(57)【要約】  単一分子を撮像する方法は、ａ）開口を備える基板面を有するキャリア基板を備える組立体を用意するステップであって、開口が、基板面に取り付けられる受容層で覆われ、受容層が、５〜１，０００ｅＶの運動エネルギーを有する低エネルギー電子に対して実質的に透過性である、ステップと、ｂ）ソフトランディングエレクトロスプレーイオン堆積によって前記受容層に単一分子を堆積させるステップであって、単一分子が載せられた受容層が形成される、ステップと、ｃ）前記単一分子が載せられた受容層のインライン型低エネルギー電子透過パターンを取得するステップと、ｄ）前記単一分子が載せられた受容層に単一分子の少なくとも１つの画像を得るために、前記電子透過パターンに再構築手順を適用するステップとを含む。上記のステップａ）からｃ）は、真空条件下で行われる。
2019504318.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）開口を備える基板面を有するキャリア基板を備える組立体を用意するステップであって、前記開口が、前記基板面に取り付けられる受容層で覆われ、前記受容層が、５〜１，０００ｅＶの運動エネルギーを有する低エネルギー電子に対して実質的に透過性である、ステップと、
ｂ）ソフトランディングエレクトロスプレーイオン堆積によって前記受容層に単一分子を堆積させるステップであって、単一分子が載せられた受容層が形成される、ステップと、
ｃ）前記単一分子が載せられた受容層のインライン型低エネルギー電子透過パターンを取得するステップと、
ｄ）前記単一分子が載せられた受容層に単一分子の少なくとも１つの画像を得るために、前記電子透過パターンに再構築手順を適用するステップとを含み、
上記の前記ステップａ）からｃ）が、真空条件下で行われる、
単一分子を撮像する方法。
【請求項２】
ステップｂ）が、単一分子のイオンを形成するための単一分子のイオン化と、前記単一分子のイオンの静電的抽出およびマスフィルタリングと、マスフィルタされた単一分子のイオンの、前記受容層への静電的案内とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単一分子が、タンパク質分子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記受容層が、グラフェン単層である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記電子透過パターンが、ホログラムである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記基板面が、Ｐｔ、ＰｄおよびＲｈで構成されるグループから選択される白金族元素で構成され、好ましくはＰｔである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ａ）開口を備える基板面を有するキャリア基板を収容する真空チャンバであって、前記開口が、前記基板面に取り付けられる受容層で覆われ、前記受容層が、５〜１，０００ｅＶの運動エネルギーを有する低エネルギー電子に関して実質的に透過性である、真空チャンバと、
ｂ）単一分子が載せられた受容層を形成するために、ソフトランディングエレクトロスプレーイオン堆積によって前記受容層に単一分子を堆積させる手段と、
ｃ）前記単一分子が載せられた受容層のインライン型低エネルギー電子透過パターンを取得する手段とを備える、
請求項１に記載の方法を実行するための機器。
【請求項８】
前記単一分子が載せられた受容層に、単一分子の少なくとも１つの画像を得るために、前記電子透過パターンに再構築手順を適用するための手段をさらに備える、請求項７に記載の機器。
【請求項９】
前記再構築手段が、ホログラフィック電子透過パターンを処理するように構成される、請求項８に記載の機器。
【請求項１０】
前記堆積させる手段が、単一分子のイオンを形成するために単一分子をイオン化する手段と、前記単一分子のイオンを静電的抽出およびマスフィルタリングする手段と、前記受容層にマスフィルタされた単一分子のイオンを静電的に案内する手段とを含む、請求項７から９のいずれか１項に記載の機器。
