(57)【要約】  本発明は分子生物学および細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本発明はラビリンチュラ綱宿主細胞用のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに関する。【選択図】なし
2019520069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガイドポリヌクレオチドおよびＣａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの供給源を含む、天然には存在しないまたは操作された組成物であって、前記ガイドポリヌクレオチドは、本質的に宿主細胞中の標的ポリヌクレオチドの逆相補体であるガイド配列を含み、前記ガイドポリヌクレオチドが前記宿主細胞中において前記標的ポリヌクレオチドで前記Ｃａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成され得、前記ガイド配列は、本質的に前記宿主細胞のゲノム中の５’−（Ｎ）ｙＰＡＭ−３’ポリヌクレオチド配列標的の（Ｎ）ｙ部分の逆相補体であり、ｙは８〜３０の整数であり、ＰＡＭはプロトスペーサー隣接モチーフであり、前記宿主細胞はラビリンチュラ綱であり、好ましくはトラウストチトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目のメンバーであり、好ましくはトラウストチトリアシエ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）科のメンバーであり、より好ましくはオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）からなる群から選択される属のメンバーであり、さらにより好ましくはスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＡＴＣＣ＃  ２０８８８であり、ＰＡＭは好ましくは、５’−ＸＧＧ−３’、５’−ＸＧＧＸＧ−３’、５’−ＸＸＡＧＡＡＷ−３’、５’−ＸＸＸＸＧＡＴＴ−３’、５’−ＸＸＡＧＡＡ−３’、５’−ＸＡＡＡＡＣ−３’からなる群から選択される配列であり、Ｘは任意のヌクレオチドまたはその類似体であり得、好ましくはＸは任意のヌクレオチドであり得、ＷはＡまたはＴである、組成物。
【請求項２】
前記Ｃａｓタンパク質はポリヌクレオチドによりコードされている、および／または前記ガイドポリヌクレオチドはポリヌクレオチドによりコードされている、もしくはこのポリヌクレオチド上に存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｃａｓタンパク質はあるポリヌクレオチドによりコードされており、および／または前記ガイドポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドによりコードされており、もしくはこの別のポリヌクレオチド上に存在しており、前記一方または両方のポリヌクレオチドはベクターに含まれている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ガイドポリヌクレオチドは、実際のガイドポリヌクレオチドを生成するために転写されるポリペプチドによりコードされている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｃａｓタンパク質はあるポリヌクレオチドによりコードされており、および／または前記ガイドポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドによりコードされており、もしくはこの別のポリヌクレオチド上に存在しており、前記両方のポリヌクレオチドは１つのベクターに含まれている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記Ｃａｓタンパク質は、あるベクターに含まれているポリヌクレオチドによりコードされており、前記ガイドポリヌクレオチドは、別のベクターに含まれている別のポリヌクレオチドによりコードされており、もしくはこの別のポリヌクレオチド上に存在しており、好ましくは、前記Ｃａｓタンパク質をコードするベクターは低強度のプロモーターにより駆動され、前記ガイドポリヌクレオチドをコードするベクターは高強度のプロモーターにより駆動される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
１種または複数種または全てのベクターは選択マーカーを含み、好ましくは各ベクターは別個の選択マーカーを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ガイドポリヌクレオチドに１種または複数種の外来性ポリヌクレオチドが作動可能に連結されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記Ｃａｓタンパク質は少なくとも１種の核局在化配列を含み、好ましくは異種核局在化配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記Ｃａｓタンパク質は前記標的配列の位置で両方のポリヌクレオチド鎖の開裂を指示する活性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドは前記宿主細胞にコドン最適化されており、好ましくはコドン対最適化されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能に連結されているポリヌクレオチドによりコードされており、好ましくはラビリンチュラ綱ＥＦ−１プロモーターに作動可能に連結されているポリヌクレオチドによりコードされている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターに作動可能に連結されているポリヌクレオチドは、前記ガイドポリヌクレオチドおよび自己プロセシングリボザイムを含むプレガイドポリヌクレオチドをコードし、転写された場合には、前記ガイドポリヌクレオチドは前記プレガイドポリヌクレオチド転写産物から前記自己プロセシングリボザイムにより放出される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
細胞中でのポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、宿主細胞と請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物とを接触させることを含み、前記ガイドポリヌクレオチドが前記宿主細胞中において前記標的ポリヌクレオチドで前記Ｃａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される、方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞は目的の化合物をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞は組換え宿主細胞である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物を含む宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞を作製する方法であって、宿主細胞と請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物とを接触させることを含み、前記ガイドポリヌクレチドが前記宿主細胞中において前記標的ポリヌクレオチドで前記Ｃａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される、方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞をＣａｓタンパク質の供給源と最初に接触させ、続いてガイドポリヌクレオチドおよび任意選択で外来性ポリヌクレオチドの供給源と接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞は目的の化合物をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法または請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞は組換え宿主細胞である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法または請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
目的の化合物の製造の方法であって、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法により得られる宿主細胞または請求項１７に記載の宿主細胞または請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法に従って作製された宿主細胞を、前記目的の化合物の産生を促す条件下で培養すること、ならびに任意選択で目的の化合物を精製することまたは単離することを含む方法。
【請求項２３】
前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である、請求項１４〜１６および１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃａｓタンパク質の発現は中強度のプロモーターにより駆動される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記中強度のプロモーターはアルファチューブリンプロモーターである、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、２０１６年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／３６１，７４１号明細書の出願日の利益を主張し、この明細書の開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［背景］
［技術分野］
[0002]本開示は分子生物学および細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は藻類ラビリンチュラ綱宿主細胞用のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに関する。
【０００３】
［関連分野の説明］
[0003]ゲノム技術および分析方法における最近の進歩により、多様な範囲の生物学的機能および疾患と関連する遺伝因子をカタログ化してマッピングする能力が顕著に加速されている。個々の遺伝要素の選択的撹乱を可能にすることにより原因の遺伝的変異の系統的な逆操作を可能にするために、ならびに合成生物学、生物工学的応用および医学的応用を進歩させるために、正確なゲノム操作技術が必要とされる。標的とされたゲノムの撹乱を生じさせるためにゲノム編集技術（例えばデザイナージンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはホーミングメガヌクレアーゼ）が利用可能であるが、入手可能であり、セットアップが容易であり、スケーラブルであり且つゲノム内の複数箇所のターゲティングに適している新規のゲノム編集技術が依然として必要とされている。メガヌクレアーゼの操作はほとんどの学術研究者にとっては困難であり、なぜならば、これらの酵素のＤＮＡ認識および開裂機能が単一のドメイン中で絡み合っているからである。操作されたジンクフィンガーアレイの頑強な構築は、アレイ中の個々のジンクフィンガードメインの間の状況依存的な効果を考慮する必要があるために多くの実験室にとって困難であることも証明されている。そのため、多様な用途による宿主細胞内の特定の配列のターゲティングのための代替の且つ頑強な技術に関する差し迫った必要性が存在する。この技術的問題に対する解決策は、本特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態により提供される。
【０００４】
［簡潔な概要］
[0004]本出願はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをベースとしており、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは標的特異的配列に対してカスタマイズされたタンパク質の生成を必要とせず、むしろ特定のポリヌクレオチド標的を認識するようにガイドポリヌクレオチドによりプログラムされ得る単一のＣａｓ酵素を必要とし、換言すると、このＣａｓ酵素を、前記ガイドポリヌクレオチド分子を使用して特定のポリヌクレオチド標的に対して動員し得る。このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをゲノミクス技術および分析方法のレパートリーに追加することにより、分子生物学の分野での既存の方法論を顕著に単純化し得る。
【０００５】
[0005]本発明は、ガイドポリヌクレオチドおよびＣａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの供給源を含む、天然には存在しないまたは操作された組成物であって、このガイドポリヌクレオチドは、本質的に宿主細胞中の標的ポリヌクレオチドの逆相補体である配列を含み、このガイドポリヌクレオチドがこの宿主細胞中において標的ポリヌクレオチドでＣａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成され得る、組成物を提供する。
【０００６】
[0006]本発明は、細胞中でのポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、宿主細胞と本発明に係る組成物とを接触させることを含み、ガイドポリヌクレオチドがこの宿主細胞中において標的ポリヌクレオチドでＣａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される、方法にさらに関する。
【０００７】
[0007]本発明は、本発明に係る組成物を含む宿主細胞にさらに関する。
【０００８】
[0008]本発明は、宿主細胞を作製する方法であって、宿主細胞と本発明に係る組成物とを接触させることを含み、ガイドポリヌクレチドがこの宿主細胞中において標的ポリヌクレオチドでＣａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される、方法にさらに関する。
【０００９】
[0009]本発明は、目的の化合物の製造の方法であって、本発明に係る宿主細胞をこの目的の化合物を促す条件下で培養すること、および任意選択で目的の化合物を精製することまたは単離することを含む方法にさらに関する。
【００１０】
[0010]本開示の性質、目的および利点のさらなる理解のために、下記の図面（同様の参照番号は同様の要素を示す）と共に読まれる下記の詳細な説明を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は典型的なガイドポリヌクレオチドの例を示す。両方のガイドポリヌクレオチドとも、ガイド配列（ｃｒＲＮＡ）とガイドポリヌクレオチド構造成分とを含むガイド−ＲＮＡ’である。上方の図では、このガイドポリヌクレオチド構造成分は互いにハイブリダイズしている２つの別々の分子で構成されており、これらの個々の成分はｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒ−メイト配列（ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と称され得る。下方の図では、このガイドポリヌクレオチド構造成分は内部ハイブリダイゼーションを有する単一分子で構成されている。この図の出典はＳａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｕｎｇ，２０１４およびＭａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０（１０）：９５７−６３，２０１３である。
【図２】図２は、ガイドポリヌクレオチド（ガイドＲＮＡ自己プロセシングリボザイムをｇＲＳＲと略す）がどのようにして構築されるかを示す。ハンマーヘッド型リボザイムおよびＨＤＶリボザイムは、最終的な且つ機能する成熟ガイドポリヌクレオチド（ガイドＲＮＡ）を形成するＲＮＡ分子を開裂する。
【図３】図３は、１％アガロースゲル上で泳動させた消化プラスミドおよびＰＣＲ増幅断片を示す。
【図４】図４は、ｐＹＢ３２細菌形質転換およびｐＹＢ３３細菌形質転換から得られた形質転換体のコロニーＰＣＲの結果を示す。
【図５】図５は、Ｔ１８８形質転換体およびＴ１８９形質転換体のゲノムＤＮＡに由来するアンプリコンを分離し、プロモーターおよび部分的Ｃａｓ９の存在に関して試験したアガロースゲルを示す。
【図６】図６は、ＯｒｆＡ／Ｐｆａ１遺伝子座へのＣａｓ９の組込みを立証する、アガロースゲル上で泳動させたＴ１８８形質転換体およびＴ１８９形質転換体のゲノムＤＮＡに由来するアンプリコンを示す。
【図７】図７は、ゲノムＤＮＡから増幅させて１％アガロースゲル上で泳動させたスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）遺伝子の一部を示す。
【図８】図８は、ベクターｐＣＬ４００中のＦＡＳ遺伝子座へのパロモマイシンおよびｇＲＮＡカセットのＰＣＲクローニングの結果を示す。
【図９】図９は、１つのアンプリコンとして最初の３種のＣＳ  ｇＲＮＡ標的を包含する全領域を増幅させるために実施したＰＣＲの結果およびｇＲＮＡ３  ＣＳ４標的を増幅させるための別のＰＣＲの結果を別々に示す。
【図１０】図１０は、Ｔ２０６形質転換体のゲノムＤＮＡから別々にｇＲＮＡ３  ＣＳ１標的を増幅させるために実施したＰＣＲの結果を示す。
【図１１】図１１は、ｐＬＣ１２２−Ｃａｓ９プラスミドおよびｐＹＢ３０プラスミドの消化の結果を示す。
【図１２】図１２は、ｐＹＢ６１細菌形質転換から得られた形質転換体のコロニーＰＣＲの結果を示す。
【図１３】図１３は、１％アガロースゲルにより、ｐＣＬ１２２プラスミドの消化の結果を示す。
【図１４】図１４は、１％アガロースゲルにより、ｐＹＢ６６クローニング用のｇＲＮＡ３  ＣＳ１カセットのアンプリコンを示す。
【図１５】図１５は、１％アガロースゲルにより、ｇＲＮＡ３  ＣＳ１（ｐＹＢ６６断片）の消化の結果を示す。
【図１６】図１６は、ｐＹＢ６６細菌形質転換から得られた形質転換体のコロニーＰＣＲの結果を示す。
【図１７】図１７は、１％アガロースゲルにより、ｐＹＢ６１プラスミドの消化の結果を示す。
【図１８】図１８は、１％アガロースゲルにより、ｐＹＢ７３クローニング用のｇＲＮＡ３  ＣＳ１カセットのアンプリコンを示す。
【図１９】図１９は、ｐＹＢ７３細菌形質転換から得られた形質転換体のコロニーＰＣＲの結果を示す。
【図２０】図２０は、Ｔ２１２形質転換体のゲノムＤＮＡに由来するアンプリコンを分離し、ＣａｒＧ遺伝子の存在に関して試験したアガロースゲルを示す。
【図２１】図２１は、Ｔ２８０形質転換体、Ｔ２８１形質転換体、Ｔ２８５形質転換体およびＴ２８６形質転換体のゲノムＤＡＮに由来するアンプリコンを分離し、部分的プロモーターおよびＣａｓ９配列の存在に関して試験したアガロースゲルを示す。
【図２２】図２２は、Ｔ２８１形質転換体およびＴ２８６形質転換体のゲノムＤＮＡに由来するアンプリコンを分離し、ｇＲＮＡカセットの存在に関して試験したアガロースゲルを示す。
【図２３】図２３は、Ｔ２８２形質転換体およびＴ２８７形質転換体のゲノムＤＮＡに由来するアンプリコンを分離し、部分的ｇＲＮＡカセットの存在に関して試験したアガロースゲルを示す。
【図２４】図２４は、Ｔ２８１形質転換体、Ｔ２８２形質転換体、Ｔ２８６形質転換体およびＴ２８７形質転換体のゲノムＤＮＡから別々にｇＲＮＡ３  ＣＳ１標的を増幅させるために実施したＰＣＲの結果を示す。
【００１２】
［配列表の説明］
[0035]配列番号１はｐＣＬ１２２−Ｃａｓ９ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0036]配列番号２はｐＹＢ３１ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0037]配列番号３はｐＹＢ３２ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0038]配列番号４はｐＹＢ３３ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0039]配列番号５はｐＣＬ３９９ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0040]配列番号６はｐＣＬ４００ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0041]配列番号７はｐＣＬ４０１ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0042]配列番号８はｐＣＬ４０２ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0043]配列番号９はｐＹＢ３６ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0044]配列番号１０はｐＹＢ３７ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0045]配列番号１１はｐＹＢ３８ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0046]配列番号１２はｐＹＢ３９ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0047]配列番号１３は１２１  Ｔｕｂ  ｓｅｑ  Ｆプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0048]配列番号１４はｐＹＢ３２／３  Ｃ  Ｒ１プライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0049]配列番号１５はＣＳ  ｐｒｏ  Ｋｐｎ  ＩＦ  Ｆ１プライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0050]配列番号１６はＣＳ  ｐｒｏ  ＢａｍＨ  ＩＦ  Ｒ１プライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0051]配列番号１７はＣＳ  ｐｒｏ  ＢａｍＨ  ＩＦ  Ｆ２プライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0052]配列番号１８はＣＳ  ｐｒｏ  Ｎｄｅ  ＩＦ  Ｒ２プライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0053]配列番号１９はＯ  Ａ１−ＫＯ  Ｆプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0054]配列番号２０はｐＹＢ３２／３  ＳＶ４０  Ｒ１プライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0055]配列番号２１はＯ  Ａ１−ＫＯ  Ｒプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0056]配列番号２２はｐＹＢ３２／３  Ｃ  Ｆ１プライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0057]配列番号２３は５’ＦＡＳ  ＰｍｅＮｄｅプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0058]配列番号２４は３’ＦＡＳ  ＰｍｅＨｐａプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0059]配列番号２５はｐＣＬ４０２  ＩＦ  Ｆプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0060]配列番号２６はｐＣＬ４０２  ＩＦ  Ｒプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0061]配列番号２７はｐＹＢ３６  ＣＳ１  Ｆプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0062]配列番号２８はｐＹＢ３６  ＣＳ１  Ｒプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0063]配列番号２９はｐＹＢ３６  ＣＳ３  Ｒプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0064]配列番号３０はｐＹＢ３６  ＣＳ４  Ｆプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0065]配列番号３１はｐＹＢ３６  ＣＳ４  Ｒプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0066]配列番号３２はｐＹＢ３０ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0067]配列番号３３はｐＹＢ６１ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0068]配列番号３４はｐＹＢ６６ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0069]配列番号３５はｐＹＢ７３ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0070]配列番号３６はｐＣＬ３１０ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0071]配列番号３７はｐＣＬ１２２ベクターのヌクレオチド配列を示す。
[0072]配列番号３８はｐＹＢ６６  ＢａｍＢｇｌ  Ｆプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0073]配列番号３９はｐＹＢ６６  Ｎｄｅ  Ｒプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0074]配列番号４０はｐＹＢ６６  ＥＦ１  ｓｅｑ  Ｆプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0075]配列番号４１はｐＣＬ１２２  ＯｒｆＣ  Ｒプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0076]配列番号４２はｐＹＢ７３  ｇＲＮＡ  Ｐｓｔ  Ｋｐｎ  ＩＦ  Ｆプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0077]配列番号４３はｐＹＢ７３  ｇＲＮＡ  Ｘｈｏ  Ｐｓｔ  ＩＦ  Ｒプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0078]配列番号４４はｐＹＢ７３  ｓｅｑ  Ｆプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0079]配列番号４５はｐＹＢ７３  ｓｅｑ  Ｒプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0080]配列番号４６はｐＹＢ１３  ｐＹＢ１  ｓｅｑ  Ｆプライマーのヌクレオチド配列を示す。
[0081]配列番号４７はＴＴ  ｐＹＢ７３  ＨＤＶ  Ｒプライマーのヌクレオチド配列を示す。
【００１３】
［詳細な説明］
[0082]本開示をさらに説明する前に、下記で説明する本開示の特定の実施形態の変形が行われ得ることから且つ添付の特許請求の範囲内である限りにおいて、本開示はこの特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。用いられる用語は特定の実施形態を説明することを目的としており限定することは意図されていないことも理解されたい。その代わりに、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲により確立されるであろう。
