(57)【要約】  本発明は、単一細胞を小滴内に封入することであって、小滴は、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅し且つ沈めるための試薬を更に含有する、封入することと、封入された単一細胞を溶解することと、封入された自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成することであって、各ｓｃＦｖアンプリコンは、重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を含む、生成することとにより、封入された自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
封入された自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成する方法であって、
ａ．単一細胞を小滴内に封入するステップであって、前記小滴は、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬を更に含有する、ステップと、
ｂ．前記封入された単一細胞を溶解するステップと、
ｃ．前記封入された自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成するステップであって、各ｓｃＦｖアンプリコンは、重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を含む、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞は、Ｂ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬は、ヒトＩｇ配列に対して設計されたプライマーを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試薬は、表１又は表５に示されるプライマーを含むプライマープールを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記封入されたアンプリコンを生成するステップは、最初に天然重鎖及び軽鎖可変領域配列から重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを形成することを含み、及び前記試薬は、
ａ．第１及び第２の重鎖可変領域プライマーと、
ｂ．第１及び第２の軽鎖可変領域プライマーと
を含むプライマープールを含み、前記第１の重鎖可変領域プライマー及び前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記プライマープールは、前記第２のプライマーよりも低い濃度の前記第１のプライマーを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の重鎖可変領域プライマーは、第１のオーバーハング配列に融合され、前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、第２のオーバーハング配列に融合され、前記オーバーハング配列は、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１及び第２のオーバーハング配列は、少なくとも部分的に相補的である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ａ．前記第１の重鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの重鎖可変領域内に結合するリバースプライマーであり、且つ前記第２の重鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの前記重鎖可変領域外に結合するフォワードプライマーであり、及び
ｂ．前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの軽鎖可変領域内に結合するフォワードプライマーであり、且つ前記第２の軽鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの前記軽鎖可変領域外に結合するリバースプライマーである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
封入された自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンを生成する方法であって、
ａ．単一細胞を小滴内に封入するステップであって、前記小滴は、封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を増幅するための試薬を更に含有する、ステップと、
ｂ．前記封入された単一細胞を溶解するステップと、
ｃ．前記封入された自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンを生成するステップであって、各ｓｃＴＣＲアンプリコンは、ＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を含む、ステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記自然対合ＴＣＲ鎖アンプリコンは、α及びβ鎖アンプリコンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記自然対合ＴＣＲ鎖アンプリコンは、γ及びδ鎖アンプリコンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は、Ｔ細胞である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬は、Ｔｉｔａｎ（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ  ｎｏ  １１８５５４７６００１）を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記封入するステップは、マイクロ流体力学を使用することを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記封入するステップは、水性懸濁液を油と組み合わせて、小滴内の前記封入された単一細胞を含むエマルションを形成することを含み、前記水性懸濁液は、前記細胞と、アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための前記試薬とを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記油は、フッ素化油である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞の前記懸濁液は、約１００万〜約５００万細胞／ｍｌ、好ましくは約３５０万〜約４５０万細胞／ｍｌ、より好ましくは約４００万細胞／ｍｌの密度である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞の前記懸濁液は、安定剤を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記封入されたアンプリコンを生成するステップは、ＲＴ−ＰＣＲを使用することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
死んだ又は死にかけている細胞からの少なくともいくつかの遊離核酸が小滴内に封入されることを防止するステップを更に含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記防止するステップは、封入前に細胞を４８時間未満にわたって刺激することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記防止するステップは、封入前に生細胞を選択することを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記防止するステップは、オリゴヌクレオチド被覆磁気ビーズを使用して前記核酸を隔離することを含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法によって生成される、封入された自然対合アンプリコン。
【請求項２６】
自然対合アンプリコンのライブラリーを生成する方法であって、
ａ．請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法により、封入された自然対合アンプリコンを生成するステップと、
ｂ．前記小滴を溶解して、自然対合アンプリコンのライブラリーを生成するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法によって生成される自然対合アンプリコンのライブラリー。
【請求項２８】
抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成する方法であって、
ａ．請求項２７に記載の方法による自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成するステップと、
ｂ．自然対合ｓｃＦｖアンプリコンの更なるライブラリーを生成するステップであって、前記更なるライブラリーの前記自然対合ｓｃＦｖアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｖ１−Ｌ−Ｖ２−Ｒ２を有し、ここで、
ｉ．Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、且つそれぞれ制限酵素部位を含み、
ｉｉ．Ｖ１及びＶ２は、自然対合重鎖及び軽鎖可変領域であり、Ｖ１が前記軽鎖可変領域である場合、Ｖ２は、前記重鎖可変領域であり、又はＶ１が前記重鎖可変領域である場合、Ｖ２は、前記軽鎖可変領域であり、及び
ｉｉｉ．Ｌは、直接結合又はリンカーである、ステップと
を含む方法。
【請求項２９】
前記自然対合ｓｃＦｖアンプリコンの更なるライブラリーを生成するステップは、ネステッドＰＣＲを使用することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ネステッドＰＣＲは、Ｖ１のＦＲ１及びＶ２のＦＲ４に結合するプライマーを使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成する方法であって、
ａ．請求項２７に記載の方法による自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成するステップと、
ｂ．自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンの更なるライブラリーを生成するステップであって、前記更なるライブラリーの前記自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｃ１−Ｌ−Ｃ２−Ｒ２を有し、ここで、
ｉ．Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、且つそれぞれ制限酵素部位を含み、
ｉｉ．Ｃ１及びＣ２は、自然対合α及びβ  ＴＣＲ鎖であり、Ｃ１が前記α  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、前記β  ＴＣＲ鎖であり、又はＣ１が前記β  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、前記α  ＴＣＲ鎖であり、及び
ｉｉｉ．Ｌは、直接結合又はリンカーである、ステップと
を含む方法。
【請求項３２】
抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成する方法であって、
ａ．請求項２７に記載の方法による自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成するステップと、
ｂ．自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンの更なるライブラリーを生成するステップであって、前記更なるライブラリーの前記自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｃ１−Ｌ−Ｃ２−Ｒ２を有し、ここで、
ｉ．Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、且つそれぞれ制限酵素部位を含み、
ｉｉ．Ｃ１及びＣ２は、自然対合γ及びδ  ＴＣＲ鎖であり、Ｃ１が前記γ  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、前記δ  ＴＣＲ鎖であり、又はＣ１が前記δ  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、前記γ  ＴＣＲ鎖であり、及び
ｉｉｉ．Ｌは、直接結合又はリンカーである、ステップと
を含む方法。
【請求項３３】
前記自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンの更なるライブラリーを生成するステップは、ネステッドＰＣＲを使用することを含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ネステッドＰＣＲは、制限酵素部位を含むオーバーハング配列に融合されるプライマーを使用する、請求項２９、３０又は３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒ１は、Ｓｆｉ１制限酵素部位を含み、及びＲ２は、Ｎｏｔ１制限酵素部位を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリー。
【請求項３７】
抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリーを生成する方法であって、
ａ．請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の方法により、自然対合アンプリコンのライブラリーを生成するステップと、
ｂ．前記自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリーを発現させるステップと
を含む方法。
【請求項３８】
自然対合ｓｃＦｖライブラリーを生成するためのものであり、自然対合ｓｃＦｖをｓｃＦｖ−Ｆｃとして発現させることを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
自然対合ｓｃＦｖライブラリーを生成するためのものであり、自然対合ｓｃＦｖをｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーとして発現させることを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリー。
【請求項４１】
抗原特異的分子を特定する方法であって、
ａ．請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法により、自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリーを生成するステップと、
ｂ．抗原サンプルを用いて前記自然対合ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリーを調べるステップと、
ｃ．抗原特異的分子を特定するステップと
を含む方法。
【請求項４２】
前記自然対合ライブラリーは、ｓｃＦｖライブラリーであり、及び前記抗原特異的分子は、抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗原サンプルは、腫瘍組織、細菌全体又はウィルス粒子である、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法によって生成される抗原特異的分子。
【請求項４５】
単一細胞を小滴内に封入するためのマイクロ流体力学の使用であって、前記小滴は、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬を更に含有する、使用。
【請求項４６】
前記細胞は、Ｂ細胞である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記試薬は、ヒトＩｇ配列に対して設計されたプライマーを含む、請求項４５又は４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記試薬は、表１又は表５に示されるプライマーを含むプライマープールを含む、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記試薬は、
ａ．第１及び第２の重鎖可変領域プライマーと、
ｂ．第１及び第２の軽鎖可変領域プライマーと
を含むプライマープールを含み、前記第１の重鎖可変領域プライマー及び前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５０】
前記プライマープールは、前記第２のプライマーよりも低い濃度の前記第１のプライマーを含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記第１の重鎖可変領域プライマーは、第１のオーバーハング配列に融合され、前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、第２のオーバーハング配列に融合され、前記オーバーハング配列は、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、請求項４９又は５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記第１及び第２のオーバーハング配列は、少なくとも部分的に相補的である、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
ａ．前記第１の重鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの重鎖可変領域内に結合するリバースプライマーであり、且つ前記第２の重鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの前記重鎖可変領域外に結合するフォワードプライマーであり、及び
ｂ．前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの軽鎖可変領域内に結合するフォワードプライマーであり、且つ前記第２の軽鎖可変領域プライマーは、前記天然配列／アンプリコンの前記軽鎖可変領域外に結合するリバースプライマーである、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５４】
単一細胞を小滴内に封入するためのマイクロ流体力学の使用であって、前記小滴は、封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬を更に含有する、使用。
【請求項５５】
前記ＴＣＲ鎖アンプリコンは、α及びβ鎖アンプリコンである、請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
前記ＴＣＲ鎖アンプリコンは、γ及びδ鎖アンプリコンである、請求項５４に記載の使用。
【請求項５７】
前記細胞は、Ｔ細胞である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５８】
前記試薬は、Ｔｉｔａｎ（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ  ｎｏ  １１８５５４７６００１）を含む、請求項４５〜５７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５９】
