(57)【要約】精製組換えセレノプロテイン、例えば、抗体及び酵素などを含む組成物を提供する。このような組換えポリペプチド及びその菌株を製造するための方法も同様に提供する。本開示の第１の実施形態は精製組換えポリペプチドを含む組成物を提供し、上記ポリペプチドは、ポリペプチドの野生型には存在しない選択位置に少なくとも１つのセレノシステイン残基を含み、組成物中における組換えポリペプチドの少なくとも８０％は、選択位置にセレノシステイン残基を含む。
2019520083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製組換えポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドの野生型には存在しない選択位置に少なくとも１つのセレノシステイン残基を含み、前記組成物中における前記組換えポリペプチドの少なくとも８０％は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記組成物中における前記組換えポリペプチドの８０％〜９９．９％は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物中における前記組換えポリペプチドの９０％〜９９％は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物中における前記組換えポリペプチドの少なくとも９５％は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物中における前記組換えポリペプチドの少なくとも９９％は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組換えポリペプチドは、ヒトポリペプチドに対して少なくとも９０％同一である、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ヒトポリペプチドは疾患に関与するポリペプチドである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組換えポリペプチドは抗体または酵素を含む、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドは選択位置に少なくとも２つのセレノシステイン残基を含む、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記選択位置の前記２つのセレノシステイン残基はジセレニド結合を形成する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは酵素または抗体を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体はアグリコシル化抗体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも５０μｇの前記精製組換えポリペプチドを含む、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
精製組換えポリペプチドは９７％〜９９．９％の純度である、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドは、選択位置に２、３、４、５、６、７、８、９または１０のセレノシステイン残基を含む、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、対象を治療するための方法。
【請求項１８】
（ａ）配列番号：１であり、配列番号：１の３４４位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｂ）配列番号：２であり、配列番号：２の７０２位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｃ）配列番号：３であり、配列番号：３の６５５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｄ）配列番号：４であり、配列番号：４の７３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｅ）配列番号：５であり、配列番号：５の７８１位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｆ）配列番号：６であり、配列番号：６の１３６位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｇ）配列番号：７であり、配列番号：７の１８３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｈ）配列番号：８であり、配列番号：８の１位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｉ）配列番号：９であり、配列番号：９の１０２位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｊ）配列番号：１０であり、配列番号：１０の１０５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｋ）配列番号：１１であり、配列番号：１１の６７３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｌ）配列番号：１２であり、配列番号：１２の６９位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｍ）配列番号：１３であり、配列番号：１３の１０７位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｎ）配列番号：１７であり、配列番号：１７の２４６位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｏ）配列番号：１８であり、配列番号：１８の５４５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、及び／または、
（ｐ）配列番号：１９であり、配列番号：１９の１２４位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１９】
（ａ）配列番号：１であり、配列番号：１の３４４位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｂ）配列番号：２であり、配列番号：２の７０２位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｃ）配列番号：３であり、配列番号：３の６５５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｄ）配列番号：４であり、配列番号：４の７３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｅ）配列番号：５であり、配列番号：５の７８１位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｆ）配列番号：６であり、配列番号：６の１３６位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｇ）配列番号：７であり、配列番号：７の１８３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｈ）配列番号：８であり、配列番号：８の１位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｉ）配列番号：９であり、配列番号：９の１０２位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｊ）配列番号：１０であり、配列番号：１０の１０５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｋ）配列番号：１１であり、配列番号：１１の６７３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｌ）配列番号：１２であり、配列番号：１２の６９位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｍ）配列番号：１３であり、配列番号：１３の１０７位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｎ）配列番号：１７であり、配列番号：１７の２４６位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
（ｏ）配列番号：１８であり、配列番号：１８の５４５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、または、
（ｐ）配列番号：１９であり、配列番号：１９の１２４位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドは、配列番号：１の３４４位に相当する位置にＰｒｏ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドは、配列番号：２の７０２位に相当する位置にＨｉｓ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドは、配列番号：３の６５５位に相当する位置にＡｌａ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドは、配列番号：４の７３位に相当する位置にＡｌａ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドは、配列番号：５の７８１位に相当する位置にＧｌｙ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドは、配列番号：６の１３６位に相当する位置にＶａｌ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドは、配列番号：７の１８３位に相当する位置にＡｌａ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドは、配列番号：８の１位に相当する位置にＡｒｇ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドは、配列番号：９の１０２位に相当する位置にＣｙｓ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドは、配列番号：１０の１０５位に相当する位置にＣｙｓ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドは、配列番号：１１の６７３位に相当する位置にＬｅｕ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドは、配列番号：１２の６９位に相当する位置にＧｌｙ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドは、配列番号：１３の１０７位に相当する位置にＳｅｒ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドは、配列番号：１７の２４６位に相当する位置にＡｌａ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドは、配列番号：１８の５４５位に相当する位置にＩｌｅ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドは、配列番号：１９の１２４位に相当する位置にＰｒｏ置換を含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３６】
前記ポリペプチドは、配列番号：１の９９９位に相当する位置にＴｈｒ置換、４５７位に相当する位置にＴｈｒ置換、５９１位に相当する位置にＰｒｏ置換、１８３位に相当する位置にＴｈｒ置換、３５８位に相当する位置にＬｅｕ置換、２３位に相当する位置にＡｒｇ置換、９０２位に相当する位置にＩｌｅ置換、８８９位に相当する位置にＶａｌ置換、６２０位に相当する位置にＣｙｓ置換、及び／または、１７４位に相当する位置にＧｌｙ置換、を更に含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３７】
前記ポリペプチドは、配列番号：３の３９８位に相当する位置にＣｙｓ置換、６５２位に相当する位置にＡｌａ置換、２６４位に相当する位置にＣｙｓ置換、及び／または、２１位に相当する位置にＡｌａ置換、を更に含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３８】
前記ポリペプチドは、配列番号：４の４５位に相当する位置にＡｓｎ置換、２９０位に相当する位置にＬｅｕ置換、２７１位に相当する位置にＡｓｐ置換、１５３位に相当する位置にＴｙｒ置換、４５位に相当する位置にＶａｌ置換、２８４位に相当する位置にＰｒｏ置換、７３位に相当する位置にＩｌｅ置換、６８位に相当する位置にＬｅｕ置換、６９位に相当する位置にＩｌｅ置換、３０５位に相当する位置にＣｙｓ置換、１４４位に相当する位置にＳｅｒ置換、及び／または、２８１位に相当する位置にＶａｌ置換、を更に含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３９】
前記ポリペプチドは、配列番号：５の９１６位に相当する位置にＧｌｙ置換、９３８位に相当する位置にＨｉｓ置換、８６０位に相当する位置にＨｉｓ置換、９２５位に相当する位置にＡｓｐ置換、及び／または、４７０位に相当する位置にＭｅｔ置換、を更に含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４０】
前記ポリペプチドは、配列番号：６の１１５位に相当する位置にＡｌａ置換、３８６位に相当する位置にＡｒｇ置換、１５５位に相当する位置にＡｒｇ置換、９８位に相当する位置にＳｅｒ置換、２０１位に相当する位置にＡｌａ置換、２９４位に相当する位置にＴｈｒ置換、１５９位に相当する位置にＴｙｒ置換、及び／または、１１２位に相当する位置にＩｌｅ置換、を更に含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドは、配列番号：１８の７６位に相当する位置にＧｌｙ置換、２９３位に相当する位置にＶａｌ置換、６３７位に相当する位置にＴｈｒ置換、３位に相当する位置にＶａｌ置換、３１１位に相当する位置にＳｅｒ置換、４７１位に相当する位置にＴｈｒ置換、２２８位に相当する位置にＶａｌ置換、３１１位に相当する位置にＳｅｒ置換、及び／または、２５７位に相当する位置にＴｈｒ置換、を更に含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドは、配列番号：７の１７３位に相当する位置にＶａｌ置換、１９６位に相当する位置にＬｅｕ置換、１８０位に相当する位置にＰｈｅ置換、２４９位に相当する位置にＡｌａ置換、５位に相当する位置にＶａｌ置換、２７３位に相当する位置にＬｅｕ置換、及び／または、１７６位に相当する位置にＡｓｎ置換、を更に含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドは、配列番号：９の１５位に相当する位置にＣｙｓ置換、及び／または、３０位に相当する位置に置換、を更に含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリペプチドは、配列番号：１９の１９３位に相当する位置にＩｌｅ置換、２３３位に相当する位置にＴｈｒ置換、３００位に相当する位置にＡｌａ置換、及び／または、１９９位に相当する位置にＡｒｇ置換、を更に含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４５】