【００１４】
[0083]第１の態様では、本発明は、ガイドポリヌクレオチドおよびＣａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの供給源を含む、天然には存在しないまたは操作された組成物であって、このガイドポリヌクレオチドは、本質的に宿主細胞中の標的ポリヌクレオチドの逆相補体であるガイド配列を含み、このガイドポリヌクレオチドがこの宿主細胞中において標的ポリヌクレオチドでＣａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成され得、このガイド配列は、本質的にこの宿主細胞のゲノム中の５’−（Ｎ）ｙＰＡＭ−３’ポリヌクレオチド配列標的の（Ｎ）ｙ部分の逆相補体であり、ｙは８〜３０の整数であり、より好ましくは１０〜３０の整数であり、より好ましくは１５〜３０の整数であり、より好ましくは１７〜２７の整数であり、より好ましくは１７〜２０の整数であり、より好ましくは１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７であり、ＰＡＭはプロトスペーサー隣接モチーフであり、この宿主細胞はラビリンチュラ綱であり、好ましくはトラウストチトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目であり、より好ましくはトラウストチトリアシエ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）科であり、より好ましくは、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）からなる群から選択される属のメンバーであり、さらにより好ましくはスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＡＴＣＣ＃  ２０８８８であり、ＰＡＭは好ましくは、５’−ＸＧＧ−３’、５’−ＸＧＧＸＧ−３’、５’−ＸＸＡＧＡＡＷ−３’、５’−ＸＸＸＸＧＡＴＴ−３’、５’−ＸＸＡＧＡＡ−３’、５’−ＸＡＡＡＡＣ−３’からなる群から選択される配列であり、Ｘは任意のヌクレオチドまたはその類似体であり得、好ましくはＸは任意のヌクレオチドであり得、ＷはＡまたはＴである、組成物を提供する。
【００１５】
[0084]本組成物、本供給源、本ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、本ガイドポリヌクレオチド、本Ｃａｓタンパク質、本標的ポリヌクレオチド、本宿主細胞および本ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は本明細書において、本発明に係る組成物、本発明に係る供給源、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、本発明に係るガイドポリヌクレオチド、本発明に係るＣａｓタンパク質、本発明に係る標的ポリヌクレオチド、本発明に係る宿主細胞および本発明に係るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体と称される。完全を期すために、「ａ」は本明細書の他の箇所で「少なくとも１」と定義されることから、本発明に係る組成物は、少なくとも１種（即ち、１種、２種、３種またはより多く）のガイドポリヌクレオチドおよび／または少なくとも１種（即ち、１種、２種、３種またはより多く）のＣａｓタンパク質の供給源を含む。従って、本発明は好都合なことに多重ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを提供する。そのような多重ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは好都合なことに、ドナーポリヌクレオチドの導入、ポリヌクレオチドの欠失、および宿主細胞のゲノムへのポリヌクレオチドライブラリの挿入に使用され得る。本明細書では、多重ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、複数種のＣａｓタンパク質のうちの１種、複数種のガイドポリヌクレオチドのうちの１種および／または１種もしくは複数種のドナーポリヌクレオチドの使用を指す場合がある。
【００１６】
[0085]用語「ＣＲＩＳＰＲシステム」、「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム」および「ＣＲＩＳＰＲ酵素システム」は本明細書では互換的に使用され、本発明の全ての実施形態の文脈において、標的ポリヌクレオチドと一緒にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成するのに必要とされる要素の集まりを指し、これらの要素はＣａｓタンパク質およびガイドポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されない。
【００１７】
[0086]用語「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体」は本発明の全ての実施形態の文脈において、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし且つＣａｓタンパク質と複合体化したガイドポリヌクレオチドを含む複合体を指す。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９タンパク質が挙げられるがこれに限定されない非変異Ｃａｓタンパク質が使用される最も簡単な形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の形成により、標的ポリヌクレオチド中でまたは標的ポリヌクレオチド付近（例えば、この標的ポリヌクレオチドから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０またはより多くの塩基対内）で一方または両方のポリヌクレチド鎖が開裂される。典型的には、本発明に係る標的ポリヌクレオチド（本明細書において下記で定義する）はＰＡＭ配列（本明細書において下記で定義する）と会合しており、このＰＡＭ配列は好ましくはこの標的ポリヌクレオチドのすぐ下流（３’）に存在し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の形成により概して、このＰＡＭ配列の３塩基対上流（５’）で一方または両方のポリヌクレオチド鎖が開裂される。
【００１８】
[0087]用語「天然には存在しない組成物」は本発明の全ての実施形態の文脈において、本発明で使用される形態では天然に存在しない組成物を指す。個々の要素は例えば自然界においてそれ自体で存在してもよいし他の要素との組み合わせで存在してもよいが、この天然には存在しない組成物は、例えば天然組成物と比べて多いまたは少ない少なくとも１種の要素を含む。
【００１９】
[0088]用語「操作された組成物」は本発明の全ての実施形態の文脈において、得られる要素が自然界では存在しないように要素のうちの少なくとも１種が操作されている（即ち人により改変されている）組成物を指す。少なくとも１種の操作された要素を含むことにより、操作された組成物は天然には存在しないことになる。
【００２０】
[0089]用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」および「核酸」は本明細書では互換的に使用され、本発明の全ての実施形態の文脈において、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはこれらの混合物もしくは類似体のいずれか）のポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有し得、且つ既知または未知の任意の機能を実施し得る。下記はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、オリゴヌクレオチドおよびプライマー。ポリヌクレオチドは１つまたは複数の改変ヌクレオチド（例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体またはヌクレオチド等価物）を含み得、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド等価物は、改変塩基および／もしくは改変骨格および／もしくは非天然のヌクレオシド間連結またはこれらの改変の組み合わせを有する残基として定義される。好ましいヌクレオチド類似体およびヌクレオチド等価物をセクション「一般的定義」で説明する。必要に応じて、ヌクレオチド構造に対する改変をポリヌクレオチドの構築の前後に導入し得る。ポリヌクレオチドは、例えば標識化合物との共役により、重合後にさらに改変され得る。
【００２１】
[0090]本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、慣用的なホスホジエステル結合または非慣用的な結合（例えば、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）で見られるアミド結合）を含み得る。ポリヌクレオチドは、完全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列（例えば、翻訳されていない５’配列および３’配列、コード配列、ならびに核酸配列の断片、エピトープ、ドメインおよびバリアント）を含み得る。ポリヌクレオチドは任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成され得、これらは改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であり得るもしくはより典型的には二本鎖であり得るまたは一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成され得る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域で構成され得る。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）、またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンもしくはデオキシシチジン；「ＤＡＮ分子」）、またはこれらの任意のホスホエステル類似体（例えばホスホロチオエートおよびチオエステル）を含み得る。ポリヌクレオチドはまた、１つまたは複数の改変塩基、または安定性もしくは他の理由のために改変されたＤＡＮ骨格もしくはＲＮＡ骨格も含み得る。「改変」塩基として、例えばトリチル化塩基および珍しい塩基（例えばイノシン）が挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して様々な改変を行い得、そのため「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的または代謝的に改変された形態を包含する。用語核酸分子は、この分子の一次構造および二次構造のみを指し、この分子を任意の特定の三次形態に限定するものではない。そのため、この用語は、特に線状または環状のＤＮＡ分子（例えば制限断片）、プラスミドおよび染色体で見出される二本鎖ＤＮＡを含む。本明細書において、特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の議論では、ＤＮＡの非転写鎖（即ち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’への方向での配列のみを示すという通常の慣習に従って配列を説明し得る。
【００２２】
[0091]用語「単離」核酸分子は、核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡであって、これらの天然環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。単離核酸分子のさらなる例として、異種宿主細胞中で維持された組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的にもしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドを含む核酸分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子として、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写産物が挙げられる。本発明に係る単離核酸分子として、合成により製造されたそのような分子がさらに挙げられる。加えて、核酸分子またはポリヌクレオチドは調節エレメント（例えばプロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーター）を含み得る。
【００２３】
[0092]「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの会合体を指し、且つｃＤＮＡ核酸およびゲノムＤＮＡ核酸を含む。「遺伝子」はまた、特定のタンパク質を発現する核酸断片（例えば、個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン））、ならびにコード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）および後続する調節配列（３’非コード配列）も指す。「天然遺伝子」は、遺伝子であって、この遺伝子自体の調節配列と共に自然界で見出されるような遺伝子を指す。
【００２４】
[0093]一部の実施形態では、核酸分子は、本明細書で報告されたポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％もしくは９０％同一のまたは本明細書で報告されたポリヌクレオチド配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のポリヌクレオチド配列を含む。用語「パーセント同一性」は、当技術分野で既知であるように、２種以上のアミノ酸配列または２種以上のポリヌクレオチド配列の比較により決定した場合での、これらの配列の間の関係性のことである。当技術分野では、「同一性」はまた、場合によっては、一連のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の間の一致により決定した場合での、そのような配列の間の配列関連性の程度も意味する。
【００２５】
[0094]本発明の参照ポリヌクオレチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」のポリヌクレオチド配列を有する核酸分子により、この核酸分子のポリヌクレオチド配列は、このポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の各１００個のヌクレオチド当たり最大５個のヌクレオチドの相違を含み得ることを除いて参照配列と同一であることが意図されている。換言すると、参照ポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチド配列を有する核酸分子を得るために、この参照配列中のヌクレオチドの最大５％を欠失させ得る、もしくは別のヌクレオチドに置換し得る、または多くのヌクレオチド（この参照配列中の総ヌクレオチドの最大５％）をこの参照配列に挿入し得る。
【００２６】
[0095]現実問題としては、任意の特定のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が本発明のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかを既知のコンピュータプログラムを使用して慣習的に決定し得る。配列のアラインメントおよび同一性スコアの算出を使用して、クエリー配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的な一致を決定する方法を決定し得る。参照アルゴリズムへのマップおよびＧｅｎｅｉｏｕｓ参照アセンブラを有するコンピュータプログラムＧｅｎｅｉｏｕｓ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ）を使用してアラインメントを行った。
【００２７】
[0096]本発明に係るガイドポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るおよびこの標的ポリヌクレオチドへのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの配列特異的結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成され得るガイド配列を少なくとも含む。活性なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の形成を可能とするために、このガイドポリヌクレオチドはまた、特定の二次構造を有し且つこのガイドポリヌクレオチドへのＣａｓタンパク質の結合を可能にする配列も好ましくは含む。そのような配列は、当技術分野ではｔｒａｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒ配列、ｔｒａｃｒ足場またはガイドポリヌクレオチド構造成分として知られており、これらの用語は本明細書では互換的に使用され、ｔｒａｃｒはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲの略語であり、そのためｔｒａｃｒＲＮＡはトランス活性化ＣＲＳＰＲ  ＲＮＡを意味する。本来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム中のｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣａｓヌクレアーゼにｃｒＲＮＡ（ガイド配列）を連結する内在性の細菌ＲＮＡであり、あらゆるｃｒＲＮＡを結合させ得る。ガイドポリヌクレオチド構造成分は、単一のポリヌクレオチド分子で構成されていてもよいし、互いにハイブリダイズした２種以上の分子またはＣａｓタンパク質もしくは類似の機能の他のヌクレアーゼと会合する２種以上の分子で構成されていてもよい。ガイドポリヌクレオチド構造体のそのような成分はｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒ−メイト配列と称され得る。
【００２８】
[0097]従って、このガイドポリヌクレオチドはまた、ｔａｒｃｒ配列および／またはｔｒａｃｒ−メイト配列も好ましくは含む。このガイドポリヌクレオチドは、本明細書の上記で記載されたポリヌクレオチドの一般的定義に従うポリヌクレオチドであり、好ましいガイドポリヌクレオチドはリボヌクレオチドを含み、より好ましいガイドポリヌクレオチドはＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）である。ガイドポリヌクレオチド構造体の２つの例を図１に示す。
【００２９】
[0098]本発明の文脈では、好ましくは宿主細胞中のような生理学的条件下で対象配列が標的配列または標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし得る場合には、配列は本質的に標的配列または標的ポリヌクレオチドの逆相補体と称される。ガイド配列とこのガイド配列の対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインさせた場合に、好ましくは５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％よりも高い配列同一性である。標的ポリヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドである場合、ガイド配列等の対象配列は、標的ポリヌクレオチドのいずれかの鎖（例えばコード鎖または非コード鎖）とハイブリダイズし得る場合がある。
【００３０】
[0099]好ましくは、本発明に係るガイド配列は、標的中の特有の標的配列を標的とする。好ましくは、本発明に係るガイド配列は、ＰＡＭ配列に直接隣接する標的ポリヌクレオチド中の８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個（より好ましくは８個、９個、１０個、１１個または１２個）のヌクレオチドとの１００％配列同一性を有する。
【００３１】
[00100]本発明に係るガイド配列は好ましくは８〜３０個のヌクレオチド長であり、より好ましくは１０〜３０個のヌクレオチド長であり、より好ましくは１５〜３０個のヌクレオチド長であり、より好ましくは１７〜２７個のヌクレオチド長であり、より好ましくは１７〜２０個のヌクレオチド長であり、より好ましくは１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個または２７個のヌクレオチド長である。ガイド配列の、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの配列特異的な結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される能力を、任意の適切なアッセイで評価し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの成分（例えば、試験するガイド配列）を、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの成分をコードするベクターによるトランスフェクションおよびその後の例えば標準的な配列解析アッセイによる優先的な開裂ならびに／または標的配列内の細胞修復機構により誘発された変異の評価により、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供し得る。標的ポリヌクレオチドの開裂をまた、標的ポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの成分（例えば試験するガイド配列）、およびこの試験ガイド配列とは異なるコントロールガイド配列を準備し、試験ガイド配列反応とコントロールガイド配列反応との間で標的配列での結合または開裂の割合を比較することにより、試験管中でも評価し得る。他のアッセイも可能であり且つ当業者に既知である。
【００３２】
[00101]ガイドポリヌクレオチド構造成分は、活性なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の形成に必要であると考えられる。このガイドポリヌクレオチド構造成分は必ずしもガイド配列に作動可能に連結されてはいないと考えられるが、ガイドポリヌクレオチド構造成分はガイドポリヌクレオチド内のガイド配列に作動可能に連結されてもよい。野生型ガイドポリヌクレオチド構造成分の全てまたは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０個もしくは約２０個超、約２６個もしくは約２６個超、約３２個もしくは約３２個超、約４５個もしくは約４５個超、約４８個もしくは約４８個超、約５４個もしくは約５４個超、約６３個もしくは約６３個超、約６７個もしくは約６７個超、約８５個もしくは約８５個超またはより多くのヌクレオチド）を含み得るまたはからなり得る、本発明に係るガイドポリヌクレオチド構造成分は、例えば本発明に係るｔｒａｃｒ−メイト配列の全てまたは一部への本発明に係るｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部のハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の一部を形成し、本発明に係るガイド配列に好ましくは作動可能に連結される。本発明に係るｔｒａｃｒ配列は、好ましくは宿主細胞中のような生理学的条件下でハイブリダイズするために、本発明に係るｔｒａｃｒ−メイト配列に対して十分な相補性を有し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の形成を容易にする。本発明に係る標的配列と同様に、機能するために十分な相補性が存在するという条件で、完全な相補性は必要とされないと考えられる。好ましくは、本発明に係るｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合に本発明に係るｔｒａｃｒ−メイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有する。上記で論じたように、配列をアラインさせるために任意の適切なアルゴリズムを使用して最適なアラインメントを決定し得る。
【００３３】
[00102]概して、本発明に係るｔａｒｃｒメイト配列として、標的配列でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の形成を容易にするために本発明に係るｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列が挙げられ、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、本発明に係るｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした、本発明に係るｔｒａｃｒメイト配列を含む。本発明に係るｔｒａｃ配列および本発明に係るｔｒａｃｒメイト配列の相補性の程度は、これらの２種の配列のうちの短い方の長さに沿ってｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列の最適なアラインメントに関して好ましくは定義される。上記で論じたように、配列をアラインさせるために任意の適切なアルゴリズムを使用して最適なアラインメントを決定し得る。
【００３４】
[00103]好ましくは、本発明に係るｔｒａｃｒメイト配列および本発明に係るｔｒａｃｒ配列に関して、ｔｒａｃｒ配列またはｔｒａｃｒメイト配列のいずれか内の自己相補性等の二次構造が考慮される。好ましくは、本発明に係るｔｒａｃｒ配列と本発明に係るｔｒａｃｒメイト配列との間の相補性の程度は、最適にアラインされた場合にこれらの２種の配列のうちの短い方の長さに沿って５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％よりも高い配列同一性である。好ましくは、本発明に係るｔｒａｃｒメイト配列は、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個またはより多くのヌクレオチド長である。好ましくは、本発明に係るトレーサー配列は、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個またはより多くのヌクレオチド長である。好ましくは、本発明に係るｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列、即ち、本発明に係るガイドポリヌクレオチド構造成分は、これらの２種の間のハイブリダイゼーションによりヘアピン等の二次構造を含むハイブリダイゼーション複合体が生じるように、単一の転写産物内に含まれる。そのようなハイブリダイゼーション複合体はまた、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列が単一の転写産物に含まれない場合にも形成され得る。ヘアピン構造を形成するための、本発明に係るｔｒａｃｒ配列中のおよび／または本発明に係るｔｒａｃｒメイト配列中のおよび／または本発明に係るガイドポリヌクレオチド構造成分中の好ましいループ形成配列は４個のヌクレオチド長であり、最も好ましくは配列ＧＡＡＡを有し、代替配列ではより長いまたはより短いループ配列が使用され得る。このループ配列は、ヌクレオチドトリプレット（例えばＡＡＡ）および追加のヌクレオチド（例えばＣまたはＧ）を好ましくは含む。ループ形成配列の例としてＣＡＡＡおよびＡＡＡＧが挙げられる。好ましくは、本発明に係るｔｒａｃｒ配列および／もしくは本発明に係るｔｒａｃｒメイト配列またはこれらのハイブリダイゼーション複合体ならびに／または本発明に係るガイドポリヌクレオチド構造成分は、少なくとも２つ以上のヘアピンを含む、または少なくとも２つ以上のヘアピンを形成し得る。より好ましくは、本発明に係るｔｒａｃｒ配列および／もしくは本発明に係るｔｒａｃｒメイト配列またはこれらのハイブリダイゼーション複合体ならびに／または本発明に係るガイドポリヌクレオチド構造成分は、２つ、３つ、４つもしくは５つのヘアピンを含む、または２つ、３つ、４つもしくは５つのヘアピンを形成し得る。好ましくは、本発明に係るｔｒａｃｒ配列および／もしくは本発明に係るｔｒａｃｒメイト配列またはこれらのハイブリダイゼーション複合体ならびに／または本発明に係るガイドポリヌクレオチド構造成分は、最大５つのヘアピンを含む、または最大５つのヘアピンを形成し得る。好ましくは、本発明に係るｔｒａｃｒ配列と本発明に係るｔｒａｃｒ−メイト配列との単一の転写産物また��本発明に係るｔｒａｃｒ配列と本発明に係るｔｒａｃｒメイト配列とのハイブリダイゼーション複合体および／または本発明に係るガイドポリヌクレオチド構造成分は、転写終結配列（好ましくはポリＴ配列であり、例えば６個のＴヌクレオチドである）をさらに含む。述べたように、ガイドポリヌクレオチド構造成分は当業者に既知であり、背景情報を例えばＧａｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３で見出し得る。
