封入送達系を含む放出制御製剤等の、急速な放出から保護する担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤を調製するための多くの方法は、例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８によって説明されている。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、米国食品医薬品局の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）条件下で製造される。
【０２３４】
開示される二重特異性抗ＫＬＢ抗体を含有する持続放出製剤も調製することができる。持続放出調製物の好適な例には、本抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられるがこれに限定されず、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。ある特定の実施形態では、活性成分は、例えば、コアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中、またはマイクロエマルジョン中に封入され得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２３５】
ある特定の投与経路によって本開示の抗体を投与するためには、化合物を、その不活性化を防止するための物質でコーティングするか、またはそれを化合物と同時投与することが必要であり得る。例えば、本化合物は、適切な担体、例えば、リポソーム、または希釈剤中で対象に投与されてもよい。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水及び緩衝水溶液が挙げられる。リポソームには、水中油中水型ＣＧＦエマルション、及び従来のリポソームが挙げられる（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
【０２３６】
薬剤的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散液、及び滅菌注射液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。薬学的活性物質のためのかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で既知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である限りを除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。補足的活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【０２３７】
治療用組成物は、典型的に、製造及び保管条件下で、無菌であり、実質的に等張であり、かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として、処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）を含有する溶媒または分散媒質、及びその適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含むことによって、もたらすことができる。
【０２３８】
無菌注射液は、必要な量の本二重特異性抗体を、必要に応じて、上に列挙された成分のうちの１つまたはその組み合わせを有する適切な溶媒中に組み込み、続いて精密濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上で列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に、その事前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加的な所望の成分を添加した粉末をもたらす、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０２３９】
治療用組成物は、当該技術分野で既知の医療機器により投与することができる。例えば、本開示の治療用組成物は、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示されている機器等の無針皮下注射機器により投与することができる。本発明において有用なインプラント及びモジュールの例には、制御された速度で薬剤を分注するための埋め込み型マイクロ注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号；薬剤の経皮投与のための治療用機器を開示している米国特許第４．，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための変流量式埋め込み型注入装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号；複数のチャンバ部分を有する浸透圧性薬物送達システムを開示している米国特許第４，４３９，１９６号；及び浸透圧性薬物送達システムを開示している米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くの他のかかるインプラント、送達システム、及びモジュールが既知である。
【０２４０】
治療量組成物用の本発明の製剤は、経口、経鼻、局所（口腔内及び舌下を含む）、直腸、膣、及び／または非経口投与に好適なものを含む。本製剤は、好都合にも単位剤形で提供することができ、薬学の分野において周知である任意の方法によって調製することができる。担体材料と組み合わせて単一剤形を産出することができる二重特異性抗体の量は、治療される対象及び特定の投与様式に応じて変動する。担体材料と組み合わせて単一剤形を産出することができる二重特異性抗体の量は、一般に、治療効果をもたらすような組成物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、約０．１パーセント〜約７０パーセント、または約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲である。
【０２４１】
また膣内投与に好適な本明細書に開示される主題の製剤には、当該技術分野において適切であることが知られているような担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡、または噴霧製剤が挙げられる。本発明の化合物の局所または経皮投与のための剤形には、粉末、噴霧、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、及び吸入剤が挙げられる。活性化合物は、薬学的に許容される担体と、必要であり得る任意の保存剤、緩衝液、または噴霧剤と一緒に、無菌条件下で混合され得る。
【０２４２】
「非経口投与」及び「非経口で投与される」という語句は、経腸及び局所投与以外の投与様式、通常は注射による投与を意味し、限定せずに、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内注射ならびに注入を含む。
【０２４３】
これらの薬学的組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤等のアジュバントを含有することができる。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順によって、ならびに、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤を含めることによっての両方で、確実にされ得る。糖、塩化ナトリウム等のような等張剤を組成物に含めることもまた、望ましいことであり得る。更に、注射可能な医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらすことができる。
【０２４４】
本発明の抗体が医薬品としてヒト及び動物に投与されるとき、それらは、それ自体で、または例えば薬学的に許容される担体と組み合わせられた約０．０１％〜約９９．５％（または約０．１〜約９０％）の二重特異性抗体を含む医薬組成物として、与えることができる。
【０２４５】
ＶＩ．製品及びキット
本明細書に開示される主題は、更に製品及びキットに関する。例えば、限定するものではなく、本開示の製品及び／またはキットは、１つ以上の本明細書に開示される多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体を含み得る。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、本製品は、容器と、容器上のまたは容器に伴うラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器の非限定例には、ボトル、バイアル、シリンジ、及びＩＶ溶液バッグが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の多様な材料から形成され得る。容器は、それ自体によって、または別の組成物と組み合わせて、病態の治療、予防、及び／または診断に有効である組成物を保持することができ、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈注射溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであり得る）。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、本開示の製品及び／またはキットは、上記の障害の治療、予防、及び／または診断に有用な物質を含有する。ある特定の実施形態では、組成物中の少なくとも１つの活性剤が本明細書に開示される主題の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選定した病態を治療するために使用されることを示し得る。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、本製品は、（ａ）本明細書に開示される主題の本明細書に開示される二重特異性抗体を含む組成物を中に収容した第１の容器と、（ｂ）更なる細胞傷害性薬剤または治療剤を含む組成物を中に収容した第２の容器とを含み得る。ある特定の実施形態では、本製品は、本組成物が特定の病態を治療するために使用され得ることを示す添付文書を更に含み得る。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、本製品は、追加の容器、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液等であるがこれらに限定されない薬学的に許容される緩衝液を含む第２または第３の容器を更に含み得る。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含むことができる。
