(57)【要約】  本発明は、膵内分泌細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現している膵臓ベータ細胞へと分化させる方法を提供する。これらの膵臓ベータ細胞は、多能性幹細胞の段階的分化によって得られてもよい。膵臓ベータ細胞は、膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びグルコース刺激性インスリン分泌を呈する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵内胚葉細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を発現する機能的ベータ細胞へと分化させる方法であって、膵内分泌細胞を、ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することを含む、方法。
【請求項２】
前記培養培地に、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ若しくは２つ以上が更に補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養培地がＡＬＫ５阻害剤を欠く、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地にＡＬＫ５阻害剤が補充される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記培地に、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充され、前記培地がＡＬＫ５阻害剤を含有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培地にＴ３が補充される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記培地にＡＺＴが補充される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培地にＤＥＺＡが補充される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的ベータ細胞が、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞、初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、未成熟ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞、及び機能的ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞のうちの１つ又は２つ以上の段階的分化によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、空気−液体界面で前記細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、懸濁クラスター中で前記細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
膵内分泌細胞のインビトロ分化によって得られた、単一ホルモンインスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する機能的ベータ細胞のインビトロ集団。
【請求項１３】
前記細胞がＵＣＮ３及びＳＬＣ２Ａ１も発現する、請求項１２に記載の集団。
【請求項１４】
前記細胞が、グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸を呈する、請求項１２に記載の集団。
【請求項１５】
前記グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸が、ヒト膵島細胞のものに類似している、請求項１４に記載の集団。
【請求項１６】
ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で膵内分泌細胞を培養することによって得られる、単一ホルモンインスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現する膵臓ベータ細胞のインビトロ集団。
【請求項１７】
前記培地に、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される、請求項１６に記載の集団。
【請求項１８】
前記培地がＡＬＫ５阻害剤を欠く、請求項１６又は１７に記載の集団。
【請求項１９】
前記培地にＴ３が補充される、請求項１６又は１７に記載の集団。
【請求項２０】
前記培地に、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充され、前記培地がＡＬＫ５阻害剤を含有しない、請求項１６に記載の集団。
【請求項２１】
前記培地にＴ３が補充される、請求項１６に記載の集団。
【請求項２２】
前記培地にＡＺＴが補充される、請求項２１に記載の集団。
【請求項２３】
前記培地にＤＥＺＡが補充される、請求項２２に記載の集団。
【請求項２４】
前記細胞がＵＣＮ３及びＳＬＣ２Ａ１も発現する、請求項１６に記載の集団。
【請求項２５】
前記細胞が、グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸を呈する、請求項１６に記載の集団。
【請求項２６】
前記グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸が、膵島細胞のものに類似している、請求項１６に記載の集団。
【請求項２７】
多能性幹細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現する機能的ベータ細胞へと分化させる方法であって、
ａ．多能性幹細胞を未成熟ベータ細胞へと分化させ、かつ
ｂ．ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で前記未成熟ベータ細胞を培養することによって、前記未成熟ベータ細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を発現する機能的ベータ細胞へと分化させる、方法。
【請求項２８】
前記機能的ベータ細胞が、ヒト膵島細胞と類似しているグルコース依存性ミトコンドリア呼吸を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記機能的ベータ細胞が、ヒト膵島細胞に類似しているグルコース刺激性インスリン分泌を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記機能的ベータ細胞が、複数の相においてインスリンを分泌する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記培養培地に、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養培地がＡＬＫ５阻害剤を欠く、請求項２７又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養培地にＴ３が補充される、請求項２７又は３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記培地に、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充され、前記培地がＡＬＫ５阻害剤を含有しない、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記培地にＴ３が補充される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記培地にＡＺＴが補充される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記培地にＤＥＺＡが補充される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が、空気−液体界面で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記方法が、懸濁クラスター中で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
多能性幹細胞を分化させる前記工程が、
ａ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ１細胞」）へと分化させる工程と、
ｂ．前記ステージ１細胞を、初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ２細胞」）へと分化させる工程と、
ｃ．前記ステージ２細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ３細胞」）へと分化させる工程と、
ｄ．前記ステージ３細胞を、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ４細胞」）へと分化させる工程と、
ｅ．前記ステージ４細胞を、膵内分泌前駆細胞（「ステージ５細胞」）へと分化させる工程と、
ｆ．前記ステージ５細胞を、未成熟ベータ細胞へと分化させる工程と、を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記工程ｅ．及びｆ．が、前記空気−液体界面で培養することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記工程ｅ．及びｆ．が、懸濁クラスター中で前記細胞を培養することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、前記多能性幹細胞をＭＣＸ化合物及びＧＤＦ−８が補充された培地中で培養することによって、多能性幹細胞をステージ１細胞へと分化させることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、前記ステージ１細胞をＦＧＦ７及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ１細胞をステージ２細胞へと分化させることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、前記ステージ２細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ２細胞をステージ３細胞へと分化させることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が、前記ステージ３細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ３細胞をステージ４細胞へと分化させることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が、前記ステージ４細胞をＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ４細胞をステージ５細胞へと分化させることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記培地に、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が、前記ステージ５細胞をＢＭＰ阻害剤、アスコルビン酸、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ５細胞を未成熟ベータ細胞へと培養することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記培地にＡＬＫ５阻害剤又はガンマセクレターゼ阻害剤が更に補充される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記方法が、前記未成熟ベータ細胞をＡＬＫ５阻害剤を欠き、かつＺＭ４４７４３９、ＡＺＴ、Ｎ−アセチルシステイン、ＤＥＺＡ、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することによって、前記未成熟ベータ細胞をＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現している機能的ベータ細胞へと分化させることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項５２】
前記グルコース依存性ミトコンドリア呼吸のグルコース刺激後の酸素消費速度応答が、基礎酸素消費速度を約２０％〜約８０％上回る範囲である、請求項１４、２５、及び２８に記載の方法。
【請求項５３】
前記酸素消費速度応答が、グルコース刺激の少なくとも１５分後に生じた、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記グルコース刺激性インスリン分泌が、グルコース刺激に応答した急速な二相インスリン分泌を含む、請求項１４、２５、及び２８に記載の方法。
【請求項５５】
前記二相性インスリン分泌の第１相が、基礎分泌の少なくとも４倍〜少なくとも８倍増加し、第２相が、前記基礎分泌の少なくとも２倍〜少なくとも４倍増加する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記インスリン分泌が、前記グルコース刺激の少なくとも５分〜少なくとも１０分後に生じる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記機能的ベータ細胞がヒト膵島細胞と類似しているグルコース依存性ミトコンドリア呼吸を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
前記機能的ベータ細胞が膵島細胞に類似しているグルコース刺激性インスリン分泌を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記グルコース依存性ミトコンドリア呼吸のグルコース刺激後の酸素消費速度応答が、基礎酸素消費速度を約２０％〜約８０％上回る範囲である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記酸素消費速度応答が、グルコース刺激の少なくとも１５分後に生じた、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記グルコース刺激性インスリン分泌が、グルコース刺激に応答した急速な二相性インスリン分泌を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記二相性インスリン分泌の第１相が、基礎分泌の少なくとも４倍〜少なくとも８倍増加し、第２相が、前記基礎分泌の少なくとも２倍〜少なくとも４倍増加する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記インスリン分泌が、前記グルコース刺激の少なくとも５分〜少なくとも１０分後に生じる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ステージ４細胞が凍結保存される、請求項４０に記載の方法。
【請求項６５】
前記工程ｅが、ステージ４凍結保存細胞を培養することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｔ３が１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲である、請求項６、２１、３５、及び５１に記載の方法。
【請求項６７】
前記培地にＴ３が補充され、前記Ｔ３が１ｎＭ〜１μＭの範囲である、請求項４８〜５０に記載の方法。
【請求項６８】
多能性幹細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現する機能的ベータ細胞へと分化させる方法であって、
ａ．前記多能性幹細胞を、前記多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａが補充された培地中で培養することによって得られた胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させ、
ｂ．前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する前記細胞を未成熟ベータ細胞へと分化させ、かつ
ｃ．ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で前記未成熟ベータ細胞を培養することによって、前記未成熟ベータ細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を発現する機能的ベータ細胞へと分化させる、方法。
【請求項６９】
前記機能的ベータ細胞がヒト膵島細胞と類似しているグルコース依存性ミトコンドリア呼吸を有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記機能的ベータ細胞がヒト膵島細胞に類似しているグルコース刺激性インスリン分泌を有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記機能的ベータ細胞が、複数の相においてインスリンを分泌する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記培養培地に、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記培養培地がＡＬＫ５阻害剤を欠く、請求項６８又は７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記培養培地にＴ３が補充される、請求項６８又は７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記培地に、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充され、また前記培地がＡＬＫ５阻害剤を含有しない、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
前記培地にＴ３が補充される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記培地にＡＺＴが補充される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記培地にＤＥＺＡが補充される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記方法が、空気−液体界面において、懸濁クラスター中で、ローラボトル中で、又はマイクロキャリア上で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８０】
前記方法が、ローラボトル中で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８１】
前記方法が、マイクロキャリア上のローラボトル中で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
多能性幹細胞を分化させる前記工程が、
ａ．前記多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａが補充された培地中で培養することによって、前記多能性幹細胞を前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ１細胞」）へと分化させる工程と、
ｂ．前記ステージ１細胞を、初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ２細胞」）へと分化させる工程と、
ｃ．前記ステージ２細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ３細胞」）へと分化させる工程と、
ｄ．前記ステージ３細胞を、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ４細胞」）へと分化させる工程と、
ｅ．前記ステージ４細胞を、膵内分泌前駆細胞細胞（「ステージ５細胞」）へと分化させる工程と、
ｆ．前記ステージ５細胞を、未成熟ベータ細胞へと分化させる工程と、を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８３】
前記工程ｅ．及びｆ．が、前記空気−液体界面において、懸濁クラスター中で、ローラボトル中で、又はマイクロキャリア上で培養することを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記工程ｅ．及びｆ．が、ローラボトル中で前記細胞を培養することを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記工程ｅ．及びｆ．が、マイクロキャリア上のローラボトル中で前記未成熟ベータ細胞を培養することを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記方法が、前記ステージ１細胞をＦＧＦ７及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ１細胞をステージ２細胞へと分化させることを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記方法が、前記ステージ２細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ２細胞をステージ３細胞へと分化させることを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
前記培地がＢＭＰ阻害剤を欠く、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記方法が、前記ステージ３細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ３細胞をステージ４細胞へと分化させることを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項９０】
前記培地がＢＭＰ阻害剤を欠く、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記方法が、前記ステージ４細胞をＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ４細胞をステージ５細胞へと分化させることを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項９２】
前記培地に、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記方法が、前記ステージ５細胞をＢＭＰ阻害剤、アスコルビン酸、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することによって、前記ステージ５細胞を未成熟ベータ細胞へと培養することを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項９４】
前記培地にＡＬＫ５阻害剤又はガンマセクレターゼ阻害剤が更に補充される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記方法が、前記未成熟ベータ細胞を、ＡＬＫ５阻害剤を欠き、かつＺＭ４４７４３９、ＡＺＴ、Ｎ−アセチルシステイン、ＤＥＺＡ、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することによって、前記未成熟ベータ細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現している機能的ベータ細胞へと分化させることを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項９６】
前記多能性幹細胞がヒトＨ１又はＨ９細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項９７】
前記多能性幹細胞がヒトＣｙＴ４９細胞である、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６２／３５２，９６８号（２０１６年６月２１日出願）に対する優先権を主張し、その全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、多能性幹細胞の分化から生じる機能的膵臓ベータ細胞及び集団をインビトロで産生するための方法に関する。特に、本発明は、ミトコンドリア呼吸／活性応答及び二相インスリン分泌応答を呈するベータ細胞又はベータ細胞の集団に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｉ型真性糖尿病の細胞補充療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞、又はベータ（β）細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、胚性幹細胞又は誘導性多能性幹細胞などの多能性幹細胞から機能的ベータ細胞を生成するものがある。
【０００４】
脊椎動物の胚発生では、多能性細胞は、原腸形成として知られるプロセスにおいて３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）から構成される細胞群を生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。
【０００５】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮培地の産生を記載した（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００５，２３：１５３４〜１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号）。マウスの腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植により、内胚葉組織の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が生じた（米国特許第７，７０４，７３８号）。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化させることができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４号）。免疫不全マウスの脂肪パッド中のこれら膵臓前駆細胞のその後の移植により、３〜４ヶ月の成熟期の後に、機能的膵内分泌細胞の形成が生じた（米国特許第７，５３４，６０８号及び同第７，９９３，９２０号）。
【０００６】
小分子阻害剤が、膵内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧＦ−β受容体及びＢＭＰ受容体の小分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０１１，１３８：８６１〜８７１；Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１１，６０：２３９〜２４７）は、膵内分泌細胞の数を増強するために使用されている。加えて、小分子活性因子もまた、胚体内胚葉細胞又は膵内胚葉細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００９，２１：７２７〜７３２）。Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００９，５：２５８〜２６５）。
【０００７】
一般に、前駆細胞を機能的ベータ細胞に分化させるプロセスは、様々なステージを経て進み、ヒト多能性幹細胞などの前駆細胞から膵臓細胞を生成するためのプロトコルを改善することにおいて進歩した。研究におけるこれらの進歩にも関わらず、前駆細胞を分化させるプロセスの各工程は、特有の問題を提示する。このため、機能的膵内分泌細胞、とりわけ機能的ベータ細胞を産生する目的で、更なる分化プロトコル開発の必要性が依然として存在する。特に、機能性ベータ細胞で観察される急速かつ調節されたグルコース刺激性インスリン分泌（「ＧＳＩＳ」）を可能にするグルコース応答性インスリン産生細胞のインビトロの生成を提供することが望ましい。具体的には、第１相及び第２相のインスリン分泌後にミトコンドリア呼吸／活性の増加を呈する機能的ベータ細胞をインビトロで産生する方法を提供することが望ましい。
【０００８】
ＧＳＩＳは、グルコース輸送体（溶質担体ファミリー２、メンバー１；ＳＬＣ２Ａ１；又はグルコース輸送体１と一般に称される；ヒトベータ細胞のＧＬＵＴ１）、及びグルコースのピルビン酸塩への代謝を介して、解糖という名のプロセスをとおして、グルコースをベータ細胞中に取り込むことによって開始される。ミトコンドリアへのピルビン酸塩の取り込み、ＴＣＡ（トリカルボン酸、及び後続の電子伝達鎖（「ＥＴＣ」、本明細書では「ミトコンドリア活性」又は「ミトコンドリア呼吸」と称される）の活性化）サイクルをとおしたその代謝は、インスリンエキソサイトーシスと密接に連結することで、急速かつ正しい量のインスリン放出を確実にする。
【０００９】
膵島内の機能的ベータ細胞は、２つの連続相においてグルコース濃度の急激な増加の際にインスリンを分泌することが示されている（Ｈｅｎｑｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２００９）５２（５）：７３９〜７５１）。両方の相の振幅及び持続期間は、細胞内Ｃａ２＋シグナル又は相加分泌結合因子の動態によって調節される。第１の相（１ｓｔ）のインスリン分泌は、結合し、容易に解放可能なインスリン顆粒の小さいプールのエキソサイトーシスを表す。振幅はより小さいが持続期間がより長い第２の相（２ｎｄ）のインスリン分泌は、顆粒を顆粒の貯蔵プールから移動させること、及び解放のためにそれらをドッキング／プライミングすることを表す。ベータ細胞における成熟の重要なマーカーである二相性ＧＳＩＳは、ヒト発達の出生後の相まで検出されず、未成熟ベータ細胞に見られる単相性ＧＳＩＳとは対照的である（Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９８８）３７：２８６〜２９１）。
【００１０】
２型糖尿病では、ＧＳＩＳの第１の相は存在せず、ＧＳＩＳの第２の相も低下する。ベータ細胞数が自己免疫攻撃により大きく低下する１型糖尿病は、確固とした二相性ＧＳＩＳを欠くことが報告されている（Ｋｒｏｇｖｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２０１５）６４：２５０６〜２５１２）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
具体化され十分に記載されるように、本発明は、多能性幹細胞の分化から生じる機能的ベータ細胞（機能的膵臓ベータ細胞）及び細胞の集団をインビトロで産生させるための方法を提供する。特に、本発明は、ミトコンドリア呼吸／活性応答及び二相インスリン分泌応答を呈する機能的膵臓ベータ細胞（インスリン産生細胞）又は機能的ベータ細胞の集団の生成に関する。
【００１２】
本発明の一態様は、多能性幹細胞を機能性ベータ細胞へと分化させる方法である。本発明の特定の態様は、膵内胚葉細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を発現している機能的ベータ細胞へと分化させる方法である。実施形態において、本方法は、膵内分泌細胞を、ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上の小分子が補充された培養培地中で培養することを含む。
【００１３】
本発明の実施形態は、膵内分泌細胞のインビトロの分化によって得られた単一のホルモンインスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＭＡＦＡを発現している機能的膵臓ベータ細胞のインビトロの集団である。いくつかの実施形態において、機能的ベータ細胞の集団はまた、ＵＣＮ３及びＳＬＣ２Ａ１を共発現する。実施形態において、ＭＡＦＡ発現は未成熟ベータ細胞と比較して増加する。実施形態において、機能的ベータ細胞のインビトロの集団は、膵内分泌細胞を、ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上の小分子が補充された培地中で培養することによって得られる。
【００１４】
本発明の更なる実施形態は、多能性幹細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現している機能的ベータ細胞へと分化させる方法であり、本方法は、多能性幹細胞を膵内分泌細胞へと分化させる工程と、膵内分泌細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を発現している機能的ベータ細胞へと分化させる工程と、を含む。実施形態において、ＭＡＦＡ発現は未成熟ベータ細胞と比較して増加する。実施形態において、本方法は、膵内分泌細胞を、ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上の小分子が補充された培養培地中で培養することを含む。
【００１５】
上に記載の実施形態の各々において、培養培地には、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、及び製剤Ｉのうちの１つ又は２つ以上が補充される。上記の実施形態において、培養培地には、Ｔ３、Ｔ４、及びその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される。上記の実施形態では、培養培地には、ＡＬＫ５阻害剤が補充される。上記のいくつかの実施形態において、培養培地はＡＬＫ５阻害剤を欠く。上記の本発明の実施形態において、培養培地にはＡＺＴ又はＤＥＺＡが補充される。上記のいくつかの実施形態において、培養培地にはＡＺＴ及びＤＥＺＡの両方が補充される。
【００１６】
上に記載の本発明の実施形態において、培地にはガンマセクレターゼ阻害剤が更に補充される。上記の実施形態のいくつかにおいて、培養培地にはＴ３が補充される。実施形態のいくつかにおいて、Ｔ３は、１ｎＭ〜１μＭの範囲である。特定の実施形態において、Ｔ３は、１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲である。
【００１７】
更に上に記載の本発明の実施形態において、機能的ベータ細胞は、以下の群、すなわち、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞；初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞；前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞；膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞；膵内分泌前駆細胞；及び未成熟ベータ細胞（膵内分泌細胞）に特徴的なマーカーを発現する細胞から選択される細胞のうちの１つ又は２つ以上の段階的分化によって得られる。
【００１８】
上に記載の実施形態の各々において、本方法は、空気−液体界面で細胞を培養することを含む。上に記載のいくつかの実施形態において、本方法は、懸濁液中の細胞、例えば、懸濁液中の細胞クラスターを培養することを含む。
【００１９】
上記の実施形態において、分化した機能的ベータ細胞は、未成熟ベータ細胞よりも高いレベルでＭＡＦＡを発現する。実施形態において、分化した機能的ベータ細胞は、未成熟ベータ細胞よりも高いレベルでＵＣＮ３を発現する。上記のいくつかの実施形態において、ＭＡＦＡ及びＵＣＮ３の発現は、未成熟ベータ細胞における発現と比較して増加する。
【００２０】
上記の本発明の実施形態において、機能的ベータ細胞の集団は、グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸を呈する。上に記載の実施形態において、グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸は、ヒト膵島細胞のものに類似している。上に記載の本発明の実施形態において、機能的ベータ細胞は、複数の相においてインスリンを分泌する。
【００２１】
上に記載の実施形態において、グルコース依存性ミトコンドリア呼吸のグルコース刺激後の最大酸素消費速度応答は、基礎酸素消費速度を約２０％〜約８０％上回る範囲である。実施形態において、酸素消費速度応答は、グルコース刺激の少なくとも１５分後に生じた。
【００２２】
上記の実施形態において、グルコース刺激性インスリン分泌は、グルコース刺激に応答した急速な二相性インスリン分泌を含む。実施形態において、二相性インスリン分泌の第１相は、基礎分泌の少なくとも４倍〜少なくとも８倍増加し、二相性インスリン分泌の第２相は、基礎分泌の少なくとも２倍〜少なくとも４倍増加する。実施形態において、インスリン分泌は、グルコース刺激の少なくとも５分〜少なくとも１０分後に生じる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞を分化させる方法は、多能性幹細胞を、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ１細胞」）へと分化させる工程と、ステージ１細胞を、初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ２細胞」）へと分化させる工程と、ステージ２細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ３細胞」）へと分化させる工程と、ステージ３細胞を、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ４細胞」）へと分化させる工程と、ステージ４細胞を膵内胚葉／内分泌前駆細胞（膵内胚葉細胞及び膵内分泌前駆細胞の一方又は両方に特徴的なマーカーを発現する細胞、「ステージ５」）へと分化させる工程と、ステージ５細胞を未成熟ベータ細胞（膵内分泌細胞、「ステージ６」）へと分化させる工程と、ステージ６細胞を機能的ベータ細胞（膵内分泌細胞、「ステージ７」）へと分化させる工程と、を含む。
【００２４】
実施形態において、本分化方法は、多能性幹細胞をＭＣＸ化合物及びＧＤＦ−８が補充された培地中で培養することによって、多能性幹細胞をステージ１細胞へと分化させることを含む。
【００２５】
実施形態において、本方法は、ステージ１細胞をＦＧＦ７及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、ステージ１細胞をステージ２細胞へと分化させることを含む。
【００２６】
実施形態において、本方法は、ステージ２細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、ステージ２細胞をステージ３細胞へと分化させることを含む。
【００２７】
実施形態において、本方法は、ステージ３細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、ステージ３細胞をステージ４細胞へと分化させることを含む。
【００２８】
実施形態において、本方法は、ステージ４細胞をＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、アスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、ステージ４細胞をステージ５細胞へと分化させることを含む。実施形態において、培地には、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される。いくつかの実施形態において、培地にはＡＬＫ５阻害剤が更に補充される。
【００２９】
実施形態において、本方法は、ステージ５細胞をＢＭＰ阻害剤、アスコルビン酸、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することによって、ステージ５細胞を膵内分泌細胞へと培養することを含む。実施形態において、培地にはＴ３が補充される。いくつかの実施形態において、Ｔ３は、１ｎＭ〜１μＭの範囲である。ある特定の実施形態において、Ｔ３は、１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲である。いくつかの実施形態において、培地には更にＡＬＫ５阻害剤が補充される。他の実施形態では、培地にはＡＬＫ５阻害剤が補充されない。いくつかの実施形態において、培地にはガンマセクレターゼ阻害剤が更に補充される。ある特定の実施形態において、培地には、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、及び製剤Ｉのうちの１つ又は２つ以上が補充される。実施形態において、培地にはＡＺＴ又はＤＥＺＡが補充される。いくつかの実施形態において、培養培地にはＡＺＴ及びＤＥＺＡの両方が補充される。実施形態において、本方法は、空気−液体界面で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、懸濁液中の細胞、例えば、懸濁液中の細胞クラスターを培養することを含む。
【００３０】
上に記載の分化方法の実施形態の各々において、膵内胚葉細胞（「ステージ４細胞」）は凍結保存されてもよい。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞を膵内分泌前駆細胞へと分化させる方法は、凍結保存された細胞を培養することを含む。
【００３１】
上に記載の実施形態の各々において、多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞などのヒト多能性幹細胞であってもよい。一実施形態において、多能性幹細胞はヒトＨ１又はＨ９細胞であってもよい。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、多能性幹細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現する機能的ベータ細胞へと分化させる方法であり、（ａ）多能性幹細胞を、多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａが補充された培地中で培養することによって得られた胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることと、（ｂ）胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を未成熟ベータ細胞へと分化させることと、（ｃ）ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４２、ＵＣＮ０６４６、ＴＣ−Ｅ５００３、Ａ３６６、ＰＦ０３８１４７３５、ＺＭ４４７４３９、ＳＢ７４７６５１Ａ、ＰＦＩ１、ＬＹ３０３５１１、ＭＳ４３６、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ピロキサミド、ＣＩ９９９４、又はＭＣ１５６８のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で未成熟ベータ細胞を培養することによって、未成熟ベータ細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を発現する機能的ベータ細胞へと分化させることと、を含む。本方法に使用される多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞などのヒト多能性幹細胞であってもよい。一実施形態において、多能性幹細胞はヒトＣｙＴ４９細胞である。
【００３３】
これらの機能的ベータ細胞は、ヒト膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸又はグルコース刺激性インスリン分泌を有してもよい。機能的ベータ細胞はまた、複数の相においてインスリンを分泌してもよい。
【００３４】
本方法のある特定の実施形態において、培養培地はＡＬＫ５阻害剤を欠く。いくつかの実施形態において、培養培地には、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充される。他の実施形態では、培養培地にはＴ３が補充される。代替実施形態において、培地には、ＺＭ４４７４３９、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充され、ＡＬＫ５阻害剤が含まれない。培地には、Ｔ３、ＡＺＴ、又はＤＥＺＡが補充されてもよい。
【００３５】
本方法は、空気−液体界面、懸濁クラスター中、ローラボトル中、又はマイクロキャリア上で未成熟ベータ細胞を培養することを含んでもよい。一実施形態において、本方法は、ローラボトル中で未成熟ベータ細胞を培養することを含む。別の実施形態では、本方法は、マイクロキャリア上のローラボトル中で未成熟ベータ細胞を培養することを含む。
【００３６】
本方法において多能性幹細胞を未成熟ベータ細胞へと分化させることは、（ａ）多能性幹細胞をアクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａが補充された培地中で培養することによって、多能性幹細胞を、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ１細胞」）へと分化させることと、（ｂ）ステージ１細胞を、初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ２細胞」）へと分化させることと、（ｃ）ステージ２細胞を、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ３細胞」）へと分化させることと、（ｄ）ステージ３細胞を、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ４細胞」）へと分化させることと、（ｅ）ステージ４細胞を、膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ５細胞」）へと分化させることと、（ｆ）ステージ５細胞を、未成熟ベータ細胞へと分化させることと、を含んでもよい。ある特定の実施形態において、工程ｅ．及びｆ．は、空気−液体界面、懸濁クラスター中、ローラボトル中、又はマイクロキャリア上で培養することを含む。他の実施形態では、工程ｅ．及びｆ．は、ローラボトル中で細胞を培養することを含む。更に他の実施形態において、工程ｅ．及びｆ．は、マイクロキャリア上のローラボトル中で未成熟ベータ細胞を培養することを含む。
【００３７】
ある特定の実施形態において、本方法は、ステージ１細胞をＦＧＦ７及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、ステージ１細胞をステージ２細胞へと分化させることを含む。他の実施形態では、本方法はまた、ステージ２細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、ステージ２細胞をステージ３細胞へと分化させることも含む。ある特定の実施形態において、培地はＢＭＰ阻害剤を欠く。また別の実施形態において、本方法は、ステージ３細胞をＦＧＦ７、レチノイン酸、ＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、ステージ３細胞をステージ４細胞へと分化させることを含む。この場合も、ある特定の実施形態において、培地はＢＭＰ阻害剤を欠く。
【００３８】
別の実施形態では、本方法は、ステージ４細胞をＳＡＮＴ−１、ＰＫＣ活性剤、ＢＭＰ阻害剤、及びアスコルビン酸が補充された培地中で培養することによって、ステージ４細胞をステージ５細胞へと分化させることを含む。培地には、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が更に補充されてもよい。
【００３９】
代替的な実施形態において、本方法は、ステージ５細胞をＢＭＰ阻害剤、アスコルビン酸、Ｔ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することによって、ステージ５細胞を未成熟ベータ細胞へと培養することを含む。培地には、ＡＬＫ５阻害剤又はガンマセクレターゼ阻害剤が更に補充されてよい。本方法は、未成熟ベータ細胞を、ＡＬＫ５阻害剤を欠き、ＺＭ４４７４３９、ＡＺＴ、Ｎ−アセチルシステイン、ＤＥＺＡ、製剤Ｉ、及びＴ３、Ｔ４、又はその類似体のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地中で培養することによって、未成熟ベータ細胞を、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａを発現する機能的ベータ細胞へと分化させることを含み得る。
【００４０】
上に記載の分化の方法の実施形態の各々において、培養は、懸濁培養又は細胞凝集体懸濁培養であってもよい。ある特定の実施形態において、培養は、ローラボトル中、マイクロキャリア上、又はローラボトル中のマイクロキャリア上で実行されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
図１Ａ〜１Ｈは、ステージ７でＭＡＦＡ又はＵＣＮ３発現を上方調節する小分子についてのスクリーニングの結果を示す。
【図１Ａ】ＭＡＦＡのステージ７発現が、Ｓ６Ｄ７、すなわち未処理の培養物、又はＵＮＣ０６３８（選択的なＧ９ａ及びＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＵＮＣ０６４６（強力かつ選択的なＧ９ａ／ＧＬＰ阻害剤）、ＵＮＣ０６４２（強力かつ選択的なＧ９ａ及びＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＴＣ−Ｅ５００３（選択的なＰＲＭＴ１アルギニンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、Ａ３６６（強力かつ選択的なＧ９ａ／ＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＰＦ０３８１４７３５（オーロラキナーゼＡ及びＢ阻害剤）、ＺＭ４４７４３９（オーロラキナーゼＢを阻害）、ＳＢ７４７６５１Ａジヒドロクロリド（強力なＭＳＫ１阻害剤、他のＡＧＣ群のキナーゼも阻害する）、ＰＦＩ１（ＢＥＴブロモドメイン阻害剤）、ＬＹ３０３５１１（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、及びＢＲＤ４阻害剤）、ＭＳ４３６（強力かつ選択的なＢＲＤ４ブロモドメイン阻害剤）、並びにＭＣ１５６８（ＨＤＡＣクラスＩＩ（ＩＩａ）を選択的に阻害する）による処理後にステージ７においてＤＭＳＯで処理した培養物と比較して、大幅に上方調節されたことを実証する。
【図１Ｂ】ＭＡＦＡのステージ７発現が、Ｓ６Ｄ７、すなわち未処理の培養物、又はＵＮＣ０６３８（選択的なＧ９ａ及びＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＵＮＣ０６４６（強力かつ選択的なＧ９ａ／ＧＬＰ阻害剤）、ＵＮＣ０６４２（強力かつ選択的なＧ９ａ及びＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＴＣ−Ｅ５００３（選択的なＰＲＭＴ１アルギニンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、Ａ３６６（強力かつ選択的なＧ９ａ／ＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＰＦ０３８１４７３５（オーロラキナーゼＡ及びＢ阻害剤）、ＺＭ４４７４３９（オーロラキナーゼＢを阻害）、ＳＢ７４７６５１Ａジヒドロクロリド（強力なＭＳＫ１阻害剤、他のＡＧＣ群のキナーゼも阻害する）、ＰＦＩ１（ＢＥＴブロモドメイン阻害剤）、ＬＹ３０３５１１（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、及びＢＲＤ４阻害剤）、ＭＳ４３６（強力かつ選択的なＢＲＤ４ブロモドメイン阻害剤）、並びにＭＣ１５６８（ＨＤＡＣクラスＩＩ（ＩＩａ）を選択的に阻害する）による処理後にステージ７においてＤＭＳＯで処理した培養物と比較して、大幅に上方調節されたことを実証する。
【図１Ｃ】ＭＡＦＡのステージ７発現が、Ｓ６Ｄ７、すなわち未処理の培養物、又はＵＮＣ０６３８（選択的なＧ９ａ及びＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＵＮＣ０６４６（強力かつ選択的なＧ９ａ／ＧＬＰ阻害剤）、ＵＮＣ０６４２（強力かつ選択的なＧ９ａ及びＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＴＣ−Ｅ５００３（選択的なＰＲＭＴ１アルギニンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、Ａ３６６（強力かつ選択的なＧ９ａ／ＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＰＦ０３８１４７３５（オーロラキナーゼＡ及びＢ阻害剤）、ＺＭ４４７４３９（オーロラキナーゼＢを阻害）、ＳＢ７４７６５１Ａジヒドロクロリド（強力なＭＳＫ１阻害剤、他のＡＧＣ群のキナーゼも阻害する）、ＰＦＩ１（ＢＥＴブロモドメイン阻害剤）、ＬＹ３０３５１１（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、及びＢＲＤ４阻害剤）、ＭＳ４３６（強力かつ選択的なＢＲＤ４ブロモドメイン阻害剤）、並びにＭＣ１５６８（ＨＤＡＣクラスＩＩ（ＩＩａ）を選択的に阻害する）による処理後にステージ７においてＤＭＳＯで処理した培養物と比較して、大幅に上方調節されたことを実証する。
【図１Ｄ】ＭＡＦＡのステージ７発現が、Ｓ６Ｄ７、すなわち未処理の培養物、又はＵＮＣ０６３８（選択的なＧ９ａ及びＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＵＮＣ０６４６（強力かつ選択的なＧ９ａ／ＧＬＰ阻害剤）、ＵＮＣ０６４２（強力かつ選択的なＧ９ａ及びＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＴＣ−Ｅ５００３（選択的なＰＲＭＴ１アルギニンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、Ａ３６６（強力かつ選択的なＧ９ａ／ＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＰＦ０３８１４７３５（オーロラキナーゼＡ及びＢ阻害剤）、ＺＭ４４７４３９（オーロラキナーゼＢを阻害）、ＳＢ７４７６５１Ａジヒドロクロリド（強力なＭＳＫ１阻害剤、他のＡＧＣ群のキナーゼも阻害する）、ＰＦＩ１（ＢＥＴブロモドメイン阻害剤）、ＬＹ３０３５１１（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、及びＢＲＤ４阻害剤）、ＭＳ４３６（強力かつ選択的なＢＲＤ４ブロモドメイン阻害剤）、並びにＭＣ１５６８（ＨＤＡＣクラスＩＩ（ＩＩａ）を選択的に阻害する）による処理後にステージ７においてＤＭＳＯで処理した培養物と比較して、大幅に上方調節されたことを実証する。
