(57)【要約】本開示は、ＲＯＲ１またはその一部分、例えばＲＯＲ１タンパク質の細胞内Ｃ末端部分、と結合するものを含む、抗ＲＯＲ１結合タンパク質、ならびに免疫組織化学的方法および診断方法におけるそのような結合タンパク質の使用に関する。結合タンパク質を使用する関連キットおよび方法も提供し、同様に、疾患または状態を有する被験体を処置する方法であって、被験体は、本開示の結合タンパク質または方法によりそのような処置の候補であると決定されている、方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＲ１の細胞内プロテインキナーゼのＣ末端側にある前記ＲＯＲ１の部分と特異的に結合する結合タンパク質であって、任意選択で、免疫グロブリン様結合タンパク質である、および／あるいは抗体もしくはその抗原結合断片であるか、または抗体もしくはその抗原結合断片を含む、結合タンパク質。
【請求項２】
（ｉ）配列番号３を含むペプチドであって、前記ペプチドが、任意選択で配列番号３からなる、ペプチド、および／または（ｉｉ）ＲＯＲ１タンパク質のエピトープに特異的に結合する、結合タンパク質であって、前記エピトープが、（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内にあるか、および／または（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内の１つもしくは複数のアミノ酸を含む、結合タンパク質。
【請求項３】
配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、配列番号１２、１３または１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む抗体またはその断片を含む結合タンパク質であって、前記抗体が、任意選択で、（ｉ）配列番号３を含むペプチドであって、前記ペプチドが、任意選択で配列番号３からなる、ペプチド、および／または（ｉｉ）ＲＯＲ１タンパク質のエピトープに特異的に結合し、前記エピトープが、（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内にあるか、および／または（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内の１つもしくは複数のアミノ酸を含む、結合タンパク質。
【請求項４】
配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列内に位置するエピトープに結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
前記ＲＯＲ１またはＲＯＲ１タンパク質が、ヒトＲＯＲ１である、請求項１から４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
前記ＲＯＲ１および／または前記ペプチドおよび／または前記エピトープと１×１０−７Ｍまたはそれ未満のＫｄで結合する、請求項１から５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
（ａ）配列番号６または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号６のバリアントに記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；（ｂ）配列番号７または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号７のバリアントで示される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；および（ｃ）配列番号８または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号８のバリアントで示される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
（ａ）配列番号９または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号９のバリアントで示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；（ｂ）配列番号１０または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号１０のバリアントで示される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；および（ｃ）配列番号１１または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号１１のバリアントで示される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
（ｉ）配列番号１２、１３もしくは１４に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列内のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；および／または（ｉｉ）配列番号１５もしくは１６に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列内のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
前記重鎖ＣＤＲ３が、配列番号２９または配列番号３０に記載の配列を含み、および／または前記軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号３５または配列番号３６に記載の配列を含む、請求項９に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号１２、１３もしくは１４に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列内の、ＣＤＲ１および／もしくはＣＤＲ２のアミノ酸配列をそれぞれ有する、重鎖ＣＤＲ１および／もしくは重鎖ＣＤＲ２；ならびに／または（ｉｉ）配列番号１５もしくは１６に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列内のＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、軽鎖ＣＤＲ１および／もしくは軽鎖ＣＤＲ２をさらに含む、請求項９または１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
前記重鎖ＣＤＲ１が、配列番号２１、２２、２３または２４に記載の配列を含み、および／または前記重鎖ＣＤＲ２が、配列番号２５、２６、２７または２８に記載の配列を含むか；および／または前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号３１または３２に記載の配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号３３または３４に記載の配列を含む、請求項１１に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および配列番号１２、１３または１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むか；ならびに／あるいは配列番号３７を含むＶＨ、および／または配列番号３８を含むＶＬを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
抗体またはその抗原結合断片である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
抗体を含み、前記抗体が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、請求項１４に記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体が、６Ｄ４と称する抗体の抗原結合部分である、および／または６Ｄ４と称する抗体の抗原結合部分を含む、請求項１５に記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
抗体の抗原結合断片を含み、前記抗原結合断片がｓｃＦｖである、請求項１６に記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
前記ｓｃＦｖが、モノクローナル抗体６Ｄ４のＶＬおよびＶＨを含む、請求項１７に記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
ＲＯＲ２に結合しない、請求項１から１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
ＲＯＲ１の細胞内プロテインキナーゼドメインのＣ末端側に位置するＲＯＲ１エピトープとの特異的結合について基準結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と競合する、結合タンパク質。
【請求項２１】
ＲＯＲ１との結合および／または配列番号３のペプチドとの結合について請求項１から１９のいずれか一項に記載の結合タンパク質と競合する、ならびに／あるいは請求項１から１９のいずれか一項に記載の結合タンパク質と同じまたは重複するＲＯＲ１のエピトープと結合する、結合タンパク質。
【請求項２２】
前記基準結合タンパク質が、配列番号６に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号８に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号９に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１１に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の結合タンパク質。
【請求項２３】
前記基準結合タンパク質が、配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および配列番号１２、１３または１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、請求項２０または２２に記載の結合タンパク質。
【請求項２４】
前記結合タンパク質、前記基準結合タンパク質、または両方が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２５】
前記結合タンパク質、前記基準結合タンパク質、または両方が抗体を含み、前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２４に記載の結合タンパク質。
【請求項２６】
前記結合タンパク質、前記基準結合タンパク質、または両方が、キメラまたはヒト化抗体である、請求項２４または２５に記載の結合タンパク質。
【請求項２７】
前記結合タンパク質、前記基準結合タンパク質、または両方が、抗体の抗原結合断片を含み、前記抗原結合断片が、ｓｃＦｖである、請求項２４に記載の結合タンパク質。
【請求項２８】
前記結合タンパク質、前記基準結合タンパク質、または両方が、抗原結合ドメインを含む融合タンパク質である、請求項２０から２７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項２９】
前記融合タンパク質の抗原結合ドメインが、抗体の抗原結合断片である、請求項２８に記載の結合タンパク質。
【請求項３０】
抗体の前記抗原結合断片が、ｓｃＦｖである、請求項２９に記載の結合タンパク質。
【請求項３１】
基準抗体が、モノクローナル抗体６Ｄ４である、請求項２０から３０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項３２】
マーカーをさらに含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項３３】
前記マーカーが、酵素、色素、蛍光標識、ペプチドタグ、またはタンパク質タグである、請求項３２に記載の結合タンパク質。
【請求項３４】
（ａ）前記結合タンパク質が、生物学的試料の細胞中に内因的に存在する前記タンパク質、前記ＲＯＲ１および／またはエピトープと特異的に結合することができ、前記試料が、ホルマリン固定もしくは凍結された組織切片および／または透過処理された細胞を任意選択で含むか、および／または任意選択で被験体の腫瘍に由来するものであり、ならびに／あるいは（ｂ）前記結合タンパク質が、ＲＯＲ１の内因性発現を、基準抗体が前記内因性発現を検出しない条件下で検出することができ、前記基準抗体が、任意選択で、ポリクローナルＲＯＲ１抗体、ＲＯＲ１のＮ末端部分を認識するＲＯＲ１抗体、ａｂ１３５６６９、抗ヒトＲＯＲ１ヤギポリクローナル抗体、抗ヒトＲＯＲ１ウサギポリクローナル抗体、抗ＲＯＲ１  ４Ａ５、および抗ヒトＲＯＲ１  ２Ａ２からなる群より選択される、請求項１から３３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項３５】
前記試料が、血液悪性疾患および固形腫瘍からなる群より選択される腫瘍組織に由来する、請求項３４に記載の結合タンパク質。
【請求項３６】
前記試料が、（ａ）ＣＬＬまたはＭＣＬに由来するか、あるいは（ｂ）卵巣がん、任意選択で肺腺癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌および非定型カルチノイドの中から選択される肺がん、または任意選択でトリプルネガティブ乳がんである乳がんに由来する、請求項３５に記載の結合タンパク質。
【請求項３７】
前記試料が、骨髄、脂肪組織、副甲状腺、食道および膵臓からなる群より選択される正常組織に由来する、請求項３５に記載の結合タンパク質。
【請求項３８】
完全長ＲＯＲ１と特異的に結合する、請求項１から３７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
【請求項３９】
請求項１から３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質と担体または賦形剤とを含む組成物。
【請求項４０】
請求項１から３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドを含有する宿主細胞用にコドン最適化される、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
発現制御配列に作動可能に連結されている請求項４０または４１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現構築物。
【請求項４３】
プラスミドまたはウイルスベクター内に存在する、請求項４２に記載の発現構築物。
【請求項４４】
レンチウイルスベクターまたはγ−レトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター内に存在する、請求項４２または４３に記載の発現構築物。
【請求項４５】
請求項４２から４４のいずれか一項に記載の発現構築物を含むか、または発現構築物により提供されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項４６】
請求項１から３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質を作製するための方法であって、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の発現構築物を含むか、または発現構築物により提供されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、前記結合タンパク質を発現させるのに好適な条件下で培養するステップ、および任意選択で、前記結合タンパク質を培養物から単離するステップを含む、方法。
【請求項４７】
完全長ＲＯＲ１を発現する細胞を同定するための方法であって、細胞を請求項１から３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質と接触させるステップ、および前記細胞への前記結合タンパク質の特異的結合を検出することによって、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞を同定するステップを含む、方法。
【請求項４８】
（ａ）生物学的試料を請求項１から３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質または請求項３８に記載の組成物と接触させるステップ、および（ｂ）前記結合タンパク質と前記試料中のペプチドもしくはエピトープとの特異的結合またはその欠如を検出するステップを含み、それによって、前記試料中のＲＯＲ１またはＲＯＲ１エピトープの存在または非存在を検出する、検出方法。
【請求項４９】
（ｂ）で検出された前記特異的結合のレベルを基準レベルと比較するステップをさらに含み、前記基準レベルと比較した結合レベルの増加が、前記試料中のＲＯＲ１またはＲＯＲ１エピトープの存在を示す、請求項４８に記載の検出方法。
【請求項５０】
前記試料が、被験体から得られる、請求項４８または４９に記載の検出方法。
【請求項５１】
前記試料が、組織切片および／または細胞を含む、請求項４８から５０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５２】
前記試料が、ホルマリン固定もしくは凍結された組織切片および／または透過処理された細胞を含むか、ならびに／あるいは前記試料が、血液悪性疾患および固形腫瘍からなる群より選択される腫瘍に由来し、および／または正常組織に由来する、請求項５０または５１に記載の検出方法。
【請求項５３】
前記試料が、（ａ）ＣＬＬまたはＭＣＬに由来するか、あるいは（ｂ）卵巣がん、任意選択で肺腺癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌および非定型カルチノイドの中から選択される肺がん、または任意選択でトリプルネガティブ乳がんである乳がんに由来するか、あるいは（ｃ）骨髄、脂肪組織、副甲状腺、食道および膵臓からなる群より選択される正常組織に由来する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が、ホルマリン固定され、パラフィンに包埋されているか、または前記細胞が、凍結され、最適切断温度化合物に包埋されている、請求項４７から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞中の完全長ＲＯＲ１の存在が、免疫組織化学または免疫ブロッティングによって検出される、請求項４７から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
組織試料中のＲＯＲ１の存在を同定するための方法であって、組織試料を請求項１から３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質と接触させるステップ、および前記組織への前記結合タンパク質の特異的結合を検出することによって、前記ＲＯＲ１を発現する組織を同定するステップを含み、前記ＲＯＲ１は、任意選択で完全長および／または細胞表面ＲＯＲ１である、方法。
【請求項５７】
完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する疾患を有する、または有するリスクがある被験体を同定するための方法であって、前記被験体からの組織試料を請求項１から３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質と接触させるステップ、および前記組織への前記結合タンパク質の特異的結合を検出することによって、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する疾患を有する、または有するリスクがある被験体を同定するステップを含む、方法。
【請求項５８】
完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する前記疾患が、過剰増殖性疾患または状態である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記過剰増殖性疾患または状態が、腫瘍である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記腫瘍が、任意選択でＣＬＬまたはＭＣＬである血液腫瘍であり、および／または任意選択で肺腺癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、非定型カルチノイドもしくはトリプルネガティブ乳がんである、任意選択で乳がん、肺がん、卵巣がんもしくは膵がん腫瘍である、固形腫瘍である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記腫瘍が、原発性腫瘍、転移性腫瘍、または両方を含む、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記結合タンパク質を接触させる前記試料またはその一部分の中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、前記方法により前記ＲＯＲ１またはエピトープを発現すると決定された場合、前記被験体または試料が、抗ＲＯＲ１療法での処置の候補として同定され、前記抗ＲＯＲ１療法が、任意選択で養子細胞療法である任意選択で免疫療法である、請求項４７から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記試料が由来する前記組織が、前記方法により、前記ＲＯＲ１またはエピトープを均一にまたは均質に発現すると決定された場合、前記被験体または試料が、抗ＲＯＲ１療法での処置の候補として同定され、前記抗ＲＯＲ１療法が、任意選択で養子細胞療法である任意選択で免疫療法である、請求項４７から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記試料を得た前記被験体に、ＲＯＲ１標的化療法を投与するステップをさらに含み、前記ＲＯＲ１標的化療法が、任意選択で養子細胞療法である任意選択で免疫療法である、請求項４７から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
過剰増殖性疾患または状態を有する被験体が、ＲＯＲ１特異的処置から恩恵を受けることになるかどうかを同定するための方法であって、前記被験体からの組織試料を請求項１から３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質と接触させるステップ、および前記組織への前記結合タンパク質の特異的結合を検出することによって、前記被験体がＲＯＲ１特異的処置から恩恵を受けることになるか否かを同定するステップを含む、方法。
【請求項６６】
前記特異的結合が、前記結合タンパク質を接触させた前記組織もしくはその一部分の表面積の、または前記組織もしくはその一部分の中の細胞の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％において検出された、および／あるいは前記組織において均一にまたは均質に観察された場合には、前記被験体が、前記ＲＯＲ１特異的処置から恩恵を受けることになる被験体として同定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記処置が、免疫療法であり、前記免疫療法が、任意選択で養子細胞療法であり、任意選択で抗ＲＯＲ１抗体を含むキメラ抗原受容体を含み、前記抗ＲＯＲ１抗体が、任意選択で、Ｒ１２と称する抗体であるか、またはＲ１２と称する抗体と結合について競合する、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する過剰増殖性疾患または状態を有する被験体の予後を決定するための方法であって、前記被験体からの組織試料を請求項１から３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質と接触させるステップ、および前記組織への前記結合タンパク質の特異的結合を検出するステップを含み、特異的結合を検出するステップによって前記被験体がＲＯＲ１特異的処置の非存在下で予後不良であると同定される、方法。
【請求項６９】
特異的結合を検出するステップによって前記被験体が腫瘍転移を有すると同定され、および／または前記組織試料が、ホルマリン固定され、パラフィンに包埋されているか、もしくは前記細胞が、凍結され、最適切断温度化合物に包埋されている、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記被験体を前記抗ＲＯＲ１療法で処置するステップをさらに含む、請求項４７から６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
疾患または状態を有する被験体に抗ＲＯＲ１療法を投与するステップを含む処置の方法であって、被験体における前記疾患または状態の組織または試料が、表面で発現されるＲＯＲ１の均一または均質な発現を有すると同定されている、方法。
【請求項７２】
前記疾患または状態が、腫瘍であり、任意選択で固形腫瘍または血液腫瘍である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記腫瘍が、ＣＬＬ、ＭＣＬ、乳がん、肺がん、卵巣がん、および膵がんからなる群より選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記腫瘍が、肺腺癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、非定型カルチノイド、またはトリプルネガティブ乳がんである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
決定が、請求項４７から７０のいずれか一項に記載の方法によって行われる、請求項７１から７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記疾患または状態が、肺腺癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、非定型カルチノイド、またはトリプルネガティブ乳がんである、請求項１から７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