【０２５０】
以下の実施例は、本明細書に開示される主題を例示するだけのものであり、決して限定的であるとみなされるべきではない。
【実施例】
【０２５１】
実施例１：抗ＫＬＢ抗体の開発及び特性評価
この実施例は、抗ＫＬＢモノクローナル抗体の生成を説明する。抗ＫＬＢモノクローナル抗体を産生させるために、ＫＬＢノックアウト（ＫＬＢ．ｋｏ）マウス（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）に、ＫＬＢもしくはＦＧＦＲ１ｃのいずれかを発現しているｐＲＫベクターもしくはｐＣＭＶベクターか、または乳酸加リンガー溶液中で希釈したｍＦｌｔ３リガンド（ＤＮＡ）及びｍＧＭ−ＣＳＦ（ＤＮＡ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を伴うかもしくは伴わない、ヒトＫＬＢ及びＦＧＦＲ１ｃを発現しているｐＣＭＶ．ｈＫＬＢ．ＩＲＥＳ．ｈＦＧＦＲ１ｃベクターか、いずれかを、それぞれ５０μｇ用いて、合計３〜１３注射で、１〜４週間隔で、水圧尾静脈（ＨＴＶ）注射によって免疫付与するか、あるいはＰＢＳ中で希釈したヒトＫＬＢ及びＦＧＦＲ１ｃで安定してトランスフェクトした５００万個の３００．１９細胞を用いて、合計１２注射で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって、毎週、免疫付与した。マウスに、ＨＴＶを介したＫＬＢ及びＦＧＦＲ１ｃプラスミドＤＮＡか、またはｉ．ｐ．注射を介したそれぞれ２μｇのヒトＫＬＢタンパク質及びカニクイザルＫＬＢタンパク質を伴う５００万個の３００．１９−ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃトランスフェクト細胞か、いずれかを、それぞれ５０μｇ、融合前ブーストとして与えた。
【０２５２】
最後の免疫付与の３日後に脾臓を採取した。ＦＡＣＳによって全ての血清がヒトＫＬＢ及び／またはＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体を過剰発現している２９３細胞への強力な結合を示したマウス由来の脾細胞を、電気融合（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  ＣＥＥＦ−５０装置、ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）によってＰ３Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ．１マウス骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）と融合させた。Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｃ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ４７−０００１）によって２回洗浄した後、単離した脾細胞及び骨髄腫細胞を１：１の割合で混合し、次に１０００万細胞／ｍｌでＣｙｔｏｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｃ中に再懸濁させた。電気融合は製造業者の指示に従って行った。融合させた細胞を、７％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で一晩ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｃ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０３８０３）中で培養した。翌日、融合させた細胞を遠心分離させた後、抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を有する１０ｍｌのＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｃ中に再懸濁させ、次にＨＡＴ成分を含有する９０ｍｌのＭｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂａｓｅｄ  ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｄ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０３８０４）と一緒に穏やかに混合した。細胞をＯｍｎｉＴｒａｙプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）にプレーティングし、７％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で成長させた。６〜７日間の培養後、蛍光コロニーを選択し、Ｃｌｏｎｅｐｉｘ  ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、２００μＬ／ウェルのＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０３８０５）を含有する９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号３５３０７５）に移した。ハイブリドーマ培地をＥＬＩＳＡスクリーニングの３日前に交換した。ピッキングの７日後に上清をＥＬＩＳＡによって抗マウスＩｇＧに対してスクリーニングした。ＥＬＩＳＡによってマウスＩｇＧ発現を示すハイブリドーマを増殖させ、細胞ベースのＥＬＩＳＡ及び／またはＦＡＣＳによって、ヒトＫＬβ、マウスＫＬＢ、カニクイザルＫＬＢ、ヒトＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体、カニクイザルＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体、ヒトＦＧＦＲ１ｃ、及び／またはヒトＫＬα／ＫＬＢを過剰発現している２９３細胞への結合についてスクリーニングした。上清も、ＦＡＣＳによって抗ＫＬＢ  ８Ｃ５抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）との結合競合についてスクリーニングした。全てのＩｇＧ陽性上清も、ヒトＦＧＦＲ１ｃ及びＫＬβ／ＦＧＦＲ１ｃ複合体を過剰発現している２９３細胞を使用して、ＧＡＬ／Ｅｌｋ１ルシフェラーゼアッセイにおいて、アゴニスト活性についてスクリーニングした。ＲＮｅａｓｙ��ット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＦＡＣＳ陽性及びアゴニスト性ハイブリドーマ細胞株からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを生成し、配列決定のために増幅させた。重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を、発現のためにｐＲＫプラスミドベクター（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）に挿入した。ＦＡＣＳ結合活性及びアゴニスト活性を示した固有のクローンからのプラスミドＤＮＡを、２９３細胞において組み換え発現させた。次いで、これまでに説明されているように（Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９：３０３，２０００）、上清をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。
【０２５３】
上記の方法を使用して、ＫＬＢの単一エピトープに結合するモノクローナル抗ＫＬＢ抗体を産生する約４個の異なるハイブリドーマ、２Ｃ１２、４Ｈ７、２３Ｂ３、及び２８Ｂ７を特定した。
【０２５４】
第５のモノクローナル抗体である１２Ｂ８は、以下の実験方法を使用して特定した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ｈＦＧＦＲ１ｃ及びｈＫＬＢタンパク質を安定して発現しているＨＥＫ２９３細胞で免疫付与した。１２週間後に膵臓を採取し、ハイブリドーマを生成した。ハイブリドーマを産生する抗ｈＫＬＢ抗体を、免疫付与に使用したＨＥＫ２９３細胞を使用して、ＦＡＣＳ分析によって特定した。簡潔には、ｈＫＬＢを単独で発現しているか、ｈＦＧＦＲ１を単独で発現しているか、またはそれらの両方を発現している２９３細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ）中の希釈したハイブリドーマ上清及びＰＥ複合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）で染色した。同じＦＡＣＳ緩衝液を使用して染色した細胞を洗浄した。染色した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及びＦｌｏｗＪｏ  ＦＡＣＳ分析ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）によって分析した。ＩｇＧ重鎖及び軽鎖をコードしているｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングした。