【請求項１１】
前記堆積させる手段が、単一タンパク質分子を堆積させるように構成される、請求項７から１０のいずれか１項に記載の機器。
【請求項１２】
前記受容層が、グラフェン単層である、請求項７から１１のいずれか１項に記載の機器。
【請求項１３】
前記基板面が、Ｐｔ、ＰｄおよびＲｈで構成されるグループから選択される白金族元素で構成され、好ましくはＰｔである、請求項７から１２のいずれか１項に記載の機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一分子、詳細には単一タンパク質分子を撮像するための方法および機器に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日利用可能なタンパク質の構造的情報の大半は、集合して結晶を構築する多くの分子を平均化することにより、または信号雑音比が低い電子顕微鏡写真から選択される大きい集団を平均化することにより、それぞれＸ線結晶解析実験または低温電子顕微鏡法による研究から得られてきた１０。目覚ましい量の利用可能なデータがあるにもかかわらず、当然ながら個々の１つだけの分子から構造的データを取得したいという強い要望が生まれている。生物学的に関連する分子の大半は異なる立体構造を示すが、関連する構造的詳細は、平均化を必要とするとき確認されないままである。さらに、タンパク質全体の大きいサブセット、具体的には、重要なカテゴリである膜タンパク質のサブセットは、まったく結晶化しない。１つの個々のタンパク質、またはタンパク質複合体のみを十分に詳細に分析することができた場合、最終的にはこれらの目的にも到達可能になる。
【０００３】
構造生物学に有意義な貢献をするためには、単一分子を撮像するためのツールは、個々のタンパク質を、その構造を明らかにするのに十分な量のデータを取得するのに十分な長さで、理想的には単一分子を破壊することなく観察することを可能にしなければならない。最新式の収差補正ＴＥＭに利用されている、Ｘ線と高エネルギー電子の両方にとっての強い非弾性散乱断面積は、１つだけの分子の高分解能再構築を明らかにするために必要とされる十分な弾性散乱事象の蓄積を妨げる。輝度が大幅に機能強化され、パルス継続時間が減じられた将来的なＸ線自由電子レーザ（ＸＦＥＬ）は、最終的に単一分子を撮像するという目標を達成する可能性がある。しかし、現在の、かつ予見可能な最新式のＸＦＥＬの性能は、少なくとも１００万個の分子を平均化することを依然として必要とする１，１１〜１３。
【０００４】
タンパク質分子とは別に、単一分子の撮像が望ましいはずの、多くの他のタイプの他の分子も存在する。これらは、分子のサイズが様々な分子を含む。
【０００５】
上記に鑑みて、本発明の一目的は、単一分子を撮像する方法および機器を提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
ここで、上記の目的は、請求項１に定められる方法によって達成できることが分かっている。
【０００７】
したがって、本発明の一態様によれば、単一分子を撮像する方法は、
ａ）開口を備える基板面を有するキャリア基板を備える組立体を用意するステップであって、開口が、基板面に取り付けられる受容層で覆われ、受容層が、５〜１，０００ｅＶの運動エネルギーを有する低エネルギー電子に対して実質的に透過性である、ステップと、
ｂ）ソフトランディングエレクトロスプレーイオン堆積によって前記受容層に単一分子を堆積させるステップであって、単一分子が載せられた受容層が形成される、ステップと、
ｃ）前記単一分子が載せられた受容層のインライン型低エネルギー電子透過パターンを取得するステップと、
ｄ）前記単一分子が載せられた受容層に単一分子の少なくとも１つの画像を得るために、前記電子透過パターンに再構築手順を適用するステップとを含み、
上記のステップａ）からｃ）は、真空条件下で行われる。
【０００８】
本発明の別の態様によれば、単一分子を撮像する方法を実行するための機器は、