前記ポリペプチドは、配列番号：１７の２４６位に相当する位置にＡｌａ置換を更に含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドは、配列番号：１１の１１９位に相当する位置にＶａｌ置換、５３５位に相当する位置にＰｒｏ置換、３７３位に相当する位置にＡｒｇ置換、５３５位に相当する位置にＳｅｒ置換、１１９位に相当する位置にＴｈｒ置換、６０１位に相当する位置にＡｌａ置換、１０３位に相当する位置にＬｙｓ置換、３１位に相当する位置にＡｓｐ置換、６６２位に相当する位置にＩｌｅ置換、３５９位に相当する位置にＬｙｓ置換、及び／または、５１９位に相当する位置にＡｓｐ置換、を更に含む、請求項１９に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４７】
（ｉ）配列番号：１４に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）２１２位に相当する位置にＩｌｅ置換、１６２位に相当する位置にＡｓｎ置換、２９９位に相当する位置にＡｌａ置換、及び／または、２２０位に相当する位置にＡｒｇ置換、を含む、ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項４８】
（ｉ）配列番号：１４に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）２１２位に相当する位置にＩｌｅ置換、１６２位に相当する位置にＡｓｎ置換、２９９位に相当する位置にＡｌａ置換、及び／または、２２０位に相当する位置にＡｒｇ置換、を含む、組換えポリペプチド。
【請求項４９】
（ｉ）配列番号：１５に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）１８４位に相当する位置にＡｌａ置換、１７３０位に相当する位置にＡｓｎ置換、１８８８位に相当する位置にＡｓｐ置換、３５２位に相当する位置にＴｈｒ置換、３７４位に相当する位置にＳｅｒ置換、１４２３位に相当する位置にＡｒｇ置換、１５０２位に相当する位置にＧｌｕ置換、２８５位に相当する位置にＧｌｎ置換、４７０位に相当する位置にＬｙｓ置換、９３９位に相当する位置にＴｈｒ置換、１６６９位に相当する位置にＰｈｅ置換、２０３４位に相当する位置にＩｌｅ置換、１７１３位に相当する位置にＡｓｎ置換、７０４位に相当する位置にＴｈｒ置換、及び／または、１０８４位に相当する位置にＩｌｅ置換、を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項５０】
（ｉ）配列番号：１５に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）１８４位に相当する位置にＡｌａ置換、１７３０位に相当する位置にＡｓｎ置換、１８８８位に相当する位置にＡｓｐ置換、３５２位に相当する位置にＴｈｒ置換、３７４位に相当する位置にＳｅｒ置換、１４２３位に相当する位置にＡｒｇ置換、１５０２位に相当する位置にＧｌｕ置換、２８５位に相当する位置にＧｌｎ置換、４７０位に相当する位置にＬｙｓ置換、９３９位に相当する位置にＴｈｒ置換、１６６９位に相当する位置にＰｈｅ置換、２０３４位に相当する位置にＩｌｅ置換、１７１３位に相当する位置にＡｓｎ置換、７０４位に相当する位置にＴｈｒ置換、及び／または、１０８４位に相当する位置にＩｌｅ置換、を含む、組換えポリペプチド。
【請求項５１】
（ｉ）配列番号：１６に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）１１２位に相当する位置にＰｈｅ置換、１２６位に相当する位置にＡｌａ置換、９７８位に相当する位置にＬｅｕ置換、１９９位に相当する位置にＧｌｙ置換、４７６位に相当する位置にＴｈｒ置換、及び／または、７３５位に相当する位置にＶａｌ置換、を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項５２】
（ｉ）配列番号：１６に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）１１２位に相当する位置にＰｈｅ置換、１２６位に相当する位置にＡｌａ置換、９７８位に相当する位置にＬｅｕ置換、１９９位に相当する位置にＧｌｙ置換、４７６位に相当する位置にＴｈｒ置換、及び／または、７３５位に相当する位置にＶａｌ置換、を含む、組換えポリペプチド。
【請求項５３】
請求項１８、請求項４７、請求項４９または請求項５１に記載の核酸分子から選択される少なくとも１つの核酸分子を含む菌株。
【請求項５４】
前記菌株は、請求項１８、請求項４７、請求項４９または請求項５１に記載の核酸分子から選択される少なくとも１つの核酸分子によりコードされる前記ポリペプチドを発現する、請求項５３に記載の菌株。
【請求項５５】
少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の前記核酸分子を含む、請求項５３に記載の菌株。
【請求項５６】
前記菌株は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の前記核酸分子によりコードされる前記ポリペプチドを発現する、請求項５５に記載の菌株。
【請求項５７】
前記菌株はＥ．ｃｏｌｉ株である、請求項５５に記載の菌株。
【請求項５８】
配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：２２に対して少なくとも９０％同一なｔＲＮＡをコードする核酸を含み、以下の特徴、
（ｉ）７位に相当する位置にＧまたはＣ、
（ｉｉ）４９位に相当する位置にＴ、
（ｉｉｉ）５０位に相当する位置にＡまたはＣ、
（ｉｖ）６４位に相当する位置にＴ、
（ｖ）６５位に相当する位置にＧまたはＡ、及び／または、
（ｖｉ）６６位に相当する位置にＧ、ＴまたはＣ、
のうちの１つまたは複数を含む、請求項５３に記載の菌株。
【請求項５９】
前記分子は、配列番号：２０に対して少なくとも約９０％同一な前記配列を含むｔＲＮＡをコードし、以下の特徴、
（ｉ）７位に相当する位置にＧ、
（ｉｉ）４９位に相当する位置にＴ、
（ｉｉｉ）５０位に相当する位置にＣ、
（ｉｖ）６４位に相当する位置にＴ、
（ｖ）６５位に相当する位置にＧ、及び／または、
（ｖｉ）６６位に相当する位置にＣ、
のうちの１つまたは複数を含む、請求項５８に記載の菌株。
【請求項６０】
前記分子は、前記特徴（ｉ）〜（ｖｉ）のうちの２、３、４、５または６つを含む、請求項５９に記載の菌株。
【請求項６１】
前記分子は、配列番号：２０に対して少なくとも９５％同一な配列を含むｔＲＮＡをコードする、請求項５８に記載の菌株。
【請求項６２】
前記分子は、配列番号：２０の前記配列を含むｔＲＮＡをコードする、請求項６１に記載の菌株。
【請求項６３】
前記分子は、配列番号：２１に対して少なくとも約９０％同一な前記配列を含むｔＲＮＡをコードする、請求項５８に記載の菌株。
【請求項６４】
前記分子は、配列番号：２１の前記配列を含むｔＲＮＡをコードする、請求項６３に記載の菌株。
【請求項６５】
前記分子は、配列番号：２２に対して少なくとも約９０％同一な前記配列を含むｔＲＮＡをコードする、請求項５８に記載の菌株。
【請求項６６】
前記分子は、配列番号：２２の前記配列を含むｔＲＮＡをコードする、請求項６５に記載の菌株。
【請求項６７】
セレノシステイン組み込み用のＴＡＧコドンを有するコード配列中に少なくとも１つの位置を有する目的のポリペプチドをコードする発現可能な核配列を更に含む、請求項５３に記載の菌株。
【請求項６８】
前記発現可能な核配列はヒトポリペプチドをコードする、請求項６７に記載の菌株。
【請求項６９】
前記発現可能な核配列は酵素または抗体をコードする、請求項６７に記載の菌株。
【請求項７０】
前記発現可能な核配列はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、請求項６７に記載の菌株。
【請求項７１】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を更に含む、請求項５３に記載の菌株。
【請求項７２】
寄託受入番号４２５９５でＮＣＩＭＢに寄託されたＥ．ｃｏｌｉ菌株。
【請求項７３】
請求項５３から請求項７２のいずれか１項に記載の菌株を含む細菌の培養物。
【請求項７４】
１〜１００ｍｇ／Ｌの前記培養物の量で発現組換えポリペプチドを含む前記培養物を含み、前記発現組換えポリペプチドは少なくとも１つのセレノシステイン残基を含む、細菌の培養物。
【請求項７５】
１０〜４０ｍｇ／Ｌの前記培養物の量で発現組換えポリペプチドを含み、前記発現組換えポリペプチドは少なくとも１つのセレノシステイン残基を含む、請求項７４に記載の培養物。
【請求項７６】
前記発現組換えポリペプチドは請求項のいずれか１項に記載のポリペプチドである、請求項７４または請求項７５に記載の培養物。
【請求項７７】
前記発現組換えポリペプチドは、前記ポリペプチドの野生型には存在しない選択位置に少なくとも１つのセレノシステイン残基を含む、請求項７４または請求項７５に記載の培養物。
【請求項７８】
前記培養物中における前記発現組換えポリペプチドの少なくとも８０％は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、請求項７７に記載の培養物。
【請求項７９】
前記培養物中における前記組換えポリペプチドの８０％〜９９．９％は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、請求項７７に記載の培養物。
【請求項８０】
前記培養物中における前記発現組換えポリペプチドの９０％〜９９％は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、請求項７７に記載の培養物。
【請求項８１】
前記培養物中における前記発現組換えポリペプチドの少なくとも９５％は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、請求項７７に記載の培養物。
【請求項８２】
前記培養物中における前記発現組換えポリペプチドの少なくとも９９％は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、請求項７７に記載の培養物。
【請求項８３】
前記発現組換えポリペプチドはヒトポリペプチドに対して少なくとも９０％同一である、請求項７４または請求項７５に記載の培養物。
【請求項８４】
前記ヒトポリペプチドは疾患に関与するポリペプチドである、請求項８３に記載の培養物。
【請求項８５】
前記発現組換えポリペプチドは抗体または酵素を含む、請求項７４または請求項７５に記載の培養物。
【請求項８６】
前記ポリペプチドは選択位置に少なくとも２つのセレノシステイン残基を含む、請求項７４または請求項７５に記載の培養物。
【請求項８７】
前記選択位置の前記２つのセレノシステイン残基はジセレニド結合を形成する、請求項８６に記載の培養物。
【請求項８８】
前記ポリペプチドは、選択位置に２、３、４、５、６、７、８、９または１０のセレノシステイン残基を含む、請求項８６に記載の培養物。
【請求項８９】
請求項７４から請求項８８のいずれか１項に記載の培養物から精製した少なくとも第１のセレノシステイン残基を含むポリペプチド。
【請求項９０】
少なくとも１つのセレノシステイン残基を含むポリペプチドを発現させるための方法であって、
（ａ）セレン供給源の存在下、請求項５３から請求項７２のいずれか１項に記載の菌株内で前記ポリペプチドをコードする核酸を発現させることと、
（ｂ）前記細菌から前記組換えポリペプチドを精製することと、
を含む、前記方法。
【請求項９１】
（ａ）セレン供給源の存在下、請求項５３から請求項７２のいずれか１項に記載の菌株内で前記ポリペプチドをコードする核酸を発現させることと、
（ｂ）前記細菌から前記組換えポリペプチドを精製することと、
を含む方法により製造した、選択位置に少なくとも１つのセレノシステイン残基を含む組換えポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年７月１１日出願の米国仮特許出願番号６２／３６０，７４５号の利益を主張するものであり、その全体は参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、米国国立科学財団の助成による認可番号ＣＨＥ１４０２７５３のもとで、政府による支援を受けて成立した。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は一般に、分子生物学分野に関する。より詳細には、本発明は、非標準アミノ酸を含むポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
セレンは、セレノプロテインを発現するために特定の微生物が使用する。セレノプロテインとは、原核生物と真核生物の両方に存在し非標準アミノ酸であるセレノシステインを含有するポリペプチドの固有群のことである。セレノシステインはシステインと比較して有意に低いｐＫａ（遊離アミノ酸において５．２対８．５）及びはるかに強い求核性を有しており、そのためタンパク質の化学的性質及び機能を変化させるための魅力的な標的となっている。あいにく、ほとんどのセレノプロテインは、Ｅ．ｃｏｌｉ（組換えタンパク質産生用の標準的な宿主）で産生することが困難であることが判明している。これは、細菌における本質的に低いセレノシステイン組み込み効率（タンパク質合成の停止に対して４〜５％）によるものである。加えて、ＳＥＣＩＳエレメントがＵＧＡコドンにすぐ続きコード配列の一部を形成する条件により、どのタンパク質がセレノシステイン挿入の対象となるかが大いに限定される。
【０００５】
近年では、標準的な翻訳機構に適合し、かつアンバー終止コドンを抑制してセレノシステインを高効率で組み込むことが可能な進化Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡＳｅｃもまた開発された。しかしながら、セレノシステインを効率的に組み込んで商業相当量の組換えセレノプロテインを産生することを可能とする機構に対する未対応のニーズが存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の第１の実施形態は精製組換えポリペプチドを含む組成物を提供し、上記ポリペプチドは、ポリペプチドの野生型には存在しない選択位置に少なくとも１つのセレノシステイン残基を含み、組成物中における組換えポリペプチドの少なくとも８０％は、選択位置にセレノシステイン残基を含む。特定の態様では、組換えポリペプチドは抗体または酵素を含む。特定の態様では、組成物は、少なくとも１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、５００μｇまたは１ｍｇの精製組換えポリペプチドを含む。一部の態様では、精製組換えポリペプチドは９５％〜９９．９％の純度、例えば、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の純度である。
