(57)【要約】  成熟野生型アルファー溶血素アミノ酸配列において、Ｈ３５Ｇ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａ、および／またはＫ１４７Ｎでの少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、アルファ溶血素の変異体を本明細書に記載する。特定の例において、変異体は、成熟アルファ溶血素アミノ酸配列において、Ｅ１１１Ｓ、Ｍ１１３Ｓ、Ｔ１４５Ｓ、Ｋ１４７Ｓ、またはＬ１３５Ｉでの置換を有してもよい。α−溶血素変異体にはまた、成熟野生型アルファ溶血素のＨ１４４Ａでの置換および／または残基１２７〜１３１に渡る一連のグリシン残基もまた含まれてもよい。やはり提供するのは、アルファ溶血素変異体を含むナノポア集合体であって、増加したナノポア寿命を有する、前記ナノポア集合体である。さらに、増加した寿命を提供することに加えて、減少した通過時間（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｔｈｒｅａｄ）を提供する変異体を提供する。したがって、本明細書に提供する変異体は、ナノポア寿命を増加させ、そしてかつ変異体を含むナノポアを用いて、ＤＮＡ配列決定反応の効率および精度を改善する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４に示すアミノ酸配列のα−溶血素（α−ＨＬ）変異体であって、配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有し、そして配列番号１４のＥ１１１Ｎ／Ｅ１１１Ｓ、Ｍ１１３Ａ／Ｍ１１３Ｓ、Ｋ１４７Ｎ／Ｋ１４７Ｓ、Ｔ１４５Ｓ、Ｌ１３５Ｉ、またはその組み合わせのいずれか１つに対応する位のアミノ酸置換を含む、前記α−溶血素変異体。
【請求項２】
配列番号１４に示すアミノ酸配列のＨ１４４Ａに対応するアミノ酸置換をさらに含む、請求項１のα−溶血素変異体。
【請求項３】
配列番号１４に示すアミノ酸配列のＨ３５Ｇに対応する置換をさらに含む、請求項１または２のα−溶血素変異体。
【請求項４】
配列番号１４に示すアミノ酸配列のアミノ酸１２７〜１２９に対応するポリＧ置換をさらに含む、請求項１〜３のいずれかのα−溶血素変異体。
【請求項５】
配列番号１４に示すアミノ酸配列のＫ１３１Ｇに対応する置換をさらに含む、請求項１〜４のいずれかのα−溶血素変異体。
【請求項６】
配列番号１４に示すアミノ酸配列のＶ１４９Ｋ、Ｅ２８７Ｒ、Ｔ１０９Ｋ、またはＰ１５１Ｋの任意の１つに対応する位、あるいはその組み合わせでのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜５のいずれかのα−溶血素変異体。
【請求項７】
配列番号１７、１８、１９、２０、または２２に示す配列に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有する配列を有する、請求項１〜６のいずれか記載のα−溶血素変異体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の少なくとも１つのα−溶血素（α−ＨＬ）変異体を含む、七量体ナノポア集合体。
【請求項９】
アルファ溶血素変異体の１つに結合しているＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項８のいずれかの七量体ナノポア集合体。
【請求項１０】
変異体が、イソペプチド結合を通じてＤＮＡポリメラーゼに結合している、請求項９の七量体ナノポア集合体。
【請求項１１】
天然アルファ溶血素からなるナノポア集合体に比較して、増加した寿命を有する、請求項９または１０記載の七量体ナノポア集合体。
【請求項１２】
天然アルファ溶血素からなる七量体ナノポア集合体に比較して、寿命が、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれより多く増加する、請求項１１記載の七量体ナノポア集合体。
【請求項１３】
ターゲット分子を検出するための方法であって：
（ａ）膜において、検出電極に隣接してまたはその近傍に配置される、請求項８〜１２記載の七量体ナノポアを含むチップを提供し；
（ｂ）該ナノポアを通じて核酸分子を導き、ここで該核酸分子はレポーター分子と会合し、該核酸分子はアドレス領域およびプローブ領域を含み、該レポーター分子は該プローブ領域で該核酸分子と会合し、そして該レポーター分子はターゲット分子とカップリングする；
（ｃ）該核酸分子が該ナノポアを通じて導かれる間に、該アドレス領域を配列決定して、該アドレス領域の核酸配列を決定し；そして
（ｄ）コンピュータプロセッサの補助で、（ｃ）で決定した該アドレス領域の核酸配列に基づいて、該ターゲット分子を同定する
工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
核酸配列決定のための七量体ナノポア集合体であって：
７つのアルファ溶血素単量体であって、各単量体が、配列番号１７、１８、１９、２０、または２２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記単量体；
該７つのアルファ溶血素単量体の少なくとも１つに結合している、ＤＮＡポリメラーゼ
を含む；
該ナノポア集合体は、天然アルファ溶血素からなるナノポアに比較して、増加した寿命を有する、
前記ナノポア集合体。
【請求項１５】
配列番号１７、１８、１９、２０、または２２に示すアミノ酸配列のＶ１４９Ｋ置換をさらに含み、該Ｖ１４９Ｋ置換が通過時間（Ｔｉｍｅ−Ｔｏ−Ｔｈｒｅａｄ）を減少させる、請求項１４の七量体ナノポア集合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]マルチサブユニット・ナノポアに集合した際、核酸配列決定反応中のナノポアの配列決定寿命を増加させる、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）アルファ溶血素変異体に関する方法および組成物を開示する。マルチサブユニット・ナノポアに集合した際、配列決定効率および精度を改善する変異体もまた開示する。
【発明の概要】
【０００２】
背景
[0002]溶血素は、非常に多様な生物によって産生されるタンパク質毒素ファミリーのメンバーである。いくつかの溶血素、例えばアルファ溶血素は、膜中に孔またはチャネルを形成することによって、細胞膜（例えば宿主細胞膜）の完全性を破壊しうる。孔形成タンパク質によって膜中に形成される孔またはチャネルを用いて、膜の片側から反対側に、特定のポリマー（例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を輸送することも可能である。
【０００３】
[0003]アルファ溶血素（α−ＨＬ、ａ−ＨＬまたはアルファ−ＨＬ）は、宿主細胞膜中にチャネルを形成する自己集合溶血素毒素である。より具体的には、７つのアルファ溶血素単量体が、生物学的膜中で七量体ベータ−バレル孔に集合する。アルファ溶血素は、安定性が高く、そして一本鎖ＤＮＡを収容するには十分に広いが、二本鎖ＤＮＡを収容するほどには広くないナノポアに自己集合する（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら、１９９６）ことを含めて、多くの好適な特性を有する。これらの特性および他の特性に基づいて、アルファ溶血素は、ナノポア配列決定群の主な構成要素となってきている。
【０００４】
[0004]ａ−ＨＬ孔におけるＤＮＡ検出に関する以前の研究は、孔を通じてＤＮＡが転位置する際のイオン電流シグネチャーを分析することに重点を置いており（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら、１９９６、Ａｋｅｓｏｎら、１９９９、Ｍｅｌｌｅｒら、２００１）、これは転位置速度（１００ｍＶで〜１ｎｔ／μｓ）およびイオン電流シグナルに生得的なノイズを考慮すると非常に困難な仕事であった。孔内部に永続的に係留されたプローブ分子の取り込みによって、ナノポアに基づくセンサーにおいて、より高い特異性が達成されてきている（Ｈｏｗｏｒｋａら、２００１ａおよびＨｏｗｏｒｋａら、２００１ｂ；Ｍｏｖｉｌｅａｎｕら、２０００）。
【０００５】
[0005]ナノポアの使用は、ＤＮＡ配列決定に革命を起こしたが、野生型アルファ溶血素を用いたナノポアは、短時間しか配列データを生成できない。したがって、配列決定反応中のアルファ溶血素ナノポアの寿命は、しばしば、配列決定反応の律速特徴として働く。さらに、野生型アルファ溶血素の使用は、しばしば、有意な数の欠失エラーを生じ、すなわち測定されない塩基が生じる。したがって、配列決定寿命の増加を含む、改善された特性を持つアルファ溶血素ナノポアが望ましい。
【０００６】
発明の概要
[0006]本明細書に提供するのは、ナノポアに取り込まれた際、ＤＮＡ配列決定反応中のナノポアの寿命を改善する突然変異体ブドウ球菌アルファ溶血素（αＨＬ）ポリペプチドである。例えば、本明細書記載の１またはそれより多い変異体を含むナノポアは、野生型アルファ溶血素からなるナノポアよりも、より長く持続し、そしてしたがってより多くの配列決定データを提供する。
【０００７】
[0007]特定の例示的側面において、α−溶血素（α−ＨＬ）変異体は、配列番号１４（成熟野生型アルファ溶血素配列）のＥ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａ、Ｋ１４７Ｎ、またはその組み合わせのいずれか１つに対応する位での置換を含む。α−溶血素変異体には、配列番号１４のＨ３５ＧまたはＫ１３５Ｇでの置換もまた含まれてもよい。α−溶血素変異体には、特定の側面において、配列番号１４の残基１２６〜１３１で１またはそれより多いグリシン残基、例えば配列番号１４の残基１２６〜１３１の全長に渡る一連のグリシン残基もまた含まれてもよい。例えば、変異体には、配列番号１４の１２６〜１３１由来のグリシン残基スパンを生じる、配列番号１４に示すアミノ酸配列のアミノ酸１２７〜１２９に対応するポリＧ置換もまた含まれてもよい。
【０００８】
[0008]特定の例示的側面において、α−溶血素変異体には、本明細書記載の置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列が含まれる一方、α−溶血素変異体の配列は、配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有する。特定の例示的側面において、α−溶血素変異体には、配列番号１７、１８、１９、２０、または２２に示すアミノ酸配列に、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。
【０００９】
[0009]特定の例示的側面において、本明細書記載のアルファ溶血素変異体は、例えば共有結合を通じて、ＤＮＡポリメラーゼに結合する。例えば、アルファ溶血素変異体は、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ連結を通じてＤＮＡポリメラーゼに結合する。特定の例示的側面において、アルファ溶血素変異体は、イソペプチド結合を通じてＤＮＡポリメラーゼに結合する。
【００１０】
[0010]特定の例示的側面において、七量体ナノポア集合体を提供する。該集合体には、例えば、少なくとも１つまたはそれより多くの本明細書記載のアルファ溶血素変異体が含まれる。例えば、七量体ナノポア集合体には、本明細書記載のものなどの、配列番号１４のＥ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａ、Ｋ１４７Ｎ、またはその組み合わせの置換を有する１またはそれより多いアルファ溶血素タンパク質が含まれてもよい。特定の例示的側面において、七量体ナノポア集合体には、本明細書記載のものなどの、配列番号１４のＥ１１１Ｓ、Ｍ１１３Ｓ、Ｔ１４５Ｓ、Ｋ１４７ＳまたはＬ１３５Ｉ、あるいはその組み合わせの置換を有する１またはそれより多いアルファ溶血素タンパク質が含まれてもよい。特定の例示的側面において、七量体ナノポアの７つのアルファ溶血素単量体の各々は、本明細書に記載されるようなアルファ溶血素変異体である。該変異体は、本明細書記載の同じ変異体または異なる変異体の組み合わせであってもよい。特定の例示的側面において、ナノポア集合体には、配列番号１７、１８、１９、２０、または２２に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有する１またはそれより多い変異体が含まれる。ナノポアを組み立てるために、アルファ溶血素変異体を用い、そしてこれに頼ることによって、特定の例示的側面において、生じるナノポアの寿命は、天然アルファ溶血素からなる七量体ナノポア集合体に比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれより多く増加する。
【００１１】
[0011]特定の例示的側面において、本明細書記載のアルファ溶血素変異体のいずれかをコードする核酸もまた提供する。例えば、核酸配列は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に由来してもよい（配列番号１）。特定の例示的側面において、本明細書記載の溶血素変異体のいずれか１つをコードする任意のこうした核酸を含むベクターもまた提供する。該ベクターで形質転換されている宿主細胞もまた提供する。
【００１２】
[0012]特定の例示的側面において、本明細書に記載するようなアルファ溶血素変異体を産生する方法を提供する。該方法には、例えば、適切な培地中で、アルファ溶血素変異体を産生するために適した条件下で、ベクターを含む宿主細胞を培養する工程が含まれる。次いで、当該技術に知られる方法を用いて、培養から変異体を得る。
【００１３】