【図１Ｅ】ＵＣＮ３のステージ７発現が、Ｓ６Ｄ７、すなわち未処理の培養物、又は５−アザシチジン（「ＡＺＴ」）（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ピロキサミド（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）、及びＣＩ９９４（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）の添加後に、ステージ７においてＤＭＳＯで処理した培養物と比較して、増加したことを実証する。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図１Ｆ】ＵＣＮ３のステージ７発現が、Ｓ６Ｄ７、すなわち未処理の培養物、又は５−アザシチジン（「ＡＺＴ」）（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ピロキサミド（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）、及びＣＩ９９４（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）の添加後に、ステージ７においてＤＭＳＯで処理した培養物と比較して、増加したことを実証する。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図１Ｇ】ＵＣＮ３のステージ７発現が、Ｓ６Ｄ７、すなわち未処理の培養物、又は５−アザシチジン（「ＡＺＴ」）（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ピロキサミド（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）、及びＣＩ９９４（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）の添加後に、ステージ７においてＤＭＳＯで処理した培養物と比較して、増加したことを実証する。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図１Ｈ】ＵＣＮ３のステージ７発現が、Ｓ６Ｄ７、すなわち未処理の培養物、又は５−アザシチジン（「ＡＺＴ」）（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ピロキサミド（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）、及びＣＩ９９４（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）の添加後に、ステージ７においてＤＭＳＯで処理した培養物と比較して、増加したことを実証する。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、ＭＡＦＡ又はＵＣＮ３いずれかの上方調節因子として選択された小分子の頑強性を実証し、これはそれらの効果が異なるステージ７条件付けプロトコルにわたって維持されたためである。３−デアザネプラノシンＡ（「ＤＥＺＡ」）がＭＡＦＡの有効な情報調節因子であることが分かったが、ＵＣＮ３はそうではなかった（図２Ａ）。ＡＺＴは、ステージ７の間にＵＣＮ３上方調節因子として確認されたが、ＭＡＦＡ上方調節因子としては確認されなかった（図２Ｂ）。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、ＭＡＦＡ又はＵＣＮ３いずれかの上方調節因子として選択された小分子の頑強性を実証し、これはそれらの効果が異なるステージ７条件付けプロトコルにわたって維持されたためである。３−デアザネプラノシンＡ（「ＤＥＺＡ」）がＭＡＦＡの有効な情報調節因子であることが分かったが、ＵＣＮ３はそうではなかった（図２Ａ）。ＡＺＴは、ステージ７の間にＵＣＮ３上方調節因子として確認されたが、ＭＡＦＡ上方調節因子としては確認されなかった（図２Ｂ）。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ａ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。図３Ａは、ＩＮＨＢＢが、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを用いる条件においてヒト膵島細胞で見られる発現を上回って富化され、ＡＺＴ／ＤＥＺＡの存在下又は非存在下のＡＬＫ５阻害剤の除去により、ＩＮＨＢＢがヒト膵島細胞で見られるレベルまで減少したことを示す。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｂ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。図３Ｂは、ＩＮＨＡ発現が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去によりＡＬＩクラスターにおいてヒト膵島細胞のレベルまで増加したことを示す。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｃ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。それぞれ図３Ｃ及び３Ｄに示されるＭＡＦＡ及びＳＬＣ２Ａ１発現がＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去によって減少し、同時に、ＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加により、ＭＡＦＡ及びＳＬＣ２Ａ１発現がヒト膵島細胞レベルまで救済される。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｄ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。それぞれ図３Ｃ及び３Ｄに示されるＭＡＦＡ及びＳＬＣ２Ａ１発現がＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去によって減少し、同時に、ＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加により、ＭＡＦＡ及びＳＬＣ２Ａ１発現がヒト膵島細胞レベルまで救済される。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｅ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。ＵＣＮ３発現は、ＡＬＩクラスタークラスターにおけるＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去により、ヒト膵島細胞のレベル又はヒト膵島細胞を上回るレベルまで増加した。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｆ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。Ｇ６ＰＣ２（グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット２）発現は、ＡＬＩクラスタークラスターにおけるＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去により、ヒト膵島細胞のレベル又はヒト膵島細胞を上回るレベルまで増加した。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｇ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。ＰＤＫ１（ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１）発現は、ＡＬＩクラスタークラスターにおけるＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去により、ヒト膵島細胞のレベル又はヒト膵島細胞を上回るレベルまで増加した。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｈ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。ＩＮＳ（インスリン）の発現は、まずＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去により、次にＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加により、徐々に段階的に増加した。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｉ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。ＧＪＤ２（ギャップ結合タンパク質、デルタ２；併せてＣＸ３６／コネキシン３６）の発現は、まずＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去により、次にＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加により、徐々に段階的に増加した。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｊ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。ＳＩＸ２（ＳＩＸホメオボックス２）の発現は、まずＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去により、次にＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加により、徐々に段階的に増加した。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｋ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。ＰＤＸ１の発現は、まずＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去により、次にＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加により、徐々に段階的に増加した。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｌ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。ＮＫＸ６．１の発現は、条件にわたって大幅に変化しなかったが、ＡＬＩクラスター中のそれらの発現は、一貫してヒト膵島細胞において観察されるレベルであったか又はそのレベルを上回った。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図３Ｍ】ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間の改善したステージ７条件付けの後で、ヒト膵島細胞で観察されるレベルまで増加したことを実証する。ステージ７分化中に用いた改善点には、以下、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加が含まれる。ＧＬＰ１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）の発現は、条件にわたって大幅に変化しなかったが、ＡＬＩクラスター中のそれらの発現は、一貫してヒト膵島細胞において観察されるレベルであったか又はそのレベルを上回った。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図４Ａ】タンパク質存在の観点から、Ｓ７Ｄ７において成熟マーカー：ＰＤＸ１（図４Ａ）、ＮＫＸ６．１（図４Ｂ）、ＭＡＦＡ（図４Ｃ）、ＳＬＣ２Ａ１（図４Ｄ）、及びＵＣＮ３（図４Ｅ）を共発現するＡＬＩ細胞クラスター中のＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。代表的なヒト膵島細胞染色を左の列に示す。ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１条件を中央の列に示す。ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４条件を右の列に示す。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図４Ｂ】タンパク質存在の観点から、Ｓ７Ｄ７において成熟マーカー：ＰＤＸ１（図４Ａ）、ＮＫＸ６．１（図４Ｂ）、ＭＡＦＡ（図４Ｃ）、ＳＬＣ２Ａ１（図４Ｄ）、及びＵＣＮ３（図４Ｅ）を共発現するＡＬＩ細胞クラスター中のＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。代表的なヒト膵島細胞染色を左の列に示す。ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１条件を中央の列に示す。ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４条件を右の列に示す。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図４Ｃ】タンパク質存在の観点から、Ｓ７Ｄ７において成熟マーカー：ＰＤＸ１（図４Ａ）、ＮＫＸ６．１（図４Ｂ）、ＭＡＦＡ（図４Ｃ）、ＳＬＣ２Ａ１（図４Ｄ）、及びＵＣＮ３（図４Ｅ）を共発現するＡＬＩ細胞クラスター中のＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。代表的なヒト膵島細胞染色を左の列に示す。ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１条件を中央の列に示す。ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４条件を右の列に示す。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図４Ｄ】タンパク質存在の観点から、Ｓ７Ｄ７において成熟マーカー：ＰＤＸ１（図４Ａ）、ＮＫＸ６．１（図４Ｂ）、ＭＡＦＡ（図４Ｃ）、ＳＬＣ２Ａ１（図４Ｄ）、及びＵＣＮ３（図４Ｅ）を共発現するＡＬＩ細胞クラスター中のＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。代表的なヒト膵島細胞染色を左の列に示す。ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１条件を中央の列に示す。ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４条件を右の列に示す。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図４Ｅ】タンパク質存在の観点から、Ｓ７Ｄ７において成熟マーカー：ＰＤＸ１（図４Ａ）、ＮＫＸ６．１（図４Ｂ）、ＭＡＦＡ（図４Ｃ）、ＳＬＣ２Ａ１（図４Ｄ）、及びＵＣＮ３（図４Ｅ）を共発現するＡＬＩ細胞クラスター中のＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。代表的なヒト膵島細胞染色を左の列に示す。ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１条件を中央の列に示す。ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４条件を右の列に示す。全ての条件は、Ｓ７Ｄ７、ＡＬＩクラスターである。
【図５Ａ】特にステージ７に特異的な「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１」条件付けによってＡＬＩでのヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態を呈する、Ｓ７Ｄ７でのＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。図５Ａは、ＯＣＲが注射後（「ｉｐ」）１５分でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。逆に、未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターは、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈した（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）。
【図５Ｂ】特にステージ７に特異的な「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１」条件付けによってＡＬＩでのヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態を呈する、Ｓ７Ｄ７でのＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。未成熟Ｓ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターと見分けがつかないグルコース依存性ミトコンドリア動態を呈するＳ７Ｄ７  ＡＬＩクラスター条件：ＡＬＫ５、Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１（１００．３％±４．０４−注射後１５分；１０７．８％±６．５１−注射後７２分）。
【図５Ｃ】特にステージ７に特異的な「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１」条件付けによってＡＬＩでのヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態を呈する、Ｓ７Ｄ７でのＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。未成熟Ｓ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターと見分けがつかないグルコース依存性ミトコンドリア動態を呈するＳ７Ｄ７  ＡＬＩクラスター条件：「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１」（９６．９％±３．０６−注射後１５分；１０９．０％±４．５８−注射後７２分）。
【図５Ｄ】特にステージ７に特異的な「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１」条件付けによってＡＬＩでのヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態を呈する、Ｓ７Ｄ７でのＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。図５Ｄは、Ｓ７Ｄ７  ＡＬＩクラスター群の中で、「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１」条件のみが、ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態（１１２．４％±３．２５−注射後１５分；１２９．５％±３．７８−注射後７２分）を呈したことを実証する。
【図５Ｅ】特にステージ７に特異的な「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１」条件付けによってＡＬＩでのヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態を呈する、Ｓ７Ｄ７でのＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。未成熟Ｓ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターと見分けがつかないグルコース依存性ミトコンドリア動態を呈するＳ７Ｄ７  ＡＬＩクラスター条件：「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」（１０３．４％±４．７６−注射後１５分；１１３．６％±６．７２−注射後７２分）。
【図５Ｆ】特にステージ７に特異的な「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１」条件付けによってＡＬＩでのヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態を呈する、Ｓ７Ｄ７でのＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。未成熟Ｓ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターと見分けがつかないグルコース依存性ミトコンドリア動態を呈するＳ７Ｄ７  ＡＬＩクラスター条件：「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」（１０２．１％±４．０４−注射後１５分；１１２．７％±３．３８−注射後７２分）。
【図６Ａ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。図６Ａは、これをとおして（ｉ）新たなＳ４Ｄ３単分子層又はＳ４Ｄ３凍結保存細胞を、（ｉｉ）Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）方法によって、（ｉｉｉ）細胞クラスターへと組み立てる手順を描出する。
【図６Ｂ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。図６Ｂは、Ｓ４Ｄ５  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター中で、膵内胚葉ＴＦ  ＰＤＸ１（上段、左）及びＮＫＸ６．１（上段、中央）は高いタンパク質存在が検出されたが、内分泌ＴＦ  ＮＥＵＲＯＤ１（上段、右）、代替的非膵内胚葉系統配分ＴＦ  ＳＯＸ２（下段、中央）、及びＣＤＸ２（下段、右）では低いタンパク質存在現が検出されたことを示す。
【図６Ｃ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。図６Ｃでは、ＦＡＣＳ分析により、細胞の９９．３±０．１％がＰＤＸ１＋（左）であり、８４．４±０．１％がＮＫＸ６．１＋（中央）であったが、２．２±０．４％がＮＫＸ６．１＋  ＮＥＵＲＯＤ１＋（右）、又は１．３５±０．５５％がＮＫＸ６．１＋  ＣＨＧＡ＋（中央）であったことが示される（Ｓ４ＤＳ  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター）。
【図６Ｄ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。図６Ｄは、Ｓ４Ｄ３単分子層と比較した場合、ＰＤＸ１（上段、左）、ＮＫＸ６．１（上段、右）の高い遺伝子発現、並びにＮＥＵＲＯＤ１（下段、左）及びＣＨＧＡ（下段、右）の低い発現が維持されたため、頑強な膵内胚葉特性がＳ４Ｄ３凍結保存細胞に由来するＳ４Ｄ４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター中で維持されたことを示す。
【図６Ｅ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。図６Ｅは、これをとおして（ｉ）新たなＳ４Ｄ３単分子層又はＳ４Ｄ３凍結保存細胞を、（ｉｉ）Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）方法によって細胞クラスターへと組み立て、（ｉｉｉ）Ｓ６Ｄ６によって懸濁培養中で、（ｉｖ）未成熟ベータ細胞へと分化させる手順を描出する。
【図６Ｆ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。Ｓ６Ｄ６  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターのＦＡＣＳ分析により、細胞の７８．５±１．８７％がＮＫＸ６．１＋  ＣＨＧＡ＋（左、図６Ｆ）であり、７３．６±４．３４％がＮＫＸ６．１＋  ＮＥＵＲＯＤ１＋（右、図６Ｆ）、３８．４±５．９６％がＮＫＸ６．１＋インスリン＋（左、図６Ｇ）であった頑強な未成熟ベータ細胞タンパク質プロファイルが示される。インスリン陽性集団（全細胞の５０．２±６．９２％がインスリン＋であった）の大部分がＮＫＸ６．１＋（左、図６Ｇ）であり、グルカゴン陽性（７．４３±１．４９％インスリン＋グルカゴン＋；（右、図６Ｇ）はそうではなかった。
【図６Ｇ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。Ｓ６Ｄ６  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターのＦＡＣＳ分析により、細胞の７８．５±１．８７％がＮＫＸ６．１＋  ＣＨＧＡ＋（左、図６Ｆ）であり、７３．６±４．３４％がＮＫＸ６．１＋  ＮＥＵＲＯＤ１＋（右、図６Ｆ）、３８．４±５．９６％がＮＫＸ６．１＋インスリン＋（左、図６Ｇ）であった頑強な未成熟ベータ細胞タンパク質プロファイルが示される。インスリン陽性集団（全細胞の５０．２±６．９２％がインスリン＋であった）の大部分がＮＫＸ６．１＋（左、図６Ｇ）であり、グルカゴン陽性（７．４３±１．４９％インスリン＋グルカゴン＋；（右、図６Ｇ）はそうではなかった。
【図６Ｈ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。図６Ｈは、Ｓ６Ｄ６で、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター中のＣ−ペプチド陽性細胞の大部分が、ＰＤＸ１＋（左）及びＮＫＸ６．１＋（中央）の両方であった場合によって示す。
【図６Ｉ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。図６Ｉは、成熟の門番であるＴＦ  ＭＡＦＡ（右）のタンパク質存在は、Ｓ６Ｄ６で既に容易に検出され、これまでのＡＬＩクラスターのＳ６Ｄ６〜Ｓ６Ｄ７におけるものより高いレベルで発現されたことを示す（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４（３２）１１，１１２１〜１１３３）（ＡＬＩ  Ｓ７Ｄ７比較については図３Ｃも参照されたい）。
【図６Ｊ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。インスリンの発現は、これまでのＡＬＩクラスターのＳ６Ｄ６〜Ｓ６Ｄ７におけるものより高かった。
【図６Ｋ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。ＰＤＸ１の発現は、これまでのＡＬＩクラスターのＳ６Ｄ６〜Ｓ６Ｄ７におけるものより高かった。
【図６Ｌ】懸濁培養において未成熟膵臓ベータ細胞へと分化したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを実証する。ＮＫＸ６．１の発現は、これまでのＡＬＩクラスターのＳ６Ｄ６〜Ｓ６Ｄ７におけるものより高かった。
【図７Ａ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。図７Ａは、これをとおして（ｉ）新たなＳ４Ｄ３単分子層又はＳ４Ｄ３凍結保存細胞をＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターへと組み立て、（ｉｉ  ＆  ｉｉｉ）ステージ５、６、及び７をとおして懸濁培養によって条件付けて、（ｉｖ）Ｓ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを生成する手順を描出する。
【図７Ｂ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。ステージ７の間に「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩのＢＬＡＲ００１」によって培養したＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、ベースラインのベータ細胞タンパク質プロファイルを維持した（図７Ｂ〜７Ｃ）。細胞の８９％がＮＫＸ６．１＋  ＣＨＧＡ＋（左、図７Ｂ）、７７．７％がＮＫＸ６．１＋  ＮＥＵＲＯＤ１＋（右、図７Ｂ）であった。
【図７Ｃ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。ステージ７の間に「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩのＢＬＡＲ００１」によって培養したＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、ベースラインのベータ細胞タンパク質プロファイルを維持した（図７Ｂ〜７Ｃ）。細胞の４０．８％がＮＫＸ６．１＋インスリン＋（左、図７Ｃ）であった。ＩＮＳＵＬＩＮ陽性集団（全細胞の４６．４％がインスリン＋であった）の大部分がＮＫＸ６．１＋（左、図７Ｃ）であり、グルカゴン陽性（３．９％インスリン＋グルカゴン＋；（右、図７Ｃ）ではなかった。
【図７Ｄ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。成熟マーカーであるＭＡＦＡ（図７Ｄ）、ＵＣＮ３（図７Ｅ）、ＳＬＣ２Ａ１（図７Ｆ）、Ｇ６ＰＣ２（図７Ｇ）、インスリン（図７Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図７Ｉ）の遺伝子発現は、ステージ７「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」で条件付けられたＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターにおいてヒト膵島レベルであったか又はそれを上回った。ＭＡＦＡ（図３Ｃ）、Ｇ２ＰＣ２（図３Ｆ）、インスリン（図３Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図３Ｌ）などの成熟マーカーの発現レベルＳ７Ｄ７は、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）（「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」）において、ＡＬＩクラスターにおけるものよりもはるかに高かった。
【図７Ｅ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。成熟マーカーであるＭＡＦＡ（図７Ｄ）、ＵＣＮ３（図７Ｅ）、ＳＬＣ２Ａ１（図７Ｆ）、Ｇ６ＰＣ２（図７Ｇ）、インスリン（図７Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図７Ｉ）の遺伝子発現は、ステージ７「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」で条件付けられたＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターにおいてヒト膵島レベルであったか又はそれを上回った。ＭＡＦＡ（図３Ｃ）、Ｇ２ＰＣ２（図３Ｆ）、インスリン（図３Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図３Ｌ）などの成熟マーカーの発現レベルＳ７Ｄ７は、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）（「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」）において、ＡＬＩクラスターにおけるものよりもはるかに高かった。
【図７Ｆ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。成熟マーカーであるＭＡＦＡ（図７Ｄ）、ＵＣＮ３（図７Ｅ）、ＳＬＣ２Ａ１（図７Ｆ）、Ｇ６ＰＣ２（図７Ｇ）、インスリン（図７Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図７Ｉ）の遺伝子発現は、ステージ７「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」で条件付けられたＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターにおいてヒト膵島レベルであったか又はそれを上回った。ＭＡＦＡ（図３Ｃ）、Ｇ２ＰＣ２（図３Ｆ）、インスリン（図３Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図３Ｌ）などの成熟マーカーの発現レベルＳ７Ｄ７は、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）（「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」）において、ＡＬＩクラスターにおけるものよりもはるかに高かった。
【図７Ｇ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。成熟マーカーであるＭＡＦＡ（図７Ｄ）、ＵＣＮ３（図７Ｅ）、ＳＬＣ２Ａ１（図７Ｆ）、Ｇ６ＰＣ２（図７Ｇ）、インスリン（図７Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図７Ｉ）の遺伝子発現は、ステージ７「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」で条件付けられたＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターにおいてヒト膵島レベルであったか又はそれを上回った。ＭＡＦＡ（図３Ｃ）、Ｇ２ＰＣ２（図３Ｆ）、インスリン（図３Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図３Ｌ）などの成熟マーカーの発現レベルＳ７Ｄ７は、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）（「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」）において、ＡＬＩクラスターにおけるものよりもはるかに高かった。
【図７Ｈ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。成熟マーカーであるＭＡＦＡ（図７Ｄ）、ＵＣＮ３（図７Ｅ）、ＳＬＣ２Ａ１（図７Ｆ）、Ｇ６ＰＣ２（図７Ｇ）、インスリン（図７Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図７Ｉ）の遺伝子発現は、ステージ７「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」で条件付けられたＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターにおいてヒト膵島レベルであったか又はそれを上回った。ＭＡＦＡ（図３Ｃ）、Ｇ２ＰＣ２（図３Ｆ）、インスリン（図３Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図３Ｌ）などの成熟マーカーの発現レベルＳ７Ｄ７は、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）（「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」）において、ＡＬＩクラスターにおけるものよりもはるかに高かった。
【図７Ｉ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。成熟マーカーであるＭＡＦＡ（図７Ｄ）、ＵＣＮ３（図７Ｅ）、ＳＬＣ２Ａ１（図７Ｆ）、Ｇ６ＰＣ２（図７Ｇ）、インスリン（図７Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図７Ｉ）の遺伝子発現は、ステージ７「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」で条件付けられたＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターにおいてヒト膵島レベルであったか又はそれを上回った。ＭＡＦＡ（図３Ｃ）、Ｇ２ＰＣ２（図３Ｆ）、インスリン（図３Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図３Ｌ）などの成熟マーカーの発現レベルＳ７Ｄ７は、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）（「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」）において、ＡＬＩクラスターにおけるものよりもはるかに高かった。
【図７Ｊ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。図７Ｊ〜７Ｍは、ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」ステージ７条件付けに加えることで、かなりの数の非グルカゴン（図７Ｊ；下段、右）Ｃ−ペプチド細胞（タンパク質存在の観点からＳ７Ｄ７で共発現した）、ＰＤＸ１（図７Ｊ；下段、左）、ＮＫＸ６．１（図７Ｊ；下段、中央）、ＭＡＦＡ（図７Ｋ；下段、左）、ＵＣＮ３（図７Ｋ；下段、中央）、及びＳＬＣ２Ａ１（図７Ｋ；下段、右）が生成されたことを実証する。
【図７Ｋ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。図７Ｊ〜７Ｍは、ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」ステージ７条件付けに加えることで、かなりの数の非グルカゴン（図７Ｊ；下段、右）Ｃ−ペプチド細胞（タンパク質存在の観点からＳ７Ｄ７で共発現した）、ＰＤＸ１（図７Ｊ；下段、左）、ＮＫＸ６．１（図７Ｊ；下段、中央）、ＭＡＦＡ（図７Ｋ；下段、左）、ＵＣＮ３（図７Ｋ；下段、中央）、及びＳＬＣ２Ａ１（図７Ｋ；下段、右）が生成されたことを実証する。
【図７Ｌ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。図７Ｊ〜７Ｍは、ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」ステージ７条件付けに加えることで、かなりの数の非グルカゴン（図７Ｊ；下段、右）Ｃ−ペプチド細胞（タンパク質存在の観点からＳ７Ｄ７で共発現した）、ＰＤＸ１（図７Ｊ；下段、左）、ＮＫＸ６．１（図７Ｊ；下段、中央）、ＭＡＦＡ（図７Ｋ；下段、左）、ＵＣＮ３（図７Ｋ；下段、中央）、及びＳＬＣ２Ａ１（図７Ｋ；下段、右）が生成されたことを実証する。図７Ｌ〜７Ｍは、タンパク質存在の観点から、Ｓ７Ｄ７成熟マーカー；ＰＤＸ１（図７Ｌ；下段、下）、ＮＫＸ６．１（図７Ｌ；下段、中央）、ＭＡＦＡ（図７Ｍ；下段、下）、ＳＬＣ２Ａ１（図７Ｍ；下段、右）によって共発現されるが、グルカゴン（図７Ｌ；下段、右）、又はＵＣＮ３（図７Ｍ；下段、中央）によっては共発現されないＣ−ペプチド細胞の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」特異的ステージ７条件付けによる生成を実証する。
【図７Ｍ】成熟膵臓ベータ細胞への懸濁培養によるＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターの生成を実証する。図７Ｊ〜７Ｍは、ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」ステージ７条件付けに加えることで、かなりの数の非グルカゴン（図７Ｊ；下段、右）Ｃ−ペプチド細胞（タンパク質存在の観点からＳ７Ｄ７で共発現した）、ＰＤＸ１（図７Ｊ；下段、左）、ＮＫＸ６．１（図７Ｊ；下段、中央）、ＭＡＦＡ（図７Ｋ；下段、左）、ＵＣＮ３（図７Ｋ；下段、中央）、及びＳＬＣ２Ａ１（図７Ｋ；下段、右）が生成されたことを実証する。図７Ｌ〜７Ｍは、タンパク質存在の観点から、Ｓ７Ｄ７成熟マーカー；ＰＤＸ１（図７Ｌ；下段、下）、ＮＫＸ６．１（図７Ｌ；下段、中央）、ＭＡＦＡ（図７Ｍ；下段、下）、ＳＬＣ２Ａ１（図７Ｍ；下段、右）によって共発現されるが、グルカゴン（図７Ｌ；下段、右）、又はＵＣＮ３（図７Ｍ；下段、中央）によっては共発現されないＣ−ペプチド細胞の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」特異的ステージ７条件付けによる生成を実証する。
【図８Ａ】ヒト膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びＧＳＩＳ動態を有する懸濁培養による多能性幹細胞由来成熟膵臓ベータ細胞の生成を実証する。図８Ａ〜８Ｂは両方とも、ＯＣＲが注射後１５分でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島細胞が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターは、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈した（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）。ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態が、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターとの関連でＳ７Ｄ１３の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件で観察された（１１０．７％±２．４６−注射後１５分；１２５．９％±２．２７−注射後７２分）（図８Ａ）。懸濁液中の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、高いグルコース刺激に応答して、ヒト膵島細胞レベルを上回る酸素を消費した（１６２．０％±１１．５１−注射後１５分；１７７．１％±０．９９−注射後７２分）（図８Ｂ）。図８Ｃは、ヒト膵島細胞内の成熟ベータ細胞が、グルコース刺激に応答して急速な二相性インスリン分泌を複数ラウンドの間行う能力を呈したことを示す。ヒト膵島細胞は、インスリン分泌の「オン−オフ」切り替えを複数ラウンドの間行う能力を実証した。試験した全ての条件が、ＫＣｌに対する強力なインスリン分泌応答を呈した（図８Ｃ〜８Ｉ）。エキセンジン−４の添加は、示されたヒト膵島におけるＧＳＩＳ応答の大きさを増大させなかったが、ＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ＧＳＩＳプロファイルに対する比較のために含めた（図８Ｄ）。ＢＬＡＲ００１（図８Ｅ）においてか、又はＢＬＡＲ００４（図８Ｆ）においての「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ」でステージ７の間に条件付けられたＳ７Ｄ２１−ＡＬＩクラスターは、第１の二相性ＧＳＩＳ応答は示したが（約４〜１０倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、第２の二相性ＧＳＩＳ応答は示さず、また比較的遅い二相性ＧＳＩＳ応答であった。ＡＬＩクラスターは、刺激後の３ｍＭのＤ−グルコースの再潅流時にインスリン分泌の第２の相を遮断する能力を有しなかった。「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」でステージ７の間に条件付けたＳ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、強力な第１の二相性ＧＳＩＳ（約５倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、続いてＧＳＩＳを完全に遮断する能力、及び弱い第２の単相応答を呈した（図８Ｇ）。ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件付けに加えることにより、Ｓ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、複数ラウンドのヒト膵島に類似した二相性ＧＳＩＳ（約５〜７倍の第１のＧＳＩＳ応答の��１の相）、及び高グルコースパルス間でＧＳＩＳを完全に遮断する能力を呈した（図８Ｈ〜８Ｉ）。
【図８Ｂ】ヒト膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びＧＳＩＳ動態を有する懸濁培養による多能性幹細胞由来成熟膵臓ベータ細胞の生成を実証する。図８Ａ〜８Ｂは両方とも、ＯＣＲが注射後１５分でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島細胞が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターは、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈した（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）。ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態が、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターとの関連でＳ７Ｄ１３の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件で観察された（１１０．７％±２．４６−注射後１５分；１２５．９％±２．２７−注射後７２分）（図８Ａ）。懸濁液中の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、高いグルコース刺激に応答して、ヒト膵島細胞レベルを上回る酸素を消費した（１６２．０％±１１．５１−注射後１５分；１７７．１％±０．９９−注射後７２分）（図８Ｂ）。図８Ｃは、ヒト膵島細胞内の成熟ベータ細胞が、グルコース刺激に応答して急速な二相性インスリン分泌を複数ラウンドの間行う能力を呈したことを示す。ヒト膵島細胞は、インスリン分泌の「オン−オフ」切り替えを複数ラウンドの間行う能力を実証した。試験した全ての条件が、ＫＣｌに対する強力なインスリン分泌応答を呈した（図８Ｃ〜８Ｉ）。エキセンジン−４の添加は、示されたヒト膵島におけるＧＳＩＳ応答の大きさを増大させなかったが、ＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ＧＳＩＳプロファイルに対する比較のために含めた（図８Ｄ）。ＢＬＡＲ００１（図８Ｅ）においてか、又はＢＬＡＲ００４（図８Ｆ）においての「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ」でステージ７の間に条件付けられたＳ７Ｄ２１−ＡＬＩクラスターは、第１の二相性ＧＳＩＳ応答は示したが（約４〜１０倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、第２の二相性ＧＳＩＳ応答は示さず、また比較的遅い二相性ＧＳＩＳ応答であった。ＡＬＩクラスターは、刺激後の３ｍＭのＤ−グルコースの再潅流時にインスリン分泌の第２の相を遮断する能力を有しなかった。「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」でステージ７の間に条件付けたＳ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、強力な第１の二相性ＧＳＩＳ（約５倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、続いてＧＳＩＳを完全に遮断する能力、及び弱い第２の単相応答を呈した（図８Ｇ）。ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件付けに加えることにより、Ｓ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、複数ラウンドのヒト膵島に類似した二相性ＧＳＩＳ（約５〜７倍の第１のＧＳＩＳ応答の��１の相）、及び高グルコースパルス間でＧＳＩＳを完全に遮断する能力を呈した（図８Ｈ〜８Ｉ）。
【図８Ｃ】ヒト膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びＧＳＩＳ動態を有する懸濁培養による多能性幹細胞由来成熟膵臓ベータ細胞の生成を実証する。図８Ａ〜８Ｂは両方とも、ＯＣＲが注射後１５分でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島細胞が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターは、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈した（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）。ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態が、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターとの関連でＳ７Ｄ１３の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件で観察された（１１０．７％±２．４６−注射後１５分；１２５．９％±２．２７−注射後７２分）（図８Ａ）。懸濁液中の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、高いグルコース刺激に応答して、ヒト膵島細胞レベルを上回る酸素を消費した（１６２．０％±１１．５１−注射後１５分；１７７．１％±０．９９−注射後７２分）（図８Ｂ）。図８Ｃは、ヒト膵島細胞内の成熟ベータ細胞が、グルコース刺激に応答して急速な二相性インスリン分泌を複数ラウンドの間行う能力を呈したことを示す。ヒト膵島細胞は、インスリン分泌の「オン−オフ」切り替えを複数ラウンドの間行う能力を実証した。試験した全ての条件が、ＫＣｌに対する強力なインスリン分泌応答を呈した（図８Ｃ〜８Ｉ）。エキセンジン−４の添加は、示されたヒト膵島におけるＧＳＩＳ応答の大きさを増大させなかったが、ＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ＧＳＩＳプロファイルに対する比較のために含めた（図８Ｄ）。ＢＬＡＲ００１（図８Ｅ）においてか、又はＢＬＡＲ００４（図８Ｆ）においての「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ」でステージ７の間に条件付けられたＳ７Ｄ２１−ＡＬＩクラスターは、第１の二相性ＧＳＩＳ応答は示したが（約４〜１０倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、第２の二相性ＧＳＩＳ応答は示さず、また比較的遅い二相性ＧＳＩＳ応答であった。ＡＬＩクラスターは、刺激後の３ｍＭのＤ−グルコースの再潅流時にインスリン分泌の第２の相を遮断する能力を有しなかった。「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」でステージ７の間に条件付けたＳ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、強力な第１の二相性ＧＳＩＳ（約５倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、続いてＧＳＩＳを完全に遮断する能力、及び弱い第２の単相応答を呈した（図８Ｇ）。ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件付けに加えることにより、Ｓ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、複数ラウンドのヒト膵島に類似した二相性ＧＳＩＳ（約５〜７倍の第１のＧＳＩＳ応答の��１の相）、及び高グルコースパルス間でＧＳＩＳを完全に遮断する能力を呈した（図８Ｈ〜８Ｉ）。
【図８Ｄ】ヒト膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びＧＳＩＳ動態を有する懸濁培養による多能性幹細胞由来成熟膵臓ベータ細胞の生成を実証する。図８Ａ〜８Ｂは両方とも、ＯＣＲが注射後１５分でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島細胞が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターは、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈した（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）。ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態が、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターとの関連でＳ７Ｄ１３の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件で観察された（１１０．７％±２．４６−注射後１５分；１２５．９％±２．２７−注射後７２分）（図８Ａ）。懸濁液中の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、高いグルコース刺激に応答して、ヒト膵島細胞レベルを上回る酸素を消費した（１６２．０％±１１．５１−注射後１５分；１７７．１％±０．９９−注射後７２分）（図８Ｂ）。図８Ｃは、ヒト膵島細胞内の成熟ベータ細胞が、グルコース刺激に応答して急速な二相性インスリン分泌を複数ラウンドの間行う能力を呈したことを示す。ヒト膵島細胞は、インスリン分泌の「オン−オフ」切り替えを複数ラウンドの間行う能力を実証した。試験した全ての条件が、ＫＣｌに対する強力なインスリン分泌応答を呈した（図８Ｃ〜８Ｉ）。エキセンジン−４の添加は、示されたヒト膵島におけるＧＳＩＳ応答の大きさを増大させなかったが、ＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ＧＳＩＳプロファイルに対する比較のために含めた（図８Ｄ）。ＢＬＡＲ００１（図８Ｅ）においてか、又はＢＬＡＲ００４（図８Ｆ）においての「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ」でステージ７の間に条件付けられたＳ７Ｄ２１−ＡＬＩクラスターは、第１の二相性ＧＳＩＳ応答は示したが（約４〜１０倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、第２の二相性ＧＳＩＳ応答は示さず、また比較的遅い二相性ＧＳＩＳ応答であった。ＡＬＩクラスターは、刺激後の３ｍＭのＤ−グルコースの再潅流時にインスリン分泌の第２の相を遮断する能力を有しなかった。「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」でステージ７の間に条件付けたＳ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、強力な第１の二相性ＧＳＩＳ（約５倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、続いてＧＳＩＳを完全に遮断する能力、及び弱い第２の単相応答を呈した（図８Ｇ）。ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件付けに加えることにより、Ｓ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、複数ラウンドのヒト膵島に類似した二相性ＧＳＩＳ（約５〜７倍の第１のＧＳＩＳ応答の��１の相）、及び高グルコースパルス間でＧＳＩＳを完全に遮断する能力を呈した（図８Ｈ〜８Ｉ）。