【０２５５】
これら５つの抗ＫＬＢ抗体、１２Ｂ８、２Ｃ１２、４Ｈ７、２３Ｂ３、及び２８Ｂ７は、ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃアゴニスト抗体として機能することが示された（図４及び５）。これら５つの抗体についての重鎖可変領域及び軽鎖可変領域ＣＤＲ配列を、それぞれ、表２及び表３に示す。これらの抗ＫＬＢ抗体の完全長重鎖及び軽鎖配列は、表４及び図１３〜１７に示す。これらの抗体は、本明細書では親抗体と称する。
表2．抗ＫＬＢ抗体についての重鎖可変領域CDR配列
2019504617.tif 000005
表3．抗ＫＬＢ抗体についての軽鎖可変領域ＣＤＲ配列
2019504617.tif 000006
表４．特定した抗ＫＬＢ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域
2019504617.tif 000007
【０２５６】
実施例２：二重特異性抗ＫＬＢ抗体のスクリーニング
この実施例では、二重特異性抗ＫＬＢ抗体のスクリーニングを行い、二重特異性抗ＫＬＢ抗体のＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃアゴニスト活性を２９３Ｔ細胞中で試験した。
【０２５７】
ＫＬＢ上の２つの結合部位、例えば、エピトープに結合する二重特異性抗体を、表１及び２で上に列挙した親抗体の抗ＫＬＢ抗体配列を使用して生成した。生成した二重特異性抗体の要約については表５を参照されたい。二重特異性抗体は、ＶＬｆＨ（可変軽完全重（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｆｕｌｌ  ｈｅａｖｙ））形式で完全重鎖に連結した単一軽鎖可変領域を用いる「ノブ・イントゥ・ホール」ヘテロ二量体化技法を使用して産生させた（図１を参照されたい）。Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９：７，ｐ６１７−６２１（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０，２６−３５（１９９７）、Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１，７５３−７５９（２０１３）も参照されたい。
【０２５８】
ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃアゴニスト活性を呈した二重特異性抗体をスクリーニングするために、軽鎖及び重鎖の各々をＶＬｆＨ形式で発現させた。図１に示すように、ＶＬｆＨ形式は、配列番号６８に記載の配列を有するアミノ酸を含むリンカーを介して可変軽鎖ドメインに連結した完全長重鎖を含む。ＶＬｆＨ形式の軽鎖可変ドメイン及び完全長重鎖を有するポリペプチドを生成するために、ＡＴＧＡＹＡ（配列番号８３）をコードするｃＤＮＡ−Ｒ１０８（ＥＵ付番システムに従う）までの軽鎖可変ドメイン−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（リンカー、配列番号６８）−ＣＨ１残基Ｆ１２６（ＥＵ付番システムに従う）までを含み、５´末端でＢｓｉＷＩ制限部位を、３´末端でＰｓｐＯＭＩ／ＡｐａＩ制限を含む重鎖可変ドメインを、商業的に合成した。様々なアイソタイプ及びＣＨ３におけるノブホール突然変異を含むヒンジ変異型を有する、完全重鎖をコードする標準的なｐＲＫベクターにサブクローニングするために、ｃＤＮＡを制限酵素ＢｓｉＷＩ及びＰｓｐＯＭＩで消化させた。結果として得られる翻訳されたポリペプチドは、形式ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＹＡ（シグナルペプチド、配列番号６９）−Ｒ１０８（ＥＵ付番システムに従う）までの軽鎖可変ドメイン−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（リンカー、配列番号６８）−完全重鎖を含む。
【０２５９】
同じ軽鎖定常鎖（ＣＬ）ドメインをＶＬｆＨポリペプチドの各対に使用した。ＣＬドメインを、プライマー：５´−ＴＴＴＣＣＣＴＴＴＡＴＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＴＡＴＣ  ＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣ−３´（配列番号６３）、５´−ＴＴＴＣＣＣＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ  ＴＣＴＴＴＧＴ−３´（配列番号６４）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、配列番号６６に記載の以下のヌクレオチド配列を含むヒトカッパ（κ）軽鎖についてのｃＤＮＡを含有するプラスミドから増幅させた。配列番号６６は以下に提供する。
ＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＣＧＴＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ（配列番号６６）
配列番号６６は、以下に提供する配列番号６５に記載のアミノ酸配列をコードする。    ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号６５）
【０２６０】
次に、増幅させたＤＮＡを、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始前及び停止コドンの後で固有部位と同じ制限酵素部位を含有する標準的なｐＲＫベクターにサブクローニングするために、制限酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化させて、以下に提供する配列番号６７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをもたらした：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号６７）。カッパ定常軽の開始は、Ｔ１０９（ＥＵ付番システムに従う）であるが、Ｔ１０９に限定されず、Ｒ１０８及び前のエルボー（ｅｌｂｏｗ）残基を含む。この定常軽鎖（ＣＬ）ＤＮＡを１回だけクローニングし、上に開示のＶＬｆＨ  ＤＮＡとの対形成に再利用した。
【０２６１】
これまでに記載されている様々な体積のＣＨＯ（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０６：７５１−７６３）細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ（Ｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８０：１０−１６）細胞の一過性トランスフェクション培養における発現のために、ＶＬｆＨとＣＬ  ｐＲＫ  ＤＮＡとを同量で混合し、二重特異性抗体のヘテロ二量体化を促進した。ＣＬドメインを、ＶＬｆＨポリペプチドから別個のポリペプチドとして発現させた。ＣＬドメインが自律的に折り畳み、折り畳んでいる間にＢｉＰと相互作用しないことがこれまでに示されている（Ｈｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４４：２１−３０）。加えて、ＣＬドメインは、重鎖（ＨＣ）と対形成されるまで分泌を失速させるＥＲ保留シグナルを有しないため、自身で効率的に分泌され得る。軽鎖（ＬＣ）及び代理軽鎖（λ５）（Ｂａｎｋｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：２９１−２９４）は、２つのドメインを介してＨＣと相互作用することができる。ＣＬ：ＣＨ１界面に加えて、（ＬＣについての）ＶＬ及び（λ５についての）第１のベータ鎖は、相互作用中に更なる安定性を提供する。単離されたＣＬについての会合動態が、うまく（ｉ）ＣＨ１上のＢｉＰ等のシャンペロンを置き換え、（ｉｉ）ＣＨ１と安定して対形成し、（ｉｉｉ）ＣＨ１を安定させて、ＣＨ１において最終プロリン異性化を可能にし、最終折り畳み状態に入るために十分早く締まっているかどうかは現在のところ分かっていない（Ｆｅｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．３４：５６９−５７９）。可変ドメインの相互作用の寄与がないと、ＣＬ：ＣＨ１相互作用は、ＣＨ１の適当な折り畳みを可能にし、ＶＬ−ＨＣ融合の折り畳みの欠陥を取り返すには一過性の程度が過ぎた可能性がある。
【０２６２】
２つのＶＬｆＨポリペプチドの同時発現によってヘテロ二量体化が得られたかどうかを決定するために、質量分析を行った。質量分析データを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６２３０  ＴＯＦ  ＬＣ−ＭＳシステム及び１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して取得した。二重特異性抗体を、４．６ｍｍ×５０ｍｍのＰＬＲＰ−Ｓ逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して精製した。完全な質量を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェア（Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｂ．０４．００）を使用してＭａｘｉｍｕｍ  Ｅｎｔｒｏｐｙ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎによって得た。図２Ａ〜Ｂに示すように、ＶＬｆＨの同時発現により、２つのＶＬｆＨポリペプチドのヘテロ二量体化が生じた。開示される方法により、９５％超のヘテロ二量体化及び５％未満のホモ二量体化が生じた。
