(57)【要約】ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルにおいて形成される脂質二重層を検出する方法を開示する。積分キャパシタを脂質メンブレンと結合する。脂質メンブレンは作用電極と対向電極との間にある。対向電極に交流（ＡＣ）電圧を印加する。アナログ／ディジタル変換器（ＡＤＣ）によって、積分キャパシタの両端間の電圧を周期的にサンプリングする。積分キャパシタ両端間にてサンプリングした電圧において、ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定する。積分キャパシタ両端間にてサンプリングした電圧において判定した、ＡＣ電圧の変化に応答した変化に基づいて、脂質メンブレンが脂質二重層を含むか否か検出する。【選択図】図６Ａ
2019511721.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルにおいて形成される脂質二重層を検出する方法であって、
脂質メンブレンを積分キャパシタと結合するステップであって、前記脂質メンブレンが作用電極と対向電極との間にある、ステップと、
交流（ＡＣ）電圧を前記対向電極に印加するステップと、
アナログ／ディジタル変換器（ＡＤＣ）によって積分キャパシタの両端間の電圧を周期的にサンプリングするステップと、
前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において、前記ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定するステップと、
前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において判定された、前記ＡＣ電圧の変化に応答した変化に基づいて、前記脂質メンブレンが脂質二重層を含むことを検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、更に、前記ＡＣ電圧が正区間から負区間に変化したとき、または前記ＡＣ電圧が負区間から正区間に変化したときに、前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において、前記ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定するステップを含む、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法であって、更に、前記ＡＣ電圧が正区間から負区間に変化したとき、または前記ＡＣ電圧が負区間から正区間に変化したときに、前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において、前記ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定するステップを含み、ＡＣ正区間が正の方形波を含み、ＡＣ負区間が負の方形波を含む、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法であって、更に、前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧においてスパイクを検出し、続いて前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした実質的に小さい電圧を検出することによって、前記脂質メンブレンが脂質二重層を含むことを検出するステップを含み、前記スパイクが、前記ＡＣ電圧が正区間から負区間に変化するとき、または前記ＡＣ電圧が負区間から正区間に変化するときに発生する、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法であって、更に、前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧におけるスパイクの大きさ(magnitude)を所定の閾値と比較し、前記スパイクの大きさが前記所定の閾値よりも大きい場合、前記脂質メンブレンが脂質二重層を含むことを検出するステップを含む、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法であって、更に、
前記積分キャパシタを一定プリチャージ電圧源に接続することによって、前記積分キャパシタをプリチャージするステップと、
前記積分キャパシタが、当該積分キャパシタから前記一定プリチャージ電圧源に充電された後、前記積分キャパシタが、前記脂質メンブレンに付随する容量を介して充電または放電するために、所定の時間期間だけ待つステップと、
前記所定の待機時間の後、前記積分キャパシタの両端間の電圧をサンプリングするステップと、
を含む、方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記積分キャパシタをプリチャージするステップ、前記プリチャージ電圧源を前記積分キャパシタから切断するステップ、および前記積分キャパシタが、前記脂質メンブレンに付随する容量を介して充電または放電するのを待つステップが、前記ＡＤＣのサンプリング・レートで繰り返される、方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記ＡＤＣのサンプリング・レートが、前記ＡＣ電圧の周波数よりも少なくとも１０倍高い、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法であって、更に、前記脂質メンブレンが脂質二重層を含むという検出に応答して、前記脂質二重層が電界によって破壊しないように、前記セル内のスイッチを開くことによって、前記脂質メンブレンの両端間に更なる電気刺激を印加するのを無効化するステップを含む、方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法であって、更に、前記セルにおけるスイッチを開くことによって、前記脂質メンブレンが前記セル内部のウェルを密封する前では、前記作用電極と前記対向電極との間に前記電気刺激を印加するのを無効化するステップを含む、方法。
【請求項１１】
ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセル内に形成される脂質二重層を検出する機器であって、
−積分キャパシタと、
−前記積分キャパシタに結合された作用電極と、
−対向電極であって、前記作用電極と当該対向電極との間に堆積された脂質メンブレンが前記積分キャパシタと結合される、対向電極と、
−ＡＣ電圧を前記対向電極に印加する交流（ＡＣ）電圧源と、
−前記積分キャパシタの両端間における電圧を周期的にサンプリングするアナログ／ディジタル変換器（ＡＤＣ）と、
−前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において、前記ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定し、前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において判定した、前記ＡＣ電圧の変化に応答した前記変化に基づいて、前記脂質メンブレンが脂質二重層を含むことを検出するように構成されたプロセッサまたは回路と、
を含む、機器。
【請求項１２】
請求項１１記載の機器において、前記プロセッサまたは回路が、更に、前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において、前記ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定するように構成される、機器。
【請求項１３】
請求項１１記載の機器において、前記プロセッサまたは回路が、更に、前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧においてスパイクを検出し、続いて前記積分キャパシタの両端間にてサンプリングした実質的に小さい電圧を検出することによって、前記脂質メンブレンが脂質二重層を含むことを検出するように構成され、前記スパイクが、前記ＡＣ電圧が正区間から負区間に変化するとき、または前記ＡＣ電圧が負区間から正区間に変化するときに発生する、機器。
【請求項１４】
請求項１１記載の機器であって、更に、一定プリチャージ電圧源を含み、前記プロセッサまたは回路が、更に、（ｉ）前記積分キャパシタを前記一定プリチャージ電圧源に接続することによって、前記積分キャパシタをプリチャージし、（ｉｉ）前記積分キャパシタが前記一定プリチャージ電圧源値に充電された後、前記プリチャージ電圧源を前記積分キャパシタから切断し、（ｉｉｉ）前記積分キャパシタが、前記脂質メンブレンに付随する容量を介して充電または放電するまで、所定時間期間待ち、（ｉｖ）前記所定の待機期間の後、前記積分キャパシタの両端間にて、前記ＡＤＣに電圧をサンプリングさせるように構成される、機器。
【請求項１５】
請求項１１記載の機器であって、更に、前記セル内に、前記プロセッサまたは回路によって制御されるスイッチを含み、前記プロセッサまたは回路が、更に、前記脂質メンブレンが脂質二重層を含むという検出に応答して、前記セルにおいて前記スイッチを開放することによって、前記脂質メンブレンの両端間に更なる電気刺激を印加するのを無効化するように構成される、機器。
【請求項１６】