【００３５】
[00104]本発明に係る全ての実施形態の文脈において、用語「標的ポリヌクレオチド」は、本発明に係るガイド配列が相補性を有するように設計されている本発明に係る標的配列を指し、本発明に係る標的配列と本発明に係るガイド配列との間のハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし且つＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在するという条件で、完全な相補性は必ずしも必要ではない。好ましくは、本発明に係るガイド配列は、標的中の特有の標的配列を標的とする。好ましくは、本発明に係るガイド配列は、ＰＡＭ配列に直接隣接する標的ポリヌクレチド中の８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個（より好ましくは８個、９個、１０個、１１個または１２個）のヌクレオチドと１００％の配列同一性を有する。本発明に係る標的ポリヌクレオチドは任意のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチド）を含み得、且つ一本鎖または二本鎖であり得る。この標的ポリヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドである場合、本発明に係るガイド配列は、この標的ポリヌクレオチドのいずれかの鎖（例えばコード鎖または非コード鎖）とハイブリダイズし得る場合がある。
【００３６】
[00105]本発明に係る標的ポリヌクレオチドは細胞の核または細胞質に位置し得る。本発明に係る標的ポリヌクレオチドは、宿主細胞の小器官（例えばミトコンドリアまたは色素体）に位置し得る。本発明に係る標的ポリヌクレオチドは、ゲノムに含まれていてもよいし、染色体に含まれていてもよいし、染色体外であってもよいし、人工染色体に含まれていてもよいし、任意の染色体実体中にまたは染色体外実体（例えば、エピソームプラスミドもしくはベクター等の常染色体複製実体）中に存在してもよい。本発明に係る標的ポリヌクレオチドは、この宿主細胞にとって固有であってもよいし外来であってもよい。
【００３７】
[00106]本発明に係る標的ポリヌクレオチドはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と好ましくは会合しており、このＰＡＭはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体により認識される短いポリヌクレオチドである。好ましくは、この標的ポリヌクレオチドおよびＰＡＭは連結されており、このＰＡＭは好ましくはこの標的ポリヌクレオチドのすぐ下流（３’）に存在する。このＰＡＭの正確な配列および長さは様々であり得、例えば、機能が類似する異なるＣａｓタンパク質およびヌクレアーゼは異なるＰＡＭ配列を必要とする場合がある。本発明に係る好ましいＰＡＭは、２〜８個のヌクレオチド長のポリヌクレオチドである。好ましいＰＡＭは、５’−ＸＧＧ−３’、５’−ＸＧＧＸＧ−３’、５’−ＸＸＡＧＡＡＷ−３’、５’−ＸＸＸＸＧＡＴＴ−３’、５’−ＸＸＡＧＡＡ−３’、５’−ＸＡＡＡＡＣ−３’からなる群から選択され、Ｘは任意のヌクレオチドまたはその類似体であり得、好ましくは任意のヌクレオチドであり得、ＷはＡまたはＴである。より好ましいＰＡＭは５’−ＸＧＧ−３’である。このＰＡＭは好ましくはＣａｓタンパク質と適合する。最も広く使用されているＣＡＳ／ＣＲＩＳＰＲシステムはＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来し、適合するＰＡＭ配列５’−ＸＧＧ−３’は標的配列のすぐ下流（３’）に位置する。ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓタンパク質に好ましいＰＡＭは５’−ＸＸＸＸＧＡＴＴ−３’であり、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓタンパク質に好ましいＰＡＭは５’−ＸＸＡＧＡＡ−３’であり、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）に好ましいＰＡＭは５’−ＸＡＡＡＡＣ−３’である。好ましいＰＡＭは、使用されるＣａｓタンパク質に適合する。本発明に係るＣａｓタンパク質を、野生型Ｃａｓタンパク質に適合する天然ＰＡＭとは異なるＰＡＭに適合するように操作し得る。従って、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを、カスタマイズされた特異的ターゲティングに使用し得る。
【００３８】
[00107]用語「ハイブリダイゼーション」は、１種または複数種のポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。この水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対形成により、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合によりまたは任意の他の配列特異的様式で起こりえる。この複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセスにおける工程（例えば、酵素によるポリヌクレオチドの開裂）を構成し得る。好ましいハイブリダイゼーション条件は、本発明に係る宿主細胞内のような生理学的条件である。
【００３９】
[00108]本発明の全ての実施形態の文脈における用語「供給源」は、ガイドポリヌクレオチドおよびＣａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのあらゆる供給源を指す。このガイドポリヌクレオチドおよびＣａｓタンパク質は別々の供給源に存在し得る。そのような場合、本発明に係る組成物は、ガイドポリヌクレオチドの供給源およびＣａｓタンパク質の供給源を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む。あらゆる供給源とは、ガイドポリヌクレオチドおよびＣａｓタンパク質が例えばそれらがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム内で機能し得る形態で存在し得ることを意味する。このガイドポリヌクレオチドおよび／またはこのＣａｓタンパク質はこれらの活性形態で提供され得、且つ例えば不活性な形態または別の実体から提供され得る。このガイドポリヌクレオチドは例えば別のポリヌクレオチド上に存在してもよいし、実際のガイドポリヌクレオチドを生成するために転写されるポリヌクレオチドによりコードされてもよい。このＣａｓタンパク質は、実際のＣａｓタンパク質を生成するために転写されるおよび／または翻訳されるポリヌクレオチド（例えばＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）によりコードされ得る。コードポリヌクレオチドは、本明細書で定義された核酸構築物中におよび／または本明細書で定義されたベクター中に存在し得る。そのような核酸構築物およびベクターは本明細書において、本発明に係る核酸構築物および本発明に係るベクターと称される。
【００４０】
[00109]好ましくは、本発明に係る組成物において、機能が関連するＣａｓタンパク質もしくはヌクレアーゼはポリヌクレオチドによりコードされている、および／またはガイドポリヌクレオチドはポリヌクレオチドによりコードされている、もしくはこのポリヌクレオチド上に存在する。
【００４１】
[00110]好ましくは、本発明に係る組成物において、機能が関連するＣａｓタンパク質もしくはヌクレアーゼはあるポリヌクレオチドによりコードされており、および／またはガイドポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドによりコードされており、もしくはこの別のポリヌクレオチド上に存在しており、一方または両方のポリヌクレオチドはベクターに含まれる。
【００４２】
[00111]好ましくは、本発明に係る組成物において、ガイドポリヌクレオチドは、実際のガイドポリヌクレオチドを生成するために転写されるポリヌクレオチドによりコードされている。従って、一実施形態では、本発明に係る組成物において、好ましくは、ガイドポリヌクレオチドは前記ガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの形態で存在しており、このガイドポリヌクレオチドは、宿主細胞中での前記ポリヌクレオチドの転写時に得られる。
【００４３】
[00112]好ましくは、本発明に係る組成物において、Ｃａｓタンパク質はあるポリヌクレオチドによりコードされており、ガイドポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドによりコードされており、またはこの別のポリヌクレオチド上に存在しており、これらのポリヌクレオチドは１つのベクターに含まれる。
【００４４】
[00113]好ましくは、本発明に係る組成物において、Ｃａｓタンパク質は、あるベクターに含まれているポリヌクレオチドによりコードされており、ガイドポリヌクレオチドは、別のベクターに含まれている別のポリヌクレオチドによりコードされている、またはこの別のポリヌクレオチド上に存在している。好ましくは、Ｃａｓタンパク質をコードするベクターは低コピーベクターであり、および／またはこのＣａｓ転写産物の発現を駆動するプロモーターは低強度プロモーターであり、ガイドポリヌクレオチドをコードするベクターは高コピーベクターであり、および／またはｇＲＮＡ転写産物の発現を駆動するプロモーターは高強度プロモーターである。これによりＣａｓタンパク質とガイドポリヌクレオチドとの差次的発現が可能となり、Ｃａｓタンパク質は例えばガイドポリヌクレオチドと比べて低いレベルで発現され得る。任意の手段（例えばＲＮＡ配列決定）によりプロモーター強度を推定し得る。ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）は、様々な条件下でトランスクリプトームにわたって発現を測定するための高感度な且つ正確なツールである。このツールにより、ＲＰＫＭ値（１００万のマッピングされた読み取り値当たりの転写産物のキロベース当たりの読み取り値（Ｒｅａｄｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ））として報告される転写産物レベルでの遺伝子発現の定量的近似が可能になる。スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）由来の代表的な遺伝子のＲＰＫＭ値および相対的なプロモーター強度を表１に記載する。
【００４５】
【表１】
2019520069.tif 000003
【００４６】
[00114]低強度の（即ち弱い）スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）プロモーターの例として、カロテノイドシンターゼの発現を駆動するものが挙げられるがこれに限定されない。中強度（即ち中程度）のスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）プロモーターの例として、アルファ−チューブリンの発現を駆動するものが挙げられるがこれに限定されない。高強度の（即ち強い）スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）プロモーターの例として、伸長因子１（ＥＦ−１）の発現を駆動するものが挙げられるがこれに限定されない。ＲＰＫＭ値は相対的なプロモーター強度を示すと一般に考えられているが、天然のゲノム環境中でのプロモーターは発現ベクターの環境中で同一の強度を厳密には有しない場合があることは当業者に既知である。そのため、当業者は、表１に記載された相対的なプロモーター強度が本発明の文脈では変動し得ることを理解するだろう。
【００４７】
[00115]そのため、本発明は、ガイドポリヌクレオチドおよびＣａｓタンパク質がそれ自体で提供される可能性またはこれらがベクター上でコードされるもしくはベクター上に存在する可能性を提供する。後者の場合では、コードポリヌクレオチドがそれぞれ別々のベクター上に存在してもよいし、両方が単一のベクター上に存在してもよい。従って、一実施形態では、本発明は、本発明に係る組成物であって、本発明に係るＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、または本発明に係るガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドが単一のベクター上に存在し、このベクターは、コード産物の発現に必要な任意の要素（例えばプロモーター要素およびターミネーター要素）をさらに含み得る、組成物を提供する。そのような単一の（オールインワン）ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに必要な全ての構成要素が一緒に存在するという利点を有し、加えて、単一の形質転換事象は、任意選択でドナーポリヌクレオチドと組み合わせて宿主細胞中にこれらの構成要素を導入するのに十分である。
【００４８】
［ベクター］
[00116]本発明の全ての実施形態の文脈において、ベクターは任意のベクター（例えばプラスミドまたはウイルス）であり得、この任意のベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供され得且つ本発明に係るポリヌクレオチドの発現を媒介し得る。ベクターの選択は概して、このベクターの、このベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存するだろう。好ましいベクターは、本明細書の実施例で使用されるベクターである。ベクターは、線状ポリヌクレオチドであってもよいし線状または閉環状のプラスミドであってもよい。ベクターは組み込み型または自律複製型のベクターであり得、即ち、染色体実体または染色体外実体として存在するベクターであり得（これらのベクターの複製は染色体複製に依存している、または染色体複製から独立している）、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体であり得る。
【００４９】
[00117]好ましくは、ベクターは、宿主細胞に導入された場合にゲノムに組み込まれるようになり且つこのベクターが組み込まれている染色体と一緒に複製されるようになるものであり得る。組込みベクターは、宿主細胞の染色体中においてランダムにまたは所定の標的遺伝子座で組み込まれ得る。好ましい組込みベクターはＤＮＡ断片を含み、このＤＮＡ断片は、宿主細胞のゲノム中の所定の標的遺伝子座へのこのベクターの組込みをターゲティングするために、この所定の遺伝子座中のＤＮＡ配列と相同である。標的とされる組込みを促進するために、この細胞の形質転換前にベクターを好ましくは線状化する。線状化を、このベクターの少なくとも一方の末端（好ましくはいずれかの末端）に標的遺伝子座に相同な配列が隣接するように好ましくは実施する。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは好ましくは少なくとも３０ｂｐであり、好ましくは少なくとも５０ｂｐであり、好ましくは少なくとも０．１ｋｂであり、さらに好ましくは少なくとも０．２ｋｂであり、より好ましくは少なくとも０．５ｋｂであり、さらにより好ましくは１ｋｂであり、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。好ましくは、宿主細胞のゲノムへの標的組込み（即ち、所定の標的遺伝子座中での組込み）の効率は、宿主細胞の増大した相同組換え能力により増加する。
【００５０】
[00118]ベクター中の相同な隣接ＤＮＡ配列（標的遺伝子座に相同である）は、発現された遺伝子座に由来し得、このことは、この隣接ＤＮＡ配列が、宿主細胞中での発現が可能である遺伝子に由来することを意味する。隣接ＤＮＡ配列は、適切な選択剤を培養培地に補充した場合に形質転換細胞が増殖するように選択マーカー遺伝子と連結され得る。この隣接ＤＮＡ配列を当業者に既知の任意の手段により設計し得、１つの好ましい設計は、飽和脂肪酸シンターゼおよび／または多価不飽和脂肪酸シンターゼ（ＰＵＦＡシンターゼ）をコードする遺伝子への相同組換えを指示し、その結果、これらのシンターゼの変異または破壊により飽和脂肪酸および／または多価不飽和脂肪酸に対する栄養要求性が生じる。飽和脂肪酸および／または多価不飽和脂肪酸に対して栄養要求性である細胞は、増殖のためのサプリメントとして飽和脂肪および／または多価不飽和脂肪を必要とする。別の好ましい設計は、優勢選択マーカー遺伝子の形質転換体が適切な優性選択剤の存在下での増殖が可能であるように、前記選択マーカー遺伝子の発現を可能にする。
【００５１】
[00119]本発明に係るポリヌクレオチドの１コピー超を微生物宿主細胞に挿入して、前記ポリヌクレオチドによりコードされる産物の産生を媒介し得る。このことを、好ましくは宿主細胞のゲノム中にポリヌクレオチドの複数のコピーを組み込むことによりまたは操作可能な立体配置にて高度に発現された遺伝子座でのポリヌクレオチドの組込みを標的とすることにより行い得る。あるいは、複数のコピーの組込みを、本発明に係るポリヌクレオチドと共に増幅可能な選択マーカー遺伝子を含ませることにより達成させ得、その結果、この選択マーカー遺伝子の増幅したコピー（およびこれによる核酸配列の追加のコピー）を含む細胞を、適切な選択剤の存在下でこの細胞を培養することにより選択し得る。本発明に係るポリヌクレオチドのコピー数をさらに増加させるために、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットで説明されているような遺伝子変換の技術を使用し得る。
【００５２】
[00120]本発明に係るＣａｓタンパク質および／または本発明に係るガイドポリヌクレオチドをコードする本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノムに組み込まれる場合、例えば所望のゲノム編集を行う際にこのゲノムからこのポリヌクレオチドを切除することが望ましい場合がある。ポリヌクレオチドの切除を当業者に既知の任意の手段により実施し得、１つの好ましい手段は、栄養要求性を誘発した遺伝子変異または遺伝子破壊を修復するヌクレオチドによる二次形質転換であり、その結果、栄養要求性が取り除かれている細胞が、栄養要求体により必要とされる栄養素が取り除かれている培養培地中での増殖により代わりに選択され得る。切除のための別の手段は、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを使用することだろう。
【００５３】
[00121]本発明に係るベクターは、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞に導入される本発明に係るポリヌクレオチドを共に含む２種以上のベクターもしくはプラスミドを含むベクター系であり得る。
【００５４】
[00122]本発明に係るベクターは１種または複数種の選択マーカーを含み得、この選択マーカーは形質転換細胞の容易な選択を可能にする。一実施形態では、本発明に係る組成物において、１種または複数種または全種のベクターは選択マーカーを含み、好ましくは各ベクターは別個の選択マーカーを含む。選択マーカーは、遺伝子であって、この遺伝子の産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性および同類のものを付与する、遺伝子である。選択マーカーは、発現カセットとしてベクターにより細胞に導入されてもよいし別々のベクターにより導入されてもよい。
【００５５】
[00123]ラビリンチュラ綱細胞中での使用のための選択マーカーは、下記を含むがこれらに限定されない群から選択され得る：ｎｐｔＩＩ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ、パロモマイシン耐性を付与する）、ＡＬＳ（アセトラクテートシンターゼ、スルホメツロンメチル耐性を付与する）、ｂｓｄ（ブラストサイジン−Ｓ−デアミナーゼ、ブラストサイジン耐性を付与する）およびＳｈ  ｂｌｅ（フレオマイシン結合、ゼオシン耐性を付与する）。
【００５６】
[00124]あるいは、既に論じた株のように飽和脂肪酸シンターゼ遺伝子または多価不飽和脂肪酸シンターゼ遺伝子の不活性化変異を有する、対応する変異体宿主細胞を必要とする栄養要求性マーカー等の特異的選択マーカーを使用し得る。好ましい実施形態では、選択マーカー遺伝子を含まないポリペプチドを産生し得る形質転換宿主細胞を得るために、発現構築物の導入後に形質転換宿主細胞から選択マーカーを欠失させる。
【００５７】
[00125]本発明に係るベクターを構築すべく上記で説明した要素を連結するために使用される手順は当業者に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９５を参照されたい）。
【００５８】
[00126]本発明の全ての実施形態の文脈におけるＣａｓタンパク質は、本発明の目的に適したあらゆるＣａｓタンパク質を指す。Ｃａｓタンパク質は酵素活性を含んでもよいし酵素活性を含まなくてもよい。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例として下記が挙げられる：Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても既知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらの相同体またはこれらの改変バージョン。これらのＣａｓタンパク質は当業者に既知であり、例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列をアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中に見出し得る。好ましくは、本発明に係る非改変Ｃａｓタンパク質（例えばＣａｓ９等）はＤＮＡ開裂活性を有する。好ましくは、係るＣａｓタンパク質はＣａｓ９であり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来のＣａｓ９であり得る。好ましくは、本発明に係るＣａｓタンパク質は、標的ポリヌクレオチドの位置での（例えば標的ポリヌクレオチド内でのおよび／または標的ポリヌクレオチドの逆相補体内での）一方または両方のポリヌクレオチド鎖の開裂を指示する。本明細書では、標的ポリヌクレオチドの位置は、標的ポリヌクレオチドの最初のまたは最後のヌクレオチドから約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、１００個、２００個、５００個またはより多くのヌクレオチドの範囲内と定義され、より好ましくは、標的ポリヌクレオチドの最初のまたは最後のヌクレオチドから１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、１００個、２００個、５００個またはより多くのヌクレオチドの範囲内と定義され、さらにより好ましくは、標的ポリヌクレオチドの最初のまたは最後のヌクレオチドから１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個のヌクレオチドの範囲内と定義される。従って、本発明に係るＣａｓタンパク質は好ましくは、標的ポリヌクレオチドの最初のまたは最後のヌクレオチドから約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、１００個、２００個、５００個またはより多くのヌクレオチドの範囲内で一方または両方のポリヌクレオチド鎖の開裂を指示し、より好ましくは、標的ポリヌクレオチドの最初のまたは最後のヌクレオチドから１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、１００個、２００個、５００個またはより多くのヌクレオチドの範��内で一方または両方のポリヌクレオチド鎖の開裂を指示し、さらにより好ましくは、標的ポリヌクレオチドの最初のまたは最後のヌクレオチドから１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個のヌクレオチドの範囲内で一方または両方のポリヌクレオチド鎖の開裂を指示する。典型的には、本発明に係る標的ポリヌクレオチドはＰＡＭ配列（本明細書の他の箇所で定義されている）と会合しており、このＰＡＭ配列は好ましくは、この標的配列のすぐ下流（３’）に存在し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の形成により概して、このＰＡＭ配列の３塩基対上流（５’）で一方または両方のポリヌクレオチド鎖が開裂される。
【００５９】
[00127]好ましくは、本発明に係る組成物中のＣａｓタンパク質は、標的ポリヌクレオチドの位置で両方のポリヌクレオチド鎖の開裂を指示する活性を有する。Ｃａｓヌクレアーゼ活性は概して、２つの別々の触媒ドメイン（即ちＲｕｖＣおよびＨＮＨ）により実施される。各ドメインは一方のポリヌクレオチド鎖を切断し、各ドメインは単一点変異により不活性化され得る。
【００６０】
[00128]そのため、本発明に係るＣａｓタンパク質を、変異Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を変更され、標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を開裂する能力を欠くように、対応する野生型Ｃａｓタンパク質に対して都合よく変異させ得る。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメインでのアスパラギン酸塩からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を開裂するヌクレアーゼからニッカーゼへと変換し、このニッカーゼは本明細書において、標的ポリヌクレオチドの一本鎖を開裂するＣａｓタンパク質と定義される。Ｃａｓ９をニッカーゼにする変異の他の例として、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４ＡおよびＮ８６３Ａが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の文脈において、ニッカーゼ活性を有するＣａｓタンパク質は相同組換えによるゲノム編集に使用され得、好ましくはＲａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３に従う二重ニッキング技術に使用され得る。従って、本発明に係る好ましいＣａｓタンパク質は少なくとも１つの変異を含み、その結果、このタンパク質は、対応する野生型Ｃａｓタンパク質と比べてヌクレアーゼ活性が変更されており、好ましくは、標的配列の位置で単一のポリヌクレオチド鎖の開裂を指示する活性を有する。そのようないわゆるニッカーゼ変異体は、二本鎖の構成において好都合に使用され得、即ち、変異したＲｕｖＣを有するＣａｓタンパク質ニッカーゼ変異体と、ＮＨＮが変異しているＣａｓタンパク質ニッカーゼ変異体とを含む本発明に係る組成物において好都合に使用され得、その結果、一方のＣａｓタンパク質変異体はポリヌクレオチド標的の一方の鎖に切れ目を入れ、他方のＣａｓタンパク質変異体はポリヌクレオチド標的の他方の鎖に切れ目を入れる。使用される２種のガイドポリヌクレオチドに応じて、２種の異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が、ポリヌクレオチド標的中の２つの一本鎖に効率的に切れ目を入れ、これらの切れ目は、最大５個、１０個、２０個、３０個またはより多く離れたいくつかのヌクレオチドであり得る。そのような二重ニッキング法（ｄｏｕｂｌｅ  ｎｉｃｋｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）により、非相同末端結合（ＮＥＪＨ）の特異性が大きく増強される。二重ニッキングに関する背景情報を例えばＲａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３で見出し得る。