【図８Ｅ】ヒト膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びＧＳＩＳ動態を有する懸濁培養による多能性幹細胞由来成熟膵臓ベータ細胞の生成を実証する。図８Ａ〜８Ｂは両方とも、ＯＣＲが注射後１５分でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島細胞が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターは、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈した（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）。ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態が、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターとの関連でＳ７Ｄ１３の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件で観察された（１１０．７％±２．４６−注射後１５分；１２５．９％±２．２７−注射後７２分）（図８Ａ）。懸濁液中の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、高いグルコース刺激に応答して、ヒト膵島細胞レベルを上回る酸素を消費した（１６２．０％±１１．５１−注射後１５分；１７７．１％±０．９９−注射後７２分）（図８Ｂ）。図８Ｃは、ヒト膵島細胞内の成熟ベータ細胞が、グルコース刺激に応答して急速な二相性インスリン分泌を複数ラウンドの間行う能力を呈したことを示す。ヒト膵島細胞は、インスリン分泌の「オン−オフ」切り替えを複数ラウンドの間行う能力を実証した。試験した全ての条件が、ＫＣｌに対する強力なインスリン分泌応答を呈した（図８Ｃ〜８Ｉ）。エキセンジン−４の添加は、示されたヒト膵島におけるＧＳＩＳ応答の大きさを増大させなかったが、ＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ＧＳＩＳプロファイルに対する比較のために含めた（図８Ｄ）。ＢＬＡＲ００１（図８Ｅ）においてか、又はＢＬＡＲ００４（図８Ｆ）においての「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ」でステージ７の間に条件付けられたＳ７Ｄ２１−ＡＬＩクラスターは、第１の二相性ＧＳＩＳ応答は示したが（約４〜１０倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、第２の二相性ＧＳＩＳ応答は示さず、また比較的遅い二相性ＧＳＩＳ応答であった。ＡＬＩクラスターは、刺激後の３ｍＭのＤ−グルコースの再潅流時にインスリン分泌の第２の相を遮断する能力を有しなかった。「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」でステージ７の間に条件付けたＳ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、強力な第１の二相性ＧＳＩＳ（約５倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、続いてＧＳＩＳを完全に遮断する能力、及び弱い第２の単相応答を呈した（図８Ｇ）。ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件付けに加えることにより、Ｓ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、複数ラウンドのヒト膵島に類似した二相性ＧＳＩＳ（約５〜７倍の第１のＧＳＩＳ応答の��１の相）、及び高グルコースパルス間でＧＳＩＳを完全に遮断する能力を呈した（図８Ｈ〜８Ｉ）。
【図８Ｆ】ヒト膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びＧＳＩＳ動態を有する懸濁培養による多能性幹細胞由来成熟膵臓ベータ細胞の生成を実証する。図８Ａ〜８Ｂは両方とも、ＯＣＲが注射後１５分でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島細胞が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターは、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈した（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）。ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態が、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターとの関連でＳ７Ｄ１３の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件で観察された（１１０．７％±２．４６−注射後１５分；１２５．９％±２．２７−注射後７２分）（図８Ａ）。懸濁液中の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、高いグルコース刺激に応答して、ヒト膵島細胞レベルを上回る酸素を消費した（１６２．０％±１１．５１−注射後１５分；１７７．１％±０．９９−注射後７２分）（図８Ｂ）。図８Ｃは、ヒト膵島細胞内の成熟ベータ細胞が、グルコース刺激に応答して急速な二相性インスリン分泌を複数ラウンドの間行う能力を呈したことを示す。ヒト膵島細胞は、インスリン分泌の「オン−オフ」切り替えを複数ラウンドの間行う能力を実証した。試験した全ての条件が、ＫＣｌに対する強力なインスリン分泌応答を呈した（図８Ｃ〜８Ｉ）。エキセンジン−４の添加は、示されたヒト膵島におけるＧＳＩＳ応答の大きさを増大させなかったが、ＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ＧＳＩＳプロファイルに対する比較のために含めた（図８Ｄ）。ＢＬＡＲ００１（図８Ｅ）においてか、又はＢＬＡＲ００４（図８Ｆ）においての「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ」でステージ７の間に条件付けられたＳ７Ｄ２１−ＡＬＩクラスターは、第１の二相性ＧＳＩＳ応答は示したが（約４〜１０倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、第２の二相性ＧＳＩＳ応答は示さず、また比較的遅い二相性ＧＳＩＳ応答であった。ＡＬＩクラスターは、刺激後の３ｍＭのＤ−グルコースの再潅流時にインスリン分泌の第２の相を遮断する能力を有しなかった。「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」でステージ７の間に条件付けたＳ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、強力な第１の二相性ＧＳＩＳ（約５倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、続いてＧＳＩＳを完全に遮断する能力、及び弱い第２の単相応答を呈した（図８Ｇ）。ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件付けに加えることにより、Ｓ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、複数ラウンドのヒト膵島に類似した二相性ＧＳＩＳ（約５〜７倍の第１のＧＳＩＳ応答の��１の相）、及び高グルコースパルス間でＧＳＩＳを完全に遮断する能力を呈した（図８Ｈ〜８Ｉ）。
【図８Ｇ】ヒト膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びＧＳＩＳ動態を有する懸濁培養による多能性幹細胞由来成熟膵臓ベータ細胞の生成を実証する。図８Ａ〜８Ｂは両方とも、ＯＣＲが注射後１５分でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島細胞が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターは、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈した（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）。ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態が、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターとの関連でＳ７Ｄ１３の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件で観察された（１１０．７％±２．４６−注射後１５分；１２５．９％±２．２７−注射後７２分）（図８Ａ）。懸濁液中の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、高いグルコース刺激に応答して、ヒト膵島細胞レベルを上回る酸素を消費した（１６２．０％±１１．５１−注射後１５分；１７７．１％±０．９９−注射後７２分）（図８Ｂ）。図８Ｃは、ヒト膵島細胞内の成熟ベータ細胞が、グルコース刺激に応答して急速な二相性インスリン分泌を複数ラウンドの間行う能力を呈したことを示す。ヒト膵島細胞は、インスリン分泌の「オン−オフ」切り替えを複数ラウンドの間行う能力を実証した。試験した全ての条件が、ＫＣｌに対する強力なインスリン分泌応答を呈した（図８Ｃ〜８Ｉ）。エキセンジン−４の添加は、示されたヒト膵島におけるＧＳＩＳ応答の大きさを増大させなかったが、ＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ＧＳＩＳプロファイルに対する比較のために含めた（図８Ｄ）。ＢＬＡＲ００１（図８Ｅ）においてか、又はＢＬＡＲ００４（図８Ｆ）においての「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ」でステージ７の間に条件付けられたＳ７Ｄ２１−ＡＬＩクラスターは、第１の二相性ＧＳＩＳ応答は示したが（約４〜１０倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、第２の二相性ＧＳＩＳ応答は示さず、また比較的遅い二相性ＧＳＩＳ応答であった。ＡＬＩクラスターは、刺激後の３ｍＭのＤ−グルコースの再潅流時にインスリン分泌の第２の相を遮断する能力を有しなかった。「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」でステージ７の間に条件付けたＳ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、強力な第１の二相性ＧＳＩＳ（約５倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、続いてＧＳＩＳを完全に遮断する能力、及び弱い第２の単相応答を呈した（図８Ｇ）。ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件付けに加えることにより、Ｓ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、複数ラウンドのヒト膵島に類似した二相性ＧＳＩＳ（約５〜７倍の第１のＧＳＩＳ応答の��１の相）、及び高グルコースパルス間でＧＳＩＳを完全に遮断する能力を呈した（図８Ｈ〜８Ｉ）。
【図８Ｈ】ヒト膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びＧＳＩＳ動態を有する懸濁培養による多能性幹細胞由来成熟膵臓ベータ細胞の生成を実証する。図８Ａ〜８Ｂは両方とも、ＯＣＲが注射後１５分でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島細胞が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターは、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈した（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）。ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態が、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターとの関連でＳ７Ｄ１３の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件で観察された（１１０．７％±２．４６−注射後１５分；１２５．９％±２．２７−注射後７２分）（図８Ａ）。懸濁液中の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、高いグルコース刺激に応答して、ヒト膵島細胞レベルを上回る酸素を消費した（１６２．０％±１１．５１−注射後１５分；１７７．１％±０．９９−注射後７２分）（図８Ｂ）。図８Ｃは、ヒト膵島細胞内の成熟ベータ細胞が、グルコース刺激に応答して急速な二相性インスリン分泌を複数ラウンドの間行う能力を呈したことを示す。ヒト膵島細胞は、インスリン分泌の「オン−オフ」切り替えを複数ラウンドの間行う能力を実証した。試験した全ての条件が、ＫＣｌに対する強力なインスリン分泌応答を呈した（図８Ｃ〜８Ｉ）。エキセンジン−４の添加は、示されたヒト膵島におけるＧＳＩＳ応答の大きさを増大させなかったが、ＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ＧＳＩＳプロファイルに対する比較のために含めた（図８Ｄ）。ＢＬＡＲ００１（図８Ｅ）においてか、又はＢＬＡＲ００４（図８Ｆ）においての「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ」でステージ７の間に条件付けられたＳ７Ｄ２１−ＡＬＩクラスターは、第１の二相性ＧＳＩＳ応答は示したが（約４〜１０倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、第２の二相性ＧＳＩＳ応答は示さず、また比較的遅い二相性ＧＳＩＳ応答であった。ＡＬＩクラスターは、刺激後の３ｍＭのＤ−グルコースの再潅流時にインスリン分泌の第２の相を遮断する能力を有しなかった。「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」でステージ７の間に条件付けたＳ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、強力な第１の二相性ＧＳＩＳ（約５倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、続いてＧＳＩＳを完全に遮断する能力、及び弱い第２の単相応答を呈した（図８Ｇ）。ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件付けに加えることにより、Ｓ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、複数ラウンドのヒト膵島に類似した二相性ＧＳＩＳ（約５〜７倍の第１のＧＳＩＳ応答の��１の相）、及び高グルコースパルス間でＧＳＩＳを完全に遮断する能力を呈した（図８Ｈ〜８Ｉ）。
【図８Ｉ】ヒト膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びＧＳＩＳ動態を有する懸濁培養による多能性幹細胞由来成熟膵臓ベータ細胞の生成を実証する。図８Ａ〜８Ｂは両方とも、ＯＣＲが注射後１５分でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島細胞が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターは、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈した（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）。ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態が、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターとの関連でＳ７Ｄ１３の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件で観察された（１１０．７％±２．４６−注射後１５分；１２５．９％±２．２７−注射後７２分）（図８Ａ）。懸濁液中の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、高いグルコース刺激に応答して、ヒト膵島細胞レベルを上回る酸素を消費した（１６２．０％±１１．５１−注射後１５分；１７７．１％±０．９９−注射後７２分）（図８Ｂ）。図８Ｃは、ヒト膵島細胞内の成熟ベータ細胞が、グルコース刺激に応答して急速な二相性インスリン分泌を複数ラウンドの間行う能力を呈したことを示す。ヒト膵島細胞は、インスリン分泌の「オン−オフ」切り替えを複数ラウンドの間行う能力を実証した。試験した全ての条件が、ＫＣｌに対する強力なインスリン分泌応答を呈した（図８Ｃ〜８Ｉ）。エキセンジン−４の添加は、示されたヒト膵島におけるＧＳＩＳ応答の大きさを増大させなかったが、ＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ＧＳＩＳプロファイルに対する比較のために含めた（図８Ｄ）。ＢＬＡＲ００１（図８Ｅ）においてか、又はＢＬＡＲ００４（図８Ｆ）においての「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ」でステージ７の間に条件付けられたＳ７Ｄ２１−ＡＬＩクラスターは、第１の二相性ＧＳＩＳ応答は示したが（約４〜１０倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、第２の二相性ＧＳＩＳ応答は示さず、また比較的遅い二相性ＧＳＩＳ応答であった。ＡＬＩクラスターは、刺激後の３ｍＭのＤ−グルコースの再潅流時にインスリン分泌の第２の相を遮断する能力を有しなかった。「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」でステージ７の間に条件付けたＳ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、強力な第１の二相性ＧＳＩＳ（約５倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、続いてＧＳＩＳを完全に遮断する能力、及び弱い第２の単相応答を呈した（図８Ｇ）。ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件付けに加えることにより、Ｓ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、複数ラウンドのヒト膵島に類似した二相性ＧＳＩＳ（約５〜７倍の第１のＧＳＩＳ応答の��１の相）、及び高グルコースパルス間でＧＳＩＳを完全に遮断する能力を呈した（図８Ｈ〜８Ｉ）。
【図９Ａ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ａは、ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来膵内胚葉を生成するための段階的分化プロトコルを描出する。重要な転写因子（「ＴＦ」）を各ステージについて示す。
【図９Ｂ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｂは、１ｍＬあたりの１００万細胞（millions of cells per mL)単位で、ｈＥＳＣ入力に対する生成されたＳ４Ｄ３細胞の数を示す。
【図９Ｃ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｃは、０．１ＰＢＳ  Ｍｉｎｉ及び０．５ＰＢＳ  ＭｉｎｉについてのＳ４Ｄ３収率を示す。例えば、０．５ＰＢＳ懸濁培養形式では、１個のｈＥＳＣ細胞あたり４．０８±０．８５４（４０８万±８５万４千）細胞が生成され、ＰＥＣ−０１  ｄ１２（２．２３±０．０９０）よりも顕著に多かった。図９Ｃは、１００ｍＬ（０．１ＰＢＳ）から５００ｍＬ（０．５ＰＢＳ）に培地体積をスケールアップしたときの、Ｓ４Ｄ３総細胞収率の約６倍の増加（１００万細胞単位）を実証する。
【図９Ｄ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｄ及び９Ｅは、２リットルのローラボトル（図９Ｄ、右）、０．１ＰＢＳ（図９Ｅ、中央）、及び０．５ＰＢＳ（図９Ｅ、右）懸濁形式からのＳ４Ｄ３凝集体の位相差画像及び直径（マイクロメートル単位）を描出し、２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１２（図９Ｄ、左）及びＰＥＣ−０１  ｄ１５（図９Ｅ、左）は、先行技術の例として示される。０．１ＰＢＳ及び０．５ＰＢＳ懸濁培養によって生成されたＳ４Ｄ３凝集体は、ローラボトルによって生成された凝集体よりも一様に小さい。
【図９Ｅ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｄ及び９Ｅは、２リットルのローラボトル（図９Ｄ、右）、０．１ＰＢＳ（図９Ｅ、中央）、及び０．５ＰＢＳ（図９Ｅ、右）懸濁形式からのＳ４Ｄ３凝集体の位相差画像及び直径（マイクロメートル単位）を描出し、２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１２（図９Ｄ、左）及びＰＥＣ−０１  ｄ１５（図９Ｅ、左）は、先行技術の例として示される。０．１ＰＢＳ及び０．５ＰＢＳ懸濁培養によって生成されたＳ４Ｄ３凝集体は、ローラボトルによって生成された凝集体よりも一様に小さい。
【図９Ｆ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｆ〜９Ｌは、Ｓ４Ｄ３凝集体についての遺伝子発現を示す。ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣに対する、ＮＫＸ６．１（図９Ｆ）、ＰＴＦ１Ａ（図９Ｇ）、ＰＤＸ１（図９Ｈ）、ＳＯＸ２（図９Ｉ）、ＣＤＸ２（図９Ｊ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図９Ｋ）、及びＣＨＧＡ（図９Ｌ）の遺伝子発現を、２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳにおいて生成されたＳ４Ｄ３凝集体、並びに２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１５について示す。図９Ｆ〜９Ｌは、ＰＥＣ−０１  ｄ１５（先行技術）と比べて、代替的な内胚葉系統の発現及び早期膵内分泌分化を制限すると同時の膵内胚葉遺伝子プログラムの頑強な誘導を実証する。
【図９Ｇ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｆ〜９Ｌは、Ｓ４Ｄ３凝集体についての遺伝子発現を示す。ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣに対する、ＮＫＸ６．１（図９Ｆ）、ＰＴＦ１Ａ（図９Ｇ）、ＰＤＸ１（図９Ｈ）、ＳＯＸ２（図９Ｉ）、ＣＤＸ２（図９Ｊ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図９Ｋ）、及びＣＨＧＡ（図９Ｌ）の遺伝子発現を、２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳにおいて生成されたＳ４Ｄ３凝集体、並びに２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１５について示す。図９Ｆ〜９Ｌは、ＰＥＣ−０１  ｄ１５（先行技術）と比べて、代替的な内胚葉系統の発現及び早期膵内分泌分化を制限すると同時の膵内胚葉遺伝子プログラムの頑強な誘導を実証する。
【図９Ｈ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｆ〜９Ｌは、Ｓ４Ｄ３凝集体についての遺伝子発現を示す。ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣに対する、ＮＫＸ６．１（図９Ｆ）、ＰＴＦ１Ａ（図９Ｇ）、ＰＤＸ１（図９Ｈ）、ＳＯＸ２（図９Ｉ）、ＣＤＸ２（図９Ｊ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図９Ｋ）、及びＣＨＧＡ（図９Ｌ）の遺伝子発現を、２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳにおいて生成されたＳ４Ｄ３凝集体、並びに２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１５について示す。図９Ｆ〜９Ｌは、ＰＥＣ−０１  ｄ１５（先行技術）と比べて、代替的な内胚葉系統の発現及び早期膵内分泌分化を制限すると同時の膵内胚葉遺伝子プログラムの頑強な誘導を実証する。
【図９Ｉ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｆ〜９Ｌは、Ｓ４Ｄ３凝集体についての遺伝子発現を示す。ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣに対する、ＮＫＸ６．１（図９Ｆ）、ＰＴＦ１Ａ（図９Ｇ）、ＰＤＸ１（図９Ｈ）、ＳＯＸ２（図９Ｉ）、ＣＤＸ２（図９Ｊ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図９Ｋ）、及びＣＨＧＡ（図９Ｌ）の遺伝子発現を、２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳにおいて生成されたＳ４Ｄ３凝集体、並びに２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１５について示す。図９Ｆ〜９Ｌは、ＰＥＣ−０１  ｄ１５（先行技術）と比べて、代替的な内胚葉系統の発現及び早期膵内分泌分化を制限すると同時の膵内胚葉遺伝子プログラムの頑強な誘導を実証する。
【図９Ｊ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｆ〜９Ｌは、Ｓ４Ｄ３凝集体についての遺伝子発現を示す。ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣに対する、ＮＫＸ６．１（図９Ｆ）、ＰＴＦ１Ａ（図９Ｇ）、ＰＤＸ１（図９Ｈ）、ＳＯＸ２（図９Ｉ）、ＣＤＸ２（図９Ｊ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図９Ｋ）、及びＣＨＧＡ（図９Ｌ）の遺伝子発現を、２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳにおいて生成されたＳ４Ｄ３凝集体、並びに２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１５について示す。図９Ｆ〜９Ｌは、ＰＥＣ−０１  ｄ１５（先行技術）と比べて、代替的な内胚葉系統の発現及び早期膵内分泌分化を制限すると同時の膵内胚葉遺伝子プログラムの頑強な誘導を実証する。
【図９Ｋ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｆ〜９Ｌは、Ｓ４Ｄ３凝集体についての遺伝子発現を示す。ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣに対する、ＮＫＸ６．１（図９Ｆ）、ＰＴＦ１Ａ（図９Ｇ）、ＰＤＸ１（図９Ｈ）、ＳＯＸ２（図９Ｉ）、ＣＤＸ２（図９Ｊ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図９Ｋ）、及びＣＨＧＡ（図９Ｌ）の遺伝子発現を、２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳにおいて生成されたＳ４Ｄ３凝集体、並びに２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１５について示す。図９Ｆ〜９Ｌは、ＰＥＣ−０１  ｄ１５（先行技術）と比べて、代替的な内胚葉系統の発現及び早期膵内分泌分化を制限すると同時の膵内胚葉遺伝子プログラムの頑強な誘導を実証する。
【図９Ｌ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｆ〜９Ｌは、Ｓ４Ｄ３凝集体についての遺伝子発現を示す。ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣに対する、ＮＫＸ６．１（図９Ｆ）、ＰＴＦ１Ａ（図９Ｇ）、ＰＤＸ１（図９Ｈ）、ＳＯＸ２（図９Ｉ）、ＣＤＸ２（図９Ｊ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図９Ｋ）、及びＣＨＧＡ（図９Ｌ）の遺伝子発現を、２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳにおいて生成されたＳ４Ｄ３凝集体、並びに２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１５について示す。図９Ｆ〜９Ｌは、ＰＥＣ−０１  ｄ１５（先行技術）と比べて、代替的な内胚葉系統の発現及び早期膵内分泌分化を制限すると同時の膵内胚葉遺伝子プログラムの頑強な誘導を実証する。
【図９Ｍ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｎ〜９Ｐは、２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１２凝集体（図９Ｍ）、及びＰＥＣ−０１  ｄ１５凝集体（図９Ｑ）と比べて、２リットルのローラボトル（図９Ｎ）、０．１ＰＢＳ（図９Ｏ）、及び０．５ＰＢＳ（図９Ｐ）において新たなプロトコルによって生成されたＳ４Ｄ３凝集体に関して、膵内胚葉マーカー（例えば、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１）はタンパク質共局在性が強力であったが、代替的な内胚葉系統のタンパク質マーカー（例えば、ＳＯＸ２、ＣＤＸ２）及び内分泌分化のためのマーカー（例えば、ＣＨＧＡ）はそうではなかったことを示す。
【図９Ｎ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｎ〜９Ｐは、２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１２凝集体（図９Ｍ）、及びＰＥＣ−０１  ｄ１５凝集体（図９Ｑ）と比べて、２リットルのローラボトル（図９Ｎ）、０．１ＰＢＳ（図９Ｏ）、及び０．５ＰＢＳ（図９Ｐ）において新たなプロトコルによって生成されたＳ４Ｄ３凝集体に関して、膵内胚葉マーカー（例えば、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１）はタンパク質共局在性が強力であったが、代替的な内胚葉系統のタンパク質マーカー（例えば、ＳＯＸ２、ＣＤＸ２）及び内分泌分化のためのマーカー（例えば、ＣＨＧＡ）はそうではなかったことを示す。
【図９Ｏ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｎ〜９Ｐは、２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１２凝集体（図９Ｍ）、及びＰＥＣ−０１  ｄ１５凝集体（図９Ｑ）と比べて、２リットルのローラボトル（図９Ｎ）、０．１ＰＢＳ（図９Ｏ）、及び０．５ＰＢＳ（図９Ｐ）において新たなプロトコルによって生成されたＳ４Ｄ３凝集体に関して、膵内胚葉マーカー（例えば、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１）はタンパク質共局在性が強力であったが、代替的な内胚葉系統のタンパク質マーカー（例えば、ＳＯＸ２、ＣＤＸ２）及び内分泌分化のためのマーカー（例えば、ＣＨＧＡ）はそうではなかったことを示す。
【図９Ｐ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｎ〜９Ｐは、２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１２凝集体（図９Ｍ）、及びＰＥＣ−０１  ｄ１５凝集体（図９Ｑ）と比べて、２リットルのローラボトル（図９Ｎ）、０．１ＰＢＳ（図９Ｏ）、及び０．５ＰＢＳ（図９Ｐ）において新たなプロトコルによって生成されたＳ４Ｄ３凝集体に関して、膵内胚葉マーカー（例えば、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１）はタンパク質共局在性が強力であったが、代替的な内胚葉系統のタンパク質マーカー（例えば、ＳＯＸ２、ＣＤＸ２）及び内分泌分化のためのマーカー（例えば、ＣＨＧＡ）はそうではなかったことを示す。
【図９Ｑ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成を実証する。図９Ｎ〜９Ｐは、２リットルのローラボトルによって生成されたＰＥＣ−０１  ｄ１２凝集体（図９Ｍ）、及びＰＥＣ−０１  ｄ１５凝集体（図９Ｑ）と比べて、２リットルのローラボトル（図９Ｎ）、０．１ＰＢＳ（図９Ｏ）、及び０．５ＰＢＳ（図９Ｐ）において新たなプロトコルによって生成されたＳ４Ｄ３凝集体に関して、膵内胚葉マーカー（例えば、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１）はタンパク質共局在性が強力であったが、代替的な内胚葉系統のタンパク質マーカー（例えば、ＳＯＸ２、ＣＤＸ２）及び内分泌分化のためのマーカー（例えば、ＣＨＧＡ）はそうではなかったことを示す。
【図１０Ａ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ａは、ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の非機能的インスリン産生細胞を生成するための開示された段階的分化プロトコルを描出する。ステージ５条件付けに対するＳ４Ｄ３  ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来細胞の投入から始めて、重要な転写因子（「ＴＦ」）を各ステージについて示す。
【図１０Ｂ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｂは、１ｍＬあたりの１００万細胞（millions of cells per mL）単位で、ｈＥＳＣ入力に対する生成されたＳ６Ｄ７細胞の数を示す。例えば、新たなプロトコルを用いる０．５ＰＢＳ懸濁培養形式により、１個のｈＥＳＣ細胞あたり２．４±０．１６９のＳ６Ｄ７細胞が生成された。
【図１０Ｃ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｃは、０．１ＰＢＳ及び０．５ＰＢＳ培養のＳ６Ｄ７収率を示す。図１０Ｃは、１００ｍＬ（０．１ＰＢＳ）から５００ｍＬ（０．５ＰＢＳ）に培地体積をスケールアップしたときの、Ｓ６Ｄ７総細胞収率の約７．５倍の増加（１００万細胞単位）を実証する。
【図１０Ｄ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｄは、２リットルのローラボトル（図１０Ｄ、左）、０．１ＰＢＳ（図１０Ｄ、中央）、及び０．５ＰＢＳ（図１０Ｄ、右）懸濁形式からのＳ５Ｄ３凝集体の位相差画像を描出する。
【図１０Ｅ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｅは、２リットルのローラボトル（図１０Ｅ、左）、０．１ＰＢＳ（図１０Ｅ、中央）、及び０．５ＰＢＳ（図１０Ｅ、右）懸濁形式からのＳ６Ｄ７凝集体の位相差画像を描出し、各写真の下に凝集体の直径を示す。
【図１０Ｆ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｆは、２リットルのローラボトル（図１０Ｆ、左）、及び０．１ＰＢＳ（図１０Ｆ、右）懸濁形式からのＳ７Ｄ１３凝集体の位相差画像を描出する。０．１ＰＢＳ及び０．５ＰＢＳによる懸濁培養は、ステージ７をとおして締まった凝集構造を維持した。逆に、ステージ６〜７の凝集体は緩く、２リットルのローラボトルの懸濁培養において細胞のシートを形成した。
【図１０Ｇ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｇ〜１０Ｎは、Ｓ４Ｄ３、Ｓ５Ｄ３、Ｓ６Ｄ７、及びＳ７Ｄ７での遺伝子発現を示す。図１０Ｇ〜１０Ｎは、新たなプロトコルを使用する全ての懸濁培養法により、頑強な膵臓モノホルモンインスリン産生細胞遺伝子特性が誘導されたことを実証する。２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳ懸濁法は、ＰＤＸ１（図１０Ｇ）、ＮＫＸ６．１（図１０Ｈ）、ＣＨＧＡ（図１０Ｉ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図１０Ｊ）、ＮＧＮ３（図１０Ｋ）、インスリン（図１０Ｌ）、ＭＡＦＡ（図１０Ｍ）、及びグルカゴン（図１０Ｎ）の発現を比較的等しく誘導した。
【図１０Ｈ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｇ〜１０Ｎは、Ｓ４Ｄ３、Ｓ５Ｄ３、Ｓ６Ｄ７、及びＳ７Ｄ７での遺伝子発現を示す。図１０Ｇ〜１０Ｎは、新たなプロトコルを使用する全ての懸濁培養法により、頑強な膵臓モノホルモンインスリン産生細胞遺伝子特性が誘導されたことを実証する。２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳ懸濁法は、ＰＤＸ１（図１０Ｇ）、ＮＫＸ６．１（図１０Ｈ）、ＣＨＧＡ（図１０Ｉ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図１０Ｊ）、ＮＧＮ３（図１０Ｋ）、インスリン（図１０Ｌ）、ＭＡＦＡ（図１０Ｍ）、及びグルカゴン（図１０Ｎ）の発現を比較的等しく誘導した。
【図１０Ｉ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｇ〜１０Ｎは、Ｓ４Ｄ３、Ｓ５Ｄ３、Ｓ６Ｄ７、及びＳ７Ｄ７での遺伝子発現を示す。図１０Ｇ〜１０Ｎは、新たなプロトコルを使用する全ての懸濁培養法により、頑強な膵臓モノホルモンインスリン産生細胞遺伝子特性が誘導されたことを実証する。２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳ懸濁法は、ＰＤＸ１（図１０Ｇ）、ＮＫＸ６．１（図１０Ｈ）、ＣＨＧＡ（図１０Ｉ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図１０Ｊ）、ＮＧＮ３（図１０Ｋ）、インスリン（図１０Ｌ）、ＭＡＦＡ（図１０Ｍ）、及びグルカゴン（図１０Ｎ）の発現を比較的等しく誘導した。
【図１０Ｊ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｇ〜１０Ｎは、Ｓ４Ｄ３、Ｓ５Ｄ３、Ｓ６Ｄ７、及びＳ７Ｄ７での遺伝子発現を示す。図１０Ｇ〜１０Ｎは、新たなプロトコルを使用する全ての懸濁培養法により、頑強な膵臓モノホルモンインスリン産生細胞遺伝子特性が誘導されたことを実証する。２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳ懸濁法は、ＰＤＸ１（図１０Ｇ）、ＮＫＸ６．１（図１０Ｈ）、ＣＨＧＡ（図１０Ｉ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図１０Ｊ）、ＮＧＮ３（図１０Ｋ）、インスリン（図１０Ｌ）、ＭＡＦＡ（図１０Ｍ）、及びグルカゴン（図１０Ｎ）の発現を比較的等しく誘導した。
【図１０Ｋ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｇ〜１０Ｎは、Ｓ４Ｄ３、Ｓ５Ｄ３、Ｓ６Ｄ７、及びＳ７Ｄ７での遺伝子発現を示す。図１０Ｇ〜１０Ｎは、新たなプロトコルを使用する全ての懸濁培養法により、頑強な膵臓モノホルモンインスリン産生細胞遺伝子特性が誘導されたことを実証する。２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳ懸濁法は、ＰＤＸ１（図１０Ｇ）、ＮＫＸ６．１（図１０Ｈ）、ＣＨＧＡ（図１０Ｉ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図１０Ｊ）、ＮＧＮ３（図１０Ｋ）、インスリン（図１０Ｌ）、ＭＡＦＡ（図１０Ｍ）、及びグルカゴン（図１０Ｎ）の発現を比較的等しく誘導した。
【図１０Ｌ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｇ〜１０Ｎは、Ｓ４Ｄ３、Ｓ５Ｄ３、Ｓ６Ｄ７、及びＳ７Ｄ７での遺伝子発現を示す。図１０Ｇ〜１０Ｎは、新たなプロトコルを使用する全ての懸濁培養法により、頑強な膵臓モノホルモンインスリン産生細胞遺伝子特性が誘導されたことを実証する。２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳ懸濁法は、ＰＤＸ１（図１０Ｇ）、ＮＫＸ６．１（図１０Ｈ）、ＣＨＧＡ（図１０Ｉ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図１０Ｊ）、ＮＧＮ３（図１０Ｋ）、インスリン（図１０Ｌ）、ＭＡＦＡ（図１０Ｍ）、及びグルカゴン（図１０Ｎ）の発現を比較的等しく誘導した。
【図１０Ｍ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｇ〜１０Ｎは、Ｓ４Ｄ３、Ｓ５Ｄ３、Ｓ６Ｄ７、及びＳ７Ｄ７での遺伝子発現を示す。図１０Ｇ〜１０Ｎは、新たなプロトコルを使用する全ての懸濁培養法により、頑強な膵臓モノホルモンインスリン産生細胞遺伝子特性が誘導されたことを実証する。２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳ懸濁法は、ＰＤＸ１（図１０Ｇ）、ＮＫＸ６．１（図１０Ｈ）、ＣＨＧＡ（図１０Ｉ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図１０Ｊ）、ＮＧＮ３（図１０Ｋ）、インスリン（図１０Ｌ）、ＭＡＦＡ（図１０Ｍ）、及びグルカゴン（図１０Ｎ）の発現を比較的等しく誘導した。
【図１０Ｎ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｇ〜１０Ｎは、Ｓ４Ｄ３、Ｓ５Ｄ３、Ｓ６Ｄ７、及びＳ７Ｄ７での遺伝子発現を示す。図１０Ｇ〜１０Ｎは、新たなプロトコルを使用する全ての懸濁培養法により、頑強な膵臓モノホルモンインスリン産生細胞遺伝子特性が誘導されたことを実証する。２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳ懸濁法は、ＰＤＸ１（図１０Ｇ）、ＮＫＸ６．１（図１０Ｈ）、ＣＨＧＡ（図１０Ｉ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図１０Ｊ）、ＮＧＮ３（図１０Ｋ）、インスリン（図１０Ｌ）、ＭＡＦＡ（図１０Ｍ）、及びグルカゴン（図１０Ｎ）の発現を比較的等しく誘導した。
【図１０Ｏ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｏ〜１０Ｔは、０．５ＰＢＳにおけるＳ５Ｄ３（図１０Ｏ〜１０Ｐ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｑ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｒ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ１３（図１０Ｓ）、及び０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１４（図１０Ｔ）の、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１、インスリンなどであるが、グルカゴンではない、インスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性の段階的形成を示す。
【図１０Ｐ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｏ〜１０Ｔは、０．５ＰＢＳにおけるＳ５Ｄ３（図１０Ｏ〜１０Ｐ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｑ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｒ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ１３（図１０Ｓ）、及び０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１４（図１０Ｔ）の、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１、インスリンなどであるが、グルカゴンではない、インスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性の段階的形成を示す。
【図１０Ｑ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｏ〜１０Ｔは、０．５ＰＢＳにおけるＳ５Ｄ３（図１０Ｏ〜１０Ｐ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｑ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｒ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ１３（図１０Ｓ）、及び０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１４（図１０Ｔ）の、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１、インスリンなどであるが、グルカゴンではない、インスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性の段階的形成を示す。
【図１０Ｒ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｏ〜１０Ｔは、０．５ＰＢＳにおけるＳ５Ｄ３（図１０Ｏ〜１０Ｐ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｑ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｒ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ１３（図１０Ｓ）、及び０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１４（図１０Ｔ）の、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１、インスリンなどであるが、グルカゴンではない、インスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性の段階的形成を示す。
【図１０Ｓ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｏ〜１０Ｔは、０．５ＰＢＳにおけるＳ５Ｄ３（図１０Ｏ〜１０Ｐ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｑ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｒ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ１３（図１０Ｓ）、及び０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１４（図１０Ｔ）の、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１、インスリンなどであるが、グルカゴンではない、インスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性の段階的形成を示す。
【図１０Ｔ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｏ〜１０Ｔは、０．５ＰＢＳにおけるＳ５Ｄ３（図１０Ｏ〜１０Ｐ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｑ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｒ）、２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ１３（図１０Ｓ）、及び０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１４（図１０Ｔ）の、ＣＨＧＡ、ＮＫＸ６．１、インスリンなどであるが、グルカゴンではない、インスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性の段階的形成を示す。
【図１０Ｕ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｕは、ＰＥＣ−０１由来Ｓ６Ｄ７細胞についての、ＣＨＧＡ、インスリン、グルカゴンを共発現しているＮＫＸ６．１細胞の普及率、並びにインスリン及びＧＬＵＣＡＯＮを共発現している細胞の普及率を示す。図１０Ｕは、２リットルのローラボトルにおけるＰＥＣ−０１由来Ｓ６Ｄ７凝集体について、ポリホルモンインスリン産生細胞の高い普及率、及びひいてはモノホルモンインスリン陽性細胞の少ない数を示す。
【図１０Ｖ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｖは、ＰＥＣ−０１由来Ｓ６Ｄ７、０．１ＰＢＳ  Ｓ７Ｄ１４及びローラボトル（ＲＢ）Ｓ７Ｄ１３についてのグルカゴン及びＮＫＸ６．１の共局在性を示す。図１０Ｖは、全てのインスリン＋グルカゴン＋細胞が、試験した全ての条件（ＰＥＣ−０１由来Ｓ６Ｄ７、新たなプロトコルを用いる０．１ＰＢＳ  Ｓ７Ｄ１４及びＲＢ  Ｓ７Ｄ１３）において、ＮＫＸ６．１の存在について陰性であることを実証する。
【図１０Ｗ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｗ〜１０ＡＢは、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｗ〜１０Ｘ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１６（図１０Ｙ〜１０Ｚ）、及び２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ２３（図１０ＡＡ〜１０ＡＢ）の、シナプトフィジン（汎内分泌マーカー）、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡなどのインスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性を示す。ステージ７により、非機能的モノホルモンインスリン産生細胞を示す、シナプトフィジン、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡの間の頑強なタンパク質共局在性が観察された。
【図１０Ｘ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｗ〜１０ＡＢは、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｗ〜１０Ｘ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１６（図１０Ｙ〜１０Ｚ）、及び２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ２３（図１０ＡＡ〜１０ＡＢ）の、シナプトフィジン（汎内分泌マーカー）、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡなどのインスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性を示す。ステージ７により、非機能的モノホルモンインスリン産生細胞を示す、シナプトフィジン、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡの間の頑強なタンパク質共局在性が観察された。
【図１０Ｙ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｗ〜１０ＡＢは、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｗ〜１０Ｘ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１６（図１０Ｙ〜１０Ｚ）、及び２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ２３（図１０ＡＡ〜１０ＡＢ）の、シナプトフィジン（汎内分泌マーカー）、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡなどのインスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性を示す。ステージ７により、非機能的モノホルモンインスリン産生細胞を示す、シナプトフィジン、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡの間の頑強なタンパク質共局在性が観察された。
【図１０Ｚ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｗ〜１０ＡＢは、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｗ〜１０Ｘ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１６（図１０Ｙ〜１０Ｚ）、及び２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ２３（図１０ＡＡ〜１０ＡＢ）の、シナプトフィジン（汎内分泌マーカー）、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡなどのインスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性を示す。ステージ７により、非機能的モノホルモンインスリン産生細胞を示す、シナプトフィジン、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡの間の頑強なタンパク質共局在性が観察された。
【図１０ＡＡ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｗ〜１０ＡＢは、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｗ〜１０Ｘ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１６（図１０Ｙ〜１０Ｚ）、及び２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ２３（図１０ＡＡ〜１０ＡＢ）の、シナプトフィジン（汎内分泌マーカー）、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡなどのインスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性を示す。ステージ７により、非機能的モノホルモンインスリン産生細胞を示す、シナプトフィジン、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡの間の頑強なタンパク質共局在性が観察された。
【図１０ＡＢ】複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成を実証する。図１０Ｗ〜１０ＡＢは、０．１ＰＢＳにおけるＳ６Ｄ７（図１０Ｗ〜１０Ｘ）、０．１ＰＢＳにおけるＳ７Ｄ１６（図１０Ｙ〜１０Ｚ）、及び２リットルのローラボトルにおけるＳ７Ｄ２３（図１０ＡＡ〜１０ＡＢ）の、シナプトフィジン（汎内分泌マーカー）、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡなどのインスリン産生細胞マーカーのタンパク質共局在性を示す。ステージ７により、非機能的モノホルモンインスリン産生細胞を示す、シナプトフィジン、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡの間の頑強なタンパク質共局在性が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の以下の詳細な記載は、添付の図面と併せて読むことでより深い理解が得られるであろう。図面は、本発明のある特定の実施形態を例証するために提供される。しかしながら、本発明は、示される正確な構成、実施例、及び手段に限定されない。開示を明確にするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形態」を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を記載又は例示する小項目に分割する。
【００４３】
Ａ．定義
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を生成する場合がある。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能的細胞へとインビトロで分化する能力を特徴とする。幹細胞はまた、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に（全てではないとしても）ほとんどの組織に寄与する。幹細胞は、それらの発生上の潜在性によって分類される。多能性幹細胞は、全ての胚細胞型を生じさせることが可能である。