請求項１１記載の機器であって、更に、前記セル内に、前記プロセッサまたは回路によって制御されるスイッチを含み、前記プロセッサまたは回路が、更に、前記脂質メンブレンが前記セル内においてウェルを密封する前では、前記セルにおいて前記スイッチを開放することによって、前記作用電極および前記対向電極間に電気刺激を印加するのを無効化するように構成される、機器。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]  近年における半導体業界内の超小型化の進展により、生物工学学者が、従前では嵩張っていた検知ツールを、フォーム・ファクタを増々小さくして、いわゆるバイオチップ上に詰め込み始めることが可能になった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
これらを一層ロバストに、効率的に、そして価格効率的にするバイオチップの技術を開発することができれば望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
[0002]  本発明は、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルにおいて形成される脂質二重層を検出する方法を提供する。この方法は、
−脂質メンブレンを積分キャパシタと結合するステップであって、脂質メンブレンが作用電極と対向電極との間にある、ステップと、
−交流（ＡＣ）電圧を対向電極に印加するステップと、
−アナログ／ディジタル変換器（ＡＤＣ）によって積分キャパシタの両端間の電圧を周期的にサンプリングするステップと、
−積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において、ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定するステップと、
−積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において判定された、ＡＣ電圧の変化に応答した変化に基づいて、脂質メンブレンが脂質二重層を含むことを検出するステップと、
を含む。
【０００４】
更に、本発明による方法は、更に、ＡＣ電圧が正区間から負区間に変化したとき、またはＡＣ電圧が負区間から正区間に変化したときに、積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において、ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定するステップを含んでもよい。加えて、この方法は、更に、ＡＣ電圧が正区間から負区間に変化したとき、またはＡＣ電圧が負区間から正区間に変化したときに、積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において、ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定するステップを含んでもよく、ＡＣ正区間が正の方形波を含み、ＡＣ負区間が負の方形波を含む。また、本発明は、積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧においてスパイクを検出し、続いて積分キャパシタの両端間にてサンプリングした実質的に小さい電圧を検出することによって、脂質メンブレンが脂質二重層を含むことを検出するステップを含んでもよく、スパイクは、ＡＣ電圧が正区間から負区間に変化するとき、またはＡＣ電圧が負区間から正区間に変化するときに発生する。更に、本発明は、積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧におけるスパイクの大きさ(magnitude)を所定の閾値と比較し、スパイクの大きさが所定の閾値よりも大きい場合、脂質メンブレンが脂質二重層を含むことを検出するステップを含んでもよい。また、本発明は、積分キャパシタを一定プリチャージ電圧源に接続することによって、積分キャパシタをプリチャージするステップと、積分キャパシタが一定のプリチャージ電圧源の値に充電された後、プリチャージ電圧源を積分キャパシタから切断するステップと、積分キャパシタが、脂質メンブレンに付随する容量を介して充電または放電するために、所定の時間期間だけ待つステップと、所定の待機時間の後、積分キャパシタの両端間の電圧をサンプリングするステップとを含んでもよい。一実施形態では、積分キャパシタをプリチャージするステップ、プリチャージ電圧源を積分キャパシタから切断するステップ、および積分キャパシタが、脂質メンブレンに付随する容量を介して充電または放電するのを待つステップが、ＡＤＣのサンプリング・レートで繰り返される。ＡＤＣのサンプリング・レートは、ＡＣ電圧の周波数よりも少なくとも１０倍高くてもよい。また、本発明は、脂質メンブレンが脂質二重層を含むという検出に応答して、脂質二重層が電界によって破壊しないように、セル内のスイッチを開くことによって、更なる電気刺激を脂質メンブレンの両端間に印加するのを無効化する(disable)ステップを含んでもよい。最後に述べるが決して軽んずべきでないこととして、本発明は、セルにおけるスイッチを開くことによって、脂質メンブレンがセル内部のウェルを密封する前では、作用電極と対向電極との間に電気刺激を印加するのを無効化するステップを含んでもよい。
【０００５】
[0003]  また、本発明は、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセル内に形成される脂質二重層を検出する機器またはシステムを提供する。この機器は、
−積分キャパシタと、
−積分キャパシタに結合された作用電極と、
−対向電極であって、作用電極と当該対向電極との間に堆積された脂質メンブレンが積分キャパシタと結合される、対向電極と、
−ＡＣ電圧を対向電極に印加する交流（ＡＣ）電圧源と、
−積分キャパシタの両端間における電圧を周期的にサンプリングするアナログ／ディジタル変換器（ＡＤＣ）と、
−積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において、ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定し、積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において判定した、ＡＣ電圧の変化に応答した変化に基づいて、脂質メンブレンが脂質二重層を含むことを検出するように構成されたプロセッサまたは回路と、
を含む。
【０００６】
[0004]  前述のプロセッサまたは回路は、更に、ＡＣ電圧が正区間から負区間に変化したとき、またはＡＣ電圧が負区間から正区間に変化したときに、積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において、ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定するように構成されてもよい。更に、このプロセッサまたは回路は、ＡＣ電圧が正区間から負区間に変化したとき、またはＡＣ電圧が負区間から正区間に変化したときに、積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧において、ＡＣ電圧の変化に応答した変化を判定するように構成されてもよく、ＡＣ正区間が正の方形波を含み、ＡＣ負区間が負の方形波を含む。また、このプロセッサまたは回路は、更に、積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧においてスパイクを検出し、続いて積分キャパシタの両端間にてサンプリングした実質的に小さい電圧を検出することによって、脂質メンブレンが脂質二重層を含むことを検出するように構成されてもよく、スパイクは、ＡＣ電圧が正区間から負区間に変化するとき、またはＡＣ電圧が負区間から正区間に変化するときに発生する。また、このプロセッサまたは回路は、更に、積分キャパシタの両端間にてサンプリングした電圧におけるスパイクの大きさ(magnitude)を所定の閾値と比較し、スパイクの大きさが所定の閾値よりも大きい場合、脂質メンブレンが脂質二重層を含むことを検出するように構成されてもよい。
【０００７】
[0005]  前述のシステムまたは機器は、更に、
−一定プリチャージ電圧源を含んでもよく、前述のプロセッサまたは回路が、更に、
−積分キャパシタを一定プリチャージ電圧源に接続することによって、積分キャパシタをプリチャージし、
−積分キャパシタが一定プリチャージ電圧源の値に充電された後、プリチャージ電圧源を積分キャパシタから切断し、
−積分キャパシタが、脂質メンブレンに付随する容量を介して充電または放電するまで、所定時間期間待ち、
−所定の待機期間の後、積分キャパシタの両端間にて、ＡＤＣに電圧をサンプリングさせるように構成される。
【０００８】
積分キャパシタをプリチャージするステップ、プリチャージ電圧源を積分キャパシタから切断するステップ、および積分キャパシタが、脂質メンブレンに付随する容量を介して充電または放電するのを待つステップは、ＡＤＣのサンプリング・レートで繰り返されてもよい。ＡＤＣのサンプリング・レートは、ＡＣ電圧の周波数よりも少なくとも１０倍高くてもよい。また、ＡＤＣのサンプリング・レートは、１５００から５０００Ｈｚの間であり、ＡＣ電圧の周波数は２５および１００Ｈｚの間である。
【０００９】