【００６１】
[00129]本発明に係るＣａｓタンパク質は、全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠く変異Ｃａｓ９を生じさせるために、Ｃａｓ９の２種以上の変異触媒ドメイン（例えばＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩおよび／またはＲｕｖＣ  ＩＩＩ）を含み得る。一部の実施形態では、Ｄ１０Ａ変異は、全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くＣａｓ９酵素を産生するために、Ｈ８４０Ａ変異、Ｈ８５４Ａ変異またはＮ８６３Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わされる。好ましくは、Ｃａｓタンパク質は、変異酵素のＤＮＡ開裂活性がこの酵素の非変異形態に対して約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％未満またはより低い場合には、全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くと考えられる。全ての酵素活性を実質的に欠くＣａｓタンパク質は遺伝子サイレンシングまたは発現の下方制御に好都合に使用され得、なぜならば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が標的ポリヌクレオチドからの転写を妨げるからである。他の変異も有用な場合があり、Ｃａｓ９または他のＣａｓタンパク質がＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）以外の種に由来する場合、対応するアミノ酸中での変異により同様の効果が達成され得、これらの対応するアミノ酸を同定する方法は当業者に既知である。
【００６２】
[00130]本発明に係るＣａｓタンパク質は融合タンパク質であり得、且つ少なくとも１種の異種機能ドメインを含み得、そのようなドメインは好ましくは、例えばＡｇｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｇｇａｒｗａｌ，Ａ．Ｋ．；Ｗａｈ，Ｄ．Ａ．；Ｈｉｒｓｃｈ，Ｊ．Ａ．；Ｄｏｒｎｅｒ，Ｌ．Ｆ．；Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ，Ｉ．（１９９７）．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｍｏｄｕｌａｒ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＦｏｋＩ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ＤＮＡ”．Ｎａｔｕｒｅ  ３８８（６６３７）：９７−１００）により説明されているＦｏｋＩ活性を含むドメインである。酵素ＦｏｋＩはフラボバクテリウム・オケアノコイテス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ）中で天然に見出され、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメインとＣ末端での非特異的ＤＮＡ開裂ドメインとからなる細菌ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼである（Ｄｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＦｏｋＩタンパク質が、５’−ＧＧＡＴＧ−３’：３’−ＣＡＴＣＣ−５’認識部位でこのＦｏｋＩタンパク質のＤＮＡ結合ドメインを介して二本鎖ＤＮＡに結合した場合、ＤＮＡ開裂ドメインが活性化されて、さらなる配列特異性なしに、この認識部位に最も近いヌクレオチドから９個のヌクレオチド上流で第１の鎖を開裂し、且つ１３個のヌクレオチド下流で第２の鎖を開裂する（Ｗａｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。Ｃａｓ９−ＦｏｋＩ融合は、特にＧｕｉｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；およびＴｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４で説明されている。
【００６３】
[00131]本発明に係るＣａｓ融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質に加えて１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはより多くのドメインを含み得る。Ｃａｓタンパク質に融合され得るタンパク質ドメインの例として下記が挙げられるがこれらに限定されない：エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに下記の活性のうちの１つまたは複数を有するタンパク質ドメイン：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、歴史的改変活性（ｈｉｓｔｏｒｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、ＲＮＡ開裂活性、および核酸結合活性。エピトープタグの非限定的な例として、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例として下記が挙げられるがこれらに限定されない：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および自己蛍光タンパク質（例えば青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ））。Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡ分子に結合するまたは他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片（例えば、限定されないがマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン融合、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ  １６タンパク質融合）をコードする遺伝子配列に融合され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書で説明されている。タグ付きＣａｓタンパク質を使用して標的ポリヌクレオチドの位置を同定し得る。本発明に係る好ましいＣａｓ融合タンパク質は、本明細書において上記で定義されたＦｏｋＩドメインを含む。
【００６４】
[00132]本発明に係る好ましいＣａｓタンパク質は核局在化配列を含み、好ましくは異種核局在化配列を含む。そのような核局在化配列は核局在化シグナルとも称される。好ましくは、そのような核局在化シグナルは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体に、宿主細胞の核中において検出可能な量での前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の蓄積を駆動するのに十分な強度を付与する。理論に拘束されることを望まないが、核局在化配列は宿主細胞中でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ活性に必要ではないが、特に核酸分子の標的を核中に定めることに関しては、そのような配列を含むことにより、このシステムの活性が増強されると考えられる。そのような核局在化配列はＣａｓタンパク質中に好ましくは存在するが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの核への標的化が促進されるように他の箇所にも存在し得る。好ましい核局在化配列はＳＶ４０核局在化配列である。
【００６５】
[00133]本発明に係る組成物および任意の他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドは好ましくは、このポリヌクレオチドが発現される宿主細胞にコドン最適化されており、より好ましくは、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドはコドン対最適化されている。概して、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１個のコドン（例えば１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個超またはより多くのコドン）を、天然アミノ酸配列を維持しつつ、目的の宿主細胞の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンに置き換えることによる、この宿主細胞中での発現の増強のために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の差違）はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、この翻訳効率は、数ある中でも、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞中での選択されたｔＲＮＡの優位性は概して、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、コドン最適化に基づいて、所与の生物中での最適な遺伝子発現に遺伝子を適合させ得る。コドン使用表は例えば「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表を多くの方法で適応させ得る。例えばＮａｋａｍｕｒａ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００を参照されたい。特定の宿主細胞中での発現に特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、例えばＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も利用可能である。好ましくは、Ｃａｓタンパク質をコードする配列中の１個または複数個のコドン（例えば１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個もしくはより多くのまたは全てのコドン）は、特定のアミノ酸に関して最も頻繁に使用されるコドンに対応する。コドン最適化の好ましい方法は国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットおよび国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットで説明されている。国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットはコドン対最適化を取り扱う。コドン対最適化は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がこのヌクレオチド配列のコドン使用（特に使用されるコドン対）に関して改変して、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現および／またはコードされるポリペプチドの産生を改善している方法である。コドン対を、コード配列中の２つの連続したトリプレット（コドン）のセットと定義する。本発明に係る組成物中の供給源中のＣａｓタンパク質の量は変動し得、且つ最適な性能のために最適化され得る。宿主細胞中の非常に高レベルのＣａｓタンパク質を避けることが好都合であり得、なぜならば、高レベルのＣａｓタンパク質は、たとえガイドポリヌクレオチドが存在していなくても宿主細胞に対して毒性であり得るからである（例えばＲｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４およびＪａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４を参照されたい）。例えば、Ｃａｓタン���ク質の発現用に、より弱いプロモーター、抑制性プロモーターまたは誘導性プロモーターを選択することにより発現レベルを調節する方法は当業者に既知である。タンパク質の発現に適したプロモーターの例が本明細書の他の箇所に示されている。
【００６６】
[00134]本発明に係るガイドポリヌクレオチドがポリヌクレオチドによりコードされている本発明に係る組成物では、このガイドポリヌクレオチドの発現は、コードポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターにより促進され得る。そのようなプロモーターは、当業者に既知の任意の適切なプロモーターであり得る。いくつかのタイプのプロモーターを使用し得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを使用することも好都合であり得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびこのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターに関する背景情報を例えばＭａｒｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６で見出し得る。従って、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを使用することが好都合であり得、これらは当業者に既知であり、例えばＫｏｒｎｂｅｒｇ，１９９９で概説されている。しかしながら、ＲＮＡ  ＩＩポリメラーゼ由来の転写産物は複雑な転写ターミネーターを有することが多く、転写産物はポリアデニル化されており、このことは、ガイドポリヌクレオチドの要求を妨げ得、なぜならば、５’末端および３’末端の両方が機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを生じるのに必要な二次構造を達成するために正確に定義される必要があるからである。しかしながら、これらの欠点を回避し得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが使用される場合、ガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドはまた、自己プロセシングリボザイムもコードし得、且つＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターに作動可能に連結され得、従って、このポリヌクレオチドは、ガイドポリヌクレオチドと自己プロセシングリボザイムとを含むプレガイドポリヌクレオチドをコードし、転写された場合には、このプレガイドポリヌクレオチド転写産物から自己プロセシングリボザイムによりガイドポリヌクレオチドが放出される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターに作動可能に連結された本発明に係るプレガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む好ましい構築物は、本明細書の実施例１〜４で示されているものである。そのような構築物に関する背景情報を例えばＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４で見出し得る。
【００６７】
[00135]好ましくは、本発明に係る組成物では、ガイドポリヌクレオチドはポリヌクレオチドによりコードされている。好ましくは、本発明に係る組成物では、ガイドポリヌクレオチドはポリヌクレオチドによりコードされ、前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターに作動可能に連結されており、且つガイドポリヌクレオチドおよび自己プロセシングリボザイムを含むプレガイドポリヌクレオチドをコードし、転写された場合には、このプレガイドポリヌクレオチド転写産物から自己プロセシングリボザイムによりガイドポリヌクレオチドが放出される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターに作動可能に連結された本発明に係るプレガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む好ましい構築物は、本明細書の実施例１〜４に示されているものである。好都合なことに、複数のプレガイドポリヌクレオチドおよび複数の自己プロセシングリボザイムは、１つまたは複数のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターに作動可能に連結された単一のポリヌクレオチドによりコードされ得る。
【００６８】
[00136]本発明の第１の態様に係る組成物を好都合に使用して、宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現を調節し得る。従って、第２の態様では、本発明は、宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、宿主細胞と本発明の第１の態様に係る組成物とを接触させることを含み、ガイドポリヌクレオチドが宿主細胞中において標的ポリヌクレオチドでのＣａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される、方法を提供する。
【００６９】
[00137]本発明の文脈における用語「発現」は本明細書において、ポリヌクレオチドテンプレートからポリヌクレオチドが転写される（例えば、ＤＮＡテンプレートポリヌクレオチドがｍＲＮＡポリヌクレオチド転写産物もしくは他のＲＮＡ転写産物に転写される）プロセスおよび／または続いてｍＲＮＡ転写産物がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスと定義される。転写産物およびコードされたポリペプチドはまとめて「遺伝子産物」と称され得る。ポリヌクレオチド転写産物がゲノムテンプレートＤＮＡに由来する場合、発現は、宿主細胞中でのｍＲＮＡ転写産物のスプライシングを含み得る。用語「発現を調節する」は本明細書において、同一の条件を使用してアッセイした場合に、発現が調節されていない親宿主細胞と比較して発現の増加または減少を指す。発現の減少は、ｍＲＮＡ等の転写産物の量の減少および／またはポリペプリド等の翻訳産物の量の減少であり得る。その結果、発現の増加は、ｍＲＮＡ等の転写産物の量の増加および／またはポリペプチド等の翻訳産物の量の増加であり得る。
【００７０】
[00138]好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、標的ポリヌクレオチドの位置で一方または両方のポリヌクレオチド鎖を開裂し、その結果、遺伝子産物の発現が調節される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体はまた、ヌクレアーゼ活性も変更されていてもよく、標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を開裂する能力を実質的に欠いており、そのような場合、発現は、この複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合により調節される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は標的ポリヌクレオチドからの転写を妨げることから、実質的に全ての酵素活性を欠くＣａｓタンパク質は、遺伝子サイレンシングまたは発現の下方制御に好都合に使用され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質を、プログラム可能な転写活性化または目的の遺伝子のサイレンシングための転写因子へと改変し得る（Ｌａｒｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００７１】
[00139]本発明の第１の態様に係る組成物は、ポリヌクレオチドの欠失に好都合に使用され得る。一実施形態では、本発明の第１の態様に係る組成物が少なくとも１種もしくは２種のガイドポリヌクレオチドの供給源および／または少なくとも少なくとも１種のＣａｓタンパク質の供給源を含む場合、少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体または２種の異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体であって、標的ポリヌクレオチドのある位置でまたは異なる位置で一方または両方のポリヌクレオチド鎖を開裂し、その結果、標的ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド断片が欠失する、少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体または２種の異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される。好ましくは、少なくとも１種もしくは２種のガイドポリヌクレオチドおよび／または少なくとも少なくとも１種のＣａｓタンパク質の供給源を含む本発明に係るそのような組成物は、ガイドポリヌクレオチドにより標的とされる少なくとも１種または２種の標的ポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的であると本明細書において下記で定義される外来性ポリヌクレオチドをさらに含む。欠失するそのようなポリヌクレオチド断片または欠失断片は、いくつかのヌクレオチドの長さから最大で数千個のヌクレオチドの長さであり得、遺伝子全体が欠失し得る、または遺伝子のクラスタが欠失し得る。従って、本発明は、宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、ポリヌクレオチド断片が標的ポリヌクレオチドから欠失する方法を提供する。
【００７２】
[00140]一実施形態では、発現を調節する方法は、標的ポリヌクレオチドの少なくとも１箇所での一方または両方のポリヌクレオチド鎖の開裂およびその後の外来性ポリヌクレオチドとの相同組換えによる標的ポリヌクレオチドの改変を含む。そのような場合では、本発明の第１の態様に係る組成物は、そのような外来性ポリヌクレオチドを好ましくはさらに含む。そのような改変は、標的ポリヌクレオチド中での少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失または置換をもたらし得、挿入ヌクレオチドまたは置換ヌクレオチドは外来性ポリヌクレオチドに由来し得る。外来性ポリヌクレオチドが、例えばＤｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．およびＢｅｅｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．で説明されている非組込み実体である場合にも改変を行い得、この場合には、標的ポリヌクレオチドは改変されるが、外来性ポリヌクレオチドのヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドに導入されない。結果として、本発明に係るＣａｓタンパク質がタンパク質として宿主細胞に導入される場合、得られる宿主は非組み換え宿主細胞である。外来性ポリヌクレオチドは目的の任意のポリヌクレオチド（例えば、本明細書の下記で定義される目的の化合物をコードするポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドの一部またはそのバリアント）であり得る。そのような外来性ポリヌクレオチドは本明細書では本発明に係る外来性ポリヌクオレチドと称され、一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよい。
【００７３】
[00141]当業者は、本発明に係る組成物および方法について様々な用途を考慮し得る。本発明に係る組成物および方法を使用して、ゲノム中のポリヌクレオチド（または遺伝子）を改変し得る、編集し得る、または破壊し得る。例えば、標的ポリヌクレオチドの両方の鎖で切断する完全に活性なＣａｓタンパク質が使用される場合、および外来性ポリヌクレオチドが適切な修復テンプレートとして存在しない場合、二本鎖切断は非相同末端結合修復（ＮＨＥＪ）により修復される。１つまたはいくつかのヌクレオチドのＮＨＥＪ挿入および／または欠失（場合によって置換と解釈され得る）が起き得る間に、これらは修復部位で無作為に挿入され、または欠失し、これはＮＨＥＪの特徴である。そのような挿入および／または欠失はコード配列のリーディングフレームに影響を及ぼし得、（未熟な）終止コドンの生成またはスプライス部位の変更の場合には遺伝子産物中のまたはさらにトランケート型タンパク質中のアミノ酸変化がもたらされる。
【００７４】
[00142]外来性ポリヌクレオチドが修復テンプレートとして存在する場合には、相同末端結合修復（ＨＥＪ）（相同指向修復（ＨＤＲ）としても既知である）を使用する本発明に係る組成物および方法を使用してゲノム中のポリヌクレオチド（または遺伝子）を改変し得る、編集し得る、または破壊し得る。例えば、標的ポリヌクレオチド（即ち、二本鎖切断の上流（５’）および下流（３’））に対して配列同一性を有する外来性ポリヌクレオチドが本発明に係るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムと一緒に存在する場合、ＨＤＲは、標的ポリヌクレオチド中での二本鎖切断で外来性ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドを導入する（または実際に複製する）。好ましくは、本発明に係る外来性ポリヌクオレチドは、外来性ポリヌクレオチド自体または改変されたポリヌクレオチドがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにより切断されるリスクを回避するために、標的配列自体およびその後の機能性ＰＡＭ配列を含まない。
【００７５】