前記封入は、水性懸濁液を油と組み合わせて、小滴内の前記封入された単一細胞を含むエマルションを形成することを含み、前記水性懸濁液は、前記細胞と、アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための前記試薬とを含む、請求項４５〜５８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６０】
前記油は、フッ素化油である、請求項５９に記載の使用。
【請求項６１】
細胞の前記懸濁液は、約１００万〜約５００万細胞／ｍｌ、好ましくは約３５０万〜約４５０万細胞／ｍｌ、より好ましくは約４００万細胞／ｍｌの密度である、請求項５９又は６０に記載の使用。
【請求項６２】
細胞の前記懸濁液は、安定剤を含む、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６３】
前記試薬は、ＲＴ−ＰＣＲのための試薬である、請求項４５〜６２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６４】
抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合組換えｓｃＦｖを含むｓｃＦｖライブラリーであって、各ｓｃＦｖは、互いに連結された、単一細胞の自然対合の重鎖及び軽鎖可変領域を含む、ｓｃＦｖライブラリー。
【請求項６５】
前記ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ−Ｆｃである、請求項６４に記載のｓｃＦｖライブラリー。
【請求項６６】
ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである、請求項６４に記載のｓｃＦｖライブラリー。
【請求項６７】
前記細胞は、Ｂ細胞である、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載のｓｃＦｖライブラリー。
【請求項６８】
各ｓｃＦｖの前記重鎖及び軽鎖可変領域は、リンカーによって連結され、前記リンカーは、グリシン及び／又はセリンに富んでいる、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載のｓｃＦｖライブラリー。
【請求項６９】
各ｓｃＦｖの前記重鎖及び軽鎖可変領域は、５〜３０アミノ酸長、好ましくは１０〜２０アミノ酸長、好ましくは１３〜１８アミノ酸長、より好ましくは１５アミノ酸長のリンカーによって連結されている、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載のｓｃＦｖライブラリー。
【請求項７０】
Ｔ細胞受容体結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合組換えｓｃＴＣＲを含むｓｃＴＣＲライブラリーであって、各ｓｃＴＣＲは、互いに連結された、単一細胞の自然対合のＴＣＲ鎖を含む、ｓｃＴＣＲライブラリー。
【請求項７１】
前記自然対合ＴＣＲ鎖は、α及びβ鎖である、請求項７０に記載のｓｃＴＣＲライブラリー。
【請求項７２】
前記自然対合ＴＣＲ鎖は、γ及びδ鎖である、請求項７０に記載のｓｃＴＣＲライブラリー。
【請求項７３】
前記細胞は、Ｔ細胞である、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載のｓｃＦｖライブラリー。
【請求項７４】
各ｓｃＴＣＲの前記ＴＣＲ鎖は、リンカーによって連結され、前記リンカーは、グリシン及び／又はセリンに富んでいる、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載のｓｃＴＣＲライブラリー。
【請求項７５】
各ｓｃＴＣＲの前記ＴＣＲ鎖は、５〜３０アミノ酸長、好ましくは１０〜２０アミノ酸長、好ましくは１３〜１８アミノ酸長、より好ましくは１５アミノ酸長のリンカーによって連結されている、請求項７０〜７４のいずれか一項に記載のｓｃＴＣＲライブラリー。
【請求項７６】
前記リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である、請求項６７、６９、７４又は７５のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項７７】
抗原特異的分子を特定する方法であって、
ａ．抗原サンプルを用いて、
ｉ．請求項４０に記載の自然対合ｓｃＦｖ若しくはｓｃＴＣＲライブラリー、又は
ｉｉ．請求項６４〜７６のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ若しくはｓｃＴＣＲライブラリー
を調べるステップと、
ｂ．抗原特異的分子を特定するステップと
を含む方法。
【請求項７８】
前記自然対合ライブラリーは、ｓｃＦｖライブラリーであり、前記抗原特異的分子は、抗体である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記抗原サンプルは、腫瘍組織、細菌全体又はウィルス粒子である、請求項７７又は７８に記載の方法。
【請求項８０】
請求項７７〜７９のいずれか一項に記載の方法によって生成される抗原特異的分子。
【請求項８１】
抗原特異的分子を特定するための、
ａ．請求項４０に記載の自然対合ｓｃＦｖ若しくはｓｃＴＣＲライブラリー、又は
ｂ．請求項６４〜７６のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ若しくはｓｃＴＣＲライブラリー
の使用であって、抗原サンプルを用いて前記ｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリーを調べることと、抗原特異的分子を特定することとを含む、使用。
【請求項８２】
前記ライブラリーは、ｓｃＦｖライブラリーであり、前記抗原特異的分子は、抗体である、請求項８１に記載の使用。
【請求項８３】
前記抗原サンプルは、腫瘍組織、細菌全体又はウィルス粒子である、請求項８１又は８２に記載の使用。
【請求項８４】
ａ．単一細胞を、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬と共に小滴内に封入するためのマイクロ流体チップと、
ｂ．封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結して、ｓｃＦｖアンプリコンを生成するための試薬と
を含むキット。
【請求項８５】
前記細胞は、Ｂ細胞である、請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
前記試薬は、ＲＴ−ＰＣＲのための試薬を含む、請求項８４又は８５に記載のキット。
【請求項８７】
前記試薬は、ヒトＩｇ配列に対して設計されたプライマーを含む、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８８】
前記試薬は、表１又は表５に示されるプライマーを含むプライマープールを含む、請求項８７に記載のキット。
【請求項８９】
前記試薬は、
ａ．第１及び第２の重鎖可変領域プライマーと、
ｂ．第１及び第２の軽鎖可変領域プライマーと
を含むプライマープールを含み、前記第１の重鎖可変領域プライマー及び前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、請求項８４〜８８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９０】
前記プライマープールは、前記第２のプライマーよりも低い濃度の前記第１のプライマーを含む、請求項８９に記載のキット。
【請求項９１】
前記第１の重鎖可変領域プライマーは、第１のオーバーハング配列に融合され、前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、第２のオーバーハング配列に融合され、前記オーバーハング配列は、相互作用して、前記重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する、請求項８９又は９０に記載のキット。
【請求項９２】
前記第１及び第２のオーバーハング配列は、少なくとも部分的に相補的である、請求項９１に記載のキット。
【請求項９３】
ａ．前記第１の重鎖可変領域プライマーは、重鎖可変領域内に結合するように設計されるリバースプライマーであり、且つ前記第２の重鎖可変領域プライマーは、重鎖可変領域外に結合するように設計されるフォワードプライマーであり、及び
ｂ．前記第１の軽鎖可変領域プライマーは、軽鎖可変領域内に結合するように設計されるフォワードプライマーであり、且つ前記第２の軽鎖可変領域プライマーは、軽鎖可変領域外に結合するように設計されるリバースプライマーである、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９４】
前記ｓｃＦｖアンプリコンをｓｃＦｖ−Ｆｃとして発現させるための発現ベクターを更に含む、請求項８４〜９３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９５】
前記ｓｃＦｖアンプリコンをｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーの一部として発現させるための発現ベクターを更に含む、請求項８４〜９３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９６】
ネステッドＰＣＲを使用して前記ｓｃＦｖアンプリコンを増幅するためのプライマーを更に含む、請求項８４〜９５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９７】
前記ネステッドＰＣＲプライマーは、重鎖可変領域のＦＲ１及び軽鎖可変領域のＦＲ４に結合するように設計されている、請求項９６に記載のキット。
【請求項９８】
ａ．単一細胞を、封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬と共に小滴内に封入するためのマイクロ流体チップと、
ｂ．封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を増幅及び連結して、ｓｃＴＣＲアンプリコンを生成するための試薬と
を含むキット。
【請求項９９】
前記ＴＣＲ鎖アンプリコンは、α及びβ鎖アンプリコンである、請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
前記ＴＣＲ鎖アンプリコンは、γ及びδ鎖アンプリコンである、請求項９８に記載のキット。
【請求項１０１】
前記細胞は、Ｔ細胞である、請求項９８〜１００のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０２】
ネステッドＰＣＲを使用して前記ｓｃＴＣＲアンプリコンを増幅するためのプライマーを更に含む、請求項９８〜１０１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０３】
前記ネステッドＰＣＲプライマーは、制限酵素部位を含むオーバーハング配列に融合される、請求項９６、９７又は１０２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０４】
前記ネステッドＰＣＲプライマーは、プライマー対を含み、一方のプライマーは、Ｓｆｉ１制限酵素部位をコードするオーバーハング配列に融合され、及び他方のプライマーは、Ｎｏｔ１制限酵素部位をコードするオーバーハング配列に融合される、請求項１０３に記載のキット。
【請求項１０５】
前記マイクロ流体チップは、親フッ素性チップである、請求項８４〜１０４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０６】
フッ素化油を更に含む、請求項８４〜１０５のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドナー由来の細胞のプールからの抗体レパートリーの発掘に関する。特に、本発明は、抗体結合及び機能に関するスクリーニングを可能にする自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトドナー由来の抗体レパートリーを発掘するための以前の方法は、治療的に価値のある抗体を特定すること、新規な標的を定義すること、及び疾病に対する免疫応答に関する洞察を提供することに役立ってきた。これらの抗体を単離する方法は、一般に、２つのカテゴリー：Ｂ細胞等の細胞から抗体を直接単離すること、又はファージディスプレイ、酵母ディスプレイ若しくは哺乳動物ディスプレイ等のコンビナトリアルライブラリーから抗体を選択することに分けられる。２つの手法は、異なる強度を有する。例えば、Ｂ細胞から直接得られる抗体は、通常、効力及び製造特性がより良好であるが、ディスプレイプラットフォームは、後のスクリーニングに関する能力、深い発掘及びクローン安定性を提供する（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），１２：３９７−４０７；これは参照により本明細書に組み込まれる）。現在、両方の手法の利益を組み合わせた高スループット技術は存在しない。
【０００３】
現在、多数の細胞を封入した後、次世代シーケンシング技術によってそれらのＶＨ及びＶＬ領域を配列決定する技術が利用可能である。可変領域の元の対合は、Ｂ細胞と共に封入された粒子上のバーコード化プライマーの使用によって維持される。これらの技術により、レパートリーの抗原特異性又は他の生物学的機能に関する任意の情報を有することなく、配列の系統発生解析が可能となる。これらの技術は、抗体配列の高スループット翻訳及び続くスクリーニングを可能にしない。これは、免疫レパートリーの機能的分析において重大な制限をもたらす（ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１３），３１：１６６−１６９；Ｓｔｅｒｎ  Ｊ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．（２０１４），６：２４８；Ｔａｎ  Ｙ−Ｃ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（２０１４），６６：２７０６−２７１５；Ｔａｎ  Ｙ−Ｃ、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１４），１５１：５５−６５；Ｌｕ，Ｄ．Ｒ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１４），１５２：７７−８９；Ｒｏｂｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１３），２５：６４６−６５２；ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１５），２１：８６−９１；これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。更に、抗体リードの検証は、遺伝子合成、クローニング及び発現を必要とし、これは、機能的に評価され得る多数の候補に厳しい妨げをもたらし得る（Ｇａｌｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５），３５：４６３−４７８；参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００４】
マイクロタイタープレート内で単一細胞からｓｃＦｖ及びＦａｂ等の組換え抗体断片を生成することが記述されているが、この手法は、一度に最大で数千の細胞のみを取り扱うことが可能であり、最大成功率が３０〜６０％であるという点でスループットにおいて厳しく制限されている（Ｍｅｉｊｅｒ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００６），３５８：７６４−７７２；Ｔｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００８），３２９；１１２−１２４；これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００５】
これらの技術の両方は、一般的な採血から得られる約１０７のＢ細胞を圧倒的にアンダーサンプルする低いスクリーニングスループットの欠点を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、活性に関する迅速スクリーニングを可能とするフォーマットにおいて、ヒトドナーからの自然対合抗体配列を、自然の多様性を十分に包含するように高い十分なスループットで迅速に単離することができる技術又は手法が当技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、抗体結合及び機能に関してスクリーニングされ得る自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成するための方法に関する。これに関連して、本発明は、方法、キット、ｓｃＦｖアンプリコンの組換えライブラリー、及びｓｃＦｖの組換えライブラリーを提供する。また、これに関連して、本発明は、抗原特異的分子を特定するための方法にも関する。
【０００８】
本発明は、抗体結合及び機能に関してスクリーニングされ得る自然対合単一鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）アンプリコンを生成するための方法にも関する。これに関連して、本発明は、方法、キット、ｓｃＴＣＲアンプリコンの組換えライブラリー、及びｓｃＴＣＲの組換えライブラリーを提供する。また、これに関連して、本発明は、抗原特異的分子を特定するための方法にも関する。
【０００９】
本発明は、単一細胞を小滴内に封入するためのマイクロ流体力学の使用にも関する。
【００１０】
本発明の実施形態は、特許請求の範囲に定義されている。
【００１１】
ここで、添付の図面を参照して本発明がより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】免疫レプリカプラットフォームに関する戦略である。患者（例えば、回復期の患者）から単離された細胞（例えば、Ｂ細胞）は、同族ＶＨ及びＶＬ領域が増幅及び連結されるようにＲＴ−ＰＣＲ試薬と共に油中水小滴内に封入される。得られたアンプリコンは、そのまま発現に使用できるｓｃＦｖを形成し、そのｓｃＦｖは、スクリーニング、選択のためのファージ上の表示、又はレパートリー特徴付けのためのディープシーケンシングのためにｓｃＦｖ−Ｆｃ又はＩｇＧとして発現され得る。
【図２】単一細胞のマイクロ流体封入である。封入前に赤色又は緑色に染色された単一細胞のマイクロ流体封入を（Ａ）明視野、（Ｂ）ＦＩＴＣ及び（Ｃ）Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄチャネルにおいて可視化した。小滴境界線の輪郭を参照のためにチャネルＢ及びＣ上に重ね合わせた。
【図３】１次Ｂ細胞から自然対合ｓｃＦｖを回収する戦略である。（Ａ）同族ＶＨ及びＶＬ領域を、ＩＭＧＴ生殖系列配列から設計されたプライマープールを使用して小滴内で増幅する。２つのアンプリコンを、プライマーを使用して相補的なオーバーハング（緑色）と連結し、これは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーも生成する。限定量のＶＨ−ｉｎ−Ｒ及びＶＬ−ｉｎ−Ｆプライマープールを使用することにより、個々のＶＨ及びＶＬ領域よりも完全ｓｃＦｖの増幅が優先される。（Ｂ）ＶＨ  ＦＲ１及びＶＬ  ＦＲ４に特異的なプライマーを使用するネステッドＰＣＲステップは、最終的なｓｃＦｖを増幅し（Ｃ）、パニング又は直接スクリーニングのためにＳｆｉ１／Ｎｏｔ１を介したベクター内へのクローニングを可能にするオーバーハングを有する。