[0006]  更に、前述のシステムまたは機器は、セル内に、プロセッサまたは回路によって制御されるスイッチを含んでもよく、プロセッサまたは回路は、更に、脂質メンブレンがセル内においてウェルを密封する前では、セルにおいてスイッチを開放することによって、作用電極および対向電極間に電気刺激を印加するのを無効化するように構成される。また、このシステムまたは機器は、セル内に、プロセッサまたは回路によって制御されるスイッチを含んでもよく、プロセッサまたは回路は、更に、脂質メンブレンが脂質二重層を含むという検出に応答して、セルにおいてスイッチを開放することによって、脂質メンブレンの両端間に電気刺激を印加するのを無効化するように構成される。ＡＣ電圧の絶対振幅は、１００および２５０ｍＶの間にすればよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
[0007]  以下の詳細な説明および添付図面において、本発明の種々の実施形態を開示する。
【図１】図１は、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップ(sequencing chip)におけるセル１００の実施形態を示す。
【図２】図２は、ナノＳＢＳ技術によってヌクレオチド配列決定を実行するセル２００の実施形態を示す。
【図３】図３は、予め装填されたタグによってヌクレオチド配列決定を実行しようとするセルの実施形態を示す。
【図４】図４は、予め装填されたタグによってヌクレオチド配列決定を実行するプロセス４００の実施形態を示す。
【図５】図５は、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップにおけるセル５００の実施形態を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルにおける回路６００の実施形態を示し、既に形成されている脂質二重層を破壊させることなく、セル内に脂質二重層が形成されているか否か検出するように、この回路を構成することができる。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルにおける、図６Ａに示したものと同じ回路６００を示す。図６Ａと比較すると、作用電極と対向電極との間に脂質メンブレン／二重層を示す代わりに、作用電極および脂質メンブレン／二重層の電気特性を表す電気モデルを示す。
【図７】図７は、システムの脂質二重層測定フェーズ中における回路６００の一部の電気特性を表す電気モデル７００を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、±ΔＶｌｉｑに応答した小さい±ＶＡＤＣの観察から、セル内に脂質二重層が形成されていないことを検出することを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、±ΔＶｌｉｑに応答した大きい±ＶＡＤＣの観察から、セル内に脂質二重層が形成されていることを検出することを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、セル内に脂質二重層が形成される前およびされた後におけるＶＡＤＣ対時間の関係の例示的なプロットを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、脂質二重層が形成されていない時間期間ｔ１中におけるＶＡＤＣ対時間の関係の例示的なプロット（図９Ａ参照）の拡大図(zoomed-in view)を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、脂質二重層が形成されている時間期間ｔ２中におけるＶＡＤＣ対時間の関係（図９Ａ参照）の例示的なプロットの拡大図を示す。
【図１０】図１０は、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセル内に脂質層を形成する改良技術のプロセス１０００の実施形態を示す。
【図１１】図１１は、シリコン・チップを密封するフロー・チェンバが改良され、液体および気体がチップ表面上を通過し、チップ表面上にあるセンサと接触することを可能にするナノポア・ベースのシーケンシング・システム１１００の上面図を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、プロセス１０００の脂質減厚刺激フェーズ(lipid-thinning stimulus phase)および塩類緩衝液流通フェーズ(flowing phase)を多数回繰り返した後における、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの分布を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、プロセス１０００の脂質減厚刺激フェーズおよび塩緩衝液流通フェーズを更に多くの回数繰り返した後における、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの分布を示す。
【図１３】図１３は、二重層測定フェーズ、電気脂質減厚刺激フェーズ、および塩緩衝液流通フェーズのタイミング図の実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
[0027]  本発明は、多数の方法で実現することができ、プロセス、装置、システム、組成物、コンピュータ読み取り可能記憶媒体上に具体化されたコンピュータ・プログラム製品、および／またはプロセッサに結合されたメモリ上に格納されているおよび／またはこのメモリによって供給された命令を実行するように構成されたプロセッサのようなプロセッサとして、実現されることを含む。本明細書では、これらの実施態様、または本発明が取ることができるあらゆる他の形態も技術と呼んでもよい。一般に、開示するプロセスのステップの順序は、発明の範囲内で変更してもよい。特に注記しない限り、タスクを実行するように構成されるものとして記述されるプロセッサまたはメモリのようなコンポーネントは、所与の時点においてそのタスクを実行するように一時的に構成される汎用コンポーネント、またはそのタスクを実行するように製造された特定コンポーネントとして実現することができる。本明細書において使用する場合、「プロセッサ」という用語は、コンピュータ・プログラム命令のようなデータを処理するように構成された１つ以上のデバイス、回路、および／または処理コアを指す。
【００１２】
[0028]  以下に、本発明の原理を図示する添付図面と共に、本発明の１つ以上の実施形態の詳細な説明を示す。このような実施形態と関係付けて本発明について説明するが、本発明はいずれの実施形態にも限定されない。本発明の範囲は請求項によってのみ限定され、本発明は、多数の代替、変更、および均等を包含する。以下の説明では、本発明の完全な理解を得るために、多数の具体的な詳細を明記する。これらの詳細は例示の目的に限って提示するのであり、本発明は、これら具体的な詳細の一部または全部がなくても、請求項にしたがって実施することができる。明確さを得るという目的のために、本発明に関係する技術分野において周知の技術的素材については、本発明を不必要に曖昧にしないように、詳細には説明しないこととする。
【００１３】
[0029]  内径が１ナノメートル程度のポア・サイズを有するナノポア・メンブレン・デバイスは、急速ヌクレオチド配列決定において有望である。導電性液体内に浸漬されたナノポアの両端間に電圧電位を印加すると、ナノポアを横切るイオンの導通に帰する小さいイオン電流を観察することができる。電流のサイズは、ポア・サイズに感応する(sensitive)。
【００１４】
[0030]    ナノポア・ベースのシーケンシング・チップは、ＤＮＡシーケンシングに使用することができる。ナノポア・ベースのシーケンシング・チップは、アレイとして構成された大多数のセンサ・セルを組み込む。例えば、百万個のセルから成るアレイが、１０００行×１０００列のセルを含むこともできる。
【００１５】
[0031]    図１は、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップにおけるセル１００の一実施形態を示す。セルの表面上にメンブレン１０２が形成されている。ある実施形態では、メンブレン１０２は脂質二重層である。可溶性タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ：soluble protein nanopore transmembrane molecular complexes）と対象検体とを含有するバルク電解質(bulk electrolyte)１１４が、セルの表面上に直接配置されている。電気穿孔法によって、１つのＰＮＴＭＣ１０４がメンブレン１０２内に挿入される。アレイ内にある個々のメンブレンは、互いに化学的にも電気的にも接続されない。つまり、アレイにおける各セルは独立したシーケンシング・マシン(sequencing machine)であり、ＰＮＴＭＣと会合した１つのポリマー分子に一意のデータを生成する。ＰＮＴＭＣ１０４は、検体に対して作用し、そうしなければ不浸透性である二重層を通るイオン電流を変調する。
【００１６】
[0032]  引き続き図１を参照すると、アナログ測定回路１１２が、電解質１０８の薄膜によって覆われている金属電極１１０に接続されている。この電解質１０８の薄膜は、イオン不浸透性のメンブレン１０２によって、バルク電解質１１４からは分離されている。ＰＮＴＭＣ１０４は、メンブレン１０２と交差し、イオン電流がバルク液体から作用電極１１０に流れる唯一の経路を提供する。また、セルは、電気化学電位センサである対向電極（ＣＥ）１１６も含む。また、セルは基準電極１１７も含む。