[00143]本発明の実施形態では、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが外来性ポリヌクレオチド（ドナーポリヌクレオチド、ドナーＤＮＡ、修復テンプレート）を含む場合、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは好ましくは、１つまたは複数の別々のポリヌクレオチドまたはベクターにコードされるかこれらのポリヌクレオチドまたはベクターに存在する２種以上のガイドポリヌクレオチドを含み、２種以上の外来性ポリヌクレオチドは、２種以上のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の形成を可能にする前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムと一緒に用意される。本発明に係る方法では、本発明に係るそのようなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを好都合に使用して、２種以上の標的ポリヌクレオチドで発現を調節し得る（即ち、複数の標的部位を標的とする方法）。本発明に係るそのようなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは偶然にも、１種または複数種の標的ポリヌクレオチドで１種、２種またはより多くのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成する。そのような方法を使用して、宿主細胞のゲノム中で、任意選択で１種または複数種の外来性ポリヌクレオチドと組み合わせて１つまたは複数の挿入、欠失、置換を生じ得る、または形成されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体により遺伝子の発現を調節し得る。
【００７６】
［宿主細胞］
[00144]本発明のこの態様に係る方法では、好ましい宿主細胞は、本明細書の他の箇所で定義される目的の化合物をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７７】
[00145]本発明のこの態様に係る方法では、宿主細胞は、組換え宿主細胞であってもよいし非組み換え宿主細胞であってもよい。
【００７８】
[00146]一部の実施形態では、宿主細胞はラビリンチュラ綱であり、好ましくはトラウストチトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目のメンバーであり、好ましくはトラウストチトリアシエ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）科のメンバーであり、より好ましくは、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）からなる群から選択される属のメンバーであり、さらにより好ましくはスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＡＴＣＣ＃  ２０８８８である。
【００７９】
[00147]本発明のこの態様に係る宿主細胞中でポリヌクレオチドの発現を調節する方法により、本発明の第１の態様に係る組成物の構成要素を好ましくは含む改変宿主細胞がもたらされる。従って、第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に係る組成物を含む宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は本明細書で定義される任意の宿主細胞であり得、本明細書の他の箇所で定義される目的の化合物をコードするポリヌクレオチドをさらに含み得る。
【００８０】
[00148]第４の態様では、本発明は、宿主細胞を作製する方法であって、宿主細胞と本発明の第１の態様に係る組成物とを接触させることを含み、ガイドポリヌクレオチドがこの宿主細胞中において標的ポリヌクレオチドでＣａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される、方法が提供される。一実施形態では、本発明の第１の態様に係る組成物との接触を２段階で実施し得、この２段階では、宿主細胞を最初に本発明に係るＣａｓタンパク質の供給源と接触させ、続いて宿主細胞を、本発明に係るガイドポリヌクレオチドの供給源および任意選択の本発明に係る外来性ポリヌクレオチドと接触させる。本発明のこの実施形態での宿主細胞は本明細書で定義される任意の種類の宿主細胞であり得、本明細書の他の箇所で定義される目的の化合物をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明に係る宿主細胞を作製する好ましい方法は、子孫宿主細胞を作製する工程を含み、前記子孫宿主細胞中には、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの構成要素がもはや存在しない。
【００８１】
[00149]本発明の第１の態様に係る組成物は、本明細書で定義される任意のそのような組成物であり得る。宿主細胞と本発明に係る組成物とを接触させることを、当業者に既知の任意の手段により実施し得る。本発明に係る宿主細胞を、本発明に係る組成物を含む溶液に単純に入れ得る。本発明に係る組成物を宿主細胞に送達する具体的な手段を使用し得る。当業者はそのような方法（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ；Ａｕｓｕｂｅｌ，上記参照）に気付いており、この方法として、エレクトロポレーション法、粒子衝撃または微粒子衝撃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、プロトプラスト法およびアグロバクテリウム媒介形質転換（ＡＭＴ）が挙げられるがこれらに限定されない。ラビリンチュラ綱を当技術分野で既知の任意の方法を使用して形質転換させ得る。トラウストキトリドの遺伝子形質転換用の一般的な技術は米国特許第７，００１，７７２号明細書および同第８，６３７，６５１号明細書ならびにＣｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）で詳細に説明されており、これらの全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
[00150]好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は標的ポリヌクレオチドの位置で一方または両方のポリヌクレオチド鎖を開裂し、その結果、遺伝子産物の発現が調節される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体はまた、変化したヌクレアーゼ活性も有し得、且つ標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を開裂する能力も欠き得、そのような場合、この複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合により発現が調節される。
【００８３】
[00151]一実施形態では、本発明の第１の態様に係る組成物が少なくとも１種もしくは２種のガイドポリヌクレオチドの供給源および／または少なくとも１種のＣａｓタンパク質の供給源を含む場合、少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体または２種の異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体であって、標的ポリヌクレオチドのある位置でまたは異なる位置で一方または両方のポリヌクレオチド鎖を開裂し、その結果、標的ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド断片が欠失する、少なくとも１種のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体または２種の異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される。好ましくは、少なくとも１種もしくは２種のガイドポリヌクレオチドおよび／または少なくとも少なくとも１種のＣａｓタンパク質の供給源を含む本発明に係るそのような組成物は、ガイドポリヌクレオチドにより標的とされる少なくとも１種または２種の標的ポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的であると本明細書において下記で定義される外来性ポリヌクレオチドをさらに含む。欠失するそのようなポリヌクレオチド断片または欠失断片は、いくつかのヌクレオチドの長さから最大で数千個のヌクレオチドの長さであり得、遺伝子全体が欠失し得る、または遺伝子のクラスタが欠失し得る。従って、本発明は、宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、ポリヌクレオチド断片が標的ポリヌクレオチドから欠失する方法を提供する。
【００８４】
[00152]一実施形態では、ポリヌクレオチド断片が標的ポリヌクレオチドから欠失している宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現を調節する方法は、宿主細胞と本明細書で説明されている組成物とを接触させることを含み、ガイドポリヌクレオチドが宿主細胞中において標的ポリヌクレオチドでＣａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される。好ましくは、ポリヌクレオチド断片が標的ポリヌクレオチドから欠失している宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現を調節する方法は、宿主細胞と本明細書で説明されている組成物とを接触させることを含み、ガイドポリヌクレオチドが宿主細胞中において標的ポリヌクレオチドでＣａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される。別の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチド断片が標的ポリヌクレオチドから欠失している宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現を調節する方法は、宿主細胞と本明細書で説明されている組成物とを接触させることを含み、ガイドポリヌクレオチドが宿主細胞中において標的ポリヌクレオチドでＣａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成され、本明細書で説明されている組成物は外来性ポリヌクレオチドまたはドナーポリヌクレオチドを含まない。宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現を調節する方法の別の実施形態では、この組成物は自律複製ベクターに含まれる。
【００８５】
[00153]従って、本発明は一実施形態において、ポリヌクレオチド断片が標的ポリヌクレオチドから欠失している宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、宿主細胞と、好ましくは本明細書で定義されているドナーポリヌクレオチドを含まない、本明細書で説明されている組成物とを接触させることを含み、ガイドポリヌクレオチドが宿主細胞中において標的ポリヌクレオチドでＣａｓタンパク質の結合を指示してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成される、方法に関する。
【００８６】
[00154]好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の位置で両方のポリヌクレオチド鎖の開裂を指示する活性を有し、この開裂は、Ｃａｓタンパク質による開裂時に互いに再結合する２つの相同領域の間に含まれるゲノムの領域で起こり、その結果、前記領域の間に含まれるポリヌクレオチドが欠失する。好ましくは、この２つの相同領域の間の相同性の程度は相同組換えを可能にするようなものである。好ましくは、これらの２つの相同領域は、これらの相同領域の全長にわたり少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または１００％の配列同一性を有する。相同領域の長さはラビリンチュラ綱であっても非常に短くなり得、通常は相同組換えを可能にするには少なくとも１ｋｂｐまたは数ｋｂｐの長さが必要であることを驚くべきことに発見している。従って、好ましい実施形態では、相同領域の長さは好ましくは最大１ｋｂであり、最大０．５ｋｂであり、最大１００ｂｐであり、最大５０ｂｐであり、最大４０ｂｐであり、最大３０ｂｐであり、最大２０ｂｐであり、最大１０ｂｐである。
【００８７】
[00155]好ましくは、これらの２つの相同領域の距離は最大１０ｋｂであり、最大９であり、最大８ｋｂであり、最大７ｋｂであり、最大６ｋｂであり、最大５ｋｂであり、最大４ｋｂであり、最大３ｋｂであり、最大２ｋｂであり、最大１ｋｂであり、最大０．５ｋｂであり、最大１００ｂｐであり、最大５０ｂｐであり、最大４０ｂｐであり、最大３０ｂｐであり、最大２０ｂｐであり、最大１０ｂｐである。
【００８８】
[00156]一態様では、本発明は、１箇所または複数箇所のＰＡＭ部位を標的として定め、ドナーＤＮＡを使用することなくポリヌクレオチドの欠失を作るための方法を設計するための、ＰＡＭ部位の近傍で約７〜２０ｂｐの相同領域の間に含まれるゲノム中のＰＡＭ部位を同定し得るソフトウェアアルゴリズムに関する。
【００８９】
[00157]上記の方法を、設計された方法でのポリヌクレオチド配列の効率的な除去に使用し得る。例えば、Ｃａｓ９発現カセットをゲノムに導入し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに媒介された数ラウンドの改変の後に、このＣａｓ９発現カセット中でのｇＲＮＡターゲティング部位の導入により、このゲノムからこのＣＡＳ９発現カセットを除去し得、このＣａｓ９発現カセットは、上記で定義された２つの相同領域の間に含まれ（好ましくは１００ｂｐ長、より好ましくは２０ｂｐ、１５ｂｐ長またはより短い）且つＣａｓ９オープンリーディングフレームまたはこの発現カセットの大部分を開裂する。
【００９０】
[00158]上記の方法を、遺伝子の一過性不活性化にも使用し得る。例えば、遺伝子（例えばカロテノイドシンターゼまたは飽和脂肪酸シンターゼまたは多価不飽和脂肪酸シンターゼ）を、このカロテノイドシンターゼ遺伝子または飽和脂肪酸シンターゼ遺伝子または多価不飽和脂肪酸シンターゼ遺伝子のＯＲＦ中に、５’末端および３’末端それぞれに２つの相同領域を含む（好ましくは、これらの相同領域は１００ｂｐであり、より好ましくは２０ｂｐであり、１５ｂｐ長であり、またはより短い）ポリヌクレオチド配列を挿入することにより、非機能的にする可能性がある。上述したシンターゼ遺伝子を、上記で説明したようにドナーＤＮＡを使用することなくＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを使用して再び機能的にし得る。
【００９１】
[00159]一実施形態では、本発現を調節する方法は、標的ポリヌクレオチドの少なくとも１箇所での一方のまたは両方のポリヌクレオチド鎖の開裂、続いて外来性ポリヌクレオチドとの相同組換えによる標的ポリヌクレオチドの改変を含む。そのような場合、本発明の第１の態様に係る組成物は、そのような外来性ポリヌクレオチドを好ましくはさらに含む。そのような改変は、標的ポリヌクレオチド中の少なくとも１個のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を生じ得、挿入ヌクレオチドまたは置換ヌクレオチドは、この外来性ポリヌクレオチドに由来してもよいし由来しなくてよい。一実施形態では、この外来性ポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドと相同な領域を含む。好ましくは、これらの相同な領域の間の相同性の程度は相同組換えを可能にするようなものである。好ましくは、これらの相同な領域は、これらの相同な領域の全長にわたり少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または１００％の配列同一性を有する。この外来性ポリヌクレオチドが非組込み実体である場合にも改変を行い得、この場合には、標的ポリヌクレオチドは改変されるが、外来性ポリヌクレオチドのヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドに導入されない。結果として、本発明に係るＣａｓタンパク質がタンパク質として宿主細胞に導入される場合、得られる宿主は非組み換え宿主細胞である。そのため、本発明のこの態様に係る方法では、この宿主細胞は組換え宿主細であってもよいし非組み換え宿主細胞であってもよい。この外来性ポリヌクレオチドは目的の任意のポリヌクレオチド（例えば、本明細書で定義される目的の化合物をコードするポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドの一部またはそのバリアント）であり得る。
【００９２】
[00160]別の態様では、本発明は、目的の化合物の製造方法であって、本発明の第３もしくは第４の態様に係る宿主細胞、または本発明の第２の態様に係る方法により得られた宿主細胞、または本発明の第４の態様に係る方法により得られた宿主細胞を、目的の化合物を促す条件下で培養すること、および任意選択で目的の化合物を精製することまたは単離することを含む方法を提供する。
【００９３】
[00161]本発明の全ての実施形態の文脈における目的の化合物は、あらゆる生物学的化合物であり得る。この生物学的化合物は、バイオマスまたはバイオポリマーまたは代謝産物であり得る。この生物学的化合物は、単一のポリヌクレオチドによりコードされてもよいし生合成経路もしくは代謝経路を構成する一連のポリヌクレオチドによりコードされてもよい、または単一のポリヌクレオチドの産生の直接的結果であってもよいし一連のポリヌクレオチドの産物であってもよい（このポリヌクレオチドは遺伝子であり得、これらの一連のポリヌクレオチドは遺伝子クラスタであり得る）。本発明の全ての実施形態では、目的の生物学的化合物をコードする単一のポリヌクレオチドもしくは一連のポリヌクレオチドまたは目的の生物学的化合物と関連する生合成経路もしくは代謝経路は、本発明に係る組成物および方法にとって好ましい標的である。この生物学的化合物は、宿主細胞に固有であってもよいし宿主細胞に対して異種であってもよい。
【００９４】
[00162]用語「異種生物学的化合物」は本明細書において、細胞に固有ではない生物学的化合物と定義される、または天然の生物学的化合物であって、この天然の生物学的化合物を変更するために構造的改変が行われている天然の生物学的化合物と定義される。
【００９５】
[00163]用語「バイオポリマー」は本明細書において、同一の、類似のまたは非類似のサブユニット（モノマー）の鎖（またはポリマー）と定義される。このバイオポリマーはあらゆるバイオポリマーであり得る。このバイオポリマーは、例えば核酸、ポリアミン、ポリオール、ポリペプチド（もしくはポリアミド）または多糖であり得るがこれらに限定されない。
【００９６】
[00164]このバイオポリマーはポリペプチドであり得る。このポリペプチドは、目的の生物学的活性を有する任意のポリペプチドであり得る。用語「ポリペプチド」は本明細書において、特定の長さのコード産物を指すことを意味しておらず、従ってペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を包含する。用語ポリペプチドは任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。このポリマーは直鎖であってもよいし分枝鎖であってもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。この用語はまた、改変（例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作（例えば、標識要素との共役））されているアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然のおよび／または非天然のもしくは合成のアミノ酸（例えばグリシンおよびＤ光学異性体またはＬ光学異性体の両方）ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む。ポリペプチドは、上述したポリペプチドおよびハイブリッドポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子および操作バリエーションをさらに含む。このポリペプチドは宿主細胞に固有であってもよいし宿主細胞に対して異種であってもよい。このポリペプチドは、コラーゲンもしくはゼラチンまたはこれらのバリアントもしくはハイブリッドであってもよい。このポリペプチドは、抗体またはその一部、抗原、凝固因子、酵素、ホルモンまたはホルモンバリアント、レセプターまたはその一部、調節タンパク質、構造タンパク質、レポーター、または輸送タンパク質、分泌プロセスに関与するタンパク質、折り畳みプロセスに関与するタンパク質、シャペロン、ペプチドアミノ酸輸送体、グリコシル化因子、転写因子、合成ペプチドまたはオリゴペプチド、細胞内タンパク質であってもよい。この細胞内タンパク質は酵素であってもよく、例えばプロテアーゼ、セラミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、アミノペプチダーゼ、アシラーゼ、アルドラーゼ、ヒドロキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、リパーゼであってもよい。このポリペプチドはまた、細胞外に分泌される酵素であってもよい。そのような酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼの群に属してもよい。酵素は、カルボヒドラーゼ、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼまたはβ−グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼまたはペクチン分解酵素、例えばキシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、エキソポリガラクツロナーゼラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アラビノキシランヒドロラーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼまたはアミロース分解酵素；ヒドロラーゼ、イソメラーゼまたはリガーゼ、ホスファターゼ、例えばフィダーゼ、エステラーゼ、例えばリパーゼ、タンパク質分解酵素、オキシドレダクターゼ、例えばオキシダーゼ���トランスフェラーゼまたはイソメラーゼであってもよい。酵素はフィターゼであってもよい。酵素は、アミノペプチダーゼ、アスパラギナーゼ、アミラーゼ、マルトース生成アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンド−プロテアーゼ、メタロ−プロテアーゼ、セリン−プロテア−ゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、タンパク質デアミナーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ガラクトリパーゼ、クロロフィラーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはグルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼであってもよい。
【００９７】
[00165]本発明によれば、目的の化合物は、国際公開第２０１０／１０２９８２号パンフレットで説明されているような分泌特性が改善されているポリペプチドまたは酵素であり得る。本発明によれば、目的の化合物は、別のポリペプチドがポリペプチドまたはその断片のＮ末端またはＣ末端に融合した融合ポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドを、あるポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）を別のポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）に融合させることにより作製する。
【００９８】
[00166]融合ポリペプチドを作製する技術は当技術分野で既知であり、ポリペプチドをコードするコード配列を、このコード配列がインフレームであり且つ融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーターおよびターミネーターの制御下であるように連結することが挙げられる。ハイブリッドポリペプチドは少なくとも２種の異なるポリペプチド（１種またはより多くが宿主細胞に対して異種であり得る）から得られた部分的ポリペプチド配列または完全ポリペプチド配列の組み合わせを含み得る。融合ポリペプチドおよびシグナル配列融合の例は、例えば国際公開第２０１０／１２１９３３号パンフレットで説明されている通りである。
【００９９】
[00167]本バイオポリマーは多糖であり得る。この多糖は、あらゆる多糖（例えば、限定されないがムコ多糖（例えばヘパリンおよびヒアルロン酸）ならびに窒素含有多糖（例えばキチン））であり得る。好ましい選択肢では、この多糖はヒアルロン酸である。
【０１００】
[00168]本発明に係る目的の化合物をコードするまたは目的の化合物の産生に関与する化合物をコードするポリヌクレオチドは、一次代謝産物または二次代謝産物（例えば有機酸、カロテノイド、（ベータ−ラクタム）抗生物質およびビタミン）の合成に関与する酵素をコードし得る。そのような代謝産物は、本発明に係る生物学的化合物とみなされ得る。
【０１０１】
[00169]用語「代謝産物」は一次代謝産物および二次代謝産物の両方を包含し、この代謝産物はあらゆる代謝産物であり得る。好ましい代謝産物は、不飽和の脂肪および脂質（例えば、限定されないが脂肪酸ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エルカ酸（ｅｕｒｃｉｃ  ａｃｉｄ）、パウリン酸、バクセン酸（ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ）、エイコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸（ｎ−３）、アラキドン酸（ｎ−６）、オクタデカペンタエン酸、ステアリドン酸、リノレン酸（ｎ６またはｎ３）、リノール酸、オレイン酸、パルミトオレイン酸、オクタコサオクタエン酸およびこれらで構成された脂質）、飽和の脂肪および脂質（例えば、限定されないが脂肪酸：カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸およびこれらで構成された脂質）、硫酸化脂質、ソホロ脂質、ラクトン、セラミド、リン脂質、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、脂肪酸エーテル、脂肪酸アルデヒド、ステロール、カロテノイド、オキシリピン、レゾルビン、ロイコトリエン、プロスタグランジン、有機酸（例えば、限定されないが酢酸、酪酸、クエン酸、グルコン酸、アジピン酸、フマル酸、イタコン酸、リンゴ酸、メバロン酸およびコハク酸）、糖アルコール、ならびに糖酸である。
【０１０２】
[00170]代謝産物は、（例えば生合成経路または代謝経路での）１種または複数種の遺伝子によりコードされ得る。一次代謝産物は、細胞の一次代謝または一般的な代謝の産物であり、この産物はエネルギー代謝、成長および構造に関係する。二次代謝産物は二次代謝の産物である（例えばＲ．Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１を参照されたい）。
【０１０３】
[00171]一次代謝産物は、アミノ酸、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、糖、トリグリセリドまたはビタミンであり得るがこれらに限定されない。
【０１０４】
[00172]二次代謝産物は、アルカロイド、クマリン、フラボノイド、ポリケチド、キニーネ、ステロイド、ペプチドまたはテルペンであり得るがこれらに限定されない。二次代謝産物は、抗生物質、摂食阻害剤、誘引剤、殺菌剤、殺真菌剤、ホルモン、殺虫剤または殺鼠剤であり得る。
【０１０５】
[00173]本生物学的化合物は選択マーカーの産物でもあり得る。選択マーカーは目的のポリヌクレオチドの産物であり、この産物は、殺生物剤耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、原栄養性から栄養要求体、および同類のものを付与する。選択マーカーとして、ｎｐｔＩＩ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ）、ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）、ｂｓｄ（ブラストサイジン−Ｓ−デアミナーゼ）およびＳｈ  ｂｌｅ（フレオマイシン結合）ならびにこれらの等価物が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０６】