【０００７】
一部の態様では、組成物中における組換えポリペプチドの８０％〜９９．９％は、選択位置にセレノシステイン残基を含む。特定の態様では、組成物中における組換えポリペプチドの９０％〜９９％は、選択位置にセレノシステイン残基を含む。一部の態様では、組成物中における少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の組換えポリペプチドは、選択位置にセレノシステイン残基を含む。なおも更なる態様では、組成物は、選択位置に少なくとも２つのセレノシステイン残基を有する組換えポリペプチドを含み、組成物中における組換えポリペプチドの８０％〜９９．９％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）は、選択位置に両方のセレノシステイン残基を含む。その上更なる態様では、組成物は、ジセレニド結合を形成する少なくとも２つのセレノシステイン残基を選択位置に有する組換えポリペプチドを含み、組成物中における組換えポリペプチドの８０％〜９９．９％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）は、選択位置のセレノシステイン残基間にジセレニド結合を含む。
【０００８】
一部の態様では、組換えポリペプチドは、ヒトポリペプチドに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。特定の態様では、ヒトポリペプチドは疾患に関与するポリペプチドである。一部の態様では、ヒトポリペプチドは、酵素、ケモカイン、サイトカイン、抗体またはＴ細胞受容体である。一部の態様では、抗体はアグリコシル化抗体である。なおも更なる態様では、ヒトポリペプチドはジスルフィド結合を含むポリペプチドであり、組換えポリペプチドはジスルフィド結合の代わりにジセレニド結合を含む。
【０００９】
特定の態様では、ポリペプチドは、選択位置に２、３、４、５、６、７、８、９または１０のセレノシステイン残基を含む。更なる態様では、組成物中における組換えポリペプチドの少なくとも約８０％〜９９．９％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）は、それぞれの選択位置にセレノシステイン残基を含む。なおも更なる態様では、ポリペプチドは選択位置に少なくとも２つのセレノシステイン残基を含む。特定の態様では、選択位置の２つのセレノシステイン残基はジセレニド結合を形成する。
【００１０】
更なる実施形態では、精製組換えポリペプチドを含む実施形態の組成物を含む医薬組成物を提供し、上記ポリペプチドは、ポリペプチドの野生型には存在しない選択位置に少なくとも１つのセレノシステイン残基を含み、組成物中における組換えポリペプチドの少なくとも８０％〜９９．９％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）は、選択位置にセレノシステイン残基を含む。
【００１１】
更なる実施形態では、精製組換えポリペプチドを含む実施形態の有効量の医薬組成物を投与することを含む対象を治療するための方法を提供し、上記ポリペプチドは、ポリペプチドの野生型には存在しない選択位置に少なくとも１つのセレノシステイン残基を含み、組成物中における組換えポリペプチドの少なくとも８０％〜９９．９％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）は、選択位置にセレノシステイン残基を含む。
【００１２】
その上更なる実施形態では、（ａ）配列番号：１であり、配列番号：１の３４４位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｂ）配列番号：２であり、配列番号：２の７０２位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｃ）配列番号：３であり、配列番号：３の６５５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｄ）配列番号：４であり、配列番号：４の７３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｅ）配列番号：５であり、配列番号：５の７８１位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｆ）配列番号：６であり、配列番号：６の１３６位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｇ）配列番号：７であり、配列番号：７の１８３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｈ）配列番号：８であり、配列番号：８の１位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｉ）配列番号：９であり、配列番号：９の１０２位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｊ）配列番号：１０であり、配列番号：１０の１０５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｋ）配列番号：１１であり、配列番号：１１の６７３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｌ）配列番号：１２であり、配列番号：１２の６９位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｍ）配列番号：１３であり、配列番号：１３の１０７位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｎ）配列番号：１７であり、配列番号：１７の２４６位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｏ）配列番号：１８であり、配列番号：１８の５４５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、及び／または、（ｐ）配列番号：１９であり、配列番号：１９の１２４位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００１３】
更なる実施形態では、（ａ）配列番号：１であり、配列番号：１の３４４位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｂ）配列番号：２であり、配列番号：２の７０２位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｃ）配列番号：３であり、配列番号：３の６５５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｄ）配列番号：４であり、配列番号：４の７３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｅ）配列番号：５であり、配列番号：５の７８１位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｆ）配列番号：６であり、配列番号：６の１３６位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｇ）配列番号：７であり、配列番号：７の１８３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｈ）配列番号：８であり、配列番号：８の１位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｉ）配列番号：９であり、配列番号：９の１０２位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｊ）配列番号：１０であり、配列番号：１０の１０５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｋ）配列番号：１１であり、配列番号：１１の６７３位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｌ）配列番号：１２であり、配列番号：１２の６９位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｍ）配列番号：１３であり、配列番号：１３の１０７位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｎ）配列番号：１７であり、配列番号：１７の２４６位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、（ｏ）配列番号：１８であり、配列番号：１８の５４５位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、または、（ｐ）配列番号：１９であり、配列番号：１９の１２４位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドを提供する。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００１４】
一部の態様では、上記段落に記載のポリペプチドは、配列番号：１の３４４位に相当する位置にＰｒｏ置換を含む。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号：２の７０２位に相当する位置にＨｉｓ置換を含む。一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：３の６５５位に相当する位置にＡｌａ置換を含む。一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：４の７３位に相当する位置にＡｌａ置換を含む。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号：５の７８１位に相当する位置にＧｌｙ置換を含む。一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：６の１３６位に相当する位置にＶａｌ置換を含む。一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：７の１８３位に相当する位置にＡｌａ置換を含む。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号：８の１位に相当する位置にＡｒｇ置換を含む。一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：９の１０２位に相当する位置にＣｙｓ置換を含む。一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１０の１０５位に相当する位置にＣｙｓ置換を含む。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１１の６７３位に相当する位置にＬｅｕ置換を含む。一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１２の６９位に相当する位置にＧｌｙ置換を含む。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１３の１０７位に相当する位置にＳｅｒ置換を含む。一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１７の２４６位に相当する位置にＡｌａ置換を含む。特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１８の５４５位に相当する位置にＩｌｅ置換を含む。一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１９の１２４位に相当する位置にＰｒｏ置換を含む。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００１５】
一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、配列番号：１の９９９位に相当する位置にＴｈｒ置換、４５７位に相当する位置にＴｈｒ置換、５９１位に相当する位置にＰｒｏ置換、１８３位に相当する位置にＴｈｒ置換、３５８位に相当する位置にＬｅｕ置換、２３位に相当する位置にＡｒｇ置換、９０２位に相当する位置にＩｌｅ置換、８８９位に相当する位置にＶａｌ置換、６２０位に相当する位置にＣｙｓ置換、及び／または、１７４位に相当する位置にＧｌｙ置換、であるアミノ酸配列を更に含む。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００１６】
特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号：３に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、配列番号：３の３９８位に相当する位置にＣｙｓ置換、６５２位に相当する位置にＡｌａ置換、２６４位に相当する位置にＣｙｓ置換、及び／または、２１位に相当する位置にＡｌａ置換、であるアミノ酸配列を更に含む。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００１７】
一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：４に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、配列番号：４の４５位に相当する位置にＡｓｎ置換、２９０位に相当する位置にＬｅｕ置換、２７１位に相当する位置にＡｓｐ置換、１５３位に相当する位置にＴｙｒ置換、４５位に相当する位置にＶａｌ置換、２８４位に相当する位置にＰｒｏ置換、７３位に相当する位置にＩｌｅ置換、６８位に相当する位置にＬｅｕ置換、６９位に相当する位置にＩｌｅ置換、３０５位に相当する位置にＣｙｓ置換、１４４位に相当する位置にＳｅｒ置換、及び／または、２８１位に相当する位置にＶａｌ置換、であるアミノ酸配列を更に含む。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００１８】
特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号：５に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、配列番号：５の９１６位に相当する位置にＧｌｙ置換、９３８位に相当する位置にＨｉｓ置換、８６０位に相当する位置にＨｉｓ置換、９２５位に相当する位置にＡｓｐ置換、及び／または、４７０位に相当する位置にＭｅｔ置換、であるアミノ酸配列を更に含む。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００１９】