【図４】免疫レプリカプラットフォームは、同族鎖対合を維持する。（Ａ）１次ヒト細胞及びマウスＢ細胞を混合し、封入されるか又は未封入形態（「開放システム」／「コンビナトリアル」）で処理されるかのいずれかである。定常領域に特異的なプライマーを使用して、連結されたＣＨ１−ＣＫアンプリコンを生成し、ヒト（薄い灰色）又はマウス（濃い灰色）領域に特異的なプライマーを使用して鎖対合を決定した。（Ｂ）正確に対合された種（星印で示す）の増幅を示すアガロースゲルは、封入を使用して得ることができる一方、開放システムは、全ての可能性を比較的等しい量で生成する。
【図５】１次Ｂ細胞からのｓｃＦｖアンプリコンの生成である。そのまま発現に使用できるｓｃＦｖアンプリコンを、封入（「小滴」−レーン２及び４）又は未封入（「開放」−レーン３及び５）フォーマットのいずれかにおいて、４８時間刺激したヒトＢ細胞から生成した。
【図６】ディープシーケンシングからのＶ／Ｊ生殖系列多様性の分布である。ＳｃＦｖアンプリコンを、封入を有するか又は有さずに２人の健康な個人から生成し、ＶＨ、Ｖκ及びＶλ領域の増幅のための鋳型として使用し、これらはバーコード化され、ペアエンドＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングによって配列決定された。独特の配列をＩＭＧＴ生殖系列配列にアラインし、小滴（黒色棒ブラフ）又は開放（白色棒グラフ）ライブラリーから得られた独特の全配列の百分率として示す。
【図７】工程の改善は、ＰＣＲ中の小滴安定性を高めた。（Ａ）ＰＣＲサイクリング（４５サイクル）前及び後の収集されたエマルションの写真である。（Ｂ）に見られるように、最適化されたＰＣＲ条件及び賦形剤は、安定性の増大に寄与し、単分散小滴を生成した。
【図８】インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ−ＳＤ−円形）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）マンナン（三角形）に対する２人の健康なドナー（６４２及び４３２）に関する血清力価である。ドナー６４２に関する力価は破線／白色記号で示し、ドナー４３２に関する力価は実線／黒色記号で示す。
【図９】小滴マイクロ流体力学を使用した単一細胞の封入である。細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ及びＧｒｅｅｎ染料で染色し、混合し、単一細胞の封入に好ましい密度で小滴内に封入した。各小滴は、独立した反応容器を形成し、それにより細胞の同族Ｖ遺伝子が増幅及び対合され得る。スケールバー＝４００μｍ。
【図１０】１次Ｂ細胞は、逆転写の条件で効率的に溶解する。（Ａ）培養培地、封入緩衝液（「低張緩衝液」）及びＲＴ−ＰＣＲ緩衝液のいずれかの中で３０分間インキュベートした細胞に関して、ＶｉＣｅｌｌ生存率アナライザーを使用して細胞生存率測定を行った。比較のために、１回の凍結解凍サイクル後の生存率も測定した。（Ｂ）細胞溶解物の外観検査である。細胞をＴｒｙｐａｎＢｌｕｅで染色し、ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液で５０℃において３０分間インキュベートする前及びインキュベートした後に画像化した。
【図１１】単一細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ試薬によって小滴内で効率的に溶解する。ＩＭ９多発性骨髄腫細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ又はＧｒｅｅｎで染色し、画像化の直前にＰＢＳ緩衝液（Ａ）又はＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（Ｂ）と共に封入した。（Ｃ）単一細胞をＲＴ−ＰＣＲ試薬及びＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ染料と共に封入して、細胞溶解による二本鎖核材料の放出を可視化した。
【図１２】細胞インキュベーションは、死んだ又は死にかけている細胞から生成された遊離ＲＮＡをもたらす。
【図１３】スクリーニング及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のための自然対合ライブラリーの生成である。（Ａ）各封入Ｂ細胞からのＶＨ及びＶＬ領域を特異的プライマーセットによって増幅し、相補的なオーバーハングを介してインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）対合する。ＶＨ  ＦＲ１及びＶＬ  ＦＲ４プライマーによるネステッドＰＣＲは、オーバーハングを有する完全長ｓｃＦｖを生成して、バーコード化対合ＭｉＳｅｑシーケンシングを可能にする。ＶＨ及びＶＬ  ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４は、それぞれＲ２及びＲ１プライマーによって配列決定される一方、Ｒ３プライマーは、インデックス読み取りを提供してデマルチプレキシングを可能にする。アンプリコンは、Ｓｆｉ１／Ｎｏｔ１制限部位を介してアダプター配列が切断されて、下流選択及びスクリーニングのために発現又はファージミドベクターにサブクローニングされ得る。（Ｂ〜Ｃ）代表的なデータセットからのＮＧＳデータである。１００万の刺激Ｂ細胞からのｓｃＦｖライブラリーがエマルション又はコンビナトリアル様式のいずれかで生成された。（Ｂ）エマルションライブラリーは、１：１  ＶＬ：ＶＨ比（サンプル中央値）に圧倒的に好都合であったが、コンビナトリアルライブラリーはスクランブルされた。（Ｃ）複数の対合が見られた場合、優勢パートナーは、エマルションライブラリーでは配列の９９％を占めたが（サンプル中央値）、パートナーは、コンビナトリアルライブラリーではより均一に分布した。
【図１４】対合ＶＨ及びＶＬ読み取りデータの次世代シーケンシング品質である。（Ａ）ＶＨ及び（Ｂ）ＶＬ配列の代表的なシーケンシングＰｈｒｅｄ品質スコアである。フレームワーク（ＦＷ）及びＣＤＲ領域を示す。
【図１５】この研究からの小滴内で生成された抗体ライブラリー（レーン１、２）及び参照研究（ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１５），２１：８６−９１；これは参照により本明細書に組み込まれる）（レーン３〜６）を比較するトップペア（ｔｏｐ−ｐａｉｒ）分析によるＶＨ−ＶＬ対合精度である。細胞数及びシーケンシング深度は、サンプル間で同等である。スチューデントのｔ検定を使用して、ドナー１又はドナー２と他のライブラリーのいずれかとの間で＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図１６−１】特異的結合剤に関するファージ−ディスプレイ濃縮である。総Ｂ細胞（Ａ）及びメモリー（Ｂ）Ｂ細胞から得られたエマルションライブラリーを赤血球凝集素Ｈ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｈ１Ｎ１）に対する２ラウンドのファージディスプレイパニングに供し、濃縮をポリクローナルファージＥＬＩＳＡによって測定した。
【図１６−２】特異的結合剤に関するファージ−ディスプレイ濃縮である。（Ｃ）赤血球凝集素Ｈ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｈ１Ｎ１  −  無地）、Ｈ５（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４  Ｈ５Ｎ１  −  平行線）又は無関係対照（白色）に対する１８のモノクローナルｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体に関する特異的ＥＬＩＳＡ結合データである。
【図１６−３】特異的結合剤に関するファージ−ディスプレイ濃縮である。（Ｄ）インフルエンザＡのグループ１（青色）及び２（赤色）サブタイプ、並びにインフルエンザＢの両方の系列（緑色）からの赤血球凝集素抗原のパネルに対する１つのモノクローナルｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の交差反応性を示すＥＬＩＳＡ結合データである。負の対照のｈｉｓタグタンパク質に対する結合は灰色で示す。エラーバーは、３回行われた測定の標準偏差を表す。
【図１７】赤血球凝集素Ｈ１に対する２ラウンドの選択後の濃縮を示すポリクローナルファージＥＬＩＳＡである。非選択ライブラリーは、Ｈ１  ＣＡ／０９、Ｈ１  ＳＤ／０７、Ｈ２  ＭＯ／０６、Ｈ５  ＶＮ／０４、Ｈ６  ＨＫ／９７及びＨ９  ＨＫ／９９に関して示される一方、ラウンド２の選択ライブラリーは、Ｈ３  ＰＥ／０９及びＨ７  ＮＬ／０３に関して示される。Ｈ１（実線）又は無関係タンパク質対照（破線）に対する、希釈ファージの結合を、乳化された総Ｂ細胞（Ａ）、乳化されたメモリーＢ細胞（Ｂ）、コンビナトリアル総Ｂ細胞（Ｃ）又はコンビナトリアルメモリーＢ細胞（Ｄ）から生成されたライブラリーに関して測定した。
【図１８】赤血球凝集素Ｈ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｈ１Ｎ１）に対する２ラウンドのパニング前及び後のモノクローナルＶＨ生殖系列分布である。同じドナーからのライブラリーを封入（Ａ、Ｃ）又はコンビナトリアル（Ｂ、Ｄ）フォーマットのいずれかで生成した。非選択ライブラリー分布（Ａ、Ｂ）を、読み取りクラスターを個々のＶＨ生殖系列遺伝子にマッピングすることによって次世代シーケンシングから計算した。１００を超えるクローンをＳａｎｇｅｒシーケンシングによって配列決定して、ファージディスプレイ選択後に生殖系列多様性を得た。ＩＧＨＶ１−６９、重鎖相互作用のみを介してグループ１赤血球凝集素に接触することが既知の抗体をコードする遺伝子の相対的存在量を各プロット内に示す。  表１：ｓｃＦｖ生成に使用されたプライマー配列である。  表２：Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに使用されたプライマーである。  表３：ヒト及びマウスＣＨ１／Ｃκ連結に使用されたプライマーである。  表４：２つのよく見出される抗原に対する免疫レプリカキャンペーンである。２人の健康なドナー（６４２及び４３２）からのＢ細胞をｓｃＦｖ生成に使用した。約１０，０００の１次Ｂ細胞からのＶＨ／ＶＬ領域を封入（「小滴」）又は非封入（「開放」）フォーマットのいずれかで増幅及び対合して、ｓｃＦｖカセットを生成し、そのカセットをｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクターに直接クローニングした。５，６３２の細菌発現ｓｃＦｖ−Ｆｃクローンを、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ−ＳＤ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）マンナンに対する結合に関してＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。  表５：Ｖ／Ｊ遺伝子増幅に使用されたプライマーである。標的遺伝子に特異的に結合するプライマーの領域は大文字で示される一方、オーバーハングは小文字で示される。接尾辞「＿ｌｄｒ」で示される各遺伝子に関するリーダー配列を有する標的Ｖ／Ｊ遺伝子を列挙する。  表６：ファージディスプレイ生成又は次世代シーケンシングプロファイリングのためのライブラリー増幅に使用されるプライマーである。特定のインデックス配列は、下線が引かれている。  表７：次世代シーケンシングデータからの独特の配列の分析である。  表８：スチューデントのｔ検定を使用したトップペア分析によるＶＨ−ＶＬ対合精度の統計的比較である。小滴内で生成された抗体ライブラリーを、この研究（ドナー１及びドナー２）及び参照研究（ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１５），２１：８６−９１；これは参照により本明細書に組み込まれる）間で比較する（データセットＳＲＲ１５８５２４８、ＳＲＲ１５８５２４９、ＳＲＲ１５８５２６５及びＳＲＲ１５８５２６７）。細胞数及びシーケンシング深度は、サンプル間で同等である。  表９：ファージディスプレイライブラリー特徴付けである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、患者から単離された単一細胞、例えばＢ細胞を、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬と共に油中水小滴内に封入して、ｓｃＦｖの組換えライブラリーを生成することを可能にする。記載全体において、ファージディスプレイを参照しているが、酵母ディスプレイ及び哺乳動物ディスプレイ技術を同じように適用することができ、本発明者らが、それらの代替的ディスプレイシステムを明らかに想定していることが当業者によって認識されるであろう。
【００１４】
本発明は、封入された単一細胞からの可変領域（ＶＨ及びＶＬ）をクローニングし、それらを連結してｓｃＦｖを形成することを含む。各細胞を物理的に分離することにより、抗体結合及び機能を回復するのに不可欠な天然ＶＨ−ＶＬ対合が保存される。得られたアンプリコンは、そのまま発現に使用できるｓｃＦｖを形成する。ｓｃＦｖのライブラリーは、ファージ−ディスプレイパニングによって濃縮され、又は次世代シーケンシングを使用してディープシーケンシングされて、結合及び機能に関して直接スクリーニングできる翻訳可能なｓｃＦｖライブラリーである。
【００１５】
本発明は、そのまま発現に使用できるｓｃＦｖライブラリーをスクリーニング方法（例えば、相−ディスプレイ）と結合して、抗原特異的クローンに関して濃縮することを更に可能にする。本発明は、特に、天然Ｂ細胞多様性を発掘して、ヒト患者からの抗原特異的抗体を迅速に単離することにより、抗原特異的抗体の高スループット特定を可能にする。本発明は、既存の技術によって見出されない抗体の特定を可能にする。
【００１６】
本発明は、封入された自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成する方法を提供し、この方法は、単一細胞を小滴内に封入することであって、小滴は、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合の増幅及び連結のための試薬を更に含有する、封入することと、封入された単一細胞を溶解し、且つ封入された自然対合ｓｃＦｖアンプリコンを生成することであって、各ｓｃＦｖアンプリコンは、重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を含む、生成することとを含む。
【００１７】
一般に、ｓｃＦｖアンプリコンは、式Ｖ１−Ｌ−Ｖ２を含む。Ｌは、リンカーである。一実施形態において、Ｖ１は、重鎖可変領域であり、Ｖ２は、軽鎖可変領域であり、即ち、ｓｃＦｖアンプリコンは、式ＶＨ−Ｌ−ＶＬを有する。別の実施形態では、Ｖ２は、重鎖可変領域であり、Ｖ１は、軽鎖可変領域であり、即ち、ｓｃＦｖアンプリコンは、式ＶＬ−Ｌ−ＶＨを有する。
【００１８】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬は、ヒトＩｇ配列に対して設計されたプライマーを含む。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬は、表１に示されるプライマーを含むプライマープールを含む。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬は、表５に示されるプライマーを含むプライマープールを含む。表１又は表５のプライマーのグループは、必要に応じて更に細分することができ、例えば、プライマーの適切なセットは、細胞がκ若しくはλ発現細胞、又は異なるＩｇ  Ｈアイソタイプを発現する細胞に分離される場合に使用することができる。プライマーは、当技術分野で既知のカスタムソフトウエアを用いて設計することができる。重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンは、最初にｓｃＦｖアンプリコンの生成において天然重鎖及び軽鎖可変領域配列から形成される。
【００１９】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される封入されたｓｃＦｖアンプリコンを生成するための生成ステップは、最初に天然重鎖及び軽鎖可変領域配列から重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを形成することを含み、及び試薬は、第１及び第２の重鎖可変領域プライマー、並びに第１及び第２の軽鎖可変領域プライマーを含むプライマープールを含み、第１の重鎖可変領域プライマー及び第１の軽鎖可変領域プライマーは、相互作用して、重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する。一実施形態において、プライマープールは、第２のプライマーよりも低い濃度の第１のプライマーを含む。好ましくは、第１のプライマーの濃度は、第２のプライマーの濃度と比較して２〜８、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の因数で低下される。好ましくは、濃度は、８の因数で低下される。可変領域内に結合する核酸プライマーの量を制限することにより、個々のＶＨ及びＶＬ領域よりも完全ｓｃＦｖの増幅に好都合である。
【００２０】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される第１の重鎖可変領域プライマーは、第１のオーバーハング配列に融合され、及び本明細書のいずれかに定義される第１の軽鎖可変領域プライマーは、第２のオーバーハング配列に融合され、オーバーハング配列は、相互作用して、重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンを連結する。好ましくは、第１及び第２のオーバーハング配列は、少なくとも部分的に相補的である。より好ましくは、第１及び第２のオーバーハング配列は、完全に相補的である。２領域アンプリコンは、オーバーラップ発現ＰＣＲを使用して連結されてｓｃＦｖアンプリコンを生成することができる。
【００２１】
一実施形態において、ＲＴ−ＰＣＲは、オーバーラップ伸長ＰＣＲと組み合わせて使用される。
【００２２】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される第１の重鎖可変領域プライマーは、天然配列／アンプリコンの重鎖可変領域内に（一般に、ＦＲ４の３’末端で）結合するリバースプライマーであり、且つ本明細書のいずれかに定義される第２の重鎖可変領域プライマーは、天然配列／アンプリコンの重鎖可変領域外に結合するフォワードプライマーであり、及び本明細書のいずれかに定義される第１の軽鎖可変領域プライマーは、天然配列／アンプリコンの軽鎖可変領域内に（一般に、ＦＲ１の５’末端で）結合するフォワードプライマーであり、且つ本明細書のいずれかに定義される第２の軽鎖可変領域プライマーは、天然配列／アンプリコンの軽鎖可変領域外部に結合するリバースプライマーである。
【００２３】
別の実施形態では、本明細書のいずれかに定義される第１の重鎖可変領域プライマーは、天然配列／アンプリコンの重鎖可変領域内に（一般に、ＦＲ１の５’末端で）結合するフォワードプライマーであり、且つ本明細書のいずれかに定義される第２の重鎖可変領域プライマーは、天然配列／アンプリコンの重鎖可変領域外に結合するリバースプライマーであり、及び本明細書のいずれかに定義される第１の軽鎖可変領域プライマーは、天然配列／アンプリコンの軽鎖可変領域内に（一般に、ＦＲ４の３’末端で）結合するリバースプライマーであり、且つ本明細書のいずれかに定義される第２の軽鎖可変領域プライマーは、天然配列／アンプリコンの軽鎖可変領域外に結合するフォワードプライマーである。
【００２４】
これらの試薬は、小滴内で同族ＶＨ及びＶＬ領域が増幅されることを可能にする。