[0013]特定の他の例示的側面において、ターゲット分子を検出する方法を提供する。該方法には、例えば、検出電極に隣接してまたはその近傍に配置される膜中に、本明細書に記載するようなナノポア集合体を含むチップを提供する工程が含まれる。次いで、該方法には、該ナノポアを通じて核酸分子を導く工程が含まれる。該核酸分子は、レポーター分子と会合し、そして該核酸分子にはアドレス領域およびプローブ領域が含まれる。該レポーター分子は、該プローブ領域で該核酸分子と会合し、そしてターゲット分子とカップリングする。該方法はさらに、前記核酸分子が前記ナノポアを通じて導かれる間に、該アドレス領域を配列決定して、前記アドレス領域の核酸配列を決定する工程を含む。該ターゲット分子は、コンピュータプロセッサの補助で、決定したアドレス領域の核酸配列に基づいて、同定される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】[0014]図１Ａは、標準的Ｈ１４４Ａナノポアに関する寿命評価を示すヒストグラムである。ｙ軸は、ｘ軸上のビン内の寿命を有した孔の数である。ｘ軸は、電流が単一溶血素ナノポアのものに対応したチャネルを通過する１００ｓ間隔の数（回）である。この実験を７２００ｓ、または７２回、行った。  [0015]図１Ｂは、図１Ａと同じ実行に関するＨ１４４Ａナノポアの障害の機構の分析を示すグラフである。この実験は７２００ｓ、または７２回、行われ、図１Ａと同じ実行に関するナノポアの障害の機構の分析に相当する。示すように、個々の孔をいくつかのカテゴリーにおいてドットとして示す。第一のカテゴリーは、実験終了まで存続した孔に関するものであり；障害の様式は、装置の停止であった。第二のカテゴリーは、電流が単一ナノポアの電流の＞１０ｘのレベルまで非常に迅速に増加したために、Ｇｅｎｉａ  ＦＰＧＡによって停止されたセルに関するものであり、これは脂質二重層が破壊された一般的な指標である。第三のカテゴリーは、開口チャネル電流が、単一孔のものから、多数の単一孔のものに増加したが、１０ｘ電流未満である際のものである。これは、典型的には、元来は１つのみを宿していた二重層内に、２、３、４、５、６、７、８、または９のナノポアが挿入されたことを示す。ノイズのビンは、典型的には測定中の電流の不安定なレベルを生じる、何らかの未知の様式の障害が起こった孔を含有し；これらは電極の障害のためである可能性もある。最後のカテゴリーは、二重層であり、そしてナノポアを通過する電流はもはや測定されず、むしろ脂質二重層の特徴的に低いコンダクタンスが見られる状況に対応する。
【図２】[0016]図２Ａは、Ｎ修正（Ｎ  Ｒｅｃｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ナノポアに関する寿命評価を示すヒストグラムである。ｙ軸は、ｘ軸上のビン内の寿命を有した孔の数である。ｘ軸は、電流が単一Ｎ修正溶血素ナノポアのものに対応するチャネルを通過する１００ｓ間隔（回）の数である。この実験を３６００ｓ、または３６回行った。  [0017]図２Ｂは、図２Ａと同じ実行に関するＮ修正ナノポアの障害の機構の分析を示すグラフである。この実験は３６００ｓ、または３６回、行われ、図１Ａと同じ実行に関するナノポアの障害の機構の分析に相当する。この図において、個々の孔をいくつかのカテゴリーのドットとして示す。第一のカテゴリーは、実験終了まで存続した孔に関するものであり；障害の様式は、装置の停止であった。第二のカテゴリーは、電流が単一ナノポアの電流の＞１０ｘのレベルまで非常に迅速に増加したために、Ｇｅｎｉａ  ＦＰＧＡによって停止されたセルに関するものであり、これは脂質二重層が破壊された一般的な指標である。第三のカテゴリーは、開口チャネル電流が、単一孔のものから、多数の単一孔のものに増加したが、１０ｘ電流未満である際のものである。これは、典型的には、元来は１つのみを宿していた二重層内に、２、３、４、５、６、７、８、または９のナノポアが挿入されたことを示す。ノイズのビンは、典型的には測定中の電流の不安定なレベルを生じる、何らかの未知の様式の障害が起こった孔を含有し；これは電極の障害のためである可能性もある。最後のカテゴリーは、二重層であり、そしてナノポアを通過する電流はもはや測定されず、むしろ脂質二重層の特徴的に低いコンダクタンスが見られる状況に対応する。
【図３】[0018]図３Ａは、Ｎ修正ナノポアに関する寿命評価を示すヒストグラムである。ｙ軸は、ｘ軸上のビン内の寿命を有した孔の数である。ｘ軸は、電流が単一Ｎ修正溶血素ナノポアのものに対応するチャネルを通過する１００ｓ間隔（回）の数である。この実験を１８０００ｓ、または１８０回行った。  [0019]図３Ｂは、図３Ａと同じ実行に関するＮ修正ナノポアの障害の機構の分析を示すグラフである。この実験は３６００ｓ、または３６回、行われ、図１Ａと同じ実行に関するナノポアの障害の機構の分析に相当する。この図において、個々の孔をいくつかのカテゴリーのドットとして示す。第一のカテゴリーは、実験終了まで存続した孔に関するものであり；障害の様式は、装置の停止であった。第二のカテゴリーは、電流が単一ナノポアの電流の＞１０ｘのレベルまで非常に迅速に増加したために、Ｇｅｎｉａ  ＦＰＧＡによって停止されたセルに関するものであり、これは脂質二重層が破壊された一般的な指標である。第三のカテゴリーは、開口チャネル電流が、単一孔のものから、多数の単一孔のものに増加したが、１０ｘ電流未満である際のものである。これは、典型的には、元来は１つのみを宿していた二重層内に、２、３、４、５、６、７、８、または９のナノポアが挿入されたことを示す。ノイズのビンは、典型的には測定中の電流の不安定なレベルを生じる、何らかの未知の様式の障害が起こった孔を含有し；これらは電極の障害のためである可能性もある。最後のカテゴリーは、二重層であり、そしてナノポアを通過する電流はもはや測定されず、むしろ脂質二重層の特徴的に低いコンダクタンスが見られる状況に対応する。
【図４】[0020]図４Ａは、１つのアルファ溶血素／ファイ２９  ＤＮＡポリメラーゼ・コンジュゲート、および配列番号４に示すように、各々、Ｈ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａで置換を有する６つのアルファ溶血素変異体（すなわち１：６の比）を含む、七量体ナノポアと比較した際の、対照七量体ナノポアに関する通過時間（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｔｈｒｅａｄ）を示すグラフである。対照ナノポア（「ＷＴ」と表示）には、１：６の比のアルファ溶血素／ファイ２９  ＤＮＡポリメラーゼ・コンジュゲート対６つの野生型アルファ溶血素が含まれる。これらのデータは、孔がポリメラーゼおよびテンプレートＤＮＡの両方を有したことを示す、タグ化ヌクレオチドを捕捉した多くの孔から組み合わされている。各タグ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔに対応）に関して示されるように、変異体アルファ溶血素を含むナノポアに関する通過速度（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ  ｒａｔｅ）は、対照ナノポアに比較して有意に増加し、したがって、通過時間が改善された（減少した）ことが明らかであった。Ｃ−ヌクレオチドタグの場合、通過速度は、２２１．６２ｓ−１（標準偏差１３．６ｓ−１）から６６３．１５（標準偏差１７２ｓ−１）に増加した。他のヌクレオチドタグは、図１に示すのと類似の増加を示した。  [0021]図４Ｂは、図４Ａを生成するために用いた生データを示すグラフである。図２は、本発明者らのＡＣカップリング系のアナログ・デジタルコンバータ（ＡＤＣ）値に相当し、これは、適用バイアスが正である（１７５ＡＤＣ単位）場合、および適用バイアスが負である（４５ＡＤＣ単位）場合の開口チャネルに関するＡＤＣ値を生じさせる。タグ化ヌクレオチドが孔内を通過する際、正バイアス適用中のＡＤＣ値は、開口チャネルレベルから１４５ＡＤＣ単位に減少する。このいくつかの例が、図４Ｂの拡大下部パネル中の１０２０〜１０４０ｓに示される。適用バイアスが負である場合、タグ化ヌクレオチドは孔から出ていき、これが、負の開口チャネルレベルが有意に減少しない理由である。通過速度を計算するため、通過レベルに到達するＡＤＣ値に関する正のバイアス期間各々に必要な時間分布を、その直前のサイクルが通過ＡＤＣ値で終了したサイクルに関してカウントする。次いで、このヒストグラムを、標準的な単一指数関数に適合させ、この減衰率が通過速度である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
[0022]本明細書に別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する業の一般の当業者の１人によって通常理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  第２版，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９４）、およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，  ＮＹ  （１９９１）は、本発明で用いる用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書に記載するものと類似かまたは同等のいかなる方法および材料も本発明の実施または試験に使用可能であるが、好ましい方法および材料を記載する。実施者は、当該技術分野の定義および用語に関しては、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、１９９３を参照されたい。本発明は、記載する特定の方法論、プロトコル、および試薬には限定されないことが理解される、これは、これらが多様でありうるためである。
【００１６】
[0023]数値範囲は、範囲を定義する数を包含する。用語「約」は、値のプラスまたはマイナス１０パーセント（１０％）を意味するよう用いられる。例えば、「約１００」は、９０〜１１０の間の任意の数を指す。
【００１７】
[0024]別に示さない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’方向に、左から右に記述され；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向へ、左から右に記述される。
[0025]本明細書に提供する見出しは、本発明の多様な側面または態様の限定ではなく、こうした側面または態様は、本明細書を全体として参照することによって得られうる。したがって、直後に定義する用語は、本明細書を全体として参照することによって、より完全に定義される。
【００１８】
定義
[0026]アルファ溶血素：本明細書において、「アルファ溶血素」、「α−溶血素」、「ａ−ＨＬ」および「α−ＨＬ」は、交換可能に用いられ、そして七量体の水充填膜貫通チャネル（すなわちナノポア）に自己集合する単量体タンパク質を指す。文脈に応じて、該用語はまた、７つの単量体タンパク質によって形成される膜貫通チャネルを指すことも可能である。
【００１９】
[0027]アミノ酸：本明細書において、用語「アミノ酸」は、最も広い意味で、ポリペプチド鎖内に取り込まれうる任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの態様において、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの態様において、アミノ酸は天然存在アミノ酸である。いくつかの態様において、アミノ酸は合成アミノ酸であり；いくつかの態様において、アミノ酸はＤ−アミノ酸であり；いくつかの態様において、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準的アミノ酸」は、天然存在ペプチド中に一般的に見られる２０の標準的Ｌ−アミノ酸のいずれかを指す。「非鎖アミノ酸」は、合成的に調製されたか、または天然供給源から得られたかにかかわらず、標準的アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書において、「合成アミノ酸」または「非天然アミノ酸」は、限定されるわけではないが、塩、アミノ酸誘導体（例えばアミド）、および／または置換を含む、化学的修飾アミノ酸を含む。ペプチド中のカルボキシ末端および／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、その活性に不都合に影響を及ぼすことなく、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または他の化学薬品での置換によって修飾されていてもよい。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与していてもよい。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と交換可能に用いられ、そして遊離アミノ酸および／またはペプチドのアミノ酸残基を指してもよい。遊離アミノ酸またはペプチドの残基を指すかどうかは、該用語が用いられる文脈から明らかであろう。すべてのアミノ酸残基配列は、その左および右方向が、アミノ末端からカルボキシ末端の慣用的な方向である式によって表されることに注目すべきである。
【００２０】
[0028]塩基対（ｂｐ）：本明細書において、塩基対は、二本鎖核酸中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の相互関係を指す。
【００２１】
[0029]相補性：本明細書において、用語「相補性」は、２つのポリヌクレオチド鎖の領域間、または塩基対形成を通じた２つのヌクレオチド間の配列相補性の広い概念を指す。アデニン・ヌクレオチドは、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと、特異的水素結合（「塩基対形成」）を形成可能であることが知られる。同様に、シトシン・ヌクレオチドは、グアニン・ヌクレオチドと塩基対形成可能であることが知られる。
【００２２】
[0030]発現カセット：「発現カセット」または「発現ベクター」は、ターゲット細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の具体的な核酸要素を含む、組換え的または合成的に生成される核酸構築物である。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、または核酸断片に取り込まれてもよい。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中に、転写しようとする核酸配列およびプロモーターが含まれる。
【００２３】