【００１７】
[0033]  ある実施形態では、ナノポア・アレイが、合成（ナノ−ＳＢＳ）技術による１つの分子ナノポア・ベース・シーケンシングを使用し、並列シーケンシングを可能にする。図２は、ナノ−ＳＢＳ技術によってヌクレオチド・シーケンシングを実行するセル２００の一実施形態を示す。ナノ−ＳＢＳ技術では、シーケンシングする鋳型２０２およびプライマをセル２００に導入する。この鋳型−プライマ複合体に対して、４つの異なるタグ付きヌクレオチド２０８をバルク水相(bulk aqueous phase)に追加する。正しくタグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼ２０４と複合体を形成すると、タグの尾部(tail)がナノポア２０６のバレル(barrel)に位置する。ナノポア２０６のバレル内に保持されたタグは、一意のイオン遮断信号(ionic blockade signal)２１０を生成し、これによって、タグの化学構造が全く別であることから、追加された塩基を電子的に同定する。
【００１８】
[0034]  図３は、予め装填されたタグによってヌクレオチド・シーケンシングを実行しようとするセルの一実施形態を示す。ナノポア３０１はメンブレン３０２内に形成される。酵素３０３（例えば、ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼ）がナノポアと会合している。場合によっては、ポリメラーゼ３０３がナノポア３０１に共有結合することもある。ポリメラーゼ３０３は、シーケンシングする核酸分子３０４と会合している。ある実施形態では、核酸分子３０４は円形である。場合によっては、核酸分子３０４が直線状となることもある。ある実施形態では、核酸プライマ３０５が核酸分子３０４の一部に交雑される(hybridize)。ポリメラーゼ３０３は、触媒として機能して、一本鎖核酸分子３０４を鋳型として使用して、プライマ３０５上にヌクレオチド３０６の取り込み(incorporation)を引き起こす。ヌクレオチド３０６はタグ種（「タグ」）３０７を含む。
【００１９】
[0035]  図４は、予め装填されたタグによる核酸シーケンシングのプロセス４００の一実施形態を示す。ステージＡは、図３において説明したようなコンポーネントを示す。ステージＣは、ナノポアに装填されたタグを示す。「装填された」タグ(loaded tag)とは、かなりの時間量、例えば、０．１ミリ秒（ｍｓ）から１００００ｍｓの間ナノポア内に位置しているもの、および／またはナノポア内または付近に居続けるものとして差し支えない。場合によっては、予め装填されたタグが、ヌクレオチドから放出される前に、ナノポアに装填されることがある。ある実例では、ヌクレオチド取り込みイベントによって放出された後にナノポアを通過する（および／またはナノポアによって検出される）タグの可能性が、適度に高い場合、例えば、９０％〜９９％である場合、タグは予め装填される。
【００２０】
[0036]  ステージＡにおいて、タグ付きヌクレオチド（４つの異なるタイプＡ、Ｔ，Ｇ、またはＣの内の１つ）は、ポリメラーゼと会合していない。ステージＢにおいて、タグ付きヌクレオチドがポリメラーゼと会合する。ステージＣにおいて、ポリメラーゼがナノポアにドッキングする。メンブレンおよび／またはナノポアの両端間に印加された電圧によって生成される電界の存在の下で発生する力のような、電気的な力によって、ドッキングの間にタグはナノポア内に引き込まれる。
【００２１】
[0037]  会合したタグ付きヌクレオチドの一部は、核酸分子と塩基対合しない(base paired)。これら非対合ヌクレオチドは、通例、正しく対合したヌクレオチドがポリメラーゼと会合し続ける時間尺度より短い時間尺度でポリメラーゼによって拒絶される。非対合ヌクレオチドは一時的にしかポリメラーゼと会合しないため、図４に示すプロセス４００は、通例、ステージＤを越えて進行しない。例えば、非対合ヌクレオチドは、ステージＢにおいて、またはプロセスがステージＣに入った直後に、ポリメラーゼによって拒絶される。
【００２２】
[0038]  ポリメラーゼがナノポアとドッキングする前では、ナノポアのコンダクタンスは〜３００ピコ・ジーメンス（３００ｐＳ）である。ステージＣにおいて、ナノポアのコンダクタンスは、タグ付けされたヌクレオチドの４つの型の１つに対応して、それぞれ、約６０ｐＳ、８０ｐＳ、１００ｐＳ、または１２０ｐＳとなる。ポリメラーゼは、成長中の核酸分子にヌクレオチドを取り込み、タグ分子を放出するため、異性化およびトランスリン酸化の反応を起こす。具体的には、タグがナノポア内に保持されると、タグの化学構造が全く別であるために、一意のコンダクタンス信号（例えば、図２における信号２１０を参照のこと）が生成され、これによって、付加された塩基が電子的に同定される。サイクル（即ち、ステージＡからＥまでまたはステージＡからＦまで）を繰り返すことによって、核酸分子のシーケンシングを可能にする。ステージＤにおいて、放出されたタグはナノポアを通過する。
【００２３】
[0039]  場合によっては、図４のステージＦにおいて見られるように、成長中の核酸分子へ取り込まれないタグ付きヌクレオチドもナノポアを通過することもある。この取り込まれないヌクレオチドは、実例の中には、ナノポアによって検出できる場合もあるが、本方法は、取り込まれたヌクレオチドと取り込まれないヌクレオチドとの間で、少なくとも部分的に、ヌクレオチドがナノポアにおいて検出される時間に基づいて区別する手段を提供する。取り込まれていないヌクレオチドに結合している(bound)タグは、ナノポアを素早く通過し、検出される時間期間は短い（例えば、１０ｍｓ未満）が、取り込まれたヌクレオチドに結合しているタグは、ナノポアへ装填され、検出される時間期間長い（例えば、少なくとも１０ｍｓ）。
【００２４】
[0040]  図５は、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップにおけるセル５００の実施形態を示す。セル５００は誘電体層５０１を含む。誘電体層５０１を形成するために使用される誘電体材料は、ガラス、酸化物、窒化物等を含む。更に、セル５００は、誘電体層５０１の上に誘電体層５０４も含む。誘電体層５０４は、ウェル５０５を包囲する壁を形成する。ウェル５０５内の底面には、作用電極５０２が配置されている。誘電体層５０４を形成するために使用される誘電体材料は、ガラス、酸化物、一窒化ケイ素（ＳｉＮ）等を含む。誘電体層５０４の上面は、シラン処理されてもよい。シラン処理によって、誘電体層５０４の上面上に疎水層５２０が形成される。ある実施形態では、疎水層５２０は約１．５ナノメートル（ｎｍ）の厚さを有する。
【００２５】
[0041]  誘電体層の壁５０４によって形成されたウェル５０５は、更に、作用電極５０２の上方に塩類溶液５０６の膜を含む。塩類溶液５０６は、以下の内の１つを含めばよい。塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム(lithium glutamate)、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）。ある実施形態では、塩類溶液５０６の膜は、約３ミクロン（μｍ）の厚さを有する。
【００２６】
[0042]  図５に示すように、メンブレンが誘電体層５０４の上面上に形成され、ウェル５０５を跨いで広がっている。例えば、このメンブレンは、疎水層５２０の上面に形成された脂質単層５１８を含む。メンブレンがウェル５０５の開口に到達すると、脂質単層は、ウェルの開口を跨ぐ脂質二重層５１４に遷移する(transition)。タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ：protein nanopore transmembrane molecular complexes）および対象検体を含有するバルク電解液５０８が、ウェルの直接上方に配されている。１つのＰＮＴＭＣ／ナノポア５１６が、電気穿孔法によって脂質二重層５１４に挿入される。ナノポア５１６は、脂質二重層５１４と交差し、バルク電解液５０８から作用電極５０２への唯一の経路をイオン流に提供する。更に、バルク電解液５０８は、以下の内１つを含んでもよい。塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム(lithium glutamate)、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）。
【００２７】
[0043]  セル５００は、対向電極（ＣＥ）５１０を含む。これは電気化学電位センサである。また、セル５００は基準電極５１２も含む。ある実施形態では、対向電極５１０は、複数のセル間で共有され、したがって共通電極とも呼ぶ。共通電極は、測定セル内でナノポアと接触するバルク液体に共通電位を印加するように構成することができる。共通電位および共通電極は測定セルの全てに共通である。
【００２８】
[0044]  ある実施形態では、作用電極５０２は金属電極である。非ファラデー伝導では、作用電極５０２は、腐食および酸化に強い金属、例えば、プラチナ、金、窒化チタン、およびグラファイトで作るとよい。 例えば、作用電極５０２は、プラチナが電気メッキされたプラチナ電極であってもよい。他の例では、作用電極５０２は窒化チタン（ＴｉＮ）作用電極でもよい。