表５．二重特異性抗ＫＬＢ抗体
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【０２６３】
ＶＬｆＨ形式の二重特異性抗体のアゴニスト活性を決定するために、ルシフェラーゼアッセイを行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養し、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ウミシイタケルシフェラーゼ（ｐＲＬ−ＳＶ４０，Ｐｒｏｍｅｇａ）をコードする発現ベクター、ＦＧＦＲ１ｃ、転写活性化因子（ｐＦＡ２−Ｅｌｋ１，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、及びＧＡＬ４  結合部位によって駆動される蛍ルシフェラーゼレポーター（ｐＦＲ−Ｌｕｃ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって一過性トランスフェクションを行った。翌日、トランスフェクトした細胞を、更に６〜８時間、無血清培地中で培養し、二重特異性抗ＫＬＢ抗体及び対応する親モノクローナル抗体の各々を、濃度を増加させながら試験した。組換えヒトＦＧＦ２１（Ｒ＆Ｄ）を一部のルシフェラーゼ実験において参照として使用した。細胞をＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解させ、４℃で１時間、または−２０℃で一晩のいずれかでインキュベートした。細胞ルシフェラーゼ活性を、ＤＵＡＬ−ＧＬＯ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して決定した。蛍ルシフェラーゼ活性を、同時発現させたウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化し、結果を、リガンド濃度の関数として相対発光量（ＲＬＵ）でプロットした。
【０２６４】
ＨＥＫ２９３ＴｄｅｌＦＧＦＲ１細胞中で、ＦＧＦＲ１遺伝子を、ガイドＲＮＡであるａａｃｔｔｃａｃｔｇｔｃｔｔｇｇｃａｇｃｃｇｇ及びｇａｔｃｔｃｃａｇｇｔａｃａｇｇｇｇｃｇａｇｇを使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によって不活性化した。細胞を、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＣａｓ９発現プラスミドと、Ｕ６プロモーターの制御下で各ガイドＲＮＡを発現しているプラスミドとを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、コロニーを、ＤＭＥＭ７５％と、２２ミクロンのフィルターを通して事前に濾過しておいたトランスフェクトした培養物からの上清２５％とで構成される馴化培地を含む９６ウェルプレート中、１ウェルあたり１細胞でソーティングした。コロニーを、ＦＡＣＳによってＦＧＦＲ１ｃ表面発現の不在についてスクリーニングした。プライマーであるＡＴＧＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＣＧＧ（配列番号８４）及びＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧ（配列番号８５）を使用するゲノムＤＮＡ  ＰＣＲを使用して、ＦＧＦＲ１欠乏クローンがＦＧＦＲ１遺伝子座における欠失を担持することを更に確認した。１つのＦＧＦＲ１陰性クローンを増殖させてルシフェラーゼレポーターアッセイに使用した。
【０２６５】
図３に示すように、ＶＬｆＨ形式の二重特異性抗体（ｔｃＢｓＩｇＧ）はアゴニスト活性を呈した。例えば、ＶＬｆＨ形式の二重特異性抗体１２Ｂ８／２３Ｂ３は、単独のＶＬｆＨ形式の親抗体１２Ｂ８及び２３Ｂ３よりも高いアゴニスト活性を呈した（図３）。加えて、ＶＬｆＨ形式の二重特異性抗体１２Ｂ８／２３Ｂ７は、単独のＶＬｆＨ形式の親抗体１２Ｂ８及び２３Ｂ７よりも高いアゴニスト活性を呈した（図３）。これらの結果により、二重特異性抗体を特定するためのＶＬｆＨ系スクリーニング方法が、アゴニスト活性に著しい影響を与えず、二重特異性抗体の一般的スクリーニングとして使用できることを示す。５つのバイエピトープ性抗体及び親抗体を、同じｔｃＢｓＩｇＧ形式ではあるが、ＨＭＷ種及び他の可能性のある不純物を除去するために２カラム精製を用いて、連続して産生させた。これらの単分散ｔｃＢｓＩｇＧ調製物は単一特異性の親と比較してより優れたアゴニスト活性を保持したため（データ割愛）、最初のスクリーニングプロセス中に更なる精製の必要がないことを確認した。
【０２６６】
実施例３：二重特異性抗ＫＬＢ抗体の特性評価
実施例２で特定した二重特異性抗体を、二重特異性ＩｇＧ抗体に再フォーマティングし、実施例２に記載したルシフェラーゼを使用してＫＬＢ／ＦＧＦＲ１ｃアゴニスト活性について分析した。図４及び５に示すように、アゴニスト活性を呈すると特定したＶＬｆＨ形式の二重特異性抗体（ｔｃＢｓＩｇＧ）は、ＩｇＧ抗体に再フォーマティングしたときにも活性を示したため、実施例２に記載したスクリーニング方法によるいかなる偽の陽性も生じなかったことが示された。例えば、二重特異性抗体１２Ｂ８／２３Ｂ３は、単独の親抗体１２Ｂ８及び２３Ｂ３よりも高いアゴニスト活性を呈した。二重特異性抗ＫＬＢ抗体１２Ｂ８／２Ｃ１２、２３Ｂ３／２８Ｂ７、２Ｃ１２／２８Ｂ７、及び４Ｈ７／２８Ｂ７についても類似の結果が観察された（図４及び５）。これらの結果により、開示される二重特異性抗体がそれらの対応する単独の単一特異性親抗体よりも高いアゴニスト活性を呈することが示される。
【０２６７】
二重特異性抗ＫＬＢ抗体の有効性を、対応する親抗体対の１：１混合物の活性を比較することで分析した。例えば、二重特異性抗体２３Ｂ３−２８Ｂ７の活性を、２３Ｂ３対２８Ｂ７の１：１混合物の活性と比較した。図６に示すように、複合体特異的抗ＫＬＢ二重特異性抗体２３Ｂ３／２８Ｂ７の１対はロックされた二重特異性を必要とした。即ち、２３Ｂ３及び２８Ｂ７結合部位のアゴニスト作用は、これらの可変領域が同じ二重特異性抗体の一部である場合、それらが２つの別個のモノクローナル抗体の一部として作用する場合よりも優れている。
【０２６８】
実施例４：ＫＬＢ二重特異性抗体のアゴニスト活性にはＦＧＦＲ１ｃが必要である
この実施例では、開示される二重特異性抗体を更に分析して、それらのアゴニスト活性が発現ＦＧＦＲ１ｃ及び／またはＫＬＢに依存したかどうかを決定した。
【０２６９】
ＫＬＢを有するＦＧＦＲ１ｃを発現しているかまたはＫＬＢを有するＦＧＦＲ２ｃを発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＧＡＬ４−Ｅｌｋ１系ルシフェラーゼアッセイにおいて試験した際、抗ＫＬＢ抗体のアゴニスト活性には、ＫＬＢの発現及びＦＧＦＲ１ｃの発現が必要とされたことを観察した（図７）。本二重特異性抗体は、ルシフェラーゼ活性を、組換えＦＧＦＲ１ｃ及びｈＫＬＢを発現している細胞においては用量依存性様式で誘導するが、ＦＧＦＲ１ｃに極めて密接に関係している受容体であるＦＧＦＲ２ｃとＫＬＢとを同時発現している細胞においては誘導しなかったことが観察されたため、これらの二重特異性抗体が、ＫＬＢ依存性ＦＧＦＲアゴニストとして作用することが示された（図７）。
【０２７０】
更に、二重特異性抗ＫＬＢ抗体は、ＦＧＦ２１の抗糖尿病活性についての関連細胞型を表す初代ヒト脂肪細胞においてＥＲＫ等のＭＡＰＫシグナル伝達媒介物のリン酸化を誘導する活性を呈した（図８）。ＦＧＦ２１、抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体（ＢｓＡｂ２）、ＦＧＦＲ１ｃアームとＫＬＢアームとを有する二重特異性抗体（主抗体）、及びアイソタイプ一致抗体であるトラスツズマブを対照として使用した。
【０２７１】
二重特異性抗ＫＬＢ抗体についての作用様式を更に理解するために、ＫＬＢ及びＦＧＦＲ１ｃを発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＭＡＰＫリン酸化カスケードを始動させるそれらの能力を、ルシフェラーゼ系レポーターアッセイを使用して定量化した。
【０２７２】
抗体結合をフローサイトメトリーによって決定した。細胞を、９６ウェル組織培養プレートに２×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、一晩成長させた。翌日、各ウェルを、ＦｕｇｅｎｅＨＤトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の仕様に従って使用し、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。４８時間後、細胞を解離させ、３％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した冷ＰＢＳ中で洗浄し、２μｇ／ｍｌの指定された抗ＫＬＢ抗体と共に４５分間氷上でインキュベートし、再度洗浄した後、４μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に４５分間氷上でインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ分析器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリーによって分析した。以下の表６に示すように、本二重特異性抗体は、主抗ＫＬＢ／抗ＦＧＦＲ１ｃ二重特異性抗体であるＢｓＡｂ２と比較して高いＥＣ５０を呈した。例えば、二重特異性抗ＫＬＢ抗体２３Ｂ３／２８Ｂ７は、ルシフェラーゼ系レポーターアッセイを使用して、０．６３ｎＭというＢｓＡｂ２と比較して極めて高いＥＣ５０値を呈した（表６を参照されたい）。