[0031]異種：「異種」核酸構築物または配列は、発現される細胞に対して天然ではない配列の部分を有する。異種は、調節配列に関しては、その発現を現在制御している同じ遺伝子を、天然には制御するように機能しない調節配列（すなわちプロモーターまたはエンハンサー）を指す。一般的に、異種核酸配列は、存在している細胞またはゲノム部分に内因性ではなく、そして感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等によって細胞に添加されている。「異種」核酸構築物は、天然細胞で見られる調節配列／ＤＮＡコード配列組み合わせと同じまたは異なる、調節配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含有してもよい。
【００２４】
[0032]宿主細胞：用語「宿主細胞」によって、ベクターを含有し、そして発現構築物の複製、ならびに／あるいは転写または転写および翻訳（発現）を補助する細胞を意味する。本発明で使用するための宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、あるいは真核細胞、例えば酵母、植物、昆虫、両生類、または哺乳動物細胞であってもよい。一般的に、宿主細胞は、原核、例えば大腸菌である。
【００２５】
[0033]寿命：本明細書において、用語「寿命」または「ナノポア寿命」は、一般に、ナノポアが配列決定反応において機能して、有用な配列決定データを提供する時間の全長を指すように用いられる。より具体的には、ナノポアの寿命は、開口チャネル電流レベルによって決定されるように、実験開始およびナノポアが適切に機能するのをやめたときの間の時間を測定することによって、測定可能である。
【００２６】
[0034]単離：「単離」分子は、例えば天然環境において、通常会合している少なくとも１つの他の分子から分離されている核酸分子である。単離核酸分子には、核酸分子を通常発現する細胞に含有される核酸分子が含まれるが、該核酸分子は染色体外に存在するか、または天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００２７】
[0035]修飾アルファ溶血素：本明細書において、用語「修飾アルファ溶血素」は、別の（すなわち親）アルファ溶血素から生じたアルファ溶血素を指し、そして親アルファ溶血素に比較して、１またはそれより多いアミノ酸改変（例えばアミノ酸置換、欠失、または挿入）を含有する。いくつかの態様において、本発明の修飾アルファ溶血素は、天然存在または野生型アルファ溶血素から生じるかまたは修飾されている。いくつかの態様において、本発明の修飾アルファ溶血素は、限定されるわけではないが、キメラアルファ溶血素、融合アルファ溶血素または別の修飾アルファ溶血素を含む、組換えまたは操作アルファ溶血素から生じるかまたは修飾されている。典型的には、修飾アルファ溶血素は、親アルファ溶血素に比較して、少なくとも１つの変化した表現型を有する。
【００２８】
[0036]突然変異：本明細書において、用語「突然変異」は、限定されるわけではないが、置換、挿入、欠失（一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を含む）を含む、親配列に導入される変化を指す。突然変異の結果には、限定されるわけではないが、親配列によってコードされるタンパク質には見られない、新規特徴、特性、機能、表現型または特質の生成が含まれる。
【００２９】
[0037]ナノポア：用語「ナノポア」は、本明細書において、一般的に、膜中に形成されるかまたは別の方式で提供される孔、チャネル、または通路を指す。膜は、有機膜、例えば脂質二重層、または合成膜、例えばポリマー素材で形成される膜であってもよい。膜は、ポリマー素材であってもよい。ナノポアは、検出回路または検出回路にカップリングした電極、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路に隣接してまたはその近傍に配置されてもよい。いくつかの例において、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）から約１０００ｎｍの桁の特徴的な幅または直径を有する。いくつかのナノポアはタンパク質である。アルファ溶血素は、タンパク質ナノポアの一例である。
【００３０】
[0038]核酸分子：用語「核酸分子」には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびｃＤＮＡ分子が含まれる。遺伝暗号の縮重の結果として、所定のタンパク質、例えばアルファ溶血素および／またはその変異体をコードする多数のヌクレオチド配列を産生可能であることが理解されるであろう。本発明は、変異体アルファ溶血素をコードする、すべてのありうる変異体ヌクレオチド配列を意図し、これらはすべて、遺伝暗号の縮重を仮定して可能である。
【００３１】
[0039]プロモーター：本明細書において、用語「プロモーター」は、下流遺伝子の転写を指示するように機能する核酸配列を指す。プロモーターは、一般的に、ターゲット遺伝子が発現される宿主細胞に適切であろう。プロモーターは、他の転写および翻訳制御核酸配列（「調節配列」ともまた称される）とともに、所定の遺伝子を発現するために必要である。一般的に、転写および翻訳制御配列には、限定されるわけではないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列が含まれる。
【００３２】
[0040]精製された：本明細書において、「精製された」は、分子が、含有される試料重量の少なくとも９５％、または重量の少なくとも９８％の濃度で試料中に存在することを意味する。
【００３３】
[0041]精製する：本明細書において、用語「精製する」は、一般的に、トランスジェニック核酸またはタンパク質含有細胞を、生化学精製および／またはカラムクロマトグラフィに供することを指す。
【００３４】
[0042]タグ：本明細書において、用語「タグ」は、原子または分子、あるいは原子または分子のコレクションであってもよい、検出可能部分を指す。タグは、光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば誘導性、容量性）シグネチャーを提供してもよく、このシグネチャーをナノポアの補助で検出してもよい。典型的には、ヌクレオチドがタグに付着されている場合、これは「タグ化ヌクレオチド」と称される。タグは、リン酸部分を通じてヌクレオチドに付着してもよい。
【００３５】
[0043]通過時間：用語「通過時間」または「ＴＴＴ」は、ポリメラーゼ−タグ複合体または核酸鎖がタグをナノポアのバレル内に通過させるためにかかる時間を意味する。
[0044]変異体：本明細書において、用語「変異体」は、親タンパク質に比較した際、改変された特性、例えば改変されたイオン電導度を示す修飾タンパク質を指す。
【００３６】
[0045]変異体溶血素：用語「変異体溶血素遺伝子」または「変異体溶血素」は、それぞれ、黄色ブドウ球菌由来のアルファ溶血素遺伝子の核酸配列が、コード配列を除去し、付加し、そして／または操作することによって改変されているか、あるいは発現されるタンパク質のアミノ酸配列が、本明細書記載の発明と一致して修飾されていることを意味する。
【００３７】
[0046]ベクター：本明細書において、用語「ベクター」は、異なる宿主細胞間のトランスファーのために設計されている核酸構築物を指す。「発現ベクター」は、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）細胞において、異種ＤＮＡ断片を取り込みそして発現する能力を有するベクターを指す。多くの原核および真核発現ベクターが商業的に入手可能である。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識内である。
【００３８】
[0047]野生型：本明細書において、用語「野生型」は、天然存在供給源から単離された際、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する、天然遺伝子または遺伝子産物を指す。
[0048]パーセント相同性：用語「％相同性」は、本明細書において、本明細書の用語「％同一性」と交換可能に用いられ、そして配列整列プログラムを用いて整列された際、本発明のポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸配列または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列間の核酸またはアミノ酸配列同一性の度合いを指す。例えば、本明細書において、８０％相同性は、定義されるアルゴリズムによって決定される８０％配列同一性と同じことを意味し、そしてしたがって、所定の配列の相同体は、所定の配列の全長に渡って、８０％より高い配列同一性を有する。配列同一性の例示的レベルには、限定されるわけではないが、所定の配列、例えば本明細書に記載するような、本発明のポリペプチドの任意の１つに関するコード配列に対する、８０、８５、９０、９５、９８％またはそれより高い配列同一性が含まれる。
【００３９】
[0049]２つの配列間の同一性を決定するために使用可能な例示的なコンピュータプログラムには、限定されるわけではないが、インターネット上で公的に利用可能である、一組のＢＬＡＳＴプログラム、例えばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮが含まれる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７もまた参照されたい。
【００４０】
[0050]典型的には、所定の核酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ配列および他の公的データベース中の核酸配列に比較して評価する際、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて、配列検索を実行する。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列および他の公的データベース中のアミノ酸配列に対して、すべての読み枠において翻訳されている核酸配列を検索するには、ＢＬＡＳＴＸプログラムが好ましい。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸはどちらも、１１．０のオープンギャップペナルティおよび１．０の伸長ギャップペナルティのデフォルトパラメータを用いて実行され、そしてＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用する（例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２，  １９９７を参照されたい）。
【００４１】
[0051]２またはそれより多い配列間の「％同一性」を決定するために、例えば、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１の伸長ギャップペナルティ、ＢＬＯＳＵＭ  ３０類似性マトリックスを含むデフォルトパラメータで実行する、ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン１３．０．７中のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを用いて、選択された配列の好ましい整列を行う。
【００４２】
命名法
[0052]本明細書および請求項において、アミノ酸残基の慣用的な１文字および３文字暗号を用いる。
【００４３】
[0053]参照を容易にするため、本出願の変異体は、以下の命名法を用いて記載される：元来のアミノ酸（単数または複数）；位（単数または複数）；置換アミノ酸（単数または複数）。この命名法にしたがって、例えば、１１１位のアスパラギンによるグルタミン酸の置換は：
Ｇｌｕ１１１ＡｓｎまたはＥ１１１Ｎ
と示される。
多数の突然変異は、プラス記号によって分離され、例えば：
Ｈｉｓ３５Ｇｌｙ＋Ｇｌｕ１１１ＡｓｎまたはＨ３５Ｇ＋Ｅ１１１Ｎ
は、それぞれ、ヒスチジンに対してグリシンおよびグルタミン酸に対してアスパラギンを置換する、３５位および１４９位の突然変異を示す。アミノ酸置換のスパンおよび／または残基のスパンは、ダッシュ記号によって示され、例えば残基１２６から１３１のグリシンのスパンは：１２６−１３１Ｇｌｙまたは１２６−１３１Ｇである。特異的置換における変動は、フォワードスラッシュによって示される。例えば、Ｅ１１１Ｎ／Ｅ１１１Ｓは、１１１位のＥ残基が、それぞれ、Ｎ残基またはＳ残基のいずれに置換されてもよいことを意味する。
【００４４】
アルファ溶血素の部位特異的突然変異誘発
[0054]黄色ブドウ球菌アルファ溶血素野生型配列は、本明細書に提供され（配列番号１、核酸コード領域；配列番号１４、タンパク質配列）そして別の箇所で入手可能である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓまたはＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ９０５３６およびＡＡＡ２６５９８）。
【００４５】
[0055]当該技術分野に知られる任意の方法によって、点突然変異を導入可能である。例えば、製造者の指示にしたがって、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ２キット（Ｓｔａｔｅｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、点突然変異を作製可能である。
【００４６】
[0056]商業的企業、例えばＩＤＴ  ＤＮＡからプライマーを注文してもよい。
アルファ溶血素変異体
[0057]本明細書に提供するアルファ溶血素には、核酸配列決定反応中、変異体を取り込んだナノポアが、安定な開口チャネルを伴い、改善されたナノポア寿命を有する、特定の置換、あるいは１またはそれより多い組み合わせの置換が含まれる。ナノポア寿命を改善することによって、こうした長寿命ナノポアを用いた配列決定反応は、より長い配列決定反応の経過に渡って、より安定な配列決定データを生成可能である。
【００４７】
[0058]特定の例示的態様において、変異体には、特定の突然変異または一連の突然変異が含まれる。例えば、変異体には、配列番号１４のＥ１１１Ｎ／Ｅ１１１Ｓ、Ｍ１１３Ａ／Ｍ１１３Ｓ、Ｌ１３５Ｉ、Ｔ１４５Ｓ、Ｋ１４７Ｎ／Ｋ１４７Ｓ、またはその組み合わせのいずれか１つのアミノ酸置換が含まれてもよい。さらに、特定の例示的態様において、変異体にはまた、配列番号１４のＨ３５Ｇ置換も含まれてもよい。