ａ）開口を備える基板面を有するキャリア基板を収容する真空チャンバであって、開口が、基板面に取り付けられる受容層で覆われ、受容層が、５〜１，０００ｅＶの運動エネルギーを有する低エネルギー電子に関して実質的に透過性である、真空チャンバと、
ｂ）単一分子が載せられた受容層を形成するために、ソフトランディングエレクトロスプレーイオン堆積によって前記受容層に単一分子を堆積させる手段と、
ｃ）前記単一分子が載せられた受容層のインライン型低エネルギー電子透過パターンを取得する手段とを備える。
【０００９】
本文脈では、「低エネルギー電子」という用語は、低エネルギー電子が向けられる受容層に対して、５〜１，０００ｅＶの範囲の運動エネルギーを有する電子のことを指すと理解されるものとする。
【００１０】
基本的に、本発明の方法は、小さい無機分子または有機分子から非常に大きい生体分子まで、多種多様な分子に適用することができる。本発明の方法は、ダイマー、オリゴマー、およびクラスターなどの、分子の集合体にも適用可能である。
【００１１】
３原子分子、またさらには２原子分子などの非常に小さい、比較的揮発性の分子の場合、受容層に単一分子を十分に安定的に配置するために、周囲温度よりずっと低い温度まで受容層を冷却することが必要な場合があることが理解されよう。
【００１２】
「ソフトランディングエレクトロスプレーイオン堆積」という用語は、エレクトロスプレーイオン堆積の、一般に知られている方法論の一実装形態と理解されるものであり、「ソフトランディング」は、所望されないいかなる効果も避けるのに十分に小さいイオン衝撃エネルギーを用いて行われる堆積を指すものである。対応するエネルギー閾値は、特定の用途に依存する。多くの場合、衝撃エネルギーは、分子結合の解離を避けるために十分に低いものとする。しかし、弱く結合する分子集合体の調査では、特にソフトな堆積条件が必要とされることになるのは明らかである。
【００１３】
有利な実施形態は、さらに以下の説明、および従属請求項に定められる。
【００１４】
一実施形態によれば（請求項２および請求項１０）、単一分子の堆積は、単一分子のイオンを形成するための単一分子のイオン化と、前記単一分子のイオンの静電的抽出およびマスフィルタリングと、マスフィルタされた単一分子のイオンの、前記受容層への静電的案内とを含む。
【００１５】
一実施形態によれば（請求項３および請求項１１）、単一分子は、タンパク質分子である。
【００１６】
有利な一実施形態によれば（請求項４および請求項１２）、受容層は、グラフェン単層である。ウルトラクリーン自立グラフェンは、他で詳細に述べられているＰｔ金属触媒作用法によって準備することができる６（ＷＯ２０１４／０６４０５７Ａ２も参照）。
【００１７】
基本的に、種々のタイプの電子透過パターンを使用して、対象となる単一分子の所望の情報を得ることができる。たとえば、低エネルギー電子回折パターン技法が使用され得る。有利な一実施形態によれば（請求項５および請求項９）、電子透過パターンは、ホログラムである。
【００１８】
さらに好都合な一実施形態（請求項６および請求項１３）によれば、基板面は、Ｐｔ、ＰｄおよびＲｈで構成されるグループから選択される白金族元素で構成され、好ましくはＰｔである。
【００１９】
有利な一実施形態によれば、本発明の機器は、前記単一分子が載せられた受容層に、単一分子の少なくとも１つの画像を得るために、前記電子透過パターンに再構築手順を適用するための手段をさらに備える。
【００２０】
添付図面と併せて解釈される、本発明の種々の実施形態の以下の説明を参照することにより、本発明の上記その他の特徴および目的、ならびにそれらを達成する手法がより明らかになり、本発明自体がよりよく理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】単一タンパク質を撮像するための概略ワークフローである。上から下に：ウルトラクリーン自立グラフェンの準備および特徴付け。ｍ／ｚフィルタされたＥＳ−ＩＢＤシステムでの、自立グラフェン上へのタンパク質の堆積。低エネルギー電子線ホログラフィによる、先に特徴付けられた領域内のタンパク質の撮像。実験ワークフロー全体を通して、試料は、２つの実験チャンバ間の移動において、ＵＨＶスーツケースの助けを借り、厳格なＵＨＶ条件に保たれる（さらなる詳細については補足情報を参照）。