前記抗ＲＯＲ１療法が、免疫療法を含む、請求項７０から７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記免疫療法が、養子細胞療法を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記免疫療法が、抗ＲＯＲ１抗体断片を含むキメラ抗原受容体を発現する細胞を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記抗体断片が、Ｒ１２と称する抗体、その抗原結合領域を含有する抗体に由来するか、またはＲ１２と称する抗体と結合について競合する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記組織への前記結合タンパク質の特異的結合が、免疫組織化学または免疫ブロッティングによって検出される、請求項４７から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
請求項１から３８のいずれか一項に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質を含む、キット。
【請求項８４】
請求項３９に記載の組成物を含む、キット。
【請求項８５】
組織試料中の完全長ＲＯＲ１の存在を検出するために使用される、請求項８３または８４に記載のキット。
【請求項８６】
組織試料が、ホルマリン固定され、パラフィンに包埋されているか、または前記組織試料が、凍結され、最適切断温度化合物に包埋されている、請求項８３または８４に記載のキット。
【請求項８７】
組織試料中の完全長ＲＯＲ１の存在が、免疫組織化学または免疫ブロッティングによって検出される、請求項８３から８６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益に関する声明
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＣＡ１１４５３６およびＣＡ１３８２９３の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
配列表に関する記述
本願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名称は、３６００５６＿４３７ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧである。このテキストファイルは５２．２ＫＢであり、２０１７年２月１日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されることになる。
【背景技術】
【０００３】
受容体チロシンキナーゼＲＯＲ１は、多種多様な腫瘍において過剰発現されるが、ごく少数の正常組織でも過剰発現される、腫瘍胎児抗原である。ＲＯＲ１は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および一部の上皮がんにおいて高度に発現される。ヒトＲＯＲ１は、遺伝子Ｒｏｒ１によりコードされ、この遺伝子Ｒｏｒ１は、細胞表面に局在する９３７アミノ酸完全長アイソフォーム（ＲＯＲ１＿ｖ１）と、細胞内に局在したままである完全長ＲＯＲ１のＮ末端部分を主として含有する短い（短縮）３９３アミノ酸アイソフォーム（ＲＯＲ１＿ｖ２）という、２つの推定スプライスバリアントをコードしている（Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｂｌｏｏｄ  １１６巻、４５３２頁、２０１０年）。
【０００４】
腫瘍細胞表面でのＲＯＲ１の高度な発現および正常組織における最小限のＲＯＲ１発現に基づいて、ＲＯＲ１は、治療薬で標的とするのに良い腫瘍特異的または腫瘍関連抗原である。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞がＲＯＲ１発現腫瘍を標的とするように設計された（Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｂｌｏｏｄ  １１６巻：４５３２〜４１頁、２０１０年）。患者が、ＲＯＲ１を発現する悪性疾患を有するかどうか、およびＲＯＲ１特異的療法に適しているかどうかを決定するために、被験体から得られる試料中のものなどの、被験体の細胞における内因性ＲＯＲ１の発現、例えば組織切片中の、例えば、細胞表面で発現される形態のＲＯＲ１、例えば、細胞表面で発現される完全長ＲＯＲ１分子の発現を検出することができる診断試薬を有することは重要である。
【０００５】
免疫組織化学（ＩＨＣ）は、医療診断で組織中のタンパク質の存在または非存在を決定するために使用される一般的手法である。腫瘍組織は、ＩＨＣ分析に付される前に慣例的にホルマリン固定されパラフィンに包埋されている（ＦＦＰＥ組織）。したがって、ＲＯＲ１診断用抗体は、組織学的試料において内因性発現したＲＯＲ１を検出できなければならない。市販の抗ＲＯＲ１抗体は、ＦＦＰＥ組織における内因性ＲＯＲ１を有効に検出しない。さらに、ほとんどの市販抗体は、ＲＯＲ１のＮ末端部分を標的とするものであり、完全長ＲＯＲ１と完全長ＲＯＲ１のアミノ末端部分のみを含有する短いＲＯＲ１アイソフォームとの差を検出することができない。
それ故、内因性発現したＲＯＲ１の検出および定量に有用な抗体に対する要求が依然として存在する。本開示は、そのような要求に応え、さらに他の関連する利点を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｂｌｏｏｄ（２０１０年）１１６巻、４５３２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある特定の態様では、本開示は、ＲＯＲ１の細胞内プロテインキナーゼドメインのＣ末端側にあるＲＯＲ１の部分と特異的に結合する結合タンパク質であって、任意選択で、免疫グロブリン様結合タンパク質である、および／あるいは抗体もしくはその抗原結合断片であるか、または抗体もしくはその抗原結合断片を含む、結合タンパク質に関する。
【０００８】
他の態様では、本開示は、（ｉ）配列番号３を含むペプチドであって、前記ペプチドが、任意選択で配列番号３からなる、ペプチド、および／または（ｉｉ）ＲＯＲ１タンパク質のエピトープに特異的に結合する結合タンパク質であって、前記エピトープが、（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内にあるか、および／または（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内の１つもしくは複数のアミノ酸を含む、結合タンパク質を提供する。
【０００９】
さらに他の態様では、配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、配列番号１２、１３または１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む抗体またはその断片を含む結合タンパク質であって、抗体が、任意選択で、（ｉ）配列番号３を含むペプチドであって、前記ペプチドが、任意選択で配列番号３からなる、ペプチド、および／または（ｉｉ）ＲＯＲ１タンパク質のエピトープに特異的に結合し、エピトープが、（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内にあるか、および／または（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内の１つもしくは複数のアミノ酸を含む、結合タンパク質を提供する。
【００１０】
さらに他の態様では、本開示は、ＲＯＲ１の細胞内プロテインキナーゼドメインのＣ末端側に位置するＲＯＲ１エピトープとの特異的結合について基準結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と競合する、結合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号３のペプチドとの結合について基準タンパク質と競合する結合タンパク質を提供する。
【００１１】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の結合タンパク質を含む組成物に関する。
【００１２】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１３】
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現構築物に関する。
【００１４】
ある特定の他の態様では、本開示は、本明細書に記載の発現構築物を含むか、または本明細書に記載の発現構築物により提供されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【００１５】
ある特定の他の態様では、本開示による結合タンパク質を作製する方法であって、発現構築物を含むか、または発現構築物により提供されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、結合タンパク質を発現させるのに好適な条件下で培養するステップ、および任意選択で、結合タンパク質を培養物から単離するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
ある特定の他の態様では、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞を同定する方法であって、細胞を本明細書で開示する結合タンパク質と接触させるステップ、および結合タンパク質と細胞の特異的結合を検出することによって、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞を同定するステップを含む方法を提供する。
【００１７】
ある特定の他の態様では、本開示は、（ａ）生物学的試料を本明細書で開示する結合タンパク質または組成物と接触させるステップ、および（ｂ）結合タンパク質と試料中のペプチドもしくはエピトープとの特異的結合またはその欠如を検出するステップを含み、それによって、試料中のＲＯＲ１またはＲＯＲ１エピトープの存在または非存在を検出する、検出方法を提供する。
【００１８】
ある特定の他の態様では、本開示は、組織試料中のＲＯＲ１の存在を同定する方法であって、組織試料を本明細書で開示する結合タンパク質と接触させるステップ、および結合タンパク質と組織の特異的結合を検出することによって、ＲＯＲ１を発現する組織を同定するステップを含み、ＲＯＲ１は、任意選択で完全長および／または細胞表面ＲＯＲ１である、方法を提供する。
【００１９】
ある特定の他の態様では、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する疾患を有する、または有するリスクがある、被験体を同定する方法であって、被験体からの組織試料を結合タンパク質と接触させるステップ、および結合タンパク質と組織の特異的結合を検出することによって、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する疾患を有する、または有するリスクがある、被験体を同定するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
ある特定の他の態様では、過剰増殖性疾患または状態を有する被験体が、ＲＯＲ１特異的処置から恩恵を受けることになるかどうかを同定するための方法であって、被験体からの組織試料を本明細書で開示する結合タンパク質と接触させるステップ、および結合タンパク質と組織の特異的結合を検出することによって、被験体がＲＯＲ１特異的処置から恩恵を受けることになるか否かを同定するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
ある特定の他の態様では、過剰増殖性疾患または状態を有する被験体が、ＲＯＲ１特異的処置から恩恵を受けることになるかどうかを同定するための方法であって、被験体からの組織試料を本明細書で開示する結合タンパク質と接触させるステップ、および結合タンパク質と組織の特異的結合を検出することによって、被験体がＲＯＲ１特異的処置から恩恵を受けることになるか否かを同定するステップを含む方法を提供する。
【００２２】
ある特定の他の態様では、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する過剰増殖性疾患または状態を有する被験体の予後を決定するための方法であって、被験体からの組織試料を本明細書で開示する結合タンパク質と接触させるステップ、および結合タンパク質と組織の特異的結合を検出するステップを含み、特異的結合を検出するステップによって被験体がＲＯＲ１特異的処置の非存在下で予後不良であると同定される、方法を提供する。
【００２３】
ある特定の他の態様では、疾患または状態を有する被験体に抗ＲＯＲ１療法を投与するステップを含む処置の方法であって、被験体における疾患または状態の組織または試料が、表面で発現されるＲＯＲ１の均一または均質な発現を有すると同定されている、方法を提供する。一部の実施形態では、決定は、上で開示した方法により行われる。
【００２４】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示する、結合タンパク質もしくは免疫グロブリン様結合タンパク質、または組成物を含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＲＯＲ１スプライスバリアントの概略図を示す。Ｒｏｒ１は、次のような２つのスプライスバリアントとして発現される：細胞表面に局在するＲＯＲ１の完全長９３７アミノ酸アイソフォーム（本明細書では「ＲＯＲ１＿ｖ１」と呼ばれる）；およびＲＯＲ１＿ｖ１の細胞外Ｎ末端部分のみを含み（すなわち、膜貫通ドメインとチロシンキナーゼドメインを含有する細胞内Ｃ末端部分とを欠き）、したがって、細胞膜に局在しない、短縮３９３アミノ酸スプライスアイソフォーム（本明細書では「ＲＯＲ１＿ｖ２」と呼ばれる）。
【００２６】
【図２】図２は、リアルタイムＰＣＲにより測定された正常なヒトおよびアカゲザルからの様々な異なる組織における完全長Ｒｏｒ１転写物の発現レベルを例証する。異なる２ドナーからの初代慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞であって、高レベルのＲＯＲ１を発現することが公知である細胞を、陽性対照として使用した（Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｂｌｏｏｄ  １１６巻、４５３２頁、２０１０年を参照されたい）。
【００２７】
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、様々な組織に対する市販および公開抗ＲＯＲ１抗体の免疫組織化学（ＩＨＣ）による試験結果を示す。染色は、抗ＲＯＲ１抗体の結合を示す。（Ａ）市販および公開抗ＲＯＲ１抗体を、正常扁桃組織（ＲＯＲ１−）、ＣＬＬおよびマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞（ＲＯＲ１＋、完全長）、Ｋ５６２細胞（ＲＯＲ１−）、ならびに完全長ＲＯＲ１を過剰発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞（ＲＯＲ１＋、完全長）においてＲＯＲ１と特異的に結合するそれらの能力について試験した。（Ｂ）市販のおよび以前に公開された抗ＲＯＲ１抗体を使用する、ＲＯＲ１トランスフェクトＫ５６２細胞、対照Ｋ５６２細胞、ＣＬＬリンパ節および扁桃組織に関するＩＨＣ染色。
【図３Ｂ】同上。
【００２８】
【図４】図４は、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体２Ａ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によるＲＯＲ１結合が、ホルマリン固定組織試料に関して低減されることを示す。ＲＯＲ１を発現するＲＯＲ１＋細胞（ＣＬＬおよびＫ５６２／ＲＯＲ１細胞）を一晩ホルマリン固定した。上のパネルは、非固定細胞と比較して、ホルマリン固定ＲＯＲ１＋細胞における、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体２Ａ２を使用して行ったフローサイトメトリー分析によるＲＯＲ１の検出低減を例証するものである。下のパネルは、ＲＯＲ１を過剰発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞が、ＣＬＬ細胞により内因性発現されるレベルよりはるかに高レベルのＲＯＲ１タンパク質を発現することを免疫ブロットによって実証するものである。
【００２９】
【図５】図５は、マウスの免疫化に使用したペプチドのＲＯＲ１のＣ末端部分における位置（アミノ酸４０４〜９３７）を示す。図５に示されているＣ末端アミノ酸配列（それぞれ、ヒトについては配列番号５１、およびマウスについては配列番号５３）は、完全長ＲＯＲ１（ＲＯＲ１＿ｖ１）（例えば、ヒトについては配列番号１にまたはマウスについては配列番号５２に対応する完全長ＲＯＲ１）のみに存在する。ヒトＲＯＲ１抗体産生のためのマウスの免疫化に使用したペプチドの位置および配列が囲み枠で示されている（配列番号２、３、５４および５５に対応する）。
【００３０】
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、ＲＯＲ１のＣ末端部分と結合する抗体の産生についてのポリクローナルマウス血清およびハイブリドーマクローンのスクリーニングを例証する。（Ａ）１３０ｋＤａ  ＲＯＲ１タンパク質を検出するための免疫ブロット分析によるＲＯＲ１−Ｋ５６２細胞およびＲＯＲ１＋ＣＬＬ細胞溶解物に対する複数のポリクローナルマウス血清のスクリーニング。（Ｂ）ＣＬＬ細胞において発現される完全長ＲＯＲ１のみに結合することができる抗体の産生についての免疫ブロット分析によるハイブリドーマクローンのスクリーニング結果。抗ＲＯＲ１抗体を産生するクローンが、ＣＬＬ細胞溶解物において１３０ｋＤａバンドの存在により検出された。抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体クローン６Ｄ４（矢印により示されているレーン）は、ＣＬＬ細胞溶解物において強い１３０ｋＤａバンドを示す。クローン４Ａ１１もまた強い１３０ｋＤａバンドを示す。
【図６Ｂ】同上。
【００３１】
【図７】図７は、完全長ＲＯＲ１過剰発現細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１＋細胞）とＲＯＲ１を発現しない細胞（ＲＯＲ１−と呼ばれる、Ｋ５６２細胞）とを使用する、ＩＨＣによるＲＯＲ１特異性についての抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体６Ｄ４の試験結果を示す。抗体６Ｄ４は、Ｋ５６２／ＲＯＲ１＋細胞での過剰発現された完全長ＲＯＲ１の明瞭な高度の細胞表面染色と、Ｋ５６２細胞（ＲＯＲ１−）での最小のバックグラウンド染色を示した。
【００３２】
【図８】図８は、ＲＯＲ１＋（ＣＬＬおよびＭＣＬリンパ節）およびＲＯＲ１−（扁桃）組織に関する抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体６Ｄ４（右パネル）のＩＨＣによる試験結果を示す。抗体６Ｄ４は、ＣＬＬおよびＭＣＬ腫瘍リンパ節において、正常扁桃組織では検出不能だった内因性完全長ＲＯＲ１の明瞭な細胞表面染色を示した。
【００３３】
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）６Ｄ４についてのＦＦＰＥ細胞のＩＨＣ染色を他のクローンに由来するモノクローナル抗体と比較して示す。（Ａ）対照Ｋ５６２細胞、ＲＯＲ１トランスフェクトＫ５６２細胞、およびＣＬＬリンパ節に対する濃縮ハイブリドーマ上清のＩＨＣスクリーニングからの代表クローン。（Ｂ）６Ｄ４  ｍＡｂでのＦＦＰＥ処理ＣＬＬ  ＰＢＭＣ（ｎ＝２）のＩＨＣ染色と抗ＲＯＲ１  ｍＡｂ  ２Ａ２でのフローサイトメトリー染色のペア。
【図９Ｂ】同上。
【００３４】
【図１０Ａ】図１０Ａから１０Ｃは、ｍＡｂ  ６Ｄ４およびアイソタイプによるＦＦＰＥ細胞のＩＨＣ染色、ならびに細胞溶解物のＲＯＲ１発現についての免疫ブロット分析をさらに例証する。（Ａ）６Ｄ４  ｍＡｂでのＦＦＰＥ  ＲＯＲ１トランスフェクト細胞株および対照細胞株（左パネル）ならびにＲＯＲ１＋腫瘍細胞株（右パネル）のＩＨＣ染色。スケールバーは、５０μｍを表す。抗ＲＯＲ１  ６Ｄ４  ｍＡｂ抗体（実線）、抗ＲＯＲ２抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−ＦＡＢ２０６４１Ｇ）（破線）、およびアイソタイプ抗体（陰影灰色）でのフローサイトメトリー染色のペア。（Ｂ）アイソタイプと比較しての６Ｄ４  ｍＡｂによるＦＦＰＥ扁桃組織ならびにＣＬＬおよびＭＣＬリンパ節の染色。（Ｃ）６Ｄ４  ｍＡｂでのＲＯＲ１−およびＲＯＲ１＋細胞株の免疫ブロット分析。完全長ＲＯＲ１が１３０ｋＤａタンパク質として発現される。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【００３５】
【図１１】図１１は、ＲＯＲ１＋腫瘍のＩＨＣスコア付けの代表的な画像を示す。「スコア０」は、染色がないことを示す。「スコア１」は、膜染色が高倍率で可視の低レベル染色を示す。「スコア２」および「スコア３」は、低倍率で可視の高度の膜染色を示す。
【００３６】
【図１２】図１２は、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体６Ｄ４を用いてＩＨＣにより分析した、上皮がんにおける完全長ＲＯＲ１の発現を示す。明瞭な細胞表面染色が卵巣がん、肺腺癌およびトリプルネガティブ乳がんにおいて観察された。
【００３７】
【図１３】図１３は、抗体６Ｄ４により検出された、肺がん亜型（腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、および非定型カルチノイド）におけるＲＯＲ１発現を示す。アイソタイプ対照抗体での染色と比較して、この抗体でこれらのがん型の各々においてＲＯＲ１染色が観察された。
【００３８】
【図１４】図１４は、重要な正常ヒト組織に由来する組織切片に関する抗体６Ｄ４およびアイソタイプ対照を使用する染色の結果を示す。
【００３９】
【図１５】図１５は、抗体６Ｄ４を使用して検出された、正常ヒト組織のサブセット（副甲状腺、食道、膵臓）に関するＲＯＲ１の発現を示す。
【００４０】
【図１６Ａ】図１６Ａから１６Ｃは、６Ｄ４  ｍＡｂを使用する、卵巣がんにおける膜ＲＯＲ１染色を示す。（Ａ）６Ｄ４  ｍＡｂで染色された卵巣がん亜型試料の代表的なＩＨＣ画像。スケールバーは、１００μｍを表す。中央のパネルにおける四角の中の領域が、下のパネルにおいて１０倍に拡大されている。（Ｂ）卵巣がんの異なる亜型におけるＲＯＲ１＋腫瘍のパーセント。（Ｃ）ＲＯＲ１＋卵巣がんサブセットにおけるＲＯＲ１高度およびＲＯＲ１低度腫瘍のパーセント。
【図１６Ｂ】同上。
【図１６Ｃ】同上。
【００４１】
【図１７Ａ】図１７Ａから１７Ｃは、６Ｄ４  ｍＡｂを使用する、乳がんにおける膜ＲＯＲ１染色を示す。（Ａ）６Ｄ４  ｍＡｂで染色された乳がん亜型組織試料の代表的なＩＨＣ画像。スケールバーは、１００μｍを表す。中央のパネルにおける四角の中の領域が、下のパネルにおいて１０倍に拡大されている。（Ｂ）乳がんの異なる亜型におけるＲＯＲ１＋腫瘍のパーセント。（Ｃ）ＲＯＲ１＋乳がんサブセットにおけるＲＯＲ１高度およびＲＯＲ１低度腫瘍のパーセント。
【図１７Ｂ】同上。
【図１７Ｃ】同上。
【００４２】
【図１８Ａ】図１８Ａから１８Ｄは、６Ｄ４  ｍＡｂを使用する、肺がんにおける膜ＲＯＲ１染色を示す。（Ａ）６Ｄ４  ｍＡｂで染色された肺がん亜型試料におけるＲＯＲ１発現の代表的なＩＨＣ画像。スケールバーは、１００μｍを表す。中央のパネルにおける四角の中の領域が、下のパネルにおいて１０倍に拡大されている。（Ｂ）肺がんの異なる亜型におけるＲＯＲ１＋腫瘍のパーセント。（Ｃ）ＲＯＲ１＋肺がんサブセットにおけるＲＯＲ１高度およびＲＯＲ１低度腫瘍のパーセント。（Ｄ）ＲＯＲ１＋肺腺癌の原発性および適合する転移性リンパ節におけるＲＯＲ１発現の代表的なＩＨＣ画像。スケールバーは、５０μｍを表す。
【図１８Ｂ】同上。
【図１８Ｃ】同上。
【図１８Ｄ】同上。
【００４３】
【図１９Ａ】図１９Ａおよび１９Ｂは、ｍＡｂ  ６Ｄ４を使用して膵臓腺癌におけるＲＯＲ１発現を示す。（ａ）膵臓腺癌におけるＲＯＲ１染色の代表的なＩＨＣ画像。スケールバーは、１００μｍを表す。右端のパネルは、中央のパネルの拡大画像である。（Ｂ）膵臓腺癌におけるＲＯＲ１＋腫瘍のパーセント。
【図１９Ｂ】同上。
【００４４】
【図２０Ａ】図２０Ａから２０Ｆは、ｍＡｂ  ６Ｄ４でのＩＨＣ染色、その後の免疫ブロットによる検証によって示された、正常ヒト組織におけるＲＯＲ１発現を示す。（Ａ）６Ｄ４  ｍＡｂでのヒト副甲状腺および膵島における膜ＲＯＲ１染色。スケールバーは、１００μｍを表す。中央のパネルにおける四角の中の領域が、下のパネルにおいて１０倍に拡大されている。（Ｂ）ヒト胃腸管の異なる領域におけるＲＯＲ１発現。スケールバーは、１００μｍを表す。中央のパネルにおける四角の中の領域が、下のパネルにおいて１０倍に拡大されている。（Ｃ）ＲＯＲ１染色は、正常ヒト大脳、小脳、心臓、肺、脾臓および肝臓にはない。スケールバーは、１００μｍを表す。（Ｄ）６Ｄ４  ｍＡｂを使用する、正常組織におけるＲＯＲ１の免疫ブロット分析。（Ｅ）ポリクローナル抗ＲＯＲ１を使用する、ＲＯＲ１高度正常組織の分析の免疫ブロット。（Ｆ）組織溶解物がＰＮＧａｓｅ  ＦでＮ結合型グリコシル化を除去するように処理された、正常組織におけるＲＯＲ１発現の免疫ブロット検証。脱グリコシル化ＲＯＲ１が１００ｋＤａで泳動している。
【図２０Ｂ】同上。
【図２０Ｃ】同上。
【図２０Ｄ】同上。
【図２０Ｅ】同上。
【図２０Ｆ】同上。
【００４５】
【図２１】図２１は、ＣＬＬ  ＰＢＭＣ、分化脂肪細胞、および正常ヒト胃腸組織におけるＲｏｒ１（完全長ＲＯＲ１をコードするもの、ＲＯＲ１＿ｖ１）の転写物発現を示す。
【００４６】
【図２２Ａ】図２２Ａから２２Ｄは、ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞活性とＲＯＲ１発現との関係を例証する。（Ａ）ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞またはｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞による、異なる標的細胞とともに２：１のＴ細胞：標的比で２４時間培養した後の、サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−２）産生（２つの独立した実験を平均したデータ）。（Ｂ）前駆脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した成熟脂肪細胞の６Ｄ４  ｍＡｂでのＲＯＲ１染色。（Ｃ）異なる２ドナーからのＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞またはｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞による、脂肪細胞、膵島細胞または膵腺房細胞とともに２：１のＴ細胞：標的比で２４時間培養した後の、ＩＦＮ−γ産生。（Ｄ）ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞またはｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞をＣＦＳＥ標識標的とともに５：１のＴ細胞：標的比でインキュベートした。高レベルのヨウ化プロピジウム（ＰＩ高度）標的細胞を有する細胞の百分率を２４時間後に測定した。