【００４８】
[0059]さらに、変異体には、配列番号１４の残基１２７〜１２９のポリＧ置換が含まれてもよい。変異体にはさらに、Ｋ１３１Ｇ突然変異が含まれてもよい。こうしたものとして、特定の例示的態様において、本明細書に記載する、Ｅ１１１Ｎ／Ｅ１１１Ｓ、Ｍ１１３Ａ／Ｍ１１３Ｓ、Ｌ１３５Ｉ、Ｔ１４５Ｓ、Ｋ１４７Ｎ／Ｋ１４７Ｓ、および／またはＨ３５Ｇ置換には、配列番号１４の残基１２６〜１３１の一連のポリ−Ｇアミノ酸が付随する。ナノポア安定性を改善するため、特定の例示的態様において、本明細書記載のアルファ溶血素変異体には、配列番号１４のＨ１４４Ａのアミノ酸置換がさらに含まれてもよい。
【００４９】
[0060]特定の例示的態様において、アルファ溶血素変異体には、置換の特定の組み合わせが含まれる。例えば、アルファ溶血素変異体には、Ｅ１１１Ｎ＋Ｋ１４７Ｎ置換またはＥ１１１Ｓ＋Ｋ１４７Ｓ置換が含まれてもよい。さらにまたはあるいは、アルファ溶血素変異体には、Ｅ１１１Ｎ＋Ｋ１４７Ｎ＋Ｍ１１３Ａ置換またはＥ１１１Ｓ＋Ｋ１４７Ｓ＋Ｍ１１３Ｓ置換が含まれてもよい。特定の例示的態様において、アルファ溶血素変異体には、置換／残基の以下の組み合わせの１つが含まれる：
Ｅ１１１Ｎ＋１２６−１３１Ｇ＋Ｈ１４４Ａ＋Ｋ１４７Ｎ；
Ｈ３５Ｇ＋Ｅ１１１Ｎ＋Ｈ１４４Ａ＋Ｋ１４７Ｎ；
Ｈ３５Ｇ＋Ｅ１１１Ｎ＋Ｍ１１３Ａ＋１２６−１３１Ｇ＋Ｈ１４４Ａ＋Ｋ１４７Ｎ；
Ｅ１１１Ｎ＋Ｍ１１３Ａ＋１２７−１３１Ｇ＋Ｋ１４７Ｎ；または
Ｅ１１１Ｓ＋Ｍ１１３Ｓ＋Ｔ１４５Ｓ＋Ｋ１４７Ｓ＋Ｌ１３５Ｉ。
【００５０】
[0061]特定の例示的態様において、変異体には、本明細書記載の置換の１またはそれより多くが含まれる一方、変異体の全配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列に、最大８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより高い配列同一性を保持する。同様に、他の例示的態様において、変異体には、本明細書記載の置換の１またはそれより多くが含まれる一方、変異体の全配列は、配列番号１４に示すアミノ酸配列に、最大８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより高い配列同一性を保持する。特定の態様において、変異体は、配列番号１７、１８、１９、２０または２２に示すアミノ酸配列に、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより高い配列同一性を有する。
【００５１】
[0062]いかなる特定の理論によって束縛されることも望ましくないが、ナノポアが本明細書記載の変異体を含む場合、孔の収縮側が広がり、それによって核酸配列決定反応中に、孔を、より多くのイオンが流れることが可能になると考えられる。その結果、こうした変異体を含むナノポアは、ナノポアが交流電流に供された際、孔を渡る、より少ない純塩移動を有すると考えられる。純塩移動を減少させることによって、孔を渡る浸透圧不均衡が減少し、それによって、ナノポアの全体の安定性が改善される。したがって、生じるナノポアは、例えば野生型（天然）アルファ溶血素からなるナノポアに比較して、改善された寿命を有する。
【００５２】
[0063]特定の例示的態様において、ナノポア寿命を改善する本明細書記載のアルファ溶血素変異体はまた、配列決定反応中、通過時間を改善しうる。すなわち、変異体がナノポアに取り込まれた際、ナノポアの寿命および通過時間の両方が改善され、したがって、優れたナノポアを生じる。例えば、Ｈ３５Ｇ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａ、Ｋ１４７Ｎ、または１２７−１２９Ｇ置換のいずれかが、ナノポアの寿命および通過時間の両方を改善しうる。同様に、Ｅ１１１Ｓ、Ｍ１１３Ｓ、Ｔ１４５Ｓ、Ｋ１４７Ｓ、またはＬ１３５Ｉ突然変異のいずれかが、ナノポアの寿命および通過時間の両方を改善しうる。
【００５３】
[0064]特定の例示的態様において、さらなる置換が変異体内に取り込まれて、生じるナノポアの通過時間を改善し、それによってナノポアの全体の機能（寿命および通過時間の両方）を改善しうる。例えば、通過時間を改善するために、突然変異させうる残基のリストを表１に提供する。特定の例示的態様において、表１に同定する配列番号１４のアミノ酸の１またはそれより多くを突然変異させる（ｍｕｔｉｎｇ）ことから形成される、改善されたナノポア寿命および改善された時間を生じる変異体は、配列番号１４に示す配列に８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより高い配列同一性を有する。特定の例示的態様において、突然変異は、正電荷の付加を生じる。例えば、突然変異は、表１に同定するアミノ酸残基の、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、または正電荷を所持しうる他のアミノ酸への置換を生じうる。
【００５４】
[0065]特定の例示的態様において、ナノポア寿命を改善するためのＨ３５Ｇ、Ｅ１１１Ｎ／Ｅ１１１Ｓ、Ｍ１１３Ａ／Ｍ１１３Ｓ、Ｌ１３５Ｉ、Ｔ１４５Ｓ、Ｋ１４７Ｎ／Ｋ１４７Ｓ、および／または１２７−１２９Ｇ置換（またはその組み合わせ）に加えて、突然変異には、通過時間もまた改善する、特定のさらなる置換が含まれてもよい。例えば、変異体には、配列番号１４のＶ１４９Ｋ、Ｅ２８７Ｒ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１５１Ｋ、またはその組み合わせのいずれか１つのアミノ酸置換がさらに含まれてもよい。他の例示的態様において、変異体には、１またはそれより多くのこれらの同じ置換が含まれてもよい一方、全体の配列は、配列番号１４に示すアミノ酸配列に最大８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより高い配列同一性を有してもよい。特定の例示的態様において、配列番号１４の最初の１７アミノ酸の１またはそれより多くは、Ａ、Ｎ、Ｋ、またはその組み合わせのいずれかに突然変異された。さらにまたはあるいは、任意の変異体には、本明細書に記載するように、配列番号１４に示す配列の残基１２７から残基１３１に渡る一連のグリシン残基置換が含まれてもよい。
【００５５】
表１：アルファ溶血素変異体を形成するように突然変異されてもよい、成熟アルファ溶血素の残基
【００５６】
【表１】
2019525911.tif 000002
【００５７】
＊位は配列番号１４の特定のアミノ酸位に対応する。
[0066]α−溶血素変異体には、本明細書に記載するような置換の多様な組み合わせが含まれてもよいが、特定の例示的態様において、α−溶血素変異体には、通過時間を改善するための置換の特定の組み合わせが含まれる。例えば、α−溶血素変異体には、配列番号１４に示す配列のアミノ酸置換の以下の組み合わせが含まれてもよい：
Ｈ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ；
Ｖ１４９Ｋ＋Ｅ２８７Ｒ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｖ１４９Ｋ＋Ｅ２８７Ｒ；
Ｔ１０９Ｋ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｐ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｖ１４９Ｋ＋Ｐ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｔ１０９Ｋ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｖ１４９Ｋ＋Ｋ１４７Ｎ＋Ｅ１１１Ｎ＋１２７−１３１Ｇ＋Ｍ１１３Ａ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｖ１４９Ｋ＋Ｋ１４７Ｎ＋Ｅ１１１Ｎ＋１２７−１３１Ｇ＋Ｍ１１３Ａ；または、
Ｔ１０９Ｋ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｐ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇ。
【００５８】
こうした組み合わせには、例えば配列番号１４のＨ１４４Ａの置換、および／または配列番号１４のアミノ酸１２７〜１３１での一連のグリシン残基も含まれてもよい。特定の例示的態様において、α−溶血素変異体には、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列が含まれ、各配列中で同定される置換（単数または複数）は、例えば、変異体において保持される。
【００５９】
[0067]特定の例示的態様において、本明細書記載のアミノ酸置換は、異種分子、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付加を可能にする。特定の例示的態様において、ａ−ＨＬ変異体は、１またはそれより多い翻訳後修飾を有する。特定の例示的側面において、置換は、塩基性であるかまたは約５〜約８．５のｐＨで正に荷電される非天然アミノ酸である。
【００６０】
[0068]特定の例示的態様において、本明細書記載の変異体のすべてまたは部分を形成するアミノ酸は、立体異性体であってもよい。さらにまたはあるいは、本明細書記載の変異体のすべてまたは部分を形成するアミノ酸は、天然存在アミノ酸、非天然存在アミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸、酵素的に合成されたアミノ酸、誘導体化アミノ酸、アミノ酸を模倣するように設計された構築物または構造等の修飾であってもよい。本明細書記載の変異体を形成するアミノ酸は、天然存在タンパク質中に見られる２０の一般的なアミノ酸の１またはそれより多く、あるいは修飾および異常アミノ酸の１またはそれより多くであってもよい。特定の例示的態様において、アミノ酸は、ＤまたはＬアミノ酸であってもよい。
【００６１】
[0069]特定の例示的態様において、変異体にはまた、１またはそれより多い修飾アミノ酸も含まれてもよい。修飾アミノ酸は、誘導体化アミノ酸または修飾および異常アミノ酸であってもよい。修飾および異常アミノ酸の例には、限定されるわけではないが、２−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、３−アミノアジピン酸（Ｂａａｄ）、β−アミノ−プロピオン酸（Ｂａｌａ、β−アラニン）、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ、ピペリジン酸）、４−アミノ酪酸（４Ａｂｕ）、６−アミノカプロン酸（Ａｃｐ）、２−アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３−アミノイソ酪酸（Ｂａｉｂ）、２−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、デスモシン（Ｄｅｓ）、２，２’−ジアミノピメリン酸（Ｄｐｍ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、Ｎ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）、Ｎ−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、アロ―ヒドロキシリジン（ＡＨｙｌ）、３−ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ）、４−ヒドロキシプロリン（４Ｈｙｐ）、イソデスモシン（Ｉｄｅ）、アロ−イソロイシン（Ａｌｌｅ）、Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、ザルコシン）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｍｅｌｌｅ）、６−Ｎ−メチルリジン（ＭｅＬｙｓ）、Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、およびオルニチン（Ｏｒｎ）が含まれる。修飾および異常アミノ酸の他の例は、一般的に、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，  第２版，  ２００２年４月，  Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ａ．  Ｇｒａｎｔ監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｈｒｕｂｙ  Ｖ  Ｊ，  Ａｌ−ｏｂｅｉｄｉ  ＦおよびＫａｚｍｉｅｒｓｋｉ  Ｗ：  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２６８：２４９−２６２，  １９９０；ならびにＴｏｎｉｏｌｏ  Ｃ：  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  ３５：２８７−３００，  １９９０に記載され；そのすべての解説は、本明細書に明確に援用される。
【００６２】
[0070]特定の例示的態様において、変異体のアミノ酸配列は、Ｄ−またはＬ−アミノ酸の配列を中断するいかなる修飾および異常アミノ酸も含まずに、連続的である。他の態様において、配列には、上述のような１またはそれより多い修飾および異常アミノ酸が含まれてもよい。例えば、変異体の配列は、１またはそれより多い修飾および異常アミノ酸によって中断されていてもよい。したがって、非ペプチド性主鎖を有する構造を含む、シュードペプチドおよびペプチド模倣体を提供する。特定の例示的態様において、変異体には、ペプチドの二量体または多量体が含まれる。
【００６３】
[0071]変異体およびＷＴアルファ溶血素が操作可能であるように、特定の例示的態様において、本明細書記載のアミノ酸配列のいずれか、例えば配列番号４〜１４、および１７〜２０、および２２に示すものにはまた、リンカー配列またはアフィニティタグも含まれてもよく、そしてさらに、こうしたタグを除去するための配列（例えばプロテアーゼ切断部位）が含まれてもよい。例えば、本明細書記載のアミノ酸配列のいくつかの態様において、配列には、Ｃ末端に、ＧＬＳＡＥＮＬＹＦＱＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６、式中、ＴＥＶ配列を下線で示す）を有する、リンカー／ＴＥＶ／ＨｉｓＴＡＧ配列が含まれてもよい。当業者は、こうした配列が変異体の精製を可能にすることを認識するであろう。