【図２】自立グラフェンに堆積される個々のＢＳＡタンパク質の画像を示す図である。ａ、ＢＳＡイオンビームのマススペクトルである。アンフォールドされたＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡ４９１９）のイオンビームは、２％ギ酸が加えられた、水とエタノールの１：１混合液に溶かされた０．４ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの溶液をエレクトロスプレーすることによって準備された。３０μＬ／ｈｒの流量では、２ｎＡのイオン電流が、ＴＯＦ−ＭＳで測定される。１０００ｕ／ｅを超えるマススペクトルは、多電荷タンパク質（ｚ＝＋３５…＋６０）の特徴的なピーク群を示す。低いｍ／ｚ範囲（＜１０００ｕ／ｅ）および高いｍ／ｚ範囲（＞２０００ｕ／ｅ）には、いかなるピークもなく、夾雑および非特異的な凝塊がない、純粋なビームを示している。ｂ、グラフェン上の、堆積された高電荷状態のＢＳＡタンパク質の調査画像である。マススペクトルから予想されるように、タンパク質の大部分はアンフォールドされている状態である。フォールドされた構造のＢＳＡの２つの高倍率画像が、ｃおよびｄに示される。スケールバーは、ｂでは５０ｎｍに対応し、ｃおよびｄでは５ｎｍに対応する。対応する配向の、タンパク質データバンク（ｐｄｂ  ｉｄ：３Ｖ０３）からのＢＳＡの原子モデルが、比較のためにｅおよびｆに示されている。
【図３】シトクロムＣの低エネルギー電子線ホログラム、およびそれらの再構築物を示す図である。ａは、１４２ｅＶ（左）、１３２ｅＶ（中央）、および１１７ｅＶ（右）の運動電子エネルギーで記録されたＣｙｔＣの３つのホログラムである。ｂは、グラフェン上の様々な配向でのタンパク質を示す数値再構築である。スケールバーは、２ｎｍに対応する。ｃ、Ｘ線結晶解析データから導き出され、タンパク質データバンク（ｐｄｂ  ｉｄ：１ＨＲＣ）に記録を取られている、平均化されたタンパク質構造に基づいた、考えられる配向の提案である。
【図４】３０ｐＡ／ｈ未変性ＣｙｔＣの堆積前（ａ）および堆積後（ｂ）の自立グラフェンを示す図である。ｂでは、２〜５ｎｍのサイズの個々の球状物体、またはそれらの塊が観察される。このような凝塊は、以前、低電荷状態での未変性ＣｙｔＣの堆積後、Ａｕ（１１１）表面に観察されている１４。ｃ、電子点源（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｐｏｉｎｔ  ｓｏｕｒｃｅ）を球状物体に近づけるように動かした後、それらの寸法を測定することができ、寸法は、個々の折り畳まれたＣｙｔＣ分子のサイズに対応する。スケールバーは、ａおよびｂでは５０ｎｍに対応し、ｃでは５ｎｍに対応する。
【図５】２つの個々のヘモグロビンおよびそれらの再構築物の低エネルギー電子線ホログラムを示す図である。ａは、それぞれ７１ｅＶ（左）および６９ｅＶ（右）の運動電子エネルギーで記録されたヘモグロビンの２つのホログラムである。ｂは、２つの異なる配向での、グラフェン上のタンパク質複合体を示す数値再構築である。スケールバーは、５ｎｍに対応する。物体の周りの拡散リングは、インライン型ホログラフィに固有の、焦点が合っていない２重像の存在によるものである。ｃは、Ｘ線結晶解析データから導き出され、タンパク質データバンク（ｐｄｂ  ｉｄ：２ＱＳＳ）に記録を取られている、平均化されたタンパク質構造に基づいた、考えられる配向の提案である。
【図６】ＣｙｔＣ複合体の配向の時間発展を示す図である。後に続く観察との間の時間差は３０秒である。これらの画像から、堆積されたタンパク質のうちの少なくともいくつかは、自立グラフェン上で動くことができることが明らかである。低エネルギー電子線ホログラフィは、表面上でのタンパク質の拡散を調査するための方法でもあるように思われる。この観察により、空間中にタンパク質を固定し、原子分解能を達成するために、低温で作動する低エネルギー電子ホログラフィック顕微鏡が必要とされる可能性があることが示唆される。スケールバーは、５ｎｍに対応する。