【００４４】
分化は、特殊化されていない（unspecialized）（「拘束されていない（uncommitted）」）又は比較的特殊化されていない細胞が、特殊化された細胞、例えば、神経細胞又は筋細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞は、細胞の系統の範囲内で、より特殊化した（「拘束された」）立場をとる細胞である。分化プロセスに適用されたときの用語「拘束された」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ、通常の環境下で、異なる細胞型に分化したり、又は比較的分化されていない細胞型に戻ったりすることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞の系統内で比較的特殊化されて（又は拘束されて）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞の系統は、その細胞の遺伝性、すなわち、その細胞がどの細胞に由来するか、またその細胞がどのような細胞を生じさせ得るかを規定する。細胞の系統は、発達及び分化の遺伝スキームの範囲内で、その細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、拘束されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。
【００４５】
本明細書で使用するとき「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。これに関して、差異的発現とは、未分化細胞又は分化の別のステージの細胞と比較して、陽性マーカーについては増殖したレベルを意味し、陰性マーカーについては減少したレベルを意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出限界は、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から特定及び区別することが可能である。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「細胞密度」及び「播種密度」は、本明細書において互換的に使用され、固体又は半固体平面又は湾曲基質の単位面積あたりに播種された細胞の数を指す。
【００４７】
本明細書で使用するとき、「懸濁培養」は、表面に接着するよりもむしろ、培地内で懸濁された細胞の培養、単一細胞、又はクラスターを指す。
【００４８】
本明細書で使用するとき、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されたとき、特異的マーカー「について陽性」、「陽性」又は「＋」である。同様に、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されないとき、特異的マーカー「について陰性」、「陰性」又は「−」である。とりわけ、蛍光活性細胞分類サイトメトリー（「ＦＡＣＳ」）による陽性は通常約２％を超えるが、ＦＡＣＳによる陰性閾値は通常約１％を下回る。ポリメラーゼ連鎖反応サイトメトリー（「ＰＣＲ」）による陽性は、通常約３０サイクル（Ｃｔｓ）以下であるが、ＰＣＲによる陰性は、通常約３１サイクルを超える。
【００４９】
静的インビトロ細胞培養において、多能性幹細胞の機能的膵内分泌細胞への分化を複製する試みでは、分化プロセスは、多くの連続ステージを通じて進行すると見られる場合が多い。とりわけ、分化プロセスは、一般に複数のステージを通じて進行すると見られている。この段階的分化において、「ステージ１」は、分化プロセスの第１の工程、多能性幹細胞の、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ１細胞」）への分化を指す。「ステージ２」は、第２の工程、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ２細胞」）への分化を指す。「ステージ３」は、第３の工程、初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ３細胞」）への分化を指す。「ステージ４」は、第４の工程、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ４細胞」）への分化を指す。「ステージ５」は、第５の工程、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵内胚葉細胞及び膵内分泌前駆細胞のうちの一方又は両方に特徴的なマーカーを発現する細胞（集合的に「ステージ５細胞」又は代替的に「膵内胚葉／内分泌前駆体細胞」と称される）への分化を指す。ステージ６は、第６の工程、膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、未成熟ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（「ステージ６細胞」）への分化を指す。本発明の細胞及び細胞の集団を産生するプロセスにおいて、及びその目的で、第７の工程、「ステージ７」が使用され、未成熟ベータ細胞（膵内分泌細胞）に特徴的なマーカーを発現する細胞の、機能的ベータ細胞でありステージ６細胞と比較してより成熟した表現型を有する細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を指す。「より成熟した表現型を有する機能的ベータ細胞」又は「ステージ７細胞」は、ステージ６細胞と比較したときに、単一ホルモンインスリン＋、ＭＡＦＡ＋、ＮＫＸ６．１＋、ＵＣＮ３＋、ＳＬＣ２Ａ１＋、及びＰＤＸ１＋だけでなく、より未成熟な膵内分泌細胞、特に未成熟ベータ細胞よりも高いレベルでＭＡＦＡを発現する膵内分泌細胞を意味する。
【００５０】
特定集団の全ての細胞がこれらのステージを同じ速度で進行するとは限らないことに留意されたい。結論として、インビトロ細胞培養において、特に後期分化ステージでは、集団に存在する細胞の大半よりも分化経路を進行していなかったり、大半よりも進行していていたりする細胞の存在を検出することは稀ではない。例えば、ステージ５での細胞の培養中、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーの出現を見ることは稀ではない。本発明を例証する目的で、上で特定されたステージと関連した様々な細胞型の特徴が本明細書に記載される。
【００５１】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保有している細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＦＯＸＡ２（肝細胞核因子３−β（「ＨＮＦ３−β」）としても知られる）、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ブラチュウリー（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、ケルベロス、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１のうちの少なくとも１つを発現する。胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーは、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７である。したがって、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７の発現によって特徴付けられ得る。加えて、細胞がステージ１に留まることができる時間の長さに応じて、ＨＮＦ４αにおける増加が観察され得る。
【００５２】
「初期腸管細胞」は、本明細書で使用するとき、胚体内胚葉に由来し、肺、肝臓、膵臓、胃、及び腸などの全ての内胚葉器官を生じることができる細胞を指す。腸管細胞は、胚体内胚葉細胞によって発現されたものに対するＨＮＦ４αの実質的に増加した発現で特徴付けられ得る。例えば、ＨＮＦ４αのｍＲＮＡ発現の１０倍〜４０倍の増加が、ステージ２中に観察され得る。
【００５３】
「前腸内胚葉細胞」は、本明細書で使用するとき、食道、肺、胃、肝臓、膵臓、膀胱、及び十二指腸の一部分を生じる細胞を指す。前腸内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びＨＮＦ４αのうちの少なくとも１つを発現する。前腸内胚葉細胞は、腸管細胞と比較してＰＤＸ１の発現の増加で特徴付けられ得る。例えば、ステージ３培養において、細胞の５０パーセント超が、典型的にＰＤＸ１を発現する。
【００５４】
「膵内胚葉細胞」は、本明細書で使用するとき、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＮＧＮ３、ガストリン、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵内胚葉細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２の実質的発現の欠失で特徴付けられ得る。
【００５５】
「膵内分泌前駆細胞」は、本明細書で使用するとき、膵ホルモン発現細胞になることが可能な膵内胚葉細胞を指す。膵内分泌前駆細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、又はＡＲＸのうちの少なくとも１つを発現する。膵内分泌前駆細胞は、ＮＫＸ２．２及びＮｅｕｒｏＤ１の発現によって特徴付けられ得る。
【００５６】
「膵内分泌細胞」は、本明細書で使用するとき、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。これらのホルモンに加え、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーとしては、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＨＢ９、及びＰＡＸ６のうちの１つ又は２つ以上を含む。
【００５７】
「ベータ細胞」（「β細胞」）は、インスリンを発現する能力は有するが、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチドを発現する能力は有しない膵内分泌細胞である。β細胞に特徴的なマーカーを発現する膵内分泌細胞は、インスリン及び以下の転写因子、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＨＢ９、ＭＡＦＡ、及びＰＡＸ６のうちの少なくとも１つによって特徴付けることができる。
【００５８】
「機能的ベータ細胞」は、急速な調節されたグルコース刺激性インスリン分泌（「ＧＳＩＳ」）を確実にする、具体的には、後のミトコンドリア呼吸／活性の増加の後に第１相及び第２相のインスリン分泌（「二相性ＧＳＩＳ」）が続く、十分に確立されているプロセスを示す膵内分泌細胞である。詳細には、機能的ベータ細胞は、二相性ＧＳＩＳの以下の特性、すなわち、（ｉ）ミトコンドリア呼吸／活性とインスリン分泌とのカップリング、（ｉｉ）増大した要求（本明細書では高グルコース濃度として定義される）に応答する急速なインスリン分泌応答、（ｉｉｉ）要求が沈静化した後に急速にインスリン分泌を停止する能力、（ｉｖ）インスリン分泌の「オン−オフ」切り替えを複数ラウンド行う能力、（ｖ）要求によって決定されるとおりに正しい量のインスリンを分泌する能力、並びに（ｖｉ）複数のインスリン分泌促進剤（例えば、エキセンジン−４、又はアミノ酸Ｌ−グルタミン及びＬ−アルギニン）に応答する能力、のうちの少なくとも１つを呈する。機能的ベータ細胞は、インスリン及び以下の転写因子、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＨＢ９、ＰＡＸ６、ＭＡＦＡ、ＳＬＣ２Ａ１、ＵＣＮ３、及びＧＬＰ１Ｒの少なくとも１つの発現によって特徴付けられてもよい。
【００５９】
「未成熟ベータ細胞」は、グルコース依存性ミトコンドリア呼吸／活性、及び二相性ＧＳＩＳを示さない膵内分泌細胞である。β細胞に特徴的なマーカーを発現する未成熟ベータ細胞は、インスリン及び以下の転写因子、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＨＢ９、ＭＡＦＡ、及びＰＡＸ６のうちの少なくとも１つによって特徴付けることができる。
【００６０】
「空気−液体界面」又は「ＡＬＩ」は、本明細書で使用するとき、開放培養容器又は培地で部分的に充填された培養容器内に存在する空気−液体界面を指す。本明細書では便宜上「空気」と称されるが、本発明は、周囲環境内で見出されるガス及び組成物の混合物に限定されない。本発明は、具体的に企図され、例えば、特定成分が豊富であるか、又は特定成分が枯渇若しくは排除された混合物を含む、周囲環境とは異なる組成物を有するガス混合物を含む。
【００６１】
本明細書では、「ｄ１」、「１ｄ」、及び「１日目」、「ｄ２」、「２ｄ」、及び「２日目」などが同義的に使用される。これらの数字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコル中の異なるステージにおける培養の特定の日を指す。
【００６２】
第１の相（１ｓｔ）のインスリン分泌は、グルコース濃度の急激な増加の際に、結合し、容易に解放可能なインスリン顆粒の小さいプールの急速なエキソサイトーシスを表す。
【００６３】
第１の相のインスリン分泌と比較して程度は低いが持続期間が長い第２の相（２ｎｄ）のインスリン分泌は、顆粒を顆粒の貯蔵プールから移動させること、及び解放のためにそれらを結合させる／プライミングすることを表す。
【００６４】
ＯＣＲは、酸素消費速度として定義され、具体的には電子伝達鎖（「ＥＴＣ」）を介した、ミトコンドリア呼吸の指標であり、ミトコンドリア活性の直接的な測定値である。
【００６５】
「有効量」又は「治療量」又はそれにおける等価物は、ある程度のｈＥＳＣの分化、又は部分的に分化したｈＥＳＣ（１つ以上のこれまでの分化ステージに供されたものなど）の更なる分化を提供するために存在すべき化合物の量を指す。追加の例において、化合物は、ｈＥＳＣの培養培地中に存在してもよく、又はいずれかの増殖ステージの間にｈＥＳＣに添加されてもよい。いくつかの実施形態において、化合物、薬剤、小分子、又は増殖因子を使用して、胚体内胚葉細胞、前腸細胞、膵臓前腸細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞を含む膵内胚葉系統細胞が産生される。ある特定の例において、肝細胞は、あらゆる分化の前に又は分化の第１のステージ中に、化合物、薬剤、小分子、又は増殖因子に曝露されてもよく、一方で他の例においては、肝細胞は、例えば胚体内胚葉などの中間の細胞型にまず分化し、次に化合物、薬剤、小分子、又は増殖因子に曝露されてもよい。
【００６６】
本発明の「化合物」、「小分子化合物」、又はそれらの等価物は、本明細書に開示される一般処方（例えば、表ＸＩ）に包含される化合物を指し、その構造が本明細書に開示される処方内の任意の特定の化合物又はその類似体を含む。本発明の化合物は、それらの化学構造又は化学名のいずれかによって特定され得る。化学構造及び化学名が一致しない場合は、化学構造がその化合物の独自性を決定する。本発明の化合物は、１つ又は２つ以上のキラル中心又は二重結合を含んでもよいため、立体異性体、例えば、二重結合異性体（すなわち、幾何異性体）、鏡像異性体、又はジアステレオマーとして存在してもよい。したがって、本明細書に示される化学構造は、例示される化合物の全ての可能性のある鏡像異性体及び立体異性体を包含し、これには、立体異性体として純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋な、鏡像異性体として純粋な、又はジアステレオマーとして純粋な）、並びに鏡像異性体及び立体異性体混合物が含まれる。鏡像異性体及び立体異性体混合物は、当業者に周知の分離技法又はキラル合成技法を使用して、それらの構成鏡像異性体又は立体異性体成分に分解することができる。本発明の化合物はまた、１つ又は２つ以上の原子が従来天然に見出された原子質量とは異なる原子質量を有する、同位体標識された化合物を含む。本発明の化合物に組み込まれ得る同位体の例には、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌが挙げられるが、これらに限定されない。更に、当然のことながら、本発明の化合物の部分構造が例示されるとき、括弧はその部分構造の分子の残りの部分への結合点を示す。
【００６７】
Ｂ．多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、指定されたＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１抗体の１つ又は２つ以上を発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５〜１１４７）。多能性幹細胞のインビトロの分化は、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１発現の喪失をもたらす。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって記載されるように、商標ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｒｅｄを付して販売されているアルカリホスファターゼ基質キットで発生させることによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有する。未分化の多能性幹細胞はまた、典型的には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）によって検出されるように、ＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
【００６８】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の３胚葉層の全ての細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（「ＳＣＩＤ」）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれらの３胚葉由来の細胞型の根拠について組織学的に調べることによって確認され得る。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉層に関連したマーカーの存在に対して評価することにより決定することができる。
【００６９】
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド技法を使用して核型を決定し、次いで確立された、対応する霊長類種の核型と比較し得る。細胞は「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体が全て揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。
【００７０】
Ｃ．多能性幹細胞の源
本発明の方法では、任意の多能性幹細胞が使用され得る。使用され得る多能性幹細胞の例示の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織を含む、多能性細胞の樹立株が挙げられる。限定されない例は、ヒト胚性幹細胞（「ｈＥＳＣ」）又はヒト胚生殖細胞の樹立株であり、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、及びＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｏｔｅｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）などである。
【００７１】
フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２など多数の多能性に関係する転写因子の強制発現を使用して、成体体細胞に由来する誘導性多能性細胞（ＩＰＳ）又は再プログラム化された多能性細胞（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１１，１２：１６５〜１８５、ＩＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３〜６７６も参照されたい）も使用することもできる。本発明の方法で使用されるヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎらによって記載されるようにも調製され得る（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７；Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １９９８，３８：１３３〜１６５；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４４〜７８４８）。ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ．）などの変異体ヒト胚性幹細胞株、又はＴａｋａｈａｓｈｉｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３１：１〜１２（２００７）に開示されている細胞などのヒト体細胞に由来する細胞を使用し得る。ある特定の実施形態において、本発明での使用に好適な多能性幹細胞は、Ｌｉら（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：１６〜１９，２００９）、Ｍａｈｅｒａｌｉら（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １：５５〜７０，２００７）、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：２３０〜２４０）、Ｎａｋａｇａｗａら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：１０１〜１０６，２００８）、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（Ｃｅｌｌ  １３１：８６１〜８７２，２００７）、及び米国特許出願公開第２０１１／０１０４８０５号に記載されている方法に従って誘導され得る。ある特定の実施形態において、本発明での使用に好適な多能性幹細胞は、「ナイーブ」であると見なされ、以下に記載の方法、すなわち、Ｇａｆｎｉら（Ｎａｔｕｒｅ，５０４：２８２，２０１３）、及びＷａｒｅら（ＰＮＡＳ，１１１：４４８４〜４４８９，２０１４）の方法に従って誘導し得る。これらの参考文献、特許、及び特許出願の全ては、とりわけそれらが多能性細胞の単離、培養、増殖、及び分化に関するため、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００７２】
多能性幹細胞の他の供給源は、誘導された多能性幹細胞を含む（ＩＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３〜６７６）。好適な細胞の更に他の供給源には、ヒト臍帯組織由来細胞、ヒト羊水由来細胞、ヒト胎盤由来細胞、及びヒト単為生殖生物が挙げられる。一実施形態において、臍帯組織由来細胞は、米国特許第７，５１０，８７３号に記載の方法によって得てもよい。別の実施形態において、胎盤組織由来細胞は、米国特許出願公開第２００５／００５８６３１号の方法を使用して得てもよい。別の実施形態において、羊水由来細胞は、米国特許出願公開第２００７／０１２２９０３号に記載の方法を使用して得てもよい」。これらの特許出願の各々の開示は、それが細胞の単離及び特徴付けに関するため、その全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、多能性幹細胞は、非胎生起源であり得る。
【００７３】
Ｄ．多能性幹細胞の増殖及び培養
多能性幹細胞を増殖及び培養する多くの異なる既知の方法が、特許請求される発明で使用されてもよい。例えば、多能性幹細胞は、好適な培養基質上で平板培養されてもよい。一実施形態において、好適な培養基質は、基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るものなどの細胞外マトリックス成分である。好適な培養基質は、商標ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を付して販売されている再構成された基底膜である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ  Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【００７４】
当該技術分野において既知の他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は、代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパリンサルフェート、及び同様のものを、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【００７５】
多能性幹細胞は、好適な分布で、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に平板培養されてもよい。これらの特徴の全ては、播種分布に細心の注意を払うことで利益を得られるものであり、当業者は容易に決定することができる。好適な培養培地は、以下の成分、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにより商標ＧＩＢＣＯ（登録商標）（カタログ番号１１９６５−０９２）を付して販売されているダルベッコ改変イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより商標ＧＩＢＣＯ（登録商標）（カタログ番号１０８２９−０１８）を付して販売されているノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（「ＫＯ  ＤＭＥＭ」）、ハムＦ１２／５０％  ＤＭＥＭ基本培地、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより商標ＧＩＢＣＯ（登録商標）（カタログ番号２５０３０−０８１）を付して販売されている２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより商標ＧＩＢＣＯ（登録商標）（カタログ番号１１１４０−０５０）を付して販売されている非必須アミノ酸溶液、β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（カタログ番号Ｍ７５２２）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより商標ＧＩＢＣＯ（登録商標）（カタログ番号１３２５６−０２９）を付して販売されているヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」）から作製され得る。ヒト胚性幹細胞の大規模増殖及び制御された分化プロセスは、懸濁バイオリアクターを使用しても達成することができる。
【００７６】
Ｅ．多能性幹細胞の分化
多能性細胞が機能的β細胞に向かって分化するとき、それらは、様々なステージを通じて分化し、各々が特定のマーカーの存在又は非存在によって特徴付けられ得る。これらのステージへの細胞の分化は、培養培地に添加されるある特定の因子の存在及び欠失を含む、特異的培養条件によって達成される。一般に、この分化は、多能性幹細胞の、胚体内胚葉系統及び胚体内胚葉細胞への分化を必要とし得る。次いでこれらの細胞は、初期腸管細胞へと更に分化され得、次いで順次前腸内胚葉細胞へと分化され得る。前腸内胚葉細胞は、膵内胚葉細胞へと分化され得、次いで膵内分泌前駆細胞又は膵内胚葉／膵内分泌前駆細胞へと更に分化され得る。これらの細胞は、膵臓ホルモン産生又は分泌細胞へと分化され得る。この出願は、好ましくは培地で部分的に充填された培養容器内に存在する空気−液体界面又は懸濁液中で細胞を培養することによって、特にステージ５〜７のうちの１つ又は２つ以上において空気−液体界面又は懸濁液中で細胞を培養することによって、多能性幹細胞の膵内分泌細胞に向けた段階的分化を提供する。
【００７７】
甲状腺ホルモントリヨードチロニン（「Ｔ３」）及びチロキシン（「Ｔ４」）、並びにそれらの類似体のうちの１つ又は２つ以上が、単独で又はＡＬＫ−５阻害剤との更なる組み合わせで、分化のステージ１〜７のうちの１つ又は２つ以上で、好ましくはステージ５〜７の各々で培養する細胞内で使用され得る。代替的に、ＡＬＫ−５阻害剤は、分化の１つ又は２つ以上のステージにおいて、しかし好ましくはステージ５〜７の各々で、より好ましくはステージ５〜６の各々で、単独で使用され得る。より好ましくは、甲状腺ホルモン又はそれらの類似体及びＡＬＫ５阻害剤のうちの１つ又は２つ以上は、１つ又は２つ以上の分化ステージにおいて、好ましくはステージ５〜７の各々で、より好ましくはステージ５〜６の各々で使用される。好適な甲状腺ホルモン類似体には、制限なしに、ＧＣ−１（Ｓｏｂｅｒｔｉｒｏｍｅ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手可能）、３，５−ジヨードチロプロピオン酸（「ＤＩＰＴＡ」）、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００８，１１１：２６２〜２６７及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ  ２００３，１００：１００６７〜１００７２に論じられているＫＢ−１４１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ  ２００７，１０４：１５４９０〜１５４９５に論じられているＭＢ０７３４４、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，Ｍａｙ  ２００９，５０：９３８及びＥｎｄｏｃｒ．Ｐｒａｃｔ．２０１２，１８（６）：９５４〜９６４に論じられているＴ０６８１が挙げられ得る（これらの開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。有用なＡＬＫ５阻害剤としては、好ましいＡＬＫ５阻害剤でもある、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ＡＬＫ５ｉ（Ａｘｘｏｒａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＳＤ２０８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＩＴＤ−１（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＹ２１０９７６１（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａ８３−０１（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＹ２１５７２９９（Ｘｃｅｓｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｇｉｂｓｔｏｗｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及びＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が挙げられる。
【００７８】
発明の追加の好ましい実施形態において、これらの方法は、ビタミンＥ、アセチルシステイン、ビタミンＣ、抗酸化剤補助剤（カタログ番号Ａ１３４５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣ  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、グルタチオン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、及び同様のものなどの抗酸化剤、及びそれらの組み合わせの一方又は両方を含む分化培地を用いて、１つ又は２つ以上のステージで細胞を処理すること、しかし好ましくは細胞をステージ７中に処理することを含む。更により好ましい実施形態において、ステージ６を実行する際に、ガンマセクレターゼ阻害剤が使用され、これはガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸＩ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ガンマセクレターゼ阻害剤ＸＶＩ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエチルエステル（「ＤＡＰＴ」）（カタログ番号２６３４、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、及び同様のもの、並びにそれらの組み合わせとすることができる。ガンマセクレターゼ阻害剤の有用な量は、約５０ｎＭ〜５０００ｎＭ、好ましくは約５０ｎＭ〜５００ｎＭであり得る。抗酸化剤の量は、約０．１〜１００μＭ、代替的には約０．１〜２０μＭ、及び好ましくは約１〜１０μＭであり得る。代替的に、抗酸化剤の有用な量は、約１００ｎＭ〜５ｍＭ、約１０００ｎＭ〜２ｍＭ、及び好ましくは約０．１〜１ｍＭであり得る。
【００７９】
本発明の実施形態において、ある特定の小分子は、１つ又は２つ以上の分化のステージの培地において、好ましくはステージ６及び７の一方又は両方で使用される。対象とする小分子は、オーロラキナーゼ、ｐ９０リボソームＳ６キナーゼ、又はメチルトランスフェラーゼ受容体ＤＯＴ１Ｌを阻害することが可能なものであり、好ましくは、培養された細胞の酸化ストレスを低減する抗酸化剤と共に使用される。特に対象とするものはオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ及びＲＳＫ阻害剤ＩＩである。オーロラキナーゼ阻害剤ＩＩは、（４−（４’−ベンズアミドアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン）の名称で知られる細胞透過性化合物である。ＲＳＫ阻害剤ＩＩは、ジヒドロプテリジノン２−（３，５−ジフルオロ−４−ヒドロキシ−アニリノ）−８−イソペンチル−５，７−ジメチル−７Ｈ−プテリジン−６−オンのラセミ混合物である。対象とする他のオーロラキナーゼ阻害剤には、ＺＭ４４７４３９及びＰＦ０３８１４７３５が挙げられる。ＤＯＴ１Ｌのタンパク質メチルトランスフェラーゼ受容体阻害剤、特にＥＰＺ−５６７６も対象とする。ＥＰＺ−５６７６は、タンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１ＬのＳ−アデノシルメチオニン（「ＳＡＭ」）阻害剤である。この化合物は、細胞増殖を阻害することが示されているＤＯＴ１Ｌ（テロメアサイレンシング−１様のかく乱物質（disruptor of telomere silencing 1-like））メチルトランスフェラーゼ阻害剤である。これは、化学名９Ｈ−プリン−６−アミン、９−［５−デオキシ−５−［［ｃｉｓ−３−［２−［６−（１，１−ジメチルエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］エチル］シクロブチル］（１−メチルエチル）アミノ］−β−Ｄ−リボフラノシル］−、及び（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−５−［［［３−［２−（６−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）エチル］シクロブチル］−プロパン−２−イルアミノ］メチル］オキソラン−３，４−ジオールで知られている。対象とする更なる阻害剤は、５−アザシチジン（「ＡＺＴ」）などのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ピロキサミド及びＣＩ９９４などのヒストンデアセチラーゼ阻害剤である。対象とする追加の小分子には、ＵＮＣ０６３８、ＵＮＣ０６４６、ＵＮＣ０６４２、及びＡ３６６（Ｇ９ａ及びＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＴＣ−Ｅ５００３（ＰＲＭＴ１アルギニンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＳＢ７４７６５１Ａジヒドロクロリド（ＭＳＫ１阻害剤、他のＡＧＣ群のキナーゼも阻害する）、ＰＦＩ１（ＢＥＴブロモドメイン阻害剤）、ＬＹ３０３５１１（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、及びＢＲＤ４阻害剤）、ＭＳ４３６（ＢＲＤ４ブロモドメイン阻害剤）、並びにＭＣ１５６８（クラスＩＩのＨＤＡＣを選択的に阻害する）、並びに３−デアザネプラノシンＡ（「ＤＥＺＡ」）が挙げられる。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態において、小分子は、ステージ６及び７のうちの１つ又は２つ以上の培地中で、より好ましくはステージ７の培地中で使用される。有用な小分子の量は、成熟マーカーの最良の発現を示す量、及びどの量が毒性作用をもたらさないかを選択することによって決定され得る。典型的に、有用な量は、約５００ｎＭ〜１０μＭ、代替的には約５００ｎＭ〜５μＭ、及び好ましくは約５００ｎＭ〜２μＭとなる。
【００８１】
多能性細胞の、成熟した表現型を有する膵内分泌細胞（機能的ベータ細胞）に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
多能性幹細胞の特性は当業者には周知であり、多能性幹細胞の更なる特性が引き続き同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１のうちの１つ又は２つ以上の発現が挙げられる。これらは、ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能であり得る。
【００８２】
例示的な多能性幹細胞として、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２が挙げられる。また、多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も好適である。
【００８３】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーの少なくとも１つを発現している細胞は本発明での使用に好適である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。代替の態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。代替の態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００８４】
膵内胚葉系統に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞もまた、本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵内胚葉細胞であり、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現は、ＣＤＸ２及びＳＯＸ２の発現より実質的に高い。ある特定の実施形態において、ＦＡＣＳにより測定して、細胞の３０％超が、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現し、細胞の３０％未満が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を発現する。ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２の発現より少なくとも２倍高い細胞が特に有用である。
【００８５】
膵内分泌系統に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞もまた、本発明における使用に更に適している。本発明の一態様において、膵内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、又は膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な膵臓ホルモン発現細胞であり得る。好ましい実施形態において、膵内分泌細胞は、インスリン産生β細胞である。
【００８６】
本発明のある特定の実施形態において、機能的ベータ細胞（成熟した表現型の膵内分泌ベータ細胞）に特徴的なマーカーを発現する細胞に到達するために、多能性幹細胞で開始するプロトコルが用いられる。このプロトコルは、以下を含む。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
ある特定の実施形態において、本発明は、多能性幹細胞（例えば、ステージ１前の細胞）をステージ７細胞に分化させることを包含するが、本発明はまた、他のステージの細胞をステージ７に向かって分化させることも包含する。とりわけ、本発明は、ステージ４細胞のステージ７細胞への分化を包含する。本プロセスは別個のステージで記載されているが、分化プロセスを通じた細胞の処理並びに進行は、連続的又は継続的であり得る。多能性幹細胞の、ステージ６又はステージ７細胞への分化は、懸濁培養において行うことができる。
【００８９】
分化効率は、被処理細胞集団を、対象とする分化細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤、例えば抗体に曝露することにより決定されてもよい。培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらの方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、インシチュハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．２００１  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）、及びイムノアッセイ、例えば、材料切片の免疫組織化学的分析、ウェスタンブロット、並びに無傷細胞内でアクセス可能なマーカーの場合、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照されたい）が挙げられる。
【００９０】
分化細胞は、更に精製されてもよい。例えば、多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、被処理細胞集団を、精製される分化細胞により特徴的に発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより、分化細胞を精製してもよい。ある特定の実施形態において、分化細胞は精製されない。
【００９１】
細胞分化に望ましい十分な量のビタミン、無機物、塩、グルコース、アミノ酸、及び担体タンパク質を含有する任意の好適な増殖培地は、様々なステージ１〜７に使用され得る。好ましくは、以下、すなわち、ステージ１−ＭＣＤＢ−１３１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手可能）又はＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ステージ２−ＭＣＤＢ−１３１又はダルベッコ改変イーグル培地Ｆ１２（「ＤＭＥＭ−Ｆ１２」）、ステージ３〜５−ＭＣＤＢ−１３１、ＢＬＡＲ（表１及び表ＩＶ）、又はＤＭＥＭ、並びにステージ６及び７−ＢＬＡＲ又はＣＭＲＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が使用される。好ましくは、培地のグルコース濃度は、ステージ１〜４については約１０ｍＭに保持され、又はより好ましくはそれより低く保持され、ステージ５〜７については約１０ｍＭより高く保持される。好ましくは、ステージ７については、培地は、十分な量のビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素、例えば、製剤Ｉを含有する。
【００９２】
ステージ１：多能性細胞の、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
多能性幹細胞は、当技術分野において既知の方法により、又は本発明で提案される方法により、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させるために有用であると報告されている方法は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１５３４〜１５４１（２００５）、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，１６５１〜１６６２（２００４）、ＭｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，２９〜３８（２００７）、及びＤ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。追加の好適な分化方法は、米国特許出願公開第２００７／０２５４３５９号、米国特許出願公開第２００９／０１７０１９８号、米国特許出願公開第２０１１／００９１９７１号、米国特許出願公開第２０１０／００１５７１１号、米国特許出願公開第２０１２／０１９０１１１号、米国特許出願公開第２０１２／０１９０１１２号、及び米国特許出願公開第２０１２／０１９６３６５号に開示されている。これらの開示は、それらが多能性幹細胞の胚体内胚葉細胞への分化に関するため、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００９３】
一実施形態において、多能性細胞は、好適な増殖培地、好ましくはＭＣＤＢ−１３１又はＲＰＭＩで処理される。培地は、好ましくは増殖分化因子、例えば増殖分化因子８（「ＧＤＦ８」）、及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（「ＧＳＫ３β」）阻害剤、例えば米国特許出願公開第２０１０／００１５７１１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される環式アニリン−ピリジントリアジン化合物が補充され、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を誘導する。好ましいＧＳＫ３β阻害剤は、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン（「ＭＣＸ化合物」）である。処理は、多能性幹細胞を、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約７５ｎｇ／ｍＬ〜約１２５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８が補充された培地と接触させることを必要とし得る。この処理はまた、細胞を、約０．１〜約５μＭ、代替的に約０．５〜約２．５μＭ、好ましくは約１μＭのＭＣＸ化合物と接触させることも必要とし得る。多能性細胞は、約２〜５日間、好ましくは約２〜３日間にわたって培養され、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化を促進してもよい。
【００９４】
好ましい実施形態において、細胞は、ＧＤＦ８及びＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８及びより低い濃度のＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８の存在下、ＭＣＸ化合物の非存在下で１日培養される。とりわけ、細胞は、ＧＤＦ８及び約１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８及び約０．１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８の存在下、ＭＣＸ化合物の非存在下で１日培養される。代替的に、細胞は、ＧＤＦ８及び約１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養され、続いてＧＤＦ８及び約０．１μＭのＭＣＸ化合物の存在下で１日培養されてもよい。
【００９５】
代替的に、多能性幹細胞は、血清の非存在下、アクチビンＡを含有する培地中で培養され得、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清を用いて培養した後、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されるように、細胞を異なる濃度のアクチビンＡ及び血清を用いて培養する。別の代替形態では、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＤ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５に開示されるように、細胞を血清と共にアクチビンＡを用いて培養することによって胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させてもよい。多能性幹細胞はまた、アクチビンＡ及びＷＮＴリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＷＮＴリガンドを除去し、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されるように、細胞を血清と共にアクチビンＡを用いて培養することによっても胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させてもよい。
【００９６】
本発明の一実施形態において、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａで処理され、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成をもたらす。処理は、多能性幹細胞を、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約７５ｎｇ／ｍＬ〜約１２５ｎｇ／ｍＬ、代替的に約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと接触させることを必要とし得る。この処理はまた、細胞を、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約１５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａと接触させることを必要とし得る。多能性細胞は、約３日間培養され、胚体内胚葉細胞に到達し得る。一実施形態において、細胞は、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａの存在下で１日培養され、続いてアクチビンＡの存在下で（ＷＮＴ３Ａは存在しない）残りを培養する。
【００９７】
胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成を検出するために、特定のプロトコルの実行前後に細胞をマーカーの存在について試験してもよい。多能性幹細胞は、一般にかかるマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞が胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現し始めた際に検出され得る。
【００９８】
ステージ２：胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＭＣＤＢ−１３１又はＤＭＥＭ−Ｆ１２などの増殖培地中で、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化され得る。一実施形態において、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０を含有する培地を用いて培養して、細胞を分化させることを含む。例えば、細胞培養物は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約７５ｎｇ／ｍＬ、代替的に約２５ｎｇ／ｍＬ〜約７５ｎｇ／ｍＬ、更に代替的に約３０ｎｇ／ｍＬ〜約６０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約５０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、より好ましくはＦＧＦ７、及び最も好ましくは約２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を含み得る。細胞は、これらの条件下で約２〜３日間、好ましくは約２日間培養され得る。
【００９９】
別の実施形態において、腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、線維芽細胞増殖因子、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、及びアスコルビン酸（ビタミンＣ）を用いて培養することを含む。培養培地は、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭのアスコルビン酸、代替的に約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭのアスコルビン酸、代替的に約０．２５ｍＭのアスコルビン酸を含み得る。細胞培養物はまた、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約３５ｎｇ／ｍＬ、代替的に約１５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約２５ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、より好ましくはＦＧＦ７も含み得る。例えば、細胞培養物は、約０．２５ｍＭのアスコルビン酸及び約２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を含み得る。一実施形態において、ステージ１細胞は、ＦＧＦ７及びアスコルビン酸で２日間処理される。
【０１００】
ステージ３：初期腸管細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
ステージ２から生じる初期腸管細胞は、これらの細胞を、ＭＣＤＢ−１３１、ＤＭＥＭなどの増殖培地、又はＢＬＡＲなどのカスタム培地（表Ｉ）中で培養することによってステージ３細胞、つまり前腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化し得る。培地は、（ｉ）線維芽細胞増殖因子、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、及びより好ましくはＦＧＦ７、（ｉｉ）レチノイン酸（「ＲＡ」）、（ｉｉｉ）１−ピペラジンアミン、Ｎ−［（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレン］−４−（フェニルメチル）−又は（（Ｅ）−４−ベンキシル−Ｎ−（（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル），エチレン−ピペラジン−１−アミン）である、ソニックヘッジホッグ（「ＳＨＨ」）シグナル伝達経路アンタゴニスト（例えばスムーズンド（Smoothened）アンタゴニスト（「ＳＡＮＴ−１」）、２−メトキシエチル１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−４−（３ヒドロキシフェニル）−７−（２−メトキシフェニル）−２−メチル−５−オキソ−３−キノリンカルボキシレートである、ＨＰＩ−１、及び好ましくはＳＡＮＴ−１、（ｉｖ）タンパク質キナーゼＣ（「ＰＫＣ」）活性因子、例えば（（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエンオイルアミノ）ベンゾラクタム）（「ＴＰＢ」）、ホルボール−１２，１３−ジブチレート（「ＰＤＢｕ」）、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（「ＰＭＡ」）又はインドラクタムＶ（「ＩＬＶ」）及び好ましくはＴＰＢ、（ｖ）骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）阻害剤、例えばＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、又はコーディン、及び好ましくはＬＤＮ−１９３１８９、並びに（ｖｉ）アスコルビン酸が補充され得る。代替的に、スムーズンド（「ＳＭＯ」）受容体阻害剤（例えば、ＭＲＴ１０（Ｎ［［［３−ベンゾイルアミノ）フェニル］アミノ］チオキソメチル］−３，４，５−トリメトキシベンズアミド））又はシクロパミンもまた使用されてもよい。例えば、細胞培養物は、約１００ｎＭ〜約５００ｎＭ、代替的に約１００ｎＭ〜約４００ｎＭ、代替的に約２００ｎＭのＰＫＣ活性因子を含み得る。細胞は、これらの増殖因子、小分子アゴニスト、及びアンタゴニストの存在下で約２〜４日間、好ましくは約２〜３日間、より好ましくは約２日間培養され得る。