【００２９】
[0045]  ナノポアを脂質二重層内に挿入するステップは、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセル内に、脂質二重層が適正に形成されたことが判定された後に実行される。技術によっては、脂質二重層がセル内に適正に形成されたか否か判定するプロセスは、既に適正に形成されている脂質二重層を破壊させるおそれがある。例えば、刺激電圧が印加されると、電極間に電流を導通させることになろう。刺激電圧に対して測定される応答は、適正に形成された脂質二重層を有するセル（即ち、脂質分子の厚さの２つの層である脂質二重層）と適正に形成された脂質二重層がないセル（例えば、セルが、厚い脂質と溶液との混合膜(combined film)を有し、この膜がセルのウェルを跨いで広がっている場合）との間で区別するために使用することができるが、刺激電圧レベルは、場合によっては、既に適正に形成されている脂質二重層を破壊させるのに十分な程に高い。言い換えると、脂質二重層を検査するための刺激電圧は、脂質二重層に対して破壊的であるとして差し支えない。既に適正に形成されている脂質二重層が刺激電圧によって破壊された場合、非常に高い電流が、短絡状態の結果として、電極間に流れ始める。応答して、システムは、特定のセルにおいて再度新たな脂質二重層を再形成しようとすることができるが、これは時間がかかりしかも非効率的である。加えて、その後の試行において脂質二重層が特定のセルにおいて再形成(reform)できない場合もある。その結果、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップにおいて、適正に形成された脂質二重層およびナノポアを有するセルの全体的な割合（即ち、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップの歩留まり）は低くなる。
【００３０】
[0046]  ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセル内に形成された脂質二重層を検出するための非破壊技術を開示する。脂質二重層を検出するための非破壊技術は、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップの効率および歩留まり向上を含む多くの利点を有する。
【００３１】
[0047]  図６Ａは、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルにおける回路６００の実施形態を示す。この回路は、既に形成されている脂質二重層を破壊させることなく、脂質二重層がセル内に形成されているか否か検出するように構成することができる。
【００３２】
[0048]  図６Ａは、脂質メンブレン／二重層６１２間に電圧が印加されるように、セル作用電極６１４と対向電極６１６との間に位置する脂質メンブレンまたは脂質二重層６１２を示す。脂質二重層は、脂質分子の２つの層で作られた薄いメンブレンである。脂質メンブレンは、脂質分子の数枚の層（２つよりも多い）で作られたメンブレンである。また、脂質メンブレン／二重層６１２はバルク液体／電解液６１８と接触する。尚、作用電極６１４、脂質メンブレン／二重層６１２、および対向電極６１６は、図１における作用電極、脂質二重層、および対向電極と比較すると、上下逆さまに描かれていることを注記しておく。ある実施形態では、対向電極は、複数のセル間で共有され、したがって共通電極とも呼ぶ。共通電極は、共通電極を電圧源Ｖｌｉｑ６２０に接続することによって、測定セル内にある脂質メンブレン／二重層と接触するバルク液体に共通電位を印加するように構成することができる。共通電位および共通電極は、測定セルの全てに共通である。各測定セル内に作用セル電極があり、共通電極とは対照的に、作用セル電極６１４は、他の測定セルにおける作用セル電極とは独立した別個の電位を印加するように構成可能である。
【００３３】
[0049]  図６Ｂは、図６Ａに示したのと同じナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルにおける回路６００を示す。図６Ａと比較すると、作用電極と対向電極との間に脂質メンブレン／二重層を示す代わりに、作用電極および脂質メンブレン／二重層の電気特性を表す電気モデルが示されている。
【００３４】
[0050]  電気モデル６２２は、作用電極６１４の電気特性を表すキャパシタ６２４を含む。作用電極６１４に付随する容量は、二重層容量（Ｃｄｏｕｂｌｅ ｌａｙｅｒ）とも呼ぶ。更に、電気モデル６２２は、脂質メンブレン／二重層に付随する容量をモデル化するキャパシタ６２６（Ｃｂｉｌａｙｅｒ）と、脂質メンブレン／二重層に付随する抵抗をモデル化する抵抗器６２８（Ｒｂｉｌａｙｅｒ）とを含む。脂質メンブレン／二重層に付随する抵抗は非常に高く、したがってＲｂｉｌａｙｅｒを開放回路と置き換えてもよく、こうすることによって、電気モデル６２２はＣｂｉｌａｙｅｒと直列のＣｄｏｕｂｌｅ ｌａｙｅｒに縮小する。
【００３５】
[0051]  電圧源Ｖｌｉｑ６２０は、交流（ＡＣ）電圧源である。対向電極６１６はバルク液体６１８内に浸漬されており、ＡＣ非ファラデー・モードが、方形波電圧Ｖｌｉｑを変調し、測定セル内において脂質メンブレン／二重層と接触するバルク液体にそれを印加するために利用される。ある実施形態では、Ｖｌｉｑは、振幅が±２００〜２５０ｍＶ、周波数が２５および１００Ｈｚの間の方形波である。
【００３６】
[0052]  パス・デバイス(pass device)６０６は、脂質メンブレン／二重層および電極を測定回路６００に接続する、または測定回路６００から切断するために使用することができるスイッチである。このスイッチは、セル内において脂質メンブレン／二重層間に印加することができる電圧刺激を有効化(enable)または無効化する(disable)。脂質二重層を形成するために脂質がセルに堆積される前では、２つの電極間のインピーダンスは非常に低い。何故ならセルのウェルが密封されておらず、したがって短絡回路状態を回避するためにスイッチ６０６が開かれたままになっているからである。一旦脂質溶媒がセルに溜まり(deposited)セルのウェルを密封したなら、スイッチ６０６を閉じてもよい。
【００３７】
[0053]  更に、回路６００はチップ上に製作された積分キャパシタ(integrating capacitor)６０８（ｎｃａｐ）も含む。リセット信号６０３を使用してスイッチ６０１を閉じることによって、積分キャパシタ６０８を電圧源Ｖｐｒｅ６０５に接続し、積分キャパシタ６０８をプリチャージする。ある実施形態では、電圧源Ｖｐｒｅ６０５は振幅が９００ｍＶの一定正電圧を供給する。スイッチ６０１が閉じているとき、積分キャパシタ６０８は電圧源Ｖｐｒｅ６０５の正電圧レベルにプリチャージされる。
【００３８】
[0054]  積分キャパシタ６０８がプリチャージされた後、積分キャパシタ６０８が電圧源Ｖｐｒｅ６０５から切断されるように、リセット信号６０３を使用してスイッチ６０１を開く。この時点において、Ｖｌｉｑのレベルに応じて、対向電極６１６の電位は、作用電極６１４の電位よりも高いレベルになることができ、またはその逆になることができる。例えば、方形波Ｖｌｉｑの正区間において（即ち、ＡＣ電圧源信号サイクルの闇期間）、対向電極６１６の電位は、作用電極６１４の電位よりも高い。同様に、方形波Ｖｌｉｑの負区間において（即ち、ＡＣ電圧源信号サイクルの明期間）、対向電極６１６の電位は作用電極６１４の電位よりも低いレベルとなる。この電位差のために、積分キャパシタ６０８は、ＡＣ電圧源信号サイクルの闇期間に充電し、ＡＣ電圧源信号サイクルの明期間に放電することができる。
【００３９】
[0055]  アナログ／ディジタル変換器（ＡＤＣ）６１０のサンプリング・レートに応じて、積分キャパシタ６０８は、固定時間期間充電または放電し、次いで積分キャパシタ６０８に蓄積された電圧をＡＤＣ６１０によって読み出すことができる。ＡＤＣ６１０によるサンプリングの後、積分キャパシタ６０８が再度電圧源Ｖｐｒｅ６０５に接続されるように、リセット信号６０３を使用してスイッチ６０１を閉じることによって、積分キャパシタ６０８を再度プリチャージする。ある実施形態では、ＡＤＣ６１０のサンプリング・レートは１５００から２０００Ｈｚの間である。ある実施形態では、ＡＤＣ６１０のサンプリング・レートは５ｋＨｚまでである。例えば、１ｋＨｚのサンプリング・レートでは、積分キャパシタ６０８は１ｍｓまでの期間充電または放電し、次いで、積分キャパシタ６０８に蓄積された電圧はＡＤＣ６１０によって読み出される。ＡＤＣ６１０によるサンプリングの後、積分キャパシタ６０８が再度電圧源Ｖｐｒｅ６０５に接続されるように、リセット信号６０３を使用してスイッチ６０１を閉じることによって、積分キャパシタ６０８を再度プリチャージする。次いで、積分キャパシタ６０８をプリチャージし、積分キャパシタ６０８が充電または放電するための固定時間期間だけ待ち、積分キャパシタに蓄積された電圧をＡＤＣ６１０によってサンプリングするステップは、システムの脂質二重層測定フェーズにわたって周期的に繰り返される。
【００４０】