【００２５】
本発明は、患者から単離された単一細胞、例えばＴ細胞を、封入された単一細胞からのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖アンプリコンの自然対合を増幅及び連結する試薬と共に油中水小滴内に封入して、単一鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）の組換えライブラリーを形成することも可能にする。
【００２６】
本発明はまた、封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖をクローニングし、且つそれらを連結してｓｃＴＣＲを形成することを含む。各細胞を物理的に分離することにより、抗体結合及び機能を回復するのに不可欠な天然ＴＣＲ対合が保存される。得られたアンプリコンは、そのまま発現に使用できるｓｃＴＣＲを形成する。ｓｃＴＣＲのライブラリーは、ファージ−ディスプレイパニングによって濃縮され、又は次世代シーケンシングを使用してディープシーケンシングされて、結合及び機能に関して直接スクリーニングできる翻訳可能なｓｃＴＣＲライブラリーである。
【００２７】
本発明は、封入された自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンを製造する方法を提供し、この方法は、単一細胞を小滴内に封入することであって、小滴は、封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合の増幅のための試薬を更に含有する、封入することと、封入された単一細胞を溶解することと、封入された自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンを生成することであって、各ｓｃＴＣＲアンプリコンは、ＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を含む、生成することとを含む。
【００２８】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される自然対合ＴＣＲ鎖アンプリコンは、α及びβ鎖アンプリコンである。別の実施形態では、本明細書のいずれかに定義される自然対合ＴＣＲ鎖アンプリコンは、γ及びδ鎖アンプリコンである。
【００２９】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される封入のステップは、マイクロ流体力学を使用することを含む。マイクロ流体力学は、ライブラリーへの並行増幅のために、数１００万の細胞、潜在的には全レパートリーをピコリットルサイズの小滴内に保存することが可能であり、従って高スループット手法を提供する。一実施形態において、ライブラリーは、ｓｃＦｖライブラリーである（図１）。別の実施形態では、ライブラリーは、ｓｃＴＣＲライブラリーである。
【００３０】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義されるマイクロ流体力学は、圧力ポンプを有するガラスマイクロ流体チップを使用することを含む。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義されるマイクロ流体チップは、親フッ素性チップである。マイクロ流体チップは、水性流体の２つの流れを合流するように設計され、一方は、細胞の懸濁液を運び、且つ他方は、一段階逆転写（ＲＴ）及びオーバーラップ伸長ＰＣＲのための試薬を含有する。マイクロ流体力学は、均一サイズの小滴を高速で確実に生成するのに使用される。
【００３１】
いくつかのグループにより、細胞ベースのＲＴ−ＰＣＲは、５ｎＬ未満の体積で実行できないと報告されているが（ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１３），３１：１６６−１６９；ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１５），２１：８６−９１；Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．（２０１１），１０８：１３９９９−１４００４；Ｅａｓｔｂｕｒｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ＯＮＥ（２０１３），８：ｅ６２９６１；これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）、本発明の方法は、ピコリットルサイズの小滴、例えば体積２００ｐＬの小滴内で細胞から直接Ｉｇ転写産物を問題なく増幅することができる。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される小滴は、体積が約５０ｐＬ〜約６００ｐＬである。一実施形態において、小滴は、体積が約１００ｐＬ〜約３００ｐＬである。一実施形態において、小滴は、体積が約２００ｐＬである。
【００３２】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される封入ステップは、水性懸濁液を油と組み合わせて、水−油小滴内に封入された単一細胞を含むエマルションを形成することを含み、水性懸濁液は、細胞と、アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬とを含む。
【００３３】
一実施形態において、本方法は、封入ステップ前のステップを更に含み、このステップは、細胞と、アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬とを含む水性懸濁液を提供することを含む。一実施形態において、提供するステップは、細胞を含む第１の水性懸濁液中の細胞を刺激し、且つ続いて細胞を、アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬と組み合わせて、細胞及びアンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬を含む水性懸濁液を形成することを含む。一般に、細胞は、約４８時間、好ましくは少なくとも４８時間にわたって刺激され得ることが理解される。
【００３４】
細胞懸濁液の滴定は、１０個の小滴の各々に関しておよそ１個の細胞を達成し、これは、ポアソン統計に基づいて単一細胞の封入を＞９５％の確率でもたらす（図９）。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される細胞の懸濁液は、約１００万〜約５００万細胞／ｍｌの密度である。好ましい実施形態では、本明細書のいずれかに定義される細胞の懸濁液は、約３５０万〜約４５０万細胞／ｍｌの密度である。より好ましい実施形態では、本明細書のいずれかに定義される細胞の懸濁液は、約４００万細胞／ｍｌの密度である。これらの密度は、小滴内に封入された単一細胞を得るのに最適である（図２）。これらの密度により、およそ１００μｍの直径の小滴内に封入された単一細胞も得られる。空の小滴も生成され得るが、これらは鋳型細胞が存在しないため、ライブラリーに寄与しない。
【００３５】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される細胞の懸濁液は、抗凝集剤を含む。別の実施形態では、封入前に、本明細書のいずれかに定義される細胞の懸濁液は、例えば、常磁性撹拌ディスクを用いて撹拌される。抗凝集賦形剤の使用及び／又は撹拌は、封入前に、懸濁した細胞が沈殿することを防止する。刺激された細胞、例えばＢ細胞又はＴ細胞は、時間と共に集合する傾向があるため、抗凝集賦形剤の使用及び／又は撹拌は、流速の変化及び複数の細胞が一緒に封入されることを防止する。
【００３６】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される細胞の懸濁液は、安定剤を含む。好ましくは、安定剤は、両親媒性分子である。より好ましくは、安定剤は、アセチル化ＢＳＡである。アセチル化ＢＳＡは、水−油界面を安定化し、界面張力を低下させることができる両親媒性分子である（Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７），８（１）：１−６；これは参照により本明細書に組み込まれる）。本発明者らは、アセチル化ＢＳＡの使用により、ＰＣＲサイクリングの過酷な条件において小滴の合体が低下することを見出した。更に、アセチル化ＢＳＡの存在は、逆転写酵素等の酵素が界面において変性することを防止し得る。
【００３７】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される封入されたアンプリコンを生成するための生成ステップは、ＲＴ−ＰＣＲを含む。
【００３８】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される油は、低粘度の油である。好ましい実施形態では、本明細書のいずれかに定義される油は、フッ素化油である。より好ましい実施形態では、本明細書のいずれかに定義される油は、ＨＦＥ−７５００フッ素化油＋２％ｗ／ｖ  ００８−フルオロ界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｃａｔ  ｎｏ  ００８−ＦＬＵＯＲＯＳＵＲＦＡＣＴＡＮＴ−ＨＦＥ７５００である。本発明に使用される細胞（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞）の寿命に起因して、本発明の方法のスループットは、細胞の封入に必要な時間によって制限される。本発明者らは、スループットが、細胞の封入のための水−油小滴の形成に使用される油の粘度を低下させることによって改善され得ることを見出した。詳細には、本発明者らは、粘度が低い油が流速を増大させ得ることを見出した。一実施形態において、油に関するマイクロ流体の流速は、９０〜１２５μＬ／分、好ましくは１００μＬ／分であり、水性流体は、５．６〜７μＬ／分、好ましくは６．２２μＬ／分である。油の粘度の低下は、単一の小滴内に２つ以上の細胞が封入される危険性を低減するため、細胞密度の増大等の代替案よりも好ましい。
【００３９】
上記に定義した本発明の方法は、数百万の細胞の封入を可能にする。好ましくは、少なくとも１００万、少なくとも２００万、少なくとも３００万、少なくとも４００万、少なくとも５００万、少なくとも６００万、少なくとも７００万、少なくとも８００万、少なくとも９００万又は少なくとも１０００万の細胞が封入される。上記に定義した本発明の方法は、１００万の細胞を約４０分以内に封入することができる。
【００４０】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義されるアンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬は、標準的なＲＴ−ＰＣＲ試薬を含む。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される試薬は、Ｔｉｔａｎ（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ  ｎｏ  １１８５５４７６００１）を含む。
【００４１】
水性構成成分及びマイクロ流体の流速の上記の最適化は、サイズの均一性が改善され、またＲＴ−ＰＣＲ中の完全性が改善された小滴を生成する。これは、アンプリコン生成の確実性の改善を可能にする。
【００４２】
細胞が小滴内に封入される前に、いくつかの細胞は、死んで溶解し、それらの遺伝子材料（例えば、核酸）を周囲培地中に放出する。核酸、例えばＶＨ又はＶＬ領域をコードする核酸は、小滴を汚染し、非自然対合生成物をもたらす可能性がある。小滴内に存在する汚染核酸のレベルを最小限にすることが望ましいことが当業者によって認識されるであろう。特に、死んだ又は死にかけている細胞からの遊離核酸は、ＲＮＡである。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される方法は、死んだ又は死にかけている細胞からの少なくともいくつかの遊離核酸が小滴内に封入されることを防止することを更に含む。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される方法は、死んだ又は死にかけている細胞からの実質的に全部の遊離核酸が小滴内に封入されることを防止することを更に含む。好ましくは、本明細書のいずれかに定義される方法は、死んだ又は死にかけている細胞からの遊離核酸が小滴内に封入されることを防止することを更に含む。これを達成する任意の方法が本発明の範囲内にあることが当業者によって認識されるであろう。
【００４３】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される方法は、小滴内に封入された死んだ又は死にかけている細胞からの遊離核酸のレベルを低下させることを更に含む。死んだ又は死にかけている細胞からの遊離核酸のレベルは、この方法ステップが行われなかった場合に封入されたであろうレベルと比較して低下されることが理解されるであろう。これを達成する任意の方法が本発明の範囲内にあることが当業者によって認識されるであろう。一実施形態において、死んだ又は死にかけている細胞からの遊離核酸のレベルは、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低下される。
【００４４】
一実施形態において、防止することは、封入前に細胞を４８時間未満にわたって刺激することを含む。一実施形態において、低下させることは、細胞を含む第１の水性溶液中で細胞を４８時間未満にわたって刺激することを含む。
【００４５】
一実施形態において、防止することは、封入前に生細胞を選択することを含む。一実施形態において、低下させることは、水性懸濁液中でアンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬と組み合わせるために生細胞を選択することを含む。一実施形態において、選択することは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。一実施形態において、選択することは、ビーズベースの細胞選択を含む。封入に選択される所望の細胞は、生細胞であり、死んだ又は死にかけている細胞でないことが当業者によって認識されるであろう。
【００４６】
一実施形態において、防止することは、磁気ビーズを使用して、死んだ又は死にかけている細胞からの遊離核酸を隔離することを含む。一実施形態において、低下させることは、磁気ビーズを使用して、死んだ又は死にかけている細胞からの遊離核酸を第１の水性溶液から隔離することを含む。一実施形態において、低下させることは、死んだ又は死にかけている細胞からの遊離核酸を、細胞及び試薬を含む水性懸濁液から隔離することを含む。死んだ又は死にかけている細胞からの遊離核酸の隔離は、小滴内に封入された死んだ又は死にかけている細胞からの遊離核酸のレベルが低下するように遊離核酸が除去されることを可能にする。一実施形態において、磁気ビーズは、オリゴヌクレオチド被覆磁気ビーズである。一実施形態において、磁気ビーズは、ポリ−ｄＴビーズである。核酸結合剤、特にＲＮＡ結合剤を有する磁化ビーズが封入前に細胞懸濁液に添加されて、周囲培地中に存在する遊離核酸、特にＲＮＡを「拭い取る」。ビーズは、磁場を使用して封入前に除去され得、それにより汚染核酸が除去される。
【００４７】
上記に定義した方法によって生成される、封入された自然対合アンプリコンは、本発明の範囲内である。上記に定義した方法に従って生成される、封入された自然対合アンプリコンの特徴を有する封入された自然対合アンプリコンも本発明の範囲内である。一実施形態において、封入された自然対合アンプリコンは、ｓｃＦｖアンプリコンである。別の実施形態では、封入された自然対合アンプリコンは、ｓｃＴＣＲアンプリコンである。
【００４８】
本発明は、自然対合アンプリコンのライブラリーを製造する方法を更に提供し、この方法は、上記に定義した方法に従って、封入された自然対合アンプリコンを生成することと、小滴を溶解して、自然対合アンプリコンのライブラリーを生成することとを含む。一実施形態において、自然対合アンプリコンは、ｓｃＦｖアンプリコンである。別の実施形態では、自然対合アンプリコンは、ｓｃＴＣＲアンプリコンである。小滴を溶解するための市販のキットが利用可能である（例えば、ＥＵＲｘのＭｉｃｅｌｌｕｌａキット）。小滴由来のＤＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＰＣＲ精製キットを使用して、又はイソブタノール（Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１１），４１０：１５５−１５７；これは参照により本明細書に組み込まれる）及びジエチルエーテル（Ｄｉｅｈｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００６），３；５５１−５５９；これは参照により本明細書に組み込まれる）の使用等の他の方法によって精製することができ、記載されている。上記の方法に従って生成される自然対合アンプリコンのライブラリーは、本発明の範囲内である。この方法に従って生成される自然対合アンプリコンのライブラリーの特徴を有する自然対合アンプリコンのライブラリーも本発明の範囲内である。一実施形態において、自然対合アンプリコンは、ｓｃＦｖアンプリコンである。別の実施形態では、自然対合アンプリコンは、ｓｃＴＣＲアンプリコンである。
【００４９】
本発明は、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成する方法を更に提供し、この方法は、上記に定義した方法に従って自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成することと、自然対合ｓｃＦｖアンプリコンの更なるライブラリーを生成することとを含み、更なるライブラリーの自然対合ｓｃＦｖアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｖ１−Ｌ−Ｖ２−Ｒ２を有し、ここで、Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、且つそれぞれ制限酵素部位を含み、Ｖ１及びＶ２は、自然対合重鎖及び軽鎖可変領域であり、Ｖ１が軽鎖可変領域である場合、Ｖ２は、重鎖可変領域であり、又はＶ１が重鎖可変領域である場合、Ｖ２は、軽鎖可変領域であり、及びＬは、直接結合又はリンカーである。一実施形態において、更なるライブラリーの自然対合ｓｃＦｖアンプリコンは、一般式Ｒ１−ＶＨ−Ｌ−ＶＬ−Ｒ２を有し、即ち、Ｖ１は、ＶＨであり、及びＶ２は、ＶＬである。別の実施形態では、更なるライブラリーの自然対合ｓｃＦｖアンプリコンは、一般式Ｒ１−ＶＬ−Ｌ−ＶＨ−Ｒ２を有し、即ち、Ｖ１は、ＶＬであり、及びＶ２は、ＶＨである。
【００５０】
本発明は、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成する方法を更に提供し、この方法は、上記に定義した方法に従って自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成することと、自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンの更なるライブラリーを生成することとを含み、更なるライブラリーの自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｃ１−Ｌ−Ｃ２−Ｒ２を有し、ここで、Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、且つそれぞれ制限酵素部位を含み、Ｃ１及びＣ２は、自然対合α及びβ  ＴＣＲ鎖であり、Ｃ１がα  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、β  ＴＣＲ鎖であり、又はＣ１がβ  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、α  ＴＣＲ鎖であり、及びＬは、直接結合又はリンカーである。一実施形態において、Ｃ１は、α  ＴＣＲ鎖であり、及びＣ２は、β  ＴＣＲ鎖であり、即ち、更なるライブラリーの自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｃα−Ｌ−Ｃβ−Ｒ２を有し、ここで、Ｃαは、α  ＴＣＲ鎖であり、及びＣβは、β  ＴＣＲ鎖である。別の実施形態では、Ｃ１は、β  ＴＣＲ鎖であり、及びＣ２は、α  ＴＣＲ鎖であり、即ち、更なるライブラリーの自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｃβ−Ｌ−Ｃα−Ｒ２を有し、即ち、ここで、Ｃαは、α  ＴＣＲ鎖であり、及びＣβは、β  ＴＣＲ鎖である。