[00174]本発明によれば、目的の化合物は好ましくは、目的の化合物のリストで説明されているポリペプチドである。
【０１０７】
[00175]本発明の別の実施形態によれば、目的の化合物は好ましくは代謝産物である。
【０１０８】
[00176]本発明に係る宿主細胞は既に目的の化合物を産生し得る場合がある。この宿主細胞はまた、ポリペプチドをコードする同種核酸構築物または異種核酸構築物を有してもよく、このポリペプチドは目的の化合物であってもよいし目的の化合物の産生に関与するポリペプチドであってもよい。目的の化合物を産生し得るように藻類宿主細胞を改変し得る方法は当業者に既知である。
【０１０９】
［一般的定義］
[00177]本明細書および添付の特許請求の範囲の全体を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「有する」ならびに変形（例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」）は包括的に解釈されるべきである。即ち、これらの単語は、文脈が許す限り、具体的に列挙されていない他の要素または整数の可能な包含を伝えることが意図されている。
【０１１０】
[00178]用語「ａ」および「ａｎ」は本明細書において、１または複数（即ち１または少なくとも１）の物品の文法上の目的語を指すために使用される。例として、「１つの要素」は１つの要素または複数の要素を意味し得る。
【０１１１】
[00179]単語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、数値と関連して使用される場合（例えば約１０）、好ましくは、この値が、この値の１％多いまたは少ない所与の値（１０）であり得ることを意味する。
【０１１２】
[00180]別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【０１１３】
[00181]好ましいヌクレオチド類似体またはヌクレオチド等価物は改変骨格を含む。そのような骨格の例は、モルフォリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格、ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格、メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格、ならびにアミド骨格により提供される。骨格中の残基間の連結はリン原子を含まないこと（例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間連結により形成されている連結）がさらに好ましい。
【０１１４】
[00182]好ましいヌクレオチド類似体またはヌクレオチド等価物は、修飾ポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１４９７−１５００）。ＰＮＡベースの分子は、塩基対認識に関してＤＮＡ分子の真の模倣物である。このＰＮＡの骨格は、ペプチド結合により連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位で構成され、この骨格にはメチレンカルボニル結合により核酸塩基が連結されている。代替骨格は、一炭素延長ピロリジンＰＮＡモノマー（ｏｎｅ−ｃａｒｂｏｎ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ  ＰＮＡ  ｍｏｎｏｍｅｒ）を含む（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ  ａｎｄ  Ｋｕｍａｒ（２００５）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ，４９５−４９７）。ＰＮＡ分子の骨格は荷電リン酸基を含まないことから、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは通常、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドそれぞれと比べて安定である（Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，５６６−５６８）。
【０１１５】
[00183]さらに好ましい骨格は、リボース糖またはデオキシリボース糖が６員モルフォリノ環に置き換えられている、モルフォリノヌクレオチド類似体またはモルフォリノヌクレオチド等価物を含む。最も好ましいヌクレオチド類似体またはヌクレオチド等価物は、リボース糖またはデオキシリボース糖が６員モルフォリノ環に置き換えられており且つ隣接モルフォリノ環の間のアニオン性ホスホジエステル連結が非イオン性ホスホロジアミデート連結に置き換えられているホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含む。
【０１１６】
[00184]さらに好ましいヌクレオチド類似体またはヌクレオチド等価物は、ホスホジエステル連結中の非架橋酸素のうちの少なくとも１つの置換を含む。この改変は塩基対形成をわずかに不安定にさせるが、ヌクレアーゼ分解に対して顕著な耐性を付加する。好ましいヌクレオチド類似体またはヌクレオチド等価物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネートまたは他のアルキルホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、およびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、例えば３’−アミノホスホルアミデート、およびアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートまたはボラノホスフェートを含む。
【０１１７】
[00185]さらに好ましいヌクレオチド類似体またはヌクレオチド等価物は、２’位、３’位および／または５’位で一置換されているまたは二置換されている１つまたは複数の糖部分、例えば−ＯＨ；−Ｆ；１つまたは複数のヘテロ原子により中断され得る、置換されたまたは非置換の直鎖または分枝鎖の低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、アリール、またはアラルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；アミノキシ、メトキシエトキシ；−ジメチルアミノオキシエトキシ；および−ジメチルアミノエトキシエトキシを含む。この糖部分は、ピラノースもしくはその誘導体またはデオキシピラノースもしくはその誘導体であり得、好ましくはリボースもしくはその誘導体またはデオキシリボースもしくはその誘導体であり得る。そのような好ましい誘導体化糖部分は、２’−炭素原子が糖環の３’炭素原子または４’炭素原子に連結され、それにより二環式糖部分が形成されているロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。好ましいＬＮＡは２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸を含む（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｎｏ．１：２４１−２４２）。これらの置換により、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド等価物にＲＮアーゼＨおよびヌクレアーゼ耐性が付与され、標的に対する親和性が増加する。
【０１１８】
[00186]本発明の文脈におけるアミノ酸配列または核酸配列の「配列同一性」または「同一性」は本明細書において、２種以上のアミノ酸（ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質）配列または２種以上の核酸（ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）配列の比較により決定した場合での、これらの配列の間の関係として定義される。当技術分野では、「同一性」はまた、場合によっては、一連のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の一致により決定した場合での、そのような配列の間の配列関連性の程度も意味する。本発明の範囲内では、特定の配列との配列同一性は、前記特定のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の全長にわたる配列同一性を好ましくは意味する。
【０１１９】
[00187]２種のアミノ酸配列の間の「類似性」は、あるペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列およびこのアミノ酸配列の保存されたアミノ酸置換体と、別のペプチドまたはポリペプチドの配列とを比較することにより決定される。好ましい実施形態では、同一性または類似性は、本明細書で同定された全配列（配列番号）にわたり算出される。「同一性」および「類似性」を既知の方法により容易に算出し得、この方法として下記で説明されているものが挙げられるがこれらに限定されない：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）。
【０１２０】
[00188]同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列の間に最大の一致を付与するように設計されている。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。２種の配列の間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法として、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）が挙げられる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の出所から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）。同一性を決定するために、周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも使用し得る。
【０１２１】
[00189]ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは下記の通りである：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２；Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：１２；およびＧａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：４。これらのパラメータに有用なプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから「Ｏｇａｐ」プログラムとして公的に入手可能である。上述したパラメータは、アミノ酸比較のためのデフォルトパラメータ（加えて、末端ギャップに関してはペナルティなし）である。
【０１２２】
[00190]核酸比較のための好ましいパラメータは下記の通りである：Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：５０；Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：３。Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．にあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして入手可能。上記に示したものは、核酸比較のためのデフォルトパラメータである。
【０１２３】
[00191]任意選択で、アミノ酸類似性の程度の決定において、当業者に明らかなように、当業者はいわゆる「保存的」アミノ酸置換も考慮し得る。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の一群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の一群はセリンおよびトレオニンであり、アミノ含有側鎖を有するアミノ酸の一群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の一群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の一群はリシン、アルギニンおよびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の一群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。本明細書で開示されているアミノ酸配列の置換バリアントは、開示されている配列中の少なくとも１つの残基が除去されており且つこの位置に異なる残基が挿入されているものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれの好ましい保存的置換は下記の通りである：Ａｌａからｓｅｒへ；Ａｒｇからｌｙｓへ；Ａｓｎからｇｌｎまたはｈｉｓへ；Ａｓｐからｇｌｕへ；Ｃｙｓからｓｅｒまたはａｌａへ；Ｇｌｎからａｓｎへ；Ｇｌｕからａｓｐへ；Ｇｌｙからｐｒｏへ；Ｈｉｓからａｓｎまたはｇｌｎへ；Ｉｌｅからｌｅｕまたはｖａｌへ；Ｌｅｕからｉｌｅまたはｖａｌへ；Ｌｙｓからａｒｇへ；ｇｌｎまたはｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕまたはｉｌｅへ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕまたはｔｙｒへ；Ｓｅｒからｔｈｒへ；Ｔｈｒからｓｅｒへ；Ｔｒｐからｔｙｒへ；Ｔｙｒからｔｒｐまたはｐｈｅへ；およびＶａｌからｉｌｅまたはｌｅｕへ。
【０１２４】
[00192]本発明に係るポリヌクレオチドはヌクレオチド配列により表される。本発明に係るポリペプチドはアミノ酸配列により表される。本発明に係る核酸構築物は、天然に存在する遺伝子から単離されているポリヌクレオチド、または天然には存在しないであろう様式で組み合わされているもしくは並置されているポリヌクレオチドのセグメントを含むように改変されているポリヌクレオチドと定義される。任意選択で、本発明に係る核酸構築物中に存在するポリヌクレオチドは１種または複数種の制御配列に作動可能に連結されており、この制御配列は、宿主細胞中でのまたは細胞フリー系中でのコード産物の産生または発現を指示する。
【０１２５】
[00193]本明細書中で提供される配列情報を、誤って同定された塩基の包含を必要とするほど狭く解釈すべきではない。当業者は、そのように誤って同定された塩基を識別し得、そのようなエラーを訂正する方法を知っている。
【０１２６】
[00194]本発明の全ての実施形態（即ち、本発明に係る組成物、発現を調節する方法、本発明に係る組成物を含む宿主細胞、本発明に係る宿主細胞を作製する方法、本発明に係る宿主細胞、および本発明に係る目的の化合物の製造の方法）は好ましくは、細胞フリーのインビトロ系ではなく宿主細胞を指し、換言すると、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは好ましくは、細胞フリーのインビトロ系ではなく宿主細胞系である。
【０１２７】
[00195]本発明の全ての実施形態（例えば、本発明に係る組成物、発現を調節する方法、本発明に係る組成物を含む宿主細胞、本発明に係る宿主細胞を作製する方法、本発明に係る宿主細胞、および本発明に係る目的の化合物の製造の方法）では、この宿主細胞は、一倍体宿主細胞、二倍体宿主細胞または多倍数宿主細胞であり得る。
【０１２８】
[00196]本発明に係る宿主細胞はラビリンチュラ綱宿主細胞であり、好ましくはトラウストチトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目であり、より好ましくはトラウストチトリアシエ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）科であり、より好ましくはオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）からなる群から選択される属のメンバーであり、さらにより好ましくはスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＡＴＣＣ＃  ２０８８８である
【０１２９】
[00197]（好ましくはゲノム中での）改変は本明細書において、１つまたは複数の改変と解釈される。（好ましくは本発明に係る宿主細胞のゲノム中での）改変は、下記のいずれかによりもたらされ得る：
ａ）親宿主細胞を組換え遺伝子操作技術に供すること；および／または
ｂ）親宿主細胞を（古典的な）変異誘発に供すること；および／または
ｃ）親宿主細胞を阻害化合物または阻害組成物に供すること。
【０１３０】
[00198]宿主細胞のゲノムの改変は本明細書において、宿主細胞のゲノム中のポリヌクレオチド配列の変化をもたらすあらゆる事象として定義される。
【０１３１】
[00199]好ましくは、本発明に係る宿主細胞は、同一条件下で分析した際に、改変されていない親宿主細胞と比較した場合に、本明細書で定義されているような望ましくない化合物の産生の減少または非産生がもたらされる（好ましくはこの宿主細胞のゲノム中での）改変を有する。
【０１３２】
[00200]当業者に既知の任意の手段（例えば、限定されないが古典的な株改良、ランダム変異誘発およびその後の選択）により改変を導入し得る。部位特異的変異誘発によっても改変を導入し得る。
【０１３３】
[00201]改変は、ポリヌクレオチド配列中の１つまたは複数のヌクレオチドの導入（挿入）、置換（置き換え）または除去（欠失）により達成され得る。ポリペプチド等の望ましくない化合物をコードするポリヌクレオチドの完全なまたは部分的な欠失が達成され得る。望ましくない化合物は、本明細書の他の箇所で列挙された任意の望ましくない化合物であり得、代謝産物等の望ましくない化合物の合成の生物学的経路中でのタンパク質および／または酵素でもあり得る。あるいは、前記望ましくない化合物をコードするポリヌクレオチドは、前記望ましくない化合物をコードしないまたは前記望ましくない化合物の部分的にもしくは完全に不活性な形態をコードするポリヌクレオチド配列に部分的にまたは完全に置き換えられ得る。別の代替では、１つまたは複数のヌクレオチドを、前記望ましくない化合物をコードするポリヌクレオチドに挿入して前記ポリヌクレオチドを破壊し、その結果、この破壊されたポリヌクレオチドによりコードされる前記望ましくない化合物を部分的にまたは完全に不活性化させ得る。
【０１３４】
[00202]一実施形態では、本発明に係る変異体微生物細胞は、この細胞のゲノム中に下記から選択される改変を含む：
ａ）望ましくない化合物をコードするポリヌクレオチドの完全なまたは部分的な欠失、
ｂ）望ましくない化合物をコードするポリヌクレオチドの、前記望ましくない化合物をコードしないまたは前記望ましくない化合物の部分的にもしくは完全に不活性な形態をコードするポリヌクレオチド配列への完全なまたは部分的な置き換え、
ｃ）望ましくない化合物をコードするポリヌクレオチド配列中での１つまたは複数のヌクレオチドの挿入およびその後の破壊されたポリヌクレオチドによる前記望ましくない化合物の部分的なまたは完全な不活性化による、このポリヌクレオチドの破壊。
【０１３５】
[00203]この改変は、例えば前記望ましくない化合物の転写または翻訳に必要なコード配列中または調節配列中であり得る。例えば、終止コドンの導入、開始コドンの除去またはコード配列のオープンリーディングフレームの変更もしくはフレームシフトをもたらすようにヌクレオチドを挿入し得る、または除去し得る。コード配列またはその調節エレメントの改変は下記により達成され得る：部位特異的変異誘発またはランダム変異誘発、ＤＮＡシャフリング法、ＤＮＡ再構築法、遺伝子合成（例えばＹｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｎｇ（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（７），ｎａｒ．ｏｕｐｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｒｅｐｒｉｎｔ／３２／７／ｅ５９での電子アクセス、またはＧｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９６８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，６０：１３３８−１３４４；Ｓｃａｒｐｕｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１：３５６−３６５；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３を参照されたい）、または当技術分野で既知の方法に従うＰＣＲにより生じた変異誘発。ランダム変異誘発手段の例は当技術分野で公知であり、例えば化学的（例えばＮＴＧ）変異誘発または物理的（例えばＵＶ）変異誘発が挙げられる。部位特異的変異誘発手段の例は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ＩＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、またはＨｏ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ”，Ｇｅｎｅ，１９８９  Ａｐｒ  １５，７７（１）：５１−９）で説明されているＰＣＲを使用するもしくはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ．（Ｅｄｓ．Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ．ＩＳＢＮ  １−８９８４８６−０１−８；１９９５  Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＰＯ  Ｂｏｘ  １，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，Ｕ．Ｋ．）で説明されているＰＣＲを使用する重複発現である。
【０１３６】
[00204]好ましい改変方法は、組換え遺伝子操作技術（例えば、部分的なもしくは完全な遺伝子置き換え、または部分的なもしくは完全な遺伝子欠失）をベースとする。
【０１３７】
[00205]例えば、ポリヌクレオチド、核酸構築物または発現カセットの置き換えの場合には、置き換えられる標的遺伝子座で適切なＤＮＡ配列を導入し得る。この適切なＤＮＡ配列は好ましくは、クローニングベクター上に存在する。好ましい組込みクローニングベクターはＤＮＡ断片を含み、このＤＮＡ断片はポリヌクレオチドと相同であり、および／または置き換えられる遺伝子座へのこのクローニングベクターの組込みのターゲティングのために、この所定の遺伝子座に隣接するポリヌクレオチドに対して相同性を有する。標的を定めた組込みを促進するために、このクローニングベクターを細胞の形質転換の前に好ましくは線状化する。好ましくは、線状化を、このクローニングベクターの少なくとも一方の端部（好ましくはどちらかの端部）に、置き換えられるＤＮＡ配列（または隣接配列）に相同な配列が隣接するように実施する。このプロセスは相同組換えと称されており、この技術も（部分的な）遺伝子欠失を達成するために使用し得る。
【０１３８】
[00206]例えば、内在性ポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチドを、（完全に機能する）ポリペプチドを産生し得ないポリヌクレオチドである欠陥ポリヌクレオチドに置き換え得る。相同組換えにより、この内在性ポリヌクレオチドが欠陥ポリヌクレオチドに置き換わる。この欠陥ポリヌクレオチドがマーカーもコードすることが望ましい場合があり、このマーカーは、核酸配列が改変されている形質転換体の選択に使用され得る。
【０１３９】
[00207]望ましくない化合物の産生の減少または非産生をもたらす改変を様々な方法により得ることができ、例えば、そのような望ましくない化合物に対する抗体または化学的阻害剤またはタンパク質阻害剤または物理的阻害剤により得ることができる（Ｔｏｕｒ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌｉｇｈｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ）。あるいは、または上述した技術と組み合わせて、望ましくない化合物の産生の減少または非産生を、例えばＵＶ変異誘発もしくは化学的変異誘発により得ることもできる（Ｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｓｓａｙ”（２０１０）ＡｐｐＩ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６２（４）：９３５−９４１）、または本明細書で説明されているような望ましくないポリペプチドの酵素活性を阻害する阻害剤の使用により得ることもできる（例えば、β−グルコシダーゼの阻害剤として機能するノジリマイシン（Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｄ  ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ＤＨＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．”（２０１２−０１）Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）。
【０１４０】
[00208]本発明の一実施形態では、本発明に係る宿主細胞のゲノムの改変は、望ましくない化合物をコードするポリヌクレオチドの少なくとも１箇所の改変である。
【０１４１】
[00209]化合物（例えば望ましくない化合物、例えば望ましくないポリペプチドおよび／または酵素）の産生での細胞の不完全性は本明細書において、下記の表現型特性をもたらすために（好ましくはゲノムが）改変されている変異体微生物宿主細胞と定義される：ａ）この細胞は、望ましくない化合物の産生がより少ない、もしくは望ましくない化合物を実質的に産生しない、および／またはｂ）この細胞は、同一条件下で分析された場合に、改変されていない親宿主細胞と比較して、活性が低下しているもしくは特定の活性が低下している望ましくない化合物、または活性を有しないもしくは特定の活性を有しない望ましくない化合物、およびこれらの可能性のうちの１つもしくは複数の組み合わせを産生する。
【０１４２】
[00210]好ましくは、本発明に係る改変宿主細胞は、改変されてない且つ同一条件下で測定されている親宿主細胞と比較した場合に、１％少ない望ましくない化合物を産生し、少なくとも５％少ない望ましくない化合物、少なくとも１０％少ない望ましくない化合物、少なくとも２０％少ない望ましくない化合物、少なくとも３０％少ない望ましくない化合物、少なくとも４０％少ない望ましくない化合物、少なくとも５０％少ない望ましくない化合物、少なくとも６０％少ない望ましくない化合物、少なくとも７０％少ない望ましくない化合物、少なくとも８０％少ない望ましくない化合物、少なくとも９０％少ない望ましくない化合物、少なくとも９１％少ない望ましくない化合物、少なくとも９２％少ない望ましくない化合物、少なくとも９３％少ない望ましくない化合物、少なくとも９４％少ない望ましくない化合物、少なくとも９５％少ない望ましくない化合物、少なくとも９６％少ない望ましくない化合物、少なくとも９７％少ない望ましくない化合物、少なくとも９８％少ない望ましくない化合物、少なくとも９９％少ない望ましくない化合物、少なくとも９９．９％少ない望ましくない化合物、または最も好ましくは１００％少ない望ましくない化合物を産生する。