一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：６に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、配列番号：６の１１５位に相当する位置にＡｌａ置換、３８６位に相当する位置にＡｒｇ置換、１５５位に相当する位置にＡｒｇ置換、９８位に相当する位置にＳｅｒ置換、２０１位に相当する位置にＡｌａ置換、２９４位に相当する位置にＴｈｒ置換、１５９位に相当する位置にＴｙｒ置換、及び／または、１１２位に相当する位置にＩｌｅ置換、であるアミノ酸配列を更に含む。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００２０】
一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１８に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、配列番号：１８の７６位に相当する位置にＧｌｙ置換、２９３位に相当する位置にＶａｌ置換、６３７位に相当する位置にＴｈｒ置換、３位に相当する位置にＶａｌ置換、３１１位に相当する位置にＳｅｒ置換、４７１位に相当する位置にＴｈｒ置換、２２８位に相当する位置にＶａｌ置換、３１１位に相当する位置にＳｅｒ置換、及び／または、２５７位に相当する位置にＴｈｒ置換、であるアミノ酸配列を更に含む。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００２１】
特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号：７に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、配列番号：７の１７３位に相当する位置にＶａｌ置換、１９６位に相当する位置にＬｅｕ置換、１８０位に相当する位置にＰｈｅ置換、２４９位に相当する位置にＡｌａ置換、５位に相当する位置にＶａｌ置換、２７３位に相当する位置にＬｅｕ置換、及び／または、１７６位に相当する位置にＡｓｎ置換、であるアミノ酸配列を更に含む。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００２２】
一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：９に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、配列番号：９の１５位に相当する位置にＣｙｓ置換、及び／または、３０位に相当する位置に置換、であるアミノ酸配列を更に含む。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００２３】
特定の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１９に対して少なくとも９０％同一であり、配列番号：１９の１９３位に相当する位置にＩｌｅ置換、２３３位に相当する位置にＴｈｒ置換、３００位に相当する位置にＡｌａ置換、及び／または、１９９位に相当する位置にＡｒｇ置換、であるアミノ酸配列を更に含む。
【００２４】
一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１７に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、配列番号：１７の２４６位に相当する位置にＡｌａ置換、であるアミノ酸配列を更に含む。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００２５】
一部の態様では、ポリペプチドは、配列番号：１１に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、配列番号：１１の１１９位に相当する位置にＶａｌ置換、５３５位に相当する位置にＰｒｏ置換、３７３位に相当する位置にＡｒｇ置換、５３５位に相当する位置にＳｅｒ置換、１１９位に相当する位置にＴｈｒ置換、６０１位に相当する位置にＡｌａ置換、１０３位に相当する位置にＬｙｓ置換、３１位に相当する位置にＡｓｐ置換、６６２位に相当する位置にＩｌｅ置換、３５９位に相当する位置にＬｙｓ置換、及び／または、５１９位に相当する位置にＡｓｐ置換、であるアミノ酸配列を更に含む。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００２６】
別の実施形態では、（ｉ）配列番号：１４に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）２１２位に相当する位置にＩｌｅ置換、１６２位に相当する位置にＡｓｎ置換、２９９位に相当する位置にＡｌａ置換、及び／または、２２０位に相当する位置にＡｒｇ置換、を含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００２７】
更に別の実施形態では、（ｉ）配列番号：１４に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）２１２位に相当する位置にＩｌｅ置換、１６２位に相当する位置にＡｓｎ置換、２９９位に相当する位置にＡｌａ置換、及び／または、２２０位に相当する位置にＡｒｇ置換、を含む組換えポリペプチドを提供する。なおも更なる態様では、上記ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸分子を提供する。
【００２８】
更なる実施形態では、（ｉ）配列番号：１５に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）１８４位に相当する位置にＡｌａ置換、１７３０位に相当する位置にＡｓｎ置換、１８８８位に相当する位置にＡｓｐ置換、３５２位に相当する位置にＴｈｒ置換、３７４位に相当する位置にＳｅｒ置換、１４２３位に相当する位置にＡｒｇ置換、１５０２位に相当する位置にＧｌｕ置換、２８５位に相当する位置にＧｌｎ置換、４７０位に相当する位置にＬｙｓ置換、９３９位に相当する位置にＴｈｒ置換、１６６９位に相当する位置にＰｈｅ置換、２０３４位に相当する位置にＩｌｅ置換、１７１３位に相当する位置にＡｓｎ置換、７０４位に相当する位置にＴｈｒ置換、及び／または、１０８４位に相当する位置にＩｌｅ置換、を含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００２９】
その上更なる実施形態では、（ｉ）配列番号：１５に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）１８４位に相当する位置にＡｌａ置換、１７３０位に相当する位置にＡｓｎ置換、１８８８位に相当する位置にＡｓｐ置換、３５２位に相当する位置にＴｈｒ置換、３７４位に相当する位置にＳｅｒ置換、１４２３位に相当する位置にＡｒｇ置換、１５０２位に相当する位置にＧｌｕ置換、２８５位に相当する位置にＧｌｎ置換、４７０位に相当する位置にＬｙｓ置換、９３９位に相当する位置にＴｈｒ置換、１６６９位に相当する位置にＰｈｅ置換、２０３４位に相当する位置にＩｌｅ置換、１７１３位に相当する位置にＡｓｎ置換、７０４位に相当する位置にＴｈｒ置換、及び／または、１０８４位に相当する位置にＩｌｅ置換、を含む組換えポリペプチドを提供する。
【００３０】
一実施形態では、（ｉ）配列番号：１６に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）１１２位に相当する位置にＰｈｅ置換、１２６位に相当する位置にＡｌａ置換、９７８位に相当する位置にＬｅｕ置換、１９９位に相当する位置にＧｌｙ置換、４７６位に相当する位置にＴｈｒ置換、及び／または、７３５位に相当する位置にＶａｌ置換、を含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００３１】
更なる実施形態では、（ｉ）配列番号：１６に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列、ならびに、（ｉｉ）１１２位に相当する位置にＰｈｅ置換、１２６位に相当する位置にＡｌａ置換、９７８位に相当する位置にＬｅｕ置換、１９９位に相当する位置にＧｌｙ置換、４７６位に相当する位置にＴｈｒ置換、及び／または、７３５位に相当する位置にＶａｌ置換、を含む組換えポリペプチドを提供する。
【００３２】
一実施形態ではまた、実施形態の少なくとも１つの核酸分子を含む、または、実施形態の少なくとも１つのポリペプチド（例えば、配列番号：１のポリペプチドのうちの１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり表１に記載した置換のうちの１つを含むポリペプチド）を発現する、菌株を提供する。一部の態様では、菌株は、表１のポリペプチドをコードする少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９の核酸分子を含む。一部の態様では、菌株は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９の核酸分子によりコードされるポリペプチドを発現する。
【００３３】
更なる態様では、菌株は、セレノシステイン組み込み用の、ｔＲＮＡをコードする核酸及びアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を含む。一部の態様では、ｔＲＮＡはＵＡＧコドンを認識する。一部の態様では、菌株は、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：２２に対して少なくとも９０％同一なｔＲＮＡをコードする核酸を含む。一部の態様では、菌株は、以下の特徴、（ｉ）７位に相当する位置にＧまたはＣ、（ｉｉ）４９位に相当する位置にＴ、（ｉｉｉ）５０位に相当する位置にＡまたはＣ、（ｉｖ）６４位に相当する位置にＴ、（ｖ）６５位に相当する位置にＧまたはＡ、及び／または、（ｖｉ）６６位に相当する位置にＧ、ＴまたはＣ、のうちの１つまたは複数を更に含む。一部の態様では、分子は、配列番号：２０に対して少なくとも約９０％同一な配列を含むｔＲＮＡをコードし、以下の特徴、（ｉ）７位に相当する位置にＧ、（ｉｉ）４９位に相当する位置にＴ、（ｉｉｉ）５０位に相当する位置にＣ、（ｉｖ）６４位に相当する位置にＴ、（ｖ）６５位に相当する位置にＧ、及び／または、（ｖｉ）６６位に相当する位置にＣ、のうちの１つまたは複数を含む。更なる態様では、分子は、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０または配列番号：４に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を含むｔＲＮＡをコードする。特定の態様では、分子は、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０または配列番号：４を含むｔＲＮＡをコードする。
【００３４】
一部の態様では、菌株は、セレノシステイン組み込み用のＴＡＧコドンを有するコード配列中に少なくとも１つの位置を有する目的のポリペプチドをコードする発現可能な核配列を更に含む。特定の態様では、発現可能な核配列はヒトポリペプチドをコードする。一部の態様では、発現可能な核配列は酵素または抗体をコードする。特定の態様では、発現可能な核配列はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。一部の態様では、菌株は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を更に含む。
【００３５】
更なる態様では、菌株は、グラム陰性菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株などである。更なる実施形態では、受入番号４２５９５でＮＣＩＭＢに寄託されたＥ．ｃｏｌｉ菌株を提供する。その上更なる実施形態では、セレン供給源の存在下、実施形態に記載の菌株内でポリペプチドをコードする核酸を発現させて、細菌から組換えポリペプチドを精製することにより製造した、選択位置に少なくとも１つのセレノシステイン残基を含む組換えポリペプチドを提供する。
【００３６】
更なる実施形態では、５〜１００ｍｇ／Ｌの培養物の量で発現組換えポリペプチドを含む、細菌の培養物を提供する。特定の態様では、発現組換えポリペプチドは少なくとも１つのセレノシステイン残基を含む。一部の態様では、細菌の培養物は、１０〜４０ｍｇ／Ｌの培養物の量で発現組換えポリペプチドを含み、上記発現組換えポリペプチドは少なくとも１つのセレノシステイン残基を含む。特定の態様では、発現組換えポリペプチドは、５〜５０ｍｇ／Ｌ、１０〜８０ｍｇ／Ｌ、１５〜６０ｍｇ／Ｌ、１０〜３０ｍｇ／Ｌ、２０〜８０ｍｇ／Ｌ、３０〜９０ｍｇ／Ｌ、４０〜８０ｍｇ／Ｌ、５０〜７０ｍｇ／Ｌ、６０〜９０ｍｇ／Ｌ、７０〜８０ｍｇ／Ｌ、または、９０〜１００ｍｇ／Ｌの培養物の量で存在する。特定の態様では、発現組換えポリペプチドは、５〜１０ｍｇ／Ｌ、７〜１５ｍｇ／Ｌ、１０〜２０ｍｇ／Ｌ、１５〜３０ｍｇ／Ｌ、２０〜３５ｍｇ／Ｌ、３０〜４０ｍｇ／Ｌ、３５〜４５ｍｇ／Ｌ、４０〜５０ｍｇ／Ｌ、４５〜５５ｍｇ／Ｌ、５０〜５０ｍｇ／Ｌ、５５〜６５ｍｇ／Ｌ、５０〜６０ｍｇ／Ｌ、６５〜７０ｍｇ／Ｌ、７５〜８５ｍｇ／Ｌ、８５〜９０ｍｇ／Ｌ、８０〜９５ｍｇ／Ｌ、８５〜９８ｍｇ／Ｌ、または、９５〜１００ｍｇ／Ｌの培養物の量で存在する。特定の態様では、発現組換えポリペプチドは、培養物中において少なくとも１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、３５ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、４５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、５５ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、６５ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、８５ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、９５ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、またはそれ以上の量である。
【００３７】