【００５１】
本発明は、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成する方法を更に提供し、この方法は、上記に定義した方法に従って自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成することと、自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンの更なるライブラリーを生成することとを含み、更なるライブラリーの自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｃ１−Ｌ−Ｃ２−Ｒ２を有し、ここで、Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、且つそれぞれ制限酵素部位を含み、Ｃ１及びＣ２は、自然対合γ及びδ  ＴＣＲ鎖であり、Ｃ１がγ  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、δ  ＴＣＲ鎖であり、又はＣ１がδ  ＴＣＲ鎖である場合、Ｃ２は、γ  ＴＣＲ鎖であり、及びＬは、直接結合又はリンカーである。一実施形態において、Ｃ１は、γ  ＴＣＲ鎖であり、及びＣ２は、δ  ＴＣＲ鎖であり、即ち、更なるライブラリーの自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｃγ−Ｌ−Ｃδ−Ｒ２を有し、ここで、Ｃγは、γ  ＴＣＲ鎖であり、及びＣδは、δ  ＴＣＲ鎖である。別の実施形態では、Ｃ１は、δ  ＴＣＲ鎖であり、及びＣ２は、γ  ＴＣＲ鎖であり、即ち、更なるライブラリーの自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンは、一般式Ｒ１−Ｃδ−Ｌ−Ｃγ−Ｒ２を有し、即ち、ここで、Ｃγは、γ  ＴＣＲ鎖であり、及びＣδは、δ  ＴＣＲ鎖である。
【００５２】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義されるＲ１及びＲ２は、異なる。好ましくは、Ｌは、リンカーである。好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、異なり、及びＬは、リンカーである。
【００５３】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される自然対合アンプリコンの更なるライブラリーを生成することは、ネステッドＰＣＲを使用することを含む。ネステッドＰＣＲは、アンプリコンの生成に使用されるものと異なるプライマーの第２のセットを使用して完全アンプリコンを増幅する。従って、ネステッドＰＣＲの続く実行は、そのまま発現に使用できる最終的なアンプリコンを増幅し、非特異的プライマー結合に起因して形成された代替的ＰＣＲ産物の増幅を低減する。一実施形態において、アンプリコンは、ｓｃＦｖアンプリコンである。更なる実施形態において、ネステッドＰＣＲは、Ｖ１のＦＲ１及びＶ２のＦＲ４に結合するプライマーを使用する。従って、完全ｓｃＦｖアンプリコン産物が増幅され得る。別の実施形態では、アンプリコンは、ｓｃＴＣＲアンプリコンである。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義されるネステッドＰＣＲは、制限酵素部位を含むオーバーハング配列に融合されるプライマーを使用する。好ましい制限酵素部位は、Ｓｆｉ１及びＮｏｔ１である。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義されるＲ１は、Ｓｆｉ１制限酵素部位を含み、及び本明細書のいずれかに定義されるＲ２は、Ｎｏｔ１制限酵素部位を含む。得られたアンプリコンは、そのまま発現に使用できるアンプリコンを形成し、このアンプリコンは、ファージ−ディスプレイパニング又は直接スクリーニングのための任意の数の発現システムのための発現ベクターに容易にクローン化され得る。
【００５４】
上記に定義した方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーは、本発明の範囲内である。上記に定義した方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーの特徴を有する抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーも本発明の範囲内である。
【００５５】
上記に定義した方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーは、本発明の範囲内である。上記に定義した方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーの特徴を有する抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーも本発明の範囲内である。
【００５６】
本発明は、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖライブラリーを生成する方法を更に提供し、この方法は、本明細書に記載した方法に従って自然対合ｓｃＦｖアンプリコンのライブラリーを生成することと、自然対合ｓｃＦｖを発現させることとを含む。一実施形態において、この方法は、自然対合ｓｃＦｖをｓｃＦｖ−Ｆｃとして発現させることを含む。別の実施形態では、この方法は、自然対合ｓｃＦｖをＩｇＧに再編成（ｒｅｆｏｒｍａｔ）することを含む。好ましくは、この再編成されたＩｇＧは、ファージ−ディスプレイパニングによって濃縮され、又はレパートリー特徴付けのために次世代シーケンシングを使用してディープシーケンシングされて、結合及び機能に関して直接スクリーニングすることができる。更なる実施形態において、この方法は、自然対合ｓｃＦｖをｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーとして発現させることを含む。
【００５７】
本発明は、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲライブラリーを生成する方法を更に提供し、この方法は、本明細書に記載した方法に従って自然対合ｓｃＴＣＲアンプリコンのライブラリーを生成することと、自然対合ｓｃＴＣＲを発現させることとを含む。
【００５８】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義されるｓｃＦｖライブラリーの各ｓｃＦｖは、リンカーによって互いに連結された単一細胞の自然対合の重鎖及び軽鎖可変領域を含む。リンカーは、重鎖及び軽鎖可変領域の対合を可能にする長さを有する必要がある。別の実施形態では、本明細書のいずれかに定義されるｓｃＴＣＲライブラリーの各ｓｃＴＣＲは、リンカーによって互いに連結された単一細胞の自然対合のＴＣＲ鎖を含む。リンカーは、ＴＣＲ鎖間の対合を可能にする長さを有する必要がある。好ましくは、本明細書のいずれかに定義されるリンカーは、グリシン及び／又はセリンに富んでいる。より好ましくは、本明細書のいずれかに定義されるリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３であり、以下の配列によってコードされる：
ｇｇａｇｇｃｇｇｃｇｇｔａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｃｔｃａｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａａｇｔ（配列番号１６８）。
【００５９】
一実施形態において、リンカーは、５〜３０アミノ酸長を有する。好ましくは、本明細書のいずれかに定義されるリンカーは、１０〜２０アミノ酸長を有する。より好ましくは、本明細書のいずれかに定義されるリンカーは、１３〜１８アミノ酸長を有する。なおより好ましくは、本明細書のいずれかに定義されるリンカーは、１５アミノ酸長を有する。好適なリンカーは、当業者に周知であろう。
【００６０】
上記に定義した方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖライブラリーは、本発明の範囲内である。上記に定義した方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖライブラリーの特徴を有する抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＦｖライブラリーも本発明の範囲内である。有利には、ｓｃＦｖライブラリーは、そのまま発現に使用できる。
【００６１】
上記に定義した方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲライブラリーは、本発明の範囲内である。上記に定義した方法によって生成される、抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲライブラリーの特徴を有する抗原結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合ｓｃＴＣＲライブラリーも本発明の範囲内である。有利には、ｓｃＴＣＲライブラリーは、そのまま発現に使用できる。
【００６２】
本発明は、抗原特異的分子を特定するための方法を更に提供し、この方法は、本明細書に記載した方法に従って自然対合ｓｃＦｖライブラリーを生成することと、抗原サンプルを用いて自然対合ｓｃＦｖライブラリーを調べることと、抗原特異的分子を特定することとを含む。
【００６３】
本発明は、抗原特異的分子を特定するための方法を更に提供し、この方法は、本明細書に記載した方法に従って自然対合ｓｃＴＣＲライブラリーを生成することと、抗原サンプルを用いて自然対合ｓｃＴＣＲライブラリーを調べることと、抗原特異的分子を特定することとを含む。
【００６４】
本明細書に記載したこの技術は、Ｂ細胞によって例示され、プラットフォームがＢ細胞レパートリー保存のために確立される。Ｔ細胞受容体もｓｃＦｖフォーマットに変換され、活性を維持するため（Ｇｒｅｇｏｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９６），２６（１０）：２４１０−１６；これは参照により本明細書に組み込まれる）、この技術は、同じようにＴ細胞受容体レパートリーの保存に適用することができる。
【００６５】
本発明はまた、単一細胞を小滴内に封入するためのマイクロ流体力学の使用を提供し、小滴は、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬を更に含有する。本発明はまた、単一細胞を小滴内に封入するためのマイクロ流体力学の使用を提供し、小滴は、封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬を更に含有する。本発明の方法に関連して前述した全実施形態は、上記のマイクロ流体力学の使用に同じように適用される。使用の実施形態は、特許請求の範囲に更に定義されている。
【００６６】
本発明はまた、本明細書に定義した方法のいずれかを実施するためのキットを提供する。本発明は、特に、単一細胞を、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬と共に小滴内に封入するためのマイクロ流体チップと、封入された単一細胞からの重鎖及び軽鎖可変領域アンプリコンの自然対合を増幅及び連結して、ｓｃＦｖアンプリコンを生成するための試薬とを含むキットを提供する。本発明は、特に、単一細胞を、封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を増幅及び連結するための試薬と共に小滴内に封入するためのマイクロ流体チップと、封入された単一細胞からのＴＣＲ鎖アンプリコンの自然対合を増幅及び連結して、ｓｃＴＣＲアンプリコンを生成するための試薬とを含むキットを提供する。使用説明書もキットに含まれ得る。キットはまた、チューブ（ｔｕｂｉｎｇ）、チューブインターフェース及びポンプを更に含み得る。キットはまた、小滴を可視化するための装置、例えば顕微鏡を更に含み得る。キットは、本明細書に定義した方法のいずれかに従って単一細胞を封入するためのマイクロ流体プラットフォームを含み得る。本発明の方法に関連して本明細書に前述した実施形態は、キットの構成要素に関する情報を更に提供し得る。キットの実施形態は、特許請求の範囲に更に定義されている。
【００６７】
本発明は、抗体結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合組換えｓｃＦｖを含むｓｃＦｖライブラリーを更に提供し、各ｓｃＦｖは、互いに連結された単一細胞の自然対合の重鎖及び軽鎖可変領域を含む。本発明はまた、Ｔ細胞受容体結合及び／又は機能に関するスクリーニングのための自然対合組換えｓｃＴＣＲを含むｓｃＴＣＲライブラリーを提供し、各ｓｃＴＣＲは、互いに連結された単一細胞の自然対合のＴＣＲ鎖を含む。本発明の方法に関連して本明細書に前述した実施形態は、ライブラリーの特徴に関する更なる情報を提供し得る。有利には、ライブラリーは、翻訳可能であり得る。本ライブラリーは、高スループット翻訳及び続く配列のスクリーニングを可能にする。
【００６８】
ライブラリーの実施形態は、特許請求の範囲に更に定義されている。
【００６９】
本発明は、抗原特異的分子を特定するための方法を更に提供し、この方法は、本明細書のいずれかに定義される自然対合ｓｃＦｖを、抗原サンプルを用いて調べることと、抗原特異的分子を特定することとを含む。本発明は、抗原特異的分子を特定するための方法を更に提供し、この方法は、本明細書のいずれかに定義されるｓｃＦｖライブラリーを、抗原サンプルを用いて調べることと、抗原特異的分子を特定することとを含む。
【００７０】
本発明は、抗原特異的分子を特定するための方法を更に提供し、この方法は、本明細書のいずれかに定義される自然対合ｓｃＴＣＲを、抗原サンプルを用いて調べることと、抗原特異的分子を特定することとを含む。本発明は、抗原特異的分子を特定するための方法を更に提供し、この方法は、本明細書のいずれかに定義されるｓｃＴＣＲライブラリーを、抗原サンプルを用いて調べることと、抗原特異的分子を特定することとを含む。
【００７１】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される自然対合ライブラリー又は本明細書のいずれかに定義されるライブラリーは、ｓｃＦｖライブラリーであり、及び抗原特異的分子は、抗体である。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される抗体は、モノクローナル抗体である。
【００７２】
一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される抗原サンプルは、腫瘍組織である。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される抗原サンプルは、細菌全体である。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される抗原サンプルは、ウィルス粒子である。一実施形態において、本明細書のいずれかに定義される抗原サンプルは、赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を含む。
【００７３】
交差反応性抗原特異的分子の特定を可能にするために、好ましくは異なる抗原サンプルを用いてライブラリーを複数のラウンドにわたり調べ得ることが当業者によって認識されるであろう。一実施形態において、抗原特異的分子は、交差反応性である。
【００７４】
本発明はまた、抗原特異的分子を特定するための、本明細書のいずれかに定義される自然対合ｓｃＦｖライブラリーの使用を提供する。本発明はまた、抗原特異的分子を特定するための、本明細書のいずれかに定義されるｓｃＦｖライブラリーの使用を提供する。本発明はまた、抗原特異的分子を特定するための、本明細書のいずれかに定義される自然対合ｓｃＴＣＲライブラリーの使用を提供する。本発明はまた、抗原特異的分子を特定するための、本明細書のいずれかに定義されるｓｃＴＣＲライブラリーの使用を提供する。
【００７５】
一実施形態において、上記に定義した使用は、抗原サンプルを用いてｓｃＦｖ又はｓｃＴＣＲライブラリーを調べることと、抗原特異的分子を特定することとを含む。本発明の方法に関連して前述した全実施形態は、上記に定義した使用に同じように適用される。使用の実施形態は、特許請求の範囲に更に定義されている。
【００７６】
本明細書に定義した方法は、ヒトＢ細胞からの抗体の単離を可能にするが、この方法は、Ｖ遺伝子配列情報が利用可能な任意の種からの抗体の単離に容易に拡大することができる。これは、特に低い融合効率（０．０２％未満（Ｙｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００８），３３６；１４２−１５１；参照により本明細書に組み込まれる））がレパートリーの有意な損失をもたらすハイブリドーマ技術の幅及び深さを拡大するのに有用であり得る。本明細書に定義した方法は、骨髄腫融合パートナーが利用可能でない生物体からのモノクローナル抗体の生成にも適用することができる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリー（対合α／β又はδ／γ鎖からなる）も類似した組換えフォーマットで補足することができ、単一鎖ＴＣＲは、ファージ及び酵母ディスプレイによる選択を受け入れることが示されている（Ｌｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５），２３：３４９−３５４；Ｓｍｉｔｈ、Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｆｔｏｎ  ＮＪ（２０１５），１３１９：９５−１４１；両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７７】
本発明の方法は、数百万の１次ヒトＢ細胞から天然レパートリーを強力且つ高感度のスクリーニングプラットフォームに迅速に保存することが可能であり、治療的抗体開発、免疫レパートリー特徴付け及び合理的なワクチン設計のための潜在的重要性を有する。例えば、可変領域を連結して翻訳可能なｓｃＦｖフォーマットとすることにより、複数の技術の強みを組み合わせることが可能となる。ディスプレイプラットフォームの膨大なスクリーニング能力を使用して、自然に進化した抗体応答の完全な豊かさを発掘する。
【００７８】
本発明は、天然のレパートリーからのリード抗体生成の迅速方法を提供する  −  一人の研究者が、数百万の１次Ｂ細胞から、４週間以内に特異的なモノクローナル抗体に急速に前進させることができる。これは、特に新興感染症、例えばＥｂｏｌａ大流行に対抗する際に特に有益であり得る。
【００７９】
本発明のライブラリーは、新たなドナーが加えられた際に拡張することができ、複数の標的（細菌又は腫瘍組織の全部を含む）に対して繰り返しパニングすることができ、又は未来の使用のために無限に保管することができる更新可能な資源を構成する。
【００８０】