表６
2019504617.tif 000009
【０２７３】
実施例５：抗ＫＬＢ抗体のエピトープマッピング
この実施例では、実施例１で特定した抗ＫＬＢ抗体のエピトープマッピングを、ＦＡＣＳ（図９）、ルシフェラーゼ系レポーターアッセイ（図１０）、及びエピトープビニング（図１１Ａ〜１１Ｂ）によって行った。
【０２７４】
以下に記載のキメラヒト／ラットＫＬＢタンパク質（図９及び１０）またはキメラヒトＦＧＦＲ１ｃ／ＦＧＦＲ２ｃタンパク質（図１０）を、ＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３ＴｄｅｌＦＧＦＲ１細胞の表面上で一過性発現させ、示す抗体で染色し、フローサイトメトリー（図９）またはルシフェラーゼ系レポーターアッセイ（図１０）によって分析した。図９及び１０では、ＫＬＢ及びＦＧＦＲキメラを絵で表し、ヒトＫＬＢまたはＦＧＦＲ１ｃ配列を黒色で、ラットＫＬＢまたはヒトＦＧＦＲ２ｃ配列を白色で示す。
【０２７５】
これらのアッセイに基づくと、モノクローナル抗体１２Ｂ８が、ＫＬＢのアミノ酸配列
ＩＱＦＹＮＫＶＩＳＳＲＧＦＰＦＥＮＳＳＳＲＣＳＱＴＱＥＮＴＥＣＴＶＣＬＦＬＶＱＫＫＰＬＩＦＬＧＣＣＦＦＳＴＬＶＬＬＬＳＩＡＩＦＱＲＱＫＲＲＫＦＷＫＡＫＮＬＱＨＩＰＬＫＫＧＫＲＶＶＳ（配列番号４３）の少なくとも一部に結合すると推論できる。
【０２７６】
モノクローナル抗体２Ｃ１２、２３Ｂ３、及び４Ｈ７は、ＫＬＢのアミノ酸配列
ＡＤＳＨＷＲＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＥＰＬＦＫＴＧＤＹＰＡＡＭＲＥＹＩＡＳＫＨＲＲＧＬＳＳＳＡＬＰＲＬＴＥＡＥＲＲＬＬＫＧＴＶＤＦＣＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＭＨＥＱＬＡＧＳＲＹＤＳＤＲＤＩ（配列番号４４）の少なくとも一部に結合する。
【０２７７】
モノクローナル抗体２８Ｂ７は、ＫＬＢのアミノ酸配列
ＦＳＧＤＧＲＡＩＷＳＫＮＰＮＦＴＰＶＮＥＳＱＬＦＬＹＤＴＦＰＫＮＦＦＷＧＩＧＴＧＡＬＱＶＥＧＳＷＫＫＤＧＫＧＰＳＩＷＤＨＦＩＨＴＨＬＫＮＶＳＳＴＮＧＳＳＤＳＹＩＦＬＥＫＤＬＳＡＬＤＦＩＧＶＳＦＹＱＦＳＩＳＷＰＲＬＦＰＤＧＩＶＴＶＡＮＡＫＧＬＱＹＹＳＴＬＬＤＡＬＶＬＲＮＩＥＰＩＶＴＬＹＨＷＤＬＰＬＡＬＱＥＫＹＧＧＷＫＮＤＴＩＩＤＩＦＮＤＹＡＴＹＣＦＱＭＦＧＤＲＶＫＹＷＩＴＩＨＮＰＹＬＶＡＷＨＧＹＧＴＧＭＨＡＰＧＥＫＧＮＬＡＡＶＹＴＶＧＨＮＬＩＫＡＨＳＫＶＷＨＮＹＮＴＨＦＲＰＨＱＫＧＷＬＳＩＴＬＧＳＨＷＩＥＰＮＲＳＥＮＴＭＤＩＦＫＣＱＱＳＭＶＳＶＬＧＷＦＡＮＰＩＨＧＤＧＤＹＰＥＧＭＲＫＫＬＦＳＶＬＰＩＦＳＥＡＥＫＨＥＭＲＧＴＡＤＦＦＡＦＳＦＧＰＮＮＦＫＰＬＮＴＭＡＫＭＧＱＮＶＳＬＮＬＲＥＡＬＮＷＩＫＬＥＹＮＮＰＲＩＬＩＡＥＮＧＷＦＴＤＳＲＶＫＴＥＤＴＴＡＩＹＭＭＫＮＦＬＳＱＶＬＱＡＩＲＬＤＥＩＲＶＦＧＹＴＡＷＳＬＬＤＧＦＥＷＱＤＡＹＴＩＲＲＧＬＦＹＶＤＦＮＳＫＱＫＥＲＫＰＫＳＳＡＨＹＹＫＱＩＩＲＥＮＧＦＳＬＫＥＳＴＰＤＶＱＧＱＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＳＶＡＳＳＰＱＦＳＤＰＨＬＹＶＷＮＡＴＧＮＲＬＬＨＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＡＱＣＴＤＦＶＮＩＫＫＱＬＥＭＬＡＲＭＫＶＴＨＹＲＦＡＬＤＷＡＳＶＬＰＴＧＮＬＳＡＶＮＲＱＡ（配列番号４５）の少なくとも一部に結合する。
【０２７８】
同様に、ＦＧＦＲ１ｃ配列
ＫＴＶＡＬＧＳＮＶＥＦＭＣＫＶＹＳＤＰＱＰＨＩＱＷＬＫＨＩＥＶＮＧＳＫＩＧＰＤＮＬＰＹＶＱＩＬＫＴＡＧＶＮＴＴＤＫＥＭＥＶＬＨＬＲＮＶＳＦＥＤＡＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧＬＳＨＨＳＡＷＬＴＶＬＥＡＬＥＥＲＰＡＶＭＴ（配列番号４６）が、モノクローナル抗体１２Ｂ８、２３Ｂ３、４Ｈ７、及び２８Ｂ７がアゴニスト活性を及ぼすために必要とされる。
【０２７９】
以下のヒト／ラットＫＬＢ及びヒトＦＧＦＲ１ｃ／ＦＧＦＲ２ｃタンパク質ならびにキメラを、ベクターにクローニングし、ＦＡＣＳ分析のためにはＨＥＫ２９３Ｔ、またはルシフェラーゼアッセイのためにはＨＥＫ２９３ＴｄｅｌＦＧＦＲ１の表面に発現させた。ヒトＫＬＢ配列は太字で示し、ヒト／ラット配列の結合部付近にある相同配列は斜体で示す。同様に、ＦＧＦＲ２ｃは太字で示し、ＦＧＦＲ１ｃとＦＧＦＲ２ｃとの間で相同である結合配列は斜体で示す。
【０２８０】
ヒトＫＬＢ：
2019504617.tif 000010
2019504617.tif 000011
（配列番号４７）．
【０２８１】
ＫＬＢタンパク質Ａに対応する相同ラット領域：
ＦＳＧＤＧＫＡＩＷＤＫＫＱＹＶＳＰＶＮＰＧＱＬＦＬＹＤＴＦＰＫＮＦＳＷＧＶＧＴＧＡＦＱＶＥＧＳＷＫＡＤＧＲＧＰＳＩＷＤＲＹＶＤＳＨＬＲＧＶＮＳＴＤＲＳＴＤＳＹＶＦＬＥＫＤＬＬＡＬＤＦＬＧＶＳＦＹＱＦＳＩＳＷＰＲＬＦＰＮＧＴＶＡＡＶＮＡＫＧＬＱＹＹＲＡＬＬＤＳＬＶＬＲＮＩＥＰＩＶＴＬＹＨＷＤＬＰＬＴＬＱＥＥＹＧＧＷＫＮＡＴＭＩＤＬＦＮＤＹＡＴＹＣＦＱＴＦＧＤＲＶＫＹＷＩＴＩＨＮＰＹＬＶＡＷＨＧＦＧＴＧＭＨＡＰＧＥＫＧＮＬＴＡＶＹＴＶＧＨＮＬＩＫＡＨＳＫＶＷＨＮＹＤＫＮＦＲＰＨＱＫＧＷＬＳＩＴＬＧＳＨＷＩＥＰＮＲＴＥＮＭＥＤＶＩＮＣＱＨＳＭＳＳＶＬＧＷＦＡＮＰＩＨＧＤＧＤＹＰＥＦＭＫＴＳＳＶＩＰＥＦＳＥＡＥＫＥＥＶＲＧＴＡＤＦＦＡＦＳＦＧＰＮＮＦＲＰＳＮＴＶＶＫＭＧＱＮＶＳＬＮＬＲＱＶＬＮＷＩＫＬＥＹＤＮＰＲＩＬＩＳＥＮＧＷＦＴＤＳＹＩＫＴＥＤＴＴＡＩＹＭＭＫＮＦＬＮＱＶＬＱＡＩＫＦＤＥＩＱＶＦＧＹＴＡＷＴＬＬＤＧＦＥＷＱＤＡＹＴＴＲＲＧＬＦＹＶＤＦＮＳＥＱＫＥＲＫＰＫＳＳＡＨＹＹＫＱＩＩＱＤＮＧＦＰＬＱＥＳＴＰＤＭＫＧＱＦＰＣＤＦＳＷＧＶＴＥＳＶＬＫＰＥＦＴＶＳＳＰＱＦＴＤＰＨＬＹＶＷＮＶＴＧＮＲＬＬＹＲＶＥＧＶＲＬＫＴＲＰＳＱＣＴＤＹＶＳＩＫＫＲＶＥＭＬＡＫＭＫＶＴＨＹＱＦＡＬＤＷＴＳＩＬＰＴＧＮＬＳＫＩＮＲＱＶＬＲＹＹＲＣＶＶＳＥＧＬＫＬＧＩＳＰＭＶＴＬＹＨＰＴＨＳＨＬＧＬＰＭＰＬＬＳＳＧＧＷＬＮＴＮＴＡＫＡＦＱＤＹＡＧＬＣＦＫＥＬＧＤＬＶＫＬＷＩＴＩＮＥＰＮＲＬＳＤＭＹＮＲＴＳＮＤＴＹＲＡＡＨＮＬＭＩＡＨＡＱＶＷＨＬＹＤＲＱＹＲＰＶＱＨＧＡＶＳＬＳＬＨＳＤＷＡＥＰＡＮＰＹＶＥＳＨＷＫＡＡＥＲＦＬＱＦＥＩＡＷＦＡＤＰＬＦＫＴＧＤＹＰＬＡＭＫＥＹＩＡＳＫＫＱＲＧＬＳＳＳＶＬＰＲＦＴＬＫＥＳＲＬＶＫＧＴＩＤＦＹＡＬＮＨＦＴＴＲＦＶＩＨＫＱＬＮＴＮＣＳＶＡＤＲＤＶＱＦＬＱＤＩＴＲＬＳＳＰＳＲＬＡＶＴＰＷＧＭＲＫＬＬＧＷＩＲＲＮＹＲＤＭＤＩＹＶＴＡＮＧＩＤＤＬＡＬＥＤＤＱＩＲＫＹＹＬＥＫＹＶＱＥＡＬＫＡＹＬＩＤＫＶＫＩＫＧＹＹＡＦＫＬＴＥＥＫＳＫＰＲＦＧＦＦＴＳＤＦＫＡＫＳＳＶＱＦＹＳＫＬＩＳＳＳＧＦＳＳＥＮＲＳＰＡＣＧＱＰＰＥＤＴＥＣＡＩＣＳＦＬＴＱＫＫＰＬＩＦＦＧＣＣＦＩＳＴＬＡＡＬＬＳＩＴＩＦＨＨＲＫＲＲＫＦＱＫＡＲＮＬＱＮＩＰＬＫＫＧＨＳＲＶＦＳ（配列番号４８）
【０２８２】
ヒト／ラットＫＬＢキメラ：
2019504617.tif 000012
2019504617.tif 000013
2019504617.tif 000014
（配列番号４９）
【０２８３】
ヒト／ラットＫＬＢキメラ：
2019504617.tif 000015
2019504617.tif 000016
（配列番号５０）
【０２８４】
ヒト／ラットＫＬＢキメラ：
2019504617.tif 000017
2019504617.tif 000018
2019504617.tif 000019
（配列番号５１）
【０２８５】
ヒト／ラットＫＬＢキメラ：
2019504617.tif 000020
2019504617.tif 000021
2019504617.tif 000022
（配列番号５２）
【０２８６】
ヒト／ラットＫＬＢキメラ：
2019504617.tif 000023
2019504617.tif 000024
（配列番号５３）
【０２８７】
ヒト／ラットＫＬＢキメラ：
2019504617.tif 000025
2019504617.tif 000026
2019504617.tif 000027
（配列番号５４）
【０２８８】
ヒト／ラットＫＬＢキメラ：
2019504617.tif 000028
2019504617.tif 000029
（配列番号５５）
【０２８９】
ヒト／ラットＫＬＢキメラ：
2019504617.tif 000030
2019504617.tif 000031
（配列番号５６）
【０２９０】
ヒトＦＧＦＲ１ｃ：
2019504617.tif 000032
2019504617.tif 000033
2019504617.tif 000034
（配列番号５７）
【０２９１】
ヒトＦＧＦＲ２ｃ：
ＲＰＳＦＳＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥＥＰＰＴＫＹＱＩＳＱＰＥＶＹＶＡＡＰＧＥＳＬＥＶＲＣＬＬＫＤＡＡＶＩＳＷＴＫＤＧＶＨＬＧＰＮＮＲＴＶＬＩＧＥＹＬＱＩＫＧＡＴＰＲＤＳＧＬＹＡＣＴＡＳＲＴＶＤＳＥＴＷＹＦＭＶＮＶＴＤＡＩＳＳＧＤＤＥＤＤＴＤＧＡＥＤＦＶＳＥＮＳＮＮＫＲＡＰＹＷＴＮＴＥＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣＰＡＧＧＮＰＭＰＴＭＲＷＬＫＮＧＫＥＦＫＱＥＨＲＩＧＧＹＫＶＲＮＱＨＷＳＬＩＭＥＳＶＶＰＳＤＫＧＮＹＴＣＶＶＥＮＥＹＧＳＩＮＨＴＹＨＬＤＶＶＥＲＳＰＨＲＰＩＬＱＡＧＬＰＡＮＡＳＴＶＶＧＧＤＶＥＦＶＣＫＶＹＳＤＡＱＰＨＩＱＷＩＫＨＶＥＫＮＧＳＫＹＧＰＤＧＬＰＹＬＫＶＬＫＡＡＧＶＮＴＴＤＫＥＩＥＶＬＹＩＲＮＶＴＦＥＤＡＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧＩＳＦＨＳＡＷＬＴＶＬＰＡＰＧＲＥＫＥＩＴＡＳＰＤＹＬＥＩＡＩＹＣＩＧＶＦＬＩＡＣＭＶＶＴＶＩＬＣＲＭＫＮＴＴＫＫＰＤＦＳＳＱＰＡＶＨＫＬＴＫＲＩＰＬＲＲＱＶＴＶＳＡＥＳＳＳＳＭＮＳＮＴＰＬＶＲＩＴＴＲＬＳＳＴＡＤＴＰＭＬＡＧＶＳＥＹＥＬＰＥＤＰＫＷＥＦＰＲＤＫＬＴＬＧＫＰＬＧＥＧＣＦＧＱＶＶＭＡＥＡＶＧＩＤＫＤＫＰＫＥＡＶＴＶＡＶＫＭＬＫＤＤＡＴＥＫＤＬＳＤＬＶＳＥＭＥＭＭＫＭＩＧＫＨＫＮＩＩＮＬＬＧＡＣＴＱＤＧＰＬＹＶＩＶＥＹＡＳＫＧＮＬＲＥＹＬＲＡＲＲＰＰＧＭＥＹＳＹＤＩＮＲＶＰＥＥＱＭＴＦＫＤＬＶＳＣＴＹＱＬＡＲＧＭＥＹＬＡＳＱＫＣＩＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＶＴＥＮＮＶＭＫＩＡＤＦＧＬＡＲＤＩＮＮＩＤＹＹＫＫＴＴＮＧＲＬＰＶＫＷＭＡＰＥＡＬＦＤＲＶＹＴＨＱＳＤＶＷＳＦＧＶＬＭＷＥＩＦＴＬＧＧＳＰＹＰＧＩＰＶＥＥＬＦＫＬＬＫＥＧＨＲＭＤＫＰＡＮＣＴＮＥＬＹＭＭＭＲＤＣＷＨＡＶＰＳＱＲＰＴＦＫＱＬＶＥＤＬＤＲＩＬＴＬＴＴＮＥＥＹＬＤＬＳＱＰＬＥＱＹＳＰＳＹＰＤＴＲＳＳＣＳＳＧＤＤＳＶＦＳＰＤＰＭＰＹＥＰＣＬＰＱＹＰＨＩＮＧＳＶＫＴ（配列番号５８）
【０２９２】
ＦＧＦＲ１ｃ／ＦＧＦＲ２ｃキメラ：
2019504617.tif 000035
2019504617.tif 000036
2019504617.tif 000037
（配列番号５９）
【０２９３】
ＦＧＦＲ１ｃ／ＦＧＦＲ２ｃキメラ：
2019504617.tif 000038
2019504617.tif 000039
（配列番号６０）
【０２９４】
ＦＧＦＲ１ｃ／ＦＧＦＲ２ｃキメラ：
2019504617.tif 000040
2019504617.tif 000041
2019504617.tif 000042
（配列番号６１）。
【０２９５】
ＦＧＦＲ１ｃ／ＦＧＦＲ２ｃキメラ：
2019504617.tif 000043
2019504617.tif 000044
（配列番号６２）。
【０２９６】
エピトープビニング実験（図１１Ａ〜１１Ｂ）を、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４システム（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）において、抗マウスＦｃまたは抗ヒトＦｃ捕捉バイオセンサを使用して、８チャネルまたは１６チャネルモードのＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｆｅｒｏｍｅｔｒｙによって行った。アッセイは７ステップの結合サイクルからなった：１）抗マウスＦｃバイオセンサを泳動緩衝液（１倍の動力学用緩衝液、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  １８−５０３２）に１分間浸漬させ、ベースラインを確立し、２）２０μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ２ａ（参照）抗体を１０分かけて捕捉し、３）別のベースラインを１．５分かけて確立し、４）１００ｎＭのヒトＫＬＢを１０分かけてローディングし、第３のベースラインを１．５分かけて確立し、６）５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１（試験）抗体を１０分かけて会合させ、７）１０分かけて解離させた。抗ヒトＦｃ捕捉バイオセンサを用いたエピトープビニングを同様に行った。図１１の要約は、各抗体について決定されたビンを示す。
【０２９７】
図１２は、例示的なバイオレイヤーインフェロメトリー実験を示す。この実施例では、２Ｃ１２（ヒトＩｇＧ１）が、組換えＫＬＢへの結合について、２３Ｂ３とは競合するが２８Ｂ７または８Ｃ５（マウスＩｇＧ）とは競合しない。
【０２９８】
実施例６：三鎖二重特異性ＩｇＧ：高速二重特異性抗体スクリーニングのための抗体プラットフォーム
材料及び方法
キャピラリー電気泳動による精製された抗体の特性評価
Ｃａｌｉｐｅｒ  ＧＸ  ＩＩマイクロ流体システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）において試料を分析した。全ての試料を、これまでに説明されているように調製した（Ｋｉｍ，２０１６）。チップは、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅに提供されている製造業者の指示に従って調製した。
【０２９９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる精製された抗体の特性評価
質量分析データを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６２３０  ＴＯＦ  ＬＣ−ＭＳシステム及び１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して取得した。ＩｇＧを４．６ｍｍ×５０ｍｍのＰＬＲＰ−Ｓ逆相カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で分離させた。完全な質量を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェア（Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｂ．０４．００）を使用してＭａｘｉｍｕｎ  Ｅｎｔｒｏｐｙ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎによって得た。
【０３００】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ分析
ｔｃＩｇＧ及び従来のＩｇＧの結合親和性決定のために、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００及びタンパク質Ａセンサチップを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を使用し、単量体ヒトＫＬＢの希釈物を、分析物として、固定したｔｃＩｇＧまたは従来のＩｇＧに２５℃で注射して、一価親和性を決定した。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して計算した。平衡解離定数（Ｋｄ）を、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。
【０３０１】
ウェスタンブロット
ヒト初代皮下前脂肪細胞をＬｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。細胞を、供給業者のプロトコルに従って成長させ、分化させた。簡潔には、細胞を、ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、及びＧＡ−１０００を含有する前脂肪細胞基礎培地−２において成長させた。集密に達した後、細胞を、デキサメタゾン、インドメタシン、及び３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を含有する成長培地中で分化させた。ＥＲＫシグナル伝達分析のために、細胞を１０日間分化させ、３時間無血清培地中で成長させた後、示される抗体と共にもう１時間更に培養した。プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤錠（Ｒｏｃｈｅ，ＵＳＡ）を含有する２倍のＬＤＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中で細胞を溶解させて、細胞抽出物を生成した。試料を、標準的な方法によってウェスタンブロット分析に使用した。ウェスタンブロット分析に使用した抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）製であった：ｐＥＲＫ１／２（Ｔ２０２／２０４）、（カタログ番号４３７０）、ＥＲＫ１／２（カタログ番号４６９５）、及びＨＳＰ９０（カタログ番号４８７４）。
【０３０２】
結果
トランスのＶＬ−ＨＣ融合及びＣＬ発現により、ＢｓＩｇＧについての同族軽鎖対形成問題が解決される
新規の三鎖ＢｓＩｇＧ（ｔｃＢｓＩｇＧ）形式についての模式図を図１８Ａに示す。この新規のプラットフォームにおいて、重鎖のヘテロ二量体化は、これまでに説明されている「ノブ・イントゥ・ホール」突然変異（Ｒｉｄｇｗａｙ，１９９６、Ａｔｗｅｌｌ，１９９７）によって達成した。ＶＬ−ＨＣ融合（ＶＬｆＨ）を設計し、正しい重鎖−軽鎖対形成を獲得するために、短い（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−リンカーを使用し、抗体ｓｃＦｖの設計に類似して抗体ＶＬドメインのＣ末端部を重鎖のＮ末端に繋留した（図１８Ａ、左）。ＨＥＣＫ２９３細胞におけるＣＬを有しないＶＬｆＨ単独の発現により、タンパク質Ａ親和性カラム精製回収後、キャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）に基づき、ＶＬｆＨ発現は微量しかまたは全く生じなかった（図１８Ｂ、レーン１）。抗体ＣＨ１ドメインの折り畳みがＣＬドメインとの対形成を必要とするというこれまでの観察は、この結果に起因した（Ｆｅｉｇｅ，２００９）。ＣＬドメインとの対形成は、最終品質管理ステップとして働き、適切に折り畳まれた抗体が分泌されることを確実にすると提案されている（Ｆｅｉｇｅ，２０１４）。これを試験するために、単離されたＣＬドメインが、ＣＨ１ドメインの折り畳みを補完し、ＶＬｆＨハイブリッドタンパク質の生産的な分泌（図１８Ａ、右）を可能にして、三鎖ＩｇＧ（ｔｃＩｇＧ）を生むことができるかどうかの決定を目指した。抗ＫＬＢ抗体、クローン２８Ｂ７単一エピトープ性ｔｃＩｇＧを、ＩｇＧ１、２、及び４のアイソタイプ、ならびにＩｇＧ１及びＩｇＧ４の脱グリコシル化（Ｎ２９７Ｇ）バージョン中で作製した。ＣＬドメインをコードする別々のプラスミドの同時トランスフェクションの後、インタクトな親抗体と同等の収率で抗体を回収することに成功した（図１８Ｂ）。ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＢｓＩｇＧが現在の臨床開発では主要な抗体クラスであったが、他のアイソタイプも、抗体エフェクター機能及び抗体活性を調節するために単一特異性抗体として一般に活用利用された。このため、ｔｃＩｇＧ技術を他の治療的に関連性のあるヒトアイソタイプＩｇＧ２及びＩｇＧ４にも利用できるかどうかを評価した。ＣＬドメインの要件は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４におけるＶＬｆＨの発現全体で一貫しており、Ｎ２９７Ｇ突然変異を有するＩｇＧ１及びＩｇＧ４の共通した脱グリコシル化バージョンの挙動は類似していた（図１８Ｂ）。ＣＬ同時発現後の全体的な収率は、対応する野生型ＩｇＧアイソタイプ対照と同等であった。電気泳動分析によって、ＣＬとＣＨ１との間の鎖間ジスルフィド結合が効率的に形成されたことが示された。したがって、抗体の生産的な折り畳み及び分泌のために、抗体ＶＬ及びＣＬドメインが単一ポリペプチド鎖として共有的に接続する必要はない。