一部の態様では、発現組換えポリペプチドは実施形態のポリペプチド（例えば、配列番号：１のポリペプチドのうちの１つに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり表１に記載した置換のうちの１つを含むポリペプチド）である。特定の態様では、発現組換えポリペプチドは、ポリペプチドの野生型には存在しない選択位置に少なくとも１つのセレノシステイン残基を含む。一部の態様では、培養物中における発現組換えポリペプチドの少なくとも８０％は、選択位置にセレノシステイン残基を含む。特定の態様では、培養物中における組換えポリペプチドの８０％〜９９．９％は、選択位置にセレノシステイン残基を含む。一部の態様では、培養物中における発現組換えポリペプチドの９０％〜９９％は、選択位置にセレノシステイン残基を含む。一部の態様では、培養物中における発現組換えポリペプチドの少なくとも９５％は、選択位置にセレノシステイン残基を含む。一部の態様では、培養物中における発現組換えポリペプチドの少なくとも９９％は、選択位置にセレノシステイン残基を含む。一部の態様では、発現組換えポリペプチドはヒトポリペプチドに対して少なくとも９０％同一である。特定の態様では、ヒトポリペプチドは疾患に関与するポリペプチドである。一部の態様では、発現組換えポリペプチドは抗体または酵素を含む。特定の態様では、ポリペプチドは選択位置に少なくとも２つのセレノシステイン残基を含む。一部の態様では、選択位置の２つのセレノシステイン残基はジセレニド結合を形成する。特定の態様では、ポリペプチドは、選択位置に２、３、４、５、６、７、８、９または１０のセレノシステイン残基を含む。なおも更なる実施形態では、実施形態の培養物から精製した少なくとも第１のセレノシステイン残基を含むポリペプチドを提供する。更に別の実施形態では、（ａ）セレン供給源の存在下、実施形態の菌株内でポリペプチドをコードする核酸を発現させること、及び、（ｂ）細菌から組換えポリペプチドを精製すること、を含む、少なくとも１つのセレノシステイン残基を含むポリペプチドを発現させるための方法を提供する。別の実施形態では、（ａ）セレン供給源の存在下、実施形態の菌株内でポリペプチドをコードする核酸を発現させること、及び、（ｂ）細菌から組換えポリペプチドを精製すること、を含む方法により製造した、選択位置に少なくとも１つのセレノシステイン残基を含む組換えポリペプチドを提供する。
【００３８】
なおも更なる実施形態では、少なくとも１つのセレノシステイン残基を含むポリペプチドを産生するための宿主としての、実施形態の菌株の使用を提供する。更なる態様では、セレン供給源を含む培地内で菌株を培養する。
【００３９】
更なる実施形態では、少なくとも第１の非標準アミノ酸、及びマーカーポリペプチドの少なくとも１つの位置が上記第１の非標準アミノ酸である場合に高活性を示すスクリーンまたは選択マーカーポリペプチドを組み込むための翻訳成分をコードする非相同核酸を含む遺伝子組換え菌株を提供する。特定の態様では、スクリーンマーカーは蛍光性または発光性のポリペプチドである。更なる態様では、菌株は、実施形態の少なくとも１つの核酸分子を含む、または、実施形態の少なくとも１つのポリペプチド（例えば、配列番号：１のポリペプチドのうちの１つに対して少なくとも９０％同一であり表１に記載した置換のうちの１つを含むポリペプチド）を発現する。
【００４０】
その他の態様では、菌株は、マーカーポリペプチドの少なくとも１つの位置が上記第１の非標準アミノ酸である場合に高活性を示す選択マーカーをコードする非相同核酸を含む。更なる態様では、選択マーカーは抗生物質耐性をもたらすポリペプチドである。特定の態様では、選択マーカーはβ−ラクタマーゼ酵素である。
【００４１】
一部の態様では、菌株はグラム陽性菌細胞またはグラム陰性菌細胞である。一部の特定の態様では、菌細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。その他の特定の態様では、菌細胞はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ菌またはＳｅｒｒａｔｉａ菌である。更なる態様では、菌細胞はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ菌細胞またはＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ菌細胞である。
【００４２】
特定の態様では、第１の非標準アミノ酸を組み込むための翻訳成分は、第１の非標準アミノ酸用の、ｔＲＮＡをコードする核酸及びアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を含む。一部の態様では、ｔＲＮＡはＵＡＧコドンを認識する。更なる態様では、ｔＲＮＡは、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２または配列番号：２３に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。特定の態様では、ｔＲＮＡは、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２または配列番号：２３を含む。
【００４３】
なおも更なる態様では、第１の非標準アミノ酸を組み込むための翻訳成分は、第１の非標準アミノ酸を合成するための酵素をコードする核酸を更に含む。特定の態様では、非標準アミノ酸はセレノシステインである。その他の態様では、細胞は、ｓｅｌＡ、ｓｅｌＢ及び／またはｓｅｌＣをコードする核酸を含む。特定の態様では、細胞はｓｅｌＡをコードする核酸を含む。一部の態様では、菌細胞は、不活化または欠失したｐｒｆＡ遺伝子を含む。特定の態様では、内在性アンバー（ＴＡＧ）コドンを欠失するように、細胞を遺伝子改変した。一部の特定の態様では、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ３２１．ΔＡである、または、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ３２１．ΔＡに由来する。
【００４４】
更なる実施形態では、本発明は、上記の実施形態及び態様に記載の菌細胞の集団を提供する。特定の態様では、集団は１×１０３〜１×１０１２個の菌細胞を含む。
【００４５】
なおも更なる実施形態では、（ｉ）実施形態に記載の菌株、及び商業用ポリペプチドをコードする発現カセットを得ること、及び（ｉｉ）商業用ポリペプチドを発現させる条件で菌株をインキュベートすること、を含む、少なくとも第１の非標準アミノ酸を含む商業用ポリペプチドを製造するための方法を提供する。一部の態様では、商業用ポリペプチドをコードする発現カセットは、誘導性プロモーターの制御下にある。特定の態様では、方法は、発現商業用ポリペプチドを単離することを更に含む。
【００４６】
その上なおも更なる実施形態では、本発明は、（ｉ）実施形態に記載の菌細胞の集団を得ること（上記細胞は候補ポリペプチドのライブラリをコードし、上記ポリペプチドは少なくとも第１の非標準アミノ酸位置を含む）、及び（ｉｉ）細菌の集団をスクリーニングして所望の生物学的活性を有する候補ポリペプチドを同定すること、を含む、所望の活性を有するポリペプチドをスクリーニングするための方法を提供する。特定の態様では、菌細胞の集団は、１００〜１０，０００，０００の異なる候補ポリペプチドをコードする核酸構築物を含む。
【００４７】
なおも更なる実施形態では、組換え核酸分子を提供し、分子は、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：２２に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なｔＲＮＡをコードし、以下の特徴、７位に相当する位置にＧまたはＣ、４９位に相当する位置にＴ、５０位に相当する位置にＡまたはＣ、６４位に相当する位置にＴ、６５位に相当する位置にＧまたはＡ、及び／または、６６位に相当する位置にＧ、ＴまたはＣ、のうちの１つまたは複数を含む。一部の特定の態様では、分子は、配列番号：２０に対して少なくとも約９０％同一な配列を含むｔＲＮＡをコードし、上記の特徴のうちの１つまたは複数を含む。更なる特定の態様では、分子は、上記の特徴のうちの２、３、４、５または６つを含む。特定の態様では、分子は、配列番号：２１または配列番号：１９に対して少なくとも約９０％同一な配列を含むｔＲＮＡをコードする。特定の態様では、分子は、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：２２の配列を含むｔＲＮＡをコードする。
【００４８】
その上なおも更なる実施形態では、β−ラクタマーゼ酵素をコードする組換えポリペプチドを提供し、上記酵素は酵素の活性化に必要なジスルフィド結合を２つのシステイン位置間に含み、上記２つのシステイン位置のうち少なくとも１つはセレノシステインで置換される。一部の態様では、上記システイン残基の両方はセレノシステインで置換される。更なる態様では、β−ラクタマーゼ酵素はＳＭＥ型β−ラクタマーゼまたはＮＭＣ−Ａ  β−ラクタマーゼである。例えば、β−ラクタマーゼは、配列番号：２４に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を含んでいてもよく、Ｃ６９及び／またはＣ２３８に相当する位置はセレノシステインである。特定の態様では、Ｃ６９及びＣ２３８に相当する位置はセレノシステインである。
【００４９】
本発明の更なる実施形態では、上記の実施形態及び態様に記載のポリペプチドをコードする組換え核酸分子を提供する。一部の態様では、セレノシステイン位置（複数可）に相当するコドンはＵＡＧコドンである。その他の態様では、配列は、配列番号：２５に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００５０】
本明細書で使用する場合、特定の構成成分に関する「実質的に含まない」とは、特定の構成成分が組成物へと意図的に製剤化されていないこと、及び／または、わずかな汚染物質としてまたは微量で存在していることを意味するために本明細書で使用される。それゆえ、組成物の任意の意図しない汚染による特定構成成分の総量は、０．０１％をかなり下回る。標準的な解析法により特定構成成分の量が検出され得ない組成物が最も好ましい。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは複数を意味していてもよい。本発明における請求項（複数可）で使用する場合、語「含む」と共に使用する場合の語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは２つ以上を意味していてもよい。
【００５２】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、単に選択肢を意味することまたはその選択肢が相互排他的であることを明確に示さない限りにおいて、単なる選択肢及び「及び／または」を意味する定義を本開示が支持してはいるが、「及び／または」を意味するために使用される。本明細書で使用する場合、「別の」とは、少なくとも第２のまたはそれ以上のことを意味していてもよい。
【００５３】
本出願の全体にわたり、用語「約」とは、値または試験対象中に存在する変動を測定するために採用する装置、方法における誤差の固有変動を値が含むことを示すために使用される。
【００５４】
本発明のその他の目的、特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態により明らかとなるであろう。しかしながら、発明を実施するための形態及び特定の実施例については、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、単に例示として示されていると理解するべきであり、そのため、本発明の趣旨内及び範囲内における様々な変更及び修正は、本明細書の発明を実施するための形態により当業者に明らかとなるであろう。
【００５５】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様を更に説明するために含まれる。本明細書で提供する特定の実施形態の発明を実施するための形態と組み合わせてこれら図面のうちの１つまたは複数を参照することにより、本発明をより適切に理解することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１Ａ〜１Ｃ：セレノプロテイン産生用のＥ．ｃｏｌｉ株が増殖及び生存においてセレノシステインに条件的に依存していることを示す図である。天然ジスルフィド結合（Ａ）を有する組み込みβ−ラクタマーゼを含有するＥ．ｃｏｌｉ株は、β−ラクタム抗生物質カルベニシリンの存在下で生存するのにセレン補充を必要としない。それぞれセレニル−スルフヒドリル結合またはジセレニド結合のいずれかを形成する、１つの不可欠なセレノシステイン残基（Ｂ）または２つの不可欠なセレノシステイン残基（Ｃ）のいずれかを有するＥ．ｃｏｌｉ株は、β−ラクタム抗生物質に対する耐性のためのセレンを必要とする。セレノシステイン組み込みに対する条件的依存により、さもなければ毒性となるセレノシステイン生合成及び組み込み機構の低下または減弱を防止する。Ｂ及びＣにおいて、線は、上部から下部にかけて、１６時間時点のＭＯＰＳ  ＥＺ、Ｓｅのみ、Ｓｅ＋Ｃａｒｂ、及びＣａｒｂのみを示している。
【図２】図２Ａ〜２Ｂ：セレノプロテイン産生用のＥ．ｃｏｌｉ株が、細胞増殖、及びセレノシステイン依存性β−ラクタマーゼを介してβ−ラクタム抗生物質に対する耐性を有意に向上させる一組の変異を含有していることを示す図である。親Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ａ）は、富栄養培地内における増殖中にセレノシステイン依存性β−ラクタマーゼが介在する、β−ラクタム抗生物質に対する中程度の耐性を有している。一連の変異を含有する組換えセレノプロテイン産生用のＥ．ｃｏｌｉ株（Ｂ）は、より高い増殖率、最終細胞密度、及びカルベニシリンに対する耐性を有している。この向上した増殖が、変異株を組換えセレノプロテイン産生用の優れた宿主にする。Ａにおいて、線は、上部から下部にかけて、１６時間時点のＬＢ、１００  Ｃａｒｂ、１０００  Ｃａｒｂ、及び１００００  Ｃａｒｂを示している（１０００  Ｃａｒｂと１００００  Ｃａｒｂの線は重なっている）。Ｂにおいて、線は、上部から下部にかけて、１６時間時点のＬＢ、１００  Ｃａｒｂ、１０００  Ｃａｒｂ、及び１００００  Ｃａｒｂを示している（１００  Ｃａｒｂと１０００  Ｃａｒｂの線は重なっている）。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｂ：セレノプロテイン産生用のＥ．ｃｏｌｉ株が、所定の培地内における細胞増殖を有意に向上させる一組の変異を含有していることを示す図である。親Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ａ）は、所定の増殖培地内において、長い誘導期を有し、増殖不良を示している。一連の変異を含有する組換えセレノプロテイン産生用のＥ．ｃｏｌｉ株（Ｂ）は、より高い増殖率、最終細胞密度、及びβ−ラクタム抗生物質に対するセレノシステイン依存性耐性を有している。再現性及び品質保証のために、通常、組換えタンパク質の商業的な製造用に所定の増殖培地を使用する。Ａ及びＢにおいて、線は、上部から下部にかけて、２０時間時点のＭＯＰＳ  ＥＺ、Ｓｅのみ、Ｓｅ＋Ｃａｒｂ、及びＣａｒｂのみを示している。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｂ：セレノプロテイン産生用のＥ．ｃｏｌｉ株が、所定の培地内における細胞増殖を有意に向上させる一組の変異を含有していることを示す図である。親Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ａ）は、所定の増殖培地内において、長い誘導期を有し、増殖不良を示している。一連の変異を含有する組換えセレノプロテイン産生用のＥ．ｃｏｌｉ株（Ｂ）は、より高い増殖率、最終細胞密度、及びβ−ラクタム抗生物質に対するセレノシステイン依存性耐性を有している。再現性及び品質保証のために、通常、組換えタンパク質の商業的な製造用に所定の増殖培地を使用する。Ａ及びＢにおいて、線は、上部から下部にかけて、２０時間時点のＭＯＰＳ  ＥＺ、Ｓｅのみ、Ｓｅ＋Ｃａｒｂ、及びＣａｒｂのみを示している。