【図７】シトクロムＣ（左）およびヘモグロビン（右）のマススペクトルを示す図である。上はマスフィルタリングが表示される前のｍ／ｚスペクトルである。下はマスフィルタされた対応するスペクトルである。
【図８】ＵＨＶ真空スーツケースおよびその性能を示す図である。ａは、低エネルギー電子顕微鏡とＥＳ−ＩＢＤチャンバの間でのウルトラクリーン自立グラフェンのＵＨＶ移動を可能にする移送スーツケースの３次元レンダリングである。タンパク質堆積のない、完全な移動および輸送サイクルの前（ｂ）および後（ｃ）の、低エネルギー電子投影画像である。２つの真空チャンバ間の移動手順の過程において、これに関連するグラフェンの夾雑が蓄積することはなかった。
【図９】ＵＨＶ真空スーツケースおよびその性能を示す図である。ａは、低エネルギー電子顕微鏡とＥＳ−ＩＢＤチャンバの間でのウルトラクリーン自立グラフェンのＵＨＶ移動を可能にする移送スーツケースの３次元レンダリングである。タンパク質堆積のない、完全な移動および輸送サイクルの前（ｂ）および後（ｃ）の、低エネルギー電子投影画像である。２つの真空チャンバ間の移動手順の過程において、これに関連するグラフェンの夾雑が蓄積することはなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
実験的調査
ウルトラクリーン自立グラフェンは、他で詳細に述べられているＰｔ金属触媒作用法によって準備された６。低エネルギー電子ホログラフィック顕微鏡のＵＨＶチャンバからＥＳ−ＩＢＤ装置のＵＨＶチャンバへとウルトラクリーン基板を移動する前に、基板の清浄度が特徴付けられ、自立グラフェンのまったく同じ領域をタンパク質堆積の前後で比較するために参照用画像が記録される。
【００２３】
実験ワークフロー全体を通して、試料は、２つの実験チャンバ間の移動においてＵＨＶスーツケースの助けを借り、厳格なＵＨＶ条件に保たれる。
【００２４】
ＥＳ−ＩＢＤ手順および低エネルギー電子線ホログラフィ実験方式の詳細は、補足情報において説明される。
【００２５】
単一タンパク質を撮像するためのワークフローは、図１に示されるようにいくつかのステップを含む。ウルトラクリーン自立グラフェン試料は、最近開発された白金族元素触媒作用法を使用して準備され６、低エネルギー電子ホログラフィック顕微鏡でキャラクタライズされる（図１上）。このような試料は、その後、１０−１１ｍｂａｒの状況（ｒｅｇｉｍｅ）で作動するＵＨＶスーツケースを用いて、常時ＵＨＶ条件の下でＥＳ−ＩＢＤシステム（図１中央）に移動される（さらなる詳細については補足情報を参照）。未変性シトクロムＣ（ＣｙｔＣ）、およびヘモグロビン（ＨＧ）のイオンビームが、エレクトロスプレーイオン化およびマスフィルタリングによって発生する。ＣｙｔＣについては、電荷状態ｚ＝５〜７が選択される１５。ＨＧの場合、インタクトな複合体の電荷状態ｚ＝１６またはｚ＝１７が、未変性立体構造になることが知られており１６、したがって対応するｍ／ｚ領域が選択される（対応するマススペクトルは、補足情報に示されている）。第３の実験では、高電荷状態ｚ＝３５〜６０のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が、堆積用に選ばれる（図２参照）。３つの場合すべてにおいて、イオンは、電荷当たり２〜５ｅＶの運動エネルギーで１４、１００ｎｍ厚さのＳｉＮ膜にミリングされる５００×５００ｎｍ２の開口を覆うウルトラクリーン自立グラフェンに着地する６。
【００２６】
堆積後、試料は、維持されたＵＨＶ条件の下でＥＳ−ＩＢＤシステムから低エネルギー電子ホログラフィック顕微鏡へと再び移動され、ここで個々のタンパク質の低エネルギー電子線ホログラムが記録される１３。Ｄｅｎｎｉｓ  Ｇａｂｏｒの、ホログラフィの最初のアイデアに触発されたこの実験方式では、試料は、試料の前方わずか１００ｎｍに配置される原子的に鋭いフィールドエミッタチップによって発生する（図１下）、低エネルギー電子の高度にコヒーレントなビームに向けられる。散乱電子波および非散乱電子波によって形成される干渉パターン、いわゆるホログラムが、数センチメートル離れた電子検出器に記録される（さらなる詳細については補足情報を参照）。それに続く、ホログラムから試料平面１７〜１９への波面の逆伝搬を含む数値ホログラム再構築により、タンパク質の構造が最終的に明らかになる。