【図２２Ｂ】同上。
【図２２Ｃ】同上。
【図２２Ｄ】同上。
【００４７】
【図２３Ａ】図２３Ａから２３Ｄは、ヒトＲＯＲ１とアカゲザルＲＯＲ１との間の類似性を例証し、そしてｍＡｂ  ６Ｄ４とアカゲザルＲＯＲ１の結合を示す。（Ａ）ｍＡｂ  ６Ｄ４によって認識されるヒトＲＯＲ１配列（配列番号３）、マウスＲＯＲ１配列（配列番号５７）およびアカゲザルＲＯＲ１配列（配列番号５９）のアラインメント。（Ｂ）アカゲザルＲＯＲ１に対する抗体６Ｄ４の結合。抗体６Ｄ４を（Ａ）Ｋ５６２（ＲＯＲ１−）細胞および（Ｂ）アカゲザルＲＯＲ１を発現するＫ５６２細胞に対してＩＨＣによって試験した。抗体６Ｄ４を（Ｃ）アカゲザルＴ細胞（ＲＯＲ１−）および（Ｄ）アカゲザルＲＯＲ１をトランスフェクトしたアカゲザルＴ細胞に対しても試験した。抗体６Ｄ４は、Ｋ５６２細胞またはアカゲザルＴ細胞のいずれかにおいて過剰発現されたとき、完全長アカゲザルＲＯＲ１の明瞭な細胞表面染色を示した。（Ｃ）アカゲザル副甲状腺および膵島におけるＲＯＲ１染色。中央のパネルにおける四角の中の領域が、右のパネルにおいて１０倍に拡大されている。（Ｄ）マカク胃腸管の異なる領域におけるＲＯＲ１染色の代表的なＩＨＣ画像。中央のパネルにおける四角の中の領域が、右のパネルにおいて１０倍に拡大されている。スケールバーは、１００μｍを表す。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【図２３Ｄ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本開示は、結合タンパク質、例えば、免疫グロブリン様結合タンパク質、例えば抗体（その抗原結合断片を含む）であって、例えば、ＲＯＲ１もしくはそのエピトープまたはＲＯＲ−１由来ペプチド、例えば、表面で発現される、内因性のおよび／または完全長のＲＯＲ１に特異的である、例えば、それらと特異的に結合する、結合タンパク質を提供する。それらの結合タンパク質をコードする核酸、それらの結合タンパク質を発現する宿主細胞、およびそれらの使用方法も提供する。本明細書で提供する結合タンパク質は、一部の態様では、ＲＯＲ１のＣ末端部分と特異的に結合し、したがって、細胞表面に位置することが判明している、ＲＯＲ１の完全長アイソフォームの発現を検出するために使用することができ、一部の実施形態では、細胞内に一般に局在するそのＣ末端部分を欠く短縮ＲＯＲ１アイソフォームとは結合しない。加えて、一部の態様では、免疫グロブリン様結合タンパク質は、例えばホルマリン固定されパラフィンに包埋された（ＦＦＰＥ）細胞または組織において、完全長ＲＯＲ１の発現を検出するために使用することができ、したがって、ＲＯＲ１治療剤またはレジメンに伴う診断ツールとしてまたはコンパニオン診断薬として有用である。例えば、本明細書で提供する免疫グロブリン様結合タンパク質は、被験体がＲＯＲ１特異的療法から恩恵を受けることになるかどうか、そのような療法を投与、継続もしくは調整すべきかどうか、および／または特定の腫瘍型をそのように処置すべきかどうかを決定するために使用することができる。提供される実施形態のいずれかにおいて使用するための療法の例は、免疫療法、例えば、抗体療法および／もしくは養子免疫療法、ならびに／またはＲＯＲ１特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾細胞、例えばＴ細胞を含むものである。
【００４９】
免疫療法などのＲＯＲ１特異的療法の投与を含むものなどの、治療方法も提供する。ある特定の実施形態では、療法は、抗ＲＯＲ１抗体もしくはその断片、例えば、そのような抗体断片を含むＣＡＲであるか、または抗ＲＯＲ１抗体もしくはその断片、例えば、そのような抗体断片を含むＣＡＲを含む。さらなる実施形態では、療法は、ＣＡＲが、ヒトＲＯＲ１の細胞外部分などの、ＲＯＲ１と特異的に結合する、ＣＡＲ修飾細胞であるか、またはそのようなＣＡＲ修飾細胞を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖなどの抗体断片を含む結合ドメインを介してＲＯＲ１と結合する。一部の態様では、ＣＡＲは、スペーサー、例えば、１つもしくは複数の抗体定常領域および／またはヒンジ領域を含み、一部の態様では、ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、ならびに１つまたは複数の、一般には１つより多くの細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータ由来のもしくは他の一次シグナル伝達ドメイン、ならびに／または共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８および／もしくは４１ＢＢに由来するものをさらに含む。
【００５０】
一部の実施形態では、ＣＡＲおよび／または抗体は、エピトープ特異性であるか、エピトープ特異性を含むか、もしくはエピトープ特異性を共有し、ならびに／またはＲ１２と称する抗ＲＯＲ１  ＩｇＧ１抗体（これは、例えば、Ｙａｎｇら、ＰｌｏＳ  ＯＮＥ、６巻：ｅ２１０１８、２０１１年；Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９巻：３１５３頁、２０１３年；米国特許出願公開第２０１３／０２５１６４２号に開示されている）、および／もしくはその抗原結合部分、例えばｓｃＦｖ、および／もしくはそのＣＤＲを含む抗体と、結合について競合する。Ｒ１２の抗原結合ｓｃＦｖ断片を含有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＣＡＲ療法において抗腫瘍反応性を有効に促進することが実証されている（Ｈｕｄｅｃｅｋら、２０１３年；国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２０１４／０３１６８７）。
【００５１】
一部の実施形態では、疾患または状態は、腫瘍であるか、または腫瘍を含み、該腫瘍は、原発性であってもよく、または転移性であってもよい。一部の態様では、疾患または状態は、任意選択でＣＬＬまたはＭＣＬである血液腫瘍であり、および／または任意選択で肺腺癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、非定型カルチノイドもしくはトリプルネガティブ乳がんである、任意選択で乳がん、肺がん、卵巣がんもしくは膵がん腫瘍である、固形腫瘍である。一部の態様では、疾患もしくは状態における細胞の、またはそれに関連する組織の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、治療により認識されるＲＯＲ１またはそのエピトープもしくはペプチドを発現し、および／あるいはそのようなタンパク質またはエピトープまたはペプチドは、そこで均一にまたは均質に発現される。一部の態様では、そのような発現は、本明細書で提供する抗体を使用して、および／またはそのような抗体とともに使用される検出方法を使用して、決定されたものである。
【００５２】
本開示をより詳細に示す前に、本明細書で使用される一定の用語の定義を提供することは、本開示の理解の助けになるだろう。さらなる定義は、本開示を通して示す。
【００５３】
本明細書では、任意の濃度範囲、百分率範囲、比の範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、述べられている範囲内の任意の整数の値、および適宜、その分数（例えば、整数の十分の一および百分の一）を含むと解されるものとする。また、任意の物理的特徴、例えば、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さに関して本明細書で述べられている任意の数値範囲は、別段の指示がない限り、述べられている範囲内の任意の整数を含むと解されるものとする。
【００５４】
本明細書で使用される用語「約」は、別段の指示がない限り、示されている範囲、値または構造の±２０％を意味する。
【００５５】
本明細書で使用される用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、列挙されている成分の「１つまたは複数」を指すと解されたい。代替案（例えば「または」）の使用は、代替案のどちらか一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると解されたい。
【００５６】
加えて、本明細書に記載の構造および置換基の様々な組み合わせに由来する個々の化合物または化合物群は、あたかも各化合物または化合物群が個々に記載されている場合と同程度に、本願により開示されていると解されたい。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本開示の範囲内である。
【００５７】
本明細書で使用される用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、同義的に使用され、これらの用語および異表記は、非限定的と解釈されることを意図したものである。
【００５８】
用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を、明記されている材料もしくはステップに、または特許請求された発明の基本的特徴に著しい影響を与えないものに限定する。例えば、タンパク質ドメイン、領域もしくはモジュール（例えば、結合ドメイン、ヒンジ領域、リンカーモジュール）、またはタンパク質（１つもしくは複数のドメイン、領域もしくはモジュールを有し得る）は、ドメイン、領域、モジュールまたはタンパク質のアミノ酸配列が、併せて、ドメイン、領域、モジュールもしくはタンパク質の長さの最大２０％（例えば、最大１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）に寄与し、かつドメイン、領域、モジュールまたはタンパク質の活性（例えば、結合タンパク質の標的結合親和性）に実質的な影響を与えない（すなわち、活性を５０％を超えて、例えば、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％も低下させない）、伸長、欠失、変異、またはそれらの組み合わせ（例えば、アミノもしくはカルボキシ末端またはドメイン間のアミノ酸）を含む場合、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」。
【００５９】
本明細書で使用される「ＲＯＲ１」または「受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１」は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｑ０１９７３−１、Ｑ０１９７３−２もしくはＱ０１９７３−３のいずれか１つのヒト基準アミノ酸配列との相同性を有する哺乳動物受容体チロシンキナーゼポリペプチド、または基準アミノ酸配列のコンセンサス配列、またはそのアイソフォームもしくはバリアントもしくは断片である。例示的ホモログは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｑ９Ｚ１３９−１のマウスアミノ酸配列である。その完全長形態のＲＯＲ１は、（１）免疫グロブリン様ドメインとＦｒｉｚｚｌｅｄドメインとクリングルドメインとを含有する細胞外部分、（２）膜貫通部分、および（３）チロシンキナーゼドメインを含有する細胞内部分を含み（図１）、これを本明細書では「完全長ＲＯＲ１」または「ＲＯＲ１＿ｖ１」と呼ぶ。ある特定の実施形態では、完全長ＲＯＲ１は、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、ヒト完全長ＲＯＲ１である。ＲＯＲ１は、完全長ＲＯＲ１のＮ末端部分を含むが完全長ＲＯＲ１の膜貫通および細胞内部分を欠く、細胞内アイソフォーム（Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｂｌｏｏｄ  １１６巻：４５３２頁、２０１０年）として見いだされることもあり、これを本明細書では「短縮ＲＯＲ１」または「短いアイソフォームＲＯＲ１」または「ＲＯＲ１＿ｖ２」と呼ぶ。
【００６０】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸残基で構成された化合物を指す。用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同義語であることもあり、または加えて、２つまたはそれより多くのポリペプチドの複合体を指すこともある。ポリペプチドは、他の成分（例えば、共有結合されているもの）、例えば、タグ、標識、生物活性分子、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含有することもある。特定の実施形態では、ポリペプチドは、断片であってもよい。本明細書で使用される「断片」は、基準配列において見いだされる１つまたは複数のアミノ酸を欠くポリペプチドを意味する。断片は、基準配列において見いだされる結合ドメイン、抗原またはエピトープを含むことができる。基準ポリペプチドの断片は、基準配列のアミノ酸配列のアミノ酸の少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くを有することができる。
【００６１】
本明細書に記載の「バリアント」ポリペプチド種は、本明細書に提示の基準ポリペプチドと比べて、１つまたは複数の部位に１つもしくは複数の非天然アミノ酸、１つもしくは複数のアミノ酸置換、１つもしくは複数のアミノ酸挿入、１つもしくは複数のアミノ酸欠失、またはそれらの組み合わせを有する。ある特定の実施形態では、「バリアント」は、基準ポリペプチドと比べて実質的に同様の活性（例えば、酵素機能、免疫原性）または構造を有するポリペプチドを意味する。基準ポリペプチドのバリアントは、当技術分野において公知の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定して、基準ポリペプチドのアミノ酸配列との少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有することができる。バリアントは、例えば、遺伝的多型またはヒトによる操作の結果として得ることができる。アミノ酸の保存的置換は周知であり、自然に起こることもあり、またはタンパク質が組換えで産生されるときに導入されることもある。アミノ酸置換、欠失および付加を、当技術分野において公知の変異誘発方法を使用してタンパク質に導入してもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、２００１年を参照されたい）。オリゴヌクレオチド誘導部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手順を利用して、所望される置換、欠失または挿入に応じて変化させた特定のコドンを有する変化したポリペプチドを得てもよい。あるいは、ランダムまたは飽和変異誘発技術、例えば、アラニンスキャニング変異誘発、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、およびオリゴヌクレオチド誘導変異誘発を使用して、ポリペプチドバリアントを調製してもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲を参照されたい）。
【００６２】
２つまたはそれより多くのポリペプチドまたは核酸分子配列の文脈での用語「同一の」または「同一性パーセント」は、当技術分野において公知の方法、例えば配列比較アルゴリズムを使用して、手動アラインメントにより、または目視検査により測定して、比較ウインドウまたは指定領域にわたって比較し、最もよく一致するように整列させたとき、同じである２つもしくはそれより多くの配列もしくは部分配列、または指定領域にわたって同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定百分率（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性）を有する２つもしくはそれより多くの配列もしくは部分配列を意味する。例えば、配列同一性および配列類似性パーセントの決定に好適な好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３８９頁、１９７７年）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３頁、１９９０年）に、それぞれ記載されている。
【００６３】
本明細書で使用される「融合タンパク質」は、天然ではタンパク質中で一緒に見いだされない少なくとも２つの異なるドメインを有する、一本鎖ポリペプチドを含む。融合タンパク質をコードする核酸分子を、ＰＣＲを使用して構築すること、組換えにより作出すること、もしくは同様のことができ、またはそのような融合タンパク質を合成により作製することができる。融合タンパク質は、他の成分（例えば、共有結合されているもの）、例えば、タグまたは生物活性分子をさらに含有することもある。
【００６４】
「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、３’−５’ホスホジエステル結合によって連結されているデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかを含有する、一本鎖もしくは二本鎖直鎖状または環状ポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはベクターＤＮＡを含む。
【００６５】
本開示のポリヌクレオチドのバリアントも企図される。バリアントポリヌクレオチドは、本明細書に記載の基準ポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９．９％同一であるか、または約６５℃〜６８℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、もしくは約４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で規定配列の基準ポリヌクレオチドとハイブリダイズするものである。ポリヌクレオチドバリアントは、本明細書に記載の機能性を有する免疫グロブリン様結合タンパク質またはその抗原結合断片をコードする能力を保持する。
【００６６】
用語「単離される」は、材料がその元の環境（例えば、その材料が天然に存在する場合には天然環境）から除去されることを意味する。例えば、生きている動物内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然系に共存する材料の一部またはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であることもあり、ならびに／またはそのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物（例えば、細胞溶解物）の一部であることもあり、およびさらには、そのようなベクターもしくは組成物が核酸もしくはポリペプチドにとっての天然環境の一部でない点で単離されていることもある。
【００６７】
核酸配列を細胞に挿入する文脈での用語「導入される」は、「トランスフェクション」、「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸分子を細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込むことができるか、自律レプリコンに変換することができるか、または（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡを）一過性に発現することができる、真核または原核細胞への核酸配列の組込みへの言及を含む。
【００６８】
本明細書で使用される「異種」または「外因性」核酸分子、構築物または配列は、宿主細胞にとって生得的なものではないが、宿主細胞からの核酸分子または核酸分子の一部と相同であり得る、核酸分子または核酸分子の部分を指す。異種または外因性核酸分子、構築物または配列の供給源は、異なる属または種からのものであり得る。ある特定の実施形態では、異種または外因性核酸分子は、例えばコンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または同様のものにより、宿主細胞または宿主ゲノムに付加され（すなわち、宿主細胞または宿主ゲノムに内因性のものでも生得的なものでもなく）、付加された分子は、宿主ゲノムに組み込まれることもあり、または染色体外遺伝物質として（例えば、自己複製ベクターのプラスミドもしくは他の形態として）存在することもあり、および複数のコピーで存在することもある。加えて、「異種の」は、宿主細胞に導入された外因性核酸分子によってコードされている非生得的酵素、タンパク質または他の活性を、たとえ宿主細胞が同種タンパク質または活性をコードしていたとしても、指す。
【００６９】
本明細書で使用される用語「内因性」または「生得的」は、宿主細胞中に通常存在する遺伝子、タンパク質または活性を指す。さらに、親遺伝子、タンパク質または活性と比較して変異、過剰発現、シャッフル、重複または別様に変化している遺伝子、タンパク質または活性は、それでもやはり、その特定の宿主細胞に内因性または生得的であると見なされる。例えば、第１の遺伝子からの内因性制御配列（例えば、プロモーター、翻訳減衰配列）を使用して、第２の生得的遺伝子または核酸分子の発現を変化させるまたは調節することができ、その場合、第２の生得的遺伝子または核酸分子の発現または調節は、親細胞における通常の発現または調節とは異なる。
【００７０】
「免疫組織化学」（ＩＨＣ）は、細胞および組織試料などの、組織学試料中の抗原の存在を、抗原に特異的な抗体を使用して検出するために使用される技術を意味する。細胞または組織試料は、被験体または生物学的供給源から得られる、いずれの組織または細胞であってもよい。「被験体」または「生物学的供給源」は、例えば、ヒトもしくは非ヒト動物、初代細胞、細胞培養物、または培養に適合させた細胞株であり得、これらには、染色体に組み込まれた核酸分子もしくはエピソーム組換え核酸分子もしくは異種核酸分子を含有し得る遺伝子操作された細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、不死化したもしくは不死化可能な細胞もしくは細胞株、分化したもしくは分化可能な細胞もしくは細胞株、形質転換細胞もしくは細胞株、または同様のものが含まれる。ある特定の実施形態では、生物学的試料は、ヒトからのものである。「ヒト患者」は、完全長ＲＯＲ１などのＲＯＲ１の発現もしくは過剰発現に関連する任意の疾患もしくは状態に罹患しているか、またはそのような疾患もしくは状態を発症するもしくは再発するリスクがある、ヒト被験体を意味する。
【００７１】
「免疫ブロット」または「免疫ブロッティング」（ウェスタンブロットとも呼ばれる）は、ゲル電気泳動を使用してタンパク質を分離し、分離されたタンパク質を、抗原に特異的な抗体またはその断片もしくはバリアントで染色する、組織ホモジネートまたは抽出物の試料中の抗原（例えば、ＲＯＲ１）の存在を検出するために使用される技術を意味する。
【００７２】
ＲＯＲ１に特異的な結合タンパク質
ＲＯＲ１タンパク質および／またはその一部分と一般に特異的に結合するＲＯＲ１結合タンパク質などの結合タンパク質を提供する。結合タンパク質は、結合ドメインを含み、本明細書において一部の実施形態で開示する結合タンパク質は、完全長ＲＯＲ１アイソフォーム中に存在するが短縮ＲＯＲ１アイソフォーム中には存在しないＲＯＲ１のＣ末端部分と結合するので、完全長ＲＯＲ１を特異的に検出する。対照的に、ほとんどの市販および公開抗ＲＯＲ１抗体は、完全長ＲＯＲ１（ＲＯＲ１＿ｖ１）形態と短縮ＲＯＲ１（ＲＯＲ１＿ｖ２）形態の両方に存在する、ＲＯＲ１のＮ末端部分に対するものである。したがって、本開示の免疫グロブリン結合ドメインおよび免疫グロブリン様タンパク質を使用して、高い程度の特異性で（例えば、内因性）完全長ＲＯＲ１を発現する細胞および組織を同定することができる。
【００７３】
さらに、本開示の免疫グロブリン結合ドメインおよびタンパク質は、例えばがん細胞により、内因性発現された完全長ＲＯＲ１を検出することができる。加えて、本明細書で開示する免疫グロブリン様結合タンパク質は、ホルマリン固定されパラフィンに包埋された（ＦＦＰＥ）組織試料などの組織学試料における完全長ＲＯＲ１の内因性発現を検出するのに有用である。比較すると、市販および公開抗ＲＯＲ１抗体は、組織学試料において内因性発現したＲＯＲ１に一貫性なく結合するか、そのようなＲＯＲ１を弱く検出するか、または一般には検出することができない。例えば、そのような市販の抗体は、ホルマリン固定されパラフィンに包埋された組織学的試料における内因性ＲＯＲ１発現を検出しない。したがって、本明細書で開示する免疫グロブリン結合ドメインおよびタンパク質は、公知の抗ＲＯＲ１抗体と比較して、内因性発現したＲＯＲ１を検出するのにより高い感度も（より大きい特異性に加えて）示す。
【００７４】
本明細書で使用される「結合ドメイン」または「結合領域」は、標的（例えば、抗原、リガンド）を特異的に認識してその標的と結合する能力を有するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはペプチド（例えば、抗体、受容体）もしくはその一部分を指す。結合ドメインは、目的の生体分子または別の標的についての任意の天然に存在する、合成、半合成または組換えで産生された結合パートナーを含む。例示的結合ドメインとしては、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、受容体外部ドメイン、またはリガンドが挙げられる。免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）は、本明細書では「免疫グロブリン結合ドメイン」と呼ばれる。特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための様々なアッセイが公知であり、そのようなアッセイには、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析が含まれる。
【００７５】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、より大きいポリペプチドまたはタンパク質の一部であり、「結合タンパク質」と呼ばれる。「免疫グロブリン結合タンパク質」または「免疫グロブリン様結合タンパク質」は、１つまたは複数の免疫グロブリン結合ドメインを含有するポリペプチドであって、様々な免疫グロブリン関連タンパク質足場または構造の任意の形態、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、またはそのような免疫グロブリン結合ドメインもしくは他の結合ドメインのうちの２つもしくはそれより多くを含む融合タンパク質であり得る、ポリペプチドを指す。