【０１０１】
代替的に、ステージ３細胞は、ＳＭＯ受容体阻害剤、ＳＡＮＴ−１、レチノイン酸、及びノギンが補充された培養培地中でこれらの細胞を培養することによってステージ２細胞から得られてもよい。細胞は、約２〜４日間、好ましくは約２日間培養され得る。
【０１０２】
一実施形態において、培地は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約３５ｎｇ／ｍＬ、代替的に約１５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬ、代替的に約２５ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子、好ましくはＦＧＦ７又はＦＧＦ１０、より好ましくはＦＧＦ７、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭのアスコルビン酸、代替的に約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭ、代替的に約０．２５ｍＭのアスコルビン酸、約０．１μＭ〜約０．４μＭのＳＡＮＴ−１、約１００〜約３００ｎＭのＴＰＢ、並びに約５０ｎＭ〜約２００ｎＭ、及び約１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９が補充される。別の実施形態において、培地は、約２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７、約１μＭのレチノイン酸、約０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、約２００ｎＭのＴＰＢ、約１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、及び約０．２５ｍＭのアスコルビン酸が補充される。
【０１０３】
一実施形態において、培地は、約０．１μＭ〜約０．３μＭのＳＡＮＴ−１、約０．５μＭ〜約３μＭのレチノイン酸、及び約７５ｎｇ／ｍＬ〜約１２５ｎｇ／ｍＬのノギンが補充される。
【０１０４】
ステージ４：前腸内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化。
一実施形態において、本発明の方法は、ステージ３細胞を、任意の好適な増殖培地であり得、好ましくはＭＣＤＢ−１３１、ＤＭＥＭ、又はＢＬＡＲなどのカスタム培地（表Ｉ）である分化培地で処理することによる、ステージ４細胞の誘導を含む。培地には、以下、すなわち、（ａ）ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩＩ、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＳＤ−２０８、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＡＬＫ５ｉ及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩからなる群から選択されるＡＬＫ５阻害剤、（ｂ）Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３の類似体、Ｔ４の類似体、及びそれらの混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、（ｃ）ＳＡＮＴ−１又はＨＩＰ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、（ｄ）ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、又はコーディンから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤、（ｅ）ＴＰＢ、ＰＰＢｕ、ＰＭＡ、及びＩＬＶから選択されるＰＫＣ活性因子、（ｆ）ＦＧＦ−７又はＦＧＦ−１０から選択される線維芽細胞増殖因子、（ｇ）レチノイン酸、並びに（ｈ）アスコルビン酸のうちの１つ又は２つ以上が補充されてもよい。例えば、ＭＣＤＢ１３１又は好ましくはＢＬＡＲなどの増殖培地は、ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト（ＳＡＮＴ−１若しくはＨＰＩ−１など）、ＢＭＰ阻害剤（ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、若しくはコーディンなど）、アスコルビン酸、及びＰＫＣ活性因子（ＴＰＢ、ＰＤＢｕ、ＰＭＡ、若しくはＩＬＶなど）が補充され、有用な分化培地を提供し得る。
【０１０５】
ステージ３細胞を、こうした培地中で約２〜４日間、好ましくは約２〜３日間、より好ましくは約３日間培養することは、通常、ステージ３細胞をステージ４細胞へと分化させるのに十分である。別の実施形態において、培地には、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストが補充され得る。好ましい実施形態において、ステージ３細胞は、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約１００ｎＭ  ＲＡ、約２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、約１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び約２００ｎＭのＴＰＢが補充された培地で３日間処理され得る。
【０１０６】
ステージ４において、細胞は、ステージ全体の間、又は約２〜３日間の平板培養後のいずれかに、空気−液体界面で培養され得る。具体的に、本発明は、空気−液体界面で多能性幹細胞から誘導された細胞を分化させるためのインビトロ細胞培養を提供し、これは、（ａ）培養容器と、（ｂ）容器内の、容器の容積の一部分のみを充填するのに十分な体積の増殖培地と、（ｃ）培地に隣接する容器の一部分を充填する容器内の空気と、（ｄ）培地と空気との間の界面に位置する多孔性基質と、（ｅ）培地が細胞の表面の一部分のみに接触するように、基質の表面上に配置された多能性幹細胞から誘導される細胞と、を含む。代替的に、ステージ４は、平板培養中で全体的に行われ得る。
【０１０７】
ステージ４において代替的に、約２〜３日間の平板培養後、細胞は細胞クラスターへと凝集され得る。具体的には、本発明は、細胞クラスターなどの凝集した細胞として調製された細胞を分化させるためのインビトロ細胞培養を提供し、これは、（ａ）細胞の凝集又は細胞クラスターの形成を促進する培養容器と、（ｂ）容器内のある体積の増殖培地（培養培地）と、（ｃ）細胞が誘導されて凝集しクラスターを形成するように、容器内に配置された多能性幹細胞に由来する細胞と、を含む。実施形態において、容器は、ウェル又はマイクロウェルを有するプレート、例えば、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレート（マイクロウェルプレート、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）である。具体的には、細胞クラスターは、例えば、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートを使用して、サイズ及び形状が均一な細胞の凝集体を形成させるためにマイクロウェルを有するプレートにおいて調製された。実施形態において、凝集した細胞又は細胞クラスターを調製するために、ウェル又はマイクロウェルあたり約５００〜２０００細胞が播種される。具体的には、ウェル又はマイクロウェルあたり約５０〜約３０００細胞が播種され、好ましくは約５０〜約２０００細胞、約５０〜１０００細胞、約５０〜約９００細胞、約５０〜約８００細胞、約１００〜約８００細胞、約２５０〜約８００細胞、又は約５００〜約８００細胞が播種される。より好ましくは、ウェル又はマイクロウェルあたり約７００〜約８００細胞が播種される。
【０１０８】
更なる実施形態において、細胞を凝集させる方法によって形成された細胞クラスターは、懸濁液中で更に培養されてもよく（懸濁培養）、これは、凝集した細胞又は細胞クラスターをウェル又はマイクロウェルから取り除くこと、及び凝集した細胞／細胞クラスターを懸濁培養容器に播種することを含む。実施形態において、凝集した細胞／細胞クラスターは、約０．７５×１０６細胞／ｍＬ〜約２．０×１０６細胞／ｍＬ、好ましくは約１×１０６細胞／ｍＬ〜約２．０×１０６細胞／ｍＬ、より好ましくは約１．５×１０６細胞／ｍＬ〜約２．０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で懸濁培養中に播種される。当業者に既知の任意の懸濁培養系が、凝集した細胞の懸濁クラスター化に有用であり得る。とりわけ、懸濁培養系は、凝集した細胞又は細胞クラスターを、スピナーフラスコ又はスピナーホイールフラスコなどのフラスコ中に播種することを含み得る。
【０１０９】
更なる実施形態において、ステージ４の完了時（２〜３日間の培養後）の細胞は、Ｒｈｏ関連キナーゼ（「ＲＯＣＫ」）阻害剤、例えば、Ｙ２７６３２（（１Ｒ，４ｒ）−４−（（Ｒ）−１−アミノエチル）−Ｎ−（ピリジン−４−イル）シクロヘキサンカルボキシアミド）、ＧＳＫ２６９９６２（Ｎ−［３−［［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ］フェニル］−４−［２−（４−モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド）、Ｈ１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン、２ＨＣｌ）、及びＳＲ３６７７（Ｎ−［２−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］−４−（１Ｈ−ピラゾール−４−イル）フェニル−２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−２−カルボキシアミドジヒドロクロリド）で処理され得る。ある特定の実施形態において、約１〜２０μＭ、約１〜１５μＭ、約１〜１０μＭ、又は約１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。
【０１１０】
本明細書の発明のある特定の実施形態において、後期ステージ４細胞、例えば、付着性平板培養中で１〜２日間又は１〜３日間培養された細胞のみが、ステージ４の完了のために、続けて空気−液体界面で培養されてもよく、又は細胞クラスターなどの凝集した細胞に培養されてもよい。本明細書の発明の一実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤で処理された後期ステージ４細胞のみが、空気−液体界面で培養される。実施形態において、０．５〜約０．７５×１０５細胞／マイクロリットルが播種され、空気−液体界面で培養される。代替的に、約２〜６×１０６細胞が播種され、空気−液体界面で培養される。別の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤で処理された後期ステージ４細胞は、培養されて、細胞を凝集させ、細胞クラスターなどの凝集した細胞を形成する。実施形態において、細胞は、細胞の凝集又は細胞クラスター（細胞の三次元の凝集体）を促進する容器中に播種される。いくつかの実施形態において、容器は、ウェル又はマイクロウェルを有するプレートである。具体的には、細胞クラスターは、例えば、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレート（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、サイズ及び形状が均一な細胞の凝集体を形成させるためにマイクロウェルを有するプレートにおいて調製される。実施形態において、凝集した細胞又は細胞クラスターを調製するために、ウェル又はマイクロウェルあたり約５０〜３０００細胞が播種される。具体的には、ウェル又はマイクロウェルあたり約５０〜約３０００細胞が播種され、好ましくは約５０〜約２０００細胞、約５０〜１０００細胞、５０〜９００細胞、５０〜８００細胞、１００〜８００細胞、２５０〜８００細胞、又は約５００〜約８００細胞が播種される。より好ましくは、ウェル又はマイクロウェルあたり約７００〜８００細胞が播種される。別の実施形態では、凝集した細胞又は細胞クラスターは懸濁液中で更に培養される。ある特定の実施形態において、平板培養中の付着性細胞は、空気−液体界面で培養する前、又は細胞クラスターの形成など細胞を凝集させるために培養する前に、ＴｒｙｐＬＥ（商標）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、又はＤｉｓｐａｓｅ（商標）などのタンパク質分解及びコラーゲン分解酵素を含有する溶液などの細胞脱離溶液で処理され得る。
【０１１１】
代替実施形態において、ステージ４細胞は、ＡＬＫ５阻害剤、ノギン、及びＰＫＣ活性因子、例えばＴＰＢが補充された増殖培地を含む分化培地でステージ３細胞を処理することによって、ステージ３細胞から得られ得る。ある特定の実施形態において、培地は、約０．１μＭ  ＡＬＫ５阻害剤、約１００ｎｇ／ｍＬのノギン、及び約５００ｎＭ  ＴＰＢが補充され得る。細胞培養は、単層形式であり得る。処理は、合計約３日間にわたって継続し得る。ある特定の実施形態において、細胞は、２日間処理された後、最終日にタンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、又はそれらの両方で処理されて、単細胞懸濁液を生成し得る。結果として生じる細胞は、空気−液体界面で播種されるか、又は凝集した細胞若しくは細胞クラスターを生成するように播種され得る。単細胞は、凝集して約１００マイクロメートル未満の直径を有する細胞クラスターとなった後、ＡＬＫ５阻害剤及びＬＤＮ−１９３１８９の存在下で培養される。ある特定の実施形態において、約１００マイクロメートル未満の直径を有する細胞クラスターは、約２００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤及び約１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９が補充された培地中で培養され得る。代替実施形態において、ステージ４細胞を空気−液体界面又は懸濁液中で培養することは、内分泌関連マーカーと共に、膵内胚葉マーカーを著しく増強することができる。
【０１１２】
ステージ５：膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化。
一実施形態において、本発明の方法は、ステージ４細胞を、任意の好適な増殖培地であり得、好ましくはＭＣＤＢ−１３１、ＤＭＥＭ、又はＢＬＡＲなどのカスタム培地（表Ｉ）である分化培地で処理することによる、ステージ５細胞の生成を含む。培地には、以下、すなわち、（ａ）ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩＩ、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＳＤ−２０８、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＡＬＫ５ｉ、及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩからなる群から選択されるＡＬＫ５阻害剤、（ｂ）Ｔ３、Ｔ４、Ｔ３の類似体、Ｔ４の類似体、及びそれらの混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、（ｃ）ＳＡＮＴ−１又はＨＩＰ−１から選択されるＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、（ｄ）ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、又はコーディンから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤、（ｅ）レチノイン酸、（ｆ）アスコルビン酸、（ｇ）ヘパリン、及び（ｈ）硫酸亜鉛のうちの１つ又は２つ以上が補充され得、細胞を、好ましくは空気−液体界面で約２〜４日間、好ましくは約３日間培養して、細胞をステージ５細胞へと分化させる。別の実施形態において、増殖培地はまた、ＳＭＯ阻害剤（ＭＲＴ１０又はシクロパミンなど）、及びＦＧＦ−７又はＦＧＦ−１０から選択される線維芽細胞増殖因子の一方又は両方が補充される。ステージ４細胞の処理は、約２〜４日間、好ましくは約３日間行われ、細胞をステージ５細胞へと分化させる。
【０１１３】
好ましい実施形態において、ステージ４細胞は、約０．１μＭ〜約０．４μＭのＳＡＮＴ−１及び好ましくは約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ  ＲＡ、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭアスコルビン酸、代替的に約０．２ｍＭ〜約０．４ｍＭ及び好ましくは約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約５０ｎＭ〜約２００ｎＭ及び好ましくは約１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約１μＭのＴ３、並びに約１００００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤、より好ましくはＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充された培地で細胞を処理することによって、ステージ５細胞へと分化される。更に別の実施形態において、細胞はまた、任意選択で好ましくは約１〜１５μＭ、代替的に約１〜１０μＭ、代替的に約５〜１０μＭ、好ましくは約１０μＭの硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）、及び約１〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１０μｇ／ｍＬのヘパリンでも処理される。ステージ４細胞の処理は、約２〜４日間、好ましくは約３日間行われ、細胞をステージ５細胞へと分化させる。
【０１１４】
また別の実施形態において、本発明の方法は、ステージ４細胞を、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤、又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＲＡ、ＢＭＰ受容体阻害剤、及びＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で処理することと、細胞を空気−液体界面で約３日間培養して、細胞をステージ５細胞へと分化させることとによって、ステージ５細胞を得ることを含む。代替実施形態において、培地は、ＲＡ、ＢＭＰ受容体阻害剤、及びＡＬＫ５阻害剤と共に、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。したがって、一実施形態において、ステージ４細胞は、ヘパリン、ＺｎＳＯ４、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＲＡ、ＬＤＮ−１９３１８９、及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充された培地でステージ４細胞を処理することによってステージ５細胞へと分化され得る。代替実施形態において、培地は、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。一実施形態において、ステージ４細胞は、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ  ＲＡ、約５０ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約１０ｎＭのＴ３、及び約１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で細胞を処理することによってステージ５細胞へと分化される。好適なＡＬＫ５阻害剤としては、ＳＤ−２０８、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩＩ、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ステージ４細胞の処理は、約２〜４日間、好ましくは約３日間行われ、細胞をステージ５細胞へと分化させる。
【０１１５】
好ましい実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。別の好ましい実施形態において、約１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが使用される。代替の好ましい実施形態において、ステージ４細胞は、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭのＲＡ、約１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、及び約１００００ｎＭ（１０ｍＭ）のＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充された培地で処理される。また別の代替実施形態において、本発明の方法は、ステージ４細胞を、ＳＭＯ阻害剤、又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＲＡ、及びＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で処理することと、細胞を好ましくは空気−液体界面又は懸濁液中で約２〜４日間、好ましくは約３日間培養して、細胞をステージ５細胞へと分化させることとを含む。代替実施形態において、培地は、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。一実施形態において、ステージ４細胞は、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ  ＲＡ、約５０ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約１μＭ  Ｔ３、及び約１０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で細胞を処理することによってステージ５細胞へと分化される。
【０１１６】
空気−液体界面で培養するために播種される細胞の量は異なり得る。例えば、細胞を空気−液体界面で培養するために、約０．５〜６×１０５細胞／μＬを含有する単細胞懸濁液の液滴が多孔性基質（例えば、フィルター）上に播種され得る。懸濁液は、約２×１０５細胞／μＬ〜約６×１０５細胞／μＬ、約４×１０５細胞／μＬ〜約６×１０５細胞／μＬ、約５×１０５細胞／μＬ〜約６×１０５細胞／μＬ、約５×１０５細胞／μＬ〜約６×１０５細胞／μＬ、約２×１０５細胞／μＬ〜約５×１０５細胞／μＬ、約２×１０５細胞／μＬ〜約４×１０５細胞／μＬ、又は約３×１０５細胞／μＬを含有し得、空気−液体界面に位置するフィルターなどの多孔性基質の上に播種され得る。一部の実施形態において、約０．５×１０５細胞／μＬ〜約０．７５×１０５細胞／μＬ、約０．６×１０５細胞／μＬ〜約０．７５×１０５細胞／μＬ、又は約０．５×１０５細胞／μＬ〜約０．６×１０５細胞／μＬを含有する単細胞懸濁液の液滴は、ＡＬＩで培養されるように多孔性支持体の上に播種される。
【０１１７】
懸濁培養について、マイクロウェルを有するプレートにおいて細胞クラスターが生成され、その後これが懸濁培養系に播種される。実施形態において、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートを使用して凝集が誘導され、ここで、凝集した細胞又は細胞クラスターを調製するために、ウェル又はマイクロウェルあたり約５０〜３０００細胞が播種される。具体的には、ウェル又はマイクロウェルあたり約５０〜約３０００細胞が播種され、好ましくは約５０〜約２０００細胞、約５０〜１０００細胞、約５０〜約９００細胞、約５０〜約８００細胞、約１００〜約８００細胞、約２５０〜約８００細胞、又は約５００〜約８００細胞が播種される。より好ましくは、ウェル又はマイクロウェルあたり約７００〜約８００細胞が播種される。凝集した細胞／細胞クラスターは、約０．７５×１０６細胞／ｍＬ〜約２．０×１０６細胞／ｍＬ、好ましくは約１×１０６細胞／ｍＬ〜約２．０×１０６細胞／ｍＬ、約１．２５×１０６細胞／ｍＬ〜約２．０×１０６細胞／ｍＬ、及びより好ましくは約１．５×１０６細胞／ｍＬ〜約２．０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で懸濁培養中に播種される。
【０１１８】
別の実施形態において、本発明の方法は、ステージ４細胞を、ＢＭＰ受容体阻害剤（例えば、ＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、又はコーディン）及びＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で約１日間処理して、ステージ４細胞をステージ５細胞へと分化させることを含む。例えば、培地は、約１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、及び約１００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤及び約１μＭ  Ｔ３が補充され得る。細胞は、付着性平板培養中にあり得るか又はクラスターの形態であり得る。ある特定の実施形態において、細胞は、空気−液体界面で培養する前又は凝集した細胞又は細胞クラスターを形成させるために培養する前に、タンパク質分解酵素及びコラーゲン分解酵素を含有する溶液などの細胞脱離溶液で処理され得る。
【０１１９】
前述の方法に従い、本発明は、膵内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵内分泌前駆細胞（膵内胚葉／膵内分泌前駆細胞）に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させるための細胞培養を更に提供し、これは、（ａ）培養容器と、（ｂ）容器内の、容器の容積の一部分のみを充填するのに十分な体積の増殖培地と、（ｃ）培地に隣接する容器の一部分を充填する容器内の空気と、（ｄ）培地と空気との間の界面に位置する多孔性基質と、（ｅ）培地が細胞の表面の一部分のみに接触するように、基質の表面上に配置された多能性幹細胞から誘導される膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞と、を含む。
【０１２０】
前述の方法に従い、代替的に、本発明は、膵内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵内分泌前駆細胞（膵内胚葉／膵内分泌前駆細胞）に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させるための細胞培養を更に提供し、これは、（ａ）細胞の凝集又は細胞クラスターの形成を促進する培養容器と、（ｂ）容器内のある体積の増殖培地（培養培地）と、（ｃ）細胞が誘導されて凝集しクラスターを形成するように、容器内に配置された多能性幹細胞に由来する細胞と、（ｄ）懸濁液（懸濁培養）中に配置された生成された細胞クラスターと、を含む。実施形態において、細胞凝集のための容器は、ウェル又はマイクロウェルを有するプレート、例えば、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレート（マイクロウェルプレート、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）である。実施形態において、懸濁培養系は、凝集した細胞又は細胞クラスターを、フラスコ、例えば、スピナーフラスコ又はスピナーホイールフラスコなどの懸濁培養容器中に播種することを含んでもよい。
【０１２１】
ステージ６：膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、未成熟ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化。
一実施形態において、本発明の方法は、ステージ５細胞を、任意の好適な増殖培地、好ましくはＭＣＤＢ−１３１又はＣＭＲＬ、より好ましくはＢＬＡＲなどのカスタム培地（表Ｉ）であり得る分化培地で処理することによって、ステージ６細胞を得ることを含む。培地には、以下、すなわち、
（ａ）ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩＩ、ＴＧＦ−β阻害剤ＳＢ４３１５４２、ＳＤ−２０８、ＩＴＤ−１、ＬＹ２１０９７６１、Ａ８３−０１、ＬＹ２１５７２９９、ＡＬＫ５ｉ、及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩからなる群から選択されるＡＬＫ５阻害剤、（ｂ）Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体、及びそれらの混合物からなる群から選択される甲状腺ホルモン、（ｃ）好ましくはＬＤＮ−１９３１８９、ノギン、又はコーディンから選択されるＢＭＰ受容体阻害剤、（ｄ）ガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸ、ガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸＩ、ガンマセクレターゼ阻害剤ＸＶＩ、又はＤＡＰＴなどのガンマセクレターゼ阻害剤、（ｅ）アスコルビン酸、（ｆ）ヘパリン、並びに（ｇ）硫酸亜鉛のうちの１つ又は２つ以上が補充されてもよい。細胞は、好ましくは空気−液体界面又は懸濁培養中で、約２〜４日間、好ましくは約３日間培養されて、ステージ５細胞をステージ６細胞へと分化され得る。任意選択で、培地には、ＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、スムーズンド受容体阻害剤、線維芽細胞増殖因子、及びレチノイン酸のうちの１つ又は２つ以上が更に補充され得る。
【０１２２】
好ましい実施形態において、ステージ５細胞は、約５０ｎＭ  ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約１００００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤及び好ましくはＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１μＭ  Ｔ３、約１００ｎＭのガンマセクレターゼ阻害剤が補充された培地で約７日間処理することによってステージ６細胞へと分化され得る。代替的に、ステージ５細胞は、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約５０ｎＭ  ＲＡ、約０．２５ｍＭアスコルビン酸、約１０００ｎＭ  ＡＬＫ５阻害剤、及び１μＭ  Ｔ３が補充された培地で約３日間処理することによってステージ６細胞へと分化され得る。細胞は、こうした培地中で、必要に応じて更に２日間以上培養され得る。
【０１２３】
代替的に、ステージ５細胞は、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体及びそれらの混合物、並びにＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で処理し、好ましくは空気−液体界面又は懸濁液中で、約１〜７日間、代替的に約６日間、代替的に約７日間培養することによってステージ６細胞へと分化され得る。代替実施形態において、培地は、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。例えば、細胞は、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約１０００ｎＭのＴ３、及び約５００〜約１０，０００ｎＭ、代替的に約５００ｎＭ、代替的に約１０００ｍＭ、及び代替的に約１０，０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤が補充された培地中で培養され得る。好適なＡＬＫ５阻害剤としては、ＳＤ−２０８、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｖ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤Ｉ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＶ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＶＩ、ＴＧＦ−β受容体阻害剤ＩＩＩ、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
好ましい実施形態において、ＡＬＫ５阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。より好ましい実施形態において、約１００００ｎＭ（１０ｍＭ）のＡＬＫ５阻害剤ＩＩが使用される。したがって、一実施形態において、ステージ５細胞は、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体及びそれらの混合物、並びにＡＬＫ５阻害剤が補充された培地で処理し、空気−液体界面又は懸濁液中で、好ましくは約７日間培養することによってステージ６細胞へと分化され得る。代替実施形態において、培地は、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。ある特定の実施形態において、細胞は、空気−液体界面又は懸濁液中で培養する前に、タンパク質分解酵素及びコラーゲン分解酵素を含有する溶液などの細胞脱離溶液で処理され得る。
【０１２５】
別の実施形態において、ステージ５細胞は、ヘパリン、ＳＭＯ阻害剤又はＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニスト、ＢＭＰ阻害剤、Ｔ３、及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充された培地で処理し、空気−液体界面で約５日〜約７日間、代替的に約５日間、代替的に約６日間、代替的に約７日間培養することによってステージ６細胞へと分化され得る。これらの実施形態において、培地は、約１０μｇ／ｍＬのヘパリン、約０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、約１００ｎＭ  ＬＤＮ−１９３１８９、約１０００ｎＭのＴ３、及び約１０，０００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充され得る。ある特定の実施形態において、培地は、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）が更に補充されてもよい。例えば、培地は、約１０ｍＭ  ＺｎＳＯ４が更に補充されてもよい。代替実施形態において、培地は、ＳＭＯ阻害剤及びＳＨＨシグナル伝達経路アンタゴニストの両方が補充され得る。
【０１２６】
本発明の特に好ましい実施形態において、オーロラキナーゼ阻害剤、好ましくはオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩ、ＲＳＫ阻害剤、好ましくはＲＳＫ阻害剤ＩＩ、及びＤＯＴ１Ｌのタンパク質メチルトランスフェラーゼ阻害剤、好ましくはＥＰＺ−５６７６のうちの１つ又は２つ以上が培地に添加される。添加される量は、オーロラキナーゼ及びＲＳＫ阻害剤については約１００〜５０００ｎＭ、代替的に約１０００〜５０００ｎＭ、代替的に約２０００〜５０００ｎＭ、代替的に約３０００〜５０００ｎＭ、好ましくは約１０００〜２０００ｎＭ、ＤＯＴ１Ｌ阻害剤については約１００〜１０００ｎＭ、より好ましくは約１μＭ〜約１０ｎＭであり得る。
【０１２７】
前述の方法に従い、本発明は、膵内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を、未成熟ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させるための細胞培養を更に提供し、これは、（ａ）培養容器、（ｂ）容器内の、容器の容積の一部分のみを充填するのに十分な体積の増殖培地、（ｃ）培地に隣接する容器の一部分を充填する容器内の空気、（ｄ）培地と空気との間の界面に位置する多孔性基質、及び（ｅ）培地が細胞の表面の一部分のみに接触するように、基質の表面上に配設された多能性幹細胞に由来する膵内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を含む。
【０１２８】
前述の方法に従い、代替的に、本発明は、膵内分泌前駆細胞（又は膵内胚葉／内分泌前駆細胞）に特徴的なマーカーを発現する細胞を、未成熟ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させるための細胞培養を更に提供し、これは、（ａ）細胞の凝集又は細胞クラスターの形成を促進する培養容器、（ｂ）容器内のある体積の増殖培地（培養培地）、（ｃ）細胞が誘導されて凝集しクラスターを形成するように、容器内に配置された多能性幹細胞に由来する細胞、及び（ｄ）懸濁液（懸濁培養）中に配置された生成された細胞クラスターを含む。実施形態において、細胞凝集のための容器は、ウェル又はマイクロウェルを有するプレート、例えば、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートである。実施形態において、懸濁培養系は、凝集した細胞又は細胞クラスターを、フラスコ、例えば、スピナーフラスコ又はスピナーホイールフラスコなどの懸濁培養容器中に播種することを含んでもよい。
【０１２９】
一実施形態において、本発明の実施形態に従い培養されたステージ５細胞が用いられ、ステージ６細胞へと分化されるが、一方で他の実施形態において、ステージ６及びステージ７細胞を得るために、他のプロトコルに従い培養されたステージ５細胞が本方法に用いられてもよい。
【０１３０】
実施形態において、本発明の方法は、単一ホルモン陽性であるステージ６細胞の形成をもたらす。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、ＮＫＸ６．１、インスリン、クロモグラニン、及びＰＤＸ１を共発現するステージ６細胞をもたらす。別の実施形態において、本発明の方法は、ＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現するステージ６細胞をもたらす。本発明のある特定の実施形態において、本方法は、ステージ４〜６、又は後期ステージ４〜６、又はステージ５及び６でカスタム培地であるＢＬＡＲ（表Ｉを参照されたい）を用いる。培地は、毎日、又は代替的に１日おきに交換され得る。
【０１３１】
別の実施形態において、本発明は、ＮＫＸ６．１及びクロモグラニンを共発現するステージ６細胞を形成する方法に関し、ステージ４、好ましくは後期ステージ４細胞を、空気−液体界面又は懸濁液中でステージ６細胞へと培養することを含む。更に別の実施形態において、本発明は、ステージ４、好ましくは後期ステージ４細胞を、空気−液体界面又は懸濁液中でステージ６細胞へと培養することによって、ＮＫＸ６．１ステージ６細胞を発現する単一ホルモンインスリン陽性細胞を形成する方法に関する。
【０１３２】
ステージ７：未成熟ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞の、二相ＧＳＩＳ及びミトコンドリア呼吸応答が可能な機能的ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化。
一実施形態において、本発明の方法は、ステージ６細胞を、任意の好適な増殖培地、好ましくはＭＣＤＢ−１３１若しくはＣＭＲＬ、又はより好ましくはＢＬＡＲ００１（表１）若しくはＢＬＡＲ００４（表ＩＶ）などのカスタム培地（表ＩＶ）であり得る分化培地で７日間処理することを含む。
【０１３３】
培地は、以下、すなわち、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムであって、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘが補充されたもの；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０ｎＭのＴ３（「低Ｔ３」）；１ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（「ＮＡＣ」）；０．５μＭのＺＭ４４７４３９（「ＺＭ」）；及び製剤Ｉ（「ＦＩ」）（表ＸＩＩ）を構成する以下の成分、すなわち、１：２００希釈のＲＰＭＩビタミン補助剤；１：２００希釈のＭＥＭ非必須アミノ酸補助剤；１：２０００希釈の既知組成脂質濃縮物；１：２００希釈のピルビン酸ナトリウム；１：２０００希釈の微量元素Ａ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号２５−０２１）；１：２０００希釈の微量元素Ｂ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号２５−０２２）のうちの１つ又は２つ以上が補充される。ステージ７を得るために添加され得る追加の化合物には、約１０ｎＭのＴ３（「低Ｔ３」）；５μＭ  ５−アザシチジン（「ＡＺＴ」）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２３８５）；又は約１μＭ  ３−デアザネプラノシンＡ（「ＤＥＺＡ」）（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．、カタログ番号２０６０）が含まれる。ステージ７細胞を得るための実施形態において、培地はＡＬＫ５阻害剤を含有しない。
【０１３４】
一実施形態において、ステージ６細胞は、約１０ｎＭのＴ３、約０．５μＭのオーロラキナーゼ阻害剤ＩＩのうちの１つ又は２つ以上、及び約１ｍＭのＮ−アセチルシステインが補充された培地による処理によって、ステージ７細胞へと分化され得る。代替的に、ステージ６細胞は、ヘパリン、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体又はそれらの混合物、抗酸化剤、及びオーロラキナーゼ阻害剤、又はそれらの混合物が補充された培地で処理し、空気−液体界面又は懸濁培養で約７〜２１日間、代替的に約７〜１０日間、好ましくは約７日間培養することによってステージ７細胞へと分化され得る。
【０１３５】
前述の方法に従い、本発明は、膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を、機能的ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させるための細胞培養を更に提供し、これは、（ａ）培養容器と、（ｂ）容器内の、容器の容積の一部分のみを充填するのに十分な体積の増殖培地と、（ｃ）培地に隣接する容器の一部分を充填する容器内の空気と、（ｄ）培地と空気との間の界面に位置する多孔性基質と、（ｅ）培地が細胞の表面の一部分のみに接触するように、基質の表面上に配置された多能性幹細胞由来の膵内胚葉／内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞と、を含む。
【０１３６】
一実施形態において、本発明の実施形態に従い培養されたステージ６細胞が用いられ、ステージ７細胞へと分化されるが、他の実施形態において、ステージ７細胞を得るために、他のプロトコルに従い培養されたステージ６細胞が本方法に用いられてもよい。別の実施形態において、本発明の方法は、単一ホルモン陽性であるステージ７細胞の形成をもたらす。したがって、一実施形態において、本発明の方法は、ＮＫＸ６．１、クロモグラニン、ＰＤＸ１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡを共発現するステージ７細胞をもたらす。別の実施形態において、本発明の方法は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、インスリン、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡを共発現するステージ７細胞をもたらす。更に別の実施形態において、細胞の各々は、細胞集団の少なくとも約１０％、代替的に少なくとも約２０％、代替的に少なくとも約３０％、代替的に少なくとも約４０％、代替的に少なくとも約５０％、代替的に少なくとも約６０％、代替的に少なくとも約７０％、代替的に少なくとも約８０％、又は代替的に少なくとも約９０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡ結果を発現する、細胞の集団をもたらす。
【０１３７】
一部の実施形態において、結果として生じる細胞集団の細胞の少なくとも１０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡを発現する。他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも２０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡを発現する。他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも３０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡを発現する。また他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも４０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡを発現する。更に他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡを発現する。また他の実施形態において、集団の細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡを発現する。代替実施形態において、集団の細胞の少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％が、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡを発現する。
【０１３８】
本発明のある特定の好ましい実施形態において、本方法は、ステージ４〜７又は後期ステージ４〜７、又はステージ５、６、及び７でカスタム培地ＢＬＡＲ（表Ｉ）を用いる。培地は、好ましくは毎日、又は代替的に１日おきに交換され得る。
【０１３９】
別の実施形態において、本発明は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びクロモグラニンを共発現するステージ７細胞を形成する方法に関し、本方法は、ステージ４、好ましくは後期ステージ４細胞を、空気−液体界面又は懸濁液中でステージ７細胞へと培養することを含む。更に別の実施形態において、本発明は、ステージ４、好ましくは後期ステージ４細胞を、空気−液体界面又は懸濁液中でステージ７細胞へと培養することによって、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡステージ７細胞を発現する単一ホルモンインスリン陽性細胞（機能的ベータ細胞）を形成する方法に関する。
【０１４０】
本発明は、多能性細胞から膵内分泌細胞への経路における全てのステージについて、空気−液体界面で培養することを企図しているが、本発明は、平板又は浸漬培養におけるステージ１〜ステージ４細胞、並びに空気−液体界面又は懸濁培養で細胞を培養することによるステージ５、６、及び７細胞の形成を提供する。他の実施形態において、本発明は、ステージ４、５、及び６細胞を空気−液体界面で培養することを含む、多能性細胞の分化の段階的方法に関する。ある特定の実施形態において、ステージ４〜７中に培養される細胞は、空気−液体界面で培養され得る。他の実施形態において、後期ステージ４〜ステージ６細胞、又はステージ５及びステージ６細胞のみが空気−液体界面又は懸濁液中で培養される。更に別の代替実施形態において、ステージ１〜４は、平板培養において細胞を培養することによって行われ、ステージ５〜７、又はステージ６〜７、又はステージ７のみは、懸濁培養において培養することによって行われる。
【０１４１】
加えて、ステージ５、６、及び７のうちの１つ又は全ての間の培養は、Ｔ３、Ｔ４、それらの類似体、及びＡＬＫ５阻害剤のうちの１つ若しくは２つ以上、又はＴ３、Ｔ４、及びそれらの類似体のうちの１つ若しくは２つ以上、又はＡＬＫ５阻害剤の存在下で行われる。好ましい実施形態において、ステージ５、６、及び７のうちの１つ又は２つ以上、及び好ましくはそれらの全ての間の培養は、Ｔ３及びＡＬＫ５阻害剤の存在下、及びより好ましくはＴ３及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩの存在下で行われる。より好ましい実施形態において、ステージ７中の培養は、低濃度のＴ３の存在下で行われる。好ましい実施形態において、ステージ７中の培養は、ＡＬＫ５阻害剤を含まずに行われる。
【０１４２】
細胞が空気−液体界面（「ＡＬＩ」）で培養されるとき、細胞は、多孔性基質上で培養され得、それにより、細胞は上側で空気と接触し、底側で細胞培養培地と接触する。例えば、十分な体積の培地が、多孔性基質（例えば、フィルター挿入物）を収容する培養容器の底部に添加され得、それにより、培地は基質上に存在する細胞の底面と接触するが、それらを被包又は浸漬しない。好適な多孔性基質は、細胞の増殖及び分化に悪影響を及ぼさない任意の材料で形成され得る。例示的な多孔性基質は、ポリエチレンテレフタレート（「ＰＥＴ」）、ポリエステル、又はポリカーボネートなどのポリマーで作製される。好適な多孔性基質は、コーティングされても、コーティングされなくてもよい。一実施形態において、コーティングは、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）であり得る。本発明の別の実施形態において、多孔性基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングされ得る多孔性フィルター挿入物である。本発明の別の実施形態において、多孔性基質は、無コーティングフィルター挿入物である。基質の多孔性は、細胞生存性を維持し、細胞の分化を促進するのに十分であるべきである。
【０１４３】
空気−液体界面での細胞の培養は、細胞を、多孔性フィルター挿入物などの多孔性基質上に播種することを含む。ある特定の実施形態において、基質孔径は、約０．３〜約３マイクロメートルの範囲であり得る。播種は、細胞を単層培養物からの単一細胞として、又は単層培養物からの細胞のクラスターとして懸濁液へと放出し、続いて単一細胞懸濁液又は懸濁された細胞培養物をＡＬＩで多孔性基質の上に分取することによって達成され得る。細胞は、約１０００細胞／μＬ〜約１００，０００細胞／μＬを有する懸濁液から多孔性基質上に播種され得る。細胞は、個々の細胞又は細胞の凝集体若しくはクラスターを含有する細胞懸濁液の液滴として播種され得る。ある特定の実施形態において、細胞は、米国特許出願公開第２０１４／０１８６３０５号に開示されている方法を使用して空気−液体界面で培養され得、この開示は、空気液体界面での多能性幹細胞の培養及び分化に関して本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
培地は、１日おき又は好ましくは毎日、交換又はリフレッシュされ得る。多孔性基質の上部で増殖される細胞は、一般に単一細胞ではないが、むしろそれらは、シートの形態であるか、又は凝集細胞クラスターとして存在する。ＡＬＩで培養される細胞は、培地中に浸漬された細胞と比較して、より高い酸素分圧を経験し得る。
【０１４５】
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、懸濁培養においてクラスターとして細胞を培養し分化させることによって行われてもよい。多能性幹細胞の懸濁培養及び分化のための例示的な好適な方法は、米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９３号及び同第２０１４／０２９５５５２号に開示されており、これらの開示は、懸濁クラスターを使用した多能性幹細胞の培養及び分化に関して本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、本発明は、インビトロ細胞培養を提供し、これは、細胞が誘導されて凝集し、クラスターを形成するように、増殖培地（培養培地）を有する、細胞の凝集又は細胞クラスターの形成を促進する培養容器中に細胞を播種することを含む、細胞クラスターなどの凝集した細胞として調製された細胞を分化させることを含む。実施形態において、細胞の凝集を誘導するのに有用な容器は、ウェル又はマイクロウェルを有するプレート、例えば、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートである。結果として生じる凝集した細胞又は細胞クラスターは、懸濁液中で更に培養され（懸濁培養）、これは、凝集した細胞／細胞クラスターをマイクロウェルから取り除き、これらを懸濁培養容器に播種し、それにより、凝集した細胞を懸濁液中で分化させることを含む。
【０１４６】
本発明の実施形態は、空気−液体界面又は懸濁液中での後期ステージ４〜７、好ましくはステージ５〜７細胞の形成を包含する。細胞は、多能性幹細胞を分化させることによって、又はステージ３、４、５、又は６細胞を更に分化させることによって形成され得る。ステージ４細胞は、空気−液体界面で全体的に培養され得るか、又は細胞は、ステージ４の早期部分（約１〜２日）の間に、浸漬平板培養において培養され得、次いでステージ４の後期部分（２日目〜３日目のあたり）については空気−液体界面又は懸濁液中で培養され得る。好ましくは、ステージ４は、ＡＬＩ又は懸濁液中で行われないが、浸漬培養において行われる。
【０１４７】