【図４】図４Ａ〜４Ｂ：ジセレニド結合を含有するＥ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸還元酵素のインタクトマススペクトル及びＵＶＰＤフラグメンテーションマップを示す図である。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨＦＲのマススペクトル（Ａ、平均マスを示す）により、約１００％の効率で２つのセレノシステイン残基が組み込まれていることが確認される。１つのセリン残基または２つのセリン残基のいずれかの組み込みに相当するマスは検出されなかった。ＵＶＰＤフラグメンテーションマップ（Ｂ、配列番号：２６）により、３９位及び８５位にセレノシステイン（Ｕ）が組み込まれジセレニド結合が形成されていることが確認される。ジセレニド結合形成は、２つのセレノシステイン残基間のフラグメンテーション事象に相当するイオンの欠乏により示されている。ＤＨＦＲの収率は８ｍｇ／Ｌであった。ジセレニド結合を含有するその他のタンパク質は、４０ｍｇ／Ｌを超える収率で発現していた。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａ〜５Ｃ：２つの不可欠なジセレニド結合を含有する抗ＭＳ２  ｓｃＦｖのマススペクトル及びＵＶＰＤフラグメンテーションマップを示す図である。組換えセレノプロテイン発現用に開発したＥ．ｃｏｌｉ株は、細菌細胞質内におけるジセレニド安定化抗体フラグメントの産生を可能とする。ジスルフィド結合を含有するタンパク質の発現用に開発したＥ．ｃｏｌｉ株とは異なり、この株は高い細胞質酸化還元電位を必要としない。実験で同定したモノ同位体マス（Ａ）は、２つのジセレニド結合を形成している４つのセレノシステイン残基を含有する組換え抗ＭＳ２  ｓｃＦｖと一致する。ジセレニド結合形成は、４つのプロトンの消失により示されている（Ａ、行３対行２）。４つのセレノシステイン残基を含有する抗ＭＳ２  ｓｃＦｖのインタクトマススペクトル（Ｂ）は平均マスを示した。セリン残基の組み込みに相当するマスは検出されなかった。ＵＶＰＤフラグメンテーションマップ（Ｃ、配列番号：２７）により、４２位、１１６位、１７９位及び２４９位にセレノシステイン（Ｕ）が組み込まれ、またジセレニド結合が形成されていることが確認される。ジセレニド結合形成は、対のセレノシステイン残基（Ｕ４２：Ｕ１１６、及び、Ｕ１７９：Ｕ２４９）間のフラグメンテーション事象に相当するイオンの欠乏により示されている。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃ：２つの不可欠なジセレニド結合を含有する抗ＭＳ２  ｓｃＦｖのマススペクトル及びＵＶＰＤフラグメンテーションマップを示す図である。組換えセレノプロテイン発現用に開発したＥ．ｃｏｌｉ株は、細菌細胞質内におけるジセレニド安定化抗体フラグメントの産生を可能とする。ジスルフィド結合を含有するタンパク質の発現用に開発したＥ．ｃｏｌｉ株とは異なり、この株は高い細胞質酸化還元電位を必要としない。実験で同定したモノ同位体マス（Ａ）は、２つのジセレニド結合を形成している４つのセレノシステイン残基を含有する組換え抗ＭＳ２  ｓｃＦｖと一致する。ジセレニド結合形成は、４つのプロトンの消失により示されている（Ａ、行３対行２）。４つのセレノシステイン残基を含有する抗ＭＳ２  ｓｃＦｖのインタクトマススペクトル（Ｂ）は平均マスを示した。セリン残基の組み込みに相当するマスは検出されなかった。ＵＶＰＤフラグメンテーションマップ（Ｃ、配列番号：２７）により、４２位、１１６位、１７９位及び２４９位にセレノシステイン（Ｕ）が組み込まれ、またジセレニド結合が形成されていることが確認される。ジセレニド結合形成は、対のセレノシステイン残基（Ｕ４２：Ｕ１１６、及び、Ｕ１７９：Ｕ２４９）間のフラグメンテーション事象に相当するイオンの欠乏により示されている。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａ〜６Ｄ：野生型抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖ（それぞれＡとＢ）及びセレノ抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖ（それぞれＣとＤ）のＵＶＰＤフラグメントマップ及びＥＬＩＳＡを示す図である。１９３ｎｍのＵＶＰＤ配列情報において、共有結合した（または電位的に結合した）システイン残基（Ａ、配列番号：２８）及び共有結合した（または電位的に結合した）セレノシステイン残基（Ｃ、配列番号：２９）は灰色で濃淡を付けている。配列カバレッジ内のギャップは、システイン残基間における共有ジスルフィド結合の形成を示している。セレノシステイン残基間にフラグメンテーションが無いことにより、２つのジセレニド結合の形成が確認される。結合性は野生型抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖと同一である。野生型抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖをＤＴＴで処理することにより活性が有意に低下する（Ｂ）。セレノシステイン含有ｓｃＦｖは還元条件に対する強い耐性を示す（Ｄ）。５０ｍＭのＤＴＴで処理することにより、親和性のわずかな低下のみがもたらされた（ＥＣ５０  ７．９５ｎＭ〜ＥＣ５０  １１．４ｎＭ）。図６Ｂ及び図６Ｄにおいて、線は、上部から下部にかけて、ｓｃＦｖ濃度１０ｎＭにおける０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、及び、５０ｍＭ  ＤＴＴを示している。
【図６Ｃ−Ｄ】図６Ａ〜６Ｄ：野生型抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖ（それぞれＡとＢ）及びセレノ抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖ（それぞれＣとＤ）のＵＶＰＤフラグメントマップ及びＥＬＩＳＡを示す図である。１９３ｎｍのＵＶＰＤ配列情報において、共有結合した（または電位的に結合した）システイン残基（Ａ、配列番号：２８）及び共有結合した（または電位的に結合した）セレノシステイン残基（Ｃ、配列番号：２９）は灰色で濃淡を付けている。配列カバレッジ内のギャップは、システイン残基間における共有ジスルフィド結合の形成を示している。セレノシステイン残基間にフラグメンテーションが無いことにより、２つのジセレニド結合の形成が確認される。結合性は野生型抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖと同一である。野生型抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖをＤＴＴで処理することにより活性が有意に低下する（Ｂ）。セレノシステイン含有ｓｃＦｖは還元条件に対する強い耐性を示す（Ｄ）。５０ｍＭのＤＴＴで処理することにより、親和性のわずかな低下のみがもたらされた（ＥＣ５０  ７．９５ｎＭ〜ＥＣ５０  １１．４ｎＭ）。図６Ｂ及び図６Ｄにおいて、線は、上部から下部にかけて、ｓｃＦｖ濃度１０ｎＭにおける０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、及び、５０ｍＭ  ＤＴＴを示している。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ〜７Ｃ：Ｅ．ｃｏｌｉ株  ＢＬ２１ＤＥ３（Ａ、配列番号：３０）、Ｔ７  Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｂ、配列番号：３０）、ＲＴΔＡ−２Ｘ３１０Ｋ（Ｃ、配列番号：３１）内で産生されたトラスツズマブ（ハーセプチン）ｓｃＦｖのＵＶＰＤフラグメントマップを示す図である。上に示した１９３ｎｍのＵＶＰＤ配列情報において、共有結合した（または電位的に結合した）システイン残基（Ｂ）及び共有結合したセレノシステイン残基（Ｃ）は灰色で濃淡を付けている。Ａのタンパク質配列全体の均一なフラグメンテーションは、ジスルフィド結合が形成されていないことを示している。Ｂの後半の配列におけるフラグメンテーションが無いことにより、ＶＨ領域のみにおけるジスルフィド結合の形成が確認される。酸化条件で発現しているにもかかわらず、ＶＬ領域内においてジスルフィド結合は形成されなかった。ＣにおけるＶＬ領域とＶＨ領域の両方でフラグメンテーションが無いことにより、２つのジセレニド結合の形成が確認される。ジセレニドｓｃＦｖのみが、天然及び想定共有結合構築物を採用した。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃ：Ｅ．ｃｏｌｉ株  ＢＬ２１ＤＥ３（Ａ、配列番号：３０）、Ｔ７  Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｂ、配列番号：３０）、ＲＴΔＡ−２Ｘ３１０Ｋ（Ｃ、配列番号：３１）内で産生されたトラスツズマブ（ハーセプチン）ｓｃＦｖのＵＶＰＤフラグメントマップを示す図である。上に示した１９３ｎｍのＵＶＰＤ配列情報において、共有結合した（または電位的に結合した）システイン残基（Ｂ）及び共有結合したセレノシステイン残基（Ｃ）は灰色で濃淡を付けている。Ａのタンパク質配列全体の均一なフラグメンテーションは、ジスルフィド結合が形成されていないことを示している。Ｂの後半の配列におけるフラグメンテーションが無いことにより、ＶＨ領域のみにおけるジスルフィド結合の形成が確認される。酸化条件で発現しているにもかかわらず、ＶＬ領域内においてジスルフィド結合は形成されなかった。ＣにおけるＶＬ領域とＶＨ領域の両方でフラグメンテーションが無いことにより、２つのジセレニド結合の形成が確認される。ジセレニドｓｃＦｖのみが、天然及び想定共有結合構築物を採用した。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
タンパク質中における非標準アミノ酸の使用は、広範囲の用途に利用可能な著しく発展した機能を有するポリペプチドの実現性を提供する。例えば、ポリペプチドにセレノシステインを組み込むことにより、高レベルの安定性または活性を有する酵素を開発すること、及び非常に活性な治療用ポリペプチドを製造することが可能となり得る。しかしながら、これらの手法はこれまでのところ、翻訳経路を安定的に保持して予測可能かつ確実にコードポリペプチドにセレノシステインを組み込む微生物を作製できないことにより制限されている。それゆえ、本開示は、効率的にセレノシステインタンパク質を産生することができる進化Ｅ．ｃｏｌｉ株及び進化Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子を提供することにより、現行技術に関する課題を克服する。特に、コードセレノシステイン残基の実質的に完全な組み込みを示す商業相当量のセレノプロテインを得ることを初めて可能にする。本製造を可能とする菌株及び変異遺伝子も提供する。例えば、本明細書で示す試験は、セレン豊富培地内における生存を最適化しセレノシステインに対する依存の維持を確保するための経路を含有する、ａｃｒＢ、ａｄｈＥ、ａｒｃＢ、ｃｙｓＫ、ｄｎａＥ、ｆｔｓＡ及びｆｔｓＬを含む遺伝子内におけるいくつかの点変異を同定している。１つの例示的な菌株は、高い増殖率、より高い最終細胞密度、及びこの株を使用して生成したポリペプチド内に約１００％のセレノシステイン組み込みをもたらす、それらのコア変異を含有する変異ＲＴΔＡ  ２Ｘ３１０Ｋ  Ｅ．ｃｏｌｉ株である。それゆえ、本明細書では、効率的にセレノシステインを組み込み、セレノシステイン位置を組み込むポリペプチドを製造するための方法及び組成物を提供する。
【００５８】
Ｉ．セレノシステインを組み込むための機構
本開示の実施形態では、セレノシステインを組み込むための機構、例えば、セレノプロテインを産生するための機構などを提供する。一態様では、機構は菌株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株などであり、細胞増殖またはセレノシステイン組み込みを高める遺伝子のうちの１つまたは複数内に１つまたは複数のアミノ酸置換または欠失を含む。菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ０１２  ＭＧ１６５５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ０００９６．３）、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｃ３２１ΔＡ（ＵＳ２０１６／００６０３０１）またはＥ．ｃｏｌｉ株ＲＴΔＡであってもよい。特定の実施形態では、菌株はＲＴΔＡ  ２Ｘ３１０Ｋ株である。
【００５９】
特定の態様では、機構は、セレノシステインに条件的に依存する進化菌株を含む。１つの例では、ゲノムｓｅｌＡ、ｓｅｌＢ及びｓｅｌＣ遺伝子（それぞれｓｅｌＡ、ｓｅｌＢ及びｔＲＮＡＳｅｃをコードする）の欠失を含み、一連の非天然アミノ酸の効率的な組み込みを可能とする解離因子１（ＲＦ１）をコードするｐｒｆＡ遺伝子を欠く、ＲＴΔＡ株などの株から進化菌株を誘導する。これら遺伝子を欠失させることにより、ＵＡＧ抑制ｔＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡＳｅｃＵｘ）と内在性セレノシステイン組み込み機構の間における任意のクロストークが排除される。加えて、ＲＴΔＡ株は、セレノシステインに対するレポータータンパク質、β−ラクタム抗生物質に対する耐性のためのセレノシステイン組み込みに条件的に依存させるのに不可欠なセレニル−スルフヒドリル結合またはジセレニド結合（ΔａｐｈＣ：：ｎｍｃＡ  Ｃ６９Ｕ  Ｃ２３８、または、Ｃ６９Ｕ  Ｃ２３８Ｕ）を有するＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ由来のＮＭＣ−Ａ  β−ラクタマーゼ、を含有する。セレノシステイン組み込みに対する条件的依存により、さもなければ毒性となるセレノシステイン生合成及び組み込み機構の低下または減弱を防止する。セレノシステイン組み込みの効率は、セレノシステインの部位特異的組み込みのための進化ｔＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡＳｅｃＵｘ；米国特許出願公開番号２０１７／０１６６９４５号（参照として本明細書に組み込まれる））の発現により向上し得る。更なる向上作用は、ｓｅｌＤ、ｓｅｌＡ及び／またはｐｓｔＫ遺伝子を含むがこれらに限定されない様々な遺伝子の発現を含んでいてもよい。例えば、菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｅｌＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｅｌＡ、及びＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｐｓｔＫを発現することができる。