【００６４】
ナノポア集合体および挿入
[0072]本明細書記載のアルファ溶血素ペプチドは、多量体タンパク質集合体（すなわちナノポア）に組み立て可能である。したがって、生じるナノポアには、複数のアルファ溶血素サブユニットが含まれるであろう。例えば、七量体アルファ溶血素ナノポアには７つのサブユニットが含まれる。
【００６５】
[0073]本明細書記載のアルファ溶血素変異体のいずれも、ナノポア集合体に使用可能である。所定のナノポアのサブユニットは、例えば、同じポリペプチドの同一コピーであってもよいし、またはこれらは異なるポリペプチドであってもよい。例えば、七量体集合体の７つのサブユニット各々は、配列番号１７、１８、１９、２０、または２２に示すアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有してもよい。他の例示的態様において、サブユニットには、配列番号１７、１８、１９、２０、または２２に同定される置換が含まれてもよいが、それぞれ、配列番号１７、１８、１９、２０、または２２に示すアミノ酸配列に８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより高い配列同一性を有していればよい。
【００６６】
[0074]他の例示的態様において、サブユニット各々には、同じシリーズの置換が含まれてもよく、ナノポアの各サブユニットの１またはそれより多くが、異なる全体のアミノ酸配列を有してもよい。すなわち、特定の置換または置換の組み合わせが、所定のナノポア中のすべてのサブユニット間で保存されていてもよい一方、多様なサブユニットの全体のアミノ酸配列が異なっていてもよい。特定の例示的態様において、同じまたは実質的に同じである変異体アルファ溶血素サブユニットを含むナノポアは、異なるアルファ溶血素サブユニットの混合物を有するナノポアに比較して、改善された寿命を提供する。例えば、配列番号１７、１８、１９、２０、または２２に示すアミノ酸配列の１つに、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより高い配列同一性を有するアルファ溶血素変異体サブユニットのみを含むナノポアは、野生型（天然）サブユニットとともに変異体サブユニットを含むナノポアよりもより長い寿命を有しうる。
【００６７】
[0075]特定の例示的態様において、１またはそれより多いサブユニットには、本明細書に記載するような通過時間を改善する置換がさらに含まれてもよい。したがって、生じるナノポアは、寿命の改善および通過時間の増加の両方を有してもよい。特定の例示的態様において、ナノポアには、本明細書記載の変異体および他のアルファ溶血素ポリペプチド、例えば野生型（天然）アルファ溶血素の混合物が含まれてもよい。特定の例示的態様において、ナノポアは、修飾サブユニット（例えばａ−ＨＬ変異体）対非修飾サブユニット（例えばａ−ＨＬ）の定義された比を有する。特定の例示的態様において、そして以下にさらに記載するように、ナノポアは、ナノポア集合体を形成するため、サブユニットの１つに付着するポリメラーゼを有する。
【００６８】
[0076]やはり本明細書に提供するのは、修飾サブユニット対非修飾サブユニットの定義された比を有する多量体タンパク質（例えばナノポアまたはナノポア集合体）を産生するための方法である。ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２７を参照すると、複数のサブユニットを有するタンパク質を組み立てるための方法には、複数の第一のサブユニット２７０５を提供し、そして複数の第二のサブユニット２７１０を提供する工程が含まれ、第二のサブユニットは第一のサブユニットと比較した際、修飾されている。いくつかの場合、第一のサブユニットは野生型である（例えば天然供給源から精製されるかまたは組換え的に産生される）。第二のサブユニットは、任意の適切な方式で修飾されてもよい。いくつかの場合、第二のサブユニットは、付着した（例えば融合タンパク質として）タンパク質（例えばポリメラーゼ）を有する。
【００６９】
[0077]特定の例示的態様において、修飾サブユニットは、化学的に反応性である部分（例えば連結を形成するために適したアジドまたはアルキン基）を含んでもよい。いくつかの場合、方法は、実体（例えばポリメラーゼ）を化学的に反応性である部分に付着させる反応（例えばクリック化学環化付加）を行う工程をさらに含んでもよい。
【００７０】
[0078]特定の例示的態様において、方法には、第一の比で、第一のサブユニットを第二のサブユニット２７１５と接触させて、第一のサブユニットおよび第二のサブユニットを有する複数のタンパク質２７２０を形成する工程がさらに含まれてもよい。例えば、ポリメラーゼと付着するために適した反応基を有する１部分の修飾ａＨＬサブユニットを、６部分の野生型ａＨＬサブユニットと混合してもよい（すなわち第一の比は１：６）。複数のタンパク質は、第一のサブユニット対第二のサブユニットの複数の比を有してもよい。例えば、混合サブユニットは、修飾対非修飾サブユニットの化学量論の分布を有する、いくつかのナノポアを形成してもよい（例えば１：６、２：５、３：４）。
【００７１】
[0079]特定の例示的態様において、単純にサブユニットを混合することによって、タンパク質を形成する。例えばａＨＬナノポアの場合、界面活性剤（例えばデオキシコール酸）は、ａＨＬ単量体を誘発して、孔コンホメーションを取らせる。ナノポアはまた、例えば脂質（例えば１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）または１，２−ジ−０−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ））および中程度の温度（例えば約１００℃未満）を用いて、形成可能である。いくつかの場合、ＤＰｈＰＣと緩衝溶液を混合すると、大型多層小胞（ＬＭＶ）が生成され、そしてこの溶液にａＨＬサブユニットを添加して、そして４０℃で３０分間混合物をインキュベーションすると、孔形成が生じる。
【００７２】
[0080]２つの異なるタイプのサブユニットを用いる場合（例えば天然野生型タンパク質、および単一の点突然変異を含有していてもよい第二のａＨＬ単量体）、生じるタンパク質は、混合化学量論（例えば野生型および突然変異体タンパク質の）を有しうる。これらのタンパク質の化学量論は、特定の例示的態様において、孔形成反応で用いられる２つのタンパク質の濃度比に依存する式にしたがうことも可能である。この式は、以下の通りである：
１００Ｐｍ＝１００［ｎ！／ｍ！（ｎ−ｍ）！］・ｆｍｕｔｍ・ｆｗｔｎ−ｍ、式中、
Ｐｍ＝ｍの数の突然変異体サブユニットを有する孔の可能性
ｎ＝サブユニット総数（例えばａＨＬに関して７）
ｍ＝「突然変異体」サブユニットの数
ｆｍｕｔ＝ともに混合された突然変異体サブユニットの割合または比
ｆｗｔ＝ともに混合された野生型サブユニットの割合または比
[0081]該方法は、第一のサブユニット対第二のサブユニットを有するタンパク質２７２５の第二の比を濃縮するため、複数のタンパク質を分画する工程をさらに含んでもよい。例えば、１つのそして１つのみの修飾サブユニット（例えば１：６の第二の比）を有するナノポアタンパク質を単離してもよい。しかし、任意の第二の比が適切である。第二の比の分布はまた、例えば、１または２のいずれかの修飾サブユニットを有するタンパク質を濃縮するよう分画されてもよい。タンパク質を形成するサブユニットの総数は、ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２７に示されるように、常に７というわけではない（例えば異なるナノポアを用いてもよいし、または６つのサブユニットを有するアルファ溶血素ナノポアを形成してもよい）。いくつかの態様において、１つの修飾サブユニットのみを有するタンパク質を濃縮する。こうした場合、第二の比は、（ｎ−１）の第一のサブユニットあたり１つの第二のサブユニットであり、式中、ｎはタンパク質を構成するサブユニットの数である。
【００７３】
[0082]第一の比は、第二の比と同じであってもよいが、そうである必要はない。いくつかの態様において、突然変異単量体を有するタンパク質は、突然変異サブユニットを持たないものよりもより効率的に形成されない。この場合、第一の比は、第二の比より大きくてもよい（例えば、ナノポアにおいて、１つの突然変異対６つの非突然変異サブユニットの第二の比が望ましい場合、適切な数の１：６タンパク質を形成するには、１：６より高い比でサブユニットを混合する必要がありうる）。
【００７４】
[0083]異なる第二の比のサブユニットを有するタンパク質は、分離の際に異なって振る舞う可能性がある（例えば異なる保持時間を有する）。特定の例示的態様において、クロマトグラフィ、例えばイオン交換クロマトグラフィまたはアフィニティクロマトグラフィを用いて、タンパク質を分画する。第一および第二のサブユニットは修飾以外は同一でありうるため、タンパク質上の修飾の数は、分離の基礎として働きうる。いくつかの場合、第一または第二のサブユニットのいずれかは、分画を可能にするかまたはその効率を改善するため、（例えば修飾に加えて）精製タグを有する。いくつかの態様において、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ストレプトアビジンタグ（Ｓｔｒｅｐタグ）、または他のペプチドタグを用いる。いくつかの態様において、第一および第二のサブユニットは、各々、異なるタグを含み、そして分画工程は各タグに基づいて分画する。Ｈｉｓタグの場合、低ｐＨでタグ上に電荷を生成する（ヒスチジン残基は、側鎖のｐＫａ未満で正に荷電するようになる）。他方に比較して、ａＨＬ分子の一方の電荷に有意な相違があるため、イオン交換クロマトグラフィを用いて、０、１、２、３、４、５、６、または７の「電荷タグ化」ａＨＬサブユニットを有するオリゴマーを分離することも可能である。原理的には、この電荷タグは、均一な電荷を所持する任意の一連のアミノ酸であってもよい。図２８および図２９は、Ｈｉｓタグに基づくナノポアの分画の例を示す。図２８は、２８０ナノメートルの紫外吸光度、２６０ナノメートルの紫外吸光度、および伝導率のプロットを示す。ピークは、多様な比の修飾および非修飾サブユニットを持つナノポアに対応する。ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２９は、ＨｉｓタグおよびＳｔｒｅｐタグの両方を用いた、ａＨＬナノポアおよびその突然変異体の分画を示す。
【００７５】
[0084]特定の例示的態様において、分画後、タンパク質に実体（例えばポリメラーゼ）を付着させる。タンパク質はナノポアタンパク質であってもよく、そして実体はポリメラーゼであってもよい。いくつかの例において、方法はさらに、第二の比を有するタンパク質を二重層内に挿入する工程を含む。
【００７６】
[0085]本明細書に記載するように、ナノポアは、複数のサブユニットを含んでもよい。ポリメラーゼは、サブユニットの１つに付着していてもよく、そして少なくとも１つでそしてすべてより少ないサブユニットが、第一の精製タグを含む。いくつかの例において、すべてのサブユニットが第一の精製タグまたは第二の精製タグを含む。第一の精製タグは、例えば、ポリヒスチジンタグであってもよい（例えばポリメラーゼが付着したサブユニット上）。
【００７７】
ナノポアへのポリメラーゼの付着
[0086]本明細書に記載するように、ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）をナノポアに付着させ、そして／またはその近傍に配置する。ＤＮＡ合成反応中にＤＮＡを合成可能な任意のＤＮＡポリメラーゼを、本明細書記載の方法および組成物にしたがって用いてもよい。例示的なＤＮＡポリメラーゼには、限定されるわけではないが、ファイ２９（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）バクテリオファージφ２９）、ｐоｌ６（クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）ファージ・ファイＣＰＶ４；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＨ２７１１３．１）またはｐоｌ７（アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）ファージＡｖ−１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＲ６７６７１．１）が含まれる。特定の例示的態様において、ナノポア集合体に付着するのは、ＤＮＡ操作または修飾酵素、例えばリガーゼ、ヌクレアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、トランスフェラーゼ、またはトポイソメラーゼである。
【００７８】