例えば、最近発足したＨｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｍｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｃｒｏｗｅ，Ｊ．Ｅ．＆Ｋｏｆｆ，Ｗ．Ｃ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１５），１４：１４２１−１４２５）等、抗体機能を予測するための次世代シーケンシングを使用する大規模な活動は、特に利益を得る可能性がある。このプロジェクトは、１０００人の個人からの発現された抗体レパートリーをシーケンシングし、シーケンシング情報のみに基づいてワクチン反応性を推測することを目的としている。このプロジェクトに対して追加される刺激的なことは、本明細書に概略した方法を使用してこれらの個人からのプールされたディスプレイライブラリーを構築し、それにより、任意の数のワクチン候補に対するヒトレパートリーの反応性を直接測定できることであり得る。
【実施例】
【００８１】
実施例１：プライマー設計
全ヒトＩｇ配列の最大適用範囲のためにＰｅｒｌで記述されたカスタムソフトウエアを使用してプライマーを設計した（表１及び表５）。リーダー、可変及び定常領域に関するヌクレオチド配列を、ヒト重鎖、λ及びκ遺伝子（偽遺伝子及び切断型転写産物を除く）に関してＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００９），３７）からダウンロードし、プライマーの４セットを各遺伝子ファミリーに関して設計した。外部プライマー（プライマー名における「ｏｕｔ」添字）を、Ｐｒｉｍｅｒ３を呼び出すことによって設計し、プライマーをリーダー配列のスプライスジャンクションにまたがるように設計し（「ｏｕｔ＿５」プライマー）、又は定常領域の第１の５０塩基内に結合するように設計した（「ｏｕｔ＿３」プライマー）。ＶＫ＿ｏｕｔ＿３の場合、手作業で設計したプライマーを可変領域−定常領域スプライスジャンクションにまたがるように形成した。全プライマーは、最小融解温度６０℃でアニールするように設計された。内部プライマー（プライマー名における「ｉｎ」添字）を、プライマーの５’末端をＶコーディング配列のｓｔａｒｔ（「ｉｎ＿５」）又はｅｎｄ（「ｉｎ＿３」）に固定することによって設計し、Ｐｒｉｍｅｒ３からのＯｌｉｇｏ  Ｔｍモジュールを使用してＴｍが６０℃に達するまで伸長した。ＦＲ４特異的プライマーも特異性の増大のために手作業で設計した。可能な場合、各セット内のプライマーを、最大で４つの縮重塩基を有するように統一した。可能な場合、各セット内のプライマーをオーバーハングに融合して、リンカー形成（ＶＨ＿ｉｎ＿３及びＶＫ／Ｌ＿ｉｎ＿５）を可能にした。可能な場合、各セット内のプライマーをオーバーハングに融合して、ＮｏｔＩ又はＳｆｉＩによる制限消化を可能にした。可能な場合、各セット内のプライマーをＭｉＳｅｑディープシーケンシングのためにバーコード化した（表１）。
【００８２】
実施例２：免疫レプリカ技術を用いた細胞からの自然対合ｓｃＦｖの回収
実施例２．１：１次ヒトＢ細胞の封入
以下に記載するこの方法は、１次Ｂ細胞のプールから抗体レパートリーを、同族重鎖及び軽鎖対合を維持しながら、スクリーニング可能なフォーマットに保存するプラットフォームを提供する（図１）。これを達成するために、各Ｂ細胞を、試薬を含有する油中水小滴内に封入し、この試薬は、重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子転写産物のＲＴ−ＰＣＲ増幅、並びにｓｃＦｖアンプリコンを生成するためのオーバーラップ伸長ＰＣＲによるそれらの対合用である。
【００８３】
ＲｏｂｏＳｅｐヒトＢ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１９０５４ＲＦ）を使用して、健康なヒト血液サンプルからＢ細胞を単離した。この細胞を５００ｘｇで１０分間遠心分離し、インスリン−トランスフェリン−セレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４１４００−０４５）、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１００８２−１４７）、０．５μｇ／ｍｌ  ｍｅｇａＣＤ４０Ｌ（Ｅｎｚｏ、ＬＸ−５２２−１１０−Ｃ０１０）、３３ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２１（内部で製造）及びペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０３７８−０１６）で補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０４９１−０１）中に再懸濁し、３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間増殖させた。封入前に細胞をＰＢＳ（７００ｘｇで３分間）中で洗浄し、その後、抗凝集剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、００１００５７ＤＧ）の１：１，０００希釈及び０．４ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ（ＥＵＲｘ、Ｅ４０２０−０１）を含有する低浸透圧電気融合緩衝液（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、９４０００２１５０）中に再懸濁した。
【００８４】
刺激されたＢ細胞は、時間と共に凝集する傾向を有し、これは、流速の変化及び複数の細胞が一緒に封入される原因となり得る。抗凝集賦形剤及び常磁性撹拌ディスクの使用により、封入前に細胞の沈殿が回避されることが見出された。
【００８５】
アセチル化ＢＳＡは、水−油界面を安定化し、界面張力を低下させることができる両親媒性分子である（Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９７），８（１）：１−６；これは参照により本明細書に組み込まれる）。ＰＣＲサイクリングの過酷な条件における小滴の合体が最適化された。低い変性温度とアセチル化ＢＳＡの使用との組み合わせは、小滴の合体を減少させ、小滴安定性を改善した（図７）。好ましくは、変性温度は、約８５℃〜約９５℃の範囲内である。より好ましくは、変性温度は、約８６℃〜約９０℃の範囲内である。例えば、変性温度は、約８８℃であり得る。更に、アセチル化ＢＳＡの存在は、逆転写酵素等の酵素を界面での変性から保護し得る。
【００８６】
小滴内の試薬は、小滴が形成されると加える又は減じることができないため、反応混合物は、単一の反応ミックスにおいて全ステップを行うように最適化された。細胞を２ｘＲＴ−ＰＣＲマスターミックスと１：１比で封入した。ストックプライマーを１００μＭで等量で混合してプールを形成し、これをＲＴ−ＰＣＲミックスに加えた。
【００８７】
３００μｌの典型的なマスターミックスは、４．８６μｌ  ＶＨ−ｏｕｔ−Ｆ−Ｔ７、４．８６μｌ  ＶＬ−ｏｕｔ−Ｒ−Ｔ３、２μｌ  ＶＨ−ｉｎ−Ｒ及び２μｌ  ＶＬ−ｉｎ−Ｆ（表２）、１２０ｕｌ  ５ｘ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、２４μｌ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックス、５４．１μｌ  Ｑ溶液（Ｑｉａｇｅｎ、２１０２１２）、１２μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８１０９−０１７）及び３０μｌ  ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０７７７−０１９）から構成されていた。試薬を氷上でインキュベートしたままにし、その後、０．２２μｍスピンフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、８１６９）を通して遠心分離した。
【００８８】
ＭｉｃｅｌｌｕｌａエマルションＰＣＲキット（ＥＵＲｘ、３６００−０２）を使用し、６０％構成成分１、２０％構成成分２及び２０％構成成分３を使用してエマルションの有機相を作製した。試薬を最大速度で６０秒間混合及びボルテックスし、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。封入前に有機相を０．２２μｍフィルターでろ過した。
【００８９】
ＯＢ１流量制御器（Ｅｌｖｅｓｙｓ）を使用して揚送された流体を用いて、２−試薬小滴生成チップ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ、３２００２４２）上で封入を行った。細胞及びＲＴ−ＰＣＲミックスの水性流体をそれぞれ５７ｍｂａｒで揚送すると共に油液体を１０１ｍｂａｒで揚送した。得られたエマルションを６分画分（約４０μｌエマルション／画分）でＰＣＲストリップチューブ内に収集した。対照として、等量の細胞及びＲＴ−ＰＣＲミックスを組み合わせ、４０μｌアリコートでＰＣＲストリップチューブ内に分割して開放ＰＣＲ反応を行った。
【００９０】
「外部」プライマーに対する「内部」の相対的な量を、８の因数で低下させることにより（図３）、早期ＰＣＲサイクル中の内部プライマーの選択的枯渇が可能となり、個々の可変領域アンプリコンよりも完全連結産物の生成に有利に作用することが見出された（データは示さず）。
【００９１】
実施例２．２：自然対合可変領域遺伝子を含有するｓｃＦｖの生成
５５℃で３０分間の逆転写ステップ、次いでＲＴの熱失活／８８℃で２分間のＴａｑポリメラーゼの賦活化により、封入及び開放逆転写ＰＣＲ反応を行った。続いて、４５サイクルのＰＣＲ（８８℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で１分間）、最終的な７２℃で１０分間の伸長ステップを行った。小滴上の過剰の油は、手作業で取り除き、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、２８１０６）の５ｘ過剰の緩衝液ＰＢを加えることによって小滴を溶解し、ＰＣＲ産物を製造業者の指示書に従って精製した。産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、２８７０６）を使用して１％アガロース上で６００〜１２００ｂｐにサイズ選択し、４０μｌ  ＥＢ緩衝液中に溶出した。
【００９２】
実施例２．３：自然対合可変領域遺伝子を含有するｓｃＦｖの増幅
ＶＨ−ｉｎ−ＦとＶＫ−ｉｎ−Ｒ又はＶＬ−ｉｎ−Ｒのいずれかとの混合物（１：５０希釈、表２）を使用して、１μｌの鋳型としての精製ＲＴ−ＰＣＲ産物、３μｌの希釈プライマーミックス、１．５μｌの１０ｘＨｉｆｉ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ緩衝液、０．３μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．６μｌの５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び０．０６μｌのＨｉｆｉ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１３０４−０１１）からなる１５μｌ反応物におけるネステッドＰＣＲ増幅を行った。サイクリング条件は、９４℃で２分間の初期変性ステップ、次いで４５サイクルのＰＣＲ（９４℃で１５秒間、６１℃で３０秒間、６８℃で６０秒間）、及び６８℃で１０分間の最終的な伸長ステップからなっていた。産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋＰＣＲ精製キットを使用して精製し、４０μｌ  ＥＢ緩衝液中に溶出した。
【００９３】
実施例３：単一のハイブリドーマ細胞の封入
単一細胞の封入を証明するために、１００万のマウスハイブリドーマ細胞の２つのアリコートを、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５５２及びＣ７０２５）を使用して製造業者の指示書に従って赤色又は緑色蛍光で染色した。染色細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、上述した条件を用いて、ＲＴ−ＰＣＲミックスをＰＢＳに置き換えて封入した。小滴を６ウェル皿内に収集し、Ｅｖｏｓ  ＦＬ自動細胞画像化システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して倍率２００ｘで画像化した。
【００９４】
４００万細胞／ｍｌの密度は、およそ１００μｍの直径の小滴内への殆どの単一細胞の封入に最適であることが見出された（図２）。この工程中、多数の空の小滴が生成したが、鋳型細胞が存在しないため、これらはｓｃＦｖライブラリーに寄与しなかった。
【００９５】
実施例４：注射器及び圧力ポンプを使用した小滴安定性の比較
小滴安定性の改善を測定するために、２つの方法を使用して、マウスハイブリドーマ細胞及びＲＴ−ＰＣＲ緩衝液を用いて小滴を生成した。第１の方法は、２つの注射器ポンプ（Ｒａｚｅｌ  Ｒ−９９）を使用して、それぞれ水性及び油流体をマイクロ流体チップに供給した。水性流体は、１ｍＬ注射器内に装填され、単一のポンプから０．５μｌ／分で同時に分配された一方、油：界面活性剤溶液は、３ｍＬ注射器内に装填され、別個のポンプから１．５μｌ／分で分配された。第２の方法は、パルスレス圧力ポンプを使用する上述されたものであった。０．５μｌエマルションを９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、倍率２５ｘで画像化して合体及び小滴均一性に関して調べた。次いで、エマルションを４５サイクルのＲＴ−ＰＣＲ（上述したような）に供し、再度画像化した。
【００９６】
最適化ＰＣＲ条件及び賦形剤は、単分散小滴を生成すると共に安定性の増大に寄与した（図７）。
【００９７】
実施例５：免疫レプリカ技術によるｓｃＦｖの自然鎖対合の検証
ＲＴ−ＰＣＲ中の単一細胞の封入及び小滴安定性の達成における最適化を試験するために、１次ヒト細胞とマウスＢ細胞との混合物を使用し、プライマーセットをＣＨ１及びＣκ領域を増幅及び連結するように設計した。
【００９８】
より詳細には、健康なドナー由来の１次ヒトＢ細胞を、上述したように処理及び刺激した。マウスＢ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１９８５４）を使用して、製造業者の指示書に従って１次マウスＢ細胞を脾細胞から単離した。これらの細胞を、ヒトＢ細胞と同一の条件で、ｍｅｇａＣＤ４０ＬをマウスＣＤ４０Ｌ（Ｅｎｚｏ、ＬＸ−５２２−１２０−Ｃ０１０）及びマウスＩＬ２１（内部で製造）に置き換えて刺激した。４８時間刺激細胞を１：１比で組み合わせ、１０，０００の細胞を上述したように封入した。１０，０００の細胞を封入なしで直接ＲＴ−ＰＣＲミックス中に組み合わせることにより、並行「開放」反応を行った。上述したように、ＲＴ−ＰＣＲ及びネステッドＰＣＲを使用してＳｃＦｖ−様アンプリコンを生成し、プライマーセットは、ＣＨ１及びＣκ領域を増幅及び対合するように設計された。
【００９９】
可変領域の代わりに定常領域を使用することにより、予想されるアウトプットの複雑性を高く低減し、４つの可能性：対合断片（ｈＣＨ１−ｈＣκ及びｍＣＨ１−ｍＣκ）を有する２つのアンプリコン、及びスクランブル断片（ｈＣＨ１−ｍＣκ及びｍＣＨ１−ｈＣκ）を有する２つのアンプリコンのみとし、これらは、特異的プライマーを用いネステッドＰＣＲによって容易に検出することができ、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって確認された。予想通り、開放反応を用いて全ての可能な産物が特定されたが、印象的なことに、免疫レプリカ技術は、正確に対合したアンプリコンのみを生成した（図４）。これは、鎖対合が小滴内で維持される証拠を提供する。
【０１００】
実施例６：１次ヒトＢ細胞からの抗原特異的ｓｃＦｖの単離
実施例６．１：共通抗原に対する血清力価の決定
２人の健康なドナー（６４２及び４３２）由来の血清を５００ｘｇで１０分間の全血の遠心分離によって単離した後、ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、３％無脂肪ミルク−Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１０６４０４ＸＴＵ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０−ＢＤＨ、ＢＤＨ４２１０）中で希釈した。カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）マンナン及びインフルエンザ赤血球凝集素（Ｓｏｕｔｈ  Ｄａｋｏｔａ）抗原を社内で生成し、９６ウェル高結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３６９０）上に４μｇ／ｍｌで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液で２時間ブロックした後、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、段階希釈の血清と共に１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、結合ＩｇＧを１：１０，０００希釈の抗ヒトＦｃ−γ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ、１０９−０３５−０９８）で５分間にわたるＴＭＢ展開（ＫＰＬ、５２−００−０４）によって検出した。等量の１Ｍ塩酸を加えて反応を停止させた後、４５０ｎｍでの吸光度を測定することによって比色分析を行った。
【０１０１】
両方のドナーは、２つの共通治療的標的：インフルエンザ赤血球凝集素（Ｈ１、Ｓｏｕｔｈ−Ｄａｋｏｔａ変異体）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）マンナンに対する中程度の血清力価を有した（図８）。
【０１０２】
実施例６．２：抗原特異的ｓｃＦｖの単離
免疫レプリカ技術を検証するために、単一細胞の封入を有する及び有さない１次ヒトＢ細胞から生成されたライブラリーの直接比較を行った。
【０１０３】
２人の健康なドナー（６４２及び４３２）の各々に関して、およそ１０，０００の１次Ｂ細胞を、上述したようなヒト可変遺伝子増幅及び鎖対合のための完全セットのプライマーと共に封入した（「ｅｍ」）。並行して、可変遺伝子対合がスクランブルされることが予測される、封入されていない（開放（「ｏｐ」）反応）１０，０００の１次Ｂ細胞を使用して各ドナーに関する参照ライブラリーも生成した。
【０１０４】
ＲＴ−ＰＣＲ及びネステッドＰＣＲ増幅後、ＥＬＩＳＡによる高スループットスクリーニングのために、ｓｃＦｖアンプリコンバンドを、ＮｏｔＩ／ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｃａｔ  ｎｏ  Ｒ０１８９Ｓ及びＲ０１２３Ｓ）を用いてｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクター内にサブクローニングした（図５）。
【０１０５】