【００７６】
指定ドメインの「Ｃ末端」側に結合する結合ドメインまたはタンパク質は、指定ドメイン内に位置するまたは指定ドメインよりもタンパク質のＣ末端の近くに位置するエピトープと結合する、結合ドメインまたはタンパク質を指す。例えば、「ＲＯＲ１の細胞内プロテインキナーゼドメインのＣ末端側」への結合は、細胞内プロテインキナーゼドメイン内に位置するか、細胞内プロテインキナーゼドメインに隣接して（該ドメインの隣にもしくは約１０〜約１５アミノ酸以内に）および該ドメインよりもＲＯＲ１のＣ末端の近くに位置するか、またはＲＯＲ１のＣ末端と細胞内プロテインキナーゼドメインの間に位置する、ＲＯＲ１の部分との結合を指す。
【００７７】
ある特定の態様では、本開示は、ＲＯＲ１のＣ末端部分に特異的に結合する結合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＲＯＲ１の細胞内プロテインキナーゼドメインのＣ末端側に特異的に結合する。特定の実施形態では、結合タンパク質は、免疫グロブリン様結合タンパク質である。さらなる実施形態では、結合タンパク質は、抗体もしくはその抗原結合断片であるか、または抗体もしくはその抗原結合断片を含む。上述の実施形態のいずれにおいても、ＲＯＲ１は、ヒトＲＯＲ１であってもよい。例えば、一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、例えば、６Ｄ４またはその抗原結合断片、例えば、配列番号３７および／または３８に記載の配列を含むもの、あるいは１つもしくは複数のそのＣＤＲを含む抗体、またはＲＯＲ１もしくはＲＯＲ１ペプチドとの結合についてそのような抗体と競合する抗体である。
【００７８】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、受容体、または他の結合ドメインもしくは結合タンパク質と特異的に結合することができる、任意のアミノ酸配列またはタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基を含有し、特異的三次元構造特性はもちろん特異的電荷特性も有することができる。
【００７９】
ある特定の実施形態では、本開示の免疫グロブリン様結合タンパク質は、配列番号２、３、４、５、５４または５５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列内に位置するエピトープと特異的に結合することができる。さらなる実施形態では、本開示の免疫グロブリン様結合タンパク質は、配列番号２、３、５４または５５に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるアミノ酸配列内に位置するエピトープと特異的に結合することができる。さらなる実施形態では、本開示の免疫グロブリン様結合タンパク質は、Ｎ−ＮＰＲＹＰＮＹＭＦＰＳＱＧＩＴＰＱＧＱＩＡＧＦＩＧＰＰＩＰ−Ｃ（配列番号３）のアミノ酸配列内に位置するエピトープと特異的に結合する。
【００８０】
ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号３を含むペプチドであって、前記ペプチドが、任意選択で配列番号３からなる、ペプチド、および／または（ｉｉ）ＲＯＲ１タンパク質のエピトープに特異的に結合し、エピトープが、（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内にあるか、および／または（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内の１つもしくは複数のアミノ酸を含む。
【００８１】
特異的実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列内に位置するエピトープに結合する。
【００８２】
結合ドメインの供給源としては、ヒト、齧歯類、鳥類、ウサギおよびヒツジを含む、様々な種からの抗体可変領域（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂもしくは可溶性ＶＨドメインまたはドメイン抗体としてフォーマットすることができるもの）が挙げられる。結合ドメインのさらなる供給源としては、他の種、例えば、ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダもしくはラマからのもの；Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４巻：５２１頁、１９９７年；Ｖｉｎｃｋｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４巻：３２７３頁、２００９年；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３巻：４４６頁、１９９３年およびＮｇｕｙｅｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５巻：４１３頁、１９９８年）、テンジクザメ（Ｒｏｕｘら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’  ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５巻：１１８０４頁、１９９８年）、スポッテッドラットフィッシュ（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５４巻：３９頁、２００２年）、またはヤツメウナギ（Ｈｅｒｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’  ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５巻：２０４０頁、２００８年、およびＡｌｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９巻：３１９頁、２００８年）からの抗体の可変領域が挙げられる。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成することができるようであり、すなわち、これらの機能性抗体は、重鎖のみのホモ二量体である（「重鎖抗体」と呼ばれる）（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２巻：１１６１頁、２００４年；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４巻：２８５３頁、２００４年；Ｂａｒａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１２巻：５８０頁、２００６年；およびＢａｒｔｈｅｌｅｍｙら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３巻：３６３９頁、２００８年）。
【００８３】
抗体技術の当業者によって理解されている用語には、本明細書において明確に異なって定義されていない限り、各々、当技術分野で獲得された意味が与えられる。用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続されている少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含むインタクト抗体、ならびにインタクト抗体によって認識される抗原標的分子と結合する能力を有するまたは保持する、インタクト抗体の任意の抗原結合部分または断片、例えば、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦａｂ’２断片を指す。したがって、本明細書での用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含み、該ポリクローナルおよびモノクローナル抗体には、インタクト抗体およびそれらの機能性（抗原結合）抗体断片が含まれ、そのような抗体断片には、抗原結合断片（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖抗体断片（一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む）、およびシングルドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片が含まれる。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子操作された形態および／または別様に修飾された形態、例えば、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびにヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性、抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、タンデムジｓｃＦｖ、タンデムトリｓｃＦｖを包含する。別段の記述がない限り、用語「抗体」は、その機能性抗体断片を包含すると解されたい。この用語は、任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、インタクトまたは完全長抗体も包含し、そのようなクラスまたはサブクラスには、ＩｇＧならびにそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤが含まれる。
【００８４】
モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、非ヒト、キメラ、ヒト化またはヒトのものであってもよい。免疫グロブリン構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１４章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年）に総説されている。
【００８５】
例えば、用語「ＶＬ」および「ＶＨ」は、抗体軽鎖および重鎖それぞれからの可変結合領域を指す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として公知の、別個の明確に定義された部分領域（ｓｕｂ−ｒｅｇｉｏｎ）で構成されている。用語「ＣＬ」は、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽鎖からの定常領域を指す。用語「ＣＨ」は、「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を指し、この領域は、抗体アイソタイプに依存して、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）へとさらに分割可能である。「Ｆａｂ」（抗原結合断片）は、抗原と結合する抗体の部分であり、可変領域と、鎖間ジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている重鎖のＣＨ１とを含む。
【００８６】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義の用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」が、抗原特異性および／または結合親和性を付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことは、当技術分野において公知である。一般に、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）があり、各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）がある。「フレームワーク領域」および「ＦＲ」が、重鎖および軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すことは、当技術分野において公知である。一般に、各完全長重鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３およびＦＲ−Ｈ４）があり、各完全長軽鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３およびＦＲ−Ｌ４）がある。
【００８７】
所与のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、いくつかの周知スキームのいずれかを使用して容易に決定することができ、そのようなスキームには、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１年）によるもの（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３巻：９２７〜９４８頁、１９９７年）によるもの（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、ＭａｃＣａｌｌｕｍら（Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２巻：７３２〜７４５頁、１９９６年）によるもの（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら（Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７巻：５５〜７７頁、２００３年）によるもの（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）、およびＨｏｎｅｇｇｅｒ  ＡおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  Ａ（Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９巻：６５７〜７０頁、２００１年）によるもの（「Ａｈｏ」番号付けスキーム）が含まれる。
【００８８】
所与のＣＤＲまたはＦＲの境界は、同定に使用されるスキームによって変わり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造アラインメントに基づき、その一方でＣｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づく。ＫａｂａｔスキームとＣｈｏｔｈｉａスキームの両方の番号付けは、最も一般的な抗体領域配列長に基づくものであり、挿入には挿入文字、例えば「３０ａ」によって対応し、一部の抗体には欠失が出現する。２つのスキームは、ある特定の挿入および欠失（「インデル」）を異なる位置に配置するため、結果として異なる番号付けになる。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複雑な結晶構造の分析に基づくものであり、多くの点でＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームと類似している。
【００８９】
下の表１はＫａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａおよびＣｏｎｔａｃｔスキームによってそれぞれ同定されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３の例示的位置境界を列挙するものである。ＣＤＲ−Ｈ１については、Ｋａｂａｔ番号付けスキームとＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの両方を使用する残基番号付けが列挙されている。ＦＲは、ＣＤＲ間に位置し、例えば、ＦＲ−Ｌ１は、ＣＤＲ−Ｌ１とＣＤＲ−Ｌ２の間に位置する、など。示されているＫａｂａｔ番号付けスキームは、Ｈ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を配置するため、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、示されているＫａｂａｔ番号付け規定を使用して番号付けしたとき、ループの長さに依存してＨ３２とＨ３４の間で変動することに注目される。
【表１】
2019511904.tif 000002
【００９０】
したがって、別段の指定がない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域、の「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」または個々の指定ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２）は、上述のスキームのいずれかによって定義される、ある（または特異的）相補性決定領域を包含すると解されたい。例えば、特定のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ３）が、所与のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を含有すると述べられている場合、そのようなＣＤＲは、上述のスキームのいずれかによって定義される可変領域内の対応するＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ３）の配列を有すると解される。一部の実施形態では、指定ＣＤＲ配列が指定される。同様に、別段の指定がない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域、のＦＲまたは個々の指定ＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２）は、公知スキームのいずれかによって定義される、ある（または特異的）フレームワーク領域を包含すると解されたい。一部の事例では、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＣｏｎｔａｃｔ法によって定義されるＣＤＲなどの、特定のＣＤＲ（単数または複数）またはＦＲ（単数または複数）の同定のためのスキームが指定される。他の場合、ＣＤＲまたはＦＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。
【００９１】
提供する抗体の中には、抗体断片もある。「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、抗体は、可変重鎖領域を含む一本鎖抗体断片、可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体断片、または両方を含む一本鎖抗体断片、例えばｓｃＦｖである。
【００９２】
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。ある特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である。
【００９３】
抗体断片は、例えば、インタクト抗体のタンパク質分解性消化、および組換え宿主細胞による産生などの、様々な技術によって作製することができる。一部の実施形態では、抗体は、組換えで産生された断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカー、によって連結された２つもしくはそれより多くの抗体領域または抗体鎖を有するものなどの、天然に存在しない配置（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）および／または天然に存在するインタクト抗体の酵素的消化によって産生することができない配置を含む断片である。一部の態様では、抗体断片は、ｓｃＦｖである。
【００９４】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域部分」は、１つまたは複数の定常ドメイン、例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４またはそれらの任意の組み合わせを含み得る、抗体からのＦｃ断片の重鎖定常領域セグメント（「結晶性断片」領域またはＦｃ領域）を指す。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域部分は、ＩｇＧ、ＩｇＡもしくはＩｇＤ抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはそれらの任意の組み合わせ、あるいはＩｇＭまたはＩｇＥ抗体のＣＨ３およびＣＨ４ドメインおよびそれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態では、ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ３ＣＨ４構造は、同じ抗体アイソタイプからの部分領域ドメインを有し、ヒトのもの、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ（例えば、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ２ＣＨ３）である。バックグラウンドにより、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンのエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）および補体結合、Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＦｃＲｎ）との結合、Ｆｃ領域を欠くポリペプチドと比べて長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期、プロテインＡ結合、ならびにおそらくさらには経胎盤移行に関与する（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７巻：５２５頁、１９８９年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本開示の免疫グロブリン様結合タンパク質において見いだされるＦｃ領域部分は、これらのエフェクター機能の１つまたは複数を媒介することができる、あるいはこれらの活性の１つもしくは複数またはすべてを、例えば当技術分野において公知の１つまたは複数の変異によって、欠くであろう。
【００９５】
加えて、抗体は、Ｆａｂ領域とＦｃ領域の間に通常は位置するヒンジ配列を有する（しかし、ヒンジの下方セクションが、Ｆｃ領域のアミノ末端部分を含むこともある）。バックグラウンドにより、免疫グロブリンヒンジは、Ｆａｂ部分が空間内を自由に移動できるように可撓性スペーサーとしての機能を果す。定常領域とは対照的に、ヒンジは、構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス間およびさらにはサブクラス間で配列と長さの両方が異なる。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域は、自由に可撓性であり、これにより、Ｆａｂ断片は、それらの対称軸の周りを回転し、２つの重鎖間ジスルフィド架橋の第１の架橋を中心とする球内に移動することが可能になる。比較すると、ヒトＩｇＧ２ヒンジは比較的短く、また４つの重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された堅いポリプロリン二重らせんを含有し、この二重らせんが可撓性を制限する。ヒトＩｇＧ３ヒンジは、その固有の伸長したヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）の点で他のサブクラスとは異なり、このヒンジ領域は、６２個のアミノ酸（２１個のプロリンおよび１１個のシステインを含む）を含有し、非可撓性ポリプロリン二重らせんを形成するが、Ｆａｂ断片がＦｃ断片から比較的遠くに離れているので、より大きい可撓性をもたらす。ヒトＩｇＧ４ヒンジは、ＩｇＧ１より短いが、ＩｇＧ２と同じ長さを有し、その可撓性は、ＩｇＧ１とＩｇＧ２の中間である。
【００９６】
本明細書で使用される、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域内のアミノ酸残基の位置は、別段の定めがない限り、Ｋａｂａｔ番号付け規定に従ってヒトＩｇＧ１の可変領域が１２８のアミノ酸残基で構成されていると仮定して、番号付けされる。ヒトＩｇＧ１重鎖の番号付けされた定常領域は、その後、他の免疫グロブリン重鎖の定常領域内のアミノ酸残基に番号付けするための基準として使用される。ヒトＩｇＧ１重鎖以外の免疫グロブリン重鎖の定常領域内の目的のアミノ酸残基の位置は、目的のアミノ酸残基と整列する、ヒトＩｇＧ１重鎖内のアミノ酸残基の位置である。ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域と他の免疫グロブリン重鎖の定常領域間のアラインメントは、デフォルトパラメータを用いてＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を使用するＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）などの、当技術分野において公知のソフトウェアプログラムを使用して行うことができる。本明細書に記載の番号付けシステムによれば、例えば、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２領域は、他のＣＨ２領域と比較してそのアミノ末端付近にアミノ酸欠失を有することもあるが、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２における２９６に位置する「Ｎ」の位置は、この残基がヒトＩｇＧ１  ＣＨ２における２９７位の「Ｎ」と整列するので、やはり２９７位と見なされる。
【００９７】
一部の実施形態では、免疫グロブリン様結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片である。例えば、結合タンパク質は抗体を含み、抗体は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の実施形態では、免疫グロブリン様結合タンパク質は、モノクローナル抗体６Ｄ４またはその抗原結合断片である。
【００９８】
ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質、例えば、抗体またはその結合断片は、配列番号６、７および８に記載の配列を含む重鎖またはその一部分を含有する。一部の実施形態では、重鎖またはその一部分は、配列番号２１、２５および２９、ならびに／または２２、２６および２９、ならびに／または２３、２７および２９、ならびに／または２４、２８および３０に記載のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含む。一部の実施形態では、重鎖またはその一部分は、配列番号３７またはそれと少なくとも９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、および／あるいは配列番号１２、１３または１４に記載の配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％の同一性または１００％の同一性を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号８、２９または３０の配列、および配列番号１１、３５または３６の配列を含む。ある特定の実施形態では、結合タンパク質、例えば、抗体またはその断片は、配列番号９、１０および１１に記載の配列を含む軽鎖またはその一部分を含有する。一部の実施形態では、軽鎖またはその一部分は、配列番号３１、３３および３５、ならびに／または３２、３４および３６に記載のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含む。一部の実施形態では、軽鎖またはその一部分は、配列番号３８を含むか、またはそれと少なくとも９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％の同一性を有する配列を含み、および／あるいは配列番号１５または１６に記載の配列と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％の同一性または１００％の同一性を含む。一部の実施形態では、重鎖またはその一部分は、ＶＨであるか、またはＶＨを含み、一部の実施形態では、軽鎖またはその一部分は、ＶＬであるか、またはＶＬを含む。
【００９９】
ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、（ａ）配列番号６または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号６のバリアントに記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；（ｂ）配列番号７または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号７のバリアントで示される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；および（ｃ）配列番号８または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号８のバリアントで示される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本開示の免疫グロブリン様結合タンパク質は、（ａ）配列番号９または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号９のバリアントで示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；（ｂ）配列番号１０または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号１０のバリアントで示される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；および（ｃ）配列番号１１または１つもしくは２つのアミノ酸置換を有する配列番号１１のバリアントで示される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、本開示の免疫グロブリン様結合タンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および配列番号１２、１３または１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。上述の実施形態のいずれにおいても、免疫グロブリン様結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片、例えば、モノクローナル抗体もしくは操作されたモノクローナル抗体またはその結合断片である。
【０１００】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示する結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１２、１３もしくは１４に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）内のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３；および／または（ｉｉ）配列番号１５もしくは１６に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のＣＤＲ３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、重鎖ＣＤＲ３は、配列番号２９もしくは配列番号３０に記載の配列を含み、および／または軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号３５もしくは配列番号３６に記載の配列を含む。そのような実施形態では、結合タンパク質は、配列番号１２、１３もしくは１４に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）内の、ＣＤＲ１および／もしくはＣＤＲ２のアミノ酸配列をそれぞれ有する、重鎖ＣＤＲ１および／もしくは重鎖ＣＤＲ２；ならびに／または（ｉｉ）配列番号１５もしくは１６に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、軽鎖ＣＤＲ１および／もしくは軽鎖ＣＤＲ２を、さらに含み得る。特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号２１、２２、２３もしくは２４に記載の配列を含み、および／または重鎖ＣＤＲ２は、配列番号２５、２６、２７もしくは２８に記載の配列を含むか；および／または軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号３１もしくは３２に記載の配列を含み、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号３３もしくは３４に記載の配列を含む。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および配列番号１２、１３または１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むか、ならびに／または結合タンパク質は、配列番号３７を含むＶＨ、および／または配列番号３８を含むＶＬを含む。
【０１０２】
ある特定の他の実施形態では、結合タンパク質は、抗体の抗原結合断片、例えば、ｓｃＦｖ（短いペプチドリンカーによって接続されている、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ））を含む。例えば、本開示の免疫グロブリン様結合タンパク質は、配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有するｓｃＦｖを含むか、あるいは配列番号３８の配列と、配列番号１２、１３または１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含むか、あるいは配列番号３７の配列、またはそれと少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１２、１３または１４に記載のアミノ酸配列を有するＶＨを含むか、あるいは配列番号３７の配列、またはそれと少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％の同一性を有する配列と、配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列を有するＶＬとを含むか、あるいは配列番号３８、またはそれと少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、モノクローナル抗体６Ｄ４またはその結合断片の可変ドメインＶＬおよびＶＨを有するｓｃＦｖを含む。
【０１０３】
さらに他の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および配列番号１２、１３または１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体またはその断片を含み、抗体は、任意選択で、（ｉ）配列番号３を含むペプチドであって、前記ペプチドが、任意選択で配列番号３からなる、ペプチド、および／または（ｉｉ）ＲＯＲ１タンパク質のエピトープに特異的に結合し、エピトープが、（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内にあるか、および／または（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列内の１つもしくは複数のアミノ酸を含む。
【０１０４】
なおさらなる実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ＲＯＲ２に結合しない。
【０１０５】
本明細書で使用される「特異的に結合する」または「に特異的な」は、一部の実施形態では、結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１抗体）または結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）が、試料中の任意の他の分子または成分と有意に会合または結合しないが、標的分子と１０５Ｍ−１に等しいまたはそれより高い親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡会合定数）（この会合反応についての結合速度［ｋｏｎ］の解離速度［ｋｏｆｆ］に対する比に相当する）で会合または結合することを指す。結合ドメイン（またはそれらの融合タンパク質）は、「高親和性」結合ドメイン（またはそれらの融合タンパク質）および「低親和性」結合ドメイン（またはそれらの融合タンパク質）として分類することができる。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１または少なくとも１０９Ｍ−１のＫａを有する結合ドメインを指す。「低親和性」結合ドメインは、最大１０８Ｍ−１、最大１０７Ｍ−１、最大１０６Ｍ−１、最大１０５Ｍ−１のＫａを有する結合ドメインを指す。あるいは、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）として親和性を定義することができる。
【０１０６】
特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するためのおよび結合ドメインまたは融合タンパク質親和性を決定するための様々なアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、分析用超遠心分離、分光法および表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））分析は、公知である（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１巻：６６０頁、１９４９年；Ｗｉｌｓｏｎ、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５巻：２１０３頁、２００２年；Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３巻：２５６０頁、１９９３年；および米国特許第５，２８３，１７３号、５，４６８，６１４号または等価物を参照されたい）。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、上述の結合タンパク質のいずれも、ヒトＲＯＲ１などのＲＯＲ１と高親和性で結合する。例えば、ヒトＲＯＲ１への高い親和性を有する免疫グロブリン様結合タンパク質は、１×１０−７またはそれ未満のＫｄで結合する。
【０１０８】
上述の実施形態のいずれにおいても、結合タンパク質は、ヒトＲＯＲ１と結合することができ、一部の態様では、マウスＲＯＲ１などの別の種のＲＯＲ１と結合しないか、または特異的に結合せず、および／またはアカゲザルなどのさらに別の種のＲＯＲ１と結合する。
【０１０９】
なおさらなる実施形態では、本開示は、ＲＯＲ１の細胞内プロテインキナーゼドメインのＣ末端側に位置するＲＯＲ１エピトープとの特異的結合について基準結合タンパク質（例えば、免疫グロブリン様結合タンパク質、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合結合タンパク質）と競合する、結合タンパク質（例えば、免疫グロブリン様結合タンパク質、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合結合タンパク質）を提供する。用語「競合する」は、同じエピトープについて競合する免疫グロブリン様結合タンパク質または抗体もしくはその結合断片の文脈で使用される場合、試験されている免疫グロブリン結合タンパク質または抗体もしくはその結合断片が、基準免疫グロブリン様結合タンパク質または抗体もしくはその結合断片とＲＯＲ１エピトープの特異的結合を防止または阻害する、アッセイによって決定される免疫グロブリン様結合タンパク質間の競合を意味する。例えば、抗体６Ｄ４またはその結合断片によって認識される同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する試験抗体は、エピトープを含有する標的タンパク質（ＲＯＲ１）またはその断片との結合について競合することができるであろう。競合結合アッセイは、当技術分野において公知であり、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合的酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイを含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質と本明細書で開示する基準タンパク質とは、ＲＯＲ１との結合および／または配列番号３のペプチドとの結合について競合する、および／またはＲＯＲ１の同じもしくは重複するエピトープと結合する。一部の実施形態では、基準結合タンパク質は、配列番号６に記載の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７に記載の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号８に記載の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号９に記載の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１０に記載の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１１に記載の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、免疫グロブリン様結合タンパク質は、ＲＯＲ１の細胞内プロテインキナーゼドメインのＣ末端側に位置するＲＯＲ１エピトープとの特異的結合について基準免疫グロブリン結合タンパク質と競合し、基準結合タンパク質は、配列番号１５または１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および配列番号１２、１３または１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、基準結合タンパク質は、配列番号１５、１６または３８に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および配列番号１２、１３、１４または３７に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。特定の実施形態では、基準結合タンパク質は、モノクローナル抗体６Ｄ４またはその抗原結合断片を含む。
【０１１０】
より多くの実施形態では、結合タンパク質、基準結合タンパク質または両方は、各々個々に、抗体またはその抗原結合断片である。例えば、結合タンパク質、基準結合タンパク質または両方は、モノクローナル抗体であってもよい、抗体を含み得る。特定の実施形態では、例えば、基準結合タンパク質は、モノクローナル抗体６Ｄ４である。一部の実施形態では、結合タンパク質、基準結合タンパク質または両方は、各々個々に、キメラまたはヒト化抗体を含み得る。なおさらなる実施形態では、結合タンパク質、基準結合タンパク質または両方は、抗体の抗原結合断片を含み、抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。なおさらなる実施形態では、結合タンパク質、基準結合タンパク質または両方は、抗原が哺乳動物またはヒトＲＯＲ１などのＲＯＲ１である、抗原結合ドメイン（例えば、モノクローナル抗体６Ｄ４からのｓｃＦｖ）を含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、融合タンパク質の抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合断片である。例えば、融合タンパク質は、抗体の抗原結合断片を含み得、抗原結合断片は、哺乳動物またはヒトＲＯＲ１などのＲＯＲ１に特異的なｓｃＦｖである。
【０１１１】
一部の実施形態では、本明細書で開示する結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質は、マーカー、例えば、酵素、色素、蛍光標識、ＤＮＡバーコード（例えば、５ヌクレオチド長から最大７５ヌクレオチド長までの範囲のもの）、またはタグをさらに含む。本明細書で使用される「ペプチドタグ」または「タンパク質タグ」は、目的のタンパク質に取り付けられているか、融合しているか、またはその一部であり、異種または非内因性同族結合分子が特異的に結合する、固有のペプチド配列であって、特に、タグの付いているペプチドもしくはタンパク質が、タンパク質もしくは他の材料の不均質な集団の一部である場合、またはタグの付いているペプチドまたはタンパク質を発現する細胞が、細胞の不均質な集団（例えば、生物学的試料）の一部である場合、その結合特性を使用して、タグの付いているペプチドもしくはタンパク質、またはタグの付いているペプチドもしくはタンパク質を発現する細胞を検出、同定、単離もしくは精製、追跡、濃縮または標的化することができる、固有のペプチド配列を指す。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、マーカーは、蛍光標識、例えば、シアニン色素、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセイン、もしくはそのスルホン化誘導体、または蛍光タンパク質を含む。あるいは、結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質は、発色性受容体酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含むことができる。他の実施形態では、マーカーは、タグ分子であり得る。一部の実施形態では、マーカーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏイメージングに使用されるタグであり得る。さらなる実施形態では、マーカーは、結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質を単離するために使用されるタグであり得る。なおさらなる実施形態では、マーカーは、例えば、Ｍｙｃタグ、ＨｉｓタグまたはＳｔｒｅｐタグ（登録商標）などの、ペプチドタグまたはタンパク質タグである。
【０１１３】
上述の実施形態のいずれにおいても、結合タンパク質は、（ａ）生物学的試料の細胞中に内因的に存在するタンパク質、ＲＯＲ１および／またはエピトープと特異的に結合することができ、試料は、ホルマリン固定もしくは凍結された組織切片および／または透過処理された細胞を任意選択で含むか、および／または任意選択で被験体の腫瘍に由来するものである。一部の実施形態では、試料は、血液悪性疾患および固形腫瘍からなる群より選択される腫瘍組織に由来する。特定の実施形態では、試料は、（ａ）ＣＬＬまたはＭＣＬに由来するか、あるいは（ｂ）卵巣がん、任意選択で肺腺癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌および非定型カルチノイドの中から選択される肺がん、または任意選択でトリプルネガティブ乳がんである乳がんに由来する。さらに他の実施形態では、試料は、骨髄、脂肪組織、副甲状腺、食道および膵臓からなる群より選択される、正常組織に由来する。
【０１１４】
上述の実施形態のいずれにおいても、結合タンパク質は、任意選択で、完全長ＲＯＲ１と特異的に結合する。
【０１１５】
上述の実施形態のいずれにおいても、結合タンパク質は、ＲＯＲ１の内因性発現を、基準抗体が前記内因性発現を検出しない条件下で検出することができ、基準抗体は、任意選択で、ポリクローナルＲＯＲ１抗体、ＲＯＲ１のＮ末端部分を認識するＲＯＲ１抗体、ａｂ１３５６６９、抗ヒトＲＯＲ１ヤギポリクローナル抗体、抗ヒトＲＯＲ１ウサギポリクローナル抗体、抗ＲＯＲ１  ４Ａ５、および抗ヒトＲＯＲ１  ２Ａ２からなる群より選択される。
【０１１６】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質または抗体もしくはその結合断片と薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。診断および治療上の使用のための薬学的に許容される担体は、薬学技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ（編集）、第１８版、１９９０年）に、およびＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ、Ｄｒｕｇ，  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ  （Ｓ．Ｃ．Ｓｍｏｌｉｎｓｋｉ編、１９９２年）に記載されている。例示的な薬学的に許容される担体には、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、希釈剤、保存薬、色素／着色剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、乳化剤、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。例えば、生理的ｐＨの滅菌食塩水およびリン酸緩衝食塩水は、好適な薬学的に許容される担体であり得る。保存薬、安定剤、色素または同種のものが、医薬組成物に提供されることもある。加えて、抗酸化剤および懸濁剤が使用されることもある。医薬組成物は、希釈剤、例えば水、緩衝液、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、低分子量ポリペプチド（約１０残基未満）、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、デキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤も、含有することがある。中性緩衝食塩水、または非特異的血清アルブミンと混合された食塩水は、例示的な希釈剤である。
【０１１７】
抗ＲＯＲ１結合タンパク質の使用
別の態様では、本開示は、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、細胞表面でＲＯＲ１を発現する細胞、および／またはＲＯＲ１を発現する細胞を同定する方法は、本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と細胞を接触させるステップ、および結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と細胞の特異的結合を検出することによって、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞を同定するステップを含む。ある特定の実施形態では、検出されることになる完全長ＲＯＲ１は、細胞によって通常発現されるまたは内因性発現されるＲＯＲ１である。さらなる実施形態では、接触させることになる細胞は、内因性または異種ＲＯＲ１を過剰発現するように遺伝子改変されたものである。ある特定の実施形態では、細胞は、ホルマリン固定され、パラフィンに包埋されている。他の実施形態では、細胞は、凍結され、最適切断温度化合物（Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＣＴ）に包埋されている。例えば、そのような調製された細胞または組織は、細胞中の完全長ＲＯＲ１の存在について免疫組織化学により探索される。さらに他の実施形態では、細胞中の完全長ＲＯＲ１の存在は、細胞から得られる溶解物を探索することにより行われる免疫ブロットによって検出される。
【０１１８】
さらに別の態様では、（ａ）生物学的試料を本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と接触させるステップ、および（ｂ）結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と試料中のペプチドもしくはエピトープとの特異的結合またはその欠如を検出するステップを含み、それによって、試料中のＲＯＲ１またはＲＯＲ１エピトープの存在または非存在を検出する、検出方法を提供する。一部の実施形態では、検出方法は、（ｂ）で検出された特異的結合のレベルを基準レベルと比較するステップをさらに含み、基準レベルと比較した結合レベルの増加は、試料中のＲＯＲ１またはＲＯＲ１エピトープの存在を示す。特定の実施形態では、試料は、被験体から得られる。さらなる実施形態では、試料は、組織切片および／または細胞を含む。ある特定の実施形態では、試料は、ホルマリン固定もしくは凍結された組織切片および／または透過処理された細胞を含むか、および／または試料は、血液悪性疾患および固形腫瘍からなる群より選択される腫瘍に由来し、および／または正常組織に由来する。例えば、特定の実施形態では、試料は、（ａ）ＣＬＬまたはＭＣＬに由来するか、あるいは（ｂ）卵巣がん、任意選択で肺腺癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌および非定型カルチノイドの中から選択される肺がん、または任意選択でトリプルネガティブ乳がんである乳がんに由来するか、あるいは（ｃ）骨髄、脂肪組織、副甲状腺、食道および膵臓からなる群より選択される正常組織に由来する。一部の実施形態では、試料は、ホルマリン固定されパラフィンに包埋されている細胞を含み、または細胞は、凍結され、最適切断温度化合物（ＯＣＴ）に包埋される。一部の実施形態では、細胞中の完全長ＲＯＲ１の存在は、免疫組織化学または免疫ブロッティングにより検出される。