【０３０３】
次に、可能性のある二重特異性抗体産生のために、ｔｃＩｇＧ形式がノブ・イントゥ・ホール突然変異と互換性があるかどうかを評定した。ノブ及びホール半分のＩｇＧの発現及び組織化を、各自で、または同時発現時のいずれかで比較した。以前に観察したように、ノブのみまたはホールのみの各自による発現により、半抗体及びいくらかの共有的ホモ二量体が主に生じた（図１８Ｃ）。標準的なＩｇＧとｔｃＩｇＧ形式との間では、発現または組織化における大きな差異は観察されなかった。同じ細胞におけるノブ及びホール半抗体の同時発現により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４の３つの主要なヒトアイソタイプ全てにおいて、１５０ＫＤａの種の効率的な組織化が生じた（図１８Ｃ）。単一特異性二価ｔｃＩｇＧとして及び二重特異性ｔｃＩｇＧとしてのヒトｔｃＩｇＧ２及びｔｃＩｇＧ４の観察された収率及び産生物の品質は、それらの対応するＩｇＧアイソタイプと同等であった。
【０３０４】
ｔｃＩｇＧノブ及びｔｃＩｇＧホールの単一細胞発現が抗体重鎖のヘテロ二量体形成に影響しないことを確実にするため、精製した抗体を質量分析によって分析した（図１８Ｄ）。ホモ二量体汚染物質はわずかしか検出されなかった。本明細書では三鎖ＩｇＧ（ｔｃＩｇＧ）形式と称する、単離されたＣＬドメインと繋留したＶＬｆＨ形式は、それらの存在度が従来のＢｓＩｇＧと同等であるため、ヘテロ二量体形成に悪影響を及ぼさないと結論付けた。
【０３０５】
ｔｃＢｓＩｇＧ形式の抗ＫＬＢバイエピトープ性抗体の産生
上記の５つの抗ＫＬＢモノクローナル抗体の由来するバイエピトープ性抗体を産生させるために、まず各抗体をＶＬｆＨノブベクター及びＶＬｆＨホールベクターにクローニングした。これにより、両方の重鎖配向（即ち、ノブ／ホール及びホール／ノブ）にある１０個の可能性があるバイエピトープの組み合わせを含む、ｔｃＩｇＧ形式の２５個の異なる抗体（表８）の産生が可能となった。抗体の組み合わせ各々についてノブ−ホール配向の両方を有することで、独立した複製が提供された。加えて、親単一特異性抗体をｔｃＩｇＧノブ及びｔｃＩｇＧ．ホール同時発現形式で生成して（表８、灰色のセル）、ベンチマークとし、５つの抗ＫＬＢモノクローナル抗体と対形成させる陽性（表８、（＋）発現対照）及び陰性（表８、（−）発現対照）ノブ及びホールｔｃＩｇＧ発現対照を含めた。
表８  ＨＥＫ２９３Ｔ中での発現及びＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅによる精製後のｔｃ
ＩｇＧの回収収率（ｍｇ／Ｌ）
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【０３０６】
２５個全てのｔｃＩｇＧ抗体をキャリパー電気泳動によって特性評価すると、比較可能な組織化効率を示した。全抗体について優勢なバンドは約１５０ｋＤａであり、このことは正しいドメイン対形成及びジスルフィド結合形成を示す（図１９Ａ）。また、親抗体の非効率的な発現により、結果として得られるバイエピトープ性抗体の発現収率が制限されたことに気付いた。これは、ノブ・イントゥ・ホール突然変異による効率的なヘテロ二量体化の結果である。例えば、陰性発現対照ｔｃＩｇＧは、二価として発現されるとき、及び任意の他の抗体と同時発現されるときに、収率が下がった（図１９Ａ及び１９Ｂ）。同時に、これにより、質量分析によって確認して、最低限のホモ二量体形成が確実となった。
【０３０７】
ｔｃＩｇＧを更に特性評価するために、ｔｃＩｇＧを分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。ＨＴＰ発現、及びタンパク質Ａクロマトグラフィーによる単一カラム精製の後で、ｔｃＩｇＧは１％〜７０％の範囲の高分子量（ＨＭＷ）種を有し、これは、親ｔｃＩｇＧの特性に関係すると見られ、このことは、それらの親標準ＩｇＧにも相関する。ノブ及びホールｔｃＩｇＧとして同時発現された陽性発現対照ｔｃＩｇＧは、ＨＭＷ種を有しなかったが、２つの比較的低発現である抗ＫＬＢ  ｔｃＩｇＧ、１２Ｂ８及び２３Ｂ３は、はるかに多量のＨＭＷ種を有した（図１９Ｃ）。興味深いことに、ＨＭＷ種の量は、陽性発現対照ｔｃＩｇＧと１２Ｂ８  ｔｃＩｇＧとの同時発現、及び挙動が不良な１２Ｂ８  ｔｃＩｇＧと挙動がわずかに良好な２３Ｂ３  ｔｃＩｇＧとの同時発現の場合と同様、挙動が良好なｔｃＩｇＧ半抗体が、挙動が不良なｔｃＩｇＧ半抗体と同時発現されたときに、平均された（図１９Ｃ）。ＨＭＷは各抗体の活性に影響し得るが、発明者らは、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける２５個の抗体の特性評価を進めることを決定した。更なるカラムステップにより、スループットが減少し得、発明者らは、よりよく精製された物質によって活性を検証することにした。
【０３０８】
抗ＫＬＢ  ｔｃＢｓＩｇＧバイエピトープ性抗体のインビトロスクリーニングにより、リンカーのないＢｓＩｇＧに翻訳される５個の優れた対を特定する。
抗ＫＬＢ  ｔｃＢｓＩｇＧバイエピトープ性抗体のインビトロスクリーニングは実施例２に記載した。リンカーのないＢｓＩｇＧに翻訳される５つの優れた対を特定した：１２Ｂ８／２３Ｂ３、１２Ｂ８／２Ｃ１２、２３Ｂ３／２８Ｂ７、２Ｃ１２／２８Ｂ７、及び４Ｈ７／２８Ｂ７（図３〜６）。
【０３０９】
ｔｃＩｇＧ形式のリンカーがスクリーニング中にバイエピトープ性ｔｃＩｇＧの結合親和性に干渉しないことを確実にするために、相対的アゴニスト活性が最も高い抗体４Ｈ７及び２８Ｂ７の結合動態を、ｔｃＩｇＧ１及び標準ＩｇＧ１の両方としてＢｉａｃｏｒｅによって評定した。これらの２つの形式についての結合動態における顕著な差は観察されず、このことは、ｔｃＩｇＧ形式が親抗体の結合動態を保存すること示した（表９）。
表９  ＩｇＧ及びｔｃＩｇＧ形式としての抗ＫＬＢ抗体２８Ｂ７及び４Ｈ７の結合動態  値は、２つの独立したＢｉａｃｏｒｅ実験の平均±範囲である
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【０３１０】
抗体アイソタイプが抗体アゴニスト活性に与える影響
抗体アイソタイプが抗体のアゴニスト及びリガンド模倣活性を調節し得ることがこれまでに報告されている（Ｗｈｉｔｅ，２０１４、Ｓａｍｐｅｉ，２０１４）。これを受けて、抗体アイソタイプが、他のバイエピトープ対と比べて最も高いアゴニスト特性を有した４Ｈ７／２８Ｂ７バイエピトープ性抗体の活性に影響し得るかどうかを調査した。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アイソタイプとしての抗体を産生させ（インビトロの組織化）、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて異なるアイソタイプの活性と比較した（図２０Ａ）。ヒトＩｇＧ２構築物のために、第２のヒンジシステイン（Ｋａｂａｔ付番のＣ２３３、ＥＵ付番のＣ２２０Ｓと同じ）をセリンに突然変異させて、最も効率的なインビトロの組織化を可能にした。このアッセイでは、ＩｇＧ１アイソタイプとしての４Ｈ７／２８Ｂ７バイエピトープ性抗体の活性はＩｇＧ２アイソタイプの活性の約２倍であった一方で、ＩｇＧ４アイソタイプは中等レベルの活性を有した。これら３つの抗体のＥＣ５０は類似しており、抗体アイソタイプは結合親和性に影響しないという考えと一致した。
【０３１１】
次に、評価を発展させて、ヒト初代脂肪細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化を評定した。このアッセイのため、分化させた初代ヒト脂肪細胞を様々なモノクローナル抗体で処理し、ＥＲＫ１／２リン酸化レベルをウェスタンブロットによって評定した。初代細胞を使用するこのアッセイの結果は、ルシフェラーゼレポーターアッセイと一致した。４Ｈ７／２８Ｂ７バイエピトープ性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アイソタイプバックグラウンドのいずれにおいてもアゴニストとして作用する（図２０Ｂ及び２０Ｃ）。更に、４Ｈ７及び２８Ｂ７抗体は、１：１混合物として組み合わせたとき、または単一の分子バイエピトープ性抗体として、単一親分子活性と比較してより優れた活性を呈した。
【０３１２】
考察