【００２７】
個々のＣｙｔＣタンパク質のホログラムおよびそれらの各再構築物が、図３（ａ〜ｂ）に示されている。ＣｙｔＣの堆積前後の自立グラフェンの調査画像が、図４に示されている。撮像されたタンパク質の形状は、Ｘ線結晶解析研究から得られる構造的データ情報、およびタンパク質データバンク（ｐｄｂ  ｉｄ：１ＨＲＣ）から入手可能な構造的データ情報と比較される。撮像されたＣｙｔＣの全体のサイズは、予想された寸法に対応し、低エネルギー電子画像は、いくつかの特異な配向において、タンパク質に関連付けることができる。電子画像の分解能は、個々のＣｙｔＣおよびそれらの塊（図３ｂ）を識別するのに十分である。ＤＮＡでは先に実証されているように８、電子への露出中、タンパク質の分解の兆候は観察されていない。
【００２８】
図３の右の列に示されるデータからは、いくつかのＣｙｔＣによって形成される塊が、堆積前に集合しているのか、それとも堆積後に集合しているのかは、依然として明らかではない。一方、図５では、個々のヘモグロビンの２つのホログラムおよびそれらの各再構築物が示され、我々の方法では、個々のタンパク質を撮像するだけでなく、生物学的に関連するタンパク質複合体全体を堆積させ、撮像することも可能であることを実証している。個々のヘモグロビンの高コントラスト画像から明らかなように、タンパク質複合体全体の正確な寸法と共に球状構造が明らかになるだけではなく、異なる配向でのその形状の詳細も明らかになる。図５（ｂ右）では、サイズが０．７〜０．８ｎｍの構造的特徴を、はっきりと識別することができ、低エネルギー電子画像のための粗分解能推定（ｒｏｕｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｓｔｉｍａｔｅ）として機能する可能性がある。ホログラムでは、連続する干渉縞間の間隔は、より高次に向かって徐々に小さくなる。したがって、高次の干渉縞、およびその結果としての高分解能の構造的詳細は、機械的振動の影響を最も受けやすい。現在、後者によって分解能が制限されており、この制限を克服し、原子分解能に近づくために、低エネルギー電子ホログラフィック顕微鏡の機械的安定性を向上させる懸命な努力がなされている。
【００２９】
現段階では、タンパク質データバンクの構造との比較は、対象実験の性質を有する。しかし、将来的な目標は、知られていないタンパク質の構造、および異なっているのは少数の原子の位置のみである可能性がある、それらのすべての考えられる立体構造を直接発見することである。しかし、この大望への道においては、追加的な根本的課題、たとえば基板の影響、ＵＨＶ条件下で水和殻を付加する可能性、ならびにタンパク質の拡散およびそれに続くタンパク質複合体への会合などの移送に関連する問題が今後対処されなければならない。低エネルギー電子線ホログラフィによる、自立グラフェン上でのフォールドされたタンパク質の拡散の最初の観察が図６に示されており、ここで述べられている我々の方法も、動的プロセスにアクセスできることを示している。
【００３０】
終わりになるが、低エネルギー電子線ホログラフィとＥＳ−ＩＢＤ技術を組み合わせることにより、どのように単一タンパク質を撮像するかが示されてきた。これにより、未変性の単一タンパク質およびタンパク質複合体の構造的詳細を、それらを破壊することなく明らかにするための最初のツールがもたらされた。大きいタンパク質複合体２０、特に膜タンパク質２１，２２のエレクトロスプレーイオン化における最近の進歩により、生物学的に重要であるが容易に結晶化しようとしないこれらの主体の構造にさえも、ことによると近い将来にはアクセスできるようになろう。
【００３１】
裸の自立グラフェンは、低エネルギー電子を用いるコヒーレント回折により、既に２オングストロームの分解能で撮像されているが２３、次には、ここで述べられている技術を取り入れ、構造生物学において、単一タンパク質レベルで原子分解能に到達することが課題である。