[0087]特定の例示的態様において、ポリメラーゼはポリメラーゼ変異体である。例えば、ポリメラーゼ変異体には、米国特許出願第１５／０１２，３１７号（ＵＳ  ２０１６／０２２２３６３  Ａ１として公開、本明細書において、「’３１７出願」とも称される）に同定される任意のポリメラーゼ変異体が含まれてもよい。こうした変異体には、例えば、配列番号１５（’３１７出願の配列番号２に対応する）のＨ２２３Ａ、Ｎ２２４Ｙ／Ｌ、Ｙ２２５Ｌ／Ｔ／Ｉ／Ｆ／Ａ、Ｈ２２７Ｐ、Ｉ２９５Ｗ／Ｆ／Ｍ／Ｅ、Ｙ３４２Ｌ／Ｆ、Ｔ３４３Ｎ／Ｆ、Ｉ３５７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｈ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｅ／Ｙ／Ｐ、Ｓ３６０Ｇ、Ｌ３６１Ｍ／Ｗ／Ｖ、Ｉ３６３Ｖ、Ｓ３６５Ｑ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｇ、Ｓ３６６Ａ／Ｌ、Ｙ３６７Ｌ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｎ、Ｐ３６８Ｇ、Ｄ４１７Ｐ、Ｅ４７５Ｄ、Ｙ４７６Ｖ、Ｆ４７８Ｌ、Ｋ５１８Ｑ、Ｈ５２７Ｗ／Ｒ／Ｌ、Ｔ５２９Ｍ／Ｆ、Ｍ５３１Ｈ／Ｙ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｌ／Ｖ、Ｎ５３５Ｌ／Ｙ／Ｍ／Ｋ／Ｉ、Ｇ５３９Ｙ／Ｆ、Ｐ５４２Ｅ／Ｓ、Ｎ５４５Ｋ／Ｄ／Ｓ／Ｌ／Ｒ、Ｑ５４６Ｗ／Ｆ、Ａ５４７Ｍ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｓ、Ｌ５４９Ｑ／Ｙ／Ｈ／Ｇ／Ｒ、Ｉ５５０Ａ／Ｗ／Ｔ／Ｇ／Ｆ／Ｓ、Ｎ５５２Ｌ／Ｍ／Ｓ、Ｇ５５３Ｓ／Ｔ、Ｆ５５８Ｐ／Ｔ、Ａ５９６Ｓ、Ｇ６０３Ｔ、Ａ６１０Ｔ／Ｅ、Ｖ６１５Ａ／Ｔ、Ｙ６２２Ａ／Ｍ、Ｃ６２３Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｄ６２４Ｆ、Ｉ６２８Ｙ／Ｖ／Ｆ、Ｙ６２９Ｗ／Ｈ／Ｍ、Ｒ６３２Ｌ／Ｃ、Ｎ６３５Ｄ、Ｍ６４１Ｌ／Ｙ、Ａ６４３Ｌ、Ｉ６４４Ｈ／Ｍ／Ｙ、Ｔ６４７Ｇ／Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｓ、Ｉ６４８Ｋ／Ｒ／Ｖ／Ｎ／Ｔ、Ｔ６５１Ｙ／Ｆ／Ｍ、Ｉ６５２Ｑ／Ｇ／Ｓ／Ｎ／Ｆ／Ｔ、Ｋ６５５Ｇ／Ｆ／Ｅ／Ｎ、Ｗ６５６Ｅ、Ｄ６５７Ｒ／Ｐ／Ａ、Ｖ６５８Ｌ、Ｈ６６０Ａ／Ｙ、Ｆ６６２Ｉ／Ｌ、Ｌ６９０Ｍ、またはその組み合わせの１またはそれより多いアミノ酸置換が含まれる。特定の例示的態様において、ポリメラーゼには１またはそれより多いこうした置換が含まれ、そしてポリメラーゼは、配列番号１５に示すアミノ酸配列に、８０％、９０％、９５％、９８％またはそれより高い配列同一性を有する。’３１７出願に記載されるように、ポリメラーゼ変異体は、親ポリメラーゼに比較して、改変された酵素活性、忠実性、処理能力、伸長速度、配列決定精度、長い連続読み取り能、安定性、または可溶性を有してもよい。
【００７９】
[0088]ポリメラーゼは、当該技術分野に知られる任意の適切な方式で、ナノポア集合体に付着していてもよい。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（ＷＯ２０１４／０７４７２７として公開；  Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０２（ＷＯ２００６／０２８５０８として公開）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０（ＷＯ２０１２／０８３２４９として公開；コロンビア大学）を参照されたい。特定の例示的態様において、ポリメラーゼは、ナノポア（例えば溶血素）タンパク質単量体に付着し、そして次いで、完全ナノポア七量体に組み立てられる（例えば付着したポリメラーゼを伴う１つの単量体対付着したポリメラーゼを含まない６つのナノポア（例えば溶血素）単量体の比で）。次いで、ナノポア七量体を膜に挿入してもよい。
【００８０】
[0089]ポリメラーゼをナノポアに付着させるための別の方法は、溶血素単量体にリンカー分子を付着させるか、または溶血素単量体が付着部位を有するように突然変異させて、そして次いで、完全ナノポア七量体を（例えばリンカーおよび／または付着部位を有する１つの単量体対リンカーおよび／または付着部位を持たない６つの溶血素単量体の比で）組み立てる工程を含む。次いで、ポリメラーゼを付着部位または付着リンカーに付着させてもよい（例えば、膜に挿入する前にまとめて）。また、（例えば七量体）ナノポアが膜中で形成された後に、付着部位または付着リンカーにポリメラーゼを付着させてもよい。いくつかの場合、複数のナノポア−ポリメラーゼ対を、バイオチップの複数の膜（例えばウェルおよび／または電極上に沈着される）内に挿入する。いくつかの場合、ナノポア複合体へのポリメラーゼの付着は、各電極上のバイオチップ上で起こる。
【００８１】
[0090]任意の適切なケミストリー（例えば共有結合および／またはリンカー）で、ポリメラーゼをナノポアに付着させてもよい。いくつかの場合、ポリメラーゼを分子ステープルでナノポアに付着させる。いくつかの例において、分子ステープルは、３つのアミノ酸配列（リンカーＡ、ＢおよびＣと示される）を含む。リンカーＡは、溶血素単量体から伸長可能であり、リンカーＢはポリメラーゼから伸長可能であり、そしてリンカーＣは、次いで、リンカーＡおよびＢを結合させ（例えばリンカーＡおよびＢの両方の周囲に巻き付くことによって）、そしてしたがってナノポアにポリメラーゼをナノポアに付着させることも可能である。また、リンカーＣを、リンカーＡまたはリンカーＢの一部として構築して、こうしてリンカー分子の数を減少させてもよい。
【００８２】
[0091]特定の例示的態様において、ＳｏｌｕｌｉｎｋＴＭ化学を用いて、ポリメラーゼをナノポアに連結させる。ＳｏｌｕｌｉｎｋＴＭは、ＨｙＮｉｃ（６−ヒドラジノ−ニコチン酸、芳香族ヒドラジン）および４ＦＢ（４−ホルミルベンゾエート、芳香族アルデヒド）の間の反応であってもよい。いくつかの例において、クリック化学（例えばＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手可能）を用いて、ポリメラーゼをナノポアに連結させる。いくつかの例において、溶血素分子内にジンクフィンガー突然変異を導入し、そして次いで、分子（例えばＤＮＡ中間体分子）を用いて、ポリメラーゼを溶血素のジンクフィンガー部位に連結させる。
【００８３】
[0092]さらにまたはあるいは、生理学的条件下で、自発的に共有イソペプチド連結を形成する、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系を用いて、アルファ溶血素単量体をポリメラーゼに連結してもよい。例えば、Ｌｉら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４  Ｊａｎ  ２３；  ４２６（２）：３０９−１７を参照されたい。例えば、ＳｐｙＴａｇドメインを有するアルファ溶血素タンパク質を発現させてもよい。さらに、アルファ溶血素に連結しようとするＤＮＡポリメラーゼを、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインを有する融合タンパク質として、別個に発現させてもよい。アルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質とＤＮＡポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を混合することによって、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質が相互作用して、共有イソペプチド連結を通じて、ＤＮＡポリメラーゼに連結されたアルファ溶血素単量体を形成する。特定の例示的態様において、リンカー配列を通じて、ＳｐｙＴａｇドメインをアルファ溶血素に付着させる。例えば、リンカー−ＳｐｙＴａｇタンパク質には、配列ＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号２１）が含まれてもよく、ここで下線部分はリンカー配列であり、そして太字部分はＳｐｙＴａｇ配列である。特定の例示的態様において、ＨｉｓＴａｇは、ＳｐｙＴａｇ配列のＳｐｙＴａｇ配列に付着する。例えば、ＫＧリンカーを通じて、ＨｉｓＴａｇをＳｐｙＴａｇに連結してもよい。
【００８４】
[0093]特定の例示的態様において、ナノポア単量体をナノポア集合体に取り込む前に、ポリメラーゼをナノポア単量体に付着させてもよい。例えば、アルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質の発現および精製後、精製アルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質を、精製ポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質と混合して、こうしてＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質が互いに結合して、アルファ溶血素／ポリメラーゼ単量体を形成することを可能にする。次いで、本明細書に記載するように、単量体をナノポア集合体に取り込んで、七量体集合体を形成してもよい。
【００８５】
[0094]特定の例示的態様において、ナノポア集合体の形成後に、ナノポア集合体にポリメラーゼを付着させる。例えば、アルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質の発現および精製後、融合タンパク質をナノポア集合体に取り込んで、七量体ナノポア集合体を形成する。次いで、ポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質を、七量体集合体と混合して、こうしてＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質が互いに結合することを可能にし、次いで、ポリメラーゼのナノポア集合体への結合を生じる。
【００８６】
[0095]ナノポアに基づく配列決定反応の性質のため、当業者は、各ナノポア集合体と会合するのは（多数のポリメラーゼでなく）単一のポリメラーゼのみであることが有益であることを認識するであろう。こうした集合体を達成するため、例えば、単一のＳｐｙＴａｇしか持たず、したがって、単一のポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの付着を可能にするように、ナノポア集合体を設計してもよい。
【００８７】
[0096]アルファ溶血素の場合、例えばアルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇタンパク質とさらなるアルファ溶血素タンパク質を混合すると、０、１、２、３、４、５、６、または７つのアルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇサブユニットを有する七量体が生じる。しかし、各七量体と会合するＳｐｙＴａｇ配列の数が異なる（０、１、２、３、４、５、６、または７）ため、七量体は異なる電荷を有する。したがって、特定の例示的態様において、陽イオン交換クロマトグラフィでの溶出を通じるなど、当該技術分野に知られる方法によって、七量体を分離してもよい。次いで、溶出された分画を調べて、どの分画が単一のＳｐｙＴａｇを含む集合体を含むか決定してもよい。次いで、単一のＳｐｙＴａｇを含む分画を用いて、単一ポリメラーゼを各集合体に付着させて、それによって、単一ポリメラーゼが付着したナノポア集合体を生成してもよい。
【００８８】
[0097]どの七量体分画が単一のＳｐｙＴａｇを含有するか（そしてしたがって、七量体あたり、１つのみのポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質に結合可能であるか）を決定するために、多様な方法が適切でありうるが、特定の例示的態様において、分子量に基づいて、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて、異なる七量体分画を分離することも可能である。次いで、試薬を用いて、各分画と会合するＳｐｙＴａｇの存在を確認してもよい。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分離する前に、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を分画に添加してもよい。
【００８９】
[0098]より少数のＳｐｙＴａｇを含む七量体は、より多数のＳｐｙＴａｇを含む七量体よりも小さいため、単一のＳｐｙＴａｇを含む分画は、最も遠いバンド移動、およびバンドに対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のＧＦＰ蛍光の存在によって明らかであるように、同定可能である。例えば、７つのアルファ溶血素単量体およびゼロのＳｐｙＴａｇ融合タンパク質を含有する分画は、最も遠くに移動するであろうが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰと混合した際に、七量体に結合するＳｐｙＴａｇが存在しないため、蛍光を生じないであろう。しかし、単一のＳｐｙＴａｇを含有する分画は、（他の蛍光バンドに比較して）二番目に遠くに移動し、そしてかつ蛍光を生じ、それによって、七量体に結合した単一ＳｐｙＴａｇを含む分画の同定が可能であろう。七量体に結合した単一ＳｐｙＴａｇを含む分画の同定後、次いで、ポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質をこの分画に添加して、それによって、ポリメラーゼをナノポア集合体に連結することも可能である。
【００９０】
[0099]本明細書に記載する方法および組成物を用いることによって、単一ＤＮＡポリメラーゼに係留され、そして本明細書に記載するようなアルファ溶血素変異体の１またはそれより多くを含む、ナノポア集合体を達成してもよい。例えば、七量体ナノポアには、７つの変異体サブユニットが含まれてもよく、各サブユニットは、配列番号１７、１８、１９、２０、または２２に示すアミノ酸配列の１つ、あるいはサブユニットの１つに付着したＤＮＡポリメラーゼとそれぞれ８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより同一であるアミノ酸配列に対応する配列を有する。
【００９１】
装置セットアップ
[0100]本明細書記載のナノポアを、検出回路、例えば集積回路の検出電極に隣接して配置された膜中に形成するかまたは別の方式で包埋してもよい。集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）であってもよい。いくつかの例において、集積回路は電界効果トランジスタまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。検出回路は、チップまたはナノポアを有する他のデバイス中に配置されてもよいし、あるいはチップまたはデバイスから離れて、例えばオフチップ配置であってもよい。半導体は、限定されるわけではないが、ＩＶ族（例えばケイ素）およびＩＩＩ−Ｖ族半導体（例えばガリウムヒ素）を含む、任意の半導体であってもよい。ヌクレオチドまたはタグを検出するための装置およびデバイスセットアップに関しては、例えばＷＯ２０１３／１２３４５０を参照されたい。
【００９２】
[0101]孔に基づくセンサー（例えばバイオチップ）を、単一分子の電気検査に用いてもよい。孔に基づくセンサーには、検出電極に隣接してまたはその近傍に配置された膜中に形成された本開示のナノポアが含まれてもよい。センサーには、対電極が含まれてもよい。膜には、トランス側（すなわち検出電極に向く側）およびシス側（すなわち対電極に向く側）が含まれる。