[0056]  積分キャパシタ６０８（ｎｃａｐ）において、脂質メンブレン／二重層と接触するバルク液体に印加されるデルタ電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答したΔ電圧変化ΔＶＡＤＣを監視することによって、脂質二重層がセル内に形成されたか否か検出するために、回路６００を使用することができる。以下で更に詳しく説明するように、脂質二重層測定フェーズの間、回路６００は、Ｃｂｉｌａｙｅｒ６２６、Ｃｄｏｕｂｌｅ ｌａｙｅｒ６２４、およびｎｃａｐ６０８が直列に接続された分圧器としてモデル化することができ、この分圧器の中間点において引き出される(tapped)電圧変化は、脂質二重層が形成されたか否か判定するために、ＡＤＣ６１０によって読み取ることができる。
【００４１】
[0057]  図７は、システムの脂質二重層測定フェーズ中における回路６００の一部の電気特性を表す電気モデル７００を示す。図７に示すようにＣｄｏｕｂｌｅ ｌａｙｅｒ６２４がＣｂｉｌａｙｅｒ６２６と直列に接続されているが、Ｒｂｉｌａｙｅｒ６２８（図６Ｂ参照）は電気モデル７００から削除されている。Ｒｂｉｌａｙｅｒ６２８を電気モデル７００から削除することができるのは、脂質メンブレン／二重層に付随する抵抗が非常に高く、したがってＲｂｉｌａｙｅｒを開放回路として近似してもよいからである。図７に示すように、Ｃｄｏｕｂｌｅ ｌａｙｅｒ６２４およびＣｂｉｌａｙｅｒ６２６が更にｎｃａｐ６０８と直列に接続されている。
【００４２】
[0058]  ＡＣモードで動作するとき、ＡＤＣによって読み取られる電圧（ＶＡＤＣ）は次の式で決定することができる。
【数１】
2019511721.tif 000003
ここで、Ｚ＝１／（ｊωＣ）、Ｚ（ｃａｐ）は、ｎｃａｐに付随するＡＣインピーダンス、Ｚ（ｄｏｕｂｌｅ ｌａｙｅｒ）は作用電極に付随するＡＣインピーダンス、そしてＺ（ｂｉｌａｙｅｒ）は脂質メンブレン／二重層に付随するＡＣインピーダンスである。
【００４３】
[0059]  二重層のＡＣインピーダンスＺ（ｄｏｕｂｌｅ  ｌａｙｅｒ）は、Ｚ（ｂｉｌａｙｅｒ）およびＺ（ｎｃａｐ）と比較すると非常に低い値を有する。何故なら、Ｃｄｏｕｂｌｅ  ｌａｙｅｒがＣｂｉｌａｙｅｒまたはｎｃａｐの容量よりも遙かに大きいからである。したがって、Ｚ（ｎｃａｐ）＝１／（ｊωＣｎｃａｐ）、Ｚ（ｂｉｌａｙｅｒ）＝１／ｊωＣｂｉｌａｙｅｒ、およびＺ（ｄｏｕｂｌｅ  ｌａｙｅｒ）＝０を代入すると、式（１）を次のように簡略化することができる。
【数２】
2019511721.tif 000004
ここで、Ｃ（ｎｃａｐ）はｎｃａｐに付随する容量であり、Ｃ（ｂｉｌａｙｅｒ）は脂質メンブレン／二重層に付随する容量である。
【００４４】
[0060]  脂質が最初にセル内に堆積されて脂質二重層を形成するとき、これらのセルの一部は自発的に形成された脂質二重層を有するが、セルの一部は、単に、セルのウェルの各々を跨がって広がる厚い脂質メンブレン（脂質分子および溶媒が結合された複数の層）を有するだけである。脂質二重層に付随する容量は、２層の脂質分子よりも厚い脂質メンブレンに付随する容量よりも大きい。何故なら、脂質メンブレン／二重層の容量はその厚さに反比例するからである。脂質メンブレンは減厚して(thin out)脂質二重層になるように遷移するので、厚さが減少し、その付随する容量は増大する。先の式（２）において、脂質二重層がセル内において形成し始めると、Ｃ（ｂｉｌａｙｅｒ）は増大するが、Ｃ（ｎｃａｐ）は一定のままであり、全体として見るとＶＡＤＣが増大する。したがって、ＶＡＤＣの増大は、脂質二重層がセル内で形成されたことの指標として使用することができる。
【００４５】
[0061]  ある実施形態では、脂質二重層がセル内で形成されたか否か検出するために、積分キャパシタ６０８（ｎｃａｐ）において、脂質メンブレン／二重層と接触するバルク液体に印加されたデルタ電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答したデルタ電圧変化ΔＶＡＤＣを監視する。例えば、式（２）を次のように書き換えることができる。
【数３】
2019511721.tif 000005
ここで、ΔＶＡＤＣは、ＡＤＣによって読み取られた、積分キャパシタ６０８（ｎｃａｐ）における電圧変化であり、ΔＶｌｉｑは、バルク液体に印加された電圧変化であり、Ｃ（ｎｃａｐ）はｎｃａｐに付随する容量であり、Ｃ（ｂｉｌａｙｅｒ）は、脂質メンブレン／二重層に付随する容量である。
【００４６】
[0062]  以上の式（３）において、Ｃ（ｎｃａｐ）は一定のままであるが、Ｃ（ｂｉｌａｙｅｒ）は、脂質二重層がセル内において形成し始めるに連れて増大するので、ΔＶＡＤＣも増大する。ΔＶＡＤＣは、脂質メンブレン／二重層に付随する容量Ｃ（ｂｉｌａｙｅｒ）に大まかに比例する。したがって、ΔＶＡＤＣの増大は、脂質二重層がセル内において形成されたことの指標として使用することができる。
【００４７】
[0063]  ある実施形態では、観察可能なΔＶＡＤＣを最大化して脂質二重層検出の信頼性を高めるために、脂質メンブレン／二重層と接触するバルク液体に印加される最大電圧変化（最大ΔＶｌｉｑ）に応答するΔＶＡＤＣを監視して、脂質二重層がセル内において形成されたか否か検出する。
【００４８】
[0064]  図８Ａは、正／負電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答する小さい正／負電圧変化±ΔＶＡＤＣを観察した結果、脂質二重層がセル内に形成されたことが検出されなかったことを示す。図８Ｂは、正／負電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答する大きい正／負電圧変化±ΔＶＡＤＣを観察した結果、脂質二重層がセル内に形成されたことが検出されたことを示す。
【００４９】
[0065]  図８Ａにおいて、最大正電圧変化＋ΔＶｌｉｑが発生するのは、方形波Ｖｌｉｑが負区間から正区間に変化するときであり、一方最大負電圧変化−ΔＶｌｉｑが発生するのは、方形波Ｖｌｉｑが正区間から負区間に変化するときである。図８Ａにおいて、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある時点では、脂質二重層がセル内に形成されていない場合、小さい＋ΔＶＡＤＣしか観察することができない。ΔＶｌｉｑが負の最大値にある時点では、脂質二重層がセル内に形成されていない場合、小さい−ΔＶＡＤＣしか観察することができない。
【００５０】
[0066]  図８Ｂにおいて、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある時点では、脂質二重層が既にセル内に形成されている場合、大きい正電圧変化＋ΔＶＡＤＣを観察することができる。そして、ΔＶｌｉｑが負の最大値にある時点では、脂質二重層が既にセル内に形成されている場合、大きい負の電圧変化−ΔＶＡＤＣを観察することができる。
【００５１】
[0067]  ある実施形態では、ΔＶｌｉｑの絶対値（｜ΔＶｌｉｑ｜）が最大値であるときに観察されたΔＶＡＤＣの絶対値（｜ΔＶＡＤＣ｜）を、所定の閾値と比較する。（｜ΔＶＡＤＣ｜＞所定の閾値）の場合、脂質二重層が検出されたと判定する。逆に、（｜ΔＶＡＤＣ｜＜所定の閾値）の場合、脂質二重層は検出されないと判定する。
【００５２】
[0068]  図９Ａは、脂質二重層がセル内に形成される前およびされた後におけるＶＡＤＣ対時間の関係を示す例示的なプロットを示す。図９Ａにおけるプロットは、実際の検査データに基づく。図９Ａに示すように、ｙ軸上のＶＡＤＣの単位はＡＤＣカウントである。しかしながら、他の単位も同様に使用してもよい。図９Ａに示すように、脂質二重層が形成されていない時間期間ｔ１では、記録された｜ΔＶＡＤＣ｜値は、脂質二重層がセル内に形成された後の時間期間ｔ２中に記録されたものよりも小さい。
【００５３】
[0069]  図９Ｂは、脂質二重層が形成されていない時間期間ｔ１中におけるＶＡＤＣ対時間の関係（図９Ａ参照）の例示的なプロットの拡大図を示す。図９Ｂに示す結果は、図８Ａと一致する。図９Ｂにおいて、最大値＋ΔＶｌｉｑが発生するのは、方形波Ｖｌｉｑが負区間から正区間に変化するときであり、最大の−ΔＶｌｉｑが発生するのは、方形波Ｖｌｉｑが正区間から負区間に変化するときである。図９Ｂにおいて、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある時点では、脂質二重層がセル内に形成されていないので、小さい＋ΔＶＡＤＣしか観察することができない。ΔＶｌｉｑが負の最大値にある時点では、脂質二重層がセル内に形成されていないので、小さい−ΔＶＡＤＣしか観察することができない。
【００５４】
[0070]  図９Ｃは、脂質二重層が形成されている時間期間ｔ２中におけるＶＡＤＣ対時間の関係（図９Ａ参照）の例示的なプロットの拡大図を示す。図９Ｃに示す結果は、図８Ｂと一致する。図９Ｃにおいて、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある時点では、脂質二重層が既にセル内に形成されているので、２つの連続するサンプル点間で大きい＋ΔＶＡＤＣを観察することができる。ΔＶｌｉｑが負の最大値にある時点では、脂質二重層が既にセル内に形成されているので、大きい−ΔＶＡＤＣを観察することができる。尚、方形波Ｖｌｉｑが１つの区間から他の区間に変化した直後では、ΔＶｌｉｑは０に留まり、ＶＡＤＣは応答してゼロまで減少することを注記しておく。図９Ｃに示すように、脂質二重層が既にセル内に形成されているとき、ＶＡＤＣにおいて正または負のスパイクを観察することができる。正または負のスパイクの後には、遙かに小さいＶＡＤＣ値が続く。
【００５５】