【００６０】
特定の実施形態では、セレノシステイン組み込み機構は、１つまたは複数のアミノ酸欠失または置換を有する１つまたは複数のＥ．ｃｏｌｉ遺伝子をコードする。遺伝子としては、ａｃｒＢ（配列番号：１）、ａｄｈＥ（配列番号：２）、ａｒｃＢ（配列番号：３）、ｃｙｓＫ（配列番号：４）、ｄｎａＥ（配列番号：５）、ｆｔｓＡ（配列番号：６）、ｆｔｓＬ（配列番号：１８）、ｈｅｍＡ（配列番号：７）、ｍｄｆＡ（配列番号：８）、ｏｍｐＲ（配列番号：９）、ｏｘｙＲ（配列番号：１９）、ｐｃｎＢ（配列番号：１０）、ｐｒｆＢ（配列番号：１７）、ｐｔａ（配列番号：１１）、ｑｕｅＥ（配列番号：６９）、及び／または、ｙｄｉＬ（配列番号：１３）を挙げることができる。別の遺伝子としては、ｐｄｘＢ（配列番号：１４）、ｙｅｅＪ（配列番号：１５）及びｙｐｈＧ（配列番号：１６）が挙げられる。例えば、セレノシステイン組み込み菌株は、少なくとも１つのｈｅｍＡ変異と組み合わせてｐｒｆＢ遺伝子内にＴ２４６Ａ変異を含んでいてもよい。別の例では、セレノシステイン組み込み菌株は、少なくとも１つのｈｅｍＡ変異及び少なくとも１つのｙｅｅＪ変異と組み合わせてｐｒｆＢ遺伝子内にＴ２４６Ａ変異を含んでいてもよい。これら遺伝子における例示的なアミノ酸置換については、表１に記載している。
【００６１】
【表１−１】
2019520083.tif 000003
【表１−２】
2019520083.tif 000004
【００６２】
追加の態様では、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子は、１つまたは複数のその他のアミノ置換により更に修飾されてもよい。例えば、１つまたは複数の位置でアミノ酸置換を実施してもよく、その置換はほぼ同等の親水性を有するアミノ酸に対するものである。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する上で、ハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は通常、当該技術分野において理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性が得られたタンパク質の二次構造に寄与し、その結果として、その他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのタンパク質の相互作用を規定するということは一般に認められている。それゆえ、セレノシステイン含有ポリペプチドにおいてこのような保存的置換を実施してもよく、それらの活性に対する影響はせいぜい軽微であると考えられる。米国特許４，５５４，１０１号に詳細に記載されているとおり、以下の親水性値、アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）がアミノ酸残基に対応付けられている。これらの値を指標として用いることにより、その親水性値が±２以内であることが好ましいアミノ酸の置換、その親水性値が±１以内であることが特に好ましいアミノ酸の置換、及び、その親水性値が±０．５以内であることが更により特に好ましいアミノ酸の置換を行ってもよい。それゆえ、本明細書に記載するセレノシステイン含有ポリペプチドのいずれかを、異なるがほぼ同等の親水性値を有する相同なアミノ酸であるアミノ酸の置換により修飾してもよい。＋／−１．０ポイント以内または＋／−０．５ポイント以内の親水性を有するアミノ酸は相同であるとみなされる。
【００６３】
ＩＩ．セレノシステインを含む組換えポリペプチドの製造
セレノシステインを含むポリペプチド、例えば、抗体またはジスルフィド結合タンパク質などを産生するために、本明細書で提供するセレノシステイン組み込み機構を使用してもよい。一部の例においては、セレノシステイン残基で天然システインを置換してもよく、または、セレノシステイン残基の置換がポリペプチドの構造及び機能を変化させない任意の部位、例えば、セリン残基において置換してもよい。なおも更なる態様では、実施形態に記載の方法を使用して、通常は１つまたは複数のセレノシステイン残基、例えば、ヒトセレノプロテイン（例えば、ヒトＴｒｘＲ）などを含むポリペプチドを製造してもよい。
【００６４】
特定の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、プラスミド）を機構に導入して、細胞が少なくとも１つのセレノシステイン残基をポリペプチド内に組み込む条件下、セレン含有増殖培地内で培養してもよい。それから、得られたセレノシステイン含有ポリペプチドを単離して、質量分析またはＸ線結晶構造解析などにより解析してもよい。
【００６５】
標準的な手法に従い細胞内において自律複製可能な組換えベクターを用いて、細胞内に核酸を導入してから、それら核酸を細胞内に維持してもよい。形質転換の方法、発現媒体の選択は、発現させるポリペプチド及び選択した宿主機構の性質によって決まる。形質転換法については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）に記載されており、発現媒体については、当該技術分野において周知の発現媒体、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｕｐｐｌ．１９８７）から選択してもよい。非相同ポリペプチドの発現を誘導するために、細胞培養培地は通常、１〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２〜４０ｎｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは５〜２５ｎｇ／ｍｌのセレンを含有する。セレンは、亜セレン酸ナトリウム、または、セレンの別の可溶性の酸化形態として存在していてもよい（例えば、０．１〜５０μＭ、特に５〜２５μＭのＮａ２ＳｅＯ３を使用してもよい）。「非相同」核酸とは、それを導入する細胞または動物に対して部分的または完全に外来である核酸、または、非相同タンパク質が少なくとも１つのアミノ酸を置換したセレノシステインを含有するという点を除き細胞または動物の内在遺伝子に対して相同である核酸のことを意味する。
【００６６】
核酸配列の発現を得るために、核酸と機能的に連結してその核酸の発現を制御する１つまたは複数の制御配列を有するベクターを用いて配列を組み込んでもよい。ベクターは、挿入核酸の発現を駆動するためのプロモーターなどのその他の配列、ポリペプチドまたはペプチドが融合として産生されるような核酸配列、及び／または、宿主細胞内で産生されたポリペプチドが細胞から分泌されるような分泌シグナルをコードする核酸を含んでいてもよい。それから、ベクターを宿主細胞に形質転換する（ベクターは宿主細胞内で機能的である）ことにより、ポリペプチドが産生されるように宿主細胞を培養することにより、及び、宿主細胞または周囲の培地からポリペプチドを回収することにより、ポリペプチドを得てもよい。本発明の実施形態において有用な原核細胞としてはＥ．ｃｏｌｉが挙げられ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを有する株が過剰発現の緩和に好ましい場合がある。
【００６７】
一部の例においては、セレノシステイン残基で天然システインを置換してもよく、または、セレノシステイン残基の置換がポリペプチドの構造及び機能を変化させない任意の部位、例えば、セリン残基において置換してもよい。このようなアミノ酸は当業者に周知の方法により同定することができ、通常、タンパク質の触媒活性または結合活性（例えば、変異解析により測定される）には関与しない位置、または、ポリペプチドの構造的完全性に重要と考えられる位置に存在する。特定のポリペプチドでは、セレノシステイン残基は、ジスルフィド架橋を形成する２つのシステイン残基で通常は占められるであろう位置に組み込まれてもよく、その結果、セレノシステイン残基が質量分析で同定可能なジセレニド結合を形成することになる。標準的な手法を使用して、セレノシステインもまた修飾して、セレニド基、セレンオキシド基、セレニン酸基、セレノン酸基、セレノン基、または、セレノ−硫黄基を形成してもよい。
【００６８】
別の実施形態では、セレノシステイン残基は、置換によりポリペプチドの構造及び／または機能が変更されることが既知である（または予測された）ポリペプチド内の部位に組み込まれる。このことは、ポリペプチドの機能または特性を向上させるため、ポリペプチドの生物学的機能同定を補助するため、ポリペプチドの構造を決定するためまたはポリペプチドを精製するため、例えば、ポリペプチドドメイン、活性部位、または、薬物または別のポリペプチドの結合部位の同定補助のためであってもよい。
Ａ．セレノシステインを含む抗体
【００６９】
セレノシステインを含む組換えポリペプチドは、抗体、例えば、モノクローナル抗体などをコードしていてもよい。一部の態様では、野生型抗体ではシステインであるだろう位置でセレノシステイン残基を置換してもよい。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはその抗原結合フラグメントであってもよい。特定の態様では、抗体は、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆ（ａｂ’）３抗体、一価ｓｃＦｖ抗体、二価ｓｃＦｖ抗体または単一ドメイン抗体である。抗体は、非ヒト抗体、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体または脱免疫化抗体であってもよい。一部の例においては、抗体は、造影剤、化学療法剤、毒素または放射性核種にコンジュゲートされていてもよい。本明細書ではまた、本明細書に記載する実施形態及び態様の抗体を薬学的に許容される担体内に含む組成物を提供する。
【００７０】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの任意の免疫結合物質、遺伝子組換えＩｇＧに加えて、抗原結合活性を保持する抗体ＣＤＲドメインを含むポリペプチドを広く意味することを目的としている。キメラ抗体、親和性成熟抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体もしくは抗原結合抗体フラグメント、または、天然または合成リガンドからなる群から抗体を選択してもよい。それゆえ、周知の手法及び本明細書に記載の手法を用いて、少なくとも１つのセレノシステイン残基を含有する、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、ならびに、結合ドメイン及びＣＤＲ（上記いずれかの改変形態を含む）を製造してもよい。一部の態様では、抗体は、ジセレニド結合を形成可能な少なくとも２つのセレノシステイン残基を含む。
【００７１】
モノクローナル抗体は、全ての抗体産生細胞が単一のＢリンパ球細胞株に由来するために全ての抗体分子が同一エピトープを認識する単一種抗体である。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製するための方法は通常、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同一株から開始する。一部の実施形態では、モノクローナル抗体を作製するためにマウス及びラットなどのげっ歯類を使用する。一部の実施形態では、モノクローナル抗体を作製するために、ウサギ細胞、ヒツジ細胞またはカエル細胞を使用する。ラットの使用は周知であり、特定の利点を提供し得る。慣例的にマウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）が使用され、通常、高パーセンテージの安定融合をもたらす。
【００７２】
一実施形態では、抗体は、キメラ抗体、例えば、非相同非ヒト配列、ヒト配列またはヒト化配列（例えば、フレームワーク配列及び／または定常ドメイン配列）にグラフトした、非ヒトドナー由来の抗原結合配列を含む抗体である。外来抗体の可変領域をインタクトのままにしつつ、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖定常ドメインをヒト起源の類似ドメインに置換するための方法が開発されている。代替的に、「完全ヒト」モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックなマウス内で産生される。両方のげっ歯類（例えば、マウスとヒト）のアミノ酸配列を有する抗体可変ドメインを組換え構築することにより、モノクローナル抗体の可変ドメインをよりヒト形態に変換するための方法もまた開発されている。「ヒト化」モノクローナル抗体において、超可変ＣＤＲのみがマウスモノクローナル抗体に由来し、フレームワーク領域及び定常領域はヒトアミノ酸配列に由来する（米国特許番号５，０９１，５１３号及び６，８８１，５５７号を参照のこと）。げっ歯類に固有な抗体内のアミノ酸配列をヒト抗体の対応する位置に見られるアミノ酸配列に置換することにより、治療的使用の間における有害免疫反応の可能性を低下させると考えられている。また抗体を産生するハイブリドーマまたはその他の細胞を遺伝的変異またはその他の変化に供してもよく、それらの変異または変化は、ハイブリドーマにより産生される抗体の結合特異性を変化させてもさせなくてもよい。
【００７３】
本実施形態に好適な抗体フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる「Ｆｄ」フラグメント、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなる「Ｆｖ」フラグメント、（ｉｖ）ＶＨドメインからなる「ｄＡｂ」フラグメント、（ｖ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、２つの連結Ｆａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）（ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、２つのドメインを結合して結合ドメインを形成させるペプチドリンカーにより連結している）、（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（米国特許番号５，０９１，５１３号を参照のこと）、及び、（ｉｘ）ディアボディ、遺伝子融合により構築された多価フラグメントまたは多重特異性フラグメント（米国特許出願公開２００５０２１４８６０号）が挙げられるがこれらに限定されない。ＶＨドメインとＶＬドメインを連結させるジスルフィド架橋を導入することにより、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはディアボディ分子を安定化させてもよい。ＣＨ３ドメインに連結したｓｃＦｖを含むミニボディもまた作製してもよい（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００７４】