【０１４３】
[00211]本明細書中で提供される配列情報を、誤って同定された塩基の包含を必要とするほど狭く解釈すべきではない。当業者は、そのように誤って同定された塩基を識別し得、そのようなエラーを訂正する方法を知っている。
【０１４４】
[00212]本明細書に記載されている各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
[00213]本発明を下記の実施例によりさらに説明する。
【０１４６】
［実施例］
［実施例１］
[00214]［形質転換用のＣａｓ９ベクターの設計および構築］
[00215]ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＭＧＡＳ５００５  Ｃａｓ９配列を、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）中での発現用にコドン最適化した。使用した基本的なＣａｓ９ペプチド配列は、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３で使用されたものと本質的に同一であったが、説明されているＨＡタグまたはＧＦＰ融合を含まなかった（下記を参照されたい）。このＣａｓ９を合成した後（ＤＮＡ２．０，Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）、パロモマイシン選択カセットを含むｐＣＬ１２２ベクター中にクローニングして、ｐＣＬ１２２−Ｃａｓ９（配列番号）と命名したベクターを得た。ＯｒｆＡ／Ｐｆａ１隣接部を合成してｐＣＬ１２１（ゼオシン選択カセットを有する）中にクローニングし（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、最終ベクターをｐＹＢ３１（配列番号２）と命名した（例えば米国特許第８，９４０，８８４号明細書を参照されたい）。Ｃａｓ９遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩの制限部位および制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）（図３）ならびにＲａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ，Ｒｉｓｃｈ−Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した消化およびライゲーションにより、ｐＣＬ１２２−Ｃａｓ９ベクターからｐＹＢ３１ベクター中へとサブクローニングした。ＮＥＢ１０β化学的コンピテント細胞を形質転換させ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、得られたコロニーを、選択したコロニー、プライマー１２１  Ｔｕｂ  ｓｅｑ  Ｆ（配列番号１３）およびｐＹＢ３２／３Ｃ  Ｒ１（配列番号１４）（表２）を含むＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ならびに５％ＤＭＳＯ（体積：体積）を使用するコロニーＰＣＲでスクリーニングし、この反応に下記のサイクリング条件を適用した：５分にわたり９５℃、（３０秒にわたり９５℃、３０秒にわたり５９℃、１分にわたり７２℃）×３５サイクル、５分にわたり７２℃（図４）。ＰＣＲにより陽性のコロニーからプラスミドを単離し、配列決定し、得られた１種のベクターをｐＹＢ３２（配列番号３）と命名した。
【０１４７】
【表２】
2019520069.tif 000004
【０１４８】
[00216]既に述べたように、他の研究は、Ｃａｓ９発現のレベルが形質転換体の生存率およびヌクレアーゼ活性を最適化するのに重要であることを示している。ｐＹＢ３２プラスミドでは、Ｃａｓ９遺伝子は、中強度のプロモーターであるアルファチューブリンプロモーターの制御下にある。カロチンシンターゼ（ＣＳ）遺伝子由来の弱いプロモーターを選択して同様に試験し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によりｐＹＢ３１中にクローニングした。ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングの準備において、ｐＹＢ３１プラスミドをＫｐｎＩ酵素およびＮｄｅＩ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。ＣＳプロモーターを、ＣＳ  ｐｒｏ  ＫｐｎＩ  ＩＦ  Ｆ１プライマー（配列番号１５）およびＣＳ  ｐｒｏ  ＢａｍＨＩ  ＩＦ  Ｒ１プライマー（配列番号１６）（表３）、５％ＤＭＳＯ（体積：体積）、ＫＯＤ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、ならびにテンプレートとして使用するｐＴＨ０４３（ＣＳプロモーターを有するプラスミド）で増幅させた。反応サイクリング条件は下記の通りであった：２分にわたり９５℃、（２０秒にわたり９５℃、１０秒にわたり６６℃、２０秒にわたり７０℃）×３５サイクル、２分にわたり７０℃。Ｃａｓ９を、ＣＳ  ｐｒｏ  ＢａｍＨＩ  ＩＦ  Ｆ２プライマー（配列番号１７）およびＣＳ  ｐｒｏ  ＮｄｅＩ  ＩＦ  Ｒ２プライマー（配列番号１８）（表３）、５％ＤＭＳＯ（体積：体積）、ＫＯＤ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ならびにテンプレートとして使用するｐＣＬ１２２−Ｃａｓ９で増幅させた。反応サイクリング条件は下記の通りであった：２分にわたり９５℃、（２０秒にわたり９５℃、１０秒にわたり６５℃、１分４５秒にわたり７０℃）×３５サイクル、２分にわたり７０℃。
【０１４９】
【表３】
2019520069.tif 000005
【０１５０】
[00217]ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で泳動させ、予想サイズのバンドを切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してゲル精製した（図３）。ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニング用の製造業者のプロトコルに従って、Ｃａｓ９  ＰＣＲ断片、ＣＳプロモーターＰＣＲ断片および線状化ｐＹＢ３１断片を連結し、ＮＥＢ１０β化学的コンピテント細胞を形質転換させ、得られたコロニーを、上記で説明したコロニーＰＣＲでスクリーニングした（図４）（７２℃での１分３０秒の伸長時間）。配列の検証後、ＣＳプロモーターに作動可能に連結されたＣａ９を含む、得られたベクターのうちの１つをｐＹＢ３３（配列番号４）と命名した。
【０１５１】
[00218]ｐＹＢ３２およびｐＹＢ３３のクローニングを、消化、ライゲーションおよびＩｎＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲクローニングの組み合わせを通じて行った。図３に示すように、全ての断片が産生され且つカラム精製後に予想サイズのバンドを有した。消化したプラスミドおよびＰＣＲ増幅断片を１％アガロースゲル上で泳動させた。下記のように、予想サイズの断片を全てのレーンで観測した：ｐＹＢ３１−ＢａｍＨＩ＋ＮｄｅＩ＝８３８ｂｐ＋６５５５ｂｐ、ｐＹＢ３１−ＫｐｎＩ＋ＮｄｅＩ＝１２８９ｂｐ＋６１０４ｂｐ、Ｃａｓ９−ＢａｍＨＩ＋ＮｄｅＩ＝４１５７ｂｐ＋５７７３ｂｐ、ＣＳ  ＰＣＲ断片＝１０４６ｂｐ、Ｃａｓ９  ＰＣＲ断片＝４１８９ｂｐ。このゲルおよび後続の全てのゲルで使用した分子量マーカーはＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉ−Ｌａｄｄｅｒ（Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）であり、断片サイズを図３の右側のパネルに示す。
【０１５２】
[00219]ｐＹＢ３２細菌形質転換およびｐＹＢ３３細菌形質転換から得られたコロニーをコロニーＰＣＲで分析し、予想サイズのアンプリコンを有するコロニーを図４においてボールド体で示す。このコロニーは、ｐＹＢ３２−２、−４、−９、−１４、−１５、−２４、−２５、−２８、およびｐＹＢ３３−１６、およびｐＹＢ３３Ｄ−１、−１４である。ｐＹＢ３２−２およびｐＹＢ３３−１６は、正確な配列を有することを確認したものの一つであり、後続の研究に使用した。ｐＹＢ３２およびｐＹＢ３３のクローニングからのコロニーＰＣＲの結果に関して、予想されるアンプリコンサイズは下記の通りである：ｐＹＢ３２＝１０２８ｂｐ、ｐＹＢ３３＝１５８４ｂｐ。
【０１５３】
［実施例２］
[00220]［形質転換およびＣａｓ９形質転換体の選択］
[00221]スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種の野生型株ＡＴＣＣ  ２０８８８を、下記で説明するように粒子衝撃法および微粒子銃機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）を使用するｐＹＢ３２およびｐＹＢ３３による形質転換用に使用した。簡潔に言うと、２０８８８を、一晩２００ｒｐｍで振盪しつつ、２７℃にて２５０ｍＬの平底三角フラスコ中のＭ５０−２０培地（例えば米国特許第８，００３，７７２号明細書を参照されたい）２５ｍＬ中で増殖させた。その後、培養物を、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ中においてＭ２Ｂ培地（例えば米国特許第８，００３，７７２号明細書を参照されたい）５０ｍＬで１／１００に希釈し、一晩同一条件下で増殖させた。スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）培養物が初期対数期（０．６〜２ＯＤ単位／ｍＬ）であった場合に、この培養物を１０分にわたり３，２２０×ｇでの遠心分離により回収した。上清をデカントし、ペレットを２０ＯＤ単位／ｍＬの最終濃度までＭ２Ｂに再懸濁させ、得られた細胞懸濁液１００μＬを非選択Ｍ２Ｂ寒天プレート（直径約４ｃｍ）の約３分の１上に円運動で広げた。プラスミドｐＹＢ３２およびｐＹＢ３３を一晩２５℃にてＳｗａＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製した。次いで、各精製プラスミド５μｇを、２．５ＭのＣａＣｌ２  ５０μＬ、０．１Ｍのスペルミジン２０μＬおよび調製したＭ１０  Ｔｕｎｇｓｔｅｎビーズ（製造業者のプロトコルに従う、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）５０μＬと混合し、１分にわたりボルテックスし、次いで室温で１０分にわたりインキュベートしてビーズを沈殿させた。ＤＮＡ被覆ビーズを１００％エタノール２５０μＬで１回洗浄し、次いでビーズを１００％エタノール６０μＬに再懸濁させた。調製した各マクロキャリア（マクロキャリア組立体の調製用の製造業者のプロトコルに従う）は、マクロキャリアディスクの中心にスポットされたエタノール中に被覆ビーズ１０μＬを有しており、エタノールを乾燥させた。破裂ディスクホルダにより、７０％イソプロパノール中での短時間の滅菌後に１，１００ｐｓｉ定格の破裂ディスクを内側に配置し、組み立てたマクロキャリアを最上部の棚位置で微粒子銃プラットフォームに取り付け、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の細胞パッチを有するＭ２Ｂ寒天プレートを最上部から３番目の棚上で細胞側を上にして配置した。微粒子銃チャンバ内の真空が約２７ｐｓｉに達した場合に、破裂ディスクが破裂するまでヘリウムを燃焼させ、ヘリウム流を遮断し、このチャンバを大気に開放し、衝撃されたプレートをこのチャンバから取り出した。この衝撃プロセスを全ての試料およびコントロールに関して繰り返し、ｐＹＢ３２で衝撃したスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種２０８８８をＴ１８８と命名し、ｐＹＢ３３で衝撃したスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）培養物をＴ１８９と命名した。衝撃されたプレートを４時間にわたり２７℃でインキュベートし、その後、細胞をＭ２Ｂ約１ｍＬでプレートから洗い流し、０．４％ランダムメチル化β−シクロデキストリン（ＣＴＤ  Ｈｏｌ��ｉｎｇｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｉｇｈ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＦＬ）中の０．５ｍＭのＤＨＡ（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ，Ｗａｔｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＮ）および５０μｇ／ｍＬのゼオシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含む４枚のＭ２Ｂ寒天プレートに等分した。細菌を３ｍｍの滅菌ガラスビーズで広げ、ビーズを除去し、プレートを包み、約７〜１０日にわたり２７℃でインキュベートした。コロニーが２〜４ミリメートルのサイズに達した場合に、各コロニーを、ＤＨＡ（上記で説明したようにランダムメチル化β−シクロデキストリンと複合体化されている）と共にまたはＤＨＡなしで１００μｇ／ｍＬのゼオシンを含むＭ２Ｂ寒天プレート上にレプリカパッチして（ｒｅｐｌｉｃａ−ｐａｔｃｈ）、ＯｒｆＡ／Ｐｆａ１遺伝子の破壊により誘発された栄養要求性に関して選択した。
【０１５４】
[00222]ＤＨＡに対して栄養要求性であることを確認したコロニーを選び出し、２５０ｍＬの平底三角フラスコ中において４０％のβ−シクロデキストリン５００μＬおよび５０ｍＭのＤＨＡ溶液を補充したＭ５０−２０  ５０ｍＬに播種し、４８時間にわたり２００ｒｐｍで２７℃振盪機中に配置した。４８時間のインキュベーション時間の後、培養物２ｍＬを１０分にわたる５，０００×ｇでの遠心分離により集め、上清をデカントし、ペレットを改変フェノール−クロロホルム抽出後のゲノムＤＮＡ単離に使用した。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）によるＰＣＲのテンプレートとして使用して、ｐＹＢ３２およびｐＹＢ３３に関するコロニーＰＣＲスクリーニングについて説明したようにプライマー、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎマスターミックスおよびサイクリング条件を使用してゼオシンカセットおよびＣａｓ９遺伝子の存在を確認した（図５）。Ｔ１８８形質転換体およびＴ１８９形質転換体でのＯｒｆＡ／Ｐｆａ１遺伝子の破壊をＰＣＲで確認した。具体的には、５’隣接領域を、Ｏ  Ａ１−ＫＯ  Ｆプライマー（配列番号１９）およびｐＹＢ３２／３  ＳＶ４０  Ｒ１プライマー（配列番号２０）（表４）、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス、５％ＤＭＳＯ（体積：体積）およびテンプレートとしてのＴ１８８／Ｔ１８９  ｇＤＮＡによるＰＣＲで調べ、サイクリング条件は下記の通りであった：２分にわたり９５℃、（３０秒にわたり９５℃、３０秒にわたり６０℃、２分１５秒にわたり７２℃）×３５サイクル、５分にわたり７２℃。さらに、３’隣接領域を、Ｏ  Ａ１−ＫＯ  Ｒプライマー（配列番号２１）およびｐＹＢ３２／２  ＣＦ  １プライマー（配列番号２２）（表４）、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス、５％ＤＭＳＯ（体積：体積）およびテンプレートしてのＴ１８８／Ｔ１８９  ｇＤＮＡによるＰＣＲで調べ、サイクリング条件は下記の通りであった：２分にわたり９５℃、（３０秒にわたり９５℃、３０秒にわたり５９℃、２分にわたり７２℃）×３５サイクル、５分にわたり７２℃（図６）。
【０１５５】
【表４】
2019520069.tif 000006
【０１５６】
[00223]Ｃａｓ９遺伝子の組込みおよびＯｒｆＡ／Ｐｆａ１での破壊に関してＰＣＲにより陽性の培養物を、ランダムメチル化β−シクロデキストリンおよびＤＨＡを補充したＭ５０−２０  ２５ｍＬに播種し、既に説明したように２４時間にわたり増殖させた。培養物のＯＤ６００を測定し、各培養物の２ＯＤ単位を、２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコ中においてランダムメチル化β−シクロデキストリンおよびＤＨＡを補充したＳＰＦＭ（ｐＨ６．７５）５０ｍＬに播種し、２００ｒｐｍにて２７℃振盪機中で４８時間にわたり増殖させた後、凍結保存のために５％グリセロール（体積：体積）を添加した。さらなる研究のために、２つのコロニー（各形質転換群から１つ）を選択した（Ｔ１８８−１−２０およびＴ１８９−１−２０）。
【０１５７】
[00224]野生型スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種２０８８８を衝撃によりｐＹＢ３２プラスミドおよびｐＹＢ３３プラスミドで形質転換させ、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）シンターゼのＯｒｆＡ／ＰＦＡ１遺伝子座でのＣａｓ９の挿入に起因して２０８８８においてＤＨＡ栄養要求性が生じた。コロニーを計数し、ＤＨＡを含むまたは含まない選択プレート上にレプリカパッチした。ＤＨＡに対して栄養要求性であるコロニーを両方の形質転換群から無作為に選び出し、さらなるキャラクタリゼーションのために使用した。
【０１５８】
[00225]表５に示すように、ｐＹＢ３３プラスミドによる形質転換効率はｐＹＢ３２プラスミドと比べて低く、見出した栄養要求性コロニーの画分で同様の傾向を観察した。
【０１５９】
【表５】
2019520069.tif 000007
【０１６０】
[00226]Ｔ１８８形質転換体およびＴ１８９形質転換体を、Ｃａｓ９に連結されたプロモーターの存在およびＣａｓ９遺伝子の上流領域に関して調べた。Ｔ１８８クローンの場合、予想されるアンプリコンサイズは１０２８ｂｐであり、Ｔ１８９の場合は１５８４ｂｐであった。図５に示すように、クローンＴ１８９−１−３０を除く全てが予想されるアンプリコンサイズを生じ、さらなる試験に使用した。
【０１６１】
[00227]ＯｒｆＡ／Ｐｆａ１遺伝子座でのＣａｓ９の組込みをＰＣＲで確認し、５’隣接領域および３’隣接領域の両方を野生型特異的外部プライマーおよびＣａｓ９特異的内部プライマーの組み合わせで増幅させ、その結果、組込みが起こった場合にのみアンプリコンが達成可能であった（図６）。Ｃａｓ９組込みの５’隣接部の予想されるアンプリコンサイズは２２２９ｂｐであり、３’隣接部は１９７３ｂｐであった。試験した株の全てが、ＯｒｆＡ／Ｐｆａ１遺伝子座でのＣａｓ９の組込みに関して陽性であった。
【０１６２】
［実施例３］
[00228]［ｇＲＮＡベクターの設計および構築］
[00229]ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）カセットの全てを、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に由来する伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーターにより発現されるように設計した。それぞれの場合において、ｇＲＮＡ配列には２つのリボザイム配列（ハンマーヘッド型およびＨＤＶ）が隣接していた（Ｇａｏ  Ｙ  ａｎｄ  Ｚｈａｏ  Ｙ“Ｓｅｌｆ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ−ｆｌａｎｋｅｄ  ＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ”Ｊ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５６（４）：３４３−３４９（２０１４））。「ＮＧＧ］プロトスペーサー隣接モチーフを含む４種の標的配列をカロチンシンターゼ遺伝子内で同定し、それぞれのすぐ上流２０ｂｐを標的配列として選択した。両方のリボザイム、標的配列およびガイドＲＮＡを含む１つのカセットを合成し、ＢｇｌＩＩ部位およびＮｄｅＩ部位（ＤＮＡ２．０）を使用してｐＣＬ１２２ベクター中にクローニングし、ｐＣＬ４０１（配列番号７）と命名したベクター（さらなるクローニング用の前駆体プラスミドである）を得た。最終ｇＲＮＡカセットベクターを調製するために、プラスミドｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＮｄｅＩおよびＨｐａＩで消化し、得られた大きい方の断片をゲル精製した。スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）脂肪酸シンターゼ断片（ＦＡＳ）の断片を、５’  ＦＡＳ  ＰｍｅＮｄｅプライマー（配列番号２３）および３’  ＦＡＳ  ＰｍｅＨｐａプライマー（配列番号２４）（表６）、ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘおよび５％ＤＭＳＯによる、スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種２０８８８のゲノムＤＮＡのＰＣＲにより増幅させ、下記のサイクリング条件を使用した：２分にわたり９５℃、（２０秒にわたり９５℃、１０秒にわたり６２℃、５１秒にわたり７０℃）×４０サイクル、５分にわたり７０℃（図７）。得られた断片をＨｐａＩ制限酵素およびＮｄｅＩ制限酵素で消化して精製した。
【０１６３】
【表６】
2019520069.tif 000008
【０１６４】
[00230]適切に精製して消化したｐＳＰ７３断片およびＦＡＳ断片をＲａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して連結し、ＮＥＢ１０β細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換させてベクターｐＣＬ３９９（配列番号５）を得た。次いで、ｐＣＬ３９９ベクターをＮｄｅＩエンドヌクレアーゼ単独で消化し、末端をＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で平滑化し、このベクターをＲａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキットにより再連結し、それによりＮｄｅＩ部位を除去した。得られたベクターをｐＣＬ４００（配列番号６）と命名した。パロモマイシン発現カセットおよびｇＲＮＡカセットを、テンプレートとしてｐＣＬ４０１（配列番号７）を使用して増幅させ、ＩｎＦｕｓｉｏｎ  ＰＣＲクローニングにより、ＸｈｏＩで予め消化したｐＣＬ４００に挿入してベクターｐＣＬ４０２（配列番号８）を作製した。簡潔に言うと、ｐＣＬ４０２  ＩＦ  Ｆプライマー（配列番号２５）およびＰＣＬ４０２  ＩＦ  Ｒプライマー（配列番号２６）（表７）、５％ＤＭＳＯ（体積：体積）、ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、ｐＣＬ４０１プラスミドテンプレートを使用してｐＣＬ４０１から所望の断片を増幅させ、下記のサイクリング条件を使用した：２分にわたり９５℃、（２０秒にわたり９５℃、１０秒にわたり６０℃、１分２５秒にわたり７０℃）×３５サイクル、５分にわたり７０℃（図８）。得られたベクターをｐＣＬ４０２と命名した。
【０１６５】
【表７】
2019520069.tif 000009
【０１６６】
[00231]ＢｇｌＩＩ隣接部位およびＮｄｅＩ隣接部位により４種のゲノムカロチンシンターゼ標的配列を合成した（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ，Ｍｅｂａｎｅ，ＮＣ）。これらの断片をｇＲＮＡ  ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３およびＣＳ４と命名した。４種全ての断片およびベクターｐＣＬ０４０２をＢｇｌＩＩおよびＮｄｅＩで消化した。全ての適切な断片をゲル精製し、またはカラム精製し、次いでＲａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して一緒に連結し、得られたベクターをｐＹＢ３６（ｇＲＮＡ３  ＣＳ１；配列番号９）、ｐＹＢ３７（ｇＲＮＡ３  ＣＳ２；配列番号１０）、ｐＹＢ３８（ｇＲＮＡ３  ＣＳ３；配列番号１１）およびｐＹＢ３９（ｇＲＮＡ３  ＣＳ４；配列番号１２）と命名した。
【０１６７】
[00232]スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）由来の遺伝子編集成分を除去するために、Ｃａｓ９カセットおよびガイドＲＮＡカセットの両方を、遺伝子を破壊（ノックアウト）して、それにより栄養要求性を誘発するように設計した。Ｃａｓ９選択による栄養要求性はＤＨＡに対するものであったが、ｇＲＮＡ挿入の場合に誘発された栄養要求性は、脂肪酸シンターゼ遺伝子座（ＦＡＳ）の破壊に起因してパルミチン酸に対するものであった。ＦＡＳ遺伝子の一部をスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種２０８８８のゲノムＤＮＡから増幅させ、次いで１％アガロースゲル上で泳動させた（図８）。このアンプリコンの予想サイズは２５３０ｂｐであった。２つの試料を調製してゲル上にロードし、予想サイズのバンドはＰＣＲの主要産物であったが、ＰＣＲ条件があまり理想的ではない可能性があり、将来最適化する必要があるかもしれないことを示す他のより小さいサイズのバンドが存在した。２．５ｋｂｐのバンドを切り取ってゲル精製し、ベクターｐＣＬ３９９のクローニングに使用した。
【０１６８】
[00233]ＰＣＲを、ベクターｐＣＬ４００中のＦＡＳ遺伝子座へのパロモマイシンカセットおよびｇＲＮＡカセットのクローニング用に設定した。このアンプリコンの予想サイズは３３７６ｂｐであり、この予想サイズはゲル上に現れる主要なバンドであった（図８）。次いで、この断片をｐＣＬ４００中にクローニングしてｐＣＬ４０２を得た。
【０１６９】
［実施例４］
[00234]［ｇＲＮＡ構築物の形質転換および選択］
[00235]Ｔ１８８−１−２０株およびＴ１８９−１−２０株（両方とも、異なるプロモーター（それぞれアルファチューブリンおよびＣＳ）の制御下でＣａｓ９発現カセットを含むことをＰＣＲで確認しており、ＰＲＦＡシンターゼのＯｒｆＡ／ＰＦＡ１遺伝子座で挿入されている）を、０．５ｍＭのＤＨＡと共に０．４％のランダムメチル化β−シクロデキストリンを補充したＭ５０−２０  ２５ｍＬを含む平底三角フラスコ中に播種し、２７℃、２００ｒｐｍで一晩増殖させた。両方の株を、上記で説明したようにβ−シクロデキストリンおよびＤＨＡを補充したＭ２Ｂ  ５０ｍＬを含むバッフル付きフラスコ中に１／５０に希釈し、２７℃で一晩増殖させた。Ｔ１８８培養物およびＴ１８９培養物を上記で説明したように後日回収し、衝撃用の調製を上記で説明したように実行した。衝撃の前にｐＹＢ３６〜３９プラスミドをＰｍｅＩで消化してカラム精製し、４種の消化プラスミド全てを２種の株の形質転換に使用して、Ｔ２０２〜２０９と命名した形質転換体（それぞれｐＹＢ３６〜３９を含むＴ１８８、ｐＹＢ３６〜３９を含むＴ１８９）を得た。衝撃からの回復から４時間後に、得られた形質転換体を、０．５ｍＭのＤＨＡ、０．５ｍＭのＣ１６：０（パルミチン酸、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および５０μｇ／ｍＬのパロモマイシンと共に０．４％のβ−シクロデキストリンを含むＭ２Ｂプレート上に蒔いた。プレートを包み、７〜１０日にわたり２７℃でインキュベートした。直径が２〜４ｍｍのときに、コロニーを、０．５ｍＭのパルミチン酸を含むまたは含まないＭ２Ｂ＋０．４％β−シクロデキストリン＋０．５ｍＭ  ＤＨＡ＋５０μｇ／ｍＬパロモマイシン上にレプリカパッチして、ＦＡＳ遺伝子座でのｇＲＮＡカセット挿入の結果として生じたパルミチン酸に対する栄養要求性を確認した。ＤＨＡおよびパルミチン酸の両方に対して栄養要求性であることを確認した８種の形質転換体のそれぞれから１０個のコロニーを選び出し、０．４％のβ−シクロデキストリン、０．５ｍＭのＤＨＡおよび０．５ｍＭのパルミチン酸を補充したＭ５０−２０  ２５ｍＬを含む平底三角フラスコ中に播種し、培養物を２７℃、２００ｒｐｍで４８時間にわたり増殖させ、４８時間の時点で、各培養物２ｍＬをゲノムＤＮＡ調製用に採取した。ゲノムＤＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出した後、ＰＣＲを実行して、ｇＲＮＡカセットが標的とされる領域を含むカロチンシンターゼ遺伝子座を増幅させた。Ｔ２０２、２０３、２０４、２０７、２０８からの選択された形質転換体からのｇＤＮＡを、ｐＹＢ３６  ＣＳ１  Ｆプライマー（配列番号２７）およびｐＹＢ３６  ＣＳ３  Ｒプライマー（配列番号２９）（表８）、５％ＤＭＳＯ（体積：体積）、ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、テンプレートとしての各ｇＤＮＡを使用するＰＣＲで増幅させ、下記のサイクリング条件を使用した：２分にわたり９５℃、（２０秒にわたり９５℃、１０秒にわたり６１℃、２１秒にわたり７０℃）×３５サイクル、５分にわたり７０℃（図９）。Ｔ２０６からのｇＤＮＡを、ｐＹＢ３６  ＣＳ１  ＦプライマーおよびｐＹＢ３６  ＣＳ１  Ｒプライマー（配列番号２８）（表８）、５％ＤＭＳ���（体積：体積）、ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘで増幅させ、下記のサイクリン条件を使用した：２分にわたり９５℃、（２０秒にわたり９５℃、１０秒にわたり６１℃、１１秒にわたり７０℃）×３５サイクル、５分にわたり７０℃（図１０）。Ｔ２０５およびＴ２０９からのｇＤＮＡを、ｐＹＢ３６  ＣＳ４  Ｆプライマー（配列番号３０）およびｐＹＢ３６  ＣＳ４  Ｒプライマー（配列番号３１）（表８）、５％ＤＭＳＯ（体積：体積）、ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを使用して増幅させ、下記のサイクリング条件を使用した：２分にわたり９５℃、（２０秒にわたり９５℃、１０秒にわたり６１℃、２１秒にわたり７０℃）×３５サイクル、５分にわたり７０℃（図９）。