[0071]  前述のように、液体溶媒混合物を最初にセル内に溜めて脂質二重層を形成するとき、セルの一部は自発的に形成された脂質二重層を有するが、セルの一部は、脂質分子の複数の層が溶媒と結合してセルのウェルの各々を跨いで広がる、厚い脂質メンブレンを有するに過ぎない。ナノポア・ベースのシーケンシング・チップの歩留まり（即ち、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップにおいて、適正に形成された脂質二重層およびナノポアを有するセルの割合）を高めるために、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップは、追加のセルにおける脂質二重層の形成を促進するために追加のステップを実行することもできる。例えば、脂質二重層が未だ形成されていないセルに、電気脂質減厚刺激を加えることによって、厚い脂質メンブレンの上方における液体流通の効率を高めることができ、これによって、一層効率的に厚い脂質メンブレンを減厚して脂質二重層に遷移させることができるように、あらゆる余分な脂質溶媒の除去を促進する。また、脂質二重層が未だ形成されていないセルに電気脂質減厚刺激を加えることによって、余分な脂質溶媒を絞り出し、厚い脂質メンブレンを減厚して脂質二重層にするに資する静電力を発生する(create)。一方、既に脂質二重層が内部に適正に形成されているセルは、同じ電気脂質減厚刺激にそれ以上露出させてはならない。何故なら、電気刺激は薄い脂質二重層の一部を破壊するおそれがあるからである。したがって、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップにおいて、脂質二重層が内部に形成されているセルの部分を検出し、脂質二重層が未だ適正に内部に形成されていないセルの部分から分離するために、本願において記載する非破壊技術を使用することが有利である。セルを異なるグループに分割することによって、異なるグループに入ったセルに異なる処理を行うことができ、これによって効率向上を達成し、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップの全体的な歩留まりを高める。
【００５６】
[0072]  図１０は、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルにおいて脂質層を形成する改良技術のプロセス１０００の実施形態を示す。ある実施形態では、図１０のナノポア・ベースのシーケンシング・チップは図１のセル１００を複数個含む。ある実施形態では、図１０のナノポア・ベースのシーケンシング・チップは図５のセル５００を複数個含む。ある実施形態では、図１０のナノポア・ベースのシーケンシング・チップは図６Ａおよび図６Ｂの回路６００を含む。
【００５７】
[0073]  プロセス１０００は、異なる種類の流体（例えば、液体または気体）を、フロー・チェンバ(flow chamber)を介して、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルに通過させるステップを含む。特性（例えば、圧縮性、疎水性、および粘度）が著しく異なる複数の流体を、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップの表面上にあるセンサのアレイ上を通過させる。効率向上のためには、アレイにおけるセンサの各々が流体に継続的に(in a consistent manner)露出されなければならない。例えば、異なる種類の流体の各々は、その流体がチップに送達されて、セルの表面の各々を均一に被覆し接触し、次いでチップから排出される(delivered out of)ように、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップ上を流通されなければならない。前述のように、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップは、アレイとして構成された大多数のセンサ・セルを内蔵する。更に多くのセルを含むようにナノポア・ベースのシーケンシング・チップを規模拡大するに連れて、チップのセルを横切る異なる種類の流体の均一な流れを達成することは一層困難になる。
【００５８】
[0074]  ある実施形態では、図１０のプロセス１０００を実行するナノポア・ベースのシーケンシング・システムは、蛇行する流体流路を有する改良フロー・チェンバを含む。この流路は、流路の長さに沿ってチップの異なるセンサ上を横断するように、流体を導く。図１１は、シリコン・チップを密封する改良フロー・チェンバを有するナノポア・ベースのシーケンシング・システム１１００の上面図を示す。このフロー・チェンバは、液体および気体を、チップ表面上にあるセンサ上を通過させ、センサと接触させる。このフロー・チェンバは、蛇行または螺旋状流路１１０８を含む。流路１１０８は、センサ・バンク１１０６（各バンクは数千個のセンサ・セルを含む）の１つの列（または１つの行）の上を直接流れるように、チップの一端から逆端まで流体を導き、次いでセンサ・バンクの全てを少なくとも１回横断し終えるまで、折り返しセンサ・バンクの他の隣接する列上を直接流れるように、繰り返し流体を導く。図１１に示すように、システム１１００は導入口１１０２および排出口１１０４を含む。
【００５９】
[0075]  図１１を参照すると、流体が導入口１１０２を通ってシステム１１００内に導かれる。導入口１１０２は管または針でもよい。例えば、管または針は１ミリメートルの直径を有するのでもよい。１つの連続空間を有する広いフロー・チェンバ内に液体または気体を直接供給する代わりに、導入口１１０２は液体または気体を蛇行流路１１０８内に供給する。蛇行流路１１０８は、センサ・バンク１１０６の１つの列上を直接流れるように、液体または気体を導く。蛇行流路１１０８は、天板(top plate)およびガスケットを、チェンバを蛇行チャネルに分割する仕切り(divider)１１１０と互いに積層してフロー・セルを形成し、次いでフロー・セルをチップの上面上に装着することによって形成することができる。一旦液体または気体が蛇行流路１１０８を通過したなら、液体または気体は排出口１１０４を通ってシステム１１００外に導かれる。
【００６０】
[0076]  システム１１００は、チップ表面上にあるセンサ全ての上を一層均一に流体が流れることを可能にする。流路幅は、毛細管現象が効果を発揮するように十分に狭く構成される。更に具体的には、表面張力（流体内の凝集力によって生ずる）および流体と密封面(enclosing surface)との間における接着力が、流体を纏めるように作用し、これによって流体または気体の泡が粉砕し不感帯が生ずるのを防止する。例えば、流路は１ミリメートル以下の幅を有するとよい。狭い流路は、流体の流量を制御することを可能にし、以前の流体流または気体流からの残余量を最小に止める。
【００６１】
[0077]  図１０を参照すると、１００２において、塩類／電解質緩衝液を、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルを通過するように、フロー・チェンバを介して流通させ、セル内のウェルを塩類緩衝液で実質的に満たす。塩類緩衝液は、以下の内１つを含めばよい。塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム(lithium glutamate)、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＬｌ２）。ある実施形態では、塩類緩衝液の濃度は３００ｍＭ（ミリモル）である。
【００６２】
[0078]  １００４において、フロー・チェンバを介して、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルを通過するように、脂質および溶媒混合液を流通させる。ある実施形態では、脂質および溶媒混合液は、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ：diphytanoylphosphatidylcholine）のような脂質分子を含む。ある実施形態では、脂質および溶媒混合液は、デカンまたはトリデカンを含む。脂質および溶媒混合液を最初にセル内に溜めて脂質二重層を形成するとき、セルの一部は自発的に形成された脂質二重層を有するが、セルの一部は、セルのウェルの各々を跨いで広がる厚い脂質メンブレンを有するに過ぎない（脂質分子の複数の層が溶媒と結合する）。ナノポア・ベースのシーケンシング・チップの歩留まり（即ち、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップにおいて、適正に形成された脂質二重層およびナノポアを有するセルの割合）を高めるために、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップには、追加のセルにおける脂質二重層の形成を促進するために、２つのフェーズ、即ち、電気脂質減厚刺激フェーズおよび緩衝液流通フェーズが繰り返し行われる(go through)。
【００６３】
[0079]  プロセス１０００の電気脂質減厚刺激フェーズは、ステップ１００６、１００８、および１０１０を含む。ある実施形態では、このフェーズ・ステップ１００６、１００８、および１０１０は、図１０に示すような順序で実行することができる。ある実施形態では、ステップ１００６、１００８、および１０１０は異なる順序で実行してもよい。ある実施形態では、これらのステップを同時に実行してもよい。