抗体様結合ペプチド模倣薬もまた、実施形態において検討される。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、短縮抗体（ｐａｒｅｄ−ｄｏｗｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）として作用し、より長い血清中半減期に加えて煩雑さの少ない合成法という特定の利点を有するペプチドである「抗体様結合ペプチド模倣薬」（ＡＢｉＰ）について記載している。
【００７５】
鳥類及び哺乳類を含む任意の動物供給源から抗体を作製してもよい。好ましくは、抗体は、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリである。加えて、より新しい技術により、ヒト抗体の開発及びヒト組み合わせ抗体ライブラリからのヒト抗体のスクリーニングが可能となる。例えば、米国特許番号６，９４６，５４６号（参照として本明細書に組み込まれる）に記載のように、バクテリオファージ抗体発現技術を用いて、動物の免疫化を行わない状態で特定の抗体を産生させることができる。これらの技術については、Ｍａｒｋｓ（１９９２）；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）；及びＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）に更に記載されている。
【００７６】
一部の態様では、セレノシステイン残基を有する抗体は、医薬品として使用される抗体であってもよい。例えば、抗体は、セツキシマブなどの市販の抗体医薬品のＣＤＲ配列を含んでいてもよい。
【００７７】
ＩＩＩ．寄託情報
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＲＴΔＡ  ２Ｘ３１０Ｋの代表的な凍結寄託が、２０１６年６月２２日、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ），２３  Ｓｔ．Ｍａｃｈａｒ  Ｄｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ２  １ＲＹ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍで行われている。これら寄託細胞には、受入番号ＮＣＩＭＢ  ４２５９５が付与されている。
【００７８】
上記寄託は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の条件及び条項に従って実施され、少なくとも３０（３０）年間の期間、寄託試料の備蓄に対する直近の請求を寄託所が受け付けた後少なくとも５（０５）年間の期間、または、特許の有効期間のうちいずれか長い方の期間にわたり実施され、その期間の間に実施不可能となる場合には交換される。
【実施例】
【００７９】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するために含まれる。以下に続く実施例に開示されている技術は本発明の実施において良好に機能する本発明者が発見した技術を表し、その結果、それらの実施に好ましい方法を構成するとみなすことができることを、当業者は理解するべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑み、開示される特定の実施形態において多くの変更が実施可能であること、及び、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなおも得られることを理解するべきである。
【００８０】
実施例１−ＲＴΔＡ  ２Ｘ３１０Ｋの作製及びキャラクタリゼーション
セレノシステイン組み込み用のいくつかの菌株を作製してから進化させた。より効率的なセレノシステイン組み込み株の誘導用に、上記のＥ．ｃｏｌｉ  ＲＴΔＡ株（Ｔｈｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；（参照として本明細書に組み込まれる））を使用した。要約すると、ＲＴΔＡ株は、株Ｃ３２１．ΔＡ（Ｌａｊｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）内にｓｅｌＡ、ｓｅｌＢ及びｓｅｌＣ遺伝子（それぞれｓｅｌＡ、ｓｅｌＢ及びｔＲＮＡＳｅｃをコードする）の欠失を含み、一連の非天然アミノ酸の効率的な組み込みを可能とする解離因子１（ＲＦ１）をコードするｐｒｆＡ遺伝子を欠く。これら遺伝子を欠失させることにより、新しいｔＲＮＡＳｅｃライブラリと内在性セレノシステイン組み込み機構の間におけるすべてのクロストークが排除された。
【００８１】
加えて、ＲＴΔＡ株は、セレノシステイン依存性レポータータンパク質、セレノシステインに条件的に依存させるのに不可欠なセレニル−スルフヒドリル結合またはジセレニド結合（ΔａｐｈＣ：：ｎｍｃＡ  Ｃ６９Ｕ  Ｃ２３８、または、Ｃ６９Ｕ  Ｃ２３８Ｕ）を有するＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ由来のＮＭＣ−Ａ  β−ラクタマーゼを含有する。この酵素は、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のＳＭＥ−１  β−ラクタマーゼ（活性化のために活性部位セリン残基に隣接したジスルフィド結合が必要となることを上記で示しているが、Ｅ．ｃｏｌｉにかなりの適合コストを付与する酵素）に対して高い配列類似性を有している。天然ジスルフィド結合を有する組み込みβ−ラクタマーゼを含有するＥ．ｃｏｌｉ株は、β−ラクタム抗生物質カルベニシリンの存在下で生存するのにセレン補充を必要としないことが認められた。それぞれセレニル−スルフヒドリル結合またはジセレニド結合のいずれかを形成する、１つの不可欠なセレノシステイン残基または２つの不可欠なセレノシステイン残基のいずれかを有するＥ．ｃｏｌｉ株は、β−ラクタム抗生物質に対する耐性のためのセレンを必要とした（図１Ａ〜図１Ｃ）。セレノシステイン組み込みに対する条件的依存により、さもなければ毒性となるセレノシステイン生合成及び組み込み機構の低下または減弱を防止する。
【００８２】
セレノシステイン組み込みに必要な機構をもたらす２つのプラスミドを導入した。第１のプラスミドは、ＣｌｏＤＦ１３複製起点を含有し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｅｌＤ遺伝子、及びセレノシステインの部位特異的組み込み用の進化ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＳｅｃＵｘ；米国特許出願公開２０１７／０１６６９４５号）を発現した。第２のプラスミド（ＲＳＦ１０３０複製起点を含有する）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｅｌＡ遺伝子及びＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｐｓｔＫ遺伝子を発現した。これら２つのプラスミドによる形質転換後、システイン残基を形成する不可欠なジスルフィド結合の代わりにゼロ、１または２つのセレノシステイン残基のいずれかを含有するＮＭＣ−Ａ  β−ラクタマーゼをゲノムのａｐｈＣ遺伝子座に導入した。このことは、一部のβ−ラクタム抗生物質に対するセレノシステイン依存性耐性を付与し、細胞内におけるセレノシステイン組み込みのための最低閾値の設定に役割を果たした。
【００８３】
２種類の異なる条件（抗生物質濃度を上昇させるまたは温度を上昇させる）下、得られた株（３回、対照株と共に）を２５００世代超（コンフルエントとなるまで２０５回継代）進化させた。進化後、全ての株に対して全ゲノムシークエンシングを実施した。株は、コード領域内に１００〜３００の非同義変異を含有していた。キャラクタリゼーション用に、高濃縮されたこれら変異のサブセット（多数の独立した株内に存在する）を親株に導入した。これらの変異（上記の表１を参照のこと）は、増殖率の増加、生存能、亜セレン酸耐性、またはその他の有益な特性を付与した。全ての進化株は、様々な異なる条件において、親株と比較して劇的に向上した増殖を示した。
【００８４】
株のうちの１つに由来する単一クローン（２Ｘ３１０Ｋと呼ばれる）を単離し、組換えセレノプロテイン産生用のこれら進化株の潜在性を評価するために使用した。この株は、かなりの収率でジセレニド含有タンパク質を産生可能である。２つのセレノシステイン残基を有する組み込みＮＭＣ−Ａ  β−ラクタマーゼを含有する親ＲＴΔＡ株がβ−ラクタム抗生物質カルベニシリンに対する中程度の耐性を示す一方で、変異２Ｘ３１０Ｋ株はカルベニシリンに対するより高い耐性を示した（図２Ａ〜図２Ｂ）。この向上した増殖が、変異株を組換えセレノプロテイン産生用の優れた宿主にする。加えて、親株が所定の培地内における長い誘導期及び増殖不良を示す一方で、変異２Ｘ３１０Ｋ株はより高い増殖率及び最終細胞密度を示した（図３Ａ〜図３Ｂ）。
【００８５】
セレノシステイン組み込み効率をモニターしてタンパク質改変の実現性を実証するために、遺伝子改変非必須セレニル−スルフヒドリル結合を含有するＥ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を産生させた。トップダウン質量分析では、ＤＨＦＲ含有セリンに相当する検出可能なバックグラウンドのないほぼ１００％のセレノシステイン組み込みを示した。約１００％の効率で、３９位及び８５位に２つのセレノシステイン残基が組み込まれていることが観察された（図４Ａ〜図４Ｂ）。解析により、ジセレニド結合の存在も確認された。
【００８６】
変異２Ｘ３１０Ｋ株を使用して、細菌細胞質内においてジセレニド安定化抗ＭＳ２抗体フラグメントを産生した。ジスルフィド結合を含有するタンパク質の発現用に開発したＥ．ｃｏｌｉ株とは異なり、この株は高い細胞質酸化還元電位を必要としない。実験で同定したモノ同位体マスは、２つのジセレニド結合を形成した４つのセレノシステイン残基を含有する組換え抗ＭＳ２  ｓｃＦｖと一致した（図５Ａ〜図５Ｃ）。それゆえ、株は安定化セレノプロテインを効率的に産生することができる。更に、組換えセレノプロテインの収率を更に上昇させるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有するように、株を遺伝子改変した。
【００８７】
変異２Ｘ３１０Ｋ株を使用して、セレノ抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖを産生した。ＵＶＰＤ配列情報のセレノシステイン残基間にフラグメンテーションが無い（図６Ｃに示す）ことにより、２つのジセレニド結合の形成が確認される。セレノ抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖの結合性は、野生型抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖと同一である（図６Ａに示す）。しかしながら、野生型抗リシンＡ鎖ｓｃＦｖをＤＴＴで処理することにより活性が有意に低下する（図６Ｂ）一方で、セレノシステイン含有ｓｃＦｖは還元条件に対する強い耐性を示す（図６Ｄ）。
【００８８】
Ｅ．ｃｏｌｉ株  ＢＬ２１ＤＥ３、Ｔ７  Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ及びＲＴΔＡ−２Ｘ３１０Ｋを使用して、トラスツズマブ（ハーセプチン）ｓｃＦｖを産生した。ＢＬ２１ＤＥ３株では、図７Ａのタンパク質配列全体に均一なフラグメンテーションが見られるように、ジスルフィド結合は形成されなかった。Ｔ７  Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ株では、図７Ｂの後半の配列においてフラグメンテーションが無いことが見られるように、ＶＨ領域内にのみジスルフィド結合が形成された。しかしながら、ＲＴΔＡ−２Ｘ３１０Ｋ株では、図７ＣにおけるＶＬ領域とＶＨ領域の両方でフラグメンテーションが無いことが見られるように、２つのジセレニド結合が形成された。それゆえ、ジセレニドｓｃＦｖのみが、天然及び想定共有結合構築物を採用した。
【００８９】
本明細書に開示及び本願請求項に記載の方法の全ては、本開示に鑑み、過度な実験をすることなく実施及び実行可能である。本発明の組成物及び方法について好ましい実施形態の点から記載してきたが、本発明の概念、趣旨及び範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の本方法、及び本方法の工程または本方法の工程の配列に変形形態を適用可能であることは当業者には明らかである。より具体的には、化学的と生理学的の両方で関連する特定の薬剤を、同一または類似の結果を得ながら、本明細書に記載の薬剤に置き換えてもよいということは明らかである。当業者に明らかな全てのこのような類似した置き換え及び変更は、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の趣旨、範囲及び概念内であると見なされる。
【００９０】
参照文献
以下の参照文献は、それらが本明細書中に記載する詳細の補助となる例示的な手続き上またはその他の詳細を提供する限りにおいて、参照として明示的に本明細書に組み込まれる。
米国特許番号４，５５４，１０１号
米国特許番号５，０９１，５１３号
米国特許番号６，９４６，５４６号
米国特許番号６，８８１，５５７号
米国特許出願公開番号２００５／０２１４８６０号
米国特許出願公開番号２０１７／０１６６９４５号
Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）
Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９−１３，１９９４
Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｕｐｐｌ．１９８７）
Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−８０，１９９２
Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：３０５５−６１，１９９６
Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７（１）：１０５−３２，１９８２
Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４９（２）：２０９−１６，２００３
Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７−１０  １９９２
Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６３：５５１−６７，１９９６
Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−９１，１９９４
Ｔｈｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３７（１）：４６−４９，２０１５
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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