【０１７０】
【表８】
2019520069.tif 000010
【０１７１】
[00236]得られたＰＣＲアンプリコンをカラム精製し、ｐＪｅｔ１．２ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中にクローニングし、得られた細菌形質転換体をミニプレップし、キットで提供されるプライマーで挿入物を配列決定した。Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアを使用して配列をアラインさせた。
【０１７２】
[00237]ｇＲＮＡをコードするベクターによる２種のＣａｓ９バックグラウンド（Ｔ１８８およびＴ１８９）の形質転換を成功裏に実行し、下記の表９に示すように多数の二重栄養要求株を得た（Ｔ２０２〜２０９と命名した）。選択株を後に遺伝子レベルで分析して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）事象を示すカロテノイドシンターゼ遺伝子座のあらゆる変異を検出した。
【０１７３】
【表９】
2019520069.tif 000011
【０１７４】
[00238]ＤＨＡおよびパルミチン酸の両方の補充を必要とする栄養要求性であることが分かったｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９形質転換体からｇＤＮＡを単離した後、あるＰＣＲを使用して、１つのアンプリコンとして最初の３種のＣＳ  ｇＲＮＡ標的を包含する全領域を増幅させ、別のＰＣＲを使用してｇＲＮＡ３  ＣＳ４標的を別に増幅させた（図９）。ｇＲＮＡ３  ＣＳ１〜３形質転換体ＤＮＡからのアンプリコンの場合の予想サイズは１０４０ｂｐであり、ｇＲＮＡ３  ＣＳ４形質転換体からは７１５ｂｐであった。ｇＲＮＡ  ＣＳ１〜３標的に関するアンプリコンの場合、Ｔ１８８系統に由来する試料は正しいサイズの単一バンドを有した。しかしながら、Ｔ１８９に由来する試料（Ｔ１８９親株自体からのｇＤＮＡを含む）は複数のバンドを有し、約１ｋｂｐのバンドが最も顕著であり且つ約１．５ｋｂｐのバンドが２番目に顕著であった。１．５ｋｂｐのバンドは非特異的増幅の産物であると判断した。非特異的バンドの存在を低減するためのＰＣＲの最適化を行わず、全ての形質転換体に関して約１ｋｂｐのバンドをゲルから切り出してｐＪｅｔ１．２クローニングに使用した。全てのＣＳ４アンプリコンは正しいサイズの単一バンドであった。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ形質転換体のそれぞれからのアンプリコンを有する、得られたいくつかのｐＪｅｔ形質転換体コロニーを配列決定して、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡがＣＳ配列に何らかの影響を及ぼしたかどうかを決定した。
【０１７５】
[00239]加えて、クローンのＴ２０６系統に対して分析を実施した。図９に示すように、Ｔ２０６形質転換体からｇＤＮＡを抽出し、ＰＣＲのテンプレートとして使用してｇＲＮＡ３  ＣＳ１標的配列のみを増幅させ、予想アンプリコンサイズは６８９ｂｐであった。前の図で観察したものと同様に、このサイズのバンドをゲル（他のより高い分子量のバンドの真ん中に主要バンド）上で観察した。予想される約７００ｂｐサイズのゲル断片を切断して精製し、ｐＪｅｔ１．２クローニングおよびこの断片の配列決定に使用して、Ｃａｓ９−ｇＤＮＡがＣＳ遺伝子中に何らかの配列変化を含んでいたかをどうかを決定した（図１０）。
【０１７６】
[00240]Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの両方をコードするベクターで形質転換したクローンからのＣＳ遺伝子座のアンプリコンを含む複数のｐＪｅｔベクターを配列決定すると、いくつかの種類の変化が起きていることを観察した（表１０）。以前の研究は、ＣＡＳ９がＤＮＡを開裂し、ＰＡＭ配列の３塩基対上流の位置で二本鎖を切断することを示していた（Ｊｉｎｅｋ  ｅｆ  ａｌ．“Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６０９６）：８１６−８２１，２０１２）。二本鎖切断の部位では、可変長の挿入変異および／または欠失変異を生じさせ得る不正確な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介修復から変異が生じる可能性があることが分かっている（Ｓａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｕｎｇ，“ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２（４）：３４７−３５５，  ２０１４）。予想されるように、観測した変化の全てはＰＡＭ（この場合ではＡＧＧ）に対して−３位置で起こる。Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡ形質転換体中で検出したスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種２０８８８のカロテノイドシンターゼの例示的変異を表１０に示し、欠失をダッシュで示し且つ挿入を下線付きのテキストで示した。
【０１７７】
【表１０】
2019520069.tif 000012
【０１７８】
[00241]本明細書で引用した全ての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれると具体的に且つ個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。いずれの参考文献の引用も出願日前のこの参考文献の開示に関してであり、本開示が先行発明によりそのような参考文献に先行する権利が付与されていないことの承認として解釈すべきではない。
【０１７９】
[00242]上記で説明した要素のそれぞれが、または２種以上が一緒に、上記で説明した種類とは異なる他の種類の方法においても有用な用途を見出し得ることが理解されるだろう。さらに分析することなく、上述は、他者が、現在の知識を適用することにより、先行技術の観点から、添付の特許請求の範囲に記載された本開示の包括的なまたは具体的な態様の本質的な特徴を明確に構成する特徴を省略することなく、本開示を様々な用途に容易に適合させ得るように本開示の要旨を完全に明らかにしているだろう。上述の実施形態は例として提示されているのみであり、本開示の範囲は下記の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【０１８０】
［実施例５］
[00243]［非標的Ｃａｓ９ベクター（ｐＹＢ６１）の設計および構築］
[00244]既に、Ｃａｓ９プラスミドを、ＰＵＦＡシンターゼ遺伝子（ＯｒｆＡサブユニット；ｐＹＢ３２およびｐＹＢ３３を参照されたい）での標的を定めた組込み用に設計した。このように設計したＣａｓ９カセットの組込みにより、ＯｒｆＡ遺伝子およびＤＨＡ栄養要求性がノックアウトされた。栄養要求性の誘発は、ＯｒｆＡ遺伝子座でのその後の組込みに関する形質転換体の容易なスクリーニングを可能にするが、ＣＲＩＳＰＲ媒介カロチンシンターゼノックアウトの識別をより困難にした。いかなる染色体遺伝子座も標的とすることなくＣａｓ９用の発現カセットを有するプラスミドを構築し、異所性のランダム組込みの効果を試験した。プラスミドｐＣＬ１２２−Ｃａｓ９（配列番号１）をＢａｍＨＩ−ＨＦ（ＮＥＢ）およびＮｅｄＩ（ＮＥＢ）で消化して、２つの断片（４１４０ｂｐおよび５７８０ｂｐのサイズ）を得た。４１４０ｂｐの断片を１％アガロースゲル上で分離させ、切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した（図１１）。プラスミドｐＹＢ３０（配列番号３２）は、ＧＦＰの発現およびゼオシン耐性を駆動するアルファ−チューブリンプロモーターの部分的断片を含む。このプラスミドをＢａｍＨＩ−ＨＦ（ＮＥＢ）およびＮｄｅＩ（ＮＥＢ）で消化して、２つの断片（８３８ｂｐおよび４７２４ｂｐ）を得た。４７２４ｂｐの断片を１％アガロースゲル上で分離させ、切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した（図１１）。目的の２つの断片を、Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して連結した。次いで、ＮＥＢ１０β化学的コンピテント細胞（ＮＥＢ）を、このライゲーション反応体の一部で形質転換させた。得られたコロニーを、２×ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、プライマー１２１  Ｔｕｂ  ｓｅｑ  ＦおよびｐＹＢ３２／３Ｃ  Ｒ１、ならびに５％最終ＤＭＳＯを用いたＰＣＲによるスクリーニング用のテンプレートとして使用した。下記のサイクリング条件を適用した：５分にわたり９５℃、［３０秒にわたり９５℃、３０秒にわたり５９℃、１分にわたり７２℃］を３５サイクル、および５分にわたり７２℃（既に説明している）（図１２）。ＰＣＲにより陽性形質転換体と確認したコロニーからプラスミドを抽出し、配列決定し、得られたベクターをｐＹＢ６１（配列番号３３）と命名した。
【０１８１】
【表１１】
2019520069.tif 000013
【０１８２】
［実施例６］
[00245]［非標的ｇＲＮＡベクター（ｐＹＢ６６）の設計および構築］
[00246]既に、ｇＲＮＡプラスミドは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）遺伝子座を標的とし、それによりパルミチン酸に対する栄養要求性を生じさせた。この栄養要求性は、ＣＲＩＳＰＲ媒介カロチンシンターゼ不活性化から生じる表現型をマスクした。カロテノイド生合成に関与する遺伝子座でのＣＲＩＳＰＲ媒介表現型の変化をよりよく識別するために、非標的ｇＲＮＡベクターを作製した。プラスミドｐＣＬ１２２（配列番号３７）をＢａｍＨＩ−ＨＦ（ＮＥＢ）およびＮｄｅＩ（ＮＥＢ）で消化してＧＦＰをコードするリーディングフレームを除去し、２つの断片（８３８ｂｐおよび５７７３ｂｐのサイズ）を得た。５７７３ｂｐの断片を１％アガロースゲル上で分離させ、切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した（図１３）。ｇＲＮＡ３  ＣＳ１をコードするカセットを、２×ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、プライマーｐＹＢ６６  ＢａｍＢｇｌ  ＦおよびｐＹＢ６６  Ｎｄｅ  Ｒ、ならびに５％最終ＤＭＳＯと共にテンプレートとしてプラスミドｐＹＢ３６（配列番号９）を使用するＰＣＲで増幅させた。下記のサイクリング条件を適用した：２分にわたり９５℃、［２０秒にわたり９５℃、１０秒にわたり５９℃、５秒にわたり７０℃］を３５サイクル、および２分にわたり７２℃（図１４）。得られたＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してカラム精製し、ＢａｍＨＩ−ＨＦ（ＮＥＢ）およびＮｄｅＩ（ＮＥＢ）で消化した。消化後、得られたＤＮＡ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（図１５）を使用して再び精製した。消化したｐＣＬ１２２断片およびｇＲＮＡ断片を、Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して連結した。次いで、ＮＥＢ１０β化学的コンピテント細胞を、このライゲーション反応体の一部で形質転換させ、得られた細菌コロニーを、２×ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、プライマーｐＹＢ６６  ＥＦ１  ｓｅｑ  ＦおよびｐＣＬ１２２  ＯｒｆＣ  Ｒ、ならびに５％最終体積のＤＭＳＯを使用するコロニーＰＣＲによりスクリーニングし、下記のサイクリング条件を使用した：１０分にわたり９５℃、［３０秒にわたり９５℃、３０秒にわたり６０℃、４５秒にわたり７２℃］を３５サイクル、および５分にわたり７２℃（図１６）。ＰＣＲにより陽性のコロニーからプラスミドを抽出し、配列決定し、得られたベクターをｐＹＢ６６（配列番号３４）と命名した。
【０１８３】
【表１２】
2019520069.tif 000014
【０１８４】
［実施例７］
[00247]［Ｃａｓ９およびｇＲＮＡのベクター（ｐＹＢ７３）の設計および構築］
[00248]単一の優性選択マーカーと共にＣａｓ９カセットおよびｇＲＮＡカセットの両方を含むベクターを作製し、ゲノム編集に対するそのような配置の効率を試験した。プラスミドｐＹＢ６１をＰｓｔＩ（ＮＥＢ）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した（図１７）。下記：２×ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、プライマーｐＹＢ７３  ｇＲＮＡ  Ｐｓｔ  Ｋｐｎ  ＩＦ  ＦおよびｐＹＢ７３  ｇＲＮＡ  Ｘｈｏ  Ｐｓｔ  ＩＦ  Ｒ、ならびに５％最終ＤＭＳＯによるＰＣＲを使用して、ｐＹＢ３６からｇＲＮＡ発現カセットを増幅させた。サイクリング条件を下記の通りに使用した：２分にわたり９５℃、［２０秒にわたり９５℃、１０秒にわたり５８℃、３８秒にわたり７０℃］を３５サイクル、および２分にわたり７０℃（図１８）。得られたＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してカラム精製した。製造業者のプロトコルに従ってＩｎＦｕｓｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、精製した消化済ｐＹＢ６１断片と、精製した消化済ｇＲＮＡ  ＰＣＲ断片とを連結した。ＮＥＢ１０β化学的コンピテント細胞をこのＩｎＦｕｓｉｏｎ反応体の一部で形質転換させ、得られた細菌コロニーを、下記：２×ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、プライマーｐＹＢ７３  ｓｅｑ  ＦおよびｐＹＢ７３  ｓｅｑ  Ｒ、ならびに５％最終ＤＭＳＯによるＰＣＲでスクリーニングした。下記のサイクリング条件を適用した：１０分にわたり９５℃、［３０秒にわたり９５℃、３０秒にわたり６０℃、２分にわたり７２℃］を３５サイクル、および５分にわたり７２℃（図１９）。ＰＣＲにより陽性のコロニーからプラスミドを抽出し、配列決定し、得られたベクターをｐＹＢ７３（配列番号３５）と命名した。プラスミドｐＹＢ７３は、任意の特定の遺伝子を標的とするようには設計されていない。
【０１８５】
【表１３】
2019520069.tif 000015
【０１８６】
［実施例８］
[00249]［ＣａｒＧ株の設計、構築および形質転換］
[00250]ＣＲＩＰＳＲ媒介カロチンシンターゼ遺伝子不活性化（白色コロニー表現型）を有する形質転換体と、ＣＲＩＰＳＲ媒介カロチンシンターゼ遺伝子不活性化を有しない形質転換体（黄色がかったオレンジ色コロニー表現型）との区別を改善するために、ムーコル・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）由来のＣａｒＧ遺伝子（ゲラニルゲラニルピロホスフェートシンターゼ）をスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）中での発現にコドン最適化した。産生されるカロテノイドの総量を増加させて形質転換体をよりオレンジ色にするはずであるＣａｒＧ遺伝子をＤＮＡ２．０で合成し、ブラストサイジン選択カセットを含むスキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）発現ベクター中にクローニングした。得られたベクターをｐＣＬ３１０（配列番号３６）と命名した。
【０１８７】
[00251]スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種の野生型株ＡＴＣＣ  ２０８８８を、粒子衝撃法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いたｐＣＬ３１０による形質転換に使用した。ＡＴＣＣ  ２０８８８を、一晩２００ｒｐｍで振盪しつつ、＋２７℃にて２５０ｍＬの平底三角フラスコ中のＭ５０−２０培地２５ｍＬ中で増殖させた。その後、２０８８８培養物を、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ中においてＭ２Ｂ培地５０ｍＬで１／１００に希釈し、既に使用した条件下で一晩増殖させた。２０８８８培養物が初期対数期（０．６〜２ＯＤ単位／ｍＬ）であった場合に、この２０８８８培養物を１０分にわたる３，２２０×ｇの遠心分離により回収した。上清をデカントし、ペレットを２０ＯＤ単位／ｍＬの最終濃度までＭ２Ｂに再懸濁させた。得られた細胞懸濁液１００μＬを非選択Ｍ２Ｂ寒天プレート（直径約２インチ）の約３分の１上に広げた。プラスミドＤＮＡ  ５μｇおよびｐＣＬ３１０  ５μｇを、２．５ＭのＣａＣｌ２  ５０μＬ、０．１Ｍのスペルミジン２０μＬおよび調製したＭ１０  Ｔｕｎｇｓｔｅｎビーズ（製造業者のプロトコルに従う）５０μＬと混合し、１分にわたりボルテックスし、次いで室温で１０分にわたりインキュベートしてビーズを沈殿させた。ＤＮＡ被覆ビーズを１００％エタノール２５０μＬで１回洗浄し、次いでビーズを１００％エタノール６０μＬに再懸濁させた。調製した各マクロキャリア（マクロキャリア組立体の調製用の製造業者のプロトコルに従う）は、フードからの振動が最小となる条件下において、中心にスポットされたエタノール中に被覆ビーズ１０μＬを有しており、そのためエタノールを乾燥させた。両方を７０％イソプロパノール中で短時間滅菌した後、破裂ディスクホルダに１，１００ｐｓｉ破裂ディスクを固定した。組み立てたマクロキャリアプラットフォームを最上部の棚位置に配置し、２０８８８細胞パッチを有するＭ２Ｂ寒天プレートを最上部から３番目の棚上で細胞側を上にして配置した。衝撃装置のチャンバ内の水銀柱が約２７インチという真空になった場合、破裂ディスクが破裂するまでヘリウムを燃焼させた。次いで、ヘリウム流を遮断し、このチャンバを大気に開放した。次いで、衝撃されたプレートをこのチャンバから取り出した。この衝撃プロセスを全ての試料およびコントロールに関して繰り返した。ｐＣＬ３１０で衝撃した２０８８８株をＴ２１２と命名した。衝撃されたプレートを４時間にわたり＋２７℃インキュベーター中でインキュベートし、その後、細胞をＭ２Ｂ約１ｍＬでプレートから洗い流し、１００μｇ／ｍＬのブラストサイジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む４枚のＭ２Ｂ寒天プレートに等分した。細菌を３ｍｍの滅菌ガラスビーズで広げた。ビーズの除去後、プレートを包み、５〜８日にわたり＋２７℃でインキュベートした。コロニーが２〜４ミリメートルのサイズに達した場合に、コロニーを、１００μｇ／ｍＬのブラストサイジンを含むＭ２Ｂ寒天プレート上にパッチした。ブラストサイジンに対して耐性であることを確認したコロニーを選び出し、２５０ｍＬの平底三角フラスコ中においてＭ５０−２０  ５０ｍＬに播種し、４８時間にわたり＋２７℃および２００ｒｐｍでの振盪機中に配置した。４８時間のインキュベーション時間の後、培養物２ミリリットルを１０分にわたる４，０００×ｇでの遠心分離により集め、上清をデカントし、ペレットを改変フェノール−クロロホルム抽出後のゲノムＤＮＡ単離に使用した。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるＰＣＲテンプレートとして使用し、プライマーｐＹＢ１３  ｐＹＢ１  ｓｅｑ  ＦおよびｐＣＬ１２２  ＯｒｆＣ  Ｒならびに５％最終濃度までのＤＭＳＯを使用してＣａｓ９カセットの存在を確認した。下記のサイクリング条件を適用した：２分にわたり９５℃、［３０秒にわたり９５℃、３０秒にわたり６３℃、１分４５秒にわたり７２℃］を３５サイクル、および５分にわたり７２℃（図２０）。ＰＣＲで決定した場合にｐＣＬ１３０形質転換ＤＮＡの存在に関して陽性であり且つ野生型コントロールと比較して濃いオレンジ色に見えたいくつかの形質転換体を、ＵＶ−Ｖｉｓ法により総カロテノイドに関して分析した。この分析から、２種の株（Ｔ２１２−３−１およびＴ２１２−３−２）を、より高い総カロテノイドを有すると同定した。ゲノム編集要素によるその後の研究のためにＴ２１２−３−２を選択した。
【０１８８】
【表１４】
2019520069.tif 000016
【０１８９】
［実施例９］
[00252]［ｐＹＢ６１、ｐＹＢ６６およびｐＹＢ７３によるＴ２１２および２０８８８の形質転換］
[00253]スキゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）中での編集効率への非標的ベクターの効果を試験するために、いくつかの形質転換を、上記で説明した粒子衝撃法を使用して実施した。この形質転換を下記のように設定した：ｐＹＢ６１で形質転換されたＴ２８０−Ｔ２１２−３−２株、およびｐＹＢ６１で形質転換されたＴ２８５−ＡＴＣＣ  ２０８８８野生型株。両方の形質転換を実行して、ｇＲＮＡ試験作業のためにＣａｓ９を予め発現するレシピエント株を作製した。その後の形質転換を下記のように設定した：ｐＹＢ６１およびｐＹＢ６６で共形質転換したＴ２８１−Ｔ２１２−３−２株、ならびにｐＹＢ６１およびｐＹＢ６６で共形質転換したＴ２８６−ＡＴＣＣ  ２０８８８野生型株。Ｔ２８１およびＴ２８６の形質転換を実施して、ゲノム中の任意の特定の遺伝子座を標的とするように設計されていないプラスミドを用いて編集効率を評価した。ｐＹＢ７３で形質転換したＴ２８２−Ｔ２１２−３−２株およびｐＹＢ７３で形質転換したＴ２８７−ＡＴＣＣ  ２０８８８野生型株を比較して、ゲノム編集用の両方の要素を持つ単一のプラスミドによる編集効率を評価した。５０μｇ／ｍＬでゼオシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充したＭ２Ｂプレート上で、Ｔ２８０形質転換、Ｔ２８２形質転換、Ｔ２８５形質転換、Ｔ２８７形質転換を選択した。５０μｇ／ｍＬでゼオシンを補充し且つ１００μｇ／ｍＬでパロモマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＭ２Ｂプレート上で、Ｔ２８１形質転換およびＴ２８６形質転換を選択した。これらの形質転換の全てから得たコロニーを、１００μｇ／ｍＬのゼオシンのみを含むまたは１００μｇ／ｍＬのゼオシンおよび１００μｇ／ｍＬのパロモマイシンを一緒に含む選択Ｍ２Ｂプレート上にパッチした。これらのパッチプレート上で力強く増殖し且つ適用可能な場合に白色コロニー表現型を示したパッチを、さらなる分析のために選択した。これらの株をこのパッチプレートから取り出し、２５０ｍＬの三角平底フラスコ中のＭ５０−２０培地２５ｍＬに播種した。フラスコを約２４時間にわたり＋２７℃、２００ｒｐｍで増殖させた。各播種のアリコート２ｍＬを採取して微量遠心管に入れ、１０分にわたり７，５００×ｇで遠心沈殿させた。上清をデカントし、ペレットを使用して、改変フェノール−クロロホルム抽出法を使用してゲノムＤＮＡを調製した。得られたｇＤＮＡを、選択カセットおよび目的の遺伝子の存在に関してＰＣＲによる分析にかけた。Ｔ２８０、Ｔ２８１、Ｔ２８５、Ｔ２８６の場合、選択カセットのターミネーターとＣａｓ９遺伝子の最初との間の接合部を、下記を使用して増幅させた：２×ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、プライマー１２１  Ｔｕｂ  ｓｅｑ  ＦおよびｐＹＢ３２／３  ＣＲ１、５％最終濃度までのＤＭＳＯ、ならびにｇＤＮＡ。下記の条件を適用した：２分にわたり９５℃、［３０秒にわたり９５℃、３０秒にわたり５８℃、１分２秒にわたり７２℃］を３５サイクル、および５分にわたり７２℃（図２１）。Ｔ２８１およびＴ２８６の場合。ｇＲＮＡカセットの存在を、下記のような全ｇＲＮＡカセットのＰＣＲ増幅により評価した：２×ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、プライマーｐＹＢ６６  ＥＦ１  ｓｅｑ  ＦおよびｐＣＬ１２２  ＯｒｆＣ  Ｒ、５％最終濃度までのＤＭＳＯ、ならびにｇＤＮＡ。下記のサイクリング条件を適用した：２分にわたり９５℃、［３０秒にわたり９５℃、３０秒にわたり６０℃、４７秒にわたり７２℃］を３５サイクル、および５分にわたり７２℃（図２２）。Ｔ２８２およびＴ２８７の場合、ｇＲＮＡカセットの存在を下記のようなＰＣＲにより評価した：２×ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、プライマーｐＹＢ６６  ＥＦ１  ｓｅｑ  ＦおよびＴＴ  ｐＹＢ７３  ＨＤＶ  Ｒ、５％最終濃度でのＤＭＳＯ、およびｇＤＮＡ。下記のサイクリング条件を適用した：２分にわたり９５℃、［３０秒にわたり９５℃、３０秒にわたり６０．９℃、１６秒にわたり７２℃］を３５サイクル、および５分にわたり７２℃（図２３）。Ｃａｓ９およびｇＲＮＡに関してＰＣＲで陽性と試験したＴ２８１形質転換体、Ｔ２８２形質転換体、Ｔ２８６形質転換体およびＴ２８７形質転換体をＰＣＲにかけて、ＣＳ遺伝子においてｇＲＮＡが変化に影響を及ぼす部分を増幅させ、ＰＣＲアンプリコンを配列決定し且つこの遺伝子編集実験で得られたインデルの種類を観察した。ＣＳ遺伝子のこの関連部分を増幅させるためのＰＣＲを下記で調製した：２×ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、プライマーｐＹＢ３６  ＣＳ１  ＦおよびｐＹＢ３６  ＣＳ１  Ｒ、５％最終濃度までのＤＭＳＯ、およびｇＤＮＡ。下記のサイクリング条件を適用した：２分にわたり９５℃、［２０秒にわたり９５℃、１０秒にわたり６１℃、１１秒にわたり７０℃］を３５サイクル、および５分にわたり７０℃（図２４）。ＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してカラム精製し、ｐＹＢ３６  ＣＳ１  ＦおよびｐＹＢ３６  ＣＳ１  Ｒで配列を確認した。
【０１９０】
【表１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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