【０１１９】
さらに別の態様では、本開示は、組織試料中のＲＯＲ１の存在を同定する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、組織試料を本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と接触させるステップ、および組織との特異的結合を検出することによって、ＲＯＲ１を発現する組織を同定するステップを含み、ＲＯＲ１は、任意選択で完全長および／または細胞表面ＲＯＲ１である。ある特定の実施形態では、組織試料は、ホルマリン固定され、パラフィンに包埋されている。他の実施形態では、組織試料は、凍結され、最適切断温度化合物（ＯＣＴ）に包埋されている。さらなる実施形態では、組織試料中の完全長ＲＯＲ１の存在は、免疫組織化学により検出される。なおさらなる実施形態では、組織試料中の完全長ＲＯＲ１の存在は、細胞溶解物を探索することにより行われる免疫ブロットによって検出される。
【０１２０】
一部の実施形態では、細胞または組織試料中の完全長ＲＯＲ１の量を定量する方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、細胞または組織を本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と接触させるステップ、および結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と細胞の特異的結合を定量することによって、細胞または組織の完全長ＲＯＲ１の量を定量するステップを含む。一部の実施形態では、細胞によって発現される完全長ＲＯＲ１は、通常は内因性発現されるＲＯＲ１である。他の実施形態では、細胞は、ＲＯＲ１を過剰発現するように遺伝子操作されたものである。さらなる実施形態では、細胞または組織試料は、ホルマリン固定され、パラフィンに包埋されている。他の実施形態では、細胞または組織試料は、凍結され、最適切断温度化合物（ＯＣＴ）に包埋されている。なおさらなる実施形態では、細胞または組織試料中の完全長ＲＯＲ１の量は、免疫組織化学により検出される。さらに他の実施形態では、細胞中の完全長ＲＯＲ１の量は、細胞溶解物を探索することにより行われる免疫ブロットによって検出される。
【０１２１】
本開示のさらに別の態様には、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する疾患を有する、または有するリスクがある、被験体を同定する方法がある。本開示の特定の実施形態では、被験体または生物学的供給源は、悪性の疾患、障害もしくは状態を含む、疾患、障害もしくは状態を有することが疑われるものであってもよく、または有するリスクがあるものであってもよい。本明細書で使用される「リスク」は、指定された疾患または状態を発症する被験体の尤度（確率）である。リスクは、被験体が、ある期間（例えば、１、２、３、４または５年）以内に疾患を発症する尤度の表現である。「高リスク」は、被験体が指定された疾患または状態を発症する可能性が５０％より高いことを示す。反対に、「低リスク」は、被験体が指定された疾患または状態を発症する可能性が５０％未満であることを示す。一部の実施形態では、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する疾患を有する、または有するリスクがある、被験体を同定する方法は、被験体からの組織試料を本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と接触させるステップ、および結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と組織の特異的結合を検出するステップ、およびそれによって、ＲＯＲ１または完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する疾患を有する、または有するリスクがある、被験体を同定するステップを含む。
【０１２２】
例えば、被験体は、被験体から採取した細胞または組織の試験試料が、検出可能なレベルの完全長ＲＯＲ１または対象試料と比較して増加したレベルの完全長ＲＯＲ１を有した場合、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する疾患を有すると、または有するリスクがあると、同定され得る。ある特定の事例では、被験体は、完全長ＲＯＲ１が試験試料中に存在するが、対照中に存在しないか、または対照では検出不能である場合、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する疾患を有すると、または有するリスクがあると同定され得る。さらなる例では、試験レベルと対照レベルとの差は、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、またはそれより高い倍数であり得る。生物学的試料は、試験される場合、または「対照」と比較される場合、「試験試料」と呼ばれる。本明細書で使用される「対照」は、同じ患者および同じ組織からの非罹病試料；目的の疾患を有さない、もしくは有することが疑われる、被験体からの試料；目的の疾患を有さない、もしくは有することが疑われる、様々な被験体からの試料のプール（例えば、２〜約１００，０００の被験体からの試料を含む）；または目的の疾患を有さない、もしくは有することが疑われる、１または複数の被験体からのデータ（例えば、１〜約５，０００〜約１０，０００〜約１００，０００〜約１，０００，０００もしくはそれより多くの被験体からのバイオマーカーレベルに関する情報を含むデータベース）を指す。ある特定の実施形態では、「試験試料」は、分析され、結果（すなわち、ＲＯＲ１の発現）は、複数の分析した非罹病または正常試料に由来するデータを有するデータベースから算出された平均のまたはある特定の同定されたベースラインレベルを含む「対照」と比較される。
【０１２３】
一部の実施形態では、標的分子の標準または公知ベースラインレベル（例えば、「正常」レベル）の尺度を提供する「基準」または「標準」を任意選択でアッセイに含めてもよい。ある特定の実施形態では、基準試料は、健常個体（すなわち、目的の疾患を有さない個体または有することが疑われる個体）からの試料のプール（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの試料を合わせたもの）である。ある特定の事例では、「試験試料」および「対照試料」は、基準試料とともにアッセイで調査されることになる。これらの事例では、「試験」および「対照」試料は、基準試料と比較されることになるので、まとめて「標的試料」と呼ばれることもある。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、被験体は、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する疾患を有することが疑われることもあり、または有するリスクがあることもあり、本開示のある特定の他の実施形態では、被験体にそのような疾患のリスクまたは存在がないことが分かっていることもある。一部の実施形態では、被験体は、年齢、性別、食事、民族性、家族歴またはそれらの組み合わせなどの、特異的特徴によって識別される亜集団に属するため、リスクを有することまたはリスクがあることが疑われる。一部の実施形態では、被験体は、遺伝子の変異または遺伝性疾患を有する場合、リスクがあることが疑われる。一部の実施形態では、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する疾患は、過剰増殖性疾患または状態である。例えば、ある特定の実施形態では、過剰増殖性疾患または状態は、腫瘍である。一部の実施形態では、腫瘍は、血液腫瘍、例えば、ＣＬＬまたはＭＣＬであり得る。さらなる実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍、例えば、乳がん、肺がん、卵巣がんまたは膵がん腫瘍であり得る。例えば、一部の実施形態では、がんは、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、または非定型カルチノイドである。ある特定の実施形態では、肺がんは、肺腺癌である。ある特定の他の実施形態では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がんである。一部の実施形態では、腫瘍は、原発性腫瘍、転移性腫瘍、または両方を含む。
【０１２５】
結合タンパク質の特異的結合を検出するステップを含む上述の方法のいずれにおいても、方法は、ＲＯＲ１またはエピトープを発現させる方法によって決定して、組織の表面積の、または組織中の細胞の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％において特異的結合が検出された場合、被験体または試料を、抗ＲＯＲ１療法（例えば、養子細胞療法などの免疫療法）による処置の候補として同定するステップをさらに含む。
【０１２６】
結合タンパク質の特異的結合を検出するステップを含む上述の方法において、方法は、方法によって決定して、試料が由来する組織が、ＲＯＲ１またはそのエピトープを均一にまたは均質に発現すると判明した場合、被験体または試料を抗ＲＯＲ１療法（例えば、養子細胞療法などの免疫療法）での処置の候補として同定するステップをさらに含む。
【０１２７】
本開示のさらに他の態様では、過剰増殖性疾患または状態を有する被験体が、ＲＯＲ１特異的処置から恩恵を受けることになるかどうかを同定するための方法であって、被験体からの組織試料を本明細書に記載の結合タンパク質と接触させるステップ、および結合タンパク質と組織の特異的結合を検出することによって、ＲＯＲ１特異的処置から恩恵を受けることになる被験体を同定するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＲＯＲ１特異的処置は、免疫療法、例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋら（Ｂｌｏｏｄ  １１６巻：４５３２〜４１頁、２０１０年）に記載のＲＯＲ１  ＣＡＲなどのＲＯＲ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞を投与することを含むＴ細胞療法である。例示的なＲＯＲ１  ＣＡＲは、ＲＯＲ１の細胞外部分を標的とし、したがって、完全長ＲＯＲ１アイソフォームを標的とするが、細胞内アイソフォームを標的としない。したがって、一部の実施形態では、ＲＯＲ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法から恩恵を受けることになる被験体を同定する方法であって、結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と組織の特異的結合によって示されるような完全長ＲＯＲ１の発現により、被験体が治療から恩恵を受けることができると同定される、方法を提供する。ある特定の実施形態では、処置は、免疫療法であり、免疫療法は、任意選択で養子細胞療法であり、任意選択で抗ＲＯＲ１抗体を含むキメラ抗原受容体を含み、抗ＲＯＲ１抗体は、任意選択で、Ｒ１２と称する抗体であるか、またはＲ１２と称する抗体と結合について競合する。抗体Ｒ１２は、Ｙａｎｇら（ＰＬｏＳＯＮＥ  ６巻：ｅ２１０１８、２０１１年）およびＨｕｄｅｃｅｋら（Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９巻：３１５３頁、２０１３年）に開示されており、同書に開示されている抗体およびその抗原結合断片は、参照により本明細書に組み入れられる。一部の実施形態では、被験体は、ＲＯＲ１またはそのエピトープを発現させる方法によって決定して、組織の表面積の、または組織中の細胞の、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％において、または少なくとも６０％〜少なくとも８５％、もしくは少なくとも５０％〜少なくとも９０％の範囲において、特異的結合が検出された場合、ＲＯＲ１特異的処置から恩恵を受けることになる被験体として同定される。一部の実施形態では、被験体は、ＲＯＲ１またはそのエピトープを均一にまたは均質に発現する、試料が由来する組織が、方法により決定された場合、ＲＯＲ１特異的処置からの恩恵を受けることになる被験体として同定される。特定の実施形態では、ＲＯＲ１特異的処置は、養子細胞療法などの免疫療法である。上述の実施形態のいずれにおいても、ＲＯＲ１特異的処置は、抗ＲＯＲ１結合タンパク質または抗体、例えば、Ｒ１２と称する抗体である抗体、またはＲ１２抗体と結合について競合する結合タンパク質もしくは抗体である抗体を含む、キメラ抗原受容体を含む。
【０１２８】
本発明のさらに多くの態様では、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する過剰増殖性疾患または状態を有する被験体の予後を決定するための方法であって、被験体からの組織試料を本明細書に記載の結合タンパク質と接触させるステップ、および結合タンパク質と組織の特異的結合を検出するステップを含み、組織における完全長ＲＯＲ１との特異的結合を検出するステップによって被験体がＲＯＲ１特異的処置の非存在下で予後不良であると同定される、方法を提供する。本明細書で使用される「予後」は、特異的疾患、障害または状態に罹患している被験体についての臨床転帰（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ）の尤度である。がんに関して、予後は、被験体が（例えば、１、２、３、４もしくは５年間）生存する尤度（確率）、または腫瘍が転移する尤度の表現である。「予後不良」は、被験体が指定された時点（例えば、１、２、３、４もしくは５年）まで生存しない可能性が５０％より高いこと、または腫瘍が転移する可能性が５０％より高いことを示す。反対に、「予後良好」は、被験体が指定された時点（例えば、１、２、３、４もしくは５年）まで生存する可能性が５０％より高いこと、または腫瘍が転移しない可能性が５０％より高いことを示す。
【０１２９】
一部の実施形態では、結合タンパク質と組織の特異的結合によって示される、完全長ＲＯＲ１を検出するステップによって、被験体は、腫瘍、腫瘍転移、または両方を有すると同定される。一部の実施形態では、完全長ＲＯＲ１を発現する細胞に関連する過剰増殖性疾患または状態を有する被験体の予後を決定するための方法は、被験体からの組織試料を本明細書に記載の結合タンパク質と接触させるステップ、および結合タンパク質の組織との特異的結合を検出するステップを含み、組織における完全長ＲＯＲ１を検出することによって被験体はＲＯＲ１特異的処置の非存在下で予後不良であると同定される。これらの実施形態のいずれにおいても、組織試料は、ホルマリン固定され、パラフィンに包埋されているか、または組織試料は、凍結され、ＯＣＴに包埋されている。ある特定の実施形態では、組織試料中の完全長ＲＯＲ１の存在は、免疫組織化学または免疫ブロッティングにより検出される。
【０１３０】
結合タンパク質の特異的結合を検出するステップを含む上述の実施形態のいずれにおいても、方法は、免疫療法などの抗ＲＯＲ１療法で被験体を処置するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、免疫療法は、養子細胞療法を含む。これらの実施形態のいずれにおいても、抗ＲＯＲ１療法は、ＲＯＲ１に特異的なキメラ抗原受容体を含み、ＲＯＲ１に特異的なキメラ抗原受容体は、抗ＲＯＲ１抗体結合タンパク質または結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＲＯＲ１に特異的なキメラ抗原受容体は、Ｒ１２と称する抗体からの結合ドメインを含むか、またはＲ１２抗体と結合について競合する結合ドメインを含む。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、ヒト被験体における療法の有効性を評価する方法であって、療法を投与し、療法の有効性を決定することによる方法を本明細書で提供する。「有効性」は、療法が、腫瘍のサイズまたは数などの疾病負荷をいかによく処置または低減させるかの尺度である。検出可能なＲＯＲ１の低減は、疾病負荷の低減および良好な有効性の指標である。検出可能なＲＯＲ１レベルに変化がないこと、または検出可能なＲＯＲ１レベルの低下した速度は、療法が、腫瘍抑制性（ｔｕｍｏｒｏｓｔａｔｉｃ）であることの指標であり得る。検出可能なＲＯＲ１レベルにおける増加の統計的に有意な速度に対して効果がないことは、不良な有効性、最小の有効性、または有効性欠如の指標である。ある特定の実施形態では、有効性は、生存期間と相関関係があり得る。例えば、対照と比較して統計的に有意に患者の生存期間を増加させる療法は、より高い有効性と相関している。反対に、対照と比較して統計的に有意に生存期間を増加させない療法は、不良な有効性、最小の有効性、または有効性なしと相関している。
【０１３２】
一部の実施形態では、療法の有効性は、対照とまたは以前に測定されたレベルと比較した細胞または組織試料における完全長ＲＯＲ１の発現の測定により評価される。一部の実施形態では、細胞または組織試料は、ホルマリン固定されパラフィンに包埋されているか、または細胞は凍結され、最適切断温度化合物（ＯＣＴ）に包埋されている。試料中の完全長ＲＯＲ１のレベルは、完全長ＲＯＲ１と特異的に結合する結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質の量を検出することにより測定される。一部の実施形態では、結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と細胞または組織の特異的結合は、免疫組織化学または免疫ブロッティングにより検出される。方法の一部の態様では、評価されることになる療法は、外科手術、化学療法、細胞障害性療法、免疫介在療法、標的化療法、放射線療法、もしくは放射線化学療法、またはそれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態では、療法により過剰増殖性障害または状態、例えばがんが処置される。一部の実施形態では、療法は、Ｈｕｄｅｃｅｋら（Ｂｌｏｏｄ  １１６巻：４５３２〜４１頁、２０１０年）に記載のＲＯＲ１  ＣＡＲなどのＲＯＲ１  ＣＡＲを発現するＴ細胞を投与することを含むＴ細胞療法などの、免疫療法である。
【０１３３】
さらなる態様では、本開示は、疾患または状態を有する被験体に抗ＲＯＲ１療法を投与するステップを含む処置の方法であって、被験体における疾患または状態の組織または試料が、表面で発現されるＲＯＲ１の均一または均質な発現を有すると同定されている、方法を提供する。ある特定の実施形態では、疾患または状態は、腫瘍、例えば、固形腫瘍または血液腫瘍である（例えば、腫瘍は、ＣＬＬ、ＭＣＬ、乳がん、肺がん、卵巣がんもしくは膵がん腫瘍であるか、または腫瘍は、肺腺癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、非定型カルチノイド、もしくはトリプルネガティブ乳がんである）。ある特定の実施形態では、処置方法は、肺腺癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、非定型カルチノイドおよびトリプルネガティブ乳がんの中から選択される疾患または状態を有する被験体に投与するステップを含む。特定の実施形態では、抗ＲＯＲ１療法は、免疫療法、例えば養子細胞療法、またはＲ１２と称する抗体（Ｙａｎｇら、ＰＬｏＳＯｎｅ  ６巻：ｅ２１０１８、２０１１年、およびＨｕｄｅｃｅｋら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９巻：３１５３頁、２０１３年を参照されたく、同書に記載の抗体およびその抗原結合断片は参照により本明細書に組み入れられる）などの抗ＲＯＲ１抗体断片を含むキメラ抗原受容体を発現する細胞を含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、疾患または状態を有する被験体に抗ＲＯＲ１療法を投与するステップを含む処置の方法であって、被験体における疾患または状態の組織または試料が、表面で発現されるＲＯＲ１の均一または均質な発現を有すると同定されている、方法を提供する。ある特定の実施形態では、疾患または状態は、腫瘍であり、任意選択で固形腫瘍または血液腫瘍である。一部のさらなる実施形態では、腫瘍は、ＣＬＬ、ＭＣＬ、乳がん、肺がん、卵巣がん、および膵がんからなる群より選択される。特定の実施形態では、腫瘍は、肺腺癌、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、非定型カルチノイド、またはトリプルネガティブ乳がんである。一部の実施形態では、抗ＲＯＲ１療法は、養子細胞療法などの免疫療法を含む。一部の実施形態では、免疫療法は、抗ＲＯＲ１抗体断片を含むキメラ抗原受容体を発現する細胞を含む。特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｒ１２と称する抗体、その抗原結合領域を含有する抗体、またはＲ１２と称する抗体と結合について競合する抗体に由来する、抗ＲＯＲ１抗体断片を含む。なおさらなる実施形態では、キメラ抗原受容体を発現する細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む。上述の実施形態では、表面で発現されるＲＯＲ１の発現は、本明細書で開示する方法を使用して決定された。
【０１３５】
別の態様では、本開示は、本発明による診断方法を行うのに有用な材料を含むキットを提供する。ある特定の態様では、本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、細胞または組織試料中の完全長ＲＯＲ１の存在を検出するために使用される。一部のそのような実施形態では、キットは、組織試料中の完全長ＲＯＲ１の存在を検出するために使用され、組織試料は、ホルマリン固定され、パラフィンに包埋されている。他の実施形態では、組織試料は、凍結され、ＯＣＴに包埋されている。一部の実施形態では、組織試料中の完全長ＲＯＲ１の存在は、免疫組織化学または免疫ブロットにより検出される。一部の実施形態では、キットは、ＨＲＰを含む二次抗体を含む。
【０１３６】
さらに他の態様では、組成物を含むキットであって、組成物が、本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と担体または賦形剤とを含む、キットを提供する。一部の実施形態では、キットは、細胞または組織試料中の完全長ＲＯＲ１の存在を検出するために使用される。一部の実施形態では、試料は、ホルマリン固定されパラフィンに包埋されている組織試料である。他のそのような実施形態では、組織試料は、凍結され、ＯＣＴに包埋されている。一部の実施形態では、組織試料中の完全長ＲＯＲ１の存在は、免疫組織化学または免疫ブロットにより検出される。一部の実施形態では、キットは、ＨＲＰを含む二次抗体を含む。
【０１３７】
本明細書に記載の完全長ＲＯＲ１の存在を同定する方法は、臨床検査室、実験室、または医師（ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ）によって行われることがある。本発明は、これらの異なる状況で使用することができるキットを提供する。本明細書における方法に従って生物学的試料を特徴付けるための、および被験体における過剰増殖性疾患または状態を診断するための、材料および試薬を、キットで組み立てることができる。ある特定の態様では、キットは、本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質と、本開示の方法に従ってキットを使用するための指示とを含む。
【０１３８】
本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質を含むキットは、抗原結合分子を係留するための１つまたは複数の支持体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（マイクロアレイスライド、ビーズ、プラスチックチューブ、または他の表面を含む）、二次抗体、標識用緩衝液または試薬、洗浄用緩衝液または試薬、免疫検出用緩衝液または試薬、および検出手段をさらに含むことができる。手順の種々のステップを行うためにこれらの緩衝液および試薬を使用するためのプロトコールをキットに含めることもできる。試薬を固体（例えば、凍結乾燥）形態で供給してもよく、または液体形態で供給してもよい。本開示のキットは、個々の緩衝液または試薬各々のための異なる容器（例えば、スライド、バイアル、アンプル、試験管、フラスコまたはビン）を任意選択で含むことができる。各成分は、そのそれぞれの容器内にアリコートにされていると、または濃縮形態で提供されていると、一般に好適であろう。開示する方法のある特定のステップを行うのに好適な他の容器を提供することもできる。キットの個々の容器は、商業販売のために厳重に密封された状態で好ましくは維持される。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本開示のキットは、対照試料、対照スライド、基準試料、基準スライド、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。本開示の１つまたは複数の方法に従ってキットを使用するための指示は、被験体から得た生物学的試料を処理するための指示、試験を行うための指示、もしくは結果を解釈するための指示、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。本開示のキットは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を監督する政府機関（例えば、ＦＤＡ）によって指示された形式での注意書きをさらに含むことができる。
【０１４０】
抗ＲＯＲ１結合タンパク質産生のための核酸および宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の免疫グロブリン結合ドメインまたは免疫グロブリン様結合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態では、免疫グロブリン結合ドメインまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ある特定の型の細胞における発現を増進させるように、または最大にするように、コドン最適化することができる（例えば、Ｓｃｈｏｌｔｅｎら、Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１９巻：１３５〜１４５頁、２００６年）。本明細書で使用される「コドン最適化」ポリヌクレオチドは、宿主細胞ｔＲＮＡレベルの存在量に応じてサイレント変異で修飾されたコドンを有する異種ポリペプチドである。