４つのライブラリー（６４２−ｅｍ、６４２−ｏｐ、４３２−ｅｍ及び４３２−ｏｐ）からの形質転換体を、２ｘＹＴ寒天＋１００μｇ／ｍｌカルベニシリン＋２％ブドウ糖（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｙ６２６０）を含有するＱｔｒａｙｓ上に蒔き、各々について１，４０８のコロニーを、６０ｕｌ  ＬＢ＋１００μｇ／ｍｌカルベニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０１７７−０１２）＋２％ブドウ糖（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｇ０５３５）を含む３８４ウェルプレート内に採集し、３７℃で一晩増殖させた。５μｌの一晩培養物を使用して、２５０μｌ再構成ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ６８０３）＋１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む３８４深ウェルプレートに接種し、２５℃で３日間にわたり増殖させた。３日後、培養物を１：１０希釈のＰｏｐＣｕｌｔｕｒｅ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、７１０９２）＋１：１０，０００希釈のＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０４７−０１９）で処理し、デブリを４０００ｘｇで１５分間の遠心分離によって排除した。ブロッキングステップがＰＢＳ中の３％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、７０３０）＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＢＤＨ、ＢＤＨ４２１０）を使用した以外、上述したようにＥＬＩＳＡによって抗原結合を行った。抗体は抗原特異的と思われ、シグナルは平均背景シグナル＋背景標準偏差の２０倍よりも大きかった。ヒットは、抗体をグリセロールストックから再発現させ、ＥＬＩＳＡを繰り返すことによって検証された。
【０１０６】
固定化抗原に対する結合に関してスクリーニングした５，６３２のコロニーのうち、赤血球凝集素に対する５つの結合剤、及びマンナンに対する１つの結合剤が特定された（表３）。大部分のヒット（５／６）が小滴ライブラリーに由来し、自然鎖対合を保存することにより、コンビナトリアルライブラリーの構成中に損失され得るクローンの特定が容易になることが示唆された。
【０１０７】
実施例６．３：Ｖ／Ｊ生殖系列多様性のディープシーケンシング分析
並行して、封入及び開放ライブラリーのレパートリーをペアエンドＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑディープシーケンシングによって特徴付けた。
【０１０８】
ｓｃＦｖアンプリコンはＭｉＳｅｑディープシーケンシングには大き過ぎるため、別個のＶＨ及びＶＫ／Ｌ断片を、特異的プライマーセットを使用して増幅した（表１）。ｉＶＨ−ｉｎ−Ｆ／ｉＶＨ−ｉｎ−Ｒ、ｉＶＫ−ｉｎ−Ｆ／ｉＶＫ−ｉｎ−Ｒ及びｉＶＬ−ｉｎ−Ｆ／ｉＶＬ−ｉｎ−Ｒ（１：５０希釈、表２）の混合物を使用して、１μｌ鋳型、３μｌ  １：５０希釈のプライマーミックス（ＶＨ−ｉｎ−Ｆ＋ＶＬ−ｉｎ−Ｒ）、１．５μｌ  １０ｘ  Ｈｉｆｉ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ緩衝液、０．３μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．６μｌ  ５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び０．０６μｌ  Ｈｉｆｉ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１３０４−０１１）からなる１５μｌ反応物におけるネステッドＰＣＲ増幅を行った。サイクリング条件は、９４℃で２分間の初期変性ステップ、その後の４５サイクルのＰＣＲ（９４℃で１５秒間、６１℃で３０秒間、６８℃で６０秒間）、及び６８℃で１０分間の最終的な伸長ステップからなっていた。産物をＭｉＳｅｑ  ２ｘ２５０ｂｐペアエンドシーケンシング（ＳｅｑＭａｔｉｃ）のために提出した。生の読み取りデータを、ＦＡＳＴＱファイルの報告された品質スコアに基づいて品質フィルタリングした。独特の読み取りデータをＩＭＧＴ  Ｖ及びＪ遺伝子生殖系列配列にマッピングして、小滴内での増幅の結果として導入された可能性がある任意のバイアスを決定した。
【０１０９】
開放ライブラリーにおいて検出された全遺伝子ファミリーは、封入ライブラリーの範囲内でも非常に類似した割合で特定され、小滴増幅はレパートリーを偏らせないことが示唆された（図６）。
【０１１０】
実施例７：免疫レプリカライブラリーのスループットを増大させるための工程最適化
免疫レプリカ技術のスループットを１０６細胞に増大させるために、粘度がより低い油担体（フッ素化油）を使用してより高い流速の使用を可能にした。ＶｉＣｅｌｌで計数された１０６細胞は、３０〜４０分間で問題なく封入された。
【０１１１】
ＲＴ−ＰＣＲ構成成分、細胞封入緩衝液及びマイクロ流体の流速を更に最適化して、１０６  Ｂ細胞から小滴を生成し、この小滴は、ＲＴ−ＰＣＲ中の安定性が改善され、サイズが均一であった。
【０１１２】
実施例８：組換えヒトＢ細胞レパートリーは、稀な特異的且つ自然対合抗体に関するスクリーニングを可能にする
以下に記載する方法は、２００万の１次Ｂ細胞を、次世代シーケンシングによる対合レパートリーのプロファイリングの能力をなお維持しながら、直接濃縮され及び機能に関してスクリーニングされ得る自然対合の発現可能なライブラリーに保存することを示す（図１）。これは、Ｂ細胞をピコリットルサイズの小滴（およそ２００ｐＬの体積）内に封入することによって達成され、それらの同族Ｖ遺伝子は、インフレームで融合されてｓｃＦｖカセットを形成する。１００万のＢ細胞が４０分以内に封入され得るように、ガラスマイクロ流体チップを圧力ポンプと共に使用して均一サイズの小滴を高速で確実に生成した。
【０１１３】
この手法の能力は、２人の健康なドナーの末梢血細胞から自然対合ファージ−ディスプレイライブラリーを構成することによって証明され、これは、選択が複数のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）サブタイプに対する抗体交差反応性へ推進されることを可能にした。
【０１１４】
全血単離から１８の独特の抗ＨＡモノクローナル抗体への前進は、４週間以内に達成された。これらの抗体の６つは、インフルエンザＡ（グループ１及び２）及びＢ系列からの１０個の異なるサブタイプに対して交差反応性を示した１つを含み、複数のＨＡサブタイプに対して交差反応性であった。これらの抗体配列の圧倒的多数は、対合レパートリーの次世代シーケンシングによって検出されず、この方法が、既存の技術によって見出される可能性が低い非常に稀なリードをどのように単離できるかを示している。
【０１１５】
実施例８．１：スループットを増大させるための最適化工程を使用した、１次ヒトＢ細胞の対合免疫グロブリンレパートリーの、発現可能なフォーマットへの保存
対合免疫グロブリンレパートリーを発現可能なフォーマットに保存するために、全ての既知のヒトＶ及びＪ遺伝子のマルチプレックス増幅のためのプライマーセットを、実施例１に記載したようにＩＭＧＴコンセンサス配列から計算的に設計した。合計で９２プライマーを設計して、ｓｃＦｖ生成のために適切なオーバーハングを有する５４２の機能的ヒトＶ及びＪアレルを増幅した（表５）。
【０１１６】
健康なドナーからの総Ｂ細胞を単離し、上記の実施例に記載したように刺激した。メモリーＢ細胞単離のために、ヒトスイッチ（Ｓｗｉｔｃｈｅｄ）メモリーＢ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を更に使用する。
【０１１７】
２００万のＢ細胞を２人の健康なドナーの血液から別々に単離した：ドナー１からの総Ｂ細胞、及びドナー２からのＩｇＧ＋／ＩｇＡ＋スイッチメモリーＢ細胞。
【０１１８】
各ドナーに関して細胞をＰＢＳ中で洗浄し（７００ｇで３分間）、半分に分割した。
【０１１９】
１００万の細胞を最適化ＲＴ−ＰＣＲミックスと共に封入して、自然対合アンプリコンライブラリー（「エマルションライブラリー」）を生成した。詳細には、１００万の細胞を封入緩衝液：１：１，０００希釈の抗凝集剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、０１−００５７ＡＥ）及び１６％  ＯｐｔｉＰｒｅｐ密度勾配培地（Ｓｉｇｍａ、Ｄ１５５６）を含有する低浸透圧電気融合緩衝液（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、９４０００２００１）中に再懸濁した。
【０１２０】
細胞を２ｘＲＴ−ＰＣＲマスターミックスと共に１：１比で封入した。各セット内のプライマーを等量で混合し、最適化された濃度の各セットをＲＴ−ＰＣＲミックスに加えた。典型的な２ｘマスターミックスは、１３９ｎＭ  ＶＨ−ｏｕｔ−Ｆ、４１６ｎＭ  ＶＬ−ｏｕｔ−Ｒ、３９ｎＭ  ＶＨ−ｉｎ−Ｒ及び１３ｎＭ  ＶＬ−ｉｎ−Ｆ（表３）、２ｘ  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ反応緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ  ｎｏ  １１８５５４７６００１）、４％  Ｔｉｔａｎ  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックス（Ｒｏｃｈｅ、１１８５５４７６００１）、１８．２％  Ｑ溶液（Ｑｉａｇｅｎ、２１０２１２）、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８４２７０１３）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｒｏｃｈｅ、１１８５５４７６００１）及び１２０単位ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０７７７０１９）から構成されていた。
【０１２１】
ＯＢ１流量制御器（Ｅｌｖｅｆｌｏｗ、ＭＫＩＩ）を使用して流体を揚送して、２−試薬小滴生成親フッ素性チップ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ、３２００５１０）上で封入を行った。細胞及びＲＴ−ＰＣＲミックスの水性液体をそれぞれ３０ｍｂａｒで揚送した一方、ＨＦＥ−７５００フッ素化油＋２％ｗ／ｖ  ００８−フルオロ−界面活性剤（ＲＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、００８−ＦＬＵＯＲＯＳＵＲＦＡＣＴＡＮＴ−ＨＦＥ７５００）を６７ｍｂａｒで揚送し、圧力を水性流体の１：１ミックスが得られるように微調整した。得られたエマルションをＰＣＲストリップチューブ内に画分で収集し（約４０μｌエマルション／画分）、鉱物油で覆った。過剰のフッ素化油を取り除いて、全体の体積を１００μＬに維持した。
【０１２２】
この方法を用いて、１００万のＢ細胞を４０分以内で封入できることが見出された。この方法により、均一サイズの小滴を高速で確実に生成することが可能となる。
【０１２３】
残りの１００万の細胞を使用して、コンビナトリアルｓｃＦｖライブラリー（「コンビナトリアルライブラリー」）を構築した。詳細には、１００万の細胞を、ＲＮＥａｓｙ  ＲＮＡ  単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造業者の指示書に従って全ＲＮＡに関して処理した。ＶＨ及びＶＬ配列が別々に増幅された後、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（同じプライマーセットを使用して）によって対合したことを除いて、エマルションの場合と同じマスターミックスを使用して、２５０ｎｇの総ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【０１２４】
実施例８．２：自然対合Ｖ遺伝子を含有するｓｃＦｖの増幅
５０℃で３０分間の逆転写、次いでＲＴの熱失活／８８℃で２分間のＴａｑポリメラーゼの賦活化により、封入及びコンビナトリアルライブラリーを形成した。続いて、４５（エマルション）又は３５（コンビナトリアル）サイクルのＰＣＲ（８８℃で１０秒間、６２℃で３０秒間、６８℃で４５秒間）及び最終的な６８℃で７分間の伸長ステップを行った。小滴の下方の過剰の油は、手作業で取り除き、等量のＰｉｃｏ−Ｂｒｅａｋ  １（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）を使用して小滴を化学的に合体させた。増幅したＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２％アガロース上でサイズ選択した。
【０１２５】
いくつかのグループにより、細胞ベースのＲＴ−ＰＣＲは、５ｎＬ未満の体積で実行できないと報告されているが（ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１３），３１：１６６−１６９；ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１５），２１：８６−９１；Ｗｈｉｔｅ，．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．（２０１１），１０８：１３９９９−１４００４；Ｅａｓｔｂｕｒｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ＯＮＥ（２０１３），８：ｅ６２９６１；これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）、この方法は、およそ２００ｐＬの体積の小滴内で細胞からＩｇ転写産物を直接増幅できることが見出された。
【０１２６】
両方のケースは、（５’から３’へ）ＶＨリーダー配列、ＶＨ、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３リンカー、ＶＬ、ＣＬのＮ末端の部分からなる連結産物をもたらした。次いで、この産物を、ＶＨ  ＦＲ１及びＶＬ  ＦＲ４特異的プライマーセットを用いたネステッドＰＣＲの鋳型として使用して、完全長ｓｃＦｖアンプリコンライブラリーを生成した（図１３Ａ）。
【０１２７】
保存されたレパートリーの深度評価を得るために、ネステッドＰＣＲプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ上での次世代シーケンシングを可能にするバーコード化オーバーハングを含有した（図１３Ａ）。
【０１２８】
ネステッドＰＣＲ増幅は、２５％精製ＲＴ−ＰＣＲ産物、１００ｎＭ  ＶＨ−ｉｎ−Ｆ及びＶＬ−ｉｎ−Ｒプライマープール（表５）、１ｘ  Ｈｉｆｉ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ緩衝液、０．１５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び０．６単位Ｈｉｆｉ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなっていた。サイクリング条件は、９４℃で２分間の初期変性ステップ、その後の５０サイクルのＰＣＲ（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で６０秒間）、及び６８℃で１０分間の最終的な伸長ステップからなっていた。産物を再度上記のようにサイズ選択した。
【０１２９】
共通のフォワード（Ｉｌｌｕ＿ｓｃａｌｅｕｐ＿Ｆ）及びバーコード化リバースプライマー（Ｉｌｌｕ＿Ｒ＿Ｎ５０Ｘ）を使用して最終的な規模拡大ＰＣＲを行って、ライブラリー構成及びＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを可能にした（表６）。本発明者らは、Ｑ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を製造業者の指示書に従って使用し、以下のサーモサイクリングプログラムを使用した：９８℃で２分間、９８℃で１０秒間及び７２℃で３０秒間の１２〜２０サイクル、７２℃で２分間。
【０１３０】
実施例８．３：次世代シーケンシング及びバイオインフォマティクス分析
各バーコード化ライブラリーを８５０ｂｐにサイズ選択し、等量で組み合わせ、カスタムプライミング手法（ＳｅｑＭａｔｉｃ）を使用した２×３００ｂｐ  ＭｉＳｅｑシーケンシングに供した。カスタムプライミング戦略は、ＦＲ４、ＣＤＲ３及びＦＲ３からなるＶＨ及びＶＬの３’末端の対合３００ｂｐ読み取りデータを得るように設計された（図１４）。Ｒ１及びＲ２プライマー（表６）を、それぞれＶＬ及びＶＨ配列を生成するために使用した一方、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ５プライマーをインデックス読み取りのために使用した。ＶＬ読み取りは、コンストラクトの３’末端に導入したプライミング部位を使用して得られたが、ＶＨ読み取りは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列にアニーリングされた内部プライマーを必要とした（表６）。
【０１３１】
デマルチプレキシング後、生のＦａｓｔｑ読み取りデータを、ＦａｓｔＱＣを使用して品質フィルタリングし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｆａｓｔｑ  ＩＤによって対合し、ＩＭＧＴ  Ｖ及びＪ遺伝子にアラインし、Ｋａｂａｔ定義に従って注釈をつけて（Ｌｌｏｙｄ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．ＰＥＤＳ（２００９）２２：１５９−１６８；これは参照により本明細書に組み込まれる）、ＣＤＲ３配列を抽出した。続いて、ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３配列を連結し、アミノ酸アイデンティティが９２％を超える場合、クラスタリングした。
【０１３２】
独特のＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３配列を計数し、各々の独特のＶＨと対合した独特のＶＬ配列の数を対合効率の目安として計算した。複数のＣＤＲＬ３と対合したＣＤＲＨ３配列の場合、トップペア重量は、最も豊富なＣＤＲＬ３と全ＣＤＲＬ３配列との数の比として決定した（ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１５），２１：８６−９１；これは参照により本明細書に組み込まれる）。全部で２６６，３４４及び２，６６６，９２６の独特のＣＤＲＨ３：ＣＤＲＬ３クラスターがそれぞれ２つのエマルション及びコンビナトリアルライブラリーに関して回収された（表７）。
【０１３３】
エラー訂正漸近Ｃｈａｏ豊かさ推定器（Ｃｈｉｕ，Ｃ．−Ｈ．＆Ｃｈａｏ，．ＰｅｅｒＪ（２０１６），４：ｅ１６３４；これは参照により本明細書に組み込まれる）を使用してクラスタリングパラメーターを検証し、シーケンシングアーチファクトに関して調整したアンプリコンライブラリーの算出された多様性は、観察されたクラスター数に非常に近いことが見出された。これは、クラスタリングパラメーターが真に独特の配列の損失を最小限にする一方、シーケンシングエラーに関して確実に訂正した証拠を提供する。
【０１３４】
実施例８．４：抗体の自然鎖対合の検証
実施例８．４．１：マウス及びヒトＢ細胞混合物を使用した検証
単一細胞の封入及び同族鎖対合の達成に対するこの手法を検証するために、１次ヒト及びマウスＢ細胞を単離し、実施例５に記載したように刺激した。等量の１次刺激マウス及びヒトＢ細胞を混合し、この混合物からの１０，０００の細胞を実施例８．１に記載したように封入した。
【０１３５】
１０，０００の細胞を封入なしで直接ＲＴ−ＰＣＲミックス中に組み合わせることによって並行「コンビナトリアル」反応を行った。ＲＴ−ＰＣＲ及びネステッドＰＣＲ条件は、実施例８．２に記載した通りであり、プライマーセットをＣＨ１及びＣκ領域を増幅及び対合するように設計した（表３）。
【０１３６】
予想通り、コンビナトリアルフォーマットは、全ての可能な産物を生成したが、際立ったことに、封入によって自然対合アンプリコンのみが生成された（図４ｂ）。
【０１３７】