一実施形態において、本発明は、機能的ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を多能性幹細胞から産生するための方法を提供し、この方法は、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞を、膵内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることと、空気−液体界面又は懸濁液中での培養により、膵内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることと、を含む。本方法は、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が補充された培地による処理を含み得る。本方法は、前腸内胚葉細胞（ステージ３細胞）に特徴的なマーカーを発現する細胞を、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体の一方又は両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が補充された培地による処理、並びに平板培養における培養によって膵内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞（ステージ４細胞）へと分化させることを含み得る。本方法はまた、膵内胚葉細胞（ステージ４細胞）に特徴的なマーカーを発現する細胞を、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体の一方又は両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が補充された培地による処理、並びに平板培養又は空気−液体界面若しくは懸濁液中での培養における培養によって未成熟ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（ステージ６細胞）へと分化させることを含み得る。本方法は、ステージ６細胞を、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、又はそれらの類似体のうちの一方又は両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方、併せて、オーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ又は２つ以上、並びに任意選択で抗酸化剤、例えば、ビタミンＥ又はアセチルシステインが補充された培地による処理によって、ステージ６と比較してより成熟した表現型を有する、機能的ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（ステージ７細胞）へと分化させることを更に含む。有用なアセチルシステインの好ましい量は、約０．１〜約２ｍＭである。ビタミンＥの好ましい量は、約０．１〜約１０μＭである。また別の実施形態において、本方法は、ステージ５細胞を、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体のうちの一方若しくは両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方、併せて、ガンマセクレターゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地で処理することによって、ステージ６を行うことを更に含む。また別の実施形態において、ステージ６は、ステージ５細胞を、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体のうちの一方若しくは両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方、併せて、ガンマセクレターゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ又は２つ以上が補充された培地で処理することによって行われ、続いて、（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、又はそれらの類似体のうちの一方又は両方、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）���び（ｉｉ）の両方、併せて、オーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、タンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ又は２つ以上、並びに任意選択で抗酸化剤、例えば、ビタミンＥ又はアセチルシステインが補充された培地による処理によって、ステージ７が行われる。
【０１４８】
本発明の一実施形態は、機能的ベータ細胞（成熟ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する膵内分泌細胞）（ステージ７細胞）を形成する方法であり、膵内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞（ステージ４細胞）を、空気−液体界面又は懸濁液中で培養することによってステージ７細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることを含む。より成熟した表現型の機能的ベータ細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＰＤＸ１、並びに以下の転写因子、すなわち、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＰＡＸ４、ＨＢ９、及びＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現する。一実施形態において、本発明の方法は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＨＢ９、及びＭＡＦＡについて陽性であるステージ６細胞の形成をもたらす。好ましくは、少なくともステージ５〜７の間に、本方法は、Ｔ３、Ｔ４、若しくはそれらの類似体、ＡＬＫ５阻害剤、又は両方が補充された培地による処理を含む。ステージ６細胞は、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＨＢ９、及びＭＡＦＡについて陽性である細胞であってもよい。他の実施形態では、ステージ６又は７細胞は、単一ホルモン陽性細胞である。例えば、ステージ６及び７細胞は、（ａ）ＮＫＸ６．１及びクロモグラニンを共発現するか、（ｂ）ＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現するか、又は（ｃ）ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、及び単一ホルモンインスリンを共発現する細胞であってもよい。ステージ７細胞は、ステージ６細胞と比較して、細胞集団内で増加したレベル及び増加した細胞数で、単一ホルモンインスリン及びＭＡＦＡを発現する。
【０１４９】
別の実施形態において、本発明は、例えば、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共発現細胞の集団を好ましくは空気−液体界面又は懸濁液中で培養及び分化させることによって、単一ホルモン陽性細胞（例えば、ＮＫＸ６．１及びインスリンを共発現する細胞、又はＮＫＸ６．１及びクロモグラニンを共発現する細胞）の数を増強する方法を提供する。別の実施形態において、空気−液体界面又は懸濁液中で培養された膵内胚葉細胞を、以下、すなわち、ＡＬＫ５阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、エフリンリガンド、ＥｐｈＢ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、ＥＧＦｒ阻害剤、レチノイン酸、ビタミンＣ、Ｔ３／Ｔ４、グルコース、細胞周期調節因子、ＷＮＴ調節因子、ＳＨＨ阻害剤、オーロラ阻害剤、抗酸化剤、ビタミンＥ、アセチル−システイン、又はそれらの組み合わせから選択される化合物での処理によって機能的ベータ細胞へと更に分化させる。
【０１５０】
更なる実施形態において、本発明は、多能性細胞を分化させる段階的方法に関し、本方法は、ステージ４〜ステージ６細胞を、十分な量の（ｉ）Ｔ３、Ｔ４、及びそれらの類似体のうちの１つ又は２つ、（ｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含有する培地中で培養し、ステージ６細胞を、オーロラキナーゼ阻害剤、ＲＳＫ阻害剤、及びタンパク質メチルトランスフェラーゼＤＯＴ１Ｌの阻害剤のうちの１つ又は２つ以上、並びに抗酸化剤を任意選択で含有する培地中で更に培養して、インスリン、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡを発現する、機能的ベータ細胞（成熟した表現型の膵内分泌細胞）及び機能的ベータ細胞の集団を生成することを含む。
【０１５１】
本明細書に記載する方法に従い生成されたステージ６及び７細胞はまた、膵臓ホルモン及び内分泌マーカーの分泌に対するそれらの作用についての化合物のスクリーニングにおける使用のためにも適切である。とりわけ、ＡＬＩ又は懸濁培養で培養されたステージ４〜ステージ７細胞は、３８４〜６ウェル形式の異なる培養形式で試験することができる。こうした形式は、後に続く膵内胚葉、膵内分泌前駆体、膵内分泌及び膵β細胞マーカーの発現に関する、様々な用量及び時間間隔での様々な小分子又は生物学の評価を可能にする。こうした評価は、遺伝子発現をＰＣＲによって、タンパク質発現をＦＡＣＳ若しくは免疫染色によって、又は小分子／生物学の追加により影響される細胞による因子の分泌についてはＥＬＩＳＡによって測定することによって達成され得る。
【０１５２】
Ｆ．本発明の方法により得ることができる細胞
本発明は、本発明の方法によって得ることができるステージ７細胞、又はステージ７細胞の集団を提供する。ある特定の実施形態において、細胞又は細胞集団は、分化後に精製されない。ある特定の実施形態において、これらのステージ７細胞は、単一ホルモンインスリンを発現し、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＭＡＦＡ陽性であり、加えて、これらの細胞は、ステージ６細胞よりも高いＭＡＦＡの発現レベルを有する。細胞は、ＵＣＮ３をステージ６細胞（未成熟ベータ細胞）より高いレベルで発現する。結果として生じる細胞集団は、ＭＡＦＡ陽性細胞と単一ホルモンインスリン発現細胞との両方がステージ６細胞より高いパーセンテージである。本発明はまた、ＮＫＸ６．１発現（好ましくは約３０％超）、ＰＤＸ１発現（好ましくは約３０％超）、ＵＣＮ３発現（好ましくは約１０％超）、ＳＬＣ２Ａ１発現（好ましくは約１０％超）、及びＭＡＦＡ発現（好ましくは約１０％超）で特徴付けられる、機能的ベータ細胞（成熟した表現型の膵内分泌細胞）に特徴的なマーカーを発現するインスリン陽性細胞又はインスリン陽性細胞の集団も提供する。
【０１５３】
本発明の実施形態において、ステージ７細胞又は細胞集団は、インスリン産生細胞又はインスリン産生細胞の集団である。インスリン産生細胞は、ヒト膵島細胞に類似した、ミトコンドリア呼吸／活性、及びグルコースに対するＧＳＩＳ応答を呈する機能的に成熟したベータ細胞である。本発明の実施形態において、機能的に成熟したベータ細胞は、懸濁培養において生成される。
【０１５４】
実施形態において、機能的ベータ細胞は、グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸を呈する。実施形態において、グルコース刺激性インスリン分泌及びグルコース依存性ミトコンドリア呼吸は、ヒト膵島細胞のものに類似している。本発明の実施形態において、機能的ベータ細胞は、複数の相においてインスリンを分泌する。
【０１５５】
実施形態において、グルコース依存性ミトコンドリア呼吸は、グルコース刺激後の最大酸素消費速度応答が、基礎酸素消費速度を、約２０％〜約８０％、好ましくは約２０％〜約７０％、２０％〜約〜約６０％、より好ましくは約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％上回る範囲である。実施形態において、酸素消費速度応答は、グルコース刺激後少なくとも１０分〜約１５分、好ましくは約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分で生じる。実施形態において、基礎ＯＣＲより早い酸素消費速度は、少なくとも６０分〜少なくとも８０分、好ましくは少なくとも７０分〜少なくとも８０分、より好ましくは少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０分間維持される。
【０１５６】
上記の実施形態において、グルコース刺激性インスリン分泌は、グルコース刺激に応答した急速な二相性インスリン分泌を含む。実施形態において、二相性インスリン分泌の第１相は、基礎分泌の少なくとも４倍〜少なくとも８倍増加し、好ましくは基礎分泌の少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、又は８倍増加する。実施形態において、二相性インスリン分泌の第２相は、基礎分泌の少なくとも２倍〜少なくとも４倍増加し、好ましくは基礎分泌の少なくとも２倍、３倍、又は４倍増加する。実施形態において、インスリン分泌は、グルコース刺激後少なくとも５分〜少なくとも１０分、好ましくはグルコース刺激後少なくとも５分、少なくとも６分、少なくとも７分、少なくとも８分、少なくとも９分、又は少なくとも１０分で生じる。
【０１５７】
表Ａ及びＢは、本発明の方法の実施形態における使用に好適な例示的培養条件を例示する。以下の表Ａ及びＢで使用される場合、「ＭＣＸ」はＭＣＸ化合物、「ＡＡ」はアクチビン、「ＡＬＫ５ｉｎｈ．」はＡＬＫ５阻害剤、「ＲＡ」はレチノイン酸、「Ｖｉｔ．Ｃ」はアスコルビン酸、「ｉｎｈ．」は阻害剤、及び「ａｃｔ．」は活性因子である。ある特定の実施形態において、１つのステージ（例えば、ステージ１、２、３、４、５、６、又は７のうちのいずれか１つ）における処理のうちのいずれか１つは、別のステージ（例えば、ステージ１、２、３、４、５、６、又は７のうちのいずれか１つ）における処理のうちのいずれか１つと組み合わせられてもよい。他の実施形態では、表Ａ中の方法とは異なる方法によって得られたステージ４細胞が、表Ｂに示される培養条件を使用してステージ５〜ステージ７細胞へと分化されてもよい。他の実施形態では、表Ａ及びＢ中の方法とは異なる方法によって得られたステージ５細胞が、表Ｂに示される培養条件を使用してステージ６又はステージ７細胞へと分化されてもよい。更に他の実施形態において、表Ａ及びＢ中の方法とは異なる方法によって得られたステージ６細胞が、表Ｂに示される培養条件を使用してステージ７細胞へと分化されてもよい。
【０１５８】
【表２】
2019518465.tif 000004
【０１５９】
【表３】
2019518465.tif 000005
【０１６０】
本明細書をとおして引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明を以下の非限定的実施例によって更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１６１】
以下の実施例で使用した材料及び化合物の供給元は表Ｘで特定する。
【０１６２】
（実施例１）
ＭＡＦＡ又はＵＣＮ３発現を上方調節する小分子のスクリーニング及び特定。
以下の実施例は、ＭＡＦＡ（ｖ−ｍａｆトリ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＡ）又はＵＣＮ３（ウロコルチン３）を含む成熟ベータ細胞マーカーの遺伝子発現を増加させることによって膵臓ベータ細胞の成熟状況を増強することができる小分子の特定を対象とする。２８代継代のＥＺ８培地によるヒト胚幹細胞株Ｈ１（「Ｈ１−ｈＥＳＣ」）の細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地栄養混合物Ｆ−１２（「ＤＭＥＭ−Ｆ１２」）、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子２（「ＦＧＦ２」）、１ｎｇ／ｍＬの形質転換増殖因子ベータ（「ＴＧＦβ」）、１：１００希釈のインスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン（「ＩＴＳ−Ｘ」）、２％脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（「ＦＡＦ−ＢＳＡ」）、及び２０ｎｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子−１（「ＩＧＦ−１」）の、１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２（「Ｙ化合物」）を補充した培地中にコーティングした皿の中で１：３０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上に０．０９４×１０６細胞／ｃｍ２で単一細胞として播種した。Ｙ化合物を、播種後最初の２４時間の間にのみ添加した。播種の４８時間後に、培養物を、不完全なＰＢＳ（マグネシウム又はカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。
【０１６３】
図１Ａ〜１Ｈについて、以下のプロトコルを用いて培養物を分化させた。プロトコルのステージ１〜４の間、培養物を平面付着培養上で維持した。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を以下のステージ１培地、すなわち、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、カタログ番号５７６１）を含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ増殖分化因子８（「ＧＤＦ８」）、及び１．５μＭの１４−プロプ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン（「ＭＣＸ化合物」）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８、及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で、細胞を更に１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１中で、細胞を更に１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び５０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子７（「ＦＧＦ７」）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で、細胞を２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；２５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｎ−［（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレン］−４−（フェニルメチル）−１−ピペラジンアミン）；１μＭレチノイン酸（「ＲＡ」）；０．２５ｍＭアスコルビン酸、３００ｎＭのＰＫＣ活性因子（（２Ｓ，５Ｓ−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−トリフルオロメチル）フェニル−２，４，−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム（「ＴＰＢ」）；及び骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）受容体阻害剤ＬＤＮ−１９３１８９−ＨＣｌ（「ＬＤＮ−ＨＣｌ」）が補充されたＢＬＡＲ００１カスタム培地（表Ｉを参照されたい）で、２日間、細胞を２日間処理した。ステージ３の１日目に使用したＬＤＮ−ＨＣｌの濃度は１００ｎＭであり、ステージ３の２日目については１０ｎＭであった。
ｄ．ステージ４（３日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ；２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、５０ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；０．２５ｍＭアスコルビン酸；及び２００ｎＭ  ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞を３日間処理した。ステージ４（３日間）の終了時に、平板皿の中で培養した細胞を空気−液体界面（「ＡＬＩ」）に播種した。具体的には、細胞を１０μＭのＹ−２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳですすぎ、濃度１倍の酵素ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ酵素で約２分間処理した後、酵素を除去し、フラスコをそっと叩くことで細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）表面から除去した。結果として生じた細胞の懸濁液を、０．５〜１．０×１０６細胞（５μＬ分量中）の密度で、１０ｃｍプレート上の０．４マイクロメートル又は３．０マイクロメートルの多孔性細胞培養フィルター挿入物のいずれかの上に播種した。８．０ｍＬの培地を、各挿入物の底部に添加し、フィルターの尖端、又は上部、側部には更なる培地を添加しなかった。培地は、ステージ５、６、及び７の持続期間の間毎日交換した。
ｅ．ステージ５（３日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１；５０ｎＭ  ＲＡ；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；３，３’，５−トリヨード−Ｌ−スリオニンナトリウム塩の形態にある１μＭのＴ３；１０μＭの２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（「ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ」又は「ＡＬＫ５」）が補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞をＡＬＩにて３日間処理した。
ｆ．ステージ６（７日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；１μＭのＴ３；１０μＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ；及び１００ｎＭ（Ｓ，Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）アセチルアミノ］−Ｎ−（５−メチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル）プロピオンアミド（「ガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸ」）が補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞をＡＬＩにて７日間処理した。
ｇ．ステージ７（７日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；１μＭのＴ３；１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ；１ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（「ＮＡＣ」）が補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞をＡＬＩにて処理した。
加えて、ステージ７（Ｓ７）の間に、図１Ａ〜１Ｈについて、細胞を、２０ｍＭ  Ｄ−グルコース及びＢＭＥビタミン補助剤（１００倍の１：１００希釈）にて条件付けし、表ＸＩに列挙し記載する７９個全ての小分子に曝露した。７９個の小分子のうち、以下の化合物、すなわち、（ｉ）ゼブラリン；（ｉｉ）ロメグアトリブ；（ｉｉｉ）５−アザシチジン；（ｉｖ）ミトキサントロン二塩酸塩；（ｖ）ＥＧＣＧ；（ｖｉ）フィセチン；（ｖｉｉ）ＳＧＩ  １０２７；（ｖｉｉｉ）テモゾロミド；（ｉｘ）Ｌ００２；（ｘ）Ｃ６４６；及び（ｘｉ）ＳＧＣ０９４６がＭＡＦＡ又はＵＣＮ３の発現を誘導した。
【０１６４】
図２Ａ〜２Ｂについて、培養物を、以下のプロトコルを使用して分化させた。プロトコルのステージ１〜４の間、培養物を平面付着培養上で維持した。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を以下のステージ１培地、すなわち、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−、１００ｎｇ／ｍＬ増殖分化因子８（「ＧＤＦ８」）、及び１．５μＭの１４−プロプ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン（「ＭＣＸ化合物」）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地の中で１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８、及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で、細胞を更に１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１中で、細胞を更に１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び５０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子７（「ＦＧＦ７」）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で、細胞を２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；２５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｎ−［（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレン］−４−（フェニルメチル）−１−ピペラジンアミン）；１μＭレチノイン酸（「ＲＡ」）；０．２５ｍＭアスコルビン酸、３００ｎＭのＰＫＣ活性因子（（２Ｓ，５Ｓ−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−トリフルオロメチル）フェニル−２，４，−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム（「ＴＰＢ」）；及び骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）受容体阻害剤ＬＤＮ−１９３１８９−ＨＣｌ（「ＬＤＮ−ＨＣｌ」）が補充されたＢＬＡＲ００１カスタム培地で、２日間、細胞を２日間処理した。ステージ３の１日目に使用したＬＤＮ−ＨＣｌの濃度は１００ｎＭであり、ステージ３の２日目については５０ｎＭであった。
ｄ．ステージ４（３日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ；２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、７０ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；０．２５ｍＭアスコルビン酸；及び２００ｎＭ  ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞を３日間処理した。ステージ４（３日間）の終了時に、平板皿の中で培養した細胞を空気−液体界面（「ＡＬＩ」）に播種した。具体的には、細胞を１０μＭのＹ２７６３２で４時間処理し、ＰＢＳですすぎ、濃度１倍の酵素ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ酵素で約２分間処理した後、酵素を除去し、フラスコをそっと叩くことで細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）表面から除去した。結果として生じた細胞の懸濁液を、０．５〜１．０×１０６細胞（５μＬ分量中）の密度で、１０ｃｍプレート内の０．４マイクロメートルの多孔性細胞培養フィルター挿入物又は３．０マイクロメートルの多孔性細胞培養フィルター挿入物のいずれかの上に播種した。８．０ｍＬの培地を、各挿入物の底部に添加し、フィルターの尖端、又は上部、側部には更なる培地を添加しなかった。培地は、ステージ５、６、及び７の持続期間の間毎日交換した。
ｅ．ステージ５（３日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１；５０ｎＭ  ＲＡ；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；３，３’，５−トリヨード−Ｌ−スリオニンナトリウム塩の形態にある１μＭのＴ３；１０μＭの２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（「ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ」又は「ＡＬＫ５」）が補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞をＡＬＩにて３日間処理した。
ｆ．ステージ６（７日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；１μＭのＴ３；１０μＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ；及び１００ｎＭ（Ｓ，Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）アセチルアミノ］−Ｎ−（５−メチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル）プロピオンアミド（「ガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸ」）が補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞をＡＬＩにて７日間処理した。
ｇ．ステージ７（７日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０ｎＭのＴ３（「低Ｔ３」）；１ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（「ＮＡＣ」）が補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞をＡＬＩにて処理した。
更に図２Ａ及び２Ｂについては、０．５μＭのＺＭ４４７４３９（「ＺＭ」）；及び製剤Ｉ（「ＦＩ」）（表ＸＩＩ）を構成する以下の成分、すなわち、１：２００希釈のＲＰＭＩビタミン補助剤；１：２００希釈のＭＥＭ非必須アミノ酸補助剤；１：２０００希釈の既知組成脂質濃縮物；１：２００希釈のピルビン酸ナトリウム；１：２０００希釈の微量元素Ａ；及び１：２０００希釈の微量元素Ｂを７日間添加した。ステージ７の間に添加した追加の成分には、５μＭ  ５−アザシチジン（「ＡＺＴ」）；又は１μＭ若しくは１０μＭ  ３−デアザネプラノシンＡ（「ＤＥＺＡ」）のいずれかが含まれた。
【０１６５】
本明細書に記載される実施形態は、出願人専有のＢＬＡＲ培地、具体的にはＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４培地を使用する。ＢＬＡＲ培地は、２０１２年１２月３１日出願の第６１／７４７，６６２号の利益を主張する共に２０１３年１２月１８日出願のＰＣＴ／ＵＳ１３／７５９３９及び米国特許出願整理番号第１３／９９８，８８４号で最初に記載され、その後再びＲｅｚａｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，３２（１１）１１２４〜１１３４，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｔａｂｌｅ  ３（２０１４年９月１１日にオンラインで公開）で記載され、その参照はそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＢＬＡＲ００１及びＢＬＡＲ００４は、列挙される薬剤又は賦形剤の濃度又はレベルが異なる。
【０１６６】
【表４】
2019518465.tif 000006
【０１６７】
一般に、本明細書の実施形態は、ステージ１〜７において上に記載したように、ヒト多能性細胞を大幅に分化させる。ステージ７では、様々な小分子を添加し、それらの作用を定量的リアルタイムＰＣＲによって評価した。表ＩＩには小分子及びそれらの標的を列挙する。これらの小分子を評価し、各々２μＭをステージ７で添加した。この実施例で試験した化合物の化学名及び構造を表ＸＩに示す。
【０１６８】
【表５−１】
2019518465.tif 000007
【０１６９】
【表５−２】
2019518465.tif 000008
【０１７０】
【表５−３】
2019518465.tif 000009
【０１７１】
分化した細胞の定量化及び特徴付け：様々なステージでの遺伝子発現の定量化のために、実質的に上述のＲｅｚａｎｉａら（２０１４）に記載されているように、ヒト膵島、Ｈ１−ｈＥＳＣ、ステージ６の７日目（Ｓ６Ｄ７）、及びステージ７の７日目〜ステージ７の１４日目（Ｓ７Ｄ７〜Ｓ７Ｄ１４）の細胞をＡＬＩクラスターとして回収した。遺伝子発現を、カスタムＴａｑｍａｎ  Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して細胞中で評価した。配列検出用ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてデータを解析し、ΔΔＣｔ法を用いて、未分化Ｈ１−ｈＥＳＣに対してハウスキーピング遺伝子としてのＧＡＰＤＨを用いて正規化した。プライマーの詳細を、表ＩＩＩに概説する。
【０１７２】
【表６】
2019518465.tif 000010
【０１７３】
図１Ａ〜１Ｄは、小分子によって処理した後のＭＡＦＡの発現の定量的リアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示すグラフであり、ここで、様々な小分子は、Ｓ６Ｄ７、又はステージ７（Ｓ７Ｄ７）の処理していない若しくはＤＭＳＯで処理した培養と比較して、ＭＡＦＡの発現を増加させた。ＵＮＣ０６３８（図１Ａ；選択的なＧ９ａ及びＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＵＮＣ０６４６（図１Ａ；強力かつ選択的なＧ９ａ／ＧＬＰ阻害剤）、ＵＮＣ０６４２（図１Ａ；強力かつ選択的なＧ９ａ及びＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＴＣ−Ｅ５００３（図１Ｂ；選択的なＰＲＭＴ１アルギニンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、Ａ３６６（図１Ｂ；強力かつ選択的なＧ９ａ／ＧＬＰヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ＰＦ０３８１４７３５（図１Ｂ；オーロラキナーゼＡ及びＢ阻害剤）、ＺＭ４４７４３９（図１Ｂ；オーロラキナーゼＢを阻害）、ＳＢ７４７６５１Ａジヒドロクロリド（図１Ｂ；強力なＭＳＫ１阻害剤；他のＡＧＣ群キナーゼも阻害）、ＰＦＩ１（図１Ｂ；ＢＥＴブロモドメイン阻害剤）、ＬＹ３０３５１１（図１Ｂ；ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、及びＢＲＤ４阻害剤）、ＭＳ４３６（図１Ｂ；強力かつ選択的なＢＲＤ４ブロモドメイン阻害剤）、及びＭＣ１５６８（図１Ｃ；ＨＤＡＣクラスＩＩ（ＩＩａ）を選択的に阻害）の添加により、Ｓ６Ｄ７、又はステージ７の処理していない若しくはＤＭＳＯで処理した培養と比較して、ＭＡＦＡの発現が大幅に上方調節された。図１Ｅ〜１Ｈは、小分子によって処理した後のＵＣＮ３の発現の定量的リアルタイムＰＣＲ分析からのデータを描出するグラフであり、５−アザシチジン（「ＡＺＴ」）（図１Ｅ；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤）、ピロキサミド（図１Ｇ；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）、及びＣＩ９９４（図１Ｇ；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）の添加により、Ｓ６Ｄ７、又はステージ７の処理していない若しくはＤＭＳＯで処理した培養と比較して、ＵＣＮ３の発現が大幅に上方調節された。
【０１７４】
図２Ａ及び２Ｂは、ＭＡＦＡ又はＵＣＮ３いずれかの上方調節因子として選択された小分子の頑強性を実証し、これはそれらの作用が異なるステージ７条件付けプロトコルにわたって維持されるためである。
【０１７５】
図２Ａ及び２Ｂに示される培養条件は、ステージ７（Ｓ７）における以下の変化、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（「ＡＬＫ５」）の除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下（「低Ｔ３」）；（ｉｉｉ）ＺＭ４４７４３９（「ＺＭ」）の添加；並びに（ｉｖ）ビタミン、微量元素、脂質、及びアミノ酸のカクテル（製剤Ｉ−表ＸＩＩ）の添加によって図１とは異なる。具体的には、試験した基礎条件は、（１）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（「ＡＬＫ５」）なし；（２）低Ｔ３；（３）低ＺＭ；（４）低Ｈ；（５）低ＮＡＣ；（６）ＦＩ；及びＢＬＡＲ００１であった。ＡＺＴは、ステージ７の間、ＵＣＮ３（図２Ｂ）上方調節因子として確認されたが、ＭＡＦＡ（図２Ａ）上方調節因子としては確認されなかった。試験した小分子に加えて、３−デアザネプラノシンＡ（「ＤＥＺＡ」；図２Ａ）がＭＡＦＡ発現の効果的な上方調節因子であることが分かったが、ＺＭ４４７４３９の存在下であってもＵＣＮ３（図２Ｂ）発現の効果的な上方調節因子ではなかった。
【０１７６】
要約すると、この実施例は、ステージ７の間に成熟マーカーであるＭＡＦＡ又はＵＣＮ３の発現を上方調節する小分子の特定を実証する。
【０１７７】
（実施例２）
改善された成熟マーカー発現を有し、空気−液体界面でのヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態を有する内分泌細胞の生成。
以下の実施例は、以下の成熟マーカー、すなわち、ＰＤＸ１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス１）；ＮＫＸ６．１（ＮＫ６ホメオボックス１）；ＭＡＦＡ；ＵＣＮ３、ＳＬＣ２Ａ１（溶質担体ファミリー２メンバー１；ＧＬＵＴ１／グルコース輸送体１とも称される）を共発現し、またヒト膵島細胞に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態を示す、Ｃ−ペプチド（プロインスリン分子中のインスリンＡ鎖及びＢ鎖を接続する単鎖３１アミノ酸ポリペプチド）細胞の生成を実証する。２８代継代のＥＺ８培地によるヒト胚幹細胞株Ｈ１（「Ｈ１−ｈＥＳＣ」）の細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地栄養混合物Ｆ−１２（「ＤＭＥＭ−Ｆ１２」）、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子２（「ＦＧＦ２」）、１ｎｇ／ｍＬの形質転換増殖因子ベータ（「ＴＧＦβ」）、１：１００希釈のインスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン（「ＩＴＳ−Ｘ」）、２％脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（「ＦＡＦ−ＢＳＡ」）、及び２０ｎｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子−１（「ＩＧＦ−１」）の、１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２（「Ｙ化合物」）を補充した培地中の１：３０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコーティングした皿の上に０．０９４×１０６細胞／ｃｍ２で単一細胞として播種した。播種の４８時間後に、培養物を、不完全なＰＢＳ（マグネシウム又はカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。
【０１７８】
図３Ａ〜３Ｍ、４Ａ〜４Ｅ、及び５Ａ〜５Ｆについて、以下のプロトコルを用いて培養物を分化させた。プロトコルのステージ１〜４の間、培養物を平面付着培養上で維持した。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を以下のステージ１培地、すなわち、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ増殖分化因子８（「ＧＤＦ８」）、及び１．５μＭの１４−プロプ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン（「ＭＣＸ化合物」）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８、及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で、細胞を更に１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１中で、細胞を更に１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び５０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子７（「ＦＧＦ７」）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で、細胞を２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；２５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｎ−［（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレン］−４−（フェニルメチル）−１−ピペラジンアミン）；１μＭレチノイン酸（「ＲＡ」）；０．２５ｍＭアスコルビン酸、３００ｎＭのＰＫＣ活性因子（（２Ｓ，５Ｓ−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−トリフルオロメチル）フェニル−２，４，−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム（「ＴＰＢ」）；及び骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）受容体阻害剤ＬＤＮ−１９３１８９−ＨＣｌ（「ＬＤＮ−ＨＣｌ」）が補充されたＢＬＡＲ００１カスタム培地で、２日間、細胞を２日間処理した。ステージ３の１日目に使用したＬＤＮ−ＨＣｌの濃度は１００ｎＭであり、ステージ３の２日目については５０ｎＭであった。
ｄ．ステージ４（３日間）及びＳ４Ｄ３でのＡＬＩ移行：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ；２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、７０ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；０．２５ｍＭアスコルビン酸；及び２００ｎＭ  ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞を３日間処理した。ステージ４（３日間）の終了時に、平板皿の中で培養した細胞を空気−液体界面（「ＡＬＩ」）上に播種した。ＡＬＩ移行について、細胞を１０μＭのＹ化合物で４時間処理し、ＰＢＳですすぎ、濃度１倍の酵素ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ酵素で約２分間処理した後、酵素を除去し、フラスコをそっと叩くことで細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）表面から除去した。結果として生じた細胞の懸濁液を、０．５〜１．０×１０６細胞（５μＬ分量中）の密度で、１０ｃｍプレート内の０．４マイクロメートルの多孔性細胞培養フィルター挿入物又は３．０マイクロメートルの多孔性細胞培養フィルター挿入物のいずれかの上に播種した。８．０ｍＬの培地を、各挿入物の底部に添加し、フィルターの尖端、又は上部、側部には更なる培地を添加しなかった。培地は、ステージ５、６、及び７の持続期間の間毎日交換した。
ｅ．ステージ５（３日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１；５０ｎＭ  ＲＡ；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；３，３’，５−トリヨード−Ｌ−スリオニンナトリウム塩の形態にある１μＭのＴ３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ６３９７）；１０μＭの２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（「ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ」又は「ＡＬＫ５」）が補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞をＡＬＩにて３日間処理した。
ｆ．ステージ６（７日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；１μＭのＴ３；１０μＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ；及び１００ｎＭ（Ｓ，Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）アセチルアミノ］−Ｎ−（５−メチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル）プロピオンアミド（「ガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸ」）が補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞をＡＬＩにて７日間処理した。
ｇ．ステージ７（７日間）：ＡＬＩにある細胞を、２種類のカスタムＢＬＡＲ培地ＢＬＡＲ００１及びＢＬＡＲ００４で処理した。第１の培地は、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０ｎＭのＴ３（「低Ｔ３」）；１ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（「ＮＡＣ」）；０．５μＭのＺＭ４４７４３９（「ＺＭ」）；及び製剤Ｉ（「ＦＩ」）を構成する以下の成分、すなわち、１：２００希釈のＲＰＭＩビタミン補助剤；１：２００希釈のＭＥＭ非必須アミノ酸補助剤；１：２０００希釈の既知組成脂質濃縮物；１：２００希釈のピルビン酸ナトリウム；１：２０００希釈の微量元素Ａ；１：２０００希釈の微量元素Ｂが７日間補充されたＢＬＡＲ００１培地（成分の一覧は表Ｉに概説する）である。ステージ７の間に添加した追加の成分には、１μＭのＴ３又は１０ｎＭのＴ３（「低Ｔ３」）のいずれか；１０μＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ；５μＭ  ５−アザシチジン（「ＡＺＴ」）；又は１μＭ若しくは１０μＭ  ３−デアザネプラノシンＡ（「ＤＥＺＡ」）が含まれた。
第２の培地は、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（「ＮＡＣ」）；０．５μＭのＺＭ４４７４３９（「ＺＭ」）；及び製剤Ｉ（「ＦＩ」）を構成する以下の成分、すなわち、１：２００希釈のＲＰＭＩビタミン補助剤；１：２００希釈のＭＥＭ非必須アミノ酸補助剤；１：２０００希釈の既知組成脂質濃縮物；１：２００希釈のピルビン酸ナトリウム；１：２０００希釈の微量元素Ａ；１：２０００希釈の微量元素Ｂが７日間補充されたＢＬＡＲ００４（成分の一覧は表ＩＶに概説する）培地であった。ステージ７の間に添加した追加の成分には、１μＭのＴ３又は１０ｎＭのＴ３（「低Ｔ３」）のいずれか；１０μＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ；５μＭ  ５−アザシチジン（「ＡＺＴ」）；又は１μＭ若しくは１０μＭ  ３−デアザネプラノシンＡ（「ＤＥＺＡ」）が含まれた。
【０１７９】
【表７】
2019518465.tif 000011
【０１８０】
分化した細胞の特徴付け及び定量化：様々なステージでの遺伝子発現の定量化のために、Ｒｅｚａｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４；３２（１１）：１１２１〜１１３３に記載されているように、ヒト膵島細胞、Ｈ１−ｈＥＳＣ、ステージ６の７日目（Ｓ６Ｄ７）、及びステージ７の７日目〜ステージ７の１４日目（Ｓ７Ｄ７〜Ｓ７Ｄ１４）の細胞をＡＬＩクラスターとして回収した。遺伝子発現を、カスタムＴａｑｍａｎ  Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して細胞中で評価した。配列検出用ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてデータを解析し、ΔΔＣｔ法を用いて、未分化Ｈ１−ｈＥＳＣに対してハウスキーピング遺伝子としてのＧＡＰＤＨを用いて正規化した。プライマーの詳細を、表Ｖに概説する。
【０１８１】
【表８】
2019518465.tif 000012
【０１８２】
様々なステージにおけるタンパク質の共局在化の定量化のため、ヒト膵島、Ｓ７Ｄ７細胞をＡＬＩ細胞クラスターとして回収し、免疫蛍光法（「ＩＦ」）により分析した。Ｈ１−ｈＥＳＣ由来細胞を、上記のＲｅｚａｎｉａら（２０１４）に実質的に記載されているように、かつ本明細書の表ＶＩに列挙する抗体を用いて調製し、染色した。凍結切片のため、細胞をＰＢＳですすいだ後、４℃の４％  ＰＦＡ中で一晩固定した。固定後、４％ＰＦＡを除去し、細胞をＰＢＳで２回すすぎ、４℃の３０％スクロース溶液中で一晩インキュベートした。これらのサンプルを、ＯＣＴ溶液中で凍結保存し、５μｍの切片を、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  ｐｌｕｓスライド（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＬＬＣ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ、カタログ番号４８３１１−７０３）上に置いた。
【０１８３】
ＩＦ染色には、一次抗体を適切に希釈して４℃で一晩添加し、一方二次抗体は室温で３０分間添加した後に、ＰＢＳですすぎ、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｔａｉｎ封入試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号Ｈ−１２００）を添加した。Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて切片を可視化した。
【０１８４】
【表９】
2019518465.tif 000013
【０１８５】
様々なステージにおけるグルコース依存性ミトコンドリア活性の定量化のために、成熟ヒト膵島、Ｓ６Ｄ７  ＡＬＩクラスター、及びＳ７Ｄ７  ＡＬＩクラスターを回収し、それらの酸素消費速度（「ＯＣＲ」）を、２０ｍＭ  Ｄ−グルコースの注射の前後にＸＦｅ２４  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０２２３８−１００）上で測定した。ＡＬＩクラスターをそれらのステージ７条件付けから除去し、３７℃の非ＣＯ２環境とベースラインＯＣＲを達成するように設計された培地との両方において２時間インキュベートした。プレインキュベーション培地は、ＸＦベース培地中に１ｍＭ  Ｄ−グルコース、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有した。プレインキュベーション後、ＡＬＩクラスターをＳｅａｈｏｒｓｅマシンにロードし、ここで以下の測定、すなわち、（ｉ）ベースラインＯＣＲを３回（Ｄ−グルコース注射前）、及び（ｉｉ）Ｄ−グルコース後を５回（注射後インキュベーション時間：７２分）を行った。全てのＯＣＲ測定値を、スピナーにおけるＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌクラスターの個々のサンプルのＤＮＡ含有量に対して正規化した。ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＭｉｃｒｏＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号５６３０４）によって単離し、ＤＮＡ含有量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００  ＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＮＤ８０００）によって測定した。
【０１８６】
図３Ａ〜３Ｍは、ＡＬＩ細胞クラスター中の成熟マーカーの集合の遺伝子発現が、７日間のステージ７条件付けの後で、ヒト膵島で観察されるレベルまで増加したことを実証する。成熟マーカーは、急速なグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）のプラスの刺激に必要な遺伝子として本明細書では定義される。以下の一覧は、ＡＬＩクラスター中のＳ７Ｄ７による成熟マーカーの遺伝子発現を改善することが観察されたステージ７分化プロトコルにおける変化を詳述する：（ｉ）ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去；（ｉｉ）Ｔ３濃度の低下；（ｉｉｉ）ＤＥＺＡの添加；（ｉｖ）ＡＺＴの添加；（ｖ）ＺＭの添加；（ｖｉ）グルコース濃度の５．５６ｍＭへの低下；及び（ｖｉｉ）ビタミン、非必須アミノ酸、脂質、ピルビン酸ナトリウム、及び微量元素の定義されたカクテル（製剤Ｉ−「ＦＩ」）の添加。類似の所見及び結果が、ステージ７中のＢＬＡＲ００１系条件付け及びＢＬＡＲ００４系条件付けの両方に対する成熟遺伝子の遺伝子発現特性に関して見られた。図３Ａは、ＩＮＨＢＢが、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩを利用する条件下でヒト膵島細胞において見られる発現を上回って富化されたことを示す。所見により、Ｓ７細胞において、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩによるＴＧＦＢ１（形質転換増殖因子ベータ１）の阻害が、ＧＳＩＳプロセスを阻害する負のＴＧＦ−ベータシグナル伝達プロファイルを励起することが示唆される。ＡＺＴ／ＤＥＺＡの存在下又は非存在下でのＡＬＫ５阻害剤の除去が、ＩＮＨＢＢをヒト膵島細胞で見られるレベルまで減少させ、その結果、ステージ７の間のＧＳＩＳに対する負のＴＧＦ−ベータシグナル伝達の影響を排除することが観察された。加えて、図３Ｂは、ＩＮＨＡ発現が、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去によりＡＬＩクラスターにおいてヒト膵島のレベルまで増加することが観察されたことを示す。
【０１８７】
それぞれ図３Ｃ及び３Ｄに示されるＭＡＦＡ及びＳＬＣ２Ａ１発現がＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去によって減少したことが観察され、同時に、ＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加により、ＭＡＦＡ及びＳＬＣ２Ａ１発現がヒト膵島レベルまで救済される。ＵＣＮ３（図３Ｅ）、Ｇ６ＰＣ２（グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット２；図３Ｆ）、及びＰＤＫ１（ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１；図３Ｇ）発現は、ＡＬＩクラスタークラスターにおけるＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去により、ヒト膵島細胞のレベル又はヒト膵島細胞を上回るレベルまで増加した。ＩＮＳ（インスリン；図３Ｈ）、ＧＪＤ２（ギャップ結合タンパク質、デルタ２；併せてＣＸ３６／コネキシン３６；図３Ｉ）、ＳＩＸ２（ＳＩＸホメオボックス２；図３Ｊ）、及びＰＤＸ１（図３Ｋ）の発現は、まずＡＬＫ５阻害剤ＩＩの除去により、次にＡＺＴ／ＤＥＺＡの添加により、徐々に段階的に増加することが観察された。ＮＫＸ６．１（図３Ｌ）及びＧＬＰ１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体；図３Ｍ）の発現の変化は、条件にわたって観察されなかったが、ＡＬＩクラスター中のそれらの発現は、一貫してヒト膵島において観察されるレベルであったか又はそのレベルを上回った。