【０１４１】
一部の実施形態では、核酸分子は、２つまたはそれより多くのドメインが切断部位によって隔てられている、結合タンパク質（例えば、抗体重鎖および軽鎖、またはＶＨおよびＶＬ結合領域を含む抗体結合ドメイン）をコードする。ある特定の実施形態では、切断部位は、ＶＨもしくはＶＬのアミノ末端側の約２〜約２０個のアミノ酸、ＶＨもしくはＶＬのカルボキシ末端側の約２〜約２０個のアミノ酸、自己切断型アミノ酸配列、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、切断部位は、結合タンパク質ドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端の約２〜約１５、約２〜約１０、または約２〜約５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、切断部位は、ブタテッショウイルス−１からの２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）（例えば、配列番号１７に記載のアミノ酸配列）、ウマ鼻炎Ａウイルスからの２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）（例えば、配列番号１９に記載のアミノ酸配列）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスからの２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）（例えば、配列番号１８に記載のアミノ酸配列）、口蹄疫ウイルスからの２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）（例えば、配列番号２０に記載のアミノ酸配列）またはそれらの任意の組み合わせを含む、自己切断型アミノ酸配列である（例えば、Ｋｉｍら、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ６巻：ｅ１８５５６、２０１１年を参照されたく、同書に記載の２Ａ核酸およびアミノ酸配列は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１４２】
さらに別の態様では、本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現構築物を提供する。本開示は、結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質、およびペプチドタグまたはタンパク質タグをコードするポリヌクレオチドを含む発現構築物も提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現制御配列に作動可能に連結されていることがある。本明細書で使用される「発現構築物」は、好適な宿主において核酸分子の発現を果すことができる好適な制御配列に作動可能に連結されている核酸分子を含有するＤＮＡ構築物を指す。発現構築物は、ベクター（例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター）内に存在してもよく、またはゲノムに組み込まれていてもよい。用語「作動可能に連結される」は、単一ポリヌクレオチド断片上の２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドが、あるポリヌクレオチドの機能が他のポリヌクレオチドによる影響を受けるように、会合していることを指す。例えば、プロモーターとコード配列は、プロモーターがそのコード配列の発現に影響を与えることができる（すなわち、コード配列が、プロモーターの転写制御下にある）場合、作動可能に連結している。用語「発現制御配列」（調節配列とも呼ばれる）は、それらが作動可能に連結されているコード配列の発現およびプロセシングを果す、ポリヌクレオチド配列を指す。例えば、発現制御配列としては、転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；およびことによると、タンパク質分泌を増進する配列を挙げることができる。
【０１４３】
一部の実施形態では、発現構築物は、ベクター内に存在する。「ベクター」は、別の核酸を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＲＮＡベクター、または直鎖状もしくは環状ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であってもよく、これらは、染色体、非染色体、半合成もしくは合成核酸を含み得る。例示的なベクターは、自己複製能力があるもの（エピソームベクター）、または連結されている核酸を発現させる能力があるもの（発現ベクター）である。例示的なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばオルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびに二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられ、二本鎖ＤＮＡウイルスには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリアポックス）が含まれる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが挙げられる（Ｃｏｆｆｉｎ，  Ｊ．  Ｍ．、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：  Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｂ．  Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６年）。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。一部の他の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。一部のそのような実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはγ−レトロウイルスベクターである。
【０１４４】
ある特定の他の態様では、本開示は、本明細書に記載の発現構築物もしくはベクターを含むか、または本明細書に記載の発現構築物により提供されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本明細書で使用される用語「宿主」は、目的のポリペプチド（例えば、抗ＲＯＲ１抗体またはその抗原結合断片）を産生するための異種または外因性核酸分子での遺伝子修飾の標的となる細胞または微生物を指す。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、異種または外因性タンパク質の生合成に関係するまたは関係しない所望の特性を付与する他の遺伝子修飾（例えば、検出可能なマーカーの包含）を、任意選択で、既に有することもあり、または含むように修飾されることもある。１つより多くの異種または外因性核酸分子を、別の核酸分子として、複数の個々に制御された遺伝子として、ポリシストロニック核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはそれらの任意の組み合わせとして、宿主細胞に導入することができる。２つまたはそれより多くの外因性核酸分子を宿主細胞に導入する場合、２つまたはそれより多くの外因性核酸分子を、単一の核酸分子として（例えば、単一のベクターを用いて）導入し、別々のベクターを用いて、宿主染色体の単一の部位または複数の部位に組み込むことができることは理解される。言及した異種核酸分子またはタンパク質活性の数は、コードする核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指し、宿主細胞に導入される別々の核酸分子の数を指さない。
【０１４５】
なおさらなる態様では、本開示は、本明細書に記載の結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質を作製する方法であって、発現構築物もしくはベクターを含むか、または本明細書に記載の発現構築物により提供されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質を発現させるのに好適な条件下で培養するステップ、および任意選択で、結合タンパク質または免疫グロブリン様結合タンパク質を培養物から単離するステップを含む方法を提供する。
【実施例】
【０１４６】
（実施例１）
ＲＯＲ１転写物発現の組織分布
Ｒｏｒ１転写物の発現を、様々なヒトおよびアカゲザル組織のパネルにおいて定量的リアルタイムＰＣＲによって特徴付けた。ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用して、ヒトおよびマカク組織におけるＲＯＲ１発現を決定した。ほとんどの組織からのｃＤＮＡは、ＢｉｏＣｈａｉｎ（登録商標）から入手し、追加のｃＤＮＡ試料は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ−ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用して、ヒト膵臓および結腸（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ならびに初代Ｂ−ＣＬＬ細胞からのＲＮＡ（１μｇ）で出発して調製した。７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのＰｏｗｅｒ−ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ−ＰＣＲミックスを使用する１０μＬ反応に、ｃＤＮＡ（２μＬ）を使用した。
【化１】
2019511904.tif 000003
を含む遺伝子特異的フォワード（Ｆ）およびリバース（Ｒ）プライマーを使用して、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨおよびＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）の幾何平均にＲＯＲ１発現を正規化した。
【０１４７】
プライマー効率および倍数変化は、Ｐｆａｆｆｌ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９巻：ｅ４５、２００１年）を使用して決定し、発現は、初代Ｂ−ＣＬＬ細胞と比べて決定した。
【０１４８】
図２に示されているように、Ｒｏｒ１転写物発現レベルは、ほとんどの正常組織において本質的に検出不能であった。しかし、高レベルのＲＯＲ１を発現することが公知であるＣＬＬ細胞と比較して、低レベルのＲｏｒ１転写物が脂肪および膵臓において検出可能であった。したがって、高度なＲＯＲ１発現が腫瘍に存在し、その一方で正常組織が最小乃至は検出不能のＲＯＲ１発現を示すことに鑑みて、ＲＯＲ１は本質的に腫瘍関連抗原であるので、ＲＯＲ１は良好な治療標的となり、そして、そのような治療薬は最小乃至は検出不能の毒性を有する可能性が高い。
【０１４９】
（実施例２）
他の抗ＲＯＲ１抗体はＲＯＲ１を免疫組織学的に検出することができない
いくつかの公開されているまたは市販の抗ＲＯＲ１抗体を免疫組織化学（ＩＨＣ）試薬として様々な細胞株および組織で試験して、ＲＯＲ１発現を特異的に検出するそれらの能力を調査した。ホルマリン固定されパラフィンに包埋された（ＦＦＰＥ）細胞および組織を用いて、各抗体について公開されている具体的なプロトコールを使用して、ＩＨＣアッセイを行った。試験した抗ヒトＲＯＲ１抗体は、抗ヒトＲＯＲ１  ａｂ１３５６６９（ａｂｃａｍ（登録商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡからのウサギポリクローナル抗体）（Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉ．  Ｒｅｐ．  ２４巻：５８１１頁、２０１４年）、抗ヒトＲＯＲ１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮからのヤギポリクローナル抗体ＡＦ２０００）（Ｄａｖｅら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７巻：ｅ５２６５５、２０１２年）、抗ヒトＲＯＲ１  ＃４１０２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡからのウサギポリクローナル抗体）（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２１巻：３４８頁、２０１２年）、抗ヒトＲＯＲ１  ４Ａ５（マウスモノクローナル抗体）（Ｚｈａｎｇら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １８１巻：１９０３頁、２０１２年）、および抗ヒトＲＯＲ１  ２Ａ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡからのマウスモノクローナル抗体）であった。
【０１５０】
市販のＲＯＲ１特異的抗体でのＩＨＣ染色は、公開されているプロトコールを使用した（Ｚｈａｎｇら、２０１４年；Ｄａｖｅら、２０１２年；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、２０１２年；Ｚｈａｎｇら、２０１２年を参照されたい）。４Ａ５モノクローナル抗体については、抗原賦活化（Ｔｒｉｌｏｇｙ−３０分、高塩濃度緩衝液−３０分）の後、一次抗体（８μｇ／ｍＬ）一晩、そしてＣＳＡ増幅（研究者プロトコール）または抗マウスポリマーを続けた。すべての抗体についての染色をＤＡＢで可視化した。
【０１５１】
第１の実験では、ＲＯＲ１発現を次の細胞において決定した：（１）Ｋ５６２（ＲＯＲ１−）細胞（陰性対照）、（２）扁桃組織（ＲＯＲ１−）（陰性対照）、（３）完全長ＲＯＲ１を過剰発現する、Ｒｏｒ１をトランスフェクトしたＫ５６２細胞（ＲＯＲ１＋）（陽性対照）、（４）ＣＬＬリンパ節（ＲＯＲ１＋、完全長）、およびＭＣＬリンパ節（ＲＯＲ１＋、完全長）。公開されている抗体のいくつかは、Ｋ５６２細胞において完全長ＲＯＲ１の過剰発現を検出することができた（褐色染色によって証明される）が、試験した公知の抗体はいずれも、ＣＬＬおよびＭＣＬリンパ節において内因性発現した完全長ＲＯＲ１を検出することができなかった（図３Ａ）。
【０１５２】
第２の実験では、ＲＯＲ１発現が、（１）Ｒｏｒ１をトランスフェクトしたＫ５６２細胞（ＲＯＲ１＋）、（２）Ｋ５６２（ＲＯＲ１−）細胞、（３）ＣＬＬリンパ節組織（ＲＯＲ１＋、完全長）、および（４）扁桃組織（ＲＯＲ１−）において決定された。第１の実験と同様、試験した抗ＲＯＲ１抗体のほとんどは、ＲＯＲ１を過剰発現する形質導入細胞を染色したが、ＦＦＰＥ  ＣＬＬリンパ節試料を染色しなかった（図３Ｂ）。様々な抗原賦活化および染色条件を使用する試みにもかかわらず、正常扁桃において最小バックグラウンドでのＣＬＬリンパ節におけるＲＯＲ１の再現可能な検出のための条件は、同定されなかった（データを示さない）。
【０１５３】
入手可能な試薬がＲＯＲ１を染色できなかったことは、いくつかの理由に起因する可能性があった。完全長ＲＯＲ１のＮ末端領域における抗体により認識されるエピトープは、ホルマリン固定により破壊される可能性があり、ＩＨＣステップの抗原賦活化手順は、抗体認識に十分なエピトープを回復させることができない可能性がある。この可能性と一致して、ＣＬＬ細胞の、または完全長ＲＯＲ１を過剰発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞のホルマリン固定は、サイトメトリー分析によるＲＯＲ１の検出を低下させた（図４、上のパネル）。さらに、ＲＯＲ１を過剰発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞を免疫ブロットすることにより、ＣＬＬ細胞と比較してはるかに高レベルのＲＯＲ１が検出された（図４、下のパネル）。それ故、現在入手可能な抗ＲＯＲ１試薬には、がん組織において発現される内因性ＲＯＲ１レベルを検出するのに十分な感度がない可能性がある。
【０１５４】
したがって、ある特定の入手可能な抗ＲＯＲ１抗体は、例えば、腫瘍および／または他の組織上での、例えばホルマリン固定された組織または他の調製組織における、内因性ＲＯＲ１発現を、最適に感度のよい特異的な様式で検出する能力の点で、完全に満足できるものではない。
【０１５５】
（実施例３）
完全長ＲＯＲ１に特異的な抗体
内因性完全長ＲＯＲ１（ＲＯＲ１＿ｖ１）を検出することができるが、短い細胞内ＲＯＲ１アイソフォーム（ＲＯＲ１＿ｖ２）と交差反応しない、一部の態様では診断、検出および／または予後用試薬として有用である、抗体を生成した。特に、完全長ＲＯＲ１内にのみ存在する（および一般に、例えばがん細胞の、細胞表面に局在する唯一のアイソフォームである）ＲＯＲ１のＣ末端部分を使用して、抗体のパネルを生成した。簡単に言うと、ヒトＲＯＲ１のＣ末端領域内に位置するアミノ酸に対応する４つのペプチドのセット（図５）を用いて、雌ＢＡＬＢ／ｃおよびＣＤ１マウスに免疫化した。ＲＯＲ１は、マウスとヒトとの間で高度に保存される（９７％アミノ酸相同性）ので、ヒトＲＯＲ１とマウスＲＯＲ１との間で最大のアミノ酸相違を有する（しかし、ヒトプロテオームにおける他の配列とはほとんど相同性を有さない）ＲＯＲ１＿ｖ１の細胞内領域からのペプチドを、マウスの免疫応答の惹起を助長するために選択した。４つの合成ペプチドをＫＬＨにカップリングさせた。免疫化されたマウスからのポリクローナル血清を試験して、高力価抗ＲＯＲ１抗体を有するマウスを同定した。ＷＥＳ免疫ブロットデバイス（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ）を使用してＲＯＲ１＋ＣＬＬおよびＫ５６２  ＲＯＲ１−細胞溶解物に対する免疫ブロットを行うことにより、ポリクローナル血清をスクリーニングした。次いで、従来の方法を使用して、高い抗ＲＯＲ１力価を有するマウスの脾細胞からハイブリドーマを作製してモノクローナル抗体を生成し、蛍光標識標的抗原との結合に基づいて１２２２のクローンを選択した。ハイブリドーマを採取し、ＲＯＲ１ペプチドカクテルを保有するサイトメトリービースアレイを使用してペプチド結合についてランク付けした。
【０１５６】
上位１３３のハイブリドーマクローンからの上清を、免疫ブロットおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を使用してスクリーニングした。免疫ブロット分析は、ＲＯＲ１に特異的な抗体についての上清の初期スクリーニングに使用した。溶解緩衝液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）］を使用して、全細胞溶解物を調製した。細胞ペレットを溶解緩衝液に細胞１×１０７個／ｍｌで再懸濁させ、１０分間、氷上でインキュベートし、その後、１３，０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間、遠心分離した。ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、上清中のタンパク質濃度を決定した。ＣＬＬ細胞からの細胞溶解物を、標準的プロトコールを使用してＷＥＳ免疫ブロットシステム（Ａｌｔｏｇｅｎ  Ｌａｂｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）で泳動させ、抗マウスＨＲＰで可視化した。免疫化されたマウスからのポリクローナル血清を、初代ＣＬＬ細胞（ＲＯＲ１＋）およびＲＯＲ１−Ｋ５６２細胞からの溶解物に対する免疫ブロットによりスクリーニングして、完全長ＲＯＲ１に対応する１３０ｋＤａバンドを検出する血清を同定した（図６Ａ）。ＣＬＬ細胞の溶解物における１３０ｋＤａ  ＲＯＲ１バンド（ＲＯＲ１＿ｖ１）を認識するいくつかのクローンを同定した（図６Ｂ）。クローン６Ｄ４は、免疫ブロッティングにより明瞭な１３０ｋＤａ  ＲＯＲ１バンドを特異的に検出した（図６Ｂ）。ハイブリドーマ６Ｄ４には、その後のサブクローニングとペプチド結合の反復検証のラウンドを２ラウンド行った。
【０１５７】
ＲＯＲ１＿ｖ１を検出したクローンを、次いで、異なるＦＦＰＥ組織（Ｋ５６２／ＲＯＲ１＋細胞株、Ｋ５６２細胞、ＣＬＬリンパ節、および複数の正常扁桃組織）のパネルに対してＩＨＣ分析により試験した。組織の４マイクロメートル切片を切り出し、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｒｘ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）で染色した。Ｈ２緩衝液で２０分間、スライドを前処理した。内因性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素で５分間、ブロックした。タンパク質ブロックを１０分間適用した（抗体希釈剤中、１５％ヤギ血清、５％ヒト血清）。マウス抗ＲＯＲ１  ６Ｄ４モノクローナル抗体については、抗体を１：５０希釈で使用し、組織に３０分間適用し、その後、Ｌｅｉｃａ  ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ  ＨＲＰマウス特異的ポリマー（ＰＶ６１１０）を使用して１２分間、一切の結合６Ｄ４抗体を検出し、染色をＲｅｆｉｎｅ  ＤＡＢ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびヘマトキシリン対比染色で可視化した。アイソタイプ対照（ＩｇＧ）スライド（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各試行に含めた。特異的結合は、ＤＡＢ基質の褐色の色によって示された。
【０１５８】
クローン６Ｄ４からの精製モノクローナル抗体を次の細胞型のＦＦＰＥ検体に対して試験した：（１）Ｋ５６２細胞（ＲＯＲ１−）、および（２）完全長ＲＯＲ１を過剰発現するようにトランスフェクトされたＫ５６２細胞（Ｋ５６２／ＲＯＲ１＋）。抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体６Ｄ４は、Ｋ５６２／ＲＯＲ１＋に対して高レベルの明瞭な膜染色を実証し、かつＲＯＲ１−Ｋ５６２細胞でのバックグラウンド染色がないことを実証した（図７）。抗ヒトＲＯＲ１  ６Ｄ４抗体を、初代ヒトＣＬＬおよびＭＣＬ腫瘍リンパ節のパネルに対しても試験して、正常ヒト扁桃組織（ＲＯＲ１−）を陰性対照として用いて内因性完全長ＲＯＲ１発現を検出することができるかどうかを決定した。抗ＲＯＲ１モノクローナル６Ｄ４は、ＣＬＬおよびＭＣＬ腫瘍細胞において明瞭な特異的膜染色を実証し、正常扁桃組織に対するバックグラウンド染色はなかった（図８）。これらの結果は、トランスフェクト細胞におけるＲＯＲ１過剰発現の検出に加えて、精製モノクローナル抗ＲＯＲ１  ６Ｄ４抗体は、少なくとも２つの異なる腫瘍型において内因性発現したＲＯＲ１を感度よく検出することができることを実証する。
【０１５９】
対照的に、多くの他のクローンからの上清は、ＲＯＲ１を過剰発現するＫ５６２細胞を染色したが、ＦＦＰＥ  ＣＬＬリンパ節における内因性ＲＯＲ１を検出することができなかった（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０１６０】
マウスを免疫化するのに使用した４つの異なるＲＯＲ１ペプチドの混合物からの、１つのＲＯＲ１ペプチド断片に、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体クローン６Ｄ４が特異的に結合した。抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体６Ｄ４は、完全長ＲＯＲ１（ＲＯＲ１＿Ｖ１）のＣ末端領域に位置する、ヒトＲＯＲ１ペプチド内のエピトープ７８６−ＮＰＲＹＰＮＹＭＦＰＳＱＧＩＴＰＱＧＱＩＡＧＦＩＧＰＰＩＰ−８１４（配列番号３）と結合することが判明した（図５を参照されたい）。二次標的デコンボリューション（ＢＤ（商標）Ｅｌｉｓｐｏｔ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）用のサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）を使用して、そのエピトープをマッピングした。
【０１６１】
総合すれば、これらの研究は、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体６Ｄ４が、ヒト細胞および組織、例えば、がんにおいて内因性発現した完全長ＲＯＲ１を特異的かつ感度よく検出することができることを実証する。
【０１６２】
（実施例４）
モノクローナル抗体６Ｄ４の特異性の検証  
精製６Ｄ４モノクローナル抗体をＲＯＲ１およびＲＯＲ２との結合についてさらに評価した。簡単に言うと、ヒトＲＯＲ１＿ｖ１をコードする核酸分子（ＮＰ＿００５００３．２）、およびＲＯＲ２をコードする核酸分子（ｐＤＯＭＲ２２３−ＲＯＲ２−Ａｄｄｇｅｎｅ）を、Ｌｅｉｓｅｇａｎｇら（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ８６巻：５７３頁、２００８年）により記載されたようにレトロウイルスベクターにクローニングした。細胞株Ｋ５６２、ＪｅＫｏ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、および２９３ＴをＡＴＣＣから入手した。ヒトＲＯＲ１＿ｖ１、ヒトＲＯＲ２（配列番号５６）およびアカゲザルＲＯＲ１＿ｖ１（配列番号５８）ペプチドを発現するレトロウイルスベクターを用いて、Ｋ５６２細胞に形質導入した。抗ＲＯＲ１（クローン２Ａ２−Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）および抗ＲＯＲ２（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−ＦＡＢ２０６４１Ｇ）またはアイソタイプを用いて、以前に記載されたようにフロー染色（ｆｌｏｗ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った（Ｂｅｒｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３巻：２０６頁、２０１５年を参照されたい）。
【０１６３】