【００６４】
[0080]  １００６において、本願において説明する非破壊技術を使用して、図６Ａおよび図６Ｂの回路６００を使用して、セル内に脂質二重層が形成されているか否か検出する。この検出は、積分キャパシタ６０８（ｎｃａｐ）の電圧において、脂質メンブレン／二重層と接触するバルク液体に印加された電圧の変化（ΔＶｌｉｑ）に応答する変化ΔＶＡＤＣを監視することを含む。脂質二重層が検出されたセルを、脂質二重層が検出されていないセルとは異なるグループに分離する。脂質二重層が検出されたセルの各々において、脂質二重層および電極を測定回路６００から切断するためにパス・デバイス６０６を開放し、電気脂質減厚刺激をセルに印加するのを無効化する。
【００６５】
[0081]  １００８において、電気脂質減厚刺激を、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルに印加する。脂質二重層が未だ形成されていないセルに、電気脂質減厚刺激を加えることによって、厚い脂質メンブレンの上方における液体流通の効率を高めることができ、これによって、一層効率的に厚い脂質メンブレンを減厚して脂質二重層に遷移させることができるように、あらゆる余分な脂質溶媒の除去を促進する。また、脂質二重層が未だ形成されていないセルに電気脂質減厚刺激を加えることによって、余分な脂質溶媒を絞り出し、厚い脂質メンブレンを減厚して脂質二重層にするのに役立つ静電力を発生する(create)。ある実施形態では、図６Ａおよび図６Ｂの同じ回路６００を使用して、電気脂質減厚刺激を印加してもよい。脂質二重層検出と脂質減厚との間における回路６００の設定の相違は、Ｖｌｉｑの絶対振幅が脂質二重層の検出では低いことである。例えば、脂質二重層検出のための絶対振幅Ｖｌｉｑは１００ｍＶから２５０ｍＶの間にするとよく、一方脂質減厚のための絶対振幅Ｖｌｉｑは２５０ｍＶから５００ｍＶの間にするとよい。
【００６６】
[0082]  ステップ１０１０において、電気脂質減厚刺激フェーズが終了したか否か判定する。ある実施形態では、脂質二重層を内部に有しているとして検出されていないあらゆるセルに、 電気脂質減厚刺激を２秒間印加する。しかしながら、他の所定の時間期間も同様に使用してもよい。このフェーズが未だ終わっていない場合、前述の時間期間が終了するまで、プロセス１０００はステップ１００６および１００８に再度戻る。そうでない場合、プロセス１０００は次に塩類緩衝液流通フェーズに進む。
【００６７】
[0083]  プロセス１０００の塩類緩衝液流通フェーズは、ステップ１０１２、１０１４、および１０１６を含む。ある実施形態では、このフェーズの間、ステップ１０１２、１０１４、および１０１６を、図１０に示すような順序で実行すればよい。ある実施形態では、ステップ１０１２、１０１４、および１０１６を異なる順序で実行してもよい。ある実施形態では、これらのステップを同時に実行してもよい。
【００６８】
[0084]  １０１２において、ステップ１００６において使用した同じ非破壊技術を使用して、図６Ａおよび図６Ｂの回路６００を使用して、セル内に脂質二重層が形成されているか否か検出する。脂質二重層が検出されたセルは、脂質二重層が検出されていないセルとは異なるグループに分けられる。脂質二重層が検出されたセルの各々において、脂質二重層および電極を測定回路６００から切断するために、パス・デバイス６０６を開放する。
【００６９】
[0085]  １０１４において、フロー・チェンバを介してナノポア・ベースのシーケンシング・チップのセルを通過するように、塩類／電解質緩衝液を流通させる(flow)。セル全体にわたって塩類緩衝液を流通させる目的は、セルの各々上において脂質二重層の形成を促進することである。塩類緩衝液をセル全体にわたって流通させると、セル上に堆積している脂質および溶媒混合液の厚さが減少し、脂質二重層の形成を促進する。
【００７０】
[0086]  １０１６において、塩類緩衝液流通フェーズが終了したか否か判定する。ある実施形態では、２秒の期間塩類緩衝液を流通させる。しかしながら、他の所定の時間期間も同様に使用してもよい。このフェーズが未だ終了していない場合、プロセス１０００は、この時間期間が終了するまで、ステップ１０１２および１０１４に再度戻り、そうでない場合、プロセス１０００はステップ１０１８に進む。
【００７１】
[0087]  １０１８において、プロセス１０００の電気脂質減厚刺激フェーズおよび塩類緩衝液流通フェーズを繰り返すべきか否か判定する。このステップにおいて、異なる判断基準を使用してもよい。ある実施形態では、電気脂質減厚刺激フェーズおよび塩類緩衝液流通フェーズを所定回数実行する。ある実施形態では、これら２つのフェーズは、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップに対する目標歩留まりに達するまで繰り返す。ある実施形態では、刺激による減厚および緩衝液流通の最後の繰り返し(round)において、脂質二重層が形成されたとして検出されたばかりのセルの増分数または割合が所定の閾値よりも低い場合、プロセス１０００を終了する。ある実施形態では、最後に印加された電気脂質減厚刺激レベルが所定の最大閾値、例えば、５００ｍＶに達するまで、２つのフェーズを繰り返す。
【００７２】
[0088]  プロセス１０００の電気脂質減厚刺激フェーズおよび塩類緩衝液流通フェーズがもう一度(next)繰り返されようとしている場合、プロセス１０００はステップ１０２０に進む。ステップ１０２０において、印加される次の電気脂質減厚刺激を決定する。ある実施形態では、固定の所定量、例えば、１００ｍＶの刻みだけ電気脂質減厚刺激レベルを高くする。ある実施形態では、最後の繰り返し中に脂質二重層が形成されたとして検出されたばかりのセルの増分数または割合が所定の閾値よりも低い場合、電気脂質減厚刺激レベルを、固定の所定量だけ高め、そうでない場合、直前の電気脂質減厚刺激は有効であると判断し、したがって同じ電気脂質減厚刺激レベルを再度使用する。
【００７３】
[0089]  図１２Ａ、図１２Ｂ、および図１２Ｃは、プロセス１０００の電気脂質減厚刺激フェーズおよび塩類緩衝液流通フェーズを多数回繰り返すに連れて、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップにおいて脂質二重層が適正に形成されたセルの全体的な割合（即ち、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップの歩留まり）が高くなることを示すヒストグラム図である。これらの図の各々について、ｘ軸は、脂質メンブレン／二重層と接触するバルク液体に印加された電圧の変化（ΔＶｌｉｑ）に応答した、積分キャパシタ６０８（ｎｃａｐ）における電圧変化ΔＶＡＤＣであり、一方ｙ軸はそのΔＶＡＤＣ値が一定のΔＶＡＤＣビン内に収まるセルの数である。図１２Ａは、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す。図１２Ｂは、プロセス１０００の脂質減厚刺激フェーズおよび塩類緩衝液流通フェーズを多数回繰り返した後における、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの分布を示す。図１２Ｃは、プロセス１０００の脂質減厚刺激フェーズおよび塩類緩衝液流通フェーズを更に多くの回数繰り返した後における、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの分布を示す。この例では、ΔＶＡＤＣ値が５０以上のセルが、脂質二重層が内部に形成されていると判定される。図１２Ａに示すように、初期状態では、僅かな数のセルだけに、脂質二重層が検出されている。図１２Ｂに示すように、プロセス１０００の脂質減厚刺激フェーズおよび塩類緩衝液流通フェーズを多数回繰り返した後、脂質二重層が検出されたセルの数は増大する。最後に、図１２Ｃに示すように、プロセス１０００の脂質減厚刺激フェーズおよび塩類緩衝液流通フェーズを更に多くの回数繰り返した後、ナノポア・ベースのシーケンシング・チップにおけるセルの大多数で、脂質二重層が検出されている。
【００７４】
[0090]  図１３は、二重層測定フェーズ、電気脂質減厚刺激フェーズ、および塩類緩衝液流通フェーズについてのタイミング図の実施形態を示す。この例では、セル内に脂質が堆積された後に二重層測定フェーズを開始する。二重層測定フェーズは約２秒の時間続く。このフェーズ中、セルの全てを動作可能にする(enable)。Ｖｌｉｑの絶対値は２５０ｍＶである。
【００７５】
[0091]  二重層測定フェーズに続いて、電気脂質減厚刺激フェーズを実行する。これは約２秒の時間続く。このフェーズ中、セル内でΔＶＡＤＣの絶対値（｜ΔＶＡＤＣ｜）が閾値１を超えたとき、そのセル内において脂質二重層が検出され、このセルを電圧源から切断する。Ｖｌｉｑの絶対値は、２５０から５００ｍＶの間である。
【００７６】
[0092]  電気脂質減厚刺激フェーズに続いて、塩類緩衝液流通フェーズを実行する。後者は約２〜１０秒の時間続く。このフェーズ中、セル内でΔＶＡＤＣの絶対値（｜ΔＶＡＤＣ｜）が閾値２を超えたとき、そのセル内において脂質二重層が検出され、このセルを電圧源から切断する。Ｖｌｉｑの絶対値は、２５０ｍＶである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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