補足情報
エレクトロスプレーイオンビーム堆積（ＥＳ−ＩＢＤ）
【００３２】
ソフトランディングエレクトロスプレーイオンビーム堆積は、手製の器具で実施される４，５。イオンビームは、２０〜３０μＬ／ｈの流量および約３ｋＶのエミッタ電圧で最適化された流体力学的挙動を有するナノエレクトロスプレー源によって発生する２４。陽イオンは、加熱された金属毛細管を通って真空に入り、イオンファネルおよびｒｆ専用モードで作動される衝突コリメーション（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ  ｃｏｌｌｉｍａｔｉｏｎ）四重極で平行化される。第３のポンピングステージでは、マスフィルタリング四重極は、対象となるｍ／ｚ領域を選択し、これは、第４のポンピングステージにおいて、飛行時間型質量分析計によって監視される。ここでは、逆電位型エネルギー分析器が、イオンの運動エネルギーを測定する。ビームは、次いで、２×１０−１０ｍｂａｒにされ、タンパク質の堆積が起きる第６のポンピングステージの標的に向かって、静電レンズによって案内される。ゆるやかな着地を確実にするために、バイアス電圧を標的に印加し、したがってタンパク質イオンの運動エネルギーを低減することにより、衝突エネルギーが制御される。
【００３３】
未変性ＣｙｔＣ（ウシ、Ｆｌｕｋａ３０３９８）のイオンビームを得るために、０．１５ｍｇ／ｍＬの溶液が、水性５０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファ中で調製された。２５μＬ／ｈｒのスプレー流量では、１．１ｎＡであるイオン電流が、ＴＯＦ−ＭＳで検出される。フィルタされていないマススペクトル（図７左／上）は、折り畳まれたＣｙｔＣに対応する、＋５〜＋７の低電荷状態を示す。より低いｍ／ｚ値では、高電荷の（ｚ＞＋８）ほどかれているＣｙｔＣに対応するピーク、およびフラグメントまたは夾雑に関連するピークが見いだされる。ＴＯＦ−ＭＳのダイナミックレンジが制限されていることにより、検出器の増幅は、非常に高く設定されており、その結果、未変性ＣｙｔＣのピークが歪んでいることに留意されたい。ｍ／ｚ選択的四重極は、５％の差動直流電圧で７００Ｖのｒｆ振幅を設定することにより、１２５０ｕ／ｅから約３５００ｕ／ｅまでのｍ／ｚ窓を選択するように調整された。これは、ほどかれているタンパク質（低いｍ／ｚ）および定義されていない重い会合体（高いｍ／ｚ）が取り除かれる、主に未変性ＣｙｔＣ（図７左／下）のビームがもたらされる。
【００３４】
ヘモグロビン（ウシ、ＳｉｇｍａＨ２５００）は、２つがＡ、２つがＢである、４つのミオグロビンサブユニットのタンパク質複合体である。イオンビームは、５０ｍＭの酢酸アンモニウムバッファ中に調製される０．３ｍｇ／ｍＬのＨＧの溶液から生成される。６００ｐＡの電流が、ＴＯＦ−ＭＳで検出された。マススペクトルは、非常に複雑であり、手製のリニアＴＯＦ−ＭＳの分解能およびダイナミックレンジに関する性能が制限されていることにより、部分的にのみ分解される。しかし、資料のスペクトルとの比較により、特徴的なピーク（図７右／下）を識別することが可能になり、これらのピークは、四重極を用いるマスフィルタリングにより、高いｍ／ｚ範囲（＞５０００ｕ／ｅ）での非特異的な凝塊が取り除かれた後、より顕著になる。堆積のために送信されるビームは、ダイマー（Ｄ）およびモノマー（ＨＢＡ）と共に、未変性インタクトＨＧ複合体（Ｑ１７＋、Ｑ１６＋）を含む。
【００３５】
低エネルギー電子線ホログラフィ