抗体６Ｄ４は、非形質導入Ｋ５６２細胞またはヒトＲＯＲ２を発現するＫ５６２細胞に対して最小のバックグラウンドでＫ５６２／ＲＯＲ１を染色し、ならびに十分に特徴付けされたクローン２Ａ２を使用するフローサイトメトリーにより細胞表面ＲＯＲ１染色も示す、ＪｅＫｏ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＮＣＩ−Ｈ１９７５を含む、造血および上皮性腫瘍細胞株を染色した（図１０Ａ）。ヒトＲＯＲ２を発現するＫ５６２細胞では染色が観察されなかった（図１０Ａ、下の左側）。精製６Ｄ４をＣＬＬおよびＭＣＬリンパ節ならびにＰＢＭＣの染色についても試験し、正常ヒト扁桃に対して最小のバックグラウンドで均一な膜染色が観察された（図１０Ｂ）。Ｋ５６２／ＲＯＲ１、初代ＣＬＬおよびＭＣＬ細胞、ならびにＲＯＲ１＋腫瘍株からの溶解物の６Ｄ４での免疫ブロットは、完全長ＲＯＲ１と一致する１３０ｋＤａバンドを検出した（図１０Ｃ）。
【０１６４】
これらの結果は、６Ｄ４モノクローナル抗体が、以前の試薬より高い感度で、かつＲＯＲ２に対する交差反応性を伴わずに、原発性腫瘍上での完全長ＲＯＲ１の内因性細胞表面発現を特異的に検出することを実証する。
【０１６５】
（実施例５）
ＲＯＲ１を発現する固形腫瘍を同定するための抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体６Ｄ４の使用
抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体６Ｄ４が、罹病組織などの組織における内因性ＲＯＲ１、例えば、固形腫瘍におけるＲＯＲ１細胞表面発現を検出することができるかどうかを決定するために、精製抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体６Ｄ４を、乳がん、肺がん、卵巣がんおよび膵がんのホルマリン固定されパラフィンに包埋された（ＦＦＰＥ）試料に関する免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイに使用した。
【０１６６】
ＩＨＣ試料は、上の実施例３で説明したように調製した。２名の独立した認定病理学者が腫瘍組織に細胞表面ＲＯＲ１についてのスコアを付け、それらのスコアを平均した。「０−陰性」、「１−抗体での低度の膜染色」、「２または３−抗体での高度の膜染色」として組織にスコアを付けた（図１１）。均質な染色および限局的染色を、それぞれ、腫瘍の５０％超に対する染色および３０％未満に対する染色と定義した。
【０１６７】
上皮がん腫瘍細胞に対する６Ｄ４抗体の感度および特異性
第１の研究において、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体６Ｄ４は、アイソタイプ対照と比較して、完全長ＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞と感度よく、特異的に結合することができることが判明した。特に、ＲＯＲ１は、トリプルネガティブ乳がん、肺腺癌および卵巣がん組織を有する患者のサブセットにおいて高度に発現されることが判明した（図１２）。この研究では、卵巣がん、肺腺癌およびトリプルネガティブ乳がんのそれぞれ５０％、７５％および５０％は均質なＲＯＲ１発現を有することが観察された。図１３に示されているように、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌および非定型カルチノイドを含む、様々な肺がん型においても染色が観察された。図１４および１５に示されているように、抗体は、正常ヒト組織のサブセット（副甲状腺、膵島、および食道領域を含む）においてのみ、低レベルのＲＯＲ１を検出した。
【０１６８】
上皮がんにおけるＲＯＲ１発現
ａ．卵巣がん
以前に公開された研究において、卵巣がんのおおよそ５０％はＲｏｒ１転写物を発現することが判明し、高いＲｏｒ１転写物レベルを有する腫瘍を有する患者は、好ましくない無病および無転移生存期間を有した（Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４巻：５８１１頁、２０１４年）。しかし、その研究でのＲＯＲ１のＩＨＣ分析は、染色を主として腫瘍細胞の細胞質および核に限局したものであり、これは、腫瘍細胞株上の完全長ＲＯＲ１＿ｖ１の細胞表面発現とは異なった。
【０１６９】
それ故、様々な組織学の１５９の卵巣がんからなる２つの組織マイクロアレイを、ＩＨＣにおいて６Ｄ４モノクローナル抗体を使用して調査した。卵巣がんの５０パーセント（５０％）は、主として膜および細胞質の６Ｄ４での染色を示した（図１６Ａ）。腫瘍の９２％において、ＲＯＲ１は、均一に発現され、これを細胞の５０％より多くの明確な膜染色と定義し、陽性腫瘍における染色強度は、細胞表面染色の強度に基づいて高度または低度と分類することができた（図１１）。組織学的亜型に分類して、類内膜腺癌のおおよそ９０％は、ＲＯＲ１＋であり、陽性腫瘍の６０％は、ＲＯＲ１高度であり、漿液性乳頭状癌の７４％は、ＲＯＲ１＋であって、５０％がＲＯＲ１高度にグレード分けされ、粘液性腺癌の４４％は、ＲＯＲ１＋（３１％ＲＯＲ１高度）であり、漿液性腺癌の３７％は、ＲＯＲ１＋（５０％ＲＯＲ１高度）であった（図１６Ｂ、１６Ｃ）。細胞表面ＲＯＲ１は、卵巣がんのある特定の亜型、例えば、明細胞癌および粘液性乳頭腺癌では、低いか、または存在しない。少数の転移性試料（１明細胞、４漿液性乳頭状、および７漿液性腺癌）を調査し、転移性漿液性乳頭状腺癌の７５％および漿液性腺癌の４０％がＲＯＲ１＋であった。これらの結果は、６Ｄ４  ｍＡｂが、卵巣がんの大部分において細胞表面、完全長ＲＯＲ１を検出し、ＲＯＲ１発現の予後的意義の決定にもＲＯＲ１標的化療法に適格な患者の同定にも有用であり得ることを実証する。
【０１７０】
ｂ．乳がん
ＲＯＲ１遺伝子発現は、公けに利用可能なＧＥＯデータベースを使用して乳がんにおいて以前に調査され、高度なＲＯＲ１発現が、上皮間葉転換（ＥＭＴ）遺伝子シグネチャーおよびより低い無転移生存期間と相関した（Ｚｈａｎｇら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ７巻：ｅ３１１２７、２０１２年；Ｃｕｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３巻：３６４９頁、２０１３年）。これらの報告の１つにより、原発性のがんの７０％においてＩＨＣによりＲＯＲ１タンパク質発現が観察された（乳房小葉（ｌｏｂｕｌａｒ  ｂｒｅａｓｔ）の７５％および乳管（ｄｕｃｔａｌ  ｂｒｅａｓｔ）の７０％はＲＯＲ１＋であった）が、その研究で使用された試薬での染色は、核および細胞質に限局されたものであり、これは、検出されたタンパク質が、ＲＯＲ１の細胞表面、完全長バリアントではない可能性があることを示唆する（Ｚｈａｎｇら、２０１２年）。独立したグループが、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）においてＩＨＣによりＲＯＲ１を調査し、２２％はＲＯＲ１＋であり、これらの患者は、より短い無疾患生存期間を有することが判明した（Ｃｈｉｅｎら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈｉｖ  ４６８巻：５８９頁、２０１６年）。
【０１７１】
本研究では、６Ｄ４  ｍＡｂを使用して、２４のＥＲ／ＰＲ＋、１２のＨｅｒ２＋および６０のＴＮＢＣ試料をＲＯＲ１について分析した（図１７Ａ〜１７Ｃ）。低度のＲＯＲ１染色がＥＲ／ＰＲ＋のわずかな百分率で観察され（１２％ＲＯＲ１＋）、ＨＥＲ２＋腫瘍ではＲＯＲ１発現は観察されなかった。しかし、ＲＯＲ１は、ＴＮＢＣで高度に発現され、試料の５７％はＲＯＲ１＋であり、５６％がＲＯＲ１高度としてグレード分けされ、７４％が均質な染色を示した（図１７Ｂ〜１７Ｃ）。
【０１７２】
ｃ．肺がん
以前の研究において、マイクロアレイおよびＰＣＲによりＲｏｒ１転写物が非小細胞肺がんにおいて同定された（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２１巻：３４８頁、２０１２年；Ｋａｒａｃｈａｌｉｏｕら、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３巻：１２２頁、２０１４年）。種々のポリクローナルおよびモノクローナル抗体を用いるＩＨＣにより、全肺がんの４０％を構成する肺腺癌の２４〜９０％においてＲＯＲ１の染色が示された（Ｚｈａｎｇら、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １８１巻：１９０３頁、２０１２年；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２１巻：３４８頁、２０１２年；Ｌｉｕら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  １０巻：ｅ０１２７０９２、２０１５年）。他の肺がん亜型におけるＲＯＲ１発現は、十分に特徴付けされていない。
【０１７３】
６Ｄ４  ｍＡｂを使用して種々の組織学的型の１３７の原発性肺がんにおいてＲＯＲ１発現を調査した。ＲＯＲ１発現は、肺腺癌において最も高頻度であり（４２％がＲＯＲ１＋であって、３８％がＲＯＲ１高度にグレード分けされる）、少数（１２％）の扁平上皮癌にＲＯＲ１＋  染色があった（図１８Ａ〜１８Ｃ）。本発明者らは、腺扁平上皮癌、大細胞癌、小細胞癌、および非定型カルチノイド腫瘍においてもＲＯＲ１染色を観察したが、これらの腫瘍は、陽性頻度の正確な推定のために調査するには少なすぎた（図１８Ｂ〜１８Ｃ）。すべてのＲＯＲ１＋肺腫瘍が均質な染色を示した。
【０１７４】
ＲＯＲ１は、ＥＭＴおよび腫瘍の移動において役割を果たすと報告されているので、本発明者らは、適合する転移病変におけるＲＯＲ１発現を評価して、原発性腫瘍におけるＲＯＲ１発現が維持されるかどうかを決定した。５０％がＲＯＲ１＋腫瘍を有する肺腺癌患者からの３０の原発性および適合する転移性リンパ節において、ＲＯＲ１発現を調査した。ＲＯＲ１＋原発性腫瘍を有する患者において、適合する転移性リンパ節の６０％は、ＲＯＲ１＋のままであり、４０％は、ＲＯＲ１−であった（図１８Ｄ）。２名の患者に関して、原発性腫瘍はＲＯＲ１−であったが、転移性リンパ節はＲＯＲ１＋であった。これらの結果は、肺腺癌におけるＲＯＲ１発現増加と転移能とに直接的な相関関係がない可能性があること、またはＲＯＲ１発現の維持が、遠隔転移部位での腫瘍増殖に必要ない可能性があることを示唆している。
【０１７５】
ｄ．膵がん
膵臓腺癌は、ある研究でＲＯＲ１を高頻度に（８３％）発現すると以前に報告されている（Ｚｈａｎｇら、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １８１巻：１９０３頁、２０１２年）。
【０１７６】
６Ｄ４  ｍＡｂを使用して膵臓腺癌の３８症例において細胞表面ＲＯＲ１発現を決定した（図１９Ａ）。驚くべきことに、本発明者らは、ほんの一部の腫瘍（１５％）においてＲＯＲ１が低レベルで発現することを見いだした（図１９Ｂ）。
【０１７７】
要約
全体的に見て、一般的な上皮がんについての本分析は、細胞表面で発現される高レベルの完全長ＲＯＲ１が卵巣がん、ＴＮＢＣおよび肺腺癌のかなりの割合に存在することを示す。ＲＯＲ１染色は典型的には均質であり、これは、そのような腫瘍細胞の圧倒的多数がＲＯＲ１標的化療法に感受性であり得ることを示唆している。
【０１７８】
これらの結果は、ＲＯＲ１を表面で発現する造血性または固形腫瘍におけるものを含む、抗ＲＯＲ１キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をその細胞表面で発現する免疫細胞を含む、免疫療法などのＲＯＲ１特異的療法で標的となる腫瘍関連抗原標的としてのＲＯＲ１の有用性を裏付ける。さらに、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体６Ｄ４は、高感度の特異的な診断試薬として、またはＲＯＲ１特異的療法のためのコンパニオン診断薬として有用である。
【０１７９】
（実施例６）
正常アカゲザルおよびヒト組織におけるＲＯＲ１発現
ヒト
ＲＯＲ１を標的とする抗体または養子Ｔ細胞療法に対する懸念は、正常組織上でのＲＯＲ１の発現に起因するオン標的オフ腫瘍（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ、ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ）毒性の可能性である（Ｍｏｒｇａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８巻：８４３頁、２０１０年；Ｌａｍｅｒｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２１巻：９０４頁、２０１３年；Ｈａｓｓａｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３巻：５１４４頁、２００７年）。全組織溶解物のリアルタイムＰＣＲまたは免疫ブロットにより正常組織におけるＲＯＲ１発現を分析した以前の研究により、ほとんどの正常組織においてＲＯＲ１は存在しないか、または低レベルで発現されることが判明した（Ｂａｓｋａｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４巻：３９６頁、２００８年；Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｂｌｏｏｄ  １１６巻：４５３２頁、２０１０年；Ｄａｖｅら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ７巻：ｅ５２６５５、２０１２年；Ｆｕｋｕｄａら、ＰＮＡＳ  １０５巻：３０４７頁、２００８年）。全組織ｃＤＮＡプールまたは溶解物は、ＲＯＲ１を検出する際の重要な第一段階であるが、発現が少数の細胞または組織領域に局在した場合、発現を検出できないことがある。フローサイトメトリーを使用して、細胞表面で発現される完全長ＲＯＲ１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで脂肪細胞前駆体から分化した脂肪細胞上に、および骨髄での正常Ｂ細胞分化の初期に存在することが証明された（Ｈｕｄｅｃｅｋら、２０１０年）。いくつかの研究によって、以前に入手可能であった抗体試薬を用いてＩＨＣを使用して正常組織におけるＲＯＲ１発現が調査されたが、脂肪細胞を除いて正常組織において細胞表面で発現されるＲＯＲ１は報告されていない（Ｄａｖｅら、２０１２年；Ｃｈｏｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｍｙｅｌｏｍａ  ＆  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １５巻、補遺：Ｓ１６７、２０１５年）。
【０１８０】
６Ｄ４  ｍＡｂは、ＲＯＲ１に対して高感度かつ特異的であり、他の抗体で試験してＲＯＲ１陰性であると以前に考えられていた正常組織上のＲＯＲ１を検出する可能性があった。それ故、２つのヒト多臓器正常組織マイクロアレイパネルを使用してＩＨＣによりＲＯＲ１発現を評価した。ＲＯＲ１は、脳、心臓、肺および肝臓には存在しなかったが、正常な副甲状腺、膵島細胞、および胃腸管の複数の領域において有意な細胞表面染色が検出された（図２０Ａ〜２０Ｃ）。細胞表面ＲＯＲ１は、食道の基底部上皮内層において、胃前庭部粘膜の表面および小窩上皮細胞において、ならびに十二指腸粘膜（吸収細胞、杯細胞および腺窩上皮）において発現された（図２０Ｂ）。腸粘膜上でのＲＯＲ１発現は、内腔上皮上および細胞間結合部間より高度であるように見えた（図２０Ｂ）。細胞表面ＲＯＲ１は、空腸でも回腸でも見られず、低レベルが上行および下行結腸の表面および腺窩上皮において観察された（図２０Ｂ）。
【０１８１】
以前の研究により正常組織ではＩＨＣによりＲＯＲ１が検出されなかった事実にかんがみて、６Ｄ４を用いて観察された細胞表面染色が別のタンパク質との交差反応性を反映しないことを確認するために、免疫ブロット分析を行った。陽性組織の急速凍結試料を入手し、６Ｄ４および以前に公開されたポリクローナルヤギ抗ＲＯＲ１抗体（Ｄａｖｅら、２０１２年）を用いる免疫ブロット分析用に細胞溶解物を調製した。加えて、ＲＯＲ１＿ｖ１に特異的なプライマー（Ｂｅｒｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３巻：２０６頁、２０１５年）を用いるリアルタイムＰＣＲ用にｃＤＮＡを調製した。ＣＬＬ細胞からの溶解物において、ならびに副甲状腺、膵島、胃前庭部および胃体部、食道、十二指腸および結腸からの溶解物において、６Ｄ４とポリクローナルヤギ抗ＲＯＲ１抗体の両方を使用する免疫ブロットにより、１３０ｋＤａ完全長ＲＯＲ１タンパク質と一致するバンドが検出された（図２０Ｄおよび２０Ｅ）。ＲＯＲ１バンドは、副甲状腺などの組織からの溶解物では、Ｎ結合型グリコシル化などの翻訳後修飾の差におそらく起因して、ＣＬＬと比較してわずかに高い分子量であった（図２０Ｄ）。Ｎ結合型グリコシル化を除去するＰＮＧａｓｅＦで溶解物を処理すると、１００ｋＤａの脱グリコシル化ＲＯＲ１タンパク質バンドが、Ｋａｕｃｋａら（Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ  ２０３巻：３５１頁、２０１１年）によって以前に報告されたように陽性組織において検出された（図２０Ｆ）。リアルタイムＰＣＲによるヒト腸組織におけるＲｏｒ１＿ｖ１転写物の測定は、胃および脂肪細胞において有意なＲｏｒ１転写物が示したが、これらの組織における転写物レベルは、ＣＬＬ患者からの末梢血試料よりも低かった（図２１）。
【０１８２】
これらの研究は、いくつかの正常成人組織において細胞表面で発現される完全長ＲＯＲ１を検出するのに十分な感度が抗体６Ｄ４にあることを示す。脂肪細胞（米国特許第９，１６３，２５８号）以外に、以前の報告により、副甲状腺、膵島、および胃腸管の領域（食道、胃および十二指腸を含む）においてＲＯＲ１は検出されなかった。
【０１８３】
アカゲザル
ヒト組織における上述の知見にもかかわらず、ＲＯＲ１  ＣＡＲにより認識されるエピトープが保存され、正常マカク組織が同様のレベルのＲｏｒ１転写物を発現するため、好適であると考えられている前臨床アカゲザル（Ｍａｃａｃｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）モデルにおいて、ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の安全性が以前に実証された（Ｂｅｒｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３巻：２０６頁、２０１５年）。非常に高用量の機能性ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入でさえ、マカクにおいて毒性は認められなかった（Ｂｅｒｇｅｒら、２０１５年）。
【０１８４】
ＲＯＲ１タンパク質が、マカクにおいてヒトの場合と同じ正常組織において発現されるかどうかをさらに評価するために、アカゲザルＲＯＲ１（例えば、配列番号５８）を認識する６Ｄ４  ｍＡｂの能力を試験した。配列番号５９に対応するアカゲザルＲＯＲ１エピトープは、ヒトＲＯＲ１における対応する配列とアミノ酸が１個異なる（図２３Ａ）。先ず、Ｋ５６２およびアカゲザルＴ細胞にアカゲザルＲＯＲ１（ＸＰ＿０１４９９６７３５）をＢｅｒｇｅｒら（２０１５年）に記載されたように形質導入し、６Ｄ４  ｍＡｂで染色した。アカゲザルＲＯＲ１を発現するように形質導入された細胞は、６Ｄ４抗体の結合を示す褐色染色を示した（図２３Ｂ）。加えて、正常アカゲザル組織パネルに関してＩＨＣを行い、ＩＨＣは、副甲状腺、膵島および胃腸管（食道基底部上皮、胃前庭部粘膜の小窩上皮細胞、および十二指腸粘膜の腸腺を含む）を含む、ヒト組織において観察されたのと同様の細胞表面ＲＯＲ１を同じ組織において示した（図２３Ｃおよび２３Ｄ）。しかし、ＲＯＲ１は、ヒト結腸において検出された低いレベルとは対照的に、アカゲザル結腸では検出されなかった。
【０１８５】
これらの結果は、ＲＯＲ１の発現パターンが、アカゲザルおよびヒト組織において非常に類似していることを示す。Ｂｅｒｇｅｒら（２０１５年）において観察されたマカクにおけるＲＯＲ１  ＣＡＲ−Ｔ細胞注入後の毒性の臨床的、生化学的または組織学的証拠の欠如は、非炎症正常組織へのＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の輸送があまりにも少量なので毒性を引き起こすことができない可能性があること、または抗原のレベルがこれらの組織ではｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＡＲ−Ｔ細胞認識に不十分である可能性があることを示す。
【０１８６】
（実施例７）
ＲＯＲ１特異的ＣＡＲはＲＯＲ１発現に比例して細胞を標的とする
６Ｄ４  ｍＡｂにより検出されるＲＯＲ１のレベルが、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞による認識に十分であるかどうかを決定するために、本発明者らは、初代ヒト分化脂肪細胞、膵島細胞および腺房細胞をＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞と共培養し、培養上清中のサイトカインを測定した。初代脂肪細胞をヒト白色前駆脂肪細胞（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ）（Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｂｌｏｏｄ  １１６巻：４５３２頁、２０１０年）から分化させた。初代ヒト膵島の２０００の膵島等価物、腺房細胞、および膵島培養用の培地をＰｒｏｄｏ  ｌａｂｓから入手した。Ｈｕｄｅｃｅｋら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９巻：３１５３頁、２０１３年）に記載されているように、ＲＯＲ１特異的Ｒ１２ｓｃＦｖ  ＣＡＲを発現させるためにＲＯＲ１  ＣＡＲレンチウイルスをヒトＴ細胞に形質導入した。初代脂肪細胞、膵島、および腺房細胞を、独立した２ドナーから調製した形質導入していないＴ細胞およびＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞とともに、２：１のＴ細胞：標的比で共培養した。２４時間の共培養後に上清を回収し、サイトカイン産生をマルチプレックスイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）によってアッセイした。標的細胞に標識するためのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とを使用して５：１のＴ細胞：標的比で標的殺滅を行って、２４時間のインキュベーション後に死滅標的細胞の百分率のスコアを付けた（Ｚａｒｉｔｓｋａｙａら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９巻：６０１頁、２０１０年を参照されたい）。
【０１８７】
同じドナーからのｍｏｃｋ  Ｔ細胞ではなくＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、初代脂肪細胞および膵島細胞とともにインキュベートしたとき、インターフェロンγ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−２を分泌した（図２２Ａ〜２２Ｃ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養中のサイトカイン分泌レベルは、標的上でのＲＯＲ１発現に比例した。加えて、ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＲＯＲ１＋Ｋ５６２／ＲＯＲ１細胞および分化脂肪細胞を溶解したが、Ｋ５６２細胞を溶解しなかった（図２２Ｄ）。
【０１８８】
これらの知見は、ＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ｍＡｂ  ６Ｄ４によって示されるＲＯＲ１発現に比例して細胞を標的とするという結論を裏付ける。
【０１８９】
本明細書において言及するおよび／または出願データシートに列挙する、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公表文献のすべては、２０１６年２月２日に出願した米国特許仮出願第６２／２９０，３３７号および２０１６年４月１９に出願した米国特許仮出願第６２／３２４，８７６号を含めて、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。上記の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を得ることができる。様々な特許、出願および公表文献の概念を利用するために必要に応じて実施形態の態様を変更して、またさらなる実施形態を得ることができる。上記の詳細な説明に照らして、これらおよび他の変更を実施形態に加えることができる。
【０１９０】
一般に、下記の特許請求の範囲において使用する用語は、本明細書および本特許請求の範囲において開示する特定の実施形態に本特許請求の範囲を限定すると解釈すべきでなく、そのような特許請求の範囲を伴う均等物の全範囲とともにすべての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、本特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
2019511904.tif 000030
【図１８Ｂ】
2019511904.tif 000031
【図１８Ｃ】
2019511904.tif 000032
【図１８Ｄ】
2019511904.tif 000033
【図１９Ａ】
2019511904.tif 000034
【図１９Ｂ】
2019511904.tif 000035
【図２０Ａ】
2019511904.tif 000036
【図２０Ｂ】
2019511904.tif 000037
【図２０Ｃ】
2019511904.tif 000038
【図２０Ｄ】
2019511904.tif 000039
【図２０Ｅ】
2019511904.tif 000040
【図２０Ｆ】
2019511904.tif 000041
【図２１】
2019511904.tif 000042
【図２２Ａ】
2019511904.tif 000043
【図２２Ｂ】
2019511904.tif 000044
【図２２Ｃ】
2019511904.tif 000045
【図２２Ｄ】
2019511904.tif 000046
【図２３Ａ】
2019511904.tif 000047
【図２３Ｂ】
2019511904.tif 000048
【図２３Ｃ】
2019511904.tif 000049
【図２３Ｄ】
2019511904.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月3日(2018.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019511904000001.app
【国際調査報告】
2019511904.tif 000051
2019511904.tif 000052
2019511904.tif 000053