【０１８８】
図４Ａ〜４Ｅは、タンパク質存在の観点から以下の成熟マーカー、すなわち、Ｓ７Ｄ７においてＰＤＸ１（図４Ａ）、ＮＫＸ６．１（図４Ｂ）、ＭＡＦＡ（図４Ｃ）、ＳＬＣ２Ａ１（図４Ｄ）、及びＵＣＮ３（図４Ｅ）を共発現するＡＬＩ細胞クラスター中のＣ−ペプチド細胞の生成を実証する。図４Ａ〜４Ｅの各々について、ＩＦ染色が、単一チャネルとして、Ｃ−ペプチドを上の列、対象とする成熟タンパク質を下の列に示される。代表的なヒト膵島染色が左の行、ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１条件付けが中央の行、ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４条件が右の行に示される。全てではないにしても大部分のＣ−ペプチド陽性細胞が、ヒト膵島で見られるように、ＰＤＸ１（図４Ａ）及びＮＫＸ６．１（図４Ｂ）に対して同時に陽性であった。Ｃ−ペプチド陽性細胞のかなりの部分が、ＢＬＡＲ００１条件及びＢＬＡＲ００４条件の両方にわたって、ＭＡＦＡ（図４Ｃ）、ＳＬＣ２Ａ１（図４Ｄ）、及びＵＣＮ３（図４Ｅ）についても同時に陽性であった。しかしながら、ＭＡＦＡ、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＣＮ３の発現は、Ｃ−ペプチド同時陽性細胞に限定されなかった。
【０１８９】
図５Ａ〜５Ｅは、ステージ７に特異的な特定の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１」条件付けによって空気−液体界面（「ＡＬＩ」）でのヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態を呈する、Ｓ７Ｄ７でのＣ−ペプチド細胞の生成を示す。酸化消費速度（「ＯＣＲ」）によって表されるミトコンドリア呼吸又は活性を、ベースライン及び２０ｍＭ  Ｄ−グルコース注射後に測定した。７２分間にわたる５回のＯＣＲ測定を２０ｍＭ  Ｄ−グルコース注射後に行い、測定値を、個々のサンプル各々のＤＮＡ含有量によって正規化したＯＣＲのベースラインを超えたパーセンテージとして描出した。図５Ａは、ＯＣＲが注射後（「ｉｐ」）１５分（「分」）でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島（黒丸の線）が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。逆に、未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスター（灰色三角形の線）は、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈する（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）ことが観察された。図５Ｄは、Ｓ７Ｄ７  ＡＬＩクラスター群の中で、ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１条件（灰色四角形の線）のみが、ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態（１１２．４％±３．２５−注射後１５分；１２９．５％±３．７８−注射後７２分）を呈することが観察されたことを描出する。以下のＳ７Ｄ７  ＡＬＩクラスター条件（黒色四角形の線）は、未成熟Ｓ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターと見分けがつかないグルコース依存性ミトコンドリア動態を呈することが見られた：ＡＬＫ５、Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１（１００．３％±４．０４−注射後１５分；１０７．８％±６．５１−注射後７２分）（図５Ｂ）；ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００１（９６．９％±３．０６−注射後１５分；１０９．０％±４．５８−注射後７２分）（図５Ｃ）；ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４（１０３．４％±４．７６−注射後１５分；１１３．６％±６．７２−注射後７２分）（図５Ｅ）；及びＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ／ＤＥＺＡ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４（１０２．１％±４．０４−注射後１５分；１１２．７％±３．３８−注射後７２分）（図５Ｆ）。
【０１９０】
要約すると、この実施例は、ステージ７条件付けの改善を組み込むことで、ＡＬＩにおけるｈＥＳＣ由来成熟ベータ細胞の成熟状況が増強されることを実証する。具体的には、この実施例は、多数のベータ細胞成熟マーカーを共発現し、グルコース依存性ミトコンドリア呼吸などのヒト膵島に類似したベータ細胞特異的機能を呈するＣ−ペプチド細胞のＡＬＩにおける生成を示す。
【０１９１】
（実施例３）
拡張可能な懸濁培養に適した細胞クラスター形式における頑強な膵内胚葉細胞及び未成熟ベータ細胞の生成
以下の実施例は、拡張可能な懸濁培養に適したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスター形式における頑強な膵内胚葉細胞又は未成熟ベータ細胞のいずれかの生成を実証する。この実施例で使用した懸濁培養物は、スピナーフラスコ中で培養したＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター（「スピナー中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター」）であった。２８代継代のＥＺ８培地によるヒト胚幹細胞株Ｈ１（「Ｈ１−ｈＥＳＣ」）の細胞を、ダルベッコ変法イーグル培地栄養混合物Ｆ−１２（「ＤＭＥＭ−Ｆ１２」）、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子２（「ＦＧＦ２」）、１ｎｇ／ｍＬの形質転換増殖因子ベータ（「ＴＧＦβ」）、１：１００希釈のインスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン（「ＩＴＳ−Ｘ」）、２％脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（「ＦＡＦ−ＢＳＡ」）、及び２０ｎｇ／ｍＬのインスリン様増殖因子−１（「ＩＧＦ−１」）の、１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤Ｙ−２７６３２（「Ｙ化合物」）を補充した培地中の１：３０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）をコーティングした皿の上に０．０９４×１０６細胞／ｃｍ２で単一細胞として播種した。Ｙ化合物を、播種後最初の２４時間の間にのみ添加した。播種の４８時間後に、培養物を、不完全なＰＢＳ（マグネシウム又はカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水を意味する「−／−」と表される）中で洗浄した。
【０１９２】
図６Ａ〜６Ｌについて、以下のプロトコルを用いて培養物を分化させた。図６Ｉ〜６Ｌに示されるＳ６Ｄ６  ＡＬＩ細胞クラスターを、ステージ４の３日目に、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを、新たなＳ４Ｄ３単分子層又は凍結保存したＳ４Ｄ３細胞（以下でより詳細に記載する）のいずれかから、更に４８時間（ステージ４の５日目、すなわちＳ４Ｄ５）培養することによって調製したことを除き、上に記載したように培養した。培地は分化プロトコル全体にわたって毎日交換した。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を以下のステージ１培地、すなわち、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ増殖分化因子８（「ＧＤＦ８」）、及び１．５μＭの１４−プロプ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン（「ＭＣＸ化合物」）（ＧＳＫ−３β阻害剤）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８、及び０．１μＭ  ＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で、細胞を更に１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１中で、細胞を更に１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び５０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子７（「ＦＧＦ７」）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で、細胞を２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；２５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｎ−［（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレン］−４−（フェニルメチル）−１−ピペラジンアミン）；１μＭレチノイン酸（「ＲＡ」）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｒ２６２５）；０．２５ｍＭアスコルビン酸、３００ｎＭのＰＫＣ活性因子（２Ｓ，５Ｓ−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−トリフルオロメチル）フェニル−２，４，−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム（「ＴＰＢ」）；及び骨形態形成タンパク質（「ＢＭＰ」）受容体阻害剤ＬＤＮ−１９３１８９−ＨＣｌ（「ＬＤＮ−ＨＣｌ」）が補充されたＢＬＡＲ００１カスタム培地（表Ｉを参照されたい）で、２日間、細胞を２日間処理した。ステージ３の１日目に使用したＬＤＮ−ＨＣｌの濃度は１００ｎＭであり、ステージ３の２日目については１０ｎＭであった。
ｄ．ステージ４（３日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ；２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、７０ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；０．２５ｍＭアスコルビン酸；及び２００ｎＭ  ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞を３日間処理した。
ｅ．ステージ４の３日目の単分子層の凍結保存：Ｓ４Ｄ３単分子層からの凍結保存した細胞バンクを以下の手順によって確立した。簡潔には、Ｓ４Ｄ３単分子層を、１０μＭ  Ｙ化合物で４時間処理した。次に、細胞を単一細胞懸濁液としてＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ酵素によって放出させた後、「放出」培地（４ｋＵ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ  Ｉ及び１０μＭ  Ｙ化合物が補充された、「ｋ節」で詳述するステージ４の完全培地）によって酵素を中和した。単一細胞を沈降させ、冷「放出」培地中に再懸濁させ、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−１００によって計数した。冷「凍結保存」培地（６０％  ＫＳＲ；１５％  ＢＬＡＲ００１；５％  ＨＥＰＥＳ（１Ｍ濃度）；２０％  ＤＭＳＯ）を、１対１の割合の添加で、冷「放出」培地中の単一細胞懸濁液に添加した。４．５ｍＬの１対１「凍結保存／放出」培地中の５．０×１０６細胞を１本の５ｍＬ凍結保存バイアルに添加した。バイアル（複数可）をＣＲＦ（速度制御冷凍庫（Controlled Rate Freezer））（Ｐｌａｎａｒ  ＰＬＣ、カタログ番号Ｋｒｙｏ  ３６０）に移し、その中で細胞を以下の凍結プロファイルによって凍結させ、液体窒素中で長期間貯蔵した。ＣＲＦ凍結手順を表ＶＩＩに示す。
ｆ．凍結保存したＳ４Ｄ３単分子層細胞の解凍：５．０×１０６のＳ４Ｄ３単分子層細胞を含有する凍結した５ｍＬバイアルを３７℃の水浴中で２分解凍した。細胞をＳ４Ｄ３後の培地（「ｇ」節中で以下に詳述する）中に収集し、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００ＥＸプレートのＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ウェルあたり約７８７細胞の密度で添加した。
ｇ．Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター移行のためのステージ４（２日間）：Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター生成のために、ステージ４の３日目の単分子層細胞又は解凍したステージ４の３日目の凍結保存細胞をＹ化合物で４時間処理し、ＰＢＳですすぎ、３分間Ａｃｃｕｔａｓｅ細胞脱離溶液で処理した後、酵素を除去し、フラスコをそっと叩くことによって、細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）表面から除去した。結果として生じる細胞の懸濁液を、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００ＥＸプレートのＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ウェルあたり約７８７細胞の密度で添加し、プレートを１００×ｇで穏やかに沈降させて、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを生成した。クラスターあたりの細胞の量は５０〜３０００細胞の範囲とすることができる。ステージ４の３日目の単分子層細胞のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターへの移動及び４８時間凝集後培養に使用した培地（「Ｓ４Ｄ３後培地」）は、以下のとおりである：細胞は、３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ；２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、７０ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；０．２５ｍＭアスコルビン酸；及び２００ｎＭ  ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ００１培地で、２日間処理された。１０μＭ  Ｙ化合物及び２μｇ／ｍＬヒト組換えラミニンを、最初の２４時間の間にのみ培地に添加した。２日後、本明細書ではＳ４Ｄ５と称されるＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターをＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）プレートのウェルから除去し、ＰＢＳ０．１ＭＡＧスピナーに移した（「懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌクラスター」）。
ｈ．ステージ５（３日間）：Ｓ４Ｄ５  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターをＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００ＥＸプレートから回収し、３日間ステージ５培地中で、細胞密度１５０〜２００万細胞／ｍＬ、回転速度２７ｒｐｍ（毎分の回転数）にてＰＢＳ０．１ＭＡＧスピナーに移した。２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１；５０ｎＭ  ＲＡ；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；３，３’，５−トリヨード−Ｌ−スリオニンナトリウム塩の形態にある１μＭのＴ３；及び１０μＭの２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（「ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ」又は「ＡＬＫ５」）が補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞を処理した。４ｋＵ／ｍＬ  ＤＮａｓｅＩ及び５μＭ  Ｙ化合物をステージ５の１日目にのみ補充した。
ｉ．ステージ６（６日間〜８日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；１μＭのＴ３；１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ」）、及び１００ｎＭの（Ｓ，Ｓ）−２−［２−（３，５−ジフルオロフェニル）アセチルアミノ］−Ｎ−（５−メチル−６−オキソ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−イベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル）プロピオンアミド（「ガンマセクレターゼ阻害剤「ＸＸ」）が補充されたＢＬＡＲ００１培地中で、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを処理した。
【０１９３】
【表１０】
2019518465.tif 000014
【０１９４】
分化した細胞の定量化及び特徴付け：様々なステージでのタンパク質共局在化の定量化のために、Ｓ４Ｄ５  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター及びＳ６Ｄ６  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを回収し、免疫蛍光法（「ＩＦ」）によって分析した。使用した特徴付けの手順及び試薬は、実施例２の表ＶＩに示すとおりであった。
【０１９５】
様々なステージでの遺伝子発現の定量化のために、ステージ４の５日目のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター及びステージ６の６日目のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを回収し、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（３２）１１，１１２１〜１１３３に記載されるように逆転写酵素定量的ポリメラーゼ連鎖反応（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）によって分析した。使用した特徴付けの手順及び試薬は、実施例２の表Ｖに示すとおりであった。
【０１９６】
タンパク質存在の共局在化の定量化のために、ステージ４の５日目のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター及びステージ６  Ｄ６  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを回収し、蛍光活性化フローサイトメトリー（「ＦＡＣＳ」）によって分析した。ＦＡＣＳ染色は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４（３２）１１，１１２１〜１１３３に記載されるように、かつ表ＶＩＩに列挙される抗体を使用して行った。分化した細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ中で５〜１０分間３７℃でインキュベートし、単一細胞懸濁液中に放出させた後、０．２％  ＢＳＡを含有するＰＢＳの染色緩衝液で２回洗浄した。細胞内抗体染色は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ紫色蛍光反応染料を４℃で３０分間用い、続いて冷ＰＢＳで１回洗浄することによって達成した。細胞の固定を３００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液中で行った後、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で２回洗浄した。次に、細胞を適切な抗体と共に４℃で３０分間（非結合抗体）又は１時間（結合抗体）インキュベートした後、２回洗浄し、その後、獲得される事象を少なくとも３０，０００にしてＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを用い、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで分析した。ＦＡＣＳ分析中、非生細胞は除外し、ゲーティングはアイソタイプ抗体（「ＩｇＧ」）を用いて決定した。
【０１９７】
【表１１】
2019518465.tif 000015
【０１９８】
図６Ａは、これをとおして（ｉ）新たなＳ４Ｄ３単分子層又はＳ４Ｄ３凍結保存細胞を、（ｉｉ）Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）方法によって、（ｉｉｉ）細胞クラスターへと組み立てる手順を描出する。図６Ｂは、Ｓ４Ｄ５  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター中で、膵内胚葉ＴＦ  ＰＤＸ１（上段、左）及びＮＫＸ６．１（上段、中央）では高いタンパク質存在が検出され、内分泌ＴＦ  ＮＥＵＲＯＤ１（上段、右）、代替的非膵内胚葉系統配分ＴＦ  ＳＯＸ２（下段、中央）、及びＣＤＸ２（下段、右）では低いタンパク質存在が検出されたことを示す。ＦＡＣＳ分析（図６Ｃ）により、細胞の９９．３±０．１％がＰＤＸ１＋（左）であり、８４．４±０．１％がＮＫＸ６．１＋（中央）であったが、２．２±０．４％がＮＫＸ６．１＋  ＮＥＵＲＯＤ１＋（右）、又は１．３５±０．５５％がＮＫＸ６．１＋  ＣＨＧＡ＋（中央）であったことが示される。図６Ｄは、Ｓ４Ｄ３単分子層と比較した場合、ＰＤＸ１（上段、左）、ＮＫＸ６．１（上段、右）の高い遺伝子発現、並びにＮＥＵＲＯＤ１（下段、左）及びＣＨＧＡ（下段、右）の低い発現が維持されたため、頑強な膵内胚葉特性がＳ４Ｄ３凍結保存細胞に由来するＳ４Ｄ４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター中で維持されたことを示す。全体的に、Ｓ４Ｄ５  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４（３２）１１，１１２１〜１１３３で報告されているこれまでのステージ４細胞よりも優れた程度の非内分泌膵内胚葉特性を呈した。これらの結果は、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターが、ベータ細胞に向けた懸濁培養に基づく分化の開発の拡張可能な出発点を提供するため、重要である。
【０１９９】
図６Ｅは、これをとおして（ｉ）新たなＳ４Ｄ３単分子層又はＳ４Ｄ３凍結保存細胞を、（ｉｉ）Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）方法によって細胞クラスターへと組み立て、（ｉｉｉ）Ｓ６Ｄ６によって懸濁培養中で、（ｉｖ）未成熟ベータ細胞へと分化させる手順を描出する。Ｓ６Ｄ６  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターのＦＡＣＳ分析により、未成熟ベータ細胞タンパク質プロファイルが、細胞の７８．５±１．８７％がＮＫＸ６．１＋  ＣＨＧＡ＋（左、図６Ｆ）であり、７３．６±４．３４％がＮＫＸ６．１＋  ＮＥＵＲＯＤ１＋（右、図６Ｆ）、３８．４±５．９６％がＮＫＸ６．１＋インスリン＋（左、図６Ｇ）として示される。インスリン陽性集団（全細胞の５０．２±６．９２％がインスリン＋であった）の大部分がＮＫＸ６．１＋（左、図６Ｇ）であり、グルカゴン陽性（７．４３±１．４９％インスリン＋グルカゴン＋；（右、図６Ｇ）はそうではなかった。図６Ｈは、ＩＦにより、Ｓ６Ｄ６で、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター中のＣ−ペプチド陽性細胞の大部分が、ＰＤＸ１＋（左）とＮＫＸ６．１＋（中央）との両方であったことを示す。驚くべきことに、成熟の門番であるＴＦ  ＭＡＦＡ（右）のタンパク質存在は、Ｓ６Ｄ６で既に容易に検出され、Ｓ６Ｄ６〜Ｓ６Ｄ７でこれまでのＡＬＩクラスターより高いレベルで発現された（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４（３２）１１，１１２１〜１１３３）（図６Ｉ；ＡＬＩ  Ｓ７Ｄ７比較については図３Ｃも参照されたい）。同様に、インスリン（図６Ｊ）、ＰＤＸ１（図６Ｋ）、及びＮＫＸ６．１（図６Ｌ）の発現は、Ｓ６Ｄ６〜Ｓ６Ｄ７でこれまでのＡＬＩクラスターより高かった。これらの結果により、Ｓ４Ｄ５  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを未成熟ベータ細胞状態に向けて懸濁培養中で培養することができ、機能的な成熟ベータ細胞への懸濁培養に基づく分化に向けた拡張可能であり準備の整った出発点を提供することが証明される。
【０２００】
要約すると、この実施例は、ステージ４細胞が、それらの膵内胚葉の表現型を維持しながら、凝集して細胞クラスターとなるように作製できることを実証する。更に、これらのステージ４細胞クラスターは、拡張可能な懸濁培養によって、頑強な未成熟ベータ細胞表現型に向けて更に分化することができる（ステージ６）。
【０２０１】
（実施例４）
成熟ヒト膵島に類似した増強されたベータ細胞成熟マーカー発現及びタンパク質存在を有する内分泌細胞の懸濁培養生成
以下の実施例は、成熟マーカーであるＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１の共発現及びタンパク質存在を呈するＣ−ペプチド細胞の懸濁培養による生成を実証する。２８代継代でＥＺ８培地で培養したＨ１−ｈＥＳＣ細胞株の細胞を、１０μＭのＹ化合物が補充された、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１”の培地中のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）を１：３０希釈でコーティングした皿の上に、０．０９４×１０６細胞／ｃｍ２で単一細胞として播種した。Ｙ化合物を、播種後最初の２４時間の間にのみ添加した。播種の４８時間後、培養物をＰＢＳ（−／−）中で洗浄した。
【０２０２】
図７Ａ〜７Ｍについて、以下のプロトコルを用いて培養物を分化させた。プロトコルのステージ１〜４の間、培養物を平面付着培養上で維持した。Ｓ４Ｄ３単分子層又は凍結保存したＳ４Ｄ３細胞から開始して、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを調製し、更に４８時間培養した（ステージ４の５日目、すなわちＳ４Ｄ５）。培地は分化プロトコル全体にわたって毎日交換した。ステージ５、６、及び７の間、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを、ステージ６が６日間と比較して７日間にわたって起こることを除き、実施例３に記載したように懸濁培養において培養した。
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を以下のステージ１培地、すなわち、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８、及び１．５μＭのＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８、及び０．１μＭ  ＧＳＫ−３β阻害剤が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で、細胞を更に１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１中で、細胞を更に１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で、細胞を２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；２５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１μＭ  ＲＡ；０．２５ｍＭアスコルビン酸、３００ｎＭのＴＰＢ」）；及びＬＤＮ−ＨＣｌが２日間補充されたＢＬＡＲ００１カスタム培地で細胞を２日間処理した。ステージ３の１日目に使用したＬＤＮ−ＨＣｌの濃度は１００ｎＭであり、ステージ３の２日目については１０ｎＭであった。
ｄ．ステージ４（３日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ；２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、７０ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；０．２５ｍＭアスコルビン酸；及び２００ｎＭ  ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞を３日間処理した。
ステージ４の３日目の単分子層の凍結保存：Ｓ４Ｄ３単分子層からの凍結保存した細胞バンクを、実施例３及び表ＶＩＩに概説する手順によって確立した。
ｅ．凍結保存したＳ４Ｄ３単分子層細胞の解凍：５．０×１０６のＳ４Ｄ３単分子層細胞を含む凍結した５ｍＬバイアルを実施例３に記載したように解凍した。
ｆ．Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター移行のためのステージ４（２日間）：Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを、実施例３に記載したように、ステージ４の３日目の単分子層細胞又は解凍した凍結保存したステージ４の３日目の細胞から生成した。
ｇ．ステージ５（３日間）：Ｓ４Ｄ５  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターをＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００ＥＸプレートから回収し、３日間ステージ５培地中に、細胞密度１５０〜２００万細胞／ｍＬ、回転速度２７ｒｐｍ（毎分の回転数）のＰＢＳ０．１ＭＡＧスピナーに移した。２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１；５０ｎＭ  ＲＡ；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；１μＭのＴ３；及び１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞を処理した。４ｋＵ／ｍＬ  ＤＮａｓｅＩ及び５μＭ  Ｙ化合物をステージ５の１日目にのみ補充した。
ｈ．ステージ６（７日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；１μＭのＴ３；１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び１００ｎＭのガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸが補充されたＢＬＡＲ００１培地で、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを処理した。
ｉ．ステージ７（６日間〜７日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）、１０ｎＭのＴ３（「低Ｔ３」）；１ｍＭ  ＮＡＣ；０．５μＭ  ＺＭ」）；及び製剤Ｉ（「ＦＩ」）を構成する以下の成分すなわち、１：２００希釈のＲＰＭＩビタミン補助剤；１：２００希釈のＭＥＭ非必須アミノ酸補助剤；１：２０００希釈の既知組成脂質濃縮物；１：２００希釈のピルビン酸ナトリウム；１：２０００希釈の微量元素Ａ；１：２０００希釈の微量元素Ｂが補充されたＢＬＡＲ００１培地又はＢＬＡＲ００４培地のいずれかで、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを７日間処理した。ステージ７の間に添加した追加の成分には、４μＭ  ＡＺＴ、又は１μＭ  ＤＥＺＡのいずれかが含まれた。明確にするために、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、上に記載した濃度（ＢＬＡＲ００１系培地又はＢＬＡＲ００４系培地のいずれか）を用いた２つの条件、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ；（ｉｉ）ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡでステージ７の間に培養した。
【０２０３】
ステージ５、６、及び７については、細胞培養を、Ｓ４Ｄ５  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター又はＳ４Ｄ３移行ＡＬＩクラスターのいずれかで開始することによって条件付けた。Ｓ４Ｄ５  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターをＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００ＥＸプレートから回収し、細胞密度１５０〜２００万細胞／ｍＬで、回転速度２７ｒｐｍ（毎分の回転数）のＰＢＳ０．１ＭＡＧスピナーに移した。
【０２０４】
分化した細胞の定量化及び特徴付け：ステージ７のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター及びヒト膵島を、実施例２及び３に記載したようにＩＦ、ＦＡＣＳ、及びｑＲＴ−ＰＣＲによって特徴付けた。
【０２０５】
図７Ａは、これをとおして（ｉ）新たなＳ４Ｄ３単分子層又はＳ４Ｄ３凍結保存細胞をＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターへと組み立て、（ｉｉ  ＆  ｉｉｉ）ステージ５、６、及び７をとおして懸濁培養によって条件付けて、（ｉｖ）Ｓ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを生成する手順を描出する。Ｓ６Ｄ６  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター（図６Ｆ〜６Ｇ）において観察されたように、ステージ７の間に「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩのＢＬＡＲ００１」によって培養したＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、ベースラインのベータ細胞タンパク質プロファイルを維持した（図７Ｂ〜７Ｃ）。細胞の８９％がＮＫＸ６．１＋  ＣＨＧＡ＋（左、図７Ｂ）、７７．７％がＮＫＸ６．１＋  ＮＥＵＲＯＤ１＋（右、図７Ｂ）、４０．８％がＮＫＸ６．１＋インスリン＋（左、図７Ｃ）であった。ＩＮＳＵＬＩＮ陽性集団（全細胞の４６．４％がインスリン＋であった）の大部分がＮＫＸ６．１＋（左、図７Ｃ）であり、グルカゴン陽性（３．９％インスリン＋グルカゴン＋；（右、図７Ｃ）ではなかった。
【０２０６】
ベースラインのベータ細胞プロファイルに加えて、成熟マーカーであるＭＡＦＡ（図７Ｄ）、ＵＣＮ３（図７Ｅ）、ＳＬＣ２Ａ１（図７Ｆ）、Ｇ６ＰＣ２（図７Ｇ）、インスリン（図７Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図７Ｉ）の遺伝子発現が、ステージ７「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩのＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」で条件付けられたＳ７Ｄ７  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターにおいてヒト膵島レベルであったか又はそれを上回った。ＭＡＦＡ（図３Ｃ）、Ｇ２ＰＣ２（図３Ｆ）、インスリン（図３Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（図３Ｌ）などの成熟マーカーのＳ７Ｄ７での発現レベルは、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）（「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩのＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」）においてはるかに、次にＡＬＩクラスターにおいて高かった。
【０２０７】
実際に、図７Ｊ〜７Ｍは、ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」ステージ７条件付けに加えることで、かなりの数の非グルカゴン（図７Ｊ；下段、右）Ｃ−ペプチド細胞（タンパク質存在の観点からＳ７Ｄ７で共発現した）、ＰＤＸ１（図７Ｊ；下段、左）、ＮＫＸ６．１（図７Ｊ；下段、中央）、ＭＡＦＡ（図７Ｋ；下段、左）、ＵＣＮ３（図７Ｋ；下段、中央）、及びＳＬＣ２Ａ１（図７Ｋ；下段、右）が生成されたことを実証する。各図面について、ＩＦ染色が、Ｃ−ペプチドについて上段に単一チャネルとして示される。ＭＡＦＡ、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＣＮ３のタンパク質存在は、Ｃ−ペプチド陽性細胞に限定されないが、細胞集団の少なくとも約１０％が、Ｃ−ペプチド、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＳＬＣ２Ａ１、及びＵＣＮ３の共発現を示すことが予測される。対照的に、図７Ｌ〜７Ｍは、タンパク質存在の観点から、Ｓ７Ｄ７成熟マーカーＰＤＸ１の部分的な集合（図７Ｌ；下段、左）、ＮＫＸ６．１（図７Ｌ；下段、中央）、ＭＡＦＡ（図７Ｍ；下段、左）、ＳＬＣ２Ａ１（図７Ｍ；下段、右）によって共発現されるが、グルカゴン（図７Ｌ；下段、右）及びＵＣＮ３（図７Ｍ；下段、中央）によっては共発現されないＣ−ペプチド細胞の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」特異的ステージ７条件付けによる生成を実証する。Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターのステージ７「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」条件付けにより、遺伝子発現及びタンパク質存在によって評価されるように、かなりの数の成熟成人ヒト膵島に類似した成熟ベータ細胞が生成された。
【０２０８】
要約すると、この実施例は、ステージ４細胞クラスターが、ステージ７条件付けの変化によって機能的ベータ細胞に向けた懸濁培養において更に分化することができること実証する。具体的には、実施例４は、懸濁培養中の細胞クラスターの中の、ベータ細胞の適切な機能性に必須であるベータ細胞成熟マーカーを共発現するＣ−ペプチド細胞の生成を示す。
【０２０９】
（実施例５）
成熟ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びグルコース刺激性インスリン分泌動態を有する内分泌細胞の懸濁培養生成
以下の実施例は、ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びグルコース刺激性インスリン分泌（「ＧＳＩＳ」）動態を有する機能的に成熟したベータ細胞の懸濁培養による生成を実証する。培養条件は実施例４と同じである。２８代継代でＥＺ８培地で培養したＨ１−ｈＥＳＣ細胞株の細胞を、１０μＭのＹ化合物が補充された、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、０．２５ｍＭアスコルビン酸、１００ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ、１：１００希釈のＩＴＳ−Ｘ、２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１の培地中のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）を１：３０希釈でコーティングした皿の上に、０．０９４×１０６細胞／ｃｍ２で単一細胞として播種した。Ｙ化合物を、播種後最初の２４時間の間にのみ添加した。播種の４８時間後、培養物をＰＢＳ（−／−）中で洗浄した。
【０２１０】
図８Ａ〜８Ｉについて、以下のプロトコルを用いて培養物を分化させた。プロトコルのステージ１〜４の間、培養物を平面付着培養上で維持した。Ｓ４Ｄ３単分子層又は凍結保存したＳ４Ｄ３細胞から開始して、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）細胞クラスターを調製し、更に４８時間培養した（ステージ４の５日目、すなわちＳ４Ｄ５）。培地は分化プロトコル全体にわたって毎日交換した。ステージ５、６、及び７の間、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを、実施例３に記載したように懸濁培養において培養した。図８Ｅ〜８Ｆに示すＡＬＩクラスターは、実施例２に記載したように培養した。簡潔には、
ａ．ステージ１（３日間）：細胞を以下のステージ１培地、すなわち、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８、及び１．５μＭのＭＣＸ化合物が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８、及び０．１μＭ  ＧＳＫ−３β阻害剤が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で、細胞を更に１日培養した。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ８が補充されたＭＣＤＢ−１３１中で、細胞を更に１日培養した。
ｂ．ステージ２（２日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で、細胞を２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；２５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、１μＭ  ＲＡ；０．２５ｍＭアスコルビン酸、３００ｎＭのＴＰＢ」）；及びＬＤＮ−ＨＣｌが２日間補充されたＢＬＡＲ００１カスタム培地で細胞を２日間処理した。ステージ３の１日目に使用したＬＤＮ−ＨＣｌの濃度は１００ｎＭであり、ステージ３の２日目については１０ｎＭであった。
ｄ．ステージ４（３日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ；２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、７０ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；０．２５ｍＭアスコルビン酸；及び２００ｎＭ  ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ００１培地で、細胞を３日間処理した。
ｅ．ステージ４の３日目の単分子層の凍結保存：Ｓ４Ｄ３単分子層からの凍結保存した細胞バンクを、実施例３及び表ＶＩＩに概説する手順を使用して確立した。
ｆ．凍結保存したＳ４Ｄ３単分子層細胞の解凍：５．０×１０６のＳ４Ｄ３単分子層細胞を含有する凍結した５ｍＬバイアルを実施例３に記載したように解凍した。同じ手順をＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターのいずれかの移行に適用することができる。
ｇ．Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター移行又はＳ４Ｄ３  ＡＬＩクラスター移行のためのステージ４（２日間）：Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを、実施例３に記載したように、ステージ４の３日目の単分子層細胞又は解凍した凍結保存したステージ４の３日目の細胞から生成した。ＡＬＩクラスターを、実施例２に記載したようにステージ４の３日目の細胞で生成した。
実施例４と同様、ステージ５、６、及び７については、細胞培養を、Ｓ４Ｄ５  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター又はＳ４Ｄ３移行ＡＬＩクラスターのいずれかで開始することによって条件付けた。Ｓ４Ｄ５  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターをＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）４００ＥＸプレートから回収し、細胞密度１５０〜２００万細胞／ｍＬで、回転速度２７ｒｐｍ（毎分の回転数）のＰＢＳ０．１ＭＡＧスピナーに移した。
ｈ．ステージ５（３日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１；５０ｎＭ  ＲＡ；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；１μＭのＴ３；及び１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ００１培地で、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）又はＡＬＩクラスターを３日間処理した。４ｋＵ／ｍＬ  ＤＮａｓｅＩ及び５μＭ  Ｙ化合物を、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターについて、ステージ５の１日目にのみ補充した。
ｉ．ステージ６（７日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；１μＭのＴ３；１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び１００ｎＭのガンマセクレターゼＸＸが補充されたＢＬＡＲ００１培地中で、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）又はＡＬＩクラスターを処理した。
ｊ．ステージ７（７日間〜１４日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）、１０ｎＭのＴ３（「低Ｔ３」）；１ｍＭ  ＮＡＣ；０．５μＭ  ＺＭ」）；及び製剤Ｉ（「ＦＩ」）を構成する以下の成分、すなわち、１：２００希釈のＲＰＭＩビタミン補助剤；１：２００希釈のＭＥＭ非必須アミノ酸補助剤；１：２０００希釈の既知組成脂質濃縮物；１：２００希釈のピルビン酸ナトリウム；１：２０００希釈の微量元素Ａ；１：２０００希釈の微量元素Ｂが補充されたＢＬＡＲ００１培地又はＢＬＡＲ００４培地のいずれかで、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターを７日間処理した。ステージ７の間に添加した追加の成分には、４μＭ  ＡＺＴ、又は１μＭ  ＤＥＺＡのいずれかが含まれた。明確にするために、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）又はＡＬＩクラスターは、上に記載した濃度（ＢＬＡＲ００１系培地又はＢＬＡＲ００４系培地のいずれか）を用いた２つの条件、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ；（ｉｉ）ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡでステージ７の間に培養した。図８Ａ、８Ｂ、８Ｈ、８Ｉ：ステージ７の間、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌクラスターを２つの条件、すなわち、（ｉ）ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、０．５μＭ  ＺＭ、１０μｇ／ｍＬ  Ｈ、１ｍＭ  ＮＡＣ；（ｉｉ）Ｓ７Ｄ１〜Ｓ７Ｄ５−ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、０．５μＭ  ＺＭ、１０μｇ／ｍＬ  Ｈ、１ｍＭ  ＮＡＣ；５μＭ  ＡＺＴ；１μＭ  ＤＥＺＡ；Ｓ７Ｄ６〜Ｓ７Ｄ１３又はＳ７Ｄ１４−ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、０．５μＭ  ＺＭ、１０μｇ／ｍＬ  Ｈ、１ｍＭ  ＮＡＣで、Ｓ７Ｄ１３又はＳ７Ｄ１４へと培養した。
【０２１１】
分化した細胞の定量化及び特徴付け：Ｓ６Ｄ７  ＡＬＩクラスターのグルコース依存性ミトコンドリア活性の定量化のため、ステージ７のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター及び成熟ヒト膵島細胞を、実施例２に記載したようにＳｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ２４デバイスによって特徴付けた。ＡＬＩ／Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター又はヒト膵島を回収し、それらの酸素消費速度（「ＯＣＲ」）を、２０ｍＭ  Ｄ−グルコースの注射の前後にＸＦｅ２４  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ上で測定した。ＡＬＩ／Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター又はヒト膵島をそれらのステージ７条件付けから除去し、３７℃の非ＣＯ２環境とベースラインＯＣＲを達成するように設計された培地との両方において２時間インキュベートした。プレインキュベーション培地は、ＸＦベース培地中に１ｍＭ  Ｄ−グルコース、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有した。プレインキュベーション後、ＡＬＩ／Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター又はヒト膵島をＳｅａｈｏｒｓｅマシンにロードし、ここで以下の測定、すなわち、（ｉ）ベースラインＯＣＲを３回（Ｄ−グルコース注射前）；（ｉｉ）Ｄ−グルコース後を５回（注射後インキュベーション時間：７２分）を行った。全てのＯＣＲ測定値を、個々のサンプルのＤＮＡ含有量に対して正規化した。ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＭｉｃｒｏＫｉｔによって単離し、ＤＮＡ含有量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００  ＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒによって測定した。
【０２１２】
グルコース依存性インスリン分泌の定量化のため、ステージ７のＡＬＩクラスター、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター、及び成熟ヒト膵島を、細胞洗い流し（cell perifusion）システム（ＢｉｏＲｅｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ、カタログ番号ＰＥＲＩ４−０２）によって特徴付けた。簡潔には、インスリン分泌をベースラインに対して正規化するために、ＡＬＩ／Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター又はヒト膵島を温かい（３７℃）クレブス緩衝液（表ＩＸ）に移した。細胞を洗い流しチャンバ（ＢｉｏＲｅｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＥＲＩ−ＣＨＡＭＢＥＲ）にロードし、以下、すなわち、（ｉ）３ｍＭ  Ｄ−グルコース；（ｉｉ）１６．７ｍＭ  Ｄ−グルコース±１００ｎｇ／ｍＬエキセンジン−４（「Ｅｘ４」）；及び（ｉｉｉ）３ｍＭ  Ｄ−グルコースを含む２５ｍＭ  ＫＣｌのいずれかが補充された４つの逐次的なクレブス緩衝液を用いて継続的に潅流させた（流量１００μＬ／分）。具体的な洗い流しプロトコルを各図面に示す。潅流液サンプルを毎分収集し、Ｃ−ペプチドタンパク質レベル（単位ｎｇ／ｍＬ）をＣ−ＰＥＰＴＩＤＥ  ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ、カタログ番号１０−１１３６−０１）によって検出した。
【０２１３】
【表１２】
2019518465.tif 000016
【０２１４】
図８Ａ及び８Ｂは、２０ｍＭ  Ｄ−グルコースに対する懸濁液中のＳ７Ｄ１３  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターのミトコンドリア応答を示す。図８Ａ及び８Ｂは、ＯＣＲが注射後（「ｉｐ」）１５分（「分」）でベースラインを１２３．３％±１２．９２超えたことによって実証されるとおり、ヒト膵島（黒丸の線）が高Ｄ−グルコースに急速に応答し、経時的に高いＯＣＲ（１３１．５％±１１．３２；注射後７２分）を維持したことを示す。逆に、未成熟Ｃ−ペプチド陽性細胞について富化されたＳ６Ｄ７  ＡＬＩクラスター（灰色三角形の線）は、高いＤ−グルコースに対する急速なＯＣＲ応答を欠き（１０４．４％±３．３７；注射後１５分）、経時的に比較的弱いＯＣＲ応答を呈した（１１３．３％±４．５１；注射後７２分）。ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態が、懸濁液中のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターとの関連でＳ７Ｄ１３の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件で観察された（１１０．７％±２．４６−注射後１５分；１２５．９％±２．２７−注射後７２分）（灰色四角形の線）（図８Ａ）。対照的に、「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００１又はＢＬＡＲ００４」Ｓ７Ｄ７  ＡＬＩクラスターは、ヒト膵島レベルのグルコース依存性ミトコンドリア呼吸動態を示さなかった（図５Ｃ及び５Ｅ）。加えて、懸濁液中の「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＡＺＴ、ＤＥＺＡ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、高いグルコース刺激に応答して、ヒト膵島レベルをはるかに上回る酸素を消費した（１６２．０％±１１．５１−注射後１５分；１７７．１％±０．９９−注射後７２分）（灰色四角形の線）（図８Ｂ）。ＤＥＺＡ及びＡＺＴはステージ７条件付けの最初の４日間のみ投与したため、ＡＺＴ及びＤＥＺＡによってもたらされた機能的なミトコンドリア応答性がステージ７のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターにおいて少なくとも１０日間は安定であったことが示唆された。
【０２１５】