実施例８．４．２：スパイクイン実験によるｓｃＦｖの自然鎖対合の検証
健康なドナーの血液から単離された１００万の総Ｂ細胞を１０，０００のＩＭ−９細胞（１％）と混合した後、最適化されたＲＴ−ＰＣＲミックスと共に封入して、（５’から３’へ）ＶＨリーダー配列、ＶＨ、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３リンカー、ＶＬ、ＣＬのＮ末端の部分からなる自然対合アンプリコンライブラリーを生成した。次いで、この産物を、ＶＨ  ＦＲ１及びＶＬ  ＦＲ４特異的なプライマーセットを用いたネステッドＰＣＲの鋳型として使用して、完全長ｓｃＦｖアンプリコンライブラリーを生成した（図１３Ａ）。
【０１３８】
正確な鎖対合の更なる検証として、ＩＭ−９  ＣＤＲＨ３配列（ＲＲＧＶＴＤＩＤＰＦＤＩ；ＩＭ９−ＣＤＲＨ３−Ｆｗｄ）に特異的なプライマーを一般的なリバースプライマー（Ｒ１、表６）と共に使用して、ＩＭ−９重鎖と対合する全ＶＬ配列を増幅した。得られたアンプリコンをクローン化し、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって分析し、この分析は正確な対合を示し、９７／１０１コロニーにおいて既知のＩＭ−９  ＶＬ（ＱＨＹＮＲＰＷＴ）を有した（９６％対合精度）。これにより、競合Ｂ細胞の圧倒的存在量を用いても、本方法は、正確な鎖対合を維持することが確認された。
【０１３９】
実施例８．４．３：各ＣＤＲＨ３配列と対合する独特のＣＤＲＬ３配列の数の決定
免疫レプリカシステムが鎖対合を保存することのなお更なる検証として、各ＣＤＲＨ３配列と対合した独特のＣＤＲＬ３配列の数を決定した。
【０１４０】
予想通り、コンビナトリアルライブラリーは、各ＣＤＲＨ３配列が中央値５〜９の独特のＣＤＲＬ３配列と対合された雑多な対合を示した（図１３Ｂ、表７）。シーケンシング深度（１０６）は、コンビナトリアルライブラリー（１０１２）の理論的な配列多様性を大きくアンダーサンプルすることを仮定すれば、コンビナトリアル対合の真の率は、相当より高い可能性があるであろう。これは、中央値１：１  ＣＤＲＨ３／ＣＤＲＬ３対合であり、狭い分布が観察されたエマルションライブラリーに対する著しい対照であった。複数の対合が検出された場合、トップペア分析は、ＶＨ−ＶＬ対合における９５％〜９８％精度を決定した（図１３Ｃ）。トップペア方法は、シーケンシングのみに好適であり、スクリーニングに好適でないアンプリコンを生成する以前公表された方法において、同族鎖対合を検証するのに使用されている（ＤｅＫｏｓｋｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１５），２１：８６−９１；これは参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、同様のシーケンシング深度及び出発細胞数を使用して、対合効率は、本方法を用いると有意により良好であることが見出された（ｐ＜０．００７、図１５及び表８）。
【０１４１】
実施例８．５：封入された単一Ｂ細胞の画像化
Ｂ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＣＭＴＰＸ又はＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造業者の指示書に従って染色した。染色細胞をＰＢＳに再懸濁し、上述した条件を用いて、ＲＴ−ＰＣＲミックスをＰＢＳに置き換えて封入した。細胞溶解物を２つの方法で画像化した：（１）染色細胞を封入緩衝液に再懸濁し、ＲＴ−ＰＣＲミックスと共に封入し、５０℃で５分間加熱した；（２）未染色細胞を２ｘ  ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＲＴ−ＰＣＲミックスと共に封入し、５分間で５０℃に加熱した。小滴をμ−’Ｓｌｉｄｅ０．１’チャネルスライド（Ｉｂｉｄｉ）内に収集し、Ｅｖｏｓ  ＦＬ自動細胞画像化システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して倍率２００ｘで画像化した。
【０１４２】
ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液の添加と５０℃でのインキュベーションによって生じた堅牢な細胞溶解物を、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染色（図１０）並びにＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎによる細胞質染色及び核材料の放出の検出（図１１）によって観察した。
【０１４３】
実施例８．６：ファージディスプレイライブラリー構成及び抗赤血球凝集素抗体の濃縮
原理の証明として、ｓｃＦｖライブラリーを使用して、インフルエンザ赤血球凝集素、ヒトが通常暴露される抗原に対する抗体を単離した。
【０１４４】
実施例８．６．１：ｓｃＦｖライブラリーを使用した抗体の単離
エマルション及びコンビナトリアルライブラリーをファージミドベクターにバルクサブクローニングして（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６），１４：３０９−３１４；これは参照により本明細書に組み込まれる）、１ｘ１０８の形質転換体にわたるファージ−ディスプレイライブラリーを構成した。
【０１４５】
詳細には、エマルション及びコンビナトリアルアンプリコンライブラリーを、Ｎｏｔ１／Ｓｆｉ１制限酵素（ＮＥＢ）を使用してファージミドベクター（ｐＣＡＮＴＡＢ６）にサブクローニングし、ファージディスプレイライブラリーをＶａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６），１４：３０９−３１４（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように生成した。４つのライブラリーの各々からの９６のコロニーを対数期中期（ｍｉｄ−ｌｏｇ）まで培養し、Ｍ１３−Ｋ０７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で感染させて一晩モノクローナルファージ生成を開始した。抗体ディスプレイをＥＬＩＳＡによって決定した。１μｇ／ｍｌ抗ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を９６ウェルＭＡＸＩＳＯＲＰプレート（Ｎｕｎｃ）上に一晩固定化し、３％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＢＤＨ）で２時間ブロックした。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ  ｐＨ７．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄した後、希釈ファージ上清を結合させ、抗Ｍ１３−ＨＲＰ抗体（１：５０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して検出し、ＴＭＢ（ＫＰＬ）によって可視化した。ｓｃＦｖに融合されたｍｙｃ  ｔａｇに対するモノクローナルファージＥＬＩＳＡは、ライブラリーがほぼｓｃＦｖを良好に表示し、ポジティブディスプレイがクローンの９０〜９９％に関して見られたことを示した（表９）。
【０１４６】
組換え赤血球凝集素タンパク質をＢｅｎｊａｍｉｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０１４），８８：６７４３−６７５０（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように発現させ且つ精製した。使用したＨＡタンパク質は、以下の通りである：Ｈ１  ＣＡ／０９、／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｈ１Ｎ１；Ｈ１  ＳＤ／０７、Ａ／Ｓｏｕｔｈ  Ｄａｋｏｔａ／０６／２００７  Ｈ１Ｎ１；Ｈ２  ＭＯ／０６、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｍｉｓｓｏｕｒｉ／２００６  Ｈ２Ｎ３；Ｈ５  ＶＮ／０４、／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４  Ｈ５Ｎ１；Ｈ６  ＨＫ／９７、Ａ／ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７  Ｈ６Ｎ１；Ｈ９  ＨＫ／９７、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／Ｇ９／９７  Ｈ９Ｎ２；Ｈ３  ＰＥ／０９、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９  Ｈ３Ｎ２；Ｈ７  ＮＬ／０３、Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３  Ｈ７Ｎ７；Ｂ  ＦＬ／０６、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／２００６  Ｙａｍａｇａｔａ  ｌｉｎｅａｇｅ；Ｂ  ＢＲ／０８、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８  Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｌｉｎｅａｇｅ）。
【０１４７】
４つのライブラリーを、使用済みの７５ｎＭビオチン化赤血球凝集素Ｈ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｈ１Ｎ１）を使用して、Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６），１４：３０９−３１４（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように２ラウンドの濃縮に供した。
【０１４８】
ファージとのインキュベーション前に、固定化ニュートラアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して特定のビオチン化抗原を捕捉して、増幅されたファージアウトプットをポリクローナルＥＬＩＳＡによってプロファイリングした。ポリクローナルファージＥＬＩＳＡは、Ｂ細胞源に関わらず、特異的赤血球凝集素Ｈ１結合剤に関する堅牢な濃縮を確認した（図１６Ａ及び１６Ｂ、図１７）。注目すべきことに、コンビナトリアルライブラリーが全体的により強力な特異的濃縮を示した一方、濃縮されたクローンのモノクローナルシーケンシングは、対応するエマルションライブラリー（２．９％、図１８）と比較してＩＧＨＶ１−６９生殖系列配列に関する強いバイアス（９０％）を示した。
【０１４９】
抗体を含有するＩＧＨＶ１−６９は、重鎖相互作用のみを介してグループ１赤血球凝集素サブタイプに接触できることが以前に示されているため（Ｐａｐｐａｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１４），５１６：４１８−４２２；これは参照により本明細書に組み込まれる）、コンビナトリアルライブラリーの濃縮は、細菌内で良好に発現されるか又は折り畳まれるＩＧＨＶ１−６９に対するＶＬパートナーの選択によって推進されたことが示唆される。これは、コンビナトリアルライブラリーを用いた際の重要なバイアスを強調するものである。
【０１５０】
実施例８．６．２：交差反応性抗体に関する特異的濃縮
交差反応性抗体を特異的に濃縮するために、第１ラウンドのアウトプットを非循環性グループ１サブタイプ、インフルエンザＡ赤血球凝集素Ｈ５（７５ｎＭ、／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）に関してエマルションライブラリーからパニングした。
【０１５１】
濃縮されたライブラリーを、Ｎｏｔ１／Ｓｆｉ１制限酵素（ＮＥＢ）を使用してｓｃＦｖ−Ｆｃ発現ベクター（Ｘｉａｏ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１５），１０：ｅ０１４０６９１；これは参照により本明細書に組み込まれる）にバルクサブクローニングし、化学的にコンピテントなトップ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。単一のクローンを、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２％ブドウ糖（ＴｅｋＮｏｖａ）を含有するＬＢ中で一晩増殖させた後、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する再構成ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１：５００に希釈した。細胞を２５℃で７２時間誘導し、遠心分離によってペレット化した。希釈した上清を使用し、抗Ｆｃ−γ−ＨＲＰ２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、上述したようにＥＬＩＳＡによって抗原反応性を決定した。シーケンシング後、独特のクローンをＨＥＫ−２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞内で６日間発現させ、上清を使用してＥＬＩＳＡによる結合を確認した。
【０１５２】
スクリーニングした５，６３２のクローンのうちの３２０のクローンが、１８の独特の配列からなるＨ１に対する特異的結合を示した。これは、６つの独特の抗体を含み、この抗体は、パニングに使用した両方の抗原に対する交差反応性を示した（図１６Ｃ）。驚くべきことに、これらの抗体（ＩＧＨＶ１−１８／ＩＧＬＶ１−４４）の１つは、Ａ（グループ１及び２）及びインフルエンザＢの両方の系列（Ｙａｍａｇａｔａ及びＶｉｃｔｏｒｉａ）からのサブタイプを含む、試験した１０のＨＡサブタイプの全部に対する特異的結合を示し、１６ｎＭ〜５１ｎＭの範囲の比較的類似したＥＣ５０値を有した（図１６Ｄ）。このような普遍的な抗インフルエンザ抗体は、極めて稀であると考えられ、長い間探し求められてきたが、コンビナトリアルファージ−ディスプレイによって１度特定されたのみである（Ｄｒｅｙｆｕｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２），３３７：１３４３−１３４８；これは参照により本明細書に組み込まれる）。使用した健康なドナーサンプル中のそのような抗体の存在は予想外であったが、レパートリーの深い発掘によってこの抗体を単離する能力は、本方法の能力を示すものである。
【０１５３】
実施例８．６．３：ＣＤＲＨ３：ＣＤＲＬ３対合によって確認されたヒットの相対的頻度
保存されたＢ細胞レパートリーにおけるヒットの相対的頻度を確認するために、そのＣＤＲＨ３：ＣＤＲＬ３対の各々を次世代シーケンシングデータセット内で探し、最大で４つのアミノ酸ミスマッチが、可能なシーケンシング誘導による突然変異を構成することを許容した。１８の抗原特異的配列の１つのみが２６６，３４４の独特の対合配列クラスターの中で認められ、これは、残りのヒットが次世代シーケンシングではあまりにも稀であるために検出できないことを示唆する。この配列（００８９ＥＡ−Ｃ０２）は、４，９５６，２４９のマッピングされた読み取りデータの２つを占めた（表７）。選択後、このクローンは、スクリーニングされた５，６３２クローンのうちの３２で繰り返され、濃縮は１４，０００倍であることが見出された。
【０１５４】
自然ヒト抗体を表示する他のプラットフォームが同様に適用でき、本発明者らがそのような代替的ディスプレイシステムを明確に想定していることが当業者によって認識されるであろう。例えば、酵母ディスプレイシステムは、レパートリー内に存在する可能性があるが、細菌内のヒト抗体の発現及び折り畳みの相違によって選択されなかった更なる抗原特異的配列の特定を可能にし得る。
【０１５５】
このプラットフォームは、遺伝子特異的プライマーからのＰＣＲの成功に依存するため、プライマー結合部位内の抗体遺伝子変異型を、得られたライブラリーから排除することが可能である。等しい活性を有するが、より少ない突然変異を有する祖先抗体（Ｍａｃａｇｎｏ，．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０１０），８４：１００５−１０１３；これは参照により本明細書に組み込まれる）が依然として捕捉される可能性がある。
【０１５６】
それにも関わらず、このリードの特定のセットは、シーケンシング情報のみでは予測されなかった可能性がある。次世代シーケンシングによって決定されたこれらのリードの希少性が元のＢ細胞プール内で表す範囲では、これは、これらのリードが個々のＢ細胞の培養及びスクリーニングの標準的な方法を介して見出され得なかったことを示唆する。
【０１５７】
実施例９：封入前の細胞溶解物は、小滴をＲＮＡで汚染し得る
小滴内に取り込む前の死んだ又は死にかけている細胞からの遊離ＲＮＡの封入は、自然対合ライブラリーの単離を妨害し得ると考えられた。特に、ＶＨ又はＶＬ領域をコードするＲＮＡは、小滴を汚染し、非自然対合産物をもたらす可能性がある。封入前の細胞溶解物が小滴をＲＮＡで汚染するか否かを決定するために、４８時間刺激細胞を一般的な封入と同じ時間（３０分間）インキュベートし、次いで上清又は細胞ペレット（正の対照）のいずれかからＶＨ領域のバルクＲＴ−ＰＣＲを行った。水対照は、負の対照として含まれていた。
【０１５８】
結果は、有意な量のＲＮＡが細胞から放出されることを示す（図１２）。
【０１５９】
この問題を緩和する方法には、刺激時間の短縮、生細胞のより厳格な選択（例えば、ＦＡＣＳ、ビーズベースの）、及びオリゴ被覆磁気ビーズを使用したＲＮＡの隔離が含まれる。
【０１６０】
実施例１０：理論的な単一細胞の封入百分率
理論的には、単一の小滴内に封入される細胞の数は、細胞と小滴の比が１：１０と仮定すると、λ＝０．１のポアソン分布に従う。
【数１】
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式中、λ＝０．１である。
【０１６１】
単一細胞の封入百分率は、単一細胞を有する小滴を、≧１の細胞を有する小滴で除算する百分率として定義され、従って、確率は、以下のように計算することができる。
【数２】
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【０１６２】
細胞懸濁液の滴定は、１０個の小滴の各々に関しておよそ１個の細胞を達成し、これは、ポアソン統計に基づいて単一細胞の封入を＞９５％の確率でもたらす（図９）。
【０１６３】
【表１】
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【０１６４】
【表２】
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【０１６５】
【表３】
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【０１６６】
【表４】
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【０１６７】
【表５】
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【０１６８】
【表６】
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【０１６９】
【表７】
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【０１７０】
【表８】
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【０１７１】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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