二重特異性及びバイエピトープ性抗体が強力なリガンド模倣対として働き得ることは、これまでに示されている。しかしながら、これらの抗体を見い出すことは困難である場合が多く、固有の機能的組み合わせを特定するために最大で何千もの組み合わせをスクリーニングする必要がある（Ｚｈａｎｇ，２０１２、Ｋｉｔａｚａｗａ，２０１２、Ｋｏｌｕｍａｍ，２０１５）。本明細書に記載されるｔｃＢｓＩｇＧ形式により、ＢｓＩｇＧの発現及び産生を単純化し、ＢｓＩｇＧ組み合わせの大規模パネルのハイスループットスクリーニングを可能にする新規のシステムが提供される。この戦略を使用すると、アゴニスト抗体の活性が、バイエピトープ性抗体への同時製剤化または組み合わせによって更に強化され得ることが示された。助長された活性を呈したバイエピトープの組み合わせは、親抗体の特性評価から完全に予測し得ず、ｔｃＢｓＩｇＧシステムの可用性を示す。観察は、他のアゴニスト抗体、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２７、またはＧＩＴＲを標的にし、免疫刺激活性をもたらすものに及び得る。
【０３１３】
ｔｃＢｓＩｇＧ形式は、抗体構造における修飾、特に、インビボの免疫原性反応を励起し得るＣＬのＮ末端でのリンカー及びネオエピトープの付加を含む。しかしながら、これらの問題は、インビトロスクリーニング活動には関係がない。いくつかの見込みある抗体対を特定すると、以降の前臨床及び臨床開発のために、選択した数のＢｓＩｇＧを従来のＢｓＩｇＧ形式で再フォーマティングし得る。この時点で、得られた結果が従来のＩｇＧ形式で反復され得ることが、いずれのスクリーニング形式にも必須である。本明細書に記載されるｔｃＩｇＧ形式は、抗体の全体的な構築を保存し、結果を、臨床用途にはより望ましいリンカーのないＢｓＩｇＧに変換することを可能にする。これは、ｔｃＢｓＩｇＧ形式のような二重特異性分子の産生において類似したスループットを提供するが、標的アーム間の幾何及び距離を改変し得る、ｓｃＦｖのヘテロ二量体Ｆｃへの融合（Ｍｏｏｒｅ，２０１１）等の他の技術よりも有利である。加えて、他のＢｓＩｇＧ形式と比べたｔｃＢｓＩｇＧ形式の別の利点は、二重特異性抗体のマトリックスを産生するためにクローニングする必要のあるプラスミドの総数がより少ないこと（即ち、各半抗体につき１つのみのプラスミド）である。薬物開発における抗体のスクリーニングの域を越えて、ｔｃＩｇＧ形式は、診断用途の二重特異性抗体を産生する可能性を有する。単一細胞中でｔｃＩｇＧを産生する能力により、ＢｓＩｇＧを産生させるための費用効果の高い方法がもたらされる。
【０３１４】
ｔｃＩｇＧ形式の別の利点は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプへのその適用可能性である。抗体アイソタイプ特異的活性が報告されている。例えば、ＣＤ４０に対するヒトＩｇＧ２抗体が、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４アイソタイプと比べてスーパーアゴニスト活性を呈することがこれまでに報告されている（Ｗｈｉｔｅ，２０１４）。加えて、第ＩＸａ／Ｘ因子に向けた二重特異性抗体の第ＶＩＩＩ因子リガンド模倣活性の振幅が抗体クラスに依存したことが報告されている（Ｓａｍｐｅｉ，２０１４）。これらの観察に基づき、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アイソタイプとしての４Ｈ７／２８Ｂ７リードバイエピトープ性ＩｇＧのアゴニスト活性を比較した。抗体アイソタイプ間で著しい差異が観察されたが、ヒトＩｇＧ１が最良のアゴニスト活性を示した。これは、ヒトＩｇＧ１としての抗ＫＬＢ対を最初にスクリーニングしたことに一部帰し得る。最初のスクリーニングを、全てのアイソタイプのＢｓＩｇＧを使用して行っていたら、異なる対及びアイソタイプが選択されていた可能性がある。ｔｓＩｇＧ形式の他のヒトアイソタイプとの互換性により、このスクリーニングが可能となり得る。加えて、これにより、Ｆｃガンマ受容体との異なる係合の効力によって、三重複合体を形成することが可能となる。これは、本抗ＫＬＢモデルシステムにおいては無関係であるが、主要標的化アゴニスト抗体の発見に重要であり得る。
【０３１５】
結論として、ｔｃＢｓＩｇＧ形式により、幅広い用途に対するＢｓＩｇＧスクリーニングのための卓越した戦略が提供される。
【０３１６】
実施例７：結合親和性試験
この実施例では、開示される二重特異性抗体を更に分析して、それらの結合親和性を決定した。抗ＫＬＢ抗体クローン２８Ｂ７及び４Ｈ７の結合親和性パラメータ（ｋａ（１／Ｍｓ）、ｋｄ（１／ｓ）、及びＫＤ（ｎＭ））を、ＩｇＧ形式とｔｃＩｇＧ形式との両方で決定した（図２１）。各抗体クローン内で、従来のＩｇＧ形式とｔｃＩｇＧ形式との間の結合親和性差が最小であった。例えば、クローン２８Ｂ７のＩｇＧ形式及びｔｃＩｇＧ形式のＫＤは、それぞれ２．６５ｎＭ及び２．０５ｎＭであった。クローン４Ｈ７のＩｇＧ形式及びｔｃＩｇＧ形式のＫＤは、それぞれ０．７８ｎＭ及び１．２９ｎＭであった。
【０３１７】
参考文献
Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．（１９９７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２７０  ２６−３５．
Ｆｅｉｇｅ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．（２０１４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１８４４  ２０２４−２０３１．
Ｆｅｉｇｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｒｏｓｃｕｒｔｈ，Ｓ．，Ｍａｒｃｉｎｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．，Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｌ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ．（２００９）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，３４  ５６９−５７９．
Ｋｉｍ，ＨＳ．（２０１６）ＭＡｂｓ，８  １５３６−１５４７．
Ｋｉｔａｚａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８  １５７０−１５７４．
Ｋｏｌｕｍａｍ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，２  ７３０−７４３．
Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＭＡｂｓ，３  ５４６−５５７．
Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９  ６１７−６２１．
Ｓａｍｐｅｉ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＭＡｂｓ  ０−００．
Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １−２５．
Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．ａ．，１０９  １５７２８−１５７３３．
【０３１８】
図示され特許請求される様々な実施形態に加えて、開示される主題は、本明細書に開示され特許請求される特徴の他の組み合わせを有する他の実施形態も対象とする。このため、本明細書に提示される特定の特徴は、開示される主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組み合わせを含むように、開示される主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わされ得る。開示される主題の特定の実施形態の前述の説明は例示及び説明目的で提示されている。包括的であること、または開示される主題を開示される実施形態に限定することは意図されていない。
【０３１９】
開示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な修正及び変形を開示される主題の組成物及び方法に行い得ることが、当業者には明らかとなる。よって、開示される主題は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内である修正及び変形を含むことが意図される。様々な出版物、特許、及び特許出願が本明細書で引用されており、それらの内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
2019504617.tif 000051
【図４】
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【図５】
2019504617.tif 000053
【図６】
2019504617.tif 000054
【図７】
2019504617.tif 000055
【図８】
2019504617.tif 000056
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2019504617.tif 000059
【図１２】
2019504617.tif 000060
【図１３−１】
2019504617.tif 000061
【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
2019504617.tif 000067
【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ−１】
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【図１９Ｃ−２】
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【図１９Ｃ−３】
2019504617.tif 000079
【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019504617.tif 000084
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