図８Ｃは、ヒト膵島内の成熟ベータ細胞が、グルコース刺激に応答して急速な二相性インスリン分泌を複数ラウンド行う能力を呈したことを実証する。第２の二相性ＧＳＩＳ応答は第１の応答と比較して鈍かった（約７〜８倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）。また、ヒト膵島は、インスリン分泌の「オン−オフ」切り替えを複数ラウンド行う能力、及びＫＣｌによって媒介される膜の脱分極の際に多大なインスリン顆粒の放出を行う能力を実証した。試験した全ての条件により、ＫＣｌに対する強力なインスリン分泌応答が示された（図８Ｃ〜８Ｉ）。エキセンジン−４（「Ｅｘ４」）の添加は、示されるヒト膵島におけるＧＳＩＳ応答の大きさを増大させなかったが、ＡＬＩ又はＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）ＧＳＩＳプロファイルに対する比較のために含めた（図８Ｄ）。ＢＬＡＲ００１（図８Ｅ）又はＢＬＡＲ００４（図８Ｆ）のいずれかでの「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ」においてステージ７の間に条件付けられたＳ７Ｄ８〜Ｓ７Ｄ１０−ＡＬＩクラスターは、単一の二相性ＧＳＩＳ応答は示したが（約４〜１０倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、第２の二相性ＧＳＩＳ応答は示さず、また比較的遅い二相性ＧＳＩＳ応答であった。また、ＡＬＩクラスターは、刺激後の３ｍＭ  Ｄ−グルコースの再潅流時にインスリン分泌の第２の相を遮断する能力を有しなかった。対照的に、「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩのＢＬＡＲ００４」でステージ７の間に条件付けたＳ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、強力な第１の二相性ＧＳＩＳ（約５倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、続いてＧＳＩＳを完全に遮断する能力、及び弱い第２の単相応答を呈した（図８Ｇ）。ＤＥＺＡ及びＡＺＴを「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＦＩ、ＢＬＡＲ００４」条件付けに添加することにより、Ｓ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターは、複数ラウンドのヒト膵島に類似した二相性ＧＳＩＳ（約５〜７倍の第１のＧＳＩＳ応答の第１の相）、及び高グルコースパルス間でＧＳＩＳを完全に遮断する能力を呈した（図８Ｈ〜８Ｉ）。図８Ｈ及び８Ｉは、「ＡＬＫ５なし、低Ｔ３、ＺＭ、Ｈ、ＮＡＣ、ＤＥＺＡ、ＡＺＴのＢＬＡＲ００４」Ｓ７Ｄ１４  Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスター条件の２つの生物学的複製を表す。図８Ｈ〜８Ｉでは、ＤＥＺＡ及びＡＺＴはステージ７条件付けの最初の４日間のみ投与したため、ＡＺＴ及びＤＥＺＡによってもたらされた頑強な二相性ＧＳＩＳ応答がステージ７のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ（商標）クラスターにおいて少なくとも１０日間は安定であったことが示唆された。
【０２１６】
要約すると、実施例５は、ヒト膵島に類似したグルコース依存性ミトコンドリア呼吸及びＧＳＩＳ動態を有する、細胞凝集及び懸濁培養によるｈＥＳＣ由来機能的ベータ細胞の生成（ステージ７）を実証する。
【０２１７】
【表１３−１】
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【０２１８】
【表１３−２】
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【０２１９】
【表１３−３】
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【０２２０】
【表１４−１】
2019518465.tif 000020
【０２２１】
【表１４−２】
2019518465.tif 000021
【０２２２】
【表１４−３】
2019518465.tif 000022
【０２２３】
【表１４−４】
2019518465.tif 000023
【０２２４】
【表１４−５】
2019518465.tif 000024
【０２２５】
【表１４−６】
2019518465.tif 000025
【０２２６】
【表１４−７】
2019518465.tif 000026
【０２２７】
【表１４−８】
2019518465.tif 000027
【０２２８】
【表１４−９】
2019518465.tif 000028
【０２２９】
【表１５】
2019518465.tif 000029
【０２３０】
上記の実施例は、典型的には細胞周期阻害剤として機能する様々な小分子を記載するが、予期せず本明細書の発明において記載されるまで、それらは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＳＬＣ２Ａ１を含む主要な成熟ベータ細胞マーカーの発現を誘導する。
【０２３１】
（実施例６）：
複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来の膵内胚葉の生成。
以下の実施例は、複数の懸濁培養形式（ローラボトル、及びＰＢＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクター）での分化プロトコルを利用する、ヒト多能性幹細胞、特に、ＣｙＴ４９ヒト胚幹細胞株（「ｈＥＳＣ」）由来の膵内胚葉細胞の改善した生成を実証する。表ＸＩＩＩに、ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来膵内胚葉に行った特定の増強を列挙する。具体的には、ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣから生成された膵内胚葉は、共にインスリン産生細胞の更に効率的な生成のために重要な要件である代替的内胚葉系統及び内分泌分化の両方のより低い普及率を呈し、Ｈ１  ｈＥＳＣ由来膵内胚葉により似ている（実施例３）。更に、ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来膵内胚葉を生成するために必要な時間が５日間短縮される。新たなＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来膵内胚葉プロトコルは、ローラボトル形式及びバイオリアクター形式に応用することができるため、スケールアウト製造及びスケールアップ製造の両方を可能にする。
【０２３２】
【表１６】
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【０２３３】
表ＸＩＶは、改善したＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来膵内胚葉の生成のための分化プロトコルに行った主な調整を概説する。主な差異には、ステージ３〜４中のＢＭＰ阻害の欠如、並びに基本培地としてのＭＣＤＢ１３１（ステージ１〜２）及びＢＬＡＲ００１（ステージ３〜４）の使用が含まれる。
【０２３４】
【表１７】
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【０２３５】
機能している細胞バンク４Ａ（「ＷＣＢ４Ａ」）の２７代継代のヒト胚幹細胞株ＣｙＴ４９（「ＣｙＴ４９−ｈＥＳＣ」；ＮＩＨ登録００４１）の細胞を、以下の、すなわち、１：１００倍ＧｌｕｔａＭＡＸを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）栄養混合物Ｆ−１２（「ＤＭＥＭ−Ｆ１２」；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号１０５６５）、１：１０希釈（「１０％濃度」）のＸｅｎｏＦｒｅｅ（「ＸＦ」）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（「ＫＳＲ」；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２６１８）、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＭＥＭ非必須アミノ酸、１：１００希釈（「１倍濃度」）のペニシリン−ストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍＬのヒトアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、カタログ番号３３８−ＡＣ）、及び１０ｎｇ／ｍＬヒトヘレグリン−ベータ１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、カタログ番号１００−０３）の増殖培地中で組織培養物によって処理した皿の上に０．０３３×１０６細胞／ｃｍ２で単一細胞として播種した。１：１０希釈のヒト血清ＡＢ（「１０％濃度」；Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ、カタログ番号ＨＰ−１０２２）は、播種後最初の２４時間の間にのみ使用した。播種の９６時間後、コンフルエントなＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ培養物を上述の増殖培地中で継代した。代替的に、コンフルエントなＣｙＴ４９  ｈＥＳＣを、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号ＡＭ１０５）処理（３７℃で３分間）によって単一細胞懸濁液として放出させ、１：１００倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０５６５）、１倍濃度のペニシリン−ストレプトマイシン、１：５０希釈のＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＭＥ１３００７０Ｌ１）、１０ｎｇ／ｍＬヒトアクチビンＡ、１０ｎｇ／ｍＬヒトへレグリン−ベータ１、及び２００ｎｇ／ｍＬ  ＬＲ３−ＩＧＦ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、カタログ番号ＬＲＭ００１）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２の培地においてローラボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、カタログ番号ＣＬＳ４３１６４４）中で速度３１ｒｐｍ及び濃度１ｍＬあたり１００万細胞で凝集させた。
【０２３６】
図９Ａ〜９Ｑについて、培養物を、懸濁培養形式で以下のプロトコル（図９Ａに描出する）を使用して分化させた。プロトコルのステージ１〜４の間、懸濁培養を、３１ｒｐｍの２リットルのローラボトル（「ＲＢ」）、４５ｒｐｍの０．１ＰＢＳ  Ｍｉｎｉ又は０．５ＰＢＳ  Ｍｉｎｉ  ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクター（ＰＢＳＢｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａ）いずれかの中に維持した。「０．１ＰＢＳ」は、１００ｍＬ  Ｍｉｎｉ  ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクターを指し、「０．５ＰＢＳ」は、５００ｍＬ  Ｍｉｎｉ  ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクターを指す。ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ凝集体を、１ｍＬあたり約１８〜３６万細胞で、５００ｍＬ培地体積の２リットルのローラボトル、１００ｍＬ培地体積の０．１ＰＢＳ  Ｍｉｎｉ、又は５００ｍＬ培地体積の０．５ＰＢＳ  Ｍｉｎｉの中に投入した。細胞培養培地は毎日交換した。
ａ．ステージ１（２日間）：分化していないＥＳ凝集体を以下のステージ１培地、すなわち、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１：１００希釈（「１倍濃度」）のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、最終濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬヒトアクチビンＡ、５０ｎｇ／ｍＬマウスＷｎｔ３Ａ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１３２４−ＷＮ）、及び１：１００００希釈のＩＴＳ−Ｘ（「インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン」；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、カタログ番号５１５０００５６）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で１日培養した：。次に、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬヒトアクチビンＡ、及び１：１００００希釈のＩＴＳ−Ｘが補充されたＭＣＤＢ−１３１培地中で、細胞を更に１日培養した。
ｂ．ステージ２（３日間）：２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、０．５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ、１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．２５ｍＭアスコルビン酸、及び５０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子７（「ＦＧＦ７」；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号ＡＦ−１００−１９）が補充されたＭＣＤＢ−１３１培地で、凝集体を２日間処理した。
ｃ．ステージ３（２日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；０．２５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；２５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１（Ｎ−［（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレン］−４−（フェニルメチル）−１−ピペラジンアミン）；１μＭレチノイン酸（「ＲＡ」）；０．２５ｍＭアスコルビン酸；及び３００ｎＭのＰＫＣ活性因子（（２Ｓ，５Ｓ−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−トリフルオロメチル）フェニル−２，４，−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム（「ＴＰＢ」）が２日間補充されたＢＬＡＲ００１カスタム培地で、凝集体を２日間処理した。
ｄ．ステージ４（３日間）：３．６ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；濃度１０ｍＭのＤ−グルコースを得るための４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；０．２５％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１、５０ｎＭ  ＲＡ；２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７、０．２５ｍＭアスコルビン酸；及び３００ｎＭ  ＴＰＢが補充されたＢＬＡＲ００１培地で、凝集体を３日間処理した。
【０２３７】
全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，４４５，２７３号、同第８，８９５，３００号は、少なくとも以下に列挙するプロトコルによって生成されるＰＥＣ−０１（「膵内胚葉細胞−０１」）ｄ１５を記載する。ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ凝集体を、１ｍＬあたり１．０μＬ〜２．０μＬの凝集体ペレット体積（「ＡＰＶ」）で投入した。以下のプロトコルのステージ１〜４は、３１ｒｐｍで回転する体積の２リットルのローラボトル中に５００ｍＬで懸濁培養として維持した。
ａ．ステージ１（２日間；ｄ１〜ｄ２）：分化していないＥＳ凝集体を、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；０．２％ウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」；ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  Ｕｔａｈ、カタログ番号ＳＨ３００７０．０３）；１倍濃度のペニシリン−ストレプトマイシン；１：５０００希釈のＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、カタログ番号４１４００）；１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ；及び５０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３Ａが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１８７０−０７６）で１日処理した。次に、細胞を、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；０．２％ウシ胎仔血清；１倍濃度のペニシリン−ストレプトマイシン；１：５０００希釈のＩＴＳ；１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ；及び５０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３Ａが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１８７０−０７６）で１日処理した。
ｂ．ステージ２（３日間；ｄ３〜ｄ５）：凝集体を、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；０．２％ウシ胎仔血清；１倍濃度のペニシリン−ストレプトマイシン；１：１０００希釈のＩＴＳ；２５ｎｇ／ｍＬヒトＦＧＦ７；及び２．５ｕＭ形質転換増殖因子−ベータ阻害剤ＩＶ（「ＴＧＦ−β」；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、カタログ番号６１６４５４）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地で１日処理した。次に、細胞を、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；０．２％ウシ胎仔血清；１倍濃度のペニシリン−ストレプトマイシン；１：１０００希釈のＩＴＳ；及び２５ｎｇ／ｍＬヒトＦＧＦ７が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地で更に２日間培養した。
ｃ．ステージ３（３日間；ｄ６〜ｄ８）：凝集体を、１：５０希釈のＢ−２７補助剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１７５０４−０４４）；１倍濃度のペニシリン−ストレプトマイシン；１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１：１０００希釈のＩＴＳ；３ｎＭ  ＴＴＮＰＢ（「４−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸」；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、カタログ番号Ｔ３７５７）；０．２５ｕＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（「３−ケト−Ｎ−アミノエチル−Ｎ’−アミノカプロイルジヒドロシンナモイルシクロパミン」；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｙｏｒｋ，Ｃａｎａｄａ、カタログ番号Ｋ１７１０００）；及び５０ｎｇ／ｍＬヒトノギン（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３３４４−ＮＧ）が補充されたＤＭＥＭ−ＨＩグルコース培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１９６０−０５１）で３日間処理した。
ｄ．ステージ４（３日間；ｄ９〜ｄ１２；ｄ１２は「ＰＥＣ−０１  ｄ１２」と称する）：凝集体を、１：５０希釈のＢ−２７補助剤；１倍濃度のペニシリン−ストレプトマイシン；１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；５０ｎｇ／ｍＬヒト上皮増殖因子（「ＥＧＦ」；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号ＡＦ−１００−１５）；５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７；及び５０ｎｇ／ｍＬヒトノギンが補充されたＤＭＥＭ−ＨＩグルコース培地で３日間処理した。
ｅ．ｄ１２での凍結保存：凝集体を、１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１５％濃度のＤＭＳＯ（「ジメチルスルホキシド」；Ｏｒｉｇｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ、カタログ番号ＣＰ−１０）；６０％濃度のＸＦ不含ＫＳＲ；及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（「Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸」；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１５６３００８０）が補充されたＤＭＥＭ−ＨＩ  Ｇｌｕｃｏｓｅ培地中に再懸濁させた。ｄ１２凝集体を、以下のプロトコル、すなわち、（１）開始温度−２．０Ｃ；（２）−２．０Ｃ／分で−９．０Ｃまで；（３）−９．０Ｃにて１０分間、そして手動で凍結を開始；（４）−０．２Ｃ／分で−４０Ｃまで；（５）−２５Ｃ／分で−１５０Ｃまで；（６）液体窒素貯蔵庫に移す、を使用して、速度制御冷凍庫（「ＣＲＦ」；Ｐｌａｎｅｒ  ＰＬＣ，Ｓｈｅｐｐｅｒｔｏｎ  Ｓｕｎｂｕｒｙ−ｏｎ−Ｔｈａｍｅｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、カタログ番号Ｋｒｙｏ  ５６０−１６）中で凍結保存した。
ｆ．凍結保存後からＰＥＣ−０１まで（３日間；ｄ１３〜ｄ１５）：凝集体を、１：５０希釈のＢ−２７補助剤；１倍濃度のペニシリン−ストレプトマイシン；１倍濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；５０ｎｇ／ｍＬヒト上皮増殖因子（「ＥＧＦ」；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号ＡＦ−１００−１５）；５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７；及び５０ｎｇ／ｍＬヒトノギンが補充されたＤＭＥＭ−ＨＩグルコース培地で３日間処理した。１日目にのみ、１０Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ番号０４５３６２８２００１）を培地に補充した。
【０２３８】
分化した細胞の特徴付け：２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、又は０．５ＰＢＳ懸濁培養法を利用する遺伝子発現の定量化のため、ＣｙＴ４９−ｈＥＳＣ、ステージ４の３日目（「Ｓ４Ｄ３」）、及びＰＥＣ−０１  ｄ１５の凝集体を、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，（３２）１１，１１２１〜１１３３に記載されているように回収した。遺伝子発現を、カスタムＴａｑｍａｎ  Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して細胞中で評価した。配列検出用ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてデータを解析し、ΔΔＣｔ法を用いて、未分化ＣｙＴ４９−ｈＥＳＣに対してハウスキーピング遺伝子としてのＧＡＰＤＨを用いて正規化した。プライマーの詳細を、表ＸＶに概説する。
【０２３９】
【表１８】
2019518465.tif 000032
【０２４０】
２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、又は０．５ＰＢＳ懸濁培養法を利用するタンパク質存在共局在性の定量化のため、ＣｙＴ４９−ｈＥＳＣ、ステージ４の３日目（「Ｓ４Ｄ３」）、及びＰＥＣ−０１  ｄ１５の凝集体を回収し、蛍光活性化フローサイトメトリー（「ＦＡＣＳ」）によって分析した。ＦＡＣＳ染色は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４（３２）１１，１１２１〜１１３３に記載されるように、かつ表ＸＶＩに列挙される抗体を使用して行った。分化した細胞を、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号ＡＭ１０５）中で室温で２０分間インキュベートし、単一細胞懸濁液中に放出させた後、ａｕｔｏＭＡＣＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ緩衝液（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１２０−０９１−２２１）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（「４％  ＰＦＡ」；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１５８１２７）中で室温で３０分間固定し、続いてａｕｔｏＭＡＣＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ緩衝液中で２回洗浄した。続いて、細胞を適切な抗体（表ＸＶＩ）を用いてインキュベートした後、獲得される事象を少なくとも３０，０００にしてＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを用い、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで分析した。ＦＡＣＳ分析中、非生細胞は除外し、ゲーティングはアイソタイプ抗体（「ＩｇＧ」）を用いて決定した。
【０２４１】
【表１９】
2019518465.tif 000033
【０２４２】
２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、又は０．５ＰＢＳ懸濁培養法を利用する細胞収率の定量化のため、ＣｙＴ４９−ｈＥＳＣ及びステージ４の３日目（「Ｓ４Ｄ３」）の凝集体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−１００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ、カタログ番号ＮＣ−１００）によって計数した。
【０２４３】
図９Ａは、新たなプロトコルを利用してＣｙＴ４９  ｈＥＳＣを膵内胚葉（例えば、Ｓ４Ｄ３）に向かって分化させる方法を描出する。ここでＰＥＣ−０１  ｄ１２及びＰＥＣ−０１  ｄ１５を、先行技術の例として取り上げる。懸濁液培養方法、つまり２リットルのローラボトル又は０．１ＰＢＳ若しくは０．５ＰＢＳ縦型ホイールバイオリアクターを、膵内胚葉中間体を介したインスリン産生細胞の商業規模の生成に対するそれらの互換性に基づいて用いた。２リットルのローラボトル形式は、膵内胚葉細胞のスケールアウトに有用なツールであるが、インスリン産生細胞の最終的な商業規模には理想的ではない。ＰＢＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクターシステムは、体積を増大させ、経時的に小さい／コンパクトな凝集体サイズを維持しながら、インスリン産生細胞の産生を累進的に改善する能力を提供することになる、代替的なスケールアップシステムである。図９Ｂは、予測したように、Ｓ４Ｄ３での細胞収率が、ｈＥＳＣ投入と比べた細胞数の著しい拡大を反映することを実証する。ｈＥＳＣ投入に対するＳ４Ｄ３細胞の比率は、新たなプロトコルを利用する懸濁培養法全てにわたって一貫し、２リットルのローラボトルについて４．３０±０．７８２、０．１ＰＢＳについて３．２７±０．５８５、及び０．５ＰＢＳについて４．０８±０．８５４、先行技術（ｈＥＳＣ投入あたり２．２３±０．０９０のＰＥＣ−０１  ｄ１２細胞）から顕著に増加した。更に、開示の分化プロトコルを、ＰＢＳ  ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクターシステムを使用して効果的にスケールアップできることを図９Ｃにおいて実証する。培地体積を１００ｍＬ（０．１ＰＢＳ）から５００ｍＬ（０．５ＰＢＳ）に増加させると、Ｓ４Ｄ３収率の約６倍の増加（図９Ｃ）が観察された。加えて、０．１ＰＢＳ（約１５０±３３．２マイクロメートル）又は０．５ＰＢＳ（約１５３±３７．６マイクロメートル）のいずれかの懸濁形式を利用することで、ローラボトル系のＳ４Ｄ３（約２７４±９２．５マイクロメートル）及びＰＥＣ−０１  ｄ１２（約２５９±５５．３マイクロメートル）と比べて均一により小さいＳ４Ｄ３凝集体が生じた。ＰＥＣ−０１凝集体のサイズを０．１ＰＢＳ及び０．５ＰＢＳ（ＰＥＣ−０１  ｄ１５；約１９１±４５．４マイクロメートル）で見られた規模に縮小するためには、ＰＥＣ−０１  ｄ１２の凍結保存、解凍、及び更に３日間の培養が必要であった（図９Ｄ〜９Ｅ）。全ての懸濁培養法にわたって、頑強な膵内胚葉表現型が、新たなＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来分化プロトコルを利用して達成されたことが実証された。ＮＫＸ６．１（図９Ｆ）、ＰＴＦ１Ａ（図９Ｇ）、ＰＤＸ１（図９Ｈ）は全て、ＰＥＣ−０１  ｄ１５に類似して、２リットルのローラボトル、０．１ＰＢＳ、０．５ＰＢＳ法において大幅に誘導された。ＳＯＸ２（代替的な内胚葉系統；図９Ｉ）、ＮＥＵＲＯＤ１（早期の内分泌分化；図９Ｋ）、及びＣＨＧＡ（早期の内分泌分化；図９Ｌ）の高まった発現をもたらしたＰＥＣ−０１  ｄ１５分化プロトコルとは異なり、新たな分化プロトコルは、これらの非膵内胚葉マーカーを、ＣｙＴ４９中で試験した全ての懸濁培養法において���下させた。実際に、非膵内胚葉のかかる富化により、タンパク質レベルを評価すると膵内胚葉産生の効率が減少する。ＰＥＣ−０１  ｄ１２（約３８．０％；図９Ｍ）と比べて、ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１との間のタンパク質共局在性は、新たなＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来分化プロトコル；２リットルのローラボトル（約６４．６％（図９Ｎ））、０．１ＰＢＳ（約４８．９％（図９Ｏ））、及び０．５ＰＢＳ（約６５．３％（図９Ｐ））を利用する全ての新たなＳ４Ｄ３懸濁培養法にわたって増強された。更に、新たなＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来分化プロトコル；２リットルのローラボトル（約２．０％（図９Ｎ））、０．１ＰＢＳ（約１０．０％（図９Ｏ））、及び０．５ＰＢＳ（約６．２％（図９Ｐ））を利用する全ての新たなＳ４Ｄ３懸濁培養法とは異なり、ＰＥＣ−０１  ｄ１２において観察されたＰＤＸ１＋  ＮＫＸ６．１＋膵内胚葉の約４９％がＳＯＸ２＋（図９Ｍ）も発現した。ＰＥＣ−０１  ｄ１２において見られた膵内胚葉の比較的低いパーセンテージは、増加した早期内分泌分化の普及率（約４９．６％；図９Ｍ）全ての新たなＳ４Ｄ３懸濁培養法；２リットルのローラボトル（約２６．９％（図９Ｎ））、０．１ＰＢＳ（約２６．６％（図９Ｏ））、及び０．５ＰＢＳ（約３０．２％（図９Ｐ））と比べて、増加した早期内分泌分化の普及率（約４９．６％；図９Ｍ）にも反映された。ＳＯＸ２（約２２．５％；図９Ｑ）及びＣＨＧＡ（約４２．５％；図９Ｑ）の低減によってＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の共局在性をわずかに増加させるためには（ＰＥＣ−０１  ｄ１５；約４７．５％；図９Ｑ）、ＰＥＣ−０１  ｄ１２の凍結保存、解凍、及び３日間の追加の細胞培養が必要であった。ＮＫＸ６．１とＣＤＸ２との間のタンパク質共局在性は、全種類の懸濁培養にわたるＳ４Ｄ３での低いＣＤＸ２遺伝子発現（図９Ｊ）とよく似て、試験した全ての条件にわたって低かった（図９Ｍ〜９Ｑ）。
【０２４４】
（実施例７）：
複数の種類の懸濁培養におけるＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来のインスリン産生細胞の生成。
以下の実施例は、複数の懸濁培養形式（ローラボトル、並びに０．１ＰＢＳ及び０．５ＰＢＳ両方のＢｉｏｔｅｃｈ  ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクター）における新たな分化プロトコルを利用するＣｙＴ４９ヒト胚幹細胞株（「ｈＥＳＣ」）由来の膵臓インスリン産生細胞の改善した生成を実証する。表ＸＶＩＩに、ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来インスリン産生細胞に行った特定の増強を列挙する。ＰＥＣ−０１由来及びＰＥＣ−０１類似由来のインスリン産生細胞までの持続期間は同様であるが（先行技術はＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１５（１０）４，１２１４〜１２２２）、ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣからインスリン陽性細胞を産生させるために使用される新しい分化プロトコルは、ポリホルモンインスリン産生細胞（ＩＮＳ＋  ＧＣＧ＋両方）の大幅な減少、及びモノホルモンインスリン産生細胞中のＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＣＨＧＡ、ＭＡＦＡのタンパク質存在を介して、モノホルモンインスリン産生細胞（ＩＮＳ＋のみ）の産生の増強を呈する。ＧＣＧの存在の欠如、及びモノホルモンインスリン陽性細胞におけるＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡの存在の誘導は、ヒト膵島に類似した機能性の最終的な獲得の要件である（実施例２〜５）。更に、新たなＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来膵臓インスリン産生細胞プロトコルは、初めて、インスリン産生細胞の最終的な商業用細胞製造をローラボトルによるスケールアウトよりも良好に取り扱うことができるバイオリアクターにおけるスケールアップ性能を呈する（実施例７）。
【０２４５】
【表２０】
2019518465.tif 000034
【０２４６】
表ＸＶＩＩＩは、改善したＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来膵内胚葉の生成のための分化プロトコルに行った主な調整を概説する。主な差異には、使用した小分子及び基本培地が含まれる。略記には以下が含まれる：Ｎｉｃ−ニコチンアミド；ＭＧ−Ｍａｔｒｉｇｅｌ；ＧＳＩ−ガンマセクレターゼ阻害剤；ＲＯＣＫｉ−Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤。
【０２４７】
【表２１】
2019518465.tif 000035
【０２４８】
機能している細胞バンク４Ａ（「ＷＣＢ４Ａ」）の２７代継代のヒト胚幹細胞株ＣｙＴ４９（「ＣｙＴ４９−ｈＥＳＣ」；ＮＩＨ登録００４１）を、実施例６に記載したように播種し、維持した。また、ステージ１〜４をとおしたＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ凝集及び分化を、実施例６に記載したように行った。
【０２４９】
図１０Ａ〜１０ＡＢについて、培養物を、懸濁培養形式で以下のプロトコル（図１０Ａに描出する）を使用してステージ５〜７の間に更に分化させた。プロトコルのステージ５〜７の間、懸濁培養を、３１ｒｐｍのローラボトル（「ＲＢ」）、４５ｒｐｍの０．１ＰＢＳ  Ｍｉｎｉ若しくは０．５ＰＢＳ  Ｍｉｎｉ  ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクターいずれかの中に維持した。「０．１ＰＢＳ」は、１００ｍＬ  Ｍｉｎｉ  ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクターを指し、「０．５ＰＢＳ」は、５００ｍＬ  Ｍｉｎｉ  ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクターを指す。ステージ７の分化プロトコルは基礎条件付けと称されることに留意されたい。これは、インスリン産生細胞の機能性を誘導するためのカクテルが含まれず、別の開示の対象となるためである。ステージ５〜６の間は培地を毎日交換し、ステージ７では１日おきに交換した。
ａ．ステージ５（３日間）：Ｓ４Ｄ３  ＣｙＴ４９（実施例６−新たなＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ由来プロトコル）又はＰＥＣ−０１  ｄ１５由来凝集体を、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１；５０ｎＭ  ＲＡ；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；１μＭのＴ３；及び１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩが補充されたＢＬＡＲ００１培地で処理した。
ｂ．ステージ６（７日間）：凝集体を、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；最終濃度２０ｍＭのＤ−グルコースを達成するための１４．５ｍＭ  Ｄ−グルコース；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）；１０μＭ  ＺｎＳＯ４；１００ｎＭ  ＬＤＮ−ＨＣｌ；１μＭのＴ３；１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、及び１００ｎＭのガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸが補充されたＢＬＡＲ００１培地中で処理した。０．５ＰＢＳ懸濁培養中のＳ５Ｄ３凝集体を、ステージ６〜７のために０．１ＰＢＳ懸濁培養に移した。
ｃ．ステージ７（７日間〜２３日間）：凝集体を、２．７ｇ／１０００ｍＬ重炭酸ナトリウムを含有し、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ；１倍ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２％  ＦＡＦ−ＢＳＡ；１０μｇ／ｍＬのヘパリン（「Ｈ」）、１０ｎＭのＴ３（「低Ｔ３」）；１ｍＭ  ＮＡＣ」）；及び製剤Ｉ（「ＦＩ」）を構成する以下の成分、すなわち、１：２００希釈のＲＰＭＩビタミン補助剤；１：２００希釈のＭＥＭ非必須アミノ酸補助剤；１：２０００希釈の既知組成脂質濃縮物；１：２００希釈のピルビン酸ナトリウム；１：２０００希釈の微量元素Ａ；１：２０００希釈の微量元素Ｂが補充されたＢＬＡＲ００１培地中で処理した。
【０２５０】
分化した細胞の特徴付け：ローラボトル、０．１ＰＢＳ、又は０．５ＰＢＳ懸濁培養法を利用する遺伝子発現の定量化のため、ＣｙＴ４９−ｈＥＳＣ、ステージ４の３日目（「Ｓ４Ｄ３」）、ステージ５の３日目（「Ｓ５Ｄ３」）、ステージ６の７日目（「Ｓ６Ｄ７」）、及びステージ７の７日目（「Ｓ７Ｄ７」）の凝集体を、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，（３２）１１，１１２１〜１１３３、及び実施例１に記載されているように回収した。プライマーの詳細を、表ＸＩＸに概説する。
【０２５１】
【表２２】
2019518465.tif 000036
【０２５２】
ローラボトル、０．１ＰＢＳ、又は０．５ＰＢＳ懸濁培養法を利用するタンパク質存在共局在性の定量化のため、ＣｙＴ４９−ｈＥＳＣ、ステージ５の３日目（「Ｓ５Ｄ３」）、ステージ６の７日目（「Ｓ６Ｄ７」）、ステージ７の１３日目（「Ｓ７Ｄ１３」）、及びステージ７の１４日目（「Ｓ７Ｄ１４」）の凝集体を、実施例１に記載したように、回収し、蛍光活性化フローサイトメトリー（「ＦＡＣＳ」）によって分析した。ＦＡＣＳ分析に使用した抗体の一覧を表ＸＸに示す。
【０２５３】
【表２３】
2019518465.tif 000037
【０２５４】
ローラボトル、０．１ＰＢＳ、又は０．５ＰＢＳ懸濁培養法を利用する細胞収率の定量化のため、ＣｙＴ４９−ｈＥＳＣ及びステージ６の７日目（「Ｓ６Ｄ７」）の凝集体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−１００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ、カタログ番号ＮＣ−１００）によって計数した。
【０２５５】
ローラボトル、０．１ＰＢＳ、又は０．５ＰＢＳ懸濁培養法を利用するタンパク質共局在性の定量化のため、ステージ６の７日目（「Ｓ６Ｄ７」）、ステージ７の１６日目（「Ｓ７Ｄ１６」）、及びステージ７の２３日目（「Ｓ７Ｄ２３」）の凝集体を回収し、免疫蛍光法（「ＩＦ」）によって分析した。ＣｙＴ４９−ｈＥＳＣ由来凝集体を、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，（３２）１１，１１２１〜１１３３とこれまでの実施例との両方に記載されているように、また本明細書の表ＸＸＩに列挙する抗体を使用して、調製した。
【０２５６】
【表２４】
2019518465.tif 000038
【０２５７】
図１０Ａは、ステージ５〜７をとおしてＳ４Ｄ３  ＣｙＴ４９由来ｈＥＳＣをインスリン産生細胞に向かって分化させるために使用される新たなプロトコルを描出する。具体的には、ここで誘導されるインスリン産生細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＣＨＧＡ、インスリン、及びＭＡＦＡの共発現及びタンパク質存在を呈するが、グルカゴンではそうではなかった。図１０Ｂは、Ｓ６Ｄ７での細胞収率が、２リットルのローラボトル（「ＲＢ」）（０．９５±０．３１  Ｓ６Ｄ７対ｈＥＳＣ投入）及び０．１ＰＢＳ（０．９２±０．２３  Ｓ６Ｄ７対ｈＥＳＣ投入）懸濁培養法について、最初のｈＥＳＣ投入とほぼ等しかったことを実証する。際立ったことに、０．５ＰＢＳ形式を使用する懸濁培養は、最も高いＳ６Ｄ７での細胞収率を呈し、１回のｈＥＳＣ細胞投入について、２．４±０．１６９  Ｓ６Ｄ７細胞が生成された。更に、ステージ５〜７の分化プロトコルを、ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクターシステムを使用して効果的にスケールアップできることが実証された（図１０Ｃを参照されたい）。培地体積を１００ｍＬ（０．１ＰＢＳ）から５００ｍＬ（０．５ＰＢＳ）に増加させると、Ｓ６Ｄ７収率の約７．５倍の増加（図１０Ｃ）が観察された。加えて、０．１ＰＢＳ又は０．５ＰＢＳいずれかの懸濁形式を利用することで、２リットルのローラボトルに基づく凝集体と比べて均一により小さいＳ５Ｄ３（図１０Ｄ）、Ｓ６Ｄ７（図１０Ｅ）、及びＳ７Ｄ１３−Ｓ７Ｄ１４（図１０Ｆ）凝集体が生じた。簡潔には、ローラボトルを使用して開示のプロトコルによって懸濁培養したＳ６Ｄ７凝集体は、以下の直径、すなわち、ＲＢが約２６５±７９．０マイクロメートル（図１０Ｅ、左）、０．１ＰＢＳが約１９０±５９．９マイクロメートル（図１０Ｅ、中央）、及び０．５ＰＢＳが約２２７±５９．０マイクロメートル（図１０Ｅ、右）の直径を呈した。また、ＰＢＳ  Ｍｉｎｉ  ＭａｇＬｉｆｔ（商標）縦型ホイールバイオリアクターを利用すると、ヒト膵島レベルの機能性に必要とされる、締まった凝集体サイズ及びＳ７Ｄ１４をとおした構造が維持された（図１０Ｆ）（実施例７）。逆に、２リットルのローラボトル懸濁液中のＳ７Ｄ１３凝集体は、最終的にそれらの締まった凝集体構造を喪失し、緩い細胞シートを形成した（図１０Ｆ）。新たなプロトコルを使用する全ての懸濁培養法により、頑強な膵臓インスリン産生細胞遺伝子特性が誘導されたことが実証された。ＲＢ、０．１ＰＢＳ、及び０．５ＰＢＳは、ベータ細胞転写因子ＰＤＸ１（図１０Ｇ）、ＮＫＸ６．１（図１０Ｈ）；内分泌マーカー／転写因子ＣＨＧＡ（図１０Ｉ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図１０Ｊ）、ＮＧＮ３（図１０Ｋ）；ベータ細胞ホルモンインスリン（図１０Ｌ）；及び早期ベータ細胞成熟転写因子ＭＡＦＡ（図１０Ｍ）の発現の維持／増加を誘導した。逆に、ＰＥＣ−０１  ｄ１５凝集体を、２リットルのローラボトル中で新たな分化プロトコルを使用してインスリン産生細胞へと分化させると（「ＰＥＣ−０１由来」）、インスリンと共にグルカゴン発現の顕著な誘導（図１０Ｌ，１０Ｎ）が観察された。実際に、タンパク質存在分析により、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，（３２）１��，１１２１〜１１３３に既に記載されているように、新たな分化プロトコルが、頑強な膵内分泌前駆体（ステージ５）を誘導することで、ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株におけるモノホルモンインスリン産生細胞（ステージ６〜７）の産生をもたらしたことが実証された。図１０Ｏは、Ｓ５Ｄ３により、０．５ＰＢＳ中で培養した凝集体の約５４．１％が、ＣＨＧＡ＋  ＮＫＸ６．１＋であったことを示し（全ての懸濁形式についてＳ４Ｄ３での約１％のＣＨＧＡ＋  ＮＫＸ６．１＋から増加；図９Ｎ〜９Ｐ）、これは高い率の内分泌分化の結果であり、Ｓ５Ｄ３でのＰＡＸ４＋  ＣＨＧＡ＋細胞の富化により示される。ＰＡＸ４は、膵臓における内分泌分化の推進力であるＮＧＮ３の直接標的遺伝子である。Ｓ７Ｄ１３〜Ｓ７Ｄ１４により、ＮＫＸ６．１＋インスリン＋細胞の総数は、Ｓ５Ｄ３での約１５．４％（図１０Ｐ）からＳ６Ｄ７のＲＢにおける約４０．３％（図１０Ｑ）；Ｓ６Ｄ７での０．１ＰＢＳにおける約４４．７％（図１０Ｒ）；Ｓ７Ｄ１３のＲＢにおける約５１．８％（図１０Ｓ）；及びＳ７Ｄ１４の０．１ＰＢＳにおける約４８．９％（図１０Ｔ）へと、全ての懸濁形式で劇的に増加した。同様に、Ｓ７Ｄ１３〜Ｓ７Ｄ１３により、ＮＫＸ６．１＋  ＣＨＧＡ＋細胞のパーセンテージは、Ｓ４Ｄ３での約１％（図９Ｎ〜９Ｐ）からＳ６Ｄ７のＲＢにおける約８１．０％（図１０Ｑ）；Ｓ６Ｄ７の０．１ＰＢＳにおける約８８．７％（図１０Ｒ）；Ｓ７Ｄ１３のＲＢにおける約７９．６％（図１０Ｓ）；及びＳ７Ｄ１４の０．１ＰＢＳにおける約８０．９％（図１０Ｔ）へと、増加した。ステージ７で新たなプロトコルによって産生されたＮＫＸ６．１＋インスリン＋細胞の大部分が、モノホルモンであり、アルファ細胞ホルモングルカゴンについて富化されず、Ｓ６Ｄ７のＲＢでは約１８．８％のインスリン＋グルカゴン＋（図１０Ｑ）；Ｓ６Ｄ７の０．１ＰＢＳでは約１４．４％（図１０Ｒ）；Ｓ７Ｄ１３のＲＢでは約７．７％（図１０Ｓ）；及びＳ７Ｄ１４の０．１ＰＢＳでは約６．５％（図１０Ｔ）であったことが実証された。更に、ポリホルモン細胞がステージ７までに全細胞のわずかな部分しか構成しなかったことが実証され（図１０Ｓ〜１０Ｔ）、これは、ＣｙＴ４９由来Ｓ４Ｄ３細胞内の数がＨ１由来Ｓ４Ｄ３細胞と比べて元々多いＣＨＧＡ＋  ＮＫＸ６．１−集団から生じる可能性が高い（実施例３）。際立ったことに、Ｓ６Ｄ７の２リットルのローラボトルにおけるＰＥＣ−０１由来凝集体は、約４１．９％のインスリンとグルカゴンとの間の共局在性を呈した。試験した全ての条件において、グルカゴン（ＧＬＵＣＧＡＯＮ）＋インスリン＋細胞は、Ｓ６Ｄ７の２リットルのローラボトルにおけるＰＥＣ−０１由来凝集体、及び新たなプロトコルのＳ４Ｄ３由来のＳ７Ｄ１４の０．１ＰＢＳ、Ｓ７Ｄ１３の２リットルのローラボトルについて示されたように、ＮＫＸ６．１＋ではなかった（図１０Ｖ）。インスリン産生内分泌細胞の頑強な誘導がＩＦ分析に映し出されている。ＲＢ形式又は０．１ＰＢＳ形式のいずれかでクラスター化した凝集体は、Ｓ６Ｄ７（０．１ＰＢＳ−図１０Ｗ）及びＳ７Ｄ１６〜Ｄ２３（ＲＢ−図１０ＡＡ；０．１ＰＢＳ−図１０Ｙ）の両方でシナプトフィジン＋  ＮＫＸ６．１＋インスリン＋細胞の優れた富化を示した。更に、早期成熟転写因子ＭＡＦＡは、Ｓ６Ｄ７の０．１ＰＢＳ（図１０Ｘ）において既に誘導され、Ｓ７Ｄ２３のＲＢ（図１０ＡＢ）及びＳ７Ｄ１６の０．１ＰＢＳ（図１０Ｚ）においてステージ７でインスリン陽性細胞と同時に存在するようになった。
【０２５８】
以上、本発明を、様々な具体的な材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に記載及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には理解されるように、このような細部には多くの変更が示唆される可能性がある。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されることが意図される。本出願において引用される全ての参照文献、特許及び特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2019518465.tif 000039
【図１Ｂ】
2019518465.tif 000040
【図１Ｃ】
2019518465.tif 000041
【図１Ｄ】
2019518465.tif 000042
【図１Ｅ】
2019518465.tif 000043
【図１Ｆ】
2019518465.tif 000044
【図１Ｇ】
2019518465.tif 000045
【図１Ｈ】
2019518465.tif 000046
【図２Ａ】
2019518465.tif 000047
【図２Ｂ】
2019518465.tif 000048
【図３Ａ】
2019518465.tif 000049
【図３Ｂ】
2019518465.tif 000050
【図３Ｃ】
2019518465.tif 000051
【図３Ｄ】
2019518465.tif 000052
【図３Ｅ】
2019518465.tif 000053
【図３Ｆ】
2019518465.tif 000054
【図３Ｇ】
2019518465.tif 000055
【図３Ｈ】
2019518465.tif 000056
【図３Ｉ】
2019518465.tif 000057
【図３Ｊ】
2019518465.tif 000058
【図３Ｋ】
2019518465.tif 000059
【図３Ｌ】
2019518465.tif 000060
【図３Ｍ】
2019518465.tif 000061
【図４Ａ】
2019518465.tif 000062
【図４Ｂ】
2019518465.tif 000063
【図４Ｃ】
2019518465.tif 000064
【図４Ｄ】
2019518465.tif 000065
【図４Ｅ】
2019518465.tif 000066
【図５Ａ】
2019518465.tif 000067
【図５Ｂ】
2019518465.tif 000068
【図５Ｃ】
2019518465.tif 000069
【図５Ｄ】
2019518465.tif 000070
【図５Ｅ】
2019518465.tif 000071
【図５Ｆ】
2019518465.tif 000072
【図６Ａ】
2019518465.tif 000073
【図６Ｂ】
2019518465.tif 000074
【図６Ｃ】
2019518465.tif 000075
【図６Ｄ】
2019518465.tif 000076
【図６Ｅ】
2019518465.tif 000077
【図６Ｆ】
2019518465.tif 000078
【図６Ｇ】
2019518465.tif 000079
【図６Ｈ】
2019518465.tif 000080
【図６Ｉ】
2019518465.tif 000081
【図６Ｊ】
2019518465.tif 000082
【図６Ｋ】
2019518465.tif 000083
【図６Ｌ】
2019518465.tif 000084
【図７Ａ】
2019518465.tif 000085
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図７Ｍ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図９Ｌ】
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【図９Ｍ】
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【図９Ｎ】
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【図９Ｏ】
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【図９Ｐ】
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【図９Ｑ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１０Ｌ】
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【図１０Ｍ】
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【図１０Ｎ】
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【図１０Ｏ】
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【図１０Ｐ】
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【図１０Ｑ】
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【図１０Ｒ】
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【図１０Ｓ】
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【図１０Ｔ】
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【図１０Ｕ】
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【図１０Ｖ】
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【図１０Ｗ】
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【図１０Ｘ】
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【図１０Ｙ】
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【図１０Ｚ】
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【図１０ＡＡ】
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【図１０ＡＢ】
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【国際調査報告】
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