Ｄｅｎｎｉｓ  Ｇａｂｏｒの、インライン型ホログラフィの最初のアイデアに触発された低エネルギー電子ホログラフィック装置３（（図８）では２５，２６、鋭い（１１１）配向タングステンチップが、電子点源（ＥＰＳ）として機能し、高度にコヒーレントな電子の発散ビームを提供する２７，２８。３軸ナノポジショナの助けを借りて、原子サイズの電子フィールドエミッタを、試料までわずか１００ｎｍのところまで持ってくることができる。電子波の一部は物体で弾性的に散乱し、したがって物体波と呼ばれ、波の散乱しない部分は参照波を表す。離れている検出器では、ホログラム、すなわちこれらの２つの波面の干渉から得られるパターンが記録される。撮像システムの倍率は、検出器から点源までの距離と、試料から点源までの距離との間の比によって与えられ、１０５にもなり得る。回折パターンとは対照的に、ホログラムは、物体波の位相情報を含み、したがって、物体構造を明確に再構築することができる。ホログラムからの数値再構築は、本質的には物体平面への逆伝搬によって達成され、これはフレネル・キルヒホッフの積分変換（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を評価することに相当する１７〜１９。
【００３６】
ＵＨＶ移動
真空スーツケース（図９（ａ）（Ｆｅｒｒｏｖａｃ  ＧｍｂＨ、Ｚｕｒｉｃｈ））は、一方が電子線ホログラフィであり、他方がエレクトロスプレーイオンビーム堆積である、ＵＨＶをベースにする２つの実験の間で、試料を移動するために使用される。
【００３７】
スーツケースは、バッテリ駆動電源によって作動されるＳＡＥＳゲッター／イオンゲッターポンプの組合せを備えている。圧力は、圧力が１×１０−９ｍｂａｒの状況まで上がる、短時間の移動（１〜２分）を除き、常に２×１０−１０ｍｂａｒ未満に保たれる。本来はＳＴＭ実験用に開発されたこのスーツケースの性能は、種々の表面科学調査からよく知られている２９，３０。
【００３８】
それぞれの器具は、スーツケースを取り付けることができるロードロックを備えている。ロードロックは、ＬＮ２温度の低温活性炭トラップによって補助されるターボ分子ポンプによって排気される。１０−９ｍｂａｒ範囲の圧力が数時間以内に確立され、夾雑のない試料の移動を確実にする。図９は、Ｚｕｒｉｃｈに設けられている低エネルギー電子ホログラフィック顕微鏡からＳｔｕｔｔｇａｒｔにあるＥＳ−ＩＢＤチャンバへ、そしてＺｕｒｉｃｈにある顕微鏡に戻る移動の前（ｂ）、およびその移動後（ｃ）の、自立グラフェンのまったく同じ領域の低エネルギー電子投影画像を示す。移動および移送に起因する、夾雑に関連する兆候は観察されていない。
【００３９】
結びの所見
単一タンパク質分子の場合についてここで例示される、単一分子の撮像という目的を達成するために、３つの要件を習得し、組み合わせる必要がある。第１に、さらなる検証のために個々のタンパク質を分離する方法が手近になければならず、これは、Ｘ線分析のためにタンパク質を集合させて結晶にするという現在の課題とは正反対のものである１，２。さらに、散乱実験から十分な構造的情報を蓄積するのに十分に長い間、単一タンパク質を空間中に固定したままにする技術が求められる。最後になるが、構造的詳細は低エネルギー電子線ホログラフィによって入手可能であるので３、観察中、放射による損傷がタンパク質を分解しないことを確実にしながら、構造的詳細を解明するのに十分に小さい波長を用いてゆるやかに放射することが、撮像にとって極めて重要である。ここでは、ソフトランディングエレクトロスプレービーム堆積により４，５、特異的な選択、ならびに超高真空環境での、個々のタンパク質およびタンパク質複合体のウルトラクリーン自立グラフェン６への安定した堆積５が可能になることが示されている。グラフェンは低エネルギー電子に対して透過性であり７、かつ後者は生物学的分子を損傷させないので８，９、個々のタンパク質（シトクロムＣおよびＢＳＡ）、ならびにタンパク質複合体（ヘモグロビン）の、信号雑音比が高い電子線ホログラムを取得することができた。数値ホログラム再構築物により、単一タンパク質の全体の形状が明らかになる。これを用いて、平均化処理の結果としてではない、個々の折り畳まれたタンパク質およびタンパク質複合体の画像が、初めて得られた。
【００４０】
参考文献
【表１Ａ】
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【表１Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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