【００９３】
[0102]特定の例示的態様において、本明細書記載のアルファ溶血素変異体の１またはそれより多くを含むナノポアは、野生型アルファ溶血素を含むナノポア（すなわち、本明細書記載の置換のいずれも含まないナノポア）に比較して、改善されたナノポア寿命を有するであろう。特定の例示的態様において、ナノポアに含まれる変異体の数がより多いことは、ナノポア寿命の改善のレベルがより高いことに対応する。例えば、７つのアルファ溶血素サブユニット各々が、配列番号１７、１８、１９、２０、または２２に示す配列、あるいはそれぞれこれらに８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより同一である配列の１つに対応する、七量体ナノポアは、野生型（天然）アルファ溶血素のみまたは７より少ない変異体を含むナノポアよりも、より長い寿命を有しうる。すなわち、特定の例示的態様において、ナノポア中に含まれる変異体の数がより多いことは、より長いナノポア寿命に対応する。特定の例示的態様において、七量体ナノポアのサブユニットの７つすべてに、置換、例えばナノポア寿命を改善する同じ置換または重複する置換が含まれる。所定のナノポアにおける変異体は、同じ変異体または異なる変異体の組み合わせであってもよい。
【００９４】
[0103]特定の例示的態様において、配列番号１７、１８、１９、２０、および２２に提供するものなどの、本明細書に記載するような１またはそれより多いアルファ溶血素変異体を含むナノポアの寿命は、野生型（天然）アルファ溶血素のみを含むナノポアに比較した際、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれより多く増加する。特定の例示的態様において、本明細書に記載するような１またはそれより多いアルファ溶血素変異体を含むナノポアの寿命は、野生型（天然）アルファ溶血素のみを含むナノポアに比較した際、２倍または３倍になる。
【００９５】
[0104]特定の例示的態様において、改善されたナノポア寿命に加えて、タグが孔を通過する時間（通過時間またはＴＴＴ）を減少させることも可能である。例えば、本明細書記載の変異体の１またはそれより多くを含むナノポアに関するＴＴＴは、野生型（天然）アルファ溶血素からなる七量体ナノポアに比較した際、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれより多く減少することも可能である。こうしたものとして、本明細書記載の変異体の１またはそれより多くを含むナノポアは、野生型（天然）アルファ溶血素からなる七量体ナノポア集合体に比較した際、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれより多く増加した寿命、ならびに５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれより多く減少したＴＴＴを有することも可能である。
【００９６】
[0105]以下の実験的開示において、以下の略語が当てはまる：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定濃度）；ｍоｌ（モル）；ｍｍоｌ（ミリモル）；μｍоｌ（マイクロモル）；ｎｍоｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（セ氏温度）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）。
【実施例】
【００９７】
[0106]本発明は、請求するような本発明の範囲をいかなる意味でも制限することを意図しない、以下の実施例において、さらに詳細に記載される。付随する図は、本発明の明細および説明の不可分の一部と見なされるよう意味される。引用されるすべての参考文献は、そこに記載されるものすべてに関して、本明細書に特に援用される。以下の例は、例示のために提供され、請求する発明を限定するためではない。
【００９８】
実施例１
発現および回収
[0107]本実施例は、細菌宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）からのタンパク質の発現および回収を例示する。
【００９９】
[0108]野生型ａ−ＨＬをコードするＤＮＡを商業的供給源から購入した。配列を、配列決定によって検証した。
[0109]プラスミド構築。野生型または変異体α−溶血素のいずれかをコードする遺伝子を、Ｔ７プロモーターの調節下、ｐＰＲ−ＩＢＡ２プラスミド（ＩＢＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）内に挿入した。
【０１００】
[0110]形質転換。当該技術分野に周知の技術を用いて、野生型または変異体α−溶血素をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで、大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより）細胞を形質転換した。簡潔には、細胞を氷上で融解した（凍結されている場合）。次に、望ましいＤＮＡ（適切なベクター／プラスミド中）をコンピテント細胞内に直接添加し（コンピテント細胞のものの５％を超えてはならない）、そしてチューブをはじくことによって混合した。チューブを氷上に２０分間置いた。次に、細胞を混合せずに４２℃の水槽に４５秒間置き、その後、チューブを氷上に２分間置いた。次いで、細胞を、０．９ｍｌのＳＯＣ培地を含有する１５ｍｌの無菌培養チューブ（室温であらかじめ温めておく）に移し、そして振盪装置中、３７℃で１時間培養した。最後に、細胞アリコットを、適切な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレート上に広げ、そしてプレートを３７℃で一晩インキュベーションした。
【０１０１】
[0111]タンパク質発現。形質転換後、コロニーを摘み取り、そして適切な抗生物質を含有する少量（例えば３ｍｌ）の増殖培地（例えばＬＢブロス）に接種し、３７℃で一晩振盪した。
【０１０２】
[0112]翌朝、１ｍｌの一晩培養物を、発現プラスミドを選択するために適切な抗生物質を含有する新規の１００ｍｌの自己誘導培地、例えばＭａｇｉｃ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移す。培養物を振盪しながら２５℃でおよそ１６時間増殖させるが、これは発現プラスミドに応じる。３，０００ｇで２０分間、４℃で遠心分離することによって、細胞を採取し、そして使用するまで−８０℃で保存した。
【０１０３】
[0113]精製。超音波によって細胞を溶解した。アフィニティカラムクロマトグラフィによって、均質になるまでアルファ溶血素を精製した。
実施例２
アルファ溶血素変異体
[0114]以下の実施例は、所望の残基での突然変異の導入を詳述する。
【０１０４】
[0115]突然変異。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ多部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を用いて、部位特異的突然変異誘発を行い、例としてのＨ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａ（配列番号４）およびＨ３５Ｇ＋Ｅ１１１Ｎ＋Ｍ１１３Ａ＋１２６−１３１Ｇ＋Ｈ１４４Ａ＋Ｋ１４７Ｎ（配列番号１９）を調製し、これらの配列は、精製のため、Ｃ末端リンカー／ＴＥＶ／ＨｉｓＴａｇを含む。また、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ多部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を実行して、変異体（Ｅ１１１Ｎ＋Ｍ１１３Ａ＋１２６−１３１Ｇ＋Ｋ１４７Ｎ、配列番号２０）を調製し、該変異体は、ポリメラーゼ付着のため、Ｃ末端ＳｐｙＴａｇ、ＫＧリンカー、およびＨｉｓＴａｇを含む。実施例１におけるように変異体を発現させ、そして精製した。
【０１０５】
実施例３
変異体を含むナノポアの組み立て
[0116]本実施例は、続くポリメラーゼ付着のためのＳｐｙＴａｇ配列を有する１つのサブユニット（「α−ＨＬ変異体−ＳｐｙＴａｇ」サブユニット）およびＳｐｙＴａｇを含まない６つのα−ＨＬ変異体サブユニット（「α−ＨＬ変異体」サブユニット）を含む、１：６七量体ナノポアの組み立てを記載する。
【０１０６】
[0117]実施例１および２に記載するように、Ｃ末端ＳｐｙＴａｇ、ＫＧリンカー、およびＨｉｓＴａｇを含むα−ＨＬ変異体−ＳｐｙＴａｇ（Ｅ１１１Ｎ＋Ｍ１１３Ａ＋１２６−１３１Ｇ＋Ｋ１４７Ｎ、配列番号２０）を調製し、そして発現させた。次いで、α−ＨＬ変異体−ＳｐｙＴａｇタンパク質を、コバルト溶出緩衝剤（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８）を用いて、コバルトアフィニティカラム上で精製した。５日以内に用いる場合はタンパク質を４℃で保存し、そうでない場合は、８％トレハロースを添加し、そして−８０℃で保存した。
【０１０７】
[0118]α−ＨＬ変異体サブユニットに関しては、実施例１および２に記載するように、リンカー／ＴＥＶ／ＨｉｓＴａｇを含むＨ３５Ｇ＋Ｅ１１１Ｎ＋Ｍ１１３Ａ＋１２６−１３１Ｇ＋Ｈ１４４Ａ＋Ｋ１４７Ｎ（配列番号１９）の変異体を調製し、そして発現させ、そしてコバルト溶出緩衝剤（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８）を用いて、コバルトアフィニティカラム上で精製した。次いで、α−ＨＬ変異体タンパク質を、タンパク質５ｍｇあたり１ｍｇのＴＥＶプロテアーゼとともに、４℃で４時間インキュベーションした。ＴＥＶプロテアーゼとインキュベーションした後、混合物をコバルトアフィニティカラム上で精製して、ＴＥＶプロテアーゼおよび未消化タンパク質を除去した。５日以内に用いる場合はタンパク質を４℃で保存し、そうでない場合は、８％トレハロースを添加し、そして−８０℃で保存した。
【０１０８】
[0119]およそ１０ｍｇの総タンパク質を用いて、α−ＨＬ変異体−ＳｐｙＴａｇ対所望のα−ＨＬ変異体タンパク質溶液を、１：９の比でともに混合し、最終的に望ましい比で七量体混合物の形成が促進されるようにした。こうした混合物七量体は、多様な比のα−ＨＬ変異体−ＳｐｙＴａｇ対α−ＨＬ変異体タンパク質（０：７、１：６、２：５、３：４等）を含む多様な分画を生じ、ここでα−ＨＬ変異体−ＳｐｙＴａｇ構成要素は、七量体の０、１、２、３、４、５、６、または７の単量体サブユニットとして存在する。
【０１０９】
[0120]ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）脂質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８または１５０ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５のいずれかに、最終濃度５０ｍｇ／ｍｌで溶解し、そしてα−ＨＬ単量体の混合物を最終濃度５ｍｇ／ｍｌまで添加した。α−ＨＬ単量体混合物を、３７℃で少なくとも６０分間インキュベーションした。その後、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（βＯＧ）を最終濃度５％（重量／体積）まで添加して、生じた脂質−タンパク質混合物を可溶化した。試料を遠心分離して、タンパク質凝集物および残った脂質複合体を除去し、そしてさらに精製するため、上清を収集した。
【０１１０】
[0121]次いで、α−ＨＬ七量体の混合物を陽イオン交換精製に供し、そして溶出分画を収集した。各分画に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に２つの試料を調製した。第一の試料には、１５μＬのα−ＨＬ溶出物のみが含まれ、そして第二の試料を、３μｇのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰと合わせた。次いで、試料を遮光して、室温で１〜１６時間インキュベーションした。インキュベーション後、５μＬの４ｘＬａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝剤（Ｂｉｏ−ＲａｄＴＭ）を各試料に添加した。次いで、試料およびＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｌｕｓＴＭ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅタンパク質ラダーを、４−２０％  Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅタンパク質プレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に装填した。ゲルを２００ｍＶで３０分間泳動した。次いで、Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅフィルターを用いて、ゲルを画像化した。
【０１１１】
[0122]七量体α−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇへのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰのコンジュゲート化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の分子量バンドシフトを通じて観察可能である。単一のＳｐｙＴａｇを含有する七量体は、単一のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰ分子に結合し、そしてしたがって七量体孔の分子量に加えてＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰの分子量に対応するシフトを有する一方、２またはそれより多いＳｐｙＴａｇを含む七量体は、対応するより大きな分子量シフトを有するはずである。したがって、上記の七量体α−ＨＬ精製中に陽イオン交換カラムから溶出されるピークを、α−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇ対α−ＨＬ変異体の比に関して分析することも可能である。さらに、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰ付着の存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを画像化した際、ＧＦＰ−蛍光フィルターを用いて観察可能である。
【０１１２】
[0123]この原理に基づき、分子量標準タンパク質ラダーを用いて、分子量シフトがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰの単一の付加に対応する分画を決定した。Ｂｉｏ−Ｒａｄのステイン・フリー画像化系を用いて、分子量シフトを決定した。ブルーフィルターを用いて、ＧＦＰ蛍光の存在を決定した。蛍光の存在を用いて、ＳｐｙＴａｇタンパク質の存在を確認した。次いで、１：６の比、すなわち１つのα−ＨＬ変異体−ＳｐｙＴａｇ対６つのα−ＨＬ変異体に対応する溶出分画をさらなる実験に用いた。
【０１１３】
[0124]これらの同じまたは類似の方法を用いて、Ｈ３５Ｇ＋Ｅ１１１Ｎ＋Ｍ１１３Ａ＋１２６−１３１Ｇ＋Ｈ１４４Ａ＋Ｋ１４７Ｎ（配列番号１９）α−ＨＬ変異体の各々に付加されたＶ１４９Ｋ置換を有する１：６七量体もまた産生した。すなわち、１：６七量体の「６つ」の構成要素には、Ｖ１４９Ｋ置換が含まれ、α−ＨＬ変異体−ＳｐｙＴａｇの「１つ」の構成要素は、表１にＮ修正と示すＥ１１１Ｎ＋Ｍ１１３Ａ＋１２６−１３１Ｇ＋Ｋ１４７Ｎであった（配列番号２０）。
【０１１４】
[0125]上述の１：６七量体に加えて、これらの同じまたは類似の方法を用いて、６つのＨ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａ（配列番号４）α−ＨＬ変異体を有する１：６七量体を生成した。より具体的には、こうした１：６七量体は、１：６比の「１つ」の構成要素としての野生型α−ＨＬ−ＳｐｙＴａｇ、および６つのＨ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａ（配列番号４）α−ＨＬ変異体を含む「６つ」の構成要素を有する。
【０１１５】
実施例４
ポリメラーゼの付着
[0126]本実施例は、ナノポアへのポリメラーゼの付着を提供する。
【０１１６】
[0127]ポリメラーゼは任意の適切な手段によってナノポアにカップリングさせてもよい。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（ＷＯ２０１４／０７４７２７として公開；  Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０２（ＷＯ２００６／０２８５０８として公開）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０（ＷＯ２０１２／０８３２４９として公開；コロンビア大学）を参照されたい。
【０１１７】
[0128]ポリメラーゼ、例えばファイ２９  ＤＮＡポリメラーゼを、リンカー分子を通じてタンパク質ナノポア（例えばアルファ溶血素）にカップリングした。具体的には、生理学的条件下で、自発的に共有イソペプチド連結を形成する、ＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ系を用いた。例えば、Ｌｉら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４  Ｊａｎ  ２３；４２６（２）：３０９−１７を参照されたい。
【０１１８】
[0129]簡潔には、Ｓｔｉｃｋｙファイ２９  ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ  ＨｉｓＴａｇを、実施例１にしたがって発現させ、そしてコバルトアフィニティカラムを用いて精製した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリメラーゼおよびＳｐｙＴａｇオリゴマー化タンパク質を、１：１モル比で、３ｍＭ  ＳｒＣｌ２中、４℃で一晩インキュベーションした。次いで、サイズ排除クロマトグラフィを用いて、１：６のポリメラーゼ−テンプレート複合体を精製する。
【０１１９】
実施例５
変異体の活性
[0130]本実施例は、実施例１〜４に提供されるようなナノポア（付着したポリメラーゼを含むナノポア）の活性を示す。
【０１２０】
[0131]変異体ナノポアをアッセイして、置換の影響を決定した。より具体的には、α−ＨＬ変異体−ＳｐｙＴａｇ（ポリメラーゼが付着している）を含むナノポアの「１つ」の構成要素、およびα−ＨＬ変異体を含む「６つ」の構成要素を含む、１：６比のナノポアをアッセイして、ナノポア寿命に対する置換の影響を決定した。Ｖ１４９Ｋ置換もまた含むナノポアを同様にアッセイして、ナノポア寿命を決定した（以下の表１を参照されたい）。さらに、１：６の「１つ」の構成要素としての野生型α−ＨＬ−ＳｐｙＴａｇ（ポリメラーゼが付着している）および「６つ」の構成要素としての６つのＨ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａ（配列番号４）α−ＨＬ変異体を有するナノポアを、通過時間に対する置換の影響に関して分析した。
【０１２１】
[0132]アッセイを実行するため、２０１４年１０月２３日出願のＰＣＴ／ＵＳ１４／６１８５３に記載されるように、二重層を形成し、そして孔を挿入した。分子（および／または核酸の配列）を検出するために用いたナノポアデバイス（またはセンサー）は、ＷＯ２０１３１２３４５０に記載されるようにセットアップされた。
【０１２２】
ナノポア寿命の評価
[0133]このアッセイは、ナノポアが、交流電圧、すなわち方形波の影響下で、脂質二重層中で適切に機能可能である時間を測定するように設計された。
【０１２３】
[0134]ナノポア寿命を測定するため、我々は、孔寿命に対して、交流正電圧および負電圧（方形波）を用いるアッセイを考案した。我々の配列決定複合体は、単一のＤＮＡポリメラーゼに付着したタンパク質ナノポア（αＨＬ）で構成される（実施例４を参照されたい）。電流は、適用される正電圧および負電圧において、孔を通じて示差的に通過する。ナノポアは、負電圧に比較して、正電圧下でイオンを示差的に通過させうる。これは、ウェルの外への塩および水イオンのポンピングを導く。孔の寿命全体で、このプロセスは次第に二重層を変形させ、そしてナノポアがもはや二重層を渡ってイオンを伝導しないようにする。これが起きた場合、孔寿命は終了となる。次いで、これらの時間を記録して、そして図１Ａ、図２Ａ、および図３Ａに示すように、ヒストグラムとしてプロットする。
【０１２４】
[0135]「寿命」アッセイを実行するため、Ｇｅｎｉａ  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇデバイスをＧｅｎｉａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇチップとともに用いる。電極を条件化し、そしてＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２６５１４に説明されるように、チップ上にリン脂質二重層を確立する。ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２６５１４（ＷＯ２０１３／１２３４５０として公開）に記載されるプロトコルにしたがって、Ｇｅｎｉａの配列決定複合体を二重層に挿入する。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、３００ｍＭ  ＫＧｌｕ、３μＭタグ化ヌクレオチド、３ｍＭ  Ｍｇ２＋で構成される緩衝系を用い、８０Ｈｚの調節率で、２３５ｍＶピーク間適用電圧で、孔寿命データを収集した。
【０１２５】
[0136]図１Ａ〜１Ｂ、２Ａ〜２Ｂ、および３Ａ〜３Ｂに示すように、１：６比のα−ＨＬ変異体−ＳｐｙＴａｇ（Ｅ１１１Ｎ＋Ｍ１１３Ａ＋１２６−１３１Ｇ＋Ｋ１４７Ｎ、配列番号２０）およびα−ＨＬ変異体サブユニット（Ｈ３５Ｇ＋Ｅ１１１Ｎ＋Ｍ１１３Ａ＋１２６−１３１Ｇ＋Ｈ１４４Ａ＋Ｋ１４７Ｎ（配列番号１９））を含むナノポアは、有意に改善された寿命を示した。そして、Ｖ１４９Ｋ置換は、改善されるナノポア寿命の全体のレベルを減少させたが、にもかかわらず、寿命は、５．４％から〜２６％の孔が少なくとも１時間持続することによって改善された（対照に比較した際）（表１を参照されたい）。
【０１２６】
【表２】
2019525911.tif 000003
【０１２７】
表１−改善されたナノポア寿命に対するＶ１４９Ｋの評価。簡潔には、異なる条件下での通過時間および孔寿命両方に関して、異なる孔タイプを試験した。Ｅ１１１Ｎ＋Ｍ１１３Ａ＋１２６−１３１Ｇ＋Ｋ１４７Ｎは、スペースを節約するために「Ｎ修正」と称する。Ｎ修正孔は、Ｈ１４４ＡまたはＶ１４９Ｋ対応物よりもより長い孔寿命を有する。Ｖ１４９ＫおよびＮ修正突然変異が組み合わされると、生じる突然変異体は、０．０００１μＭに希釈された際、Ｖ１４９Ｋ単独よりも＞２ｘの孔寿命を有する。
【０１２８】
通過時間の評価
[0137]このアッセイは、交流電圧、すなわち方形波を用いて、ナノポアに付着したＤＮＡポリメラーゼによってタグ化分子が捕捉されるためにかかる時間を測定するように設計された。
【０１２９】
[0138]我々の配列決定複合体において、ＤＮＡポリメラーゼによってタグ化ヌクレオチドが捕捉されるためにかかる時間を測定するため、我々は、交互の正電圧および負電圧（方形波）を用いて、これにかかる時間量を決定するアッセイを考案した。我々の配列決定複合体は、単一ＤＮＡポリメラーゼに付着したタンパク質ナノポア（αＨＬ）で構成される（実施例４を参照されたい）。タグ化ヌクレオチドは、負に荷電され、そしてしたがって、適用される電圧の性質が正である際に、ナノポアに誘引され、そしてナノポア配列決定複合体に適用される電圧が負である際に、反発する。したがって、我々は、正および負電位の間で電圧をサイクリングすることによって、タグが孔を通過するためにかかる時間を測定し、そしてタグが通過する（減少した電流の束（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｆｌｕｘ））際に対して、ナノポアの電流が遮られていない（開口チャネル）場合の時間がどのくらいかを決定することが可能である。
【０１３０】
[0139]「通過時間」アッセイを実行するため、Ｇｅｎｉａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇチップとともに、Ｇｅｎｉａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇデバイスを用いる。電極を条件化し、そしてＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２６５１４に説明されるように、チップ上にリン脂質二重層を確立する。ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２６５１４（ＷＯ２０１３／１２３４５０として公開）に記載されるプロトコルにしたがって、Ｇｅｎｉａの配列決定複合体を二重層に挿入する。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、３００ｍＭ  ＫＧｌｕ、３μＭタグ化ヌクレオチド、３ｍＭ  Ｍｇ２＋で構成される緩衝系を用い、８０Ｈｚの負荷サイクル、２３５ｍＶピーク間適用電圧で、通過時間データを収集した。
【０１３１】
[0140]データを収集した後、方形波の正の部分の最後まで持続し、そして続く方形波上の別のタグ捕捉が続く、タグ化ヌクレオチドの捕捉（通過レベル）を示した、方形波に関して、データを分析した。第二の方形波が、開口チャネル電流を閉塞していないと報告される時間の長さを決定することによって、通過時間を測定した。例として、１０の連続方形波が、方形波の正部分の終わりまで持続するタグ化ヌクレオチド捕捉を示した場合、通過時間パラメータは、方形波２〜１０（ポリメラーゼは以前の方形波において結合したタグを持たなかったため、第一の方形波は計算に組み込まれない）より計算されるであろう。次いで、これらの通過時間数を、実験における孔のすべてに関して収集し、そして統計パラメータをこれらから抽出した（例えば平均、中央値、標準偏差等）。
【０１３２】
[0141]対照に比較した際の、Ｈ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａ変異体に関する結果を、図４Ａ〜４Ｂに示す。
[0142]引用リスト
特許文献
【０１３３】
【化１】
2019525911.tif 000004
【０１３４】
非特許文献
【０１３５】
【化２】
2019525911.tif 000005
【０１３６】
【化３】
2019525911.tif 000006
【０１３７】
[0143]本明細書に引用される各特許、特許出願、刊行物、文書、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウェブサイト、および他の刊行資料の全体は、すべての表、図面、および図表を含めて、本明細書に援用される。すべての特許および刊行物は、各々が特にそして個々に本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いまで、本明細書に援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認ではなく、あるいはこれらの刊行物または文書の内容または日付に関するいかなる承認も構成しない。本明細書に言及するすべての特許および刊行物は、本発明が関連する技術分野の一般の当業者の技術レベルを示す。
【図１】
2019525911.tif 000007
【図２】
2019525911.tif 000008
【図３】
2019525911.tif 000009
【図４】
2019525911.tif 000010
【配列表】
2019525911000001.app
【国際調査報告】
2019525911.tif 000011
2019525911.tif 000012
2019525911.tif 000013
2019525911.tif 000014
2019525911.tif 000015
2019525911.tif 000016